JP2021502123A - ウイルスベクターの調製手段及び方法並びにその使用 - Google Patents

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Abstract

ウイルス粒子の調製及び精製方法、並びにそれを含む組成物及び使用が提供される。【選択図】図２

Description

配列表
本願は、ＥＦＳ−ＷｅｂからＡＳＣＩＩ形式で提出された配列表を含み、この配列表は本明細書によって全体として参照により援用される。２０１８年１０月３１日に作成された前記ＡＳＣＩＩ複製物は、名称がＡＶＥＸ−００３００１ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔであり、１４，６３９バイトのサイズである。
関連出願
本願は、２０１７年１１月８日に出願された米国仮特許出願第６２／５８３，０３５号明細書に対する優先権を主張するものであり、その内容は全体として参照により本明細書に援用される。
本開示は、ウイルス粒子の調製及び精製方法並びにそれを含む組成物及び使用に関する。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）はパルボウイルス科（ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）のメンバーである。ＡＡＶゲノムは、約４．７キロベース（ｋｂ）を含む、且つ非構造Ｒｅｐ（複製）及び構造Ｃａｐ（カプシド）タンパク質をコードする２つの主要なオープンリーディングフレームからなる線状一本鎖ＤＮＡ分子で構成されている。ＡＡＶコード領域には、約１４５ヌクレオチド長の、ＤＮＡ複製開始時にプライマーとして機能するヘアピン構造に折り畳まれることができる分断されたパリンドローム配列を含む２つのシス作用性逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列が隣接する。ＤＮＡ複製におけるその役割に加えて、ＩＴＲ配列は、ウイルス組込み、宿主ゲノムからのレスキュー、及び成熟ビリオンへのウイルス核酸のカプシド化に必要であることが示されている（Ｍｕｚｙｃｚｋａ，（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７−１２９）。
複数のＡＡＶ血清型が存在し、多様な組織向性を提供する。既知の血清型には、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０及びＡＡＶ１１が含まれる。ＡＡＶ９については、米国特許第７，１９８，９５１号明細書及びＧａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１−６３８８（２００４）（これらは本明細書によって全体として参照により援用される）に記載されている。ＡＡＶ６及びＡＡＶ８の送達の進歩により、単純な全身性静脈内又は腹腔内注射後に骨格筋及び心筋をこれらの血清型によって形質導入することが可能になっている。Ｐａｃａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．，９９（４）：３−９（２００６）及びＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３（３）：３２１−８（２００５）を参照のこと。しかしながら、ＡＡＶを使用して中枢神経系内にある細胞型を標的とするには、外科的脳実質内注射が必要となっている。Ｋａｐｌｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，“Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ ｔｏｌｅｒａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ａｎ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ） ｂｏｒｎｅ ＧＡＤ ｇｅｎｅ ｆｏｒ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ：ａｎ ｏｐｅｎ ｌａｂｅｌ，ｐｈａｓｅ Ｉ ｔｒｉａｌ．”Ｌａｎｃｅｔ，３６９：２０９７−２１０５；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ＡＡＶ２−ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ ｆｏｒ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ：ａ ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ，ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｒｉａｌ．”Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ ９：１１６４−１１７２；及びＷｏｒｇａｌｌ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｌａｔｅ ｉｎｆａｎｔｉｌｅ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｃｅｒｏｉｄ ｌｉｐｏｆｕｓｃｉｎｏｓｉｓ ｂｙ ＣＮＳ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ２ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ＣＬＮ２ ｃＤＮＡ．”Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，１９（５）：４６３−７４を参照のこと。
ＡＡＶ血清型２型（ＡＡＶ２）ゲノムのヌクレオチド配列は、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，４５：５５５−５６４（１９８３）に提示され、Ｒｕｆｆｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ，７５：３３８５−３３９２（１９９４）によって訂正されたとおりである。ＩＴＲ内には、ウイルスＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、カプシド化／パッケージング及び宿主細胞染色体組込みを指図するシス作用配列が含まれる。３つのＡＡＶプロモーター（その相対マッピング位置からｐ５、ｐ１９、及びｐ４０と呼ばれる）が、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部オープンリーディングフレームの発現をドライブする。２つのｒｅｐプロモーター（ｐ５及びｐ１９）が、単一のＡＡＶイントロンの差次的スプライシング（ヌクレオチド２１０７及び２２２７における）と共に、ｒｅｐ遺伝子から４つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、及びｒｅｐ４０）の産生をもたらす。ｒｅｐタンパク質は複数の酵素的特性を備え、最終的にはそれらがウイルスゲノムの複製に関与する。ｃａｐ遺伝子はｐ４０プロモーターから発現し、３つのカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３をコードする。選択的スプライシング部位及び非コンセンサス翻訳開始部位が、これらの３つの関連するカプシドタンパク質の産生に関与する。単一のコンセンサスポリアデニル化部位が、ＡＡＶゲノムのマッピング位置９５に位置する。ＡＡＶのライフサイクル及び遺伝学については、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８：９７−１２９（１９９２）にレビューされている。
ＡＡＶに由来するベクターは、（ｉ）筋線維及びニューロンを含めた多様な非分裂及び分裂細胞型に感染（形質導入）することが可能であり；（ｉｉ）ウイルス構造遺伝子を欠いているため、ウイルス感染に対する天然の宿主細胞応答、例えばインターフェロン媒介性応答がなくなり；（ｉｉｉ）野生型ウイルスはこれまでヒトにおけるいかなる病理とも関連付けられたことがなく；（ｉｖ）宿主細胞ゲノムへの組込み能を有する野生型ＡＡＶと対照的に、複製欠損ＡＡＶベクターは概してエピソームとして残り、従って癌遺伝子の挿入突然変異誘発又は活性化のリスクが限定され；及び（ｖ）他のベクター系と対照的に、ＡＡＶベクターは顕著な免疫応答を引き起こさず（ｉｉを参照）、従って治療用トランス遺伝子の長期発現を（その遺伝子産物が拒絶されないならば）もたらすという理由で、遺伝子材料の送達に特に魅力的である。
自己相補的アデノ随伴ベクター（ｓｃＡＡＶ）は、天然に存在するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）から遺伝子療法における使用向けに操作されたウイルスベクターである。ｓｃＡＡＶは、コード領域が分子内二本鎖ＤＮＡ鋳型を形成するように設計されているため「自己相補的」と称される。典型的なＡＡＶゲノムは一本鎖ＤＮＡ鋳型であるため、標準的なＡＡＶゲノムライフサイクルの律速段階は第２鎖合成を伴う。しかしながら、ｓｃＡＡＶゲノムにはこれは当てはまらない。感染時、細胞媒介性の第２鎖合成を待つのでなく、むしろｓｃＡＡＶの２つの相補的な半分が会合して、いつでも複製及び転写できる状態の１つの二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）単位を形成することになる。
例えば、空のカプシドが少なく、宿主細胞タンパク質が少なく、及び／又は夾雑ＤＮＡが少ないながらも高い効力を保持しているＡＡＶ医薬製品の規模拡張性のある製造及び精製方法を開発することが依然として必要とされている。
本開示は、ＡＡＶ粒子調製物を含めた精製ウイルス粒子調製物の調製方法を提供する。
一部の実施形態において、本開示は、（ａ）１〜８×１０１３ＡＡＶ９ウイルスベクターゲノム／ｍＬ（ｖｇ／ｍＬ）、（ｂ）約７％未満の空のウイルスカプシド、（ｃ）１×１０１３ｖｇ／ｍＬ当たり約１００ｎｇ／ｍＬ未満の宿主細胞タンパク質、及び（ｄ）１×１０１３ｖｇ／ｍＬ当たり約５×１０６ｐｇ／ｍＬ未満の残留宿主細胞ＤＮＡを含む医薬組成物を提供し、ここで１〜８×１０１３ＡＡＶ９ウイルスベクターゲノム／ｍＬの少なくとも約８０％は機能性である。
一実施形態において、ＡＡＶ９ウイルスベクターは、生存運動ニューロン（ＳＭＮ）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。一実施形態において、ＡＡＶ９ウイルスベクターは、メチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。一実施形態において、ＡＡＶ９ウイルスベクターは、スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）を標的とする低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチドを含む。一実施形態において、ＡＡＶ９ウイルスベクターは、修飾ＡＡＶ２ ＩＴＲ、ニワトリβ−アクチン（ＣＢ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサー、修飾ＳＶ４０後期１６ｓイントロン、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル、及び非修飾ＡＡＶ２ ＩＴＲを含む。
本開示は、医薬製剤を提供する。一部の実施形態において、水性医薬製剤は、（ａ）生存運動ニューロン（ＳＭＮ）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶ９ウイルスベクター、（ｂ）トリス緩衝液、（ｃ）塩化マグネシウム、（ｄ）塩化ナトリウム、及び（ｅ）ポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）を含み、ここで医薬組成物は保存剤を含まない。製剤の一実施形態において、ＡＡＶ９ウイルスベクターは、修飾ＡＡＶ２ ＩＴＲ、ニワトリβ−アクチン（ＣＢ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサー、修飾ＳＶ４０後期１６ｓイントロン、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル、及び非修飾ＡＡＶ２ ＩＴＲを更に含む。製剤の一実施形態において、トリス緩衝液濃度は約１０〜３０ｎＭ、例えば約２０ｍＭである。一実施形態において、製剤のｐＨは約７．７〜約８．３、例えば約ｐＨ８．０（例えば、ＵＳＰ＜７９１＞（全体として参照により援用される）により測定したとき）である。製剤の一実施形態において、塩化マグネシウム濃度は約０．５〜１．５ｍＭ、例えば約１ｍＭである。製剤の一実施形態において、塩化ナトリウム濃度は約１００〜３００ｍＭ、例えば約２００ｍＭである。一実施形態において、製剤は約０．００５％ｗ／ｖポロキサマー１８８を含む。
本開示の別の態様は、ＳＭＮタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶ９ウイルスベクター（例えば、本明細書に開示されるとおりの組成物又は製剤）を髄腔内又は静脈内経路によって患者に投与することを含む、それを必要としている患者におけるＩ型脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）の治療方法に関し、ここで患者は、（ａ）９ヵ月齢以下であり、（ｂ）少なくとも約２．６ｋｇの体重であり、（ｃ）両アレル性ＳＭＮ１ヌル突然変異又は欠失を有し、及び（ｄ）ＳＭＮ２の少なくとも１つの機能性コピーを有する。一実施形態において、ＡＡＶ９ウイルスベクターは、修飾ＡＡＶ２ ＩＴＲ、ニワトリβ−アクチン（ＣＢ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサー、修飾ＳＶ４０後期１６ｓイントロン、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル、及び非修飾ＡＡＶ２ ＩＴＲを含む。ある実施形態において、患者の体重は約８．５ｋｇ以下である。一実施形態において、患者はＳＭＮ２遺伝子の少なくとも１つのコピーのエクソン７にｃ．８５９Ｇ＞Ｃ置換を有しない。ある実施形態において、治療は６ヵ月齢より前に患者に投与される。ある実施形態において、治療は、筋緊張低下、運動技能遅滞、定頸不全、円背姿勢及び関節過度可動性から選択される１つ以上のＳＭＡ症状が発症する前に患者に投与される。一実施形態において、患者は、投与前にＥＬＩＳＡ結合イムノアッセイによって決定したとき１：１００以下の抗ＡＡＶ９抗体力価を有する。
本明細書にはまた、本明細書に開示されるとおりのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む組成物又は製剤を患者に投与することを含む、疾患発症を伴う又は伴わない脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）Ｉ型小児患者の治療方法も開示される。
本開示はまた、メチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶ９ウイルスベクターを髄腔内又は静脈内経路によって患者に投与することを含む、それを必要としている患者におけるレット症候群の治療方法にも関する。
本開示はまた、スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）を標的とする低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶ９ウイルスベクターを髄腔内又は静脈内経路によって患者に投与することを含む、それを必要としている患者における筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の治療方法にも関する。
本開示の別の態様は、Ｉ型ＳＭＡに罹患している患者の治療方法に関し、この方法は、（ａ）患者の体重を決定するステップ、（ｂ）ＡＡＶ９ウイルスベクター医薬組成物のバイアルが入ったキットを入手するステップ、及び（ｃ）バイアルからのＡＡＶ９ウイルスベクターを患者に投与するステップを含み、ここで各バイアル中のウイルスベクター濃度は約２．０×１０１３ｖｇ／ｍＬであり、ＡＡＶ９ウイルスベクターは、ＳＭＮタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み；及びここでキットは以下の本数のバイアルを含む。
一実施形態において、本キットは、突然変異ＡＡＶ２ ＩＴＲ、ニワトリβ−アクチン（ＣＢ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサー、修飾ＳＶ４０後期１６ｓイントロン、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル、及びＡＡＶ２ ＩＴＲを含むＡＡＶ９ウイルスベクターを含む。一実施形態において、ＡＡＶウイルスベクターは、約１．０×１０１４〜２．５×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で注入によって投与される。
本開示の別の態様は、生存運動ニューロン（ＳＭＮ）タンパク質をコードするポリヌクレオチドをＡＡＶ９ウイルスベクターが含む組成物又は（ａ）生存運動ニューロン（ＳＭＮ）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶ９ウイルスベクター、（ｂ）トリス緩衝液、（ｃ）塩化マグネシウム、（ｄ）塩化ナトリウム、及び（ｅ）ポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）を含む製剤が入ったバイアルを含む、Ｉ型脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）に罹患している患者の治療用キットに関する。
本開示の別の態様は、生存運動ニューロン（ＳＭＮ）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、且つｐＨ７．７〜８．３、例えば約８．０の２０ｍＭトリス、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．００５％ｗ／ｖポロキサマー１８８中に約２．０×１０１３ｖｇ／ｍＬの濃度で製剤化された約５．５ｍＬ又は約８．３ｍＬのＡＡＶ９ウイルスベクターが入ったバイアルを含むキットに関する。
本開示の別の態様は、ある容積の組成物であって、生存運動ニューロン（ＳＭＮ）タンパク質をコードするポリヌクレオチドをＡＡＶ９ウイルスベクターが含む組成物又は（ａ）生存運動ニューロン（ＳＭＮ）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶ９ウイルスベクター、（ｂ）トリス緩衝液、（ｃ）塩化マグネシウム、（ｄ）塩化ナトリウム、及び（ｅ）ポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）を含む製剤を静脈内注入によってそれを必要としている患者に投与することを含む、Ｉ型ＳＭＡの治療方法に関する。
本開示の別の態様は、ＡＡＶウイルスベクターの製造方法に関する。一実施形態において、ＡＡＶウイルスベクターの製造方法は、（ａ）接着細胞を培養するステップ、（ｂ）接着細胞に１つ又は複数のプラスミドをトランスフェクトしてＡＡＶウイルスベクターの産生を可能にするステップ、（ｃ）接着細胞を溶解させてＡＡＶウイルスベクターを単離するステップ、（ｄ）（ｃ）の細胞ライセートを酸性化及び清澄化するステップ、（ｅ）（ｄ）の産物を陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）を用いて精製するステップ、（ｆ）（ｅ）の産物をタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）を用いてろ過するステップ、（ｇ）（ｆ）の産物を塩化セシウム（ＣｓＣｌ）緩衝液中で超遠心するステップ；及び（ｈ）（ｇ）の産物からＡＡＶウイルスベクターを収集するステップを含む。
本開示の別の態様は、細胞培養ライセートからのＡＡＶウイルスベクターの精製方法に関し、この方法は、（ａ）細胞ライセートを酸性化及び清澄化するステップ、（ｂ）（ａ）の産物を陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）を用いて精製するステップ、（ｃ）（ｂ）の産物をタンジェンシャルフローろ過でろ過するステップ、（ｄ）（ｃ）の産物を２〜４Ｍ塩化セシウム（ＣｓＣｌ）緩衝液を用いて超遠心するステップ、（ｅ）（ｄ）の産物からＡＡＶウイルスベクターを収集するステップ、（ｆ）（ｅ）の産物をタンジェンシャルフローろ過でろ過するステップを含む。ある実施形態において、本方法は工業規模で実施される。ある実施形態において、本方法は、製造バッチ当たり５×１０１５ｖｇ超、又は８×１０１５ｖｇ超又は１×１０１６ｖｇ超の収率を生じる。
本開示の別の態様は、本明細書に開示される方法のいずれかにより調製されるとおりのＳＭＮタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶ９ウイルスベクターを投与することによる、ＳＭＡ１型を有する患者の治療方法に関する。
本開示の別の態様は、本明細書における方法のいずれかにより調製されるとおりのＭＥＣＰ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶ９ウイルスベクターを投与することによる、レット症候群を有する患者の治療方法に関する。
本開示の別の態様は、本明細書における方法のいずれかにより調製されるとおりのＳＯＤ１を標的とするｓｈＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶ９ウイルスベクターを投与することによる、ＡＬＳを有する患者の治療方法に関する。
本開示の別の態様は、本明細書における方法のいずれかにより製造される、ＳＭＮタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶ９ウイルスベクターに関する。
本開示の別の態様は、本明細書における方法のいずれかにより製造される、ＳＭＮタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶ９ウイルスベクターを含む医薬組成物に関する。
本開示の別の態様は、ＳＭＮタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶ９ウイルスベクターと、トリス緩衝液と、塩化マグネシウム溶液と、塩化ナトリウム溶液とを含む水性医薬組成物に関し、ここで医薬組成物は保存剤を含まず、及びここで組成物は、本明細書における方法のいずれかにより製造される。
本開示の別の態様は、本明細書における方法のいずれかにより製造される、ＭＥＣＰ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶ９ウイルスベクターに関する。
本開示の別の態様は、本明細書における方法のいずれかにより製造される、ＭＥＣＰ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶ９ウイルスベクターを含む医薬組成物に関する。
本開示の別の態様は、本明細書における方法のいずれかにより製造される、ＳＯＤ１を標的とするｓｈＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶ９ウイルスベクターに関する。
本開示の別の態様は、（ａ）修飾ＡＡＶ２ ＩＴＲと、ニワトリβ−アクチン（ＣＢ）プロモーターと、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサーと、修飾ＳＶ４０後期１６ｓイントロンと、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナルと、非修飾ＡＡＶ２ ＩＴＲとを含む自己相補的ＡＡＶ９ウイルスベクター、（ｂ）ｐＨ８．０の２０ｍＭトリス、（ｃ）１ｍＭ ＭｇＣｌ２、（ｄ）２００ｍＭ ＮａＣｌ、及び（ｅ）０．００５％ポロキサマー１８８を含む医薬組成物を静脈内投与することによる、それを必要としている患者におけるＩ型ＳＭＡの治療方法に関し、ここで患者は体重が２．６ｋｇ〜８．５ｋｇである。一実施形態において、本組成物は保存剤を含まない。
一実施形態において、患者は、（ａ）９ヵ月齢以下であり、（ｂ）少なくとも約２．６ｋｇの体重であり、（ｃ）両アレル性ＳＭＮ１ヌル突然変異又は欠失を有し、及び（ｄ）ＳＭＮ２の少なくとも１つの機能性コピーを有する。
本開示の別の態様は、（ａ）修飾ＡＡＶ２ ＩＴＲと、ニワトリβ−アクチン（ＣＢ）プロモーターと、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサーと、修飾ＳＶ４０後期１６ｓイントロンと、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナルと、非修飾ＡＡＶ２ ＩＴＲとを含む自己相補的ＡＡＶ９ウイルスベクター、（ｂ）ｐＨ８．０の２０ｍＭトリス、（ｃ）１ｍＭ ＭｇＣｌ２、（ｄ）２００ｍＭ ＮａＣｌ、及び（ｅ）０．００５％ポロキサマー１８８を含む医薬組成物の静脈内投与に好適な、又はそれ用に製造される組成物に関する。
一部の実施形態において、本明細書には組成物又は製剤が開示され、ここで本組成物又は製剤は、以下のうちの少なくとも１つ：（ａ）１．０×１０１３ｖｇ当たり約０．０９ｎｇ未満のベンゾナーゼ、（ｂ）約３０μｇ／ｇ（ｐｐｍ）未満のセシウム、（ｃ）約２０〜８０ｐｐｍのポロキサマー１８８、（ｄ）１．０×１０１３ｖｇ当たり約０．２２ｎｇ未満のＢＳＡ、（ｅ）１．０×１０１３ｖｇ当たり約６．８×１０５ｐｇ未満の残留プラスミドＤＮＡ、（ｆ）１．０×１０１３ｖｇ当たり約１．１×１０５ｐｇ未満の残留ｈｃＤＮＡ、及び（ｇ）１．０×１０１３ｖｇ当たり約４ｎｇ未満のｒＨＣＰを含む。
一部の実施形態において、本開示は、ワーキングセルバンクに由来する中間体（例えば、凍結中間体）を産生する上流工程を提供し、ここで上流工程は、（ａ）細胞を培養するステップ、（ｂ）培養細胞にプラスミド（例えば３つのプラスミド）をトランスフェクトするステップ、（ｃ）培養期間後に細胞から拡大したウイルス粒子を回収するステップ、（ｄ）ウイルス粒子をろ過によって精製して任意のインタクトな細胞又は細胞デブリを除去するステップ、（ｅ）ステップ（ｄ）からの溶出液をタンジェンシャルフローろ過に供するステップ、及び（ｇ）任意選択で、得られた精製ウイルス粒子中間調製物を凍結するステップを含む。一部の実施形態において、上流工程は、更なる処理ステップ、特に、ｇ．、最終医薬製品を産生する更なる精製及び製剤化ステップと組み合わされる。
一実施形態において、ワーキングセルバンクはＨＥＫ２９３細胞を含む。他の実施形態において、当該技術分野で利用可能な、且つ本明細書に開示される方法における使用に好適な別の細胞型又は誘導体が使用される。
一実施形態において、トランスフェクションステップはポリエチレンイミンを利用する。一実施形態において、トランスフェクションステップは、トランス遺伝子プラスミド、例えばｐＳＭＮ、ｐＡＡＶプラスミド及びｐＨＥＬＰプラスミドを使用した三重ベクタートランスフェクションを含む。
一実施形態において、本工程は、トランスフェクト細胞を溶解緩衝液及び界面活性剤で溶解させることを更に含む。
一実施形態において、回収ステップは、産物を例えば５０〜２００Ｕ／ｍｌの濃度、例えば７５〜１５０Ｕ／ｍｌの濃度のベンゾナーゼなどのエンドヌクレアーゼで処理して残留宿主細胞ＤＮＡを低減することを含む。
一実施形態において、精製ステップは、デプスろ過と、続く大型分子夾雑物及び細胞デブリを除去するフィルタ、例えば０．４５ミクロンフィルタであって、しかしベクターゲノムがそこを通過することは許容するフィルタでのろ過とを含む。任意の好適なデプスフィルタを使用し得る。
一実施形態において、タンジェンシャルフローろ過（「ＴＦＦ」）はステップ（ｄ）の溶出液の５〜１５倍、例えば６〜１０倍濃縮及び少なくとも４ダイアボリューム（ｄｉａｖｏｌｕｍｅ）、例えば６ダイアボリュームのダイアフィルトレーション又は１０ダイアボリューム、又は１２ダイアボリューム、又は１５ダイアボリュームのダイアフィルトレーションを実現する。任意の好適なＴＦＦフィルタを使用し得る。ある実施形態において、ＴＦＦ膜はセルロース膜である。ある実施形態において、ＴＦＦ膜は３００ｋＤａカットオフを有する。
第二に、本開示は、中間体（例えば凍結中間体）をろ過済み原薬に処理する下流工程を提供する。下流工程ステップには、酸性化及び清澄化ステップ（ろ過を用いる）と、それに続く陽イオン交換クロマトグラフィー、タンジェンシャルフローろ過、ＣｓＣｌ超遠心及び更なるタンジェンシャルフローろ過ステップが含まれ、これにより精製されたＡＡＶ粒子が薬学的に許容可能な担体中に懸濁されているろ過済み原薬が産生される。
一実施形態において、酸性化及び清澄化ステップは、デプスろ過と、続く大型分子夾雑物及び細胞デブリを除去するフィルタ、例えば０．４５ミクロンフィルタでのろ過とを含む。一部の実施形態において、ｐＨ調整が制御される。このステップの一部として、一実施形態では、デタージェント、例えばＴｗｅｅｎが添加される。一部の実施形態において、Ｔｗｅｅｎの添加速度及びＴｗｅｅｎの濃度範囲が制御される。
一実施形態において、陽イオン交換クロマトグラフィーは、０．２ミクロン細孔径の複合スルホニル樹脂を使用した膜ベースのクロマトグラフィー樹脂を含む。
一実施形態において、塩化セシウム（ＣｓＣｌ）超遠心ステップは、２〜４Ｍ ＣｓＣｌ、例えば約３Ｍ ＣｓＣｌを使用する。
別の実施形態において、ＣｓＣｌ超遠心ステップは約４０〜５０ｋＲＰＭで約２０〜２５時間実施される。別の実施形態において、ＣｓＣｌ超遠心ステップは約４５ｋＲＰＭで約２２時間実施される。
一実施形態において、タンジェンシャルフローろ過（「ＴＦＦ」）はステップ（ｄ）の溶出液の５〜１５倍、例えば６〜１０倍濃縮及び少なくとも４ダイアボリューム、例えば６ダイアボリュームのダイアフィルトレーション又は１０ダイアボリューム、又は１２ダイアボリューム、又は１５ダイアボリュームのダイアフィルトレーションを実現する。ある実施形態において、ＴＦＦ膜は３００ｋＤａカットオフを有する。
一実施形態において、溶出液は検出レベル未満のセシウム（Ｃｓ）である。別の実施形態において、Ｃｓの検出レベルは５０百万分率（ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ）（ｐｐｍ）未満である。別の実施形態において、Ｃｓの検出レベルは約５０〜７０ｐｐｍである。別の実施形態において、Ｃｓの検出レベルは約７０〜９０百万分率（ｐｐｍ）である。別の実施形態において、Ｃｓの検出レベルは約９０〜１１０百万分率（ｐｐｍ）である。別の実施形態において、Ｃｓの検出レベルは約１１０〜１３０百万分率（ｐｐｍ）である。別の実施形態において、Ｃｓの検出レベルは約１３０〜１５０百万分率（ｐｐｍ）である。別の実施形態において、Ｃｓの検出レベルは１５０百万分率（ｐｐｍ）未満である。
これらの精製方法を用いると、１×１０１３ベクターゲノム（「ｖｇ」）／ｍｌ当たり５×１０６ｐｇ／ｍｌ未満の残留宿主細胞ＤＮＡ（ｈｃＤＮＡ）、例えば１×１０１３ｖｇ／ｍＬ当たり１．２×１０６ｐｇ／ｍＬ未満のｈｃＤＮＡを含む高収率ウイルス調製物、例えばＡＡＶ調製物（例えば、ＡＡＶ９−ＳＭＮ）を調製することができる。従って、７．５×１０１５ｖｇの投与を受ける５ｋｇの患者であれば、５ｋｇ用量当たり最大でも１．２×１０６ｐｇ／ｍＬ × ７．５×１０１５ｖｇ／（１×１０１３ｖｇ／ｍＬ）＝８．４×１０７ｐｇのｈｃＤＮＡ＝８４，０００ｎｇのｈｃＤＮＡを取り込むに過ぎないことになる。一実施形態において、調製物は、１．０×１０１３ｖｇ当たり５．０×１０５ｐｇ未満の残留宿主細胞ＤＮＡ、１．０×１０１３ｖｇ当たり２．０×１０５ｐｇ未満の残留宿主細胞ＤＮＡ、１．０×１０１３ｖｇ当たり１．１×１０５ｐｇ未満の残留宿主細胞ＤＮＡ、１．０×１０１３ｖｇ当たり１．０×１０５ｐｇ未満の残留宿主細胞ＤＮＡ、１．０×１０１３ｖｇ当たり０．９×１０５ｐｇ未満の残留宿主細胞ＤＮＡ、１．０×１０１３ｖｇ当たり０．８×１０５ｐｇ未満の残留宿主細胞ＤＮＡ、又は間にある任意の濃度を含む。
一実施形態において、ＡＡＶは、ＡＡＶ２由来のＩＴＲを有する複製欠損ＡＡＶ９、例えばｓｃＡＡＶ９である。別の実施形態において、ＡＡＶベクターはＳＭＮトランス遺伝子を担持する。ある実施形態において、ＳＭＮコードＤＮＡはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００３４４．２に示される。ＳＭＮ ＤＮＡの保存的ヌクレオチド置換もまた企図される（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００３４４．２に示されるとおりの、６２５位におけるグアニンからアデニンへの変更）。
本開示の別の態様は、（ａ）静脈内（「ＩＶ」）注射又は（ｂ）髄腔内（「ＩＴ」）投与のいずれかに好適な製剤におけるＡＡＶ粒子を含む医薬組成物に関する。
別の実施形態において、本医薬組成物は、１０％未満の空のカプシド、８％未満の空のカプシド、７％未満の空のカプシド、５％未満の空のカプシド、３％未満の空のカプシド、又は１％未満の空のカプシドを有する。一部の実施形態において、本医薬組成物は約５％未満の空のカプシドを有する。一実施形態において、空のカプシドの数は検出限界未満である。一部の実施形態において、空のカプシドは治療利益なしに有害反応（例えば、免疫反応、炎症反応、肝臓反応、及び／又は心臓反応）を生じさせ得るため、医薬組成物は低量の空のカプシドを有することが有利である。
別の実施形態において、前記医薬組成物中の残留宿主細胞タンパク質（「ｒＨＣＰ」）は、１×１０１３ｖｇ／ｍｌ当たり１００ｎｇ／ｍｌ以下のｒＨＣＰ、例えば、１×１０１３ｖｇ／ｍｌ当たり４０ｎｇ／ｍｌ以下のｒＨＣＰ又は１×１０１３ｖｇ／ｍｌ当たり１〜５０ｎｇ／ｍｌのｒＨＣＰである。一実施形態において、本明細書に開示される医薬組成物は、１．０×１０１３ｖｇ当たり１０ｎｇ未満のｒＨＣＰ、又は１．０×１０１３ｖｇ当たり５ｎｇ未満のｒＨＣＰ、１．０×１０１３ｖｇ当たり４ｎｇ未満のｒＨＣＰ、又は１．０×１０１３ｖｇ当たり３ｎｇ未満のｒＨＣＰ、又は間にある任意の濃度を含む。
別の実施形態において、前記医薬組成物中の残留宿主細胞ＤＮＡ（「ｈｃＤＮＡ」）は、１×１０１３ｖｇ／ｍｌ当たり５×１０６ｐｇ／ｍｌ以下のｈｃＤＮＡ、１×１０１３ｖｇ／ｍｌ当たり１．２×１０６ｐｇ／ｍｌ以下のｒＨＤＮＡ、又は１×１０１３ｖｇ／ｍｌ当たり１×１０５ｐｇ／ｍｌのｒＨＤＮＡ〜１×１０１３ｖｇ／ｍｌ当たり１．２×１０６ｐｇ／ｍｌである。一実施形態において、前記医薬組成物中の残留宿主細胞ＤＮＡは、１．０×１０１３ｖｇ当たり５．０×１０５ｐｇ未満、１．０×１０１３ｖｇ当たり２．０×１０５ｐｇ未満、１．０×１０１３ｖｇ当たり１．１×１０５ｐｇ未満、１．０×１０１３ｖｇ当たり１．０×１０５ｐｇ未満のｈｃＤＮＡ、１．０×１０１３ｖｇ当たり０．９×１０５ｐｇ未満のｈｃＤＮＡ、１．０×１０１３ｖｇ当たり０．８×１０５ｐｇ未満のｈｃＤＮＡ、又は間にある任意の濃度である。
ある実施形態において、前記医薬組成物中の残留プラスミドＤＮＡは、１×１０１３ｖｇ／ｍｌ当たり１．７×１０６ｐｇ／ｍｌ以下、又は１×１０１３ｖｇ／ｍｌ当たり１×１０５ｐｇ／ｍｌ〜１×１０１３ｖｇ／ｍｌ当たり１．７×１０６ｐｇ／ｍｌである。一実施形態において、前記医薬組成物中の残留プラスミドＤＮＡは、１．０×１０１３ｖｇ当たり１０．０×１０５ｐｇ未満、１．０×１０１３ｖｇ当たり８．０×１０５ｐｇ未満、又は１．０×１０１３ｖｇ当たり６．８×１０５ｐｇ未満である。
ある実施形態において、本明細書に開示される医薬組成物は、１．０×１０１３ｖｇ当たり０．５ｎｇ未満、１．０×１０１３ｖｇ当たり０．３ｎｇ未満、１．０×１０１３ｖｇ当たり０．２２ｎｇ未満、又は１．０×１０１３ｖｇ当たり０．２ｎｇ未満、又は間にある任意の濃度のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む。一実施形態において、前記医薬組成物中のベンゾナーゼは、１．０×１０１３ｖｇ当たり０．２ｎｇ未満、１．０×１０１３ｖｇ当たり０．１ｎｇ未満、１．０×１０１３ｖｇ当たり０．０９ｎｇ未満、１．０×１０１３ｖｇ当たり０．０８ｎｇ未満又は間にある任意の濃度である。一実施形態において、前記医薬組成物中のポロキサマー１８８は、約１０〜１５０ｐｐｍ、約１５〜１００ｐｐｍ、又は約２０〜８０ｐｐｍである。一実施形態において、前記医薬組成物中のセシウムは、５０μｇ／ｇ（ｐｐｍ）未満、３０μｇ／ｇ（ｐｐｍ）未満又は２０μｇ／ｇ（ｐｐｍ）未満、又は間にある任意の濃度である。
ある実施形態において、本明細書に開示される医薬組成物は、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定したとき、１０％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、又は間にある任意のパーセンテージの総不純物を含む。一実施形態において、総純度は、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定したとき、９０％超、９２％超、９３％超、９４％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、又は間にある任意のパーセンテージである。本医薬組成物の一実施形態において、非単一不特定関連不純物は、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した（ｍｅａｓｒｕｅｄ）とき、５％超、４％超、３％超又は２％超、又は間にある任意のパーセンテージである。一実施形態において、本医薬組成物は、８５％超、８６％超、８７％超、８８％超、８９％超、９０％超、９１％超、９１．９％超、９２％超、９３％超、又は間にある任意のパーセンテージの全カプシドに対する中身の詰まったカプシドのパーセンテージ（例えば、分析的超遠心法により測定したときピーク１＋ピーク２）を含む。本医薬組成物の一実施形態において、分析的超遠心法によりピーク１で測定した中身の詰まったカプシドのパーセンテージは、２０〜８０％、２５〜７５％、３０〜７５％、３５〜７５％、又は３７．４〜７０．３％である。本医薬組成物の一実施形態において、分析的超遠心法によりピーク２で測定した中身の詰まったカプシドのパーセンテージは、２０〜８０％、２０〜７０％、２２〜６５％、２４〜６２％、又は２４．９〜６０．１％である。
一実施形態において、本明細書に開示される医薬組成物は、１．０〜５．０×１０１３ｖｇ／ｍＬ、１．２〜３．０×１０１３ｖｇ／ｍＬ又は１．７〜２．３×１０１３ｖｇ／ｍＬのゲノム力価を含む。
一実施形態において、本明細書に開示される医薬組成物は、５ＣＦＵ／ｍＬ未満、４ＣＦＵ／ｍＬ未満 ３ＣＦＵ／ｍＬ未満、２ＣＦＵ／ｍＬ未満、又は１ＣＦＵ／ｍＬ未満、又は間にある任意の濃度のバイオバーデンを呈する。一実施形態において、ＵＳＰ、例えばＵＳＰ＜８５＞（全体として参照により援用される）に基づくエンドトキシンの量は、１．０ＥＵ／ｍＬ未満、０．８ＥＵ／ｍＬ未満又は０．７５ＥＵ／ｍＬ未満である。
一実施形態において、ＵＳＰ、例えばＵＳＰ＜７８５＞（全体として参照により援用される）に基づく本明細書に開示される医薬組成物のオスモル濃度は、３５０〜４５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、３７０〜４４０ｍＯｓｍ／ｋｇ又は３９０〜４３０ｍＯｓｍ／ｋｇである。一実施形態において、本医薬組成物は、容器当たり１２００個未満の２５μｍより大きい粒子、容器当たり１０００個未満の２５μｍより大きい粒子、容器当たり６００個未満の２５μｍより大きい粒子、容器当たり５００個未満の２５μｍより大きい粒子、又は間にある任意の値だけ含有する。一実施形態において、本医薬組成物は、容器当たり１００００個未満の１０μｍより大きい粒子、容器当たり８０００個未満の１０μｍより大きい粒子、又は容器当たり６０００個未満の１０μｍより大きい粒子を含有する。
一実施形態において、本医薬組成物は、０．５〜５．０×１０１３ｖｇ／ｍＬ、１．０〜４．０×１０１３ｖｇ／ｍＬ、１．５〜３．０×１０１３ｖｇ／ｍＬ又は１．７〜２．３×１０１３ｖｇ／ｍＬのゲノム力価を有する。
一実施形態において、本明細書に開示される医薬組成物は、以下のうちの１つ以上：１．０×１０１３ｖｇ当たり約０．０９ｎｇ未満のベンゾナーゼ、約３０μｇ／ｇ（ｐｐｍ）未満のセシウム、約２０〜８０ｐｐｍのポロキサマー１８８、１．０×１０１３ｖｇ当たり約０．２２ｎｇ未満のＢＳＡ、１．０×１０１３ｖｇ当たり約６．８×１０５ｐｇ未満の残留プラスミドＤＮＡ、１．０×１０１３ｖｇ当たり約１．１×１０５ｐｇ未満の残留ｈｃＤＮＡ、１．０×１０１３ｖｇ当たり約４ｎｇ未満のｒＨＣＰ、ｐＨ７．７〜８．３、約３９０〜４３０ｍＯｓｍ／ｋｇ、容器当たり約６００個未満の≧２５μｍサイズの粒子、容器当たり約６０００個未満の≧１０μｍサイズの粒子、約１．７×１０１３〜２．３×１０１３ｖｇ／ｍＬのゲノム力価、１．０×１０１３ｖｇ当たり約３．９×１０８〜８．４×１０１０ＩＵの感染力価、１．０×１０１３ｖｇ当たり約１００〜３００μｇの全タンパク質、約７．５×１０１３ｖｇ／ｋｇ用量のウイルスベクターによるΔ７ＳＭＡマウスの≧２４日の生存期間中央値、インビトロ細胞ベースアッセイに基づく約７０〜１３０％の相対効力、及び／又は約５％未満の空のカプシドを含む。
様々な実施形態において、本明細書で考察されるウイルス粒子のいずれか（例えば、ＡＡＶ ＳＭＮ、ＡＡＶ ＭＥＣＰ２、又はＡＡＶ ＳＯＤ１ウイルス粒子）を含む本明細書に開示される医薬組成物は、参照標準の±２０％の間、±１５％の間、±１０％の間、又は±５％の間の効力を保持している。一部の実施形態において、効力は好適なインビトロ細胞アッセイ又はインビボ動物モデルを用いて測定される。例えば、効力又は％機能性ＡＡＶ ＳＭＮウイルス粒子は、ＳＭＡの動物モデル、例えばＳＭＡΔ７マウス、又は好適な細胞株、例えばＳＭＡΔ７マウスの皮質から単離された（ｉｓｌａｔｅｄ）初代神経前駆細胞（ＮＰＣ）を使用した定量的細胞ベースアッセイを用いて決定されてもよい。一実施形態において、効力は、Ｆｏｕｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２８（３），ｐｐ．２７１−２７４（２０１０）の方法を用いて参照標準に対するものとして評価される。任意の好適な参照標準を使用し得る。効力又は％機能性ＡＡＶ ＭｅＣＰ２は、好適なインビトロ細胞アッセイ又はインビボ動物モデル、例えば、Ｇｕｙ ｅｔ ａｌ．，“Ｒｅｖｅｒｓａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｅｆｅｃｔｓ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｒｅｔｔ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．”Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１５（５８１５）：１１４３−７にあるようなＭｅｃｐ２ノックアウトマウスを用いて評価されてもよい。効力又は％機能性ＡＡＶ ＳＯＤ１は、好適なインビトロ細胞アッセイ又はインビボ動物モデル、例えば、Ｇｕｒｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｍｉｃｅ ｔｈａｔ ｅｘｐｒｅｓｓ ａ ｈｕｍａｎ Ｃｕ，Ｚｎ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ．”Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６４（５１６６）：１７７２−５にあるようなＳＯＤ１変異マウスを用いて評価されてもよい。一実施形態において、本医薬組成物は、７．５×１０１３ｖｇ／ｋｇ用量を与えたＳＭＡΔ７マウスにおける生存期間中央値により決定したとき、１５日超、２０日超、２２日超又は２４日超のインビボ効力を有する。ある実施形態において、本医薬組成物は、細胞ベースアッセイにより試験したとき、参照標準及び／又は好適な対照と比べて５０〜１５０％、６０〜１４０％又は７０〜１３０％のインビボ相対効力を有する。
一実施形態において、静脈内（「ＩＶ」）製剤は、７．５〜８．５のｐＨ、約１〜８×１０１３ウイルスベクターゲノム／ｍＬ（ｖｇ／ｍＬ）、又は２×１０１３ｖｇ／ｍｌ〜６×１０１３ｖｇ／ｍｌのゲノム力価、及び任意選択で３８４〜４４８ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する。一実施形態において、ＩＶ製剤は、ｐＨ８．０のトリス緩衝液中にＭｇＣｌ２、ＮａＣｌ、ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８を含む。
一実施形態において、ＩＶ投与には、ＳＭＮトランス遺伝子を担持するＡＡＶ−９ベクターが、適切なセッティング（例えば、インターベンション用特別室、手術室、専用手技室）において無菌条件下で、末梢肢静脈（腕又は脚）に挿入された静脈内カテーテルから指示用量を単回投与され、約３０〜６０分かけてゆっくりと注入される。
別の実施形態において、本明細書における開示は、患者へのｒＡＡＶ９及び非イオン性低浸透圧性造影剤の髄腔内（「ＩＴ」）送達を含む、ポリヌクレオチドをそれを必要としている患者の中枢神経系に送達する組成物及び方法を提供し、ここでｒＡＡＶ９は、そのポリヌクレオチドを含む自己相補的ゲノムを含む。ポリヌクレオチドは、例えば、脳、脊髄、グリア細胞、アストロサイト及び／又は下位運動ニューロンに送達される。非イオン性低浸透圧性造影剤は、例えば、イオビトリドール、イオヘキソール、イオメプロール、イオパミドール、イオペントール、イオプロミド、イオベルソール又はイオキシランである。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは生存運動ニューロン（ＳＭＮ）ポリヌクレオチドである。一実施形態において、造影剤は、イオヘキソール、例えばイオヘキソール１８０（Ｏｍｎｉｐａｑｕｅ １８０として販売されており、１８０ｍｇ／ｍＬの有機ヨウ素当量の３８８ｍｇイオヘキソールを含有する）である。
一実施形態において、ＩＴ投与には、ＳＭＮトランス遺伝子を担持するｓｃＡＡＶ９ベクターが通常生理食塩水で希釈され、腰椎髄腔内注射による注射のＸ線撮影でのモニタリングについて小児への使用が承認され、且つその適応表示がある適切な高比重造影剤（Ｏｍｎｉｐａｑｕｅ １８０など）と予め混合される。ＳＭＮトランス遺伝子を担持するＡＡＶ−９ベクター＋造影剤及び／又は生理食塩水を含む水性組成物の総容積は、５ｍＬを超えないものとなる。造影剤及びＳＭＮトランス遺伝子を担持するｓｃＡＡＶ−９ベクターは、共製剤化され、共包装され、又は包装されて個別に患者施設に届けられてもよい。
患者は、ＰＩＣＵ患者室又は他の適切なセッティング（例えば、インターベンション用特別室、手術室、専用手技室）において無菌条件下、救急重症者処置管理にすぐに移すことのできる状態で、ＳＭＮトランス遺伝子を担持するｓｃＡＡＶ−９ベクターの投与を髄腔内注射によって受ける。施設は、先端面取り部を硬膜線維と平行にして挿入された無傷針を使用し得る；これは、硬膜の損傷を大幅に低減して、結果的に小児の場合を含めた腰椎穿刺後の脳脊髄液漏出リスクを低下させることが示されている（Ｅｂｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｈｅａｄａｃｈｅ ａｎｄ Ｂａｃｋａｃｈｅ Ａｆｔｅｒ Ｌｕｍｂａｒ Ｐｕｎｃｔｕｒｅ ｉｎ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ ａｎｄ Ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｓ：Ａ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｓｔｕｄｙ．”Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ，１１３（６）：１５８８−１５９２；Ｋｉｅｃｈｌ−Ｋｏｈｌｅｎｄｏｒｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ Ｆｌｕｉｄ Ｌｅａｋａｇｅ Ａｆｔｅｒ Ｌｕｍｂａｒ Ｐｕｎｃｔｕｒｅ ｉｎ Ｎｅｏｎａｔｅｓ：Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｏｎｏｇｒａｐｈｉｃ Ａｐｐｅａｒａｎｃｅ．”Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒｏｅｎｔｇｅｎｏｌｏｇｙ，１８１（１）：２３１−２３４）。
ＩＴ注射を受けるいずれの患者も、鎮静／麻酔が推奨される。方法及び投薬法は、各施設の麻酔科医の裁量によることになるが、手技中及び手技後にトレンデレンブルグ体位をとらせても痛覚が消失して動かないことを確実にするのに十分な程度の鎮静又は不安緩解を取り入れるべきである。患者はＩＴ療法薬の投与後１５分間は頭部を下方に３０°傾けてトレンデレンブルグ体位をとり、頸部及び脳領域への分布を促すことになる。
患者が側臥位をとり、スタイレット付きのカテーテルが腰椎穿刺によってくも膜下腔のＬ３〜Ｌ４又はＬ４〜Ｌ５棘間腔に挿入される。くも膜下カニューレ挿入は、カテーテルから澄明な脳脊髄液（ＣＳＦ）が流れることで確認される。ＣＳＦは除去され、施設内ガイドラインに従い廃棄されることになる。予め混合された造影剤溶液中にあるＳＭＮトランス遺伝子を担持するｓｃＡＡＶ−９ベクターは、くも膜下腔に直接注入される。
一実施形態において、本開示は、本明細書に開示される医薬組成物の静脈内又は髄腔内送達を含む、それを必要としている患者における神経学的疾患の治療方法を提供し、ここでパルボウイルスは自己相補的ｒＡＡＶ９ゲノムを含み、操作されたトランス遺伝子はＳＭＮポリヌクレオチドを含み、及び疾患はＳＭＡである。
別の実施形態において、本開示は、本明細書に開示される医薬組成物を造影剤と共に髄腔内送達することを含む、それを必要としている患者における神経学的疾患の治療方法を提供し、ここでパルボウイルスは自己相補的ｒＡＡＶ９ゲノムを含み、操作されたトランス遺伝子はＳＭＮポリヌクレオチドを含み、疾患はＳＭＡであり、及び造影剤はｏｍｎｉｐａｑｕｅ １８０である。
別の実施形態において、本開示は、本明細書に開示される医薬組成物を造影剤と共に髄腔内送達することを含む、それを必要としている患者におけるＩＩ型、ＩＩＩ型、又はＩＶ型ＳＭＡの治療方法を提供し、ここでパルボウイルスは自己相補的ｒＡＡＶ９ゲノムを含み、操作されたトランス遺伝子はＳＭＮポリヌクレオチドを含み、及び造影剤はｏｍｎｉｐａｑｕｅ １８０である。
別の実施形態において、本開示は、本明細書に開示される医薬組成物の静脈内送達を含む、それを必要としている患者におけるＩ型ＳＭＡの治療方法を提供し、ここでパルボウイルスは自己相補的ｒＡＡＶ９ゲノムを含み、及び操作されたトランス遺伝子はＳＭＮポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、患者は０〜９ヵ月齢である。一部の実施形態において、患者は０〜６ヵ月齢である。他の実施形態において、小児患者は最大約８ｋｇの体重である。一部の実施形態において、小児患者は約８．５ｋｇ以下である。一部の実施形態において、小児患者は約２．６ｋｇ以上である。
別の実施形態において、本開示は、バイアル内の本明細書に開示される医薬組成物の静脈内投与を含む、それを必要としている患者におけるＩ型ＳＭＡの治療用キットを提供する。一部の実施形態において、患者の体重が測定され、患者の体重に基づき用量が計算される。
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本開示が属する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。
本明細書で使用されるとき、単語の単数形にはまた、文脈上特に明確に指示されない限り、その単語の複数形も含まれる；例えば、用語「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、単数形又は複数形であると理解され、用語「又は」は包含的と理解される。例として、「要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つ以上の要素を意味する。
本明細書全体を通じて語句「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、又は「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などの変化形は、明記される要素、整数又はステップ、又は一群の要素、整数若しくはステップを包含するが、任意の他の要素、整数又はステップ、又は一群の要素、整数若しくはステップを除外しないことを含意するものと理解されるであろう。本明細書全体を通じて語句「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」、又は「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ）」などの変化形は、明記される要素、整数又はステップ、又は一群の要素、整数若しくはステップを包含し、且つ任意の他の要素、整数又はステップ、又は一群の要素、整数若しくはステップを除外することを含意するものと理解されるであろう。本明細書全体を通じて語句「〜から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」、又は「〜から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」などの変化形は、明記される要素、整数又はステップ、又は一群の要素、整数若しくはステップ、及びその開示及び／又は特許請求の範囲の基本的な且つ新規の特徴に実質的に影響を及ぼさない任意の他の要素、整数又はステップ、又は一群の要素、整数若しくはステップを包含することを含意するものと理解されるであろう。
約とは、明記される値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、又は０．０１％以内と理解することができる。パーセンテージ値に関連して使用されるとき、「約」は、±１％以内（例えば、「約５％」は、４％〜６％以内と理解することができる）、又は±０．５％以内（例えば、「約５％」は、４．５％〜５．５％以内と理解することができる）と理解することができる。文脈から特に明らかでない限り、本明細書に提供される数値は全て、用語「約」によって修飾される。
本開示の実施又は試験においては、本明細書に記載されるものと同様の又は等価な方法及び材料を使用し得るが、好適な方法及び材料を以下に記載する。本明細書において言及される刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は全て、全体として参照により援用される。本明細書に引用される参考文献は、特許請求される本開示の先行技術であると認めるものではない。矛盾が生じた場合、定義を含め、本明細書が優先するものとする。加えて、材料、方法、及び例は例示に過ぎず、限定することを意図するものではない。本開示の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。
本開示の様々な目的及び利点並びに更なる完全な理解は、付属の図面を併せて考慮したとき以下の詳細な説明及び添付の特許請求の範囲を参照することにより明らかであり、より容易に理解される。
図１はｐＳＭＮ、ｐＨＥＬＰ及びｐＡＡＶのプラスミドマップである。図１Ａは、ｐＳＭＮのプラスミドマップを示す。ｐＳＭＮは、前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーエレメントを伴うニワトリ−β−アクチンハイブリッドプロモーターの制御下でヒト生存運動ニューロン（ＳＭＮ）ｃＤＮＡを発現する組換え自己相補的ＡＡＶ ＤＮＡゲノムに関する情報をコードするプラスミドである。ＳＭＮ ｃＤＮＡは完全長の機能タンパク質をコードする。発現カセットは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）に由来する修飾イントロン配列及びウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナルを含有する。この発現カセット（ＣＭＶ−ＣＢ−ＳＶ４０−ＳＭＮ−ＢＧＨｐＡ）にはＡＡＶ２由来の逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接する。左のＩＴＲは、自己相補的ＡＡＶゲノムを優先的にパッケージングするように修飾される。ＩＴＲ間にある、且つＩＴＲを含む領域は、一緒になって、創薬製品（ｔｈｅ ｆｉｎｄ ｄｒｕｇｓ ｐｒｏｄｕｃｔ）の製造時に組換えＡＡＶ９カプシドにパッケージングされる。組換えＡＡＶゲノムへのパッケージングが意図されない重要なｐＳＭＮ成分として、カナマイシン耐性（ＫａｎＲ）をコードするオープンリーディングフレーム及びｐＵＣに由来する複製起点（ｏｒｉ）が含まれる。ｏｒｉ及びＫａｎＲ領域はプラスミド製造に有用である。 図１Ｂは、ｐＨＥＬＰプラスミドのプラスミドマップを示す。ｐＨＥＬＰプラスミドは、組換えアデノ随伴ウイルス産生に必要なトランス作用性アデノウイルス成分を含有する。ｐＨＥＬＰプラスミドは、ＡＡＶ複製に重要な因子を提供するアデノウイルスゲノムの領域、即ち、Ｅ２Ａ、Ｅ４、及びＶＡ ＲＮＡを含有する。ｒＡＶＶ複製に関わるアデノウイルスＥ１機能は、宿主２９３細胞のトランスフェクションによって提供される。しかしながら、ｐＨＥＬＰプラスミドは他のアデノウイルス複製又は構造遺伝子を含有しない。このプラスミド中に存在するアデノウイルス配列は、アデノウイルスゲノムの僅か約２８％（９，２８０／３５，９３８）に相当するに過ぎず、逆方向末端反復配列など、複製に決定的に重要なシスエレメントを含有しない。従って、かかる産生系から感染性アデノウイルスは生じないものと思われる。 図１Ｃは、ＡＡＶプラスミドのプラスミドマップを示す。野生型ＡＡＶゲノムは、ｒｅｐ及びｃａｐオープンリーディングフレームに隣接する逆方向末端反復配列と呼ばれる２つの非コード構造エレメントを含有する。ｒｅｐ及びｃａｐは、それぞれ、ウイルス複製及びカプシドタンパク質をコードする。組換えアデノ随伴ウイルスベクターの産生においては；これらのウイルス性ＩＴＲはシスで用いられる唯一のエレメントであり、一方でウイルス性オープンリーディングフレームはトランスで供給される。接着性ＨＥＫ２９３細胞の一過性トランスフェクションを用いるＡＡＶの作製方法は、異なる遺伝エレメントを分割してプラスミドを分けることにより、それらのエレメントのシス／トランスの役割に対応する。ｐＡＡＶ２／９プラスミドは、ＡＡＶ２ ｒｅｐ遺伝子及びＡＡＶ９ ｃａｐ遺伝子のオープンリーディングフレームを含有する。 特別に優れた接着性に関するＨＥＫ２９３細胞の選択及びプレマスターセルバンク（ＭＣＢ）バンク化の工程フローチャートを示す。 特別に優れた接着性に関するＨＥＫ２９３細胞の選択及びプレプレマスターセルバンク（ＭＣＢ）バンク化のための細胞処理詳細の要約を示す。 原薬上流工程フロー図を示す。 原薬下流工程フロー図を示す。 １２０分の時点まで添加したＴｗｅｅｎ ２０によるＸＭｕＬＶの不活性化を示す。 １２０分の時点まで添加したＴｗｅｅｎ ２０によるＰＲＶの不活性化を示す。 細胞播種密度実験におけるＨＥＫ２９３細胞拡大工程フローを示す。 成長及び代謝産物プロファイルを示す。ＨＥＫ ２９３細胞をバイオリアクター（ｐＨ７．２３、３７．０℃、５５％溶存酸素（ＤＯ））に１２，０００及び８，０００細胞／ｃｍ２でデュプリケートで播種した。播種後４日（１２，０００細胞／ｃｍ２）及び５日（８，０００細胞／ｃｍ２）の時点で細胞にＤＮＡプラスミド／ＰＥＩをトランスフェクトした。播種後８日（１２，０００細胞／ｃｍ２）及び９日（８，０００細胞／ｃｍ２）でバイオリアクターを回収した。Ｎｏｖａ ＢｉｏＦｌｅｘでｐＨ及び代謝産物の読取り値を毎日読み取った。 図９−１の続きである。 図９−１の続きである。 細胞播種密度（８０００又は１２０００細胞／ｃｍ２）及び４つの異なるトランスフェクション時間長さ（２０分、１時間又は２時間）の関数としてのウイルスゲノム産生を示す。 製造工程全体を通じて異なるろ過ステップでサンプリングした中間体のウイルス力価を示す。 ＴＦＦ１ステップにおけるウイルスベクターの回収及び宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の除去を示す。 細胞播種密度実験におけるＨＥＫ２９３細胞拡大工程フローを示す。 ＨＥＫ ２９３細胞をバイオリアクター（ｐＨ７．２３、３７．０℃、５５％ＤＯ）に８，０００細胞／ｃｍ２、９，３５０細胞／ｃｍ２、１０，７００細胞／ｃｍ２、１２，０５０細胞／ｃｍ２でデュプリケートで播種したことを示す。播種５日後に細胞にＤＮＡプラスミド／ＰＥＩ（１：１ｍ／ｍ）をトランスフェクトした。ＮＯＶＡ ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ ４００を使用してｐＨ及び代謝産物分析を実施した。 図１４−１の続きである。 図１４−１の続きである。 図１４−１の続きである。 図１４−１の続きである。 バイオリアクターでの４つの出発播種密度からの原薬産生を示す。ウイルス力価及び単位表面積当たりに回収されたベクターゲノムの比較。 図１５−１の続きである。 第１相（工程Ａ）及び第３相試験（工程Ｂ）製造工程を示す。 同等性及び製造の一貫性の結果を示す表を提供する−工程Ａ（第１相）及び工程Ｂ（第３相）産物。工程Ｂ産物には、工程Ａと比較したとき更なる利益があることが示される。 図１７−１の続きである。 工程Ａ（第１相ロットＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３）及び工程Ｂ（第３相ロット６００１５６）のペアワイズ比較を用いて工程Ａと工程Ｂとの間の同等性を示す。工程Ｂ産物には、工程Ａと比較したとき更なる利益があることが示される。 工程Ｂ（第３相）ロット６００１５６及び６００３０７のペアワイズ比較による製造の一貫性の評価を示す。 リアルタイム貯蔵条件≦−６０℃で１２ヵ月間貯蔵したＮＣＨロットＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３の安定性プロファイルを示す。 第１相材料（ＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３）の沈降係数（秒×１０−１３）を示し、空のカプシド（７％）が約６０×１０−１３秒の沈降係数、及び完全なカプシドが約８０〜１５０×１０−１３秒の沈降係数範囲であることを示す。 第３相材料（６００１５６）の沈降係数（秒×１０−１３）を示し、空のカプシド（２％）が約６０×１０−１３秒の沈降係数、及び完全なカプシドが約８０〜１５０×１０−１３秒の沈降係数範囲であることを示す。 第３相材料（６００３０７）の沈降係数（秒×１０−１３）を示し、空のカプシド（４％）が約６０×１０−１３秒の沈降係数、及び完全なカプシドが約８０〜１５０×１０−１３秒の沈降係数範囲であることを示す。
ＡＡＶ遺伝子療法の開発を動物モデルを越えて臨床試験へと及び／又は治療使用に向けて前進させるため、ヒトでの使用に好適なウイルス材料を産生可能な規模拡張性のある工程を開発した。
一部の実施形態において、「ベクター」とは、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、ビリオンなど、適切な調節エレメントと結び付けられたとき複製能を有する、且つ細胞間で遺伝子配列を移すことのできる任意の遺伝エレメントが意味される。従って、この用語には、クローニング及び発現媒体、並びにウイルスベクターが含まれる。
一部の実施形態において、「ＡＡＶベクター」とは、限定なしに、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８及びＡＡＶ−９を含めたアデノ随伴ウイルス血清型に由来するベクターが意味される。ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ野生型遺伝子のうちの１つ以上、例えばｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子が全体として又は部分的に欠失しているが、機能性の隣接ＩＴＲ配列は保持している。機能性ＩＴＲ配列は、ＡＡＶビリオンのレスキュー、複製及びパッケージングに必要である。従って、ＡＡＶベクターは、本明細書では、ウイルスの複製及びパッケージングをシスで提供する配列（例えば機能性ＩＴＲ）を少なくとも含むものと定義される。ＩＴＲは野生型ヌクレオチド配列である必要はなく、その配列が機能性のレスキュー、複製及びパッケージングを提供する限りにおいて、例えばヌクレオチドの挿入、欠失又は置換によって改変されてもよい。一実施形態において、ベクターは、ＡＡＶ−２由来のＩＴＲを有するＡＡＶ−９ベクターである。また、「ＡＡＶベクター」とは、標的細胞の核へのベクター核酸の送達に効率的な媒体を提供するタンパク質外殻又はカプシドも意味される。
一部の実施形態において、「ｓｃＡＡＶ」とは、自己相補的アデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）が意味され、これは、遺伝子療法における使用のため天然に存在するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）から操作されたウイルスベクターである。ｓｃＡＡＶは、コード領域が分子内二本鎖ＤＮＡ鋳型を形成するように設計されているため「自己相補的」と称される。
一部の実施形態において、用語「ベクター関連不純物」は、真正の組換えＡＡＶ粒子以外のあらゆる種類のＡＡＶ粒子を指す。ベクター関連不純物には、空のＡＡＶカプシド（「エンプティ」、又は「空の粒子」とも称される）、及び意図されるベクターゲノム以外のポリヌクレオチド配列を含有するＡＡＶ粒子（「ＡＡＶカプシド化核酸不純物」又は「ＡＡＶカプシド化ＤＮＡ不純物」とも称される）が含まれる。
一部の実施形態において、「組換えウイルス」とは、例えば粒子への異種核酸構築物の付加又は挿入によって遺伝的に改変されたウイルスが意味される。「組換え」は「ｒ」と省略されてもよく、例えばｒＡＡＶは組換えＡＡＶを指し得る。用語「ＡＡＶ」は、本明細書で使用されるとき、「組換えＡＡＶ」又は「ｒＡＡＶ」を包含することが意図される。
一部の実施形態において、「ＡＡＶビリオン」とは、野生型（ｗｔ）ＡＡＶウイルス粒子（ＡＡＶカプシドタンパク質外被と結び付いた線状一本鎖ＡＡＶ核酸ゲノムを含む）など、完全なウイルス粒子が意味される。この点で、任意の１つのＡＡＶビリオン中にいずれかの相補的方向の一本鎖ＡＡＶ核酸分子、例えば「センス」鎖又は「アンチセンス」鎖がパッケージングされることができ、両方の鎖が等しく感染性である。
一部の実施形態において、用語「組換えＡＡＶビリオン」、「ｒＡＡＶビリオン」、「ＡＡＶベクター粒子」、「完全なカプシド」、及び「完全な粒子」は、本明細書では、両側にＡＡＶ ＩＴＲが隣接する目的の異種ヌクレオチド配列をカプシド化するＡＡＶタンパク質外殻を含む感染性の複製欠損ウイルスとして定義される。ｒＡＡＶビリオンは、ＡＡＶベクターを指定する配列、ＡＡＶヘルパー機能及びアクセサリー機能がそこに導入された好適な宿主細胞において産生される。このようにして、宿主細胞は、続く遺伝子送達のための感染性組換えビリオン粒子へのＡＡＶベクター（目的の組換えヌクレオチド配列を含有する）のパッケージングをもたらすＡＡＶポリペプチドをコードする能力を持つようになる。
一部の実施形態において、用語「空のカプシド」、及び「空の粒子」は、ＡＡＶタンパク質外殻を含むが、両側にＡＡＶ ＩＴＲが隣接する目的の異種ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド構築物を全体として又は部分的に欠いているＡＡＶビリオンを指す。
用語「宿主細胞」は、ＡＡＶヘルパー構築物、ＡＡＶベクタープラスミド、アクセサリー機能ベクター、又は他のトランスファーＤＮＡのレシピエントとして使用することができる、又はそれとして使用されている、例えば、微生物、酵母細胞、昆虫細胞、及び哺乳類細胞を意味する。この用語には、トランスフェクトされた元の細胞の子孫が含まれる。従って、「宿主細胞」は、本明細書で使用されるとき、概して外因性ＤＮＡ配列をトランスフェクトされた細胞を指す。自然、偶発的、又は意図的突然変異に起因して、単一の親細胞の子孫が必ずしも形態の点又はゲノム若しくは全ＤＮＡ相補体の点で元の親と完全に同一とは限らないことが理解される。
別の実施形態において、用語「ＡＡＶヘルパー機能」は、発現してＡＡＶ遺伝子産物を供与することのできる、ひいてはその産物がトランスで生産的ＡＡＶ複製のために機能するＡＡＶ由来のコード配列を指す。従って：ＡＡＶヘルパー機能には、主要なＡＡＶオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、ｒｅｐ及びｃａｐの両方が含まれる。Ｒｅｐ発現産物は、とりわけ：ＡＡＶのＤＮＡ複製起点の認識、結合及びニッキング；ＤＮＡヘリカーゼ活性；及びＡＡＶ（又は他の異種）プロモーターからの転写の調節など、多くの機能を備えることが示されている。Ｃａｐ発現産物は必須のパッケージング機能を提供する。ＡＡＶヘルパー機能は、本明細書では、ＡＡＶベクターから失われているＡＡＶ機能をトランスで補完するために使用される。
一実施形態において、用語「ＡＡＶヘルパー構築物」は、概して、目的のヌクレオチド配列の送達用形質導入ベクターの産生に使用されることになるＡＡＶベクターから欠失しているＡＡＶ機能を提供するヌクレオチド配列を含む核酸分子を指す。ＡＡＶヘルパー構築物は、ＡＡＶ ｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子の一過性発現を付与してＡＡＶ複製に必要なＡＡＶ機能の欠落を補完するため一般に用いられている；しかしながら、ヘルパー構築物はＡＡＶ ＩＴＲを欠いており、それ自体は複製もパッケージングもできない。ＡＡＶヘルパー構築物は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルス、又はビリオンの形態であってもよい。Ｒｅｐ及びＣａｐ発現産物の両方をコードする一般に用いられているプラスミドｐＡＡＶ／Ａｄ及びｐｌＭ２９＋４５など、幾つものＡＡＶヘルパー構築物が記載されている。例えば、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２８；及びＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２９３６−２９４５を参照のこと。Ｒｅｐ及び／又はＣａｐ発現産物をコードする幾つもの他のベクターが記載されている。例えば、米国特許第５，１３９，９４１号明細書及び同第６，３７６，２３７号明細書を参照のこと。
別の実施形態において、用語「トランスフェクション」は、細胞による外来ＤＮＡの取込みを指して使用され、細胞は、細胞膜の内側に外因性ＤＮＡが導入されているとき、「トランスフェクト」されている。幾つものトランスフェクション技法が当該技術分野において概して公知である。例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、及びＣｈｕ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｇｅｎｅ １３：１９７を参照のこと。かかる技法を用いて１つ以上の外因性ＤＮＡ部分を好適な宿主細胞に導入することができる。
本明細書で使用されるとき、用語「細胞株」は、インビトロでの連続的又は持続的成長及び分裂能力を有する細胞集団を指す。更に、かかるクローン集団の貯蔵又は移送中に核型に自然の又は誘導性の変化が起こり得ることが当該技術分野において公知である。従って、言及される細胞株に由来する細胞は、祖先細胞又は培養物と厳密に同一ではないこともあり、言及される細胞株には、かかる変異体が含まれる。一部の実施形態において、用語「ＨＥＫ２９３細胞」、「２９３細胞」又はこれらの文法上の等価語は、ここでは同義的に使用され、本明細書に開示される方法において使用される宿主／パッケージング細胞株を指す。
一部の実施形態において、用語「溶出液」は、文脈により、物質を溶出させるために使用される緩衝液を指すと理解されてもよい。一部の実施形態において、用語「溶出液」は、文脈により、溶出した物質、例えば、先行する精製ステップからの、例えばアッセイ又は更なる精製に望ましい産物又は物質を指すと理解されてもよい。
一部の実施形態において、本明細書に記載される方法は、医薬品及び医薬部外品の製造管理及び品質管理規則（ｇｏｏｄ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｐｒａｃｔｉｃｅ：ＧＭＰ）を用いて工業規模で実施される。ＧＭＰは、医薬品品質を確保するための規制実践、例えば連邦医薬品局（Ｆｅｄｅｒａｌ Ｄｒｕｇ Ａｇｅｎｃｙ：ＦＤＡ）によって施行されるものである。ＧＭＰ規則は製造工程の管理を確立する。現行のＧＭＰ規則の例はＦＤＡにより発表されている。一部の実施形態において、本明細書に記載される方法は、工業規模でのＡＡＶウイルスベクターの産生にＧＭＰ手順を利用する。これまで、遺伝子療法用のＡＡＶウイルスベクターの工業規模産生は、規模拡張性の問題が理由で難題であった。従って、一部の実施形態において、本明細書に記載される方法は、ＡＡＶウイルスベクターを例えば接着細胞において工業規模で、且つヒトへの投与に十分な純度レベルで産生することにより利点を付与した。用語「工業規模」は、例えば収率が製造バッチ当たり５×１０１５ｖｇ超、又は８×１０１５ｖｇ超又は１×１０１６ｖｇ超であるような、ベンチ規模よりも大きい、例えば商業規模での細胞におけるウイルスベクターの産生方法を指す。
上流工程
一部の実施形態では、上流工程を用いてワーキングセルバンクに由来する中間体が産生され、ここで上流工程は、（ａ）細胞、例えば接着細胞を培養するステップ、（ｂ）培養した細胞、例えば接着細胞に３つのプラスミドをトランスフェクトするステップ、（ｃ）培養期間後に例えば全細胞溶解によって細胞から拡大後のウイルス粒子を回収するステップ、（ｄ）ウイルス粒子をろ過によって精製して任意のインタクトな細胞又は細胞デブリを除去するステップ、（ｅ）ステップ（ｄ）からの溶出液をタンジェンシャルフローろ過に供するステップ、及び（ｆ）任意選択で、得られた精製ウイルス粒子中間調製物を凍結するステップを含む。一部の実施形態において、中間調製物は凍結されてもよい。他の実施形態において、中間調製物は下流処理前に凍結されなくてもよい。一部の実施形態において、本明細書に開示される上流工程で調製されたＡＡＶは、本明細書に記載されるとおりの、ＳＯＤ１を標的とするｓｈＲＮＡをコードするＡＡＶ、ＭＥＣＰ２をコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶ、又はＳＭＮをコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶである。一部の実施形態において、上流工程は、ＧＭＰに基づき工業規模で行われる。
１．細胞株トランスフェクション及び培養
一態様において、本明細書にはｒＡＡＶゲノムが開示される。このｒＡＡＶゲノムは、ポリペプチド（限定はされないが、ＳＭＮポリペプチドを含む）をコードする、又は突然変異タンパク質若しくはそれらの遺伝子の調節配列に向けられるｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス、及び／又はｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドに隣接する１つ以上のＡＡＶ ＩＴＲを含む。ポリヌクレオチドは、標的細胞において機能性の転写調節ＤＮＡ、具体的にはプロモーターＤＮＡ、エンハンサーＤＮＡ及びポリアデニル化シグナル配列ＤＮＡに作動可能に連結され、遺伝子カセットを形成する。遺伝子カセットはまた、哺乳類細胞で発現したときにＲＮＡ転写物のプロセシングを促進するためイントロン配列も含み得る。
一部の実施形態において、ｒＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ９）ゲノムは、限定はされないが、脊髄及び脳外傷／傷害を含めた神経系傷害、脳卒中、及び脳癌に加えて、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病を含めた神経変性障害の治療用の栄養因子又は保護因子をコードする。既知の神経系成長因子の非限定的な例としては、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン−４／５（ＮＴ−４／５）、ニューロトロフィン−６（ＮＴ−６）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、線維芽細胞成長因子ファミリー（例えば、ＦＧＦ１〜１５）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、インスリン様成長因子ファミリーの特定のメンバー（例えば、ＩＧＦ−１）、ニュールツリン、パーセフィン、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、イムノフィリン、形質転換成長因子（ＴＧＦ）成長因子ファミリー、ニューレグリン、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮成長因子ファミリー（例えばＶＥＧＦ１６５）、フォリスタチン、Ｈｉｆ１などが挙げられる。また、概して、本明細書で企図される栄養因子又は保護因子の各々を調節するジンクフィンガー転写因子も企図される。更なる実施形態において、神経免疫機能を調節するための方法が、限定はされないが、ミクログリア及びアストログリア活性化の例えばＮＦｋＢ阻害による阻害、又はｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス、若しくはｍｉＲＮＡによる神経保護のためのＮＦｋＢ（種々の細胞型におけるＮＦｋＢ及び関連する経路の二重作用）を含め、企図される。更に別の実施形態において、ｒＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ９）ゲノムはアポトーシス阻害因子（例えば、ｂｃｌ２、ｂｃｌｘＬ）をコードする。脊髄損傷の治療のための、栄養因子又は脊髄損傷調節タンパク質又は軸索成長阻害因子の抑制因子（例えば、Ｎｏｇｏの抑制因子［Ｏｅｒｔｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２３（１３）：５３９３−５４０６（２００３）］をコードするｒＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ９）の使用もまた企図される。
パーキンソン病などの神経変性障害の治療のため、ｒＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ９）ゲノムは、様々な実施形態において、芳香族酸ドーパデカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）、チロシンヒドロキシラーゼ、ＧＴＰシクロヒドロラーゼ１（ｇｔｐｃｈ１）、アポトーシス阻害因子（例えば、ｂｃｌ２、ｂｃｌｘＬ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、抑制性神経伝達物質−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、又はドーパミン生合成に関与する酵素をコードする。更なる実施形態において、ｒＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ９）ゲノムは、例えばパーキン及び／又はシヌクレインの修飾因子をコードし得る。
アルツハイマー病などの神経変性障害の治療のため、一部の実施形態において、アセチルコリン産生を増加させる方法が企図される。一部の実施形態において、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）のレベルを増加させる方法又はアセチルコリンエステラーゼ（ＡｃｈＥ）の活性を阻害する方法が企図される。
ｒＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ９）ゲノムは、一部の実施形態において、ハンチントン病などの神経変性障害の治療のための、突然変異ハンチントンタンパク質（ｈｔｔ）発現を低下させる方法に用いられるｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス、及び／又はｍｉＲＮＡをコードする。
ｒＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ９）ゲノムは、様々な実施形態において、ＡＬＳなどの神経変性障害の治療用に用いられるｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス、及び／又はｍｉＲＮＡをコードする。治療は、ＴＮＦ−α、一酸化窒素、パーオキシナイトライト、及び／又は一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）など、疾患の分子マーカーの発現低下をもたらす。
一部の実施形態において、ベクターは、ＡＬＳについてのスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ、例えばＳＯＤ−１）、又はＡＬＳ若しくはパーキンソン病についてのＧＤＮＦ若しくはＩＧＦ１などの神経栄養因子など、突然変異タンパク質に向けられる低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードする。
一実施形態において、本明細書に記載される方法及び材料は、ＡＬＳの治療に用いられてもよい。ＡＬＳは、脳及び脊髄における進行性の運動ニューロン喪失を生じる神経変性疾患であり、発話、摂食、運動及び最終的には呼吸能力の喪失を含む症状を伴う。この疾患は、典型的には診断から３〜５年以内に死亡する。ＡＬＳ原因の９０〜９５％は原因不明だが、一部のＡＬＳはスーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）遺伝子の遺伝子突然変異によって引き起こされ、ここでは突然変異が毒性の優性機能獲得を引き起こす。マウス研究では、ＳＯＤ１ノックアウトによって疾患が起こらなくなることが示され、従って突然変異体ＳＯＤ１のレベルをノックダウンする療法が、疾患症状を軽減するものと考えられる。
一部の実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＡＬＳについてのＳＯＤ１を標的とするｓｈＲＮＡをコードする。ＳＯＤ１に対するｓｈＲＮＡをコードする例示的ＡＡＶ、例えばｓｃＡＡＶ９構築物が、国際公開第２０１５０３１３９２号パンフレット及び米国特許出願公開第２０１６２７２９７６号明細書（これらの内容は本明細書によって全体として援用される）に提供される。一部の実施形態において、ＳＯＤ１に対するｓｈＲＮＡをコードするＡＡＶ構築物は、本明細書に開示される方法を用いて調製されてもよい。一部の実施形態において、このようなＡＡＶ構築物がＡＬＳの治療に使用されてもよい。一部の実施形態において、ＳＯＤ１ ＡＡＶは、１０％未満、例えば、７％、５％、４％、３％、２％、又は１％未満の空のカプシドを呈する。一部の実施形態において、ＳＯＤ１ ＡＡＶは、低量の、例えば本明細書でＡＡＶベクターの調製及び精製に関して考察されるレベルの残留宿主細胞タンパク質、宿主細胞ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、及び／又はエンドトキシンを呈する。本明細書で使用されるとき、「ＡＶＸＳ−３０１」はｓｃＡＡＶ９ベクターの非限定的な例であり、即ち、抗ヒトＳＯＤ１ ｓｈＲＮＡをコードするポリヌクレオチド（例えばｐＳＯＤ１ｓｈ）、修飾ＡＡＶ２ ＩＴＲ、ヒトＨ１プロモーター、及び非修飾ＡＡＶ２ ＩＴＲを含む。修飾及び非修飾ＩＴＲは、抗ヒトＳＯＤ１ ｓｈＲＮＡ発現カセットに対していずれの向き（即ち、５’側又は３’側）になってもよい。
本明細書で使用されるとき、「ｐＳＯＤ１ｓｈ」ベクタープラスミドは、スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）遺伝子の発現を標的とする低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチド、即ち抗ＳＯＤ１ ｓｈＲＮＡカセットを含み、ここでこのカセットには、例えばｐＳＯＤ１ｓｈをコードするポリヌクレオチドの「左」及び「右」の、アデノ随伴ウイルス逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列が隣接する。一部の実施形態において、ｐＳＯＤ１ｓｈをコードするポリヌクレオチドは、ヒトＳＯＤ１ ｍＲＮＡを特異的に標的とする低分子ヘアピンＲＮＡに転写される。一部の実施形態において、ｐＳＯＤ１ｓｈをコードするポリヌクレオチドを囲むＩＴＲ配列は、天然、変異体、又は修飾ＡＡＶ ＩＴＲ配列である。一部の実施形態において、少なくとも１つのＩＴＲ配列が、天然、変異体又は修飾ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列である。一部の実施形態において、ＩＴＲは、ｐＳＯＤ１ｓｈをコードするポリヌクレオチドに隣接する。一部の実施形態において、２つのＩＴＲ配列が両方ともに、天然、変異体又は修飾ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列である。一部の実施形態において、「左」のＩＴＲが、自己相補的ゲノムの産生を可能にする修飾ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列であり、「右」のＩＴＲが天然ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列である。一部の実施形態において、「右」のＩＴＲが、自己相補的ゲノムの産生を可能にする修飾ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列であり、「左」のＩＴＲが天然ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列である。一部の実施形態において、ｐＳＯＤ１ｓｈベクターは、例えばＭｙｓｌｉｎｋｓｉにより記載されるとおりの、ヒトＨ１ ＲＮＡプロモーターのセグメントを更に含む。Ｍｙｓｌｉｎｋｓｋｉ ｅｔ ａｌ．“Ａｎ ｕｎｕｓｕａｌｌｙ ｃｏｍｐａｃｔ ｅｘｔｅｒｎａｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｆｏｒ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＩＩＩ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ Ｈ１ＲＮＡ ｇｅｎｅ．”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２９（１２）：２５０２−２５０９。一部の実施形態において、ｐＳＯＤ１ｓｈベクターは、発現カセットのサイズを増加させるため、ランダムなプラスミド骨格のセグメントで作られるユニークなスタッファー配列を更に含む。一部の実施形態において、ｐＳＯＤ１ｓｈベクターは、抗ヒトＳＯＤ１ ｓｈＲＮＡ、修飾ＡＡＶ２ ＩＴＲ、ヒトＨ１プロモーター、及び非修飾ＡＡＶ２ ＩＴＲをコードするポリヌクレオチドを含む。
一実施形態において、本明細書に記載される方法及び材料は、レット症候群などの神経発達障害の治療に使用されてもよい。レット症候群は、初めは乳児期に認識されるまれな神経学的障害であり、９０〜９５％の症例でＸ染色体上のＭＥＣＰ２遺伝子の突然変異によって起こる。Ｒｕｔｈｉｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｒｅｔｔ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｉｓ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ ＭＥＣＰ２，ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｍｅｔｈｙｌ−ＣｐＧ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ２．”Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２３：１８５−１８８。Ｘ染色体のコピーを１つしか有しない男児は、典型的には生後間もなく死亡するが、Ｘ染色体のコピーを２つ有する女児は、通常この遺伝子の機能性コピーを１つ有する。６〜１８ヵ月で症状が現れ始め、手もみ又は手絞り、手叩き、手こすり、手洗い、又は手を口に入れるなどの特徴的症状を伴う。この疾患は進行性で、自閉症様行動、不規則呼吸、摂食及び嚥下困難、発育遅延及び発作が含まれ得る重大な能力障害を伴う。ＭＥＣＰ２遺伝子の既知の突然変異は２００種あり、疾患の重症度は、Ｘ染色体不活性化及び遺伝子量補正のレベルに応じて患者毎に大きく異なる。マウス研究では、ＭＥＣＰ２突然変異がニューロンの死滅を引き起こさないことが示され、これが神経変性障害でないことが示唆される。Ｇｕｙ ｅｔ ａｌ，“Ｒｅｖｅｒｓａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｅｆｅｃｔｓ ｉｎ ａ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｒｅｔｔ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ．”Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１５（５８１５）”１１４３−１１４７。
レット症候群に関する実施形態のため、ｒＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ９）ゲノムは、例えば、メチルシトシン結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）をコードし得る。ＭｅＣＰ２をコードするポリヌクレオチドを含む例示的ＡＡＶ、例えばｓｃＡＡＶ９構築物が、米国特許第９，４１５，１２１号明細書（この内容は本明細書によって全体として援用される）に提供される。一部の実施形態において、ＭｅＣＰ２をコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶ構築物は、本明細書に開示される方法を用いて調製されてもよい。一部の実施形態において、このようなＡＡＶ構築物がレット症候群の治療に使用されてもよい。一部の実施形態において、ＭｅＣＰ２ ＡＡＶは、１０％未満、例えば、７％、５％、４％、３％、２％、又は１％未満の空のカプシドを呈する。一部の実施形態において、ＭｅＣＰ２ ＡＡＶは、低量の、例えば本明細書でＡＡＶベクターの調製及び精製に関して考察されるレベルの残留宿主細胞タンパク質、宿主細胞ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、及び／又はエンドトキシンを呈する。
本明細書で使用されるとき、「ＡＶＸＳ−２０１」はｓｃＡＡＶ９ベクターの非限定的な例であり、即ち、ＭＥＣＰ２ ｃＤＮＡ発現カセットを含むポリヌクレオチド（例えばｐＭＥＣＰ２）、修飾ＡＡＶ２ ＩＴＲ、マウスＭｅｃｐ２プロモーター、修飾ＳＶ４０イントロン（ｉｎｔｒｏ）、最小ポリアデニル化シグナル、及び非修飾ＡＡＶ２ ＩＴＲを含む。修飾及び非修飾ＩＴＲは、ＭＥＣＰ２ ｃＤＮＡ発現カセットに対していずれの向き（即ち、５’側又は３’側）になってもよい。
本明細書で使用されるとき、「ｐＭＥＣＰ２」ベクタープラスミドは、ＭＥＣＰ２タンパク質をコードするポリヌクレオチド、修飾ＡＡＶ２ ＩＴＲ、マウスＭｅｃｐ２プロモーター、修飾ＳＶ４０イントロン（ｉｎｔｒｏ）、最小ポリアデニル化シグナル、及び非修飾ＡＡＶ２ ＩＴＲを含む。一部の実施形態において、ｐＭＥＣＰ２は、ＭＥＣＰ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクター構築物、即ちＭＥＣＰ２ ｃＤＮＡ発現カセットであり、ここでこのカセットには、例えばＭＥＣＰ２遺伝子をコードするポリヌクレオチドの「左」及び「右」の、アデノ随伴ウイルス逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列が隣接する。一部の実施形態において、ＭＥＣＰ２をコードするポリヌクレオチドは、ヒトＭＥＣＰ２配列、例えば、天然に存在するヒトＭＥＣＰ２配列又はそのアイソフォーム、変異体、若しくは突然変異体である。一部の実施形態において、ＩＴＲ配列は、天然、変異体、又は修飾ＡＡＶ ＩＴＲ配列である。一部の実施形態において、少なくとも１つのＩＴＲ配列が、天然、変異体又は修飾ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列である。一部の実施形態において、２つのＩＴＲ配列が両方ともに、天然、変異体又は修飾ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列である。一部の実施形態において、「左」のＩＴＲが、自己相補的ゲノムの産生を可能にする修飾ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列であり、「右」のＩＴＲが天然ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列である。一部の実施形態において、「右」のＩＴＲが、自己相補的ゲノムの産生を可能にする修飾ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列であり、「左」のＩＴＲが天然ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列である。一部の実施形態において、ｐＭＥＣＰ２ベクターは、マウスＭｅｃｐ２プロモーターの全てではないがセグメントを更に含む。一部の実施形態において、ｐＭＥＣＰ２ベクターはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）イントロンを更に含む。一部の実施形態において、ｐＭＥＣＰ２ベクターは、例えば、Ｌｅｖｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｏｌｙ（Ａ） ｓｉｔｅ．”Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，３：１０１９−１０２５により定義されるとおりの、最小ポリアデニル化シグナルを更に含む。
一部の実施形態において、本明細書に開示されるｒＡＡＶゲノムは、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ ＤＮＡを欠いている。ｒＡＡＶゲノム中のＡＡＶ ＤＮＡ（例えばＩＴＲ）は、限定はされないが、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８、ＡＡＶ−９、ＡＡＶ−１０及びＡＡＶ−１１を含め、その組換えウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型由来であってよい。これらのＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は当該技術分野において公知である。例えば、ＡＡＶ−１の完全ゲノムはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００２０７７に提供され；ＡＡＶ−２の完全ゲノムはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ ００１４０１及びＳｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．，４５：５５５−５６４｛１９８３）に提供され：ＡＡＶ−３の完全ゲノムはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿１８２９に提供され；ＡＡＶ−４の完全ゲノムはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１８２９に提供され；ＡＡＶ−５ゲノムはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０８５７１６に提供され；ＡＡＶ−６の完全ゲノムはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１８６２に提供され；ＡＡＶ−７及びＡＡＶ−８ゲノムの少なくとも一部は、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＸ７５３２４６及びＡＸ７５３２４９に提供され；ＡＡＶ−９ゲノムは、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１−６３８８（２００４）に提供され；ＡＡＶ−１０ゲノムは、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７−７６（２００６）に提供され；及びＡＡＶ−１１ゲノムは、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５−３８３（２００４）に提供される。
本明細書で使用されるとき、「ｐＳＭＮ」ベクタープラスミドは、ＳＭＮタンパク質をコードするポリヌクレオチド、即ち、ＳＭＮ ｃＤＮＡ発現カセットを含み、ここでこのカセットには、例えばＳＭＮ遺伝子をコードするポリヌクレオチドの「左」及び「右」の、アデノ随伴ウイルス逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列が隣接する。一部の実施形態において、ＳＭＮをコードするポリヌクレオチドは、ヒトＳＭＮ配列、例えば、天然に存在するヒトＳＭＮ配列又はそのアイソフォーム、変異体、若しくは突然変異体である。一部の実施形態において、ＩＴＲ配列は、天然、変異体、又は修飾ＡＡＶ ＩＴＲ配列である。一部の実施形態において、少なくとも１つのＩＴＲ配列が、天然、変異体、又は修飾ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列である。一部の実施形態において、２つのＩＴＲ配列が両方ともに、天然、変異体、又は修飾ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列である。一部の実施形態において、「左」のＩＴＲが、自己相補的ゲノムの産生を可能にする修飾ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列であり、「右」のＩＴＲが天然ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列である。一部の実施形態において、「右」のＩＴＲが、自己相補的ゲノムの産生を可能にする修飾ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列であり、「左」のＩＴＲが天然ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列である。一部の実施形態において、ｐＳＭＮプラスミドはＣＭＶエンハンサー／ニワトリβ−アクチン（「ＣＢ」）プロモーターを更に含む。一部の実施形態において、ｐＳＭＮプラスミドはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）イントロンを更に含む。一部の実施形態において、ｐＳＭＮプラスミドはウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化（ポリＡ）終結シグナルを更に含む。上記で考察される成分のうちの１つ以上に使用され得る例示的配列を以下の表１に示す。一部の実施形態において、以下の表１に示される全ての配列が使用される。一部の実施形態において、「ＡＶＸＳ−１０１」は、表１の全ての配列を使用する、且つ用語ｐＳＭＮの範囲内に含まれるベクター構築物の非限定的な例である。
一部の実施形態において、ｐＳＭＮベクターは、ＳＭＮ ｃＤＮＡ発現カセット、修飾ＡＡＶ２ ＩＴＲ、ニワトリβ−アクチン（ＣＢ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサー、修飾ＳＶ４０後期１６ｓイントロン、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル、及び非修飾ＡＡＶ２ ＩＴＲを含み得る。修飾及び非修飾ＩＴＲは、ＳＭＮ ｃＤＮＡ発現カセットに対していずれの向き（即ち、５’側又は３’側）になってもよい。
一部の実施形態において、例えば、本明細書に記載される製造工程中、ベクター構築物配列は、例えばＡＡＶ９ビリオンにカプシド化される。これらの実施形態において、カプシド化は、安定した機能性のトランス遺伝子、例えば完全に機能性のヒトＳＭＮトランス遺伝子、ＭＥＣＰ２トランス遺伝子、又は抗ＳＯＤ１ ｓｈＲＮＡを送達する能力を有する非複製性の組換えＡＡＶ９カプシドにおけるカプシド化である。一部の実施形態において、カプシドは、ＶＰ２及びＶＰ３が２つのトランケート型のＶＰ１となり、全てが共通のＣ末端配列を有するような選択的スプライシングによって産生される６０個のウイルスタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）を例えば１：１：１０の比で含む。一部の実施形態において、この製造工程の産物、例えば薬物製品は、安定した完全に機能性のヒトＳＭＮトランス遺伝子、ＭＥＣＰ２トランス遺伝子、又は抗ＳＯＤ１ ｓｈＲＮＡを送達するため非複製性の組換えＡＡＶ９カプシドを含み得る。一部の実施形態において、カプシドは、ＶＰ２及びＶＰ３が２つのトランケート型のＶＰ１となり、全てが共通のＣ末端配列を有するような選択的スプライシングによって産生される６０個のウイルスタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）を１：１：１０の比で含む。
一部の実施形態において、機能性ウイルスベクターの量は、好適なインビトロ細胞アッセイ又はインビボ動物モデルを用いて測定したときの機能性ｖｇ／ｍＬの％によって決定される。例えば、機能性ＡＡＶ ＳＭＮの％は、ＳＭＡの動物モデル、例えばＳＭＡΔ７マウスを使用した相対効力によるか、又は好適な細胞株、例えばＳＭＡΔ７マウスの皮質から単離された初代神経前駆細胞（ＮＰＣ）を使用した定量的細胞ベースアッセイによりアッセイされてもよい。機能性ＡＡＶ ＭｅＣＰ２の％は、好適なインビトロ細胞アッセイ又はインビボ動物モデル、例えばＭｅｃｐ２ノックアウトマウスを用いてアッセイされてもよい。機能性ＡＡＶ ＳＯＤ１の％は、好適なインビトロ細胞アッセイ又はインビボ動物モデル、例えばＳＯＤ１変異マウスを用いてアッセイされてもよい。
例示的ベクター構築物、例えばＡＶＸＳ−１０１のＤＮＡ配列を表１に示す。
別の態様において、ＡＶＸＳ−１０１ベクター構築物のＤＮＡ配列は配列番号１に提供される：

一部の実施形態において、ｐＳＭＮプラスミドによってコードされるＳＭＮタンパク質のアミノ酸配列は以下を含む：
一部の実施形態において、ＡＡＶカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３は同じ転写物に由来する。これらは選択的な開始部位を有するが、カルボキシ末端は共有する。以下では、ＶＰ１特異的アミノ酸配列を黒色で示し、太字にする。ＶＰ１及びＶＰ２に共通するアミノ酸配列には下線を付し、斜体にする。３つ全てのカプシドタンパク質に共通するアミノ酸は太字及び斜体である。
一実施形態において、ＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号３に示されるアミノ酸配列をコードする転写物に由来する。
別の態様において、本明細書には、ｒＡＡＶゲノムを含むＤＮＡプラスミドが開示される。このＤＮＡプラスミドは、ＡＡＶ９カプシドタンパク質を有する感染性ウイルス粒子にｒＡＡＶゲノムをアセンブルするためＡＡＶのヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、Ｅ１欠失アデノウイルス又はヘルペスウイルス）と共に感染許容性細胞に移される。ｒＡＡＶ粒子の産生技法は当該技術分野において標準的であり、この技法においては、パッケージングしようとするＡＡＶゲノム、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、並びにヘルパーウイルス機能が細胞に提供される。一部の実施形態において、ｒＡＡＶの産生には、単一の細胞（本明細書ではパッケージング細胞と称される）の中に存在する以下の成分：ｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムと別個の（即ち、そこにない）ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、及びヘルパーウイルス機能が関わる。シュードタイプｒＡＡＶの産生については、例えば、国際公開第０１／８３６９２号パンフレット（参照により全体として本明細書に援用される）に開示されている。様々な実施形態において、ＡＡＶカプシドタンパク質を修飾することにより組換えベクターの送達を促進し得る。カプシドタンパク質の修飾は、概して当該技術分野において公知である。例えば、米国特許出願公開第２００５／００５３９２２号明細書及び米国特許出願公開第２００９／０２０２４９０号明細書（これらの開示は全体として参照により本明細書に援用される）を参照のこと。
ｒＡＡＶ産生の一般的原理については、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９９２，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５３３−５３９；及びＭｕｚｙｃｚｋａ，１９９２，ＣＵＭ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：９７−１２９）にレビューされている。様々な手法が、Ｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２（１９８４）；Ｈｅｎｎｏｎａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６４６６（１９８４）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１（１９８５）；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３（１９８８）；及びＬｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８８ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：３４９（１９８８）．Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２−３８２８）；米国特許第５，１７３，４１４号明細書；国際公開第９５／１３３６５号パンフレット及び対応する米国特許第５，６５８，７７６号明細書；国際公開第９５／１３３９２号パンフレット；国際公開第９６／１７９４７号パンフレット；ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００号明細書；国際公開第９７／０９４４１号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３号明細書）；国際公開第９７／０８２９８号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２号明細書）；国際公開第９７／２１８２５号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７号明細書）；国際公開第９７／０６２４３号パンフレット（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４号明細書）；国際公開第９９／１１７６４号パンフレット；Ｐｅｒｒｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｖａｃｃｉｎｅ １３：１２４４−１２５０；Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：６０９−６１５；Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：１１２４−１１３２；米国特許第５，７８６，２１１号明細書；米国特許第５，８７１，９８２号明細書；及び米国特許第６，２５８，５９５号明細書に記載されている。前述の文献は、特にｒＡＡＶ産生に関連するこれらの文献の節に重点を置いて、本明細書により全体として参照により本明細書に援用される。
パッケージング細胞の例示的作成方法は、ＡＡＶ粒子産生に必要な全ての成分を安定に発現する細胞株を作り出すことである。例えば、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠いているｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムと別個のＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、及びネオマイシン耐性遺伝子などの選択可能マーカーを含むプラスミド（又は複数のプラスミド）が細胞のゲノムに組み込まれる。ＡＡＶゲノムは、ＧＣテール法（Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ６．ＵＳＡ，７９：２０７７−２０８１）、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む合成リンカーの付加（Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｇｅｎｅ，２３：６５−７３）又は直接的に、平滑末端ライゲーション（Ｓｅｎａｐａｔｈｙ ＆ Ｃａｒｔｅｒ，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：４６６１−４６６６）などの手順によって細菌プラスミドに導入されている。次にパッケージング細胞株にアデノウイルスなどのヘルパーウイルスを感染させる。この方法の利点は、細胞を選択可能であり、ｒＡＡＶの大規模産生に好適なことである。好適な方法の他の例では、プラスミドよりむしろアデノウイルス又はバキュロウイルスを利用してｒＡＡＶゲノム及び／又はｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子がパッケージング細胞に導入される。
従って本明細書における開示は、様々な実施形態において、感染性ｒＡＡＶを産生するパッケージング細胞を提供する。パッケージング細胞は、懸濁液中で培養される非接着細胞であっても、又は接着細胞であってもよい。一実施形態において、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ ２９３細胞及びＰｅｒＣ．６細胞（コグネイト２９３株）など、任意の好適なパッケージング細胞株を使用することができる。一実施形態において、細胞株はＨＥＫ ２９３細胞である。
ウイルスベクター産生収率を増加させるため、接着細胞を培養し、培養フラスコへの接着性の改善に関して選択してもよい。一部の実施形態において、後続のバイオリアクター播種ステップにおけるトランスフェクション効率及び細胞数が改善する。継代培養時、当該技術分野において公知の方法により細胞が細胞培養表面から剥がされ得る。例えば、細胞は、掻き取ることによるか、又はプロテアーゼを含む溶液中でインキュベートすることによって浮き上がらせてもよい。例示的実施形態では、ＨＥＫ２９３細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシンによって室温で約２分間解離させてもよい。血清を含有する成長培地を加えることにより解離を停止させてもよく、懸濁液のピペッティングを繰り返すことにより細胞集塊を解離させてもよい。次に細胞懸濁液をペレット化してもよく、単離されたペレットを好適な完全成長培地に再懸濁してもよい。次に細胞を新規細胞培養チャンバに播種して接着させてもよい。然る時間後に表面に接着しない細胞は、細胞培養培地が完全に成長培地に入れ替わる前に、細胞培養培地と共に穏やかに吸引することにより除去してもよい。一部の実施形態において、細胞を接着させておく時間は、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間又は約７時間であってもよい。細胞が拡大したら、この工程を繰り返して、培養フラスコに強力に接着する細胞の画分を増加させてもよい。一部の実施形態において、この工程は少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、又は任意の好適な回数だけ繰り返される。例示的実施形態において、ＨＥＫ２９３細胞は７５ｃｍ２フラスコに播種し、３７℃インキュベーターにおいて４時間接着させた後、接着が弱い細胞を吸引によって除去し、細胞培養培地を交換する。例示的実施形態において、強力な接着性の細胞を選択する工程は、３回の細胞培養継代にわたって繰り返される。
他の実施形態において、ｒＡＡＶ９（即ち、感染性カプシド化ｒＡＡＶ９粒子）は、本明細書に開示されるｒＡＡＶゲノムを含む。一態様において、ｒＡＡＶゲノムは自己相補的ゲノムである。
別の態様において、「ｒＡＡＶ ＳＭＮ」と称されるｒＡＡＶ９など、ｒＡＡＶが提供される。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ ＳＭＮゲノムは順番に、第１のＡＡＶ２ ＩＴＲ、サイトメガロウイルスエンハンサーを伴うニワトリ−βアクチンプロモーター、ＳＶ４０イントロン、ＳＭＮをコードするポリヌクレオチド、ウシ成長ホルモン由来のポリアデニル化シグナル配列、及び第２のＡＡＶ２ ＩＴＲを有する。一部の実施形態において、ＳＭＮをコードするポリヌクレオチドは、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＭＮ＿０００３４４．２、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１７４１１、又は任意の他の好適なヒトＳＭＮアイソフォームに示される又はそれに由来するヒトＳＭＮ遺伝子である。例示的ＳＭＮ配列は、以下の配列を含む：
ＳＭＮ ＤＮＡの保存的ヌクレオチド置換もまた企図される（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００３４４．２の６２５位におけるグアニンからアデニンへの変更）。一部の実施形態において、ゲノムはＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ ＤＮＡを欠いており、即ちゲノムのＩＴＲ間にＡＡＶ ｒｅｐ又はｃａｐ ＤＮＡがない。企図されるＳＭＮポリペプチドとしては、限定はされないが、ＮＣＢＩタンパク質データベース番号ＮＰ＿０００３３５．１に示されるヒトＳＭＮ１ポリペプチドが挙げられる。実施形態において、ＳＭＮ ＤＮＡは、ヒトＳＭＮポリペプチド（例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ１６６３７、アイソフォーム１（Ｑ１６６３７−１）によって特定されるヒトＳＭＮタンパク質）をコードするポリヌクレオチドを含む。また、ＳＭＮ１修飾因子ポリペプチドプラスチン−３（ＰＬＳ３）も企図される［Ｏｐｒｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２０（５８７５）：５２４−５２７（２００８）］。他のポリペプチドをコードする配列がＳＭＮ ＤＮＡと置き換えられてもよい。
トランスフェクション前、細胞は、フラスコ又は好適なバイオリアクター、又は両方において好適な培養培地中で拡大させる。一部の実施形態において、細胞は、細胞培養培地の連続循環を提供するバイオリアクターにおいて拡大させてもよい。一実施形態において、細胞は、２００ｍ２、３３３ｍ２、又は５００ｍ２ ｉＣＥＬＬｉｓバイオリアクターにおいて拡大させる。一つの培養培地は、５〜１０％ＦＢＳ、４．５ｇ／Ｌグルコース、４ｍＭ Ｌ−グルタミンを含有するＤＭＥＭである。一部の実施形態では、接着細胞を再循環培地バッグ内の培地に加え、バイオリアクター中に循環させる。一部の実施形態では、細胞培養培地又は任意の他の培地は、蠕動ポンプを使用してバイオリアクター中に連続的に再循環させる。細胞はフラスコ又はバイオリアクター内に培養及びトランスフェクションに好適な密度で播種され得る。播種密度は細胞型及びトランスフェクションまでの時間に依存し得る。一部の実施形態において、細胞は約８０００〜１６０００細胞／ｃｍ２で播種される。ある実施形態において、ＨＥＫ２９３細胞は８０００〜１２，０００細胞／ｃｍ２で播種される。
形質導入細胞を対象に形質導入及び再導入する好適な方法は、当該技術分野において公知である。一実施形態において、細胞はインビトロで、例えば適切な培地中にｒＡＡＶを細胞と合わせ、目的のＤＮＡを担持する細胞に関してサザンブロット及び／又はＰＣＲなどの従来技法を用いるか、又は選択可能マーカーの使用によってスクリーニングすることにより形質導入することができる。
一部の実施形態において、パッケージング細胞株には３つのプラスミド：ＡＡＶベクター中にパッケージングしようとするベクター配列をコードする又はそれを含むプラスミド（例えば、ｐＳＭＮ、ｐＭＥＣＰ２トランス遺伝子、又はｐＳＯＤ１ｓｈ）、ｐＨＥＬＰ及びｐＡＡＶ２／９がトランスフェクトされる。トランスフェクションは、限定はされないが、電気穿孔、例えばリポフェクタミン、カチオン性ポリマー及びカチオン性脂質によるリポフェクションを含め、当該技術分野において公知の技法のいずれを用いても実施してもよい。任意の好適なトランスフェクション培地を使用し得る。トランスフェクション工程の一実施形態では、接着ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞に三重ＤＮＡプラスミドポリエチレンイミン（ＰＥＩ）共沈殿物がトランスフェクトされる。一実施形態において、ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＳＭＮベクター（ＣＢプロモーターとＳＭＮをコードするポリヌクレオチドとを含む自己相補的ＡＡＶ９ベクター）が、大規模接着細胞バイオリアクターにおけるＰＥＩ共沈殿物を用いた接着ＨＥＫ２９３細胞中への三重ＤＮＡプラスミドトランスフェクションを用いて産生される。一実施形態において、細胞拡大に使用されるＤＭＥＭ成長培地は、変法ＤＭＥＭトランスフェクション培地に置き換えられる。この培地はカルシウム及びＬ−グルタミン不含で配合される。一実施形態において、トランスフェクション培地は、ＦＢＳ不含、カルシウム不含、Ｌ−グルタミン不含及び４．５ｇ／Ｌグルコース含有ＤＭＥＭである。一部の実施形態において、血清不含（例えば、ＦＢＳ不含）のトランスフェクション培地はトランスフェクションの有効性を向上させる。ある実施形態において、トランスフェクション培地はＯｐｔｉＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）である。一実施形態では、３つのプラスミド（ｐＳＭＮ、ｐＨＥＬＰ及びｐＡＡＶ２／９）をトランスフェクション培地中でＰＥＩと共に混合して反応させる。一部の実施形態において、３つのプラスミドは約１：１：１のモル比で共に混合される。一部の実施形態において、プラスミド及びＰＥＩは１：１のＤＮＡ：ＰＥＩ重量比で混合される。一部の実施形態において、プラスミド及びＰＥＩは１：１未満のＤＮＡ：ＰＥＩ重量比で混合される。ある実施形態において、ｐＳＭＮ、ｐＨＥＬＰ及びｐＡＡＶ２／９は１：１：１のモル比でＯｐｔｉＭＥＭ培地中に混合される。かかる実施形態において、ＰＥＩは、ＤＮＡ：ＰＥＩが重量基準で１：１となるように加えられる。一部の実施形態において、反応は０〜６０分間、又は１０〜４５分間、又は２０〜３０分間生じさせる。ある実施形態において、反応は１５〜３０分間生じさせる。
ある実施形態において、本開示は、ＡＡＶベースのウイルスベクターの製造方法を提供し、この方法は、（ｉ）工業規模のバイオリアクターにおいて接着ＨＥＫ２９３細胞を培養するステップ、（２）接着細胞にプラスミドを６０分未満にわたってトランスフェクトしてＡＡＶベクターの産生を可能にするステップ、及び任意選択で更なる処理、精製、製剤化及び充填ステップを適用して医薬製品を作製するステップを含む。この工程の一実施形態において、ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＳＭＮベクターは、ポリエチレンイミン（「ＰＥＩ」）共沈殿物を用いた三重ＤＮＡプラスミドトランスフェクションを用いて作製される。ある実施形態において、このトランスフェクションに利用される３つのプラスミドは、ｐＳＭＮ、ｐＡＡＶ２／９、及びｐＨＥＬＰである。
トランスフェクションは、パッケージング細胞株をＤＮＡ−ＰＥＩ共沈物と接触させることにより実施されてもよい。一部の実施形態では、トランスフェクション培地中のＤＮＡ−ＰＥＩ共沈物が培地再循環バッグに充填される。一部の実施形態では、トランスフェクション培地中のＤＮＡ−ＰＥＩ共沈物がバイオリアクター内を循環し、成長培地に完全に取って代わる。一部の実施形態では、トランスフェクション培地中のＤＮＡ−ＰＥＩ共沈物をバイオリアクター内で接着細胞に接触させる。一部の実施形態では、トランスフェクション培地中のＤＮＡ−ＰＥＩ共沈物をバイオリアクター内で最長２時間にわたって接着細胞に接触させる。一部の実施形態では、トランスフェクションは１〜２時間にわたって行う。一部の実施形態では、トランスフェクションは、１時間未満、例えば、１０分、２０分、３０分、４０分又は５０分にわたって行う。一部の実施形態では、トランスフェクションは１〜２時間にわたって行う。一部の実施形態では、トランスフェクションは、バイオリアクター中に完全成長培地を再循環させてトランスフェクション培地を完全に入れ替えることにより停止させる。
２．拡大したウイルス粒子の回収
トランスフェクション後に好適な細胞拡大時間が経った後、一部の実施形態では、細胞を溶解させてウイルス粒子を回収する。一部の実施形態において、細胞は細胞溶解工程の開始前にリアクターから解離される。一部の実施形態において、細胞はインサイチューで溶解させる。任意選択で、ウイルス粒子は溶解させることなく回収される。一部の実施形態において、エンドヌクレアーゼが最終目標濃度まで加えられ、例えばバイオリアクター内を循環する。エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方を分解するものであってよい。一実施形態において、エンドヌクレアーゼは、商品名ベンゾナーゼ（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）（登録商標）（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で販売されているセラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）由来の遺伝子操作されたエンドヌクレアーゼである（Ｅａｖｅｓ，Ｇ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂａｃｔ．１９６３，８５，２７３−２７８；Ｎｅｓｔｌｅ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９６９，２４４，５２１９−５２２５）。この酵素は、ｐＮＵＣ１産生プラスミドを含有する株Ｋ１２の突然変異体である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｗ３１１０から産生及び精製される（米国特許第５，１７３，４１８号明細書、本明細書によって全体として参照により援用される）。構造的に、このタンパク質は、２つの重要なジスルフィド結合を有する約３０ｋＤａサブユニットの同一の２４５アミノ酸の二量体である。ベンゾナーゼ（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）（登録商標）はあらゆる形態のＤＮＡ及びＲＮＡ（一本鎖、二本鎖、線状及び環状）を分解し、多種多様な作業条件で有効であり、核酸を２〜５塩基長の５’−一リン酸末端オリゴヌクレオチドに消化する。ベンゾナーゼ（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）（登録商標）は、現行の医薬品及び医薬部外品の製造管理及び品質管理規則（ｃｕｒｒｅｎｔ ｇｏｏｄ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｐｒａｃｔｉｃｅ：ｃＧＭＰ）に基づき作製され、従って、工業規模のタンパク質及び／又はウイルス粒子精製工程で使用することができる。ｃＧＭＰ条件下で作製される他のエンドヌクレアーゼも、同様に本願に開示される精製方法において使用することができる。一実施形態において、ベンゾナーゼは、５０〜２００Ｕ／ｍｌ、例えば７５〜１５０Ｕ／ｍｌ、例えば約１００Ｕ／ｍＬの最終濃度となるようにバイオリアクターに加えられる。一部の実施形態において、ベンゾナーゼを加えると、バイオリアクターにおける高いｖｇ産生が実現しつつ宿主細胞ＤＮＡが著しく減少する。
一部の実施形態において、エンドヌクレアーゼは、リアクターに溶解緩衝液を加える前に混合させておく。一部の実施形態において、細胞溶解溶液は、接着細胞と最長１時間、最長２時間、最長３時間、最長４時間又は最長５時間混合させておく。一部の実施形態において、溶解緩衝液は、好適な緩衝液中に塩化マグネシウム及び／又はＴｗｅｅｎ−２０を含み得る。例示的実施形態において、溶解緩衝液は、５００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０％Ｔｗｅｅｎ ２０、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ８．０である。溶解反応を停止させるため、ベンゾナーゼ反応をクエンチする塩ショ糖液（ＳＳＳ）を加えてもよい。一部の実施形態では、リンス緩衝液を含む回収バッグにＳＳＳを加え、１５分間混合する。一部の実施形態において、バイオリアクターはバイオリアクターリンス緩衝液でリンスされ、次にリンス液が回収物収集バッグに、クエンチされた細胞溶解溶液及び溶解した細胞内容物と共に収集され、これらが全て一緒になってバルク回収物を含む。一部の実施形態において、バイオリアクターリンス緩衝液は、トリス、ＭｇＣｌ２、ＮａＣｌ、Ｔｗｅｅｎ−２０及びショ糖を含み得る。例示的実施形態において、バイオリアクターリンス緩衝液は、２０ｍＭトリス、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１％Ｔｗｅｅｎ−２０ｗ／ｖ及び１％ショ糖ｗ／ｖ、ｐＨ８．１を含む。
３．ウイルス粒子の精製
回収後、バルク回収物ウイルス粒子は、典型的にはろ過によって濃縮及び精製されてもよい。一実施形態において、ウイルス粒子は、デプスろ過と、それに続く大型分子夾雑物及び細胞デブリを除去するフィルタ、例えば０．４５μｍフィルタであって、しかしベクターゲノムがそこを通過することは許容するフィルタでのろ過によってろ過される。任意の好適なデプスフィルタを使用し得る。
当該技術分野において理解されるとおり、デプスろ過とは、大量の大型粒子（例えば、インタクトな細胞又は細胞デブリ）を含有する溶液を、かかる条件下で急速に詰まり得る膜ろ過と比較して多孔質ろ過剤を使用して清澄化することを指す。様々な細孔径の種々のデプスろ過剤が、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｐａｌｌ、Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ、及びＳａｒｔｏｒｉｏｕｓなど、種々の製造者から市販されている。
デプスろ過の目標流速は、フィルタ入口圧力を規格の範囲内に保つため下げられてもよい。全てのバルク回収物がろ過された後、デプスフィルタは、特定の実施形態では、続く第１のタンジェンシャルフローろ過ステップ（「ＴＦＦ１」）に使用されるダイアフィルトレーション緩衝液でチェーシング（ｃｈａｓｅ）されてもよい。デプスフィルタプール液は混合される。次にデプスフィルタプール液を０．４５μｍフィルタでろ過することにより、バルク回収物材料が更に清澄化されてもよい。次に０．４５μｍフィルタはＴＦＦ１緩衝液でチェーシング（ｃｈａｓｅ）される。
４．タンジェンシャルフローろ過
様々な実施形態において、タンジェンシャルフローろ過が、例えばタンジェンシャルフローろ過を用いたバルク回収物の濃縮、並びに塩及びタンパク質の除去に用いられる。タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）（クロスフローろ過ＣＦＦとも称される）は当業者に周知であり、広範囲の状況下でのその実施のための機器及びプロトコルが、限定はされないが、Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＮＹ及びＳｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｓ、Ｒａｎｃｈｏ Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ，ＣＡを含め、種々の製造者から市販されている。概して、ＴＦＦは、膜の表面を横切る保持液の再循環を伴い得る。この穏やかなクロスフロー供給液が、特定の実施形態では、膜の汚れを最小限に抑え、高いろ過率を維持し、且つ高い産物回収率をもたらす。一実施形態において、ＴＦＦステップは、本明細書に例示されるとおり、フラットシートシステムで実現されてもよい。フラットシートシステムは大規模産生で使用されてもよく、ここでかかるシステムは、ウイルス粒子に過剰な剪断力がかかることを防ぐ手段（例えば、オープンフローチャネル）を備える。或いは、ＴＦＦステップは、本明細書に例示されるとおり、中空糸システムで実現されてもよい。一実施形態において、ＴＦＦシステムの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）は２００〜４００ｋＤａ、例えば約３００ｋＤａである。
一実施形態において、ＴＦＦ１ステップは、３００ｋＤａ ＭＷカットオフ再生セルロース膜カセットを使用して実施される。このカセットはフラッシュされ、ＮａＯＨ溶液で衛生化され、及びＴＦＦ１緩衝液で平衡化される。一実施形態において、ＴＦＦ１緩衝液は、２０ｍＭトリス、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１％ショ糖、ｐＨ８．１を含む。
一部の実施形態において、ＴＦＦ１ステップの濃縮相は、清澄化された回収物の容積が約１０分の１に減少するように選択される。目標保持液容積に達した後、ダイアフィルトレーション作業が開始されてもよい。保持液のダイアフィルトレーションは、一部の実施形態では、約６ダイアボリュームのＴＦＦ１緩衝液で行うことができる。一部の実施形態において、保持液のダイアフィルトレーションは、約５〜２０、又は１０〜１５、又は１２ダイアボリュームのＴＦＦ１緩衝液で行われる。６ダイアボリュームの透過液全流量が達成された後、保持液は再び濃縮され、回収されてもよい。中間原薬の産物回収率を増加させるため、膜のリンス、例えば２回の連続的なリンスが実行されてもよい。
５．中間産物
一部の実施形態において、次に中間原薬はドライアイス上又はフリーザー内で凍結され、次に≦−６０℃の貯蔵場所に移されてもよい。他の実施形態において、下流工程の前に中間産物を凍結する必要はない。
一部の実施形態において、更なる処理のため（例えば、例えば本明細書に記載されるとおりの下流工程による精製（ｐｕｒｆｉｃａｔｉｏｎ）のため）、複数の中間産物原体ロットが共にプールされる。複数の中間産物原体ロットは凍結及び貯蔵前にプールされてもよい。他の実施形態において、複数の中間産物原体ロットは、凍結及び貯蔵されたロットを解凍した後にプールされてもよい。
下流工程
一部の実施形態では、下流工程を用いて中間産物（例えばプールされた中間産物）がろ過済み原薬に処理される。一部の実施形態において、下流工程ステップには、（ａ）酸性化及び清澄化（例えば、ろ過を用いる）、（ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィー、（ｃ）タンジェンシャルフローろ過（「ＴＦＦ２」）、（ｄ）ＣｓＣｌ超遠心、（ｅ）ウイルスベクターの収集及び（ｆ）更なるタンジェンシャルフローろ過（「ＴＦＦ３」）が含まれ、これにより精製されたＡＡＶ粒子が薬学的に許容可能な担体中に懸濁されているろ過済み原薬が産生される。一部の実施形態において、下流工程は、ＴＦＦ１中間体の産生後に以下の製造ステップ：ＴＦＦ１中間体の解凍及びプール、酸性化及び清澄化、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）、タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ２）、ＣｓＣｌ超遠心による完全なカプシド／空のカプシドの分離、タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ３）による濃縮／緩衝液交換、ＴＦＦ３プール材料ろ過による原薬の生成、原薬の希釈及びろ過による薬物製品の産生、薬物製品の貯蔵及びバイアルへの薬物製品の充填を含む。
一部の実施形態において、本明細書に開示される下流工程を用いて、本明細書に記載されるとおりＡＡＶ ＳＭＮ、ＡＡＶ ＭＥＣＰ２、又はＳＯＤ１を標的とするｓｈＲＮＡをコードするＡＡＶを含む中間体が処理されてもよい。
１．中間体の酸性化及び清澄化
中間体が凍結される実施形態では、下流工程はＴＦＦ１中間材料を解凍することから始まる。デタージェント、例えばＴｗｅｅｎ ２０を使用して、酸性ｐＨ下でのバルクの宿主細胞タンパク質及びＤＮＡのフロキュレーションを促進してもよい。次にデタージェントを含有するＴＦＦ１中間体のｐＨを降下させてもよい。次に、ｐＨの降下時に形成された凝集物及び沈殿物が、デプスフィルタ並びに大型分子夾雑物及び細胞デブリを除去するフィルタ、例えば０．４５μｍフィルタであって、しかしベクターゲノムがそこを通過することは許容するフィルタで溶液をろ過することにより除去されてもよい。任意の好適なデプスフィルタを使用し得る。
一実施形態において、Ｔｗｅｅｎ ２０は、１０〜２０％Ｔｗｅｅｎ ２０の最終濃度に達するようにＴＦＦ１中間溶液にゆっくりと加えられる。一部の実施形態において、Ｔｗｅｅｎ ２０を加えた後の目標組成は、２０ｍＭトリス、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１％ショ糖ｍ／ｖ、ｐＨ８．１中３６％のＴｗｅｅｎ ２０溶液である。一部の実施形態において、Ｔｗｅｅｎ ２０は約１〜６時間の時間をかけてゆっくりと加えられる。一部の実施形態において、Ｔｗｅｅｎ ２０は３〜６時間かけてゆっくりと加えられる。一部の実施形態において、Ｔｗｅｅｎ ２０は４時間かけてゆっくりと加えられる。一部の実施形態において、Ｔｗｅｅｎ ２０／ＴＦＦ１中間溶液は室温で一晩インキュベートさせておく。一部の実施形態において、Ｔｗｅｅｎ ２０／ＴＦＦ１中間溶液は室温で８〜２０時間インキュベートさせておく。例示的実施形態において、Ｔｗｅｅｎ ２０／ＴＦＦ１中間溶液は室温で１２〜２０時間インキュベートさせておく。
インキュベーション後、任意の好適な酸を加えることにより、Ｔｗｅｅｎ ２０を含有するＴＦＦ１中間体のｐＨを降下させてもよい。一部の実施形態では、１Ｍグリシン、ｐＨ２．５を加えて３．５±０．１の目標ｐＨを達成する。一部の実施形態において、目標ｐＨはｐＨ３．０〜４．０、約ｐＨ３．３〜３．７、約ｐＨ３．４〜３．６、又は約ｐＨ３．５である。ｐＨが許容範囲内になったら、溶液を任意のサイズのフィルタに通過させてもよい。例示的実施形態において、デプスフィルタ（例えば、Ｃｌａｒｉｓｏｌｖｅ ＰＯＤ）、それと直列の０．４５μｍフィルタ（例えば、Ｏｐｔｉｃａｐ ＸＬ１０ Ｄｕｒａｐｏｒｅフィルタ）又は０．８／０．４５μｍ ＰＥＳフィルタが使用される。
２．陽イオン交換クロマトグラフィー
様々な実施形態において、陽イオン交換（ＣＥＸ）捕捉クロマトグラフィーステップを用いて、例えば、ウイルスカプシドが宿主細胞タンパク質、宿主細胞ＤＮＡ、宿主細胞脂質、Ｔｗｅｅｎ ２０及び他の工程関連不純物と分離される。陽イオン交換クロマトグラフィーの原理は当該技術分野において周知であるが、簡潔に言えば、この方法は、単離しようとする正電荷粒子と使用される負電荷樹脂との間の電荷間相互作用に頼るものである。一般に、初めにｐＨ及び伝導性が安定するまで数ダイアボリュームの緩衝液を流すことによりカラムを平衡化させる。次にサンプルをロードし、ローディング緩衝液でカラムを洗浄する。最後に、溶出緩衝液を使用してカラムから目的のサンプルを溶出させ、サンプルを含有する画分を収集する。目的のサンプルの存在は、溶出液の吸光度測定によって検出することができる。
一実施形態において、ＣＥＸステップには、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ Ｓ０３−８０００先端複合材料カラム（スルホニル）（２μｍ細径）クロマトグラフィーカラムが利用される。一実施形態において、溶出ピークは、ＯＤ２８０における急激な上昇から開始して収集される。ＯＤ２８０は、伝導性が８０〜８５ｍＳ／ｃｍになると上昇し始め得る。ＣＥＸ溶出物は常法どおり収集されてもよく、２画分で収集されてもよい。一実施形態において、第１の画分はＯＤ２８０における急激な上昇から開始され、１．５コレクション容積（ＣＶ）が収集される。別の実施形態において、第２の画分は第１の画分の直後に開始され、１．０ＣＶが収集される。これらの２つの画分がプールされ、次にｐＨ８．０±０．３０に中和される。一実施形態において、中和緩衝液は、２０℃の１．０Ｍ トリス、ｐＨ９．１±０．１を含む。
３．タンジェンシャルフローろ過２
一部の実施形態では、濃縮、タンパク質不純物の除去、及び続くＣｓＣｌ超遠心ステップに適切な緩衝液への緩衝液交換のため、タンジェンシャルフローろ過ステップ（ＴＦＦ２）が用いられる。任意の好適なＴＦＦ膜を使用し得る。ある実施形態において、ＴＦＦ２ステップには、３００ｋＤ ＭＷＣＯ再生セルロース膜が利用される。
一部の実施形態において、このステップの濃縮相は、ＣＥＸ溶出物の容積が減少するように設計される。一実施形態では、保持液がダイアフィルトレーション緩衝液で２倍希釈され、保持液がその初期容積まで濃縮される。一実施形態では、ダイアフィルトレーション緩衝液は、２０ｍＭトリス、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２％ポロキサマー１８８、１％ショ糖を含有するｐＨ８．１±０．１、２０℃のＴＦＦ２ ＮａＣｌダイアフィルトレーション緩衝液である。かかる実施形態において、この工程は、新しい緩衝液によるダイアフィルトレーションが完了するまで繰り返されてもよい。一実施形態では、保持液がＣｓＣｌ含有ダイアフィルトレーション緩衝液で２倍希釈され、保持液がその初期容積まで濃縮される。ある実施形態では、ＣｓＣｌ含有ダイアフィルトレーション緩衝液は、２０ｍＭトリス、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、３Ｍ ＣｓＣｌ、０．２％ポロキサマー１８８を含有するｐＨ８．１±０．１、２０℃のＴＦＦ２ ＣｓＣｌダイアフィルトレーション緩衝液である。かかる実施形態において、この工程は、新しい緩衝液によるダイアフィルトレーションが完了するまで繰り返されてもよい。ＣｓＣｌダイアフィルトレーションの完了後、次に保持液は、システムのホールドアップ容積に依存する規定の容積まで濃縮されてもよい。一部の実施形態において、ＴＦＦ２システムからの産物回収率を最大化するため、膜のリンス、例えば２回の連続的なリンスが実行される。
４．ＣｓＣｌ超遠心
インビボ遺伝子形質導入にＡＡＶが使用される一部の実施形態において、ｒＡＡＶの最終産物は不純物及び空の粒子を最小限しか含有しない。ＡＡＶベクターの２つの精製方法は、イオジキサノール勾配又はＣｓＣｌ勾配のいずれかを用いた超遠心である。これらの２つの方法を比較する一研究では、ＣｓＣｌと比較してイオジキサノールではより高いベクター純度のＡＡＶベクターが得られたが、空のウイルスカプシドがより多かったことが実証された。Ｓｔｒｏｂｅｌ ｅｔ ａｌ．“Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｅｓｉｕｍ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ−ａｎｄ Ｉｏｄｉｘａｎｏｌ−Ｂａｓｅｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．”Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２６（４）：１４７−１５７。ＣｓＣｌの使用が空のウイルスカプシド量の低下につながるとしても、ＣｓＣｌは細胞にとって毒性であり得るとともに、残留ＣｓＣｌの除去に複数回の精製ステップが必要となり得るため、イオジキサノール（約１日）のようなより短時間の方法と比較して長い工程所要時間（約３．５日）につながり得る。別の研究では、残留ＣｓＣｌを除去するためのステップの多さにより、高頻度でｒＡＡＶの劇的な損失が生じて低い収率及び回収率につながり、多くの場合にこの方法の他の利益が打ち消されることが示されている。Ｈｅｒｍｅｎｓ ｅｔ ａｌ．“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ ｂｙ Ｉｏｄｉｘａｎｏｌ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ Ａｌｌｏｗｓ Ｒａｐｉｄ ａｎｄ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｔｏｃｋｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｔｈｅ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ．”Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１０：１８８５−１８９１。更に、これらの２つの方法は実験室では前臨床サンプルの作製に上手く機能するが、これらには規模拡張性がなく、従って市販用製品の大規模産生には好適でない。例えば、Ｔｏｍｏｎｏ ｅｔ ａｌ．，“Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ−ｆｒｅｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅ １（ｒＡＡＶ１）．”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｍｅｔｈｏｄｓ ＆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，３：１５０５８を参照のこと（「塩化セシウム（ＣｓＣｌ）又はイオジキサノール密度超遠心法を用いた精製方法は大規模産生には好適でない」）。
一部の実施形態において、例えば空のカプシドを完全なカプシドと分離するため、超遠心ステップが用いられる。予想外にも、本明細書に開示されるＣｓＣｌ超遠心方法は規模拡張性があり、精製ＡＡＶベクターの大規模産生に好適であった。超遠心は分析的超遠心によって実施されてもよく、勾配緩衝液の使用を伴い得る。勾配緩衝液の例としては、限定はされないが、ＣｓＣｌ、ショ糖、イオジキサノール及び当該技術分野において公知の他のものが挙げられる。遠心は、所望のｇ力に達する能力を有する任意の遠心機、例えば、タイプ５０．２ Ｔｉロータ又は等価なロータを備えた自動Ｏｐｔｉｍａ ＸＰＮ １００超遠心システム又は等価なシステムで実施することができる。超遠心後、空のカプシドと完全なカプシドとがチューブ内で異なるバンドに分かれ、特異的バンドから材料を抜き取ることによってこれを抽出し得る。一部の実施形態において、ＴＦＦ２精製後のろ過済み材料が２４１，６００〜３０２，０００ｇ（５０．２ Ｔｉロータにおける約４０，０００〜５０，０００ｒｐｍ）で遠心される。一部の実施形態において、ＴＦＦ２精製後のろ過済み材料が一晩遠心される。一部の実施形態において、ＴＦＦ２精製後のろ過済み材料が１６〜２４時間遠心される。一部の実施形態において、ＴＦＦ２精製後のろ過済み材料が２０〜２４時間遠心される。一部の実施形態において、ＴＦＦ２精製後のろ過済み材料が１５〜２５℃で遠心される。ある実施形態において、ＴＦＦ２精製後のろ過済み材料が３０２，０００ｇ（５０．２ Ｔｉロータにおける５０，０００ｒｐｍ）で２０℃において１７時間遠心される。一部の実施形態において、ＣｓＣｌ遠心用の緩衝液は、以下の成分であって、（ａ）ＣｓＣｌを含み、（ｂ）ＭｇＣｌ２、（ｃ）ポロキサマー１８８及び（ｄ）トリスのうちの１つ以上を更に含む成分うちの１つ以上を有し得る。一部の実施形態において、ＣｓＣｌ用の緩衝液は、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の全てを含み得る。一部の実施形態において、ＣｓＣｌ用の緩衝液はｐＨ７．５〜８．５、又はｐＨ７．９〜８．２である。ある実施形態において、ＣｓＣｌ遠心に好適な緩衝液は、２０ｍＭトリス、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、３Ｍ ＣｓＣｌ、０．２％ポロキサマー１８８、ｐＨ８．１±０．１０である。遠心ステップの完了後、超遠心機からチューブが取り出されてもよい。一部の実施形態において、一番上のバンド、バンドＡが、空のカプシドを含有する。一部の実施形態において、上から二番目以降のバンド、バンドＢ、Ｃ及びＤが完全なカプシドダブレットバンドを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶウイルスベクターはシリンジを使用して収集される。ある実施形態において、バンドＢ、Ｃ及びＤは、３０ｍＬシリンジに取り付けられた１８Ｇ針をバンドＤのほんの少し下からチューブの中央まで挿入することによって取り出される。他の実施形態（ｅｍｂｏｄｉｅｍｅｎｔｓ）において、当該技術分野において公知の及び／又は本明細書に記載されるとおりの技法を用いてバンドが完全なカプシド又は空のカプシドの存在に関してアッセイされてもよく、及び完全なカプシドを含有するバンドが収集されてもよい。
空のウイルスカプシドと空でないウイルスカプシドとの比は、標準的な実験技法によって測定することができる。一部の実施形態において、測定は吸光度測定によって行われる。一部の実施形態において、測定はＵＶ吸光度測定によって行われる。一部の実施形態において、カプシドタンパク質の総量及びＤＮＡの総量は、ＵＶ吸光度測定から決定することができる。一部の実施形態において、測定は光屈折率測定によって行われる。一部の他の実施形態において、測定は分析的超遠心法によって行われる。
一実施形態において、超遠心後に収集されるＡＡＶウイルスベクターは、空のカプシドを８％未満、空のカプシドを７％未満、５％未満、３％未満、又は１％未満有する。一実施形態において、超遠心後に収集されるＡＡＶウイルスベクターは空のカプシドを１〜１０％有する。一実施形態において、超遠心後に収集されるＡＡＶウイルスベクターは空のカプシドを２〜８％有する。一実施形態において、空のカプシドの数は検出限界を下回る。別の実施形態において、空のカプシドの割合は、全カプシドに対する割合として決定される。
５．タンジェンシャルフローろ過３によるろ過済み原薬の生成
一部の実施形態では、ＣｓＣｌの除去、及び完全なベクターカプシドの濃縮のため、タンジェンシャルフローろ過ステップ（ＴＦＦ３）が用いられる。タンジェンシャルフローろ過は、好適な膜を使用して実施し得る。一実施形態において、３００ｋＤａ ＭＷＣＯ再生セルロース膜が使用される。膜によってベクターカプシドが保持され得る。ＴＦＦ３作業の濃縮相は、残留ＣｓＣｌの濃度及び超遠心プールの容積が減少するように設計されてもよい。一部の実施形態において、目標保持液容積に達した後、ダイアフィルトレーションが開始される。保持液のダイアフィルトレーションは、最大１０ダイアボリュームの好適なＴＦＦ３緩衝液で行われる。一実施形態において、好適なＴＦＦ３緩衝液は、以下の成分であって、（ａ）トリス、（ｂ）ＭｇＣｌ２、（ｃ）ＮａＣｌ、又は（ｄ）ポロキサマー１８８を含む成分のうちの１つ以上を含み得る。一実施形態において、好適なＴＦＦ３緩衝液は、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の全てを含み得る。一実施形態において、ＴＦＦ３緩衝液はｐＨ７．５〜８．５、ｐＨ７．７〜８．３、又はｐＨ８．０である。ある実施形態において、好適なＴＦＦ３緩衝液は、２０℃の２０ｍＭトリス、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．００１％ポロキサマー１８８、ｐＨ８．０±０．１を含む。別の実施形態において、好適なＴＦＦ３緩衝液は、２０℃の２０ｍＭトリス、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．００５％ポロキサマー１８８、ｐＨ８．０±０．１を含む。一実施形態において、濃縮された保持液を０．２μｍ Ｐａｌｌ Ｓｕｐｏｒ（登録商標）ＥＫＶ滅菌用グレードフィルタ（Ｍｉｎｉ Ｋｌｅｅｎｐａｋ）フィルタを使用してろ過すると、ろ過済み原薬が産生される。一部の実施形態において、本明細書に記載される方法では、製造バッチ当たり５×１０１５ｖｇ超、又は８×１０１５ｖｇ超又は１×１０１６ｖｇ超のｒＡＡＶが得られる。
医薬組成物
本明細書に開示される方法により精製されるウイルス（例えばＡＡＶ）粒子は、ヒト対象に投与することができる十分な純度で高収率で産生され得る。一部の実施形態において、ウイルスベクターは、約１〜８×１０１３ウイルスベクターゲノム／ｍＬ（ｖｇ／ｍＬ）、又は約１．７〜２．３×１０１３ｖｇ／ｍＬの濃度で製剤化される。一部の実施形態において、ウイルスベクターは、約１．９〜２．１×１０１３ｖｇ／ｍＬの濃度で製剤化される。一部の実施形態において、ウイルスベクターは、約２．０×１０１３ｖｇ／ｍＬの濃度で製剤化される。
一部の実施形態では、ウイルスベクターの産生工程において、核酸材料を含有しない空のウイルスカプシドが生成され得る。低量の空のウイルスカプシドを含む医薬組成物（ｐｈａｒｍａｃｕｅｔｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）は、未成熟な免疫系を有する患者、例えば乳児が、治療利益なしに不必要に抗原性物質（空のカプシド、宿主細胞タンパク質、宿主細胞ＤＮＡ）に曝露されることを回避するため有利であり得る。一部の実施形態において、かかる医薬組成物は、インフュージョンリアクション又は広域免疫応答の可能性を低減し得るとともに、治療有効性を改善し得る。ゲノム材料を有する完全なウイルスカプシドと比較すると、空のカプシドは密度が異なるため、これらの２つの種は勾配遠心法か、又は当該技術分野において公知の他の方法によって分離することが可能である。一部の実施形態において、空のカプシドは超遠心法によって分離される。一部の実施形態において、空のカプシドはＣｓＣｌ勾配超遠心法によって分離される。他の実施形態において、空のカプシドはイオジキサノール勾配超遠心法によって分離される。一部の実施形態において、空のカプシドはショ糖勾配超遠心法によって分離される。
空のウイルスカプシドと空でないウイルスカプシドとの比は、標準的な実験技法によって測定することができる。一部の実施形態において、比は吸光度測定によって測定される。一部の実施形態において、比はＵＶ吸光度測定によって測定される。一部の実施形態において、カプシドタンパク質の総量及びＤＮＡの総量はＵＶ吸光度測定によって決定することができる。一部の実施形態において、測定は光屈折率測定によって決定される。一部の他の実施形態において、測定は分析的超遠心法によって決定される。
高レベルの空のカプシドは、ウイルスベクター治療の有効性に難題を突きつけ得る。一実施形態において、医薬組成物は、１０％未満の空のカプシド、８％未満の空のカプシド、７％未満、約５％未満、３％未満、１％未満の空のカプシドを有する。別の実施形態において、医薬組成物は１〜１０％の空のカプシドを有する。別の実施形態において、医薬組成物は２〜８％の空のカプシドを有する。別の実施形態において、医薬組成物は、６％以下の空のカプシド、５％の空のカプシド、４％の空のカプシド、３％の空のカプシド、２％の空のカプシド、又はそれ未満を有する。ある実施形態において、空のカプシドの数は検出限界を下回る。別の実施形態において、空のカプシドの割合は、全カプシドに対する割合として、例えばＡＵＣを用いて決定される。一部の実施形態において、空のカプシドがこのように低い割合であることにより、例えば、より高い割合の空のカプシドを有する組成物と比較したとき、患者への投与後の治療の有効性が改善され、及び／又は有害事象（例えば、炎症反応、肝傷害）が減少する。一部の実施形態において、本明細書に開示されるウイルスベクターの調製方法は、先行方法、例えば、接着細胞及び／又は本明細書に記載される精製方法を使用しないもののレベルと比較したとき、これらの改善された空のカプシド割合をもたらす。
ウイルスベクターの産生工程において、ウイルスベクターの生成に使用される接着細胞（例えばＨＥＫ２９３細胞）からの残留タンパク質は、完全に分離して取り除くことはできない可能性もある。残留宿主細胞タンパク質には、免疫応答を誘発する恐れがある。残留宿主細胞の量は、ウイルスカプシドタンパク質と残留宿主細胞タンパク質とを区別できる任意の標準的な実験技法によって測定することができる。一部の実施形態において、残留宿主細胞タンパク質の量は、サイズ排除又はイオン交換クロマトグラフィーによって測定することができる。一部の実施形態において、測定は、親細胞特異抗体を用いたウエスタンブロットによって行うことができる。一実施形態において、残留宿主細胞タンパク質の量は酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって測定することができる。一部の実施形態において、残留宿主細胞タンパク質の量は市販のＥＬＩＳＡキットによって測定することができる。一部の実施形態において、残留宿主細胞タンパク質の量は、Ｃｙｇｎｕｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＨＥＫ２９３ ＨＣＰ ＥＬＩＳＡキットによって測定することができる。
別の実施形態において、前記医薬組成物中の残留宿主細胞タンパク質は、１×１０１３ｖｇ／ｍｌ当たり５×１０６ｐｇ／ｍｌ以下、１×１０１３ｖｇ／ｍＬ当たり１．２×１０６ｐｇ／ｍｌ以下又は１×１０１３ｖｇ／ｍｌ当たり１×１０５ｐｇ／ｍｌ〜１×１０１３ｖｇ／ｍｌ当たり１．２×１０６ｐｇ／ｍｌ又は１×１０１３ｖｇ／ｍｌ当たり４０ｎｇ／ｍｌ以下である。ある実施形態において、医薬組成物は、１．０×１０１３ｖｇ当たり５、４、３、２、１ｎｇ以下又はそれより少ない残留宿主細胞タンパク質を含む。一実施形態において、医薬組成物は、１．０×１０１３ｖｇ当たり４ｎｇ以下の残留宿主細胞タンパク質を含む。
ウイルスベクターの産生工程において、接着細胞（例えばＨＥＫ２９３細胞）からの残留宿主細胞ＤＮＡ又はウイルスベクターの生成のためにトランスフェクトされた残留プラスミドＤＮＡは、完全には除去できない可能性もある。精製工程（例えば、酸性化、清澄化、タンジェンシャルフローろ過等）では、バルクの残留宿主細胞又はプラスミドＤＮＡが除去される。一実施形態において、残留宿主細胞又はプラスミドＤＮＡの量の測定は、ＰＣＲによって実施される。別の実施形態において、残留宿主細胞又はプラスミドＤＮＡの量の測定は、宿主細胞又はプラスミド配列に特異的なプライマーによる定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって実施される。別の実施形態において、残留宿主細胞又はプラスミドＤＮＡの量の測定は、デジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によって実施される。一実施形態において、プラスミドＤＮＡの量は、プラスミドのカナマイシン耐性遺伝子領域に特異的なプライマーによるｑＰＣＲアッセイを用いて決定される。別の実施形態において、残留宿主細胞ＤＮＡの量は、市販のｑＰＣＲアッセイキット、例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒによるｒｅｓＤＮＡＳＥＱ（登録商標）ヒト残留ＤＮＡ定量化キット、Ｂｉｏｒａｄによる残留ＤＮＡ定量化スーパーミックス、又は任意の等価な製品により決定される。残留宿主細胞又はプラスミドＤＮＡの量を低減すると、治療転帰（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｏｕｔｃｏｍｏｅｓ）を改善することができ、本明細書に開示される治療における使用のためにかかる組成物が精製及び／又は選択されてもよい。
ある実施形態において、前記医薬組成物中の残留宿主細胞ＤＮＡは、１×１０１３ｖｇ／ｍｌ当たり１．７×１０６ｐｇ／ｍｌ以下、１×１０１３ｖｇ／ｍｌ当たり１×１０５ｐｇ／ｍｌ〜１×１０１３ｖｇ／ｍｌ当たり１．２×１０６ｐｇ／ｍｌである。ある実施形態において、前記医薬組成物中の残留宿主細胞ＤＮＡは、１．０×１０１３ｖｇ当たり３×１０５、２×１０５、１．１×１０５、１×１０５ｐｇ以下であるか、又はそれより少ない。実施形態において、前記医薬組成物中の残留宿主細胞ＤＮＡは１．０×１０１３ｖｇ当たり１．１×１０５ｐｇ以下である。
別の実施形態において、前記医薬組成物中の残留プラスミドＤＮＡは、１×１０１３ｖｇ／ｍｌ当たり１．７×１０６ｐｇ／ｍｌ以下、１×１０１３ｖｇ／ｍｌ当たり１×１０５ｐｇ／ｍｌ〜１×１０１３ｖｇ／ｍｌ当たり１．７×１０６ｐｇ／ｍｌである。別の実施形態において、前記医薬組成物中の残留プラスミドＤＮＡは１．０×１０１３ｖｇ当たり６．８×１０５ｐｇ以下である。
ある実施形態において、医薬組成物中の残留宿主細胞ＤＮＡは１．０×１０１３ｖｇ当たり１．１×１０５ｐｇ以下であり、及び前記医薬組成物中の残留プラスミドＤＮＡは、１．０×１０１３ｖｇ当たり６．８×１０５ｐｇ以下である。
ある実施形態において、医薬組成物中の残留宿主細胞ＤＮＡは１．０×１０１３ｖｇ当たり１．１×１０５ｐｇ以下であり、及び前記医薬組成物中の残留プラスミドＤＮＡは１．０×１０１３ｖｇ当たり６．８×１０５ｐｇ以下であり、及び前記医薬組成物中の残留宿主細胞タンパク質は１．０×１０１３ｖｇ当たり４ｎｇ以下である。
一部の実施形態において、医薬組成物中のエンドトキシンの量は、１．０×１０１３ｖｇ／ｍＬ当たり約１ＥＵ／ｍＬ未満、１．０×１０１３ｖｇ／ｍＬ当たり約０．７５ＥＵ／ｍＬ未満、１．０×１０１３ｖｇ／ｍＬ当たり約０．５ＥＵ／ｍＬ未満、１．０×１０１３ｖｇ／ｍＬ当たり約０．４ＥＵ／ｍＬ未満、１．０×１０１３ｖｇ／ｍＬ当たり約０．３５ＥＵ／ｍＬ未満、１．０×１０１３ｖｇ／ｍＬ当たり約０．３ＥＵ／ｍＬ未満、１．０×１０１３ｖｇ／ｍＬ当たり約０．２５ＥＵ／ｍＬ未満、１．０×１０１３ｖｇ／ｍＬ当たり約０．２ＥＵ／ｍＬ未満、１．０×１０１３ｖｇ／ｍＬ当たり約０．１５ＥＵ／ｍＬ未満、１．０×１０１３ｖｇ／ｍＬ当たり約０．１ＥＵ／ｍＬ未満、１．０×１０１３ｖｇ／ｍＬ当たり約０．０５ＥＵ／ｍＬ未満、又は、１．０×１０１３ｖｇ／ｍＬ当たり約０．０２ＥＵ／ｍＬ未満である。エンドトキシンの量の決定方法は、例えばリムルスアメボサイトライセート（ＬＡＬ）試験など、当該技術分野において公知である。実施形態において、エンドトキシンは、米国薬局方（Ｐｈａｒｍａｃｏｐｉｅａ）（「ＵＳＰ」）＜８５＞（全体として参照により本明細書に援用される）に従いアッセイされる。
一実施形態において、医薬組成物中のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）は、１．０×１０１３ｖｇ当たり０．５ｎｇ未満、１．０×１０１３ｖｇ当たり０．３ｎｇ未満、又は１．０×１０１３ｖｇ当たり０．２２ｎｇ未満である。一実施形態において、前記医薬組成物中のベンゾナーゼは、１．０×１０１３ｖｇ当たり０．２ｎｇ未満、１．０×１０１３ｖｇ当たり０．１ｎｇ未満、又は１．０×１０１３ｖｇ当たり０．０９ｎｇ未満である。
一実施形態において、本明細書に開示される医薬組成物は、以下のうちの１つ以上を含む：１．０×１０１３ｖｇ当たり約０．０９ｎｇ未満のベンゾナーゼ、約３０μｇ／ｇ（ｐｐｍ）未満のセシウム、約２０〜８０ｐｐｍのポロキサマー１８８、１．０×１０１３ｖｇ当たり約０．２２ｎｇ未満のＢＳＡ、１．０×１０１３ｖｇ当たり約６．８×１０５ｐｇ未満の残留プラスミドＤＮＡ、１．０×１０１３ｖｇ当たり約１．１×１０５ｐｇ未満の残留ｈｃＤＮＡ、１．０×１０１３ｖｇ当たり約４ｎｇ未満のｒＨＣＰ、ｐＨ７．７〜８．３、約３９０〜４３０ｍＯｓｍ／ｋｇ、容器当たり約６００個未満の≧２５μｍサイズの粒子、容器当たり約６０００個未満の≧１０μｍサイズの粒子、約１．７×１０１３〜２．３×１０１３ｖｇ／ｍＬのゲノム力価、１．０×１０１３ｖｇ当たり約３．９×１０８〜８．４×１０１０ＩＵの感染力価、１．０×１０１３ｖｇ当たり約１００〜３００μｇの全タンパク質、約７．５×１０１３ｖｇ／ｋｇ用量のウイルスベクターによるΔ７ＳＭＡマウスの≧２４日の生存期間中央値、インビトロ細胞ベースアッセイに基づく約７０〜１３０％の相対効力、及び／又は約５％未満の空のカプシド。
一実施形態において、本明細書に開示される医薬組成物は、以下のうちの１つ以上、例えば全てを含む：ｐＨ７．７〜８．３（例えば、ＵＳＰ＜７９１＞により測定したとき）、約３９０〜４３０ｍＯｓｍ／ｋｇ（例えば、ＵＳＰ＜７８５＞により測定したとき）、容器当たり約６００個未満の≧２５μｍサイズの粒子（例えば、ＵＳＰ＜７８７＞により測定したとき）、容器当たり約６０００個未満の≧１０μｍサイズの粒子（例えば、ＵＳＰ＜７８７＞により測定したとき）、約１．７×１０１３〜２．３×１０１３ｖｇ／ｍＬのゲノム力価、１．０×１０１３ｖｇ当たり約３．９×１０８〜８．４×１０１０ＩＵの感染力価、１．０×１０１３ｖｇ当たり約１００〜３００μｇの全タンパク質、例えば本明細書に記載されるとおりの例えばインビボ機能性（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｉｙ）試験において、約７．５×１０１３ｖｇ／ｋｇ用量のウイルスベクターによるΔ７ＳＭＡマウスの≧２４日の生存期間中央値、インビトロ細胞ベースアッセイに基づく約７０〜１３０％の相対効力、及び／又は約５％未満の空のカプシド。実施形態において、本明細書に開示される医薬組成物は、９５％以上の総純度を含む（例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定したとき）。実施形態において、本明細書に開示される医薬組成物は、非単一不特定関連不純物を２％超のレベルで含む（例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定したとき）。実施形態において、本明細書に開示される医薬組成物は、０．７５ＥＵ／ｍＬ以下のエンドトキシンレベルを含む（例えば、ＵＳＰ＜８５＞により測定したとき）。実施形態において、本明細書に開示される医薬組成物は、例えばＵＳＰ＜７１＞により測定したとき、無菌性試験で増殖がないとの試験結果が出る。
高レベルの残留宿主細胞タンパク質、宿主細胞ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、及び／又はエンドトキシンは、ウイルスベクター治療の有効性に難題を突きつけ得る。一部の実施形態において、残留宿主細胞タンパク質、宿主細胞ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、及び／又はエンドトキシンがこのように低量（ｌｏｗ ａｍｏｕｎｓ）であることにより、例えばより高量を有する組成物と比較したとき、患者への投与後の治療の有効性が改善され、及び／又は有害事象（例えば、炎症反応、肝傷害）が減少する。一部の実施形態において、本明細書に開示されるウイルスベクターの調製方法は、先行方法、例えば、接着細胞及び／又は本明細書に記載される精製方法を使用しないもののレベルと比較したとき、これらの改善されたレベルをもたらす。一部の実施形態において、本明細書における方法はまた、低量（ｌｏｗ ａｍｏｕｎｓ）の残留宿主細胞タンパク質、宿主細胞ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、及び／又はエンドトキシンに加えて、空のカプシドの割合が低下したウイルスベクターの調製も可能にする。
一部の実施形態において、ＴＦＦ後、例えば２回目のＴＦＦ後の残留セシウムの量は約５０μｇ／ｇを下回る。一部の実施形態において、ＴＦＦ後、例えば２回目のＴＦＦ後の残留セシウムの量は約３０μｇ／ｇを下回る。一部の実施形態において、ＴＦＦ後、例えば２回目のＴＦＦ後の残留セシウムの量は約２０μｇ／ｇを下回る。一部の実施形態において、医薬組成物中の残留セシウムは３０μｇ／ｇ（ｐｐｍ）以下である。一部の実施形態において、残留ＣｓＣｌの量は、質量分析法、誘導結合プラズマ質量分析法（ＩＣＰ−ＭＳ）、及び／又は別の好適な方法によって測定されてもよい。一部の実施形態において、２回目のＴＦＦ後の残留セシウムの量は、例えばＩＣＰ−ＭＳを用いて、定量限界を下回る。
一部の実施形態において、２回目のＴＦＦ後に収集されるＡＡＶウイルスベクターの濃度は、約５×１０１２ｖｇ／ｍｌ以上、約１×１０１３ｖｇ／ｍｌ以上、又は約３×１０１３ｖｇ／ｍｌ以上である。
一実施形態において、本医薬組成物は、以下のうちの１つ以上を有する：１．０×１０１３ｖｇ当たり０．０９ｎｇ未満のベンゾナーゼ、３０μｇ／ｇ（ｐｐｍ）未満のセシウム、約２０〜８０ｐｐｍのポロキサマー１８８、１．０×１０１３ｖｇ当たり０．２２ｎｇ未満のＢＳＡ、１．０×１０１３ｖｇ当たり６．８×１０５ｐｇ未満の残留プラスミドＤＮＡ、１．０×１０１３ｖｇ当たり１．１×１０５ｐｇ未満の残留ｈｃＤＮＡ、及び１．０×１０１３ｖｇ当たり４ｎｇ未満のｒＨＣＰ。
別の実施形態において、本医薬組成物は、参照標準の±２０％の間、±１５％の間、±１０％の間、又は±５％の間の効力を保持している。一実施形態において、効力は、Ｆｏｕｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２８（３），ｐｐ．２７１−２７４（２０１０）の方法を用いて、参照標準に対するものとして評価される。任意の好適な参照標準を使用し得る。一実施形態において、本医薬組成物は、ＳＭＡΔ７マウスによって試験したとき、あるインビボ効力を有する。ある実施形態において、７．５×１０１３ｖｇ／ｋｇ用量を与えた被験マウスが、１５日超、２０日超、２２日超又は２４日超の生存期間中央値を有する。一実施形態において、本医薬組成物は、細胞ベースアッセイによって試験したとき参照標準及び／又は好適な対照と比べて５０〜１５０％、６０〜１４０％又は７０〜１３０％であるインビトロ相対効力を有する。
本開示により精製されたウイルス粒子（ｖｉｒｕｓ ｐａｒｔｉｃｌｅ）（例えば、ウイルス粒子（ｖｉｒａｌ ｐａｒｔｉｃｌｅ））を公知の方法により製剤化して、薬学的に有用な組成物を調製することができる。本開示の組成物は、当該技術分野において公知の技法を用いて、哺乳類対象、例えばヒトへの投与用に製剤化することができる。詳細には送達系は、筋肉内、皮内、粘膜、皮下、静脈内、髄腔内、注射用デポー型装置又は局所投与用に製剤化されてもよい。
送達系が溶液又は懸濁液として製剤化されるとき、送達系は許容可能な担体中、例えば水性担体中にある。例えば、水、緩衝用水、０．８％生理食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸など、種々の水性担体を使用し得る。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技法によって滅菌されてもよく、又は滅菌ろ過されてもよい。結果として生じる水性溶液は、そのまま使用するため包装されてもよく、又は凍結乾燥されてもよく、ここで凍結乾燥調製物は、投与前に滅菌溶液と組み合わされる。
組成物、例えば医薬組成物は、生理的条件を近似するため、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、オレイン酸トリエタノールアミン等、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、等張化剤、湿潤剤などの薬学的に許容可能な補助物質を含有し得る。一部の実施形態において、医薬組成物は保存剤を含む。一部の他の実施形態において、医薬組成物は保存剤を含まない。
ウイルスベクター、例えば、本明細書に開示される組成物及び製剤中にあるウイルスベクターのゲノム力価は、幾つもの標準的な方法で決定することができる。ウイルスベクターに特異的なプライマーによるＰＣＲは相対測定を提供できるが、より少量のサンプル及び絶対測定には定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）が用いられ得る。ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）は、水−油エマルション滴技術をベースとするデジタルＰＣＲの実施方法である。サンプルが数万個の液滴に分割され、各個別の液滴で鋳型分子のＰＣＲ増幅が行われる。検量線を作成したり、又は高い増幅効率のプライマーを有したりする必要がないため、ｄｄＰＣＲは典型的には、従来のＰＣＲベースの技法ほど多くのサンプルを使用しない。一実施形態において、ウイルスベクターのゲノム力価はＰＣＲを用いて決定される。別の実施形態において、ウイルスベクターのゲノム力価はｑＰＣＲを用いて決定される。別の実施形態において、ウイルスベクターのゲノム力価はｄｄＰＣを用いて決定される。ｄｄＰＣＲを用いたウイルスゲノム力価の決定方法については、例えば、Ｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，“Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ ａｎｄ Ｓｅｌｆ−Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｔｉｔｅｒｓ ｂｙ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ，”Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２５（２）：１１５−１２５に記載されている。
一部の実施形態において、ＰＣＲベースの方法は、ＳＭＮ遺伝子を標的とする特異的に設計されたプライマー及びプローブを使用してカプシド化ＡＡＶ９ウイルスゲノムを検出及び定量化する。他の実施形態において、ＰＣＲベースの方法は、ニワトリβ−アクチンプロモーターを標的とする特異的に設計されたプライマー及びプローブを使用してカプシド化ＡＡＶ９ウイルスゲノムを検出及び定量化する。他の実施形態において、ＰＣＲベースの方法は、ＣＭＶエンハンサーを標的とする特異的に設計されたプライマー及びプローブを使用してカプシド化ＡＡＶ９ウイルスゲノムを検出及び定量化する。他の実施形態において、ＰＣＲベースの方法は、ＩＴＲ配列を標的とする特異的に設計されたプライマー及びプローブを使用してカプシド化ＡＡＶ９ウイルスゲノムを検出及び定量化する。他の実施形態において、ＰＣＲベースの方法は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを標的とする特異的に設計されたプライマー及びプローブを使用してカプシド化ＡＡＶ９ウイルスゲノムを検出及び定量化する。
一部の実施形態において、本医薬組成物は約ｐＨ７．７〜８．３であり、３９０〜４３０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する。一部の実施形態において、ｐＨは、ｐＨメーターを使用して測定される。一部の実施形態において、ｐＨは、米国薬局方（ＵＳＰ）、例えば＜７９１＞（全体として参照により援用される）による標準セットに基づき温度補償付きマイクロ電極を使用して電位差測定法で測定される。一部の実施形態において、オスモル濃度は、ＵＳＰ、例えばＵＳＰ＜７８５＞（全体として参照により援用される）に基づき凝固点降下法を用いて測定される。一部の実施形態において、オスモル濃度は、蒸気圧降下浸透圧計を使用して測定される。他の実施形態において、オスモル濃度は、膜浸透圧計を使用して測定される。
一実施形態において、静脈内製剤は、７．５〜８．５のｐＨ、２×１０１３ｖｇ／ｍｌ〜６×１０１３ｖｇ／ｍｌのゲノム力価、及び３８４〜４４８ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する。別の実施形態において、静脈内製剤は、７．５〜８．５のｐＨ、１．５×１０１３ｖｇ／ｍｌ〜３．５×１０１３ｖｇ／ｍｌのゲノム力価、及び３８４〜４４８ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する。別の実施形態において、静脈内製剤は、７．５〜８．５のｐＨ、１．８×１０１３ｖｇ／ｍｌ〜２．２×１０１３ｖｇ／ｍｌのゲノム力価、及び３８４〜４４８ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する。ある実施形態において、ＩＶ製剤は約０．１〜２．０ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む。ある実施形態において、ＩＶ製剤は約１００〜３００ｍＭ ＮａＣｌを含む。ある実施形態において、ＩＶ製剤は約０．００１％〜０．０１％ｗ／ｖポロキサマー１８８を含む。ある実施形態において、ＩＶ製剤は、例えば７．５〜８．５のｐＨの、１０〜３０ｍＭトリス緩衝液中の水性製剤である。
ある実施形態において、ＩＶ製剤は、ｐＨ８．０の２０ｍＭトリス緩衝液中、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．００５％ｗ／ｖポロキサマー１８８を含む。実施形態において、ＩＶ製剤は、約１×１０１３〜３×１０１３ｖｇ／ｍＬ又は１．７×１０１３〜２．３×１０１３ｖｇ／ｍＬのゲノム力価を含む。
医薬組成物の使用
他の実施形態において、本明細書には、ポリヌクレオチドを含むゲノムを有するｒＡＡＶ９を投与することを含む、患者の中枢神経系へのポリヌクレオチドの送達方法が開示される。一部の実施形態において、送達は、ポリヌクレオチドを含むゲノムを有するｒＡＡＶ９を投与することを含む、患者の中枢神経系へのポリヌクレオチドの髄腔内送達である。一部の実施形態において、非イオン性低浸透圧性造影剤もまた患者に投与される。非イオン性低浸透圧性造影剤は、患者の中枢神経系において標的細胞の形質導入を増加させる。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ９ゲノムは自己相補的ゲノムである。他の実施形態において、ｒＡＡＶ９ゲノムは一本鎖ゲノムである。
一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは脳領域に送達される。送達に企図される脳の部位としては、限定はされないが、運動皮質及び脳幹が挙げられる。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは脊髄に送達される。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは下位運動ニューロンに送達される。本開示の実施形態は、ｒＡＡＶ９を利用してポリヌクレオチドを神経及びグリア細胞に送達する。一部の実施形態において、グリア細胞は、ミクログリア細胞、オリゴデンドロサイト又はアストロサイトである。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ９を使用してポリヌクレオチドがシュワン細胞に送達される。
使用には、例えば、ＳＭＡ及びＡＬＳなどの下位運動ニューロン疾患並びにポンペ病、リソソーム蓄積障害、多形性膠芽腫及びパーキンソン病の治療が含まれる。リソソーム蓄積障害としては、限定はされないが、アクチベーター欠損症／ＧＭ２ガングリオシドーシス、α−マンノシドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、コレステリルエステル蓄積症、慢性ヘキソサミニダーゼＡ欠損症、シスチン蓄積症、ダノン病、ファブリー病、ファーバー病、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシス、ゴーシェ病（Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型）、ＧＭ１ガングリオシドーシス（乳児型、乳児後期型／若年型、成人型／慢性）、Ｉ細胞病／ムコリピドーシスＩＩ、乳児遊離シアル酸蓄積症／ＩＳＳＤ、若年型ヘキソサミニダーゼＡ欠損症、クラッベ病（乳児発症型、遅発型）、異染性白質ジストロフィー、ムコ多糖症障害（偽性ハーラー・ポリジストロフィー／ムコリピドーシスＩＩＩＡ、ＭＰＳ Ｉ型ハーラー症候群、ＭＰＳ Ｉ型シャイエ症候群、ＭＰＳ Ｉ型ハーラー・シャイエ症候群、ＭＰＳ ＩＩ型ハンター症候群、サンフィリポ症候群Ａ型／ＭＰＳ ＩＩＩ Ａ型、サンフィリポ症候群Ｂ型／ＭＰＳ ＩＩＩ Ｂ型、サンフィリポ症候群Ｃ型／ＭＰＳ ＩＩＩ Ｃ型、サンフィリポ症候群Ｄ型／ＭＰＳ ＩＩＩ Ｄ型、モルキオＡ型／ＭＰＳ ＷＡ型、モルキオＢ型／ＭＰＳ ＩＶＢ型、ＭＰＳ ＩＸ型ヒアルロニダーゼ欠損症、ＭＰＳ ＶＩ型マロトー・ラミー、ＭＰＳ ＶＩＩ型スライ症候群、ムコリピドーシスＩ／シアリドーシス、ムコリピドーシスＩＩＩＣ、ムコリピドーシスＩＶ型）、多種スルファターゼ欠損症、ニーマン・ピック病（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型）、神経セロイドリポフスチン症（ＣＬＮ６疾患（非定型乳児後期型、遅発バリアント、早期若年型）、バッテン・シュピールマイアー・フォークト／若年型ＮＣＬ／ＣＬＮ３疾患、フィンランドバリアント乳児後期型ＣＬＮ５、ヤンスキー・ビールショースキー病／乳児後期型ＣＬＮ２／ＴＰＰ１疾患、クーフス／成人発症型ＮＣＬ／ＣＬＮ４疾患、北部てんかん／乳児後期バリアントＣＬＮ８、サンタブオリ・ハルチア（Ｓａｎｔａｖｕｏｒｉ−Ｈａｌｔｉａ）／乳児型ＣＬＮ１／ＰＰＴ疾患、β−マンノシドーシス、ポンペ病／ＩＩ型糖原病、ピクノディスオストーシス、サンドホフ病／成人発症型／ＧＭ２ガングリオシドーシス、サンドホフ病／ＧＭ２ガングリオシドーシス−乳児型、サンドホフ病／ＧＭ２ガングリオシドーシス−若年型、シンドラー病、サラ病／シアル酸蓄積症、テイ・サックス／ＧＭ２ガングリオシドーシス、ウォルマン病が挙げられる。
更なる実施形態において、本方法及び材料の使用は、レット症候群、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病などの神経系疾患の治療、又は脊髄及び脳外傷／傷害を含めた神経系傷害、脳卒中、及び脳癌の治療に適応される。一実施形態において、本方法及び材料の使用は、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）の治療に適応される。
ＳＭＡには４種類あり、これらは従来、発症年齢及び最も高い獲得運動機能によって分類されている。いずれの形態のＳＭＡも、常染色体劣性遺伝であり、生存運動ニューロン１（ＳＭＮ１）遺伝子の突然変異によって引き起こされる。ヒトはまた、ＳＭＮ２と呼ばれるＳＭＮ遺伝子の第２のほぼ同一のコピーも保有する。Ｌｅｆｅｂｖｒｅ ｅｔ ａｌ．“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｐｉｎａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｇｅｎｅ．”Ｃｅｌｌ，８０（１）：１５５−６５。Ｍｏｎａｎｉ ｅｔ ａｌ．“Ｓｐｉｎａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ：ａ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ ａ ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ；ａ ｍｏｔｏｒ−ｎｅｕｒｏｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ．”Ｎｅｕｒｏｎ，４８（６）：８８５−８９６。ＳＭＮ１及びＳＭＮ２遺伝子は両方ともにＳＭＮタンパク質を発現するが、ＳＭＮ２はエクソン７に翻訳的にサイレントな突然変異を含み、これがＳＭＮ２転写物におけるエクソン７の取込みを非効率にする。従って、ＳＭＮ２は、完全長ＳＭＮタンパク質及びエクソン７を欠くトランケート型のＳＭＮの両方を、トランケート型を優勢型として産生する。結果として、ＳＭＮ２によって産生される機能性完全長タンパク質の量は、ＳＭＮ１によって産生される量と比べてはるかに（７０〜９０％だけ）少ない。Ｌｏｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．“Ａ ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｉｎ ｔｈｅ ＳＭＮ ｇｅｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ａｎｄ ｉｓ ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ ｓｐｉｎａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ．”ＰＮＡＳ，９６（１１）６３０７−６３１１。Ｍｏｎａｎｉ ｅｔ ａｌ，“Ａ ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｔｈａｔ ａｌｔｅｒｓ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｅｓ ｔｈｅ ＳＭＡ ｇｅｎｅ ＳＭＮ１ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃｏｐｙ ｇｅｎｅ ＳＭＮ２．”Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ８（７）：１１７７−１１８３。ＳＭＮ２はＳＭＮ１遺伝子の損失を完全に補償することはできないが、軽症型のＳＭＡの患者は概してＳＭＮ２コピー数がより高い。Ｌｅｆｅｂｖｒｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｅｖｅｒｉｔｙ ａｎｄ ＳＭＮ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｅｖｅｌ ｉｎ ｓｐｉｎａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ．”Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ １６（３）：２６５−２６９。Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｐｉｎａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ：ｎｅｗ ａｎｄ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｆｒｏｍ ｍｏｄｅｌ ｍｉｃｅ．”Ｃｕｒｒ Ｎｅｕｒｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｐ １０（２）：１０８−１１７。注意すべきは、ＳＭＮ２コピー数が唯一の表現型修飾因子ではないことである。詳細には、ＳＭＮ２遺伝子のエクソン７におけるｃ．８５９Ｇ＞Ｃ変異体が、正の疾患修飾因子と報告されている。この特定の突然変異を有する患者は、重症度の低い疾患表現型を有する。Ｐｒｉｏｒ ｅｔ ａｌ．，“Ａ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｏｆ ｓｐｉｎａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ ｉｎ ｔｈｅ ＳＭＮ２ ｇｅｎｅ．”Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ８５（３）：４０８−４１３。
Ｉ型ＳＭＡ（乳児発症型又はウェルドニッヒ・ホフマン病とも称される）は、出生時に又は６ヵ月齢までにＳＭＡ症状が発現する場合である。この型では、乳児は典型的には、筋緊張が低く（筋緊張低下）、泣声が弱く、及び呼吸窮迫を有する。こうした乳児は多くの場合に嚥下及び吸啜困難を有し、支持なしでの座位保持が可能という発達マイルストーンに到達しない。こうした乳児は多くの場合に、筋緊張低下、運動技能遅滞、定頸不全、円背姿勢及び関節過度可動性から選択されるＳＭＡ症状のうちの１つ以上を示す。典型的には、こうした乳児は、各５番染色体上に１つずつ、２つのコピーのＳＭＮ２遺伝子を有する。全新規ＳＭＡ症例の半数超が、ＳＭＡ Ｉ型である。
ＩＩ型又は中間型ＳＭＡは、その発症が７〜１８ヵ月齢の間で、小児が独力で起立又は歩行できるようになる前であるＳＭＡの場合である。２型ＳＭＡの小児は、概して少なくとも３個のＳＭＮ２遺伝子を有する。遅発型ＳＭＡ（ＩＩＩ型及びＩＶ型ＳＭＡ、軽症型ＳＭＡ、成人発症型ＳＭＡ及びクーゲルバーグ・ウェランダー病としても知られる）は、様々なレベルの脱力を生じる。ＩＩＩ型ＳＭＡは、その発症が１８ヵ月より後であり、小児は独力で起立又は歩行できるが、補助を必要とし得る。ＩＶ型ＳＭＡは、その発症が成人であり、人はその成人期以降に歩行が可能である。ＩＩＩ型又はＩＶ型ＳＭＡの人は、概して４〜８個のＳＭＮ２遺伝子を有し、それらからかなりの量の完全長ＳＭＮタンパク質が産生され得る。
一実施形態において、用語「治療」は、本明細書に開示されるとおりのｒＡＡＶを含む組成物の有効用量、又は有効な複数用量をそれを必要としている動物（ヒトを含む）に静脈内投与するか、又は髄腔内経路によって投与するステップを含む。障害／疾患の発症前にこの用量が投与される場合、投与は予防的である。障害／疾患の発症後にこの用量が投与される場合、投与は治療的である。実施形態において、有効用量は、治療下の障害／疾患状態に関連する少なくとも１つの症状を緩和する（消失させるか、又は低減するかのいずれかの）用量、障害／疾患状態への進行を減速させる又は防止する用量、障害／疾患状態の進行を減速させる又は防止する用量、疾患の程度を減じる用量、疾患の（部分的な又は全面的な）寛解をもたらす用量、及び／又は生存を延長させる用量である。治療に企図される疾患状態の例は、本明細書に示される。
一実施形態において、本開示のｒＡＡＶを含む組成物は、それを必要としているＳＭＡ Ｉ型の患者に静脈内投与される。別の実施形態において、本開示のｒＡＡＶを含む組成物は、それを必要としているＳＭＡ ＩＩ型、ＩＩＩ型、又はＩＶ型の患者に髄腔内投与される。
本明細書には、ＡＡＶ９ウイルスベクターを髄腔内又は静脈内経路によって投与することによる、それを必要としている患者におけるＩ型ＳＭＡの治療方法が開示される。一部の実施形態において、患者は０〜９ヵ月齢である。一部の他の実施形態において、患者は０〜６ヵ月齢である。患者Ｉ型ＳＭＡの治療にウイルスベクターが使用される一部の実施形態では、患者の体重が決定される。一部の実施形態において、患者は８．５ｋｇ未満の体重である。一部の実施形態において、患者は２．６ｋｇ超の体重である。一部の実施形態において、患者は２．６〜８．５ｋｇの体重である。
一部の実施形態において、患者はＳＭＮ１遺伝子の１つのコピーに突然変異、例えばヌル突然変異を有する（コードされるＳＭＮ１を非機能性にする任意の突然変異を包含する）。一部の実施形態において、患者はＳＭＮ１遺伝子の２つのコピーに突然変異、例えばヌル突然変異を有する。一部の実施形態において、患者は、ＳＭＮ１遺伝子の全てのコピーに突然変異、例えばヌル突然変異を有する。一部の実施形態において、患者はＳＭＮ１遺伝子の１つのコピーに欠失を有する。一部の実施形態において、患者はＳＭＮ１遺伝子の２つのコピーに欠失を有する。一部の実施形態において、患者は両アレル性ＳＭＮ１突然変異を有し、即ち、染色体の両方のアレルにＳＭＮ１の欠失又は置換のいずれかを有する。一部の実施形態において、患者はＳＭＮ２遺伝子の機能性コピーを少なくとも１つ有する。一部の実施形態において、患者はＳＭＮ２遺伝子の機能性コピーを少なくとも２つ有する。一部の実施形態において、患者はＳＭＮ２遺伝子の機能性コピーを少なくとも２つ有する。一部の実施形態において、患者はＳＭＮ２遺伝子の機能性コピーを少なくとも３つ有する。一部の実施形態において、患者はＳＭＮ２遺伝子の機能性コピーを少なくとも４つ有する。一部の実施形態において、患者はＳＭＮ２遺伝子の機能性コピーを少なくとも５つ有する。一部の実施形態において、患者はＳＭＮ２遺伝子の少なくとも１つのコピーのエクソン７にｃ．８５９Ｇ＞Ｃ置換を有しない。一部の実施形態において、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２遺伝子の遺伝子配列は、全ゲノムシーケンシングによって決定されてもよい。他の実施形態において、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２遺伝子の遺伝子配列及びコピー数は、ハイスループットシーケンシングによって決定されてもよい。一部の実施形態において、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２遺伝子の遺伝子配列及びコピー数は、マイクロアレイ解析によって決定されてもよい。一部の実施形態において、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２遺伝子の遺伝子配列及びコピー数は、サンガーシーケンシングによって決定されてもよい。一部の実施形態において、ＳＭＮ１又はＳＭＮ２遺伝子のコピー数は、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によって決定されてもよい。
一部の実施形態において、患者は１つ以上のＳＭＡ症状を示す。ＳＭＡ症状には、筋緊張低下、運動技能遅滞、定頸不全、円背姿勢及び関節過度可動性が含まれ得る。一部の実施形態において、定頸不全は、肩（前面及び背面）を支えながら患者にあぐら座位をとらせることにより決定される。定頸は、患者が上体を起こした状態を保持する能力によって評価される。一部の実施形態において、患者が仰臥位にあるときの自発運動が観察され、患者が肘、膝、手及び足を表面から持ち上げる能力によって運動技能が評価される。一部の実施形態において、患者の握力は、患者の手掌に指を入れ、患者をその肩が表面から浮くまで引き上げることにより測定される。筋緊張低下及び握力は、患者がどれだけ早く／長く把握を維持するかによって測定される。一部の実施形態において、定頸は、患者の頭部を最大限可能なまで回旋させておき、患者が頭部を正中線に向かって戻す能力を測定することにより評価される。一部の実施形態において、肩の姿勢は、頭部及び体幹を支えながら患者を座らせ、腕の長さだけ離れたところにある肩の高さの刺激物を取ろうと患者が肘又は肩を屈曲させて手を伸ばすかどうかを観察することにより評価されてもよい。一部の実施形態において、肩の姿勢はまた、患者に側臥位をとらせ、腕の長さだけ離れたところにある肩の高さの刺激物を取ろうと患者が肘又は肩を屈曲させて手を伸ばすかどうかを観察することにより評価されてもよい。一部の実施形態において、運動技能は、患者の足を撫でたとき、くすぐったとき又はつねったときに患者がその股関節部又は膝を屈曲させるかどうかを観察することにより評価される。一部の実施形態において、公知の臨床尺度、例えばＣＨＯＰ ＩＮＴＥＮＤにより、肩屈曲、肘屈曲、股関節の内転、頸部屈曲、頭部伸展、頸部伸展、及び／又は脊柱の内屈が評価されてもよい。公知の臨床尺度、例えばＣＨＯＰ ＩＮＴＥＮＤに基づき他のＳＭＡ症状が判定されてもよい。
一部の実施形態において、患者は、本明細書に記載される検査のうちの１つを用いて決定されるとおりの、Ｉ型ＳＭＡの症状（例えば、１つ以上の症状）を示した後に治療される。一部の実施形態において、患者は、Ｉ型ＳＭＡの症状を示す前に治療される。一部の実施形態において、患者は、症候性となる前に、遺伝子検査に基づきＩ型ＳＭＡと診断される。
本明細書では、併用療法もまた企図される。併用は、本明細書で使用されるとき、同時に行われる治療又は逐次的に行われる治療のいずれも含む。方法の併用には、特定の標準的医学治療（例えば、ＡＬＳにおけるリルゾール）の追加が、新規療法との併用と同じく含まれ得る。例えば、他のＳＭＡ療法には、プレｍＲＮＡに改変・結合してそのスプライシングパターンを改変するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）が含まれる。Ｓｉｎｇｈ．ｅｔ ａｌ．，“Ａ ｍｕｌｔｉ−ｅｘｏｎ−ｓｋｉｐｐｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｒｅｖｅａｌｓ ｓｕｒｐｒｉｓｉｎｇ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｓｐｌｉｃｅ ｉｓｏｆｏｒｍｓ ｏｆ ｓｐｉｎａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ ｇｅｎｅｓ．”Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ，７（１１）：ｅ４９５９５。一実施形態において、ヌシネルセン（米国特許第８，３６１，９７７号明細書及び同第８，９８０，８５３号明細書（参照により本明細書に援用される））が使用されてもよい。ヌシネルセンは、ＳＭＮ２プレｍＲＮＡのイントロン６、エクソン７又はイントロン７を標的とする承認済みのＡＳＯであり、完全長ＳＭＮタンパク質が一層効率的に産生されるようにＳＭＮ２のスプライシングを調節する。一部の実施形態において、ＡＡＶ９ウイルスベクターを含む治療方法は、筋エンハンサーと併用して投与される。一部の実施形態において、ＡＡＶ９ウイルスベクターを含む治療方法は、神経保護剤と併用して投与される。一部の実施形態において、ＡＡＶ９ウイルスベクターを含む治療方法は、ＳＭＮを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドベースの薬物と併用して投与される。一部の実施形態において、ＡＡＶ９ウイルスベクターを含む治療方法は、ヌシネルセンと併用して投与される。一部の実施形態において、ＡＡＶ９ウイルスベクターを含む治療方法は、ミオスタチン阻害薬と併用して投与される。一部の実施形態において、ＡＡＶ９ウイルスベクターを含む治療方法は、スタムルマブと併用して投与される。
それを必要としている出生後の個体への送達が企図されるが、胎児への子宮内送達もまた企図される。
ウイルスベクターを含む医薬組成物を使用したＩ型ＳＭＡ患者の治療方法が企図される。一部の実施形態において、ウイルスベクターは約１〜８×１０１３ＡＡＶ９ウイルスベクターゲノム／ｍＬ（ｖｇ／ｍＬ）の濃度で製剤化される。一部の実施形態において、ウイルスベクターは約１．７〜２．３×１０１３ｖｇ／ｍＬの濃度で製剤化される。一部の実施形態において、ウイルスベクターは約１．９〜２．１×１０１３ｖｇ／ｍＬの濃度で製剤化される。一部の実施形態において、ウイルスベクターは約２．０×１０１３ｖｇ／ｍＬの濃度で製剤化される。
患者のＩ型ＳＭＡの治療にウイルスベクターが使用される一部の実施形態において、ＡＡＶウイルスベクター（例えばＡＡＶ ＳＭＮ）は約１．０〜２．５×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で患者に投与される。患者のＩ型ＳＭＡの治療にウイルスベクターが使用される一部の実施形態において、ＡＡＶウイルスベクターは約１．１×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で患者に投与される。患者のＩ型ＳＭＡの治療にウイルスベクターが使用される一部の実施形態において、ＡＡＶウイルスベクターは約４５〜７０分かけて患者に注入される。患者のＩ型ＳＭＡの治療にウイルスベクターが使用される一部の実施形態において、ＡＡＶウイルスベクターは約６０分かけて患者に注入される。患者のＩ型ＳＭＡの治療にウイルスベクターが使用される一部の実施形態において、ＡＡＶウイルスベクターは、輸液ポンプ、蠕動ポンプ又は当該技術分野において公知の任意の他の機器を使用して患者に注入される。患者のＩ型ＳＭＡの治療にウイルスベクターが使用される一部の実施形態において、ＡＡＶウイルスベクターはシリンジポンプを使用して患者に注入される。
投与されるｒＡＡＶウイルスベクターの力価は、例えば、詳細なｒＡＡＶ、投与方法、治療目標、個体、及び標的とされる１つ又は複数の細胞型に応じて変わることになり、当該技術分野において標準的な方法によって決定されてもよい。ｒＡＡＶの力価は、１ｍｌ当たり約１×１０６、約１×１０７、約１×１０８、約１×１０９、約１×１０１０、約１×１０１１、約１×１０１２、約１×１０１３、約１×１０１４、又はそれ以上のＤＮアーゼ耐性粒子（ＤＲＰ）の範囲であり得る。投薬量はまた、ベクターゲノム（ｖｇ）の単位で表されてもよい。ゲノム力価は、本願、Ｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．に記載されるとおりのｄｄＰＣＲ、又は当該技術分野において公知の任意の他の方法を用いて決定することができる。
投薬量はまた、ヒトへの投与タイミングに基づき変わり得る。ｒＡＡＶのこれらの投薬量は、成人では約１×１０１１ｖｇ／ｋｇ、約１×１０１２ｖｇ／ｋｇ、約１×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約１×１０１４ｖｇ／ｋｇ、約１×１０１５ｖｇ／ｋｇ、約１×１０１６ｖｇ／ｋｇ、又はそれ以上の体重１キログラム当たりのベクターゲノムの範囲であり得る。新生児については、ｒＡＡＶの投薬量は、約１×１０１１ｖｇ／ｋｇ、約１×１０１２ｖｇ／ｋｇ、約３×１０１２ｖｇ／ｋｇ、約１×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約３×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約１×１０１４ｖｇ／ｋｇ、約３×１０１４ｖｇ／ｋｇ、約１×１０１５ｖｇ／ｋｇ、約３×１０１５ｖｇ／ｋｇ、約１×１０１６ｖｇ／ｋｇ、約３×１０１６ｖｇ／ｋｇ、又はそれ以上の体重１キログラム当たりのベクターゲノムの範囲であり得る。
投薬量はまた、ヒトへの投与タイミングに基づき変わり得る。ｒＡＡＶのこれらの投薬量は、成人で約１×１０１１ｖｇ／ｋｇ／週、約１×１０１２ｖｇ／ｋｇ／週、約１×１０１３ｖｇ／ｋｇ／週、約１×１０１４ｖｇ／ｋｇ／週、約１×１０１５ｖｇ／ｋｇ／週、約１×１０１６ｖｇ／ｋｇ／週、又はそれ以上の体重１キログラム当たりのベクターゲノムの範囲であり得る。新生児については、ｒＡＡＶの投薬量は、約１×１０１１ｖｇ／ｋｇ／週、約１×１０１２ｖｇ／ｋｇ／週、約３×１０１２ｖｇ／ｋｇ／週、約１×１０１３ｖｇ／ｋｇ／週、約３×１０１３ｖｇ／ｋｇ／週、約１×１０１４ｖｇ／ｋｇ／週、約３×１０１４ｖｇ／ｋｇ／週、約１×１０１５ｖｇ／ｋｇ／週、約３×１０１５ｖｇ／ｋｇ／週、約１×１０１６ｖｇ／ｋｇ／週、約３×１０１６ｖｇ／ｋｇ／週、又はそれ以上の１週間体重１キログラム当たりのベクターゲノムの範囲であり得る。成人で１×１０１１ｖｇ／１．５ｋｇ／週、約１×１０１２ｖｇ／１．５ｋｇ／週、約１×１０１３ｖｇ／１．５ｋｇ／週、約１×１０１４ｖｇ／１．５ｋｇ／週、約１×１０１５ｖｇ／１．５ｋｇ／週、約１×１０１６ｖｇ／１．５ｋｇ／週、又はそれ以上の体重１キログラム当たりのベクターゲノムのｒＡＡＶの投薬量。新生児については、ｒＡＡＶの投薬量は、約１×１０１１ｖｇ／１．５ｋｇ／週、約１×１０１２ｖｇ／１．５ｋｇ／週、約３×１０１２ｖｇ／ｋｇ／週、約１×１０１３ｖｇ／１．５ｋｇ／週、約３×１０１３ｖｇ／１．５ｋｇ／週、約１×１０１４ｖｇ／１．５ｋｇ／週、約３×１０１４ｖｇ／１．５ｋｇ／週、約１×１０１５ｖｇ／１．５ｋｇ／週、約３×１０１５ｖｇ／１．５ｋｇ／週、約１×１０１６ｖｇ／１．５ｋｇ／週、約３×１０１６ｖｇ／１．５ｋｇ／週、又はそれ以上の１週間体重１．５キログラム当たりのベクターゲノムの範囲であり得る。
ある実施形態において、用量は、患者体重１ｋｇ当たり約１．１×１０１４ベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）である。ある実施形態において、５ｋｇの患者であれば、０．５×１０１４〜５．０×１０１４ベクターゲノムの総用量を受けることになる。ある実施形態において、ウイルスベクターはトリス緩衝生理食塩水中に入れて投与される。ある実施形態において、ウイルスベクターは、約５〜２０ｍＬ／ｋｇ、約１０〜２０ｍＬ／ｋｇ、又は約５．５〜６．５ｍＬ／ｋｇのトリス緩衝生理食塩水中に入れて投与される。
用量は、幾つもの標準的な方法で決定することができる。ウイルスベクターに特異的なプライマーによるＰＣＲは相対測定を提供できるが、より少量のサンプル及び絶対測定にはｑＰＣＲが用いられ得る。ｄｄＰＣＲは、水−油エマルション滴技術をベースとするデジタルＰＣＲの実施方法である。Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ ｈｉｔｓ ｉｔｓ ｓｔｒｉｄｅ．”Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，９（６）：５４１−５４４。Ｓｙｋｅｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｔａｒｇｅｔｓ ｆｏｒ ＰＣＲ ｂｙ ｕｓｅ ｏｆ ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｄｉｌｕｔｉｏｎ．”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１３（３）４４４−４４９。サンプルが数万個の液滴に分割され、各個別の液滴で鋳型分子のＰＣＲ増幅が行われる。検量線を作成したり、又は高い増幅効率のプライマーを有したりする必要がないため、ｄｄＰＣＲは典型的には、従来のＰＣＲベースの技法ほど多くのサンプルを使用しない。市販のｄｄＰＣＲ機の例としては、限定はされないが、ＢｉｏＲａｄ ＱＸ１００ ｄｄＰＣＲ及びＲａｉｎＤａｎｃｅ Ｒａｉｎｄｒｏｐ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲが挙げられる。一実施形態において、用量はＰＣＲを用いて決定される。別の実施形態において、用量はｑＰＣＲを用いて決定される。別の実施形態において、用量はデジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を用いて決定される。一部の実施形態において、ＰＣＲベースの方法は、ＳＭＮ遺伝子を標的とする特異的に設計されたプライマー及びプローブを使用してカプシド化ＡＡＶ９ウイルスゲノムを検出及び定量化する。他の実施形態において、ＰＣＲベースの方法は、ニワトリβ−アクチンプロモーターを標的とする特異的に設計されたプライマー及びプローブを使用してカプシド化ＡＡＶ９ウイルスゲノムを検出及び定量化する。他の実施形態において、ＰＣＲベースの方法は、ＣＭＶエンハンサーを標的とする特異的に設計されたプライマー及びプローブを使用してカプシド化ＡＡＶ９ウイルスゲノムを検出及び定量化する。他の実施形態において、ＰＣＲベースの方法は、ＩＴＲ配列を標的とする特異的に設計されたプライマー及びプローブを使用してカプシド化ＡＡＶ９ウイルスゲノムを検出及び定量化する。他の実施形態において、ＰＣＲベースの方法は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを標的とする特異的に設計されたプライマー及びプローブを使用してカプシド化ＡＡＶ９ウイルスゲノムを検出及び定量化する。
一態様において、２．０×１０１３ｖｇ／ｍｌを薬物製品の目標濃度として用いて、以下の表に従い用量が投与される。
一部の実施形態において、ＡＡＶウイルスベクターを含む医薬組成物は約２０〜７０分、例えば約４５〜７０分かけて患者に注入される。一部の実施形態において、ＡＡＶウイルスベクターを含む医薬組成物は約６０分かけて患者に注入される。一部の実施形態において、ＡＡＶウイルスベクターを含む医薬組成物は、輸液ポンプ、蠕動ポンプ又は当該技術分野において公知の任意の他の機器を使用して患者に注入される。一部の実施形態において、ＡＡＶウイルスベクターを含む医薬組成物はシリンジポンプを使用して患者に注入される。
治療に適している患者のプレスクリーニング、並びに本明細書に（ｈｅｒｉｅｎ）開示される判定基準により同定された患者への治療の投与もまた企図される。ＡＡＶは、細胞性及び体液性の両方の免疫応答を生じさせ得る。結果として、ＡＡＶベースの遺伝子療法に対する潜在的患者の一部は、ＡＡＶに対する既存の抗体を持っている。Ｊｅｕｎｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｅ−ｅｘｉｓｔｉｎｇ ａｎｔｉ−Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｓ ａ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｉｎ ＡＡＶ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．”Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２４（２）：５９−６７。Ｂｏｕｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ ｓｅｒｕｍ ＩｇＧ ａｎｄ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ ａｇａｉｎｓｔ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）ｔｙｐｅｓ １，２，５，６，８，ａｎｄ ９ ｉｎ ｔｈｅ ｈｅａｌｔｈｙ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｕｓｉｎｇ ＡＡＶ ｖｅｃｔｏｒｓ．”Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，２１：７０４−７１２。極めて低いレベルの抗体であっても形質導入の成功を妨げ得るため、先行する抗ＡＡＶ抗体は、ＡＡＶ遺伝子療法の普遍的適用への深刻な障害となる。一部の実施形態において、ＡＡＶウイルスベクターの投与前に患者の抗ＡＡＶ９抗体力価のレベルが決定される。一部の実施形態において、患者の抗ＡＡＶ９抗体力価のレベルは、ＥＬＩＳＡ結合イムノアッセイによって決定される。一部の実施形態において、患者は、治療の投与前にＥＬＩＳＡ結合イムノアッセイによって決定したとき１：１００以下の抗ＡＡＶ９抗体力価を有する。一部の実施形態において、患者は、治療の投与前にＥＬＩＳＡ結合イムノアッセイによって決定したとき１：５０以下の抗ＡＡＶ９抗体力価を有する。一部の実施形態において、患者は、治療後にＥＬＩＳＡ結合イムノアッセイによって決定したとき１：１００を上回る抗ＡＡＶ９抗体力価を有し、１〜８週間にわたって、又は力価が１：１００未満に低下するまでモニタされる。一部の実施形態において、患者は、治療後にＥＬＩＳＡ結合イムノアッセイによって決定したとき１：１００を上回る抗ＡＡＶ９抗体力価を有し、１〜８週間にわたって、又は力価が１：５０未満に低下するまでモニタされる。
高い抗ＡＡＶ抗体力価を解消する一つの手法は、免疫抑制薬の使用である。シクロスポリンＡとの併用でのモノクローナル抗ＣＤ２０抗体リツキシマブは、抗ＡＡＶ力価を下げるのに有効であることが示されている。Ｍｉｎｇｏｚｚｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍｏｒａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ ａ ｎｏｎｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ＡＡＶ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｆｏｒ ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ Ｂ．”Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，２０：１４１０−１４１６。別の手法は、ベクター投与前に中和抗体を枯渇させるためのプラスマフェレーシスの使用である。Ｍｏｎｔｅｉｌｈｅｔ ｅｔ ａｌ．，“Ａ １０ ｐａｔｉｅｎｔ ｃａｓｅ ｒｅｐｏｒｔ ｏｎ ｔｈｅ ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｐｌａｓｍａｐｈｅｒｅｓｉｓ ｕｐｏｎ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ ａｇａｉｎｓｔ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）ｔｙｐｅｓ １，２，６，ａｎｄ ８．”Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，１９（１１）：２０８４−２０９１。プラスマフェレーシスでは、患者から血液が抜き取られ、血漿及び血液細胞が遠心又は中空糸ろ過のいずれかによって分離される。次に血液細胞が処理済みの血漿又は生理食塩水中４．５％ヒトアルブミンなどの補液のいずれかと共に患者に戻される。治療的アフェレーシスの一般的な用途は、望ましくない免疫グロブリンの除去であるが、この場合、プラスマフェレーシスは、抗ＡＡＶ抗体を枯渇させるための魅力的な手法に相当する。一部の実施形態において、患者は、治療前又は治療後にＥＬＩＳＡ結合イムノアッセイによって決定したとき１：１００を上回る抗ＡＡＶ９抗体力価を有し、プラスマフェレーシスで処置される。一部の実施形態において、患者は、治療前又は治療後にＥＬＩＳＡ結合イムノアッセイによって決定したとき１：５０を上回る抗ＡＡＶ９抗体力価を有し、プラスマフェレーシスで処置される。
ＡＡＶ９に対する既存の母体抗体は、母乳又は子宮内での経胎盤移行によって乳児患者に移行し得る。一部の実施形態において、患者は、治療前又は治療後にＥＬＩＳＡ結合イムノアッセイによって決定したとき１：１００を上回る抗ＡＡＶ９抗体力価を有し、人工栄養に切り換えられる。一部の実施形態において、患者は、治療前又は治療後にＥＬＩＳＡ結合イムノアッセイによって決定したとき１：５０を上回る抗ＡＡＶ９抗体力価を有し、人工栄養に切り換えられる。
治療の投与前及び投与後には、患者の状態がモニタされ得る。ＡＡＶベースの治療を受けた患者の一部は血小板減少症を起こしており、これは、低血小板数によって特徴付けられる状態である。血小板減少症は、血球計算器で希釈血液サンプルを使用して全血球数によって検出することができる。血小板減少症はまた、患者の血液（薄層塗抹標本又は末梢血スメア）で調製したスライドを顕微鏡下で観察することによっても検出することができる。正常ヒト血小板数は１５０，０００細胞／ｍｌ〜約４５０，０００細胞／ｍｌの範囲である。
一部の実施形態において、患者は投与前に約６７，０００細胞／ｍｌ超の血小板数を有し、又は約１００，０００細胞／ｍｌ超、又は約１５０，０００細胞／ｍｌ超を有する。一部の実施形態において、患者は投与前に約１５０，０００細胞／ｍｌ未満の血小板数を有し、又は約１００，０００細胞／ｍｌ未満、又は約６７，０００細胞／ｍｌ未満を有し、１〜８週間にわたって、又は血小板数が約６７，０００細胞／ｍｌ超、又は約１００，０００細胞／ｍｌ超、又は約１５０，０００細胞／ｍｌ超に増加するまでモニタされる。ウイルスベクターの投与後の血小板数が約６７，０００細胞／ｍｌ未満である一部の実施形態において、患者は血小板輸血で治療されてもよい。一部の実施形態において、患者はウイルスベクターの投与前に血小板減少症を有しない。一部の実施形態において、患者はウイルスベクターの投与後に血小板減少症を有し、約１〜８週間にわたって、又は患者が血小板減少症を有しなくなるまでモニタされる。一部の実施形態において、患者はウイルスベクターの投与後に血小板減少症を有し、血小板輸血で治療される。
患者の状態のモニタリングはまた、血小板、血清タンパク質電気泳動、血清γグルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）及びアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、総ビリルビン、グルコース、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）、クレアチニン、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、電解質、アルカリホスファターゼ及びアミラーゼのレベルを測定する標準的な血液検査も伴い得る。トロポニンＩレベルは心臓の健康の一般的な尺度であり、レベルの上昇は心臓の損傷又は心臓関連病態を反映する。一部の実施形態において、トロポニン−Ｉレベルはウイルスベクターの投与後にモニタされる。一部の実施形態において、患者はウイルスベクターの投与前に約０．３、０．２、０．１５、又は０．１μｇ／ｍｌ未満のトロポニン−Ｉレベルを有し得る。一部の実施形態において、患者はウイルスベクターの投与前に約０．１７６μｇ／ｍｌ未満のトロポニン−レベルを有し得る。一部の実施形態において、患者はウイルスベクターの投与後に約０．１７６μｇ／ｍｌ超のトロポニン−レベルを有し得る。一部の実施形態において、患者はウイルスベクターの投与後にトロポニン−Ｉレベルが約０．１７６μｇ／ｍｌ未満になるまで心モニタリングを受ける。
アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）及びアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及び総ビリルビンは肝機能の一般的な尺度であり、一方、クレアチニンは腎機能を追う。ＡＳＴ、ＡＬＴ又は総ビリルビンのレベルの上昇は、肝機能不全を指示し得る。一部の実施形態において、患者はウイルスベクターの投与前に正常な肝機能を有する。一部の実施形態において、患者はウイルスベクターの投与前に約８〜４０Ｕ／Ｌ未満の肝トランスアミナーゼレベルを有する。一部の実施形態において、患者はウイルスベクターの投与前に約８〜４０Ｕ／Ｌ未満のＡＳＴ又はＡＬＴレベルを有する。一部の実施形態において、患者はウイルスベクターの投与前に３．０ｍｇ／ｄＬ未満のビリルビンレベルを有する。一部の実施形態において、患者はウイルスベクターの投与前に１．８ｍｇ／ｄＬ未満のクレアチニンレベルを有する。一部の実施形態において、患者はウイルスベクターの投与前に８〜１８ｇ／ｄＬのヘモグロビン（Ｈｇｂ）レベルを有する。一部の実施形態において、患者はウイルスベクターの投与前に２００００／ｍｍ３未満の白血球（ＷＢＣ）数を有する。
治療方法の有効性は、治療前及び治療後に種々の運動技能検査を用いて決定されてもよい。詳細には、Ｉ型ＳＭＡ患者の運動技能を判定するため、フィラデルフィア小児病院乳児神経筋疾患検査（Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ Ｉｎｆａｎｔ Ｔｅｓｔ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ：ＣＨＯＰ ＩＮＴＥＮＤ）が開発された。Ｇｌａｎｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ Ｉｎｆａｎｔ Ｔｅｓｔ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ（ＣＨＯＰ ＩＮＴＥＮＤ）：Ｔｅｓｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙ．”Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，２０（３）：１５５−１６１。ＣＨＯＰ ＩＮＴＥＮＤ検査は、平均年齢１１．５ヵ月（１．４〜３７．９ヵ月）の２６人のＩ型ＳＭＡ乳児についての乳児運動能力検査（Ｔｅｓｔ ｏｆ Ｉｎｆａｎｔ Ｍｏｔｏｒ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ：ＴＩＭＰ）及び新たに考案されたＳＭＡの運動評価であるフィラデルフィア小児病院ＳＭＡ強度検査（Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ Ｔｅｓｔ ｏｆ Ｓｔｒｅｎｇｔｈ ｉｎ ＳＭＡ：ＣＨＯＰ ＴＯＳＳ）による判定を受けて開発された。治療有効性の検査はＣＨＯＰ ＩＮＴＥＮＤ検査に限定されず、限定はされないが、ＴＩＭＰ、ＣＨＯＰ ＴＯＳＳ、ピーボディ発達運動尺度（Ｐｅａｂｏｄｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｍｏｔｏｒ Ｓｃａｌｅｓ）、ブラゼルトン新生児行動評価（Ｂｒａｚｅｌｔｏｎ Ｎｅｏｎａｔａｌ Ｂｅｈａｖｉｏｒ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）検査、運動マイルストーン発達調査（Ｍｏｔｏｒ Ｍｉｌｅｓｔｏｎｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｓｕｒｖｅｙ）、インタラクティブビデオ判定によって捉えた能力（Ａｂｉｌｉｔｙ Ｃａｐｔｕｒｅｄ Ｔｈｒｏｕｇｈ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ Ｖｉｄｅｏ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ：ＡＣＴＩＶＥ）、ベイリー乳幼児発達尺度（Ｂａｙｌｅｙ Ｓｃａｌｅ ｏｆ Ｉｎｆａｎｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）及び複合運動活動電位（ＣＭＡＰ）測定を含め、当該技術分野において公知の他の運動技能検査もまた含まれ得る。
一部の実施形態では、ＣＨＯＰ ＩＮＴＥＮＤ尺度を用いて治療前ベースライン検査が実施される。一実施形態において、治療の有効性は、フォローアップビジットの間にＣＨＯＰ ＩＮＴＥＮＤ尺度を用いて決定される。一部の実施形態において、ＣＨＯＰ ＩＮＴＥＮＤは、定頸、立ち直り反射、支持ありでの座位、仰臥位及び腹臥位における体幹運動の尺度を含む。一部の実施形態において、ＣＨＯＰ ＩＮＴＥＮＤは、補助しながらの寝返り動作時、腹位懸垂及び支持ありでの立位における抗重力運動の尺度を含む。
ＡＡＶベクターが関わる多くの遺伝子療法研究では、ＡＡＶベクターに対する抗原特異的Ｔ細胞応答が観察されており、これは遺伝子導入後２〜４週間と予想し得る。かかる抗原特異的Ｔ細胞応答の一つの可能性のある帰結は、形質導入細胞のクリアランス及びトランス遺伝子の発現欠損である。ＡＡＶベースの療法に対する宿主免疫応答を弱めるため、患者に免疫抑制薬が与えられてもよい。一部の実施形態において、患者にはウイルスベクターの投与前にグルココルチコイドが与えられてもよい。一部の実施形態において、患者にはウイルスベクターの投与前にコルチコステロイドが与えられてもよい。一部の実施形態において、患者にはウイルスベクターの投与前に経口ステロイド薬が与えられてもよい。経口ステロイド薬の例としては、限定はされないが、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロン、ベタメタゾン（ｂｅｔｈａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、デキサメタゾン及びヒドロコルチゾンが挙げられる。一部の実施形態において、経口ステロイド薬はプレドニゾロンである、又はそれを含む。一部の実施形態において、患者はウイルスベクター投与の少なくとも２４時間前に予防的ステロイド薬を開始する。一部の実施形態において、患者には経口ステロイド薬がウイルスベクター投与後少なくとも３０日間にわたって与えられる。一部の実施形態において、経口ステロイド薬は１日１回投与される。一部の実施形態において、経口ステロイド薬は１日２回投与される。一部の実施形態において、経口ステロイド薬は約０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ、例えば約１ｍｇ／ｋｇの用量で与えられる。一部の実施形態において、経口ステロイド薬は約０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、例えば約１ｍｇ／ｋｇ／日の用量で与えられる。一部の実施形態において、ウイルスベクターの投与後にＡＳＴ及びＡＬＴのレベルがモニタされる。かかる実施形態において、経口ステロイド薬治療は、ＡＳＴ及びＡＬＴレベルが例えば臨床標準及び当該技術分野において公知の方法により決定したときの正常上限の２倍、又は約１２０ＩＵ／Ｌを超えたときに投与される。一部の実施形態において、経口ステロイド薬治療は、ＡＳＴ及びＡＬＴレベルが例えば臨床標準及び当該技術分野において公知の方法により決定したときの正常上限の２倍、又は約１２０ＩＵ／Ｌを超えている限り、３０日超にわたって投与される。コルチコステロイドによる持続的治療の間、副腎のコルチゾール産生が自然に低下する。コルチコステロイド治療を急に中止すると、体がコルチゾール欠乏を来し得る。経口ステロイド薬が患者に少なくとも３０日間与えられる一部の実施形態において、ステロイド用量はスケジュールに沿って徐々に漸減される。一部の実施形態において、経口ステロイド薬用量は、ＡＳＴ及びＡＬＴレベルが例えば臨床標準及び当該技術分野において公知の方法により決定したときの正常上限の２倍、又は約１２０ＩＵ／Ｌを下回ったとき、漸減される。一部の実施形態において、漸減は、２週間にわたって０．５ｍｇ／ｋｇ／日、それに続き更に２週間にわたって０．２５ｍｇ／ｋｇ／日に段階的に減らすことを含む。一部の他の実施形態において、経口ステロイド薬の漸減は医師の裁量により行われる。
キット
本明細書における開示はまた、それを必要としている患者におけるＳＭＡの治療用キットも提供し、ここで本キットは、本明細書に開示されるＳＭＮポリヌクレオチドを含むウイルスベクターの有効な量又は用量を含む医薬組成物の１用量以上を含み、ＳＭＡの型（本明細書に更に開示されるとおり）に応じて、本キットは、造影剤（−例えば、ｏｍｎｉｐａｑｕｅ １８０）、並びに医薬調製物又は組成物及び造影剤の使用方法に関する説明書を更に含む。
一部の実施形態において、本キットは、ウイルスベクター医薬組成物のバイアルを含む。一部の実施形態において、ウイルスベクター医薬組成物は約１．７〜２．３×１０１３ｖｇ／ｍＬの濃度である。一部の実施形態において、ウイルスベクター医薬組成物は約１．９〜２．１×１０１３ｖｇ／ｍＬの濃度である。一部の実施形態において、ウイルスベクター医薬組成物は約２．０×１０１３ｖｇ／ｍＬの濃度である。一部の実施形態において、バイアルは約５．９ｍＬのウイルスベクター医薬組成物を含む。一部の実施形態において、バイアルは約８．７ｍＬのウイルスベクター医薬組成物を含む。一部の実施形態において、本キットは、５．９ｍＬバイアルを含まないか、少なくとも１本の５．９ｍＬバイアル、少なくとも２本の５．９ｍＬバイアル又は少なくとも３本の５．９ｍＬバイアルを含む。一部の実施形態において、本キットは、８．７ｍＬバイアルを含まないか、少なくとも１本の８．７ｍＬバイアル、少なくとも２本の８．７ｍＬバイアル、少なくとも３本の８．７ｍＬバイアル、少なくとも４本の８．７ｍＬバイアル、少なくとも５本の８．７ｍＬバイアル、少なくとも６本の８．７ｍＬバイアルを含む。
本キットが患者のＩ型ＳＭＡの治療に使用される一部の実施形態では、患者の体重が決定される。本キットが患者のＩ型ＳＭＡの治療に使用される一部の実施形態において、患者の体重は少なくとも約２．６ｋｇである。本キットが患者のＩ型ＳＭＡの治療に使用される一部の実施形態において、患者の体重は約８．５ｋｇ以下である。本キットが患者のＩ型ＳＭＡの治療に使用される一部の実施形態において、患者の体重は約２．６〜８．５ｋｇである。本キットが患者のＩ型ＳＭＡの治療に使用される一部の実施形態では、キット内のバイアルからのＡＡＶウイルスベクターが患者に投与される。本キットが患者のＩ型ＳＭＡの治療に使用される一部の実施形態において、キット内のバイアルからのＡＡＶウイルスベクターは約１．０〜２．５×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で患者に投与される。本キットが患者のＩ型ＳＭＡの治療に使用される一部の実施形態において、キット内のバイアルからのＡＡＶウイルスベクターは約１．１×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で患者に投与される。本キットが患者のＩ型ＳＭＡの治療に使用される一部の実施形態において、キット内のバイアルからのＡＡＶウイルスベクターは約４５〜７０分かけて患者に注入される。本キットが患者のＩ型ＳＭＡの治療に使用される一部の実施形態において、キット内のバイアルからのＡＡＶウイルスベクターは約６０分かけて患者に注入される。本キットが患者のＩ型ＳＭＡの治療に使用される一部の実施形態において、キット内のバイアルからのＡＡＶウイルスベクターは、輸液ポンプ、蠕動ポンプ又は当該技術分野において公知の任意の他の機器を使用して患者に注入される。本キットが患者のＩ型ＳＭＡの治療に使用される一部の実施形態において、キット内のバイアルからのＡＡＶウイルスベクターはシリンジポンプを使用して患者に注入される。
一実施形態において、ベクターは静脈内又は髄腔内投与される。一実施形態において、ベクターは静脈内投与される。一実施形態において、ベクターはｏｍｎｉｐａｑｕｅ １８０と共に静脈内投与される。別の実施形態において、ベクターはｏｍｎｉｐａｑｕｅ １８０と共に髄腔内投与される。
別の態様において、本明細書では、ｒＡＡＶで患者の標的細胞（限定はされないが、神経又はグリア細胞を含む）に形質導入する方法が企図される。
本明細書に開示されるｒＡＡＶで患者の細胞に形質導入すると、ｒＡＡＶによってコードされるポリペプチド又はＲＮＡの持続発現が起こり得る。従って本開示は、ｒＡＡＶ（例えば、ＳＭＮタンパク質をコードする）を動物又はヒト患者に投与／送達する方法を提供する。このような方法は、１つ以上のｒＡＡＶで神経及び／又はグリア細胞に形質導入することを含む。形質導入は、組織特異的調節エレメントを含む遺伝子カセットで行われてもよい。例えば、ニューロン内での特異的発現又はアストロサイトでの特異的発現を可能にするプロモーター。例としては、ニューロン特異的エノラーゼ及びグリア線維性酸性タンパク質プロモーターが挙げられる。摂取された薬物の制御下にある誘導性プロモーターもまた開発されてもよい。
一部の態様において、本開示のベクターを本明細書に記載されるとおりの造影剤と組み合わせて使用したとき、造影剤と組み合わせて使用しないときの本開示のベクターの形質導入と比べて細胞の形質導入は増加することが企図される。様々な実施形態において、本開示のベクターを本明細書に記載されるとおりの造影剤と組み合わせて使用したとき、造影剤と組み合わせて使用しないときの本開示のベクターの形質導入と比べて細胞の形質導入は少なくとも約１％、又は少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１２０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、少なくとも約３００％、少なくとも約３５０％、少なくとも約４００％、少なくとも約４５０％、少なくとも約５００％又はそれ以上増加する。更なる実施形態において、細胞の形質導入は、本開示のベクターを本明細書に記載されるとおりの造影剤と組み合わせて使用したとき、造影剤と組み合わせて使用しないときの本開示のベクターの形質導入と比べて約１０％〜約５０％、又は約１０％〜約１００％、又は約５％〜約１０％、又は約５％〜約５０％、又は約１％〜約５００％、又は約１０％〜約２００％、又は約１０％〜約３００％、又は約１０％〜約４００％、又は約１００％〜約５００％、又は約１５０％〜約３００％、又は約２００％〜約５００％増加する。
本開示はまた、本開示のベクター及び造影剤をそれを必要としている患者の中枢神経系に髄腔内投与すると、本開示のベクターを造影剤なしに投与したときの患者の生存と比べて患者の生存が増加する態様も提供する。様々な実施形態において、本開示のベクター及び造影剤は、それを必要としている患者の中枢神経系に個別に髄腔内投与される。他の実施形態において、ベクター及び造影剤は共製剤化され、中枢神経系又はそれを必要としている患者に髄腔内投与される。他の実施形態において、ベクター及び造影剤は、中枢神経系又はそれを必要としている患者への髄腔内投与用に同じパッケージで提供される。様々な実施形態において、本開示のベクター及び造影剤をそれを必要としている患者の中枢神経系に投与すると、本開示のベクターを造影剤なしに投与したときの患者の生存と比べて、患者の生存が少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％又はそれ以上増加する。
一部の態様において、本開示のベクターを造影剤と組み合わせて使用したとき、及び患者にトレンデレンブルグ体位（Ｔｒｅｎｄｅｌｅｎｂｅｒｇ ｐｏｓｉｔｉｏｎ）（頭低位）をとらせたとき、細胞の形質導入が更に増加することが企図される。一部の実施形態において、例えば、患者は、髄腔内ベクター注入中又は注入後に、頭低位となるよう約１度〜約３０度、約１５〜約３０度、約３０〜約６０度、約６０〜約９０度、又は約９０〜最大約１８０度）傾けられる。様々な実施形態において、細胞の形質導入は、本明細書に記載されるとおり本開示のベクターを造影剤及びトレンデレンブルグ体位（Ｔｒｅｎｄｅｌｅｎｂｅｒｇ ｐｏｓｉｔｉｏｎ）と組み合わせて使用したとき、造影剤及びトレンデレンブルグ体位（Ｔｒｅｎｄｅｌｅｎｂｅｒｇ ｐｏｓｉｔｉｏｎ）と組み合わせて使用しないときの本開示のベクターの形質導入と比べて少なくとも約１％、又は少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１２０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、少なくとも約３００％、少なくとも約３５０％、少なくとも約４００％、少なくとも約４５０％、少なくとも約５００％又はそれ以上増加する。更なる実施形態において、細胞の形質導入は、本明細書に記載されるとおり本開示のベクターを造影剤及びトレンデレンブルグ体位（Ｔｒｅｎｄｅｌｅｎｂｅｒｇ ｐｏｓｉｔｉｏｎ）と組み合わせて使用したとき、造影剤及びトレンデレンブルグ体位（Ｔｒｅｎｄｅｌｅｎｂｅｒｇ ｐｏｓｉｔｉｏｎ）と組み合わせて使用しないときの本開示のベクターの形質導入と比べて約１０％〜約５０％、又は約１０％〜約１００％、又は約５％〜約１０％、又は約５％〜約５０％、又は約１％〜約５００％、又は約１０％〜約２００％、又は約１０％〜約３００％、又は約１０％〜約４００％、又は約１００％〜約５００％、又は約１５０％〜約３００％、又は約２００％〜約５００％増加する。
本開示はまた、本開示のベクター及び造影剤をトレンデレンブルグ体位（Ｔｒｅｎｄｅｌｅｎｂｅｒｇ ｐｏｓｉｔｉｏｎ）をとったそれを必要としている患者の中枢神経系に髄腔内投与すると、患者の生存が、本開示のベクターを造影剤及びトレンデレンブルグ体位（Ｔｒｅｎｄｅｌｅｎｂｅｒｇ ｐｏｓｉｔｉｏｎ）なしに投与したときの患者の生存と比べて更に増加する態様も提供する。様々な実施形態において、本開示のベクター及び造影剤をトレンデレンブルグ体位（Ｔｒｅｎｄｅｌｂｅｒｇ ｐｏｓｉｔｉｏｎ）をとったそれを必要としている患者の中枢神経系に投与すると、患者の生存が、本開示のベクターを造影剤及びトレンデレンブルグ体位（Ｔｒｅｎｄｅｌｅｎｂｅｒｇ ｐｏｓｉｔｉｏｎ）なしに投与したときの患者の生存と比べて少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％又はそれ以上増加する。
本開示及び添付の特許請求の範囲で使用されるとおり、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上特に明確に指示されない限り複数形の指示対象を含む。任意選択の、又は任意選択で、とは、続いて記載される事象又は状況が起こっても又は起こらなくてもよく、及びその記載に事象又は状況が起こる場合と、それが起こらない場合とが包含されることを意味する。例えば、任意選択で組成物が組み合わせを含み得るという語句は、その組成物が異なる分子の組み合わせを含んでもよく、又は組み合わせを含まなくてもよいことを意味し、その記載に組み合わせ及び組み合わせ無し（即ち、組み合わせ中の個々のメンバー）の両方が包含されることになる。範囲は、本明細書では、約一つの特定の値から、及び／又は約別の特定の値までとして表され得る。かかる範囲が表されるとき、別の態様は、一つの特定の値から、及び／又は他の特定の値までを含む。同様に、先行する約の使用により値が近似値として表されるとき、その特定の値が別の態様を形成することは理解されるであろう。更に、範囲の各々の端点は、他方の端点に対して有意であるとともに、他方の端点と独立にも有意であることが理解されるであろう。
本開示は、限定するものと解釈されてはならない以下の例によって更に例示される。本願全体を通じて引用される全ての参考文献、特許、及び公開特許出願の内容、並びに図は、あらゆる目的から全体として参照により本明細書に援用される。
以下の例は例示であり、上記に記載される本開示の範囲を限定するものではないと考えられるべきである。
実施例１−プレＧＭＰマスターセルバンクの作成
方法
解凍：単一細胞バイアル（１×１０６細胞）を３７℃の水浴中で約１分間解凍し、５ｍＬの予め温めた完全成長培地に内容物を希釈した。細胞をＴ−２５ｃｍ２フラスコに移し、３７℃のインキュベーターで４日間、培養培地を予め温めた完全成長培地と毎日交換しながら成長させた。
接着性増加に関する選択：以下の技法を用いて細胞を培養して、強く接着する細胞を選択した。２５ｃｍ２フラスコ内で細胞が９５％コンフルエンシーに達した後、細胞を継代培養した。細胞を５ｍＬのＰＢＳで洗浄し、次に０．５〜１ｍＬのＨｙＱＴａｓｅによって室温で約２分間解離した。５ｍＬ完全成長培地を加えることにより解離を停止させ、繰り返しピペッティングして細胞集塊を解離させた。次に細胞懸濁液を２００×ｇで４分間遠心した。上清を廃棄し、細胞ペレットを１０ｍＬの完全成長培地に再懸濁した。細胞を７５ｃｍ２フラスコに移した。３７℃のインキュベーターで４時間インキュベートした後、細胞培養培地を吸引することにより接着の弱い細胞を洗い流して接着の弱い細胞及び非接着細胞を取り除いた。培養培地を１０ｍＬの予め温めた完全成長培地と交換した。この工程により、目視検査によれば細胞数の最大３５％だけ細胞量が減少した。細胞を更に２日間インキュベートした後、再び継代培養した。播種４時間後の培地交換からなるこの選択工程を３回実施した後、選択された細胞集団を拡大した（図２及び図３）。最終選択ステップでは、細胞は２５ｍＬの最終容積として２×１７５ｃｍ２フラスコに播種した。播種４時間後の最後の培地交換後に細胞損失の減少があったことが認められた。
細胞拡大：続いて細胞が２×１７５ｃｍ２フラスコ内でコンフルエントになった後、細胞を拡大した。細胞を１５ｍＬ ＰＢＳで洗浄し、次に３ｍＬ ＨｙＱＴａｓｅで解離し、室温で約２分間インキュベートした。１０ｍＬの完全成長培地を加えることにより解離を停止させた。次に細胞懸濁液を遠心し、上清の吸引後に２つの細胞ペレットを生じさせた。各ペレットを８ｍＬの完全成長培地に再懸濁し、この濃縮細胞懸濁液の２ｍＬを８×１７５ｃｍ２フラスコに加えた。これらのフラスコは、２０ｍＬの完全成長培地を合計２２ｍＬの細胞懸濁液及び１：４の分割比となるように加えることによって調製した。次の拡大ステップも同じ手順を用いたが、以下の点は変更した：４×１７５ｃｍ２フラスコは１：２の分割比で拡大し、及び４×１７５ｃｍ２フラスコは１：３の分割比で拡大した。これにより合計２０×１７５ｃｍ２フラスコとなった。
回収：２０×１７５ｃｍ２フラスコから細胞を回収した。細胞を１５ｍＬのＰＢＳで洗浄し、次に先述のとおり３ｍＬ ＨｙＱＴａｓｅで解離した。１０ｍＬの完全成長培地を加えることにより細胞解離を停止させ、４×１７５ｃｍ２フラスコからの細胞懸濁液を１×５０ｍＬチューブに加えて５０ｍＬチューブに収集した。これにより、各４０ｍＬの細胞懸濁液の５×５０ｍＬチューブとなった。チューブを遠心して細胞ペレットを作り、上清を吸引し、細胞を１０ｍＬの完全成長培地で再懸濁すると、５０ｍＬの細胞懸濁液となった。
この容積を、各チューブにつき合計２５ｍＬの細胞懸濁液として２×５０ｍＬチューブに分割した。１：２希釈したこのサンプルを使用することにより、血球計算器及びトルイジン（Ｔｏｌｕｄｉｎｅ）（トリパン）ブルーを使用してチューブ細胞当たりの生細胞数を計算した。チューブ１サンプルは生細胞数が１．９９×１０６細胞／ｍＬで、３．９８×１０６細胞／ｍＬの細胞濃度が得られ、及びチューブ２サンプルは生細胞数が２．４×１０６細胞／ｍＬ（合計１×１０８細胞）で、４．８×１０６細胞／ｍＬの細胞濃度が得られた（合計１．２×１０８細胞）。従って、合計２．２×１０８細胞が回収された。両方のチューブを再び遠心し（６分、２００×ｇ）、ペレットをそれぞれ１０ｍＬ（チューブ１）及び１２ｍＬ（チューブ２）の凍結用培地中に再懸濁して細胞濃度を１×１０７細胞／ｍＬに調整した。これらの２つの細胞懸濁液をプールし、２２本の滅菌クライオバイアルに１ｍＬアリコート（各々１×１０７細胞が入っている）を充填した（表３）。
次に、充填したバイアルを新鮮なイソプロパノールと共に凍結チャンバに一晩移し、−８０℃のフリーザー内で制御された速度で凍結させた。次に凍結バイアルを液体窒素槽内の気相式液体窒素に移した。ＧＭＰ施設にバンク化されることになる１０本のバイアルをドライアイス上に移した。
ＡＴＣＣからのＨＥＫ２９３細胞を解凍し、３継代で接着性増加に適合させることに成功した後、拡大し、シードバンクのバンク化に成功した。このシードバンクを成長及び外来病原体（マイコプラズマ、真菌及び細菌）の存在に関して試験した。試験により、このシードバンクがＧＭＰ施設におけるマスターセルバンク化に好適であることが示された。
実施例２−上流工程
上流工程（例えば、図４を参照のこと）を用いてワーキングセルバンクに由来する中間体を産生した。ここで上流工程は、（ａ）接着細胞を培養するステップ、（ｂ）培養細胞に図１に示されるとおりの３つのプラスミド（例えば、本明細書に記載されるＡＡＶ ＳＭＮを含む）をトランスフェクトしてＡＡＶウイルスベクターの産生を可能にするステップ、（ｃ）接着細胞を溶解させてＡＡＶウイルスベクターを単離するステップ、（ｄ）ウイルス粒子をろ過によって精製して任意のインタクトな細胞又は細胞デブリを除去するステップ、及び（ｅ）精製された（ｄ）の産物をタンジェンシャルフローろ過に供するステップ、及び（ｆ）得られた精製ウイルス粒子中間調製物を凍結するステップを含む。代替的実施形態において、本明細書に開示される上流工程によって調製されたＡＡＶは、本明細書に開示されるとおりのＳＯＤ１を標的とするｓｈＲＮＡ又はＭＥＣＰ２をコードする。
（ａ）接着細胞の培養
ＨＥＫ２９３細胞を解凍し、ＣＯ２インキュベーターを用いて使い捨てフラスコ内で７継代にわたって拡大した。解凍した細胞を細胞拡大成長培地で洗浄し、遠心し、新鮮な細胞拡大成長培地に再懸濁した。この再懸濁細胞を、細胞拡大成長培地が入ったフラスコに播種し、インキュベートした。
細胞がコンフルエントになったところで、細胞をＤＰＢＳで洗浄し、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ酵素溶液でフラスコから取り出した。細胞拡大成長培地を加えて酵素（ｅｎｙｍｅ）溶液を中和し、懸濁細胞を分割して、細胞拡大成長培地が入った新しいフラスコに再播種した。この拡大工程を７回繰り返した。繰り返しの最終回では、懸濁細胞はフラスコに再播種せず、代わりに細胞スラリーをバイオリアクターに接種して更に拡大させた。
接種に先立ち、接種用にｉＣＥＬＬｉｓ ５００／２００ｍ２又はｉＣＥＬＬｉｓ ５００／３３３ｍ２接着細胞バイオリアクターを調製した。調製作業には、使い捨てバイオリアクターの荷解き、現物検査、漏れ試験、管類アセンブリの取り付け、及びプローブ平衡化が含まれた。細胞拡大成長培地を入れてバイオリアクターを平衡化させた。ｐＨ（ｐＨ６．９〜７．５）、温度（３５℃〜３９℃）、及び溶存酸素（４０〜１２５％）が規定の範囲内にあることを確認後、バイオリアクターに４８００〜７０００細胞／ｃｍ２（２００ｍ２リアクターについて）又は５０００〜１２０００細胞／ｃｍ２（３３３ｍ２リアクターについて）の目標播種密度で播種した。再循環培地バッグ中の培地に前のステップからの細胞スラリーを加え、バイオリアクター内に循環させた。
（ｂ）接着細胞のトランスフェクション
バイオリアクター接種時点から４、５又は６日後、接着ＨＥＫ２９３細胞に三重ＤＮＡプラスミドＰＥＩ共沈殿物をトランスフェクトした。このトランスフェクションに利用した３つのプラスミドは、ｐＳＭＮ、ｐＡＡＶ２／９、及びｐＨＥＬＰである。細胞拡大に使用したＤＭＥＭ成長培地をバイオリアクターから取り出し、トランスフェクション培地に交換する。大規模接着細胞バイオリアクターにおいてポリエチレンイミン（「ＰＥＩ」）共沈殿物を用いた接着性ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞への三重ＤＮＡプラスミドトランスフェクションを用いてｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＳＭＮベクターを作製する。このベクタープラスミドｐＳＭＮは、ヒト生存運動ニューロンタンパク質（ＳＭＮ）のｃＤＮＡを含む。このトランスフェクションに利用した３つのプラスミドは、ｐＳＭＮ（２２２ｍｇ）、ｐＡＡＶ２／９（３３３ｍｇ）、及びｐＨＥＬＰ（４４４ｍｇ）である。これらのプラスミドは１：１：１のモル比でトランスフェクトされてもよい。トランスフェクション培地は、ＰＥＩ−プラスミド共沈殿物を加える前に、バイオリアクター温度が＞３０℃になるまでバイオリアクター内で平衡化させた。ＰＥＩ−プラスミド共沈殿工程は、トランスフェクション培地にプラスミドを加えること、及び０．２μろ過して反応バッグに入れることを伴う。ＰＥＩをトランスフェクション培地に加え、次に反応バッグに加えた。ＰＥＩ−プラスミド比は、重量基準で約１：１である。ＰＥＩ−プラスミド反応物を手動で混合して均一懸濁液を形成した。及び反応は１５〜３０分の時間にわたって行う。この反応時間の終わりに、ＰＥＩ−プラスミド共沈殿物を反応バッグからバイオリアクターに移した。このＰＥＩ−プラスミド共沈殿物をバイオリアクター内で１〜２時間（別の継続期間が実施例７に記載される）にわたって混合させた後、撹拌を再開した。次の培地交換前にトランスフェクション培地をバイオリアクターに１８〜２４時間再循環させた。
バイオリアクター６日目、トランスフェクションから１８〜２４時間後、バイオリアクターを排液し、トランスフェクション培地再循環培地バッグをトランスフェクション後培地に交換した。トランスフェクション後培地をバイオリアクター中で再循環させながらバイオリアクターに再充填した。７日目、６日目の培地交換から１８〜２４時間後、再循環バッグ中のトランスフェクション後培地を新鮮なトランスフェクション後培地バッグに交換した。このステップの間、バイオリアクターは排液しなかった。培地の再循環は、通常９日目である回収まで継続する。
（ｃ）トランスフェクト接着細胞の溶解
バイオリアクター内で９日後、リアクターから最終的な回収前サンプルを採取し、全細胞溶解工程を開始した。バイオリアクターに１００Ｕ／ｍＬの最終濃度となるようにベンゾナーゼを加えた。ベンゾナーゼをリアクター内で混合させて、そのリアクターに溶解緩衝液を加えた。溶解緩衝液をリアクター内で１５〜２５℃で２時間混合した後、バイオリアクターの内容物を回収バッグに移した。ベンゾナーゼ反応をクエンチする塩ショ糖液（ＳＳＳ）を回収バッグに加え、１５分間混合した。次にバイオリアクターをバイオリアクターリンス緩衝液で１５分間リンスし、次にリンス液を回収物収集バッグに、クエンチした細胞溶解溶液と共に収集した。収集バッグにリンス液が加わった後、内容物を１５分間混合し、バルク回収物サンプルを採取した。
（ｄ）ろ過及びタンジェンシャルフローろ過によるウイルス粒子の調製
混合したバルク回収物をＰＯＤデプスフィルタでろ過して収集バッグに入れた。全てのバルク回収物がろ過された後、デプスフィルタをＴＦＦ１緩衝液でチェーシング（ｃｈａｓｅ）した。デプスフィルタプール液を混合し、サンプリングした。次にデプスフィルタプール液を０．４５μｍフィルタでろ過してバルク回収物材料を更に清澄化した。次に０．４５μｍフィルタをＴＦＦ１緩衝液でチェーシング（ｃｈａｓｅ）した。
ＴＦＦ１ステップについては、５．０ｍ２の３００ｋＤａ ＭＷカットオフ再生セルロース膜カセットをフラッシュし、ＮａＯＨ溶液で衛生化し、ＴＦＦ１緩衝液で平衡化した。この作業の濃縮相は、清澄化された回収物の容積が約１０分の１に減少するように設計した。目標保持液容積に達した後、ダイアフィルトレーション作業を開始する。６ダイアボリュームのＴＦＦ１緩衝液で保持液のダイアフィルトレーションを行った。或いは、保持液のダイアフィルトレーションは、６ダイアボリュームより多いＴＦＦ１緩衝液、例えば１０ダイアボリューム（ｄｉｖｏｌｕｍｅ）、１２ダイアボリューム、又は１５ダイアボリュームで行った。６ダイアボリュームの透過液総流量が達成された後、保持液を再び濃縮し、収集バッグに回収した。２回の連続的な膜リンスを実行してＴＦＦシステムからの産物回収率を最大化し、中間原薬が産生された。
（ｅ）中間体の凍結
ＬＦＨフード内でＴＦＦ１中間体をアリコートに分けて１又は２リットル滅菌ＰＥＴＧボトルに入れ、次にドライアイス上又はフリーザー内で凍結し、−６０℃の貯蔵場所に移した。
実施例３−下流工程
下流工程（例えば、図５を参照のこと）を用いてＴＦＦ１中間体をろ過済み原薬に処理した。一部の実施形態において、本明細書に開示される下流工程を用いて、本明細書に記載されるとおりのＡＡＶ ＳＭＮ、ＡＡＶ ＭＥＣＰ２、又はＳＯＤ１を標的とするｓｈＲＮＡをコードするＡＡＶを含む中間体を処理し得る。下流工程ステップには、（ａ）中間体を（ろ過を用いて）酸性化及び清澄化するステップ、（ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて精製するステップ、（ｃ）タンジェンシャルフローろ過（「ＴＦＦ２」）でろ過するステップ、（ｄ）ＣｓＣｌ緩衝液を用いて超遠心することにより中身の詰まったカプシドと空のウイルスカプシドとを分離するステップ、（ｅ）ＡＡＶウイルスベクターを収集するステップ、及び（ｄ）収集されたＡＡＶウイルスベクターを第２のタンジェンシャルフローろ過（「ＴＦＦ３」）ステップでろ過するステップが含まれる。
（ａ）酸性化及び清澄化
上流工程からのＴＦＦ１中間材料（それ以前に凍結した場合には室温に解凍する）をミキサでバッグに送り込んだ。プールしたＴＦＦ１中間体を混合し、サンプルを採取して力価を決定した。プールしたＴＦＦ１中間体は、１１〜１４％のＴｗｅｅｎ ２０を添加することにより直ちに処理した。Ｔｗｅｅｎ ２０は、酸性ｐＨ条件下でのバルクの宿主細胞タンパク質及びＤＮＡのフロキュレーションを促進するために使用した。この混合物を１２〜２０時間インキュベートさせておいた。次に酸性化緩衝液（１Ｍグリシン）を加えることによりｐＨをｐＨ３．３〜３．７に下げた。次に、溶液を１．１ｍ２ Ｃｌａｒｉｓｏｌｖｅ及び２．２ｍ２ Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋Ｃ０ＨＣデプスフィルタ及び０．４５μｍポリッシングフィルタでろ過することにより、ｐＨを下げた後に形成された沈殿物を取り除いた。この工程により、酸性化及び清澄化されたＴＦＦ中間体が生じた。
（ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製
陽イオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィーステップを用いてウイルスカプシドをタンパク質、ＤＮＡ、及び他の工程不純物、例えば、宿主細胞脂質、ＴＷＥＥＮ ２０と分離した。このステップには、自動プロセスクロマトグラフィーシステムを用いて操作されるＣＩＭｍｕｌｔｕｓ Ｓ０３−８０００先端複合材料カラム（スルホニル）（０．２μｍ細径）クロマトグラフィーカラム（８．０Ｌ）を利用した。緩衝液及び溶液について、以下の表に記載する。
酸性化及び清澄化したＴＦＦ中間体（即ち、ＣＥＸロード）を清浄化及び平衡化したＣＥＸカラムにロードした。条件は、ウイルスベクターがモノリスカラムに結合するようなものであった。ＣＥＸ Ａ緩衝液でカラムから未結合の材料を洗浄した。ＣＥＸ Ａ緩衝液中のＣＥＸ Ｂ緩衝液の勾配によって樹脂から産物を溶出させた。画分１の収集は、溶出勾配の始まりから開始して１０カラム容積（ＣＶ）ｅａにわたった、２．３〜２．７ＣＶの規定容積。クロマトグラフィーカラムは各バッチ後に廃棄した（即ち、クロマトグラフィーカラムは再利用しなかった）。次にＣＥＸ産物溶出物（画分２）を中和緩衝液を用いて７．７〜８．３のｐＨに中和した。
（ｃ）タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ２）によるろ過
ＴＦＦ２ステップでは、ウイルスベクターを濃縮し、タンパク質不純物を除去し、緩衝液をＣｓＣｌ超遠心ステップに適切な緩衝液に交換した。中和したＣＥＸ溶出物を、０．３ｍ２の３００ｋＤａ ＭＷＣＯ再生セルロース膜を装着したＴＦＦシステムを用いて処理した。
中和したＣＥＸ溶出物の容積を目標保持液容積に減少させた。目標保持液容積に達した後、不連続ＴＦＦモード（バッチモード）でダイアフィルトレーションを開始した。保持液をＴＦＦ２ ＮａＣｌダイアフィルトレーション緩衝液で２倍希釈し、保持液をその初期容積まで濃縮した。ＴＦＦ２ ＮａＣｌダイアフィルトレーション緩衝液によるダイアフィルトレーションが完了するまでこれを繰り返した。次に保持液をＴＦＦ２ ＣｓＣｌダイアフィルトレーション緩衝液で２倍希釈し、保持液をその初期容積まで濃縮した。ＴＦＦ２ ＮａＣｌダイアフィルトレーション緩衝液によるダイアフィルトレーションが完了するまでこれを繰り返した。
中和したＣＥＸ溶出物の物理的力価、システムのホールドアップ容積、システムのフラッシュ容積、及び保持液密度に基づき保持液を最終重量に更に濃縮して所望の目標ベクター濃度を達成し、回収して収集バッグに入れた。ＴＦＦ２ ＣｓＣｌダイアフィルトレーション緩衝液でシステムのフラッシュサイクルを１回行った後、産物をブローダウンしてＴＦＦシステムからの産物回収率を最大化した。ＴＦＦ２保持液のサンプル（これは保持液及びフラッシュ液を含有する）を物理的力価測定のため採取した。ＴＦＦ２膜カセットは各バッチ後に廃棄した（即ち、ＴＦＦ膜は再利用しなかった）。
（ｄ）ＣｓＣｌ超遠心
超遠心ステップの目的は、塩化セシウム勾配超遠心法を利用することにより完全なカプシドから空のカプシドを除去することであった。超遠心チューブにＴＦＦ２保持液を加え、チューブを密封した。タイプ５０．２ Ｔｉロータ又は等価なロータを備えた自動Ｏｐｔｉｍａ ＸＰＮ １００超遠心システム又は等価なシステムなど、超遠心機にチューブを置いた。充填したチューブを２０℃において４５，０００ｒｐｍで２２時間遠心した。
（ｅ）ＡＡＶウイルスベクターの収集
遠心ステップの完了後、超遠心機からチューブを取り出し、バイオセーフティキャビネットに置いた。産物の入ったチューブを廃棄物容器の上にあるリングスタンドにマウントした。ランプをチューブの真下に位置決めして、空のカプシドバンド（バンドＡ、一番上のバンド）、完全なカプシドのダブレットバンド（バンドＢ及びバンドＣ、ダブレットの上及び下のバンド）、及びダブレットの下の一番下のバンド（バンドＤ）を可視化した。シリンジに取り付けた針でチューブに穴をあけてチューブをベントし、針によってバンドＢ、Ｃ、及びＤを取り取り出した。収集された材料を収集バッグに移した。収集された超遠心プール（ＵＣプール）をＴＦＦ２緩衝液で希釈して、ＴＦＦ２ロード材料中で一貫した出発ＣｓＣｌ濃度に至らせた。希釈したＵＣプールはＴＦＦ３ステップで処理される。ＣｓＣｌ超遠心ステップ用の緩衝液を以下の表に挙げる。
（ｆ）タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ３）によるろ過
ＴＦＦ３ステップでは、ＣｓＣｌを除去し、最終製剤化緩衝液を用いて完全なベクターを濃縮した。５０ｃｍ２の３００ｋＤａ ＭＷＣＯ再生セルロース膜と併せてタンジェンシャルフローろ過システムを利用した。膜によってウイルスベクターが保持された。
希釈後ＵＣプールの容積を目標保持液容積に減少させた。目標容積に達した後、一定の保持液容積での連続ダイアフィルトレーションを開始した。ＴＦＦ３緩衝液で保持液のダイアフィルトレーションを行った。ダイアフィルトレーションの保持液のサンプルを物理的力価測定のため採取した。透過液重量を目標とすることにより保持液を更に濃縮し、この重量は、１）ダイアフィルトレーション終了時のＴＦＦシステム中の保持液容積、２）希釈後ＵＣプールの物理的力価、３）目標原薬（ＤＳ）濃度、４）システムフラッシュ液及びフィルタフラッシュ液の合計容積、及び５）ＴＦＦ３緩衝液の密度により計算した。ＴＦＦ３膜カセットは各バッチ後に廃棄した（即ち、カセットは再利用しない）。
ＴＦＦ３緩衝液によるＴＦＦ膜の２回連続２０ｍＬリンスを実施して、ＴＦＦシステムからベクターを回収した。０．２ｍｍ Ｐａｌｌ Ｓｕｐｏｒ（登録商標）ＥＫＶ滅菌用グレードフィルタ（Ｍｉｎｉ Ｋｌｅｅｎｐａｋ）によってリンス液を回収した。ＴＦＦ３緩衝液でフィルタのリンスを実施して、フィルタに残る任意のベクターを回収し、ろ過後ＴＦＦ３プール（即ち、原薬ＤＳ）の最終容積を調整した。ＤＳをアリコートに分けて１２５又は２５０ｍＬ ＰＥＴＧボトルに入れ、＜−６０℃で凍結した。
実施例４−製剤化及び充填
薬物製品（ＤＰ）は、単回用量、保存剤不含、無菌、澄明〜やや不透明、及び無色〜淡白色の、２．０×１０１３ｖｇ／ｍｌの目標濃度の非複製性自己相補的ＡＡＶ９ベクターの静脈内注入液であった。ＤＰは、２０ｍＭトリス、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．００５％ｗ／ｖポロキサマー１８８を含んだ。この溶液のｐＨ範囲は７．７〜８．３であった。
滅菌した既製の１０ｍｌ Ｃｒｙｓｔａｌ Ｚｅｎｉｔｈ（ＣＺ）バイアルにＤＰを充填し、滅菌した既製のクロロブチル（ｃｈｒｌｏｒｏｂｕｔｙｌ）ゴム栓で栓をして、滅菌した２０ｍｍフリップオフアルミニウムシールで密封した。バイアルには５．５ｍＬ又は８．３ｍＬのいずれかの名目充填容積を充填した。目標過充填は０．４ｍＬであり、バイアルは５．９±０．１ｍＬ又は８．７±０．１ｍＬとなるように充填した。
実施例５−効力アッセイ
薬物製品の相対効力を定量的インビボアッセイを用いて測定した。このアッセイでは、確立されたＳＭＡ疾患マウスモデルを使用した。つがいのＳＭＡΔ７マウス系統（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、＃００５０２５）は、表現型は正常であるが、その子孫の約２５％が、標的となるＳＭＮ遺伝子突然変異に関してホモ接合であり、ＳＭＡ様表現型を示す。これらのマウスは５日目までに筋脱力の徴候を示し、その翌週には歩行異常を生じて転び易くなる。Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓは、ＳＭＡ様表現型を有する動物の平均生存期間を約１５±２日と報告している。パイロット試験では、ＳＭＡ様表現型を有する未治療の動物について１６．３日の生存期間中央値が実証された（幾何平均；ｎ＝３試験；試験当たり１０匹のマウス）。
生物学的に活性な薬物製品を静脈内（ＩＶ）注入によって投与すると、用量（ｖｇ／ｋｇ）の関数である生存期間の増加が得られる。標準物質（先行ベクターバッチ）と比べた薬物製品効力を測定した。薬物製品及び標準物質の力価（ベクターゲノム／ｍＬ；ｖｇ／ｍＬ）をドロップレットデジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄｄＰＣＲ）によって決定した。ベクターを生理食塩水に希釈して、ＳＭＡ様表現型を有するマウスに投与されることになる３つの指定用量レベルの各々を実現した。
アッセイの結果は、そのアッセイが適合性を満たす場合、受入れ可能と考えられる。アッセイ適合性は、以下からなる：
１．陰性対照サンプルの受入れ限界（１５±２日、生存期間中央値）
２．陽性対照サンプルの受入れ限界（＞４０日、生存期間中央値）
３．参照標準生存期間中央値用量反応曲線に関する受入れ限界
本試験においては、先行ベクターバッチ（以下、先行バッチ）を使用して、０．９％生理食塩水を使用した０（ゼロ）用量（未治療群）を含む５つの異なる用量レベルで薬物製品（以下、サンプルバッチ）を投与したときのＳＭＡΔ７マウスの生存期間中央値（日）の間の線形相関を決定した。表１０は、先行バッチ参照バッチを使用した検量線を示す。
この試験のデータにより、生存期間中央値用量反応曲線の直線範囲は０〜７．４ｖｇ／ｋｇであったことが実証された。先行バッチ参照標準の線形回帰曲線を薬物製品サンプルバッチ線形回帰曲線と比較することにより、薬物製品サンプルバッチの相対効力を確立した。これは、各線形回帰線（即ち、参照標準及び試験物質）のｙ切片及び傾きの比を用いることにより達成された。パーセント相対効力計算は、以下の式（１）に記述される：
％ＲＰ＝［（試験物質のｙ切片／傾き）÷（参照標準のｙ切片／傾き）］×１００（１）
第１相臨床試験に使用した先行バッチを参照標準バッチとして使用し、１００％の効力を割り当てた。
前述のデータにより、生存期間中央値用量反応曲線の直線部分を用いて予備的アッセイ受入れ判定基準が確立され、薬物製品臨床バッチの相対効力が以下のとおり決定された：
・５つの用量（ｖｇ／ｋｇ）レベルを使用して生存期間中央値（日）用量反応曲線を作成した
・線形用量反応モデルの実行に用量０、１．２Ｅ＋１３及び７．４Ｅ＋１３を選択した。
・生理食塩水（未治療群）の適合性限界は１３〜１７日の生存期間中央値であった。
・参照標準サンプルの適合性限界は、以下と確立された：
〇傾き≧２．０Ｅ−１３
〇ｙ切片≧１６．００（日）
〇ｙ切片／傾き比≧８．５Ｅ＋１３
〇Ｒ２≧０．７
Δ７マウスモデルを使用して、薬物製品を含めたＳＭＡ療法の有効性を実証した。１５日±２日の生存期間中央値では、ＴＦＦ３緩衝溶液（媒体）治療対照動物は信頼できるベースライン対照を提供し、それからの生存期間中央値の増加として製品効力を測定することができる。薬物製品による開発作業では、投与用量（ｖｇ／ｋｇ）を対数変換して、治療されたＳＭＡΔ７新生仔マウスの生存期間中央値（日数単位）に対してプロットしたとき線形相関でマウスモデルの生存に影響を及ぼすドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を用いたゲノム力価によって決定される３つの用量（媒体治療用量を除く）が同定された。低力価、中間力価、及び高力価標準については、表１１の標準力価（ｖｇ／ｍＬ）を参照のこと。加えて、検量線ゼロ点並びに陰性対照の両方にＴＦＦ緩衝液（媒体）溶液が使用される。≧４０日の生存期間を実証する用量（生存期間中央値の倍増を実証する用量より高い）もまた、陽性対照として含めた。
用量溶液調製（希釈スキーム例については表１２を参照のこと。
陰性対照−ＴＦＦ３緩衝溶液（薬物製品最終製剤化緩衝液）を陰性対照として使用する
陽性対照−試験物質ロットはＴＦＦ３緩衝溶液を使用して１．１０×１０１４ｖｇ／ｋｇで調製する。希釈スキーム例については表１２を参照のこと。
参照標準溶液−参照標準ロットは、ＴＦＦ３緩衝溶液を使用して表１１に説明される３つの濃度で調製する。
試験物質調製−ＴＦＦ３緩衝溶液を使用して試験物質を希釈した。希釈は、５０μｌの最終総容積中、マウス当たり表１１に説明される試験用量（ｖｇ／ｋｇ）が生じるように計算した。希釈はその時点で１２匹のマウスについて行い、治療されたマウスの最低寿命を≧４０日の生存期間中央値（日）に増加させることを目標とした陽性対照としての１つの追加の容積を含んだ。
対照サンプルの受入れ限界
陰性対照（未治療マウス）−陰性対照群のアッセイ受入れ限界は、ＳＭＡΔ７マウスが１５±２日の生存期間中央値を達成することであった。加えて、１０日以内に死亡するマウスはいずれも、分析から除外することになる。
陽性対照（目標臨床用量で治療される群）−陽性対照群のアッセイ受入れ限界は、治療されたマウスの寿命が最低でも≧４０日の生存期間中央値であることであった。加えて、１０日以内に死亡するマウスはいずれも、分析から除外することになる。
参照標準用量反応曲線の受入れ限界
投与用量（ｖｇ／ｍＬ）に対して生存期間中央値（日）をプロットする参照標準線形用量反応曲線について、アッセイ適合性判定基準が決定されることになる。アッセイ適合性判定基準については表１３を参照のこと。
ｙ切片／傾き比−参照標準及び試験物質についての投与用量（ｖｇ／ｋｇ）に対する生存期間中央値（日）の線形回帰曲線を決定する。各線形回帰について傾きに対するｙ切片の比を計算する。
結果報告
相対効力結果の定性的報告−アッセイ毎にアッセイ適合性判定基準を判定した後、陽性対照材料について一点での生存期間中央値（日）読取りが≧４０日にあることを決定する。陽性対照群の生存期間中央値が≧４０日である場合、判定基準不適合が満たされる場合にはその試験物質は処分され得る。
相対効力結果の定量的報告−アッセイ毎にアッセイ適合性判定基準を判定した後、試験物質の相対効力を定量的に決定する。陽性対照が≧４０日に達し、且つ７．５×１０１３ｖｇ／ｋｇの上側標準用量に相当するマウス群について３１±３日の生存期間中央値が達成されたら、試験物質の相対効力を報告し得る。試験物質のパーセント相対効力（％ＲＰ）は、生存期間中央値（日）用量反応の線形回帰のｙ切片及び傾きを用いて以下のとおり計算されることになる：
％ＲＰ＝１００％×［（試験物質ｙ切片／傾き）÷（参照標準ｙ切片／傾き）］
実施例６：界面活性剤不活性化試験
低ｐＨ及びｔｗｅｅｎの影響を分けるため、ｐＨ７．６及び４〜８％Ｔｗｅｅｎ−２０を有する原薬ＴＦＦ１中間体のサンプルを界面活性剤不活性化試験に使用した。ＴＦＦ１中間体のＴｗｅｅｎ−２０濃度は、酸性化前にＴＦＦ１中間体にＴｗｅｅｎ−２０を添加したときの完全工程と比べて約２．５分の１である。この低いＴｗｅｅｎ−２０濃度は、原薬工程で界面活性剤によって促される不活性化についての最悪条件と考えられた。界面活性剤処理によるウイルス不活性化ステップについての試験物質は、４〜８％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＴＦＦ−１中間体であった。界面活性剤処理ステップによるウイルス不活性化能力を判定するため、ＸＭｕＬＶ及びＰＲＶを各々使用して、デュプリケート実験において試験物質をウイルスでスパイクした。ウイルスはプラーク形成感染力アッセイを用いて定量化した。
ＴＦＦ１製造ステップでは、４〜８％Ｔｗｅｅｎ−２０の界面活性剤濃度範囲が生じる。ＴＦＦ１中間体をプールし、そのＴＦＦ１中間体に１６〜２０℃の作業温度で更なる１２％のＴｗｅｅｎ−２０を１２〜２０時間の時間にわたって混合しながら追加した。４〜８％Ｔｗｅｅｎ−２０の濃度及び１６．０℃±０．１℃の制御された温度でウイルス除去工程を実施した。１６時間の典型的な工程所要時間に対し、この不活性化工程の所要時間は１２０分であった。
不活性化工程のため、試験物質の容積を測定し、目標温度に平衡化し、次にウイルスでスパイクすることにより、不活性化負荷を調製した。スパイクした不活性化負荷のサンプルを６時点で取り出して、時間の経過：＜１分、１５分、３０分、６０分、９０分、及び１２０分に伴う不活性化の動態を実証した。収集後、各サンプルを成長培地に希釈してウイルス不活性化を停止させ、ウイルスに関してアッセイした。９０分及び１２０分におけるアッセイ感度を高めるため、これらの時点サンプルの大容積もまた、ウイルスに関してアッセイした。このステップについては試験物質中にＴｗｅｅｎ−２０が存在するため、不活性化負荷の力価は、スパイク用ウイルスの力価及びスパイクしたウイルスの容積から計算した。
界面活性剤処理（Ｔｗｅｅｎ−２０）によるウイルス不活性化の有効性は、９０分の時点における両方のウイルスの４ｌｏｇ１０より高いＬＲＶ値からも明らかなとおり、有効であることが示された。界面活性剤処理による不活性化の動態は、図６及び図７に、Ｔｗｅｅｎ−２０界面活性剤処理中の１２０分の経過にわたるウイルス不活性化速度のグラフとして示す。
実施例７：高い播種密度、早いトランスフェクション及び回収並びにＤＮＡ／ＰＥＩ混合回数が原薬の産生に及ぼす効果
高い播種密度、１日早いトランスフェクション及び回収並びにＤＮＡ／ＰＥＩ混合回数がＤＳの産生に及ぼす効果を判定した。各条件につき、１．６ｍ２バイオリアクターにおいてデュプリケートで判定した。
材料及び方法
細胞のスケールアップ
ＨＥＫ ２９３細胞を解凍し、１０％ＦＢＳを補足したＤＭＥＭに再懸濁した。細胞を室温において２０９×ｇで５分間遠心し、次に上清を除去し、新鮮ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳを加えた。生細胞密度及び生存率に関して細胞をカウントし、２×Ｔ１７５ｃｍ２フラスコに播種して、培養物が約９０％コンフルエンシーに達するまで３日間、３７．０℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。細胞継代毎に使用済みの培地を取り除き、フラスコを０．０８ｍＬ／ｃｍ２のＰＢＳ（−ＣａＣｌ２、−ＭｇＣｌ２）で洗浄し、次にフラスコをＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（０．０４ｍＬ／ｃｍ２）で処理し、３７．０℃、５％ＣＯ２で２〜３分間インキュベートした。ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ（０．０４ｍＬ／ｃｍ２）でトリプシンをクエンチした。図８の図に従い細胞を拡大し、播種した。
細胞接種及びモニタリング
バイオリアクターにＨＥＫ ２９３細胞を、成長培地（高グルコースＤＭＥＭ＋１０％オーストラリア産ＦＢＳ＋１：１００ペニシリンストレプトマイシン（Ｐｅｎ Ｓｔｒｅｐ）中８，０００細胞／ｃｍ２及び１２，０００細胞／ｃｍ２の目標密度で、デュプリケートで撹拌しながら接種した。工程パラメータは、ｐＨ７．２３、３７．０℃、５５％溶存酸素（ＤＯ）及び２ｃｍ／ｓの線速度に設定した。播種の２４時間後、ＤＭＥＭ成長培地（０．１８８ｍＬ／ｃｍ２）の再循環をオンにして再循環速度（１２．５ｍＬ／分）に至らせた。オフラインｐＨ、代謝産物、及び栄養素に関して採取される毎日のサンプルは、Ｎｏｖａ ＢｉｏＦｌｅｘを使用して読み取った。播種後４日目（１２，０００細胞／ｃｍ２）、５日目（８，０００細胞／ｃｍ２）及び９日目、３つのファイバーを取り出し、１：１：１ｖ／ｖのＰＢＳ、Ａ１００及びＢ１００溶液（ＣｈｅｍｏＭｅｔｅｃ）で溶解させ、全核数に関してカウントして（ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ ＮＣ−２００）、培養物の成長をモニタした。
トランスフェクション
細胞接種後４日目（１２，０００細胞／ｃｍ２）及び５日目（８，０００細胞／ｃｍ２）、再循環を停止させて、各バイオリアクター内の細胞にプラスミドＤＮＡ及びポリエチレンイミン（ＰＥＩ）をトランスフェクトした。ＤＮＡ及びＰＥＩは１：１ｍｇ／ｍｇの比で混合した。プラスミドＤＮＡは、ｐＳＭＮプラスミド、ｐＡＡＶ２／９プラスミド及びｐＨＥＬＰプラスミドを１：１．５：２の質量比でトランスフェクトし、ＤＭＥＭ−／−培地；高グルコース、−ＣａＣｌ２、−Ｌ−グルタミンに加え、０．２μＭろ過し、逆さにすることにより混合した。ＰＥＩはＤＭＥＭ−／−培地に加え、逆さにすることにより混合した。次にＤＮＡにＰＥＩを加え、逆さにすることにより混合し、８，０００細胞／ｃｍ２（対照）及び１２，０００細胞／ｃｍ２について室温で２０分間インキュベートした。他の２つの８，０００細胞／ｃｍ２条件についてはＤＮＡ／ＰＥＩを１時間及び２時間インキュベートした。このＤＮＡ／ＰＥＩ複合混合物を使用して、４条件の各々につき２つのバイオリアクターをトランスフェクトした。各バイオリアクターにＤＮＡ／ＰＥＩ複合物を加え、工程パラメータで２時間インキュベートした。トランスフェクションの２時間後、再循環ループを再びオンにした。
トランスフェクション後培地交換
トランスフェクションの２４時間後、バイオリアクター及び再循環ループ内の全ての培地を取り除き、ＯｐｔｉＭＥＭ＋１：１００Ｐｅｎ Ｓｔｒｅｐ（０．１３２ｍＬ／ｃｍ２）に交換し、工程パラメータで２４時間再循環させた。トランスフェクションの４８時間後、再循環からのみ全ての培地を取り除き、ＯｐｔｉＭＥＭ＋１：１００Ｐｅｎ Ｓｔｒｅｐ（１２ｍＬ／分）に交換し、工程パラメータで再循環させた。
回収
細胞接種後８日目（１２，０００細胞／ｃｍ２）及び９日目（８，０００細胞／ｃｍ２）、ベンゾナーゼ（１００Ｕ／ｍＬ）を加え、溶解緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１％Ｔｗｅｅｎ ２０）でチェーシング（ｃｈａｓｅ）し、工程パラメータで２時間インキュベートした。バイオリアクターを排液し、ショ糖塩溶液（５００ｍＭ ＮａＣｌ、１％ｗ／ｖショ糖）を加え、それらを逆さにすることにより混合した。バイオリアクターをバイオリアクターリンス緩衝液（５００ｍＭ ＮａＣｌ、１％ｗ／ｖショ糖、２０ｍＭトリス塩基、１％ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ ２０、１ｍＭ ＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ）によって約１５分間、工程パラメータで洗浄した。バイオリアクターを排液し、バイオリアクターリンス緩衝液を粗バルク回収物と共にプールし、逆さにすることにより混合し、ｄｄＰＣＲアッセイ用にサンプリングした。
デプスろ過及びタンジェンシャルフローろ過
細胞接種後８日目（１２，０００細胞／ｃｍ２）及び９日目（対照８，０００細胞／ｃｍ２）、各条件について（ｎ＝２バイオリアクター）バイオリアクターを回収し、サンプリングし、粗ライセートをプールした。次にプールしたライセートをＭｉｌｌｉｓｔａｋ Ｃ０ＨＣ Ｐｏｄ、２７０ｃｍ２フィルタ及びＭｉｌｌｉｐａｋ ４０、０．４５μｍ、Ｄｕｒａｐｏｒｅ、２００ｃｍ２ポリッシュフィルタ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で清澄化した。Ｃ０ＨＣ＋０．４５後にサンプルを採取し、−８０．０℃で凍結した。次に清澄化したライセートをタンジェンシャルフローＰｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）２限外ろ過モジュールＰＬＣＭＫ Ｃ ０．１ｍ２フィルタ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によって濃縮した。最終産物のダイアフィルトレーションには少なくとも６ダイアボリュームを使用した。ＴＦＦ１ろ過後サンプルを入手し、−８０．０℃で凍結した。サンプルは全て、ＡＡＶ２／９力価及び宿主細胞タンパク質に関して分析にかけた。
バイオリアクターにおいてプラスミドを使用してＤＳを産生した。データはデュプリケートの各条件を表し、表１４に示すバイオリアクター番号及び条件に対応する。
細胞成長：播種日（０日目）に細胞をカウントし、播種後４日目（１２，０００細胞／ｃｍ２）、５日目（８，０００細胞／ｃｍ２）及び９日目に核をカウントした。データは、全てのリアクター内の細胞が０日目〜５日目の間に指数関数的に成長したことを示している。トランスフェクション後、９日目の核数は、バイオリアクター２２１で５日目〜９日目に総核数が２．０倍に増加したことを示唆している。他のリアクター（２２２〜２２８）はいずれも、５日目〜９日目に有意な成長を呈しなかった。バイオリアクター２２１における成長の増加は、総核数カウントに使用される個々のファイバー上で細胞の分布が不均一なことに基づくアーチファクトであり得る。図９Ａ〜図９Ｅに示される代謝産物データに基づけば、全てのバイオリアクター内の細胞が同様に成長した可能性がある。
ｐＨ、栄養素及び代謝産物：全てのバイオリアクター培養物でグルコース消費の傾向が同じであったことから、バイオリアクター２２１の成長曲線の増加にも関わらず、細胞はグルコースを同様の速度で消費したことが示唆される。最初の３日間、１２，０００細胞／ｃｍ２で播種したバイオリアクターのｐＨは平均７．０６であり、８，０００細胞／ｃｍ２では平均７．１８であった。ｐＨは栄養素代謝の増加に伴いやや下がり、アンモニウムイオンレベルが高くなると同時に９日目までに上昇した。乳酸塩は５日目（バイオリアクター２２１、２２３、２２４、２２５、２２７）及び６日目（バイオリアクター２２２、２２６、２２８）まで上昇し、次に産生の終わりが近付くにつれ横這いになったことから、この段階でのエネルギー源としての乳酸塩の利用が示唆される。
産生力価
回収材料からのウイルスゲノムをデジタルドロップレット（ｄｄＰＣＲ）によって測定した。１２，０００細胞／ｃｍ２で播種したバイオリアクターでは力価は約１．５倍の高さであり、平均力価測定値が６．３７Ｅ＋１０ｖｇ／ｍＬ（ｎ＝２）であったのに対し、８，０００細胞／ｃｍ２で播種した対照バイオリアクターは平均力価測定値が４．３３Ｅ＋１０ｖｇ／ｍＬであった（ｎ＝２）。力価データから、高い密度での播種、１日早いトランスフェクション及び回収が、より高いＤＳ産生収率を支持することが示唆される。ＤＮＡ／ＰＥＩを２０分間インキュベートした対照（４．３３Ｅ１０ｖｇ／ｍＬ ｎ＝２）と比較して、１時間インキュベートしたＤＮＡ／ＰＥＩについての力価収率は１．４分の１の平均力価測定値の低下を呈し（３．１７Ｅ１０ｖｇ／ｍＬ ｎ＝２）、２時間インキュベーションについては、平均力価測定値は１．６分の１の低下であった（２．６７Ｅ１０ｖｇ／ｍＬ ｎ＝２）。データから、インキュベーション時間が長いほど力価の低下につながることが示唆される。これは、ＤＮＡ及びＰＥＩが、ＨＥＫ２９３細胞の効率的なトランスフェクションが可能でない大型の複合体を形成することに起因し得る。陽性対照としての既知の工程における産生と比較したときの、１ｍＬ当たりのウイルス産生及び表面積値を図１０に示す。
清澄化及び濃縮ステップの各ステップで測定されたウイルス力価を図１１に示す。ＴＦＦ１ステップの間の各ステップにおける残留宿主細胞タンパク質を図１２Ａ〜図１２Ｂに示す。
実施例８：播種密度が原薬の産生に及ぼす効果
播種密度がＤＳの産生に及ぼす効果を判定した。４つの播種密度を判定し、バイオリアクターにおいて各播種密度につきデュプリケートとした。
細胞のスケールアップ
ＨＥＫ ２９３細胞を解凍し、１０％ＦＢＳを補足したＤＭＥＭに再懸濁した。細胞を室温において２０９×ｇで５分間遠心し、次に上清を除去し、新鮮ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳを加えた。生細胞密度及び生存率に関して細胞をカウントし、２×Ｔ１７５ｃｍ２フラスコに播種して、培養物が約９０％コンフルエンシーに達するまで４日間、３７．０℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。細胞継代毎に使用済みの培地を取り除き、フラスコを０．０８ｍＬ／ｃｍ２のＰＢＳ（−ＣａＣｌ２、−ＭｇＣｌ２）で洗浄し、次にフラスコをＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（０．０４ｍＬ／ｃｍ２）で処理し、３７．０℃、５％ＣＯ２で２〜３分間インキュベートした。ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ（０．０４ｍＬ／ｃｍ２）でトリプシンをクエンチした。図１３の図に従い細胞を拡大し、播種した。
細胞接種及びモニタリング
バイオリアクターにＨＥＫ ２９３細胞を、７００ｍｌ成長培地（高グルコースＤＭＥＭ＋１０％オーストラリア産ＦＢＳ＋１：１００Ｐｅｎ Ｓｔｒｅｐ）中４つの目標密度：８，０００細胞／ｃｍ２、９，３５０細胞／ｃｍ２、１０，７００細胞／ｃｍ２及び１２，０５０細胞／ｃｍ２で、各々デュプリケートで撹拌しながら接種した。工程パラメータは、ｐＨ７．２３、３７．０℃、５５％溶存酸素（ＤＯ）及び２ｃｍ／ｓの線速度に設定した。播種の２４時間後、ＤＭＥＭ成長培地（総容積はこのとき０．１８８ｍＬ／ｃｍ２）の再循環をオンにして再循環速度（１２．５ｍＬ／分）に至らせた。オフラインｐＨ、代謝産物、及び栄養素に関して毎日サンプルを採取し、Ｎｏｖａ ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ ４００を使用して読み取った。播種後５日目及び９日目に３つのファイバーを取り出し、１：１：１ｖ／ｖのＰＢＳ、Ａ１００及びＢ１００溶液（ＣｈｅｍｏＭｅｔｅｃ）で溶解させ、全核数に関してカウントして（ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ ＮＣ−２００）、培養物の成長をモニタした。
トランスフェクション
細胞接種後５日目、再循環を停止させて、各バイオリアクターチャンバ内の（再循環ボトルでない）培地を６００ｍｌ ＤＭＥＭ−／−培地（高グルコース、−ＣａＣｌ２、−Ｌグルタミン）に交換した。各リアクターにプラスミドＤＮＡ及びポリエチレンイミン（ＰＥＩｐｒｏ）を１：１の質量比でトランスフェクトした。プラスミドＤＮＡを１：１．５：２の質量比（ｐＳＭＮ−３．５６ｍｇ、ｐＡＡＶ２／９−５．３４ｍｇ、及びｐＨＥＬＰ−７．１ｍｇ）で混合し、３００ｍＬ ＤＭＥＭ−／−培地に加え、０．２μＭろ過し、逆さにすることにより混合した。ＰＥＩ（１６ｍＬ）を３００ｍＬ ＤＭＥＭ−／−培地に加え、逆さにすることにより混合した。ＰＥＩ及びＤＮＡ混合物を合わせ、逆さにすることにより混合し、室温で２０分間インキュベートした。各６００ｍｌ ＰＥＩ／ＤＮＡ複合混合物を使用して２つのバイオリアクターをトランスフェクトし、各対応する播種密度について繰り返した。ＰＥＩ／ＤＮＡ複合体を各バイオリアクターに加え、工程パラメータで２時間インキュベートした。トランスフェクションの２時間後、再循環ループを再びオンにした（１２．５ｍＬ／分）。
トランスフェクション後培地交換
トランスフェクションの２４時間後、バイオリアクター及び再循環ループ内の全ての培地を取り除き、ＯｐｔｉＭＥＭ（０．１３２ｍＬ／ｃｍ２）に交換して、工程パラメータで２４時間再循環させた（１２．５ｍＬ／分）。トランスフェクションの４８時間後、再循環ボトル内の培地を新鮮なＯｐｔｉＭＥＭに入れ替え、工程パラメータで再循環させた（１２ｍＬ／分）。
回収
細胞接種後９日目、ベンゾナーゼ（１００Ｕ／ｍＬ）を加え、溶解緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１％Ｔｗｅｅｎ ２０）でチェーシング（ｃｈａｓｅ）し、工程パラメータで２時間インキュベートした。バイオリアクターを排液し、ショ糖塩溶液（５００ｍＭ ＮａＣｌ、１％ｗ／ｖショ糖）を加え、逆さにすることにより混合した。バイオリアクターをバイオリアクターリンス緩衝液（５００ｍＭ ＮａＣｌ、１％ｗ／ｖショ糖、２０ｍＭトリス塩基、１％ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ ２０、１ｍＭ ＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ）で１５分間、工程パラメータで洗浄した。バイオリアクターを排液し、バイオリアクターリンス緩衝液を粗バルク回収物と共にプールし、逆さにすることにより混合し、ｄｄＰＣＲアッセイ用にサンプリングした。
バイオリアクターにおいてプラスミドを使用して原薬を産生した。リアクターに様々な密度で播種し、同じスケジュールでトランスフェクトし、回収した（それぞれ、播種後５日目、９日目）。データは、以下の表１５に示されるとおり、各播種密度のデュプリケートを表す。
細胞成長：播種日（０日目）に細胞をカウントし、播種後５及び９日目に核をカウントした。データは、全てのリアクター内の細胞が０日目〜５日目の間に指数関数的に成長したことを示している。出発播種密度の差にも関わらず、核数が示すところによれば、５日目に群間で細胞数に大きな差はない。トランスフェクション後、９日目の核数は、リアクターのうちの５つ（２２１、２２４、２２５、２２６、２２８）で５日目〜９日目に総核数が倍増したことを示唆している。２つのリアクター（２２２、２２３）では、図１４Ａに示されるとおり、総核数が１．４倍に増加した。リアクター２２７では５日目〜９日目に総核数が３．８倍に増加した。この差は、カウントに使用される個々のファイバー間で細胞の分布が不均一なことに基づくアーチファクトであり得る。図１４Ｂ〜図１４Ｅに示される代謝産物データに基づけば、全てのリアクター内の細胞が同様に成長した可能性がある。
ｐＨ、栄養素及び代謝産物：全てのバイオリアクター培養物でグルコース消費（図１４Ｂ）の傾向が同じであったことから、出発播種密度の差にも関わらず、細胞はグルコースを同様の速度で消費したことが示唆される。最初の３日間、全ての培養物でオフラインｐＨ（図１４Ｃ）は一貫したままであり（ｐＨ７．２５）、栄養素代謝の増加に伴い下がり、８日目の後にアンモニウムイオンレベルが高くなると同時に上昇した（図１４Ｅ）。乳酸塩（図１４Ｄ）は６日目まで上昇し、次に産生の終わりが近付くにつれ横這いになったことから、この段階でのエネルギー源としての乳酸塩の利用が示唆される。異なる出発密度で播種したリアクター間において代謝産物プロファイルに有意差は認められなかった。これは、出発播種密度の差が最小限で、＜１．２倍の差であることに起因する可能性がある。
産生力価
回収材料からのウイルスゲノムをデジタルドロップレット（ｄｄＰＣＲ）によって測定した。８，０００細胞／ｃｍ２及び１０，０７０細胞／ｃｍ２の出発播種密度間で力価は同等であり、それぞれ、平均３．９９Ｅ＋１０±２．１Ｅ＋０９ｖｇ／ｍＬ（ｎ＝２）及び３．７０Ｅ＋１０±７．４Ｅ＋０９ｖｇ／ｍＬ（ｎ＝２）であった。理由を特定できないが、９，３５０細胞／ｃｍ２で播種したリアクターは５．０２Ｅ＋０８ｖｇ／ｍＬ（ｎ＝２）の平均力価測定値を呈し、隣接密度で播種したリアクターの平均力価と比べて約２ｌｏｇ低かった。この差は、この播種密度での生産性の欠如というよりむしろ、トランスフェクション又は回収中に特定できない操作ミスがあった結果と思われる。１２，０５０細胞／ｃｍ２で播種したレプリケートリアクターは互いの２倍の差を実証し、一方のリアクターは低播種密度について観察される範囲内、３．２Ｅ＋１０ｖｇ／ｍｌであったのに対し、第２のリアクターでは僅か１．４Ｅ＋１０ｖｇ／ｍｌの力価しか生じたに過ぎなかった。１ｍＬ当たりのウイルス産生及び表面積値を図１５Ａに示す。
図１５Ｂに示されるとおり、播種密度及びＤＳの産生を判定した。８Ｅ＋０３〜１０Ｅ＋０３細胞／ｃｍ２の範囲で播種したＨＥＫ ２９３細胞は、一貫した成長プロファイル、ｐＨ、グルコース消費、乳酸塩及びアンモニア発生を示した。加えて、同等の力価が生じたことから、やや高い播種密度であっても産生に悪影響はないことが示唆される。対照的に、１２×１０３細胞／ｃｍ２の高い密度で播種したリアクターは、他の条件と比較して平均力価が低いことを含め、デュプリケート間でより高いばらつきを呈したことから、この実験で用いられた手法が産生に最適でない可能性があることが示唆される。これらの結果から、バイオリアクター実験については細胞を８×１０３〜１×１０４細胞／ｃｍ２の範囲の密度で播種することが支持される。
実施例９：同等性評価
第１相臨床試験（工程Ａ）に使用したＡＶＸＳ−１０１薬物製品とピボタル臨床試験（工程Ｂ）に使用した薬物製品との間の同等性を主要目的として評価し、副次目的は、薬物製品ロット６００１５６及び６００３０７を比較することにより、工程Ｂを用いる製造の一貫性を評価することであった。図１６は、第１相（工程Ａ）及び第３相試験（工程Ｂ）製造工程フロー及びそれらの違いを表す。
同等性評価は、ネーションワイド小児病院（Ｎａｔｉｏｎｗｉｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ：ＮＣＨ）で製造された第１相臨床薬物製品ロットＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３及びＡｖｅＸｉｓで製造された薬物製品ロット６００１５６を使用して実施した。
製品
表１６に要約するとおり、以下の材料ロットを判定した。この評価には、工程Ａを用いた第１相臨床薬物製品ロットＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３及び工程Ｂを用いたＡＶＸＳ−１０１薬物製品ロット６００１５６から得られた品質特性の直接比較が含まれた。加えて、スケールアップ工程の再現性及び一貫性に関してロット６００１５６の出荷時試験結果をロット６００３０７と共に総合的に判定した。
製造工程概要
図１７Ａ〜図１７Ｂは、同等性結果の要約を提供する。
同等性及び製造の一貫性評価
同等であると評価されたための工程Ａ及び工程Ｂ材料、並びに工程Ｂ材料は一貫性があると評価された。工程Ｂ材料はまた、更なる利益、例えば工業規模産生上の利益を有することも決定された。
試験方法
ｐＨ
ロットＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３（工程Ａ）、ロット６００１５６（工程Ｂ）及びロット６００３０７（工程Ｂ）に関してｐＨ分析を実施した。いずれの工程の結果も、７．９〜８．０の範囲であった。これにより、工程Ａ及び工程Ｂ材料のｐＨが同等であったこと、及び工程Ｂ材料に一貫性があることが実証された。
外観
ロットＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３（工程Ａ）、ロット６００１５６（工程Ｂ）及びロット６００３０７（工程Ｂ）に関して目視検査により外観を調べた。工程Ａと工程Ｂとの外観結果の明らかな違いは、ベクター濃度（ゲノム力価）が異なることに起因した。ロットＮＣＨ ＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３は工程Ｂロットよりもベクター濃度が低かった。結果として、ロットＮＣＨ ＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３は希釈度が高くなり、より澄明な無色の溶液につながった一方、工程Ｂロットについての無色〜白色のやや不透明な観察結果は、１ｍＬ当たりの溶液中のウイルス粒子濃度が約４倍であることに起因する。
濃度が異なることを考慮すると、工程Ａ及び工程Ｂ材料の外観は同等であると評価され、工程Ｂ材料には一貫性があると評価された。
オスモル濃度
ロットＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３（工程Ａ）、ロット６００１５６（工程Ｂ）及びロット６００３０７（工程Ｂ）に関して凝固点降下によりオスモル濃度を調べた。いずれの工程の結果も、４１０〜４１５ｍＯＳｍ／ｋｇの範囲であった。これにより、工程Ａ及び工程Ｂ材料のオスモル濃度が同等であったこと、及び工程Ｂ材料に一貫性があったことが実証された。
サブビジブル粒子
ロットＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３（工程Ａ）、ロット６００１５６（工程Ｂ）及びロット６００３０７（工程Ｂ）に関して光遮蔽法によりサブビジブル粒子を調べた。いずれの工程の結果も、ＵＳＰモノグラフの注射用薬物製品に関する推奨限界値を十分に下回った。これにより、工程Ａ及び工程Ｂ材料のサブビジブル粒子数が同等であったこと、及び工程Ｂ材料に一貫性があったことが実証された。
ゲノム力価
ロットＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３（工程Ａ）、ロット６００１５６（工程Ｂ）及びロット６００３０７（工程Ｂ）に関してｄｄＰＣＲによりゲノム力価を調べた。ＡＶＸＳ−１０１ロットのゲノム力価は製造時の目標濃度に基づき変動することが予想された。工程Ｂ（３．７×１０１３ｖｇ／ｍＬ及び４．０×１０１３ｖｇ／ｍｌ）によって生じたゲノム力価は、工程Ａ（１．１×１０１３ｖｇ／ｍＬ）のゲノム力価の少なくとも３倍であったため、従ってＡＶＸＳ−１０１の大規模製造には工程Ｂの方が優れた方法であった。
感染力価
ロットＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３（工程Ａ）、ロット６００１５６（工程Ｂ）及びロット６００３０７（工程Ｂ）に関してＴＣＩＤ５０により感染力価を調べた。工程Ｂ（１．３×１０１０ＩＵ／ｍＬ及び６．７×１０９ＩＵ／ｍｌ）では工程Ａ（５．９×１０１０ＩＵ／ｍＬ）と比べて平均して６６％高い感染力価が生じた。これは、例えば、ｒＡＡＶ、例えばＡＶＸＳ−１０１の大規模製造に有利であり得る。
全タンパク質
ロットＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３（工程Ａ）、ロット６００１５６（工程Ｂ）及びロット６００３０７（工程Ｂ）に関してマイクロＢＣＡにより全タンパク質を調べた。１．０×１０１３ｖｇ／ｍＬに対して正規化すると、いずれの工程の結果も、１６７〜１７９μｇ／ｍＬの範囲であった。正規化した全タンパク質値により、工程Ａ及び工程Ｂ材料が同等であったこと、及び工程Ｂ材料に一貫性があったことが実証された。
インビボ相対効力
ロットＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３をアッセイの標準物質として使用した。標準検量線に基づけば、ロット６００１５６及びロット６００３０７について得られた各効力結果は、それぞれ９７％及び９６％であった。これらの結果により、工程Ａ及び工程Ｂ材料が同等であったこと、及び工程Ｂ材料に一貫性があったことが実証された。
ウエスタンブロットによるアイデンティティ
ロットＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３（工程Ａ）、ロット６００１５６（工程Ｂ）及びロット６００３０７（工程Ｂ）に関してウエスタンブロットによりアイデンティティを調べた。主バンド（ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３）のブロットプロファイル及び見かけの分子量値は工程Ａ及び工程Ｂ材料について同等であると評価され、及び工程Ｂ材料に一貫性があったこともまた評価された。
ＡＵＣによる％空のカプシド
ロットＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３（工程Ａ）、ロット６００１５６（工程Ｂ）及びロット６００３０７（工程Ｂ）に関してＡＵＣにより％空のカプシドを調べた。ロットＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３（工程Ａ）の結果は７％であった。ロット６００１５６及び６００３０７（工程Ｂ）の結果は、それぞれ２％及び４％であった。工程Ｂ（２％及び４％）では、産生された空のカプシドはＡＵＣにより測定したとき工程Ａ（７％）の約２分の１であった。従って、工程Ｂは、低濃度の空のカプシドを含む改良された組成物を産生可能であった。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるアイデンティティ及び純度
ロットＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３（工程Ａ）、 ロット６００１５６（工程Ｂ）及びロット６００３０７（工程Ｂ）に関してＳＤＳ−ＰＡＧＥによりアイデンティティ及び純度を調べた。いずれの工程の％総純度も≧９８％であり、３つのカプシドタンパク質の各々の結合パターン並びに見かけの分子量は高度に一貫性があった。これらの結果により、工程Ａ及び工程Ｂ材料が同等であったこと、及び工程Ｂ材料に一貫性があったことが実証された。
残留宿主細胞タンパク質
ロットＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３（工程Ａ）、ロット６００１５６（工程Ｂ）及びロット６００３０７（工程Ｂ）に関してＥＬＩＳＡにより残留宿主細胞タンパク質を調べた。試験した全てのロットの結果が、アッセイのＬＯＱ（８ｎｇ／ｍＬ）未満であった。これらの結果により、工程Ａ及び工程Ｂ材料が同等であったこと、及び工程Ｂ材料に一貫性があったことが実証された。
残留ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
ロットＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３（工程Ａ）、ロット６００１５６（工程Ｂ）及びロット６００３０７（工程Ｂ）に関して残留ＢＳＡを調べた。試験した全てのロットの結果が、アッセイのＬＯＱ（０．５０ｎｇ／ｍＬ）未満であった。これらの結果は、工程Ａ及び工程Ｂ材料が同等であること、及び工程Ｂ材料に一貫性があることを実証している。
残留ベンゾナーゼ
ロットＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３（工程Ａ）、ロット６００１５６（工程Ｂ）及びロット６００３０７（工程Ｂ）に関してＥＬＩＳＡにより残留ベンゾナーゼを調べた。試験した全てのロットの結果が、アッセイのＬＯＱ（０．２０ｎｇ／ｍＬ）未満であった。これらの結果は、工程Ａ及び工程Ｂ材料が同等であること、及び工程Ｂ材料に一貫性があることを実証している。
残留宿主細胞ＤＮＡ
ロットＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３（工程Ａ）、ロット６００１５６（工程Ｂ）及びロット６００３０７（工程Ｂ）に関してｑＰＣＲにより残留宿主細胞ＤＮＡを調べた。１．０×１０１３ｖｇ／ｍＬに対して正規化すると、工程Ａの結果は３．７×１０５ｐｇ／ｍＬであった一方、工程Ｂの結果は、それぞれ０．７６×１０５ｐｇ／ｍＬ及び０．６８×１０５ｐｇ／ｍＬであった。従って、工程Ｂでは、大幅に低い残留ｈｃＤＮＡのウイルスベクターが産生された。これは、例えば、ｒＡＡＶ、例えばＡＶＸＳ−１０１の大規模製造に有利であり得る。
統計的分析
定量的品質特性に関して統計的分析を実施した。比較は以下に挙げるとおりの工程Ａロット（ＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３）と各工程Ｂロット（６００１５６及び６００３０７）との間でペアワイズで実施した。これらの結果は図１８及び図１９に示す。
これらの試験は、工程Ｂが優れたウイルスベクター産生方法であることを示している。工程Ｂは、一貫してより多量のウイルスベクターを産生したとともに（ゲノム力価及び感染力価により測定したとき）、不純物がより少なく（残留ｈｃＤＮＡがより少なかった）、空のカプシドが少なかった。
次世代シーケンシング
次世代シーケンシング（ＮＧＳ）もまた実施して、工程ＢからのＡＶＸＳ−１０１薬物製品第３相材料のアイデンティティを確立し（ゲノム配列を決定及び／又は確認し）、それについて配列変異体（部分集団）が存在したかどうかを評価した。資金援助者から提供された参照配列（ｐｓｃＳＭＮ）に対する配列データセットのアラインメントにより、変異体検出を可能にするゲノムの全長にわたる完全な（１００％の）幅及び十分な深さのカバレッジが明らかになった。合計４つの軽微な変異位置が認められたが、しかしながらこれらは、真の変異体というよりむしろ、ＡＡＶの配列決定が困難な領域（例えば、その高いＧＣ含量及びパリンドローム配列のために配列決定が困難なことで有名な逆方向末端反復（ＩＴＲ））の範囲内でのシーケンシングエラーに相当するように見える。シーケンシング結果については表１７を参照のこと。
第１相ロットＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３安定性プロファイル
ロットＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３を≦−６０℃で１２ヵ月間貯蔵した。各時点でロットを分析した。好ましくない傾向は認められない。図２０に、現在までの安定性結果を示す。
第１相臨床試験に使用したＡＶＸＳ−１０１に関して同等性試験を完了した。評価は、ネーションワイド小児（Ｎａｔｉｏｎｗｉｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ）で製造された第１相臨床薬物製品ロットＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３及びＡｖｅＸｉｓで製造されたＡＶＸＳ−１０１薬物製品ロット６００１５６を使用して実施した。加えて、工程Ｂロット６００１５６及び６００３０７を使用して製造の一貫性を判定した。同等性評価（工程Ａ対工程Ｂ）及び製造の一貫性（工程Ｂロット６００１５６対６００３０７）の両方について、本試験では、新規改良された工程及び分析的方法を用いてＡＶＸＳ−１０１臨床試験材料のアイデンティティ、品質、純度、及び効力を判定し、同等性及び製造の一貫性のロバストな評価を可能にした。
定量的品質特性に関して統計的分析を実施した。比較は工程ＡロットＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３と工程Ｂロット６００１５６との間でペアワイズで実施した。工程Ａと比べて工程Ｂの方が、より高純度でより多量のウイルスベクターを産生した良好な方法であった。例えば、工程Ａと比較したとき、工程Ｂによって産生されたウイルスベクターは、感染力価が４８％高く、ゲノム力価（ｇｅｎｏｍｉｃ ｔｉｅｒ）が８％高く、１０μｍ径超のサブビジブル粒子が９２％少なく、２５μｍ径超のサブビジブル粒子が５０％少なく、空のカプシドが１００％少なく、及び残留ｈｃＤＮＡが１１％少なかった。結果は全て、各品質特性の試験限界と比べて一貫性があった。
更に、工程Ｂを用いた製造の一貫性を確立するため、ロット６００１５６及び６００３０７を使用してペアワイズ比較を実施した。工程Ｂロット６００１５６と６００３０７との間のこの初期ペアワイズ比較の結果は、製造の一貫性を呈している。同様に結果は全て、各品質特性の試験限界と比べて一貫性があった。
この結果判定に基づけば、工程Ａを用いた第１相臨床薬物製品ロットＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３及び工程Ｂを用いたＡＶＸＳ−１０１薬物製品ロット６００１５６から得られた品質特性により、工程Ｂではより多量のウイルスベクター及び純度の向上が生じたことが実証された。これは、例えばｒＡＡＶの大規模製造に有利であり得る。加えて、工程Ｂから生成されたこれらの２つの材料ロット（ロット６００１５６及び６００３０７）は再現性があり、更に製造の一貫性を呈することが見出された。
実施例１０：分析的超遠心（ＡＵＣ）分析
第１相（工程Ａ、ロットＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３）及び第３相（工程Ｂ、ロット６００１５６及び６００３０７）からの材料をＡＵＣ方法を用いて分析した。ＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３、６００１５６、及び６００３０７のＡＵＣプロファイル（デュプリケートで分析した）をそれぞれ、図２１、図２２、及び図２３に示す。
各材料のＡＵＣ分析は、空のカプシド含有量がそれぞれ２％及び４％である第３相材料（工程Ｂ、ロット６００１５６及び６００３０７）と比較したとき、上昇した空のカプシド含有量（７％）を示す第１相材料（工程Ａ、ロットＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３）では、空のカプシドと完全なカプシドとについて同様の沈降係数を呈する。これは、工程ＢにおけるＣｓＣｌ勾配超遠心製造ステップが、工程Ａに用いられているイオジキサノール勾配超遠心製造ステップと比較して、空のカプシドを完全なカプシドとより有効に分離可能であることに起因する。
臨床的及び商業的体裁を用いるＡＶＸＳ−１０１産生ロットは、超遠心を用いたＣｓＣｌ勾配精製工程に供したとき、ネーションワイド小児病院（Ｎａｔｉｏｎｗｉｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）で産生された第１相臨床試験材料（ＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３）及びＡｖｅＸｉｓによる各々の後続の生産ロットの両方において一貫してカプシドの３つの可視的バンドを呈する。工程Ａを用いた第１相臨床薬物製品ロットＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３及び工程Ｂを用いたＡＶＸＳ−１０１薬物製品ロット６００１５６のＡＵＣプロファイルに基づけば、これらの材料は同等と考えられる。加えて、工程Ｂから生成された２つの材料ロット（ロット６００１５６及び６００３０７）のＡＵＣプロファイルは一貫性があると評価された。
実施例１１−上流工程
上流工程を用いてワーキングセルバンクに由来する中間体を産生した。ここで上流工程は、（ａ）細胞を培養するステップ、（ｂ）培養細胞に図１に示されるとおりの３つのプラスミドをトランスフェクトするステップ、（ｃ）培養期間後に細胞から拡大したウイルス粒子を回収するステップ、（ｄ）ウイルス粒子をろ過によって精製して任意のインタクトな細胞又は細胞デブリを除去するステップ、（ｅ）ステップ（ｄ）からの溶出液をタンジェンシャルフローろ過に供するステップ、及び（ｆ）得られた精製ウイルス粒子中間調製物を凍結するステップを含む。
トランスフェクション前、フラスコ又は好適なバイオリアクター、又は両方において細胞を好適な培養培地中で拡大した。１つの培養培地は、１０％ＦＢＳ、４．５ｇ／Ｌグルコース、４ｍＭ Ｌ−グルタミン含有ＤＭＥＭである。一実施形態では、最初にフラスコ内で接着細胞を成長させて、次にｉＣＥＬＬｉｓバイオリアクターに移してバイオリアクター内で接着細胞を更に拡大させる。
細胞拡大後、接着ＨＥＫ２９３細胞に三重ＤＮＡプラスミドＰＥＩ共沈殿物をトランスフェクトした。このトランスフェクションに利用される３つのプラスミドは、ｐＳＭＮ、ｐＡＡＶ２／９、及びｐＨＥＬＰである。細胞拡大に使用したＤＭＥＭ成長培地を変法ＤＭＥＭトランスフェクション培地に交換する。ＤＭＥＭトランスフェクション培地は、ＦＢＳ不含、カルシウム不含、Ｌ−グルタミン不含で、且つ４．５ｇ／Ｌグルコースを含有した。大規模接着細胞バイオリアクターにおいてＰＥＩ共沈殿物を用いた接着ＨＥＫ２９３細胞への三重ＤＮＡプラスミドトランスフェクションを用いてｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ＳＭＮベクターを作製した。このベクタープラスミドｐＳＭＮはヒトＳＭＮのｃＤＮＡを含有する。このトランスフェクションに利用した３つのプラスミドは、ｐＳＭＮ（２２２ｍｇ）、ｐＡＡＶ２／９（３３３ｍｇ）、及びｐＨＥＬＰ（４４４ｍｇ）である。トランスフェクション培地は、ＰＥＩ−プラスミド共沈殿物を加える前に、バイオリアクター温度が＞３０℃になるまでバイオリアクター内で平衡化させた。ＰＥＩ−プラスミド共沈殿工程には、プラスミドをトランスフェクション培地に加えること、及び０．２μろ過して反応バッグに入れることが含まれた。ＰＥＩをトランスフェクション培地に加え、次に反応バッグに入れた。ＰＥＩ−プラスミド反応物を手動で混合して均一懸濁液を形成した。及びこの反応は１５〜３０分の時間にわたって行う。この反応時間の終わりに、バイオリアクターにＰＥＩ−プラスミド共沈殿物を加えた。このＰＥＩ−プラスミド共沈殿物をバイオリアクター内で１〜２時間にわたって混合させた後、再循環を再開した。次の培地交換前にＤＭＥＭ成長培地をバイオリアクターに１８〜２４時間再循環させた。
ｒＡＡＶ ＳＭＮゲノム（配列番号１のヌクレオチド９８０〜３３３６）は順番に、ＡＡＶ２ ＩＴＲ、サイトメガロウイルスエンハンサーを伴うニワトリβ−アクチンプロモーター、ＳＶ４０イントロン、（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００３４４．２）に示されるＳＭＮコードＤＮＡ、ウシ成長ホルモン由来のポリアデニル化シグナル配列及びもう一つのＡＡＶ２ ＩＴＲを有する。ＳＭＮ ＤＮＡの保存的ヌクレオチド置換もまた企図される（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００３４４．２の６２５位におけるグアニンからアデニンへの変更）。ゲノムはＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ ＤＮＡを欠いており、即ちゲノムのＩＴＲ間にＡＡＶ ｒｅｐ又はｃａｐ ＤＮＡはない。企図されるＳＭＮポリペプチドとしては、限定はされないが、ＮＣＢＩタンパク質データベース番号ＮＰ＿０００３３５．１に示されるヒトＳＭＮ１ポリペプチドが挙げられる。ｒＡＡＶ９ ＳＭＮベクターについては、Ｆｏｕｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２８（３）：２７１−２７４（２０１０）に記載され、ここでベクターゲノム挿入物の配列は、配列番号１のヌクレオチド９８０〜３３３６として示される）。
バイオリアクター６日目、トランスフェクションの１８〜２４時間後、バイオリアクターを排液し、ＤＭＥＭ再循環培地バッグを２００リットルの新鮮ＯｐｔｉＭＥＭトランスフェクション後培地に交換した。バイオリアクターに６４リットルを再充填し、バイオリアクターにおける再循環を再開した。７日目、６日目の培地交換から１８〜２４時間後、再循環バッグ（約１３５リットル）中のＯｐｔｉＭＥＭトランスフェクション後培地を新鮮なＯｐｔｉＭＥＭ培地バッグに交換した。このステップの間、バイオリアクターは排液しなかった。培地の再循環は、９日目の回収まで継続した。
バイオリアクター内で９日後、リアクターから最終的な回収前サンプルを採取し、細胞溶解工程を開始した。バイオリアクターに１００Ｕ／ｍＬの最終濃度となるようにベンゾナーゼを加えた。ベンゾナーゼをリアクター内で混合させた後、リアクターに７．１リットルの溶解溶液を加えた。最初の回収ステップ前に、溶解溶液をリアクター内で２時間混合した。２時間の溶解の終了時、バイオリアクターの内容物を回収バッグに移した。回収バッグに８．９リットルの塩ショ糖液（ＳＳＳ）を加え、１５分間混合した。このＳＳＳ溶液により回収培地中のベンゾナーゼがクエンチされた。次にバイオリアクターをバイオリアクターリンス緩衝液でリンスした。バイオリアクターのリンスには、バイオリアクターに６４リットルのバイオリアクターリンス緩衝液を加え、１５分間混合した。次にリンス液を共通の回収物収集バッグに移した。収集バッグにリンス液が加わった後、内容物を１５分間混合し、バルク回収物サンプルを採取した。
混合したバルク回収物をデプスフィルタでろ過して収集バッグに入れた。全てのバルク回収物がろ過された後、デプスフィルタを５０リットルのＴＦＦ１ダイアフィルトレーション緩衝液でチェーシング（ｃｈａｓｅ）した。デプスフィルタプール液を混合し、サンプリングした。次にデプスフィルタプール液を０．４５μｍフィルタでろ過してバルク回収物材料を更に清澄化した。次に０．４５μｍフィルタを６リットルのＴＦＦ１緩衝液でチェーシング（ｃｈａｓｅ）する。
ＴＦＦ１ステップについては、５．０ｍ２の３００ｋＤａＭＷカットオフ再生セルロース膜カセットをフラッシュし、ＮａＯＨ溶液で衛生化し、及びＴＦＦ１緩衝液で平衡化した。この作業の濃縮相は、清澄化された回収物の容積が約１０分の１に減少するように設計した。目標保持液容積に達した後、ダイアフィルトレーション作業を開始する。６ダイアボリュームのＴＦＦ１緩衝液で保持液のダイアフィルトレーションを行った。６ダイアボリュームの透過液総流量が実現した後、保持液を再び濃縮し、収集バッグに回収した。２回の連続的な膜リンスを実行してＴＦＦシステムからの産物回収率を最大化し、中間原薬が産生された。ＬＦＨフード内でＴＦＦ１中間体をアリコートに分けて１又は２リットル滅菌ＰＥＴＧボトルに入れ、次にドライアイス上又はフリーザー内で凍結し、−６０℃の貯蔵場所に移した。
実施例１２−下流工程
下流工程を用いて中間体をろ過済み原薬に処理した。下流工程ステップには、酸性化及び清澄化ステップ（ろ過を用いる）と、それに続く陽イオン交換クロマトグラフィー、タンジェンシャルフローろ過（「ＴＦＦ２」）、ＣｓＣｌ超遠心及び更なるタンジェンシャルフローろ過ステップ（「ＴＦＦ３」）が含まれ、これにより精製されたＡＡＶ粒子が薬学的に許容可能な担体中に懸濁されているろ過済み原薬が産生された。具体的には、下流工程は、ＴＦＦ１中間体の産生後に以下の製造ステップを含んだ：ＴＦＦ１中間体の解凍及びプール、酸性化及び清澄化、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）、タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ２）、ＣｓＣｌ超遠心による完全なカプシド／空のカプシドの分離、タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ３）による濃縮／緩衝液交換、ＴＦＦ３プール材料ろ過による原薬の生成、原薬の希釈及びろ過による薬物製品の産生、薬物製品の貯蔵及びバイアルへの薬物製品の充填。
ＴＦＦ１中間材料を解凍し、穏やかに混合した。Ｔｗｅｅｎ ２０を使用して、酸性ｐＨ下でのバルクの宿主細胞タンパク質及びＤＮＡのフロキュレーションを促進した。ＣＥＸクロマトグラフィーのため、１５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含有するＴＦＦ１中間体プールのｐＨを下げた（ｐＨ３．５）。次に、溶液をデプスフィルタ及び０．４５μｍフィルタでろ過することにより、ｐＨを下げた後に形成された沈殿物を取り除いた。
Ｔｗｅｅｎ ２０（２０ｍＭトリス、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１％ショ糖ｍ／ｖ、ｐＨ８．１中３６％Ｔｗｅｅｎ ２０溶液）をＴＦＦ１中間溶液に４時間かけてゆっくりと加え、２０％Ｔｗｅｅｎ ２０の最終濃度を実現した。室温（ＲＴ）で一晩インキュベートした後、ＴＦＦ１中間体／Ｔｗｅｅｎスパイクプールの１ｋｇ当たり約４ｇの１Ｍグリシン ｐＨ２．５を加えることによりＴｗｅｅｎ ２０含有ＴＦＦ１中間体のｐＨを下げて、３．５±０．１の目標ｐＨを実現した。ｐＨが許容範囲内になった後、溶液をＣｌａｒｉｓｏｌｖｅ ＰＯＤデプスフィルタ、それと直列の０．４５μｍ Ｏｐｔｉｃａｐ ＸＬ１０ Ｄｕｒａｐｏｒｅフィルタ又は０．８／０．４５μ ＰＥＳフィルタに通過させて、続いてこれらのフィルタをＣＥＸ緩衝液ＡでＰＯＤフィルタのホールドアップ容積の２倍＋ポリッシングフィルタの１ホールドアップ容積だけフラッシュした。
陽イオン交換（ＣＥＸ）捕捉クロマトグラフィーステップを用いてウイルスカプシドをタンパク質、ＤＮＡ及び他の工程不純物と分離した。このステップには、自動プロセスクロマトグラフィーシステムを用いて操作されるＣＩＭｍｕｌｔｕｓ Ｓ０３−８０００先端複合材料カラム（スルホニル）（細孔２μｍ）クロマトグラフィーカラム（８．０Ｌ）を利用した。緩衝液及び溶液については、以下の表に記載する。
清澄化し、酸性化したＴＦＦ１中間体のタンパク質含有量により、ＣＥＸカラム負荷を決定した。ＣＥＸカラムのタンパク質負荷は、最大カラム容量の７０％に設定した。
溶出ピークをＯＤ２８０における急激な上昇から開始して手動で収集した。ＯＤ２８０は伝導性が８０〜８５ｍＳ／ｃｍのとき上昇した。ＣＥＸ溶出物（産物）の近似容積は約２０リットル又は２．５ＣＶ（カラム容積）であった。ＣＥＸ溶出物は２つの画分で収集した。第１の画分はＯＤ２８０における急激な上昇から開始し、１．５ＣＶにわたって収集した。第２の画分は第１の画分の直後に開始し、１．０ＣＶにわたって収集した。これらの２つの画分をｐＨ９．０中和緩衝液を使用してｐＨ８．０±０．３０に中和した。
ＴＦＦ２ステップでは、濃縮し、タンパク質不純物を除去し、緩衝液をＣｓＣｌ超遠心ステップに適切な緩衝液に交換した。タンジェンシャルフローろ過システムを０．４ｍ２（２回のＣＥＸサイクル）又は０．２ｍ２（１回のＣＥＸサイクル）３００ｋ ＭＷＣＯ再生セルロース膜と併せて利用した。
この作業の濃縮相は、ＣＥＸ溶出物の容積を減少させた。目標保持液容積に達した後、不連続ＴＦＦモード（バッチモード）でダイアフィルトレーションを開始した。保持液を２倍希釈し、不連続ＴＦＦモードで８ダイアボリュームのＴＦＦ２ ＮａＣｌダイアフィルトレーション緩衝液及びその後８ダイアボリュームのＴＦＦ２ ＣｓＣｌダイアフィルトレーション緩衝液によるダイアフィルトレーションにかけた。ＣｓＣｌダイアフィルトレーションが完了した後、保持液をシステムのホールドアップ容積に依存する規定の容積に濃縮した。２回の連続的な膜リンスを実行してＴＦＦ２システムからの産物回収率を最大化した。
保持液供給速度は、透過液への２０％の変換速度（５００ｍＬの保持液供給高速当たり１００ｍｌの透過液流速）として５Ｌ／ｍ２／分（０．１ｍ２カセット当たり５００ｍＬ／分）に設定した。透過液流速は、透過液チューブ上のクランプによって、保持液供給流速の２０％の透過液流速が維持されるように制御した。
塩化セシウム勾配超遠心法を利用することにより、超遠心法を用いて完全なカプシドから空のカプシドを除去し得る。ＣｓＣｌ超遠心ステップには、タイプ５０．２ Ｔｉロータ又は等価なロータを備えた自動Ｏｐｔｉｍａ ＸＰＮ １００超遠心システム又は等価なシステムを使用した。超遠心チューブにＴＦＦ２精製後のろ過済み材料を、溶液に気泡が混入しないようにチューブ壁の内側に沿ってゆっくりと加えた。充填されたチューブを携帯型ヒートシーラで密封し、２０℃において３０２，０００ｇ（５０．２ Ｔｉロータで５０，０００ｒｐｍ）で１７時間遠心した。遠心ステップの完了後、超遠心機からチューブを取り出し、バイオセーフティキャビネットに置いた。産物の入ったチューブを廃棄物容器の上にあるリングスタンドにマウントした。ランプをチューブの真下に位置決めして、空のカプシドバンド（バンドＡが一番上のバンドである）、完全なカプシドのダブレットバンド（バンドＢ及びＣ、ダブレットの上及び下のバンド）、及びダブレットの下の一番下のバンドをチューブ上にマークした。３０ｍＬシリンジに取り付けられた１８Ｇ針をバンドＤのほんの少し下からチューブの中央まで挿入することにより、バンドＢ、Ｃ、及びＤを取り出した。収集された材料を滅菌１Ｌ ＰＥＴＧボトルに移した。全ての遠心チューブからの材料を滅菌１Ｌ ＰＥＴＧボトルにプールして超遠心機（ＵＣ）プールを作製した。ＣｓＣｌ超遠心ステップ用の緩衝液を以下の表に挙げる。
ＴＦＦ３ステップでは、ＣｓＣｌを除去し、最終製剤化緩衝液を使用して充填ベクターを濃縮した。タンジェンシャルフローろ過システムを２つの５０ｃｍ２ ３００ｋ ＭＷＣＯ再生セルロース膜と併せて利用した。ＴＦＦ３作業の濃縮相は、残留ＣｓＣｌの濃度及びＵＣプールの容積が減少するように設計した。目標保持液容積に達した後、ダイアフィルトレーションを開始した。１０ダイアボリュームのＴＦＦ３緩衝液で保持液のダイアフィルトレーションを行った。ダイアフィルトレーションが完了した後、濃縮された保持液を０．２μｍ Ｐａｌｌ Ｓｕｐｏｒ（登録商標）ＥＫＶ滅菌用グレードフィルタ（Ｍｉｎｉ Ｋｌｅｅｎｐａｋ）フィルタに通して二次コニカルチューブに移した。
膜の連続的なリンスを実行してＴＦＦ３システムからベクターを回収した。先にＴＦＦ３保持液を保持した一次コニカルチューブにＴＦＦ３緩衝液を加えた。この材料をセルロース膜を通じて再循環させた。再循環後、フラッシュ液を０．２μｍ Ｐａｌｌ Ｓｕｐｏｒ（登録商標）ＥＫＶ滅菌用グレードフィルタ（Ｍｉｎｉ Ｋｌｅｅｎｐａｋ）フィルタに通して二次コニカルチューブに移した。ＴＦＦ３濃縮物及び部分的プールを混合して、≧４．５×１０１３ｖｇ／ｍＬの原薬（プールされたＴＦＦ３保持液＋２回のリンス液）の最終ベクター濃度を実現した。
膜の連続的なリンスを実行してＴＦＦ３システムからの産物回収率を最大化した。先にＴＦＦ３保持液及び初期フラッシュ材料を保持した一次コニカルチューブにＴＦＦ３緩衝液を加えた。この材料をセルロース膜を通じて再循環させた。二次コニカルチューブにおいて決められた重量が実現するまで、二次フラッシュ液を０．２μｍ Ｐａｌｌ Ｓｕｐｏｒ（登録商標）ＥＫＶ滅菌用グレードフィルタ（Ｍｉｎｉ Ｋｌｅｅｎｐａｋ）フィルタに通して二次コニカルチューブに移した。この最終濃縮溶液が、原薬（ＤＳ）と称される。
ＤＳをＰａｌｌ Ｓｕｐｏｒ（登録商標）ＥＫＶ滅菌用グレードフィルタ（Ｍｉｎｉ Ｋｌｅｅｎｐａｋ）でろ過し、滅菌使い捨てアセンブリを使用して滅菌１Ｌガラスボトルに入れた。ＴＦＦ３プールのろ過前に、蠕動ポンプを使用してＴＦＦ３緩衝液をフィルタに通過させ、廃棄物フラッシュバッグに廃棄することにより、フィルタをフラッシュした。次に蠕動ポンプを使用してフラッシュ済みのフィルタで原薬（ＤＳ）をろ過し、１Ｌ滅菌ガラスボトルに収集した。５×１０１３ｖｇ／ｍＬの目標としたＤＳ濃度に基づき、ＤＳを保持する二次コニカルチューブにＴＦＦ３緩衝液を加え、３．５×１０１３ｖｇ／ｍＬの目標濃度となるようにフィルタに通して希釈薬物製品（「ＤＰ」）を調製した。
ＤＰの調製のためのフィルタフラッシュ及びＤＳ希釈に使用されるＴＦＦ３緩衝液は、以下の配合を含む。
５ｍＬの滅菌した既製のＣｒｙｓｔａｌ Ｚｅｎｉｔｈ（ＣＺ）バイアルにＤＰを充填し、滅菌した既製の栓で栓をして、滅菌した既製のシールで密封した。
実施例１３−効力アッセイ
薬物製品の相対効力を定量的インビボアッセイを用いて測定した。このアッセイでは、確立されたＳＭＡ疾患マウスモデルを使用した。つがいのＳＭＡΔ７マウス系統（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、＃００５０２５）は、表現型は正常であるが、その子孫の約２５％が、標的となるＳＭＮ遺伝子突然変異に関してホモ接合であり、ＳＭＡ様表現型を示す。これらのマウスは５日目までに筋脱力の徴候を示し、その翌週には歩行異常を生じて転び易くなる。Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓは、ＳＭＡ様表現型を有する動物の平均生存期間を約１５±２日と報告している。パイロット試験では、ＳＭＡ様表現型を有する未治療の動物について１６．３日の生存期間中央値が実証された（幾何平均；ｎ＝３試験；試験当たり１０匹のマウス）。
生物学的に活性な薬物製品を静脈内（ＩＶ）注入によって投与すると、用量（ｖｇ／ｋｇ）の関数である生存期間の増加が得られる。標準物質（先行ベクターバッチ）と比べた薬物製品効力を測定した。薬物製品及び標準物質の力価（ベクターゲノム／ｍＬ；ｖｇ／ｍＬ）をドロップレットデジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄｄＰＣＲ）によって決定した。ベクターを生理食塩水に希釈して、ＳＭＡ様表現型を有するマウスに投与されることになる３つの指定用量レベルの各々を実現した。
アッセイの結果は、そのアッセイが適合性を満たす場合、受入れ可能と考えられる。アッセイ適合性は、以下からなる：
４．陰性対照サンプルの受入れ限界（１５±２日、生存期間中央値）
５．陽性対照サンプルの受入れ限界（＞４０日、生存期間中央値）
６．参照標準生存期間中央値用量反応曲線の受入れ限界
本試験においては、先行ベクターバッチ（以下、先行バッチ）を使用して、０．９％生理食塩水を使用した０（ゼロ）用量（未治療群）を含む５つの異なる用量レベルで薬物製品を投与したときのＳＭＡΔ７マウスの生存期間中央値（日）の間の線形相関を決定した。表２４は、先行バッチ参照バッチを使用した検量線を示す。
この試験のデータにより、生存期間中央値用量反応曲線の直線範囲は０〜７．４ｖｇ／ｋｇであったことが実証された。先行バッチ参照標準の線形回帰曲線を薬物製品バッチ８１６８３６線形回帰曲線と比較することにより、薬物製品バッチ８１６８３６の相対効力を確立した。これは、各線形回帰線（即ち、参照標準及び試験物質）のｙ切片及び傾きの比を用いることにより達成された。パーセント相対効力計算は、以下の式（１）に記述される：
％ＲＰ＝［（試験物質のｙ切片／傾き）÷（参照標準のｙ切片／傾き）］×１００（１）
第１相臨床試験で使用したＮＣＨ０６１３バッチを参照標準バッチとして使用し、１００％の効力を割り当てた。
前述のデータにより、生存期間中央値用量反応曲線の直線部分を用いて予備的アッセイ受入れ判定基準が確立され、薬物製品臨床バッチの相対効力が以下のとおり決定された：
・５つの用量（ｖｇ／ｋｇ）レベルを使用して生存期間中央値（日）用量反応曲線を作成した
・線形用量反応モデルの実行に用量０、１．２Ｅ＋１３及び７．４Ｅ＋１３を選択した。
・生理食塩水（未治療群）の適合性限界は１３〜１７日の生存期間中央値であった。
・参照標準サンプルの適合性限界は、以下と確立された：
〇傾き≧２．０Ｅ−１３
〇ｙ切片≧１６．００（日）
〇ｙ切片／傾き比≧８．５Ｅ＋１３
〇Ｒ２≧０．７
Δ７マウスモデルを使用して、薬物製品を含めたＳＭＡ療法薬の有効性を実証した。１５日±２日の生存期間中央値では、未治療又は生理食塩水治療対照動物は信頼できるベースライン対照を提供し、それからの生存期間中央値の増加として製品効力を測定することができる。薬物製品による開発作業では、投与用量（ｖｇ／ｋｇ）を対数変換して、治療されたＳＭＡΔ７新生仔マウスの生存期間中央値（日数単位）に対してプロットしたとき線形相関でマウスモデルの生存に影響を及ぼすドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を用いたゲノム力価によって決定される３つの用量（媒体治療用量を除く）が同定された。低力価、中間力価、及び高力価標準については、表２６の標準力価（ｖｇ／ｍＬ）を参照のこと。加えて、検量線ゼロ点並びに陰性対照の両方にＴＦＦ緩衝液（媒体）溶液が使用される。≧４０日の生存期間を実証する用量（生存期間中央値の倍増を実証する用量より高い）もまた、陽性対照として含めた。
用量溶液調製（希釈スキーム例については表２６を参照のこと。
陰性対照−０．９％生理食塩水を陰性対照として使用する
陽性対照−試験物質ロットは生理食塩水を使用して１．５×１０１４ｖｇ／ｋｇで調製する。
参照標準溶液−参照標準ロットは、生理食塩水を使用して表２５に説明される３つの濃度で調製する。
試験物質調製−生理食塩水を使用して試験物質を希釈した。希釈は、マウス当たり５０μｌの最終総容積中、表２６に説明される試験用量（ｖｇ／ｋｇ）が生じるように計算した。希釈はその時点で１０匹のマウスについて行い、治療されたマウスの最低寿命を≧４０日の生存期間中央値（日）に増加させることを目標とした陽性対照としての１つの追加の容積を含んだ。
対照サンプルの受入れ限界
陰性対照（未治療マウス）−陰性対照群のアッセイ受入れ限界は、ＳＭＡΔ７マウスが１５±２日の生存期間中央値を達成することであった。加えて、１０日以内に死亡するマウスはいずれも、分析から除外することになる。群に８匹以上のマウスが使用される場合、１０日以内の死亡について最大２匹のマウスを除外し得る。
陽性対照（目標臨床用量で治療される群）−陽性対照群のアッセイ受入れ限界は、治療されたマウスの寿命が最低でも≧４０日の生存期間中央値であることであった。加えて、１０日以内に死亡するマウスはいずれも、分析から除外することになる。群に８匹以上のマウスが使用される場合、１０日以内の死亡について最大２匹のマウスを除外し得る。
参照標準用量反応曲線の受入れ限界
投与用量（ｖｇ／ｍＬ）に対して生存期間中央値（日）をプロットする参照標準線形用量反応曲線について、アッセイ適合性判定基準が決定されることになる。アッセイ適合性判定基準については表２７を参照のこと。
Ｙ切片／傾き比−参照標準及び試験物質についての投与用量（ｖｇ／ｋｇ）に対する生存期間中央値（日）の線形回帰曲線を決定する。各線形回帰について傾きに対するｙ切片の比を計算する。
結果報告
相対効力結果の定性的報告−アッセイ毎にアッセイ適合性判定基準を判定した後、陽性対照材料について一点での生存期間中央値（日）読取りが≧４０日にあることを決定する。陽性対照群の生存期間中央値が≧４０日である場合、判定基準不適合が満たされる場合にはその試験物質は処分され得る。
相対効力結果の定量的報告−アッセイ毎にアッセイ適合性判定基準を判定した後、試験物質の相対効力を定量的に決定する。陽性対照が≧４０日に達し、且つ７．５×１０１３ｖｇ／ｋｇの上側標準用量に相当するマウス群について３１±３日の生存期間中央値が達成されたら、その試験物質の相対効力を報告し得る。試験物質のパーセント相対効力（％ＲＰ）は、生存期間中央値（日）用量反応の線形回帰のｙ切片及び傾きを用いて以下のとおり計算されることになる：
％ＲＰ＝１００％×［（試験物質ｙ切片／傾き）÷（参照標準ｙ切片／傾き）］
実施例１４−脊髄性筋萎縮症のための単回用量遺伝子置換療法：用量研究
脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）は、生存運動ニューロン１をコードする遺伝子（ＳＭＮ１）の喪失又は機能不全によって生じる重篤な小児単一遺伝子疾患である。この疾患の発生率は１０，０００人の出生に約１人であり、保因者頻度は５４人に１人である。ＳＭＡは下位運動ニューロンの変性及び喪失によって特徴付けられ、これが筋萎縮につながる。この疾患は、発症年齢及びマイルストーン獲得に基づき４つの亜型（１〜４）に分けられる。ＳＭＡ１型（ＳＭＡ１）は最も重症型であり、乳児死亡の最も多い遺伝的原因である。ＳＭＡには２つの形態のＳＭＮがある；ＳＭＮ１は、ＳＭＮタンパク質の機能的産生に関与する主要な遺伝子である。ＳＭＮ２はスプライシングの間にエクソン７を優先的に除外し、結果として、ＳＭＮ１と比較すると機能性ＳＭＮタンパク質をごく一部しか産生しない。従って、ＳＭＮ２コピー数は疾患表現型を修飾し、ＳＭＮ２の２つのコピーの存在がＳＭＡ１に関連する。ＳＭＮ１両アレル欠失及び２コピーのＳＭＮ２を有する乳児は、ＳＭＡ１のリスクが９７％である。
ＳＭＡ１の自然歴（歴史的コホート）の最近の研究では、この疾患を有する乳児の間での症状発現時の年齢中央値が１．２ヵ月（範囲、０〜４ヵ月）であり、この疾患は、筋緊張低下、乳児期早期からの重度の脱力、及び支持なしでの座位不能によって特徴付けられることが示された。２コピーのＳＭＮ２を有するＳＭＡ１乳児では、死亡時又は少なくとも１４日連続で１日少なくとも１６時間の非侵襲的換気（持続的換気と等価と考えられる）が必要となる時点の年齢中央値は１０．５ヵ月であった。罹患小児の１つのコホートでは、１３．６ヵ月時点で持続的換気補助なしに生存したのは僅か２５％であり、２０ヵ月までにこの補助なしに生存したのは８％であった。２コピーのＳＭＮ２を有する患者に関する国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）の支援を受けた別の前向き多施設歴史的研究（ＮｅｕｒｏＮＥＸＴ）は、８ヵ月の気管開口術なしの生存期間中央値を示した（９５％信頼区間、６〜１７）。全てのＳＭＡ１患者が出生後に呼吸及び嚥下機能が急激に低下し、最終的には、十分な栄養を維持し及び誤嚥に伴う呼吸器リスクを低減するため、（経鼻胃チューブ又は胃瘻チューブからの）機械的栄養補助が必要になる。症状の発現が３ヵ月齢までに起こるＳＭＡ１患者について、ほとんどの患者は１２ヵ月齢までに栄養補助が必要となる。
ＳＭＡ１患者はまた、ＣＨＯＰ ＩＮＴＥＮＤ（フィラデルフィア小児病院乳児神経筋疾患検査）尺度で測定したとき、運動機能の主要なマイルストーンを獲得せず、機能低下がある（ＣＨＯＰ ＩＮＴＥＮＤは０〜６４の範囲をとり、ここではスコアが高いほど良好な運動機能であることを指し、四肢の抗重力運動など、運動機能の僅かな変化に感受性があるツールである）。３４人のＳＭＡ１患者の歴史的分析では、１人を除く全ての患者が６ヵ月齢以降は少なくとも４０のスコアに達しなかった。ＮｅｕｒｏＮＥＸＴコホートでは、ＣＨＯＰ ＩＮＴＥＮＤスコアは６ヵ月齢〜１２ヵ月齢の間に平均１０．７点下がった。
運動ニューロンのＳＭＮタンパク質レベルを増加させる治療戦略は、ＳＭＮ２の有効性を亢進させることに重点が置かれてきた。一つの手法は、ＳＭＮ２におけるエクソン７スプライシングを阻害するために開発されたアンチセンスオリゴヌクレオチドであるヌシネルセン（Ｉｏｎｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ／Ｂｉｏｇｅｎ）の中枢神経系送達とされている。この薬物は、重症ＳＭＡのマウスモデルにおいて脱力を改善し、罹患マウスの平均寿命を１６日から２５日に増加させることが示されている。２０１６年１２月にヌシネルセンはＳＭＡの治療に食品医薬品局（Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）によって承認された。この薬物は、生後２ヵ月以内における４負荷用量後の反復髄腔内注射を用いて投与される。
可能性のある別のＳＭＡ１治療は遺伝子療法であり、これは、自己相補的アデノ随伴ウイルス血清型９型（ｓｃＡＡＶ９）（この組換えウイルスのコード領域は分子内二本鎖ＤＮＡ［又は自己相補的］鋳型を形成する）でＳＭＮのコピーを送達する単回静脈内投与として与えられる。この手法によって運動ニューロン及び末梢組織におけるＳＭＮ発現が誘導されており、それがマウスモデルにおけるＳＭＡの効果を抑え、このモデルの平均生存期間を１５日から低用量（体重１キログラム当たり６．７×１０１３ｖｇ）では２８．５日及びより高用量のベクター（１キログラム当たり２．０×１０１４及び３．３×１０１４ｖｇ）では２５０日を超えるまでに延長させている。
ＳＭＮタンパク質が遍在的に発現し、且つＳＭＡ１が、多くの細胞型（例えば、心臓、膵臓、及び骨格筋）と共に、複数の系（例えば、自律神経系及び腸管神経系、心血管系、及び膵臓）に発症することを踏まえると、血液脳関門を越え、且つ脊髄のあらゆる領域にある中枢神経系ニューロンを標的とすることに加え、ＡＡＶ９媒介性遺伝子療法の全身投与が有利であり得る。ハイブリッドサイトメガロウイルスエンハンサー−ニワトリβアクチンプロモーターと組み合わせたこのベクターの自己相補的特徴が、ＳＭＮの迅速且つ持続的な発現を可能にする。２０１４年４月、本発明者らは、ニワトリβ−アクチンプロモーターの制御下にあるヒト生存運動ニューロン遺伝子（ｈＳＭＮ）の送達を伴う単回用量のｓｃＡＡＶ９（ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＳＭＮ）（ＡＶＸＳ−１０１）の投与を受けたＳＭＡ１乳児が関わる遺伝子置換療法の試験を開始した。
方法
患者及び試験手順：本試験の目的上、患者は全て、ＳＭＡ１の遺伝子確定診断、ホモ接合性ＳＭＮ１エクソン７欠失、及び２コピーのＳＭＮ２を有した。ＳＭＮ２のエクソン７にｃ．８５９Ｇ→Ｃ疾患修飾因子を有する患者は除外した。選択された患者は、出生直後から６ヵ月齢までに、運動技能遅滞、定頸不全、円背姿勢及び関節過度可動性を伴う臨床評価によって決定されるとおりの筋緊張低下によって特徴付けられる疾患の発現を示していた者であった。活動性ウイルス感染症（ＨＩＶ又はＢ型若しくはＣ型肝炎の血清陽性を含む）又は不必要な遺伝子導入リスクをもたらす併発疾患を有する患者は本試験から除外した。侵襲的換気補助（陽圧法を伴う気管切開術）が必要な患者又はスクリーニングビジット時にパルスオキシメトリ＜９５％飽和の患者もまた除外した。
患者は、投与される遺伝子療法の用量に基づく２つのコホートに登録した。コホート１の患者は低用量（１キログラム当たり６．７×１０１３ｖｇ）の投与を受け、５ヵ月にわたって登録した；コホート２の患者は高用量（１キログラム当たり２．０×１０１４ｖｇ）の投与を受け、１年にわたって登録した。投与後３０日目、コホート１の患者１に対するＩＦＮ−γ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによりＴ細胞応答が検出され、ＡＡＶ９カプシドに対して＞５０である１０６個の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）当たりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）の急増が示された（正常、１０６個のＰＢＭＣ当たり＜５０ＳＦＣ）。プレドニゾロンを２ｍｇ／ｋｇで開始し、３５日間、Ｔ細胞応答及び血清トランスアミナーゼが低下するまで維持した。結果として、この実験プロトコルは修正され、患者２〜１５は１日１キログラム当たり１ｍｇの用量の経口プレドニゾロンの投与を遺伝子ベクターの投与２４時間前から開始して約３０日間受けた。治療は、プレドニゾロンを維持しながら、ＡＳＴ及びＡＬＴ酵素が１２０ＩＵ／Ｌのレベルを下回り且つＴ細胞応答が１０６個のＰＢＭＣ当たり１００ＳＦＣを下回るまで継続した後、臨床上の判断に基づきプレドニゾロンを漸減することになった。
ベクターは通常生理食塩水（１キログラム当たり約１０〜２０ｍｌ）に入れて送達し、これは約６０分間で静脈内注入した。一部の患者は登録時点で胃瘻造設術又は経鼻胃チューブを用いた経腸栄養が必要であったが、その選択は親又は主治医の意向に基づいた。本試験に登録後は、栄養補助が必要な全ての患者に胃瘻チューブの留置を行い、試験中、チューブは抜去しなかった。
アウトカム：主要アウトカムは、グレード３以上の任意の治療関連有害事象を基準とする安全性の決定であった。副次アウトカムは、死亡までの時間又は持続的換気補助の必要性であった。後者は、急性の可逆的疾患がない又は周術期状態でない中での、少なくとも１４日間連続で１日少なくとも１６時間の呼吸補助として定義した。探索的アウトカムには、運動マイルストーンの獲得（特に、支持なしでの座位）及びＣＨＯＰ ＩＮＴＥＮＤスコアが含まれた。
ＳＭＡにおけるＣＨＯＰ ＩＮＴＥＮＤ尺度の適用においては、４０点を超えるスコアの維持が臨床的に有意味と見なされている。支持なしでの座位は、以下の判定基準により判定し、等級分けした：ベイリー乳幼児発達尺度（Ｂａｙｌｅｙ Ｓｃａｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｆａｎｔ ａｎｄ Ｔｏｄｄｌｅｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）粗大運動下位検査の項目２２による、少なくとも５秒間の支持なしでの座位（「支持なしでの座位」）；世界保健機関（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ：ＷＨＯ）判定基準による、少なくとも１０秒間の支持なしでの座位（「ＷＨＯ判定基準に従う支持なしでの座位」）；及び上述のベイリー尺度（Ｂａｙｌｅｙ Ｓｃａｌｅｓ）の項目２６による、少なくとも３０秒間の支持なしでの座位（「自力での機能的座位」）。主要な運動マイルストーンは、インタラクティブビデオ判定によって捉えた能力−ミニ（Ａｂｉｌｉｔｙ Ｃａｐｔｕｒｅｄ Ｔｈｒｏｕｇｈ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ Ｖｉｄｅｏ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ−ｍｉｎｉ：ＡＣＴＩＶＥ−ｍｉｎｉ）によって独立した評価者が患者のビデオ記録を調べることにより確認した。複合筋活動電位（ＣＭＡＰ）はベースライン時及び注入後６ヵ月毎に表面電極から記録した。筋肉の病理学的状態は電気インピーダンスミオグラフィー（ＥＩＭ）によって定量化した。
統計的分析：全ての患者において安全性分析を実施し、これらの患者はまた、一次生存分析（上記及びプロトコルに定義するとおり）並びにＣＨＯＰ ＩＮＴＥＮＤ尺度のベースラインから１ヵ月及び３ヵ月までの変化の分析にも含まれた。かかるベースラインから各試験ビジットまでの変化は、反復測定混合効果モデルを用いて分析した。混合モデルは、コホート及びビジットの固定効果並びにベースラインスコアの共変量を含んだ。コホート２ではマイルストーンの獲得並びに栄養及び換気補助を分析した。統計的分析は、ＳＡＳソフトウェア、バージョン９．４を使用して実施した。歴史的コホートとの比較は全て、もっぱら記述的とした。
結果
患者：スクリーニングを受けた１６人の患者のうち、１人は抗ＡＡＶ９抗体力価の持続的上昇（＞１：５０）が理由で除外した。本試験に組み入れた１５人の患者のうち、３人が低用量コホート１に登録し、１２人が高用量コホート２に登録した。治療時点での患者の平均年齢は、コホート１で６．３ヵ月（範囲、５．９〜７．２）、及びコホート２で３．４ヵ月（範囲、０．９〜７．９）であった（表２８）。
生存及び持続的換気：試験終了時、全ての患者が少なくとも２０ヵ月齢に達しており、持続的機械換気は不要であった；その最新の肺評価時における年齢中央値はコホート１で３０．８ヵ月、及びコホート２で２５．７ヵ月であった。対照的に、歴史的コホートの患者で持続的機械換気が不要であったのは８％に過ぎなかった。コホート１の１人の患者は、２９ヵ月齢の時点で流涎過多のため持続的換気を必要とした。唾液腺結紮後、非侵襲的換気を使用する必要性が１日１５時間に２５％低下した。
運動機能評価：コホート１及び２の全ての患者においてＣＨＯＰ ＩＮＴＥＮＤ尺度に関してベースラインからのスコア増加があり、試験中、その変化が維持された。コホート２の患者は平均増加が１ヵ月時点で９．８点及び３ヵ月時点で１５．４点であった（両方の比較についてＰ＜０．００１）；１１人の患者は４０点を超えるスコアを達成し、維持した。２０１７年８月７日の試験カットオフ時、コホート１の患者は１６．３点の平均ベースラインから平均７．７点増加し、コホート２の患者は２８．２点の平均ベースラインから平均２４．６点増加した。
コホート２における運動マイルストーン：コホート２の１２人の患者のうち合計１１人が少なくとも５秒間、１０人が少なくとも１０秒間、及び９人が少なくとも３０秒間の支持なしでの座位が可能であった（表３１）。合計１１人が定頸を獲得し、９人が寝返りでき、並びに２人がずり這い、つかまり立ち、単独立位、及び独歩が可能であった。１１人の患者は発話能力を達成した。歴史的コホートの患者でこれらの運動マイルストーンのいずれかを獲得した者はおらず、発話能力を獲得した者もほぼいなかった。
コホート２における肺及び栄養状態：コホート２の１２人の患者の中で、１０人はベースライン時に非侵襲的換気が不要であったのに対し、最終回のフォローアップビジット時に換気補助を受けていなかったのは７人であった（表２９）。ベースライン時、７人の患者は経腸栄養が不要であったが、その中の１人は後に、恐らくは脊柱側彎症手術に関連して遺伝子置換療法後に胃瘻チューブの留置が必要になった。遺伝子置換療法前に経腸栄養を受けていた５人の患者のうち、最終回のフォローアップ時には、１２人中１１人の患者が自力での嚥下能力を獲得又は保持しており、４人が経口摂取可能であった。
安全性：試験終了時点で、２つのコホートの１３人の患者に合計５６件の重篤有害事象が認められた。治験責任医師らは、有害事象共通用語規準（Ｃｏｍｍｏｎ Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ Ａｄｖｅｒｓｅ Ｅｖｅｎｔｓ）に従い、検査値に基づけばこれらの事象のうち２件の事象が治療関連グレード４事象であると決定した（表３０）。コホート１の患者１には血清アミノトランスフェラーゼ値の上昇（アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）について正常範囲上限の３１倍及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）について上限の１４倍）があったが、他の肝機能異常（即ち、総ビリルビン及び間接ビリルビン並びにアルカリホスファターゼ）はなく、臨床症状はなかった。上記に記載したとおり、これらの上昇はプレドニゾロン治療によって軽減され、プレドニゾロン治療は続いて残りの患者にも投与された。コホート２の１人の患者は、血清ＡＬＴ及びＡＳＴ値の上昇（ＡＬＴについて正常範囲上限の３５倍及びＡＳＴについて３７倍）を軽減するために追加的なプレドニゾロンが必要であった。２４１件の非重篤有害事象のうち、２人の患者における３件が治療関連と見なされ、無症候性の血清アミノトランスフェラーゼ値上昇からなったが（ＡＬＴ及びＡＳＴ、両方ともに正常範囲上限の１０倍未満）、これらは追加のプレドニゾロン治療なしに解消された（表０．肝機能検査に他の異常はなかった。１５人の患者のうち１４人は、ＳＭＡ１小児において高頻度で死亡又は気管開口術の必要性を招くことになる呼吸器疾患を有した。
ＳＭＮをコードするＤＮＡを含有するアデノ随伴ウイルスベクターをＳＭＡ１患者において単回静脈内注入すると、この疾患の歴史的コホートと比べて生存が延びた。１５人の患者全てが、２つのＳＭＮ２コピーを有するＳＭＡ１患者についての１０．５ヵ月というこれまでに報告されている持続的換気なしでの生存の年齢中央値を超えた。また全ての患者が、典型的には僅か８％のこの疾患の患者が持続的換気なしに生存するに過ぎない時点である２０ヵ月のベンチマークも超えた。コホート２の１２人の患者のうち４人は、１人を除き全員が、歴史的コホートでは報告されたことのない運動機能マイルストーンを獲得した。達成された運動機能は、摂食（手から口へ）、座位、及び発話に反映されるとおり、臨床的に有意味であった。登録時に補助ケアが不要であった患者の大半は、最終回のフォローアップビジット時に栄養補助（７人中６人の患者）及び換気補助（１０人中７人の患者）なしであった。２つのコホートにおいて、患者はＣＨＯＰ ＩＮＴＥＮＤ尺度のスコアがベースラインから増加した。コホート２における最初の１ヵ月以内の平均増加は９．８点であり、これはＮｅｕｒｏＮＥＸＴ研究における歴史的コホートで６〜１２ヵ月齢の間に平均１０点超低下したのと対照的であった。
ＳＭＮΔ７マウスモデルにおけるＳＭＮ遺伝子置換療法の前臨床試験では、恐らくは運動ニューロンがまだインタクトな時点での早期治療による生存及び運動機能の改善が示された。本発明者らの早期治療試験における臨床所見は、前臨床試験におけるその方向性を反映したものであった。早期治療後、２人の患者がずり這い、起立、及び歩行が支持なしで可能であった。これらの患者は両者ともＳＭＡの家族歴を有し、恐らくはそれが早期診断に寄与した。本発明者らの試験における２つのコホートの患者は全て、運動機能が改善し続けているが、前臨床及び臨床データは、ＳＭＡに関する早期治療及び新生児検診の利益を示唆している。
ＡＡＶ遺伝子置換療法によって引き起こされる重篤有害事象は、２人の患者における治療約３週間後の血清アミノトランスフェラーゼ値の上昇に限られ、他の肝酵素異常はなかった；他の２人の患者に、重篤有害事象の定義についてのカットオフ（即ち、正常範囲の＞１０倍）に達しない上昇があった。肝酵素の上昇はプレドニゾロン治療によって軽減された。１人の患者は抗ＡＡＶ９抗体が存在したためスクリーニングを通過しなかったが、これは、小児及び若年成人で抗ＡＡＶ９血清陽性率が低く、４０歳を超える人で抗ＡＡＶ９血清陽性率が高くなることを示唆する集団研究と一致している。しかしながら、ウイルスに対する抗体の存在はＡＡＶ遺伝子置換療法の制約であり得る。
本試験では、歴史的コホートを対照とした単一群設計を用いたが、これは、疾患の自然歴が十分に特徴付けられていて且つ致死性であるときの限られた数の選択肢のうちの１つである。既発表の歴史的研究と同様の均一サンプルを登録するため、本発明者らは、両アレル性ＳＭＮ１突然変異及び２つのＳＭＮ２コピーを有した症候性のＳＭＡ１患者のみを組み入れるように登録を制限し、ＳＭＮ２のエクソン７にｃ．８５９Ｇ→Ｃ遺伝的修飾因子を有する患者は、この遺伝的修飾因子がより軽症の表現型の疾患を予測するものであるため登録しなかった。しかしながら、この遺伝子置換療法が症候性の患者、又は特定のゲノム亜型を有する患者に限定される必要はない。
結論として、ＳＭＮをコードするＤＮＡを含有するアデノ随伴ウイルスベクターの高用量をＳＭＡ１患者において単回静脈内注入すると、生存が延び、運動機能が改善し、及びＣＨＯＰ ＩＮＴＥＮＤ尺度のスコアがこれまでにこの疾患で観察されたことのないレベルにまで増加した。かかる改善により、歴史的研究のものと比べて補助ケアが必要な患者の割合が低下した。最長２年のフォローアップの中で、効果の減少又は運動機能の臨床的後退が報告されたことはなかった。数人の患者に一過性及び無症候性のアミノトランスフェラーゼ値の上昇があった。ＳＭＡ１患者における遺伝子置換療法の長期安全性及び耐久性を評価するには、更なる試験が必要である。
実施例１５−ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＳＭＮの薬物動態
従来の臨床薬物動態試験は、遺伝子置換療法製品には適用できない。しかしながら、体液及び排泄物として体外に排出されるベクターの量を評価するｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＳＭＮベクター排出試験は、従来の薬物動態試験に代えて遺伝子置換療法に用い得る尺度である。
臨床試験中、複数の時点で、ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＳＭＮの注入後のベクター排出を調べた。唾液、尿及び便のサンプルを３０日目まで毎週、次に１２ヵ月目まで毎月、その後３ヵ月毎に採取した。ドロップレットデジタルポリメラーゼ連鎖反応による１８ヵ月目のビジットまでのｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＳＭＮベクター排出分析に、５人の患者からのサンプルを使用した。ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＳＭＮベクター排出に関して分析した５人の患者全てに、１．１×１０１４ｖｇ／ｋｇの治療用量を投与した。
注入後の排出サンプル中にｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＳＭＮを検出可能であった。尿及び唾液中のｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＳＭＮ濃度は、注入後１日目に体内初期濃度の０．１％〜０．０１％であり、その後、濃度は定量限界未満に下がった。便中では、注入後１日目に体内初期濃度の１０％〜３０％のレベルを検出可能であった。１人の患者は、注入後１４日目に便中に体内初期濃度の２８０％のピーク濃度を示した。対照的に、データを利用可能であった３人の患者は、注入後１４日目に体内初期濃度の＜１％の濃度を示し、濃度は注入後３０日間にわたって約４ｌｏｇ減少した（１０，０００分の１）。総じて、ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＳＭＮは主に便で体外に除去され、便中では注入後６０日目までに定量限界を下回った。
実施例１６−非臨床毒性試験
動物薬理学：Δ７ ＳＭＡマウス疾患モデル（ＳＭＮ Δ７マウス）におけるｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＳＭＮベクターの注入後、未治療ＳＭＮ Δ７マウスと比較して体重が増加し、正向反射行動が改善し、生存が用量依存的に有意に延長し、及びＳＭＡ関連心臓障害が正常化した。
動物毒性学：マウスにおける静脈内注入後、ベクター及びトランス遺伝子は広く分布し、最も高い発現が概して心臓及び肝臓に見られ、実質的な発現が脳及び脊髄に見られた。ピボタル優良試験所基準（Ｇｏｏｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ：ＧＬＰ）準拠３ヵ月マウス毒性試験において、毒性の主な標的器官は心臓及び肝臓であった。ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＳＭＮベクター関連の心室所見は用量依存性の炎症、浮腫及び線維化を含み、心房所見は炎症及び血栓症を含んだ。肝所見は、肝細胞肥大、クッパー細胞活性化、及び散在性肝細胞壊死を含んだ。マウスにおけるｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＳＭＮベクター関連の心及び肝所見について無有害作用量（ＮｏＡＥＬ）は特定されず、最大耐量は、１．１×１０１４ｖｇ／ｋｇの推奨治療用量に対して約１．４倍の安全域を与えて、１．５×１０１４ｖｇ／ｋｇと定義された。マウスで観察された所見を霊長類に適用できるかどうかは、現時点では不明である。
実施例１７−小児患者における脊髄性筋萎縮症
本試験は、遺伝子検査によって両アレル性ＳＭＮ１欠失、２コピーの生存運動ニューロン２（ＳＭＮ２）、エクソン７におけるｃ．８５９Ｇ＞Ｃ修飾の陰性所見が確認された、且つ臨床症状の発症が６ヵ月齢未満であるＳＭＡ１型患者におけるｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＳＭＮベクターの安全性及び有効性を判定する第１相試験であった。０．９〜７．９ヵ月齢の患者においてｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＳＭＮベクターを単回用量注入時に静脈内送達した。２つのコホートに投与した：コホート１（ｎ＝３）は、本試験に用いられる低用量の投与を受け、コホート２（ｎ＝１２）は、本試験に用いられる高用量（治療用量：１．１×１０１４ｖｇ／ｋｇ）の投与を受けた。報告される試験アウトカムはコホート２を反映し、ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＳＭＮベクター注入後２４ヵ月までの全患者のフォローアップを含む。
死亡率及び無イベント生存率
生存及びイベントまでの時間分析がｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＳＭＮベクターの有効性を裏付ける。コホート２では、全１２人の患者（１００％）が２４ヵ月齢超で無イベントであったのに対し、自然歴研究では僅か８％の患者であった。これは、未治療の患者と比較したときの、ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＳＭＮベクターを注入した患者についての全生存の有意且つ臨床的に有意味な増加を示している。注入後２年の時点で患者の死亡報告はなかった。
運動発達マイルストーン
運動発達マイルストーンを調べた；全１５人の患者についての評価をビデオで記録して、運動発達マイルストーンの獲得を確認できるようにした。コホート２の患者は、一貫して主要な運動発達マイルストーンを獲得し、維持した。投与後２４ヵ月のフォローアップの時点で、１１人の患者（９１．７％）はその≧３秒の頸定保持及び≧５秒の支持なしでの座位が可能であり、１０人の患者（８３．３％）は≧１０秒の支持なしでの座位が可能であり、９人の患者（７５．０％）は≧３０秒の支持なしでの座位が可能であり、及び２人の患者は各々（１６．７％）、単独立位、支持ありでの歩行及び独歩が可能であった。本試験の進行中の観察的長期フォローアップに現在登録されているコホート２患者は、その運動発達マイルストーンを維持しており、一部は追加的な運動マイルストーンを獲得している。
肺
ベースライン時に非侵襲的換気（ＮＩＶ）を使用していなかったコホート２の１０人の患者のうち、７人は２４ヵ月のフォローアップ時にＮＩＶの日常使用がなかった。ほぼ全ての患者が、ＳＭＡ１型小児において典型的に気管開口術又は死亡を招く共通の小児呼吸器疾患を起こした。全ての患者が、気管開口術又は持続的換気の必要性なしに呼吸器科入院を乗り切った。
栄養
栄養確保もまた観察した。コホート２において、７人の患者は遺伝子置換療法前に経腸栄養を受けていなかった。これらの７人の患者のうち１人は、脊柱側彎症手術からの回復が困難であったことを受けて創傷治癒を促進するため栄養補助を有したが、経口摂取もあった。遺伝子置換療法前に経腸栄養を受けていたコホート２の５人の患者のうち４人は、試験終了時に経口摂取可能であった；従って、コホート２の１２人の患者のうち合計１１人が経口摂取可能で、６人は経口摂取のみであった。
運動機能（ＣＨＯＰ−ＩＮＴＥＮＤ）
治療用量の投与を受けている患者は、１ヵ月目及び３ヵ月目までに統計的に有意な運動機能の改善を実現した；フィラデルフィア小児病院乳児神経筋疾患検査（ＣＨＯＰ−ＩＮＴＥＮＤ）のベースラインからの平均増加は、それぞれ９．８点（ｎ＝１２、Ｐ＜０．００１）及び１５．４点（ｎ＝１２、Ｐ＜０．００１）であった。
ｓｃＡＡＶ９．ＣＢ．ｈＳＭＮベクターを注入した患者において、運動機能の改善は時間が経っても持続した。１２人中１１人（９１．７％）のコホート２患者が２４ヵ月時点で≧５０のＣＨＯＰ−ＩＮＴＥＮＤスコアを実現した。早期の介入及び投与が応答に正の影響を及ぼすように見える。一般臨床診療では、６ヵ月齢以上の未治療ＳＭＡ１型小児がＣＨＯＰ−ＩＮＴＥＮＤで４０点のスコアを上回ることはない。更に、前向き自然歴の一部として追跡された未治療乳児では、６〜１２ヵ月齢の間に１０．７点の平均低下が報告された。
実施例１８−ｑＰＣＲを用いたＡＡＶ９ウイルスベクター中の残留宿主細胞ＤＮＡの測定
方法
この方法は、ＡＡＶ原薬、例えばＡＶＸＳ−１０１、及び工程間サンプル中の残留ｈｃＤＮＡのｑＰＣＲによる定量化に用いた。１プレート当たり最大６つのサンプルを試験した。ｑＰＣＲアッセイはＴａｑＭａｎプローブを使用して実施した。ＴａｑＭａｎプローブは、５’末端に結合した蛍光発生レポーター色素と、３’末端に結合した非蛍光性消光剤とを有する。プローブがインタクトな間は、消光剤がレポーター色素に近接しているため、レポーター色素が発する蛍光は大幅に減少する。プローブが切断されるとレポーター色素と消光剤とが分離し、レポーター蛍光が増加する。
ヒトゲノム内の反復配列に結合するように設計された隣接フォワード及びリバースプライマーを反応混合物に加え、サンプル及び標準中に存在する標的配列にアニーリングさせた。ＴａｑＭａｎ蛍光発生プローブはプライマー部位間にアニーリングした。鋳型変性、プライマーアニーリング及び産物伸長の連続サイクルにより、標的配列を増幅した。増幅サイクルの伸長ステップの間、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性によってプローブからレポーター色素が放出され、消光剤から色素が遊離して、鋳型の量に比例した蛍光発光が生じた。
ｑＰＣＲ機器によって９６ウェルプレートの各ウェルの蛍光を測定した。追加のＰＣＲサイクルを通じて標的配列の増量を行った。及び結果は、プローブからより多くのレポーター色素が放出され、連続ＰＣＲサイクル毎に蛍光が高まったというものである。蛍光シグナルが所定の閾値に達するために必要な増幅サイクル回数を測定する。このサイクルは、閾値サイクル又はＣＴ値と称される。サンプル又は標準ウェル中の出発ＤＮＡ濃度が高いほど、閾値蛍光レベルに達するために必要なＰＣＲサイクルの回数が減り、ＣＴ値が低くなる。各標準時点について測定されるＣＴ値に対してｌｏｇ１０（ＤＮＡ濃度）をプロットすることにより、検量線を決定する。ＣＴ値を使用して、サンプルの個々のＣＴ値を使用し且つＤＮＡ値について解くことにより、サンプル中に存在するＤＮＡの量を決定する。
初めにＷａｋｏＤＮＡ抽出キット（Ｗａｋｏ、２９５−５０２０１）を使用してサンプルを調製した。簡潔に言えば、試験用サンプルを十分に混合し、１０００倍希釈した。希釈したサンプルを４本のチューブに分割し（各５００μＬ）、それらのチューブのうちの２本に５０μＬの水を加え（スパイクなしレプリケート）、一方で他の２本のチューブに５０μＬの３０，０００ｐｇ／ｍＬ ＤＮＡ標準を加えた（スパイクあり対照）。各チューブに２０μＬのＮ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム溶液を加えて５秒間ボルテックスし、次に短時間遠心することにより、タンパク質可溶化を実施した。グリコーゲン及びＰｅｌｌｅｔ Ｐａｉｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ、７０７４８）を含有するＮａＩ溶液を、それが２０００：５：４の比のＮａＩ：グリコーゲン：Ｐｅｌｌｅｔ Ｐａｉｎｔとなるように調製した。各チューブに５００μＬのＮａＩ混合物を加え、５３℃±１℃で１５分間インキュベートした。チューブを加熱から外し、９００μＬのイソプロパノールと混合し、室温で１５分間インキュベートした。次にチューブを１８℃において１０，０００ｇで１５分間遠心し、上清をデカントした。残りのペレットを８００μＬの洗浄溶液Ａで洗浄し、スピンし、２回再ペレット化した。最後に、グリコーゲンを含有する１５００μＬの冷イソプロパノール洗浄溶液でペレットを洗浄し、スピンし、再ペレット化した。最終ペレット化物を５００μＬヌクレアーゼフリー水に再懸濁した。
ｒｅｓＤＮＡ ＳＥＱヒト定量キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ａ２６３６６）を使用してｑＰＣＲを実施した。キットに指示されるとおり２×Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌマスターミックス、１０×ヒトＤＮＡアッセイミックス及び陰性対照を組み合わせることにより、反応混合物を調製した。２０μＬ反応混合物を１０μＬの調製サンプルと混合し、ＰＣＲプレート上の各ウェルに加えた。各サンプルにつきトリプリケートでプレーティングした。プレートを光学粘着フィルムで密封した。熱サイクルでは、初めに融解を９５℃で１０分間実施し、次にサンプルを９５℃で１５秒間と６０℃で１分間との間のサイクルに４０サイクルかけた。
ｌｏｇ単位のＤＮＡ量（［ｐｇ／ｍＬ］）に対するＣＴ値をプロットすることにより、検量線を作成した。以下の式によって与えられる直線にデータをフィッティングした：
ＣＴ値＝ｍ×ｌｏｇ１０（ｘ）＋ｂ
式中、ｘ＝標準の濃度、ｐｇ／ｍＬ単位であり、ｍは傾きであり、及びｂはｙ切片である。宿主細胞ＤＮＡの濃度は、上記の式を用いてウェルのＣＴ値から逆算し、次に希釈係数によって補正した。
結果
ｑＰＣＲにより測定された残留宿主細胞ＤＮＡは、先行ベクターバッチについて３．７×１０５ｐｇ／ｍＬ、ＡＶＸＳ−１０１ロット６００１５６について０．７６×１０５ｐｇ／ｍＬ、ＡＶＸＳ１−１０１ロット６００３０７について０．６８×１０５ｐｇ／ｍＬ、及びＡＶＸＳ−２０１ ＤＳについて１．３×１０５ｐｇ／ｍＬであった。
実施例１９−ＥＬＩＳＡによるＡＡＶ９ウイルスベクター中の残留宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の測定
方法
市販の酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キットを使用して、ＡＶＸＳ−１０１サンプル中の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）濃度を測定した。Ｃｙｇｎｕｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓヒト胎児腎臓２９３ＨＣＰ ＥＬＩＳＡキットは、固相２部位酵素イムノアッセイである。これは直接サンドイッチ法に基づくもので、２つのポリクローナル抗体がＨＣＰの別個の抗原決定基に対して向けられる。インキュベーションの間に、サンプル中のＨＣＰが、マイクロプレートウェルに結合した抗ＨＣＰ抗体及び溶液中のペルオキシダーゼコンジュゲート抗ＨＣＰ抗体と結合した。
インキュベーション期間後、ウェルを洗浄して全ての未結合の酵素コンジュゲート抗体を除去した。次にウェルに３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質溶液を加えた。結合したペルオキシダーゼコンジュゲートが基質の色変化反応を触媒した。酸を加えることによりこの反応を停止させると、４５０ｎｍで分光光度法により（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｍｅｔｒｉｃａｌｌｙ）読み取ることのできる比色エンドポイントが得られた。加水分解された基質の量は、存在するＨＣＰの濃度に正比例した。
試験するサンプルを本方法の範囲４ｎｇ／ｍＬ〜２００ｎｇ／ｍＬに適合するように希釈した。次に各サンプルをＳＤＢで２倍希釈し（１１０μＬサンプル及び１１０μＬ ＳＤＢ）、混合した。一貫性を確かめるため、スパイクした対照もまた作製した。スパイクした対照では、１１０μＬの各サンプルを２７．５μＬの２００ｎｇ／ｍＬ ＨＣＰ標準及び８２．５μＬのＳＤＢと混合した。最後に、５０μＬの各標準、対照又は試験サンプルを９６ウェルプレートのウェルに加え、１００μＬの抗ＨＥＫ ２９３−ＨＲＰコンジュゲートと混合した。条件は全て、トリプリケートでプレーティングした。プレートをシールテープで密封し、室温において４００〜６００ｒｐｍで２時間振盪した。インキュベーション後、ウェル内の溶液をプレートを逆さまにして振り払い、吸収性タオルで拭き取ることにより取り除いた。ウェルを洗浄瓶で洗浄し、手早く拭き取って軽く叩き、洗浄溶液をウェルに浸らせないようにした。この洗浄を４回繰り返し、最終回の洗浄後、逆さまにして約２０秒間静置させることにより排液した。最後に、プレートの各ウェルに１００μＬのＴＭＢ基質を加え、撹拌なしに室温で２０〜３０分間インキュベートした。１００μＬの停止液を各ウェルに加えることにより、反応を停止させた。このプレートを停止液を加えてから４５分以内にプレートリーダーに装填し、プレートを４５０ｎｍ及び６５０ｎｍで読み取った。
片対数グラフ中に標準の平均吸光度を標準の理論上のＨＣＰ濃度に対してプロットして、以下の式に基づき４パラメータロジスティック（４ＰＬ）当てはめ曲線を作成した：
Ｙ＝［（Ａ−Ｄ）／（１＋（Ｘ／Ｃ）＾Ｂ）］＋Ｄ
式中、Ａは下方漸近線であり、Ｂはヒル勾配であり、Ｃは２つの漸近線間の中点吸光度値に対応する濃度（ｎｇ／ｍＬ）であり、Ｄは上方漸近線であり、Ｘはサンプル濃度（ｎｇ／ｍＬ）であり、及びＹは吸光度である。次にこの検量線を用いることにより、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏソフトウェアを使用してスパイクありサンプル対照及びスパイクなし試験サンプルのＨＣＰ濃度を決定した。この試験は、検量線のｒ２が≧０．９８であり、２００ｎｇ／ｍＬ標準の平均補正後吸光度が≧１．０ＯＤであり、０ｎｇ／ｍＬ標準の平均補正後吸光度が≦０．２ＯＤであり、及び３ウェルレプリケートにわたる補正後吸光度の変動係数が≦１５％であった場合に限り受け入れるものとした。各サンプルのＨＣＰ最終濃度は、以下の式を用いて計算した：
ＨＣＰ濃度サンプル（ｎｇ／ｍＬ）＝希釈係数×平均ＨＣＰ濃度計測値（ｎｇ／ｍＬ）。
結果
ＥＬＩＳＡによって測定された残留宿主細胞タンパク質は、先行ベクターバッチ、ＡＶＸＳ−１０１ロット６００１５６、ＡＶＸＳ１−１０１ロット６００３０７及びＡＶＸＳ−２０１ ＤＳについて定量限界（８ｎｇ／ｍＬ）未満であった。
実施例２０−ＥＬＩＳＡによるＡＡＶ９ウイルスベクター中の残留ベンゾナーゼの測定
方法
市販の酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キットを使用して、ＡＡＶ産物、例えばＡＶＸＳ−１０１中の残留ベンゾナーゼ濃度を測定した。ＭｅｒｃｋベンゾナーゼエンドヌクレアーゼＥＬＩＳＡキットＩＩは、固相２部位酵素イムノアッセイである。これは直接サンドイッチ法に基づくもので、２つのポリクローナル抗体がベンゾナーゼの別個の抗原決定基に対して向けられる。インキュベーションの間に、サンプル中のベンゾナーゼが、マイクロプレートウェルに結合した抗ベンゾナーゼ抗体及び溶液中のペルオキシダーゼコンジュゲート抗ベンゾナーゼ抗体と結合した。
インキュベーション期間後、ウェルを洗浄して全ての未結合の酵素コンジュゲート抗体を除去した。次にウェルに３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質溶液を加えた。結合したペルオキシダーゼコンジュゲートが基質の色変化反応を触媒した。酸を加えることによりこの反応を停止させると、４５０ｎｍで分光光度法により読み取ることのできる比色エンドポイントが得られた。加水分解された基質の量は、存在するベンゾナーゼの濃度に正比例する。
簡潔に言えば、１７５μＬのサンプルを１７５μＬのＰＢＳＴと合わせることにより、サンプルを２倍希釈した。並行して、１７５μＬのサンプルを３５μＬの１０ｎｇ／ｍＬベンゾナーゼ標準及び１４０μＬのＰＢＳＴと合わせることにより、ベンゾナーゼでスパイクしたサンプル対照もまた調製した。キットからのプレコートしたＥＬＩＳＡストリップをストリップ支持体にマウントし、各ウェルにつき１００μＬの各試験混合物をロードした。ブランクについては、サンプルの代わりに１００μＬのＰＢＳＴをロードした。各条件はトリプリケートでロードした。プレートを密封し、プレートシェーカー（４５０ｒｐｍ）で撹拌しながら室温で２時間±５分インキュベートした。インキュベーション後、内容物を廃棄し、イムノウォッシャーを使用して約３５０μＬのＰＢＳＴを加えることによりプレートを洗浄し、１分間インキュベートし、次に逆さにして吸収性タオルに載せて軽く叩いた。合計３回の洗浄を実施した後、各ウェルに１００μＬの希釈ＨＲＰコンジュゲート抗体を加えた。プレートを密封し、プレートシェーカー（４５０ｒｐｍ）で撹拌しながら室温で１時間±５分インキュベートした。インキュベーション後、内容物を廃棄し、イムノウォッシャーを使用して約３５０μＬのＰＢＳＴを加えることによりプレートを洗浄し、１分間インキュベートし、次に逆さにして吸収性タオルに載せて軽く叩いた。合計３回の洗浄を実施した後、各ウェルに１００μＬのＴＭＢ基質を加えた。プレートを密封し、内容物を暗所下で撹拌なしに室温で１５〜４０分間インキュベートした。各ウェルに１００μＬの０．２Ｎ Ｈ２ＳＯ４停止液を加えることにより反応を停止させた。停止液を加えてから４５分以内に分光光度計を使用して４５０ｎｍでプレートの吸光度を測定した。
片対数グラフ中に標準の平均吸光度を標準の理論上のベンゾナーゼ濃度に対してプロットして、以下の式に基づき４パラメータロジスティック（４ＰＬ）当てはめ曲線を作成した：
Ｙ＝［（Ａ−Ｄ）／（１＋（Ｘ／Ｃ）＾Ｂ）］＋Ｄ
式中、Ａは下方漸近線であり、Ｂはヒル勾配であり、Ｃは２つの漸近線間の中点吸光度値に対応する濃度（ｎｇ／ｍＬ）であり、Ｄは上方漸近線であり、Ｘはサンプル濃度（ｎｇ／ｍＬ）であり、及びＹは吸光度である。次にこの検量線を用いることにより、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏソフトウェアを使用してスパイクありサンプル対照及びスパイクなし試験サンプルのＨＣＰ濃度を決定した。この試験は、検量線のｒ２が≧０．９８であり、２．５ｎｇ／ｍＬ標準の平均補正後吸光度が≧１．０ＯＤであり、０．１０ｎｇ／ｍＬ標準の平均補正後吸光度がＰＢＳＴブランクの平均ＯＤよりも高く、及び３ウェルレプリケートにわたる補正後吸光度の変動係数が≦１５％であった場合に限り受け入れるものとした。各サンプルのＨＣＰ最終濃度は、以下の式を用いて計算した：
ベンゾナーゼ濃度サンプル（ｎｇ／ｍＬ）＝希釈係数×平均ベンゾナーゼ濃度測定値（ｎｇ／ｍＬ）。
結果
ＥＬＩＳＡによって測定された残留ベンゾナーゼ濃度は、先行ベクターバッチ、ＡＶＸＳ−１０１ロット６００１５６、ＡＶＸＳ１−１０１ロット６００３０７及びＡＶＸＳ−２０１ ＤＳについて定量限界（０．２ｎｇ／ｍＬ）未満であった。
実施例２１−マイクロＢＣＡアッセイによるＡＡＶ９ウイルスベクター中のタンパク質濃度の測定
方法
２ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、２３２０９）参照タンパク質標準及びマイクロＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、２３２３５）を使用して、例えばＡＶＸＳ−１０１の、工程間、原薬及び薬物製品サンプル中のタンパク質の量をマイクロＢＣＡプレートアッセイにより測定した。このアッセイは、全タンパク質の比色検出及び定量化のためのデタージェント適合性ビシンコニン酸（ＢＣＡ）製剤に基づく。ＢＣＡは、アルカリ性環境でタンパク質によってＣｕ２＋が減少すると形成されるＣｕ１＋を検出する。ＢＣＡの２つの分子が１つの第一銅イオン（Ｃｕ１＋）とキレート化することにより紫色呈色反応産物が形成され、これは５６２ｎｍで、タンパク質濃度の増加と線形関係にある強い吸光度を呈する。
簡潔に言えば、希釈剤（２０倍希釈の製剤緩衝液、２００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．００１％ｗ／ｖ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８、ｐＨ８．０）に２ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡの段階希釈を実施することにより標準を調製した。ＡＶＸＳ−１０１の試験サンプルもまた水に２０倍希釈し、希釈剤中に段階希釈物を作製した。目標濃度は約７．５μｇ／ｍＬである。キットからの２５部のマイクロＢＣＡ試薬Ａ、２４部の試薬Ｂ及び１部の試薬Ｃを混合することにより、ワーキング試薬（ＷＲ）を調製した。１５０μＬの各標準及び試験サンプルを９６ウェルプレートにトリプリケートでロードし、１５０μＬのＷＲと混合した。プレートを密封し、プレートシェーカー上で３０秒間、３００ｒｐｍで振盪した。次にプレートを振盪なしに３７℃±２℃で２時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを１０００ｒｐｍで２分間遠心して凝縮物を収集し、インキュベーション後にプレートを１５〜６０分間冷却した。プレートをプレートリーダーにおいて５６２ｎｍで読み取り、データをＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏで分析した。
標準の平均吸光度と標準の理論上のタンパク質濃度を片対数プロットでプロットし、二次式の当てはめを作成した。二次式の当てはめは、以下の式に基づく：
Ｙ＝Ａ＋Ｂｘ＋Ｃｘ２
式中、Ａ、Ｂ、Ｃは曲線当てはめパラメータであり、ｘはサンプル濃度、μｇ／ｍＬ単位であり、及びＹは吸光度、ＯＤ単位である。この試験は、検量線のｒ２が≧０．９８であり、ブランクの平均吸光度が最も低い標準（１μｇ／ｍＬ）の平均吸光度未満であり、各標準の３ウェルレプリケートにわたる吸光度の変動係数が≦１０％であった場合に限り受け入れるものとした。次にこの検量線を用いて、試験サンプル中のタンパク質濃度を決定した。最終的なタンパク質濃度は、以下の式を用いて計算した：
全タンパク質濃度（μｇ／ｍＬ）＝希釈係数×平均タンパク質濃度計測値（μｇ／ｍＬ）。
結果
マイクロＢＣＡによって測定された全タンパク質濃度は、先行ベクターバッチについて１．０×１０１３ｖｇ／ｍＬ当たり１６７μｇ／ｍＬ、ＡＶＸＳ−１０１ロット６００１５６について１．０×１０１３ｖｇ／ｍＬ当たり１７９μｇ／ｍＬ、ＡＶＸＳ１−１０１ロット６００３０７について１．０×１０１３ｖｇ／ｍＬ当たり１７６μｇ／ｍＬ、ＡＶＸＳ−２０１ ＤＰについて１．０×１０１３ｖｇ／ｍＬ当たり１８２μｇ／ｍＬ及びＡＶＸＳ−３０１ ＤＰについて１．０×１０１３ｖｇ／ｍＬ当たり４１８μｇ／ｍＬであった。
実施例２２−ＡＶＸＳ−１０１、ＡＶＸＳ−２０１及びＡＶＸＳ−３０１の純度及び出荷規格
実施例１〜４からのＡＶＸＳ−１０１原薬及びＡＶＸＳ−１０１薬物製品を純度に関して試験した。表３２及び表３３は、これらの製品の規格及び出荷判定基準を示す。
ＡＶＸＳ−１０１に関する記載、例えば実施例１〜４の記載と同じ工程を用いてＡＶＸＳ−２０１及びＡＶＸＳ−３０１を製造し、精製することができる。バイオリアクターで産生された各製品のバッチの規格及び出荷判定基準を表３４〜表３６に示す。
ＡＶＸＳ−２０１及びＡＶＸＳ−３０１について実現した高純度は、本願に記載されるとおりのＡＡＶウイルスベクターの産生及び精製方法が異なるペイロードのＡＡＶウイルスベクターにわたって幅広い適用性を示すことを示している。
添付の図面を参照しながら実施形態を説明したが、本開示は詳細な実施形態に限定されず、添付の特許請求の範囲に定義されるとおりの本開示及び実施形態の範囲又は趣旨から逸脱することなく当業者によってそれらに様々な変更及び修正がなされ得ることが理解されるべきである。
例示的実施形態のリスト
１．医薬組成物であって、
（ａ）トランス遺伝子で操作された１〜８×１０１３ベクターゲノム／ｍｌのパルボウイルス；
（ｂ）５．０％未満の空のカプシド；
（ｃ）１×１０１３ｖｇ／ｍｌ当たり４０ｎｇ／ｍｌ未満の残留宿主細胞タンパク質；
（ｄ）１×１０１３ｖｇ／ｍｌ当たり１．２×１０６ｐｇ／ｍｌ未満の残留宿主細胞ＤＮＡ
を含み；及び、
（ｅ）１〜８×１０１３ベクターゲノム／ｍｌの少なくとも８０％が機能性である、組成物。
２．残留プラスミドＤＮＡの量が１×１０１３ｖｇ当たり１．７×１０６ｐｇ未満を含む、実施形態１の組成物。
３．パルボウイルスのベクターゲノム／ｍｌの量が１．８〜２．２×１０１３ベクターゲノム／ｍｌを含む、実施形態１の組成物。
４．哺乳類宿主細胞培養物からＡＡＶ粒子を精製して凍結中間原薬を形成する方法であって、
（ａ）組換えＡＡＶビリオンをトランスフェクトされた細胞を培養するステップ；
（ｂ）培養期間後に細胞から拡大したウイルス粒子を回収するステップ；
（ｃ）ウイルス粒子をろ過によって精製して任意のインタクトな細胞又は細胞デブリを除去するステップ；
（ｄ）ステップ（ｃ）からの溶出液をタンジェンシャルフローろ過に供するステップ；及び、
（ｅ）得られた精製ウイルス粒子中間調製物を凍結するステップ
を含む方法。
５．回収ステップ中にエンドヌクレアーゼが使用される、実施形態４の方法。
６．エンドヌクレアーゼがベンゾナーゼである、実施形態５の方法。
７．精製ステップがデプスろ過と、それに続く大型分子夾雑物及び細胞デブリを除去するフィルタでのろ過を用いる、実施形態４の方法。
８．タンジェンシャルフローろ過ステップがセルロース膜を使用する、実施形態４の方法。
９．哺乳類宿主細胞培養物からＡＡＶ粒子のサンプルを精製して薬物製品を形成する方法であって、
（ａ）酸性化及び清澄化ステップ；
（ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィーステップ；
（ｃ）タンジェンシャルフローろ過ステップ；
（ｄ）ＣｓＣｌ超遠心によって空のカプシドを除去するステップ；及び、
（ｅ）タンジェンシャルフローろ過ステップ
を含む方法。
１０．酸性化及び清澄化ステップが、サンプルをｐＨ３．５に調整することを含み、宿主細胞タンパク質及びＤＮＡがデタージェントによるフロキュレーションによって除去される、実施形態９の方法。
１１．陽イオン交換カラムがスルホニル樹脂を含む、実施形態９の方法。
１２．タンジェンシャルフローろ過ステップ（ｃ）が３００ｋＤａ ＭＷの分子量カットオフのセルロース膜を使用し、陽イオン交換ステップの溶出物容積を少なくとも６分の１に低減する、実施形態９の方法。
１３．ＣｓＣｌ超遠心ステップがサンプル中の空のカプシドの少なくとも８０％を除去し、デプスろ過と、それに続く０．４５ミクロンフィルタでのろ過を用いる、実施形態９の方法。
１４．タンジェンシャルフローろ過ステップ（ｅ）が３００ｋＤａ ＭＷの分子量カットオフのセルロース膜を使用する、実施形態９の方法。
１５．実施形態１〜３のいずれか１つの医薬組成物の静脈内又は髄腔内送達を含む、それを必要としている患者における神経学的疾患の治療方法であって、パルボウイルスが自己相補的ＡＡＶ９ゲノムを含み、及び操作されたトランス遺伝子がＳＭＮポリヌクレオチドを含み、及び疾患がＳＭＡである、方法。
１６．実施形態１〜３のいずれか１つの医薬組成物の造影剤と合わせた髄腔内送達を含む、それを必要としている患者における神経学的疾患の治療方法であって、パルボウイルスが自己相補的ＡＡＶ９ゲノムを含み、及び操作されたトランス遺伝子がＳＭＮポリヌクレオチドを含み、疾患がＳＭＡであり、及び造影剤がｏｍｎｉｐａｑｕｅ １８０である、方法。
１７．ＳＭＡがＩＩ型、ＩＩＩ型又はＩＶ型ＳＭＡである、実施形態１５〜１６のいずれか１つの方法。
１８．実施形態１〜３のいずれか１つの医薬組成物の造影剤と合わせた髄腔内送達を含む、それを必要としている患者におけるＩＩ型、ＩＩＩ型、又はＩＶ型ＳＭＡの治療方法であって、パルボウイルスが自己相補的ＡＡＶ９ゲノムを含み、操作されたトランス遺伝子がＳＭＮポリヌクレオチドを含み、及び造影剤がｏｍｎｉｐａｑｕｅ １８０である、方法。
１９．実施形態１〜３のいずれか１つの医薬組成物の静脈内送達を含む、それを必要としている患者におけるＩ型ＳＭＡの治療方法であって、パルボウイルスが自己相補的ＡＡＶ９ゲノムを含み、及び操作されたトランス遺伝子がＳＭＮポリヌクレオチドを含む、方法。
２０．患者が０〜９ヵ月齢である、実施形態１９の方法。
２１．患者が０〜６ヵ月齢である、実施形態２０の方法。
２２．小児患者が最大約８ｋｇの体重である、実施形態１９の方法。
２２．小児患者が最大約８ｋｇの体重である、実施形態１９の方法。

本発明の様々な実施形態を以下に示す。
１．ａ．１〜８×１０ 13 ＡＡＶ９ウイルスベクターゲノム／ｍＬ（ｖｇ／ｍＬ）；
ｂ．約７％未満の空のウイルスカプシド；
ｃ．１×１０ 13 ｖｇ／ｍＬ当たり約１００ｎｇ／ｍＬ未満の宿主細胞タンパク質；
ｄ．１×１０ 13 ｖｇ／ｍＬ当たり約５×１０ 6 ｐｇ／ｍＬ未満の残留宿主細胞ＤＮＡ
を含む医薬組成物であって；
及び前記１〜８×１０ 13 ＡＡＶ９ウイルスベクターゲノム／ｍＬの少なくとも約８０％が機能性である、組成物。
２．前記ＡＡＶ９ウイルスベクターが、生存運動ニューロン（ＳＭＮ）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、上記１に記載の組成物。
３．前記ＡＡＶ９ウイルスベクターが、メチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、上記１に記載の組成物。
４．前記ＡＡＶ９ウイルスベクターが、スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）を標的とする低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチドを含む、上記１に記載の組成物。
５．前記ＡＡＶ９ウイルスベクターが、修飾ＡＡＶ２ ＩＴＲ、ニワトリβ−アクチン（ＣＢ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサー、修飾ＳＶ４０後期１６ｓイントロン、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル、及び非修飾ＡＡＶ２ ＩＴＲを含む、上記２に記載の組成物。
６．前記ポリヌクレオチドが配列番号２のＳＭＮタンパク質をコードする、上記２又は５に記載の組成物。
７．前記ＡＡＶ９ウイルスベクターが配列番号１を含む、上記２、５、又は６のいずれかに記載の組成物。
８．１．７〜２．３×１０ 13 ＡＡＶ９ｖｇ／ｍＬを含む、上記１〜７のいずれかに記載の組成物。
９．１．９〜２．１×１０ 13 ＡＡＶ９ｖｇ／ｍＬを含む、上記１〜８のいずれかに記載の組成物。
１０．約２×１０ 13 ＡＡＶ９ｖｇ／ｍＬを含む、上記１〜９のいずれかに記載の組成物。
１１．約５％未満の空のカプシドを含む、上記１〜１０のいずれかに記載の組成物。
１２．約３％未満の空のカプシドを含む、上記１〜１１のいずれかに記載の組成物。
１３．約１％未満の空のカプシドを含む、上記１〜１２のいずれかに記載の組成物。
１４．１〜２×１０ 14 ｖｇのＡＡＶ９ウイルスベクターを含む又はそれからなる、上記１〜１３のいずれかに記載の組成物。
１５．１．１×１０ 14 ｖｇのＡＡＶ９ウイルスベクターを含む又はそれからなる、上記１〜１４のいずれかに記載の組成物。
１６．１．７×１０ 14 ｖｇのＡＡＶ９ウイルスベクターからなる、上記１〜１５のいずれかに記載の組成物。
１７．機能性ウイルスベクターゲノムのパーセンテージが、インビトロ細胞アッセイ又はインビボ動物モデルを用いて測定される、上記１〜１６のいずれかに記載の組成物。
１８．生存運動ニューロン（ＳＭＮ）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶ９ウイルスベクター、トリス緩衝液、塩化マグネシウム、塩化ナトリウム、及びポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）を含む水性医薬製剤であって、前記医薬組成物が保存剤を含まない、製剤。
１９．前記ＡＡＶ９ウイルスベクターが、修飾ＡＡＶ２ ＩＴＲ、ニワトリβ−アクチン（ＣＢ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサー、修飾ＳＶ４０後期１６ｓイントロン、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル、及び非修飾ＡＡＶ２ ＩＴＲを更に含む、上記１８に記載の製剤。
２０．前記ポリヌクレオチドが配列番号２のＳＭＮタンパク質をコードする、上記１８又は１９に記載の製剤。
２１．前記ＡＡＶ９ウイルスベクターが配列番号１を含む、上記１８〜２０のいずれかに記載の製剤。
２２．前記トリス緩衝液濃度が約１０〜３０ｎＭ、例えば約２０ｍＭである、上記１８〜２１のいずれかに記載の製剤。
２３．前記製剤のｐＨが約７．７〜約８．３、例えば約ｐＨ８．０（例えば、ＵＳＰ＜７９１＞により測定したとき）である、上記１８〜２２のいずれかに記載の製剤。
２４．前記塩化マグネシウム濃度が約０．５〜１．５ｍＭ、例えば約１ｍＭである、上記１８〜２３のいずれかに記載の製剤。
２５．前記塩化ナトリウム濃度が約１００〜３００ｍＭ、例えば約２００ｍＭである、上記１８〜２４のいずれかに記載の製剤。
２６．約０．００５％ｗ／ｖのポロキサマー１８８を含む、上記１８〜２５のいずれかに記載の製剤。
２７．３９０〜４３０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度（例えば、ＵＳＰ＜７８５＞により測定したとき）を有する、上記１８〜２６のいずれかに記載の製剤。
２８．前記ＡＡＶ９ウイルスベクターが、上記１〜１７のいずれかに記載の組成物中にある、上記１８〜２７のいずれかに記載の製剤。
２９．上記１８〜２８のいずれかに記載の製剤又は上記２又は５〜１７のいずれかに記載の組成物を髄腔内又は静脈内経路によって患者に投与することを含む、それを必要としている患者におけるＩ型脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）の治療方法であって、前記患者が、
ａ．９ヵ月齢以下であり；
ｂ．少なくとも約２．６ｋｇの体重であり；
ｃ．両アレル性ＳＭＮ１ヌル突然変異又は欠失を有し；及び
ｄ．ＳＭＮ２の少なくとも１つの機能性コピーを有する、方法。
３０．前記ＡＡＶ９ウイルスベクターが、修飾ＡＡＶ２ ＩＴＲ、ニワトリβ−アクチン（ＣＢ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサー、修飾ＳＶ４０後期１６ｓイントロン、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル、及び非修飾ＡＡＶ２ ＩＴＲを含む、上記２９に記載の方法。
３１．前記ポリヌクレオチドが配列番号２のＳＭＮタンパク質をコードする、上記２９又は３０に記載の方法。
３２．前記ＡＡＶ９ウイルスベクターが配列番号１を含む、上記２９〜３１のいずれかに記載の方法。
３３．前記ウイルスベクターを約１〜２．５×１０ 14 ｖｇ／ｋｇの用量で投与することを含む、上記２９〜３２のいずれかに記載の方法。
３４．前記ウイルスベクターを約１．１×１０ 14 ｖｇ／ｋｇの用量で投与することを含む、上記２９〜３３のいずれかに記載の方法。
３５．ウイルスベクターゲノムの量が、ｄｄＰＣＲを用いて測定される、上記３３又は３４に記載の方法。
３６．前記患者が約８．５ｋｇ以下の体重である、上記２９〜３５のいずれかに記載の方法。
３７．前記患者がＳＭＮ２遺伝子の少なくとも１つのコピーのエクソン７にｃ．８５９Ｇ＞Ｃ置換を有しない、上記２９〜３６のいずれかに記載の方法。
３８．前記治療が６ヵ月齢より前に前記患者に投与される、上記２９〜３７のいずれかに記載の方法。
３９．前記治療が、筋緊張低下、運動技能遅滞、定頸不全、円背姿勢及び関節過度可動性から選択される１つ以上のＳＭＡ症状が発生する前に前記患者に投与される、上記２９〜３８のいずれかに記載の方法。
４０．前記患者が、投与前にＥＬＩＳＡ結合イムノアッセイによって決定したとき１：１００以下の抗ＡＡＶ９抗体力価を有する、上記２９〜３９のいずれかに記載の方法。
４１．前記患者が、投与前にＥＬＩＳＡ結合イムノアッセイによって決定したとき１：５０以下の抗ＡＡＶ９抗体力価を有する、上記２９〜４０のいずれかに記載の方法。
４２．前記患者が、投与後にＥＬＩＳＡ結合イムノアッセイによって決定したとき１：１００を上回る抗ＡＡＶ９力価を有し、約１〜８週間にわたって、又は力価が１：１００未満に低下するまでモニタされる、上記２９〜４１のいずれかに記載の方法。
４３．前記患者が、投与後にＥＬＩＳＡ結合イムノアッセイによって決定したとき１：１００を上回る抗ＡＡＶ９力価を有し、約１〜８週間にわたって、又は力価が１：５０未満に低下するまでモニタされる、上記２９〜４２のいずれかに記載の方法。
４４．前記患者が、投与前又は投与後にＥＬＩＳＡ結合イムノアッセイによって決定したとき１：１００を上回る抗ＡＡＶ９力価を有し、例えば投与前又は投与後に人工栄養に切り換えられる、上記２９〜３９のいずれかに記載の方法。
４５．前記患者が、投与前又は投与後にＥＬＩＳＡ結合イムノアッセイによって決定したとき１：５０を上回る抗ＡＡＶ９力価を有し、例えば投与前又は投与後に人工栄養に切り換えられる、上記２９〜３９のいずれかに記載の方法。
４６．前記患者が、投与後にＥＬＩＳＡ結合イムノアッセイによって決定したとき１：１００を上回る抗ＡＡＶ９力価を有し、プラスマフェレーシスを用いて治療される、上記２９〜４５のいずれかに記載の方法。
４７．前記患者が、投与後にＥＬＩＳＡ結合イムノアッセイによって決定したとき１：５０を上回る抗ＡＡＶ９力価を有し、プラスマフェレーシスを用いて治療される、上記２９〜４６のいずれかに記載の方法。
４８．前記患者が、投与前に約６７，０００細胞／ｍｌより高い、又は約１００，０００細胞／ｍｌより高い、又は約１５０，０００細胞／ｍｌより高い血小板数を有する、上記２９〜４７のいずれかに記載の方法。
４９．前記患者が、投与後に約６７，０００細胞／ｍｌより低い、又は約１００，０００細胞／ｍｌより低い、又は約１５０，０００、細胞／ｍｌより低い血小板数を有し、約１〜８週間にわたって、又は血小板数が約６７，０００細胞／ｍｌ、又は約１００，０００細胞／ｍｌを上回る、又は約１５０，０００細胞／ｍｌを上回るまでモニタされる、上記２９〜４８のいずれかに記載の方法。
５０．前記患者が、投与後に約６７，０００細胞／ｍｌより低い血小板数を有し、血小板輸血で治療される、上記２９〜４９のいずれかに記載の方法。
５１．前記患者が投与前に血小板減少症を有しない、上記２９〜５０のいずれかに記載の方法。
５２．前記患者が投与後に血小板減少症を有し、約１〜８週間にわたって、又は前記患者が血小板減少症を有しなくなるまでモニタされる、上記２９〜５１のいずれかに記載の方法。
５３．前記患者が投与後に血小板減少症を有し、血小板輸血で治療される、上記２９〜５２のいずれかに記載の方法。
５４．前記患者が前記ウイルスベクターの投与前に約０．１７６ｕｇ／ｍｌ未満のトロポニン−Ｉレベルを有する、上記２９〜５３のいずれかに記載の方法。
５５．前記患者の前記トロポニン−Ｉレベルが前記ウイルスベクターの投与後にモニタされる、上記２９〜５４のいずれかに記載の方法。
５６．投与後に前記患者のトロポニン−Ｉレベルが約０．１７６ｕｇ／ｍｌ未満になるまで心モニタリングが実施される、上記５４又は５５に記載の方法。
５７．前記患者が投与前に正常な肝機能を有する、上記２９〜５６のいずれかに記載の方法。
５８．前記患者が投与前に約８〜４０Ｕ／Ｌ未満の肝トランスアミナーゼレベルを有する、上記５７に記載の方法。
５９．前記肝トランスアミナーゼが、アラニントランスアミナーゼ（ＡＳＴ）、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、及びこれらの組み合わせから選択される、上記５８に記載の方法。
６０．前記患者が、投与前に３．０ｍｇ／ｄＬ未満のビリルビンレベル、１．８ｍｇ／ｄＬ未満のクレアチニンレベル、８〜１８ｇ／ｄＬのＨｇｂレベル、及び／又は約２００００／ｍｍ 3 未満の白血球数を有する、上記２９〜５９のいずれかに記載の方法。
６１．前記ウイルスベクターがトリス緩衝生理食塩水中に入れて投与される、上記２９〜６０のいずれかに記載の方法。
６２．前記ウイルスベクターが、約５〜２０ｍＬ／ｋｇ、約１０〜２０ｍＬ／ｋｇ、又は約５．５〜６．５ｍＬ／ｋｇのトリス緩衝生理食塩水で投与される、上記２９〜６１のいずれかに記載の方法。
６３．前記ウイルスベクターが約４５〜７５分かけて注入される、上記２９〜６２のいずれかに記載の方法。
６４．前記ウイルスベクターが約６０分かけて注入される、上記２９〜６３のいずれかに記載の方法。
６５．前記注入がシリンジポンプを含む、上記６３又は６４に記載の方法。
６６．前記患者が前記ウイルスベクターの投与の少なくとも２４時間前に経口ステロイド薬を投与される、上記２９〜６５のいずれかに記載の方法。
６７．前記患者が前記ウイルスベクターの投与後少なくとも３０日間にわたって経口ステロイド薬を投与される、上記２９〜６６のいずれかに記載の方法。
６８．前記経口ステロイド薬が１日１回投与される、上記６７に記載の方法。
６９．前記経口ステロイド薬が１日２回投与される、上記６７に記載の方法。
７０．前記患者が、前記ウイルスベクターの投与後にＡＬＴ及び／又はＡＳＴのレベルの上昇に関してモニタされ、前記経口ステロイド薬が３０日後もＡＳＴ及び／又はＡＬＴレベルが正常上限の２倍未満又は約１２０ＩＵ／Ｌ未満になるまで投与され続ける、上記６６〜６９のいずれかに記載の方法。
７１．前記患者が経口ステロイド薬を、ＡＳＴ及び／又はＡＬＴレベルが正常上限の２倍未満又は約１２０ＩＵ／Ｌ未満になるまで投与される、上記６６〜７０のいずれかに記載の方法。
７２．前記経口ステロイド薬が約１ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、上記６６〜７０のいずれかに記載の方法。
７３．ＡＳＴ及びＡＬＴが正常上限の２倍未満又は約１２０ＩＵ／Ｌ未満になった後、前記経口ステロイド薬投与を漸減させることを更に含む、上記６６〜７１のいずれかに記載の方法。
７４．前記漸減が、２週間で０．５ｍｇ／ｋｇ／日に至らせ、続いて更に２週間で０．２５ｍｇ／ｋｇ／日に至らせる段階的増加を含む、上記７３に記載の方法。
７５．前記経口ステロイド薬を約１ｍｇ／ｋｇの用量で３０日間投与し、次に２週間で０．５ｍｇ／ｋｇ／日に至り、続いて更に２週間で０．２５ｍｇ／ｋｇ／日に至るまで漸減させることを含む、上記６６〜７３のいずれかに記載の方法。
７６．前記経口ステロイド薬がプレドニゾロン又は等価薬である、上記６６〜７５のいずれかに記載の方法。
７７．前記患者に筋エンハンサー又は神経保護剤を投与することを含む、上記２９〜７６のいずれかに記載の方法。
７８．前記患者にＳＭＮを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む、上記２９〜７７のいずれかに記載の方法。
７９．前記患者にヌシネルセンを投与することを含む、上記２９〜７８のいずれかに記載の方法。
８０．前記患者にスタムルマブを投与することを含む、上記２９〜７９のいずれかに記載の方法。
８１．有効性がＣＨＯＰ−ＩＮＴＥＮＤ尺度を用いて決定される、上記２９〜８０のいずれかに記載の方法。
８２．疾患発症を伴う又は伴わない脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）Ｉ型小児患者の治療方法であって、上記２又は５〜２８のいずれかに記載のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む組成物又は製剤を前記患者に投与することを含む、方法。
８３．それを必要としている患者におけるレット症候群の治療方法であって、上記３又は８〜１７のいずれかに記載の組成物を髄腔内又は静脈内経路によって前記患者に投与することを含む、方法。
８４．それを必要としている患者における筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の治療方法であって、上記４又は８〜１７のいずれかに記載の組成物を髄腔内又は静脈内経路によって前記患者に投与することを含む、方法。
８５．Ｉ型ＳＭＡに罹患している患者の治療方法であって、
ａ．前記患者の体重を決定すること；
ｂ．ＡＡＶ９ウイルスベクター医薬組成物のバイアルが入ったキットを入手することであって、前記キットが以下の本数のバイアルを含み：
ｃ．各バイアルのウイルスベクター濃度が約２．０×１０ 13 ｖｇ／ｍＬであり；
ｄ．前記ＡＡＶ９ウイルスベクターが、ＳＭＮタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むこと；及び
ｅ．前記バイアルから前記ＡＡＶ９ウイルスベクターを前記患者に投与することを含む、方法。
８６．前記ＡＡＶ９ウイルスベクターが、突然変異ＡＡＶ２ ＩＴＲ、ニワトリβ−アクチン（ＣＢ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサー、修飾ＳＶ４０後期１６ｓイントロン、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル、及びＡＡＶ２ ＩＴＲを含む、上記８５に記載の方法。
８７．前記ポリヌクレオチドが配列番号２のＳＭＮタンパク質をコードする、上記８５又は８６に記載の方法。
８８．前記ＡＡＶ９ウイルスベクターが配列番号１を含む、上記８５〜８７のいずれかに記載の方法。
８９．前記ＡＡＶウイルスベクターが約１．０×１０ 14 〜２．５×１０ 14 ｖｇ／ｋｇの用量で注入によって投与される、上記８５〜８８のいずれかに記載の方法。
９０．前記ＡＡＶウイルスベクターが約１．１×１０ 14 ｖｇ／ｋｇの用量で注入によって投与される、上記８５〜８９のいずれかに記載の方法。
９１．前記ウイルスベクターが約４５〜７０分かけて注入される、上記８９又は９０に記載の方法。
９２．前記ウイルスベクターが約６０分かけて注入される、上記８９〜９１のいずれかに記載の方法。
９３．前記注入がシリンジポンプを含む、上記８９〜９２のいずれかに記載の方法。
９４．ウイルスベクターゲノムの量がｄｄＰＣＲを用いて測定される、上記８５〜９３のいずれかに記載の方法。
９５．ＡＡＶ９ウイルスベクターの用量力価がｄｄＰＣＲによって測定される、上記８５〜９４のいずれかに記載の方法。
９６．以下の用量容積を投与することを含む、上記８５〜９５のいずれかに記載の方法。
９７．上記２又は５〜１７のいずれかに記載の組成物又は上記１８〜２８のいずれかに記載の製剤が入ったバイアルを含む、Ｉ型脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）に罹患している患者の治療用キット。
９８．生存運動ニューロン（ＳＭＮ）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、且つｐＨ７．７〜８．３、例えば約８．０で２０ｍＭトリス、１ｍＭ ＭｇＣｌ 2 、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．００５％ｗ／ｖポロキサマー１８８中約２．０×１０ 13 ｖｇ／ｍＬの濃度で製剤化された約５．５ｍＬ又は約８．３ｍＬのＡＡＶ９ウイルスベクターが入ったバイアルを含むキット。
９９．前記ＡＡＶ９ウイルスベクターが、突然変異ＡＡＶ２ ＩＴＲ、ニワトリβ−アクチン（ＣＢ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサー、修飾ＳＶ４０後期１６ｓイントロン、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル、及びＡＡＶ２ ＩＴＲを含む、上記９８に記載のキット。
１００．前記ポリヌクレオチドが配列番号２のＳＭＮタンパク質をコードする、上記９８又は９９に記載のキット。
１０１．前記ＡＡＶ９ウイルスベクターが配列番号１を含む、上記９８〜１００のいずれかに記載のキット。
１０２．ウイルスベクターゲノムの量がｄｄＰＣＲを用いて測定される、上記９８〜１０１のいずれかに記載のキット。
１０３．ある容積の上記２又は５〜１７のいずれかに記載の組成物又は上記１８〜２８のいずれかに記載の製剤をそれを必要としている患者に静脈内注入によって投与することを含む、Ｉ型ＳＭＡの治療方法。
１０４．前記患者の体重が２．６〜３．０ｋｇである場合、前記容積が１６．５ｍＬである、上記１０３に記載の方法。
１０５．前記患者の体重が３．１〜３．５ｋｇである場合、前記容積が１９．３ｍＬである、上記１０３に記載の方法。
１０６．前記患者の体重が３．６〜４．０ｋｇである場合、前記容積が２２．０ｍＬである、上記１０３に記載の方法。
１０７．前記患者の体重が４．１〜４．５ｋｇである場合、前記容積が２４．８ｍＬである、上記１０３に記載の方法。
１０８．前記患者の体重が４．６〜５．０ｋｇである場合、前記容積が２７．５ｍＬである、上記１０３に記載の方法。
１０９．前記患者の体重が５．１〜５．５ｋｇである場合、前記容積が３０．３ｍＬである、上記１０３に記載の方法。
１１０．前記患者の体重が５．６〜６．０ｋｇである場合、前記容積が３３．０ｍＬである、上記１０３に記載の方法。
１１１．前記患者の体重が６．１〜６．５ｋｇである場合、前記容積が３５．８ｍＬである、上記１０３に記載の方法。
１１２．前記患者の体重が６．６〜７．０ｋｇである場合、前記容積が３８．５ｍＬである、上記１０３に記載の方法。
１１３．前記患者の体重が７．１〜７．５ｋｇである場合、前記容積が４１．３ｍＬである、上記１０３に記載の方法。
１１４．前記患者の体重が７．６〜８．０ｋｇである場合、前記容積が４４．０ｍＬである、上記１０３に記載の方法。
１１５．前記患者の体重が８．１〜８．５ｋｇである場合、前記容積が４６．８ｍＬである、上記１０３に記載の方法。
１１６．ＡＡＶウイルスベクターの製造方法であって、
ａ．接着細胞を培養すること；
ｂ．前記接着細胞に１つ又は複数のプラスミドをトランスフェクトして前記ＡＡＶウイルスベクターの産生を可能にすること；
ｃ．前記接着細胞を溶解させて前記ＡＡＶウイルスベクターを単離すること；
ｄ．前記（ｃ）の細胞ライセートを酸性化及び清澄化すること；
ｅ．前記（ｄ）の産物を陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）を用いて精製すること；
ｆ．前記（ｅ）の産物をタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）を用いてろ過すること；
ｇ．前記（ｆ）の産物を塩化セシウム（ＣｓＣｌ）緩衝液中で超遠心すること；及び
ｈ．前記（ｇ）の産物から前記ＡＡＶウイルスベクターを回収すること
を含む方法。
１１７．前記ＡＡＶがＡＡＶ９である、上記１１６に記載の方法。
１１８．前記ＡＡＶが自己相補的（ｓｃＡＡＶ）である、上記１１６又は１１７に記載の方法。
１１９．前記接着細胞がＨＥＫ２９３細胞である、上記１１６〜１１８のいずれかに記載の方法。
１２０．前記接着細胞が培養前に接着性に関して選択される、上記１１６〜１１９のいずれかに記載の方法。
１２１．前記選択が、前記接着細胞を複数回継代培養することにより接着性に関して選択することを含む、上記１１６〜１２０のいずれかに記載の方法。
１２２．前記接着細胞が培養用バイオリアクターに播種される、上記１１６〜１２１のいずれかに記載の方法。
１２３．前記バイオリアクターが、細胞培養培地の連続循環を提供することができる大規模バイオリアクターである、上記１２２に記載の方法。
１２４．前記バイオリアクターが２００ｍ 2 又は３３３ｍ 2 バイオリアクターである、上記１２２又は１２３に記載の方法。
１２５．前記バイオリアクターが５００ｍ 2 バイオリアクターである、上記１２２又は１２３に記載の方法。
１２６．前記接着細胞を再循環培地バッグ内の培地に加え、例えば蠕動ポンプを使用して前記バイオリアクターに循環させる、上記１２２〜１２５のいずれかに記載の方法。
１２７．前記接着細胞が培養用バイオリアクターに播種される間、前記蠕動ポンプ輸送が継続される、上記１２６に記載の方法。
１２８．前記播種密度が約８，０００〜１２，０００細胞／ｃｍ 2 である、上記１２２〜１２７のいずれかに記載の方法。
１２９．前記トランスフェクションステップが、前記再循環培地バッグにトランスフェクション培地を加えること、及び前記トランスフェクション培地を例えば蠕動ポンプを使用して前記バイオリアクターに循環させることを含む、上記１２２〜１２８のいずれかに記載の方法。
１３０．前記循環、例えば蠕動ポンプ輸送が１５〜２５℃で行われる、上記１２６〜１２９のいずれかに記載の方法。
１３１．前記トランスフェクションステップが、アデノウイルスヘルパープラスミド（ｐＨＥＬＰ）を前記接着細胞に接触させることを含む、上記１１６〜１３０のいずれかに記載の方法。
１３２．前記トランスフェクションステップが、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子をコードするプラスミドを前記接着細胞に接触させることを含む、上記１１６〜１３１のいずれかに記載の方法。
１３３．前記トランスフェクションステップが、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子をコードするプラスミドを前記接着細胞に接触させることを含む、上記１１６〜１３２のいずれかに記載の方法。
１３４．前記トランスフェクションステップが、同じプラスミド（ｐＡＡＶ）上にＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子及びＡＡＶ ｃａｐ遺伝子をコードするプラスミドを前記接着細胞に接触させることを含む、上記１１６〜１３３のいずれかに記載の方法。
１３５．前記ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子がｒｅｐ２である、上記１３２又は１３４に記載の方法。
１３６．前記ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子がｃａｐ９である、上記１３３又は１３４に記載の方法。
１３７．前記トランスフェクションステップが、トランスフェクション剤ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を前記接着細胞に接触させることを含む、上記１１６〜１３５のいずれかに記載の方法。
１３８．ＰＥＩと前記プラスミドのうちの少なくとも１つとの比が重量基準で１：１未満である、上記１３７に記載の方法。
１３９．ＰＥＩと前記プラスミドのうちの少なくとも１つとの比が重量基準で約１：１である、上記１３７に記載の方法。
１４０．前記トランスフェクションステップが、血清を含有しないトランスフェクション培地を前記接着細胞に接触させることを含む、上記１１６〜１３９のいずれかに記載の方法。
１４１．前記トランスフェクションステップが、カルシウムを含有しないトランスフェクション培地を前記接着細胞に接触させることを含む、上記１１６〜１４０のいずれかに記載の方法。
１４２．前記トランスフェクションステップが、グルタミンを含有しないトランスフェクション培地を前記接着細胞に接触させることを含む、上記１１６〜１４１のいずれかに記載の方法。
１４３．前記トランスフェクションステップが１０〜６０分間実施される、上記１１６〜１４２のいずれかに記載の方法。
１４４．前記トランスフェクションステップが１０〜３０分間実施される、上記１１６〜１４３のいずれかに記載の方法。
１４５．前記トランスフェクションステップが３０分未満の間実施される、上記１１６〜１４４のいずれかに記載の方法。
１４６．前記トランスフェクションステップが２０〜３０分間実施される、上記１１６〜１４５のいずれかに記載の方法。
１４７．前記トランスフェクションステップが１５〜３０分間実施される、上記１１６〜１４６のいずれかに記載の方法。
１４８．前記溶解するステップが全細胞溶解を含む、上記１１６〜１４７のいずれかに記載の方法。
１４９．前記溶解するステップが、エンドヌクレアーゼを補足した溶解緩衝液を使用することを含む、上記１１６〜１４８のいずれかに記載の方法。
１５０．前記エンドヌクレアーゼがベンゾナーゼである、上記１４９に記載の方法。
１５１．前記溶解するステップが、ＴＷＥＥＮを補足した溶解緩衝液を使用することを含む、上記１１６〜１５０のいずれかに記載の方法。
１５２．前記溶解するステップが１５〜２５℃で実施される、上記１１６〜１５１のいずれかに記載の方法。
１５３．前記ステップ（ｃ）の細胞ライセートを前記（ｄ）の酸性化ステップ前に凍結することを更に含む、上記１１６〜１５２のいずれかに記載の方法。
１５４．細胞培養ライセートからのＡＡＶウイルスベクターの精製方法であって、
ａ．前記細胞ライセートを酸性化及び清澄化するステップ；
ｂ．前記（ａ）の産物を陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）を用いて精製するステップ；
ｃ．前記（ｂ）の産物をタンジェンシャルフローろ過でろ過するステップ；
ｄ．前記（ｃ）の産物を２〜４Ｍ塩化セシウム（ＣｓＣｌ）緩衝液を用いて超遠心するステップ；
ｅ．前記（ｄ）の産物から前記ＡＡＶウイルスベクターを収集するステップ；
ｆ．前記（ｅ）の産物をタンジェンシャルフローろ過でろ過するステップ
を含む方法。
１５５．前記酸性化ステップが、前記細胞ライセートを約３．０〜４．０のｐＨに酸性化することを含む、上記１１６〜１５４のいずれかに記載の方法。
１５６．前記酸性化ステップが、前記細胞ライセートを約３．３〜３．７のｐＨに酸性化することを含む、上記１１６〜１５５のいずれかに記載の方法。
１５７．前記酸性化ステップが、前記細胞ライセートを約３．４〜３．６のｐＨに酸性化することを含む、上記１１６〜１５６のいずれかに記載の方法。
１５８．前記酸性化ステップが、前記細胞ライセートを約３．５のｐＨに酸性化することを含む、上記１１６〜１５７のいずれかに記載の方法。
１５９．前記超遠心が４０，０００〜５０，０００ｒｐｍで実施される、上記１１６〜１５８のいずれかに記載の方法。
１６０．前記超遠心が約４３，０００〜４６，０００ｒｐｍで実施される、上記１１６〜１５９のいずれかに記載の方法。
１６１．前記超遠心が１５〜２５℃で実施される、上記１１６〜１６０のいずれかに記載の方法。
１６２．前記超遠心が１６〜２４時間実施される、上記１１６〜１６１のいずれかに記載の方法。
１６３．前記超遠心が２０〜２４時間実施される、上記１１６〜１６２のいずれかに記載の方法。
１６４．前記ＣｓＣｌが約３Ｍの濃度である、上記１１６〜１６８のいずれかに記載の方法。
１６５．前記細胞ライセートが前記酸性化ステップの前にＴｗｅｅｎと共にインキュベートされる、上記１１６〜１６４のいずれかに記載の方法。
１６６．前記細胞ライセートが前記酸性化ステップの前にＴｗｅｅｎと共に約８〜２０時間インキュベートされる、上記１１６〜１６５のいずれかに記載の方法。
１６７．前記清澄化ステップが、前記細胞ライセートをデプスフィルタでろ過することを含む、上記１１６〜１６６のいずれかに記載の方法。
１６８．前記清澄化ステップが、前記細胞ライセートを０．４５ミクロンフィルタでろ過することを含む、上記１１６〜１６７のいずれかに記載の方法。
１６９．前記ＣＥＸがスルホニル樹脂を含む、上記１１６〜１６８のいずれかに記載の方法。
１７０．少なくとも１つのＴＦＦステップが、３００ｋＤａ ＭＷの分子量カットオフのセルロース膜を使用することを含み、前記陽イオン交換ステップの溶出物容積を少なくとも６分の１に低減する、上記１１６〜１６９のいずれかに記載の方法。
１７１．少なくとも１つのＴＦＦステップが、約３００ｋＤａ ＭＷの分子量カットオフのセルロース膜を使用することを含む、上記１１６〜１７０のいずれかに記載の方法。
１７２．前記ＣｓＣｌ緩衝液が約３Ｍ ＣｓＣｌを含む、上記１１６〜１７１のいずれかに記載の方法。
１７３．前記ＣｓＣｌ緩衝液が、トリス、ＭｇＣｌ 2 、及びポロキサマー１８８を含む、上記１１６〜１７２のいずれかに記載の方法。
１７４．前記ＣｓＣｌ緩衝液が約２０ｍＭトリスを含む、上記１１６〜１７３のいずれかに記載の方法。
１７５．前記ＣｓＣｌ緩衝液が約２ｍＭ ＭｇＣｌ 2 を含む、上記１１６〜１７４のいずれかに記載の方法。
１７６．前記ＣｓＣｌ緩衝液が、ポロキサマー１８８、任意選択で約０．２％ｗ／ｖポロキサマー１８８を含む、上記１１６〜１７５のいずれかに記載の方法。
１７７．前記ＣｓＣｌ緩衝液が約ｐＨ７．５〜８．５である、上記１１６〜１７６のいずれかに記載の方法。
１７８．前記ＣｓＣｌ緩衝液が約ｐＨ７．９〜８．２である、上記１１６〜１７７のいずれかに記載の方法。
１７９．空のウイルスカプシドの数が、前記超遠心した細胞ライセートから前記ＡＡＶウイルスベクターを収集した後の総ウイルスカプシドの７％未満である、上記１１６〜１７８のいずれかに記載の方法。
１８０．空のウイルスカプシドの数が、前記超遠心した細胞ライセートから前記ＡＡＶウイルスベクターを収集した後の総ウイルスカプシドの５％未満である、上記１１６〜１７９のいずれかに記載の方法。
１８１．空のウイルスカプシドの数が、前記超遠心した細胞ライセートから前記ＡＡＶウイルスベクターを収集した後の総ウイルスカプシドの３％未満である、上記１１６〜２００のいずれかに記載の方法。
１８２．空のウイルスカプシドの数が、前記超遠心した細胞ライセートから前記ＡＡＶウイルスベクターを収集した後の総ウイルスカプシドの１％未満である、上記１１６〜２０１のいずれかに記載の方法。
１８３．空のウイルスカプシドの数がＡＵＣによって測定される、上記１７９〜１８２のいずれかに記載の方法。
１８４．前記ＡＡＶウイルスベクターが、前記超遠心した細胞ライセートからシリンジを使用して収集される、上記１１６〜１８３のいずれかに記載の方法。
１８５．前記２回目のＴＦＦステップ後に収集される前記ＡＡＶウイルスベクターが、トリス、ＭｇＣｌ 2 、ＮａＣｌ、及びポロキサマー１８８を含む溶液中に貯蔵される、上記１１６〜１８４のいずれかに記載の方法。
１８６．前記溶液が約２０ｍＭトリスを含む、上記１８５に記載の方法。
１８７．前記溶液が約１ｍＭ ＭｇＣｌ 2 を含む、上記１８５又は１８６に記載の方法。
１８８．前記溶液が約２００ｍＭ ＮａＣｌを含む、上記１８５〜１８７のいずれかに記載の方法。
１８９．前記溶液が約０．００５％ｗ／ｖポロキサマー１８８を含む、上記１８５〜１８８のいずれかに記載の方法。
１９０．前記溶液が約ｐＨ７．５〜８．５である、上記１８５〜１８９のいずれかに記載の方法。
１９１．前記溶液が約ｐＨ７．７〜８．３である、上記１８５〜１９０のいずれかに記載の方法。
１９２．前記２回目のＴＦＦ後に収集される前記ＡＡＶウイルスベクターが、約３０μｇ／ｇ未満又は約２０μｇ／ｇ未満のＣｓＣｌを含有する、上記１１６〜１９１のいずれかに記載の方法。
１９３．前記２回目のＴＦＦ後に収集されるＡＡＶウイルスベクターの濃度が約３×１０ 13 ｖｇ／ｍｌ以上である、上記１１６〜１９２のいずれかに記載の方法。
１９４．宿主細胞タンパク質及び／又は宿主細胞ＤＮＡが、前記細胞ライセートからデタージェントによるフロキュレーションを用いて除去される、上記１１６〜１９３のいずれかに記載の方法。
１９５．前記ＡＡＶウイルスベクターが、生存運動ニューロン（ＳＭＮ）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、上記１１６〜１９４のいずれかに記載の方法。
１９６．前記ＡＡＶウイルスベクターが、突然変異ＡＡＶ２ ＩＴＲ、ニワトリβ−アクチン（ＣＢ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサー、修飾ＳＶ４０後期１６ｓイントロン、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル、及びＡＡＶ２ ＩＴＲを含む、上記１１６〜１９５のいずれかに記載の方法。
１９７．前記ポリヌクレオチドが配列番号２のＳＭＮタンパク質をコードする、上記１９５又は１９６に記載の方法。
１９８．前記ＡＡＶウイルスベクターが配列番号１を含む、上記１９５又は１９６に記載の方法。
１９９．前記ＳＭＮタンパク質をコードする前記プラスミド、前記ｐＡＡＶをコードする前記プラスミド、及び前記ｐＨＥＬＰをコードする前記プラスミドが１：１：１の比でトランスフェクトされる、上記１９５〜１９８のいずれかに記載の方法。
２００．前記ＡＡＶウイルスベクターが、ＭＥＣＰ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、上記１１６〜１９４のいずれかに記載の方法。
２０１．前記ＡＡＶウイルスベクターが、ＳＯＤ１を標的とするｓｈＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む、上記１１６〜１９４のいずれかに記載の方法。
２０２．上記１１６〜１９９のいずれかに記載の方法により調製されるとおりのＳＭＮタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶ９ウイルスベクターを投与することによる、ＳＭＡ１型を有する患者の治療方法。
２０３．上記１１６〜１９４又は２００のいずれかに記載の方法により調製されるとおりのＭＥＣＰ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶ９ウイルスベクターを投与することによる、レット症候群を有する患者の治療方法。
２０４．上記１１６〜１９４又は２０１のいずれかに記載の方法により調製されるとおりのＳＯＤ１を標的とするｓｈＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶ９ウイルスベクターを投与することによる、ＡＬＳを有する患者の治療方法。
２０５．上記１１６〜１９９のいずれかに記載の方法により製造される、ＳＭＮタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶ９ウイルスベクター。
２０６．上記１１６〜１９９のいずれかに記載の方法により製造される、ＳＭＮタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶ９ウイルスベクターを含む医薬組成物。
２０７．ＳＭＮタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶ９ウイルスベクターと、トリス緩衝液と、塩化マグネシウム溶液と、塩化ナトリウム溶液とを含む水性医薬組成物であって、前記医薬組成物が保存剤を含まず、及び前記組成物が上記１１６〜１９９のいずれかに記載の方法により製造される、組成物。
２０８．上記１１６〜１９４又は２００のいずれかに記載の方法により製造される、ＭＥＣＰ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶ９ウイルスベクター。
２０９．上記１１６〜１９４又は２００のいずれかに記載の方法により製造される、ＭＥＣＰ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶ９ウイルスベクターを含む医薬組成物。
２１０．上記１１６〜１９４又は２０１のいずれかに記載の方法により製造される、ＳＯＤ１を標的とするｓｈＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶ９ウイルスベクター。
２１１．上記１１６〜１９４又は２０１のいずれかに記載の方法により製造される、ＳＯＤ１を標的とするｓｈＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶ９ウイルスベクターを含む医薬組成物。
２１２．ａ．修飾ＡＡＶ２ ＩＴＲと、ニワトリβ−アクチン（ＣＢ）プロモーターと、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサーと、修飾ＳＶ４０後期１６ｓイントロンと、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナルと、非修飾ＡＡＶ２ ＩＴＲとを含む自己相補的ＡＡＶ９ウイルスベクター；
ｂ．ｐＨ８．０の２０ｍＭトリス；
ｃ．１ｍＭ ＭｇＣｌ２；
ｄ．２００ｍＭ ＮａＣｌ；及び
ｅ．０．００５％ポロキサマー１８８
を含む医薬組成物を静脈内投与することによる、それを必要としている患者におけるＩ型ＳＭＡの治療方法であって；
前記患者が２．６ｋｇ〜８．５ｋｇの体重である、方法。
２１３．前記組成物が保存剤を含まない、上記２１２に記載の方法。
２１４．前記患者が：
ａ．９ヵ月齢以下であり；
ｂ．少なくとも約２．６ｋｇの体重であり；
ｃ．両アレル性ＳＭＮ１ヌル突然変異又は欠失を有し；及び
ｄ．ＳＭＮ２の少なくとも１つの機能性コピーを有する、
上記２１２又は２１３に記載の方法。
２１５．ａ．修飾ＡＡＶ２ ＩＴＲと、ニワトリβ−アクチン（ＣＢ）プロモーターと、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサーと、修飾ＳＶ４０後期１６ｓイントロンと、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナルと、非修飾ＡＡＶ２ ＩＴＲとを含む自己相補的ＡＡＶ９ウイルスベクター；
ｂ．ｐＨ８．０の２０ｍＭトリス；
ｃ．１ｍＭ ＭｇＣｌ２；
ｄ．２００ｍＭ ＮａＣｌ；及び
ｅ．０．００５％ポロキサマー１８８
を含む医薬組成物の静脈内投与に好適な、又はそれ用に製造される組成物。
２１６．保存剤を含まない、上記２１５に記載の組成物。
２１７．工業規模で実施される、上記１１６〜２０１のいずれかに記載の方法。
２１８．産生されるＡＡＶ収率が、製造バッチ当たり５×１０ 15 ｖｇ超、又は８×１０ 15 ｖｇ超又は１×１０ 16 ｖｇ超である、上記１１６〜２０１又は２１７のいずれかに記載の方法。
２１９．以下のうちの少なくとも１つ：
ａ．１．０×１０ 13 ｖｇ当たり約０．０９ｎｇ未満のベンゾナーゼ、
ｂ．約３０μｇ／ｇ（ｐｐｍ）未満のセシウム、
ｃ．約２０〜８０ｐｐｍのポロキサマー１８８、
ｄ．１．０×１０ 13 ｖｇ当たり約０．２２ｎｇ未満のＢＳＡ、
ｅ．１．０×１０ 13 ｖｇ当たり約６．８×１０ 5 ｐｇ未満の残留プラスミドＤＮＡ、
ｆ．１．０×１０ 13 ｖｇ当たり約１．１×１０ 5 ｐｇ未満の残留ｈｃＤＮＡ、
ｇ．１．０×１０ 13 ｖｇ当たり約４ｎｇ未満のｒＨＣＰ、
ｈ．約ｐＨ７．７〜８．３、
ｉ．約３９０〜４３０ｍＯｓｍ／ｋｇ、
ｊ．容器当たり約６００個未満の≧２５μｍサイズの粒子、
ｋ．容器当たり約６０００個未満の≧１０μｍサイズの粒子、
ｌ．約１．７×１０ 13 〜２．３×１０ 13 ｖｇ／ｍＬのゲノム力価、
ｍ．１．０×１０ 13 ｖｇ当たり約３．９×１０ 8 〜８．４×１０ 10 ＩＵの感染力価、
ｎ．１．０×１０ 13 ｖｇ当たり約１００〜３００μｇの全タンパク質、
ｏ．約７０〜１３０％の相対効力、及び
ｐ．約５％未満の空のカプシド
を含む、上記１〜１７、１８〜２８、８２〜８４、又は２０５〜２１１のいずれかに記載の組成物又は製剤。
２２０．以下のうちの少なくとも１つ：
ａ．約ｐＨ７．７〜８．３、
ｂ．約３９０〜４３０ｍＯｓｍ／ｋｇ、
ｃ．容器当たり約６００個未満の≧２５μｍサイズの粒子、
ｄ．容器当たり約６０００個未満の≧１０μｍサイズの粒子、
ｅ．約１．７×１０ 13 〜２．３×１０ 13 ｖｇ／ｍＬのゲノム力価、
ｆ．１．０×１０ 13 ｖｇ当たり約３．９×１０ 8 〜８．４×１０ 10 ＩＵの感染力価、
ｇ．１．０×１０ 13 ｖｇ当たり約１００〜３００μｇの全タンパク質、
ｈ．約２０〜８０ｐｐｍのＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８含有量（ｃｏｎｅｎｔ）、
ｉ．約７０〜１３０％の相対効力、
ｊ．７．５×１０ 13 ｖｇ／ｋｇの用量で２４日以上のΔ７ＳＭＮマウスモデルにおける生存期間中央値（ｍｅｄｉａｎ ｓｕｒｖｉａｌ）、
ｋ．約５％未満の空のカプシド、
ｌ．及び約９５％以上の総純度、及び
ｍ．約０．７５ＥＵ／ｍＬ以下のエンドトキシン
を含む、上記１〜１７、１８〜２８、８２〜８４、又は２０５〜２１１のいずれかに記載の組成物又は製剤。
２２１．以下のうちの少なくとも１つ：
ａ．１．０×１０ 13 ｖｇ当たり約０．０９ｎｇ未満のベンゾナーゼ、
ｂ．約３０μｇ／ｇ（ｐｐｍ）未満のセシウム、
ｃ．約２０〜８０ｐｐｍのポロキサマー１８８、
ｄ．１．０×１０ 13 ｖｇ当たり約０．２２ｎｇ未満のＢＳＡ、
ｅ．１．０×１０ 13 ｖｇ当たり約６．８×１０ 5 ｐｇ未満の残留プラスミドＤＮＡ、
ｆ．１．０×１０ 13 ｖｇ当たり約１．１×１０ 5 ｐｇ未満の残留ｈｃＤＮＡ、及び
ｇ．１．０×１０ 13 ｖｇ当たり約４ｎｇ未満のｒＨＣＰ
を含む、上記１〜１７、１８〜２８、８２〜８４、又は２０５〜２１１のいずれかに記載の組成物又は製剤。

Claims (221)

  1. ａ．１〜８×１０１３ＡＡＶ９ウイルスベクターゲノム／ｍＬ（ｖｇ／ｍＬ）；
    ｂ．約７％未満の空のウイルスカプシド；
    ｃ．１×１０１３ｖｇ／ｍＬ当たり約１００ｎｇ／ｍＬ未満の宿主細胞タンパク質；
    ｄ．１×１０１３ｖｇ／ｍＬ当たり約５×１０６ｐｇ／ｍＬ未満の残留宿主細胞ＤＮＡ
    を含む医薬組成物であって；
    及び前記１〜８×１０１３ＡＡＶ９ウイルスベクターゲノム／ｍＬの少なくとも約８０％が機能性である、組成物。
  2. 前記ＡＡＶ９ウイルスベクターが、生存運動ニューロン（ＳＭＮ）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記ＡＡＶ９ウイルスベクターが、メチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組成物。
  4. 前記ＡＡＶ９ウイルスベクターが、スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）を標的とする低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組成物。
  5. 前記ＡＡＶ９ウイルスベクターが、修飾ＡＡＶ２ ＩＴＲ、ニワトリβ−アクチン（ＣＢ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサー、修飾ＳＶ４０後期１６ｓイントロン、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル、及び非修飾ＡＡＶ２ ＩＴＲを含む、請求項２に記載の組成物。
  6. 前記ポリヌクレオチドが配列番号２のＳＭＮタンパク質をコードする、請求項２又は５に記載の組成物。
  7. 前記ＡＡＶ９ウイルスベクターが配列番号１を含む、請求項２、５、又は６のいずれか一項に記載の組成物。
  8. １．７〜２．３×１０１３ＡＡＶ９ｖｇ／ｍＬを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
  9. １．９〜２．１×１０１３ＡＡＶ９ｖｇ／ｍＬを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
  10. 約２×１０１３ＡＡＶ９ｖｇ／ｍＬを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
  11. 約５％未満の空のカプシドを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
  12. 約３％未満の空のカプシドを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
  13. 約１％未満の空のカプシドを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
  14. １〜２×１０１４ｖｇのＡＡＶ９ウイルスベクターを含む又はそれからなる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
  15. １．１×１０１４ｖｇのＡＡＶ９ウイルスベクターを含む又はそれからなる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
  16. １．７×１０１４ｖｇのＡＡＶ９ウイルスベクターからなる、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
  17. 機能性ウイルスベクターゲノムのパーセンテージが、インビトロ細胞アッセイ又はインビボ動物モデルを用いて測定される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
  18. 生存運動ニューロン（ＳＭＮ）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶ９ウイルスベクター、トリス緩衝液、塩化マグネシウム、塩化ナトリウム、及びポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）を含む水性医薬製剤であって、前記医薬組成物が保存剤を含まない、製剤。
  19. 前記ＡＡＶ９ウイルスベクターが、修飾ＡＡＶ２ ＩＴＲ、ニワトリβ−アクチン（ＣＢ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサー、修飾ＳＶ４０後期１６ｓイントロン、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル、及び非修飾ＡＡＶ２ ＩＴＲを更に含む、請求項１８に記載の製剤。
  20. 前記ポリヌクレオチドが配列番号２のＳＭＮタンパク質をコードする、請求項１８又は１９に記載の製剤。
  21. 前記ＡＡＶ９ウイルスベクターが配列番号１を含む、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の製剤。
  22. 前記トリス緩衝液濃度が約１０〜３０ｎＭ、例えば約２０ｍＭである、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の製剤。
  23. 前記製剤のｐＨが約７．７〜約８．３、例えば約ｐＨ８．０（例えば、ＵＳＰ＜７９１＞により測定したとき）である、請求項１８〜２２のいずれか一項に記載の製剤。
  24. 前記塩化マグネシウム濃度が約０．５〜１．５ｍＭ、例えば約１ｍＭである、請求項１８〜２３のいずれか一項に記載の製剤。
  25. 前記塩化ナトリウム濃度が約１００〜３００ｍＭ、例えば約２００ｍＭである、請求項１８〜２４のいずれか一項に記載の製剤。
  26. 約０．００５％ｗ／ｖのポロキサマー１８８を含む、請求項１８〜２５のいずれか一項に記載の製剤。
  27. ３９０〜４３０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度（例えば、ＵＳＰ＜７８５＞により測定したとき）を有する、請求項１８〜２６のいずれか一項に記載の製剤。
  28. 前記ＡＡＶ９ウイルスベクターが、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組成物中にある、請求項１８〜２７のいずれか一項に記載の製剤。
  29. 請求項１８〜２８のいずれか一項に記載の製剤又は請求項２又は５〜１７のいずれか一項に記載の組成物を髄腔内又は静脈内経路によって患者に投与することを含む、それを必要としている患者におけるＩ型脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）の治療方法であって、前記患者が、
    ａ．９ヵ月齢以下であり；
    ｂ．少なくとも約２．６ｋｇの体重であり；
    ｃ．両アレル性ＳＭＮ１ヌル突然変異又は欠失を有し；及び
    ｄ．ＳＭＮ２の少なくとも１つの機能性コピーを有する、方法。
  30. 前記ＡＡＶ９ウイルスベクターが、修飾ＡＡＶ２ ＩＴＲ、ニワトリβ−アクチン（ＣＢ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサー、修飾ＳＶ４０後期１６ｓイントロン、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル、及び非修飾ＡＡＶ２ ＩＴＲを含む、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記ポリヌクレオチドが配列番号２のＳＭＮタンパク質をコードする、請求項２９又は３０に記載の方法。
  32. 前記ＡＡＶ９ウイルスベクターが配列番号１を含む、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記ウイルスベクターを約１〜２．５×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与することを含む、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記ウイルスベクターを約１．１×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与することを含む、請求項２９〜３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. ウイルスベクターゲノムの量が、ｄｄＰＣＲを用いて測定される、請求項３３又は３４に記載の方法。
  36. 前記患者が約８．５ｋｇ以下の体重である、請求項２９〜３５のいずれか一項に記載の方法。
  37. 前記患者がＳＭＮ２遺伝子の少なくとも１つのコピーのエクソン７にｃ．８５９Ｇ＞Ｃ置換を有しない、請求項２９〜３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. 前記治療が６ヵ月齢より前に前記患者に投与される、請求項２９〜３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. 前記治療が、筋緊張低下、運動技能遅滞、定頸不全、円背姿勢及び関節過度可動性から選択される１つ以上のＳＭＡ症状が発生する前に前記患者に投与される、請求項２９〜３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記患者が、投与前にＥＬＩＳＡ結合イムノアッセイによって決定したとき１：１００以下の抗ＡＡＶ９抗体力価を有する、請求項２９〜３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. 前記患者が、投与前にＥＬＩＳＡ結合イムノアッセイによって決定したとき１：５０以下の抗ＡＡＶ９抗体力価を有する、請求項２９〜４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 前記患者が、投与後にＥＬＩＳＡ結合イムノアッセイによって決定したとき１：１００を上回る抗ＡＡＶ９力価を有し、約１〜８週間にわたって、又は力価が１：１００未満に低下するまでモニタされる、請求項２９〜４１のいずれか一項に記載の方法。
  43. 前記患者が、投与後にＥＬＩＳＡ結合イムノアッセイによって決定したとき１：１００を上回る抗ＡＡＶ９力価を有し、約１〜８週間にわたって、又は力価が１：５０未満に低下するまでモニタされる、請求項２９〜４２のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記患者が、投与前又は投与後にＥＬＩＳＡ結合イムノアッセイによって決定したとき１：１００を上回る抗ＡＡＶ９力価を有し、例えば投与前又は投与後に人工栄養に切り換えられる、請求項２９〜３９のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記患者が、投与前又は投与後にＥＬＩＳＡ結合イムノアッセイによって決定したとき１：５０を上回る抗ＡＡＶ９力価を有し、例えば投与前又は投与後に人工栄養に切り換えられる、請求項２９〜３９のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記患者が、投与後にＥＬＩＳＡ結合イムノアッセイによって決定したとき１：１００を上回る抗ＡＡＶ９力価を有し、プラスマフェレーシスを用いて治療される、請求項２９〜４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記患者が、投与後にＥＬＩＳＡ結合イムノアッセイによって決定したとき１：５０を上回る抗ＡＡＶ９力価を有し、プラスマフェレーシスを用いて治療される、請求項２９〜４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記患者が、投与前に約６７，０００細胞／ｍｌより高い、又は約１００，０００細胞／ｍｌより高い、又は約１５０，０００細胞／ｍｌより高い血小板数を有する、請求項２９〜４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. 前記患者が、投与後に約６７，０００細胞／ｍｌより低い、又は約１００，０００細胞／ｍｌより低い、又は約１５０，０００、細胞／ｍｌより低い血小板数を有し、約１〜８週間にわたって、又は血小板数が約６７，０００細胞／ｍｌ、又は約１００，０００細胞／ｍｌを上回る、又は約１５０，０００細胞／ｍｌを上回るまでモニタされる、請求項２９〜４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. 前記患者が、投与後に約６７，０００細胞／ｍｌより低い血小板数を有し、血小板輸血で治療される、請求項２９〜４９のいずれか一項に記載の方法。
  51. 前記患者が投与前に血小板減少症を有しない、請求項２９〜５０のいずれか一項に記載の方法。
  52. 前記患者が投与後に血小板減少症を有し、約１〜８週間にわたって、又は前記患者が血小板減少症を有しなくなるまでモニタされる、請求項２９〜５１のいずれか一項に記載の方法。
  53. 前記患者が投与後に血小板減少症を有し、血小板輸血で治療される、請求項２９〜５２のいずれか一項に記載の方法。
  54. 前記患者が前記ウイルスベクターの投与前に約０．１７６ｕｇ／ｍｌ未満のトロポニン−Ｉレベルを有する、請求項２９〜５３のいずれか一項に記載の方法。
  55. 前記患者の前記トロポニン−Ｉレベルが前記ウイルスベクターの投与後にモニタされる、請求項２９〜５４のいずれか一項に記載の方法。
  56. 投与後に前記患者のトロポニン−Ｉレベルが約０．１７６ｕｇ／ｍｌ未満になるまで心モニタリングが実施される、請求項５４又は５５に記載の方法。
  57. 前記患者が投与前に正常な肝機能を有する、請求項２９〜５６のいずれか一項に記載の方法。
  58. 前記患者が投与前に約８〜４０Ｕ／Ｌ未満の肝トランスアミナーゼレベルを有する、請求項５７に記載の方法。
  59. 前記肝トランスアミナーゼが、アラニントランスアミナーゼ（ＡＳＴ）、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、及びこれらの組み合わせから選択される、請求項５８に記載の方法。
  60. 前記患者が、投与前に３．０ｍｇ／ｄＬ未満のビリルビンレベル、１．８ｍｇ／ｄＬ未満のクレアチニンレベル、８〜１８ｇ／ｄＬのＨｇｂレベル、及び／又は約２００００／ｍｍ３未満の白血球数を有する、請求項２９〜５９のいずれか一項に記載の方法。
  61. 前記ウイルスベクターがトリス緩衝生理食塩水中に入れて投与される、請求項２９〜６０のいずれか一項に記載の方法。
  62. 前記ウイルスベクターが、約５〜２０ｍＬ／ｋｇ、約１０〜２０ｍＬ／ｋｇ、又は約５．５〜６．５ｍＬ／ｋｇのトリス緩衝生理食塩水で投与される、請求項２９〜６１のいずれか一項に記載の方法。
  63. 前記ウイルスベクターが約４５〜７５分かけて注入される、請求項２９〜６２のいずれか一項に記載の方法。
  64. 前記ウイルスベクターが約６０分かけて注入される、請求項２９〜６３のいずれか一項に記載の方法。
  65. 前記注入がシリンジポンプを含む、請求項６３又は６４に記載の方法。
  66. 前記患者が前記ウイルスベクターの投与の少なくとも２４時間前に経口ステロイド薬を投与される、請求項２９〜６５のいずれか一項に記載の方法。
  67. 前記患者が前記ウイルスベクターの投与後少なくとも３０日間にわたって経口ステロイド薬を投与される、請求項２９〜６６のいずれか一項に記載の方法。
  68. 前記経口ステロイド薬が１日１回投与される、請求項６７に記載の方法。
  69. 前記経口ステロイド薬が１日２回投与される、請求項６７に記載の方法。
  70. 前記患者が、前記ウイルスベクターの投与後にＡＬＴ及び／又はＡＳＴのレベルの上昇に関してモニタされ、前記経口ステロイド薬が３０日後もＡＳＴ及び／又はＡＬＴレベルが正常上限の２倍未満又は約１２０ＩＵ／Ｌ未満になるまで投与され続ける、請求項６６〜６９のいずれか一項に記載の方法。
  71. 前記患者が経口ステロイド薬を、ＡＳＴ及び／又はＡＬＴレベルが正常上限の２倍未満又は約１２０ＩＵ／Ｌ未満になるまで投与される、請求項６６〜７０のいずれか一項に記載の方法。
  72. 前記経口ステロイド薬が約１ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項６６〜７０のいずれか一項に記載の方法。
  73. ＡＳＴ及びＡＬＴが正常上限の２倍未満又は約１２０ＩＵ／Ｌ未満になった後、前記経口ステロイド薬投与を漸減させることを更に含む、請求項６６〜７１のいずれか一項に記載の方法。
  74. 前記漸減が、２週間で０．５ｍｇ／ｋｇ／日に至らせ、続いて更に２週間で０．２５ｍｇ／ｋｇ／日に至らせる段階的増加を含む、請求項７３に記載の方法。
  75. 前記経口ステロイド薬を約１ｍｇ／ｋｇの用量で３０日間投与し、次に２週間で０．５ｍｇ／ｋｇ／日に至り、続いて更に２週間で０．２５ｍｇ／ｋｇ／日に至るまで漸減させることを含む、請求項６６〜７３のいずれか一項に記載の方法。
  76. 前記経口ステロイド薬がプレドニゾロン又は等価薬である、請求項６６〜７５のいずれか一項に記載の方法。
  77. 前記患者に筋エンハンサー又は神経保護剤を投与することを含む、請求項２９〜７６のいずれか一項に記載の方法。
  78. 前記患者にＳＭＮを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む、請求項２９〜７７のいずれか一項に記載の方法。
  79. 前記患者にヌシネルセンを投与することを含む、請求項２９〜７８のいずれか一項に記載の方法。
  80. 前記患者にスタムルマブを投与することを含む、請求項２９〜７９のいずれか一項に記載の方法。
  81. 有効性がＣＨＯＰ−ＩＮＴＥＮＤ尺度を用いて決定される、請求項２９〜８０のいずれか一項に記載の方法。
  82. 疾患発症を伴う又は伴わない脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）Ｉ型小児患者の治療方法であって、請求項２又は５〜２８のいずれか一項に記載のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む組成物又は製剤を前記患者に投与することを含む、方法。
  83. それを必要としている患者におけるレット症候群の治療方法であって、請求項３又は８〜１７のいずれか一項に記載の組成物を髄腔内又は静脈内経路によって前記患者に投与することを含む、方法。
  84. それを必要としている患者における筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の治療方法であって、請求項４又は８〜１７のいずれか一項に記載の組成物を髄腔内又は静脈内経路によって前記患者に投与することを含む、方法。
  85. Ｉ型ＳＭＡに罹患している患者の治療方法であって、
    ａ．前記患者の体重を決定すること；
    ｂ．ＡＡＶ９ウイルスベクター医薬組成物のバイアルが入ったキットを入手することであって、前記キットが以下の本数のバイアルを含み：

    ｃ．各バイアルのウイルスベクター濃度が約２．０×１０１３ｖｇ／ｍＬであり；
    ｄ．前記ＡＡＶ９ウイルスベクターが、ＳＭＮタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むこと；及び
    ｅ．前記バイアルから前記ＡＡＶ９ウイルスベクターを前記患者に投与することを含む、方法。
  86. 前記ＡＡＶ９ウイルスベクターが、突然変異ＡＡＶ２ ＩＴＲ、ニワトリβ−アクチン（ＣＢ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサー、修飾ＳＶ４０後期１６ｓイントロン、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル、及びＡＡＶ２ ＩＴＲを含む、請求項８５に記載の方法。
  87. 前記ポリヌクレオチドが配列番号２のＳＭＮタンパク質をコードする、請求項８５又は８６に記載の方法。
  88. 前記ＡＡＶ９ウイルスベクターが配列番号１を含む、請求項８５〜８７のいずれか一項に記載の方法。
  89. 前記ＡＡＶウイルスベクターが約１．０×１０１４〜２．５×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で注入によって投与される、請求項８５〜８８のいずれか一項に記載の方法。
  90. 前記ＡＡＶウイルスベクターが約１．１×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で注入によって投与される、請求項８５〜８９のいずれか一項に記載の方法。
  91. 前記ウイルスベクターが約４５〜７０分かけて注入される、請求項８９又は９０に記載の方法。
  92. 前記ウイルスベクターが約６０分かけて注入される、請求項８９〜９１のいずれか一項に記載の方法。
  93. 前記注入がシリンジポンプを含む、請求項８９〜９２のいずれか一項に記載の方法。
  94. ウイルスベクターゲノムの量がｄｄＰＣＲを用いて測定される、請求項８５〜９３のいずれか一項に記載の方法。
  95. ＡＡＶ９ウイルスベクターの用量力価がｄｄＰＣＲによって測定される、請求項８５〜９４のいずれか一項に記載の方法。
  96. 以下の用量容積を投与することを含む、請求項８５〜９５のいずれか一項に記載の方法。
  97. 請求項２又は５〜１７のいずれか一項に記載の組成物又は請求項１８〜２８のいずれか一項に記載の製剤が入ったバイアルを含む、Ｉ型脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）に罹患している患者の治療用キット。
  98. 生存運動ニューロン（ＳＭＮ）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、且つｐＨ７．７〜８．３、例えば約８．０で２０ｍＭトリス、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．００５％ｗ／ｖポロキサマー１８８中約２．０×１０１３ｖｇ／ｍＬの濃度で製剤化された約５．５ｍＬ又は約８．３ｍＬのＡＡＶ９ウイルスベクターが入ったバイアルを含むキット。
  99. 前記ＡＡＶ９ウイルスベクターが、突然変異ＡＡＶ２ ＩＴＲ、ニワトリβ−アクチン（ＣＢ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサー、修飾ＳＶ４０後期１６ｓイントロン、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル、及びＡＡＶ２ ＩＴＲを含む、請求項９８に記載のキット。
  100. 前記ポリヌクレオチドが配列番号２のＳＭＮタンパク質をコードする、請求項９８又は９９に記載のキット。
  101. 前記ＡＡＶ９ウイルスベクターが配列番号１を含む、請求項９８〜１００のいずれか一項に記載のキット。
  102. ウイルスベクターゲノムの量がｄｄＰＣＲを用いて測定される、請求項９８〜１０１のいずれか一項に記載のキット。
  103. ある容積の請求項２又は５〜１７のいずれか一項に記載の組成物又は請求項１８〜２８のいずれか一項に記載の製剤をそれを必要としている患者に静脈内注入によって投与することを含む、Ｉ型ＳＭＡの治療方法。
  104. 前記患者の体重が２．６〜３．０ｋｇである場合、前記容積が１６．５ｍＬである、請求項１０３に記載の方法。
  105. 前記患者の体重が３．１〜３．５ｋｇである場合、前記容積が１９．３ｍＬである、請求項１０３に記載の方法。
  106. 前記患者の体重が３．６〜４．０ｋｇである場合、前記容積が２２．０ｍＬである、請求項１０３に記載の方法。
  107. 前記患者の体重が４．１〜４．５ｋｇである場合、前記容積が２４．８ｍＬである、請求項１０３に記載の方法。
  108. 前記患者の体重が４．６〜５．０ｋｇである場合、前記容積が２７．５ｍＬである、請求項１０３に記載の方法。
  109. 前記患者の体重が５．１〜５．５ｋｇである場合、前記容積が３０．３ｍＬである、請求項１０３に記載の方法。
  110. 前記患者の体重が５．６〜６．０ｋｇである場合、前記容積が３３．０ｍＬである、請求項１０３に記載の方法。
  111. 前記患者の体重が６．１〜６．５ｋｇである場合、前記容積が３５．８ｍＬである、請求項１０３に記載の方法。
  112. 前記患者の体重が６．６〜７．０ｋｇである場合、前記容積が３８．５ｍＬである、請求項１０３に記載の方法。
  113. 前記患者の体重が７．１〜７．５ｋｇである場合、前記容積が４１．３ｍＬである、請求項１０３に記載の方法。
  114. 前記患者の体重が７．６〜８．０ｋｇである場合、前記容積が４４．０ｍＬである、請求項１０３に記載の方法。
  115. 前記患者の体重が８．１〜８．５ｋｇである場合、前記容積が４６．８ｍＬである、請求項１０３に記載の方法。
  116. ＡＡＶウイルスベクターの製造方法であって、
    ａ．接着細胞を培養すること；
    ｂ．前記接着細胞に１つ又は複数のプラスミドをトランスフェクトして前記ＡＡＶウイルスベクターの産生を可能にすること；
    ｃ．前記接着細胞を溶解させて前記ＡＡＶウイルスベクターを単離すること；
    ｄ．前記（ｃ）の細胞ライセートを酸性化及び清澄化すること；
    ｅ．前記（ｄ）の産物を陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）を用いて精製すること；
    ｆ．前記（ｅ）の産物をタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）を用いてろ過すること；
    ｇ．前記（ｆ）の産物を塩化セシウム（ＣｓＣｌ）緩衝液中で超遠心すること；及び
    ｈ．前記（ｇ）の産物から前記ＡＡＶウイルスベクターを回収すること
    を含む方法。
  117. 前記ＡＡＶがＡＡＶ９である、請求項１１６に記載の方法。
  118. 前記ＡＡＶが自己相補的（ｓｃＡＡＶ）である、請求項１１６又は１１７に記載の方法。
  119. 前記接着細胞がＨＥＫ２９３細胞である、請求項１１６〜１１８のいずれか一項に記載の方法。
  120. 前記接着細胞が培養前に接着性に関して選択される、請求項１１６〜１１９のいずれか一項に記載の方法。
  121. 前記選択が、前記接着細胞を複数回継代培養することにより接着性に関して選択することを含む、請求項１１６〜１２０のいずれか一項に記載の方法。
  122. 前記接着細胞が培養用バイオリアクターに播種される、請求項１１６〜１２１のいずれか一項に記載の方法。
  123. 前記バイオリアクターが、細胞培養培地の連続循環を提供することができる大規模バイオリアクターである、請求項１２２に記載の方法。
  124. 前記バイオリアクターが２００ｍ２又は３３３ｍ２バイオリアクターである、請求項１２２又は１２３に記載の方法。
  125. 前記バイオリアクターが５００ｍ２バイオリアクターである、請求項１２２又は１２３に記載の方法。
  126. 前記接着細胞を再循環培地バッグ内の培地に加え、例えば蠕動ポンプを使用して前記バイオリアクターに循環させる、請求項１２２〜１２５のいずれか一項に記載の方法。
  127. 前記接着細胞が培養用バイオリアクターに播種される間、前記蠕動ポンプ輸送が継続される、請求項１２６に記載の方法。
  128. 前記播種密度が約８，０００〜１２，０００細胞／ｃｍ２である、請求項１２２〜１２７のいずれか一項に記載の方法。
  129. 前記トランスフェクションステップが、前記再循環培地バッグにトランスフェクション培地を加えること、及び前記トランスフェクション培地を例えば蠕動ポンプを使用して前記バイオリアクターに循環させることを含む、請求項１２２〜１２８のいずれか一項に記載の方法。
  130. 前記循環、例えば蠕動ポンプ輸送が１５〜２５℃で行われる、請求項１２６〜１２９のいずれか一項に記載の方法。
  131. 前記トランスフェクションステップが、アデノウイルスヘルパープラスミド（ｐＨＥＬＰ）を前記接着細胞に接触させることを含む、請求項１１６〜１３０のいずれか一項に記載の方法。
  132. 前記トランスフェクションステップが、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子をコードするプラスミドを前記接着細胞に接触させることを含む、請求項１１６〜１３１のいずれか一項に記載の方法。
  133. 前記トランスフェクションステップが、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子をコードするプラスミドを前記接着細胞に接触させることを含む、請求項１１６〜１３２のいずれか一項に記載の方法。
  134. 前記トランスフェクションステップが、同じプラスミド（ｐＡＡＶ）上にＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子及びＡＡＶ ｃａｐ遺伝子をコードするプラスミドを前記接着細胞に接触させることを含む、請求項１１６〜１３３のいずれか一項に記載の方法。
  135. 前記ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子がｒｅｐ２である、請求項１３２又は１３４に記載の方法。
  136. 前記ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子がｃａｐ９である、請求項１３３又は１３４に記載の方法。
  137. 前記トランスフェクションステップが、トランスフェクション剤ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を前記接着細胞に接触させることを含む、請求項１１６〜１３５のいずれか一項に記載の方法。
  138. ＰＥＩと前記プラスミドのうちの少なくとも１つとの比が重量基準で１：１未満である、請求項１３７に記載の方法。
  139. ＰＥＩと前記プラスミドのうちの少なくとも１つとの比が重量基準で約１：１である、請求項１３７に記載の方法。
  140. 前記トランスフェクションステップが、血清を含有しないトランスフェクション培地を前記接着細胞に接触させることを含む、請求項１１６〜１３９のいずれか一項に記載の方法。
  141. 前記トランスフェクションステップが、カルシウムを含有しないトランスフェクション培地を前記接着細胞に接触させることを含む、請求項１１６〜１４０のいずれか一項に記載の方法。
  142. 前記トランスフェクションステップが、グルタミンを含有しないトランスフェクション培地を前記接着細胞に接触させることを含む、請求項１１６〜１４１のいずれか一項に記載の方法。
  143. 前記トランスフェクションステップが１０〜６０分間実施される、請求項１１６〜１４２のいずれか一項に記載の方法。
  144. 前記トランスフェクションステップが１０〜３０分間実施される、請求項１１６〜１４３のいずれか一項に記載の方法。
  145. 前記トランスフェクションステップが３０分未満の間実施される、請求項１１６〜１４４のいずれか一項に記載の方法。
  146. 前記トランスフェクションステップが２０〜３０分間実施される、請求項１１６〜１４５のいずれか一項に記載の方法。
  147. 前記トランスフェクションステップが１５〜３０分間実施される、請求項１１６〜１４６のいずれか一項に記載の方法。
  148. 前記溶解するステップが全細胞溶解を含む、請求項１１６〜１４７のいずれか一項に記載の方法。
  149. 前記溶解するステップが、エンドヌクレアーゼを補足した溶解緩衝液を使用することを含む、請求項１１６〜１４８のいずれか一項に記載の方法。
  150. 前記エンドヌクレアーゼがベンゾナーゼである、請求項１４９に記載の方法。
  151. 前記溶解するステップが、ＴＷＥＥＮを補足した溶解緩衝液を使用することを含む、請求項１１６〜１５０のいずれか一項に記載の方法。
  152. 前記溶解するステップが１５〜２５℃で実施される、請求項１１６〜１５１のいずれか一項に記載の方法。
  153. 前記ステップ（ｃ）の細胞ライセートを前記（ｄ）の酸性化ステップ前に凍結することを更に含む、請求項１１６〜１５２のいずれか一項に記載の方法。
  154. 細胞培養ライセートからのＡＡＶウイルスベクターの精製方法であって、
    ａ．前記細胞ライセートを酸性化及び清澄化するステップ；
    ｂ．前記（ａ）の産物を陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）を用いて精製するステップ；
    ｃ．前記（ｂ）の産物をタンジェンシャルフローろ過でろ過するステップ；
    ｄ．前記（ｃ）の産物を２〜４Ｍ塩化セシウム（ＣｓＣｌ）緩衝液を用いて超遠心するステップ；
    ｅ．前記（ｄ）の産物から前記ＡＡＶウイルスベクターを収集するステップ；
    ｆ．前記（ｅ）の産物をタンジェンシャルフローろ過でろ過するステップ
    を含む方法。
  155. 前記酸性化ステップが、前記細胞ライセートを約３．０〜４．０のｐＨに酸性化することを含む、請求項１１６〜１５４のいずれか一項に記載の方法。
  156. 前記酸性化ステップが、前記細胞ライセートを約３．３〜３．７のｐＨに酸性化することを含む、請求項１１６〜１５５のいずれか一項に記載の方法。
  157. 前記酸性化ステップが、前記細胞ライセートを約３．４〜３．６のｐＨに酸性化することを含む、請求項１１６〜１５６のいずれか一項に記載の方法。
  158. 前記酸性化ステップが、前記細胞ライセートを約３．５のｐＨに酸性化することを含む、請求項１１６〜１５７のいずれか一項に記載の方法。
  159. 前記超遠心が４０，０００〜５０，０００ｒｐｍで実施される、請求項１１６〜１５８のいずれか一項に記載の方法。
  160. 前記超遠心が約４３，０００〜４６，０００ｒｐｍで実施される、請求項１１６〜１５９のいずれか一項に記載の方法。
  161. 前記超遠心が１５〜２５℃で実施される、請求項１１６〜１６０のいずれか一項に記載の方法。
  162. 前記超遠心が１６〜２４時間実施される、請求項１１６〜１６１のいずれか一項に記載の方法。
  163. 前記超遠心が２０〜２４時間実施される、請求項１１６〜１６２のいずれか一項に記載の方法。
  164. 前記ＣｓＣｌが約３Ｍの濃度である、請求項１１６〜１６８のいずれか一項に記載の方法。
  165. 前記細胞ライセートが前記酸性化ステップの前にＴｗｅｅｎと共にインキュベートされる、請求項１１６〜１６４のいずれか一項に記載の方法。
  166. 前記細胞ライセートが前記酸性化ステップの前にＴｗｅｅｎと共に約８〜２０時間インキュベートされる、請求項１１６〜１６５のいずれか一項に記載の方法。
  167. 前記清澄化ステップが、前記細胞ライセートをデプスフィルタでろ過することを含む、請求項１１６〜１６６のいずれか一項に記載の方法。
  168. 前記清澄化ステップが、前記細胞ライセートを０．４５ミクロンフィルタでろ過することを含む、請求項１１６〜１６７のいずれか一項に記載の方法。
  169. 前記ＣＥＸがスルホニル樹脂を含む、請求項１１６〜１６８のいずれか一項に記載の方法。
  170. 少なくとも１つのＴＦＦステップが、３００ｋＤａ ＭＷの分子量カットオフのセルロース膜を使用することを含み、前記陽イオン交換ステップの溶出物容積を少なくとも６分の１に低減する、請求項１１６〜１６９のいずれか一項に記載の方法。
  171. 少なくとも１つのＴＦＦステップが、約３００ｋＤａ ＭＷの分子量カットオフのセルロース膜を使用することを含む、請求項１１６〜１７０のいずれか一項に記載の方法。
  172. 前記ＣｓＣｌ緩衝液が約３Ｍ ＣｓＣｌを含む、請求項１１６〜１７１のいずれか一項に記載の方法。
  173. 前記ＣｓＣｌ緩衝液が、トリス、ＭｇＣｌ２、及びポロキサマー１８８を含む、請求項１１６〜１７２のいずれか一項に記載の方法。
  174. 前記ＣｓＣｌ緩衝液が約２０ｍＭトリスを含む、請求項１１６〜１７３のいずれか一項に記載の方法。
  175. 前記ＣｓＣｌ緩衝液が約２ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む、請求項１１６〜１７４のいずれか一項に記載の方法。
  176. 前記ＣｓＣｌ緩衝液が、ポロキサマー１８８、任意選択で約０．２％ｗ／ｖポロキサマー１８８を含む、請求項１１６〜１７５のいずれか一項に記載の方法。
  177. 前記ＣｓＣｌ緩衝液が約ｐＨ７．５〜８．５である、請求項１１６〜１７６のいずれか一項に記載の方法。
  178. 前記ＣｓＣｌ緩衝液が約ｐＨ７．９〜８．２である、請求項１１６〜１７７のいずれか一項に記載の方法。
  179. 空のウイルスカプシドの数が、前記超遠心した細胞ライセートから前記ＡＡＶウイルスベクターを収集した後の総ウイルスカプシドの７％未満である、請求項１１６〜１７８のいずれか一項に記載の方法。
  180. 空のウイルスカプシドの数が、前記超遠心した細胞ライセートから前記ＡＡＶウイルスベクターを収集した後の総ウイルスカプシドの５％未満である、請求項１１６〜１７９のいずれか一項に記載の方法。
  181. 空のウイルスカプシドの数が、前記超遠心した細胞ライセートから前記ＡＡＶウイルスベクターを収集した後の総ウイルスカプシドの３％未満である、請求項１１６〜２００のいずれか一項に記載の方法。
  182. 空のウイルスカプシドの数が、前記超遠心した細胞ライセートから前記ＡＡＶウイルスベクターを収集した後の総ウイルスカプシドの１％未満である、請求項１１６〜２０１のいずれか一項に記載の方法。
  183. 空のウイルスカプシドの数がＡＵＣによって測定される、請求項１７９〜１８２のいずれか一項に記載の方法。
  184. 前記ＡＡＶウイルスベクターが、前記超遠心した細胞ライセートからシリンジを使用して収集される、請求項１１６〜１８３のいずれか一項に記載の方法。
  185. 前記２回目のＴＦＦステップ後に収集される前記ＡＡＶウイルスベクターが、トリス、ＭｇＣｌ２、ＮａＣｌ、及びポロキサマー１８８を含む溶液中に貯蔵される、請求項１１６〜１８４のいずれか一項に記載の方法。
  186. 前記溶液が約２０ｍＭトリスを含む、請求項１８５に記載の方法。
  187. 前記溶液が約１ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む、請求項１８５又は１８６に記載の方法。
  188. 前記溶液が約２００ｍＭ ＮａＣｌを含む、請求項１８５〜１８７のいずれか一項に記載の方法。
  189. 前記溶液が約０．００５％ｗ／ｖポロキサマー１８８を含む、請求項１８５〜１８８のいずれか一項に記載の方法。
  190. 前記溶液が約ｐＨ７．５〜８．５である、請求項１８５〜１８９のいずれか一項に記載の方法。
  191. 前記溶液が約ｐＨ７．７〜８．３である、請求項１８５〜１９０のいずれか一項に記載の方法。
  192. 前記２回目のＴＦＦ後に収集される前記ＡＡＶウイルスベクターが、約３０μｇ／ｇ未満又は約２０μｇ／ｇ未満のＣｓＣｌを含有する、請求項１１６〜１９１のいずれか一項に記載の方法。
  193. 前記２回目のＴＦＦ後に収集されるＡＡＶウイルスベクターの濃度が約３×１０１３ｖｇ／ｍｌ以上である、請求項１１６〜１９２のいずれか一項に記載の方法。
  194. 宿主細胞タンパク質及び／又は宿主細胞ＤＮＡが、前記細胞ライセートからデタージェントによるフロキュレーションを用いて除去される、請求項１１６〜１９３のいずれか一項に記載の方法。
  195. 前記ＡＡＶウイルスベクターが、生存運動ニューロン（ＳＭＮ）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１１６〜１９４のいずれか一項に記載の方法。
  196. 前記ＡＡＶウイルスベクターが、突然変異ＡＡＶ２ ＩＴＲ、ニワトリβ−アクチン（ＣＢ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサー、修飾ＳＶ４０後期１６ｓイントロン、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル、及びＡＡＶ２ ＩＴＲを含む、請求項１１６〜１９５のいずれか一項に記載の方法。
  197. 前記ポリヌクレオチドが配列番号２のＳＭＮタンパク質をコードする、請求項１９５又は１９６に記載の方法。
  198. 前記ＡＡＶウイルスベクターが配列番号１を含む、請求項１９５又は１９６に記載の方法。
  199. 前記ＳＭＮタンパク質をコードする前記プラスミド、前記ｐＡＡＶをコードする前記プラスミド、及び前記ｐＨＥＬＰをコードする前記プラスミドが１：１：１の比でトランスフェクトされる、請求項１９５〜１９８のいずれか一項に記載の方法。
  200. 前記ＡＡＶウイルスベクターが、ＭＥＣＰ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１１６〜１９４のいずれか一項に記載の方法。
  201. 前記ＡＡＶウイルスベクターが、ＳＯＤ１を標的とするｓｈＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１１６〜１９４のいずれか一項に記載の方法。
  202. 請求項１１６〜１９９のいずれか一項に記載の方法により調製されるとおりのＳＭＮタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶ９ウイルスベクターを投与することによる、ＳＭＡ１型を有する患者の治療方法。
  203. 請求項１１６〜１９４又は２００のいずれか一項に記載の方法により調製されるとおりのＭＥＣＰ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶ９ウイルスベクターを投与することによる、レット症候群を有する患者の治療方法。
  204. 請求項１１６〜１９４又は２０１のいずれか一項に記載の方法により調製されるとおりのＳＯＤ１を標的とするｓｈＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶ９ウイルスベクターを投与することによる、ＡＬＳを有する患者の治療方法。
  205. 請求項１１６〜１９９のいずれか一項に記載の方法により製造される、ＳＭＮタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶ９ウイルスベクター。
  206. 請求項１１６〜１９９のいずれか一項に記載の方法により製造される、ＳＭＮタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶ９ウイルスベクターを含む医薬組成物。
  207. ＳＭＮタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶ９ウイルスベクターと、トリス緩衝液と、塩化マグネシウム溶液と、塩化ナトリウム溶液とを含む水性医薬組成物であって、前記医薬組成物が保存剤を含まず、及び前記組成物が請求項１１６〜１９９のいずれか一項に記載の方法により製造される、組成物。
  208. 請求項１１６〜１９４又は２００のいずれか一項に記載の方法により製造される、ＭＥＣＰ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶ９ウイルスベクター。
  209. 請求項１１６〜１９４又は２００のいずれか一項に記載の方法により製造される、ＭＥＣＰ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶ９ウイルスベクターを含む医薬組成物。
  210. 請求項１１６〜１９４又は２０１のいずれか一項に記載の方法により製造される、ＳＯＤ１を標的とするｓｈＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶ９ウイルスベクター。
  211. 請求項１１６〜１９４又は２０１のいずれか一項に記載の方法により製造される、ＳＯＤ１を標的とするｓｈＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶ９ウイルスベクターを含む医薬組成物。
  212. ａ．修飾ＡＡＶ２ ＩＴＲと、ニワトリβ−アクチン（ＣＢ）プロモーターと、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサーと、修飾ＳＶ４０後期１６ｓイントロンと、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナルと、非修飾ＡＡＶ２ ＩＴＲとを含む自己相補的ＡＡＶ９ウイルスベクター；
    ｂ．ｐＨ８．０の２０ｍＭトリス；
    ｃ．１ｍＭ ＭｇＣｌ２；
    ｄ．２００ｍＭ ＮａＣｌ；及び
    ｅ．０．００５％ポロキサマー１８８
    を含む医薬組成物を静脈内投与することによる、それを必要としている患者におけるＩ型ＳＭＡの治療方法であって；
    前記患者が２．６ｋｇ〜８．５ｋｇの体重である、方法。
  213. 前記組成物が保存剤を含まない、請求項２１２に記載の方法。
  214. 前記患者が：
    ａ．９ヵ月齢以下であり；
    ｂ．少なくとも約２．６ｋｇの体重であり；
    ｃ．両アレル性ＳＭＮ１ヌル突然変異又は欠失を有し；及び
    ｄ．ＳＭＮ２の少なくとも１つの機能性コピーを有する、
    請求項２１２又は２１３に記載の方法。
  215. ａ．修飾ＡＡＶ２ ＩＴＲと、ニワトリβ−アクチン（ＣＢ）プロモーターと、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサーと、修飾ＳＶ４０後期１６ｓイントロンと、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナルと、非修飾ＡＡＶ２ ＩＴＲとを含む自己相補的ＡＡＶ９ウイルスベクター；
    ｂ．ｐＨ８．０の２０ｍＭトリス；
    ｃ．１ｍＭ ＭｇＣｌ２；
    ｄ．２００ｍＭ ＮａＣｌ；及び
    ｅ．０．００５％ポロキサマー１８８
    を含む医薬組成物の静脈内投与に好適な、又はそれ用に製造される組成物。
  216. 保存剤を含まない、請求項２１５に記載の組成物。
  217. 工業規模で実施される、請求項１１６〜２０１のいずれか一項に記載の方法。
  218. 産生されるＡＡＶ収率が、製造バッチ当たり５×１０１５ｖｇ超、又は８×１０１５ｖｇ超又は１×１０１６ｖｇ超である、請求項１１６〜２０１又は２１７のいずれか一項に記載の方法。
  219. 以下のうちの少なくとも１つ：
    ａ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約０．０９ｎｇ未満のベンゾナーゼ、
    ｂ．約３０μｇ／ｇ（ｐｐｍ）未満のセシウム、
    ｃ．約２０〜８０ｐｐｍのポロキサマー１８８、
    ｄ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約０．２２ｎｇ未満のＢＳＡ、
    ｅ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約６．８×１０５ｐｇ未満の残留プラスミドＤＮＡ、
    ｆ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約１．１×１０５ｐｇ未満の残留ｈｃＤＮＡ、
    ｇ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約４ｎｇ未満のｒＨＣＰ、
    ｈ．約ｐＨ７．７〜８．３、
    ｉ．約３９０〜４３０ｍＯｓｍ／ｋｇ、
    ｊ．容器当たり約６００個未満の≧２５μｍサイズの粒子、
    ｋ．容器当たり約６０００個未満の≧１０μｍサイズの粒子、
    ｌ．約１．７×１０１３〜２．３×１０１３ｖｇ／ｍＬのゲノム力価、
    ｍ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約３．９×１０８〜８．４×１０１０ＩＵの感染力価、
    ｎ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約１００〜３００μｇの全タンパク質、
    ｏ．約７０〜１３０％の相対効力、及び
    ｐ．約５％未満の空のカプシド
    を含む、請求項１〜１７、１８〜２８、８２〜８４、又は２０５〜２１１のいずれか一項に記載の組成物又は製剤。
  220. 以下のうちの少なくとも１つ：
    ａ．約ｐＨ７．７〜８．３、
    ｂ．約３９０〜４３０ｍＯｓｍ／ｋｇ、
    ｃ．容器当たり約６００個未満の≧２５μｍサイズの粒子、
    ｄ．容器当たり約６０００個未満の≧１０μｍサイズの粒子、
    ｅ．約１．７×１０１３〜２．３×１０１３ｖｇ／ｍＬのゲノム力価、
    ｆ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約３．９×１０８〜８．４×１０１０ＩＵの感染力価、
    ｇ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約１００〜３００μｇの全タンパク質、
    ｈ．約２０〜８０ｐｐｍのＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８含有量（ｃｏｎｅｎｔ）、
    ｉ．約７０〜１３０％の相対効力、
    ｊ．７．５×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量で２４日以上のΔ７ＳＭＮマウスモデルにおける生存期間中央値（ｍｅｄｉａｎ ｓｕｒｖｉａｌ）、
    ｋ．約５％未満の空のカプシド、
    ｌ．及び約９５％以上の総純度、及び
    ｍ．約０．７５ＥＵ／ｍＬ以下のエンドトキシン
    を含む、請求項１〜１７、１８〜２８、８２〜８４、又は２０５〜２１１のいずれか一項に記載の組成物又は製剤。
  221. 以下のうちの少なくとも１つ：
    ａ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約０．０９ｎｇ未満のベンゾナーゼ、
    ｂ．約３０μｇ／ｇ（ｐｐｍ）未満のセシウム、
    ｃ．約２０〜８０ｐｐｍのポロキサマー１８８、
    ｄ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約０．２２ｎｇ未満のＢＳＡ、
    ｅ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約６．８×１０５ｐｇ未満の残留プラスミドＤＮＡ、
    ｆ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約１．１×１０５ｐｇ未満の残留ｈｃＤＮＡ、及び
    ｇ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約４ｎｇ未満のｒＨＣＰ
    を含む、請求項１〜１７、１８〜２８、８２〜８４、又は２０５〜２１１のいずれか一項に記載の組成物又は製剤。
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