KR20240028976A - 뇌에서 높은 발현 수준을 갖는 aav 조성물 - Google Patents

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니콜라스 씨. 플라이차니스
니콜라스 에스. 고에든
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캡시다, 인크.
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Abstract

CNS에서 증가된 바이러스 형질도입을 갖는 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)를 포함하는 조성물 및 키트가 본원에 기재된다. 본원에 기재된 rAAV 조성물은 트랜스진, 예컨대 치료 핵산을 캡시드화한다. rAAV를 사용하는 유전자 요법이 기재된다. CNS-관련 질환 및 상태를 치료하는 방법이 또한 기재된다.

Description

뇌에서 높은 발현 수준을 갖는 AAV 조성물
재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)는 분열 및 비-분열 세포 둘 다를 형질도입하는 그의 능력, 감염된 세포에서의 에피솜 DNA로서의 그의 장기간 지속성, 및 그의 낮은 면역원성으로 인해 치료 용도에서 유전자 전달을 위한 벡터로서 널리 사용된다. 이들 특징은 이들을 치료 용도, 예컨대 유전자 요법에서의 적용에 매력적이게 한다. 그러나, 대상체에게 전신 전달 시, 별개의 세포-유형에서 선택적으로 및 효율적으로 발현하기 위해 기존 AAV 혈청형의 성능을 유의하게 개선시킬 필요가 있다. 이러한 필요성은 AAV가 중추 신경계 (CNS)에서 발현되어야 하는 경우에 특히 급성이다.
발명의 개요
비-인간 영장류 (NHP)에서 반복 라운드의 선택을 통해 캡시드 구조 내로 조작된 형질도입을 갖는 rAAV가 본원에 개시되며, CNS에서 측정될 때 증가된 형질도입을 갖는 변이체를 생성한다.
본 발명은 CNS로의 광범위한 형질도입을 갖는 rAAV를 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 표 1, 도 1-3 및/또는 화학식 I 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 펩티드 삽입 서열을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 표 1, 도 1-3 및/또는 화학식 I 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 펩티드 삽입을 갖는 AAV 캡시드 단백질이 대상체에서 증가된 CNS 형질도입을 특징으로 하는 것인 변형된 캡시드 단백질이다.
본 개시내용은 또한 표 1, 도 1-3 및/또는 화학식 I 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 펩티드 삽입을 갖는 rAAV, 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 포함한다.
본원에 개시된 측면은 본 개시내용의 AAV 캡시드 단백질 또는 AAV 캡시드를 포함하는 제약 제제의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 질환 또는 상태를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 상태는 대상체의 CNS 및 뇌의 질환 또는 상태이다. 이와 관련하여, 본 발명은 질환 또는 의학적 상태를 치료 또는 예방하기 위한 의약의 제조에서의 rAAV의 용도를 포함한다.
본 발명의 다른 측면은 하기 상세한 설명 및 청구범위로부터 명백할 것이다.
본 발명의 신규 특징은 첨부된 청구범위에 구체적으로 제시된다. 본 발명의 특색 및 이점은, 본 발명의 원리가 이용되는 예시적 실시양태를 제시하는 하기 상세한 설명, 및 첨부된 도면을 참조하여 보다 잘 이해될 것이다:
도 1은 조작된 AAV 라이브러리의 2 라운드의 평가 후에 비-인간 영장류 CNS에서 발견된 아미노산 서열을 코딩하는 AAV 캡시드 단백질 삽입 및 치환 아미노산 서열을 보여준다.
도 2는 AAV 캡시드 단백질 삽입 및 치환 아미노산 서열, 및 하나의 비-인간 영장류 CNS에서 발견된 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열을 보여준다.
도 3은 AAV 캡시드 단백질 삽입 및 치환 아미노산 서열, 및 또 다른 비-인간 영장류 CNS에서 발견된 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열을 보여준다.
본 개시내용의 상세한 설명
한 측면에서, 본 개시내용은 CNS에서 높은 발현 수준을 갖는 rAAV를 제공한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 표 1, 도 1-3 및/또는 화학식 I 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 펩티드 삽입 및/또는 치환을 갖는 rAAV를 제공한다.
본원에 개시된 측면은 화학식 I의 아미노산 서열을 포함하는 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 캡시드를 제공한다:
X1-X2-X3-N-T-T-X4-X5-X6-X7-X8 (I) (서열식별번호(SEQ ID NO): 72)
여기서 X1은 A, E, Q, T 및 V로부터 선택된 아미노산이고; X2는 Q, I, M, A, P, 및 V로부터 선택된 아미노산이고; X3은 L, S, Q, M 및 T로부터 선택된 아미노산이고; X4는 K 및 R로부터 선택된 아미노산이고; X5는 P, I, N, A, Q, H, I, V, S 및 L로부터 선택된 아미노산이고; X6은 T, I, V, A, Q, S, L, M, G, H 및 R로부터 선택된 아미노산이고; X7은 A, D, N, S, T, M, P, Q, E, G, V, I 및 W로부터 선택된 아미노산이고; X8은 Q, G, F, A, S, D, E, M, P, R, T 및 Y로부터 선택된 아미노산이다.
일부 실시양태에서, AAV 캡시드 단백질은 X1이 A이고 X2가 Q인 화학식 I의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, AAV 캡시드 단백질은 X3이 L인 화학식 I의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, AAV 캡시드 단백질은 X3이 N인 화학식 I의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, AAV 캡시드 단백질은 X4가 K인 화학식 I의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, AAV 캡시드 단백질은 X5가 P 또는 S인 화학식 I의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, AAV 캡시드 단백질은 X6이 V 또는 T인 화학식 I의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 표 1에 기재된 바와 같은 서열은 LNTTKSV (서열식별번호: 41), LNTTKPT (서열식별번호: 42), LNTTKPS (서열식별번호: 43), LNTTKPV (서열식별번호: 44), LNTTKNI (서열식별번호: 45), LNTTKPI (서열식별번호: 46), NNTTKPI (서열식별번호: 47), LNTTKNM (서열식별번호: 48), LNTTKPR (서열식별번호: 49), LNTTKNV (서열식별번호: 50), LNTTKQM (서열식별번호: 51), LNTTKPQ (서열식별번호: 52), LNTTKIT (서열식별번호: 53), LNTTKLH (서열식별번호: 54), LNTTKNG (서열식별번호: 55), VNTTKPI (서열식별번호: 56), MNTTKPI (서열식별번호: 57), LNTTKPL (서열식별번호: 58), TNTTKPI (서열식별번호: 59), LNTTKSF (서열식별번호: 60) 및 LALPKPI (서열식별번호: 114)로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 표 1에 기재된 바와 같은 서열은 AQLNTTKSVMQ (서열식별번호: 2), AQLNTTKPTDR (서열식별번호: 3), AQLNTTKPTVG (서열식별번호: 4), AQLNTTKPSPG (서열식별번호: 5), AQLNTTKPTGP (서열식별번호: 6), AQLNTTKPTAG (서열식별번호: 7), AQLNTTKPVAG (서열식별번호: 8), AQLNTTKNITQ (서열식별번호: 9), AQLNTTKPTSF (서열식별번호: 10), AQLNTTKPTPS (서열식별번호: 11), MANNTTKPIAQ (서열식별번호: 12), AQLNTTKPIAQ (서열식별번호: 13), AQLNTTKPTSY (서열식별번호: 14), AQLNTTKNMTQ (서열식별번호: 15), AQLNTTKPRDE (서열식별번호: 16), AQLNTTKPTAQ (서열식별번호: 17), AQLNTTKNVTQ (서열식별번호: 18), QTNNTTKPIAQ (서열식별번호: ), AQLNTTKQMNQ (서열식별번호: 19), AQLNTTKHVDQ (서열식별번호: 20), AQLNTTKQIDQ (서열식별번호: 21), VALNTTKPIAQ (서열식별번호: 22), AMTNTTKPIAQ (서열식별번호: 23), AQLNTTKPANQ (서열식별번호: 24), AQLNTTKNVNQ (서열식별번호: 25), AQLNTTKPVVA (서열식별번호: 26), AQLNTTKPQNQ (서열식별번호: 27), AQLNTTKPQLQ (서열식별번호: 28), AQLNTTKITDQ (서열식별번호: 29), AQLNTTKLHDQ (서열식별번호: 30), AQLNTTKNGYQ (서열식별번호: 31), ANVNTTKPIAQ (서열식별번호: 32), EQMNTTKPIAQ (서열식별번호: 33), AQLNTTKPLQF (서열식별번호: 34), AQLNTTKPSSG (서열식별번호: 35), AQLNTTKPVMQ (서열식별번호: 36), AQLNTTKPLAQ (서열식별번호: 37), TITNTTKPIAQ (서열식별번호: 38), AQLNTTKSFGQ (서열식별번호: 39), AQLNTTKPTAQ (서열식별번호: 116) 및 AQLNTTKPTTS (서열식별번호: 117)로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 삽입 서열은 표 1에 열거된 펩티드 서열에 의해 나타내어진다.
표 1.
일부 측면에서, 삽입 아미노산 서열은 표 1, 도 1-3 및/또는 화학식 I에 제공된 아미노산 서열에 대해 적어도 71.4% 동일하다. 일부 측면에서, 삽입 아미노산 서열은 표 1, 도 1-3 및/또는 화학식 I에 제공된 아미노산 서열에 대해 적어도 86.7% 동일하다.
또한, 치료 재조합 AAV (rAAV) 입자를 생산하기 위한 방법 및 키트, 뿐만 아니라 CNS에 영향을 미치는 질환 또는 상태의 치료를 위한 rAAV 입자를 포함하는 방법 및 제약 조성물 또는 제제가 본원에 개시된다.
CNS에서 증가된 바이러스 형질도입으로 조작된 AAV 캡시드가 본원에 개시된다. AAV 캡시드는 바이러스 벡터를, 예를 들어 치료 유전자 발현 산물을 코딩하는 이종 핵산으로 캡시드화할 수 있다. CNS에서의 이종 핵산의 형질도입은 이종 핵산을 캡시드화하는 본 개시내용의 AAV 캡시드의 대상체로의 전신 전달 시 달성될 수 있다. 본원에 개시된 AAV 캡시드는 중추 신경계의 장애를 포함하나 이에 제한되지는 않는 인간 질환을 치료하기 위한 유전자 요법의 많은 적용에 유리하다.
본 개시내용의 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 AAV 벡터가 또한 본원에 제공된다. 예를 들어, 본 개시내용의 바이러스 벡터는 VP1, VP2, 및 VP3 (이들 중 적어도 하나는 본 개시내용의 AAV 캡시드 단백질을 생산하도록 변형됨)을 코딩하는 AAV 바이러스 Cap (캡시드)를 포함하는 핵산 서열을 포함한다. 제공된 재조합 AAV 벡터는 AAV 혈청형 (예를 들어, AAV9) 또는 본 발명의 삽입을 포함하는 변이체 AAV 혈청형으로부터 유래될 수 있다.
AAV 캡시드
트랜스진을 표적 세포 또는 환경 내로 (대상체에게 전신 투여될 때 대상체에서) 통합시키는 데 유용한 변형된 아데노-연관 (AAV) 바이러스 캡시드 조성물이 본원에 제공된다.
rAAV는 이종 핵산 (예를 들어, 치료 핵산, 유전자 편집 기구)을 캡시드화하도록 조작될 수 있는 AAV 캡시드를 포함한다. AAV 캡시드는 3개의 AAV 캡시드 단백질 단량체, VP1, VP2, 및 VP3으로 구성된다. 이들 3개의 VP 단백질의 60개 카피는 1:1:10 비로 상호작용하여 바이러스 캡시드를 형성한다. VP1은 ~137개의 아미노산 N-말단 영역 (VP1u)에 더하여 VP2 단백질 전체를 커버하고, VP2는 ~65개의 아미노산 N-말단 영역 (VP1/2 공통 영역)에 더하여 VP3 전체를 커버한다. 3개의 캡시드 단백질은 VP3의 보존된 아미노산 서열을 공유하며, 이는 일부 경우에 아미노산 위치 138에서 시작하는 영역 (예를 들어, AA139-736)이다.
이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 모 AAV 캡시드 서열은 VP1 영역을 포함하는 것으로 이해된다. 특정 실시양태에서, 모 AAV 캡시드 서열은 VP1, VP2 및/또는 VP3 영역, 또는 그의 임의의 조합을 포함한다. 모 VP1 서열은 모 AAV 캡시드 서열과 동의어인 것으로 간주될 수 있다.
AAV VP3 구조는 모든 혈청형에 공통적인 고도로 보존된 영역, 코어 8-가닥 β-배럴 모티프 (βB-βI) 및 소형 α-나선 (αA)을 함유한다. β-가닥 사이에 삽입된 루프 영역은 β-가닥 H와 I 사이의 특유의 HI 루프, β-가닥 D와 E 사이의 DE 루프, 및 루프의 상부를 형성하는 9개의 가변 영역 (VR)으로 이루어진다. 이들 VR, 예컨대 AA588 루프는 캡시드 표면 상에서 발견되며, 수용체 결합, 형질도입 및 항원 특이성을 포함한 AAV 생활 주기에서의 특이적 기능적 역할과 연관될 수 있다.
일부 측면에서, 본 발명의 rAAV 변이체는 서열식별번호: 1의 AAV9 천연 서열의 아미노산 588-589에 상응하는 잔기에 펩티드 삽입을 갖는 AAV 캡시드 단백질을 포함한다.
AAV 캡시드는 각각 예컨대 모 AAV 캡시드 단백질 구조 (AAV9 VP1 넘버링)의 588 루프에 삽입을 갖는 AAV 캡시드 단백질 (예를 들어, VP1, VP2, 및 VP3)을 포함한다. 588 루프는 AAV2의 헤파란 술페이트 결합 부위를 함유하고, 펩티드 디스플레이에 적용될 수 있다. AAV9에 대한 유일하게 공지된 수용체는 N-연결된 말단 갈락토스 및 AAV 수용체 (AAVR)이지만, 많은 증거가 다른 것들이 있음을 가리킨다. AAV9 588 루프에 대한 변형은 표적 생체내 환경에서 증가된 트랜스진 형질도입을 부여하는 것으로 본원에 제시된다.
한 측면에서, 본 발명은 표 1, 도 1-3 및/또는 화학식 I 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 AAV 588 루프에서의 펩티드 삽입을 제공한다.
CNS 세포 유형 (예를 들어, 뇌 내피 세포, 뉴런, 성상세포)에서의 보다 높은 형질도입을 부여하는 588 루프에서의 삽입을 갖는 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 캡시드가 본원에 개시된다. 특히, 본원에 개시된 AAV 캡시드 단백질은 대상체의 CNS에서 이종 핵산 (예를 들어, 트랜스진)의 rAAV-매개 형질도입을 가능하게 한다. 본 개시내용의 AAV 캡시드는 제약 조성물로서 제제화될 수 있다. 또한, AAV 캡시드는 다양한 적용에 사용하기 위해 단리 및 정제될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 rAAV 캡시드는 본원에 개시된 방법을 사용하여 생성된다. 일부 경우에, rAAV 캡시드는 키메라이다. 일부 경우에, rAAV 또는 그 안에 포함된 변이체 AAV 단백질은 모 AAV 캡시드 또는 캡시드 단백질과 비교하여 표적 조직 내 rAAV의 국재화의 증가를 부여한다.
AAV 캡시드 단백질
변형된 캡시드 단백질 (예를 들어, VP1, VP2, VP3)로 조작된 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 재조합 AAV (rAAV) 캡시드가 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 rAAV 캡시드 단백질은 본원에 개시된 방법을 사용하여 생성된다. 일부 실시양태에서, AAV 캡시드 단백질은 치료 핵산 (예를 들어, 트랜스진)을 대상체에게 전달하는 방법에 사용된다. 일부 경우에, rAAV 캡시드 단백질은 이들을 특정 치료 용도, 예를 들어 본원에 개시된 것과 같은 대상체에서의 질환 또는 장애의 치료에 특히 적합하게 만드는 목적하는 AAV 발현을 갖는다.
rAAV 캡시드 단백질은 대상체에게 rAAV의 전신 투여 시 대상체의 CNS, 예를 들어 뇌에서의 최적화된 발현을 위해 조작된다. rAAV 캡시드 단백질은 표 1 및 도 1에 제공된 삽입을 포함하도록 조작된다. 표 1 및 도 1에 제공된 삽입을 포함하는 rAAV 캡시드 단백질은 캡시드화된 트랜스진의 효율적인 형질도입을 달성하도록 조작된다. 특히, rAAV 캡시드 단백질은 대상체의 뇌에서 증가된 발현을 갖는다.
본원에 기재된 조작된 AAV 캡시드 단백질은, 일부 경우에, 588 루프 내의 아미노산 위치에서 모 AAV 캡시드 단백질에 대해 이종인 아미노산의 삽입을 갖는다. 일부 실시양태에서, 아미노산은 삽입의 아미노산 위치에서 모 AAV 캡시드 단백질에 대해 내인성이 아니다. 아미노산은 상이한 AAV 캡시드 단백질에서의 치환의 삽입과 동일하거나 동등한 아미노산 위치에서의 자연 발생 아미노산일 수 있다.
일반적으로, 삽입은 모 AAV 캡시드 단백질 내의 588 루프에서 삽입 또는 치환된 5-량체, 6-량체, 또는 7-량체 서열 (각각 5-량체, 6-량체, 또는 7-량체)을 포함한다. 본원에 제공된 측면은 AA588-589에 삽입된 7개의 아미노산 중합체 (7-량체)를 포함하는 아미노산 삽입을 제공하고, 7-량체 서열에 플랭킹된 아미노산 위치 (예를 들어, AA587-588 및/또는 AA589-590)에서 1 또는 2개의 아미노산의 치환을 추가로 포함하여 모 AAV 캡시드 단백질의 588 루프에서 11개의 아미노산 중합체 (11-량체)를 생산할 수 있다. 본원에 기재된 7-량체는 축중성 프라이머와의 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 사용하여 유리하게 생성되었으며, 여기서 7개의 아미노산 각각은 데옥시리보스 핵산 (DNA) 서열 N-N-K에 의해 코딩된다. "N"은 4개의 DNA 뉴클레오티드 중 임의의 것이고, K는 구아닌 (G) 또는 티민 (T)이다. 무작위 7-량체 아미노산 서열을 생성하는 이러한 방법은 단백질 수준에서 12억8천만개의 가능한 조합을 가능하게 한다.
본 개시내용의 rAAV 캡시드 단백질은 AAV 캡시드 단백질의 아미노산 서열에 아미노산의 삽입을 포함한다. 본 개시내용의 조작된 AAV 캡시드 단백질이 생산되는 AAV 캡시드는 "모" AAV 캡시드로 지칭된다. AAV-1의 완전한 게놈은 진뱅크(GenBank) 수탁 번호 NC_002077에 제공되고; AAV-2의 완전한 게놈은 진뱅크 수탁 번호 NC_001401 및 문헌 [Srivastava et al., J. Virol., 45: 555-564 (1983)]에 제공되고; AAV-3의 완전한 게놈은 진뱅크 수탁 번호 NC_1829에 제공되고; AAV-4의 완전한 게놈은 진뱅크 수탁 번호 NC_001829에 제공되고; AAV-5 게놈은 진뱅크 수탁 번호 AF085716에 제공되고; AAV-6의 완전한 게놈은 진뱅크 수탁 번호 NC_00 1862에 제공되고; AAV-7 및 AAV-8 게놈의 적어도 일부는 각각 진뱅크 수탁 번호 AX753246 및 AX753249에 제공되고; AAV-9 게놈은 문헌 [Gao et al., J. Virol., 78: 6381-6388 (2004)]에 제공되고; AAV-10 게놈은 문헌 [Mol. Ther., 13(1): 67-76 (2006)]에 제공되고; AAV-11 게놈은 문헌 [Virology, 330(2): 375-383 (2004)]에 제공되고; AAV-12 게놈의 일부는 진뱅크 수탁 번호 DQ813647에 제공되고; AAV-13 게놈의 일부는 진뱅크 수탁 번호 EU285562에 제공된다.
일부 경우에, 모 AAV는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 및 AAV12로부터 선택된 혈청형을 갖는 AAV로부터 유래된다. 또 다른 것으로부터 "유래된" AAV 캡시드 단백질은 변이체 AAV 캡시드 단백질일 수 있다. 변이체는 예를 들어 AAV 캡시드 단백질의 아미노산 서열에 이종 아미노산을 포함할 수 있다. 이종 아미노산은 AAV 캡시드 단백질에서 비-자연 발생일 수 있다. 이종 아미노산은 상이한 AAV 캡시드 단백질에서 자연 발생일 수 있다. 일부 경우에, 모 AAV 캡시드가 미국 특허 공개 2020/0165576 및 미국 특허 출원 일련 번호 62/832,826 및 PCT/US20/20778에 기재되어 있고, 이들 각각의 내용은 본원에 포함된다.
일부 경우에, 모 AAV는 AAV9이다. 일부 경우에, AAV9 캡시드 단백질의 아미노산 서열은 서열식별번호: 1을 포함한다. AAV9 VP1 캡시드 단백질의 아미노산 서열 (>tr|Q6JC40|Q6JC40_9VIRU 캡시드 단백질 VP1 OS=아데노-연관 바이러스 9 OX=235455 GN=cap PE=1 SV=1)은 서열식별번호: 1에 제공된다 (MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQSAQAQAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL). 일부 경우에, 모 AAV 캡시드 단백질 서열은 서열식별번호: 1에 대해 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 상동성이다.
간을 포함한 향성을 갖는 천연 AAV 혈청형, 예컨대 AAV9로부터의 AAV 캡시드 단백질은 선천성 면역 반응을 활성화시키며, 이는 일부 경우에 대상체에서 중증 염증 반응을 유발하며, 이는 다기관 부전으로 이어질 수 있다. 표적 생체내 조직 (예를 들어, 뇌)에 대한 천연 AAV 혈청형의 형질도입을 개선시킴으로써, 본 개시내용의 rAAV 입자는 AAV-매개 트랜스진 전달의 면역원성 특성을 감소시키고, 선천성 면역 반응의 활성화를 방지한다.
일부 경우에, 모 AAV 캡시드 단백질은 서열식별번호: 1에 제공된 전체 VP1 영역 (예를 들어, 아미노산 1-736)을 포함한다. 일부 경우에, 모 AAV 캡시드 단백질은 VP1, VP2 및 VP3 AAV9 캡시드 단백질에서 발견되는 공통 영역인 서열식별번호: 1 내의 아미노산 217-736을 포함한다. 일부 경우에, AAV 캡시드 단백질은 VP1 및 VP2에서 발견되는 공통 영역인 서열식별번호: 1 내의 아미노산 64-736을 포함한다. 모 AAV 캡시드 단백질 서열은 서열식별번호: 1로부터의 1-736, 10-736, 20-736, 30-736, 40-736, 50-736, 60-736, 70-736, 80-736, 90-736, 100-736, 110-736, 120-736, 130-736, 140-736, 150-736, 160-736, 170-736, 180-736, 190-736, 200-736, 210-736, 220-736, 230-736, 240-736, 250-736, 260-736, 270-736, 280-736, 290-736, 300-736, 310-736, 320-736, 330-736, 340-736, 350-736, 360-736, 370-736, 380-736, 390-736, 400-736, 410-736, 420-736, 430-736, 440-736, 및 450-736으로부터 선택된 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, rAAV 변이체는 서열식별번호: 1의 아미노산 217 내지 아미노산 736에 대해 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 AAV 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 경우에, 아미노산 삽입은 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질의 3배 대칭 축에 있다.
AAV 캡시드 단백질 내의 아미노산 서열의 삽입이 본원에 개시된다. 서열 넘버링 명칭 "588-589"가 AAV9, 예를 들어 AAV VP1에 대해 언급되는 경우에, 본 발명은 또한 다른 AAV 혈청형 내의 유사한 위치에서의 삽입을 포함한다. 본원에 사용된 "AA588-589"는 아미노산 (또는 아미노산 서열)의 삽입이 모 AAV VP 캡시드 단백질의 아미노산 서열 내의 위치 588에서의 아미노산 (AA) 바로 뒤 및 위치 589에서의 AA 바로 앞 (VP1 넘버링)에 있다는 것을 나타낸다. 아미노산 587-591은 서열식별번호: 1에 기재된 "AQAQA"를 포함하는 모티프를 포함한다. 예시적인 AAV 캡시드 단백질 서열이 표 2에서 제공된다. 예를 들어, LNTTKPT (서열식별번호: 42)는 AAV9 캡시드 아미노산 서열에서 AA588-589에 삽입되고, 변이체 A (서열식별번호: 66)를 제공한다. 본원 (표 1, 도 1-3 및/또는 화학식 I)에 개시된 서열은 모 AAV9 캡시드 단백질의 아미노산 서열 내의 AA588-589에, 또는 AA587-590 (아미노산 AA587-590을 대체함), 그의 변이체, 또는 상이한 혈청형의 모 AAV (예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3 등)의 동등한 아미노산 위치에 삽입될 수 있는 것으로 고려된다. 본원에 개시된 임의의 AAV 캡시드 단백질 서열에서, 위치 449에서의 아미노산은 R 또는 K일 수 있다.
표 2. 예시적인 AAV 캡시드 단백질 서열
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본원에 기재된 삽입은, 일부 경우에, AA588-589에서의 7-량체 삽입을 포함할 수 있다. 아미노산 위치 587-590에서의 임의의 아미노산 [AQAQ]으로의 치환에 추가로 본원에 개시된 임의의 7-량체 삽입은 11-량체를 포함할 수 있는 것으로 고려된다.
심지어 전신 전달되는 경우에도, 대상체 내의 CNS에서의 증가된 형질도입을 부여하는 모 AAV 캡시드 단백질에 상기 기재된 삽입을 갖는 AAV 캡시드 단백질이 본원에 개시된다. 본원에 기재된 AAV 캡시드 단백질의 많은 이점 중 하나는 CNS 내의 조직 및 세포를 표적화하는 그의 능력이다. 조직은 뇌일 수 있다. CNS 세포의 비제한적 예는 뉴런 및 신경교 세포를 포함한다. 신경교 세포는 핍지교세포, 상의 세포, 성상세포 및 소교세포로부터 선택될 수 있다.
일부 경우에, AAV 캡시드 단백질은 모 AAV9 캡시드 단백질 (서열식별번호: 1) 내의 아미노산 위치 588-589 또는 587-590에 표 1, 도 1-3 및 화학식 I의 아미노산 서열의 적어도 또는 약 5, 6, 또는 7개의 아미노산의 삽입을 포함한다. 일부 경우에, AAV 캡시드 단백질은 뇌에서 증가된 바이러스 형질도입 효율을 갖는다.
본 개시내용의 rAAV 캡시드 단백질은 또한 WO 2020068990에 기재된 바와 같이 모 AAV9 캡시드 단백질 또는 그의 변이체 내의 아미노산 위치 452-458에 아미노산 서열의 치환을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열의 치환은 모 AAV9 캡시드 단백질 내의 아미노산 위치 452-458에 KDNTPGR (서열식별번호: 73)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열의 치환은 모 AAV9 캡시드 단백질 내의 아미노산 위치 452-458에 DGAATKN (서열식별번호: 74)을 포함한다.
본원에 기재된 rAAV 캡시드 단백질은 단리 및 정제될 수 있다. AAV는 관련 기술분야의 표준 방법에 의해, 예컨대 칼럼 크로마토그래피, 아이오딕사놀 구배 또는 염화세슘 구배에 의해 단리 및 정제될 수 있다. 헬퍼 바이러스로부터 AAV를 정제하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Clark et al., Hum. Gene Ther., 10(6): 1031-1039 (1999); Schenpp and Clark, Methods Mol. Med., 69: 427-443 (2002)]; 미국 특허 번호 6,566,118 및 WO 98/09657에 개시된 방법을 포함할 수 있다.
또한, 단리되고 정제되거나, 그렇지 않은 본원에 개시된 AAV 캡시드 단백질은 일부 경우에 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함하는 제약 제제로 제제화될 수 있다.
rAAV 캡시드 단백질은 나노입자, 제2 분자, 또는 바이러스 캡시드 단백질에 접합될 수 있다. 일부 경우에, 나노입자 또는 바이러스 캡시드 단백질은 본원에 기재된 치료 핵산을 캡시드화할 것이다. 일부 경우에, 제2 분자는 치료제, 예를 들어 소분자, 항체, 항원-결합 단편, 펩티드 또는 단백질, 예컨대 본원에 기재된 것이다.
"퍼센트 동일성"은 실제로 매칭되는 기호의 퍼센트이다. 퍼센트 유사성은 유사한 기호의 퍼센트이다. 갭 맞은편의 기호는 무시된다. 유사성은 한 쌍의 기호에 대한 점수화 매트릭스 값이 유사성 역치인 0.50 이상일 때 점수화된다. 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지의 버전 10에서 사용된 점수화 행렬은 BLOSUM62이다 (문헌 [Henikoff and Henikoff, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915] 참조).
본원에 제공된 서열 동일성/유사성 값은 디폴트 세팅을 사용하여 BLAST+ 2.5.0 프로그램 스위트 (blast.ncbi.nlm.nih.gov)를 사용하여 수득된 값을 지칭할 수 있다 (Camacho, C., et al. (2009) BLAST+: architecture and applications. BMC Bioinformatics 10:421).
관련 기술분야의 통상의 기술자가 이해할 바와 같이, BLAST 검색은 단백질이 무작위 서열로서 모델링될 수 있다고 가정한다. 그러나, 많은 실제 단백질은 동종중합체성 트랙, 단기간 반복부, 또는 1개 이상의 아미노산이 풍부한 영역일 수 있는 비무작위 서열의 영역을 포함한다. 이러한 저-복잡성 영역은 단백질의 다른 영역이 완전히 상이하더라도 비관련 단백질 사이에 정렬될 수 있다. 다수의 저-복잡성 필터 프로그램을 사용하여 이러한 저-복잡성 정렬을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, SEG (Wooten and Federhen, (1993) Comput. Chem. 17: 149-63) 및 XNU (Ci-ayerie and States (1993) Comput. Chem. 17: 191-201) 저-복잡성 필터가 단독으로 또는 조합되어 사용될 수 있다.
용어 "실질적 동일성" 및 "실질적으로 동일한"은 폴리펩티드 또는 핵산이 참조 서열에 대해 55-100% 서열 동일성, 적어도 55% 서열 동일성, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 65%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 75%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 85%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 99% 서열 동일성 또는 참조 서열에 대해 55-100% 서열 동일성의 범위 내의 값의 임의의 백분율을 갖는 서열을 포함한다는 것을 나타낸다. 퍼센트 서열 동일성은 명시된 비교 윈도우에 걸쳐 발생할 수 있다. 최적 정렬은 상기 문헌 [Needleman and Wunsch]의 상동성 정렬 알고리즘을 사용하여 확인 또는 수행될 수 있다.
예를 들어, 삽입 서열은 본원에 개시된 서열과 정확하게 동일하지는 않지만, 본원에 열거된 다양한 서열에 대해 명백하게 기재된 치환 이외에, 본원에 기재된 서열의 활성 또는 특성을 실질적으로 손상시키지 않는 아미노산 잔기의 추가의 치환, 예컨대 상동성 소프트웨어, 예를 들어 BLOSUM62 매트릭스에 의해 예측되는 것을 갖는 서열을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
AAV 입자
본원에 기재된 삽입 서열을 갖는 rAAV 입자는 CNS에서 증가된 형질도입을 갖는다. 일부 경우에, 증가된 형질도입은 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 30배, 40배, 50배 또는 100배 또는 그 초과의 증가를 포함한다. 일부 경우에, 증가된 형질도입은 적어도 2배이다. 일부 경우에, 증가된 형질도입은 적어도 4배이다. 일부 경우에, 증가된 형질도입은 적어도 8배이다.
본원에 기재된 삽입 서열을 갖는 rAAV 입자는 CNS에서 증가된 발현을 갖는다. rAAV가 더 많거나 더 적은 발현을 보유하는지 여부를 검출하는 것은 대상체로부터 수득된 조직 샘플에서 rAAV에 의해 캡시드화된 이종 핵산으로부터 발현된 유전자 발현 산물 (예를 들어, RNA 또는 단백질)의 수준을 측정하는 것을 포함한다. 유전자 발현 산물의 발현을 측정하기 위한 적합한 방법은 차세대 서열분석 (NGS) 및 정량적 폴리머라제 연쇄 반응 (qPCR)을 포함한다.
CNS에서의 증가된 발현은 도 1에 제공된 cpm 값에 의해 나타내어진다.
이종 핵산
질환 또는 상태, 또는 질환 또는 상태의 증상의 치료 또는 예방에 유용한 치료 핵산이 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, 치료 핵산은 치료 유전자 발현 산물을 코딩한다. 유전자 발현 산물의 비제한적 예는 질환 또는 장애, 또는 질환 또는 장애의 증상의 치료, 예방 및/또는 개선에 사용하기 위한 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 효소, 항체, 항원 결합 단편, 핵산 (RNA, DNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 등), 및 유전자 편집 성분을 포함한다. 일부 경우에, 치료 핵산은 rAAV, 예컨대 본원에 개시된 것에 의해 대상체의 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 정치된다.
각각 바이러스 벡터 (예를 들어, 단일 가닥 DNA 분자 (ssDNA))를 포함하는 rAAV가 본원에 개시된다. 일부 경우에, 바이러스 벡터는 트랜스진에 플랭킹된, 각각 약 145개의 염기인 2개의 역전된 말단 반복부 (ITR) 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 트랜스진은 치료 핵산, 및 일부 경우에, 오픈 리딩 프레임 (ORF) 내에 치료 핵산과 시스로 프로모터를 포함한다. 프로모터는 표적 세포의 핵에서 치료 핵산의 전사를 개시할 수 있다. ITR 서열은 임의의 AAV 혈청형으로부터의 것일 수 있다. AAV 혈청형의 비제한적 예는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 및 AAV12를 포함한다. 일부 경우에, ITR은 AAV2로부터의 것이다. 일부 경우에, ITR은 AAV9로부터의 것이다.
임의의 수의 뉴클레오티드를 포함할 수 있는 트랜스진이 본원에 개시된다. 일부 경우에, 트랜스진은 약 100개 미만의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 트랜스진은 적어도 약 100개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 트랜스진은 적어도 약 200개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 트랜스진은 적어도 약 300개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 트랜스진은 적어도 약 400개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 트랜스진은 적어도 약 500개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 트랜스진은 적어도 약 1000개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 트랜스진은 적어도 약 5000개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 트랜스진은 5,000개 초과의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 트랜스진은 약 500개 내지 약 5000개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 트랜스진은 약 5000개의 뉴클레오티드를 포함한다. 본원에 개시된 임의의 경우에, 트랜스진은 DNA, RNA, 또는 DNA와 RNA의 하이브리드를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 트랜스진은 단일 가닥일 수 있다. 일부 경우에, 트랜스진은 이중 가닥일 수 있다.
표적 유전자 또는 그의 유전자 발현 산물의 발현 또는 활성을 조정하는 데 유용한 트랜스진이 본원에 개시된다. 일부 경우에, 트랜스진은 본원에 기재된 rAAV 입자의 rAAV 캡시드 단백질에 의해 캡시드화된다. 일부 경우에, rAAV 입자는 대상체에서 본원에 개시된 질환 또는 상태를 치료하기 위해 대상체에게 전달된다. 일부 경우에, 전달은 전신 전달이다.
본원에 개시된 트랜스진은 건강한 또는 정상 개체의 것과 유사한 수준으로 내인성 유전자를 발현시키는 데 유용하다. 이는 유전자 발현 산물의 과소발현 또는 발현 결여와 관련된 질환 또는 상태의 치료에 특히 유용하다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 트랜스진은 내인성 유전자의 발현 수준이 건강한 또는 정상 개체의 발현 수준을 초과하도록 내인성 유전자를 과다발현하는 데 유용하다. 추가로, 트랜스진은 외인성 유전자 (예를 들어, 활성제, 예컨대 항체, 펩티드, 핵산 또는 유전자 편집 성분)를 발현하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료 유전자 발현 산물은 세포에서 하나 이상의 내인성 생물학적 과정의 활성을 변경, 증진, 증가 또는 유도할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 트랜스진은 내인성 유전자, 예를 들어 우성 음성 유전자의 발현을 감소시키는 데 유용하다. 일부 실시양태에서, 치료 유전자 발현 산물은 세포에서 1개 이상의 내인성 생물학적 과정의 활성을 변경, 억제, 감소, 예방, 제거 또는 손상시킬 수 있다. 일부 측면에서, 유전자 발현의 증가는 적어도 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 및 100%의 증가를 지칭한다. 한 측면에서, 표적화된 유전자의 단백질 생성물은 적어도 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 및 100% 증가될 수 있다. 일부 측면에서, 유전자 발현의 감소는 적어도 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 및 100%의 증가를 지칭한다. 한 측면에서, 표적화된 유전자의 단백질 생성물은 적어도 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 및 100% 감소될 수 있다.
내인성 서열 (내인성 또는 트랜스진의 일부)이 트랜스진으로 발현되는 경우에, 내인성 서열은 전장 서열 (야생형 또는 돌연변이체) 또는 부분 서열일 수 있다. 내인성 서열은 기능적일 수 있다. 이들 전장 또는 부분 서열의 기능의 비제한적 예는 트랜스진 (예를 들어, 치료 유전자)에 의해 발현된 폴리펩티드의 혈청 반감기를 증가시키는 것 및/또는 운반체로서 작용하는 것을 포함한다.
트랜스진은 내인성 유전자의 전부 또는 일부가 발현되거나 또는 전혀 발현되지 않도록 내인성 유전자 내로 삽입될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 트랜스진은, 예를 들어 트랜스진과의 융합물로서, 내인성 서열의 일부 (트랜스진에 대해 N-말단 및/또는 C-말단)가 발현되거나 또는 어느 것도 발현되지 않도록 내인성 유전자좌 내로 삽입될 수 있다. 다른 경우에, 트랜스진 (예를 들어, 내인성 유전자에 대한 추가의 코딩 서열을 갖거나 또는 갖지 않음)은 임의의 내인성 유전자좌, 예를 들어 세이프-하버 유전자좌 내로 통합된다. 예를 들어, 프라탁신 (FXN) 트랜스진이 내인성 FXN 유전자 내로 삽입될 수 있다. 트랜스진은 임의의 유전자, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 유전자 내로 삽입될 수 있다.
본 개시내용의 적어도 하나의 이점은 실질적으로 임의의 치료 핵산이 임의의 치료 유전자 발현 산물을 발현하는 데 사용될 수 있다는 것이다. 일부 경우에, 치료 유전자 발현 산물은 치료 단백질 또는 펩티드 (예를 들어, 항체, 항원-결합 단편, 펩티드, 또는 단백질)이다. 한 실시양태에서, 치료 핵산에 의해 코딩되는 단백질은 50-5000개 아미노산 길이이다. 일부 실시양태에서, 코딩되는 단백질은 50-2000개 아미노산 길이이다. 일부 실시양태에서, 코딩되는 단백질은 50-1000개 아미노산 길이이다. 일부 실시양태에서, 코딩되는 단백질은 50-1500개 아미노산 길이이다. 일부 실시양태에서, 코딩되는 단백질은 50-800개 아미노산 길이이다. 일부 실시양태에서, 코딩되는 단백질은 50-600개 아미노산 길이이다. 일부 실시양태에서, 코딩되는 단백질은 50-400개 아미노산 길이이다. 일부 실시양태에서, 코딩되는 단백질은 50-200개 아미노산 길이이다. 일부 실시양태에서, 코딩되는 단백질은 50-100개 아미노산 길이이다. 일부 실시양태에서, 코딩되는 펩티드는 4-50개 아미노산 길이이다. 일부 실시양태에서, 코딩되는 단백질은 테트라펩티드, 펜타펩티드, 헥사펩티드, 헵타펩티드, 옥타펩티드, 노나펩티드 또는 데카펩티드이다. 일부 실시양태에서, 코딩되는 단백질은 2-30개 아미노산, 예컨대 예를 들어 5-30, 10-30, 2-25, 5-25, 10-25 또는 10-20개 아미노산의 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 코딩되는 단백질은 적어도 11, 12, 13, 14, 15, 17, 20, 25 또는 30개의 아미노산의 펩티드, 또는 50개 이하의 아미노산, 예를 들어 35, 30, 25, 20, 17, 15, 14, 13, 12, 11 또는 10개 이하의 아미노산인 펩티드를 포함한다.
치료 단백질 또는 펩티드의 비제한적 예는 아드레날린성 효능제, 항아폽토시스 인자, 아폽토시스 억제제, 시토카인 수용체, 시토카인, 세포독소, 적혈구생성제, 글루탐산 데카르복실라제, 당단백질, 성장 인자, 성장 인자 수용체, 호르몬, 호르몬 수용체, 인터페론, 인터류킨, 인터류킨 수용체, 키나제, 키나제 억제제, 신경 성장 인자, 네트린, 신경활성 펩티드, 신경활성 펩티드 수용체, 신경원성 인자, 신경원성 인자 수용체, 뉴로필린, 신경영양 인자, 뉴로트로핀, 뉴로트로핀 수용체, N-메틸-D-아스파르테이트 길항제, 플렉신, 프로테아제, 프로테아제 억제제, 단백질 데카르복실라제, 단백질 키나제, 단백질 키나제 억제제, 단백질분해 단백질, 단백질분해 단백질 억제제, 세마포린, 세마포린 수용체, 세로토닌 수송 단백질, 세로토닌 흡수 억제제, 세로토닌 수용체, 세르핀, 세르핀 수용체 및 종양 억제자를 포함한다. 특정 실시양태에서, 치료 단백질 또는 펩티드는 뇌-유래 신경영양 인자 (BDNF), 섬모 신경영양 인자 (CNTF), 대식세포 콜로니-자극 인자 (CSF), 표피 성장 인자 (EGF), 섬유모세포 성장 인자 (FGF), 고나도트로핀, 인터페론-감마 (IFN), 인슐린-유사 성장 인자 1 (IFG-1), 신경 성장 인자 (NGF), 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF), 색소 상피-유래 인자 (PEDF), 형질전환 성장 인자 (TGF), 형질전환 성장 인자-베타 (TGF-B), 종양 괴사 인자 (TNF), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 프로락틴, 소마토트로핀, 아폽토시스 단백질 1의 X-연관 억제제 (XIAP1), 인터류킨 1 (IL-1), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-10, 바이러스 IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, 및 IL-18로부터 선택된다.
치료 유전자 발현 산물은 유전자 편집 성분을 포함할 수 있다. 유전자 편집 성분의 비제한적 예는 CRISPR/Cas, 인공 부위-특이적 RNA 엔도뉴클레아제 (ASRE), 아연 핑거 엔도뉴클레아제 (ZFN), 및 전사 인자 유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN)에 요구되는 것을 포함한다. 비제한적 예에서, 헌팅톤병을 갖는 대상체가 확인된다. 이어서, 대상체에게 헌팅틴 (HTT) 유전자의 전사를 억제하도록 조작된 ZFN을 코딩하는 바이러스 벡터를 캡시드화하는 rAAV의 제1 양이 전신 투여된다. rAAV는 표 1, 도 1-3 및 화학식 I 중 어느 하나에 제공된 아미노산 서열을 포함하는 변형된 AAV 캡시드 단백질을 포함하여, 표적을 벗어난 기관, 예컨대 간에서의 발현을 감소시키면서 ZFN의 신경계로의 적절한 표적화를 가능하게 할 것이다. 필요한 경우에, 치료 유효량의 ZFN이 대상체의 신경계에서 발현될 때까지 대상체에게 제2 또는 제3 용량의 rAAV가 투여된다.
치료 핵산은 비-단백질 코딩 유전자, 예를 들어 안티센스 RNA, RNAi, shRNA 및 마이크로 RNA (miRNA), miRNA 스폰지 또는 디코이를 코딩하는 서열을 포함할 수 있고, 조건부 유전자 결실, 조건부 (레콤비나제-의존성) 발현을 위한 레콤비나제 전달은 본원에 기재된 유전자 편집 성분에 요구되는 것을 포함한다. 비-단백질 코딩 유전자는 또한 tRNA, rRNA, tmRNA, piRNA, 이중 가닥 RNA, snRNA, snoRNA, 및/또는 긴 비-코딩 RNA (IncRNA)를 코딩할 수 있다. 일부 경우에, 비-단백질 코딩 유전자는 표적 유전자 또는 유전자 발현 산물의 발현 또는 활성을 조정할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 RNA는 CNS에서 유전자 발현을 억제하는 데 사용될 수 있다. 일부 경우에, 유전자 발현의 억제는 적어도 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 및 100%만큼의 억제를 지칭한다. 일부 경우에, 표적화된 유전자의 단백질 생성물은 적어도 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 및 100%만큼 억제될 수 있다. 유전자는 야생형 유전자 또는 적어도 1개의 돌연변이를 갖는 유전자일 수 있다. 표적화된 단백질은 야생형 단백질 또는 적어도 1개의 돌연변이를 갖는 단백질일 수 있다.
치료 핵산은 CNS의 질환 또는 장애에 연루된 유전자 또는 유전자로부터 발현된 유전자 발현 산물의 발현 또는 활성을 조정할 수 있다. 예를 들어, 치료 핵산은 일부 경우에 본원에 기재된 유전자 또는 유전자의 변형된 버전이다. 일부 경우에, 유전자 또는 유전자 발현 산물은 억제된다. 일부 경우에, 유전자 또는 유전자 발현 산물은 증진된다.
또 다른 예에서, 치료 핵산은 이펙터 유전자 발현 산물, 예컨대 그 안의 유전자를 표적화하는 데 특이적인 유전자 편집 성분을 포함한다. 유전자의 비제한적 예는 ATP1A2, CACNAIA, SETD5, SHANK3, NF2, DNMT1, TCF4, RAI1, PEX1, ARSA, EIF2B5, EIF2B1, EIF2B2, NPCl, ADAR, MFSD8, STXBP1, PRICKLE2, PRRT2, IDUA, STX1B, 사르코글리칸 알파 (SGCA), 글루탐산 데카르복실라제 65 (GAD65), 글루탐산 데카르복실라제 67 (GAD67), CLN2, 신경 성장 인자 (NGF), 신경교 세포 유래 신경영양 인자 (GDNF), 운동 뉴런 1의 생존, STXBP1, 텔로머 (SMN1), 인자 X (FIX), 레티노이드 이소머로히드롤라제 (RPE65), 사르코/내형질 세망 Ca2+-ATPase (SERCA2a), 글루코세레브로시다제 (GCase), 갈락토세레브로시다제 (GALC), CDKL5, 프라탁신 (FXN), 헌팅틴 (HTT), 메틸-CpG 결합 단백질 2 (MECP2), 퍼옥시솜 생물발생 인자 (PEX), 프로그래뉼린 (GRN), 항튜불린제, 구리-아연 슈퍼옥시드 디스뮤타제 (SOD1), 이두로네이트 2 술파타제 (hIDS), 글루코실세라미다제 베타 (GBA), 유약 X 정신 지체 1 (FMR1), NPC 세포내 콜레스테롤 수송체 1 (NPCl), SCN1A, C9orf72, NPS3 및 NLRP3 인플라마솜으로부터 선택된 표적 유전자 또는 유전자 발현 산물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 퍼옥시솜 생물발생 인자 (PEX)는 PEX1, PEX2, PEX3, PEX4, PEX5, PEX6, PEX7, PEX10, PEX11β, PEX12, PEX13, PEX14, PEX16, PEX19, 및 PEX26으로부터 선택된다. 일부 경우에, 유전자 또는 유전자 발현 산물은 억제된다. 일부 경우에, 유전자 또는 유전자 발현 산물은 증진된다.
AAV 벡터
본원에 개시된 측면은 본원에 기재된 AAV 캡시드 및 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 플라스미드 벡터를 포함한다. 본원에 기재된 AAV 벡터는 rAAV의 어셈블리 및 이종 핵산의 바이러스 패키징에 유용하다. 또한, AAV 벡터는 이종 핵산을 포함하는 트랜스진을 코딩할 수 있다.
AAV 벡터는 트랜스진을 포함할 수 있고, 이는 일부 경우에 이종 유전자 발현 산물 (예를 들어, 치료 유전자 발현 산물, 재조합 캡시드 단백질 등)을 코딩한다. 트랜스진은 트랜스진에 플랭킹된 2개의 역전된 말단 반복부 (ITR)와 시스이다. 트랜스진은 치료 유전자 발현 산물을 코딩하는 치료 핵산을 포함할 수 있다. rAAV의 제한된 패키징 용량 (~5 kB)으로 인해, 일부 경우에, 더 긴 트랜스진은, 제1은 3' 스플라이스 공여자를 갖고 제2는 5' 스플라이스 수용자를 갖는 2개의 AAV 벡터 사이에 분할될 수 있다. 세포의 공동-감염 시, 콘카테머가 형성되고, 이는 함께 스플라이싱되어 전장 트랜스진을 발현한다.
트랜스진은 일반적으로 그의 발현이 통합 부위에서 내인성 프로모터, 즉 트랜스진이 삽입되는 내인성 유전자의 발현을 유도하는 프로모터에 의해 유도되도록 삽입된다. 일부 경우에, 트랜스진은 프로모터 및/또는 인핸서, 예를 들어 구성적 프로모터 또는 유도성 또는 조직/세포 특이적 프로모터를 포함한다. 비제한적 예로서, 프로모터는 CMV 프로모터, CMV-β-액틴-인트론-β-글로빈 하이브리드 프로모터 (CAG), CBA 프로모터, FRDA 또는 FXN 프로모터, UBC 프로모터, GUSB 프로모터, NSE 프로모터, 시냅신 프로모터, MeCP2 프로모터, GFAP 프로모터, H1 프로모터, U6 프로모터, NFL 프로모터, NFH 프로모터, SCN8A 프로모터 또는 PGK 프로모터일 수 있다. 비제한적 예로서, 프로모터는 인간 신장 인자 1α-서브유닛 (EF1α), 극초기 시토메갈로바이러스 (CMV), 닭 β-액틴 (CBA) 및 그의 유도체 CAG, β 글루쿠로니다제 (GUSB), 및 유비퀴틴 C (UBC)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 조직-특이적 발현 요소일 수 있다. 트랜스진은 뉴런에 대한 조직-특이적 발현 요소, 예컨대 비제한적으로 뉴런-특이적 에놀라제 (NSE), 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF), 혈소판-유래 성장 인자 B-쇄 (PDGF-β), 시냅신 (Syn), 메틸-CpG 결합 단백질 2 (MeCP2), Ca2+/칼모듈린-의존성 단백질 키나제 II (CaMKII), 대사성 글루타메이트 수용체 2 (mGluR2), NFL, NFH, np32, PPE, Enk 및 EAAT2 프로모터를 포함할 수 있다. 트랜스진은 성상세포에 대한 조직-특이적 발현 요소, 예컨대 비제한적으로 신경교 섬유질 산성 단백질 (GFAP) 및 EAAT2 프로모터를 포함할 수 있다. 트랜스진은 핍지교세포에 대한 조직-특이적 발현 요소, 예컨대 비제한적으로 미엘린 염기성 단백질 (MBP) 프로모터를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 프로모터는 1 kb 미만이다. 프로모터는 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800 또는 800 초과의 길이를 가질 수 있다. 프로모터는 200-300, 200-400, 200-500, 200-600, 200-700, 200-800, 300-400, 300-500, 300-600, 300-700, 300-800, 400-500, 400-600, 400-700, 400-800, 500-600, 500-700, 500-800, 600-700, 600-800 또는 700-800의 길이를 가질 수 있다. 프로모터는 표적화된 조직, 예컨대 비제한적으로, CNS에서 일정 기간 동안 치료 유전자 발현 산물의 발현을 제공할 수 있다. 치료 유전자 발현 산물의 발현은 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 19시간, 20시간, 21시간, 22시간, 23시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 2주, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 3주, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일, 29일, 30일, 31일, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 1년, 13개월, 14개월, 15개월, 16개월, 17개월, 18개월, 19개월, 20개월, 21개월, 22개월, 23개월, 2년, 3년, 4년, 5년, 6년, 7년, 8년, 9년, 10년, 11년, 12년, 13년, 14년, 15년, 16년, 17년, 18년, 19년, 20년, 21년, 22년, 23년, 24년, 25년, 26년, 27년, 28년, 29년, 30년, 31년, 32년, 33년, 34년, 35년, 36년, 37년, 38년, 39년, 40년, 41년, 42년, 43년, 44년, 45년, 46년, 47년, 48년, 49년, 50년, 55년, 60년, 65년, 또는 65년 초과의 기간 동안일 수 있다. 페이로드의 발현은 1-5시간, 1-12시간, 1-2일, 1-5일, 1-2주, 1-3주, 1-4주, 1-2개월, 1-4개월, 1-6개월, 2-6개월, 3-6개월, 3-9개월, 4-8개월, 6-12개월, 1-2년, 1-5년, 2-5년, 3-6년, 3-8년, 4-8년 또는 5-10년 또는 10-15년, 또는 15-20년, 또는 20-25년, 또는 25-30년, 또는 30-35년, 또는 35-40년, 또는 40-45년, 또는 45-50년, 또는 50-55년, 또는 55-60년, 또는 60-65년 동안일 수 있다.
AAV 벡터는 헬퍼 바이러스의 게놈을 포함할 수 있다. 헬퍼 바이러스 단백질은 재조합 AAV (rAAV)의 어셈블리, 및 이종 핵산을 함유하는 트랜스진의 rAAV 내로의 패키징에 요구된다. 헬퍼 바이러스 유전자는 세포에서 발현될 때 AAV 복제를 돕는 아데노바이러스 유전자 E4, E2a 및 VA이다. 일부 실시양태에서, AAV 벡터는 E2를 포함한다. 일부 실시양태에서, AAV 벡터는 E4를 포함한다. 일부 실시양태에서, AAV 벡터는 VA를 포함한다. 일부 경우에, AAV 벡터는 헬퍼 바이러스 단백질 중 하나, 또는 임의의 조합을 포함한다.
트랜스진에서 사용하기 위한 표적 유전자 또는 유전자 발현 산물은 ATP1A2, CACNAIA, SETD5, SHANK3, NF2, DNMT1, TCF4, RAI1, PEX1, ARSA, EIF2B5, EIF2B1, EIF2B2, NPCl, ADAR, MFSD8, STXBP1, PRICKLE2, PRRT2, IDUA, STX1B, 사르코글리칸 알파 (SGCA), 글루탐산 데카르복실라제 65 (GAD65), 글루탐산 데카르복실라제 67 (GAD67), CLN2, 신경 성장 인자 (NGF), 신경교 세포 유래 신경영양 인자 (GDNF), 운동 뉴런 1의 생존, STXBP1, 텔로머 (SMN1), 인자 X (FIX), 레티노이드 이소머로히드롤라제 (RPE65), 사르코/내형질 세망 Ca2+-ATPase (SERCA2a), 글루코세레브로시다제 (GCase), 갈락토세레브로시다제 (GALC), CDKL5, 프라탁신 (FXN), 헌팅틴 (HTT), 메틸-CpG 결합 단백질 2 (MECP2), 퍼옥시솜 생물발생 인자 (PEX), 프로그래뉼린 (GRN), 항튜불린제, 구리-아연 슈퍼옥시드 디스뮤타제 (SOD1), 이두로네이트 2 술파타제 (hIDS), 글루코실세라미다제 베타 (GBA), 유약 X 정신 지체 1 (FMR1), NPC 세포내 콜레스테롤 수송체 1 (NPCl), SCN1A, C9orf72, NPS3 및 NLRP3 인플라마솜으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 퍼옥시솜 생물발생 인자 (PEX)는 PEX1, PEX2, PEX3, PEX4, PEX5, PEX6, PEX7, PEX10, PEX11β, PEX12, PEX13, PEX14, PEX16, PEX19, 및 PEX26으로부터 선택된다.
AAV 벡터는 본원에 기재된 재조합 AAV (rAAV) 캡시드 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 바이러스 게놈을 포함할 수 있다. 바이러스 게놈은 Rep 단백질을 코딩하는 복제 (Rep) 유전자, 및 제1 오픈 리딩 프레임 (ORF1) 내에 AAP 단백질 또는 제2 오픈 리딩 프레임 (ORF2) 내에 Cap 단백질을 코딩하는 캡시드 (Cap) 유전자를 포함할 수 있다. Rep 단백질은 Rep78, Rep68, Rep52 및 Rep40으로부터 선택된다. 일부 경우에, 본원에 기재된 변형된 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 Cap 유전자는 변형된다. 야생형 Cap 유전자는 3개의 단백질, VP1, VP2 및 VP3을 코딩한다. 일부 경우에, VP1이 변형된다. 일부 경우에, VP2가 변형된다. 일부 경우에, VP3이 변형된다. 일부 경우에, 3개의 VP1-VP3 모두가 변형된다. AAV 벡터는 야생형 Rep78, Rep68, Rep52, Rep40 및 AAP 단백질을 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 표 3에 제시된 서열식별번호: 71에 제공된 AAV9 VP1 유전자는 표 4의 서열식별번호: 75-113 중 어느 하나를 포함하도록 변형된다. 본원에 기재된 AAV 벡터는 본원에 기재된 방법에 의해 변이체 AAV 캡시드를 생산하는 데 사용될 수 있다.
표 3. VP1 캡시드 단백질 핵산 서열
Figure pct00010
Figure pct00011
표 4.
rAAV의 생산 방법
AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 캡시드 및 치료 핵산을 코딩하는 바이러스 벡터를 생산하는 방법이 본원에 개시된다. AAV 캡시드 단백질은 세포 (예를 들어, 불멸화 줄기 세포) 내로 모 AAV 바이러스로부터의 역전된 말단 반복부 (ITR) 서열에 의해 플랭킹된 트랜스진 카세트를 함유하는 제1 벡터 (트랜스진 카세트는 표적 세포의 핵에서 이종 핵산의 전사를 유도하는 프로모터 서열을 가짐), AAV 캡시드 단백질을 갖는 AAV 게놈을 코딩하는 제2 벡터 (생산되는 변이체에 대해 AAV Rep 유전자 뿐만 아니라 변형된 Cap 유전자를 코딩함), 및 AAV 캡시드 구조의 조립 및 변형된 AAV 캡시드 구조에서 트랜스진의 패키징에 필요한 헬퍼 바이러스 단백질을 코딩하는 제3 벡터를 도입함으로써 생산된다. 조립된 AAV 캡시드는 관련 기술분야에 공지된 적합한 방법을 사용하여 세포로부터 단리 및 정제될 수 있다. 표 1은 본원에 기재된 방법에 사용하기 위한 DNA 서열을 제공한다.
재조합 AAV (rAAV) 벡터에 함유되고 본 개시내용의 AAV 캡시드 단백질에 의해 캡시드화된 트랜스진이 또한 본원에 제공된다. 본원에 개시된 트랜스진은 다양한 목적을 위해, 예컨대 대상체에서 질환 또는 상태를 치료하기 위해 대상체에게 전달된다. 트랜스진은 표적 유전자 또는 유전자 발현 산물의 활성 또는 발현을 조정하는 유전자 편집 성분일 수 있다. 대안적으로, 트랜스진은 그 자체, 또는 또 다른 표적 유전자 또는 유전자 발현 산물의 활성 또는 발현을 조정하는 데 효과적인 치료 유전자 발현 산물을 코딩하는 유전자이다.
본원에 개시된 측면은 (a) (i) 모 AAV 바이러스로부터의 역전된 말단 반복부 (ITR) 서열에 의해 플랭킹된 트랜스진 카세트를 함유하는 제1 벡터 (트랜스진 카세트는 표적 세포의 핵에서 이종 핵산의 전사를 유도하는 프로모터 서열을 가짐); (ii) 본 발명의 AAV 캡시드 단백질을 갖는 AAV 게놈을 코딩하는 제2 벡터; 및 (iii) AAV 캡시드 구조의 조립 및 변형된 AAV 캡시드 구조에서 트랜스진의 패키징에 필요한 헬퍼 바이러스 단백질을 코딩하는 벡터를 포함하는 핵산을 세포 내로 도입하고; (b) 세포 내에서 본원에 기재된 AAV 캡시드 단백질을 발현시키고; (c) 본원에 개시된 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 입자를 조립하고; (d) AAV 입자를 패키징하는 것을 포함하는, rAAV 바이러스 또는 바이러스 입자를 제조하는 방법을 제공한다. 일부 경우에, 세포는 포유동물 세포이다. 일부 경우에, 세포는 불멸화된다. 일부 경우에, 불멸화 세포는 배아 줄기 세포이다. 일부 경우에, 배아 줄기 세포는 인간 배아 줄기 세포이다. 일부 경우에, 인간 배아 줄기 세포는 인간 배아 신장 293 (HEK-293) 세포이다. 일부 경우에, Cap 유전자는 서열식별번호: 71에 제시된 데옥시리보스 핵산 (DNA)으로부터 유래된다. 일부 경우에, 5' ITR 및 3' ITR은 AAV2 혈청형으로부터 유래된다. 일부 경우에, 5' ITR 및 3' ITR은 AAV5 혈청형으로부터 유래된다. 일부 경우에, 5' ITR 및 3' ITR은 AAV9 혈청형으로부터 유래된다. 일부 경우에, 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열은 트랜스로 존재한다. 일부 경우에, 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열은 시스로 존재한다. 일부 경우에, 제1 핵산 서열, 제2 핵산 서열 및 제3 핵산 서열은 트랜스로 존재한다.
본원에 개시된 Cap 유전자는 본 개시내용의 변형된 AAV 캡시드 단백질 부분을 코딩하는 DNA 서열인, 표 4로부터의 서열식별번호: 75-113 중 어느 하나를 포함한다.
일부 경우에, 방법은 변형된 AAV 캡시드 단백질에 의해 캡시드화되도록 치료 유전자 발현 산물을 코딩하는 제1 핵산 서열을 패킹하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 입자는 적합한 바이러스 정제 방법, 예컨대 본원에 기재된 것을 사용하여 단리, 농축 및 정제된다.
일부 경우에, 본 개시내용의 rAAV는 문헌 [Challis, R. C. et al. Nat. Protoc. 14, 379 (2019)]에 기재된 방법을 사용하여 생성된다. 간략하게, 폴리에틸렌이민 (PEI)을 사용한 HEK293T 세포 (ATCC)의 삼중 형질감염을 수행하고, 세포 용해물 및 배지 둘 다로부터 120시간 후에 바이러스를 수집하고, 아이오딕사놀 상에서 정제하였다. 비제한적 예에서, rAAV는 표준 형질감염 프로토콜 (예를 들어, PEI)을 사용한 전구체 세포 (예를 들어, HEK293T) 세포의 삼중 형질감염에 의해 생성된다. 바이러스 입자는 소정 기간 후 (예를 들어, 형질감염 72시간 후)에 배지로부터, 그리고 보다 나중 시점 (예를 들어, 형질감염 120시간 후)에 세포 및 배지로부터 수거된다. 배지에 존재하는 바이러스를 8% 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 500 mM 염화나트륨으로의 침전에 의해 농축시키고, 침전된 바이러스를 수집된 세포로부터 제조된 용해물에 첨가한다. 바이러스를 아이오딕사놀 (옵티프렙(Optiprep), 시그마(Sigma)) 단계 구배 (15%, 25%, 40% 및 60%) 상에서 정제한다. 바이러스를 농축시키고, PBS 중에서 제제화한다. 바이러스 역가는 qPCR 및 대조군으로서 선형화된 게놈 플라스미드를 사용하여 DNaseI-내성 벡터 게놈 카피 (VG)의 수를 측정함으로써 결정된다.
세포는 인간, 영장류, 뮤린, 고양이, 개, 돼지, 양, 소, 말, 에핀, 염소 및 루핀 숙주 세포로부터 선택될 수 있다. 일부 경우에, 세포는 전구 또는 전구체 세포, 예컨대 줄기 세포이다. 일부 경우에, 줄기 세포는 중간엽 세포, 배아 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포 (iPSC), 섬유모세포 또는 다른 조직 특이적 줄기 세포이다. 세포는 불멸화될 수 있다. 일부 경우에, 불멸화 세포는 HEK293 세포이다. 일부 경우에, 세포는 분화된 세포이다. 제공된 개시내용에 기초하여, 이러한 시스템을 관심 표적 세포 유형에서 레콤비나제를 발현하는 임의의 트랜스제닉 세포주와 함께 사용하여 그러한 표적 세포 집단을 보다 효율적으로 형질도입시키는 AAV 캡시드를 개발할 수 있는 것으로 예상된다.
치료 방법
본원에 개시된 1종 이상의 조성물 (예를 들어, rAAV 입자, AAV 벡터, 제약 조성물)의 치료 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 질환 또는 상태, 또는 질환 또는 상태의 증상을 치료하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 본원에 기재된 rAAV 캡시드 단백질이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 본원에 기재된 단리 및 정제된 rAAV 캡시드 단백질이다. 일부 실시양태에서, rAAV 입자는 트랜스진 (예를 들어, 치료 핵산)을 포함하는 AAV 벡터를 캡시드화한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 본원에 개시된 치료제와 접합된 본원에 기재된 rAAV 캡시드 단백질이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 rAAV 입자 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 조성물은 대상체에게 단독으로 투여된다 (예를 들어, 독립 요법). 일부 실시양태에서, 조성물은 질환 또는 상태에 대한 1차 요법이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 질환 또는 상태에 대한 2차, 3차 또는 4차 요법이다.
재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 매개 유전자 전달은 에피솜 이종 핵산 (예를 들어, 트랜스진, 치료 핵산)의 핵 발현을 위한 바이러스 형질도입의 AAV 메카니즘을 활용한다. 숙주 생체내 환경으로의 전달 시, rAAV는 (1) 표적 세포 상의 세포 표면 수용체에 결합 또는 부착하고, (2) 세포내이입하고, (3) 핵으로 수송하고, (4) 바이러스를 탈코팅하여 캡시드화된 이종 핵산을 방출하고, (5) 핵에서의 전사를 위한 주형으로서 이종 핵산을 단일-가닥으로부터 이중-가닥 DNA로 전환시키고, (6) 숙주 세포의 핵에서 에피솜 이종 핵산을 전사시킬 것이다 ("형질도입"). 증가된 형질도입 (숙주 세포에서의 에피솜 이종 핵산의 전사)을 갖도록 조작된 rAAV는 유전자 요법 적용에 바람직하다.
본원에 개시된 측면은 대상체에게 치료 유효량의 본 개시내용의 rAAV 또는 본 개시내용의 제약 제제를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 유전자 생성물은 치료 유전자 생성물인, 대상체에서 질환 또는 상태를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 투여는 두개내, 심실내, 뇌실내, 정맥내, 동맥내, 비강내, 척수강내, 대수조내 또는 피하에 의한 것이다.
본 개시내용의 이종 핵산을 캡시드화하는 rAAV를 투여함으로써 대상체에서 표적 유전자 또는 유전자 발현 산물의 발현 또는 활성을 조정하는 것을 포함하는, 표적 유전자 또는 그의 유전자 발현 산물의 이상 발현 또는 활성과 연관된 질환 또는 상태를 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 경우에, 표적 유전자 또는 유전자 발현 산물의 발현 또는 활성은 정상 (비-이환) 개체에서의 것에 비해 감소되고; rAAV를 대상체에게 투여하는 것은 표적 유전자 또는 유전자 발현 산물의 발현 또는 활성을 증가시키기에 충분하다. 일부 경우에, 유전자 또는 유전자 발현 산물의 발현 또는 활성은 정상 개체에서의 것에 비해 증가되고; rAAV를 대상체에게 투여하는 것은 표적 유전자 또는 유전자 발현 산물의 발현 또는 활성을 감소시키기에 충분하다. 비제한적 예에서, 일부 경우에 프레세닐린 1 및/또는 프레세닐린 2 (각각 유전자 PSEN1 및 PSEN2에 의해 코딩됨)의 기능-획득에 의해 유발되는 알츠하이머병으로 진단된 대상체에게 침묵 RNA (siRNA), 또는 PSEN1 mRNA에 대한 기능-상실 효과를 갖는 다른 RNAi인 치료 핵산을 캡시드화하는 본원에 개시된 rAAV가 투여된다.
또한, 대상체에게 본원에 기재된 치료 유전자 발현 산물을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 rAAV 벡터의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 본원에 개시된 질환 또는 상태를 예방하는 방법이 제공된다. rAAV 벡터는 본원에 기재된 변형된 캡시드 단백질 또는 rAAV 바이러스 입자에서 캡시드화될 수 있다. 일부 경우에, 치료 유전자 발현 산물은 표적 유전자 또는 유전자 발현 산물의 활성 또는 발현을 조정하는 데 효과적이다.
본원에 개시된 rAAV를 포함하는 조성물을 투여함으로써 대상체에서 질환 또는 상태를 치료하는 방법이 본원에 개시된다. 본원에 개시된 rAAV의 이점은 rAAV가 척수성 근육 위축 (SMA), 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 파킨슨병, 폼페병, 제II형 뮤코폴리사카라이드증, 유약 X 증후군, STXBP1 뇌병증, 크라베병, 헌팅톤병, 알츠하이머병, 배튼병, 리소솜 축적 장애, 다형성 교모세포종, 레트 증후군, 레베르 선천성 흑암시, 후기 영아 신경 세로이드 리포푸신증 (LINCL), 만성 통증, 졸중, 척수 손상, 외상성 뇌 손상 및 리소솜 축적 장애를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 트랜스진 요법으로부터 이익을 얻을 실질적으로 임의의 질환 또는 상태를 치료하는 데 사용될 수 있다는 것이다.
일부 경우에, 질환 또는 상태는 대상체의 특정한 생체내 환경, 예를 들어 CNS에 국재화된다. 본 개시내용의 조성물은 본원에 기재된 질환 또는 상태의 치료에 특히 유용한데, 이는 이들이 생체내 환경을 특이적으로 또는 보다 효율적으로 표적화하고, 질환 또는 상태의 발병기전 또는 병리상태와 관련된 표적 유전자 발현 산물의 활성 또는 발현을 조정하도록 조작된 치료 핵산을 전달하기 때문이다.
(a) 표적 생체내 환경에 영향을 미치는 질환 또는 상태를 갖는 대상체를 진단하는 단계; 및 (b) 대상체에게 치료 유효량의 본원에 개시된 조성물 (예를 들어, rAAV 입자, AAV 벡터, 제약 조성물)을 투여함으로써 질환 또는 상태를 치료하는 단계를 포함하며, 여기서 조성물은 증가된 발현으로 조작된 것인, 대상체에서 질환 또는 상태, 또는 질환 또는 상태의 증상을 치료하는 방법이 본원에 제공된다.
(a) 대상체에게 조성물 (예를 들어, rAAV 입자, AAV 벡터, 제약 조성물)을 투여하는 단계; 및 (b) 증가된 형질도입으로 대상체에서 치료 핵산을 표적 생체내 환경 내로 발현시키는 단계를 포함하는, 대상체에서 표적을 앓고 있는 질환 또는 상태, 또는 질환 또는 상태의 증상을 치료하는 방법이 본원에 개시된다.
일부 실시양태에서, 방법은 오프-타겟 생체내 환경, 예컨대 간에서 이종 핵산의 전달을 감소 또는 제거하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 전달은 CNS에서의 (예를 들어, 이종 핵산의) 형질도입의 증가를 특징으로 한다.
일부 실시양태에서, CNS에 영향을 미치는 질환 또는 상태를 치료하는 방법은 대상체에서 CNS에 rAAV 입자를 투여하는 것을 포함하며, rAAV 입자는 모 AAV 캡시드 단백질 내의 아미노산 위치 588-589에서 표 1, 도 1-3 및 화학식 I에 제공된 아미노산 서열의 약 5, 6 또는 7개의 아미노산의 삽입을 포함하는 rAAV 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, CNS에 영향을 미치는 질환 또는 상태를 치료하는 방법은 대상체에서 CNS에 rAAV 입자를 투여하는 것을 포함하며, rAAV 입자는 아미노산 서열의 약 5, 6 또는 7개의 아미노산의 삽입 뿐만 아니라 표 1, 도 1-3 및 화학식 I에 제공된 바와 같은 아미노산 위치 587-590에서 발견되는 아미노산 [AQAQ]에서의 1개 이상의 치환을 포함하는 rAAV 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 모 AAV 캡시드 단백질은 AAV9 캡시드 단백질 (예를 들어, 서열식별번호: 1에 제공됨)이다.
표적 유전자 발현 산물의 조정을 필요로 하는 대상체에게 본원에 개시된 조성물 (예를 들어, rAAV 입자, AAV 벡터, 제약 조성물)을 투여하는 것을 포함하는, 표적 유전자 발현 산물을 조정하는 방법이 또한 제공된다. 예를 들어, 본원에 제공된 방법은 표적 유전자 발현 산물의 발현 또는 활성을 조정하는 이종 핵산을 포함하는 바이러스 벡터를 캡시드화하는 rAAV 캡시드 단백질을 갖는 rAAV를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
용어 "정상 개체"는 유전자 또는 그의 유전자 발현 산물의 발현 또는 활성의 변이를 특징으로 하는 질환 또는 상태를 앓지 않는 개체를 지칭한다.
일부 실시양태에서, CNS의 질환 또는 상태는 하기로부터 선택된다: 투명 격막 부재, 산성 리파제 질환, 산성 말타제 결핍, 후천성 간질양 실어증, 급성 파종성 뇌척수염, 주의력 결핍-과잉행동 장애 (ADHD), 아디 동공, 아디 증후군, 부신백질이영양증, 뇌량의 무발생증, 실인증, 에카르디 증후군, 에카르디-구티에레스 증후군 장애, AIDS-신경계 합병증, 알렉산더병, 알퍼병, 교대 편마비, 알츠하이머병, 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 무뇌증, 동맥류, 안젤만 증후군, 혈관종증, 무산소증, 항인지질 증후군, 실어증, 실행증, 거미막 낭, 지주막염, 아놀드-키아리 기형, 동정맥 기형, 아스퍼거 증후군, 운동실조, 모세혈관확장성 운동실조, 운동실조 및 소뇌 또는 척수소뇌 변성, 심방 세동 및 졸중, 주의력 결핍-과잉행동 장애, 자폐증 스펙트럼 장애, 자율신경성 기능장애, 요통, 바르트 증후군, 배튼병, 베커 근긴장증, 베체트병, 벨 마비, 양성 본태성 안검연축, 양성 초점성 근위축, 양성 두개내 고혈압, 베른하르트-로트 증후군, 빈스방거병, 안검연축, 블로흐-술즈베르거 증후군, 상완 신경총 출산 손상, 상완 신경총 손상, 브래드버리-에글스톤 증후군, 뇌 및 척수 종양, 뇌 동맥류, 뇌 손상, 브라운-세카르 증후군, 연수척수성 근육 이영양증, 피질하 경색 및 백질뇌병증을 동반한 상염색체 우성 뇌동맥병증 (CADASIL), 카나반병, 손목 터널 증후군, 작열통, 해면종, 해면 혈관종, 해면 기형, 중심 경수 증후군, 중심 척수 증후군, 중추성 통증 증후군, 중심 뇌교 수초용해, 두부 장애, 세라미다제 결핍, 소뇌 변성, 소뇌 저형성증, 뇌 동맥류, 뇌 동맥경화증, 뇌 위축, 뇌 각기병, 뇌 해면 기형, 뇌 거대증, 뇌 저산소증, 뇌성 마비, 뇌-안구-안면-골격 증후군 (COFS), 샤르코-마리-투스병, 샤르코-마리-투스 증후군, 전형적 근형부 점상 연골이형성증 (RCDP), 키아리 기형, 콜레스테롤 에스테르 축적 질환, 무도병, 유극적혈구증가무도병(Choreoacanthocytosis), 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증 (CIDP), 만성 기립성 불내증, 만성 통증, 코케인 증후군, 제II형 코케인 증후군, 코핀 로우리 증후군, 거대후두각, 혼수, 복합 부위 통증 증후군, 선천성 안면 양측마비, 선천성 근무력증, 선천성 근병증, 선천성 혈관 해면 기형, 피질기저 변성, 두개 동맥염, 두개골유합증, 크리 뇌염, 크로이츠펠트-야콥병, 누적 외상 장애, 쿠싱 증후군, 거대세포 봉입체 질환, 시토메갈로바이러스 감염, 춤추는 눈-춤추는 발 증후군, 댄디-워커 증후군, 도슨병, 난청, 드 모르시어 증후군, 데제린-클룸프케 마비, 치매, 다발경색 치매, 의미 치매, 피질하 치매, 루이 소체 치매, 치상 소뇌 운동실조, 치상핵구 위축, 피부근염, 발달 행동곤란, 데빅 증후군, 당뇨병성 신경병증, 미만성 경화증, 드라베 증후군, 뒤시엔느 근육 이영양증, 자율신경실조증, 쓰기장애, 난독증, 연하곤란, 행동곤란, 마이오클로누스성 소뇌성 근실조, 진행성 소뇌성 근실조, 이상긴장증, 조기 영아 간질성 뇌병증, 빈 안장 증후군, 뇌염, 기면성 뇌염, 뇌탈출증, 뇌병증, (가족성 영아) 뇌병증, 뇌삼차신경 혈관종증, 간질, 간질성 편마비, 에르브 마비, 에르브-뒤시엔느 및 데제린-클룸프케 마비, 본태성 진전, 뇌교외 수초용해, 파브리병, 파르 증후군, 기절, 가족성 자율신경실조증, 가족성 혈관종, 가족성 특발성 기저 신경절 석회화, 가족성 주기성 마비, 가족성 경직성 마비, 파버병, 열성 발작, 섬유근성 이형성증, 피셔 증후군, 저긴장영아 증후군, 족하수, 유약 X 증후군, 프리드라이히 운동실조, 전두측두엽 치매 (FTD), 고셔병, 전신성 강글리오시드증, 게르스트만 증후군, 게르스트만-스트라우슬러-샤잉커병, 거대 축삭 신경병증, 거대 세포 동맥염, 거대 세포 봉입체 질환, 교모세포종, 구상 세포 백질이영양증, 설인 신경통, 글리코겐 축적 질환, 길랑-바레 증후군, 할러보르덴-스파츠병, 두부 손상, 두통, 지속성 반두통, 편측안면 연축, 교대성 편마비, 유전성 신경병증, 유전성 경직성 하반신마비, 유전성 다발신경염성 실조, 대상 포진, 이성 대상 포진, 히라야마 증후군, 홀름-아디 증후군, 완전전뇌증, HTLV-1 연관 척수병증, 휴즈 증후군, 헌팅톤병, 무뇌수두증, 수두증, 수두증 - 정상압, 수척수증, 고코르티솔증, 과다수면, 고긴장증, 저긴장증, 저산소증, 면역-매개 뇌척수염, 봉입체 근염, 색소실조증, 영아 저긴장증, 영아 신경축삭 이영양증, 영아 피탄산 축적 질환, 영아 레프숨병 (IRD), 영아 연축, 염증성 근병증, 후두공뇌탈출기형, 장 지방이영양증, 두개내 낭, 두개내 고혈압, 이삭 증후군, 주버트 증후군, 컨스-세이어 증후군, 케네디병, 킨스번 증후군, 클라인-레빈 증후군, 클리펠-페일 증후군, 클리펠-트레노우네이 증후군 (KTS), 클리버-부시 증후군, 코르사코프 기억상실 증후군, 크라베병, 쿠겔베르그-벨란더병, 쿠루병, 램버트-이튼 근무력 증후군, 란다우-클레프너 증후군, 외측 대퇴 피부 신경 포착, 외측 연수 증후군, 학습 불능, 라이병, 레녹스-가스타우트 증후군, 레쉬-니한 증후군, 백질이영양증, 레빈-크리틀리 증후군, 루이 소체 치매, 지질 축적 질환, 지질성 단백증, 활택뇌증, 잠금 증후군, 루게릭병, 루푸스 - 신경계 후유증, 라임병 - 신경계 합병증, 마차도-요셉병, 대뇌증, 메이플 시럽뇨 질환, 거대뇌증, 멜커슨-로젠탈 증후군, 수막염, 수막염 및 뇌염, 멘케스병, 멘케스 증후군, 지각이상성 대퇴신경통, 이염성 백질이영양증, 소두증, 편두통, 밀러 피셔 증후군, 미니 졸중, 미토콘드리아 근병증, 뫼비우스 증후군, 단일사지 근위축증, 운동 뉴런 질환, 모야모야병, 점액지질증, 뮤코폴리사카라이드증, 뮤코폴리사카라이드증 II, 다발경색 치매, 다초점성 운동 신경병증, 다발성 경화증, 다계통 위축, 기립성 저혈압을 동반한 다계통 위축, 근육 이영양증, 선천성 근무력증, 중증 근무력증, 수초탈락성 미만성 경화증, 유아의 근간대성 뇌병증, 근간대성경련, 근병증, 선천성 근병증, 갑상선중독성 근병증, 근긴장증, 선천성 근긴장증, 근긴장성 이영양증, 기면증, 신경유극적혈구증가증, 뇌 철 축적을 동반한 신경변성, 신경섬유종증, 신경이완제 악성 증후군, AIDS의 신경계 합병증, 라임병의 신경계 합병증, 시토메갈로바이러스 감염의 신경계 결과, 폼페병의 신경계 징후, 루푸스의 신경계 후유증, 시신경척수염, 신경근긴장증, 신경 세로이드 리포푸신증, 뉴천 이동 장애, 유전성 신경병증, 신경사르코이드증, 신경매독, 신경독성, 해면 모반, 니만-픽병, 오설리번-맥레오드 증후군, 후두 신경통, 오타하라 증후군, 올리브교뇌소뇌 위축, 안진전 근간대성경련, 기립성 저혈압, 과사용 증후군, 만성 통증, 판토테네이트 키나제-연관 신경변성, 부신생물성 증후군, 감각이상, 파킨슨병, 발작성 무도무정위운동증, 발작성 반두통, 패리-롬버그, 펠리제우스-메르츠바허병, 페나 쇼커 II 증후군, 신경주위 낭, 주기성 마비, 말초 신경병증, 뇌실주위 백질연화증, 지속 식물 상태, 전반적 발달 장애, 페닐케톤뇨, 피탄산 축적 질환, 픽병, 신경 조임, 이상근 증후군, 뇌하수체 종양, 다발근염, 폼페병, 공뇌증, 소아마비후 증후군, 포진후 신경통, 감염후 뇌척수염, 체위성 저혈압, 체위성 기립성 빈맥 증후군, 체위성 빈맥 증후군, 프라더-윌리 증후군, 원발성 치상 위축, 원발성 측삭 경화증, 원발성 진행성 실어증, 프리온 질환, 진행성 편측안면 위축, 진행성 보행성 운동실조, 진행성 다초점성 백질뇌병증, 진행성 경화성 회백질위축증, 진행성 핵상 마비, 얼굴인식불능증, 슈도-토치 증후군, 가성톡소플라스마증 증후군, 가성 뇌종양, 심인성 운동, 람세이 헌트 증후군 I, 람세이 헌트 증후군 II, 라스무센 뇌염, 반사 교감신경 이영양증 증후군, 레프숨병, 영아 레프숨병, 반복 운동 장애, 반복 스트레스 손상, 하지 불안 증후군, 레트로바이러스-연관 척수병증, 레트 증후군, 라이 증후군, 류마티스성 뇌염, 릴리-데이 증후군, 천골 신경근 낭, 세인트 비투스 댄스, 타액선 질환, 샌드호프병, 쉴더병, 분열뇌증, 자이텔버거병, 발작 장애, 의미 치매, 중격-시신경 이형성증, 영아기 중증 근간대성 간질 (SMEI), 흔들린 아기 증후군, 대상포진, 샤이-드래거 증후군, 쇼그렌 증후군, 수면 무호흡, 수면병, 소토스 증후군, 경직, 이분 척추, 척수 경색, 척수 손상, 척수 종양, 척수성 근육 위축, 척수소뇌성 운동실조, 척수소뇌성 위축, 척수소뇌 변성, 스틸-리차드슨-올스제위스키 증후군, 강직-인간 증후군, 선조체흑질 변성, 졸중, 스터지-웨버 증후군, STXBP1 뇌병증, 아급성 경화성 범뇌염, 피질하 동맥경화성 뇌병증, 단기-지속, 일측성, 신경통형 (SUNCT) 두통, 연하 장애, 시데남 무도병, 실신, 매독성 척수성 경화증, 척수수공동증, 척수공동증, 전신 홍반성 루푸스, 척수매독, 탄지에르병, 지연성 이상운동증, 타로프 낭종, 테이-삭스병, 측두 동맥염, 테더링 척수 증후군, 톰슨 근긴장증, 흉곽 출구 증후군, 갑상선중독성 근병증, 동통성 틱, 토드 마비, 투렛 증후군, 일과성 허혈 발작, 전염성 해면상 뇌병증, 횡단성 척수염, 외상성 뇌 손상, 진전, 삼차 신경통, 열대성 경직성 하반신부전마비, 트로이어 증후군, 결절성 경화증, 혈관 발기성 종양, 중추 신경계의 혈관염 증후군, 폰 에코노모병, 폰 히펠-린다우병 (VHL), 폰 히펠-린다우 증후군, 폰 레클링하우젠병, 발렌버그 증후군, 베르드니히-호프만병, 베르니케-코르사코프 증후군, 웨스트 증후군, 편타증, 휘플병, 윌리암스 증후군, 윌슨병, 월만병, X-연관 척수 및 연수성 근육 위축 및 젤베거 증후군.
일부 실시양태에서, 제약 제제는 치료 유전자 발현 산물을 코딩하는 치료 핵산을 포함한다. 일부 경우에, 치료 유전자 발현 산물은 ATP1A2, CACNAIA, SETD5, SHANK3, NF2, DNMT1, TCF4, RAI1, PEX1, ARSA, EIF2B5, EIF2B1, EIF2B2, NPCl, ADAR, MFSD8, STXBP1, PRICKLE2, PRRT2, IDUA, STX1B, 사르코글리칸 알파 (SGCA), 글루탐산 데카르복실라제 65 (GAD65), 글루탐산 데카르복실라제 67 (GAD67), CLN2, 신경 성장 인자 (NGF), 신경교 세포 유래 신경영양 인자 (GDNF), 운동 뉴런 1의 생존, STXBP1, 텔로머 (SMN1), 인자 X (FIX), 레티노이드 이소머로히드롤라제 (RPE65), 사르코/내형질 세망 Ca2+-ATPase (SERCA2a), 글루코세레브로시다제 (GCase), 갈락토세레브로시다제 (GALC), CDKL5, 프라탁신 (FXN), 헌팅틴 (HTT), 메틸-CpG 결합 단백질 2 (MECP2), 퍼옥시솜 생물발생 인자 (PEX), 프로그래뉼린 (GRN), 항튜불린제, 구리-아연 슈퍼옥시드 디스뮤타제 (SOD1), 이두로네이트 2 술파타제 (hIDS), 글루코실세라미다제 베타 (GBA), 유약 X 정신 지체 1 (FMR1), NPC 세포내 콜레스테롤 수송체 1 (NPCl), SCN1A, C9orf72, NPS3 및 NLRP3 인플라마솜으로부터 선택된 표적 유전자 또는 유전자 발현 산물의 활성 또는 발현을 조정하는 데 효과적이다. 일부 실시양태에서, 퍼옥시솜 생물발생 인자 (PEX)는 PEX1, PEX2, PEX3, PEX4, PEX5, PEX6, PEX7, PEX10, PEX11β, PEX12, PEX13, PEX14, PEX16, PEX19, 및 PEX26으로부터 선택된다.
일부 측면에서, CNS 질환 또는 장애에 수반되는 유전자의 다른 예는 MAPT, IDUA, SNCA, ATXN2, Ube3a, GNS, HGSNAT, NAGLU, SGSH, CLN1, CLN3, CLN4, CLN5, CLN6, CLN7, CLN8, CTSD, ABCD1, HEXA, HEXB, ASM, ASPA, GLB1, AADC, MFN2, GNAO1, SYNGAP1, GRIN2A, GRIN2B, KCNQ2, EPM2A, NHLRC1, SLC6A1, SLC13A5, SURF1, GBE1, ATXN1, ATXN3, 및 ATXN7을 포함한다.
일부 경우에, 치료 유전자 발현 산물은 유전자 편집 성분을 포함한다. 일부 경우에, 유전자 편집 성분은 인공 부위-특이적 RNA 엔도뉴클레아제 (ASRE), 아연 핑거 엔도뉴클레아제 (ZFN), 전사 인자 유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 (CRlSPR)/Cas 효소, 및 CRlSPR/Cas 가이드 RNA로부터 선택된다.
일부 경우에, 유전자의 발현 또는 유전자 발현 산물의 발현 또는 활성은 대상체에게 조성물을 투여함으로써 억제된다. 일부 경우에, 유전자의 발현 또는 유전자 발현 산물의 발현 또는 활성은 대상체에게 조성물을 투여함으로써 증진된다.
제제, 투여량 및 투여 경로
이종 핵산을 캡시드화하는 rAAV 입자를 대상체에서 CNS에 전달하는 것을 포함하며, rAAV 입자는 (i) CNS에서의 이종 핵산의 증가된 형질도입을 포함하고, 여기서 rAAV 입자는 모 AAV 캡시드 단백질 내의 아미노산 위치 588-589에서 표 1, 도 1-3 및 화학식 I에 제공된 아미노산 서열의 5, 6 또는 7개의 아미노산의 삽입 뿐만 아니라 표 1, 도 1-3 및 화학식 I에 제공된 바와 같은 아미노산 위치 587-590에서 발견되는 아미노산 [AQAQ]에서의 1개 이상의 치환을 포함하는 rAAV 캡시드 단백질을 갖는 것인 방법이 본원에 개시된다.
일반적으로, 본원에 개시된 방법은 전신 투여에 의해 치료 rAAV 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 방법은 정맥내 ("i.v.") 투여에 의해 치료 rAAV 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 치료 rAAV 조성물을 추가의 경로, 예컨대 피하 주사, 근육내 주사, 피내 주사, 경피 주사, 경피 투여, 비강내 투여, 림프내 주사, 직장 투여, 위내 투여, 안내 투여, 뇌실내 투여, 척수강내, 수조내, 또는 임의의 다른 적합한 비경구 투여에 의해 투여할 수 있다. 치료제의 투여 경로, 투여량, 시점 및 지속기간은 조정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료제의 투여는 질환 또는 상태의 급성 및 만성 증상 중 하나 또는 둘 다의 발병 전 또는 후에 이루어진다. CNS로의 다른 전달 경로는 두개내 투여, 측뇌실 투여 및 혈관내 투여를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 개시된 질환 또는 상태를 예방 또는 치료하기 위한 제약 조성물의 유효 용량 및 투여량은 질환 또는 상태, 또는 질환 또는 상태의 증상과 관련된 관찰된 유익한 반응에 의해 정의된다. 유익한 반응은 질환 또는 상태, 또는 질환 또는 상태의 증상을 예방, 완화, 정지 또는 치유하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유익한 반응은 대상체에서 바이오마커, 전사체 위험 프로파일 또는 장 마이크로바이옴의 존재, 수준 또는 활성의 측정가능한 개선을 검출함으로써 측정될 수 있다. 본원에 사용된 "개선"은 정상 개체 (예를 들어 질환 또는 상태를 앓지 않는 개체)에서 관찰되는 존재, 수준 또는 활성으로의 존재, 수준 또는 활성의 이동을 지칭한다. 치료 rAAV 조성물이 치료상 유효하지 않거나, 또는 질환 또는 상태, 또는 질환 또는 상태의 증상의 충분한 완화를 제공하지 않는 경우에, 투여량 및/또는 투여 경로는 변화될 수 있거나, 또는 추가의 작용제가 치료 rAAV 조성물과 함께 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 환자가 치료 rAAV 조성물의 요법을 시작함에 따라, 환자는 또한 제2 치료 요법을 중단한다 (예를 들어, 용량의 단계적 감소).
일부 경우에, 제약 조성물의 용량은 적어도 또는 약 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015, 1016, 또는 1017의 감염성 입자의 농도를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 감염성 입자의 농도는 2x107, 2x108, 2x109, 2x1010, 2x1011, 2x1012, 2x1013, 2x1014, 2x1015, 2x1016, 또는 2x1017이다. 일부 경우에, 감염성 입자의 농도는 3x107, 3x108, 3x109, 3x1010, 3x1011, 3x1012, 3x1013, 3x1014, 3x1015, 3x1016, 또는 3x1017이다. 일부 경우에, 감염성 입자의 농도는 4x107, 4x108, 4x109, 4x1010, 4x1011, 4x1012, 4x1013, 4x1014, 4x1015, 4x1016, 또는 4x1017이다. 일부 경우에, 감염성 입자의 농도는 5x107, 5x108, 5x109, 5x1010, 5x1011, 5x1012, 5x1013, 5x1014, 5x1015, 5x1016, 또는 5x1017이다. 일부 경우에, 감염성 입자의 농도는 6x107, 6x108, 6x109, 6x1010, 6x1011, 6x1012, 6x1013, 6x1014, 6x1015, 6x1016, 또는 6x1017이다. 일부 경우에, 감염성 입자의 농도는 7x107, 7x108, 7x109, 7x1010, 7x1011, 7x1012, 7x1013, 7x1014, 7x1015, 7x1016, 또는 7x1017이다. 일부 경우에, 감염성 입자의 농도는 8x107, 8x108, 8x109, 8x1010, 8x1011, 8x1012, 8x1013, 8x1014, 8x1015, 8x1016, 또는 8x1017이다. 일부 경우에, 감염성 입자의 농도는 9x107, 9x108, 9x109, 9x1010, 9x1011, 9x1012, 9x1013, 9x1014, 9x1015, 9x1016, 또는 9x1017이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 rAAV 조성물의 전달에 적합한 제약상 허용되는 부형제 및 담체 용액의 제제, 뿐만 아니라 다양한 치료 요법에서 본원에 기재된 특정한 조성물을 사용하기 위한 적합한 투여 및 치료 요법이 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, 각각의 치료상 유용한 조성물 중 치료 유전자 발현 산물의 양은 적합한 투여량이 화합물의 임의의 주어진 단위 용량에서 수득되도록 하는 방식으로 제조될 수 있다. 용해도, 생체이용률, 생물학적 반감기, 투여 경로, 제품 보관 수명, 뿐만 아니라 다른 약리학적 고려사항과 같은 인자가 이러한 제약 제제를 제조하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 고려될 것이고, 따라서 다양한 투여량 및 치료 요법이 바람직할 수 있다.
일부 실시양태에서, 주사가능한 용도에 적합한 rAAV-기반 바이러스 조성물의 제약 형태는 멸균 수용액 또는 분산액, 및 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 담체는, 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 그의 적합한 혼합물, 및/또는 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어 코팅, 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지에 의해 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 이루어질 수 있다. 많은 경우에, 등장화제, 예를 들어 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다.
일부 경우에, 주사가능한 수용액의 투여를 위해, 용액은 필요한 경우에 적합하게 완충될 수 있고, 액체 희석제는 먼저 충분한 염수 또는 글루코스로 등장성이 된다. 이들 특정한 수용액은 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여에 특히 적합하다. 치료되는 대상체의 상태에 따라 투여량의 약간의 변이는 반드시 발생하게 된다. 투여를 담당하는 사람은 어떠한 경우에도 개별 대상체에 대한 적절한 용량을 결정할 것이다. 또한, 인간 투여를 위해, 제제는 FDA 사무국의 생물제제 표준에 의해 요구되는 멸균성, 발열원성, 및 일반적 안전성 및 순도 표준을 충족시켜야 한다.
본원에 개시된 rAAV 조성물을 포함하는 멸균 주사가능한 용액이 본원에 개시되며, 이는 필요한 양의 본원에 개시된 rAAV 조성물을 상기 열거된 여러 다른 성분과 함께 적절한 용매 중에 혼입시킨 후, 필요에 따라, 여과 멸균함으로써 제조된다. 일반적으로, 분산액은 다양한 멸균된 활성 성분을 기본 분산 매질 및 상기 열거된 것으로부터의 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 활성 성분 플러스 그의 이전에 멸균-여과된 용액으로부터의 임의의 추가의 목적하는 성분의 분말을 생성하는 진공-건조 및 동결-건조 기술이다. 주사가능한 용액은 전신 투여, 예를 들어 정맥내 또는 척수강내 투여에 유리할 수 있다.
대상체에게 투여되는 적합한 용량 및 투여량은 특정한 치료 rAAV 조성물, 질환 상태 및 그의 중증도, 치료를 필요로 하는 대상체의 정체성 (예를 들어, 체중, 성별, 연령)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 인자에 의해 결정되고, 예를 들어 투여될 구체적 작용제, 투여 경로, 치료될 상태, 및 치료될 대상체 또는 숙주를 포함한 사례를 둘러싼 특정한 상황에 따라 결정될 수 있다.
rAAV 조성물의 양 및 이러한 조성물의 투여 시간은 본 교시내용의 이익을 갖는 관련 기술분야의 통상의 기술자의 이해 범위 내에 있을 것이다. 그러나, 개시된 조성물의 치료 유효량의 투여는 단일 투여, 예를 들어 이러한 치료를 받고 있는 환자에게 치료 이익을 제공하기에 충분한 수의 감염성 입자의 단일 주사에 의해 달성될 가능성이 있다. 이는, 적어도 부분적으로, 특정 표적 세포 (예를 들어, 뉴런)가 분열하지 않는다는 사실에 의해 가능해지며, 이는 다중 또는 만성 투여에 대한 필요를 제거한다.
특정 실시양태에서, 세포 배양 검정 및 동물 연구로부터 수득된 데이터는 인간을 포함한 포유동물에서 사용하기 위한 치료상 유효한 1일 투여량 범위 및/또는 치료상 유효한 단위 투여량을 공식화하는 데 사용된다. 특정 실시양태에서, 투여량 범위 및/또는 단위 투여량은 사용되는 투여 형태 및 이용되는 투여 경로에 따라 이 범위 내에서 달라진다.
조합 요법
치료 rAAV는 단독으로 또는 추가의 치료제와 조합되어 (함께, "치료제") 사용될 수 있다. 일부 경우에, 본원에 사용된 치료 rAAV는 단독으로 투여된다. 치료제는 조합 요법으로 함께 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 조합 요법은 동일한 날 내에 투여될 수 있거나, 또는 수일, 수주, 수개월 또는 수년 이상 떨어져 투여될 수 있다.
추가의 치료제는 소분자를 포함할 수 있다. 추가의 치료제는 항체 또는 항원-결합 단편을 포함할 수 있다. 추가의 치료제는 지질 나노입자-기반 요법, 안티센스 올리고뉴클레오티드 요법, 뿐만 아니라 다른 바이러스 요법을 포함할 수 있다.
추가의 치료제는 세포-기반 요법을 포함할 수 있다. 예시적인 세포-기반 요법은 비제한적으로 면역 이펙터 세포 요법, 키메라 항원 수용체 T-세포 (CAR-T) 요법, 자연 킬러 세포 요법 및 키메라 항원 수용체 자연 킬러 (NK) 세포 요법을 포함한다. NK 세포 또는 CAR-NK 세포 중 어느 하나, 또는 NK 세포 및 CAR-NK 세포 둘 다의 조합이 본원에 개시된 방법과 조합되어 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, NK 세포 및 CAR-NK 세포는 인간 유도 만능 줄기 세포 (iPSC), 제대혈, 또는 세포주로부터 유래된다. NK 세포 및 CAR-NK 세포는 시토카인 수용체 및 자살 유전자를 포함할 수 있다. 세포-기반 요법은 줄기 세포 요법을 포함할 수 있다. 줄기 세포 요법은 배아 또는 체세포 줄기 세포일 수 있다. 줄기 세포는 공여자로부터 (동종) 단리되거나 또는 대상체로부터 (자가) 단리될 수 있다. 줄기 세포는 대상체의 세포로부터 유래된 확장된 지방-유래 줄기 세포 (eASC), 조혈 줄기 세포 (HSC), 중간엽 줄기 (기질) 세포 (MSC), 또는 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)일 수 있다.
키트
본원에 개시된 조성물을 포함하는 키트가 본원에 개시된다. 또한, CNS의 질환 또는 상태의 치료 또는 예방을 위한 키트가 본원에 개시된다. 일부 경우에, 질환 또는 상태는 암, 병원체 감염, 폐 질환 또는 상태, 신경계 질환, 근육 질환, 또는 면역 장애, 예컨대 본원에 기재된 것이다.
한 실시양태에서, 키트는 본 개시내용의 치료 핵산 (예를 들어, 치료 핵산) 및 재조합 AAV (rAAV) 캡시드 단백질을 코딩하는 재조합 AAV 벡터를 캡시드화하는 rAAV 입자의 조성물의 유효량을 함유하는 치료 또는 예방 조성물을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 키트는 본원에 기재된 rAAV에 의해 변형된 세포 ("변형된 세포")의 유효량을 치료 핵산을 발현하는 단위 투여 형태에 함유하는 치료 또는 예방 조성물을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 키트는 치료 조성물을 함유할 수 있는 멸균 용기를 포함하고; 이러한 용기는 박스, 앰플, 보틀, 바이알, 튜브, 백, 파우치, 블리스터-팩, 또는 관련 기술분야에 공지된 다른 적합한 용기 형태일 수 있다. 이러한 용기는 플라스틱, 유리, 합지, 금속 호일, 또는 의약을 보유하기에 적합한 다른 물질로 제조될 수 있다.
일부 경우에, 키트는 세포를 추가로 포함한다. 일부 경우에, 세포는 포유동물이다. 일부 경우에, 세포는 불멸화된다. 일부 경우에, 불멸화 세포는 배아 줄기 세포이다. 일부 경우에, 배아 줄기 세포는 인간 배아 줄기 세포이다. 일부 경우에, 인간 배아 줄기 세포는 인간 배아 신장 293 (HEK-293) 세포이다. 일부 경우에, 키트는 치료 유전자 발현 산물을 코딩하는 이종 핵산을 포함하는 AAV 벡터를 추가로 포함한다. 일부 경우에, AAV 벡터는 에피솜이다.
일부 경우에, rAAV는 질환 또는 상태 (예를 들어, CNS의 질환)를 갖거나 또는 발병할 위험이 있는 대상체에게 rAAV를 투여하기 위한 지침서와 함께 제공된다. 지침서는 일반적으로 질환 또는 상태의 치료 또는 예방을 위한 조성물의 사용에 대한 정보를 포함할 수 있다.
일부 경우에, 지침서는 하기 중 적어도 하나를 포함한다: 치료 rAAV 조성물의 설명; 본원에 개시된 질환 또는 상태의 치료 또는 예방을 위한 투여 스케줄 및 투여; 예방조치; 경고; 적응증; 반대-적응증; 과다투여 정보; 유해 반응; 동물 약리학; 임상 연구; 및/또는 참고사항. 지침서는 용기 (존재하는 경우) 상에 직접, 또는 용기에 적용된 라벨로서, 또는 용기 내에 또는 용기와 함께 공급된 개별 시트, 팜플렛, 카드 또는 폴더로서 인쇄될 수 있다. 일부 경우에, 지침서는 대상체에게 rAAV를 단독으로 투여하는 절차를 제공한다. 일부 경우에, 지침서는 rAAV가 전신 전달을 위해 제제화되는 것을 제공한다.
정의
본원에 사용된 용어는 단지 특정한 경우를 기재하기 위한 것이며, 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본원에 사용된 단수 형태는 문맥이 달리 명백하게 나타내지 않는 한 복수 형태를 또한 포함하는 것으로 의도된다. 또한, 용어 "포함한", "포함하다", "갖는", "가지다", "수반한" 또는 그의 변형이 상세한 설명 및/또는 청구범위에 사용되는 경우에, 이러한 용어는 용어 "포함하는"과 유사한 방식으로 포괄적인 것으로 의도된다.
용어 "약" 또는 "대략"은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정된 바와 같은 특정한 값에 대한 허용되는 오차 범위 내에 있음을 의미하며, 이는 부분적으로 값이 어떻게 측정 또는 결정되는지, 예를 들어 측정 시스템의 한계에 좌우될 것이다. 예를 들어, "약"은 주어진 값에서의 실시당 1 또는 1 초과의 표준 편차 이내를 의미할 수 있다. 특정한 값이 본 출원 및 청구범위에 기재된 경우에, 달리 언급되지 않는 한 용어 "약"은 특정한 값에 대한 허용되는 오차 범위를 의미하는 것으로 가정되어야 한다.
본원에 사용된 "로 본질적으로 이루어진"은 조성물 및 방법을 정의하는 데 사용되는 경우에, 언급된 목적을 위한 조합에 대해 임의의 본질적 유의성을 갖는 다른 요소를 배제하는 것을 의미할 것이다. 따라서, 본원에 정의된 바와 같은 요소로 본질적으로 이루어진 조성물은 청구된 개시내용의 기본적이고 신규한 특징(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 다른 물질 또는 단계, 예컨대 여드름, 습진, 건선 및 장미증과 같은 피부 장애를 치료하기 위한 조성물을 배제하지 않을 것이다.
용어 "상동적", "상동성" 또는 "퍼센트 상동성"은 일반적으로 참조 서열과 동일하거나 유사한 서열을 갖는 아미노산 서열 또는 핵산 서열을 의미하기 위해 본원에 사용된다. 서열의 퍼센트 상동성은 본 출원의 출원일 현재, BLAST의 가장 최근 버전을 사용하여 결정될 수 있다.
용어 "증가된" 또는 "증가"는 일반적으로 통계적으로 유의한 양만큼의 증가를 의미하기 위해 본원에 사용된다. 일부 실시양태에서, 용어 "증가된" 또는 "증가"는 참조 수준과 비교하여 적어도 10%의 증가, 예를 들어 참조 수준, 표준 또는 대조군과 비교하여 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%의 증가 또는 최대 100% (및 이를 포함함)의 증가 또는 10-100% 사이의 임의의 증가를 의미한다. "증가"의 다른 예는 참조 수준과 비교하여 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 1000배 또는 그 초과의 증가를 포함한다.
용어 "감소된" 또는 "감소"는 일반적으로 통계적으로 유의한 양만큼의 감소를 의미하기 위해 본원에 사용된다. 일부 실시양태에서, "감소된" 또는 "감소"는 참조 수준과 비교하여 적어도 10%만큼의 감소, 예를 들어 참조 수준과 비교하여 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%만큼의 감소 또는 최대 100% (및 이를 포함함)의 감소 (예를 들어, 참조 수준과 비교하여 부재 수준 또는 비-검출가능한 수준), 또는 10-100%의 임의의 감소를 의미한다. 마커 또는 증상과 관련하여, 이들 용어는 이러한 수준의 통계적으로 유의한 감소를 의미한다. 감소는 예를 들어, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40% 또는 그 초과일 수 있고, 바람직하게는 주어진 질환을 갖지 않는 개체에 대한 정상의 범위 내로서 허용되는 수준까지 하향된다.
용어 "대상체"는 임의의 유기체이다. 일부 경우에, 유기체는 포유동물이다. 포유동물의 비제한적 예는 포유동물 부류의 임의의 구성원: 인간, 비-인간 영장류, 예컨대 침팬지, 및 다른 유인원 및 원숭이 종; 농장 동물, 예컨대 소, 말, 양, 염소, 돼지; 가축, 예컨대 토끼, 개 및 고양이; 실험 동물, 예컨대 설치류, 예컨대 래트, 마우스 및 기니 피그 등을 포함한다. 한 측면에서, 포유동물은 인간이다. 본원에 사용된 용어 "동물"은 인간 및 비-인간 동물을 포함한다. 한 실시양태에서, "비-인간 동물"은 포유동물, 예를 들어 설치류, 예컨대 래트 또는 마우스이다. 한 실시양태에서, "비-인간 영장류"는 포유동물, 예를 들어 원숭이이다. 일부 경우에, 대상체는 환자이고, 이는 본원에 사용된 바와 같이, 특정 질환 또는 장애로 진단된 대상체를 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "유전자"는, 임의로 코딩 서열의 상류 또는 하류에 위치할 수 있는 회합된 조절 영역, 예컨대 프로모터, 오퍼레이터, 종결인자 등과 함께, 개별 단백질을 코딩하는 핵산 또는 RNA ("코딩 서열" 또는 "코딩 영역"으로도 지칭됨)의 절편을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "아데노-연관 바이러스" 또는 "AAV"는 아데노-연관 바이러스 또는 그의 유도체를 지칭한다. AAV의 비제한적 예는 AAV 유형 1 (AAV1), AAV 유형 2 (AAV2), AAV 유형 3 (AAV3), AAV 유형 4 (AAV4), AAV 유형 5 (AAV5), AAV 유형 6 (AAV6), AAV 유형 7 (AAV7), AAV 유형 8 (AAV8), AAV 유형 9 (AAV9), AAV 유형 10 (AAV10), AAV 유형 11 (AAV11), AAV 유형 12 (AAV12), 조류 AAV, 소 AAV, 개 AAV, 말 AAV, 영장류 AAV, 비-영장류 AAV, 및 양 AAV를 포함한다. 일부 경우에, AAV는 "영장류 AAV"로서 기재되며, 이는 영장류를 감염시키는 AAV를 지칭한다. 마찬가지로, AAV는 소 동물을 감염시킬 수 있다 (예를 들어, "소 AAV" 등). 일부 경우에, AAV는 야생형, 또는 자연 발생 AAV이다. 일부 경우에, AAV는 재조합 AAV이다.
본원에 사용된 용어 "AAV 캡시드"는 아데노-연관 바이러스의 캡시드 단백질 또는 펩티드를 지칭한다. 일부 경우에, AAV 캡시드 단백질은 유전자 정보 (예를 들어, 트랜스진, 치료 핵산, 바이러스 게놈)를 캡시드화하도록 구성된다. 일부 경우에, 본 개시내용의 AAV 캡시드는 상응하는 모 AAV 캡시드 단백질에 비해 변형된 AAV 캡시드이다.
본원에 사용된 용어 "향성"은 제2 생체내 환경에 비해 생체내 환경 내로 캡시드화된 유전자 정보를 발현하는 것에 대한 특이성 및/또는 그의 효율의 증가 또는 감소를 포함할 수 있는 AAV 캡시드의 품질 또는 특징을 지칭한다. 일부 경우에, 생체내 환경은 세포-유형이다. 일부 경우에, 생체내 환경은 기관 또는 기관계이다.
본원에 사용된 용어 "AAV 벡터"는 바이러스와 관련된 유전자 정보를 코딩하는 핵산 중합체를 지칭한다. AAV 벡터는 재조합 AAV 벡터 (rAAV)일 수 있고, 이는 재조합 유전학 방법을 사용하여 생성된 AAV 벡터를 지칭한다. 일부 경우에, rAAV 벡터는 적어도 하나의 이종 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 야생형 또는 자연 발생 AAV 게놈 이외의 폴리뉴클레오티드, 예컨대 트랜스진)를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "AAV 입자"는 AAV 바이러스, 비리온, AAV 캡시드 단백질 또는 그의 성분을 지칭한다. 일부 경우에, AAV 입자는 모 AAV 입자에 비해 변형된다.
용어 "유전자 산물" 또는 "유전자 발현 산물"은 폴리뉴클레오티드 서열의 발현 산물, 예컨대 예를 들어 폴리펩티드, 펩티드, 단백질 또는 RNA, 예를 들어 간섭 RNA (예를 들어, siRNA, miRNA, shRNA) 및 메신저 RNA (mRNA)를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "이종"은 비교되는 나머지 실체의 것과 유전자형적으로 별개의 실체로부터 유래된 유전자 요소 (예를 들어, 코딩 영역) 또는 유전자 발현 산물 (예를 들어, RNA, 단백질)을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "내인성"은 유기체 또는 유기체 내의 특정한 세포에서 자연 발생하거나 또는 그와 회합된 유전자 요소 (예를 들어, 코딩 영역) 또는 유전자 발현 산물 (예를 들어, RNA, 단백질)을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "치료하다", "치료하는" 및 "치료"는 장애, 질환 또는 상태; 또는 장애, 질환 또는 상태와 연관된 증상 중 1종 이상을 완화 또는 제거하거나; 또는 장애, 질환 또는 상태 자체의 원인을 완화 또는 근절시키는 것을 지칭한다. 바람직한 치료 효과는 질환의 발생 또는 재발의 예방, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접적 또는 간접적 병리학적 결과의 감소, 전이의 예방, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 호전 또는 완화, 및 완화 또는 개선된 예후를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
용어 "치료 유효량"은 투여될 때 장애, 질환 또는 질환의 상태의 증상 중 1종 이상의 발생을 예방하거나 또는 어느 정도까지 완화시키기에 충분한 화합물 또는 요법의 양; 또는 연구원, 수의사, 의사 또는 임상의에 의해 추구되는 세포, 조직, 계, 동물 또는 인간의 생물학적 또는 의학적 반응을 도출하기에 충분한 화합물의 양을 지칭한다.
용어 "제약상 허용되는 담체", "제약상 허용되는 부형제", "생리학상 허용되는 담체" 또는 "생리학상 허용되는 부형제"는 제약상 허용되는 물질, 조성물 또는 비히클, 예컨대 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 용매 또는 캡슐화 물질을 지칭한다. 성분은 제약 제제의 다른 성분과 상용성이라는 의미에서 "제약상 허용되는" 것일 수 있다. 이는 또한 합리적인 이익/위험 비에 상응하는, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 면역원성, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직 또는 기관과 접촉하여 사용하기에 적합할 수 있다. 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition; Lippincott Williams & Wilkins: Philadelphia, PA, 2005; Handbook of Pharmaceutical Excipients, 5th Edition; Rowe et al., Eds., The Pharmaceutical Press and the American Pharmaceutical Association: 2005; 및 Handbook of Pharmaceutical Additives, 3rd Edition; Ash and Ash Eds., Gower Publishing Company: 2007; Pharmaceutical Preformulation and Formulation, Gibson Ed., CRC Press LLC: Boca Raton, FL, 2004]을 참조한다.
용어 "제약 조성물"은 본원에 개시된 화합물과 다른 화학적 성분, 예컨대 희석제 또는 담체의 혼합물을 지칭한다. 제약 조성물은 유기체에 대한 화합물의 투여를 용이하게 할 수 있다. 전신 투여를 포함하나 이에 제한되지는 않는 화합물을 투여하는 다수의 기술이 관련 기술분야에 존재한다.
"샘플"의 비제한적 예는 핵산 및/또는 단백질이 수득될 수 있는 임의의 물질을 포함한다. 비제한적 예로서, 이는 전혈, 말초 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 점액, 소변, 정액, 림프, 분변 추출물, 협부 스왑, 세포 또는 다른 체액, 또는 외과적 생검 또는 외과적 절제를 통해 수득된 조직을 포함하나 이에 제한되지는 않는 조직을 포함한다. 대안적으로, 샘플은 1차 환자 유래 세포주, 또는 보존된 샘플 형태의 보관된 환자 샘플, 또는 신선 동결 샘플을 통해 수득될 수 있다.
용어 "생체내"는 대상체의 신체에서 일어나는 사건을 기재하는 데 사용된다.
용어 "시험관내"는 물질이 수득되는 생물학적 공급원으로부터 분리되도록 실험실 시약을 보유하기 위한 용기에 함유되어 일어나는 사건을 기재하는 데 사용된다. 시험관내 검정은 살아있는 또는 죽은 세포가 사용되는 세포-기반 검정을 포괄할 수 있다. 시험관내 검정은 또한 무손상 세포가 사용되지 않는 무세포 검정을 포괄할 수 있다.
용어 "CNS" 또는 "중추 신경계"는 뇌, 시상, 피질, 피각, 측뇌실, 수질, 교뇌, 편도체, 운동 피질, 미상, 시상하부, 선조체, 복측 중뇌, 신피질, 기저 신경절, 해마, 대뇌, 소뇌, 뇌간 및 척수로부터 선택된 조직을 의미한다. 뇌는 전두엽, 측두엽, 후두엽 및 두정엽을 포함한 다양한 피질 및 피질하 영역을 포함한다.
용어 "전신 전달"은 전신이 영향을 받도록 의약 또는 다른 물질을 순환계 내로 투여하는 경로로서 정의된다. 투여는 경장 투여 (위장관을 통한 약물의 흡수) 또는 비경구 투여 (일반적으로 주사, 주입 또는 이식)를 통해 일어날 수 있다. "순환계"는 혈액 또는 뇌척수액 순환계 둘 다를 포함한다. CNS에 대한 전신 투여의 예는 동맥내, 정맥내 또는 척수강내 주사를 포함한다. 다른 예는 척추 (즉, 요추에 제한되지는 않음) 또는 뇌 (즉, 대수조에 제한되지는 않음) 내의 임의의 위치에서의 뇌척수액으로의 투여를 포함한다. 용어 "전신 투여" 및 "전신 전달"은 상호교환가능하게 사용된다.
본원에 사용된 섹션 표제는 단지 조직화 목적을 위한 것이며, 기재된 대상에 제한되는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예
실시예 1
아프리카 녹색 원숭이에서 변형된 캡시드 단백질을 확인하는 방법
조작된 아데노-연관 바이러스 (AAV)의 치료 적용가능성에 대한 주요 관심사는 그의 형질도입 프로파일이 인간 적용으로 얼마나 잘 옮겨지는지이다. 이전의 조작 활동은 그의 사용의 용이성 및 유연성으로 인해 시험관내 또는 생체내 설치류 스크리닝 플랫폼에 초점을 맞추었지만, 비-인간 영장류 (NHP)에서의 직접 스크리닝 활동은 번역되는 바이러스를 확인할 가능성이 훨씬 더 크다. 본 발명의 개발을 뒷받침하는 조작 활동을 위해 노령 NHP인 아프리카 녹색 원숭이를 선택하였다. 조작 활동은 주로 아미노산 위치 588에 위치한 AAV9 캡시드 표면의 영역 (천연 AAV 혈청형 사이의 가변 영역이고 수용체 결합에서 역할을 갖는 캡시드 표면 상의 가장 노출된 루프 중 하나)에 대해 지시되었다. 위치 588과 589 사이의 펩티드의 삽입은 본 발명자들 등에 의해 과거에 연구되었고, 신규 수용체 결합 (혈액-뇌 장벽 횡단 및 뇌의 높은 형질도입을 용이하게 하기 위한 설치류 뇌 내피 상의 Ly6a의 AAV-PHP.B/AAV-PHP.eB 결합) 및 대폭 변경된 캡시드 향성을 생성하였다. 바이러스 캡시드의 라이브러리는 NHP CNS를 향한 신규 향성을 달성하기 위해 AAV9 내의 이 부위에서 무작위 7개 아미노산 삽입을 수행함으로써 생성하였다.
플라스미드. 제1-라운드 바이러스 DNA 라이브러리는 NNK 축중성 프라이머 (인티그레이티드 DNA 테크놀로지스, 인크.(Integrated DNA Technologies, Inc.), IDT)를 사용하여 아미노산 450-599 사이의 AAV9 캡시드 게놈의 절편을 증폭시켜 아미노산 588과 589 사이에 7개의 무작위 아미노산을 삽입함으로써 (모든 가능한 변이 포함) 생성하였다. 이어서, 생성된 라이브러리 삽입물을 이전에 기재된 바와 같이 깁슨 어셈블리를 통해 rAAV-ΔCap-in-rev-RNA 플라스미드 내로 도입하였다. 생성된 캡시드 DNA 라이브러리인 rAAV-Cap-Cag-GFP11은 아미노산 수준에서 ~12억8천만개 변이체의 다양성을 함유하였다. 제2 라운드 바이러스 DNA 라이브러리를 제1 라운드와 유사하게 생성하였지만, 588에 삽입된 NNK 축중성 프라이머 대신에, 합성된 올리고 풀 (트위스트 바이오사이언스(Twist Biosicence))을 사용하여 CAP를 갖는 UBC-Cap-DNA 및 CAG-Cap-DNA 구축물에서 선택된 변이체만을 생성하였다. 이러한 제2-라운드 DNA 라이브러리는 아미노산 수준에서 3000-15000개의 변이체로부터의 다양성을 함유하였고, 각각의 변이체에 대해 2-6개의 바코딩된 복제물이 존재하였다.
라이브러리 바이러스 생산을 위한 Rep 유전자를 제공하기 위해 HEK293T 세포 내로 형질감염된 AAV2/9 REP-AAP-ΔCAP 플라스미드는 라이브러리 삽입물을 함유하는 각각의 단계에서 라이브러리 플라스미드와 공동-형질감염된 이 플라스미드 사이의 타당한 재조합 사건 후에 바이러스 라이브러리 생산 동안 야생형 AAV9 캡시드의 생산을 방지한다.
바이러스 생산. 재조합 AAV를 확립된 프로토콜에 따라 생성하였다. 간략하게, 불멸화 HEK293T 세포 (ATCC)를 폴리에틸렌이민 (PEI)을 사용하여 4개의 벡터로 사중 형질감염시켰다. 제1 벡터는 모 AAV 바이러스로부터의 역전된 말단 반복부 (ITR) 서열이 플랭킹된 rAAV-Cap-in-cis-Lox 라이브러리였다. 제2 벡터는 AAV2/9 REP-AAP-ΔCAP 플라스미드였다. 제3 벡터는 바이러스 어셈블리 및 변형된 캡시드 구조로의 이종 핵산의 패키징에 필요한 헬퍼 바이러스 단백질을 코딩하는 핵산을 함유한다. 제4는 최적의 형질감염 효율을 위해 올바른 PEI/DNA 비를 달성하기 위해 포함된 pUC-18 플라스미드이다. 단지 10 ng의 rAAV-Cap-in-cis-Lox 라이브러리 DNA를 형질감염시켜 (150 mm 플레이트당) 다중 라이브러리 DNA가 동일한 세포에 진입할 가능성을 감소시켰다. 형질감염 60시간 후에 세포 및 배지로부터 바이러스 입자를 수거하였다. 배지에 존재하는 바이러스를 8% 폴리에틸렌 글리콜 및 500 mM 염화나트륨으로 침전시킴으로써 농축시키고, 침전된 바이러스를 수집된 세포로부터 제조된 용해물에 첨가한다. 바이러스를 아이오딕사놀 (옵티프렙, 시그마) 단계 구배 (15%, 25%, 40% 및 60%) 상에서 정제한다. 바이러스를 농축시키고, PBS 중에서 제제화한다. 바이러스 역가는 qPCR 및 대조군으로서 선형화된 게놈 플라스미드를 사용하여 DNaseI-내성 벡터 게놈 카피 (VG)의 수를 측정함으로써 결정된다.
동물. 아프리카 녹색 원숭이 절차는 비르시오, 인크.(Virscio, Inc.)의 IACUC 위원회에 의해 승인되었다. 아프리카 녹색 원숭이를 태어나 비르시오, 인크. 콜로니에서 사육하고, 표준 조건 하에 수용하였다. 이들에게 먹이를 자유롭게 공급하고, 비르시오, 인크.에서 NHP를 위한 영장류 풍부화 프로그램의 일부로서 풍부화를 제공하였다. AAV 주입을 위해, 동물을 내인성 중화 항체 (nAb)에 대해 스크리닝하였다. 스크리닝된 동물은 혈청의 1:5 희석에서 어떠한 검출가능한 차단 반응도 나타내지 않았다. 주입 전날, 동물의 음식물을 제거하였다. 시험 물품을 정맥내 주입 또는 요추 척수강내 투여를 통해 투여하였다. 활성 및 거동을 생애 과정에 걸쳐 매일 모니터링하였다.
DNA/RNA 회수 및 서열분석. 라운드 1 및 라운드 2 바이러스 라이브러리를 아프리카 녹색 원숭이에게 5 x 1012 내지 1 x 1013 vg/kg 동물의 용량으로 주사하고, rAAV 게놈을 주사 4주 후에 회수하였다. 동물을 안락사시키고, 뇌 (라운드 1 및 라운드 2 둘 다), 척수 (라운드 1 및 라운드 2) 및 간 (라운드 1 및 라운드 2)을 회수하고, 순간 동결시키고, -80℃에서의 장기간 저장에 배치하였을 뿐만 아니라 다른 말초 조직, 예컨대 심장, 비장, 부신, 신장 및 대퇴사두근도 그렇게 하였다. 라운드 1의 경우, 뇌를 각각 20 mg씩 11개의 뇌 영역으로, 라운드 2의 경우, 11개의 뇌 영역으로 분리하였다. 20-300 mg의 각각의 뇌 절편, 척수, 및 간을 매그맥스 DNA 울트라(MagMAX DNA ULTRA) (A25597) 및 비드 러프터(Bead Ruptor) 96 (옴니, 인크(OMNI, INC))을 사용하여 완충제에서 균질화하고, 바이러스 DNA를 제조업체 권장 프로토콜에 따라 단리하였다. 회수된 바이러스 DNA를 RNase로 처리하고, 자이모 DNA 클린 앤드 콘센트레이터 키트 (D4033)로 정제하였다. 바이러스 게놈은 주형으로서 총 추출된 바이러스 DNA의 50%를 사용하여 캡시드 게놈에서 588-589 삽입 부위에 플랭킹된 프라이머를 사용한 25 사이클의 PCR 증폭에 의해 풍부화하였다. 자이모 DNA 정제 후에, 샘플을 조직 유형에 따라 1:10 내지 1:1000으로 희석하고, 각각의 희석물을 10회 사이클의 PCR로 라이브러리 가변 영역 주위에서 추가로 증폭시켰다. 후속적으로, 샘플을 일루미나 인덱스를 갖는 맞춤 프라이머를 사용하여 추가의 10회 사이클 동안 추가로 증폭시켰다. 증폭 생성물을 210 bp 밴드의 보다 우수한 분리 및 회수를 위해 2% 저융점 아가로스 겔 (써모피셔 사이언티픽, 16520050) 상에서 실행하였다.
단지 제2 라운드 라이브러리에 대해, 패키징된 바이러스 라이브러리 DNA를 바이러스 캡시드의 소화 및 함유된 ssDNA의 정제에 의해 주사된 바이러스 라이브러리로부터 단리하였다. 이들 바이러스 게놈을 2개의 PCR 증폭 단계, 예컨대 조직으로부터 추출된 바이러스 DNA에 의해 증폭시켜 일루미나 차세대 서열분석을 위한 어댑터 및 인덱스를 부가하고, 겔 전기영동 후에 정제하였다. 이 바이러스 라이브러리 DNA를 조직으로부터 추출된 바이러스 DNA와 함께 일루미나 NextSeq 2000 시스템을 사용한 심층 서열분석을 위해 보냈다.
NGS 데이터 정렬 및 프로세싱. NGS 실행으로부터의 미가공 fastq 파일을 맞춤 제작 스크립트 (캡시다 CapSeq 툴)로 프로세싱하였다. 제1 라운드 라이브러리에 대해, 이들 데이터세트를 프로세싱하기 위한 파이프라인은 저품질 판독물을 제거하기 위한 필터링, 각각의 서열에 대한 품질 점수의 이용, 및 PCR-유도된 돌연변이 또는 높은 GC-함량으로부터의 편향의 제거를 수반하였다. 이어서, 필터링된 데이터세트를 완벽한 스트링 매치 알고리즘에 의해 정렬하고, 트리밍하여 정렬 품질을 개선시켰다. 각각의 서열에 대한 판독물 카운트를 빼내고, 조직에 의해 디스플레이하였으며, 이 시점에 뇌에서 발견된 모든 서열을 제2 라운드 라이브러리의 형성을 위해 컴파일링하였다.
제2 라운드 라이브러리에 대해, 조직에 의한 판독 카운트를 유사하게 표로 만들었다. 이어서, 1의 판독물 카운트를 각각의 서열에 부가하여 0 값을 제거하고, 각각의 서열에 대한 모든 뇌 영역을 함께 합산하고, 주어진 7-량체 아미노산 서열의 각각의 코돈 복제물에 대한 판독물 서열을 함께 합산하여 각각의 펩티드 삽입에 대한 단일 값을 제공하였다. 마지막으로, 데이터는 log10 백만분율 (Cpm)로 정규화되었다. 뇌의 정규화된 cpm 대 바이러스의 cpm으로 풍부화 값을 계산하고, log10으로 전환시켰다.
본 발명의 바람직한 실시양태가 본원에 제시되고 기재되었지만, 이러한 실시양태는 단지 예로서 제공된다는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 본 발명을 벗어나지 않으면서 다수의 변형, 변화 및 치환이 이제 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 일어날 것이다. 본원에 기재된 본 발명의 실시양태에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시하는 데 사용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 하기 청구범위는 본 발명의 범주를 한정하고, 이들 청구범위의 범주 내의 방법 및 구조 및 그의 등가물이 그에 의해 포괄되는 것으로 의도된다.
본 명세서에서 언급된 모든 간행물, 특허, 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허, 또는 특허 출원이 참조로 포함되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 지시된 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> CAPSIDA, INC. <120> AAV COMPOSITIONS HAVING HIGH EXPRESSION LEVELS IN BRAIN <130> CAPS-013/01WO 35847/62 <140> PCT/US22/24603 <141> 2022-04-13 <150> 63/174,434 <151> 2021-04-13 <160> 705 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 736 <212> PRT <213> adeno-associated virus 9 <400> 1 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Gln Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu Gln Ser Pro 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632 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 632 Glu His Tyr Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 633 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 633 Glu Leu Lys Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 634 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 634 Glu Thr Ser Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 635 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 635 Glu Val Thr Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 636 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 636 Phe Arg Glu Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 637 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 637 Phe Ser Pro Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 638 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 638 Gly Gly Val Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 639 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 639 Gly Pro Ser Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 640 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 640 Gly Pro Thr Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 641 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 641 Gly Pro Val Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 642 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 642 Gly Ser Asn Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 643 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 643 Gly Ser Ser Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 644 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 644 Gly Thr Leu Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 645 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 645 Gly Tyr Ser Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 646 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 646 Ile Gly Tyr Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 647 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 647 Ile Met His Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 648 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 648 Ile Pro Ser Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 649 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 649 Ile Thr Ser Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 650 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 650 Leu Ala Leu Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 651 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 651 Leu Ala Thr Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 652 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 652 Leu His Asn Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 653 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 653 Leu Val Met Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 654 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 654 Leu Tyr Ser Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 655 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 655 Met Gly Thr Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 656 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 656 Asn Ala Ile Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 657 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 657 Asn Ala Pro Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 658 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 658 Asn Glu His Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 659 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 659 Asn Asn Pro Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 660 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 660 Asn Thr His Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 661 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 661 Asn Thr Thr Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 662 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 662 Pro Gly Leu Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 663 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 663 Pro Thr Ser Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 664 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 664 Gln Ile Ser Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 665 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 665 Gln Pro Leu Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 666 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 666 Gln Val Glu Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 667 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 667 Arg Asp Thr Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 668 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 668 Arg Pro Leu Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 669 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 669 Arg Thr Glu Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 670 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 670 Ser Ala Thr Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 671 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 671 Ser Asp Gly Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 672 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 672 Ser Glu Ala Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 673 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 673 Ser Phe Phe Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 674 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 674 Ser Asn Ser Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 675 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 675 Ser Pro Ser Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 676 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 676 Ser Ser Pro Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 677 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 677 Ser Ser Gln Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 678 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 678 Ser Ser Ser Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 679 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 679 Ser Val Glu Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 680 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 680 Thr Glu Leu Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 681 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 681 Thr Glu Arg Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 682 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 682 Thr Glu Val Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 683 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 683 Thr Gly Val Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 684 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 684 Thr Asn Val Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 685 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 685 Thr Gln Ile Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 686 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 686 Thr Ser Asn Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 687 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 687 Thr Thr Asn Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 688 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 688 Thr Thr Val Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 689 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 689 Thr Val Phe Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 690 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 690 Val Ala Val Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 691 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 691 Val Glu Val Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 692 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 692 Val Phe Ser Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 693 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 693 Val His Leu Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 694 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 694 Val Leu Ser Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 695 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 695 Val Asn Leu Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 696 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 696 Val Ser Asn Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 697 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 697 Val Ser Ser Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 698 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 698 Trp Asp Val Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 699 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 699 Trp Ser Ile Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 700 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 700 Tyr Ala Leu Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 701 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 701 Tyr Asp Gly Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 702 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 702 Tyr Met Pro Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 703 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 703 Tyr Ser Leu Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 704 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 704 Tyr Ser Asn Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 <210> 705 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 705 Tyr Ser Ser Asn Thr Thr Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10

Claims (37)

  1. 표 1 또는 도 1-3에 제공된 바와 같은 서열을 포함하는 AAV 캡시드 단백질.
  2. 하기 화학식 I의 삽입 서열을 포함하는 AAV 캡시드 단백질:
    X1-X2-X3-N-T-T-X4-X5-X6-X7-X8 (I) (서열식별번호(SEQ ID NO): 72)
    여기서 X1은 A, E, Q, T 및 V로부터 선택된 아미노산이고; X2는 Q, I, M, A, P, 및 V로부터 선택된 아미노산이고; X3은 L, S, Q, M 및 T로부터 선택된 아미노산이고; X4는 K 및 R로부터 선택된 아미노산이고; X5는 P, I, N, A, Q, H, I, V, S 및 L로부터 선택된 아미노산이고; X6은 T, I, V, A, Q, S, L, M, G, H 및 R로부터 선택된 아미노산이고; X7은 A, D, N, S, T, M, P, Q, E, G, V, I 및 W로부터 선택된 아미노산이고; X8은 Q, G, F, A, S, D, E, M, P, R, T 및 Y로부터 선택된 아미노산이다.
  3. 제2항에 있어서, X1이 A이고; X2가 Q인 AAV 캡시드 단백질.
  4. 제2항에 있어서, X3이 L인 AAV 캡시드 단백질.
  5. 제2항에 있어서, X3이 N인 AAV 캡시드 단백질.
  6. 제2항에 있어서, X4가 K인 AAV 캡시드 단백질.
  7. 제2항에 있어서, X5가 S인 AAV 캡시드 단백질.
  8. 제2항에 있어서, X6이 V인 AAV 캡시드 단백질.
  9. 제1항에 있어서, 서열이 AQLNTTKSVMQ (서열식별번호: 2), AQLNTTKPTDR (서열식별번호: 3), AQLNTTKPTVG (서열식별번호: 4), AQLNTTKPSPG (서열식별번호: 5), AQLNTTKPTGP (서열식별번호: 6), AQLNTTKPTAG (서열식별번호: 7), AQLNTTKPVAG (서열식별번호: 8), AQLNTTKNITQ (서열식별번호: 9), AQLNTTKPTSF (서열식별번호: 10), AQLNTTKPTPS (서열식별번호: 11), MANNTTKPIAQ (서열식별번호: 12), AQLNTTKPIAQ (서열식별번호: 13), AQLNTTKPTSY (서열식별번호: 14), AQLNTTKNMTQ (서열식별번호: 15), AQLNTTKPRDE (서열식별번호: 16), AQLNTTKPTAQ (서열식별번호: 17), AQLNTTKNVTQ (서열식별번호: 18), QTNNTTKPIAQ (서열식별번호: ), AQLNTTKQMNQ (서열식별번호: 19), AQLNTTKHVDQ (서열식별번호: 20), AQLNTTKQIDQ (서열식별번호: 21), VALNTTKPIAQ (서열식별번호: 22), AMTNTTKPIAQ (서열식별번호: 23), AQLNTTKPANQ (서열식별번호: 24), AQLNTTKNVNQ (서열식별번호: 25), AQLNTTKPVVA (서열식별번호: 26), AQLNTTKPQNQ (서열식별번호: 27), AQLNTTKPQLQ (서열식별번호: 28), AQLNTTKITDQ (서열식별번호: 29), AQLNTTKLHDQ (서열식별번호: 30), AQLNTTKNGYQ (서열식별번호: 31), ANVNTTKPIAQ (서열식별번호: 32), EQMNTTKPIAQ (서열식별번호: 33), AQLNTTKPLQF (서열식별번호: 34), AQLNTTKPSSG (서열식별번호: 35), AQLNTTKPVMQ (서열식별번호: 36), AQLNTTKPLAQ (서열식별번호: 37)로부터 선택된 것인 AAV 캡시드 단백질. TITNTTKPIAQ (서열식별번호: 38), AQLNTTKSFGQ (서열식별번호: 39), AQLNTTKPTAQ (서열식별번호: 116) 및 AQLNTTKPTTS (서열식별번호: 117)로부터 선택된 것인 AAV 캡시드 단백질.
  10. LNTTKSV (서열식별번호: 41), LNTTKPT (서열식별번호: 42), LNTTKPS (서열식별번호: 43), LNTTKPV (서열식별번호: 44), LNTTKNI (서열식별번호: 45), LNTTKPI (서열식별번호: 46), NNTTKPI (서열식별번호: 47), LNTTKNM (서열식별번호: 48), LNTTKPR (서열식별번호: 49), LNTTKNV (서열식별번호: 50), LNTTKQM (서열식별번호: 51), LNTTKPQ (서열식별번호: 52), LNTTKIT (서열식별번호: 53), LNTTKLH (서열식별번호: 54), LNTTKNG (서열식별번호: 55), VNTTKPI (서열식별번호: 56), MNTTKPI (서열식별번호: 57), LNTTKPL (서열식별번호: 58), TNTTKPI (서열식별번호: 59) 및 LNTTKSF (서열식별번호: 60)로부터 선택된 삽입 서열을 포함하는 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 캡시드 단백질.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, AAV가 AAV9인 AAV 캡시드 단백질.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, AAV가 서열식별번호: 1에 제공된 것인 AAV 캡시드 단백질.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 삽입이 아미노산 588과 아미노산 589 사이에 있는 것인 AAV 캡시드.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 60 카피의 AAV 캡시드 단백질이 AAV 캡시드 내로 어셈블리된 것인 AAV 캡시드 단백질.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, AAV 캡시드의 VP1, VP2, 및 VP3에 존재하는 AAV 캡시드 단백질.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 전신 전달되는 경우 대상체 내의 CNS에서 측정될 때 증가된 형질도입 효율 중 적어도 하나를 특징으로 하는 AAV 캡시드 단백질.
  17. 제10항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, A589N 및/또는 Q590P를 포함하는 아미노산 치환을 추가로 포함하는 AAV 캡시드 단백질.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 캡시드.
  19. 제18항에 있어서, 키메라인 AAV 캡시드.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 단리 및 정제된 AAV 캡시드.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, CNS의 질환 또는 상태를 치료하기 위한 전신 투여용 제약 제제로서 제제화된 AAV 캡시드로서, 제약 제제는 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함하는 것인 AAV 캡시드.
  22. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, CNS에서 발현되는 AAV 캡시드 단백질.
  23. 제22항에 있어서, CNS가 뉴런, 핍지교세포, 성상세포, 및 뇌 혈관 세포로부터 선택된 세포-유형을 포함하는 것인 AAV 캡시드 단백질.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, CNS가 뇌, 시상, 피질, 피각, 측뇌실, 수질, 교뇌, 편도체, 운동 피질, 미상, 시상하부, 선조체, 복측 중뇌, 신피질, 기저 신경절, 해마, 시상, 대뇌, 소뇌, 뇌간, 및 척수로부터 선택된 조직을 포함하는 것인 AAV 캡시드 단백질.
  25. 서열식별번호: 75-113으로 이루어진 군으로부터 선택된, 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 펩티드를 코딩하는 핵산 서열.
  26. 표 4에 제공된 바와 같은 펩티드 서열을 코딩하는 핵산 서열.
  27. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터.
  28. a) 제27항의 재조합 벡터를 포함하는 제1 벡터;
    b) 헬퍼 바이러스 단백질을 코딩하는 제2 벡터; 및
    c) 치료 유전자 발현 산물을 코딩하는 치료 핵산을 포함하는 제3 벡터
    를 포함하는 키트.
  29. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 제약 제제의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 질환 또는 상태를 치료하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 질환 또는 상태가 대상체의 CNS의 질환 또는 상태인 방법.
  31. 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항의 AAV 캡시드로부터 재조합 AAV 입자를 제조하는 방법으로서, 방법이 하기를 포함하는 것인 방법:
    a. 하기를 포함하는 핵산을 세포 내로 도입하는 단계:
    i. 치료 유전자 발현 산물을 코딩하는 제1 핵산 서열;
    ii. 제1항 내지 제70항 중 어느 한 항의 AAV 캡시드를 발현하도록 변형된 캡시드 (Cap) 유전자를 포함하는 재조합 바이러스 게놈을 코딩하는 제2 핵산 서열; 및
    iii. AAV 헬퍼 바이러스 게놈을 코딩하는 제3 핵산 서열; 및
    b. 재조합 AAV 입자를 어셈블리하는 단계로서, 재조합 AAV 입자는 제1 핵산을 캡시드화하는 AAV 캡시드를 포함하는 것인 단계.
  32. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 전신 전달되는 경우 대상체 내의 조직에서 측정될 때 증가된 형질도입을 특징으로 하는 AAV 캡시드 단백질.
  33. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 조직이 뇌 조직인 AAV 캡시드 단백질.
  34. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 AAV 캡시드 단백질 및 바이러스 게놈을 포함하는 AAV 입자.
  35. LNTTKSV (서열식별번호: 41), LNTTKPT (서열식별번호: 42), LNTTKPS (서열식별번호: 43), LNTTKPV (서열식별번호: 44), LNTTKNI (서열식별번호: 45), LNTTKPI (서열식별번호: 46), NNTTKPI (서열식별번호: 47), LNTTKNM (서열식별번호: 48), LNTTKPR (서열식별번호: 49), LNTTKNV (서열식별번호: 50), LNTTKQM (서열식별번호: 51), LNTTKPQ (서열식별번호: 52), LNTTKIT (서열식별번호: 53), LNTTKLH (서열식별번호: 54), LNTTKNG (서열식별번호: 55), VNTTKPI (서열식별번호: 56), MNTTKPI (서열식별번호: 57), LNTTKPL (서열식별번호: 58), TNTTKPI (서열식별번호: 59), LNTTKSF (서열식별번호: 60) 및 LALPKPI (서열식별번호: 114)로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드.
  36. LNTTKSV (서열식별번호: 41), LNTTKPT (서열식별번호: 42), LNTTKPS (서열식별번호: 43), LNTTKPV (서열식별번호: 44), LNTTKNI (서열식별번호: 45), LNTTKPI (서열식별번호: 46), NNTTKPI (서열식별번호: 47), LNTTKNM (서열식별번호: 48), LNTTKPR (서열식별번호: 49), LNTTKNV (서열식별번호: 50), LNTTKQM (서열식별번호: 51), LNTTKPQ (서열식별번호: 52), LNTTKIT (서열식별번호: 53), LNTTKLH (서열식별번호: 54), LNTTKNG (서열식별번호: 55), VNTTKPI (서열식별번호: 56), MNTTKPI (서열식별번호: 57), LNTTKPL (서열식별번호: 58), TNTTKPI (서열식별번호: 59), LNTTKSF (서열식별번호: 60) 및 LALPKPI (서열식별번호: 114) 중 어느 하나를 포함하는 캡시드를 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV).
  37. AQLNTTKSVMQ (서열식별번호: 2), AQLNTTKPTDR (서열식별번호: 3), AQLNTTKPTVG (서열식별번호: 4), AQLNTTKPSPG (서열식별번호: 5), AQLNTTKPTGP (서열식별번호: 6), AQLNTTKPTAG (서열식별번호: 7), AQLNTTKPVAG (서열식별번호: 8), AQLNTTKNITQ (서열식별번호: 9), AQLNTTKPTSF (서열식별번호: 10), AQLNTTKPTPS (서열식별번호: 11), MANNTTKPIAQ (서열식별번호: 12), AQLNTTKPIAQ (서열식별번호: 13), AQLNTTKPTSY (서열식별번호: 14), AQLNTTKNMTQ (서열식별번호: 15), AQLNTTKPRDE (서열식별번호: 16), AQLNTTKPTAQ (서열식별번호: 17), AQLNTTKNVTQ (서열식별번호: 18), QTNNTTKPIAQ (서열식별번호: ), AQLNTTKQMNQ (서열식별번호: 19), AQLNTTKHVDQ (서열식별번호: 20), AQLNTTKQIDQ (서열식별번호: 21), VALNTTKPIAQ (서열식별번호: 22), AMTNTTKPIAQ (서열식별번호: 23), AQLNTTKPANQ (서열식별번호: 24), AQLNTTKNVNQ (서열식별번호: 25), AQLNTTKPVVA (서열식별번호: 26), AQLNTTKPQNQ (서열식별번호: 27), AQLNTTKPQLQ (서열식별번호: 28), AQLNTTKITDQ (서열식별번호: 29), AQLNTTKLHDQ (서열식별번호: 30), AQLNTTKNGYQ (서열식별번호: 31), ANVNTTKPIAQ (서열식별번호: 32), EQMNTTKPIAQ (서열식별번호: 33), AQLNTTKPLQF (서열식별번호: 34), AQLNTTKPSSG (서열식별번호: 35), AQLNTTKPVMQ (서열식별번호: 36), AQLNTTKPLAQ (서열식별번호: 37), TITNTTKPIAQ (서열식별번호: 38), AQLNTTKSFGQ (서열식별번호: 39), AQLNTTKPTAQ (서열식별번호: 116) 및 AQLNTTKPTTS (서열식별번호: 117) 중 어느 하나를 포함하는 캡시드를 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV).
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