KR20240014846A - Aav2-anks1a 재조합 바이러스를 포함하는 알츠하이머 질병 치료용 조성물 - Google Patents

Aav2-anks1a 재조합 바이러스를 포함하는 알츠하이머 질병 치료용 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR20240014846A
KR20240014846A KR1020220092509A KR20220092509A KR20240014846A KR 20240014846 A KR20240014846 A KR 20240014846A KR 1020220092509 A KR1020220092509 A KR 1020220092509A KR 20220092509 A KR20220092509 A KR 20220092509A KR 20240014846 A KR20240014846 A KR 20240014846A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
anks1a
disease
aav2
brain
amyloid
Prior art date
Application number
KR1020220092509A
Other languages
English (en)
Inventor
박수철
Original Assignee
숙명여자대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 숙명여자대학교산학협력단 filed Critical 숙명여자대학교산학협력단
Priority to KR1020220092509A priority Critical patent/KR20240014846A/ko
Priority to PCT/KR2022/018026 priority patent/WO2024025042A1/ko
Publication of KR20240014846A publication Critical patent/KR20240014846A/ko

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0075—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the delivery route, e.g. oral, subcutaneous
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

AAV2-ANKS1A 재조합 바이러스를 포함하는 알츠하이머 질병 치료용 조성물 이 제공된다. 구체적으로 ANKS1A (Ankyrin Repeat And Sterile Alpha Motif Domain Containing 1A) 단백질이 소포체에서 만들어진 LRP1 수용체와 상호 결합하여, LRP1 수용체의 세포막 수송을 촉진함으로써, 뇌 조직에서 베타 아밀로이드 단백질 배출을 촉진한다는 사실을 개시하고, 뇌혈관에만 특이적으로 감염하는 아데노 연관 바이러스 (AAV)와 재조합하여 퇴행성 뇌 질환의 예방 및 치료에 사용될 수 있는 바이러스를 제공한다.

Description

AAV2-ANKS1A 재조합 바이러스를 포함하는 알츠하이머 질병 치료용 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR TREATING ALZHEHEIMER'S DISEASE COMPRISING AAV2-ANKS1A RECOMBINANT VIRUS}
본 발명은 ANKS1A 유전자가 도입된 재조합 아데노 연관 바이러스(rAAV)를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
최근 급격한 고령화가 사회문제로 부상하였고, 동시에 노인인구의 급격한 증가로 치매(dementia)의 발생률과 유병률이 급격히 증가하고 있다. 치매 환자 및 치매 관리 비용 증가는 전 세계적에 사회 경제적 부담으로 작용하고 있다.
알츠하이머 질병(Alzheimer's Disease, AD)은 치매을 일으키는 가장 흔한 퇴행성 뇌질환으로 서서히 발병하여 기억력을 포함한 인지기능의 악화가 점진적으로 진행되는 특징을 가지며, 전체 치매 환자의 약 75%가 이에 해당하는 것으로 알려져 있다.
알츠하이머 질병(AD)의 정확한 발명 기전과 원인에 대해서는 완전히 밝혀져 있지 않지만, 알츠하이머 질병 환자의 뇌에서 베타 아밀로이드(Amyloid beta; Aβ)라 불리는 단백질 응집체가 공통적으로 발견되며, 과인산화된 타우 단백질에 의한 신경섬유 덩어리가 함께 발견되는 것으로 알려져 있다. 베타 아밀로이드는 일반적으로는 매우 낮은 농도로 존재하며 신경세포의 생리적 기능 중 일부를 담당하지만, 노화가 진행되거나 산화적인 스트레스를 많이 받는 경우, 또는 가족력에 의한 유전적 원인으로 베타 아밀로이드의 항상성 유지에 문제가 생기게 되면 베타 아밀로이드가 축적될 수 있다.
이렇게 축적되는 베타 아밀로이드는 보통 서로 응집되며 저분자의 올리고머(Olig-omer)부터 시작하여 섬유화 또는 플라크(Plaque)라 불리는 큰 응집체까지 다양한 형태로 뇌에 축적된다. 이렇게 뇌에 축적된 베타 아밀로이드는 대뇌 신경계 손상을 유발하고 인지기능을 저하하여, 알츠하이머 치매를 포함한 각종 퇴행성 뇌질환을 유발하는 것으로 알려져 있다.
예전부터 베타 아밀로이드 축적의 주요 원인으로 노화에 따른 뇌 노화 과정에서 아밀로이드 독성 펩타이드가 과도하게 생산되는 것이 지목되어 왔다. 그러나 근래에는 뇌에서 생성된 아밀로이드 펩타이드가 제거되는 과정, 즉, 뇌 내부의 베타 아밀로이드 펩타이드 제거 시스템의 열화가 알츠하이머 발병의 중요한 원인일 수 있다는 연구결과가 나타나고 있다. 특히, 대뇌 혈관의 배출 시스템 (cerebrovascular clearance system)이 정상적으로 기능하지 못하면 뇌 건강이 유지되지 않는 것으로 이해하고 있다.
하지만, 현재까지도 베타 아밀로이드 단백질 제거에 직접적인 영향을 주는 방식의 치료제는 임상 약물 시험에서도 그 효과가 입증되거나 개발된 바 없다. 또한, 임상적으로도 베타 아밀로이드 침착이 심한 경우에도 치매증상을 나타내지 않는 경우와, 베타 아밀로이드 침착이 심한 부위와 뇌 신경퇴행 부위가 불일치하는 경우가 있어, 베타 아밀로이드 단백질와 알츠하이머 치매의 발현에 있어서 추가적인 기전 연구의 필요성이 높게 대두되고 있으며, 새로운 개념의 치료제 개발에 대한 수요가 매우 높다.
본 발명은 ANKS1A 유전자 발현을 이용하여 알츠하이머의 원인물질의 제거를 촉진할 수 있는 알츠하이머 질병의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명의 기술적 과제는 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제는 아래의 기재로부터 해당 기술 분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
일 실시태양에서 퇴행성 뇌 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 ANKS1A 유전자가 도입된 재조합 아데노 연관 바이러스(rAAV)를 유효성분으로 포함할 수 있다.
일 실시태양에서, 상기 재조합 아데노 연관 바이러스(rAAV)가 특이적으로 뇌 혈관 세포를 표적하는 것일 수 있다.
일 실시태양에서, 상기 재조합 아데노 연관 바이러스(rAAV)는 특이적으로 뇌 혈관 세포를 표적하는 아데노 연관 바이러스 2 변이체(AAV2)에 ANKS1A 유전자가 도입된 것 (AAV2-ANKS1A)일 수 있다.
일 실시태양에서, AAV2-ANKS1A는 LRP1 수용체의 세포질 부분의 NPXY 모티프에 결합하는 ANKS1A 단백질을 발현할 수 있다.
일 실시태양에서, 상기 퇴행성 뇌 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 뇌 신경조직에서 베타 아밀로이드를 뇌 혈관으로 배출하는 과정을 촉진할 수 있다.
일 실시태양에서, 상기 퇴행성 뇌 질환은 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨 병, 헌팅턴 병, 다발성경화증(multiple sclerosis),　경도인지장애 (mild cognitive impairment), 대뇌　아밀로이드　맥관병증, 아밀로이드성 뇌졸증 (stroke), 전신성　아밀로이드병, 더취(Dutch) 형　아밀로이드증, 니만-픽병, 노인성 치매, 루이 소체 치매(Lewy Body Dementia), 및 전두측두엽 치매(Frontotemporal Dementia)로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
일 실시태양에서, 상기 퇴행성 뇌 질환은 알츠하이머병(Alzheimer's disease)일 수 있다.
일 실시태양에서, 퇴행성 뇌 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 다음 특성을 나타낼 수 있다: (a) ANKS1A 단백질 (amyloid precursor protein: APP) 발현 촉진; (b) LRP1 수용체의 혈관 세포표면 레벨 증가; 또는 (c) 뇌 혈관으로의 베타 아밀로이드 배출 증가.
일 실시태양에서, ANKS1A 유전자가 도입된 재조합 아데노 연관 바이러스의 제조 방법은 (i) ANKS1A 유전자를 탑재한 전달 플라스미드(transfer plasmid)를 준비하는 단계, (ii) 캡시드 변형된 AAV2 플라스미드와 pAAV2 헬퍼 (helper)를 준비하는 단계 (iii) (i)의 전달 플라스미드, 캡시드 변형된 AAV2 플라스미드 및 상기 헬퍼를 혼합하는 단계, 및 (iv) 혼합된 플라스미드를 패키징 세포주에 형질주입하는 단계를 포함할 수 있다.
일 실시태양에서, 상기 캡시드 변형된 AAV2는 뇌 혈관 세포를 표적하도록 변형된 AAV2인 것일 수 있다.
일 실시태양은 뇌혈관 특이적으로 감염하는 ANKS1A 유전자가 도입된 재조합 아데노 연관 바이러스를 제공할 수 있다.
기타 실시 예들의 구체적인 사항들은 상세한 설명 및 도면들에 포함되어 있다.
본 발명에 따르면, ANKS1A 유전자 결실 또는 단백질 결핍에 의해 대뇌 혈관에서 베타 아밀로이드 펩타이드가 축적되며, 그 결과 개체의 인지 기능이 현저하게 감소되는 것을 확인하였다. 또한, 뇌 혈관 특이적으로 감염하고 ANKS1A 유전자 발현 특성을 가지는 바이러스를 제작하였으며, 이를 인지기능이 저하된 개체에 투여하는 것에 의해 대뇌 혈관에서 베타 아밀로이드 펩타이드 축적을 감소시키고, 인지기능을 정상으로 회복할 수 있다. 따라서, 본 발명의 재조합 바이러스 및 이를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물은 베타 아밀로이드 축적에 의해 유발되는 퇴행성 뇌 질환, 바람직하게는 알츠하이머 질병의 예방 및 치료에 사용될 수 있다.
도 1은 대뇌 신경세포에서 형성되고 분비된 베타 아밀로이드 펩타이드의 배출과정을 도식화한 도이다.
도 2는 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 1 (LRP1; Low density lipoprotein receptor-related protein 1)의 구조를 도식화한 도이다.
도 3은 ANKS1A 유전자 및 ANKS1B 유전자의 구조를 도식화한 도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 ANKS1A 단백질의 역할을 나타내기 위하여 와일드 타입과 ANKS1A 넉아웃 모델에서의 LRP1 수용체의 세포막으로의 이송 과정을 간략히 비교하여 도시한 도이다.
도 5는 ANKS1A가 뇌 혈관에서 특이적으로 발현함을 확인한 LacZ 활성 결과(A)와, ANKS1B가 뇌 혈관에서 특이적으로 발현하지 않음을 확인한 LacZ 활성 결과(B)를 비교하여 나타낸 도이다.
도 6은 ANKS1A가 대뇌 및 해마에 있는 모든 뇌 혈관에서 특이적으로 발현함을 나타낸 X-gal 염색 및 col IV 항체 염색 관찰 결과이다.
도 7은 인간 LRP1의 유사체인 mLRP4-T100의 유전자 구조를 도식화한 도이다.
도 8은 mLRP4-T100 발현 HEK293 세포주에서 ANKS1A 넉아웃되지 않은 경우, ANKS1A 넉아웃된 경우, ANKS1A 넉아웃 후 다시 ANKS1A을 주입한 경우에 대해 HA/DAPI 면역 염색 결과(A) 및 각각의 경우를 정량화하여 표면 LRP 레벨의 유의성을 나타낸 결과(B)를 나타낸 도이다.
도 9는 mLRP4-T100 돌연변이체에 따른 ANKS1A 단백질이 결합 정도를 나타낸 HA/DAPI 면염 염색 결과(A) 및 각각의 경우를 정량화하여 표면 LRP 레벨의 유의성을 나타낸 결과(B)이다.
도 10은 혈관 특이적으로 ANKS1A를 넉아웃한 마우스(ANKS1Af/f; Tie2-Cre 마우스)와 정상 마우스(ANKS1A+/+; Tie2-Cre 마우스)의 해마 및 대뇌 피질의 LRP1 세포 표면 레벨을 IB-4 혈관염색 및 LRP1 면역형광염색하여 나타낸 결과(A) 및 각각의 경우를 정량화하여 표면 LRP 레벨의 유의성을 나타낸 결과(B)이다.
도 11은 혈관 특이적으로 ANKS1A를 넉아웃한 마우스(ANKS1Af/f; Tie2-Cre 마우스)와 정상 마우스(ANKS1A+/+; Tie2-Cre 마우스)의 해마 및 대뇌 피질에서 형광으로 표지 된 베타 아밀로이드 펩타이드의 혈관내 함입 (internalization)된 정도를나타낸 결과(A) 및 도 11B는 각각의 경우를 정량화하여 혈관 내 베타 아밀로이드 펩타이드 양 차이의 유의성을 나타낸 결과(B)이다.
도 12는 ANKS1A유전자를 넉아웃한 알츠하이머 마우스 모델 (ANKS1A-/-;5XFAD 마우스)과 ANKS1A유전자를 넉아웃하지 않은 알츠하이머 마우스 모델 (ANKS1A+/+;5XFAD 마우스)의 뇌 혈관 조직 주변의 베타 아밀로이드 펩타이드의 분포를 나타낸 결과(A)이고, 도 12는 각각의 경우를 정량화하여 혈관 내 베타 아밀로이드 펩타이드 양의 차이에 따른 결과의 유의성을 나타낸 결과(B)이다.
도 13은 ANKS1A유전자를 넉아웃한 알츠하이머 마우스 모델 (ANKS1A-/-;5XFAD 마우스)와 ANKS1A유전자를 넉아웃하지 않은 알츠하이머 마우스 모델 (ANKS1A+/+;5XFAD 마우스)의 뇌 혈관을 Col IV 면역염색하고 누수된 혈액을 마우스 IgG 면역염색하여 나타낸 결과(A)이고, 도 13는 해마 및 대뇌피질에서의 상대 IgG 형광광도를 나타낸 결과(B)이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 ANKS1A 유전자가 도입된 재조합 아데노 연관 바이러스의 제조 과정을 간략히 나타낸 모식도이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 AAV2-GFP를2개월 된 쥐꼬리에 주사한 후 30일 뒤 관찰하여 GFP 발현 부위와 혈관과 위치가 일치함을 나타낸 것이다.
도 16은 본 발명의 Y-메이즈에서 수행한 실험과정의 도식도이다.
도 17은ANKS1A유전자를 넉아웃하지 않은 알츠하이머 마우스 모델 (ANKS1A+/+;5XFAD 마우스), ANKS1A유전자를 넉아웃하였지만 본 발명의 일 실시예에 따른 AAV2-ANKS1A를 주입한 마우스 모델 각각에 대하여 Y-메이즈 실험을 수행한 결과이다.
아래에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명의 실시태양에 대하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시태양에 한정되지 않는다.
명세서 및 청구범위 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
달리 정의되지 않는다면, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 보통 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 또는 동일한 임의의 방법 및 물질이 또한 본 발명의 실행 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질이 이제 기재된다. 본 명세서에서 언급된 모든 간행물은 간행물이 인용되는 것과 관련하여 방법 및/또는 물질을 개시하고 기재하기 위해 본 명세서에 참조로서 포함된다.
본 발명자들은 알츠하이머 질병의 예방 및 치료 효과를 나타낼 수 있는 제제를 개발하기 위해 베타 아밀로이드 단백질의 배출 기전에 영향을 미치는 인자를 밝혀내기 위하여 노력한 결과, ANKS1A (Ankyrin Repeat And Sterile Alpha Motif Domain Containing 1A) 단백질이 소포체에서 만들어진 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 (LRP1, Low density lipoprotein receptor-related protein 1) 수용체와 상호 결합하여 LRP1 수용체의 세포막 수송을 촉진함으로써, 베타 아밀로이드 단백질 배출을 촉진한다는 사실을 밝혀내었다.
주로 대뇌 신경세포에서 형성되고 분비된 베타 아밀로이드 펩타이드들은 불수용성 플라크 (insoluble plaque)를 형성하기 전에 뇌 혈관 표면에 있는 LRP1 수용체에 결합하고, 형성된 결합체는 트랜스시토시스(transcytosis) 과정을 통해 혈관 밖으로 배출되어 혈액과 함께 간으로 운반되어 분해된다. LRP1 수용체는 100개의 아미노산으로 구성된 비교적 짧은 세포질 부분 (cytoplasmic region)을 가진다. ANKS1A 단백질의 유사 단백질인 ANKS1B 단백질은 LRP1의 세포질 부분에 결합하는 것으로 알려져 있으나, ANKS1A 단백질과 LRP1 수용체의 상호 결합여부 및 생물학적 의미는 본 발명에 이르기까지 밝혀진 바가 없었다.
본 발명은 ANKS1A 단백질이 소포체에서 만들어진 LRP1 수용체와 상호 결합하여 LRP1 수용체의 세포막 운반을 촉진한다는 새로운 기전을 밝혀낸 것에 기초한다. 이를 이용하여 ANKS1A 유전자 발현을 통해 뇌 혈관에서 베타 아밀로이드 단백질의 배출을 촉진시킴으로써 베타 아밀로이드 단백질의 축적에 의해 야기되는 퇴행성 뇌 질환, 예를 들어, 알츠하이머 질병의 예방 및 치료에 기여할 수 있다.
특히, 본 발명자들은 표적 부위에 특이적으로 ANKS1A 유전자를 발현시키기 위한 수단을 선별하여 본 발명을 완성하였다. 구체적으로, 본 발명은 뇌 혈관에만 특이적으로 감염하는 아데노 연관 바이러스(AAV, Adeno-associated virus)에 ANKS1A 유전자를 도입한 재조합 AAV 바이러스를 제공한다. 즉, 본 발명의 재조합 AAV 바이러스는 뇌 혈관 세포, 바람직하게는 뇌 혈관 내피세포를 표적하므로 ANKS1A 유전자를 표적 부위에서 특이적으로 발현시킬 수 있다.
본 발명은 ANKS1A 유전자가 도입된 재조합 아데노 연관 바이러스 rAAV를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌 질환, 바람직하게는 알츠하이머 질병 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 "베타 아밀로이드"는 아밀로이드 전구체 단백질 (amyloid　precursor　protein: APP)에서 잘려져 나온 단백질 파편으로, 뇌세포 독성을 일으키고 알츠하이머 질병의 발병원인으로 알려져 있다. 주로 대뇌 신경세포에서 형성되고 분비된 베타 아밀로이드 펩타이드들은 불수용성 플라크 (insoluble plaque)를 형성하기 전에 뇌 혈관 표면에 있는 LRP1 수용체에 결합하고, 트랜스시토시스 과정을 통해 혈관 밖으로 배출되어 간에서 분해된다 (도 1). 본 발명에서 용어 베타 아밀로이드 단백질 또는 베타 아밀로이드는 상호 호환적으로 사용되며, 베타 아밀로이드 펩타이드, 응집체, 플라크 등을 포함한다.
본 발명에서 "LRP1 수용체"는 LDL 수용체 관련 단백질1수용체를 의미하며, 인간 LRP1 수용체일 수 있으나, 이에 한정되지 않고 당업자에게 통용되는 범위 내의 유사체를 포함한다. 도 2를 참조하여, LRP1은 515kDa의 세포 외 알파 사슬과 트랜스 골지 분획 내에서 600kDa의 전구체 폴리펩티드로부터 단백질 분해 절단에 의해 생성된 85kDa의 베타 사슬로 구성된 것일 수 있다. 100개의 아미노산으로 구성된 비교적 짧은 세포질 부분 (cytoplasmic region)을 가질 수 있다. 본 발명의 LRP1 수용체는 세포질 부분에 ANKS1A 단백질과 상호작용하는 모티프를 가지며, 바람직하게는 NPXY 모티프에서 상호작용이 이루어지나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 목적을 달성하는 범위 내에서 유사체, 돌연변이체 및 대체제가 포함됨을 통상의 기술자는 이해할 수 있을 것이다.
일 실시태양에서, LRP1 수용체의 유사체의 하나의 예로서 mLRP4-T100이 고려될 수 있으며, m은 막(membrane), LRP4는 네 번째 리간드 결합 부분, T100은 막횡단 도메일(transmembrane domain) 이후 100개의 세포질 영역을 의미한다. 이는 와일드 타입 LRP1과 동일하게 소포체에서 생성되고 골지체에서 성숙되어 세포막으로 운반되는 수용체이다.
본 발명에서 "ANKS1A　단백질"은 안키린 반복 및 SAM 도메인을 포함하는 단백질 1A(Ankyrin repeat and Sterile Alpha Motif domain-containing protein 1A)로서, 도 3을 참조하여, 7개의 안키린 반복 부위와 SAM 도메인을 포함하고 있는 단백질을 의미한다. ANKS1A　단백질은 포유동물에서 유래된 것일 수 있으며, 예를 들어, 인간, 원숭이, 설치류 등에서 유래된 것일 수 있다. 예를 들어, ANKS1A　단백질은 인간으로부터 유래된 아미노산 서열(NCBI accession No. Q92625.4)을 가질 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시태양에서, ANKS1A 단백질은 뇌 혈관 내피세포에서 LRP1 수용체의 세포질 부분의 NPXY 모티프에 결합할 수 있으나 이에 제한되지는 않으며, 본 발명의 목적을 달성하는 범위 내에서 유사체 및 돌연변이체를 모두 포함한다.
본 발명에서 "ANKS1A　유전자"는 ANKS1A 단백질을 발현하는 유전자로 인간은 6번째 염색체 상(6p21.31)에 존재하고, 염기 서열 (NCBI accession No.NM_015245.2)을 가질 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 "퇴행성 뇌 질환"은 신경계의　신경세포에 점진적이고 꾸준한 사멸로 인한　퇴행성　변화가 나타나면서 여러 가지 증상을 유발하는　질환을 지칭할 수 있으며, 특히, 뇌의 베타 아밀로이드 배출 저하 및 축적에 의해 나타나는 각종 질환을 포괄한다. 　퇴행성 뇌　질환의 예로 알츠하이머 질병, 파킨슨 병, 헌팅턴 병, 다발성경화증,　경도인지장애, 대뇌　아밀로이드　맥관병증, 아밀로이드성 뇌졸증, 전신성　아밀로이드병, 더취(Dutch) 형　아밀로이드증, 니만-픽병, 노인성 치매, 루이 소체 치매, 및 전두측두엽 치매 등을 들 수 있으며, 바람직하게는 알츠하이머 질병일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상호호환적으로 사용되는 용어 "아데노 연관 바이러스" 또는 "AAV"는 아데노 연관 바이러스 자체 또는 이의 유도체를 지칭하는 데 사용될 수 있다. 아데노 연관 바이러스는 데펜도파르보비루스 (Dependoparvovirus) 속에 속하고 다음으로 파르보비리대(Parvoviridae) 과에 속하는 작은 바이러스로, 이 바이러스는 인간 및 특정 영장류를 감염시키지만 질환을 일으키지 않는다. 본 발명에서 이 용어는 모든 하위 유형과 자연 발생 및 재조합 형태를 모두 포함한다. 아데노 연관 바이러스는 치료 유전자 전달을 위한 벡터 시스템으로서 사용될 수 있다.
일 실시태양에서, 아데노 연관 바이러스는 ANSKS1A 유전자 발현을 위한 바이러스 벡터로 사용될 수 있으며, 변형된 것일 수 있다. 일 실시태양에서 본 발명의 아데노 연관 바이러스는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 또는 AAV12, 슈도형, 키메라 또는 이들의 변이체로부터 선택될 수 있고, 바람직하게는 아데노 연관 바이러스 2형 (AAV-2)일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
일 실시태양에서, 아데노 연관 바이러스는 특정 조직 특이성, 예를 들어, 뇌 혈관 특이성이 향상되거나 특정 조직 또는 세포, 예를 들어 뇌 혈관 세포를 특이적으로 표적하도록 변형된 것일 수 있다.
아데노 연관 바이러스는 단일-가닥 DNA를 캡슐화하는　캡시드(Capsid)로 불리는 단백질 쉘로 구성되는데, 캡시드 단백질과 AAV와의 결합 변형 또는 캡시드 단백질의 변형을 이용하여 AAV의 감염성 및 숙주-벡터 관련 특성, 예컨대 적응 면역 반응, 향성, 특이성 등에 영향을 줄 수 있다.
일 실시태양에서, 공지된 방법을 사용하여 뇌혈관 특이적 AAV2 바이러스를 제조할 수 있다 (EMBO Molecular Medicine Vol 8 | No 6 | 2016).
일 실시태양에서, 아데노 연관 바이러스 2의 캡시드(Capsid) 단백질의 특정 부위, 예를 들어, 558번 알지닌 (arginine, R) 위치에 7개의 아미노산으로 구성된 NRGTEWD를 도입하여 뇌 혈관 내피세포를 특이적으로 표적하도록 변형된 것을 사용할 수 있다. 이에 의해 본 발명은 뇌혈관 세포 또는 조직 특이적으로 ANKS1A 유전자를 발현할 수 있다. 조직 또는 세포 특이적 표적하는 바이러스 변이체를 사용하는 경우, 바이러스 변이체는 통상의 기술자에게 공지된 방법으로 제조될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "재조합 아데노 연관 바이러스" 또는 "rAAV"는 AAV에 이종성인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV의 재조합으로 변형된 바이러스를 나타내는 것이고, 바람직하게는 ANKS1A 유전자가 도입된 것일 수 있다.
일 실시태양에서 재조합 아데노 연관 바이러스 ANKS1A 유전자가 뇌 혈관을 표적하는 아데노 연관 바이러스에 도입되어 제조될 수 있다.
일 실시태양에서, ANKS1A 유전자를 탑재한 전달 플라스미드, 캡시드 변형된 AAV2 플라스미드 및 pAAV2 헬퍼를 혼합하여 패키징 세포주에 형질 주입함으로써 ANKS1A가 도입된 재조합 AAV를 제조할 수 있다. 바람직하게는 캡시드 변형된 AAV2 플라스미드는 뇌 혈관 세포를 표적하도록 변형된 AAV2일 수 있다.
본 발명에서 "치료"는 특히 개체 내에서 증상을 감소시키거나 또는 완화하는 것, 악화되거나 또는 진행하는 것에서 증상을 예방, 지연, 감약하는 것, 회복을 촉진하거나 또는 예후를 개선하는 것 또는 질환이 없는 경우에 질환을 예방하는 것을 모두 포함한 임의의 형태의 치료를 의미한다. 소정의 개체에 대해 증상 개선, 그 악화, 퇴행, 또는 진행은 객관적 측정 또는 주관적 측정에 의해 결정될 수 있다. 따라서, "치료" 및 "예방"은 증상의 완전한 제거만을 의미하도록 의도되지 않는다.
본 발명의 용어 "개체"는 본 발명에 따른 치료용 조성물의 투여에 의해 증상이 호전될 수 있는 질병을 가진 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개 등의 동물 또는 인간을 포함한다. 본 발명에 따른 약제학적 조성물을 개체에게 투여함으로써, 질병을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다. 본 발명에 따른 상기 치료방법은 인간을 제외한 동물을 치료하는 방법일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 실시태양에서, ANKS1 유전자가 도입된 재조합 아데노 연관 바이러스를 개체 내에 투여하는 경우, ANKS1A 단백질이 표적 세포, 예를 들어 뇌혈관 내피세포에서 특이적으로 발현될 수 있다. 뇌 혈관에서 발현된 ANKS1A 단백질은 LRP1 수용체의 세포막 수송을 촉진하여, 뇌 조직에서의 베타 아밀로이드의 효과적인 배출을 야기할 수 있다. 도 4에서 본 발명의 일 실시예에 따른 ANKS1A 단백질의 역할을 나타내기 위하여 와일드 타입과 ANKS1A 넉아웃 모델에서의 LRP1 수용체의 세포막으로의 이송 과정을 간략히 비교하여 도시하였다.
본 발명의 일 실시태양은 ANKS1A 유전자가 도입된 재조합 아데노 연관 바이러스를 유효성분을 포함하는 조성물을 포함한다.
본 발명에서, 상기 조성물은 퇴행성 뇌 질환, 바람직하게는 알츠하이머 질환의 예방 또는 치료가 필요한 개체에 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명의 ANKS1A 유전자가 도입된 재조합 아데노 연관 바이러스(rAAV)을 포함하는 조성물은 투여를 위해서 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.
액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 주사용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.
일 실시태양에서, 본 발명의 조성물은 상기 유효성분 이외에 약학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 포함할 수 있으며, 예를 들어, 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등의 가용화제를 사용할 수 있다. 일 실시태양에서, 본 발명의 조성물은 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로 등을 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다. 본 발명의 조성물은 혈액뇌관문을 통과하거나, 또는 내피와 직접 접촉하기 위해 적용되는 처방물로서 투여될 수 있다. 혹은 배양배지에 첨가될 수 있다
본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 레벨은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 그러나 투여 경로, 질환의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 개체에 투여되는 경우, ANKS1A 단백질 (amyloid precursor protein: APP) 발현을 촉진하거나, LRP1 수용체 혈관 세포표면 레벨을 증가시키거나 또는 뇌 혈관으로의 베타 아밀로이드 배출을 증가할 수 있다.
본 발명에 따른 재조합 아데노 연관 바이러스, 바람직하게는 AAV2-ANKS1A 바이러스는 단백질이 특정 조직, 뇌 혈관에 특이적으로 감염되기 때문에, ANKS1A 단백질 발현이 뇌 혈관에 국한되어 형성될 수 있다. 따라서, 알츠하이머 질병 치료제로 사용하는 경우, 기타 조직에서 발생할 수 있거나 야기할 수 있는 병리적인 부작용을 최소화할 수 있다. 또한, AAV 바이러스를 이용한 유전자 치료제로서, 한 번의 감염으로 안정하고 오랫동안 발현을 지속할 수 있다. 특히 분열하지 않는 세포에 감염시키는 것에 의해 반영구적인 효과를 기대할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> ANKS1A의 뇌 혈관 특이적 발현 특성 확인
ANKS1A 유전자가 뇌 혈관에서 특이적으로 발현한다는 점을 확인하기 위하여, ANKS1A 및 ANKS1B 유전자 좌위(genomic locus)에 LacZ 리포터(reporter) 유전자가 도입된 마우스를 각각 준비하였다. LacZ 활성은 ANKS1A 또는 ANKS1B 유전자를 발현하는 조직을 나타내므로 이를 X-gal 염색을 실행하여 확인하였다. 구체적으로, 각각의 마우스가 2개월 되었을 때 전체 뇌를 적출하고 X-gal 염색을 실행한 결과, ANKS1A 유전자 좌위에 LacZ 리포터 유전자가 도입된 마우스(ANKS1A+/LacZ)에서는 ANKS1A 유전자가 뇌 혈관 조직에서 발현됨을 확인하였다. (도 5, A) 반면, ANKS1B 유전자 좌위에 LacZ 리포터 유전자가 도입된 마우스(ANKS1B+/LacZ)에서는 LacZ 활성이 나타나지 않아, ANKS1B 유전자는 뇌 혈관에서 발현하지 않는 것을 확인하였다. (도 5, B) 이어서, ANKS1A+/LacZ 마우스의 뇌의 관상 절편을 준비하고 X-gal 염색과 Col IV 항체 (혈관 염색)로 염색하여 관찰하였다. 그 결과, 대뇌 피질과 해마에 있는 모든 뇌 혈관에서 특이적으로 ANKS1A가 발현하고 있음을 확인하였다. (도 6)
<실시예 2> ANKS1A의 역할 확인-LRP1의 소포체로부터의 방출 촉진
2-1. ANKS1A 단백질의 역할 확인
본 실험에서는 HEK293 세포를 사용하였다. 이 세포는 인간 신장 상피 세포 세포주로서 일반적으로 실험실에서 널리 사용된다. ANKS1A 단백질을 내재적으로 발현하고 있는 대조군으로서 사용하였다. 또, CRISPR-CAS9 방법으로 ANKS1A 단백질이 발현하지 않도록 제작된 세포주를 ANKS1A 넉아웃 세포주(KO-1, KO-2 세포주)로서 실험에 사용하였다. 각각의 세포주에 mLRP4-T100을 발현하고, 세포막에 있는 단백질은 N-말단 부분에 있는 HA를 인식하는 항체로 면역염색(붉은색)하였다. mLRP4-T100은 인간 LRP1의 유사체로서 와일드 타입 LRP1과 동일하게 소포체에서 생성되고 골지체에서 성숙되어 세포막으로 운반되는 수용체의 특성을 가진다. m은 막(membrane), LRP4는 네 번째 리간드 결합 부분, T100은 막횡단 도메일(transmembrane domain) 이후 100개의 세포질 영역을 의미한다. 성숙한 형태 역시 두 부분으로 잘려 있지만, 항상 서로 결합한 complex 형태로 세포막에 존재하며, 도 7에 그 구조를 간략히 도식화하였다.
그 결과 도 8에 나타낸 것처럼, 대조군에서는 mLRP4-T100이 세포막에 많이 존재하고 있으나(A, 1번 패널), ANKS1A가 넉아웃된 KO-1, KO-2에서는 mLRP4-T100이 세포막에 훨씬 적게 존재하였다(A, 2번, 4번 패널).
이어서, ANKS1A 단백질이 mLRP4-T100의 세포막으로 수송되는데 기여하는지 확인하기 위하여 다시 정상적인 ANKS1A를 주입하였다. 그 결과, mLRP4-T100이 세포막에 존재하는 밀도가 높아진 것을 확인하였다. (도 8, A 3번 5번 패널). 이러한 결과를 표면 LRP 레벨로 수치화하여 나타내었으며(도 8, B), 통계적으로 모두 유의성을 나타내었다. 이로부터 ANKS1A 단백질이 소포체에서 생성된 LRP1을 세포막으로 수송하는 역할을 할 것임을 예상할 수 있다. 다음으로, ANKS1A가 LRP1에 결합하는 모티프 부위를 확인하기 위한 실험을 진행하였다.
2-2. ANKS1A 결합 LRP1 수용체 모티프 확인
LRP1의 세포질 부분에 존재하는 두 개의 NPXY, YXXL 모티프 중 어느 부분이 ANKS1A와 상호 작용하는지 확인하고자 mLRP4-T100의 세 가지 돌연변이를 제작하였다. 도 7을 참고하면, N26A는 mLRP4-T100의 세포질 100개의 아미노산 중 26번째 N(아스파라진)이 A(알라닌)으로 치환된 돌연변이를 의미하고, N60A는 mLRP4-T100의 세포질 100개의 아미노산 중 60번째 N(아스파라진)이 A(알라닌)으로 치환된 돌연변이를 의미하고, L66A는 mLRP4-T100의 세포질 100개의 아미노산 중 66번째 L(류신)이 A(알라닌)로 치환된 돌연변이를 의미한다. 정상적인 ANKS1A를 내재적으로 발현하는 HEK293 대조군 세포주에 세 가지 mLRP4-T100 돌연변이 구조체를 발현하고 HA 항체로 면역염색하고 그 결과를 관찰하였다. 그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이 NPXY 모티프 돌연변이가 일어난 mLRP4-T100은 세포막에 매우 적게 존재하는 것을 확인하였다 (도 9, A, 3번, 4 번, 5번 패널). 이러한 결과를 표면 LRP 레벨로 수치화하여 나타내었으며(도 9, B), 통계적으로 모두 유의성을 나타내었다. 이로부터, ANKS1A는 LRP1의 NPXY 모티프와 상호작용을 통해 LRP1 수용체의 세포막으로의 수송을 촉진한다는 점을 확인하였다.
<실시예 3> 뇌 혈관 조직에서 ANKS1A 넉아웃 확인 실험
3-1. LRP1 세포 표면 레벨 감소 확인
뇌 혈관 조직에서 LRP1 세포 표면 레벨이 감소하는지 확인하기 위해, 혈관 특이적으로 ANKS1A를 넉아웃시킨 마우스를 다음의 방식으로 준비하였다. 먼저, ANKS1Af/f 마우스를 준비하였는데 이들은 ANKS1A 유전자 좌위(gene locus) 중 6번 엑손 앞과 8번 엑손 뒤에 loxP 사이트가 각각 있으므로, Cre가 존재하는 환경에서 Cre-lox 재조합 방법에 의해 표적하는 엑손 제거가 가능하다. Cre가 발현 환경을 위해 Tie2 프로모터에 의하여 Cre를 발현하는 Tie2-Cre 마우스로 사용하였다. Tie2는 일반적으로 혈관 내피세포 (endothelial cell)에서만 특이적으로 발현하기 때문에, ANKS1Af/f 마우스에서 Cre-lox 시스템을 이용하여 6,7,8 번 엑손을 제거하였다. 혈관에서 Cre 발현에 의해 ANKS1A 유전자가 혈관 특이적으로 넉아웃된 ANKS1Af/f; Tie2-Cre 마우스 (ANKS1A cKO (conditional knock-out) 마우스)를 사용하였다. 한편, 정상적인 대조군 마우스로서 ANKS1A+/+; Tie2-Cre 마우스를 사용하였다.
각각의 쥐가 2개월이 되었을 때 뇌를 적출하고 비브라톰(vibratome)을 사용하여 200 μm 두께로 관상단면으로 잘라서 사용하였다. 살아있는 절편을 4 ℃에 넣고 LRP1의 세포 밖 부분을 인식하는 항체로 16시간 처리하였다. 다음날 PBS로 여러 번 씻은 다음 뇌조직에 있는 혈관은 IB4로 염색하고 LRP1에 결합된 항체는 형광으로 표지된 2차 항체로 염색하였다. 그 후 공초점 현미경으로 분석하였다. 특히, Imaris software로 혈관은 하얀색, 혈관에 있는 LRP1은 빨간색, 혈관 외에 있는 LRP1은 녹색으로 구분하였다. 그 결과, 대뇌 피질 및 해마에 있는 혈관에서, 대조군의 경우 LRP1의 레벨이 많이 검출되었지만 ANKS1A 유전자가 넉아웃된 마우스의 경우 LRP1의 레벨이 상당히 감소한 것을 확인하였다 (도 10, A).
이러한 결과는 세 개의 마우스 그룹 (대조군 및 넉아웃 마우스로 N=3 pairs)에 대한 실험을 혈관 세포 표면의 LRP1 레벨 수준을 나타내는 방식으로 통계적으로 처리하였을 때 모두 유의성이 있었다. (도 10,B). 즉, 혈관 특이적으로 ANKS1A를 KO 시킨 마우스 뇌 혈관 조직에서 LRP1 세포 표면 레벨이 감소함을 확인하였다.
3-2. 베타 아밀로이드 펩타이드 제거능력이 결여 확인
앞서 실시예 3-1에서 사용한 것과 같은 같은 마우스로부터 같은 방식으로 각각의 절편을 준비하고 베타 아밀로이드 펩타이드를 형광으로 표지 처리하였다. 그 후, 37 ℃에서 30분간 배양하여 펩타이드가 혈관 안으로 잘 들어가도록 유도하였다. 혈관 밖에 남아있는 베타 아밀로이드 펩타이드는 PBS로 여러 번 씻어냈다. 그 결과, 대조군 마우스의 뇌 혈관 조직에는 많은 양의 베타 아밀로이드 펩타이드가 함입(internalization)되었으나, ANKS1A 넉아웃 마우스의 뇌 혈관 조직에서는 상대적으로 적은 수의 펩타이드가 검출됨을 확인하였다. 이러한 차이는 대뇌 피질과 해마에 있는 혈관에서 모두 유사하게 관찰되었다. (도 11, A) 이러한 결과들은 세 개의 마우스 그룹 (N 대조군 및 넉아웃 마우스로 N=3 pairs)을 이용한 실험을 통계적으로 처리하였을 때 모두 유의성이 있었다. (도 11, B) 이로부터, 혈관 특이적으로 ANKS1A 넉아웃한 마우스 뇌 혈관 조직에서 베타 아밀로이드 펩타이드 배출량이 감소함을 확인하였다.
<실시예 4> 알츠하이머 마우스 모델 확인 실험
4-1. ANKS1A 유전자 결실이 뇌 혈관벽 주변의 베타 아밀로이드 펩타이드의 축적에 미치는 영향 분석
ANKS1A가 넉아웃 되면 뇌 혈관 조직 주변에 베타 아밀로이드 펩타이드가 증가하는지를 확인하기 위해 알츠하이머 마우스 모델에서 확인하는 실험을 수행하였다. 일반적인 마우스는 평균 수명이 약 2년으로 알츠하이머 질병에 걸리지 않으므로 인위적으로 치매유발된 형질전환 마우스를 준비하였다. 구체적으로, 인간의 알츠하이머 유발 유전자 5종 (아밀로이드 전구체 단백질(APP, amyloid precursor protein)의 Swedish (K670N/M671L) 돌연변이, Florida (I716V) 돌연변이, 및 London (V717I) 돌연변이, 및 프리세닐린(PSEN1)의 M146L 돌연변이 및 프리세닐린(PSEN1)의 L286V 돌연변이)을 모두 발현하는 5XFAD 마우스를 준비하고 경과를 관찰하였다. 그 결과, 형질전환 후 2 개월부터 대뇌 피질에서 베타 아밀로이드 펩타이드가 축적된 플라크가 관찰되기 시작하였다.
실험을 위하여 5XFAD 마우스와 ANKS1A 넉아웃 마우스를 서로 교배하여 ANKS1A+/+; 5XFAD 마우스를 대조군으로 사용하였고 ANKS1A-/-; 5XFAD 마우스를 실험군으로 관찰하여 ANKS1A 유전자 결실로 인해 알츠하이머 질병이 더 가속화되는지 연구하였다.
먼저, 각 쥐가 5개월이 되었을 때 고정(fixing)된 뇌를 적출하고 관상 절편을 준비한 다음, 혈관은 Col IV 항체로 (붉은색), 베타 아밀로이드 플라크는 6E10 항체로 (녹색)으로 면역염색하고 공초점 현미경으로 분석하였다. 특히 이마리스 소프트웨어(Imaris software)를 이용하여 뇌 혈관 주변에 있는 베타 아밀로이드 플라크만 분석을 수행하였다. 그 결과 ANKS1A-/-; 5XFAD 마우스 대뇌 조직 주변에서 ANKS1A+/+; 5XFAD 마우스보다 베타 아밀로이드 플라크 비율과 크기 (5000 μm3 이상인 것)가 유의성있게 증가한 것을 확인하였다. (도 12, A). 이러한 결과는 대뇌 피질 및 해마에 있는 뇌 혈관 조직 모두에서 나타났다. 또 실험 결과를 정량적으로 혈액 내 플라크 농도 및 1,000 um3 이상 크기 플라크의 혈액 내 농도, 5,000 um3 이상 크기 플라크의 혈액 내 농도에 대하여 그래프화 해서 나타내었고, 통계적 유의성을 보였다. (도 12, B) (N= 4 groups). 이로부터 ANKS1A 결실이 뇌 혈관벽 주변의 베타 아밀로이드 펩타이드의 축적 증가를 야기한다는 것을 확인하였다.
상술한 실험결과로부터 ANKS1A가 뇌 혈관 세포에서 LRP1의 세포표면으로의 운반을 촉진함으로써 LRP1의 베타아밀로이드 제거능력을 촉진한다는 결론을 도출할 수 있다.
4-2. ANKS1A 결실이 뇌 조직으로의 혈액 누수에 미치는 영향 확인
알츠하이머 환자의 뇌 혈관 조직 주변을 관찰해보면, 70% 이상의 환자에서 아밀로이드 플라크가 증가하여 뇌 혈관 장벽 (BBB)이 손상되고, 뇌 혈관에서 혈액 일부가 뇌 조직으로 누수되는 것이 관찰된다. 뇌 혈관에서 뇌 조직으로 누수된 혈액은 뇌 조직에서 염증을 유발하고 신경계 손상을 주는 것으로 알려져있다. 상술한 실험을 통해 ANKS1A 결실이 뇌 혈관 조직에서 아밀로이드 플라크를 증가시키는 것을 확인하였으며, ANKS1A 넉아웃된 알츠하이머 마우스 모델의 뇌 혈관 조직에서 혈관 밀도와 길이가 유의미하게 감소해 있음을 관찰하여 확인하였다. (도시하지 않음).
ANKS1A 결실이 뇌 조직으로의 혈액 누수에 미치는 영향을 관찰하기 위해, 실시예 4-1과 동일한 방식으로 준비된 ANKS1A+/+; 5XFAD 마우스와 ANKS1A-/-; 5XFAD 마우스를 사용하였다. 두 마우스 모델의 혈관을 Col IV 항체로 면역염색(붉은색)하고 누수되고 있는 혈액을 마우스IgG (mIgG) 항체로 면역염색(녹색)하였다. 그 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이, ANKS1A가 넉아웃된 알츠하이머 마우스 모델에서는 혈액 일부가 뇌조직으로 누수가 일어나고 있음을 확인할 수 있었다. (도 13, A) 이를 상대적 mIgG 강도에 대한 그래프로 나타내었고 통계적으로 유의미한 결과를 확인하였다. (도 13, B). 이로부터, 알츠하이머 모델에서 ANKS1A 결실이 뇌 혈관 장벽 약화를 유도하고, 혈액의 누수를 야기한다는 점을 확인하였다.
<실시예 5> 뇌 혈관 특이적 ANKS1A 발현 재조합 바이러스의 제조
5-1 뇌 혈관 특이적 AAV2 바이러스의 확인
AAV2-BR1은 AAV2 (아데노 연관 바이러스 2)의 capsid 단백질의 특정 부위, 즉 558번 알지닌 (arginine, R) 위치에 7개의 아미노산으로 구성된 NRGTEWD를 도입하여 제조될 수 있으며, 마우스 뇌 혈관에 특이적으로 감염된다. (EMBO molecular medicine (2016))
본 발명자는 뇌 혈관 특이적 감염하는 바이러스 벡터의 제조를 확인하기 위하여, 먼저 상술한 방식으로 녹색 형광 단백질 GFP (Green Fluorescent Protein)를 발현하는 AAV2-GFP를 제조하였다. 구체적으로, 벡터빌더(VectorBuilder®)의 벡터제작 서비스를 이용하여 GFP 유전자를 탑재한 전달 플라스미드(transfer plasmid)와 캡시드 변형 pAAV2(modified_Mut_NR) 플라스미드를 제작하였다. GFP 유전자를 탑재한 전달 플라스미드(transfer plasmid)로서 VB010000-9394npt 및 캡시드 변형 pAAV2(modified_Mut_NR) 플라스미드로서 VB210803-1105zyc를 사용하였다. pAAV2-헬퍼를 혼합하여 세포주로서 HEK293에 발현함으로써 GFP 유전자가 도입된 재조합 AAV2 바이러스를 제작하였다 (도 14). 이렇게 제작한 AAV2-GFP 바이러스를 고순도로 정제하고 1013 GC/ml로 농축하였다(약 1013개 이상/1 ml) 정제 및 농축된 바이러스를 2개월 된 마우스 꼬리 정맥에 50 ul 주사한 후 30 일 경과 후 마우스의 뇌를 적출하고 관상 절편을 준비하였다. 혈관을 ZO-1으로 염색하고 공초점 현미경으로 분석한 결과, GFP 발현 위치가 정확히 뇌 혈관임을 확인하였다. (도 15). 대뇌 피질 및 해마를 포함한 거의 모든 뇌 지역의 혈관에서 GFP 발현이 관찰되었으며, 뇌 이외의 지역에서는 발견되지 않았다. (도시되지 않음). 이로부터 뇌 혈관을 표적하는 AAV2 바이러스를 제작하였고, 뇌 혈관 특이적 유전자 전달 벡터로서 기능함을 확인하였다.
5-2. 뇌 혈관 특이적 AAV2 바이러스를 이용한 뇌 혈관 특이적 ANKS1A 발현
GFP 발현 유전자를 탑재한 전달 플라스미드(transfer plasmid) 대신에 ANKS1A를 탑재한 전달 플라스미드(VB210803-1080zfb)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 5-1과 동일한 방식을 사용하여 ANKS1A 발현 유전자가 탑재된 재조합 AAV2 바이러스를 제작하였다. 이렇게 제작한 AAV2-ANKS1A 바이러스를 고순도로 정제되었으며 1013 GC/ml로 농축하였다. 이것을 ANKS1A가 넉아웃된 5XFAD 알츠하이머 마우스(ANKS1A-/-; 5XFAD 마우스)가 2개월 되었을 때 AAV2-ANKS1A를 마우스 꼬리 정맥에 50 ul 주사하고 5개월까지 사육하였다. 대조군으로는 5XFAD 마우스를 사용하여 Y-미로 행동실험을 수행하였다. 사용된 마우스는 모두 5개월 된 수컷만 사용하였다. 구체적으로, Y 모양의 미로에서 3개의 통로 중 한쪽 통로 (arm, 폐쇄 통로)에는 마우스가 못 들어가게 막아놓고 다른 두 개의 arm에만 5분 동안 자유롭게 움직이게 하였다. 이후 30분 동안 케이지로 옮겨서 Y-미로에 대한 기억이 남아있지 않도록 하였다. 적어도 30분이 경과 후, 다시 마우스를 Y-미로에 투입하고, 이번에는 3 개의 통로를 모두 개방하여 5분 동안 세 개의 통로에 자유롭게 통행할 수 있도록 하였다 (시험실험). 이 시험실험동안 마우스가 새로 개방된 통로에 들어간 횟수와 시간을 측정하였다. 이로부터 뇌 인지기능을 상대적으로 비교하였다. 사용된 Y 미로 행동시험 구조를 도 16에 간략히 도시하였다.
그 결과, 대조군인 ANKS1A가 넉아웃되지 않은 알츠하이머 마우스에 비교하여 ANKS1A가 넉아웃된 된 알츠하이머 마우스의 경우 새로 개방된 통로에 들어간 횟수와 새로운 통로에서 머문 시간이 매우 유의미하게 줄어들었다 (도 16). 한편, ANKS1A가 넉아웃되었으나 다시 AAV2-ANKS1A를 주입한 알츠하이머 마우스의 경우, ANKS1A가 넉아웃된 알츠하이머 마우스에 비교하여 새로 개방된 통로에 들어간 횟수와 시간이 유의미하게 증가함을 확인하였다. 특히, 대조군인 ANKS1A 넉아웃 과정을 전혀 거치지 않은 알츠하이머 마우스보다도 인지력이 증가한 것을 확인할 수 있었다. (도 17, 3번 lane).
상기 <실시예 1> 내지 <실시예 5>을 통해 뇌 혈관 특이적 ANKS1A 발현은 알츠하이머 질병에 의해 저하된 인지기능 회복에 매우 효과적이며, ANKS1A 유전자 발현을 이용하여 알츠하이머의 원인물질인 베타 아밀로이드 플라크 제거를 촉진할 수 있음을 확인하였다.
또한, 본 명세서에서는 ANKS1A를 조직특이적으로 발현하도록 하는 수단을 밝혔다. 구체적으로, 뇌 혈관 세포에만 특이적으로 감염하는 아데노 연관 바이러스에 ANKS1A 유전자를 도입하는 것에 의해 ANKS1A 단백질이 뇌 혈관 세포에서 특이적으로 발현된다. 이것은 개체 내에 퇴행성 뇌 질환의 치료 또는 예방 용도로 투여되는 경우 다른 조직에 미칠 부작용을 최소화할 수 있음을 나타낸다. 또한, AAV 바이러스를 이용한 유전자 발현은 한 번의 감염으로 안정하게 오랫동안 발현을 지속할 수 있으며, 안전성이 매우 뛰어나다. 특히 분열하지 않는 세포에 감염하는 경우는 거의 반영구적이며, 따라서, 본 발명의 재조합 바이러스, 예를 들어, AAV2-ANKS1A 바이러스는 뇌 혈관을 표적하여 감염된 이후, 반영구적으로 발현될 수 있다.
본 발명의 AAV2-ANKS1A 재조합 바이러스는 뇌 혈관에서 ANKS1A 발현을 통해 LRP1 수용체 증가 및 베타 아밀로이드 펩타이드 제거 촉진 효과를 나타내므로, 초기 경증 알츠하이머 환자나 MCI 환자에서 뇌에 독성 단백질이 축적되는 것을 예방하거나 치료하는데에 유용하게 사용될 수 있다.
이상 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시태양 및 실시예를 설명하였으나, 본 발명은 상기 실시태영 및 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 제조될 수 있으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (11)

  1. ANKS1A 유전자가 도입된 재조합 아데노 연관 바이러스(rAAV)를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 재조합 아데노 연관 바이러스(rAAV)가 특이적으로 뇌 혈관 세포를 표적하는 것인 퇴행성 뇌 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 재조합 아데노 연관 바이러스(rAAV)는 특이적으로 뇌 혈관 세포를 표적하는 아데노 연관 바이러스 2 변이체(AAV2)에 ANKS1A 유전자가 도입된 것 (AAV2-ANKS1A)인 퇴행성 뇌 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 AAV2-ANKS1A는 LRP1 수용체의 세포질 부분의 NPXY 모티프에 결합하는 ANKS1A 단백질을 발현하는 퇴행성 뇌 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 뇌 신경조직에서 베타 아밀로이드를 뇌 혈관으로 배출하는 과정을 촉진하는 것인 퇴행성 뇌 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 퇴행성 뇌 질환은 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨 병, 헌팅턴 병, 다발성경화증(multiple sclerosis),　경도인지장애 (mild cognitive impairment), 대뇌　아밀로이드　맥관병증, 아밀로이드성 뇌졸증 (stroke), 전신성　아밀로이드병, 더취(Dutch) 형　아밀로이드증, 니만-픽병, 노인성 치매, 루이 소체 치매(Lewy Body Dementia), 및 전두측두엽 치매(Frontotemporal Dementia)로 이루어진 군에서 선택되는 것인 퇴행성 뇌 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 퇴행성 뇌 질환은 알츠하이머병(Alzheimer's disease)인 퇴행성 뇌 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  8. 하기의 특성을 나타내는 제1항의 퇴행성 뇌 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물:
    (a) ANKS1A 단백질 (amyloid precursor protein: APP) 발현 촉진;
    (b) LRP1 수용체의 혈관 세포표면 레벨 증가; 또는
    (c) 뇌 혈관으로의 베타 아밀로이드 배출 증가
  9. (i) ANKS1A 유전자를 탑재한 전달 플라스미드(transfer plasmid)를 준비하는 단계, (ii) 캡시드 변형된 AAV2 플라스미드와 pAAV2 헬퍼 (helper)를 준비하는 단계 (iii) (i)의 전달 플라스미드, 캡시드 변형된 AAV2 플라스미드 및 상기 헬퍼를 혼합하는 단계, 및 (iv) 혼합된 플라스미드를 패키징 세포주에 형질주입하는 단계를 포함하는 ANKS1A 유전자가 도입된 재조합 아데노 연관 바이러스의 제조 방법.
  10. 제10항에 있어서, 상기 캡시드 변형된 AAV2는 뇌 혈관 세포를 표적하도록 변형된 AAV2인 ANKS1A 발현 유전자가 도입된 재조합 아데노 연관 바이러스의 제조 방법.
  11. 뇌혈관 특이적으로 감염하는 ANKS1A 유전자가 도입된 재조합 아데노 연관 바이러스.
KR1020220092509A 2022-07-26 2022-07-26 Aav2-anks1a 재조합 바이러스를 포함하는 알츠하이머 질병 치료용 조성물 KR20240014846A (ko)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020220092509A KR20240014846A (ko) 2022-07-26 2022-07-26 Aav2-anks1a 재조합 바이러스를 포함하는 알츠하이머 질병 치료용 조성물
PCT/KR2022/018026 WO2024025042A1 (ko) 2022-07-26 2022-11-15 Aav2-anks1a 재조합 바이러스를 포함하는 알츠하이머 질병 치료용 조성물

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020220092509A KR20240014846A (ko) 2022-07-26 2022-07-26 Aav2-anks1a 재조합 바이러스를 포함하는 알츠하이머 질병 치료용 조성물

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20240014846A true KR20240014846A (ko) 2024-02-02

Family

ID=89706844

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020220092509A KR20240014846A (ko) 2022-07-26 2022-07-26 Aav2-anks1a 재조합 바이러스를 포함하는 알츠하이머 질병 치료용 조성물

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR20240014846A (ko)
WO (1) WO2024025042A1 (ko)

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060073119A1 (en) * 2004-09-01 2006-04-06 Avigen, Inc. Methods for treating neurodegenerative disorders
GB201403684D0 (en) * 2014-03-03 2014-04-16 King S College London Vector
WO2020210655A1 (en) * 2019-04-11 2020-10-15 California Institute Of Technology Virus compositions with enhanced specificity in the brain

Also Published As

Publication number Publication date
WO2024025042A1 (ko) 2024-02-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2021203044B2 (en) Adeno-Associated Virus Vector Delivery Of B-Sarcoglycan And Microrna-29 And The Treatment Of Muscular Dystrophy
EP3364970B1 (en) Gene therapy for use in treating lysosomal storage disease
JP6309373B2 (ja) Ａａｖベクターの末梢注入を使用する広範囲におよぶ運動ニューロンへの遺伝子の送達
US10647751B2 (en) Production of large-sized microdystrophins in an AAV-based vector configuration
RU2673484C2 (ru) Способы и композиции для лечения амилоидных отложений
JP2022527917A (ja) 導入遺伝子発現のための操作されたアデノ随伴（ａａｖ）ベクター
EP3506930A1 (en) Methods and vectors for treating cns disorders
WO2019152857A1 (en) Methods and materials for treating brain injuries
US11680276B2 (en) Compositions and methods for treating retinal disorders
JP2022543722A (ja) 機能的ニューロン死に関連する神経系疾患の予防および／または治療におけるＰｔｂｐ１阻害剤の使用
KR20240014846A (ko) Aav2-anks1a 재조합 바이러스를 포함하는 알츠하이머 질병 치료용 조성물
US20230340529A1 (en) Adeno-associated virus for delivery of kh902 (conbercept) and uses thereof
JP2023522852A (ja) Ｉｄｓ遺伝子導入のためのアデノ随伴ウイルス組成物及びその使用方法
JP2022526526A (ja) オーバーラップａａｖベクターを使用する大きいサイズのクアシジストロフィンの産生
EP4410988A1 (en) An aav2-vector variant for targeted transfer of genes
US20230048017A1 (en) Adeno-associated virus for delivery of kh902 (conbercept) and uses thereof
KR20230112672A (ko) 신경변성 질환을 위한 유전자 요법
US20230330269A1 (en) Treatment of rpe65-associated eye diseases and disorders
AU2017318717B2 (en) Methods and vectors for treating CNS disorders
WO2023077123A9 (en) Aav-mediated therapies for vision loss associated with friedreich&#39;s ataxia
WO2024079292A1 (en) Gene therapy treatment
JP2022531177A (ja) 神経変性障害を治療するための方法