JP2022526018A - 脳内への特異性が増強されたウイルス組成物 - Google Patents

脳内への特異性が増強されたウイルス組成物 Download PDF

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Abstract

例えば脳および肝臓の標的細胞型におけるウイルス形質導入の特異性の増加および効率の向上を示す指向性を有する、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を含む組成物およびキットが提供される。多重化されたＣｒｅ組換えに基づくＡＡＶ標的進化（Ｍ－ＣＲＥＡＴＥ）法を使用してｒＡＡＶを発見する方法、およびｒＡＡＶ媒介導入遺伝子療法により様々な疾患および状態を処置する方法を含むが、これらに限定されない、ｒＡＡＶの治療および生物医学研究への応用も記載される。

Description

関連出願
本願は、２０１９年４月１１日に出願した米国特許仮出願第６２／８３２，８３６号の利益および優先権を主張するものであり、この仮出願の内容は、その全体が本明細書に組み込まれる。
連邦政府による資金提供を受けた研究の記載
本発明は、米国国立衛生研究所により与えられたＮＳ０８７９４９、ＭＨ１１７０６９およびＯＤ０２５５３５のもとで政府の支援を受けてなされたものである。政府は本発明に一定の権利を有する。
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）は、分裂細胞と非分裂細胞の両方に形質導入するそれらの能力、感染細胞内でのエピソームＤＮＡとしてのそれらの長期存続、およびそれらの低い免疫原性のため、基礎科学研究および治療への応用において遺伝子送達用のベクターとして広く使用されている。これらの特徴のため、ｒＡＡＶは、基礎科学への応用にも、遺伝子療法などの診療の場への応用にも、魅力的なものである。しかし、対象への全身送達時に、明確に異なる脳細胞型を特異的に標的とするように既存の血清型の性能を有意に向上させる必要がある。この必要性は、ＡＡＶが、中枢神経系（ＣＮＳ）に至るために血液脳関門（ＢＢＢ）を横断しなければならない場合、特に切実である。
既存のＡＡＶ血清型の全身送達は、ある特定の細胞型および器官に対する形質導入に限定されており、他の細胞型および器官では非特異的な重複する指向性を指し示す。これは、遺伝子療法への応用の際にいくつかの厄介な問題をもたらし、そのような問題には、影響を受けていない器官および細胞型（特に、肝臓）に対する形質導入に起因するオフターゲット効果、および目的の組織または器官において十分な治療レベルを達成するためのより大量のウイルス投薬量の必要性が、これらに限定されないが、含まれる。
ＣＮＳ内で測定されたときに特異性の増加および形質導入効率の上昇、ならびに一部の場合には、肝臓のような標的外環境では特異性の減少および形質導入効率の低下を有する指向性があるバリアントを生じさせる、反復的な正および負の選択ラウンドによって操作してカプシド構造に特異性を持たせたｒＡＡＶが、本明細書で開示される。本明細書に記載のｒＡＡＶは、全身送達（例えば、静脈内注射）時に対象における標的環境（例えば、標的細胞型または組織）への幅広い形質導入を達成する。
多重化されたＣｒｅ組換えに基づくＡＡＶ標的進化（Ｍ－ＣＲＥＡＴＥ）法を使用して本開示のｒＡＡＶを操作する方法も提供される。Ｍ－ＣＲＥＡＴＥ法は、（１）カプシドタンパク質配列への変異の導入、（２）定義された細胞集団に移動するバリアントのみのｉｎ ｖｉｖｏでの偏りのない選択および回収、（３）細胞膜の横断、（４）核への移動、ならびに（５）それらの遺伝子投薬量のパッケージングの解除および発現により、増強された形質導入効率および／または特異性を生じさせる。最も望ましい指向性（例えば、特定のｉｎ ｖｉｖｏ環境に対する増強された効率および特異性）を呈するバリアントカプシドが回収され、ディープシークエンシングにより同定される。偏りのない選択および解析のための戦略は、バリアントのエンリッチメントスコアを（標的組織ライブラリーを出発ウイルスライブラリーに対して正規化することにより）決定すること、および合成ライブラリー構築を通して選択ラウンド間の（各バリアントが等しく表される）偏りのない伝搬を判定することを含む。標的に対するバリアントの選択に関する有用な見識をもたらす、シークエンシングデータからの得られたライブラリーの詳細な特徴付けも、開示される。
Ｍ－ＣＲＥＡＴＥを使用して生成されたＡＡＶカプシドライブラリーが、本明細書で開示される。第１のライブラリー、ＡＡＶ９における７－ｍｅｒペプチド挿入（７－ｍｅｒ－ｉライブラリー）を、異なる脳細胞型－内皮細胞、ニューロンおよび星状膠細胞－にわたっての並行ｉｎ ｖｉｖｏ選択のために構築し、血液脳関門（ＢＢＢ）を標的とする能力はもちろん、それを横断し、中枢神経系（ＣＮＳ）に広く形質導入する能力も増強されたＡＡＶ９バリアントの大型プールを得た。第２のライブラリー、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂにおける３－ｍｅｒペプチド置換（３－ｍｅｒ－ｓライブラリー）を、ディープシークエンシングを組み込むことにより再調査して、カプシドを回収した。より大きな特異性でＣＮＳニューロンに形質導入するバリアントを含むＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂバリアントのプールを発見した。本開示のｒＡＡＶは、脳血液関門の内皮細胞、中枢神経系における異なる細胞型に広く形質導入することができるバリアント、およびニューロンへの形質導入に向けてより大きな特異性を呈することができるバリアントを効率的に標的とすることができる。
本明細書で開示される態様は、（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸２１７～アミノ酸７３６と少なくとも９８％同一である第１のアミノ酸配列と、（ｉｉ）配列番号１内のアミノ酸５８８＿５８９位に挿入された表２～３または図３３で提供されるアミノ酸配列と少なくとも５７．１％同一の第２のアミノ酸配列とを含み、対象に全身送達されたときに対象の中枢神経系（ＣＮＳ）において測定されたとき、配列番号１で提供される天然ＡＡＶカプシドタンパク質と比較して特異性の増加および形質導入効率の向上のうちの少なくとも一方を特徴とする、ＡＡＶカプシドタンパク質を含む、ＡＡＶカプシドを提供する。一部の実施形態では、第２のアミノ酸配列は、表２～３または図３３で提供されるアミノ酸配列と少なくとも７１．４％同一である。一部の実施形態では、第２のアミノ酸配列は、表２～３または図３３で提供されるアミノ酸配列と少なくとも８６．７％同一である。一部の実施形態では、第２のアミノ酸配列は、ＴＡＬＫＰＦＬ、ＴＴＬＫＰＦＬ、ＴＬＱＩＰＦＫ、ＴＭＱＫＰＦＩ、ＳＩＥＲＰＦＫ、ＲＹＱＧＤＳＶ、およびＴＴＬＫＰＦＳからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶカプシドのＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３中に存在する。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、キメラである。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質の６０コピーがアセンブルされてＡＡＶカプシドになる。一部の実施形態では、ＣＮＳは、ニューロン、乏突起膠細胞、星状膠細胞、および脳血管細胞からなる群から選択される細胞型を含む。一部の実施形態では、ＣＮＳは、脳、視床、皮質、線条体、腹側中脳、および脊髄からなる群から選択される組織を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、アミノ酸置換Ａ５８７Ｄをさらに含む。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、アミノ酸置換Ｑ５８８Ｇをさらに含む。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、Ａ５８９Ｎを含むアミノ酸置換をさらに含む。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、Ｑ５９０Ｐを含むアミノ酸置換をさらに含む。一部の実施形態では、配列番号１内のアミノ酸５８８＿５８９位における第２のアミノ酸配列は、ＴＬＡＶＰＦＫでも、ＫＦＰＶＡＬＴでも、ＳＶＳＫＰＦＬでも、ＦＴＬＴＴＰＫでも、ＭＮＡＴＫＮＶでも、ＮＧＧＴＳＳＳでも、ＴＲＴＮＰＥＡでも、ＹＴＬＳＱＧＷでもない。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、単離され、精製される。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、肝臓の疾患または状態を処置するための静脈内投与用の医薬製剤として製剤化され、この医薬製剤は、薬学的に許容される担体をさらに含む。一部の実施形態では、医薬製剤は、治療剤をさらに含む。
本明細書で開示される態様は、配列番号１で提供されるＡＡＶカプシドタンパク質のアミノ酸配列中のアミノ酸５８８とアミノ酸５８９の間に７アミノ酸挿入物（Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７）を含むＡＡＶカプシドタンパク質を含む、ＡＡＶカプシドであって、Ｘ１がＥ、Ｄ、Ｇ、Ｒ、Ｓ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸である、ＡＡＶカプシドを提供する。一部の実施形態では、Ｘ２は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｔ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸である。一部の実施形態では、Ｘ３は、Ｅ、Ｋ、Ｌ、Ｔ、およびＱからなる群から選択されるアミノ酸である。一部の実施形態では、Ｘ４は、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｔ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸である。一部の実施形態では、Ｘ５は、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｐ、Ｌ、Ｑ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸である。一部の実施形態では、Ｘ６は、Ｆ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸である。一部の実施形態では、Ｘ７は、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸である。一部の実施形態では、７アミノ酸挿入物は、ＴＡＬＫＰＦＬ、ＴＴＬＫＰＦＬ、ＴＬＱＩＰＦＫ、ＴＭＱＫＰＦＩ、ＳＩＥＲＰＦＫ、ＲＹＱＧＤＳＶ、およびＴＴＬＫＰＦＳからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶカプシドのＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３中に存在する。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、キメラである。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質の６０コピーがアセンブルされてＡＡＶカプシドになる。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、対象に全身送達されたときに対象の中枢神経系（ＣＮＳ）において測定されたとき、配列番号１で提供される天然ＡＡＶカプシドタンパク質と比較して特異性の増加および形質導入効率の向上のうちの少なくとも一方を特徴とする。一部の実施形態では、ＣＮＳは、ニューロン、グリア細胞、乏突起膠細胞、上衣細胞、星状膠細胞、シュワン細胞、衛星細胞、および腸管グリア細胞からなる群から選択される細胞型を含む。一部の実施形態では、ＣＮＳは、脳、視床、皮質、線条体、腹側中脳、および脊髄からなる群から選択される組織を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、Ａ５８７Ｄを含むアミノ酸置換をさらに含む。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、Ｑ５８８Ｇを含むアミノ酸置換をさらに含む。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、Ａ５８９Ｎを含むアミノ酸置換をさらに含む。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、Ｑ５９０Ｐを含むアミノ酸置換をさらに含む。一部の実施形態では、７アミノ酸挿入物は、ＴＬＡＶＰＦＫでも、ＫＦＰＶＡＬＴでも、ＳＶＳＫＰＦＬでも、ＦＴＬＴＴＰＫでも、ＭＮＡＴＫＮＶでも、ＮＧＧＴＳＳＳでも、ＴＲＴＮＰＥＡでも、ＹＴＬＳＱＧＷでもない。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、単離され、精製される。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、肝臓の疾患または状態を処置するための静脈内投与用の医薬製剤として製剤化され、この医薬製剤は、薬学的に許容される担体をさらに含む。一部の実施形態では、医薬製剤は、治療剤をさらに含む。
本明細書で提供される態様は、（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸２１７～アミノ酸７３６と少なくとも９８％同一である第１のアミノ酸配列と、（ｉｉ）配列番号１内のアミノ酸５８８＿５８９位における表４または図３５で提供されるアミノ酸配列と少なくとも５７．１％同一の第２のアミノ酸配列とを含み、対象に全身送達されたときに対象の肝臓において測定されたとき、配列番号１で提供される天然ＡＡＶカプシドタンパク質と比較して特異性の増加および形質導入効率の向上のうちの少なくとも一方を特徴とする、ＡＡＶカプシドタンパク質を含む、ＡＡＶカプシドを提供する。一部の実施形態では、第２のアミノ酸配列は、表４または図３５で提供されるアミノ酸配列と少なくとも７１．４％同一である。一部の実施形態では、第２のアミノ酸配列は、表４または図３５で提供されるアミノ酸配列と少なくとも８６．７％同一である。一部の実施形態では、第２のアミノ酸配列は、ＫＡＹＳＶＱＶ、ＰＳＧＳＡＲＳ、およびＲＴＡＮＡＬＧからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶカプシドのＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３中に存在する。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、キメラである。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質の６０コピーがアセンブルされてＡＡＶカプシドになる。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、単離され、精製される。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、肝臓の疾患または状態を処置するための静脈内投与用の医薬製剤として製剤化され、この医薬製剤は、薬学的に許容される担体をさらに含む。一部の実施形態では、医薬製剤は、治療剤をさらに含む。
本明細書で開示される態様は、（ｉ）配列番号１のアミノ酸２１７～アミノ酸７３６と少なくとも９８％同一である第１のアミノ酸配列と、（ｉｉ）配列番号１内のアミノ酸５８８＿５８９位に挿入された表２～３または図３３で提供されるアミノ酸配列と少なくとも５７．１％同一の第２のアミノ酸配列とを含み、対象に全身送達されたときに対象の中枢神経系（ＣＮＳ）において測定されたとき、配列番号１で提供される天然ＡＡＶカプシドタンパク質と比較して特異性の増加および形質導入効率の向上のうちの少なくとも一方を特徴とする、ＡＡＶカプシドタンパク質を提供する。一部の実施形態では、第２のアミノ酸配列は、表２～３または図３３で提供されるアミノ酸配列と少なくとも７１．４％同一である。一部の実施形態では、第２のアミノ酸配列は、表２～３または図３３で提供されるアミノ酸配列と少なくとも８６．７％同一である。一部の実施形態では、第２のアミノ酸配列は、ＴＡＬＫＰＦＬ、ＴＴＬＫＰＦＬ、ＴＬＱＩＰＦＫ、ＴＭＱＫＰＦＩ、ＳＩＥＲＰＦＫ、ＲＹＱＧＤＳＶ、およびＴＴＬＫＰＦＳからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶカプシドのＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３中に存在する。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、キメラである。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質の６０コピーがアセンブルされてＡＡＶカプシドになる。一部の実施形態では、ＣＮＳは、ニューロン、乏突起膠細胞、星状膠細胞、および脳血管細胞からなる群から選択される細胞型を含む。一部の実施形態では、ＣＮＳは、脳、視床、皮質、線条体、腹側中脳、および脊髄からなる群から選択される組織を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、アミノ酸置換Ａ５８７Ｄをさらに含む。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、アミノ酸置換Ｑ５８８Ｇをさらに含む。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、Ａ５８９Ｎを含むアミノ酸置換をさらに含む。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、Ｑ５９０Ｐを含むアミノ酸置換をさらに含む。一部の実施形態では、配列番号１内のアミノ酸５８８＿５８９位における第２のアミノ酸配列は、ＴＬＡＶＰＦＫでも、ＫＦＰＶＡＬＴでも、ＳＶＳＫＰＦＬでも、ＦＴＬＴＴＰＫでも、ＭＮＡＴＫＮＶでも、ＮＧＧＴＳＳＳでも、ＴＲＴＮＰＥＡでも、ＹＴＬＳＱＧＷでもない。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、単離され、精製される。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、肝臓の疾患または状態を処置するための静脈内投与用の医薬製剤として製剤化され、この医薬製剤は、薬学的に許容される担体をさらに含む。一部の実施形態では、医薬製剤は、治療剤をさらに含む。
本明細書で開示される態様は、配列番号１で提供されるＡＡＶカプシドタンパク質のアミノ酸配列中のアミノ酸５８８とアミノ酸５８９の間に７アミノ酸挿入物（Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７）を含むＡＡＶカプシドタンパク質であって、Ｘ１がＥ、Ｄ、Ｇ、Ｒ、Ｓ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸である、ＡＡＶカプシドタンパク質を提供する。一部の実施形態では、Ｘ２は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｔ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸である。一部の実施形態では、Ｘ３は、Ｅ、Ｋ、Ｌ、Ｔ、およびＱからなる群から選択されるアミノ酸である。一部の実施形態では、Ｘ４は、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｔ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸である。一部の実施形態では、Ｘ５は、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｐ、Ｌ、Ｑ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸である。一部の実施形態では、Ｘ６は、Ｆ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸である。一部の実施形態では、Ｘ７は、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸である。一部の実施形態では、７アミノ酸挿入物は、ＴＡＬＫＰＦＬ、ＴＴＬＫＰＦＬ、ＴＬＱＩＰＦＫ、ＴＭＱＫＰＦＩ、ＳＩＥＲＰＦＫ、ＲＹＱＧＤＳＶ、およびＴＴＬＫＰＦＳからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶカプシドのＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３中に存在する。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、キメラである。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質の６０コピーがアセンブルされてＡＡＶカプシドになる。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、対象に全身送達されたときに対象の中枢神経系（ＣＮＳ）において測定されたとき、配列番号１で提供される天然ＡＡＶカプシドタンパク質と比較して特異性の増加および形質導入効率の向上のうちの少なくとも一方を特徴とする。一部の実施形態では、ＣＮＳは、ニューロン、グリア細胞、乏突起膠細胞、上衣細胞、星状膠細胞、シュワン細胞、衛星細胞、および腸管グリア細胞からなる群から選択される細胞型を含む。一部の実施形態では、ＣＮＳは、脳、視床、皮質、線条体、腹側中脳、および脊髄からなる群から選択される組織を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、Ａ５８７Ｄを含むアミノ酸置換をさらに含む。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、Ｑ５８８Ｇを含むアミノ酸置換をさらに含む。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、Ａ５８９Ｎを含むアミノ酸置換をさらに含む。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、Ｑ５９０Ｐを含むアミノ酸置換をさらに含む。一部の実施形態では、７アミノ酸挿入物は、ＴＬＡＶＰＦＫでも、ＫＦＰＶＡＬＴでも、ＳＶＳＫＰＦＬでも、ＦＴＬＴＴＰＫでも、ＭＮＡＴＫＮＶでも、ＮＧＧＴＳＳＳでも、ＴＲＴＮＰＥＡでも、ＹＴＬＳＱＧＷでもない。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、単離され、精製される。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、肝臓の疾患または状態を処置するための静脈内投与用の医薬製剤として製剤化され、この医薬製剤は、薬学的に許容される担体をさらに含む。一部の実施形態では、医薬製剤は、治療剤をさらに含む。
本明細書で提供される態様は、（ｉ）配列番号１のアミノ酸２１７～アミノ酸７３６と少なくとも９８％同一である第１のアミノ酸配列と、（ｉｉ）配列番号１内のアミノ酸５８８＿５８９位における表４または図３５で提供されるアミノ酸配列と少なくとも５７．１％同一の第２のアミノ酸配列とを含み、対象に全身送達されたときに対象の肝臓において測定されたとき、配列番号１で提供される天然ＡＡＶカプシドタンパク質と比較して特異性の増加および形質導入効率の向上のうちの少なくとも一方を特徴とする、ＡＡＶカプシドタンパク質を提供する。一部の実施形態では、第２のアミノ酸配列は、表４または図３５で提供されるアミノ酸配列と少なくとも７１．４％同一である。一部の実施形態では、第２のアミノ酸配列は、表４または図３５で提供されるアミノ酸配列と少なくとも８６．７％同一である。一部の実施形態では、第２のアミノ酸配列は、ＫＡＹＳＶＱＶ、ＰＳＧＳＡＲＳ、およびＲＴＡＮＡＬＧからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶカプシドのＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３中に存在する。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、キメラである。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質の６０コピーがアセンブルされてＡＡＶカプシドになる。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、単離され、精製される。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、肝臓の疾患または状態を処置するための静脈内投与用の医薬製剤として製剤化され、この医薬製剤は、薬学的に許容される担体をさらに含む。一部の実施形態では、医薬製剤は、治療剤をさらに含む。
本明細書で開示される態様は、本明細書に記載のＡＡＶカプシドおよびＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸配列を含むプラスミドベクターを含む。一部の事例では、プラスミドベクターは、細菌性である。一部の事例では、プラスミドベクターは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉに由来する。一部の事例では、核酸配列は、５’から３’の方向に、（１）５’逆位末端反復（ＩＴＲ）配列、（２）複製（Ｒｅｐ）遺伝子、（３）カプシド（Ｃａｐ）遺伝子、および（４）３’ＩＴＲを含み、Ｃａｐ遺伝子は、本明細書に記載のＡＡＶカプシドタンパク質をコードする。一部の事例では、プラスミドベクターは、偽型ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする。一部の事例では、Ｃａｐ遺伝子は、配列番号６～１０のいずれか１つで提供されるデオキシリボース核酸（ＤＮＡ）に由来する。一部の事例では、Ｃａｐ遺伝子を含む核酸配列は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第１６／５８２，６３５号で提供されているＤＮＡ配列のうちのいずれか１つと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である。一部の事例では、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲは、ＡＡＶ２血清型に由来する。一部の事例では、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲは、ＡＡＶ５血清型に由来する。一部の事例では、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲは、ＡＡＶ９血清型に由来する。
本明細書で開示される態様は、対象における疾患または状態を処置する方法であって、本開示のＡＡＶカプシドタンパク質またはＡＡＶカプシドを含む医薬製剤の治療有効量を投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、疾患または状態は、対象の中枢神経系（ＣＮＳ）または肝臓の疾患または状態である。一部の実施形態では、肝臓の疾患または状態は、アラジール症候群、アルコール関連肝疾患、アルファ－１アンチトリプシン欠損症、自己免疫性肝炎、良性肝臓腫瘍、胆道閉塞、肝硬変、クリグラー・ナジャー症候群、ガラクトース血症、ジルベール症候群、ヘモクロマトーシス、肝性脳症、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、肝腎症候群、妊娠性肝内胆汁うっ滞（ＩＣＰ）、リソソーム酸性リパーゼ欠損症（ＬＡＬ－Ｄ）、肝嚢胞、肝臓がん、新生児黄疸、非アルコール性脂肪肝疾患、原発性胆汁性胆管炎（ＰＢＣ）、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）、ライ症候群、Ｉ型糖原病、およびウィルソン病からなる群から選択される。一部の実施形態では、ＣＮＳの疾患または状態は、透明中隔欠損、酸性リパーゼ病、酸性マルターゼ欠損症、後天性てんかん性失語症、急性散在性脳脊髄炎、注意欠陥・多動性障害（ＡＤＨＤ）、アディー瞳孔、アディー症候群、副腎白質ジストロフィー、脳梁欠損症、失認、アイカルディ症候群、アイカルディ・グティーエール症候群障害、ＡＩＤＳ－神経学的合併症、アレキサンダー病、アルパース病、交代性片麻痺、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、無脳症、動脈瘤、アンジェルマン症候群、血管腫症、無酸素症、抗リン脂質抗体症候群、失語症、失行症、くも膜嚢胞、くも膜炎、アーノルド・キアリ奇形、動静脈奇形、アスペルガー症候群、運動失調、毛細血管拡張症性運動失調症、運動失調および小脳または脊髄小脳変性症、心房細動および脳卒中、注意欠陥・多動性障害、自閉症スペクトラム障害、自律神経障害、背部痛、バース症候群、バッテン病、ベッカー型筋強直症、ベーチェット病、ベル麻痺、良性本態性眼瞼痙攣、良性限局性筋萎縮症、良性頭蓋内圧亢進症、ベルンハルト・ロート症候群、ビンスワンガー病、眼瞼痙攣、ブロッホ・サルツバーガー症候群、分娩時腕神経叢損傷、腕神経叢損傷、ブラッドベリー・エッグルストン症候群、脳および脊椎腫瘍、脳動脈瘤、脳損傷、ブラウン・セカール症候群、球脊髄性筋萎縮症、皮質下梗塞と白質脳症を伴う常染色体優性脳動脈症（ＣＡＤＡＳＩＬ）、カナバン病、手根管症候群、カウザルギー、カベルノーマ、海綿状血管腫、海綿状血管奇形、中心性頸髄症候群、中心性脊髄症候群、中枢性疼痛症候群、橋中心髄鞘崩壊症、頭蓋障害、セラミダーゼ欠損症、小脳変性症、小脳形成不全、脳動脈瘤、脳動脈硬化症、脳萎縮、脳性脚気、脳海綿状血管奇形（Cerebral Cavemous Malformation）、脳性巨人症、低酸素性脳症、脳性麻痺、脳・眼・顔・骨格症候群（ＣＯＦＳ）、シャルコー・マリー・トゥース病、シャルコー・マリー・トゥース症候群、古典的肢根型点状軟骨異形成症（ＲＣＤＰ）、キアリ奇形、コレステロールエステル蓄積症、舞踏病、有棘赤血球舞踏病、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）、慢性起立性調節障害、慢性疼痛、コケイン症候群ＩＩ型、コフィン・ローリー症候群、コルポセファリー、昏睡、複合性局所疼痛症候群、先天性顔面両側麻痺、先天性筋無力症、先天性ミオパチー、先天性海綿状血管奇形、大脳皮質基底核変性症、頭蓋動脈炎、頭蓋骨癒合症、クリー脳炎、クロイツフェルト・ヤコブ病、累積外傷性障害、クッシング症候群、巨細胞封入体症、サイトメガロウイルス感染症、ダンシングアイズ・ダンシングフィート症候群、ダンディー・ウォーカー症候群、ドーソン病、難聴、ドモルシア症候群、デジュリン・クルンプケ麻痺、認知症、多発脳梗塞性認知症、意味性認知症、皮質下認知症、レビー小体型認知症、歯状核小脳運動失調症、歯状赤核萎縮、皮膚筋炎、発達性失行、デビック症候群、糖尿病性ニューロパチー、びまん性硬化症、ドラベ症候群、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、自律神経異常、書字障害、失読症、嚥下障害、統合運動障害、ミオクローヌス性小脳性共同運動障害、進行性小脳性共同運動障害、ジストニア、早期乳児てんかん性脳症、エンプティセラ症候群、脳炎、嗜眠性脳炎、脳ヘルニア、脳症、脳症（家族性新生児）、脳三叉神経領域血管腫症、てんかん、てんかん性片麻痺、エルブ型麻痺、エルブ・デュシェンヌおよびデジュリン・クルンプケ麻痺、本態性振戦、橋外髄鞘崩壊症、ファブリー病、ファール症候群、失神、家族性自律神経失調症、家族性血管腫、家族性特発性基底核石灰化症、家族性周期性麻痺、家族性痙性麻痺、ファーバー病、熱性痙攣、線維筋性異形成、フィッシャー症候群、筋緊張低下児症候群、下垂足、フリードライヒ運動失調症、前頭側頭型認知症、ゴーシェ病、全身性ガングリオシドーシス、ゲルストマン症候群、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、巨大軸索ニューロパチー、巨細胞動脈炎、巨細胞封入体病、神経膠芽腫、グロボイド細胞白質ジストロフィー、舌咽神経痛、糖原病、ギラン・バレー症候群、ハラーフォルデン・シュパッツ病、頭部損傷、頭痛、持続性片側頭痛、片側顔面痙攣、交代性片麻痺（Hemiplegia Alterans）、遺伝性ニューロパチー、遺伝性痙性対麻痺、多発神経炎型遺伝性失調症、帯状疱疹、耳帯状疱疹、平山症候群、ホームズ・アディー症候群、全前脳胞症、ＨＴＬＶ－１関連ミエロパチー、ヒューズ症候群、ハンチントン病、水頭無脳症、水頭症、正常圧水頭症、水脊髄症、副腎皮質ホルモン過剰症、過眠、筋緊張亢進、筋緊張低下、低酸素症、免疫介在性脳脊髄炎、封入体筋炎、色素失調症、小児筋緊張低下、乳児神経軸索ジストロフィー、乳児フィタン酸蓄積症、乳児レフサム病、乳児痙攣、炎症性ミオパチー、後頭孔脳脱出症、腸性脂肪異栄養症、頭蓋内嚢胞、頭蓋内圧亢進症、アイザックス症候群、ジュベール症候群、カーンズ・セイヤー症候群、ケネディー病、キンスボーン症候群、クライン・レビン症候群、クリッペル・フェイル症候群、クリッペル・トレノネー症候群（ＫＴＳ）、クリューバー・ビューシー症候群（Kliiver-Bucy Syndrome）、コルサコフ健忘症候群、クラッベ病、クーゲルベルグ・ウェランダー病、クールー病、ランバート・イートン筋無力症候群、ランドウ・クレフナー症候群、外側大腿皮神経絞扼、外側髄症候群、学習障害、リー病、レノックス・ガストー症候群、レッシュ・ナイハン症候群、白質ジストロフィー、レビン・クリチリー症候群、レビー小体型認知症、脂質蓄積症、リポイドタンパク症、滑脳症、閉じ込め症候群、ルー・ゲーリック病、ループス－神経学的後遺症、ライム病－神経学的合併症、マチャド・ジョセフ病、大脳症、巨脳症、メルカーソン・ローゼンタール症候群、髄膜炎、髄膜炎および脳炎、メンケス病、異常感覚性大腿神経痛、異染性白質ジストロフィー、小頭症、偏頭痛、ミラー・フィッシャー症候群、軽度の脳卒中、ミトコンドリアミオパチー、メビウス症候群、一側性筋萎縮症、運動ニューロン疾患、もやもや病、ムコリピドーシス、ムコ多糖症、多発脳梗塞性認知症、多巣性運動ニューロパチー、多発性硬化症、多系統萎縮症、起立性低血圧を伴う多系統萎縮症、筋ジストロフィー、先天性筋無力症、重症筋無力症、びまん性骨髄破壊性硬化症、乳児期ミオクロニー脳症、ミオクローヌス、ミオパチー、先天性ミオパチー、甲状腺中毒性ミオパチー、筋強直症、先天性筋強直症、ナルコレプシー、神経有棘赤血球症、脳内鉄沈着を伴う神経変性症、神経線維腫症、神経遮断薬悪性症候群、ＡＩＤＳの神経学的合併症、ライム病の神経学的合併症、サイトメガロウイルス感染症の神経学的転帰、ポンペ病の神経症状、ループスの神経学的後遺症、視神経脊髄炎、神経性筋強直症、神経セロイドリポフスチン症、神経細胞移動障害、遺伝性ニューロパチー、神経サルコイドーシス、神経梅毒、神経毒性、海綿状母斑、ニーマン・ピック病、オサリバン・マクラウド症候群、後頭部神経痛、大田原症候群、オリーブ橋小脳萎縮症、オプソクローヌス・ミオクローヌス、起立性低血圧、過用症候群、慢性疼痛、パントテン酸キナーゼ関連神経変性症、腫瘍随伴症候群、異常知覚、パーキンソン病、発作性舞踏アテトーゼ、発作性片側頭痛、パリー・ロンバーグ、ペリツェウス・メルツバッハー病、ペナ・ショッカー症候群ＩＩ型、神経根嚢胞、周期性麻痺、末梢性ニューロパチー、脳室周囲白質軟化症、遷延性植物状態、広汎性発達障害、フィタン酸蓄積症、ピック病、圧迫神経、梨状筋症候群、下垂体腫瘍、多発性筋炎、ポンペ病、孔脳症、ポリオ後症候群、帯状疱疹後神経痛、感染後脳脊髄炎、体位性低血圧症、体位性起立性頻脈症候群、体位性頻脈症候群、原発性歯状核萎縮症、原発性側索硬化症、原発性進行性失語症、プリオン病、進行性顔面片側萎縮、進行性歩行運動失調、進行性多巣性白質脳症、進行性硬化性ポリオジストロフィー、進行性核上性麻痺、相貌失認、偽トーチ症候群、偽性トキソプラズマ症候群、偽脳腫瘍、心因性運動、ラムゼイ・ハント症候群Ｉ型、ラムゼイ・ハント症候群ＩＩ型、ラスムッセン脳炎、反射性交感神経ジストロフィー症候群、レフサム病、乳児型レフサム病、反復動作障害、反復性ストレイン損傷、下肢静止不能症候群、レトロウイルス関連ミエロパチー、レット症候群、ライ症候群、リウマチ性脳炎、ライリー・デイ症候群、仙骨神経根嚢腫、聖ヴィトゥス舞踏病、唾液腺疾患、サンドホフ病、シルダー病、裂脳症、ザイテルベルガー病、発作性障害、意味性認知症、中隔視神経形成異常症、乳児重症ミオクロニーてんかん（ＳＭＥＩ）、乳幼児揺さぶられ症候群、帯状疱疹、シャイ・ドレーガー症候群、シェーグレン症候群、睡眠時無呼吸、睡眠病、ソトス症候群、痙攣、二分脊椎、脊髄梗塞、脊髄損傷、脊髄腫瘍、脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳萎縮症、脊髄小脳変性症、スティール・リチャードソン・オルゼウスキー症候群、全身硬直症候群、線条体黒質変性症、脳卒中、スタージ・ウェーバー症候群、亜急性硬化性全脳炎、皮質下動脈硬化性脳症、短時間持続性片側神経痛様（ＳＵＮＣＴ）頭痛、嚥下障害、シデナム舞踏病、失神、梅毒性脊髄硬化症、脊髄水空洞症、脊髄空洞症、全身性エリテマトーデス、脊髄ろう、遅発性ジスキネジア、タルロブ嚢胞、テイ・サックス病、側頭動脈炎、脊髄係留症候群、トムゼン筋強直症、胸郭出口症候群、甲状腺中毒性ミオパチー、疼痛性チック、トッド麻痺、トゥレット症候群、一過性脳虚血発作、伝達性遺伝性海綿状脳症、横断性脊髄炎、外傷性脳損傷、振戦、三叉神経痛、熱帯性痙性不全対麻痺、トロイヤー症候群、結節性硬化症、血管性勃起性腫瘍、中枢および抹消神経系の血管炎症候群、フォン・エコノモ病、フォンヒッペル・リンダウ病（ＶＨＬ）、フォン・レックリングハウゼン病、ワレンベルク症候群、ウェルドニッヒ・ホフマン病、ウェルニッケ・コルサコフ症候群、ウエスト症候群、むち打ち症、ウィップル病、ウィリアムズ症候群、ウィルソン病、ウォルマン病、およびＸ連鎖性球脊髄性筋萎縮症からなる群から選択される。一部の実施形態では、医薬製剤は、治療用遺伝子発現産物をコードする治療用核酸を含む。一部の事例では、治療用遺伝子発現産物は、サルコグリカンアルファ（ＳＧＣＡ）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６５（ＧＡＤ６５）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６７（ＧＡＤ６７）、ＣＬＮ２、神経成長因子（ＮＧＦ）、生存運動ニューロン１、テロメア型（ＳＭＮ１）、第Ｘ因子（ＦＩＸ）、レチノイドイソメロヒドロラーゼ（ＲＰＥ６５）、筋小胞体／小胞体Ｃａ２＋－ＡＴＰａｓｅ（ＳＥＲＣＡ２ａ）、β－グルコセレブロシダーゼ（ＧＣａｓｅ）、フラタキシン（ＦＸＮ）、ハンチンチン（ＨＴＮ）、メチル化ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）、ペルオキシソーム形成因子（ＰＥＸ）、プログラニュリン（ＧＲＮ）、抗チューブリン剤、銅－亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）、グルコシルセラミダーゼベータ（ＧＢＡ）、ＮＰＣ細胞内コレステロール輸送体１（ＮＰＣ１）、およびＮＬＲＰ３インフラマソームからなる群から選択される、標的遺伝子または遺伝子発現産物の活性または発現のモジュレーションに有効である
。一部の事例では、治療用遺伝子発現産物は、遺伝子編集成分を含む。一部の事例では、遺伝子編集成分は、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、人工部位特異的ＲＮＡエンドヌクレアーゼ（ＡＳＲＥ）、ジンクフィンガーエンドヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、および転写因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）からなる群から選択される。
本明細書で開示される態様は、本開示のＡＡＶカプシドから組換えＡＡＶ粒子を製造する方法であって、（ａ）細胞に、（ｉ）治療用遺伝子発現産物をコードする第１の核酸配列と、（ｉｉ）本開示のＡＡＶカプシドを発現するように改変されたカプシド（Ｃａｐ）遺伝子を含む組換えウイルスゲノムをコードする第２の核酸配列と、（ｉｉｉ）ＡＡＶヘルパーウイルスゲノムをコードする第３の核酸配列とを含む核酸を導入するステップ；および（ｂ）第１の核酸をカプシド内封入しているＡＡＶカプシドを含む組換えＡＡＶ粒子をアセンブルするステップを含む方法を提供する。
本明細書で開示される態様は、（ａ）細胞に、（ｉ）５’および３’逆位末端反復（ＩＴＲ）配列で囲まれた治療用遺伝子発現産物をコードする第１の核酸配列と、（ｉｉ）５’ＩＴＲ配列、複製（Ｒｅｐ）遺伝子、カプシド（Ｃａｐ）遺伝子、および３’ＩＴＲを含むウイルスゲノムをコードし、Ｃａｐ遺伝子が本明細書に記載のＡＡＶカプシドタンパク質をコードする、第２の核酸配列と、（ｉｉｉ）Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ２ａおよびＶＡ ＲＮＡからなる群から選択される第１のヘルパーウイルスタンパク質をコードし、必要に応じて、Ｅ１ａまたはＥ１ｂ５５ｋを含む第２のヘルパーウイルスタンパク質をコードする、第３の核酸配列とを含む核酸を導入するステップ；（ｂ）細胞において本明細書に記載のＡＡＶカプシドタンパク質を発現させるステップ；（ｃ）本明細書で開示されるＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子をアセンブルするステップ、および（ｄ）第１の核酸配列をＡＡＶ粒子にパッケージングするステップを含む方法を提供する。一部の事例では、細胞は、哺乳動物細胞である。一部の事例では、細胞は、不死化細胞である。一部の事例では、不死化細胞は、胚性幹細胞である。一部の事例では、胚性幹細胞は、ヒト胚性幹細胞である。一部の事例では、ヒト胚性幹細胞は、ヒト胎児腎臓２９３（ＨＥＫ－２９３）細胞である。一部の事例では、Ｃａｐ遺伝子は、配列番号６～１０のいずれか１つで提供されるデオキシリボース核酸（ＤＮＡ）に由来する。一部の事例では、Ｃａｐ遺伝子を含む核酸配列は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第１６／５８２，６３５号で提供されているＤＮＡ配列のうちのいずれか１つと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である。一部の事例では、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲは、ＡＡＶ２血清型に由来する。一部の事例では、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲは、ＡＡＶ５血清型に由来する。一部の事例では、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲは、ＡＡＶ９血清型に由来する。一部の事例では、第１の核酸配列および第２の核酸配列は、トランスの関係にある。一部の事例では、第１の核酸配列および第２の核酸配列は、シスの関係にある。一部の事例では、第１の核酸配列、第２の核酸配列および第３の核酸配列は、トランスの関係にある。
本明細書で開示される態様は、組換えＡＡＶ粒子を製造する方法であって、（ａ）（ｉ）ＡＡＶカプシド遺伝子と、（ｉｉ）検出可能であるリコンビナーゼ依存性変化を促進し、２つのＣｒｅ認識部位を含む、Ｃｒｅリコンビナーゼの認識配列とを含む組換えＡＡＶゲノムを用意するステップ；（ｉｉｉ）Ｃｒｅリコンビナーゼを発現する細胞の集団に組換えＡＡＶゲノムをトランスフェクトするステップであって、それによって、Ｃｒｅリコンビナーゼが、組換え事象を誘導して組換えＡＡＶゲノムのリコンビナーゼ依存性変化を生じさせ、リコンビナーゼ依存性変化が、Ｃｒｅ認識部位と隣接している配列の逆位を含む、ステップ；（ｉｖ）細胞の集団中の標的細胞のリコンビナーゼ依存性変化率の増加を検出するステップ；（ｖ）細胞の集団中の標的外細胞のリコンビナーゼ依存性変化率の減少を検出するステップ；および（ｖｉ）リコンビナーゼ依存性変化によって生成される組換えＡＡＶゲノムを同定するステップを含み、前記同定されたｒＡＡＶゲノムが、逆位を含み、前記同定された組換えＡＡＶゲノムが、標的細胞に対する特異性の増加および標的外細胞に対する特異性の減少を有することを特徴とするＡＡＶカプシド粒子をコードする、方法を提供する。一部の実施形態では、標的外細胞は、肝細胞である。一部の実施形態では、標的細胞は、ニューロン、グリア細胞、乏突起膠細胞、上衣細胞、星状膠細胞、シュワン細胞、衛星細胞、および腸管グリア細胞からなる群から選択される細胞である。
本明細書で開示される態様は、（ａ）本開示の組換えベクターを含む第１のベクターと、（ｂ）ヘルパーウイルスタンパク質をコードする第２のベクターと、（ｃ）治療用遺伝子発現産物をコードする治療用核酸を含む第３のベクターとを含む、キットを提供する。
本明細書で開示される態様は、（ａ）ウイルスゲノムをコードする第１の核酸配列を含む第１のベクターであって、ウイルスゲノムが、５’から３’の方向に、（ｉ）５’逆位末端反復（ＩＴＲ）配列、（ｉｉ）複製（Ｒｅｐ）遺伝子、（ｉｉｉ）本明細書に記載のＡＡＶカプシドタンパク質をコードするカプシド（Ｃａｐ）遺伝子、および（ｉｖ）３’ＩＴＲを含む、第１のベクターと、（ｂ）必要に応じて、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ２ａ、ＶＡ ＲＮＡ、Ｅ１ａおよびＥ１ｂ５５ｋのうちの少なくとも１つを含むヘルパーウイルスタンパク質をコードする第２の核酸配列を含む第２のベクターとを含む、キットを提供する。一部の事例では、キットは、細胞をさらに含む。一部の事例では、細胞は、哺乳動物細胞である。一部の事例では、細胞は、不死化細胞である。一部の事例では、不死化細胞は、胚性幹細胞である。一部の事例では、胚性幹細胞は、ヒト胚性幹細胞である。一部の事例では、ヒト胚性幹細胞は、ヒト胎児腎臓２９３（ＨＥＫ－２９３）細胞である。一部の事例では、キットは、治療用遺伝子発現産物をコードする異種核酸を含むＡＡＶベクターをさらに含む。一部の事例では、ＡＡＶベクターは、エピソームである。
参照による組み込み
本明細書で言及されるすべての公表文献、特許および特許出願は、個々の公表文献、特許または特許出願各々が参照により組み込まれると具体的かつ個々に指し示されている場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の新規特徴は、添付の特許請求の範囲において具体的に示される。本発明の原理が活用される例示的実施形態を示す後続の詳細な説明、および添付の図面を参照することにより、本発明の特徴および利点のよりよい理解が得られるであろう。
図１は、特異的な幅広い指向性を有するカプシドを同定するための多重化された選択手法を示す。ステップ１～６は、ラウンド－１（Ｒ１）選択におけるワークフローを説明し、ステップ７～９は、合成プール法を使用するラウンド－２（Ｒ２）選択を説明し、ステップ１ａ、２ａおよび６ａ～ｂは、Ｒ１およびＲ２選択後にカプシドを回収するためのディープシークエンシングの組込みを示し、ステップ１０～１１は、正および／または負の選択基準、続いてバリアント特徴付けを説明する。
図２は、６０－ｍｅｒ形態（左側）、トリマー形態（中央）およびモノマー形態（右側）の、赤色で強調表示された７－ｍｅｒ－ｉライブラリーについての挿入部位を有する、ＡＡＶ９カプシドの構造モデル（ＰＤＢ ３ＵＸ１）を示す。
図３は、ギブソンアセンブリーおよびウイルス産生後にディープシークエンシングにより回収されたＲ１ ＤＮＡおよびウイルスライブラリーの経験的累積分布頻度（ＥＣＤＦ）をそれぞれ示す。
図４は、カプシドライブラリーをエンリッチメントスコアの減少順によりソートして、Ｔｅｋ－Ｃｒｅ、ＳＮＡＰ２５－Ｃｒｅ、およびＧＦＡＰ－Ｃｒｅ脳組織（Ｃｒｅ系統当りｎ＝２）からの３つのＲ１ライブラリーから回収されたバリアントの分布を示す。ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｖ２バリアントのエンリッチメントスコアもマッピングされている。
図５は、Ｒ２合成プール（左側）およびＰＣＲプール（右側）ライブラリー設計の概略図である。
図６は、上述のライブラリーとそれらの理論上の組成間のライブラリー重複パーセンテージを示す重ね合わせ棒グラフを示す。
図７は、２つの方法からのＤＮＡおよびウイルスライブラリーのヒストグラムであって、ライブラリー内のバリアントがそれらのリードカウント（ｌｏｇ１０スケール）によりビニングされており、ヒストグラムの高さがそれらの頻度に比例する、ヒストグラムを示す。
図８は、すべてのＣｒｅトランスジェニック系統（Ｃｒｅ系統当りマウスｎ＝２；平均値がプロットされている）および両方の方法からの、Ｒ２脳ライブラリーの分布であって、ライブラリーがエンリッチメントスコア（ｌｏｇ１０スケール）の減少順にソートされている、分布を示す。これらのライブラリーからの正にエンリッチされたバリアントの総数が点線の直線により強調表示されており、ＡＡＶ９の相対エンリッチメントが、合成プールプロット上にマッピングされている。
図９は、Ｔｅｋ－Ｃｒｅ脳ライブラリーからの８４６２バリアントの２つの代替コドン複製についてのエンリッチメントスコア（ｌｏｇ１０スケール）の比較を示す（マウスｎ＝２；平均値がプロットされている）。破線が高信頼度シグナル（＞０．３）とノイズを分けている。高信頼度シグナル（下方）について、線形最小二乗回帰が２つのコドンと回帰直線間で決定される（最良適合）。決定係数Ｒ２が示されている。
図１０は、統計的有意性に達することを前提として、各位置における所与のＡＡの相対エンリッチメントまたは枯渇の大きさ（ｌｏｇ２変化倍数）を表すヒートマップを示す（Ｐ値≦０．０００１の場合、箱に入れられる；両側、２比率ｚ検定；ｐ値はボンフェローニ補正を使用して多重比較用に補正されている）。オリゴプールに対して正規化されたＲ２ ＤＮＡ（上、約９０００ＡＡ配列）、Ｒ２ ＤＮＡに対して正規化されたＲ２ウイルス（中央、ｎ＝約９０００配列）、Ｒ２ウイルスに対して正規化された合成プール法からの０．３より高いエンリッチメントを有するＲ２ Ｔｅｋ脳ライブラリー（高信頼度シグナル）（下、１５４配列）（脳ライブラリーについてｎ＝２、マウスごとに１。他のすべてのライブラリー、ｎ＝１）。
図１１は、少なくとも１つのＣｒｅ依存性合成プール選択の脳組織内にエンリッチされたバリアント（より明るい文字列；細胞型当りマウスｎ＝２；平均値がプロットされている）についての器官にわたってのＣｒｅ非依存性相対エンリッチメントのヒートマップを示す（Ｃｒｅ系統ごとにマウスｎ＝２；３つのＣｒｅ系統からの６試料にわたっての平均値がプロットされている）（左側）。最も多いＣＮＳにエンリッチされたバリアント（中央）の拡大表示、およびスパイクインライブラリー対照とともに本研究で特徴付けされるバリアント（右側）の拡大表示が、示されている。
図１２は、Ｔｅｋ－Ｃｒｅ（左側）、ＧＦＡＰ－Ｃｒｅ（中央）、ならびにＳＮＡＰ－ＣｒｅおよびＳｙｎ－Ｃｒｅ併用（右側）選択でのエンリッチメント後の合成プール脳ライブラリーからのバリアントのクラスタリング解析を示す。ノードのサイズは、脳における相対エンリッチメントを表す。類似度を表すエッジ（接続線）の太さ。対応するＡＡ頻度ロゴ（ＡＡサイズは、存在率を表し、色は、ＡＡ特性をコードする）を有する明確に異なるファミリー（黄色）。
図１３は、ＡＡＶ９カプシドのＡＡ５８８～５８９位間のＡＡＶ－ＰＨＰバリアントの７－ｍｅｒ挿入ペプチド配列を示す。
図１４は、ｓｓＡＡＶ：ＣＡＧ－ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎゲノムを使用するＡＡＶ９（左側）およびＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｖ１（右側）媒介発現を示す（ｎ＝３；Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ成体マウスにおける３×１０１１ｖｇ ＩＶ用量／マウスでの３週間の発現）。これらの画像は、皮質（下）からのより高い倍率の画像とともに、脳の矢状断面（上）のものと同じ顕微鏡設定下で取得した。αＧＬＵＴ１抗体染色を、血管系を示すために画像に使用した。
図１５は、Ｔｅｋ－Ｃｒｅ成体マウスにおけるｓｓＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｖ１：ＣＡＧ－ＤＩＯ－ＥＹＦＰ（左側）（ｎ＝２；４週間の発現；１×１０１２ｖｇ ＩＶ用量／マウス）による、およびＡｉ１４レポーターマウスにおけるｓｓＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｖ１：Ｐｌｅ２６１－ｉＣｒｅ（右側）（ｎ＝２；３週間の発現、３×１０１１ｖｇ ＩＶ用量／マウス）による、血管形質導入を示す。組織がαＧＬＵＴ１で染色されている。
図１６は、皮質におけるｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎ（ＸＦＰ）発現と重複しているαＧＬＵＴ１での血管系染色のパーセンテージを示す。一元配置ＡＮＯＶＡノンパラメトリッククラスカル・ウォリス検定（Ｐ値 ０．００３６）と、未補正ダン検定を使用する追跡多重比較（ＰＨＰ．Ｖ１に対してＡＡＶ９について０．００７０のＰ値）とが、報告されている。＊＊Ｐ≦０．０１が示されており、Ｐ＞０．０５は示されていない；データは、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍである；ＡＡＶバリアントごとにマウスｎ＝３；細胞型ごとにマウス１匹につき２～４画像から定量化された細胞。
図１７は、皮質においてｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎ（ＸＦＰ）発現と重複している、各細胞型特異的マーカー（星状膠細胞についてαＧＬＵＴ１、αＳ１００、ニューロンについてαＮｅｕＮ、乏突起膠細胞系譜細胞についてαＯｌｉｇ２）で染色された細胞のパーセンテージを示す。クラスカル・ウォリス検定（０．００７８のＰ値）、および未補正ダン検定（それぞれ、血管細胞に対してニューロンについて０．０２３５のＰ値、および星状膠細胞に対してニューロンについて０．０１７４のＰ値）が、報告されている。＊Ｐ ０．０５が示されており、Ｐ＞０．０５は示されていない；データは、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍである；マウスｎ＝３；細胞型ごとにマウス１匹につき２～４画像から定量化された細胞。
図１８は、Ｔｅｋ－Ｃｒｅマウスにおける（図１６に記載の）血管形質導入の効率を示す（ｎ＝２；脳領域ごとにマウス１匹につき３画像からの平均値）。
図１９は、Ａｉ１４マウスにおける血管形質導入の効率を示す（ｎ＝２、脳領域当りマウス１匹につき４画像からの平均値）。
図２０は、矢状断面脳および肝臓切片におけるＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ４～Ｂ６およびＣ１バリアント、ならびにＢ、ｅＢ、およびＡＡＶ９対照による形質導入を示す。取得された画像の各セット（縦方向）にわたって、顕微鏡設定をＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢと合わせた。矢状断面脳画像上の白い四角形の枠は、視床をマーク付けし、右側に対する図の正確な領域をマーク付けしない。ベクターには、ｓｓＡＡＶ：ＣＡＧ－２ｘＮＬＳ－ＥＧＦＰゲノムがパッケージングされている（群当りｎ＝３；１×１０１１ｖｇ ＩＶ用量／成体Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス；３週間の発現）。組織が、細胞型特異的マーカーで：ニューロンについてαＮｅｕＮで、星状膠細胞についてαＳ１００で、および乏突起膠細胞系譜細胞についてαＯｌｉｇ２で、染色されている。肝臓組織が、ＤＮＡ染色剤であるＤＡＰＩで染色されている。 同上。
図２１～２３は、指し示されている脳領域（群ごとにｎ＝３；１×１０１１ｖｇ用量）に検出可能な核局在ＥＧＦＰがある、αＮｅｕＮ＋（図２１）、αＳ１００＋（図２２）およびαＯｌｉｇ２＋（図２３）細胞のパーセンテージを示す。テューキー検定を使用する多重比較用に補正した二元配置ＡＮＯＶＡが、調整されたＰ値とともに報告されている（プロット上に、＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１、＊＊＊Ｐ≦０．００１、＊＊Ｐ≦０．０１、＊Ｐ≦０．０５が示されており、Ｐ＞０．０５は示されていない；９５％ＣＩ；データは、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．である。データセットは、マウスごとに１細胞型マーカー当り１領域につき２画像の平均値を含む）。 図２１～２３は、指し示されている脳領域（群ごとにｎ＝３；１×１０１１ｖｇ用量）に検出可能な核局在ＥＧＦＰがある、αＮｅｕＮ＋（図２１）、αＳ１００＋（図２２）およびαＯｌｉｇ２＋（図２３）細胞のパーセンテージを示す。テューキー検定を使用する多重比較用に補正した二元配置ＡＮＯＶＡが、調整されたＰ値とともに報告されている（プロット上に、＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１、＊＊＊Ｐ≦０．００１、＊＊Ｐ≦０．０１、＊Ｐ≦０．０５が示されており、Ｐ＞０．０５は示されていない；９５％ＣＩ；データは、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．である。データセットは、マウスごとに１細胞型マーカー当り１領域につき２画像の平均値を含む）。 図２１～２３は、指し示されている脳領域（群ごとにｎ＝３；１×１０１１ｖｇ用量）に検出可能な核局在ＥＧＦＰがある、αＮｅｕＮ＋（図２１）、αＳ１００＋（図２２）およびαＯｌｉｇ２＋（図２３）細胞のパーセンテージを示す。テューキー検定を使用する多重比較用に補正した二元配置ＡＮＯＶＡが、調整されたＰ値とともに報告されている（プロット上に、＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１、＊＊＊Ｐ≦０．００１、＊＊Ｐ≦０．０１、＊Ｐ≦０．０５が示されており、Ｐ＞０．０５は示されていない；９５％ＣＩ；データは、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．である。データセットは、マウスごとに１細胞型マーカー当り１領域につき２画像の平均値を含む）。
図２４は、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ＢのＡＡ５８７～５９７（またはＡＡＶ９の対応するＡＡ５８７～５９０）間の３つのＡＡ多様化の組合せを用いる３－ｍｅｒ－ｓ ＰＨＰ．Ｂライブラリーの設計を示す。親ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂとの共有ＡＡ同一性が、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ＮおよびＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢについて特有のモチーフとともに示されている。
図２５は、エンリッチメントスコアによるＲ２脳および肝臓ライブラリーの（ＡＡレベルでの）分布を示す（Ｒ２ウイルスライブラリーに対して正規化されており、バリアントがエンリッチメントスコアの減少順にソートされている）。すべてのライブラリーにわたってのＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢおよびＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｎのエンリッチメントがプロット上にマッピングされている。
図２６は、統計的有意性が倍数変化に達する場合のみの、多様な領域にわたっての各位置における所与のＡＡの相対エンリッチメントまたは枯渇の大きさ（ｌｏｇ２変化倍数）を表すヒートマップを示す（Ｐ値≦０．０００１の場合、箱に入れられる；両側、２比率ｚ検定；ｐ値はボンフェローニ補正を使用して多重比較用に補正されている）。プロットは、脳内に高度にエンリッチされたバリアント（平均エンリッチメントスコア＞０．５（この場合、平均値は、Ｖｇｌｕｔ２、ＶｇａｔおよびＧＦＡＰにわたって導き出される）、マウス系統ごとにライブラリーｎ＝１（系統ごとにマウス２匹からプールされた試料））および肝臓において過少表示（＜０．０）されたバリアント（３２ＡＡ配列）を含む。
図２７は、ノードサイズが肝臓における負のエンリッチメントの程度を表し、エッジ（接続線）の太さがノード間の類似度を表す、Ｖｇａｔ脳ライブラリーからのエンリッチされたバリアントのクラスタリング解析を示す。２つの明確に異なるファミリーが黄色で強調表示されており、それらの対応するＡＡ頻度ロゴが下に示されている（ＡＡサイズは、存在率を表し、色は、ＡＡ特性をコードする）。
図２８は、指し示されている脳領域にｓｓＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｎ：ＣＡＧ－２ｘＮＬＳ－ＥＧＦＰがあるニューロン、星状膠細胞および乏突起膠細胞系譜細胞のパーセンテージを示す（ｎ＝３；成体Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス１匹当り１×１０１１ｖｇ ＩＶ用量；３週間の発現；データは、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．である；２０×対物レンズを使用して全領域を包含する、細胞型マーカーごとにマウス１匹につき皮質、視床および線条体についての６～８画像ならびに腹側中脳についての２画像）。テューキー検定を使用する多重比較用に補正した二元配置ＡＮＯＶＡにより、調整されたＰ値が得られ、＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１の場合は報告され、Ｐ＞０．０５についてはｎｓ、９５％ＣＩ、であった。
図２９は、脳の３つの区域（皮質、ＳＮｃ（黒質緻密部）および視床）にわたってＮｅｕＮ染色（マゼンタ）を用いてｓｓＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｎ：ＣＡＧ－ＮＬＳ－ＥＧＦＰによる形質導入を示す（ｎ＝２；成体Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス１匹当り２×１０１１ｖｇ ＩＶ用量；３週間の発現）。 同上。
図３０は、以前の研究（ＰＨＰ．Ｂ～Ｂ３、ＰＨＰ．ｅＢ）または本研究（ＰＨＰ．Ｂ４～Ｂ８、ＰＨＰ．Ｖ１～２、ＰＨＰ．Ｃ１～３）のどちらかで同定された、本明細書に記載のすべてのバリアントの脳にエンリッチされた配列ファミリーを示す、クラスタリング解析を示す。ノード間の類似度を表すエッジ（接続線）の太さ。論じられたすべてのバリアントについての（ＡＡＶ９カプシドの）５８８～５８９間に挿入されたＡＡ配列が、下に示されている。
図３１は、３つの異なるマウス株：Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、ＢＡＬＢ／ｃＪおよびＦＶＢ／ＮＪにわたっての矢状断面脳切片におけるＡＡＶ９、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｖ１およびＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｎの形質導入（右側）を、視床脳領域のより高倍率の画像（左側）とともに示す。
図３２は、Ｃ５７ＢＬ／６ＪおよびＢＡＬＢ／ｃＪマウスの矢状断面脳切片におけるＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｃ１～Ｃ３による形質導入（右側）を、視床脳領域のより高倍率の画像（左側）とともに示す。図３１および３２において、矢状断面脳画像上の白い四角形の枠は、視床の配置を表し、左側に対する図の拡大表示される正確な面積を表さない。すべての矢状断面にわたって、およびすべての視床領域にわたって、取得された画像の顕微鏡設定を合わせた。ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｖ１における差し込み図は、輝度が強化された拡大表示である。指し示されているカプシドを使用して、ｓｓＡＡＶ：ＣＡＧ－ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎをパッケージングした（群ごとにｎ＝２～３；６～８週齢成体マウス１匹当り１×１０１１ｖｇ ＩＶ用量；３週間の発現。図３１および３２で報告されるデータは、１回の独立した試験からのものであり、この試験では、すべてのウイルスを新たに調製し、投薬量の一貫性のために同じアッセイで力価判定した。ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｃ２およびＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｃ３を、独立した試験で、ＢＡＬＢ／ｃＪ、群ごとにｎ＝２、についてさらに検証した）。
図３３は、すべての細胞系の中で脳組織内に正にエンリッチされた７－ｍｅｒおよび１１－ｍｅｒバリアントを提供する。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。
図３４は、１つの特定のライブラリーではエンリッチされたが、全ての他の脳および肝臓ライブラリーでは負にエンリッチされた、７－ｍｅｒおよび１１－ｍｅｒバリアントを提供する。 同上。
図３５は、肝臓組織におけるすべてのｃｒｅ系統の中で正にエンリッチされた１１－ｍｅｒバリアントを提供する。 同上。 同上。 同上。
図３６は、Ｍ－ＣＲＥＡＴＥで使用された遺伝子スイッチの略図である。アクセプターベクターは、Ｃｒｅ＋細胞からのカプシドの選択的回収に使用されるＬｏｘ部位間のフォワードおよびリバースプライマーの位置を示す。Ｒｅｐ－ＡＡＰΔＣａｐベクターは、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶｐ３タンパク質の合成を防止するように設計されている停止コドンに加えて、Ｃａｐ遺伝子内の４８０ｂｐの欠失を示す。ＡＡＰタンパク質翻訳は、これらの改変による影響を受けない。
図３７は、Ｃｒｅ－Ｌｏｘ反転戦略を使用して標的集団からｒＡＡＶゲノムを選択的に回収するためのプロトコールおよびディープシークエンシング用の試料の調製についての概略図を示す。
図３８は、特定のシークエンシング深度から得られたＲ１ ＤＮＡおよびウイルスライブラリーのライブラリーカバレッジを例証する。
図３９は、試料抽出ＤＮＡおよびウイルス内の、または組織内の異なるＣｒｅ系統にわたっての、またはＲ１選択からの組織にわたっての、バリアント重複のパーセンテージを示す。
図４０は、Ｒ１選択後に異なるＣｒｅトランスジェニックマウスにわたって脳組織からＮＧＳにより回収されたライブラリーについてのＡＡＶカプシドリードカウントの分布を示す。点線は、一例に過ぎず、シグナルをノイズから大まかに分けるものであり（シグナル対ノイズの推定のための方法を参照されたい）、この文脈でのシグナルは、Ｒ２選択のための入力を表す。
図４１は、０．１ｇの肝臓からの全ｒＡＡＶゲノム回収量で示される、異なる処置を使用する組織からのｒＡＡＶゲノム回収量を示す。
図４２は全抽出ＤＮＡのｎｇ当りの回収されたｒＡＡＶゲノムのパーセンテージを示す。
図４３は、ＳｍａＩ制限酵素で処理されたまたは未処理であった、トリゾールにより抽出されたｒＡＡＶゲノムのＣＴ値（ｑＰＣＲからのサイクル閾値）を示す。
図４４は、肝臓組織からの１ｎｇの全ＤＮＡから回収されたミトコンドリアＤＮＡのＣＴ値（より少ないゲノム回収のための内部対照；倍数変化＝１０．７９（２ΔＣＴ））を示す。図４１～４４において、マウスｎ＝４；ＧＦＡＰ－Ｃｒｅ系統から２匹およびＴｅｋ－Ｃｒｅ系統から２匹；各データ点は、３回の技術的反復の平均値から導き出され、エラーバーは、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．である；マン・ホイットニー検定、両側（図４１、４２および４４での正確なＰ値０．０２８６（＊Ｐ≦０．０５）、および図４３での正確なＰ値０．１１４３（ｎ．ｓ．、Ｐ＞０．０５、ＣＩ ９５％））。図４１、４２および４４で報告されるデータは、１回の独立した試験からのものであり、図４３で報告されるデータは、３回の独立した試験からのものである。
図４５は、カプシドＤＮＡライブラリー１０ｎｇ当りの得られたベクター収量をＲ１およびＲ２ベクター産生にわたって示す。
図４６は、合成プールおよびＰＣＲプール法により産生されたＤＮＡおよびウイルスライブラリーの分布をＮＧＳリードカウントの標準スコアにより示す。ウイルスライブラリー内のバリアントが、標準スコアの減少順によりソートされ、それぞれのＤＮＡライブラリーからのそれらのスコアがそれらの上にマッピングされている。
図４７は、線形最小二乗回帰と、回帰直線（最良適合）と、決定係数を表すＲ２とによって決定される、合成プールおよびＰＣＲプール法により産生されたＤＮＡおよびウイルスライブラリーについてのリードカウント（ライブラリーごとにｎ＝１）の標準スコア間の相関を示す。
図４８は、各Ｃｒｅ系統選択で使用されたマウス２匹の脳組織からの、合成プール（左側）およびＰＣＲプール（右側）設計により産生された、カプシドライブラリーの分布を示す。合成プールライブラリー設計で導入されたスパイクインライブラリーの分布が中央に示されている。 同上。
図４９は、図４７に関して記載された方法と同じ方法により決定された、合成プールおよびＰＣＲプール法により産生された脳ライブラリーからのバリアントのエンリッチメントスコアの相関を例証する（Ｃｒｅ系統ごとにｎ＝２；平均値がプロットされている）。
図５０は、ＧＦＡＰ－Ｃｒｅ（左側）、ＳＮＡＰ－Ｃｒｅ（中央）およびＳｙｎ－Ｃｒｅ（右側）脳ライブラリーからのバリアントの２つの代替コドン複製のエンリッチメントスコア（ｌｏｇ１０）間の線形最小二乗回帰による相関解析を示す（Ｃｒｅ系統ごとにｎ＝２；平均値がプロットされている）。点線が高信頼度シグナルとノイズを分けている。高信頼度シグナル（下方）は、線形回帰直線（最良適合）により評価され、Ｒ２は、決定係数を表す。
図５１は、反復実験で回収された８０００を超えるバリアントを用いて、異なる脳ライブラリーにわたって、バリアントの２つのコドン複製間のエンリッチメントスコアの差を示す。
図５２は、統計的有意性に達する「入力」ライブラリー２に対して正規化された「出力」ライブラリー１におけるＡＡの偏りの大きさ（ｌｏｇ２変化倍数）を表すヒートマップを示す（Ｐ値≦０．０００１の場合、箱に入れられる；１比率ｚ検定が行われた公知のＮＮＫ鋳型に対して正規化されたＲ１ ＤＮＡを除いて、両側、２比率ｚ検定；およびｐ値はボンフェローニ補正を使用して多重比較用に補正されている）。ＮＮＫ鋳型に対して正規化されたＲ１ ＤＮＡライブラリー（上方左側、約９，０００，０００配列）、Ｒ１ ＤＮＡライブラリーに対して正規化されたＲ１ウイルス（下方左側、約１０，０００，０００配列）、Ｒ２ウイルスに正規化された脳における１．０より上のエンリッチメントスコアを有するＲ２ ＧＦＡＰライブラリー（上方右側、２０配列）、およびＲ２ウイルスに対して正規化された１．２より上のエンリッチメントスコアを有するＲ２ ＳＮＡＰライブラリー（下方右側、１７配列）が、示されている（ＤＮＡ、ウイルスについてはｎ＝１、および脳ライブラリーについてはｎ＝２）。
図５３は、ＰＣＲプール設計による、およびスパイクインライブラリーを用いる合成プール設計による、Ｔｅｋ、ＧＦＡＰ、および組み合わせられたニューロン脳ライブラリー（ＳＮＡＰおよびＳｙｎ）からのバリアントであって、脳内のそれらの相対エンリッチメントを表すノードサイズ、およびノード間で共有されるＡＡ同一性の程度を表すエッジ（接続線）の太さで示される、正にエンリッチされたバリアントについてのクラスタリング解析を示す。明確に異なるファミリーが、黄色で強調表示されており、対応するＡＡ頻度ロゴが下にある（ＡＡサイズは、存在率を反映し、カラーコードは、ＡＡ特性に基づく）。 同上。
図５４は、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎを駆動するＣＡＧプロモーターをパッケージングしているＡＡＶ９（上方の横列）およびＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｖ１（下方の横列）の発現をすべての器官にわたって示す（ｎ＝３；成体Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス１匹当り３×１０１１ｖｇ用量；３週間の発現）。
図５５は、核局在ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２レポーターの発現を駆動するＧｆＡＢＣ１Ｄプロモーターを保有するＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｖ１（左側）およびＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ（右側）カプシドのＩＶ送達後の皮質星状膠細胞（Ｓ１００＋）における発現を示す（成体マウス１匹当り１×１０１２ｖｇ用量；４週間の発現）。ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２発現と重複した皮質Ｓ１００＋細胞のパーセンテージが、定量化される（ｎ＝２；各データ点はマウス１匹につき３画像からの平均値である）。
図５６は、Ａｉ１４－ｔｄＴｏｍａｔｏレポーター成体マウスにおける一本鎖（ｓｓ）ＡＡＶ９、ＰＨＰ．ｅＢの発現を示す（１群当りｎ＝２～３；成体マウス１匹当り３×１０１１ｖｇ用量；３週間の発現）。
図５７は、Ａｉ１４－ｔｄＴｏｍａｔｏレポーター成体マウスにおけるＰＨＰ．Ｖ１の発現を示す（１群当りｎ＝２～３；成体マウス１匹当り３×１０１１ｖｇ用量；３週間の発現）。
図５８は、Ａｉ１４－ｔｄＴｏｍａｔｏレポーター成体マウスにおけるＰｌｅ２６１プロモーター保有ｉＣｒｅ導入遺伝子のパッケージングの発現を左側に示す（１群当りｎ＝２～３；成体マウス１匹当り３×１０１１ｖｇ用量；３週間の発現）。右側の縦列において、図５８は、ＥＧＦＰを駆動するＣＢ６普遍的プロモーター（上方）およびＥＧＦＰを駆動するＣＡＧプロモーター（下方）を保有する自己相補的（ｓｃ）ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｖ１の発現を示す。レクチンＤｙＬｉｇｈｔ ５９４染色も示されている（ｎ＝２～３；成体Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス１匹当り３×１０１１ｖｇ用量；２週間の発現）。図５６、５７、および図５８の左側の縦列における実験は、ウイルスの新鮮バッチからの１回の独立した試験から報告され、投薬量の一貫性のために同じアッセイで力価判定される。図５８における実験は、２回の独立した試験で検証した（群ごとにｎ＝２）。
図５９は、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎの発現を駆動するＣＡＧプロモーターを保有する、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｖ２バリアントおよび対照ＡＡＶ９によるマウス脳に対する形質導入を示す（ｎ＝３；成体Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス１匹当り３×１０１１ｖｇ ＩＶ用量；３週間の発現）。図１４における矢状断面脳画像のものにも同じ顕微鏡設定を使用して、矢状断面脳画像（左側）を取得した。αＧＬＵＴまたはαＳ１００またはαＯｌｉｇ２で染色されたＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｖ２形質導入脳切片の、より高倍率画像が示されている。
図６０は、Ｔｅｋ－Ｃｒｅ成体マウスにおけるＣＡＧ－ＤＩＯ－ＥＹＦＰを保有するＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｖ２による脳血管系に対する形質導入を示し（左側；マウス１匹当り１×１０１２ｖｇ ＩＶ用量；４週間の発現）、その効率（右側）は、脳の異なる区域にわたってのαＧＬＵＴ１染色とＥＹＦＰ発現の重複により決定される（ｎ＝２；マウスごとに１脳領域につき３画像の平均値）。
図６１は、ＧＦＡＰ－Ｃｒｅ成体マウスにおけるＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｖ２による星状膠細胞に対する形質導入を示す（マウス１匹当り１×１０１２ｖｇ ＩＶ用量；４週間の発現）。ＥＹＦＰ発現と重複した皮質Ｓ１００＋細胞のパーセンテージが、定量化される（ｎ＝２；マウス１匹につき３画像の平均値）。
図６２は、ＥＧＦＰ＋であるＤＡＰＩ＋細胞のパーセンテージとして定量化された肝臓の肝細胞に対する形質導入レベルを示す（ｎ＝３；ＣＡＧ－２×ＮＬＳ－ＥＧＦＰがパッケージングされたベクター；１×１０１１ｖｇ ＩＶ用量／成体Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス；３週間の発現；平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ；群ごとにマウス１匹につき４画像。一元配置ＡＮＯＶＡ、ノンパラメトリッククラスカル・ウォリス検定により０．００８８の近似Ｐ値を得た）。
図６３は、図１４におけるＡＡＶ９およびＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｖ１矢状断面脳画像のものにも同じ顕微鏡設定を使用して取得された、ＣＡＧ－ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎゲノムをパッケージングしているＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ４、Ｂ７、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｘ１（ＡＲＱＭＤＬＳ）およびＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｘ２（ＴＮＫＶＧＮＩ）による脳組織に対する形質導入を示す（ｎ＝３；１×１０１１ｖｇ ＩＶ用量／成体Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス；３週間の発現）。
図６４は、ＣＡＧ－ｍＲｕｂｙ２ゲノムを使用するＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ８による脳に対する形質導入を示す（ｎ＝３；３×１０１１ｖｇ ＩＶ用量／成体Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス；３週間の発現）。
図６５は、ＣＡＧ－２×ＮＬＳ－ＥＧＦＰをパッケージングしているＡＡＶ９（左側）、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｘ３（ＱＮＶＴＫＧＶ）（中央）およびＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｘ４（ＬＮＡＩＫＮＩ）（右側）ベクターの形質導入を示す（ｎ＝２；１×１０１１ｖｇ ＩＶ用量／成体Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス；３週間の発現）。図６２～６５におけるデータは、１回の独立した試験から報告されたものである。
図６６～６７は、Ｒ１（図６６）およびＲ２（図６７）脳ライブラリーの分布を示す（ＡＡレベルで；スコアの減少順にソートされたＲＣの標準スコア（ＳＳ））。ライブラリーにわたってＡＡＶ－ＰＨＰ．ＮおよびＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢについてのＳＳがこのプロットの拡大ビュー上にマッピングされている（点線の囲み枠）。 図６６～６７は、Ｒ１（図６６）およびＲ２（図６７）脳ライブラリーの分布を示す（ＡＡレベルで；スコアの減少順にソートされたＲＣの標準スコア（ＳＳ））。ライブラリーにわたってＡＡＶ－ＰＨＰ．ＮおよびＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢについてのＳＳがこのプロットの拡大ビュー上にマッピングされている（点線の囲み枠）。
図６８は、Ｒ２ウイルス（入力ライブラリー）に対して正規化されたＲ２肝臓ライブラリーからの正にエンリッチされたバリアント（上位１００配列）の多様な領域にわたってのＡＡ分布のヒートマップを示す。
図６９は、ＧＦＡＰおよびＶｇｌｕｔ２脳ライブラリーからのバリアントであって、肝臓におけるそれらの相対的な負のエンリッチメントを表すノードのサイズ、およびノード間でのそれらの相対同一性を表すエッジ（連続線）の太さで示される、正にエンリッチされたバリアントについてのクラスタリング解析を示す。
図７０は、ｓｓＡＡＶ：ＣＡＧ－ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎがパッケージングされたＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ（上方の横列）およびＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｎ（下方の横列）の発現をすべての器官にわたって示す（ｎ＝３；成体Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス１匹当り３×１０１１ｖｇ ＩＶ用量；３週間の発現）。
図７１は、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎの発現を駆動するＣＡＧプロモーターを保有するＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｎバリアントによるマウス脳に対する形質導入を示す（ｎ＝３；成体Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス１匹当り１×１０１１ｖｇ ＩＶ用量；３週間の発現）。蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション連鎖反応（ＦＩＴＣ－ＨＣＲ）を使用して、興奮性ニューロンをＶｇｌｕｔ１でおよび抑制性ニューロンをＧａｄ１で標識した。ＥＧＦＰ発現が特定の細胞マーカーと共局在した少数の細胞が、アスタリスク記号により強調表示されている。
図７２は、ヒト脳微血管内皮細胞培養（ＨＢＭＥＣ）でのＡＡＶ９、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢおよびＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｖ１の形質導入を示す。ベクターにｓｓＡＡＶ：ＣＡＧ－ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎをパッケージングした。群にわたっての平均蛍光強度を定量化した（群ごとに０．９５ｃｍ２表面積の組織培養ウェルｎ＝３；用量ごとに群ごとに１ウェルにつき３画像を３日の発現後にイメージングした；表面積０．９５ｃｍ２当り用量１×１０８ｖｇおよび１×１０１０ｖｇ）。テューキー検定を使用する多重比較用に補正した二元配置ＡＮＯＶＡにより、１×１０８ｖｇについて、ＰＨＰ．Ｖ１に対するＡＡＶ９の０．００５１、ＰＨＰ．Ｖ１に対するＰＨＰ．ｅＢの０．００９６、ＰＨＰ．ｅＢに対するＡＡＶ９の０．８２２２、および１×１０１０ｖｇについて、ＰＨＰ．Ｖ１に対するＡＡＶ９の０．００５２、ＰＨＰ．Ｖ１に対するＰＨＰ．ｅＢの０．００４９、ＰＨＰ．ｅＢに対するＡＡＶ９の０．９９９６という調整Ｐ値を得た（＊＊Ｐ≦０．０１はプロット上に示され、Ｐ＞０．０５は示されない；平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、９５％ＣＩ）。
図７３は、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｃ２およびＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｃ３による皮質脳領域に対する形質導入を、２つの異なるマウス株：Ｃ５７ＢＬ／６ＪおよびＢＡＬＢ／ｃＪにわたって示す。ベクターにｓｓＡＡＶ：ＣＡＧ－ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎをパッケージングした（１群当りｎ＝２～３；１×１０１１ｖｇ ＩＶ用量／成体マウス；３週間の発現）。同じ顕微鏡設定を使用して、すべての画像を取得した。図７２および７３で報告されるデータは、１回の独立した試験からのものであり、この試験ではすべてのウイルスを新たに調製し、投薬量の一貫性のために同じアッセイで力価判定し、ＢＡＬＢ／ｃＪについては独立した試験でＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｃ２およびＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｃ３についてさらに検証した。
図７４は、内部選択対照としておよび新たなバリアントの相対性能の標準としての役割を果たす、以前の公表文献で同定されたＡＡＶ９および約５０の追加のバリアント（ＡＡＶ－ＰＨＰ．ＢまたはＡＡＶＰＨＰ．ｅＢのような十分に特徴づけられているバリアント、ならびに前の方法論を使用して同定されたがｉｎ ｖｉｖｏで特徴付けられていない多くのバリアントを含む）（およびそれらの代替コドン複製物）のスパイクインライブラリーの詳細を提供する。Deverman, B. E. et al. Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain. Nat. Biotechnol.34, 204-209 (2016) および Chan, K. Y. et al. Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems. Nat. Neurosci. 20, 1172-1179 (2017)；これらの各々の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。スパイクインライブラリーを合成プールライブラリーの一部として生成した。 同上。 同上。 同上。
図７５は、スパイクインライブラリーについてのエンリッチメントスコアを示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。
本開示の好ましい事例を本明細書で示し、説明してきたが、このような事例が単なる例としてのみ提供されることは当業者には明らかであろう。本開示から逸脱することなく、非常に多くの変形形態、変更形態および置換形態が、今や当業者の心に浮かぶことであろう。本明細書に記載の本開示の事例の様々な代替案を、本開示の実施の際に利用することができることは、理解されるはずである。後続の特許請求の範囲により本開示の範囲が定義されること、およびこれらの特許請求の範囲内の方法および構造ならびにそれらの均等物がこれらの特許請求の範囲に包含されることが意図されている。
導入遺伝子が対象に全身（例えば、静脈内、鼻腔内）投与されたときに、導入遺伝子を対象における標的細胞または環境（例えば、細胞型または組織）に組み込むのに有用な、改変アデノ随伴（ＡＡＶ）ウイルスカプシド組成物が、本明細書で提供される。本開示の改変ＡＡＶカプシドタンパク質は、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質におけるアミノ酸の少なくとも１つの挿入または置換を含み、この挿入および置換が、参照ＡＡＶカプシドタンパク質と比較して特異性の増加もしくは減少、または参照ＡＡＶカプシドタンパク質と比較して導入遺伝子形質導入効率の向上もしくは低下などの、所望の指向性をもたらす。
操作して所望の指向性を持たせた、例えば、組織または細胞などの標的ｉｎ ｖｉｖｏ環境内へのウイルス形質導入の特異性が増加された、ＡＡＶカプシドが、本明細書で開示される。一部の実施形態では、本開示のＡＡＶカプシドは、対象の中枢神経系（ＣＮＳ）を特異的に標的とするように操作される。一部の実施形態では、本開示のＡＡＶカプシドは、対象の肝臓を特異的に標的とするように操作される。ＡＡＶカプシドは、異種核酸、例えば治療用遺伝子発現産物をコードする異種核酸を有するウイルスベクターをカプシド内封入することができる。標的ｉｎ ｖｉｖｏ環境（例えば、脳、肝臓）内への異種核酸の高特異的形質導入を、異種核酸をカプシド内封入している本開示のＡＡＶカプシドの対象への全身送達時に達成することができる。本明細書で開示されるＡＡＶカプシドは、脳の単一遺伝子障害（monogenetic disorder）（例えば、ＧＬＵＴ１欠損症候群、ムコ多糖症ＩＩＩＣ型）の診断および／または処置などの多くの応用に有利であり、養子細胞療法および生物医学研究への応用を生み出す。
ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶカプシドタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３）を含み、これらのタンパク質各々には、親ＡＡＶカプシドタンパク質構造の５８８ループ（ＡＡＶ９ ＶＰ１番号付け）内のアミノ酸に少なくとも１アミノ酸の挿入または置換がある。５８８ループは、ＡＡＶ２のヘパラン硫酸結合部位を含有し、ペプチドディスプレイに適している。ＡＡＶ９の公知の受容体は、Ｎ結合型末端ガラクトースおよびＡＡＶ受容体（ＡＡＶＲ）のみであるが、多くのことが、他のものが存在することを示唆している。ＡＡＶ９ ５８８ループへの改変は、齧歯動物モデルにおいて参照ＡＡＶと比較して標的ｉｎ ｖｉｖｏ環境内への特異性の増加および導入遺伝子形質導入の向上をもたらすことが、本明細書で示される。一部の場合には、親ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ血清型９（別名ＡＡＶ９）を有する。
ＡＡＶ媒介導入遺伝子送達の最も一般的な方法は、標的ｉｎ ｖｉｖｏ環境への直接注射による方法であり、これは、侵襲性のより低い方法と比較して、傷害または死亡のリスク、疼痛およびより高い費用をはじめとする多くの理由のため、不利である。例えば、頭蓋内注射は、脳の出血を引き起こすことがある。静脈内投与による前のＡＡＶ媒介送達は、直接注射の必要を避けるが、標的ｉｎ ｖｉｖｏ環境（例えば、組織または細胞）に対する特異性の低減という欠点があり、その結果、標的外形質導入事象が生じることになり、標的ｉｎ ｖｉｖｏ環境において十分な治療レベルに達するためにより多くのウイルス負荷量が必要となる。これは、ＡＡＶが、血液脳関門（ＢＢＢ）を横断しなければならない場合、特に顕著である。
参照ＡＡＶカプシドタンパク質と比較して特異性が増加した、導入遺伝子（例えば、治療用核酸）を含むウイルスベクターをカプシド内封入している本開示のＡＡＶカプシドを、全身投与するステップを含む方法が、開示される。本開示のＡＡＶカプシドは、対象におけるＢＢＢの横断および特定の標的細胞型（例えば、ニューロン、内皮細胞）内への導入遺伝子の形質導入が可能である。したがって、本開示のＡＡＶカプシドタンパク質は、ヒト疾患、特に、標的ｉｎ ｖｉｖｏ環境を冒す疾患を処置するための、導入遺伝子療法に好適である。
組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターに含有されている導入遺伝子、および本開示のＡＡＶカプシドタンパク質によりカプシド内封入されている導入遺伝子も、本明細書で提供される。本明細書で開示される導入遺伝子は、様々な目的のために、例えば、対象における疾患または状態を処置するために、対象に送達される。導入遺伝子は、標的遺伝子または遺伝子発現産物の活性または発現をモジュレートする遺伝子編集成分であり得る。あるいは、導入遺伝子は、それ自体の活性もしくは発現のモジュレーションに有効である治療用遺伝子発現産物、または別の標的遺伝子もしくは遺伝子発現産物をコードする遺伝子である。
多重化されたＣｒｅ組換えに基づくＡＡＶ標的進化（Ｍ－ＣＲＥＡＴＥ）を含む、７－ｍｅｒまたは３－ｍｅｒペプチド挿入を同定するための方法が、本明細書で提供される。本開示のＭ－ＣＲＥＡＴＥ法は、（１）ディープシークエンシングを使用して選択前にウイルス産生の偏りを補正することにより各バリアントについての真のエンリッチメントスコアの計算を支援し、（２）等しいバリアントを表示するラウンド１後合成プールライブラリーの作成により連続選択ラウンドの偏りの伝播の低減を支援し、（３）プール内の選択されたバリアントごとに２つのコドン複製を含むことにより偽陽性の低減を支援し、（４）回収されたカプシドライブラリーのディープシークエンシングを複数の標的（細胞型または器官）間で比較することにより正と負両方の選択基準を支持する。これらの特徴によって、ｉｎ ｖｉｖｏで検証および特徴付けする価値があるバリアントを、情報に基づいて、自信をもって選ぶことが可能になる。
ＡＡＶカプシドタンパク質と治療用核酸をコードするウイルスベクターとを含むＡＡＶカプシドを産生する方法が、本明細書で開示される。ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶカプシド構造のアセンブリーおよびＡＡＶカプシド内への導入遺伝子のパッケージングに必要とされる、導入遺伝子をコードする（例えば、治療用核酸を含有する）第１のベクターと、ＡＡＶカプシドタンパク質を有するＡＡＶゲノムをコードする第２のベクターと、ヘルパーウイルスタンパク質をコードする第３のベクターとを、細胞（例えば、不死化幹細胞）に導入することにより、産生される。アセンブルされたＡＡＶカプシドを、当技術分野において公知の好適な方法を使用して細胞から単離および精製することができる。
本開示のＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸配列を含む組換えＡＡＶベクターも、本明細書で提供される。例えば、本開示のウイルスベクターは、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３をコードするＡＡＶウイルスＣａｐ（カプシド）を含む核酸配列を含み、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３のうちの少なくとも１つは、本開示のＡＡＶカプシドタンパク質を産生するように改変されている。提供される組換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型（例えばＡＡＶ９）に由来し得る。
Ｉ．組成物
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）媒介遺伝子送達は、エピソーム異種核酸（例えば、導入遺伝子、治療用核酸）の核発現のためのＡＡＶウイルス形質導入機序を利用する。宿主ｉｎ ｖｉｖｏ環境に送達されると、ｒＡＡＶは、（１）標的細胞上の細胞表面受容体に結合または付着し、（２）エンドサイトーシスを受け、（３）核に輸送され、（４）ウイルスを脱コートしてカプシド内封入された異種核酸を放出し、（５）核内での転写のための鋳型としての異種核酸を一本鎖から二本鎖ＤＮＡに変換し、（６）宿主細胞の核内でエピソーム異種核酸を転写（「形質導入」）することになる。特異性（標的細胞上の細胞表面受容体への結合）の増加および形質導入効率（宿主細胞内でのエピソーム異種核酸の転写）の向上を有するように操作されたｒＡＡＶは、遺伝子療法への応用に望ましい。
ｒＡＡＶは、異種核酸（例えば、治療用核酸、遺伝子編集機構）をカプシド内封入するように操作することができるＡＡＶカプシドを含む。ＡＡＶカプシドは、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３という３つのＡＡＶカプシドタンパク質モノマーで構成されている。これら３つのＶＰタンパク質の６０のコピーが比率１：１：１０で相互作用してウイルスカプシドを形成する（図２）。ＶＰ１は、約１３７アミノ酸Ｎ末端領域（ＶＰ１ｕ）に加えてＶＰ２タンパク質全体を包含し、ＶＰ２は、約６５アミノ酸Ｎ末端領域（ＶＰ１／２共通領域）に加えてＶＰ３全体を包含する。３つのカプシドタンパク質は、一部の場合にはアミノ酸１３８位で始まる領域（例えば、ＡＡ１３９～７３６）である、ＶＰ３の保存アミノ酸配列を共有する。
ＡＡＶ ＶＰ３構造は、すべての血清型に共通である高保存領域と、コア八本鎖β－バレルモチーフ（βＢ～βＩ）と、小さいα－ヘリックス（αＡ）とを含有する。β鎖間に挿入されたループ領域は、β鎖ＨとＩの間の特徴的なＨＩループと、β鎖ＤとＥの間のＤＥループと、ループの頂部を形成する９つの可変領域（ＶＲ）とからなる。これらのＶＲ、例えばＡＡ５８８ループは、カプシド表面に見られ、受容体結合、形質導入および抗原特異性をはじめとするＡＡＶ生活環における特定の機能的役割に関連し得る。
例えば脳細胞型（例えば、脳内皮細胞、ニューロン、星状膠細胞）および肝臓細胞型に対するより高い特異性を含む、特定の細胞型における形質導入に対するより高い特異性を特徴とする、所望の指向性をもたらす置換が５８８ループにあるＡＡＶカプシドタンパク質を含む、ＡＡＶカプシドが本明細書で開示される。詳細には、本明細書で開示されるＡＡＶカプシドタンパク質は、対象の脳または肝臓内への異種核酸（例えば、導入遺伝子）のｒＡＡＶ媒介形質導入を可能にする。本開示のＡＡＶカプシド、またはＡＡＶカプシドタンパク質を、医薬組成物として製剤化することができる。加えて、ＡＡＶカプシド、またはＡＡＶカプシドタンパク質を、単離し、精製して、様々な応用に使用することができる。
Ａ．アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質
改変カプシドタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）を用いて操作されるＡＡＶカプシドタンパク質を含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）カプシドが、本明細書で開示される。一部の実施形態では、本開示のｒＡＡＶカプシドタンパク質は、本明細書で開示される方法（例えば、Ｍ－ＣＲＥＡＴＥ）を使用して生成される。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、治療用核酸（例えば、導入遺伝子）を対象に送達する方法において使用される。一部の事例では、ｒＡＡＶカプシドタンパク質は、それらを、ある特定の治療応用、例えば、本明細書で開示されるものなどの対象における疾患または障害の処置に特に好適なものにする、望ましいＡＡＶ指向性を有する。
ｒＡＡＶカプシドタンパク質、例えば表２～３および図３３で提供されるものは、対象へのｒＡＡＶの全身投与時に対象の血液脳関門（ＢＢＢ）へのおよび経由の侵入の最適化のために操作される。脳への治療用導入遺伝子の以前のＡＡＶ媒介送達方法は、頭蓋内注射を必要とした。頭蓋内注射は、対象を不快にさせ、一部の場合には対象に苦痛を与える、侵襲的手技である。例えば、頭蓋内注射は、脳の出血を引き起こすことがある。加えて、頭蓋内送達は、あまり拡散せず、非常に不均一である。表２～４および図３３で提供されるｒＡＡＶカプシドタンパク質は、頭蓋内注射の必要をなくす指向性を有するように、その上、カプシド内封入された導入遺伝子の広範かつ効率的な形質導入も達成するように操作されている。詳細には、指向性は、参照ＡＡＶと比較して、対象の中枢神経系（ＣＮＳ）における特異性の増加および効率（例えば、ウイルス形質導入の効率）の向上のうちの少なくとも一方を含む。
本明細書に記載の操作されたＡＡＶカプシドタンパク質は、一部の場合には、５８８ループ内のアミノ酸位置に親ＡＡＶカプシドタンパク質にとって異種であるアミノ酸の挿入を有する。一部の実施形態では、アミノ酸は、アミノ酸挿入位置において親ＡＡＶカプシドタンパク質にとって内在性でない。アミノ酸は、異なるＡＡＶカプシドタンパク質における挿入または置換と同じまたは同等のアミノ酸位置に天然に存在するアミノ酸であることもある。
本明細書で提供される態様は、ＡＡ５８８＿５８９に挿入される７アミノ酸ポリマー（７－ｍｅｒ）を含み、親ＡＡＶカプシドタンパク質の５８８ループにおいて１１アミノ酸ポリマー（１１－ｍｅｒ）を産生するために１または２アミノ酸の置換を７－ｍｅｒ配列に隣接するアミノ酸位置（例えば、ＡＡ５８７－５８８および／またはＡＡ５８９－５９０）にさらに含み得るアミノ酸挿入物を提供する。７アミノ酸の各々がデオキシリボース核酸（ＤＮＡ）配列Ｎ－Ｎ－Ｋによりコードされる、本明細書に記載の７－ｍｅｒは、縮重プライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して有利に生成された。「Ｎ」は、４つのＤＮＡヌクレオチドのいずれかであり、Ｋは、グアニン（Ｇ）またはチミン（Ｔ）である。ランダム７－ｍｅｒアミノ酸配列を生成するこの方法は、タンパク質レベルで１２億８０００万の可能な組合せを可能にする。開発される７－ｍｅｒはランダムであるので、７－ｍｅｒ中の一部のアミノ酸は、ＡＡＣカプシドタンパク質のそのアミノ酸位置に天然に存在することがあり、その一方で他のアミノ酸は異なることがある。
各々が、特有の７－ｍｅｒまたは１１－ｍｅｒを５８８ループに有し、各々が、複数のトランスジェニック動物に全身投与されたときにトランスジェニック動物の標的ｉｎ ｖｉｖｏ環境内にレポーター遺伝子を有効に形質導入する配列の選択的増幅および回収を可能にするレポーター遺伝子をカプシド内封入している、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を生成した。標的ｉｎ ｖｉｖｏ環境（例えば、中枢神経系、肝臓）において正のエンリッチメントが見られた７－ｍｅｒおよび１１－ｍｅｒが、本明細書で提供される。「エンリッチメント」は、トランスジェニック動物に投与したウイルスライブラリー内のその存在率と比較したｉｎ ｖｉｖｏ環境の組織内の所与の７－ｍｅｒまたは１１－ｍｅｒの存在率である。０より高いエンリッチメントスコアは、正のエンリッチメントを指し示す。０未満のエンリッチメントスコアは、負のエンリッチメントを指し示す。所望のエンリッチメントプロファイルを有するｒＡＡＶのサブセットをｉｎ ｖｉｖｏで個々に試験して、正確な全身的発現（例えば、特異性および形質導入効率）を判定した。ウイルス形質導入の特異性の増加および一部の場合には形質導入効率の向上を含む、所望の指向性を呈するこのサブセットからのｒＡＡＶは、多種多様な目的（例えば、治療、診断、科学的発見）に有用な、標的化ｒＡＡＶ媒介導入遺伝子送達に比類なく適していると考えられる。
本明細書に記載の７－ｍｅｒまたは１１－ｍｅｒを有するｒＡＡＶ粒子は、標的ｉｎ ｖｉｖｏ環境（例えば、組織または細胞型）内への形質導入効率の向上を有する。一部の事例では、形質導入効率の向上は、参照ＡＡＶと比較して、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、２１倍、２２倍、２３倍、２４倍、２５倍、２６倍、２７倍、２８倍、２９倍、３０倍、３１倍、３２倍、３３倍、３４倍、３５倍、３６倍、３７倍、３８倍、３９倍、４０倍、４１倍、４２倍、４３倍、４４倍、４５倍、４６倍、４７倍、４８倍、４９倍、５０倍、７５倍もしくは１００倍またはそれを超える向上を含む。一部の事例では、形質導入効率の向上は、少なくとも３０倍である。一部の事例では、形質導入効率の向上は、少なくとも４０倍である。一部の事例では、形質導入効率の向上は、少なくとも５０倍である。一部の事例では、形質導入効率の向上は、少なくとも６０倍である。一部の事例では、形質導入効率の向上は、少なくとも８０倍である。一部の事例では、形質導入効率の向上は、少なくとも９０倍である。一部の事例では、形質導入効率の向上は、少なくとも１００倍である。
本明細書に記載の７－ｍｅｒまたは１１－ｍｅｒを有するｒＡＡＶ粒子は、参照ＡＡＶと比較して、標的ｉｎ ｖｉｖｏ環境（例えば、組織または細胞型）内への特異性の増加を有する。ｒＡＡＶが、参照ＡＡＶよりも標的ｉｎ ｖｉｖｏ環境に対して大きい特異性を所有するのか、小さい特異性を所有するのかを検出することは、対象における標的ｉｎ ｖｉｖｏ環境から得られた組織試料中のｒＡＡＶによりカプシド内封入された異種核酸から発現された遺伝子発現産物（例えば、ＲＮＡまたはタンパク質）のレベルを測定すること；および測定されたレベルを対照レベル（例えば、参照ＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ９）によりカプシド内封入された異種核酸から発現された遺伝子発現産物についてのレベルなど）と比較することを含む。遺伝子発現産物の発現の測定に好適な方法、ルシフェラーゼレポーターアッセイおよび定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）。
特異性の増加は、標的ｉｎ ｖｉｖｏ環境におけるエンリッチメントの増加と相関し、このエンリッチメントは、一部の場合には本明細書の図３３～３５で提供されるエンリッチメントスコアで表される。非限定的な例として、脳内に正にエンリッチされること（約２．５１のエンリッチメントスコア）が本明細書で示されるＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｖ２（ＴＴＬＫＰＦＬ）は、参照ＡＡＶ９（ほぼ０％）と比較して脳において（例えば、蛍光レポーターアッセイにより測定して）レポーター遺伝子発現の増加（レポーター遺伝子で形質導入された皮質脳血管系細胞の約６０％および皮質星状膠細胞の約６０％）も呈した。特定の理論により拘束されるものではないが、本開示の発明者らは、本明細書で開示されるすべてのｒＡＡＶについてこの相関が見られると予想し、さらに、エンリッチメントスコアは（負であろうと、正であろうと）、有意性が高いほど、ｉｎ ｖｉｖｏ環境での遺伝子発現産物の測定レベルにより指し示されるｉｎ ｖｉｖｏ環境に対するより有意性の高い特異性と相関し得ると予想することになった。
本明細書で開示される場合の形質導入効率は、（１）標的ｉｎ ｖｉｖｏまたは標的外ｉｎ ｖｉｖｏ環境における本明細書で開示される改変ＡＡＶカプシドタンパク質によりカプシド内封入された異種核酸を発現する細胞の数、および（２）単個細胞における異種核酸の発現の量の、少なくとも一方により測定され得る。参照ＡＡＶと比較して、標的ｉｎ ｖｉｖｏ環境内へのｒＡＡＶ媒介形質導入の存在またはレベルの増加が観察された場合、標的ｉｎ ｖｉｖｏ環境に対する特異性が推測され得る。参照ＡＡＶと比較して、標的外ｉｎ ｖｉｖｏ環境内へのｒＡＡＶ媒介形質導入の非存在またはレベルの低下が観察された場合、標的外ｉｎ ｖｉｖｏ環境に対する特異性の欠如または低減が推測され得る。
参照ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、またはそのバリアントからなる群から選択される血清型を有し得る。例えば、参照ＡＡＶは、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ、およびＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｓからなる群から選択される血清型を有することができる。
本開示のｒＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶカプシドタンパク質のアミノ酸配列内にアミノ酸の挿入を含む。本開示の操作されたＡＡＶカプシドタンパク質が産生されるＡＡＶカプシドは、「親」ＡＡＶカプシドと呼ばれる。一部の場合には、親ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１およびＡＡＶ１２からなる群から選択される血清型を有する。ＡＡＶ－１の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００２０７７で提供されており、ＡＡＶ－２の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１４０１およびSrivastava et al., J. Virol., 45: 555-564 (1983)で提供されており、ＡＡＶ－３の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿１８２９で提供されており、ＡＡＶ－４の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１８２９で提供されており、ＡＡＶ－５ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０８５７１６で提供されており、ＡＡＶ－６の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１８６２で提供されており、ＡＡＶ－７およびＡＡＶ－８ゲノムの少なくとも部分は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＸ７５３２４６およびＡＸ７５３２４９でそれぞれ提供されており、ＡＡＶ－９ゲノムは、Gao et al., J. Virol., 78: 6381-6388 (2004)で提供されており、ＡＡＶ－１０ゲノムは、Mol.Ther., 13(1): 67-76 (2006)で提供されており、ＡＡＶ－１１ゲノムは、Virology, 330(2): 375-383 (2004)で提供されており、ＡＡＶ－１２ゲノムの部分は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＤＱ８１３６４７で提供されており、ＡＡＶ－１３ゲノムの部分は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＥＵ２８５５６２で提供されている。
一部の場合には、親ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１およびＡＡＶ１２からなる群から選択される血清型を有するＡＡＶに由来する。別のものに「由来する」ＡＡＶカプシドタンパク質は、バリアントＡＡＶカプシドタンパク質であり得る。バリアントは、例えば、ＡＡＶカプシドタンパク質のアミノ酸配列内に異種アミノ酸を含み得る。異種アミノ酸は、ＡＡＶカプシドタンパク質中に天然に存在しないことがある。異種アミノ酸は、異なるＡＡＶカプシドタンパク質中に天然に存在することもある。一部の事例では、親ＡＡＶカプシドは、米国特許出願第６２／７３６，９０４号、同第１６／５８２，６３５号、同第６２／８３２，８１２号、および同第６２／８３２，８２６号に記載されており、これらの参考特許文献の各々の内容は、本明細書に組み込まれる。例えば、親ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶカプシドタンパク質の４５５ループが改変されていることがある（例えば、ＡＡ４５２～４５８における７－ｍｅｒの置換、ＡＡＶ９ ＶＰ１番号付け）。
一部の事例では、親ＡＡＶは、ＡＡＶ９である。一部の事例では、ＡＡＶ９カプシドタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１を含む。ＡＡＶ９ ＶＰ１カプシドタンパク質（＞ｔｒ｜Ｑ６ＪＣ４０｜Ｑ６ＪＣ４０＿９ＶＩＲＵ カプシドタンパク質 ＶＰ１ ＯＳ＝アデノ随伴ウイルス９ ＯＸ＝２３５４５５ ＧＮ＝ｃａｐ ＰＥ＝１ ＳＶ＝１）のアミノ酸配列は、配列番号１
Figure 2022526018000001
 で提供される。一部の事例では、親ＡＡＶカプシドタンパク質配列は、配列番号１と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％相同である。
ＡＡＶカプシドタンパク質のアミノ酸配列のアミノ酸５８８とアミノ酸５８９の間のアミノ酸位置におけるアミノ酸（またはアミノ酸配列）の挿入が、本明細書で開示される。本明細書で使用される場合「ＡＡ５８８＿５８９」は、アミノ酸（またはアミノ酸配列）の挿入が、親ＡＡＶ ＶＰカプシドタンパク質のアミノ酸配列内の（ＶＰ１番号付け）５８８位のアミノ酸（ＡＡ）の直後かつ５８９位のＡＡの直前にあることを指し示す。アミノ酸５８７～５９１は、配列番号１の中に示されているような「ＡＱＡＱＡ」を含むモチーフを含む。例示的なＡＡＶカプシドタンパク質配列が表１で提供される。例えば、ＱＡＶＲＴＳＬは、ＡＡＶ９カプシドアミノ酸配列中のＡＡ５８８＿５８９に挿入されており、配列番号３で提供されている。別の例では、ＴＬＡＶＰＦＫは、ＡＡＶ９カプシドアミノ酸配列中のＡＡ５８８＿５８９に挿入されており、配列番号２で提供されている。本明細書（図３３～３５、表２～４）で開示される７－ｍｅｒ挿入物を親ＡＡＶ９カプシドタンパク質、そのバリアントのアミノ酸配列中のＡＡ５８８＿５８９、または異なる血清型（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３など）の親ＡＡＶにおける同等のアミノ酸位置に挿入することができることが想定される。
本明細書に記載の１１－ｍｅｒは、一部の場合、ＡＡ５８８＿５８９に７－ｍｅｒ挿入、およびアミノ酸位置ＡＡ５８７～５９０に１つまたは複数のアミノ酸の置換を含み得る。一部の場合には、アミノ酸５８７～５９０は、その位置において親ＡＡＶカプシドタンパク質にとって内在性でないアミノ酸で置換されている。一部の場合には、ＡＡ５８７は、Ｄで置換されている（例えば、Ａ５８７Ｄ）。一部の場合には、ＡＡ５８７は、Ａで置換されている（例えば、Ｑ５８７Ａ）。一部の場合には、ＡＡ５８７は、Ｓで置換されている（例えば、Ｑ５８７Ｓ）。一部の場合には、ＡＡ５８７は、Ｇで置換されている（例えば、Ｑ５８７Ｇ）。一部の場合には、ＡＡ５８８は、Ｇで置換されている（例えば、Ｑ５８８Ｇ）。一部の場合には、ＡＡ５８９は、Ｎで置換されている（例えば、Ａ５８９Ｎ）。一部の場合には、ＡＡ５９０は、Ｐで置換されている（例えば、Ａ５９０）。非限定的な例では、配列番号４（ＰＨＰ－ＡＡＶ．ｅＢ）は、ＡＡ５８８＿ＡＡ５８９におけるＴＬＡＶＰＦＫの挿入と、置換Ａ５８７ＤおよびＱ５８８Ｇとを含む。別の非限定的な例では、配列番号５（ＰＨＰ－ＡＡＶ．Ｎ）は、ＡＡ５８８＿ＡＡ５８９におけるＴＴＬＫＰＦＳの挿入と、置換Ａ５８７Ｄ、Ｑ５８８Ｇ、Ａ５８９ＮおよびＱ５９０Ｐとを含む。アミノ酸５８７～５９０位における任意のアミノ酸での置換に加えて、本明細書で開示される任意の７－ｍｅｒ挿入物は、１１－ｍｅｒを含み得ることが想定される。
表1.例示的なAAVカプシドタンパク質配列
Figure 2022526018000002
Figure 2022526018000003
Figure 2022526018000004
本明細書に記載のｒＡＡＶカプシドタンパク質を単離および精製することができる。ＡＡＶは、当技術分野において標準的な方法により、例えば、カラムクロマトグラフィーまたは塩化セシウム勾配により、単離および精製することができる。ヘルパーウイルスからＡＡＶを精製する方法は、当技術分野において公知であり、例えば、Clark et al., Hum.Gene Ther., 10(6): 1031-1039 (1999)；Schenpp and Clark, Methods Mol.Med., 69: 427-443 (2002)；米国特許第６，５６６，１１８号およびＷＯ９８／０９６５７で開示されている方法を含み得る。
ｒＡＡＶカプシドタンパク質を、ナノ粒子、第２の分子、またはウイルスカプシドタンパク質にコンジュゲートすることができる。一部の場合には、ナノ粒子またはウイルスカプシドタンパク質は、本明細書に記載の治療用核酸をカプシド内封入することになる。一部の事例では、第２の分子は、治療剤、例えば、小分子、抗体、抗原結合性断片、ペプチドまたはタンパク質、例えば本明細書に記載のものである。一部の事例では、第２の分子は、検出可能な部分である。例えば、検出可能な部分にコンジュゲートされた改変ＡＡＶカプシドタンパク質を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの生物医学研究への応用に使用することができ、この検出可能な部分は、改変カプシドタンパク質を可視化するために使用される。検出可能な部分にコンジュゲートされた改変ＡＡＶカプシドタンパク質を診断目的で使用することもできる。
中枢神経系を標的とするＡＡＶカプシドタンパク質
親ＡＡＶカプシドタンパク質の上記のアミノ酸位置に少なくとも１アミノ酸の置換または挿入がある、ＡＡＶカプシドタンパク質であって、この置換または挿入が、全身送達された場合でさえ、対象における中枢神経系（ＣＮＳ）または末梢神経系（ＰＮＳ）に対する特異性の増加をもたらす、親ＡＡＶカプシドタンパク質が、本明細書で開示される。本明細書に記載のＡＡＶカプシドタンパク質の多くの利点のうちの１つは、ＣＮＳを標的とし、血液脳関門（ＢＢＢ）を透過するそれらの能力である。
ｉｎ ｖｉｖｏ環境は、細胞であることがある。細胞は、中枢神経系（ＣＮＳ）細胞および末梢神経系（ＰＮＳ）細胞からなる群から選択される細胞型であり得る。ＣＮＳ細胞の非限定的な例としては、ニューロンおよびグリア細胞が挙げられる。グリア細胞は、乏突起膠細胞、上衣細胞および星状膠細胞からなる群から選択することができる。ＰＮＳ細胞の非限定的な例としては、ニューロンまたはグリア細胞が挙げられる。グリア細胞は、シュワン細胞、衛星細胞および腸管グリア細胞からなる群から選択することができる。
ｉｎ ｖｉｖｏ環境は、組織であることがある。組織は、脳または脊髄であることがある。組織は、器官、例えば、大脳、小脳、脳幹、皮質、線条体、視床、側脳室、被殻、視床下部、髄質、脳橋、海馬、扁桃体、運動皮質、またはこれらの組合せの領域であることもある。
親ＡＡＶカプシドタンパク質における少なくとも１アミノ酸挿入または置換を有するＡＡＶカプシドタンパク質が、本明細書で開示される。挿入または置換は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０もしくは１１アミノ酸またはそれより多くのアミノ酸の挿入または置換であり得る。一部の事例では、アミノ酸は、連続している。一部の事例では、アミノ酸は、連続していない。
一部の事例では、挿入は、表２～３または図６のいずれか１つで提供される配列のうちのいずれか１つで提供される少なくとも１アミノ酸の挿入である。一部の事例では、挿入は、表２～３または図６のいずれか１つで提供される配列のうちのいずれか１つで提供される少なくとも２アミノ酸の挿入である。一部の事例では、挿入は、表２～３または図６のいずれか１つで提供される配列のうちのいずれか１つで提供される少なくとも３アミノ酸の挿入である。一部の事例では、挿入は、表２～３または図６のいずれか１つで提供される配列のうちのいずれか１つで提供される少なくとも４アミノ酸の挿入である。一部の事例では、挿入は、表２～３または図６のいずれか１つで提供される少なくとも５アミノ酸の挿入である。一部の事例では、挿入は、表２～３または図６のいずれか１つで提供される少なくとも６アミノ酸の挿入である。一部の事例では、挿入は、表２～３または図６のいずれか１つで提供される少なくとも７アミノ酸の挿入である。
少なくとも１アミノ酸Ｘ１の挿入を有するＡＡＶカプシドタンパク質であって、Ｘ１が、Ａ、Ｅ、Ｄ、Ｇ、Ｒ、ＳおよびＴからなる群から選択される、ＡＡＶカプシドタンパク質が、本明細書で開示される。一部の事例では、挿入は、２アミノ酸をさらに含み、Ｘ２は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、およびＹからなる群から選択される。一部の事例では、挿入は、３アミノ酸をさらに含み、Ｘ３は、Ｅ、Ｋ、Ｌ、ＴおよびＱからなる群から選択される。一部の事例では、挿入は、少なくとも４アミノ酸をさらに含み、Ｘ１は、Ａ、Ｅ、Ｄ、Ｇ、Ｒ、ＳおよびＴからなる群から選択され、Ｘ２は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、およびＹからなる群から選択され、Ｘ３は、Ｅ、Ｋ、Ｌ、ＴおよびＱからなる群から選択され、Ｘ４は、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｒ、Ｔ、およびＶからなる群から選択される。一部の事例では、挿入は、５アミノ酸をさらに含み、Ｘ５は、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｐ、Ｌ、Ｑ、およびＶからなる群から選択される。一部の事例では、挿入は、６アミノ酸をさらに含み、Ｘ６は、Ｆ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、およびＶからなる群から選択される。一部の事例では、挿入は、少なくとも７アミノ酸をさらに含み、Ｘ７は、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｓ、およびＶからなる群から選択される。
一部の実施形態では、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７は、連続している（Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７）。一部の実施形態では、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７のうちのいずれか２個は、連続している。一部の実施形態では、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７のうちのいずれか３個は、連続している。一部の実施形態では、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７のうちのいずれか４個は、連続している。一部の実施形態では、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７のうちのいずれか５個は、連続している。一部の実施形態では、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７のうちのいずれか６個は、連続している。一部の実施形態では、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７のうちのいずれか７個は、連続している。一部の実施形態では、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７は、連続していない。一部の実施形態では、挿入は、ＴＬＡＶＰＦＫではない。
本明細書で開示される７－ｍｅｒは、一部の場合には、共通のモチーフを共有する。７－ｍｅｒ（Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７）は、一部の場合には、Ｘ１位にＴ、Ｘ２位にＬ、Ｘ５位にＰ、Ｘ６位にＦ、およびＸ７位にＫまたはＬを有すると有利である。一部の実施形態では、７－ｍｅｒは、Ｔ－Ｌ－Ｘ３－Ｘ４－Ｐ－Ｆ－Ｋを含み、式中のＸ３およびＸ４は、任意のアミノ酸である。一部の実施形態では、７－ｍｅｒは、Ｔ－Ｌ－Ｘ３－Ｘ４－Ｐ－Ｆ－Ｌを含み、式中のＸ３およびＸ４は、任意のアミノ酸である。一部の場合には、Ｘ３は、Ａではない。一部の場合には、Ｘ３は、Ａ、Ｓ、Ｑ、またはＥ、またはＬである。一部の場合には、Ｘ４は、Ｖではない。一部の場合には、Ｘ４は、Ｒ、Ｋ、Ｖ、またはＱである。
一部の場合には、７－ｍｅｒは、Ｘ１－Ｌ－Ａ－Ｖ－Ｐ－Ｆ－Ｋ（式中、Ｘ１は、Ｔ、ＳまたはＮ以外の任意のアミノ酸である）；Ｘ１－Ｘ２－Ａ－Ｖ－Ｐ－Ｆ－Ｋ（式中、Ｘ１は、Ｔ、ＳまたはＮ以外の任意のアミノ酸であり、Ｘ２は、ＬまたはＶ以外の任意のアミノ酸である）；またはＸ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｖ－Ｐ－Ｆ－Ｋ（式中、Ｘ１は、Ｔ、ＳまたはＮ以外の任意のアミノ酸であり、Ｘ２は、ＬまたはＶ以外の任意のアミノ酸であり、Ｘ３は、Ａ、Ｓ、Ｑ、Ｐ、またはＴ以外の任意のアミノ酸である）；またはＸ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｐ－Ｆ－Ｋ（式中、Ｘ１は、Ｔ、ＳまたはＮ以外の任意のアミノ酸であり、Ｘ２は、ＬまたはＶ以外の任意のアミノ酸であり、Ｘ３は、Ａ、Ｓ、Ｑ、Ｐ、またはＴ以外の任意のアミノ酸であり、Ｘ４は、Ｖ、Ｔ、Ｑ、Ｎ、Ｌ、またはＭ以外の任意のアミノ酸である）であり得る。一部の事例では、７－ｍｅｒは、Ｔ－Ｌ－Ａ－Ｘ４－Ｐ－Ｆ－Ｋであり、式中のＸは、Ｖ以外の任意のアミノ酸である。一部の事例では、７－ｍｅｒは、Ｔ－Ｌ－Ａ－Ｘ４－Ｐ－Ｆ－Ｋであり、式中のＸは、Ｔ、Ｑ、Ｎ、Ｌ、またはＭ以外の任意のアミノ酸である。
一部の場合には、７－ｍｅｒ（Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７）は、ＴＡＬＫＰＦＬを含む。一部の事例では、７－ｍｅｒは、ＴＴＬＫＰＦＬを含む。一部の事例では、７－ｍｅｒは、ＴＬＱＩＰＦＫを含む。一部の事例では、７－ｍｅｒは、ＴＭＱＫＰＦＩを含む。一部の事例では、７－ｍｅｒは、ＳＩＥＲＰＦＫを含む。一部の事例では、７－ｍｅｒは、ＲＹＱＧＤＳＶを含む。
一部の事例では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、親ＡＡＶ９カプシドタンパク質（配列番号１）のアミノ酸５８８＿５８９位にアミノ酸配列Ｔ－Ｘ２－Ｌ－Ｋ－Ｐ－Ｆ－Ｌの少なくともまたは約３、４、５、６もしくは７アミノ酸の挿入を含み、式中、Ｘ２は、ＡまたはＴである。一部の場合には、ＡＡＶカプシドタンパク質は、参照ＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ９）と比較して、脳血管細胞（ＧＬＵＴ１＋）内へのウイルス形質導入の特異性の増加を有する。一部の場合には、ＡＡＶカプシドタンパク質は、参照ＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ９）と比較して、星状膠細胞内へのウイルス形質導入の特異性の増加を有する。
一部の事例では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、親ＡＡＶ９カプシドタンパク質（配列番号１）のアミノ酸５８８＿５８９位にアミノ酸配列Ｔ－Ｘ２－Ｑ－Ｘ４－Ｐ－Ｆ－Ｘ７の少なくともまたは約３、４、５、６もしくは７アミノ酸の挿入を含み、式中のＸ２は、ＬまたはＭであり、Ｘ４は、Ｉ、ＫまたはＬであり、Ｘ７は、ＫまたはＩである。一部の場合には、ＡＡＶカプシドタンパク質は、参照ＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ９）と比較して、ニューロンおよび星状膠細胞内へのウイルス形質導入の特異性の増加を有する。一部の事例では、アミノ酸配列は、ＴＬＱＩＰＦＫである。一部の事例では、アミノ酸配列は、ＴＭＱＫＰＦＩである。一部の事例では、アミノ酸配列は、ＴＬＱＬＰＦＫである。
一部の事例では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、親ＡＡＶ９カプシドタンパク質（配列番号１）のアミノ酸５８８＿５８９位にアミノ酸配列Ｓ－Ｉ－Ｅ－Ｒ－Ｐ－Ｆ－Ｋの少なくともまたは約３、４、５、６もしくは７アミノ酸の挿入を含む。一部の場合には、ＡＡＶカプシドタンパク質は、参照ＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ９）と比較して、ニューロンおよび星状膠細胞内へのウイルス形質導入の特異性の増加を有する。
一部の事例では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、親ＡＡＶ９カプシドタンパク質（配列番号１）のアミノ酸５８８＿５８９位にアミノ酸配列Ｒ－Ｙ－Ｑ－Ｇ－Ｄ－Ｓ－Ｖの少なくともまたは約３、４、５、６もしくは７アミノ酸の挿入を含む。一部の場合には、ＡＡＶカプシドタンパク質は、参照ＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ９）と比較して、星状膠細胞内へのウイルス形質導入の特異性の増加を有する。
表2:より高い効率および特異性でCNSを標的とすることができる7-mer標的化ペプチドのリスト
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表3: CNSを標的とすることができる11-mer標的化ペプチド
Figure 2022526018000017
肝臓を標的とするＡＡＶカプシドタンパク質
親ＡＡＶカプシドタンパク質の上記のアミノ酸位置に少なくとも１アミノ酸の置換または挿入があるＡＡＶカプシドタンパク質であって、この置換または挿入が、肝臓に対する特異性の増加をもたらす、ＡＡＶカプシドタンパク質が、本明細書で開示される。一部の事例では、挿入は、表４および／または図３５で提供される配列のうちのいずれか１つで提供される少なくとも１アミノ酸を含む。一部の事例では、挿入は、表４および／または図３５で提供される配列のうちのいずれか１つで提供される少なくとも２アミノ酸を含む。一部の事例では、挿入は、表４および／または図３５で提供される配列のうちのいずれか１つで提供される少なくとも３アミノ酸を含む。一部の事例では、挿入は、表４および／または図３５で提供される配列のうちのいずれか１つで提供される少なくとも４アミノ酸を含む。一部の事例では、挿入は、表４および／または図３５で提供される少なくとも５アミノ酸を含む。一部の事例では、挿入は、表４および／または図３５で提供される少なくとも６アミノ酸を含む。一部の事例では、挿入は、表４および／または図３５で提供される少なくとも７アミノ酸を含む。一部の事例では、アミノ酸は、連続している。一部の事例では、アミノ酸は、連続していない。一部の事例では、挿入は、親ＡＡＶカプシドタンパク質のアミノ酸５８８＿５８９位にある。一部の事例では、親カプシドタンパク質は、配列番号１で提供されるＡＡＶ９カプシドタンパク質である。
表4.肝臓を標的とする7-mer標的化ペプチドのリスト
Figure 2022526018000018
Figure 2022526018000019
Figure 2022526018000020
本明細書で開示されるＡＡＶカプシドおよびＡＡＶカプシドタンパク質は、一部の実施形態では、単離される。一部の事例では、本明細書で開示されるＡＡＶカプシドおよびＡＡＶカプシドタンパク質は、単離され、精製される。加えて、単離および精製された、またはされていない、本明細書で開示されるＡＡＶカプシドおよびＡＡＶカプシドタンパク質を、医薬製剤に製剤化することができ、この医薬製剤は、一部の場合には、薬学的に許容される担体をさらに含む。
Ｂ．異種核酸
本明細書で開示される疾患もしくは状態の、または疾患もしくは状態の症状の、処置または予防に有用な治療用核酸が、本明細書で開示される。一部の実施形態では、治療用核酸は、治療用遺伝子発現産物をコードする。遺伝子発現産物の非限定的な例としては、疾患もしくは障害、または疾患もしくは障害の症状の処置、予防法および／または改善に使用するための、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、酵素、抗体、抗原結合性断片、核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡなど）、および遺伝子編集成分が挙げられる。一部の事例では、治療用核酸は、本明細書で開示されるものなどのｒＡＡＶによって対象の生命体、細胞、組織または器官に配置される。
ウイルスベクター（例えば、一本鎖ＤＮＡ分子（ｓｓＤＮＡ））を各々が含むｒＡＡＶが、本明細書で開示される。一部の事例では、ウイルスベクターは、導入遺伝子に隣接している、各々約１４５塩基である、２つの逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含む。一部の実施形態では、導入遺伝子は、治療用核酸を含み、一部の場合には、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内で治療用核酸とシスの関係にあるプロモーターを含む。プロモーターは、標的細胞の核内で治療用核酸の転写を開始させることができる。ＩＴＲ配列は、いずれのＡＡＶ血清型からのものであってもよい。ＡＡＶ血清型の非限定的な例としては、ＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１およびＡＡＶ１２が挙げられる。一部の場合には、ＩＴＲは、ＡＡＶ２からのＩＴＲである。一部の場合には、ＩＴＲは、ＡＡＶ９からのＩＴＲである。
任意の数のヌクレオチドを含むことができる導入遺伝子が、本明細書で開示される。一部の場合には、導入遺伝子は、約１００未満のヌクレオチドを含むことができる。一部の場合には、導入遺伝子は、少なくとも約１００ヌクレオチドを含むことができる。一部の場合には、導入遺伝子は、少なくとも約２００ヌクレオチドを含むことができる。一部の場合には、導入遺伝子は、少なくとも約３００ヌクレオチドを含むことができる。一部の場合には、導入遺伝子は、少なくとも約４００ヌクレオチドを含むことができる。一部の場合には、導入遺伝子は、少なくとも約５００ヌクレオチドを含むことができる。一部の場合には、導入遺伝子は、少なくとも約１０００ヌクレオチドを含むことができる。一部の場合には、導入遺伝子は、少なくとも約５０００ヌクレオチドを含むことができる。一部の場合には、導入遺伝子は、少なくとも約１０，０００ヌクレオチドを含むことができる。一部の場合には、導入遺伝子は、少なくとも約２０，０００ヌクレオチドを含むことができる。一部の場合には、導入遺伝子は、少なくとも約３０，０００ヌクレオチドを含むことができる。一部の場合には、導入遺伝子は、少なくとも約４０，０００ヌクレオチドを含むことができる。一部の場合には、導入遺伝子は、少なくとも約５０，０００ヌクレオチドを含むことができる。一部の場合には、導入遺伝子は、約５００～約５０００の間のヌクレオチドを含むことができる。一部の場合には、導入遺伝子は、約５０００～約１０，０００の間のヌクレオチドを含むことができる。本明細書で開示されるいずれの場合も、導入遺伝子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡとＲＮＡのハイブリッドを含み得る。一部の場合には、導入遺伝子は、一本鎖状であり得る。一部の場合には、導入遺伝子は、二本鎖状であり得る。
標的遺伝子またはその遺伝子発現産物の発現または活性のモジュレーションに有用な導入遺伝子が、本明細書で開示される。一部の事例では、導入遺伝子は、本明細書に記載のｒＡＡＶ粒子のｒＡＡＶカプシドタンパク質によりカプシド内封入される。一部の事例では、ｒＡＡＶ粒子は、対象における本明細書で開示される疾患または状態を処置するために対象に送達される。一部の事例では、送達は、全身（例えば、静脈内、鼻腔内）送達である。
本明細書で開示される導入遺伝子は、健常または正常個体のものと同様のレベルで内在性遺伝子を発現させるのに有用である。これは、遺伝子発現産物の過少発現または発現の欠如に関連する疾患または状態の処置に特に有用である。一部の実施形態では、本明細書で開示される導入遺伝子は、内在性遺伝子の発現レベルが健常または正常個体の発現レベルより高くなるように内在性遺伝子を過剰発現させるのに有用である。加えて、導入遺伝子を使用して、外来遺伝子（例えば、活性物質、例えば、抗体、ペプチド、核酸または遺伝子編集成分）を発現させることができる。一部の実施形態では、治療用遺伝子発現産物は、細胞における１つまたは複数の内在性生物学的プロセスの活性を変更すること、増強すること、増加させることまたは誘導することができる。一部の実施形態では、本明細書で開示される導入遺伝子は、内在性遺伝子、例えばドミナントネガティブ遺伝子の発現を低減させるのに有用である。一部の実施形態では、治療用遺伝子発現産物は、細胞における１つまたは複数の内因性生物学的プロセスの活性を変更すること、阻害すること、低減させること、防止すること、消失させること、または損なわせることができる。一部の態様では、遺伝子発現の増加は、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％および１００％増加を指す。一態様では、標的遺伝子のタンパク質産物を少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％および１００％増加させることができる。一部の態様では、遺伝子発現の減少は、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％および１００％増加を指す。一態様では、標的遺伝子のタンパク質産物を少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％および１００％減少させることができる。
内在性配列（内在性導入遺伝子または導入遺伝子の一部）が導入遺伝子とともに発現される場合、内在性配列は、完全長配列（野生型もしくは突然変異型）であることもあり、または部分配列であることもある。内在性配列は、機能性であり得る。これらの完全長または部分配列の機能の非限定的な例としては、導入遺伝子（例えば、治療用遺伝子）により発現されるポリペプチドの血清半減期を延長することおよび／または担体として作用することが挙げられる。
内在性遺伝子のすべてが発現されるように、内在性遺伝子の一部が発現されるように、またはいずれの内在性遺伝子も発現されないように、導入遺伝子を内在性遺伝子に挿入することができる。例えば、内在性配列の一部（導入遺伝子のＮ末端側および／またはＣ末端側）が、例えば導入遺伝子との融合体として、発現されるように、またはいずれの内在性配列も、例えば導入遺伝子との融合体として、発現されないように、本明細書に記載の導入遺伝子を内在性遺伝子座に挿入することができる。他の場合には、導入遺伝子（例えば、内在性遺伝子の追加のコード配列を有するまたは有さない）が、任意の内在性遺伝子座、例えば、セーフハーバー遺伝子座に組み込まれる。例えば、フラタキシン（ＦＸＮ）導入遺伝子を内在性ＦＸＮ遺伝子に挿入することができる。導入遺伝子を、任意の遺伝子、例えば本明細書に記載の遺伝子に、挿入することができる。
本開示の少なくとも１つの利点は、事実上あらゆる治療用核酸を、任意の治療用遺伝子発現産物を発現させるために使用することができることである。一部の事例では、治療用遺伝子発現産物は、治療用タンパク質またはペプチド（例えば、抗体、抗原結合性断片、ペプチド、またはタンパク質）である。一実施形態では、治療用核酸によりコードされるタンパク質は、長さが５０～５０００アミノ酸の間である。一部の実施形態では、コードされるタンパク質は、長さが５０～２０００アミノ酸の間である。一部の実施形態では、コードされるタンパク質は、長さが５０～１０００アミノ酸の間である。一部の実施形態では、コードされるタンパク質は、長さが５０～１５００アミノ酸の間である。一部の実施形態では、コードされるタンパク質は、長さが５０～８００アミノ酸の間である。一部の実施形態では、コードされるタンパク質は、長さが５０～６００アミノ酸の間である。一部の実施形態では、コードされるタンパク質は、長さが５０～４００アミノ酸の間である。一部の実施形態では、コードされるタンパク質は、長さが５０～２００アミノ酸の間である。一部の実施形態では、コードされるタンパク質は、長さが５０～１００アミノ酸の間である。一部の実施形態では、コードされるペプチドは、長さが４～５０アミノ酸の間である。一部の実施形態では、コードされるタンパク質は、テトラペプチド、ペンタペプチド、ヘキサペプチド、ヘプタペプチド、オクタペプチド、ノナペプチドまたはデカペプチドである。一部の実施形態では、コードされるタンパク質は、２～３０アミノ酸、例えば、５～３０、１０～３０、２～２５、５～２５、１０～２５、または１０～２０アミノ酸などのペプチドを含む。一部の実施形態では、コードされるタンパク質は、少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１７、２０、２５もしくは３０アミノ酸のペプチド、または５０アミノ酸以内、例えば、３５、３０、２５、２０、１７、１５、１４、１３、１２、１１もしくは１０アミノ酸以内であるペプチドを含む。
治療用タンパク質またはペプチドの非限定的な例としては、アドレナリン作動性アゴニスト、抗アポトーシス因子、アポトーシス阻害剤、サイトカイン受容体、サイトカイン、細胞毒素、赤血球生成剤、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、糖タンパク質、増殖因子、増殖因子受容体、ホルモン、ホルモン受容体、インターフェロン、インターロイキン、インターロイキン受容体、キナーゼ、キナーゼ阻害剤、神経成長因子、ネトリン、神経活性ペプチド、神経活性ペプチド受容体、神経原性因子、神経原性因子受容体、ニューロピリン、神経栄養因子、ニューロトロフィン、ニューロトロフィン受容体、Ｎ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸アンタゴニスト、プレキシン、プロテアーゼ、プロテアーゼ阻害剤、タンパク質デカルボキシラーゼ、プロテインキナーゼ、プロテインキナーゼ阻害剤、タンパク質分解性タンパク質、タンパク質分解性タンパク質阻害剤、セマフォリン（semaphoring）、セマフォリン受容体、セロトニン輸送タンパク質、セロトニン取込み阻害剤、セロトニン受容体、セルピン、セルピン受容体、および腫瘍抑制因子が挙げられる。ある特定の実施形態では、治療用タンパク質またはペプチドは、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（ＣＳＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、性腺刺激ホルモン、インターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ）、インスリン様増殖因子１（ＩＦＧ－１）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子－ベータ（ＴＧＦ－Ｂ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、プロラクチン、ソマトトロピン、Ｘ連鎖アポトーシス抑制タンパク質１（ＸＩＡＰ１）、インターロイキン１（ＩＬ－１）、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１０、ウイルスＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、およびＩＬ－１８からなる群から選択される。
治療用遺伝子発現産物は、遺伝子編集成分を含み得る。遺伝子編集成分の非限定的な例としては、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、人工部位特異的ＲＮＡエンドヌクレアーゼ（ＡＳＲＥ）、ジンクフィンガーエンドヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、および転写因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）に必要とされるものが挙げられる。非限定的な例では、ハンチントン病に罹患している対象が同定される。その場合、ハンチンチン（ＨＴＴ）遺伝子の転写を抑制するように操作されたＺＦＮをコードするウイルスベクターをカプシド内封入しているｒＡＡＶの第１の量が対象に全身投与される。一部の事例では、投与経路は、静脈内経路である。ｒＡＡＶは、神経系へのＺＦＮの適切な標的化と同時に肝臓などの標的外器官の再標的化を可能にするために、表２～３または図３３のいずれか１つで提供されるアミノ酸配列を含む改変ＡＡＶカプシドタンパク質を含むことになる。必要に応じて、ｒＡＡＶの第２または第３の用量が、ＺＦＮの治療有効量が対象の神経系に発現されるまで、対象に投与される。別の非限定的な例では、嚢胞性線維症に罹患している対象が同定される。その場合、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）遺伝子の転写を抑制するように操作されたＺＦＮをコードするウイルスベクターをカプシド内封入しているｒＡＡＶの第１の量が対象に全身投与される。一部の事例では、投与経路は、鼻腔内経路（例えば、鼻腔内スプレー）である。ｒＡＡＶは、肺へのＺＦＮの適切な標的化を可能にするために、図３３または表２～３で提供されるアミノ酸配列を含む改変ＡＡＶカプシドタンパク質を含むことになる。必要に応じて、ｒＡＡＶの第２または第３の用量が、ＺＦＮの治療有効量が対象の肺に発現されるまで、対象に投与される。
治療用核酸は、非タンパク質コード遺伝子、例えば、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡおよびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡスポンジまたはデコイをコードする配列を含むことができ、条件付き遺伝子欠失のためのリコンビナーゼの送達、条件付き（リコンビナーゼ依存性）発現は、本明細書に記載の遺伝子編集成分に必要とされるものを含む。非タンパク質コード遺伝子は、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔｍＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡおよび／または長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ＩｎｃＲＮＡ）もコードすることがある。一部の場合には、非タンパク質コード遺伝子は、標的遺伝子または遺伝子発現産物の発現または活性をモジュレートすることができる。例えば、本明細書に記載のＲＮＡを使用して、標的細胞、例えば中枢神経系（ＣＮＳ）または末梢器官（例えば、肺）の細胞、における遺伝子発現を阻害することができる。一部の場合には、遺伝子発現の阻害は、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％および１００％阻害を指す。一部の場合には、標的遺伝子のタンパク質産物を少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％および１００％阻害することができる。遺伝子は、野生型遺伝子であることもあり、または少なくとも１つの突然変異を有する遺伝子であることもある。標的タンパク質は、野生型タンパク質であることもあり、または少なくとも１つの突然変異を有するタンパク質であることもある。
治療用核酸は、脳の疾患または障害に関与する遺伝子の、またはその遺伝子から発現される遺伝子発現産物の、発現または活性をモジュレートすることができる。例えば、治療用核酸は、一部の場合には、本明細書に記載の遺伝子またはその遺伝子の改変バージョンである。別の例では、治療用核酸は、エフェクター遺伝子発現産物、例えば、その中の遺伝子を標的化することに特異的な遺伝子編集成分を含む。遺伝子の非限定的な例としては、サルコグリカンアルファ（ＳＧＣＡ）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６５（ＧＡＤ６５）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６７（ＧＡＤ６７）、ＣＬＮ２遺伝子、神経成長因子（ＮＧＦ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、生存運動ニューロン１、テロメア型（ＳＭＮ１）、β－グルコセレブロシダーゼ（ＧＣａｓｅ）、フラタキシン（ＦＸＮ）、ハンチンチン（ＨＴＮ）、メチル化ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）、ペルオキシソーム形成因子（ＰＥＸ）、プログラニュリン（ＧＲＮ）、抗チューブリン剤、銅－亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）、グルコシルセラミダーゼベータ（ＧＢＡ）、ＮＰＣ細胞内コレステロール輸送体１（ＮＰＣ１）、およびＮＰＳ３が挙げられる。一部の実施形態では、ペルオキシソーム形成因子（ＰＥＸ）は、ＰＥＸ１、ＰＥＸ２、ＰＥＸ３、ＰＥＸ４、ＰＥＸ５、ＰＥＸ６、ＰＥＸ７、ＰＥＸ１０、ＰＥＸ１１β、ＰＥＸ１２、ＰＥＸ１３、ＰＥＸ１４、ＰＥＸ１６、ＰＥＸ１９、およびＰＥＸ２６からなる群から選択される。一部の事例では、遺伝子または遺伝子発現産物は、阻害される。一部の事例では、遺伝子または遺伝子発現産物は、増強される。
治療用核酸は、特定の器官（例えば、肺、心臓、肝臓、筋肉、眼）の疾患または障害に関与する遺伝子の、またはその遺伝子から発現される遺伝子発現産物の、発現または活性をモジュレートする。遺伝子の非限定的な例としては、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）、第Ｘ因子（ＦＩＸ）、ＲＰＥ６５、レチノイドイソメロヒドロラーゼ（ＲＰＥ６５）、サルコグリカンアルファ（ＳＧＣＡ）、および筋小胞体／小胞体Ｃａ２＋－ＡＴＰａｓｅ（ＳＥＲＣＡ２ａ）が挙げられる。一部の実施形態では、治療用遺伝子発現産物は、ヒト、ネズミ科動物、鳥類の動物、ブタ、ウシ亜科動物、ヒツジ属動物、ネコ科動物、イヌ科動物、ウマ科動物、エピン、ヤギ亜科動物、オオカミまたは霊長類起源のものである。一部の事例では、遺伝子または遺伝子発現産物は、阻害される。一部の事例では、遺伝子または遺伝子発現産物は、増強される。
Ｃ．ＡＡＶベクター
遺伝情報を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが、本明細書で開示される。本明細書に記載のＡＡＶベクターは、ｒＡＡＶのアセンブリーおよび異種核酸のウイルスパッケージングに有用である。加えて、ＡＡＶベクターは、異種核酸を含む導入遺伝子をコードすることができる。一部の事例では、ＡＡＶベクターは、ＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１およびＡＡＶ１２からなる群から選択されるＡＡＶ血清型からのものである。一部の事例では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ、およびＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｓからなる群から選択される改変ＡＡＶ血清型から選択される。
ＡＡＶベクターは、一部の場合には異種遺伝子発現産物（例えば、治療用遺伝子発現産物、組換えカプシドタンパク質など）をコードする、導入遺伝子を含むことができる。導入遺伝子は、導入遺伝子に隣接する２つの逆位末端反復（ＩＴＲ）とシスの関係にある。導入遺伝子は、治療用遺伝子発現産物をコードする治療用核酸を含み得る。ｒＡＡＶの限られたパッケージング容量（約２．５ｋＢ）のため、一部の場合には、より長い導入遺伝子は、２つのＡＡＶベクター、３’スプライスドナーを有する第１のＡＡＶベクターと５’スプライスアクセプターを有する第２のＡＡＶベクター、との間で分割されることがある。細胞への同時感染時にコンカテマーが形成し、これらが一緒にスプライシングされて完全長導入遺伝子を発現する。
一般に、導入遺伝子は、その発現が、組込み部位の内在性プロモーター、すなわち、導入遺伝子が挿入される内在性遺伝子の発現を駆動するプロモーター、によって駆動されるように挿入される。一部の事例では、導入遺伝子は、プロモーターおよび／またはエンハンサー、例えば、構成的プロモーターまたは誘導性もしくは組織／細胞特異的プロモーターを含む。非限定的な例として、プロモーターは、ＣＭＶプロモーター、ＣＭＶ－β－アクチン－イントロン－β－グロビンハイブリッドプロモーター（ＣＡＧ）、ＣＢＡプロモーター、ＦＲＤＡもしくはＦＸＮプロモーター、ＵＢＣプロモーター、ＧＵＳＢプロモーター、ＮＳＥプロモーター、シナプシンプロモーター、ＭｅＣＰ２プロモーター、ＧＦＡＰプロモーター、Ｈ１プロモーター、Ｕ６プロモーター、ＮＦＬプロモーター、ＮＦＨプロモーター、ＳＣＮ８Ａプロモーター、またはＰＧＫプロモーターであり得る。非限定的な例として、プロモーターは、ヒト伸長因子１α－サブユニット（ＥＦ１α）、最初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）およびその誘導体ＣＡＧ、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）、ならびにユビキチンＣ（ＵＢＣ）を含むがこれらに限定されない、組織特異的発現エレメントであり得る。導入遺伝子は、ニューロンのための組織特異的発現エレメント、例えば、これらに限定されないが、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、血小板由来増殖因子Ｂ－鎖（ＰＤＧＦ－β）、シナプシン（Ｓｙｎ）、メチル化ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）、代謝型グルタミン酸受容体２（ｍＧｌｕＲ２）、ＮＦＬ、ＮＦＨ、ｎｐ３２、ＰＰＥ、ＥｎｋおよびＥＡＡＴ２プロモーターを含むこともある。導入遺伝子は、星状膠細胞のための組織特異的発現エレメント、例えば、これらに限定されないが、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）およびＥＡＡＴ２プロモーターを含むこともある。導入遺伝子は、乏突起膠細胞のための組織特異的発現エレメント、例えば、これに限定されないが、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）プロモーターを含むこともある。
一部の実施形態では、プロモーターは、１ｋｂ未満である。プロモーターは、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００の、または８００より長い長さを有し得る。プロモーターは、２００～３００、２００～４００、２００～５００、２００～６００、２００～７００、２００～８００、３００～４００、３００～５００、３００～６００、３００～７００、３００～８００、４００～５００、４００～６００、４００～７００、４００～８００、５００～６００、５００～７００、５００～８００、６００～７００、６００～８００または７００～８００の間の長さを有し得る。プロモーターは、標的組織、例えば、これらに限定されないが、中枢神経系および末梢器官（例えば、肺）において、ある期間にわたって治療用遺伝子発現産物の発現を提供することができる。治療用遺伝子発現産物の発現は、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、２週間、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、３週間、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、３１日、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１年、１３ヶ月、１４ヶ月、１５ヶ月、１６ヶ月、１７ヶ月、１８ヶ月、１９ヶ月、２０ヶ月、２１ヶ月、２２ヶ月、２３ヶ月、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、１０年、１１年、１２年、１３年、１４年、１５年、１６年、１７年、１８年、１９年、２０年、２１年、２２年、２３年、２４年、２５年、２６年、２７年、２８年、２９年、３０年、３１年、３２年、３３年、３４年、３５年、３６年、３７年、３８年、３９年、４０年、４１年、４２年、４３年、４４年、４５年、４６年、４７年、４８年、４９年、５０年、５５年、６０年、６５年の期間または６５年より長い期間にわたることがある。ペイロードの発現は、１～５時間、１～１２時間、１～２日間、１～５日間、１～２週間、１～３週間、１～４週間、１～２ヶ月間、１～４ヶ月間、１～６ヶ月間、２～６ヶ月間、３～６ヶ月間、３～９ヶ月間、４～８ヶ月間、６～１２ヶ月間、１～２年間、１～５年間、２～５年間、３～６年間、３～８年間、４～８年間、または５～１０年間、または１０～１５年間、または１５～２０年間、または２０～２５年間、または２５～３０年間、または３０～３５年間、または３５～４０年間、または４０～４５年間、または４５～５０年間、または５０～５５年間、または５５～６０年間、または６０～６５年間にわたることがある。
ＡＡＶベクターは、ヘルパーウイルスのゲノムを含むことができる。ヘルパーウイルスタンパク質は、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）のアセンブリー、および異種核酸を含有する導入遺伝子のｒＡＡＶへのパッケージングに必要とされる。ヘルパーウイルス遺伝子は、細胞において発現されたときにＡＡＶ複製を支援するアデノウイルス遺伝子Ｅ４、Ｅ２ａおよびＶＡである。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、Ｅ２を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、Ｅ４を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＶＡを含む。一部の事例では、ＡＡＶベクターは、ヘルパーウイルスタンパク質のうちの１つ、または任意の組合せを含む。
ＡＡＶベクターは、本明細書に記載の組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）カプシドタンパク質をコードする核酸を含むウイルスゲノムを含むことができる。ウイルスゲノムは、Ｒｅｐタンパク質をコードする複製（Ｒｅｐ）遺伝子と、第１のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ１）内にＡＡＰタンパク質をコードする、または第２のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ２）内にＣａｐタンパク質をコードする、カプシド（Ｃａｐ）遺伝子とを含むことができる。Ｒｅｐタンパク質は、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０からなる群から選択される。一部の事例では、Ｃａｐ遺伝子は、本明細書に記載の改変ＡＡＶカプシドタンパク質をコードするように改変される。野生型Ｃａｐ遺伝子は、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３という３つのタンパク質をコードする。一部の場合には、ＶＰ１が改変される。一部の場合には、ＶＰ２が改変される。一部の場合には、ＶＰ３が改変される。一部の場合には、ＶＰ１～ＶＰ３の３つ全てが改変される。ＡＡＶベクターは、野生型Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、Ｒｅｐ４０およびＡＡＰタンパク質をコードする、核酸を含むことができる。
本開示のＡＡＶカプシドタンパク質の改変部分をコードするＤＮＡ配列である配列番号１０～４３４、８６０～８６３、８６８～９４９、１０６８～５６６１、１４８４１～１４８８０、および１４９６１～１５０５３のいずれか１つを含むＡＡＶベクターが、本明細書で開示される。一部の事例では、ＡＡＶベクターは、７－ｍｅｒ改変ＡＡＶカプシドタンパク質部分をコードする配列番号１０～４３４および８６８～９４９のいずれか１つで提供される核酸配列を含む。本開示のＡＡＶベクターは、表５で提供される配列番号６～９のいずれか１つを含むＶＰ１ Ｃａｐ遺伝子を含むことができる。ＡＡＶベクターは、配列番号６～９のいずれか１つの７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％を含むことができる。
一部の事例では、表５で提供される、配列番号６で提供されるＡＡＶ９ ＶＰ１遺伝子は、配列番号１０～４３４、８６０～８６３、８６８～９４９、１０６８～５６６１、１４８４１～１４８８０、および１４９６１～１５０５３のいずれか１つを含むように改変される。一部の事例では、同じく表５で提供されるＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ ＶＰ１（配列番号９）は、配列番号１０～４３４、８６０～８６３、８６８～９４９、１０６８～５６６１、１４８４１～１４８８０、および１４９６１～１５０５３のいずれか１つを含むように改変される。本明細書に記載のＡＡＶベクターは、本明細書に記載の方法によりバリアントＡＡＶカプシドを産生するために使用され得る。
表5. VP1カプシドタンパク質核酸配列
Figure 2022526018000021
Figure 2022526018000022
Figure 2022526018000023
Figure 2022526018000024
Figure 2022526018000025
Figure 2022526018000026
 ＩＩ．方法
Ａ．ＡＡＶを産生する方法
本明細書で開示されるものなどの組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を同定する方法が、本明細書で開示される。標的ｉｎ ｖｉｖｏ環境に特異的なＡＡＶペプチドは、多重化されたＣｒｅ組換えに基づくＡＡＶ標的進化（Ｍ－ＣＲＥＡＴＥ）を使用して同定される。図１は、Ｍ－ＣＲＥＡＴＥを使用するワークフローを提供する。Ｍ－ＣＲＥＡＴＥは、ＡＡＶ Ｒｅｐ遺伝子からの調節エレメントにより制御される完全長ＡＡＶ Ｃａｐ遺伝子をＣｒｅ逆位可能スイッチとカップリングさせるｒＡＡＶカプシドゲノム（下記実施例２で説明される通りのｒＡＡＶ－Ｃａｐ－ｉｎ－ｃｉｓ－ｌｏｘまたはｒＡＡＶ－ΔＣａｐ－ｉｎ－ｃｉｓ－ｌｏｘ２）を使用する。ｒＡＡＶ－ΔＣａｐ－ｉｎ－ｃｉｓ－ｌｏｘ２骨格は、２つのＬｏｘ部位（ｌｏｘ７１およびｌｏｘ６６）と隣接している両方向性ポリＡを有する。ΔＣａｐ骨格は、カプシド遺伝子の一部分が欠けているので、非機能性である。特定の部位に突然変異が誘発されたライブラリー断片がカプシドに挿入されると、それが完全機能性ベクターになる。Ｃｒｅリコンビナーゼを発現する細胞において、Ｃｒｅ－Ｌｏｘ組換えは、Ｌｏｘ部位のＬｏｘ７２およびＬｏｘＰへの反転に加えて、ポリＡの逆位を促進する。（図１および３６を参照されたい）。本明細書で開示されるランダム化７－ｍｅｒおよび１１－ｍｅｒは、ＰＣＲを使用して生成され、次いで、ｒＡＡＶ－ΔＣａｐ－ｉｎ－ｃｉｓ－ｌｏｘに挿入されて、カプシドタンパク質配列内に（例えば、ＡＡ５８８＿５８９に）ランダム化挿入または置換があるウイルスライブラリーが生成される。（図１）。第１のｉｎ ｖｉｖｏ選択ラウンドにおいて、ウイルスライブラリーは、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現するトランスジェニック動物の血流に注射（例えば、静脈内注射）される。ｉｎ ｖｉｖｏ環境（例えば、脳／肝臓）内への注射後にトランスジェニック動物から組織が得られる。レポーター遺伝子発現産物の選択的増幅発現を使用して、逆位のレポーター発現カセットが検出される。組織中のｒＡＡＶが単離され、挿入部位の周りのウイルスゲノムがシークエンシングされ、ＡＡＶ９鋳型ＤＮＡ断片とアラインメントされる。回収された７－ｍｅｒおよび１１－ｍｅｒは、標的ｉｎ ｖｉｖｏ環境にエンリッチされており、別のｒＡＡＶ－ΔＣａｐ－ｉｎ－ｃｉｓ－ｌｏｘ２骨格にクローニングされた。そして別のｉｎ ｖｉｖｏ選択ラウンドが行われる。標的ｉｎ ｖｉｖｏ環境にエンリッチされたおよび標的外ｉｎ ｖｉｖｏ環境に負にエンリッチされた７－ｍｅｒおよび１１－ｍｅｒが、好適な方法、例えば次世代シークエンシングを使用してシークエンシングされる。図３３～３５は、本明細書で提供される方法を使用して同定されたＤＮＡ配列を提供する。
方法は、ＡＡＶカプシド遺伝子とＣｒｅリコンビナーゼの認識配列とを含むｒＡＡＶゲノムを用意するステップを含む。一部の場合には、ｒＡＡＶゲノムは、レポーター発現カセットに隣接する、Ｃｒｅリコンビナーゼの２つの認識配列を有する。Ｃｒｅリコンビナーゼの認識配列（例えば、ＬｏｘＰ）は、レポーターカセットの逆位が細胞内のＣｒｅリコンビナーゼの存在下で促進されるように配向される。方法は、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現する細胞の集団にｒＡＡＶゲノムをトランスフェクトするステップを含む。Ｃｒｅリコンビナーゼが逆位（例えば、トランスジェニック動物のゲノム内へのレポーター遺伝子の「反転」）を誘導する。一部の場合には、任意の好適な方法、例えば、定量的ポリメラーゼ連鎖反応、または免疫組織化学的検査を使用して、逆位率（例えば、標的細胞におけるレポーター遺伝子の発現レベル）を測定することができる。レポーター遺伝子の発現レベルが参照値と比較され、参照値は、一部の場合には、参照ＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ９）による逆位率である。本明細書で開示される方法は、標的ｉｎ ｖｉｖｏ環境で参照ＡＡＶの逆位率と比較して逆位率の増加を検出する方法を提供する。一部の場合には、参照ＡＡＶの逆位率と比較して標的外細胞で逆位率の減少が検出される。本明細書に記載の方法を使用して回収されるｒＡＡＶゲノムは、標的細胞に対する特異性の増加および標的外細胞に対する特異性の減少を有するＡＡＶカプシド粒子（例えば、カプシドタンパク質、カプシド）をコードする。
本明細書で開示されるｒＡＡＶを産生する方法が、本明細書で開示される。一部の事例では、標的細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）におけるＡＡＶ産生に必要とされるすべてのエレメントが、当技術分野において公知の好適な方法を使用して標的細胞に一過性にトランスフェクトされる。例えば、本開示のｒＡＡＶは、導入遺伝子（例えば、治療用核酸）を保有するＩＴＲ含有プラスミドを有する第１のベクター、ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子を保有する第２のベクター、および（３）アデノウイルスから単離されたヘルパー遺伝子を提供する第３のベクターという、３つのプラスミドベクターをコトランスフェクトすることにより、産生することができる。本明細書に記載の方法は、アデノウイルス不含である高力価ＡＡＶベクターを生成する。本明細書で開示されるＣａｐ遺伝子は、本開示の改変ＡＡＶカプシドタンパク質部分をコードするＤＮＡ配列である配列番号１０～４３４、８６０～８６３、８６８～９４９、１０６８～５６６１、１４８４１～１４８８０、および１４９６１～１５０５３のいずれか１つを含む。一部の場合には、本開示のｒＡＡＶは、Challis, R. C. et al. Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents. Nat. Protoc.14, 379 (2019)に記載されている方法を使用して生成され、前記参考文献は、これによりその全体が参照により組み込まれる。手短に述べると、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用するＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）のトリプルトランスフェクションが行われ、１２０時間後に細胞溶解物と培地の両方からウイルスが回収され、イオジキサノールを用いて精製される。
（ａ）細胞に、（１）治療用遺伝子発現産物をコードする第１の核酸配列と、（２）（ｉ）Ｒｅｐタンパク質をコードする複製（Ｒｅｐ）遺伝子および（ｉｉ）本明細書に記載の改変ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする改変カプシド（Ｃａｐ）遺伝子を含む、ウイルスゲノム成分をコードする第２の核酸配列と、（３）ＡＡＶヘルパーウイルスのゲノムをコードする第３の核酸配列とを含む核酸を導入するステップ；および（ｂ）第１の核酸をカプシド内封入し、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質の指向性と比較して、対象における標的ｉｎ ｖｉｖｏ環境に対する特異性の増加、および標的外ｉｎ ｖｉｖｏ環境に対する特異性の減少を有する指向性を有する、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）カプシドをアセンブルするステップを含む方法が、本明細書で開示される。一部の事例では、方法は、治療用遺伝子発現産物をコードする第１の核酸配列を、それが改変ＡＡＶカプシドタンパク質によりカプシド内封入されるようにパッキングするステップをさらに含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、単離され、濃縮され、本明細書に記載のものなどの好適なウイルス精製法を使用して精製される。
非限定的な例では、ｒＡＡＶは、標準的なトランスフェクションプロトコール（例えば、ＰＥＩ）を使用する先駆細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ）細胞のトリプルトランスフェクションにより生成される。ウイルス粒子は、ある時間の後（例えば、トランスフェクションの７２時間後）に培地から採取され、より後の時点（例えば、トランスフェクションの１２０時間後）に細胞および培地から採取される。培地中に存在するウイルスは、８％ポリ（エチレングリコール）および５００ｍＭ塩化ナトリウムでの沈殿により濃縮され、沈殿したウイルスが、回収された細胞から調製された溶解物に添加される。ウイルスは、イオジキサノール（Ｏｐｔｉｐｒｅｐ、Ｓｉｇｍａ）の段階的勾配（１５％、２５％、４０％および６０％）を用いて精製される。ウイルスは濃縮され、ＰＢＳ中で製剤化される。ウイルス力価は、ｑＰＣＲと対照としての線状化ゲノムプラスミドとを使用してＤＮａｓｅＩ耐性ベクターゲノムコピー（ＶＧ）の数を測定することにより決定される。
Ｒｅｐタンパク質は、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０からなる群から選択することができる。ＡＡＶヘルパーウイルスのゲノムは、Ｅ２、Ｅ４およびＶＡからなる群から選択されるＡＡＶヘルパー遺伝子を含む。第２の核酸と第１の核酸は、トランスの関係にあり得る。第２の核酸と第１の核酸は、シスの関係にあり得る。
細胞は、ヒト、霊長類、ネズミ科動物、ネコ科動物、イヌ科動物、ブタ、ヒツジ属動物、ウシ亜科動物、ウマ科動物、エピン、ヤギ亜科動物およびオオカミ宿主細胞からなる群から選択することができる。一部の事例では、細胞は、幹細胞などの、前駆細胞または先駆細胞である。一部の事例では、幹細胞は、間葉細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、線維芽細胞または他の組織特異的幹細胞である。細胞は、不死化細胞であることもある。一部の場合には、不死化細胞は、ＨＥＫ２９３細胞である。一部の事例では、細胞は、分化細胞である。提供される本開示に基づいて、その系を、目的の標的細胞型においてリコンビナーゼを発現する任意のトランスジェニック系列と併用して、より効率的にその標的細胞集団に形質導入するＡＡＶカプシドを開発することができると予想される。
Ｂ．異種核酸のｒＡＡＶ媒介送達方法
それを必要とする対象に異種核酸（例えば、本明細書で開示される治療用核酸または導入遺伝子）を送達する方法が、本明細書で開示される。導入遺伝子は、本明細書に記載のものなどの組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）カプシドタンパク質またはｒＡＡＶ粒子によりカプシド内封入され得る。
方法、例えば、科学研究を目的とする、または養子細胞療法を生み出すための方法は、ｅｘ ｖｉｖｏであり得る。対象は、ヒト初代細胞もしくは成熟細胞、または細胞系であり得る。対象は、サル、ハムスターまたはマウスからの細胞であり得る。いずれにせよ、送達は、組成物を細胞または細胞系と接触させることを含み得る。
方法、例えば、それを必要とする対象における疾患または状態を処置する方法は、ｉｎ ｖｉｖｏであり得る。一部の事例では、対象は、哺乳動物、例えば、ヒトまたは非ヒト霊長類であり得、この場合、組成物の送達は、対象に組成物を投与することを含み得る。一部の実施形態では、異種核酸の送達は、本明細書に記載の投与経路のいずれか１つを使用して組成物を対象に投与することを含む。
一部の実施形態では、標的ｉｎ ｖｉｖｏ環境内への異種核酸の形質導入を増加させる方法は、標的ｉｎ ｖｉｖｏ環境（例えば、組織または細胞型）内への形質導入効率の向上を有するように操作された、本明細書に記載のｒＡＡＶ粒子を送達するステップを含む。一部の事例では、形質導入効率の向上は、参照ＡＡＶと比較して、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、２１倍、２２倍、２３倍、２４倍、２５倍、２６倍、２７倍、２８倍、２９倍、３０倍、３１倍、３２倍、３３倍、３４倍、３５倍、３６倍、３７倍、３８倍、３９倍、４０倍、４１倍、４２倍、４３倍、４４倍、４５倍、４６倍、４７倍、４８倍、４９倍、５０倍、７５倍もしくは１００倍またはそれを超える向上を含む。一部の事例では、形質導入効率の向上は、少なくとも３０倍である。一部の事例では、形質導入効率の向上は、少なくとも４０倍である。一部の事例では、形質導入効率の向上は、少なくとも５０倍である。一部の事例では、形質導入効率の向上は、少なくとも６０倍である。一部の事例では、形質導入効率の向上は、少なくとも８０倍である。一部の事例では、形質導入効率の向上は、少なくとも９０倍である。一部の事例では、形質導入効率の向上は、少なくとも１００倍である。
標的ｉｎ ｖｉｖｏ環境に異種核酸を送達する方法であって、参照ＡＡＶと比較して特異性の増加を有するように操作された本明細書に記載のｒＡＡＶ粒子を標的ｉｎ ｖｉｖｏ環境（例えば、組織または細胞型）内に送達するステップを含む方法も提供される。方法は、一部の場合には、ｒＡＡＶが参照ＡＡＶよりも標的ｉｎ ｖｉｖｏ環境に対して大きい特異性を所有するかどうかを検出するステップであって、対象における標的ｉｎ ｖｉｖｏ環境から得られた組織試料中のｒＡＡＶによりカプシド内封入された異種核酸から発現された遺伝子発現産物（例えば、ＲＮＡまたはタンパク質）のレベルを測定すること；および測定されたレベルを対照レベル（例えば、参照ＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ９）によりカプシド内封入された異種核酸から発現された遺伝子発現産物についてのレベルなど）と比較することを含むステップを含む。遺伝子発現産物の発現の測定に好適な方法、ルシフェラーゼレポーターアッセイおよび定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）。
一部の事例では、参照ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、またはそのバリアントからなる群から選択される血清型を有する。例えば、参照ＡＡＶは、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ、およびＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｓからなる群から選択される血清型を有することができる。
ＣＮＳへの送達
標的ｉｎ ｖｉｖｏ環境に異種核酸を送達する方法であって、対象における中枢神経系（ＣＮＳ）からなる群から選択される標的ｉｎ ｖｉｖｏ環境に組成物を送達するステップを含み、組成物が、ｒＡＡＶカプシドタンパク質を有するｒＡＡＶ粒子を含み、ｒＡＡＶカプシドタンパク質が、異種核酸（例えば、治療用核酸）をコードするウイルスベクターをカプシド内封入するものである、方法が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、異種核酸をカプシド内封入しているｒＡＡＶ粒子は、操作されたｒＡＡＶカプシドタンパク質を含み、対象のＣＮＳまたはＰＮＳにおいて測定されたとき、対象に全身投与された場合でも、参照ＡＡＶと比較して特異性の増加および一部の場合には形質導入効率の向上を有するものである。
方法は、ｒＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子であって、対象におけるＣＮＳにおいて測定されたときに参照ＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ９）と比較して特異性の増加および／または形質導入効率の向上を有する、ｒＡＡＶ粒子を送達するステップを含む。一部の実施形態では、送達は、全身送達である。あるいは、送達は、直接（例えば、ＣＮＳの患部への）送達である。
ｒＡＡＶカプシドタンパク質は、親ＡＡＶのアミノ酸配列に、表２～３のいずれか１つで提供されるアミノ酸配列中に提示されている少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１アミノ酸の置換を含み得る。一部の事例では、Ｘ１は、Ａ、Ｅ、Ｄ、Ｇ、Ｒ、ＳおよびＴからなる群から選択される。一部の事例では、挿入は、２アミノ酸をさらに含み、Ｘ２は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、およびＹからなる群から選択される。一部の事例では、挿入は、３アミノ酸をさらに含み、Ｘ３は、Ｅ、Ｋ、Ｌ、ＴおよびＱからなる群から選択される。一部の事例では、挿入は、少なくとも４アミノ酸をさらに含み、Ｘ１は、Ａ、Ｅ、Ｄ、Ｇ、Ｒ、ＳおよびＴからなる群から選択され、Ｘ２は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、およびＹからなる群から選択され、Ｘ３は、Ｅ、Ｋ、Ｌ、ＴおよびＱからなる群から選択され、Ｘ４は、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｒ、Ｔ、およびＶからなる群から選択される。一部の事例では、挿入は、５アミノ酸をさらに含み、Ｘ５は、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｐ、Ｌ、Ｑ、およびＶからなる群から選択される。一部の事例では、挿入は、少なくとも６アミノ酸をさらに含み、Ｘ６は、Ｆ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、およびＶからなる群から選択される。一部の事例では、挿入は、少なくとも７アミノ酸をさらに含み、Ｘ７は、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｓ、およびＶからなる群から選択される。
異種核酸をカプシド内封入しているｒＡＡＶ粒子を対象のＣＮＳに送達するステップを含む方法であって、ｒＡＡＶ粒子が、（ｉ）ＣＮＳに対する異種核酸の特異性の増加および／または形質導入効率の向上を含み、ｒＡＡＶ粒子が、アミノ酸配列ＴＡＬＫＰＦＬ、ＴＴＬＫＰＦＬ、ＴＬＱＩＰＦＫ、ＴＭＱＫＰＦＩ、もしくはＲＹＱＧＤＳＶの、または表２～３もしくは図３３で提供される任意のアミノ酸配列の、少なくともまたは約３、４、５、６もしくは７アミノ酸の挿入を親ＡＡＶカプシドタンパク質のアミノ酸５８８＿５８９位に含む、ｒＡＡＶカプシドタンパク質を有する、方法が、本明細書で開示される。一部の実施形態では、送達は、全身送達である。一部の実施形態では、送達は、直接送達である（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ環境に注射される）。一部の実施形態では、親ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質（例えば、配列番号１で提供されるものについて）である。一部の実施形態では、送達は、参照ＡＡＶ、例えばＡＡＶ９、による異種核酸の送達よりも特異的である。一部の実施形態では、送達は、全身（例えば、静脈内）送達である。一部の実施形態では、対象は哺乳動物である。一部の実施形態では、対象はヒトである。
肝臓への送達
一部の場合には、異種核酸を送達する方法は、対象における標的ｉｎ ｖｉｖｏ環境に組成物を送達するステップを含み、組成物は、ｒＡＡＶカプシドタンパク質を有するｒＡＡＶ粒子を含み、ｒＡＡＶカプシドタンパク質は、異種核酸（例えば、治療用核酸）をコードするウイルスベクターをカプシド内封入するものである。一部の場合には、標的ｉｎ ｖｉｖｏ環境は、肝臓である。一部の実施形態では、異種核酸をカプシド内封入しているｒＡＡＶ粒子は、操作されたｒＡＡＶカプシドタンパク質を含み、対象の標的ｉｎ ｖｉｖｏ環境において測定されたとき、対象に全身投与された場合でも、特異性の増加および一部の場合には形質導入効率の向上を有するものである。
一部の実施形態では、方法は、ｒＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子であって、参照ＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ９）と比較して対象の肝臓に対する異種核酸の特異性の増加および／または形質導入効率の向上を有するｒＡＡＶ粒子を送達するステップを含む。一部の実施形態では、肝臓への標的化用に最適化されたｒＡＡＶは、配列番号９５０～１０３１および１５０５４～１５１４６で提供されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有する（図３５）。
肝臓への異種核酸の送達に好適なｒＡＡＶカプシドタンパク質は、親ＡＡＶカプシドタンパク質内への少なくとも１アミノ酸の挿入を含むことができる。一部の事例では、挿入は、表４または図３５で提供されるアミノ酸配列中に提示されている少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１アミノ酸を含む。
異種核酸をカプシド内封入しているｒＡＡＶ粒子を、対象の肝臓からなる群から選択される標的ｉｎ ｖｉｖｏ環境に送達するステップを含む方法であって、ｒＡＡＶ粒子が、標的ｉｎ ｖｉｖｏ環境に対する異種核酸の特異性の増加および／または形質導入効率の向上を含み、ｒＡＡＶ粒子が、表４または図３５で提供されるアミノ酸配列の少なくともまたは約３、４、５、６、７、８、９、１０または１１アミノ酸の挿入を含む、ｒＡＡＶカプシドタンパク質を有する、方法が、本明細書で開示される。一部の実施形態では、送達は、参照ＡＡＶ、例えばＡＡＶ９、による異種核酸の送達よりも特異的である。一部の実施形態では、方法は、参照ＡＡＶと比較して、肝臓などの標的外ｉｎ ｖｉｖｏ環境内への異種核酸の送達を低減させるまたは減らすステップをさらに含む。一部の実施形態では、送達は、参照ＡＡＶの標的ｉｎ ｖｉｖｏ環境内への形質導入効率と比較して標的ｉｎ ｖｉｖｏ環境内への（例えば、異種核酸の）形質導入効率の向上を特徴とする。一部の実施形態では、送達は、全身（例えば、静脈内）送達である。一部の実施形態では、対象は哺乳動物である。一部の場合には、哺乳動物は、ヒトである。
Ｃ．処置方法
対象における疾患もしくは状態をまたは疾患もしくは状態の症状を処置する方法であって、本明細書で開示される１つまたは複数の組成物（例えば、ｒＡＡＶ粒子、ＡＡＶベクター、医薬組成物）の治療有効量を対象に投与するステップを含む方法が、本明細書で開示される。一部の実施形態では、組成物は、本明細書に記載のｒＡＡＶカプシドタンパク質である。一部の実施形態では、組成物は、本明細書に記載の単離および精製されたｒＡＡＶカプシドタンパク質である。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、導入遺伝子（例えば、治療用核酸）を含むＡＡＶベクターをカプシド内に封入している。一部の実施形態では、組成物は、本明細書で開示される治療剤とコンジュゲートした本明細書に記載のｒＡＡＶカプシドタンパク質である。一部の実施形態では、組成物は、ｒＡＡＶ粒子と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物である。一部の実施形態では、１つまたは複数の組成物は、単独で対象に投与される（例えば、独立型療法）。一部の実施形態では、１つまたは複数の組成物は、追加の剤と組み合わせて投与される。一部の実施形態では、組成物は、疾患または状態の第一選択療法である。一部の実施形態では、組成物は、疾患または状態の第二選択、第三選択または第四選択療法である。
対象における疾患もしくは状態をまたは疾患もしくは状態の症状を処置する方法であって、（ａ）標的ｉｎ ｖｉｖｏ環境を冒す疾患または状態であると対象を診断するステップ、および（ｂ）本明細書で開示される組成物（例えば、ｒＡＡＶ粒子、ＡＡＶベクター、医薬組成物）の治療有効量を対象に投与することにより疾患または状態を処置するステップを含み、組成物が、操作され、標的ｉｎ ｖｉｖｏ環境に対する特異性の増加を有するものである、方法が、本明細書で提供される。
対象における標的ｉｎ ｖｉｖｏ環境を冒す疾患もしくは状態をまたは疾患もしくは状態の症状を処置する方法であって、（ａ）対象に組成物（例えば、ｒＡＡＶ粒子、ＡＡＶベクター、医薬組成物）を投与するステップ、および（ｂ）参照ＡＡＶと比較して増加した特異性および／または向上した形質導入効率で対象における標的ｉｎ ｖｉｖｏ環境内に治療用核酸を発現させるステップを含む方法が、本明細書で開示される。一部の場合には、参照ＡＡＶは、ＡＡＶ９、またはそのバリアントである。
中枢神経系（ＣＮＳ）を冒す疾患または状態を処置する方法は、対象のＣＮＳにｒＡＡＶ粒子を投与するステップを含み、ｒＡＡＶ粒子は、アミノ酸配列ＴＡＬＫＰＦＬ、ＴＴＬＫＰＦＬ、ＴＬＱＩＰＦＫ、ＴＭＱＫＰＦＩ、ＲＹＱＧＤＳＶ、もしくはＴＴＬＫＰＦＳのまたは表２～３もしくは図３３で提供される任意のアミノ酸配列の少なくともまたは約３、４、５、６、７、８、９、１０または１１アミノ酸の挿入を、親ＡＡＶカプシドタンパク質のアミノ酸５８８＿５８９位に含む、ｒＡＡＶカプシドタンパク質を含む。一部の場合には、挿入物は、ＴＬＡＶＰＦＫでも、ＫＦＰＶＡＬＴでも、ＳＶＳＫＰＦＬでも、ＦＴＬＴＴＰＫでも、ＭＮＡＴＫＮＶでも、ＮＧＧＴＳＳＳでも、ＴＲＴＮＰＥＡでも、ＹＴＬＳＱＧＷでもない。一部の実施形態では、親ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質（例えば、配列番号１で提供されるものについて）である。一部の事例では、親ＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号１と少なくとも９５％、９６％、９６．１、９６．２％、９６．３％、９６．４％、９６．５％、９６．６％、９６．７％、９６．８％、９６．９％、９７．０％、９７．１％、９７．２％、９７．３％、９７．４％、９７．５％、９７．６％、９７．７％、９７．８％、９７．９％、９８．０％、９８．１％、９８．２％、９８．３％、９８．４％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．７％、９８．８％、９８．９％、９９．０％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００．０％同一である、アミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、送達は、参照ＡＡＶ、例えばＡＡＶ９による異種核酸の送達よりも特異的である。一部の実施形態では、送達は、全身（例えば、静脈内）送達である。一部の実施形態では、対象は、ヒトまたは非ヒト霊長類である。
肝臓を含む標的ｉｎ ｖｉｖｏ環境を冒す疾患または状態を処置する方法は、対象の標的ｉｎ ｖｉｖｏ環境にｒＡＡＶ粒子を投与するステップを含み、ｒＡＡＶ粒子は、配列番号９５０～１０３１および１５０５４～１５１４６（図３５）のいずれか１つで提供されるアミノ酸配列の少なくともまたは約３、４、５、６、７、８、９、１０または１１アミノ酸の置換を含む、ｒＡＡＶカプシドタンパク質を含む。一部の実施形態では、方法は、参照ＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ９）と比較して対象の肝臓に対する特異性の増加を有する、ｒＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子を送達するステップを含む。一部の実施形態では、肝臓への標的化用に最適化されたｒＡＡＶは、親ＡＡＶカプシドタンパク質のアミノ酸５８８＿５８９位にアミノ酸配列ＫＡＹＳＶＱＶ、ＰＳＧＳＡＲＳ、およびＲＴＡＮＡＬＧを含むアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、親ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質（例えば、配列番号１で提供されるものについて）である。一部の事例では、親ＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号１と少なくとも９５％、９６％、９６．１、９６．２％、９６．３％、９６．４％、９６．５％、９６．６％、９６．７％、９６．８％、９６．９％、９７．０％、９７．１％、９７．２％、９７．３％、９７．４％、９７．５％、９７．６％、９７．７％、９７．８％、９７．９％、９８．０％、９８．１％、９８．２％、９８．３％、９８．４％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．７％、９８．８％、９８．９％、９９．０％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００．０％同一である、アミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、送達は、参照ＡＡＶ、例えばＡＡＶ９、による異種核酸の送達よりも特異的である。一部の実施形態では、送達は、全身（例えば、静脈内、または鼻腔内）送達である。一部の実施形態では、対象は、ヒトまたは非ヒト霊長類である。
標的遺伝子発現産物をモジュレートする方法であって、それを必要とする対象に、本明細書で開示される組成物（例えば、ｒＡＡＶ粒子、ＡＡＶベクター、医薬組成物）を投与するステップを含む方法も提供される。例えば、本明細書で提供される方法は、標的遺伝子発現産物の発現または活性をモジュレートする異種核酸を含むウイルスベクターをカプシド内封入するｒＡＡＶカプシドタンパク質を有するｒＡＡＶを対象に投与するステップを含む。一部の実施形態では、疾患または状態は、正常個体と比較して、遺伝子またはその遺伝子発現産物の発現または活性の増大または増強を特徴とする。一部の場合には、組成物の治療有効量の投与は、遺伝子またはその遺伝子発現産物の発現または活性を、正常個体において典型的であるレベルに回復させる。用語「正常個体」は、遺伝子またはその遺伝子発現産物の発現または活性の変動を特徴とする疾患または状態に冒されていない個体を指す。
中枢神経系（ＣＮＳ）疾患または障害に関わる遺伝子の非限定的な例としては、サルコグリカンアルファ（ＳＧＣＡ）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６５（ＧＡＤ６５）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６７（ＧＡＤ６７）、ＣＬＮ２遺伝子、神経成長因子（ＮＧＦ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、生存運動ニューロン１、テロメア型（ＳＭＮ１）、β－グルコセレブロシダーゼ（ＧＣａｓｅ）、フラタキシン（ＦＸＮ）、ハンチンチン（ＨＴＮ）、メチル化ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）、ペルオキシソーム形成因子（ＰＥＸ）、プログラニュリン（ＧＲＮ）、抗チューブリン剤、銅－亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）、グルコシルセラミダーゼベータ（ＧＢＡ）、ＮＰＣ細胞内コレステロール輸送体１（ＮＰＣ１）、およびＮＰＳ３が挙げられる。一部の実施形態では、ペルオキシソーム形成因子（ＰＥＸ）は、ＰＥＸ１、ＰＥＸ２、ＰＥＸ３、ＰＥＸ４、ＰＥＸ５、ＰＥＸ６、ＰＥＸ７、ＰＥＸ１０、ＰＥＸ１１β、ＰＥＸ１２、ＰＥＸ１３、ＰＥＸ１４、ＰＥＸ１６、ＰＥＸ１９、およびＰＥＸ２６からなる群から選択される。特定の器官（例えば、肺、心臓、肝臓、筋肉、眼）の疾患または障害に関与する遺伝子の非限定的な例としては、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）、第Ｘ因子（ＦＩＸ）、ＲＰＥ６５、レチノイドイソメロヒドロラーゼ（ＲＰＥ６５）、サルコグリカンアルファ（ＳＧＣＡ）、および筋小胞体／小胞体Ｃａ２＋－ＡＴＰａｓｅ（ＳＥＲＣＡ２ａ）が挙げられる。一部の事例では、遺伝子の発現、または遺伝子発現産物の発現もしくは活性は、対象への組成物の投与により阻害される。一部の事例では、遺伝子の発現、または遺伝子発現産物の発現もしくは活性は、対象への組成物の投与により増強される。
一部の場合には、組成物は、所望の治療効果を得るために、１日１回または複数回、１日当たり対象の体重に対して約０．０００１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約０．００５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ～約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、または約１ｍｇ／ｋｇ～約２５ｍｇ／ｋｇを送達するのに十分な投薬レベルで投与される。
一部の場合には、投与される組成物のウイルスゲノム（ｖｇ）濃度は、１．０×１０１１ｖｇ毎キログラム（ｋｇ）～１．０×１０１６ｖｇ／ｋｇの間である。一部の場合には、感染粒子の濃度は、少なくともまたは約１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５、１０１６、または１０１７である。一部の場合には、感染粒子の濃度は、２×１０７、２×１０８、２×１０９、２×１０１０、２×１０１１、２×１０１２、２×１０１３、２×１０１４、２×１０１５、２×１０１６、または２×１０１７である。一部の場合には、感染粒子の濃度は、３×１０７、３×１０８、３×１０９、３×１０１０、３×１０１１、３×１０１２、３×１０１３、３×１０１４、３×１０１５、３×１０１６、または３×１０１７である。一部の場合には、感染粒子の濃度は、４×１０７、４×１０８、４×１０９、４×１０１０、４×１０１１、４×１０１２、４×１０１３、４×１０１４、４×１０１５、４×１０１６、または４×１０１７である。一部の場合には、感染粒子の濃度は、５×１０７、５×１０８、５×１０９、５×１０１０、５×１０１１、５×１０１２、５×１０１３、５×１０１４、５×１０１５、５×１０１６、または５×１０１７である。一部の場合には、感染粒子の濃度は、６×１０７、６×１０８、６×１０９、６×１０１０、６×１０１１、６×１０１２、６×１０１３、６×１０１４、６×１０１５、６×１０１６、または６×１０１７である。一部の場合には、感染粒子の濃度は、７×１０７、７×１０８、７×１０９、７×１０１０、７×１０１１、７×１０１２、７×１０１３、７×１０１４、７×１０１５、７×１０１６、または７×１０１７である。一部の場合には、感染粒子の濃度は、８×１０７、８×１０８、８×１０９、８×１０１０、８×１０１１、８×１０１２、８×１０１３、８×１０１４、８×１０１５、８×１０１６、または８×１０１７である。一部の場合には、感染粒子の濃度は、９×１０７、９×１０８、９×１０９、９×１０１０、９×１０１１、９×１０１２、９×１０１３、９×１０１４、９×１０１５、９×１０１６、または９×１０１７である。
一部の実施形態では、ステップの投与は、１回行われる。あるいは、ステップの投与は、少なくも２回反復される。ステップの投与は、１日に１回行われ得る。一部の場合には、ステップの投与は、静脈内投与を含む。一部の場合には、投与は、経肺投与を含む。一部の場合には、投与は、経鼻腔内投与（例えば、スプレー）を含む。一部の場合には、ステップの投与は、組成物を標的ｉｎ ｖｉｖｏ環境に注射することを含む。一部の場合には、ステップの投与は、組成物を標的ｉｎ ｖｉｖｏ環境に注射することを含まない。
対象
対象に、例えば、対象の疾患または状態を処置または予防するために、ＡＡＶ粒子およびウイルスベクターの少なくとも一方を送達する方法が、本明細書で開示される。対象は、一部の場合には、哺乳動物である。哺乳動物の非限定的な例としては、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、チンパンジーまたは家畜が挙げられる。一部の事例では、哺乳動物は、非ヒト霊長類である。一部の事例では、対象は、ヒトである。本開示の対象は、疾患または状態と診断されないこともある。あるいは、対象は、疾患もしくは障害と診断される、または疾患もしくは障害に罹患している疑いがある、患者であることもある。
疾患または状態
本明細書で開示されるものなどのｒＡＡＶを含む組成物を投与することにより対象における疾患または状態を処置する方法が、本明細書で開示される。本明細書で開示されるｒＡＡＶの少なくとも１つの利点は、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、ポンペ病、ハンチントン病、アルツハイマー病、バッテン病、リソソーム蓄積障害、多形神経膠芽腫、レット症候群、レーバー先天黒内障、遅発型小児性神経セロイドリポフスチン沈着症（ＬＩＮＣＬ）、慢性疼痛、脳卒中、脊髄損傷、外傷性脳損傷およびリソソーム蓄積障害を含むがこれらに限定されない、導入遺伝子療法の恩恵を受けることになる事実上あらゆる疾患または状態を、ｒＡＡＶを使用して処置することができることである。
疾患または状態は、一部の実施形態では、正常個体と比較して遺伝子またはその遺伝子発現産物の発現または活性の低減または減らすことを特徴とし得る。一部の実施形態では、正常個体と比較して遺伝子またはその遺伝子発現産物の発現または活性の増大または増強を特徴とする。
一部の場合には、疾患または状態は、対象の特定のｉｎ ｖｉｖｏ環境、例えば、脳または肝臓に局在する。本開示の組成物は、ｉｎ ｖｉｖｏ環境を特異的に標的とし、疾患または状態の病因または病態に関わる標的遺伝子発現産物の活性または発現をモジュレートするように操作された治療用核酸を送達するため、本明細書に記載の疾患または状態の処置に特に有用である。
一部の事例では、疾患または状態は、中枢神経系（ＣＮＳ）の疾患または状態を含む。ＣＮＳの疾患の非限定的な例としては、透明中隔欠損、酸性リパーゼ病、酸性マルターゼ欠損症、後天性てんかん性失語症、急性散在性脳脊髄炎、注意欠陥・多動性障害（ＡＤＨＤ）、アディー瞳孔、アディー症候群、副腎白質ジストロフィー、脳梁欠損症、失認、アイカルディ症候群、アイカルディ・グティーエール症候群障害、ＡＩＤＳ－神経学的合併症、アレキサンダー病、アルパース病、交代性片麻痺、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、無脳症、動脈瘤、アンジェルマン症候群、血管腫症、無酸素症、抗リン脂質抗体症候群、失語症、失行症、くも膜嚢胞、くも膜炎、アーノルド・キアリ奇形、動静脈奇形、アスペルガー症候群、運動失調、毛細血管拡張症性運動失調症、運動失調および小脳または脊髄小脳変性症、心房細動および脳卒中、注意欠陥・多動性障害、自閉症スペクトラム障害、自律神経障害、背部痛、バース症候群、バッテン病、ベッカー型筋強直症、ベーチェット病、ベル麻痺、良性本態性眼瞼痙攣、良性限局性筋萎縮症、良性頭蓋内圧亢進症、ベルンハルト・ロート症候群、ビンスワンガー病、眼瞼痙攣、ブロッホ・サルツバーガー症候群、分娩時腕神経叢損傷、腕神経叢損傷、ブラッドベリー・エッグルストン症候群、脳および脊椎腫瘍、脳動脈瘤、脳損傷、ブラウン・セカール症候群、球脊髄性筋萎縮症、皮質下梗塞と白質脳症を伴う常染色体優性脳動脈症（ＣＡＤＡＳＩＬ）、カナバン病、手根管症候群、カウザルギー、カベルノーマ、海綿状血管腫、海綿状血管奇形、中心性頸髄症候群、中心性脊髄症候群、中枢性疼痛症候群、橋中心髄鞘崩壊症、頭蓋障害、セラミダーゼ欠損症、小脳変性症、小脳形成不全、脳動脈瘤、脳動脈硬化症、脳萎縮、脳性脚気、脳海綿状血管奇形、脳性巨人症、低酸素性脳症、脳性麻痺、脳・眼・顔・骨格症候群（ＣＯＦＳ）、シャルコー・マリー・トゥース病、シャルコー・マリー・トゥース症候群、古典的肢根型点状軟骨異形成症（ＲＣＤＰ）、キアリ奇形、コレステロールエステル蓄積症、舞踏病、有棘赤血球舞踏病、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）、慢性起立性調節障害、慢性疼痛、コケイン症候群ＩＩ型、コフィン・ローリー症候群、コルポセファリー、昏睡、複合性局所疼痛症候群、先天性顔面両側麻痺、先天性筋無力症、先天性ミオパチー、先天性海綿状血管奇形、大脳皮質基底核変性症、頭蓋動脈炎、頭蓋骨癒合症、クリー脳炎、クロイツフェルト・ヤコブ病、累積外傷性障害、クッシング症候群、巨細胞封入体症、サイトメガロウイルス感染症、ダンシングアイズ・ダンシングフィート症候群、ダンディー・ウォーカー症候群、ドーソン病、難聴、ドモルシア症候群、デジュリン・クルンプケ麻痺、認知症、多発脳梗塞性認知症、意味性認知症、皮質下認知症、レビー小体型認知症、歯状核小脳運動失調症、歯状赤核萎縮、皮膚筋炎、発達性失行、デビック症候群、糖尿病性ニューロパチー、びまん性硬化症、ドラベ症候群、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、自律神経異常、書字障害、失読症、嚥下障害、統合運動障害、ミオクローヌス性小脳性共同運動障害、進行性小脳性共同運動障害、ジストニア、早期乳児てんかん性脳症、エンプティセラ症候群、脳炎、嗜眠性脳炎、脳ヘルニア、脳症、脳症（家族性新生児）、脳三叉神経領域血管腫症、てんかん、てんかん性片麻痺、エルブ型麻痺、エルブ・デュシェンヌおよびデジュリン・クルンプケ麻痺、本態性振戦、橋外髄鞘崩壊症、ファブリー病、ファール症候群、失神、家族性自律神経失調症、家族性血管腫、家族性特発性基底核石灰化症、家族性周期性麻痺、家族性痙性麻痺、ファーバー病、熱性痙攣、線維筋性異形成、フィッシャー症候群、筋緊張低下児症候群、下垂足、フリードライヒ運動失調症、前頭側頭型認知症、ゴーシェ病、全身性ガングリオシドーシス、ゲルストマン症候群、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、巨大軸索ニューロパチー、巨細胞動脈炎、巨細胞封入体病、神経膠芽腫、グロボイド細胞白質ジストロフィー、舌咽神経痛、糖原病、ギラン・バレー症候群、ハラーフォルデン・シュパッツ病、頭部損傷、頭痛、持続性片側頭痛、片側顔面痙攣、交代性片麻痺、遺伝性ニューロパチー、遺伝性痙性対麻痺、多発神経炎型遺伝性失調症、帯状疱疹、耳帯状疱疹、平山症候群、ホームズ・アディー症候群、全前脳胞症、ＨＴＬＶ－１関連ミエロパチー、ヒューズ症候群、ハンチントン病、水頭無脳症、水頭症、正常圧水頭症、水脊髄症、副腎皮質ホルモン過剰症、過眠、筋緊張亢進、筋緊張低下、低酸素症、免疫介在性脳脊髄炎、封入体筋炎、色素失調症、小児筋緊張低下、乳児神経軸索ジストロフィー、乳児フィタン酸蓄積症、乳児レフサム病、乳児痙攣、炎症性ミオパチー、後頭孔脳脱出症、腸性脂肪異栄養症、頭蓋内嚢胞、頭蓋内圧亢進症、アイザックス症候群、ジュベール症候群、カーンズ・セイヤー症候群、ケネディー病、キンスボーン症候群、クライン・レビン症候群、クリッペル・フェイル症候群、クリッペル・トレノネー症候群（ＫＴＳ）、クリューバー・ビューシー症候群、コルサコフ健忘症候群、クラッベ病、クーゲルベルグ・ウェランダー病、クールー病、ランバート・イートン筋無力症候群、ランドウ・クレフナー症候群、外側大腿皮神経絞扼、外側髄症候群、学習障害、リー病、レノックス・ガストー症候群、レッシュ・ナイハン症候群、白質ジストロフィー、レビン・クリチリー症候群、レビー小体型認知症、脂質蓄積症、リポイドタンパク症、滑脳症、閉じ込め症候群、ルー・ゲーリック病、ループス－神経学的後遺症、ライム病－神経学的合併症、マチャド・ジョセフ病、大脳症、巨脳症、メルカーソン・ローゼンタール症候群、髄膜炎、髄膜炎および脳炎、メンケス病、異常感覚性大腿神経痛、異染性白質ジストロフィー、小頭症、偏頭痛、ミラー・フィッシャー症候群、軽度の脳卒中、ミトコンドリアミオパチー、メビウス症候群、一側性筋萎縮症、運動ニューロン疾患、もやもや病、ムコリピドーシス、ムコ多糖症、多発脳梗塞性認知症、多巣性運動ニューロパチー、多発性硬化症、多系統萎縮症、起立性低血圧を伴う多系統萎縮症、筋ジストロフィー、先天性筋無力症、重症筋無力症、びまん性骨髄破壊性硬化症、乳児期ミオクロニー脳症、ミオクローヌス、ミオパチー、先天性ミオパチー、甲状腺中毒性ミオパチー、筋強直症、先天性筋強直症、ナルコレプシー、神経有棘赤血球症、脳内鉄沈着を伴う神経変性症、神経線維腫症、神経遮断薬悪性症候群、ＡＩＤＳの神経学的合併症、ライム病の神経学的合併症、サイトメガロウイルス感染症の神経学的転帰、ポンペ病の神経症状、ループスの神経学的後遺症、視神経脊髄炎、神経性筋強直症、神経セロイドリポフスチン症、神経細胞移動障害、遺伝性ニューロパチー、神経サルコイドーシス、神経梅毒、神経毒性、海綿状母斑、ニーマン・ピック病、オサリバン・マクラウド症候群、後頭部神経痛、大田原症候群、オリーブ橋小脳萎縮症、オプソクローヌス・ミオクローヌス、起立性低血圧、過用症候群、慢性疼痛、パントテン酸キナーゼ関連神経変性症、腫瘍随伴症候群、異常知覚、パーキンソン病、発作性舞踏アテトーゼ、発作性片側頭痛、パリー・ロンバーグ、ペリツェウス・メルツバッハー病、ペナ・ショッカー症候群ＩＩ型、神経根嚢胞、周期性麻痺、末梢性ニューロパチー、脳室周囲白質軟化症、遷延性植物状態、広汎性発達障害、フィタン酸蓄積症、ピック病、圧迫神経、梨状筋症候群、下垂体腫瘍、多発性筋炎、ポンペ病、孔脳症、ポリオ後症候群、帯状疱疹後神経痛、感染後脳脊髄炎、体位性低血圧症、体位性起立性頻脈症候群、体位性頻脈症候群、原発性歯状核萎縮症、原発性側索硬化症、原発性進行性失語症、プリオン病、進行性顔面片側萎縮、進行性歩行運動失調、進行性多巣性白質脳症、進行性硬化性ポリオジストロフィー、進行性核上性麻痺、相貌失認、偽トーチ症候群、偽性トキソプラズマ症候群、偽脳腫瘍、心因性運動、ラムゼイ・ハント症候群Ｉ型、ラムゼイ・ハント症候群ＩＩ型、ラスムッセン脳炎、反射性交感神経ジストロフィー症候群、レフサム病、乳児型レフサム病、反復動作障害、反復性ストレイン損傷、下肢静止不能症候群、レトロウイルス関連ミエロパチー、レット症候群、ライ症候群、リウマチ性脳炎、ライリー・デイ症候群、仙骨神経根嚢腫、聖ヴィトゥス舞踏病、唾液腺疾患、サンドホフ病、シルダー病、裂脳症、ザイテルベルガー病、発作性障害、意味性認知症、中隔視神経形成異常症、乳児重症ミオクロニーてんかん（ＳＭＥＩ）、乳幼児揺さぶられ症候群、帯状疱疹、シャイ・ドレーガー症候群、シェーグレン症候群、睡眠時無呼吸、睡眠病、ソトス症候群、痙攣、二分脊椎、脊髄梗塞、脊髄損傷、脊髄腫瘍、脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳萎縮症、脊髄小脳変性症、スティール・リチャードソン・オルゼウスキー症候群、全身硬直症候群、線条体黒質変性症、脳卒中、スタージ・ウェーバー症候群、亜急性硬化性全脳炎、皮質下動脈硬化性脳症、短時間持続性片側神経痛様（ＳＵＮＣＴ）頭痛、嚥下障害、シデナム舞踏病、失神、梅毒性脊髄硬化症、脊髄水空洞症、脊髄空洞症、全身性エリテマトーデス、脊髄ろう、遅発性ジスキネジア、タルロブ嚢胞、テイ・サックス病、側頭動脈炎、脊髄係留症候群、トムゼン筋強直症、胸郭出口症候群、甲状腺中毒性ミオパチー、疼痛性チック、トッド麻痺、トゥレット症候群、一過性脳虚血発作、伝達性遺伝性海綿状脳症、横断性脊髄炎、外傷性脳損傷、振戦、三叉神経痛、熱帯性痙性不全対麻痺、トロイヤー症候群、結節性硬化症、血管性勃起性腫瘍、中枢および抹消神経系の血管炎症候群、フォン・エコノモ病、フォンヒッペル・リンダウ病（ＶＨＬ）、フォン・レックリングハウゼン病、ワレンベルク症候群、ウェルドニッヒ・ホフマン病、ウェルニッケ・コルサコフ症候群、ウエスト症候群、むち打ち症、ウィップル病、ウィリアムズ症候群、ウィルソン病、ウォルマン病、およびＸ連鎖性球脊髄性筋萎縮症が挙げられる。
一部の事例では、疾患または状態は、肝臓疾患もしくは障害を含むか、または肝臓疾患もしくは障害に関連している。非限定的な例としては、胆汁酸合成異常（例えば、ウィルソン病、進行性家族性肝内胆汁うっ滞症３型）、炭水化物代謝障害（例えば、遺伝性果糖不耐症、糖原病ＩＶ型）、アミノ酸代謝異常（例えば、高チロシン血症Ｉ型）、尿素サイクル異常症（例えば、アルギニノコハク酸リアーゼ欠損症、シトリン欠損症（ＣＴＬＮ２、ＮＩＣＣＤ））、脂質代謝障害（例えば、コレステリルエステル蓄積症）ならびに、これらに限定されないがアルファ－１アンチトリプシン欠損症、嚢胞性線維症、遺伝性ヘモクロマトーシス、アルストレム症候群および先天性肝線維症を含む、他のものが挙げられる。
一部の事例では、疾患または状態は、肝臓の疾患または状態である。肝臓疾患または障害の非限定的な例としては、アラジール症候群、アルコール関連肝疾患、アルファ－１アンチトリプシン欠損症、自己免疫性肝炎、良性肝臓腫瘍、胆道閉塞、肝硬変、クリグラー・ナジャー症候群、ガラクトース血症、ジルベール症候群、ヘモクロマトーシス、肝性脳症、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、肝腎症候群、妊娠性肝内胆汁うっ滞（ＩＣＰ）、リソソーム酸性リパーゼ欠損症（ＬＡＬ－Ｄ）、肝嚢胞、肝臓がん、新生児黄疸、非アルコール性脂肪肝疾患、原発性胆汁性胆管炎（ＰＢＣ）、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）、ライ症候群、Ｉ型糖原病、およびウィルソン病が挙げられる。
標的遺伝子またはその遺伝子発現産物の異常な発現または活性に関連する疾患または状態を処置する方法であって、本開示の異種核酸をカプシド内封入しているｒＡＡＶを投与することにより対象における標的遺伝子または遺伝子発現産物の発現または活性をモジュレートするステップを含む方法が、本明細書で提供される。一部の事例では、投与は、全身投与である。一部の事例では、標的遺伝子または遺伝子発現産物の発現または活性は、正常（非罹病）個体におけるそのものと比較して減少され、対象へのｒＡＡＶの投与は、標的遺伝子または遺伝子発現産物の発現または活性を正常個体のものへと増大させるのに十分なものである。一部の事例では、遺伝子または遺伝子発現産物の発現または活性は、正常個体におけるそのものと比較して増大され、対象へのｒＡＡＶの投与は、標的遺伝子または遺伝子発現産物の発現または活性を減少させるのに十分なものである。非限定的な例では、一部の場合にはプレセニリン１および／またはプレセニリン２（遺伝子ＰＳＥＮ１およびＰＳＥＮ２によりそれぞれコードされる）の機能獲得により引き起こされる、アルツハイマー病と診断された対象に、サイレンシングＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）であるかまたはＰＳＥＮ１ ｍＲＮＡに対する機能喪失効果を有する他のＲＮＡｉである、治療用核酸をカプシド内封入している本明細書で開示されるｒＡＡＶが投与される。
対象における本明細書で開示される疾患または状態を処置または予防する方法であって、本明細書に記載の治療用遺伝子発現産物をコードする核酸配列を含むＡＡＶベクターの治療有効量を対象に投与するステップを含む方法も提供される。ＡＡＶベクターを、本明細書に記載の改変カプシドタンパク質またはＡＡＶウイルス粒子にカプシド内封入することができる。一部の事例では、治療用遺伝子発現産物は、標的遺伝子または遺伝子発現産物の活性または発現のモジュレーションに有効である。
製剤、投薬量、および投与経路
一般に、本明細書で開示される方法は、全身投与により治療用ｒＡＡＶ組成物を投与するステップを含む。一部の事例では、方法は、経口投与により治療用ｒＡＡＶ組成物を投与するステップを含む。一部の事例では、方法は、腹腔内注射により治療用ｒＡＡＶ組成物を投与するステップを含む。一部の事例では、方法は、肛門座薬の形態で治療用ｒＡＡＶ組成物を投与するステップを含む。一部の事例では、方法は、静脈内（「ｉ．ｖ．」）投与により治療用ｒＡＡＶ組成物を投与するステップを含む。本明細書で開示される治療用ｒＡＡＶ組成物を他の経路、例えば、皮下注射、筋肉内注射、皮内注射、経皮的注射、経皮投与、鼻腔内投与、リンパ内注射、直腸投与、胃内投与、眼内投与、脳室内投与、くも膜下腔内に、または任意の他の好適な非経口投与によって、投与することもできることが考えられる。一部の事例では、方法は、治療用ｒＡＡＶ組成物を局所投与により、例えば、ｒＡＡＶ組成物を対象の領域（例えば、鼓膜、膀胱）にブラシでこすりつけるかまたは別様に接触させることなどにより、投与するステップを含む。一部の実施形態では、傷害または炎症部位により近い局所送達経路のほうが全身経路より好ましい。治療薬の投与の経路、投薬量、時点および継続期間を、調整することができる。一部の実施形態では、治療薬の投与は、疾患または状態の急性および慢性症状のどちらかまたは両方の開始の前または後である。
本明細書で開示される疾患または状態を予防または処置するための医薬組成物の有効用量および投薬量は、疾患もしくは状態、または疾患もしくは状態の症状、に関して観察される有益な応答により定義される。有益な応答は、疾患もしくは状態の、または疾患もしくは状態の症状の、予防、軽減、抑止または治癒を含む。一部の実施形態では、有益な応答は、対象における、バイオマーカーの存在、レベルもしくは活性、トランスクリプトームのリスクプロファイル、または腸管微生物叢の、測定可能な改善を検出することにより測定することができる。本明細書で使用される場合の「改善」は、正常個体（例えば、疾患にも状態にも罹患していない個体）において観察される、その存在、レベルまたは活性の、ある存在、レベルまたは活性へのシフトを指す。治療用ｒＡＡＶ組成物が、治療に有効でない、あるいは疾患もしくは状態、または疾患もしくは状態の症状の十分な軽減をもたらさない場合には、投薬量および／または投与経路を変えることができ、または追加の薬剤を治療用ｒＡＡＶ組成物とともに対象に投与することができる。一部の実施形態では、患者は、治療用ｒＡＡＶ組成物のレジメンが開始されると、患者はまた、第２の処置レジメンから離脱（例えば、用量の段階的減少）させられる。
一部の実施形態では、本開示による医薬組成物を、所望の治療、診断または予防効果を得るために、１日１回または複数回、１日当たり対象の体重に対して約０．０００１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約０．００５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ～約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、または約１ｍｇ／ｋｇ～約２５ｍｇ／ｋｇを送達するのに十分な投薬レベルで投与することができる。上記投薬濃度が、当業者によってｋｇ当たりのｖｇ、すなわちウイルスゲノム、にまたは投与される全ウイルスゲノムに換算され得ることは、理解されるであろう。
一部の場合には、医薬組成物の用量は、少なくともまたは約１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５、１０１６、または１０１７の感染粒子の濃度を含み得る。一部の場合には、感染粒子の濃度は、２×１０７、２×１０８、２×１０９、２×１０１０、２×１０１１、２×１０１２、２×１０１３、２×１０１４、２×１０１５、２×１０１６、または２×１０１７である。一部の場合には、感染粒子の濃度は、３×１０７、３×１０８、３×１０９、３×１０１０、３×１０１１、３×１０１２、３×１０１３、３×１０１４、３×１０１５、３×１０１６、または３×１０１７である。一部の場合には、感染粒子の濃度は、４×１０７、４×１０８、４×１０９、４×１０１０、４×１０１１、４×１０１２、４×１０１３、４×１０１４、４×１０１５、４×１０１６、または４×１０１７である。一部の場合には、感染粒子の濃度は、５×１０７、５×１０８、５×１０９、５×１０１０、５×１０１１、５×１０１２、５×１０１３、５×１０１４、５×１０１５、５×１０１６、または５×１０１７である。一部の場合には、感染粒子の濃度は、６×１０７、６×１０８、６×１０９、６×１０１０、６×１０１１、６×１０１２、６×１０１３、６×１０１４、６×１０１５、６×１０１６、または６×１０１７である。一部の場合には、感染粒子の濃度は、７×１０７、７×１０８、７×１０９、７×１０１０、７×１０１１、７×１０１２、７×１０１３、７×１０１４、７×１０１５、７×１０１６、または７×１０１７である。一部の場合には、感染粒子の濃度は、８×１０７、８×１０８、８×１０９、８×１０１０、８×１０１１、８×１０１２、８×１０１３、８×１０１４、８×１０１５、８×１０１６、または８×１０１７である。一部の場合には、感染粒子の濃度は、９×１０７、９×１０８、９×１０９、９×１０１０、９×１０１１、９×１０１２、９×１０１３、９×１０１４、９×１０１５、９×１０１６、または９×１０１７である。
一部の実施形態では、本明細書に記載のｒＡＡＶ組成物の送達に好適な薬学的に許容される賦形剤および担体溶液の製剤、ならびに本明細書に記載の特定の組成物を様々な処置レジメンで使用するための好適な投薬および処置レジメンが、本明細書で開示される。一部の実施形態では、治療に有用な組成物各々における治療用遺伝子発現産物の量を、好適な投薬量が化合物の任意の所与の単位用量で得られることになるように、調製することができる。溶解度、バイオアベイラビリティ、生物学的半減期、投与経路、製品の有効期間、および他の薬理学的考慮事項などの因子が、そのような医薬製剤を調製する当業者によって熟考されることになり、それ故、様々な投薬量および処置レジメンが望ましいことがある。一部の事例では、ｒＡＡＶ組成物は、眼内送達、硝子体内送達、非経口送達、皮下送達、静脈内送達、脳室内送達、筋肉内送達、くも膜下腔内送達、経口送達、腹腔内送達、経口もしくは鼻孔吸入による送達、または直接注射による１つもしくは複数の細胞、組織もしくは器官への直接注射による送達、いずれかのための、本明細書で開示される好適に製剤化された医薬組成物である。
一部の実施形態では、注射剤としての使用に好適な、ＡＡＶに基づくウイルス組成物の医薬品形態は、滅菌水溶液または分散液、および無菌注射用溶液または分散液の即時調製のための無菌粉末を含む。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、これらの好適な混合物、および／または植物油を含有する、溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用により、分散液の場合は必要粒径の維持により、および界面活性剤の使用により、維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって、もたらすことができる。多くの場合、等張剤、例えば糖および塩化ナトリウムを含めるほうが好ましいであろう。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に使用することにより、もたらすことができる。
一部の場合には、注射用水溶液の投与のために、例えば、溶液を必要に応じて好適に緩衝し、液体希釈剤を最初に十分な食塩水またはグルコースで等張性にすることができる。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与に特に好適である。処置されることになる対象の状態に依存して、投薬量の多少の変動が必然的に起こることになる。いずれにせよ、投与の担当者が個々の対象にとって適した用量を決定することになる。さらに、ヒトへの投与のために、調製物は、ＦＤＡ生物系審査部（Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）の基準による要求事項としての無菌性、発熱性、ならびに一般安全性および純度基準を満たさなければならない。
本明細書で開示されるｒＡＡＶ組成物を含む無菌注射用溶液であって、上に列挙された他の成分のうちのいくつかを必要に応じて含有する適した溶媒に本明細書で開示されるｒＡＡＶ組成物を必要量で添合し、その後、濾過滅菌することにより調製される、無菌注射用溶液が、本明細書で開示される。一般に、分散液は、基礎分散媒と上に列挙されたものからの他の必要成分とを含有する滅菌ビヒクルに様々な滅菌活性成分を添合することにより調製される。無菌注射用溶液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、任意の追加の所望成分を加えた活性成分の粉末を、前以て滅菌濾過されたその溶液から生じさせる、真空乾燥および凍結乾燥法である。注射用溶液は、例えば静脈内投与による、全身投与に有利であり得る。
中性または塩形態の製剤も本明細書で提供される。薬学的に許容される塩は、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基とで形成される）、および例えば塩酸もしくはリン酸などの無機酸とで形成される、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などのような有機酸とで形成される、酸付加塩を含む。遊離カルボキシル基とで形成される塩は、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは水酸化第二鉄などの無機塩基から誘導することもでき、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基から誘導することもできる。製剤化されると、溶液は、投薬処方に適合する方法で、治療に有効であるような量で投与されることになる。製剤は、注射用溶液、薬物放出カプセルなどのような様々な剤形で容易に投与される。
経肺投与は、頬側投与によって有利に果たすことができる。一部の実施形態では、製剤は、活性成分を含む乾燥粒子を含み得る。そのような実施形態では、乾燥粒子は、約０．５ｎｍ～約７ｎｍまたは約１ｎｍ～約６ｎｍの範囲の直径を有し得る。一部の実施形態では、製剤は、乾燥粉末を分散するように推進剤の流れを方向付けることができる乾燥粉末リザーバを備えているデバイスを使用して投与するための乾燥粉末の形態であり得る。一部の実施形態では、自己推進式の溶媒／粉末計量供給容器が使用されることもある。そのような実施形態では、活性成分は、密封容器内の低沸点推進剤に溶解および／または懸濁されていることもある。そのような粉末は、重量で粒子の少なくとも９８％が０．５ｎｍより大きい直径を有し、数で粒子の少なくとも９５％が７ｎｍ未満の直径を有する、粒子を含み得る。あるいは、重量で粒子の少なくとも９５％は、１ｎｍより大きい直径を有し、数で粒子の少なくとも９０％は、６ｎｍ未満の直径を有する。乾燥粉末組成物は、糖などの固体微粉末希釈剤を含むことがあり、単位剤形で適便に提供される。低沸点推進剤は、一般に、大気圧で６５°Ｆ未満の沸点を有する液体推進剤を含む。一般に、推進剤は、組成物の５０％～９９．９％（ｗ／ｗ）を構成することがあり、活性成分は、組成物の０．１％～２０％（ｗ／ｗ）を構成することがある。推進剤は、追加の成分、例えば、液体非イオン性および／もしくは固体アニオン性界面活性剤ならびに／または固体希釈剤（活性成分を含む粒子と同じ次数の粒径を有し得る）をさらに含むこともある。
肺送達用に製剤化された医薬組成物は、溶液および／または懸濁液の液滴の形態で活性成分を提供することができる。そのような製剤を、活性成分を含む、必要に応じて無菌の、水性および／または希釈アルコール溶液および／または懸濁液として調製、包装および／または販売することができ、任意の噴霧および／または霧化デバイスを使用して適便に投与することができる。そのような製剤は、着香剤、例えばサッカリンナトリウム、揮発油、緩衝剤、表面活性剤、および／または保存剤、例えばヒドロキシ安息香酸メチルを含むがこれらに限定されない、１つまたは複数の追加の成分をさらに含むこともある。この投与経路により提供される液滴は、約０．１ｎｍ～約２００ｎｍの範囲の平均直径を有し得る。肺送達に有用な本明細書に記載の製剤は、鼻腔内送達にも有用であり得る。一部の実施形態では、鼻腔内投与用の製剤は、活性成分を含む粗粉末であって、約０．２μｍ～５００μｍの平均粒径を有する粗粉末を含む。そのような製剤は、嗅ぎ薬が摂取される方法で、すなわち、鼻の近くに保持された粉末の容器からの鼻腔経由での急速吸入により、投与される。
経鼻投与に好適な製剤は、例えば、約０．１％（ｗ／ｗ）ほども少量から１００％（ｗ／ｗ）ほども多量の活性成分を含むことがあり、本明細書に記載の追加の成分の１つまたは複数を含むこともある。医薬組成物を、頬側投与に好適な製剤で調製、包装および／または販売することができる。そのような製剤は、例えば、従来の方法を使用して作製された錠剤および／またはトローチ剤の形態であることがあり、例えば、０．１％～２０％（ｗ／ｗ）活性成分を含むことがあり、残部は、経口溶解性および／または分解性組成物と、必要に応じて、本明細書に記載の追加の成分のうちの１つまたは複数とを含む。あるいは、頬側投与に好適な製剤は、活性成分を含む、粉末ならびに／またはエアロゾル化および／もしくは霧化された溶液および／もしくは懸濁液を、含むことがある。そのような粉末状の、エアロゾル化されたおよび／またはエアロゾル化された製剤は、分散されたとき、約０．１ｎｍ～約２００ｎｍの範囲の平均粒径および／または液滴径を含むことがあり、本明細書に記載の任意の追加の成分のうちの１つまたは複数をさらに含むこともある。
対象に投与される好適な用量および投薬量は、特定の治療用ｒＡＡＶ組成物、病状およびその重症度、処置を必要とする対象の正体（例えば、体重、性別、年齢）を含むがこれらに限定されない因子により決定され、例えば、投与されることになる具体的な薬剤、投与経路、処置されることになる状態、および処置されることになる対象または宿主を含む、その症例を巡る特定の状況に従って決定され得る。
ＡＡＶ組成物の量およびそのような組成物の投与の回数は、本教示の恩恵にあずかる当業者の権限内であるであろう。しかし、開示される組成物の治療有効量の投与を、そのような処置を受けることになる患者に治療利益をもたらすのに十分な数の感染粒子の単回投与、例えば単回注射、により果たすことができる可能性が高い。このことは、少なくとも一部は、ある特定の標的細胞（例えば、ニューロン）が分裂せず、そのため複数回の投与または慢性投与の必要がないという事実により、可能になる。
あるいは、一部の状況では、ＡＡＶベクター組成物の複数回投与または連続投与を、そのような組成物の投与を監督する医師による判断に応じて、比較的短い期間にわたって提供することが望ましいこともあり、または比較的長い期間にわたって提供することが望ましいこともある。例えば、哺乳動物に投与される感染粒子の数は、感染粒子約１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３個またはさらにはそれより多い個数／ｍｌほどであることがあり、これが、処置されることになる特定の疾患または障害の治療を果たすために必要に応じて、単回用量として与えられるか、または２回もしくはそれより多い回数の投与に分けて与えられる。実際には、ある特定の実施形態では、特定の治療レジメンの所望の効果を達成するために、単独で、または１つもしくは複数の他の治療薬と組み合わせて、２つまたはそれより多くの異なるＡＡＶベクター組成物を投与することが望ましいことがある。様々な実施形態では、１日投薬量および単位投薬量は、使用される治療用ｒＡＡＶ組成物の活性、処置される疾患または状態、投与方法、個々の対象の要件、処置されることになる疾患または状態の重症度、および実施者の判断を含むがこれらに限定されない、いくつかの可変要素に依存して変更される。
一部の実施形態では、治療用ｒＡＡＶ組成物の投与は、１時間に１回、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１年、２年、３年、４年、または、５年または１０年に１回である。有効投薬量範囲を処置に対する対象の応答に基づいて調整することができる。一部の投与経路は、他の経路よりも高濃度の治療有効量を必要とすることになる。
本開示の利点を考えると予期されないが、患者の状態が改善されないある特定の実施形態では、医者の自由裁量により、治療用ｒＡＡＶ組成物の投与は、患者の疾患または状態の症状を改善するまたは別様に制御もしくは限定するために慢性的に、すなわち、患者の生涯を通してを含む、長期間にわたって、投与される。患者の状態が改善したある特定の実施形態では、投与されている治療用ｒＡＡＶ組成物の用量は、ある特定の期間（すなわち、「休薬期間」）、一時的に低減または一時的に中止され得る。特定の実施形態では、休薬期間の長さは、２日～１年の間であり、これは、単に例として、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、１２日、１５日、２０日、２８日、または２８日より長い期間を含む。休薬期間中の用量低減は、単なる例として、１０％～１００％低減であり、これは、単なる例として、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％および１００％低減を含む。ある特定の実施形態では、投与されている薬物の用量は、ある特定の期間（すなわち、「薬物転用」）、一時的に低減または一時的に中止され得る。特定の実施形態では、薬物転用の長さは、２日～１年の間であり、これは、単に例として、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、１２日、１５日、２０日、２８日、または２８日より長い期間を含む。薬物転用中の用量低減は、単なる例として、１０％～１００％低減であり、これは、単なる例として、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％および１００％低減を含む。好適な期間の後、必要に応じて通常の投薬スケジュールが再開される。
一部の実施形態では、患者の状態の改善が生じると、必要に応じて維持用量が投与される。その後、特定の実施形態では、投薬量もしくは投与の頻度または両方は、症状に応じて、疾患、障害または状態の改善が保たれるレベルへと低減される。しかし、ある特定の実施形態では、患者は、症状のいずれかの再発に基づいて長期的に間欠的処置を必要とする。
そのような治療レジメンの毒性および治療有効性は、細胞培養物または実験動物において、ＬＤ５０およびＥＤ５０の判定を含むがこれらに限定されない、標準的な薬学的手順により判定される。毒性効果と治療効果の用量比が治療指数であり、これはＬＤ５０とＥＤ５０間の比として表現される。ある特定の実施形態では、細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトを含む哺乳動物において使用するための治療に有効な１日投薬量範囲および／または治療に有効な単位投薬量の公式化に使用される。一部の実施形態では、本明細書に記載の治療用ｒＡＡＶ組成物の投薬量は、最小の毒性でＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。ある特定の実施形態では、１日投薬量範囲および／または単位投薬量は、利用される剤形および活用される投与経路に依存してこの範囲内で変動する。
追加の治療薬
治療用核酸は、単独で、または追加の治療薬（まとめて、「治療剤」）と組み合わせて、使用され得る。一部の場合には、本明細書で使用される場合の「追加の治療剤」は、単独で投与される。治療剤は、併用療法で一緒にまたは逐次的に投与されることもある。併用療法は、同日に投与されることもあり、または１または複数日、週間、月間もしくは年を空けて投与されることもある。一部の場合には、本明細書で提供される治療用核酸は、対象に第一選択の治療が奏効しないと判定された場合に投与される。
追加の治療剤は、小分子を含むことができる。追加の治療剤は、抗体またはその抗原結合性断片を含むことができる。追加の治療剤は、細胞ベースの治療法を含むことができる。例示的な細胞ベースの治療法としては、免疫エフェクター細胞療法、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）療法、ナチュラルキラー細胞療法、およびキメラ抗原受容体ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞療法が挙げられるが、これらに限定されない。ＮＫ細胞、またはＣＡＲ－ＮＫ細胞、またはＮＫ細胞とＣＡＲ－ＮＫ細胞との組合せのいずれかを、本明細書で開示される方法と組み合わせて使用することができる。一部の実施形態では、ＮＫ細胞およびＣＡＲ－ＮＫ細胞は、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、臍帯血、または細胞系に由来する。ＮＫ細胞およびＣＡＲ－ＮＫ細胞は、サイトカイン受容体および自殺遺伝子を含むことができる。細胞ベースの治療法は、幹細胞療法を含むことができる。幹細胞療法は、胚性幹細胞であることもあり、または体性幹細胞であることもある。幹細胞は、ドナーから単離されることもあり（同種異系）、または対象から単離されることもある（自己細胞）。幹細胞は、増殖させた脂肪由来幹細胞（ｅＡＳＣ）、造血幹細胞（ＨＳＣ）、間葉系幹（間質）細胞（ＭＳＣ）、または対象の細胞に由来する人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であり得る。
ＩＩＩ．キット
本明細書で開示される組成物を含むキットが、本明細書で開示される。中枢神経系（ＣＮＳ）または標的器官もしくは環境（例えば、肝臓）の疾患または状態の処置または予防のためのキットも、本明細書で開示される。一部の事例では、疾患または状態は、がん、病原体感染、肺疾患もしくは状態、神経疾患、筋肉疾患、または免疫障害、例えば、本明細書に記載のものである。一実施形態では、キットは、治療用核酸（例えば、治療用核酸）と本開示の組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）カプシドタンパク質とをコードする組換えＡＡＶベクターをカプシド内封入しているｒＡＡＶ粒子の組成物の有効量を含有する、治療用または予防用組成物を含むことができる。別の実施形態では、キットは、本明細書に記載のｒＡＡＶにより改変された細胞（「改変細胞」）の有効量を含有する治療用または予防用組成物を、治療用核酸を発現する単位剤形で含むことができる。一部の実施形態では、キットは、治療用組成物を収容することができる滅菌容器を含み、そのような容器は、箱、アンプル、瓶、バイアル、管、バッグ、ポーチ、ブリスターパック、または当技術分野において公知の他の好適な容器形態であり得る。そのような容器は、プラスチック、ガラス、ラミネート紙、金属ホイル、または医薬を保持するのに好適な他の材料で作製されたものであり得る。
一部の場合には、ｒＡＡＶは、疾患もしくは状態（例えば、ＣＮＳ、ＰＮＳ、肝臓などの疾患）に罹患している対象またはそれを発症するリスクがある対象にｒＡＡＶを投与するための使用説明書と一緒に提供される。使用説明書は、一般に、疾患または状態の処置または予防のための組成物の使用についての情報を含むことができる。
一部の場合には、キットは、同種異系細胞を含むことができる。一部の場合には、キットは、ゲノム改変を含み得る細胞を含むことができる。一部の場合には、キットは、「オフ・ザ・シェルフ」細胞を含むことができる。一部の場合には、キットは、臨床使用のために増殖させることができる細胞を含むことができる。一部の場合には、キットは、研究用のコンテンツを含有することができる。
一部の場合には、使用説明書は、次のうちの少なくとも１つを含む：治療用ｒＡＡＶ組成物の説明；本明細書で開示される疾患もしくは状態の処置もしくは予防のための投薬量スケジュールおよび投与；使用上の注意；警告；適応症；禁忌症；過剰投薬情報；有害反応；動物薬理学；臨床研究；および／または参考資料。使用説明書は、容器（存在する場合）に直接印刷されることもあり、または容器に貼り付けられているラベルとして存在することもあり、または容器内にもしくは容器とともに供給される別のシート、パンフレット、カードもしくはホルダーとして存在することもある。一部の場合には、使用説明書は、対象にｒＡＡＶを単独で投与するための手順を提供する。一部の場合には、使用説明書は、本明細書で開示される追加の治療剤の投与の少なくとも約１時間（ｈｒ）、２ｈｒ、３ｈｒ、４ｈｒ、５ｈｒ、６ｈｒ、７ｈｒ、８ｈｒ、９ｈｒ、１０ｈｒ、１１ｈｒ、１２ｈｒ、１３ｈｒ、１４ｈｒ、１５ｈｒ、１６ｈｒ、１７ｈｒ、１８ｈｒ、１９ｈｒ、２０ｈｒ、２１ｈｒ、２２ｈｒ、２３ｈｒ、２４ｈｒ、２５ｈｒ、２６ｈｒ、２７ｈｒ、２８ｈｒ、２９ｈｒ、３０ｈｒ後もしくは前に、またはその投与後もしくは前２日、３日、４日、５日、６日もしくは７日以内に、ｒＡＡＶを対象に投与するための手順を提供する。一部の事例では、使用説明書は、ｒＡＡＶが静脈内投与用に製剤化されることを規定する。
ＩＶ．定義
本明細書で使用される用語法は、特定のケースを説明することを目的にしたものに過ぎず、限定するように意図されていない。本明細書で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈による別段の明確な指示がない限り、複数形も含むように意図されている。さらに、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「伴う（ｗｉｔｈ）」、またはこれらの異表記が、発明を実施するための形態および／または特許請求の範囲のどちらかで使用される限りでは、このような用語は、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と同様に包括的であるように意図されている。
用語「約」または「おおよそ」は、当業者により決定される特定の値の許容される誤差範囲内であることを意味し、この許容される誤差範囲は、値が測定または判定される方法、例えば、測定システムの限定に一部依存することになる。例えば、「約」は、所与の値に関して慣例に従って１以内の標準偏差を意味することもあり、または１より大きい標準偏差を意味することもある。特定の値が本願および特許請求の範囲に記載される場合、別段の記述がない限り、用語「約」は、特定の値の許容される誤差範囲を意味するとされたい。
本明細書で使用される場合、組成物および方法を定義するために使用されるときの「から本質的になる」は、述べられている目的のための組合せにとってあらゆる本質的に有意なもの以外の要素を除外することを意味するものとする。したがって、本明細書で定義される場合の要素から本質的になる組成物は、ざ瘡、湿疹、乾癬および酒さのような皮膚障害を処置するための組成物などの、特許請求の範囲に記載の開示の基本的な新規の特徴に実質的に影響を与えない他の材料またはステップを除外しないことになる。
用語「相同（の）」、「相同性」または「相同性パーセント」は、参照配列と同じまたは同様の配列を有するアミノ酸配列または核酸配列を一般に意味するように本明細書では使用される。配列の相同性パーセントは、本願の出願日の時点でのＢＬＡＳＴの最新バージョンを使用して決定され得る。
用語「増加した」または「増加（する）」は、統計的に有意な量の増加を一般に意味するように本明細書では使用される。一部の実施形態では、用語「増加した」または「増加（する）」は、参照レベルと比較して少なくとも１０％の増加、例えば、参照レベル、標準または対照と比較して少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、もしくは少なくとも約３０％、もしくは少なくとも約４０％、もしくは少なくとも約５０％、もしくは少なくとも約６０％、もしくは少なくとも約７０％、もしくは少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約９０％の増加、もしくは１００％までの、および１００％を含む増加、または１０～１００％の間の任意の増加を意味する。「増加（する）」の他の例としては、参照レベルと比較して少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍の増加またはそれより大きい増加が挙げられる。
用語「減少した」または「減少（する）」は、統計的に有意な量の減少を一般に意味するように本明細書で使用される。一部の実施形態では、「減少した」または「減少（する）」は、参照レベルと比較して少なくとも１０％低減、例えば、参照レベルと比較して少なくとも約２０％、もしくは少なくとも約３０％、もしくは少なくとも約４０％、もしくは少なくとも約５０％、もしくは少なくとも約６０％、もしくは少なくとも約７０％、もしくは少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約９０％減少、もしくは１００％までの、および１００％を含む減少（例えば、参照レベルと比較して消失したレベルまたは検出不能のレベル）、または１０～１００％の間の任意の減少を意味する。マーカーまたは症状に関して、これらの用語は、そのようなレベルの統計的に有意な減少を意味する。減少は、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％またはそれより大幅であることがあり、好ましくは、所与の疾患に罹患していない個体についての正常な範囲内と認められるレベルに下がる。
用語「対象」は、任意の生物である。一部の事例では、生物は、哺乳動物である。哺乳動物の非限定的な例としては、哺乳綱の任意のメンバー：ヒト、非ヒト霊長類、例えば、チンパンジー、ならびに他の類人猿およびサル種；家畜、例えば、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ；飼育動物、例えば、ウサギ、イヌおよびネコ；ラット、マウスおよびモルモットなどの齧歯動物を含む実験動物などが挙げられる。一態様では、哺乳動物はヒトである。用語「動物」は、本明細書で使用される場合、人間および非ヒト動物を含む。一実施形態では、「非ヒト動物」は、哺乳動物、例えば、齧歯動物、例えばラットまたはマウスである。一部の事例では、対象は患者であり、本明細書で使用される場合、患者は、特定の疾患または障害と診断された対象を指し得る。
用語「遺伝子」は、本明細書で使用される場合、個々のタンパク質またはＲＮＡをコードする核酸のセグメント（「コード配列」または「コード領域」とも呼ばれる）を、必要に応じて、コード配列の上流または下流に位置し得る関連調節領域、例えば、プロモーター、オペレーター、ターミネーターなどとともに指す。
用語「アデノ随伴ウイルス」または「ＡＡＶ」は、本明細書で使用される場合、アデノ随伴ウイルスまたはそれらの派生物を指す。ＡＡＶの非限定的な例としては、ＡＡＶ １型（ＡＡＶ１）、ＡＡＶ ２型（ＡＡＶ２）、ＡＡＶ ３型（ＡＡＶ３）、ＡＡＶ ４型（ＡＡＶ４）、ＡＡＶ ５型（ＡＡＶ５）、ＡＡＶ ６型（ＡＡＶ６）、ＡＡＶ ７型（ＡＡＶ７）、ＡＡＶ ８型（ＡＡＶ８）、ＡＡＶ ９型（ＡＡＶ９）、ＡＡＶ １０型（ＡＡＶ１０）、ＡＡＶ １１型（ＡＡＶ１１）、ＡＡＶ １２型（ＡＡＶ１２）、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、およびヒツジＡＡＶが挙げられる。一部の事例では、ＡＡＶは「霊長類ＡＡＶ」と記載され、霊長類ＡＡＶは、霊長類に感染するＡＡＶを指す。同様に、ＡＡＶは、ウシ亜科の動物に感染し得る（例えば、「ウシＡＡＶ」など）。一部の事例では、ＡＡＶは、野生型ＡＡＶまたは天然に存在するＡＡＶである。一部の事例では、ＡＡＶは、組換えＡＡＶである。
用語「ＡＡＶカプシド」は、本明細書で使用される場合、アデノ随伴ウイルスのカプシドタンパク質またはペプチドを指す。一部の事例では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、遺伝情報（例えば、導入遺伝子、治療用核酸、ウイルスゲノム）をカプシド内封入するように作られている。一部の事例では、本開示のＡＡＶカプシドは、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質と比較して改変されたＡＡＶカプシドである。
用語「指向性」は、本明細書で使用される場合、第２のｉｎ ｖｉｖｏ環境と比較してｉｎ ｖｉｖｏ環境におけるものへのカプシド内封入遺伝情報の発現に対する特異性および／または発現の効率の向上もしくは低下を含み得る、ＡＡＶカプシドの質または特徴を指す。ｉｎ ｖｉｖｏ環境は、一部の事例では、細胞型である。ｉｎ ｖｉｖｏ環境は、一部の事例では、器官、または器官系である。
用語「ＡＡＶベクター」は、本明細書で使用される場合、ウイルスに関する遺伝情報をコードする核酸ポリマーを指す。ＡＡＶベクターは、組換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶ）であることがあり、ｒＡＡＶは、組換え遺伝学法を使用して生成されたＡＡＶベクターを指す。一部の事例では、ｒＡＡＶベクターは、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチド（例えば、導入遺伝子などの、野生型または天然に存在するＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含む。
用語「ＡＡＶ粒子」は、本明細書で使用される場合、ＡＡＶウイルス、ビリオン、ＡＡＶカプシドタンパク質またはその成分を指す。一部の場合には、ＡＡＶ粒子は、親ＡＡＶ粒子と比較して改変されている。
「遺伝子産物」または「遺伝子発現産物」という用語は、例えば、ポリペプチド、ペプチド、タンパク質、または干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）およびメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む、ＲＮＡなどについての、ポリヌクレオチド配列の発現産物を指す。
用語「動作可能に連結されている」または「作動可能に連結されている」は、互いに近接している、および一部の場合には互いに隣り合っている、２つまたはそれより多くのエレメント（例えば、遺伝子エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサー、終結シグナル配列、ポリアデニル化配列など）の配置であって、これらの２つまたはそれより多くのエレメント間の機能的な関係を可能にする配置を指す。１つの非限定的な例では、コード領域に動作可能に連結されているプロモーターは、コード配列の転写の開始を可能にする。
用語「異種」は、本明細書で使用される場合、それが比較されている実体の残部のものとは遺伝子型的に明確に異なる実体に由来する遺伝子エレメント（例えば、コード領域）または遺伝子発現産物（例えば、ＲＮＡ、タンパク質）を指す。
用語「内在性」は、本明細書で使用される場合、生物にまたはその生物体内の特定の細胞に天然に存在するまたは付随する遺伝子エレメント（例えば、コード領域）または遺伝子発現産物（例えば、ＲＮＡ、タンパク質）を指す。
「検出可能な部分」は、本明細書で使用される場合、化合物または生体分子に共有結合または非共有結合させることができる部分であって、例えば当技術分野において公知の技法を使用して、検出することができる部分を指す。実施形態では、検出可能な部分は、共有結合されている。検出可能な部分は、結合された化合物または生体分子のイメージングに備えることができる。検出可能な部分は、２つの化合物間の接触を指し示すことができる。例示な検出可能な部分は、フルオロフォア、抗体、反応性色素、放射標識部分、磁性造影剤、および量子ドットである。例示的なフルオロフォアとしては、フルオレセイン、ローダミン、ＧＦＰ、クマリン、ＦＩＴＣ、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＢＯＤＩＰＹ、およびシアニン色素が挙げられる。例示的な放射性核種としては、フッ素－１８、ガリウム－６８および銅－６４が挙げられる。例示的な磁性造影剤としては、ガドリニウム、酸化鉄および鉄白金、およびマンガンが挙げられる。
用語「処置する」、「処置すること」および「処置」は、本明細書で使用される場合、障害、疾患もしくは状態を、または障害、疾患もしくは状態に関連する症状の１つもしくは複数を、軽減または抑制すること、あるいは障害、疾患または状態それ自体の原因を軽減または根絶することを指す。処置の望ましい効果としては、疾患の発生または再発を防止すること、症状を軽減すること、疾患の任意の直接的または間接的病理学的帰結を少なくすること、転移を防止すること、疾患進行速度を低下させること、病状を改善または緩和すること、および寛解、または予後改善を挙げることができるが、これらに限定されない。
用語「治療有効量」は、投与されたときに障害、疾患もしくはその疾患の状態についての症状のうちの１つもしくは複数の発生を防止するのに十分であるまたは前記１つもしくは複数をある程度軽減するのに十分である、化合物または治療の量、あるいは研究者、獣医、医師または臨床家により探求され続ける、細胞、組織、系、動物またはヒトの生物学的または医学的応答を惹起するのに十分である化合物の量を指す。
用語「薬学的に許容される担体」、「薬学的に許容される賦形剤」、「生理的に許容される担体」または「生理的に許容される賦形剤」は、薬学的に許容される材料、組成物またはビヒクル、例えば、液体または固体充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、またはカプセル化材料を指す。成分は、医薬製剤の他の構成要素と適合性であるという意味で、「薬学的に許容され」得る。それはまた、ヒトおよび動物の組織または器官と接触する使用に好適でもあり、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、免疫原性または他の問題もしくは合併症を伴わず、妥当なリスク便益比に見合っているものであり得る。Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition；Lippincott Williams & Wilkins: Philadelphia, PA, 2005；Handbook of Pharmaceutical Excipients, 5th Edition；Rowe et al., Eds., The Pharmaceutical Press and the American Pharmaceutical Association: 2005；およびHandbook of Pharmaceutical Additives, 3rd Edition；Ash and Ash Eds., Gower Publishing Company: 2007； Pharmaceutical Preformulation and Formulation, Gibson Ed., CRC Press LLC: Boca Raton, FL, 2004を参照されたい。
用語「医薬組成物」は、本明細書で開示される化合物と他の化学成分、例えば希釈剤または担体、との混合物を指す。医薬組成物は、生物への化合物の投与を促進することができる。化合物を投与する複数の技法が当技術分野に存在し、そのような技法は、経口、注射、エアロゾル、非経口および局所投与を含むがこれらに限定されない。
「試料」の非限定的な例は、核酸および／またはタンパク質を得ることができる任意の材料を含む。非限定的な例として、これらは、全血、末梢血、血漿、血清、唾液、粘液、尿、精液、リンパ液、糞抽出物、口腔内スワブ、細胞または他の体液もしくは組織を含み、組織は、外科生検もしくは外科的切除によって得られる組織を含むが、これに限定されない。様々な実施形態では、試料は、大腸および／または小腸からの組織を含む。様々な実施形態では、大腸試料は、盲腸、結腸（上行結腸、横行結腸、下行結腸、およびＳ状結腸）、直腸および／または肛門管を含む。一部の実施形態では、小腸試料は、十二指腸、空腸、および／または回腸を含む。あるいは、試料は、患者由来の初代細胞系から得ることができ、または保存試料の形式のアーカイブされた患者試料であることもあり、または新鮮凍結試料であることもある。
用語「ｉｎ ｖｉｖｏ」は、対象の体内で起こる事象を記述するために使用される。
用語「ｅｘ ｖｉｖｏ」は、対象の体外で起こる事象を記述するために使用される。ｅｘ ｖｉｖｏアッセイは、対象に対して行われない。もっと正確に言えば、それは、対象から切り離されている試料で行われる。試料を用いて行われるｅｘ ｖｉｖｏアッセイの例が、「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」アッセイである。
用語「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」は、検査室試薬を保持するための容器内に、それをその材料が採取される生物源から隔離されるように収容して行われる、事象を記述するために使用される。ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイは、生細胞または死細胞が用いられる、細胞に基づくアッセイを包含し得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイは、無傷細胞が用いられない、無細胞アッセイも包含し得る。
本明細書で使用されるセクションの見出しは、単に構成のためのものであり、記載される主題を限定すると見なすべきでない。
Ｖ．実施例
（実施例１）
ｒＡＡＶを産生する方法
組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を産生する。標準的なトランスフェクションプロトコール（例えば、ＰＥＩを用いる）を使用して、３つのプラスミドベクターを不死化ＨＥＫ２９３にトリプルトランスフェクトする。第１のベクターは、親ＡＡＶウイルスからの逆位末端反復（ＩＴＲ）配列と隣接している導入遺伝子カセットを含有する。導入遺伝子カセットは、プロモーター配列を有し、それが標的細胞の核内での異種核酸の転写を駆動する。第２のベクターは、ＡＡＶ Ｒｅｐ遺伝子と改変Ｃａｐ遺伝子とをコードする核酸、例えば、ＡＡＶ２／９ ＲＥＰ－ＡＡＰ－ΔＣａｐを含有する。改変Ｃａｐ遺伝子は、本開示の改変ＡＡＶカプシドタンパク質をコードするＤＮＡ配列である、図３３～３５で提供されるＤＮＡ配列のいずれか１つを含む。第３のベクターは、ウイルスのアセンブリーにおよび改変カプシド構造への異種核酸のパッケージングに必要とされるヘルパーウイルスタンパク質をコードする核酸を含有する。
ウイルス粒子を、トランスフェクションの７２時間後に培地から採取し、トランスフェクションの１２０時間後に細胞および培地から採取する。培地中に存在するウイルスを８％ポリ（エチレングリコール）および５００ｍＭ塩化ナトリウムでの沈殿により濃縮し、沈殿したウイルスを、回収した細胞から調製した溶解物に添加する。イオジキサノール（Ｏｐｔｉｐｒｅｐ、Ｓｉｇｍａ）の段階的勾配（１５％、２５％、４０％および６０％）を用いてウイルスを精製する。ウイルスを濃縮し、ＰＢＳ中で製剤化する。ｑＰＣＲと対照としての線状化ゲノムプラスミドとを使用してＤＮａｓｅＩ耐性ベクターゲノムコピー（ＶＧ）の数を測定することにより、ウイルス力価を決定する。
（実施例２）
バリアントＡＡＶカプシドタンパク質を同定する方法
プラスミド
ライブラリー生成。ｒＡＡＶ－ΔＣａｐ－ｉｎ－ｃｉｓ－Ｌｏｘ２プラスミド（図３６）は、ｒＡＡＶ－ΔＣａｐ－ｉｎ－ｃｉｓ－Ｌｏｘプラスミドの改変体である。７－ｍｅｒ－ｉライブラリー断片生成のために、ｐＣＲＩＩ－９Ｃａｐ－ＸＥプラスミドを鋳型として使用した。ＡＡＶ２／９ ＲＥＰ－ＡＡＰ－ΔＣａｐプラスミド（図３６）をＡＡＶ２／９ ＲＥＰ－ＡＡＰプラスミドから改変した。
ｒＡＡＶ－ΔＣａｐ－ｉｎ－ｃｉｓ－Ｌｏｘ２プラスミドは、ＡＡＶ２ ＩＴＲと隣接している３つの主要エレメントからなる。（ｉ）蛍光タンパク質であるｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎの発現、続いて合成ポリアデニル化配列の発現を駆動する、ＵＢＣ普遍的プロモーター。旧バージョンのプラスミドのｍＣｈｅｒｒｙ発現カセットをｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎカセットに置き換えた。（ｉｉ）スプライシング配列とＡＡＶ５ ｐ４１プロモーターとを有するＡＡＶ２ ｒｅｐ遺伝子の一部分（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＦ０８５７１６．１の１６８０～１９７４残基）、これに続くＡＡＶ９ ｃａｐ遺伝子。このプラスミドの以前のバージョンであるｒＡＡＶ－ΔＣａｐ－ｉｎ－ｃｉｓ－Ｌｏｘは、ＡＡＶ９ Ｃａｐ遺伝子のＡＡ４５０および５９２における制限部位ＸｂａＩとＡｇｅＩの間に短い１２ｂｐの配列を有する。より新しいバージョンのプラスミドでは、これをインフレームのｍＲｕｂｙ２遺伝子の７２３ｂｐ配列（充填剤ＤＮＡとして作用する）に置き換えた。（ｉｉｉ）ｌｏｘ７１およびｌｏｘ６６部位と隣接しているＳＶ４０ポリアデニル化配列。この小さな変化を以前のバージョンのプラスミドに導入して、クローニングのしやすさを促進し、哺乳動物細胞トランスフェクションを可視化した。これらのｒＡＡＶプラスミドのＬｏｘ部位は、中レベルのＣｒｅ非依存性反転を示す。これを、ＰＣＲに基づくカプシド回収中に、増幅サイクル数を、ライブラリーを注射した野生型マウス（すなわち、Ｃｒｅ発現を欠いている）から抽出した対照ＤＮＡからのいかなるｒＡＡＶカプシドも回収することができない所まで低下させることにより、最小限に抑えた。ｐＣＲＩＩ－９Ｃａｐ－ＸＥプラスミドは、ＡＡ４５０～５９２からのＡＡＶ９カプシド遺伝子配列を含有し、ＸｂａＩおよびＡｇｅＩ制限部位と隣接している。
ＡＡＶ２／９ ＲＥＰ－ＡＡＰ－ΔＣａｐプラスミドは、ＡＡＶ９カプシド配列のＡＡ４５０～５９２の欠失に加えて、ＡＡＶ２／９ ＲＥＰ－ＡＡＰの前から存在していた５つの停止コドンを有する。これらの改変は、ベクター産生に影響を与えなかった。ＲＥＰ－ＡＡＰとｒＡＡＶ－ΔＣａｐ－ｉｎ－ｃｉｓ－Ｌｏｘ２プラスミドの間の重複する断片をなくすことにより、ベクター産生のコトランスフェクション中にＡＡＶ９野生型カプシドを生成する可能性があり得るプラスミド間の組換えが最小限に抑えられる。
カプシド特徴付け
ＡＡＶカプシド。ｐＵＣｍｉｎｉ－ｉＣＡＰ－ＰＨＰ．Ｂ骨格を使用して、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂカプシドの５８７～５９７位の間に７－ｍｅｒ挿入または１１－ｍｅｒ置換があるＡＡＶカプシドバリアンドを作製した（Ａｄｄｇｅｎｅ ＩＤ：１０３００２）。
ｓｓＡＡＶゲノム。ＡＡＶカプシドバリアントを特徴付けるために、単鎖（ｓｓ）ｒＡＡＶゲノムを使用した。ｐＡＡＶ：ＣＡＧ－ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ２７（等価プラスミド、ｐＡＡＶ：ＣＡＧ－ｅＹＦＰ３５；Ａｄｄｇｅｎｅ ＩＤ：１０４０５５）、ｐＡＡＶ：ＣＡＧ－ＮＬＳ－ＥＧＦＰ２６（１つのＮＬＳを有する等価バージョンがＡｄｄｇｅｎｅ ＩＤ １０４０６１にある）、ｐＡＡＶ：ＣＡＧ－ＤＩＯ－ＥＹＦＰ３５（Ａｄｄｇｅｎｅ ＩＤ：１０４０５２）、ｐＡＡＶ：ＧｆＡＢＣ１Ｄ－２ｘＮＬＳ－ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２３５（Ａｄｄｇｅｎｅ ＩＤ：１０４０５３）、およびｐＡＡＶ－Ｐｌｅ２６１－ｉＣｒｅ３０（Ａｄｄｇｅｎｅ ＩＤ ４９１１３）などの、ゲノムを使用した。
ｐＡＡＶ：ＣＡＧ－ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ２ゲノムは、蛍光タンパク質であるｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎの発現を駆動する、普遍的ＣＭＶ－β－アクチン－イントロン－β－グロビン（ＣＡＧ）ハイブリッドプロモーターからなる（等価プラスミド、ｐＡＡＶ：ＣＡＧ－ｅＹＦＰ３；Ａｄｄｇｅｎｅ ＩＤ：１０４０５５）。ｐＡＡＶ：ＣＡＧ－ＮＬＳ－ＥＧＦＰ１は、ＥＧＦＰのＮおよびＣ末端におけるＮＬＳ配列からなり、ＣＡＧプロモーターにより駆動される。１つのＮＬＳを有する等価バージョンがＡｄｄｇｅｎｅ（ＩＤ １０４０６１）にある。ｐＡＡＶ：ＣＡＧ－ＤＩＯ－ＥＹＦＰ３（Ａｄｄｇｅｎｅ ＩＤ：１０４０５２）は、ＣＡＧプロモーターの反対向きに構築されたＥＹＦＰ遺伝子からなり、それは、両側が一対のＣｒｅ－Ｌｏｘ部位（Ｌｏｘ ＰおよびＬｏｘ ２２７２）と隣接している。
Ｃｒｅを発現する細胞では、Ｃｒｅ－ｌｏｘ対は、転写および翻訳を可能にするＥＹＦＰを逆位にし、その後、ｌｏｘ部位を切除して、再逆位を防止する。他の箇所ではｐＡＡＶ：ＧＦＡＰ－２ｘＮＬＳ－ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２（Ａｄｄｇｅｎｅ ＩＤ：１０４０５３）と呼ばれるｐＡＡＶ：ＧｆＡＢＣ１Ｄ－２ｘＮＬＳ－ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２３は、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２のＮ末端およびＣ末端におけるＮＬＳ配列からなり、星状膠細胞特異的プロモーターＧｆＡＢＣ１Ｄ４により駆動される。ｐＡＡＶ：Ｐｌｅ２６１－ｉＣｒｅ５（Ａｄｄｇｅｎｅ ＩＤ ４９１１３）は、ｉＣｒｅの発現を駆動する内皮細胞特異的プロモーターを含有する。
ＡＡＶバリアントを特徴付けるためにｐＡＡＶ：ＣＡＧ－ＸＦＰ（ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎ）をパッケージングした。しかし、細胞型：ニューロン、星状膠細胞および乏突起膠細胞の定量化を行う際、顕微鏡画像を使用するさらに容易な定量化のために、ＣＡＧ－ＮＬＳ－ＥＧＦＰを使用して発現を核に制限した。ＧＦＡＰ－ＮＬＳ－ｍＴｕｒｑ２は、星状膠細胞を定量化するために使用される。ＣＡＧ－ＤＩＯ－ＥＹＦＰは、このプラスミド内のｌｏｘ部位の存在のため、Ｃｒｅドライバー系統に使用される。
Ｇｕａｎｇｐｉｎｇ Ｇａｏ博士からの自己相補的ゲノムである、ｓｃＡＡＶ：ＣＢ６－ＥＧＦＰゲノムは、ＣＭＶエンハンサー（サイトメガロウイルス最初期エンハンサー）とニワトリβ－アクチンプロモーターとハイブリッドイントロンとを含むハイブリッド普遍的ＣＢ６プロモーター（９７５ｂｐ）であって、ＥＧＦＰの発現を駆動するプロモーターを有する。このゲノムは、ＥＧＦＰ遺伝子の後にウサギグロビンポリＡ（１２７ｂｐ）を有する。ｓｃＡＡＶ：ＣＡＧ－ＥＧＦＰ（Ａｄｄｇｅｎｅ ＩＤ：８３２７９）、ベクターは、普遍的ＣＭＶ－β－アクチン－イントロン－β－グロビン（ＣＡＧ）ハイブリッドプロモーターを使用してＥＧＦＰの発現を駆動する。
ラウンド－１ ＡＡＶカプシドライブラリー生成
突然変異誘発戦略。混合塩基を含有する縮重プライマー（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．からのもの）を伴う、ＮＮＫ飽和突然変異誘発戦略を使用して、７－ｍｅｒランダム化挿入を設計した。Ｎは、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ塩基であり得、Ｋは、ＧまたはＴであり得る。この戦略を使用して、３３コドンを使用する７－ｍｅｒペプチドの各位置の２０すべてのＡＡの組合せを得、その結果、ＡＡ組合せレベルで１，２８０，０００，０００のライブラリーサイズを生じさせた。３－ｍｅｒ－ｓ ＰＨＰ．Ｂライブラリーについての突然変異誘発戦略は、Chan, K. Y. et al. Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems. Nat. Neurosci.20, 1172-1179 (2017)に記載されている。
ライブラリークローニング。ＡＡ５８８と５８９の間に７－ｍｅｒランダム挿入がある４８０ｂｐ ＡＡＶカプシド断片（４５０～５９２ＡＡ）を、混合塩基縮重プライマーを用いて従来のＰＣＲ法により生成した。ライブラリー断片を、ｐＣＲＩＩ－９Ｃａｐ－ＸＥ鋳型から、Ｑ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＮＥＢ；Ｍ０４９４Ｓ）と、フォワードプライマーであるＸＦ：５’－ＡＣＴＣＡＴＣＧＡＣＣＡＡＴＡＣＴＴＧＴＡＣＴＡＴＣＴＣＴＣＴＡＧＡＡＣ－３’、およびリバースプライマーである７ｘＭＮＮ－５８８ｉ：５’－ＧＴＡＴＴＣＣＴＴＧＧＴＴＴＴＧＡＡＣＣＣＡＡＣＣＧＧＴＣＴＧＣＧＣＣＴＧＴＧＣＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＴＴＧＧＧＣＡＣＴＣＴＧＧＴＧＧＴＴＴＧＴＧ－３’によって増幅させた。点突然変異、組換えおよび鋳型スイッチングに起因する、ＰＣＲ誘導性の偏りを回避するために、ＰＣＲ増幅を１５～２０サイクルに限定し、反応の規模を拡大して必要収量を得た。得られたＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上で泳動させ、Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ；Ｄ４００７）で抽出した。清浄なゲル泳動ボックスおよび新たに調製した１×ＴＡＥ緩衝剤を使用することのような予防措置を講じることによってこのステップ中のＡＡＶ夾雑を回避することが、必要不可欠である。
ｒＡＡＶ－ΔＣａｐ－ｉｎ－ｃｉｓ－Ｌｏｘ２プラスミド（６９６０ｂｐ）を制限酵素ＡｇｅＩおよびＸｂａＩで線状化し、その後、二重消化のためにＮＥＢ推奨プロトコールを行った。消化されたプラスミドを０．８％～１％アガロースゲル上で泳動させて、線状化骨格（６２３７ｂｐ）をＺｙｍｏｃｌｅａｎ Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙキットで抽出した。
増幅されたライブラリー断片を、５０℃で６０分間アセンブルするためにＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＮＥＢ；Ｅ２６２１Ｓ）およびベクターのインサートに対するモル比１：２を用いて、アセンブルして線状化ベクターにした。
ライブラリー精製。次いで、アセンブルされたライブラリーを、Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓａｆｅ（ＰＳ）ＤＮａｓｅ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ；Ｅ３１０５Ｋ）処置に付して、アセンブルされた産物を、混合物から、アセンブルされていないＤＮＡ断片を分解することにより精製した。Ｒ１ライブラリーについては、１μｇの投入ＤＮＡ当りおよそ３ＵのＰＳ ＤＮａｓｅを、３７℃で３０分の反応に使用した。あるいは、ＮＥＢ推奨プロトコール（ＮＥＢ；Ｍ０３４５Ｓ）後にエキソヌクレアーゼＶ（ＲｅｃＢＣＤ）を使用した。両方の手順により同等の結果を得た。得られた混合物をＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ａｎｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ；Ｄ４０１３）でさらに精製した。
ライブラリー収量。ＰＳ処置後１５～２０％のアセンブリー効率で、２０μＬの反応当り１００ｎｇの投入ＤＮＡにつき約１５～２０ｎｇの収量を得た。７－ｍｅｒ－ｉ ＤＮＡライブラリーを構築するために、おおよそ５～６μｇの投入ＤＮＡを使用しておよそ８００ｎｇのアセンブルされたライブラリーを得た。
品質管理。ライブラリーのアセンブリー成功を検証するために、１ｎｇのアセンブルされた最終ライブラリーをＥ．ｃｏｌｉ ＳＵＲＥ ２ Ｓｕｐｅｒｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；２００１５２）に導入して形質転換を生じさせた。３７℃で一晩インキュベーション後、カルベニシリン抗生物質を含有するＬＢ／寒天プレート上のコロニーを同定した。挿入部位の周囲のＤＮＡライブラリーをシークエンシングした（Ｌａｒａｇｅｎ；サンガーシークエンシング）。偏りのないライブラリーは、多様な領域のあらゆる塩基位置にわたって等しい多様性（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃの各々２５％）の複数のヌクレオチドピークを示す。ＩＴＲが無傷であることを確かめるために、ＳｍａＩ消化をＮＥＢ推奨プロトコール（ＮＥＢ；Ｒ０１４１Ｓ）に従って実行した。トランスフェクション成功を検証し、１５０ｍｍ皿当りのベクター産生収量を評価するために、１０ｎｇの７－ｍｅｒ－ｉライブラリーを使用してＨＥＫ２９３プロデューサー細胞にトランスフェクトした。ＨＥＫ細胞にわたってｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎタンパク質の均一な発現が観察され、０．１～１×１０１１ｖｇの平均収量を１５０ｍｍ皿ごとに得た。皿ごとの平均収量を使用して、ｉｎ ｖｉｖｏ選択のためのベクター産生の規模を拡大した（図４５を参照されたい）。
ラウンド－２ ＡＡＶカプシドＤＮＡライブラリー
ＰＣＲプール設計。比例的プーリングを維持するために、個々のライブラリーの多様性に基づいてプールする必要がある各試料／ライブラリーの分率を数学的に決定した。このプロセスは、ノイズを含まない多様性の推定、およびより高いＲＣ範囲に入る高信頼度バリアントの区間についての曲線下面積を決定することによる試料にわたってこの多様性の増幅の考慮を含む。曲線下面積（ＡＵＣ）は、複合シンプソン公式を使用して、ライブラリー内の回収されたバリアントすべて（Ｘ座標）をそれらのリードカウント（ディープシークエンシングデータからのＲＣまたはコピー数、Ｙ座標）に対してプロットすることにより推定した（図４０を参照されたい）。ＡＵＣの明確な区間を決定するために、ＲＣの減少順に基づいてデータをソートした。目に見えて、この分布は２相を有し、より高いＲＣ範囲にバリアントのより一定の傾きがあり、続いて、曲線の傾きの急落（約５０分の１～１０００分の１のＲＣ）がある。観察により、曲線のこのより高度な急勾配側は、シークエンシングの誤り／ＰＣＲ突然変異が顕著であり、したがって、この誤りが支配的な傾きは、別様に＿＿からのノイズと呼ばれ、ＡＵＣ推定から外される。複合シンプソン公式を、複合台形則などの別の関数と比較すると、差は極めて小さかった。
次いで、この面積を使用して、式：［曲線下面積／プールされたライブラリーの総数］を使用してＰＣＲプールライブラリーにプールする必要がある個々のライブラリーの分率を決定する。
プールされた試料を、プライマー５８８－Ｒ２ｌｉｂ－Ｆ：５’－ＣＡＣＴＣＡＴＣＧＡＣＣＡＡＴＡＣＴＴＧＴＡＣＴＡＴＣＴＣＴＣＴ－３’および５８８－Ｒ２ｌｉｂ－Ｒ：５’－ＧＴＡＴＴＣＣＴＴＧＧＴＴＴＴＧＡＡＣＣＣＡＡＣＣＧ－３’を使用するＱ５ポリメラーゼによる１０秒間９８℃、２０秒間６０℃そして３０秒間７２℃の１２サイクルでのさらなる増幅の鋳型として使用した。Ｒ１ライブラリー生成と同様に、ＰＣＲ産物をアセンブルしてｒＡＡＶ－ΔＣａｐ－ｉｎ－ｃｉｓ－Ｌｏｘ２プラスミドにし、ウイルスを産生した。
Ｒ２を構築するために使用したＲ１ライブラリーは、すべてのＣｒｅ系統からのマウスの脳の半分（約０．３ｇ）および脊髄の一部分（０．１～０．２ｇ）からの、Ｃｒｅ－Ｌｏｘ反転ｒＡＡＶ ＤＮＡであった。ここで処理した組織の量は、完全なカプシドライブラリー回収に十分なものであった。別個にプールし、増幅させたライブラリー（ＰＣＲプールまたは合成プールごとに）を、ギブソンアセンブリーと、フォローアップＰＳまたはエキソヌクレアーゼＶ処置（Ｒ１ライブラリー生成で説明した通り）を使用してアセンブルした。ライブラリー生成の成功を、形質転換、サンガーシークエンシング、およびＩＴＲ ＳｍａＩ消化により検証した。
ベクター産生のために、約１０ｎｇの精製およびアセンブルされたライブラリーを使用して、２９３Ｔ細胞の１５０ｍｍ皿各々にトランスフェクトし、１５０ｍｍ皿当り約６×１０１１ｖｇの収量を得た（すなわち、当然のことながら、これらの配列がＲ１選択を乗り切ることができるほど十分に既に産生されていたことを前提として、Ｒ２収量は、Ｒ１の収量の６倍であった）。
合成プール設計。ＰＣＲプール戦略で説明したように、ライブラリー分布のプロットから誤りが支配的なノイズの傾きより上のＲＣを用いて高信頼度バリアントを選んだ（図４０を参照されたい）。これにより、すべてのＣｒｅ系統のすべての脳および脊髄試料から約９０００の配列を得た。Ｒ１ライブラリー生成の説明で述べたのと同様のプライマー設計を使用した。プライマーＸＦ：５’－ＡＣＴＣＡＴＣＧＡＣＣＡＡＴＡＣＴＴＧＴＡＣＴＡＴＣＴＣＴＣＴＡＧＡＡＣ－３’および１１－ｍｅｒ－５８８ｉ：５’－ＧＴＡＴＴＣＣＴＴＧＧＴＴＴＴＧＡＡＣＣＣＡＡＣＣＧＧＴＣＴＧＣＧＣＸＸＸＸＸＸＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＸＸＸＸＸＸＡＣＴＣＴＧＧＴＧＧＴＴＴＧＴＧ－３’（この式中の「ＸＸＸＸＸＸＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＸＸＸＸＸＸ」を、ＡＡＶ９カプシド上の残基５８７～５８８「ＡＱ」および残基５８９～５９０「ＡＱ」である、７－ｍｅｒ挿入部位（６×Ｘ）の両側に隣接している２つの隣接コドンの改変を伴う、７－ｍｅｒ組織回収バリアント（７×ＭＮＮ）の特有のヌクレオチド配列で置き換えた）。合成のための配列を選択するために、Ｒ１脳および脊髄ライブラリーを選び、ＰＣＲプール戦略で説明したのと同じＲＣ限界値を使用した。これにより、すべてのＣｒｅ系統のすべての脳および脊髄試料から約９０００の配列を得た。スパイクインライブラリーは、１１－ｍｅｒ突然変異バリアントを有するので、「ＸＸＸＸＸＸＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＸＸＸＸＸＸ」を１１－ｍｅｒバリアントの特異的ヌクレオチド配列で置き換えた、同じプライマー設計。このライブラリー内の各配列の複製物を、哺乳動物用に最適化された異なるコドンを用いて設計した。これらのプライマーは、注文作製のＰｙｔｈｏｎに基づくスクリプト（コードは、Ｇｉｔｈｕｂで入手できるようになるであろう）を使用して設計した。注文設計オリゴプールをＴｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓが等モル比で合成した。このオリゴプールを使用して、１０秒間９８℃、２０秒間６０℃そして３０秒間７２℃の１３サイクルにわたってｐＣＲＩＩ－ＸＥ Ｃａｐ９鋳型を増幅させた。より多くの大規模ライブラリー調製収量を得るために、第１のＰＣＲの産物を、プライマーＸＦおよび５８８－Ｒ２ｌｉｂ－Ｒ（上記）を使用する第２のＰＣＲの鋳型として使用し、１３サイクルにわたって増幅させた。Ｒ１ライブラリー生成の説明の中で記述したように、ウイルス産生のためにＰＣＲ産物をアセンブルしてｒＡＡＶ骨格にし、処理し、精製した。１５０ｍｍ皿当り約１０ｎｇのＨＥＫ２９３細胞が、約６×１０１１ｖｇのウイルスライブラリーを産生した。
ＡＡＶウイルスライブラリー産生および精製
ＨＥＫ２９３プロデューサー細胞における７－ｍｅｒ－ｉライブラリーのカプシドモザイク形成を防止するために、１５０ｍｍ皿当りわずか１０ｎｇのアセンブルされたライブラリーを、ＡＡＶベクター産生のために必要な他の試薬とともにトランスフェクトした。２９３Ｔプロデューサー細胞に対する１５０ｍｍ皿当り１０ｎｇのライブラリートランスフェクションに加えて、３つのプラスミド：ＡＡＶ２／９ ＲＥＰ－ＡＡＰ－ΔＣａｐ、ｐＵＣ１８およびｐＨｅｌｐｅｒ（ＡＡＶ複製のためのアデノウイルスタンパク質をコードする遺伝子）を、１：１：２の比率でトランスフェクトした。プラスミドｐＵＣ１８は、ポリエチレンイミンを使用する最適なトランスフェクション（ＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ；２４７６５－１）トランスフェクション）に必要なＮ：Ｐ比を維持するために少量のライブラリーＤＮＡを補償するための充填剤ＤＮＡとして作用する。細胞および培養培地をトランスフェクションの６０時間後に採取してウイルス粒子を回収した。ｒＡＡＶの採取および精製は、プロトコールに従って行った。プレート当りの少ないライブラリーＤＮＡ量および早い細胞採取時点は、ベクター産生中のモザイクカプシドアセンブリーの可能性を低減させるために必要不可欠である（以前の報告に見られる同様の考慮事項）。
７－ｍｅｒ－ｉライブラリーについては、産生の規模を６０皿（約１．８×１０７細胞／皿）に拡大し、ライブラリーをトランスフェクトした約１０％で約１×１０８の完全形質転換体を結果として得た。約１×１０８の完全形質転換体を伴うＮＮＫ ７ｍｅｒライブラリーについて、特有のバリアントの数は、９．９９×１０７である。
精製ｒＡＡＶウイルスライブラリーからのｒＡＡＶ ＤＮＡ抽出のために、精製ウイルスライブラリーの約１０％を使用して、プロテイナーゼＫ処置によりウイルスゲノムを抽出した。精製ライブラリーからの一切の夾雑ＤＮＡを分解するために、それを、１００μｌのＤＮａｓｅ Ｉ緩衝液中のＤＮａｓｅ Ｉ酵素（１０Ｕ／μｌの５μｌ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；４７１６７２８００１）で処置し、１時間、３７℃でインキュベートした。５μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡを７０℃で１０分間添加することにより、酵素を不活性化した。ＤＮａｓｅ Ｉ処置後、５μｌの２０μｇ／μｌのプロテイナーゼＫを含有する１２０μｌのプロテイナーゼ溶液を添加することによりカプシドタンパク質シェルを消化し、５０℃で一晩インキュベートした。プロテイナーゼＫを不活性化するために、混合物を９５℃で沸騰させた。次いで、抽出されたｒＡＡＶライブラリーＤＮＡを濃縮し、フェノール・クロロホルムおよびエタノールを使用して精製した。等体積のフェノ－ル：クロロホルム：イソアミルアルコール ２５：２４：１、ｐＨ８．０（約２５０μｌ；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；１５５９３０３１）を添加し、３０秒間ボルテックスした。混合物を５分間、室温（ＲＴ）でインキュベートした後、１５，０００ｒｐｍで１０分間、４℃で遠心分離した。上方の水性相を分離し、等体積のクロロホルムと混合し、３０秒間ボルテックスした。ＲＴで５分のインキュベーション後、１５，０００ｒｐｍで１０分間、４℃で遠心分離した。上方の水性相を分離し、２μｌのＣｏ－Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｎｔ Ｐｉｎｋ（Ｂｉｏｌｉｎｅ；ＢＩＯ－３７０７５）を伴う１０分の１の体積の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）、および２．５倍量の氷冷１００％エタノールを添加した後、３０秒間ボルテックスした。混合物を少なくとも１時間、－２０℃でインキュベートした後、１５，０００ｒｐｍで１５分間、４℃で遠心分離した。ペレットを空気乾燥させ、ＴＥ緩衝液に再懸濁させた。Ｑｕｂｉｔ ｓｓＤＮＡアッセイを使用してＤＮＡ濃度を判定した。
動物
この研究で行われるすべての動物手順は、カリフォルニア工科大学（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）（ＩＡＣＵＣ）により承認された。この研究に使用したＣ５７ＢＬ／６Ｊ（０００６６４）、Ｔｅｋ－Ｃｒｅ（８８６３）、ＳＮＡＰ２５－Ｃｒｅ（２３５２５）、ＧＦＡＰ－Ｃｒｅ（０１２８８６）、Ｓｙｎ１－Ｃｒｅ（３９６６）、およびＡｉ１４（００７９０８）マウス系統は、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＪＡＸ）から購入した。ｉｎ ｖｉｖｏライブラリー選択のために、６～８週齢の成体雄および雌マウスにウイルスライブラリーを静脈内注射した。両方の性別をカプシド選択に使用して、性別による偏り最小でカプシドバリアントを回収した。ｒＡＡＶのＩＶ注射を成体マウスの後眼窩洞に施した。ｒＡＡＶの形質導入表現型を試験するために、６～８週齢のＣ５７ＢＬ／６ＪまたはＴｅｋ－ＣｒｅまたはＡｉ１４成体雄マウスをランダムに割り当てた。実験者には、この研究で行った一切の実験について知らせた。
ｉｎ ｖｉｖｏ選択
７－ｍｅｒ－ｉウイルスライブラリー選択を、異なる系統のＣｒｅトランスジェニック成体マウス：Ｒ１選択についてはＴｅｋ－Ｃｒｅ、ＳＮＡＰ２５－ＣｒｅおよびＧＦＡＰ－Ｃｒｅ、Ｒ２選択についてはこれら３系統に加えてＳｙｎ１－Ｃｒｅで実行した。雄および雌成体マウスに、Ｒ１選択のために２×１０１１ｖｇ／マウスのウイルスベクター用量を、およびＲ２選択のために１×１０１２ｖｇ／マウスの用量を、静脈内投与した。用量は、選択ラウンド間で異なるウイルス収量に基づいて決定した（図４５）。両方の性別を使用して、性別による偏り最小でカプシドバリアントを回収した。注射の２週間後、マウスを安楽死させ、脳を含むすべての器官を回収し、ドライアイスを用いて急速凍結させ、－８０℃で保管した。
組織からのｒＡＡＶゲノム抽出
最適化。組織からのｒＡＡＶゲノム抽出のために、トリゾール法（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；１５５９６）およびＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ；２７１０４）の両方を製造業者の推奨プロトコールに従って使用し、トリゾール法のほうが効率的であることが判明した。０．１ｇのマウス肝臓からの全ｒＡＡＶゲノム回収量を、ｓｓＡＡＶ－ΔＣａｐ－ｉｎ－ｃｉｓ－Ｌｏｘ２ゲノムのｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ遺伝子に結合するプライマーｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ－Ｆ：５’－ＣＧＡＣＡＣＡＴＧＡＧＴＴＡＣＡＣＡＴＣＴＴＴＧＧＣＴＣ－３’およびｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ－Ｒ：５’－ＧＧＡＧＧＴＣＡＣＣＣＴＴＧＧＴＧＧＡＣＴＴＣ－３’を使用して、定量的ＰＣＲにより定量化した。内部対照として、ミトコンドリアＤＮＡ量（より少ないゲノムの回収の尺度）を、プライマーＭｉｔｏ－Ｆ：５’－ＣＣＣＡＧＣＴＡＣＴＡＣＣＡＴＣＡＴＴＣＡＡＧＴ－３’およびＭｉｔｏ－Ｒ：５’－ＧＡＴＧＧＴＴＴＧＧＧＡＧＡＴＴＧＧＴＴＧＡＴＧＴ－３’を使用して定量化した。１ｎｇの全抽出ＤＮＡ当りのウイルスＤＮＡのパーセンテージは、トリゾール法でよりもＱＩＡｐｒｅｐキットでのほうが約１．５倍高かったが、総合回収率は、ＱＩＡｐｒｅｐキットでのほうが低かった。
抽出されたウイルスゲノムをＳｍａＩ（ＩＴＲ内に見られる）などの制限酵素で消化して、ＰＣＲによるｒＡＡＶゲノム回収率を改善した。これを、Ｃｒｅ＋プライマーであるＣａｐＦ－５６：５’－ＡＴＴＧＧＣＡＣＣＡＧＡＴＡＣＣＴＧ ＡＣＴＣＧＴＡＡ－３’、Ｃｒｅ＋Ｒ－５８：５’－ＣＡＡＧＴＡＡＡＡＣＣＴＣＴＡＣＡＡＡＴＧＴＧＧＴＡＡＡＡＴＣＧ－３’、ならびにＣｒｅ－プライマーであるＣａｐＦ－５６（上記参照）およびＣｒｅ－Ｒ－５７：５’－ＧＴＣＣＡＡＡＣＴＣＡＴＣＡＡＴＧＴＡＴＣＴＴＡＴＣＡＴＧＴＣＴＧ－３’を用いて定量的ＰＣＲにより解析した。
トリゾール法でのｒＡＡＶゲノム抽出。凍結脳半球の半分（おおよそ０．３ｇ）を、２ｍｌガラス製ホモジナイザー（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｄ８９３８）または電動式プラスチック製内筒（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；１２－１４１－３６１、１２－１４１－３６３）（より小さい組織用）で均質化し、以前の研究で説明したように処理した。次いで、抽出されたＤＮＡを、３～６μｌの１０μｇ／μｌ ＲＮａｓｅ Ｃｏｃｋｔａｉｌ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；ＡＭ２２８６）処置してＲＮＡを除去し、ＳｍａＩ制限酵素で消化した。次いで、処置された混合物を、Ｚｙｍｏ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ａｎｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒキット（Ｄ４０３３）で精製した。ディープシークエンシングデータ解析から、ｒＡＡＶゲノム回収のために処理した組織の量は十分であることが観察された。
Ｃｒｅ依存性ＰＣＲによるｒＡＡＶゲノム回収。Ｃｒｅ組換えにより反転されたＬｏｘ部位を有するｒＡＡＶゲノムを選択的に回収し、Ｌｏｘ部位が反転されている場合にのみＰＣＲ産物を生じさせるプライマーを用いてＰＣＲを使用して増幅させた（図３７を参照されたい）。プライマー７１Ｆ：５’－ＣＴＴＣＣＡＧＴＴＣＡＧＣＴＡＣＧＡＧＴＴＴＧＡＧＡＡＣ－３’およびＣＤＦ／Ｒ：５’－ＣＡＡＧＴＡＡＡＡＣＣＴＣＴＡＣＡＡＡＴＧＴＧＧＴＡＡＡＡＴＣＧ－３’を使用し、Ｃｒｅで組み換えられたゲノムを、１０秒間９８℃、３０秒間５８℃そして１分間７２℃の２５サイクルにわたってＱ５ ＤＮＡポリメラーゼを使用して増幅させた。
ＰＣＲ（Ｃｒｅ非依存性）による全ｒＡＡＶゲノム回収。組織からすべてのｒＡＡＶゲノムを回収するために、プライマーＸＦ（５’－ＡＣＴＣＡＴＣＧＡＣＣＡＡＴＡＣＴＴＧＴＡＣＴＡＴＣＴＣＴＣＴＡＧＡＡＣ－３’）および５８８－Ｒ２ｌｉｂ－Ｒ（５’－ＧＴＡＴＴＣＣＴＴＧＧＴＴＴＴＧＡＡＣＣＣＡＡＣＣＧ－３’）を使用して、ゲノムを、１０秒間９８℃、３０秒間６０℃そして３０分間７２℃の２５サイクルにわってＱ５ ＤＮＡポリメラーゼを使用して増幅させた。
ＮＧＳのための試料調製
ディープシークエンシングを使用して選択を解析するために、ｉｎ ｖｉｖｏ選択後のＤＮＡライブラリー、ウイルスライブラリー、および組織ライブラリーを処理して多様な７－ｍｅｒ挿入領域の周りにフローセルアダプターを付加させた（図３７を参照されたい）。
ｒＡＡＶ ＤＮＡおよびウイルスＤＮＡライブラリーの調製。ギブソンアセンブリーを行ったｒＡＡＶ ＤＮＡライブラリー、およびウイルスライブラリーから抽出したＤＮＡを、カプシド上のランダム化７－ｍｅｒ挿入からおよそ５０塩基に位置し、５’末端にリード１およびリード２フローセル配列を含有する、プライマー５８８ｉ－ｌｉｂ－ＰＣＲ１－６ｂｐＵＩＤ－Ｆ：５’－ＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＡＡＮＮＮＮＮＮＡＧＴＣＣＴＡＴＧＧＡＣＡＡＧＴＧＧＣＣＡＣＡ－３’および５８８ｉ－ｌｉｂ－ＰＣＲ１－Ｒ：５’－ＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＴＣＣＴＴＧＧＴＴＴＴＧＡＡＣＣＣＡＡＣＣＧ－３’を使用して、Ｑ５ ＤＮＡポリメラーゼにより増幅させた。
ＮＧＳのためのＤＮＡおよびウイルスライブラリーを最小限に増幅するために使用したプライマーである、５８８ｉ－ｌｉｂ－ＰＣＲ１－６ｂｐＵＩＤ－Ｆ：５’ＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＡＡＮＮＮＮＮＮＡＧＴＣＣＴＡＴＧＧＡＣＡＡＧＴＧＧＣＣＡＣＡ－３’は、ＮＧＳに使用されるリード－１配列の１９ヌクレオチド「５’－ＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ」の後に位置する６ヌクレオチド長ＵＩＤ（一意の識別子）「ＮＮＮＮＮＮ」、およびリンカー「ＡＡ」を有する。ＵＩＤの後の配列「ＡＧＴＣＣＴＡＴＧＧＡＣＡＡＧＴＧＧＣＣＡＣＡ」は、ＡＡＶ９カプシドにアニールする領域である。ＵＩＤは、可能性があるＰＣＲ増幅の誤りを同定するためのＮＧＳデータ解析に最適な特徴部である。しかし、このＵＩＤ特徴部を欠いている組織からのｒＡＡＶゲノム回収に使用したプライマー（プライマー７１Ｆ：５’－ＣＴＴＣＣＡＧＴＴＣＡＧＣＴＡＣＧＡＧＴＴＴＧＡＧＡＡＣ－３’およびＣＤＦ／Ｒ：５’－ＣＡＡＧＴＡＡＡＡＣＣＴＣＴＡＣＡＡＡＴＧＴＧＧＴＡＡＡＡＴＣＧ－３’）との一貫性を維持するために、この研究ではこの特徴部をＮＧＳデータ解析に活用しなかった。ＵＩＤまたはあらゆる種類のオーバーハングは、組織からのＰＣＲに基づく回収に影響を与えるように思われた。恐らく、プライマー熱安定性には、組織から抽出される非常に少量のｒＡＡＶゲノムにおいて果たす重要な役割がある。
５０μｌ反応において５～１０ｎｇの鋳型ＤＮＡを使用して、１０秒間９８℃、３０秒間６０℃そして１０秒間７２℃の４サイクルにわたってＤＮＡを最小限に増幅させた。次いで、混合物をＰＣＲ精製キットで精製した。次いで、溶出されたＤＮＡを第２のＰＣＲで鋳型として使用して、上で説明したのと同じ温度サイクルを使用する１２サイクル反応で推奨プライマー（ＮＥＢ；Ｅ７３３５Ｓ、Ｅ７５００Ｓ、Ｅ７６００Ｓ）によって一意の識別子（単一または二重）を付加させた。次いで、試料を、追加の処理および検証後にディープシークエンシングに送った。
インデックス付加後のＰＣＲ産物を、ゲル上のおおよそ１２０ｂｐのＤＮＡバンドのより良好な分離および回収のための新たに調製した２％低融点アガロースゲル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１６５２００５０）上で泳動させた。試料をＮＧＳに送る前に、ランダム化７－ｍｅｒ位置のヌクレオチド多様性をサンガーシークエンシングにより確かめた。必要に応じて、プライマーＮＧＳ－ＱＣ－Ｆ：５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧ－３’およびＮＧＳ－ＱＣ－Ｒ：５’－ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡ－３’での１０秒間９８℃、３０秒間６０℃そして１０秒間７２℃の１５～２０サイクルを使用するサンガーシークエンシングのために十分な試料を送るために、必要に応じたＰＣＲを実行した。検証し次第、ライブラリーを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２５００ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｌａｒｄ ａｎｄ Ｍｕｒｉｅｌ Ｊａｃｏｂｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃａｌｔｅｃｈ；Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｏｒｅ、Ｃｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ）を使用するディープシークエンシングに送った。
ｒＡＡＶ組織ＤＮＡライブラリーの調製。組織からのＰＣＲ増幅ｒＡＡＶ ＤＮＡライブラリー（セクション：ｉｎ ｖｉｖｏ選択（ｉ）（ｃ）を参照されたい）を、鋳型としてのこのＤＮＡの、プライマー１５２７：５’－ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＧＡＣＡＡＧＴＧＧＣＣＡＣＡＡＡＣＣＡＣＣＡＧ－３’および１５３２：５’－ＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＣＣＴＴＧＧＴＴＴＴＧＡＡＣＣＣＡＡＣＣＧ－３’（これらは、カプシド上のランダム化７－ｍｅｒ挿入物からおよそ５０塩基に位置し、５’末端にリード１およびリード２配列を含有する）に対する、１：１００希釈物を用いて、さらに増幅させた。そのＤＮＡを、１０秒間９８℃、３０秒間５９℃そして１０秒間７２℃の１０サイクルにわたってＱ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ ＭｉｘまたはＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＩＩ Ｑ５ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＮＥＢ；Ｍ０５４４）により増幅させた。混合物をＰＣＲ精製キットで精製した。次いで、溶出されたＤＮＡを第２のＰＣＲで鋳型として使用して、上で（ＤＮＡおよびウイルスライブラリー調製について）説明したのと同じ温度サイクルでの１０サイクル反応で推奨プライマー（ＮＥＢ；Ｅ７３３５Ｓ、Ｅ７５００Ｓ、Ｅ７６００Ｓ）を使用して一意の識別子（単一または二重）を付加させた。抽出されたＤＮＡを、前のセクションで説明したように、サンガーシークエンシングにより検証してディープシークエンシングに送った。
ＡＡＶベクターのｉｎ ｖｉｖｏ特徴付け
ＡＡＶカプシドバリアントのクローニング。ｐＵＣｍｉｎｉプラスミド上のＭｓｃＩ部位（５８１ＡＡ位にある）からＡｇｅＩ部位（６００ＡＡ位にある）に及ぶ１１－ｍｅｒ置換を有する（７－ｍｅｒ－ｉバリアントの場合は、ＡＡＶ９カプシドからの隣接しているアミノ酸ＡＡ５８７～５８８「ＡＱ」およびＡＡ５８９～５９０「ＡＱ」をコドン改変に付した）重複するフォワードおよびリバースプライマーを使用して、ＡＡＶカプシドバリアントをｐＵＣｍｉｎｉ－ｉＣＡＰ－ＰＨＰ．Ｂ骨格（Ａｄｄｇｅｎｅ ＩＤ：１０３００２）にクローニングした。カスタムｐｙｔｈｏｎスクリプト（コードは、ｇｉｔｈｕｂで入手できるようになるであろう）を使用して、すべてのカプシドバリアントのためのプライマーを設計し、それらは全断片挿入をカバーするので、これらのプライマーを自己アニーリングさせ、ＰＣＲを使用して増幅させて、鋳型ＤＮＡを使用せずにｄｓＤＮＡ断片を生じさせる。それらを、１０秒間９８℃、３０秒間６０℃そして１０秒間７２℃の２０サイクルにわたってＱ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘにより増幅させる。次いで、この断片をギブソンアセンブリー法によりアセンブルしてＭｓｃＩ／ＡｇｅＩ消化ｐＵＣｍｉｎｉ－ｉＣＡＰ－ＰＨＰ．Ｂ骨格にした。骨格上に第２のＭｓｃＩ部位があるが、これをメチル化によってブロックした。次いで、アセンブルされたプラスミドをＮＥＢ Ｓｔａｂｌｅ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ；Ｃ３０４０Ｈ）に導入して形質転換を生じさせ、コロニーをカルベニシリン／アンピシリン－ＬＢ寒天プレートで選択した。
ＡＡＶ－ＰＨＰバリアントをクローニングするために使用したプライマーのリスト：７－ｍｅｒ－ｉおよび３－ｍｅｒ－ｓライブラリーからのバリアントを１１－ｍｅｒ置換と同様にクローニングした。
表6. AAV-PHPバリアントのためのプライマー
Figure 2022526018000027
Figure 2022526018000028
Figure 2022526018000029
Figure 2022526018000030
Figure 2022526018000031
ＡＡＶベクター産生。最適化されたプロトコールを使用して、ＡＡＶベクターを５～１０個の１５０ｍｍプレートから産生し、これにより、成体マウスへの投与に十分な量を得た。
ＡＡＶベクター投与。ＡＡＶベクターを１～１０×１０１１ｖｇの用量で成体の雄マウス（６～８週齢）に後眼窩注射によって静脈内投与した。ＡＡＶ用量は、実験の必要性に応じて決定した。定量化のためのＣＡＧ－ＮＬＳ－ＧＦＰ関連実験を、１×１０１１ｖｇの中等度の用量で行ったが、これは、この用量がＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ特徴付けのために前に決定した用量であったことが前提であった。そうでない場合は、非ＮＬＳゲノム関連実験を３×１０１１ｖｇで行ったが、例外として、Ｃｒｅ－ドライバー系統（ＧＦＡＰ－ＣｒｅまたはＴｅｋ－Ｃｒｅ）、またはより低強度のプロモーターを含有するゲノム（ＧＦＡＰ－ＮＬＳ－ｍＴｕｒｑ）の場合は、用量が１×１０１２ｖｇであった。この高用量は、これらの系における新しいベクターの最大の可能性を理解するために選んだ。
強力な普遍的プロモーターであるＣＡＧを保有するベクターを用いるすべての実験を、３週間インキュベートした。４週間のインキュベーションは、より長い待ち時間が一般に推奨されている、Ｃｒｅドライバー系統または細胞型特異的プロモーターからの発現を伴ったインキュベーションである。２週間のインキュベーションは、ベクターが強力な普遍的プロモーターを有する自己相補的ゲノムを保有した場合のインキュベーションである。
組織処理。３週間の発現後（別段の断り書きがない限り）、マウスを、Ｅｕｔｈａｓｏｌ（ペントバルビタールナトリウムおよびフェニトインナトリウム溶液、Ｖｉｒｂａｃ ＡＨ）で麻酔し、０．１Ｍリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）３０～５０ｍＬ、続いて０．１Ｍ ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）３０～５０ｍｌで経心腔的灌流を行った。この手順の後、すべての器官を採取し、４％ＰＦＡ中、４℃で一晩、後固定した。次いで、組織を洗浄し、０．１Ｍ ＰＢＳおよび０．０５％アジ化ナトリウム中、４℃で保管した。この手順に使用したすべての溶液は、新たに調製したものであった。脳および肝臓については、１００μｍ厚切片をＬｅｉｃａ ＶＴ１２００ビブラトームで切断した。
血管標識のために、マウスを麻酔し、２０ｍＬの氷冷ＰＢＳ、その後、テキサスレッド標識Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ Ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ（トマト）レクチン（１：１００、Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＴＬ－１１７６）を含有する１０ｍＬの氷冷ＰＢＳで経心腔的灌流を行い、次いで、固定のために３０ｍＬの氷冷４％ＰＦＡに入れた。
免疫組織化学的検査。先ず、組織切片－典型的には１００μｍ厚－を、適切な希釈度の一次抗体を含有するブロッキング緩衝液（０．１Ｍ ＰＢＳ、ｐＨ７．４中の１０％正常ロバ血清、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００および０．０１％アジ化ナトリウム）中で２４時間、室温で、揺動装置を用いてインキュベートした。この研究に使用した一次抗体は、ウサギＳ１００（１：４００、Ａｂｃａｍ、ａｂ８６８）、ウサギＯｌｉｇ２（１：４００；Ａｂｃａｍ、ａｂ１０９１８６）、ウサギＮｅｕＮ（１：４００、Ａｂｃａｍ、ａｂ１７７４８７）、およびウサギＧＬＵＴ－１（１：４００；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ、０７－１４０１）であった。一次抗体インキュベーション後、組織を１～３回、合計５～６時間にわたって洗浄緩衝液（０．１Ｍ ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４中の０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）で洗浄した。次いで、二次抗体を適切な希釈度で含有するブロッキング緩衝液中で１２～２４時間、室温で組織をインキュベートし、次いで、５～６時間の合計時間にわたって０．１Ｍ ＰＢＳ、ｐＨ７．４中で３回洗浄した。この研究で使用した二次抗体は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ、７１１－６０５－１５２）であった。核染色を行う場合、４’，６－ジアミジン－２’－フェニルインドール・二塩酸塩（ＤＡＰＩ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、１０２３６２７６００１）を、０．１Ｍ ＰＢＳ、ｐＨ７．４中１：１０００希釈度で使用し、１５分間組織とともにインキュベートし、その後、０．１Ｍ ＰＢＳ、ｐＨ７．４中で１０分間の単回洗浄を行った。ＤＡＰＩおよび／または抗体染色組織切片を、ＰｒｏＬｏｎｇ Ｄｉａｍｏｎｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔａｎｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐ３６９７０）でマウントした。
組織におけるハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）に基づくＲＮＡ標識。蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション連鎖反応（ＦＩＴＣ－ＨＣＲ）を使用して、興奮性ニューロンをＶＧＬＵＴ１で、および抑制性ニューロンをＧＡＤ１で標識して、適合する第３世代ＨＣＲプロトコールを使用して脳組織内のＡＡＶカプシドバリアントＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｎを特徴付けた。脳組織内のＡＡＶカプシドバリアントＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｎを特徴付けるために、興奮性および抑制性ニューロンを標識するためのＨＣＲ法を模索した。蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション連鎖反応（ＦＩＴＣ－ＨＣＲ）を使用して、興奮性ニューロンをＶＧＬＵＴ１で、および抑制性ニューロンをＧＡＤ１で標識した。第３世代ＨＣＲを適応させて、特注のソフトウェア（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ＧｒａｄｉｎａｒｕＬａｂ／ＨＣＲｐｒｏｂｅ）を使用することにより１３プローブセットを標的ごとに設計した。３週間の発現後、前に説明したように（セクションＤ．組織処理）、マウスの経心腔的灌流および固定を行った。４％ＰＦＡ中での一晩の固定後の固定された組織内のＲＮａｓｅ酵素曝露を最小限に抑えるために、組織を洗浄し、０．１Ｍ ＲＮａｓｅ不含ＰＢＳおよび０．０５％アジ化ナトリウム中、４℃で保管した。採取した脳を、これ以降は、ＲＮＡｌａｔｅｒ安定化溶液／ＲＮａｓｅ不含ＰＢＳ／ＲＮａｓｅＺａｐ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＡＭ７０２１、ＡＭ９６２４、ＡＭ９７８０）などの試薬を使用してＲＮａｓｅへの曝露を回避するように注意して取り扱った。採取した脳を矢状方向にスライスして１００μｍ厚の切片にしたら、ＦＩＴＣ－ＨＣＲを行って両方の遺伝子を検出した。組織スライスを、０．１Ｍ ＲＮａｓｅ不含ＰＢＳ中の０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を用いて１時間、ＲＴで透過処理し、ハイブリダイゼーション溶液（２×ＳＳＣ緩衝液（食塩水－クエン酸ナトリウム）中の１０％デキストラン硫酸および１０％炭酸エチレン）中で＞３０分間、３７℃でプレハイブリダイズした。設計したプローブをハイブリダイゼーション溶液で希釈して２ｎＭの最終濃度を得た。次いで、組織切片を一晩、３７℃でのプローブとのハイブリダイゼーションに付した。この後、切片を、３７℃で３０分間、予温した洗浄緩衝液（２×ＳＳＣ中の１０％炭酸エチレン）で２回、その後、ＲＴで３０分間、２×ＳＳＣで２回、洗浄した。ヘアピンペア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＣＡ）を用いる増幅は、増幅緩衝液（２×ＳＳＣ中の１０×デキストラン硫酸）中で行った。ヘアピンを、９５℃で９０秒間、その後、ＲＴで３０分間、急冷し、増幅緩衝液（６０ｎＭ）で希釈した。次いで、組織を、ヘアピンを含有するこの増幅緩衝液中で一晩、ＲＴで、穏やかに攪拌しながらインキュベートした。増幅を行ったら、試料を２×ＳＳＣで短時間洗浄し、イメージングのためにＰｒｏｌｏｎｇ Ｄｉａｍｏｎｄでマウントした。
イメージングおよび画像処理。この研究におけるすべての画像は、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ８８０共焦点顕微鏡で対物レンズＦｌｕａｒ ５×０．２５ Ｍ２７、Ｐｌａｎ－Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ １０×０．４５ Ｍ２７（作動距離２．０ｍｍ）、およびＰｌａｎ－Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ ２５×０．８ Ｉｍｍ Ｃｏｒｒ ＤＩＣ Ｍ２７ マルチイマージョンのいずれかを使用して取得したか、またはＫｅｙｅｎｃｅ ＢＺ－Ｘ７００顕微鏡で取得した。取得した画像を、Ｚｅｎ Ｂｌａｃｋ ２．３ ＳＰ１（Ｚｅｉｓｓ）、ＢＺ－Ｘ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｋｅｙｅｎｃｅ）、Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｏｒ ＣＣ ２０１８（Ａｄｏｂｅ）、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（登録商標） ＣＣ ２０１８（Ａｄｏｂｅ）、およびＩｍａｒｉｓ（Ｂｉｔｐｌａｎｅ）で処理した。複数の蛍光スペクトルの重複に起因する一切のイメージングアーチファクトを防止するために、蛍光励起および発光スペクトルを、個々の色の推奨線形分離取得後に個別に保持した。任意の追加のマーカー染色に遠赤外蛍光色素を選んで、イメージングパラメーターをｉｎ ｖｉｖｏ蛍光発現とは個別に保持することによって、検出器チャネル間の一切のスペクトルの重複を防止した。取得前に組織を自己蛍光またはイメージングアーチファクトについて定期的にモニターし、必要に応じて、イメージングパラメーターを調整した。一切のイメージングアーチファクトを回避するために、ｉｎ ｖｉｖｏ形質導入のない組織を用いてイメージングパラメーターをクロスチェックした。比較中の偏りを最小限に抑えるために、画像に使用した領域を実験群間で厳密に一致させた。
組織清浄化および厚い組織のイメージング。マウス脳半球または大腿骨の半分などの、厚い組織を越えて血管系に形質導入するＰＨＰ．Ｖ１の能力を実証するために、Ｔｅｋ－Ｃｒｅマウスからの組織を４週間の発現後に評価した。
脳半球を、一次抗体である抗ＧＦＰ（Ａｖｅｓ Ｌａｂｓ、ＧＦＰ－１０２０）、および二次抗体であるヤギ抗ニワトリＩｇＹ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａ－２１１０３）で染色し、ｉＤＩＳＣＯプロトコール３８によって清浄化した。イメージングのために、市販のライトシート顕微鏡（Ｌａｖｉｓｉｏｎ ＢｉｏＴｅｃ）と特別注文の対物レンズ（４×）を使用した。得られた画像ファイルをカスタムＭＡＴＬＡＢ（登録商標）スクリプトが再編成して、ＴｅｒａＳｔｉｔｃｈｅｒでのステッチングを可能にした。３Ｄ可視化には、Ｉｍａｒｉｓ（Ｂｉｔｐｌａｎｅ）を使用した。
マウスの大腿骨をイメージングするために、骨を抗体透過のために３００μｍ厚の切片にし、一次抗体である抗ＧＦＰ、および二次抗体であるＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ロバ抗ニワトリＩｇＹ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ、７０３－５４５－１５５）で染色し、次いで、ＴＤＥ（２－２’－チオジエタノール）清浄化法４１によって清浄化した。画像を共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ８８０）で取得し、Ｉｍａｒｉｓソフトウェアで可視化した。
ｉｎ ｖｉｖｏでのｒＡＡＶ形質導入の定量化のための組織処理およびイメージング。ｒＡＡＶ形質導入の定量化のために、６～８週齢の雄マウスにウイルスを静脈内注射し、そのウイルスを（別段の特記がない限り）３週間発現させた。マウスを群にランダムに割り当て、実験者に知らせた。マウスを灌流し、器官をＰＦＡ中で固定した。脳および肝臓を１００μｍ厚切片に切断し、上で説明した通り、異なる細胞型特異的抗体で免疫染色した。画像を、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ８８０共焦点顕微鏡を用いて２５×対物レンズで取得するか、またはＫｅｙｅｎｃｅ ＢＺ－Ｘ７００顕微鏡のいずれかで取得し、群間で直接比較する画像は、同じ顕微鏡および設定で取得し、処理した。
組織内へのＰＨＰ．Ｂファミリーバリアントの形質導入の定量化のために、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ８８０共焦点顕微鏡を用いて２５×対物レンズを１×デジタルズームで使用して画像を取得した。バリアント１つにつきマウスｎ＝３を用いて、４つの脳領域－皮質、線条体、腹側中脳および視床－にわたって画像を取得し、組織を３つの細胞型マーカー（ＮｅｕＮ、Ｏｌｉｇ２、およびＳ１００）で染色した。マウスごとに、細胞型マーカーごとに脳領域１つにつき２画像を取得し、平均値をプロットした。
ＰＨＰ．Ｎ形質導入解析のために、２０×対物レンズを使用してＫｅｙｅｎｃｅ ＢＺ－Ｘ７００顕微鏡で画像を取得した。マウスｎ＝３を用いて、全脳領域をカバーするために４つの脳領域－皮質、線条体、腹側中脳および視床－にわたって３つの細胞型マーカー（ＮｅｕＮ、Ｏｌｉｇ２、およびＳ１００）についての画像を取得した。これは、細胞型マーカーごとにマウス１匹につき、皮質、視床および線条体をカバーするための６～８画像、および腹側中脳をカバーするための２画像を含んだ。マウスごとに、各領域にわたって、画像からの平均値をプロットした。
ＰＨＰ．Ｖ ＧＬＵＴ１＋形質導入解析のために、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ８８０共焦点顕微鏡を用いて２５×対物レンズを１×デジタルズームで使用して画像を取得した。ＧＬＵＴ１＋染色およびＸＦＰ発現がある画像内の明確に異なる血管各々を、形質導入について陽性と判定した。ＣＡＧ－ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎベクターからの発現の定量化を皮質にわたって行った（群ごとにｎ＝３）。各データ点をマウス１匹につき３～２画像の平均値から導き出した。Ｔｅｋ－ＣｒｅおよびＡｉ１４マウス実験については群ごとにｎ＝２で異なる脳領域を定量化した。皮質、小脳、線状体および腹側中脳については、マウスごとに１領域につき３～４画像からの平均値をプロットした。
ＡＡＶベクターのｉｎ ｖｉｔｒｏ特徴付け
ヒト脳微小血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ）（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃａｔ．１０００）を、供給業者により提供された使用説明書に従って培養した。凍結ストックバイアルからのＨＢＭＥＣを、フィブロネクチン被覆Ｔ－７５フラスコにおいて内皮細胞培地（Ｃａｔ．１００１）を使用して培養した（７０００～９０００細胞／ｃｍ２の播種密度）。細胞をフィブロネクチン被覆４８ウェルプレート（増殖面積０．９５ｃｍ２）において推奨播種密度で継代培養し、３７℃で約２４～４８時間、細胞が約７０～８０％コンフルエンスで完全に接着するまで、インキュベートした。ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎをパッケージングしているウイルスベクターを、細胞培養物に１ウェル当り１×１０８または１×１０１０ｖｇのどちらかの用量で添加した（ベクターごとに１用量につき３ウェル）。培地を２４時間後に交換し、培養物を感染後３日の時点で蛍光発現について評価した。供給業者の推奨によって、培養培地を１日おきに交換して細胞培養を維持した。
データ解析
マウス組織におけるｒＡＡＶベクター形質導入の定量化。Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（登録商標） ＣＣ ２０１８ Ｃｏｕｎｔ Ｔｏｏｌを用いて、発現および／または抗体染色が全細胞形態をカバーする細胞型についての手作業の計数を行った。Ｋｅｙｅｎｃｅ Ｈｙｂｒｉｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔソフトウェア（ＢＺ－Ｈ３Ｃ）を使用し、このソフトウェアは、全データセットの中から明確に異なる細胞を容易に検出することができた。異なるマーカーおよび群にわたって計数の一貫性を維持するために、脳のすべての区域におけるすべての群にわたっての定量化を１名に担当させた。
ＧＬＵＴ－１染色血管ならびにｓｓＡＡＶ：ＣＡＧ－ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎおよびｓｓＡＡＶ：ＣＡＧ－ＤＩＯ－ＥＹＦＰの発現について手作業の計数を行い、効率をＧＬＵＴ－１染色に対するＸＦＰ＋血管のパーセンテージとして計算した。ＮｅｕＮ－、Ｏｌｉｇ２－、およびＳ１００－染色細胞を含む、核染色または細胞体染色細胞を定量化するためにも、手作業の計数を行った。効率を細胞マーカー＋細胞に対するＸＦＰ＋細胞のパーセンテージとして計算した。
Ｋｅｙｅｎｃｅ Ｈｙｂｒｉｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔソフトウェア（ＢＺ－Ｈ３Ｃ）は、ＤＮＡ染色剤であるＤＡＰＩと共局在した肝臓の肝細胞中の核局在ＡＡＶゲノムの発現を定量化するために使用し、Ｓ１００細胞マーカーを有するｓｓＡＡＶ：ＧＦＡＰ－２ｘＮＬＳ－ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２ゲノムを対象にした研究にも使用した。
顕微鏡画像にわたっての平均蛍光強度を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して定量化した。バックグラウンド除去のために、および閾値操作を使用して、画像を処理し、平均蛍光強度を測定した。
ＮＧＳデータのアラインメントおよび処理。ＮＧＳ実行からの生ｆａｓｔｑファイルを、多様な領域７×ＮＮＫ（Ｒ１について）または１１×ＮＮＮ（Ｒ２について；これを１１×ＮＮＮとして合成したので）を含有するＡＡＶ９鋳型ＤＮＡ断片にデータをアラインメントする注文作製スクリプト（コードは、Ｇｉｔｈｕｂで入手できるようになるであろう）で処理した。これらのデータセットを処理するためのパイプラインは、配列ごとにディープシークエンシング品質スコアを使用することにより低品質リードを除去するためのデータセットのフィルター処理を含んだ。次いで、バリアント配列を、隣接鋳型配列の検索、および多様な領域のヌクレオチドの抽出（完全文字列照合アルゴリズム）により、シークエンシングリードから回収した。アラインメントされたデータの品質をさらに調査して、一切の誤った配列（例えば、停止コドンを有するもの）を除去した。生データを（補足図１ｅに示されているように）プロットして、すべてのライブラリーにわたって回収の質を研究した。ＲＣ分布に基づいて、本発明者らは、ＰＣＲまたはＮＧＳに基づく誤りの結果として生じた可能性がある、もっともらしく思われる誤った突然変異体を除去するために、二値化法を順応させた。回収された親配列上にＰＣＲ突然変異またはＮＧＳの誤りがあった場合、この親は、誤った配列よりも少なくとも１ラウンド前に存在していなければならず、したがって、ＲＣの差が存在するはずであるというのが、この前提である。
Ｒ１組織ライブラリーについて、急降下が、低カウント配列の長いテールの後の分布曲線の傾きに観察され、より高いカウント範囲に親の変形形態である配列が多いことが見てとれた。ＲＣについての閾値を、そのような誤った突然変異体を除去するように手作業で設定した。次いで、カスタムＰｙｔｈｏｎに基づくスクリプトを使用して、二値化データを、他の箇所で説明したように実験の必要性に基づいて別様に処理した。
ＰＣＲプールおよび合成プールからのＲ２組織ライブラリーについては、Ｒ１と比較して小さいライブラリーサイズを考えて、データを２ステップで二値化した。それぞれの入力ＤＮＡおよびウイルスライブラリー中に存在した組織回収配列のみを（Ｒ１組織ライブラリーと同じ原理に従って、より低カウントのバリアントを入力ライブラリーから除去した後）考慮した。このステップは、低カウントのリードの長いテールを部分的に除去した。第２のステップとして、Ｒ１組織ライブラリーについて説明した二値化を適用した。
真のバリアントが二値化中に失われる可能性があることはもっともらしく思われるが、組織およびウイルスライブラリーにおける低カウントの突然変異体が（ＲＣを入力ライブラリーに対して正規化すると）非常の高いエンリッチメントスコアを有すると思われることが多かったので、この方法は、偽陽性が最小限に抑えた。言い換えると、正および負にエンリッチされたバリアントであって、それらのＮＧＳ ＲＣの信頼度がより高いバリアントに関する選択的調査が、二値化により可能になった。
手作業の二値化法の代替案として、「折り畳み」と呼ばれる必要に応じた誤り補正法を、フィルター処理されたデータセットからの結果をさらに検証するために構築した。この方法は、最低カウントのバリアント（カウント１のバリアント）で開始し、可能性がある親バリアントについて検索するものであり、親バリアントは、１ヌクレオチドずつずれているが、少なくとも２倍高いカウントを有する（変化倍数＝（２ΔＣＴ）（式中、ＣＴは、ＰＣＲサイクル閾値である））。次いで、この誤り補正法は、これらの誤りのある可能性がある配列のカウントをそれらの元の配列に移入し、すべての配列を考慮し終えるまで再帰的に反復する。この誤り補正を二値化データに適用すると、配列の追加の約０．００２～０．０３％が（二値化により捕捉された＞１９％と比較して）捕捉され、これにより、二値化戦略がおおむね成功したことが確証された。
ＮＧＳデータ解析。次いで、アラインメントされたデータを、Ｐｙｔｈｏｎ（Ｇｉｔｈｕｂから入手可能）で記述されるスクリプトを用いて、特別注文のデータ処理パイプラインによって、さらに処理した。異なるライブラリーにわたってのバリアントのエンリッチメントスコア（合計＝Ｎ）を、リードカウント（ＲＣ）から次の式に従って計算した：エンリッチメントスコア＝ｌｏｇ１０［（組織ライブラリー１におけるバリアント１ ＲＣ／ライブラリー１におけるバリアントＮ ＲＣの合計）／（ウイルスライブラリーにおけるバリアント１ ＲＣ／ウイルスライブラリーにおけるバリアントＮ ＲＣの合計）］
Ｒ１選択バリアントとＲ２選択バリアントの間のライブラリー回収を一貫して表すために、Ｒ１選択におけるバリアントのエンリッチメントスコアを推定した。特定のライブラリー内のバリアントの標準スコアを、この式を使用して計算した：標準スコア＝（リードカウント＿ｉ－平均値）／標準偏差。式中、リードカウント＿ｉは、バリアントｉの生コピー数であり、平均値は、特定のライブラリーにわたってのすべてのバリアントのリードカウントの平均値であり、標準偏差は、特定のライブラリーにわたってのすべてのバリアントのリードカウントの標準偏差である。
ＤＮＡおよびウイルスライブラリーは、組織ライブラリーとは異なり完全な試料抽出がなされなかったので、本発明者らは、入力ライブラリー中に存在しなかったが出力ライブラリー中には存在したバリアントに対して推定ＲＣを割り当てた。例えば、Ｒ１ウイルスライブラリーは、Ｒ１組織ライブラリーへの入力ライブラリーである。これらのバリアントが、ディープシークエンシングから回収されるバリアントよりも相対的に低い存在量で見出されると仮定して、推定ＲＣを、ライブラリー内の最低ＲＣ未満である数と定義する。ウイルスライブラリーでは、１．０のＲＣが最低であったので、本発明者らは、すべての欠測バリアントに０．９の推定ＲＣを割り当てた。本発明者らは、Ｒ１ウイルスライブラリーに対して正規化されているＲ１組織ライブラリーのエンリッチメントスコアを計算するために、この方法を使用した（図１ｄ）。これを行って、２選択ラウンドにわたって一貫してライブラリーを表した。しかし、Ｒ１バリアント間の個々のエンリッチメントスコアは、ＲＣを使用してＲ１におけるシグナル対ノイズを分離するための基準に記載の通り、Ｒ２選択に選択されたバリアントに有意な付加価値を与えなかった。
ヒートマップ生成。多様な領域の相対ＡＡ分布をヒートマップとしてプロットする。プロットは、Ｐｙｔｈｏｎ Ｐｌｏｔｌｙプロッティングライブラリーを使用して生成した。カスタム「ｐｅｐａｒｓ」Ｐｙｔｈｏｎパッケージの関数を使用して、Ｐｙｔｈｏｎで記述されたカスタムスクリプトからヒートマップ値を生成した。各ヒートマップは、アミノ酸配列の期待（入力）分布と出力分布の両方を使用する。出力分布は、配列およびそれらのカウントのリストでなければならず、入力分布は、配列およびそれらのカウントのリスト、またはＮＮＫなどの鋳型からの期待アミノ酸頻度、どちらかであり得る。入力と出力の両方について、各配列のカウントに従って各位置のアミノ酸の総カウントにテールを付け、次いでカウントの総計で割り、それによって各位置における各アミノ酸の頻度を得る。次いで、出力と入力の間のｌｏｇ２変化倍数を計算する。入力または出力どちらかのカウントが０であるアミノ酸については、計算を行わない。統計的に有意なアミノ酸の偏り同士を区別するために、ｓｔａｔｓｍｏｄｅｌｓ Ｐｙｔｈｏｎライブラリーを使用して統計検定を行った。２つのアミノ酸カウントがあった場合には、両側、２比率ｚ検定を行い、出力アミノ酸カウントを鋳型からの期待入力頻度と比較するために、１比率ｚ検定を行った。次いで、すべてのｐ値を、ボンフェローニ補正を使用して多重比較用に補正した。次いで、１×１０－４の有意性閾値未満の偏りの差のみの概要をヒートマップ上に示し、他のすべての（有意でない）四角を空のままとした。
クラスタリング解析。ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）（バージョンＲ２０１７ｂ；ＭａｔｈＷｏｒｋｓ）で記述されたカスタムスクリプトを使用して、２ペプチド間の共有ＡＡの数を表す逆ハミング距離を決定した。次いで、Ｃｙｔｏｓｃａｐｅ（バージョン３．７．１５３）ソフトウェアを使用して、バリアントをクラスタリングした。強調表示クラスターを表示するＡＡ頻度プロットを、Ｗｅｂｌｏｇｏ（バージョン２．８．２）を使用して作成した。カウントが１０より大きく、Ｒ２選択後のエンリッチメントが２．５倍より大きい、すべての特有のカプシドバリアントについて、逆ハミング距離（２ペプチド間の共有ＡＡの数を表す）を決定した。このプロセスは、群内の各バリアントと他のすべてのバリアントとを反復的に比較する。次いで、Ｃｙｔｏｓｃａｐｅを使用して、カプシドバリアントをそれらの逆ハミング距離によりクラスタリングした。視覚化のための最小逆ハミング距離を、配列類似性に基づいて手作業で選んだ。
アミノ酸頻度プロットについて、一番下にある数が、１から始まる多様なモチーフの位置を表す。スタック内のアミノ酸のサイズは、ＡＡがモチーフ内のその特定の位置に現れる、特有のクローンの割合を反映する。カラーコードは、ＡＡ特性に基づく。正荷電残基Ｋ、ＲおよびＨは、青色である。負荷電残基ＤおよびＥは、赤色である。アミド含有極性残基ＱおよびＮは、赤紫色である。極性残基ＴおよびＳは、緑色である。高疎水性残基Ａ、Ｌ、Ｖ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、ＭおよびＷは、黒色である。
（実施例３）
多重化されたＣＲＥＡＴＥは、ラウンド－１選択中のカプシドライブラリーの詳細な特徴付けを可能にする
特定の細胞型または器官にエンリッチするバリアントを同定するために、複数の標的にわたっての並行選択を行い、これらの標的にわたっての各カプシドバリアントのエンリッチメントまたは枯渇をマッピングした。
ＤＮＡおよびウイルスライブラリー生成中に、ある特定のカプシドバリアントを過剰表示する偏りが蓄積する可能性があり、これにより、ｉｎ ｖｉｖｏ選択中のそれらの真のエンリッチメントが不明瞭になる。これらの偏りは、ＤＮＡライブラリー内のＰＣＲ増幅の偏りに起因することもあり、または様々なステップ：カプシドアセンブリー、ゲノムパッケージングにわたってのウイルス産生の効率、および精製中の安定性からの、配列の偏りに起因することもある。これを、ｒＡＡＶ－ΔＣａｐ９－ｉｎ－ｃｉｓ－Ｌｏｘ２プラスミド（図３６）中のＡＡＶ９の５８８～５８９位間に挿入されたランダム化７－ｍｅｒライブラリー（図１および２）である、７－ｍｅｒ－ｉライブラリーを用いて調査した。ＤＮＡアセンブリーおよびウイルス精製後のライブラリーの１０～２０×百万（Ｍ）リードの深度までのシークエンシングは、ウイルス産生中のバリアント間の偏りを捕捉するのに十分であり（図３；これらのライブラリー間の約１％バリアント重複にもかかわらず；図３８および３９）、このことにより、５８８～５８９のような許容部位であっても、試料抽出した配列空間に生物学的制約を課すことになることが実証された。ＤＮＡライブラリーは、約１０Ｍの総リード中に９．６Ｍの特有のバリアントの均一な分布（リードカウント（ＲＣ）平均値＝１．０、Ｓ．Ｄ．＝０．０７４）を有し、これは、最小の偏りを指し示していた。対照的に、ウイルスライブラリーは、約２０Ｍの深度内に３．６Ｍの特有のバリアント（ＲＣ平均値＝４．５９、Ｓ．Ｄ．＝１１．１５）を有し、これは、ウイルス産生中のバリアントのサブセットのエンリッチメントを示していた。
ｉｎ ｖｉｖｏ選択のために、７－ｍｅｒ－ｉウイルスライブラリーを、異なる脳細胞型にＣｒｅを発現する成体トランスジェニックマウス１匹当り２×１０１１ｖｇの用量で、ＧＦＡＰ－Ｃｒｅマウスの星状膠細胞に、ＳＮＡＰ２５－Ｃｒｅマウスのニューロンに、およびＴｅｋ－Ｃｒｅマウスの内皮細胞に（Ｃｒｅトランスジェニック系統ごとにマウスｎ＝２；方法を参照されたい）、静脈内注射した。静脈内（ＩＶ）注射の２週間後、脳組織および肝臓組織を採取し、後述の肝臓組織は、この組織にＡＡＶ９が高効率で形質導入するので、対照器官として役割を果たした。ｒＡＡＶゲノムを組織から抽出し、Ｃｒｅ発現細胞に形質導入したカプシドを選択的に増幅させた（図４０～４４）。ディープシークエンシングすると、脳組織から回収された約８×１０４の特有のヌクレオチドバリアント、および脊髄における＜５０のバリアント（これらのうちの約４８％はウイルスライブラリー内で同定された）が、トランスジェニック系統にわたって観察されたため、脳ライブラリーと出発ウイルスライブラリーの間の相対存在量の変化を反映するエンリッチメントスコアで各バリアントを表示した（図４）。
Figure 2022526018000032
このデータセットの２つの特徴が目立つ。第１に、脳組織内で回収されたバリアントは、ウイルス産生後にシークエンシングにより観察された形質転換カプシドライブラリーの分率間で不均衡に表示され、これにより、産生が非対称の選択結果をどのように偏らせるのかが実証された。第２に、カプシドリードカウント（ＲＣ）の分布は、選択後に回収される特有のバリアントの半数より多くが著しく低いリードカウントで現れることを明らかにした。これらのバリアントは、実験操作からの意図されたものでない突然変異体、またはＣＮＳ形質導入の基礎レベルが低いＡＡＶ９様バリアント、どちらかであり得る（図４０）。
（実施例４）
新規ラウンド－２ライブラリー設計は選択結果を改善する
ウイルス産生および回収中の配列の偏りが、事後エンリッチメントスコア付けにかかわらず選択ラウンドにわたって伝播することになることを懸念して、偏りのないライブラリーを、オリゴプール（Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてラウンド－１（Ｒ１）出力（合成プールライブラリー）に基づいて設計した。このライブラリーを、回収されたＲ１ ＤＮＡから直接ＰＣＲ増幅したライブラリーＰＣＲ（ＰＣＲプールライブラリー）と比較した（図５、表７）。
表7: R2選択のための2つの方法間の比較。この表は、合成プールおよびPCRプールR2選択方法による選択設計パラメーターのよい点と悪い点を要約する。
Figure 2022526018000033
合成プールライブラリー設計は、（１）脳および脊髄からのＲ１選択の少なくとも１つに高いリードカウントで存在する約８９５０カプシドバリアントの等モル量（図４０）と、（２）偽陽性を低減させるためのこれらの約８９５０バリアントの（哺乳動物コドン用に最適化された）代替コドン複製と、（３）対照の「スパイクイン」ライブラリー（図７４および７５）とを含み、その結果、１８，０００ヌクレオチドバリアントの全ライブラリーサイズとなった。
予期した通り、両方のラウンド－２（Ｒ２）ウイルスライブラリーは、高い力価（１５０ｍｍ皿当り１０ｎｇのＲ２ ＤＮＡライブラリーにつき約６×１０１１ｖｇ；図４５）を生じさせ、Ｒ２ ＤＮＡからのバリアントの約９９％がウイルス産生後に見られた（図６）。しかし、両方の設計からのＤＮＡおよびウイルスライブラリーの分布には、有意な差があった。ＰＣＲプールライブラリーは、Ｒ１選択の偏りを推進し（図７、４６および４７）、その存在量は、Ｒ１における組織にわたっての以前のエンリッチメントはもちろん、ウイルス産生および試料混合からの偏りも反映する。それに比べて、合成プールＤＮＡライブラリーは、より均一に分布しており、したがって、選択ラウンドにわたっての偏りの増幅が最小限に抑えられる。
ｉｎ ｖｉｖｏ選択については、成体トランスジェニックマウス１匹当り１×１０１２ｖｇの用量を、以前に使用した系統のうちの３つ（Ｃｒｅトランスジェニック系統－ＧＦＡＰ、ＳＮＡＰ２５、Ｔｅｋ－ごとにマウスｎ＝２）はもちろん、Ｓｙｎ－Ｃｒｅ系統（ニューロン用）にも投与した。ＩＶ注射の２週間後、脳試料からのｒＡＡＶゲノムを抽出し、選択的に増幅させ、ディープシークエンシングした（Ｒ１の場合と同様に）。合成プールライブラリーは、ＰＣＲプール脳ライブラリーよりも多数の正にエンリッチされたカプシドバリアント（例えば、ＧＦＡＰ－Ｃｒｅにおけるアミノ酸（ＡＡ）レベルで約７００バリアント／組織ライブラリーに対して約１７００バリアント）を産生した（図８および４８）。合成プールでは、スパイクインライブラリーからのバリアントの約９０％は、予想通り正にエンリッチされた（図４８、中央パネル；図７４）。
ＰＣＲプールライブラリーと合成プールライブラリーの両方から回収されたバリアントのエンリッチメントスコアについての相関度は、各Ｃｒｅトランスジェニック系統で変動し、これは、実験の中でのノイズの存在を実証する（図４９）。合成プールのコドン複製特徴は、各選択の中で必要とされるエンリッチメントのレベルを特定してノイズより高くすることにより、この苦境に対処する（図９、５０および５１）。これは、ＰＣＲプール設計に勝る有意な利点であり、これにより、研究者は、所与の選択におけるエンリッチメントスコアを、確信をもって解釈することが可能になる。
相関が崩れるエンリッチメント度は、Ｃｒｅ系統によって変動するように見える。ＰＣＲプールの不利な点は、それもしくは合成プールが、より大きい「真の」エンリッチメントスコアであるかどうかを確かめる方法がないこと、またはさらには、ある特定のエンリッチメント値に関する懸念の原因がある可能性があることである。これら２つの方法間の正にエンリッチされたバリアント間の相関は、正のエンリッチメントの大きさに伴って改善することが判明した。各実験について、それより低いレベルではスコアの再現性がなくなる、またはノイズが多くなる、エンリッチメントレベルがある。図５０は、本質的に、エンリッチメントスコアが低いほど「真」が多くなるＰＣＲプールも合成プールもないことを実証する。これは、そのコドン複製を用いる合成プール方法論には、それより低いレベルではエンリッチメント値にさらなる予測力がないエンリッチメントレベルを決定するための、内蔵された対照を有するためである。用語「ノイズ」は、特定の実験におけるエンリッチメントの領域であって、それ未満では値がそれらの再現性および予測力を失う、エンリッチメントの領域を指すために本明細書では使用される。ノイズより上のエンリッチメントシグナルを実験により決定することができることによって、研究者は、内部再現性のあるエンリッチメントレベルに焦点を絞り、データ解析することができ、それによって、偽陽性バリアントを選択することまたは根拠に乏しい結論を出すことを回避することができる。
したがって、特定の組織に対して最も高度にエンリッチされたバリアントのみに関心がある場合、ウイルスライブラリーに対するエンリッチメント正規化を伴うＰＣＲプール設計は、ｉｎ ｖｉｖｏ選択のサブセットのために追加の１選択ラウンドを用いる合成プール設計（例えば、Ｔｅｋ－ＣｒｅまたはＳＮＡＰ－Ｃｒｅ）と大きく異ならない可能性がある。しかし、追加の検証なしに、所与のｉｎ ｖｉｖｏ系がＴｅｋ－Ｃｒｅと同様に機能するかどうかを予測することは困難である。これは、標的特異的バリアントが、１つの特定のｉｎ ｖｉｖｏ選択で最高エンリッチメントを獲得することができない多重化選択研究では、非常に重要になる。
（実施例５）
ラウンド－２選択後のＡＡＶカプシドライブラリーの解析
ＤＮＡライブラリーのＡＡ分布は、オリゴプール設計に厳密に一致するが、ウイルス産生は、２位にＡｓｎ（Ｎ）、４位にβ分岐ＡＡ（Ｉ、Ｔ、Ｖ）および５位に正荷電ＡＡ（Ｋ、Ｒ）を有するモチーフを選択した（図１０、５２）。ＢＢＢ横断への適応度は、非常に異なるパターンをもたらした。Ｒ２ウイルスライブラリーと比較して、高度にエンリッチされるバリアント、例えば、５位におけるプロリン（Ｐ）および６位におけるフェニルアラニン（Ｆ）は、優先傾向を共有する。
したがって、脳からすべての末梢器官にわたって正にエンリッチされるバリアントの分布を判定した（図１１、左側）。脳内に高度にエンリッチされる約６０のバリアントは、すべての他の器官にわたって比較的枯渇される（図１１、中央）。スパイクイン対照バリアント（ＡＡＶ９、ＰＨＰ．Ｂ、ＰＨＰ．ｅＢ）の予想された挙動に促されて、１１の新規バリアントをさらなる検証に選び（図１１、右側）、それらは、選択がＰＣＲプールまたはＣＲＥＡＴＥに基づく場合には見落とされていたであろう、いくつかを含んでいた（表８）。
表8:方法間のAAV-PHPカプシドの順位付け。合成プールエンリッチメントスコア(M-CREATEを表す)、PCRプールエンリッチメントスコア(ほぼM-CREATEを表す）、またはPCRプールリードカウント(CREATEを表す)によりR2 Tek-Cre選択から回収されたすべてのカプシド中の選択されたバリアントの順位。最高順位である1から始まり、「回収されない」は、R2シークエンシングデータにおけるバリアントの非存在を表す。
Figure 2022526018000034
Figure 2022526018000035
これらのバリアントを、それらのエンリッチメントに起因して、およびそれらが配列空間に入る場合、選んだ。正にエンリッチされたバリアントは、配列類似性に基づいて明確に異なるファミリーにクラスタリングされることが判明した。上で論じたヒートマップと一致して、エンリッチされたほとんどのバリアントは、共通のモチーフ：１位におけるＴ、２位におけるＬ、５位におけるＰ、６位におけるＦ、および７位におけるＫまたはＬを共有する、選択によって明確に異なるファミリーを形成する（図１２、５３）。このＡＡパターンは、以前に同定したバリアントであるＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ－ＴＬＡＶＰＦＫに酷似している。メンバー間の配列類似性を考えて、本発明者らは、それらが同様にＢＢＢを横断し、中枢神経系を標的とすることができると予測した。
完全に独立して構築され、選択されたライブラリーからのＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ配列ファミリーを２倍回収することができることは、このウイルスライブラリーの配列空間カバレッジが、共通のモチーフを共有するバリアントのファミリーを回収できるほど幅広かったことを確証する。１つだけのバリアント、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂを同定したＣＲＥＡＴＥとは異なり、Ｍ－ＣＲＥＡＴＥによって、このモチーフの重要な化学的特徴を示唆する多様なＰＨＰ．Ｂ様ファミリーが得られた。このファミリー内の配列多様性は、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂの単離が、単に、（約１，３００，０００，０００の理論上の出発ライブラリーサイズを考慮する）以前の研究における幸運ではなかったこと、およびこれが、この特定の実験についての主要なファミリーであることを示唆する。
（実施例６）
ラウンド－２選択からのカプシド回収は、ＢＢＢ侵入およびＣＮＳ形質転換が増強されたＡＡＶ９バリアントのプールをもたらす
この特定の選択におけるＰＨＰ．Ｂファミリーの優位性を考えて、最もエンリッチされたメンバーであるＴＡＬＫＰＦＬを試験した（図１２および１３）。以降、このメンバーをＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｖ１と呼ぶ。ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂとのその配列類似性を考えると多少驚いたことに、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｖ１の指向性は、脳血管細胞への形質導入に偏っている（図１４、５４）。静脈内送達されたとき、普遍的ＣＡＧプロモーターの制御下にある蛍光レポーターを保有するＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｖ１は、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢでの約２０％およびＡＡＶ９での形質導入ほぼなしと比較して、ＧＬＵＴ１＋皮質脳血管系の約６０％に形質導入する（図１４および１６）。血管系に加えて、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｖ１は、皮質Ｓ１００＋星状膠細胞の約６０％にも形質導入した（図１７）。しかし、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｖ１は、星状膠細胞形質導入について、以前に報告したＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢほど効率的でない（星状膠細胞特異的ＧｆＡＢＣ１Ｄプロモーターとともにパッケージングされたとき、図５５）。
静脈内送達による内皮細胞限定の形質導入を必要する応用には、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｖ１ベクターを、３つの異なる系において：（１）Ｃｒｅ依存性発現ベクターを用いて内皮細胞型特異的Ｔｅｋ－Ｃｒｅマウスにおいて（図１５（左側）および図１８）、（２）Ｃｒｅが内皮細胞型特異的ＭｉｎｉＰｒｏｍｏｔｅｒ（Ｐｌｅ２６１）で送達される、蛍光レポーターマウスにおいて（図１５（右側）ならびに図１９および５６から図５８の左欄まで）、および（３）普遍的プロモーターを含有する自己相補的ゲノム（ｓｃＡＡＶ）をパッケージングすることによる野生型マウスにおいて（図５８の右欄）、使用することができる。ｓｃＡＡＶゲノムを使用するＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｖ１による内皮細胞特異的形質導入の機序は、不明であるが、ｓｃＡＡＶゲノムをパッケージングした場合のベクターの指向性のシフトが別のカプシドについて報告されている。
ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｖ１とＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ／ｅＢの間の指向性の劇的な差を考えて、本発明者らは、ＰＨＰ．Ｂ様ファミリー内のいくつかの追加のバリアントを試験した。ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｖ１と１つだけＡＡが異なっていた１つのバリアントであるＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｖ２－ＴＴＬＫＰＦＬは、同様の指向性を有する（図５９～６１）。ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｖ２は、Ｒ１選択ではすべての脳ライブラリーにわたって高い存在量で見出され、Ｒ２では高度にエンリッチされた（図４、１１（右側パネル）、１２、１３および４０）。その配列類似性を考えて、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｖ１のものと同様の指向性が期待された。このことを、ｉｎ ｖｉｖｏで、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ成体マウス（ｓｓＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｖ２：ＣＡＧ－ｍＮｅｏｎｇｒｅｅｎゲノム；成体マウス１匹当り３×１０１１ｖｇ用量；ｎ＝３；図５９）において、Ｔｅｋ－Ｃｒｅマウス（ｓｓＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｖ２：ＣＡＧ－ＤＩＯ－ＥＹＦＰゲノム；成体マウス１匹当り１×１０１２ｖｇ用量；ｎ＝２；図６０）において、およびＧＦＡＰ－Ｃｒｅマウス（ｓｓＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｖ２：ＣＡＧ－ＤＩＯ－ＥＹＦＰ；成体マウス１匹当り１×１０１２ｖｇ用量；ｎ＝２；図６１）において検証した。
ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｖ１とＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂの両方からのほぼ等しい偏差の配列を有する３つの他のバリアントである、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ４－ＴＬＱＩＰＦＫ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ７－ＳＩＥＲＰＦＫ、およびＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ８－ＴＭＱＫＰＦＩ（図１２、１３、２０および２１）は、ニューロンおよび星状膠細胞への形質導入の偏りがあるＰＨＰ．Ｂ様指向性を有する（図２１および６２～６４）。スパイクインライブラリーの中の類似のバリアントである、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ５－ＴＬＱＬＰＦＫおよびＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ６－ＴＬＱＱＰＦＫも、この指向性を共有した（図１３、２０、２１および６２）。
スパイクインライブラリーの性能を評価するために、配列空間内の同様の位置にある２つの高度にエンリッチされたバリアント：ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ６－ＴＬＱＬＰＦＫおよびＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ７－ＴＬＱＱＰＦＫ（図４８（中央パネル）、および５３）を選び、これらは、以前に３－ｍｅｒ－ｓ ＰＨＰ．Ｂライブラリーにおいて同定されたが、今までにｉｎ ｖｉｖｏで検証されたことがなかった。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ成体マウスにおいて、１×１０１１ｖｇの中等度の用量で、これらのバリアントは、ＰＨＰ．Ｂ様指向性も提示した（図２０～２１および６２）。
次いで、このファミリー外のＭ－ＣＲＥＡＴＥの予測力を確かめるために選択した一連のバリアントを調査した：（１）Ｂ－ファミリーからの他の試験したバリアント（図２１）と比較して同様の効率で星状膠細胞におよび低い効率でニューロンに形質導入した、完全に無関係の配列を有する高度にエンリッチされたバリアントである、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｃ１－ＲＹＱＧＤＳＶ（図１２、１３、２０および２１）。（２）Ｒ２合成プールウイルスライブラリーにおいて高い存在度で見られ、脳内で（一致して両方のコドン複製が）負にエンリッチされた、２つのバリアントであって、ＣＮＳへの形質導入が不良であるバリアント（図６３）である、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｘ１－ＡＲＱＭＤＬＳおよびＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｘ２－ＴＮＫＶＧＮＩ（図４６、右側）。（３）ＰＣＲプールＲ２からの脳ライブラリーにおいてより高い存在量で見られた２つのバリアントであって、同じく脳内でＡＡＶ９よりも優れた性能を発揮することができなかったバリアントである、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｘ３－ＱＮＶＴＫＧＶおよびＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｘ４－ＬＮＡＩＫＮＩ（図６５）。
まとめると、これらのＡＡＶバリアントの特徴付けは、いくつかの肝要な点を実証する。第１に、多様な配列ファミリー内には、機能の冗長性と新規指向性の出現の両方の余地がある。第２に、主要なファミリー外の高度にエンリッチされる配列も、増強された機能を所有する可能性がある。第３に、合成プールにおけるコドン複製一致により支えられて、組織にわたってのバリアントのエンリッチメントは、予測に役立ち得る。第４に、合成プールＲ２ライブラリーは、ＰＣＲプールＲ２中に存在する配列のサブセットを含有し、したがって、一部の増強されたバリアントを欠いていることがあるが、ＰＣＲプールを含まない集団には偽陽性がエンリッチされる。
マウスにわたって１８，０００バリアントのプールからのｉｎ ｖｉｖｏ形質導入を、確信をもって予測することができることは、選択プロセスの有意な進歩であり、個々のベクターの進化のためのＭ－ＣＲＥＡＴＥの力を実証する。
（実施例７）
ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢを生じさせるカプシド選択の再調査は、ニューロンに特異的に形質導入するバリアントを明らかにする
ＮＧＳを使用して、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢを生じさせる前のＣＲＥＡＴＥ方法論２７により生成された３－ｍｅｒ－ｓ（ｓ－置換）ＰＨＰ．Ｂライブラリーを再調査した（図２４）。野生型マウスからのＣｒｅ依存性ＰＣＲおよびＲ２肝臓ライブラリーを使用して脳ライブラリーをディープシークエンシングし（Ｃｒｅ媒介逆位にかかわらず、すべてのカプシド配列についてＰＣＲによって処理し）、脳組織内に１５０～２００の正にエンリッチされたカプシドを同定した（図２５、６６および６７）。手短に述べると、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂカプシドの５８７～５９７位（ＡＡＶ９上の５８７～５９０ＡＡに相当するもの）を連続する３つのＡＡの部分において多様化した、再調査３－ｍｅｒ－ｓ ＰＨＰ．Ｂライブラリー（合計約４０，０００バリアント）（図２４）。選択を３つのＣｒｅ－トランスジェニック系統で行った：グルタミン酸作動性ニューロンについてＶｇｌｕｔ２－ＩＲＥＳ－Ｃｒｅ、ＧＡＢＡ作動性ニューロンについてＶｇａｔ－ＩＲＥＳ－Ｃｒｅ、および星状膠細胞についてＧＦＡＰ－Ｃｒｅ。
脳内に正にエンリッチされ、肝臓内に負にエンリッチされたバリアントは、ある特定のＡＡへの有意な偏りを示した：１位におけるＧ、Ｄ、Ｅ；２位におけるＧ、Ｓ（ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢモチーフ、ＤＧを含む）；および９、１０、１１位におけるＳ、Ｎ、Ｐ（図２６および６８）。脳内に正にエンリッチされたバリアントを、それらの配列類似性に従ってクラスタリングし、肝臓内へのそれらの負のエンリッチメント（クラスター内のノードサイズにより表される）により順位付けした。Ｎと呼ばれる明確に異なるファミリーが、ＰＨＰ．Ｂ骨格上の９～１１位にある共通のモチーフ「ＳＮＰ」と合体した（図２７および６９）。
Ｎ－ファミリークラスターのコアバリアント：ＡＱＴＬＡＶＰＦＳＮＰは、Ｒ１およびＲ２選択において高い存在量で見出され、Ｖｇｌｕｔ２およびＶｇａｔ脳組織においてＧＦＡＰと比較して高いエンリッチメントスコアを有し、肝臓組織における負のエンリッチメントを有した（図２５および６６～６９）。ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢとは異なり、このバリアント（ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｎ）は、普遍的ＣＡＧプロモーターがパッケージングされた場合でもＮｅｕＮ＋ニューロンに特異的に形質導入したが、形質導入効率は、脳領域によって変動した（ＶＧＬＵＴ１＋興奮性ニューロンとＧＡＤ１＋抑制性ニューロンの両方を含む、ＮｅｕＮ＋ニューロンにおいて約１０～７０％から；図２８、２９、７０および７１）。
したがって、３－ｍｅｒ－ｓライブラリーを再検査することにより、顕著な細胞型特異的指向性を有するものを含むいくつかの新規バリアントを同定した。Ｖｇｌｕｔ２－ＣｒｅおよびＶｇａｔ－Ｃｒｅマウスをｉｎ ｖｉｖｏ選択に使用したが、ＮＧＳデータセットでの初期の調査からの興奮性および抑制性集団のニューロン亜型特異的形質導入の点で抜きん出ていたバリアントはなかった。この（ストリンジェントな）選択に対する生物学的解決策がこのライブラリーには存在しなかった可能性がある。
（実施例８）
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス株を超えてのカプシドファミリーの調査
ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢのＣＮＳ指向性の増強は、マウス株のサブセットには非存在であった。それは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、ＦＶＢ／ＮＣｒｌ、ＤＢＡ／２、およびＳＪＬ／Ｊでは非常に効率的であり、１２９Ｓ１／ＳｖｉｍＪでは中程度な増強があり、ＢＡＬＢ／ｃＪおよびいくつかの追加の株では増強がなかった。このパターンは、ＰＨＰ．Ｂファミリーからの２つの新たに同定されたバリアントであるＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｖ１およびＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｎに当てはまり（図３０、表９）、これらは、ＢＡＬＢ／ｃＪにおけるＣＮＳに形質導入しなかったが、ＦＶＢ／ＮＪ株には形質導入した（図３１）。しかし、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｖ１は、ヒト脳微小血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ）培養物に形質導入し、その結果、ＡＡＶ９およびＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢと比較して平均蛍光強度が増加した（図７２）。これは、機序の複雑さの可能性を示唆している。
表9: CREATEおよびM-CREATEにより同定されたAAV-PHPベクター。この表は、CREATEおよびM-CREATEを使用して今までに同定されたバリアントの概要を、それらの指向性、およびそれらの発見に関与した親カプシドからの進化ステップとともに提供する。
Figure 2022526018000036
重要なこととして、Ｍ－ＣＲＥＡＴＥは、ＣＮＳ内の細胞に対する形質導入の選択によってエンリッチされる多くの非ＰＨＰ．Ｂ様配列ファミリーを明らかにした。本発明者らは、以前に述べたＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｃ１：ＲＹＱＧＤＳＶはもちろん、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｃ２：ＷＳＴＮＡＧＹ、およびＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｃ３：ＥＲＶＧＦＡＱも、試験した（図３０）。これらは、ＢＡＬＢ／ｃＪおよびＣ５７ＢＬ／６ＪにおいてＣＮＳ形質導入がほぼ等しい、マウス株を問わないＢＢＢ横断の増進を示した（図３２および７３）。まとめると、これらの予備的研究は、Ｍ－ＣＲＥＡＴＥによって、株特異性がない多様なＢＢＢ侵入機序を有するカプシドバリアントを発見することができることを示唆している。
（実施例８）
バリアントＡＡＶカプシドタンパク質配列の例示的挿入
ＡＡＶカプシド内への７アミノ酸ペプチド挿入の実証：ペプチド配列「ＴＬＱＩＰＦＫ」（配列番号４３５）をＡＡＶカプシドのＡＡ５８８～５８９の間に配置する。挿入配列は、下線付きかつ太字である。
Figure 2022526018000037
ＡＡＶカプシド内への１１アミノ酸ペプチド挿入の実証：
ペプチド配列「ＤＧＴＴＬＫＰＦＬＡＱ」（配列番号８６７）を、ＡＡＶカプシドのＡＡ５８７～５９０を置き換えることにより配置する。挿入された配列は、下線付きかつ強調表示されている。
Figure 2022526018000038
Figure 2022526018000039
（実施例９）
ハンチントン病（ＨＤ）の処置
ハンチントン病に罹患している対象を同定する。次いで、ハンチンチン（ＨＴＴ）遺伝子の転写を抑制するように操作されたジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）をコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターの第１の量を対象に全身投与する。数ある器官の中でも特に、神経系へのＺＦＰの適切な標的化を可能にするために、図３３で提供されるまたは表２～４で提供されたアミノ酸配列を有する改変ＡＡＶカプシドタンパク質により、ベクターをカプシド内封入することになる。必要に応じて、ＺＦＰの治療有効量が対象の神経系に発現されるまで、ベクターの第２または第３の用量を対象に投与する。
（実施例１０）
第１Ａ相臨床試験
図３３で提供されるまたは表２～４で提供されたアミノ酸配列のいずれかを有する改変カプシドタンパク質によりカプシド内封入されたウイルスベクターを含む試験組成物の静脈内注射１回についての安全性、忍容性、薬物動態および薬力学特性を評価するために、後期ハンチントン病（ＨＤ）に罹患している対象において、第１Ａ相臨床試験を行う。適格対象は、年齢２１～６５歳の間の男性および女性である。
組み入れ基準：適格対象は、年齢２１～６５歳の間の男性および女性である。（１）国際生活機能分類（ＩＣＦ）に署名し、日付を記入する対象、（２）≧２１歳かつ≦６５歳である男性または女性参加者、（３）４０より多いか４０に等しく、かつ５０未満であるか５０に等しい、いくつかのＣＡＧリピートを第４染色体上に有するハンチントン病の証拠となる医学報告書（ＰＣＲ）を提出する参加者（参加者が検査を行っていなかった場合、および／または彼が利用可能な報告書を有さない場合、新たな検査を行うべきである）、（４）登録時点で運動評価ＵＨＤＲＳ尺度（統一ハンチントン病評価尺度）に関して５点またはそれより高いスコア、（５）登録時点でＵＨＤＲＳ尺度の機能的能力に関して８～１１点の間のスコア。
除外基準：（１）研究に登録すると対象にリスクがあると医学研究により判断されるあらゆる医学的観察データ（臨床的および物理的）、（２）研究に登録すると対象にリスクがあると医学研究により判断されるあらゆる臨床検査データ、（４）てんかんの病歴、（５）主要認知障害の診断、（６）活動性非代償性精神疾患、（７）新生物の現病歴または既往歴、（８）胃腸、肝臓、腎臓、内分泌、肺、血液学的、免疫、代謝性病態または重症の管理されていない心血管疾患の現病歴、（８）ウイルス性、細菌性、真菌性である、または別の病原体により引き起こされた、あらゆる活動性感染症の診断、（９）この研究で行われる試験のいずれかを受けることが禁忌である参加者、例えば、ペースメーカーまたは外科用クリップを有する参加者、（１０）アルコール依存症または非合法薬物の乱用者の病歴、（１１）来院Ｖ－４の前の２年間に１回または複数回の自殺エピソードの前歴、（１２）能動喫煙者または禁煙してから登録まで６ヶ月未満、（１３）血清学的検査：ＨＩＶ１および２（抗ＨＩＶ－１、２）、ＨＴＬＶ ＩおよびＩＩ、ＨＢＶ（ＨＢｓＡｇ、抗ＨＢｃ）、ＨＣＶ（抗ＨＣＶ－Ａｂ）およびＶＤＲＬ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）のうちの少なくとも１つについての検査結果陽性、（１４）イメージング用の造影剤、またはウシ由来の製品を含む、薬物アレルギーの病歴、（１５）免疫抑制薬もしくは禁止薬を使用している、または治験薬の初回投与後の最初の３ヶ月間にその使用が予想される、（１６）参加者の登録にとってリスクがあると医学研究者により解釈される、あらゆる臨床的変化。
実験：
プラセボ。０週目にプラセボの注射１回。
高用量試験。０週目に試験組成物２×１０１０ｖｇの注射１回。
中等度用量試験。０週目に試験組成物６×１０９ｖｇの注射１回。
低用量試験。０週目に試験組成物２×１０９ｖｇの注射１回。
最低用量試験。０週目に試験組成物２×１０８ｖｇの注射１回。
主要評価項目：有害事象、バイタルサイン、臨床検査、ＥＣＧ、ならびに良性および悪性新生物の発生の変化を定期的にモニターすることによる試験組成物の安全性［時間枠：５年］。定期的評価から、（１）有害事象、例えば、タイプ、頻度、強度、重篤度、重症度、および治験薬研究に関連して取られる行動など、（２）バイタルサイン（ＢＰ、ＨＲ、腋窩温）、身体検査および健康診断（ＢＭＩ、体重、身長、神経学的評価およびその他で重要視される病状－心血管、肺、消化器系、骨格筋および末梢）、（２）血液学的、生化学的、泌尿器学的および血清学的分析を含んだ臨床検査、（３）１２誘導の心電図（ＥＣＧ）、および（４）臨床検査、磁気共鳴画像法、コンピュータ断層撮影法および超音波検査による次の器官／系：ＣＮＳ、肺、肝臓、脾臓、膵臓、前立腺、精巣、泌尿器系、血管系および骨格系における良性および悪性新生物の発生および分類についての、モニタリング変化を熟考して、治験薬の安全性を詳細に評価することになる。
副次評価項目：全体的な臨床応答によるＣｅｌｌａｖｉｔａ ＨＤ（ＣＩＢＩＳ）およびＵＨＤＲＳ改善［時間枠：５年］の予備的有効性を、ＵＨＤＲＳ尺度の構成要素：運動、認知および行動の各々の結果についての統計的比較により評価することになる。全体的な臨床応答を、Ｃｅｌｌａｖｉｔａ ＨＤ処置の前と後に治験責任医師により観察されるベースラインスコア間の統計的比較によって評価することになる。炎症マーカーの比較によるＣｅｌｌａｖｉｔａ ＨＤの予備的有効性［時間枠：１年］を、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０（インターロイキンＩＬ）およびＴＮＦ－アルファ（腫瘍壊死因子アルファ）を含んだ炎症マーカーの統計的比較により評価することになる。Ｃｅｌｌａｖｉｔａ ＨＤの免疫学的応答［時間枠：１年］。Ｃｅｌｌａｖｉｔａ ＨＤにより誘導される免疫学的応答は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋増殖のベースライン結果と他の評価時点のものとの間の統計的比較により評価することになる。ＣＮＳ評価の比較によるＣｅｌｌａｖｉｔａ ＨＤの予備的有効性［時間枠：１年］。皮質厚計測時の磁気共鳴画像によるＣＮＳ評価の統計的比較により、異なる脳構造、特に基底核の体積を、陽子分光測定で同定される尾状核および代謝変化に注意して評価することになる。ハミルトンうつ病評価尺度（ＨＤＲＳ）による自殺念慮のリスク［時間枠：５年］を自殺ドメインにより評価することになる。句読点（pontuation）による分類は、軽度うつ病（スコア：８～１３）、中等度うつ病（スコア：１９～２２）および重度うつ病（スコア：＞２３）に対応し得る。
本実施例の好ましい事例を本明細書で示し、記載したが、このような事例を単なる例としてのみ提供することは、当業者には明らかであろう。本開示から逸脱することなく、非常に多くの変形形態、変更形態および置換形態がすぐに当業者の心に浮かぶことであろう。本明細書に記載の本開示の事例の様々な代替形態を本開示の実施の際に利用することができることは、理解されるはずである。下記の特許請求の範囲が本開示の範囲を定義すること、およびこれらの特許請求の範囲内の方法および構造ならびにそれらの均等物が、これらの特許請求の範囲に包含されることを意図している
本発明の好ましい実施形態を本明細書で示し、記載したが、このような実施形態を単なる例としてのみ提供することは、当業者には明らかであろう。本発明から逸脱することなく、非常に多くの変形形態、変更形態および置換形態がすぐに当業者の心に浮かぶことであろう。本明細書に記載の本発明の実施形態の様々な代替形態を、本発明を実施の際に利用することができることは、理解されるはずである。下記の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義すること、およびこれらの特許請求の範囲内の方法および構造ならびにそれらの均等物が、これらの特許請求の範囲に包含されることを意図している。

Claims (50)

  1. ａ）ｉ．配列番号１のアミノ酸２１７～アミノ酸７３６と少なくとも９８％同一である第１のアミノ酸配列と、
    ｉｉ．配列番号１内のアミノ酸５８８＿５８９位に挿入された表２～３または図３３で提供されるアミノ酸配列と少なくとも５７．１％同一の第２のアミノ酸配列と
    を含み、対象に全身送達されたときに前記対象の中枢神経系（ＣＮＳ）において測定されたとき、配列番号１で提供される天然ＡＡＶカプシドタンパク質と比較して特異性の増加および形質導入効率の向上のうちの少なくとも一方を特徴とする、ＡＡＶカプシドタンパク質
    を含む、ＡＡＶカプシド。
  2. 前記第２のアミノ酸配列が、表２～３または図３３で提供されるアミノ酸配列と少なくとも７１．４％同一である、請求項１に記載のＡＡＶカプシド。
  3. 前記第２のアミノ酸配列が、表２～３または図３３で提供されるアミノ酸配列と少なくとも８６．７％同一である、請求項１に記載のＡＡＶカプシド。
  4. 前記第２のアミノ酸配列が、ＴＡＬＫＰＦＬ、ＴＴＬＫＰＦＬ、ＴＬＱＩＰＦＫ、ＴＭＱＫＰＦＩ、ＳＩＥＲＰＦＫ、ＲＹＱＧＤＳＶ、およびＴＴＬＫＰＦＳからなる群から選択される、請求項１に記載のＡＡＶカプシド。
  5. 前記ＡＡＶカプシドタンパク質が、前記ＡＡＶカプシドのＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３中に存在する、請求項１に記載のＡＡＶカプシド。
  6. キメラである、請求項１に記載のＡＡＶカプシド。
  7. 前記ＡＡＶカプシドタンパク質の６０コピーがアセンブルされて前記ＡＡＶカプシドになる、請求項１に記載のＡＡＶカプシド。
  8. 前記ＣＮＳが、ニューロン、乏突起膠細胞、星状膠細胞、および脳血管細胞からなる群から選択される細胞型を含む、請求項１に記載のＡＡＶカプシドタンパク質。
  9. 前記ＣＮＳが、脳、視床、皮質、線条体、腹側中脳、および脊髄からなる群から選択される組織を含む、請求項１に記載のＡＡＶカプシド。
  10. 前記ＡＡＶカプシドタンパク質が、アミノ酸置換Ａ５８７ＤまたはＱ５８８Ｇをさらに含む、請求項１に記載のＡＡＶカプシド。
  11. アミノ酸置換Ａ５８９ＮまたはＱ５９０Ｐをさらに含む、請求項１に記載のＡＡＶカプシドタンパク質。
  12. 配列番号１内の前記アミノ酸５８８＿５８９位における前記第２のアミノ酸配列が、ＴＬＡＶＰＦＫでも、ＫＦＰＶＡＬＴでも、ＳＶＳＫＰＦＬでも、ＦＴＬＴＴＰＫでも、ＭＮＡＴＫＮＶでも、ＮＧＧＴＳＳＳでも、ＴＲＴＮＰＥＡでも、ＹＴＬＳＱＧＷでもない、請求項１に記載のＡＡＶカプシド。
  13. 単離され、精製される、請求項１に記載のＡＡＶカプシド。
  14. 前記ＣＮＳの疾患または状態を処置するための静脈内投与用の医薬製剤として製剤化され、前記医薬製剤が、薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１に記載のＡＡＶカプシド。
  15. 前記医薬製剤が、治療剤をさらに含む、請求項１４に記載のＡＡＶカプシド。
  16. 配列番号１で提供されるＡＡＶカプシドタンパク質のアミノ酸配列中のアミノ酸５８８とアミノ酸５８９の間に７アミノ酸挿入物（Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７）を含むＡＡＶカプシドタンパク質を含む、ＡＡＶカプシドであって、
    Ｘ１が、Ｅ、Ｄ、Ｇ、Ｒ、Ｓ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり、
    Ｘ２が、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｔ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、
    Ｘ３が、Ｅ、Ｋ、Ｌ、Ｔ、およびＱからなる群から選択されるアミノ酸であり、
    Ｘ４が、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｔ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸である、ＡＡＶカプシド。
  17. Ｘ５が、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｐ、Ｌ、Ｑ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸である、請求項１６に記載のＡＡＶカプシドタンパク質。
  18. Ｘ６が、Ｆ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸である、請求項１７に記載のＡＡＶカプシドタンパク質。
  19. Ｘ７が、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸である、請求項１８に記載のＡＡＶカプシドタンパク質。
  20. 前記７アミノ酸挿入物が、ＴＡＬＫＰＦＬ、ＴＴＬＫＰＦＬ、ＴＬＱＩＰＦＫ、ＴＭＱＫＰＦＩ、ＳＩＥＲＰＦＫ、ＲＹＱＧＤＳＶ、およびＴＴＬＫＰＦＳからなる群から選択される、請求項１６に記載のＡＡＶカプシド。
  21. 前記ＡＡＶカプシドタンパク質が、前記ＡＡＶカプシドのＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３中に存在する、請求項１６に記載のＡＡＶカプシド。
  22. キメラである、請求項１６に記載のＡＡＶカプシド。
  23. 前記ＡＡＶカプシドタンパク質の６０コピーがアセンブルされて前記ＡＡＶカプシドになる、請求項１６に記載のＡＡＶカプシド。
  24. 前記ＡＡＶカプシドタンパク質が、対象に全身送達されたときに前記対象の中枢神経系（ＣＮＳ）において測定されたとき、配列番号１で提供される天然ＡＡＶカプシドタンパク質と比較して特異性の増加および形質導入効率の向上のうちの少なくとも一方を特徴とする、請求項１６に記載のＡＡＶカプシド。
  25. 前記ＣＮＳが、ニューロン、グリア細胞、乏突起膠細胞、上衣細胞、星状膠細胞、シュワン細胞、衛星細胞、および腸管グリア細胞からなる群から選択される細胞型を含む、請求項２４に記載のＡＡＶカプシドタンパク質。
  26. 前記ＣＮＳが、脳、視床、皮質、線条体、腹側中脳、および脊髄からなる群から選択される組織を含む、請求項２４に記載のＡＡＶカプシド。
  27. 前記ＡＡＶカプシドタンパク質が、Ａ５８７ＤまたはＱ５８８Ｇを含むアミノ酸置換をさらに含む、請求項１６に記載のＡＡＶカプシド。
  28. Ａ５８９ＮまたはＱ５９０Ｐを含むアミノ酸置換をさらに含む、請求項１６に記載のＡＡＶカプシドタンパク質。
  29. 前記７アミノ酸挿入物が、ＴＬＡＶＰＦＫでも、ＫＦＰＶＡＬＴでも、ＳＶＳＫＰＦＬでも、ＦＴＬＴＴＰＫでも、ＭＮＡＴＫＮＶでも、ＮＧＧＴＳＳＳでも、ＴＲＴＮＰＥＡでも、ＹＴＬＳＱＧＷでもない、請求項１６に記載のＡＡＶカプシド。
  30. 単離され、精製される、請求項１６に記載のＡＡＶカプシド。
  31. 前記ＣＮＳの疾患または状態を処置するための静脈内投与用の医薬製剤として製剤化され、前記医薬製剤が、薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１６に記載のＡＡＶカプシド。
  32. 前記医薬製剤が、治療剤をさらに含む、請求項３１に記載のＡＡＶカプシド。
  33. ａ）ｉ．配列番号１のアミノ酸２１７～アミノ酸７３６と少なくとも９８％同一である第１のアミノ酸配列と、
    ｉｉ．配列番号１内のアミノ酸５８８＿５８９位における表４または図３５で提供されるアミノ酸配列と少なくとも５７．１％同一の第２のアミノ酸配列と
    を含み、対象に全身送達されたときに前記対象の肝臓において測定されたとき、配列番号１で提供される天然ＡＡＶカプシドタンパク質と比較して特異性の増加および形質導入効率の向上のうちの少なくとも一方を特徴とする、ＡＡＶカプシドタンパク質
    を含む、ＡＡＶカプシド。
  34. 前記第２のアミノ酸配列が、表４または図３５で提供されるアミノ酸配列と少なくとも７１．４％同一である、請求項３３に記載のＡＡＶカプシド。
  35. 前記第２のアミノ酸配列が、表４または図３５で提供されるアミノ酸配列と少なくとも８６．７％同一である、請求項３３に記載のＡＡＶカプシド。
  36. 前記第２のアミノ酸配列が、ＫＡＹＳＶＱＶ、ＰＳＧＳＡＲＳ、およびＲＴＡＮＡＬＧからなる群から選択される、請求項３３に記載のＡＡＶカプシド。
  37. 前記ＡＡＶカプシドタンパク質が、前記ＡＡＶカプシドのＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３中に存在する、請求項３３に記載のＡＡＶカプシド。
  38. キメラである、請求項３３に記載のＡＡＶカプシド。
  39. 前記ＡＡＶカプシドタンパク質の６０コピーがアセンブルされて前記ＡＡＶカプシドになる、請求項３３に記載のＡＡＶカプシド。
  40. 単離され、精製される、請求項３３に記載のＡＡＶカプシド。
  41. 前記肝臓の疾患または状態を処置するための静脈内投与用の医薬製剤として製剤化され、前記医薬製剤が、薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項３３に記載のＡＡＶカプシド。
  42. 前記医薬製剤が、治療剤をさらに含む、請求項４１に記載のＡＡＶカプシド。
  43. 請求項１から４２のいずれか一項に記載のＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸を含む、組換えベクター。
  44. ａ）請求項４３に記載の組換えベクターを含む第１のベクターと、
    ｂ）ヘルパーウイルスタンパク質をコードする第２のベクターと、
    ｃ）治療用遺伝子発現産物をコードする治療用核酸を含む第３のベクターと
    を含む、キット。
  45. 対象における疾患または状態を処置する方法であって、請求項１から４２のいずれか一項に記載のＡＡＶカプシドタンパク質を含む医薬製剤の治療有効量を投与するステップを含む方法。
  46. 前記疾患または状態が、前記対象の中枢神経系または肝臓の疾患または状態である、請求項４５に記載の方法。
  47. 請求項１から４２のいずれか一項に記載のＡＡＶカプシドから組換えＡＡＶ粒子を製造する方法であって、
    ａ）細胞に、
    ｉ．治療用遺伝子発現産物をコードする第１の核酸配列と、
    ｉｉ．請求項１から４２のいずれか一項に記載のＡＡＶカプシドを発現するように改変されたカプシド（Ｃａｐ）遺伝子を含む組換えウイルスゲノムをコードする第２の核酸配列と、
    ｉｉｉ．ＡＡＶヘルパーウイルスゲノムをコードする第３の核酸配列と
    を含む核酸を導入するステップ；および
    ｂ）前記第１の核酸をカプシド内封入している前記ＡＡＶカプシドを含む前記組換えＡＡＶ粒子をアセンブルするステップ
    を含む方法。
  48. 組換えＡＡＶ粒子を製造する方法であって、
    ａ）ｉ．ＡＡＶカプシド遺伝子と、
    ｉｉ．検出可能であるリコンビナーゼ依存性変化を促進し、２つのＣｒｅ認識部位を含む、Ｃｒｅリコンビナーゼの認識配列と
    を含む組換えＡＡＶゲノムを用意するステップ；
    ｂ）前記Ｃｒｅリコンビナーゼを発現する細胞の集団に前記組換えＡＡＶゲノムをトランスフェクトするステップであって、それによって、前記Ｃｒｅリコンビナーゼが、組換え事象を誘導して前記組換えＡＡＶゲノムのリコンビナーゼ依存性変化を生じさせ、前記リコンビナーゼ依存性変化が、前記Ｃｒｅ認識部位と隣接している配列の逆位を含む、ステップ；
    ｃ）細胞の前記集団中の標的細胞のリコンビナーゼ依存性変化率の増加を検出するステップ；
    ｄ）細胞の前記集団中の標的外細胞の前記リコンビナーゼ依存性変化率の減少を検出するステップ；および
    ｅ）前記リコンビナーゼ依存性変化によって生成される組換えＡＡＶゲノムを同定するステップ
    を含み、前記同定されたｒＡＡＶゲノムが、逆位を含み、前記同定された組換えＡＡＶゲノムが、前記標的細胞に対する特異性の増加および前記標的外細胞に対する特異性の減少を有することを特徴とするＡＡＶカプシド粒子をコードする、方法。
  49. 前記標的外細胞が、肝細胞である、請求項４８に記載の方法。
  50. 前記標的細胞が、ニューロン、グリア細胞、乏突起膠細胞、上衣細胞、星状膠細胞、シュワン細胞、衛星細胞、および腸管グリア細胞からなる群から選択される細胞である、請求項４８に記載の方法。
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