WO2021199764A1 - 修飾ベクターの作製方法、及びベクターの修飾方法 - Google Patents

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binding
compound
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博文 前田
隆英 佐々木
北野　光昭
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株式会社カネカ
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    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
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    • C12N2750/14151—Methods of production or purification of viral material

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a modified vector and a method for modifying the vector.
  • Vectors are widely used for gene therapy, but there are problems such as insufficient transferability of vectors to target tissues. As a method for solving this problem, the proteins constituting the vector have been modified, but sufficient effects for showing the medicinal effect have not been obtained.
  • Non-Patent Document 1 a method of chemically modifying a vector and introducing a ligand for enhancing the function into the vector.
  • this method uses a reagent in which a site to be bound to a functional group on the vector and a ligand for enhancing the function are integrated, so that the available reagents are limited and it is said to be an effective method. hard.
  • Patent Document 1 As another method, a method of chemically modifying in two steps has been reported (Patent Document 1 and the like).
  • this method is a method using cysteine residues, and it is difficult to say that it is a simple method because it is necessary to release cysteine residues by a reduction treatment before chemical modification. Further, there is a possibility that the vector is decomposed by this reduction treatment.
  • Non-Patent Document 2 a method of modifying a vector to introduce a cysteine residue into a mutation and then chemically modifying the vector has been reported (Non-Patent Document 2 and the like), but since it takes time to introduce the mutation, it is a simple method. Is hard to say.
  • An object of the present invention is to solve the above-mentioned problems in the past and to achieve the following objects. That is, an object of the present invention is to provide a method for producing a modified vector and a method for modifying the vector, which can easily introduce various ligands without modifying or pretreating the vector.
  • the present inventors have added a functional group (A) capable of binding to the functional group and a functional group (B) capable of binding to the ligand compound to the functional group in the vector.
  • a functional group (A) capable of binding to the functional group and a functional group (B) capable of binding to the ligand compound to the functional group in the vector In the linker compound having, and in the ligand compound having the functional group (B) capable of binding to the functional group (B) to the functional group (B).
  • the present invention is based on the above-mentioned findings by the present inventors, and the means for solving the above-mentioned problems are as follows. That is, ⁇ 1>
  • the functional group (A) in the linker compound having a functional group (A) capable of binding to the functional group and a functional group (B) capable of binding to the ligand compound is bonded to the functional group in the vector. It is characterized by including a step of binding the functional group (C) to the functional group (B) in a ligand compound having a functional group (C) capable of binding to the functional group (B). This is a method for producing a modified vector.
  • the functional group (A) in the linker compound having a functional group (A) capable of binding to the functional group and a functional group (B) capable of binding to the ligand compound is bonded to the functional group in the vector. It is characterized by including a step of binding the functional group (C) to the functional group (B) in a ligand compound having a functional group (C) capable of binding to the functional group (B). This is a vector modification method.
  • a method for producing a modified vector which can solve the above-mentioned problems in the past, achieve the above-mentioned object, and easily introduce various ligands without modifying or pretreating the vector.
  • a method of modifying the vector can be provided.
  • FIG. 1 is a diagram showing the results of SDS-PAGE after the first step in Example 1.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of SDS-PAGE after the second step in Example 1.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of SDS-PAGE after the first step and after the second step in Examples 2 and 3.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of SDS-PAGE after the first step and after the second step in Example 4.
  • FIG. 5 is a diagram showing a purification chart of cation exchange chromatography after the first step in Example 4.
  • FIG. 6 is a diagram showing a purification chart of cation exchange chromatography after the second step in Example 4.
  • the method for producing the modified vector is a method for producing the functional group in a linker compound having a functional group (A) capable of binding to the functional group and a functional group (B) capable of binding to the ligand compound as the functional group in the vector.
  • the functional group (C) in the ligand compound having the functional group (C) capable of binding to the functional group (B) is bound to the functional group (B). It may include a second step and further have other steps.
  • first step and the second step are performed is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but various ligands capable of binding to the linker compound are simply introduced into the vector. It is preferable to perform the second step after the first step from the viewpoint that the ligand options can be expanded.
  • A) is a step of combining.
  • the vector is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include a viral vector, a plasmid vector, an artificial chromosome vector, a cosmid vector, and a phosmid vector. Among these, viral vectors are preferable because they are widely used in gene therapy.
  • the virus used as the virus vector is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • adeno-associated virus AAV
  • adenovirus adenovirus
  • retrovirus adenovirus
  • lentivirus lentivirus
  • herpesvirus poliovirus
  • papilloma examples include viruses, vaccinia viruses, and pox viruses.
  • viruses vaccinia viruses, and pox viruses.
  • AAV adeno-associated virus
  • the serum types of AAV used as the virus vector include AAV1 (type 1 AAV), AAV2 (type 2 AAV), AAV3 (type 3 AAV), AAV4 (type 4 AAV), AAV5 (type 5 AAV), and AAV6 (6).
  • Type AAV AAV7 (7 type AAV), AAV8 (8 type AAV), AAV9 (9 type AAV), AAV10 (10 type AAV), AAV11 (11 type AAV), AAV12 (12 type AAV), AAV13 (13 type) AAV), AAV14 (14-type AAV), variants thereof, and the like can be mentioned, but there are no particular restrictions, and they can be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • the variant is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. For example, in order to improve the tissue specificity (directivity of infected cells) of the target cell, the variant is genetically modified (wild-type AAV). ) Modified AAV and the like.
  • the functional group in the vector is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include an amino group, a guanidine group, a hydroxyl group, a carboxyl group and an indole group. Among these, an amino group is preferable.
  • the functional group in the vector may be a functional group at a lysine residue, an arginine residue, a tyrosine residue, a serine residue, a threonine residue, or a tryptophan residue, and among these, the functional group at the lysine residue is preferable.
  • AAV adeno-associated virus
  • the functional group in the vector is a functional group constituting the capsid of the adeno-associated virus.
  • the capsid is composed of VP1, VP2, VP3 and the like.
  • the linker compound has a functional group (A) capable of binding to a functional group in the vector, a functional group (B) capable of binding to a ligand compound, and can further have a linking portion (D).
  • the functional group (A) that can be bonded to the functional group in the vector is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • OSO2R'or OP (O) (OR') 2 R'represents an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms; an aryl group having 4 to 10 carbon atoms, and here 1 to 1 to 10 carbon atoms.
  • R' represents an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms; an aryl group having 4 to 10 carbon atoms, and here 1 to 1 to 10 carbon atoms.
  • alkyl group of 6 a linear or branched alkyl group, particularly a methyl group; an ethyl group; (n-, i-) propyl group; (n-, i-, t-) butyl group is a preferable example.
  • aryl group having 4 to 10 carbon atoms examples include a phenyl group; a (2-, 3-, 4-) tolyl group; a (1-, 2-) naphthyl group; a 2-pyrrolyl group; a 2-furyl group.
  • Group; 3-thienyl group refers to an aromatic hydrocarbon group or heterocyclic group consisting of a 5- or 6-membered monocyclic or fused ring of 2-pyridyl group, and examples thereof include a methanesulfonyl group and a toluenesulfonyl group.
  • a succinimidyl group is preferable in terms of reactivity.
  • the functional group (A) may be one or more per molecule of the linker compound.
  • the functional group (B) that can bind to the ligand compound is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • an alkynyl group or an azide group is preferable, and an alkynyl group is more preferable, in terms of reactivity.
  • the number of functional groups (B) may be one or more per molecule of the linker compound.
  • the plurality of cases are not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include an azide group and an alkynyl group.
  • the linking portion (D) can link the functional group (A) and the functional group (B), and does not react with the functional group (A), the functional group (B), and the ligand compound. As long as there is no particular limitation, it can be appropriately selected according to the purpose.
  • the connecting portion (D) may have a linear structure or a branched structure, but the linear structure is preferable.
  • the connecting portion (D) may be hydrophilic, hydrophobic, or amphipathic, but the hydrophilicity is preferable.
  • the length of the connecting portion (D) is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. For example, the length of the connecting portion (D) can be adjusted by the number of carbon atoms constituting the connecting portion (D).
  • the chemical structure of the connecting portion (D) is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • a structure having an alkylene group, a structure having a carbonyl group, a structure having an ether bond, and a carboxylic acid examples thereof include a structure having an ester bond and a combination thereof.
  • the structure having an ether bond may be chain-like (for example, a straight chain such as ethylene glycol, for example, a branched chain such as propylene glycol), or a structure containing cyclic (tetrahydropyran, tetrahydrofuran, 1,4-dioxane, etc.). ) May be.
  • the connecting portion (D) include an alkylene group, an alkyleneoxy group, a poly (alkyleneoxy) group, and the like.
  • the alkylene group is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. For example, an alkylene group having 1 to 20 carbon atoms is preferable, an alkylene group having 1 to 10 carbon atoms is more preferable, and an alkylene group having 1 to 10 carbon atoms is more preferable. 1 to 4 alkylene groups are more preferred.
  • the alkyleneoxy group is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. For example, an alkyleneoxy group having 1 to 100 carbon atoms is preferable, and an alkyleneoxy group having 4 to 100 carbon atoms is more preferable.
  • An alkyleneoxy group having 5 to 50 carbon atoms is more preferable.
  • the poly (alkyleneoxy) group is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. For example, a poly (alkyleneoxy) group having 1 to 100 carbon atoms is preferable and the poly (alkyleneoxy) group has 5 to 50 carbon atoms. A poly (alkyleneoxy) group is more preferable, and a poly (alkyleneoxy) group having 6 to 40 carbon atoms is further preferable.
  • the alkylene oxide unit in the poly (alkyleneoxy) group is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. For example, ethylene oxide and propylene oxide are preferable, and ethylene oxide is more preferable.
  • linker compound is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • the bond of the functional group (A) to a functional group in the vector is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • a solution containing the linker compound and the vector is mixed and reacted. Examples thereof include a method of mixing and reacting a solution containing the linker compound to which the ligand compound is bound and the vector. After these methods, a glycine solution may be added for further reaction.
  • the solvent of the solution may be an aqueous solvent or an organic solvent, or a mixed solvent of an aqueous solvent and an organic solvent.
  • the aqueous solvent is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include HEPES (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinethesulfonic acid) buffer, phosphoric acid buffer, distilled water and the like. Be done.
  • the pH of the HEPES buffer or the phosphate buffer is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but is preferably pH 4 or more and pH 12 or less, more preferably pH 5 or more and pH 11 or less, and pH 6 or more and pH 10 or less. More preferably, pH 7 or more and pH 9 or less are particularly preferable.
  • the organic solvent is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but is preferably compatible with water.
  • examples thereof include nitrile solvents such as acetonitrile, alcoholic solvents such as methanol, ethanol and propanol, ether solvents such as tetrahydrofuran and 1,4-dioxane, sulfur solvents such as dimethyl sulfoxide, and amide solvents such as dimethylformamide.
  • nitrile solvents such as acetonitrile
  • alcoholic solvents such as methanol, ethanol and propanol
  • ether solvents such as tetrahydrofuran and 1,4-dioxane
  • sulfur solvents such as dimethyl sulfoxide
  • amide solvents such as dimethylformamide.
  • the final concentration of the linker compound (before the addition of the glycine solution) is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but is preferably 0.1 ⁇ M or more and 200 mM or less, and more preferably 0.5 ⁇ M or more and 100 mM or less. It is more preferably 5 ⁇ M or more and 80 mM or less, and particularly preferably 10 ⁇ M or more and 50 mM or less.
  • the titer of the vector is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but is preferably 1 ⁇ 10 4 vg / ⁇ L or more and 1 ⁇ 10 100 vg / ⁇ L or less, and 1 ⁇ 10 5 vg / ⁇ L. It is more preferably ⁇ L or more and 5 ⁇ 10 80 vg / ⁇ L or less, and further preferably 1 ⁇ 10 6 vg / ⁇ L or more and 1 ⁇ 10 50 vg / ⁇ L or less.
  • the concentration of the glycine solution is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but is preferably 0.1 ⁇ MM or more and 20 M or less, more preferably 0.5 ⁇ M or more and 10 M or less, and further preferably 5 ⁇ M or more and 5 M or less. It is preferable, and 10 ⁇ M or more and 4 M or less are particularly preferable.
  • the temperature of the reaction is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but is preferably 0 ° C. or higher and 70 ° C. or lower, and more preferably 40 ° C. or lower.
  • the reaction time before the addition of the glycine solution is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but is preferably 5 minutes or more and 120 hours or less, more preferably 30 minutes or more and 96 hours or less, and 1 hour. More preferably, it is 72 hours or less.
  • the reaction time after the addition of the glycine solution is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but is preferably 5 minutes or more and 120 hours or less, more preferably 30 minutes or more and 96 hours or less, and 1 hour. More preferably, it is 72 hours or less.
  • the second step is a step of binding the functional group (C) to the functional group (B) in a ligand compound having a functional group (C) capable of binding to the functional group (B).
  • the ligand compound may have a functional group (C) capable of binding to the functional group (B), a ligand portion, and further a linking portion (E).
  • the linking portion (E) is not particularly limited as long as the functional group (C) can be linked to the ligand portion and does not react with the linker compound, the functional group (C), and the ligand portion. It can be appropriately selected according to the purpose.
  • the structure and specific examples of the connecting portion (E) are the same as those of the connecting portion (D) in the above-mentioned linker compound.
  • the ligand portion of the ligand compound is a substance that has an affinity for tissues, cells, proteins, etc.
  • the labeling means adding functions such as membrane permeability and target cell specificity to the vector, and adding the functions means modifying.
  • the introduction of the linker is also modified in that it adds a scaffolding function that facilitates the introduction of other functional substances.
  • the ligand portion is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • examples thereof include sugar compounds, peptides, low molecular weight compounds and immunoglobulins. These may be one or a plurality per molecule of the ligand compound. In the case of a plurality of cases, there is no particular limitation and it can be appropriately selected depending on the intended purpose, and examples thereof include sugar compounds and peptides.
  • the sugar compound is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include monosaccharides, oligosaccharides and polysaccharides.
  • the monosaccharides referred to herein have asymmetric carbons that are mirror images of the opposite sex. It may be a body, and oligosaccharides are composed of 2 to 6 molecules of monosaccharides, and polysaccharides are polymers in which monosaccharides are connected in a straight line or by branching, and monosaccharides, disaccharides, and trisaccharides are available due to availability. Is preferable.
  • the sugar compound is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • the protecting group is a substituent that protects a hydroxyl group or an amino group contained in a sugar compound, and can be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • the protecting group for a hydroxyl group is an acyl group, a carbonate group or a carbamate group. , Cyclic acetal group, ether group and the like.
  • the acyl group is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. For example, an acetyl group, a phenylacetyl group, a halogenated acetyl group, a methoxyacetyl group, a phenoxyacetyl group, a pivaloyl group, a benzoyl group and the like can be selected.
  • the carbonate group is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include a t-butyl carbonate group and a benzyl carbonate group.
  • the carbamate group is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include a phenyl carbamate group.
  • the cyclic acetal group is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include a methylene acetal group, an ethylidene acetal group, an acetonide group and a benzylidene acetal group.
  • the ether group is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include a benzyl ether group.
  • examples of the amino group protecting group include an acyl group and a carbamate group.
  • the acyl group is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • an acetyl group, a phenylacetyl group, a halogenated acetyl group, a methoxyacetyl group, a phenoxyacetyl group, a pivaloyl group, a benzoyl group and the like can be selected.
  • the carbamate group is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include 9-fluorenylmethyl carbamate group, phenyl carbamate group and t-butyl carbamate group.
  • the acetyl group is preferable because of its low toxicity and availability.
  • the peptide compound is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • LRVRRASHLRKLRKRLLRDAKKKKKKKKKKKKKKKKKKK (SEQ ID NO: 1), KKKKKKKKKKKKKKKLRRVRLARKKKKKKKKKLRRVRLARKKKKKKKKKLRRVRLLAR ), RQIKIWFQNRRMKWK (SEQ ID NO: 5), GWTLNSAGYLLGKINLKALAALKKIL (SEQ ID NO: 6), GALLFLGFLGAGSTMGASTGMGAWSQPKKKKRKV (SEQ ID NO: 7), RRRRRRHRRR (SEQ ID NO: 8) , LLIILRRRIRKQAHAHSK (SEQ ID NO: 12), KLALKLALKALKAALKA (SEQ ID NO: 13), LLIILRRRIRKQAHAHSK (SEQ ID NO: 14), GWTLNSAGYLLGKINLKALAALKKIL (SEQ ID NO: 15) It may be a
  • the low molecular weight compound is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • it may be a substance exhibiting a medicinal effect in vivo, such as paclitaxel and a low molecular weight antibody. Can be mentioned.
  • It may be a substance for evaluating the affinity with a substance in a living body, and examples thereof include biotin and dyes. Further, a polyellene glycol group may be added thereto.
  • the dye is not particularly limited, and is, for example, Fluoresane, HiLyte Fluor 555, HiLyte Fluor 647, HiLyte Fluor 750, DyLight 350, DyLight 405, DyLight 550, DyLightAleFlaze 633, DyLightAlZ Fluor 488, Fluoro 532, Fluoro 543, Fluoro 546, Fluoro 555, Fluoro 568, Fluoro 594, Fluoro 594, Fluoro 647, Fluoro 647, Fluoro, Fluoro A polyellene glycol group may be added thereto.
  • the immunoglobulin is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include IgG, IgM, IgA, IgD and IgE.
  • the upper limit of the weight average molecular weight of the ligand compound is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but is preferably 500,000 or less, more preferably 300,000 or less, and more preferably 200,000 or less. More preferably, 100,000 or less is particularly preferable.
  • the lower limit of the weight average molecular weight of the ligand compound is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but is preferably 200 or more.
  • ligand compound examples are not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • 2-Azidoethyl 2-acetamido-2-deoxy- ⁇ -D-galactopyranose, 2-Azidoethyl ⁇ -D. -Glucopylanoside and the like can be mentioned.
  • the functional group (C) that can be bonded to the functional group (B) is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • an alkynyl group is preferable, an azido group is preferable when the functional group (B) is an alkynyl group, a tetrazine group or an alkenyl group is preferable when the functional group (B) is an alkenyl group, and the functional group (B).
  • the functional group (B) When is a carbonyl group, a hydrazine group or a hydroxylamine group is preferable, when the functional group (B) is a phosphine group, an azido group is preferable, and when the functional group (B) is a tetrazine group, an alkenyl group is preferable.
  • the functional group (B) is a hydrazine group, a carbonyl group is preferable, and when the functional group (B) is a hydroxylamine group, a carbonyl group is preferable.
  • the functional group (C) may be one or more per molecule of the ligand compound.
  • the plurality of cases are not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include an azide group and an alkynyl group.
  • the bond of the functional group (C) to the functional group (B) is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • the functional group (A) to the functional group in the vector examples thereof include a method of mixing and reacting a solution containing the reactant obtained by binding and the ligand compound, a method of mixing and reacting a solution containing the linker compound and the ligand compound, and the like.
  • the solvent of the solution may be an aqueous solvent or an organic solvent, or a mixed solvent of an aqueous solvent and an organic solvent.
  • the aqueous solvent is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include HEPES buffer, phosphoric acid buffer and distilled water.
  • the pH of the HEPES buffer or the phosphate buffer is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. However, pH 1 or more and pH 12 or less are preferable, pH 2 or more and pH 12 or less are more preferable, and pH 3 or more and pH 11 or less are preferable. More preferably, pH 4 or more and pH 10 or less are particularly preferable.
  • the organic solvent is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but is preferably compatible with water.
  • nitrile solvents such as acetonitrile
  • alcoholic solvents such as methanol, ethanol and propanol
  • ether solvents such as tetrahydrofuran and 1,4 dioxane
  • sulfur solvents such as dimethyl sulfoxide
  • amide solvents such as dimethyl formamide.
  • the mixing ratio of the aqueous solvent and the organic solvent is not particularly limited, and any insoluble component may not be significantly generated.
  • the final concentration of the ligand compound is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but is preferably 0.01 mM or more and 100 mM or less, more preferably 0.1 mM or more and 80 mM or less, and 0.2 mM or more and 50 mM. The following is more preferable.
  • the temperature of the reaction is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but is preferably 0 ° C. or higher and 70 ° C. or lower, and more preferably 40 ° C. or lower.
  • the reaction time is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but is preferably 5 minutes or more and 120 hours or less, more preferably 30 minutes or more and 96 hours or less, and 1 hour or more and 72 hours or less. More preferred.
  • the other steps are not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include a vector preparation step, a vector purification step, a reduction step, and a modification vector purification step.
  • the process for preparing the vector is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • a gene encoding the vector is transfected into cultured cells and the like from a cytolysate or a cell supernatant. Examples include a method of preparing a vector.
  • the process for purifying the vector is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • a method for purifying using a commercially available kit cell lysate for cation chromatography, and anion chromatography.
  • Size exclusion chromatography filters, methods of purification using ultrafiltration membranes, and the like.
  • the reducing step is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. For example, after the step of binding the functional group (A) in the linker compound to the functional group in the vector, or After the step of adding a reducing agent such as DTT (dithiothreitol) to the reaction solution after the step of binding the functional group (C) of the Gand compound to the functional group (B), or after the purification step. Examples thereof include a step of adding a reducing agent such as DTT to the modified vector.
  • a reducing agent such as DTT
  • the purification step of the modified vector is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • the method for modifying the vector is a method of modifying the functional group (A) in a linker compound having a functional group (A) capable of binding to the functional group and a functional group (B) capable of binding to the ligand compound as the functional group in the vector.
  • the first step, the second step, and other steps in the method for modifying the vector are as described in the method for producing the modified vector.
  • ⁇ Reference example 1 Preparation of AAV2> PAAV2 and pRC-mi342 obtained by modifying HEK293T cells (ATCC) with a medium solution of PEI (Polysciences) and pAAV2 (CELL BioLABs, Inc) of the fluorescent protein GFP so as to express VENUS (GenBank: ACQ43955.1).
  • AAV2 was produced by transfecting a medium solution of (Takarabio) and pHelper (Takarabio) and culturing at 37 ° C. under 5% CO 2 for 4 days. After adding EDTA (Etylendiaminetetraacetic acid) and exfoliating the cells, the cells were centrifuged and the cell pellet and the centrifugal supernatant were collected.
  • EDTA Etylendiaminetetraacetic acid
  • ⁇ Reference example 2 Purification of AAV2> A vector was purified from the cell pellet obtained in Reference Example 1 using AAVpro® Purification Kit (AAV2) (TaKaRa 6232). The obtained purified AAV2 was titrated using RT-PCR (Quant Studio, SYBR Green method) and found to be 4 ⁇ 10 9 vg / ⁇ L.
  • the cell pellet obtained in Reference Example 1 was treated with Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline containing 0.1 v / v% Triton X-100, a 1 M MgCl 2 aqueous solution, and an endonuclease. After stopping the reaction with EDTA, the supernatant was collected by centrifugation. The obtained supernatant was mixed and purified by cation chromatography (Thermo, POROS 50HS) and anion chromatography (Thermo, POROS 50HQ), and concentrated to obtain AAV2.
  • Example 1 Modification of AAV2>
  • the AAV2 solution obtained in Reference Example 2 was used.
  • reaction reagents 1A, 1B, 1C, 1D, 1E, 1F, 1G Using the HEPES buffer prepared by the above method, 0.125 mM DIBENZ [b, f] azocine-5 (6H) -hexanoic acid, 11,12-didehydro- ⁇ -oxo-, 2,5-dioxo-3.
  • Reaction reagent 1A which is a solution of -sulfo-1-pyrrolidinyl ester and sodium salt (Aldrich chemistry), was prepared.
  • reaction reagent 1B is 0.063 mM
  • reaction reagent 1C is 0.032 mM
  • reaction reagent 1D is 0.016 mM
  • reaction reagent 1E is 0.008 mM
  • reaction reagent 1F is 0. .004 mM
  • 0.002 mM DIBENZ [b, f] azocine-5 (6H) -hexanoic acid, 11,12-didehydro- ⁇ -oxo-, 2,5-dioxo-3-sulfo-1 which is a reaction reagent 1G -A pyrrolidinyl ester, sodium salt solution was prepared.
  • reaction reagent 2A which is a 16 mM 2-Azidoethyl 2-acetamido-2-deoxy- ⁇ -D-galactopyranoside (Sigma-Aldrich) solution was prepared. Further, the reaction reagent 2B is diluted 4 times, and the reaction reagent 2B is 4 mM, the reaction reagent 2C is 1 mM, and the reaction reagent 2D is 0.25 mM. Prepared.
  • (First step) 9 ⁇ L of the reaction reagents 1A, 1B, 1C, 1D, 1E, 1F and 1G prepared by the above method and 1 ⁇ L of the purified AAV2 solution were mixed and reacted in an incubator at 37 ° C. for 16 hours. Further, 2 ⁇ L of the 2M glycine solution (Wako) prepared in the above buffer is added and reacted in an incubator at 37 ° C. for 5 hours to generate the first step product 1A, the first step product 1B, and the first step product. A product 1C, a first step product 1D, a first step product 1E, a first step product 1F, and a first step product 1G were obtained.
  • lane 1 is a sample of the first step product 1A
  • lane 2 is a sample of the first step product 1B
  • lane 3 is a sample of the first step product 1C
  • lane 4 is a sample of the first step product 1D.
  • Lane 5 is a sample of the first step product 1E
  • lane 6 is a sample of the first step product 1F
  • lane 7 is a sample of the first step product 1G
  • lane 8 is a sample of unmodified AAV2
  • lane 9 is a sample of unmodified AAV2. It is a marker.
  • lane 1 is a sample of modified vector 2A
  • lane 2 is a sample of modified vector 2B
  • lane 3 is a sample of modified vector 2C
  • lane 4 is a sample of modified vector 2D
  • lane 5 is a buffer instead of reaction reagent 2.
  • the sample used, lane 6 is unmodified AAV2, and lane 7 is a marker.
  • Example 2 Modification of AAV2>
  • the purified AAV2 solution obtained in Reference Example 2 was used.
  • reaction reagent 1H 2 mM DIBENZ [b, f] azocine-5 (6H) -hexanoic acid, 11,12-didehydro- ⁇ -oxo-, 2,5-dioxo-3-sulfo using the phosphate buffer prepared by the above method.
  • a -1-pyrrolidinyl ester, sodium salt (Aldrich) solution (reaction reagent 1H) was prepared.
  • reaction reagent 3 Using the phosphate buffer prepared by the above method, a 16 mM 2-Azidoethyl ⁇ -D-Glucopylanoside (TCI) solution (reaction reagent 3) was prepared.
  • TCI 2-Azidoethyl ⁇ -D-Glucopylanoside
  • the modified vector 3A was obtained by reacting the reaction reagent 3 in the same manner as in Example 1. SDS-PAGE (ATTO E-R7.5L) was performed, and the progress of the reaction was confirmed by silver staining (Invitrogen). The results of silver staining are shown in FIG. It was found that the band of VP3 before the reaction was about 60 kDa and after the reaction was about 62 kDa, and the compound was added by 2 kDa.
  • Lane 1 of FIG. 3 is a sample of the first step product 1H of Example 2 (reaction reagent 1H), lane 2 is a sample of the modified vector 3A of Example 2 (reaction reagent 1H), and lane 5 is an unmodified AAV2.
  • the sample, lane 6, is a marker.
  • reaction reagent 4 Using the phosphate buffer prepared by the above method, 2 mM 4,7,10,13,16-Pentaoxa-20-azatricosanoic acid, 23- (11,12-didehydrodibenz [b, f] azocin-5 (6H)) -Yl) -19,23-dioxo-, 2,5-dioxo-1-pyrrolidinyl ester (BROADPHARM) solution (reaction reagent 4) was prepared.
  • the modified vector 3B was obtained by reacting the reaction reagent 3 in the same manner as in Example 1. SDS-PAGE (ATTO E-R7.5L) was performed, and the progress of the reaction was confirmed by silver staining (Invitrogen). The results of silver staining are shown in FIG. It was found that the band of VP3 before the reaction was about 64 kDa and after the reaction was about 68 kDa, and the compound was added by 4 kDa.
  • Lane 3 of FIG. 3 is a sample of the first step product 4 of Example 3 (reaction reagent 4), lane 4 is a sample of the modified vector 3B of Example 3 (reaction reagent 4), and lane 5 is an unmodified AAV2.
  • the sample, lane 6, is a marker.
  • Example 4 Modification of AAV2>
  • the AAV2 solution (6.6 ⁇ 10 9 vg / ⁇ L, 500 ⁇ L) obtained in Reference Example 3 was used.
  • reaction reagents 1I and 1J Preparation of reaction reagents 1I and 1J
  • a -1-pyrrolidinyl ester, sodium salt (Aldrich chemistry) solution was prepared and used as 1I. Further 1I was diluted to prepare 0.5 mM solution 1J.
  • reaction reagent 2E Preparation of reaction reagent 2E
  • a 2 mM 2-Azidoethyl 2-acetamido-2-deoxy- ⁇ -D-galactopyranoside (Sigma-Aldrich) solution was prepared and used as 2E.
  • Lanes 1 and 8 of FIG. 4 are unmodified AAV2
  • lane 2 is a sample of the first step product 1A of Example 4 (reaction reagent 1A: 0.125 mM)
  • lane 4 is Example 4 (reaction reagent 1J0. 5 mM) first step product 1J sample
  • lane 6 is a sample of first step product 1I of Example 4 (reaction reagent 1I: 1 mM)
  • lane 9 is a marker.
  • the first step product 1I, the first step product 1J, and the first step product 1A obtained by the reaction with the reaction reagents 1I, 1J, and 1A in Example 4 were subjected to cation exchange column chromatography (carrier: POROS 50HS). , Eluent: 20 mM phosphate buffer (pH 7.4), reagent condition: 100-370 mM NaCl aqueous solution). The results are shown in FIG. As a result of titration measurement using RT-PCR (Quant Studio, SYBR Green method) after purification, the first step product 1I was 5.8 ⁇ 10 11 vg / ⁇ L, and the first step product 1J was 1.8 ⁇ 10. 12 vg / ⁇ L, the first step product 1A was 1.2 ⁇ 10 12 vg / ⁇ L.
  • FIG. 5 shows unmodified AAV2
  • 2 is a sample of the first step product 1A of Example 4 (reaction reagent 1A: 0.125 mM)
  • 3 is a sample of Example 4 (reaction reagent 1J: 0.5 mM).
  • Sample of 1-step product 1J, 4 is a sample of 1-step product 1I of Example 4 (reaction reagent 1I: 1 mM)
  • the vertical axis of FIG. 5 shows the absorbance at 280 nm
  • the horizontal axis shows the elution volume.
  • Lanes 1 and 8 of FIG. 4 are unmodified AAV2, lane 3 is a sample of modified vector 2G of Example 4 (reaction reagent 1A: 0.125 mM and reaction reagent 2D: 0.25 mM), and lane 5 is Example 4.
  • Sample of modified vector 2F of (reaction reagent 1J: 0.5 mM and reaction reagent 2C: 1 mM)
  • lane 7 is a sample of modified vector 2E of Example 4 (reaction reagent 1I: 1 mM and reaction reagent 2E: 2 mM)
  • FIG. 6 shows unmodified AAV2
  • 2 is a sample of modified vector 2G of Example 4 (reaction reagent 1A: 0.125 mM and reaction reagent 2D: 0.25 mM)
  • 3 is Example 4 (reaction reagent 1J: 0).
  • It is a sample of the modified vector 2F of .5 mM and reaction reagent 2C: 1 mM)
  • the vertical axis of FIG. 6 shows the absorbance at 280 nm
  • the horizontal axis shows the elution volume.
  • Examples of aspects of the present invention include the following. ⁇ 1>
  • the functional group (A) in the linker compound having a functional group (A) capable of binding to the functional group and a functional group (B) capable of binding to the ligand compound is bonded to the functional group in the vector.
  • It is a method for producing a modification vector which comprises.
  • ⁇ 2> The production method according to ⁇ 1>, wherein the functional group in the vector is any one of an amino group, a guanidine group, a hydroxyl group, a carboxyl group, and an indole group.
  • ⁇ 3> Any of the above ⁇ 1> to ⁇ 2>, wherein the functional group in the vector is a functional group in a lysine residue, an arginine residue, a tyrosine residue, a serine residue, a threonine residue, and a tryptophan residue. It is a manufacturing method described in. ⁇ 4> The production method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>, wherein the functional group (A) is a succinimidyl group.
  • the functional group (B) is any one of an azido group, an alkynyl group, an alkenyl group, a carbonyl group, a phosphine group, a tetrazine group, a hydrazine group, and a hydroxylamine group, from ⁇ 1> to ⁇ 4>.
  • the production method according to any one of. ⁇ 6> The production method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 5>, wherein the weight average molecular weight of the ligand compound is 100,000 or less.
  • ⁇ 7> The production method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 6>, wherein the ligand compound is a sugar compound.
  • ⁇ 8> The production method according to ⁇ 7>, wherein the sugar compound has a polyethylene glycol group.
  • ⁇ 9> The production method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 6>, wherein the ligand compound is a peptide.
  • the linker compound has a polyethylene glycol group.
  • ⁇ 11> The production method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 10>, wherein the vector is an adeno-associated virus vector.
  • ⁇ 12> The production method according to ⁇ 11>, wherein the functional group in the vector is a functional group constituting the capsid of the adeno-associated virus vector.
  • the functional group in the vector is an amino group
  • the functional group (A) is a succinimidyl group
  • the functional group (B) or (C) is an azide group and / or an alkynyl group
  • the ligand compound is a sugar compound and / or a peptide.
  • the functional group in the vector is a functional group at a lysine residue
  • the functional group (B) or (C) is an azide group and / or an alkynyl group
  • the ligand compound is a sugar compound and / or a peptide.
  • the functional group (A) in the linker compound having a functional group (A) capable of binding to the functional group and a functional group (B) capable of binding to the ligand compound is bonded to the functional group in the vector. It is characterized by including a step of binding the functional group (C) to the functional group (B) in a ligand compound having a functional group (C) capable of binding to the functional group (B). This is a vector modification method.

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Abstract

ベクターにおける官能基に、前記官能基と結合可能な官能基（Ａ）と、リガンド化合物と結合可能な官能基（Ｂ）と、を有するリンカー化合物における、前記官能基（Ａ）を結合させる工程と、前記官能基（Ｂ）に、前記官能基（Ｂ）と結合可能な官能基（Ｃ）を有するリガンド化合物における、前記官能基（Ｃ）を結合させる工程と、 を含むことを特徴とする、修飾ベクターの作製方法、及びベクターの修飾方法である。

Description

修飾ベクターの作製方法、及びベクターの修飾方法
　本発明は、修飾ベクターの作製方法、及びベクターの修飾方法に関する。
　遺伝子治療には、ベクターが広く使われているが、ベクターの標的組織への移行性が十分ではないことなどが課題である。
　この課題を解決する方法として、ベクターを構成するタンパク質の改変などが行われているが、薬効を示すための十分な効果が得られていない。
　そこで、近年、ベクターを化学修飾し、ベクターに機能を高めるためのリガンドを導入する方法が開発されてきた（非特許文献１など）。
　しかしながら、この方法では、ベクター上の官能基と結合させる部位と機能を高めるためのリガンドとが一体型の試薬が使用されているため、入手できる試薬には制限があり、有効な方法とは言い難い。
　また他の方法として、２ステップで化学修飾する方法が報告されている（特許文献１など）。
　しかしながら、この方法は、システイン残基を利用する方法であり、化学修飾前に還元処理でシステイン残基を遊離させる必要があるため、簡便な方法とは言い難い。またこの還元処理によって、ベクターが分解している可能性がある。
　更に他の方法としては、ベクターを改変してシステイン残基を変異導入した後に化学修飾する方法が報告されているが（非特許文献２など）、変異導入の手間がかかるため、簡便な方法とは言い難い。
　したがって、ベクターを改変や前処理することなく、様々なリガンドを簡便に導入することができる、修飾ベクターの作製方法、及びベクターの修飾方法は全く知られておらず、これらの提供が強く求められている。
欧州特許出願公開第３４６１８３６号
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　Ｂｉｏｅｎｇ．　２００５　９２：２４－３４ ｓｍａｌｌ　２０１３　９　３：４２１－４２９
　本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、ベクターを改変や前処理することなく、様々なリガンドを簡便に導入することができる、修飾ベクターの作製方法、及びベクターの修飾方法を提供することを目的とする。
　本発明者らが、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ベクターにおける官能基に、前記官能基と結合可能な官能基（Ａ）と、リガンド化合物と結合可能な官能基（Ｂ）と、を有するリンカー化合物における、前記官能基（Ａ）を結合させる工程と、前記官能基（Ｂ）に、前記官能基（Ｂ）と結合可能な官能基（Ｃ）を有するリガンド化合物における、前記官能基（Ｃ）を結合させる工程と、を含む方法により、ベクターを改変や前処理することなく、様々なリガンドを簡便に導入することができる、修飾ベクターの作製方法、及びベクターの修飾方法が提供できることを知見した。
　本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては以下の通りである。即ち、
　＜１＞　ベクターにおける官能基に、前記官能基と結合可能な官能基（Ａ）と、リガンド化合物と結合可能な官能基（Ｂ）と、を有するリンカー化合物における、前記官能基（Ａ）を結合させる工程と、前記官能基（Ｂ）に、前記官能基（Ｂ）と結合可能な官能基（Ｃ）を有するリガンド化合物における、前記官能基（Ｃ）を結合させる工程と、を含むことを特徴とする、修飾ベクターの作製方法である。
　＜２＞　ベクターにおける官能基に、前記官能基と結合可能な官能基（Ａ）と、リガンド化合物と結合可能な官能基（Ｂ）と、を有するリンカー化合物における、前記官能基（Ａ）を結合させる工程と、前記官能基（Ｂ）に、前記官能基（Ｂ）と結合可能な官能基（Ｃ）を有するリガンド化合物における、前記官能基（Ｃ）を結合させる工程と、を含むことを特徴とする、ベクターの修飾方法である。
　本発明によると、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、ベクターを改変や前処理することなく、様々なリガンドを簡便に導入することができる、修飾ベクターの作製方法、及びベクターの修飾方法を提供することができる。
図１は、実施例１における第１の工程の後のＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す図である。 図２は、実施例１における第２の工程の後のＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す図である。 図３は、実施例２及び実施例３における第１の工程の後と第２の工程の後のＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す図である。 図４は、実施例４における第１の工程の後と第２の工程の後のＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す図である。 図５は、実施例４における第１の工程の後の陽イオン交換クロマトグラフィーの精製チャートを示す図である。 図６は、実施例４における第２の工程の後の陽イオン交換クロマトグラフィーの精製チャートを示す図である。
　（修飾ベクターの作製方法）
　前記修飾ベクターの作製方法は、ベクターにおける官能基に、前記官能基と結合可能な官能基（Ａ）と、リガンド化合物と結合可能な官能基（Ｂ）と、を有するリンカー化合物における、前記官能基（Ａ）を結合させる第１の工程と、前記官能基（Ｂ）に、前記官能基（Ｂ）と結合可能な官能基（Ｃ）を有するリガンド化合物における、前記官能基（Ｃ）を結合させる第２の工程と、を含み、さらにその他の工程を有することができる。
　前記第１の工程と、前記第２の工程を行う順番としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、リンカー化合物に結合可能な多様なリガンドを簡便にベクターに導入することができ、リガンドの選択肢が広がる点から、前記第１の工程の後に、前記第２の工程を行うことが好ましい。
　＜第１の工程＞
　前記第１の工程は、ベクターにおける官能基に、前記官能基と結合可能な官能基（Ａ）と、リガンド化合物と結合可能な官能基（Ｂ）と、を有するリンカー化合物における、前記官能基（Ａ）を結合させる工程である。
　－ベクター－
　前記ベクターとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ウイルスベクター、プラスミドベクター、人工染色体ベクター、コスミドベクター、フォスミドベクターなどが挙げられる。
　これらの中でも、遺伝子治療に広く使用されている点で、ウイルスベクターが好ましい。
　前記ウイルスベクターとして用いられるウイルスとしては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、パピローマウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルスなどが挙げられる。
　これらの中でも、病原性が低い点で、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）が好ましい。
　前記ウイルスベクターとして用いられるＡＡＶの血清型としてはＡＡＶ１（１型ＡＡＶ）、ＡＡＶ２（２型ＡＡＶ）、ＡＡＶ３（３型ＡＡＶ）、ＡＡＶ４（４型ＡＡＶ）、ＡＡＶ５（５型ＡＡＶ）、ＡＡＶ６（６型ＡＡＶ）、ＡＡＶ７（７型ＡＡＶ）、ＡＡＶ８（８型ＡＡＶ）、ＡＡＶ９（９型ＡＡＶ）、ＡＡＶ１０（１０型ＡＡＶ）、ＡＡＶ１１（１１型ＡＡＶ）、ＡＡＶ１２（１２型ＡＡＶ）、ＡＡＶ１３（１３型ＡＡＶ）、ＡＡＶ１４（１４型ＡＡＶ）、及びこれらの改変体などが挙げられるが、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
　前記改変体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、標的細胞の組織特異性（感染する細胞の指向性）向上などのため、遺伝子組み換えにより（野生型ＡＡＶを）改変させたＡＡＶなどが挙げられる。
－－ベクターにおける官能基－－
　前記ベクターにおける官能基としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アミノ基、グアニジノ基、水酸基、カルボキシル基、及びインドール基などが挙げられる。これらの中でも、アミノ基が好ましい。
　前記ベクターにおける官能基は、リジン残基、アルギニン残基、チロシン残基、セリン残基、スレオニン残基、トリプトファン残基における官能基であってもよく、これらの中でも、リジン残基における官能基が好ましい。
　前記ベクターが、前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である場合は、前記ベクターにおける官能基が、前記アデノ随伴ウイルスのカプシドを構成する官能基であることが好ましい。
　前記カプシドは、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３などから構成される。
　－リンカー化合物－
　前記リンカー化合物は、前記ベクターにおける官能基と結合可能な官能基（Ａ）と、リガンド化合物と結合可能な官能基（Ｂ）と、を有し、さらに連結部（Ｄ）を有することができる。
　－－ベクターにおける官能基と結合可能な官能基（Ａ）－－
　前記ベクターにおける官能基と結合可能な官能基（Ａ）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、スクシンイミジル基、イソシアネート基、アミノメトキシエチル基、シクロヘキセンスルホンアミド基、カルボニル基、アルデヒド基、不飽和カルボニル基、ジアゾニウムテレフタレート、ハロゲン原子、マレイミジル基、フタルイミジル基、ジアゾベンゼン基、不飽和ニトリル基、アレニル基、脱離基、などが挙げられる。
　前記脱離基としては、ＯＳＯ２Ｒ’若しくはＯＰ（Ｏ）（ＯＲ’）２（Ｒ’は炭素数１～６のアルキル基；炭素数４～１０のアリール基を表し、ここでの炭素数１～６のアルキル基としては直鎖状又は分岐状のアルキル基、中でもメチル基；エチル基；（ｎ－，ｉ－）プロピル基；（ｎ－，ｉ－，ｔ－）ブチル基が好適な例として挙げられ、また炭素数４～１０のアリール基とは、例えばフェニル基；（２－，３－，４－）トリル基；（１－，２－）ナフチル基；２－ピロリル基；２－フリル基；３－チエニル基；２－ピリジル基の５若しくは６員の単環若しくは縮合環からなる芳香族炭化水素基若しくは複素環基をいい、例えばメタンスルホニル基、トルエンスルホニル基、が挙げられる。
　これらの中でも、反応性の点で、スクシンイミジル基が好ましい。
　前記官能基（Ａ）は、前記リンカー化合物１分子あたり、１つであってもよく、複数であってもよい。
　－－リガンド化合物と結合可能な官能基（Ｂ）－－
　前記リガンド化合物と結合可能な官能基（Ｂ）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アジド基、アルキニル基、アルケニル基、カルボニル基、ホスフィン基、テトラジン基、ヒドラジン基、及びヒドロキシルアミン基などが挙げられる。
　これらの中でも、反応性の点で、アルキニル基、又はアジド基が好ましく、アルキニル基がより好ましい。
　前記官能基（Ｂ）は、前記リンカー化合物１分子あたり、１つであってもよく、複数であってもよい。複数の場合は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、アジド基及びアルキニル基などが挙げられる。
　－－連結部（Ｄ）－－
　前記連結部（Ｄ）は、前記官能基（Ａ）と前記官能基（Ｂ）とを連結することができ、前記官能基（Ａ）、前記官能基（Ｂ）、及び前記リガンド化合物と反応しない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
　前記連結部（Ｄ）は、直鎖構造であってもよいし、分岐構造であってもよいが、前記直鎖構造が好ましい。
　前記連結部（Ｄ）は、親水性であってもよいし、疎水性であってもよいし、両親媒性であってもよいが、前記親水性が好ましい。
　前記連結部（Ｄ）の長さは、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記連結部（Ｄ）を構成する炭素原子の数などによって調節することができる。
　前記連結部（Ｄ）の化学構造としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アルキレン基を有する構造、カルボニル基を有する構造、エーテル結合を有する構造、カルボン酸エステル結合を有する構造、これらの組合せなどが挙げられる。
　前記エーテル結合を有する構造は、鎖状（例えばエチレングリコールなどの直鎖、例えばプロピレングリコールなどの分岐鎖）であってもよいし、環状（テトラヒドロピラン、テトラヒドロフラン、１，４－ジオキサンなどを含む構造）あってもよい。
　前記連結部（Ｄ）の具体例としては、アルキレン基、アルキレンオキシ基、ポリ（アルキレンオキシ）基、などが挙げられる。
　前記アルキレン基としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、炭素数１～２０のアルキレン基が好ましく、炭素数１～１０のアルキレン基がより好ましく、炭素数１～４のアルキレン基がさらに好ましい。
　前記アルキレンオキシ基としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、炭素数１～１００のアルキレンオキシ基が好ましく、炭素数４～１００のアルキレンオキシ基がより好ましく、炭素数５～５０のアルキレンオキシ基がさらに好ましい。
　前記ポリ（アルキレンオキシ）基としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、炭素数１～１００のポリ（アルキレンオキシ）基が好ましく、炭素数５～５０のポリ（アルキレンオキシ）基がより好ましく、炭素数６～４０のポリ（アルキレンオキシ）基がさらに好ましい。
　前記ポリ（アルキレンオキシ）基におけるアルキレンオキサイド単位としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、エチレンオキサイド、プロピレンオキサイドが好ましく、エチレンオキサイドがより好ましい。
　前記リンカー化合物の具体例としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＤＩＢＥＮＺ［ｂ，ｆ］ａｚｏｃｉｎｅ－５（６Ｈ）－ｈｅｘａｎｏｉｃ　ａｃｉｄ，　１１，１２－ｄｉｄｅｈｙｄｒｏ－ε－ｏｘｏ－，２，５－ｄｉｏｘｏ－３－ｓｕｌｆｏ－１－ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｙｌ　ｅｓｔｅｒ，　ｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ、４，７，１０，１３，１６－Ｐｅｎｔａｏｘａ－２０－ａｚａｔｒｉｃｏｓａｎｏｉｃ　ａｃｉｄ，　２３－（１１，１２－ｄｉｄｅｈｙｄｒｏｄｉｂｅｎｚ［ｂ，ｆ］ａｚｏｃｉｎ－５（６Ｈ）－ｙｌ）－１９，２３－ｄｉｏｘｏ－，２，５－ｄｉｏｘｏ－１－ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｙｌ　ｅｓｔｅｒなどが挙げられる。
　－ベクターにおける官能基への前記官能基（Ａ）の結合－
　前記ベクターにおける官能基への前記官能基（Ａ）の結合としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記リンカー化合物と前記ベクターとを含む溶液を混合し反応させる方法、前記リガンド化合物が結合した前記リンカー化合物と前記ベクターとを含む溶液を混合し反応させる方法などが挙げられる。これらの方法の後、グリシン溶液を加えて、さらに反応させる方法であってもよい。
　前記溶液の溶媒としては、水系溶媒でも有機溶媒でもよく、水系溶媒と有機溶媒との混合溶媒でもよい。
　前記水系溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＨＥＰＥＳ（４－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）バッファー、リン酸バッファー、蒸留水などが挙げられる。
　前記ＨＥＰＥＳバッファー、又はリン酸バッファーのｐＨとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ｐＨ４以上ｐＨ１２以下が好ましく、ｐＨ５以上ｐＨ１１以下がより好ましく、ｐＨ６以上ｐＨ１０以下がさらに好ましく、ｐＨ７以上ｐＨ９以下が特に好ましい。
　前記有機溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、水と相溶性であることが好ましい。例えば、アセトニトリル等のニトリル系溶媒、メタノール、エタノール、プロパノール等のアルコール性溶媒、テトラヒドロフラン、１，４－ジオキサン等のエーテル系溶媒、ジメチルスルホキシド等の硫黄系溶媒、ジメチルホルムアミド等のアミド系溶媒を挙げることができる。
　前記水系溶媒と前記有機溶媒の混合比としては、特に制限はなく、不溶性の成分が顕著に生じなければ良い。
　前記リンカー化合物の終濃度（グリシン溶液添加前）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．１μＭ以上２００ｍＭ以下が好ましく、０．５μＭ以上１００ｍＭ以下がより好ましく、５μＭ以上８０ｍＭ以下がさらに好ましく、１０μＭ以上５０ｍＭ以下が特に好ましい。
　前記ベクターの力価としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１×１０４ｖｇ／μＬ以上１×１０１００ｖｇ／μＬ以下が好ましく、１×１０５ｖｇ／μＬ以上５×１０８０ｖｇ／μＬ以下がより好ましく、１×１０６ｖｇ／μＬ以上１×１０５０ｖｇ／μＬ以下がさらに好ましい。
　前記グリシン溶液の濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．１μＭＭ以上２０Ｍ以下が好ましく、０．５μＭ以上１０Ｍ以下がより好ましく、５μＭ以上５Ｍ以下がさらに好ましく、１０μＭ以上４Ｍ以下が特に好ましい。
　前記反応の温度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０℃以上７０℃以下が好ましく、４０℃以下がより好ましい。
　前記グリシン溶液添加前の反応の時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５分間以上１２０時間以下が好ましく、３０分間以上９６時間以下がより好ましく、１時間以上７２時間以下がさらに好ましい。
　前記グリシン溶液添加後の反応の時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５分間以上１２０時間以下が好ましく、３０分間以上９６時間以下がより好ましく、１時間以上７２時間以下がさらに好ましい。
　＜第２の工程＞
　前記第２の工程は、前記官能基（Ｂ）に、前記官能基（Ｂ）と結合可能な官能基（Ｃ）を有するリガンド化合物における、前記官能基（Ｃ）を結合させる工程である。
　－リガンド化合物－
　前記リガンド化合物は、前記官能基（Ｂ）と結合可能な官能基（Ｃ）と、リガンド部を有し、さらに連結部（Ｅ）を有することができる。
　前記連結部（Ｅ）は、前記官能基（Ｃ）と前記リガンド部とを連結することができ、前記リンカー化合物、及び前記官能基（Ｃ）、リガンド部と反応しない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
　前記連結部（Ｅ）の構造、及び具体例は、前述のリンカー化合物における連結部（Ｄ）と同様である。
　前記リガンド化合物におけるリガンド部とは、生物における組織や細胞やタンパク質等と親和性等を有する、あるいは親和性を利用してラベル化する物質であり、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
　前記ラベル化とは、ベクターに膜透過性・標的細胞特異性などの機能を付加することであり、前記機能を付加するとは、修飾することを意味する。広義の意味ではリンカーの導入もその他の機能物質を導入しやすくなる足場機能を付加している点で修飾しているといえる。
　前記リガンド部としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、糖化合物、ペプチド、低分子化合物、免疫グロブリンなどが挙げられる。
　これらは、前記リガンド化合物１分子あたり、１つであってもよく、複数であってもよい。複数の場合は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、糖化合物及びペプチドなどが挙げられる。
　前記糖化合物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、単糖類、オリゴ糖類、多糖類を挙げることができ、ここで言う単糖は不斉炭素が鏡像異性体であってもよく、オリゴ糖類とは２～６分子の単糖からなり、多糖類とは単糖が直鎖又は枝分かれで繋がったポリマーであり、入手性から単糖類、二糖類、三糖類が好ましい。また、前記糖化合物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アロース、アラビノース、エリスロース、フルクトース、フコース、ガラクトース、ガラクトサミン、グルコース、グルコサミン、グロース、グルクロン酸、イドース、イノシトール、リキソース、マンノース、マンノサミン、プシコース、ラムノース、リボース、シアル酸、ソルボース、タガトース、タロース、キシロース、ジサッカロイド、トリサッカロイド、テトラサッカロイド、オリゴサッカロイド、シクロデキストリン、２－Ａｚｉｄｏｅｔｈｙｌ　２－ａｃｅｔａｍｉｄｏ－２－ｄｅｏｘｙ－β－Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ、２－Ａｚｉｄｏｅｔｈｙｌ　β－Ｄ－Ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ、非天然型糖などが挙げられ、さらに、これらにポリエチレングリコール基や保護基が付加されたものであってもよい。
　前記保護基とは、糖化合物に含まれる水酸基やアミノ基を保護する置換基であり、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水酸基の保護基としてはアシル基やカーボネート基やカルバメート基や環状のアセタール基やエーテル基などを挙げることができる。前記アシル基としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アセチル基、フェニルアセチル基、ハロゲン化アセチル基、メトキシアセチル基、フェノキシアセチル基、ピバロイル基、ベンゾイル基などを挙げることができる。前記カーボネート基としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ｔ－ブチルカーボネート基、ベンジルカーボネート基などを挙げることができる。前記カルバメート基としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、フェニルカルバメート基などを挙げることができる。前記環状のアセタール基としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、メチレンアセタール基、エチリデンアセタール基、アセトナイド基、ベンジリデンアセタール基などが挙げられる。前記エーテル基としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ベンジルエーテル基などを挙げることができる。
　例えば、アミノ基の保護基としてはアシル基やカルバメート基などを挙げることができる。前記アシル基としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アセチル基、フェニルアセチル基、ハロゲン化アセチル基、メトキシアセチル基、フェノキシアセチル基、ピバロイル基、ベンゾイル基などを挙げることができる。前記カルバメート基としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、９－フルオレニルメチルカルバメート基、フェニルカルバメート基、ｔ－ブチルカルバメート基などを挙げることができる。
　これらの保護基の中で、アセチル基が低毒性や入手性から好ましい。
　前記ペプチド化合物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＬＲＶＲＬＡＳＨＬＲＫＬＲＫＲＬＬＲＤＡＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫ（配列番号１）、ＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＬＲＶＲＬＡＳＨＬＲＫＬＲＫＲＬＬＲＤＡ（配列番号２）、ＬＲＶＲＬＡＳＨＬＲＫＬＲＫＲＬＬＲＤＡ（配列番号３）、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号４）、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫ（配列番号５）、ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号６）、ＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号７）、ＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号８）、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号９）、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号１０）、ＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号１１）、ＬＬＩＩＬＲＲＲＩＲＫＱＡＨＡＨＳＫ（配列番号１２）、ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＡ（配列番号１３）、ＬＬＩＩＬＲＲＲＩＲＫＱＡＨＡＨＳＫ（配列番号１４）、ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号１５）などが挙げられ、環状の構造を有していてもよく、さらに、各アミノ酸がＤ体でもよく、非天然アミノ酸に置換及び／又は非天然アミノ酸が挿入されていても良く、塩を含んでいても良く、これらにポリエレングリコール基が付加されたものであってもよい。
　前記低分子化合物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、生体内で薬効を示す物質で有ればよく、例えば、パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）や低分子化抗体などを挙げることができる。生体内で物質との親和性を評価するための物質であっても良く、例えば、ビオチンや色素を挙げることができる。さらに、これらにポリエレングリコール基が付加されたものであってもよい。
　前記色素としては、特に制限はなく、例えば、フルオレセイン、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ　５５５、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ６４７、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ７５０、ＤｙＬｉｇｈｔ　３５０、ＤｙＬｉｇｈｔ　４０５、ＤｙＬｉｇｈｔ　５５０、ＤｙＬｉｇｈｔ　６３３、ＤｙＬｉｇｈｔ　７５５、Ａｌｅｚａ　Ｆｌｕｏｒ　３５０、Ａｌｅｚａ　Ｆｌｕｏｒ　４０５、Ａｌｅｚａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８、Ａｌｅｚａ　Ｆｌｕｏｒ　５３２、Ａｌｅｚａ　Ｆｌｕｏｒ　５４６、Ａｌｅｚａ　Ｆｌｕｏｒ　５５５、Ａｌｅｚａ　Ｆｌｕｏｒ　５６８、Ａｌｅｚａ　Ｆｌｕｏｒ　５９４、Ａｌｅｚａ　Ｆｌｕｏｒ　６４７、Ａｌｅｚａ　Ｆｌｕｏｒ　６８０、Ａｌｅｚａ　Ｆｌｕｏｒ　７５０、Ｃｙ　５、Ｃｙ　３などを挙げることができ、さらに、これらにポリエレングリコール基が付加されたものであってもよい。
　前記免疫グロブリンとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥなどが挙げられる。
　前記リガンド化合物の重量平均分子量の上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５００，０００以下が好ましく、３００，０００以下がより好ましく、２００，０００以下がさらに好ましく、１００，０００以下が特に好ましい。
　前記リガンド化合物の重量平均分子量の下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２００以上が好ましい。
　前記リガンド化合物の具体例としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、２－Ａｚｉｄｏｅｔｈｙｌ　２－ａｃｅｔａｍｉｄｏ－２－ｄｅｏｘｙ－β－Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ、２－Ａｚｉｄｏｅｔｈｙｌ　β－Ｄ－Ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅなどが挙げられる。
　－－官能基（Ｂ）と結合可能な官能基（Ｃ）－－
　前記官能基（Ｂ）と結合可能な官能基（Ｃ）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記官能基（Ｂ）がアジド基の場合はホスフィン基、又はアルキニル基が好ましく、前記官能基（Ｂ）がアルキニル基の場合はアジド基が好ましく、前記官能基（Ｂ）がアルケニル基の場合はテトラジン基、又はアルケニル基が好ましく、前記官能基（Ｂ）がカルボニル基の場合はヒドラジン基、又はヒドロキシルアミン基が好ましく、前記官能基（Ｂ）がホスフィン基の場合はアジド基が好ましく、前記官能基（Ｂ）がテトラジン基の場合はアルケニル基が好ましく、前記官能基（Ｂ）がヒドラジン基の場合はカルボニル基が好ましく、前記官能基（Ｂ）がヒドロキシルアミン基の場合はカルボニル基好ましい。
　前記官能基（Ｃ）は、前記リガンド化合物１分子あたり、１つであってもよく、複数であってもよい。複数の場合は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アジド基及びアルキニル基などが挙げられる。
　－官能基（Ｂ）への官能基（Ｃ）の結合：－
　前記官能基（Ｂ）への官能基（Ｃ）の結合としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ベクターにおける官能基への前記官能基（Ａ）の結合で得られた反応物と前記リガンド化合物とを含む溶液を混合し、反応させる方法、前記リンカー化合物と前記リガンド化合物とを含む溶液を混合し、反応させる方法などが挙げられる。
　前記溶液の溶媒としては、水系溶媒でも有機溶媒でもよく、水系溶媒と有機溶媒との混合溶媒でもよい。
　前記水系溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＨＥＰＥＳバッファー、リン酸バッファー、蒸留水などが挙げられる。
　前記ＨＥＰＥＳバッファー、又はリン酸バッファーのｐＨとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ｐＨ１以上ｐＨ１２以下が好ましく、ｐＨ２以上ｐＨ１２以下がより好ましく、ｐＨ３以上ｐＨ１１以下がさらに好ましく、ｐＨ４以上ｐＨ１０以下が特に好ましい。
　前記有機溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、水と相溶性であることが好ましい。例えば、アセトニトリル等のニトリル系溶媒、メタノール、エタノール、プロパノール等のアルコール性溶媒、テトラヒドロフラン、１，４ジオキサン等のエーテル系溶媒、ジメチルスルホキシド等の硫黄系溶媒、ジメチルホルムアミド等のアミド系溶媒を挙げることができる。
　前記水系溶媒と前記有機溶媒の混合比としては、特に制限はなく、不溶性の成分が顕著に生じなければ良い。
　前記リガンド化合物の終濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．０１ｍＭ以上１００ｍＭ以下が好ましく、０．１ｍＭ以上８０ｍＭ以下がより好ましく、０．２ｍＭ以上５０ｍＭ以下がさらに好ましい。
　前記反応の温度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０℃以上７０℃以下が好ましく、４０℃以下がより好ましい。
　前記反応の時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５分間以上１２０時間以下が好ましく、３０分間以上９６時間以下がより好ましく、１時間以上７２時間以下がさらに好ましい。
　＜その他の工程＞
　前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ベクターの調製工程、ベクターの精製工程、還元工程、修飾ベクターの精製工程などが挙げられる。
　－ベクターの調製工程－
　前記ベクターの調製工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、培養細胞などに、ベクターをコードする遺伝子をトランスフェクトし、細胞溶解液、又は細胞上清からベクターを調製する方法などが挙げられる。
　－ベクターの精製工程－
　前記ベクターの精製工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、市販のキットを用いて精製する方法、細胞溶解液を陽イオンクロマトグラフィー、及び陰イオンクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、フィルター、限外ろ過膜を用いて精製する方法などが挙げられる。
　－還元工程－
　前記還元工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ベクターにおける官能基に、前記リンカー化合物における、前記官能基（Ａ）を結合させる工程の後、若しくは前記官能基（Ｂ）に、前記ガンド化合物における、前記官能基（Ｃ）を結合させる工程の後の反応液に、ＤＴＴ（ジチオトレイトール）などの還元剤を加える工程、又は、精製工程後の修飾ベクターに、ＤＴＴなどの還元剤を加える工程などが挙げられる。
　－修飾ベクターの精製工程－
　前記修飾ベクターの精製工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、陽イオン交換カラムクロマトグラフィー、及び陰イオンクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、フィルター、限外ろ過膜を用いて精製する方法などが挙げられる。修飾反応の第１の工程と第２の工程の間で精製しても良いし、第２の工程の後で精製しても良い。
　（ベクターの修飾方法）
　前記ベクターの修飾方法は、ベクターにおける官能基に、前記官能基と結合可能な官能基（Ａ）と、リガンド化合物と結合可能な官能基（Ｂ）と、を有するリンカー化合物における、前記官能基（Ａ）を結合させる第１の工程と、前記官能基（Ｂ）に、前記官能基（Ｂ）と結合可能な官能基（Ｃ）を有するリガンド化合物における、前記官能基（Ｃ）を結合させる第２の工程と、を含み、さらにその他の工程を有することができる。
　ベクターの修飾方法における、前記第１の工程、前記第２の工程、及びその他の工程は、前記修飾ベクターの作製方法における記載のとおりである。
　以下、本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
＜参考例１：ＡＡＶ２の作製＞
　ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ社）に、ＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社）の培地溶液と、蛍光タンパク質ＧＦＰのｐＡＡＶ２（ＣＥＬＬ　ＢｉｏＬＡＢｓ，Ｉｎｃ）をＶＥＮＵＳ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＣＱ４３９５５．１）が発現するように改変したｐＡＡＶ２とｐＲＣ－ｍｉ３４２（タカラバイオ社）とｐＨｅｌｐｅｒ（タカラバイオ社）の培地溶液をトランスフェクションし、３７℃で５％ＣＯ２下で４日間培養することでＡＡＶ２を産生させた。ＥＤＴＡ（Ｅｔｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ）を加えて細胞を剥離した後、遠心分離して細胞ペレットと遠心上清を回収した。
＜参考例２：ＡＡＶ２の精製＞
　参考例１で得られた細胞ペレットからＡＡＶｐｒｏ（登録商標）　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＡＡＶ２）（ＴａＫａＲａ　６２３２）を用いてベクターを精製した。
　得られた精製ＡＡＶ２をＲＴ－ＰＣＲ（Ｑｕａｎｔｓｔｕｄｉｏ、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ法）を用いて力価測定した結果、４×１０９ｖｇ／μＬであった。
＜参考例３：ＡＡＶ２の精製＞
　参考例１で得られた遠心上清に、４０ｗｔ％のＰＥＧ８０００（シグマ）と２．５ＭのＮａＣｌ水溶液の混合液を加えた後に４℃で１６時間静置した。遠心分離後、沈殿層を０．１ｖ／ｖ％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００含有Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　Ｓａｌｉｎｅ、１Ｍ　ＭｇＣｌ２水溶液、更にエンドヌクレアーゼで処理した。ＥＤＴＡで反応を停止した後に遠心分離して上清を回収した。また、参考例１で得られた細胞ペレットを０．１ｖ／ｖ％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００含有Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　Ｓａｌｉｎｅ、１Ｍ　ＭｇＣｌ２水溶液、更にエンドヌクレアーゼで処理した。ＥＤＴＡで反応を停止した後に遠心分離して上清を回収した。得られた上清を混合して、陽イオンクロマトグラフィー（Ｔｈｅｒｍｏ社、ＰＯＲＯＳ　５０ＨＳ）と陰イオンクロマトグラフィー（Ｔｈｅｒｍｏ社、ＰＯＲＯＳ　５０ＨＱ）で精製し、濃縮後、ＡＡＶ２を得た。
＜実施例１：ＡＡＶ２の修飾＞
　参考例２で得られたＡＡＶ２溶液を用いた。
　（バッファーの調製）
　１ＭのＨＥＰＥＳ（ｇｉｂｃｏ社）水溶液、５ＭのＮａＣｌ（ナカライテスク社）水溶液、Ｔｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ社）を夫々水で希釈した後に、１ＭのＮａＯＨ水溶液を加えてｐＨ８．３の５０ｍＭのＨＥＰＥＳ水溶液、１６５ｍＭのＮａＣｌ水溶液、０．１ｖ／ｖ％のＴｗｅｅｎ　２０水溶液を調製した。
　（反応試薬１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、１Ｅ、１Ｆ、１Ｇの調製）
　上記の方法で調製したＨＥＰＥＳバッファーを用いて、０．１２５ｍＭのＤＩＢＥＮＺ［ｂ，ｆ］ａｚｏｃｉｎｅ－５（６Ｈ）－ｈｅｘａｎｏｉｃ　ａｃｉｄ，１１，１２－ｄｉｄｅｈｙｄｒｏ－ε－ｏｘｏ－，２，５－ｄｉｏｘｏ－３－ｓｕｌｆｏ－１－ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｙｌ　ｅｓｔｅｒ，ｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ（Ａｌｄｒｉｃｈ　ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ社）溶液である反応試薬１Ａを調製した。さらに、２倍段階希釈し、反応試薬１Ｂである０．０６３ｍＭ、反応試薬１Ｃである０．０３２ｍＭ、反応試薬１Ｄである０．０１６ｍＭ、反応試薬１Ｅである０．００８ｍＭ、反応試薬１Ｆである０．００４ｍＭ、反応試薬１Ｇである０．００２ｍＭのＤＩＢＥＮＺ［ｂ，ｆ］ａｚｏｃｉｎｅ－５（６Ｈ）－ｈｅｘａｎｏｉｃ　ａｃｉｄ，１１，１２－ｄｉｄｅｈｙｄｒｏ－ε－ｏｘｏ－，２，５－ｄｉｏｘｏ－３－ｓｕｌｆｏ－１－ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｙｌ　ｅｓｔｅｒ，ｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ溶液を調製した。
　（反応試薬２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄの調製）
　上記の方法で調製したＨＥＰＥＳバッファーを用いて１６ｍＭの２－Ａｚｉｄｏｅｔｈｙｌ　２－ａｃｅｔａｍｉｄｏ－２－ｄｅｏｘｙ－β－Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）溶液である反応試薬２Ａを調製した。さらに、４倍段階希釈して、反応試薬２Ｂである４ｍＭ、反応試薬２Ｃである１ｍＭ、反応試薬２Ｄである０．２５ｍＭの２－Ａｚｉｄｏｅｔｈｙｌ　２－ａｃｅｔａｍｉｄｏ－２－ｄｅｏｘｙ－β－Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ溶液を調製した。
　（第１の工程）
　上記の方法で調製した反応試薬１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、１Ｅ、１Ｆ、１Ｇを９μＬと精製ＡＡＶ２溶液１μＬを混合し、３７℃のインキュベーター中で１６時間反応させた。さらに、上記バッファーで調製した２Ｍグリシン溶液（Ｗａｋｏ社）を２μＬ加えて、３７℃のインキュベーター中で５時間反応させることで、第１工程生成物１Ａ、第１工程生成物１Ｂ、第１工程生成物１Ｃ、第１工程生成物１Ｄ、第１工程生成物１Ｅ、第１工程生成物１Ｆ、第１工程生成物１Ｇを得た。反応液をＤＴＴ含有サンプルバッファーで還元した後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＡＴＴＯ社）を行い、銀染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で反応の進捗を確認した。銀染色の結果を図１に示した。反応前のＶＰ１のバンドが約８２ｋＤａで、反応後が約８８ｋＤａであり、化合物が８ｋＤａ分、付加されたことが分かった。
　図１のレーン１は第１工程生成物１Ａのサンプル、レーン２は第１工程生成物１Ｂのサンプル、レーン３は第１工程生成物１Ｃのサンプル、レーン４は第１工程生成物１Ｄのサンプル、レーン５は第１工程生成物１Ｅのサンプル、レーン６は第１工程生成物１Ｆのサンプル、レーン７は第１工程生成物１Ｇのサンプル、レーン８は未修飾のＡＡＶ２のサンプル、レーン９はマーカーである。
　（第２の工程）
　上記の方法で調製した反応試薬２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ（２４μＬ）と、上記の第１工程生成物１Ａの反応溶液（１２μＬ）を混合し、３７℃のインキュベーター中で１６時間反応させることで、修飾ベクター２Ａ、修飾ベクター２Ｂ、修飾ベクター２Ｃ、修飾ベクター２Ｄを得た。反応液をＤＴＴ（ＤＩＴＨＩＯＴＨＲＥＩＴＯＬ）含有サンプルバッファーで還元した後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＡＴＴＯ社）を行い、銀染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で反応の進捗を確認した。銀染色の結果を図２に示した。反応前のＶＰ１のバンドが約８８ｋＤａで、反応後が約９２ｋＤａであり、化合物が４ｋＤａ分、付加されたことが分かった。
　図２のレーン１は修飾ベクター２Ａのサンプル、レーン２は修飾ベクター２Ｂのサンプル、レーン３は修飾ベクター２Ｃのサンプル、レーン４は修飾ベクター２Ｄのサンプル、レーン５は反応試薬２の代わりにバッファーを用いたサンプル、レーン６は未修飾のＡＡＶ２、レーン７はマーカーである。
＜実施例２：ＡＡＶ２の修飾＞
　参考例２で得られた精製ＡＡＶ２溶液を用いた。
　（リン酸バッファーの調製）
　２００ｍＭのリン酸二水素ナトリウム二水和物（Ｗａｋｏ社）と２００ｍＭのリン酸水素二ナトリウム・１２水和物（Ｗａｋｏ社）を混合及び希釈し、ｐＨ８．５の２０ｍＭリン酸バッファーを調製した。
　（反応試薬１Ｈの調製）
　上記の方法で調製したリン酸バッファーを用いて２ｍＭのＤＩＢＥＮＺ［ｂ，ｆ］ａｚｏｃｉｎｅ－５（６Ｈ）－ｈｅｘａｎｏｉｃ　ａｃｉｄ，　１１，１２－ｄｉｄｅｈｙｄｒｏ－ε－ｏｘｏ－，２，５－ｄｉｏｘｏ－３－ｓｕｌｆｏ－１－ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｙｌ　ｅｓｔｅｒ，ｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ（Ａｌｄｒｉｃｈ社）溶液（反応試薬１Ｈ）を調製した。
　（反応試薬３の調製）
　上記の方法で調製したリン酸バッファーを用いて、１６ｍＭの２－Ａｚｉｄｏｅｔｈｙｌ　β－Ｄ－Ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＴＣＩ社）溶液（反応試薬３）を調製した。
　（第１の工程）
　上記の方法で調製した反応試薬１Ｈを９μＬと精製ＡＡＶ２溶液１μＬを混合し、３７℃のインキュベーター中で１６時間反応させた。その後、上記リン酸バッファーで調製した２Ｍグリシン溶液（Ｗａｋｏ社）を２μＬ加え、３７℃のインキュベーター中で６時間静置することで反応を停止し、第１工程生成物１Ｈを得た。
　（第２の工程）
　実施例１と同様の方法で反応試薬３を反応させることで、修飾ベクター３Ａを得た。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＡＴＴＯ社　Ｅ－Ｒ７．５Ｌ）を行い、銀染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で反応の進捗を確認した。銀染色の結果を図３に示した。反応前のＶＰ３のバンドが約６０ｋＤａで、反応後が約６２ｋＤａであり、化合物が２ｋＤａ分、付加されたことが分かった。
　図３のレーン１は実施例２（反応試薬１Ｈ）の第１工程生成物１Ｈのサンプル、レーン２は実施例２（反応試薬１Ｈ）の修飾ベクター３Ａのサンプル、レーン５は未修飾のＡＡＶ２のサンプル、レーン６はマーカーである。
＜実施例３：ＡＡＶ２の修飾＞
　参考例２で得られた精製ＡＡＶ２溶液を用いた。
　（反応試薬４の調製）
　上記の方法で調製したリン酸バッファーを用いて２ｍＭの４，７，１０，１３，１６－Ｐｅｎｔａｏｘａ－２０－ａｚａｔｒｉｃｏｓａｎｏｉｃ　ａｃｉｄ，　２３－（１１，１２－ｄｉｄｅｈｙｄｒｏｄｉｂｅｎｚ［ｂ，ｆ］ａｚｏｃｉｎ－５（６Ｈ）－ｙｌ）－１９，２３－ｄｉｏｘｏ－，２，５－ｄｉｏｘｏ－１－ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｙｌ　ｅｓｔｅｒ（ＢＲＯＡＤＰＨＡＲＭ社）溶液（反応試薬４）を調製した。
　（第１の工程）
　上記の方法で調製した反応試薬４が９μＬと精製ＡＡＶ２溶液１μＬを混合し、３７℃のインキュベーター中で１６時間反応させた。その後、上記リン酸バッファーで調製した２Ｍグリシン溶液（Ｗａｋｏ社）を２μＬ加え、３７℃のインキュベーター中で６時間静置することで反応を停止し、第１工程生成物４を得た。反応液をＤＴＴ含有サンプルバッファーで還元した後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＡＴＴＯ社）を行い、銀染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で反応の進捗を確認した。銀染色の結果を図３に示した。反応前のＶＰ３のバンドが約６０ｋＤａで、反応後が約６４ｋＤａであり、化合物が４ｋＤａ分、付加されたことが分かった。
　（第２の工程）
　実施例１と同様の方法で反応試薬３を反応させることで、修飾ベクター３Ｂを得た。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＡＴＴＯ社　Ｅ－Ｒ７．５Ｌ）を行い、銀染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で反応の進捗を確認した。銀染色の結果を図３に示した。反応前のＶＰ３のバンドが約６４ｋＤａで、反応後が約６８ｋＤａであり、化合物が４ｋＤａ分、付加されたことが分かった。
　図３のレーン３は実施例３（反応試薬４）の第１工程生成物４のサンプル、レーン４は実施例３（反応試薬４）の修飾ベクター３Ｂのサンプル、レーン５は未修飾のＡＡＶ２のサンプル、レーン６はマーカーである。
＜実施例４：ＡＡＶ２の修飾＞
　参考例３で得られたＡＡＶ２溶液（６．６×１０９ｖｇ／μＬ、５００μＬ）を用いた。
　（反応試薬１Ｉ、１Ｊ調製）
　実施例１と同様のＨＥＰＥＳバッファーを用いて、１ｍＭのＤＩＢＥＮＺ［ｂ，ｆ］ａｚｏｃｉｎｅ－５（６Ｈ）－ｈｅｘａｎｏｉｃ　ａｃｉｄ，　１１，１２－ｄｉｄｅｈｙｄｒｏ－ε－ｏｘｏ－，２，５－ｄｉｏｘｏ－３－ｓｕｌｆｏ－１－ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｙｌ　ｅｓｔｅｒ，ｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ（Ａｌｄｒｉｃｈ　ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ社）溶液を調製し１Ｉとした。さらに１Ｉを希釈し、０．５ｍＭの溶液１Ｊを調製した。
　（反応試薬２Ｅの調製）
　実施例１と同様のＨＥＰＥＳバッファーを用いて、２ｍＭの２－Ａｚｉｄｏｅｔｈｙｌ　２－ａｃｅｔａｍｉｄｏ－２－ｄｅｏｘｙ－β－Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ　（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）溶液を調製し２Ｅとした。
　（第１の工程）
　上記及び実施例１で調製した１Ｉ、１Ｊ、１Ａの反応試薬１（４．５ｍＬ）とＡＡＶ２溶液（０．５ｍＬ）を混合し、３７℃のインキュベーター中で１６時間反応させた。そして、実施例１と同様のＨＥＰＥＳバッファーで調製した２Ｍのグリシン溶液（Ｗａｋｏ社）（１ｍＬ）を反応液に加えた後、３７℃のインキュベーター中で７時間反応させることで、第１工程生成物１Ｉ，第１工程生成物１Ｊ，第１工程生成物１Ａを得た。反応液をＤＴＴ含有サンプルバッファーで還元した後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＡＴＴＯ　Ｅ－Ｒ７．５Ｌ）を行い、銀染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　４５－１００１）で反応の進捗を確認した。銀染色の結果を図４に示した。反応前のＶＰ３のバンドが約６０ｋＤａで、反応後が約６２ｋＤａであり、化合物が２ｋＤａ分、付加されたことが分かった。
　図４のレーン１及びレーン８は未修飾のＡＡＶ２、レーン２は実施例４（反応試薬１Ａ：０．１２５ｍＭ）の第１工程生成物１Ａのサンプル、レーン４は実施例４（反応試薬１Ｊ０．５ｍＭ）の第１工程生成物１Ｊのサンプル、レーン６は実施例４（反応試薬１Ｉ：１ｍＭ）の第１工程生成物１Ｉのサンプル、レーン９はマーカーである。
　（修飾ＡＡＶ２の精製）
　実施例４において反応試薬１Ｉ、１Ｊ、１Ａとの反応により得た第１工程生成物１Ｉ、第１工程生成物１Ｊ、第１工程生成物１Ａを、陽イオン交換カラムクロマトグラフィー（担体：ＰＯＲＯＳ　５０ＨＳ、溶離液：２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）、グラジエント条件：１００～３７０ｍＭのＮａＣｌ水溶液）で精製した。結果を図５に示した。精製後にＲＴ－ＰＣＲ（Ｑｕａｎｔｓｔｕｄｉｏ、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ法）を用いて力価測定した結果、第１工程生成物１Ｉは５．８×１０１１ｖｇ／μＬ、第１工程生成物１Ｊは１．８×１０１２ｖｇ／μＬ、第１工程生成物１Ａは１．２×１０１２ｖｇ／μＬ、であった。
　図５の１は未修飾のＡＡＶ２、２は実施例４（反応試薬１Ａ：０．１２５ｍＭ）の第１工程生成物１Ａのサンプル、３は実施例４（反応試薬１Ｊ：０．５ｍＭ）の第１工程生成物１Ｊのサンプル、４は実施例４（反応試薬１Ｉ：１ｍＭ）の第１工程生成物１Ｉのサンプルであり、図５の縦軸は２８０ｎｍにおける吸光度、横軸は溶出体積を示す。
　（第２の工程）
　上記反応後の反応液３ｍＬに、反応試薬２Ｅ、２Ｃ、２Ｄを６ｍＬずつ添加後混合した。３７℃のインキュベーター中で１６時間反応させることで、修飾ベクター２Ｅ、修飾ベクター２Ｆ、修飾ベクター２Ｇを得た。反応液をＤＴＴ含有サンプルバッファーで還元した後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＡＴＴＯ社）を行い、銀染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で反応の進捗を確認した。銀染色の結果を図４に示した。反応前のＶＰ３のバンドが約６２ｋＤａで、反応後が約６３ｋＤａであり、化合物が１ｋＤａ分、付加されたことが分かった。
　図４のレーン１及びレーン８は未修飾のＡＡＶ２、レーン３は実施例４（反応試薬１Ａ：０．１２５ｍＭ及び反応試薬２Ｄ：０．２５ｍＭ）の修飾ベクター２Ｇのサンプル、レーン５は実施例４（反応試薬１Ｊ：０．５ｍＭ及び反応試薬２Ｃ：１ｍＭ）の修飾ベクター２Ｆのサンプル、レーン７は実施例４（反応試薬１Ｉ：１ｍＭ及び反応試薬２Ｅ：２ｍＭ）の修飾ベクター２Ｅのサンプル、レーン９はマーカーである。
　（修飾ベクター２Ｇと２Ｆの精製）
　実施例４において反応試薬２Ｃと２Ｄとの反応により得た修飾ベクター２Ｆと修飾ベクター２Ｇを、陽イオン交換カラムクロマトグラフィー（担体：ＰＯＲＯＳ　５０ＨＳ、溶離液：２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）、グラジエント条件：１００～３７０ｍＭのＮａＣｌ水溶液）で精製した。結果を図６に示した。精製後にＲＴ－ＰＣＲ（Ｑｕａｎｔｓｔｕｄｉｏ、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ法）を用いて力価測定した結果、修飾ベクター２Ｆは２．６×１０１２ｖｇ／μＬ、修飾ベクター２Ｇは２．６×１０１２ｖｇ／μＬ、であった。
　図６の１は未修飾のＡＡＶ２、２は実施例４（反応試薬１Ａ：０．１２５ｍＭ及び反応試薬２Ｄ：０．２５ｍＭ）の修飾ベクター２Ｇのサンプル、３は実施例４（反応試薬１Ｊ：０．５ｍＭ及び反応試薬２Ｃ：１ｍＭ）の修飾ベクター２Ｆのサンプルであり、図６の縦軸は２８０ｎｍにおける吸光度、横軸は溶出体積を示す。
　（修飾ベクター２Ｅの精製）
　実施例４において反応試薬２Ｅとの反応により得た修飾ＡＡＶ２においては、ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製の限外ろ過膜（Ｖｉｖａｓｐｉｎ２０－１００キロ）を用いて遠心濃縮を５回繰り返し、最終的に２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４、２５０ｍＭ　ＮａＣｌ含有）にバッファー置換することで精製した。精製後にＲＴ－ＰＣＲ（Ｑｕａｎｔｓｔｕｄｉｏ、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ法）を用いて力価測定した結果、修飾ベクター２Ｅは１．８×１０１２ｖｇ／μＬであった。
　本発明の態様としては、例えば、以下のものなどが挙げられる。
　＜１＞　ベクターにおける官能基に、前記官能基と結合可能な官能基（Ａ）と、リガンド化合物と結合可能な官能基（Ｂ）と、を有するリンカー化合物における、前記官能基（Ａ）を結合させる工程と、前記官能基（Ｂ）に、前記官能基（Ｂ）と結合可能な官能基（Ｃ）を有するリガンド化合物における、前記官能基（Ｃ）を結合させる工程と、
を含むことを特徴とする、修飾ベクターの作製方法である。
　＜２＞　前記ベクターにおける官能基が、アミノ基、グアニジノ基、水酸基、カルボキシル基、及びインドール基のいずれかである、前記＜１＞に記載の作製方法である。
　＜３＞　前記ベクターにおける官能基が、リジン残基、アルギニン残基、チロシン残基、セリン残基、スレオニン残基、トリプトファン残基における官能基である、前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の作製方法である。
　＜４＞　前記官能基（Ａ）が、スクシンイミジル基である、前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の作製方法である。
　＜５＞　前記官能基（Ｂ）が、アジド基、アルキニル基、アルケニル基、カルボニル基、ホスフィン基、テトラジン基、ヒドラジン基、及びヒドロキシルアミン基のいずれかである、前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の作製方法である。
　＜６＞　前記リガンド化合物の重量平均分子量が１００，０００以下である、前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の作製方法である。
　＜７＞　前記リガンド化合物が、糖化合物である、前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載の作製方法である。
　＜８＞　前記糖化合物が、ポリエチレングリコール基を有する、前記＜７＞に記載の作製方法である。
　＜９＞　前記リガンド化合物が、ペプチドである、前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載の作製方法である。
　＜１０＞　前記リンカー化合物が、ポリエチレングリコール基を有する、前記＜１＞から＜９＞のいずれかに記載の作製方法である。
　＜１１＞　前記ベクターが、アデノ随伴ウイルスベクターである、前記＜１＞から＜１０＞のいずれかに記載の作製方法である。
　＜１２＞　前記ベクターにおける官能基が、前記アデノ随伴ウイルスベクターのカプシドを構成する官能基である、前記＜１１＞に記載の作製方法である。
　＜１３＞　前記ベクターにおける官能基がアミノ基であり、前記官能基（Ａ）がスクシンイミジル基であり、前記官能基（Ｂ）又は（Ｃ）がアジド基及び／又はアルキニル基であり、前記リガンド化合物が、糖化合物及び／又はペプチドである、前記＜１＞から＜１２＞のいずれかに記載の作製方法である。
　＜１４＞　前記ベクターにおける官能基がリジン残基における官能基であり、前記官能基（Ｂ）又は（Ｃ）がアジド基及び／又はアルキニル基であり、前記リガンド化合物が、糖化合物及び／又はペプチドである、前記＜１＞から＜１２＞に記載の作製方法である。
　＜１５＞　ベクターにおける官能基に、前記官能基と結合可能な官能基（Ａ）と、リガンド化合物と結合可能な官能基（Ｂ）と、を有するリンカー化合物における、前記官能基（Ａ）を結合させる工程と、前記官能基（Ｂ）に、前記官能基（Ｂ）と結合可能な官能基（Ｃ）を有するリガンド化合物における、前記官能基（Ｃ）を結合させる工程と、を含むことを特徴とする、ベクターの修飾方法である。

Claims (15)

  1. 　ベクターにおける官能基に、
    　前記官能基と結合可能な官能基（Ａ）と、リガンド化合物と結合可能な官能基（Ｂ）と、を有するリンカー化合物における、前記官能基（Ａ）を結合させる工程と、
    　前記官能基（Ｂ）に、
    　前記官能基（Ｂ）と結合可能な官能基（Ｃ）を有するリガンド化合物における、前記官能基（Ｃ）を結合させる工程と、
    を含むことを特徴とする、修飾ベクターの作製方法。
  2. 　前記ベクターにおける官能基が、アミノ基、グアニジノ基、水酸基、カルボキシル基、及びインドール基のいずれかである、請求項１に記載の作製方法。
  3. 　前記ベクターにおける官能基が、リジン残基、アルギニン残基、チロシン残基、セリン残基、スレオニン残基、トリプトファン残基における官能基である、請求項１から２のいずれかに記載の作製方法。
  4. 　前記官能基（Ａ）が、スクシンイミジル基である、請求項１から３のいずれかに記載の作製方法。
  5. 　前記官能基（Ｂ）が、アジド基、アルキニル基、アルケニル基、カルボニル基、ホスフィン基、テトラジン基、ヒドラジン基、及びヒドロキシルアミン基のいずれかである、請求項１から４のいずれかに記載の作製方法。
  6. 　前記リガンド化合物の重量平均分子量が１００，０００以下である、請求項１から５のいずれかに記載の作製方法。
  7. 　前記リガンド化合物が、糖化合物である、請求項１から６のいずれかに記載の作製方法。
  8. 　前記糖化合物が、ポリエチレングリコール基を有する、請求項７に記載の作製方法。
  9. 　前記リガンド化合物が、ペプチドである、請求項１から６のいずれかに記載の作製方法。
  10. 　前記リンカー化合物が、ポリエチレングリコール基を有する、請求項１から９のいずれかに記載の作製方法。
  11. 　前記ベクターが、アデノ随伴ウイルスベクターである、請求項１から１０のいずれかに記載の作製方法。
  12. 　前記ベクターにおける官能基が、前記アデノ随伴ウイルスベクターのカプシドを構成する官能基である、請求項１１に記載の作製方法。
  13. 　前記ベクターにおける官能基がアミノ基であり、前記官能基（Ａ）がスクシンイミジル基であり、前記官能基（Ｂ）又は（Ｃ）がアジド基及び／又はアルキニル基であり、前記リガンド化合物が、糖化合物及び／又はペプチドである、請求項１から１２のいずれかに記載の作製方法。
  14. 　前記ベクターにおける官能基がリジン残基における官能基であり、前記官能基（Ｂ）又は（Ｃ）がアジド基及び／又はアルキニル基であり、前記リガンド化合物が、糖化合物及び／又はペプチドである、請求項１から１２のいずれかに記載の作製方法。
  15. 　ベクターにおける官能基に、
    　前記官能基と結合可能な官能基（Ａ）と、リガンド化合物と結合可能な官能基（Ｂ）と、を有するリンカー化合物における、前記官能基（Ａ）を結合させる工程と、
    　前記官能基（Ｂ）に、
    　前記官能基（Ｂ）と結合可能な官能基（Ｃ）を有するリガンド化合物における、前記官能基（Ｃ）を結合させる工程と、
    を含むことを特徴とする、ベクターの修飾方法。
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