CN110917148B - 一种无明胶无人血白蛋白的麻腮风联合减毒活疫苗冻干保护剂 - Google Patents

一种无明胶无人血白蛋白的麻腮风联合减毒活疫苗冻干保护剂 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种无明胶无人血白蛋白的麻腮风联合减毒活疫苗冻干保护剂，属于生物制品领域。本发明的冻干保护剂各成分在每升疫苗半成品中终浓度为：蔗糖30‑100g/L，海藻糖10‑30g/L，谷氨酸钠0.3‑15g/L，尿素0‑10g/L，甘露醇0‑10g/L，山梨醇0‑25g/L，配制保护剂的基质液为Earle's平衡盐溶液或PBS缓冲溶液或注射用水，该冻干保护剂不含有明胶和人血白蛋白。本发明的冻干保护剂用于制备麻腮风联合减毒活疫苗的冻干疫苗，能提高麻腮风联合减毒活疫苗在冻干过程和储存过程中的稳定性，提高冻干疫苗对人体安全性，减少疫苗不良反应，并能确保病毒滴度在冻干复溶后仍然保持高滴度。

Description

一种无明胶无人血白蛋白的麻腮风联合减毒活疫苗冻干保 护剂
技术领域
本发明涉及生物制品领域，具体涉及一种无明胶无人血白蛋白的麻腮风联合减毒活疫苗冻干保护剂的配方和使用方法。
背景技术
自1980年WHO宣布全世界消灭天花以来，人们期望着其他儿童传染病在全球相继被消灭。由于麻腮风(MMR)三联苗的发展和推广使用，使麻疹、腮腺炎和风疹3种疾病流行的控制在许多国家已经获得成功。
目前使用的麻腮风三联疫苗均为减毒活疫苗，而减毒活疫苗的一个劣势是其存在热不稳定性，尤其是在多种病毒同时存在的复杂环境中，其热不稳定性尤其明显。稳定减毒活疫苗的首选方法是冷冻干燥，其中冷冻保护剂的成分对病毒的热稳定性有关。研究发现使用人血白蛋白和明胶可以提高腮腺炎病毒的稳定性，不仅如此，它们还有助于防止冻干材料在冻干过程中发生物理塌陷，并在随后的固态储存中起作用。但也出现了一系列问题，现有麻腮风联合减毒活疫苗的接种人群尤其是婴幼儿，会对其中的明胶或明胶衍生物、人血白蛋白成分产生强烈的过敏反应，或者有感染肝炎的风险。明胶内含有其他菌种的内毒素亦可导致部分被接种者产生发热反应。目前，人血白蛋白在疫苗领域被广泛应用，虽然人血白蛋白来源于检测合格的健康人血，但是受现有检测技术水平的局限，人血白蛋白中携带的肝炎病源会对疫苗产生隐性污染；另外，人血白蛋白还存在供应紧张、价格昂贵、成本高的问题。目前国内各生物制品厂家生产的麻腮风联合减毒活疫苗均含有明胶和人血白蛋白，没有不含明胶和人血白蛋白的麻腮风联合减毒活疫苗冻干制品。随着国家对疫苗安全性要求逐渐提高，行业中对产品中所含动物源性成分加以限制，冻干保护剂中去除明胶和血液源性白蛋白的需求变得更加迫切。
常用在冻干活疫苗中的保护剂种类有：多羟基化合物、糖、蛋白质、聚合物、氨基酸、盐、表面活性剂等。不同种类的保护剂在冻干过程中发挥着不同作用，且不同种类的保护剂的作用具有交叉。
目前现有技术中还没有针对麻腮风联合减毒疫苗的不含明胶、人血清白蛋白的保护剂。虽然现有技术报道了很多不含明胶不含人血清白蛋白的疫苗冻干保护剂，但这些冻干保护剂均不适用于麻腮风三联疫苗的冻干保护。因此，本领域中急需一种安全有效、稳定性高、复溶后保护效力好的无明胶、无人血清白蛋白麻腮风三联活疫苗冻干保护剂。
发明内容
本发明的目的是提供一种不含明胶、不含人血白蛋白的麻腮风联合减毒活疫苗冻干保护剂，使冻干疫苗中内毒素含量下降，不易发生过敏反应，并且仍然能保持较高的稳定性、较长的有效期、较好的保护力。
为了达到上述目的，本发明提供一种麻腮风联合疫苗冻干保护剂，该冻干保护剂各成分在疫苗半成品中的终浓度为：蔗糖30-100g/L，海藻糖10-30g/L，谷氨酸钠0.3-15g/L，尿素0-10g/L，甘露醇0-10g/L，山梨醇0-25g/L，并且所述冻干保护剂中不含明胶且不含人血白蛋白；所述疫苗半成品是指冻干前的液态疫苗。
优选地，该冻干保护剂各成分在疫苗半成品中的终浓度为：蔗糖40-60g/L，海藻糖10-20g/L，谷氨酸钠1-8g/L，尿素1-5g/L，甘露醇1-5g/L，山梨醇10-25g/L。
最优选地，该冻干保护剂各成分在疫苗半成品中的终浓度为：蔗糖40g/L，海藻糖10g/L，谷氨酸钠5g/L、尿素2g/L，甘露醇1g/L，山梨醇25g/L。
本发明所述的麻腮风联合疫苗冻干保护剂，配制保护剂的基质液为Earle's平衡盐溶液或PBS缓冲溶液或注射用水。
适当的保护剂对病毒的结构稳定性和效力起着至关重要的作用，在实际应用中，不同结构和性质的保护剂对冷冻干燥的不同阶段保护蛋白质的保护机制不同，联合使用时对某些蛋白质有协同保护作用。海藻糖是一种非还原性和无毒的糖，具有保存生物活力的特殊功能，能有效地保护细胞膜和蛋白质的结构，在冻干过程中通过创造一个晶体支架来维持蛋白质和其他生物分子的构象，并保护它们不被降解。以二水合海藻糖为基础的疫苗稳定剂已被证明有助于保护小反刍兽疫减毒活疫苗的感染性。同时作为生物活性物质的稳定剂和保护剂，其在食品、保健品、化妆品、医药、分子生物学和农业等领域有着广阔的应用前景。
甘露醇和山梨醇为多羟基化合物，其多羟基化合物的羟基能替代蛋白质表面水分子的羟基，与蛋白质表面形成一层假定的水化膜，从而保护氢键的连接位点不直接暴露在周围环境中，稳定蛋白质的高级结构，防止蛋白质因冻干而变性。甘露醇对蛋白质的保护作用与其浓度、形态结构有关，而其浓度与结晶形态有时呈一定的关联性。通常认为无定型甘露醇具有使蛋白质稳定的作用而结晶态的甘露醇则失去保护功能；1％或更低浓度的甘露醇通过无定型结构的形成而阻止蛋白质药物的聚集，但是高浓度的甘露醇则易于形成结晶态而促进蛋白质药物的聚集。
本发明提供了上述麻腮风联合疫苗冻干保护剂在制备麻腮风联合冻干疫苗中的应用。
本发明提供了一种制备麻腮风联合减毒冻干疫苗的方法，包括以下步骤：
(1)分别制备麻疹病毒收获液、腮腺炎病毒收获液、风疹病毒收获液；
(2)按比例将所述的麻腮风联合疫苗冻干保护剂分别加入麻疹病毒收获液、腮腺炎病毒收获液、风疹病毒收获液中，分别制成麻疹病毒原液、腮腺炎病毒原液、风疹病毒原液；
(3)将步骤(2)制得的麻疹病毒原液、腮腺炎病毒原液、风疹病毒原液按照一定体积比混合，得到麻腮风联合冻干疫苗半成品，半成品中麻疹、腮腺炎、风疹各病毒滴度为5.5-6.5lgCCID50/ml、6.0-7.0lgCCID50/ml、4.4-5.4lgCCID50/ml；冻干后即为成品。
本发明的冻干疫苗的制备方法中，步骤(2)中，麻腮风联合疫苗冻干保护剂各成分在麻疹病毒原液中终浓度为：蔗糖30-100g/L，海藻糖10-30g/L，谷氨酸钠0.3-15g/L，尿素0-10g/L，甘露醇0-10g/L，山梨醇0-25g/L；
麻腮风联合疫苗冻干保护剂各成分在腮腺炎病毒原液中终浓度为：蔗糖30-100g/L，海藻糖10-30g/L，谷氨酸钠0.3-15g/L，尿素0-10g/L，甘露醇0-10g/L，山梨醇0-25g/L；
麻腮风联合疫苗冻干保护剂各成分在风疹病毒原液中终浓度为：蔗糖30-100g/L，海藻糖10-30g/L，谷氨酸钠0.3-15g/L、尿素0-10g/L，甘露醇0-10g/L，山梨醇0-25g/L。
步骤(3)中，所述疫苗冻干保护剂中各成分在麻腮风联合冻干疫苗半成品中的终浓度为：蔗糖40-60g/L，海藻糖10-20g/L，谷氨酸钠1-8g/L，尿素1-5g/L，甘露醇1-5g/L，山梨醇10-25g/L。
上述制备方法中，疫苗半成品按0.5ml/支进行分装。
冻干程序为：预冻：常压降温至-50℃～-55℃，并维持3h；升华干燥阶段最终温度为-38℃，达到最终温度的时间为30h，真空不控制；解析干燥阶段最终温度28℃，需10h，真空不控制。
本发明提供了上述制备方法制得的冻干疫苗产品，所述疫苗为麻腮风联合减毒活疫苗。
本发明的冻干保护剂针对特定的麻腮风三联活疫苗，能够弥补现有的国内市场的麻腮风联合减毒活疫苗都含明胶和人白的不足，克服麻腮风三联疫苗中，麻疹、腮腺炎和风疹病毒同时存在在添加冻干保护剂时，很难平衡三联疫苗中各病毒的热稳定性的技术困难，实现了在不添加明胶和人白的前体下，通过提供一种恰当配方的冻干保护剂与麻腮风三联疫苗进行复配，实现了麻腮风三联减毒活疫苗冻干再复溶使用时稳定性好、安全性高、保护效力优的效果，减少了接种疫苗的不良反应。
具体实施方式
本发明实施例采用的麻疹病毒为麻疹病毒长-47株、风疹病毒为RA27/3株，均为北京民海生物科技有限公司上市产品麻疹风疹联合减毒活疫苗使用毒株，腮腺炎病毒为腮腺炎病毒A型，本领域内公知的任何腮腺炎病毒株均适用。本发明培养麻疹病毒、腮腺炎病毒的细胞为原代鸡胚细胞，培养风疹病毒的细胞为MRC-5细胞，该细胞为北京民海生物科技有限公司从ATCC引进，本公司自主建库。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；若未特别指明，实施例中所用试剂均为市售。所有疫苗稳定剂使用的辅料质量均符合《中华人民共和国药典》三部2015版的要求。
实施例1病毒液的制备
(一)麻疹病毒液的制备
1.鸡胚孵化鸡蛋孵育：取SPF鸡群的受精鸡蛋，放入孵化箱中孵化9-11日，温度为38.0±1℃、湿度为40～70％之间，翻蛋次数120分钟/次。
2.细胞消化：取9-11日龄鸡胚，碘伏消毒，去头去内脏，胰酶消化，分散细胞，制成细胞悬液。
3.接毒：按MOI值为0.001接毒，每瓶分装1.5L，培养温度为33±1℃，转速为8r/h
3.培养、换液：细胞培养至72～96小时，培养液pH为7.4±0.2，每瓶分装2.0±0.2L，细胞培养温度为33±1℃，转速为8r/h。
4.洗换：用Earle's液洗涤细胞，洗换完补加维持液，置33±1℃恒温室培养。
5.收获：病变达50～90％，放置于2～8℃冷库内，转速为8r/h，7天以内收获。
(二)腮腺炎病毒液的制备
1.鸡胚孵化鸡蛋孵育：取SPF鸡群的受精鸡蛋，放入孵化箱中孵化9-11日，温度为38.0±1℃、湿度为40～70％之间，翻蛋次数120分钟/次。
2.细胞消化：取9-11日龄鸡胚，碘伏消毒，去头去内脏，胰酶消化，分散细胞，制成细胞悬液。
3.病毒接种：按MOI 0.005混种于细胞悬液中，置34±1℃恒温室培养。
4.洗换：置34±1℃恒温室培养48±8h，用Earle's液洗涤细胞，洗换完补加维持液，置34±1℃恒温室培养。
5.收获：病变达60～80％收获。
(三)风疹病毒液的制备
1.MRC-5细胞复苏：从液氮罐中取出细胞，复苏，置37±1℃恒温室培养。
2.MRC-5细胞传代、培养：按比例将细胞传代至5L转瓶。
3.洗换、病毒接种：用Earle's洗涤细胞，更换成维持液，加入风疹病毒，放置恒温室培养。
4.单次病毒液收获：根据细胞病变程度，分3次收取单次病毒收获液，即为目标产物。
实施例2本发明冻干保护剂的组分、含量(在疫苗半成品中的终浓度)
组分1：蔗糖，药用级，40g/L；
组分2：海藻糖，药用级，10g/L；
组分3：谷氨酸钠，药用级，5g/L；
组分4：尿素，药用级，2g/L；
组分5：甘露醇，药用级，1g/L；
组分6：山梨醇，药用级，25g/L；
溶剂：注射用水；
本发明中冻干保护剂的配制方法：将上述组分分别称量后，分别加入注射用水溶解，定溶后0.2μm滤芯除菌过滤，置室温，备用。
实施例3本发明冻干保护剂的组分、含量(在疫苗半成品中的终浓度)
组分1：蔗糖，药用级，30g/L；
组分2：海藻糖，药用级，20g/L；
组分3：谷氨酸钠，药用级，0.3g/L；
组分4：甘露醇，药用级，10g/L；
组分5：山梨醇，药用级，25g/L；
溶剂：注射用水；
本发明中冻干保护剂的配制方法：将上述组分分别称量后，分别加入注射用水溶解，定溶后0.2μm滤芯除菌过滤，置室温，备用。
实施例4冻干保护剂的组分、含量(在疫苗半成品中的终浓度)
组分1：蔗糖，药用级，50g/L；
组分2：海藻糖，药用级，10g/L；
组分3：谷氨酸钠，药用级，10g/L；
组分4：尿素，药用级，8g/L；
组分5：甘露醇，药用级，1g/L；
溶剂：注射用水；
本发明中冻干保护剂的配制方法：将上述组分分别称量后，分别加入注射用水溶解，定溶后0.2μm滤芯除菌过滤，置室温，备用。
实施例5冻干保护剂的组分、含量(在疫苗半成品中的终浓度)
组分1：蔗糖，药用级，50g/L；
组分2：谷氨酸钠，药用级，5g/L；
组分3：尿素，药用级，2g/L；
组分4：山梨醇，药用级，25g/L；
溶剂：注射用水；
本发明中冻干保护剂的配制方法：将上述组分分别称量后，分别加入注射用水溶解，定溶后0.2μm滤芯除菌过滤，置室温，备用。
实施例6冻干保护剂的组分、含量(在疫苗半成品中的终浓度)
组分1：蔗糖，药用级，100g/L；
组分2：谷氨酸钠，药用级，15g/L；
组分3：尿素，药用级，10g/L；
溶剂：注射用水；
本发明中冻干保护剂的配制方法：将上述组分分别称量后，分别加入注射用水溶解，定溶后0.2μm滤芯除菌过滤，置室温，备用。
实施例7本发明对照冻干保护剂北京民海生物科技有限公司的已上市产品麻疹风疹联合减毒活疫苗使用的保护剂
组分1：蔗糖，药用级，50g/L；
组分2：明胶，药用级，10g/L；
组分3：谷氨酸钠，药用级，10g/L；
组分4：尿素，药用级，5g/L；
组分5：精氨酸，药用级，2g/L；
组分6：人血清白蛋白，药用级，10g/L；
溶剂：注射用水。
实施例8病毒原液的制备
(一)麻疹病毒原液制备
分别按照实施例2-7的冻干保护剂配方，根据收获液量计算各保护剂用量，在收获前首先将保护剂按照计算值混合，并将pH调至6.8～7.0，进行病毒收获，混匀，通过10微米滤器澄清过滤(去除细胞碎片)，即为麻疹病毒原液。
(二)腮腺炎病毒原液制备
分别按照实施例2-7的冻干保护剂配方，根据收获液量计算各保护剂用量，在收获前首先将保护剂按照计算值混合，并将pH调至6.8～7.0，进行病毒收获，混匀，通过0.8微米滤器澄清过滤(去除细胞碎片)，即为腮腺炎病毒原液。
(三)风疹病毒原液制备
分别按照实施例2-7冻干保护剂配方，根据收获液量计算各保护剂用量，在收获前首先将保护剂按照计算值混合，并将pH调至6.8～7.0，进行病毒收获，混匀，通过5微米滤器澄清过滤(去除细胞碎片)，即为风疹病毒原液。
实施例9麻疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒之间的相互影响
(1)测定实施例8中用实施例2的配方的冻干保护剂加入所制得的各病毒原液滴度，进行点配制，点配后冻干疫苗半成品中麻疹、腮腺炎、风疹各病毒滴度分别为6.0lgCCID50/ml、6.1lgCCID50/ml、4.7lgCCID50/ml。
(2)风、腮各病毒对麻疹病毒的影响。以下麻疹病毒原液、风疹病毒原液、腮腺炎病毒原液均为实施例6中用实施例2的配方的冻干保护剂加入制得的对应病毒原液。
①麻疹病毒原液中加入稀释液(稀释液：即稀释液中各成分和浓度与疫苗原液中冻干保护剂的成分和浓度一致)稀释至理论病毒滴度6.0lgCCID50/ml，室温下作用1h，检测麻疹病毒滴度。结果见表1。
②麻疹病毒原液、腮腺炎病毒原液混合，用稀释液点配制至理论病毒滴度6.0lgCCID50/ml、6.1lgCCID50/ml，两种病毒室温下作用1h。中和腮腺炎病毒，检测麻疹病毒滴度。结果见表1。
③麻疹病毒原液、风疹病毒原液混合，用稀释液点配制至理论病毒滴度6.0lgCCID50/ml、4.7lgCCID50/ml，两种病毒室温下作用1h。中和风疹病毒，检测麻疹病毒滴度。结果见表1。
④麻疹病毒原液、腮腺炎病毒原液、风疹病毒原液混合，用稀释液点配制至理论病毒滴度6.0lgCCID50/ml、6.1lgCCID50/ml、4.7lgCCID50/ml，三种病毒室温下作用1h。中和腮腺炎病毒和风疹病毒，检测麻疹病毒滴度。
(3)麻、风各病毒对腮腺炎病毒的影响
①腮腺炎病毒原液用稀释液稀释至理论病毒滴度6.1lgCCID50/ml，室温下作用1h，检测腮腺炎病毒滴度。结果见表1。
②腮腺炎病毒原液、麻疹病毒原液混合，用稀释液点配制至理论病毒滴度6.1lgCCID50/ml、6.0lgCCID50/ml，两种病毒室温下作用1h。中和麻疹病毒，检测检测腮腺炎病毒滴度。结果见表1。
③腮腺炎病毒原液、风疹病毒原液混合，用稀释液点配制至理论病毒滴度6.1lgCCID50/ml、4.7lgCCID50/ml，两种病毒室温下作用1h。中和风疹病毒，检测腮腺炎病毒滴度。结果见表1。
④腮腺炎病毒原液、麻疹病毒原液、风疹病毒原液混合，用稀释液点配制至理论病毒滴度6.1lgCCID50/ml、6.0lgCCID50/ml、4.7lgCCID50/ml，三种病毒室温下作用1h。中和麻疹病毒和风疹病毒，检测腮腺炎病毒滴度。结果见表1。
(4)麻、腮各病毒对风疹病毒的影响。
①将风疹病毒原液用稀释液稀释至理论病毒滴度4.7lgCCID50/ml，室温下作用1h，检测风疹病毒滴度。结果见表1。
②风疹病毒原液、麻疹病毒原液混合，用稀释液点配制至理论病毒滴度4.7lgCCID50/ml、6.0lgCCID50/ml，两种病毒室温下作用1h。中和麻疹病毒，检测风疹病毒滴度。结果见表1。
③风疹病毒原液、腮腺炎病毒原液混合，用稀释液点配制至理论病毒滴度4.7lgCCID50/ml、6.1lgCCID50/ml，两种病毒室温下作用1h。中和腮腺炎病毒，检测风疹病毒滴度。结果见表1。
④风疹病毒原液、麻疹病毒原液、腮腺炎病毒混合，原液用稀释液点配制至理论病毒滴度4.7lgCCID50/ml、6.0lgCCID50/ml、6.1lgCCID50/ml，三种病毒室温下作用1h。中和麻疹病毒和腮腺炎病毒，检测风疹病毒滴度。结果见表1。
各病毒间相互影响试验结果如表1所示。与各病毒理论病毒滴度值相比较，添加了本发明实施例2的冻干保护剂后各病毒相互作用后病毒滴度检测结果一致，均在检定误差范围内，说明麻疹、腮腺炎、风疹三种病毒间无相互影响，添加了本发明实施例3和实施例4的冻干保护剂后各病毒滴度检测结果一致，均在检定误差范围内。
表1病毒间相互影响
Figure BDA0002328579340000111
实施例10麻腮风联合减毒活疫苗的制备
(1)将实施例8中获得的按照实施例2-6的冻干保护剂配方得到的麻疹病毒原液、腮腺炎病毒原液、风疹病毒原液用稀释液点配制至各病毒理论滴度6.0lgCCID50/ml、6.1lgCCID50/ml、4.7lgCCID50/ml，即获得麻腮风联合减毒活疫苗半成品。
(2)疫苗半成品按0.5ml/支进行分装。
(3)冻干程序为：预冻：常压降温至-50℃～-55℃，并维持3h；升华干燥阶段最终温度为-38℃，达到最终温度的时间为30h，真空不控制；解析干燥阶段最终温度28℃，需10h，真空不控制。
(4)冻干后的样品即为样品1、样品2、样品3、样品4、样品5。
实施例11对照苗的制备
(1)将实施例8中获得的按照实施例7的配方得到的麻疹病毒原液、腮腺炎病毒原液、风疹病毒原液用稀释液点配制至各病毒理论滴度6.0lgCCID50/ml、6.1lgCCID50/ml、4.7lgCCID50/ml，即获得麻腮风联合减毒活疫苗半成品。
(2)上述疫苗半成品按0.5ml/支进行分装。
(3)冻干方法：按照现北京民海生物科技有限公司的已上市产品麻疹风疹联合减毒活疫苗的冻干曲线进行冻干。
(4)冻干后的样品即为样品6。
实施例12
对前述制备的样品1-6进行冻干前后病毒滴度检测、外观、水分、渗透压摩尔浓度、无菌检查、支原体检查、异常毒性检查以及豚鼠全身主动过敏试验，并将样品分别进行37℃、25℃的稳定性和2～8℃稳定性试验，取样进行外观、水分、渗透压与病毒滴度检测。
检测方法如下：
麻疹病毒滴定：供试品经腮腺炎病毒和风疹病毒特异性免疫血清中和腮腺炎病毒和风疹病毒后，在Vero细胞上滴定麻疹病毒，麻疹病毒滴度应不低于3.3lgCCID50/ml。应同时进行病毒参考品滴定。
腮腺炎病毒滴定：供试品经麻疹病毒和风疹病毒特异性免疫血清中和麻疹病毒和风疹病毒后，在Vero细胞上滴定腮腺炎病毒，腮腺炎病毒滴度应不低于4.0lgCCID50/ml。应同时进行病毒参考品滴定。
风疹病毒滴定：供试品经麻疹病毒和腮腺炎病毒特异性免疫血清中和麻疹病毒和腮腺炎病毒后，在RK-13细胞上滴定风疹病毒，风疹病毒滴度应不低于3.3lgCCID50/ml。应同时进行病毒参考品滴定。
外观：应为乳酪色疏松体，复溶后应为橘红色或淡粉红色澄明液体，无异物。
水分：根据《中华人民共和国药典》2015年版三部通则0832检查，应不高于3.0％。
渗透压摩尔浓度：根据《中华人民共和国药典》2015年版三部通则0632检查。
无菌检查：根据《中华人民共和国药典》2015年版三部通则1101检查，应合格。
支原体检查：跟据《中华人民共和国药典》2015年版三部通则3301检查，应合格。
异常毒性检查：根据《中华人民共和国药典》2015年版三部通则1141检查，应合格。
豚鼠全身主动过敏试验：供试品经皮下注射致敏后再经静脉注射激发，观察豚鼠注射供试品后所产生的全身过敏反应，过敏反应应为阴性。
结果如下：
(1)样品1-6冻干前后病毒滴度检测结果见表2。
表2样品1-6冻干前后病毒滴度检测结果
Figure BDA0002328579340000131
Figure BDA0002328579340000141
表2结果说明，采用本发明不含明胶和人白的冻干保护剂配方的麻腮风三联苗(样品1-3)与现有技术中含有明胶和人白的保护剂的麻腮风三联苗(样品6)相比，虽然样品1-3不含明胶和人白，但其稳定性良好，均达到了与样品4近似的保护效果。然而不含明胶和人白的其他冻干保护剂配方制得的麻腮风三联苗(样品4和样品5)，在冻干前后，病毒滴度发生了明显的降低。
(2)样品1-6复溶后进行外观、水分、渗透压摩尔浓度、异常毒性检查、及安全性评价见表3。表3说明，与样品6相比，样品1-3的渗透压摩尔浓度更接近人体渗透压，能降低不良反应的发生。
表3样品1-6外观、水分、渗透压摩尔浓度、异常毒性检查、及安全性评价结果
Figure BDA0002328579340000142
(3)样品1-6 37℃稳定性结果见表4。
表4样品1-6在37℃下的稳定性效果评价
Figure BDA0002328579340000151
Figure BDA0002328579340000161
(4)样品1-6在25℃稳定性结果见表5。
表5样品1-6在25℃下的稳定性效果评价
Figure BDA0002328579340000162
Figure BDA0002328579340000171
Figure BDA0002328579340000181
(5)样品1-6 2-8℃稳定性结果见表6。
表6样品1-6在2-8℃下的稳定性效果评价
Figure BDA0002328579340000182
Figure BDA0002328579340000191
Figure BDA0002328579340000201
表4、表5、表6的结果说明，37℃、25℃、2-8℃条件下，14天、28天内，1年内的三联疫苗(样品1-3)内各病毒滴度的稳定性良好，稳定效果与现有技术含明胶和人白保护剂的三联苗(样品6)效果相当，但样品4-5在相应条件下的稳定性发生明显的改变，随时时间的延长，病毒滴度明显降低。
由以上数据可以看出，本发明不含明胶不含人血白蛋白的疫苗冻干保护剂与目前常规使用的含明胶和人血白蛋白的保护剂相比，稳定性结果无显著性差异，但是本发明不含明胶和人血白蛋白，大大提高了对人体的安全性，而且渗透压与现有配方相比，更接近人体渗透压，可降低疫苗的不良反应。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种麻腮风联合疫苗冻干保护剂，其特征在于，该冻干保护剂由蔗糖、海藻糖、谷氨酸钠、尿素、甘露醇和山梨醇六种组分和配制保护剂的基质液组成；
各成分在疫苗半成品中的终浓度为：蔗糖40g/L，海藻糖10g/L，谷氨酸钠5g/L，尿素2g/L，甘露醇1g/L，山梨醇25g/L；所述疫苗半成品是指冻干前的液态疫苗；
其中，配制保护剂的基质液为注射用水。
2.根据权利要求1所述的麻腮风联合疫苗冻干保护剂，其特征在于，所述麻疹病毒为麻疹病毒长-47株，风疹病毒为RA27/3株，腮腺炎病毒为腮腺炎病毒A型。
3.权利要求1-2任一项所述的麻腮风联合疫苗冻干保护剂在制备冻干麻腮风联合减毒活疫苗中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
(1)分别制备麻疹病毒收获液、腮腺炎病毒收获液、风疹病毒收获液；
(2)按比例将权利要求1-2任一项所述的麻腮风联合疫苗冻干保护剂分别加入麻疹病毒收获液、腮腺炎病毒收获液、风疹病毒收获液中，分别制成麻疹病毒原液、腮腺炎病毒原液、风疹病毒原液；
(3)将步骤(2)制得的麻疹病毒原液、腮腺炎病毒原液、风疹病毒原液按照一定体积比混合，得到麻腮风联合冻干疫苗半成品，半成品中麻疹、腮腺炎、风疹各病毒滴度为5.5-6.5lgCCID50/ml、6.0-7.0lgCCID50/ml、4.4-5.4lgCCID50/ml；冻干后即为成品。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤(2)中，麻腮风联合疫苗冻干保护剂各成分在麻疹病毒原液中终浓度为：蔗糖30-100g/L，海藻糖10-30g/L，谷氨酸钠0.3-15g/L，尿素0-10g/L，甘露醇0-10g/L，山梨醇0-25g/L；
麻腮风联合疫苗冻干保护剂各成分在腮腺炎病毒原液中终浓度为：蔗糖30-100g/L，海藻糖10-30g/L，谷氨酸钠0.3-15g/L，尿素0-10g/L，甘露醇0-10g/L，山梨醇0-25g/L；
麻腮风联合疫苗冻干保护剂各成分在风疹病毒原液中终浓度为：蔗糖30-100g/L，海藻糖10-30g/L，谷氨酸钠0.3-15g/L、尿素0-10g/L，甘露醇0-10g/L，山梨醇0-25g/L。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤(3)中，所述疫苗冻干保护剂中各成分在麻腮风联合冻干疫苗半成品中的终浓度为：蔗糖40g/L，海藻糖10g/L，谷氨酸钠5g/L，尿素2g/L，甘露醇1g/L，山梨醇25g/L。
7.权利要求3-6任一所述的应用制备得到的疫苗冻干产品，所述疫苗为麻腮风联合减毒活疫苗。
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