CN102058546B - 一种重组猪α-干扰素的冻干制剂及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重组猪α-干扰素的冻干制剂及其制备方法和用途。所述的重组猪α-干扰素的冻干制剂，以制剂的总重量计，所述的制剂中含有77-98w/w％的甘露醇。
Description
技术领域
本发明涉及冷冻干燥制剂的制备领域。更具体地涉及一种重组猪α-干扰素的冻干制剂及其制备方法和用途。
背景技术
近年来，随着新毒株、新菌株的不断出现，传统药物和疫苗效力下降，我国动物疾病的防治面临着严峻挑战。以往研究表明，猪α干扰素作为动物机体重要的细胞因子有广谱的抗病毒活性和免疫调节功能，可作为动物病毒性疫病治疗的替代药物。重组猪α干扰素(rPoIFN-α)在应用于畜牧兽医生产的实践中存在液体剂型热稳定性差、不易长期保存和远距离运输等问题。较理想的解决办法是进行制品的干燥保存，这样不仅可以利用简易条件延长保存期，而且有利于长距离运输。
蛋白质药品干燥技术有冷冻干燥、喷雾干燥、喷雾-冷冻干燥、超临界干燥等几种技术，其中应用最广泛的是冷冻干燥技术。干扰素对热比较敏感，为很好地保持制品的生物学活性，干扰素的干燥剂型多是采用真空冷冻干燥方法。医用干扰素冻干保护剂的研究颇多，人血清白蛋白作为医用干扰素保护剂应用最广泛，但人血清白蛋白是血液制品，价格昂贵，也容易传播疾病。2000年，董义蓝等筛选出右旋糖苷作为血清白蛋白的替代品，并申请了专利(专利号00110069.6)，2002年姜崴(姜崴，张春利，王雪丰等.冻干干扰素保护剂的筛选.微生物学免疫学进展[J].2002，30(4)：40-43)等研究采用右旋糖苷、山梨醇和苯甲酸钠作为重组人干扰素的冻干保护剂，效果也比较好。国外的医用干扰素的剂型研究比较早，由于每一种干燥技术都有各自的局限，研究者一直致力于改进工艺，优化配方的研究。2001年，Sebeka等(Sebeka HK，Starkuviene B，Trepsiene OV.Comparative effects of stabilizingadditives on the rates of heat inactivation of recombinant humaninterferon a-2b in solution[J].Antiviral Res 2001，50：117-127.)研究了人干扰素在热钝化温度为60℃时，氨基酸、多羟基醇、糖类、非离子表面活性剂等稳定剂能延长干扰素抗病毒活性的半衰期。2005年，巴西学者Virgilio等(Virgilio TJ.，Duclerc FP，Bronislaw P，et al.Effect oflyophilization on the structure and phase changes of PEGylated-bovineserum albumin[J].Int J Pharm.2005，304：124-134.)通过拉曼光谱法、差示扫描量热法、卡尔费休滴定残余水分等方法的检测，观察到聚乙二醇和牛血清白蛋白以1∶0.25的比例结合比1∶0.5的比例更能减少蛋白质结构的改变。2009年，Vineet等(Vineet K，Vikas KS，Devendra S.In situ precipitationand vacuum drying of interferon alpha-2a：Development of a single-stepprocess for obtaining dry，stable protein formulation[J].Int J Pharm，2009，366：88-98.)把人干扰素作为蛋白模型研究一步法干燥过程获得稳定的蛋白配方。但在国内外对rPoIFN-α剂型的研究至今还未见文献报道。
因此，本领域迫切需要提供一种重组猪α-干扰素的冻干制剂及其相应的制备方法。
发明内容
本发明旨在提供一种重组猪α-干扰素的冻干制剂。
本发明的另一个目的在于提供上述重组猪α-干扰素冻干制剂的制备方法。
本发明的再一个目的是提供上述重组猪α-干扰素冻干制剂的用途。
在本发明的第一方面，提供了一种重组猪α-干扰素的冻干制剂，以制剂的总重量计，所述的制剂中含有77-98w/w％的甘露醇。
在另一优选例中，以制剂的总重量计，其中重组猪α-干扰素和甘露醇的总量占97-99w/w％。
在另一优选例中，其中含有87-98w/w％的甘露醇。
在本发明的第二方面，提供了一种如上所述的本发明提供的冻干制剂的制备方法，所述的方法包括步骤：将重组猪α-干扰素和甘露醇的混合溶液进行冷冻干燥，得到如上所述的本发明提供的冻干制剂。
在另一优选例中，所述的方法包括步骤：
(a)将含有重组猪α-干扰素的溶液和含有甘露醇的溶液混合，得到混合溶液；和
(b)将混合溶液进行冷冻干燥，得到如上所述的本发明提供的冻干制剂；
以含有甘露醇的溶液的总体积计，其中甘露醇的浓度为5-90mg/mL；
以含有甘露醇、重组猪α-干扰素的混合溶液的总体积计，甘露醇和重组猪α-干扰素形成的总溶质浓度为6.5-91.5mg/mL。
在另一优选例中，以混合溶液的总体积计，其中含有盐浓度为0.008-0.012摩尔/升；所述的盐选自磷酸盐。
在另一优选例中，所述混合溶液的pH 6-7。
在另一优选例中，总溶质的浓度为21.5-51.5mg/mL；甘露醇的浓度为20-50mg/mL。
在另一优选例中，在整个冷冻干燥过程中冷冻干燥是在搁架温度保持在零下40℃-零上28℃下进行的。
在本发明的第三方面，提供了一种产品，包括：
(a)一个装有如权利要求1-3任一所述的冻干制剂的容器；和
(b)关于冻干制剂在稀释剂中重建成重建制剂中溶质的量为6.5-91.5mgmg/mL的说明；所述的溶质包括重组猪α-干扰素和甘露醇.
在另一优选例中，所述产品中还包含另一个装有稀释剂的容器。
在本发明的第四方面，提供了一种如上所述的本发明提供的冻干制剂的用途，用作或用于制备抗病毒治疗和/或提高免疫力的药物。
据此，本发明提供了提供一种重组猪α-干扰素的冻干制剂及其相应的制备方法。
具体实施方式
发明人经过广泛而深入的研究，发现使用一定比例的甘露醇作为冻干保护剂可以有效获得一种稳定的重组猪α-干扰素冻干制剂。
具体地，本发明提供的重组猪α-干扰素的冻干制剂，以制剂的总重量计，所述的制剂中含有77-98w/w％的甘露醇。
较佳地，以制剂的总重量计，其中重组猪α-干扰素和甘露醇的总量占97-99w/w％。
本发明的重组猪α-干扰素(rPoIFN-α)是本领域熟知的基因工程重组猪α-干扰素，可以使用本领域熟知的方法制备得到。其中优选通过毕赤酵母高效分泌表达菌株筛选、表达和发酵得到的(参见“黄海，谢蓓，于瑞嵩，等.猪IFNα基因在毕赤酵母中的高效分泌表达[J].遗传，2005，27(2)：215-220.”和“蓝胜芝，于瑞嵩，俞明月，等.猪IFNα在毕赤酵母中分泌表达条件的优化及高密度发酵[J].南京师范大学报，2006，3(29)：76-80.”)。
本发明冻干制剂的重组猪α-干扰素最好是基本上纯净，最好基本上是均相的(即没有杂蛋白等)。“基本上纯净”的重组猪α-干扰素指的是组分包含至少约90％(重量)(以组分的总重量计)的重组猪α-干扰素，较佳的为至少约95％(重量)。“基本上均相”的重组猪α-干扰素指的是以组分的总重量计，组分包含至少99％(重量)的重组猪α-干扰素。
“稳定”的制剂是指其中的重组猪α-干扰素在保藏时可基本上保持其物理和化学稳定性和完整性。稳定性可在选定的温度下和时间内测定。为进行快速筛选，制剂可在40℃下保藏2星期至1个月并同时测定稳定性。当制剂要保藏在2-8℃时，通常制剂应该在30℃或40℃下稳定至少1个月和/或在2-8℃下稳定至少2年。当制剂要保藏在30℃下时，通常制剂应在30℃下稳定至少2年和/或在40℃稳定至少6个月。例如在冻干和保藏后的干扰素生物活性可作为重组猪α-干扰素稳定性的一个标志(见实施例)。例如，“稳定”的制剂是制剂中的重组猪α-干扰素的生物活性同冻干前相比，损失小于约15％，较佳地小于约5％，最佳地小于2％。
“重建”或“复溶”制剂是指通过将冻干重组猪α-干扰素制剂溶解在稀释剂中使重组猪α-干扰素分散在重建制剂中。
“冻干保护剂”指一种分子，当它与感兴趣的重组猪α-干扰素结合时，能阻止或减少重组猪α-干扰素在冻干和后续保藏时的化学和/或物理不稳定性。本发明冻干保护剂是甘露醇。
冻干保护剂加入未冻干制剂中的量“溶解保护量”指重组猪α-干扰素在溶解保护量的冻干保护剂存在时，在冻干和保藏时基本上保持其物理和化学稳定性及完整性。按照冻干前溶液重量体积比是1％-6％的甘露醇。
这里感兴趣的“稀释剂”是药学上可接受的(对于猪体给药是安全无毒的)，能用于制备重建制剂。典型的稀释剂包括无菌水、注射用抑菌剂(BWFI)、pH缓冲液(如磷酸盐缓冲液)、无菌盐溶液、林格溶液或葡萄糖液。
“治疗”指动物疾病治疗和预防措施。那些需要治疗的受用者包括已经患有疾病和预防疾病的动物。
需要治疗的“动物”指除人以外的动物，包括家畜和农场动物和动物园、运动场动物或宠物，如猪、狗、牛、猫等。较佳的动物是猪。
“疾病”是能得益于重组猪α-干扰素治疗的疾病。它包括病毒感染性疾病，和/或免疫力低下的疾病。
本发明提供的重组猪α-干扰素冻干制剂的制备方法，是将重组猪α-干扰素和甘露醇的混合物进行冷冻干燥。
所述的混合物是将含有重组猪α-干扰素的溶液和含有甘露醇的溶液混合，得到的混合溶液。
在冷冻干燥过程中，可以使用本领域熟知的条件进行预冻、升华干燥、和解析干燥。较佳地，整个冷冻干燥过程中冷冻干燥是在搁架温度保持在零下40℃-零上28℃下进行的。
本发明还提供一种含有本发明的冻干制剂的产品和它的重建和/或用法的说明。产品包括一个容器。合适的容器包括，例如玻璃瓶、小瓶(如双室小瓶)、注射器(如双室注射器)和试管。容器可用各种材料如玻璃或塑料制得。容器中有冻干制剂，容器上的或和容器配套的标签说明了重建和/或施用的方法。例如，标签可以指示将冻干制剂重建至使重组猪α-干扰素浓度为2.0-3.0×105IU/mL。装有冻干制剂的容器可以是多次性使用小瓶，它可重复进行重建制剂的给药(如给药2-6次)。产品还可包括另一个有合适稀释剂(如注射用水)的容器。在混合稀释剂和冻干制剂时，重建制剂中的重组猪α-干扰素最终浓度至少为2.0×105IU/mL。从商业和用户角度出发，产品还可包括其它物品，包括其它缓冲液、稀释剂、滤膜、针、注射器以及装有说明书的包裹。
本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
本发明的主要优点在于：
1、提供的冻干制剂非常稳定。
2、采用的冷冻工艺简便、经典，益于广泛使用。
下面将结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分比和份数按重量计。
本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的，例如是指在100毫升的溶液中溶质的重量。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1
材料与方法
1.1试剂和仪器
牛血清白蛋白购自华美生物公司；医用20％甘露醇；人干扰素α国家准标品购自中国药品生物制品检定所；真空冷冻干燥机18L为美国LABCONCO公司产品；酶标仪ELX-800型为美国BIO-TEK公司产品；电子显微镜TS100为日本Nikon公司产品；CO2培养箱240L为德国Heraeus公司产品。
1.2样品
重组基因工程猪α干扰素由本室制备(由巴斯德毕赤酵母发酵表达，参见“张丽曼、于瑞嵩、段作营、李震、毛忠贵，重组毕赤酵母产猪IFNα的诱导条件，生物加工过程，第5卷第2期”)；制品活性检测采用细胞病变抑制法，以WISH细胞(人羊膜传代细胞株)-VSV(滤泡性口炎病毒)为检测系统，采用人α干扰素标准品校准为IU。
1.3冻干保护剂的配方
分别选择甘露醇(manitol，MAN)和牛血清白蛋白作为冻干辅料(表1)。
表1冻干前溶液的保护剂含量
| 甘露醇含量(w/v) | 1％ | 2％ | 4％ | 5％ | 6％ | 7％ | 8％ | 9％ |
| 牛血清白蛋白含量(w/v) | 0.5％ | 1％ | 1.5％ | 2％ | 3％ | 4％ | 5％ | ----- |
1.4真空冷冻干燥工艺
1.4.1共熔点的测试
采用电阻法测量了各个配方溶液的共熔点，方法参照姜平(2003)(姜平，兽医生物制品学[M].第二版.北京：中国农业出版社，2003：354-355.)，结果所有配方的共熔点范围在-10℃--20℃之间。
1.4.2冻干工艺
冻干过程中根据共熔点的范围采用了保守的冻干工艺，工艺流程如下：(1)干扰素分装：按照配方(上述冻干保护剂的配方)配制溶液(其中含有重组猪α干扰素溶液和甘露醇溶液)，用0.22μm孔径滤膜除菌过滤，在洁净层流局部100级环境中，将干扰素溶液分装在青霉素瓶中，每瓶2ml，干扰素活性含量为3.0×105IU/ml。(2)预冻：冻干箱内搁板温度降至-40℃，将制品放置冻干箱内进行预冻。(3)：升华干燥：开启真空泵，抽真空，真空度30Pa，升温速率5℃/h，终温-25℃，保温10h。(4)解析干燥：制品基本干燥以后，再以8℃/h升温，终温为30℃，保温3h。
1.5干扰素生物活性测定
采用细胞病变抑制法，以WISH细胞(人羊膜传代细胞株)-VSV(滤泡性口炎病毒)为检测系统，由于我国目前还未有猪α干扰素标准品，暂时采用人α干扰素标准品校准为IU。方法参照药典(国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].第三版.北京：化学工业出版社，2005：附录57)。将传代24-48h的WISH细胞以4.7×105cell/mL的浓度加入到96孔细胞培养板中，每孔100μL，37℃，5％CO2培养4-6h。弃上清，将稀释好的样品加入细胞培养板，每孔100μL，标准品对照首孔进行4倍稀释，其余孔对倍稀释。待细胞长满70％-80％，弃去细胞培养液，每孔加入100μL200TCID50的VSV病毒稀释液，培养24小时左右(镜检标准品溶液的病变点在1U/mL)，弃上清，每孔加入50μL染色液，室温放置30min，于自来水下轻轻洗去板上的染色液，并用吸水纸吸干，加入脱色液，每孔100μL，在微振荡器上脱色10min。使用酶标仪于570nm波长处测定每孔的吸收值(OD)，计算样品的效价。
1.6冻干制剂水分检测
采用卡尔费休法测定。
1.7冻干后放置40℃加速稳定性实验
通过外观检查、活性检测筛选出好的配方，再按照配方冻干三批制品，根据文献中的方法(奚念朱，药剂学[M].北京：人民卫生出版社，1987：141.)进行放置40℃加速稳定性实验，每个月定期采样进行活性检测，进一步筛选配方和确定制品的保存期。
结果
2.1外观检查
各个配方的制品均为白色疏松体，牛血清白蛋白为辅料的冻干制品均稍收缩、离壁；甘露醇为辅料1％浓度的冻干制品有些收缩，而其余配方均不收缩，骨架成型好，雪白、细腻不易松散。
2.2水分检测
均在3％以下，平均为1.61％。
2.3生物活性测定
采用细胞病变抑制法，对冻干前的半成品和冻干后制品在同等条件下进行生物学活性的测定，根据冻干前的半成品和冻干后的制品效价计算出每个配方的活性保持率(表2，表3)
表2牛血清白蛋白为辅料的冻干制品的生物学活性和活性保持率
| BSA(％) | 冻干前对照 | 0.5 | 1 | 1.5 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 生物学活性(×105IU/ml) | 3.00±0.28 | 1.58±0.75 | 1.68±0.31 | 1.87±0.66 | 1.82±0.23 | 2.53±0.20 | 2.48±0.15 | 2.12±0.79 |
| 活性保持率(％) | 53.29 | 55.76 | 62.52 | 60.76 | 84.33 | 82.46 | 70.63 |
表3甘露醇为辅料的冻干制品的生物学活性和活性保持率
| MAN(％) | 冻干前对照 | 1 | 2 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |
| 生物学活性(×105IU/ml) | 3.00±0.28 | 2.62±0.61 | 3.08±0.95 | 2.85±0.57 | 3.24±0.78 | 1.79±0.43 | 1.42±0.24 | 2.06±0.58 | 1.70±0.59 |
| 活性保持率(％) | 87.49 | 102.83 | 95.09 | 108.34 | 59.69±1.65 | 47.38±7.91 | 68.86±7.62 | 56.69±6.26 |
从表2和表3可以看出，以牛血清白蛋白为辅料的配方中，活性保持率普遍偏低，只有终浓度为4％的配方的保护效果稍好，但活性损失也比较大。以甘露醇为辅料的配方中，终浓度为2％、4％、5％的配方的保护效果比较好，可以进行加速稳定性实验做进一步筛选。
2.4冻干后放置40℃加速稳定性实验
以甘露醇为辅料，终浓度为2％、4％、5％的配方，样品冻干三批，做加速稳定性实验。活性检测数据见表4。
表4不同配方的稳定件实验
结果表明，三个配方的样品放置了三个月后，活性比较稳定。
讨论
应用保护剂的选择力求成本低，无污染，配方简单。牛血清白蛋白为辅料的全部配方均有收缩、离壁现象。低于1％甘露醇的冻干制品收缩、离壁，而2％以上浓度的制品均是白色疏松体，成型好。残余水分检测均在1％-2％，符合《中国生物制品规程》中医用冻干干扰素的规定。经过活性检测和加速稳定性实验表明终浓度2％、4％和5％的甘露醇的配方的制品活性损失小，稳定性好。根据文献报道，产品的有效期可暂定为两年。
本发明结果表明表明，单一成分的牛血清白蛋白不适合做重组猪α干扰素的冻干保护剂，需要其他的骨架剂配伍可能效果会更好。本发明筛选出的2％、4％、5％的甘露醇的冻干配方的制品活性损失小，稳定性很好，如投入生产，考虑节约生产成本，则2％的甘露醇的冻干配方有可能成为猪重组α干扰素理想的冻干保护剂，甘露醇价格低廉，无污染，也比较适合大规模投产使用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。
Claims (7)
1.一种重组猪α－干扰素的冻干制剂，其特征在于，以制剂的总重量计，所述的制剂中含有87－98w/w％的甘露醇；溶解保护量是冻干前溶液重量体积比为1％-5％的甘露醇；
冷冻干燥工艺流程如下：
⑴干扰素分装：按照配方配制含有重组猪α干扰素溶液和甘露醇的溶液，用0.22μm孔径滤膜除菌过滤，在洁净层流局部100级环境中，将干扰素溶液分装在青霉素瓶中，每瓶2ml，干扰素活性含量为3.0×105IU/ml；
⑵预冻：冻干箱内搁板温度降至-40℃，将制品放置冻干箱内进行预冻；
⑶：升华干燥：开启真空泵，抽真空，真空度30Pa，升温速率5℃/h，终温-25℃，保温10h；
⑷解析干燥：制品基本干燥以后，再以8℃/h升温，终温为30℃，保温3h。
2.如权利要求1所述的冻干制剂，其特征在于，以制剂的总重量计，其中重组猪α－干扰素和甘露醇的总量占97－99w/w％。
3.一种如权利要求1或2所述的冻干制剂的制备方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：将重组猪α－干扰素和甘露醇的混合溶液进行冷冻干燥，得到如权利要求1或2所述的冻干制剂；
冷冻干燥工艺流程如下：
⑴干扰素分装：按照配方配制含有重组猪α干扰素溶液和甘露醇的溶液，用0.22μm孔径滤膜除菌过滤，在洁净层流局部100级环境中，将干扰素溶液分装在青霉素瓶中，每瓶2ml，干扰素活性含量为3.0×105IU/ml；
⑵预冻：冻干箱内搁板温度降至-40℃，将制品放置冻干箱内进行预冻；
⑶：升华干燥：开启真空泵，抽真空，真空度30Pa，升温速率5℃/h，终温-25℃，保温10h；
⑷解析干燥：制品基本干燥以后，再以8℃/h升温，终温为30℃，保温3h。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：
(a)将含有重组猪α－干扰素的溶液和含有甘露醇的溶液混合，得到混合溶液；
(b)将混合溶液进行冷冻干燥，得到如权利要求1或2所述的冻干制剂；
以含有甘露醇的溶液的总体积计，其中甘露醇的浓度为20－50mg/mL；
以含有甘露醇、重组猪α－干扰素的混合溶液的总体积计，甘露醇和重组猪α－干扰素形成的总溶质浓度为21.5-51.5mg/mL。
5.一种产品，包括：
(a)一个装有如权利要求1或2所述的冻干制剂的容器；和
(b)关于冻干制剂在稀释剂中重建成重建制剂中溶质的量为6.5-91.5mg/mL及关于溶解保护量是冻干前溶液重量体积比为1％-5％的甘露醇的说明；所述的溶质包括重组猪α－干扰素和甘露醇。
6.如权利要求5所述的产品，其特征在于，所述产品还包含另一个装有稀释剂的容器。
7.一种如权利要求1或2所述的冻干制剂的用途，用于制备抗病毒治疗和/或提高免疫力的药物。
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