CN113226380A - Aav病毒载体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本文披露了包含AAV9病毒载体的组合物及使用其治疗SMA患者，例如II型及III型脊髓性肌萎缩(SMA)患者的方法。

Description

AAV病毒载体及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年11月30日提交的美国临时专利申请第62/773,894号及2019年4月17日提交的美国临时专利申请第62/835,242号的优先权。这些申请的内容以全文引用的方式并入本文中。
序列表
本申请含有已经以ASCII格式电子递交的序列表，并且将该序列表通过引用以其整体特此并入。所述ASCII副本创建于2019年11月12日，名称14452_0025-00304_SL.txt，大小为14,833字节。
技术领域
本披露涉及病毒颗粒的组合物及用途。
背景技术
腺相关病毒(AAV)为细小病毒科(parvoviridae)家族的成员。AAV基因组包含长度为约4.7千碱基(kb)的线性单链DNA分子，其具有编码非结构性Rep(复制)及结构性Cap(衣壳)蛋白质的两个主要开放阅读框。两个顺式作用反向末端重复(ITR)序列与AAV编码区侧接，这些反向末端重复(ITR)序列的长度为约145个核苷酸，具有间杂的回文序列，这些回文序列可折叠成发夹结构，其在DNA复制的起始期间充当引物。除其在DNA复制中的作用以外，已证实ITR序列在病毒整合、自宿主基因组的救援及病毒核酸衣壳化成为成熟病毒粒子中起作用(Muzyczka,(1992)Curr.Top.Micro.Immunol.[微生物学和免疫学的最新课题]158:97-129)。
存在AAV的多种血清型并且提供了不同的组织嗜性。已知的血清型包括例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10及AAV11。AAV9描述于美国专利第7,198,951号及Gao等人,J.Virol.[病毒学杂志],78:6381-6388(2004)中，其以全文引用的方式并入本文中。AAV6及AAV8递送的发展使得有可能在简单的全身性静脉内或腹膜内注射之后进行骨骼及心肌的由这些血清型进行的转导。参见Pacak等人,Circ.Res.[循环研究],99(4):3-9(2006)及Wang等人,Nature Biotech.[自然生物技术]23(3):321-8(2005)。但使用AAV靶向中枢神经系统内的细胞类型需要外科实质内注射。参见Kaplitt等人,“Safety andtolerability of gene therapy with an adeno-associated virus(AAV)borne GADgene for Parkinson’s disease:an open label,phase I trial.[腺相关病毒(AAV)携带的GAD基因治疗帕金森病的基因治疗的安全性和耐受性：一项开放标签的I期试验]”Lancet[柳叶刀],369:2097-2105；Marks等人,“Gene delivery of AAV2-neurturin forParkinson’s disease:a double-blind,randomized,controlled trial.[用于帕金森病的AAV2-neurturin的基因递送：一项双盲、随机、对照试验]”Lancet Neurol[柳叶刀神经病学]9:1164-1172；及Worgall等人,“Treatment of late infantile neuronal ceroidlipofuscinosis by CNS administration of a serotype 2adeno-associated virusexpressing CLN2 cDNA.[通过中枢神经系统施用表达CLN2 cDNA的血清型2腺相关病毒，治疗婴儿后期神经元类脂褐质病]”Hum Gene Ther[人类基因治疗],19(5):463-74。
AAV血清型2(AAV2)基因组的核苷酸序列呈现在以下文献中：Srivastava等人,JVirol[病毒学杂志],45:555-564(1983)，由以下文献修正：Ruffing等人,J Gen Virol[普通病毒学杂志],75:3385-3392(1994)。ITR内含有指导病毒DNA复制(rep)、衣壳化/封装和宿主细胞染色体整合的顺式作用序列。三种AAV启动子(针对其相对应图定位命名为p5、p19及p40)驱动编码两个AAV内部开放阅读框的rep及cap基因的表达。两个rep启动子(p5及p19)，与单个AAV内含子的差异性剪接(在核苷酸2107及2227处)偶联，引起自rep基因产生四种rep蛋白质(rep78、rep 68、rep 52及rep 40)。rep蛋白质具有最终负责复制病毒基因组的多种酶学特性。cap基因由p40启动子表达，且其编码三种衣壳蛋白VP1、VP2及VP3。可变剪接及非共同翻译起始位点负责产生三种相关衣壳蛋白。单个共同聚腺苷酸化位点位于AAV基因组的图位置95处。在以下文献中综述了AAV的生存周期和遗传学：Muzyczka,Current Topics in Microbiology and Immunology[微生物学和免疫学的当前主题],158:97-129(1992)。
来源于AAV的载体对于递送遗传物质而言尤其有吸引力，因为(i)其能够感染(转导)广泛多种未分裂及分裂细胞类型，包括肌纤维及神经元；(ii)其不具有病毒结构性基因，由此消除对病毒感染的天然宿主细胞反应，例如干扰素介导的反应；(iii)野生型病毒从未与人类中的任何病变相关联；(iv)与野生型AAV相比，其能够整合至宿主细胞基因组中，复制缺陷型AAV载体通常保持呈游离基因体形式，因此限制致癌基因的插入性突变诱发或活化的风险；及(v)与其他载体系统相比，AAV载体不触发显著免疫反应(参见ii)，因此实现治疗性转基因的长期表达(限制条件为其基因产物不被排斥)。
自互补腺相关载体(scAAV)为从天然存在的腺相关病毒(AAV)工程化的用于基因疗法的病毒载体。ScAAV称为“自互补”，因为编码区已经设计以形成分子内双链DNA模板。标准AAV基因组生命周期的限速步骤涉及第二链合成，因为典型的AAV基因组为单链DNA模板。然而，scAAV基因组并非如此。在感染时，而非等待细胞介导的第二条链合成，scAAV的两个互补的半部分将结合以形成一个双链DNA(dsDNA)单元，其准备好立即进行复制及转录。
脊髓性肌萎缩(SMA)为由染色体5q13上的运动神经元存活1基因(SMN1)的损失或突变引起的神经发生性病症，该损失或突变引起SMN蛋白质水平降低及运动神经元的选择性功能障碍。SMA为常染色体隐性、早期儿童疾病，其在活婴儿中的发病率为1:10,000。Sugarman等人,“Pan-ethnic carrier screening and prenatal diagnosis for spinalmuscular atrophy:clinical laboratory analysis of>72,400 specimens.[脊柱肌萎缩症的全民族携带者筛查和产前诊断：>72,400个标本的临床实验室分析]”Europeanjournal of human genetics[欧洲人类遗传学杂志],20(1):27-32。SMA的所有形式在遗传中为常染色体隐性且由运动神经元存活1基因(SMN1)的缺失或突变引起。人类还具有SMN1基因的第二、几乎一致的拷贝，称为SMN2。SMN1及SMN2基因均表达SMN蛋白质，然而，由SMN2产生的功能性全长蛋白质的量远低于(达到10％-15％)由SMN1产生的量。尽管SMN2不能完全补偿SMN1基因的损失，但具有SMA的较轻度的形式的患者通常具有更高的SMN2拷贝数。在由Feldkotter等人进行值大型早期研究中，SMN2的2个拷贝对于产生I型SMA为97％预测性，SMN2的3个拷贝对于产生II型SMA为83％预测性，且SMN2的4个拷贝对于III型SMA为84％预测性。Feldkotter等人,“Quantitative analyses of SMN1 and SMN2 based on real-time lightCycler PCR:fast and highly reliable carrier testing and predictionof severity of spinal muscular atrophy.[基于实时lightCycler PCR的SMN1和SMN2定量分析：快速且高度可靠的载体测试和预测脊髓性肌萎缩的严重程度]”American Journalof Human Genetics[美国人类遗传学杂志],70(2):358-368。因为这些百分比不反映修饰因子突变的可能影响，其可能潜在反映拷贝数(在不存在遗传修饰因子的情况下)与临床表型之间的关系。在113名患有I型SMA的患者中，9名具有一个SMN2拷贝的患者存活<11个月，94名具有两个SMN2拷贝的患者中的88名存活<21个月，且10名具有三个SMN2拷贝的患者中的8名存活33-66个月
I型SMA为由遗传疾病引起的婴儿死亡的主要原因。疾病严重程度及临床预后取决于SMN2的拷贝数。在其最常见及严重的形式(I型)中，在生命之前几个月观测到低张症及进行性虚弱，在年龄为6个月时引起诊断且接着在两岁时由于呼吸衰竭而死亡。I型SMA为婴儿死亡的主要遗传原因。I型SMA中的运动神经元损失在产后早期较显著(或可能甚至在产前开始)，且患者从未实现独立坐立。I型SMA患者通常具有1或2个SMN2基因的拷贝。相比的下，II型SMA在最初18个月内显现，且罹患此病状的儿童能够在无需帮助的情况下保持坐立，但从未独立行走。II型SMA患者通常具有3个SMN2基因的拷贝。III型SMA患者实现独立行走的能力。在III型量规下，IIIa型患者通常在<3岁时显现出疾病发作，而IIIb型患者在3岁之后发作。II型及III型SMA患者的运动神经元似乎在发育期间调整及补偿且持续至成年人寿命。III型SMA患者通常具有3或4个SMN2基因的拷贝。来自各种神经生理及动物研究的结果证实在胚胎期及产后早期的运动神经元的早期损失。Swoboda等人,“Natural history ofdenervation in SMA:relation to age,SMN2 copy number,and function.[SMA去神经的自然史：与年龄，SMN2拷贝数和功能的关系]”Annals of neurology[神经病学年鉴]57(5):704-12；Le等人,“Temporal requirement for high SMN expression in SMA mice.[SMA小鼠中SMN高表达的时间要求]”Human molecular genetics[人类分子遗传学],20(18):3578-91；Farrar等人,“Corticomotoneuronal integrity and adaptation in spinalmuscular atrophy.[脊髓膜神经元完整性和对脊髓性肌萎缩症的适应]”Archives ofneurology[神经学档案],69(4):467-73。
II型及III型SMA患者具有相对稳定的临床病程。此外，研究表明结果差异与实现儿童生长期间的运动神经元调整及补偿且持续至成年人寿命的SMN2拷贝的数目相关。这与其中运动神经元损失在产后早期显著(或甚至可能自产前开始，尤其对于在生命之前三个月的I型SMA患者)的I型SMA不同。已证实SMN的过表达在小鼠及非人类灵长类动物中良好耐受，且在人类的高SMN2拷贝数中不具有风险(如在具有高SMN2拷贝数的II型、III型及IV型患者中所见)。提高SMA患者中的SMN(例如II型及III型SMA)水平提供一种治疗选项。
迄今为止，SMA(例如II型及III型SMA)中的治疗成果主要集中于小分子提高SMN水平的潜力。这些小分子包括脱乙酰基酶抑制剂，如丙戊酸、丁酸钠、丁酸苯基酯及曲古霉素A(trichostatin A)。这些试剂活化SMN2启动子，引起SMA动物模型中全长SMN蛋白质增加，其目的在于针对在III型SMA患者中发现的较轻度的特征修饰疾病表型。Riessland等人,“SAHA ameliorates the SMA phenotype in two mouse models for spinal muscularatrophy.[SAHA改善了两种脊髓型肌萎缩症小鼠模型的SMA表型]”Human moleculargenetics[人类分子遗传学],19(8):1492-506；Dayangac-Erden等人,“Carboxylic acidderivatives of histone deacetylase inhibitors induce full length SMN2transcripts:a promising target for spinal muscular atrophy therapeutics.[组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的羧酸衍生物诱导全长SMN2转录物：脊髓性肌萎缩疗法的有希望的目标]”Arch Med Sci[医学研究档案],7(2):230-4 2011。
使用若干种这些试剂(最值得注意的是丁酸苯基酯、丙戊酸及羟基脲)的临床试验未产生足够的临床益处。Darbar等人,“Evaluation of muscle strength and motorabilities in children with Type II and III spinal muscle atrophy treated withvalproic acid[丙戊酸治疗II型和III型脊髓性肌萎缩患儿的肌肉力量和运动能力的评估]”BMC Neurol[BMC神经学],11:36；www.ClinicalTrials.gov。FDA最近批准诺西那生(nusinersen)，一种反义寡核苷酸(ASO)药物，其经设计以通过调节SMN2基因的剪接，由此补偿潜在遗传缺陷来提高SMN蛋白质的产量。临床研究已证实某种程度的改良运动功能之前景；然而，必须以每季度为基础经由鞘内注射无限期地施用治疗，在实现有效性之前需要冗长的诱导期，且具有需要临床监测的安全性考虑因素。因此，仍需要使用替代物(如本文中披露的替代物)的经改良的SMA(包括II型及III型SMA)的治疗。
本文中披露包含AAV9病毒载体的组合物及使用其治疗SMA，例如II型及III型SMA患者的方法。在一些实施例中，这些方法包含鞘内注射具有修饰SMA(例如II型及III型SMA表现型)的能力的AAV9病毒载体，例如引起较轻度的疾病进程、停止疾病进程和/或改良的功能性发育。
发明内容
本披露提供用于治疗SMA(例如II型或III型SMA)的组合物及方法。重组病毒载体，例如本文中披露的表达SMN转基因的scAAV，可提供用于提高SMN水平的治疗方法。因为SMN转基因较小，因此其可由scAAV有效封装，实现与原型单链AAV病毒载体相比较低的病毒效价。然而，通常在较晚的年龄诊断出II型及III型SMA患者，此时其可能太大而不能接受安全及有效的基于体重的rAAV的静脉内剂量。因此，鞘内施用，其中AAV病毒载体通过血脑障壁直接递送至脑脊髓液，可提供安全及有效的用于转移较低病毒效价的替代性方式。
本披露提供治疗有需要的患者中的SMA(例如II型或III型脊髓性肌萎缩SMA))的方法，该方法包括鞘内施用包含编码运动神经元存活(SMN)蛋白质的多核苷酸的AAV9病毒载体，其中病毒载体以约1×1013vg-5×1014vg的剂量施用。在一个此类实施例中，AAV9病毒载体包含经修饰的AAV2 ITR、鸡β-肌动蛋白(CB)启动子、巨细胞病毒(CMV)即刻/早期增强子、经修饰的SV40晚期16S内含子、牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化信号及未经修饰的AAV2ITR。在另一实施例中，多核苷酸编码SEQ ID NO:2的SMN蛋白质。在另一实施例中，AAV9病毒载体包含SEQ ID NO:1。在一些实施例中，患者在施用时年龄为六个月或更大。在其他实施例中，患者在施用时年龄为24个月或更小，任选地年龄在6个月与24个月之间。在其他实施例中，患者在施用时年龄为60个月或更小，任选地年龄在24个月与60个月之间。在一些实施例中，AAV9病毒载体以约5.0×1013vg-3.0×1014vg的剂量施用。在一些实施例中，AAV9病毒载体以至多约6.0×1013vg的剂量施用。在一些实施例中，AAV9病毒载体以约6.0×1013vg的剂量施用。在一些实施例中，AAV9病毒载体以至多约1.2×1014vg的剂量施用。在一些实施例中，AAV9病毒载体以约1.2×1014vg的剂量施用。在一些实施例中，AAV9病毒载体以至多约2.4×1014vg的剂量施用。在一些实施例中，AAV9病毒载体以约2.4×1014vg的剂量施用。
在一些实施例中，AAV9病毒载体以包含约1.0×1013vg-9.9×1014vg的单位剂量施用。在一些实施例中，AAV9病毒载体以包含约1.0×1013vg-5.0×1014vg的单位剂量施用。在一些实施例中，AAV9病毒载体以包含约5.0×1013vg-3.0×1014vg的单位剂量施用。在一些实施例中，AAV9病毒载体以包含约6.0×1013vg的单位剂量施用。在一些实施例中，AAV9病毒载体以包含约1.2×1014vg的单位剂量施用。在一些实施例中，AAV9病毒载体以包含约2.4×1014vg的单位剂量施用。
在一些实施例中，患者包含双等位基因SMN1无效突变(null mutation)或不活化缺失，任选地其中突变包含SMN1的外显子七的缺失。在一些实施例中，患者具有三个SMN2的拷贝。在一些实施例中，患者在至少一个SMN2基因的拷贝上的外显子7中不具有c.859G>C取代。在一些实施例中，通过一种或多种基因组测试来确定有需要的患者。在一些实施例中，患者在年龄为约12个月之前显现出疾病发作。在一些实施例中，患者在施用时具有在无需帮助的情况下坐立约10秒或更长时间的能力，但不能站立或行走。在一些实施例中，患者在施用时具有在无需帮助的情况下坐立的能力，例如由世界卫生组织多中心生长参考研究(World Health Organization Multicentre Growth Reference Study；WHO-MGRS)标准定义。在一些实施例中，患者在施用之后具有在无支撑情况下站立至少约三秒的能力，例如由Bayley Scales of Infant and Toddler
Figure BDA0003087277400000081
定义，例如在施用之后评估约1-24个月，例如12个月。在一些实施例中，患者在施用之后具有在无辅助情况下行走的能力，例如由Bayley Scales of Infant and Toddler
Figure BDA0003087277400000082
定义，例如在施用之后评估约1-24个月，例如约12个月。在一些实施例中，患者在施用之后具有独立地行走至少五步的能力，例如由Bayley Scales of Infant and Toddler
Figure BDA0003087277400000083
定义，如在施用之后评估约1-24个月，例如约12个月。在一些实施例中，患者在治疗之后展示自治疗时的基线量测值的变化，例如由Bayley Scales of Infant and Toddler
Figure BDA0003087277400000091
定义，如在施用之后评估约1-24个月，例如约12个月。
在一些实施例中，患者在施用之后不具有严重的脊柱侧弯，例如在X射线检验时显而易见的脊椎≥50°弯曲，如在施用之后评估约1-24个月，例如约12个月。在一些实施例中，患者未禁忌脊椎穿刺程序或鞘内疗法的施用。在一些实施例中，患者先前未经历脊柱侧弯修复手术或程序，且任选地其中患者在施用之后6个月至3年内，例如1年内未经历脊柱侧弯修复手术或程序。在一些实施例中，患者在施用之前和/或之后无需使用侵入性通气支持。在一些实施例中，患者在施用之前不具有独立站立或步行的历史。在一些实施例中，患者在施用之前和/或之后未使用胃饲管。在一些实施例中，患者在治疗时不具有活性病毒感染(包括人类免疫缺陷病毒(HIV)或对B型或C型肝炎或寨卡病毒(Zika virus)呈血清学阳性)。在一些实施例中，患者在施用之前四周内未患有严重的非肺部/呼吸道感染(例如肾盂肾炎或脑膜炎)。在一些实施例中，患者在施用之前未患有伴随疾病，例如重度肾或肝损伤、已知的癫痫发作、糖尿病、特发性低钙尿症或症状性心肌病。在一些实施例中，患者在施用之前不具有细菌脑膜炎或脑部或脊髓疾病的病史。在一些实施例中，患者在施用之前不具有已知的对泼尼松龙(prednisolone)或其他糖皮质类固醇或赋形剂的过敏性或过敏反应。在一些实施例中，患者在施用之前不具有已知的对碘或含碘产品的过敏性或过敏反应。在一些实施例中，患者未使用药物治疗肌病或神经病。在一些实施例中，患者在施用之前3个月内未接受免疫抑制性疗法、血浆清除术、免疫调节剂，诸如阿达木单抗(adalimumab)。
在一些实施例中，患者在施用之前具有等于或低于1:25、1:50、1:75或1:100的抗AAV9抗体效价，例如通过ELISA结合免疫分析法测定。在一些实施例中，患者在施用之前具有以下中的一个或多个：小于正常值上限的约3倍的γ-谷氨酰转移酶水平、小于约3.0mg/dL的胆红素水平、小于约1.0mg/dL的肌酐水平、在约8-18g/dL之间的Hgb水平和/或小于约20000个/mm3的白血球计数。在一些实施例中，患者在施用之前尚未接受意欲治疗SMA的研究性或经批准的化合物产品或疗法。在一些实施例中，其中AAV9病毒载体与对比剂共同施用，任选地其中对比剂包含碘海醇(iohexol)。在一些实施例中，所施用的对比剂的体积为约1.0-2.0mL，例如约1.5mL，任选地其中在施用之前将对比剂与AAV9病毒载体混合，例如在施用之前少于24小时、少于12小时、少于6小时、少于5小时、少于4小时、少于3小时、少于2小时、少于1小时、少于30分钟或在即将施用之前。在一些实施例中，依序施用对比剂及AAV9病毒载体，例如其中首先施用(例如鞘内)对比剂且在施用对比剂之后施用(例如鞘内)AAV9病毒载体。在一些实施例中，依序施用对比剂及AAV9病毒载体，例如其中首先施用(例如鞘内)AAV9病毒载体且在施用AAV9病毒载体之后施用(例如鞘内)对比剂。在其中依序施用AAV9病毒载体及对比剂的实施例中，在彼此间隔2小时内、1小时内、45分钟内、30分钟内、15分钟内、10分钟内或5分钟内施用AAV9病毒载体及对比剂的施用。在一些实施例中，其中向患者施用的AAV9病毒载体及对比剂的总体积不超过约10mL、约9mL或约8mL。在一些实施例中，该方法进一步包含镇静或麻醉。在一些实施例中，患者在AAV9病毒载体的施用期间和/或之后处于垂头仰卧位(Trendelenburg position)。在一些实施例中，在施用AAV9病毒载体之后，使患者处于头向下倾斜约30°保持约10-60分钟，例如约15分钟。
在一些实施例中，在施用AAV9病毒载体之前，向患者施用口服类固醇至少约1-48小时，例如约24小时。在一些实施例中，在施用病毒载体之后，向患者施用口服类固醇保持至少约10-60天，例如约30天。在一些实施例中，每天一次施用口服类固醇。在一些实施例中，每天两次施用口服类固醇。在一些实施例中，在施用病毒载体之后监测患者的ALT和/或AST水平，且其中在30天之后继续施用口服类固醇直至AST和/或ALT水平低于正常值上限的两倍或低于约120IU/L。在一些实施例中，在施用AAV9病毒载体之后监测患者的T细胞反应程度，且其中在30天之后继续施用口服类固醇直至来自患者的样品(例如血液样品)中的T细胞反应降低至低于100个斑点形成细胞(SFC)/106个外周血液单核细胞(PBMC)。
在一些实施例中，以约1mg/kg的剂量施用口服类固醇。
在一些实施例中，在AST及ALT低于正常值上限的两倍或低于约120IU/L之后逐渐减少口服类固醇。在一些实施例中，逐渐减少包含使增量逐步变成约0.5mg/kg/天保持2周，接着变成约0.25mg/kg/天再保持2周。在一些实施例中，以约1mg/kg的剂量施用口服类固醇保持30天，且接着逐渐减少至0.5mg/kg/天保持2周，接着以约0.25mg/kg/天再保持2周。在一些实施例中，口服类固醇为泼尼松龙或等效物。
在一些实施例中，使用Bayley Scales of Infant and Toddler
Figure BDA0003087277400000111
量表和/或哈默史密斯功能性运动扩展量表(Hammersmith Functional Motor Scale-Expanded；HFMSE)测定治疗功效。在一些实施例中，该方法进一步包含与AAV9病毒载体的施用同时或依序向患者施用第二治疗剂。在一些此类实施例中，第二治疗剂包含肌肉增强剂或神经保护剂。在其他此类实施例中，第二治疗剂包含靶向SMN1和/或SMN2的一种或多种反义寡核苷酸。在一些实施例中，第二治疗剂包含诺西那生和/或司他莫单抗(stamulumab)。在一些实施例中，其中使用ddPCR量测AAV9病毒载体基因组的量。在一些实施例中，患者在施用之后具有等于或高于1:25、1:50、1:75或1:100的抗AAV9抗体效价，例如通过ELISA结合免疫分析法测定，且监测约1-8周或直至效价降低至低于1:25、1:50、1:75或1:100。在一些实施例中，患者在施用之后具有等于或高于1:25、1:50、1:75或1:100的抗AAV9抗体效价，例如通过ELISA结合免疫分析法测定，且施用类固醇(例如泼尼松龙)直至效价降低至低于1:25、1:50、1:75或1:100。在一些实施例中，在施用之前，患者的血小板计数高于约67,000个细胞/ml或高于约100,000个细胞/ml，或高于约150,000个细胞/ml。在一些实施例中，在施用之后，患者的血小板计数低于约67,000个细胞/ml，或低于约100,000个细胞/ml，或低于约150,000个细胞/ml，且监测约1-8周或直至血小板计数增加至约67,000个细胞/ml，或高于约100,000个细胞/ml，或高于约150,000个细胞/ml。在一些实施例中，在施用之后，患者的血小板计数低于约67,000个细胞/ml且通过血小板输注来治疗。在一些实施例中，患者在施用AAV9病毒载体之前具有正常肝功能。在一些实施例中，患者在施用之前具有小于约8-40U/L的肝转胺酶水平。
在一些实施例中，肝转胺酶选自AST、ALT及其组合。在一些实施例中，AAV9病毒载体呈适用于鞘内施用的药物配制品形式。
本披露还提供AAV9病毒载体的用途，其用于根据本文中所描述的方法治疗SMA，例如II型或III型脊髓性肌萎缩(SMA)。
本披露提供一种药物组合物，其包含AAV9病毒载体及适用于鞘内施用的药学上可接受的载剂，其中AAV9病毒载体包含经修饰的AAV2ITR、鸡β-肌动蛋白(CB)启动子、巨细胞病毒(CMV)即刻/早期增强子、经修饰的SV40晚期16S内含子、牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化信号及未经修饰的AAV2 ITR。在一些实施例中，多核苷酸编码SEQ ID NO:2的SMN蛋白质。在一些实施例中，AAV9病毒载体包含SEQ ID NO:1。在一些实施例中，药物组合物进一步包含对比剂。在一些实施例中，对比剂以约1.0-2.0mL，例如约1.5mL的量存在。
在一些实施例中，AAV9病毒载体及对比剂的总体积不超过约10mL、约9mL或约8mL。在一些实施例中，药物组合物进一步包含其他治疗剂。在一些实施例中，药物组合物用于本文中所描述的任一种治疗方法。
在一些实施例中，药物组合物为包含约1.0×1013vg-9.9×1014vg的单位剂量。在一些实施例中，药物组合物为包含约1.0×1013vg-5.0×1014vg的单位剂量。在一些实施例中，药物组合物为包含约5.0×1013vg-3.0×1014vg的单位剂量。
在一些实施例中，药物组合物为包含约6.0×1013vg的单位剂量。在一些实施例中，药物组合物为包含约1.2×1014vg的单位剂量。在一些实施例中，药物组合物为包含约2.4×1014vg的单位剂量。
在一些实施例中，药物组合物包含以下中的至少一者：(a)约pH7.7-8.3，(b)约390-430mOsm/kg，(c)每个容器中尺寸≥25μm的颗粒少于约600个，(d)每个容器中尺寸≥10μm的颗粒少于约6000个，(e)约1.7×1013-5.3×1013vg/mL基因组效价，(f)每1.0×1013vg的感染效价为约3.9×108-8.4×1010IU，(g)每1.0×1013vg的总蛋白质为约100-300μg，(h)普朗尼克(Pluronic)F-68含量为约20-80ppm，(i)相对效能为约70％-130％，(j)在7.5×1013vg/kg的剂量下，SMNΔ7小鼠模型中的中值存活期大于或等于24天，(k)小于约5％空衣壳，(l)且总纯度大于或等于约95％，及(m)小于或等于约0.13EU/mL内毒素。
在一些实施例中，药物组合物包含以下条件中的至少一者：(a)每1.0×1013vg小于约0.09ng全能核酸酶(benzonase)，(b)小于约30μg/g(ppm)铯，(c)约20-80ppm泊洛沙姆(Poloxamer)188，(d)每1.0×1013vg小于约0.22ng BSA，(e)每1.0×1013vg小于约6.8×105pg残余质粒DNA，(f)每1.0×1013vg小于约1.1×105pg残余hcDNA，(g)每1.0×1013vg小于约4ng rHCP，(h)约pH 7.7-8.3，(i)约390-430mOsm/kg，(j)每个容器中尺寸≥25μm的颗粒少于约600个，(k)每个容器中尺寸≥10μm的颗粒少于约6000个，(l)约1.7×1013-5.3×1013vg/mL基因组效价，(m)每1.0×1013vg的感染效价为约3.9×108-8.4×1010IU，(n)每1.0×1013vg的总蛋白质为约100-300μg，(o)相对效能为约70-130％，及(p)小于约5％空衣壳。
在一些实施例中，本文中所描述的方法或组合物的用途引起与先前施用分数相比，哈默史密斯功能性运动扩展量表的分数改良。在一些实施例中，本文中所描述的方法或组合物的用途引起与先前施用分数相比，Bayley Scales of Infant and Toddler
Figure BDA0003087277400000132
第三版(
Figure BDA0003087277400000131
-III)的分数改良。
附图说明
图1展示在AAV施用之后，经处理及对照小鼠的体质量。
图2展示患有II型或III型SMA的婴儿及儿童的阶段I、开放标记单次剂量施用研究的初始研究设计。患者在剂量对比安全性研究中接受AVXS-101。
图3展示在年龄为24个月之后评估的在接受剂量A(6.0×1013vg；用菱形标注)或剂量B(1.2×1014vg)鞘内AVXS-101的2型SMA患者中，哈默史密斯功能性运动扩展量表(HFMSE)的自基线的改变的瀑布图，以最高至最低排序。年龄在六个月与两岁之间的患者在输注时的结果由灰色柱描绘；黑色柱指示在输注时，年龄在2与5岁之间。
图4展示个别2型SMA患者的HFMSE分数。
图5展示在治疗时，年龄在六个月与五岁之间的患者对AVXS-101治疗的反应，如通过HFMSE量测。
图6展示在治疗时，年龄在两岁与五岁之间的接受1.2×1014vg的剂量的患者对AVXS-101治疗的反应，如通过HFMSE量测。
图7展示在≥24个月且<60个月年龄组(初步PNCR分析)-ITT集合中，至第12个月时HFMSE分数的自基线的变化的意大利面图(spaghetti plot)。
图8展示在≥24个月且<60个月年龄组(敏感性PNCR分析)-ITT集合中，至第12个月时HFMSE分数的自基线的变化的意大利面图。
图9展示在给药时年龄<24个月的患者-ITT集合中，至12个月时在每次基线后随访时，精细运动评分的自基线的变化的意大利面图，如通过Bayley
Figure BDA0003087277400000141
测定。
图10展示在给药时年龄<24个月的患者-ITT集合中，至12个月时在每次基线后随访时，粗大运动评分的自基线的变化的意大利面图，如通过Bayley
Figure BDA0003087277400000142
测定。
图11展示在给药时年龄≥24且<60个月的患者-ITT集合中，至12个月时在每次基线后随访时，精细运动评分的自基线的变化的意大利面图，如通过Bayley
Figure BDA0003087277400000151
测定。
图12展示在给药时年龄≥24且<60个月的患者-ITT集合中，至12个月时在每次基线后随访时，粗大运动评分的自基线的变化的意大利面图，如通过Bayley
Figure BDA0003087277400000152
测定。
图13展示在给药时年龄<24个月、在年龄超过24个月后继续参与研究的患者-ITT集合中，在每次基线后随访时，HFMSE的自基线的变化的意大利面图。
具体实施方式
为了更好地理解本披露，本文中论述某些例示性实施例。此外，论述某些术语以帮助理解。
在一些实施例中，“载体”意指任何基因组件，诸如质粒、噬菌体、转座子、黏粒、染色体、病毒、病毒粒子等，其能够在与适当的控制组件结合时复制且其可在细胞之间转移基因序列。因此，该术语包括克隆及表达媒剂，以及病毒载体。
在一些实施例中，“AAV载体”意指来源于腺相关病毒血清型的载体，包括(但不限于)AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8及AAV-9。AAV载体可具有一个或多个AAV野生型基因的整体或部分缺失，例如rep和/或cap基因，但保留功能性侧接ITR序列。功能性ITR序列为AAV病毒粒子的救援、复制及封装所必需的。因此，AAV载体在本文中定义为至少包括用于实现病毒的复制及封装的呈顺式(例如功能性ITR)的序列。ITR无需为野生型核苷酸序列且可变化，例如通过核苷酸的插入、缺失或取代，只要序列实现功能性救援、复制及封装即可。在一个实施例中，载体为AAV-9载体，具有AAV-2衍生的ITR。又，“AAV载体”意指蛋白质壳或衣壳，其提供用于将载体核酸递送至目标细胞的细胞核的有效媒剂。
在一些实施例中，“scAAV”意指自互补腺相关病毒(scAAV)，其为用于基因疗法的从天然存在的腺相关病毒(AAV)工程化的病毒载体。scAAV称为“自互补”，因为编码区已经设计以形成分子内双链DNA模板。
在一些实施例中，“重组病毒”意指以遗传方式改变(例如通过向颗粒中添加或插入异源核酸构建体)的病毒。“重组”可缩写为“r”，例如rAAV可指重组AAV。如本文中所使用，术语“AAV”意欲涵盖“重组AAV”或“rAAV”。
在一些实施例中，“AAV病毒粒子”意指完整的病毒颗粒，诸如野生型(wt)AAV病毒颗粒(包含与AAV衣壳蛋白包衣结合的线性、单链AAV核酸基因组)。在此方面，任一种互补含义的单链AAV核酸分子，例如“有义”或“反义”链，可封装至任一个AAV病毒粒子中且两个链均为感染性。
在一些实施例中，术语“重组AAV病毒粒子”、“rAAV病毒粒子”、“AAV载体颗粒”、“完全蛋白壳”及“完全颗粒”在本文中定义为包括AAV蛋白质壳的感染性、复制缺陷型病毒，包裹在两侧上由AAV ITR侧接的相关异源核苷酸序列。rAAV病毒粒子在适合的宿主细胞中产生，该宿主细胞的序列指定AAV载体、AAV辅助功能及引入其中的附属功能。以此方式，使得宿主细胞能够编码AAV多肽，这些多肽用于实现将AAV载体(含有相关重组核苷酸序列)封装至感染性重组病毒粒子颗粒中以用于后续基因递送。
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本披露所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。本文引用的所有参考文献均通过引用以其全文并入。在参考文献中的术语或论述内容与本披露冲突的情况下，应以本披露为准。
如本文中所使用，除非上下文另外明确规定，否则字组的单数形式还包括复数形式；作为实例，术语“一(a/an)”及“该”应理解为单数或复数。举例而言，“组件”意指一个或多个组件。除非特定上下文另外指示，否则术语“或”应意指“和/或”。
术语“包含(comprising)”或诸如“包含(comprises)”的变化形式应理解为暗示包涵所陈述的要素、整数或步骤，或要素、整数或步骤的群组，但不排除任何其他要素、整数或步骤，或要素、整数或步骤的群组。贯穿本说明书，字组“由……组成(consisting of)”或诸如“由……组成(consists of)”的变化形式应理解为暗示包涵所陈述的要素、整数或步骤，或要素、整数或步骤的群组，且不排除任何其他要素、整数或步骤，或要素、整数或步骤的群组。贯穿本说明书，字组“基本上由……组成(consisting essentially of)”或诸如“基本上由……组成(consists essentially of)”的变化形式应理解为暗示包涵所陈述的要素、整数或步骤，或要素、整数或步骤的群组，及任何其他不实质上影响本披露和/或申请专利范围的基本及新颖特性的要素、整数或步骤，或要素、整数或步骤的群组。
约可理解为在所述值的+/-10％，例如+/-10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％内。在关于百分比值使用时，“约”可理解为在±1％内(例如“约5％”可理解为在4％-6％内)或在±0.5％内(例如“约5％”可理解为在4.5％-5.5％内)。除非上下文另外明确说明，否则本文中所提供的所有数值均由术语“约”修饰。本文中所使用的所有范围均涵盖端点。
rAAV病毒载体
在一个方面，本文中披露rAAV基因组。在一些实施例中，rAAV基因组包含一个或多个侧接编码SMN多肽的多核苷酸的AAV ITR。在一些实施例中，多核苷酸可操作地连接至在目标细胞中起作用以形成基因盒的转录控制DNA组件，例如启动子DNA、一个或多个增强子DNA和/或聚腺苷酸化信号序列DNA。基因盒还可包括内含子序列，以在哺乳动物细胞中表达时促进RNA转录物的加工。
在一些实施例中，本文中披露的rAAV基因组不具有AAV rep及cap DNA。rAAV基因组中的AAV DNA(例如ITR)可来自能够衍生重组病毒的任何AAV血清型，包括(但不限于)AAV血清型AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10及AAV-11。AAV血清型的基因组的核苷酸序列为本领域已知的。举例而言，AAV-1的完整基因组在GenBank登录号NC_002077中提供；AAV-2的完整基因组在GenBank登录号NC_001401及Srivastava等人,Virol.[病毒学],45:555-564{1983)中提供；AAV-3的完整基因组在GenBank登录号NC_1829中提供；AAV-4的完整基因组在GenBank登录号NC_001829中提供；AAV-5基因组在GenBank登录号AF085716中提供；AAV-6的完整基因组在GenBank登录号NC_00 1862中提供；至少一部分AAV-7及AAV-8基因组分别在GenBank登录号AX753246及AX753249中提供；AAV-9基因组在Gao等人，J.Virol.[病毒学杂志],78:6381-6388(2004)中提供；AAV-10基因组在Mol.Ther.[分子疗法],13(1):67-76(2006)中提供；且AAV-11基因组在Virology[病毒学]，330(2):375-383(2004)中提供。
如本文中所使用，“pSMN”载体质粒包含编码SMN蛋白质的多核苷酸，即，SMN cDNA表达盒，其中盒由腺相关病毒反向末端重复(ITR)序列侧接，例如编码SMN基因的多核苷酸的“左侧”及“右侧”。在一些实施例中，编码SMN的多核苷酸为人类SMN序列，例如天然存在的人类SMN序列或其同种型、变体或突变体。在一些实施例中，ITR序列为原生、变异型或经修饰的AAV ITR序列。在一些实施例中，至少一个ITR序列为原生、变异型或经修饰的AAV2 ITR序列。在一些实施例中，两个ITR序列均为原生、变异型或经修饰的AAV2 ITR序列。在一些实施例中，“左侧”ITR为经修饰的AAV2 ITR序列，其实现自互补基因组的产生，且“右侧”ITR为原生AAV2 ITR序列。在一些实施例中，“右侧”ITR为经修饰的AAV2 ITR序列，其实现自互补基因组的产生，且“左侧”ITR为原生AAV2 ITR序列。在一些实施例中，pSMN质粒进一步包含CMV增强子/鸡β-肌动蛋白(“CB”)启动子。在一些实施例中，pSMN质粒进一步包含猴病毒40(SV40)内含子。在一些实施例中，pSMN质粒进一步包含牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化(polyA)终止信号。可用于上文所论述的组件中的一个或多个的例示性序列展示于以下表1中。在一些实施例中，使用以下表1中展示的所有序列。在一些实施例中，“AVXS-101”为使用表1中的所有序列的载体构建体的非限制性实例且属于术语pSMN的范畴内。这些载体的实施例以及其制备及纯化方法提供于例如PCT/US2018/058744中，其以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，pSMN载体可包含SMN cDNA表达盒、经修饰的AAV2 ITR、鸡β-肌动蛋白(CB)启动子、巨细胞病毒(CMV)即刻/早期增强子、经修饰的SV40晚期16s内含子、牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化信号及未经修饰的AAV2 ITR。经修饰及未经修饰的ITR可相对于SMN cDNA表达盒呈任一种定向(即，5’或3’)。
表1：AVXS-101载体构建体DNA序列概述组件(所有nt起始及终止位置相对于SEQID NO:1)。
Figure BDA0003087277400000191
Figure BDA0003087277400000201
在一些实施例中，载体构建体序列经衣壳化，例如进入AAV9病毒粒子。在这些实施例中，衣壳化位于能够递送稳定、功能转基因(例如完全功能人类SMN转基因)的非复制、重组AAV9衣壳中。在一些实施例中，衣壳包含通过选择性剪接产生的60个病毒蛋白(VP1、VP2、VP3)，例如以1:1:10的比率，使得VP2及VP3为VP1的两种截短形式，均具有通用C端序列。在一些实施例中，制造方法的产物(例如药物产品)可包含非复制、重组AAV9衣壳以递送稳定、完全功能性人类SMN转基因。在一些实施例中，衣壳以1:1:10的比率包含通过选择性剪接产生的60个病毒蛋白(VP1、VP2、VP3)，使得VP2及VP3为VP1的两种截短形式，均具有通用C端序列。这些载体构建体的实施例以及其制备及纯化方法提供于例如PCT/US2018/058744中，其以全文引用的方式并入本文中。
在各种实施例中，pSMN载体构建体(例如AVXS-101载体构建体)的DNA序列包含SEQID NO:1：
Figure BDA0003087277400000211
Figure BDA0003087277400000221
在一些实施例中，由pSMN质粒(例如AVX101)编码的SMN蛋白质的氨基酸序列包含：
Figure BDA0003087277400000222
Figure BDA0003087277400000231
在一些实施例中，AAV衣壳蛋白VP1、VP2、VP3来源于相同转录物。这些衣壳蛋白具有替代性起始位点，但共有羧基端。下文中，VP1特异性氨基酸序列以黑体展示且加粗。VP1及VP2共有的氨基酸序列带下划线且呈斜体。所有三种衣壳蛋白共有的氨基酸加粗且呈斜体。
Figure BDA0003087277400000232
在一个实施例中，AAV衣壳蛋白来源于编码SEQ ID NO:3中所阐述的氨基酸序列的转录物。
在各种实施例中，本文中披露包含rAAV基因组的DNA质粒。将DNA质粒转移至容许用AAV的辅助病毒(例如腺病毒、E1缺失的腺病毒或疱疹病毒)感染的细胞中，以用于将rAAV基因组组装至具有AAV9衣壳蛋白的感染性病毒颗粒中。本领域可使用用于产生其中封装AAV基因组(rep及cap基因)的rAAV颗粒及向细胞提供辅助病毒功能的技术。在一些实施例中，rAAV的产生涉及单个细胞(本文中称为封装细胞)内存在以下组分：rAAV基因组、不同于rAAV基因组(即不存在于其中)的AAV rep及cap基因以及辅助病毒功能。假型rAAV的产生披露于例如WO 01/83692中，其以全文引用的方式并入本文中。在各种实施例中，AAV衣壳蛋白可经修饰以增强重组载体的递送。对衣壳蛋白的修饰通常为本领域已知的。参见例如US2005/0053922及US 2009/0202490，其披露内容以全文引用的方式并入本文中。
例如，在以下文献中综述了rAAV生产的一般原理：Carter,1992,CurrentOpinions in Biotechnology,1533-539[生物技术新见]；以及Muzyczka,1992,CUM Topicsin Microbial.and Immunol.[微生物学和免疫学的当前主题],158:97-129)。各种方法描述于Ratschin等人,Mol.Cell.Biol.[分子细胞生物学]4:2072(1984)；Hennonat等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],81:6466(1984)；Tratschin等人,Mol.Cell.Biol.[分子细胞生物学]5:3251(1985)；McLaughlin等人,J.Virol.[病毒学杂志],62:1963(1988)；及Lebkowski等人,1988Mol.Cell.Biol.[分子细胞生物学],7:349(1988)中。Samulski等人(1989,J.Virol.[病毒学杂志],63:3822-3828)；美国专利第5,173,414号；WO 95/13365及对应的美国专利第5,658,776号；WO 95/13392；WO 96/17947；PCT/US98/18600；WO 97/09441(PCT/US96/14423)；WO 97/08298(PCT/US96/13872)；WO 97/21825(PCT/US96/20777)；WO 97/06243(PCT/FR96/01064)；WO 99/11764；Perrin等人(1995)Vaccine[疫苗]13:1244-1250；Paul等人(1993)Human Gene Therapy[人基因疗法]4:609-615；Clark等人(1996)Gene Therapy[基因疗法]3:1124-1132；美国专利第5,786,211号；美国专利第5,871,982号；及美国专利第6,258,595号。此外，本文中披露的rAAV可根据PCT/US 2018/058744的披露内容制备、纯化、制造和/或调配。前述文献以全文引用的方式并入本文中，其中尤其强调文献中关于rAAV制备、纯化、产生、制造及调配的章节。
在另一个方面，包含编码SMN蛋白质的多核苷酸的rAAV(诸如本文中所论述的rAAV9)称为“rAAV SMN”。在一些实施例中，rAAV SMN基因组在序列中具有第一AAV2 ITR、具有巨细胞病毒增强子的鸡-β肌动蛋白启动子、SV40内含子、编码SMN的多核苷酸、来自牛生长激素的聚腺苷酸化信号序列及第二AAV2 ITR。在一些实施例中，编码SMN的多核苷酸为人类SMN基因，例如GenBank登录号MN_000344.2、Genbank登录号NM_017411中所阐述或有气衍生，或任何其他适合的人类SMN同种型。例示性SMN序列包含以下序列：
Figure BDA0003087277400000251
还涵盖SMN DNA的保守性核苷酸取代(例如GenBank登录号NM_000344.2的位置625处的鸟嘌呤变成腺嘌呤)。在一些实施例中，基因组不具有AAV rep及cap DNA，即，在基因组的ITR之间不存在AAV rep或cap DNA。所涵盖的SMN多肽包括(但不限于)NCBI蛋白质数据库编号NP_000335.1中阐述的人类SMN1多肽。在实施例中，SMN DNA包含编码人类SMN多肽(例如由Uniprot登录号Q16637，同种型1(Q16637-1)鉴别的人类SMN蛋白质)的多核苷酸。还涵盖SMN1修饰因子多肽网素-3(PLS3)[Oprea等人,Science[科学]320(5875):524-527(2008)]。对于SMN DNA，编码其他多肽的序列可经取代。
药物组合物
在各种实施例中，可在适用于鞘内施用的药物组合物中提供本披露的病毒颗粒(称为病毒性颗粒)。可在除病毒性颗粒以外，还包含一种或多种非活性成分和/或一种或多种其他活性成分的配制品中提供组合物。在一些实施例中，可使用本领域已知的组分及技术，在适用于哺乳动物受试者(例如人类)中的鞘内施用的配制品中调配本披露的组合物。
在一些实施例中，药物配制品包含(a)AAV9病毒载体，其包含编码运动神经元存活(SMN)蛋白质的多核苷酸，(b)Tris缓冲液，(c)氯化镁，(d)氯化钠，及(e)泊洛沙姆(poloxamer)(例如泊洛沙姆188)，其中药物组合物不包含防腐剂。在配制品的一个实施例中，AAV9病毒载体进一步包含经修饰的AAV2 ITR、鸡β-肌动蛋白(CB)启动子、巨细胞病毒(CMV)即刻/早期增强子、经修饰的SV40晚期16s内含子、牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化信号及未经修饰的AAV2 ITR。在配制品的一个实施例中，Tris缓冲液浓度为约10-30nM，例如约20mM。在一个实施例中，配制品的pH值为约7.7至约8.3，例如约pH 8.0(例如通过USP<791>(以全文引用的方式并入)量测)。在配制品的一个实施例中，氯化镁浓度为约0.5-1.5mM，例如约1mM。在配制品的一个实施例中，氯化钠浓度为约100-300mM，例如约200mM。在一个实施例中，配制品包含约0.001-0.15％w/v的泊洛沙姆188，例如约0.005％w/v的泊洛沙姆188。在一些实施例中，配制品包含约1-8×1013vg/mL，例如约1.9-4.2×1013vg/mL的AAV9病毒载体。在一些实施例中，配制品包含约1-8×1013vg/mL且AAV9病毒载体以约6.0×1013vg的单位剂量施用。在一些实施例中，配制品包含约1.9-4.2×1013vg/mL且AAV9病毒载体以约6.0×1013vg的单位剂量施用。在一些实施例中，配制品包含约1-8×1013vg/mL且AAV9病毒载体以约1.2×1014vg的单位剂量施用。在一些实施例中，配制品包含约1.9-4.2×1013vg/mL且AAV9病毒载体以约1.2×1014vg的单位剂量施用。在一些实施例中，配制品包含约1-8×1013vg/mL且AAV9病毒载体以约2.4×1014vg的单位剂量施用。在一些实施例中，配制品包含约1.9-4.2×1013vg/mL且AAV9病毒载体以约2.4×1014vg的单位剂量施用。
当以溶液或悬浮液形式调配时，递送系统可包含可接受的载剂，例如水性载剂。可使用多种水性载体，例如水、缓冲水和/或生理食盐水。配制品还可包含张力调节剂以使溶液呈等渗性或等张性，例如NaCl、糖、甘露醇及其类似物。配制品还可包含界面活性剂以使组合物对界面及剪应力稳定，例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80及其类似物。配制品可经缓冲以保持最佳pH值及稳定性，例如使用乙酸盐、丁二酸盐、柠檬酸盐、组胺酸、磷酸盐或Tris缓冲液及其类似物。这些组合物可使用灭菌技术灭菌，或可经无菌过滤。所得水性溶液可经封装以按原样使用，或冻干，经冻干的制剂在施用之前与无菌溶液组合。
组合物，例如药物组合物，可含有药学上可接受的助剂物质以模拟生理学条件，诸如pH值调节剂及缓冲剂、张力调节剂、湿润剂及其类似物，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、单月桂酸脱水山梨糖醇酯、油酸三乙醇胺等。在一些实施例中，药物组合物包含防腐剂。在一些其他实施例中，药物组合物不包含防腐剂。
在一些实施例中，药物组合物任选地还包含一种或多种其他活性或非活性组分，例如对比剂(例如OmnipaqueTM 180)。在一些实施例中，药物组合物包含病毒载体(其包含本文中披露的SMN多核苷酸)且还包含对比剂(例如OmnipaqueTM，或含有碘海醇的试剂)。在一些这些实施例中，对比剂与药物组合物预先混合。在一些其他实施例中，对比剂不与药物组合物预先混合。在一些实施例中，在即将鞘内施用之前混合对比剂与药物组合物。在一些实施例中，对比剂(例如OmnipaqueTM、碘海醇及其类似物)增加运动神经元转导。在一些实施例中，对比剂(例如OmnipaqueTM、碘海醇及其类似物)帮助将鞘内针引导至蛛膜下空间中。
在一些实施例中，对比剂与本文中披露的包含SMN多核苷酸的病毒载体组合施用，其中对比剂在施用之前不与病毒载体预先混合或共同调配。举例而言，在一些实施例中，依序施用对比剂及本文中披露的包含SMN多核苷酸的病毒载体。在一些实施例中，在即将以单次推注方式施用之前混合对比剂与包含SMN多核苷酸的病毒载体。
在一些实施例中，可根据本领域已知的方法，例如PCT/US2018/058744(其以全文引用的方式并入本文中)中描述的方法制备及纯化药物组合物。在一些实施例中，药物组合物具有小于约7％空衣壳(例如7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少，或其间的任何百分比的空衣壳)，例如由例如qPCR或ddPCR评估。在一些实施例中，药物组合物具有以下纯度特征中的一个或多个：每1.0×1013vg少于0.09ng全能核酸酶、少于30μg/g(ppm)的铯、约20-80ppm泊洛沙姆188、每1.0×1013vg少于0.22ng BSA、每1.0×1013vg少于6.8×105pg残余质粒DNA、每1.0×1013vg少于1.1×105pg残余hcDNA及每1.0×1013vg少于4ng rHCP。
在各种实施例中，药物组合物保持参考标准的+/-20％之间、+/-15％之间、+/-10％之间或+/-5％之间的效能。在一个实施例中，使用Foust等人,Nat.Biotechnol.[自然生物技术],28(3),第271-274页(2010)中的方法针对参考标准评估效能。可使用任何适合的参考标准。在一个实施例中，药物组合物具有活体内效能，如通过SMAΔ7小鼠测试。在一个实施例中，接受7.5×1013vg/kg剂量的测试小鼠的中值存活期超过15天、超过20天、超过22天或超过24天。在一个实施例中，药物组合物的效能为参考标准和/或适合的对照物的50-150％、60-140％或70-130％，如通过活体外基于细胞的分析法测试。
在一些实施例中，药物组合物中的rAAV病毒载体的浓度在约1×1013vg/mL与1×1015vg/mL之间，例如在约1-8×1013vg/mL之间。在一些实施例中，药物组合物具有小于约10％、小于约8％、小于约7％或小于约5％空病毒衣壳。在一些实施例中，药物组合物具有每1×1013vg/mL小于约100ng/mL的宿主细胞蛋白质。在一些实施例中，药物组合物具有每1×1013vg/mL小于约5×106pg/mL、小于约1×106pg/mL、小于约7.5×105pg/mL或小于6.8×105pg/mL的残余宿主细胞DNA(hcDNA)。在一些实施例中，药物组合物具有每1.0×1013vg/mL小于约10ng、小于约8ng、小于约6ng或小于约4ng残余宿主细胞蛋白质(rHCP)。在一些实施例中，每mL药物组合物中的至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约100％rAAV(例如AAV9)病毒载体基因组为功能性的。在一些实施例中，药物组合物具有小于或等于1.7×106pg/ml(每1×1013vg/ml)，或1×105pg/ml(每1×1013vg/ml)至1.7×106pg/ml(每1×1013vg/ml)的残余质粒DNA。在一些实施例中，药物组合物的全能核酸酶浓度小于0.2ng(每1.0×1013vg)、小于0.1ng(每1.0×1013vg)或小于0.09ng(每1.0×1013vg)。在一些实施例中，以药物组合物的牛血清白蛋白(BSA)浓度小于0.5ng(每1.0×1013vg)、小于0.3ng(每1.0×1013vg)或小于0.22ng(每1.0×1013vg)。在一些实施例中，药物组合物的内毒素水平小于约1EU/mL(每1.0×1013vg/mL)、小于约0.75EU/mL(每1.0×1013vg/mL)、小于约0.5EU/mL(每1.0×1013vg/mL)、小于约0.4EU/mL(每1.0×1013vg/mL)、小于约0.35EU/mL(每1.0×1013vg/mL)、小于约0.3EU/mL(每1.0×1013vg/mL)、小于约0.25EU/mL(每1.0×1013vg/mL)、小于约0.2EU/mL(每1.0×1013vg/mL)、小于约0.13EU/mL(每1.0×1013vg/mL)、小于约0.1EU/mL(每1.0×1013vg/mL)、小于约0.05EU/mL(每1.0×1013vg/mL)或小于约0.02EU/mL(每1.0×1013vg/mL)。在一些实施例中，药物组合物中的铯的浓度小于100μg/g(ppm)、小于50μg/g(ppm)或小于30μg/g(ppm)。在一些实施例中，这些方法产生具有约10-100ppm、15-90ppm或约20-80ppm泊洛沙姆188的rAAV病毒载体。在一些实施例中，以每个容器计，药物组合物具有少于2000、少于1500、少于1000或少于600个尺寸≥25μm的颗粒。在一些实施例中，以每个容器计，药物组合物具有少于10000、少于8000、少于1000或少于6000个尺寸≥10μm的颗粒。在一些实施例中，药物组合物的pH值在7.5至8.5之间、在7.6至8.4之间或在7.8至8.3之间。在一些实施例中，药物组合物的重量莫耳渗透浓度在330至490mOsm/kg之间、在360至460mOsm/kg之间或在390至430mOsm/kg之间。在一些实施例中，药物组合物的感染效价为每1.0×1013vg约1.0×108-10.0×1010IU、每1.0×1013vg约2.5×108-9.0×1010IU或每1.0×1013vg约3.9×108-8.4×1010IU。在一些实施例中，基于活体外基于细胞的分析法，相对于参考标准和/或适合的对照物，药物组合物具有约30-150％、约60-140％或约70-130％相对效能。在一些实施例中，药物组合物的总蛋白质水平为每1.0×1013vg约10-500μg、每1.0×1013vg约50-400μg或每1.0×1013vg约100-300μg。在一些实施例中，药物组合物具有活体内效能，如通过接受7.5×1013vg/kg剂量的SMNΔ7小鼠的中值存活期超过15天、超过20天、超过22天或超过24天测定。在一些实施例中，药物组合物符合一种或多种(例如所有)前述标准的组合。
本披露还提供用于治疗有需要的患者中的SMA(例如II型或III型SMA)的试剂盒，其中试剂盒包含一种或多种剂量的本文中所披露的药物组合物，例如一种剂量包含有效量或剂量的本文中披露的包含SMN多核苷酸的病毒载体且任选地还包含一种或多种其他活性或非活性组分，例如对比剂(例如OmnipaqueTM 180)，及如何使用药物制剂或组合物的说明。在一些实施例中，试剂盒包含一种或多种剂量的本文中所披露的药物组合物，例如一种剂量包含有效量或剂量的本文中披露的包含SMN多核苷酸的病毒载体且还任选地包含对比剂(例如OmnipaqueTM，或含有碘海醇的试剂)。
在一些实施例中，试剂盒包含与药物组合物在相同容器中预先混合的对比剂。在一些实施例中，试剂盒包含在试剂盒中的一个或多个容器中提供的对比剂及在一个或多个其他容器中提供的药物组合物。在一些实施例中，在鞘内施用之前混合对比剂与药物组合物。
在一些实施例中，试剂盒含有病毒载体药物组合物的一个或多个小瓶。在一些实施例中，各小瓶含有至多或约6.0×1013vg的剂量(例如单位剂量)的病毒载体药物组合物。在一些实施例中，试剂盒中的病毒载体的各小瓶(例如各单位剂量)含有约6.0×1013vg的剂量的药物组合物。在一些实施例中，试剂盒中的病毒载体的各小瓶(例如各单位剂量)含有至多或约1.2×1014vg的剂量的药物组合物。在一些实施例中，试剂盒中的病毒载体的各小瓶(例如各单位剂量)含有约1.2×1014vg的剂量的药物组合物。在一些实施例中，试剂盒中的病毒载体的各小瓶(例如各单位剂量)含有至多或约2.4×1014vg的剂量的药物组合物。在一些实施例中，试剂盒中的病毒载体的各小瓶(例如各单位剂量)含有约2.4×1014vg的剂量的药物组合物。在一些实施例中，病毒载体药物组合物的浓度为约0.1-5.0×1013vg/mL。在一些实施例中，各小瓶含有单次剂量的rAAV病毒载体。在一些实施例中，各小瓶含有多于单次剂量的rAAV病毒载体。在一些实施例中，各小瓶含有少于单次剂量的rAAV病毒载体。
rAAV9病毒载体的用途
在各种实施例中，本文中披露用于向需要治疗SMA(例如II型或III型SMA)的患者递送多核苷酸的方法，该方法包括施用具有基因组的rAAV9，该基因组包括rAAV SMN多核苷酸。在一些实施例中，递送为鞘内递送至患者的中枢神经系统，包含施用本文中披露的rAAV9。在一些实施例中，rAAV9与对比剂一起施用。在一些此类实施例中，rAAV9及对比剂同时施用，例如在单一药物组合物中。在其他此类实施例中，rAAV9及对比剂依序施用。举例而言，在一些实施例中，首先施用对比剂且在施用对比剂之后施用rAAV9。在一些实施例中，首先施用rAAV9且在施用AAV9病毒载体之后施用对比剂。在其中依序施用AAV9病毒载体及对比剂的实施例中，AAV9病毒载体及对比剂的施用可在彼此间隔例如约2小时内、1小时内、45分钟内、30分钟内、15分钟内、10分钟内或5分钟内施用。在一些实施例中，鞘内施用对比剂及rAAV9中的至少一者。在一些实施例中，对比剂及rAAV9(无论同时或依序施用)均为鞘内施用。
在一些实施例中，对比剂为非离子性、低渗透对比剂。在一些实施例中，对比剂可增加患者的中枢神经系统中目标细胞的转导。在一些实施例中，对比剂可帮助递送直接靶向蛛膜下空间。在一些实施例中，rAAV9基因组为自互补基因组。在其他实施例中，rAAV9基因组为单链基因组。
在一些实施例中，将rAAV病毒载体鞘内递送至脊椎管或蛛膜下空间中使得其到达脑脊髓液(CSF)。在一些实施例中，rAAV病毒载体可在CSF内扩散至递送位点的远程区域。在一些实施例中，将rAAV病毒载体递送至大脑区。在一些实施例中，将rAAV病毒载体递送至运动皮质和/或脑干。在一些实施例中，将rAAV病毒载体递送至脊髓。在一些实施例中，将rAAV病毒载体递送至下运动神经元。本披露的实施例使用rAAV9将rAAV病毒载体递送至神经及胶细胞。在一些实施例中，胶细胞为微神经胶质细胞、寡树突神经胶细胞或星形胶质细胞。在一些实施例中，使用rAAV9将rAAV病毒载体递送至许旺氏细胞(Schwann cell)。
所施用的rAAV病毒载体的效价可视例如特定rAAV、施用模式、治疗目标、所治疗的个体的年龄及其他特征以及所靶向的细胞类型(一种或多种)而变化。可通过已知方法测定效价。rAAV的效价可在每ml约1×106、约1×107、约1×108、约1×109、约1×1010、约1×1011、约1×1012、约1×1013、约1×1014、约1×1015或更多个DNA酶抗性颗粒(DNase resistantparticle，DRP)范围内。剂量还可以载体基因组(vg)的单位表示。可使用如本申请、Lock等人中所描述的ddPCR或本领域已知的任何其他方法测定基因组效价。剂量还可基于对人类的施用时序而变化。在成年人或新生儿中，rAAV的这些剂量可在每千克体重约1×1011vg/kg、约1×1012vg/kg、约1×1013vg/kg、约1×1014vg/kg、约1×1015vg/kg、约1×1016vg/kg或更多的载体基因组范围内。
在一些实施例中，rAAV9以1.0×1013vg-9.9×1014vg的剂量施用。在一些实施例中，rAAV9以5.0×1013vg-3.0×1014vg的剂量施用。在一些实施例中，rAAV9以至多6.0×1013vg的剂量施用。在一些实施例中，rAAV9以约6.0×1013vg的剂量施用。在一些实施例中，rAAV9以至多1.2×1014vg的剂量施用。在一些实施例中，rAAV9以约1.2×1014vg的剂量施用。在一些实施例中，rAAV9以至多2.4×1014vg的剂量施用。在一些实施例中，rAAV9以约2.4×1014vg的剂量施用。
在一些实施例中，rAAV9以约1.0×1013vg-9.9×1014vg的单位剂量施用。在一些实施例中，rAAV9以约1.0×1013vg-5.0×1014vg的单位剂量施用。在一些实施例中，rAAV9以约5.0×1013vg-3.0×1014vg的单位剂量施用。
在一些实施例中，rAAV9以约6.0×1013vg的单位剂量施用。在一些实施例中，rAAV9以约1.2×1014vg的单位剂量施用。在一些实施例中，rAAV9以约2.4×1014vg的单位剂量施用。
可通过任何适合的方法测定剂量。举例而言，具有对病毒载体具有特异性的引物的PCR可提供相关量测，而qPCR可用于较小样品及绝对量测。在一些实施例中，使用ddPCR。ddPCR为用于进行数字PCR的方法，其基于水-油乳液液滴技术。Baker等人,“Digital PCRhits its stride.[数字PCR取得了长足的发展]”Nature Methods[自然方法],9(6):541-544。Sykes等人,“Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution.[通过使用有限稀释定量PCR的靶标]”Biotechniques[生物技术],13(3)444-449。将样品分馏为成千上万个液滴，且在每个个别液滴中进行模板分子的PCR扩增。由于无需绘制标准曲线或使用具有高扩增效率的引物，因此ddPCR使用的样品通常少于传统的基于PCR的技术。可商购的ddPCR机器的实例包括(但不限于)BioRad QX100 ddPCR及RainDance RaindropDigital PCR。在一个实施例中，使用PCR测定剂量。在另一实施例中，使用qPCR测定剂量。在另一实施例中，使用数字液滴PCR(ddPCR)测定剂量。在一些实施例中，使用多种方法。在一些实施例中，基于PCR的方法使用经特定设计的靶向SMN基因的引物及探针检测及定量衣壳化AAV9病毒基因组。在其他实施例中，基于PCR的方法使用经特定设计的靶向鸡β-肌动蛋白启动子的引物及探针检测及定量衣壳化AAV9病毒基因组。在其他实施例中，基于PCR的方法使用经特定设计的靶向CMV增强子的引物及探针检测及定量衣壳化AAV9病毒基因组。在其他实施例中，基于PCR的方法使用经特定设计的靶向ITR序列的引物及探针检测及定量衣壳化AAV9病毒基因组。在其他实施例中，基于PCR的方法使用经特定设计的靶向牛生长激素聚腺苷酸化信号的引物及探针检测及定量衣壳化AAV9病毒基因组。在一些实施例中，使用适合的活体外细胞分析法或活体内动物模型量测效能。举例而言，可使用SMA的动物模型(例如SMNΔ7小鼠)或使用适合的细胞株(例如自SMAΔ7小鼠的皮质分离的初生神经先驱细胞(NPC))的定量性基于细胞的分析法测定效能或功能性AAV SMN病毒性颗粒百分比。在一个实施例中，使用Foust等人,Nat.Biotechnol.[自然生物技术],28(3),第271-274页(2010)中的方法针对参考标准评估效能。可使用任何适合的参考标准。此外，用于测定本文中披露的rAAV病毒载体中的功能性病毒载体的剂量、纯度及百分比的例示性方法还提供于PCT/US2018/058744的披露内容中，其以全文引用的方式并入本文中。
所施用的rAAV病毒载体的配制品可视例如鞘内施用方法、剂量体积及药物赋形剂而变化。Grouls等人,“General considerations in the formulation of drugs forspinal delivery.[脊柱输送药物配方中的一般注意事项]”Spinal Drug Delivery[脊髓药物输送],第15章,Elsevier Science[爱思唯尔科学],Yaksh版。在一些实施例中，可在适用于鞘内施用的治疗性配制品中施用rAAV病毒载体。在一些实施例中，可以快速注射形式鞘内施用rAAV病毒载体。在一些实施例中，可以缓慢输注形式鞘内施用rAAV病毒载体。在一些实施例中，可在无菌等张性药物溶液中调配rAAV病毒载体。在一些实施例中，可在生理食盐水溶液中调配rAAV病毒载体。在一些实施例中，可在人工CSF(例如艾氏B溶液(Elliott’sB solution))中调配rAAV病毒载体。在一些实施例中，在施用之前过滤治疗性配制品。
在各种实施例中，本文中披露的方法及材料指示用于且可用于治疗SMA，例如通过对缺乏SMN1的功能性拷贝的患者进行鞘内施用。人类还具有SMN基因的第二、几乎一致的拷贝，称为SMN2。Lefebvre等人“Identification and characterization of a spinalmuscular atrophy-determining gene.[脊柱肌肉萎缩决定基因的鉴定与表征]”Cell[细胞],80(1):155-65。Monani等人“Spinal muscular atrophy:adeficiency in aubiquitous protein；a motor-neuron specific disease.[脊髓性肌萎缩症：普遍存在的蛋白质缺乏症；运动神经元特异性疾病]”Neuron[神经元],48(6):885-896。SMN1及SMN2基因均表达SMN蛋白质，然而SMN2在外显子7中含有翻译缄默突变，其引起SMN2转录物中的外显子7的含量不足。因此，SMN2产生全长SMN蛋白质及不具有外显子7的SMN的截短版本，其中截短版本为主要形式。因此，由SMN2产生的功能性全长蛋白质的量远低于(达70％-90％)由SMN1产生的量。Lorson等人“A single nucleotide in the SMN gene regulatessplicing and is responsible for spinal muscular atrophy.[SMN基因中的单个核苷酸调节剪接并导致脊髓性肌萎缩]”PNAS[美国国家科学院院刊],96(11)6307-6311。Monani等人,“A single nucleotide difference that alters splicing patternsdistinguishes the SMA gene SMN1 from the copy gene SMN2[改变剪接模式的单个核苷酸差异将SMA基因SMN1与复制基因SMN2区分开]”Hum Mol Genet[人类分子遗传学]8(7):1177-1183。尽管SMN2不能完全补偿SMN1基因的损失，但具有SMA的较轻度的形式的患者通常具有更高的SMN2拷贝数。Lefebvre等人,“Correlation between severity and SMNprotein level in spinal muscular atrophy[脊髓性肌萎缩症严重程度与SMN蛋白水平的相关性]”Nat Genet[自然遗传学]16(3):265-269。Park等人,“Spinal muscularatrophy:new and emerging insights from model mice[脊髓性肌萎缩症：模型小鼠的新发现]”Curr Neurol Neurosci Rep[当代神经学和神经科学报告杂志]10(2):108-117。超过95％的患有SMA的个体保留至少一个SMN2基因的拷贝。一项说明为SMN2拷贝数并非唯一的表现型修饰物。具体地，已报导SMN2基因的外显子7中的c.859G>C变体为阳性疾病修饰物。具有此特定突变的患者具有严重性较低的疾病表现型。Prior等人,“A positivemodified of spinal muscular atrophy in the SMN2 gene[SMN2基因中脊髓性肌萎缩症的阳性修饰]”Am J Hum Genet[美国人类遗传学杂志]85(3):408-413。在一些实施例中，向具有超过一个、超过两个、超过三个、超过四个或超过五个SMN2基因的拷贝和/或在SMN2基因的外显子7中不具有c.859G>C变体的II型SMA患者施用本文中披露的rAAV SMN。在一些实施例中，向具有超过两个、超过三个、超过四个或超过五个SMN2基因的拷贝和/或在SMN2基因的外显子7中不具有c.859G>C变体的III型SMA患者施用本文中披露的rAAV SMN。在一些实施例中，向II型SMA患者鞘内施用本文中披露的rAAV SMN。在一些实施例中，向III型SMA患者鞘内施用本文中披露的rAAV SMN。
I型SMA(也称为婴儿发作或韦-霍二氏病(Werdnig-Hoffmann disease))为在出生或年龄为6个月时存在SMA症状。在此类型中，婴儿通常具有低肌肉张力(低张症)、哭泣无力及呼吸窘迫。其通常具有吞咽及吮吸困难，且未达到能够在无需帮助的情况下坐立的发育重要事件。其通常展示选自以下的SMA症状中的一个或多个：低张症、运动技能迟缓、头部控制不良、圆肩姿势及关节过度活动。通常，这些婴儿具有两个SMN2基因的拷贝，每个染色体5上一个。超过一半的所有新SMA病例为I型SMA。对于I型SMA，约80％的患者具有1或2个SMN2基因的拷贝。
II型或中度SMA为在年龄为7与18个月之间且在儿童可独立站立或行走之前发作的SMA。患有II型SMA的儿童通常具有至少三个SMN2基因，且约82％的II型SMA患者具有3个SMN2基因的拷贝。迟发型SMA(也称为III型及IV型SMA、轻度SMA、成年发病型SMA及库-威二氏病(Kugelberg-Welander disease))引起不同程度的无力。III型SMA在18个月之后发作，且儿童可独立站立及行走，尽管可能需要帮助。在III型SMA患者中，约96％的患者具有3或4个SMN2基因的拷贝。IV型SMA在成人期发作，且人在其成年期间能够行走。患有III型或IV型SMA的人通常具有四至八个SMN2基因，由其可产生大量的全长SMN蛋白质。
在一个实施例中，可鞘内施用rAAV(例如本文中披露的rAAV9载体)以治疗SMA，例如II型或III型SMA。术语“治疗”及该术语的其他相关形式包含向有需要的动物(包括人类)施用(例如鞘内)有效剂量或有效多个剂量的组合物的步骤，该组合物包含如本文中所披露的rAAV。若剂量在障碍/疾病发作之前施用，则施用为预防性的。若剂量在罹患障碍/疾病之后施用，则施用为治疗性的。在实施例中，有效剂量为部分或完全缓解(消除或减少)至少一种与所治疗的障碍/疾病病况相关的症状的剂量、减缓或阻止障碍/疾病病况发展的剂量、减缓或阻止障碍/疾病病况发展的剂量、减轻疾病程度的剂量、引起疾病缓解(部分或全部)的剂量和/或延长存活期的剂量。本文中阐述预期治疗的疾病病况的实例。
在一个实施例中，向需要治疗SMA(例如II型或III型SMA)的患者鞘内施用本披露的rAAV9组合物。
在一些实施例中，患者年龄为0-72个月。在一些其他实施例中患者年龄为6-60个月。在一些实施例中，患者年龄为6-24个月。在一些实施例中，患者年龄为至少6个月。在一些实施例中，患者年龄超过24个月。
在一些实施例中，患者在一个SMN1基因的拷贝中具有一个或多个突变，例如无效突变(涵盖任何使经编码的SMN1蛋白质成为非功能性的突变)。在一些实施例中，患者在两个SMN1基因的拷贝中具有一个或多个突变，例如无效突变。在一些实施例中，患者在所有SMN1基因的拷贝中具有一个或多个突变，例如无效突变。在一些实施例中，患者在一个SMN1基因的拷贝中具有缺失。在一些实施例中，患者在两个SMN1基因的拷贝中具有缺失。在一些实施例中，患者具有双等位基因SMN1突变，即，染色体的两个等位基因中SMN1的缺失或取代。在一些实施例中，患者具有至少一个SMN2基因的功能性拷贝。在一些实施例中，患者具有至少两个SMN2基因的功能性拷贝。在一些实施例中，患者具有至少三个SMN2基因的功能性拷贝。在一些实施例中，患者具有至少四个SMN2基因的功能性拷贝。在一些实施例中，患者具有至少五个SMN2基因的功能性拷贝。在一些实施例中，患者具有双等位基因SMN1无效突变或缺失且具有三个SMN2的拷贝。在一些实施例中，患者在至少一个SMN2基因的拷贝的外显子7中不具有c.859G>C取代。在一些实施例中，患者具有双等位基因SMN1无效突变或缺失、具有三个SMN2的拷贝且在至少一个SMN2基因的拷贝的外显子7中不具有c.859G>C取代。在一些实施例中，可通过例如杂交、PCR扩增和/或部分或完全染色体或基因组定序来确定SMN1或SMN2基因的遗传序列。在其他实施例中，可通过高通量定序来确定SMN1或SMN2基因的遗传序列及拷贝数。在一些实施例中，可通过微数组分析来确定SMN1或SMN2基因的遗传序列及拷贝数。在一些实施例中，可通过桑格定序(Sanger sequencing)来确定SMN1或SMN2基因的遗传序列及拷贝数。在一些实施例中，可通过荧光原位杂交(FISH)来确定SMN1或SMN2基因的拷贝数。
在一些实施例中，患者在治疗之前或在治疗的同时被诊断患有SMA，例如II型或III型SMA，例如通过基因组测试和/或运动功能测试和/或体检。在一些实施例中，通过临床症状评估来诊断II型或III型SMA，例如CHOP INTEND、Bayley Scales of Infant andToddler
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或哈默史密斯功能性运动扩展量表(HFMSE)。在一些实施例中，通过体检诊断II型或III型SMA。在一些实施例中，如通过本文中所披露的方法治疗的II型SMA患者在年龄为24个月、22个月、20个月、18个月、16个月、14个月、12个月、10个月、8个月或6个月或其间的任何年龄之前具有或显现出疾病症状的发作。在一些实施例中，通过本文中所披露的方法治疗的III型SMA患者在年龄为12个月、14个月、16个月、18个月、20个月、22个月或24个月或其间的任何年龄之后具有或显现出疾病症状的发作。在一些实施例中，在患者显现出II型或III型SMA的症状(例如，一种或多种症状)之前治疗患者，且实情为确定患者需要治疗，例如使用一种本文中所描述的基因测试。在一些实施例中，在患者显现出II型或III型SMA的症状(例如，一种或多种症状)之后治疗患者，例如使用一种本文中所描述的测试测定。在一些实施例中，在患者显现出II型或III型SMA的症状之前治疗患者。在一些实施例中，在患者显现出症状之前，基于基因测试诊断患者患有II型或III型SMA。
在一些实施例中，患者显现出一种或多种SMA症状。SMA症状可包括低张症、运动技能迟缓、头部控制不良、圆肩姿势及关节过度活动。在一些实施例中，通过在肩部(前部及后部)提供帮助的情况下使患者处于环形坐姿来测定头部控制不良。通过患者保持头部直立的能力来评估头部控制。在一些实施例中，在患者处于仰卧姿势时观测自发性移动，且通过患者抬起肘部、膝部、手部及足部离地来评估运动技能。在一些实施例中，通过将手指置放于患者的手掌中且提升患者直至其肩部离地来量测患者的握力。通过患者保持抓握的速度/时间长度来量测低张症及握力。在一些实施例中，通过使患者的头部处于可实现的最大旋转且量测患者使头部转回正中位置的能力来评估头部控制。在一些实施例中，可通过使患者在具有头部及躯干支撑的情况下坐下，且观测患者是否弯曲肘部或肩部以拿取刺激物来评估肩部姿势，该刺激物以手臂长度与肩部齐平放置。在一些实施例中，还可通过使患者处于侧卧位，且观测患者是否弯曲肘部或肩部以拿取刺激物来评估肩部姿势，该刺激物以手臂长度与肩部齐平放置。在一些实施例中，通过观测患者在其足部被抚摸、胳肢或掐捏时是否弯曲其髋部或膝部来评估运动技能。在一些实施例中，可通过已知的临床措施(例如CHOP INTEND)来评估肩部弯曲、肘部弯曲、髋部内收、颈部弯曲、头部伸出、颈部伸出和/或脊柱弯曲。可根据已知的临床措施(例如CHOP INTEND评估)其他SMA症状。
在一些实施例中，患者显现出坐立能力，但不能行走。在一些实施例中，患者显现出在无需帮助的情况下坐立10秒或更长时间的能力，但不能站立或行走。在一些实施例中，患者显现出在无需帮助的情况下，在头部直立的情况下坐立10秒或更长时间的能力，但不能行走或站立。在一些实施例中，患者显现出独立坐立的能力，如由世界卫生组织多中心生长参考研究(WHO-MGRS)标准定义。
不受理论束缚，鞘内施用可允许药物绕过血脑障壁。因此，对于以中枢神经系统为目标的药物，通过鞘内施用进行的直接递送(例如，与静脉内(IV)施用相比)可实现所需药物组合物的总剂量和/或体积降低，由此降低肝毒性风险。此外，直接递送至蛛膜下空间中可实现中枢神经系统中的细胞(例如下运动神经元、神经胶质细胞及其类似物)的更高的转导效率。蛛膜下空间中的脑脊髓液(CSF)的体积可影响选择用于鞘内递送的有效剂量浓度。因为人类中的CSF体积在约3岁之后保持相对恒定，因此可在不同患者中更容易及统一地控制患者的剂量。在一些实施例中，使用鞘内施用以通过血脑障壁。在一些实施例中，向有需要的患者(例如鉴别为需要治疗II型或III型SMA的患者)鞘内递送本文中披露的rAAV9病毒载体。在一些实施例中，将rAAV9注射至脊椎管中。在一些实施例中，将rAAV9注射至蛛膜下空间中。在一些实施例中，在PICU患者室或其他能够立即进行急性重症监护管理的适合的环境(例如介入套件、操作室、专用程序室)中，在无菌条件下注射rAAV9病毒载体。在一些实施例中，约每15±5分钟一次监测患者生命体征保持4小时且在施用病毒载体之后，每一小时±15分钟一次监测患者生命体征保持24小时。在一些实施例中，rAAV9病毒载体不包含防腐剂。在一些实施例中，在施用rAAV9病毒载体之前，向患者提供镇静剂或麻醉剂。在一些实施例中，可对处于俯卧位、膝胸卧位、侧卧位、辛氏卧位(Sim’sposition)或侧偃卧位的患者进行rAAV9病毒载体的鞘内施用。在一些实施例中，在注射器或导管中施用rAAV9病毒载体。在一些实施例中，可将导管插入L1-L2、L2-L3、L3-L4或L4-L5棘突间隙，进入蛛膜下空间。在一些实施例中，进行腰椎穿刺，收集至多10mL、至多9mL、至多8mL、至多7mL、至多6mL、至多5mL、至多4mL、至多3mL、至多2mL或至多1mL脑脊髓液。在一些实施例中，将rAAV9病毒载体直接注射至蛛膜下空间中。在一些实施例中，预先混合rAAV9病毒载体与适合的放射性造影溶液(例如甲泛葡胺(metrizamide)、碘帕醇(iopamidol)、碘海醇、碘佛醇(ioversol)、OmnipaqueTM等)且直接注射至蛛膜下空间中。在一些实施例中，在鞘内施用rAAV9病毒载体之前，鞘内施用造影溶液(例如甲泛葡胺、碘帕醇、碘海醇、碘佛醇、OmnipaqueTM等)。在一些实施例中，在鞘内施用rAAV9病毒载体之前2小时内、1小时内、45分钟内、30分钟内、15分钟内、10分钟内或5分钟内鞘内施用造影溶液。在一些实施例中，在鞘内施用rAAV9病毒载体之后，鞘内施用造影溶液(例如甲泛葡胺、碘帕醇、碘海醇、碘佛醇、OmnipaqueTM等)。在一些实施例中，在鞘内施用rAAV9病毒载体之后2小时内、1小时内、45分钟内、30分钟内、15分钟内、10分钟内或5分钟内鞘内施用造影溶液。
在一些实施例中，所施用的对比剂的体积为至多约0.5mL、至多约1.0mL、至多约1.5mL、至多约2.0mL或至多约2.5mL。在一些实施例中，所施用的总体积(rAAV9病毒载体及对比剂)不超过约5mL、不超过约6mL、不超过约7mL、不超过约8mL、不超过约9mL或不超过约10mL。在一些实施例中，在施用rAAV9病毒载体之后，使患者处于不同体位。在一些实施例中，在施用rAAV9病毒载体之后，使患者处于垂头仰卧位，或头向下倾斜20°-40°，例如30°。在一些实施例中，在施用rAAV9病毒载体之后，使患者处于垂头仰卧位，或头向下倾斜30°保持10-30分钟，例如约15分钟。
在一些实施例中，治疗可有效预防、减少、缓解、减缓和/或部分或完全逆转SMA(例如II型或III型SMA)的一种或多种症状。在治疗之前及之后，可使用多种用于运动技能的测试来测定治疗方法的功效。具体地，Bayley Scales of Infant and Toddler
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为用于评估婴儿及幼童的发育的标准量测系列。Bayley N.“BayleyScales of Infant and Toddler Development[贝利婴幼儿发展量表]”第3版,HarcourtAssessment Inc.[哈科特评估公司],2006。具体地，Bayley
Figure BDA0003087277400000422
的第III版运动量表部分(Motor Scale component of Version III)(第三版)量测粗大及精细运动技能，如抓握、坐立、堆积木及攀爬楼梯。在一些实施例中，评估患者的手部在大部分时间是否握拳。在一些实施例中，评估患者以观察其眼睛是否跟随移动的人。在一些实施例中，评估患者是否会故意尝试将其手部放入嘴中。在一些实施例中，评估患者以观察在不尝试任务时，患者是否会在大部分时间保持其手部张开。在一些实施例中，评估患者以观察当操控小型对象时，患者是否能够将其手腕自手掌向下自由地旋转至手掌向上。在一些实施例中，向患者提供积木且评估以观察患者是否使用一只或两只拾取积木、将积木自一只手转移至另一只手、用拇指垫或指尖抓取积木及患者是否通过拇指与手指部分相对来抓取积木。在一些实施例中，向患者提供食物丸粒且评估以观察患者是否用拇指垫或指尖抓取积木，及患者是否通过拇指与手指部分相对来抓取积木。在一些实施例中，向患者提供书籍且评估以观察患者是否翻开一页或一次性翻开若干页。在一些实施例中，向患者提供蜡笔或铅笔及纸张且评估以观察患者是否使用手掌抓握、静态三指抓握或四指抓握来抓取蜡笔或铅笔且在纸上做标记。在其他实施例中，评估患者以观察在纸上做标记时，患者的抓握是否为熟练、受控及动态的。在一些实施例中，评估患者以观察患者是否用一只手将纸张保持在适当位置同时用另一只手涂写或绘画。
在一些实施例中，评估患者以观察患者在玩耍时是否挺伸其手臂或腿部若干次。在一些实施例中，评估患者以观察患者可在无支撑的情况下间歇地抬起其头部。在一些实施例中，评估患者以观察患者是否可在无支撑的情况下保持其头部直立至少3秒。在一些实施例中，评估患者以观察患者是否具有协调及平衡地行走至少5步的能力。在一些实施例中，根据
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-III-Gross Motor的项目43，评估患者以观察患者是否具有协调及平衡地行走至少5步的能力。评估患者以观察患者是否具有在无帮助或支撑表面的情况下站立的能力，及患者是否具有反馈姿势控制。在一些实施例中，根据
Figure BDA0003087277400000432
-III-GrossMotor的项目40，评估患者以观察患者是否具有在无帮助的情况下站立的能力。在一些实施例中，若患者在施用治疗之后约24个月、12个月、9个月或6个月具有在无支撑的情况下站立的能力，则认为患者接受有效治疗。在一些实施例中，若患者在施用治疗之后约24个月、12个月、9个月或6个月具有在无帮助的情况下行走的能力(如由在呈现协调及平衡情况下独立地行走至少五步所定义)，则认为患者接受有效治疗。
另一种常用的婴儿发育量测方式为哈默史密斯功能性运动扩展量表(HFMSE)。O’Hagen等人,“An expanded version of the Hammersmith Functional Motor Scale forSMA II and III patients[哈默史密斯功能性运动扩展量表，适用于SMA II和III患者]”Neuromuscul Disord[神经肌肉障碍],17(9-10):693-7；Glanzman等人,“Validation ofthe Expanded Hammersmith Functional Motor Scale in spinal muscular atrophytype II and III[哈默史密斯功能性运动扩展量表在II型和III型脊髓性肌萎缩症中的验证]”J Child Neurol[儿童神经学学报],26(12):1499-1507。尽管哈默史密斯功能性运动量表可成功评估患有SMA的无法行走的个体的能力，但HFMSE提供其他13个附加项目，其可成功地区分患有II型及III型SMA的个体的运动技能。在一些实施例中，评估患者在无支撑的情况下坐立在椅子或地板上的能力。在一些实施例中，评估患者在无支撑的情况下坐立在椅子或地板上时，用一只手触摸其头部的能力。在一些实施例中，评估患者在无支撑的情况下坐立在椅子或地板上时，用两只手触摸其头部的能力。在一些实施例中，评估患者在躺下时是否能够侧滚。在一些实施例中，评估患者在躺下时是否能够自面朝上翻滚成面朝下或反之亦然。在一些实施例中，评估患者是否能够自坐立体位以控制方式躺下。在一些实施例中，评估患者在俯卧时是否能够支撑在前臂上。在一些实施例中，评估患者在俯卧体位时是否能够抬头。在一些实施例中，评估患者在俯卧时是否能够用竖直手臂支撑保持数到3。在一些实施例中，评估患者是否能够在不翻身的情况下自躺卧变成坐立体位。在一些实施例中，评估患者是否能够在保持头部直立的情况下用手及膝部支撑保持数到3。在一些实施例中，评估患者是否能够用手及膝部向前爬。在一些实施例中，评估患者在仰卧且手臂交叉叠在胸部时是否能够抬头。在一些实施例中，评估患者是否能够在用一只手支撑或不用手支撑的情况下站立保持数到3。在一些实施例中，评估患者是否能够在无任何帮助的情况下行走。在一些实施例中，评估患者在仰卧时是否能够使任一个膝部向胸部移动。在一些实施例中，评估患者是否能够在不使用手臂的情况下自高跪位变成半跪。在一些实施例中，评估患者是否能够在不使用手臂的情况下自高跪位变成站立。在一些实施例中，评估患者是否能够在不使用手臂的情况下自站立变成坐立。在一些实施例中，评估患者是否能够在不使用手臂的情况下自站立变成蹲坐。在一些实施例中，评估患者是否能够自站立向前跳跃12吋。在一些实施例中，评估患者是否能够在无帮助的情况下或藉助于一个护栏向上或向下走4步。在一些实施例中，若患者在施用治疗之后约24个月、12个月、9个月或6个月在HFMSE中呈现自基线的5-10点增加，例如8点增加，则认为患者接受有效治疗。在一些实施例中，若患者在施用治疗之后约24个月、12个月、9个月或6个月在HFMSE中呈现自基线的9点增加，则认为患者接受有效治疗。在一些实施例中，若患者在施用治疗之后约24个月、12个月、9个月或6个月在HFMSE中呈现自基线的10点增加，则认为患者接受有效治疗。
在一些实施例中，通过发育能力的变化量测治疗功效。在一些实施例中，在施用rAAV9病毒载体之前进行基线量测。在一些实施例中，基线量测包含量测Bayley Scales ofInfant and Toddler
Figure BDA0003087277400000453
的精细及粗大运动部分。在一些实施例中，基线量测包含量测Bayley Scales of Infant and Toddler
Figure BDA0003087277400000452
的粗大运动部分的项目43(在无帮助的情况下行走至少5步)。在一些实施例中，基线量测包含量测BayleyScales of Infant and Toddler
Figure BDA0003087277400000454
的粗大运动部分的项目40(在无支撑的情况下站立至少3秒)。在一些实施例中，基线量测包含根据哈默史密斯功能性运动扩展量表(HFMSE)评估患者。在一些实施例中，通过量测Bayley Scales of Infant and Toddler
Figure BDA0003087277400000455
的粗大运动部分的项目43(在无帮助的情况下行走至少5步)且与基线比较来评估治疗功效。在一些实施例中，通过量测Bayley Scales of Infant and Toddler
Figure BDA0003087277400000456
的粗大运动部分的项目40(在无支撑的情况下站立至少3秒)且与基线比较来评估治疗功效。在一些实施例中，通过根据HFMSE评估患者且与治疗之前的基线比较来评估治疗功效。在一些实施例中，通过在治疗之前30天内的量测值来建立基线。在一些实施例中，在治疗的第30天内评估治疗功效。在一些实施例中，在治疗之后每月一次评估治疗功效保持十二个月。在一些实施例中，将功效的评估录像。在一些实施例中，通过表2中展示的标准运动重要事件发育调查(Motor Milestone Development Survey)来评估显著运动重要事件。在一些实施例中，在治疗之后至少12个月、至少24个月、至少48个月、至少72个月或10年评估治疗功效。
表2：运动重要事件发育调查
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在一些实施例中，用于评估治疗功效的测试不限于Bayley Scales of Infantand Toddler
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哈默史密斯功能性运动扩展量表(HFMSE)或运动重要事件发育调查，但还可包括本领域已知的其他运动技能测试，包括(但不限于)CHOP INTEND、TIMP、CHOP TOSS、皮博迪发育运动量表(Peabody Development Motor Scales)、布拉泽尔顿新生儿行为评估测试(Brazelton Neonatal Behavior Assessment test)、经由交互式视讯评估捕捉的能力(Ability Captured Through Interactive Video Evaluation；ACTIVE)及复合运动动作电位(CMAP)的量测。
还涵盖对可接受治疗的患者的预先筛检，例如根据本文中披露的鉴别SMA(例如II型或III型SMA)的方法，以及向根据本文中披露的标准鉴别的患者施用治疗。
AAV可引起细胞及体液性免疫反应。因此，对于基于AAV的基因疗法，一部分潜在患者具有预先存在的针对AAV的抗体。Jeune等人,“Pre-existing anti-Adeno-AssociatedVirus antibodies as a challenge in AAV gene therapy[预先存在的抗腺相关病毒抗体是AAV基因治疗中的挑战]”Hum Gene Ther Methods[人类基因治疗方法],24(2):59-67。Boutin等人,“Prevalence of serum IgG and neutralizing factors against adeno-associated virus(AAV)types 1,2,5,6,8,and 9in the healthy population:implications for gene therapy using AAV vectors[在健康人群中针对1、2、5、6、8和9型腺伴随病毒(AAV)的血清IgG和中和因子的患病率：对使用AAV载体进行基因治疗的意义]”Hum Gene Ther[人类基因治疗],21:704-712。因为即使极少量抗体还可阻止成功转导，前体抗AAV抗体对AAV基因疗法的普遍应用造成重大阻碍。在一些实施例中，在施用AAV病毒载体之前测定患者中抗AAV9抗体效价的水平，且仅在抗体效价低于临限值时才通过鞘内施用向患者提供AAV。在一些实施例中，通过ELISA结合免疫分析法测定患者中抗AAV9抗体效价的水平。在一些实施例中，患者的抗AAV9抗体效价等于或低于1:100，如在施用治疗之前通过ELISA结合免疫分析法所测定。在一些实施例中，患者的抗AAV9抗体效价等于或低于1:50，如在施用治疗之前通过ELISA结合免疫分析法所测定。在一些实施例中，患者的抗AAV9抗体效价高于1:100，如在治疗之后通过ELISA结合免疫分析法所测定且监测1-8周或直至效价降低至低于1:100。在一些实施例中，患者的抗AAV9抗体效价高于1:100，如在治疗之后通过ELISA结合免疫分析法所测定且监测1-8周或直至效价降低至低于1:50。
在一些实施例中，可向具有高抗AAV抗体效价的患者施用一种或多种免疫抑制性药物。举例而言，单克隆抗CD20抗体(诸如利妥昔单抗(rituximab))与环孢素A(cyclosporine A)的组合可降低抗AAV效价。Mingozzi等人,“Pharmacologicalmodulation of humoral immunity in a nonhuman primate model of AAV genetransfer for hemophilia B[血友病B非人灵长类动物AAV基因转移模型中体液免疫的药理调节]”Mol Ther[分子疗法],20:1410-1416。在一些实施例中，患者的抗AAV9抗体效价高于1:100，如在治疗之前或之后通过ELISA结合免疫分析法所测定，且用一种或多种免疫抑制性药物(例如类固醇，如泼尼松龙)治疗。在一些实施例中，患者的抗AAV9抗体效价高于1:50，如在治疗之前或之后通过ELISA结合免疫分析法所测定，且用一种或多种免疫抑制性药物(例如类固醇，如泼尼松龙)治疗。
在一些实施例中，在载体施用之前和/或之后，具有高抗AAV抗体效价的患者可经历血浆清除术以消耗中和抗体。Monteilhet等人,“A 10patient case report on theimpact of plasmapheresis upon neutralizing factors against adeno-associatedvirus(AAV)types 1,2,6,and 8[血浆置换对中和因子1、2、6和8型腺相关病毒的影响的10例病例报告]”Mol Ther[分子疗法],19(11):2084-2091。在血浆清除术期间，自患者抽取血液且通过离心或中空纤维过滤来分离血浆及血球。接着，使血球与经处理的血浆或替代性流体(诸如含4.5％人类白蛋白的生理食盐水)一起返回患者。治疗性血球分离术的常用用途为移除不合需要的免疫球蛋白，诸如抗AAV抗体。在一些实施例中，患者的抗AAV9抗体效价高于1:100，如在治疗之前或之后通过ELISA结合免疫分析法所测定，且用血浆清除术治疗。在一些实施例中，患者的抗AAV9抗体效价高于1:50，如在治疗之前或之后通过ELISA结合免疫分析法所测定，且用血浆清除术治疗。
预先存在的针对AAV9的母体抗体可经由母乳或子宫内胎盘转移而转移至幼小患者。在一些实施例中，患者的抗AAV9抗体效价高于1:100，如在治疗之前或之后通过ELISA结合免疫分析法所测定，且改为配方奶粉喂养。在一些实施例中，患者的抗AAV9抗体效价高于1:50，如在治疗之前或之后通过ELISA结合免疫分析法所测定，且改为配方奶粉喂养。
在施用治疗之前及之后，可监测患者的病状。在一些实施例中，接受基于AAV的治疗的患者可经历低血小板计数或血小板减少，其为由低血小板计数特定表征的病状。可在血球计上使用经稀释的血液样品，通过完全血球计数来检测血小板减少。还可通过在显微镜下观察用患者血液制备的载玻片(薄血液膜或外周血涂片)来检测血小板减少。正常人类血小板计数在150,000个细胞/ml至约450,000个细胞/ml范围内。
在一些实施例中，在施用之前，患者的血小板计数高于约67,000个细胞/ml或高于约100,000个细胞/ml，或高于约150,000个细胞/ml。在一些实施例中，在施用之前，患者的血小板计数低于约150,000个细胞/ml或低于约100,000个细胞/ml，或低于约67,000个细胞/ml，且监测1-8周或直至血小板计数增加至高于约67,000个细胞/ml，或高于约100,000个细胞/ml，或高于约150,000个细胞/ml。在一些实施例中，当在施用病毒载体之后血小板计数低于约67,000个细胞/ml时，可通过血小板输注来治疗患者。在一些实施例中，在施用病毒载体之前，患者不具有血小板减少。在一些实施例中，患者在施用病毒载体之后具有血小板减少且监测约1-8周或直至患者不具有血小板减少。在一些实施例中，患者在施用病毒载体之后具有血小板减少且通过血小板输注来治疗。
监测患者的病状还可涉及量测以下中的一个或多个的水平的标准血液测试：血小板、血清蛋白质电泳、血清γ-谷氨酰转移酶(GGT)、天冬胺酸转胺酶(AST)及丙胺酸转胺酶(ALT)、总胆红素、葡萄糖、肌酸激酶(CK)、肌酐、血尿素氮(BUN)、电解质、碱性磷酸酶及淀粉酶。肌钙蛋白I水平为心脏健康的一般量度，且水平升高反映心脏损伤或心脏相关病状。在一些实施例中，在施用病毒载体之后监测肌钙蛋白-I水平。在一些实施例中，在施用病毒载体之前，患者的肌钙蛋白-I水平可小于约0.3、0.2、0.15或0.1μg/ml。在一些实施例中，在施用病毒载体之前，患者的肌钙蛋白-I水平可小于约0.176μg/ml。在一些实施例中，在施用病毒载体之后，患者的肌钙蛋白-I水平可高于约0.176μg/ml。在一些实施例中，患者在施用病毒载体之后接受心脏监测直至肌钙蛋白-I水平小于约0.176μg/ml。
天冬胺酸转胺酶(AST)及丙胺酸转胺酶(ALT)以及总胆红素为肝功能的一般量度，而肌酐反映肾功能。AST、ALT或总胆红素水平升高可指示肝功能障碍。在一些实施例中，患者在施用病毒载体之前具有正常肝功能。在一些实施例中，在施用病毒载体之前，患者的肝转胺酶水平小于约8-40U/L。在一些实施例中，在施用病毒载体之前，患者的AST或ALT水平小于约8-40U/L。在一些实施例中，患者的γ-谷氨酰转移酶(GGT)低于正常值上限的3倍，例如通过本领域已知的临床标准及方法(例如CLIA标准)测定。在一些实施例中，在施用病毒载体之前，患者的胆红素水平小于3.0mg/dL。在一些实施例中，在施用病毒载体之前，患者的肌酐水平小于1.8mg/dL、小于1.4mg/dL或小于1.0mg/dL。在一些实施例中，在施用病毒载体之前，患者的血色素(Hgb)水平在8-18g/dL之间。在一些实施例中，在施用病毒载体之前，患者的白血球(WBC)计数小于20000个/mm3。
在各种实施例中，使用如本文中所描述的AAV载体的基因疗法可产生针对AAV载体的抗原特异性T细胞反应，例如在基因转移后2-4周之间。此类抗原特异性T细胞反应的一种可能结果为清除经转导的细胞及转基因表达损失。为了尝试减弱针对基于AAV的疗法的宿主免疫反应，可向患者提供免疫抑制剂。在一些实施例中，可通过ELISPOT分析法量测T细胞反应。在一些实施例中，在施用载体之前，T细胞反应为100个斑点形成细胞(SFC)/106个外周血液单核细胞(PBMC)。在一些实施例中，在施用病毒载体之前，可向患者提供糖皮质激素。在一些实施例中，在施用病毒载体之前，可向患者提供皮质类固醇。在一些实施例中，在施用病毒载体之前，可向患者提供口服类固醇。口服类固醇的实例包括(但不限于)泼尼松(prednisone)、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、曲安西龙(triamcinolone)、贝塞米松(bethamethasone)、地塞米松(dexamethasone)及氢化可的松(hydrocortisone)。在一些实施例中，口服类固醇为或包含泼尼松龙。
在一些实施例中，在施用病毒载体之前至少12-48小时(例如至少24小时)开始向患者提供预防性类固醇。在一些实施例中，在施用病毒载体之后至少10-60天(例如至少30天)向患者提供口服类固醇。在一些实施例中，每天一次施用口服类固醇。在一些实施例中，每天两次施用口服类固醇。在一些实施例中，以约0.1-10mg/kg，例如约1mg/kg的剂量提供口服类固醇。在一些实施例中，以约0.1-10mg/kg/天，例如约1mg/kg/天的剂量提供口服类固醇。在一些实施例中，在施用病毒载体之后监测AST及ALT的水平。在此类实施例中，当AST及ALT水平超过正常值上限的两倍(例如通过本领域已知的临床标准及方法所测定)或约120IU/L时施用口服类固醇治疗。在一些实施例中，施用口服类固醇治疗超过30天且只要AST及ALT水平超过正常值上限的两倍(例如通过本领域已知的临床标准及方法所测定)或只要水平超过约120IU/L即保持施用。在一些实施例中，只要T细胞反应高于100个SFC/106个PBMC，则施用口服类固醇超过30天。在一些实施例中，施用口服类固醇治疗超过30天，直至T细胞反应降低至低于100个SFC/106个PBMC。在持续用皮质类固醇进行治疗期间，肾上腺天然降低皮质醇的产量。若突然停止皮质类固醇治疗，则身体可能经历皮质醇不足。在一些实施例中，当向患者提供口服类固醇保持至少30天时，随时间推移而缓慢地逐渐减少类固醇剂量。在一些实施例中，当AST及ALT水平降低至低于正常值上限的两倍(例如通过本领域已知的临床标准及方法所测定)或约120IU/L时逐渐减少口服类固醇剂量。在一些实施例中，逐渐减少包含逐步减少至0.5mg/kg/天保持约2周，接着0.25mg/kg/天再保持约2周。在一些其他实施例中，由医师酌情进行口服类固醇的逐渐减少。在一些实施例中，收集血液样品且通过ELISA测试针对AAV9的血清抗体、通过ELISA测试针对SMN的血清抗体或通过ELISpots测试干扰素γ(IFN-g)。
本文中还涵盖用于选择将受益于本文中披露的治疗的患者的方法。在一些实施例中，患者未禁忌脊椎穿刺程序或鞘内疗法的施用。在一些实施例中，患者不具有脊柱侧弯或严重脊柱侧弯，例如由在X射线检验时显而易见的脊椎≥50°弯曲所定义。在一些实施例中，患者在施用rAAV9病毒载体的2年、1年或6个月内未接受预先、计划或预期安排的脊柱侧弯修复手术或程序。在一些实施例中，患者无需侵入性通气支持或胃饲管。在一些实施例中，患者不具有独立站立或行走的历史。在一些实施例中，患者在施用rAAV9病毒载体时不具有活性病毒感染。在其他实施例中，这些病毒感染包括(但不限于)人类免疫缺陷病毒(HIV)或血清学阳性B型或C型肝炎或寨卡病毒。在一些实施例中，患者不具有伴随疾病，例如严重肾或肝损伤、已知的癫痫发作、糖尿病、特发性低钙尿症或症状性心肌病。在一些实施例中，患者在施用rAAV9病毒载体的四周内不具有严重非肺部感染或呼吸道感染(例如肾盂肾炎或脑膜炎)。在一些实施例中，患者不具有细菌性脑膜炎、脑部或脊髓疾病的历史。在一些实施例中，患者不具有已知的对糖皮质类固醇(例如泼尼松或泼尼松龙)或其赋形剂的过敏性或过敏反应。在一些实施例中，患者不具有已知的对碘或含碘产品的过敏性或过敏反应。在一些实施例中，患者未伴随使用用于治疗肌病或神经病的药物。在一些实施例中，患者在施用rAAV9病毒载体的三个月内未接受免疫抑制性疗法、血浆清除术、免疫调节剂，诸如阿达木单抗。
本文中还涵盖组合疗法。如本文中所使用的组合包含同时治疗或依序治疗。方法的组合可包括添加某些标准医学治疗(例如含利鲁唑(riluzole)的ALS)和/或与新颖疗法的组合。举例而言，可用于所披露的组合疗法中的其他用于SMA的疗法包括反义寡核苷酸(ASO)，其改变与前体mRNA的结合且改变其剪接模式。Singh.等人,“A multi-exon-skipping detection assay reveals surprising diversity of splice isoforms ofspinal muscular atrophy genes[多种外显子跳跃检测方法揭示了令人惊讶的脊髓性肌萎缩基因剪接亚型的多样性]”Plos One[公共科学图书馆综合],7(11):e49595。在一些实施例中，可使用诺西那生(美国专利8,361,977及US 8,980,853，其以引用的方式并入本文中)。诺西那生为经批准的ASO，其靶向SMN2前体mRNA的内含子6、外显子7或内含子7，调节SMN2的剪接以更有效地产生全长SMN蛋白质。在一些实施例中，包含AAV9病毒载体的治疗方法与肌肉增强剂组合施用。在一些实施例中，所披露的治疗方法包含施用AAV9病毒载体与神经保护剂的组合。在一些实施例中，所披露的治疗方法包含施用AAV9病毒载体与靶向SMN的基于反义寡核苷酸的药物的组合。在一些实施例中，所披露的治疗方法包含施用AAV9病毒载体与诺西那生的组合。在一些实施例中，所披露的治疗方法包含施用AAV9病毒载体与肌肉抑制素抑制药物的组合。在一些实施例中，所披露的治疗方法包含施用AAV9病毒载体与司他莫单抗的组合。在一些实施例中，所披露的治疗方法包含施用AAV9病毒载体与超过一种其他治疗的组合。
可根据本领域已知的制备及纯化方法制备本文中披露的rAAV病毒载体。在一些实施例中，纯化方法的目的在于移除来自宿主细胞的污染物及在收集病毒载体期间添加的化学物质。在一些实施例中，使用PCT/US2018/058744中披露的方法，且该PCT以全文引用的方式并入本文中。在一些实施例中，这些方法以约1×1013vg/mL与1×1015vg/mL之间，例如约1-8×1013vg/mL之间的浓度产生rAAV病毒载体。在一些实施例中，这些方法以约1.0×1013vg-9.9×1014vg的剂量(例如单位剂量)产生rAAV病毒载体。在一些实施例中，这些方法以约1.0×1013vg-5.0×1014vg的剂量(例如单位剂量)产生rAAV病毒载体。在一些实施例中，这些方法以约5.0×1013vg-3.0×1014vg的剂量(例如单位剂量)产生rAAV病毒载体。在一些实施例中，这些方法以约6.0×1013vg的剂量(例如单位剂量)产生rAAV病毒载体。在一些实施例中，这些方法以约1.2×1014vg的剂量(例如单位剂量)产生rAAV病毒载体。在一些实施例中，这些方法以约2.4×1014vg的剂量(例如单位剂量)产生rAAV病毒载体。
在一些实施例中，这些方法产生具有小于约10％、小于约8％、小于约7％或小于约5％空病毒衣壳的rAAV病毒载体。在一些实施例中，这些方法产生具有每1×1013vg/mL小于约100ng/mL的宿主细胞蛋白质的rAAV病毒载体。在一些实施例中，这些方法产生具有每1×1013vg/mL小于约5×106pg/mL、小于约1×106pg/mL、小于约7.5×105pg/mL或小于6.8×105pg/mL的残余宿主细胞DNA(hcDNA)的rAAV病毒载体。在一些实施例中，这些方法产生具有每1.0×1013vg/mL小于约10ng、小于约8ng、小于约6ng或小于约4ng残余宿主细胞蛋白质(rHCP)的rAAV病毒载体。在一些实施例中，以每mL计，这些方法所产生的rAAV(例如AAV9)病毒载体基因组中的至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约100％为功能性的。在一些实施例中，这些方法产生具有小于或等于1.7×106pg/ml(每1×1013vg/ml)或1×105pg/ml(每1×1013vg/ml)至1.7×106pg/ml(每1×1013vg/ml)的残余质粒DNA的rAAV病毒载体。在一些实施例中，这些方法产生具有每1.0×1013vg小于0.2ng、每1.0×1013vg小于0.1ng或每1.0×1013vg小于0.09ng的全能核酸酶浓度的rAAV病毒载体。在一些实施例中，这些方法产生具有每1.0×1013vg小于0.5ng、每1.0×1013vg小于0.3ng或每1.0×1013vg小于0.22ng的牛血清白蛋白(BSA)浓度的rAAV病毒载体。在一些实施例中，这些方法产生rAAV病毒载体，其具有每1.0×1013vg/mL小于约1EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.75EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.5EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.4EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.35EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.3EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.25EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.2EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.13EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.1EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.05EU/mL或每1.0×1013vg/mL小于约0.02EU/mL的内毒素水平。在一些实施例中，这些方法产生具有小于100μg/g(ppm)、小于50μg/g(ppm)或小于30μg/g(ppm)的铯浓度的rAAV病毒载体。在一些实施例中，这些方法产生具有约10-100ppm、15-90ppm或约20-80ppm泊洛沙姆188的rAAV病毒载体。在一些实施例中，这些方法产生以每个容器计，尺寸≥25μm的颗粒少于2000、少于1500、少于1000或少于600个的rAAV病毒载体。在一些实施例中，这些方法产生以每个容器计，尺寸≥10μm的颗粒少于10000、少于8000、少于1000或少于6000个的rAAV病毒载体。在一些实施例中，这些方法产生具有7.5至8.5之间、7.6至8.4之间或7.8至8.3之间的pH值的rAAV病毒载体。在一些实施例中，这些方法产生具有330至490mOsm/kg之间、360至460mOsm/kg之间或390至430mOsm/kg之间的重量莫耳渗透浓度的rAAV病毒载体。在一些实施例中，这些方法产生具有每1.0×1013vg约1.0×108-10.0×1010IU、每1.0×1013vg约2.5×108-9.0×1010IU或每1.0×1013vg约3.9×108-8.4×1010IU的感染效价的rAAV病毒载体。在一些实施例中，基于活体外基于细胞的分析法，这些方法产生相对于参考标准和/或适合的对照物具有约30-150％、约60-140％或约70-130％相对效能的rAAV病毒载体。在一些实施例中，这些方法产生具有每1.0×1013vg约10-500μg、每1.0×1013vg约50-400μg或每1.0×1013vg约100-300μg的总蛋白质水平的rAAV病毒载体。在一些实施例中，这些方法产生具有活体内效能的rAAV病毒载体，如通过以7.5×1013vg/kg的剂量给药的SMNΔ7小鼠的中值存活期大于15天、大于20天、大于22天或大于24天所测定。
在以上实施例中的任一者中，制备和/或纯化方法可产生rAAV病毒载体，其可经调配以用于施用和/或以约6.0×1013vg的单位剂量存在于药物组合物中。在以上实施例中的任一者中，制备和/或纯化方法可产生rAAV病毒载体，其可经调配以用于施用和/或以约1.2×1014vg的单位剂量存在于药物组合物中。在以上实施例中的任一者中，制备和/或纯化方法可产生rAAV病毒载体，其可经调配以用于施用和/或以约2.4×1014vg的单位剂量存在于药物组合物中。
举例而言，在一些实施例中，这些方法产生具有小于约10％、小于约8％、小于约7％或小于约5％空病毒衣壳的rAAV病毒载体，其中rAAV病毒载体经调配以用于施用和/或以约6.0×1013vg的单位剂量存在于药物组合物中。在一些实施例中，这些方法产生具有小于约10％、小于约8％、小于约7％或小于约5％空病毒衣壳的rAAV病毒载体，其中rAAV病毒载体经调配以用于施用和/或以约1.2×1014vg的单位剂量存在于药物组合物中。在一些实施例中，这些方法产生具有小于约10％、小于约8％、小于约7％或小于约5％空病毒衣壳的rAAV病毒载体，其中rAAV病毒载体经调配以用于施用和/或以约2.4×1014vg的单位剂量存在于药物组合物中。在一些实施例中，配制品或药物组合物包含约6.0×1013vg的单位剂量的rAAV病毒载体，其中rAAV病毒载体具有小于约10％、小于约8％、小于约7％或小于约5％空病毒衣壳。在一些实施例中，配制品或药物组合物包含约1.2×1014vg的单位剂量的rAAV病毒载体，其中rAAV病毒载体具有小于约10％、小于约8％、小于约7％或小于约5％空病毒衣壳。在一些实施例中，配制品或药物组合物包含约2.4×1014vg的单位剂量的rAAV病毒载体，其中rAAV病毒载体具有小于约10％、小于约8％、小于约7％或小于约5％空病毒衣壳。
在一些实施例中，这些方法产生具有每1×1013vg/mL小于约100ng/mL的宿主细胞蛋白质的rAAV病毒载体，且rAAV病毒载体经调配以用于施用和/或以约6.0×1013vg的单位剂量存在于药物组合物中。在一些实施例中，这些方法产生具有每1×1013vg/mL小于约100ng/mL的宿主细胞蛋白质的rAAV病毒载体，且rAAV病毒载体经调配以用于施用和/或以约1.2×1014vg的单位剂量存在于药物组合物中。在一些实施例中，这些方法产生具有每1×1013vg/mL小于约100ng/mL的宿主细胞蛋白质的rAAV病毒载体，且rAAV病毒载体经调配以用于施用和/或以约2.4×1014vg的单位剂量存在于药物组合物中。在一些实施例中，配制品或药物组合物包含约6.0×1013vg的单位剂量的rAAV病毒载体，其中rAAV病毒载体具有每1×1013vg/mL小于约100ng/mL的宿主细胞蛋白质。在一些实施例中，配制品或药物组合物包含约1.2×1014vg的单位剂量的rAAV病毒载体，其中rAAV病毒载体具有每1×1013vg/mL小于约100ng/mL的宿主细胞蛋白质。在一些实施例中，配制品或药物组合物包含约2.4×1014vg的单位剂量的rAAV病毒载体，其中rAAV病毒载体具有每1×1013vg/mL小于约100ng/mL的宿主细胞蛋白质。
在一些实施例中，这些方法产生rAAV病毒载体，其具有每1×1013vg/mL小于约5×106pg/mL、小于约1×106pg/mL、小于约7.5×105pg/mL或小于6.8×105pg/mL的残余宿主细胞DNA(hcDNA)，其中rAAV病毒载体经调配以用于施用和/或以约6.0×1014vg的单位剂量存在于药物组合物中。在一些实施例中，这些方法产生rAAV病毒载体，其具有每1×1013vg/mL小于约5×106pg/mL、小于约1×106pg/mL、小于约7.5×105pg/mL或小于6.8×105pg/mL的残余宿主细胞DNA(hcDNA)，其中rAAV病毒载体经调配以用于施用和/或以约1.2×1014vg的单位剂量存在于药物组合物中。在一些实施例中，这些方法产生rAAV病毒载体，其具有每1×1013vg/mL小于约5×106pg/mL、小于约1×106pg/mL、小于约7.5×105pg/mL或小于6.8×105pg/mL的残余宿主细胞DNA(hcDNA)，其中rAAV病毒载体经调配以用于施用和/或以约2.4×1014vg的单位剂量存在于药物组合物中。在一些实施例中，配制品或药物组合物包含约6.0×1013vg的单位剂量的rAAV病毒载体，其中rAAV病毒载体具有每1×1013vg/mL小于约5×106pg/mL、小于约1×106pg/mL、小于约7.5×105pg/mL或小于6.8×105pg/mL的残余宿主细胞DNA(hcDNA)。在一些实施例中，配制品或药物组合物包含约1.2×1014vg的单位剂量的rAAV病毒载体，其中rAAV病毒载体具有每1×1013vg/mL小于约5×106pg/mL、小于约1×106pg/mL、小于约7.5×105pg/mL或小于6.8×105pg/mL的残余宿主细胞DNA(hcDNA)。在一些实施例中，配制品或药物组合物包含约2.4×1014vg的单位剂量的rAAV病毒载体，其中rAAV病毒载体具有每1×1013vg/mL小于约5×106pg/mL、小于约1×106pg/mL、小于约7.5×105pg/mL或小于6.8×105pg/mL的残余宿主细胞DNA(hcDNA)。
在一些实施例中，这些方法产生rAAV病毒载体，其具有每1.0×1013vg/mL小于约10ng、小于约8ng、小于约6ng或小于约4ng残余宿主细胞蛋白质(rHCP)，其中rAAV病毒载体经调配以用于施用和/或以约6.0×1013vg的单位剂量存在于药物组合物中。在一些实施例中，这些方法产生rAAV病毒载体，其具有每1.0×1013vg/mL小于约10ng、小于约8ng、小于约6ng或小于约4ng残余宿主细胞蛋白质(rHCP)，其中rAAV病毒载体经调配以用于施用和/或以约1.2×1014vg的单位剂量存在于药物组合物中。在一些实施例中，这些方法产生rAAV病毒载体，其具有每1.0×1013vg/mL小于约10ng、小于约8ng、小于约6ng或小于约4ng残余宿主细胞蛋白质(rHCP)，其中rAAV病毒载体经调配以用于施用和/或以约2.4×1014vg的单位剂量存在于药物组合物中。在一些实施例中，配制品或药物组合物包含约6.0×1013vg的单位剂量的rAAV病毒载体，其中rAAV病毒载体具有每1.0×1013vg/mL小于约10ng、小于约8ng、小于约6ng或小于约4ng残余宿主细胞蛋白质(rHCP)。在一些实施例中，配制品或药物组合物包含约1.2×1014vg的单位剂量的rAAV病毒载体，其中rAAV病毒载体具有每1.0×1013vg/mL小于约10ng、小于约8ng、小于约6ng或小于约4ng残余宿主细胞蛋白质(rHCP)。在一些实施例中，配制品或药物组合物包含约2.4×1014vg的单位剂量的rAAV病毒载体，其中rAAV病毒载体具有每1.0×1013vg/mL小于约10ng、小于约8ng、小于约6ng或小于约4ng残余宿主细胞蛋白质(rHCP)。
在一些实施例中，以每mL计，这些方法产生的AAV9病毒载体基因组中的至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约100％为功能性的，其中rAAV病毒载体经调配以用于施用和/或以约6.0×1013vg的单位剂量存在于药物组合物中。在一些实施例中，以每mL计，这些方法产生的AAV9病毒载体基因组中的至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约100％为功能性的，其中rAAV病毒载体经调配以用于施用和/或以约1.2×1014vg的单位剂量存在于药物组合物中。在一些实施例中，以每mL计，这些方法产生的AAV9病毒载体基因组中的至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约100％为功能性的，其中rAAV病毒载体经调配以用于施用和/或以约2.4×1014vg的单位剂量存在于药物组合物中。在一些实施例中，配制品或药物组合物包含约6.0×1013vg的单位剂量的rAAV病毒载体，其中以每mL计，至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约100％的rAAV(例如rAAV9)病毒载体基因组为功能性的。在一些实施例中，配制品或药物组合物包含约1.2×1014vg的单位剂量的rAAV病毒载体，其中以每mL计，至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约100％的rAAV(例如rAAV9)病毒载体基因组为功能性的。在一些实施例中，配制品或药物组合物包含约2.4×1014vg的单位剂量的rAAV病毒载体，其中rAAV病毒载体，其中以每mL计，至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约100％的rAAV(例如rAAV9)病毒载体基因组为功能性的。
在一些实施例中，这些方法产生rAAV病毒载体，其具有小于或等于1.7×106pg/ml(每1×1013vg/ml)，或1×105pg/ml(每1×1013vg/ml)至1.7×106pg/ml(每1×1013vg/ml)的残余质粒DNA，其中rAAV病毒载体经调配以用于施用和/或以约6.0×1013vg的单位剂量存在于药物组合物中。在一些实施例中，这些方法产生rAAV病毒载体，其具有小于或等于1.7×106pg/ml(每1×1013vg/ml)，或1×105pg/ml(每1×1013vg/ml)至1.7×106pg/ml(每1×1013vg/ml)的残余质粒DNA，其中rAAV病毒载体经调配以用于施用和/或以约1.2×1014vg的单位剂量存在于药物组合物中。在一些实施例中，这些方法产生rAAV病毒载体，其具有小于或等于1.7×106pg/ml(每1×1013vg/ml)，或1×105pg/ml(每1×1013vg/ml)至1.7×106pg/ml(每1×1013vg/ml)的残余质粒DNA，其中rAAV病毒载体经调配以用于施用和/或以约2.4×1014vg的单位剂量存在于药物组合物中。在一些实施例中，配制品或药物组合物包含约6.0×1013vg的单位剂量的rAAV病毒载体，其中rAAV病毒载体具有小于或等于1.7×106pg/ml(每1×1013vg/ml)，或1×105pg/ml(每1×1013vg/ml)至1.7×106pg/ml(每1×1013vg/ml)的残余质粒DNA。在一些实施例中，配制品或药物组合物包含约1.2×1014vg的单位剂量的rAAV病毒载体，其中rAAV病毒载体具有小于或等于1.7×106pg/ml(每1×1013vg/ml)，或1×105pg/ml(每1×1013vg/ml)至1.7×106pg/ml(每1×1013vg/ml)的残余质粒DNA。在一些实施例中，配制品或药物组合物包含约2.4×1014vg的单位剂量的rAAV病毒载体，其中rAAV病毒载体具有小于或等于1.7×106pg/ml(每1×1013vg/ml)，或1×105pg/ml(每1×1013vg/ml)至1.7×106pg/ml(每1×1013vg/ml)的残余质粒DNA。
在一些实施例中，这些方法产生rAAV病毒载体，其具有每1.0×1013vg小于0.2ng、每1.0×1013vg小于0.1ng或每1.0×1013vg小于0.09ng的全能核酸酶浓度，其中rAAV病毒载体经调配以用于施用和/或以约6.0×1013vg的单位剂量存在于药物组合物中。在一些实施例中，这些方法产生rAAV病毒载体，其具有每1.0×1013vg小于0.2ng、每1.0×1013vg小于0.1ng或每1.0×1013vg小于0.09ng的全能核酸酶浓度，其中rAAV病毒载体经调配以用于施用和/或以约1.2×1014vg的单位剂量存在于药物组合物中。在一些实施例中，这些方法产生rAAV病毒载体，其具有每1.0×1013vg小于0.2ng、每1.0×1013vg小于0.1ng或每1.0×1013vg小于0.09ng的全能核酸酶浓度，其中rAAV病毒载体经调配以用于施用和/或以约2.4×1014vg的单位剂量存在于药物组合物中。在一些实施例中，配制品或药物组合物包含约6.0×1013vg的单位剂量的rAAV病毒载体，其中rAAV病毒载体具有每1.0×1013vg小于0.2ng、每1.0×1013vg小于0.1ng或每1.0×1013vg小于0.09ng的全能核酸酶浓度。在一些实施例中，配制品或药物组合物包含约1.2×1014vg的单位剂量的rAAV病毒载体，其中rAAV病毒载体具有每1.0×1013vg小于0.2ng、每1.0×1013vg小于0.1ng或每1.0×1013vg小于0.09ng的全能核酸酶浓度。在一些实施例中，配制品或药物组合物包含约2.4×1014vg的单位剂量的rAAV病毒载体，其中rAAV病毒载体具有每1.0×1013vg小于0.2ng、每1.0×1013vg小于0.1ng或每1.0×1013vg小于0.09ng的全能核酸酶浓度。
在一些实施例中，这些方法产生rAAV病毒载体，其具有每1.0×1013vg小于0.5ng、每1.0×1013vg小于0.3ng或每1.0×1013vg小于0.22ng的牛血清白蛋白(BSA)浓度，其中rAAV病毒载体经调配以用于施用和/或以约6.0×1013vg的单位剂量存在于药物组合物中。在一些实施例中，这些方法产生rAAV病毒载体，其具有每1.0×1013vg小于0.5ng、每1.0×1013vg小于0.3ng或每1.0×1013vg小于0.22ng的牛血清白蛋白(BSA)浓度，其中rAAV病毒载体经调配以用于施用和/或以约1.2×1014vg的单位剂量存在于药物组合物中。在一些实施例中，这些方法产生rAAV病毒载体，其具有每1.0×1013vg小于0.5ng、每1.0×1013vg小于0.3ng或每1.0×1013vg小于0.22ng的牛血清白蛋白(BSA)浓度，其中rAAV病毒载体经调配以用于施用和/或以约2.4×1014vg的单位剂量存在于药物组合物中。在一些实施例中，配制品或药物组合物包含约6.0×1013vg的单位剂量的rAAV病毒载体，其中rAAV病毒载体具有每1.0×1013vg小于0.5ng、每1.0×1013vg小于0.3ng或每1.0×1013vg小于0.22ng的牛血清白蛋白(BSA)浓度。在一些实施例中，配制品或药物组合物包含约1.2×1014vg的单位剂量的rAAV病毒载体，其中rAAV病毒载体具有每1.0×1013vg小于0.5ng、每1.0×1013vg小于0.3ng或每1.0×1013vg小于0.22ng的牛血清白蛋白(BSA)浓度。在一些实施例中，配制品或药物组合物包含约2.4×1014vg的单位剂量的rAAV病毒载体，其中rAAV病毒载体具有每1.0×1013vg小于0.5ng、每1.0×1013vg小于0.3ng或每1.0×1013vg小于0.22ng的牛血清白蛋白(BSA)浓度。
在一些实施例中，这些方法产生rAAV病毒载体，其具有每1.0×1013vg/mL小于约1EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.75EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.5EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.4EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.35EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.3EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.25EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.2EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.13EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.1EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.05EU/mL或每1.0×1013vg/mL小于约0.02EU/mL的内毒素水平，其中rAAV病毒载体经调配以用于施用和/或以约6.0×1013vg的单位剂量存在于药物组合物中。在一些实施例中，这些方法产生rAAV病毒载体，其具有每1.0×1013vg/mL小于约1EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.75EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.5EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.4EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.35EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.3EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.25EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.2EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.13EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.1EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.05EU/mL或每1.0×1013vg/mL小于约0.02EU/mL的内毒素水平，其中rAAV病毒载体经调配以用于施用和/或以约1.2×1014vg的单位剂量存在于药物组合物中。在一些实施例中，这些方法产生rAAV病毒载体，其具有每1.0×1013vg/mL小于约1EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.75EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.5EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.4EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.35EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.3EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.25EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.2EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.13EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.1EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.05EU/mL或每1.0×1013vg/mL小于约0.02EU/mL的内毒素水平，其中rAAV病毒载体经调配以用于施用和/或以约2.4×1014vg的单位剂量存在于药物组合物中。在一些实施例中，配制品或药物组合物包含约6.0×1013vg的单位剂量的rAAV病毒载体，其中rAAV病毒载体具有每1.0×1013vg/mL小于约1EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.75EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.5EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.4EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.35EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.3EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.25EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.2EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.13EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.1EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.05EU/mL或每1.0×1013vg/mL小于约0.02EU/mL的内毒素水平。在一些实施例中，配制品或药物组合物包含约1.2×1014vg的单位剂量的rAAV病毒载体，其中rAAV病毒载体具有每1.0×1013vg/mL小于约1EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.75EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.5EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.4EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.35EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.3EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.25EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.2EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.13EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.1EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.05EU/mL或每1.0×1013vg/mL小于约0.02EU/mL的内毒素水平。在一些实施例中，配制品或药物组合物包含约2.4×1014vg的单位剂量的rAAV病毒载体，其中rAAV病毒载体具有每1.0×1013vg/mL小于约1EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.75EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.5EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.4EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.35EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.3EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.25EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.2EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.13EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.1EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.05EU/mL或每1.0×1013vg/mL小于约0.02EU/mL的内毒素水平。
在一些实施例中，这些方法产生rAAV病毒载体，其具有小于100μg/g(ppm)、小于50μg/g(ppm)或小于30μg/g(ppm)的铯浓度，其中rAAV病毒载体经调配以用于施用和/或以约6.0×1013vg的单位剂量存在于药物组合物中。在一些实施例中，这些方法产生rAAV病毒载体，其具有小于100μg/g(ppm)、小于50μg/g(ppm)或小于30μg/g(ppm)的铯浓度，其中rAAV病毒载体经调配以用于施用和/或以约1.2×1014vg的单位剂量存在于药物组合物中。在一些实施例中，这些方法产生rAAV病毒载体，其具有小于100μg/g(ppm)、小于50μg/g(ppm)或小于30μg/g(ppm)的铯浓度，其中rAAV病毒载体经调配以用于施用和/或以约2.4×1014vg的单位剂量存在于药物组合物中。在一些实施例中，配制品或药物组合物包含约6.0×1013vg的单位剂量的rAAV病毒载体，其中rAAV病毒载体具有小于100μg/g(ppm)、小于50μg/g(ppm)或小于30μg/g(ppm)的铯浓度。在一些实施例中，配制品或药物组合物包含约1.2×1014vg的单位剂量的rAAV病毒载体，其中rAAV病毒载体具有小于100μg/g(ppm)、小于50μg/g(ppm)或小于30μg/g(ppm)的铯浓度。在一些实施例中，配制品或药物组合物包含约2.4×1014vg的单位剂量的rAAV病毒载体，其中rAAV病毒载体具有小于100μg/g(ppm)、小于50μg/g(ppm)或小于30μg/g(ppm)的铯浓度。
在一些实施例中，这些方法产生rAAV病毒载体，其具有约10-100ppm、15-90ppm或约20-80ppm泊洛沙姆188，其中rAAV病毒载体经调配以用于施用和/或以约6.0×1013vg的单位剂量存在于药物组合物中。在一些实施例中，这些方法产生rAAV病毒载体，其具有约10-100ppm、15-90ppm或约20-80ppm泊洛沙姆188，其中rAAV病毒载体经调配以用于施用和/或以约1.2×1014vg的单位剂量存在于药物组合物中。在一些实施例中，这些方法产生rAAV病毒载体，其具有约10-100ppm、15-90ppm或约20-80ppm泊洛沙姆188，其中rAAV病毒载体经调配以用于施用和/或以约2.4×1014vg的单位剂量存在于药物组合物中。在一些实施例中，配制品或药物组合物包含约6.0×1013vg的单位剂量的rAAV病毒载体，其中rAAV病毒载体具有约10-100ppm、15-90ppm或约20-80ppm泊洛沙姆188。在一些实施例中，配制品或药物组合物包含约1.2×1014vg的单位剂量的rAAV病毒载体，其中rAAV病毒载体具有约10-100ppm、15-90ppm或约20-80ppm泊洛沙姆188。在一些实施例中，配制品或药物组合物包含约2.4×1014vg的单位剂量的rAAV病毒载体，其中rAAV病毒载体具有约10-100ppm、15-90ppm或约20-80ppm泊洛沙姆188。
在一些实施例中，这些方法产生rAAV病毒载体，以每个容器计，其中尺寸≥25μm的颗粒少于2000、少于1500、少于1000或少于600个，其中rAAV病毒载体经调配以用于施用和/或以约6.0×1013vg的单位剂量存在于药物组合物中。在一些实施例中，这些方法产生rAAV病毒载体，以每个容器计，其中尺寸≥25μm的颗粒少于2000、少于1500、少于1000或少于600个，其中rAAV病毒载体经调配以用于施用和/或以约1.2×1014vg的单位剂量存在于药物组合物中。在一些实施例中，这些方法产生rAAV病毒载体，以每个容器计，其中尺寸≥25μm的颗粒少于2000、少于1500、少于1000或少于600个，其中rAAV病毒载体经调配以用于施用和/或以约2.4×1014vg的单位剂量存在于药物组合物中。在一些实施例中，配制品或药物组合物包含约6.0×1013vg的单位剂量的rAAV病毒载体，其中以每个容器计，rAAV病毒载体中尺寸≥25μm的颗粒少于2000、少于1500、少于1000或少于600个。在一些实施例中，配制品或药物组合物包含约1.2×1014vg的单位剂量的rAAV病毒载体，其中以每个容器计，rAAV病毒载体中尺寸≥25μm的颗粒少于2000、少于1500、少于1000或少于600个。在一些实施例中，配制品或药物组合物包含约2.4×1014vg的单位剂量的rAAV病毒载体，其中以每个容器计，rAAV病毒载体中尺寸≥25μm的颗粒少于2000、少于1500、少于1000或少于600个。
在一些实施例中，这些方法产生rAAV病毒载体，以每个容器计，其中尺寸≥10μm的颗粒少于10000、少于8000、少于1000或少于6000个，其中rAAV病毒载体经调配以用于施用和/或以约6.0×1013vg的单位剂量存在于药物组合物中。在一些实施例中，这些方法产生rAAV病毒载体，以每个容器计，其中尺寸≥10μm的颗粒少于10000、少于8000、少于1000或少于6000个，其中rAAV病毒载体经调配以用于施用和/或以约1.2×1014vg的单位剂量存在于药物组合物中。在一些实施例中，这些方法产生rAAV病毒载体，以每个容器计，其中尺寸≥10μm的颗粒少于10000、少于8000、少于1000或少于6000个，其中rAAV病毒载体经调配以用于施用和/或以约2.4×1014vg的单位剂量存在于药物组合物中。在一些实施例中，配制品或药物组合物包含约6.0×1013vg的单位剂量的rAAV病毒载体，其中以每个容器计，rAAV病毒载体中尺寸≥10μm的颗粒少于10000、少于8000、少于1000或少于6000个。在一些实施例中，配制品或药物组合物包含约1.2×1014vg的单位剂量的rAAV病毒载体，其中以每个容器计，rAAV病毒载体中尺寸≥10μm的颗粒少于10000、少于8000、少于1000或少于6000个。在一些实施例中，配制品或药物组合物包含约2.4×1014vg的单位剂量的rAAV病毒载体，其中以每个容器计，rAAV病毒载体中尺寸≥10μm的颗粒少于10000、少于8000、少于1000或少于6000个。
在一些实施例中，这些方法产生rAAV病毒载体，其pH值在7.5至8.5之间、在7.6至8.4之间或在7.8至8.3之间，其中rAAV病毒载体经调配以用于施用和/或以约6.0×1013vg的单位剂量存在于药物组合物中。在一些实施例中，这些方法产生rAAV病毒载体，其pH值在7.5至8.5之间、在7.6至8.4之间或在7.8至8.3之间，其中rAAV病毒载体经调配以用于施用和/或以约1.2×1014vg的单位剂量存在于药物组合物中。在一些实施例中，这些方法产生rAAV病毒载体，其pH值在7.5至8.5之间、在7.6至8.4之间或在7.8至8.3之间，其中rAAV病毒载体经调配以用于施用和/或以约2.4×1014vg的单位剂量存在于药物组合物中。在一些实施例中，配制品或药物组合物包含约6.0×1013vg的单位剂量的rAAV病毒载体，其中rAAV病毒载体的pH值在7.5至8.5之间、在7.6至8.4之间或在7.8至8.3之间。在一些实施例中，配制品或药物组合物包含约1.2×1014vg的单位剂量的rAAV病毒载体，其中rAAV病毒载体的pH值在7.5至8.5之间、在7.6至8.4之间或在7.8至8.3之间。在一些实施例中，配制品或药物组合物包含约2.4×1014vg的单位剂量的rAAV病毒载体，其中rAAV病毒载体的pH值在7.5至8.5之间、在7.6至8.4之间或在7.8至8.3之间。
在一些实施例中，这些方法产生rAAV病毒载体，其重量莫耳渗透浓度在330至490mOsm/kg之间、在360至460mOsm/kg之间或在390至430mOsm/kg之间，其中rAAV病毒载体经调配以用于施用和/或以约6.0×1013vg的单位剂量存在于药物组合物中。在一些实施例中，这些方法产生rAAV病毒载体，其重量莫耳渗透浓度在330至490mOsm/kg之间、在360至460mOsm/kg之间或在390至430mOsm/kg之间，其中rAAV病毒载体经调配以用于施用和/或以约1.2×1014vg的单位剂量存在于药物组合物中。在一些实施例中，这些方法产生rAAV病毒载体，其重量莫耳渗透浓度在330至490mOsm/kg之间、在360至460mOsm/kg之间或在390至430mOsm/kg之间，其中rAAV病毒载体经调配以用于施用和/或以约2.4×1014vg的单位剂量存在于药物组合物中。在一些实施例中，配制品或药物组合物包含约6.0×1013vg的单位剂量的rAAV病毒载体，其中rAAV病毒载体的重量莫耳渗透浓度在330至490mOsm/kg之间、在360至460mOsm/kg之间或在390至430mOsm/kg之间。在一些实施例中，配制品或药物组合物包含约1.2×1014vg的单位剂量的rAAV病毒载体，其中rAAV病毒载体的重量莫耳渗透浓度在330至490mOsm/kg之间、在360至460mOsm/kg之间或在390至430mOsm/kg之间。在一些实施例中，配制品或药物组合物包含约2.4×1014vg的单位剂量的rAAV病毒载体，其中rAAV病毒载体的重量莫耳渗透浓度在330至490mOsm/kg之间、在360至460mOsm/kg之间或在390至430mOsm/kg之间。
在一些实施例中，这些方法产生rAAV病毒载体，其具有每1.0×1013vg约1.0×108-10.0×1010IU、每1.0×1013vg约2.5×108-9.0×1010IU或每1.0×1013vg约3.9×108-8.4×1010IU的感染效价，其中rAAV病毒载体经调配以用于施用和/或以约6.0×1013vg的单位剂量存在于药物组合物中。在一些实施例中，这些方法产生rAAV病毒载体，其具有每1.0×1013vg约1.0×108-10.0×1010IU、每1.0×1013vg约2.5×108-9.0×1010IU或每1.0×1013vg约3.9×108-8.4×1010IU的感染效价，其中rAAV病毒载体经调配以用于施用和/或以约1.2×1014vg的单位剂量存在于药物组合物中。在一些实施例中，这些方法产生rAAV病毒载体，其具有每1.0×1013vg约1.0×108-10.0×1010IU、每1.0×1013vg约2.5×108-9.0×1010IU或每1.0×1013vg约3.9×108-8.4×1010IU的感染效价，其中rAAV病毒载体经调配以用于施用和/或以约2.4×1014vg的单位剂量存在于药物组合物中。在一些实施例中，配制品或药物组合物包含约6.0×1013vg的单位剂量的rAAV病毒载体，其中rAAV病毒载体具有每1.0×1013vg约1.0×108-10.0×1010IU、每1.0×1013vg约2.5×108-9.0×1010IU或每1.0×1013vg约3.9×108-8.4×1010IU的感染效价。在一些实施例中，配制品或药物组合物包含约1.2×1014vg的单位剂量的rAAV病毒载体，其中rAAV病毒载体具有每1.0×1013vg约1.0×108-10.0×1010IU、每1.0×1013vg约2.5×108-9.0×1010IU或每1.0×1013vg约3.9×108-8.4×1010IU的感染效价。在一些实施例中，配制品或药物组合物包含约2.4×1014vg的单位剂量的rAAV病毒载体，其中rAAV病毒载体具有每1.0×1013vg约1.0×108-10.0×1010IU、每1.0×1013vg约2.5×108-9.0×1010IU或每1.0×1013vg约3.9×108-8.4×1010IU的感染效价。
在一些实施例中，这些方法产生rAAV病毒载体，基于活体外基于细胞的分析法，其相对于参考标准和/或适合的对照物具有约30％-150％、约60％-140％或约70％-130％相对效能，其中rAAV病毒载体经调配以用于施用和/或以约6.0×1013vg的单位剂量存在于药物组合物中。在一些实施例中，这些方法产生rAAV病毒载体，基于活体外基于细胞的分析法，其相对于参考标准和/或适合的对照物具有约30％-150％、约60％-140％或约70％-130％相对效能，其中rAAV病毒载体经调配以用于施用和/或以约1.2×1014vg的单位剂量存在于药物组合物中。在一些实施例中，这些方法产生rAAV病毒载体，基于活体外基于细胞的分析法，其相对于参考标准和/或适合的对照物具有约30％-150％、约60％-140％或约70％-130％相对效能，其中rAAV病毒载体经调配以用于施用和/或以约2.4×1014vg的单位剂量存在于药物组合物中。在一些实施例中，配制品或药物组合物包含约6.0×1013vg的单位剂量的rAAV病毒载体，其中基于活体外基于细胞的分析法，rAAV病毒载体相对于参考标准和/或适合的对照物具有约30％-150％、约60％-140％或约70％-130％相对效能。在一些实施例中，配制品或药物组合物包含约1.2×1014vg的单位剂量的rAAV病毒载体，其中基于活体外基于细胞的分析法，rAAV病毒载体相对于参考标准和/或适合的对照物具有约30％-150％、约60％-140％或约70％-130％相对效能。在一些实施例中，配制品或药物组合物包含约2.4×1014vg的单位剂量的rAAV病毒载体，其中基于活体外基于细胞的分析法，rAAV病毒载体相对于参考标准和/或适合的对照物具有约30％-150％、约60％-140％或约70％-130％相对效能。
在一些实施例中，这些方法产生rAAV病毒载体，其总蛋白质水平为每1.0×1013vg约10-500μg、每1.0×1013vg约50-400μg或每1.0×1013vg约100-300μg，其中rAAV病毒载体经调配以用于施用和/或以约6.0×1013vg的单位剂量存在于药物组合物中。在一些实施例中，这些方法产生rAAV病毒载体，其总蛋白质水平为每1.0×1013vg约10-500μg、每1.0×1013vg约50-400μg或每1.0×1013vg约100-300μg，其中rAAV病毒载体经调配以用于施用和/或以约1.2×1014vg的单位剂量存在于药物组合物中。在一些实施例中，这些方法产生rAAV病毒载体，其总蛋白质水平为每1.0×1013vg约10-500μg、每1.0×1013vg约50-400μg或每1.0×1013vg约100-300μg，其中rAAV病毒载体经调配以用于施用和/或以约2.4×1014vg的单位剂量存在于药物组合物中。在一些实施例中，配制品或药物组合物包含约6.0×1013vg的单位剂量的rAAV病毒载体，其中rAAV病毒载体的总蛋白质水平为每1.0×1013vg约10-500μg、每1.0×1013vg约50-400μg或每1.0×1013vg约100-300μg。在一些实施例中，配制品或药物组合物包含约1.2×1014vg的单位剂量的rAAV病毒载体，其中rAAV病毒载体的总蛋白质水平为每1.0×1013vg约10-500μg、每1.0×1013vg约50-400μg或每1.0×1013vg约100-300μg。在一些实施例中，配制品或药物组合物包含约2.4×1014vg的单位剂量的rAAV病毒载体，其中rAAV病毒载体的总蛋白质水平为每1.0×1013vg约10-500μg、每1.0×1013vg约50-400μg或每1.0×1013vg约100-300μg。
在一些实施例中，这些方法产生具有活体内效能的rAAV病毒载体，如通过以7.5×1013vg/kg的剂量给药的SMNΔ7小鼠的中值存活期大于15天、大于20天、大于22天或大于24天所测定，其中rAAV病毒载体经调配以用于施用和/或以约6.0×1013vg的单位剂量存在于药物组合物中。在一些实施例中，这些方法产生具有活体内效能的rAAV病毒载体，如通过以7.5×1013vg/kg的剂量给药的SMNΔ7小鼠的中值存活期大于15天、大于20天、大于22天或大于24天所测定，其中rAAV病毒载体经调配以用于施用和/或以约1.2×1014vg的单位剂量存在于药物组合物中。在一些实施例中，这些方法产生具有活体内效能的rAAV病毒载体，如通过以7.5×1013vg/kg的剂量给药的SMNΔ7小鼠的中值存活期大于15天、大于20天、大于22天或大于24天所测定，其中rAAV病毒载体经调配以用于施用和/或以约2.4×1014vg的单位剂量存在于药物组合物中。在一些实施例中，配制品或药物组合物包含约6.0×1013vg的单位剂量的rAAV病毒载体，其中rAAV病毒载体具有活体内效能，如通过以7.5×1013vg/kg的剂量给药的SMNΔ7小鼠的中值存活期大于15天、大于20天、大于22天或大于24天所测定。在一些实施例中，配制品或药物组合物包含约1.2×1014vg的单位剂量的rAAV病毒载体，其中rAAV病毒载体具有活体内效能，如通过以7.5×1013vg/kg的剂量给药的SMNΔ7小鼠的中值存活期大于15天、大于20天、大于22天或大于24天所测定。在一些实施例中，配制品或药物组合物包含约2.4×1014vg的单位剂量的rAAV病毒载体，其中rAAV病毒载体具有活体内效能，如通过以7.5×1013vg/kg的剂量给药的SMNΔ7小鼠的中值存活期大于15天、大于20天、大于22天或大于24天所测定。
在一些实施例中，配制品或药物组合物包含约6.0×1013vg的单位剂量的rAAV病毒载体及以下释放标准中的一个或多个：小于约10％、小于约8％、小于约7％或小于约5％空病毒衣壳；每1×1013vg/mL小于约100ng/mL的宿主细胞蛋白质；每1×1013vg/mL小于约5×106pg/mL、小于约1×106pg/mL、小于约7.5×105pg/mL或小于6.8×105pg/mL的残余宿主细胞DNA(hcDNA)；每1.0×1013vg/mL小于约10ng、小于约8ng、小于约6ng或小于约4ng残余宿主细胞蛋白质(rHCP)；以每mL计，至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约100％的rAAV病毒载体基因组为功能性的；小于或等于1.7×106pg/mL(每1×1013vg/mL)，或1×105pg/mL(每1×1013vg/mL)至1.7×106pg/mL(每1×1013vg/mL)的残余质粒DNA；每1.0×1013vg小于0.2ng、每1.0×1013vg小于0.1ng或每1.0×1013vg小于0.09ng的全能核酸酶浓度；每1.0×1013vg小于0.5ng、每1.0×1013vg小于0.3ng或每1.0×1013vg小于0.22ng的牛血清白蛋白(BSA)浓度；每1.0×1013vg/mL小于约1EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.75EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.5EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.4EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.35EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.3EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.25EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.2EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.13EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.1EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.05EU/mL或每1.0×1013vg/mL小于约0.02EU/mL的内毒素水平；铯浓度小于100μg/g(ppm)、小于50μg/g(ppm)或小于30μg/g(ppm)；约10-100ppm、15-90ppm或约20-80ppm泊洛沙姆188；以每个容器计，尺寸≥25μm的颗粒少于2000、少于1500、少于1000或少于600个；以每个容器计，尺寸≥10μm的颗粒少于10000、少于8000、少于1000或少于6000个；pH值在7.5至8.5之间、在7.6至8.4之间或在7.8至8.3之间；重量莫耳渗透浓度在330至490mOsm/kg之间、在360至460mOsm/kg之间或在390至430mOsm/kg之间；感染效价为每1.0×1013vg约1.0×108-10.0×1010IU、每1.0×1013vg约2.5×108-9.0×1010IU或每1.0×1013vg约3.9×108-8.4×1010IU；基于活体外基于细胞的分析法，相对于参考标准和/或适合的对照物约30-150％、约60-140％或约70-130％相对效能；总蛋白质水平为每1.0×1013vg约10-500μg、每1.0×1013vg约50-400μg或每1.0×1013vg约100-300μg；活体内效能，如通过以7.5×1013vg/kg的剂量给药的SMNΔ7小鼠的中值存活期大于15天、大于20天、大于22天或大于24天所测定。
在一些实施例中，配制品或药物组合物包含约6.0×1013vg的单位剂量的rAAV病毒载体及以下释放标准中的一个或多个：pH值为约7.7-8.3；重量莫耳渗透浓度为约390-430mOsm/kg；以每个容器计，尺寸≥25μm的颗粒少于约600个；以每个容器计，尺寸≥10μm的颗粒少于约6000个；基因组效价为约1.7×1013-5.3×1013vg/mL；感染效价为每1.0×1013vg约3.9×108-8.4×1010IU；总蛋白质水平为每1.0×1013vg约100-300μg；普朗尼克F-68含量为约20-80ppm；基于活体外基于细胞的分析法，相对效能为约70-130％，其中该效能相对于参考标准和/或适合的对照物；由在7.5×1013vg/kg的剂量下，SMNΔ7小鼠模型中的中值存活期大于或等于24天表征的活体内效能；小于约5％空衣壳；总纯度大于或等于约95％；小于或等于约0.13EU/mL的内毒素。
在一些实施例中，配制品或药物组合物包含约6.0×1013vg的单位剂量的rAAV病毒载体及以下释放标准中的一个或多个：每1.0×1013vg小于约0.09ng全能核酸酶；小于约30μg/g(ppm)铯；约20-80ppm泊洛沙姆188；每1.0×1013vg小于约0.22ng BSA；每1.0×1013vg小于约6.8×105pg残余质粒DNA；每1.0×1013vg小于约1.1×105pg残余hcDNA；每1.0×1013vg小于约4ng rHCP；pH值为约7.7-8.3；重量莫耳渗透浓度为约390-430mOsm/kg；以每个容器计，尺寸≥25μm的颗粒少于约600个；以每个容器计，尺寸≥10μm的颗粒少于约6000个；基因组效价为约1.7×1013-5.3×1013vg/mL；感染效价为每1.0×1013vg约3.9×108-8.4×1010IU；总蛋白质水平为每1.0×1013vg约100-300μg；基于活体外基于细胞的分析法，相对效能为约70-130％，其中该效能相对于参考标准和/或适合的对照物；小于约5％空衣壳。
在一些实施例中，配制品或药物组合物包含约1.2×1014vg的单位剂量的rAAV病毒载体及以下释放标准中的一个或多个：小于约10％、小于约8％、小于约7％或小于约5％空病毒衣壳；每1×1013vg/mL小于约100ng/mL的宿主细胞蛋白质；每1×1013vg/mL小于约5×106pg/mL、小于约1×106pg/mL、小于约7.5×105pg/mL或小于6.8×105pg/mL的残余宿主细胞DNA(hcDNA)；每1.0×1013vg/mL小于约10ng、小于约8ng、小于约6ng或小于约4ng残余宿主细胞蛋白质(rHCP)；以每mL计，至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约100％的rAAV病毒载体基因组为功能性的；小于或等于1.7×106pg/mL(每1×1013vg/mL)，或1×105pg/mL(每1×1013vg/mL)至1.7×106pg/mL(每1×1013vg/mL)的残余质粒DNA；每1.0×1013vg小于0.2ng、每1.0×1013vg小于0.1ng或每1.0×1013vg小于0.09ng的全能核酸酶浓度；每1.0×1013vg小于0.5ng、每1.0×1013vg小于0.3ng或每1.0×1013vg小于0.22ng的牛血清白蛋白(BSA)浓度；每1.0×1013vg/mL小于约1EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.75EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.5EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.4EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.35EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.3EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.25EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.2EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.13EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.1EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.05EU/mL或每1.0×1013vg/mL小于约0.02EU/mL的内毒素水平；铯浓度小于100μg/g(ppm)、小于50μg/g(ppm)或小于30μg/g(ppm)；约10-100ppm、15-90ppm或约20-80ppm泊洛沙姆188；以每个容器计，尺寸≥25μm的颗粒少于2000、少于1500、少于1000或少于600个；以每个容器计，尺寸≥10μm的颗粒少于10000、少于8000、少于1000或少于6000个；pH值在7.5至8.5之间、在7.6至8.4之间或在7.8至8.3之间；重量莫耳渗透浓度在330至490mOsm/kg之间、在360至460mOsm/kg之间或在390至430mOsm/kg之间；感染效价为每1.0×1013vg约1.0×108-10.0×1010IU、每1.0×1013vg约2.5×108-9.0×1010IU或每1.0×1013vg约3.9×108-8.4×1010IU；基于活体外基于细胞的分析法，相对于参考标准和/或适合的对照物约30-150％、约60-140％或约70-130％相对效能；总蛋白质水平为每1.0×1013vg约10-500μg、每1.0×1013vg约50-400μg或每1.0×1013vg约100-300μg；活体内效能，如通过以7.5×1013vg/kg的剂量给药的SMNΔ7小鼠的中值存活期大于15天、大于20天、大于22天或大于24天所测定。
在一些实施例中，配制品或药物组合物包含约1.2×1014vg的单位剂量的rAAV病毒载体及以下释放标准中的一个或多个：pH值为约7.7-8.3；重量莫耳渗透浓度为约390-430mOsm/kg；以每个容器计，尺寸≥25μm的颗粒少于约600个；以每个容器计，尺寸≥10μm的颗粒少于约6000个；基因组效价为约1.7×1013-5.3×1013vg/mL；感染效价为每1.0×1013vg约3.9×108-8.4×1010IU；总蛋白质水平为每1.0×1013vg约100-300μg；普朗尼克F-68含量为约20-80ppm；基于活体外基于细胞的分析法，相对效能为约70-130％，其中该效能相对于参考标准和/或适合的对照物；由在7.5×1013vg/kg的剂量下，SMNΔ7小鼠模型中的中值存活期大于或等于24天表征的活体内效能；小于约5％空衣壳；总纯度大于或等于约95％；小于或等于约0.13EU/mL的内毒素。
在一些实施例中，配制品或药物组合物包含约1.2×1014vg的单位剂量的rAAV病毒载体及以下释放标准中的一个或多个：每1.0×1013vg小于约0.09ng全能核酸酶；小于约30μg/g(ppm)铯；约20-80ppm泊洛沙姆188；每1.0×1013vg小于约0.22ng BSA；每1.0×1013vg小于约6.8×105pg残余质粒DNA；每1.0×1013vg小于约1.1×105pg残余hcDNA；每1.0×1013vg小于约4ng rHCP；pH值为约7.7-8.3；重量莫耳渗透浓度为约390-430mOsm/kg；以每个容器计，尺寸≥25μm的颗粒少于约600个；以每个容器计，尺寸≥10μm的颗粒少于约6000个；基因组效价为约1.7×1013-5.3×1013vg/mL；感染效价为每1.0×1013vg约3.9×108-8.4×1010IU；总蛋白质水平为每1.0×1013vg约100-300μg；基于活体外基于细胞的分析法，相对效能为约70-130％，其中该效能相对于参考标准和/或适合的对照物；小于约5％空衣壳。
在一些实施例中，配制品或药物组合物包含约2.4×1014vg的单位剂量的rAAV病毒载体及以下释放标准中的一个或多个：小于约10％、小于约8％、小于约7％或小于约5％空病毒衣壳；每1×1013vg/mL小于约100ng/mL的宿主细胞蛋白质；每1×1013vg/mL小于约5×106pg/mL、小于约1×106pg/mL、小于约7.5×105pg/mL或小于6.8×105pg/mL的残余宿主细胞DNA(hcDNA)；每1.0×1013vg/mL小于约10ng、小于约8ng、小于约6ng或小于约4ng残余宿主细胞蛋白质(rHCP)；以每mL计，至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约100％的rAAV病毒载体基因组为功能性的；小于或等于1.7×106pg/mL(每1×1013vg/mL)，或1×105pg/mL(每1×1013vg/mL)至1.7×106pg/mL(每1×1013vg/mL)的残余质粒DNA；每1.0×1013vg小于0.2ng、每1.0×1013vg小于0.1ng或每1.0×1013vg小于0.09ng的全能核酸酶浓度；每1.0×1013vg小于0.5ng、每1.0×1013vg小于0.3ng或每1.0×1013vg小于0.22ng的牛血清白蛋白(BSA)浓度；每1.0×1013vg/mL小于约1EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.75EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.5EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.4EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.35EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.3EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.25EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.2EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.13EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.1EU/mL、每1.0×1013vg/mL小于约0.05EU/mL或每1.0×1013vg/mL小于约0.02EU/mL的内毒素水平；铯浓度小于100μg/g(ppm)、小于50μg/g(ppm)或小于30μg/g(ppm)；约10-100ppm、15-90ppm或约20-80ppm泊洛沙姆188；以每个容器计，尺寸≥25μm的颗粒少于2000、少于1500、少于1000或少于600个；以每个容器计，尺寸≥10μm的颗粒少于10000、少于8000、少于1000或少于6000个；pH值在7.5至8.5之间、在7.6至8.4之间或在7.8至8.3之间；重量莫耳渗透浓度在330至490mOsm/kg之间、在360至460mOsm/kg之间或在390至430mOsm/kg之间；感染效价为每1.0×1013vg约1.0×108-10.0×1010IU、每1.0×1013vg约2.5×108-9.0×1010IU或每1.0×1013vg约3.9×108-8.4×1010IU；基于活体外基于细胞的分析法，相对于参考标准和/或适合的对照物约30-150％、约60-140％或约70-130％相对效能；总蛋白质水平为每1.0×1013vg约10-500μg、每1.0×1013vg约50-400μg或每1.0×1013vg约100-300μg；活体内效能，如通过以7.5×1013vg/kg的剂量给药的SMNΔ7小鼠的中值存活期大于15天、大于20天、大于22天或大于24天所测定。
在一些实施例中，配制品或药物组合物包含约2.4×1014vg的单位剂量的rAAV病毒载体及以下释放标准中的一个或多个：pH值为约7.7-8.3；重量莫耳渗透浓度为约390-430mOsm/kg；以每个容器计，尺寸≥25μm的颗粒少于约600个；以每个容器计，尺寸≥10μm的颗粒少于约6000个；基因组效价为约1.7×1013-5.3×1013vg/mL；感染效价为每1.0×1013vg约3.9×108-8.4×1010IU；总蛋白质水平为每1.0×1013vg约100-300μg；普朗尼克F-68含量为约20-80ppm；基于活体外基于细胞的分析法，相对效能为约70-130％，其中该效能相对于参考标准和/或适合的对照物；由在7.5×1013vg/kg的剂量下，SMNΔ7小鼠模型中的中值存活期大于或等于24天表征的活体内效能；小于约5％空衣壳；总纯度大于或等于约95％；小于或等于约0.13EU/mL的内毒素。
在一些实施例中，配制品或药物组合物包含约2.4×1014vg的单位剂量的rAAV病毒载体及以下释放标准中的一个或多个：每1.0×1013vg小于约0.09ng全能核酸酶；小于约30μg/g(ppm)铯；约20-80ppm泊洛沙姆188；每1.0×1013vg小于约0.22ng BSA；每1.0×1013vg小于约6.8×105pg残余质粒DNA；每1.0×1013vg小于约1.1×105pg残余hcDNA；每1.0×1013vg小于约4ng rHCP；pH值为约7.7-8.3；重量莫耳渗透浓度为约390-430mOsm/kg；以每个容器计，尺寸≥25μm的颗粒少于约600个；以每个容器计，尺寸≥10μm的颗粒少于约6000个；基因组效价为约1.7×1013-5.3×1013vg/mL；感染效价为每1.0×1013vg约3.9×108-8.4×1010IU；总蛋白质水平为每1.0×1013vg约100-300μg；基于活体外基于细胞的分析法，相对效能为约70-130％，其中该效能相对于参考标准和/或适合的对照物；小于约5％空衣壳。
通过以下实例进一步说明本披露，这些实例不应解释为限制性的。出于所有目的，本申请中所引用的所有参考文献、专利及公开专利申请的内容以及图式均以全文引用的方式并入本文中。
实例
临床前评估
SMNΔ7小鼠为适用于研究基因转移的模型。Butchbach等人,“Abnormal motorphenotype in the SMNΔ7mouse model of spinal muscular atrophy[SMNΔ7小鼠脊髓性肌萎缩症模型中的异常运动表型]”Neurobiology of disease[疾病的神经生物学],27(2):207-19。将scAAV9.CB.SMN的5×1011个病毒基因组注射至年龄为1天的小鼠的面静脉可援救SMNΔ7小鼠模型。Foust等人,“Rescue of the spinal muscular atrophy phenotypein a mouse model by early postnatal delivery of SMN[出生后早期SMN传递对小鼠模型中脊髓性肌萎缩表型的拯救]”Nature biotechnology[自然生物技术],28(3):271-4。约42±2％的腰脊椎运动神经元在经scAAV9.CB.SMN处理的小鼠中转导。与未经处理的SMA小鼠相比，经scAAV9.CB.SMN处理的动物的脑部、脊髓及肌肉中的SMN水平也增加(尽管低于WT对照物)。在P1评估经scAAV9.CB.SMN或scAAV9.CB.GFP处理的SMA动物的恢复正常体位的能力且与野生型(WT)对照小鼠及未经处理的小鼠比较。WT对照物可独立快速恢复正常体位，而经SMN及绿色荧光蛋白(GFP)处理的SMA动物在P5时展示困难。然而，在P13时，与经GFP处理的对照物为20％及未经处理的SMA动物为0％相比，90％的经SMN处理的动物可独立恢复正常体位。在P18时，经SMN处理的动物大于经GFP处理的动物，但小于WT对照物。经SMN处理的小鼠的运动能力与WT对照物几乎相同，如通过开放空间测试及转轮运动所分析。
与经GFP处理的SMA动物相比，经SMN处理的SMA动物的存活期显著改良。经GFP处理的对照动物均未存活超过P22且中值寿命为15.5天。GFP小鼠的体重在P10达到峰值且接着突然下降直至死亡，而SMN小鼠展示稳定体重增加直至约P40且稳定在17g(WT对照物的体重的约一半)。经校正的动物的较小尺寸可能与scAAV9的向性及不完全转导相关，产生其中一些细胞未经转导的『嵌合』动物。此外，较小尺寸表明SMN的胚胎作用。最值得注意的是，经SMN处理的小鼠良好地存活超过年龄为250天。
还研究毒理学生物分布。在非良好实验室实践(non-Good Laboratory Practice；non-GLP)研究中，通过血管递送向24只小鼠及4只非人类灵长类动物(NHP)注射scAAV9.CB.SMN。为了评估毒性及安全性，用媒剂(PBS)(3只雄性/6只雌性)或3.3×1014vg/kg的scAAV9.CB.SMN(6只雄性/9只雌性)，经由面颞静脉将scAAV9.CB.SMN注射至P1野生型弗兰德病毒(friend virus)b型(FVB)小鼠中。先前证实此剂量在SMA16的SMNΔ7小鼠模型中最有效。预期使用P1小鼠模拟婴儿中的潜在临床研究，其为首次用于人体的临床试验的计划群体。所有小鼠在注射程序后存活且最初的24小时观测期未显示任何窘迫或体重损失的迹象。量测体质量，且对于研究的其余部分，每周一次进行实际观测；未显示对照物与经处理的群组之间的任何差异(图1)。
在注射后第60、90及180天，自小鼠收集血液以用于血液学研究及临床化学评估(ALT、AST、ALK Phos、肌酐、BUN、电解质及CK)。除在90天时间点时的一个变化以外，所有均为正常的。此差异似乎归因于与抽血位点相关的技术问题，该位点与所有其他小鼠的抽血位点不同。关于组织病理学，在注射后第120天对13只小鼠且在第180天对8只小鼠进行尸检。所有器官为正常的；尤其未在任何器官(心脏、肝、肾脏、肌肉、性腺、脑、肺、淋巴结及肠)的任何切片中发现发炎。
在四只雄性食蟹猕猴(Cynomolgus Macaques)的安全性研究中，在年龄为90天时对受试者进行注射以精密模拟在I型SMA婴儿中的治疗的可能的施用年龄。以6.7×1013/kg的剂量(其对应于SMN-Δ7小鼠展示存活期的显著增加的最低测试剂量)，通过隐静脉的导管插入术在某一时间施用scAAV9.CB.SMN载体。对动物随访六个月直至其在年龄为约9个月时被处死。未发现副作用，且所有临床化学反应为正常的。在外周血液单核细胞(PBMC)中使用ELISpot测试T细胞免疫反应，且在注射后6个月时均为阴性。
在这些非GLP研究中，血清化学反应及血液学研究以及组织病理学评估为不显著的。NHP受试者对衣壳(但非转基因)产生适合的免疫反应，其中在注射后6个月持续极高的转基因表达。这些研究提供即使在用于血脑障壁渗透的高剂量下，全身性递送scAAV9.CB.SMN也为安全及良好耐受的强有力证据。Foust等人Nat.Biotechnol.[自然生物技术],28(3),第271-274页(2010)。
当在第1天以高达3.3×1014vg/kg的水平对新生FVB小鼠进行scAAV9.CB.SMN的单次静脉内注射时，在施用之后第24周的时间点未发现测试物品相关死亡或毒性证据。治疗相关的平均体重及平均体重增加的降低以及较低的活化部分凝血活酶时间(APTT)值为轻度治疗作用，但不产生毒性。
scAAV9.CB.SMN的活性由脑部及脊髓(主要目标治疗组织)中特异性转基因核糖核酸(RNA)表达的生物分布及存在证明。在以3.3×1014vg/kg给药的雄性及雌性(第3组)中，在12及24周之后发现少量的针对AAV9衣壳的抗体。在临床病理学及组织病理学分析中未观测到变化。基于这些结果，认为scAAV9.CB.SMN在新生雄性及雌性小鼠中的无可观测的不良作用水平(NOAEL)为3.3×1014vg/kg。
在这些研究中，在小鼠(至第12周)及猕猴(至注射后14个月)中针对CSF的scAAV9.CB.SMN鞘内施用为安全及良好耐受的。小鼠中的CSF递送可能降低scAAV9.CB.SMN的周边暴露且定性聚合酶链反应(qPCR)结果指示与胸部区域相比，子宫颈及腰部区域中的转基因表达较高。猴在注射时保持垂头仰卧位5分钟且在注射之前确认对抗AAV9抗体呈血清反应阴性。在注射后6个月，所有非人类灵长类动物对AAV9抗体呈高阳性。在注射后6个月未观测到针对AAV9衣壳或SMN转基因的细胞毒性T淋巴细胞反应。未观测到脑部或脊髓中的组织退化或反应性反应。
在关键良好实验室实践(GLP)顺应性3个月小鼠毒理学研究中，毒性的主要目标器官为心脏及肝。在小鼠中的IV输注之后，载体及转基因广泛分布且通常在心脏及肝中观测到最高表达，及脑部及脊髓中的大量表达。心脏的心室中的AVXS-101相关结果包含剂量相关发炎、水肿及纤维化，且在心房中，发炎及栓塞。肝结果包含肝细胞肥大、库普弗细胞活化(Kupffer cell activation)及分散性肝细胞坏死。在小鼠中的AVXS-101相关心脏及肝结果中未发现NOAEL，且最大耐受剂量定义为1.5×1014vg/kg，提供相对于建议治疗剂量1.1×1014vg/kg的约1.4倍安全性界限。此时尚未知晓小鼠中的观测结果翻译至灵长类动物的能力。
这些数据支持进行临床试验。
为测定与静脉内(IV)注射相比，CSF递送是否可降低周边器官的转导，对头向下保持垂头仰卧位5或10分钟的非人类灵长类动物(n＝5)的组织进行详细的生物分布分析。由于治疗在脊髓及脑部中的显著改良的分布而选择这些动物，而非未处于头向下体位的非人类灵长类动物，使得此方法有利于临床试验。在注射后两周，处死食蟹猕猴且收集各种组织以进行详细的脱氧核糖核酸(DNA)及RNA生物分布分析。与脑部及脊髓中的高水平相比，scAAV9.CBA.GFP在大部分周边组织(除脾及肝以外)中较少。这些结果与来自其他组的先前报导一致。Dirren等人,“Intracerebroventricular injection of adeno-associatedvirus 6 and 9 vectors for cell type specific transgene expression in thespinal cord[脑室内注射腺伴随病毒6和9载体以在脊髓中表达细胞类型特异性转基因]”Hum Gene Ther[人类基因治疗]25:109-120；Gray等人,“Global CNS gene delivery andevasion of anti-AAV-neutralizing antibodies by intrathecal AAV administrationin non-human primates[通过鞘内注射AAV在非人类灵长类动物中进行全球CNS基因递送和抗AAV中和抗体的规避]”Gene Ther[基因治疗]20:450-459。在骨骼肌及CNS中，DNA与RNA水平之间存在强相关性，而在软组织及腺体中，RNA水平通常低于所检测的病毒基因组的预期值。具体地，睪丸、肠及脾中的RNA分子比DNA少1,000倍。尽管在周边器官中检测到AAV，但与全身性注射相比，在周边检测到的载体的量显著降低。Dirren等人；Gray等人。此外，当在P1治疗后第24周比较经静脉内或脑室内注射的小鼠时，获得类似的观测结果。因此，CSF递送使得用AVXS-101进行的未来临床试验增加显著潜在安全性组分。
在一些实施例中，垂头仰卧位改良CSF递送。在经由单次注射直接递送至CSF的SMA小鼠及非人类灵长类动物中评估scAAV9-SMN的给药及功效。当使用比静脉内(IV)施用低10倍的剂量时，在小鼠及非人类灵长类动物的全部脊髓中观测到广泛分布的转基因表达。在非人类灵长类动物中，对于类似的运动神经元靶向效率，可使用低于小鼠中的剂量的剂量。当受试者保持垂头仰卧位以促进载体扩散时，发现转导功效进一步改良。Meyer等人,“Improving single injection CSF delivery of AAV9-mediated gene therapy forSMA:a dose-response study in mice and nonhuman primates[改善AAV9介导的SMA基因疗法的单次注射CSF递送：在小鼠和非人类灵长类动物中的剂量反应研究]”Moleculartherapy:the journal of the American Society of Gene Therapy[分子疗法：美国基因疗法学会杂志]23,477-487。使动物倾斜可显著改良脊髓的胸部及子宫颈区域中的转导，如通过GFP/ChAT双重阳性运动神经元的免疫荧光及定量证明。倾斜10分钟足以分别使子宫颈、胸部及腰部区域中的运动神经元转导增加55、62及80％，根据在小鼠模型中观测的救援，其意味着患者的重要益处。运动神经元计数与各脊髓区段中的GFP转录物定量紧密相关。
实例1-临床试验方案
对具有满足以下条件的婴儿及儿童进行1期、开放标记、单次剂量施用临床试验：符合SMA的遗传诊断、SMN1的双等位基因缺失及3个SMN2的拷贝(无遗传修饰因子)，在进入研究时能够坐立但不能站立或行走。如下文所描述，患者在剂量比较安全性研究中接受多达三(3)种潜在治疗剂量的AVXS-101。将患者分为两组，在给药时年龄≥6个月且<24个月及在给药时年龄≥24个月且<60个月。登记至少十五(15)名≥6个月且<24个月的患者且登记十二(12)名≥24且<60个月的患者。
第一组登记三(3)名年龄≥6个月且<24个月的患者(群组1)，其接受6.0×1013vg的AVXS-101的施用(剂量A)。群组内每位患者的给药之间存在至少四(4)周间隔。在继续登记之前，研究者向资料安全监测委员会(Data Safety Monitoring Board；DSMB)汇报在48小时内可能、很可能或明确与研究试剂相关的所有第III级或更高级别的AE。在登记前三名患者之后且基于可用的安全性数据，做出以下决策：a)是否因毒性而停止，或b)是否使用剂量B继续进行群组2。
对于剂量B，登记三(3)名年龄<60个月的患者接受1.2×1014vg的AVXS-101的施用(剂量B)。又，群组内三名患者的给药之间存在至少4周间隔。基于来自三名群组2患者及所有群组1患者的可用的安全性数据，可能无需患者给药之间的额外4周间隔。在继续登记之前，研究者向DSMB汇报在48小时内可能、很可能或明确与研究试剂相关的所有第III级或更高级别的AE。在登记前六(6)名患者之后且基于可用的安全性数据，做出以下决策：a)是否因毒性而停止，或b)是否继续登记其他21名患者直至十二(12)名≥6个月且<24个月的患者及十二(12)名≥24个月且<60个月的患者接受剂量B。
基于正在进行中的安全性评估及来自用1.2×1014vg剂量治疗的患者的功效资料，考虑第三剂量(剂量C)的测试。三(3)名年龄<60个月的患者接受剂量C，将鞘内施用高达2.4×1014vg。与群组1及2相同，前三名接受剂量C的患者的给药之间再次存在四周间隔。在登记前三(3)名剂量C患者之后且基于可用的安全性数据，做出以下决策：a)是否因毒性而停止，或b)是否继续登记其他21名患者直至总共十二(12)名>6个月且<24个月的患者及十二(12)名≥24个月且<60个月的患者接受剂量C。
可由来自接受剂量B(1.2×1014vg)的患者的临床结果的正在进行中的安全性及功效评述来支持用于测试剂量C的适合的剂量及调整方式的选择。所选择的剂量高达鞘内递送2.4×1014vg。已向体重达到8.4kg的儿童安全地全身性(静脉内)施用高达1.1×1014vg/kg的剂量(总剂量9.24×1014vg)。此外，在临床前研究中，在大型非人类灵长类动物中，在2×1013vg/kg的剂量下，scAAV9.CB.SMN的鞘内施用直至注射后14个月也为安全及良好耐受的。
整体研究设计概述于图2中。
经由监测不良事件(AE)报导及伴随药物用量以及通过进行体检、生命征象评估、心脏血管评估及实验室评估来评估安全性。患者在鞘内注射后48小时内留在医院接受观测。患者在第7、14、21及30天返回以进行随访。在第30天随访之后，患者接着每月返回一次直至剂量施用后第12个月。在研究完成后，要求研究患者参与重要的长期后续研究，其检验AVXS-101的持续安全性长达15年。
患者数目
至少27名患者参与；若确定需要递增至剂量C，则多达51名患者可能参与。
治疗指定
此为开放标记、比较性单次剂量研究。根据本文中指定的剂量递增计划表指定治疗。
剂量调节准则
研究调查AVXS-101的单次鞘内注射。
研究终止准则
独立的资料安全监测委员会(DSMB)及医学监测器在整个试验期间持续监测安全性资料。DSMB可出于安全性原因而建议提前终止试验。若任何患者经历第III级或更高级别，则由研究者停止研究参与。非预期性及可能、很可能或明确与研究产物相关的AE毒性与临床症状一起呈现且需要医学治疗。此包括任何与研究试剂的施用相关的患者死亡、重要临床实验室结果或注射区域中任何严重的局部并发症。
若DSMB出于安全性原因建议提前终止研究，则可终止试验。也可由监管机构的建议而终止试验。最后，若患者发展不可接受的毒性水平，则也可终止试验，定义为出现任何非预期性CTCAE第3级或更高级别的AE/毒性，其可能、很可能或明确与基因替代疗法相关，且与临床症状相关联和/或需要医学治疗。
患者纳入准则
患者满足所有以下纳入准则：
1.在通过基因型进行的筛检期期间的诊断确认之后，给药时的患者年龄≥6个月且年龄为至多60个月(1800天)，患者显示在无需帮助的情况下坐立10秒或更长时间的能力，但不能站立或行走
-通过基因型进行的诊断确认包括SMN1外显子7的同型接合子不存在的实验室数据；具有确切的三个SMN2的拷贝。
2.SMN2基因修饰因子突变(c.859G>C)的阴性基因测试。
3.在年龄<12个月时临床症状发作且症状符合SMA。
4.能够独立坐立且不能独立站立或行走。独立坐立的定义由世界卫生组织(WorldHealth Organization；WHO)-MGRS准则，即能够在无支撑的情况下，在头部直立情况下坐立至少10秒定义。儿童不应使用手臂或手部保持身体平衡或支撑体位(Wijnhoven 2004)。
5.满足使用麻醉及镇静(如由研究者决定必需)的适龄制度准则。
6.使用最新的儿童疫苗。根据美国儿科学会(American Academy of Pediatrics)(AAP 2009)，还建议包括用于预防呼吸道融合病毒(RSV)感染的帕利珠单抗预防(也称为Synagis)的季节性疫苗接种。
7.父母/法定监护人愿意且能够完成知情同意书过程。
患者排除准则
患者必须不符合以下排除准则中的任一者：
1.当前或历史上具有独立站立或行走的能力。
2.禁忌脊椎穿刺程序或鞘内疗法的施用(例如脊柱裂、脑膜炎、缺陷或凝血异常，或阻止有效进入CSF空间的阻塞性脊椎硬件)或存在植入的用于CSF的引流的分流器或植入的CNS导管。
3.严重挛缩，如由指定理疗师在筛检时测定，其干扰达到/显示功能性量度(例如站立、行走)的能力或干扰接受IT给药10的能力。在X射线检验时显而易见的严重脊柱侧弯(定义为脊椎≥50°弯曲)。
4.在剂量施用的1年内具有预先、计划或预期的脊柱侧弯修复手术/程序。
5.使用侵入性通气支持(在正压下的气管切开术)或在患者苏醒时，在筛检时脉搏血氧测定法<95％饱和度，或对于高海拔>1000m，在患者苏醒时氧饱和度<92％
-在筛检与给药当天的最高值之间，脉搏血氧饱和度必须不降低≥四(4)个百分点。
6.在给药之前两周，每天使用或需要侵入性通气支持达12小时或更长时间。
7.对胃饲管具有医学必要性，其中大部分喂食通过非口服方法(即，鼻胃管或鼻空肠管)进行，或基于世界卫生组织儿童生长标准(WHO Child Growth Standards)(Onis2006)，患者的年龄别体重(weight-for-age)降低百分之3。在筛检之前进行永久性胃造口术不为排除标准。
8.活性病毒感染(包括HIV或对B型或C型肝炎呈血清学阳性，或寨卡病毒)。
9.在进入研究之前的两(2)周内需要全身性治疗和/或住院的严重非呼吸道疾病。
10.在进入研究之前的四(4)周内需要医疗照顾、医学介入或任何方式的支持性护理增加的呼吸道感染。
11.在研究给药之前的四(4)周内严重非肺/呼吸道感染(例如肾盂肾炎，或脑膜炎)，或在PI观点看来，产生不必要的基因转移风险的伴随疾病，诸如：
-重度肾或肝损伤
-已知的癫痫发作
-糖尿病
-特发性低钙尿症
-症状性心肌病
12.细菌性脑膜炎或脑部或脊髓疾病(包括肿瘤)的病史，或通过MRI或CT发现的将干扰LP程序或CSF循环的异常。
13.已知的对泼尼松龙或其他糖皮质类固醇或其赋形剂的过敏性或过敏反应。
14.已知的对碘或含碘产品的过敏性或过敏反应。
15.伴随使用以下中的任一者：用于治疗肌病或神经病的药物、用于治疗糖尿病的药剂，或正在进行中的免疫抑制性疗法、血浆清除术、免疫调节剂(诸如阿达木单抗)，或在研究给药的3个月内的免疫抑制性疗法(例如皮质类固醇、环孢素(cyclosporine)、他克莫司(tacrolimus)、甲胺喋呤、环磷酰胺、静脉内免疫球蛋白、利妥昔单抗)。
16.在剂量施用之前24小时无法停止使用轻泻剂或利尿剂。
17.抗AAV9抗体效价>1:50，如通过ELISA结合免疫分析法所测定
-若潜在患者显示抗AAV9抗体效价>1:50，则其可在筛检期的30天内接受重新测试且若在重新测试时抗AAV9抗体效价≤1:50，则将符合条件。
18.在研究给药之前认为异常实验室值为临床显著(INR>1.4)、GGT>3X ULN、胆红素≥3.0mg/dL、肌酐≥1.0mg/dL、Hgb<8或>18g/Dl；WBC>20,000/cmm。
19.在此研究的筛检之前的任何时间，参与当前SMA治疗临床试验或接受研究性或经批准的化合物产品或接受意图治疗SMA的疗法(例如丙戊酸、诺西那生)
-必须在给药之前30天停止口服β促效剂
-在此研究的筛检之前的任何时间，出于呼吸道(支气管扩张剂)管理的目的而特定指定的吸入型沙丁胺醇(albuterol)为可接受的且不为禁忌。
20.在1年研究评估期期间预期进行重大手术程序(例如脊椎手术或气管切开术)。
21.无法或不愿意遵守研究程序或无法旅行以进行重复随访。
22.不愿意对研究结果/观测结果保密或不愿意避免在社交媒体网站上发布机密研究结果/观测结果。
23.拒绝签署同意书。
患者退出准则及中止
若患者发展不可接受的毒性水平，则其还可中止研究，定义为出现任何非预期性CTCAE第3级或更高级别的AE/毒性，其可能、很可能或明确与基因替代疗法相关，且与临床症状相关联和/或需要医学治疗。若患者死亡，则其退出，在此情况下，除未经治疗的患者以外，必须对参与基因转移研究之后死亡的任何患者进行尸检。除非由于住院，否则若患者未能遵守方案要求的随访或研究程序(3个或更多个未重新要求的连续随访)，则其也可退出。父母或法定监护人撤回同意书的患者也退出研究。最终，可由研究者决定患者退出。对于出于任何原因而提前中断研究的任何患者，提前终止程序应在14天内完成。
研究产品的说明
生物产品为在巨细胞病毒(CMV)增强子/鸡-β-肌动蛋白-杂交启动子(CB)的控制下的非复制、重组、自互补腺相关病毒血清型9(AAV9)，其含有人类SMN基因的cDNA。AAV反向末端重复(ITR)已经修饰以促进转基因的分子内黏接，由此形成准备进行转录的双链转基因。已证实此经修饰的ITR，称为“自互补”(sc)ITR可显著提高转基因的转录速度及所产生的所得蛋白质。经AVXS-101(scAAV9.CB.hSMN)转导的细胞表达人类SMN蛋白质。
表3：研究产品
Figure BDA0003087277400000881
先前及伴随药物
自研究给药之前两周开始，以电子病例报表(eCRF)形式记录先前及伴随药物直至研究随访结束。
泼尼松龙的预防性施用
在正在进行中的经由静脉内灌注进行的研究AVXS-101治疗的1期临床研究中观测针对AAV载体的抗原特异性T细胞反应。此为基因转移后2-4周之间的预期反应。此类抗原特异性T细胞反应的一种可能结果为清除经转导的细胞及转基因表达损失。
为了尝试减弱针对基于AAV的疗法的宿主免疫反应，患者在AVXS-101给药之前24小时接受预防性泼尼松龙(糖皮质激素)(约1mg/kg/天)。治疗根据以下治疗指南持续约30天：
·至少直至灌注后第30天：1mg/kg/天
·第5周及第6周：0.5mg/kg/天
·第7周及第8周：0.25mg/kg/天
·第9周：停止泼尼松龙
在30天治疗之后若天冬胺酸转胺酶(AST)或丙胺酸转胺酶(ALT)值>正常值上限(ULN)的2倍，或若T细胞反应≥100SFC/106PBMC，则保持泼尼松龙的剂量直至AST及ALT值降低至低于临界值。若T细胞反应持续超过第60天，则应由研究者判断考虑保持泼尼松龙的风险益处。由研究者基于每名患者的潜在安全性问题决定这些建议的变化。
禁止药物
禁止伴随使用任何以下药物：
·用于治疗肌病或神经病的药物
·用于治疗糖尿病的药剂
·接受意图治疗SMA的疗法(例如丙戊酸、诺西那生)。
-在基因疗法给药之前，必须停止口服β-促效剂至少30天。
-可以使用吸入型β促效剂治疗SMA的呼吸道并发症，限制条件为此类药物以临床上适合的量给药
·正在进行中的免疫抑制性疗法、血浆清除术、免疫调节剂(诸如阿达木单抗)，或在试验开始3个月内的免疫抑制性疗法(例如皮质类固醇、环孢素、他克莫司、甲胺喋呤、环磷酰胺、静脉内免疫球蛋白、利妥昔单抗)
作为常规临床管理的一部分，由主治医师决定允许在泼尼松龙逐渐减少完成之后使用皮质类固醇。在此类情形中使用的泼尼松应适当地记录为伴随药物，且引起其使用的事件应适当地记录为AE。
皮质类固醇的使用(除用于支气管痉挛的吸入型皮质类固醇以外)应视为在泼尼松龙逐渐减少过程期间护理的一部分，此医学管理应与赞助商医学监测员一起讨论，其负责与逐渐减少相关的任何所指示的药物调节。
治疗顺应性
AVXS-101以单次鞘内注射形式施用。
随机化及盲式处理
此为开放标记研究。
研究产品剂量及剂量调整
患者经由鞘内注射接受单次剂量的AVXS-101(6.0×1013vg、1.2×1014vg)，或高达2.4×1014vg的第三剂量(若确定需要)。经由鞘内注射直接递送至CSF中可使病毒载体的量降低约十分的一，同时在整个CNS中具有均等分布及功效，降低病毒载体负荷且进一步优化。由正在进行中的临床结果的安全性及功效评述进一步支持用于研究所有剂量递增的适合的剂量的选择及调整，这些临床结果来自接受如所描述的先前剂量的患者。所选择的最高剂量高达鞘内递送2.4×1014vg。已向体重达到8.4kg的儿童安全地全身性(静脉内)施用高达1.1×1014vg/kg的剂量(总剂量9.24×1014vg)。此外，在临床前研究中，在大型非人类灵长类动物中，在2×1013vg/kg的剂量下，scAAV9.CB.SMN的鞘内施用直至注射后14个月也为安全及良好耐受的。
研究产品制备
由药剂师在无菌条件下以无菌方式进行AVXS-101的制备。
预先混合AVXS-101与适合的对比剂，该对比剂经批准及标记用于儿科用途，用于经由腰部鞘内注射进行的注射的放射性监测。AVXS-101+对比剂的总体积不超过8mL。
将剂量递送容器递送至指定儿科加护病房(PICU)患者室或其他能够立即进行急性重症监护管理的适合的环境(例如介入套件、操作室、专用程序室)。
患者在PICU患者室或其他能够立即进行急性重症监护管理的适合的环境(例如介入套件、操作室、专用程序室)中，在无菌条件下接受AVXS-101鞘内注射。接纳患者，且每15(+/-5)分钟一次监测生命体征保持四小时且在AVXS-101给药程序之后每小时(+/-15分钟)一次保持24小时。
向站点发送指令以使用以斜边平行于硬脑膜纤维方式插入的非创伤性针；已证实此可显著减少对硬脑膜的损伤且因此降低在腰椎穿刺之后的脑脊髓液泄漏风险(包括在儿童中)。Ebinger等人,“Headache and backache after lumbar puncture in childrenand adolescents:a prospective study[儿童和青少年腰椎穿刺后的头痛和背痛：一项前瞻性研究]”Pediatrics[儿科学],113:1588-1592；Kiechl-Kohlendorfer等人,“Cerebrospinal fluid leakage after lumbar puncture in neonates:incidence andsonographic appearance[新生儿腰穿后脑脊液漏：发生率和超声检查表现]”Am JRoentgenol[美国放射学杂志],181:231-234。
所有接受AVXS-101的患者需要镇静/麻醉。由当地麻醉师决定方法及药物，但应并入足量的镇静剂或镇静剂以确保止痛且在程序中及程序后保持垂头仰卧位而不移动。在施用载体之后，使患者处于垂头仰卧位，头向下倾斜30°保持15分钟，以增强子宫颈及脑部区域的分布。
由研究者或介入放射学家或其他经适当培训且有经验的医师在无菌条件下，通过荧光镜/放射性引导根据机构指南施用AVXS-101。使患者处于侧偃卧位且通过腰椎穿刺将具有探针的导管插入L3-L4或L4-L5棘突间隙空间，进入蛛膜下空间。通过来自导管的透明脑脊髓液(CSF)的流动确认蛛膜下套管插入。移除约四(4)mL CSF以用于剂量A及剂量B，移除与所注射的AVXS-101加对比剂的体积(高达七(7)mL)极近似的体积的CSF以用于剂量C且根据机构指南进行处理。将含AVXS-101的预先混合的对比剂溶液直接注射至蛛膜下空间中。允许根据机构标准/指南用0.5mL生理食盐水冲洗注射针。
施用后程序
在AVXS-101施用后，使患者返回指定的PICU床或其他适合的环境，同时密切监测生命体征。在给药程序后，还监测及记录伴随药物及所有AE/严重AE。
患者在PICU患者室或其他能够立即进行急性重症监护管理的适合的环境(例如介入套件、操作室、专用程序室)中留置48小时以更密切地监测精神状态。在患者留置期间，人员应根据关于感染控制的机构标准遵循适合的安全性防护措施；标准应对个人保护性仪器(PPE)具有要求，该仪器诸如手术服、手套、面罩、玻璃及闭趾鞋。向患者的家庭提供关于精神状态变化的监测的标准化、经IRB批准的报导，其包括监测发热、应激性、颈痛、光敏感性及呕吐。当符合以下准则时，患者可出院：
·无发热
·不存在过敏反应
·不存在假性脑膜炎
·不存在暗示可能的CNS感染或并发症的异常实验室值
剂量递增
群组1内的所有患者之间存在4周给药间隔，以实现在下一位患者的给药之前，来自六个时间点(第1、2、7、14、21、30天)的安全性分析的评述。
在继续登记之前，研究者向DSMB汇报在48小时认知内可能、很可能或明确与研究试剂相关的所有第III级或更高级别的AE。在登记在给药时年龄≥6个月且<24个月之前三(3)名患者之后且基于可用的安全性数据，做出以下决策：a)是否因毒性而停止，或b)使用剂量B继续进行群组2。
对于剂量B，在群组内给药时，年龄<60个月之前三(3)名患者的给药之间的存在至少4周间隔。基于来自前三(3)名群组2患者及所有群组1患者的可用的安全性数据，可能无需患者给药之间的额外4周间隔。在继续登记之前，研究者向DSMB汇报在48小时内可能、很可能或明确与研究试剂相关的所有第III级或更高级别的AE。在登记前六(6)名患者之后且基于可用的安全性数据，做出以下决策：a)是否因毒性而停止，或b)是否继续登记其他21名患者直至十二(12)名在给药时年龄≥6个月且<24个月的患者及十二(12)名在给药时年龄>24个月且<60个月的患者接受剂量B。
基于正在进行中的安全性评估及来自用1.2×1014vg剂量治疗的患者的功效资料，可考虑第三剂量(剂量C)的测试。三(3)名年龄<60个月的患者接受剂量C，将鞘内施用高达2.4×1014vg。前三名接受剂量C的患者的给药之间将再次存在四周间隔，与群组1及2相同。在登记前三(3)名剂量C患者之后且基于可用的安全性数据，做出以下决策：a)是否因安全性问题而停止施用剂量C，或b)是否继续登记其他21名患者直至总共十二(12)名≥6个月且<24个月的患者及十二(12)名≥24个月且<60个月的患者接受剂量C。
物理疗法评估：哈默史密斯功能性运动扩展量表
设计哈默史密斯功能性运动扩展量表以用于患有2型及3型脊髓性肌萎缩的儿童，以得到关于运动能力及临床进程的客观信息。
对于所有年龄≥24个月的患者，由理疗师根据表4在30天给药内且每月一次施用哈默史密斯功能性运动扩展量表保持十二(12)个月。在给药时年龄<24个月的患者在年龄达到24个月时开始进行哈默史密斯功能性运动扩展量表评估。对哈默史密斯功能性运动扩展量表评估过程进行录像。
物理疗法评估：Bayley Scales of Infant and Toddler
Figure BDA0003087277400000931
Bayley Scales of Infant and Toddler
Figure BDA0003087277400000932
第三版为标准化、标准参考婴儿评估。在基线处，在给药之前30天内完成粗大及精细运动子测试且接着每月一次直至第12个月。对Bayley
Figure BDA0003087277400000933
评估进行录像。
物理疗法评估：运动重要事件发育调查
由理疗师使用表2中展示的标准运动重要事件发育调查评估显著运动重要事件的达成，其中每项重要事件的定义由Bayley
Figure BDA0003087277400000934
促成(参见物理疗法手册(PhysicalTherapy Manual))。理疗师根据表4记录患者是否实现运动重要事件发育调查中的各项重要事件。一旦观测到，即认为实现运动重要事件。由观测到重要事件的随访日期来决定每项运动重要事件的实现日期。在筛检随访期间，理疗师根据表4完成基线重要事件实现的评估；用视讯记录此评估且记载结果。因为Bayley
Figure BDA0003087277400000935
未必需要儿童重复先前实现的重要事件，因此可用视讯捕捉各项重要事件。记载发育重要事件评估过程。
表4：评估计划表
Figure BDA0003087277400000941
Figure BDA0003087277400000951
视讯证据
对每次研究随访时的物理疗法评估进行录像以产生有力、明显、有记载的功效证据，如通过功能性能力的变化所测定。父母/法定监护人还可与研究点共享证明达成功能性能力的家庭视讯。
将视讯提供至独立、集中的审查员以进行无偏见的重要事件实现评估。独立审查员使用运动重要事件发育调查进行调查以记载视讯是否显示实现每项运动重要事件的证据。运动重要事件实现日期计算为证明实现重要事件的最早视讯日期。
其他临床评估：人口统计资料/病史
在基线处收集患者人口统计数据及病史信息且捕捉于病例报表(CRF)中。遍及整个研究，在每次随访时收集病史。病史信息包括(但不限于)：脊髓性肌萎缩的家族病史(包括受影响的兄弟姐妹或父母载体)、出生时的胎龄、出生时的身长/身高/头围、出生时的住院信息(包括住院次数、持续时间及原因，包括ICD-10编码(若可获得))、历史通气支持(若存在)及历史进食支持(若存在)。
其他临床评估：生命体征
生命体征包括30天给药内及在表4中指定的时间点时的血压、呼吸速率、脉搏及腋温。在注射期间由小组成员持续监测及记录生命体征，包括脉搏血氧饱和度及心跳速率。在第2次随访时，每15分钟(+/-5分钟)一次监测及记录生命体征保持四小时且在AVXS-101给药程序之后每一小时(+/-15分钟)一次保持24小时，这些生命体征包括血压、呼吸速率、脉搏、腋温、脉搏血氧饱和度及心跳速率。
其他临床评估：体重及身长/身高
视需要根据表4中指定的时间点量测体重以及身长和/或身高。
其他临床评估：体检
体检包括以下系统的评述：头、眼、耳、鼻及咽喉(HEENT)、肺/胸腔、心脏血管、腹部、肌肉骨胳、神经、皮肤、淋巴及泌尿生殖。在每次体检时量测头围。为量测头围，审查员将可挠性量测带牢固得包裹在头部外围，在前额的最宽部分上高于眉毛、高于耳朵且在枕骨的最突出部分上。应进行3次量测，且应以0.1cm的准确度记录最大量测值。在30天给药内且根据表4中指定的时间点完成基线体检。
其他临床评估：疫苗接种建议
鼓励患者遵循如由疾病控制中心(Center for Disease Control；CDC)建议的所有常规计划免疫。根据美国儿科学会(American Academy of Pediatrics)(AAP 2009)，还建议包括用于预防呼吸道融合病毒(RSV)感染的帕利珠单抗预防(也称为Synagis)的季节性疫苗接种。
其他临床评估：12导联心电图(ECG)
在筛检/基线、第1天、第2天、第3天、第3个月、第6个月、第9个月及第12个月(或提前终止)时进行12导联ECG。由心脏病专家收集ECG图或ECG机器资料以用于集中评述。在基因递送当天以及在基因递送后第2天及第3天进行12导联ECG(与动态心电图同时进行)。由研究者根据当地机构指南决定其他电生理学监测。
其他临床评估：12导联动态心电图
在第-1天，在剂量施用之前24小时，患者进行12导联连续动态心电图。动态心电图保持48小时(第3天)。在以下时间点一式三份地自动态心电图获取连续ECG数据：给药前、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时、24小时、36小时及48小时。在筛检及第1、2、3、6、9及12个月随访(或提前终止)时进行二十四小时动态心电图。
其他临床评估：心脏超音波检查
在筛检/基线以及第3个月、第6个月、第9个月及第12个月随访(或提前终止)时进行心脏超音波检查。
其他临床评估：脊椎X射线
在筛检/基线时进行脊椎X射线以排除具有严重脊柱侧弯或在1年研究评估期期间将需要重大脊椎手术程序的患者。
其他临床评估：肺部检验
由肺科专家在表4中指定的时间点评估患者且可由肺科专家和/或研究者决定配备非侵入性正压呼吸器(例如BiPAP)。要求需要非侵入性通气支持的患者在每次研究随访时携带机器，使得研究工作人员可取出记录实际使用数据的SD卡。将此使用数据转移至临床数据库。在错过研究随访的情况下，要求需要非侵入性通气支持的患者取出SD卡且运送至研究点。
AVXS-101注射的荧光镜/放射性引导
由介入放射学家或其他经适当培训且有经验的医师根据机构指南，在荧光分析术下，在无菌条件下进行AVXS-101鞘内注射程序。此程序可能无需捕捉放射影像。
其他临床评估：注射位点的照片
在表4中指定的时间点时获取注射位点的照片至第30天，以监测注射伤口的恢复
其他临床评估：实验室评估
遍及整个试验，在表4中指定的时间点时收集生物样品。收集生物样品且运送至中央实验室。在给药之前，收集给药之前一天(第-1天)用于实验室测试的样品且由研究点的经临床实验室改善修正案(Clinical Laboratory Improvement Amendment；CLIA)认证的当地实验室进行在当地进行处理。在一些情况下，出于直接结果或其他安全性或物流问题，可在当地收集样品。
表5：总血量
Figure BDA0003087277400000981
在无法自患者收集足够的血液的情况下，按以下优先级使用血液，其中第一项最大优先权且最后一项具有最小优先权：
1.安全性血液实验室：化学>血液学>凝血>CK-MB或肌钙蛋白
2.用于检测T细胞反应的IFN-γELISpots
3.针对AAV9及SMN的血清抗体
4.遗传学重新确认测试
若在筛检随访时不具有足以包括遗传学重新确认测试样品的血量，则患者在第2次随访之前返回。所有患者完成遗传学重新确认测试。
其他临床评估：血液学
血液学分析包括用涂片进行的具有差异及血小板计数的CBC。根据由中央实验室提供的实验室手册收集及运送样品。根据当地实验室的研究点标准程序，在住院给药期间进行即刻/同一天血液学分析，如由研究者决定。
其他临床评估：血清化学
根据由中央实验室提供的实验室手册收集及运送样品。
根据当地实验室的研究点标准程序，在住院给药期间进行即刻/同一天化学分析，如由研究者决定。
化学分析在所有研究随访时包括以下：血清γ谷氨酰转移酶(GGT)、AST/ALT、血清总胆红素、直接胆红素、白蛋白、葡萄糖、总肌酸激酶、肌酐、BUN、电解质、碱性磷酸酶。
在筛检、第7天、第30天、第60天以及第6、9及12个月/研究结束时收集CK-MB或肌钙蛋白I。在修正案5(第6.0版方案)起效之后筛检及登记的新患者中量测肌钙蛋白I代替CK-MB。在修正案5(第6.0版方案)起效时已经筛检及登记，但尚未接受基因代替疗法(第2次随访)的参与者在用AVXS-101治疗之前进行基线肌钙蛋白I测试，且进行肌钙蛋白I测试代替CK-MB。自所有其他参与者收集CK-MB。研究者自中央实验室接收来自所有研究随访的实验室结果(除第-1天以外)。
其他临床评估：病毒血清学
AAV载体的施用具有引起免疫介导性肝炎的风险。对于具有HIV或对B型或C型肝炎或寨卡病毒呈阳性血清学的患者，AAV载体的施用可能表示不合理的风险；因此，在治疗之前，在筛检时确认阴性血清学测试。根据由中央实验室提供的实验室手册收集及运送这些样品。
其他临床评估：凝血研究
凝血研究包括凝血酶原时间(PT)、部分凝血酶原时间(PTT)及国际标准化比值(INR)，根据由中央实验室提供的实验室手册收集。根据表4中指定的时间点进行凝血研究。
其他临床评估：尿分析
根据表4中指定的时间点，根据由中央实验室提供的实验室手册收集尿液样品。根据当地实验室的研究点标准程序，在住院给药期间进行第-1天及即刻/同一天尿分析，如由研究者决定。尿分析包括以下参数：颜色、透明度/浑浊度、pH值、比重、葡萄糖、酮、亚硝酸盐、白细胞酯酶、胆红素、血液、蛋白质、红血球、白血球、鳞状上皮细胞、管型、晶体、细菌、酵母。
其他临床评估：毛细血管血气
根据表4中指定的时间点完成毛细血管血气。在高血管化区域(脚跟、手指、脚趾)处，用刺血针或类似装置在患者皮肤的皮肤层中形成穿孔或小型切口。为了加速血液流动及降低动脉与静脉气压之间的差异，在穿孔之前使该区域升温。随着血液自穿孔位点自由流动，在毛细管中收集样品。
其他临床评估：ELISA：抗AAV9 Ab
根据实验室手册(用于在筛检时测试针对AAV9的血清抗体)且根据表4中指定的时间点收集血液样品且运送至中央实验室。
其他临床评估：ELISA：抗SMN Ab
根据表4中指定的时间点，根据实验室手册(用于测试针对SMN的血清抗体)收集血液样品且运送至中央实验室。
其他临床评估：IFN-γELISpots
根据表4中指定的时间点，根据实验室手册(用于进行干扰素γ(IFN-γ)ELISpots以检测对AAV9及SMN的T细胞反应)收集血液且运送至中央实验室。
其他临床评估：母体的基线筛检
存在所登记的患者的母体可能具有预先存在的针对AAV9的抗体的可能性，这些抗体可能经由子宫内胎盘转移或理论上经由母乳转移至患者。要求患者的母亲签署知情同意书以关于针对AAV9的循环抗体筛检母体。在获得知情同意书之后，自外周静脉抽取母体的血液且运送至中央实验室以用于筛检抗AAV9抗体。若发现AAV9抗体，则研究者应与母亲商讨是否继续或停止哺乳。无法进行抗AAV9抗体测试的食用来自供体来源的备用母乳的患者在参与之前过渡至配方奶粉。
其他临床评估：用于诊断确认测试的血液
根据实验室手册在筛检随访期间收集血液样品且运送至中央实验室，以用于SMN1缺失、SMN2拷贝数及不存在外显子7基因修饰因子突变(c.859G>C)的重新确认。进行此步骤以确保诊断测试操作的一致性。
其他临床评估：唾液、尿液及粪便收集
研究表明一些载体可在注射之后持续若干周自身体分泌出；此称为“病毒排出”。载体排出可在注射之后持续一周见于血液、尿液、唾液及粪便中。此时尚未知与排出载体相关联的风险；然而，不太可能存在风险，因为载体为非感染性且无法复制。无论如何，向患者家庭及护理者提供经IRB批准的关于以下的说明：若/当与患者体液和/或废料直接接触时，则使用防护性手套，以及在注射之后最少两周内保持良好手部卫生。此外，在载体注射之后两年内禁止患者献血。
根据表4(包括给药后24及48小时)，根据实验室手册收集唾液、尿液及粪便样品以用于病毒排出研究。对于至少一次排泄及一次排便，所有研究点的≥48个月的不再使用尿布的患者在第7天、第14天及第30天提供全部体积尿液及全部体积粪便样品。根据实验室手册制备样品，储存于-80℃冷冻器中，且根据实验室手册运送至中央实验室。选择参与病毒排出子研究的在研究点的患者子集收集24小时总体积尿液及粪便样品至给药后24小时及给药后48小时(以包括这些时段中的所有排泄物)。
实例2-SMA患者中的AVXS-101研究(临床试验中间结果I)
根据实例1中所描述的方案鉴别、治疗及评估患者。向脊髓性肌萎缩(SMA)患者鞘内施用AVXS-101，这些患者在进入研究时能够坐立，但不能站立或行走。除SMN1的双等位基因缺失以外，患者具有3个SMN2基因的拷贝。将患者分为两组，在给药时年龄>6个月且<24个月及在给药时年龄≥24个月且<60个月。登记十六名>6个月且<24个月的患者及十二名≥24且<60个月的患者。在较年幼组中，三名患者接受6.0×1013vg的AVXS-101的施用(剂量A)。其余较年幼患者及所有较年长患者接受1.2×1014vg的AVXS-101(剂量B)。
患者经由腰部鞘内(IT)注射，以单次施用形式接受预先与用于放射性监测的1.5mL适合的对比剂混合的AVXS-101。患者在治疗之后之前两个月接受预防性泼尼松龙以减弱宿主免疫反应。在治疗之后12个月时段内周期性评估安全性及功效。对于在给药时年龄>6个月且<24个月的患者，功效量度为获得独立站立能力的患者的比例(Bayley Scalesof Infant and Toddler
Figure BDA0003087277400001021
-粗大运动子集第40号)。评估其他重要事件，由世界卫生组织多中心生长参考研究(WHO-MGRS)规则(Wijnhoven 2004)定义，包括自背面滚动至侧面、爬行、在具有支撑的情况下站立、拉着站起来及在存在或不存在帮助的情况下行走。对于在给药时年龄≥24个月且<60个月的患者，量测结果为哈默史密斯功能性运动扩展量表(HFMSE)中自基线的变化。每月评估反应者(定义为实现HFMSE分数>3分；Swoboda等人,2010)的百分比。
在接受剂量A(6.0×1013vg；n＝3)或剂量B(1.2×1014vg；n＝13)鞘内AVXS-101之后的五至12个月评估年龄在6与24个月之间的2型SMA患者。如表6中所示，
Figure BDA0003087277400001022
粗大运动量表分数的变化在-1与14分之间的范围内(平均增量+SD为3.6+3.5pts)，其中16名患者中的14名(87.5％)展示自基线的改良。16名患者中的七名在治疗之后实现至少一个新的
Figure BDA0003087277400001023
项目。两名患者(每个剂量组中一名)实现独立站立的研究终点(E02、E24)；一名患者(E24)实现在年龄为20个月之前站立且现在可独立走动。
表6：年龄为6个月-24个月的2型SMA患者中，所选择的Bayley Scales of Infantand Toddler Development-粗大运动量表的项目。
Figure BDA0003087277400001031
(X)表示在治疗之前独立进行项目的能力；(O)表示在治疗之后新的独立进行项目的能力。
在接受剂量B(1.2×1014vg；n＝12)鞘内AVXS-101之后的五至九个月评估年龄在两岁与五岁之间的2型SMA患者。如表7中所示，
Figure BDA0003087277400001032
粗大运动量表分数的变化在-8与10分之间的范围内(平均增量+SD为2.1+1.3pts)，其中12名患者中的九名(75％)展示自基线的改良。12名患者中的五名(42％)在治疗之后实现至少一个新的
Figure BDA0003087277400001033
项目。两名患者(E07；E13)在治疗之后显示在具有支撑的情况下站立的能力。一名患者(E07)现在能够在具有帮助的情况下行走。
Figure BDA0003087277400001041
对在达到两岁之后的患者(6至24个月年龄组)及更年长的患者(2至5岁年龄组)进行哈默史密斯功能性运动扩展量表(HFMSE)。HFMSE分数的变化在-4与14分之间的范围内(平均增量+SD为4.3+5.3pts)，19名患者中的12名(63.1％)展示自基线的改良。较年长组(2至5岁)中的12名患者中的七名(58％)展示HFMSE的改良，而较年幼(6至24个月)组中的七名患者中的五名(71％)得到改良。一名在年龄为20.3个月时接受治疗的患者(E02)获得在无支撑的情况下站立的能力。19名患者中的十二名(63％)视为反应者(实现三分或更高的HFMSE改良)(图3)。未发现在治疗时，HFMSE分数与患者年龄之间的相关性。Swoboda等人(2010)“SMA CARNI-VAL Trial Part I:Double-Blind, Randomized,Placebo-ControlledTrial of L-Carnitine and Valproic Acid in Spinal Muscular Atrophy,[SMA CARNI-VAL试验第一部分：脊髓性肌萎缩症中左旋肉碱和丙戊酸的双盲，随机，安慰剂对照试验]”PLOS ONE[公共科学图书馆综合]5(8):e12140。
Figure BDA0003087277400001061
图3展示个别患者的HFMSE分数与患者年龄的关系。不在6至24个月年龄组中的患者中开始HFMSE的测试直至其年龄达到24个月。百分之六十三的患者(19名中的12名)展示HFMSE的改良。剂量A(6.0×1013vg)组中的一名患者在八个月治疗时展示八分的改良；第二名剂量A患者在七个月评估之后降低两分。
在此研究中，实现至少3分HFMSE改良的患者表征为反应者。对于较年长的群组(两岁至五岁)，对于12名患者，自基线开始评估HFMSE直至治疗的第5个月，且对于10名及5名患者，分别在第六个月及第七个月评估。对于较年幼的群组(六个月至两岁)，在三个月及四个月时评估一名患者，且在接受AVXS-101治疗之后六个月及七个月评估五名患者。较年长组中的所有患者以及较年幼组中的年龄达到两岁及更大的患者展示于图5中。在一个月治疗后即观测到50％的快速反应率。反应率保持等于或高于50％至研究的第七个月，反应率具有随时间推移而增加的趋势。
对于自基线至五个月治疗的完全群组(n＝12)，进行HFMSE评估的较年长群组(两岁至五岁)中的患者的每月反应者比率展示于图6中。在一个月治疗后即观测到50％的反应率。除治疗后第六个月以外，反应者比率保持等于或高于50％至研究的第七个月。一名早期反应者在六个月评估时出现HFMSE降低，使此时间点的反应者比率降低至低于50％。
总而言的，在四至十二个月的观测期期间，在24名患者中的11名中观测到二十三件新的运动重要事件(表6至8)。在较年长群组中，在研究的第5个月与第9个月之间，平均HFMSE分数增加4.3分(表8)。两个年龄群组中的大部分患者(63％)在治疗之后具有HFMSE分数的改良，与剂量无关(图3、4)。此研究中的百分之五十的患者在仅一个月疗法之后具有HFMSE的临床上有意义的改良(即，反应者，分数>3分)，其中反应者比率随时间推移而逐渐增加。用AVXS-101进行的治疗比关于其他疗法(诸如护理标准)所报导更有效。这些结果表明大部分患者对鞘内AVXS-101的单次给药具有早期反应且展示快速反应起效，且在研究鞘内施用的AVXS-101期间保持作用。
实例3-SMA患者中的AVXS-101研究(临床试验中间结果II)
本文中呈现如实例1及2中详细描述的临床试验的其他中间结果。向脊髓性肌萎缩(SMA)患者鞘内(IT)施用AVXS-101，这些患者在进入研究时能够在无支撑的情况下坐立≥10秒，但不能独立站立或行走。除SMN1的双等位基因缺失以外，患者具有3个SMN2基因的拷贝。将患者分成两个组，在给药时年龄≥6个月且<24个月及在给药时年龄≥24个月且<60个月。使用Bayley
Figure BDA0003087277400001081
对所有研究患者(年龄≥6个月且<60个月)进行治疗前基线评估，且使用HFMSE对年龄≥24月且<60个月的组进行其他基线评估。
在这些两个年龄组内，如所描述施用三种不同的治疗剂量：三名在给药时年龄≥6个月且<24个月的患者接受6.0×1013vg的AVXS-101的单次IT施用(剂量A)。十三名年龄≥6个月且<24个月的患者及十二名年龄≥24月且<60个月的患者接受1.2×1014vg的AVXS-101的单次IT施用(剂量B)。三名在给药时年龄≥6个月且<24个月的患者接受2.4×1014vg的AVXS-101的单次IT施用(剂量C)。在未来的研究中，将向额外的21名患者施用剂量C，其中这些患者中的9名来自在给药时年龄≥6个月且<24个月的组，且这些患者中的12名来自在给药时年龄≥24月且<60个月的组。
当前研究群体还包括意向治疗(Intent-to-Treat；ITT)集合中的31名患者，其定义为所有接受IT AVXS-101的患者，其中19名患者在登记时年龄≥6个月且<24个月，且12名患者在登记时年龄≥24月且<60个月。此外，功效完成分析集合(ECAS)中包括4名患者(3名剂量A及1名剂量B患者)，其定义为所有完成12个月给药后随访的患者。在中间结果中，使用ITT集合作为主要群体且使用ECAS作为支持性群体进行所有功效分析。
比较来自用AVXS-101治疗的患者的数据与患者水平数据，该患者水平数据来自由儿科神经肌肉临床研究(Pediatric Neuromuscular Clinical Research；PNCR)网络收集的同行审阅及广泛所引用的天然病史数据集。Kaufmann等人,“Prospective cohort studyof spinal muscular atrophy types 2 and 3[前瞻性队列研究2型和3型脊髓性肌萎缩症]”(2012)Neurology[神经学],79(18):1889-1897。PNCR为自337名患有任何形式的SMA的患者的群组开发的大型天然病史研究，在3个具有显著的管理SMA的专业知识的大型、国际认可的三级医学中心(哈佛大学(Harvard University)/波士顿儿童医院(BostonChildren’s Hospital)、哥伦比亚大学(Columbia University)及宾夕法尼亚大学(University of Pennsylvania)/费城儿童医院(Children’s Hospital ofPhiladelphia))进行。数据不含使用Bayley Scales of Infant and Toddler
Figure BDA0003087277400001091
进行的评估，其限制PNCR数据用于≥6个月且<24个月年龄组。PNCR研究群组中未评估由Prior及同事描述的SMN2修饰因子突变(c.859G>C)。Prior等人,“A positivemodifier of spinal muscular atrophy in the SMN2 gee[SMN2 gee中脊髓性肌萎缩症的正向调节剂]”(2009)A.J.Hum.Genet.[美国人类遗传学期刊],85(3):408-441。
PNCR N＝51天然病史对照组：对于年龄≥6个月且<24个月的患者，自PNCR天然病史研究抽取的51名患者的群组称为“群体匹配”对照群组。此对比群组包括满足以下准则的全部51名参与PNCR研究的患者：(1)患有2型或3型SMA，(2)3个SMN2的拷贝，(3)症状在年龄为12个月之前发作，及(4)在年龄为36个月时或之前进行至少一次随访。在此群组中，7/51名患者(13.74％)实现独立站立的能力，其定义为在年龄为36个月时或之前的任何时间，实现HFMSE的第19项的评分为2。5/51名患者(10％)实现独立行走的能力，且定义为在年龄为36个月时或之前的任何时间，实现HFMSE的第20项的评分为2。
PNCR N＝15天然病史对照组：对于年龄≥24个月且<60个月的患者，选择自PNCR天然病史研究抽取的15名患者的群组的患者水平资料作为“群体匹配”对照群组。此对照组用于初步分析。此天然病史对照组具有：(1)2型或3型SMA，(2)3个SMN2的拷贝，(3)症状在年龄为12个月之前发作，(4)在年龄为24个月之前诊断患有SMA，及(5)在参与PNCR研究时不能站立或行走。群组成员在年龄为24与60个月之间接受HFMS或HFMSE评估，其用作与后续评估的比较的基线。此15名患者的PNCR组具有一名在基线及所有后续随访时记录HFMSE评分为0的患者。在来自该群组的5/15(33％)名个体中，收集HFMSE分数保持超过12个月的时段。最后一次随访为18个月(2/15名患者，13％)、42个月(2/15名患者，13％)及48个月(1/15名患者，7％)。
PNCR N＝17天然病史对照组：对于年龄≥24个月且<60个月的患者，鉴别自PNCR研究抽取的17名患者的群组的患者水平资料，以改良患者组与天然病史对照组之间的匹配。此对照组用于敏感性分析。十二名原先在PNCR N＝15对照组中的患者现属于PNCR N＝17天然病史对照组。不包括三名原先在PNCR N＝15对照组中的患者(一名个体在基线及后续随访时HFMSE＝0，2名个体在>12个月时进行最后一次随访)。这些17名个体具有与研究组尽可能紧密匹配的年龄、临床及遗传准则。在≥24个月且<60个月年龄范围内的第一次随访定义为基线随访。使用在12个月间隔内之后续随访测定HFMSE的自基线的变化。临床上，这些个体能够坐立，但不能独立站立或行走。遗传学上，患者持有双等位基因SMN1缺失及3个SMN2的拷贝。使用PNCR天然病史对照组的限制在于参与者中的评估间隔不一致。因此，此对照组中的一些个体的数据≤12个月(参见例如表13)。
所有参与的患者的按照治疗及按照年龄进行的患者分布情况详细描述于表9中。安全性分析集合的按照治疗及按照年龄组进行的人口统计数据及基线特征的概述提供于表10中。
表9：患者分布情况-所有患者(中间结果II截止值)
Figure BDA0003087277400001101
Figure BDA0003087277400001111
表10：人口统计数据及基线特征-安全性分析集合
Figure BDA0003087277400001112
Figure BDA0003087277400001121
Figure BDA0003087277400001131
中间结果：主要功效终点的≥6个月且<24个月组中间评估(剂量A、B及C；总n＝19)
此年龄组的主要功效终点为实现Bayley Scales of Infant and Toddler
Figure BDA0003087277400001132
-粗大运动子集第40项，“在无支撑的情况下站立至少3秒”。若在12个月给药后随访期间的任何时间达成重要事件，则认为患者实现此重要事件。由独立的中央审查员确认重要事件的研究点评估的视讯记录。
ITT集合的给药的主要功效结果概述于下文及表11中：
对于剂量A(6.0×1013vg的AVXS-101)，3名患者中的1名(33.3％)，患者007-001，在治疗后11个月实现在具有支撑的情况下站立。此患者在给药时的年龄为约20个月。尽管患者未独立站立，但此患者在进入研究时实现以下技能：支撑重量(
Figure BDA0003087277400001133
第33项)、在具有支撑的情况下行走(
Figure BDA0003087277400001134
第37项)及在具有支撑的情况下侧向行走(
Figure BDA0003087277400001135
第38项)。
对于剂量B(1.2×1014vg的AVXS-101)，13名患者中的1名(7.7％)，患者007-002，在治疗后3个月内实现在无支撑的情况下站立。此患者在给药时的年龄为约7个月。根据研究医师，此患者不具有由神经检验鉴别的SMA的临床表现。因为患者具有受影响的兄弟姐妹，患者在生命早期通过基因测试进行诊断且随后进行神经传导研究。在进入研究之前，患者的复合肌动作电位(CMAP)异常。
对于剂量C(2.4×1014vg的AVXS-101)，无患者(3名患者中0名)直至在治疗后12个月的评估中实现在无支撑的情况下站立的重要事件(表11)。
对于剂量B+剂量C，16名患者中的1名(6.3％)，患者007-002(上文所描述)，在治疗后3个月实现在无支撑的情况下站立的重要事件。
表11：在直至12个月的任一次基线后随访时实现独立站立的能力的在给药时年龄<24个月的患者的比例-ITT集合
Figure BDA0003087277400001141
*仅对剂量B、C及B+C进行费雪精确测试。
对于来自PNCR N＝51数据集的患有2型及3型SMA的天然病史对照组，51名患者中的7名(13.7％)实现在无支撑的情况下站立的重要事件(如表11中所示)。
使用费雪精确测试(用于各组之间关于实现重要事件(主要功效终点)的患者的比例的比较)及卡本-麦尔分析(Kaplan-Meier analysis)(用于支持性功效终点)，根据方案进行统计分析。在直至12个月的任一次基线后随访时实现独立站立的能力的主要功效终点概述于表11中。
对于PNCR组中的所有患者以及通过ITT集合的中剂量，概述实现独立站立的能力的时间。使用Cox比例风险模型评估治疗差异，其中在基线时的患者年龄作为共变量，风险比(95％CI)为0.43(0.05，3.93)(剂量B组)、0(0，不可评估)(剂量C组)及0.37(0.04，3.39)(剂量B+剂量C组)，其中p值分别为0.4576、0.9951及0.3826。大部分研究患者在截至报导中间结果时未实现独立站立的重要事件，阻止诸如百分之25中值及百分之75的值的计算。
中间结果：主要功效终点的≥24个月且<60个月组中间评估(剂量B；总n＝12)
a.PNCR N＝15天然病史对照组的主要功效分析
此年龄组的主要功效终点为在第12个月时HFMSE的自基线的变化。使用ITT集合概述及分析HFMSE中的基线、基线后及自基线值的变化。对于方案中指定的分析，使用PNCR N＝15天然病史对照组作为主要“群体匹配”对照群组。
用AVXS-101剂量B治疗的个体及PNCR N＝15天然病史对照组的直至第12个月时的HFMSE分数的自基线的变化的意大利面图显示于图7中。经治疗的患者及对照组的描述性统计资料提供于表12中。
在PNCR N＝15天然病史对照组中，基线HFMSE分数的平均值±标准偏差(SD)为11.8±7.34。在此PNCR对照组中，可在第2个月(-0.6±1.35)、第4个月(0.4±0.98)、第6个月(0.2±1.72)、第9个月(1.0±2.16)及第12个月(0.8±2.86)计算HFMSE分数自基线的变化。
在AVXS-101剂量B治疗组中，基线HFMSE值为14.8±9.98。大部分经治疗的患者具有长达8个月的HFMSE资料(11/12)。在第2、4、6、9及12个月时的HFMSE分数自基线的变化分别为3.5±4.38、3.6±5.07、3.9±5.85、5.7±6.72及7。与PNCR N＝15天然病史对照组相比，剂量B治疗组展示HFMSE分数的稳定增加。
表12：指定时间点(年龄≥24个月且<60个月的患者)时的HFMSE值-ITT集合-剂量B
Figure BDA0003087277400001151
Figure BDA0003087277400001161
b.使用PNCR N＝17天然病史对照组的敏感性分析
剂量B及PNCR N＝17天然病史对照组的描述性统计资料及意大利面图提供于表13及图8中。
在PNCR N＝17天然病史对照组中，基线HFMSE分数为12.1±9.21。可在第2个月(-0.2±1.56)、第4个月(0.5±1.05)、第6个月(-0.4±5.32)、第9个月(1.1±2.03)及第12个月(-0.2±8.11)计算基线HFMSE分数的平均变化。百分之四十一(7/17)的PNCR患者不具有12个月HFMSE分数。
AVXS-101剂量B治疗组的HFMSE基线分数为14.8±9.98。在第2、4、6、9及12个月时的平均HFMSE分数自基线的变化分别为3.5±4.38、3.6±5.07、3.9±5.85、5.7±6.72及7。
与PNCR N＝17天然病史对照组相比，剂量B治疗组展示HFMSE分数的稳定增加。
表13：指定时间点(年龄≥24个月且<60个月的患者)时的HFMSE值-ITT集合(敏感性PNCR)-剂量B
Figure BDA0003087277400001171
Figure BDA0003087277400001181
中间结果：次要功效终点-运动重要事件，独立行走至少5步
对于≥6个月且<24个月年龄组及≥24且<60个月年龄组，次要功效终点为BayleyScales of Infant and Toddler
Figure BDA0003087277400001182
-粗大运动子集第43项(“独立行走≥5步”)。在任一次治疗后随访时对此重要事件进行评分直至第12个月研究随访。由独立的中央审查员审查及确认初始重要事件评估的视讯证据。
对于在给药时年龄≥6个月且<24个月的患者，一名接受剂量B(1.2×1014vg)的患者(007-002)在第4个月随访时在无帮助的情况下行走(参见先前章节中的患者说明)。实现在无帮助的情况下行走的能力的患者的比例为0％(0/3)(剂量A(6.0×1013vg))、7.7％(1/13)(剂量B(1.2×1014vg))及0％(0/3)(剂量C(2.4×1014vg))。使用PNCR N＝51天然病史对照组进行此分析。此对照组中的51名患者中的五名(9.8％)在基线时能够独立行走。在随访期期间，此对照组中没有患者能够独立行走。
对于在给药时年龄≥24个月且<60个月的患者，所有患者接受剂量B(1.2×1014vg)。此年龄组中没有患者接受剂量C。用剂量B治疗的患者都不能独立行走。主要PNCR N＝15天然病史对照组或敏感性PNCR N＝17天然病史对照组中的患者都不能独立行走。
中间结果：探索性功效终点-Bayley Scales of Infant and Toddler
Figure BDA0003087277400001183
评估
对于≥6个月且<24个月年龄组及≥24且<60个月年龄组，评估Bayley Scales ofInfant and Toddler
Figure BDA0003087277400001191
第三版(
Figure BDA0003087277400001192
-III)的精细及粗大运动部分的自基线的变化。对于≥6个月且<24个月年龄组，第二探索性终点为继续参与研究超过年龄为24个月且记录至少6个月的有价值的基线后HFMSE评估的患者中HFMSE的自基线的改变。因为PNCR数据集中未评估Bayley
Figure BDA0003087277400001193
因此仅提供年龄<24个月的患者的描述性统计资料。
尽管1型SMA患者具有严重的精细运动障碍，其中婴儿不能使用其整个手进行抓握，但精细运动功能在2型SMA及3型SMA中保留相对良好，如精细运动发育的
Figure BDA0003087277400001194
分数所反映。De Sanctis等人,“Developmental milestones in type I spinal muscularatrophy[I型脊髓性肌萎缩症的发展里程碑]”(2016)Neuromuscul.Disord.[神经肌肉障碍]26(11):754-759；Chabanon等人,“Prospective and longitudinal natural historystudy of patients with Type 2 and 3 spinal muscular atrophy:Baseline dataNatHis-SMA study[2型和3型脊髓性肌萎缩症患者的前瞻性和纵向自然史研究：基线数据NatHis-SMA研究]”(2018)PLoS ONE[公共科学图书馆综合],13(7):e0201004。在2型及3型SMA中，近端肌肉功能障碍显著大于远程肌肉功能障碍，如粗大运动发育的
Figure BDA0003087277400001195
分数所反映。a.在给药时年龄≥6个月且<24个月的患者
剂量A(6.0×1013vg)：此组中的全部3名患者完成给药后12个月评估期。在第12个月时，Bayley
Figure BDA0003087277400001196
的自基线的变化为12.3±6.51(精细运动子测试)及5.7±1.15(粗大运动子测试)。
剂量B(1.2×1014vg)：可获得全部13名患者的精细运动子测试中的自基线的变化至第6个月(5.4±3.57)。后续月的可用资料不完全：第7个月(n＝11；7.8±3.03)、第8个月(n＝10；7.4±3.60)、第9个月(n＝6；8.2±3.25)、第10个月(n＝3；11.7±3.06)、第11个月(n＝2；12.5±4.95)。在第12个月，一名患者的自基线的变化为16.0。这些患者中的精细运动技能继续改良，如通过天然病史研究所预测。Chabanon等人,“Prospective andlongitudinal natural history study of patients with Type 2 and 3 spinalmuscular atrophy:Baseline data NatHis-SMA study[2型和3型脊髓性肌萎缩症患者的前瞻性和纵向自然史研究：基线数据NatHis-SMA研究]”(2018)PLoS ONE.[公共科学图书馆综合]13(7):e0201004。
可获得全部13名患者的粗大运动子测试中的自基线的变化至第6个月(3.8±5.01)。后续月的可用资料不完全：第7个月(n＝12；4.7±4.29)、第8个月(n＝10；4.9±6.45)、第9个月(n＝6；3.5±2.07)、第10个月(n＝3；5.7±4.73)、第11个月(n＝2；8.0±4.24)及第12个月(n＝1；11.0)。患者继续实现粗大运动重要事件。无患者损失重要事件。
剂量C(2.4×1014vg)：可获得的精细运动子测试中的自基线的变化的资料有限：第2个月(n＝3；0.7±0.58)、第3个月(n＝2；3.5±0.71)；在第4个月，一名患者的自基线的变化为6.0。可获得粗大运动子测试中的自基线的变化至第4个月：第2个月(n＝3；0.3±1.53)、第3个月(n＝2；0.5±3.54)及第4个月(n＝1；4.0)。
剂量B+剂量C：剂量B+剂量C的直至第12个月的Bayley
Figure BDA0003087277400001202
中的自基线的变化的意大利面图提供于图9(精细运动)及图10(粗大运动)中。Bayley
Figure BDA0003087277400001203
的描述性统计资料提供于表14中。表14：在给药时年龄<24个月的患者在直至第12个月的任一次基线后随访时，Bayley Scale for Infant and Toddler
Figure BDA0003087277400001204
的粗大及精细运动分数的自基线的最大变化的分析-ITT集合
Figure BDA0003087277400001201
Figure BDA0003087277400001211
b.在给药时年龄≥4个月且<60个月的患者
≥24且<60个月年龄组由12名接受剂量B(1.2×1014vg)的患者构成。观测精细及粗大运动子集的增进。可获得全部12名患者的精细运动子测试中的自基线的变化至第6个月(7.6±5.62)。后续月的可用资料不完全：第7个月(n＝11；6.6±5.33)、第8个月(n＝11；8.0±5.74)、第9个月(n＝10；7.9±5.53)及第10个月(n＝2；10.5±0.71)。一名患者在第11个月(n＝1)及第12个月(n＝1)具有数据，其中分数分别为9.0及10.0。
对于粗大运动子集，可获得全部12名患者的自基线的变化至第6个月(1.8±4.47)。后续月的可用资料不完全：第7个月(n＝11；2.0±4.36)、第8个月(n＝11；2.3±4.47)、第9个月(n＝10；2.4±5.08)、第10个月(n＝2；5.5±6.36)。没有患者损失
Figure BDA0003087277400001212
粗大运动重要事件。
剂量B的直至第12个月的Bayley
Figure BDA0003087277400001222
中的自基线的变化的意大利面图提供于图11及图12中。患者008-003的曲线不正确。患者008-003的基线分数为20而非28(如最初报告)。因此，基线量测值与第1个月之间的粗大运动分数的变化为“0”而非“-8”。此外，患者008-003的粗大运动分数自基线量测值的变化为“0”(第2及3个月)、“+1”(第4个月)、“0”(第5及6个月)、“+1”(第7-11个月)及“+2”(第12个月)。
这些中间数据概述截至治疗后12个月的实例1中所描述的临床试验的功效结果。Bayley
Figure BDA0003087277400001223
的描述性统计资料提供于表15中。
表15：在给药时年龄≥24且<60个月的患者在直至第12个月的任一次基线后随访时，Bayley Scale for Infant and Toddler
Figure BDA0003087277400001224
的粗大及精细运动分数的自基线的最大变化的分析-ITT集合
Figure BDA0003087277400001221
Figure BDA0003087277400001231
中间结果：继续参与研究超过年龄为24个月的年龄≥6个月且<24个月的患者的HFMSE分数的变化
在年龄≥6且<24个月的患者组中，记录年龄达到24个月的患者的HFMSE评分。因为无法获得任何患者的治疗前基线，将HFMSE的第一次记录定义为基线。以下月份标示相对于年龄≥24个月时HFMSE的第一次记录，而非研究月份。
剂量A(6.0×1013vg)：两名患者年龄达到24个月。提供自HFMSE的第一次记录的变化：第1个月(n＝2；-0.5±4.95)、第2个月(n＝2；4.0±0.00)、第3个月(n＝2；3.5±0.71)、第4个月(n＝2；3.0±2.83)、第5个月(n＝1；5.0)及第6个月(n＝2；2.0±5.66)。
剂量B(1.2×1014vg)：八名患者年龄达到24个月。提供自HFMSE的第一次记录的变化：第1个月(n＝7；2.0±2.83)、第2个月(n＝7；2.7±2.69)、第3个月(n＝6；1.3±4.97)、第4个月(n＝3；4.7±4.51)及第5个月(n＝2；7.5±0.71)。
剂量B的直至第12个月的HFMSE分数的自基线的变化的意大利面图提供于图13中。剂量B的直至第12个月的任一次基线后随访时的HFMSE值的自基线的最大变化(平均值±SD)为17.7±5.28(n＝7)，如表16中所示。
剂量C(2.4×1014vg)：一名患者在年龄≥24个月时实现HFMSE的第一次记录。仅可获得此单一“基线”数据点。
表16：继续参与研究超过年龄为24个月的在给药时<24个月的患者在直至第12个月的任一次基线后随访时HFMSE的自基线的最大变化-ITT集合
Figure BDA0003087277400001241
中间结论
本文中所描述的临床试验为经诊断患有脊髓性肌萎缩(SMA)的年龄≥6个月且<60个月的婴儿及儿童中的正在进行中的1期、开放标记、单次剂量鞘内(IT)施用研究。迄今为止，在经治疗的患者中获得的数据展示运动功能的临床上有意义的变化，包括促进技能、促进重要事件及疾病稳定，其描述于以下各年龄组的概述中。
≥6个月且<24个月年龄组
十九名年龄≥6个月且<24个月的患者参与临床试验。三名患者接受6.0×1013vg的AVXS-101的单次给药(剂量A)，13名患者接受1.2×1014vg的AVXS-101的单次给药(剂量B)，且3名患者接受2.4×1014vg的AVXS-101的单次给药(剂量C)。四名患者完成给药后12个月评估：剂量A组中的3名患者及剂量B组中的1名患者。
此年龄组的主要功效终点为实现Bayley Scales of Infant and Toddler
Figure BDA0003087277400001242
-粗大运动子集第40项，“在无支撑的情况下站立至少3秒”。两名患者实现主要功效终点。接受剂量A的患者007-001在治疗后11个月实现在无支撑的情况下站立至少3秒。接受剂量B的患者007-002在治疗后3个月实现在无支撑的情况下站立。
次要功效终点为Bayley Scales of Infant and Toddler
Figure BDA0003087277400001251
-粗大运动子集第43项(“独立行走≥5步”)。一名接受剂量B的患者(007-002)在治疗后4个月实现在无帮助的情况下行走至少5步。
探索性终点为Bayley Scales of Infant and Toddler
Figure BDA0003087277400001252
第三版(
Figure BDA0003087277400001253
-III)的精细及粗大运动部分的自基线的变化。因为PNCR数据集中未评估Bayley
Figure BDA0003087277400001254
因此仅提供年龄<24个月的患者的描述性统计资料。然而，患者继续实现粗大运动重要事件。没有患者损失重要事件。
≥24个月且<60个月年龄组
十二名年龄≥24个月且<60个月的患者参与临床试验且接受剂量B。此年龄组中没有患者接受剂量C。一名患者完成治疗后12个月评估。
此年龄组的主要功效终点为HFMSE中的自基线的变化。为将在剂量B组中观测的变化置放于上下文中，HFMSE分数的≥3分改良视为对利益关系人(诸如照护者及临床医师)有意义及重要的，且用作用于检测临床试验中的有意义的变化的临界值。Mercuri等人,“Nusinersen versus sham control in later-onset spinal muscular atrophy[诺西那生与假手术控制迟发性脊髓性肌萎缩症]”N Engl J Med.[新英格兰医学杂志]378(7):625-635。与PNCR N＝15天然病史对照组相比，剂量B治疗组展示HFMSE分数的稳定增加。对于PNCR N＝15天然病史对照组，在第9个月观测到HFMSE分数的最大变化(n＝7)，其为1.0±2.16。当使用PNCR N＝17天然病史对照组进行敏感性分析时观测到类似结果，其中在第9个月(n＝8)时的HFMSE分数的最大变化为1.1±2.03。
对于在第9个月(n＝10)时HFMSE分数的变化，剂量B治疗组展示临床上有意义的增加，其为5.7±6.72。
探索性终点为
Figure BDA0003087277400001255
-III的精细及粗大运动部分中的自基线的变化。与较年幼组类似，患者继续实现粗大运动重要事件。没有患者损失重要事件。
Figure IDA0003087277500000011
Figure IDA0003087277500000021
Figure IDA0003087277500000031
Figure IDA0003087277500000041
Figure IDA0003087277500000051
Figure IDA0003087277500000061
Figure IDA0003087277500000071
Figure IDA0003087277500000081
Figure IDA0003087277500000091
Figure IDA0003087277500000101
Figure IDA0003087277500000111

Claims (118)

1.一种治疗有需要的患者中的脊髓性肌萎缩(SMA)的方法，该方法包括鞘内施用AAV9病毒载体，该AAV9病毒载体包含编码运动神经元存活(SMN)蛋白质的多核苷酸，其中该病毒载体以约1×1013vg-5×1014vg的剂量施用。
2.如权利要求1所述的方法，其中该AAV9病毒载体包含经修饰的AAV2 ITR、鸡β-肌动蛋白(CB)启动子、细胞巨大病毒(CMV)即刻/早期增强子、经修饰的SV40晚期16S内含子、牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化信号及未经修饰的AAV2 ITR。
3.如权利要求1至2中任一项所述的方法，其中该多核苷酸编码SEQ ID NO:2的SMN蛋白质。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中该AAV9病毒载体包含SEQ ID NO:1。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中该患者在施用时年龄为六个月或更大。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中该患者在施用时年龄为24个月或更小，任选地年龄在6个月与24个月之间。
7.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中该患者在施用时年龄为24个月或更大。
8.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中该患者在施用时年龄为60个月或更小，任选地年龄在24与60个月之间。
9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中该AAV9病毒载体以约5.0×1013vg-3.0×1014vg的剂量施用。
10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中该AAV9病毒载体以至多约6.0×1013vg的剂量施用。
11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中该AAV9病毒载体以约6.0×1013vg的剂量施用。
12.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中该AAV9病毒载体以至多约1.2×1014vg的剂量施用。
13.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中该AAV9病毒载体以约1.2×1014vg的剂量施用。
14.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中该AAV9病毒载体以至多约2.4×1014vg的剂量施用。
15.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中该AAV9病毒载体以约2.4×1014vg的剂量施用。
16.如权利要求1至15中任一项所述的方法，其中该患者包含双等位基因SMN1无效突变或不活化缺失，任选地其中这些突变包含SMN1的外显子七的缺失。
17.如权利要求1至16中任一项所述的方法，其中该患者具有三个SMN2的拷贝。
18.如权利要求1至17中任一项所述的方法，其中该患者在至少一个该SMN2基因的拷贝上的外显子7中不具有c.859G>C取代。
19.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其中该有需要的患者通过一种或多种基因组测试来确定。
20.如权利要求1至19中任一项所述的方法，其中该患者在年龄达到约12个月之前显现出疾病发作。
21.如权利要求1至20中任一项所述的方法，其中该患者在施用时具有在无需帮助的情况下坐立约10秒或更长时间的能力，但不能站立或行走。
22.如权利要求1至21中任一项所述的方法，其中该患者在施用时具有在无需帮助的情况下坐立的能力，例如由世界卫生组织多中心生长参考研究(World Health OrganizationMulticentre Growth Reference Study；WHO-MGRS)准则所定义。
23.如权利要求1至22中任一项所述的方法，其中该患者在施用之后具有在无支撑的情况下站立至少约三秒的能力，例如由Bayley Scales of Infant and Toddler
Figure FDA0003087277390000031
所定义，例如在施用之后约1-24个月，例如12个月评估。
24.如权利要求1至22中任一项所述的方法，其中该患者在施用之后具有在无帮助的情况下行走的能力，例如由Bayley Scales of Infant and Toddler
Figure FDA0003087277390000032
所定义，例如在施用之后约1-24个月，例如约12个月评估。
25.如权利要求1至24中任一项所述的方法，其中该患者在施用之后具有独立行走至少五步的能力，例如由Bayley Scales of Infant and Toddler
Figure FDA0003087277390000033
所定义，如在施用之后约1-24个月，例如约12个月评估。
26.如权利要求1至25中任一项所述的方法，其中该患者在治疗之后展示自治疗时的基线量测值的变化，例如由Bayley Scales of Infant and Toddler
Figure FDA0003087277390000034
所定义，如在施用之后约1-24个月，例如约12个月评估。
27.如权利要求1至26中任一项所述的方法，其中该患者在施用之后不具有严重脊柱侧弯，例如在X射线检验时显而易见的脊椎≥50°弯曲，如在施用之后约1-24个月，例如约12个月评估。
28.如权利要求1至27中任一项所述的方法，其中该患者未禁忌脊椎穿刺程序或鞘内疗法的施用。
29.如权利要求1至28中任一项所述的方法，其中该患者先前未经历脊柱侧弯修复手术或程序，且任选地其中该患者在施用之后6个月至3年内，例如1年内未经历脊柱侧弯修复手术或程序。
30.如权利要求1至29中任一项所述的方法，其中该患者在施用之前和/或之后无需使用侵入性通气支持。
31.如权利要求1至30中任一项所述的方法，其中该患者在施用之前不具有独立站立或行走的历史。
32.如权利要求1至31中任一项所述的方法，其中该患者在施用之前和/或之后未使用胃饲管。
33.如权利要求1至32中任一项所述的方法，其中该患者在治疗时不具有活性病毒感染(包括人类免疫缺陷病毒(HIV)或对B型或C型肝炎或寨卡病毒呈血清学阳性)。
34.如权利要求1至33中任一项所述的方法，其中该患者在施用之前的四周内未患有严重的非肺部/呼吸道感染(例如肾盂肾炎或脑膜炎)。
35.如权利要求1至34中任一项所述的方法，其中该患者在施用之前不具有伴随疾病，例如重度肾或肝损伤、已知的癫痫发作、糖尿病、特发性低钙尿症或症状性心肌病。
36.如权利要求1至35中任一项所述的方法，其中该患者在施用之前不具有细菌性脑膜炎或脑部或脊髓疾病的病史。
37.如权利要求1至36中任一项所述的方法，其中该患者在施用之前不具有已知的对泼尼松龙或其他糖皮质类固醇或赋形剂的过敏性或过敏反应。
38.如权利要求1至37中任一项所述的方法，其中该患者在施用之前不具有已知的对碘或含碘产品的过敏性或过敏反应。
39.如权利要求1至38中任一项所述的方法，其中该患者未正在使用用于治疗肌病或神经病的药物。
40.如权利要求1至39中任一项所述的方法，其中该患者在施用之前的3个月内未接受免疫抑制性疗法、血浆清除术、免疫调节剂，诸如阿达木单抗。
41.如权利要求1至40中任一项所述的方法，其中该患者在施用之前的抗AAV9抗体效价等于或低于1:25、1:50、1:75或1:100，例如通过ELISA结合免疫分析法所测定。
42.如权利要求1至41中任一项所述的方法，其中该患者在施用之前具有以下中的一个或多个：γ-谷氨酰转移酶水平小于正常值上限的约3倍、胆红素水平小于约3.0mg/dL、肌酐水平小于约1.0mg/dL、Hgb水平在约8-18g/dL之间和/或白血球计数小于约20000个/mm3。
43.如权利要求1至42中任一项所述的方法，其中该患者在施用之前未接受意图治疗SMA的研究性或经批准的化合物产品或疗法。
44.如权利要求1至43中任一项所述的方法，其中该AAV9病毒载体与对比剂共同施用，任选地其中该对比剂包含碘海醇。
45.如权利要求44所述的方法，其中所施用的该对比剂的体积为约1.0-2.0mL，例如约1.5mL，任选地其中在施用之前将该对比剂与该AAV9病毒载体混合，例如在施用之前不到24小时、不到12小时、不到6小时、不到5小时、不到4小时、不到3小时、不到2小时、不到1小时、不到30分钟或即将施用之前。
46.如权利要求44至45中任一项所述的方法，其中向该患者施用的AAV9病毒载体及对比剂的总体积不超过约10mL、约9mL或约8mL。
47.如权利要求1至46中任一项所述的方法，其中该方法进一步包含镇静或麻醉。
48.如权利要求1至47中任一项所述的方法，其中该患者在该AAV9病毒载体的施用期间和/或之后处于垂头仰卧位。
49.如权利要求1至48中任一项所述的方法，其中该患者在该AAV9病毒载体的施用之后处于头向下倾斜约30°保持约10-60分钟，例如约15分钟。
50.如权利要求1至49中任一项所述的方法，其中在施用该AAV9病毒载体之前至少约1至48小时，例如约24小时，向该患者施用口服类固醇。
51.如权利要求1至50中任一项所述的方法，其中在施用该病毒载体之后，向该患者施用口服类固醇保持至少约10-60天，例如约30天。
52.如权利要求50或51所述的方法，其中每天一次施用该口服类固醇。
53.如权利要求50或51所述的方法，其中每天两次施用该口服类固醇。
54.如权利要求51至53中任一项所述的方法，其中在施用该病毒载体之后监测该患者的ALT和/或AST水平，且其中在30天之后继续施用该口服类固醇直至AST和/或ALT水平低于正常值上限的两倍或低于约120IU/L。
55.如权利要求51至54中任一项所述的方法，其中向该患者施用口服类固醇直至AST和/或ALT水平低于正常值上限的两倍或低于约120IU/L。
56.如权利要求51至55中任一项所述的方法，其中在施用该AAV9病毒载体之后监测该患者的T细胞反应程度，且其中在30天之后继续施用该口服类固醇直至来自该患者的样品，例如血液样品中的T细胞反应降低至低于100个斑点形成细胞(SFC)/106个外周血液单核细胞(PBMC)。
57.如权利要求50至56中任一项所述的方法，其中该口服类固醇以约1mg/kg的剂量施用。
58.如权利要求51至57中任一项所述的方法，该方法进一步包括在AST及ALT低于正常值上限的两倍或低于约120IU/L之后逐渐减少该口服类固醇。
59.如权利要求58所述的方法，其中该逐渐减少包含使增量逐步变成约0.5mg/kg/天保持2周，接着变成约0.25mg/kg/天再保持2周。
60.如权利要求51至59中任一项所述的方法，该方法包括以约1mg/kg的剂量施用该口服类固醇保持30天且接着逐渐减少至0.5mg/kg/天保持2周，接着减少至0.25mg/kg/天再保持2周。
61.如权利要求50至60中任一项所述的方法，其中该口服类固醇为泼尼松龙或等效物。
62.如权利要求1至61中任一项所述的方法，其中使用Bayley Scales of Infant andToddler Development量表和/或哈默史密斯功能性运动扩展量表(HammersmithFunctional Motor Scale-Expanded；HFMSE)测定治疗功效。
63.如权利要求1至62中任一项所述的方法，该方法进一步包括与该AAV9病毒载体的施用同时或依序地向该患者施用第二治疗剂。
64.如权利要求63所述的方法，其中该第二治疗剂包含肌肉增强剂或神经保护剂。
65.如权利要求63或64所述的方法，其中该第二治疗剂包含一种或多种靶向SMN1和/或SMN2的反义寡核苷酸。
66.如权利要求63至65中任一项所述的方法，其中该第二治疗剂包含诺西那生和/或司他莫单抗。
67.如权利要求1至66所述的方法，其中使用ddPCR量测AAV9病毒载体基因组的量。
68.如权利要求1至67中任一项所述的方法，其中该患者在施用之后的抗AAV9抗体效价等于或高于1:25、1:50、1:75或1:100，例如通过ELISA结合免疫分析法所测定，且监测约1-8周或直至效价降低至低于1:25、1:50、1:75或1:100。
69.如权利要求1至68中任一项所述的方法，其中该患者在施用之后的抗AAV9抗体效价等于或高于1:25、1:50、1:75或1:100，例如通过ELISA结合免疫分析法所测定，且施用类固醇，例如泼尼松龙直至效价降低至低于1:25、1:50、1:75或1:100。
70.如权利要求1至69中任一项所述的方法，其中该患者在施用之前的血小板计数高于约67,000个细胞/ml，或高于约100,000个细胞/ml，或高于约150,000个细胞/ml。
71.如权利要求1至70中任一项所述的方法，其中该患者在施用之后的血小板计数低于约67,000个细胞/ml，或低于约100,000个细胞/ml，或低于约150,000个细胞/ml，且监测约1-8周或直至血小板计数增加至约67,000个细胞/ml，或高于约100,000个细胞/ml，或高于约150,000个细胞/ml。
72.如权利要求1至71中任一项所述的方法，其中该患者在施用之后的血小板计数低于约67,000个细胞/ml且通过血小板输注来治疗。
73.如权利要求1至72中任一项所述的方法，其中该患者在施用该AAV9病毒载体之前具有正常肝功能。
74.如权利要求73所述的方法，其中该患者在施用之前的肝转胺酶水平小于约8-40U/L。
75.如权利要求74所述的方法，其中该肝转胺酶选自AST、ALT及其组合。
76.如权利要求1至75中任一项所述的方法，其中该AAV9病毒载体呈适用于鞘内施用的药物配制品形式。
77.AAV9病毒载体用于根据任一前述权利要求所述的方法治疗脊髓性肌萎缩(SMA)的用途。
78.一种药物组合物，该药物组合物包含AAV9病毒载体及适用于鞘内施用的药学上可接受的载剂，其中该AAV9病毒载体包含经修饰的AAV2 ITR、鸡β-肌动蛋白(CB)启动子、巨细胞病毒(CMV)即刻/早期增强子、经修饰的SV40晚期16S内含子、牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化信号及未经修饰的AAV2 ITR。
79.如权利要求78所述的药物组合物，该药物组合物包含约6.0×1013vg的单位剂量的该AAV9病毒载体。
80.如权利要求78所述的药物组合物，该药物组合物包含约1.2×1014vg的单位剂量的该AAV9病毒载体。
81.如权利要求78所述的药物组合物，该药物组合物包含约2.4×1014vg的单位剂量的该AAV9病毒载体。
82.如权利要求78至81中任一项所述的药物组合物，其中多核苷酸编码SEQ ID NO:2的SMN蛋白质。
83.如权利要求78至82中任一项所述的药物组合物，其中该AAV9病毒载体包含SEQ IDNO:1。
84.如权利要求78至83中任一项所述的药物组合物，该药物组合物进一步包含对比剂。
85.如权利要求84所述的药物组合物，其中该对比剂以约1.0-2.0mL，例如约1.5mL的量存在。
86.如权利要求84至85中任一项所述的药物组合物，其中该AAV9病毒载体及对比剂的总体积不超过约10mL、约9mL或约8mL。
87.如权利要求78至83中任一项所述的药物组合物，其中该药物组合物与对比剂组合施用给患者，其中该对比剂在施用该药物组合物之前施用，任选地在施用该药物组合物之前2小时内施用。
88.如权利要求78至87中任一项所述的药物组合物，该药物组合物进一步包含其他治疗剂。
89.如权利要求78至88中任一项所述的药物组合物，其中该组合物或配制品包含以下中的至少一者：
a.约pH 7.7-8.3，
b.约390-430mOsm/kg，
c.以每个容器计，尺寸≥25μm的颗粒少于约600个，
d.以每个容器计，尺寸≥10μm的颗粒少于约6000个，
e.约1.7×1013-5.3×1013vg/mL的基因组效价，
f.感染效价为每1.0×1013vg约3.9×108-8.4×1010IU，
g.总蛋白质为每1.0×1013vg约100-300μg，
h.普朗尼克F-68含量为约20-80ppm，
i.基于活体外基于细胞的分析法，相对效能为约70-130％，其中该效能相对于参考标准和/或适合的对照物，
j.效能的特征在于在SMNΔ7小鼠模型中，在7.5×1013vg/kg的剂量下，中值存活期大于或等于24天，
k.小于约5％空衣壳，
l.及总纯度大于或等于约95％，及
m.小于或等于约0.13EU/mL的内毒素。
90.如权利要求78至89中任一项所述的药物组合物，其中该组合物或配制品包含以下中的至少一者：
a.每1.0×1013vg小于约0.09ng全能核酸酶，
b.小于约30μg/g(ppm)的铯，
c.约20-80ppm泊洛沙姆188，
d.每1.0×1013vg小于约0.22ng BSA，
e.每1.0×1013vg小于约6.8×105pg残余质粒DNA，
f.每1.0×1013vg小于约1.1×105pg残余hcDNA，
g.每1.0×1013vg小于约4ng rHCP，
h.约pH 7.7-8.3，
i.约390-430mOsm/kg，
j.以每个容器计，尺寸≥25μm的颗粒少于约600个，
k.以每个容器计，尺寸≥10μm的颗粒少于约6000个，
l.约1.7×1013-5.3×1013vg/mL的基因组效价，
m.感染效价为每1.0×1013vg约3.9×108-8.4×1010IU，
n.总蛋白质为每1.0×1013vg约100-300μg，
o.基于活体外基于细胞的分析法，相对效能为约70-130％，其中该效能相对于参考标准和/或适合的对照物，及
p.小于约5％空衣壳。
91.如权利要求78至90中任一项所述的药物组合物，该药物组合物用于在如权利要求1至76中任一项所述的方法中使用。
92.如权利要求1至76中任一项所述的方法或如权利要求77所述的用途，或如权利要求91所述使用的组合物，其中该施用引起与施用前分数相比改良的哈默史密斯功能性运动扩展量表分数。
93.如权利要求1至76中任一项所述的方法或如权利要求77所述的用途，或如权利要求91所述使用的组合物，其中该施用引起与施用前分数相比改良的Bayley Scales ofInfant and Toddler Development,第三版分数。
94.如权利要求1至76中任一项所述的方法或如权利要求77所述的用途，或如权利要求91所述使用的组合物，其中该施用引起与施用前分数相比，哈默史密斯功能性运动扩展量表分数改良至少三分。
95.一种治疗患有脊髓性肌萎缩(SMA)的患者的方法，该方法包括鞘内施用AAV9病毒载体，该AAV9病毒载体包含编码运动神经元存活(SMN)蛋白质的多核苷酸，其中该病毒载体以约6×1013vg-2.4×1014vg的剂量施用，且其中该患者在施用后9个月实现与施用前分数相比，哈默史密斯功能性运动扩展量表(HFMSE)改良至少3分。
96.如权利要求95所述的方法，其中该患者实现与施用前分数相比，在施用后9个月HFMSE改良至少4分。
97.如权利要求95所述的方法，其中该患者实现与施用前分数相比，在施用后9个月HFMSE改良至少5分。
98.一种治疗患有脊髓性肌萎缩(SMA)的患者的方法，该方法包括鞘内施用AAV9病毒载体，该AAV9病毒载体包含编码运动神经元存活(SMN)蛋白质的多核苷酸，其中该病毒载体以约6×1013vg-2.4×1014vg的剂量施用，且其中该患者在施用后12个月获得在无支撑的情况下站立至少3秒的能力。
99.一种治疗患有脊髓性肌萎缩(SMA)的患者的方法，该方法包括鞘内施用AAV9病毒载体，该AAV9病毒载体包含编码运动神经元存活(SMN)蛋白质的多核苷酸，其中该病毒载体以约6×1013vg-2.4×1014vg的剂量施用，且其中该患者在施用后12个月获得独立行走至少5步的能力。
100.一种治疗患有脊髓性肌萎缩(SMA)的患者的方法，该方法包括鞘内施用AAV9病毒载体，该AAV9病毒载体包含编码运动神经元存活(SMN)蛋白质的多核苷酸，其中该病毒载体以约6×1013vg-2.4×1014vg的剂量施用，且其中该患者实现与施用前分数相比，在施用后，Bayley Scales of Infant and Toddler Development的粗大运动部分改良至少3分。
101.如权利要求95至100中任一项所述的方法，其中该AAV9病毒载体包含经修饰的AAV2 ITR、鸡β-肌动蛋白(CB)启动子、巨细胞病毒(CMV)即刻/早期增强子、经修饰的SV40晚期16S内含子、牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化信号及未经修饰的AAV2 ITR。
102.如权利要求95至101中任一项所述的方法，其中该多核苷酸编码SEQ ID NO:2的SMN蛋白质。
103.如权利要求95至102中任一项所述的方法，其中该AAV9病毒载体包含SEQ ID NO:1。
104.如权利要求95至103中任一项所述的方法，其中该患者在施用时年龄为六个月或更大。
105.如权利要求95至104中任一项所述的方法，其中该患者在施用时年龄为24个月或更小，任选地年龄在6个月与24个月之间。
106.如权利要求95至104中任一项所述的方法，其中该患者在施用时年龄为24个月或更大。
107.如权利要求95至104中任一项所述的方法，其中该患者在施用时年龄为60个月或更小，任选地年龄在24与60个月之间。
108.如权利要求95至107中任一项所述的方法，其中该AAV9病毒载体以约6.0×1013vg的剂量施用。
109.如权利要求95至107中任一项所述的方法，其中该AAV9病毒载体以约1.2×1014vg的剂量施用。
110.如权利要求95至107中任一项所述的方法，其中该AAV9病毒载体以约2.4×1014vg的剂量施用。
111.如权利要求95至110中任一项所述的方法，其中该患者包含双等位基因SMN1无效突变或不活化缺失，任选地其中这些突变包含SMN1的外显子七的缺失。
112.如权利要求95至111中任一项所述的方法，其中该患者具有三个SMN2的拷贝。
113.如权利要求95至112中任一项所述的方法，其中该患者在至少一个该SMN2基因的拷贝上的外显子7中不具有c.859G>C取代。
114.如权利要求95至113中任一项所述的方法，其中该有需要的患者通过一种或多种基因组测试来确定。
115.如权利要求19或114所述的方法，其中该基因组测试检测一种或多种双等位基因SMN1无效突变或不活化缺失、超过一个SMN2的拷贝和/或在至少一个该SMN2基因的拷贝上的外显子7中不具有c.859G>C取代。
116.如权利要求1至76或92至115中任一项所述的方法，其中该SMA为II型SMA或III型SMA。
117.如权利要求77的用途，其中该SMA为II型SMA或II型SMA。
118.如权利要求91所述使用的药物组合物，其中向患有II型SMA或III型SMA的患者施用该药物组合物。
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