CN104524562A - 口服六价重配轮状病毒活疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种口服六价重配轮状病毒活疫苗,含有六种主要流行株血清型G1、G2、G3、G4、G8及G9,涵盖了A群轮状病毒99.6%的G血清型病毒,预计对轮状病毒腹泻有很好的预防保护效果。本发明的目的旨在提供一种口服接种的、由六价轮状病毒血清型组成的活疫苗,用以预防因轮状病毒导致的婴幼儿腹泻,所述的六价重配口服轮状病毒疫苗成分为,(1)G1、G2、G3、G4、G8及G9血清型活疫苗,各血清型原液滴度为1~5×106FFU/ml;(2)保护剂:枸橼酸0.5~2g/L、枸橼酸钠50~150g/L、蔗糖250~450g/L、氯化锌5~10mm、氯化钙10~20mm。
Description
技术领域
本发明属于疫苗制剂领域,具体而言,涉及一种口服六价重配轮状病毒活疫苗。
背景技术
人轮状病毒属于呼肠孤病毒科轮状病毒属,为无包膜RNA病毒,颗粒直径约75nm,由三层二十面体蛋白衣壳组成。其基因组为包含11个节段的双链RNA,编码6个结构蛋白(VP1、VP2、VP3、VP4、VP6、VP7)和5个非结构蛋白(NSP1、NSP2、NSP3、NSP4、NSP5),外层蛋白为VP4和VP7,內壳蛋白为VP6,核蛋白为VP1、VP2和VP3。同一个组的病毒之间能够发生基因重配。根据病毒内壳蛋白VP6抗原性不同,HRV可分为7组(A~G),导致人类腹泻的仅有A、B、C三组。A组即婴幼儿腹泻的最主要原因,本项目的轮状病毒疫苗也是根据A组设计;B组即成人腹泻轮状病毒,曾在我国爆发流行;C组感染遍布全世界,多为散发。HRV外壳蛋白VP7(糖蛋白或G蛋白)决定G血清型,外壳蛋白VP4(蛋白酶敏感蛋白或P蛋白)决定P血清型,常见的人A组轮状病毒G血清型为G1、G2、G3、G4、G8、G9,P血清型为P4、P8。不同地区流行株不同,欧洲的流行病监测表明:毒株血清型分别为G1(63%)、G2(8%)、G3(5%)、G4(15%)和未分型(8%),印度流行株为G9,巴西为G5,近年来G8逐渐成为非洲优势流行株。我国2008年在全国11个地区的HRV流行病学监测数据表明,其毒株血清型依次为G1(32.4%)、G2(10%)、G3(44.8%)、G4(0.5%)、G5(0.4%)和G9(11.9%),优势流行株由1999年的G1血清型逐渐转变为2007年的G3血清型,2013年以G9也成为优势流行株。
轮状病毒感染是波及全球的一种常见疾病,常发生于6-24月龄婴幼儿,也可感染成人,主要引起轮状病毒肠炎(Rotavirus Enteritis),导致脱水性腹泻。因发病高峰在秋季,故又名“秋季腹泻”。轮状病毒主要通过粪口途径密切接触感染,潜伏期2-4天后出现水样腹泻和呕吐,继而导致脱水症状,并伴有发热和腹痛,发病后3-9天粪便中有病毒排出,第3天病毒排出达到高峰。
几乎所有儿童在出生后3~5年都感染过轮状病毒。全球轮状病毒每年导致5岁以下儿童大约1.1亿人次胃肠炎疾病需要进行家庭护理,2.5亿人次门诊治疗,2百万人次住院治疗,60万人死亡。如今发达国家虽然腹泻发病常见,但病死率很低,超过85%的死亡发生在低收入的亚、非国家。我国94.5%的2岁以内婴幼儿感染过轮状病毒,0-5月龄婴儿粪便中轮状病毒检出率为34%,6-11月龄婴儿检出率为53%,12-23月龄为57.7%,24-35月龄为39%,36-59月龄为15%。轮状病毒腹泻患儿中男女性别比为1.77:1。轮状病毒以其广泛、频繁、能导致重症腹泻而位居世界范围内致2岁以下婴幼儿严重腹泻之病原排行榜首位。我国每年10月份到次年1月份为发病高峰期,呈现季节性分布特点。近年研究发现轮状病毒还可引起肠道外其他系统感染。
公共卫生条件的改善并不能减少轮状病毒腹泻的发病率。轮状病毒的感染目前尚无特效防治办法,主要是控制传染源,切断传播途径,严密消毒可能污染的物品。临床治疗方面,主要是及时输液,纠酸及纠正水电解质平衡等支持疗法,以减少婴儿的死亡率。在世界范围内,通过对轮状病毒研究的日趋深入,普遍认为研制轮状病毒疫苗是人类预防轮状病毒严重感染的最有效途径。
目前国内外上市的轮状病毒疫苗主要包括兰州生物制品有限责任公司的单价羊株减毒活疫苗罗特威、Merck公司五价人-牛重配减毒活疫苗Rotateq以及GSK公司单价人株减毒活疫苗Rotarix。
轮状病毒流行株多样性的特点,决定了多价疫苗才是最有效预防轮状病毒腹泻的方法,然而目前市场上的主要轮状病毒疫苗,兰州生物制品研究所的罗特威以及GSK公司的Rotarix均为单价血清型轮状病毒疫苗,血清型涵盖范围小,Merck公司的Rotateq虽然为五价轮状病毒疫苗,但血清型中不含有G8、G9血清型,对主要血清型流行株囊括范围小,其在非洲马拉维(G8血清型为优势流行株)的临床试验结果显示,对重症轮状病毒腹泻的保护率仅为40%。
因此,需要一个更为全面的多价轮状疫苗。
发明内容
本发明为口服六价重配轮状病毒活疫苗,含有六种主要流行株血清型G1、G2、G3、G4、G8及G9,涵盖了A群轮状病毒99.6%的G血清型病毒,预计对轮状病毒腹泻有很好的预防保护效果。
本发明的目的旨在提供一种口服接种的、由六价轮状病毒血清型组成的活疫苗,用以预防因轮状病毒导致的婴幼儿腹泻,属于疫苗生产制备领域范畴。本发明提供各血清型原液的制备方法,口服轮状病毒保护剂的研发以及轮状病毒疫苗的配制方法。
根据轮状病毒的感染及免疫学机制,本发明所述的轮状病毒疫苗免疫采用口服给药途径,与病毒感染途径一致,相较于注射给药,口服给药疫苗更加快捷方便,利于操作。
本发明所述的六价重配口服轮状病毒疫苗成分为,
(1)G1、G2、G3、G4、G8及G9血清型活疫苗,各血清型原液滴度为1~5×106FFU/ml;
(2)保护剂:枸橼酸0.5~2g/L、枸橼酸钠50~150g/L、蔗糖250~450g/L、氯化锌5~10mM、氯化钙10~20mM;
所述的G1血清型活病毒NIH编号为:MVS-BRV-1;
所述的G2血清型活病毒NIH编号为:MVS-BRV-2;
所述的G3血清型活病毒NIH编号为:MVS-BRV-3;
所述的G4血清型活病毒NIH编号为:MVS-BRV-4;
所述的G8血清型活病毒NIH编号为:1290×UK;
所述的G9血清型活病毒NIH编号为:MVS-BRV-10。
本发明还涉及所述的六价重配口服轮状病毒疫苗的制备方法,所述方法包括如下步骤:
(1)制备各血清型单价病毒原液,并按照目标滴度配置各个血清型病毒原液,并将各原液依次加入同一提前灭菌的容器中,充分混合并除菌,即得六价混合液;
(2)配制保护剂母液并除菌;
(3)将保护剂母液及步骤(1)配制的六价混合液混合,并将其按照2ml/瓶规格进行分装,即得到成品。
所述的除菌为0.2μm除菌过滤器过滤除菌。
所述的制备各血清型单价病毒原液的步骤为:
(1)细胞传代:各血清型病毒的培养基质为Vero细胞,首先复苏Vero细胞工作种子,37℃条件下培养3-5天后,按照一定比例进行传代扩增培养,培养容器依次分别为T25、T75、T175细胞培养瓶、10层细胞工厂、40层细胞工厂,在40层细胞工厂中培养3-5代后即可分别接种G1、G2、G3、G4、G8、G9血清型轮状病毒;
(2)病毒培养:细胞工厂内细胞汇合度达到90%以上后,进行病毒接种操作。病毒接种前,选择一个细胞工厂进行细胞计数,根据计数结果,按照病毒感染复数0.005~0.2进行计算,得出需要的病毒量;用胰蛋白酶对病毒激活,激活条件为37℃、胰蛋白酶浓度10~20μg/ml,激活15~60min;将激活的病毒接种于细胞工厂内,接种后的各血清型病毒培养于35~37℃条件下2~5天;
(3)病毒收获:待细胞病变完全(细胞脱落达到75%以上)将各细胞工厂内的液体收集于一容器内,进行下游处理;
(4)下游操作:首先进行细胞破碎处理,采用冻融或高压均质方式破碎细胞,冻融温度为-30℃~37℃,高压均质压力范围为100~1000bar,高压均质处理完后,进行细胞碎片澄清过滤操作,采用两级过滤,第一级为1.0μm~0.5μm深层过滤器,第二级为0.2μm除菌过滤器,澄清过滤完成后,对病毒液进行超滤浓缩,采用300K孔径超滤膜,对处理后的病毒收获液进行10倍浓缩,即得到单价血清型疫苗原液。
本发明还涉及所述六价重配口服轮状病毒疫苗在制备口服轮状病毒疫苗中的应用。
具体实施方式
材料与方法
1.主要材料:
1.1Vero细胞细胞来源于ATCC(American type culture collection美国标准菌种保藏中心),123代,ATCC编号:TL-CCL-81.4;
1.2人牛重配轮状病毒毒种来源于NIH(National Institutes of Health美国国立卫生研究院)
MVS-BRV-1:人-牛轮状病毒G1血清型
MVS-BRV-2:人-牛轮状病毒G2血清型
MVS-BRV-3:人-牛轮状病毒G3血清型
MVS-BRV-4:人-牛轮状病毒G4血清型
1290×UK:人-牛轮状病毒G8血清型
MVS-BRV-10:人-牛轮状病毒G9血清型
1.3轮状病毒工作代次疫苗株:轮状病毒工作代次各血清型疫苗株由武汉生物制品研究所有限责任公司制备生产(在NIH毒种的基础上扩增传代培养而得到)。
1.4细胞工厂(cell factory货号:173240)购自Corning公司
1.5细胞培养液VP-SFM、病毒培养液DMEM购自GIBCO公司
实施例1.各血清型病毒原液的制备
细胞传代:各血清型病毒的培养基质为Vero细胞,首先复苏Vero细胞工作种子,37℃条件下培养3-5天后,按照一定比例进行传代扩增培养,培养容器分别为T25、T75、T175细胞培养瓶、10层细胞工厂、40层细胞工厂,在40层细胞工厂中培养3-5代后分别接种G1、G2、G3、G4、G8、G9血清型轮状病毒。
病毒培养:细胞工厂内细胞汇合度达到90%以上后,即可进行病毒接种操作。病毒接种前,选择一个细胞工厂进行细胞计数,根据计数结果,按照MOI(病毒感染复数)0.005-0.2进行计算,得出需要的病毒量,并用胰蛋白酶对病毒激活。激活条件为37℃、胰蛋白酶浓度10-20μg/ml,激活15min-60min。将激活的病毒接种于细胞工厂内,接种后的各血清型病毒培养于35-37℃条件下2-5天。
病毒收获:待细胞病变完全(细胞脱落达到75%以上)将各细胞工厂内的液体收集于一容器内,进行下游处理。
下游操作:首先进行细胞破碎处理,采用冻融或高压均质方式破碎细胞,冻融温度为-30℃-37℃,高压均质压力范围为100-1000bar,高压均质处理完后,进行细胞碎片澄清过滤操作,采用两级过滤,第一级为1.0μm+0.5μm深层过滤器,第二级为0.2μm除菌过滤器。澄清过滤完成后,对病毒液进行超滤浓缩,采用300K孔径超滤膜,对处理后的病毒收获液进行10倍浓缩,即得到单价血清型疫苗原液。
实施例2.疫苗保护剂的研制
(1)病毒抗酸能力的确定
通过实验确定六价轮状病毒疫苗所能耐受的最低pH值。
将六价血清型病毒混合疫苗(六价疫苗原液等体积混合)与1%枸橼酸钠溶液等体积混合。
(2)准备7支一次性无菌50ml离心管,其中6支分别加入2ml步骤(1)中混合好的六价苗,另1支加入1ml六价混合苗和1mlDMEM做对照。
(3)调节pH,6支离心管中分别加入0.1M盐酸0ml、0.4ml、0.6ml、0.7ml、0.8ml、1.2ml,测得对应的pH为7.84、5.02、4.00、3.50、3.05、2.00。
(4)将7支离心管置于37℃水浴箱内孵育2h。
(5)孵育时间结束后,每支离心管中立即加入DMEM至20ml。
(6)将上述试验样品分装至冻存管中,存放于-70℃冰箱内保存待检。
(7)每个pH值对应的样品反复检测三次病毒滴度(FFA),与对照组比较,滴度无明显改变的组别对应的最低pH即为牛人重配轮状病毒减毒疫苗株所能耐受的最低pH。表1为六种血清型三次滴度检测的结果。
表1.六种血清型三次滴度检测的结果(单位:lgFFU/ml)
可以看出,pH在大于4.0时,与对照组比较,滴度无明显改变,而当pH低于4.0时,病毒滴度下降明显。从而确定牛人重配轮状病毒减毒疫苗株所能耐受的最低pH为4.0。
(2)最佳抗酸剂缓冲对选择
用酸碱滴定的方法,利用1M的氢氧化钠对四种常用酸(浓度为1M)进行滴定,根据消耗的氢氧化钠的量来确定四种酸在pH4-7之间的缓冲能力。在pH4-7之间,缓冲能力为:枸橼酸(消耗氢氧化钠17ml)>苹果酸(消耗氢氧化钠10ml)>磷酸(消耗氢氧化钠9ml)>醋酸(消耗氢氧化钠8ml),即确定缓冲能力较强的缓冲对为氢氧化钠对枸橼酸。
(3)抗酸剂缓冲对缓冲容量的确定
按照参考文献,婴儿20分钟内分泌的胃酸含量范围为0.8-1.0mM,取三支50ml离心管,分别加入盐酸的量为0.8mM、0.9mM和1.0mM,并分别向三支离心管中加入0.1M枸橼酸钠,同时监测pH,待pH升至4.0时停止加入,结果见表2.。
表2.缓冲对缓冲容量测定结果
中和0.8mM-1.0mM盐酸需要0.1M枸橼酸钠6-7.5ml,换算质量为:0.1548g-0.1935g,即2ml配方中需含有枸橼酸钠的量为:0.1548g-0.1935g,每100ml需要枸橼酸钠的量为:7.74g-9.67g。
(4)抗酸剂抗酸能力鉴定
平行设置四组实验,取四支15ml离心管,分别标记组1、组2、组3、组4,其中:
组1:1ml六价混合苗与1m DMEM等体积混合;
组2:根据计算出的抗酸剂的量预先制备2倍浓度的抗酸剂,取1ml与六价混合苗等体积混合;
组3:六价混合苗与2倍浓度抗酸剂各1ml混合后,加1M盐酸1ml(1.0mM);
组4:六价混合苗与1M盐酸各1ml等体积混合;
(2)将四支离心管放置于37℃水浴箱内孵育2h。
(3)孵育时间结束后,迅速将组1、组2、组4中各取1ml至准备好的离心管中,分别补加9ml DMEM,组3中取1.3ml并补加8.7ml DMEM,以终止盐酸作用。
(4)将四组样品分装至冻存管中,贴签,保存于-70℃冰箱内待检。
(5)各组别样品进行滴度检测(FFA检测),通过各组别的滴度差别来确定抗酸剂的抗酸效果。
结果见表3。
表3.抗酸剂缓冲能力及对六价苗滴度的影响(单位:lgFFU/ml)
由此可以看出,组1、组2、组3各血清型滴度基本无差别,而组4滴度下降明显,说明所选择的抗酸剂足够中和1.0mM的盐酸,且抗酸剂本身不会对病毒有影响。
实施例3.不同配方的筛选
5种疫苗保护剂配方成分含量见表4
表4 不同保护剂的各成分含量
各配方与对温度最敏感的血清型G9病毒混合,进行加速稳定性试验,结果见表5
表5 不同保护配方的病毒稳定性试验(所有数据为三次检测结果的均值,单位:lgFFU/ml)
可见,上述五种配方对G9的保护性都达到要求,其中F5在37℃条件下放置7天,G9滴度下降值最低,对G9保护性最好,所以F5为轮状病毒疫苗的最优保护剂配方。
实施例4.疫苗配制
(1)保护剂的配制
首先按照上述研发的最终配方成分及含量,配制出1.5倍保护剂母液
(2)六价疫苗原液混合
根据配制的目标滴度(6.2lgFFU/ml),计算出所需六价原液的量,并将各原液依次加入同一提前灭菌的容器中,充分混合,0.2μm除菌过滤至另一灭菌容器内
(3)将1.5倍保护剂母液及上述配制的六价混合液按照体积比为2:1进行混合,即得到半成品
(4)将半成品运至分装室,按照2ml/瓶规格进行分装,并贴签及外包,即得到成品。
对疫苗成品进行各血清型单价病毒滴度检测结果如下表6
表6.成品疫苗各血清型单价病毒滴度检测结果
血清型 | 成品(20111103) |
G1 | 1.36×106FFU/ml |
G2 | 7.28×105FFU/ml |
G3 | 1.53×106FFU/ml |
G4 | 1.21×106FFU/ml |
G8 | 1.09×106FFU/ml |
G9 | 9.85×105FFU/ml |
从结果看,各血清型滴度结果漂变较小,且能满足各血清型大于5.00×105FFU/ml的要求。
最后需要说明的是,以上实施例仅用于帮助本领域技术人员理解本发明的实质,并不用作对本发明保护范围的限制。
Claims (7)
1.一种口服六价重配轮状病毒活疫苗,其特征在于,所述疫苗含有六种主要流行株血清型G1、G2、G3、G4、G8及G9。
2.根据权利要求1所述的口服六价重配轮状病毒活疫苗,其特征在于,所述的六价重配口服轮状病毒疫苗成分为,
(1)G1、G2、G3、G4、G8及G9血清型活疫苗,各血清型原液滴度为1~5×106FFU/ml;
(2)保护剂:枸橼酸0.5~2g/L、枸橼酸钠50~150g/L、蔗糖250~450g/L、氯化锌5~10mM、氯化钙10~20mM。
3.根据权利要求1或2任一所述的口服六价重配轮状病毒活疫苗,其特征在于,
所述的G1血清型活病毒NIH编号为:MVS-BRV-1;
所述的G2血清型活病毒NIH编号为:MVS-BRV-2;
所述的G3血清型活病毒NIH编号为:MVS-BRV-3;
所述的G4血清型活病毒NIH编号为:MVS-BRV-4;
所述的G8血清型活病毒NIH编号为:1290×UK;
所述的G9血清型活病毒NIH编号为:MVS-BRV-10。
4.权利要求1-3所述的口服六价重配轮状病毒活疫苗的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)制备各血清型单价病毒原液,并按照目标滴度配置各个血清型病毒原液,并将各原液依次加入同一提前灭菌的容器中,充分混合并除菌,即得六价混合液;
(2)配制保护剂母液并除菌;
(3)将保护剂母液及步骤(1)配制的六价混合液混合,并将其按照2ml/瓶规格进行分装,即得到成品。
5.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,所述的除菌为0.2μm除菌过滤器过滤除菌。
6.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,所述的制备各血清型单价病毒原液的步骤为:
(1)细胞传代:各血清型病毒的培养基质为Vero细胞,首先复苏Vero细胞工作种子,37℃条件下培养3-5天后,按照一定比例进行传代扩增培养,培养容器依次分别为T25、T75、T175细胞培养瓶、10层细胞工厂、40层细胞工厂,在40层细胞工厂中培养3-5代后即可分别接种G1、G2、G3、G4、G8、G9血清型轮状病毒;
(2)病毒培养:细胞工厂内细胞汇合度达到90%以上后,进行病毒接种操作。病毒接种前,选择一个细胞工厂进行细胞计数,根据计数结果,按照病毒感染复数0.005~0.2进行计算,得出需要的病毒量;用胰蛋白酶对病毒激活,激活条件为37℃、胰蛋白酶浓度10~20μg/ml,激活15~60min;将激活的病毒接种于细胞工厂内,接种后的各血清型病毒培养于35~37℃条件下2~5天;
(3)病毒收获:待细胞病变完全(细胞脱落达到75%以上)将各细胞工厂内的液体收集于一容器内,进行下游处理;
(4)下游操作:首先进行细胞破碎处理,采用冻融或高压均质方式破碎细胞,冻融温度为-30℃~37℃,高压均质压力范围为100~1000bar,高压均质处理完后,进行细胞碎片澄清过滤操作,采用两级过滤,第一级为1.0μm~0.5μm深层过滤器,第二级为0.2μm除菌过滤器,澄清过滤完成后,对病毒液进行超滤浓缩,采用300K孔径超滤膜,对处理后的病毒收获液进行10倍浓缩,即得到单价血清型疫苗原液。
7.权利要求1-4任一所述的口服六价重配轮状病毒活疫苗在制备口服轮状病毒疫苗中的应用。
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2014
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