JP7100629B2 - 化学修飾されたカプシドを有するｒａａｖ - Google Patents

Description

本発明は、一般に遺伝子治療の分野、すなわち標的細胞、組織、器官及び生物への遺伝子送達に関し、特にウイルスベクターを介しての遺伝子送達に関する。

本発明は、特に、カプシド上で１種以上のリガンドと化学的にカップリングした組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター粒子、並びに該組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター粒子の製造方法に関する。さらに、本発明は、これらの組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター粒子の治療及び／又は診断手段としての使用に関する。

本発明では遺伝子治療についてさらに詳しく検討される。遺伝子治療は元々は遺伝性疾患の原因となる欠損遺伝子を修正するために開発されたものであるが、今日の遺伝子治療は癌、心臓発作、代謝疾患のような後天性疾患を含めた広範な疾患の治療に使用できる。この問題に取り組むための一般的なアプローチは、核酸を核に送達することを伴う。かかる核酸は、標的細胞のゲノムに挿入されることもあるし、或いはエピソームのまま残ることもある。対象の標的細胞への治療用核酸の送達は、ウイルスベクターの使用を始めとする数多く方法によって実施することができる。利用可能な数多くのウイルスベクター（レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルスなど）の中でも、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、遺伝子治療、特にインビボ用途での汎用ベクターとして普及しつつある。

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）はパルボウイルス科に属する。ＡＡＶゲノムは約４．７キロベース（ｋｂ）の直鎖状一本鎖ＤＮＡ分子からなり、非構造Ｒｅｐ（複製）タンパク質及び構造Ｃａｐ（カプシド）タンパク質をコードする２つの主要なオープンリーディングフレームからなる。

ＡＡＶ由来の組換えベクターは現在治療製剤として製品化されつつあり、最近その１つは稀少遺伝性疾患（リポタンパク質リパーゼ欠損症）の治療のために承認されている。

実際、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来のウイルスベクターは、他のベクターと比較してそれらのインビボでの優れた効率、広範な組織に対するトロピズム及び優れた安全性プロファイルのため、インビボ遺伝子導入のためのツールとして好まれるようになっている。ＡＡＶベクター遺伝子導入後の治療効果について幾つかの前臨床試験で報告されており、過去１０年間で、これらの結果のあるものは成功裡に臨床に移行し、遺伝子治療の分野における最もエキサイティングな結果の幾つかをもたらした。ヨーロッパで最初のＡＡＶ系遺伝子治療製品が最近承認されたことは、この分野が概念実証研究から臨床開発に向かって進行していることの追加の証拠をなしている。

しかし、ＡＡＶを導入遺伝子のビヒクルとして用いる大半の臨床試験は重大な限界、すなわち（ｉ）その治療指数が低いこと（治療効果の達成に高用量のベクターが通常必要とされること）、（ｉｉ）その生体内分布が広いこと、並びに（ｉｉｉ）既存の中和抗体の存在下で有効性が低いことを示している。

実際、ＡＡＶの１つの限界はその広いトロピズムにあり、導入遺伝子の発現が望まれる組織以外の他の組織での導入遺伝子の発現をもたらす。長期の遺伝子導入のために、宿主及びベクターに関連した免疫の課題を克服する必要があることも十分に認識されている。

現在までの遺伝子治療用途の多くはセロタイプ２（ＡＡＶ２）を用いている。哺乳類の筋肉細胞、肝細胞又は神経細胞のような広範な分裂終了細胞のインビボでの形質導入は、その人気を部分的に説明している。このセロタイプは、血友病Ｂの臨床試験における筋肉及び肝臓への遺伝子導入並びにレーバー先天黒内障の治療のための網膜への遺伝子導入にも用いられている。

しかし、このベクターの使用には依然として問題及び限界がある。第一に、インビボでの形質導入の効率が概して低いために高用量のベクターが通常必要とされるが、その結果毒性が増加してしまう。最も重要な問題の１つは、人口の５０～９０％がＡＡＶ２に対して血清陽性であってＡＡＶ２に対する中和抗体（ＮＡｂ）を産生し、遺伝子送達を損なうことによる。ヒト及び動物種での天然ＡＡＶ単離株（１～１２）の発見並びにこれらのＡＡＶセロタイプのカプシドの分子ツールによる遺伝子改変は、前臨床動物モデル及び第Ｉ／ＩＩ相臨床試験で有望な結果をもたらし、近い将来の臨床への移行が期待される。しかし、それらの治療指数は低いままであり、このことは、有害作用を伴いながら、それらを高濃度で投与する必要が依然としてあることを意味する。同時に、過去１０年間でＡＡＶベクターの臨床ロットの製造はかなり進歩しており、現在、遺伝子治療が移行しつつある工業化前の製薬段階で大規模製造方法が利用できる。とはいえ、第ＩＩＩ相及び市販のため高用量のベクターが必要とされる場合、現在の方法ではかかる需要を支えることはできない。

新規ＡＡＶセロタイプ（及び関連する遺伝的変異体）の将来性について実証した上述の戦略は、標的細胞型の選択的形質導入を可能にする正確なトロピズムを達成しないとして満足のいくものとはみなされておらず、ＡＡＶ由来のベクターのトロピズムを増大させるためのさらなる試みが現在なされている。実際、ＡＡＶ由来ベクターの特異性の欠如を埋め合わせるため、極めて多量のＡＡＶ由来のベクターを投与して治療閾値に達するする必要があるが、これは安全性の懸念及び及び製造上の限界のため望ましくない。

この目的のため、標的特異性を有するペプチドエピトープのウイルス表面への遺伝的導入などの様々な試みがなされてきた。その他の戦略は、一方の特異性がウイルスカプシドに対するものであり、他方の特異性が受容体に対するものである二重特異性抗体のような２つの特異性をもつリンカー分子を使用することであり、タンパク質リガンドの非共有結合のためのアダプタードメイン（プロテインＡのＺドメイン、ビオチン）が導入される。

例えば、国際公開第００／００２６５４号では、改変トロピズムは、主に元の標的細胞のウイルス受容体へのＡＡＶの結合を防ぐためになされている。この文献では、特定の実施形態において標的細胞に対する増大した親和性についても言及されている。この文献では、抗体フラグメントはカプシドに結合している。別の実施形態では、抗体の他端をリガンドに結合させて標的に対する親和性を向上させることができる（「二重特異性抗体（diabody）」の調製）。

標的組織に対するＡＡＶ由来ベクターの選択性を向上させるために、ＡＡＶカプシド上での生物学的結合及び化学的結合の組合せも従前提案されている。

例えば、国際公開第２００５／１０６０４６号には、カプシドの遺伝子改変と化学修飾を組合せる方法が提案されている。この方法の第二段階である化学修飾は、第一段階で遺伝的経路によってカプシドで富化されたシステイン残基の存在に依拠している。ＡＡＶ粒子は、リガンド、ポリマー、金ナノ粒子、蛍光分子、磁性物質又は生化学的に活性な物質でグラフト化し得る。ただし、カップリングは、ジスルフィド、チオエステル及び／又はチオエーテル結合を介して並びに後述の本発明のようにＮＣＳ結合を介して行われる。

Ｅ．Ｄ．Ｈｏｒｏｗｉｔｚ他の論文“Ｇｌｙｃａｔｅｄ ＡＡＶ Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｄｉｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｖｉｒａｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｒｏｐｉｓｍ” Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２０１１， ２２， ５２９－５３２には、他の技術的問題の中でも特に細胞トロピズムの問題について記載されている。特に、カプシド糖化による非天然アミノ酸側鎖の生成は、遺伝子治療用途のための新規組織トロピズムを呈するＡＡＶベクターの設計のための直交戦略として役立つ。

国際公開第２０１５／０６２５１６号では、ＡＡＶのカプシド及び標的細胞に対するそのトロピズムを変化させるためのクリックケミストリーによるカップリング工程の前に、アジドを含むアミノ酸のような非天然アミノ酸を遺伝子改変によってカプシドに導入しておく。

遺伝子治療のためのビヒクルとしてのＡＡＶの分野の研究の別の側面、すなわち非標的組織との特異的及び非特異的相互作用を低減させるために、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はポリ－（Ｎ－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ｐＨＰＭＡ）のようなポリマーでウイルス粒子を被覆すること、を挙げることができる。

しかし、これらのアプローチも、ＡＡＶ由来のベクターを達成するまでに様々なステップがほとんど必要とされるので、依然として完全に満足のいくものではない。また、特異的リガンドを組み込むため、これらのアプローチはカプシドの遺伝子改変を必要としている。換言すると、リガンドをＡＡＶカプシド表面に組み込むための従前の方法は、野生型カプシドには応用することができないので、所望の適応性及び単純さに欠ける。付言すると、カプシドへの遺伝子改変の導入は、ベクターのトロピズムを変化させる可能性があり、生産収率その他の生物学的パラメーターを変化させる可能性がある。さらに、このような遺伝子改変を、改変する必要のある新規セロタイプの各々に対して行う必要がある。要するに、所望の標的リガンドをＡＡＶカプシドに結合するための汎用法は存在していない。

また、Ｋｙｅ－Ｉｌ Ｊｏｏ他の報文“Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ ｂｙ Ｖｉｒｕｓ－Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ”， ＡＣＳ ＮＡＮＯ， ｖｏｌ．５， ｎｏ．５， ２４ Ｍａｙ ２０１１から、ＡＡＶ粒子のカプシドに量子ドット（ＱＤ）を結合するための化学反応も公知である。ただし、カルボジイミドカップリングが実施されており、以下の記載から明らかな通り本発明のようなチオウレア結合は実施されていない。

最後に、Ｃ．Ｅ．Ｗｏｂｕｓ他の報文“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ ２ （ＡＡＶ－２） Ｃａｐｓｉｄ： Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｐｓｉｄ Ｄｏｍａｉｎｓ Ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ＡＡｖ－２ Ｃｅｌｌ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＡＶ－２ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ”， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ．７４， ｎｏ．１９， １ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２００， ｐａｇｅｓ ９２８１－９２９３には、空のカプシドをＦＩＴＣで標識することが記載されている。しかし、本明細書において後で詳しく説明する通り、本発明ではゲノムを含むカプシドのみが関係しており、－ＣＳＮＨ－及び芳香族部分を含む結合を介してリガンドＬに結合している。

そこで、特定の器官又は組織に対するターゲティング能力、特にインビボ遺伝子送達によるターゲティング能力を向上させるために、化学カップリングによるＡＡＶ由来ベクターの改変方法を見出すことが必要とされている。

また、ＡＡＶカプシドアミノ酸配列の改変工程を必要とせずに、ＡＡＶ由来ベクターを改変することも必要とされている。

さらに、特定の細胞型へのウイルス媒介遺伝子導入が向上した新規な表面修飾ＡＡＶ由来ベクターも必要とされている。

一般的には、例えば「比活性」及び／又は「治療指数」を向上させるために、任意の性状のリガンドをＡＡＶ由来ベクターカプシド表面、すなわち様々な化学的部分に化学的にカップリングするための新規方法が必要とされている。

特に、粒子カプシドを合成ポリマー、ペプチド、炭水化物又は脂質のような部分で修飾するための新規手段を提供することが必要とされている。

さらに、治療用量を減少させることができる化学修飾組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター粒子を見出す必要性も存在する。

本発明は、正に、上述の要件を満足する新規組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター粒子、その製造方法並びにその治療及び／又は診断における用途を提供することを目的とする。

そこで、本発明は、その一つの態様では、１以上のリガンドＬと化学的にカップリングされた、カプシドタンパク質に含まれる１以上の第一級アミノ基を有する組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター粒子であって、上記リガンドＬが、下記の式（Ｉ）の化合物の形態で存在する組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター粒子に関する。

式中、Ｎ^＊はカプシドタンパク質に含まれる１つの第一級アミノ基の窒素原子であり、

は１以上のリガンドＬに直接又は間接的に共有結合した、任意的に置換されていてもよい、アリーレン又はヘテロアリーレン基を表す。

別の態様では、本発明は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター粒子を１以上のリガンドＬと化学的にカップリングさせるための方法であって、少なくとも以下の工程：
カプシドタンパク質に含まれる１以上の第一級アミノ基を有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を用意する工程、及び
上記ＡＡＶ粒子を次の式（ＩＩ）の試薬
Ｂ－Ｎ＝Ｃ＝Ｓ （ＩＩ）
（式中、Ｂは、（Ｌ）ｍ（Ｘ）Ａｒ－基であり、
Ｌは本明細書の以降で定義する通りであり、
ｍは１～１０００の整数を表し、
Ａｒは、アリーレン又はヘテロアリーレン基を表し、特に本明細書の以降で定義する通りであり、
Ｘは結合又は上記リガンドＬとＡｒとの間のスペーサーを表す。）と、第一級アミノ基を式（ＩＩ）の試薬の－Ｎ＝Ｃ＝Ｓ基と反応させるのに適した条件下で、接触させる工程
を含む方法に関する。

本発明はさらに、本発明に係る上記の方法によって得られた組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター粒子にも関する。

さらに別の態様では、本発明は、医薬、特に治療用核酸（遺伝子、ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＩｎｃＲＮＡなど）を送達するための又は矯正ゲノム編集を誘導するための医薬として使用するための、予防手段として使用するための、造影剤のような診断手段として使用するための、或いは遺伝子治療の効率研究に使用するための、本発明に係る組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター粒子にも関する。

本発明はまた、本発明の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター粒子を薬学的に許容される媒体中に含む医薬組成物に関する。

したがって、本発明で考慮される化学修飾は、ＡＡＶカプシドに存在するアミノ基と直接共有結合を形成することによって実施することができ、カプシド配列を予め遺伝子改変しておく必要がない。

分子遺伝ツールを用いて遺伝子操作したＡＡＶ株の生成とは対照的に、化学カップリングの主な利点は、粒子カプシドを、合成ポリマー、ペプチド、炭水化物又はさらには遺伝的には組み込むことのできない脂質のような部分で修飾できることである。また、合成カプシドの新規な遺伝子変異体は、臨床試験に使用するために生産及び特徴付けするのに問題となることがある。これらの合成カプシドは、トロピズム、生体内分布、ベクター構築、生産収率及び精製戦略を始めとする様々なレベルで研究しなければならないからである。

本発明のその他の態様及び利点は、本発明に関する以下の詳細な説明、特にカプシドを官能化することができる様々な有機物、例えば小分子、ポリマー又はペプチドに関する説明から明らかとなろう。

図１は、ＡＡＶ２のカプシド上の第一級アミノ基によるＦＩＴＣの共有結合カップリングを示す。 図２は、ＡＡＶ２のカプシド上の第一級アミノ基によるＧａｌＮＡｃリガンドの共有結合カップリングのための反応性官能基の同定を示す。 図３は、ＡＡＶ２のカプシド上の第一級アミノ基によるＧａｌＮＡｃリガンドの共有結合カップリングを示す。 図４は、ＧａｌＮＡｃリガンドで化学修飾したＡＡＶ２及びＡＡＶ２ベクターによるヒト初代培養肝細胞の形質導入を示す。 図５は、第一級アミノ基によるカップリングの効率に対するリガンドの当量数の影響を示す（ＦＩＴＣを用いた例）。 図６は、第一級アミノ基によるカップリングの効率（化合物６及び１３を用いた例）及びマウス初代培養肝細胞の形質導入に対するＧａｌＮＡｃリガンドの当量数の影響を示す。 図７は、第一級アミノ基によるカップリングの効率（化合物６及び１３を用いた例）及びラットの網膜の形質導入に対するマンノースリガンドの当量数の影響を示す。 図８は、ＡＡＶ２のカプシド上の第一級アミノ基によるＧａｌＮＡｃリガンドの共有結合カップリングのための異なる反応性官能基を有するリガンド１８及び１９の同定を示す。 図９は、ＡＡＶ３ｂのカプシド上の第一級アミノ基による化合物６の共有結合カップリングを示す。

以下、本発明の代表的な実施形態を示す添付の図面を参照しながら本発明について説明する。

定義
別途記載しない限り、本明細書で用いるすべての用語は当業者が理解するものと同じ意味を有し、本発明の実施に際しては、当業者の技術的知識の範囲内の分子生物学、ウイルス学及び組換えＤＮＡ技術の慣用技術が用いられる。

本明細書で用いる「投与」、「導入」又は「送達」という用語は、組換えタンパク質又はヌクレオチド発現のための本発明のプラスミド又はベクターを、対象の細胞又は細胞及び／又は組織及び／又は器官に送達することをいう。そのような投与、導入又は送達は、インビボ、インビトロ又はエクスビボで起こり得る。組換えタンパク質又はポリペプチド発現のためのプラスミドは、トランスフェクション（この用語は典型的には化学的手段（例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）又はリポフェクション）、物理的手段（エレクトロポレーション又はマイクロインジェクション）による細胞への異種ＤＮＡの挿入を意味する。）、感染（インフェクション；この用語は典型的には複製能力及び／又はそのライフサイクルを完結する能力を有する感染性因子すなわちウイルス（例えばＡＡＶ Ｒｅｐ遺伝子を発現するバキュロウイルス）による導入を意味する。）、又は形質導入（トランスダクション；この用語は、ウイルス学では通例、感染性因子の複製に必要な機能が改変されているためにライフサイクルが完結しない細胞の感染、又はウイルス性因子（例えば、バクテリオファージ又は複製欠損ウイルスベクター）によるある微生物から別の微生物への遺伝物質の伝達による細胞の感染をいう。）によって細胞に導入することができる。

組換えポリペプチド、タンパク質又はオリゴヌクレオチド発現のための本発明に係るベクターは、物理的手段（例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション又はリポフェクション）によって、或いは細胞、組織、器官又は対象へのインビトロ、インビボ又はインビボ送達のための薬学的に許容される媒体でベクターを調製することによって送達し得る。さらに、本発明の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター粒子は、物理的手段又は媒体（カップリングしたリガンド以外のもの）の助けを借りずに細胞に侵入することができる。

本明細書で用いる「宿主細胞」という用語は、例えば、ｒＡＡＶベクターのレシピエントとして使用できる或いは使用されている微生物、酵母細胞、昆虫細胞及び哺乳類細胞などをいう。この用語は形質導入された細胞の後代を包含する。このように、本明細書で用いる「宿主細胞」は、外来性核酸で形質導入された細胞をいう。なお、単一親細胞の後代は、自然の、偶発的な又は意図的な突然変異のため、形態学的に又はゲノム又はＤＮＡ全体で親細胞とは必ずしも完全に同一ではないかもしれない。

本明細書で用いる「組換え」という用語は、ＤＮＡ組換え（クローニング）法を用いて生成した核酸、ベクター、ポリペプチド又はタンパク質をいい、天然の又は野生型の核酸、ベクター、ポリペプチド又はタンパク質とは区別できる。

本明細書で用いる「対象」という用語は、ヒト、チンパンジーのような非ヒト霊長類、その他の類人猿及びサル種、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ及びウマのような家畜、イヌ及びネコのようなの飼育哺乳類、マウス、ラット及びモルモットのようなげっ歯類を含む実験動物を包含するが、これらに限定されない。この用語は特定の年齢又は性別を表すものではない。したがって、成人、成体、新生児及び新生仔の対象、並びに胎児、胎仔も、男性又は女性或いは雄又は雌を問わず、包含される。

本明細書で用いる「トロピズム」という用語は、ある細胞又は組織での組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター粒子の優先的な感染及び／又は形質導入をいう。好ましい実施形態では、ＡＡＶ粒子のトロピズムを改変するため、粒子には、それらが本来有していない標的細胞表面の受容体に対するある種の親和性のようなある種の特徴が与えられる。

本明細書で用いる「薬学的に許容される」という用語は、生理学的に忍容性であって、ヒトに投与したときに毒性又はアレルギー反応もしくは同様の有害な反応（例えば胃のむかつき、めまいなど）を通例生じない分子的存在及び組成物をいう。好ましくは、本明細書で用いる「薬学的に許容される」という用語は、動物、特にヒトで使用するために、連邦政府又は州政府の規制当局によって承認されるか或いは米国薬局方その他の一般に認められた薬局方に収載されていることを意味する。

本明細書で用いる「治療指数」という用語は、有効薬の治療効率を表すパラメータである。例えば、治療効果を達成するのに高濃度の活性物質が必要とされる場合又は効果を得るのに必要な用量が毒性を誘発する場合は治療指数は低い。対照的に、高い治療指数は、治療効果をもたらすのに必要とされる活性物質の用量が低いこと及び／又は有効薬の毒性が低いことを意味する。

本明細書で用いる「化学修飾」という用語は、化学反応による共有結合が形成された状態でのカプシドタンパク質の修飾をいう。

ＡＡＶ
あらゆる組換えアデノ随伴ウイルスを本発明で実施し得る。

組換えアデノ随伴ウイルスカプシドは、同定されたすべての天然セロタイプ、特にＡＡＶ２、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９及びＡＡＶ１０から選択することができ、特にＡＡＶ２とし得る。

また、組換えアデノ随伴ウイルスは、非天然法、例えば限定されるものではないが、カプシド変異誘発、カプシド配列へのペプチド挿入、各種セロタイプからのカプシドシャッフリング又は祖先配列再構成（ancestral reconstruction）などによって生成された合成セロタイプからも選択し得る。

組換えＡＡＶは、筋肉細胞、肝細胞又は神経細胞のような哺乳動物の広範な分裂終了細胞をインビボで形質導入することができる。

組換えＡＡＶベクターは、ＨＥＫ２９３細胞、Ａｄ又はＨＳＶに感染した安定細胞株、Ａｄ又はＨＳＶに感染した哺乳動物細胞（ｒｅｐ－ｃａｐ及び導入遺伝子を発現する）又はバキュロウイルスベクターに感染した昆虫細胞（ｒｅｐ－ｃａｐ及び導入遺伝子を発現する）の一過性トランスフェクションを始めとする様々な方法で生産することができる。これらの方法のいずれかで生産した組換えＡＡＶベクターは、本明細書に記載する化学修飾に使用し得る。ベクターは、特に、実施例２．１に例示するように、ＡＡＶ Ｒｅｐ２－Ｃａｐ２及びアデノウイルスヘルパー遺伝子（Ｅ２Ａ、ＶＡ ＲＮＡ及びＥ４）をコードするｐＨｅｌｐｅｒ ＰＤＰ２－ＫＡＮＡと、ｐＶｅｃｔｏｒ ｓｓ－ＣＡＧ－ｅＧＦＰの２つのプラスミドでのリン酸カルシウム－ＨｅＢＳ法によるＨＥＫ２９３細胞の一過性トランスフェクションによって生産し得る。

本発明の組換えアデノ随伴ウイルスは、所望に応じて、ウイルス以外の起源の任意の配列を含んでいてもよい。

カプシド
カプシドは、天然のままの又は天然のものではないアミノ基を含んでいてもよい。カプシドの表面に存在するアミノ基は化学カップリングに関与する。

特定の実施形態では、組換えアデノ随伴ウイルスベクターは、天然に存在するセロタイプ由来の野生型カプシドタンパク質から構成される。

かかる天然に存在するアミノ基は、例えばリジン、アルギニン及びシステイン、特にはリジンとすることができる。

別の特定の実施形態では、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター粒子は、天然に存在するセロタイプからカプシドタンパク質を遺伝子改変（突然変異、挿入又は欠失）したアデノ随伴ウイルス又は合成カプシドによって構成されるアデノ随伴ウイルスである。

本発明において、合成カプシドは、天然の又は人工的に創出された（ランダム突然変異、配列シャッフリング、インシリコ設計（in silico design）などによる）複数のセロタイプに由来するカプシドタンパク質の任意の組合せであって天然には存在しない新しいＡＡＶウイルスカプシドを構築及び産生することのできるものを意味する。

式（Ｉ）／リガンドＬ
本発明は、ＡＡＶカプシドの表面に存在する第一級アミノ基にリガンドＬを共有結合でグラフトさせることによってＡＡＶカプシドを化学修飾するための新規な方法を提供する。

本発明に係る組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター粒子は、

がリガンドＬの一部を形成する芳香族部分を表す実施形態として、或いは

が、１以上のリガンドＬに直接又は間接的に共有結合したアリーレン又は任意的に置換されていてもよいヘテロアリーレン基である実施形態として記載される。

換言すると、この場合、

はリガンドＬに包含される。実施例から明らかなように、本発明の概念実証は、まずこの実施形態によって行われた。

さらに、この場合、リガンドＬは、実施例２で例示するような標識剤、例えば次の式（Ａ）で例示されるもの、であってもよい。

これはフルオレセインから誘導され、さらに詳細には本明細書の以降で定義する式（ＩＩ）の試薬としてのフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）から誘導される。

この点に関して、ローダミン、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ及びｂｏｄｉｐｙのような芳香族部分を含む任意の蛍光色素でも適切に実施できる。

本発明によれば、

はリガンドＬの一部を形成しておらず、リガンドＬが

に結合しており、その結果、リガンドＬは二価基である。

特定の実施形態では、式（Ｉ）の

は、１以上のリガンドＬに直接又は間接的に共有結合した、任意的に置換されていてもよいアリーレン又はヘテロアリーレン基を表す。

典型的には、アリーレン基は、フェニレン、ナフチレン及びアントラセニレンのような芳香族環から選択され、特にフェニレン及びナフチレンから選択される。

アリーレン又はヘテロアリーレン基は、適切な基で適宜置換されていてもよい。ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アミノ基、（Ｃ_１～Ｃ_３）アルキル基又は（Ｃ_１～Ｃ_３）アルコキシ基などの基を挙げることができる。

アリーレン基は、１～３個の芳香環を含む芳香族環、例えば二環又は三環、特に、炭素原子数５～２０、特に炭素原子数５～１２の縮合芳香環を含む芳香族環を意味する。

ヘテロアリーレン基は、１～３個の芳香環、特に縮合芳香族環を含む、炭素原子数５～２０、特に炭素原子数６～１０の芳香族環で、Ｏ、Ｎ及びＳから選択されるヘテロ原子を１個以上（例えば１～４個）含む芳香族環を意味する。単環式ヘテロアリーレン基の例としては、イミダゾリレン、ピリミジレン、イソキサゾリレン、チアゾリレン、イソチアゾリル、ピリジレン、ピラゾリレン、オキサゾリレン、１，２，４－オキサジアゾリレン、チエニレン及びフリレン基が挙げられる。

特にピリジレンを挙げることができる。

二環式ヘテロアリーレン基の例としては、１Ｈ－インダゾリレン、ベンゾ［１，２，３］チアジアゾリレン、ベンゾ［１，２，５］チアジアゾリレン、ベンゾチオフェニレン、イミダゾ［１，２－ａ］ピリジレン、キノリニレン、インドリレン及びイソキノリニレン基が挙げられる。

本発明の文脈において、別途記載しない限り、
・ハロゲン原子は、フッ素原子、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子であり、特にハロゲン原子はフッ素原子である。
・アルキル基は、別途記載しない限り、炭素原子数１～５の直鎖又は枝分れ飽和脂肪族基でる。具体例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル及びペンチル基が挙げられる。
・アルコキシ基は、－Ｏ－アルキルの基であり、アルキル基は上記で定義した通りであり、特にアルキル基はメチル又はエチルである。

特定の実施形態では、

は、フェニレン基、ナフチレン又はピリジレン基であり、特に１以上のリガンドＬに直接又は間接的に共有結合した以下のいずれかの基を表す。

リガンドＬは様々な機能を果たすことができる。

リガンドＬは、典型的には、ターゲティング剤、中和抗体との相互作用を避けるための立体遮蔽剤、標識剤又は磁性剤から選択し得る。

特定の実施形態では、リガンドＬは、ターゲティングリガンド、特に細胞型特異的リガンド、殊に、タンパク質、単糖類もしくは多糖類、ステロイドホルモン、ＲＧＤモチーフペプチド、ビタミン類、小分子又はターゲティングペプチドから誘導されるものである。

一実施形態では、細胞型特異的リガンドは、転移、上皮成長因子ＥＧＦ、塩基性線維芽細胞成長因子ｂＦＧＦのようなタンパク質から誘導し得る。

一実施形態では、細胞型特異的リガンドは、ガラクトース、Ｎ－アセチルガラクトサミン及びマンノースのような単糖類もしくは多糖類から誘導し得る。

一実施形態では、細胞型特異的リガンドは、葉酸のようなビタミン類から誘導し得る。

一実施形態では、細胞型特異的リガンドは、ナプロキセン、イブプロフェンその他公知のタンパク質結合分子を始めとする小分子から誘導し得る。

一実施形態では、細胞型特異的リガンドは、ＡＳＳＬＮＩＡ（配列番号１）、ＷＤＡＮＧＫＴ（配列番号２）、ＧＥＴＲＡＰＬ（配列番号３）、ＣＧＨＨＰＶＹＡＣ（配列番号４）及びＨＡＩＹＰＲＨ（配列番号５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む筋肉ターゲティングペプチド（ＭＴＰ）から誘導し得る。ある実施形態では、筋肉ターゲティング部分はクレアチンを含み、癌ターゲティングペプチド（ＣＴＰ）は直鎖又は環状ＲＧＤペプチドに由来するアミノ酸配列を含む。

本実施形態のさらに特定の態様では、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＰＧＰｒ）によって認識されるガラクトース由来リガンドを用いて、肝細胞を特異的にターゲティングすることができる。

本発明のこの特定の態様では、式（Ｉ）の部分の群から、以下の通り表すことのできる式（Ｉａ）の部分の下位群を挙げることができる。

式中、ｎは０～５０００、特に１～２０００、殊に３～１００である。

式（Ｉ）の部分は、以下のものから選択し得る。

式（Ｃ）の部分は、ｎが３である式（Ｉａ）の部分に対応する。

別の特定の実施形態では、リガンドＬは、中和抗体との相互作用を避けるための立体遮蔽剤であり、特にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はｐＨＰＭＡのような合成ポリマーから誘導されるものである。

他の実施形態では、リガンドＬは標識剤であり、特に、例えばフルオレセイン、ローダミン、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ、ｂｏｄｉｐｙのような蛍光色素又はナノ金粒子或いは^１８Ｆ、^{１２４，１２５，１３１}Ｉ、^６４Ｃｕ又は^６７Ｃｕのような放射性色素を用いる分析遺伝子導入のための標識剤である。

他の実施形態では、リガンドＬは、鉄粒子のような磁性剤である。

様々な性状のリガンドを、カプシドでの同時又は経時的化学カップリングによって組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター粒子にカップリングさせることができる。

カップリング法
本明細書で用いる「カップリング」という用語は、ＡＡＶ粒子の表面に存在する第一級アミノ基の、共有結合が形成される状態での第一級アミノ化学修飾をいう。カップリングは、ＡＡＶ粒子の構造的完全性及びそれらのコアタンパク質機能が維持される手順をいう。カプシドの表面のある種の第一級アミノ基だけが修飾される。

カップリングは水性緩衝液中で実施し得る。

インキュベーション時間は、１～２４時間、特に４時間とし得る。

インキュベーション温度は、２０～５０℃、特に室温とし得る。

反応は、ｐＨ７～９．６、特にｐＨ９．２～９．４の緩衝系で、例えばボルテックス撹拌などを用いて実施することができる。

緩衝液系は、ＴＲＩＳ緩衝食塩水、炭酸ナトリウム－重炭酸ナトリウム緩衝液、ＰＢＳ、ｄＰＢＳから選択し得る。好ましい緩衝液系はＴＲＩＳ緩衝食塩水（ＴＢＳ）である。

式（ＩＩ）の試薬の量は、１Ｅ５～１．５Ｅ７モル当量、特に３Ｅ５～３Ｅ６モル当量とし得る。

カップリング工程後、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（０．００１％）を透析前の溶液に添加する。

追加の工程として、遊離分子をタンジェンシャルフロー濾過又は透析（２４時間にわたってｄＰＢＳ＋０．００１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃに対して４回）によって除去することができる。

このプロセスの後に、ｑＰＲＣによる粒子の滴定及びキャラクタリゼーション（ＤＬＳ、ドットブロット及びウエスタンブロット）を行ってもよい。

カップリングに用いる実験条件、特にモル比によって、ＡＡＶ２のカプシド表面でのリガンドのカップリングを調節することができる。これらは、かかるウイルス粒子の治療指数を増大させることができる最良の比率を求めるために使用される。

特定の実施形態では、本発明は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター粒子を１以上のリガンドＬと化学的にカップリングさせるための方法であって、Ｂの（Ｌ）ｍＸ－部分が次の式（ＩＩＩ）のものである方法に関する。

式中、Ｌは上記で定義した通りであり、Ｙは２価又は多価の有機基であって、１～３９個の炭素原子、０～２０個の酸素原子、０～６個の窒素原子及び０～１個の硫黄原子を含む有機基である。

他の実施形態では、本発明は、Ｘが、次の基

（式中、ｎは０～５０００、特に１～５００、２～１００、殊に３～２０の整数を表し、例えば３である。）、又は次の基

（式中、ｎは０～５０００、特に１～２０００、殊に３～１００の整数を表し、特に３である。）を表す方法に関する。

式（ＩＩ）の試薬は、当業者に公知の方法で得ることができる。

上述の式（Ｂ）の部分を得るのに有用な式（ＩＩ）の試薬の調製の例として、詳細を以下のスキーム１に記載する。

式（ＩＩ）に属する化合物６が得られるが、その調製は後の実施例１にさらに詳しく記載されている。

化合物１を、工程（ｉ）で、極性溶媒（例えばエタノール、特に水素雰囲気下のエタノール）中、触媒（例えばＰｄ－Ｃ又はＰｄ（ＯＨ）_２）の存在下で、パラトルエンスルホン酸（ＡＰＴＳ）と反応させる。得られた化合物２を次の工程（ｉｉ）で強塩基性陰イオン交換樹脂（例えばＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲＮ７８）と反応させると、化合物３を得ることができる。

化合物６の合成方法Ａ
第１の実施形態では、化合物３を工程（ｉｉｉ）で、溶媒（例えばＤＭＦ）中で１，１’－チオカルボニルジ－２（１Ｈ）－ピリドンと反応させると、化合物４を得ることができる。得られた化合物４を、次の工程（ｉｖ）で、溶媒（例えばＤＭＦ）中、例えば４０～１００℃の範囲内の温度（例えば６０℃）で、好ましくは不活性雰囲気下、特に窒素雰囲気下で、ｐ－フェニレンジアミンと反応させると、化合物５を得ることができる。

この化合物５を次の工程（ｖ）で、溶媒（例えばＤＭＦ）中、例えば４０～１００℃の範囲内の温度（例えば６０℃）で、好ましくは不活性雰囲気下、特に窒素雰囲気下で、１，１’－チオカルボニルジ－２（１Ｈ）－ピリドンと反応させると、化合物６を得ることができる。

化合物６の合成方法Ｂ
第２の実施形態では、化合物３を、工程（ｖｉ）で、溶媒（例えばＤＭＦ）中で、例えば室温で、好ましくは不活性雰囲気下、特に窒素雰囲気下でｐ－フェニレンジイソチオシアネートと反応させると、化合物６を得ることができる。

上述の式（Ｃ）の部分を得るのに有用な式（ＩＩ）の試薬の調製の例として、詳細を以下のスキーム２に記載する。式（ＩＩ）に属する化合物１３が得られるが、その調製は後の実施例１にさらに詳しく記載されている。

上記のスキーム２から明らかなように、化合物１１は溶媒、特に乾燥エタノールに溶解することができ、次いでそれを極性溶媒（特に水素雰囲気下のエタノール）中、触媒（例えばＰｄ－Ｃ又はＰｄ（ＯＨ）_２）の存在下で、パラトルエンスルホン酸（ＡＰＴＳ）と反応させればよい。次いで反応液を水素雰囲気下で撹拌することができる。任意的な濾過及び蒸発段階の後、アジドの還元はＴＬＣ及び^１Ｈ ＮＭＲ分光法によって確認できる。次いで粗生成物を強塩基性陰イオン交換樹脂（例えばＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲＮ７８）と反応させると、化合物１２を得ることができる。

化合物１２を、工程（ｉｉｉ）で、溶媒（例えばＤＭＦ）中で、例えば室温で、好ましくは不活性雰囲気下、特に窒素雰囲気下でｐ－フェニレンジイソチオシアネートと反応させると、化合物１３を得ることができる。

上述の式（Ｄ）の部分を得るのに有用な式（ＩＩ）の試薬の調製の例として、詳細を以下のスキーム３に記載する。式（ＩＩ）に関連する化合物１７が得られるが、その調製は後の実施例１にさらに詳しく記載されている。

化合物１４を、工程（ｉ）で、極性溶媒（例えばエタノール、特に水素雰囲気下のエタノール）中、触媒（例えばＰｄ－Ｃ又はＰｄ（ＯＨ）_２）の存在下で、パラトルエンスルホン酸（ＡＰＴＳ）と反応させる。得られた化合物１５を次の工程（ｉｉ）で強塩基性陰イオン交換樹脂（例えばＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲＮ７８）と反応させると、化合物１６を得ることができる。

化合物１６を、工程（ｉｉｉ）で、溶媒（例えばＤＭＦ）中で、例えば室温で、好ましくは不活性雰囲気下、特に窒素雰囲気下でｐ－フェニレンジイソチオシアネートと反応させると、化合物１７を生成させることができる。

上述の式（Ｅ）及び（Ｆ）の部分を得るのに有用な式（ＩＩ）の試薬の調製の例として、詳細を以下のスキーム式４に記載する。式（ＩＩ）に属する化合物１８及び１９が得られるが、その調製は後の実施例１にさらに詳細に記載されている。

化合物３を、工程（ｉ）で、溶媒（例えばＤＭＦ）中で、例えば室温で、好ましくは不活性雰囲気下、特に窒素雰囲気下で、２，６－ピリジンジイソチオシアネートと反応させると、化合物１８を生成させることができる。

化合物３を、工程（ｉ）で、溶媒（例えばＤＭＦ）中で、例えば室温で、好ましくは不活性雰囲気下、特に窒素雰囲気下で、１，４－ナフタレンジイソチオシアネートと反応させると、化合物１９を生成させることができる。

後述の実施例２に示すように、チオウレア官能基とリガンドＬとの間の芳香族部分の存在、或いは

がリガンドＬの一部を形成するときのリガンドＬ内の芳香族部分の存在は、ＡＡＶカプシドへの式（ＩＩ）の試薬のグラフト化を達成する上で重要な役割を果たすと思われる。

実施例２、特に実施例２．８から、９を超えるｐＨでカップリング反応を実施することも本質的な特徴であるように思われる。ｐＨに対する耐性は、使用したＡＡＶセロタイプに依存し得ると認められることもあろう。実施例２では、ＡＡＶ２に対してｐＨ＞９を用いたが、他のセロタイプは異なるｐＨ感受性を有する可能性もある。

有益なことに、本発明者らは、得られたｒＡＡＶが、実施例、特に実施例２．８に示すように、感染力を保持することを見出した。

特定の実施形態では、得られた組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター粒子を、第２のカップリング工程においてカプシドタンパク質を、特に第１のカップリング工程では未反応のアミノ基との化学カップリングによって、修飾するために、さらに反応させてもよい。

組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター粒子及びその用途
本発明に係る組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター粒子の製造方法によって得られる組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター粒子も本発明の一部をなす。

本発明のｒＡＡＶベクターが標的とする細胞は、ヒト及び他の哺乳類、例えば霊長類、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌ、ラット及びマウスなどに由来し得る。

ｒＡＡＶベクターは、あらゆる細胞型、組織又は器官を標的とすることができ、制限はない。ｒＡＡＶを送達することができる細胞の例として、限定されるものではないが、肝細胞；網膜の細胞、すなわち光受容細胞、網膜色素上皮（ＲＰＥ）、双極細胞；筋細胞、すなわち筋芽細胞、衛星細胞；中枢神経系（ＣＮＳ）の細胞、すなわち神経細胞、グリア細胞；心臓の細胞；末梢神経系（ＰＮＳ）の細胞；骨芽細胞；腫瘍細胞；リンパ球などが挙げられる。ｒＡＡＶベクターを送達することができる組織及び器官の例として、肝臓、筋肉、心筋、平滑筋、脳、骨、結合組織、心臓、腎臓、肺、リンパ節、乳腺、ミエリン、前立腺、精巣、胸腺、甲状腺、気管などが挙げられる。好ましい細胞型は、肝細胞、筋肉細胞、ＣＮＳの細胞及びＰＮＳの細胞である。好ましい組織及び器官は肝臓、筋肉、心臓、眼及び脳である。

本発明に係る組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター粒子は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター粒子のトロピズムを変化させるために、特に所望の特定の器官、組織又は細胞型をターゲティングするため、特定の細胞又は組織の形質導入を増強するため、或いは中和抗体との相互作用を低減させるために使用し得る。この仮説は、Ｍｏｓｋａｌｅｎｋｏ他によって発表されたデータ（Ｍｏｓｋａｌｅｎｋｏ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｅｐｉｔｏｐｅ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉ－ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ｖｉｒｕｓ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ， ２０００． ７４（４）： ｐ．１７６１－６））と一致しており、この報文では、６種類のペプチドのサブセットが同定されており、これらは潜在的に単一の中和エピトープを再構成する。特記すべき点は、これらのペプチドのうちの３種類が１以上の第一級アミンを保有していることである。これらの第一級アミンの化学修飾は、理論的には、ＰＥＧ化ＡＡＶ２で既に実証されているように、既存の血清中和パターンに好適な影響を与えることができる。（Ｌｅｅ， Ｇ．Ｋ．， ｅｔ ａｌ．， ＰＥＧ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｍｏｄｅｒａｔｅｌｙ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｇａｉｎｓｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ， ２００５． ９２（１）： ｐ．２４－３４； Ｌｅ， Ｈ．Ｔ．， ｅｔ ａｌ．， Ｕｔｉｌｉｔｙ ｏｆ ＰＥＧｙｌａｔｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ． Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ， ２００５． １０８（１）： ｐ．１６１－７７）。

一実施形態では、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター粒子は、高い細胞型選択性又は高い標的特異性をもたらす。

特異的な器官又は組織は、例えば肝臓、心臓、脳、網膜又は骨格筋とし得る。

特異的な細胞型は、例えば、肝細胞、心筋細胞、筋細胞、神経細胞、網膜色素上皮細胞又は光受容細胞とし得る。

化学修飾組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター粒子は、該組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター粒子の薬用量を低減することができ、或いは同じ用量の非修飾ＡＡＶの有効性及び／又は毒性を改善することができるという利点を示す。本発明に係る組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター粒子は、該組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター粒子に対する液性免疫反応を損なうという利点もある。

本発明は、さらに、本発明に係る組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター粒子の医薬としての用途、特に治療用核酸を送達するため又はゲノム編集を誘導するための医薬としての用途、予防手段として用途、造影剤のような診断手段としての用途、又は遺伝子治療の効率研究のための用途に関する。

本組換えｒＡＡＶベクター粒子は標的細胞に核酸を送達するために使用することができる。

本組換えｒＡＡＶベクター粒子はインビボ又はエクスビボで投与することができる。

本発明に係る組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター粒子は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のトロピズムを変化させるため、特に所望の特定の器官、組織又は細胞型をターゲティングするため又は特定の細胞又は組織の形質導入を増強するためのものとすることができる。

本発明に係る組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター粒子は、該組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター粒子に対する液性免疫反応を損なうためのものとすることもできる。

本発明に係る組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター粒子は、中和抗体との相互作用を低減させるためのものとすることもできる。

一実施形態では、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター粒子は、その表面への抗体の結合を低減又は防止して、その抗体媒介クリアランスを低減又は防止する。

本発明に係る組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター粒子は、肝細胞、網膜、肺、心臓、腎臓、肝臓、脳、脾臓、腫瘍又は筋肉細胞に対して、特に肝細胞、網膜色素上皮（ＲＰＥ）、光受容細胞、筋細胞又は心筋細胞に対して、選択的トロピズムを有し得る。

本発明の利点の例示として、以下の実施例から明らかなように、ＡＡＶ２粒子の化学修飾は、ＡＡＶ粒子の使用に際して従前知られた上述の限界を、すべてではないにしろ、ある程度克服することができる。

このような限界は以下の通りまとめることができる。
・ＡＡＶ２による肝細胞形質導入は、ヒトを含むすべての哺乳動物で低い。
・治療効果を達成するには高用量のベクター（１ｋｇ当たり約１０^１２個のＡＡＶ２粒子）を注射することが必要とされるが、この用量は治療効果に有害な免疫毒性を生じかねない。
・肝細胞だけでなく、肝臓の最大３０％を示す肝臓細網内皮系区画の他の細胞型もＡＡＶ２によって形質導入されてしまう。このような形質導入プロファイルの「分散」は、ＡＡＶの治療指数を低下させる。
・ＡＡＶ２の全身注射はＴ細胞反応を誘導又は活性化し、結局は形質導入細胞の排除を招く。
・人口の８０％以上がＡＡＶ２に対する中和抗体を有しているため、大量のウイルス粒子を投与しない限り、効率的な形質導入ができない。

上述の化合物６及び１３のように、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）誘導体であるリガンドをＡＡＶ２粒子表面に導入すると、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＰＧｒ）を介して肝細胞の選択的形質導入が増大する。

数ある選択的標的組織の中でも、特に網膜色素上皮（ＲＰＥ）、骨格筋を挙げることができる。

肝細胞ターゲティング戦略は、肝臓細網内皮系その他末梢標的（脾臓、心臓、肺など）での標的外形質導入事象を減少させることができる。総合的に、本発明に係る化学修飾は、治療指数の向上をもたらすとともに、既存の中和抗体に対する組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター粒子の感受性の低下及び／又は修飾カプシドに対する液性免疫反応の低減をもたらす。

そこで、さらに別の態様では、本発明はさらに、本発明に係る組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター粒子を薬学的に許容される媒体中に含む医薬組成物を提供する。

本組成物の宿主細胞又は標的細胞への送達は、様々な治療その他の目的のために実施し得る。

本医薬組成物は、特に本発明に係る１種以上の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター粒子の有効量を含有し得る。

「有効量」とは、制御又は治療すべき状態に良い変化を起こすのに十分であるが、重篤な副作用を回避するだけ十分に低い量を意味する。有効量は、得られる薬学的効果又は治療すべき特定の状態、エンドユーザーの年齢及び健康状態、治療／予防すべき状態の重症度、治療期間、他の治療の種類、用いる具体的な化合物又は組成物、投与経路などの因子に応じて変動し得る。

治療用製剤の当業者であれば、過度の実験を要することも個人的知識に依拠することもなく、所与の適応症に対して本発明の化合物の治療有効量を確認することができよう。

本発明の医薬組成物は、用量、剤形、投与経路などに応じて、公知の適切な薬学的に許容される添加物を用いて製剤化することができる。

本明細書で用いる「薬学的に許容される添加物」という用語は、あらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などを包含する。活性化合物と適合しない場合を除いて、従来のあらゆる添加物について、本発明の医薬又は医薬組成物における使用が想定される。

本発明の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター粒子は、目的のヌクレオチド配列を標的細胞に送達する方法にも使用し得る。この方法は、特に、目的の治療用遺伝子を、それを必要とする対象の細胞に送達するための方法とすることができる。

本発明によって、治療レベルのポリペプチド、タンパク質又はオリゴヌクレオチドが発現されるように、治療用外来性ＤＮＡ配列にコードされたポリペプチド、タンパク質又はオリゴヌクレオチドの対象の細胞内でのインビボ発現が可能となる。これらの結果は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター粒子送達のインビボモード及びインビトロモードの両方で認められる。

本発明は、送達方法に関して限定的なものではない。例えば、送達は局所的、組織内（例えば筋肉内、心臓内、肝臓内、腎臓内、脳内）、結膜（例えば眼窩外、眼窩内、眼窩後、網膜内、網膜下）、粘膜（例えば経口、直腸、鼻、肺）、くも膜下腔内、膀胱内、頭蓋内、全身、腹腔内、皮下、皮膚、血管内（例えば静脈内、動脈内）及びリンパ内とすることができる。別の態様では、高圧血管内注入（例えば静脈内又は動脈内注入）による受動的組織形質導入である。

さらに、送達は１種類のｒＡＡＶベクターに限定されるものではない。別の態様では、異なる外来性ＤＮＡ配列を含む複数のｒＡＡＶベクターを、標的細胞、組織、器官又は対象に同時に又は順次送達し得る。この戦略によって複数の遺伝子の発現が可能になる。

本発明の特定の実施形態では、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター粒子は静脈内投与される。

ｒＡＡＶの適切な用量は、治療すべき状態、治療すべき対象の健康状態、年齢及び体重だけでなく、適用法及び組織に応じて、当業者が容易に決定し得る。

例えば、網膜には１０^１１ｖｇ／患者が必要とされることがあり、血友病、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）又はデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）のような全身適用については、必要量は１０^１４ｖｇ／患者を超えることがある。

本発明は、上記組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター粒子の、診断方法における使用又は遺伝子治療における使用、特に、心不全、神経障害、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）のような筋障害、肝疾患、血液疾患、代謝疾患、眼病又はがん（網膜症を含む）を始めとする遺伝性障害又は後天性障害の治療のための使用に関する。また、上記組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター粒子は、免疫療法及びワクチン接種にも使用できる。

特定の実施形態では、上記組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター粒子は、肝臓、網膜及び神経筋の遺伝的疾患から選択される適応症に対して特に有用である。

本発明はさらに、本発明のｒＡＡＶをそれを必要とする対象に送達する方法であって、本発明の１種以上のｒＡＡＶを含む組成物を投与する１以上の工程を含む方法に関する。

以下の実施例及び図面を参照することによって本発明の理解を深めることができるであろう。ただし、これらの実施例及び図面は専ら例示のためのものであり、本発明を限定するものと解釈するべきではない。

材料
すべての化学試薬はＡｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ社又はＡｌｄｒｉｃｈ社から購入し、それ以上精製せずに使用した。ＡＡＶカプシドタンパク質（Ｂ１）、ウサギポリクローナル及びマウスモノクローナルＡ２０は、ＰＲＯＧＥＮ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ社から入手した。フルオレセイン標識化合物を検出するためのＡｎｔｉ－Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ－ＡＰ，Ｆａｂフラグメント（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）はＲｏｃｈｅ社から入手した。ＦＩＴＣ－大豆凝集素（ＳＢＡ）は、Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社から購入した。無水条件を必要とする反応は窒素下で実施した。すべての化合物は、^１Ｈ（４００．１３３又は３００．１３５ＭＨｚ）、^１３Ｃ（１２５．７７３又は７５．４８０ＭＨｚ）ＮＭＲ分光法（Ｂｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ３００ Ｕｌｔｒａ Ｓｈｉｅｌｄ又はＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ＩＩＩ ４００分光計）によって十分に特性解析した。ケミカルシフトはｐｐｍ単位で記載し、カップリング定数はＨｚ単位で記載する。以下の略語を使用した：ｓ＝シングレット、ｄ＝ダブレット、ｔ＝トリプレット、ｑ＝カルテット、クイン＝クインテット、ｂｒ＝ブロードシングレット。必要に応じて、^１３Ｃ異種核ＨＭＱＣ及びＨＭＢＣを用いて、構造を明確にした。高分解能マススペクトル（ＨＲＭＳ）は、ＴｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒハイブリッドＬＴＱ－オービトラップ分光計（ＥＳＩ＋）及びＢｒｕｋｅｒ Ａｕｔｏｆｌｅｘ ＩＩＩ ＳｍａｒｔＢｅａｍ分光計（ＭＡＬＤＩ）を用いて記録した。

すべての生成物は、ＵＶ及びＤＬＳ検出器を備えるフラッシュクロマトグラフィー（ＧＲＡＣＥ ＲＥＶＥＬＥＲＩＳ Ｆｌａｓｈ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｓｙｓｔｅｍ）によって精製した。

化合物１３は、Ｗａｔｅｒｓ社製のＵＰＬＣ Ｈ－Ｃｌａｓｓを用いたＨＰＬＣによって精製した。

実施例１：式（ＩＩ）の試薬及び比較反応体の合成
比較反応体９の合成スキーム

比較反応体２２の合成スキーム

本明細書で既に定義した化合物１、化合物７、化合物１０、２,６－ピリジンジイソチオシアネート及び１,４ナフタレンジイソチオシアネートは、文献、特に以下の報文及び特許文献の記載に従って合成した。
－［１］Ｒｅｎｓｅｎ ＰＣ ｅｔ ａｌ． “Ｄｅｓｉｇｎ及びｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｎｏｖｅｌ Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ－ｔｅｒｍｉｎａｔｅｄ ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄｓ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｏ ｔｈｅ ｈｅｐａｔｉｃ ａｓｉａｌｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ”． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． ２００４；４７：５７９８－８０８、及び
－［２］Ｒａｊｅｅｖ ＫＧ， ｅｔ ａｌ． “Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ａｇｅｎｔｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｗｉｔｈ ｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｌｉｇａｎｄｓ”国際公開第２０１２０３７２５４号、２０１２。
－［３］Ｃｈｅｖｏｌｏｔ Ｙ， ｅｔ ａｌ． “ＤＮＡ－Ｂａｓｅｄ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｂｉｏｃｈｉｐｓ： Ａ Ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｇｌｙｃｏ－Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”． Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ２００７；４６：２３９８－２４０２。
－［４］Ｎａｇａｒａｊａｎ， Ｋ．， ｅｔ ａｌ． “Ｑｕｅｓｔ ｆｏｒ ａｎｔｈｅｌｍｉｎｔｉｃ ａｇｅｎｔｓ． Ｐａｒｔ Ｉ． Ｐａｒａ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ ｐｈｅｎｙｌｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅｓ， ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｙｌｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅｓ ａｎｄ ｂｉｓｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅｓ，”． Ｉｎｄｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， ４８（３）， ５３－９； １９８６。

化合物１（２８４ｍｇ、０．５６ｍｍｏｌ）を乾燥エタノールに溶解し、次いでＡＰＴＳ（１０７ｍｇ、０．５６ｍｍｏｌ）を添加した後、１０％のＰｄ－Ｃ（１０重量％）を添加した。３回の真空／Ｈ_２サイクル後、反応液をＨ_２雰囲気下２０℃で一晩撹拌した。次いで溶液を濾過し、減圧下で蒸発させた。アジドの還元はＴＬＣ及び^１Ｈ ＮＭＲで確認した。蒸発後、粗生成物に１０ｍＬのメタノール及び１０ｍＬの水を添加し、次いでＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲＮ７８樹脂を添加した。反応液を２０℃で３時間撹拌し、次いで濾過し、減圧下で蒸発させた（収率：化合物３＝７７％）。
化合物３：^１Ｈ ＮＭＲ（ＭｅＯＤ）：２．０（ｓ，３Ｈ，ＮＡｃ），２．７９（ｔ，２Ｈ，ＣＨ_２ＮＨ_２，Ｊ_Ｈ－Ｈ＝５．２Ｈｚ），３．４－４．０（ｍ，１６Ｈ，ＣＨ_２Ｏ，Ｈ－２，Ｈ－３，Ｈ－４，Ｈ－５，Ｈ－６），４．４４（ｄ，１Ｈ，Ｈ－１，Ｊ_１－２＝８．４Ｈｚ）；^１３Ｃ ＮＭＲ（ＭｅＯＤ）：２３．１，４２．１，５４．３，６２．６，６９．７，６９．８，７１．３，７１．５，７１．６，７３．５，７３．６，７６．８，１０３．１，１７４．２；Ｃ_１４Ｈ_２９Ｎ_２Ｏ_８のＨＲＭＳ（ＭＡＬＤＩ）［Ｍ＋Ｈ］^＋，理論値：３５３．１９２４、実測値：３５３．１９１８。

化合物３（１６２ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦに溶解し、次いで１，１’－チオカルボニルジ－２（１Ｈ）－ピリドン（１１７ｍｇ、０．５１ｍｍｏｌ）を添加し、反応液をＮ_２雰囲気下２０℃で一晩撹拌した。溶液を次いで減圧下で蒸発させ、フラッシュクロマトグラフィーで精製した（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ：１００／０～８０／２０）。（収率：化合物４＝８８％）。
化合物４：^１Ｈ ＮＭＲ（ＭｅＯＤ）：２．０（ｓ，３Ｈ，ＮＡｃ），３．４－４．０（ｍ，１９Ｈ，ＣＨ_２Ｏ，ＣＨ_２ＮＣＳ，Ｈ－２，Ｈ－３，Ｈ－４，Ｈ－５，Ｈ－６），４．４４（ｄ，１Ｈ，Ｈ－１，Ｊ_１－２＝８．４Ｈｚ）；^１３Ｃ ＮＭＲ（ＭｅＯＤ）：２３．１，４６．３，５４．３，６２．６，６９．７，６９．８，７０．５，７１．５，７１．６，７３．５，７３．６，７６．８，１０３．１，１３３．２，１７４．２；Ｃ_１５Ｈ_２６Ｎ_２Ｏ_８ＮａＳのＨＲＭＳ（ＭＡＬＤＩ）［Ｍ＋Ｎａ］^＋，理論値：４１７．１３０８、実測値：４１７．１３１８。

化合物６の合成方法Ａ
化合物４（５０ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦに溶解し、次いでｐ－フェニレンジアミン（２８ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）を添加し、反応液をＮ_２雰囲気下７０℃で一晩撹拌した。溶液を次いで減圧下で蒸発させ、フラッシュクロマトグラフィーで精製した（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ：１００／０～８０／２０）。（収率：化合物５＝７４％）。
化合物５：^１Ｈ ＮＭＲ（ＭｅＯＤ）：１．９７（ｓ，３Ｈ，ＮＡｃ），３．４－４．０（ｍ，１７Ｈ，ＣＨ_２Ｏ，Ｈ－２，Ｈ－３，Ｈ－４，Ｈ－５，Ｈ－６），４．４３（ｄ，１Ｈ，Ｈ－１，Ｊ_１－２＝８．４Ｈｚ），６．７２（ｄ，２Ｈ，Ｊ_Ｈ－Ｈ＝８．８Ｈｚ），６．９８（ｄ，２Ｈ，Ｊ_Ｈ－Ｈ＝８．８Ｈｚ）；^１３Ｃ ＮＭＲ（ＭｅＯＤ）：２３．１，４５．４，５４．４，６２．６，６９．７，６９．８，７０．４，７１．４，７１．５，７１．６，７３．４，７６．８，１０３．１，２×１１６．９，２×１２８．１，１２８．３，１４８．３，１７４．１，１８２．４；Ｃ_２１Ｈ_３５Ｎ_４Ｏ_８ＳのＨＲＭＳ（ＭＡＬＤＩ）［Ｍ＋Ｈ］^＋，理論値：５０３．２１７６、実測値：５０３．２１７１。

化合物５（４７ｍｇ、０．０９３ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦに溶解し、次いで１，１’－チオカルボニルジ－２（１Ｈ）－ピリドン（２４ｍｇ、０．１０２ｍｍｏｌ）を添加し、反応液をＮ_２雰囲気下６０℃で一晩撹拌した。溶液を次いで減圧下で蒸発させ、フラッシュクロマトグラフィーで精製した（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ：１００／０～８０／２０）。（収率：化合物６＝６０％）。
化合物６：^１Ｈ ＮＭＲ（ＭｅＯＤ）：１．９９（ｓ，３Ｈ，ＮＡｃ），３．４－４．０（ｍ，１７Ｈ，ＣＨ_２Ｏ，Ｈ－２，Ｈ－３，Ｈ－４，Ｈ－５，Ｈ－６），４．４２（ｄ，１Ｈ，Ｈ－１，Ｊ_１－２＝８．４Ｈｚ），７．２４（ｄ，２Ｈ，Ｊ_Ｈ－Ｈ＝８．８Ｈｚ），７．５４（ｄ，２Ｈ，Ｊ_Ｈ－Ｈ＝８．８Ｈｚ）；^１３Ｃ ＮＭＲ（ＭｅＯＤ）：２３．２，４５．４，５４．３，６２．６，６９．７，６９．９，７０．３，７１．４，７１．５，７１．６，７３．４，７６．８，１０３．２，２×１２５．８，２×１２７．１，１２８．５，１３６．６，１３９．８，１７４．２，１８２．５；Ｃ_２２Ｈ_３３Ｎ_４Ｏ_８Ｓ_２のＨＲＭＳ（ＭＡＬＤＩ）［Ｍ＋Ｈ］^＋，理論値：５４５．１７４０、実測値：５４５．１７４２。

化合物６の合成方法Ｂ
化合物３（６４ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦに溶解し、次いでｐ－フェニレンジイソチオシアネート（１７５ｍｇ、０．９ｍｍｏｌ）を添加し、反応液をＮ_２雰囲気下２０℃で２時間撹拌した。溶液を次いで減圧下で蒸発させ、フラッシュクロマトグラフィーで精製した（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ：１００／０～８０／２０）。（収率：化合物６＝８５％）。
化合物６：^１Ｈ ＮＭＲ（ＭｅＯＤ）：１．９９（ｓ，３Ｈ，ＮＡｃ），３．４－４．０（ｍ，１７Ｈ，ＣＨ_２Ｏ，Ｈ－２，Ｈ－３，Ｈ－４，Ｈ－５，Ｈ－６），４．４２（ｄ，１Ｈ，Ｈ－１，Ｊ_１－２＝８．４Ｈｚ），７．２４（ｄ，２Ｈ，Ｊ_Ｈ－Ｈ＝８．８Ｈｚ），７．５４（ｄ，２Ｈ，Ｊ_Ｈ－Ｈ＝８．８Ｈｚ）；^１３Ｃ ＮＭＲ（ＭｅＯＤ）：２３．２，４５．４，５４．３，６２．６，６９．７，６９．９，７０．３，７１．４，７１．５，７１．６，７３．４，７６．８，１０３．２，２×１２５．８，２×１２７．１，１２８．５，１３６．６，１３９．８，１７４．２，１８２．５；Ｃ_２２Ｈ_３３Ｎ_４Ｏ_８Ｓ_２のＨＲＭＳ（ＭＡＬＤＩ）［Ｍ＋Ｈ］^＋，理論値：５４５．１７４０、実測値：５４５．１７４２。

化合物７（９８１ｍｇ、２．９８ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＣＭに溶解し、次いで２－（２－エトキシエトキシ）エタノール（４０４μＬ、２．９８ｍｍｏｌ）及びモレキュラーシーブを添加して溶液をＮ_２雰囲気下２０℃で０．５時間撹拌した。次いでＴＭＳＯＴｆ（２７０μＬ、１.４９ｍｍｏｌ）をＮ_２雰囲気下０℃で溶液に添加した。溶液を０℃で０．５時間撹拌し、Ｎ_２雰囲気下２０℃で一晩撹拌した。蒸発後の残渣をＤＣＭに溶解し、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液、水及び塩水でそれぞれ洗浄し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥させ、濾過し、蒸発させた。溶液を次いで減圧下で蒸発させ、フラッシュクロマトグラフィーで精製した（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ：１００／０～９５／５）。（収率：化合物８＝７３％）。
化合物８：^１Ｈ ＮＭＲ（ＭｅＯＤ）：１．１９（ｔ，３Ｈ，ＣＨ_３，Ｊ_Ｈ－Ｈ＝７．２Ｈｚ），１．９３（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ_３），１．９４（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ_３），２．０３（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ_３），２．１４（ｓ，３Ｈ，ＮＡｃ），３．５－４．２（ｍ，１４Ｈ，ＣＨ_２Ｏ，Ｈ－２，Ｈ－５，Ｈ－６），４．６７（ｄ，１Ｈ，Ｈ－１，Ｊ_１－２＝８．４Ｈｚ），５．０４（ｄｄ，１Ｈ^３，Ｊ_３－４＝３．２Ｈｚ，Ｊ_３－２＝１１．２Ｈｚ），５．３３（ｄ，１Ｈ－４，Ｊ_３－４＝３．２Ｈｚ）；^１３Ｃ ＮＭＲ（ＭｅＯＤ）：１５．４，２０．５，２×２０．６，２２．９，５１．６，５４．８，６２．７，６７．６，６８．２，７０．０，７０．９，７１．６，７１．８，７２．３，１０２．８，１７１．７，２×１７２．１，１７３．５；Ｃ_２０Ｈ_３４ＮＯ_１１のＨＲＭＳ（ＭＡＬＤＩ）［Ｍ＋Ｈ］^＋，理論値：４６４．２１３２、実測値：４６４．２１４１。

化合物８を１０ｍＬのメタノール及び１０ｍＬの水に溶解し、次いでＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲＮ７８樹脂を添加した。混合物を２０℃で３時間撹拌し、次いで濾過し、減圧下で蒸発させた（収率：化合物９＝７７％）。
化合物９：^１Ｈ ＮＭＲ（ＭｅＯＤ）：１．２（ｔ，３Ｈ，Ｊ_Ｈ－Ｈ＝６．８Ｈｚ），１．９９（ｓ，３Ｈ，ＮＡｃ），３．４－４．０（ｍ，１６Ｈ，ＣＨ_２Ｏ，Ｈ－２，Ｈ－３，Ｈ－４，Ｈ－５，Ｈ－６），４．４５（ｄ，１Ｈ，Ｈ－１，Ｊ_１－２＝８．４Ｈｚ）；^１３Ｃ ＮＭＲ（ＭｅＯＤ）：１５．４，２３．１，５４．３，６２．６，６７．６，６９．７，６９．８，７１．０，７１．６，７１．７，７３．６，７６．８，１０３．１，１７４．２；Ｃ_１４Η_２８ΝＯ_８のＨＲＭＳ（ＭＡＬＤＩ）［Ｍ＋Ｈ］^＋，理論値：３３８．１８１５、実測値：３３８．１８１９。

化合物１０（１００ｍｇ、０．０５２ｍｍｏｌ）を乾燥エタノールに溶解し、次いでＡＰＴＳ（１０ｍｇ、０．０５２ｍｍｏｌ）を添加した後、Ｐｄ－Ｃ（１０重量％）を添加した。３回の真空／Ｈ_２サイクル後、反応液をＨ_２雰囲気下２０℃で一晩撹拌した。次いで溶液を濾過し、減圧下で蒸発させた。アジドの還元はＴＬＣ及び^１Ｈ ＮＭＲで確認した。蒸発後、粗生成物に１０ｍＬのメタノール及び１０ｍＬの水を添加し、次いでＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲＮ７８樹脂を添加した。反応液を２０℃で３時間撹拌し、次いで濾過し、減圧下で蒸発させた（収率：化合物１２＝７６％）。
化合物１２：^１Ｈ ＮＭＲ（ＭｅＯＤ）：１．９９（ｓ，９Ｈ，ＮＡｃ），２．７９（ｔ，６Ｈ，ＣＨ_２ＣＯ，Ｊ_Ｈ－Ｈ＝６Ｈｚ），３．２２（ｓ，２Ｈ，ＣＨ_２ＮＨ_２），３．４－４．０（ｍ，６６Ｈ，ＣＨ_２Ｏ，Ｈ－２，Ｈ－３，Ｈ－４，Ｈ－５，Ｈ－６），４．４４（ｄ，３Ｈ，Ｈ－１，Ｊ_１－２＝８．４Ｈｚ），^１３Ｃ ＮＭＲ（ＭｅＯＤ）：３×２３．１，３×３７．６，３×４０．４，４５．７，３×５４．３，６１．２，３×６２．６，３×６８．０，３×６９．７，３×６９．８，３×７０．２，３×７０．７，３×７１．４，３×７１．５，３×７１．６，３×７３．５，３×７６．８，３×１３０．１，３×１７４．０，３×１７４．１，１７５．３５；Ｃ_５７Ｈ_１０５Ｎ_８Ｏ_３１のＨＲＭＳ（ＭＡＬＤＩ）［Ｍ＋Ｈ］^＋，理論値：１３９７．６８８６、実測値：１３９７．６８０３。

化合物１２（６４ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦに溶解し、次いでｐ－フェニレンジイソチオシアネート（１７５ｍｇ、０．９ｍｍｏｌ）を添加し、反応液をＮ_２雰囲気下２０℃で２時間撹拌した。溶液を次いで減圧下で蒸発させた。粗生成物をまずＤＣＭで洗浄してｐ－フェニレンジイソチオシアネートの大半を除去し、次いで分取ＨＰＬＣで精製した。（収率：化合物１３＝８％）。
化合物１３：^１Ｈ ＮＭＲ（ＭｅＯＤ）：２．００（ｓ，９Ｈ，ＮＡｃ），２．４６（ｔ，６Ｈ，ＣＨ_２ＣＯ，Ｊ_Ｈ－Ｈ＝６Ｈｚ），３．３０－４．２０（ｍ，６６Ｈ，ＣＨ_２Ｏ，Ｈ－２，Ｈ－３，Ｈ－４，Ｈ－５，Ｈ－６），４．２８（ｓ，２Ｈ，ＣＨ_２ＮＨ_２），４．４６（ｄ，３Ｈ，Ｈ－１，Ｊ_１－２＝８．４Ｈｚ），７．２９（ｄ，２Ｈ，Ｊ_Ｈ－Ｈ＝９Ｈｚ），７．６０（ｄ，２Ｈ，Ｊ_Ｈ－Ｈ＝９Ｈｚ）；Ｃ_６５Ｈ_１０８Ｎ_１０Ｏ_３１ＮａＳ_２のＨＲＭＳ（ＭＡＬＤＩ）［Ｍ＋Ｎａ］^＋，理論値：１６１１．６５２１、実測値：１６１１．６４８７。

化合物１４（２５０ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ）を乾燥エタノールに溶解し、次いでＡＰＴＳ（９４．１ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ）を添加した後、１０％のＰｄ－Ｃ（１０重量％）を添加した。３回の真空／Ｈ_２サイクル後、反応液をＨ_２雰囲気下２０℃で一晩撹拌した。次いで溶液を濾過し、減圧下で蒸発させた。アジドの還元はＴＬＣ及び^１Ｈ ＮＭＲで確認した。蒸発後、粗生成物に１０ｍＬのメタノール及び１０ｍＬの水を添加し、次いでＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲＮ７８樹脂を添加した。反応液を２０℃で３時間撹拌し、次いで濾過し、減圧下で蒸発させた（収率：化合物１６＝８６％）。
化合物１６：^１Ｈ ＮＭＲ（ＭｅＯＤ）：２．８０（ｔ，２Ｈ，ＣＨ_２ＮＨ_２，Ｊ_Ｈ－Ｈ＝５．４Ｈｚ），３．５－４．０（ｍ，１６Ｈ，ＣＨ_２Ｏ，Ｈ－２，Ｈ－３，Ｈ－４，Ｈ－５，Ｈ－６），４．８１（ｄ，１Ｈ，Ｈ－１，Ｊ_１－２＝１．８Ｈｚ）；Ｃ_１２Ｈ_２６ＮＯ_８のＨＲＭＳ（ＭＡＬＤＩ）［Ｍ＋Ｈ］^＋，理論値：３１１．１６０３、実測値：３１１．１６００。

化合物１６（１０５ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦに溶解し、次いでｐ－フェニレンジイソチオシアネート（３２５ｍｇ、１.７ｍｍｏｌ）を添加し、反応液をＮ_２雰囲気下２０℃で２時間撹拌した。溶液を次いで減圧下で蒸発させ、フラッシュクロマトグラフィーで精製した（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ：１００／０～８０／２０）。（収率：化合物１７＝８５％）。
化合物１７：^１Ｈ ＮＭＲ（ＭｅＯＤ）：３．５－４．０（ｍ，１８Ｈ，ＣＨ_２Ｏ，ＣＨ_２Ｎ，Ｈ－２，Ｈ－３，Ｈ－４，Ｈ－５，Ｈ－６），４．８２（ｄ，１Ｈ，Ｈ－１，Ｊ_１－２＝１．８Ｈｚ）；７．２６（ｄ，２Ｈ，Ｊ_Ｈ－Ｈ＝８．８Ｈｚ），７．５２（ｄ，２Ｈ，Ｊ_Ｈ－Ｈ＝８．８Ｈｚ）；Ｃ_２０Ｈ_２９Ｎ_３Ｏ_８ＮａＳ_２のＨＲＭＳ（ＭＡＬＤＩ）［Ｍ＋Ｎａ］^＋，理論値：５２６．１３０２、実測値：５２６．１２９４。

化合物３（２５ｍｇ、０．０７１ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦに溶解し、次いで２，６－ピリジンジイソチオシアネート（６８ｍｇ、０．９ｍｍｏｌ）を添加し、反応液をＮ_２雰囲気下２０℃で２時間撹拌した。次いで溶液を減圧下で蒸発させ、ＣＨ_３ＣＮ及びＤＣＭで数回洗浄した。（収率：化合物１８＝４２％）。
化合物１８：^１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：１．７９（ｓ，３Ｈ，ＮＡｃ），３．２－４．６（ｍ，１８Ｈ，ＣＨ_２Ｏ，Ｈ－２，Ｈ－３，Ｈ－４，Ｈ－５，Ｈ－６），４．２８（ｄ，１Ｈ，Ｈ－１，Ｊ_１－２＝８．４Ｈｚ），７．０７（ｄ，１Ｈ，Ｊ_Ｈ－Ｈ＝７．５Ｈｚ），７．１６（ｄ，１Ｈ，Ｊ_Ｈ－Ｈ＝８．１Ｈｚ），７．６０（ｍ，ＮＨ），７．８６（ｔ，１Ｈ，Ｊ_Ｈ－Ｈ＝８．１Ｈｚ）；Ｃ_２１Ｈ_３２Ｎ_５Ｏ_８Ｓ_２のＨＲＭＳ（ＭＡＬＤＩ）［Ｍ＋Ｈ］^＋，理論値：５４６．１６９７、実測値：５４６．１６９２。

化合物３（２５ｍｇ、０．０７１ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦに溶解し、次いで１，４－ナフタレンジイソチオシアネート（８６ｍｇ、０．３５５ｍｍｏｌ）を添加し、反応液をＮ_２雰囲気下２０℃で２時間撹拌した。溶液を次いで減圧下で蒸発させ、フラッシュクロマトグラフィーで精製した（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ：１００／０～８０／２０）。（収率：化合物１９＝５８％）。
化合物１９：^１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：１．８０（ｓ，３Ｈ，ＮＡｃ），３．２－４．６（ｍ，１８Ｈ，ＣＨ_２Ｏ，Ｈ－２，Ｈ－３，Ｈ－４，Ｈ－５，Ｈ－６），４．２９（ｄ，１Ｈ，Ｈ－１，Ｊ_１－２＝８．４Ｈｚ），７．６－８．１（ｍ，８Ｈ，６Ｈ_ａｒｏｍ，２ＮＨ），９．８３（ｍ，１Ｈ，ＮＨ）；Ｃ_２６Ｈ_３４Ｎ_４Ｏ_８ＮａＳ_２のＨＲＭＳ（ＭＡＬＤＩ）［Ｍ＋Ｎａ］^＋，理論値：６１７．１７１７、実測値：６１７．１７１６。

化合物２０（５００ｍｇ、１.２８ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＣＭに溶解し、次いで２－（２－エトキシエトキシ）エタノール（１７４μＬ、１.２８ｍｍｏｌ）及びＴＦＡ－Ａｇ（４２４ｍｇ、１．９２ｍｍｏｌ）を溶液に添加した。溶液を撹拌しながら、室温でＳｎＣｌ_４（１ＭのＣＨ_２Ｃｌ_２溶液、３．８４ｍＬ、３．８４ｍｍｏｌ）を滴下し（３０分以内）、Ｎ_２雰囲気下２０℃で３時間撹拌した。次いで、溶液を、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液、水及び塩水でそれぞれ洗浄し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥させ、濾過した。溶液を次いで減圧下で蒸発させ、フラッシュクロマトグラフィーで精製した（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ：１００／０～９５／５ ）。（収率：化合物２１＝７３％）。糖修飾をＴＬＣ及びマススペクトルで確認し、次いで化合物２１（１５０ｍｇ、０．３２３ｍｍｏｌ）１０ｍＬのメタノール及び１０ｍＬの水に溶解し、次いでＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲＮ７８樹脂を添加した。混合物を２０℃で３時間撹拌し、次いで濾過し、減圧下で蒸発させた（収率：化合物２２＝７７％）。
化合物２２：^１Ｈ ＮＭＲ（ＭｅＯＤ）：１．１９（ｔ，３Ｈ，Ｊ_Ｈ－Ｈ＝６．９Ｈｚ），３．４－４．０（ｍ，１６Ｈ，ＣＨ_２Ｏ，Ｈ－２，Ｈ－３，Ｈ－４，Ｈ－５，Ｈ－６），４．７９（ｄ，１Ｈ，Ｈ－１，Ｊ_１－２＝１．８Ｈｚ）；Ｃ_２０Ｈ_２９Ｎ_３Ｏ_８ＮａＳ_２のＨＲＭＳ（ＭＡＬＤＩ）［Ｍ＋Ｎａ］^＋，理論値：５２６．１３０２、実測値：５２６．１２９４。

実施例２：化学修飾ＡＡＶ２によるヒト初代培養肝細胞の形質導入
２．１．ＡＡＶ２の生産と精製
ＡＡＶ２ベクターは、ＡＡＶ Ｒｅｐ２－Ｃａｐ２及びアデノウイルスヘルパー遺伝子（Ｅ２Ａ、ＶＡ ＲＮＡ及びＥ４）をコードするｐＨｅｌｐｅｒ，ＰＤＰ２－ＫＡＮＡ並びにｐＶｅｃｔｏｒ ｓｓ－ＣＡＧ－ｅＧＦＰの２つのプラスミドから生産した。すべてのベクターは、リン酸カルシウム－ＨｅＢＳ法を用いたＨＥＫ２９３細胞の一過性トランスフェクションによって生産した。トランスフェクションして４８時間後に、ベクターで生成した細胞を収集し、まず３７℃で１時間１％Ｔｒｉｔｏｎ及びベンゾナーゼ（２５Ｕ／ｍＬ）で処理した。３７℃で１時間インキュベートした後、バルクを２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、凍結融解サイクルに付してベクター粒子を遊離させた。細胞残渣を２５００ｒｐｍで１５分間遠心分離して除去した。細胞溶解物をＰＥＧで一晩沈殿させ、４０００ｒｐｍで１時間遠心分離して清澄化した。次いで沈殿をベンゾナーゼと３７℃で３０分間インキュベートし、４℃で１０分間１００００ｇで遠心分離した後に回収した。ベクターを二重塩化セシウム（ＣｓＣｌ）勾配超遠心分離によって精製した。次いで、ウイルス懸濁液を、Ｓｌｉｄｅ－ａ－Ｌｙｚｅｒカセット（Ｐｉｅｒｃｅ社）で、若干撹拌しながらｄＰＢＳ（Ｃａ^＋＋及びＭｇ^＋＋を含有する）に対して４回続けて透析した。

２．２．カップリング及び精製（本発明及び比較反応体を用いて）
下記の式のフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）（発明外）、化合物６（本発明）、化合物９（比較）、化合物１３（本発明）、化合物１６（比較）、化合物１７（本発明）、化合物１８（本発明）、化合物１９（本発明）又は化合物２２（比較）を含有するＴＲＩＳ緩衝液ｐＨ９．３の溶液に、ＡＡＶ２－ＧＦＰ（１Ｅ１２ｖｇ、２．４９ｎｍｏｌ）を様々なモル比（３Ｅ５～１．５Ｅ７当量）で添加し、２０℃で４時間インキュベートした。次にベクターを含む溶液をｄＰＢＳ＋０．００１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃに対して透析して、ＡＡＶカプシドに結合していない遊離分子を除去した。

２．３．ウイルスゲノム抽出
ベクターサンプル中の残留ＤＮＡを除去するため、３μＬのＡＡＶ２又は化学修飾ＡＡＶ２を３７℃で４５分間２０単位のＤＮａｓｅＩ（Ｒｏｃｈｅ社＃０４７１６７２８００１）で処理した。ＤＮａｓｅＩ処理後、２０μＬのプロテイナーゼＫ ２０ｍｇ／ｍＬ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ－ＮＡＧＥＬ社＃７４０５０６）を加え、７０℃で２０分間インキュベートした。精製ＡＡＶベクターからのＤＮＡの抽出には、抽出カラム（ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（商標）ＲＮＡ Ｖｉｒｕｓ）を使用した。

２．４．定量的リアルタイムＰＣＲ分析
定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）は、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（商標）Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ Ｕｐｇｒａｄｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて実施した。すべてのＰＣＲは、プライマー、プローブ、ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（タカラバイオ（株））及び５μＬの鋳型ＤＮＡ（プラスミド標準、又はサンプルＤＮＡ）を含む２０μＬの最終体積のＰＣＲで行った。ｑＰＣＲは、９５℃で２０秒間の初期変性工程、次いで９５℃で１秒間の変性と５６℃で２０秒間のアニーリング／伸長の４５サイクルで行った。Ｓｃａ－Ｉ制限酵素で線状化したプラスミドｐＴＲ－ＵＦ－１１（ＡＴＣＣ（登録商標）ＭＢＡ－３３１（商標））の７回連続希釈したもの（１０^８～１０^２コピーのプラスミドを含む）を用いてプラスミド標準を生成した。

２．５．ウエスタンブロッティング
すべてのベクターを、Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液を用いて１００℃で５分間変性させ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ １０％Ｔｒｉｓ－グリシンポリアクリルアミドゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で分離した。Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｌｌ Ｂｌｕｅ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）を分子量サイズマーカーとして用いた。Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ ＳＤ Ｓｅｍｉ－Ｄｒｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｃｅｌｌ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）において、トランスファー緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／１９２ｍＭグリシン／０．１（ｗ／ｖ）ＳＤＳ／２０％ＭｅＯＨ）を用いて１５０ｍＡで１時間タンパク質をニトロセルロースメンブレンに移動させた後、室温で２時間、メンブレンをＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ中の５％セミスキムミルク（０．１％）又はＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ中の１％ゼラチン、０．１％Ｉｇｅｐａｌ（０．０１％）で飽和させた。飽和後、メンブレンを、ＡＡＶ２及び化学修飾ＡＡＶ２に対する抗血清（ポリクローナル、Ｂ１モノクローナル又はＡｎｔｉ－Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ－ＡＰ）で或いはＦＩＴＣ－大豆凝集素又はＦＩＴＣ－コンカナバリンＡで４℃で一晩プローブした。各段階の間に３回洗浄を行い、未結合の試薬をＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ（０．１％）で室温で１５分間除去した。バンドは、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）又はホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合二次抗体を用いて化学発光によって可視化し、Ｘ線フィルムに撮像した。

２．６．イムノドットブロット
ＰＢＳに短時間浸漬したニトロセルロース紙上に非変性ＡＡＶ２及び化学修飾ＡＡＶ２を付着させてから、ドットブロットマニホールド（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）を組み立てた。ニトロセルロースメンブレンはウエスタンブロッティングと同様に処理した。

２．７．動的光散乱
ＤＬＳはＭａｌｖｅｒｎ社製Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳを用いて行った。キャリブレーションは、３０及び３００ｎｍのＮａｎｏｓｐｅｒｅサイズ標準溶液を用いることによって予め制御した。各５０μＬのベクターをＭａｌｖｅｒｎ社製の専用キュベットＤＴＳＯ１１８に入れ、容量分析した。

２．８．ヒト及びマウス初代培養肝細胞の形質導入
マウス及びヒト初代培養肝細胞及び培地は、ＢＩＯＰＲＥＤＩＣ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社（フランス国レンヌ）から購入した。マウス及びヒト肝細胞を、２４ウェルプラスチック表面に約２．５Ｅ５細胞／ウェルの密度で播種した。受領後、細胞培養培地を除去して、添加物（ＡＤＤ２２２）を含む１ｍＬ基本培地（ＭＩＬ６００）と交換し、３７℃－５％ＣＯ_２中で２時間インキュベートした。実施例に示すように、マウス又はヒト初代培養肝細胞を、０．５ｍＬ培地中のＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ２又は化学修飾ＡＡＶ２ベクターによって１Ｅ５のＭＯＩで形質導入した。形質導入して６時間後に、０．５ｍＬの新鮮培地を各ウェルに添加した。すべてのＡＡＶベクターはＧＦＰをコードしていた。培養プレートを３７℃、５％ＣＯ_２で４８時間インキュベートしてから、ＧＦＰ陽性細胞のフローサイトメトリー分析に付した。細胞をトリプシン－ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）で剥がし、４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＢＤ－ＬＳＲＩＩ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）で分析した。すべてのデータはＦｌｏｗ Ｊｏ（Ｖ１０；Ｆｌｏｗｊｏ社（米国オレゴン州アシュランド））で処理した。

２．９．ラットの網膜の形質導入
成体オスのＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットに、ＡＥＶ２対照又は化学修飾ベクターのいずれかを１Ｅ１２ｖｇ／ｍＬの濃度で含有する２．５μｌの溶液を網膜下注射した。すべての動物で両側に、すなわち一方の眼にＡＡＶ２対照を、反対側の眼に化学修飾ＡＡＶ２＋１７ベクターを注射した。２群の動物（１群当たりｎ＝８）を使用し、１つの群はＡＡＶ２対照対ＡＡＶ２＋１７を３Ｅ５当量で注射し、２番目の群はＡＡＶ２対照対ＡＡＶ２＋１７を３Ｅ６当量で注射した。眼底でのＧＦＰ発現による蛍光を追跡するため、非侵襲的イメージングシステムを注射後１週間乃至注射後１．５ヶ月までの様々な時点で使用した。

２．１０．統計分析
すべての実験は平均±標準誤差（ＳＥＭ）として示す。統計分析にはＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ５ソフトウェアを使用した。データは一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）に付した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１の場合に、サンプルは有意に異なるとみなした。

２．１１．結果及び結論
図１は、ＡＡＶ２のカプシド上の第一級アミノ基を介するＦＩＴＣの共有結合カップリングを表す。
（Ａ）１Ｅ１２ｖｇの用量のＡＡＶ２－ＧＦＰベクターをＴＢＳ緩衝液（ｐＨ９．３）中のＦＩＴＣ（１Ｅ５又は３Ｅ５当量）の溶液に添加し、室温で４時間インキュベートした。ベクターを含む溶液をｄＰＢＳ＋０．００１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃに対して透析して、ＡＡＶカプシドに結合していない遊離のＦＩＴＣ分子を除去した。
（Ｂ）対照として、ＴＢＳ（ｐＨ９．３）中のＦＩＴＣを、反応性残基（－Ｎ＝Ｃ＝Ｓ）を含まないフルオレセイン（３Ｅ５当量）で置き換えたことを除いて、同じ実験手順を行った。
（Ｃ～Ｅ）ＡＡＶ２対照、ＴＢＳ緩衝液中のＦＩＴＣとインキュベートしたＡＡＶ２ベクターのサンプル（ＡＡＶ２ ＦＩＴＣ（１Ｅ５）及びＡＡＶ２ ＦＩＴＣ（３Ｅ５））又はＴＢＳ緩衝液中のフルオレセインとインキュベートしたＡＡＶ２ベクターのサンプル（ＡＡＶ２ Ｆｌｕｏ（３Ｅ５））を蛍光発光及びドットブロットによって分析した。この目的のため、各条件の総用量１Ｅ９ｖｇをニトロセルロースメンブレンにロードし、直接蛍光発光によって（Ｃ）、抗ＦＩＴＣ抗体を用いたドットブロットによって（Ｄ）又はカプシド全体を認識するＡ２０抗体を用いることによって（Ｅ）分析した。
（Ｆ、Ｇ）用量５Ｅ８ｖｇの同じサンプルを、変性ＡＡＶカプシドタンパク質を検出するためのポリクローナル抗体（Ｆ）又は抗ＦＩＴＣ抗体（Ｇ）を用いたウエスタンブロットによって分析した。
（Ｈ）各条件の総用量１Ｅ１０ｖｇを硝酸銀染色によって分析した。ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３は、ＡＡＶカプシドを構成する３種類のタンパク質である。タンパク質の大きさは、タンパク質ラダーに従って画像の左側に示してある。

ＡＡＶ２のカプシドの化学修飾の概念実証は、フルオロフォアＦＩＴＣを用いて行った。この目的のため、ＡＡＶ２に対する１Ｅ５又は３Ｅ５のモル比で示される２つの異なる量のＦＩＴＣを使用した（図４Ａ）。対照として、同じモル比のフルオレセインも使用した（図４－Ｂ）。

使用したすべての実験条件について、陽性のＡ２０ドットは、異なるモル比での反応及びその後のｄＰＢＳ＋Ｐｌｕｒｏｎｉｃに対する透析を経た後も、ＡＡＶ２カプシドがインタクトなままであることを示している（図４－Ｃ）。特に、陽性ＦＩＴＣ及び陰性フルオレセインドットも、ウイルスカプシドへのＦＩＴＣの共有結合カップリングを呈し、その吸着は示さなかった（図４－Ｄ）。図４－Ｅの蛍光分析で認められるドットの強度差は、これらの条件下で、ＦＩＴＣの共有結合カップリングが１Ｅ５当量のＦＩＴＣよりも３Ｅ５の方が効率的であることを実証している。

ＡＩＶカプシドサブユニットへのＦＩＴＣのコンジュゲーションに対するモル比の影響をさらに確認するためにウエスタンブロット分析を行った。上記の結果と同様に、ポリクローナル抗体の使用は、用いたモル比でＡＡＶ２カプシドサブユニットがインタクトなままであることを示している（図４－Ｆ）。図４－Ｇに示すように、フルオレセインと最も高い比率でインキュベートしたＡＡＶ２及びＡＡＶ２由来のカプシドサブユニットは、抗ＦＩＴＣ抗体とのインキュベーション後に全く陽性バンドを生じなかった。ただし、この抗体の使用は、これらの条件下で、ＦＩＴＣの共有結合が１Ｅ５当量のＦＩＴＣよりも３Ｅ５で一段と効率的であることを明らかに示している（図４－Ｇ）。

すべてのタンパク質を視覚化し、化学プロセス中に分解がないことを確認するために、条件の異なる銀染色も行った。

図４－Ｈに示すように、試験したすべての条件下でＶＰ１及びＶＰ２よりもＶＰ３バンドが強いことが観察できる。また、反応及びその後のｄＰＢＳ＋Ｐｌｕｒｏｎｉｃに対する透析を経た後もＡＡＶ２カプシドサブユニットがインタクトなままであることを示している。

図２は、ＡＡＶ２のカプシド上の第一級アミノ基を介するＧａｌＮＡｃリガンドの共有結合カップリングのための反応性官能基の同定を示す。
（Ａ）１Ｅ１２ｖｇの用量のＡＡＶ２－ＧＦＰベクターを、ＴＢＳ緩衝液（ｐＨ９．３）中の化合物４（－Ｎ＝Ｃ＝Ｓ反応性官能基を有するＧａｌＮＡｃリガンドを含む）又は化合物６（アリール－Ｎ＝Ｃ＝Ｓ反応性官能基を有するＧａｌＮＡｃリガンドを含む）（３Ｅ５当量）の溶液を添加し、室温で４時間インキュベートした。インキュベーション後、ベクターをｄＰＢＳ＋０．００１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃに対して透析して、ＡＡＶカプシドに結合していない遊離のＧａｌＮＡｃリガンド分子を除去した。対照として、ＴＢＳ（ｐＨ９．３）中の反応性残基（－Ｎ＝Ｃ＝Ｓ）を含まない化合物９（３Ｅ５当量）を用いて同じ実験手順を行った。
（Ｂ、Ｃ）ＡＡＶ２対照及びＴＢＳ緩衝液中のＧａｌＮＡｃリガンドとインキュベートしたＡＡＶ２ベクターのサンプル（ＡＡＶ２＋４、ＡＡＶ２＋６及びＡＡＶ２＋９）をドットブロットによって分析した。この目的のため、各条件の総用量１Ｅ１０ｖｇをニトロセルロースメンブレンにロードし、カプシド全体を認識するＡ２０抗体（Ｂ）を用いて又はα－アセチルガラクトサミン糖を認識する大豆－ＦＩＴＣレクチン（Ｃ）を用いて標識した。

ＡＡＶ２のカプシド表面に固定するためのリガンドの最適カップリング官能基を決定するために、－ＮＣＳを有する化合物（化合物４）、アリール－ＮＣＳを有する化合物（化合物６）（ＦＩＴＣと同様）及びこれらの肝リガンドの共有結合カップリングを担保するいかなる反応性官能基もなく、カプシド表面にも吸着しない別の化合物（化合物９）の３種類の化合物を合成した（図２－Ａ）。

ＡＡＶ２でのこれらの肝リガンドの共有結合カップリングの検証のため、ドットブロット技術を用いた。使用したすべての実験条件について、陽性のＡ２０ドットは、反応及びその後のｄＰＢＳ＋Ｐｌｕｒｏｎｉｃに対する透析を経た後もＡＡＶ２カプシドがインタクトなままであることを示している（図２－Ｂ）。化合物６で検出された陽性大豆レクチンドット（ＧａｌＮＡｃ残基と相互作用することが知られている）は、これらの条件下でアリール－ＮＣＳがＡＡＶ２のカプシドのアミノ基と反応する唯一のカップリング官能基であることを示している。フルオレセインで観察されたように、化合物９では全く検出が認められず、化合物６がＡＡＶ２のカプシド表面に吸着ではなく、共有結合していることが確認された（図２－Ｃ）。

ＴＢＳ緩衝液とアリール－ＮＣＳ官能基を有するリガンドとの併用は、ベクターに全く悪影響を及ぼさない条件で、ＡＡＶ２の表面の異なる分子との共有結合カップリングを可能にする。

図３は、ＡＡＶ２のカプシド上の第一級アミノ基を介するＧａｌＮＡｃリガンドの共有結合カップリングを表す。
（Ａ）１Ｅ１２ｖｇの用量のＡＡＶ２－ＧＦＰベクターを、ＴＢＳ緩衝液（いずれもｐＨ９．３）中の化合物６（アリール－Ｎ＝Ｃ＝Ｓ反応性官能基を有するＧａｌＮＡｃモノマーリガンド）又は化合物１３（アリール－Ｎ＝Ｃ＝Ｓ反応性官能基を有するＧａｌＮＡｃトリマーリガンド）の溶液（３Ｅ５当量）に添加し、室温で４時間インキュベートした。インキュベーション後、ベクターをｄＰＢＳ＋０．００１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃに対して透析して、ＡＡＶカプシドに結合していない遊離のＧａｌＮＡｃリガンド分子を除去した。対照として、ＴＢＳ（ｐＨ９．３）中の反応性残基を含まない化合物９（３Ｅ５当量）を用いて同じ実験手順を行った。
（Ｂ、Ｃ）ＡＡＶ２対照及びＴＢＳ緩衝液中のＧａｌＮＡｃリガンドとインキュベートしたＡＡＶ２ベクターのサンプル（ＡＡＶ２＋６、ＡＡＶ２＋９及びＡＡＶ２＋１３）をドットブロットによって分析した。この目的のため、各条件の総用量１Ｅ１０ｖｇをニトロセルロースメンブレンにロードし、集合カプシド全体を認識するＡ２０抗体（Ｂ）を用いて又はα－アセチルガラクトサミン糖を認識する大豆－ＦＩＴＣレクチン（Ｃ）を用いて標識した。
（Ｄ、Ｅ）ＡＡＶ２対照及びＴＢＳ緩衝液中のＧａｌＮＡｃリガンドとインキュベートしたＡＡＶ２ベクターのサンプル（ＡＡＶ２＋６、ＡＡＶ２＋９及びＡＡＶ２＋１３）をウエスタンブロットによって分析した。各条件の全用量の１Ｅ１０ｖｇをニトロセルロースメンブレンにロードし、変性ＡＡＶカプシドタンパク質を検出するためのポリクローナル抗体（Ｄ）によって又は大豆－ＦＩＴＣレクチン（Ｅ）を用いて標識した。ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３は、ＡＡＶカプシドを構成する３種類のタンパク質である。タンパク質の大きさは、タンパク質ラダーに従って画像の左側に示してある。

化合物６とそのアリール－ＮＣＳ官能基の化学カップリングの確認後、同じアンカー官能基を有する化合物であるトリマーＧａｌＮＡｃ化合物（化合物１３）も試験した。この特異的トリマーは、肝細胞の表面のＡＳＰＧｒとの相互作用を改善すると記載されていた（図３－Ａ）。

ＡＡＶ２ドット上でのこれらの肝リガンドの共有結合の検証のために、ドットブロット及びウエスタンブロット法を用いた。使用したすべての実験条件について、陽性のＡ２０ドットは、反応及びその後のｄＰＢＳ＋Ｐｌｕｒｏｎｉｃに対する透析を経た後もＡＡＶ２カプシドがインタクトなままであることを示している（図３－Ｂ）。フルオレセインで観察されるように、化合物９では全く検出が認められず、化合物６及び１３がＡＡＶ２のカプシド表面に吸着ではなく、共有結合していることが確認された（図３－Ｃ）。

ＡＡＶ２カプシドサブユニット上の第一級アミノ基での化合物６及び１３のコンジュゲーションを確認するためにウエスタンブロット分析を行った。ポリクローナル抗体の使用は、ＡＡＶ２カプシドサブユニットが、このカップリング工程で用いた各種リガンドとインタクトなままであることを示している（図３－Ｄ）。図３－Ｅに示すように、化合物９とインキュベートしたＡＡＶ２及びＡＡＶ２からのカプシドサブユニットは、特異的大豆レクチンとのインキュベーション後に全く陽性バンドを生じなかった。ただし、このレクチンを化合物６及び１３と共に用いると、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３の正確な分子量に陽性バンドをはっきりと示し、これらのＧａｌＮＡｃリガンドがＡＡＶカプシドの３つのサブユニット上に共有結合していることが実証された。

図４は、ＧａｌＮＡｃリガンドで化学修飾したＡＡＶ２及びＡＡＶ２ベクターによるヒト初代培養肝細胞の形質導入を示す。ヒト初代培養肝細胞（２Ｅ５細胞／ウェル）をＰ２４プレートでインキュベートし、ＡＡＶ２対照（融解直後）、ＧａｌＮＡｃ－ＡＡＶ２（ＡＡＶ２＋６、ＡＡＶ２＋１３）によって１Ｅ５のＭＯＩで形質導入した。すべてのＡＡＶベクターはＧＦＰをコードしていた。形質導入の４８時間後に、ＧＦＰ陽性細胞の百分率をＦＡＣＳ分析によって測定した。非形質導入細胞（細胞）を蛍光バックグラウンドの対照として使用した。各条件の４回の反復実験をＡＮＯＶＡ検定によって分析した（＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１）。データは平均値±ＳＤとして示す。

ＡＡＶ２上の肝リガンドによる化学修飾の効率を評価するために、ヒト初代培養肝細胞でのこれらの修飾又は非修飾粒子の形質導入を評価した。図４に示すように、化合物６でのＡＡＶ２のカプシドの化学修飾は、ＧＦＰ陽性細胞の百分率が４倍に増加し、これは同じ実験手順を行ったＡＡＶ２と比較して統計的に有意である。化合物１３の化学カップリングで得られたＧＦＰ陽性細胞の百分率の増加は同じではなかったが、この増加は統計的に有意である。

図５は、第一級アミノ基を介するカップリングの効率に対するリガンドの当量数の影響を示す（ＦＩＴＣを用いた例）。
（Ａ）１Ｅ１２ｖｇの用量のＡＡＶ２－ＧＦＰベクターを、ＴＢＳ緩衝液（ｐＨ９．３）中のＦＩＴＣ（３Ｅ５当量、３Ｅ５当量－１０×（３Ｅ５当量であるが、反応体積を１／１０に減少させたもの）、３Ｅ６当量、１．５Ｅ７）の溶液に添加し、室温で４時間インキュベートした。ベクターを含む溶液をｄＰＢＳ＋０．００１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃに対して透析して、ＡＡＶカプシドに結合していない遊離のＦＩＴＣ分子を除去した。
（Ｂ）対照として、ＴＢＳ（ｐＨ９．３）中のＦＩＴＣを反応性残基（Ｎ＝Ｃ＝Ｓ）を含まないフルオレセイン（１．５Ｅ７当量）で置き換えたことを除いて、同じ実験手順を行った。
（Ｃ、Ｄ）ＡＡＶ２対照及びＴＢＳ緩衝液中のＦＩＴＣとインキュベートしたＡＡＶ２ベクターのサンプル（ＡＡＶ２ ＦＩＴＣ（３Ｅ５）、ＡＡＶ２ ＦＩＴＣ（３Ｅ５－１０×）、ＡＡＶ２ ＦＩＴＣ（３Ｅ６）及びＡＡＶ２ ＦＩＴＣ（１．５Ｅ７））又はＴＢＳ緩衝液中のフルオレセインとインキュベートしたＡＡＶ２ベクターのサンプル（ＡＡＶ２ Ｆｌｕｏ（１．５Ｅ７））をドットブロットによって分析した。各条件の総用量１Ｅ９ｖｇをニトロセルロースメンブレンにロードし、カプシド全体を認識するＡ２０抗体（Ｃ）によって又は抗ＦＩＴＣ抗体（Ｄ）を用いて標識した。
（Ｅ、Ｆ）用量５Ｅ８ｖｇの同じサンプルを、変性ＡＡＶカプシドタンパク質を検出するためのポリクローナル抗体（Ｅ）又は抗ＦＩＴＣ抗体（Ｆ）を用いたウエスタンブロットによって分析した。ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３は、ＡＡＶカプシドを構成する３種類のタンパク質である。タンパク質の大きさは、タンパク質ラダーに従って画像の左側に示してある。
（Ｇ）ＨｅＬａ細胞（２Ｅ５細胞／ウェル）を細胞スタック内でインキュベートし、ＡＡＶ２ ＦＩＴＣ（３Ｅ５）、ＡＡＶ２ ＦＩＴＣ（３Ｅ６）及びＡＡＶ２ ＦＩＴＣ（１．５Ｅ７）によって１Ｅ５のＭＯＩで形質導入した。すべてのＡＡＶベクターはＧＦＰをコードしていた。ＧＦＰの発現を回避するため形質導入の４時間後に、緑色ＦＩＴＣ蛍光及び赤色蛍光Ａ２０免疫標識（Ａ２０一次抗体及びＡ１６４７二次抗体）の可視化による共焦点顕微鏡分析を行った。

ＡＡＶ２上のリガンドの数を調節するため、ＴＢＳ緩衝液で用いるＦＩＴＣのモル比を増加させ、それによってＡＡＶ２のカプシドの表面に結合する分子の数に影響があるか否かを評価した。ＡＩＶ２のカプシドをＦＩＴＣで飽和させるために、この比率を３Ｅ５から１．５Ｅ７に増加させた。

ＡＩＶカプシドサブユニットへのＦＩＴＣのコンジュゲーションに対するモル比の影響をさらに確認するため、ドットブロット及びウエスタンブロット分析を行った。上記の結果と同様に、Ａ２０及びポリクローナル抗体の使用は、用いた様々なモル比でＡＡＶ２カプシドサブユニットがインタクトなままであることを示している（図５－Ｃ、Ｅ）。図５－Ｄ、Ｆに示すように、最も高い比率のフルオレセインとインキュベートしたＡＡＶ２及びＡＡＶ２由来のカプシドサブユニットは、抗ＦＩＴＣ抗体とのインキュベーション後にドット又は陽性バンドを生じなかった。ただし、この抗体の使用は、そのモル比を増加させたときにＦＩＴＣの共有結合カップリングがさらに効率的になることを明らかに示している（図５－Ｆ）。付言すると、１０×ＴＢＳ緩衝液中の３Ｅ５モル比のＦＩＴＣとのカップリングを行うことによって、このベクターのカプシドでさらに多くの数のフルオロフォアをカップリングできるようになる。

ＡＡＶ２－ＦＩＴＣ（３Ｅ５）については、緑色ＦＩＴＣ蛍光（Ｊ）及び赤色蛍光Ａ２０免疫標識（Ｋ）が検出され、ＦＩＴＣとＡ２０－Ａ１６４７との共局在化が、緑色及び赤色チャネルで得られた画像を合成することによって黄色で観察され（Ｌ）、ＡＡＶ２のカプシドでのＦＩＴＣの共有結合カップリングを実証している。対照的に、ＡＡＶ２－ＦＩＴＣ（３Ｅ６）及びＡＡＶ２－ＦＩＴＣ（１．５Ｅ７）サンプル（Ｓ、Ｖ）は、Ａ２０免疫標識（Ｋ）では認められず、ＦＩＴＣとＡ２０－Ａ１６４７の共局在化は観察されなかった（Ｔ、Ｕ、Ｗ、Ｘ）。これらの結果は、ＡＡＶ２のカプシド表面上のＦＩＴＣリガンドの数の増加がＡ２０抗体との相互作用を低減させる可能性があることを示唆しており、修飾カプシドが全般的に表面認識抗体との相互作用を低減する可能性を示唆している。

図６は、第一級アミノ基を介するカップリングの効率（化合物６及び１３を用いた例）及びマウス初代培養肝細胞の形質導入に対するＧａｌＮＡｃリガンドの当量数の影響を表す。
（Ａ、Ｂ）用量１２μｌのＡＡＶ２－ＧＦＰベクターを、ＴＢＳ緩衝液（ｐＨ９．３）中の化合物６及び１３（３Ｅ５及び３Ｅ６当量）の溶液に添加し、室温で４時間インキュベートした。ベクターを含む溶液をｄＰＢＳ＋０．００１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃに対して透析して、ＡＡＶカプシドに結合していない遊離のＧａｌＮＡｃリガンド分子を除去した。
ＡＡＶ２対照及びＴＢＳ緩衝液中のＧａｌＮＡｃリガンドとインキュベートしたＡＡＶ２ベクターのサンプルをウエスタンブロットによって分析した。各条件の総用量１Ｅ１０ｖｇをニトロセルロースメンブレンにロードし、変性ＡＡＶカプシドタンパク質を検出するためのポリクローナル抗体（Ａ）によって又は大豆－ＦＩＴＣレクチン（Ｂ）を用いて標識した。ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３はＡＡＶカプシドの３種類のタンパク質である。タンパク質の大きさは、タンパク質ラダーに従って画像の左側に示してある。
（Ｃ）ＧａｌＮＡｃリガンドで化学修飾したＡＡＶ２及びＡＡＶ２ベクターによるマウス初代培養肝細胞の形質導入。マウス初代培養肝細胞（２Ｅ５細胞／ウェル）をＰ２４プレートでインキュベートし、ＡＡＶ２対照（融解直後）、ＧａｌＮＡｃ－ＡＡＶ２（ＡＡＶ２＋６（３Ｅ５及び３Ｅ６当量））によって１Ｅ５のＭＯＩで形質導入した。すべてのＡＡＶベクターはＣＡＧプロモーターの制御下でＧＦＰをコードしていた。形質導入の７２時間後に、ＧＦＰ陽性細胞の百分率をＦＡＣＳ分析によって測定した。非形質導入細胞（細胞）を対照として使用した（すなわち蛍光バックグラウンド）。各条件の３回の反復実験をＡＮＯＶＡ検定によって分析した（＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１）。データは平均値±ＳＤとして示す。

ＡＡＶ２上のリガンドの数を調節するために、ＴＢＳ緩衝液で用いる化合物６及び１３のモル比を増加させ、それによってＡＡＶ２のカプシドの表面に結合する分子の数に影響があるか否かを評価した。ＡＡＶ２のカプシドを６及び１３で飽和させるために、この比を３Ｅ５から３Ｅ６当量（式）に増加させた。

ＡＡＶカプシドサブユニットへの６及び１３のコンジュゲーションに対するモル比の影響をさらに確認するため、ウエスタンブロット分析を行った。上記の結果と同様に、（カプシドに対する）ポリクローナル抗体の使用は、用いた様々なモル比でＡＡＶ２カプシドサブユニットがインタクトなままであることを示している（図６－Ａ）。図６－Ｂに示すように、大豆レクチンの使用は、モル比を３Ｅ５から３Ｅ６に増すと、化合物６及び１３の共有結合カップリングがさらに効率的になることをはっきりと示している。ＡＡＶ２上の肝リガンドによる化学修飾の効率を評価するために、マウス初代培養肝細胞でのこれらの修飾又は非修飾ＡＡＶ２粒子の形質導入を評価した。図６－Ｃに示すように、２通りの用量（３Ｅ５及び３Ｅ６当量）の化合物６でのＡＡＶ２のカプシドの化学修飾は、ＧＦＰ陽性細胞の百分率が２倍（３Ｅ５）及び６倍（３Ｅ６）増加し、これはＡＡＶ２対照ベクターと比較して統計的に有意である。

図７は、ラットにおける第一級アミノ基を介するカップリングの効率（化合物１７を用いた例）及び網膜の形質導入に対するマンノースリガンドの当量数の影響を示す。
（Ａ）１Ｅ１２ｖｇの用量のＡＡＶ２－ＧＦＰベクターを、ＴＢＳ緩衝液（いずれもｐＨ９．３）中の化合物１７（アリール－Ｎ＝Ｃ＝Ｓ反応性官能基を有するマンノースモノマーリガンド）（３Ｅ５及び３Ｅ６当量）の溶液に添加し、室温で４時間インキュベートした。インキュベーション後、ベクターをｄＰＢＳ＋０．００１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃに対して透析して、ＡＡＶカプシドに結合していない遊離マンノースリガンド分子を除去した。対照として、ＴＢＳ（ｐＨ９．３）中の反応性残基を含まない（アリール－Ｎ＝Ｃ＝Ｓ）化合物２２（３Ｅ６当量）を用いて、同じ実験手順を行った。
（Ｂ、Ｃ）ＡＡＶ２対照及びＴＢＳ緩衝液中のマンノースリガンドとインキュベートしたＡＡＶ２ベクターのサンプルをウエスタンブロットによって分析した。各条件の総用量１Ｅ１０ｖｇをニトロセルロースメンブレンにロードし、変性ＡＡＶカプシドタンパク質を検出するためのポリクローナル抗体（Ｂ）によって又はマンノース基を特異的に認識するコンカナバリンＡレクチン（Ｃ）を用いて標識した。ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３は、ＡＡＶカプシドを構成する３種類のタンパク質である。タンパク質の大きさは、タンパク質ラダーに従って画像の左側に示してある。
（Ｄ）ＡＡＶ２対照（ＡＡＶ２）又はマンノースリガンド（化合物１７）とインキュベートしたＡＡＶ２を２つの異なる用量（３Ｅ５当量及び３Ｅ６当量）で網膜下に注射したラットの眼底におけるＧＦＰ蛍光の直接可視化。画像は、注射後１週間乃至注射後１．５ヶ月までの様々な時点で非侵襲的技術を用いて取得した。

ＡＡＶ２表面上のマンノースリガンドの数を調節するために、ＴＢＳ緩衝液で用いる化合物１７のモル比を増大させ、それがＧａｌＮＡｃリガンドとしてＡＡＶ２のカプシドの表面上に結合した分子の数に影響を及ぼすか否かを評価した。ＡＡＶ２のカプシドを化合物１７で飽和させるために、この比率を３Ｅ５から３Ｅ６に増加させた。

化合物１７のＡＡＶカプシドサブユニットへのコンジュゲーションに対するモル比の影響をさらに確認するため、ウエスタンブロット分析を行った。上記の結果と同様に、ポリクローナル抗体の使用は、用いた様々なモル比でＡＡＶ２カプシドサブユニットがインタクトなままであることを示している（図７－Ｂ）。図７－Ｃに示すように、コンカナバリンＡレクチンの使用は、モル比を３Ｅ５から３Ｅ６に増すと、化合物１７の共有結合カップリングがさらに効率的になることをはっきりと示している。

非侵襲的眼底鏡検査は、全研究の間、ＡＡＶ２対照及びＡＡＶ２＋１７処置眼の両方の網膜におけるＧＦＰ発現を示している（図７Ｄ）。左側の画像は、３Ｅ５当量の用量のＡＡＶ２＋１７で処置した眼を表しており、蛍光強度は、ＡＡＶ２対照（対側眼）と比較して同程度であった。しかし、右側の画像では、３Ｅ６当量の用量でＡＡＶ２＋１７で処置した眼は、対照ＡＡＶ２処置の反対側の眼と比較して、すべての時点でより広くより明るいＧＦＰ強度を有することが認められる。なお、蛍光シグナルは反対側の眼よりも格段に高かったので、３Ｅ６当量の用量のＡＡＶ２＋１７で処置した眼から３週間、１ヶ月及び１．５ヶ月に撮影された写真はシグナルの飽和を避けるために調整した。

図８は、ＡＡＶ２のカプシド上の第一アミノ基によるＧａｌＮＡｃリガンドの共有結合カップリングのための異なる反応性官能基の同定を示す。
（Ａ）１Ｅ１２ｖｇの用量のＡＡＶ２－ＧＦＰベクターを、ＴＢＳ緩衝液（ｐＨ９．３）中の化合物１８又は１９（３Ｅ６当量）の溶液に添加し、室温で４時間インキュベートした。インキュベーション後、ベクターをｄＰＢＳ＋０．００１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃに対して透析して、ＡＡＶカプシドに結合していない遊離ＧａｌＮＡｃリガンドを除去した。
（Ｂ、Ｃ）変性ＡＡＶカプシドタンパク質を検出するためのポリクローナル抗体（Ｂ）又は大豆レクチン（Ｃ）を用いたウェスタンブロットによって各サンプルの１Ｅ１０ｖｇの用量を分析した。

ＡＡＶのカプシド表面に適切に固定させるためのリガンドの異なるカップリング官能基を決定するために、２種類の化合物、化合物１８（ピリジンイソチオシアネート誘導体）及び化合物１９（ナフタレンイソチオシアネート誘導体）を合成した（図８Ａ）。

ＡＡＶ２カプシドサブユニット上の第一級アミノ基での化合物１８及び１９のコンジュゲーションを確認するためにウエスタンブロット分析を行った。ポリクローナル抗体の使用は、ＡＡＶ２カプシドサブユニットがこのカップリング工程で用いた各種リガンドとインタクトなままであることを示している（図８－Ｂ）。化合物１８及び１９と大豆レクチン（ＧａｌＮＡｃ基を認識する）の使用は、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３の正確な分子量に陽性バンドを示し、これらのＧａｌＮＡｃリガンドがＡＡＶカプシドの３つのサブユニット上に共有結合していることを実証する。

ＴＢＳ緩衝液と、アリール－ＮＣＳ、ポリアリール－ＮＣＳ及びヘテロアリール－ＮＣＳ官能基を有するリガンドとの併用は、ベクターに悪影響を及ぼさない条件で、ＡＡＶ２の表面の異なる分子との共有結合カップリングを可能にする。

図９は、ＡＡＶ３ｂのカプシド上の第一級アミノ基による化合物６の共有結合カップリングを表す。１Ｅ１２ｖｇの用量のＡＡＶ３ｂ－ＧＦＰベクターをＴＢＳ緩衝液（ｐＨ９．３）中の６（３Ｅ６当量）の溶液に添加し、室温で４時間インキュベートした。ベクターを含む溶液をｄＰＢＳ＋０．００１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃに対して透析して、ＡＡＶカプシドに結合していない遊離の化合物６の分子を除去した。
（Ａ、Ｂ）各条件の総用量１Ｅ９ｖｇをニトロセルロースメンブレン上にロードし、集合カプシドを認識するＡ２０抗体（Ａ）及び大豆レクチン（Ｂ）を用いたドットブロットによって分析した。
（Ｃ、Ｄ）用量１Ｅ１０ｖｇの同じサンプルを、変性ＡＡＶカプシドタンパク質を検出するためのポリクローナル抗体（Ｃ）又は大豆レクチン（Ｄ）を用いたウエスタンブロットによって分析した。

ＡＡＶ３ｂのカプシドの化学修飾の概念実証を、ＡＡＶ２と同様に化合物６を用いて行った。この目的のため、ＡＡＶ３ｂに対する化合物６のモル比として３Ｅ６を使用した。

使用したすべての実験条件について、陽性のＡ２０ドットは、ＡＡＶ３ｂカプシドが化学反応後もインタクトなままであることを示している（図９－Ａ）。特に、大豆レクチンを用いた陽性ドットも、ＡＡＶカプシドでの化合物６の共有結合カップリングを示している（図９－Ｂ）。

ウエスタンブロット分析を行って、化合物６とＡＡＶ３ｂカプシドサブユニットとのカップリングをさらに確認した。上記の結果と同様に、ポリクローナル抗体の使用は、ＡＡＶ３ｂカプシドサブユニットがインタクトなままであることを示している（図９－Ｃ）。図９－Ｄに示すように、大豆レクチンの使用はＡＡＶカプシドサブユニット上での化合物６の共有結合カップリングを示している。

結論
カップリングに用いた実験条件によって、ＡＡＶ２及びＡＡＶ３ｂのカプシドの表面上のリガンドのカップリングを調節できることをはっきりと示している。このようにカプシド表面のあらゆる性状のリガンドを化学的にカップリングすることによって新たなＡＡＶ由来ベクターを得ることができる。ベクターの比活性及び治療指数もこの方法によって改善することができる。

Claims (48)

1. １以上のリガンドＬと化学的にカップリングされた、カプシドタンパク質に含まれる１以上の第一級アミノ基を有する組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター粒子であって、上記リガンドＬが、下記の式（Ｉ）
   

   

   （式中、Ｎ^＊はカプシドタンパク質に含まれる１つの第一級アミノ基の窒素原子であり、
   

   

   は１以上のリガンドＬに直接又は間接的に共有結合した、任意的に置換されていてもよい、アリーレン又はヘテロアリーレン基を表す。）の化合物の形態で存在する、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター粒子。
2. 

   が、フェニレン基、ナフチレン又はピリジレン基である、請求項１に記載のｒＡＡＶベクター粒子。
3. 

   が、
   

   

   
   を表す、請求項１又は２に記載のｒＡＡＶベクター粒子。
4. 上記組換えアデノ随伴ウイルスベクターが、天然に存在するセロタイプ由来の野生型カプシドタンパク質から構成される、請求項１乃至３のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター粒子。
5. 上記組換えアデノ随伴ウイルスが、天然に存在するセロタイプ由来のカプシドタンパク質が遺伝子改変されたアデノ随伴ウイルス又は合成カプシドによって構成されるアデノ随伴ウイルスである、請求項１乃至４のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター粒子。
6. リガンドＬが、ターゲティング剤、中和抗体との相互作用を避けるための立体遮蔽剤、標識剤又は磁性剤である、請求項１乃至５のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター粒子。
7. 前記ターゲティング剤としての前記リガンドＬが、細胞型特異的リガンドである、請求項６に記載のｒＡＡＶベクター粒子。
8. 前記細胞型特異的リガンドが、タンパク質から、単糖類もしくは多糖類から、ステロイドホルモンから、ＲＧＤモチーフペプチドから、ビタミン類から、小分子から、又はターゲティングペプチドから誘導されるものである、請求項７に記載のｒＡＡＶベクター粒子。
9. 前記細胞型特異的リガンドが、ガラクトース、Ｎ－アセチルグルコサミン、又はマンノースから誘導されるものである、請求項７又は８に記載のｒＡＡＶベクター粒子。
10. 前記立体遮蔽剤としての前記リガンドＬが、合成ポリマーから誘導される、中和抗体との相互作用を避けるための立体遮蔽剤である、請求項６に記載のｒＡＡＶベクター粒子。
11. 前記合成ポリマーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はｐＨＰＭＡである、請求項９に記載のｒＡＡＶベクター粒子。
12. 前記標識剤としての前記リガンドＬが、分析遺伝子導入のための標識剤である、請求項６に記載のｒＡＡＶベクター粒子。
13. 前記標識剤が、蛍光色素、ナノ金粒子又は放射性色素である、請求項１２に記載のｒＡＡＶベクター粒子。
14. 前記標識剤が、フルオレセイン、ローダミン、 ^１８Ｆ、^{１２４，１２５，１３１}Ｉ、^６４Ｃｕ又は^６７Ｃｕである、請求項１３に記載のｒＡＡＶベクター粒子。
15. 前記磁性剤としての前記リガンドＬが、鉄粒子である、請求項６に記載のｒＡＡＶベクター粒子。
16. 式（Ｉ）の部分が、
    

    

    

    から選択される、請求項１乃至１５のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター粒子。
17. アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター粒子を１以上のリガンドＬと化学的にカップリングさせるための方法であって、少なくとも以下の工程：
    カプシドタンパク質に含まれる１以上の第一級アミノ基を有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を用意する工程、及び
    上記ＡＡＶ粒子を次の式（ＩＩ）の試薬
    Ｂ－Ｎ＝Ｃ＝Ｓ （ＩＩ）
    （式中、Ｂは、（Ｌ）ｍ（Ｘ）Ａｒ－基であり、
    リガンドＬは請求項６乃至１５のいずれか１項で定義した通りであり、
    ｍは１～１０００の整数を表し、
    Ａｒは、アリーレン又はヘテロアリーレン基を表し、又は請求項２若しくは３で定義した通りであり、
    Ｘは結合又は上記リガンドＬとＡｒとの間のスペーサーを表す。）と、第一級アミノ基を式（ＩＩ）の試薬の－Ｎ＝Ｃ＝Ｓ基と反応させるのに適した条件下で、接触させる工程
    を含む方法。
18. Ｘが、次の基
    

    

    （式中、ｎは０～５０００の整数である。）、又は次の基
    

    

    （式中、ｎは０～５０００の整数である。）を表す、請求項１７に記載の方法。
19. Ｘが、次の基
    

    

    （式中、ｎは１～５００の整数である。）を表す、請求項１８に記載の方法。
20. Ｘが、次の基
    

    

    （式中、ｎは２～１００の整数である。）を表す、請求項１８に記載の方法。
21. Ｘが、次の基
    

    

    （式中、ｎは３～２０の整数である。）を表す、請求項１８に記載の方法。
22. Ｘが、次の基
    

    

    （式中、ｎは３である。）を表す、請求項１８に記載の方法。
23. Ｘが、次の基
    

    

    （式中、ｎは１～２０００の整数である。）を表す、請求項１８に記載の方法。
24. Ｘが、次の基
    

    

    （式中、ｎは３～１００の整数である。）を表す、請求項１８に記載の方法。
25. Ｘが、次の基
    

    

    （式中、ｎは３である。）を表す、請求項１８に記載の方法。
26. 上記ＡＡＶ粒子を式（ＩＩ）の試薬と接触させる工程が、ＴＲＩＳ緩衝食塩水、炭酸ナトリウム－重炭酸ナトリウム緩衝液、ＰＢＳ及びｄＰＢＳから選択される緩衝液の存在下で行われる、請求項１７乃至２５のいずれか１項に記載の方法。
27. 上記ＡＡＶ粒子を式（ＩＩ）の試薬と接触させる工程が、ＴＲＩＳ緩衝食塩水の存在下で行われる、請求項２６に記載の方法。
28. 上記反応が、７～９．６のｐＨで行われる、請求項１７乃至２７のいずれか１項に記載の方法。
29. 上記反応が、９．２～９．４のｐＨで行われる、請求項２８に記載の方法。
30. 第２のカップリング工程においてカプシドタンパク質を修飾するために、得られた上記ｒＡＡＶベクター粒子をさらに反応させる、請求項１７乃至２９のいずれか１項に記載の方法。
31. 第１のカップリング工程からの未反応のアミノ基との化学カップリングによって、得られた上記ｒＡＡＶベクター粒子をさらに反応させる、請求項１７乃至３０のいずれか１項に記載の方法。
32. 当該方法が、（ｉ）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のトロピズムを変化させるためのものであり、（ｉｉ）特定の細胞又は組織の形質導入を増強するためのものであり、又は（ｉｉｉ）中和抗体との相互作用を低減させるためのものである、請求項１７乃至３１のいずれか１項に記載の方法。
33. 当該方法が、前記（ｉ）においてさらに、所望の特定の器官、組織又は細胞型をターゲティングするためのものである、請求項３２に記載の方法。
34. 医薬として使用するための、予防手段として使用するための、診断手段として使用するための、或いは遺伝子治療の効率研究に使用するための、請求項１乃至１６のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター粒子。
35. 造影剤として使用するための、請求項３４に記載のｒＡＡＶベクター粒子。
36. 治療用核酸を送達するための又は矯正ゲノム編集を誘導するための医薬品として使用する為の、請求項３４に記載のｒＡＡＶベクター粒子。
37. アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のトロピズムを変化させるための、請求項１乃至１６のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター粒子。
38. 所望の特定の器官、組織又は細胞型をターゲティングするためのものである、請求項３７に記載のｒＡＡＶベクター粒子。
39. 当該ｒＡＡＶベクター粒子に対する液性免疫反応を損なうための、請求項１乃至１６及び３４乃至３８のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター粒子。
40. 中和抗体との相互作用を低減させるための、請求項１乃至１６及び３４乃至３８のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター粒子。
41. 当該ｒＡＡＶベクター粒子が、眼、肺、心臓、腎臓、肝臓、脳、脾臓、腫瘍若しくは筋肉細胞、又は中枢神経系の細胞に対して、選択的トロピズムを有する、請求項１乃至１６及び３４乃至４０のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター粒子。
42. 当該ｒＡＡＶベクター粒子が、肝細胞、網膜、網膜色素上皮、光受容細胞、筋細胞又は心筋細胞に対して、選択的トロピズムを有する、請求項４１に記載のｒＡＡＶベクター粒子。
43. 請求項１乃至１６及び３４乃至４２のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター粒子を薬学的に許容される媒体中に含む医薬組成物。
44. （ｉ）診断方法に使用するのための、又は（ｉｉ）遺伝子治療に使用するのため、又は（ｉｉｉ）免疫療法及びワクチン接種に使用するための、請求項１乃至１６及び３４乃至４２のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター粒子又は請求項４３に記載の医薬組成物。
45. 前記（ｉｉ）において、遺伝性障害又は後天性障害の治療に使用するのためのものである、請求項４４に記載のｒＡＡＶベクター粒子又は医薬組成物。
46. 心不全、神経障害、筋障害、肝疾患、血液疾患、代謝疾患、眼病又はがんの治療に使用するのためのものである、請求項４５に記載のｒＡＡＶベクター粒子又は医薬組成物。
47. 前記リガンドＬが、マンノース、ガラクトース又はＮ－アセチルガラクトサミンから誘導される細胞型特異的リガンドである、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の治療に使用する為の、請求項１乃至１６及び３４乃至４２のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター粒子又は請求項４３に記載の医薬組成物。
48. 式（Ｉ）の部分が、下記の（ｉ）～（ｉｖ）
    

    

    

    

    

    から選択され、
    ここで、上記化学構造式（ｉ）～（ｉｖ）中に示されているリガンドが、マンノース、ガラクトース又はＮ－アセチルガラクトサミンから選択される、
    請求項１乃至１６及び３４乃至４２のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター粒子又は請求項４３に記載の医薬組成物。

Images