CN114028576B - 一种无蛋白猪伪狂犬病活疫苗耐热保护剂及其制备方法与应用 - Google Patents

一种无蛋白猪伪狂犬病活疫苗耐热保护剂及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及兽用生物制品制造领域，特别公开了一种无蛋白猪伪狂犬病活疫苗耐热保护剂及其制备方法与应用。该猪伪狂犬病活疫苗耐热保护剂，其特征在于：由等体积的A液和B液组成，所述A液由壳聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾和水制成；所述B液由羟乙基淀粉、乳酸钙、右旋糖酐、精氨酸、D‑山梨醇、海藻糖和水制成。本发明耐热保护剂的使用降低了猪伪狂犬病活疫苗产品的储运要求，解决了猪伪狂犬病活疫苗不能在2‑8℃下长期保存和运输的问题，以及市售耐热保护剂疫苗存在的应激问题，提高了产品在保存和使用中的稳定性。

Description

一种无蛋白猪伪狂犬病活疫苗耐热保护剂及其制备方法与 应用
技术领域
本发明涉及兽用生物制品制造领域，特别涉及一种无蛋白猪伪狂犬病活疫苗耐热保护剂及其制备方法与应用。
背景技术
猪伪狂犬病是由猪伪狂犬病病毒引起的多种家畜以发热、奇痒(猪除外)、繁殖障碍、脑脊髓炎为主要症状的一种高度接触性传染病。它是研究疱疹病毒生物学的一个有用的模式病毒。猪伪狂犬病毒的分类学命名为猪疱疹病毒I型，属于疱疹病毒甲亚科水痘疱疹病毒属。所有的疱疹病毒都有一个双股DNA基因组，病毒粒子大小相近(200-250nm)，结构(衣壳、被膜和囊膜)相似，且在生活周期上有潜伏期。PRV由于能感染突触连接的神经元，也被用做神经细胞线路的“活”追踪器。世界动物卫生组织(OIE)将其列为B类动物疫病，我国将其列为二类动物疫病。
疫苗免疫是防控该病最为经济有效的手段，目前市场上的活疫苗主要包括：传统减毒活疫苗、基因工程载体活疫苗、基因缺失活疫苗和遗传重组活疫苗等。大多数活疫苗为弱毒疫苗，弱毒疫苗是一种病原致病力减弱但仍具有活力的完整病原疫苗。长期以来，弱毒疫苗因其独特的优势在防控猪传染病方面发挥了重要作用。传统疫苗冻干产品一般是采用5%右旋糖酐与10%奶粉作为保护剂，耐热性能差，且在2-8℃条件下的保存期只有3-6个月，大多需要在-15℃以下保存。疫苗在常规运输、反复冻融的条件下，毒价损失严重，使其免疫效果大大降低。目前市场已有的猪伪狂犬耐热保护剂含有牛血清白蛋白等成分，在免疫动物上表现出呕吐、呼吸急促等应激反应。为此，开发一种安全有效的猪伪狂犬耐热保护剂活疫苗是赢得市场的先决条件。
发明内容
本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种安全性好、稳定性高、便于储运的无蛋白猪伪狂犬病活疫苗耐热保护剂及其制备方法与应用。
本发明是通过如下技术方案实现的：
一种无蛋白猪伪狂犬病活疫苗耐热保护剂，其特征在于：由等体积的A液和B液组成；
所述A液由以下重量分数的物质制成：壳聚糖0.5-5%，聚乙烯吡咯烷酮4-6%，磷酸氢二钾0.01-1%，磷酸二氢钾0.01-0.1%，余量为水；
所述B液由以下重量分数的物质制成：羟乙基淀粉0.5-3%，乳酸钙1-5%，右旋糖酐4-15%，精氨酸0.05-1.5%，D-山梨醇1-5%，海藻糖1-5%，余量为水。
本发明选取多种对猪伪狂犬病活疫苗抗原有特异性耐热保护作用的成分，通过合理的试验设计与配方优化，筛选出对猪伪狂犬病活疫苗抗原有耐热保护效果的复合配方，解决了猪伪狂犬病活疫苗不耐受反复冻融及运输与保存过程中不耐热的问题。
进一步优选的，所述A液和B液中的水为注射用水。
上述无蛋白猪伪狂犬病活疫苗耐热保护剂的制备方法，包括如下步骤：
（1）将壳聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾溶解于水中，灭菌得到A液；
（2）将羟乙基淀粉、乳酸钙、右旋糖酐、精氨酸、D-山梨醇、海藻糖溶解于水中，过滤除菌得到B液；
（3）将A液和B液按1:1的体积比混匀，得到所述耐热保护剂。
进一步优选的，步骤（1）中，灭菌条件为116℃下灭菌30min。
进一步优选的，步骤（2）中，过滤除菌是采用0.22μm的除菌过滤器。
上述无蛋白猪伪狂犬病活疫苗耐热保护剂在制备猪伪狂犬病活疫苗中的应用，其中所述的活疫苗为Bathar-K61弱毒株活疫苗。
进一步优选的，上述应用中，将猪伪狂犬病活疫苗抗原溶液与耐热保护剂按1:4的体积比混匀，然后分装，冷冻干燥，即得。
本发明的耐热保护剂配置的疫苗在2-8℃下保存24个月，仍保持冻干后的外形，病毒含量超过国家兽医生物制品规程的标准。冻干前后病毒损失率低，安全无应激，冻干产品耐老化效果好，从而解决了猪伪狂犬活疫苗不能在2-8℃下长期保存和运输的技术问题。
本发明耐热保护剂的使用降低了猪伪狂犬病活疫苗产品的储运要求，解决了猪伪狂犬病活疫苗不能在2-8℃下长期保存和运输的问题，以及市售耐热保护剂疫苗存在的应激问题，提高了产品在保存和使用中的稳定性。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明，以便于对本发明的理解，但并不是对本发明的限制。
实施例1：无蛋白猪伪狂犬病活疫苗耐热保护剂的制备
（1）将壳聚糖0.5%，聚乙烯吡咯烷酮（PVPK30）4%，磷酸氢二钾0.2%，磷酸二氢钾0.02%溶解于注射用水中，116℃、30min灭菌得到A液；
（2）将羟乙基淀粉1%，乳酸钙2%，右旋糖酐2.5%，精氨酸0.5%，D-山梨醇1%，海藻糖1%溶解于注射用水中，采用0.22μm的除菌过滤器过滤除菌得到B液；
（3）将A液和B液等体积混匀，得到所述耐热保护剂。
实施例2：无蛋白猪伪狂犬病活疫苗耐热保护剂的制备
（1）将壳聚糖1%，聚乙烯吡咯烷酮（PVPK30）4%，磷酸氢二钾0.2%，磷酸二氢钾0.02%溶解于注射用水中，116℃、30min灭菌得到A液；
（2）将羟乙基淀粉1.5%，乳酸钙2%，右旋糖酐3%，精氨酸0.5%，D-山梨醇1.5%，海藻糖1.5%溶解于注射用水中，采用0.22μm的除菌过滤器过滤除菌得到B液；
（3）将A液和B液等体积混匀，得到所述耐热保护剂。
实施例3：无蛋白猪伪狂犬病活疫苗耐热保护剂的制备
（1）将壳聚糖2%，聚乙烯吡咯烷酮（PVPK30）5%，磷酸氢二钾0.5%，磷酸二氢钾0.03%溶解于注射用水中，116℃、30min灭菌得到A液；
（2）将羟乙基淀粉2%，乳酸钙2%，右旋糖酐3.5%，精氨酸1%，D-山梨醇2%，海藻糖2%溶解于注射用水中，采用0.22μm的除菌过滤器过滤除菌得到B液；
（3）将A液和B液等体积混匀，得到所述耐热保护剂。
实施例4：无蛋白猪伪狂犬病活疫苗耐热保护剂的制备
（1）将壳聚糖3%，聚乙烯吡咯烷酮（PVPK30）5%，磷酸氢二钾0.5%，磷酸二氢钾0.05%溶解于注射用水中，116℃、30min灭菌得到A液；
（2）将羟乙基淀粉2%，乳酸钙3%，右旋糖酐4%，精氨酸1%，D-山梨醇3%，海藻糖3%溶解于注射用水中，采用0.22μm的除菌过滤器过滤除菌得到B液；
（3）将A液和B液等体积混匀，得到所述耐热保护剂。
实施例5：无蛋白猪伪狂犬病活疫苗耐热保护剂的制备
（1）将壳聚糖5%，聚乙烯吡咯烷酮（PVPK30）6%，磷酸氢二钾1%，磷酸二氢钾0.1%溶解于注射用水中，116℃、30min灭菌得到A液；
（2）将羟乙基淀粉4%，乳酸钙5%，右旋糖酐5%，精氨酸1.5%，D-山梨醇5%，海藻糖5%溶解于注射用水中，采用0.22μm的除菌过滤器过滤除菌得到B液；
（3）将A液和B液等体积混匀，得到所述耐热保护剂。
实施例6：不同组猪伪狂犬病毒检测
收获的猪伪狂犬病毒培养液经无菌和病毒含量测定合格后，与上述制备的耐热保护剂5个配方(实施例1、2、3、4、5)分别按体积比为1:4进行配苗，2.0ml/瓶进行分装，然后利用冷冻真空干燥机进行冻干，同时设立蔗糖牛奶保护剂(常规保护剂)为对照组。
猪伪狂犬病耐热保护剂活疫苗冻干后检测：
（1）将耐热保护剂的配方1、2、3、4、5及对照组冻干的成品按照现行《中国兽药典》要求进行检测，包括物理性状、真空度检验、剩余水份含量检测，所有检测项目均合格。检测结果见表1。
表1各组配方物理性状、真空度、剩余水份检测结果
Figure DEST_PATH_IMAGE001
（2）病毒含量测定，将疫苗用2%DMEM复溶后，再作10倍倍比稀释，取10-4、10-5、10-6、10-7，4个稀释度，每个稀释度接种6个传代细胞(ST)单层孔，阳性对照与阴性对照也各接6个孔，每孔0.1/ml，置37℃、含5%CO2培养箱中培养观察5日，检查病毒的特异性细胞病变并根据Reed-Muench法计算TCID50。每头份疫苗病毒含量应不低于105.5TCID50。各组配方冻干前后病毒含量见表2。
表2各组配方的病毒含量(TCID50/头份)测定结果
Figure DEST_PATH_IMAGE003
从表中可以看出耐热保护剂配制的苗冻干前后病毒含量损失最大为0.15个滴度，然而常规保护剂损失达到0.5个滴度。
（3）耐老化试验：将制备的5组疫苗及对照组各取5瓶在37℃放置10日，然后各随机取3瓶，测定PRV的TCID50，检测结果见表3。
表3各组配方耐老化病毒含量(TCID50/头份)检测结果
Figure 719931DEST_PATH_IMAGE005
从表中可以看出，耐热保护剂配方制备的苗耐老化后病毒含量下降滴度均不超过0.6，而常规保护剂下降滴度为1.5以上。可见，在37℃下保存10天后，本发明保护剂对疫苗有显著的保护作用。
（4）安全性试验：将制备各配方疫苗以20头份剂量免疫28-35日龄仔猪，连续14天观察仔猪存活及有无应激反应，检测结果见表4。
表4 各组配方猪伪狂犬疫苗安全性检验
Figure DEST_PATH_IMAGE006
（5）保存期试验：将制备各配方疫苗及对照组各取6瓶，放置于2～8℃保存，分别在放置后第1、3、6、12、18、24个月各取其中1瓶测定病毒含量，观察该疫苗的保存期，具体结果见表5。
表5各组保护剂配方保存期结果(病毒含量：TCID50/头份)
Figure 846018DEST_PATH_IMAGE007
从表中可以看出，耐热保护剂配方冻干的疫苗在2～8℃保存条件下，均可以保存24个月。然而，常规保护剂冻干疫苗的保存期则只有6个月可见，在2-8℃下保存2年后，本发明耐热保护剂较蔗糖牛奶保护剂对疫苗有显著的保护作用。
综上所述，本发明的保护剂经过无菌处理后应用于猪伪狂犬病活疫苗的冻干。冻干损失低于0.2个滴度，37℃放置10日，病毒含量滴度降低小于1个滴度，能在2～8℃保存24个月。超剂量免疫仔猪，表现出良好的安全性。采用本发明耐热保护剂所配制的猪伪狂犬活疫苗耐热性能良好，本发明耐热冻干保护剂对猪伪狂犬活疫苗具有良好的保护效果，提高了产品的市场竞争力。
在上述实施例中，对本发明的最佳实施方式做了描述，很显然，在本发明的发明构思下，仍可做出很多变化。在此，应该说明，在本发明的发明构思下所做出的任何改变都将落入本发明的保护范围内。

Claims (6)

1.一种无蛋白猪伪狂犬病活疫苗耐热保护剂，其特征在于：由等体积的A液和B液组成，所述A液由以下重量分数的物质制成：壳聚糖0.5-5%，聚乙烯吡咯烷酮4-6%，磷酸氢二钾0.01-1%，磷酸二氢钾0.01-0.1%，余量为注射用水；所述B液由以下重量分数的物质制成：羟乙基淀粉1-4%，乳酸钙1-5%，右旋糖酐1-5%，精氨酸0.05-1.5%，D-山梨醇1-5%，海藻糖1-5%，余量为注射用水。
2.如权利要求1所述的无蛋白猪伪狂犬病活疫苗耐热保护剂的制备方法，其特征为，包括如下步骤：（1）将壳聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾溶解于水中，灭菌得到A液；（2）将羟乙基淀粉、乳酸钙、右旋糖酐、精氨酸、D-山梨醇、海藻糖溶解于水中，过滤除菌得到B液；（3）将A液和B液按1:1的体积比混匀，得到所述耐热保护剂。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，灭菌条件为116℃下灭菌30min。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，过滤除菌是采用0.22μm的除菌过滤器。
5.如权利要求1所述的无蛋白猪伪狂犬病活疫苗耐热保护剂在制备猪伪狂犬病活疫苗中的应用，其中所述的活疫苗为Bathar-K61弱毒株活疫苗。
6.如权利要求5所述的应用，将猪伪狂犬病活疫苗抗原溶液与耐热保护剂按1:4的体积比混匀，然后分装，冷冻干燥，即得。
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