KR20210099025A

KR20210099025A - Aav 바이러스 벡터 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20210099025A
Application number: KR1020217019147A
Authority: KR
Inventors: 제임스 마이클 하트필드; 로버트 에밀 호지; 더글라스 펠트너; 조셉 발리디어; 매튜 메리지올리; 브라이언 케이. 카스파; 알란 아만 카스파
Original assignee: 노파르티스 아게
Priority date: 2018-11-30
Filing date: 2019-11-27
Publication date: 2021-08-11
Also published as: EP3886919A1; BR112021009739A2; MX2021006359A; AU2019389047A1; CN113226380A; CA3116630A1; JP2022511776A; US20220001028A1; TW202039859A; WO2020113034A1; IL282885A

Abstract

본 명세서에서 AAV9 바이러스 벡터를 포함하는 조성물 및 SMA 환자, 예를 들어, 제II형 및 제III형 척수성 근위축증(SMA) 환자를 치료하기 위해 이를 이용하는 방법이 개시된다.

Description

AAV 바이러스 벡터 및 이의 용도

관련 출원

본 출원은 2018년 11월 30일자로 출원된 미국 가출원 특허 제62/773,894호, 및 2019년 4월 17일자로 출원된 미국 가출원 특허 제62/835,242호에 대한 우선권을 주장한다. 이들 출원의 내용은 본 명세서에서 이들의 전문이 참조에 의해 포함된다.

서열목록

본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출되고, 그 전체가 본 명세서에 참조에 의해 포함되는 서열목록을 포함한다. 2019년 11월 12일자로 생성된 상기 ASCII 사본은 14452_0025-00304_SL.txt로 명명되며, 용량이 14,833 바이트이다.

기술분야

본 발명은 바이러스 입자의 조성물 및 용도에 관한 것이다.

아데노-관련 바이러스(AAV)는 파보바이러스과(parvoviridae family)의 구성원이다. AAV 게놈은 비구조적 Rep(복제) 및 구조적 Cap(캡시드) 단백질을 암호화하는 2가지 주요 오픈 리딩 프레임을 갖는 길이가 대략 4.7 킬로베이스(kb)인 선형 단일-가닥 DNA 분자를 포함한다. DNA 복제의 개시 동안 프라이머로서 작용하는 헤어핀 구조로 폴딩될 수 있는 가로막힌 회문구조 서열(interrupted palindromic sequence)을 갖는, 대략 145개의 뉴클레오티드 길이의 2개의 시스-작용성(cis-acting) 역위 말단 반복부(ITR) 서열이 AAV 암호화 영역에 측접한다. DNA 복제에서의 이들의 역할에 추가로, ITR 서열은 바이러스 통합, 숙주 게놈으로부터의 구제(rescue), 및 성숙 비리온 내로 바이러스 핵산의 캡시드화에서 어떤 역할을 하는 것으로 나타났다(Muzyczka, (1992) Curr. Top. Micro. Immunol. 158:97-129).

여러 혈청형의 AAV가 존재하며 다양한 조직 친화성을 제공한다. 공지된 혈청형은, 예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 및 AAV11을 포함한다. AAV9는 미국 특허 제7,198,951호 및 문헌[Gao et al., J. Virol., 78: 6381-6388 (2004)]에 기재되어 있으며, 이들은 본 명세서에 전문이 참조에 의해 포함된다. AAV6 및 AAV8 전달의 진보는 단순한 전신 정맥내 또는 복강내 주사 후 골격 및 심장 근육의 이들 혈청형의 형질도입을 가능하게 한다. 문헌[Pacak et al., Circ. Res., 99(4): 3-9 (2006)] 및 문헌[Wang et al., Nature Biotech. 23(3):321-8(2005)] 참조. 그러나, AAV를 사용하여 중추 신경계 내의 세포 표적 유형을 표적화하는 것은 수술적 뇌실질 내 주사가 필요하였다. 문헌[Kaplitt et al., "Safety and tolerability of gene therapy with an adeno-associated virus (AAV) borne GAD gene for Parkinson's disease: an open label, phase I trial." Lancet, 369:2097-2105; Marks et al., "Gene delivery of AAV2-neurturin for Parkinson's disease: a double-blind, randomized, controlled trial." Lancet Neurol 9:1164-1172]; 및 문헌[Worgall et al., "Treatment of late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis by CNS administration of a serotype 2 adeno-associated virus expressing CLN2 cDNA." Hum Gene Ther, 19(5):463-74] 참조.

AAV 혈청형 2(AAV2) 게놈의 뉴클레오티드 서열은 문헌[Srivastava et al., J Virol, 45: 555-564 (1983)]에 문헌[Ruffing et al., J Gen Virol, 75: 3385-3392(1994)]에 의해 보정된 바와 같이 제시되어 있다. 바이러스 DNA 복제(rep), 캡시드화/패키징 및 숙주 세포 염색체 통합을 지시하는 시스 작용성 서열은 ITR 내에 포함된다. 3개의 AAV 프로모터(이들의 상대적 맵 위치에 대해 p5, p19 및 p40으로 명명됨)는 rep 및 cap 유전자를 암호화하는 2개의 AAV 내부 오픈 리딩 프레임의 발현을 유도한다. (뉴클레오티드 2107 및 2227에 있는) 단일 AAV 인트론의 차별적 스플라이싱과 짝지어진 2개의 rep 프로모터(p5 및 p19)는 rep 유전자로부터의 4개의 rep 단백질(rep 78, rep 68, rep 52 및 rep 40)의 생성을 초래한다. rep 단백질은 궁극적으로 바이러스 게놈 복제를 담당하는 여러 가지 효소적 특성을 보유한다. cap 유전자는 p40 프로모터로부터 발현되며, 3개의 캡시드 단백질 VP1, VP2 및 VP3을 암호화한다. 선택적인 스플라이싱 및 비공통 번역 개시 부위는 이 3개의 관련된 캡시드 단백질의 생성을 초래한다. 단일 공통 폴리아데닐화 부위는 AAV 게놈의 95번 맵 위치에 위치된다. AAV의 생활사 및 유전학은 문헌[Muzyczka, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 97-129 (1992)]에 검토되어 있다.

AAV로부터 유래된 벡터는 (i) 근섬유 및 뉴런을 포함하는 매우 다양한 비분화 및 분화 세포 유형을 감염(형질도입)시킬 수 있고; (ii) 이들은 바이러스 구조 유전자가 없고, 이로 인해 바이러스 감염에 대한 천연 숙주 세포 반응, 예를 들어, 인터페론-매개 반응을 제거하며; (iii) 야생형 바이러스는 인간에서의 임의의 병리와 결코 관련되지 않고; (iv) 숙주 세포 게놈에 통합될 수 있는 야생형 AAV와 대조적으로, 복제-결핍 AAV 벡터는 일반적으로 에피솜으로서 지속되며, 따라서 종양유전자의 삽입 돌연변이유발 또는 활성화 위험을 제한하고; 그리고 (v) 다른 벡터 시스템과 대조적으로, AAV 벡터는 유의한 면역 반응을 촉발시키지 않으며(ii 참조), 따라서 (이들의 유전자 산물이 거부되지 않는다면) 치료적 이식유전자의 장기간 발현을 부여하기 때문에, 유전자 물질을 전달하는 데 특히 매력적이다.

자기-상보성 아데노-관련 벡터(Self-complementary adeno-associated vector: scAAV)는 유전자 요법에서 사용하기 위해 천연 유래 아데노-관련 바이러스(AAV)로부터 조작된 바이러스 벡터이다. ScAAV는, 암호화 영역이 분자내 이중-가닥 DNA 주형을 형성하도록 설계되었기 때문에 "자기-상보성"으로 지칭된다. 전형적 AAV 게놈이 단일-가닥 DNA 주형이기 때문에, 표준 AAV 게놈 생활사에 대한 속도-제한 단계는 제2 가닥 합성을 수반한다. 그러나, 이는 scAAV 게놈에 대한 경우가 아니다. 감염 시, 제2 가닥의 세포 매개 합성을 기다리기보다는, scAAV의 두 상보성 절반은 회합되어 즉시 복제 및 전사의 준비가 된 하나의 이중 가닥 DNA(dsDNA)를 형성할 것이다.

척수성 근위축증(spinal muscular atrophy: SMA)은, 감소된 SMN 단백질 수준 및 운동 뉴런의 선택적 기능장애를 유발하는 염색체 5q13 상의 생존 운동 뉴런 1 유전자(SMN1)의 상실 또는 돌연변이에 의해 야기되는 신경유전적 장애이다. SMA는 정상 출산의 발생률이 1:10,000인 상염색체 열성, 유아기 질환이다. 문헌[Sugarman et al., "Pan-ethnic carrier screening and prenatal diagnosis for spinal muscular atrophy: clinical laboratory analysis of >72,400 specimens." European journal of human genetics, 20(1): 27-32]. SMA의 모든 형태는 유전에서 상염색체 열성이며, 생존 운동 뉴런 1(SMN1) 유전자의 결실 또는 돌연변이에 의해 야기된다. 인간은 또한 SMN2로 불리는 SMN1 유전자의 두 번째로 거의 동일한 복제물을 지니고 있다. SMN1과 SMN2 유전자는 둘 다 SMN 단백질을 발현시키지만, 그러나, SMN2에 의해 생성된 기능적 전장 단백질의 양은 SMN1에 의해 생성된 것보다 훨씬 더(10 내지 15%만큼) 적다. SMN2는 SMN1 유전자의 상실을 완전히 보상할 수 없기 때문에, 보다 경증 형태의 SMA를 갖는 환자는 일반적으로 보다 높은 SMN2 복제수를 가진다. Feldkotter 등에 의한 대규모 조기 연구에서, SMN2의 2가지 복제물은 제I형 SMA 발생에 대해 97% 예측하고, SMN2의 3가지 복제물은 제II형 SMA 발생에 대해 83% 예측하며, SMN2의 4가지 복제불은 제III형 SMA를 84% 예측하였다. 문헌[Feldkotter et al., "Quantitative analyses of SMN1 and SMN2 based on real-time lightCycler PCR: fast and highly reliable carrier testing and prediction of severity of spinal muscular atrophy." American Journal of Human Genetics, 70(2): 358-368]. 이들 백분율은 변경자(modifier) 돌연변이의 가능한 영향을 반영하지 않기 때문에, 이들은 (유전적 변경자의 부재 하의) 복제수와 임상 표현형간의 관계를 축소해서 언급할 수도 있다. 제I형 SMA를 갖는 113명의 환자 중에서, 1개의 SMN2 복제물을 갖는 9명은 11개월 미만으로 생존하였고, 2개의 SMN2 복제물을 갖는 94명 중 88명이 21개월 미만으로 생존하였으며, 3개의 SMN2 복제물을 갖는 10명 중 8명이 33 내지 66개월로 생존하였다.

제I형 SMA는 유전적 질환으로 인한 영아 사망의 주된 원인이다. 질환 중증도 및 임상 예후는 SMN2의 복제수에 따라 다르다. 이의 가장 통상적이고 중증인 형태(제I형)에서, 저긴장 및 점진적 쇠약은 생애의 처음 몇 개월에 인식되어, 6개월령까지 진단으로 이어지고, 이어서, 2세까지 호흡부전으로 인한 사망을 야기한다. 제I형 SMA는 영아 사망의 주된 유전적 원인이다. 제I형 SMA에서의 운동뉴런 상실은 출생 후 초기에 극심하고(또는 심지어 출생전 기간에 시작될 수도 있음), 환자는 결코 독립적으로 앉기를 수행하지 못한다. 제I형 SMA 환자는 전형적으로 SMN2 유전자의 1 또는 2개의 복제물을 가진다. 대조적으로, 제II형 SMA는 처음 18개월 이내에 나타나고, 이 병태를 앓고 있는 아동은 도움을 받지 않고 앉기를 유지할 수 있지만, 결코 독립적으로 걷기를 할 수 없다. 제II형 SMA 환자는 전형적으로 SMN2 유전자의 3개의 복제물을 가진다. 제III형 SMA 환자는 도움 없이 보행하는 능력을 획득한다. 제III형 루브릭(rubric) 하에, 제IIIa형 환자는 보통 3세 미만에 질환 발병을 나타내는 반면, 제IIIb형 환자는 3세 후에 발병된다. 제II형 및 제III형 SMA 환자의 운동 뉴런은 발달 동안에 적응하고 보상되며 성인 생활까지 지속되는 것으로 나타난다. 제III형 SMA 환자는 전형적으로 SMN2 유전자의 3 또는 4개의 복제물을 가진다. 다양한 신경생리학 및 동물 연구로부터의 결과는 배아 및 출생 후 초기에 운동 뉴런의 조기 상실을 나타내었다. 문헌[Swoboda et al., "Natural history of denervation in SMA: relation to age, SMN2 copy number, and function." Annals of neurology 57(5): 704-12]; 문헌[Le et al., "Temporal requirement for high SMN expression in SMA mice." Human molecular genetics, 20(18): 3578-91]; 문헌[Farrar et al., "Corticomotoneuronal integrity and adaptation in spinal muscular atrophy." Archives of neurology, 69(4): 467-73].

제II형 및 제III형 SMA를 갖는 환자는 상대적으로 안정한 임상 과정을 가진다. 더 나아가, 연구는 결과 차이가 운동 뉴런이 아동의 성장 동안 적응하고 보상되며 성인 생활까지 지속되는 것을 가능하게 하는 SMN2 복제물의 수와 관련된다는 것을 나타낸다. 이는 운동 뉴런 상실이 출생 후 초기에 극심한(또는 특히 생애의 처음 3개월에 나타나는 I형 SMA 환자에 대해, 심지어 출생전 기간에 시작될 수도 있는) 제I형 SMA와 대조적이다. SMN의 과발현은 마우스와 비인간 영장류 둘 다에서 잘 용인되는 것으로 나타났고, (높은 SMN2 복제수를 갖는 제II형, 제III형 및 제IV형 환자에서 알 수 있는 바와 같이) 인간에서의 SMN2의 높은 복제수는 위험을 제기한다. SMA, 예를 들어, 제II형 및 제III형 SMA를 갖는 환자에서 SMN 수준을 증가시키는 것은 치료적 선택사항을 제시한다.

SMA, 예를 들어, 제II형 및 제III형 SMA의 치료 노력은 지금까지 소분자가 SMN 수준을 증가시킬 가능성에 주로 중점을 두었다. 이들은 데아세틸라제 저해제, 예컨대, 발프로산, 부티르산나트륨, 페닐부티르산 및 트리코스타틴 A를 포함한다. 제III형 SMA 환자에서 보이는 보다 경증의 특징에 대해 질환 표현형을 변형시킬 목적으로, 이들 제제는 SMN2 프로모터를 활성화시켜, SMA 동물 모델에서의 전장 SMN 단백질 증가를 초래한다. 문헌[Riessland et al., "SAHA ameliorates the SMA phenotype in two mouse models for spinal muscular atrophy." Human molecular genetics, 19(8): 1492-506]; 문헌[Dayangac-Erden et al., "Carboxylic acid derivatives of histone deacetylase inhibitors induce full length SMN2 transcripts: a promising target for spinal muscular atrophy therapeutics." Arch Med Sci, 7(2): 230-4 2011].

이들 제제, 가장 현저하게는 페닐부티르산, 발프로산, 및 하이드록시우레아 중 몇몇을 사용하는 임상 시험은 충분한 임상적 이점을 초래하지 않았다. 문헌[Darbar et al., "Evaluation of muscle strength and motor abilities in children with Type II and III spinal muscle atrophy treated with valproic acid." BMC Neurol, 11: 36; www.ClinicalTrials.gov.]. FDA는 SMN2 유전자의 스플라이싱을 조절하여, 유전자 결함을 보상함으로써 SMN 단백질 생성을 증가시키도록 설계된 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO) 약물인 뉴시너센(nusinersen)을 최근에 승인하였다. 임상 연구는 운동 기능을 개선시킴에 있어서 약간의 가능성을 나타내었지만; 치료는 사분기 기준으로 척추강내 주사를 통해 무기한으로 투여되어야 하고, 유효성 전에 오랜 유도 기간이 필요하며, 임상 모니터링이 필요한 안전성 고려 사항이 있다. 따라서, 본 명세서에 개시된 것과 같은 대안을 이용하는, 제II형 및 제III형을 포함하는 SMA의 개선된 치료에 대한 필요가 남아있다.

본 명세서에 AAV9 바이러스 벡터를 포함하는 조성물 및 SMA, 예를 들어, 제II형 및 제III형 SMA 환자를 치료하기 위해 이들을 이용하는 방법이 개시된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 SMA, 예를 들어, 제II형 및 제III형 SMA 표현형을 변형시키는 능력을 갖는, 예를 들어, 보다 경증의 질환 진행 과정, 중단된 질환 진행 및/또는 개선된 기능성 발생을 유발하는 AAV9 바이러스 벡터를 척추강내로 주사하는 단계를 포함한다.

본 발명은 SMA, 예를 들어, 제II형 또는 제III형 SMA를 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 재조합 바이러스 벡터, 예를 들어, 본 명세서에 개시된 SMN 이식유전자를 발현시키는 scAAV는 SMN 수준을 증가시키는 치료 방법을 제공할 수 있다. SMN 이식유전자는 작기 때문에, scAAV로 효율적으로 패키징되어, 원형 단일-가닥 AAV 바이러스 벡터에 비해 더 낮은 바이러스 역가를 가능하게 할 수 있다. 그러나, 제II형 및 제III형 SMA 환자는 종종 이후의 연령에 진단되는데, 이들은 rAAV의 안전하고 효과적인 중량-기준 정맥내 투약량을 받기에는 잠재적으로 너무 클 수 있다. 따라서, 바이러스 벡터가 혈액-뇌 장벽을 지나 뇌척수액까지 직접 전달되는 척추강내 투여는 보다 낮은 바이러스 역가를 전달하는 안전하고 효율적인 대안의 방법을 제공할 수 있다.

본 발명은 생존 운동 뉴런(SMN) 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV9 바이러스 벡터를 척추강내로 투여하는 단계를 포함하는 척수성 근위축증(SMA)의 치료가 필요한 환자에서 SMA, 예를 들어, 제II형 또는 제III형 SMA를 치료하는 방법을 제공하되, 바이러스 벡터는 약 1×10¹³ vg 내지 5×10¹⁴ vg의 용량으로 투여된다. 한 가지 이러한 실시형태에서, AAV9 바이러스 벡터는 변형된 AAV2 ITR, 닭 베타-액틴(CB) 프로모터, 거대세포 바이러스(CMV) 급/초기 인핸서, 변형된 SV40 후기 16S 인트론, 소 성장 호르몬(BGH) 폴리아데닐화 신호, 및 비변형 AAV2 ITR을 포함한다. 다른 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 SMN 단백질을 암호화한다. 다른 실시형태에서, AAV9 바이러스 벡터는 서열번호 1을 포함한다. 일부 실시형태에서, 환자는 투여 시 6개월령 이상이다. 다른 실시형태에서, 환자는 투여 시 24개월령 이하, 선택적으로 6개월령 내지 24개월령이다. 다른 실시형태에서, 환자는 투여 시 60개월령 이하, 선택적으로 24개월령 내지 60개월령이다. 일부 실시형태에서, AAV9 바이러스 벡터는 약 5.0×10¹³ vg 내지 3.0×10¹⁴ vg의 용량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, AAV9 바이러스 벡터는 최대 약 6.0×10¹³ vg의 용량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, AAV9 바이러스 벡터는 약 6.0×10¹³ vg의 용량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, AAV9 바이러스 벡터는 최대 약 1.2×10¹⁴ vg의 용량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, AAV9 바이러스 벡터는 약 1.2×10¹⁴ vg의 용량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, AAV9 바이러스 벡터는 최대 약 2.4×10¹⁴ vg의 용량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, AAV9 바이러스 벡터는 약 2.4×10¹⁴ vg의 용량으로 투여된다.

일부 실시형태에서, AAV9 바이러스 벡터는 약 1.0×10¹³ vg 내지 9.9×10¹⁴ vg을 포함하는 단위 용량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, AAV9 바이러스 벡터는 약 1.0×10¹³ vg 내지 5.0×10¹⁴ vg을 포함하는 단위 용량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, AAV9 바이러스 벡터는 약 5.0×10¹³ vg 내지 3.0×10¹⁴ vg을 포함하는 단위 용량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, AAV9 바이러스 벡터는 약 6.0×10¹³ vg을 포함하는 단위 용량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, AAV9 바이러스 벡터는 약 1.2×10¹⁴ vg을 포함하는 단위 용량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, AAV9 바이러스 벡터는 약 2.4×10¹⁴ vg을 포함하는 단위 용량으로 투여된다.

일부 실시형태에서, 환자는 이중 대립유전자(bi-allelic) SMN1 삭제 돌연변이(null mutation) 또는 비활성화 결실을 포함하되, 선택적으로 돌연변이는 SMN1의 엑손 7의 결실을 포함한다. 일부 실시형태에서, 환자는 SMN2의 3개의 복제물을 가진다. 일부 실시형태에서, 환자는 SMN2 유전자의 적어도 1개의 복제물에 대해 엑손 7에서 c.859G>C 치환을 갖지 않는다. 일부 실시형태에서, 치료가 필요한 환자는 1회 이상의 게놈 검사에 의해 결정된다. 일부 실시형태에서, 환자는 약 12개월령 전에 질환 발병을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 환자는 약 10초 이상 동안 도움 없이 앉는 능력을 갖지만, 투여 시 서거나 걸을 수 없다. 일부 실시형태에서, 환자는, 예를 들어, 세계보건기구 다기관 성장 참조 연구(World Health Organization Multicentre Growth Reference Study: WHO-MGRS) 기준에 의해 규정된 바와 같이, 투여 시 도움 없이 앉는 능력을 갖는다. 일부 실시형태에서, 환자는 투여 후 약 1 내지 24개월, 예를 들어, 12개월에 평가할 때, 예를 들어, Bayley Scales of Infant and Toddler Development®(베일리 영유아 발달 평가 도구)에 의해 규정된 바와 같이, 투여 후 적어도 약 3초 동안 지지 없이 서 있는 능력을 가진다. 일부 실시형태에서, 환자는, 예를 들어, 투여 후 약 1 내지 24개월, 예를 들어, 약 12개월에 평가할 때, 예를 들어, Bayley Scales of Infant and Toddler Development®에 의해 규정된 바와 같이, 투여 후 도움 없이 보행하는 능력을 가진다. 일부 실시형태에서, 환자는, 투여 후 약 1 내지 24개월, 예를 들어, 약 12개월에 평가할 때, 예를 들어, Bayley Scales of Infant and Toddler Development®에 의해 규정된 바와 같이, 투여 후 적어도 5가지 단계를 독립적으로 취하는 능력을 가진다. 일부 실시형태에서, 환자는, 투여 후 약 1 내지 24개월, 예를 들어, 약 12개월에 평가할 때, 예를 들어, Bayley Scales of Infant and Toddler Development®에 의해 규정된 바와 같이, 치료 시 기준 측정으로부터 치료 후의 변화를 나타낸다.

일부 실시형태에서, 환자는 투여 후 약 1 내지 24개월, 예를 들어, 약 12개월에 평가할 때, 투여 후 중증의 척추측만증, 예를 들어, X-선 검사 상에서 분명한 50° 이상의 만곡도를 갖지 않는다. 일부 실시형태에서, 환자는 척추강내 요법의 요추 천자 절차 또는 투여가 금지되지 않는다. 일부 실시형태에서, 환자는 척추측만증 회복술 또는 절차를 이전에 받은 적이 없고, 선택적으로 환자는 투여 후 6개월 내지 3년 이내에, 예를 들어, 1년 이내에 척추측만증 회복술 또는 절차를 갖지 않는다. 일부 실시형태에서, 환자는 투여 전에 그리고/또는 투여 후에 침습적 호흡기 지원(ventilatory support)의 사용이 필요하지 않다. 일부 실시형태에서, 환자는 투여 전에 독립적으로 서거나 보행하는 이력을 갖지 않는다. 일부 실시형태에서, 환자는 투여 전 및/또는 후에 위영양관을 사용하지 않는다. 일부 실시형태에서, 환자는 치료 시 활성 바이러스 감염(인간 면역결핍 바이러스(HIV) 또는 B형 또는 C형 간염 또는 지카 바이러스에 양성인 혈청학을 포함)을 갖지 않는다. 일부 실시형태에서, 환자는 투여 전 4주 이내에 중증의 비-폐/기도 감염(예를 들어, 신우신염 또는 뇌수막염)을 갖지 않는다. 일부 실시형태에서, 환자는 투여 전에 수반되는 질병, 예를 들어, 발작 장애, 진성 당뇨병, 특발성 저칼슘뇨증 또는 증상성 심근병증으로 알려진 주요 신장 또는 간 장애를 갖지 않는다. 일부 실시형태에서, 환자는 투여 전에 박테리아성 뇌수막염 또는 뇌 또는 척수 질환의 병력을 갖지 않는다. 일부 실시형태에서, 환자는 투여 전에 프레드니손 또는 기타 글루코코르티코스테로이드 또는 부형제에 대해 알려진 알레르기 또는 과민증을 갖지 않는다. 일부 실시형태에서, 환자는 투여 전에 요오드 또는 요오드-함유 생성물에 대해 알려진 알레르기 또는 과민증을 갖지 않는다. 일부 실시형태에서, 환자는 근병증 또는 신경병증을 치료하기 위해 약물을 취하지 않는다. 일부 실시형태에서, 환자는 투여 전 3개월 이내에 면역억제 요법, 혈장분리교환술, 면역조절제, 예컨대, 아달리무맙을 받고 있지 않다.

일부 실시형태에서, 환자는 투여 전에, 예를 들어, ELISA 결합 면역분석에 의해 결정할 때 항-AAV9 항체 역가가 1:25, 1:50, 1:75 또는 1:100 이하이다. 일부 실시형태에서, 환자는 투여 전에 정상 상한의 약 3배 미만의 감마-글루타밀 트랜스퍼라제 수준, 약 3.0 ㎎/㎗ 미만의 빌리루빈 수준, 약 1.0 ㎎/㎗ 미만의 크레아티닌 수준, 약 8 내지 18 g/㎗의 Hgb 수준, 및/또는 ㎣당 약 20000개 미만의 백혈구 계수 중 하나 이상을 가진다. 일부 실시형태에서, 환자는 투여 전에 SMA를 치료하기 위한 의도로 연구 또는 승인된 화합물 제품 또는 요법을 투여 받은 적이 없다. 일부 실시형태에서, AAV9 바이러스 벡터는 조영제와 함께 투여되되, 선택적으로 조영제는 이오헥솔을 포함한다. 일부 실시형태에서, 투여되는 조영제의 용적은 약 1.0 내지 2.0 ㎖, 예를 들어, 약 1.5 ㎖이되, 선택적으로 조영제는 투여 전에, 예를 들어, 투여 전 24시간 미만, 12시간 미만, 6시간 미만, 5시간 미만, 4시간 미만, 3시간 미만, 2시간 미만, 1시간 미만, 30분 미만에 또는 투여 직전에 AAV9 바이러스 벡터와 혼합된다. 일부 실시형태에서, 조영제 및 AAV9 바이러스 벡터는 순차적으로 투여되되, 예를 들어, 조영제는 (예를 들어, 척추강내로) 처음 투여되고, AAV9 바이러스 벡터는 조영제의 투여에 후속하여 (예를 들어, 척추강내로) 투여된다. 일부 실시형태에서, 조영제 및 AAV9 바이러스 벡터는 순차적으로 투여되되, 예를 들어, AAV9 바이러스 벡터는 (예를 들어, 척추강내로) 처음 투여되고, 조영제는 AAV9 바이러스 벡터의 투여에 후속하여 (예를 들어, 척추강내로) 투여된다. AAV9 바이러스 벡터 및 조영제가 순차적으로 투여되는 실시형태에서, AAV9 바이러스 벡터 및 조영제의 투여는 서로 2시간 이내에, 1시간 이내에, 45분 이내에, 30분 이내에, 15분 이내에, 10분 이내에 또는 5분 이내에 투여된다. 일부 실시형태에서, 환자에 투여되는 AAV9 바이러스 벡터 및 조영제의 총 용적은 약 10 ㎖, 약 9 ㎖ 또는 약 8 ㎖를 초과하지 않는다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 진정 치료(sedation) 또는 마취를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 환자는 AAV9 바이러스 벡터의 투여 동안에 그리고/또는 투여 후에 트렌델렌버그 체위(Trendelenburg position)로 위치된다. 일부 실시형태에서, 환자는 AAV9 바이러스 벡터의 투여 후 약 10 내지 60분 동안, 예를 들어, 약 15분 동안 약 30°로 머리를 아래로 숙이고 위치된다.

일부 실시형태에서, 환자는 AAV9 바이러스 벡터의 투여 전 적어도 약 1 내지 48시간, 예를 들어, 약 24시간에 경구 스테로이드를 투여 받는다. 일부 실시형태에서, 환자는 바이러스 벡터의 투여 후 적어도 약 10 내지 60일, 예를 들어, 약 30일 동안 경구 스테로이드를 투여 받는다. 일부 실시형태에서, 경구 스테로이드는 1일 1회 투여된다. 일부 실시형태에서, 경구 스테로이드는 1일 2회 투여된다. 일부 실시형태에서, 환자는 바이러스 벡터의 투여 후 ALT 및/또는 AST의 수준에 대해 모니터링되고, 경구 스테로이드는 30일 후에 AST 및/또는 ALT 수준이 정상 상한의 2배 미만 또는 약 120 IU/ℓ의 미만이 될 때까지 계속해서 투여된다. 일부 실시형태에서, 환자는 AAV9 바이러스 벡터의 투여 후 T 세포 반응 수준에 대해 모니터링되고, 경구 스테로이드는 30일 후에 환자로부터의 샘플, 예를 들어, 혈액 샘플에서의 T 세포 반응이 10⁶개의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)당 100개 미만의 스팟 형성 세포(spot forming cell: SFC)로 떨어질 때까지 계속해서 투여된다.

일부 실시형태에서, 경구 스테로이드는 약 1 ㎎/㎏의 용량으로 투여된다.

일부 실시형태에서, 경구 스테로이드는 AST 및 ALT가 정상 상한의 2배 미만 또는 약 120 IU/ℓ 미만이 된 후에 테이퍼링된다(taper). 일부 실시형태에서, 테이퍼링은 2주 동안 약 0.5 ㎎/㎏/일 다음에 2주 이상 동안 약 0.25 ㎎/㎏/일의 계단식 증가를 포함한다. 일부 실시형태에서, 경구 스테로이드는 약 1 ㎎/㎏의 용량으로 30일 동안 투여되고, 이어서, 0.5 ㎎/㎏/일까지 2주 동안 테이퍼링 다운(tapering down)한 후에, 0.25 ㎎/㎏/일로 2주 이상 동안 투여된다. 일부 실시형태에서, 경구 스테로이드는 프레드니솔론 또는 동등물이다.

일부 실시형태에서, 치료 효능은 Bayley Scales of Infant and Toddler Development® 척도 및/또는 해머스미스 운동 기능 척도-확장판(Hammersmith Functional Motor Scale-Expanded: HFMSE)을 이용하여 결정된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 AAV9 바이러스 벡터의 투여와 동시에 또는 연속해서 환자에게 제2 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 이러한 실시형태에서, 제2 치료제는 근육 향상제 또는 신경보호제를 포함한다. 다른 이러한 실시형태에서, 제2 치료제는 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 SMN1 및/또는 SMN2를 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 치료제는 뉴시너센 및/또는 스타물루맙(stamulumab)을 포함한다. 일부 실시형태에서, AAV9 바이러스 벡터 게놈의 양은 ddPCR을 이용하여 측정된다. 일부 실시형태에서, 환자는 투여 후, 예를 들어, ELISA 결합 면역분석에 의해 결정될 때, 항-AAV9 항체 역가가 1:25, 1:50, 1:75 또는 1:100 이상이고, 약 1 내지 8주 동안 또는 역가가 1:25, 1:50, 1:75 또는 1:100 미만으로 감소될 때까지 모니터링된다. 일부 실시형태에서, 환자는 투여 후, 예를 들어, ELISA 결합 면역분석에 의해 결정될 때, 항-AAV9 항체 역가가 1:25, 1:50, 1:75 또는 1:100 이상이고, 역가가 1:25, 1:50, 1:75 또는 1:100 미만으로 감소될 때까지 스테로이드, 예를 들어, 프레드니솔론이 투여된다. 일부 실시형태에서, 환자는 혈소판 계수가 투여 전에 약 67,000개의 세포/㎖ 초과 또는 약 100,000개의 세포/㎖ 초과, 또는 약 150,000개의 세포/㎖ 초과이다. 일부 실시형태에서, 환자는 투여 후 혈소판 계수가 약 67,000개의 세포/㎖ 미만, 또는 약 100,000개의 세포/㎖ 미만, 또는 약 150,000개의 세포/㎖ 미만이며, 약 1 내지 8주 동안 또는 혈소판 계수가 약 67,000개의 세포/㎖, 또는 약 100,000개의 세포/㎖ 초과, 또는 약 150,000개의 세포/㎖ 초과로 증가될 때까지 모니터링된다. 일부 실시형태에서, 환자는 투여 후 혈소판 계수가 약 67,000개의 세포/㎖ 미만이고, 혈소판 수혈로 치료된다. 일부 실시형태에서, 환자는 AAV9 바이러스 벡터의 투여 전에 정상 간 기능을 가진다. 일부 실시형태에서, 환자는 투여 전에 간 트랜스아미나제 수준이 약 8 내지 40 U/ℓ 미만이다.

일부 실시형태에서, 간 트랜스아미나제는 AST, ALT, 및 이들의 조합물로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, AAV9 바이러스 벡터는 척추강내 투여에 적합한 약제학적 제형이다.

본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 방법에 따라 SMA, 예를 들어, 제II형 또는 제III형 척수성 근위축증(SMA)의 치료에서의 AAV9 바이러스 벡터의 용도를 제공한다.

본 발명은 척추강내 투여에 적합한 AAV9 바이러스 벡터 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하되, AAV9 바이러스 벡터는 변형된 AAV2 ITR, 닭 베타-액틴(CB) 프로모터, 거대세포 바이러스(CMV) 급/초기 인핸서, 변형된 SV40 후기 16S 인트론, 소 성장 호르몬(BGH) 폴리아데닐화 신호 및 비변형 AAV2 ITR을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 SMN 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, AAV9 바이러스 벡터는 서열번호 1을 포함한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 조영제를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 조영제는 약 1.0 내지 2.0 ㎖, 예를 들어, 약 1.5 ㎖의 양으로 존재한다.

일부 실시형태에서, AAV9 바이러스 벡터 및 조영제의 총 용적은 약 10 ㎖, 약 9 ㎖ 또는 약 8 ㎖를 초과하지 않는다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 추가적인 치료제를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에 기재된 임의의 치료방법에서 사용하기 위한 것이다.

일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 1.0×10¹³ vg 내지 9.9×10¹⁴ vg을 포함하는 단위 용량이다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 1.0×10¹³ vg 내지 5.0×10¹⁴ vg을 포함하는 단위 용량이다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 5.0×10¹³ vg 내지 3.0×10¹⁴ vg을 포함하는 단위 용량이다.

일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 6.0×10¹³ vg을 포함하는 단위 용량이다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 1.2×10¹⁴ vg을 포함하는 단위 용량이다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 2.4×10¹⁴ vg을 포함하는 단위 용량이다.

일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 다음 중 적어도 하나를 포함한다: (a) 약 pH 7.7 내지 8.3, (b) 약 390 내지 430 mOsm/㎏, (c) 용기당 크기가 25 ㎛ 이상인 약 600개 미만의 입자, (d) 용기당 크기가 10 ㎛ 이상인 약 6000개 미만의 입자, (e) 약 1.7×10¹³ 내지 5.3×10¹³ vg/㎖의 게놈 역가, (f) 1.0×10¹³ vg당 약 3.9×10⁸ 내지 8.4×10¹⁰ IU의 감염성 역가, (g) 1.0×10¹³ vg당 약 100 내지 300 ㎍의 총 단백질, (h) 약 20 내지 80 ppm의 Pluronic F-68 함량, (i) 약 70 내지 130%의 상대 효력, (j) 7.5×10¹³ vg/㎏의 용량에서 24일 이상의 SMNΔ7 마우스 모델에서의 중위 생존, (k) 약 5% 미만의 빈 캡시드, (l) 및 약 95% 이상의 총 순도, 및 (m) 약 0.13 EU/㎖ 이하의 내독소.

일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 다음의 조건 중 적어도 하나를 포함한다: (a) 1.0×10¹³ vg당 약 0.09 ng 미만의 벤조나제, (b) 약 30 ㎍/g(ppm) 미만의 세슘, (c) 약 20 내지 80 ppm의 폴록사머(Poloxamer) 188, (d) 1.0×10¹³ vg당 약 0.22 ng 미만의 BSA, (e) 1.0×10¹³ vg당 약 6.8×10⁵ pg 미만의 잔여 플라스미드 DNA, (f) 1.0×10¹³ vg당 약 1.1×10⁵ pg 미만의 잔여 hcDNA, (g) 1.0×10¹³ vg당 약 4 ng 미만의 rHCP, (h) 약 pH 7.7 내지 8.3, (i) 약 390 내지 430 mOsm/㎏, (j) 용기당 크기가 25 ㎛ 이상인 약 600개 미만의 입자, (k) 용기당 크기가 10 ㎛ 이상인 약 6000개 미만의 입자, (l) 약 1.7×10¹³ 내지 5.3×10¹³ vg/㎖의 게놈 역가, (m) 1.0×10¹³ vg당 약 3.9×10⁸ 내지 8.4×10¹⁰ IU의 감염성 역가, (n) 1.0×10¹³ vg당 약 100 내지 300 ㎍의 총 단백질, (o) 약 70 내지 130%의 상대 효력, 및 (p) 약 5% 미만의 빈 캡시드.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물의 방법 또는 용도는 투여 전 점수에 비해 해머스미스 운동 기능 척도-확장판 상에서 개선된 점수를 초래한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물의 방법 또는 용도는 투여 전 점수에 비해 Bayley Scales of Infant and Toddler Development®, 3판(Bayley®-III) 상에서 개선된 점수를 초래한다.

도 1은 AAV 투여 후 처리군 마우스 및 대조군 마우스의 체질량을 나타낸다.
도 2는 제II형 또는 제III형 SMA를 갖는 영아 및 아동의 I상, 개방 표지 단일 용량 투여 연구의 초기 연구 설계를 나타낸다. 환자는 용량 비교 안전성 연구에서 AVXS-101을 투여 받는다.
도 3은 24개월령 후에 평가된 용량 A(6.0×10¹³ vg; 다이아몬드로 표시) 또는 용량 B(1.2×10¹⁴ vg) 척추강내 AVXS-101을 투여 받고 있는 제2형 SMA 환자에서 해머스미스 기능성 운동 확대 지수(HFMSE)에 대해 가장 높음 내지 가장 낮음까지 랭킹된 기준으로부터의 변화의 워터폴(waterfall) 플롯을 나타낸다. 주입 시 6개월령 내지 2세의 환자에 대한 결과는 회색 막대로 도시되고; 검정색 막대는 주입 시 2 내지 5세를 나타낸다.
도 4는 제2형 SMA를 갖는 개개 환자의 HFMSE 점수를 나타낸다.
도 5는 치료 시 6개월 내지 5세의 환자에서 HFMSE에 의해 측정할 때, AVXS-101 치료에 대한 반응을 나타낸다.
도 6은 1.2×10¹⁴ vg의 용량을 투여 받은 치료 시 2세 내지 5세의 환자에서 HFMSE에 의해 측정할 때, AVXS-101 치료에 대한 반응을 나타낸다.
도 7은 24개월령 이상이면서 60개월령 미만의 그룹에 대해 최대 12개월까지 HFMSE 점수에서 기준으로부터의 변화의 스파게티 플롯(spaghetti plot)(1차 PNCR 분석) - ITT 세트를 나타낸다.
도 8은 24개월령 이상이면서 60개월령 미만의 그룹에 대해 최대 12개월까지 HFMSE 점수에서 기준으로부터의 변화의 스파게티 플롯(민감도 PNCR 분석) - ITT 세트를 나타낸다.
도 9는 투약 시 24개월령 미만의 환자에 대해 각 기준 방문 후 최대 12개월까지 Bayley Scales®에 의해 결정된 바와 같은 소근육 운동(fine motor) 점수의 기준으로부터의 변화의 스파게티 플롯- ITT 세트를 나타낸다.
도 10은 투약 시 24개월령 미만의 환자에 대해 각 기준 방문 후 최대 12개월까지 Bayley Scales®에 의해 결정된 바와 같은 대근육 운동(gross motor) 점수의 기준으로부터의 변화의 스파게티 플롯- ITT 세트를 나타낸다.
도 11은 투약 시 24개월령 이상이면서 60개월 미만인 환자에 대해 각 기준 방문 후 최대 12개월까지 Bayley Scales®에 의해 결정된 바와 같은 소근육 운동 점수의 기준으로부터의 변화의 스파게티 플롯- ITT 세트를 나타낸다.
도 12는 투약 시 24개월령 이상이면서 60개월 미만인 환자에 대해 각 기준 방문 후 최대 12개월까지 Bayley Scales®에 의해 결정된 바와 같은 대근육 운동 점수의 기준으로부터의 변화의 스파게티 플롯- ITT 세트를 나타낸다.
도 13은 24개월령 후 연구를 계속한, 투약 시 24개월령 미만인 환자에 대해 각 방문 시 각 기준 후에 HFMSE의 기준으로부터의 변화의 스파게티 플롯 - ITT 세트를 나타낸다.

본 발명을 더 양호하게 이해하기 위해, 특정 예시적인 실시형태는 본 명세서에서 논의된다. 또한, 이해를 돕기 위해 특정 용어가 논의된다.

일부 실시형태에서, "벡터"는 적절한 제어 요소와 결합될 때 복제될 수 있고 세포 간에 유전자 서열을 전달할 수 있는 임의의 유전자 요소, 예컨대, 플라스미드, 파지, 트랜스포존, 코스미드, 염색체, 바이러스, 비리온 등을 의미한다. 따라서, 상기 용어는 클로닝 및 발현 비히클뿐만 아니라 바이러스 벡터를 포함한다.

일부 실시형태에서, "AAV 벡터"는 AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8 및 AAV-9를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 아데노-관련 바이러스 혈청형으로부터 유래된 벡터를 의미한다. AAV 벡터는 전체 또는 부분적으로 결실된 AAV 야생형 유전자 중 하나 이상, 예를 들어, rep 및/또는 cap 유전자를 가질 수 있지만, 기능성 측접 ITR 서열을 보유한다. 기능성 ITR 서열은 AAV 비리온의 구제, 복제 및 패키징에 필수적이다. 따라서, AAV 벡터는 본 명세서에서 바이러스의 복제 및 패키징(예를 들어, 기능성 ITR)을 시스로 제공하는 적어도 해당 서열을 포함하는 것으로 정의된다. ITR은 야생형 뉴클레오티드 서열이 필요하지 않으며, 서열이 기능적 구제, 복제 및 패키징을 제공하는 한, 예를 들어, 뉴클레오티드의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 변경될 수 있다. 일 실시형태에서, 벡터는 AAV-2 유래 ITR을 갖는 AAV-9 벡터이다. 또한, "AAV 벡터"는 표적 세포 핵에 대한 벡터 핵산의 전달을 위해 효율적인 비히클을 제공하는 단백질 껍질 또는 캡시드를 의미한다.

일부 실시형태에서, "scAAV"는 유전자 요법에서 사용하기 위해 천연 유래 아데노-관련 바이러스(AAV)로부터 조작된 바이러스 벡터인, 자기-상보성 아데노-관련 바이러스(scAAV)를 의미한다. scAAV는, 암호화 영역이 분자내 이중-가닥 DNA 주형을 형성하도록 설계되었기 때문에 "자기-상보성"으로 지칭된다.

일부 실시형태에서, "재조합 바이러스"는, 예를 들어, 이종성 핵산 작제물의 입자 내로의 첨가 또는 삽입에 의해 유전자 변경된 바이러스를 의미한다. "재조합"은 "r"로 약칭될 수 있으며, 예를 들어, rAAV는 재조합 AAV를 지칭할 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "AAV"는 "재조합 AAV" 또는 "rAAV"를 포함하는 것으로 본다.

일부 실시형태에서, "AAV 비리온"은 완전한 바이러스 입자, 예컨대 야생형(wt) AAV 바이러스 입자(AAV 캡시드 단백질 외피와 결합된 선형, 단일-가닥 AAV 핵산 게놈을 포함)를 의미한다. 이와 관련하여, 상보성 센스, 예를 들어, "센스" 또는 "안티센스" 가닥 중 하나의 단일-가닥 AAV 핵산 분자는 임의의 하나의 AAV 비리온으로 패키징될 수 있으며, 가닥 둘 다 동일하게 감염성이다.

일부 실시형태에서, 용어 "재조합 AAV 비리온", "rAAV 비리온", "AAV 벡터 입자", "완전 캡시드" 및 "완전 입자"는 AAV ITR에 의해 양 측면 상에 측접되는 관심 대상의 이종성 뉴클레오티드 서열을 캡시드화하는, AAV 단백질 껍질을 포함하는 감염성, 복제-결합 바이러스로서 본 명세서에서 정의된다. rAAV 비리온은 AAV 벡터, AAV 헬퍼 기능 및 이에 도입된 부속 기능을 구체화하는 서열을 갖는 적합한 숙주 세포에서 생성된다. 이런 방식에서, 후속 유전자 전달을 위해 감염성 재조합 비리온 입자에 (관심 대상의 재조합 뉴클레오티드 서열을 포함하는) AAV 벡터를 패키징하는 데 제공되는 AAV 폴레펩티드를 암호화할 수 있는 숙주 세포가 제공된다.

달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속한 분야의 당업자에게 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 열거된 모든 참고문헌은 이들의 전문이 참조에 의해 포함된다. 참고문헌의 용어 또는 논의가 본 발명과 상충되는 경우, 후자로 조절할 것이다.

본 명세서에 사용되는 바와 같은 단어의 단수 형태는 또한 문맥에서 달리 명확하게 표시되지 않는 한 복수 형태를 포함하며; 예로서, 단수 형태는 단수 또는 복수인 것으로 이해된다. 예로서, "구성요소"는 1개 이상의 구성요소를 의미한다. 용어 "또는"은 구체적 문맥이 달리 표시하지 않는 한 "및/또는"을 의미할 것이다.

"포함하는" 또는 "포함하다"와 같은 변형은 언급된 구성요소, 정수 또는 단계, 또는 구성요소, 정수 또는 단계의 그룹의 포함을 나타내는 것으로 이해될 것이지만, 임의의 다른 구성요소, 정수 또는 단계, 또는 구성요소, 정수 또는 단계들의 그룹을 제외하지는 않을 것이다. 본 명세서 전체적으로 단어 "이루어진" 또는 "이루어지다"와 같은 변형은 언급된 구성요소, 정수 또는 단계, 또는 구성요소, 정수 또는 단계의 그룹의 포함, 및 임의의 다른 구성요소, 정수 또는 단계, 또는 구성요소, 정수 또는 단계들의 그룹의 제외를 나타내는 것으로 이해될 것이다. 본 명세서 전체적으로 단어 "본질적으로 이루어진" 또는 "본질적으로 이루어지다"와 같은 변형은 언급된 구성요소, 정수 또는 단계, 또는 구성요소, 정수 또는 단계의 그룹, 및 본 발명 및/또는 청구범위의 기본적 및 신규한 특징에 실질적으로 영향을 미치지 않는 임의의 다른 구성요소, 정수 또는 단계, 또는 구성요소, 정수 또는 단계들의 포함을 나타내는 것으로 이해될 것이다.

약은 언급된 값의 +/-10% 이내, 예를 들어, +/-10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05% 또는 0.01%로서 이해될 수 있다. 백분율 값에 대한 언급에서 사용될 때, "약"은 ±1% 이내(예를 들어, "약 5%"는 4% 내지 6% 이내로서 이해될 수 있음) 또는 ±0.5% 이내(예를 들어, "약 5%"는 4.5% 내지 5.5% 이내로서 이해될 수 있음)로서 이해될 수 있다. 문맥으로부터 달리 분명하지 않은 한, 본 명세서에 제공되는 모든 수치적 값은 용어 "약"에 의해 변형된다. 본 명세서에서 사용되는 모든 범위는 종점을 포함한다.

rAAV 바이러스 벡터

일 양상에서, 본 명세서에 rAAV 게놈이 개시된다. 일부 실시형태에서, rAAV 게놈은 SMN 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 측접하는 하나 이상의 AAV ITR을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드는 전사 제어 DNA 요소, 예를 들어, 프로모터 DNA, 하나 이상의 인핸서 DNA 및/또는 표적 세포에서 기능성인 폴리아데닐화 신호 서열 DNA에 작동 가능하게 연결되어 유전자 카세트를 형성한다. 유전자 카세트는 또한 포유류 세포에서 발현될 때 RNA 전사체의 가공을 용이하게 하기 위해 인트론 서열을 포함할 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 rAAV 게놈은 AAV rep 및 cap DNA를 결여한다. rAAV 게놈의 AAV DNA(예컨대, ITR)는, AAV 혈청형 AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10 및 AAV-11을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 재조합 바이러스가 유래될 수 있는 임의의 AAV 혈청형으로부터 유래할 수 있다. AAV 혈청형의 게놈의 뉴클레오티드 서열은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, AAV-1의 완전한 게놈은 젠뱅크 수탁번호 NC_002077에서 제공되고; AAV-2의 완전한 게놈은 젠뱅크 수탁번호 NC 001401 및 문헌[Srivastava et al., Virol., 45: 555-564 {1983)]에서 제공되며: AAV-3의 완전한 게놈은 젠뱅크 수탁번호 NC_1829에 제공되며; AAV-4의 완전한 게놈은 젠뱅크 수탁번호 NC_001829에 제공되고; AAV-5 게놈은 젠뱅크 수탁번호 AF085716에서 제공되며; AAV-6의 완전한 게놈은 젠뱅크 수탁번호 NC_00 1862에서 제공되고; AAV-7 및 AAV-8 게놈의 적어도 일부는 각각 젠뱅크 수탁번호 AX753246 및 AX753249에 제공되며; AAV-9 게놈은 문헌[Gao et al., J. Virol., 78: 6381-6388 (2004)]에서 제공되고; AAV-10 게놈은 문헌[Mol. Ther., 13(1): 67-76 (2006)]에 제공되며; AAV-11 게놈은 문헌[Virology, 330(2): 375-383 (2004)]에서 제공된다.

본 명세서에 사용되는 바와 같은 "pSMN" 벡터 플라스미드는 SMN 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 즉, SMN cDNA 발현 카세트를 포함하되, 카세트는 아데노-관련 바이러스 역위 말단 반복부(ITR) 서열에 의해, 예를 들어, SMN 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 "좌측" 및 "우측"에 측접된다. 일부 실시형태에서, SMN을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 인간 SMN 서열, 예를 들어, 천연 유래 인간 SMN 서열 또는 이의 동형단백질, 변이체 또는 돌연변이체이다. 일부 실시형태에서, ITR 서열은 천연, 변이체 또는 변형된 AAV ITR 서열이다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 ITR 서열은 천연, 변이체 또는 변형된 AAV2 ITR 서열이다. 일부 실시형태에서, 두 ITR 서열은 둘 다 천연, 변이체 또는 변형된 AAV2 ITR 서열이다. 일부 실시형태에서, "좌측" ITR은 자기-상보성 게놈의 생성을 가능하게 하는 변형된 AAV2 ITR 서열이고, "우측" ITR은 천연 AAV2 ITR 서열이다. 일부 실시형태에서, "우측" ITR은 자기-상보성 게놈의 생성을 가능하게 하는 변형된 AAV2 ITR 서열이고, "좌측" ITR은 천연 AAV2 ITR 서열이다. 일부 실시형태에서, pSMN 플라스미드는 CMV 인핸서/닭 베타-액틴("CB") 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, pSMN 플라스미드는 유인원 바이러스 40(SV40) 인트론을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, pSMN 플라스미드는 소 성장 호르몬(BGH) 폴리아데닐화(폴리A) 종결 신호를 추가로 포함한다. 상기 논의된 성분 중 하나 이상에 대해 사용될 수 있는 예시적인 서열을 이하의 표 1에 나타낸다. 일부 실시형태에서, 이하의 표 1에 나타내는 모든 서열이 사용된다. 일부 실시형태에서, "AVXS-101"은 표 1의 모든 서열을 이용하며 용어 pSMN의 범주 내에 속하는 벡터 작제물의 비제한적 예이다. 이들 벡터의 실시형태 및 이들을 제조 및 정제하는 방법은 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용되는, 예를 들어, PCT/US2018/058744에서 제공된다.

일부 실시형태에서, pSMN 벡터는 SMN cDNA 발현 카세트, 변형된 AAV2 ITR, 닭 베타-액틴(CB) 프로모터, 거대세포 바이러스(CMV) 급/초기 인핸서, 변형된 SV40 후기 16S 인트론, 소 성장 호르몬(BGH) 폴리아데닐화 신호 및 비변형 AAV2 ITR을 포함할 수 있다. 변형 및 비변형 ITR은 SMN cDNA 발현 카세트에 대하여 어느 하나의 배향(즉, 5' 또는 3')에 도입될 수 있다.

일부 실시형태에서, 벡터 작제물 서열은, 예를 들어, AAV9 비리온에 캡시드화된다. 이들 실시형태에서, 캡시드화는 안정한, 기능 이식유전자, 예를 들어, 완전 기능성 인간 SMN 이식유전자를 전달할 수 있는 비복제성, 재조합 AAV9 캡시드이다. 일부 실시형태에서, 캡시드는 VP2 및 VP3이 VP1의 두 절단 형태가 되고, 모두 공통 C-말단 서열을 갖도록 교번의 스플라이싱에 의해 생성되는, 예를 들어, 1:1:10 비의 60종의 바이러스 단백질(VP1, VP2, VP3)로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 제조 과정의 생성물, 예를 들어, 약물 제품은 안정한, 완전 기능성 인간 SMN 이식유전자를 전달하기 위해 비복제성, 재조합 AAV9 캡시드를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 캡시드는 VP2 및 VP3이 VP1의 두 절단 형태가 되고, 모두 공통 C-말단 서열을 갖도록 교번의 스플라이싱에 의해 생성되는 1:1:10 비의 60종의 바이러스 단백질(VP1, VP2, VP3)로 이루어진다. 이들 벡터 작제물의 실시형태 및 이들을 제조 및 정제하는 방법은 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용되는, 예를 들어, PCT/US2018/058744에서 제공된다.

다양한 실시형태에서, pSMN 벡터 작제물, 예를 들어, AVXS-101 벡터 작제물의 DNA 서열은 서열번호 1을 포함한다:

일부 실시형태에서, pSMN 플라스미드, 예를 들어, AVX101에 의해 암호화된 SMN 단백질의 아미노산 서열은 하기를 포함한다:

일부 실시형태에서, AAV 캡시드 단백질 VP1, VP2, VP3은 동일한 전사체로부터 유래된다. 이들은 대안의 개시 부위를 갖지만, 카복시 말단을 공유한다. 이하에, VP1 특이적 아미노산 서열을 검정색으로 나타내고, 볼드체로 표시한다. VP1 및 VP2에 공통되는 아미노산 서열을 밑줄 및 이탤릭체로 표시한다. 모두 3가지의 캡시드 단백질에 공통되는 아미노산 서열을 볼드체 및 이탤릭체로 표시한다.

일 실시형태에서, AAV 캡시드 단백질은 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 암호화하는 전사체로부터 유래된다.

다양한 실시형태에서, 본 명세서에서 rAAV 게놈을 포함하는 DNA 플라스미드가 개시된다. DNA 플라스미드는 AAV9 캡시드 단백질이 있는 감염성 바이러스 입자 내로 rAAV 게놈을 조립하기 위하여 AAV의 헬퍼 바이러스(예컨대, 아데노바이러스, E1-결실 아데노바이러스 또는 헤르페스 바이러스) 감염이 허용되는 세포에 전달된다. 패키징될 AAV 게놈, rep 및 cap 유전자, 그리고 헬퍼 바이러스 기능이 세포로 제공되는 rAAV 입자를 생산하는 기술은 당업계에서 이용 가능하다. 일부 실시형태에서, rAAV의 생성은 단일 세포(본 명세서에서 패키징 세포로서 나타냄) 내에 존재하는 다음의 구성성분을 수반한다: rAAV 게놈 및 헬퍼 바이러스 기능에서 분리된(즉, 기능이 없는) rAAV 게놈, AAV rep 및 cap 유전자. 위형(pseudotyped) rAAV의 생성은 예를 들어, WO 01/83692에 개시되어 있으며, 이는 그 전체가 본 명세서에 참조로 포함된다. 다양한 실시형태에서, AAV 캡시드 단백질은 변형되어 재조합 벡터의 전달을 향상시킬 수 있다. 캡시드 단백질의 변형은 일반적으로 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제2005/0053922호 및 미국 특허 제2009/0202490호(이들의 개시 내용은 그의 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨) 참조.

rAAV 생성의 일반적 원칙은, 예를 들어, 문헌[Carter, 1992, Current Opinions in Biotechnology, 1533-539]; 및 문헌[Muzyczka, 1992, CUM Topics in Microbial. and Immunol., 158:97-129]에서 검토된다. 다양한 접근법이 다음 문헌에 기재되어 있다: 문헌[Ratschin et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072 (1984); Hennonat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6466 (1984)]; 문헌[Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251 (1985)]; 문헌[McLaughlin et al., J. Virol., 62:1963 (1988)]; 및 문헌[Lebkowski et al., 1988 Mol. Cell. Biol., 7:349 (1988). Samulski et al. (1989, J. Virol., 63:3822-3828)]; 미국 특허 제5,173,414호; WO 95/13365 및 대응하는 미국 특허 제5,658,776호; WO 95/13392; WO 96/17947; PCT/US98/18600; WO 97/09441 (PCT/US96/14423); WO 97/08298(PCT/US96/13872); WO 97/21825(PCT/US96/20777); WO 97/06243 (PCT/FR96/01064); WO 99/11764; 문헌[Perrin et al. (1995) Vaccine 13:1244-1250]; 문헌[Paul et al. (1993) Human Gene Therapy 4:609-615]; 문헌[Clark et al. (1996) Gene Therapy 3:1124-1132]; 미국 특허 제5,786,211호; 미국 특허 제5,871,982호; 및 미국 특허 제6,258,595호. 또한, 본 명세서에 개시된 rAAV는 PCT/US2018/058744의 개시내용에 따라 제조, 정제, 제작 및/또는 제형화될 수 있다. 앞서 언급한 문헌은 rAAV 제조, 정제, 생산, 제작 및 제형화에 관한 문헌의 해당 부문을 특히 강조하여, 이들의 전문이 본 명세서에 참조에 의해 포함된다.

다른 양상에서, SMN 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 rAAV, 예컨대 본 명세서에서 논의된 rAAV9는 "rAAV SMN"으로서 지칭된다. 일부 실시형태에서, rAAV SMN 게놈은 서열에 제1 AAV2 ITR, 거대세포 바이러스 인핸서를 갖는 닭-β 액틴 프로모터, SV40 인트론, SMN을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 소 성장 호르몬으로부터의 폴리아데닐화 신호 서열, 및 제2 AAV2 ITR을 가진다. 일부 실시형태에서, SMN을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어, 젠뱅크 수탁번호 MN_000344.2, 젠뱅크 수탁번호 #NM_017411, 또는 임의의 다른 적합한 인간 SMN 동형 단백질에 제시되거나 이들로부터 유래된, 인간 SMN 유전자이다. 예시적인 SMN 서열은 하기 서열을 포함한다:

SMN DNA의 보존적 뉴클레오티드 치환이 또한 상정된다(예를 들어, 젠뱅크 수탁번호 NM_000344.2의 625번 위치에서 구아닌의 아데닌으로의 변화). 일부 실시형태에서, 상기 게놈은 AAV rep 및 cap DNA가 없으며, 즉, 게놈의 ITR 사이에 AAV rep 또는 cap DNA가 없다. 상정된 SMN 폴리펩티드는 NCBI 단백질 데이터베이스 번호 NP_000335.1에 제시된 인간 SMN1 폴리펩티드를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 실시형태에서, SMN DNA는 인간 SMN 폴리펩티드(예를 들어, 수탁번호 Q16637, 동형 단백질 1(Q16637-1)에 의해 확인되는 인간 SMN 단백질)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또한 SMN1-변경자 폴리펩티드 플라스틴-3(PLS3)이 상정된다[Oprea et al., Science 320(5875): 524-527 (2008)]. 다른 폴리펩티드를 암호화하는 서열이 SMN DNA를 치환할 수 있다.

약제학적 조성물

다양한 실시형태에서, 본 발명의 바이러스 입자(바이러스 입자로서 지칭됨)는 척추강내 투여에 적합한 약제학적 조성물로 제공될 수 있다. 조성물은 바이러스 입자에 추가로 1종 이상의 비활성 성분 및/또는 1종 이상의 추가적인 활성 성분을 포함하는 제형으로 제공될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 당업계에 공지된 구성성분 및 기법을 이용하여 포유류 대상체, 예를 들어, 인간에서 척추강내 투여에 적합한 제형으로 제형화될 수 있다.

일부 실시형태에서, 약제학적 제형은 (a) 생존 운동 뉴런(SMN) 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV9 바이러스 벡터, (b) 트리스(Tris) 완충제, (c) 염화마그네슘, (d) 염화나트륨, 및 (e) 폴록사머(예를 들어, 폴록사머 188)를 포함하되, 약제학적 조성물은 보존제를 포함하지 않는다. 제형의 일 실시형태에서, AAV9 바이러스 벡터는 변형된 AAV2 ITR, 닭 베타-액틴(CB) 프로모터, 거대세포 바이러스(CMV) 급/초기 인핸서, 변형된 SV40 후기 16s 인트론, 소 성장 호르몬(BGH) 폴리아데닐화 신호, 및 비변형 AAV2 ITR을 포함한다. 제형의 일 실시형태에서, 트리스 완충제 농도는 약 10 내지 30 nM, 예를 들어, 약 20 mM이다. 일 실시형태에서, 제형의 pH는 약 7.7 내지 약 8.3, 예를 들어, 약 pH 8.0(예를 들어, (전문이 참조에 의해 원용된) USP <791>에 의해 측정)이다. 제형의 일 실시형태에서, 염화마그네슘 농도는 약 0.5 내지 1.5 mM, 예를 들어, 약 1 mM이다. 제형의 일 실시형태에서, 염화나트륨 농도는 약 100 내지 300 mM, 예를 들어, 약 200 mM이다. 일 실시형태에서, 제형은 약 0.001 내지 0.15% w/v 폴록사머 188, 예를 들어, 약 0.005% w/v 폴록사머 188을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제형은 약 1 내지 8×10¹³ vg/㎖, 예를 들어, 약 1.9 내지 4.2×10¹³ vg/㎖의 AAV9 바이러스 벡터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제형은 약 1 내지 8×10¹³ vg/㎖를 포함하고, AAV9 바이러스 벡터는 약 6.0×10¹³ vg의 단위 용량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 제형은 약 1.9 내지 4.2×10¹³ vg/㎖를 포함하고, AAV9 바이러스 벡터는 약 6.0×10¹³ vg의 단위 용량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 제형은 약 1 내지 8×10¹³ vg/㎖를 포함하고, AAV9 바이러스 벡터는 약 1.2×10¹⁴ vg의 단위 용량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 제형은 약 1.9 내지 4.2×10¹³ vg/㎖를 포함하고, AAV9 바이러스 벡터는 약 1.2×10¹⁴ vg의 단위 용량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 제형은 약 1 내지 8×10¹³ vg/㎖를 포함하고, AAV9 바이러스 벡터는 약 2.4×10¹⁴ vg의 단위 용량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 제형은 약 1.9 내지 4.2×10¹³ vg/㎖를 포함하고, AAV9 바이러스 벡터는 약 2.4×10¹⁴ vg의 단위 용량으로 투여된다.

용액 또는 현탁액으로서 제형화될 때, 전달계는 허용 가능한 담체, 예를 들어, 수성 담체를 포함할 수 있다. 다양한 수성 담체, 예를 들어, 물, 완충수 및/또는 식염수가 사용될 수 있다. 제형은 또한 용액 등삼투성(iso-osmotic) 또는 등장성을 제공하는 등장화제, 예를 들어, NaCl, 당, 만니톨 등을 포함할 수 있다. 제형은 또한 조성물을 계면 및 전단에 대해 안정화시키기 위한 계면활성제, 예를 들어, 폴리솔베이트 20, 폴리솔베이트 80 등을 포함할 수 있다. 제형은, 예를 들어, 아세트산염, 석신산염, 시트르산염, 히스티딘, 인산염 또는 트리스 완충제 등을 이용하여 최적의 pH 및 안정제를 유지하도록 완충될 수 있다. 이들 조성물은 멸균 기법을 이용하여 멸균될 수 있거나, 멸균 여과될 수 있다. 얻어진 수용액은 사용을 위해 있는 그대로 패키징되거나, 동결건조되고, 동결건조 제제는 투여 전에 멸균 용액과 합쳐진다.

조성물, 예를 들어, 약제학적 조성물은 생리적 조건에 거의 가깝도록 약제학적으로 허용 가능한 보조 물질, 예컨대 pH 조절제 및 완충제, 장성 조절제, 습윤제 등, 예를 들어, 아세트산나트륨, 락트산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 솔비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올리에이트 등을 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 보존제를 포함한다. 일부 다른 실시형태에서, 약제학적 조성물은 보존제를 포함하지 않는다.

일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 선택적으로 또한 1종 이상의 추가적인 활성 또는 비활성 성분, 예를 들어, 조영제(예를 들어, Omnipaque™ 180)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에 개시된 SMN 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터를 포함하고, 또한 조영제(예를 들어, Omnipaque™, 또는 이오헥솔-함유제)를 포함한다. 일부 이러한 실시형태에서, 조영제는 약제학적 조성물과 사전 혼합된다. 일부 다른 실시형태에서, 조영제는 약제학적 조성물과 사전 혼합되지 않는다. 일부 실시형태에서, 조영제는 척추강내 투여 직전에 약제학적 조성물과 혼합된다. 일부 실시형태에서, 조영제(예를 들어, Omnipaque™, 이오헥솔 등)는 운동 뉴런 전달을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 조영제(예를 들어, Omnipaque™, 이오헥솔 등)는 척추강내 바늘이 지주막하 공간으로 가는 것을 돕는다.

일부 실시형태에서, 조영제는 본 명세서에 개시된 SMN 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터와 조합하여 투여되되, 조영제는 투여 전에 바이러스 벡터와 사전 혼합 또는 공동제형화되지 않는다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 SMN 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조영제 및 바이러스 벡터는 순차적으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 조영제는 단일 볼루스로서 투여 직전에 SMN 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터와 혼합된다.

일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어, 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된 PCT/US2018/058744에 따라 제조 및 정제될 수 있다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은, 예를 들어, qPCR 또는 ddPCR에 의해 평가할 때, 약 7% 미만의 빈 캡시드(예를 들어, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 이하, 또는 이 사이의 임의의 백분율의 빈 캡시드)를 가진다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 다음의 순도 특징 중 하나 이상을 가진다: 1.0×10¹³ vg당 0.09 ng 미만의 벤조나제, 30 ㎍/g(ppm) 미만의 세슘, 약 20 내지 80 ppm의 폴록사머 188, 1.0×10¹³ vg당 0.22 ng 미만의 BSA, 1.0×10¹³ vg당 6.8×10⁵ pg 미만의 잔여 플라스미드 DNA, 1.0×10¹³ vg당 1.1×10⁵ pg 미만의 잔여 hcDNA, 및 1.0×10¹³ vg당 4 ng 미만의 rHCP.

다양한 실시형태에서, 약제학적 조성물은 참조 표준의 +/-20% 사이, +/-15% 사이, +/-10% 사이, 또는 +/-5% 사이의 효력을 보유한다. 일 실시형태에서, 효력은 문헌[Foust et al., Nat. Biotechnol., 28(3), pp. 271-274 (2010)]의 방법을 이용하여 참조 표준에 대해 평가된다. 임의의 적합한 참조 표준이 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 약제학적 조성물은 SMAΔ7 마우스로 시험한 바와 같은 생체내 효력을 가진다. 실시형태에서, 7.5×10¹³ vg/㎏ 용량이 주어진 시험 마우스는 중위 생존이 15일 초과, 20일 초과, 22일 초과 또는 24일 초과이다. 일 실시형태에서, 약제학적 조성물은 시험관내 세포 기반 분석에 의해 시험할 때, 효력이 참조 표준 및/또는 적합하나 대조군의 50 내지 150%, 60 내지 140% 또는 70 내지 130%이다.

일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 1×10¹³ vg/㎖ 내지 1×10¹⁵ vg/㎖, 예를 들어, 약 1 내지 8×10¹³ vg/㎖의 농도의 rAAV 바이러스 벡터를 가진다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 빈 바이러스 캡시드가 약 10% 미만, 약 8% 미만, 약 7% 미만 또는 약 5% 미만이다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 숙주 세포 단백질이 1×10¹³ vg/㎖당 약 100 ng/㎖ 미만이다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 잔여 숙주 세포 DNA(hcDNA)가 1×10¹³ vg/㎖당 약 5×10⁶ pg/㎖ 미만, 약 1×10⁶ pg/㎖ 미만, 약 7.5×10⁵ pg/㎖ 미만, 또는 6.8×10⁵ pg/㎖ 미만이다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 잔여 숙주 세포 단백질(rHCP)이 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 10 ng 미만, 약 8 ng 미만, 약 6 ng 미만, 또는 약 4 ng 미만이다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물 중 rAAV(예를 들어, AAV9) 바이러스 벡터 게놈/㎖의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 100%는 기능성이다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 잔여 플라스미드 DNA가 1×10¹³ vg/㎖당 1.7×10⁶ pg/㎖, 또는 1×10¹³ vg/㎖당 1×10⁵ pg/㎖ 내지 1×10¹³ vg/㎖당 1.7×10⁶ pg/㎖ 이하이다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 벤조나제 농도가 1.0×10¹³vg당 0.2 ng, 1.0×10¹³ vg당 0.1 ng 미만, 또는 1.0×10¹³ vg당 0.09 ng 미만이다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 소 혈청 알부민(BSA) 농도가 1.0×10¹³ vg당 0.5 ng, 1.0×10¹³ vg당 0.3 ng, 또는 1.0×10¹³ vg당 0.22 ng 미만이다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 내독소 수준이 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 1 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.75 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.5 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.4 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.35 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.3 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.25 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.2 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.13 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.1 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.05 EU/㎖ 미만, 또는 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.02 EU/㎖ 미만이다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 세슘 농도가 100 ㎍/g(ppm) 미만, 50 ㎍/g(ppm) 미만, 또는 30 ㎍/g(ppm) 미만이다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 약 10 내지 100 ppm, 15 내지 90 ppm, 또는 약 20 내지 80 ppm의 폴록사머 188를 갖는 rAAV 바이러스 벡터를 수득한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 용기당 크기가 25 ㎛ 이상인 2000개 미만, 1500개 미만, 1000개 미만 또는 600개 미만의 입자를 가진다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 용기당 크기가 10 ㎛ 이상인 10000개 미만, 8000개 미만, 1000개 미만 또는 6000개 미만의 입자를 가진다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 pH가 7.5 내지 8.5, 7.6 내지 8.4 또는 7.8 내지 8.3이다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 삼투몰농도가 330 내지 490 mOsm/㎏, 360 내지 460 mOsm/㎏ 또는 390 내지 430 mOsm/㎏이다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 감염성 역가가 1.0×10¹³ vg당 약 1.0×10⁸ 내지 10.0×10¹⁰IU, 1.0×10¹³ vg당 약 2.5×10⁸ 내지 9.0×10¹⁰IU, 또는 1.0×10¹³ vg당 약 3.9×10⁸ 내지 8.4×10¹⁰IU이다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 시험관내 세포 기반 분석에 기반하여 참조 표준 및/또는 적합한 대조군에 비해 약 30 내지 150%, 약 60 내지 140%, 또는 약 70 내지 130% 상대 효력을 가진다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 총 단백질 수준이 1.0×10¹³ vg당 약 10 내지 500 ㎍, 1.0×10¹³ vg당 약 50 내지 400 ㎍, 또는 1.0×10¹³ vg당 약 100 내지 300 ㎍이다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 7.5×10¹³ vg/㎏ 용량이 주어진 SMNΔ7 마우스에서의 15일 초과, 20일 초과, 22일 초과 또는 24일 초과의 중위 생존에 의해 결정한 바와 같은 생체내 효력을 가진다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 상기 기준 중 하나 이상(예를 들어, 모두)의 조합을 충족시킨다.

본 발명은 또한 치료가 필요한 환자에서 SMA, 예를 들어, 제II형 또는 제III형 SMA를 치료하기 위한 키트를 제공하되, 키트는 본 명세서에 개시된 약제학적 조성물의 1회 이상의 용량, 예를 들어, 본 명세서에 개시된 SMN 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터의 유효량 또는 용량을 포함하고 선택적으로 또한 1종 이상의 추가적인 활성 또는 비활성 성분, 예를 들어, 조영제(예를 들어, Omnipaque™ 180)를 포함하는 것, 및 약제학적 제제 또는 조성물을 사용하는 방법에 대한 지침을 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 본 명세서에 개시된 약제학적 조성물의 1회 이상의 용량, 예를 들어, 본 명세서에 개시된 SMN 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터의 유효량 또는 용량을 포함하고 또한 선택적으로 조영제(예를 들어, Omnipaque™, 또는 이오헥솔-함유제)를 포함하는 것을 포함한다.

일부 실시형태에서, 키트는 약제학적 조성물과 동일한 용기에서 사전혼합된 조영제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 키트 내 하나 이상의 용기에 제공된 조영제 및 하나 이상의 용기에 제공된 약제학적 조성물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조영제는 척추강내 투여 전에 약제학적 조성물과 혼합된다.

일부 실시형태에서, 키트는 바이러스 벡터 약제학적 조성물의 하나 이상의 바이알을 포함한다. 일부 실시형태에서, 각 바이알은 최대 또는 약 6.0×10¹³ vg의 용량으로 바이러스 벡터 약제학적 조성물(예를 들어, 단위 용량)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트의 바이러스 벡터의 각 바이알(예를 들어, 각 단위 용량)은 약 6.0×10¹³ vg 용량으로 약제학적 조성물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트의 바이러스 벡터의 각 바이알(예를 들어, 각 단위 용량)은 최대 또는 약 1.2×10¹⁴ vg 용량으로 약제학적 조성물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트의 바이러스 벡터의 각 바이알(예를 들어, 각 단위 용량)은 약 1.2×10¹⁴ vg 용량으로 약제학적 조성물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트의 바이러스 벡터의 각 바이알(예를 들어, 각 단위 용량)은 최대 또는 약 2.4×10¹⁴ vg 용량으로 약제학적 조성물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트의 바이러스 벡터의 각 바이알(예를 들어, 각 단위 용량)은 약 2.4×10¹⁴ vg 용량으로 약제학적 조성물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터 약제학적 조성물은 약 0.1 내지 5.0×10¹³ vg/㎖의 농도이다. 일부 실시형태에서, 각 바이알은 단일 용량의 rAAV 바이러스 벡터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 각 바이알은 단일 용량 초과의 rAAV 바이러스 벡터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 각 바이알은 단일 용량 미만의 rAAV 바이러스 벡터를 포함한다.

rAAV9 바이러스 벡터의 용도

다양한 실시형태에서, 본 명세서에서 rAAV SMN 폴리뉴클레오티드를 포함하는 게놈을 갖는 rAAV9를 투여하는 단계를 포함하는 SMA, 예를 들어, 제II형 또는 제III형 SMA에 대한 치료가 필요한 환자에게 폴리뉴클레오티드를 전달하는 방법이 개시된다. 일부 실시형태에서, 상기 전달은 본 명세서에 개시된 rAAV9를 투여하는 단계를 포함하는, 환자의 중추 신경계에 대한 척추강내 전달이다. 일부 실시형태에서, rAAV9는 조영제와 함께 투여된다. 일부 이러한 실시형태에서, rAAV9 및 조영제는, 예를 들어, 단일 약제학적 조성물로 동시에 투여된다. 다른 이러한 실시형태에서, rAAV9 및 조영제는 순차적으로 투여된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 조영제가 먼저 투여되고, rAAV9는 조영제 투여에 후속하여 투여된다. 일부 실시형태에서, rAAV9가 먼저 투여되고, 조영제는 AAV9 바이러스 벡터 투여에 후속하여 투여된다. AAV9 바이러스 벡터 및 조영제가 순차적으로 투여되는 실시형태에서, AAV9 바이러스 벡터 및 조영제의 투여는, 예를 들어, 서로 약 2시간 이내에, 1시간 이내에, 45분 이내에, 30분 이내에, 15분 이내에, 10분 이내에 또는 5분 이내에 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 적어도 1종의 조영제 및 rAAV9가 척추강내로 투여된다. 일부 실시형태에서, 조영제와 rAAV9는 둘 다(동시에 투여되든 또는 순차적으로 투여되든) 척추강내로 투여된다.

일부 실시형태에서, 조영제는 비이온성, 저삼투성 조영제이다. 일부 실시형태에서, 조영제는 환자의 중추 신경계에서 표적 세포의 형질도입을 증가시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 조영제는 지주막하 공간에 직접 전달을 표적화하는 것을 도울 수 있다. 일부 실시형태에서, rAAV9 게놈은 자기 상보성 게놈이다. 다른 실시형태에서, rAAV9 게놈은 단일 가닥 게놈이다.

일부 실시형태에서, rAAV 바이러스 벡터는 이것이 뇌척수액(CSF)에 도달되도록 척추관 또는 지주막하 공간에 척추강내로 전달된다. 일부 실시형태에서, rAAV 바이러스 벡터는 전달 부위 원위의 영역까지 CSF 내에서 확산될 수 있다. 일부 실시형태에서, rAAV 바이러스 벡터는 뇌 영역에 전달된다. 일부 실시형태에서, rAAV 바이러스 벡터는 운동 피질 및/또는 뇌줄기에 전달된다. 일부 실시형태에서, rAAV 바이러스 벡터는 척수에 전달된다. 일부 실시형태에서, rAAV 바이러스 벡터는 아래 운동 뉴런에 전달된다. 본 발명의 실시형태는 신경 및 아교세포에 rAAV 바이러스 벡터를 전달하기 위해 rAAV9를 사용한다. 일부 실시형태에서, 아교세포는 미세아교세포, 희소돌기신경교 또는 성상세포이다. 일부 실시형태에서, rAAV9는 슈반 세포(Schwann cell)에 rAAV 바이러스 벡터를 전달하기 위해 사용된다.

투여될 rAAV 바이러스 벡터의 역가는, 예를 들어, 특정 rAAV, 투여 방식, 치료 목표, 치료 중인 개체의 연령 및 특징, 및 표적화 중인 세포 유형(들)에 따라 다를 수 있다. 역가는 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다. rAAV의 역가는 ㎖당 약 1×10⁶, 약 1×10⁷, 약 1×10⁸, 약 1×10⁹, 약 1×10¹⁰, 약 1×10¹¹, 약 1×10¹², 약 1×10¹³, 약 1×10¹⁴, 약 1×10¹⁵ 이상의 DNase 저항 입자(DNase resistant particle: DRP)의 범위일 수 있다. 투약량은 또한, 벡터 게놈(vector genome: vg) 단위로 표현될 수 있다. 게놈 역가는 본 출원, 문헌[Lock et al.]에 기재된 바와 같은 ddPCR, 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 방법을 이용하여 결정될 수 있다. 투약량은 또한 인간에 대한 투여 시기에 기반하여 달라질 수 있다. rAAV의 이들 투약량은 성인 또는 신생아에서 킬로그램 체중당 약 1×10¹¹ vg/㎏, 약 1×10¹² vg/㎏, 약 1×10¹³ vg/㎏, 약 1×10¹⁴ vg/㎏, 약 1×10¹⁵ vg/㎏, 약 1×10¹⁶ vg/㎏의 범위일 수 있다.

일부 실시형태에서, rAAV9는 1.0×10¹³ vg 내지 9.9×10¹⁴ vg의 용량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, rAAV9는 5.0×10¹³ vg 내지 3.0×10¹⁴ vg의 용량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, rAAV9는 최대 6.0×10¹³ vg의 용량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, rAAV9는 약 6.0×10¹³ vg의 용량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, rAAV9는 최대 1.2×10¹⁴ vg의 용량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, rAAV9는 약 1.2×10¹⁴ vg의 용량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, rAAV9는 최대 2.4×10¹⁴ vg의 용량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, rAAV9는 약 2.4×10¹⁴ vg의 용량으로 투여된다.

일부 실시형태에서, rAAV9는 약 1.0×10¹³ vg 내지 9.9×10¹⁴ vg의 단위 용량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, rAAV9는 약 1.0×10¹³ vg 내지 5.0×10¹⁴ vg의 단위 용량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, rAAV9는 약 5.0×10¹³ vg 내지 3.0×10¹⁴ vg의 단위 용량으로 투여된다.

일부 실시형태에서, rAAV9는 약 6.0×10¹³ vg의 단위 용량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, rAAV9는 약 1.2×10¹⁴ vg의 단위 용량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, rAAV9는 약 2.4×10¹⁴ vg의 단위 용량으로 투여된다.

용량은 임의의 적합한 방법에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 벡터에 특이적인 프라이머를 이용하는 PCR은 상대 측정을 제공할 수 있는 반면, qPCR은 더 작은 샘플 및 절대 측정을 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, ddPCR이 사용된다. ddPCR은 물-기름 에멀션 액적 기술에 기반한 디지털 PCR을 수행하기 위한 방법이다. 문헌[Baker et al., "Digital PCR hits its stride." Nature Methods, 9(6):541-544]. 문헌[Sykes et al., "Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution." Biotechniques, 13(3)444-449]. 샘플은 수많은 액적으로 분획화되고, 주형 분자의 PCR 증폭은 각 개개 액적에서 일어난다. 반드시 표준 곡선을 만들거나 고증폭 효율을 갖는 프라이머를 가질 필요는 없으며, 따라서 ddPCR은 전형적으로 전통적인 PCR-기반 기법만큼 많은 샘플을 사용하지는 않는다. 상업적으로 입수 가능한 ddPCR 기계의 예는 BioRad QX100 ddPCR 및 레인댄스 레인드롭 디지털 PCR(RainDance Raindrop Digital PCR)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일 실시형태에서, 용량은 PCR을 이용하여 결정된다. 다른 실시형태에서, 용량은 qPCR을 이용하여 결정된다. 다른 실시형태에서, 용량은 디지털 액적 PCR (ddPCR)을 이용하여 결정된다. 일부 실시형태에서, 다수의 방법이 사용된다. 일부 실시형태에서, PCR-기반 방법은 SMN 유전자를 표적화하는 특이적으로 설계된 프라이머 및 프로브를 이용하여 캡시드화된 AAV9 바이러스 게놈을 검출하고 정량화한다. 다른 실시형태에서, PCR-기반 방법은 닭 베타-액틴 프로모터를 표적화하는 특이적으로 설계된 프라이머 및 프로브를 이용하여 캡시드화된 AAV9 바이러스 게놈을 검출하고 정량화한다. 다른 실시형태에서, PCR-기반 방법은 CMV 인핸서를 표적화하는 특이적으로 설계된 프라이머 및 프로브를 이용하여 캡시드화된 AAV9 바이러스 게놈을 검출하고 정량화한다. 다른 실시형태에서, PCR-기반 방법은 ITR 서열을 표적화하는 특이적으로 설계된 프라이머 및 프로브를 이용하여 캡시드화된 AAV9 바이러스 게놈을 검출하고 정량화한다. 다른 실시형태에서, PCR-기반 방법은 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호를 표적화하는 특이적으로 설계된 프라이머 및 프로브를 이용하여 캡시드화된 AAV9 바이러스 게놈을 검출하고 정량화한다. 일부 실시형태에서, 효력은 적합한 시험관내 세포 분석 또는 생체내 동물 모델을 이용하여 측정된다. 예를 들어, 효력 또는 기능성 AAV SMN 바이러스 입자%는 SMA의 동물 모델, 예를 들어, SMNΔ7 마우스 또는 적합한 세포주, 예를 들어, SMAΔ7 마우스의 피질로부터 단리된 1차 신경 전구 세포(neural progenitor cell: NPC)를 이용하는 정량적 세포-기반 분석을 이용하여 결정될 수 있다. 일 실시형태에서, 효력은 문헌[Foust et al., Nat. Biotechnol., 28(3), pp. 271-274 (2010)]의 방법을 이용하여 참조 표준과 비교하여 평가된다. 임의의 적합한 참조 표준이 사용될 수 있다. 추가로, 본 명세서에 개시된 rAAV 바이러스 벡터의 기능성 바이러스 벡터의 용량, 순도 및 백분율을 결정하기 위한 예시적인 방법이 또한 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용되는 PCT/US2018/058744의 개시내용에 제공된다.

투여될 rAAV 바이러스 벡터의 제형은, 예를 들어, 척추강내 투여 방법, 용량 용적, 및 약제학적 부형제에 따라 다를 수 있다. 문헌[Grouls et al, "General considerations in the formulation of drugs for spinal delivery." Spinal Drug Delivery, Chapter 15, Elsevier Science, Yaksh edition]. 일부 실시형태에서, rAAV 바이러스 벡터는 척추강내 투여에 적합한 치료 제형으로 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, rAAV 바이러스 벡터는 척추강내로 볼루스 주사로서 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, rAAV 바이러스 벡터는 척추강내로 느린 주입으로서 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, rAAV 바이러스 벡터는 멸균 등장성 약물 용액으로 제형화될 수 있다. 일부 실시형태에서, rAAV 바이러스 벡터는 식염수 용액으로 제형화될 수 있다. 일부 실시형태에서, rAAV 바이러스 벡터는 인공 CSF, 예를 들어, 엘리엇 B 용액(Elliott's B solution)으로 제형화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 치료 제형은 투여 전에 여과된다.

다양한 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법 및 물질은, 예를 들어, SMN1의 기능성 복제물이 없는 환자에 대한 척추강내 투여에 의한 SMA의 치료에서 지시되고 사용될 수 있다. 인간은 또한 SMN2로 불리는 SMN 유전자의 두 번째로 거의 동일한 복제물을 지니고 있다. 문헌[Lefebvre et al. "Identification and characterization of a spinal muscular atrophy-determining gene." Cell, 80(1):155-65]. 문헌[Monani et al. "Spinal muscular atrophy: a deficiency in a ubiquitous protein; a motor-neuron specific disease." Neuron, 48(6):885-896]. SMN1과 SMN2 유전자는 둘 다 SMN 단백질을 발현시키지만, 그러나 SMN2는 엑손 7에서 번역 침묵 돌연변이를 포함하고, 이는 SMN2 전사체에서 엑손 7의 비효율적 포함을 초래한다. 따라서, SMN2는 엑손 7을 결여하는 SMN의 절단 형태(절단 형태가 우세한 형태임)와 전장 SMN 단백질을 둘 다 생성한다. 그 결과, SMN2에 의해 생성된 기능적 전장 단백질의 양은 SMN1에 의해 생성된 것보다 훨씬 더(70 내지 90%만큼) 적다. 문헌[Lorson et al. "A single nucleotide in the SMN gene regulates splicing and is responsible for spinal muscular atrophy." PNAS, 96(11) 6307-6311]. 문헌[Monani et al, "A single nucleotide difference that alters splicing patterns distinguishes the SMA gene SMN1 from the copy gene SMN2." Hum Mol Genet 8(7):1177-1183]. SMN2는 SMN1 유전자의 상실을 완전히 보상할 수 없기 때문에, 경증 형태의 SMA를 갖는 환자는 일반적으로 보다 높은 SMN2 복제수를 가진다. 문헌[Lefebvre et al., "Correlation between severity and SMN protein level in spinal muscular atrophy." Nat Genet 16(3):265-269]. 문헌[Park et al., "Spinal muscular atrophy: new and emerging insights from model mice." Curr Neurol Neurosci Rep 10(2):108-117]. SMA를 갖는 개체 중 95% 초과는 SMN2 유전자의 적어도 1개의 복제물을 보유한다. SMN2 복제수가 유일한 표현형 변경자가 아님을 주의한다. 특히, SMN2 유전자의 엑손 7에서 c.859G>C 변이체는 양성 질환 변경자로서 보고되었다. 이 특정 돌연변이를 갖는 환자는 덜 중증인 질환 표현형을 가진다. 문헌[Prior et al., "A positive modified of spinal muscular atrophy in the SMN2 gene." Am J Hum Genet 85(3):408-413]. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 rAAV SMN은 SMN2 유전자의 엑손 7에서 SMN2 유전자의 1개 초과의 복제물, 2개 초과의 복제물, 3개 초과의 복제물, 4개 초과의 복제물 또는 5개 초과의 복제물을 갖고/갖거나 c.859G>C 변이체가 없는 제II형 SMA 환자에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 rAAV SMN은 SMN2 유전자의 엑손 7에서 SMN2 유전자의 2개 초과의 복제물, 3개 초과의 복제물, 4개 초과의 복제물 또는 5개 초과의 복제물을 갖고/갖거나 c.859G>C 변이체가 없는 제III형 SMA 환자에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 rAAV SMN은 제II형 SMA 환자에게 척추강내로 투여된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 rAAV SMN은 제III형 SMA 환자에게 척추강내로 투여된다.

제I형 SMA(영아 발병 또는 베르드니히-호프만병으로도 불림)는 SMA 증상이 출생 시 또는 6개월령까지 존재하는 경우이다. 이 유형에서, 아기는 전형적으로 낮은 근 긴장도(저긴장), 약한 울음 및 호흡곤란을 가진다. 이들은 종종 연하 및 빨기에 곤란을 느끼며, 도움 없이 앉을 수 있는 발달 이정표에 도달되지 못 한다. 이들은 종종 저긴장, 운동 기술 지연, 불량한 머리 가누기, 라운드 숄더 자세 및 관절의 과운동성으로부터 선택된 SMA 증상 중 하나 이상을 나타낸다. 전형적으로, 이 아기들은 SMN2 유전자의 2개의 복제물을 가지며, 하나는 각 염색체 5 상에 있다. 모든 새로운 SMA 사례의 절반 이상이 제I형 SMA이다. 제I형 SMA에 대해, 환자의 약 80%는 SMN2 유전자의 1 또는 2개의 복제물을 가진다.

이어서, 제II형 또는 중간 SMA는 SMA가 7 내지 18개월령에 발병될 때 그리고 아동이 독립적으로 서거나 보행하기 전이다. 제II형 SMA를 갖는 아동은 일반적으로 적어도 3개의 SMN2 유전자를 가지며, 제II형 SMA 환자의 약 82%는 SMN2 유전자의 3개의 복제물을 가진다. 후기 발병 SMA(제III형 및 제IV형 SMA, 경증의 SMA, 성인-발병 SMA 및 쿠겔베르그-웰란더병(Kugelberg-Welander disease)으로도 알려짐)는 가변적인 쇠약 수준을 초래한다. 제III형 SMA는 18개월 후에 발병되며, 아동은 도움이 필요할 수는 있지만 독립적으로 서고, 보행할 수 있다. 제III형 SMA 환자 중에서, 약 96%는 SMN2 유전자의 3 또는 4개의 복제물을 가진다. 제IV형 SMA는 성인기에 발병되며, 사람들은 이들의 성인기 동안 보행할 수 있다. 제III형 또는 제IV형 SMA를 갖는 사람들은 일반적으로 상당량의 전장 SMN 단백질이 생성될 수 있는 4 내지 8개의 SMN2 유전자를 가진다.

일 실시형태에서, rAAV, 예를 들어, 본 명세서에 개시된 rAAV9 벡터는 SMA, 예를 들어, 제II형 또는 제III형 SMA를 치료하기 위해 척추강내로 투여될 수 있다. 용어 "치료하다", "치료" 및 다른 관련된 용어 형태는, 예를 들어, 척추강내로, 유효 용량 또는 유효 다회 용량의 본 명세서에 개시된 바와 같은 rAAV를 포함하는 조성물을 치료가 필요한 동물(인간을 포함)에게 투여하는 단계를 포함한다. 용량이 장애/질환 증상의 발병 전에 투여될 경우, 투여는 예방적이다. 용량이 장애/질환의 발생 후에 투여될 경우, 투여는 치료적이다. 실시형태에서, 유효 용량은 치료 중인 장애/질환 상태와 관련된 적어도 하나의 증상을 부분적으로 또는 완전히 완화하고(즉, 제거하거나 감소시키고)/하거나, 장애/질환 상태로의 진행을 늦추거나 방지하고/하거나, 장애/질환 상태의 진행을 늦추거나 방지하고/하거나, 질환 정도를 감소시키고/시키거나, 질환의 (부분적 또는 전체적) 관해를 초래하고/하거나 생존을 연장시키는 용량이다. 치료를 위해 상정된 질환 상태의 예는 본 명세서에 제시된다.

일 실시형태에서, 본 발명의 rAAV9 조성물은 SMA, 예를 들어, 제II형 또는 제III형 SMA에 대한 치료가 필요한 환자에게 척추강내로 투여된다.

일부 실시형태에서, 환자는 0 내지 72개월령이다. 일부 다른 실시형태에서, 환자는 6 내지 60개월령이다. 일부 실시형태에서, 환자는 6 내지 24개월령이다. 일부 실시형태에서, 환자는 적어도 6개월령이다. 일부 실시형태에서, 환자는 24개월령 초과이다.

일부 실시형태에서, 환자는 (암호화된 SMN1 단백질 비기능성을 제공하는 임의의 돌연변이를 포함하는) SMN1 유전자의 1개의 복제물에서 하나 이상의 돌연변이, 예를 들어, 삭제 돌연변이를 가진다. 일부 실시형태에서, 환자는 SMN1 유전자의 2개의 복제물에서 하나 이상의 돌연변이, 예를 들어, 삭제 돌연변이를 가진다. 일부 실시형태에서, 환자는 SMN1 유전자의 모든 복제물에서 하나 이상의 돌연변이, 예를 들어, 삭제 돌연변이를 가진다. 일부 실시형태에서, 환자는 SMN1 유전자의 1개의 복제물에서 결실을 가진다. 일부 실시형태에서, 환자는 SMN1 유전자의 2개의 복제물에서 결실을 가진다. 일부 실시형태에서, 환자는 염색체 대립유전자 둘 다에서 SMN1의 결실 또는 치환 중 하나인 이중대립유전자 SMN1 돌연변이를 가진다. 일부 실시형태에서, 환자는 SMN2 유전자의 적어도 1개의 기능성 복제물을 가진다. 일부 실시형태에서, 환자는 SMN2 유전자의 적어도 2개의 기능성 복제물을 가진다. 일부 실시형태에서, 환자는 SMN2 유전자의 적어도 3개의 기능성 복제물을 가진다. 일부 실시형태에서, 환자는 SMN2 유전자의 적어도 4개의 기능성 복제물을 가진다. 일부 실시형태에서, 환자는 SMN2 유전자의 적어도 5개의 기능성 복제물을 가진다. 일부 실시형태에서, 환자는 이중-대립유전자 SMN1 삭제 돌연변이 또는 결실을 가지고, SMN2의 3개의 복제물을 가진다. 일부 실시형태에서, 환자는 SMN2 유전자의 적어도 1개의 복제물의 엑손 7에서 c.859G>C 치환을 갖지 않는다. 일부 실시형태에서, 환자는 이중-대립유전자 SMN1 삭제 돌연변이 또는 결실을 가지고, SMN2의 3개의 복제물을 가지며, SMN2 유전자의 적어도 1개의 복제물의 엑손 7에서 c.859G>C 치환을 갖지 않는다. 일부 실시형태에서, SMN1 또는 SMN2 유전자의 유전자 서열은, 예를 들어, 혼성화, PCR 증폭, 및/또는 부분적 또는 완전한 염색체 또는 게놈 서열분석에 의해 결정될 수 있다. 다른 실시형태에서, SMN1 또는 SMN2 유전자의 유전자 서열 및 복제수는 고속대량 서열분석(high-throughput sequencing)에 의해 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, SMN1 또는 SMN2 유전자의 유전자 서열 및 복제수는 마이크로어레이 분석에 의해 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, SMN1 또는 SMN2 유전자의 유전자 서열 및 복제수는 생어 서열분석(Sanger sequencing)에 의해 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, SMN1 또는 SMN2 유전자의 복제수는 형광 인시추 혼성화(fluorescence in-situ hybridization: FISH)에 의해 결정될 수 있다.

일부 실시형태에서, 환자는, 예를 들어, 게놈 검사 및/또는 운동 기능 검사 및/또는 신체 검사에 의해, 치료 전에 SMA, 예를 들어, 제II형 또는 제III형 SMA로 진단된 적이 있거나 동시에 진단된다. 일부 실시형태에서, 제II형 또는 제III형 SMA는 증상의 임상 평가, 예를 들어, CHOP INTEND(영아 신경근장애 검사), Bayley Scales of Infant and Toddler Development® 또는 해머스미스 운동 기능 척도-확장판(HFMSE)에 의해 진단된다. 일부 실시형태에서, 제II형 또는 제III형 SMA는 신체 검사에 의해 진단된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법에 의해 치료되는 제II형 SMA 환자는 24개월, 22개월, 20개월, 18개월, 16개월, 14개월, 12개월, 10개월, 8개월 또는 6개월령, 또는 이 사이의 임의의 연령 전에 질환 증상이 있거나 또는 질환 증상의 발병을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법에 의해 치료되는 바와 같은 제III형 SMA 환자는 12개월, 14개월, 16개월, 18개월, 20개월, 22개월, 또는 24개월령, 또는 이 사이의 임의의 연령 후에 질환 증상이 있거나 또는 질환 증상의 발병을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 환자는 제II형 또는 제III형 SMA의 증상(예를 들어, 하나 이상의 증상)을 나타내기 전에 치료되며, 대신에 환자는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 유전자 검사 중 하나를 이용하여 치료가 필요한지가 결정된다. 일부 실시형태에서, 환자는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 검사 중 하나를 이용하여 결정된 바와 같은, 제II형 또는 제III형 SMA의 증상(예를 들어, 하나 이상의 증상)을 나타낸 후에 치료된다. 일부 실시형태에서, 환자는 제II형 또는 제III형 SMA의 증상을 나타내기 전에 치료된다. 일부 실시형태에서, 환자는 증상을 보이기 전에 유전자 검사에 기반하여 제II형 또는 제III형 SMA로 진단된다.

일부 실시형태에서, 환자는 하나 이상의 SMA 증상을 나타낸다. SMA 증상은 저긴장, 운동 기술 지연, 불량한 머리 가누기, 라운드 숄더 자세 및 관절의 과운동성을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 불량한 머리 가누기는 (앞 및 뒤) 어깨에 도움을 제공하여 환자를 링 시트(ring sit) 위치로 위치시킴으로써 결정된다. 머리 가누기는 환자가 머리를 위쪽으로 유지하는 능력에 의해 평가된다. 일부 실시형태에서, 자발적 움직임은 환자가 앙와위일 때 관찰되며, 운동 기술은 이들의 팔꿈치, 무릎, 손 및 발을 지면에서 떨어지게 들어올리는 능력에 의해 평가된다. 일부 실시형태에서, 환자의 악력은 환자의 손바닥에 손가락을 대고 어깨가 지면에서 떨어질 때까지 들어올림으로써 측정된다. 저긴장 및 악력은 환자가 잡는 것을 얼마나 유지하지에 의해 측정된다. 일부 실시형태에서, 머리 가누기는 환자 머리를 최대로 이용 가능한 회전에 위치시키고 환자가 정중앙으로 머리를 되돌리는 능력을 측정함으로써 평가된다. 일부 실시형태에서, 어깨 자세는 머리와 몸통을 지지하여 환자를 앉히고, 팔 길이에서 어깨 정도에 놓인 자극에 도달하도록 환자가 팔꿈치 또는 어깨를 구부리는지를 관찰함으로써 평가될 수 있다. 일부 실시형태에서, 어깨 자세는 또한 환자를 옆으로 누운 자세로 위치시키고, 환자가 팔 길이에서 어깨 정도에 놓인 자극에 도달하도록 팔꿈치 또는 어깨를 구부리는지를 관찰함으로써 평가될 수 있다. 일부 실시형태에서, 운동 기술은 환자의 발을 쓰다듬거나, 간지럽히거나, 꼬집을 때 이들이 고관절 또는 무릎을 구부리는지를 관찰함으로써 평가된다. 일부 실시형태에서, 어깨 구부림, 팔꿈치 구부림, 고관절 내전, 목 구부림, 머리 신전, 목 신전 및/또는 척수 만곡은, 예를 들어, 공지된 임상 척도, 예를 들어, CHOP INTEND에 의해 평가될 수 있다. 다른 SMA 증상은 공지된 임상 척도, 예를 들어, CHOP INTEND에 따라 평가될 수 있다.

일부 실시형태에서, 환자는 앉는 능력을 나타내지만 보행하는 능력은 나타내지 않는다. 일부 실시형태에서, 환자는 10초 이상 동안 도움 없이 앉는 능력을 나타내지만, 서거나 보행할 수는 없다. 일부 실시형태에서, 환자는 10초 이상 동안 머리를 세운 채로 도움 없이 앉는 능력을 나타내지만, 보행하거나 설 수는 없다. 일부 실시형태에서, 환자는 세계보건기구 다기관 성장 참조 연구(WHO-MGRS) 기준으로 나타나는 바와 같이 독립적으로 앉는 능력을 나타낸다.

이론에 의해 구속되지 않고, 척추강내 투여는 약물이 혈액뇌 장벽을 우회하는 것을 가능하게 할 수 있다. 그 결과, 중추 신경계가 표적인 약물에 대해, 척추강내 투여에 의한 직접 전달은 (예를 들어, IV 투여에 비해) 필요한 약제학적 조성물의 총 용량 및/또는 용적 감소를 가능하게 하여, 간독성 위험을 감소시킬 수 있다. 더 나아가, 지주막하 공간에 직접 전달은 중추 신경계, 예를 들어, 아래 운동 뉴런, 아교세포 등에서 더 높은 형질도입 효율을 가능하게 할 수 있다. 지주막하 공간에서 뇌척수액(CSF) 용적은 척추강내 전달을 위해 선택된 유효 용량 농도에 영향을 미칠 수 있다. 인간에서 CSF 용적은 약 3세 이후에 상대적으로 일정하게 남아있기 때문에, 환자의 용량은 상이한 환자에 걸쳐 더 용이하게 그리고 균일하게 제어될 수 있다. 일부 실시형태에서, 척추강내 투여는 혈액 뇌 장벽을 통과하기 위해 사용된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 rAAV9 바이러스 벡터는 치료가 필요한 환자, 예를 들어, 제II형 또는 제III형 SMA에 대한 치료가 필요한 것으로 확인된 환자에게 척추강내로 전달된다. 일부 실시형태에서, rAAV9는 척추관 내로 주사된다. 일부 실시형태에서, rAAV9는 지주막하 공간 내로 주사된다. 일부 실시형태에서, rAAV9 바이러스 벡터는 PICU 환자 방에서, 또는 급성 중환자 관리에 대해 즉각적으로 접근하는 다른 적절한 상황(예를 들어, 중재실, 수술실, 전용 처리실)에서 멸균 조건 하에 주사된다. 일부 실시형태에서, 환자 바이탈(vital)은 바이러스 벡터의 투여 후 4시간 동안 약 15±5분마다, 그리고 24시간 동안 1시간±15마다 모니터링된다. 일부 실시형태에서, rAAV9 바이러스 벡터는 보존제를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 진정 치료 또는 마취는 rAAV9 바이러스 벡터의 투여 전에 환자에게 제공된다. 일부 실시형태에서, rAAV9 바이러스 벡터의 척추강내 투여는 복와위로, 슬흉위로, 측위로, 심스 체위(Sim's position)로 또는 옆 누운 자세로 위치된 환자에 대해 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, rAAV9 바이러스 벡터는 주사기로 또는 카테터로 투여된다. 일부 실시형태에서, 카테터는 지주막하 공간 내로 L1-L2, L2-L3, L3-L4 또는 L4-L5 극돌기 사이 공간에 삽입될 수 있다. 일부 실시형태에서, 최대 10 ㎖, 최대 9 ㎖, 최대 8 ㎖, 최대 7 ㎖, 최대 6 ㎖, 최대 5 ㎖, 최대 4 ㎖, 최대 3 ㎖, 최대 2 ㎖ 또는 최대 1 ㎖의 뇌척수액을 수집하는 요추 천자가 수행된다. 일부 실시형태에서, rAAV9 바이러스 벡터는 지주막하 공간 내로 직접 주사된다. 일부 실시형태에서, rAAV9 바이러스 벡터는 적절한 방사선투과사진 콘트라스트 용액(예를 들어, 메트리자마이드, 이오파미돌, 이오헥솔, 이오버솔, Omnipaque™ 등)과 사전 혼합되며, 지주막하 공간 내로 직접 주사된다. 일부 실시형태에서, 콘트라스트 용액(예를 들어, 메트리자마이드, 이오파미돌, 이오헥솔, 이오버솔, Omnipaque™ 등)은 rAAV9 바이러스 벡터의 척추강내 투여 전에 척추강내로 투여된다. 일부 실시형태에서, 콘트라스트 용액은 rAAV9 바이러스 벡터의 척추강내 투여 전 2시간 이내에, 1시간 이내, 45분 이내에, 30분 이내에, 15분 이내에, 10분 이내에 또는 5분 이내에 척추강내로 투여된다. 일부 실시형태에서, 콘트라스트 용액(예를 들어, 메트리자마이드, 이오파미돌, 이오헥솔, 이오버솔, Omnipaque™ 등)은 rAAV9 바이러스 벡터의 척추강내 투여 후에 척추강내로 투여된다. 일부 실시형태에서, 콘트라스트 용액은 rAAV9 바이러스 벡터의 척추강내 투여 후 2시간 이내에, 1시간 이내, 45분 이내에, 30분 이내에, 15분 이내에, 10분 이내에 또는 5분 이내에 척추강내로 투여된다.

일부 실시형태에서, 투여되는 조영제의 용적은 최대 약 0.5 ㎖, 최대 약 1.0 ㎖, 최대 약 1.5 ㎖, 최대 약 2.0 ㎖ 또는 최대 약 2.5 ㎖이다. 일부 실시형태에서, 투여되는 총 용적(rAAV9 바이러스 벡터 및 조영제)은 약 5 ㎖ 이하, 약 6 ㎖ 이하, 약 7 ㎖ 이하, 약 8 ㎖ 이하, 약 9 ㎖ 이하 또는 약 10 ㎖ 이하이다. 일부 실시형태에서, 환자는 rAAV9 바이러스 벡터의 투여 후 상이한 위치로 위치된다. 일부 실시형태에서, 환자는 rAAV9 바이러스 벡터의 투여 후 트렌델렌버그 체위로 위치되거나, 20° 내지 40°, 예를 들어, 30°로 머리를 아래로 숙인다. 일부 실시형태에서, 환자는 rAAV9 바이러스 벡터의 투여 후 트렌델렌버그 체위로 위치되거나, 10분 내지 30분, 예를 들어, 약 15분 동안 30°로 머리를 아래로 숙인다.

일부 실시형태에서, 치료는 SMA, 예를 들어, 제II형 또는 제III형 SMA의 하나 이상의 증상을 방지하고/하거나, 감소시키고/시키거나, 완화시키고/시키거나 늦추고/늦추거나 부분적 또는 완전히 반전시키는 데 효과적이다. 치료 방법의 효능은 치료 전 및 후에 운동 기술에 대해 다양한 검사를 이용하여 결정될 수 있다. 특히, Bayley Scales of Infant and Toddler Development®는 영아 및 유아의 발달을 평가하기 위해 사용되는 표준 측정 시리즈이다. 문헌[Bayley N. "Bayley Scales of Infant and Toddler Development." 3^rd edition, Harcourt Assessment Inc., 2006]. 특히, Bayley Scales®의 버전 III의 운동 척도 성분(3판)(Motor Scale component of Version III (Third Edition))은 쥐기, 앉기, 블럭 쌓기 및 계단 오르기와 같은 대근육 및 소근육 운동 기술을 측정한다. 일부 실시형태에서, 환자가 대부분의 시간에 주먹을 쥐고 있는지 여부에 따라 평가된다. 일부 실시형태에서, 환자의 눈이 움직이는 사람을 따라가는지 여부를 알아보는 평가를 받는다. 일부 실시형태에서, 환자가 손을 일부러 입에 넣는 시도를 하는지 여부에 따라 평가된다. 일부 실시형태에서, 환자가 작업을 시도하지 않을 때 대부분의 시간에 손을 잡고 있는지의 여부를 알아보는 평가를 받는다. 일부 실시형태에서, 환자가 작은 물체를 조작할 때 손목을 손바닥을 위 아래로 자유롭게 회전시킬 수 있는지를 알아보는 평가를 받는다. 일부 실시형태에서, 환자에게 블럭이 제공되고, 환자가 한쪽 손 또는 양손을 이용하여 블럭을 집고, 손에서 손으로 블럭을 옮기고, 엄지손가락 또는 손가락 끝의 바닥부분으로 블럭을 잡는지의 여부, 환자가 손가락과 부분적으로 마주보는 엄지손가락을 이용하여 블럭을 잡는지 여부를 알아보는 평가를 받는다. 일부 실시형태에서, 환자에게 식품 펠릿이 제공되고, 엄지손가락 또는 손가락 끝의 바닥부분으로 블럭을 잡는지의 여부, 환자가 손가락과 부분적으로 마주보는 엄지손가락을 이용하여 블럭을 잡는지 여부를 알아보는 평가를 받는다. 일부 실시형태에서, 환자에게 책이 제공되고, 환자가 한 페이지 또는 여러 페이지를 한 번에 넘기려는 시도를 하는지를 알아보는 평가를 받는다. 일부 실시형태에서, 환자에게 크레용 또는 연필이 제공되고, 환자가 손바닥 잡기, 고정 삼각대 잡기, 또는 사각대 잡기를 이용하여 크레용 또는 연필을 잡는 한편 종이 위에 표시를 하는지를 알아보는 평가를 받는다. 추가 실시형태에서, 환자가 종이 상에 표시를 하는 동안 움켜잡기가 발달되고, 통제되며, 동적인지를 알아보는 평가를 받는다. 일부 실시형태에서, 환자는 한 손으로 제자리에서 종이를 잡는 한편, 다른 손으로 낙서 또는 그림을 그리는지를 알아보는 평가를 받는다.

일부 실시형태에서, 환자는 팔 또는 다리를 여러 번 찌르는 한편 장난을 치는지를 알아보는 평가를 받는다. 일부 실시형태에서, 환자는 지지 없이 머리를 간헐적으로 들어올릴 수 있는지를 알아보는 평가를 받는다. 일부 실시형태에서, 환자는 적어도 3초 동안 지지 없이 머리를 세우고 유지할 수 있는지를 알아보는 평가를 받는다. 일부 실시형태에서, 환자는 협응 및 균형을 갖고 적어도 5단계로 보행하는 능력을 갖는지를 알아보는 평가를 받는다. 일부 실시형태에서, 환자는 Bayley®-III - 대근육 운동의 항목 43에 따라, 협응 및 균형을 갖고 적어도 5단계로 보행하는 능력을 갖는지를 알아보는 평가를 받는다. 일부 실시형태에서, 환자는 도움 또는 지지면 없이 서 있는 능력을 갖는지와 자세 조절을 피드백하는지를 알아보는 평가를 받는다. 일부 실시형태에서, 환자는 Bayley®-III - 대근육 운동의 항목 40에 따라, 도움 없이 서 있는 능력을 갖는지를 알아보는 평가를 받는다. 일부 실시형태에서, 환자가 치료 투여 후 약 24개월, 12개월, 9개월 또는 6개월에 지지 없이 서 있는 능력을 달성한다면 환자는 유효한 치료를 받은 것으로 간주된다. 일부 실시형태에서, 환자는 치료 투여 후 약 24개월, 12개월, 9개월, 또는 6개월에 협응 및 균형을 독립적으로 나타내는 적어도 5단계를 취함으로써 정한 바와 같이, 환자가 도움 없이 보행하는 능력을 달성한다면 환자가 유효한 치료를 받은 것으로 간주된다.

영아 발달의 다른 통상적으로 사용되는 척도는 해머스미스 운동 기능 척도-확장판(HFMSE)이다. 문헌[O'Hagen et al., "An expanded version of the Hammersmith Functional Motor Scale for SMA II and III patients." Neuromuscul Disord, 17(9-10):693-7]; 문헌[Glanzman et al., "Validation of the Expanded Hammersmith Functional Motor Scale in spinal muscular atrophy type II and III." J Child Neurol, 26(12):1499-1507]. 해머스미스 운동 기능 척도는 SMA를 갖는 걸을 수 없는 개체의 능력 평가하는 데 성공적이었지만, HFMSE는 제II형 및 제III형 SMA를 갖는 개체에서 운동 기능을 성공적으로 구별할 수 있는 추가적인 13-항목 부가물을 제공하였다. 일부 실시형태에서, 환자는 지지하지 않고 의자 또는 바닥에 앉는 능력에 대해 평가된다. 일부 실시형태에서, 환자는 머리를 손으로 만지는 한편 지지하지 않고 의자 또는 바닥에 앉는 능력에 대해 평가된다. 일부 실시형태에서, 환자는 머리를 양손으로 만지는 한편 지지하지 않고 의자 또는 바닥에 앉는 능력에 대해 평가된다. 일부 실시형태에서, 환자는 누워있는 동안 옆으로 구를 수 있는지 여부에 따라 평가된다. 일부 실시형태에서, 환자는 누워있는 동안 얼굴을 위 아래로 또는 그 반대로 굴릴 수 있는지 여부에 따라 평가된다. 일부 실시형태에서, 환자는 통제된 방식으로 앉은 자세로부터 누울 수 있는지 여부에 따라 평가된다. 일부 실시형태에서, 환자는 엎드려 있는 동안 팔뚝으로 지탱할 수 있는지 여부에 따라 평가된다. 일부 실시형태에서, 환자는 복와위인 동안 머리를 들어올릴 수 있는지 여부에 따라 평가된다. 일부 실시형태에서, 환자는 엎드려 있는 동안에 3을 세는 동안 팔을 곧게 펴고 지탱할 수 있는지 여부에 따라 평가된다. 일부 실시형태에서, 환자는 복부로 굴러가지 않고 누워있는 자세로부터 앉아있는 자세로 전환할 수 있는지 여부에 따라 평가된다. 일부 실시형태에서, 환자는 3을 세는 동안 머리를 위로 유지하면서 손과 무릎을 꿇을 수 있는지 여부에 따라 평가된다. 일부 실시형태에서, 환자는 손과 무릎으로 앞쪽으로 기어갈 수 있는지 여부에 따라 평가된다. 일부 실시형태에서, 환자는 팔을 가슴에 접고 누운 상태에서 머리를 들어올릴 수 있는지 여부에 따라 평가된다. 일부 실시형태에서, 환자는 3을 세는 동안 지지체로서 한 손으로 또는 손 없이 서 있을 수 있는지 여부에 따라 평가된다. 일부 실시형태에서, 환자는 임의의 도움 없이 보행할 수 있는지 여부에 따라 평가된다. 일부 실시형태에서, 환자는 바로 누워있는 동안 무릎 중 하나를 가슴까지 가져올 수 있는지 여부에 따라 평가된다. 일부 실시형태에서, 환자는 팔을 이용하지 않고 무릎을 꿇는 자세로부터 반 무릎을 꿇은 자세로 전환할 수 있는지 여부에 따라 평가된다. 일부 실시형태에서, 환자는 팔을 이용하지 않고 무릎을 꿇은 자세로부터 서 있는 자세로 전환할 수 있는지 여부에 따라 평가된다. 일부 실시형태에서, 환자는 팔을 이용하지 않고 서 있는 자세로부터 앉은 자세로 전환할 수 있는지 여부에 따라 평가된다. 일부 실시형태에서, 환자는 팔을 이용하지 않고 서 있는 자세로부터 웅크린 자세로 전환할 수 있는지 여부에 따라 평가된다. 일부 실시형태에서, 환자는 서 있는 위치로부터 12인치 앞쪽으로 점프할 수 있는지 여부에 따라 평가된다. 일부 실시형태에서, 환자는 도움 없이 또는 하나의 난간을 이용하여 4계단을 걸어 올라가거나 내려올 수 있는지 여부에 따라 평가된다. 일부 실시형태에서, 치료의 투여 후 약 24개월, 12개월, 9개월, 또는 6개월에 환자가 HFMSE 상의 기준으로부터 5 내지 10점 증가, 예를 들어, 8점 증가를 나타낸다면, 환자는 유효한 치료를 받은 것으로 간주된다. 일부 실시형태에서, 치료의 투여 후 약 24개월, 12개월, 9개월, 또는 6개월에 환자가 HFMSE 상의 기준으로부터 9점 증가를 나타낸다면, 환자는 유효한 치료를 받은 것으로 간주된다. 일부 실시형태에서, 치료의 투여 후 약 24개월, 12개월, 9개월, 또는 6개월에 환자가 HFMSE 상의 기준으로부터 10점 증가를 나타낸다면, 환자는 유효한 치료를 받은 것으로 간주된다.

일부 실시형태에서, 치료 효능은 발달 능력의 변화에 의해 측정된다. 일부 실시형태에서, 기준 측정은 rAAV9 바이러스 벡터의 투여 전에 취해진다. 일부 실시형태에서, 기준 측정은 Bayley Scales of Infant and Toddler Development®의 소근육 및 대근육 운동 성분을 측정하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 기준 측정은 Bayley Scales of Infant and Toddler Development®의 대근육 운동 성분의 항목 43(도움 없이 적어도 5계단을 이동)을 측정하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 기준 측정은 Bayley Scales of Infant and Toddler Development®의 대근육 운동 성분의 항목 40(적어도 3초 동안 지지 없이 서 있음)을 측정하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 기준 측정은 해머스미스 운동 기능 척도-확장판(HFMSE)에 따라 환자를 평가하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 치료 효능은 Bayley Scales of Infant and Toddler Development®의 대근육 운동 성분의 항목 43(도움 없이 적어도 5계단을 이동)을 측정하고, 기준과 비교함으로써 평가된다. 일부 실시형태에서, 치료 효능은 Bayley Scales of Infant and Toddler Development®의 대근육 운동 성분의 항목 40(적어도 3초 동안 지지 없이 서 있음)을 측정하고, 기준과 비교함으로써 평가된다. 일부 실시형태에서, 치료 효능은 HFMSE에 대해 환자를 평가하고 치료 전에 기준과 비교함으로써 평가된다. 일부 실시형태에서, 기준은 치료 전 30일 이내에 측정에 의해 확립된다. 일부 실시형태에서, 치료 효능은 치료 30일 이내에 평가된다. 일부 실시형태에서, 치료 효능은 치료 후 12개월 동안 1개월에 1회 평가된다. 일부 실시형태에서, 효능 평가는 비디오테이프 녹화된다. 일부 실시형태에서, 유의미한 운동 이정표는 표 2에 나타낸 표준 운동발달 이정표 조사에 의해 평가된다. 일부 실시형태에서, 치료 효능은 치료 후 적어도 12개월, 치료 후 적어도 24개월, 치료 후 적어도 48개월, 치료 후 적어도 72개월, 또는 치료 후 최대 10년에 평가된다.

일부 실시형태에서, 치료 효능을 평가하기 위한 검사는 Bayley Scales of Infant and Toddler Development®, 해머스미스 운동 기능 척도-확장판(HFMSE), 또는 운동 발달 이정표 조사로 제한되지 않지만, 또한 CHOP INTEND, TIMP, CHOP TOSS, 피바디 발달 운동 척도(Peabody Development Motor Scales), 브래즐턴 신생아 행동 평가 검사(Brazelton Neonatal Behavior Assessment test), 대화형 비디오 평가를 통해 포착된 능력(Ability Captured Through Interactive Video Evaluation: ACTIVE), 및 복합 운동 작용 전위(compound motor action potential: CMAP)의 측정을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 당업계에 공지된 기타 운동 기능을 포함할 수 있다.

치료를 받을 수 있는 환자의 사전 선별은 또한, 예를 들어, 본 명세서에 개시된 제II형 또는 제III형 SMA를 확인하는 방법뿐만 아니라 본 명세서에 개시된 기준에 따라 확인된 환자에 대한 치료의 투여에 따라, 상정된다.

AAV는 세포성 면역 반응과 체액성 면역 반응을 둘 다 일으킬 수 있다. 그 결과, AAV-기반 유전자 요법에 대한 잠재적 환자의 부분은 AAV에 대해 이미 존재하는 항체를 보유한다. 문헌[Jeune et al., "Pre-existing anti-Adeno-Associated Virus antibodies as a challenge in AAV gene therapy." Hum Gene Ther Methods, 24(2):59-67.]. 문헌[Boutin et al., "Prevalence of serum IgG and neutralizing factors against adeno-associated virus (AAV) types 1, 2, 5, 6, 8, and 9 in the healthy population: implications for gene therapy using AAV vectors." Hum Gene Ther, 21:704-712]. 심지어 매우 저수준의 항체가 성공적인 형질도입을 방지할 수 있기 때문에, 선행 항-AAV 항체는 AAV 유전자 요법의 보편적 적용에 대한 심각한 장애를 제기한다. 일부 실시형태에서, 환자에서의 항-AAV9 항체 역가의 수준은 AAV 바이러스 벡터의 투여 전에 결정되고, 항체 역가가 한계 수준 미만이라면 척추강내 투여만으로 환자에게 AAV가 제공된다. 일부 실시형태에서, 환자에서의 항-AAV9 항체 역가 수준은 ELISA 결합 면역분석에 의해 결정된다. 일부 실시형태에서, 환자는 치료 투여 전에 ELISA 결합 면역분석에 의해 결정할 때, 항-AAV9 항체 역가가 1:100 이하이다. 일부 실시형태에서, 환자는 치료 투여 전에 ELISA 결합 면역분석에 의해 결정할 때, 항-AAV9 항체 역가가 1:50 이하이다. 일부 실시형태에서, 환자는 치료 후에 ELISA 결합 면역분석에 의해 결정할 때 항-AAV9 항체 역가가 1:100 초과이며, 1 내지 8주 동안 또는 역가가 1:100 미만으로 감소될 때까지 모니터링된다. 일부 실시형태에서, 환자는 치료 후에 ELISA 결합 면역분석에 의해 결정할 때 항-AAV9 항체 역가가 1:100 초과이며, 1 내지 8주 동안 또는 역가가 1:50 미만으로 감소될 때까지 모니터링된다.

일부 실시형태에서, 높은 항-AAV 항체 역가를 갖는 환자는 하나 이상의 면역억제 약물이 투여될 수 있다. 예를 들어, 단클론성 항-CD20 항체, 예컨대 리툭시맙은 사이클로스포린 A와 병용하여 항-AAV 역가를 떨어뜨릴 수 있다. 문헌[Mingozzi et al., "Pharmacological modulation of humoral immunity in a nonhuman primate model of AAV gene transfer for hemophilia B." Mol Ther, 20:1410-1416]. 일부 실시형태에서, 환자는 치료 전에 또는 후에 ELISA 결합 면역분석에 의해 결정할 때 항-AAV9 항체 역가가 1:100 초과이고, 1종 이상의 면역억제 약물, 예를 들어, 스테로이드 유사 프레드니솔론로 치료된다. 일부 실시형태에서, 환자는 치료 전에 또는 후에 ELISA 결합 면역분석에 의해 결정할 때 항-AAV9 항체 역가가 1:50 초과이고, 1종 이상의 면역억제 약물, 예를 들어, 스테로이드 유사 프레드니솔론로 치료된다.

일부 실시형태에서, 높은 항-AAV 항체 역가를 갖는 환자는 벡터 투여 전에 그리고/또는 후에 중화 항체를 고갈시키기 위해 혈장분리교환술로 처리될 수 있다. 문헌[Monteilhet et al., "A 10 patient case report on the impact of plasmapheresis upon neutralizing factors against adeno-associated virus (AAV) types 1, 2, 6, and 8." Mol Ther, 19(11):2084-2091]. 혈장분리교환술 동안, 혈액은 환자로부터 채혈되고, 혈장 및 혈액 세포는 원심분리 또는 중공 섬유 여과에 의해 분리된다. 이어서, 혈액 세포를 처리된 혈장 또는 대체 유체, 예컨대 식염수 중의 4.5% 인간 알부민과 함께 인간에게 복귀시킨다. 치료적 성분채집술의 통상적인 사용은 원치않는 면역글로불린, 예컨대 항-AAV 항체의 제거이다. 일부 실시형태에서, 환자는 치료 전에 또는 치료 후에 ELISA 결합 면역분석에 의해 결정할 때 항-AAV9 항체 역가가 1:100 초과이고, 혈장분리교환술로 처리된다. 일부 실시형태에서, 환자는 치료 전에 또는 치료 후에 ELISA 결합 면역분석에 의해 결정할 때 항-AAV9 항체 역가가 1:50 초과이고, 혈장분리교환술로 처리된다.

AAV9에 대해 이미 존재하는 모계 항체는 모유 또는 자궁 내 태반 전달을 통해 어린 환자에게 전달된다. 일부 실시형태에서, 환자는 치료 전에 또는 치료 후에 ELISA 결합 면역분석에 의해 결정할 때 항-AAV9 항체 역가가 1:100 초과이고, 조제 분유로 전환된다. 일부 실시형태에서, 환자는 치료 전에 또는 치료 후에 ELISA 결합 면역분석에 의해 결정할 때 항-AAV9 항체 역가가 1:50 초과이고, 조제 분유로 전환된다.

치료 투여 전 및 후에, 환자의 병태가 모니터링될 수 있다. 일부 실시형태에서, AAV-기반 치료를 받은 환자는 낮은 혈소판 계수 또는 특히 낮은 혈소판 계수를 특징으로 하는 병태인 혈소판감소증을 경험할 수 있다. 혈소판감소증은 혈구계 상에서 혈액의 희석 샘플을 이용하여 전혈 계수에 의해 검출될 수 있다. 혈소판감소증은 또한 현미경 하에 현미경 하에 환자의 혈액(얇은 혈액 도말 또는 말초 도말)로 제조된 슬라이드를 관측함으로써 검출될 수 있다. 정상 인간 혈소판 계수는 150,000개의 세포/㎖ 내지 약 450,000개의 세포/㎖의 범위이다.

일부 실시형태에서, 환자는 혈소판 계수가 투여 전에 약 67,000개의 세포/㎖ 초과 또는 약 100,000개의 세포/㎖ 초과, 또는 약 150,000개의 세포/㎖ 초과이다. 일부 실시형태에서, 환자는 투여 전 혈소판 계수가 약 150,000개의 세포/㎖ 미만, 또는 약 100,000개의 세포/㎖ 미만, 또는 약 67,000개의 세포/㎖ 미만이며, 약 1 내지 8주 동안 또는 혈소판 계수가 약 67,000개의 세포/㎖ 초과, 또는 약 100,000개의 세포/㎖ 초과, 또는 약 150,000개의 세포/㎖ 초과로 증가될 때까지 모니터링된다. 일부 실시형태에서, 혈소판 계수가 바이러스 벡터의 투여 후 약 67,000개의 세포/㎖ 미만인 경우, 환자는 혈소판 수혈로 치료될 수 있다. 일부 실시형태에서, 환자는 바이러스 벡터의 투여 전 혈소판감소증을 갖지 않는다. 일부 실시형태에서, 환자는 바이러스 벡터의 투여 후 혈소판감소증을 가지며, 환자가 혈소판감소증을 갖지 않을 때까지 약 1 내지 8주 동안 모니터링된다. 일부 실시형태에서, 환자는 바이러스 벡터의 투여 후 혈소판감소증을 가지며, 혈소판 수혈로 치료된다.

환자 병태의 모니터링은 또한 혈소판, 혈청 단백질 전기영동법, 혈청 감마-글루타밀 트랜스퍼라제(GGT), 아스파르트산 트랜스아미나제(AST) 및 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT), 총 빌리루빈, 글루코스, 크레아틴 키나제(CK), 크레아티닌, 혈중요소질소(BUN), 전해질, 알칼리성 포스파타제 및 아밀라제 중 하나 이상의 수준을 측정하는 표준 혈액 검사를 수반할 수 있다. 트로포닌 I 수준은 심장 건강에 대한 일반적 척도이며, 상승된 수준은 심장 손상 또는 심장-관련 병태를 반영한다. 일부 실시형태에서, 트로포닌-I 수준은 바이러스 벡터의 투여 후에 모니터링된다. 일부 실시형태에서, 환자는 바이러스 벡터의 투여 전에 트로포닌-I 수준이 약 0.3, 0.2, 0.15 또는 0.1 ㎍/㎖ 미만일 수 있다. 일부 실시형태에서, 환자는 바이러스 벡터의 투여 전에 트로포닌-I 수준이 약 0.176 ㎍/㎖ 미만일 수 있다. 일부 실시형태에서, 환자는 바이러스 벡터의 투여 후에 트로포닌-I 수준이 약 0.176 ㎍/㎖ 초과일 수 있다. 일부 실시형태에서, 환자는 트로포닌-I 수준이 약 0.176 ㎍/㎖ 미만이 될 때까지 바이러스 벡터의 투여 후에 심장 모니터링을 받는다.

아스파르트산 트랜스아미나제(AST) 및 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT) 및 총 빌리루빈은 간 기능의 일반적 척도인 반면, 크레아티닌은 신장 기능을 추적한다. AST, ALT 또는 총 빌리루빈의 상승된 수준은 간 기능부전을 나타낼 수 있다. 일부 실시형태에서, 환자는 바이러스 벡터의 투여 전에 정상 간 기능을 가진다. 일부 실시형태에서, 환자는 바이러스 벡터의 투여 전에 간 트랜스아미나제 수준이 약 8 내지 40 U/ℓ 미만이다. 일부 실시형태에서, 환자는 바이러스 벡터의 투여 전에 간 AST 또는 ALT 수준이 약 8 내지 40 U/ℓ 미만이다. 일부 실시형태에서, 환자는 감마-글루타밀 트랜스퍼라제(GGT)가, 예를 들어, 임상 표준 및 당업계에 공지된 방법, 예를 들어, CLIA 표준에 의해 결정될 때, 정상 상한의 3배 미만이다. 일부 실시형태에서, 환자는 바이러스 벡터의 투여 전에 빌리루빈 수준이 3.0 ㎎/㎗ 미만이다. 일부 실시형태에서, 환자는 바이러스 벡터의 투여 전에 크레아티닌 수준이 1.8 ㎎/㎗ 미만, 1.4 ㎎/㎗ 미만 또는 1.0 ㎎/㎗ 미만이다. 일부 실시형태에서, 환자는 바이러스 벡터의 투여 전에 헤모글로빈(Hgb) 수준이 8 내지 18 g/㎗이다. 일부 실시형태에서, 환자는 바이러스 벡터의 투여 전 백혈구(WBC) 계수는 ㎣ 당 20000 미만이다.

다양한 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 AAV 벡터를 이용하는 유전자 요법은, 예를 들어, 유전자 전달 후 2 내지 4주에 AAV 벡터에 대해 항원 특이적 T-세포 반응을 생성할 수 있다. 이러한 항원 특이적 T-세포 반응에 대한 한 가지 가능한 결과는 형질도입 세포의 클리어런스(clearance) 및 이식유전자 발현의 상실이다. AAV 기반 요법에 대한 숙주 면역 반응을 약화시키기 위한 시도에서, 환자에게 면역 억제제가 제공될 수 있다. 일부 실시형태에서, T-세포 반응은 ELISPOT 분석에 의해 측정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 벡터를 투여하기 전에 T-세포 반응은 10⁶개의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)당 100개의 스팟 형성 세포(SFC)이다. 일부 실시형태에서, 환자는 바이러스 벡터의 투여 전에 글루코코티코이드가 제공될 수 있다. 일부 실시형태에서, 환자는 바이러스 벡터의 투여 전에 코티코스테로이드가 제공될 수 있다. 일부 실시형태에서, 환자는 바이러스 벡터의 투여 전에 경구 스테로이드가 제공될 수 있다. 경구 스테로이드의 예는 프레드니손, 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론, 트라이암시놀론, 베타메타손, 덱사메타손 및 하이드로코티손을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 경구 스테로이드는 프레드니솔론이거나, 이를 포함한다.

일부 실시형태에서, 환자는 바이러스 벡터를 투여하기 전에 적어도 12 내지 48시간, 예를 들어, 적어도 24시간에 예방적 스테로이드가 개시된다. 일부 실시형태에서, 환자는 바이러스 벡터를 투여한 후에 적어도 10 내지 60일, 예를 들어, 적어도 30일 동안 경구 스테로이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 경구 스테로이드는 1일 1회 투여된다. 일부 실시형태에서, 경구 스테로이드는 1일 2회 투여된다. 일부 실시형태에서, 경구 스테로이드는 약 0.1 내지 10 ㎎/㎏, 예를 들어, 약 1 ㎎/㎏의 용량으로 제공된다. 일부 실시형태에서, 경구 스테로이드는 약 0.1 내지 10 ㎎/㎏/일, 예를 들어, 약 1 ㎎/㎏/일의 용량으로 제공된다. 일부 실시형태에서, AST 및 ALT 수준은 바이러스 벡터의 투여 후에 모니터링된다. 이러한 실시형태에서, 경구 스테로이드 치료는, 예를 들어, 임상 표준 및 당업계에 공지된 방법에 의해 결정될 때, AST 및 ALT 수준이 정상 상한의 2배, 또는 약 120 IU/ℓ를 초과할 때 투여된다. 일부 실시형태에서, 경구 스테로이드 치료는, 예를 들어, 임상 표준 및 당업계에 공지된 방법에 의해 결정될 때, AST 및 ALT 수준이 정상 상한의 2배를 초과하는 한, 또는 수준이 약 120 IU/ℓ를 초과하는 한, 30일 초과 동안 투여된다. 일부 실시형태에서, 경구 스테로이드 치료는, T-세포 반응이 10⁶개의 PBMC당 100개 초과의 SFC가 된다면, 30일 초과 동안 투여된다. 일부 실시형태에서, 경구 스테로이드 치료는, T-세포 반응이 10⁶개의 PBMC당 100개 초과의 SFC가 될 때까지, 30일 초과 동안 투여된다. 코르티코스테로이드에 의한 지속 치료 동안에, 부신은 코티솔 생산을 자연적으로 감소시킨다. 코티코스테로이드 치료가 갑자기 중단된다면, 신체는 코티솔 결핍증을 경험할 수 있다. 일부 실시형태에서, 경구 스테로이드가 적어도 30일 동안 환자에게 제공되는 경우, 스테로이드 용량은 스케줄 중에 서서히 테이퍼링된다. 일부 실시형태에서, 경구 스테로이드 용량은, 예를 들어, 임상 표준 및 당업계에 공지된 방법에 의해 결정될 때, AST 및 ALT 수준이 정상 상한의 2배 또는 약 120 IU/ℓ 미만으로 떨어지는 경우에 테이퍼링된다. 일부 실시형태에서, 테이퍼링은 약 2주 동안 0.5 ㎎/㎏/일 다음에 약 2주 이상 동안 0.25 ㎎/㎏/일의 계단식 감소를 포함한다. 일부 다른 실시형태에서, 경구 스테로이드의 테이퍼링은 의사의 재량에 따라 일어난다. 일부 실시형태에서, 혈액 샘플이 수집되고, ELISA에 의해 AAV9에 대한 혈청 항체, ELISA에 의해 SMN에 대한 혈청 항체, 또는 ELISpot에 의해 인터페론 감마(IFN-g)에 대해 검사한다.

본 명세서에 개시된 치료가 유리할 수 있는 환자를 선택하는 방법이 또한 본 명세서에서 상정된다. 일부 실시형태에서, 환자는 요추 천자 절차 또는 척추강내 요법의 투여가 금지되지 않는다. 일부 실시형태에서, 환자는, 예를 들어, X-선 검사 상에서 분명한 척추의 50° 이상의 만곡에 의해 정해지는 바와 같이, 척추측만증, 또는 중증의 척추측만증을 갖지 않는다. 일부 실시형태에서, 환자는 이전에 계획되거나 예상되는 척추측만증 회복술, 또는 rAAV9 바이러스 벡터 투여의 2년 이내, 1년 이내 또는 6개월 이내에 일정이 잡힌 절차를 갖지 않는다. 일부 실시형태에서, 환자는 침습적 호흡 지지체, 또는 위영양관이 필요하지 않다. 일부 실시형태에서, 환자는 독립적으로 서거나 보행하는 이력을 갖지 않는다. 일부 실시형태에서, 환자는 rAAV9 바이러스 벡터의 투여 시 활성 바이러스 감염을 갖지 않는다. 추가 실시형태에서, 이들 바이러스 감염은 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 또는 혈청학적 양성 B형 또는 C형 간염 또는 지카 바이러스를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 환자는 수반되는 질병, 예를 들어, 주요 신장 또는 간 손상, 알려진 발작 장애, 진성 당뇨병, 특발성 저칼슘뇨증 또는 증상성 심근병증을 갖지 않는다. 일부 실시형태에서, 환자는 rAAV9 바이러스 벡터 투여 4주 이내에 중증의 비-폐 감염 또는 기도 감염(예를 들어, 신우신염 또는 뇌수막염)을 갖지 않는다. 일부 실시형태에서, 환자는 박테리아 뇌수막염, 뇌 또는 척수 질환의 병력을 갖지 않는다. 일부 실시형태에서, 환자는 글루코코르티코스테로이드, 예를 들어, 프레드니손 또는 프레드니솔론, 또는 이들의 부형제에 대해 알려진 알레르기 또는 과민증을 갖지 않는다. 일부 실시형태에서, 환자는 요오드 또는 요오드-함유 제품에 대해 알려진 알레르기 또는 과민증을 갖지 않는다. 일부 실시형태에서, 환자는 근병증 또는 신경병증을 치료하기 위해 약물을 동시에 취하지 않는다. 일부 실시형태에서, 환자는 rAAV9 바이러스 벡터의 투여 3개월 이내에 면역억제 요법, 혈장분리교환술, 면역조절제, 예컨대 아달리무맙을 받고 있지 않다.

병용 요법이 또한 본 명세서에서 상정된다. 본 설명에 사용된 조합은 동시 치료 또는 순차 치료 중 하나를 포함한다. 방법의 조합은 특정 표준 의학적 치료(예를 들어, ALS에서의 리루졸), 및/또는 신규한 요법과의 조합물의 첨가를 포함할 수 있다. 예를 들어, 개시된 병용 요법에서 사용될 수 있는 SMA에 대한 다른 요법은 전-mRNA에 대한 결합을 변경시키고 이들의 스플라이싱 패턴을 변경시키는 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO)를 포함한다. 문헌[Singh. et al., "A multi-exon-skipping detection assay reveals surprising diversity of splice isoforms of spinal muscular atrophy genes." Plos One, 7(11):e49595]. 일부 실시형태에서, 뉴시너센(본 명세서에 참조에 의해 원용되는 미국 특허 제8,361,977호 및 미국 특허 제8,980,853호)이 사용될 수 있다. 뉴시너센은 SMN2 전-mRNA의 인트론 6, 엑손 7 또는 인트론 7을 표적화하여, 전장 SMN 단백질을 더 효율적으로 생성하기 위해 SMN2의 스플라이싱을 조절하는 승인된 ASO이다. 일부 실시형태에서, AAV9 바이러스 벡터를 포함하는 치료 방법은 근육 향상제와 병용하여 투여된다. 일부 실시형태에서, 개시된 치료 방법은 신경보호제와 병용하여 AAV9 바이러스 벡터를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 개시된 치료 방법은 SMN을 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드-기반 약물과 병용하여 AAV9 바이러스 벡터를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 개시된 치료 방법은 뉴시너센과 병용하여 AAV9 바이러스 벡터를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 개시된 치료 방법은 마이오스타틴-저해 약물과 병용하여 AAV9 바이러스 벡터를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 개시된 치료 방법은 스타물루맙과 병용하여 AAV9 바이러스 벡터를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 개시된 치료 방법은 1종 초과의 추가적인 치료와 병용하여 AAV9 바이러스 벡터를 투여하는 단계를 포함한다.

본 명세서에 개시된 rAAV 바이러스 벡터는 당업계에 공지된 제조 및 정제 방법에 따라 제조될 수 있다. 일부 실시형태에서, 정제 방법은 숙주 세포로부터의 오염물질 및 바이러스 벡터의 채취 동안 첨가된 화학물질을 제거하는 시도를 한다. 일부 실시형태에서, PCT/US2018/058744에 개시된 방법이 사용되며, 상기 국제특허출원은 본 명세서에 전문이 참조에 의해 포함된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 약 1×10¹³ vg/㎖ 내지 1×10¹⁵ vg/㎖, 예를 들어, 약 1 내지 8×10¹³ vg/㎖의 농도의 rAAV 바이러스 벡터를 수득한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 약 1.0×10¹³ vg 내지 9.9×10¹⁴ vg의 용량(예를 들어, 단위 용량)으로 rAAV 바이러스 벡터를 수득한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 약 1.0×10¹³ vg 내지 5.0×10¹⁴ vg의 용량(예를 들어, 단위 용량)으로 rAAV 바이러스 벡터를 수득한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 약 5.0×10¹³ vg 내지 3.0×10¹⁴ vg의 용량(예를 들어, 단위 용량)으로 rAAV 바이러스 벡터를 수득한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 약 6.0×10¹³vg의 용량(예를 들어, 단위 용량)으로 rAAV 바이러스 벡터를 수득한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 약 1.2×10¹⁴vg의 용량(예를 들어, 단위 용량)으로 rAAV 바이러스 벡터를 수득한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 약 2.4×10¹⁴vg의 용량(예를 들어, 단위 용량)으로 rAAV 바이러스 벡터를 수득한다.

일부 실시형태에서, 상기 방법은 약 10% 미만, 약 8% 미만, 약 7% 미만 또는 약 5% 미만의 빈 바이러스 캡시드를 갖는 rAAV 바이러스 벡터를 수득한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 1×10¹³ vg/㎖당 약 100 ng/㎖ 미만의 숙주 세포 단백질을 갖는 rAAV 바이러스 벡터를 수득한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 잔여 숙주 세포 DNA(hcDNA)가 1×10¹³ vg/㎖당 약 5×10⁶ pg/㎖ 미만, 약 1×10⁶ pg/㎖ 미만, 약 7.5×10⁵ pg/㎖ 미만, 또는 6.8×10⁵ pg/㎖ 미만인 rAAV 바이러스 벡터를 수득한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 1.0×10¹³ vg/㎖당 잔여 숙주 세포 단백질(rHCP)이 약 10 ng 미만, 약 8 ng 미만, 약 6 ng 미만, 또는 약 4 ng 미만인 rAAV 바이러스 벡터를 수득한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 기능성인 rAAV(예를 들어, AAV9) 바이러스 벡터 게놈/㎖의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 100%를 수득한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 잔여 플라스미드 DNA가 1×10¹³ vg/㎖당 1.7×10⁶ pg/㎖, 또는 1×10¹³ vg/㎖당 1×10⁵ pg/㎖ 내지 1×10¹³ vg/㎖당 1.7×10⁶ pg/㎖ 이하인 rAAV 바이러스 벡터를 수득한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 벤조나제 농도가 1.0×10¹³vg당 0.2 ng, 1.0×10¹³ vg당 0.1 ng 미만, 또는 1.0×10¹³ vg당 0.09 ng 미만인 rAAV 바이러스 벡터를 수득한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 소 혈청 알부민(BSA) 농도가 1.0×10¹³vg당 0.5 ng, 1.0×10¹³ vg당 0.3 ng 미만, 또는 1.0×10¹³ vg당 0.22 ng 미만인 rAAV 바이러스 벡터를 수득한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 내독소 수준이 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 1 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.75 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.5 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.4 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.35 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.3 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.25 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.2 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.13 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.1 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.05 EU/㎖ 미만, 또는 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.02 EU/㎖ 미만인 rAAV 바이러스 벡터를 수득한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 세슘 농도가 100 ㎍/g(ppm) 미만, 50 ㎍/g(ppm) 미만, 또는 30 ㎍/g(ppm) 미만인 rAAV 바이러스 벡터를 수득한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 약 10 내지 100 ppm, 15 내지 90 ppm, 또는 약 20 내지 80 ppm의 폴록사머 188을 갖는 rAAV 바이러스 벡터를 수득한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 용기당 크기가 25 ㎛ 이상인 2000개 미만, 1500개 미만, 1000개 미만 또는 600개 미만의 입자를 갖는 rAAV 바이러스 벡터를 수득한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 용기당 크기가 10 ㎛ 이상인 10000개 미만, 8000개 미만, 1000개 미만 또는 6000개 미만의 입자를 갖는 rAAV 바이러스 벡터를 수득한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 pH가 7.5 내지 8.5, 7.6 내지 8.4 또는 7.8 내지 8.3인 rAAV 바이러스 벡터를 수득한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 삼투몰농도가 330 내지 490 mOsm/㎏, 360 내지 460 mOsm/㎏ 또는 390 내지 430 mOsm/㎏인 rAAV 바이러스 벡터를 수득한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 감염성 역가가 1.0×10¹³ vg당 약 1.0×10⁸ 내지 10.0×10¹⁰IU, 1.0×10¹³ vg당 약 2.5×10⁸ 내지 9.0×10¹⁰IU, 또는 1.0×10¹³ vg당 약 3.9×10⁸ 내지 8.4×10¹⁰IU인, rAAV 바이러스 벡터를 수득한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 시험관내 세포 기반 분석에 기반하여 참조 표준 및/또는 적합한 대조군에 비해 약 30 내지 150%, 약 60 내지 140%, 또는 약 70 내지 130% 상대 효력을 갖는 rAAV 바이러스 벡터를 수득한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 총 단백질 수준이 1.0×10¹³ vg당 약 10 내지 500 ㎍, 1.0×10¹³ vg당 약 50 내지 400 ㎍, 또는 1.0×10¹³ vg당 약 100 내지 300 ㎍인 rAAV 바이러스 벡터를 수득한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 7.5×10¹³ vg/㎏ 용량이 주어진 SMNΔ7 마우스에서의 15일 초과, 20일 초과, 22일 초과 또는 24일 초과의 중위 생존에 의해 결정한 바와 같은 생체내 효력을 갖는 rAAV 바이러스 벡터를 수득한다.

임의의 상기 실시형태에서, 제조 및/또는 정제 방법은 투여용으로 제형화될 수 있고/있거나 약 6.0×10¹³vg의 단위 용량으로 약제학적 조성물에 존재하는 rAAV 바이러스 벡터를 수득할 수 있다. 임의의 상기 실시형태에서, 제조 및/또는 정제 방법은 투여용으로 제형화될 수 있고/있거나 약 1.2×10¹⁴vg의 단위 용량으로 약제학적 조성물에 존재하는 rAAV 바이러스 벡터를 수득할 수 있다. 임의의 상기 실시형태에서, 제조 및/또는 정제 방법은 투여용으로 제형화될 수 있고/있거나 약 2.4×10¹⁴vg의 단위 용량으로 약제학적 조성물에 존재하는 rAAV 바이러스 벡터를 수득할 수 있다.

예를 들어, 일부 실시형태에서, 상기 방법은 약 10% 미만, 약 8% 미만, 약 7% 미만 또는 약 5% 미만의 빈 바이러스 캡시드를 갖는 rAAV 바이러스 벡터를 수득하되, rAAV 바이러스 벡터는 투여용으로 제형화될 수 있고/있거나 약 6.0×10¹³vg의 단위 용량으로 약제학적 조성물로 존재한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 약 10% 미만, 약 8% 미만, 약 7% 미만 또는 약 5% 미만의 빈 바이러스 캡시드를 갖는 rAAV 바이러스 벡터를 수득하되, rAAV 바이러스 벡터는 투여용으로 제형화될 수 있고/있거나 약 1.2×10¹⁴vg의 단위 용량으로 약제학적 조성물로 존재한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 약 10% 미만, 약 8% 미만, 약 7% 미만 또는 약 5% 미만의 빈 바이러스 캡시드를 갖는 rAAV 바이러스 벡터를 수득하되, rAAV 바이러스 벡터는 투여용으로 제형화될 수 있고/있거나 약 2.4×10¹⁴vg의 단위 용량으로 약제학적 조성물로 존재한다. 일부 실시형태에서, 제형 또는 약제학적 조성물은 약 6.0×10¹³ vg의 rAAV 바이러스 벡터의 단위 투약량을 포함하되, rAAV 바이러스 벡터는 약 10% 미만, 약 8% 미만, 약 7% 미만 또는 약 5% 미만의 빈 바이러스 캡시드를 가진다. 일부 실시형태에서, 제형 또는 약제학적 조성물은 약 1.2×10¹⁴ vg의 rAAV 바이러스 벡터의 단위 투약량을 포함하되, rAAV 바이러스 벡터는 약 10% 미만, 약 8% 미만, 약 7% 미만 또는 약 5% 미만의 빈 바이러스 캡시드를 가진다. 일부 실시형태에서, 제형 또는 약제학적 조성물은 약 2.4×10¹⁴ vg의 rAAV 바이러스 벡터의 단위 투약량을 포함하되, rAAV 바이러스 벡터는 약 10% 미만, 약 8% 미만, 약 7% 미만 또는 약 5% 미만의 빈 바이러스 캡시드를 가진다.

일부 실시형태에서, 상기 방법은 1×10¹³ vg/㎖당 약 100 ng/㎖ 미만의 숙주 세포 단백질을 갖는 rAAV 바이러스 벡터를 수득하고, rAAV 바이러스 벡터는 투여용으로 제형화되고/되거나 약 6.0×10¹³vg의 단위 용량으로 약제학적 조성물에 존재한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 1×10¹³ vg/㎖당 약 100 ng/㎖ 미만의 숙주 세포 단백질을 갖는 rAAV 바이러스 벡터를 수득하고, rAAV 바이러스 벡터는 투여용으로 제형화되고/되거나 약 1.2×10¹⁴ vg의 단위 용량으로 약제학적 조성물에 존재한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 1×10¹³ vg/㎖당 약 100 ng/㎖ 미만의 숙주 세포 단백질을 갖는 rAAV 바이러스 벡터를 수득하고, rAAV 바이러스 벡터는 투여용으로 제형화되고/되거나 약 2.4×10¹⁴ vg의 단위 용량으로 약제학적 조성물에 존재한다. 일부 실시형태에서, 제형 또는 약제학적 조성물은 약 6.0×10¹³ vg의 rAAV 바이러스 벡터의 단위 투약량을 포함하되, rAAV 바이러스 벡터는 1×10¹³ vg/㎖당 약 100 ng/㎖ 미만의 숙주 세포 단백질을 가진다. 일부 실시형태에서, 제형 또는 약제학적 조성물은 약 1.2×10¹⁴ vg의 rAAV 바이러스 벡터의 단위 투약량을 포함하되, rAAV 바이러스 벡터는 1×10¹³ vg/㎖당 약 100 ng/㎖ 미만의 숙주 세포 단백질을 가진다. 일부 실시형태에서, 제형 또는 약제학적 조성물은 약 2.4×10¹⁴ vg의 rAAV 바이러스 벡터의 단위 투약량을 포함하되, rAAV 바이러스 벡터는 1×10¹³ vg/㎖당 약 100 ng/㎖ 미만의 숙주 세포 단백질을 가진다.

일부 실시형태에서, 상기 방법은 잔여 숙주 세포 DNA(hcDNA)가 1×10¹³ vg/㎖당 약 5×10⁶ pg/㎖ 미만, 약 1×10⁶ pg/㎖ 미만, 약 7.5×10⁵ pg/㎖ 미만, 또는 6.8×10⁵ pg/㎖ 미만인 rAAV 바이러스 벡터를 수득하되, rAAV 바이러스 벡터는 투여용으로 제형화되고/되거나 약 6.0×10¹³vg의 단위 용량으로 약제학적 조성물에 존재한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 잔여 숙주 세포 DNA(hcDNA)가 1×10¹³ vg/㎖당 약 5×10⁶ pg/㎖ 미만, 약 1×10⁶ pg/㎖ 미만, 약 7.5×10⁵ pg/㎖ 미만, 또는 6.8×10⁵ pg/㎖ 미만인 rAAV 바이러스 벡터를 수득하되, rAAV 바이러스 벡터는 투여용으로 제형화되고/되거나 약 1.2×10¹⁴vg의 단위 용량으로 약제학적 조성물에 존재한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 잔여 숙주 세포 DNA(hcDNA)가 1×10¹³ vg/㎖당 약 5×10⁶ pg/㎖ 미만, 약 1×10⁶ pg/㎖ 미만, 약 7.5×10⁵ pg/㎖ 미만, 또는 6.8×10⁵ pg/㎖ 미만인 rAAV 바이러스 벡터를 수득하되, rAAV 바이러스 벡터는 투여용으로 제형화되고/되거나 약 2.4×10¹⁴vg의 단위 용량으로 약제학적 조성물에 존재한다. 일부 실시형태에서, 제형 또는 약제학적 조성물은 약 6.0×10¹³ vg의 rAAV 바이러스 벡터의 단위 투약량을 포함하되, rAAV 바이러스 벡터는 1×10¹³ vg/㎖당 약 5×10⁶ pg/㎖ 미만, 약 1×10⁶ pg/㎖ 미만, 약 7.5×10⁵ pg/㎖ 미만, 또는 6.8×10⁵ pg/㎖ 미만의 잔여 숙주 세포 DNA(hcDNA)를 가진다. 일부 실시형태에서, 제형 또는 약제학적 조성물은 약 1.2×10¹⁴ vg의 rAAV 바이러스 벡터의 단위 투약량을 포함하되, rAAV 바이러스 벡터는 1×10¹³ vg/㎖당 약 5×10⁶ pg/㎖ 미만, 약 1×10⁶ pg/㎖ 미만, 약 7.5×10⁵ pg/㎖ 미만, 또는 6.8×10⁵ pg/㎖ 미만의 잔여 숙주 세포 DNA(hcDNA)를 가진다. 일부 실시형태에서, 제형 또는 약제학적 조성물은 약 2.4×10¹⁴ vg의 rAAV 바이러스 벡터의 단위 투약량을 포함하되, rAAV 바이러스 벡터는 1×10¹³ vg/㎖당 약 5×10⁶ pg/㎖ 미만, 약 1×10⁶ pg/㎖ 미만, 약 7.5×10⁵ pg/㎖ 미만, 또는 6.8×10⁵ pg/㎖ 미만의 잔여 숙주 세포 DNA(hcDNA)를 가진다.

일부 실시형태에서, 상기 방법은 1.0×10¹³ vg/㎖당 잔여 숙주 세포 단백질(rHCP)이 약 10 ng 미만, 약 8 ng 미만, 약 6 ng 미만 또는 약 4 ng 미만인 rAAV 바이러스 벡터를 수득하되, rAAV 바이러스 벡터는 투여용으로 제형화되고/되거나, 약 6.0×10¹³vg의 단위 용량으로 약제학적 조성물에 존재한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 1.0×10¹³ vg/㎖당 잔여 숙주 세포 단백질(rHCP)이 약 10 ng 미만, 약 8 ng 미만, 약 6 ng 미만 또는 약 4 ng 미만인 rAAV 바이러스 벡터를 수득하되, rAAV 바이러스 벡터는 투여용으로 제형화되고/되거나, 약 1.2×10¹⁴vg의 단위 용량으로 약제학적 조성물에 존재한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 1.0×10¹³ vg/㎖당 잔여 숙주 세포 단백질(rHCP)이 약 10 ng 미만, 약 8 ng 미만, 약 6 ng 미만 또는 약 4 ng 미만인 rAAV 바이러스 벡터를 수득하되, rAAV 바이러스 벡터는 투여용으로 제형화되고/되거나, 약 2.4×10¹⁴vg의 단위 용량으로 약제학적 조성물에 존재한다. 일부 실시형태에서, 제형 또는 약제학적 조성물은 약 6.0×10¹³ vg의 rAAV 바이러스 벡터의 단위 투약량을 포함하되, rAAV 바이러스 벡터는 잔여 숙주 세포 단백질(rHCP)이 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 10 ng 미만, 약 8 ng 미만, 약 6 ng 미만, 또는 약 4 ng 미만이다. 일부 실시형태에서, 제형 또는 약제학적 조성물은 약 1.2×10¹⁴ vg의 rAAV 바이러스 벡터의 단위 투약량을 포함하되, rAAV 바이러스 벡터는 잔여 숙주 세포 단백질(rHCP)이 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 10 ng 미만, 약 8 ng 미만, 약 6 ng 미만, 또는 약 4 ng 미만이다. 일부 실시형태에서, 제형 또는 약제학적 조성물은 약 2.4×10¹⁴ vg의 rAAV 바이러스 벡터의 단위 투약량을 포함하되, rAAV 바이러스 벡터는 잔여 숙주 세포 단백질(rHCP)이 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 10 ng 미만, 약 8 ng 미만, 약 6 ng 미만, 또는 약 4 ng 미만이다.

일부 실시형태에서, 상기 방법은 기능성인 rAAV(예를 들어, AAV9) 바이러스 벡터 게놈/㎖의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 100%를 수득하되, rAAV 바이러스 벡터는 투여용으로 제형화되고/되거나, 약 6.0×10¹³ vg의 단위 용량으로 약제학적 조성물에 존재한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 기능성인 rAAV(예를 들어, AAV9) 바이러스 벡터 게놈/㎖의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 100%를 수득하되, rAAV 바이러스 벡터는 투여용으로 제형화되고/되거나, 약 1.2×10¹⁴ vg의 단위 용량으로 약제학적 조성물에 존재한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 기능성인 rAAV(예를 들어, AAV9) 바이러스 벡터 게놈/㎖의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 100%를 수득하되, rAAV 바이러스 벡터는 투여용으로 제형화되고/되거나, 약 2.4×10¹⁴ vg의 단위 용량으로 약제학적 조성물에 존재한다. 일부 실시형태에서, 제형 또는 약제학적 조성물은 약 6.0×10¹³ vg의 rAAV 바이러스 벡터의 단위 투약량을 포함하되, 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 100%의 rAAV(예를 들어, rAAV9) 바이러스 벡터 게놈은 기능성이다. 일부 실시형태에서, 제형 또는 약제학적 조성물은 약 1.2×10¹⁴ vg의 rAAV 바이러스 벡터의 단위 투약량을 포함하되, 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 100%의 rAAV(예를 들어, rAAV9) 바이러스 벡터 게놈은 기능성이다. 일부 실시형태에서, 제형 또는 약제학적 조성물은 약 2.4×10¹⁴ vg의 rAAV 바이러스 벡터의 단위 투약량을 포함하되, rAAV 바이러스 벡터, 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 100%의 rAAV(예를 들어, rAAV9) 바이러스 벡터 게놈은 기능성이다.

일부 실시형태에서, 상기 방법은 잔여 플라스미드 DNA가 1×10¹³ vg/㎖당 1.7×10⁶ pg/㎖, 또는 1×10¹³ vg/㎖당 1×10⁵ pg/㎖ 내지 1×10¹³ vg/㎖당 1.7×10⁶ pg/㎖ 이하인 rAAV 바이러스 벡터를 수득하되, rAAV 바이러스 벡터는 투여용으로 제형화되고/되거나, 약 6.0×10¹³ vg의 단위 용량으로 약제학적 조성물에 존재한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 잔여 플라스미드 DNA가 1×10¹³ vg/㎖당 1.7×10⁶ pg/㎖, 또는 1×10¹³ vg/㎖당 1×10⁵ pg/㎖ 내지 1×10¹³ vg/㎖당 1.7×10⁶ pg/㎖ 이하인 rAAV 바이러스 벡터를 수득하되, rAAV 바이러스 벡터는 투여용으로 제형화되고/되거나, 약 1.2×10¹⁴ vg의 단위 용량으로 약제학적 조성물에 존재한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 잔여 플라스미드 DNA가 1×10¹³ vg/㎖당 1.7×10⁶ pg/㎖, 또는 1×10¹³ vg/㎖당 1×10⁵ pg/㎖ 내지 1×10¹³ vg/㎖당 1.7×10⁶ pg/㎖ 이하인 rAAV 바이러스 벡터를 수득하되, rAAV 바이러스 벡터는 투여용으로 제형화되고/되거나, 약 2.4×10¹⁴ vg의 단위 용량으로 약제학적 조성물에 존재한다. 일부 실시형태에서, 제형 또는 약제학적 조성물은 약 6.0×10¹³ vg의 rAAV 바이러스 벡터의 단위 투약량을 포함하되, rAAV 바이러스 벡터는 1×10¹³ vg/㎖당 1.7×10⁶ pg/㎖, 또는 1×10¹³ vg/㎖당 1×10⁵ pg/㎖ 내지 1×10¹³ vg/㎖당 1.7×10⁶ pg/㎖ 이하의 잔여 플라스미드 DNA를 가진다. 일부 실시형태에서, 제형 또는 약제학적 조성물은 약 1.2×10¹⁴ vg의 rAAV 바이러스 벡터의 단위 투약량을 포함하되, rAAV 바이러스 벡터는 1×10¹³ vg/㎖당 1.7×10⁶ pg/㎖, 또는 1×10¹³ vg/㎖당 1×10⁵ pg/㎖ 내지 1×10¹³ vg/㎖당 1.7×10⁶ pg/㎖ 이하의 잔여 플라스미드 DNA를 가진다. 일부 실시형태에서, 제형 또는 약제학적 조성물은 약 2.4×10¹⁴ vg의 rAAV 바이러스 벡터의 단위 투약량을 포함하되, rAAV 바이러스 벡터는 1×10¹³ vg/㎖당 1.7×10⁶ pg/㎖, 또는 1×10¹³ vg/㎖당 1×10⁵ pg/㎖ 내지 1×10¹³ vg/㎖당 1.7×10⁶ pg/㎖ 이하의 잔여 플라스미드 DNA를 가진다.

일부 실시형태에서, 상기 방법은 벤조나제 농도가 1.0×10¹³vg당 0.2 ng, 1.0×10¹³ vg당 0.1 ng 미만, 또는 1.0×10¹³ vg당 0.09 ng 미만인 rAAV 바이러스 벡터를 수득하되, rAAV 바이러스 벡터는 투여용으로 제형화되고/되거나 약 6.0×10¹³ vg의 단위 용량으로 약제학적 조성물에 존재한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 벤조나제 농도가 1.0×10¹³vg당 0.2 ng, 1.0×10¹³ vg당 0.1 ng 미만, 또는 1.0×10¹³ vg당 0.09 ng 미만인 rAAV 바이러스 벡터를 수득하되, rAAV 바이러스 벡터는 투여용으로 제형화되고/되거나 약 1.2×10¹⁴ vg의 단위 용량으로 약제학적 조성물에 존재한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 벤조나제 농도가 1.0×10¹³vg당 0.2 ng, 1.0×10¹³ vg당 0.1 ng 미만, 또는 1.0×10¹³ vg당 0.09 ng 미만인 rAAV 바이러스 벡터를 수득하되, rAAV 바이러스 벡터는 투여용으로 제형화되고/되거나 약 2.4×10¹⁴ vg의 단위 용량으로 약제학적 조성물에 존재한다. 일부 실시형태에서, 제형 또는 약제학적 조성물은 약 6.0×10¹³ vg의 rAAV 바이러스 벡터의 단위 투약량을 포함하되, rAAV 바이러스 벡터는 벤조나제 농도가 1.0×10¹³vg당 0.2 ng 미만, 1.0×10¹³ vg당 0.1 ng 미만, 또는 1.0×10¹³ vg당 0.09 ng 미만이다. 일부 실시형태에서, 제형 또는 약제학적 조성물은 약 1.2×10¹⁴ vg의 rAAV 바이러스 벡터의 단위 투약량을 포함하되, rAAV 바이러스 벡터는 벤조나제 농도가 1.0×10¹³vg당 0.2 ng 미만, 1.0×10¹³ vg당 0.1 ng 미만, 또는 1.0×10¹³ vg당 0.09 ng 미만이다. 일부 실시형태에서, 제형 또는 약제학적 조성물은 약 2.4×10¹⁴ vg의 rAAV 바이러스 벡터의 단위 투약량을 포함하되, rAAV 바이러스 벡터는 벤조나제 농도가 1.0×10¹³vg당 0.2 ng 미만, 1.0×10¹³ vg당 0.1 ng 미만, 또는 1.0×10¹³ vg당 0.09 ng 미만이다.

일부 실시형태에서, 상기 방법은 소 혈청 알부민(BSA) 농도가 1.0×10¹³vg당 0.5 ng, 1.0×10¹³ vg당 0.3 ng 미만, 또는 1.0×10¹³ vg당 0.22 ng 미만인 rAAV 바이러스 벡터를 수득하되, rAAV 바이러스 벡터는 투여용으로 제형화되고/되거나 약 6.0×10¹³ vg의 단위 용량으로 약제학적 조성물에 존재한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 소 혈청 알부민(BSA) 농도가 1.0×10¹³vg당 0.5 ng, 1.0×10¹³ vg당 0.3 ng 미만, 또는 1.0×10¹³ vg당 0.22 ng 미만인 rAAV 바이러스 벡터를 수득하되, rAAV 바이러스 벡터는 투여용으로 제형화되고/되거나 약 1.2×10¹⁴ vg의 단위 용량으로 약제학적 조성물에 존재한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 소 혈청 알부민(BSA) 농도가 1.0×10¹³vg당 0.5 ng, 1.0×10¹³ vg당 0.3 ng 미만, 또는 1.0×10¹³ vg당 0.22 ng 미만인 rAAV 바이러스 벡터를 수득하되, rAAV 바이러스 벡터는 투여용으로 제형화되고/되거나 약 2.4×10¹⁴ vg의 단위 용량으로 약제학적 조성물에 존재한다. 일부 실시형태에서, 제형 또는 약제학적 조성물은 약 6.0×10¹³ vg의 rAAV 바이러스 벡터의 단위 투약량을 포함하되, rAAV 바이러스 벡터는 소 혈청 알부민(BSA) 농도가 1.0×10¹³vg당 0.5 ng 미만, 1.0×10¹³ vg당 0.3 ng 미만, 또는 1.0×10¹³ vg당 0.22 ng 미만이다. 일부 실시형태에서, 제형 또는 약제학적 조성물은 약 1.2×10¹⁴ vg의 rAAV 바이러스 벡터의 단위 투약량을 포함하되, rAAV 바이러스 벡터는 소 혈청 알부민(BSA) 농도가 1.0×10¹³vg당 0.5 ng 미만, 1.0×10¹³ vg당 0.3 ng 미만, 또는 1.0×10¹³ vg당 0.22 ng 미만이다. 일부 실시형태에서, 제형 또는 약제학적 조성물은 약 2.4×10¹⁴ vg의 rAAV 바이러스 벡터의 단위 투약량을 포함하되, rAAV 바이러스 벡터는 소 혈청 알부민(BSA) 농도가 1.0×10¹³vg당 0.5 ng 미만, 1.0×10¹³ vg당 0.3 ng 미만, 또는 1.0×10¹³ vg당 0.22 ng 미만이다.

일부 실시형태에서, 상기 방법은 내독소 수준이 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 1 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.75 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.5 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.4 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.35 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.3 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.25 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.2 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.13 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.1 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.05 EU/㎖ 미만, 또는 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.02 EU/㎖ 미만인 rAAV 바이러스 벡터를 수득하되, rAAV 바이러스 벡터는 투여용으로 제형화되고/되거나 약 6.0×10¹³ vg의 단위 용량으로 약제학적 조성물에 존재한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 내독소 수준이 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 1 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.75 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.5 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.4 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.35 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.3 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.25 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.2 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.13 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.1 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.05 EU/㎖ 미만, 또는 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.02 EU/㎖ 미만인 rAAV 바이러스 벡터를 수득하되, rAAV 바이러스 벡터는 투여용으로 제형화되고/되거나 약 1.2×10¹⁴ vg의 단위 용량으로 약제학적 조성물에 존재한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 내독소 수준이 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 1 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.75 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.5 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.4 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.35 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.3 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.25 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.2 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.13 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.1 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.05 EU/㎖ 미만, 또는 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.02 EU/㎖ 미만인 rAAV 바이러스 벡터를 수득하되, rAAV 바이러스 벡터는 투여용으로 제형화되고/되거나 약 2.4×10¹⁴ vg의 단위 용량으로 약제학적 조성물에 존재한다. 일부 실시형태에서, 제형 또는 약제학적 조성물은 약 6.0×10¹³ vg의 rAAV 바이러스 벡터의 단위 투약량을 포함하되, rAAV 바이러스 벡터는 내독소 수준이 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 1 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.75 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.5 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.4 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.35 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.3 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.25 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.2 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.13 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.1 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.05 EU/㎖ 미만, 또는 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.02 EU/㎖ 미만이다. 일부 실시형태에서, 제형 또는 약제학적 조성물은 약 1.2×10¹⁴ vg의 rAAV 바이러스 벡터의 단위 투약량을 포함하되, rAAV 바이러스 벡터는 내독소 수준이 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 1 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.75 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.5 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.4 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.35 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.3 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.25 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.2 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.13 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.1 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.05 EU/㎖ 미만, 또는 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.02 EU/㎖ 미만이다. 일부 실시형태에서, 제형 또는 약제학적 조성물은 약 2.4×10¹⁴ vg의 rAAV 바이러스 벡터의 단위 투약량을 포함하되, rAAV 바이러스 벡터는 내독소 수준이 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 1 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.75 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.5 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.4 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.35 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.3 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.25 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.2 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.13 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.1 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.05 EU/㎖ 미만, 또는 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.02 EU/㎖ 미만이다.

일부 실시형태에서, 상기 방법은 세슘 농도가 100 ㎍/g(ppm) 미만, 50 ㎍/g(ppm) 또는 30 ㎍/g(ppm) 미만인 rAAV 바이러스 벡터를 수득하며, rAAV 바이러스 벡터는 투여용으로 제형화되고/되거나, 약 6.0×10¹³ vg의 단위 용량으로 약제학적 조성물에 제공된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 세슘 농도가 100 ㎍/g(ppm) 미만, 50 ㎍/g(ppm) 또는 30 ㎍/g(ppm) 미만인 rAAV 바이러스 벡터를 수득하며, rAAV 바이러스 벡터는 투여용으로 제형화되고/되거나, 약 1.2×10¹⁴ vg의 단위 용량으로 약제학적 조성물에 제공된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 세슘 농도가 100 ㎍/g(ppm) 미만, 50 ㎍/g(ppm) 또는 30 ㎍/g(ppm) 미만인 rAAV 바이러스 벡터를 수득하며, rAAV 바이러스 벡터는 투여용으로 제형화되고/되거나, 약 2.4×10¹⁴ vg의 단위 용량으로 약제학적 조성물에 제공된다. 일부 실시형태에서, 제형 또는 약제학적 조성물은 약 6.0×10¹³ vg의 rAAV 바이러스 벡터의 단위 투약량을 포함하되, rAAV 바이러스 벡터는 세슘 농도가 100 ㎍/g(ppm) 미만, 50 ㎍/g(ppm) 미만 또는 30 ㎍/g(ppm) 미만이다. 일부 실시형태에서, 제형 또는 약제학적 조성물은 약 1.2×10¹⁴ vg의 rAAV 바이러스 벡터의 단위 투약량을 포함하되, rAAV 바이러스 벡터는 세슘 농도가 100 ㎍/g(ppm) 미만, 50 ㎍/g(ppm) 미만 또는 30 ㎍/g(ppm) 미만이다. 일부 실시형태에서, 제형 또는 약제학적 조성물은 약 2.4×10¹⁴ vg의 rAAV 바이러스 벡터의 단위 투약량을 포함하되, rAAV 바이러스 벡터는 세슘 농도가 100 ㎍/g(ppm) 미만, 50 ㎍/g(ppm) 미만 또는 30 ㎍/g(ppm) 미만이다.

일부 실시형태에서, 상기 방법은 폴록사머 188이 약 10 내지 100 ppm, 15 내지 90 ppm, 또는 약 20 내지 80 ppm인 rAAV 바이러스 벡터를 수득하되, rAAV 바이러스 벡터는 투여용으로 제형화되고/되거나, 약 6.0×10¹³ vg의 단위 용량으로 약제학적 조성물에 존재한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 폴록사머 188이 약 10 내지 100 ppm, 15 내지 90 ppm, 또는 약 20 내지 80 ppm인 rAAV 바이러스 벡터를 수득하되, rAAV 바이러스 벡터는 투여용으로 제형화되고/되거나, 약 1.2×10¹⁴ vg의 단위 용량으로 약제학적 조성물에 존재한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 폴록사머 188이 약 10 내지 100 ppm, 15 내지 90 ppm, 또는 약 20 내지 80 ppm인 rAAV 바이러스 벡터를 수득하되, rAAV 바이러스 벡터는 투여용으로 제형화되고/되거나, 약 2.4×10¹⁴ vg의 단위 용량으로 약제학적 조성물에 존재한다. 일부 실시형태에서, 제형 또는 약제학적 조성물은 약 6.0×10¹³ vg의 rAAV 바이러스 벡터의 단위 투약량을 포함하되, rAAV 바이러스 벡터는 폴록사머 188이 약 10 내지 100 ppm, 15 내지 90 ppm, 또는 약 20 내지 80 ppm이다. 일부 실시형태에서, 제형 또는 약제학적 조성물은 약 1.2×10¹⁴ vg의 rAAV 바이러스 벡터의 단위 투약량을 포함하되, rAAV 바이러스 벡터는 폴록사머 188이 약 10 내지 100 ppm, 15 내지 90 ppm, 또는 약 20 내지 80 ppm이다. 일부 실시형태에서, 제형 또는 약제학적 조성물은 약 2.4×10¹⁴ vg의 rAAV 바이러스 벡터의 단위 투약량을 포함하되, rAAV 바이러스 벡터는 폴록사머 188이 약 10 내지 100 ppm, 15 내지 90 ppm, 또는 약 20 내지 80 ppm이다.

일부 실시형태에서, 상기 방법은 용기당 크기가 25 ㎛ 이상인 2000개 미만, 1500개 미만, 1000개 미만 또는 600개 미만의 입자를 갖는 rAAV 바이러스 벡터를 수득하되, rAAV 바이러스 벡터는 투여용으로 제형화되고/되거나, 약 6.0×10¹³ vg의 단위 용량으로 약제학적 조성물에 존재한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 용기당 크기가 25 ㎛ 이상인 2000개 미만, 1500개 미만, 1000개 미만 또는 600개 미만의 입자를 갖는 rAAV 바이러스 벡터를 수득하되, rAAV 바이러스 벡터는 투여용으로 제형화되고/되거나, 약 1.2×10¹⁴ vg의 단위 용량으로 약제학적 조성물에 존재한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 용기당 크기가 25 ㎛ 이상인 2000개 미만, 1500개 미만, 1000개 미만 또는 600개 미만의 입자를 갖는 rAAV 바이러스 벡터를 수득하되, rAAV 바이러스 벡터는 투여용으로 제형화되고/되거나, 약 2.4×10¹⁴ vg의 단위 용량으로 약제학적 조성물에 존재한다. 일부 실시형태에서, 제형 또는 약제학적 조성물은 약 6.0×10¹³ vg의 rAAV 바이러스 벡터의 단위 투약량을 포함하되, rAAV 바이러스 벡터는 용기당 크기가 25 ㎛ 이상인 2000개 미만, 1500개 미만, 1000개 미만 또는 600개 미만의 입자를 가진다. 일부 실시형태에서, 제형 또는 약제학적 조성물은 약 1.2×10¹⁴ vg의 rAAV 바이러스 벡터의 단위 투약량을 포함하되, rAAV 바이러스 벡터는 용기당 크기가 25 ㎛ 이상인 2000개 미만, 1500개 미만, 1000개 미만 또는 600개 미만의 입자를 가진다. 일부 실시형태에서, 제형 또는 약제학적 조성물은 약 2.4×10¹⁴ vg의 rAAV 바이러스 벡터의 단위 투약량을 포함하되, rAAV 바이러스 벡터는 용기당 크기가 25 ㎛ 이상인 2000개 미만, 1500개 미만, 1000개 미만 또는 600개 미만의 입자를 가진다.

일부 실시형태에서, 상기 방법은 용기당 크기가 10 ㎛ 이상인 10000개 미만, 8000개 미만, 1000개 미만 또는 6000개 미만의 입자를 갖는 rAAV 바이러스 벡터를 수득하되, rAAV 바이러스 벡터는 투여용으로 제형화되고/되거나, 약 6.0×10¹³ vg의 단위 용량으로 약제학적 조성물에 존재한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 용기당 크기가 10 ㎛ 이상인 10000개 미만, 8000개 미만, 1000개 미만 또는 6000개 미만의 입자를 갖는 rAAV 바이러스 벡터를 수득하되, rAAV 바이러스 벡터는 투여용으로 제형화되고/되거나, 약 1.2×10¹⁴ vg의 단위 용량으로 약제학적 조성물에 존재한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 용기당 크기가 10 ㎛ 이상인 10000개 미만, 8000개 미만, 1000개 미만 또는 6000개 미만의 입자를 갖는 rAAV 바이러스 벡터를 수득하되, rAAV 바이러스 벡터는 투여용으로 제형화되고/되거나, 약 2.4×10¹⁴ vg의 단위 용량으로 약제학적 조성물에 존재한다. 일부 실시형태에서, 제형 또는 약제학적 조성물은 약 6.0×10¹³ vg의 rAAV 바이러스 벡터의 단위 투약량을 포함하되, rAAV 바이러스 벡터는 용기당 크기가 10 ㎛ 이상인 10000개 미만, 8000개 미만, 1000개 미만 또는 6000개 미만의 입자를 가진다. 일부 실시형태에서, 제형 또는 약제학적 조성물은 약 1.2×10¹⁴ vg의 rAAV 바이러스 벡터의 단위 투약량을 포함하되, rAAV 바이러스 벡터는 용기당 크기가 10 ㎛ 이상인 10000개 미만, 8000개 미만, 1000개 미만 또는 6000개 미만의 입자를 가진다. 일부 실시형태에서, 제형 또는 약제학적 조성물은 약 2.4×10¹⁴ vg의 rAAV 바이러스 벡터의 단위 투약량을 포함하되, rAAV 바이러스 벡터는 용기당 크기가 10 ㎛ 이상인 10000개 미만, 8000개 미만, 1000개 미만 또는 6000개 미만의 입자를 가진다.

일부 실시형태에서, 상기 방법은 pH가 7.5 내지 8.5, 7.6 내지 8.4 또는 7.8 내지 8.3인 rAAV 바이러스 벡터를 수득하되, rAAV 바이러스 벡터는 투여용으로 제형화되고/되거나, 약 6.0×10¹³ vg의 단위 용량으로 약제학적 조성물에 존재한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 pH가 7.5 내지 8.5, 7.6 내지 8.4 또는 7.8 내지 8.3인 rAAV 바이러스 벡터를 수득하되, rAAV 바이러스 벡터는 투여용으로 제형화되고/되거나, 약 1.2×10¹⁴ vg의 단위 용량으로 약제학적 조성물에 존재한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 pH가 7.5 내지 8.5, 7.6 내지 8.4 또는 7.8 내지 8.3인 rAAV 바이러스 벡터를 수득하되, rAAV 바이러스 벡터는 투여용으로 제형화되고/되거나, 약 2.4×10¹⁴ vg의 단위 용량으로 약제학적 조성물에 존재한다. 일부 실시형태에서, 제형 또는 약제학적 조성물은 약 6.0×10¹³ vg의 rAAV 바이러스 벡터의 단위 투약량을 포함하되, rAAV 바이러스 벡터는 pH가 7.5 내지 8.5, 7.6 내지 8.4 또는 7.8 내지 8.3이다. 일부 실시형태에서, 제형 또는 약제학적 조성물은 약 1.2×10¹⁴ vg의 rAAV 바이러스 벡터의 단위 투약량을 포함하되, rAAV 바이러스 벡터는 pH가 7.5 내지 8.5, 7.6 내지 8.4 또는 7.8 내지 8.3이다. 일부 실시형태에서, 제형 또는 약제학적 조성물은 약 2.4×10¹⁴ vg의 rAAV 바이러스 벡터의 단위 투약량을 포함하되, rAAV 바이러스 벡터는 pH가 7.5 내지 8.5, 7.6 내지 8.4 또는 7.8 내지 8.3이다.

일부 실시형태에서, 상기 방법은 삼투몰농도가 330 내지 490 mOsm/㎏, 360 내지 460 mOsm/㎏ 또는 390 내지 430 mOsm/㎏인 rAAV 바이러스 벡터를 수득하되, rAAV 바이러스 벡터는 투여용으로 제형화되고/되거나 약 6.0×10¹³ vg의 단위 용량으로 약제학적 조성물에 존재한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 삼투몰농도가 330 내지 490 mOsm/㎏, 360 내지 460 mOsm/㎏ 또는 390 내지 430 mOsm/㎏인 rAAV 바이러스 벡터를 수득하되, rAAV 바이러스 벡터는 투여용으로 제형화되고/되거나 약 1.2×10¹⁴ vg의 단위 용량으로 약제학적 조성물에 존재한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 삼투몰농도가 330 내지 490 mOsm/㎏, 360 내지 460 mOsm/㎏ 또는 390 내지 430 mOsm/㎏인 rAAV 바이러스 벡터를 수득하되, rAAV 바이러스 벡터는 투여용으로 제형화되고/되거나 약 2.4×10¹⁴ vg의 단위 용량으로 약제학적 조성물에 존재한다. 일부 실시형태에서, 제형 또는 약제학적 조성물은 약 6.0×10¹³ vg의 rAAV 바이러스 벡터의 단위 투약량을 포함하되, rAAV 바이러스 벡터는 삼투몰농도가 330 내지 490 mOsm/㎏, 360 내지 460 mOsm/㎏ 또는 390 내지 430 mOsm/㎏이다. 일부 실시형태에서, 제형 또는 약제학적 조성물은 약 1.2×10¹⁴ vg의 rAAV 바이러스 벡터의 단위 투약량을 포함하되, rAAV 바이러스 벡터는 삼투몰농도가 330 내지 490 mOsm/㎏, 360 내지 460 mOsm/㎏ 또는 390 내지 430 mOsm/㎏이다. 일부 실시형태에서, 제형 또는 약제학적 조성물은 약 2.4×10¹⁴ vg의 rAAV 바이러스 벡터의 단위 투약량을 포함하되, rAAV 바이러스 벡터는 삼투몰농도가 330 내지 490 mOsm/㎏, 360 내지 460 mOsm/㎏ 또는 390 내지 430 mOsm/㎏이다.

일부 실시형태에서, 상기 방법은 감염성 역가가 1.0×10¹³ vg당 약 1.0×10⁸ 내지 10.0×10¹⁰IU, 1.0×10¹³ vg당 약 2.5×10⁸ 내지 9.0×10¹⁰IU, 또는 1.0×10¹³ vg당 약 3.9×10⁸ 내지 8.4×10¹⁰IU인, rAAV 바이러스 벡터를 수득하되, rAAV 바이러스 벡터는 투여용으로 제형화되고/되거나, 약 6.0×10¹³ vg의 단위 용량으로 약제학적 조성물에 존재한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 감염성 역가가 1.0×10¹³ vg당 약 1.0×10⁸ 내지 10.0×10¹⁰IU, 1.0×10¹³ vg당 약 2.5×10⁸ 내지 9.0×10¹⁰IU, 또는 1.0×10¹³ vg당 약 3.9×10⁸ 내지 8.4×10¹⁰IU인, rAAV 바이러스 벡터를 수득하되, rAAV 바이러스 벡터는 투여용으로 제형화되고/되거나, 약 1.2×10¹⁴ vg의 단위 용량으로 약제학적 조성물에 존재한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 감염성 역가가 1.0×10¹³ vg당 약 1.0×10⁸ 내지 10.0×10¹⁰IU, 1.0×10¹³ vg당 약 2.5×10⁸ 내지 9.0×10¹⁰IU, 또는 1.0×10¹³ vg당 약 3.9×10⁸ 내지 8.4×10¹⁰IU인, rAAV 바이러스 벡터를 수득하되, rAAV 바이러스 벡터는 투여용으로 제형화되고/되거나, 약 2.4×10¹⁴ vg의 단위 용량으로 약제학적 조성물에 존재한다. 일부 실시형태에서, 제형 또는 약제학적 조성물은 약 6.0×10¹³ vg의 rAAV 바이러스 벡터의 단위 투약량을 포함하되, rAAV 바이러스 벡터는 감염성 역가가 1.0×10¹³ vg당 약 1.0×10⁸ 내지 10.0×10¹⁰IU, 1.0×10¹³ vg당 약 2.5×10⁸ 내지 9.0×10¹⁰IU 또는 1.0×10¹³ vg당 약 3.9×10⁸ 내지 8.4×10¹⁰IU이다. 일부 실시형태에서, 제형 또는 약제학적 조성물은 약 1.2×10¹⁴ vg의 rAAV 바이러스 벡터의 단위 투약량을 포함하되, rAAV 바이러스 벡터는 감염성 역가가 1.0×10¹³ vg당 약 1.0×10⁸ 내지 10.0×10¹⁰IU, 1.0×10¹³ vg당 약 2.5×10⁸ 내지 9.0×10¹⁰IU 또는 1.0×10¹³ vg당 약 3.9×10⁸ 내지 8.4×10¹⁰IU이다. 일부 실시형태에서, 제형 또는 약제학적 조성물은 약 2.4×10¹⁴ vg의 rAAV 바이러스 벡터의 단위 투약량을 포함하되, rAAV 바이러스 벡터는 감염성 역가가 1.0×10¹³ vg당 약 1.0×10⁸ 내지 10.0×10¹⁰IU, 1.0×10¹³ vg당 약 2.5×10⁸ 내지 9.0×10¹⁰IU 또는 1.0×10¹³ vg당 약 3.9×10⁸ 내지 8.4×10¹⁰IU이다.

일부 실시형태에서, 상기 방법은 시험관내 세포 기반 분석에 기반하여 참조 표준 및/또는 적합한 대조군에 비해 약 30 내지 150%, 약 60 내지 140%, 또는 약 70 내지 130% 상대 효력을 갖는 rAAV 바이러스 벡터를 수득하되, rAAV 바이러스 벡터는 투여용으로 제형화되고/되거나 약 6.0×10¹³ vg의 단위 용량으로 약제학적 조성물에 존재한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 시험관내 세포 기반 분석에 기반하여 참조 표준 및/또는 적합한 대조군에 비해 약 30 내지 150%, 약 60 내지 140%, 또는 약 70 내지 130% 상대 효력을 갖는 rAAV 바이러스 벡터를 수득하되, rAAV 바이러스 벡터는 투여용으로 제형화되고/되거나 약 1.2×10¹⁴ vg의 단위 용량으로 약제학적 조성물에 존재한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 시험관내 세포 기반 분석에 기반하여 참조 표준 및/또는 적합한 대조군에 비해 약 30 내지 150%, 약 60 내지 140%, 또는 약 70 내지 130% 상대 효력을 갖는 rAAV 바이러스 벡터를 수득하되, rAAV 바이러스 벡터는 투여용으로 제형화되고/되거나 약 2.4×10¹⁴ vg의 단위 용량으로 약제학적 조성물에 존재한다. 일부 실시형태에서, 제형 또는 약제학적 조성물은 약 6.0×10¹³ vg의 rAAV 바이러스 벡터의 단위 투약량을 포함하되, rAAV 바이러스 벡터는 시험관내 세포-기반 분석에 기반하여 참조 표준 및/또는 적합한 대조군에 비해 약 30 내지 150%, 약 60 내지 140%, 또는 약 70 내지 130%의 상대 효력을 가진다. 일부 실시형태에서, 제형 또는 약제학적 조성물은 약 1.2×10¹⁴ vg의 rAAV 바이러스 벡터의 단위 투약량을 포함하되, rAAV 바이러스 벡터는 시험관내 세포-기반 분석에 기반하여 참조 표준 및/또는 적합한 대조군에 비해 약 30 내지 150%, 약 60 내지 140%, 또는 약 70 내지 130%의 상대 효력을 가진다. 일부 실시형태에서, 제형 또는 약제학적 조성물은 약 2.4×10¹⁴ vg의 rAAV 바이러스 벡터의 단위 투약량을 포함하되, rAAV 바이러스 벡터는 시험관내 세포-기반 분석에 기반하여 참조 표준 및/또는 적합한 대조군에 비해 약 30 내지 150%, 약 60 내지 140%, 또는 약 70 내지 130%의 상대 효력을 가진다.

일부 실시형태에서, 상기 방법은 총 단백질 수준이 1.0×10¹³ vg당 약 10 내지 500 ㎍, 1.0×10¹³ vg당 약 50 내지 400 ㎍, 또는 1.0×10¹³ vg당 약 100 내지 300 ㎍인 rAAV 바이러스 벡터를 수득하되, rAAV 바이러스 벡터는 투여용으로 제형화되고/되거나 약 6.0×10¹³ vg의 단위 용량으로 약제학적 조성물에 존재한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 총 단백질 수준이 1.0×10¹³ vg당 약 10 내지 500 ㎍, 1.0×10¹³ vg당 약 50 내지 400 ㎍, 또는 1.0×10¹³ vg당 약 100 내지 300 ㎍인 rAAV 바이러스 벡터를 수득하되, rAAV 바이러스 벡터는 투여용으로 제형화되고/되거나 약 1.2×10¹⁴ vg의 단위 용량으로 약제학적 조성물에 존재한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 총 단백질 수준이 1.0×10¹³ vg당 약 10 내지 500 ㎍, 1.0×10¹³ vg당 약 50 내지 400 ㎍, 또는 1.0×10¹³ vg당 약 100 내지 300 ㎍인 rAAV 바이러스 벡터를 수득하되, rAAV 바이러스 벡터는 투여용으로 제형화되고/되거나 약 2.4×10¹⁴ vg의 단위 용량으로 약제학적 조성물에 존재한다. 일부 실시형태에서, 제형 또는 약제학적 조성물은 약 6.0×10¹³ vg의 rAAV 바이러스 벡터의 단위 투약량을 포함하되, rAAV 바이러스 벡터는 총 단백질 수준이 1.0×10¹³ vg당 약 10 내지 500 ㎍, 1.0×10¹³ vg당 약 50 내지 400 ㎍, 또는 1.0×10¹³ vg당 약 100 내지 300 ㎍이다. 일부 실시형태에서, 제형 또는 약제학적 조성물은 약 1.2×10¹⁴ vg의 rAAV 바이러스 벡터의 단위 투약량을 포함하되, rAAV 바이러스 벡터는 총 단백질 수준이 1.0×10¹³ vg당 약 10 내지 500 ㎍, 1.0×10¹³ vg당 약 50 내지 400 ㎍, 또는 1.0×10¹³ vg당 약 100 내지 300 ㎍이다. 일부 실시형태에서, 제형 또는 약제학적 조성물은 약 2.4×10¹⁴ vg의 rAAV 바이러스 벡터의 단위 투약량을 포함하되, rAAV 바이러스 벡터는 총 단백질 수준이 1.0×10¹³ vg당 약 10 내지 500 ㎍, 1.0×10¹³ vg당 약 50 내지 400 ㎍, 또는 1.0×10¹³ vg당 약 100 내지 300 ㎍이다.

일부 실시형태에서, 상기 방법은 7.5×10¹³ vg/㎏ 용량이 주어진 SMNΔ7 마우스에서의 15일 초과, 20일 초과, 22일 초과 또는 24일 초과의 중위 생존에 의해 결정한 바와 같은 생체내 효력을 갖는 rAAV 바이러스 벡터를 수득하되, rAAV 바이러스 벡터는 투여용으로 제형화되고/되거나 약 6.0×10¹³ vg의 단위 용량으로 약제학적 조성물에 존재한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 7.5×10¹³ vg/㎏ 용량이 주어진 SMNΔ7 마우스에서의 15일 초과, 20일 초과, 22일 초과 또는 24일 초과의 중위 생존에 의해 결정한 바와 같은 생체내 효력을 갖는 rAAV 바이러스 벡터를 수득하되, rAAV 바이러스 벡터는 투여용으로 제형화되고/되거나 약 1.2×10¹⁴ vg의 단위 용량으로 약제학적 조성물에 존재한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 7.5×10¹³ vg/㎏ 용량이 주어진 SMNΔ7 마우스에서의 15일 초과, 20일 초과, 22일 초과 또는 24일 초과의 중위 생존에 의해 결정한 바와 같은 생체내 효력을 갖는 rAAV 바이러스 벡터를 수득하되, rAAV 바이러스 벡터는 투여용으로 제형화되고/되거나 약 2.4×10¹⁴ vg의 단위 용량으로 약제학적 조성물에 존재한다. 일부 실시형태에서, 제형 또는 약제학적 조성물은 약 6.0×10¹³ vg의 rAAV 바이러스 벡터의 단위 투약량을 포함하되, rAAV 바이러스 벡터는 7.5×10¹³ vg/㎏ 용량이 제공된 SMNΔ7 마우스에서의 15일 초과, 20일 초과, 22일 초과 또는 24일 초과의 중위 생존에 의해 결정된 바와 같은 생체내 효력을 가진다. 일부 실시형태에서, 제형 또는 약제학적 조성물은 약 1.2×10¹⁴ vg의 rAAV 바이러스 벡터의 단위 투약량을 포함하되, rAAV 바이러스 벡터는 7.5×10¹³ vg/㎏ 용량이 제공된 SMNΔ7 마우스에서의 15일 초과, 20일 초과, 22일 초과 또는 24일 초과의 중위 생존에 의해 결정된 바와 같은 생체내 효력을 가진다. 일부 실시형태에서, 제형 또는 약제학적 조성물은 약 2.4×10¹⁴ vg의 rAAV 바이러스 벡터의 단위 투약량을 포함하되, rAAV 바이러스 벡터는 7.5×10¹³ vg/㎏ 용량이 제공된 SMNΔ7 마우스에서의 15일 초과, 20일 초과, 22일 초과 또는 24일 초과의 중위 생존에 의해 결정된 바와 같은 생체내 효력을 가진다.

일부 실시형태에서, 제형 또는 약제학적 조성물은 약 6.0×10¹³ vg의 rAAV 바이러스 벡터의 단위 투약량 및 다음의 방출 기준 중 하나 이상을 포함한다: 약 10% 미만, 약 8% 미만, 약 7% 미만 또는 약 5% 미만의 빈 바이러스 캡시드; 1×10¹³ vg/㎖당 약 100 ng/㎖ 미만의 숙주 세포 단백질; 1×10¹³ vg/㎖당 약 5×10⁶ pg/㎖ 미만, 약 1×10⁶ pg/㎖ 미만, 약 7.5×10⁵ pg/㎖ 미만 또는 6.8×10⁵ pg/㎖ 미만의 잔여 숙주 세포 DNA(hcDNA); 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 10 ng 미만, 약 8 ng 미만, 약 6 ng 미만 또는 약 4 ng 미만의 잔여 숙주 세포 단백질(rHCP); 기능성인 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 100%의 rAAV 바이러스 벡터 게놈; 1×10¹³ vg/㎖당 1.7×10⁶ pg/㎖, 또는 1×10¹³ vg/㎖당 1×10⁵ pg/㎖ 내지 1×10¹³ vg/㎖당 1.7×10⁶ pg/㎖ 이하의 잔여 플라스미드 DNA; 1.0×10¹³vg당 0.2 ng, 1.0×10¹³ vg당 0.1 ng 미만, 또는 1.0×10¹³ vg당 0.09 ng 미만의 벤조나제 농도; 1.0×10¹³vg당 0.5 ng, 1.0×10¹³ vg당 0.3 ng 미만, 또는 1.0×10¹³ vg당 0.22 ng 미만의 소 혈청 알부민(BSA); 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 1 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.75 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.5 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.4 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.35 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.3 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.25 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.2 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.13 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.1 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.05 EU/㎖ 미만, 또는 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.02 EU/㎖ 미만의 내독소 수준; 100 ㎍/g(ppm) 미만, 50 ㎍/g(ppm) 미만, 또는 30 ㎍/g(ppm) 미만의 세슘 농도; 약 10 내지 100 ppm, 15 내지 90 ppm, 또는 약 20 내지 80 ppm의 폴록사머 188; 용기당 크기가 25 ㎛ 이상인 2000개 미만, 1500개 미만, 1000개 미만 또는 600개 미만의 입자; 용기당 크기가 10 ㎛ 이상인 10000개 미만, 8000개 미만, 1000개 미만 또는 6000개 미만의 입자; 7.5 내지 8.5, 7.6 내지 8.4 또는 7.8 내지 8.3인 pH; 330 내지 490 mOsm/㎏, 360 내지 460 mOsm/㎏ 또는 390 내지 430 mOsm/㎏의 삼투몰농도; 1.0×10¹³ vg당 약 1.0×10⁸ 내지 10.0×10¹⁰IU, 1.0×10¹³ vg당 약 2.5×10⁸ 내지 9.0×10¹⁰IU, 또는 1.0×10¹³ vg당 약 3.9×10⁸ 내지 8.4×10¹⁰IU의 감염성 역가; 시험관내 세포 기반 분석에 기반하여 참조 표준 및/또는 적합한 대조군에 비해 약 30 내지 150%, 약 60 내지 140%, 또는 약 70 내지 130% 상대 효력; 1.0×10¹³ vg당 약 10 내지 500 ㎍, 1.0×10¹³ vg당 약 50 내지 400 ㎍, 또는 1.0×10¹³ vg당 약 100 내지 300 ㎍의 총 단백질 수준; 7.5×10¹³ vg/㎏ 용량이 주어진 SMNΔ7 마우스에서의 15일 초과, 20일 초과, 22일 초과 또는 24일 초과의 중위 생존에 의해 결정한 바와 같은 생체내 효력.

일부 실시형태에서, 제형 또는 약제학적 조성물은 약 6.0×10¹³ vg의 rAAV 바이러스 벡터의 단위 투약량 및 다음의 방출 기준 중 하나 이상을 포함한다: 약 7.7 내지 8.3의 pH; 약 390 내지 430 mOsm/㎏의 삼투몰농도; 용기당 크기가 25 ㎛ 이상인 약 600개 미만의 입자; 용기당 크기가 10 ㎛ 이상이며, 약 1.7×10¹³ 내지 5.3×10¹³ vg/㎖의 게놈 역가인 약 6000개 미만의 입자; 1.0×10¹³ vg당 약 3.9×10⁸ 내지 8.4×10¹⁰ IU의 감염성 역가; 1.0×10¹³ vg당 약 100 내지 300 ㎍의 총 단백질 수준; 약 20 내지 80 ppm의 Pluronic F-68 함량; 시험관내 세포 기반 분석에 기반하여 약 70 내지 130%의 상대 효력(효력은 참조 표준 및/또는 적합한 대조군에 대한 것임); 7.5×10¹³ vg/㎏의 용량으로 SMNΔ7 마우스 모델에서의 중위 생존이 24일 이상인 것을 특징으로 하는 생체내 효력; 약 5% 미만의 빈 캡시드; 약 95% 이상의 총 순도; 약 0.13 EU/㎖ 이하의 내독소.

일부 실시형태에서, 제형 또는 약제학적 조성물은 약 6.0×10¹³ vg의 rAAV 바이러스 벡터의 단위 투약량 및 다음의 방출 기준 중 하나 이상을 포함한다: 1.0×10¹³ vg당 약 0.09 ng 미만의 벤조나제; 약 30 ㎍/g(ppm) 미만의 세슘; 약 20 내지 80 ppm의 폴록사머 188; 1.0×10¹³ vg당 약 0.22 ng 미만의 BSA; 1.0×10¹³ vg당 약 6.8×10⁵ pg 미만의 잔여 플라스미드 DNA; 1.0×10¹³ vg당 약 1.1×10⁵ pg 미만의 잔여 hcDNA; 1.0×10¹³ vg당 약 4 ng 미만의 rHCP; 약 7.7 내지 8.3의 pH; 약 390 내지 430 mOsm/㎏의 삼투몰농도; 용기당 크기가 25 ㎛ 이상인 약 600개 미만의 입자; 용기당 크기가 10 ㎛ 이상인 약 6000개 미만의 입자; 약 1.7×10¹³ 내지 5.3×10¹³ vg/㎖의 게놈 역가; 1.0×10¹³ vg당 약 3.9×10⁸ 내지 8.4×10¹⁰ IU의 감염성 역가; 1.0×10¹³ vg당 약 100 내지 300 ㎍의 총 단백질 수준; 시험관내 세포 기반 분석에 기반한 약 70 내지 130%의 상대 효력(여기서, 효력은 참조 표준 및/또는 적합한 대조군에 대한 것임); 약 5% 미만의 빈 캡시드.

일부 실시형태에서, 제형 또는 약제학적 조성물은 약 1.2×10¹⁴ vg의 rAAV 바이러스 벡터의 단위 투약량 및 다음의 방출 기준 중 하나 이상을 포함한다: 약 10% 미만, 약 8% 미만, 약 7% 미만 또는 약 5% 미만의 빈 바이러스 캡시드; 1×10¹³ vg/㎖당 약 100 ng/㎖ 미만의 숙주 세포 단백질; 1×10¹³ vg/㎖당 약 5×10⁶ pg/㎖ 미만, 약 1×10⁶ pg/㎖ 미만, 약 7.5×10⁵ pg/㎖ 미만 또는 6.8×10⁵ pg/㎖ 미만의 잔여 숙주 세포 DNA(hcDNA); 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 10 ng 미만, 약 8 ng 미만, 약 6 ng 미만 또는 약 4 ng 미만의 잔여 숙주 세포 단백질(rHCP); 기능성인 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 100%의 rAAV 바이러스 벡터 게놈; 1×10¹³ vg/㎖당 1.7×10⁶ pg/㎖, 또는 1×10¹³ vg/㎖당 1×10⁵ pg/㎖ 내지 1×10¹³ vg/㎖당 1.7×10⁶ pg/㎖ 이하의 잔여 플라스미드 DNA; 1.0×10¹³vg당 0.2 ng, 1.0×10¹³ vg당 0.1 ng 미만, 또는 1.0×10¹³ vg당 0.09 ng 미만의 벤조나제 농도; 1.0×10¹³vg당 0.5 ng, 1.0×10¹³ vg당 0.3 ng 미만, 또는 1.0×10¹³ vg당 0.22 ng 미만의 소 혈청 알부민(BSA); 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 1 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.75 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.5 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.4 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.35 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.3 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.25 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.2 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.13 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.1 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.05 EU/㎖ 미만, 또는 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.02 EU/㎖ 미만의 내독소 수준; 100 ㎍/g(ppm) 미만, 50 ㎍/g(ppm) 미만, 또는 30 ㎍/g(ppm) 미만의 세슘 농도; 약 10 내지 100 ppm, 15 내지 90 ppm, 또는 약 20 내지 80 ppm의 폴록사머 188; 용기당 크기가 25 ㎛ 이상인 2000개 미만, 1500개 미만, 1000개 미만 또는 600개 미만의 입자; 용기당 크기가 10 ㎛ 이상인 10000개 미만, 8000개 미만, 1000개 미만 또는 6000개 미만의 입자; 7.5 내지 8.5, 7.6 내지 8.4 또는 7.8 내지 8.3인 pH; 330 내지 490 mOsm/㎏, 360 내지 460 mOsm/㎏ 또는 390 내지 430 mOsm/㎏의 삼투몰농도; 1.0×10¹³ vg당 약 1.0×10⁸ 내지 10.0×10¹⁰IU, 1.0×10¹³ vg당 약 2.5×10⁸ 내지 9.0×10¹⁰IU, 또는 1.0×10¹³ vg당 약 3.9×10⁸ 내지 8.4×10¹⁰IU의 감염성 역가; 시험관내 세포 기반 분석에 기반하여 참조 표준 및/또는 적합한 대조군에 비해 약 30 내지 150%, 약 60 내지 140%, 또는 약 70 내지 130% 상대 효력; 1.0×10¹³ vg당 약 10 내지 500 ㎍, 1.0×10¹³ vg당 약 50 내지 400 ㎍, 또는 1.0×10¹³ vg당 약 100 내지 300 ㎍의 총 단백질 수준; 7.5×10¹³ vg/㎏ 용량이 주어진 SMNΔ7 마우스에서의 15일 초과, 20일 초과, 22일 초과 또는 24일 초과의 중위 생존에 의해 결정한 바와 같은 생체내 효력.

일부 실시형태에서, 제형 또는 약제학적 조성물은 약 1.2×10¹⁴ vg의 rAAV 바이러스 벡터의 단위 투약량 및 다음의 방출 기준 중 하나 이상을 포함한다: 약 7.7 내지 8.3의 pH; 약 390 내지 430 mOsm/㎏의 삼투몰농도; 용기당 크기가 25 ㎛ 이상인 약 600개 미만의 입자; 용기당 크기가 10 ㎛ 이상이며, 약 1.7×10¹³ 내지 5.3×10¹³ vg/㎖의 게놈 역가인 약 6000개 미만의 입자; 1.0×10¹³ vg당 약 3.9×10⁸ 내지 8.4×10¹⁰ IU의 감염성 역가; 1.0×10¹³ vg당 약 100 내지 300 ㎍의 총 단백질 수준; 약 20 내지 80 ppm의 Pluronic F-68 함량; 시험관내 세포 기반 분석에 기반하여 약 70 내지 130%의 상대 효력(효력은 참조 표준 및/또는 적합한 대조군에 대한 것임); 7.5×10¹³ vg/㎏의 용량으로 SMNΔ7 마우스 모델에서의 중위 생존이 24일 이상인 것을 특징으로 하는 생체내 효력; 약 5% 미만의 빈 캡시드; 약 95% 이상의 총 순도; 약 0.13 EU/㎖ 이하의 내독소.

일부 실시형태에서, 제형 또는 약제학적 조성물은 약 1.2×10¹⁴ vg의 rAAV 바이러스 벡터의 단위 투약량 및 다음의 방출 기준 중 하나 이상을 포함한다: 1.0×10¹³ vg당 약 0.09 ng 미만의 벤조나제; 약 30 ㎍/g(ppm) 미만의 세슘; 약 20 내지 80 ppm의 폴록사머 188; 1.0×10¹³ vg당 약 0.22 ng 미만의 BSA; 1.0×10¹³ vg당 약 6.8×10⁵ pg 미만의 잔여 플라스미드 DNA; 1.0×10¹³ vg당 약 1.1×10⁵ pg 미만의 잔여 hcDNA; 1.0×10¹³ vg당 약 4 ng 미만의 rHCP; 약 7.7 내지 8.3의 pH; 약 390 내지 430 mOsm/㎏의 삼투몰농도; 용기당 크기가 25 ㎛ 이상인 약 600개 미만의 입자; 용기당 크기가 10 ㎛ 이상인 약 6000개 미만의 입자; 약 1.7×10¹³ 내지 5.3×10¹³ vg/㎖의 게놈 역가; 1.0×10¹³ vg당 약 3.9×10⁸ 내지 8.4×10¹⁰ IU의 감염성 역가; 1.0×10¹³ vg당 약 100 내지 300 ㎍의 총 단백질 수준; 시험관내 세포 기반 분석에 기반한 약 70 내지 130%의 상대 효력(여기서, 효력은 참조 표준 및/또는 적합한 대조군에 대한 것임); 약 5% 미만의 빈 캡시드.

일부 실시형태에서, 제형 또는 약제학적 조성물은 약 2.4×10¹⁴ vg의 rAAV 바이러스 벡터의 단위 투약량 및 다음의 방출 기준 중 하나 이상을 포함한다: 약 10% 미만, 약 8% 미만, 약 7% 미만 또는 약 5% 미만의 빈 바이러스 캡시드; 1×10¹³ vg/㎖당 약 100 ng/㎖ 미만의 숙주 세포 단백질; 1×10¹³ vg/㎖당 약 5×10⁶ pg/㎖ 미만, 약 1×10⁶ pg/㎖ 미만, 약 7.5×10⁵ pg/㎖ 미만 또는 6.8×10⁵ pg/㎖ 미만의 잔여 숙주 세포 DNA(hcDNA); 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 10 ng 미만, 약 8 ng 미만, 약 6 ng 미만 또는 약 4 ng 미만의 잔여 숙주 세포 단백질(rHCP); 기능성인 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 100%의 rAAV 바이러스 벡터 게놈; 1×10¹³ vg/㎖당 1.7×10⁶ pg/㎖, 또는 1×10¹³ vg/㎖당 1×10⁵ pg/㎖ 내지 1×10¹³ vg/㎖당 1.7×10⁶ pg/㎖ 이하의 잔여 플라스미드 DNA; 1.0×10¹³vg당 0.2 ng, 1.0×10¹³ vg당 0.1 ng 미만, 또는 1.0×10¹³ vg당 0.09 ng 미만의 벤조나제 농도; 1.0×10¹³vg당 0.5 ng, 1.0×10¹³ vg당 0.3 ng 미만, 또는 1.0×10¹³ vg당 0.22 ng 미만의 소 혈청 알부민(BSA); 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 1 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.75 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.5 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.4 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.35 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.3 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.25 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.2 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.13 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.1 EU/㎖ 미만, 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.05 EU/㎖ 미만, 또는 1.0×10¹³ vg/㎖당 약 0.02 EU/㎖ 미만의 내독소 수준; 100 ㎍/g(ppm) 미만, 50 ㎍/g(ppm) 미만, 또는 30 ㎍/g(ppm) 미만의 세슘 농도; 약 10 내지 100 ppm, 15 내지 90 ppm, 또는 약 20 내지 80 ppm의 폴록사머 188; 용기당 크기가 25 ㎛ 이상인 2000개 미만, 1500개 미만, 1000개 미만 또는 600개 미만의 입자; 용기당 크기가 10 ㎛ 이상인 10000개 미만, 8000개 미만, 1000개 미만 또는 6000개 미만의 입자; 7.5 내지 8.5, 7.6 내지 8.4 또는 7.8 내지 8.3인 pH; 330 내지 490 mOsm/㎏, 360 내지 460 mOsm/㎏ 또는 390 내지 430 mOsm/㎏의 삼투몰농도; 1.0×10¹³ vg당 약 1.0×10⁸ 내지 10.0×10¹⁰IU, 1.0×10¹³ vg당 약 2.5×10⁸ 내지 9.0×10¹⁰IU, 또는 1.0×10¹³ vg당 약 3.9×10⁸ 내지 8.4×10¹⁰IU의 감염성 역가; 시험관내 세포 기반 분석에 기반하여 참조 표준 및/또는 적합한 대조군에 비해 약 30 내지 150%, 약 60 내지 140%, 또는 약 70 내지 130% 상대 효력; 1.0×10¹³ vg당 약 10 내지 500 ㎍, 1.0×10¹³ vg당 약 50 내지 400 ㎍, 또는 1.0×10¹³ vg당 약 100 내지 300 ㎍의 총 단백질 수준; 7.5×10¹³ vg/㎏ 용량이 주어진 SMNΔ7 마우스에서의 15일 초과, 20일 초과, 22일 초과 또는 24일 초과의 중위 생존에 의해 결정한 바와 같은 생체내 효력.

일부 실시형태에서, 제형 또는 약제학적 조성물은 약 2.4×10¹⁴ vg의 rAAV 바이러스 벡터의 단위 투약량 및 다음의 방출 기준 중 하나 이상을 포함한다: 약 7.7 내지 8.3의 pH; 약 390 내지 430 mOsm/㎏의 삼투몰농도; 용기당 크기가 25 ㎛ 이상인 약 600개 미만의 입자; 용기당 크기가 10 ㎛ 이상이며, 약 1.7×10¹³ 내지 5.3×10¹³ vg/㎖의 게놈 역가인 약 6000개 미만의 입자; 1.0×10¹³ vg당 약 3.9×10⁸ 내지 8.4×10¹⁰ IU의 감염성 역가; 1.0×10¹³ vg당 약 100 내지 300 ㎍의 총 단백질 수준; 약 20 내지 80 ppm의 Pluronic F-68 함량; 시험관내 세포 기반 분석에 기반하여 약 70 내지 130%의 상대 효력(효력은 참조 표준 및/또는 적합한 대조군에 대한 것임); 7.5×10¹³ vg/㎏의 용량으로 SMNΔ7 마우스 모델에서의 중위 생존이 24일 이상인 것을 특징으로 하는 생체내 효력; 약 5% 미만의 빈 캡시드; 약 95% 이상의 총 순도; 약 0.13 EU/㎖ 이하의 내독소.

일부 실시형태에서, 제형 또는 약제학적 조성물은 약 2.4×10¹⁴ vg의 rAAV 바이러스 벡터의 단위 투약량 및 다음의 방출 기준 중 하나 이상을 포함한다: 1.0×10¹³ vg당 약 0.09 ng 미만의 벤조나제; 약 30 ㎍/g(ppm) 미만의 세슘; 약 20 내지 80 ppm의 폴록사머 188; 1.0×10¹³ vg당 약 0.22 ng 미만의 BSA; 1.0×10¹³ vg당 약 6.8×10⁵ pg 미만의 잔여 플라스미드 DNA; 1.0×10¹³ vg당 약 1.1×10⁵ pg 미만의 잔여 hcDNA; 1.0×10¹³ vg당 약 4 ng 미만의 rHCP; 약 7.7 내지 8.3의 pH; 약 390 내지 430 mOsm/㎏의 삼투몰농도; 용기당 크기가 25 ㎛ 이상인 약 600개 미만의 입자; 용기당 크기가 10 ㎛ 이상인 약 6000개 미만의 입자; 약 1.7×10¹³ 내지 5.3×10¹³ vg/㎖의 게놈 역가; 1.0×10¹³ vg당 약 3.9×10⁸ 내지 8.4×10¹⁰ IU의 감염성 역가; 1.0×10¹³ vg당 약 100 내지 300 ㎍의 총 단백질 수준; 시험관내 세포 기반 분석에 기반한 약 70 내지 130%의 상대 효력(여기서, 효력은 참조 표준 및/또는 적합한 대조군에 대한 것임); 약 5% 미만의 빈 캡시드.

본 발명은 제한하는 것으로 해석되어서는 안 되는 다음의 실시예에 의해 추가로 예시된다. 본 출원 전체적으로 모든 참고문헌, 특허 및 공개된 특허의 내용뿐만 아니라 도면은 이들의 전문이 본 명세서에 모든 목적을 위하여 참조에 의해 포함된다.

실시예

전임상 실시예

SMNΔ7 마우스는 유전자 전달을 연구하기 위한 적합한 모델이다. 문헌[Butchbach et al., "Abnormal motor phenotype in the SMNΔ7 mouse model of spinal muscular atrophy." Neurobiology of disease, 27(2): 207-19]. scAAV9.CB.SMN의 5×10¹¹개의 바이러스 게놈을 1일령 마우스의 안면 정맥에 주사하여 SMNΔ7 마우스 모델을 구제하였다. 문헌[Foust et al., "Rescue of the spinal muscular atrophy phenotype in a mouse model by early postnatal delivery of SMN. "Nature biotechnology, 28(3): 271-4]. 대략 42±2%의 요추관 운동 뉴런을 scAAV9.CB.SMN 처리 마우스에 형질도입하였다. 마찬가지로 (WT 대조군보다 더 낮은 수준이라고 할지라도) 비처리 SMA 마우스에 비해 scAAV9.CB.SMN-처리 동물의 뇌, 척수 및 근육에서의 SMN 수준을 증가시켰다. P1에 대해 scAAV9.CB.SMN 또는 scAAV9.CB.GFP 중 하나로 처리한 SMA 동물을 이들이 다시 일어서는 능력에 대해 평가하고, 야생형(WT) 대조군 마우스 및 비처리 마우스와 비교하였다. WT 대조군은 그 자신을 빠르게 바로 세울 수 있는 반면, SMN- 및 녹색 형광 단백질(Green Fluorescent Protein: GFP)-처리 SMA 동물은 P5에서 어려움을 나타내었다. 그러나, P13에 의해, SMN-처리 동물의 90%는 GFP-처리 대조군의 20% 및 비처리 SMA 동물의 0%에 비해 그 자신을 바로 세울 수 있었다. P18에서, SMN-처리 동물은 GFP-처리 동물보다 더 컸지만, WT 대조군보다 더 작았다. SMN-처리 마우스의 이동 능력은 오픈 필드 검사 및 휠 러닝(wheel running)에 의해 분석할 때 WT 대조군과 거의 동일하였다.

SMN-처리 SMA 동물의 생존은 유의미하게 개선되었다. P22를 지나 생존한 GFP-처리 대조군 동물은 없었고, 15.5일의 중위 수명을 가졌다. GFP 마우스의 체중은 P10에서 최고였고, 이어서, 사망까지 가파르게 감소되는 한편, SMN 마우스는 17 g(WT 대조군 체중의 약 절반)에서 안정화되면서 약 P40까지 꾸준한 체중 증가를 나타내었다. 보다 작은 크기의 교정된 동물은 scAAV9의 향성 및 불완전한 형질도입과 관련될 가능성이 있고, 이는 일부 세포가 형질도입되지 않은 '키메라' 동물을 생성한다. 추가적으로, 보다 작은 크기는 SMN에 대한 배아 역할을 시사한다. 가장 현저하게는, SMN-처리 마우스는 250일령을 지나서 잘 생존하였다.

독물 생체내 분포를 또한 연구하였다. 비-우수 연구실 운영기준(non-Good Laboratory Practice: 비-GLP) 연구에서, scAAV9.CB.SMN에 의한 혈관 전달에 의해 24마리의 마우스 및 4마리의 비인간 영장류(NHP)에 주사하였다. 독성 및 안전성을 평가하기 위해, 안면 측두 정맥을 통해 비히클(PBS)(3마리 수컷/6마리 암컷) 또는 3.3×10¹⁴ vg/㎏의 scAAV9.CB.SMN(6마리 수컷/9마리 암컷) 중 하나로 scAAV9.CB.SMN를 P1 야생형 프렌드 바이러스 b-형(FVB) 마우스에 주사하였다. 이 용량은 이전에 SMA16의 SMNΔ7 마우스 모델에서 가장 효능 있는 것으로 나타났다. P1 마우스를 인간 임상 시험이 처음인 계획된 집단인 영아에서의 모의 가능성 임상 연구 예상에서 사용하였다. 모든 마우스는 임의의 고통의 징후 또는 체중감소 없이 주사 절차 및 초기 24시간 관찰 기간에 생존하였다. 체질량을 측정하고, 연구의 나머지 동안 실제 관찰을 매주 수행하였고; 대조군과 처리 코호트 간에 어떤 차이도 나타나지 않았다(도 1).

주사 후 제60일, 제90일 및 제180일에, 혈액 연구 및 임상 화학 평가(ALT, AST, ALK Phos, 크레아티닌, BUN, 전해질 및 CK)를 위해 마우스로부터의 혈액을 수집하였다. 90일 시점에 하나의 변종을 제외하고 모두 정상이었다. 이 차이는 모든 다른 마우스와 상이한 채혈 부위에 관한 기술적 문제로 인한 것으로 나타났다. 조직병리학에 대해, 13마리 마우스를 주사 후 제120일에 검시하였고, 8마리 마우스를 제180일에 검시하였다. 모든 기관은 정상이었고; 특히, 임의의 기관(심장, 간, 신장, 근육, 생식선, 뇌, 폐, 림프절 및 장)으로부터의 임의의 절편에서 어떤 염증도 보이지 않았다.

4마리 수컷 사이노몰거스 마카크(Cynomolgus Macaques)에 대한 안전성 연구에서, 대상체는 SMA I형 영아에서 치료 투여의 가능성이 있는 연령에 거의 가까운 90일령에 주사되었다. SMN-Δ7 마우스가 유의미한 생존 증가를 나타내는 동안 시험한 가장 낮은 용량에 대응하는 6.7×10¹³/㎏ 용량으로 복재 정맥의 카테터삽입에 의해 scAAV9.CB.SMN 벡터를 1회 투여하였다. 동물은 대략 9개월령에 희생시킬 때까지 6개월 동안 따랐다. 어떤 유해효과도 보이지 않았으며, 모든 임상 화학은 정상이었다. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 ELISpot를 이용하여 T-세포 면역 반응을 시험하고, 주사 후 6개월에 음성이었다.

이들 비-GLP 연구에서, 혈청 화학 및 혈액 연구는 조직병리학 평가와 같이 특별한 것이 없었다. NHP 대상체는 캡시드에 대해(그러나 이식유전자에 대해서는 아님) 적절한 면역 반응을 시작하였고, 매우 높은 이식유전자 발현이 주사 후 6개월에 지속된다. 이들 연구는 혈액-뇌 장벽의 침투를 위해 사용한 고용량에서조차 전신 전달된 scAAV9.CB.SMN은 안전하고 잘 용인된다는 강한 증거를 제공한다. 문헌[Foust et al. Nat. Biotechnol., 28(3), pp. 271-274 (2010)].

신생아 FVB 마우스에 제1일에 최대 3.3×10¹⁴ vg/㎏ 수준에서 scAAV9.CB.SMN의 단일 정맥내 주사를 제공하였을 때, 시험 항목-관련 사망도 없었고, 투여 후 최대 24주 시점에 보이는 독성에 대한 증거도 없었다. 평균 체중 및 평균 체중 증가의 치료-관련 감소뿐만 아니라 더 낮은 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간(activated partial thromboplastin time: APTT) 값은 약한 치료 효과였지만, 독성을 수득하지 않았다.

scAAV9.CB.SMN의 활성은 뇌 및 척수, 주요 표적화된 치료 조직에서의 특정 이식유전자 리보핵산(RNA) 발현의 생체내 분포 및 존재에 의해 입증되었다. 3.3×10¹⁴ vg/㎏이 제공된 수컷 및 암컷(그룹 3)에서 12 및 24주에 AAV9 캡시드에 대한 저수준의 항체가 발견되었다. 임상 병리 및 조직병리학 분석에서 어떤 변경도 관찰되지 않았다. 이들 결과에 기반하여, 신생아 수컷 및 암컷 마우스에서 scAAV9.CB.SMN의 어떤 관찰 가능한 유해효과 수준(NOAEL)도 3.3×10¹⁴ vg/㎏인 것으로 간주되지 않는다.

이들 연구에서, CSF에 대한 scAAV9.CB.SMN 척추강내 투여는 마우스(제12주 내내) 및 마카크(주사 후 최대 14개월)에서 안전하고 잘 용인되었다. scAAV9.CB.SMN 및 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR) 결과의 주변 노출을 감소시킬 가능성이 있는 마우스에서의 CSF 전달은 이식유전자 발현이 흉추 부위에 비해 경부 및 요추 영역에서 더 높았다는 것을 나타낸다. 원숭이는 주사 시 5분 동안 트렌델렌버그 체위로 유지하였고, 주사 전 항-AAV9 항체에 대한 혈청반응 음성을 확인하였다. 모든 비인간 영장류는 주사 후 최대 6개월에 AAV9 항체에 대해 상당히 양성이었다. 주사 후 6개월 동안 AAV9 캡시드 또는 SMN 이식유전자 중 하나에 대한 어떤 세포독성 T-림프구 반응도 관찰되지 않았다. 뇌 또는 척수에서 어떤 조직 분해 또는 반응성 반응도 관찰되지 않았다.

중추적 우수 연구실 운영기준(GLP) 준수 3-개월 마우스 독성 연구에서, 독성의 주요 표적 기관은 심장 및 간이었다. 마우스에서의 IV 주입 후에, 벡터 및 이식유전자는 널리 분포되어 있는데 가장 높은 발현은 일반적으로 심장 및 간에서 관찰되고, 실질적인 발현은 뇌 및 척수에서 관찰되었다. 심실에서의 AVXS-101-관련 소견은 용량-관련 염증, 부종 및 섬유증으로 이루어지며, 심방에서는 염증 및 혈전증으로 이루어졌다. 간 소견은 간세포 비대, 쿠퍼 세포 활성화 및 산발적 간세포 괴사로 이루어졌다. NOAEL은 마우스에서의 AVXS-101-관련 심장 및 간 소견에 대해 확인되지 않았고, 최대 내약 용량은 1.5×10¹⁴ vg/㎏로서 정하였고, 이는 1.1×10¹⁴ vg/㎏의 권장 치료 용량에 비해 대략 1.4배의 안전성 차이를 제공하였다. 마우스 대 영장류에서의 관찰 소견의 전환성(translatability)은 이 때에는 알려져 있지 않다.

이들 데이터는 임상 시험으로 보내지는 움직임을 뒷받침한다.

CSF 전달이 정맥내(IV) 주사에 비해 말초 기관의 형질도입을 감소시킬 수 있는지의 여부를 결정하기 위해, 5 또는 10분 동안 트렌델렌버그 체위로 머리를 아래로 숙인 비인간 영장류의 조직 상에서 상세한 생체내 분포 분석을 수행하였다(n = 5). 치료가 척수 및 뇌에서의 분포를 크게 개선시켰기 때문에 머리를 아래로 숙이지 않은 비인간 영장류보다는 이들 동물을 선택하였고, 임상 시험에 대해 이 접근이 바람직하다. 주사 2주 후에, 사이노몰거스 마카크를 희생시키고, 상세한 데옥시리보핵산(DNA) 및 RNA 생체내 분포 분석을 수행하기 위해 다양한 조직을 수집하였다. 비장 및 간을 제외하고 대부분의 말초 조직에서 scAAV9.CBA.GFP는 뇌 및 척수에서의 고수준에 비해 더 낮았다. 이들 결과는 다른 그룹으로부터의 이전의 보고와 일치된다. 문헌[Dirren et al., "Intracerebroventricular injection of adeno-associated virus 6 and 9 vectors for cell type specific transgene expression in the spinal cord." Hum Gene Ther 25: 109-120]; 문헌[Gray et al., "Global CNS gene delivery and evasion of anti-AAV-neutralizing antibodies by intrathecal AAV administration in non-human primates." Gene Ther 20: 450-459]. 골격근 및 CNS에서, DNA와 RNA 간에 강한 상관관계가 있는 반면, 연조직 및 샘에서, RNA 수준은 일반적으로 검출된 바이러스 게놈에 대해 예상되는 것보다 더 낮다. 특히, 고환, 장 및 비장은 DNA보다 1,000배 더 적은 RNA 분자를 나타낸다. 말초 기관에서의 AAV의 검출에도 불구하고, 전신 주사에 비해 말초적으로 검출된 벡터 양의 유의미한 감소가 있었다. 문헌[Dirren et al.; Gray et al.]. 추가적으로, P1에서 치료 후 24주에 정맥내로 또는 뇌실내로 주사한 마우스와 비교할 때 유사한 관찰이 이루어졌다. 따라서, CSF 전달은 AVXS-101을 이용하는 장래의 임상 시험에 유의미한 잠재적 안전성 성분을 첨가하는 것이다.

일부 실시형태에서, 트렌델렌버그 체위는 CSF 전달을 개선시킨다. scAAV9-SMN의 투약 및 효능을 SMA 마우스 및 비인간 영장류에서 평가하였고, 단일 주사를 통해 CSF에 직접 전달하였다. IV 적용에 비해 10배 더 낮은 용량을 이용할 때 마우스 및 비인간 영장류에서 척수 전체적으로 광범위한 이식유전자 발현이 관찰되었다. 비인간 영장류에서, 유사한 운동 뉴런 표적화 효율에 대해 마우스에서보다 더 낮은 용량이 사용될 수 있다. 벡터의 확산을 용이하게 하기 위해 대상체가 트렌델렌버그 체위를 유지하였을 때 형질도입 효능이 더욱 개선되는 것을 발견하였다. 문헌[Meyer et al., "Improving single injection CSF delivery of AAV9-mediated gene therapy for SMA: a dose-response study in mice and nonhuman primates." Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy 23, 477-487]. GFP/ChAT 이중 양성 운동 뉴런의 면역형광 및 정량화에 의해 입증된 바와 같이, 동물의 틸팅(Tilting)은 척수의 흉부 및 경부 영역에서의 형질도입을 유의미하게 개선시켰다. 10분 동안의 틸팅은 경부, 흉부 및 요추 영역에서 각각 운동 뉴런을 55, 62 및 80%까지 증가시키는 데 충분하였고, 이는 마우스 모델에서 관찰된 구제에 따라 환자에 대한 주된 이점을 나타낸다. 운동 뉴런 계수는 척수 분절 각각에서 GFP 전사체 정량화와 밀접하게 상관관계가 있었다.

실시예 1 - 임상 시험 프로토콜

연구 참가 시 앉을 수는 있지만 서거나 보행할 수 없는, SMA와 일치되는 유전적 진단, 즉, SMN1의 이중-대립유전자 결실 및 유전적 변경자가 없는 SMN2의 3개 복제물을 갖는 영아 및 아동에 대해 1상, 개방-표지, 단일 용량 투여 임상 시험을 수행한다. 환자는 이하에 기재하는 바와 같이 최대 삼(3)회의 가능한 치료 용량의 용량 비교 안전성 연구에서 AVXS-101을 받는다. 환자는 2개 그룹, 즉, 투약시 6개월령 이상이면서 24개월령 미만인 환자, 및 투약 시 24개월 이상이면서 60개월령 미만인 환자로 계층화한다. 6개월 이상이면서 24개월 미만의 적어도 열 다섯(15)명의 환자를 등록하고, 24개월 이상이면서 60 미만의 열두(12)명의 환자를 등록한다.

제1 코호트는 AVXS-101의 6.0×10¹³ vg(용량 A)의 투여를 받을 6개월 이상이면서 24개월령 미만인 세(3)명의 환자(코호트 1)를 등록한다. 코호트 내의 각 환자의 투약 사이에 적어도 사(4)주 간격이 있다. 연구자들은 등록을 계속하기 전에 연구 기관과 관련될 가능성이 있거나 확실히 관련된 의식의 48시간 이내에 모든 III 등급 이상의 AE에 대해 데이터 안전 모니터링 위원회(Data Safety Monitoring Board: DSMB)와 협의하였다. 처음 3명의 환자의 등록 후에 이용 가능한 안전성 데이터에 기반하여, a) 독성으로 인해 중단하는지, 또는 b) 용량 B를 이용하여 코호트 2로 진행하는지의 결정을 하였다.

용량 B에 대해, 60개월령 미만의 세(3)명의 환자를 등록하여 AVXS-101의 1.2×10¹⁴ vg(용량 B)의 투여를 받는다. 또한, 코호트 내에 3명 환자의 투약 간에 적어도 4주의 간격이 있다. 3명의 코호트 2 환자 및 모든 코호트 1 환자로부터 이용 가능한 안전성 데이터에 기반하여, 환자 투약 간의 추가 4주 간격은 불필요할 수 있다. 연구자들은 등록을 계속하기 전에 연구 기관과 관련될 가능성이 있거나 확실히 관련된 48시간 이내에 모든 III 등급 이상의 AE에 대해 DSMB와 협의하였다. 처음 여섯(6)명의 등록 후에 그리고 안전성 데이터에 기반하여, a) 독성으로 인해 중단하는지, 또는 b) 6개월령 이상이면서 24개월령 미만의 열 두(12)명의 환자 및 24개월령 이상이면서 60개월령 미만의 열 두(12)명의 환자가 용량 B를 받을 때까지 추가 21명 환자를 계속해서 등록하는지를 결정한다.

1.2×10¹⁴ vg 용량으로 처리한 환자로부터의 안전성 및 효능 데이터의 진행 중인 평가에 기반하여, 세 번째 용량(용량 C)의 검사를 고려한다. 60개월령 미만의 세(3)명의 환자는 용량 C를 받으며, 척추강내로 투여되는 최대 2.4×10¹⁴ vg일 것이다. 코호트 1 및 2에서와 같이 용량 C를 받는 처음 3명 환자의 투약 간에 다시 4주의 간격이 있다. 처음 삼(3)회 용량 C 환자의 등록 후에 그리고 이용 가능한 안전성 데이터에 기반하여, a) 독성으로 인해 중단하는지, 또는 b) 6개월령 초과이면서 24개월령 미만인 총 열 두(12)명의 환자 및 용량 C을 받은 24개월령 이상이면서 60개월령 미만인 열 두(12)명의 환자가 있을 때까지 추가 21명의 환자를 계속해서 등록할지를 결정한다.

용량 C를 시험하기 위한 적절한 용량의 선택 및 정당화는 용량 B(1.2×10¹⁴ vg)를 받는 환자로부터의 임상 결과의 진행 중인 안전성 및 효능 검토에 의해 뒷받침될 수 있다. 선택된 용량은 척추강내로 전달되는 최대 2.4×10¹⁴ vg이다. 체중이 최대 8.4 ㎏인 아동에게 최대 1.1×10¹⁴ vg/㎏의 용량을 전신으로(정맥내로) 안전하게 투여하였다(총 용량 9.24×10¹⁴ vg). 또한, 전임상 연구에서, scAAV9.CB.SMN의 척추강내 투여는 2×10¹³ vg/㎏의 용량으로 거대 비인간 영장류에서 주사 후 최대 14개월까지 안전하고 잘 용인되었다.

전반적 연구 결과를 도 2에 요약한다.

유해효과(AE) 보고 및 동반 의약 사용의 모니터링을 통해, 그리고 신체 검사, 활력 징후 평가, 심장 혈관 평가 및 연구실 평가에 의해 안전성을 평가한다. 척추강내 주사 후 48시간 동안 병원에서 환자를 관찰한다. 환자는 제7일, 제14일, 제21일 및 제30일에 후속 방문을 위해 복귀한다. 환자는 이후에 용량 투여로부터 12개월 동안 제30일 방문 후에 매달 복귀한다. 연구 완료 시, 연구 환자에게 AVXS-101의 지속적 안전성을 최대 15년까지 시험하는 중요한 장기간 후속 연구에 등록할 것을 요청한다.

환자 수

적어도 27명의 환자를 등록하고; 용량 C까지의 단계적 확대가 필요하다고 정해지면, 최대 51명까지의 환자를 등록할 수 있다.

치료 평가

이는 개방 표지 비교 단일-용량 연구이다. 본 명세서에 명시한 용량 상승 스케줄에 따라 치료를 부여한다.

용량 조절 기준

본 연구는 AVXS-101의 1회 척추강내 주사를 연구한다.

연구 종료를 위한 기준

독립적 데이터 안전 모니터링 위원회(DSMB) 및 의학적 모니터는 실험 내내 계속적 기준에 대한 안전성 데이터를 모니터링한다. DSMB는 안전성을 이유로 실험의 조기 종결을 권장할 수 있다. 임의의 환자가 임상 증상이 존재하고 의학적 치료가 필요한 연구 제품과 관련될 가능성이 있거나 분명히 관련되고, 예상치 못한 III 등급 이상의 AE 독성을 경험한다면, 연구자들은 연구 등록을 중단한다. 이는 임의의 환자 사망, 중요한 임상 실험 결과, 또는 연구 제제 투여와 관련된 주사 영역에서의 임의의 중증의 국소 합병증을 포함한다.

DSMB가 안전성 이유로 연구의 조기 종결을 권장한다면, 시험을 종결할 수 있다. 시험은 또한 규제기관의 권장에 의해 종결될 수 있다. 마지막으로, 유전자 대체 요법과 관련될 가능성이 있거나 분명하게 관련되고, 임상 증상과 관련되고/되거나 의학적 치료를 필요로 하는 임의의 예상치 못한 CTCAE 등급 3 또는 더 높은 AE/독성의 발생으로서 정의되는 허용 가능하지 않은 수준의 독성이 환자에게 발생된다면 시험은 또한 종결될 수 있다.

환자 포함 기준

환자는 다음의 포함 기준을 모두 충족시킨다:

1. 10초 이상 동안 도움 없이 앉을 수 있지만 서거나 보행할 수 없는 능력을 입증한 유전자형에 의한 선별 기간 동안의 진단 확인 후 투약 시 6개월령 이상이면서 최대 60개월령(1800일)인 환자

- 유전자형에 의한 진단 확인은 SMN1 엑손 7의 동형 접합체 부재이고; SMN2의 정확히 3개의 복제물이 있는 연구실 문서를 포함한다.

2. SMN2 유전자 변경자 돌연변이(c.859G>C)에 대한 음성 유전자 시험.

3. 12개월령 미만의 SMA와 일치되는 임상 징후 및 증상의 발병.

4. 독립적으로 앉을 수 있고, 독립적으로 서거나 보행할 수 없음. 독립적으로 앉음의 정의는 세계 보건 기구(WHO)-MGRS 기준에 의해 지지 없이 적어도 10초 동안 머리를 세우고 앉을 수 있는 것으로 정의된다. 아동이 신체 균형을 맞추거나 자세를 지지하기 위해 팔 또는 손을 사용하여서는 안 된다(Wijnhoven 2004).

5. 연구자에 의해 필요한 것으로 결정된다면, 마취 및 진정 치료의 사용을 위한 연령에 맞춘 기관의 기준을 충족한다.

6. 아동기 백신에 대한 최신 정보를 얻는다. 호흡기 세포 융합 바이러스(RSV) 감염을 방지하기 위해 팔리비주맙(palivizumab) 예방(시나지스(Synagis)로도 알려짐)을 포함하는 계절 백신접종은 또한 미국 소아과 학회(American Academy of Pediatrics)(AAP 2009)에 따라 권장된다.

7. 부모(들)/법정 후견인(들)은 사전동의 절차를 기꺼이 하며 완료할 수 있다.

환자 제외 기준

환자는 임의의 다음의 제외 기준을 충족시키지 않아야 한다:

1. 독립적으로 서거나 보행하는 현재의 또는 과거의 능력.

2. 요추 천자 절차 또는 척추강내 요법의 투여에 대한 금기(예를 들어, 이분척추, 뇌수막염, 장애, 또는 응고 이상, 또는 CSF 공간에 대한 유효한 접근을 방지하는 폐쇄성 척수 하드웨어) 또는 CSF의 배수를 위해 이식된 션트(shunt) 또는 이식된 CNS 카테터의 존재.

3. 선별 시 지정된 물리치료사(들)에 의해 결정된 바와 같은, 기능성 척도(예를 들어, 서 있기, 보행)를 달성/입증하는 능력을 방해하거나 IT 투약 10을 투여받는 능력을 방해하는 몇몇 구축(contracture). X-선 검사 상에서 분명한 중증의 척추측만증(척추의 50° 이상의 만곡으로서 정의).

4. 이전의, 계획 또는 예상된 척추측만증은 용량 투여의 1년 이내에 수술/절차를 바로잡음.

5. 선별 시 환자가 깨어있는 동안 침습적 호흡기 지원(양압을 이용하는 기관절개술) 또는 95% 미만의 포화도의 맥박 산소측정법을 사용하거나, 1000 m 초과의 높은 고도에 대해 환자가 깨어있는 동안 92% 미만의 산소 포화도를 사용함.

- 맥박 산소측정법 포화도는 선별과 투약일의 가장 높은 값 사이에 사(4)% 포인트 이상이 감소되어서는 안 된다.

6. 투약 전 2주 내에 1일 12시간 이상 동안 비침습적 호흡기 지원의 사용 또는 필요.

7. 대다수의 섭식이 비경구 방법(즉, 코위영양관 또는 비 공장관)에 의해 제공되는 위영양관에 대한 의학적 필요 또는 WHO 아동 성장 표준(Onis 2006)에 기반하여 연령 체중이 75% 미만에 속하는 환자. 선별 전 영구적 위루형성술의 배치는 제외하지 않는다.

8. 활성 바이러스 감염(HIV 또는 B형 또는 C형 간염, 또는 지카 바이러스에 대한 혈청학적 양성을 포함함).

9. 연구 등록 전 이(2)주 이내에 전신 치료 및/또는 입원이 필요한 심각한 비-기도 질병.

10. 연구 등록 전 사(4)주 이내에 진찰, 의학적 개입 또는 임의의 방식의 지지 요법의 증가가 필요한 호흡기 감염.

11. PI의 소견서에서 하기와 같은 유전자 전달을 위한 불필요한 위험을 생성하는 연구 투약 또는 수반되는 질병 전에 사(4)주 이내의 중증의 비-폐/기도 감염(예를 들어, 신우신염, 또는 뇌수막염):

- 주요 신장 또는 간 손상

- 알려진 발작 장애

- 진성 당뇨병

- 특발성 저칼슘뇨증

- 증상성 심근병증

12. 종양 또는 LP 절차 또는 CSF 순환을 방해하는 MRI 또는 CT에 의한 이상을 포함하는, 박테리아 뇌수막염 또는 뇌 또는 척수 질환의 병력.

13. 프레드니솔론 또는 다른 글루티코코르티코스테로이드 또는 이들의 부형제에 대한 알려진 알레르기 또는 과민증.

14. 요오드 또는 요오드-함유 제품에 대해 알려진 알레르기 또는 과민증.

15. 다음 중 어느 것의 동시 사용: 근병증 또는 신경병증의 치료를 위한 약물, 진성 당뇨병을 치료하기 위해 사용되는 제제 또는 진행 중인 면역억제 요법, 혈장분리교환술, 면역조절제, 예컨대, 아달리무맙, 또는 연구 투약(예를 들어, 코르티코스테로이드, 사이클로스포린, 타클로리무스, 메토트렉세이트, 사이클로포스파마이드, 정맥내 면역글로불린, 리툭시맙) 3개월 이내의 면역억제 요법.

16. 용량 투여 전 24시간 내에 완하제 또는 이뇨제 사용을 보류하는 것의 불능.

17. ELISA 결합 면역분석에 의해 결정하여 1:50 초과의 항-AAV9 항체 역가

- 잠재적 환자는 1:50 초과의 항 AAV9 항체 역가를 입증하여야 하며, 그 또는 그녀는 선별 기간의 30일 이내에 재검사를 받을 수 있고, 재검사 시 항 AAV9 항체 역가가 1:50 이하라면, 참여할 자격이 있음.

18. 투약 전에 임상적으로 유의한 것으로 간주되는 비정상적 실험값(INR > 1.4), GGT > 3X ULN, 빌리루빈 ≥ 3.0 ㎎/㎗, 크레아티닌 ≥ 1.0 ㎎/㎗, Hgb <8 또는 >18 g/Dl; WBC > 20,000/cmm).

19. 본 연구를 위한 선별 전 임의의 시간에 SMA를 치료하기 위한 의도로 투여한 연구 중이거나 승인된 화합물 제품 또는 요법(예를 들어, 발프로산, 뉴시너센)의 최근의 SMA 치료 임상 시험의 참여 또는 증서

- 경구 베타 작용제는 투약 30일 전에 중단되어야 함

- 호흡 목적을 위해 특별히 처방한 흡입용 알부테롤(기관지 확장제) 관리는 허용 가능하며, 본 연구 동안의 선별 전 임의이 시간에 금지되지 않음.

20. 1년 연구 평가 기간(예를 들어, 척추 수술 또는 기관절개술) 동안 주요 수술 절차의 예상.

21. 연구 절차에 따르는 것의 불능 또는 내키지 않음 또는 반복 방문을 위한 이동에 대한 불능.

22. 연구 결과/관찰 기밀 준수를 꺼림 또는 기밀 연구 결과/관찰을 소셜 미디어 사이트 상에 올리는 것을 삼가는 것을 꺼림.

23. 동의서에 사인하는 것을 거부.

환자 철회 기준 및 중단

환자는 유전자 대체 요법과 관련될 가능성이 있거나 분명하게 관련되고, 임상 증상과 관련되고/되거나 의학적 치료를 필요로 하는 임의의 예상치 못한 CTCAE 등급 3 또는 더 높은 유해 사건/독성의 발생으로서 정의되는 허용 가능하지 않은 수준의 독성이 환자에게 발생된다면, 연구를 중단할 수 있다. 환자가 사망한다면 철회되며, 이 경우에 치료되지 않은 환자를 제외하고, 유전자 전달 연구에 참여 후 사망한 임의의 환자의 부검이 요청될 것이다. 환자는 또한 입원으로 인한 것이 아니라면, 일정이 변경되지 않은 3일 이상의 연속 방문에 대한 프로토콜-필수 방문 또는 연구 절차를 준수하지 않는 경우에 철회될 수 있다. 부모(들) 또는 법정 후견인(들)이 동의를 철회한 환자도 또한 연구로부터 철회된다. 최종적으로, 환자는 연구자의 재량으로 철회될 수 있다. 조기 종결 절차는 임의의 이유로 연구를 조기에 중단한 임의의 환자에 대해 14일 이내에 완료되어야 한다.

연구 제품의 설명

생물학적 제품은 거대세포 바이러스(CMV) 인핸서/닭-β액틴-혼성 프로모터(CB)의 제어 하에 인간 SMN 유전자의 cDNA를 함유하는 비-복제성 재조합 자기-상보성 아데노-관련 바이러스 혈청형 9(AAV9)이다. 이식유전자의 분자내 어닐링을 촉진시켜, 전사를 위한 준비를 하는 이중-가닥 이식유전자를 형성하도록 AAV 역위 말단 반복부(ITR)를 변형시켰다. "자기-상보성"(sc) ITR로 칭해지는 이 변형된 ITR은 이식유전자가 전사되는 속도를 유의미하게 증가시키는 것으로 나타났고, 결과 단백질이 생성된다. AVXS-101(scAAV9.CB.hSMN)로 형질도입된 세포는 인간 SMN 단백질을 발현시킨다.

선행 및 병용 의약

선행 및 병용 의약을 연구 방문 종료까지 연구 투약 전 2주로부터 전자 증례 기록지(electronic Case Report Form: eCRF)에 포착한다.

프레드니솔론의 예방적 투여

정맥내 주입을 통해 AVXS-101 치료를 연구하는 진행 중인 1상 임상 연구에서 AAV 벡터에 대한 항원 특이적 T-세포 반응을 관찰하였다. 이는 유전자 전달 후 2 내지 4주에 예상되는 반응이다. 이러한 항원 특이적 T-세포 반응에 대한 한 가지 가능한 결과는 형질도입 세포의 클리어런스 및 이식유전자 발현의 상실이다.

AAV 기반 요법에 대한 숙주 면역 반응을 약화시키는 시도에서, 환자는 AVXS-101 투약 24시간 전에 예방적 프레드니솔론(글루코코르티코이드)(대략 1 ㎎/㎏/일)을 받는다. 다음의 치료 가이드라인에 따라 대략 30일 동안 치료를 계속한다:

주입 후 적어도 30일까지: 1 ㎎/㎏/일

제5주 및 제6주: 0.5 ㎎/㎏/일

제7주 및 제8주: 0.25 ㎎/㎏/일

제9주: 프레드니솔론 중단

아스파르트산 아미노트랜스퍼라제(AST) 또는 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT) 값이 정상 상한(ULN)의 2×초과이거나, T-세포 반응이 치료 30일 후에 100 이상의 SFC/10⁶ PBMC라면, AST 및 ALT 값이 역치 미만으로 감소될 때까지 프레드니솔론의 용량은 유지된다. T-세포 반응이 제60일을 지나서 계속된다면, 프레드니솔론을 유지하는 것에 대한 유해 유익을 고려하여 연구자 재량을 사용하여야 한다. 이들 권고로부터의 변형은 각 환자에 대한 잠재적 안전성 문제에 기반하여 연구자의 재량이다.

금지 의약

다음의 의약 중 어느 것의 동시 사용은 금지된다:

근병증 또는 신경병증의 치료를 위한 약물

진성 당뇨병을 치료하기 위해 사용한 제제

SMA를 치료하기 위한 의도로 투여 받은 요법(예를 들어, 발프로산, 뉴시너센).

- 경구 베타-작용제는 유전자 요법 투약 전에 적어도 30일 동안 중단되어야 한다.

- SMA의 호흡 합병증을 치료하기 위해 흡입 베타 작용제를 사용할 수 있으며, 단, 이러한 의약은 임상적으로 적절한 수준으로 투약한다.

시험 시작 3개월 이내에 진행 중인 면역억제 요법, 혈장분리교환술, 면역조절제, 예컨대 아달리무맙, 또는 면역억제 요법(예를 들어, 코르티코스테로이드, 사이클로스포린, 타클로리무스, 메토트렉세이트, 사이클로포스파마이드, 정맥내 면역글로불린, 리툭시맙)

프레드니솔론 테이퍼의 완료 후 코르티코스테로이드 사용은 일상적인 임상 관리의 부분으로서 관리하는 의사의 재량으로 허용 가능하다. 이러한 상황에서의 프레드니손의 사용은 병용 의약으로서 적절하게 보고하여야 하고, 이의 용법을 재촉하는 사건은 AE로서 적절하게 보고하여야 한다.

코르티코스테로이드(기관지 경련에 대해 흡입한 코르티코스테로이드는 제외)의 사용은 프레드니솔론 테이퍼 과정 동안 관리의 부분으로서 간주하여야 하며, 이 의학적 관리는 테이퍼와 관련된 임의의 표시된 의약 조절에 책임이 있는 후원자 의학 모니터에 따라 논의하여야 한다.

치료 준수

AVXS-101을 1회 척추강내 주사로서 투여한다.

무작위 및 맹검

이는 개방 표지 연구이다.

연구 제품 용량 및 용량 정당화

환자는 1회 용량의 AVXS-101 6.0×10¹³ vg,1.2×10¹⁴ vg, 또는 필요한 경우 척추강내 주사를 통해 최대 2.4×10¹⁴ vg의 세 번째 용량을 받는다. 척추강내 주사를 통한 CSF로의 직접 전달은 CNS 전체적으로 동일한 분포 및 효능으로 바이러스 벡터의 양을 대략 10배만큼 감소시켜, 바이러스 벡터 부하를 감소시키고, 추가로 최적화시킨다. 적절한 용량의 선택 및 모든 용량 상승 연구를 위한 정당화는 기재된 바와 같은 이전의 용량을 받고 있는 환자로부터의 임상 소견의 진행 중인 안전성 및 효능 검토에 의해 뒷받침된다. 가장 높게 선택된 용량은 척추강내로 전달되는 최대 2.4×10¹⁴ vg이다. 체중이 최대 8.4 ㎏인 아동에게 최대 1.1×10¹⁴ vg/㎏의 용량을 전신으로(정맥내로) 안전하게 투여하였다(총 용량 9.24×10¹⁴ vg). 또한, 전임상 연구에서, scAAV9.CB.SMN의 척추강내 투여는 2×10¹³ vg/㎏의 용량으로 거대 비인간 영장류에서 주사 후 최대 14개월까지 안전하고 잘 용인되었다.

연구 제품 제조

AVXS-101의 제조는 약사에 의해 멸균 조건 하에 무균성으로 행한다.

AVXS-101을 승인된 적절한 조영제와 사전 혼합하고, 요추 척추강내 주사의 방사선촬영 모니터링을 위해 소아과적 용도로 표지하였다. AVXS-101 + 조영제의 총 용적은 8 ㎖를 초과하지 않는다.

용량-전달 용기를 지정된 소아 집중 치료실(PICU) 병실 또는 급성 중환자 관리에 즉시 접근하는 다른 적절한 환경(예를 들어, 중재실, 수술실, 전용 처리실)에 전달한다.

환자는 PICU 병실 또는 급성 중환자 관리에 대해 즉각적으로 접근하는 다른 적절한 환경(예를 들어, 중재실, 수술실, 전용 처리실)에서 멸균 조건 하에 AVXS-101 척추강내 주사를 받는다. 환자는 입원하고, AVXS-101 투약 절차 후 4시간 동안 15(+/- 5)분마다 그리고 24시간 동안 1시간(+/- 15분)마다 바이탈을 모니터링하였다.

현장은 경막 섬유에 평행한 경사로 삽입된 외상성 바늘을 사용하도록 지시하고; 이는 경막에 대한 손상을 상당히 감소시키고, 결과적으로 아동에서를 포함하는 요추 천자 후 뇌척수액 누출에 대한 위험을 감소시키는 것으로 나타났다. 문헌[Ebinger et al., "Headache and backache after lumbar puncture in children and adolescents: a prospective study." Pediatrics, 113:1588-1592; Kiechl-Kohlendorfer et al., "Cerebrospinal fluid leakage after lumbar puncture in neonates: incidence and sonographic appearance." Am J Roentgenol, 181:231-234].

진정 치료/마취는 AVXS-101을 받는 모든 환자에 대해 필요하다. 방법 및 의약은 국소 마취과 의사의 재량에 의하지만, 트렌델렌버그 체위 배치를 위한 절차 및 절차 후에 대한 무통증 및 움직임 없음을 보장하기 위해 충분한 정도의 진정 치료 또는 불안해소를 포함하여야 한다. 환자를 트렌델렌버그 체위로 위치시키고 벡터 투여 후 15분 동안 머리를 30°도 아래로 기울여서 경부 및 뇌 영역의 분포를 향상시킨다.

AVXS-101은 기관 가이드라인에 따라 형광투시/방사선촬영 가이드를 이용한 멸균 조건 하에 연구자 또는 중재 방사선사 또는 다른 적절하게 훈련되고 경험이 있는 의사에 의해 투여한다. 환자를 옆 누운 자세로 위치시키고, 스타일렛(stylet)이 있는 카테터를 요추 천자에 의해 L3-L4 또는 L4-L5 극돌기 사이 공간에서 지주막하 공간으로 삽입한다. 지주막하 캐뉼러 삽입으로 카테터로부터의 맑은 뇌척수액(CSF)의 유동을 확인한다. 용량 A 및 용량 B에 대해 대략 사(4) ㎖의 CSF를 제거하고, 용량 C에 대해 AVXS-101 + 주사한 조영제의 용적에 거의 근사하는 CSF의 용적(최대 칠(7) ㎖)을 제거하고, 기관의 가이드라인에 따라 처리한다. 사전-혼합 콘트라스트 용액 중 AVXS-101을 지주막하 공간에 직접 주사한다. 0.5 ㎖ 식염수를 이용하는 주사 바늘의 플러싱은 기관 표준/가이드라인에 따라 허용한다.

투여 후 절차

AVXS-101 투여 환자를 지정된 PICU 병상, 또는 다른 적절한 환경으로 복귀시키고, 활력 징후를 면밀히 모니터링한다. 병용 의약 및 모든 AE/심각한 AE를 또한 모니터링하고, 투약 절차 후에 문서화한다.

환자는 정신 상태의 보다 면밀한 모니터링을 위해 48시간 동안 PICU 병실 또는 급성 중환자 관리에 대해 즉각적으로 접근하는 다른 적절한 환경(예를 들어, 중재실, 수술실, 전용 처리실)에 있는다. 입원환자가 머무르는 동안에, 직원들에게 감염 통제를 위한 기관 표준에 따른 적절한 안전성 예방책에 따를 것을 요구하고; 표준은 개인 보호 장비(PPE), 예컨대, 가운, 장갑, 마스크, 안경 및 밀폐된 토 슈즈를 요구하여야 한다. 환자의 가족에게는 발열, 자극과민성, 목 통증, 광 민감도 및 구토에 대한 모니터링을 비롯하여 정신 상태 변화에 대한 모니터링에 관한 표준화된, IRB-승인 유인물을 제공한다. 다음의 기준을 충족할 때 환자는 병원에서 퇴원할 수 있다:

무열

과민반응의 부재

수막증의 부재

가능한 CNS 감염 또는 합병증을 시사하는 비정상적 실험값의 부재

용량 상승

다음 환자의 투약 전에 6개 시점(제1일, 제2일, 제7일, 제14, 제21일, 제30일)으로부터의 안전성 분석 검토를 가능하게 하기 위해 코호트 1 내의 모든 환자 사이에 4주의 투약 간격이 있다.

연구자들은 등록을 계속하기 전에 연구 기관과 관련될 가능성이 있거나 확실히 관련된 의식의 48시간 이내에 모든 III 등급 이상의 AE에 대해 DSMB와 협의하였다. 투약 시 6개월령 이상이면서 24개월령 미만인 처음 세(3)명의 환자의 등록 후에 이용 가능한 안전성 데이터에 기반하여, a) 독성으로 인해 중단하는지, 또는 b) 용량 B를 이용하여 코호트 2로 진행하는지의 결정을 하였다.

용량 B에 대해, 코호트 내에서 투약 시 60개월령 미만의 처음 세(3)명의 환자의 투약 간에 적어도 4주 간격이 있다. 처음 세(3)명의 코호트 2 환자 및 모든 코호트 1 환자로부터 이용 가능한 안전성 데이터에 기반하여, 환자 투약 간의 추가 4주 간격은 불필요할 수 있다. 연구자들은 등록을 계속하기 전에 연구 기관과 관련될 가능성이 있거나 확실히 관련된 48시간 이내에 모든 III 등급 이상의 AE에 대해 DSMB와 협의하였다. 처음 여섯(6)명의 등록 후에 그리고 안전성 데이터에 기반하여, a) 독성으로 인해 중단하는지, 또는 b) 투약 시 6개월령 이상이면서 24개월령 미만의 열 두(12)명의 환자 및 투약 시 24개월령 초과이면서 60개월령 미만의 열 두(12)명의 환자가 용량 B를 받을 때까지 추가 21명 환자를 계속해서 등록하는지를 결정한다.

1.2×10¹⁴ vg 용량으로 처리한 환자로부터의 안전성 및 효능 데이터의 진행 중인 평가에 기반하여, 세 번째 용량(용량 C)의 검사를 고려할 수 있다. 60개월령 미만의 세(3)명의 환자는 용량 C를 받으며, 척추강내로 투여되는 최대 2.4×10¹⁴ vg일 것이다. 코호트 1 및 2에서와 같이, 용량 C를 받는 처음 3명 환자의 투약 간에 다시 4주의 간격이 있을 것이다. 처음 삼(3)회 용량 C 환자의 등록 후에 그리고 이용 가능한 안전성 데이터에 기반하여, a) 안전성 우려로 인해 용량 C 투약을 중단하는지, 또는 b) 6개월령 이상이면서 24개월령 미만인 총 열 두(12)명의 환자 및 용량 C을 받은 24개월령 이상이면서 60개월령 미만인 열 두(12)명의 환자가 있을 때까지 추가 21명의 환자를 계속해서 등록할지를 결정한다.

물리 치료 평가: 해머스미스 운동 기능 척도- 확장판

운동 능력 및 임상 진행에 대한 객관적 정보를 제공하기 위해 제2형 및 제3형 척수성 근위축증을 갖는 아동에서의 사용을 위해 해머스미스 운동 기능 척도-확장판 고안하였다.

해머스미스 운동 기능 척도-확장판을 24개월령 이상의 모든 환자에 대해 투약 30일 이내에 십이(12)개월 내내 매달 표 4에 따라 물리 치료사에 의해 투여한다. 투약 시 24개월령 미만의 환자는 24개월령에 도달되는 시기에 해머스미스 운동 기능 척도-확장판 평가를 시작한다. 해머스미스 운동 기능 척도-확장판 세션을 비디오테이프 녹화한다.

물리 치료 평가: Bayley Scales of Infant and Toddler Development®

Bayley Scales of Infant and Toddler Development®, 3판은 표준화된, 규준 참조(norm-referenced) 영아 평가이다. 기준 투약 전 30일 이내에, 이어서, 12개월 내내 매달 대근육 및 소근육 하위검사를 완료하였다. Bayley Scales® 평가를 비디오테이프 녹화한다.

물리 치료 평가: 운동 발달 이정표 조사

유의미한 운동 이정표의 달성을 Bayley Scales®에 의해 유도된 각 이정표의 정의에 따라 표 2에 나타낸 표준 운동 이정표 발달 조사를 이용하여 물리 치료사가 평가한다(물리 치료 매뉴얼 참조). 물리 치료사는 환자가 표 4에 따라 운동 이정표 발달 조사에 대한 각 이정표를 달성하였는지의 여부를 기록한다. 일단 관찰하면, 운동 이정표가 달성된 것으로 간주한다. 이정표를 관찰한 방문일까지 각 운동 이정표의 달성일을 결정한다. 선별 방문 동안, 물리 치료사는 표 4에 따라 기준 이정표 달성 평가를 완료하고; 이 평가를 비디오 상에 녹화하고, 소견을 문서화한다. Bayley Scales®는 아동이 이전에 달성한 이정표를 반복하는 것이 반드시 요구하지는 않기 때문에, 각 이정표는 비디오로 포착할 수 있다. 발달 이정표 평가 세션을 문서화한다.

비디오 증거

각 연구 방문 시 물리 치료 평가는 기능적 능력의 변화에 의해 결정되는 바와 같이 강력하고, 입증 가능하며, 문서화된 증거를 생성하기 위한 노력으로 비디오녹화한다. 부모(들)/법정 후견인(들)은 또한 연구 현장에 따른 기능적 능력 달성을 입증하는 홈 비디오를 공유할 수 있다.

이정표 달성의 비편향 평가를 위해 독립적, 집중화된 검토자에게 비디오를 제공한다. 독립적 검토자들은 비디오가 각 운동 이정표를 달성한 증거를 나타내는지의 여부를 문서화하기 위해 운동 이정표 발달 조사를 사용한다. 이정표 달성을 입증한 가장 빠른 비디오 촬영일로서 운동 이정표 달성일을 계산한다.

기타 임상 평가: 인구통계학/병력

기준에서 환자 인구통계학 및 병력 정보를 수집하고, 증례 기록지(CRF)에서 포착한다. 연구 내내 각 방문 시 병력을 수집한다. 병력 정보는 영향을 받은 형제자매 또는 부모 보인자를 포함하는 척수성 근위축증의 가족력, 출산 시 재태 연령, 출생 시 길이/신장/머리둘레, 출생 시로부터의 입원 정보, 예를 들어, 이용 가능하다면 ICD-10 코드를 포함하는 입원 수, 입원 기간 및 입원 이유, 과거의 호흡기 지원(있는 경우), 및 과거의 섭식 지원(있는 경우)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.

기타 임상 평가: 활력 징후

활력 징후는 투약 30일 이내에 그리고 표 4에 명시된 시점에 혈압, 호흡수, 맥박 및 액화체온을 포함한다. 맥박 산소측정법 및 심박수를 포함하는 바이탈을 지속적으로 모니터링하고, 주사 동안 팀 구성원이 기록한다. 방문 2에서, 혈압, 호흡수, 맥박 액화체온, 맥박 산소측정법 및 심박수를 포함하는 바이탈을 모니터링하고, AVXS-101 투약 절차 후 4시간 동안 15분(+/- 5분)마다 그리고 24시간 동안 1시간(+/- 15분)마다 기록하였다.

기타 임상 평가: 체중 및 길이/신장

체중 및 길이 및/또는 신장을 표 4에 명시한 시점에 따라 적절하게 측정한다.

기타 임상 평가: 신체 검사

신체 검사는 다음의 시스템의 검토를 포함한다: 머리, 눈, 귀, 코 및 인후(HEENT), 폐/흉곽, 심혈관, 복부, 근골격, 신경계, 피부, 림프관, 및 비교 생식기. 각 신체 검사로 머리둘레를 측정한다. 머리둘레를 측정하기 위해, 검사자는 머리둘레 주위로, 이마의 가장 넓은 부분에 걸쳐 눈썹 위, 귀 위 및 뒷머리의 가장 눈에 띄는 부분에 걸쳐 유연한 측정 테이프를 단단히 감는다. 측정을 3회 하여야 하며, 가장 큰 측정을 0.1 ㎝의 정확도로 기록하여야 한다. 기준 신체검사를 투약 30일 이내에 그리고 표 4에 명시된 시점에 따라 완료한다.

기타 임상 평가: 백신접종 권장

환자는 질병관리센터(Center for Disease Control: CDC)가 권장하는 모든 정례적으로 계획된 예방 접종에 따르도록 권장된다. 호흡기 세포 융합 바이러스(RSV) 감염을 방지하기 위해 팔리비주맙(palivizumab) 예방(시나지스(Synagis)로도 알려짐)을 포함하는 계절 백신접종은 또한 미국 소아과 학회(American Academy of Pediatrics)(AAP 2009)에 따라 권장된다.

기타 임상 평가: 12-리드 심전도(ECG)

선별/기준, 제1일, 제2일, 제3일, 3개월, 6개월, 9개월 및 12개월(또는 조기 종료) 시 12-리드 ECG를 수행한다. 심장학자에 의한 집중화된 검토를 위해 ECG 추적 또는 ECG 기계 데이터를 수집한다. 유전자 전달일 및 유전자 전달 후 제2일 및 제3일에 12-리드 ECG를 수행한다(홀터 모니터(Holter Monitor)와 동시에). 추가적인 전기 생리학적 모니터링은 국소 기관 가이드라인에 따라 연구자의 재량에 따른다.

기타 임상 평가: 12-리드 홀터

환자는 -제1일의 용량 투여 24시간 전에 12-리드 연속 홀터 모니터를 부착하였다. 홀터 모니터는 48시간(제3일) 내내 유지한다. 일련의 ECG 데이터를 다음의 시점에 홀터 모니터 데이터로부터 삼중으로 끌어낸다: 투약 전, 2시간, 4시간, 6시간, 8시간, 12시간, 24시간, 36시간 및 48시간. 선별 및 1, 2, 3, 6, 9 및 12개월 방문(또는 조기 종료) 시 24시간 홀터 모니터링을 수행한다.

기타 임상 평가: 초음파 심전도

선별/기준 시, 및 3개월, 6개월, 9개월 및 12개월 방문(또는 조기 종료) 시 초음파심전도를 수행한다.

기타 임상 평가: 척추 X-선

1년 연구 평가 기간 동안 중증의 척추측만증을 갖는 환자 또는 주요 척추 수술 절차가 필요한 환자를 제외하기 위해 척추 X-선을 수행한다.

기타 임상 평가: 폐 검사

호흡기 내과 전문의가 표 4에 명시한 시점에 환자를 평가하고, 호흡기내과 전문의 및/또는 연구자의 재량으로 비침습적 양압 호흡기(예를 들어, BiPAP)에 적합화시킬 수 있다. 연구 직원이 실제 사용 데이터를 기록한 SD 카드를 제거할 수 있도록, 비침습적 호흡기 지원이 필요한 환자에게 각 연구 방문까지 기계를 가져올 것을 요청한다. 이 사용 데이터를 임상 데이터베이스에 옮긴다. 비침습적 호흡기 지원이 필요한 환자에게 SD 카드를 제거하도록 요청하고, 놓친 연구 방문의 경우에 이를 연구 현장까지 운송한다.

AVXS-101 주사의 형광 투시/방사선 촬영 가이드

AVXS-101 척추강내 주사 절차를 기관 가이드에 따라 중재 방사선사 또는 다른 적절하게 훈련되고 경험 있는 의사에 의해 형광투시법 하에 멸균 조건 하에 수행한다. 이 절차를 위해 방사선촬영 영상의 포착은 필요하지 않을 수도 있다.

기타 임상 평가: 주사 부위의 사진

주사 상처의 치유를 모니터링하기 위해 30일 내내 표 4에 명시된 시점에 주사 부위의 사진을 촬영한다.

기타 임상 평가: 실험 평가

표 4에 명시된 시점에 실행 내내 생물학적 샘플을 수집한다. 생물학적 샘플을 수집하고, 중앙 연구실로 운송한다. 투약 전날(-제1일)에 연구 검사를 위한 샘플을 투약 전에 수집하고, 현장의 임상 연구실 개선 개정 법안(Clinical Laboratory Improvement Amendment: CLIA)-보증된 현지 연구실에 의해 지역적으로 처리한다. 일부 경우에, 즉각적인 결과 또는 다른 안전성 또는 수송 문제를 위해 샘플을 지역적으로 수집할 수 있다.

환자로부터 충분한 혈액을 수집할 수 없는 경우에, 첫 번째가 가장 큰 우선도를 갖고, 마지막이 가장 낮은 우선도를 갖는 우선도로 혈액을 사용한다:

1. 안전성 혈액 연구: 화학 > 혈액학 > 응고 > CK-MB 또는 트로포닌

2. T-세포 반응을 검출하기 위한 IFN-γ ELISpot

3. AAV9 및 SMN에 대한 혈청 항체

4. 유전자 재확인 검사

선별 방문 시 유전자 재확인 검사를 포함하는 혈액 용적이 충분하지 않다면, 환자는 방문 2 전에 복귀한다. 모든 환자는 유전자 재확인 검사를 완료하였다.

기타 임상 평가: 혈액학

혈액학 분석은 차이가 있는 CBC 및 도말이 있는 혈소판 계수를 포함한다. 샘플을 수집하고, 중앙 연구실에 의해 제공된 연구실 매뉴얼에 따라 운송한다. 연구자에 의해 결정한 바와 같은 입원환자 투약 동안 지역 연구실에서 연주 현장 표준 절차에 따라 즉시/동일한 날의 혈액 분석을 수행한다.

기타 임상 평가: 혈청 화학

샘플을 수집하고, 중앙 연구실에 의해 제공된 연구실 매뉴얼에 따라 운송한다.

연구자에 의해 결정한 바와 같은 입원환자 투약 동안 지역 연구실에서 연주 현장 표준 절차에 따라 즉시/동일한 날의 화학 분석을 수행한다.

화학 분석은 다음의 모든 연구 방문을 포함한다: 혈청 감마 글루타밀 트랜스퍼라제(GGT), AST/ALT, 혈청 총 빌리루빈, 직접 빌리루빈, 알부민, 글루코스, 총 크레아틴 키나제, 크레아티닌, BUN, 전해질, 알칼리성 포스파타제.

선별 시, 제7일, 제30일, 제60일 및 6개월, 9개월 및 12개월/연구 종료 시 CK-MB 또는 트로포닌 I을 수집한다. 개정 5(프로토콜 버전 6.0)가 시행된 후에 선별 및 등록된 새로운 환자에서 CK-MB 대신에 트로포닌 I을 측정한다. 개정 5(프로토콜 버전 6.0)가 시행되는 때 선별 및 등록되었지만 아직 유전자 대체 요법(방문 #2)을 받지 않은 참여자는 AVXS-101에 의한 치료 전에 기준 트로포닌 I 검사를 받고, CK-MB 대신 트로포닌 I 검사를 받는다. 모든 다른 참여자로부터 CK-MB를 수집한다. 연구자는 (-제1일을 제외하고) 중앙 연구질에서 모든 연구 방문으로부터의 실험 결과를 받는다.

기타 임상 평가: 바이러스 혈청학

AAV 벡터의 투여는 면역-매개 간염을 야기할 위험이 있다. HIV 또는 B형 또는 C형 간염 또는 지카 바이러스에 대한 양성 혈청을 갖는 환자에 대해, AAV 벡터의 투여는 불합리한 위험을 나타낼 수 있으며; 따라서, 치료 전에 선별 시, 음성 혈청학적 검사를 확인한다. 이들 샘플을 수집하고, 중앙 연구실에 의해 제공된 연구실 매뉴얼에 따라 운송한다.

기타 임상 평가: 응고 연구

응고 연구는 프로트롬빈 시간(PT), 부분적 프로트롬빈 시간(PTT) 및 국제 표준화 비율(international normalized ratio: INR)을 포함하며, 이들은 중앙 연구실에 의해 제공되는 연구실 매뉴얼에 따라 수집한다. 응고 연구를 표 4에 명시된 시점에 따라 수행한다.

기타 임상 평가: 소변검사

소변 샘플을 수집하고, 표 4에 명시된 시점에 중앙 연구실에 의해 제공된 연구실 매뉴얼에 따라 운송한다. 연구자에 의해 결정한 바와 같은 입원환자 투약 동안 지역 연구실에서 연주 현장 표준 절차에 따라 -제1일 및 즉시/동일한 날의 소변분석을 수행한다. 소변분석은 다음의 파라미터를 포함한다: 색, 투명도/혼탁도, pH, 비중, 글루코스, 케톤, 아질산염, 백혈구 에스터라제, 빌리루빈, 혈액, 단백질, 적혈구, 백혈구, 편평상피세포, 외관, 결정, 박테리아, 효모.

기타 임상 평가: 모세혈액 기체

모세혈액 기체를 표 4에 명시한 시점에 따라 완료한다. 매우 혈관화된 영역(발뒤꿈치, 손가락, 발가락)에서 환자 피부의 피부층에 랜싯(lancet) 또는 유사한 장치를 이용하여 구멍을 내거나 또는 작게 절개한다. 혈류를 가속화하고 동맥 및 정맥 기체 압력 간의 차이를 감소시키기 위해, 구멍을 내기 전에 상기 영역을 따뜻하게 한다. 혈류가 천공 부위로부터 자유롭게 유동함에 따라, 샘플을 모세관에서 수집한다.

기타 임상 평가: ELISA: 항-AAV9 Ab

혈액 샘플을 수집하고, 선별 시 AAV9에 대한 혈청 항체에 대한 검사를 위해 연구실 매뉴얼에 따라 그리고 표 4에 명시된 시점에 따라 중앙 연구실까지 운송한다.

기타 임상 평가: ELISA: 항-SMN Ab

혈액 샘플을 수집하고, SMN에 대한 혈청 항체에 대한 검사를 위해 연구실 매뉴얼에 따라 그리고 표 4에 명시된 시점에 따라 중앙 연구실까지 운송한다.

기타 임상 평가: IFN-γ ELISpot

혈액을 수집하고, 표 4에 명시된 시점에 따라 AAV9 및 SMN에 대한 T-세포 반응을 검출하기 위해 인터페론 감마(IFN-γ) ELISpot을 수행하는 연구실 매뉴얼에 따라 중앙 연구실까지 운송한다.

기타 임상 평가: 어머니의 선별 기준

등록된 환자의 어머니는 자궁 내의 태반 전달을 통해 또는 이론적으로는 모유를 통해 환자에게 전달될 수 있는 AAV9에 대해 항체가 이미 존재할 가능성이 있다. AAV9에 대한 순환 항체에 대해 어머니를 선별하기 위해 부모 중 어머니에게 사전동의를 요청한다. 일단 사전동의를 받으면, 어머니는 말초 정맥으로부터 채혈하고, 항-AAV9 항체의 선별을 위해 중앙 연구실로 운송한다. AAV9 항체를 확인하면, 연구자들은 모유 수유를 계속할지 중단할지의 여부를 어머니와 논의하여야 한다. 항-AAV9 항체에 대해 검사할 수 없는 공여자 공급원으로부터의 환자가 소모하는 저장 모유를 참여 전 조제분유로 바꾼다.

기타 임상 평가: 진단 확인 검사를 위한 혈액

선별 방문 동안에 혈액을 수집하고, SMN1 결실, SMN2 복제수 및 엑손 7 유전자 변경자 돌연변이(c.859G>C) 부재의 재확인을 위한 연구실 매뉴얼에 따라 중앙 연구실로 운송한다. 진단 검사 실행에서 일관성을 보장하기 위해 이를 행한다.

기타 임상 평가: 타액, 소변 및 대변 수집

연구는 주사 후 최대 몇 주 동안 신체로부터 일부 벡터를 추출할 수 있는 것을 나타내며; 이는 "바이러스 배출(viral shedding)"로 칭한다. 주사 후 최대 1주 동안 혈액, 소변, 타액 및 대변에서 벡터 배출을 발견할 수 있다. 방출 벡터와 관련된 위험은 이 시점에 알려지지 않지만; 그러나, 벡터가 비감염성이고 복제할 수 없기 때문에 가능성이 없다. 그럼에도 불구하고, 환자 체액 및/또는 노폐물과 직접 접촉하게 될 경우 보호 장갑의 사용뿐만 아니라 주사 후 최소 2주 동안의 양호한 손 위생에 관한 IRB-승인 지침을 환자 가족 및 돌봄 제공자에게 제공한다. 추가적으로, 환자는 벡터 주사 후 2년 동안 헌혈이 금지된다.

투약 후 24시간 및 48시간을 포함하여 표 4에 따른 바이러스 배출 연구를 위한 연구실 매뉴얼에 따라 타액, 소변 및 대변 샘플을 수집한다. 더 이상 기저귀를 사용하지 않는 48개월 이상의 모든 현장의 환자는 적어도 1회의 배설 및 1회의 배변을 위해 제7일, 제14일 및 제30일에 완전한 용적의 소변 및 완전한 용적의 대변 샘플을 제공한다. 샘플을 연구실 매뉴얼에 따라 준비하고, -80℃ 냉동고에 저장하고, 연구실 매뉴얼에 따라 중앙 연구실로 운송한다. 바이러스 배출 하위 연구에 참여하기로 선택한 현장에서 환자의 하위집단은 (해당 시기의 모든 배설을 포함하기 위해) 투약 후 24시간 내지 투약 후 48시간에 24시간 총 용적 소변 및 대변 샘플을 수집하였다.

실시예 2 - SMA 환자에서의 AVXS-101 연구(임상시험 중간 결과 I)

실시예 1에 기재한 프로토콜에 따라 환자를 확인하고, 처리하고 평가하였다. 연구 등록 시 앉을 수는 있지만 서거나 보행할 수 없는 척수성 근위축증(SMA)을 갖는 환자에게 AVXS-101을 척추강내로 투여하였다. 환자는 SMN1의 이중대립유전자 결실에 추가로 SMN2 유전자의 3개의 복제물을 가졌다. 환자는 2개 그룹, 즉, 투약시 6개월령 초과면서 24개월령 미만인 환자, 및 투약 시 24개월 이상이면서 60개월령 미만인 환자로 계층화하였다. 6개월령 초과이면서 24개월령 미만인 16명의 환자 및 24개월령 이상이면서 60개월령 미만인 12명의 환자를 등록하였다. 보다 어린 연령의 그룹 내에서, 3명의 환자는 6.0×10¹³ vg의 AVXS-101(용량 A)을 투여 받았다. 보다 어린 환자의 나머지, 및 보다 나이가 있는 환자 모두는 1.2×10¹⁴ vg의 AVXS-101(용량 B)을 투여 받았다.

환자는 요추 척추강내(IT) 주사를 통한 1회 투여로서 방사선촬영 모니터링을 위해 1.5 ㎖의 적절한 조영제와 사전혼합한 AVXS-101을 투여 받았다. 환자는 숙주 면역 반응을 약화시키는 치료 후에 처음 2개월 동안 예방적 프레드니솔론을 투여받았다. 치료 후 12개월의 기간에 걸쳐 안전성 및 효능을 평가한다. 투약 시 6개월령 초과이면서 24개월령 미만인 환자에 대해, 효능 척도는 혼자서 서는 능력을 달성한 환자의 비율이다(Bayley Scales of Infant and Toddler Development®-대근육 운동 하위집단 #40). 뒤에서 옆으로 구르기, 기기, 지지하고 서기, 서기 위해 잡아당기기 및 도움을 받아서 또는 도움 없이 보행하기를 포함하는 세계보건기구 다기관 성장 참조 연구(WHO-MGRS) 기준(Wijnhoven 2004)에 의해 규정된 추가적인 이정표를 평가하였다. 투약 시 24개월령 이상이면서 60개월령 미만인 환자에 대해, 결과 척도는 해머스미스 운동 기능 척도-확장판(HFMSE)의 기준으로부터의 변화였다. 반응자의 백분율(3점 초과의 HFMSE 점수를 달성한 것으로 규정함; Swoboda, et al 2010)을 매달 평가하였다.

용량 A(6.0×10¹³ vg; n=3) 또는 용량 B(1.2×10¹⁴ vg; n=13)의 척추강내 AVXS-101을 받은 후 5 내지 12개월 사이에 제2형 SMA를 갖는 6개월령 내지 24개월령의 환자를 평가하였다. 표 6에 나타낸 바와 같이, Bayley® 대근육 운동 척도 점수의 변화는 -1 내지 14점(평균 증가 + 3.6의 SD + 3.5 pt)의 범위였고, 16명의 환자 중 14명(87.5%)은 기준으로부터의 개선을 나타낸다. 16명의 환자 중 7명은 치료 후 적어도 하나의 새로운 Bayley® 항목을 달성하였다. 2명의 환자 - 각 용량 그룹에서 1명-는 독립적으로 서기의 연구 종료를 달성하였고(E02, E24); 1명의 환자(E24)는 20개월령 전에 서기를 달성하고, 이제 독립적으로 이동한다.

용량 B(1.2×10¹⁴ vg; n=12)의 척추강내 AVXS-101을 받은 후 5 내지 9개월 사이에 제2형 SMA를 갖는 2세 내지 5세의 환자를 평가하였다. 표 7에 나타낸 바와 같이, Bayley®대근육 운동 척도 점수의 변화는 -8 내지 10점(평균 증가 + 2.1의 SD + 1.3 pt)의 범위였고, 12명의 환자 중 9명(75%)은 기준으로부터의 개선을 나타낸다. 12명의 환자 중 5명(42%)은 치료 후 적어도 하나의 새로운 Bayley® 항목을 달성하였다. 2명의 환자(E07; E13)는 치료 후 지지에 의해 서 있는 능력을 입증하였다. 1명의 환자(E07)는 이제 도움을 받아서 보행할 수 있다.

2세(6 내지 24개월령 그룹)에 도달된 후의 환자 및 더 나이가 있는 환자(2 내지 5세 그룹)에 대해 해머스미스 기능성 운동 확대 지수(HFMSE)를 수행하였다. HFMSE 점수의 변화는 -4 내지 14점(평균 증가 + 4.3의 SD + 5.3 pt) 범위였고, 19명의 환자 중 12명(63.1%)은 기준으로부터의 개선을 나타낸다. 더 나이가 있는 그룹(2 내지 5세)에서 12명의 환자 중 7명(58%)는 HFMSE에서의 개선을 나타낸 반면, 더 어린 (6 내지 24개월) 그룹에서 7명 중 5명의 환자(71%)는 개선되었다. 20.3개월령에 치료된 1명의 환자(E02)는 지지없이 서 있는 능력을 달성하였다. 19명의 환자 중 12명(63%)은 반응자로 간주하였다(3점 이상의 HFMSE에 대해 개선을 달성)(도 3). 치료 시 HFMSE 점수와 환자 연령 간의 상관관계는 발견되지 않았다. 문헌[Swoboda et al. (2010) "SMA CARNI-VAL Trial Part I: Double-Blind, Randomized, Placebo-Controlled Trial of L-Carnitine and Valproic Acid in Spinal Muscular Atrophy," PLOS ONE 5(8): e12140].

도 3은 환자 연령의 함수로서 개개 환자의 HFMSE 점수를 나타낸다. HFMSE의 검사는 이들이 24개월령에 도달될 때까지 6 내지 24개월령 그룹의 환자에서 시작하지 않았다. 환자의 63%(19명 중 12명)는 HFMSE의 개선을 나타내었다. 용량 A(6.0×10¹³ vg) 그룹에서 1명의 환자는 치료 8개월까지 8점의 개선을 나타내었고; 두 번째 용량 A 환자는 평가 7개월 후에 2점만큼 하락하였다.

HFMSE의 적어도 3점 개선을 달성한 환자를 본 연구에서 반응자로서 특성규명하였다. 보다 나이가 있는 코호트(2 내지 5세)에 대해, 12명의 환자에 대해 기준으로부터 치료 5개월까지, 그리고 10명 및 5명의 환자에 대해 6개월 및 7개월에 각각 HFMSE를 평가하였다. 보다 어린 연령의 코호트(6개월령 내지 2세)에 대해, AVXS-101 치료를 받은 후 1명의 환자를 3 내지 4개월에 평가하고, 5명의 환자를 6 내지 7개월에 평가하였다. 보다 나이가 있는 코호트의 모든 환자, 및 2세 이상에 도달된 보다 어린 연령 코호트의 환자를 도 5에 나타낸다. 치료 1개월 후에 50%의 빠른 반응률을 관찰하였다. 7개월의 연구 내내 50% 이상의 반응률이 유지되었고, 시간에 따라 반응률이 증가하는 경향이 있다.

기준으로부터 치료 5개월까지 완전한 코호트(n=12)에 대해, HFMSE 평가를 수행한 보다 나이가 있는 코호트(2 내지 5세) 환자에 대한 매달의 반응률을 도 6에 나타낸다. 치료 1개월 후에 50%의 반응률을 관찰하였다. 치료 후 6개월을 제외하고, 반응률은 연구 7개월 내내 50% 이상에서 유지되었다. 1명의 빠른 반응자는 6개월 평가 시 HFMSE의 하락이 있고, 이 시점에 반응률은 50% 미만으로 감소되었다.

전반적으로, 4 내지 12개월의 관찰 기간 동안 24명의 환자 중 11명에서 23개의 새로운 운동 이정표가 관찰되었다(표 6 내지 표 8). 보다 나이가 있는 코호트에서, 평균 HFMSE 점수는 연구 5 내지 9개월에 4.3점만큼 증가되었다(표 8). 연령 코호트 둘 다에서 대다수의 환자(63%)는 용량과 상관없이 치료 후에 HFMSE 점수가 개선되었다(도 3, 도 4). 본 연구에서 50%의 환자는 치료의 단지 1개월 후에 HFMSE의 임상적으로 의미있는 개선(즉, 점수가 3점 초과인 반응자)이 있었고, 반응률은 시간에 따라 점진적으로 증가되었다. AVXS-101을 이용하는 치료는, 예를 들어, 표준 치료와 같은 다른 요법에 대해 보고된 것보다 더 효능이 있었다. 이들 결과는 대다수의 환자가 단일 용량의 척추강내 AVXS-101에 대해 초기 반응이 있었고, 반응의 빠른 개시를 나타내며, 척추강내로 투여한 AVXS-101을 연구한 기간 내내 효과가 유지되었다는 것을 입증한다.

실시예 3 - SMA 환자에서의 AVXS-101 연구(임상시험 중간 결과 II)

실시예 1 및 2에서 상세히 설명한 바와 같은 임상 시험의 추가적인 중간 결과를 본 명세서에 제시한다. 연구 등록 시 10초 이상 동안 지지 없이 앉을 수는 있지만 독립적으로 서거나 보행할 수 없는 척수성 근위축증(SMA)을 갖는 환자에게 AVXS-101을 척추강내로(IT) 투여하였다. 환자는 SMN1의 이중대립유전자 결실에 추가로 SMN2 유전자의 3개의 복제물을 가졌다. 환자는 2개 그룹, 즉, 투약시 6개월령 이상이면서 24개월령 미만인 환자, 및 투약 시 24개월 이상이면서 60개월령 미만인 환자로 계층화하였다. Bayley Scales®를 이용하여 모든 연구 환자(6개월 이상이면서 60개월령 미만)에 대해 전처리 기준 평가를 수행하였고, HFMSE를 이용하여 24개월령 이상이면서 60개월령 미만인 그룹에 대해 추가적인 기준 평가를 수행하였다.

이들 두 연령 그룹 내에서, 3회의 상이한 치료 용량을 기재한 바와 같이 투여하였다: 투약 시 6개월령 이상이면서 24개월령 미만인 3명의 환자는 6.0×10¹³ vg의 AVXS-101(용량 A)의 단일 IT 투여를 받았다. 6개월령 이상이면서 24개월령 미만인 13명의 환자 및 24개월령 이상이면서 60개월령 미만인 12명의 환자는 1.2×10¹⁴ vg의 AVXS-101(용량 B)의 단일 IT 투여를 받았다. 투약 시 6개월령 이상이면서 24개월령 미만인 3명의 환자는 2.4×10¹⁴ vg의 AVXS-101(용량 C)의 단일 IT 투여를 받았다. 추가 연구에서, 추가 21명의 환자에 용량 C를 제공하며, 상기 환자 중 9명은 투약 시 6개월령 이상이면서 24개월령 미만이고, 상기 환자 중 12명은 투약 시 24개월령 이상이면서 60개월령 미만이다.

현재의 연구 집단은 또한 치료의향(Intent-to-Treat: ITT) 세트에 31명의 환자를 포함하며, 이들은 IT AVXS-101를 받은 모든 환자로서 정의하고, 이 중 19명의 환자는 6개월령 이상이면서 24개월령 미만이고, 12명의 환자는 등록 시 24개월령 이상이면서 60개월령 미만이었다. 또한, 4명의 환자(3명의 용량 A 및 1명의 용량 B 환자)를 투약 후 12개월의 후속조치를 완료한 모든 환자로서 정의되는 효능 완료 분석 세트(Efficacy Completer Analysis Set: ECAS)에 포함시켰다. 1차 집단으로서 ITT 세트 및 중간 결과에서 지지적 집단으로서 ECAS를 이용하여 모든 효능 분석을 수행하였다.

AVXS-101로 치료한 환자로부터의 데이터를 동료 평가(peer-reviewed) 및 소아 신경근육 임상 연구(PNCR) 네트워크에 의해 수집한 널리 인용되는 자연적 병력 데이터세트로부터 도출된 환자-수준 데이터와 비교하였다. 문헌[Kaufmann et al., "Prospective cohort study of spinal muscular atrophy types 2 and 3."(2012) Neurology, 79(18):1889-1897]. PNCR은, SMA의 관리에 상당한 전문성을 갖는 3개의 대규모의, 국제적으로 인정되는 3차 의료 센터(하버드 유니버시티/보스턴 아동 병원, 컬럼비다 유니버시티 및 펜실베이니아 유니버시티/필라델피아 아동 병원)에서 따르는, 임의의 형태의 SMA를 갖는 337명의 환자 코호트로부터 개발한 대규모 자연적 병력 연구이다. 데이터는 6개월령 이상이면서 24개월령 미만의 그룹에 대해 PNCR 데이터를 제한하는 Bayley Scales of Infant and Toddler Development®를 이용하는 평가를 포함하지 않는다. Prior와 동료에 의해 기재된 SMN2 변경자 돌연변이(c.859G>C)는 PNCR 연구 코호트에서 평가하지 않았다. 문헌[Prior et al., "A positive modifier of spinal muscular atrophy in the SMN2 gee." (2009) A. J. Hum. Genet., 85(3):408-441].

PNCR N=51 자연적 병력 대조군: 6개월령 이상이면서 24개월령 미만인 환자에 대해, PNCR 자연적 병력 연구로부터 도출한 51명 환자의 코호트를 "집단-매칭" 대조군 코호트로 표기하였다. 이 비교 코호트는 하기 기준을 충족시키는 PNCR 연구에 등록된 모두 51명의 환자를 포함한다: (1) 제2형 또는 제3형 SMA를 가짐, (2) SMN2의 3개 복제물, (3) 12개월령 전에 증상 발병, 및 (4) 36개월령에 또는 전에 적어도 1회의 방문을 함. 이 코호트 중에서, 7/51 환자(13.74%)는 혼자서 서는 능력을 달성하였고, 이는 36개월령에 또는 전의 임의의 시점에 HFMSE의 항목 #19에 대해 점수 2를 달성한 것으로 정의한다. 5/51 환자(10%)에서 혼자서 보행하는 능력이 달성되었고, 36개월령에 또는 전에 항목 #20에 대해 2의 HFMSE 점수를 달성한 것으로 정의한다.

PNCR N=15 자연적 병력 대조군: 24개월령 이상이면서 60개월령 미만인 환자에 대해, PNCR 자연적 병력 연구로부터 도출한 15명 환자의 코호트로부터의 환자-수준 데이터를 "집단-매칭" 대조군 코호트로서 선택하였다. 1차 분석을 위해 이 대조군을 사용하였다. 이 자연적 병력 대조군은 하기를 가진다: (1) 제2형 또는 제3형 SMA, (2) SMN2의 3개 복제물, (3) 12개월령 전에 증상 발병, (4) 24개월령 전에 SMA의 진단, 및 (5) PNCR 연구에 등록 시 서거나 보행하는 것의 불능. 코호트 구성원은 후속조치 평가의 비교를 위해 기준으로서 사용한 24 내지 60개월령의 HFMS 또는 HFMSE 평가를 받았다. 15명의 환자의 이 PNCR 그룹은 기준 및 모든 후속 방문 시 HFMSE 점수가 0점으로 기록된 1명의 환자가 있었다. 코호트로부터의 5/15(33%) 개체에서, 12개월보다 긴 기간 동안 HFMSE 점수를 수집하였다. 최종 방문은 2/15 환자(13%)에 대해 18개월이고, 2/15 환자(13%)에 대해 42개월이며, 1/15 환자(7%)에 대해 48개월이었다.

PNCR N=17 자연적 병력 대조군: 24개월령 이상이면서 60개월령 미만인 환자에 대해, 환자 그룹과 자연적 병력 대조군 사이의 매칭을 개선시키기 위해 PNCR 연구로부터 도출한 17명 환자의 코호트로부터의 환자-수준 데이터를 확인하였다. 민감도 분석을 위해 이 대조군을 사용하였다. 본래 PNCR N=15 대조군에서 12명의 환자는 PNCR N=17 자연적 병력 대조군이었다. PNCR N=15 대조군에서 본래 3명을 환자는 포함시키지 않았다(기준 및 후속 방문에 대해 HFMSE = 0을 갖는 1명의 개체, 최종 방문이 12개월 초과인 2명의 개체). 이들 17명의 개체는 연구 그룹에 대해 가능한 가깝게 매칭된 연령, 임상 및 유전적 기준을 가졌다. 24개월 이상이면서 60개월 미만인 제1 방문을 기준 방문으로서 정의하였다. 12개월 간격 이내의 후속 방문을 사용하여 HFMSE에 대한 기준으로부터의 변화를 결정하였다. 임상적으로, 이들 개체는 앉을 수 있지만, 독립적으로 서거나 보행할 수 없다. 유전적으로, 환자는 이중대립유전자 SMN1 결실 및 SMN2의 3개의 복제물을 보유하였다. PNCR 자연적 병력 대조군을 이용하는 제한은 평가 간격이 참가자 간에 일치되지 않았다는 것이다. 따라서, 이 대조군에서의 일부 개체는 12개월 이하의 데이터를 가졌다(예를 들어, 표 13 참조).

모든 등록된 환자에 대해 치료 및 연령에 따른 환자 기질을 표 9에서 상술한다. 안전성 분석 세트에 대해 연령에 따른 치료에 의한 인구통계학 및 기준 특징의 요약을 표 10에 제공한다.

중간 결과: 6개월령 이상이면서 24개월령 미만인 그룹의 1차 효능 종점의 중간 평가(용량 A, B 및 C; 총 n = 19)

이 연령 그룹에 대한 1차 효능 종점은 Bayley Scales of Infant and Toddler Development®- 대근육 운동 하위집단 항목 #40, "적어도 3초 동안 지지 없이 서 있음"의 달성이었다. 환자는 투약 후 12개월 후속조치 동안의 임의의 시점에 이정표가 달성된다면 이 이정표를 달성한 것으로 간주하였다. 이정표의 연구 부위 평가의 비디오 녹화를 독립적 중앙 검토자에 의해 확인하였다.

ITT 세트에 대한 용량에 따른 1차 효능 결과를 이하 및 표 11에 요약한다:

용량 A(6.0×10¹³ vg의 AVXS-101)에 대해, 3명의 환자 중 1명(33.3%)인 환자 007-001은 치료 후 11개월에 지지하여 서 있는 것을 달성하였다. 투약하였을 때 이 환자는 대략 20개월령이었다. 환자가 혼자서 서지 않았다고 해도, 이 환자는 연구 등록 시 다음의 기술을 달성하였다: 체중 지지(Bayley®#33), 지지를 받으면서 보행(Bayley®#37), 및 지지를 받으면서 보도를 보행함(Bayley®#38).

용량 B(1.2×10¹⁴ vg의 AVXS-101)에 대해, 13명의 환자 중 1명(7.7%)인 환자 007-002는 치료 후 3개월 이내에 지지 없이 서 있는 것을 달성하였다. 투약하였을 때 이 환자는 대략 7개월령이었다. 연구 의사에 따르면, 이 환자는 신경학적 검사로 확인되는 SMA의 징후가 없었다. 환자는 영향받은 형제자매가 있기 때문에, 환자는 유전자 검사를 이용하여 생애 초기에 진단되었고, 신경 전도 연구에 따랐다. 연구 등록 전에, 환자의 복합 근육 활동 전위(compound muscle action potential: CMAP)는 비정상이었다.

용량 C(2.4×10¹⁴ vg의 AVXS-101)에 대해, 환자(3명 중 0명)는 치료 후 최대 12개월까지 평가 시 지지 없이 서 있는 것의 이정표를 달성하지 못하였다(표 11).

용량 B + 용량 C에 대해, 16명의 환자 중 1명(6.3%)인 환자 007-002(상기 기재함)는 치료 3개월 후에 지지 없이 서 있는 것의 이정표를 달성하였다.

PNCR N=51 데이터 세트로부터의 제2형 및 제3형 SMA를 갖는 자연적 병력 대조군에 대해, 51명의 환자 중 7명(13.7%)은 (표 11에 나타낸 바와 같이) 지지 없이 서 있는 것의 이정표를 달성하였다.

이정표(1차 효능 종점)를 달성하는 환자의 그룹과 지지적 효능 종점을 위한 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 분석 간의 비교를 위해 피셔의 정확성 검증을 이용하여 프로토콜에 따라 통계학적 분석을 수행하였다. 12개월까지의 임의의 기준 방문 후에 독립적으로 서 있는 능력을 달성하는 1차 효능 종점을 표 11에 요약한다.

혼자서 서 있는 능력을 달성하는 시간을 PNCR 그룹 내 모든 환자에 대해서 뿐만 아니라 ITT 세트에서 용량에 따라 요약하였다. 기준에서 공변량으로서 환자 연령에 따른 치료 차이를 평가하기 위해 콕스 비례 위험 모델(Cox proportional hazards model)을 이용하여, 위험비(95% CI)는 용량 B에 대해 0.43(0.05, 3.93)이었고, 용량 C에 대해 0(0, 평가할 수 없음), 용량 B + 용량 C 그룹에 대해 0.37(0.04, 3.39)이었고, p-값은 각각 0.4576, 0.9951 및 0.3826이었다. 대부분의 연구 환자는 중간 결과의 보고와 독립적으로 서 있기의 이정표를 달성하지 않았고, 1/4, 중위수 및 3/4과 같은 값의 계산을 금지하였다.

중간 결과: 24개월령 이상이면서 60개월령 미만인 그룹의 1차 효능 종점의 중간 평가(용량 B; 총 n = 12)

a. PNCR N=15 자연적 병력 대조군을 이용한 1차 효능 분석

이 그룹에 대한 1차 효능 종점은 12개월에 HFMSE의 기준으로부터의 변화였다. 기준, 기준 후 및 HFMSE의 기준값으로부터의 변화를 요약하고, ITT 세트를 이용하여 분석한다. PNCR N=15 자연적 병력 대조군을 프로토콜에 명시된 분석을 위한 1차 "집단 매칭된" 대조군 코호트로서 사용한다.

AVXS-101 용량 B로 치료한 개체 및 PNCR N=15 자연적 병력 대조군에 대해 최대 12개월까지의 HFMSE 점수에서 기준으로부터의 변화의 스파게티 플롯을 도 7에 나타낸다. 치료한 환자 및 대조군에 대한 기술통계량을 표 12에 제공한다.

PNCR N=15 자연적 병력 대조군에서, 기준 HFMSE 점수에 대한 평균±표준 편차(SD)는 11.8±7.34였다. 이 PNCR 대조군에서, 기준 HFMSE 점수로부터의 변화를 2개월(-0.6±1.35), 4개월(0.4±0.98), 6개월(0.2±1.72), 9개월(1.0±2.16) 및 12개월(0.8±2.86)에 계산할 수 있었다.

AVXS-101 용량 B 처리군에서, 기준 HFMSE 값은 14.8±9.98였다. 대부분의 치료된 환자는 최대 8개월의 HFMSE 데이터를 가졌다(11/12). 2개월, 4개월, 6개월, 9개월 및 12개월에 기준으로부터의 HFMSE 점수 변화는 각각 3.5±4.38, 3.6±5.07, 3.9±5.85, 5.7±6.72 및 7이었다. 용량 B 처리군은 PNCR N=15 자연적 병력 대조군에 비해 HFMSE 점수의 강한 증가를 나타내었다.

b. PNCR N=17 자연적 병력 대조군을 이용하는 민감도 분석

용량 B 및 PNCR N=17 자연적 병력 대조군에 대한 기술통계 및 스파게티 플롯을 표 13 및 도 8에 제공한다.

PNCR N=17 자연적 병력 대조군에서, 기준 HFMSE 점수는 12.1±9.21이었다. 기준 HFMSE 점수로부터의 평균 변화를 2개월(-0.2±1.56), 4개월(0.5±1.05), 6개월(-0.4±5.32), 9개월(1.1±2.03) 및 12개월(-0.2±8.11)에 계산할 수 있었다. PNCR 환자의 41%(7/17)는 12개월의 HFMSE 점수를 갖지 않았다.

AVXS-101 용량 B 처리군은 HFMSE 기준이 14.8±9.98이었다. 2개월, 4개월, 6개월, 9개월 및 12개월에 기준으로부터의 평균 HFMSE 점수 변화는 각각 3.5±4.38, 3.6±5.07, 3.9±5.85, 5.7±6.72 및 7이었다.

용량 B 처리군은 PNCR N=17 자연적 병력 대조군에 비해 HFMSE 점수의 강한 증가를 나타내었다.

중간 결과: 2차 효능 종점 - 운동 이정표, 적어도 5 단계 동안 독립적으로 보행

6개월령 이상이면서 24개월령 미만인 그룹과 24개월령 이상이면서 60개월령 미만인 그룹 둘 다에 대해 2차 효능 종점은 Bayley Scales of Infant and Toddler Development®- 대근육 운동 하위집단 항목 #43("5계단 이상을 독립적으로 보행")이었다. 최대 12개월의 연구 방문까지 임의의 치료 후 방문 시 이 이정표를 점수화하였다. 초기 이정표 평가의 비디오 증거를 검토하고, 독립적 중앙 검토자가 확인하였다.

투약 시 6개월령 이상이면서 24개월령 미만인 환자에 대해, 용량 B(1.2×10¹⁴ vg)를 받은 단일 환자(007-002)는 4개월 방문까지 도움 없이 보행하였다(앞 부문의 환자 설명 참조). 도움 없이 보행하는 능력을 달성한 환자의 비율은 용량 A(6.0×10¹³ vg)에 대해 0%(0/3), 용량 B(1.2×10¹⁴ vg)에 대해 7.7%(1/13) 및 용량 C(2.4×10¹⁴ vg)에 대해 0%(0/3)였다. 이 분석을 위해 PNCR N=51 자연적 병력 대조군을 사용하였다. 이 대조군의 51명의 환자 중 5명(9.8%)은 기준 시 독립적으로 보행하였다. 후속 방문 동안, 이 대조군의 환자는 독립적으로 보행하지 않았다.

투약 시 24개월령 이상이면서 60개월령 미만인 환자에 대해, 모든 환자는 용량 B(1.2×10¹⁴ vg)를 투여 받았다. 이 연령 그룹의 환자는 용량 C를 받지 않았다. 용량 B로 치료한 환자 중에 아무도 독립적으로 보행하지 않았다. 1차 PNCR N=15 자연적 병력 대조군 또는 민감도 PNCR N=17 자연적 병력 대조군의 환자 중 아무도 독립적으로 보행하지 않았다.

중간 결과: 탐색적 효능 종점 - Bayley Scales of Infant and Toddler Development® Assessment

6개월령 이상이면서 24개월령 미만인 그룹 및 24개월령 이상이면서 60개월령 미만인 그룹에 대해, Bayley Scales of Infant and Toddler Development® 3판(Bayley®-III)의 소근육 및 대근육 운동 성분의 기준으로부터의 변화를 평가하였다. 6개월령 이상이면서 24개월령 미만인 그룹에 대해, 제2 탐색적 종점은 24개월령을 지나서 연구를 계속하고 적어도 6개월치의 기준 후 HFMSE 평가를 기록한 환자의 기준으로부터의 HFMSE 변화이다. Bayley Scales®는 PNCR 데이터세트에서 평가하지 않았기 때문에, 24개월령 미만의 환자에 대해 기술통계만을 제공한다.

1형 SMA 환자는 영아가 전체 손을 이용하여 잡을 수 없는 중증의 소근육 운동 장애를 가짐에도 불구하고, 소근육 운동 기능은 소근육 운동 발달에 대한 Bayley® 점수에 반영된 바와 같이 제2형 SMA 및 제3형 SMA에서 상대적으로 잘 보존된다. 문헌[De Sanctis et al., "Developmental milestones in type I spinal muscular atrophy." (2016) Neuromuscul. Disord. 26(11):754-759; Chabanon et al., "Prospective and longitudinal natural history study of patients with Type 2 and 3 spinal muscular atrophy: Baseline data NatHis-SMA study." (2018) PLoS ONE ,13(7): e0201004]. 제2형 및 제3형 SMA에서, 대근육 운동 발달에 대한 Bayley® 점수에 반영된 바와 같이 근위 근기능장애는 원위 근기능장애보다 유의미하게 더 크다.

a. 투약 시 6개월령 이상이면서 24개월령 미만인 환자

용량 A(6.0×10¹³ vg): 이 그룹에서의 3명의 환자는 모두 투약 후 12개월 평가 기간을 완료하였다. 12개월에 Bayley Scales®에서 기준으로부터의 변화는 소근육 운동 하위검사에 대해 12.3±6.51이었고, 대근육 운동 하위검사에 대해 5.7±1.15였다.

용량 B(1.2×10¹⁴ vg): 소근육 운동 하위검사에서 기준으로부터의 변화는 6개월에 13명의 환자 모두에 대해 이용 가능하였다(5.4±3.57). 이용 가능한 데이터는 후속 개월 동안 불완전하였다: 7개월(n=11; 7.8±3.03), 8개월(n=10; 7.4±3.60), 9개월(n=6; 8.2±3.25), 10개월(n=3; 11.7±3.06), 11개월(n=2; 12.5±4.95). 12개월은 단일 환자를 가지며, 기준으로부터의 변화가 16.0이다. 자연적 병력 연구에 의해 예측한 바와 같이 소근육 운동 기술은 이들 환자에서 계속해서 개선되었다. 문헌[Chabanon et al., "Prospective and longitudinal natural history study of patients with Type 2 and 3 spinal muscular atrophy: Baseline data NatHis-SMA study." (2018) PLoS ONE. 13(7): e0201004].

대근육 운동 하위검사에서 기준으로부터의 변화는 6개월에 13명의 환자 모두에 대해 이용 가능하였다(3.8±5.01). 이용 가능한 데이터는 후속 개월 동안 불완전하였다: 7개월(n=12; 4.7±4.29), 8개월(n=10; 4.9±6.45), 9개월(n=6; 3.5±2.07), 10개월(n=3; 5.7±4.73), 11개월(n=2; 8.0±4.24) 및 12개월(n=1; 11.0). 환자는 계속해서 대근육 운동 이정표를 얻었다. 이정표를 상실한 환자는 없었다.

용량 C(2.4×10¹⁴ vg): 소근육 운동 하위검사에서 기준으로부터의 변화에 대해 제한된 데이터를 이용 가능하다: 2개월(n=3; 0.7±0.58), 3개월(n=2; 3.5±0.71); 4개월은 단일 환자를 가지며, 기준으로부터의 변화는 6.0이었다. 대근육 운동 하위검사에서 기준으로부터의 변화는 최대 4개월 이용 가능하였다: 2개월(n=3; 0.3±1.53), 3개월(n=2; 0.5±3.54) 및 4개월(n=1; 4.0).

용량 B + 용량 C: 용량 B + 용량 C에 대해 Bayley Scales®의 기준으로부터 최대 12개월까지의 변화에 대한 스파게티 플롯을 도 9(소근육 운동) 및 도 10(대근육 운동)에 제공한다. Bayley Scales®에 대한 기술통계를 표 14에 제공한다.

b. 투약 시 4개월령 이상이면서 60개월령 미만인 환자

24개월령 이상이면서 60개월령 미만인 그룹은 용량 B(1.2×10¹⁴ vg)를 받은 12명의 환자로 구성된다. 소근육 및 대근육 운동 하위세트의 증가를 관찰하였다. 소근육 운동 하위검사에서 기준으로부터의 변화는 6개월에 12명의 환자 모두에 대해 이용 가능하였다(7.6±5.62). 이용 가능한 데이터는 후속 개월 동안 불완전하였다: 7개월(n=11; 6.6±5.33), 8개월(n=11; 8.0±5.74), 9개월(n=10; 7.9±5.53), 및 10개월(n=2; 10.5±0.71). 단일 환자는 11개월(n=1) 및 12개월(n=1)에 데이터를 가졌고, 점수는 각각 9.0, 및 10.0이었다.

대근육 운동 하위세트에 대해, 기준으로부터의 변화는 6개월 동안 12명에 대해 이용 가능하였다(1.8±4.47). 이용 가능한 데이터는 후속 개월 동안 불완전하였다: 7개월(n=11; 2.0±4.36), 8개월(n=11; 2.3±4.47), 9개월(n=10; 2.4±5.08), 10개월(n=2; 5.5±6.36). Bayley® 대근육 운동 이정표를 상실한 환자는 없었다.

용량 B에 대해 Bayley Scales®의 기준으로부터 최대 12개월까지의 변화에 대한 스파게티 플롯을 도 11 및 도 12에 제공한다. 환자 008-003에 대한 곡선은 부정확하다. 환자 008-003에 대한 기준 점수는 20이었고, 28이 아니다(처음에 보고한 바와 같음). 따라서, 기준 측정과 1개월 사이의 대근육 운동의 변화는 "0"이었고, "-8"이 아니었다. 또한, 기준 측정으로부터의 대근육 운동 점수에서 환자 008-003의 변화는 2 및 3개월에 대해 "0", 4개월에 대해 "+1", 5 및 6개월에 대해 "0", 7 내지 11개월에 대해 "+1", 및 12개월에 대해 "+2"였다.

이들 중간 데이터는 치료 후 12개월을 기준으로 실시예 1에 기재한 임상 실험으로부터의 효능 결과를 요약한다. Bayley Scales®에 대한 기술통계를 표 15에 제공한다.

중간 결과: 24개월령을 지나 연구를 계속한 6개월령 이상이면서 24개월령 미만의 환자에서 HFMSE 점수의 변화

24개월령에 도달된 6개월령 이상이면서 24개월 미만인 환자에 대해 HFMSE 점수를 기록하였다. 임의의 환자에 대해 전처리 기준을 이용 가능하지 않기 때문에, HFMSE의 첫 번째 기록을 기준으로서 정한다. 이하의 개월 표기는 연구 개월이 아닌 24개월령 이상에서 HFMSE의 첫 번째 기록에 대한 것이다.

용량 A(6.0×10¹³ vg): 2명 환자가 24개월령에 도달되었다. HFMSE의 첫 번째 기록으로부터의 변화를 제공한다: 1개월(n=2; -0.5±4.95), 2개월(n=2; 4.0±0.00), 3개월(n=2; 3.5±0.71), 4개월(n=2; 3.0±2.83), 5개월(n=1; 5.0) 및 6개월(n=2; 2.0±5.66).

용량 B(1.2×10¹⁴ vg): 8명의 환자가 24개월령에 도달되었다. HFMSE의 첫 번째 기록으로부터의 변화를 제공한다: 1개월(n=7; 2.0±2.83), 2개월(n=7; 2.7±2.69), 3개월(n=6; 1.3±4.97), 4개월(n=3; 4.7±4.51) 및 5개월(n=2; 7.5±0.71).

용량 B에 대해 HFMSE 점수에서 기준으로부터 최대 12개월까지의 변화에 대한 스파게티 플롯을 도 13에 제공한다. 용량 B에 대해 임의의 기준 방문 후 HFMSE 값에서 기준으로부터 최대 12개월까지의 최대 변화(평균± SD)는 표 16에 나타낸 바와 같이 17.7±5.28(n=7)이었다.

용량 C(2.4×10¹⁴ vg): 단일 환자가 24개월령 이상에 HFMSE의 첫 번째 기록에 도달하였다. 이 단일 "기준" 데이터 지점만을 이용 가능하다.

중간 결론

본 명세서에 기재한 임상시험은 척수성 근위축증(SMA)으로 진단된 6개월령 이상이면서 60개월령 미만인 영아 및 아동의 진행중인 1상, 개방-표지, 단일-용량 척추강내(IT) 투여 연구이다. 치료한 환자에서 지금까지 얻은 데이터는 이하의 각 연령 그룹의 요약에 기재하는 기술 진보, 이정표 진보, 및 질환 안정화를 포함하는 운동 기능의 임상적으로 의미있는 변화를 나타낸다.

6개월령 이상이면서 24개월령 미만의 그룹

6개월령 이상이면서 24개월령 미만인 19명의 환자를 임상 시험에 등록하였다. 3명의 환자는 6.0×10¹³ vg의 AVXS-101(용량 A)의 단일 용량을 받았고, 13명의 환자는 1.2×10¹⁴ vg의 AVXS-101(용량 B)의 단일 용량을 받았으며, 3명의 환자는 2.4×10¹⁴ vg의 AVXS-101(용량 C)의 단일 용량을 받았다. 4명의 환자는 12개월의 투약 후 평가를 완료하였다: 용량 A 그룹에서 3명의 환자 및 용량 B 그룹에서 1명의 환자.

이 연령 그룹에 대한 1차 효능 종점은 Bayley Scales of Infant and Toddler Development®- 대근육 운동 하위집단 #40, "적어도 3초 동안 지지 없이 서 있음"의 달성이었다. 2명의 환자는 1차 효능 종점을 달성하였다. 용량 A를 받은 환자 007-001은 치료 후 11개월에 적어도 3초 동안 지지 없이 서 있는 것을 달성하였다. 용량 B를 받은 환자 007-002는 3개월까지 지지 없이 서 있는 것을 달성하였다.

2차 효능 종점은 Bayley Scales of Infant and Toddler Development®-대근육 운동 하위집단 #43("5계단 이상을 독립적으로 보행함")이었다. 용량 B를 받은 1명의 환자(007-002)는 치료 후 4개월에 적어도 5계단에 대해 도움 없이 보행하였다.

탐색적 종점은 Bayley Scales of Infant and Toddler Development® 3판(Bayley®-III)의 소근육 및 대근육 운동 성분에서 기준으로부터의 변화였다. Bayley Scales®는 PNCR 데이터세트에서 평가하지 않았기 때문에, 24개월령 미만의 환자에 대해 기술통계만을 제공한다. 그러나, 환자는 계속해서 대근육 운동 이정표를 얻는다. 이정표를 상실한 환자는 없다.

24개월령 이상이면서 60개월령 미만의 그룹

24개월령 이상이면서 60개월령 미만인 12명의 환자를 임상시험에 등록하고, 용량 B를 받았다. 이 연령 그룹에서 용량 C를 받은 환자는 없다. 단일 환자는 12개월 치료 후 평가를 완료하였다.

이 그룹에 대한 1차 효능 종점은 HFMSE의 기준으로부터의 변화였다. 용량 B 그룹에서 관찰된 변화를 상황에 배치하기 위해, HFMSE 점수의 3점 이상의 개선은 이해관계자, 예컨대 간병인 및 임상의에게 의미있고 중요한 것으로 간주하며, 임상시험에서 의미있는 변화를 검출하기 위한 역치로서 사용한다. 문헌[Mercuri et al., "Nusinersen versus sham control in later-onset spinal muscular atrophy." N Engl J Med. 378(7): 625-635]. 용량 B 처리군은 PNCR N=15 자연적 병력 대조군 이상으로 HFMSE 점수의 강한 증가를 나타내었다. PNCR N=15 자연적 병력 대조군의 경우, HFMSE 점수의 최대 변화는 9개월(n=7)에 1.0±2.16으로 관찰되었다. PNCR N=17 자연적 병력 대조군을 이용하는 민감도 분석을 수행할 때 유사한 결과를 관찰하였고, HFMSE 점수의 최대 변화는 9개월(n=8)에 1.1±2.03이었다.

용량 B 처리군은 9개월(n=10)에 HFMSE 점수의 변화에 대해 5.7±6.72의 임상적으로 의미있는 증가를 나타내었다.

탐색적 종점은 Bayley®-III의 소근육 및 대근육 운동 성분에서 기준으로부터의 변화였다. 보다 어린 연령 그룹과 유사하게, 환자는 계속해서 대근육 운동 이정표를 얻는다. 이정표를 상실한 환자는 없다.

SEQUENCE LISTING <110> AVEXIS, INC. <120> AAV VIRAL VECTORS AND USES THEREOF <130> 14452.0025-00304 <140> <141> <150> 62/835,242 <151> 2019-04-17 <150> 62/773,894 <151> 2018-11-30 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2359 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1 ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60 ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggaatt cacgcgtgga 120 tctgaattca attcacgcgt ggtacctctg gtcgttacat aacttacggt aaatggcccg 180 cctggctgac cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata 240 gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc 300 cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac 360 ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg 420 cagtacatct actcgaggcc acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac 480 ccccaatttt gtatttattt attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg 540 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atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg 2280 gcgaccaaag gtcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc 2340 gcgcagagag ggagtggcc 2359 <210> 2 <211> 294 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 2 Met Ala Met Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Val Pro Glu Gln Glu 1 5 10 15 Asp Ser Val Leu Phe Arg Arg Gly Thr Gly Gln Ser Asp Asp Ser Asp 20 25 30 Ile Trp Asp Asp Thr Ala Leu Ile Lys Ala Tyr Asp Lys Ala Val Ala 35 40 45 Ser Phe Lys His Ala Leu Lys Asn Gly Asp Ile Cys Glu Thr Ser Gly 50 55 60 Lys Pro Lys Thr Thr Pro Lys Arg Lys Pro Ala Lys Lys Asn Lys Ser 65 70 75 80 Gln Lys Lys Asn Thr Ala Ala Ser Leu Gln Gln Trp Lys Val Gly Asp 85 90 95 Lys Cys Ser Ala Ile Trp Ser Glu Asp Gly Cys Ile Tyr Pro Ala Thr 100 105 110 Ile Ala Ser Ile Asp Phe Lys Arg Glu Thr Cys Val Val Val Tyr Thr 115 120 125 Gly Tyr Gly Asn Arg Glu Glu Gln Asn Leu Ser Asp Leu Leu Ser Pro 130 135 140 Ile Cys Glu Val Ala Asn Asn Ile Glu Gln Asn Ala Gln Glu Asn Glu 145 150 155 160 Asn Glu Ser Gln Val Ser Thr Asp Glu Ser Glu Asn Ser Arg Ser Pro 165 170 175 Gly Asn Lys Ser Asp Asn Ile Lys Pro Lys Ser Ala Pro Trp Asn Ser 180 185 190 Phe Leu Pro Pro Pro Pro Pro Met Pro Gly Pro Arg Leu Gly Pro Gly 195 200 205 Lys Pro Gly Leu Lys Phe Asn Gly Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro 210 215 220 Pro Pro His Leu Leu Ser Cys Trp Leu Pro Pro Phe Pro Ser Gly Pro 225 230 235 240 Pro Ile Ile Pro Pro Pro Pro Pro Ile Cys Pro Asp Ser Leu Asp Asp 245 250 255 Ala Asp Ala Leu Gly Ser Met Leu Ile Ser Trp Tyr Met Ser Gly Tyr 260 265 270 His Thr Gly Tyr Tyr Met Gly Phe Arg Gln Asn Gln Lys Glu Gly Arg 275 280 285 Cys Ser His Ser Leu Asn 290 <210> 3 <211> 736 <212> PRT <213> Adeno-associated virus <400> 3 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Gln Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr 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Ala Val Gln Gly Arg Asn Tyr Ile Pro 465 470 475 480 Gly Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Val Thr Gln Asn 485 490 495 Asn Asn Ser Glu Phe Ala Trp Pro Gly Ala Ser Ser Trp Ala Leu Asn 500 505 510 Gly Arg Asn Ser Leu Met Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys 515 520 525 Glu Gly Glu Asp Arg Phe Phe Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ile Phe Gly 530 535 540 Lys Gln Gly Thr Gly Arg Asp Asn Val Asp Ala Asp Lys Val Met Ile 545 550 555 560 Thr Asn Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Ser 565 570 575 Tyr Gly Gln Val Ala Thr Asn His Gln Ser Ala Gln Ala Gln Ala Gln 580 585 590 Thr Gly Trp Val Gln Asn Gln Gly Ile Leu Pro Gly Met Val Trp Gln 595 600 605 Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His 610 615 620 Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Met 625 630 635 640 Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala 645 650 655 Asp Pro Pro Thr Ala Phe Asn Lys Asp Lys Leu Asn Ser Phe Ile Thr 660 665 670 Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln 675 680 685 Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn 690 695 700 Tyr Tyr Lys Ser Asn Asn Val Glu Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly Val 705 710 715 720 Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu 725 730 735 <210> 4 <211> 1621 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 ccacaaatgt gggagggcga taaccactcg tagaaagcgt gagaagttac tacaagcggt 60 cctcccggcc accgtactgt tccgctccca gaagccccgg gcggcggaag tcgtcactct 120 taagaaggga cggggcccca cgctgcgcac ccgcgggttt gctatggcga tgagcagcgg 180 cggcagtggt ggcggcgtcc cggagcagga ggattccgtg ctgttccggc gcggcacagg 240 ccagagcgat gattctgaca tttgggatga tacagcactg ataaaagcat atgataaagc 300 tgtggcttca tttaagcatg ctctaaagaa tggtgacatt tgtgaaactt cgggtaaacc 360 aaaaaccaca cctaaaagaa aacctgctaa gaagaataaa agccaaaaga agaatactgc 420 agcttcctta caacagtgga aagttgggga caaatgttct gccatttggt cagaagacgg 480 ttgcatttac ccagctacca ttgcttcaat tgattttaag agagaaacct gtgttgtggt 540 ttacactgga tatggaaata gagaggagca 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Claims

척수성 근위축증(spinal muscular atrophy: SMA)의 치료가 필요한 환자에서 SMA를 치료하는 방법으로서, 생존 운동 뉴런(survival motor neuron: SMN) 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV9 바이러스 벡터를 척추강내로 투여하는 단계를 포함하되, 상기 바이러스 벡터는 약 1×10¹³ vg 내지 5×10¹⁴ vg의 용량으로 투여되는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 AAV9 바이러스 벡터는 변형된 AAV2 ITR, 닭 베타-액틴(CB) 프로모터, 거대세포 바이러스(CMV) 급/초기 인핸서, 변형된 SV40 후기 16S 인트론, 소 성장 호르몬(BGH) 폴리아데닐화 신호 및 비변형 AAV2 ITR을 포함하는, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 SMN 단백질을 암호화하는, 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV9 바이러스 벡터는 서열번호 1을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 투여 시 6개월령 이상인, 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 투여 시 24개월령 이하, 선택적으로 6개월령 내지 24개월령인, 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 투여 시 24개월령 이상인, 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 투여 시 60개월령 이하, 선택적으로 24개월령 내지 60개월령인, 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV9 바이러스 벡터는 약 5.0×10¹³ vg 내지 3.0×10¹⁴ vg의 용량으로 투여되는, 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV9 바이러스 벡터는 최대 약 6.0×10¹³ vg의 용량으로 투여되는, 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV9 바이러스 벡터는 약 6.0×10¹³ vg의 용량으로 투여되는, 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV9 바이러스 벡터는 최대 약 1.2×10¹⁴ vg의 용량으로 투여되는, 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV9 바이러스 벡터는 약 1.2×10¹⁴ vg의 용량으로 투여되는, 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV9 바이러스 벡터는 최대 약 2.4×10¹⁴ vg의 용량으로 투여되는, 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV9 바이러스 벡터는 약 2.4×10¹⁴ vg의 용량으로 투여되는, 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 이중 대립유전자(bi-allelic) SMN1 삭제 돌연변이(null mutation) 또는 비활성화 결실을 포함하되, 선택적으로 상기 돌연변이는 SMN1의 엑손 7의 결실을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 SMN2의 3개의 복제물을 갖는, 방법.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 상기 SMN2 유전자의 적어도 1개의 복제물에 대해 엑손 7에서 c.859G>C 치환을 갖지 않는, 방법.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료가 필요한 환자는 1회 이상의 게놈 검사에 의해 결정되는, 방법.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 약 12개월령 전에 질환 발병을 나타내는, 방법.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 약 10초 이상 동안 도움 없이 앉는 능력을 갖지만, 투여 시 서거나 보행할 수는 없는, 방법.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는, 예를 들어, 세계보건기구 다기관 성장 참조 연구(World Health Organization Multicentre Growth Reference Study: WHO-MGRS) 기준에 의해 규정된 바와 같이, 투여 시 도움 없이 앉는 능력을 갖는, 방법.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 투여 후 약 1 내지 24개월, 예를 들어, 12개월에 평가할 때, 예를 들어, Bayley Scales of Infant and Toddler Development®(베일리 영유아 발달 평가 도구)에 의해 규정된 바와 같이, 적어도 약 3초 동안 지지 없이 서 있는 능력을 갖는, 방법.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는, 예를 들어, 투여 후 약 1 내지 24개월, 예를 들어, 약 12개월에 평가할 때, 예를 들어, Bayley Scales of Infant and Toddler Development®에 의해 규정된 바와 같이, 투여 후 도움 없이 보행하는 능력을 갖는, 방법.
제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 투여 후 약 1 내지 24개월, 예를 들어, 약 12개월에 평가할 때, 예를 들어, Bayley Scales of Infant and Toddler Development®에 의해 규정된 바와 같이, 투여 후 적어도 5가지 단계를 독립적으로 취하는 능력을 갖는, 방법.
제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 투여 후 약 1 내지 24개월, 예를 들어, 약 12개월에 평가할 때, 예를 들어, Bayley Scales of Infant and Toddler Development®에 의해 규정된 바와 같이, 치료 시 기준 측정으로부터 치료 후의 변화를 나타내는, 방법.
제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 투여 후 약 1 내지 24개월, 예를 들어, 약 12개월에 평가할 때, 투여 후 중증의 척추측만증, 예를 들어, X-선 검사 상에서 분명한 50° 이상의 만곡도를 갖지 않는, 방법.
제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 요추 천자 절차 또는 척추강내 요법의 투여가 금지되지 않는, 방법.
제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 이전에 척추측만증 회복술 또는 절차를 받은 적이 없고, 선택적으로 상기 환자는 투여 후 6개월 내지 3년 이내에, 예를 들어, 1년 이내에 척추측만증 회복술 또는 절차를 갖지 않는, 방법.
제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 투여 전에 그리고/또는 투여 후에 침습적 호흡기 지원(ventilatory support)의 사용이 필요하지 않은, 방법.
제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 투여 전에 독립적으로 서거나 보행하는 이력을 갖지 않는, 방법.
제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 투여 전에 그리고/또는 투여 후에 위 영양관을 사용하지 않는, 방법.
제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 치료 시 활성 바이러스 감염(인간 면역결핍 바이러스(HIV) 또는 B형 또는 C형 간염 또는 지카 바이러스에 양성인 혈청학을 포함)을 갖지 않는, 방법.
제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 투여 전 4주 이내에 중증의 비-폐/기도 감염(예를 들어, 신우신염 또는 뇌수막염)을 갖지 않는, 방법.
제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 투여 전에 수반되는 질병, 예를 들어, 발작 장애, 진성 당뇨병, 특발성 저칼슘뇨증 또는 증상성 심근병증으로 알려진 주요 신장 또는 간 장애를 갖지 않는, 방법.
제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 투여 전에 박테리아성 뇌수막염 또는 뇌 또는 척수 질환의 병력을 갖지 않는, 방법.
제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 투여 전에 프레드니손 또는 기타 글루코코르티코스테로이드 또는 부형제에 대해 알려진 알레르기 또는 과민증을 갖지 않는, 방법.
제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 투여 전에 요오드 또는 요오드-함유 제품에 대해 알려진 알레르기 또는 과민증을 갖지 않는, 방법.
제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 근병증 또는 신경병증을 치료하기 위해 약물을 취하지 않는, 방법.
제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 투여 전 3개월 이내에 면역억제 요법, 혈장분리교환술, 면역조절제, 예컨대 아달리무맙을 받고 있지 않은, 방법.
제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 투여 전에, 예를 들어, ELISA 결합 면역분석에 의해 결정할 때 항-AAV9 항체 역가가 1:25, 1:50, 1:75 또는 1:100 이하인, 방법.
제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 투여 전에 정상 상한의 약 3배 미만의 감마-글루타밀 트랜스퍼라제 수준, 약 3.0 ㎎/㎗ 미만의 빌리루빈 수준, 약 1.0 ㎎/㎗ 미만의 크레아티닌 수준, 약 8 내지 18 g/㎗의 Hgb 수준, 및/또는 ㎣당 약 20000개 미만의 백혈구 계수 중 하나 이상을 갖는, 방법.
제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 투여 전에 SMA를 치료하기 위한 의도로 연구 또는 승인된 화합물 제품 또는 요법을 투여 받은 적이 없는, 방법.
제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV9 바이러스 벡터는 조영제와 함께 투여되되, 선택적으로 상기 조영제는 이오헥솔을 포함하는, 방법.
제44항에 있어서, 상기 투여되는 조영제의 용적은 약 1.0 내지 2.0 ㎖, 예를 들어, 약 1.5 ㎖이되, 선택적으로 상기 조영제는 투여 전에, 예를 들어, 투여 전 24시간 미만, 12시간 미만, 6시간 미만, 5시간 미만, 4시간 미만, 3시간 미만, 2시간 미만, 1시간 미만, 30분 미만에 또는 투여 직전에 상기 AAV9 바이러스 벡터와 혼합되는, 방법.
제44항 또는 제45항에 있어서, 상기 환자에 투여되는 AAV9 바이러스 벡터 및 조영제의 총 용적은 약 10 ㎖, 약 9 ㎖ 또는 약 8 ㎖를 초과하지 않는, 방법.
제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 진정 치료 또는 마취를 더 포함하는, 방법.
제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 상기 AAV9 바이러스 벡터의 투여 동안에 그리고/또는 투여 후에 트렌델렌버그 체위(Trendelenburg position)로 위치된, 방법.
제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 상기 AAV9 바이러스 벡터의 투여 후 약 10 내지 60분 동안, 예를 들어, 약 15분 동안 약 30°로 머리를 아래로 숙이고 위치된, 방법.
제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 상기 AAV9 바이러스 벡터의 투여 전 적어도 약 1 내지 48시간, 예를 들어, 약 24시간에 경구 스테로이드를 투여 받는, 방법.
제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 상기 바이러스 벡터의 투여 후 적어도 약 10 내지 60일, 예를 들어, 약 30일 동안 경구 스테로이드를 투여 받는, 방법.
제50항 또는 제51항에 있어서, 상기 경구 스테로이드는 1일 1회 투여되는, 방법.
제50항 또는 제51항에 있어서, 상기 경구 스테로이드는 1일 2회 투여되는, 방법.
제51항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 상기 바이러스 벡터의 투여 후 ALT 및/또는 AST의 수준에 대해 모니터링되고, 상기 경구 스테로이드는 30일 후에 AST 및/또는 ALT 수준이 정상 상한의 2배 미만 또는 약 120 IU/ℓ의 미만이 될 때까지 계속해서 투여된, 방법.
제51항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, AST 및/또는 ALT 수준이 정상 상한의 2배 미만 또는 약 120 IU/ℓ 미만이 될 때까지, 상기 환자에 경구 스테로이드가 투여되는, 방법.
제51항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 AAV9 바이러스 벡터의 투여 후 T 세포 반응 수준에 대해 모니터링되고, 상기 경구 스테로이드는 30일 후에 환자로부터의 샘플, 예를 들어, 혈액 샘플에서의 T 세포 반응이 10⁶개의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)당 100개 미만의 스팟 형성 세포(spot forming cell: SFC)로 떨어질 때까지 계속해서 투여되는, 방법.
제50항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 경구 스테로이드는 약 1 ㎎/㎏의 용량으로 투여되는, 방법.
제51항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, AST 및 ALT가 정상 상한의 2배 미만 또는 약 120 IU/ℓ 미만이 된 후에 상기 경구 스테로이드의 테이퍼링(taper)을 더 포함하는, 방법.
제58항에 있어서, 상기 테이퍼링은 2주 동안 약 0.5 ㎎/㎏/일 다음에 2주 이상 동안 약 0.25 ㎎/㎏/일의 계단식 증가를 포함하는, 방법.
제51항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 경구 스테로이드를 약 1 ㎎/㎏의 용량으로 30일 동안 투여하는 단계, 및 이어서, 0.5 ㎎/㎏/일까지 2주 동안 테이퍼링 다운(tapering down)한 후에, 0.25 ㎎/㎏/일로 2주 이상 동안 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
제50항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 경구 스테로이드는 프레드니솔론 또는 동등물인, 방법.
제1항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 효능은 상기 베일리 영유아 발달 평가 도구 척도 및/또는 상기 해머스미스 운동 기능 척도-확장판(Hammersmith Functional Motor Scale-Expanded: HFMSE)을 이용하여 결정되는, 방법.
제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV9 바이러스 벡터의 투여와 동시에 또는 연속해서 상기 환자에게 제2 치료제를 투여하는 단계를 더 포함하는, 방법.
제63항에 있어서, 상기 제2 치료제는 근육 향상제 또는 신경보호제를 포함하는, 방법.
제63항 또는 제64항에 있어서, 상기 제2 치료제는 SMN1 및/또는 SMN2를 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
제63항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 치료제는 뉴시너센 및/또는 스타물루맙을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV9 바이러스 벡터 게놈의 양은 ddPCR을 이용하여 측정된, 방법.
제1항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 투여 후, 예를 들어, ELISA 결합 면역분석에 의해 결정될 때, 항-AAV9 항체 역가가 1:25, 1:50, 1:75 또는 1:100 이상이고, 약 1 내지 8주 동안 또는 역가가 1:25, 1:50, 1:75 또는 1:100 미만으로 감소될 때까지 모니터링되는, 방법.
제1항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 투여 후, 예를 들어, ELISA 결합 면역분석에 의해 결정될 때, 항-AAV9 항체 역가가 1:25, 1:50, 1:75 또는 1:100 이상이고, 역가가 1:25, 1:50, 1:75 또는 1:100 미만으로 감소될 때까지 스테로이드, 예를 들어, 프레드니솔론이 투여되는, 방법.
제1항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 혈소판 계수가 투여 전에 약 67,000개의 세포/㎖ 초과 또는 약 100,000개의 세포/㎖ 초과, 또는 약 150,000개의 세포/㎖ 초과인, 방법.
제1항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 투여 후 혈소판 계수가 약 67,000개의 세포/㎖ 미만, 또는 약 100,000개의 세포/㎖ 미만, 또는 약 150,000개의 세포/㎖ 미만이며, 약 1 내지 8주 동안 또는 혈소판 계수가 약 67,000개의 세포/㎖, 또는 약 100,000개의 세포/㎖ 초과, 또는 약 150,000개의 세포/㎖ 초과로 증가될 때까지 모니터링되는, 방법.
제1항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 투여 후 혈소판 계수가 약 67,000개의 세포/㎖ 미만이고, 혈소판 수혈로 치료되는, 방법.
제1항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 상기 AAV9 바이러스 벡터의 투여 전에 정상 간 기능을 갖는, 방법.
제73항에 있어서, 상기 환자는 투여 전에 간 트랜스아미나제 수준이 약 8 내지 40 U/ℓ 미만인, 방법.
제74항에 있어서, 간 트랜스아미나제는 AST, ALT, 및 이들의 조합물로부터 선택되는, 방법.
제1항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV9 바이러스 벡터는 척추강내 투여에 적합한 약제학적 제형인, 방법.
제1항 내지 제76항 중 어느 한 항의 방법에 다른 척수성 근위축증(SMA)의 치료에서의 AAV9 바이러스 벡터의 용도.
약제학적 조성물로서, 척추강내 투여에 적합한 AAV9 바이러스 벡터 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하되, 상기 AAV9 바이러스 벡터는 변형된 AAV2 ITR, 닭 베타-액틴(CB) 프로모터, 거대세포 바이러스(CMV) 급/초기 인핸서, 변형된 SV40 후기 16S 인트론, 소 성장 호르몬(BGH) 폴리아데닐화 신호 및 비변형 AAV2 ITR을 포함하는, 약제학적 조성물.
제78항에 있어서, 약 6.0×10¹³vg의 상기 AAV9 바이러스 벡터의 단위 용량을 포함하는, 약제학적 조성물.
제78항에 있어서, 약 1.2×10¹⁴vg의 상기 AAV9 바이러스 벡터의 단위 용량을 포함하는, 약제학적 조성물.
제78항에 있어서, 약 2.4×10¹⁴vg의 상기 AAV9 바이러스 벡터의 단위 용량을 포함하는, 약제학적 조성물.
제78항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 SMN 단백질을 암호화하는, 약제학적 조성물.
제78항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV9 바이러스 벡터는 서열번호 1을 포함하는, 약제학적 조성물.
제78항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 조영제를 더 포함하는, 약제학적 조성물.
제84항에 있어서, 상기 조영제는 약 1.0 내지 2.0 ㎖, 예를 들어, 약 1.5 ㎖의 양으로 존재하는, 약제학적 조성물.
제84항 또는 제85항에 있어서, AAV9 바이러스 벡터 및 조영제의 총 용적은 약 10 ㎖, 약 9 ㎖, 또는 약 8 ㎖를 초과하지 않는, 약제학적 조성물.
제78항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 조영제와 병용하여 환자에게 투여되되, 상기 조영제는 상기 약제학적 조성물의 투여 전에, 선택적으로 상기 약제학적 조성물 투여 2시간 이내에 투여되는, 약제학적 조성물.
제78항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 추가적인 치료제를 더 포함하는, 약제학적 조성물.
제78항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물 또는 제형은 다음 중 적어도 하나를 포함하는, 약제학적 조성물:
a. 약 pH 7.7 내지 8.3,
b. 약 390 내지 430 mOsm/㎏,
c. 용기당 크기가 25 ㎛ 이상인 약 600개 미만의 입자,
d. 용기당 크기가 10 ㎛ 이상인 약 6000개 미만의 입자,
e. 약 1.7×10¹³ 내지 5.3×10¹³ vg/㎖의 게놈 역가,
f. 1.0×10¹³ vg당 약 3.9×10⁸ 내지 8.4×10¹⁰ IU의 감염성 역가,
g. 1.0×10¹³ vg당 약 100 내지 300 ㎍의 총 단백질,
h. 약 20 내지 80 ppm의 Pluronic F-68 함량;
i. 시험관내 세포 기반 분석에 기반하여 약 70 내지 130%의 상대 효력(상기 효력은 참조 표준 및/또는 적합한 대조군에 대한 것임),
j. 7.5×10¹³ vg/㎏의 용량으로 SMNΔ7 마우스 모델에서의 중위 생존이 24일 이상인 것을 특징으로 하는 효력,
k. 약 5% 미만의 빈 캡시드(empty capsid),
l. 및 약 95% 이상의 총 순도, 및
m. 약 0.13 EU/㎖ 이하의 내독소.
제78항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물 또는 제형은 다음 중 적어도 하나를 포함하는, 약제학적 조성물:
a. 1.0×10¹³ vg당 약 0.09 ng 미만의 벤조나제,
b. 약 30 ㎍/g(ppm) 미만의 세슘,
c. 약 20 내지 80 ppm의 폴록사머 188,
d. 1.0×10¹³ vg당 약 0.22 ng 미만의 BSA,
e. 1.0×10¹³ vg당 약 6.8×10⁵ pg 미만의 잔여 플라스미드 DNA,
f. 1.0×10¹³ vg당 약 1.1×10⁵ pg 미만의 잔여 hcDNA,
g. 1.0×10¹³ vg당 약 4 ng 미만의 rHCP,
h. 약 pH 7.7 내지 8.3,
i. 약 390 내지 430 mOsm/㎏,
j. 용기당 크기가 25 ㎛ 이상인 약 600개 미만의 입자,
k. 용기당 크기가 10 ㎛ 이상인 약 6000개 미만의 입자,
l. 약 1.7×10¹³ 내지 5.3×10¹³ vg/㎖의 게놈 역가,
m. 1.0×10¹³ vg당 약 3.9×10⁸ 내지 8.4×10¹⁰ IU의 감염성 역가,
n. 1.0×10¹³ vg당 약 100 내지 300 ㎍의 총 단백질,
o. 시험관내 세포 기반 분석에 기반하여 약 70 내지 130%의 상대 효력(상기 효력은 참조 표준 및/또는 적합한 대조군에 대한 것임),
p. 약 5% 미만의 빈 캡시드,
제78항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 제1항 내지 제76항 중 어느 한 항의 방법에서 사용하기 위한 약제학적 조성물.
제1항 내지 제77항 및 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여는 사전투여 점수에 비해 상기 해머스미스 운동 기능 척도-확장판에 대해 개선된 점수를 초래하는, 방법, 용도, 또는 사용을 위한 조성물.
제1항 내지 제77항 및 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여는 사전투여 점수에 비해 상기 베일리 영유아 발달 평가 도구, 3판에 대해 개선된 점수를 초래하는, 방법, 용도, 또는 사용을 위한 조성물.
제1항 내지 제77항 및 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여는 상기 해머스미스 운동 기능 척도-확장판에 대해 사전투여 점수에 비해, 점수의 적어도 3점 개선을 초래하는, 방법, 용도, 또는 사용을 위한 조성물.
척수성 근위축증(SMA)을 앓고 있는 환자의 치료 방법으로서, 생존 운동 뉴런 (SMN) 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV9 바이러스 벡터를 척추강내로 투여하는 단계를 포함하되, 상기 바이러스 벡터는 약 6×10¹³ vg 내지 2.4×10¹⁴ vg의 용량으로 투여되고, 상기 환자는 해머스미스 운동 기능 척도-확장판(HFMSE)에 대해 투여 전 점수에 비해 투여 후 9개월까지 적어도 3점의 개선을 달성한, 방법.
제95항에 있어서, 상기 환자는 HFMSE에 대해 투여 전 점수에 비해 투여 후 9개월까지 적어도 4점 개선을 달성한, 방법.
제95항에 있어서, 상기 환자는 HFMSE에 대해 투여 전 점수에 비해 투여 후 9개월까지 적어도 5점 개선을 달성한, 방법.
척수성 근위축증(SMA)을 앓고 있는 환자의 치료 방법으로서, 생존 운동 뉴런 (SMN) 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV9 바이러스 벡터를 척추강내로 투여하는 단계를 포함하되, 상기 바이러스 벡터는 약 6×10¹³ vg 내지 2.4×10¹⁴ vg의 용량으로 투여되고, 상기 환자는 투여 후 12개월까지 적어도 3초 동안 지지 없이 서는 능력을 달성하는, 방법.
척수성 근위축증(SMA)을 앓고 있는 환자의 치료 방법으로서, 생존 운동 뉴런 (SMN) 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV9 바이러스 벡터를 척추강내로 투여하는 단계를 포함하되, 상기 바이러스 벡터는 약 6×10¹³ vg 내지 2.4×10¹⁴ vg의 용량으로 투여되고, 상기 환자는 투여 후 12개월까지 적어도 5개의 계단에 대해 독립적으로 보행하는 능력을 달성하는, 방법.
척수성 근위축증(SMA)을 앓고 있는 환자의 치료 방법으로서, 생존 운동 뉴런 (SMN) 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV9 바이러스 벡터를 척추강내로 투여하는 단계를 포함하되, 상기 바이러스 벡터는 약 6×10¹³ vg 내지 2.4×10¹⁴ vg의 용량으로 투여되고, 상기 환자는 투여 전 점수에 비해 투여 후 베일리 영유아 발달 평가 도구의 대근육 운동 성분에서 적어도 3점의 개선을 달성하는, 방법.
제95항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV9 바이러스 벡터는 변형된 AAV2 ITR, 닭 베타-액틴(CB) 프로모터, 거대세포 바이러스(CMV) 급/초기 인핸서, 변형된 SV40 후기 16S 인트론, 소 성장 호르몬(BGH) 폴리아데닐화 신호 및 비변형 AAV2 ITR을 포함하는, 방법.
제95항 내지 제101항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 SMN 단백질을 암호화하는, 방법.
제95항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV9 바이러스 벡터는 서열번호 1을 포함하는, 방법.
제95항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 투여 시 6개월령 이상인, 방법.
제95항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 투여 시 24개월령 이하, 선택적으로 6개월령 내지 24개월령인, 방법.
제95항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 투여 시 24개월령 이상인, 방법.
제95항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 투여 시 60개월령 이하, 선택적으로 24개월령 내지 60개월령인, 방법.
제95항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV9 바이러스 벡터는 약 6.0×10¹³ vg의 용량으로 투여되는, 방법.
제95항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV9 바이러스 벡터는 약 1.2×10¹⁴ vg의 용량으로 투여되는, 방법.
제95항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV9 바이러스 벡터는 약 2.4×10¹⁴ vg의 용량으로 투여되는, 방법.
제95항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 이중 대립유전자 SMN1 삭제 돌연변이 또는 비활성화 결실을 포함하되, 선택적으로 상기 돌연변이는 SMN1의 엑손 7의 결실을 포함하는, 방법.
제95항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 SMN2의 3개의 복제물을 갖는, 방법.
제95항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 SMN2 유전자의 적어도 1개의 복제물에 대해 엑손 7에서 c.859G>C 치환을 갖지 않는, 방법.
제95항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료가 필요한 환자는 1회 이상의 게놈 검사에 의해 결정되는, 방법.
제19항 또는 제114항에 있어서, 상기 게놈 검사는 하나 이상의 이중-대립유전자 SMN1 삭제 돌연변이 또는 비활성화 결실, SMN2의 하나 초과의 복제물 및/또는 상기 SMN2 유전자의 적어도 하나의 복제물에 대해 엑손 7에서의 c.859G>C 치환의 결여를 검출하는, 방법.
제1항 내지 제76항 및 제92항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SMA는 제II형 SMA 또는 제III형 SMA인, 방법.
제77항에 있어서, 상기 SMA는 제II형 SMA 또는 제II형 SMA인, 방법.
제91항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 제II형 SMA 또는 제III형 SMA를 앓고 있는 환자에게 투여되는, 약제학적 조성물.