CN111566220A - 制备病毒载体的手段和方法及其用途 - Google Patents

制备病毒载体的手段和方法及其用途 Download PDF

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Abstract

提供了制备和纯化病毒颗粒的方法，以及包含所述病毒颗粒的组合物和用途。

Description

制备病毒载体的手段和方法及其用途
序列表
本申请含有已经以ASCII格式经由EFS-Web递交的序列表并且将该序列表通过引用以其整体并入本文。所述ASCII副本创建于2018年10月31日，名为AVEX-003001WO_ST25.txt，大小为14,639字节。
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年11月8日提交的美国临时专利申请号62/583,035的优先权，该申请的内容通过引用以其全文并入本文。
技术领域
本公开涉及制备和纯化病毒颗粒的方法以及包含所述病毒颗粒的组合物和用途。
背景技术
腺相关病毒(AAV)是细小病毒科的一员。AAV基因组由单链DNA分子构成，所述单链DNA分子包含约4.7千碱基(kb)并且由两个主要的开放阅读框(编码非结构Rep(复制)和结构Cap(衣壳)蛋白)组成。AAV编码区的侧翼是两个顺式作用的反向末端重复序列(ITR)，长度约145个核苷酸，带有中断的回文序列(可折叠成在DNA复制启动过程中起引物作用的发夹结构)。除了它们在DNA复制中的作用外，ITR序列已经被证明是病毒整合、从宿主基因组中拯救以及将病毒核酸包封到成熟病毒粒子中所必需的(Muzyczka,(1992)Curr.Top.Micro.Immunol.[微生物免疫学前沿]158:97-129)。
AAV存在多种血清型，并提供不同的组织嗜性。已知的血清型例如包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10和AAV11。AAV9描述于美国专利中号7,198,951和Gao等人,J.Virol.[病毒学杂志],78:6381-6388(2004)，中，其全部内容通过引用结合于此。AAV6和AAV8的递送进展使得这些血清型在简单的全身静脉内注射或腹腔内注射后转导骨骼肌和心肌成为可能。见Pacak等人,Circ.Res.[循环研究],99(4):3-9(2006)和Wang等人,Nature Biotech.[自然生物技术]23(3):321-8(2005)。然而，使用AAV来靶向中枢神经系统内的细胞类型需要外科的实质内注射。参见Kaplitt等人,“Safety andtolerability of gene therapy with an adeno-associated virus(AAV)borne GADgene for Parkinson's disease:an open label,phase I trial.[腺相关病毒(AAV)携带的GAD基因治疗帕金森病的安全性和耐受性：开放标签，I期试验]”Lancet[柳叶刀],369:2097-2105；Marks等人,“Gene delivery of AAV2-neurturin for Parkinson's disease:a double-blind,randomized,controlled trial.[AAV2-神经秩蛋白的基因递送治疗帕金森病：一项双盲、随机、对照试验]”Lancet Neurol[柳叶刀神经病学]9:1164-1172；和Worgall等人,“Treatment of late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis byCNS administration of a serotype 2 adeno-associated virus expressing CLN2cDNA.[通过CNS施用表达CLN2 cDNA的血清型2腺相关病毒治疗晚期婴儿神经元蜡样脂褐素沉着症]”Hum Gene Ther[人类基因疗法],19(5):463-74。
AAV血清型2(AAV2)基因组的核苷酸序列呈现于Srivastava等人,J Virol[病毒学杂志],45:555-564(1983)中，经Ruffing等人,J Gen Virol[基因病毒学杂志],75:3385-3392(1994)校正。指导病毒DNA复制(rep)、衣壳化/包装和宿主细胞染色体整合的顺式作用序列被包含在ITR中。三个AAV启动子(因其相对图谱位置命名为p5、p19和p40)驱动编码rep和cap基因的两个AAV内部开放阅读框的表达。这两个rep启动子(p5和p19)加上单个AAV内含子的差异剪接(在核苷酸2107和2227处)，导致从rep基因产生四种rep蛋白(rep 78、rep68、rep 52和rep 40)。Rep蛋白具有最终负责复制病毒基因组的多种酶促特性。cap基因是由p40启动子表达的，并且它编码三种衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。替代性的剪接和非共有的翻译起始位点负责产生三种相关的衣壳蛋白。单个共有聚腺苷酸化位点位于AAV基因组的图谱位置95。AAV的生命周期和遗传学综述于Muzyczka,Current Topics in Microbiologyand Immunology[微生物学和免疫学的最新论题],158:97-129(1992)。
源自AAV的载体对于递送遗传物质特别有吸引力，因为(i)它们能够感染(转导)各种各样的不分裂和分裂细胞类型，包括肌纤维和神经元；(ii)它们缺乏病毒结构基因，从而消除了对病毒感染的天然宿主细胞应答，例如干扰素介导的应答；(iii)野生型病毒从未与人类的任何病理有关；(iv)与能够整合到宿主细胞基因组中的野生型AAV相比，复制缺陷型AAV载体通常以附加体存在，从而限制了插入突变或激活癌基因的风险；和(v)与其他载体系统相比，AAV载体不触发显著的免疫应答(见ii)，因此允许治疗性转基因的长期表达(前提是其基因产物不被排斥)。
自互补腺相关载体(scAAV)是从天然存在的腺相关病毒(AAV)构建的用于基因疗法的病毒载体。ScAAV被称为“自互补”，因为编码区被设计成形成分子内双链DNA模板。标准AAV基因组生命周期的限速步骤包括第二链合成，因为典型的AAV基因组是单链DNA模板。然而，对于scAAV基因组来说，情况并非如此。在感染时，未等待细胞介导的第二条链合成，而是两条互补的半scAAV将缔合以形成易于立即复制和转录的一条双链DNA(dsDNA)。
仍然需要开发可扩展的方法来制造和纯化具有例如低空衣壳/低宿主细胞蛋白和/或低污染DNA同时保持高效力的AAV药物产品。
发明内容
本公开提供了制备纯化病毒颗粒制剂(包括AAV颗粒制剂)的方法。
在一些实施例中，本公开提供了药物组合物，其包含(a)1-8x 1013AAV9病毒载体基因组/mL(vg/mL)，(b)少于约7％的空病毒衣壳，(c)少于约100ng/mL宿主细胞蛋白/1x1013vg/mL，和(d)少于约5x 106pg/mL残余宿主细胞DNA/1x 1013vg/mL，并且其中1-8x1013AAV9病毒载体基因组/mL中至少约80％是功能性的。
在一个实施例中，AAV9病毒载体包含编码运动神经元存活(SMN)蛋白的多核苷酸。在一个实施例中，AAV9病毒载体包含编码甲基-CpG结合蛋白2(MECP2)蛋白的多核苷酸。在一个实施例中，AAV9病毒载体包含编码靶向超氧化物歧化酶1(SOD1)的短发夹RNA(shRNA)的多核苷酸。在一个实施例中，AAV9病毒载体包含经修饰的AAV2 ITR、鸡β-肌动蛋白(CB)启动子、巨细胞病毒(CMV)即刻/早期增强子、经修饰的SV40晚期16s内含子、牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化信号和未经修饰的AAV2 ITR。
本公开提供了药物配制品。在一些实施例中，水性药物配制品包含(a)包含编码运动神经元存活(SMN)蛋白的多核苷酸的AAV9病毒载体，(b)Tris缓冲液，(c)氯化镁，(d)氯化钠和(e)泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)，其中药物组合物不包含防腐剂。在配制品的一个实施例中，AAV9病毒载体还包含经修饰的AAV2 ITR、鸡β-肌动蛋白(CB)启动子、巨细胞病毒(CMV)即刻/早期增强子、经修饰的SV40晚期16s内含子、牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化信号和未经修饰的AAV2 ITR。在配制品的一个实施例中，Tris缓冲液浓度为约10-30nM，例如约20mM。在一个实施例中，配制品的pH为约7.7至约8.3，例如约pH 8.0(例如由USP<791>(通过引用以其整体并入)测量)。在配制品的一个实施例中，氯化镁浓度为约0.5-1.5mM，例如约1mM。在配制品的一个实施例中，氯化钠浓度为约100-300mM，例如约200mM。在一个实施例中，配制品包含约0.005％w/v泊洛沙姆188。
本发明的另一个方面涉及治疗有需要的患者的I型脊髓性肌萎缩(SMA)的方法，所述方法包括通过鞘内或静脉内途径给患者施用包含编码SMN蛋白的多核苷酸的AAV9病毒载体(例如本文公开的组合物或配制品)，其中患者为(a)九月龄或更小，(b)具有至少约2.6kg的体重，(c)具有双等位基因SMN1无效突变或缺失，和(d)具有SMN2的至少一个功能性拷贝。在一个实施例中，AAV9病毒载体包含经修饰的AAV2 ITR、鸡β-肌动蛋白(CB)启动子、巨细胞病毒(CMV)即刻/早期增强子、经修饰的SV40晚期16s内含子、牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化信号和未经修饰的AAV2 ITR。在一个实施例中，患者的体重不超过约8.5kg。在一个实施例中，患者在SMN2基因的至少一个拷贝的外显子7中没有c.859G>C取代。在一个实施例中，在6月龄之前给患者施用治疗。在一个实施例中，在一个或多个SMA症状发作之前给患者施用所述治疗，所述SMA症状选自肌张力减退、运动技能延迟、头部控制不良、圆肩姿势和关节活动过度。在一个实施例中，患者的抗AAV9抗体效价为1:100或低于1:100，如在施用前通过ELISA结合免疫测定法测定的。
本文还公开了治疗具有I型脊髓性肌萎缩(SMA)、具有或没有疾病发作的儿科患者的方法，所述方法包括给患者施用包含如本文所公开的腺相关病毒(AAV)载体的组合物或配制品。
本公开还涉及治疗有需要的患者中的雷特综合征的方法，所述方法包括通过鞘内或静脉内途径给患者施用包含编码甲基-CpG-结合蛋白2(MECP2)蛋白的多核苷酸的AAV9病毒载体。
本公开还涉及治疗有需要的患者的肌萎缩侧索硬化症(ALS)的方法，所述方法包括通过鞘内或静脉内途径给患者施用AAV9病毒载体，所述AAV9病毒载体包含编码靶向超氧化物歧化酶1(SOD1)的短发夹RNA(shRNA)的多核苷酸。
本发明的另一方面涉及治疗患有I型SMA的患者的方法，所述方法包括以下步骤：(a)确定患者的体重，(b)获得包含AAV9病毒载体药物组合物小瓶的试剂盒，和(c)将来自小瓶的AAV9病毒载体施用给患者，其中每个小瓶中的病毒载体浓度为约2.0x 1013vg/mL，其中AAV9病毒载体包含编码SMN蛋白的多核苷酸；并且其中所述试剂盒包括以下数量的小瓶：
Figure BDA0002574379020000061
在一个实施例中，所述试剂盒包含AAV9病毒载体，所述AAV9病毒载体包含突变的AAV2 ITR、鸡β-肌动蛋白(CB)启动子、巨细胞病毒(CMV)即刻/早期增强子、经修饰的SV40晚期16s内含子、牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化信号和AAV2 ITR。在一个实施例中，AAV病毒载体以约1.0x 1014-2.5x 1014vg/kg的剂量通过输注施用。
本公开的另一个方面涉及用于治疗患有I型脊髓性肌萎缩(SMA)的患者的试剂盒，所述试剂盒包含小瓶，所述小瓶含有组合物AAV9病毒载体(所述AAV9病毒载体包含编码运动神经元存活(SMN)蛋白的多核苷酸)或配制品，所述配制品包含(a)包含编码运动神经元存活(SMN)蛋白的多核苷酸的AAV9病毒载体，(b)Tris缓冲液，(c)氯化镁，(d)氯化钠和(e)泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)。
本公开的另一个方面涉及试剂盒，所述试剂盒包含含有约5.5mL或约8.3mL AAV9病毒载体的小瓶，所述AAV9病毒载体包含编码运动神经元存活(SMN)蛋白的多核苷酸，并以约2.0x 1013vg/mL的浓度配制在20mM Tris、1mM MgCl2、200mM NaCl、0.005％w/v泊洛沙姆188(pH 7.7-8.3，例如约8.0)中。
本公开的另一个方面涉及治疗I型SMA的方法，所述方法包括通过静脉内输注来给有需要的患者施用一定体积的组合物组合物AAV9病毒载体(所述AAV9病毒载体包含编码运动神经元存活(SMN)蛋白的多核苷酸)或配制品，所述配制品包含(a)包含编码运动神经元存活(SMN)蛋白的多核苷酸的AAV9病毒载体，(b)Tris缓冲液，(c)氯化镁，(d)氯化钠和(e)泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)。
本公开的另一方面涉及制造AAV病毒载体的方法。在一个实施例中，制造AAV病毒载体的方法包括以下步骤：(a)培养粘附细胞，(b)用一种或多种质粒转染粘附细胞以产生AAV病毒载体，(c)裂解粘附细胞以分离AAV病毒载体，(d)酸化和澄清(c)的细胞裂解物，(e)使用阳离子交换色谱(CEX)纯化(d)的产物，(f)使用切向流过滤(TFF)过滤(e)的产物，(g)在氯化铯(CsCl)缓冲液中超速离心(f)的产物；和(h)从(g)的产物收集AAV病毒载体。
本公开的另一方面涉及从细胞培养物裂解物中纯化AAV病毒载体的方法，所述方法包括以下步骤：(a)酸化和澄清细胞裂解物，(b)使用阳离子交换色谱(CEX)纯化(a)的产物，(c)通过切向流过滤来过滤(b)的产物，(d)使用2-4M氯化铯(CsCl)缓冲液超速离心(c)的产物，(e)从(d)的产物中收集AAV病毒载体，(f)通过切向流过滤来过滤(e)的产物。在一个实施例中，以工业规模执行所述方法。在一个实施例中，所述方法产生大于5x 1015vg，或大于8x 1015vg或大于1x 1016vg的产率/制造批次。
本公开的另一方面涉及通过施用根据本文公开的任一方法制备的AAV9病毒载体治疗患有1型SMA的患者的方法，所述AAV9病毒载体包含编码SMN蛋白的多核苷酸。
本公开的另一方面涉及通过施用根据本文的任一方法制备的AAV9病毒载体治疗患有雷特综合征的患者的方法，所述AAV9病毒载体包含编码MECP2蛋白的多核苷酸。
本公开的另一方面涉及通过施用根据根据本文的任一方法制备的AAV9病毒载体治疗患有ALS的患者的方法，所述AAV9病毒载体包含编码靶向SOD1的shRNA的多核苷酸。
本公开的另一个方面涉及包含编码SMN蛋白的多核苷酸的AAV9病毒载体，所述病毒载体根据本文中的任一方法制备。
本公开的另一个方面涉及包含AAV9病毒载体的药物组合物，所述AAV9病毒载体包含编码SMN蛋白的多核苷酸，所述药物组合物根据本文中的任一方法制备。
本公开的另一方面涉及水性药物组合物，其包含AAV9病毒载体(所述AAV9病毒载体包含编码SMN蛋白的多核苷酸)、Tris缓冲液、氯化镁溶液和氯化钠溶液，其中所述药物组合物不包含防腐剂，并且其中所述组合物根据本文中的任一方法制备。
本公开的另一个方面涉及包含编码MECP2蛋白的多核苷酸的AAV9病毒载体，所述病毒载体根据本文中的任一方法制备。
本公开的另一个方面涉及包含AAV9病毒载体的药物组合物，所述AAV9病毒载体包含编码MECP2蛋白的多核苷酸，所述药物组合物根据本文中的任一方法制备。
本公开的另一个方面涉及包含编码靶向SOD1的shRNA的多核苷酸的AAV9病毒载体，所述病毒载体根据本文中的任一方法制备。
本公开的另一个方面涉及通过静脉内施用药物组合物治疗有需要的患者中的I型SMA的方法，所述药物组合物包含(a)自互补AAV9病毒载体，其包含经修饰的AAV2 ITR、鸡β-肌动蛋白(CB)启动子、巨细胞病毒(CMV)即刻/早期增强子、经修饰的SV40晚期16s内含子、牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化信号和未经修饰的AAV2 ITR，(b)pH 8.0的20mM Tris，(c)1mMMgCl2，(d)200mM NaCl，和(e)0.005％泊洛沙姆188，其中患者的体重为2.6kg至8.5kg。在一个实施例中，组合物不包含防腐剂。
在一个实施例中，患者是(a)九月龄或更小，(b)具有至少约2.6kg的体重，(c)具有双等位基因SMN1无效突变或缺失，和(d)具有SMN2的至少一个功能性拷贝。
本公开的另一个方面涉及适合于或制造用于静脉内施用药物组合物的组合物，所述药物组合物包含(a)自互补AAV9病毒载体，其包含经修饰的AAV2 ITR、鸡β-肌动蛋白(CB)启动子、巨细胞病毒(CMV)即刻/早期增强子、经修饰的SV40晚期16s内含子、牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化信号和未经修饰的AAV2 ITR，(b)pH 8.0的20mM Tris，(c)1mM MgCl2，(d)200mM NaCl，和(e)0.005％泊洛沙姆188。
在一些实施例中，本文公开了组合物或配制品，其中所述组合物或配制品包含下列中的至少一种：(a)少于约0.09ng benzonase/1.0x 1013vg，(b)少于约30μg/g(ppm)铯，(c)约20-80ppm的泊洛沙姆188，(d)少于约0.22ng BSA/1.0x 1013vg，(e)少于约6.8x 105pg残余质粒DNA/1.0x 1013vg，(f)少于约1.1x 105pg残余hcDNA/1.0x 1013vg，和(g)少于约4ngrHCP/1.0x 1013vg，
在一些实施例中，本发明提供了生产衍生自工作细胞库的中间体(例如，冷冻中间体)的上游工艺，其中所述上游工艺包括以下步骤：(a)培养细胞，(b)用质粒(例如，三种质粒)转染所培养的细胞，(c)在培养周期后从所述细胞收获扩增的病毒颗粒，(d)通过过滤来纯化所述病毒颗粒以去除任何完整的细胞或细胞碎片，(e)将来自步骤(d)的洗脱液进行切向流过滤，和(g)任选地冷冻经纯化病毒颗粒的所得中间体制剂。在一些实施例中，上游工艺与进一步的加工步骤(特别是例如进一步的纯化和配制步骤)相组合，以生产最终的药物产品。
在一个实施例中，工作细胞库包括HEK293细胞。在其他实施例中，使用本领域中可获得的并且适合于在本文公开的方法中使用的另一种细胞类型或衍生物。
在一个实施例中，转染步骤利用聚乙烯亚胺。在一个实施例中，转染步骤包括使用转基因质粒(例如pSMN、pAAV质粒和pHELP质粒)的三载体转染。
在一个实施例中，所述方法还包括用裂解缓冲液和表面活性剂裂解转染的细胞。
在一个实施例中，收获步骤包括用核酸内切酶(例如浓度在50-200U/ml之间，例如浓度在75-150U/ml之间)如benzonase处理产物，以减少残余宿主细胞DNA。
在一个实施例中，纯化步骤包括深度过滤和随后通过过滤器过滤，所述过滤器去除大分子污染物和细胞碎片，例如0.45微米过滤器，但允许载体基因组通过。可以使用任何合适的深度过滤器。
在一个实施例中，切向流过滤(“TFF”)实现步骤(d)的洗脱液的5-15X(例如6-10X)浓缩和至少4个渗滤体积(例如6个渗滤体积)的渗滤或10个渗滤体积或12个渗滤体积或15个渗滤体积的渗滤。可以使用任何合适的TFF过滤器。在一个实施例中，TFF膜是纤维素膜。在一个实施例中，TFF膜具有300kDa的截留值。
第二，本公开提供了将中间体(例如，冷冻中间体)加工成经过滤的原料药的下游工艺。下游工艺步骤包括酸化和澄清步骤(使用过滤)，随后是阳离子交换色谱，切向流过滤，CsCl超速离心和进一步的切向流过滤步骤，以产生经过滤的原料药，其中纯化的AAV颗粒悬浮在药学上可接受的载体中。
在一个实施例中，酸化和澄清步骤包括深度过滤和随后通过过滤器过滤，所述过滤器去除大分子污染物和细胞碎片，例如0.45微米过滤器。在一些实施例中，pH调节是受控制的。作为所述步骤一部分，在一个实施例中，添加洗涤剂，例如吐温(Tween)。在一些实施例中，控制吐温的添加速率和吐温的浓度范围。
在一个实施例中，阳离子交换色谱包括使用具有0.2微米孔径的复合磺酰基树脂的基于膜的色谱树脂。
在一个实施例中，氯化铯(CsCl)超速离心步骤使用2-4M CsCl，例如约3M CsCl。
在另一个实施例中，CsCl超速离心步骤在约40-50kRPM下进行约20-25小时。在另一个实施例中，CsCl超速离心步骤在约45kRPM下进行约22小时。
在一个实施例中，切向流过滤(“TFF”)实现步骤(d)的洗脱液的5-15X(例如6-10X)浓缩和至少4个渗滤体积(例如6个渗滤体积)的渗滤或10个渗滤体积或12个渗滤体积或15个渗滤体积的渗滤。在一个实施例中，TFF膜具有300kDa的截留值。
在一个实施例中，洗脱液低于铯(Cs)的检测水平。在另一个实施例中，Cs的检测水平低于百万分之50(ppm)。在另一个实施例中，Cs的检测水平约为50-70ppm。在另一个实施例中，Cs的检测水平约为百万分之70-90(ppm)。在另一个实施例中，Cs的检测水平约为百万分之90-110(ppm)。在另一个实施例中，Cs的检测水平约为百万分之110-130(ppm)。在另一个实施例中，Cs的检测水平约为百万分之130-150(ppm)。在另一个实施例中，Cs的检测水平小于百万分之150(ppm)。
这些纯化方法可用于制备高产量病毒制剂，包括AAV制剂(例如，AAV9-SMN)，其包含少于5X 106pg/ml残余宿主细胞DNA(hcDNA)/1X 1013载体基因组(“vg”)/ml，例如少于1.2X 106pg/mL hcDNA/1X 1013vg/mL。因此，接受7.5X 1015vg的5kg患者获得不超过多达1.2X 106pg/mL*7.5X 1015vg/(1X 1013vg/mL)＝8.4X 107pg hcDNA＝84,000ng hcDNA/5kg剂量。在一个实施例中，制剂包含少于5.0x 105pg残余宿主细胞DNA/1.0x 1013vg、少于2.0x105pg残余宿主细胞DNA/1.0x1013vg、少于1.1x 105pg残余宿主细胞DNA/1.0x 1013vg、少于1.0x 105pg残余宿主细胞DNA/1.0x 1013vg、少于0.9x 105pg残余宿主细胞DNA/1.0x1013vg、少于0.8x 105pg残余宿主细胞DNA/1.0x 1013vg，或介于之间的任何浓度。
在一个实施例中，AAV是具有AAV2衍生ITR的复制缺陷AAV9，例如scAAV9。在另一个实施例中，AAV载体携带SMN转基因。在一个实施例中，编码SMN的DNA载于GenBank登录号NM_000344.2。SMN DNA的保守核苷酸取代也是可以考虑的(例如，在位置625的鸟嘌呤到腺嘌呤的变化，如GenBank登录号NM_000344.2中所述)。
本发明的另一个方面涉及药物组合物，所述药物组合物包含适合于(a)静脉内(“IV”)注射或(b)鞘内(“IT”)施用的配制品中的AAV颗粒。
在另一个实施例中，药物组合物具有少于10％的空衣壳、少于8％的空衣壳、少于7％的空衣壳、少于5％的空衣壳、少于3％的空衣壳、或少于1％的空衣壳。在一些实施例中，药物组合物具有少于约5％的空衣壳。在一个实施例中，空衣壳的数量低于检测极限。在一些实施例中，药物组合物具有低量的空衣壳是有利的，因为那些空衣壳可产生没有治疗益处的不良应答(例如，免疫应答、炎症应答、肝脏应答和/或心脏应答)。
在另一个实施例中，所述药物组合物中的残余宿主细胞蛋白(“rHCP”)少于或等于100ng/ml rHCP/1X 1013vg/ml，例如少于或等于40ng/ml rHCP/1X 1013vg/ml或1-50ng/mlrHCP/1X 1013vg/ml。在一个实施例中，本文公开的药物组合物包含少于10ng rHCP/1.0x1013vg、或少于5ng rHCP/1.0x 1013vg、少于4ng rHCP/1.0x 1013vg、或少于3ng rHCP/1.0x1013vg，或介于之间的任何浓度。
在另一个实施例中，所述药物组合物中的残余宿主细胞DNA(“hcDNA”)少于或等于5X 106pg/ml hcDNA/1X 1013vg/ml、少于或等于1.2X 106pg/ml rHDNA/1X 1013vg/ml、或1X105pg/ml rHDNA/1X 1013vg/ml至1.2X 106pg/ml/1X 1013vg/ml。在一个实施例中，所述药物组合物中的残余宿主细胞DNA少于5.0x 105pg/1.0x 1013vg、少于2.0x 105pg/1.0x 1013vg、少于1.1x 105pg/1.0x 1013vg、少于1.0x 105pg hcDNA/1.0x 1013vg、少于0.9x 105pghcDNA/1.0x 1013vg、少于0.8x 105pg hcDNA/1.0x 1013vg，或介于之间的任何浓度。
在一个实施例中，所述药物组合物中的残余质粒DNA少于或等于1.7X 106pg/ml/1X 1013vg/ml、或1X 105pg/ml/1X 1013vg/ml至1.7X 106pg/ml/1X 1013vg/ml。在一个实施例中，所述药物组合物中的残余质粒DNA少于10.0x 105pg/1.0x 1013vg、少于8.0x 105pg/1.0x 1013vg、或少于6.8x 105pg/1.0x 1013vg。
在一个实施例中，本文公开的药物组合物包含少于0.5ng/1.0x 1013vg、少于0.3ng/1.0x 1013vg、少于0.22ng/1.0x 1013vg、或少于0.2ng/1.0x 1013vg，或介于之间的任何浓度的牛血清白蛋白(BSA)。在一个实施例中，所述药物组合物中的benzonase少于0.2ng/1.0x 1013vg、少于0.1ng/1.0x 1013vg、少于0.09ng/1.0x 1013vg、少于0.08ng/1.0x1013vg或介于之间的任何浓度。在一个实施例中，所述药物组合物中的泊洛沙姆188为约10-150ppm、约15-100ppm、或约20-80ppm。在一个实施例中，所述药物组合物中的铯少于50μg/g(ppm)、少于30μg/g(ppm)或少于20μg/g(ppm)，或介于两者之间的任何浓度。
在一个实施例中，本文公开的药物组合物包含少于10％、少于8％、少于7％、少于6％、少于5％、少于4％、少于3％、少于2％或介于两者之间的任何百分比的总杂质，例如通过SDS-PAGE测定。在一个实施例中，例如通过SDS-PAGE测定的总纯度大于90％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％、或介于两者之间的任何百分比。在药物组合物的一个实施例中，例如通过SDS-PAGE测量，没有单一的未命名相关杂质多于5％、多于4％、多于3％或大于2％、或介于两者之间的任何百分比。在一个实施例中，药物组合物包括的填充的衣壳相对于总衣壳(例如，通过分析型超速离心测量的峰1+峰2)的百分比大于85％、大于86％、大于87％、大于88％、大于89％、大于90％、大于91％、大于91.9％、大于92％、大于93％，或介于之间的任何百分比。在药物组合物的一个实施例中，通过分析超速离心在峰1中测量的填充的衣壳的百分比为20％-80％、25％-75％、30％-75％、35％-75％或37.4％-70.3％。在药物组合物的一个实施例中，通过分析超速离心在峰2中测量的填充的衣壳的百分比为20％-80％、20％-70％、22％-65％、24％-62％或24.9％-60.1％。
在一个实施例中，本文公开的药物组合物包含1.0-5.0x 1013vg/mL、1.2-3.0x1013vg/mL或1.7-2.3x 1013vg/mL的基因组效价。
在一个实施例中，本文公开的药物组合物显示出小于5CFU/mL、小于4CFU/mL、小于3CFU/mL、小于2CFU/mL、或小于1CFU/mL、或介于两者之间的任何浓度的生物负载。在一个实施例中，根据USP，例如USP<85>(通过引用以其整体并入)的内毒素的量少于1.0EU/mL、少于0.8EU/mL或少于0.75EU/mL。
在一个实施例中，根据USP，例如USP<785>(通过引用以其整体并入)本文公开的药物组合物的渗透压摩尔浓度为350-450mOsm/kg、370-440mOsm/kg或390-430mOsm/kg。在一个实施例中，药物组合物包含少于1200个大于25μm的颗粒/容器、少于1000个大于25μm的颗粒/容器、少于600个大于25μm的颗粒/容器、少于500个大于25μm的颗粒/容器，或介于之间的任何值。在一个实施例中，药物组合物包含少于10000个大于10μm的颗粒/容器、少于8000个大于10μm的颗粒/容器、或少于6000个大于10μm的颗粒/容器。
在一个实施例中，药物组合物具有0.5-5.0x 1013vg/mL、1.0-4.0x 1013vg/mL、1.5-3.0x 1013vg/mL或1.7-2.3x 1013vg/mL的基因组效价。
在一个实施例中，本文公开的药物组合物包含以下中的一种或多种：少于约0.09ng benzonase/1.0x 1013vg，少于约30μg/g(ppm)的铯，约20-80ppm的泊洛沙姆188，少于约0.22ng BSA/1.0x 1013vg，少于约6.8x 105pg残余质粒DNA/1.0x 1013vg，少于约1.1x105pg残余hcDNA/1.0x 1013vg，少于约4ng rHCP/1.0x 1013vg，pH 7.7-8.3，约390-430mOsm/kg，少于约600个尺寸≥25μm的颗粒/容器，少于约6000个尺寸≥10μm的颗粒/容器，约1.7x1013-2.3x 1013vg/mL的基因组效价，约3.9x 108-8.4x 1010IU/1.0x 1013vg的感染效价，约100-300μg/1.0x 1013vg的总蛋白，在约7.5x 1013vg/kg剂量的病毒载体情况下Δ7SMA小鼠≥24天的中值存活，根据基于体外细胞的测定的约70％-130％相对效力和/或少于约5％空衣壳。
在各种实施例中，本文公开的包含本文讨论的任何病毒颗粒(例如，AAV SMN、AAVMECP2或AAV SOD1病毒颗粒)的药物组合物保留了参考标准品的+20％之间、+15％之间、+10％之间、或+5％之间的效力。在一些实施例中，使用合适的体外细胞测定或体内动物模型来测量效力。例如，可以使用SMA的动物模型(例如，SMAΔ7小鼠)或使用合适的细胞系(例如，分离自SMAΔ7小鼠皮层的原代神经祖细胞(NPC))的基于细胞的定量测定来确定效力或％功能性AAV SMN病毒颗粒。在一个实施例中，使用Foust等人,Nat.Biotechnol.[自然生物技术],28(3),第271-274页(2010)中的方法相对于参考标准品来评估效力。可以使用任何合适的参考标准品。可以使用合适的体外细胞测定或体内动物模型，例如Mecp2敲除小鼠(如在Guy等人,“Reversal of neurological defects in a mouse model of Rettsyndrome.[逆转雷特综合征小鼠模型中的神经系统缺陷]”Science[科学],315(5815):1143-7中)来测定效力或％功能性AAV MeCP2。可以使用合适的体外细胞测定或体内动物模型，例如SOD1突变小鼠(如在Gurney等人,“Motor neuron degeneration in mice thatexpress a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation[表达人Cu、Zn超氧化物歧化酶突变的小鼠中的运动神经元退行].”Science[科学],264(5166):1772-5中)来测定效力或％功能性AAV SOD1。在一个实施例中，药物组合物具有体内效力，其由给予7.5x 1013vg/kg剂量的SMAΔ7小鼠的中值生存期大于15天、大于20天、大于22天或大于24天而测定。在一个实施例中，药物组合物具有通过基于细胞的分析测试的相对于参考标准品和/或合适对照的50％-150％、60％-140％或70％-130％的体内相对效力。
在一个实施例中，静脉内(“IV”)配制品的pH在7.5和8.5之间的，基因组效价在约1-8x 1013病毒载体基因组/mL(vg/mL)之间，或在2X 1013vg/ml-6X 1013vg/ml之间，和任选地渗透压摩尔浓度为384-448mOsm/kg。在一个实施例中，IV配制品包含在pH 8.0的Tris缓冲液中的MgCl2、NaCl、普朗尼克F68。
在一个实施例中，对于IV施用，携带SMN转基因的AAV-9载体在适当的场景(例如，介入室、手术室、专用操作间)中在无菌条件下通过插入外周肢体静脉(臂或腿)的静脉导管以指示剂量一次性施用，并经约30-60分钟缓慢输注，
在另一个实施例中，本公开提供了将多核苷酸递送至有需要的患者的中枢神经系统的组合物和方法，包括将rAAV9和非离子型低渗造影剂鞘内(“IT”)递送至患者，其中rAAV9包括包含多核苷酸的自互补基因组。所述多核苷酸被递送至例如脑、脊髓、胶质细胞、星形胶质细胞和/或下运动神经元。非离子型的低渗透造影剂例如是碘比醇、碘海醇、碘美普尔、碘帕醇、碘喷托、碘普罗胺、碘佛醇或碘昔兰。在一些实施例中，多核苷酸是运动神经元存活(SMN)多核苷酸。在一个实施例中，造影剂是碘海醇，例如碘海醇180(以欧乃派克(Omnipaque)180出售，含有388mg碘海醇，相当于180mg有机碘/mL)。
在一个实施例中，对于IT施用，将携带SMN转基因的scAAV9载体用生理盐水稀释，并与经批准和标记用于儿科使用来经由腰椎鞘内注射对注射进行射线照相监测的适当高比重造影剂(例如欧乃派克180)预混合。包含携带SMN转基因的AAV-9载体加上造影剂和/或盐水的含水组合物的总体积不超过5mL。造影剂与携带SMN转基因的scAAV-9载体可共配制、共包装或单独包装并且递送至患者中心。
患者在无菌条件下在PICU患者室或其他可立即获得急性危重症护理管理的合适场景(例如介入室、手术室、专用操作间)中通过鞘内注射接受携带SMN转基因的scAAV-9载体。部位可使用无创伤针头，其斜角平行于硬脑膜纤维插入；这已被证明可以显著减少硬脑膜的损伤，从而降低腰椎穿刺后脑脊液漏的风险(Ebinger等人,“Headache and BackacheAfter Lumbar Puncture in Children and Adolescents:A Prospective Study.[儿童和青少年腰椎穿刺后头痛和背痛：一项前瞻性研究]”Pediatrics[儿科学],113(6):1588-1592；Kiechl-Kohlendorfer等人,“Cerebrospinal Fluid Leakage After LumbarPuncture in Neonates:Incidence and Sonographic Appearance.[新生儿腰椎穿刺后脑脊液漏：发生率和超声表现]”American Journal of Roentgenology[美国放射学杂志],181(1):231-234)，包括儿童。
建议对所有接受IT注射的患者进行镇静/麻醉。方法和药物由局部麻醉师自行决定，但应包括足够程度的镇静或抗焦虑，以确保术中和术后特伦德伦伯卧位(Trendelenburg position)定位置放的镇痛和无活动。患者将被置于特伦德伦伯卧位，头向下倾斜30°，持续15分钟，然后施用IT疗法，以增强对颈部和大脑区域的分布。
将患者置于侧卧位，通过腰椎穿刺将带管心针的导管插入L3-L4或L4-L5棘突间隙进入蛛网膜下腔。蛛网膜下腔插管通过从导管流出清澈的脑脊液(CSF)来证实。CSF将按照机构指南进行去除和处置。将携带SMN转基因的ScAAV-9载体在预先混合的对比溶液中直接注入蛛网膜下腔。
在一个实施例中，本公开提供治疗有需要的患者的神经疾病的方法，所述方法包括静脉内或鞘内递送本文公开的药物组合物，其中细小病毒包含自互补rAAV9基因组，其中工程改造的转基因包含SMN多核苷酸，并且其中所述疾病是SMA。
在另一个实施例中，本公开提供了治疗有需要的患者的神经疾病的方法，所述方法包括鞘内递送本文公开的药物组合物与造影剂，其中细小病毒包含自互补rAAV9基因组，其中工程改造的转基因包含SMN多核苷酸，其中所述疾病是SMA，并且其中所述造影剂是欧乃派克180。
在另一个实施例中，本公开提供治疗有需要的患者的II、III或IV型SMA的方法，所述方法包括鞘内递送本文公开的药物组合物与造影剂，其中细小病毒包含自互补rAAV9基因组，其中工程改造的转基因包含SMN多核苷酸，并且其中所述造影剂是欧乃派克180。
在另一个实施例中，本公开提供治疗有需要的患者的I型SMA的方法，所述方法包括静脉内递送本文公开的药物组合物，其中细小病毒包含自互补rAAV9基因组，并且其中工程改造的转基因包含SMN多核苷酸。在一些实例中，患者为0-9月龄。在一些实例中，患者为0-6月龄。在其他实施例中，儿科患者的重量高达约8kg。在一些实施例中，儿科患者为约8.5kg或更小。在一些实施例中，儿科患者为约2.6kg或更大。
在另一个实施例中，本公开提供了一种用于治疗有需要的患者中的I型SMA的试剂盒，所述试剂盒包括静脉内施用包含在小瓶中的本文公开的药物组合物。在一些实施例中，测量患者的体重，并基于患者的体重计算剂量。
除非另外定义，本文所用的全部技术术语和科学术语具有与本披露所属领域的普通技术人员通常所理解的相同意义。
如本文所使用的，单词的单数形式还包括所述单词的复数形式，除非上下文另外明确指示；作为示例，术语“一个”，“一种”和“所述”被理解为单数或复数，并且术语“或”被理解为包括在内。举例来说，“一个要素”意指一个或多个要素。
在整个说明书中，词语“包含(comprising)”或变体如“包含(comprises)”应当被理解为暗示包括所陈述的要素、整体或步骤或者要素、整体或步骤的组，但不排除任何其他的要素、整体或步骤或者要素、整体或步骤的组。在整个说明书中，词语“由……组成(consisting of)”或变体如“由以下组成(consists of)”应当被理解为暗示包括所陈述的要素、整体或步骤或者要素、整体或步骤的组，并且排除任何其他的要素、整体或步骤或者要素、整体或步骤的组。在整个说明书中，词语“基本上由……组成(consistingessentially of)”或变体如“基本上由以下组成(consists essentially of)”应当被理解为暗示包括所陈述的要素、整体或步骤或者要素、整体或步骤的组，以及不实质上影响本公开和/或权利要求的基本和新颖特征的任何其他的要素、整体或步骤或者要素、整体或步骤的组。
约可以被理解为在规定的值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、或0.01％之内。当参考百分比值使用时，“约”可理解为±1％以内(例如，“约5％”可理解为4％-6％以内)或±0.5％以内(例如，“约5％”可理解为4.5％-5.5％以内)。除非另外从上下文清楚可见，否则在此提供的所有数值被术语“大约”修饰。
虽然类似或等同于在此所述的那些的方法和材料可以用于本披露的实践或测试，但以下描述了适合的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用以其整体而并入。本文引用的参考文献不被承认是所要求保护的公开的现有技术。在有矛盾的情况下，将以本说明书(包括定义)为准。另外，所述材料、方法和实例仅仅是说明性的并不意在是限制性的。根据以下详细描述和权利要求书，本披露的其他特征和优点将是显而易见的。
附图说明
结合附图，通过参考以下详细描述和所附权利要求，本公开的各种目的和优点以及对本公开的更完整的理解是显而易见的和更容易理解的，其中：
图1.pSMN、pHELP和pAAV的质粒图谱。
图1A显示pSMN的质粒图谱。pSMN是编码重组自互补AAV DNA基因组信息的质粒，所述基因组在鸡-β-肌动蛋白杂合启动子连同立即/早期巨细胞病毒(CMV)增强子元件的控制下表达人运动神经元存活(SMN)cDNA。SMN cDNA编码全长的功能蛋白。表达盒包含来自猿猴病毒40(SV40)的经修饰的内含子序列和牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化信号。表达盒(CMV-CB-SV40-SMN-BGHpA)的侧翼是AAV2衍生的反向末端重复序列(ITR)。对左侧ITR进行修饰，以优先包装自互补AAV基因组。在寻找的药物产品的生产过程中，将ITR之间并且包括ITR的区域一起包装到重组AAV9衣壳中。不打算包装到重组AAV基因组中的关键pSMN组分包括编码卡那霉素抗性的开放阅读框(KanR)和源自pUC的复制起点(ori)。ori和KanR区域可用于质粒制造。
图1B显示了pHELP质粒的质粒图谱。pHELP质粒含有重组腺相关病毒产生所必需的反式作用腺病毒组分。pHELP质粒包含腺病毒基因组中提供对于AAV复制而言重要因子的区域，即E2A、E4和VA RNA。涉及rAVV复制的腺病毒E1功能由转染宿主293细胞提供。然而，pHELP质粒不包含其他腺病毒复制或结构基因。所述质粒中存在的腺病毒序列仅占腺病毒基因组的约28％(9,280/35,938)，且不包含对于复制而言关键的顺式元件，如反向末端重复序列。因此，这样的产生系统预计不会产生传染性腺病毒。
图1C显示AAV质粒的质粒图谱。野生型AAV基因组包含两个非编码结构元件，称为反向末端重复序列，位于rep和cap开放阅读框侧翼。Rep和cap分别编码病毒复制和衣壳蛋白。在重组腺相关病毒载体的产生中；病毒ITR是以顺式使用的唯一元件，而病毒1开放阅读框以反式提供。使用瞬时转染粘附HEK293细胞制备AAV的方法通过将不同的遗传元件分开在不同的质粒上来解决它们的顺式/反式作用。pAAV2/9质粒含有AAV2 rep基因和AAV9 cap基因的开放阅读框。
图2显示了选择HEK293细胞进行优越粘附和初级细胞库(MCB)建库的工艺流程图。
图3显示了选择HEK293细胞进行优越粘附和初级细胞库(MCB)建库的细胞处理细节的概要。
图4述原料药上游工艺流程图。
图5描述原料药下游工艺流程图。
图6显示在达120分钟时添加吐温20对XMuLV的灭活。
图7显示在达120分钟时添加吐温20对PRV的灭活。
图8描述了细胞接种密度实验期间的HEK 293细胞扩增工艺流程。
图9A-E显示生长和代谢物谱。将HEK 293细胞以12,000和8,000个细胞/cm2一式两份地接种于生物反应器(pH 7.23，37.0℃，55％溶解氧(DO))中。在接种后四天(12,000个细胞/cm2)和五天(8,000个细胞/cm2)用DNA质粒/PEI转染细胞。接种后八天(12,000个细胞/cm2)和九天(8,000个细胞/cm2)收获生物反应器。每天在Nova BioFlex上读取pH值和代谢物读数。
图10显示了作为细胞接种密度(8000或12000个细胞/cm2)和四种不同长度的转染时间(20分钟、1小时或2小时)的函数的病毒基因组产生。
图11显示了在整个制造工艺过程的不同过滤步骤中取样的中间体的病毒效价。
图12A-B显示在TFF1步骤中病毒载体回收和宿主细胞蛋白(HCP)清除。
图13描述了细胞接种密度实验期间的HEK 293细胞扩增工艺流程。
图14A-E显示HEK 293细胞以8,000个细胞/cm2、9,350个细胞/cm2、10,700个细胞/cm2、12,050个细胞/cm2一式两份地接种在生物反应器(pH 7.23，37.0℃，55％DO)中。接种后五天用DNA质粒/PEI(1:1m/m)转染细胞。使用NOVA BioProfile 400进行pH值和代谢物分析。
图15A-B显示了在生物反应器中从四种起始接种密度的原料药产生。单位表面积病毒效价和收获的载体基因组的比较。
图16显示阶段1(工艺A)和阶段3试验(工艺B)制造工艺。
图17A-B提供一个表格，说明可比性和制造一致性结果-工艺A(阶段1)和工艺B(阶段3)产物。与工艺A相比，工艺B的产物显示出另外的益处。
图18显示了工艺A和工艺B之间的可比性，使用工艺A(阶段1批次NCHAAV9SMN0613)和工艺B(阶段3批次600156)的成对比较。与工艺A相比，工艺B的产物显示出另外的益处。
图19显示了通过对工艺B(阶段3)批次600156和600307的成对比较进行的制造一致性评估。
图20显示NCH批次NCHAAV9SMN0613在≤-60℃的实时存储条件下存储12个月的稳定性谱。
图21显示了阶段1材料(NCHAAV9SMN0613)的沉降系数(秒x10-13)，显示了沉降系数为约60x 10-13秒的空衣壳(7％)，以及沉降系数范围为约80-150x 10-13秒的全衣壳。
图22显示了阶段3材料(600156)的沉降系数(秒x 10-13)，显示了沉降系数为约60x10-13秒的空衣壳(2％)，以及沉降系数范围为约80-150x 10-13秒的全衣壳。
图23显示了阶段3材料(600307)的沉降系数(秒x 10-13)，显示了沉降系数为约60x10-13秒的空衣壳(4％)，以及沉降系数范围为约80-150x 10-13秒的全衣壳。
具体实施方式
为了使AAV基因疗法的发展超越动物模型，进入临床研究和/或治疗用途，开发了一种能够产生适合人类使用的病毒材料的可扩展的方法。
在一些实施例中，“载体”是指任何遗传元件，例如质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、病毒、病毒粒子等，其当与适当的控制元件相关联时能够复制并且其能够在细胞之间转移基因序列。因此，所述术语包括克隆载体和表达载体，以及病毒载体。
在一些实施例中，“AAV载体”是指衍生自腺相关病毒血清型的载体，包括但不限于AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8和AAV-9。AAV载体可以具有全部或部分缺失的一个或多个AAV野生型基因，例如rep和/或cap基因，但保留功能性侧翼ITR序列。功能性ITR序列是AAV病毒粒子的拯救、复制和包装所必需的。因此，本文定义AAV载体以至少包括以顺式提供病毒的复制和包装(例如功能性ITR)的那些序列。ITR不必是野生型核苷酸序列，并且可以改变，例如通过核苷酸的插入、缺失或取代，只要所述序列提供功能性拯救、复制和包装即可。在一个实施例中，载体是AAV-9载体，具有AAV-2衍生的ITR。“AAV载体”也是指蛋白壳或衣壳，其提供了将载体核酸递送到靶细胞细胞核的有效媒介物。
在一些实施例中，“scAAV”是指自互补腺相关病毒(scAAV)，其是从天然存在的腺相关病毒(AAV)工程改造的用于基因疗法的病毒载体。scAAV被称为“自互补”，因为编码区已被设计成形成分子内双链DNA模板。
在一些实施例中，术语“载体相关杂质”是指除真正重组AAV颗粒之外的所有类型的AAV颗粒。载体相关杂质包括空AAV衣壳(也称为“空”，或“空颗粒”)，以及含有除预期载体基因组以外的多核苷酸序列的AAV颗粒(也称为“AAV包封的核酸杂质”或“AAV包封的DNA杂质”)。
在一些实施例中，“重组病毒”是指已被遗传改变的病毒，例如通过向所述颗粒中添加或插入异源核酸构建体。“重组”可缩写为“r”，例如，rAAV可指重组AAV。本文中使用的术语“AAV”旨在包括“重组AAV”或“rAAV”。
在一些实施例中，“AAV病毒粒子”是指完整的病毒颗粒，例如野生型(wt)AAV病毒颗粒(包含与AAV衣壳蛋白包衣相关的线性、单链AAV核酸基因组)。就这一点而言，具有互补有义(例如“正义”)链或“反义”链的单链AAV核酸分子可以包装到任何一个AAV病毒粒子中，并且这两条链具有同等的感染性。
在一些实施例中，术语“重组AAV病毒粒子”、“rAAV病毒粒子”、“AAV载体颗粒”、“全衣壳”和“全颗粒”在本文中定义为包括AAV蛋白壳的感染性复制缺陷病毒，所述AAV蛋白壳包封目标异源核苷酸序列，所述目标异源核苷酸序列两侧翼是AAV ITR。在合适的宿主细胞中产生rAAV病毒粒子，所述宿主细胞具有指定其中引入的AAV载体、AAV辅助功能和附属功能的序列。以这种方式，使宿主细胞能够编码AAV多肽，所述多肽提供将AAV载体(包含感兴趣的重组核苷酸序列)包装进入感染性重组病毒粒子颗粒以用于随后的基因递送。
在一些实施例中，术语“空衣壳”和“空颗粒”是指AAV病毒粒子，其包括AAV蛋白壳，但缺乏多核苷酸构建体的全部或部分，所述多核苷酸构建体包含在两侧翼是AAV ITR的目的异源核苷酸序列。
术语“宿主细胞”表示例如微生物、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞，其可以或已经用作AAV辅助构建体、AAV载体质粒、附属功能载体或其它转移DNA的接受体。所述术语包括已被转染的原始细胞的后代。因此，本文所用的“宿主细胞”一般指已用外源DNA序列转染的细胞。可以理解，由于自然的、偶然的或故意的突变，单个亲代细胞的子代可能不一定在形态上或在基因组或总DNA互补序列方面与原始亲代完全相同。
在另一个实施例中，术语“AAV辅助功能”是指AAV衍生的编码序列，所述编码序列可被表达以提供AAV基因产物，所述AAV基因产物反过来以反式方式起作用以进行生产性AAV复制。因此：AAV辅助功能包括两个主要的AAV开放阅读框(ORF)，rep和cap。Rep表达产物已被证明具有许多功能，其中包括：AAV DNA复制起点的识别、结合和切割；DNA解旋酶活性；以及来自AAV(或其他异源)启动子的转录的调节。Cap表达产物提供必要的包装功能。本文使用AAV辅助功能来以反式补充AAV载体中缺失的AAV功能。
在一个实施例中，术语“AAV辅助构建体”一般是指包括提供从AAV载体中缺失的AAV功能的核苷酸序列的核酸分子，所述AAV载体将用于产生转导载体以递送目的核苷酸序列。AAV辅助构建体通常用于提供AAV rep和/或cap基因的瞬时表达，以补充AAV复制所必需的缺失的AAV功能；然而，辅助构建体缺少AAV ITR，并且既不能复制也不能包装自身。AAV辅助构建体可以是质粒、噬菌体、转座子、粘粒、病毒或病毒粒子的形式。已经描述了许多AAV辅助构建体，例如常用的质粒pAAV/Ad和plM29+45，它们编码Rep和Cap表达产物。例如见Samulski等人(1989)J.Virol.[病毒学杂志]63:3822-3828；和McCarty等人(1991)J.Virol.[病毒学杂志]65:2936-2945。已经描述了许多编码Rep和/或Cap表达产物的其他载体。例如，见美国专利号5,139,941和6,376,237。
在另一个实施例中，术语“转染”用于指细胞对外源DNA的摄取，并且当外源DNA已引入细胞膜内部时，所述细胞已被“转染”。许多转染技术在本领域中是公知的。例如，见Graham等人(1973)Virology[病毒学],52:456,Sambrook等人(1989)Molecular Cloning,alaboratory manual[分子克隆：实验室手册],冷泉港实验室,纽约,Davis等人(1986)BasicMethods in Molecular Biology[分子生物学基本方法],艾利维尔出版社(Elsevier),和Chu等人(1981)Gene[基因]13:197。这样的技术可用于将一个或多个外源DNA部分引入合适的宿主细胞中。
如本文所用，术语“细胞系”是指能够在体外连续或延长生长和分裂的细胞群体。在本领域中还已知的是，在这样的克隆群体的储存或转移过程中，核型可以发生自发的或诱导的变化。因此，衍生自细胞系的细胞可能与祖先细胞或培养物不完全相同，并且细胞系包括这样的变体。在一些实施例中，术语“HEK293细胞”、“293细胞”或它们的语法等同物在这里可互换使用，并指在本文公开的方法中使用的宿主/包装细胞系。
在一些实施例中，术语“洗脱液”在上下文中可以理解为指用于洗脱物质的缓冲液。在一些实施例中，术语“洗脱液”在上下文中可以理解为指洗脱的物质，例如来自先前纯化步骤的希望的产物或物质，例如用于测定或进一步纯化。
在一些实施例中，这里描述的方法使用良好制造规范(GMP)并以工业规模执行。GMP是监管惯例，例如由联邦药品管理局(FDA)强制执行的那些，以确保药品质量。GMP法规建立了对制造过程的控制。FDA公布了现行GMP法规的示例。在一些实施例中，本文描述的方法采用GMP程序以工业规模生产AAV病毒载体。到目前为止，AAV病毒载体用于基因疗法的工业规模生产由于可扩展性问题一直是具有挑战性的。因此，在一些实施例中，本文所述的方法通过在例如粘附细胞中以工业规模和足以施用给人的纯度水平生产AAV病毒载体而提供了优点。术语“工业规模”是指以大于实验室规模，例如以商业规模(例如，其中每生产批次的产量大于5x 1015vg，或大于8x 1015vg或大于1x 1016vg)在细胞中生产病毒载体的方法。
上游工艺
在一些实施例中，上游工艺用于生产衍生自工作细胞库的中间体，其中所述上游工艺包括以下步骤：(a)培养细胞，例如粘附细胞，(b)用三种质粒转染所培养的细胞，例如粘附细胞，(c)在培养周期后从所述细胞收获扩增的病毒颗粒，例如通过总细胞裂解，(d)通过过滤来纯化所述病毒颗粒以去除任何完整的细胞或细胞碎片，(e)将来自步骤(d)的洗脱液进行切向流过滤，和(f)任选地冷冻经纯化病毒颗粒的所得中间体制剂。在一些实施例中，中间制剂可以冷冻。在其他实施例中，在下游工艺之前不需要冷冻中间制剂。在一些实施例中，用本文公开的上游工艺制备的AAV是编码靶向SOD1的shRNA的AAV，包含编码MECP2的多核苷酸的AAV，或包含编码SMN的多核苷酸的AAV，如本文所述。在一些实施例中，上游工艺在GMP下并以工业规模进行。
1.细胞系转染与培养
在一个方面，本文公开的是rAAV基因组。rAAV基因组包含一个或多个AAV ITR，其侧翼于编码多肽(包括但不限于SMN多肽)或编码针对突变蛋白质或其基因的控制序列的siRNA、shRNA、反义和/或miRNA的多核苷酸。所述多核苷酸可操作地连接到转录控制DNA，特别是启动子DNA、增强子DNA和聚腺苷酸化信号序列DNA，所述启动子DNA、增强子DNA和聚腺苷酸化信号序列DNA在靶细胞中具有功能以形成基因盒。所述基因盒还可包括内含子序列，以促进RNA转录物在哺乳动物细胞中表达时的加工。
在一些实施方案中，rAAV(例如，rAAV9)基因组编码用于治疗神经退行性障碍的营养因子或保护因子，所述神经退行性障碍包括但不限于阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病以及包括脊髓和脑创伤/损伤、中风和脑癌在内的神经系统损伤。已知神经系统生长因子的非限制性实例包括神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养素-3(NT-3)、神经营养素-4/5(NT-4/5)、神经营养素-6(NT-6)、睫状神经营养因子(CNTF)、胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)、成纤维细胞生长因子家族(例如、FGF的1-15)、白血病抑制因子(LIF)、胰岛素样生长因子家族的某些成员(例如、IGF-1)、神经秩蛋白、persephin、骨形态发生蛋白(BMP)、免疫亲和素、生长因子的转化生长因子(TGF)家族、神经调节素、表皮生长因子(EGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子家族(例如，VEGF 165)、卵泡抑素、Hif1以及其他。还通常考虑的是锌指转录因子，其调节本文所考虑的营养或保护因子中的每一个。在进一步的实施例中，考虑了调节神经免疫功能的方法，包括但不限于借助于siRNA、shRNA、反义或miRNA通过例如NFkB抑制或NFkB对神经保护的作用(在不同细胞类型中NFkB和相关途径的双重作用)抑制小胶质细胞和星形胶质细胞活化。在另外的实施例中，rAAV(例如，rAAV9)基因组编码凋亡抑制剂(例如，bcl2，bclxL)。编码营养因子或脊髓损伤调节蛋白或轴突生长抑制剂的阻遏物(例如，Nogo的阻遏物[Oertle等人,The Journal ofNeuroscience[神经科学杂志],23(13):5393-5406(2003)]的rAAV(例如，rAAV9)也考虑用于治疗脊髓损伤。
对于神经退行性障碍如帕金森病的治疗，rAAV(例如rAAV9)基因组在各种实施例中编码芳香酸多巴脱羧酶(AADC)、酪氨酸羟化酶、GTP-环化水解酶1(gtpch1)、凋亡抑制剂(例如bcl2，bclxL)、胶质细胞系衍生的神经营养因子(GDNF)、抑制性神经递质-氨基丁酸(GABA)或参与多巴胺生物合成的酶。在进一步的实施例中，rAAV(例如rAAV9)基因组可编码例如Parkin和/或突触核蛋白(synuclein)的修饰子。
为了治疗神经退行性障碍例如阿尔茨海默病，在一些实施例中，考虑了增加乙酰胆碱产生的方法。在一些实施例中，考虑了增加胆碱乙酰转移酶(ChAT)水平或抑制乙酰胆碱酯酶(AchE)活性的方法。
在一些实施例中，rAAV(例如rAAV9)基因组编码siRNA、shRNA、反义和/或miRNA，用于在降低突变亨廷顿蛋白(htt)表达的方法中使用，以治疗神经退行性障碍例如亨廷顿病。
在各种实施例中，rAAV(例如rAAV9)基因组编码siRNA、shRNA、反义和/或miRNA，用于治疗神经退行性障碍例如ALS。治疗导致疾病分子标志物例如TNF-α、一氧化氮、过氧亚硝酸盐和/或一氧化氮合酶(NOS)的表达减少。
在一些实施例中，所述载体编码短发夹RNA(shRNA)，所述短发夹RNA针对突变的蛋白质，例如针对ALS的超氧化物歧化酶(SOD，例如SOD-1)，或者针对ALS或帕金森病神经的营养因子，例如GDNF或IGF1。
在一个实施例中，本文描述的方法和材料可用于ALS的治疗。ALS是神经退行性疾病，导致脑和脊髓中的运动神经元进行性丧失，症状包括丧失说话、进食、运动和最终呼吸的能力。这种疾病通常在诊断后3-5年内导致死亡。虽然90％-95％的ALS病因不明，但部分ALS是由超氧化物歧化酶1(SOD1)基因突变引起的，其中突变导致毒性显性功能获得。小鼠研究表明，SOD1基因敲除不会导致疾病，因此，敲低突变SOD1水平的疗法被认为可以减轻疾病症状。
在一些实施例中，AAV载体编码针对ALS的靶向SOD1的shRNA。在WO 2015031392和US 2016272976(其内容全部并入于此)中提供了编码SOD1的shRNA的示例性AAV，例如scAAV9构建体。在一些实施例中，可以使用本文公开的方法制备编码SOD1的shRNA的AAV构建体。在一些实施例中，这些AAV构建体可用于治疗ALS。在一些实施例中，SOD1 AAV表现出少于10％，例如少于7％、5％、4％、3％、2％或1％的空衣壳。在一些实施例中，SOD1 AAV表现出低量的残余宿主细胞蛋白、宿主细胞DNA、质粒DNA和/或内毒素，例如本文讨论的用于制备和纯化AAV载体的水平。如本文所用，“AVXS-301”是scAAV9载体的非限制性实例，即，包含编码抗人SOD1 shRNA的多核苷酸(例如pSOD1sh)、经修饰的AAV2 ITR、人H1启动子和未经修饰的AAV2 ITR。经修饰的和未经修饰的ITR可以相对于抗人SOD1 shRNA表达盒以任一方向(即5’或3’)出现。
如本文所用，“pSOD1sh”载体质粒包含编码靶向超氧化物歧化酶1(SOD1)基因表达的短发夹RNA(shRNA)的多核苷酸，即抗SOD1 shRNA盒，其中所述盒的侧翼是腺相关病毒反向末端重复序列(ITR)，例如编码pSOD1sh的多核苷酸的“左”和“右”。在一些实施例中，编码pSOD1sh的多核苷酸转录成特异性靶向人SOD1 mRNA的短发夹RNA。在一些实施例中，围绕编码pSOD1sh的多核苷酸的ITR序列是天然的、变异的或经修饰的AAV ITR序列。在一些实施例中，至少一个ITR序列是天然的、变异的或经修饰的AAV2 ITR序列。在一些实施例中，ITR位于编码pSOD1sh的多核苷酸的侧翼。在一些实施例中，两个ITR序列都是天然的、变异的或经修饰的AAV2 ITR序列。在一些实施例中，“左”ITR是允许产生自互补基因组的经修饰的AAV2ITR序列，而“右”ITR是天然的AAV2 ITR序列。在一些实施例中，“右”ITR是允许产生自互补基因组的经修饰的AAV2 ITR序列，而“左”ITR是天然的AAV2 ITR序列。在一些实施例中，pSOD1sh载体还包括人H1 RNA启动子的片段，例如，如Myslinksi所述。Myslinkski等人“Anunusually compact external promoter for RNA polymerase III transcription ofthe human H1RNA gene.[人类H1RNA基因的RNA聚合酶III转录的异常紧凑的外部启动子]”Nucleic Acids Research[核酸研究],29(12):2502-2509。在一些实施例中，pSOD1sh载体还包含由随机质粒骨架的片段制成的独特填充序列，以增加表达盒的大小。在一些实验中，pSOD1sh载体包含编码抗人SOD1 shRNA的多核苷酸、经修饰的AAV2 ITR、人H1启动子和未经修饰的AAV2 ITR。
在一个实施例中，本文所述的方法和材料可用于治疗神经发育障碍，例如雷特综合征。雷特综合征是一种罕见的神经系统疾病，在婴儿期首次被发现，90％-95％的病例是由X染色体上的MECP2基因突变引起的。Ruthie等人,“Rett syndrome is caused bymutations in X-linked MECP2,encoding methyl-CpG-binding protein 2.[雷特综合征是由X连锁的编码甲基CpG结合蛋白2的MECP2突变引起的]”Nature Genetics[自然遗传学],23:185-188。只有一个X染色体拷贝的男孩通常在出生后不久死亡，而拥有两个X染色体拷贝的女孩通常拥有一个功能性基因拷贝。他们在6-18月龄之间开始出现症状，有标志性的症状，如手拧或挤压、拍手、摩擦、洗手、或手对嘴运动。这种疾病是进行性的，伴有严重的残疾，可包括类似自闭症的行为、呼吸不规律、进食和吞咽困难、生长迟缓和癫痫发作。已知MECP2基因有200种突变，并且取决于X失活和剂量补偿的水平，疾病的严重程度因患者而异。小鼠研究表明，MECP2突变不会导致神经元死亡，提示它不是神经退行性障碍。Guy等人,“Reversal of Neurological Defects in a Mouse Model of Rett Syndrome.[逆转雷特综合征小鼠模型中的神经系统缺陷]”Science[科学],315(5815)”1143-1147。
对于与雷特综合征相关的实施例，rAAV(例如rAAV9)基因组可编码例如甲基胞嘧啶结合蛋白2(MeCP2)。在美国专利号9,415,121(其内容全部并入本文)中提供了示例性AAV，例如scAAV9(包含编码MeCP2的多核苷酸的构建体)。在一些实施例中，包含编码MeCP2的多核苷酸的AAV构建体可使用本文公开的方法制备。在一些实施例中，这些AAV构建体可用于治疗雷特综合征。在一些实施例中，MeCP2 AAV表现出少于10％，例如少于7％、5％、4％、3％、2％或1％的空衣壳。在一些实施例中，MeCP2 AAV表现出低量的残余宿主细胞蛋白、宿主细胞DNA、质粒DNA和/或内毒素，例如本文讨论的用于制备和纯化AAV载体的水平。
如本文所用，“AVXS-201”是scAAV9载体的非限制性实例，即，包含多核苷酸(例如pMECP2)，所述多核苷酸包含MECP2 cDNA表达盒、经修饰的AAV2 ITR、鼠Mecp2启动子、经修饰的SV40内含子、最小聚腺苷酸化信号和未经修饰的AAV2 ITR。经修饰的和未经修饰的ITR可以相对于MECP2 cDNA表达盒以任一方向(即5’或3’)出现。
如本文所用，“pMECP2”载体质粒包含编码MECP2蛋白的多核苷酸、经修饰的AAV2ITR、鼠Mecp2启动子、经修饰的SV40内含子、最小聚腺苷酸化信号和未经修饰的AAV2 ITR。在一些实施例中，pMECP2是包含编码MECP2蛋白的多核苷酸(即MECP2 cDNA表达盒，其中所述盒的侧翼是腺相关病毒反向末端重复序列(ITR)，例如编码MECP2基因的多核苷酸的“左”和“右”)的载体构建体。在一些实施例中，编码MECP2的多核苷酸是人MECP2序列，例如天然存在的人MECP2序列或其同种型、变体或突变体。在一些实施例中，ITR序列是天然的、变异的或经修饰的AAV ITR序列。在一些实施例中，至少一个ITR序列是天然的、变异的或经修饰的AAV2 ITR序列。在一些实施例中，两个ITR序列都是天然的、变异的或经修饰的AAV2 ITR序列。在一些实施例中，“左”ITR是允许产生自互补基因组的经修饰的AAV2 ITR序列，而“右”ITR是天然的AAV2 ITR序列。在一些实施例中，“右”ITR是允许产生自互补基因组的经修饰的AAV2 ITR序列，而“左”ITR是天然的AAV2 ITR序列。在一些实施例中，pMECP2载体还包括小鼠Mecp2启动子的片段，但不包括全部。在一些实施例中，pMECP2载体还包括猿猴病毒40(SV40)内含子。在一些实施例中，pMECP2载体还包括最小聚腺苷酸化信号，例如，如Levitt等人,“Definition of an efficient synthetic poly(A)site.[有效的合成聚(A)位点的定义]”Genes&Development[基因与发育],3:1019-1025所定义的。
在一些实施例中，本文公开的rAAV基因组缺少AAV rep和cap DNA。rAAV基因组中的AAV DNA(例如ITR)可以来自可衍生重组病毒的任何AAV血清型，其包括但不限于AAV血清型AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10和AAV-11。AAV血清型的基因组的核苷酸序列是已知的。例如，AAV-1的完整基因组在GenBank登录号NC_002077中提供；AAV-2的完整基因组在GenBank登录号NC 001401和Srivastava等人,Virol.[病毒学],45:555-564{1983)中提供：AAV-3的完整基因组在GenBank登录号NC_1829中提供；AAV-4的完整基因组在GenBank登录号NC_001829中提供；AAV-5基因组在GenBank登录号AF085716中提供；AAV-6的完整基因组在GenBank登录号NC_00 1862中提供；AAV-7和AAV-8基因组的至少一部分分别在GenBank登录号AX753246和AX753249中提供；AAV-9基因组在Gao等人,J.Virol.[病毒学杂志],78:6381-6388(2004)中提供；AAV-10基因组在Mol.Ther.[分子疗法],13(1):67-76(2006)中提供；并且AAV-11基因组在Virology[病毒学],330(2):375-383(2004)中提供。
如本文所用，“pSMN”载体质粒包含编码SMN蛋白的多核苷酸，即SMN cDNA表达盒，其中所述盒的侧翼是腺相关病毒反向末端重复序列(ITR)，例如编码SMN基因的多核苷酸的“左”和“右”。在一些实施例中，编码SMN的多核苷酸是人SMN序列，例如天然存在的人SMN序列或其同种型、变体或突变体。在一些实施例中，ITR序列是天然的、变异的或经修饰的AAVITR序列。在一些实施例中，至少一个ITR序列是天然的、变异的或经修饰的AAV2 ITR序列。在一些实施例中，两个ITR序列都是天然的、变异的或经修饰的AAV2 ITR序列。在一些实施例中，“左”ITR是允许产生自互补基因组的经修饰的AAV2 ITR序列，而“右”ITR是天然的AAV2 ITR序列。在一些实施例中，“右”ITR是允许产生自互补基因组的经修饰的AAV2 ITR序列，而“左”ITR是天然的AAV2 ITR序列。在一些实施例中，pSMN质粒还包含CMV增强子/鸡β-肌动蛋白(“CB”)启动子。在一些实施例中，pSMN质粒还包含猿猴病毒40(SV40)内含子。在一些实施例中，pSMN质粒还包含牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化(聚A)终止信号。可用于上述组件中的一个或多个的示例性序列显示在下面的表1中。在一些实施例中，使用下面表1中所示的所有序列。在一些实施例中，“AVXS-101”是使用表1中的所有序列并落入术语pSMN的范围内的载体构建体的非限制性实例。
在一些实施例中，pSMN载体可包含SMN cDNA表达盒、经修饰的AAV2 ITR、鸡β-肌动蛋白(CB)启动子、巨细胞病毒(CMV)即刻/早期增强子、经修饰的SV40晚期16s内含子、牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化信号和未经修饰的AAV2 ITR。经修饰的和未经修饰的ITR可以相对于SMN cDNA表达盒以任一方向(即5’或3’)出现。
在一些实施例中，例如，在本文所述的制造过程中，载体构建体序列被包封入例如AAV9病毒粒子中。在这些实施例中，包封是在非复制型重组AAV9衣壳中，其能够递送稳定的功能性转基因，例如全功能人SMN转基因、MECP2转基因或抗SOD1 shRNA。在一些实施例中，衣壳由60个病毒蛋白(VP1、VP2、VP3)以例如通过交替剪接产生的1:1:10的比例构成，所述交替剪接使得VP2和VP3是VP1的两种截短形式，都具有共同的C-末端序列。在一些实施例中，所述制造工艺的产物，例如药物产品，可包含非复制型重组AAV9衣壳，以递送稳定的全功能人SMN转基因、MECP2转基因或抗SOD1 shRNA。在一些实施例中，衣壳由60个病毒蛋白(VP1、VP2、VP3)以通过交替剪接产生的1:1:10的比例构成，所述交替剪接使得VP2和VP3是VP1的两种截短形式，都具有共同的C-末端序列。
在一些实施例中，功能性病毒载体的量通过使用合适的体外细胞测定或体内动物模型测量的功能性vg/mL的％来确定。例如，可以通过使用SMA的动物模型(例如，SMAΔ7小鼠)情况下的相对效力或使用合适的细胞系(例如，分离自SMAΔ7小鼠皮层的原代神经祖细胞(NPC))的基于细胞的定量测定来测定功能性AAV SMN的％。可使用合适的体外细胞测定或体内动物模型(例如Mecp2敲除小鼠)来测定功能性AAV MeCP2的％。可使用合适的体外细胞测定或体内动物模型(例如SOD1突变小鼠)来测定功能性AAV SOD1的％。
示例性载体构建体例如AVXS-101的DNA序列描述在表1中。
表1：AVXS-101载体构建体DNA序列总结性组件(所有nt起始和终止位置与SEQ IDNO:1有关)。
Figure BDA0002574379020000341
另一方面，AVXS-101载体构建体的DNA序列在以下中提供：SEQ ID NO:1：
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg 50
ggcgaccttt ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg 100
gagtggaatt cacgcgtgga tctgaattca attcacgcgt ggtacctctg 150
gtcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga 200
cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa 250
tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc 300
cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga 350
cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct 400
tatgggactt tcctacttgg cagtacatct actcgaggcc acgttctgct 450
tcactctccc catctccccc ccctccccac ccccaatttt gtatttattt 500
attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg ggggggggcg 550
cgcgccaggc ggggcggggc ggggcgaggg gcggggcggg gcgaggcgga 600
gaggtgcggc ggcagccaat cagagcggcg cgctccgaaa gtttcctttt 650
atggcgaggc ggcggcggcg gcggccctat aaaaagcgaa gcgcgcggcg 700
ggcgggagcg ggatcagcca ccgcggtggc ggcctagagt cgacgaggaa 750
ctgaaaaacc agaaagttaa ctggtaagtt tagtcttttt gtcttttatt 800
tcaggtcccg gatccggtgg tggtgcaaat caaagaactg ctcctcagtg 850
gatgttgcct ttacttctag gcctgtacgg aagtgttact tctgctctaa 900
aagctgcgga attgtacccg cggccgatcc accggtccgg aattcccggg 950
atatcgtcga cccacgcgtc cgggccccac gctgcgcacc cgcgggtttg 1000
ctatggcgat gagcagcggc ggcagtggtg gcggcgtccc ggagcaggag 1050
gattccgtgc tgttccggcg cggcacaggc cagagcgatg attctgacat 1100
ttgggatgat acagcactga taaaagcata tgataaagct gtggcttcat 1150
ttaagcatgc tctaaagaat ggtgacattt gtgaaacttc gggtaaacca 1200
aaaaccacac ctaaaagaaa acctgctaag aagaataaaa gccaaaagaa 1250
gaatactgca gcttccttac aacagtggaa agttggggac aaatgttctg 1300
ccatttggtc agaagacggt tgcatttacc cagctaccat tgcttcaatt 1350
gattttaaga gagaaacctg tgttgtggtt tacactggat atggaaatag 1400
agaggagcaa aatctgtccg atctactttc cccaatctgt gaagtagcta 1450
ataatataga acagaatgct caagagaatg aaaatgaaag ccaagtttca 1500
acagatgaaa gtgagaactc caggtctcct ggaaataaat cagataacat 1550
caagcccaaa tctgctccat ggaactcttt tctccctcca ccacccccca 1600
tgccagggcc aagactggga ccaggaaagc caggtctaaa attcaatggc 1650
ccaccaccgc caccgccacc accaccaccc cacttactat catgctggct 1700
gcctccattt ccttctggac caccaataat tcccccacca cctcccatat 1750
gtccagattc tcttgatgat gctgatgctt tgggaagtat gttaatttca 1800
tggtacatga gtggctatca tactggctat tatatgggtt ttagacaaaa 1850
tcaaaaagaa ggaaggtgct cacattcctt aaattaagga gaaatgctgg 1900
catagagcag cactaaatga caccactaaa gaaacgatca gacagatcta 1950
gaaagcttat cgataccgtc gactagagct cgctgatcag cctcgactgt 2000
gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg cccctccccc gtgccttcct 2050
tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa 2100
attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt 2150
ggggcaggac agcaaggggg aggattggga agacaatagc aggcatgctg 2200
gggagagatc gatctgagga acccctagtg atggagttgg ccactccctc 2250
tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaaag gtcgcccgac 2300
gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag 2350
ggagtggcc 2359(SEQ ID NO:1)。
在一些实施例中，由pSMN质粒编码的SMN蛋白的氨基酸序列包含：
MAMSSGGSGGGVPEQEDSVLFRRGTGQSDDSDIWDDTALIKAYDKAVASFKHALKNGDICETSGKPKTTPKRKPAKKNKSQKKNTAASLQQWKVGDKCSAIWSEDGCIYPATIASIDFKRETCVVVYTGYGNREEQNLSDLLSPICEVANNIEQNAQENENESQVSTDESENSRSPGNKSDNIKPKSAPWNSFLPPPPPMPGPRLGPGKPGLKFNGPPPPPPPPPPHLLSCWLPPFPSGPPIIPPPPPICPDSLDDADALGSMLISWYMSGYHTGYYMGFRQNQKEGRCSHSLN(SEQ ID NO:2)。
在一些实施例中，AAV衣壳蛋白VP1、VP2、VP3衍生自相同的转录物。它们有可替代的起始位点，但共享羧基末端。下面，VP1特异性氨基酸序列以黑色并且粗体显示。VP1和VP2共有的氨基酸序列用下划线并且斜体表示。所有三种衣壳蛋白共有的氨基酸以粗体并且斜体表示。
Figure BDA0002574379020000361
Figure BDA0002574379020000371
在一个实施例中，AAV衣壳蛋白衍生自编码SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列的转录物。
在另一方面，本文公开了包含rAAV基因组的DNA质粒。将DNA质粒转移至允许被AAV的辅助病毒(例如，腺病毒，E1缺失的腺病毒或疱疹病毒)感染的细胞，以将rAAV基因组用AAV9衣壳蛋白组装成感染性病毒颗粒。用于产生rAAV颗粒的技术(其中向细胞提供待包装的AAV基因组、rep和cap基因以及辅助病毒功能)在本领域是标准的。在一些实施例中，rAAV的产生涉及单个细胞(在本文中称为包装细胞)内存在的以下组分：rAAV基因组、与rAAV基因组分开(即不在rAAV基因组中)的AAV rep和cap基因、以及辅助病毒功能。假型rAAV的产生披露于例如WO 01/83692中，将其通过引用以其整体并入本文。在各种实施例中，可以修饰AAV衣壳蛋白以增强重组载体的递送。衣壳蛋白的修饰在本领域中是公知的。参见，例如，US 2005/0053922和US2009/0202490，其公开内容全部通过引用结合于此。
rAAV生产的一般原理综述于例如Carter,1992,Current Opinions inBiotechnology,1533-539；和Muzyczka,1992,CUM Topics in Microbial.and Immunol.,158:97-129)。多种方法描述于以下文献中：Ratschin等人,Mol.Cell.Biol.[分子和细胞生物学]4:2072(1984)；Hennonat等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],81:6466(1984)；Tratschin等人,Mol.Cell.Biol.[分子和细胞生物学]5:3251(1985)；McLaughlin等人,J.Virol.[病毒学杂志],62:1963(1988)；和Lebkowski等人,1988Mol.Cell.Biol.[分子和细胞生物学],7:349(1988)。Samulski等人(1989,J.Virol.[病毒学杂志],63:3822-3828)；美国专利号5,173,414；WO 95/13365和对应的美国专利号5,658,776；WO 95/13392；WO 96/17947；PCT/US98/18600；WO 97/09441(PCT/US96/14423)；WO 97/08298(PCT/US96/13872)；WO 97/21825(PCT/US96/20777)；WO 97/06243(PCT/FR96/01064)；WO 99/11764；Perrin等人(1995)Vaccine[疫苗]13:1244-1250；Paul等人(1993)Human Gene Therapy[人类基因疗法]4:609-615；Clark等人(1996)Gene Therapy[基因疗法]3:1124-1132；美国专利号5,786,211；美国专利号5,871,982；和美国专利号6,258,595。将前述文件通过引用以其整体特此并入本文，特别强调的是文件中与rAAV产生有关的那些部分。
生成包装细胞的示例性方法是产生对于AAV颗粒产生而言，稳定表达所有必需组分的细胞系。例如，将包含以下项的质粒(或多个质粒)整合到细胞的基因组中：缺少AAVrep和cap基因的rAAV基因组、与rAAV基因组分开的AAV rep和cap基因、以及选择性标记(例如新霉素耐药性基因)。AAV基因组已通过程序如GC加尾(Samulski等人,1982,Proc.Natl.Acad.S6.USA[美国国家科学院院刊S6],79:2077-2081)、添加含有限制性内切核酸酶切割位点的合成接头(Laughlin等人,1983,Gene[基因],23:65-73)或通过直接的平端连接(Senapathy和Carter,1984,J.Biol.Chem.[生物化学杂志],259:4661-4666)而被引入细菌质粒中。然后用辅助病毒(如腺病毒)感染包装细胞。此方法的优点是，细胞是可选择的，并且适合rAAV的大规模生产。适合的方法的其他实例采用了腺病毒或杆状病毒而不是质粒来将rAAV基因组和/或rep和cap基因引入包装细胞中。
因此，本文的公开在各种实施例中提供了产生感染性rAAV的包装细胞。包装细胞可以是悬浮培养的非粘附细胞，也可以是粘附细胞。在一个实施例中，可以使用任何合适的包装细胞系，例如HeLa细胞、HEK 293细胞和PerC.6细胞(同源的293细胞系)。在一个实施例中，细胞系是HEK 293细胞。
为了增加病毒载体生产产量，可培养和选择粘附细胞以改善对培养瓶的粘附。在一些实施例中，在随后的生物反应器接种步骤期间提高转染效率和细胞计数。在继代培养期间，可以通过本领域已知的方法将细胞从细胞培养表面分离。例如，可以通过刮除或通过在包含蛋白酶的溶液中孵育来浮起细胞。在一个示例性实施例中，HEK293细胞可在室温下用PBS洗涤并用胰蛋白酶解离约2分钟。通过添加含有血清的生长培养基可以终止解离，并且细胞团可以通过反复吸移悬浮液而解离。然后，细胞悬浮液可以沉淀，分离的沉淀可以重新悬浮在合适的完全生长培养基中。然后可将细胞接种到新的细胞培养室中，并允许其粘附。在用生长培养基完全替换细胞培养基之前，可以用细胞培养基轻轻抽吸去除在一段时间后没有粘附在表面上的细胞。在一些实施例中，允许细胞粘附的时间段可以是约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时或约7小时。当细胞扩增后，可重复该过程以增加强烈粘附在培养瓶上的细胞的比例。在一些实施例中，所述过程被重复至少2次、至少3次、至少4次、至少5次或任何合适次数。在示例性实施例中，将HEK293细胞接种在75cm2烧瓶中，在通过抽吸去除弱粘附细胞并替换细胞培养基之前，允许其在37℃培养箱中粘附4小时。在示例性实施例中，选择强粘附细胞的过程重复三个细胞培养传代。
在其他实施例中，rAAV9(即，感染性的包封的rAAV9颗粒)包含本文公开的rAAV基因组。在一个方面，rAAV基因组是自身互补基因组。
在另一方面，提供了rAAV，例如名为“rAAV SMN”的rAAV9。在一些实施例中，rAAVSMN基因组在序列中具有第一AAV2 ITR、带有巨细胞病毒增强子的鸡β肌动蛋白启动子、SV40内含子、编码SMN的多核苷酸、来自牛生长激素的聚腺苷酸化信号序列和第二AAV2ITR。在一些实施例中，编码SMN的多核苷酸是人SMN基因，例如在以下中阐述或衍生自以下：GenBank登录号MN_000344.2、GenBank登录号#NM_017411，或任何其他合适的人SMN同种型。示例性SMN序列包括以下序列：
1 CCACAAATGT GGGAGGGCGA TAACCACTCG TAGAAAGCGT GAGAAGTTAC TACAAGCGGT
61 CCTCCCGGCC ACCGTACTGT TCCGCTCCCA GAAGCCCCGG GCGGCGGAAG TCGTCACTCT
121 TAAGAAGGGA CGGGGCCCCA CGCTGCGCAC CCGCGGGTTT GCTATGGCGA TGAGCAGCGG
181 CGGCAGTGGT GGCGGCGTCC CGGAGCAGGA GGATTCCGTG CTGTTCCGGC GCGGCACAGG
241 CCAGAGCGAT GATTCTGACA TTTGGGATGA TACAGCACTG ATAAAAGCAT ATGATAAAGC
301 TGTGGCTTCA TTTAAGCATG CTCTAAAGAA TGGTGACATT TGTGAAACTT CGGGTAAACC
361 AAAAACCACA CCTAAAAGAA AACCTGCTAA GAAGAATAAA AGCCAAAAGA AGAATACTGC
421 AGCTTCCTTA CAACAGTGGA AAGTTGGGGA CAAATGTTCT GCCATTTGGT CAGAAGACGG
481 TTGCATTTAC CCAGCTACCA TTGCTTCAAT TGATTTTAAG AGAGAAACCT GTGTTGTGGT
541 TTACACTGGA TATGGAAATA GAGAGGAGCA AAATCTGTCC GATCTACTTT CCCCAATCTG
601 TGAAGTAGCT AATAATATAG AACAGAATGC TCAAGAGAAT GAAAATGAAA GCCAAGTTTC
661 AACAGATGAA AGTGAGAACT CCAGGTCTCC TGGAAATAAA TCAGATAACA TCAAGCCCAA
721 ATCTGCTCCA TGGAACTCTT TTCTCCCTCC ACCACCCCCC ATGCCAGGGC CAAGACTGGG
781 ACCAGGAAAG CCAGGTCTAA AATTCAATGG CCCACCACCG CCACCGCCAC CACCACCACC
841 CCACTTACTA TCATGCTGGC TGCCTCCATT TCCTTCTGGA CCACCAATAA TTCCCCCACC
901 ACCTCCCATA TGTCCAGATT CTCTTGATGA TGCTGATGCT TTGGGAAGTA TGTTAATTTC
961 ATGGTACATG AGTGGCTATC ATACTGGCTA TTATATGGGT TTCAGACAAA ATCAAAAAGA
1021 AGGAAGGTGC TCACATTCCT TAAATTAAGG AGAAATGCTG GCATAGAGCAGCACTAAATG
1081 ACACCACTAA AGAAACGATC AGACAGATCT GGAATGTGAA GCGTTATAGAAGATAACTGG
1141 CCTCATTTCT TCAAAATATC AAGTGTTGGG AAAGAAAAAA GGAAGTGGAATGGGTAACTC
1201 TTCTTGATTA AAAGTTATGT AATAACCAAA TGCAATGTGA AATATTTTACTGGACTCTTT
1261 TGAAAAACCA TCTGTAAAAG ACTGGGGTGG GGGTGGGAGG CCAGCACGGTGGTGAGGCAG
1321 TTGAGAAAAT TTGAATGTGG ATTAGATTTT GAATGATATT GGATAATTATTGGTAATTTT
1381 ATGGCCTGTG AGAAGGGTGT TGTAGTTTAT AAAAGACTGT CTTAATTTGCATACTTAAGC
1441 ATTTAGGAAT GAAGTGTTAG AGTGTCTTAA AATGTTTCAA ATGGTTTAACAAAATGTATG
1501 TGAGGCGTAT GTGGCAAAAT GTTACAGAAT CTAACTGGTG GACATGGCTGTTCATTGTAC
1561 TGTTTTTTTC TATCTTCTAT ATGTTTAAAA GTATATAATA AAAATATTTAATTTTTTTTT
1621 A(SEQ ID NO:4)。
SMN DNA的保守核苷酸取代也是可以考虑的(例如，GenBank登录号NM_000344.2的位置625的鸟嘌呤到腺嘌呤的变化)。在一些实施例中，基因组均缺乏AAV rep和cap DNA，即在基因组的ITR之间不存在AAV rep或cap DNA。所考虑的SMN多肽包括但不限于NCBI蛋白质数据库编号NP_000335.1中列出的人SMN1多肽。在实施例中，SMN DNA包括编码人SMN多肽(例如由Uniprot登录号Q16637鉴定的人SMN蛋白，同种型1(Q16637-1))的多核苷酸。还考虑SMN1-修饰物多肽网素-3(PLS3)[Oprea等人,Science[科学]320(5875):524-527(2008)]。编码其他多肽的序列可以取代SMN DNA。
在转染前，细胞在合适的培养基中，在烧瓶或合适的生物反应器中(或在两者中)扩增。在一些实施例中，可以在提供细胞培养基连续循环的生物反应器中扩增细胞。在一个实施例中，细胞在200m2、333m2或500m2 iCELLis生物反应器中扩增。一种培养基为含5％-10％FBS、4.5g/L葡萄糖、4mM L-谷氨酰胺的DMEM。在一些实施例中，将粘附细胞添加到再循环培养基袋中的培养基中，并循环通过生物反应器。在一些实施例中，使用蠕动泵使细胞培养基或任何其他培养基连续地再循环通过生物反应器。细胞可以适当的密度接种在烧瓶或生物反应器中，用于培养和转染。接种密度可以取决于细胞类型和转染前的时间量。在一些实施例中，以约8000-16000个细胞/cm2接种细胞。在一个实施例中，以8000-12,000个细胞/cm2接种HEK293细胞。
用于转导并将转导的细胞重新引入受试者体内的合适方法是本领域已知的。在一个实施例中，可以通过以下方式对细胞进行体外转导：将rAAV与细胞组合(例如在适当的培养基中)，并使用常规技术诸如Southern印迹和/或PCR或通过使用可选标记来筛选那些携带感兴趣的DNA的细胞。
在一些实施例中，包装细胞系用三种质粒转染：编码或包含将被包装在AAV载体(例如，pSMN、pMECP2转基因或pSOD1sh)中的载体序列的质粒、pHELP和pAAV2/9。可以使用本领域已知的任何技术进行转染，包括但不限于电穿孔，脂质体转染，例如使用脂质体胺、阳离子聚合物和阳离子脂质。可以使用任何合适的转染培养基。在转染方法的一个实施例中，用三重DNA质粒聚乙烯亚胺(PEI)共沉淀转染粘附性人胚胎肾(HEK293)细胞。在一个实施例中，在大规模粘附细胞生物反应器中使用PEI共沉淀将三重DNA质粒转染到粘附HEK293细胞中来生产scAAV9.CB.SMN载体(自互补AAV9载体，其包含CB启动子和编码SMN的多核苷酸)。在一个实施例中，用经修饰的DMEM转染培养基代替用于细胞扩增的DMEM生长培养基。所述培养基不含钙和L-谷氨酰胺。在一个实施例中，转染培养基是不含FBS、不含钙、不含L-谷氨酰胺和4.5g/L葡萄糖的DMEM。在一些实施例中，不含血清(例如，不含FBS)的转染培养基提高了转染效率。在一个实施例中，转染培养基是OptiMEM(英杰公司(Invitrogen)/赛默飞世尔公司(Thermo Fisher))。在一个实施例中，将三种质粒(pSMN、pHELP和pAAV2/9)与PEI混合在转染培养基中并使其反应。在一些实施例中，三种质粒以约1:1:1的摩尔比例混合在一起。在一些实施例中，质粒和PEI按DNA:PEI的重量以1:1比例混合。在一些实施例中，质粒和PEI按DNA:PEI的重量以小于1:1的比例混合。在一个实施例中，pSMN、pHELP和pAAV2/9在OptiMEM培养基中以1:1:1的摩尔比例混合。在这样的实施例中，添加PEI使得DNA:PEI的重量比是1:1。在一些实施例中，允许反应发生0-60分钟、或10-45分钟、或20-30分钟。在一个实施例中，允许反应发生15-30分钟。
在一个实施例中，本公开提供了用于制造基于AAV的病毒载体的方法，所述方法包括以下步骤：(i)在工业规模生物反应器中培养粘附HEK293细胞；(2)用质粒转染粘附细胞少于60分钟以能够生产AAV载体；以及任选地应用进一步的处理、纯化、配制和填充步骤以生产药物产品。在该方法的一个实施例中，使用聚乙烯亚胺(“PEI”)共沉淀，使用三重DNA质粒转染生产scAAV9.CB.SMN载体。在一个实施例中，用于该转染的3个质粒是pSMN、pAAV2/9和pHELP。
转染可以通过使包装细胞系与DNA-PEI共沉淀物接触来进行。在一些实施例中，将转染培养基中的DNA-PEI共沉淀物填充到培养基再循环袋中。在一些实施例中，转染培养基中的DNA-PEI共沉淀物循环进入生物反应器并完全取代生长培养基。在一些实施例中，允许转染培养基中的DNA-PEI共沉淀物接触生物反应器中的粘附细胞。在一些实施例中，允许转染培养基中的DNA-PEI共沉淀物接触生物反应器中的粘附细胞达两小时。在一些实施例中，转染发生一至两小时。在一些实施例中，转染发生少于一小时，例如10分钟、20分钟、30分钟、40分钟或50分钟。在一些实施例中，转染发生一至两小时。在一些实施例中，通过使完全生长培养基再循环通过生物反应器并完全取代转染培养基来终止转染。
2.收获扩增的病毒颗粒
在转染后合适的细胞扩增期之后，在一些实施例中，细胞被裂解并收获病毒颗粒。在一些实施例中，在启动细胞裂解过程之前，将细胞从反应器解离。在一些实施例中，细胞原位裂解。任选地，在不裂解的情况下收获病毒颗粒。在一些实施例中，添加核酸内切酶，例如循环到生物反应器中至最终目标浓度。核酸内切酶是可以降解DNA和RNA的核酸内切酶。在一个实施例中，核酸内切酶是来自粘质沙雷氏菌的经基因工程改造的核酸内切酶(Eaves,G.N.等人J.Bact.[细菌学杂志]1963,85,273-278；Nestle,M.等人J.Biol.Chem.[生物化学]1969,244,5219-5225)，其以名称
Figure BDA0002574379020000431
商售(EMD密理博公司(EMDMillipore))。所述酶从大肠杆菌菌株W3110(菌株K12的突变体)生产和纯化，所述菌株含有pNUC1生产质粒(美国专利号5,173,418，将其通过引用以其整体并入本文)。在结构上，所述蛋白是245个氨基酸的约30kDa的相同亚基的二聚体，其中带有两个重要的二硫键。
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降解所有形式的DNA和RNA(单链、双链、线性和环状)并且在广泛的操作条件下有效，将核酸消化为长度为2-5个碱基的5'-单磷酸端基寡核苷酸。
Figure BDA0002574379020000433
是根据现行的良好制造规范(cGMP)生产的，因此可用于蛋白质和/或病毒颗粒纯化的工业规模方法。在cGMP条件下生产的其他核酸内切酶同样可用于本申请公开的纯化方法中。在一个实施例中，将benzonase添加到生物反应器中至50-200U/ml，例如75-150U/ml，例如约100U/mL的最终浓度。在一些实施例中，添加Benzonase显著减少宿主细胞DNA，同时允许在生物反应器中产生高vg。
在一些实施例中，在将裂解缓冲液加入反应器之前，允许核酸内切酶混合。在一些实施例中，允许细胞裂解溶液与粘附细胞混合多达1小时、多达2小时、多达3小时、多达4小时或多达5小时。在一些实施例中，裂解缓冲液可包含在合适缓冲液中的氯化镁和/或吐温-20。在示例性实施例中，裂解缓冲液为500mM HEPES、10％吐温20、20mM MgCl2，pH 8.0。可以添加淬灭Benzonase反应的盐蔗糖溶液(SSS)以终止裂解反应。在一些实施例中，将SSS添加到包括漂洗缓冲液的收获袋中并混合15分钟。在一些实施利中，用生物反应器漂洗缓冲液漂洗生物反应器，然后将漂洗液与猝灭的细胞裂解溶液和裂解的细胞内容物(所有这些一起构成批量收获物)一起收集在收获物收集袋中。在一些实施例中，生物反应器漂洗缓冲液可包含Tris、MgCl2、NaCl、吐温-20和蔗糖。在一个示例性实施例中，生物反应器漂洗缓冲液包含20mM Tris、1mM MgCl2、500mM NaCl、1％吐温-20w/v和1％蔗糖w/v(pH 8.1)。
3.纯化病毒颗粒
收获后，可以浓缩和纯化(典型地通过过滤)批量收获的病毒颗粒。在一个实施例中，通过深度过滤然后通过过滤器过滤来过滤病毒颗粒，所述过滤器去除大分子污染物和细胞碎片，例如0.45μm过滤器，但允许载体基因组通过。可以使用任何合适的深度过滤器。
如本领域所理解的，深度过滤是指使用多孔过滤介质澄清含有大量大颗粒(例如，完整细胞或细胞碎片)的溶液，这是与在这种条件下会迅速变得堵塞的膜过滤相比。不同孔径的各种深度过滤培养基可从各个制造商如密理博公司(Millipore)、颇尔公司(Pall)，通用电气公司(General Electric)和赛多利斯公司(Sartorious)商购。
可降低深度过滤的目标流动速率，以使过滤器入口压力保持在规定范围内。在某些实施例中，一旦过滤了所有的批量收获物，深度过滤器就可以被用于随后的第一切向流过滤步骤(“TFF1”)的渗滤缓冲液追洗。深度过滤器池是混合的。然后，深度过滤器池可通过0.45μm过滤器过滤，以进一步澄清批量收获材料。然后利用TFF1缓冲液对0.45μm过滤器进行追洗。
4.切向流过滤
在各种实施例中，切向流过滤用于浓缩批量收获物，并去除盐和蛋白质，例如使用切向流过滤。切向流过滤(TFF)(也称为交叉流过滤CFF)对于本领域技术人员来说是公知的，并且用于在广泛的情况下实施其的设备和方案可从多个制造商来商购获得，这些制造商包括但不限于纽约州华盛顿港(Port Washington)的颇尔公司(Pall Corporation)和加利福尼亚州多明格兹兰乔(Rancho Dominguez)的光谱实验室(Spectrum Labs)。通常，TFF可涉及截留物跨膜表面的再循环。在某些实施例中，这种平缓的横流进料可以使膜污染最小化，保持高过滤速率，并提供高产品回收率。在一个实施例中，TFF步骤可以用平板系统来实现，如本文所例示的。平板系统可用于大规模生产中，其中所述系统具有防止病毒颗粒上的过大剪切力的装置(例如，开放的流动通道)。可替代地，TFF步骤可以用中空光纤系统来实现，如本文所例示的。在一个实施例中，TFF系统的截留分子量(MWCO)在200-400kDa之间，例如约300kDa。
在一个实施例中，TFF1步骤使用300kDa MW截留值的再生纤维素膜盒进行。用NaOH溶液冲洗和消毒盒，并用TFF1缓冲液平衡。在一个实施例中，TFF1缓冲液包含20mM Tris、1mM MgCl2、500mM NaCl、1％蔗糖，pH 8.1。
在一些实施例中，TFF1步骤的浓缩阶段被选择为将澄清收获物的体积减小约10x。一旦达到目标滞留物体积，可开始渗滤操作。在一些实施例中，可以用约6个渗滤体积的TFF1缓冲液渗滤所述滞留物。在一些实施例中，用约5-20、或10-15、或12个渗滤体积的TFF1缓冲液渗滤所述渗余物。一旦已经达到6个渗滤体积的渗透总流量，可再次浓缩并收集滞留物。可执行漂洗，例如膜的两次连续漂洗，以增加中间原料药的产物回收率。
5.中间产物
在一些实施例中，中间原料药然后可以在干冰上或在冷冻箱中冷冻，并且然后转移到<-60℃存储。在其他实施例中，在下游工艺之前不需要冷冻中间产物。
在一些实施例中，将多个中间产物物质批次池化在一起用于进一步处理(例如，用于通过下游工艺进行纯化，例如，如本文所述)。所述多个中间产物物质批次可在冷冻和储存前池化。在其他实施例中，所述多个中间产物物质批次可在解冻冷冻和储存的批次之后池化。
下游工艺
在一些实施例中，使用下游工艺将中间产物(例如，池化的中间产物)加工成经过滤的原料药。在一些实施例中，下游工艺步骤包括：(a)酸化和澄清(例如使用过滤)，(b)阳离子交换色谱，(c)切向流过滤(“TFF2”)，(d)CsCl超速离心，(e)收集病毒载体和(f)进一步切向流过滤(“TFF3”)以产生经过滤的原料药，其中纯化的AAV颗粒悬浮在药学上可接受的载体中。在一些实施例中，下游工艺包含在TFF1中间体生产之后的以下制造步骤：解冻并且池化TFF1中间体、酸化和澄清、阳离子交换色谱(CEX)、切向流过滤(TFF2)、用于全/空衣壳分离的CsCl超速离心、用于浓缩/缓冲交换的切向流过滤(TFF3)、TFF3池材料过滤以产生原料药、原料药稀释和过滤以产生药物产品、药物产品储存和药物产品填充到小瓶中。
在一些实施例中，本文公开的下游工艺可用于处理中间体，所述中间体包括如本文所述的AAV SMN、AAV MECP2或编码靶向SOD1的AAV shRNA。
1.中间体的酸化和澄清
在冷冻中间体的实施例中，下游工艺通过解冻TFF1中间体材料开始。洗涤剂，例如吐温20，可用于促进批量宿主细胞蛋白和DNA在酸性pH下的絮凝。然后可以降低含有洗涤剂的TFF1中间体的pH值。当pH降低时形成的絮凝物和沉淀物随后可通过深度过滤器和过滤器(其去除大分子污染物和细胞碎片，例如0.45μm过滤器，但允许载体基因组通过)过滤溶液来去除。可以使用任何合适的深度过滤器。
在一个实施例中，将吐温20缓慢地添加到TFF1中间体溶液中，以达到吐温20在10％-20％之间的最终浓度。在一些实施例中，添加吐温20后的目标组成是36％吐温20在20mM Tris、1mM MgCl2、500mM NaCl、1％蔗糖m/v中的溶液(pH 8.1)。在一些实施例中，吐温20经约1-6小时缓慢添加。在一些实施例中，经3-6小时缓慢添加吐温20。在一些实施例中，经4小时缓慢添加吐温20。在一些实施例中，允许吐温20/TFF1中间体溶液在室温下孵育过夜。在一些实施例中，使吐温20/TFF1中间体溶液在室温下孵育8-20小时。在示例性实施例中，使吐温20/TFF1中间体溶液在室温下孵育12-20小时。
孵育后，可通过添加任何合适的酸来降低含有TFF1中间体的吐温20的pH值。在一些实施例中，添加1M甘氨酸pH 2.5以实现3.5±0.1的目标pH。在一些实施例中，目标pH为pH3.0-4.0、约pH 3.3-3.7、约pH 3.4-3.6、或约pH 3.5。一旦pH值在可接受范围内，溶液可以通过任何尺寸的过滤器。在示例性实施例中，使用与0.45μm过滤器(例如，Opticap XL10Durapore过滤器)或0.8/0.45μm PES过滤器一致的深度过滤器(例如，Clarisolve POD)。
2.阳离子交换色谱法
在各种实施例中，使用阳离子交换(CEX)捕获色谱步骤，例如将病毒衣壳与宿主细胞蛋白、宿主细胞DNA、宿主细胞脂质、吐温20和其他工艺相关杂质分离。阳离子交换色谱的原理在本领域中是公知的，但是，简言之，该方法依赖于待分离的带正电的颗粒和所使用的带负电的树脂之间的电荷-电荷相互作用。一般情况下，首先通过运行通过少量渗滤体积的缓冲液使柱平衡，直到pH和电导率稳定。然后加载样品，并且用加载缓冲液洗涤柱。最后，使用洗脱缓冲液将目的样品从柱上洗脱下来，并收集含有级分的样品。目的样品的存在可以通过洗脱液的光学吸光度测量来检测。
在一个实施例中，CEX步骤使用CIMmultus S03-8000高级复合柱(磺酰基)(2μm孔)色谱柱。在一个实施例中，从OD280的急剧上升处开始收集洗脱峰。当电导率在80-85mS/cm之间时，OD280开始上升。CEX洗脱液可以按照常规程序收集，并且可以分成两个级分收集。在一个实施例中，第一级分在OD280的急剧上升处开始，并且收集1.5个柱体积(CV)。在另一个实施例中，第二级分紧接在第一级分之后开始，并收集1.0CV。池化两个级分，然后中和至pH 8.0±0.30。在一个实施例中，中和缓冲液包含1.0M Tris，在20℃下pH 9.1±0.1。
3.切向流过滤2
在一些实施例中，切向流过滤步骤(TFF2)用于浓缩，去除蛋白质杂质，并将缓冲液与合适的缓冲液交换，用于随后的CsCl超速离心步骤。可以使用任何合适的TFF膜。在一个实施例中，TFF2步骤利用300kD MWCO再生纤维素膜。
在一些实施例中，该步骤的浓缩阶段设计成减少CEX洗脱液的体积。在一个实施例中，用渗滤缓冲液将滞留物稀释2倍，并将滞留物浓缩至其初始体积。在一个实施例中，渗滤缓冲液是TFF2 NaCl渗滤缓冲液，其在20℃下包含20mM Tris、2mM MgCl2、150mM NaCl、0.2％泊洛沙姆188、1％蔗糖、pH 8.1±0.1。在这样的实施例中，可以重复该过程，直到用新缓冲液的渗滤完成。在一个实施例中，用含CsCl的渗滤缓冲液将滞留物稀释2倍，并将滞留物浓缩至其初始体积。在一个实施例中，含CsCl的渗滤缓冲液是TFF2 CsCl渗滤缓冲液，其在20℃下包含20mM Tris、2mM MgCl2、3M CsCl、0.2％泊洛沙姆188、pH 8.1±0.1。在这样的实施例中，可以重复该过程，直到用新缓冲液的渗滤完成。一旦CsCl渗滤完成，滞留物可随后浓缩到规定体积，这取决于系统滞留体积。在一些实施例中，执行漂洗，例如膜的两次连续漂洗，以最大化从TFF2系统中的产物回收。
4.CsCl超速离心
在AAV用于体内基因转导的一些实施例中，rAAV的最终产物可以包含最少的杂质和空颗粒。纯化AAV载体的两种方法是使用碘克沙醇梯度或CsCl梯度的超速离心。一项比较两种方法的研究表明，碘克沙醇获得的AAV载体具有更高的载体纯度，但与CsCl相比具有更多的空病毒衣壳。Strobel等人“Comparative Analysis of Cesium Chloride-andIodixanol-Based Purification of Recombinant Adeno-Associated Viral Vectorsfor Preclinical Applications[用于临床前应用的重组腺相关病毒载体的基于氯化铯和碘克沙醇的提纯的比较分析].”Human Gene Therapy Methods[人类基因治疗方法],26(4):147-157。尽管使用CsCl导致较少量的空病毒衣壳，但CsCl可能对细胞有毒性，并且可能需要多个纯化步骤来去除残余CsCl，与碘克沙醇等较短的方法(约1天)相比，导致较长的处理时间(约3.5天)。一项不同的研究表明，去除残余CsCl的许多步骤经常导致rAAV的急剧损失，导致低产量和回收率，常常抵消了所述方法的其他优点。Hermens等人“Purificationof Recombinant Adeno-Associated Virus by Iodixanol GradientUltracentrifugation Allows Rapid and Reproducible Preparation of VectorStocks for Gene Transfer in the Nervous System.[通过碘克沙醇梯度超速离心纯化重组腺相关病毒可以快速地可重复性地制备用于神经系统中基因转移的载体储备物]”Human Gene Therapy[人类基因疗法],10:1885-1891。此外，虽然这两种方法在实验室中很好地用于生产临床前样品，但它们不具有可扩展性，因此不适合大规模生产商业产品。参见例如Tomono等人,“Ultracentrifugation-free chromatography-mediated large-scalepurification of recombinant adeno-associated virus serotype 1(rAAV1)[无超速离心色谱介导的重组腺相关病毒血清型1(rAAV1)的大规模纯化].”Molecular Therapy-Methods&Clinical Development[分子疗法-方法与临床发展],3:15058(“purificationmethods using cesium chloride(CsCl)or iodixanol density ultracentrifugationare not suitable for large-scale production”[使用氯化铯(CsCl)或碘克沙醇密度超速离心的纯化方法不适合大规模生产])。
在一些实施例中，使用超速离心步骤，例如将空衣壳与全衣壳分离。出人意料的是，本文公开的CsCl超速离心方法是可扩展的，并且适合于大规模生产纯化的AAV载体。超速离心可通过分析型超速离心进行，并可涉及使用梯度缓冲液。梯度缓冲液的实例包括但不限于CsCl、蔗糖、碘克沙醇和本领域已知的其他梯度缓冲液。离心可以在任何能够达到所需g力的离心机中进行，例如自动Optima XPN 100超离心机系统或配备50.2Ti型转子或等效转子的等效系统。超速离心后，空衣壳和全衣壳在试管内分离进入不同的条带，并且可以从特定的条带中提取材料。在一些实施例中，TFF2纯化的过滤的材料在241,600-302,000g(在50.2Ti转子中约40,000-50,000rpm)下离心。在一些实施例中，将TFF2纯化的过滤的材料离心过夜。在一些实施例中，将TFF2纯化的过滤的材料离心16-24小时。在一些实施例中，将TFF2纯化的过滤的材料离心20-24小时。在一些实施例中，TFF2纯化的过滤的材料在15℃-25℃下离心。在一个实施例中，将TFF2纯化的过滤的材料在302,000g(在50.2Ti转子中50,000rpm)下在20℃下离心17小时。在一些实施例中，用于CsCl离心的缓冲液可具有以下成分中的一种或多种：包括(a)CsCl，还包括(b)MgCl2、(c)泊洛沙姆188和(d)Tris中的一种或多种。在一些实施例中，用于CsCl的缓冲液可以包括(a)、(b)、(c)和(d)中的所有。在一些实施例中，用于CsCl的缓冲液具有pH 7.5-8.5，或pH 7.9-8.2。在一个实施例中，用于CsCl离心的合适缓冲液是20mM Tris、2mM MgCl2、3M CsCl、0.2％泊洛沙姆188，pH 8.1±0.10。离心步骤完成后，可以从超速离心机中取出管。在一些实施例中，最高的条带，条带A，包含空衣壳。在一些实施例中，次高的条带，条带B、C和D包含全衣壳双带。在一些实施例中，使用注射器收集AAV病毒载体。在一个实施例中，条带B、C和D通过连接到30mL注射器的18G针头移除，注射器刚好插入条带D下方至管的中间。在其他实施例中，可以使用本领域已知的技术和/或本文所述的技术来分析条带是否存在全衣壳或空衣壳，并且收集含有全衣壳的条带。
空病毒衣壳与非空病毒衣壳的比率可以通过标准实验室技术来测量。在一些实施例中，测量通过光学吸光度测量来完成。在一些实施例中，测量通过UV吸光度测量来完成。在一些实施例中，衣壳蛋白的总量和DNA的总量可由UV吸光度测量确定。在一些实施例中，测量通过光学折射率测量来完成。在一些其他实施例中，通过分析型超速离心进行测量。
在一个实施例中，超速离心后收集的AAV病毒载体具有少于8％的空衣壳、少于7％的空衣壳、少于5％的空衣壳、少于3％的空衣壳、或少于1％的空衣壳。在一个实施例中，超速离心后收集的AAV病毒载体具有1％-10％的空衣壳。在一个实施例中，超速离心后收集的AAV病毒载体具有2％-8％的空衣壳。在一个实施例中，空衣壳的数量低于检测极限。在另一个实施例中，空衣壳的百分比被确定为总衣壳的百分比。
5.切向流过滤3，以产生过滤的原料药
在一些实施例中，切向流过滤步骤(TFF3)用于去除CsCl并浓缩全载体衣壳。切向流过滤可以使用合适的膜进行。在一个实施例中，使用300kDa MWCO的再生纤维素膜。载体衣壳可被膜保留。TFF3操作的浓缩阶段可以设计成降低残余CsCl的浓度和超速离心池的体积。在一些实施例中，一旦达到目标滞留物体积，就开始渗滤。用多达10个渗滤体积的合适的TFF3缓冲液渗滤所述滞留物。在一个实施例中，合适的TFF3缓冲液可包括以下组分中的一种或多种，所述组分包含(a)Tris，(b)MgCl2，(c)NaCl或(d)泊洛沙姆188。在一个实施例中，合适的TFF3缓冲液可以包括(a)、(b)、(c)和(d)中的所有。在一个实施例中，TFF3缓冲液具有pH 7.5-8.5、pH 7.7-8.3或pH 8.0。在一个实施例中，合适的TFF3缓冲液包含20mMTris、1mM MgCl2、200mM NaCl、0.001％泊洛沙姆188，在20℃下pH 8.0±0.1。在另一个实施例中，合适的TFF3缓冲液包含20mM Tris、1mM MgCl2、200mM NaCl、0.005％泊洛沙姆188，在20℃下pH值8.0±0.1。在一个实施例中，使用0.2μm Pall
Figure BDA0002574379020000511
EKV无菌级过滤器(MiniKleenpak)过滤浓缩的滞留物，以产生过滤的原料药。在一些实施例中，本文描述的方法产生大于5x 1015vg、或大于8x 1015vg或大于1x 1016vg的rAAV/制造批次中/。
药物组合物
根据本文公开的方法纯化的病毒(例如，AAV)颗粒可以高产率生产，具有足够的纯度，以使它们可以施用给人受试者。在一些实施例中，以约1-8x 1013病毒载体基因组/mL(vg/mL)或约1.7-2.3x 1013vg/mL的浓度配制病毒载体。在一些实施例中，以约1.9-2.1x1013vg/mL的浓度配制病毒载体。在一些实施例中，以约2.0x 1013vg/mL的浓度配制病毒载体。
在一些实施例中，在病毒载体的生产过程中，可以生成不含核酸材料的空病毒衣壳。包含低量的空病毒衣壳的药物组合物可能是有利的，因为它们避免了使具有未成熟免疫系统的患者(例如婴儿)不必要地暴露于抗原材料(空衣壳、宿主细胞蛋白、宿主细胞DNA)而没有治疗益处。在一些实施例中，这样的药物组合物可以减少潜在的输注反应或更广泛的免疫应答，并且可以提高治疗功效。。与具有基因组材料的全病毒衣壳相比，空衣壳具有不同的密度，从而允许通过梯度离心或本领域已知的其他方法来分离这两个种类。在一些实施例中，通过超速离心分离空衣壳。在一些实施例中，通过CsCl梯度超速离心分离空衣壳。在其他实施例中，通过碘克沙醇梯度超速离心分离空衣壳。在一些实施例中，通过蔗糖梯度超速离心分离空衣壳。
空病毒衣壳与非空病毒衣壳的比率可以通过标准实验室技术来测量。在一些实施例中，所述比率通过光学吸光度测量来测量。在一些实施例中，所述比率通过UV吸光度测量来测量。在一些实施例中，衣壳蛋白的总量和DNA的总量可以通过UV吸光度测量来确定。在一些实施例中，测量值由光学折射率测量确定。在一些其他实施例中，通过分析型超速离心来确定测量值。
高水平的空衣壳可能对病毒载体治疗的功效提出挑战。在一个实施例中，药物组合物具有少于10％的空衣壳、少于8％的空衣壳、少于7％的空衣壳、少于约5％的空衣壳、少于3％的空衣壳、少于1％的空衣壳。在另一个实施例中，药物组合物具有1％-10％的空衣壳。在另一个实施例中，药物组合物具有2％-8％的空衣壳。在另一个实施例中，药物组合物具有少于或等于6％的空衣壳、5％的空衣壳、4％的空衣壳、3％的空衣壳、2％的空衣壳，或更少。在一个实施例中，空衣壳的数量低于检测极限。在另一个实施例中，空衣壳的百分比被确定为总衣壳的百分比(例如使用AUC)。在一些实施例中，例如与具有较高百分比空衣壳的组合物相比，这些低百分比空衣壳在施用给患者后改善了治疗功效和/或减少了不良事件(例如炎症应答、肝损伤)。在一些实施例中，与现有方法(例如不使用粘附细胞和/或本文所述纯化方法的方法)中的水平相比，本文公开的制备病毒载体的方法提供了这些改善的空衣壳百分比。
在病毒载体的生产过程中，来自用于产生病毒载体的粘附细胞(例如HEK293细胞)的残余蛋白可能不能完全分离出来。残余宿主细胞蛋白有可能引发免疫应答。残余宿主细胞的量可以通过任何标准实验室技术来测量，这些技术可以区分病毒衣壳蛋白和残余宿主细胞蛋白。在一些实施例中，残余宿主细胞蛋白的量可以通过尺寸排除或离子交换层析来测量。在一些实施例中，测量可以通过亲代细胞特异性抗体的蛋白质印迹完成。在一个实施例中，残余宿主细胞蛋白的量可通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测量。在一些实施例中，残余宿主细胞蛋白的量可通过商业ELISA试剂盒测量。在一些实施例中，残余宿主细胞蛋白的量可通过信固技术公司(Cygnus Technologies)HEK293 HCP ELISA试剂盒测量。
在另一个实施例中，所述药物组合物中的残余宿主细胞蛋白少于或等于5X106pg/ml/1X 1013vg/ml、少于或等于1.2X 106pg/ml/1X 1013vg/mL或1X 105pg/ml/1X1013vg/ml至1.2X 106pg/ml/1X 1013vg/ml或少于或等于40ng/ml/1X 1013vg/ml。在一个实施例中，药物组合物包含少于或等于5ng、4ng、3ng、2ng、1ng或更少ng残余宿主细胞蛋白/1.0x 1013vg。在一个实施例中，药物组合物包含少于或等于4ng残余宿主细胞蛋白/1.0x1013vg。
在病毒载体的生产过程中，来自粘附细胞(例如HEK293细胞)的残余宿主细胞DNA或转染以产生病毒载体的残余质粒DNA可能不能完全去除。纯化过程(如酸化、澄清、切向流过滤等)去除批量的残余宿主细胞或质粒DNA。在一个实施例中，通过PCR进行残余宿主细胞或质粒DNA量的测量。在另一个实施例中，通过用对宿主细胞或质粒序列特异性的引物的定量PCR(qPCR)进行残余宿主细胞或质粒DNA量的测量。在另一个实施例中，残余宿主细胞或质粒DNA的量的测量通过数字液滴PCR(ddPCR)进行。在一个实施例中，使用对质粒的卡那霉素抗性基因区域特异性的引物的qPCR测定来确定质粒DNA的量。在另一个实施例中，残余宿主细胞DNA的量由商业qPCR测定试剂盒确定，例如赛默飞世尔公司(ThermoFisher)的
Figure BDA0002574379020000541
人残余DNA定量试剂盒，伯乐公司(Biorad)的残余DNA定量超级混合物或任何等效产品。减少残余宿主细胞或质粒DNA的量可以改善治疗结局，并且可以纯化和/或选择这样的组合物用于本文公开的治疗。
在一个实施例中，所述药物组合物中的残余宿主细胞DNA少于或等于1.7X 106pg/ml/1X 1013vg/ml、1X 105pg/ml/1X 1013vg/ml至1.2X 106pg/ml/1X 1013vg/ml。在一个实施例中，所述药物组合物中的残余宿主细胞DNA少于或等于3x 105、2x 105、1.1x 105、1x105pg或更少/1.0x 1013vg。在实施例中，所述药物组合物中的残余宿主细胞DNA少于或等于1.1x 105pg/1.0x 1013vg。
在另一个实施例中，所述药物组合物中的残余质粒DNA少于或等于1.7X 106pg/ml/1X 1013vg/ml、1X 105pg/ml/1X 1013vg/ml至1.7X 106pg/ml/1X 1013vg/ml。在另一个实施例中，所述药物组合物中的残留质粒DNA少于或等于6.8x 105pg/1.0x 1013vg。
在一个实施例中，药物组合物中的残余宿主细胞DNA少于或等于1.1x 105pg/1.0x1013vg，并且所述药物组合物中的残余质粒DNA少于或等于6.8x 105pg/1.0x 1013vg。
在一个实施方案中，药物组合物中的残余宿主细胞DNA少于或等于1.1x 105pg/1.0x 1013vg，并且所述药物组合物中的残余质粒DNA少于或等于6.8x 105pg/1.0x 1013vg，并且所述药物组合物中的残余宿主细胞蛋白少于或等于4ng/1.0x 1013vg。
在一些实施例中，药物组合物中的内毒素的量为少于约1EU/mL/1.0x 1013vg/mL、少于约0.75EU/mL/1.0x 1013vg/mL、少于约0.5EU/mL/1.0x 1013vg/mL、少于约0.4EU/mL/1.0x 1013vg/mL、少于约0.35EU/mL/1.0x 1013vg/mL、少于约0.3EU/mL/1.0x 1013vg/mL、少于约0.25EU/mL/1.0x 1013vg/mL、少于约0.2EU/mL/1.0x 1013vg/mL、少于约0.15EU/mL/1.0x 1013vg/mL、少于约0.1EU/mL/1.0x 1013vg/mL、少于约0.05EU/mL/1.0x 1013vg/mL或少于约0.02EU/mL/1.0x 1013vg/mL。测定内毒素的量的方法是本领域已知的，例如鲎变形细胞裂解物(LAL)测试。在实施例中，根据美国药典(“USP”)<85>(通过引用以其整体并入本文)测定内毒素。
在一个实施例中，药物组合物中的牛血清白蛋白(BSA)为少于0.5ng/1.0x 1013vg、少于0.3ng/1.0x 1013vg，或少于0.22ng/1.0x 1013vg。在一个实施例中，所述药物组合物中的benzonase少于0.2ng/1.0x 1013vg、少于0.1ng/1.0x 1013vg、或少于0.09ng/1.0x1013vg。
在一个实施例中，本文公开的药物组合物包含以下中的一种或多种：少于约0.09ng benzonase/1.0x 1013vg，少于约30μg/g(ppm)的铯，约20-80ppm的泊洛沙姆188，少于约0.22ng BSA/1.0x 1013vg，少于约6.8x 105pg残余质粒DNA/1.0x 1013vg，少于约1.1x105pg残余hcDNA/1.0x 1013vg，少于约4ng rHCP/1.0x 1013vg，pH 7.7-8.3，约390-430mOsm/kg，少于约600个尺寸≥25μm的颗粒/容器，少于约6000个尺寸≥10μm的颗粒/容器，约1.7x1013-2.3x 1013vg/mL的基因组效价，约3.9x 108-8.4x 1010IU/1.0x 1013vg的感染效价，约100-300μg/1.0x1013vg的总蛋白，在约7.5x 1013vg/kg剂量的病毒载体情况下Δ7SMA小鼠≥24天的中值存活，根据基于体外细胞的测定的约70％-130％相对效力和/或少于约5％空衣壳。
在一个实施例中，本文公开的药物组合物包含以下中的一种或多种，例如全部：pH7.7-8.3(例如，如通过USP<791>测量的)，约390-430mOsm/kg(例如，如通过USP<785>测量的)，少于约600个尺寸≥25μm的颗粒/容器(例如，如通过USP<787>测量的)，少于约6000个尺寸≥10μm的颗粒/容器(例如，如通过USP<787>测量的)，约1.7x 1013-2.3x 1013vg/mL的基因组效价，约3.9x 108-8.4x 1010IU/1.0x 1013vg的感染效价，约100-300μg/1.0x 1013vg的总蛋白，在约7.5x 1013vg/kg剂量的病毒载体情况下Δ7SMA小鼠≥24天的中值存活(例如在体内功能测试中，例如本文所述)，根据基于体外细胞的测定的约70％-130％相对效力和/或少于约5％空衣壳。在实施例中，本文公开的药物组合物包含大于或等于95％的总纯度(例如，通过SDS-PAGE确定)。在实施例中，本文公开的药物组合物不包含大于2％(例如，通过SDS-PAGE确定)的水平的单一的未命名相关杂质。在实施例中，本文公开的药物组合物包含小于或等于0.75EU/mL的内毒素水平(例如，通过USP<85>测量)。在实施例中，本文公开的药物组合物在无菌试验中测试无生长(例如通过USP<71>测量)。
高水平的残余宿主细胞蛋白、宿主细胞DNA、质粒DNA和/或内毒素可能对病毒载体治疗的功效构成挑战。在一些实施例中，这些较低量的残余宿主细胞蛋白、宿主细胞DNA、质粒DNA和/或内毒素在施用给患者后改善治疗功效和/或减少不良事件(例如炎症应答、肝损伤)，例如与具有较高量的这些物质的组合物相比。在一些实施例中，与现有方法(例如不使用粘附细胞和/或本文所述纯化方法的方法)中的水平相比，本文公开的制备病毒载体的方法提供了这些改善的水平。在一些实施例中，本文的方法还允许制备除少量残留宿主细胞蛋白、宿主细胞DNA、质粒DNA和/或内毒素外，空衣壳百分比降低的病毒载体。
在一些实施例中，TFF(例如第二TFF)之后的残余铯的量低于约50μg/g。在一些实施例中，TFF(例如第二TFF)之后的残余铯的量低于约30μg/g。在一些实施例中，TFF(例如第二TFF)之后的残余铯的量低于约20ug/g。在一些实施例中，药物组合物中的残余铯少于或等于30ug/g(ppm)。在一些实施例中，残余CsCl的量可以通过质谱法、电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)和/或另一种合适的方法来测量。在一些实施例中，在第二TFF之后残余铯的量低于定量限(例如使用ICP-MS)。
在一些实施例中，在第二TFF之后收集的AAV病毒载体的浓度大于或等于约5x1012vg/ml、大于或等于约1x 1013vg/ml、或大于或等于约3x 1013vg/ml。
在一个实施例中，药物组合物具有以下中的一种或多种：少于0.09ng benzonase/1.0x 1013vg，少于30μg/g(ppm)的铯，约20-80ppm的泊洛沙姆188，少于0.22ng BSA/1.0x1013vg，少于6.8x 105pg残余质粒DNA/1.0x 1013vg，少于1.1x 105pg残余hcDNA/1.0x1013vg，以及少于4ng rHCP/1.0x 1013vg。
在另一个实施例中，所述药物组合物保持的效力为参考标准品的+20％、+15％、+10％或+5％。在一个实施例中，使用Foust等人,Nat.Biotechnol.[自然生物技术],28(3),第271-274页(2010)中的方法相对于参考标准品来评估效力。可以使用任何合适的参考标准品。。在一个实施例中，药物组合物具有体内效力，如通过SMAΔ7小鼠测试的。在一个实施例中，给予7.5x 1013vg/kg剂量的测试小鼠具有大于15天、大于20天、大于22天或大于24天的中值存活。在一个实施例中，药物组合物具有通过基于细胞的分析测试的相对于参考标准品和/或合适对照的50％-150％、60％-140％或70％-130％的体外相对效力。
根据本公开纯化的病毒颗粒(例如，病毒颗粒)可以根据已知的方法配制以制备药学上有用的组合物。本公开的组合物可以使用本领域已知的技术配制用于施用给哺乳动物受试者，例如人。具体地，递送系统可被配制用于肌肉内、皮内、粘膜、皮下、静脉内、鞘内、可注射的贮存型装置或局部施用。
当所述递送系统被配制成溶液或悬浮液时，所述递送系统处于可接受的载体中，例如水性载体。可以使用多种水性载体，例如，水、缓冲水、0.8％盐水、0.3％甘氨酸、透明质酸等。这些组合物可以通过常规的熟知灭菌技术灭菌，或者可以是无菌过滤的。所得水溶液可以被包装以按原样使用，或者被冻干，在给药前将该冻干制剂与无菌溶液组合。
组合物，例如药物组合物，可以含有药学上可接受的辅助物质以接近生理条件，例如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、湿润剂等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、油酸三乙醇胺等。在一些实施例中，药物组合物包含防腐剂。在一些其他实施例中，药物组合物不包含防腐剂。
病毒载体的基因组效价，例如本文公开的组合物和配制品中的病毒载体的基因组效价，可以用多种标准方法确定。用病毒载体特异性引物的PCR可提供相对测量，但定量PCR(qPCR)可用于较小样品和绝对测量。液滴数字PCR(ddPCR)是一种基于水-油乳液液滴技术的数字PCR方法。样品被分离成数万个液滴，模板分子的PCR扩增发生在每个单独的液滴中。不需要制作标准曲线或不需要具有高扩增效率的引物，因此ddPCR通常不像基于PCR的传统技术那样使用大量样品。在一个实施例中，使用PCR确定病毒载体的基因组效价。在另一个实施例中，使用qPCR确定病毒载体的基因组效价。在另一个实施例中，使用ddPC确定病毒载体的基因组效价。使用ddPCR确定病毒基因组效价的方法例如描述于Lock等人,“AbsoluteDetermination of Single-Stranded and Self-Complementary Adeno-AssociatedViral Vector Genome Titers by Droplet Digital PCR,[通过液滴数字PCR对单链和自互补腺相关病毒载体基因组效价的绝对测定]”Human Gene Therapy Methods[人类基因疗法方法],25(2):115-125。
在一些实施例中，基于PCR的方法使用靶向SMN基因的特异性地设计的引物和探针来检测和定量包封的AAV9病毒基因组。在其他实施例中，基于PCR的方法使用靶向鸡β-肌动蛋白启动子的特异性地设计的引物和探针来检测和定量包封的AAV9病毒基因组。在其他实施例中，基于PCR的方法使用靶向CMV增强子的特异性地设计的引物和探针来检测和定量包封的AAV9病毒基因组。在其他实施例中，基于PCR的方法使用靶向ITR序列的特异性地设计的引物和探针来检测和定量包封的AAV9病毒基因组。在其他实施例中，基于PCR的方法使用靶向牛生长激素聚腺苷酸化信号的特异性地设计的引物和探针来检测和定量包封的AAV9病毒基因组。
在一些实施例中，药物组合物约为pH 7.7-8.3并具有390-430mOsm/kg的渗透压摩尔浓度。在一些实施例中，使用pH计测量pH。在一些实施例中，使用具有温度补偿的微电极根据美国药典(USP)设定的标准，例如<791>(通过引用以其整体并入)，通过电位滴定法测量pH。在一些实施例中，根据USP，例如USP<785>(通过引用以其整体并入)，使用冰点降低来测量渗透压摩尔浓度。在一些实施例中，使用蒸汽压降低渗透压计来测量渗透压摩尔浓度。在其他实施例中，使用膜渗透压计来测量渗透压摩尔浓度。
在一个实施例中，静脉内注射配制品的pH值在7.5和8.5之间，基因组效价为2X1013vg/ml-6X 1013vg/ml，渗透压摩尔浓度为384-448mOsm/kg。在另一个实施例中，静脉内注射配制品的pH值在7.5和8.5之间，基因组效价为1.5X 1013vg/ml-3.5X 1013vg/ml，渗透压摩尔浓度为384-448mOsm/kg。在另一个实施例中，静脉内注射配制品的pH值在7.5和8.5之间，基因组效价为1.8X 1013vg/ml-2.2X 1013vg/ml，渗透压摩尔浓度为384-448mOsm/kg。在一个实施例中，IV配制品包含约0.1-2.0mM MgCl2。在一个实施例中，IV配制品包含约100-300mM NaCl。在一个实施例中，IV配制品包含约0.001％-0.01％w/v泊洛沙姆188。在一个实施例中，IV配制品是在10-30mM Tris缓冲液中的水性配制品，例如在7.5-8.5的pH下。
在一个实施例中，IV配制品包含在20mM Tris缓冲液(pH 8.0)中的1mM MgCl2、200mM NaCl、0.005％w/v泊洛沙姆188。在实施例中，IV配制品包含约1x 1013至3x 1013vg/mL或1.7x 1013至2.3x 1013vg/mL的基因组效价。
药物组合物的用途
在其他实施例中，本文公开了用于将多核苷酸递送至患者中枢神经系统的方法，所述方法包括施用具有包括所述多核苷酸的基因组的rAAV9。在一些实施例中，所述递送是将多核苷酸鞘内递送至患者的中枢神经系统，所述方法包括施用具有包括所述多核苷酸的基因组的rAAV9。在一些实施例中，还给患者施用非离子型低渗造影剂。非离子型低渗造影剂增加患者中枢神经系统中靶细胞的转导。在一些实施例中，rAAV9基因组是自身互补基因组。在其他实施例中，rAAV9基因组是单链基因组。
在一些实施例中，将多核苷酸递送至脑区域。考虑用于递送的脑区域包括但不限于运动皮层和脑干。在一些实施例中，将多核苷酸递送至脊髓。在一些实施例中，将多核苷酸递送至下运动神经元。本公开的实施例使用rAAV9将多核苷酸递送至神经和胶质细胞。在一些实施例中，胶质细胞是小胶质细胞、少突胶质细胞或星形胶质细胞。在一些实施例中，rAAV9用于将多核苷酸递送至施万细胞。
用途包括例如治疗下运动神经元疾病，例如SMA和ALS以及庞贝病、溶酶体储存障碍、多形性胶质母细胞瘤和帕金森病。溶酶体贮积障碍包括但不限于激活因子缺陷/GM2神经节苷脂贮积病、α-甘露糖苷贮积症、天冬氨酰葡糖胺尿症、胆固醇酯贮积病、慢性氨基己糖苷酶A缺乏症、胱氨酸贮积症、达农病(Danon disease)、法布里病、法伯病、岩藻糖苷贮积症、半乳糖涎酸贮积症、戈谢病(I型、II型、III型)、GM1神经节苷脂贮积病(婴儿期、婴儿晚期/少年、成人/慢性)、I-细胞病/粘脂贮积病II、婴儿游离唾液酸贮积病/ISSD、幼年氨基己糖苷酶A缺乏症、克拉伯病(婴儿发病、晚期发病)、异染性脑白质营养不良、粘多糖贮积病(假赫尔多营养不良(Pseudo-Hurler polydystrophy)/粘脂贮积病IIIA、MPSI赫尔综合征(MPSI Hurler Syndrome)、MPSI施艾氏综合征(MPSI Scheie Syndrome)、MPS I赫尔-施艾氏综合征(MPS I Hurler-Scheie Syndrome)、MPS II亨特综合征(MPS II Huntersyndrome)、沙费利波综合征(Sanfilippo syndrome)A型/MPS III A、沙费利波综合征B型/MPS III B、沙费利波综合征C型/MPS III C、沙费利波综合征D型/MPS III D、莫尔基奥(Morquio)A型/MPS WA、莫尔基奥B型/MPS IVB、MPS IX透明质酸酶缺乏症、MPS VI拉米氏综合征(Maroteaux-Lamy)、MPS VII Sly综合征、粘脂贮积病I/涎酸贮积症、粘脂贮积病IIIC、粘脂贮积病IV型)、多发性硫酸脂酶缺乏症、尼曼－皮克病(A型、B型、C型)、神经元蜡样脂褐质沉积症(CLN6病(非典型婴儿晚期、晚发变体、少年早期)、巴-斯-沃三氏综合征(Batten-Spielmeyer-Vogt)/少年NCL/CLN3病、芬兰变体晚期婴儿CLN5、伏-施二氏病(Jansky-Bielschowsky disease)/晚期婴儿CLN2/TPP1病、库夫斯(Kufs)/成人发病NCL/CLN4病、北方癫痫(Northern Epilepsy)/变体晚期婴儿CLN8、Santavuori-Haltia/婴儿CLN1/PPT病、β-甘露糖苷贮积症、庞贝病/糖原贮积病II型、致密成骨不全症、山德霍夫氏病(SandhoffDisease)/成人发病/GM2神经节苷脂贮积病、山德霍夫氏病/GM2神经节苷脂贮积病--婴儿、山德霍夫氏病/GM2神经节苷脂贮积病--少年、谢耳德氏病(Schindler disease)、唾液酸贮积病(Salla disease/Sialic Acid Storage Disease)、戴萨克斯症(Tay-Sachs)/GM2神经节苷脂贮积病、沃尔曼病(Wolman disease)。
在进一步的实施例中，指示所述方法和材料用于治疗神经系统疾病，例如雷特综合征、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、或用于治疗神经系统损伤，包括脊髓和脑创伤/损伤、中风和脑癌。在一个实施例中，指示所述方法和材料用于治疗脊髓性肌萎缩(SMA)。
SMA有四种类型，按发病年龄和达到的最高运动功能进行常规分类。所有形式的SMA都是常染色体隐性遗传，并且由运动神经元存活1(SMN1)基因的突变引起。人类还携带着第二个几乎完全相同的SMN基因拷贝，称为SMN2。Lefebvre等人“Identification andcharacterization of a spinal muscular atrophy-determining gene.[脊髓性肌萎缩决定基因的鉴定和表征]”Cell[细胞],80(1):155-65.Monani等人“Spinal muscularatrophy:a deficiency in a ubiquitous protein；a motor-neuron specific disease.[脊髓性肌萎缩：一种遍在蛋白质缺乏性运动神经元特异性疾病]”Neuron[神经元],48(6):885-896。SMN1和SMN2基因都表达SMN蛋白，但是SMN2在外显子7中含有翻译沉默突变，这导致SMN2转录物中没有有效包含外显子7。因此，SMN2产生全长SMN蛋白和缺少外显子7的截短版SMN，其中截短版是主要形式。结果，SMN2产生的功能性全长蛋白的量比SMN1产生的少得多(少70％-90％)。Lorson等人“A single nucleotide in the SMN gene regulatessplicing and is responsible for spinal muscular atrophy[SMN基因中的单核苷酸调节剪接，并对脊髓性肌萎缩负责].”PNAS[美国国家科学院院刊],96(11)6307-6311。Monani等人,“A single nucleotide difference that alters splicing patternsdistinguishes the SMA gene SMN1 from the copy gene SMN2.[改变剪接模式的单核苷酸差异将SMA基因SMN1与拷贝基因SMN2区分开来]”Hum Mol genet[人类分子遗传学]8(7):1177-1183。虽然SMN2不能完全补偿SMN1基因的丢失，但具有弱化形式SMA的患者一般具有较高的SMN2拷贝数。Lefebvre等人,“Correlation between severity and SMN proteinlevel in spinal muscular atrophy.[脊髓性肌萎缩严重程度与SMN蛋白水平的相关性]”Nat Genet[自然遗传学]16(3):265-269。Park等人,“Spinal muscular atrophy:new andemerging insights from model mice.[脊髓性肌萎缩：来自模型小鼠的新的和正在出现的见解]”Curr Neurol Neurosci Rep[当前神经病学和神经科学通讯]10(2):108-117。需要注意的是SMN2拷贝数并不是唯一的表型修饰因子。特别是SMN2基因的外显子7中的c.859G>C变异已被报道为阳性的疾病修饰因子。具有这种特定突变的患者具有较轻的疾病表型。Prior等人,“A positive modified of spinal muscular atrophy in the SMN2gene.[SMN2基因中脊髓性肌萎缩的阳性修饰]”Am J Hum Genet[美国人类遗传学杂志]85(3):408-413。
I型SMA(又称婴儿发病型或活-霍二氏病(Werdnig-Hoffmann disease))是指出生时或6月龄时出现SMA症状。在这种类型中，婴儿通常有低肌张力(低张力)、微弱的哭声和呼吸困难。他们经常吞咽和吸吮有困难，也没有达到能够在无人协助下坐起来的发育里程碑。他们常表现出从肌张力减退、运动技能延迟、头部控制不良、圆肩姿势和关节活动过度中选出的SMA症状中的一种或多种。典型地，这些婴儿有两个SMN2基因拷贝，每个5号染色体上有一个。超过一半的新发SMA病例为SMA I型。
II型或中间型SMA是指SMA在7月龄和18月龄之间并且在儿童能够独立站立或行走之前发病。2型SMA儿童一般有至少三个SMN2基因。晚发性SMA(也称为III型和IV型SMA，轻度SMA，成人发病型SMA和库-韦二氏病(Kugelberg-Welander disease)导致不同程度的虚弱。III型SMA在18个月后发病，并且儿童可以独立站立和行走，尽管他们可能需要帮助。IV型SMA在成年期发病，并且患者在成年期间能够行走。患有III型或IV型SMA的人通常有四到八个SMN2基因，从这些基因中可以产生相当数量的全长SMN蛋白。
在一个实施例中，术语“治疗”包括将有效剂量或有效多剂量的包含如本文所公开的rAAV的组合物静脉内或经由鞘内途径施用给有需要的动物(包括人)的步骤。如果在障碍/疾病发展之前施用该剂量，则该施用是预防性的。如果在障碍/疾病发展之后施用该剂量，则该施用是治疗性的。在实施例中，有效剂量是如下剂量，其缓和(消除或减轻)与所治疗的障碍/疾病状态相关的至少一种症状，减慢或防止进展为障碍/疾病状态，减慢或防止障碍/疾病状态进展，减小疾病的程度，导致疾病的(部分或完全)缓解和/或延长存活期。本文列出了考虑用于治疗的疾病状态的实例。
在一个实施例中，包含本公开的rAAV的组合物静脉内施用给具有I型SMA的有需要的患者。在另一个实施例中，包含本公开的rAAV的组合物鞘内施用给具有II型、III型或IV型SMA的有需要的患者。
本文公开了一种通过经由鞘内或静脉内途径施用AAV9病毒载体来治疗有需要的患者中的I型SMA的方法。在一些实施例中，患者为0-9月龄。在一些其他实施例中，患者为0-6月龄。在一些实施例中，病毒载体用于治疗患者中的I型SMA，确定患者的体重。在一些实施例中，患者的体重小于8.5kg。在一些实施例中，患者的体重超过2.6kg。在一些实施例中，患者的体重为2.6-8.5kg。
在一些实施例中，患者在SMN1基因的一个拷贝中具有突变，例如无效突变(包括使编码的SMN1无功能的任何突变)。在一些实施例中，患者在SMN1基因的两个拷贝中具有突变，例如无效突变。在一些实施例中，患者在SMN1基因的所有拷贝中具有突变，例如无效突变。在一些实施例中，患者在SMN1基因的一个拷贝中具有缺失。在一些实施例中，患者在SMN1基因的两个拷贝中具有缺失。在一些实施例中，患者具有双等位基因SMN1突变，即染色体的两个等位基因中SMN1的缺失或取代。在一些实施例中，患者具有SMN2基因的至少一个功能性拷贝。在一些实施例中，患者具有SMN2基因的至少两个功能性拷贝。在一些实施例中，患者具有SMN2基因的至少两个功能性拷贝。在一些实施例中，患者具有SMN2基因的至少三个功能性拷贝。在一些实施例中，患者具有SMN2基因的至少四个功能性拷贝。在一些实施例中，患者具有SMN2基因的至少五个功能性拷贝。在一些实施例中，患者在SMN2基因的至少一个拷贝的外显子7中没有c.859G>C取代。在一些实施例中，SMN1或SMN2基因的基因序列可以通过全基因组测序来确定。在其他实施例中，SMN1或SMN2基因的基因序列和拷贝数可通过高通量测序来确定。在一些实施例中，SMN1或SMN2基因的基因序列和拷贝数可通过微阵列分析来确定。在一些实施例中，SMN1或SMN2基因的基因序列和拷贝数可通过桑格测序来确定。在一些实施例中，SMN1或SMN2基因的拷贝数可通过荧光原位杂交(FISH)来确定。
在一些实施例中，患者表现出一个或多个SMA症状。SMA症状可包括肌张力减退、运动技能延迟、头部控制不良、圆肩姿势和关节活动过度。在一些实施例中，通过在肩部(前和后)处给予辅助的情况下将患者置于环坐位置来确定头部控制不良。头部控制通过患者保持头部直立的能力来评估。在一些实施例中，当患者处于仰卧位置时观察到自发运动，并且通过患者将其肘、膝盖、手和脚抬起离开表面的能力来评估运动技能。在一些实施例中，通过将手指放在患者的手掌中并抬起患者直到他们的肩膀脱离表面来测量患者的握力。肌张力减退和握力是通过患者保持抓握多久/多长时间来衡量的。在一些实施例中，通过将患者的头部置于最大可用旋转中并测量患者将头部朝中线转回的能力来评估头部控制。在一些实施例中，肩部姿势可以通过在头部和躯干支持下使患者坐下，并且观察患者是否屈曲肘部或肩部以达到以臂长放置在肩部水平的刺激物来评估。在一些实施例中，肩部姿势也可以通过将患者置于侧躺位置，并且观察患者是否屈曲肘部或肩部以达到以臂长放置在肩部水平的刺激物来评估。在一些实施例中，通过观察当患者的脚被抚摸、挠或捏时患者是否弯曲他们的髋或膝来评估运动技能。在一些实施例中，肩部屈曲、肘部屈曲、髋部内收、颈部屈曲、头部延伸、颈部延伸和/或脊柱弯曲可以通过已知的临床测量(例如，CHOP INTEND)来评估。其他SMA症状可以根据已知的临床测量方法，例如CHOP INTEND来评估。
在一些实施例中，在患者表现出如使用本文描述的测试之一所确定的I型SMA的症状(例如，一个或多个症状)后进行治疗。在一些实施例中，在患者表现出I型SMA症状之前对其进行治疗。在一些实施例中，在患者出现症状之前，基于基因测试将其诊断为I型SMA。
本文还考虑了组合疗法。如本文所用的组合包括同时治疗或依序治疗。方法的组合可以包括添加某些标准医学治疗(例如ALS中的利鲁唑)，与新疗法的组合也是如此。例如，SMA的其他治疗方法包括反义寡核苷酸(ASO)，其改变与前体mRNA的结合，并改变它们的剪接模式。Singh等人,“A multi-exon-skipping detection assay reveals surprisingdiversity of splice isoforms of spinal muscular atrophy genes.[一项多外显子跳过检测定验揭示了脊髓性肌萎缩基因剪接异构体的惊人多样性]”Plos One[公共科学图书馆：综合],7(11):e49595。在一个实施例中，可以使用努辛生(nusinersen)(美国专利8,361,977和US 8,980,853，通过引用并入本文)。努辛生是一种已获批准的ASO，靶向SMN2前体mRNA的内含子6、外显子7或内含子7，调节SMN2的剪接以更有效地产生全长SMN蛋白。在一些实施例中，包含AAV9病毒载体的治疗方法与肌肉增强剂组合施用。在一些实施例中，包含AAV9病毒载体的治疗方法与神经保护剂组合施用。在一些实施例中，包含AAV9病毒载体的治疗方法与靶向SMN的基于反义寡核苷酸的药物组合施用。在一些实施例中，包含AAV9病毒载体的治疗方法与努辛生组合施用。在一些实施例中，包含AAV9病毒载体的治疗方法与肌生成抑制蛋白抑制药物组合施用。在一些实施例中，包含AAV9病毒载体的治疗方法与司达鲁单抗组合施用。
虽然考虑在出生后向需要分娩的个体递送，但也考虑对胎儿进行宫内递送。
考虑使用包含病毒载体的药物组合物治疗I型SMA患者的方法。在一些实施例中，以约1-8x 1013个AAV9病毒载体基因组/mL(vg/mL)的浓度配制病毒载体。在一些实施例中，以约1.7-2.3x 1013vg/mL的浓度配制病毒载体。在一些实施例中，以约1.9-2.1x 1013vg/mL的浓度配制病毒载体。在一些实施例中，以约2.0x 1013vg/mL的浓度配制病毒载体。
在一些实施例中，其中病毒载体用于治疗患者的I型SMA，AAV病毒载体(例如AAVSMN)以约1.0-2.5x 1014个vg/kg的剂量施用给患者。在一些实施例中，其中病毒载体用于治疗患者的I型SMA，AAV病毒载体以约1.1x 1014vg/kg的剂量施用给患者。在一些实施例中，病毒载体用于治疗患者的I型SMA，AAV病毒载体经约45-70分钟输注到患者体内。在一些实施例中，病毒载体用于治疗患者的I型SMA，AAV病毒载体经约60分钟输注到患者体内。在一些实施例中，病毒载体用于治疗患者的I型SMA，使用输注泵、蠕动泵或本领域已知的任何其他设备将AAV病毒载体输注到患者体内。在一些实施例中，病毒载体用于治疗患者的I型SMA，使用注射泵将AAV病毒载体输注到患者体内。
待施用的rAAV病毒载体效价将根据例如特定的rAAV、施用方式、治疗目标、个体和所靶向的一种或多种细胞类型而变化，并且可以通过本领域中标准的方法来确定。rAAV的效价可为约1X 106、约1X 107、约1X 108、约1X 109、约1X 1010、约1X 1011、约1X 1012、约1X1013、约1X 1014个或更多个DNA酶抗性颗粒(DRP)/ml。剂量也可以以载体基因组的单位(vg)来表示。基因组效价可使用本申请中所述的ddPCR(在Lock等人中)或本领域已知的任何其他方法来测定。
剂量也可以根据对人的施用时间而变化。rAAV的这些剂量范围在成人中可为约1X1011vg/kg、约1X 1012vg/kg、约1X 1013vg/kg、约1X 1014vg/kg、约1X 1015vg/kg、约1X1016vg/kg、或更多载体基因组/千克体重。对于新生儿，rAAV的剂量范围可为约1X 1011vg/kg、约1X 1012vg/kg、约3X 1012vg/kg、约1X 1013vg/kg、约3X 1013vg/kg、约1X 1014vg/kg、约3X 1014vg/kg、约1X 1015vg/kg、约3X 1015vg/kg、约1X 1016vg/kg、约3X 1016vg/kg或更多载体基因组/千克体重。
剂量也可以根据对人的施用时间而变化。rAAV的这些剂量范围在成人中可为约1X1011vg/kg/周、约1X 1012vg/kg/周、约1X 1013vg/kg/周、约1X 1014vg/kg/周、约1X 1015vg/kg/周、约1X 1016vg/kg/周、或更多载体基因组/千克体重。对于新生儿，rAAV的剂量范围可为约1X 1011vg/kg/周、约1X 1012vg/kg/周、约3X 1012vg/kg/周、约1X 1013vg/kg/周、约3X1013vg/kg/周、约1X 1014vg/kg/周、约3X 1014vg/kg/周、约1X 1015vg/kg/周、约3X 1015vg/kg/周、约1X 1016vg/kg/周、约3X 1016vg/kg/周、或更多载体基因组/千克体重/周。rAAV的剂量在成人中1X 1011vg/1.5kg/周、约1X 1012vg/1.5kg/周、约1X 1013vg/1.5kg/周、约1X1014vg/1.5kg/周、约1X 1015vg/1.5kg/周、约1X 1016vg/1.5kg/周、或更多载体基因组/千克体重。对于新生儿，rAAV的剂量范围可为约1X 1011vg/1.5kg/周、约1X 1012vg/1.5kg/周、约3X 1012vg/kg/周、约1X 1013vg/1.5kg/周、约3X 1013vg/1.5kg/周、约1X 1014vg/1.5kg/周、约3X 1014vg/1.5kg/周、约1X 1015vg/1.5kg/周、约3X 1015vg/1.5kg/周、约1X 1016vg/1.5kg/周、约3X 1016vg/1.5kg/周、或更多载体基因组/1.5千克体重/周。
在一个实施例中，剂量为约1.1X 1014个载体基因组/kg(vg/kg)患者体重。在一个实施例中，5kg患者将接受0.5X 1014至5.0X 1014个载体基因组的总剂量。在一个实施例中，病毒载体在Tris缓冲盐水中施用。在一个实施例中，所述病毒载体在约5-20mL/kg、约10-20mL/kg或约5.5-6.5mL/kg的Tris缓冲盐水中施用。
剂量可以通过许多标准方法来确定。用病毒载体特异性引物的PCR可提供相对测量，但qPCR可用于较小样品和绝对测量。ddPCR是一种基于水-油乳液液滴技术的数字PCR方法。Baker等人,“Digital PCR hits its stride.[数字PCR大发展]”Nature Methods[自然方法],9(6):541-544.Sykes等人,“Quantitation of targets for PCR by use oflimiting dilution.[限制性稀释对PCR目标的定量]”Biotechniques[生物技术],13(3)444-449。样品被分离成数万个液滴，模板分子的PCR扩增发生在每个单独的液滴中。不需要制作标准曲线或不需要具有高扩增效率的引物，因此ddPCR通常不像基于PCR的传统技术那样使用大量样品。市售ddPCR机器的实例包括但不限于伯乐(BioRad)QX100 ddPCR和雨舞雨滴数字PCR(RainDance Raindrop Digital PCR)。在一个实施例中，使用PCR确定剂量。在另一个实施例中，使用qPCR确定剂量。在另一个实施例中，使用数字液滴PCR(ddPCR)确定剂量。在一些实施例中，基于PCR的方法使用靶向SMN基因的特异性地设计的引物和探针来检测和定量包封的AAV9病毒基因组。在其他实施例中，基于PCR的方法使用靶向鸡β-肌动蛋白启动子的特异性地设计的引物和探针来检测和定量包封的AAV9病毒基因组。在其他实施例中，基于PCR的方法使用靶向CMV增强子的特异性地设计的引物和探针来检测和定量包封的AAV9病毒基因组。在其他实施例中，基于PCR的方法使用靶向ITR序列的特异性地设计的引物和探针来检测和定量包封的AAV9病毒基因组。在其他实施例中，基于PCR的方法使用靶向牛生长激素聚腺苷酸化信号的特异性地设计的引物和探针来检测和定量包封的AAV9病毒基因组。
在一个方面，使用2.0X 1013vg/ml作为药物产物的目标浓度，根据下表施用剂量。
表2：给药
患者体重范围(kg) 剂量体积<sup>a</sup>(mL)
2.6-3.0 16.5
3.1-3.5 19.3
3.6-4.0 22.0
4.1-4.5 24.8
4.6-5.0 27.5
5.1-5.5 30.3
5.6-6.0 33.0
6.1-6.5 35.8
6.6-7.0 38.5
7.1-7.5 41.3
7.6-8.0 44.0
8.1-8.5 46.8
a注意：使用患者体重范围的上限计算剂量体积。
在一些实施例中，包含AAV病毒载体的药物组合物经约20-70分钟，例如经约45-70分钟输注到患者体内。在一些实施例中，包含AAV病毒载体的药物组合物经约60分钟输注到患者体内。在一些实施例中，使用输注泵、蠕动泵或本领域已知的任何其他设备将包含AAV病毒载体的药物组合物输注到患者体内。在一些实施例中，使用注射泵将包含AAV病毒载体的药物组合物输注到患者体内。
还考虑了对适于治疗的患者进行预先筛选，以及对根据本文公开的标准鉴定的患者施用治疗。AAVs可引起细胞免疫和体液免疫应答。因此，一小部分可能接受AAV基因疗法的患者体内预先存在抗AAV抗体。Jeune等人,“Pre-existing anti-Adeno-AssociatedVirus antibodies as a challenge in AAV gene therapy.[预先存在的抗腺相关病毒抗体在AAV基因治疗中的挑战]”Hum Gene Ther Methods[人类基因治疗方法],24(2):59-67。Boutin等人,“Prevalence of serum IgG and neutralizing factors against adeno-associated virus(AAV)types 1,2,5,6,8,and 9in the healthy population:implications for gene therapy using AAV vectors.[健康人群中抗腺相关病毒(AAV)1、2、5、6、8和9型血清IgG和中和因子的流行情况：使用AAV载体进行基因疗法的意义]”HumGene Ther[人类基因疗法],21:704-712。因为即使很低水平的抗体也能阻止成功转导，前抗AAV抗体对AAV基因疗法的普遍应用构成严重障碍。在一些实施例中，在施用AAV病毒载体之前测定患者中的抗AAV9抗体效价水平。在一些实施例中，患者中的抗AAV9抗体效价水平通过ELISA结合免疫测定法确定。在一些实施例中，患者的抗AAV9抗体效价为1:100或低于1:100，如在施用治疗之前通过ELISA结合免疫测定法确定的。在一些实施例中，患者的抗AAV9抗体效价为1:50或低于1:50，如在施用治疗之前通过ELISA结合免疫测定法确定的。在一些实施例中，患者在治疗后具有如通过ELISA结合免疫测定法确定的高于1:100的抗AAV9抗体效价，并且监测1-8周或直到效价降低到低于1:100。在一些实施例中，患者在治疗后具有如通过ELISA结合免疫测定法确定的高于1:100的抗AAV9抗体效价，并且监测1-8周或直到效价降低到低于1:50。
克服高抗AAV抗体效价的一个途径是使用免疫抑制剂药物。单克隆抗CD20抗体利妥昔单抗联合环孢素A已被证明能有效降低抗AAV滴度。Mingozzi等人,“Pharmacologicalmodulation of humoral immunity in a nonhuman primate model of AAV genetransfer for hemophilia B.[AAV基因转移治疗血友病B的非人灵长类动物模型中体液免疫的药理学调节]”Mol Ther[分子疗法],20:1410-1416。另一种方法是在施用载体之前使用血浆置换来耗尽中和抗体。Monteilhet等人,“A 10 patient case report on theimpact of plasmapheresis upon neutralizing factors against adeno-associatedvirus(AAV)types 1,2,6,and 8.[关于血浆置换对于抗腺相关病毒(AAV)1、2、6和8型的中和因子的影响的10名患者病例报告]”Mol Ther[分子疗法],19(11):2084-2091。在血浆分离过程中，从患者体内抽取血液，通过离心或中空纤维过滤分离血浆和血细胞。然后血细胞与处理过的血浆或替代液(如4.5％的人白蛋白盐水)一起返回给患者。治疗性单采的一个常见用途是去除不需要的免疫球蛋白，但在这种情况下，血浆置换是耗尽抗AAV抗体的一个有吸引力的方法。在一些实施例中，患者在治疗之前或之后具有高于1:100的抗AAV9抗体效价(如通过ELISA结合免疫测定法确定的)，并且用血浆置换术治疗。在一些实施例中，患者在治疗之前或之后具有高于1:50的抗AAV9抗体效价(如通过ELISA结合免疫测定法确定的)，并且用血浆置换术治疗。
预先存在的AAV9母源抗体可能通过母乳或子宫内胎盘转移而转移给婴儿患者。在一些实施例中，患者在治疗之前或之后具有高于1:100的抗AAV9抗体效价(如通过ELISA结合免疫测定法确定的)，并且转换为配方喂养。在一些实施例中，患者在治疗之前或之后具有高于1:50的抗AAV9抗体效价(如通过ELISA结合免疫测定法确定的)，并且转换为配方喂养。
在施用治疗之前和之后，可以监测患者的状况。一些接受过基于AAV的治疗的患者出现了血小板减少，这是一种以低血小板计数为特征的状况。血小板减少可以通过在血细胞计数仪上使用稀释的血液样品进行全血计数来检测。通过在显微镜下观察用患者血液制备的玻片(一层薄的血膜或外周血涂片)，也可以检测血小板减少。正常人血小板计数范围为150,000个细胞/ml至约450,000个细胞/ml。
在一些实施例中，患者在施用前血小板计数高于约67,000个细胞/ml或高于约100,000个细胞/ml，或高于约150,000个细胞/ml。在一些实施例中，患者在施用前血小板计数低于约150,000个细胞/ml，或低于约100,000个细胞/ml，或低于约67,000个细胞/ml，并且监测1-8周或直到血小板计数增加到高于约67,000个细胞/ml，或高于约100,000个细胞/ml，或高于约150,000个细胞/ml。在施用病毒载体后血小板计数低于约67,000个细胞/ml的一些实施例中，可以用血小板输注治疗患者。在一些实施例中，患者在施用病毒载体之前没有血小板减少。在一些实施例中，患者在施用病毒载体后出现血小板减少，并被监测约1-8周或直到患者没有血小板减少。在一些实施例中，患者在施用病毒载体后出现血小板减少，并且用血小板输注治疗。
监测患者的病症还可涉及标准血液测试，其测量血小板、血清蛋白电泳、血清γ-谷氨酰转移酶(GGT)、天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)、总胆红素、葡萄糖、肌酸激酶(CK)、肌酐、血尿素氮(BUN)、电解质、碱性磷酸酶和淀粉酶的水平。肌钙蛋白I水平是心脏健康的一般测量指标，升高的水平反映心脏受损或与心脏相关病症。在一些实施例中，在施用病毒载体后监测肌钙蛋白I水平。在一些实施例中，在施用病毒载体前，患者可具有少于约0.3、0.2、0.15或0.1μg/ml的肌钙蛋白I水平。在一些实施例中，在施用病毒载体前，患者可具有少于约0.176μg/ml的肌钙蛋白I水平。在一些实施例中，在施用病毒载体后，患者可具有高于约0.176μg/ml的肌钙蛋白I水平。在一些实施例中，患者在施用药病毒载体后接受心脏监测，直到肌钙蛋白I水平小于约0.176μg/ml。
天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)以及总胆红素是肝功能的一般测量指标，而肌酐则跟踪肾功能。AST、ALT或总胆红素水平升高可能提示肝脏功能障碍。在一些实施例中，在施用病毒载体前，患者具有正常的肝功能。在一些实施例中，在施用病毒载体前，患者的肝转氨酶水平低于约8-40U/L。在一些实施例中，在施用病毒载体前，患者的AST或ALT水平低于约8-40U/L。在一些实施例中，在施用病毒载体前，患者的胆红素水平低于3.0mg/dL。在一些实施例中，在施用病毒载体前，患者的肌酐水平低于1.8mg/dL。在一些实施例中，在施用病毒载体前，患者的血红蛋白(Hgb)水平在8-18g/dL之间。在一些实施例中，在施用病毒载体前，患者的白细胞(WBC)计数少于20000个/mm3。
治疗方法的功效可以在治疗前后使用各种运动技能测试来确定。特别是，开发了费城儿童医院婴儿神经肌肉障碍测试(Children’s Hospital of Philadelphia InfantTest of Neuromuscular Disorders(CHOP INTEND))来评估I型SMA患者的运动技能。Glanzman等人,“The Children’s Hospital of Philadelphia Infant Test ofNeuromuscular Disorders(CHOP INTEND):Test development and reliability.[费城儿童医院婴儿神经肌肉障碍测试(CHOP INTEND)：测试开发和可靠性]”NeuromuscularDisorders[神经肌肉障碍],20(3):155-161。使用婴儿运动表现测试(TIMP)和费城儿童医院SMA强度测试(CHOP TOSS)(新设计的SMA运动评估)对26名平均年龄11.5个月(1.4-37.9个月)的I型SMA患儿进行评估后，开发了CHOP INTEND测试。治疗功效的测试不限于CHOPINTEND测试，还可以包括本领域已知的其它运动技能测试，包括但不限于TIMP、CHOP TOSS、皮博迪发育运动量表(Peabody Development Motor Scales)、布雷泽尔顿新生儿行为评估(Brazelton Neonatal Behavior Assessment)测试、运动里程碑发育调查、通过交互式视频评估(ACTIVE)捕获的能力、贝利婴儿发育量表(Bayley Scale of Infant Development)和复合运动动作电位(CMAP)的测量。
在一些实施例中，使用CHOP INTEND量表执行治疗前的基线测试。在一个实施例中，在随访期间使用CHOP INTEND量表来确定治疗的功效。在一些实施例中，CHOP INTEND包括头部控制，翻正反应，在支撑的坐位、仰卧和俯卧位置中的躯干运动的测量。在一些实施例中，CHOP INTEND包括辅助翻身、仰卧位悬吊和支撑的站立中的反重力运动的测量。
在许多涉及AAV载体的基因疗法研究中，已经观察到对AAV载体的抗原特异性T细胞应答，并且可能在基因转移后2-4周之间发生。此类抗原特异性T细胞反应的一种可能结果是转导细胞的清除和转基因表达的丧失。为了抑制宿主对基于AAV的疗法的免疫应答，可以给患者给予免疫抑制剂。在一些实施例中，可以在施用病毒载体前给予患者糖皮质激素。在一些实施例中，可以在施用病毒载体前给予患者皮质类固醇。在一些实施例中，可以在施用病毒载体前给予患者口服类固醇。口服类固醇的实例包括但不限于泼尼松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、曲安奈德、倍他米松、地塞米松和氢化可的松。在一些实施例中，口服类固醇是或包含泼尼松龙。在一些实施例中，患者在施用病毒载体前至少24小时开始使用预防性类固醇。在一些实施例中，在施用病毒载体后给予患者口服类固醇至少30天。在一些实施例中，口服类固醇每日施用一次。在一些实施例中，口服类固醇每日施用两次。在一些实施例中，口服类固醇以约0.1-10mg/kg，例如约1mg/kg的剂量给予。在一些实施例中，口服类固醇以约0.1-10mg/kg/天，例如约1mg/kg/天的剂量给予。在一些实施例中，在施用病毒载体后监测AST和ALT的水平。在这样的实施例中，当AST和ALT水平超过正常上限(例如由本领域已知的临床标准和方法确定)的两倍或约120IU/L时施用口服类固醇治疗。在一些实施例中，只要AST和ALT水平超过正常上限(例如由本领域已知的临床标准和方法确定)的两倍或者超过约120IU/L，则口施用口服类固醇治疗超过30天。在皮质类固醇持续治疗期间，肾上腺自然减少皮质醇的产生。如果突然停止皮质类固醇治疗，身体可能会经历皮质醇缺乏。在给患者口服类固醇至少30天的一些实施例中，类固醇剂量在时间表上缓慢渐减。在一些实施例中，当AST和ALT水平下降低于正常上限(例如由本领域已知的临床标准和方法确定)的两倍或约120IU/L时渐减口服类固醇剂量。在一些实施例中，渐减包括阶梯式递减至0.5mg/kg/天，持续2周，然后是0.25mg/kg/天，再持续2周。在一些其他实施例中，口服类固醇的渐减由医生自行决定。
试剂盒
本发明还提供了用于治疗有需要的患者的SMA的试剂盒，其中所述试剂盒包括一个或多个剂量的药物组合物，所述药物组合物包含有效量或剂量的病毒载体，所述病毒载体包含本文公开的SMN多核苷酸，并且取决于SMA的类型(如本文进一步公开的)，所述试剂盒还包括造影剂(-例如，欧乃派克180)，以及关于如何使用所述药物制剂或组合物和所述造影剂的说明。
在一些实施例中，试剂盒包含病毒载体药物组合物的小瓶。在一些实施例中，病毒载体药物组合物的浓度为约1.7-2.3x 1013vg/mL。在一些实施例中，病毒载体药物组合物的浓度为约1.9-2.1x 1013vg/mL。在一些实施例中，病毒载体药物组合物的浓度为约2.0x1013vg/mL。在一些实施例中，小瓶包含约5.9mL病毒载体药物组合物。在一些实施例中，小瓶包含约8.7mL病毒载体药物组合物。在一些实施例中，试剂盒不包含5.9mL小瓶、包含至少一个5.9mL小瓶、包含至少两个5.9mL小瓶或包含至少三个5.9mL小瓶。在一些实施例中，试剂盒不包含8.7mL小瓶，包含至少一个8.7mL小瓶、包含至少两个8.7mL小瓶、包含至少三个8.7mL小瓶、包含至少四个8.7mL小瓶、包含至少五个8.7mL小瓶、包含至少六个8.7mL小瓶。
在试剂盒用于治疗患者的I型SMA的一些实施例中，确定患者的体重。在试剂盒用于治疗患者的I型SMA的一些实施例中，患者的重量为至少约2.6kg。在试剂盒用于治疗患者的I型SMA的一些实施例中，患者的重量为不大于约8.5kg。在试剂盒用于治疗患者的I型SMA的一些实施例中，患者的重量为约2.6-8.5kg。在试剂盒用于治疗患者的I型SMA的一些实施例中，将试剂盒中小瓶中的AAV病毒载体施用给患者。在试剂盒用于治疗患者的I型SMA的一些实施例中，将试剂盒中小瓶中的AAV病毒载体以约1.0-2.5x 1014vg/kg的剂量施用给患者。在试剂盒用于治疗患者的I型SMA的一些实施例中，将试剂盒中小瓶中的AAV病毒载体以约1.1x 1014vg/kg的剂量施用给患者。在试剂盒用于治疗患者的I型SMA的一些实施例中，将试剂盒中小瓶中的AAV病毒载体经约45-70分钟输注到患者体内。在试剂盒用于治疗患者的I型SMA的一些实施例中，将试剂盒中小瓶中的AAV病毒载体经约60分钟输注到患者体内。在试剂盒用于治疗患者的I型SMA的一些实施例中，使用输注泵、蠕动泵或本领域已知的任何其他设备将试剂盒中的小瓶中的AAV病毒载体输注到患者体内。在试剂盒用于治疗患者的I型SMA的一些实施例中，使用注射泵将试剂盒中小瓶中的AAV病毒载体输注到患者体内。
在一个实施例中，静脉内或鞘内施用载体。在一个实施例中，静脉内施用载体。在一个实施例中，载体与欧乃派克180一起静脉内施用。在另一个实施例中，载体与欧乃派克180一起鞘内施用。
在另一个方面，本文考虑了用rAAV转导患者的靶细胞(包括但不限于神经细胞或胶质细胞)的方法。
本文公开的用rAAV转导患者细胞可导致rAAV编码的多肽或RNA的持续表达。因此，本公开提供了给动物或人类患者施用/递送rAAV(例如，编码SMN蛋白)的方法。这些方法包括用一种或多种rAAV转导神经细胞和/或胶质细胞。可以用包含组织特异性控制元件的基因盒进行转导。例如，允许在神经元内特异性表达或在星形胶质细胞内特异性表达的启动子。实例包括神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白启动子。也可以开发在摄入药物控制下的诱导型启动子。
在一些方面，考虑了相对于本公开的载体未与造影剂组合使用时的转导，当本公开的载体与本文所述的造影剂组合使用时细胞的转导增加。在各种实施例中，相对于本公开的载体未与造影剂组合使用时的转导，当本公开的载体与本文所述的造影剂组合使用时细胞的转导增加至少约1％或至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约120％、至少约150％、至少约180％、至少约200％、至少约250％、至少约300％、至少约350％、至少约400％、至少约450％、至少约500％或更高。在其它实施例中，相对于本公开的载体未与造影剂组合使用时的转导，当本公开的载体与本文所述的造影剂组合使用时细胞的转导增加约10％至约50％、或约10％至约100％、或约5％至约10％、或约5％至约50％、或约1％至约500％、或约10％至约200％、或约10％至约300％、或约10％至约400％、或约100％至约500％、或约150％至约300％、或约200％至约500％。
本发明还提供了这样的方面，其中将本公开的载体和造影剂鞘内施用给有需要的患者的中枢神经系统导致患者的存活相对于在不存在造影剂的情况下施用本公开的载体时患者的存活增加。在各种实施例中，本发明的载体和造影剂分别鞘内施用到有需要的患者的中枢神经系统。在其他实施例中，载体和造影剂被共同配制并鞘内施用给中枢神经系统或有需要的患者。在其他实施例中，载体和造影剂被提供在相同的包装中，用于鞘内施用给中枢神经系统或有需要的患者。在各种实施例中，将本公开的载体和造影剂施用给有需要的患者的中枢神经系统导致患者的存活相对于在不存在造影剂的情况下施用本公开的载体时患者的存活增加至少约1％、至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约150％、至少约200％或更多。
在一些方面，考虑了当本公开的载体与造影剂组合使用时并且当将患者置于特伦德伦伯卧位(头向下位置)时，细胞的转导进一步增加。在一些实施例中，例如，在鞘内载体输注期间或之后，患者在头向下位置倾斜约1度至约30度、约15至约30度、约30至约60度、约60至约90度、或约90达至约180度。在各种实施例中，相对于本公开的载体未与造影剂和特伦德伦伯卧位组合使用时的转导，当本公开的载体与本文所述的造影剂和特伦德伦伯卧位组合使用时细胞的转导增加至少约1％或至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约120％、至少约150％、至少约180％、至少约200％、至少约250％、至少约300％、至少约350％、至少约400％、至少约450％、至少约500％或更高。在其它实施例中，相对于本公开的载体未与造影剂和特伦德伦伯卧位组合使用时的转导，当本公开的载体与本文所述的造影剂和特伦德伦伯卧位组合使用时细胞的转导增加约10％至约50％、或约10％至约100％、或约5％至约10％、或约5％至约50％、或约1％至约500％、或约10％至约200％、或约10％至约300％、或约10％至约400％、或约100％至约500％、或约150％至约300％、或约200％至约500％。
本发明还提供了这样的方面，其中将本公开的载体和造影剂鞘内施用给处于特伦德伦伯卧位的有需要的患者的中枢神经系统导致患者的存活相对于在不存在造影剂和特伦德伦伯卧位的情况下施用本公开的载体时患者的存活进一步增加。在各种实施例中，将本公开的载体和造影剂施用给处于特伦德伦伯卧位的有需要的患者的中枢神经系统导致患者的存活相对于在不存在造影剂和特伦德伦伯卧位的情况下施用本公开的载体时患者的存活增加至少约1％、至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约150％、至少约200％或更多。
除非上下文另外清楚地规定，否则如本公开和所附权利要求中所使用的，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该(the)”包括复数个指示物。“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件或情况，可能发生或不发生，并且该描述包括其中事件、情况或组分发生的例子以及其中不发生该事件或情况的例子。例如，短语任选的组合物可以包含组合是指组合物可以包含不同分子的组合或者可以不包含组合，使得所述描述包括组合和不包括组合(即组合的单独成员)两者。在本文中范围可以表达为从“约”一个具体值，和/或至“约”其他具体值。当表达这样的范围时，另一方面包括从一个具体值和/或到另一个具体值。类似地，当通过使用先行词“约”将值表示为近似值时，将理解该特定值形成另一个方面。将进一步理解，每个范围的端点相对于其他端点都是重要的，并且独立于其他端点。
通过以下实施例进一步说明本公开，不应将所述实施例视为限制。出于所有目的，在本申请中引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容以及附图通过引用将其全部并入本文。
实例
以下实例应被认为是说明性的，而不是限制上述公开的范围。
实例1-前GMP主细胞库的生成
方法
解冻：将单细胞小瓶(1x 106个细胞)在37℃水浴中解冻约1分钟，并将内容物稀释在5mL预温的完全生长培养基中。将细胞转移到T-25cm2烧瓶中，并在37℃培养箱中生长4天，每天用预先加热的完全生长培养基替换培养基。
针对增加的粘附性的选择：使用以下技术培养细胞以选择强粘附细胞。当细胞在25cm2烧瓶中达到95％汇合时，将细胞传代培养。细胞用5mL PBS洗涤，然后用0.5-1mLHyQTase在室温下解离约2分钟。通过添加5mL完全生长培养基终止解离，并反复移液以解离细胞团。然后将细胞悬浮液以200x g离心4分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于10mL完全生长培养基中。将细胞转移到75cm2烧瓶中。在37℃培养箱中孵育4小时后，用抽吸细胞培养基洗去弱粘附细胞，以去除弱粘附和非粘附细胞。用10mL预热的完全生长培养基代替培养基。通过目测，这一过程使细胞质量减少多达35％。细胞在再次传代培养之前再孵育2天。该选择过程(由在接种后4小时更换培养基组成)在扩增所选择的细胞群之前进行三次(图2和图3)。在最后的选择步骤中，将细胞接种到2x 175cm2烧瓶中，最终体积为25mL。注意到在最后4小时的接种后培养基改变后细胞损失减少。
细胞扩增：一旦细胞在2x 175cm2烧瓶中汇合，随后扩增细胞。用15mL PBS洗涤细胞，然后用3mL HyQTase解离细胞，并在室温下孵育约2分钟。通过添加10mL完全生长培养基终止解离。一旦吸出上清液，离心细胞悬浮液以产生2个细胞沉淀。将每个沉淀重新悬浮在8mL完全生长培养基中，并将2mL该浓缩细胞悬浮液加入8x 175cm2烧瓶中。通过添加20mL完全生长培养基准备烧瓶，得到总共22mL细胞悬浮液，并且分开比为1:4。下一个扩增步骤使用了相同的程序，但有以下变化：4x 175cm2烧瓶以1:2的分开比扩增，并且4x 175cm2烧瓶以1:3的分开比扩增。这导致总共20x 175cm2烧瓶。
收获：从20x 175cm2烧瓶中收集细胞。用15mL PBS洗涤细胞，然后用3mL HyQTase解离，如前所述。通过添加10mL完全生长培养基终止细胞解离，并收集到50mL试管中，其中来自4x 175cm2烧瓶的细胞悬浮液加入到1x 50mL试管中。这导致5x 50mL试管，每个试管中有40mL细胞悬浮液。离心试管以产生细胞沉淀，吸出上清液，并用10mL完全生长培养基重新悬浮细胞，得到50mL细胞悬浮液。
将体积分开进入2x 50mL试管，每管共25mL细胞悬浮液。将1:2稀释的样品用于使用血细胞仪和甲苯胺(Toludine)(台盼)蓝计算每管细胞的活细胞计数。管1样品的活细胞计数为1.99x 106个细胞/mL，产生3.98x 106个细胞/mL的细胞浓度，管2样品的活细胞计数为2.4x 106个细胞/mL(总1x 108个细胞)，产生4.8x 106个细胞/mL(总1.2x 108个细胞)的细胞浓度。这样，总共收获2.2x 108个细胞。将两个试管再次离心(6分钟，200x g)，并将沉淀分别再悬浮在10mL(试管1)和12mL(试管2)的冷冻培养基中，以调节细胞浓度至1x 107个细胞/mL。池化两个细胞悬浮液，并将1mL等分样品(每个含有1x 107个细胞)填充到22个无菌冷冻瓶中(表3)。
表3：总收获细胞的计算
Figure BDA0002574379020000811
然后将填充好的小瓶与新鲜异丙醇转移到冷冻室中，在-80℃的冷冻箱中过夜，进行受控速率冷冻。然后将冷冻的小瓶转移到液氮罐中的气相液氮中。将10个小瓶在干冰上转移到GMP设施中储存。
将来自ATCC的HEK293细胞解冻，并在扩增和种子库成功建立之前成功地以3代培养适应增加的粘附。针对生长和不定因子(支原体、真菌和细菌)的存在对种子库的进行了测试。测试表明，种子库适合于GMP设施的主细胞库。
实例2-上游工艺
上游工艺(参见例如图4)用于生产衍生自工作细胞库的中间体，其中所述上游工艺包括以下步骤：(a)培养粘附细胞，(b)用如图1所示的三种质粒(例如，包含本文所述的AAV SMN)转染所述培养的细胞，以能够产生所述AAV病毒载体，(c)裂解所述粘附细胞以分离所述AAV病毒载体，(d)通过过滤纯化所述病毒颗粒以去除任何完整的细胞或细胞碎片，以及(e)将(d)的纯化的产物进行切向流过滤，以及(f)冷冻经纯化的病毒颗粒的所得中间体制剂。在可替代的实施例中，用本文公开的上游工艺制备的AAV编码靶向本文公开的SOD1或MECP2的shRNA。
(a)培养粘附细胞
解冻HEK293细胞并用CO2培养箱在一次性烧瓶中扩增七代。解冻的细胞用细胞扩增生长培养基洗涤，离心并用新鲜的细胞扩增生长培养基重悬浮。将重悬浮的细胞接种到含有细胞扩增生长培养基的烧瓶中并孵育。
当细胞汇合时，用DPBS洗涤所述细胞，并且用TrypLE Select酶溶液从烧瓶中取出。添加细胞扩增生长培养基以中和酶溶液，并且将悬浮的细胞分开并重新接种到含有细胞扩增生长培养基的新烧瓶中。这样的扩增过程重复7次。在最后一次迭代中，悬浮的细胞没有重新接种到烧瓶中，而是将细胞浆液接种到生物反应器中进行进一步的扩增。
制备iCELLis 500/200m2或iCELLis 500/333m2粘附细胞生物反应器用于接种前的接种。准备活动包括一次性生物反应器的拆包、物理检查、泄漏测试、管道组件连接和探针平衡。充入细胞扩增生长培养基以平衡生物反应器。一旦pH(pH 6.9-7.5)、温度(35℃-39℃)和溶解氧(40％-125％)被证实在规定的范围内，生物反应器以4800-7000个细胞/cm2(对于200m2反应器)或5000-12000个细胞/cm2(对于333m2反应器)的目标接种密度接种。将来自前一步骤的细胞浆液添加到再循环培养基袋中的培养基中，并循环通过生物反应器。
(b)转染粘附细胞
在生物反应器接种后的第4、5或6天，用三重DNA质粒PEI共沉淀转染粘附HEK293细胞。用于该转染的3种质粒是pSMN、pAAV2/9和pHELP。将用于细胞扩增的DMEM生长培养基从生物反应器中移除，用转染培养基代替。在大规模粘附细胞生物反应器中使用聚乙烯亚胺(“PEI”)共沉淀，使用三重DNA质粒转染到粘附人胚胎肾(HEK293)细胞中，制备scAAV9.CB.SMN载体。载体质粒pSMN包含人运动神经元存活蛋白(SMN)的cDNA。用于该转染的3种质粒是pSMN(222mg)、pAAV2/9(333mg)和pHELP(444mg)。质粒可以1:1:1摩尔比转染。在添加PEI-质粒共沉淀之前，使转染培养基在生物反应器中平衡，直到生物反应器温度>30℃。PEI-质粒共沉淀过程包括将质粒添加到转染培养基中，并进行0.2μ过滤到反应袋中。将PEI添加到转染培养基中，然后添加到反应袋中。PEI-质粒的重量比为约1:1。人工混合PEI-质粒反应形成均相悬浮液，并且反应经15-30分钟。在反应时间结束时，PEI-质粒共沉淀从反应袋转移到生物反应器中。在重新开始搅拌之前，使PEI-质粒共沉淀在生物反应器中混合1-2小时(实例7中描述了可替代的持续时间)。转染培养基在生物反应器中再循环18-24小时，然后进行下一次培养基更换。
在生物反应器第6天，转染后18-24小时，生物反应器排空，并用转染后培养基替换转染培养基再循环培养基袋。用转染后培养基重新填充生物反应器，并在生物反应器中再循环。在第7天，在第6天更换培养基后18-24小时，用新鲜袋的转染后培养基替换再循环袋中的转染后培养基。在此步骤中，生物反应器不排空。培养基的再循环一直持续到收获，通常在第9天。
(c)裂解转染的粘附细胞
在生物反应器中9天后，从反应器中提取最终的预收获样品，并启动全细胞裂解过程。将Benzonase加入生物反应器中至终浓度为100U/mL。使Benzonase在反应器中混合，并向反应器中添加裂解缓冲液。裂解缓冲液在反应器中于15℃-25℃混合2小时，然后将生物反应器的内容物转移到收获袋中。将淬灭Benzonase反应的盐蔗糖溶液(SSS)添加到收获袋中并混合15分钟。然后用生物反应器漂洗缓冲液漂洗生物反应器15分钟，然后将漂洗液与淬灭的细胞裂解液一起收集到收获物收集袋中。一旦将漂洗液加入收集袋中，将内容物混合15分钟，并取批量收获样品。
(d)通过过滤和切向流过滤制备病毒颗粒
混合的批量收获物通过POD深度过滤器过滤到收集袋中。一旦所有批量收获都被过滤，用TFF1缓冲液追洗深度过滤器。对深度过滤池进行混合并且取样。然后，深度过滤器池通过0.45μm过滤器过滤，以进一步澄清批量收获材料。然后利用TFF1缓冲液对0.45μm过滤器进行追洗。
对于TFF1步骤，5.0m2的300kDa MW截留值的再生纤维素膜盒被冲洗，用NaOH溶液消毒并用TFF1缓冲液平衡。该操作的浓缩阶段被设计为将澄清收获物的体积减少约10x。一旦达到目标滞留物体积，开始渗滤操作。用6个渗滤体积的TFF1缓冲液渗滤滞留物。可替代地，可以用超过6个渗滤体积的TFF1缓冲液，例如10个渗滤体积、12个渗滤体积或15个渗滤体积，渗滤所述滞留物。一旦达到6个渗滤体积的渗透总流量，再次浓缩滞留物并收获到收集袋中。对膜进行两次连续漂洗，以使从TFF系统中的产物回收最大化，从而产生中间原料药。
(e)冷冻中间体
将TFF1中间体等分放入LFH罩内的1升或2升无菌PETG瓶中，然后在干冰或冷冻箱中冷冻，并转移至-60℃储存。
表4：上游工艺中使用的缓冲液
Figure BDA0002574379020000841
实例3-下游工艺
使用下游工艺(见例如图5)将TFF1中间体处理成经过滤的原料药。在一些实施例中，本文公开的下游工艺可用于处理中间体，所述中间体包括如本文所述的AAV SMN、AAVMECP2或编码靶向SOD1的AAV shRNA。下游工艺步骤包括：(a)酸化和澄清中间体(使用过滤)，(b)使用阳离子交换色谱纯化，(c)使用切向流过滤(“TFF2”)进行过滤，(d)使用CsCl缓冲液进行超速离心以分离填充的和空的病毒衣壳，(e)收集AAV病毒载体，和(d)使用第二切向流过滤(“TFF3”)步骤过滤收集的AAV病毒载体。
(a)酸化和澄清
将来自上游工艺的TFF1中间体材料(如果先前冷冻，则解冻至室温)用混合器泵入袋中。混合池化的TFF1中间体，并取样品测定效价。通过添加11％-14％的吐温20立即处理池化的TFF1中间体。在酸性pH条件下，吐温20用于促进宿主细胞蛋白和DNA的批量絮凝。将混合物孵育12-20小时。然后通过添加酸化缓冲液(1M甘氨酸)将pH降低到pH 3.3-3.7。然后将溶液过滤通过1.1m2 Clarisolve和2.2m2 Millistak+C0HC深度过滤器和0.45μm精制过滤器，去除pH降低后形成的沉淀。该过程得到酸化且澄清的TFF中间体。
(b)阳离子交换色谱纯化
阳离子交换(CEX)色谱步骤用于将病毒衣壳与蛋白质、DNA和其他工艺杂质(例如宿主细胞脂质，吐温(TWEEN)20)分离。该步骤利用使用自动过程色谱系统操作的CIMmultusS03-8000高级复合柱(磺酰基)(0.2μm孔)色谱柱(8.0L)。缓冲液和溶液如下表所示：
表5：一个CEX循环的缓冲液和溶液
Figure BDA0002574379020000861
将酸化且澄清的TFF中间体(即CEX负载)装载到清洁并平衡的CEX柱上。所述条件使得病毒载体与整体柱结合。用CEX A缓冲液从柱中洗涤未结合的材料。将产物用在CEX A缓冲液中的CEX B缓冲液梯度从树脂洗脱。在洗脱梯度开始时开始收集级分1，收集10个柱体积(CV)，规定体积为2.3-2.7CV。色谱柱在每批后丢弃(即色谱柱不重复使用)。然后使用中和缓冲液将CEX产物洗脱液(级分2)中和至pH 7.7-8.3。
(c)切向流过滤(TFF2)
TFF2步骤浓缩病毒载体，去除蛋白质杂质，并将缓冲液交换为用于CsCl超速离心步骤的适当缓冲液。中和的CEX洗脱液使用装有0.3m2的300kDa MWCO再生纤维素膜的TFF系统处理。
将中和的CEX洗脱液的体积减少到目标滞留物体积。一旦达到目标滞留物体积，以不连续TFF模式(批处理模式)开始渗滤。用TFF2 NaCl渗滤缓冲液将滞留物稀释2倍，并且滞留物浓缩至其初始体积。重复此操作，直到用TFF2 NaCl渗滤缓冲液完成渗滤。然后用TFF2CsCl渗滤缓冲液将滞留物稀释2倍，并将滞留物浓缩至其初始体积。重复此操作，直到用TFF2 NaCl渗滤缓冲液完成渗滤。
基于中和的CEX洗脱液的物理效价、系统滞留体积、系统冲洗体积和滞留物密度，将滞留物进一步浓缩至最终质量，以达到所需的目标载体浓度，并回收到收集袋中。使用TFF2 CsCl渗滤缓冲液的系统的一个冲洗循环之后是产物排放，以最大限度地从TFF系统中回收产物。取TFF2滞留物的样品(其包含滞留物和冲洗物)用于物理效价测量。每批后丢弃TFF2膜盒(即TFF膜不重复使用)。
表6：TFF2的缓冲液
Figure BDA0002574379020000871
(d)CsCl超速离心
超速离心步骤的目的是利用氯化铯梯度超速离心从全衣壳去除空衣壳。将TFF2滞留物添加到超速离心管中并密封管。将管放置在超速离心机中，如自动Optima XPN 100超离心机系统或配备50.2Ti型转子或等效转子的等效系统。填充的管在20℃下以45,000rpm离心22小时。
(e)收集AAV病毒载体
离心步骤完成后，将试管从超速离心机中取出并置于生物安全柜中。将含有产物的管安装在废物容器上方的环形支架上。在试管正下方放置灯以使以下各项可视化：空衣壳条带(条带A，最高条带)、全衣壳双条带(条带B和条带C，双条带的上条带和下条带)以及双条带下方的最低条带(条带D)。用附接在注射器上的针头刺穿管以使管通气，用针头去除条带B、C和D。收集的材料被转移到收集袋中。用TFF2缓冲液稀释收集的超速离心池(UC池)，以达到TFF2负载材料中一致的起始CsCl浓度。稀释的UC池在TFF3步骤中处理。CsCl超速离心步骤的缓冲液列于下表：
表7：CsCl超速离心的缓冲液
Figure BDA0002574379020000881
(f)切向流过滤(TFF3)
TFF3步骤去除CsCl并使用最终配制缓冲液浓缩全载体。采用切向流过滤系统与50cm2的300kDa MWCO再生纤维素膜联合使用。病毒载体被膜滞留。
将稀释的UC池的体积减少到目标滞留物体积。一旦达到目标体积，开始以恒定的滞留物体积进行连续渗滤。滞留物用TFF3缓冲液渗滤。取渗滤的滞留物的样品用于物理效价测定。通过以渗透重量为目标进一步浓缩滞留物，渗透重量通过以下计算：1)渗滤结束时TFF系统中滞留物的体积，2)稀释的UC池物理效价，3)目标原料药(DS)浓度，4)系统冲洗物和过滤器冲洗物的组合体积，以及5)TFF3缓冲液的密度。每批后丢弃TFF3膜盒(即盒不重复使用)。
表8：TFF3的缓冲液
Figure BDA0002574379020000882
用TFF3缓冲液对TFF膜进行两次连续的20mL漂洗，以从TFF系统中回收载体。漂洗液通过0.2mm Pall
Figure BDA0002574379020000883
EKV无菌级过滤器(Mini Kleenpak)回收。用TFF3缓冲液进行过滤器漂洗，以回收过滤器中剩余的任何载体，并调节过滤的TFF3池(即原料药DS)的最终体积。将DS等分到125mL或250mL PETG瓶中，并且在<-60℃条件下冷冻。
实例4-配制和填充
药物产品(DP)为单剂量，无防腐剂，无菌，透明至稍不透明，无色至淡白色，以目标浓度2.0x 1013vg/ml静脉输注非复制型自互补AAV9载体。DP包含20mM Tris、1mM MgCl2、200mM NaCl、0.005％w/v泊洛沙姆188。溶液的pH范围为7.7至8.3。
表9：药物产品装置操作-缓冲剂组成
Figure BDA0002574379020000891
将DP装入无菌、即用、10ml Crystal Zenith(CZ)小瓶中，用无菌、即用、氯丁基弹性体塞子塞住，并用无菌、20mm翻转式铝封条密封。用5.5mL或8.3mL的标称填充体积填充小瓶。目标过量填充为0.4mL，小瓶填充5.9±0.1mL或8.7±0.1mL。
实例5-效力测定
所述药物产品的相对效力使用定量体内测定来测量。所述测定使用已建立的SMA疾病小鼠模型。SMAΔ7小鼠品系(杰克森实验室，#005025)的繁殖对在表型上正常，但其后代中约25％对于靶向的SMN基因突变为纯合子，并显示SMA样表型。到了第5天，他们出现肌肉无力的迹象，在接下来的一周里，他们出现异常的步态和跌倒的倾向。杰克森实验室(Jackson Laboratories)报告SMA样表型动物的平均存活时间为约15±2天。试点研究表明，具有SMA样表型的未治疗动物的中值存活时间为16.3天(几何平均数；n＝3个研究；每个研究10只小鼠)。
通过静脉内(IV)输注施用的生物活性药物产品产生作为剂量(vg/kg)的函数的存活时间的增加。相对于参考材料(先前批次载体)测量药物产品效力。通过液滴数字聚合酶链反应(ddPCR)确定药物产品和参考材料(载体基因组/mL；vg/mL)的效价。将载体在盐水中稀释以达到三个特定剂量水平中的每一个，这些剂量水平将施用给具有SMA样表型的小鼠。
如果测定通过了适用性，则测定结果被认为是可接受的。测定适用性由以下组成：
1.阴性对照样品的接受限度(15±2天，中值存活)
2.阳性对照样品的接受限度(>40天，中值存活)
3.参考标准中值存活剂量-应答曲线的接受限度
在本研究中使用先前批次(以下称为先前批次)的载体以确定以五种不同剂量水平(包括使用0.9％生理盐水溶液(未处理组)的0(零)剂量)给予药物产品(以下称为样品批次)时SMAΔ7小鼠的中值存活(天)之间的线性相关性。表10显示了使用先前批次参考批次的校准曲线。
表10：使用AVXS-101五个剂量水平的校准曲线
随时间变化的先前批次标准参考
Figure BDA0002574379020000901
*未确定(ND)-截止2017年8月24日中值存活(天)未达到
本研究的数据显示，中值存活剂量-应答曲线的线性范围为0-7.4vg/kg。通过比较先前批次参考标准品的线性回归曲线与药物产品样品批次的线性回归曲线，建立药物产品样品批次的相对效力。这是通过使用每条线性回归线(即参考标准品和测试品)的y截距和斜率的比值来完成的。百分比相对效力计算由下面的等式(1)描述：
％RP＝[(测试品的y截距/斜率)÷(参考标准品的y截距/斜率)]X 100(1)
阶段1临床试验中使用的先前批次用作参考标准批次，并指定效力为100％。
上述数据使用中值存活剂量-应答曲线的线性部分建立了初步测定接受标准，以确定药物产品临床批次的相对效力，如下所示：
·使用5个剂量(vg/kg)水平生成中值存活(天)剂量-应答曲线
·选择剂量0、1.2E+13和7.4E+13运行线性剂量应答模型。
·盐水(未治疗组)的适用性限度为13至17天的中值存活。
·参照标准样品的适用性限度为：
ο斜率≥2.0E-13
ο y截距≥16.00(天)
ο y截距/斜率比值≥8.5E+13
ο R2≥0.7
用Δ7小鼠模型证明SMA疗法(包括药物产品)的功效。中值存活为15天±2天，TFF3缓冲溶液(媒剂)处理的对照动物提供了可靠的基线对照，从中产品效力可以测量为中值存活的增加。药物产品的开发工作确定了三(3)个剂量(不包括媒剂处理的剂量)，这三(3)个剂量使用液滴数字PCR(ddPCR)由基因组效价确定，当施用的剂量(vg/kg)被对数变换并相对于处理的SMAΔ7新生小鼠的中值存活(天)作图时，这三(3)个剂量以线性相关性方式影响小鼠模型的存活。低、中、高效价标准参见表11中的标准效价(vg/mL)。此外，TFF缓冲液(媒剂)溶液用于零(0)校准曲线点和阴性对照。显示存活期≥40天的剂量(显示大于中值存活期翻倍的剂量)也被包括作为阳性对照。
表11：目标剂量
Figure BDA0002574379020000921
剂量溶液制剂(稀释方案实例参见表12。
阴性对照--TFF3缓冲溶液(药物产品最终配制缓冲液)用作阴性对照
阳性对照--使用TFF3缓冲溶液以1.10x 1014vg/kg制备测试品批次。稀释方案实例见表12。
参考标准溶液-使用TFF3缓冲溶液以表11中描述的三种浓度制备参考标准品批次。
表12：参考标准品和试品稀释方案(实例)
Figure BDA0002574379020000922
测试品制备-使用TFF3缓冲溶液稀释测试品。计算稀释度以产生每只小鼠的表11所示的测试剂量(vg/kg)，最终总体积为50μl。同时对12只小鼠进行稀释，用一个另外的体积作为阳性对照，目标是将处理小鼠的最低寿命增加到≥40天的中值存活(天)。
对照样品的接受界限
阴性对照组(未处理小鼠)--阴性对照组的测定接受界限是SMAΔ7小鼠达到15±2天的中值存活。此外，任何在≤10天内断气的小鼠将被排除在分析之外。
阳性对照(以目标临床剂量治疗的组)--阳性对照组的测定接受界限是治疗的小鼠的最低寿命是≥40天的中值存活。此外，任何在≤10天内断气的小鼠将被排除在分析之外。
参考标准剂量应答曲线的接受界限
将确定参考标准线性剂量应答曲线的测定适用性标准，所述曲线绘制中值存活(天)与施用剂量(vg/mL)之间的关系。测定适用性标准见表13。
表13：测定适用性标准(参考标准线性剂量-应答曲线)
Figure BDA0002574379020000931
Y截距/斜率比值--测定参考标准品和测试品的中值存活(天)相比于施用剂量(vg/kg)的线性回归曲线。计算每个线性回归的y截距与斜率的比值。
报告结果
相对效力结果的定性报告--在测定阳性对照材料的单点中值存活(天)读数≥40天之前，对每次测定的测定适用性标准进行评估。如果阳性对照组的中值存活≥40天，在满足以下标准的情况下，可处置测试品。
相对效力结果的定量报告--在对测试品的相对效力进行定量测定之前，对每个测定的测定适用性标准进行评估。一旦阳性对照达到≥40天，并且达到代表上限标准剂量7.5x 1013vg/kg的小鼠组的31±3天的中值存活，即可报告测试品的相对效力。测试品的相对效力百分比(％RP)将使用中值存活(天)剂量-应答的线性回归的y截距和斜率计算如下：
％RP＝100％*[(测试品y截距/斜率)÷(参考标准品y截距/斜率)]
实例6：表面活性剂灭活研究
为了分离低pH和吐温的影响，使用具有pH为7.6和4％-8％吐温-20的原料药TFF1中间体样品进行表面活性剂灭活研究。TFF1中间体中的吐温-20浓度比在整个过程中当在酸化之前将吐温-20添加到TFF1中间体中时低约2.5倍。这种更低的吐温-20浓度被认为是在原料药工艺中表面活性剂驱动的灭活的最坏情况。通过表面活性剂处理的病毒灭活步骤的测试品是含有4％-8％吐温-20的TFF-1中间体。为了评估通过表面活性剂处理步骤灭活病毒的能力，在重复实验中分别使用XMuLV和PRV用病毒掺加测试品。使用斑形成感染性测定来定量病毒。
TFF1制造步骤产生4％-8％吐温-20的表面活性剂浓度范围。池化TFF1中间体，在16℃-20℃的操作温度下，向TFF1中间体中再添加12％的吐温-20，混合时间为12-20小时。病毒清除过程在浓度为4％-8％的吐温-20和控制温度为16.0℃±0.1℃下进行。灭活过程的持续时间为120分钟，而典型的过程时间为16小时。
对于灭活过程，通过测量测试品的体积，平衡到目标温度，然后掺加病毒来制备灭活负载。在六(6)个时间点去除掺加的灭活负载的样品，以证明灭活随时间的动力学：<1分钟、15分钟、30分钟、60分钟、90分钟和120分钟。收集后，每个样品在生长培养基中稀释以停止病毒灭活，并进行病毒测定。为了提高90分钟和120分钟时的检测灵敏度，还对这些时间点的大量样品进行病毒测定。由于在用于该步骤的测试品中存在吐温-20，灭活负载的效价由掺加的病毒的效价和掺加的病毒的体积计算。
通过表面活性剂处理(吐温-20)的病毒灭活效果被显示是有效的，如在90分钟时间点上两种病毒的LRV值大于4log10所证明的。通过表面活性剂处理的灭活动力学如图6和图7所示，其为吐温-20表面活性剂处理期间经120分钟的病毒灭活速率的曲线图。
实例7：较高的接种密度、较早的转染和收获时间以及DNA/PEI混合时间对原料药生产的影响
评估了较高的接种密度、提前1天转染和收获以及DNA/PEI混合时间对DS生产的影响。在1.6m2生物反应器中一式两份地评估每种条件。
材料与方法
细胞规模扩大
将HEK 293细胞解冻后重悬于补充有10％FBS的DMEM中。在室温下以209x g离心5min，去除上清，并且添加新鲜DMEM+10％FBS。针对活细胞密度和活力来计数细胞，并且接种于2x T175 cm2烧瓶中，并且在37.0℃，5％CO2条件下孵育三天，直到培养物达到约90％汇合。对于每个细胞传代，去除用过的培养基，用0.08mL/cm2的PBS(-CaCl2，-MgCl2)洗涤烧瓶，然后用TrypLE Select(0.04mL/cm2)处理烧瓶，并在37.0℃，5％CO2下孵育2-3分钟。胰蛋白酶用DMEM+10％FBS(0.04mL/cm2)猝灭。细胞按照图8中的图表进行扩增和接种。
细胞接种和监测
将HEK 293细胞以8,000个细胞/cm2和12,000个细胞/cm2的目标密度在生长培养基(高糖DMEM+10％澳大利亚来源的FBS+1:100青霉素链霉素(Pen Strep))中在搅拌下接种到生物反应器中。工艺参数设定为pH 7.23、37.0℃、溶解氧(DO)55％、线速度2cm/s。接种后24小时，用DMEM生长培养基进行的再循环(0.188mL/cm2)开启至再循环速度(12.5mL/min)。使用Nova BioFlex读取每日采集的样品的离线pH值、代谢物和营养物。在接种后第四天(12,000个细胞/cm2)、第五天(8,000个细胞/cm2)和第九天，去除三个纤维并用1:1:1v/v PBS、A100和B100溶液(ChemoMetec公司)裂解，并计数(NucleoCounter NC-200)总细胞核以监测培养物生长。
转染
细胞接种后第四天(12,000个细胞/cm2)和第五天(8,000个细胞/cm2)，停止再循环，并且用质粒DNA和聚乙烯亚胺(PEI)转染每个生物反应器中的细胞。DNA和PEI以1:1mg/mg的比例混合。质粒DNA与pSMN质粒以1:1.5:2的质量比转染，pAAV2/9质粒和pHELP质粒添加如DMEM-/-培养基中；高葡萄糖、-CaCl2、-L-谷氨酰胺和0.2μM过滤并通过倒置混合。将PEI添加到DMEM-/-培养基中，并且通过倒置混合。然后将PEI添加到DNA中，通过倒置混合，并将在室温下孵育20分钟(对于8,000个细胞/cm2(对照)和12,000个细胞/cm2)。对于另两个8,000个细胞/cm2条件，DNA/PEI孵育1小时和2小时。对于所述四个条件中的每一个，该DNA/PEI复合物混合物用于转染两个生物反应器。向每个生物反应器中添加DNA/PEI复合物，并在工艺参数下孵育两小时。转染后两小时重新开启再循环回路。
转染后培养基更换
转染后24小时，移除生物反应器和再循环回路中的所有培养基，用OptiMEM+1:100Pen Strep(0.132mL/cm2)替换，并在工艺参数下再循环24小时。转染后48小时，仅从再循环中取出所有培养基，并用OptiMEM+1:100Pen Strep(12mL/min)替换，并在工艺参数下再循环。
收获
细胞接种后第八天(12,000个细胞/cm2)和第九天(8,000个细胞/cm2)，添加Benzonase(100U/mL)，用裂解缓冲液(50mM HEPES，1％吐温20)追洗，并在工艺参数下孵育两小时。将生物反应器排空，添加蔗糖盐溶液(500mM NaCl，1％w/v蔗糖)，并且将其通过倒置混合。在工艺参数下，用生物反应器漂洗缓冲液(500mM NaCl、1％w/v蔗糖、20mM Tris碱、1％v/v吐温20、1mM MgCl2.6H2O)洗涤生物反应器约15分钟。将生物反应器排空，并且将生物反应器漂洗缓冲液与粗品批次收获物池化，通过倒置混合，并且取样进行ddPCR测定。
深度过滤和切向流过滤
在第八天(12,000个细胞/cm2)和第九天(对照8,000个细胞/cm2)，收获细胞接种后生物反应器，取样并将粗裂解物池化用于每种条件(n＝2个生物反应器)。池化的裂解产物然后通过Millistak C0HC Pod，270cm2过滤器和Millipak 40，0.45μm，双孔，200cm2精制过滤器(EMD密理博公司(EMD Millipore))澄清。在C0HC+0.45后取样，并且于-80.0℃冷冻。然后通过切向流
Figure BDA0002574379020000972
2超滤模块PLCMK C 0.1m2过滤器(EMD密理博公司)将澄清的裂解物浓缩。使用至少6个渗滤体积对最终产物进行渗滤。获得TFF1过滤后的样品并在-80.0℃下冷冻。所有样品均针对AAV2/9效价和宿主细胞蛋白进行提交。
利用质粒在生物反应器中生产DS。数据代表每个条件(一式两份)，对应的生物反应器编号和条件如表14所示。
表14：生物反应器编号和对应的条件。
Figure BDA0002574379020000971
细胞生长：在接种当天(第0天)计数细胞，并在接种后第4天(12,000个细胞/cm2)、第5天(8,000个细胞/cm2)和第9天计数细胞核。数据表明，所有反应器中的细胞在第0天到第5天之间呈指数增长。转染后，第9天的细胞核计数表明，从第5天到第9天，生物反应器221在总细胞核方面增加了2.0倍。所有其他反应器(222到228)在第5天和第9天之间没有表现出显著的增长。生物反应器221中生长的增加可能是基于用于总细胞核计数的单个纤维上细胞的不均匀分布的伪影。根据图9A-E所示的代谢物数据，所有生物反应器中的细胞可能生长得相似。
pH、营养物和代谢物：所有生物反应器培养物中葡萄糖消耗趋势相同，表明尽管生物反应器221生长曲线增加，细胞消耗葡萄糖的速率相似。在头三天，在12,000个细胞/cm2下接种的生物反应器的pH平均为7.06，在8,000个细胞/cm2下接种的生物反应器的pH平均为7.18。pH随着养分代谢的增加而略有下降，到第9天随着铵离子水平的升高而升高。乳酸增加直到第5天(生物反应器221、223、224、225、227)和第6天(生物反应器222、226、228)，然后在接近生产结束时趋于稳定，这表明在该阶段使用乳酸作为能源。
生产效价
采用数字液滴法(ddPCR)对来自收获材料的病毒基因组进行测量。在以12,000个细胞/cm2接种的生物反应器中，效价比以8,000个细胞/cm2接种的对照生物反应器(平均效价为4.33E+10vg/mL(n＝2))高约1.5倍，平均效价为6.37E+10vg/mL(n＝2)。效价数据表明，以较高的密度接种、早一天转染和收获支持更高的DS产量。与DNA/PEI孵育20分钟的对照(4.33E 10vg/mL，n＝2)相比，DNA/PEI孵育一小时的效价产量在测量的平均效价方面显示出1.4倍的下降(3.17E 10vg/mL，n＝2)，而孵育两小时的测量的平均效价则显示出1.6倍的下降(2.67E10vg/mL，n＝2)。数据表明，较长的孵育时间导致效价下降。这可能是由于DNA和PEI形成大的复合物，其无法高效转染HEK293细胞。图10给出了病毒产量/mL和表面积值，并与作为阳性对照的已知工艺中的产量进行了比较。
在澄清和浓缩步骤的每个步骤测量的病毒效价如图11所示。TFF1步骤期间各步骤的残余宿主细胞蛋白如图12A-B所示。
实例8：接种密度对原料药生产的影响
研究了接种密度对DS生产的影响。对四种接种密度进行了评估，每种接种密度在生物反应器中是一式两份。
细胞规模扩大
将HEK 293细胞解冻后重悬于补充有10％FBS的DMEM中。在室温下以209x g离心5min，去除上清，并且添加新鲜DMEM+10％FBS。针对活细胞密度和活力来计数细胞，并且接种于2x T175 cm2烧瓶中，并且在37.0℃，5％CO2条件下孵育四天，直到培养物达到约90％汇合。对于每个细胞传代，去除用过的培养基，用0.08mL/cm2的PBS(-CaCl2，-MgCl2)洗涤烧瓶，然后用TrypLE Select(0.04mL/cm2)处理烧瓶，并在37.0℃，5％CO2下孵育2-3分钟。胰蛋白酶用DMEM+10％FBS(0.04mL/cm2)猝灭。细胞按照图13中的图表进行扩增和接种。
细胞接种和监测
用HEK 293细胞以四种目标密度接种生物反应器，每种密度是一式两份：8,000个细胞/cm2、9,350个细胞/cm2、10,700个细胞/cm2和12,050个细胞/cm2在700ml生长培养基(高葡萄糖DMEM+10％澳大利亚来源FBS+1:100Pen Strep)中，伴随搅拌。工艺参数设定为pH7.23、37.0℃、溶解氧(DO)55％、线速度2cm/s。接种后24小时，用DMEM生长培养基(现在的总体积为0.188mL/cm2)进行的再循环开启至再循环速度(12.5mL/min)。使用NovaBioProfile 400读取每日采集的样品的离线pH值、代谢物和营养物。在接种后第五天和第九天，去除三个纤维并用1:1:1v/v PBS、A100和B100溶液(ChemoMetec公司)裂解，并计数(NucleoCounter NC-200)总细胞核以监测培养物生长。
转染
细胞接种后第五天，停止再循环，用600ml DMEM-/-培养基(高葡萄糖，-CaCl2，-L谷氨酰胺)替换每个生物反应器室(不是再循环瓶)内的培养基。每个反应器用质粒DNA和聚乙烯亚胺(PEIpro)以1:1的质量比转染。质粒DNA以1:1.5:2的质量比(pSMN-3.56mg，pAAV2/9-5.34mg，以及pHELP-7.1mg)混合，添加到300mL DMEM-/-培养基中，0.2μM过滤，并且通过倒置混合。将PEI(16mL)添加到300mL DMEM-/-培养基中，并且通过倒置混合。将PEI和DNA混合物组合，通过倒置混合并在室温下孵育20分钟。每个600ml PEI/DNA复合物混合物用于转染两个生物反应器，对于每个相应的接种密度重复。将PEI/DNA复合物添加到每个生物反应器中，并在工艺参数下孵育两小时。在转染后两小时(12.5mL/min)返回再循环回路。
转染后培养基更换
转染后24小时，移除生物反应器和再循环回路中的所有培养基并用OptiMEM(0.132mL/cm2)替换，并在工艺参数下再循环(12.5mL/min)24小时。转染48小时后，再循环瓶中的培养基用新鲜OptiMEM更换，并以工艺参数(12mL/min)再循环。
收获
细胞接种后第九天，添加Benzonase(100U/mL)，用裂解缓冲液(50mM HEPES，1％吐温20)追洗，并在工艺参数下孵育两小时。将生物反应器排空，并且添加蔗糖盐溶液(500mMNaCl，1％w/v蔗糖)，通过倒置混合。在工艺参数下，用生物反应器漂洗缓冲液(500mM NaCl、1％w/v蔗糖、20mM Tris碱、1％v/v吐温20、1mM MgCl2.6H2O)洗涤生物反应器15分钟。将生物反应器排空，并且将生物反应器漂洗缓冲液与粗品批次收获物池化，通过反转混合，并且取样进行ddPCR测定。
利用质粒在生物反应器中生产原料药。以不同的密度接种反应器，并在相同的时间表(分别在接种后第5天，第9天)转染和收获。如下表15所示，数据代表每种接种密度的一式两份：
表15：起始接种密度生物反应器编号
8,000个细胞/cm<sup>2</sup> 221,222
9,350个细胞/cm<sup>2</sup> 223,224
10,700个细胞/cm<sup>2</sup> 225,226
12,050个细胞/cm<sup>2</sup> 227,228
细胞生长：接种当天(第0天)计数细胞，并且在接种后第5天和第9天计数细胞核。数据表明，所有反应器中的细胞在第0天到第5天之间呈指数增长。尽管起始接种密度不同，细胞核计数并不表明第5天组间细胞数量的重大差异。转染后，第9天的细胞核计数表明，反应器中的五个(221、224、225、226、228)的总细胞核从第5天到第9天增加了一倍。两个反应器(222、223)的总细胞核增加了1.4倍，如图14A所示。从第5天到第9天，反应器227的总细胞核增加了3.8倍。这种差异可能是基于用于计数的单个纤维之间细胞分布不均匀的伪影。根据图14B-E所示的代谢物数据，所有反应器中的细胞可能生长得相似。
pH、营养物和代谢物：葡萄糖消耗(图14B)在所有生物反应器培养物中趋势相同，表明尽管起始接种密度不同，培养物以相似的速率消耗葡萄糖。离线pH(图14C)在所有培养物中的前三天保持一致(pH7.25)，随着营养代谢的增加而下降，并且随着铵离子水平的升高而在第8天后增加(图14E)。乳酸盐(图14D)增加直到第6天，然后在接近生产结束时趋于稳定，这表明在此阶段利用乳酸盐作为能量源。在不同起始密度下接种的反应器之间，代谢产物谱没有观察到显著差异。这可能是因为起始接种密度的差异很小，<1.2倍差异。
生产效价
采用数字液滴法(ddPCR)对来自收获材料的病毒基因组进行测量。起始接种密度为8,000个细胞/cm2和10,070个细胞/cm2之间的效价具有可比性，平均分别为3.99E+10±2.1E+09vg/mL(n＝2)和3.70E+10±7.4E+09vg/mL(n＝2)。由于无法确定的原因，以9,350个细胞/cm2接种的反应器显示出5.02E+08vg/mL(n＝2)的平均效价测量值，比以侧翼密度接种的反应器的平均效价低约2个对数。这种差异很可能是转染或收获过程中未确定的操作错误的结果，而不是在这种接种密度下生产力的缺乏。以12,050个细胞/cm2接种的重复反应器彼此之间显示出两倍的差异，其中一个反应器在对于较低接种密度而观察到的范围内，为3.2E+10vg/ml，而第二个反应器产生的效价仅为1.4E+10vg/ml。病毒产量/mL和表面积值如图15A所示。
如图15B所示，评估了接种密度和DS产量。在8E+03至10E+03个细胞/cm2范围内接种的HEK 293细胞显示一致的生长谱、pH、葡萄糖消耗、乳酸和氨生成。此外，产生了可比的效价，表明稍微更高的接种密度不会对产量产生负面影响。相反，以12x 103个细胞/cm2的较高密度接种的反应器显示出重复之间的更多变异性，包括与其他条件相比较低的平均效价，表明本实验中使用的方法可能不是最佳的生产方法。这些结果支持在8x 103和1x 104个细胞/cm2的密度范围内接种细胞进行生物反应器实验。
实例9：可比性评估
将用于阶段1临床研究(工艺A)的AVXS-101药物产品与用于关键临床研究(工艺B)的药物产品之间的可比性作为主要目标进行评估，次要目标是通过比较药物产品批次600156和600307来评估使用工艺B的制造一致性。图16表示阶段1(工艺A)和阶段3试验(工艺B)的制造工艺流程以及它们之间的差异。
使用国立儿童医院(NCH)制造的阶段1临床药物产品批次NCHAAV9SMN0613和AveXis公司制造的药物产品批次600156进行可比性评估。
产物
对下列材料批次进行了评估，如表16所总结。所述评估包括直接比较来自使用工艺A的阶段1临床药物产品批次NCHAAV9SMN0613和使用工艺B的AVXS-101药物产品批次600156的结果质量属性。此外，对批次600156和批次600307的释放测试结果进行了整体评估，以确定放大工艺的可重复性和一致性。
表16：要评估的AVXS-101药物产品在工艺A(阶段1)和工艺B(阶段3)之间的可比性以及工艺B的制造一致性
Figure BDA0002574379020001031
制造工艺概述
图17A-B提供了可比性结果的总结。
可比性和制造一致性评估
工艺A和工艺B材料被评估为是可比性的，并且工艺B材料被评估为是一致的。工艺B材料也被确定具有另外的益处，例如，用于工业规模生产。
试验方法
pH
对批次NCHAAV9SMN0613(工艺A)、批次600156(工艺B)和批次600307(工艺B)进行pH分析。两种工艺的结果范围为7.9-8.0。这表明工艺A和工艺B材料的pH值具有可比性，并且工艺B材料是一致的。
外观
对批次NCHAAV9SMN0613(工艺A)、批次600156(工艺B)和批次600307(工艺B)进行外观目测。工艺A和工艺B在外观结果上的明显差异是由于不同的载体浓度(基因组效价)。批次NCH AAV9SMN0613具有比工艺B批次更低的载体浓度。结果，批次NCH AAV9SMN0613更稀释，导致更透明和无色的溶液，而工艺B批次的无色到白色和稍不透明的观察是由于溶液中每mL约4倍的病毒颗粒浓度。
考虑到浓度差异，工艺A和工艺B材料的外观被评估为是可比性的，并且工艺B材料被评估为是一致的。
渗透压摩尔浓度
对批次NCHAAV9SMN0613(工艺A)、批次600156(工艺B)和批次600307(工艺B)通过冰点降低进行渗透压摩尔浓度测量。两种工艺的结果范围为410-415mOSm/kg。这表明工艺A和工艺B材料的渗透压摩尔浓度具有可比性，并且工艺B材料是一致的。
亚可见颗粒
对批次NCHAAV9SMN0613(工艺A)、批次600156(工艺B)和批次600307(工艺B)通过光阻法进行亚可见颗粒测量。两种方法的结果都远远低于关于注射药物产品的USP专著中的推荐限值。这表明工艺A和工艺B材料的亚可见颗粒计数具有可比性，并且工艺B材料是一致的。
基因组效价
对批次NCHAAV9SMN0613(工艺A)、批次600156(工艺B)和批次600307(工艺B)通过ddPCR进行基因组效价测量。AVXS-101批次的基因组效价预计会根据生产中的目标浓度而波动。工艺B产生的基因组效价(3.7x 1013vg/mL和4.0x 1013vg/ml)比工艺A的基因组效价(1.1x 1013vg/mL)高至少3倍，因此工艺B是用于大规模制造AVXS-101的更好方法。
感染效价
对批次NCHAAV9SMN0613(工艺A)、批次600156(工艺B)和批次600307(工艺B)通过TCID50进行感染效价测量。工艺B(1.3x 1010IU/mL和6.7x 109IU/ml)比工艺A(5.9x 1010IU/mL)产生平均高66％的感染效价，这可能是有利的，例如用于rAAV例如AVXS-101的大规模制造。
总蛋白
对批次NCHAAV9SMN0613(工艺A)、批次600156(工艺B)和批次600307(工艺B)通过微BCA进行总蛋白测量。归一化至1.0x 1013vg/mL，两种方法的结果范围为167-179μg/mL。归一化的总蛋白值表明，工艺A和工艺B材料具有可比性，并且工艺B材料是一致的。
体内相对效力
批次NCHAAV9SMN0613用作测定的参考材料。基于参考标准曲线，批次600156和批次600307获得的各效力结果分别为97％和96％。这些结果表明，工艺A和工艺B材料具有可比性，并且工艺B材料是一致的。
通过蛋白质印迹测定的身份
对批次NCHAAV9SMN0613(工艺A)、批次600156(工艺B)和批次600307(工艺B)通过蛋白质印迹进行身份测定。主要条带(VP1、VP2和VP3)的印迹图谱和表观分子量值被评估为对于工艺A和工艺B材料具有可比性，并且还评估工艺B材料是一致的。
AUC空衣壳％
对批次NCHAAV9SMN0613(工艺A)、批次600156(工艺B)和批次600307(工艺B)通过AUC进行空衣壳％测量。批次NCHAAV9SMN0613(工艺A)的结果为7％。批次600156和600307(工艺B)的结果分别为2％和4％。通过AUC测定，工艺B(2％和4％)产生的空衣壳比工艺A(7％)少约两倍。因此，方法B能够产生包含较低浓度空衣壳的改进组合物。
通过SDS-PAGE测定的身份和纯度
对批次NCHAAV9SMN0613、批次600156(工艺B)及批次600307(工艺B)通过SDS-PAGE进行身份和纯度测定(工艺A)。两种工艺得到的总纯度％都≥98％，三种衣壳蛋白中每一种的带型和表观分子量高度一致。这些结果表明，工艺A和工艺B材料具有可比性，并且工艺B材料是一致的。
残余宿主细胞蛋白
对批次NCHAAV9SMN0613(工艺A)、批次600156(工艺B)和批次600307(工艺B)通过ELISA进行残余宿主细胞蛋白测量。对于所述测定，所有批次的结果都<LOQ(8ng/mL)。这些结果表明，工艺A和工艺B材料具有可比性，并且工艺B材料是一致的。
残余牛血清白蛋白(BSA)
对批次NCHAAV9SMN0613(工艺A)、批次600156(工艺B)和批次600307(工艺B)进行残余BSA测量。对于所述测定，所有批次的结果都<LOQ(0.50ng/mL)。这些结果表明，工艺A和工艺B材料具有可比性，并且工艺B材料是一致的。
残余Benzonase
对批次NCHAAV9SMN0613(工艺A)、批次600156(工艺B)和批次600307(工艺B)通过ELISA进行残余Benzonase测量。对于所述测定，所有批次的结果都<LOQ(0.20ng/mL)。这些结果表明，工艺A和工艺B材料具有可比性，并且工艺B材料是一致的。
残余宿主细胞DNA
对批次NCHAAV9SMN0613(工艺A)、批次600156(工艺B)和批次600307(工艺B)通过qPCR进行残余宿主细胞DNA测量。归一化为1.0x 1013vg/mL，工艺A的结果为3.7x 105pg/mL，工艺B的结果分别为0.76x 105pg/mL和0.68x 105pg/mL。因此，工艺B产生具有显著更低残余hcDNA的病毒载体，这可能是有利的，例如，用于rAAV例如AVXS-101的大规模制造。
统计分析
对定量质量属性进行统计分析。如下所列，在工艺A批次(NCHAAV9SMN0613)和每个工艺B批次(600156和600307)之间进行成对比较。这些结果如图18和19所示。
这些研究表明，工艺B是生产病毒载体的优越方法。工艺B一致性地产生较大数量的病毒载体(通过基因组效价和感染效价测量)，杂质少(残余hcDNA较低)，空衣壳较少。
下一代测序
还进行下一代测序(NGS)，以证实(确定和/或确认基因组序列)的身份，并评估来自工艺B的AVXS-101药物产品阶段3材料是否存在序列变异(亚群)。序列数据集与赞助者提供的参考序列(pscSMN)的比对揭示了基因组全长的完全(100％)宽度和足够深度的覆盖，以能够检测变异。总共有四个微小的变异位点被注意到，然而这些似乎代表了难以测序区域(例如，AAV的反向末端重复序列(ITR)，由于其高GC含量和回文序列而众所周知地难以测序)内的测序错误，而不是真正的变异。测序结果参见表17。
表17：来自工艺B的AVXS-101阶段3批次600156的DNA测序结果
Figure BDA0002574379020001081
阶段1批次NCHAAV9SMN0613稳定性曲线
批次NCHAAV9SMN0613在≤-60℃条件下储存12个月。在每个时间点，对批次进行分析。没有注意到不利的趋势。图20显示了迄今为止的稳定性结果。
完成了用于阶段1临床研究的AVXS-101的可比性研究。使用国立儿童医院制造的阶段1临床药物产品批次NCHAAV9SMN0613和AveXis公司制造的AVXS-101药物产品批次600156进行评估。此外，使用工艺B批次600156和600307评估制造一致性。对于可比性评估(工艺A相比于工艺B)和制造一致性(工艺B批次600156相比于600307)，所述研究使用新改进的工艺和分析方法评估了AVXS-101临床试验材料的身份、质量、纯度和效力，以能够对可比性和制造一致性进行稳健评估。
对定量质量属性进行统计分析。在工艺A批次NCHAAV9SMN0613和工艺B批次600156之间进行成对比较。与工艺A相比，工艺B是更好的方法，产生更高数量的纯度更高的病毒载体。例如，与工艺A相比，工艺B产生的病毒载体的感染效价高48％，基因组效价高8％，大于10μm大小的亚可见颗粒少92％，大于25μm大小的亚可见颗粒少50％，空衣壳少100％，残余hcDNA少11％。所有结果相对于每个质量属性的测试限度是一致的。
此外，为了建立使用工艺B的制造一致性，使用批次600156和600307进行成对比较。从工艺B批次600156和600307之间的这一初始成对比较的结果显示出在制造中的一致性。所有结果相对于每个质量属性的测试限度也是一致的。
基于结果评价，使用工艺A的阶段1临床药物产品批次NCHAAV9SMN0613和使用工艺B的AVXS-101药物产品批次600156的所得质量属性证明了工艺B产生更高数量的病毒载体和改进的纯度，这可能是有利的，例如，用于rAAV的大规模制造。此外，从工艺B产生的两批材料(批次600156和600307)被发现是可复制的，进一步显示出制造一致性。
实例10：分析型超速离心(AUC)分析
使用AUC方法分析来自阶段1(工艺A，批次NCHAAV9SMN0613)和阶段3(工艺B，批次600156和600307)的材料。图21、图22和图23分别显示了NCHAAV9SMN0613、600156和600307的AUC谱(一式两份地进行分析)。
每种材料的AUC分析显示空衣壳和全衣壳的相似沉降系数，其中当与空衣壳含量分别为2％和4％的阶段3材料(工艺B，批次600156和600307)相比时，阶段1材料(工艺A，批次NCHAAV9SMN0613)显示出升高的空衣壳含量(7％)。这是由于与工艺A所采用的碘克沙醇梯度超速离心制造步骤相比，工艺B中的CsCl梯度超速离心制造步骤能够更有效地将空衣壳与全衣壳分离。
在国立儿童医院生产的阶段1临床试验材料(NCHAAV9SMN0613)和AveXis公司的每个后续生产批次中，使用临床和商业展示的AVXS-101生产批次在经受使用超速离心的CsCl梯度纯化过程时一致地显示出三条可见的衣壳条带。基于使用工艺A的阶段1临床药物产品批次NCHAAV9SMN0613和使用工艺B的AVXS-101药物产品批次600156的AUC谱，这些材料被认为是可比较的。此外，工艺B产生的两批材料(批次600156和600307)的AUC谱被评估为是一致的。
实例11-上游工艺
使用上游工艺生产衍生自工作细胞库的中间体，其中所述上游工艺包括以下步骤：(a)培养细胞，(b)用图1所示的三种质粒转染所述培养的细胞，(c)在培养期后从所述细胞中收获扩增的病毒颗粒，(d)通过过滤来纯化所述病毒颗粒以去除任何完整的细胞或细胞碎片，(e)将来自步骤(d)的洗脱液进行切向流过滤，和(f)冷冻经纯化病毒颗粒的所得中间体制剂。
在转染前，细胞在合适的培养基中，在烧瓶或合适的生物反应器中(或在两者中)扩增。一种培养基为含10％FBS、4.5g/L葡萄糖、4mM L-谷氨酰胺的DMEM。在一个实施例中，粘附细胞最初在烧瓶中生长，然后转移到iCELLis生物反应器中，用于在生物反应器内进一步的粘附细胞扩增。
细胞扩增后，用三重DNA质粒PEI共沉淀转染粘附HEK293细胞。用于该转染的3种质粒是；pSMN、pAAV2/9和pHELP。用经修饰的DMEM转染培养基代替用于细胞扩增的DMEM生长培养基。DMEM转染培养基不含FBS、不含钙、不含L-谷氨酰胺和4.5g/L葡萄糖。在大规模粘附细胞生物反应器中，使用PEI共沉淀法将三重DNA质粒转染粘附HEK293细胞，制备scAAV9.CB.SMN载体。载体质粒pSMN含有人SMN的cDNA。用于该转染的3种质粒是；pSMN(222mg)、pAAV2/9(333mg)和pHELP(444mg)。在添加PEI-质粒共沉淀之前，使转染培养基在生物反应器中平衡，直到生物反应器温度>30℃。PEI-质粒共沉淀过程包括将质粒添加到转染培养基中，并进行0.2μ过滤到反应袋中。将PEI添加到转染培养基中，然后添加到反应袋中。人工混合PEI-质粒反应形成均相悬浮液，并且反应经15-30分钟。在反应时间结束时，将PEI-质粒共沉淀加入生物反应器中。使PEI-质粒共沉淀在生物反应器中混合1-2小时，然后重新开始再循环。DMEM生长培养基在生物反应器中再循环18-24小时，然后进行下一次培养基更换。
rAAV SMN基因组(SEQ ID NO:1的核苷酸980-3336)在序列中具有AAV2 ITR、带有巨细胞病毒增强子的鸡β肌动蛋白启动子、SV40内含子、(GenBank登录号NM_000344.2)中陈述的编码SMN的DNA、来自牛生长激素的聚腺苷酸化信号序列和另一个AAV2 ITR。SMN DNA的保守核苷酸取代也是可以考虑的(例如，GenBank登录号NM_000344.2的位置625的鸟嘌呤到腺嘌呤的变化)。基因组均缺乏AAV rep和cap DNA，即在基因组的ITR之间不存在AAV rep或cap DNA。所考虑的SMN多肽包括但不限于NCBI蛋白质数据库编号NP_000335.1中列出的人SMN1多肽。在Foust等人,Nature Biotechnology[自然生物技术]28(3):271-274(2010)中描述了rAAV9 SMN载体，其中载体基因组插入物的序列显示为SEQ ID NO:1)的核苷酸980-3336。
在生物反应器第6天，转染后18-24小时，生物反应器排空，用200升新鲜OptiMEM转染后培养基替换DMEM再循环培养基袋。将生物反应器重新填充64升，并重新启动生物反应器中的再循环。在第7天，在第6天更换培养基后的18-24小时，用一袋新鲜的OptiMEM培养基替换再循环袋中的OptiMEM转染后培养基(约135升)。在此步骤中，生物反应器不排空。培养基的再循环一直持续到在第9天收获。
在生物反应器中9天后，从反应器中提取最终的预收获样品，并启动细胞裂解过程。将Benzonase加入生物反应器中至终浓度为100U/mL。在使Benzonase在反应器中混合后，向反应器中添加7.1升裂解溶液。在第一收获步骤之前，将裂解溶液在反应器中混合2小时。在2小时裂解结束时，将生物反应器的内容物转移到收获袋中。向收获袋中添加8.9升盐蔗糖溶液(SSS)并混合15分钟。SSS溶液猝灭了收获培养基中的Benzonase。然后用生物反应器漂洗缓冲液漂洗生物反应器。对于生物反应器漂洗，向生物反应器中添加64升生物反应器漂洗缓冲液并混合15分钟。然后将漂洗液转移到共同收获物收集袋中。一旦将漂洗液加入收集袋中，将内容物混合15分钟，并取批量收获样品。
混合的批量收获物通过深度过滤器过滤到收集袋中。一旦所有批量收获都被过滤，用50升TFF1渗滤缓冲液追洗深度过滤器。对深度过滤池进行混合并且取样。然后，深度过滤器池通过0.45μm过滤器过滤，以进一步澄清批量收获材料。然后利用6升TFF1缓冲液对0.45μm过滤器进行追洗。
对于TFF1步骤，5.0m2的300kDa MW截留值的再生纤维素膜盒被冲洗，用NaOH溶液消毒并用TFF1缓冲液平衡。该操作的浓缩阶段被设计为将澄清收获物的体积减少约10x。一旦达到目标滞留物体积，开始渗滤操作。用6个渗滤体积的TFF1缓冲液渗滤滞留物。一旦达到6个渗滤体积的渗透总流量，再次浓缩滞留物并收获到收集袋中。对膜进行两次连续漂洗，以使从TFF系统中的产物回收最大化，从而产生中间原料药。将TFF1中间体等分放入LFH罩内的1升或2升无菌PETG瓶中，然后在干冰或冷冻箱中冷冻，并转移至-60℃储存。
表18：上游工艺中使用的缓冲液
Figure BDA0002574379020001121
实例12-下游工艺
使用下游工艺将中间体处理成经过滤的原料药。下游工艺步骤包括酸化和澄清步骤(使用过滤)，随后是阳离子交换色谱，切向流过滤(“TFF2”)，CsCl超速离心和进一步的切向流过滤步骤(“TFF3”)，以产生经过滤的原料药，其中纯化的AAV颗粒悬浮在药学上可接受的载体中。具体地说，下游工艺包含在TFF1中间体生产之后的以下制造步骤：解冻并且池化TFF1中间体、酸化和澄清、阳离子交换色谱(CEX)、切向流过滤(TFF2)、用于全/空衣壳分离的CsCl超速离心、用于浓缩/缓冲交换的切向流过滤(TFF3)、TFF3池材料过滤以产生原料药、原料药稀释和过滤以产生药物产品、药物产品储存和药物产品填充到小瓶中。
解冻TFF1中间体材料并轻轻混合。在酸性pH下，吐温20用于促进宿主细胞蛋白和DNA的批量絮凝。含15％吐温20的TFF1中间体池的pH降低用于CEX色谱(pH 3.5)。pH降低后形成的沉淀物经由过滤溶液通过深度且0.45μm过滤器来去除。
经4小时将吐温20(在20mM Tris、1mM MgCl2、500mM NaCl、1％蔗糖m/v中的36％吐温20溶液，pH 8.1)缓慢添加到TFF1中间体溶液中，以获得20％吐温20的最终浓度。在室温(RT)下孵育过夜后，通过添加约4g 1M甘氨酸pH 2.5/kg TFF1中间体/吐温加标池，降低含有TFF1中间体的吐温20的pH，以达到3.5±0.1的目标pH。一旦pH值在可接受范围内，溶液通过与0.45μm Opticap XL10双孔过滤器或0.8/0.45μPES过滤器串联的Clarisolve POD深度过滤器，然后用CEX缓冲液A将过滤器冲洗两倍POD过滤器滞留体积加一个精制过滤器滞留体积。
阳离子交换(CEX)捕获色谱步骤用于将病毒衣壳与蛋白质、DNA和其他工艺杂质分离。该步骤利用使用自动过程色谱系统操作的CIMmultus S03-8000高级复合柱(磺酰基)(2μm孔)色谱柱(8.0L)。
缓冲液和溶液如下表所示：
表19：一个CEX循环的缓冲液和溶液
Figure BDA0002574379020001141
通过澄清的酸化的TFF1中间体的蛋白质含量确定CEX柱负载。CEX柱的蛋白质负载量设定为最大柱容量的70％。
从OD280的急剧上升处开始手动收集洗脱峰。当电导率在80-85mS/cm之间时，OD280上升。CEX洗脱液(产物)的适当体积为约20升或2.5CV(柱体积)。CEX洗脱液以两级分收集。第一级分在OD280的急剧上升处开始，并且收集1.5CV。第二级分紧接在第一级分之后开始，并收集1.0CV。用pH 9.0中和缓冲液中和两级分至pH 8.0±0.30。
TFF2步骤浓缩、去除蛋白质杂质，并将缓冲液交换为用于CsCl超速离心步骤的适当缓冲液。采用切向流过滤系统与0.4m2(2个CEX循环)或0.2m2(1个CEX循环)300k MWCO再生纤维素膜联合使用。
该操作的浓缩阶段减少了CEX洗脱液的体积。一旦达到目标滞留物体积，以不连续TFF模式(批处理模式)开始渗滤。滞留物稀释2X，用8个渗滤体积的TFF2 NaCl渗滤缓冲液渗滤，然后用8个渗滤体积的TFF2 CsCl渗滤缓冲液以间断TFF模式渗滤。一旦CsCl渗滤完成，滞留物被浓缩到规定体积，这取决于系统滞留体积。执行膜的两次连续漂洗，以最大化从TFF2系统中的产物回收。
将滞留物进料速率设定为5L/m2/min(500mL/min/0.1m2盒)，其中渗透转化率为20％(100ml渗透流速/500mL滞留物进料速率)。渗透流速由渗透管上的夹具控制，以保持渗透流速为滞留物进料流速的20％。
表20：TFF2的缓冲液
Figure BDA0002574379020001151
超速离心可用于利用氯化铯梯度超速离心从全衣壳去除空衣壳。CsCl超速离心步骤采用自动化的Optima XPN 100超离心系统或配备50.2Ti型转子或等效转子的等效系统。将TFF2纯化的过滤的材料沿管壁内侧缓慢地加入超速离心管中，而不向溶液中引入气泡。填充的管用手持式热封器密封，并在302,000g(在50.2Ti转子中50,000rpm)下在20℃下离心17小时。离心步骤完成后，将试管从超速离心机中取出并置于生物安全柜中。将含有产物的管安装在废物容器上方的环形支架上。在试管下方放置灯，并且在试管上标记空衣壳条带(条带A为最高条带)、全衣壳双条带(条带B和条带C，双条带的上条带和下条带)和双条带下方的最低条带。条带B、C和D通过连接到30mL注射器的18G针头移除，注射器刚好插入条带D下方至管的中间。将收集的材料转移到无菌1L PETG瓶中。将来自所有离心管的材料池化到无菌1L PETG瓶中以产生超速离心(UC)池。CsCl超速离心步骤的缓冲液列于下表：
表21：CsCl超速离心的缓冲液
Figure BDA0002574379020001161
TFF3步骤去除CsCl并使用最终配制缓冲液浓缩全载体。采用切向流过滤系统与两个50cm2的300k MWCO再生纤维素膜联合使用。TFF3操作的浓缩阶段设计成降低残余CsCl的浓度和UC池的体积。一旦达到目标滞留物体积，开始渗滤。用10个渗滤体积的TFF3缓冲液渗滤滞留物。一旦渗滤完成，浓缩的滞留物通过0.2μm Pall
Figure BDA0002574379020001162
EKV无菌级过滤器(MiniKleenpak)转移到二级锥形管中。
连续漂洗膜以从TFF3系统中回收载体。将TFF3缓冲液添加到先前容纳TFF3滞留物的初级锥形管中。这种材料再循环通过纤维素膜。再循环后，冲洗液通过0.2μm Pall
Figure BDA0002574379020001163
EKV无菌级过滤器(Mini Kleenpak)转移至二级锥形管中。混合TFF3浓缩物和部分池，以获得最终载体浓度≥4.5X 1013vg/mL的原料药(池化的TFF3滞留物+两次漂洗)。
执行膜的连续漂洗，以最大化从TFF3系统中的产物回收。将TFF3缓冲液添加到先前容纳TFF3滞留物和初始冲洗材料的初级锥形管中。这种材料再循环通过纤维素膜。二次冲洗物通过0.2μm Pall
Figure BDA0002574379020001164
EKV无菌级过滤器(Mini Kleenpak)转移到二级锥形管中，直到二级锥形管中达到确定的重量。最终的浓缩溶液称为原料药(DS)。
表22：TFF3的缓冲液
Figure BDA0002574379020001165
使用Pall
Figure BDA0002574379020001166
EKV无菌级过滤器(Mini Kleenpak)将DS过滤到无菌1L玻璃瓶中(使用无菌一次性组件)。在过滤TFF3池之前，通过使用蠕动泵使TFF3缓冲液通过过滤器并丢弃到废物冲洗袋来冲洗过滤器。然后使用蠕动泵将原料药(DS)通过冲洗的过滤器过滤，并收集到1L无菌玻璃瓶中。基于5x 1013vg/mL的DS的目标浓度，将TFF3缓冲液添加到容纳DS的二级锥形管中并通过过滤器以制备稀释药物产物(“DP”)至3.5x 1013vg/mL的目标浓度。
用于过滤器冲洗和DS稀释以制备DP的TFF3缓冲液由以下配制构成。
表23：药物产品装置操作-缓冲剂组成
Figure BDA0002574379020001171
将DP装入5mL无菌、即用Crystal Zenith(CZ)小瓶中，用无菌、即用塞子塞住，并用无菌、即用封条密封。
实例13-效力测定
所述药物产品的相对效力使用定量体内测定来测量。所述测定使用已建立的SMA疾病小鼠模型。SMAΔ7小鼠品系(杰克森实验室，#005025)的繁殖对在表型上正常，但其后代中约25％对于靶向的SMN基因突变为纯合子，并显示SMA样表型。到了第5天，他们出现肌肉无力的迹象，在接下来的一周里，他们出现异常的步态和跌倒的倾向。杰克森实验室(Jackson Laboratories)报告SMA样表型动物的平均存活时间为约15±2天。试点研究表明，具有SMA样表型的未治疗动物的中值存活时间为16.3天(几何平均数；n＝3个研究；每个研究10只小鼠)。
通过静脉内(IV)输注施用的生物活性药物产品产生作为剂量(vg/kg)的函数的存活时间的增加。相对于参考材料(先前批次载体)测量药物产品效力。通过液滴数字聚合酶链反应(ddPCR)确定药物产品和参考材料(载体基因组/mL；vg/mL)的效价。将载体在盐水中稀释以达到三个特定剂量水平中的每一个，这些剂量水平将施用给具有SMA样表型的小鼠。
如果测定通过了适用性，则测定结果被认为是可接受的。测定适用性由以下组成：
4.阴性对照样品的接受限度(15±2天，中值存活)
5.阳性对照样品的接受限度(>40天，中值存活)
6.参考标准中值存活剂量-应答曲线的接受限度
在本研究中使用先前批次(以下称为先前批次)的载体以确定以五种不同剂量水平(包括使用0.9％生理盐水溶液(未处理组)的0(零)剂量)给予药物产品时SMAΔ7小鼠的中值存活(天)之间的线性相关性。表24显示了使用先前批次参考批次的校准曲线。
表24：使用AVXS-101五个剂量水平的校准曲线
Figure BDA0002574379020001181
*未确定(ND)-截止2017年8月24日中值存活(天)未达到
本研究的数据显示，中值存活剂量-应答曲线的线性范围为0-7.4vg/kg。通过比较先前批次参考标准品的线性回归曲线与药物产品批次816836的线性回归曲线，建立药物产品批次816836的相对效力。这是通过使用每条线性回归线(即参考标准品和测试品)的y截距和斜率的比值来完成的。百分比相对效力计算由下面的等式(1)描述：
％RP＝[(测试品的y截距/斜率)÷(参考标准品的y截距/斜率)]X 100(1)
阶段1临床试验中使用的NCH0613批用作参考标准批次，并指定效力为100％。
上述数据使用中值存活剂量-应答曲线的线性部分建立了初步测定接受标准，以确定药物产品临床批次的相对效力，如下所示：
·使用5个剂量(vg/kg)水平生成中值存活(天)剂量-应答曲线
·选择剂量0、1.2E+13和7.4E+13运行线性剂量应答模型。
·盐水(未治疗组)的适用性限度为13至17天的中值存活。
·参照标准样品的适用性限度为：
ο斜率≥2.0E-13
ο y截距≥16.00(天)
ο y截距/斜率比值≥8.5E+13
ο R2≥0.7
用Δ7小鼠模型证明SMA疗法(包括药物产品)的功效。中值存活为15天±2天，未处理的或盐水处理的对照动物提供了可靠的基线对照，从中产品效力可以测量为中值存活的增加。药物产品的开发工作确定了三(3)个剂量(不包括媒剂处理的剂量)，这三(3)个剂量使用液滴数字PCR(ddPCR)由基因组效价确定，当施用的剂量(vg/kg)被对数变换并相对于处理的SMAΔ7新生小鼠的中值存活(天)作图时，这三(3)个剂量以线性相关性方式影响小鼠模型的存活。低、中、高效价标准参见表26中的标准效价(vg/mL)。此外，TFF缓冲液(媒剂)溶液用于零(0)校准曲线点和阴性对照。显示存活期≥40天的剂量(显示大于中值存活期翻倍的剂量)也被包括作为阳性对照。
表25：目标剂量
Figure BDA0002574379020001191
剂量溶液制剂(稀释方案实例参见表26。
阴性对照--使用0.9％盐水作为阴性对照
阳性对照--使用盐水以1.5x 1014vg/kg制备测试品批次。
参考标准溶液-使用盐水溶液以表25中描述的三种浓度制备参考标准品批次。
表26：参考标准品和试品稀释方案(实例)
Figure BDA0002574379020001201
测试品制备-使用盐水溶液稀释测试品。计算稀释度以产生每只小鼠的表26所示的测试剂量(vg/kg)，最终总体积为50μl。同时对10只小鼠进行稀释，用一个另外的体积作为阳性对照，目标是将处理小鼠的最低寿命增加到≥40天的中值存活(天)。
对照样品的接受界限
阴性对照组(未处理小鼠)--阴性对照组的测定接受界限是SMAΔ7小鼠达到15±2天的中值存活。此外，任何在≤10天内断气的小鼠将被排除在分析之外。如果在组中使用超过7只小鼠，则最多2只小鼠可因为在<＝10天断气而被排除。
阳性对照(以目标临床剂量治疗的组)--阳性对照组的测定接受界限是治疗的小鼠的最低寿命是≥40天的中值存活。此外，任何在≤10天内断气的小鼠将被排除在分析之外。如果在组中使用超过7只小鼠，则最多2只小鼠可因为在<＝10天断气而被排除。
参考标准剂量应答曲线的接受界限
将确定参考标准线性剂量应答曲线的测定适用性标准，所述曲线绘制中值存活(天)与施用剂量(vg/mL)之间的关系。测定适用性标准见表27。
表27：测定适用性标准(参考标准线性剂量-应答曲线)
Figure BDA0002574379020001211
Y截距/斜率比值--测定参考标准品和测试品的中值存活(天)相比于施用剂量(vg/kg)的线性回归曲线。计算每个线性回归的y截距与斜率的比值。
报告结果
相对效力结果的定性报告--在测定阳性对照材料的单点中值存活(天)读数≥40天之前，对每次测定的测定适用性标准进行评估。如果阳性对照组的中值存活≥40天，在满足以下标准的情况下，可处置测试品。
相对效力结果的定量报告--在对测试品的相对效力进行定量测定之前，对每个测定的测定适用性标准进行评估。一旦阳性对照达到≥40天，并且达到代表上限标准剂量7.5x 1013vg/kg的小鼠组的31±3天的中值存活，即可报告测试品的相对效力。测试品的相对效力百分比(％RP)将使用中值存活(天)剂量-应答的线性回归的y截距和斜率计算如下：
％RP＝100％*[(测试品y截距/斜率)÷(参考标准品y截距/斜率)]
实例14-脊髓性肌萎缩的单剂量基因替代疗法治疗：剂量研究
脊髓性肌萎缩(SMA)是一种严重的儿童单基因病，是由于编码运动神经元存活1(SMN1)的基因缺失或功能障碍所致。该病的发病率为约万分之一活产儿，其中携带者频率为54分之1。SMA的特征是下运动神经元的变性和缺失，从而导致肌萎缩。根据发病年龄和里程碑达成，所述疾病分为四个亚型(1至4)。SMA 1型(SMA1)是最严重的形式和婴儿死亡的最常见遗传原因。有两种形式的SMN；SMN1是负责产生功能性SMN蛋白的主要基因。SMN2在剪接过程中优先排除外显子7，因此，与SMN1相比，只产生功能性SMN蛋白的一小部分。因此，SMN2拷贝数改变疾病表型，SMN2的两个拷贝的存在与SMA1相关。
SMN1双等位基因缺失且SMN2双拷贝的婴儿患SMA1的风险为97％。
最近对SMA1(历史队列)自然病程的研究表明，具有所述疾病的婴儿的症状发作时的中值年龄为1.2个月(范围为0到4个月)，并且所述疾病特征为肌张力减退、从婴儿早期开始严重虚弱、无支撑不能坐。在有两个SMN2拷贝的SMA1婴儿中，死亡时的中值年龄或需要连续至少14天每天至少16小时无创通气(被认为相当于永久性通气)的中值年龄为10.5个月。在受影响的儿童的一个队列中，只有25％在13.6个月时在没有永久性通气支持情况下存活，到20个月时8％在没有这种支持的情况下存活。另一项由美国国立卫生研究院(NeuroNEXT)赞助的、涉及具有两个SMN2拷贝的患者的前瞻性多中心历史研究显示了无气管造口术的中值存活为8个月(95％置信区间，6至17个月)。所有SMA1的患者都有一个陡峭的出生后呼吸和吞咽功能下降，并且最终需要器械的营养的支持(通过鼻饲管或胃造口术管)以维持足够的营养并减少与吸入有关的呼吸风险。对于在3月龄时出现症状的SMA1患者，大多数患者在12月龄时需要喂养支持。
SMA1患者在运动功能方面也没有达到主要的里程碑，并且有功能下降，如在CHOPINTEND(费城儿童医院婴儿神经肌肉障碍测试)量表上测量的，所述量表范围从0到64，其中得分较高表明运动功能较好，这是对运动功能的微小变化(例如肢体的反重力运动)很敏感的工具。在对34名SMA1患者的历史分析中，除1名患者外，所有患者在6月龄后未达到至少40得分。在NeuroNEXT队列中，从6月龄到12月龄，CHOP INTEND得分平均下降10.7分。
提高运动神经元中SMN蛋白水平的治疗策略集中于增强SMN2的有效性。一种方法是中枢神经系统递送努辛生(怡诺思制药公司/渤健公司(Ionis Pharmaceuticals/Biogen))，这是一种反义寡核苷酸，开发用于抑制SMN2的外显子7剪接。这种药物已经被证明可以改善严重SMA鼠模型中的虚弱，并将受影响小鼠的中值寿命从16天增加到25天。2016年12月，努辛生获得食品药品监督管理局批准，用于治疗SMA。这种药物是在生命的最初2个月内经过四次负荷剂量后，通过反复鞘内注射的方式施用。
SMA1的一种潜在替代治疗方法是作为一次性静脉内施用给予的基因疗法，其递送在自互补腺相关病毒血清型9(scAAV9)中的一个SMN拷贝。(这种重组病毒的编码区形成分子内双链DNA[或自互补]模板。)该方法诱导了运动神经元和外周组织中SMN的表达，这在小鼠模型中对抗了SMA的影响，并且在低剂量(6.7x 1013vg/千克体重)下将该模型中的平均存活从15天延长到28.5天，并且在更高剂量(2.0x 1014和3.3x 1014vg/千克)载体下延长到250天以上。
除了跨越血脑屏障和靶向脊髓所有区域的中枢神经系统神经元之外，AAV9介导的基因疗法的全身性施用可能是有利的，因为SMN蛋白是遍在表达的并且SMA1影响多个系统(例如，自主神经系统和肠神经系统、心血管系统和胰腺)以及许多细胞类型(例如，心脏、胰腺和骨骼肌)。载体的自互补特性与杂合巨细胞病毒增强子-鸡β肌动蛋白启动子组合使得SMN能够快速、持续地表达。2014年四月，我们启动了一项基因替代疗法的研究，涉及患有SMA1的婴儿，这些婴儿接受一次性剂量的scAAV9(scAAV9.CB.hSMN)(AVXS-101)，其中递送在鸡β-肌动蛋白启动子的控制下的人运动神经元存活基因(hSMN)。
方法
患者和研究程序：为了研究的目的，所有患者都有SMA1、纯合SMN1外显子7缺失和SMN2的两个拷贝的遗传上确认的诊断。在SMN2外显子7中携带c.859G→C疾病修饰因子的患者被排除在外。被选择的患者从出生到6个月开始发病，特征是临床评估的肌张力减退，伴有运动技能延迟、头部控制不良、圆肩姿势和关节活动过度。具有活动性病毒感染(包括HIV或乙型或丙型肝炎血清学阳性)或具有为基因转移造成不必要的风险的伴随疾病的患者被排除在研究之外。筛选就诊时需要有创通气支持(正压气管切开术)或脉搏血氧饱和度<95％的患者也被排除在外。
根据施用的基因疗法的剂量，患者被登记入两个队列。队列1中的患者接受低剂量(6.7x 1013vg/千克)，并经5个月的过程登记；队列2中的人接受高剂量(2.0x 1014vg/千克)，并经一年的过程登记。在给药后第30天，对队列1中的患者1进行的IFN-γELISpot测定检测到T细胞应答，并显示每106个外周血单核细胞(PBMC)中>50个斑点形成细胞(SFC)直接针对AAV9衣壳的突然峰值(正常的是每106个PBMC中<50个SFC)。泼尼松龙以2mg/kg开始，维持35天，直到T细胞应答和血清转氨酶降低。结果，对实验方案进行了修改，患者2至15接受口服泼尼松龙，剂量为1mg/千克/天，持续约30天，从施用基因载体前24小时开始。治疗继续使用强的松龙，维持直到AST和ALT酶降至120IU/L水平以下，并且T细胞应答降至100个SFC/106个PBMC以下，此时根据临床判断渐减泼尼松龙。
将载体在生理盐水(约10至20ml/千克)中递送，所述生理盐水在大约60分钟的时间段内静脉内输注。在登记时，一些患者需要通过胃造口术管或鼻饲管进行肠道喂养，其选择基于父母或主治医生的偏好。一旦登记入研究，所有需要营养支持的患者都接受了胃造口术管的放置，并且在研究期间没有去除这些管。
结局：主要结局是根据任何3级或更高的治疗相关不良事件来确定安全性。次要结局是死亡时间或需要永久性通气辅助。后者的定义是在没有急性、可逆性疾病或围手术期状态的情况下，每天至少16小时的通气辅助，持续至少14天。探索性结局包括运动里程碑达成(特别是无辅助坐)和CHOP INTEND意图得分。
在应用CHOP INTEND量表时，维持40分以上的得分已被认为对SMA有临床意义。根据以下标准对无辅助坐进行评估和分类：根据贝利婴儿发育量表粗大运动子测试(“无辅助坐”)第22项，无辅助坐至少5秒；根据世界卫生组织(WHO)标准(“WHO标准下的无辅助坐”)，无辅助坐至少10秒；以及根据上述贝利量表第26项(“独立功能性坐”)，无辅助坐至少30秒。主要的运动里程碑是通过独立的审查者通过交互式视频评估拍摄的能力-小型(AbilityCaptured Through Interactive Video Evaluation-mini，ACTIVE-mini)来检查患者的视频记录来确认的。在基线时和输液后每6个月从表面电极记录复合肌肉动作电位(CMAP)。通过电阻抗肌动描记法(EIM)定量肌肉病理状态。
统计分析：对所有患者进行了安全性分析，这些患者也包括在存活初步分析(如上面和方案中定义的)中和CHOP INTEND量表从基线到1个月和3个月的变化分析中。使用用于重复测量的混合效应模型分析了这种从基线到每次研究就诊的变化。混合模型包括队列和就诊的固定效应以及基线得分的协变量。对队列2的里程碑达成和营养及通气支持进行分析。采用SAS软件版本9.4进行统计学分析。所有与历史队列的比较都只是描述性的。
结果
患者：在筛选的16名患者中，1名因抗AAV9抗体效价持续升高(>1:50)而被排除。登记入研究的15名患者中，3名登记入低剂量队列1，12名登记入高剂量队列2。治疗时患者的平均年龄在队列1中为6.3个月(范围为5.9至7.2)，在队列2中为3.4个月(范围为0.9至7.9)(表28)。
表28：15名患者的人口学特征和临床特征
Figure BDA0002574379020001261
存活和永久性通气：到研究结束时，所有患者年龄至少达到20个月，并且不需要永久性器械通气；最后一次肺评估的中值年龄在队列1为30.8个月，在队列2为25.7个月。相比之下，在历史队列中，只有8％的患者不需要永久性器械通气。在29月龄的时候，队列1中的一个患者因为多涎而需要永久性通气。涎腺结扎后，使用无创通气的要求减少了25％至每天15小时。
运动功能评估：队列1和队列2中的所有患者在CHOP INTEND量表上的得分较基线增加，并且在研究期间保持了这些变化。队列2的患者在1个月时平均增加9.8分，在3个月时平均增加15.4分(两比较都是P<0.001)；11名患者达到并维持得分40分以上。在2017年8月7日的研究截止点，队列1的患者在平均基线16.3分的基础上平均增加了7.7分，队列2的患者在平均基线28.2分的基础上平均增加了24.6分。
队列2中的运动里程碑：队列2中的12名患者中共有11名能够在无辅助的情况下坐至少5秒，10名至少10秒，9名至少30秒(表31)。共有11名实现头部控制，9名能翻身，2名能爬行、拉站、独立站立以及独立行走。11名患者获得说话的能力。历史队列中没有患者达到这些运动里程碑中的任何一个，并且罕有达到说话的能力。
表29：队列2的12名患者的无事件存活和运动以及其他里程碑。
Figure BDA0002574379020001271
队列2的肺和营养状况：在队列2的12名患者中，10名在基线时不需要无创通气，而7名在最后一次随访就诊时不需要通气辅助(表29)。基线时，7名患者不需要肠道喂养，包括1名随后在基因替代疗法后需要放置胃造口术管，这可能与脊柱侧凸手术有关。在基因替代疗法前接受肠道喂养的5名患者中，在最后一次随访时，12名患者中有11名获得或保持独立吞咽能力，并且4名能够口服喂养。
安全性：截至研究结束，两个队列中的13名患者共观察到56例严重不良事件。在这些事件中，调查人员根据不良事件的通用术语标准，根据实验室值确定2例事件为治疗相关的4级事件(表30)。队列1中的患者1血清氨基转移酶水平升高(丙氨酸氨基转移酶(ALT)正常范围上限的31倍和天冬氨酸氨基转移酶(AST)正常范围上限的14倍)，无其他肝功能异常(即总胆红素和间接胆红素及碱性磷酸酶)，并且无临床表现。如上所述，这些升高通过泼尼松龙治疗而减弱，随后在其余患者中施用泼尼松龙治疗。队列2中的一名患者需要另外的泼尼松龙来减弱升高的血清ALT和AST水平(ALT是正常范围上限的35倍，AST是正常范围上限的37倍)。在241例非严重性不良事件中，3例被认为与治疗有关，包括2名患者血清氨基转移酶水平无症状升高(ALT和AST，均低于正常范围上限的10倍)，这在没有额外泼尼松龙治疗的情况下得到解决(表0。肝功能检查无其他异常。在15名患者中，14名患有呼吸疾病，这些疾病在患有SMA1的儿童中经常导致死亡或需要进行气管造口术。
表30：不良事件。
Figure BDA0002574379020001281
Figure BDA0002574379020001291
在SMA1患者中单次静脉输注含有编码SMN的DNA的腺相关病毒载体导致了比该疾病历史队列更长的存活。所有15名患者均超过了先前报道的有两个SMN2拷贝的SMA1患者无永久性通气的中值存活年龄10.5个月。所有的患者也超过了20个月的基准，此时只有8％的患此病患者在没有永久性通气的情况下存活。4队列2中的12名患者中，除了1名患者外，所有的患者都达到了历史队列中未报道的运动功能里程碑。所获得的运动功能是有临床意义的，如进食(吃手)、坐和说话所反映的。大多数在登记时不需要支持性护理的患者在最后一次随访就诊时没有营养支持(7名患者中的6名)和通气支持(10名患者中的7名)。在两个队列中，患者在CHOP INTEND量表上的得分较基线增加。在队列2的第一个月内，平均增加9.8分，而在NeuroNEXT研究的历史队列中，6到12个月的平均下降超过10分。
在SMNΔ7小鼠模型中进行的SMN基因替代疗法的临床前研究显示，早期治疗(可能是在运动神经元仍然完整的时候)可改善小鼠的存活和运动功能。我们的早期治疗研究中的临床发现反映了临床前研究的方向。两名患者经早期治疗后能在无支持的情况下爬行、站立和行走。两名患者均有SMA家族史，这可能有助于早期诊断。尽管我们研究的两个队列中的所有患者的运动功能持续改善，临床前和临床数据表明早期治疗和新生儿SMA筛查是有益的。
AAV基因替代疗法引起的严重不良事件仅限于在两名患者中治疗后约3周血清氨基转移酶水平升高，而无其他肝酶异常；另外两名患者的升高未达到严重不良事件定义的截断值(即，大于正常范围的10倍)。泼尼松龙治疗可减轻肝酶的升高。1名患者由于抗AAV9抗体的存在而未通过筛选，这与群体研究一致，该研究表明儿童和青年中抗AAV9血清阳性率较低，而40岁以上的人中抗AAV9血清阳性率增加。然而，病毒抗体的存在可能是AAV基因替代疗法的一个限制。
本研究采用单组设计，以历史队列作为对照，当疾病的自然病程被良好表征并且是致命的时，这是有限的选择之一。为了登记与已发表的历史研究相似的同质样品，我们限制登记以仅包括具有双等位基因SMN1突变和两个SMN2拷贝的有症状的SMA1患者，而没有登记具有SMN2的外显子7中c.859G→C基因修饰因子的患者，因为该基因修饰因子预测了较温和的疾病表型。然而，这种基因替代疗法不必局限于有症状的患者，或具有特定基因组亚型的患者。
总之，在SMA1患者中一次性静脉内输注含有编码SMN的DNA的高剂量腺相关病毒载体导致延长的存活，改善的运动功能，并增加CHOP INTEND量表得分，达到此前在该疾病中未观察到的水平。这些改善导致需要支持性护理的患者百分比低于历史研究中的患者百分比。在长达2年的随访中，没有报道运动功能的效果减弱或临床衰退。几个患者有短暂的和无症状的氨基转移酶水平升高。需要进一步的研究来评估基因替代疗法在SMA1患者中的长期安全性和持久性。
实例15-scAAV9.CB.hSMN的药代动力学
常规的临床药代动力学研究不适用于基因替代疗法产品。然而，scAAV9.CB.hSMN载体脱落研究(其评估通过体液和排泄物从体内消除的载体数量)是一种可用于代替基因替代疗法的常规药代动力学研究的测量方法。
在临床研究期间，在多个时间点调查输注scAAV9.CB.hSMN后的载体脱落情况。唾液、尿液和大便样品每周收集至第30天，然后每月收集至第12个月，此后每3个月收集一次。采用液滴数字聚合酶链反应对5名患者的样品进行scAAV9.CB.hSMN载体脱落分析，至第18月就诊。用1.1x 1014vg/kg的治疗剂量对进行scAAV9.CB.hSMN载体脱落分析的5名患者给药。
scAAV9.CB.hSMN在输注后的脱落样品中检测到。在输注后第1天尿和唾液中的scAAV9.CB.hSMN浓度为体内初始浓度的0.1％至0.01％，此后浓度降至定量限以下。在大便中，输注后第1天可检测到体内初始浓度的10％至30％水平。1名患者在输注后第14天大便中显示出峰值浓度，为体内初始浓度的280％。相比之下，有数据可查的3名患者在输注后第14天体内浓度<1％的初始浓度，输注后经30天浓度下降约4个对数(10,000倍)。总体而言，scAAV9.CB.hSMN主要在大便中从体内清除，到输注后第60天，其在大便中低于定量限。
实例16-非临床毒理学测试
动物药理学：在Δ7SMA疾病小鼠模型(SMNΔ7小鼠)中输注scAAV9.CB.hSMN载体后，与未处理的SMNΔ7小鼠相比，体重增加，扶正行为改善，存活以剂量依赖的方式显著延长，并且SMA相关的心脏缺陷向正常恢复。
动物毒理学：在小鼠中静脉内输注后，载体和转基因广泛分布，其中在心脏和肝脏中表达最高，在脑和脊髓中也有大量表达。在关键的符合实验室良好规范(GLP)的3个月小鼠毒理学研究中，毒性的主要靶器官是心脏和肝脏。在心室中的scAAV9.CB.hSMN载体相关发现包括剂量相关的炎症/水肿和纤维化，在心房中包括炎症和血栓形成。肝脏发现包括肝细胞肥大、枯否细胞活化和散在肝细胞坏死。在小鼠中，scAAV9.CB.hSMN载体相关的心脏和肝脏发现未确定无不良效应水平(NoAEL)，最大耐受剂量定义为1.5x 1014vg/kg，其相对于1.1x 1014vg/kg的推荐治疗剂量，提供了大约1.4倍的安全裕度。目前还不知道在小鼠中观察到的发现是否可以转换到灵长类动物。
实例17-儿科患者脊髓性肌萎缩
本试验为阶段1研究，评估scAAV9.CB.hSMN载体在SMA 1型患者中的安全性和有效性，所述患者经遗传检测证实双等位基因SMN1缺失，2个运动神经元存活2(SMN2)拷贝，外显子7中c.859G>C修饰阴性，且在6月龄前出现临床症状。scAAV9.CB.hSMN载体在0.9至7.9月龄的患者中单剂量输注来静脉内递送。两个队列被给药：队列1(n＝3)接受本研究中使用的低剂量，队列2(n＝12)接受本研究中使用的高剂量(治疗剂量：1.1x 1014vg/kg)。报告的研究结局反映了队列2，并且包括所有患者在输注scAAV9.CB.hSMN载体后24个月的随访。
死亡率和无事件存活
存活和事件时间分析支持scAAV9.CB.hSMN载体的功效。在队列2中，所有12名患者(100％)超过24月龄并且无事件发生，而在自然病程研究中只有8％的患者。这表明，与未经治疗的患者相比，输注scAAV9.CB.hSMN载体的患者总存活显著地并且具有临床意义地增加。输注后2年，无患者死亡报告。
发育运动里程碑
检查发育运动里程碑；对所有15名患者的评估都进行了录像，以确认发育运动里程碑的达成。队列2中的患者始终达到并保持了关键的发育运动里程碑。给药后24个月随访，11名患者(91.7％)能挺直头部≥3秒并且无支持坐≥5秒，10名患者(83.3％)能无支持坐位≥10秒，9名患者(75.0％)能无支持坐≥30秒，以及2名患者(16.7％)各自能够独立站立、辅助行走和单独行走。队列2的患者(其目前被登记接受这项研究的长期观察随访)保持了他们的运动发育里程碑，其中有些患者达成了另外的运动里程碑。
表31：在剂量后24个月的随访中，根据独立的中心回顾，出现显著运动功能里程碑的患者(全分析集)
Figure BDA0002574379020001331
肺
队列2中10名基线时未使用无创通气(NIV)的患者中，7名在24个月随访时不再使用每日NIV。几乎所有的患者都经历了常见的儿童呼吸疾病，在SMA 1型的儿童中，典型的结果是气管造口术或死亡。所有患者在没有气管造口术或需要永久性通气的情况下在因呼吸疾病住院中存活。
营养
同时也观察到营养的增加。在队列2中，七名患者在基因替代疗法前没有接受肠道喂养。在这7名患者中，有一(1)名患者从脊柱侧凸手术难以恢复，之后接受营养支持以帮助伤口愈合，但同时也接受口服喂养。队列2中在接受基因替代疗法前肠道喂养的5名患者中有四(4)名在研究结束时能够口服喂养；因此，在队列2中的12名患者中，共有11名能够口服喂养，6名仅用口服喂养。
运动功能(CHOP-INTEND)
接受治疗剂量的患者在第1个月和第3个月达到统计学上显著的运动功能改善；费城儿童医院婴儿神经肌肉障碍测试(CHOP-INTEND)较基线分别平均增加9.8分(n＝12，P<0.001)和15.4分(n＝12，P<0.001)。
输注scAAV9.CB.hSMN载体的患者的运动功能改善随着时间的推移持续。十二名队列2患者中的十一名(91.7％)在24个月时达到≥50的CHOP-INTEND得分。早期干预和剂量似乎积极地影响应答。在一般临床实践中，6月龄或6月龄以上未接受治疗的SMA 1型儿童在CHOP-INTEND上的得分不超过40分。此外，在作为预期自然病史的一部分的未接受治疗的婴儿中，报道6至12月龄的平均下降为10.7分。
实例18-使用qPCR测量AAV9病毒载体中残余宿主细胞DNA方法
将该方法用于通过qPCR对AAV原料药例如AVXS-101中的以及处理中样品中的hcDNA进行定量。每个平板测试多达六个样品。使用TaqMan探针进行qPCR分析。TaqMan探针具有与5’端结合的荧光报告染料和与3’端结合的非荧光猝灭剂。在探针完好的同时，猝灭剂靠近报告染料大大降低了报告染料发出的荧光。探针的裂解分离了报告染料和猝灭剂，增加了报告荧光。
将设计用于结合人类基因组内重复序列的侧翼正向和反向引物添加到反应混合物中，并与样品和标准品中存在的靶序列退火。TaqMan荧光探针在引物位点之间退火。模板变性、引物退火和产物延伸的连续循环扩增了靶序列。在扩增循环的延伸步骤中，Taq DNA聚合酶的核酸外切酶活性从探针中释放报告染料，使染料从猝灭剂中释放出来，从而产生与模板量成比例的荧光发射。
用qPCR仪测量96孔板各孔的荧光。通过另外的PCR循环，实现靶序列的数量的增加，结果是在每个依次PCR循环中，更多的报告染料从探针中释放以及更高的荧光。测量荧光信号达到预定阈值所需的扩增循环次数。此循环称为阈值循环或CT值。样品或标准品孔中DNA起始浓度越大，达到阈值荧光水平所需的PCR循环次数越少，CT值越低。通过绘制log10(DNA浓度)相比于每个标准点测得的CT值来确定标准曲线。通过使用样品的单独CT值并求解DNA值，CT值用于确定样品中存在的DNA的量。
首先使用Wako DNA提取试剂盒(Wako公司，295-50201)制备样品。简单地说，将用于测试的样品混合均匀并稀释1000倍。将稀释的样品分进入四个试管(每个试管500μL)，向其中两个试管中添加50μL水(未加标的重复)，向另外两个试管中添加50μL 30,000pg/mLDNA标准品(加标的对照)。蛋白质增溶通过以下来进行：将20μL的N-月桂酰肌氨酸钠溶液添加到每个试管中，涡旋5秒，然后短暂离心。制备含有糖原和沉淀涂料(Pellet Paint)(Novagen公司，70748)的NaI溶液，使得它们以NaI:糖原:沉淀涂料为2000:5:4的比例。每管中添加500μL NaI混合物，在53℃±1℃孵育15分钟。将试管从热中取出，与900μL异丙醇混合，并在室温下孵育15分钟。然后将试管在10,000g下于18℃离心15分钟，并倾析上清液。剩余的沉淀粒用800μL洗涤溶液A洗涤，离心并再沉淀两次。最后，用1500μL含糖原的冷冻异丙醇洗涤液洗涤沉淀，离心并再沉淀。将最终的沉淀重悬浮于500μL无核酸酶的水中。
使用resDNA SEQ人定量试剂盒(应用生物系统公司(Applied Biosystems)，A26366)进行qPCR。按照试剂盒中的指示，通过组合2x环境主混合物，10x人类DNA测定混合物和阴性对照制备反应混合物。将20μL反应混合物与10μL制备的样品混合并添加到PCR板上的每个孔中。每个样品一式三份添加到版中。用光学胶膜封板。在热循环过程中，首先在95℃下进行熔融10分钟，然后将样品在95℃下15秒和60℃下1分钟之间循环，共40个循环。
通过绘制CT值相比于DNA量对数([pg/mL])生成标准曲线。数据拟合到由以下等式给出的直线上：
CT值＝m x log10(x)+b
其中x＝以pg/mL的标准品浓度，m为斜率，并且b为y截距。利用上述等式从孔的CT值反算宿主细胞DNA浓度，然后用稀释因子校正。
结果
qPCR测量的残余宿主细胞DNA为：对于先前批次载体为3.7x 105pg/mL，对于AVXS-101批次600156为0.76x 105pg/mL，对于AVXS1-101批次600307为0.68x 105pg/mL，以及对于AVXS-201DS为1.3x 105pg/mL。
实例19-通过ELISA测量AAV9病毒载体中残余宿主细胞蛋白(HCP)方法
用商用酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒测量AVXS-101样品中宿主细胞蛋白(HCP)浓度。天鹅座技术(Cygnus Technologies)公司的人胚胎肾293HCP ELISA试剂盒是一种固相双位点酶免疫测定。它基于直接夹心技术，其中两种多克隆抗体直接针对HCP的分开的抗原决定簇。在孵育过程中，样品中的HCP与抗HCP抗体(其与微量板孔良好结合)结合，并与溶液中的过氧化物酶缀合的抗HCP抗体结合。
孵育期后，清洗孔以去除任何未结合的酶缀合的抗体。然后向孔中添加3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)底物溶液。结合的过氧化物酶缀合物在底物中催化变色反应。反应被酸的添加所终止，这给出了一个可在450nm处用分光光度法读取的比色终点。水解的底物的量与存在的HCP浓度成比例。
待测样品稀释至符合方法范围，从4ng/mL至200ng/mL。然后将每个样品在SDB中稀释2倍(110μL样品和110μL SDB)并混合。此外，还制作了加标对照(Spiked control)，以检查其一致性。在加标对照中，110μL的每个样品与27.5μL的200ng/mL HCP标准品和82.5μL的SDB混合。最后，将50μL的每个标准品、对照或测试样品添加到96孔板上的孔中，并与100μL的抗-HEK 293-HRP缀合物混合。所有条件均为一式三份入板。用密封带密封板，在室温下以400-600rpm振荡2小时。孵育后，通过将板上下翻动并用吸收性毛巾吸干来去除孔中的溶液。用洗涤瓶洗涤孔，迅速吸干并轻敲，不让洗涤溶液浸泡在孔中。重复洗涤4次，并允许在最后一次洗涤后倒置放置约20秒以排干。最后，将100μL的TMB底物加到板的每个孔中，并且在室温下不搅拌孵育20-30分钟。通过向每个孔中添加100μL终止溶液来终止反应。在添加终止溶液的45分钟内将板装载到板读取器上，并在450nm和650nm处读取板。
将标准品的平均吸光度相对于标准品的理论HCP浓度绘制成半对数图，以基于以下等式生成四参数罗吉特(4PL)拟合曲线：
Y＝[(A-D)/(1+(X/C)^B)]+D
其中A为底渐近线，B为希尔斜率，C为对应于两个渐近线之间吸光度值中点的浓度(ng/mL)，D为顶渐近线，X为样品浓度(ng/mL)，并且Y为吸光度。然后使用SoftMax Pro软件使用标准曲线来确定加标样品对照和未加标测试样品中的HCP浓度。如果标准曲线的r2≥0.98，200ng/mL标准品的平均校正吸光度≥1.0OD，0ng/mL标准品的平均校正吸光度≤0.2OD，3个重复孔的校正吸光度变异系数≤15％，方可接受所述测试。每个样品的HCP最终浓度使用以下等式计算：
HCP浓度样品(ng/mL)＝稀释因子x测量的平均HCP浓度(ng/mL)。
结果
ELISA测量的残余宿主细胞蛋白低于先前批次载体、AVXS-101批次600156、AVXS1-101批次600307和AVXS-201DS的定量限值(8ng/mL)。
实例20-通过ELISA测量AAV9病毒载体中残余benzonase方法
使用商用酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒测量AAV产物(例如AVXS-101)中的残余benzonase浓度。默克公司Benzonase核酸内切酶(Merck Benzonase Endonuclease)ELISA试剂盒II是固相双位点酶免疫测定。它基于直接夹心技术，其中两种多克隆抗体直接针对Benzonase的分开的抗原决定簇。在孵育过程中，样品中的Benzonase与抗Benzonase抗体(其与微量板孔良好结合)结合，并与溶液中的过氧化物酶缀合的抗Benzonase抗体结合。
孵育期后，清洗孔以去除任何未结合的酶缀合的抗体。然后向孔中添加3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)底物溶液。结合的过氧化物酶缀合物在底物中催化变色反应。反应被酸的添加所终止，这给出了一个可在450nm处用分光光度法读取的比色终点。水解的底物的量与存在的Benzonase浓度成比例。
简言之，通过将175μL样品与175μL PBST组合，将样品稀释2倍。平行地，通过将175μL的样品与35μL的10ng/mL Benzonase标准品和140μL的PBST组合，也制备了加benzonase的样品对照。将试剂盒中的预涂ELISA条带安装在条带支撑器中，每个孔负载100μL的每个测试混合物。对于空白，负载100μL PBST代替样品。每种条件一式三份地负载。将板密封并在板振荡器(450rpm)上搅拌下在室温下孵育2小时±5分钟。孵育后，丢弃内容物，并且添加约350μL PBST使用免疫洗涤器洗涤平板，并且孵育1分钟，然后倒置并在吸收性毛巾上轻敲。在向每个孔中添加100μL稀释的HRP缀合抗体之前，共进行3次洗涤。将板密封并在板振荡器(450rpm)上搅拌下在室温下孵育1小时±5分钟。孵育后，丢弃内容物，并且添加约350μL PBST使用免疫洗涤器洗涤平板，并且孵育1分钟，然后倒置并在吸收性毛巾上轻敲。在向每个孔中添加100μL TMB底物之前，共进行3次洗涤。将板密封，并且将内容物在室温下在黑暗中在不搅拌情况下孵育15-40分钟。通过向每个孔中添加100μL的0.2N H2SO4终止溶液来终止反应。在添加终止溶液的45分钟内，使用分光光度计在450nm处测量板的吸光度。
将标准品的平均吸光度相对于标准品的理论Benzonase浓度绘制成半对数图，以基于以下等式生成四参数罗吉特(4PL)拟合曲线：
Y＝[(A-D)/(1+(X/C)^B)]+D
其中A为底渐近线，B为希尔斜率，C为对应于两个渐近线之间吸光度值中点的浓度(ng/mL)，D为顶渐近线，X为样品浓度(ng/mL)，并且Y为吸光度。然后使用SoftMax Pro软件使用标准曲线来确定加标样品对照和未加标测试样品中的HCP浓度。如果标准曲线的r2≥0.98，2.5ng/mL标准品的平均校正吸光度≥1.0OD，0.10ng/mL标准品的平均校正吸光度大于PBST空白的平均OD，3个重复孔的校正吸光度变异系数≤15％，方可接受所述测试。每个样品的HCP最终浓度使用以下等式计算：
Benzonase浓度样品(ng/mL)＝稀释因子x测量的平均Benzonase浓度(ng/mL)。
结果
ELISA测量的残余benzonase浓度低于先前批次载体、AVXS-101批次600156、AVXS1-101批次600307和AVXS-201DS的定量限值(0.2ng/mL)。
实例21-通过微BCA测定测量AAV9病毒载体中蛋白质浓度方法
使用2mg/mL牛血清白蛋白(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)，23209)参考蛋白标准品和微BCA蛋白测定试剂盒(赛默飞世尔科技公司，23235)，通过微BCA平板测定法测量在(例如AVXS-101的)处理中、原料药和药物产品样品中的蛋白量。所述测定基于洗涤剂兼容的二辛可宁酸(BCA)配制品，其用于比色检测和总蛋白定量。BCA检测Cu1 +，Cu1+是当Cu2+在碱性环境中被蛋白质还原时形成的。两个BCA分子与一个亚铜离子(Cu1+)螯合形成紫色的反应产物，其在562nm处有与蛋白质浓度增加呈线性关系的强吸光度。
简言之，通过在稀释剂(配制品缓冲液的20倍稀释，200mM NaCl、20mM Tris、1mMMgCl2，0.001％w/v普朗尼克F-68，pH 8.0)中连续稀释2mg/mL BSA制备标准品。AVXS-101的测试样品也在水中稀释20倍，并在稀释剂中进行连续稀释。目标浓度为约7.5μg/mL。工作试剂(WR)由试剂盒中的25份微BCA试剂A、24份试剂B和1份试剂C混合制备。将150μL的每个标准品和测试样品一式三份负载到96孔板中，并与150μL的WR混合。将板密封，并在板振荡器上以300rpm振荡30秒。然后在37℃±2℃不振荡的情况下孵育板2小时。孵育后，将板以1000rpm离心2分钟以收集凝结物，并且孵育后将板冷却15-60分钟。在562nm的板读取器中读取板，并用SoftMax Pro分析数据。
将标准品的平均吸光度相比于标准品的理论蛋白质浓度绘制成半对数图，并产生二次拟合。二次拟合基于以下等式：
Y＝A+Bx+Cx2
其中A、B、C为曲线拟合参数，x为以μg/mL的样品浓度，并且Y为以OD的吸光度。如果标准曲线的r2≥0.98，空白的平均吸光度小于最低标准品(1μg/mL)的平均吸光度，且各标准品的3个重复孔的吸光度变异系数≤10％，方可接受所述测试。然后用标准曲线确定测试样品中的蛋白质浓度。使用以下等式计算最终蛋白质浓度：
总蛋白浓度(μg/mL)＝稀释因子x测量的平均蛋白质浓度(μg/mL)。
结果
通过微BCA测量的总蛋白浓度为：对于先前批次载体为167μg/mL/1.0x 1013vg/mL，对于AVXS-101批次600156为179μg/mL/1.0x1013vg/mL，对于AVXS1-101批次600307为176μg/mL/1.0x 1013vg/mL，对于AVXS-201DP为182μg/mL/1.0x 1013vg/mL以及对于AVXS-301 DP为418μg/mL/1.0x 1013vg/mL。
实例22-AVXS-101、AVXS-201和AVXS-301的纯度和释放规范
对来自实例1至4的AVXS-101原料药和AVXS-101药物产品进行纯度测试。表32和33显示了这些产品的规范和释放标准。
表32：AVXS-101原料药释放规范
工艺相关杂质 来源 验收标准
宿主细胞蛋白(HCP) 细胞基质 ≤4ng/1.0E13 vg
宿主细胞DNA 细胞基质 ≤1.15E5 pg/1.0E13 vg
牛血清白蛋白(BSA) 细胞培养 ≤0.22ng/1.0E13 vg
质粒DNA(pDNA) 细胞培养 ≤ 6.8E5 pg/1.0E13 vg
聚乙烯亚胺(PEI) 细胞培养 释放时未测试
Benzonase 下游处理 ≤0.09ng/1.0E13 vg
吐温20 下游处理 释放时未测试
泊洛沙姆188 下游处理 20-80ppm
铯(Cs) 下游处理 ≤30μg/g(ppm)
乙醇 下游处理 释放时未测试
表33：AVXS-101药物产品释放规范
Figure BDA0002574379020001421
Figure BDA0002574379020001431
AVXS-201和AVXS-301可以使用与AVXS-101所述相同的工艺，例如，如实例1-4所述的工艺来制造和纯化。生物反应器中生产的每种产品的批次的规范和释放标准显示在表34-36中。
表34：AVXS-201原料药批次283-0218-005
Figure BDA0002574379020001432
Figure BDA0002574379020001441
表35：AVXS-201药物产品批次283-0218-006
Figure BDA0002574379020001442
Figure BDA0002574379020001451
表36：测试批次AVXS-301药物产品的纯度
Figure BDA0002574379020001452
Figure BDA0002574379020001461
AVXS-201和AVXS-301获得的高纯度表明，如本申请中所述的生产和纯化AAV病毒载体的方法显示了跨具有不同有效载荷的AAV病毒载体的广泛适用性。
在参考附图描述了实施例之后，应当理解，本公开不限于精确的实施例，并且本领域技术人员可以在其中实现各种改变和修改，而不脱离如所附权利要求中所定义的本公开和实施例的范围或精神。
示例性实施例列表
1.一种药物组合物，所述药物组合物包含：
(a)1-8X 1013个载体基因组/ml的用转基因工程改造的细小病毒；
(b)少于5.0％的空衣壳；
(c)少于40ng/ml残余宿主细胞蛋白/1X 1013vg/ml；
(d)少于1.2X 106pg/ml残余宿主细胞DNA/1X 1013vg/ml；以及，
(e)1-8X 1013个载体基因组/ml中的至少80％是功能性的。
2.如实施例1所述的组合物，其中所述残余质粒DNA的量包括少于1.7X 106pg/1X1013vg。
3.如实施例1所述的组合物，其中所述细小病毒的载体基因组/ml的量包括1.8-2.2X 1013个载体基因组/ml。
4.一种从哺乳动物宿主细胞培养物中纯化AAV颗粒以形成冷冻的中间体原料药的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)培养已经用重组AAV病毒粒子转染的细胞；
(b)在培养期后从所述细胞中收获扩增的病毒颗粒；
(c)通过过滤来纯化所述病毒颗粒以去除任何完整的细胞或细胞碎片；
(d)将来自步骤(c)的洗脱液进行切向流过滤；以及，
(e)冷冻经纯化的病毒颗粒的所得中体间制剂。
5.如实施例4所述的方法，其中在收获步骤期间使用核酸内切酶。
6.如实施例5所述的方法，其中所述核酸内切酶是benzonase。
7.根据实施例4所述的方法，其中纯化步骤使用深度过滤，然后通过去除大分子污染物和细胞碎片的过滤器进行过滤。
8.如实施例4所述的方法，其中所述切向流过滤步骤使用纤维素膜。
9.一种纯化来自哺乳动物宿主细胞培养物的AAV颗粒样品以形成药物产品的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)酸化和澄清步骤；
(b)阳离子交换色谱步骤；
(c)切向流过滤步骤；
(d)CsCl超速离心步骤以去除空衣壳；以及，
(e)切向流过滤步骤。
10.如实施例9所述的方法，其中所述酸化和澄清步骤包括将所述样品调节至pH3.5，并且通过用洗涤剂絮凝去除宿主细胞蛋白和DNA。
11.如实施例9所述的方法，其中所述阳离子交换柱包括磺酰基树脂。
12.如实施例9所述的方法，其中所述切向流过滤步骤(c)使用分子量截留值300kDa MW的纤维素膜，并且将所述阳离子交换步骤的洗脱液体积减少至少六倍。
13.如实施例9所述的方法，其中所述CsCl超速离心步骤使用深度过滤、然后通过0.45微米过滤器过滤来去除所述样品中至少80％的空衣壳。
14.如实施例9所述的方法，其中所述切向流过滤步骤(e)使用分子量截留值300kDa MW的纤维素膜。
15.一种治疗有需要的患者的神经疾病的方法，所述方法包括静脉内或鞘内递送如实施例1-3中任一项所述的药物组合物，其中所述细小病毒包含自互补AAV9基因组，并且其中所述工程改造的转基因包含SMN多核苷酸，并且其中所述疾病是SMA。
16.一种治疗有需要的患者的神经疾病的方法，所述方法包括鞘内递送如实施例1-3中任一项所述的药物组合物与造影剂，其中所述细小病毒包含自互补AAV9基因组，并且其中所述工程改造的转基因包含SMN多核苷酸，其中所述疾病是SMA，并且其中所述造影剂是欧乃派克180。
17.如实施例15-16中任一项所述的方法，其中所述SMA是II型、III型或IV型SMA。
18.一种治疗有需要的患者的II、III或IV型SMA的方法，所述方法包括鞘内递送如实施例1-3中任一项所述的药物组合物与造影剂，其中所述细小病毒包含自互补AAV9基因组，其中所述工程改造的转基因包含SMN多核苷酸，并且其中所述造影剂是欧乃派克180。
19.一种治疗有需要的患者的I型SMA的方法，所述方法包括静脉内递送如实施例1-3中任一项所述的药物组合物，其中所述细小病毒包含自互补AAV9基因组，并且其中所述工程改造的转基因包含SMN多核苷酸。
20.如实施例19所述的方法，其中所述患者是0-9月龄。
21.如实施例20所述的方法，其中所述患者是0-6月龄。
22.如实施例19所述的方法，其中儿科患者的重量高达约8kg。
Figure IDA0002574379100000011
Figure IDA0002574379100000021
Figure IDA0002574379100000031
Figure IDA0002574379100000041
Figure IDA0002574379100000051
Figure IDA0002574379100000061
Figure IDA0002574379100000071
Figure IDA0002574379100000081

Claims (221)

1.一种药物组合物，所述药物组合物包含：
a.1-8x 1013个AAV9病毒载体基因组/mL(vg/mL)；
b.少于约7％的空病毒衣壳；
c.少于约100ng/mL宿主细胞蛋白/1x 1013vg/mL；
d.少于约5x 106pg/mL残余宿主细胞DNA/1x 1013vg/mL；
并且其中所述1-8x 1013个AAV9病毒载体基因组/mL中至少约80％是功能性的。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述AAV9病毒载体包含编码运动神经元存活(SMN)蛋白的多核苷酸。
3.如权利要求1所述的组合物，其中所述AAV9病毒载体包含编码甲基-CpG结合蛋白2(MECP2)蛋白的多核苷酸。
4.如权利要求1所述的组合物，其中所述AAV9病毒载体包含编码靶向超氧化物歧化酶1(SOD1)的短发夹RNA(shRNA)的多核苷酸。
5.如权利要求2所述的组合物，其中所述AAV9病毒载体包含经修饰的AAV2 ITR、鸡β-肌动蛋白(CB)启动子、巨细胞病毒(CMV)即刻/早期增强子、经修饰的SV40晚期16s内含子、牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化信号和未经修饰的AAV2 ITR。
6.如权利要求2或5所述的组合物，其中所述多核苷酸编码SEQ ID NO:2的SMN蛋白。
7.如权利要求2、5或6中任一项所述的组合物，其中所述AAV9病毒载体包含SEQ ID NO:1。
8.如权利要求1-7中任一项所述的组合物，所述组合物包含1.7-2.3x 1013AAV9 vg/mL。
9.如权利要求1-8中任一项所述的组合物，所述组合物包含1.9-2.1x 1013AAV9 vg/mL。
10.如权利要求1-9中任一项所述的组合物，所述组合物包含约2x 1013AAV9 vg/mL。
11.如权利要求1-10中任一项所述的组合物，所述组合物包含少于约5％的空衣壳。
12.如权利要求1-11中任一项所述的组合物，所述组合物包含少于约3％的空衣壳。
13.如权利要求1-12中任一项所述的组合物，所述组合物包含少于约1％的空衣壳。
14.如权利要求1-13中任一项所述的组合物，所述组合物包含以下或由以下组成：1-2x1014vg的所述AAV9病毒载体。
15.如权利要求1-14中任一项所述的组合物，所述组合物包含以下或由以下组成：1.1x1014vg的所述AAV9病毒载体。
16.如权利要求1-15中任一项所述的组合物，所述组合物由1.7x 1014vg的所述AAV9病毒载体组成。
17.如权利要求1-16中任一项所述的组合物，其中使用体外细胞测定或体内动物模型测量功能性病毒载体基因组的百分比。
18.一种水性药物配制品，所述水性药物配制品包含：包含编码运动神经元存活(SMN)蛋白的多核苷酸的AAV9病毒载体、Tris缓冲液、氯化镁、氯化钠和泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)，其中所述药物组合物不包含防腐剂。
19.如权利要求18所述的配制品，其中所述AAV9病毒载体还包含经修饰的AAV2 ITR、鸡β-肌动蛋白(CB)启动子、巨细胞病毒(CMV)即刻/早期增强子、经修饰的SV40晚期16s内含子、牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化信号和未经修饰的AAV2 ITR。
20.如权利要求18或19所述的配制品，其中所述多核苷酸编码SEQ ID NO:2的SMN蛋白。
21.如权利要求18-20中任一项所述的配制品，其中所述AAV9病毒载体包含SEQ ID NO:1。
22.如权利要求18-21中任一项所述的配制品，其中所述Tris缓冲液浓度为约10-30nM，例如约20mM。
23.如权利要求18-22中任一项所述的配制品，其中所述配制品的pH为约7.7至约8.3，例如约pH 8.0(例如通过USP<791>测量)。
24.如权利要求18-23中任一项所述的配制品，其中所述氯化镁浓度为约0.5-1.5mM，例如约1mM。
25.如权利要求18-24中任一项所述的配制品，其中所述氯化钠浓度为约100-300mM，例如约200mM。
26.如权利要求18-25中任一项所述的配制品，其中所述配制品包含约0.005％w/v泊洛沙姆188。
27.如权利要求18-26中任一项所述的配制品，其中所述配制品的渗透压摩尔浓度为390-430mOsm/kg(例如通过USP<785>测量)。
28.如权利要求18-27中任一项所述的配制品，其中所述AAV9病毒载体是在如权利要求1-17中任一项所述的组合物中。
29.一种治疗有需要的患者的I型脊髓性肌萎缩(SMA)的方法，所述方法包括通过鞘内或静脉内途径给所述患者施用如权利要求18-28中任一项所述的配制品或如权利要求2或5-17中任一项所述的组合物，其中所述患者：
a.九月龄或更小；
b.体重至少约2.6kg；
c.具有双等位基因SMN1无效突变或缺失；以及
d.具有至少一个功能性SMN2拷贝。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述AAV9病毒载体包含经修饰的AAV2 ITR、鸡β-肌动蛋白(CB)启动子、巨细胞病毒(CMV)即刻/早期增强子、经修饰的SV40晚期16s内含子、牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化信号和未经修饰的AAV2 ITR。
31.如权利要求29或30所述的方法，其中所述多核苷酸编码SEQ ID NO:2的SMN蛋白。
32.如权利要求29-31中任一项所述的方法，其中所述AAV9病毒载体包含SEQ ID NO:1。
33.如权利要求29-32中任一项所述的方法，所述方法包括以约1-2.5x 1014vg/kg的剂量施用所述病毒载体。
34.如权利要求29-33中任一项所述的方法，所述方法包括以约1.1x 1014vg/kg的剂量施用所述病毒载体。
35.如权利要求33或34所述的方法，其中使用ddPCR测量病毒载体基因组的数量。
36.如权利要求29-35中任一项所述的方法，其中所述患者体重不超过约8.5kg。
37.如权利要求29-36中任一项所述的方法，其中所述患者在SMN2基因的至少一个拷贝的外显子7中没有c.859G>C取代。
38.如权利要求29-37中任一项所述的方法，其中在6月龄之前给所述患者施用所述治疗。
39.如权利要求29-38中任一项所述的方法，其中在一个或多个SMA症状发作之前给所述患者施用所述治疗，所述SMA症状选自肌张力减退、运动技能延迟、头部控制不良、圆肩姿势和关节活动过度。
40.如权利要求29-39中任一项所述的方法，其中所述患者的抗AAV9抗体效价为1:100或低于1:100，如在施用前通过ELISA结合免疫测定法测定的。
41.如权利要求29-40中任一项所述的方法，其中所述患者的抗AAV9抗体效价为1:50或低于1:50，如在施用前通过ELISA结合免疫测定法确定的。
42.如权利要求29-41中任一项所述的方法，其中所述患者在施用后具有如通过ELISA结合免疫测定法确定的高于1:100的抗AAV9效价，并且监测约1-8周或直到效价降低到低于1:100。
43.如权利要求29-42中任一项所述的方法，其中所述患者在施用后具有如通过ELISA结合免疫测定法确定的高于1:100的抗AAV9效价，并且监测约1-8周或直到效价降低到低于1:50。
44.如权利要求29-39中任一项所述的方法，其中所述患者在施用前或施用后具有如通过ELISA结合免疫测定法确定的高于1:100的抗AAV9效价，并且例如在施用前或施用后切换到配方喂养。
45.如权利要求29-39中任一项所述的方法，其中所述患者在施用前或施用后具有如通过ELISA结合免疫测定法确定的高于1:50的抗AAV9效价，并且例如在施用前或施用后切换到配方喂养。
46.如权利要求29-45中任一项所述的方法，其中所述患者在施用后具有如通过ELISA结合免疫测定法确定的高于1:100的抗AAV9效价，并使用血浆置换术治疗。
47.如权利要求29-46中任一项所述的方法，其中所述患者在施用后具有如通过ELISA结合免疫测定法确定的高于1:50的抗AAV9效价，并使用血浆置换术治疗。
48.如权利要求29-47中任一项所述的方法，其中所述患者在施用前血小板计数高于约67,000个细胞/ml或高于约100,000个细胞/ml，或高于约150,000个细胞/ml。
49.如权利要求29-48中任一项所述的方法，其中所述患者在施用后血小板计数低于约67,000个细胞/ml，或低于约100,000个细胞/ml，或低于约150,000个细胞/ml，并且监测约1-8周或直到血小板计数增加到约67,000个细胞/ml，或高于约100,000个细胞/ml，或高于约150,000个细胞/ml。
50.如权利要求29-49中任一项所述的方法，其中所述患者在施用后血小板计数低于约67,000个细胞/ml，并用血小板输注治疗。
51.如权利要求29-50中任一项所述的方法，其中所述患者在施用前没有血小板减少。
52.如权利要求29-51中任一项所述的方法，其中所述患者在施用后出现血小板减少，并被监测约1-8周或直到患者没有血小板减少。
53.如权利要求29-52中任一项所述的方法，其中所述患者在施用后出现血小板减少，并且用血小板输注治疗。
54.如权利要求29-53中任一项所述的方法，其中在施用所述病毒载体前，所述患者具有少于约0.176ug/ml的肌钙蛋白I水平。
55.如权利要求29-54中任一项所述的方法，其中在施用所述病毒载体后监测所述患者的肌钙蛋白I的水平。
56.如权利要求54或权利要求55所述的方法，其中在施用后进行心脏监测，直到所述患者的肌钙蛋白I水平低于约0.176ug/ml。
57.如权利要求29-56中任一项所述的方法，其中所述患者在施用前肝功能正常。
58.如权利要求57所述的方法，其中所述患者在施用前的肝转氨酶水平低于约8-40U/L。
59.如权利要求58所述的方法，其中所述肝转氨酶选自丙氨酸转氨酶(AST)、天冬氨酸转氨酶(ALT)及其组合。
60.如权利要求29-59中任一项所述的方法，其中所述患者在施用前的胆红素水平低于3.0mg/dL、肌酐水平低于1.8mg/dL、Hgb水平在8-18g/dL之间、和/或白细胞计数少于约20000个/mm3。
61.如权利要求29-60中任一项所述的方法，其中所述病毒载体在Tris缓冲盐水中施用。
62.如权利要求29-61中任一项所述的方法，其中所述病毒载体在约5-20mL/kg、约10-20mL/kg或约5.5-6.5mL/kg的Tris缓冲盐水中施用。
63.如权利要求29-62中任一项所述的方法，其中经约45-75分钟输注所述病毒载体。
64.如权利要求29-63中任一项所述的方法，其中经约60分钟输注所述病毒载体。
65.如权利要求63或权利要求64所述的方法，其中所述输注包括注射泵。
66.如权利要求29-65中任一项所述的方法，其中在施用所述病毒载体前至少24小时给所述患者施用口服类固醇。
67.如权利要求29-66中任一项所述的方法，其中在施用所述病毒载体后给所述患者施用口服类固醇至少30天。
68.如权利要求67所述的方法，其中所述口服类固醇每日施用一次。
69.如权利要求67所述的方法，其中所述口服类固醇每日施用两次。
70.如权利要求66-69中任一项所述的方法，其中在施用所述病毒载体后监测所述患者的ALT和/或AST的升高水平，并且其中在30天后继续施用所述口服类固醇，直到AST和/或ALT水平低于正常上限的两倍或低于约120IU/L。
71.如权利要求66-70中任一项所述的方法，其中给所述患者施用口服类固醇直到AST和/或ALT水平低于正常上限的两倍或低于约120IU/L。
72.如权利要求66-70中任一项所述的方法，其中所述口服类固醇以约1mg/kg的剂量施用。
73.如权利要求66-71中任一项所述的方法，所述方法进一步包括在AST和ALT低于正常上限的两倍或低于约120IU/L后，渐减所述口服类固醇施用。
74.如权利要求73所述的方法，其中所述渐减包括阶梯式递增至0.5mg/kg/天，持续2周，然后是0.25mg/kg/天，再持续2周。
75.如权利要求66-73中任一项所述的方法，所述方法包括以约1mg/kg的剂量施用所述口服类固醇30天，并且然后渐减降至0.5mg/kg/天，持续2周，然后是0.25mg/kg/天，再持续2周。
76.如权利要求66-75中任一项所述的方法，其中所述口服类固醇是泼尼松龙或等效物。
77.如权利要求29-76中任一项所述的方法，所述方法包括给所述患者施用肌肉增强剂或神经保护剂。
78.如权利要求29-77中任一项所述的方法，所述方法包括给所述患者施用靶向SMN的反义寡核苷酸。
79.如权利要求29-78中任一项所述的方法，所述方法包括给所述患者施用努辛生。
80.如权利要求29-79中任一项所述的方法，所述方法包括给所述患者施用司达鲁单抗。
81.如权利要求29-80中任一项所述的方法，其中使用CHOP-INTEND量表来确定功效。
82.一种治疗具有I型脊髓性肌萎缩(SMA)、具有或没有疾病发作的儿科患者的方法，所述方法包括给所述患者施用包含如权利要求2或5-28中任一项所述的腺相关病毒(AAV)载体的组合物或配制品。
83.一种治疗有需要的患者的雷特综合征的方法，所述方法包括通过鞘内或静脉内途径给所述患者施用如权利要求3或8-17中任一项所述的组合物。
84.一种治疗有需要患者的肌萎缩侧索硬化症(ALS)的方法，所述方法包括通过鞘内或静脉内途径给所述患者施用如权利要求4或8-17中任一项所述的组合物。
85.一种治疗患有I型SMA的患者的方法，所述方法包括：
a.确定所述患者的体重；
b.获得包含AAV9病毒载体药物组合物小瓶的试剂盒，其中所述试剂盒包含以下数量的小瓶：
Figure FDA0002574379010000081
Figure FDA0002574379010000091
c.其中每个小瓶中的病毒载体浓度为约2.0x 1013vg/mL；
d.其中所述AAV9病毒载体包含编码SMN蛋白的多核苷酸；以及
e.将来自所述小瓶的AAV9病毒载体施用给所述患者。
86.如权利要求85所述的方法，其中所述AAV9病毒载体包含突变的AAV2 ITR、鸡β-肌动蛋白(CB)启动子、巨细胞病毒(CMV)即刻/早期增强子、经修饰的SV40晚期16s内含子、牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化信号和AAV2 ITR。
87.如权利要求85或86所述的方法，其中所述多核苷酸编码SEQ ID NO:2的SMN蛋白。
88.如权利要求85-87中任一项所述的方法，其中所述AAV9病毒载体包含SEQ ID NO:1。
89.如权利要求85-88中任一项所述的方法，其中所述AAV病毒载体以约1.0x 1014-2.5x1014vg/kg的剂量通过输注施用。
90.如权利要求85-89中任一项所述的方法，其中所述AAV病毒载体以约1.1x 1014vg/kg的剂量通过输注施用。
91.如权利要求89或权利要求90所述的方法，其中经约45-70分钟输注所述病毒载体。
92.如权利要求89-91中任一项所述的方法，其中经约60分钟输注所述病毒载体。
93.如权利要求89-92中任一项所述的方法，其中所述输注包括注射泵。
94.如权利要求85-93中任一项所述的方法，其中使用ddPCR测量病毒载体基因组的数量。
95.如权利要求85-94中任一项所述的方法，其中通过ddPCR测量AAV9病毒载体的剂量效价。
96.如权利要求85-95中任一项所述的方法，所述方法包括施用以下剂量体积：
患者体重范围(kg) 剂量体积(mL) 2.6-3.0 16.5 3.1-3.5 19.3 3.6-4.0 22.0 4.1-4.5 24.8 4.6-5.0 27.5 5.1-5.5 30.3 5.6-6.0 33.0 6.1-6.5 35.8 6.6-7.0 38.5 7.1-7.5 41.3 7.6-8.0 44.0 8.1-8.5 46.8。
97.一种用于治疗患有I型脊髓性肌萎缩(SMA)的患者的试剂盒，所述试剂盒包含含有如权利要求2或5-17中任一项所述的组合物或如权利要求18-28中任一项所述的配制品的小瓶。
98.一种试剂盒，所述试剂盒包含含有约5.5mL或约8.3mL AAV9病毒载体的小瓶，所述AAV9病毒载体包含编码运动神经元存活(SMN)蛋白的多核苷酸，并以约2.0x 1013vg/mL的浓度配制在20mM Tris、1mM MgCl2、200mM NaCl、0.005％w/v泊洛沙姆188中，pH 7.7-8.3，例如约8.0。
99.如权利要求98所述的试剂盒，其中所述AAV9病毒载体包含突变的AAV2 ITR、鸡β-肌动蛋白(CB)启动子、巨细胞病毒(CMV)即刻/早期增强子、经修饰的SV40晚期16s内含子、牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化信号和AAV2 ITR。
100.如权利要求98或权利要求99所述的试剂盒，其中所述多核苷酸编码SEQ ID NO:2的SMN蛋白。
101.如权利要求98-100中任一项所述的试剂盒，其中所述AAV9病毒载体包含SEQ IDNO:1。
102.如权利要求98-101中任一项所述的试剂盒，其中使用ddPCR测量病毒载体基因组的数量。
103.一种治疗I型SMA的方法，所述方法包括通过静脉内输注给有需要的患者施用一定体积的如权利要求2或5-17中任一项所述的组合物或如权利要求18-28中任一项所述的配制品。
104.如权利要求103所述的方法，其中如果所述患者的体重为2.6-3.0kg，所述体积为16.5mL。
105.如权利要求103所述的方法，其中如果所述患者的体重为3.1-3.5kg，所述体积为19.3mL。
106.如权利要求103所述的方法，其中如果所述患者的体重为3.6-4.0kg，所述体积为22.0mL。
107.如权利要求103所述的方法，其中如果所述患者的体重为4.1-4.5kg，所述体积为24.8mL。
108.如权利要求103所述的方法，其中如果所述患者的体重为4.6-5.0kg，所述体积为27.5mL。
109.如权利要求103所述的方法，其中如果所述患者的体重为5.1-5.5kg，所述体积为30.3mL。
110.如权利要求103所述的方法，其中如果所述患者的体重为5.6-6.0kg，所述体积为33.0mL。
111.如权利要求103所述的方法，其中如果所述患者的体重为6.1-6.5kg，所述体积为35.8mL。
112.如权利要求103所述的方法，其中如果所述患者的体重为6.6-7.0kg，所述体积为38.5mL。
113.如权利要求103所述的方法，其中如果所述患者的体重为7.1-7.5kg，所述体积为41.3mL。
114.如权利要求103所述的方法，其中如果所述患者的体重为7.6-8.0kg，所述体积为44.0mL。
115.如权利要求103所述的方法，其中如果所述患者的体重为8.1-8.5kg，所述体积为46.8mL。
116.一种制造AAV病毒载体的方法，所述方法包括：
a.培养粘附细胞；
b.用一种或多种质粒转染所述粘附细胞以能够产生所述AAV病毒载体；
c.裂解所述粘附细胞以分离所述AAV病毒载体；
d.酸化和澄清(c)的细胞裂解物；
e.使用阳离子交换色谱(CEX)纯化(d)的产物；
f.使用切向流过滤(TFF)过滤(e)的产物；
g.在氯化铯(CsCl)缓冲液中超速离心(f)的产物；以及
h.从(g)的产物中收集所述AAV病毒载体。
117.如权利要求116所述的方法，其中所述AAV为AAV9。
118.如权利要求116或117所述的方法，其中所述AAV为自互补的(scAAV)。
119.如权利要求116-118中任一项所述的方法，其中所述粘附细胞为HEK293细胞。
120.如权利要求116-119中任一项所述的方法，其中在培养前选择所述粘附细胞用于粘附。
121.如权利要求116-120中任一项所述的方法，其中所述选择包括多次传代培养所述粘附细胞以选择用于粘附。
122.如权利要求116-121中任一项所述的方法，其中所述粘附细胞接种于生物反应器中用于培养。
123.如权利要求122所述的方法，其中所述生物反应器为可提供细胞培养基的连续循环的大型生物反应器。
124.如权利要求122或123所述的方法，其中所述生物反应器为200m2或333m2生物反应器。
125.如权利要求122或123所述的方法，其中所述生物反应器为500m2生物反应器。
126.如权利要求122-125中任一项所述的方法，其中将所述粘附细胞添加到再循环培养基袋中的培养基中，并例如使用蠕动泵循环通过所述生物反应器。
127.如权利要求126所述的方法，其中当所述粘附细胞接种于生物反应器中用于培养时，蠕动泵送是连续的。
128.如权利要求122-127中任一项所述的方法，其中所述接种密度为约8,000-12,000个细胞/cm2。
129.如权利要求122-128中任一项所述的方法，其中所述转染步骤包括将转染培养基添加到再循环培养基袋中，并且例如使用蠕动泵使所述转染培养基循环通过所述生物反应器。
130.如权利要求126-129中任一项所述的方法，其中所述循环，例如蠕动泵送，发生在15℃-25℃之间。
131.如权利要求116-130中任一项所述的方法，其中所述转染步骤包括使所述粘附细胞与腺病毒辅助质粒(pHELP)接触。
132.如权利要求116-131中任一项所述的方法，其中所述转染步骤包括使所述粘附细胞与编码AAV rep基因的质粒接触。
133.如权利要求116-132中任一项所述的方法，其中所述转染步骤包括使所述粘附细胞与编码AAV cap基因的质粒接触。
134.如权利要求116-133中任一项所述的方法，其中所述转染步骤包括使所述粘附细胞与在同一质粒(pAAV)上编码AAV rep基因和AAV cap基因的质粒接触。
135.如权利要求132或权利要求134所述的方法，其中所述AAV rep基因为rep2。
136.如权利要求133或134所述的方法，其中所述AAV cap基因为cap9。
137.如权利要求116-135中任一项所述的方法，其中所述转染步骤包括使所述粘附细胞与转染剂聚乙烯亚胺(PEI)接触。
138.如权利要求137所述的方法，其中PEI与所述质粒中的至少一种的重量比小于1:1。
139.如权利要求137所述的方法，其中PEI与所述质粒中的至少一种的重量比为约1:1。
140.如权利要求116-139中任一项所述的方法，其中所述转染步骤包括使所述粘附细胞与不含血清的转染培养基接触。
141.如权利要求116-140中任一项所述的方法，其中所述转染步骤包括使所述粘附细胞与不含钙的转染培养基接触。
142.如权利要求116-141中任一项所述的方法，其中所述转染步骤包括使所述粘附细胞与不含谷氨酰胺的转染培养基接触。
143.如权利要求116-142中任一项所述的方法，其中所述转染步骤进行10-60分钟。
144.如权利要求116-143中任一项所述的方法，其中所述转染步骤进行10-30分钟。
145.如权利要求116-144中任一项所述的方法，其中所述转染步骤进行小于30分钟。
146.如权利要求116-145中任一项所述的方法，其中所述转染步骤进行20-30分钟。
147.如权利要求116-146中任一项所述的方法，其中所述转染步骤进行15-30分钟。
148.如权利要求116-147中任一项所述的方法，其中所述裂解步骤包括全细胞裂解。
149.如权利要求116-148中任一项所述的方法，其中所述裂解步骤包括使用补充有核酸内切酶的裂解缓冲液。
150.如权利要求149所述的方法，其中所述核酸内切酶是benzonase。
151.如权利要求116-150中任一项所述的方法，其中所述裂解步骤包括使用补充有吐温的裂解缓冲液。
152.如权利要求116-151中任一项所述的方法，其中所述裂解步骤在15℃-25℃之间进行。
153.如权利要求116-152中任一项所述的方法，所述方法进一步包括在(d)的酸化步骤前冷冻步骤(c)的细胞裂解物。
154.一种从细胞培养物裂解物中纯化AAV病毒载体的方法，所述方法包括以下步骤：
a.酸化和澄清所述细胞裂解物；
b.使用阳离子交换色谱(CEX)纯化(a)的产物；
c.通过切向流过滤来过滤(b)的产物；
d.使用2-4M氯化铯(CsCl)缓冲液超速离心(c)的产物；
e.从(d)的产物中收集所述AAV病毒载体；
f.通过切向流过滤来过滤(e)的产物。
155.如权利要求116-154中任一项所述的方法，其中所述酸化步骤包括将所述细胞裂解物酸化至约3.0-4.0的pH。
156.如权利要求116-155中任一项所述的方法，其中所述酸化步骤包括将所述细胞裂解物酸化至约3.3-3.7的pH。
157.如权利要求116-156中任一项所述的方法，其中所述酸化步骤包括将所述细胞裂解物酸化至约3.4-3.6的pH。
158.如权利要求116-157中任一项所述的方法，其中所述酸化步骤包括将所述细胞裂解物酸化至约3.5的pH。
159.如权利要求116-158中任一项所述的方法，其中所述超速离心在40,000-50,000rpm之间进行。
160.如权利要求116-159中任一项所述的方法，其中所述超速离心在约43,000-46,000rpm之间进行。
161.如权利要求116-160中任一项所述的方法，其中所述超速离心在15℃-25℃之间进行。
162.如权利要求116-161中任一项所述的方法，其中所述超速离心进行16-24小时。
163.如权利要求116-162中任一项所述的方法，其中所述超速离心进行20-24小时。
164.如权利要求116-168中任一项所述的方法，其中所述CsCl的浓度为约3M。
165.如权利要求116-164中任一项所述的方法，其中所述细胞裂解物在所述酸化步骤前与吐温孵育。
166.如权利要求116-165中任一项所述的方法，其中所述细胞裂解物在所述酸化步骤前与吐温孵育约8-20小时。
167.如权利要求116-166中任一项所述的方法，其中所述澄清步骤包括使所述细胞裂解物通过深度过滤器进行过滤。
168.如权利要求116-167中任一项所述的方法，其中所述澄清步骤包括使所述细胞裂解物通过0.45微米过滤器进行过滤。
169.如权利要求116-168中任一项所述的方法，其中所述CEX包括磺酰基树脂。
170.如权利要求116-169中任一项所述的方法，其中至少一个TFF步骤包括使用分子量截留值300kDa MW的纤维素膜，并将所述阳离子交换步骤的洗脱液体积减少至少六倍。
171.如权利要求116-170中任一项所述的方法，其中至少一个TFF步骤包括使用分子量截留值约300kDa MW的纤维素膜。
172.如权利要求116-171中任一项所述的方法，其中所述CsCl缓冲液包含约3M CsCl。
173.如权利要求116-172中任一项所述的方法，其中所述CsCl缓冲液包含Tris、MgCl2和泊洛沙姆188。
174.如权利要求116-173中任一项所述的方法，其中所述CsCl缓冲液包含约20mMTris。
175.如权利要求116-174中任一项所述的方法，其中所述CsCl缓冲液包含约2mM MgCl2。
176.如权利要求116-175中任一项所述的方法，其中所述CsCl缓冲液包含泊洛沙姆188，任选地包含约约0.2％w/v泊洛沙姆188。
177.如权利要求116-176中任一项所述的方法，其中所述CsCl缓冲液在约pH 7.5-8.5之间。
178.如权利要求116-177中任一项所述的方法，其中所述CsCl缓冲液在约pH 7.9-8.2之间。
179.如权利要求116-178中任一项所述的方法，其中从超速离心的细胞裂解物中收集所述AAV病毒载体后，空病毒衣壳数量低于总病毒衣壳数量的7％。
180.如权利要求116-179中任一项所述的方法，其中从超速离心的细胞裂解物中收集所述AAV病毒载体后，空病毒衣壳数量低于总病毒衣壳数量的5％。
181.如权利要求116-200中任一项所述的方法，其中从超速离心的细胞裂解物中收集所述AAV病毒载体后，空病毒衣壳数量低于总病毒衣壳数量的3％。
182.如权利要求116-201中任一项所述的方法，其中从超速离心的细胞裂解物中收集所述AAV病毒载体后，空病毒衣壳数量低于总病毒衣壳数量的1％。
183.如权利要求179-182中任一项所述的方法，其中通过AUC测量空病毒衣壳数量。
184.如权利要求116-183中任一项所述的方法，其中使用注射器从超速离心的细胞裂解物中收集所述AAV病毒载体。
185.如权利要求116-184中任一项所述的方法，其中在第二TFF步骤之后收集的AAV病毒载体储存在包含Tris、MgCl2、NaCl和泊洛沙姆188的溶液中。
186.如权利要求185所述的方法，其中所述溶液包含约20mM Tris。
187.如权利要求185或权利要求186所述的方法，其中所述溶液包含约1mM MgCl2。
188.如权利要求185-187中任一项所述的方法，其中所述溶液包含约200mM NaCl。
189.如权利要求185-188中任一项所述的方法，其中所述溶液包含约0.005％w/v泊洛沙姆188。
190.如权利要求185-189中任一项所述的方法，其中所述溶液在约pH 7.5-8.5之间。
191.如权利要求185-190中任一项所述的方法，其中所述溶液在约pH 7.7-8.3之间。
192.如权利要求116-191中任一项所述的方法，其中在第二TFF后收集的AAV病毒载体含有少于约30μg/g或少于约20μg/g的CsCl。
193.如权利要求116-192中任一项所述的方法，其中在第二TFF后收集的AAV病毒载体的浓度大于或等于约3x 1013vg/ml。
194.如权利要求116-193中任一项所述的方法，其中使用洗涤剂絮凝从所述细胞裂解物中去除宿主细胞蛋白和/或宿主细胞DNA。
195.如权利要求116-194中任一项所述的方法，其中所述AAV病毒载体包含编码运动神经元存活(SMN)蛋白的多核苷酸。
196.如权利要求116-195中任一项所述的方法，其中所述AAV病毒载体包含突变的AAV2ITR、鸡β-肌动蛋白(CB)启动子、巨细胞病毒(CMV)即刻/早期增强子、经修饰的SV40晚期16s内含子、牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化信号和AAV2 ITR。
197.如权利要求195或权利要求196所述的方法，其中所述多核苷酸编码SEQ ID NO:2的SMN蛋白。
198.如权利要求195-196中任一项所述的方法，其中所述AAV病毒载体包含SEQ ID NO:1。
199.如权利要求195-198中任一项所述的方法，其中编码SMN蛋白的质粒、编码pAAV的质粒和编码pHELP的质粒以1:1:1的比例转染。
200.如权利要求116-194中任一项所述的方法，其中所述AAV病毒载体包含编码MECP2蛋白的多核苷酸。
201.如权利要求116-194中任一项所述的方法，其中所述AAV病毒载体包含编码靶向SOD1的shRNA的多核苷酸。
202.一种通过施用根据权利要求116-199中任一项所述的方法制备的AAV9病毒载体治疗患有1型SMA的患者的方法，所述AAV9病毒载体包含编码SMN蛋白的多核苷酸。
203.一种通过施用根据权利要求116-194或200中任一项所述的方法制备的AAV9病毒载体治疗患有雷特综合征的患者的方法，所述AAV9病毒载体包含编码MECP2蛋白的多核苷酸。
204.一种通过施用根据权利要求116-194或201中任一项所述的方法制备的AAV9病毒载体治疗患有ALS的患者的方法，所述AAV9病毒载体包含编码靶向SOD1的shRNA的多核苷酸。
205.一种根据权利要求116-199中任一项所述的方法制造的AAV9病毒载体，所述AAV9病毒载体包含编码SMN蛋白的多核苷酸。
206.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求116-199中任一项所述的方法制备的AAV9病毒载体，所述AAV9病毒载体包含编码SMN蛋白的多核苷酸。
207.一种水性药物组合物，所述水性药物组合物包含AAV9病毒载体，所述AAV9病毒载体包含编码SMN蛋白的多核苷酸、Tris缓冲液、氯化镁溶液和氯化钠溶液，其中所述药物组合物不包含防腐剂，并且其中所述组合物根据权利要求116-199中任一项所述的方法制备。
208.一种根据权利要求116-194或200中任一项所述的方法制造的AAV9病毒载体，所述AAV9病毒载体包含编码MECP2蛋白的多核苷酸。
209.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求116-194或200中任一项所述的方法制备的AAV9病毒载体，所述AAV9病毒载体包含编码MECP2蛋白的多核苷酸。
210.一种根据权利要求116-194或201中任一项所述的方法制造的AAV9病毒载体，所述AAV9病毒载体包含编码靶向SOD1的shRNA的多核苷酸。
211.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求116-194或201中任一项所述的方法制备的AAV9病毒载体，所述AAV9病毒载体包含编码靶向SOD1的shRNA的多核苷酸。
212.一种通过静脉内施用药物组合物治疗有需要的患者的I型SMA的方法，所述药物组合物包含：
a.自互补AAV9病毒载体，所述自互补AAV9病毒载体包含经修饰的AAV2 ITR、鸡β-肌动蛋白(CB)启动子、巨细胞病毒(CMV)即刻/早期增强子、经修饰的SV40晚期16s内含子、牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化信号和未经修饰的AAV2 ITR；
b.20mM Tris，pH 8.0；
c.1mM MgCl2；
d.200mM NaCl；以及
e.0.005％泊洛沙姆188；
其中所述患者的体重为2.6kg至8.5kg。
213.如权利要求212所述的方法，其中所述组合物不包含防腐剂。
214.如权利要求212或213所述的方法，其中所述患者：
a.九月龄或更小；
b.体重至少约2.6kg；
c.具有双等位基因SMN1无效突变或缺失；以及
d.具有至少一个功能性SMN2拷贝。
215.一种适合或制造用于静脉内施用药物组合物的组合物，所述药物组合物包含：
a.自互补AAV9病毒载体，所述自互补AAV9病毒载体包含经修饰的AAV2 ITR、鸡β-肌动蛋白(CB)启动子、巨细胞病毒(CMV)即刻/早期增强子、经修饰的SV40晚期16s内含子、牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化信号和未经修饰的AAV2 ITR；
b.20mM Tris，pH 8.0；
c.1mM MgCl2；
d.200mM NaCl；以及
e.0.005％泊洛沙姆188。
216.如权利要求215所述的组合物，其中所述组合物不包含防腐剂。
217.如权利要求116-201中任一项所述的方法，其中以工业规模执行所述方法。
218.如权利要求116-201或217中任一项所述的方法，其中生产的AAV产量大于5x1015vg、或大于8x 1015vg或大于1x 1016vg/制造批次。
219.如权利要求1-17、18-28、82-84或205-211中任一项所述的组合物或配制品，其中所述组合物或配制品包含以下中的至少一种：
a.少于约0.09ng benzonase/1.0x 1013vg，
b.少于约30μg/g(ppm)的铯，
c.约20-80ppm的泊洛沙姆188，
d.少于约0.22ng BSA/1.0x 1013vg，
e.少于约6.8x 105pg残余质粒DNA/1.0x 1013vg，
f.少于约1.1x 105pg残余hcDNA/1.0x 1013vg，
g.少于约4ng rHCP/1.0x 1013vg，
h.约pH 7.7-8.3，
i.约390-430mOsm/kg，
j.少于约600个尺寸≥25μm的颗粒/容器，
k.少于约6000个尺寸≥10μm的颗粒/容器，
l.约1.7x 1013-2.3x 1013vg/mL基因组效价，
m.感染效价为约3.9x 108-8.4x 1010IU/1.0x 1013vg，
n.约100-300μg总蛋白/1.0x 1013vg，
o.相对效力为约70％-130％，和
p.少于约5％的空衣壳。
220.如权利要求1-17、18-28、82-84或205-211中任一项所述的组合物或配制品，其中所述组合物或配制品包含以下中的至少一种：
a.约pH 7.7-8.3，
b.约390-430mOsm/kg，
c.少于约600个尺寸≥25μm的颗粒/容器，
d.少于约6000个尺寸≥10μm的颗粒/容器，
e.约1.7x 1013-2.3x 1013vg/mL基因组效价，
f.感染效价为约3.9x 108-8.4x 1010IU/1.0x 1013vg，
g.约100-300μg总蛋白/1.0x 1013vg，
h.普朗尼克F-68含量为约20-80ppm，
i.相对效力为约70％-130％，
j.在Δ7SMN小鼠模型中，在7.5x 1013vg/kg的剂量下中值存活数大于或等于24天，
k.少于约5％的空衣壳，
l.且总纯度大于或等于约95％，以及
m.少于或等于约0.75EU/mL的内毒素。
221.如权利要求1-17、18-28、82-84或205-211中任一项所述的组合物或配制品，其中所述组合物或配制品包含以下中的至少一种：
a.少于约0.09ng benzonase/1.0x 1013vg，
b.少于约30μg/g(ppm)的铯，
c.约20-80ppm的泊洛沙姆188，
d.少于约0.22ng BSA/1.0x 1013vg，
e.少于约6.8x 105pg残余质粒DNA/1.0x 1013vg，
f.少于约1.1x 105pg残余hcDNA/1.0x 1013vg，以及
g.少于约4ng rHCP/1.0x 1013vg。
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