BR112021009739A2

BR112021009739A2 - Vetores virais aav e usos dos mesmos

Info

Publication number: BR112021009739A2
Application number: BR112021009739-2A
Authority: BR
Inventors: James Michael HATFIELD; Robert Emil Hodge; Douglas Feltner; Joseph BALLEYDIER; Matthew MERIGGIOLI; Brian K. Kaspar; Allan Arman KASPAR
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 2018-11-30
Filing date: 2019-11-27
Publication date: 2021-10-19
Also published as: EP3886919A1; MX2021006359A; AU2019389047A1; CN113226380A; KR20210099025A; CA3116630A1; JP2022511776A; US20220001028A1; TW202039859A; WO2020113034A1; IL282885A

Abstract

vetores virais aav e usos dos mesmos. a presente invenção refere-se a composições que compreendem vetores virais aav9 e métodos de uso dos mesmos para tratar pacientes com sma, por exemplo, pacientes com atrofia muscular espinhal (sma) tipo ii e tipo iii.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "VETORES VIRAIS AAV E USOS DOS MESMOS".

PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica a prioridade do Pedido de Patente Provisório Nº U.S. 62/773.894 depositado em 30 de novembro de 2018 e do Pedido de Patente Provisório Nº U.S. 62/835.242 depositado em 17 de abril de 2019. O conteúdo desses pedidos está incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

[0002] O pedido atual contém uma Listagem de Sequência que foi enviada por via eletrônica em formato ASCII e está incorporada no presente documento a título de referência em sua totalidade. A dita cópia de ASCII, criada em 12 de novembro de 2019, é denominada 14452_0025-00304_SL.txt e tem 14.833 bytes de tamanho.

CAMPO DA DIVULGAÇÃO

[0003] Essa divulgação se refere a composições e usos de partículas virais.

ANTECEDENTES

[0004] O vírus adenoassociado (AAV) é um membro da família parvoviridae. O genoma de AAV compreende uma molécula de DNA de fita simples linear de aproximadamente 4,7 quilobases (kb) de comprimento tendo dois principais quadros de leitura abertos que codificam as proteínas Rep não estruturais (replicação) e Cap estruturais (capsídeo). Duas sequências de repetição terminal invertida (ITR) de ação cis, com aproximadamente 145 nucleotídeos de comprimento, com sequências palindrômicas interrompidas que podem se enovelar em estruturas em forma de grampo que funcionam como iniciadores durante a iniciação de replicação de DNA estão flanqueando das regiões de codificação de AAV. Além de sua função na replicação de DNA, as sequências de ITR divulgaram exercer uma função na integração viral, resgate do genoma hospedeiro e encapsidação de ácido nucleico viral em vírions maduros (Muzyczka, (1992) Curr. Top. Micro. Immunol. 158:97-129).

[0005] Múltiplos sorotipos de AAV existem e oferecem tropismo de tecido variado. Os sorotipos conhecidos incluem, por exemplo, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 e AAV11. AAV9 é descrito na patente US N° 7.198.951 e em Gao et al., J. Virol., 78: 6381-6388 (2004), que estão incorporadas no presente documento a título de referência em sua totalidade. Avanços na entrega de AAV6 e AAV8 tornaram possível a transdução por esses sorotipos de músculo esquelético e cardíaco após injeções intravenosas ou intraperitoneais sistêmicas simples. Consultar Pacak et al., Circ. Res., 99(4): 3-9 (2006) e Wang et al., Nature Biotech. 23(3): 321-8 (2005). O uso de AAV para alvejar tipos de células alvo dentro do sistema nervoso central, entretanto, exigiu injeção intraparenquimatosa cirúrgica. Consultar Kaplitt et al., "Safety and tolerability of gene therapy with an adeno-associated virus (AAV) borne GAD gene for Parkinson's disease: an open label, phase I trial". Lancet, 369:2097-2105; Marks et al., "Gene delivery of AAV2-neurturin for Parkinson's disease: a double-blind, randomized, controlled trial". Lancet Neurol 9:1164-1172; e Worgall et al., "Treatment of late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis by CNS administration of a serotype 2 adeno-associated virus expressing CLN2 cDNA". Hum Gene Ther, 19(5):463-74.

[0006] A sequência de nucleotídeos do genoma de AAV sorotipo 2 (AAV2) é apresentada em Srivastava et al., J Virol, 45: 555-564 (1983) como corrigida por Ruffing et al., J Gen Virol, 75: 3385-3392 (1994). As sequências de ação cis que dirigem a replicação de DNA viral (rep), encapsidação/empacotamento e integração cromossômica de célula hospedeira estão contidas nas ITRs. Três promotores de AAV (denominados p5, p19 e p40 por suas localizações relativas no mapa) conduzem a expressão dos dois quadros de leitura abertos internos de AAV que codificam os genes rep e cap. Os dois promotores rep (p5 e p19), acoplados ao splicing diferencial do único íntron de AAV (nos nucleotídeos 2107 e 2227), resultam na produção de quatro proteínas rep (rep 78, rep 68, rep 52 e rep 40) do gene rep. As proteínas rep possuem múltiplas propriedades enzimáticas que são, por fim, responsáveis pela replicação do genoma viral. O gene cap é expresso a partir do promotor p40 e o mesmo codifica as três proteínas capsidiais VP1, VP2 e VP3. O splicing alternativo e os sítios de início da tradução não consenso são responsáveis pela produção das três proteínas capsidiais relacionadas. Um único sítio de poliadenilação consenso está situado na posição 95 do mapa do genoma de AAV. O ciclo de vida e a genética de AAV são analisados em Muzyczka, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 97-129 (1992).

[0007] Os vetores derivados de AAV são particularmente atrativos para a entrega de material genético, pois (i) os mesmos têm capacidade de infectar (transduzir) uma grande variedade de tipos de células não divisoras e divisoras, incluindo fibras musculares e neurônios; (ii) os mesmos são desprovidos de genes estruturais virais, eliminando assim as respostas de células hospedeiras naturais à infecção viral, por exemplo, respostas mediadas por interferon; (iii) vírus de tipo selvagem nunca foram associados a qualquer patologia em seres humanos; (iv) ao contrário de AAVs tipo selvagem, que têm capacidade de integração no genoma da célula hospedeira, vetores de AAV deficientes em replicação geralmente persistem como epissomas, limitando assim o risco de mutagênese por inserção ou ativação de oncogenes; e (v) ao contrário de outros sistemas de vetores, os vetores AAV não ativam uma resposta imunológica significativa (consultar ii), concedendo assim a expressão a longo prazo dos transgenes terapêuticos (desde que seus produtos gênicos não sejam rejeitados).

[0008] Vetores adenoassociadosautocomplementares (scAAV) são vetores virais geneticamente modificados do vírus adenoassociado (AAV) de ocorrência natural para uso na terapia gênica. ScAAV é denominado "autocomplementar", pois a região de codificação foi projetada para formar um modelo de DNA de fita dupla intramolecular. Uma etapa determinante de taxa para o ciclo de vida do genoma de AAV padrão envolve a síntese de segunda fita, uma vez que o genoma de AAV típico é um modelo de DNA de fita simples. Entretanto, esse não é o caso para genomas de scAAV. Após a infecção, em vez de esperar por síntese mediada por célula da segunda fita, as duas metades complementares de scAAV se associarão para formar uma unidade de DNA de fita dupla (dsDNA) que está pronta para replicação e transcrição imediatas.

[0009] A atrofia muscular espinhal (SMA) é um distúrbio neurogenético causado por uma perda ou mutação no gene de sobrevivência do neurônio motor 1 (SMN1) no cromossomo 5q13, que leva a níveis reduzidos de proteína SMN e a uma disfunção seletiva de neurônios motores. SMA é uma doença da primeira infância autossômica recessiva com uma incidência de 1: 10.000 nascidos vivos. Sugarman et al., "Pan-ethnic carrier screening and prenatal diagnosis for spinal muscular atrophy: clinical laboratory analysis of >72,400 specimens". European journal of human genetics, 20(1): 27-32. Todas as formas de SMA são autossômicas recessivas por herança e são causadas por deleções ou mutações do gene de sobrevivência do neurônio motor 1 (SMN1). Os seres humanos também carregam uma segunda cópia quase idêntica do gene SMN1 chamada SMN2. Ambos os genes SMN1 e SMN2 expressam a proteína SMN, no entanto, a quantidade de proteína de comprimento total funcional produzida por

SMN2 é muito menor (em 10 a 15%) do que a produzida por SMN1. Embora o SMN2 não possa compensar completamente a perda do gene SMN1, os pacientes com formas mais brandas de SMA geralmente têm números de cópias de SMN2 mais altos. Em um grande estudo inicial de Feldkotter et al., 2 cópias de SMN2 foram 97% preditivas para o desenvolvimento de SMA Tipo I, 3 cópias de SMN2 foram 83% preditivas para o desenvolvimento de SMA Tipo II e 4 cópias de SMN2 foram 84% preditivas de SMA Tipo III. Feldkotter et al., "Quantitative analyses of SMN1 and SMN2 based on real-time lightCycler PCR: fast and highly reliable carrier testing and prediction of severity of spinal muscular atrophy". American Journal of Human Genetics, 70(2): 358-

368. Como essas porcentagens não refletem o possível impacto de mutações modificadoras, as mesmas podem subestimar a relação entre o número de cópias (na ausência de um modificador genético) e o fenótipo clínico. Entre 113 pacientes com SMA Tipo I, 9 com uma cópia de SMN2 viveram <11 meses, 88/94 com duas cópias de SMN2 viveram <21 meses e 8/10 com três cópias de SMN2 viveram 33 a 66 meses

[0010] A SMA Tipo I é a principal causa de mortalidade infantil devido a doenças genéticas. A gravidade da doença e o prognóstico clínico dependem do número de cópias de SMN2. Em sua forma mais comum e grave (Tipo I), hipotonia e fraqueza progressiva são reconhecidas nos primeiros meses de vida, levando ao diagnóstico aos 6 meses de idade e, então, à morte devido à insuficiência respiratória aos dois anos de idade. A SMA Tipo I é a principal causa genética de morte infantil. A perda de neurônios motores em SMA Tipo I é profunda no período pós-natal inicial (ou pode até começar no período pré-natal), e os pacientes nunca alcançam uma posição sentada independente. Pacientes com SMA tipo I tipicamente têm 1 ou 2 cópias do gene SMN2. Em contrapartida, a SMA tipo II se manifesta nos primeiros 18 meses, e as crianças afetadas por essa afecção conseguem se manter sentadas sem auxílio, mas nunca andam independentemente. Pacientes com SMA tipo II tipicamente têm 3 cópias do gene SMN2. Os pacientes com SMA Tipo III conseguem andar sem auxílio. De acordo com a rubrica do Tipo III, os pacientes do Tipo IIIa geralmente apresentam início da doença com <3 anos de idade, enquanto os pacientes do Tipo IIIb apresentam início após 3 anos de idade. Os neurônios motores em pacientes com SMA do tipo II e III parecem se adaptar e compensar durante o desenvolvimento e persistem na vida adulta. Pacientes com SMA tipo III tipicamente têm 3 ou 4 cópias do gene SMN2. Os achados de vários estudos neurofisiológicos e em animais mostraram uma perda inicial de neurônios motores nos períodos embrionários e pós-natal iniciais. Swoboda et al., "Natural history of denervation in SMA: relation to age, SMN2 copy number, and function". Annals of neurology 57(5): 704-12; Le et al., "Temporal requirement for high SMN expression in SMA mice". Human molecular genetics, 20(18): 3578-91; Farrar et al., "Corticomotoneuronal integrity and adaptation in spinal muscular atrophy". Archives of neurology, 69(4): 467-73.

[0011] Os pacientes com SMA Tipos II e III têm um curso clínico relativamente estável. Além disso, estudos mostram que as diferenças de resultados estão relacionadas ao número de cópias de SMN2 que permitem que os neurônios motores se adaptem e compensem durante o crescimento da criança e persistam na vida adulta. Isso contrasta com SMA Tipo I, em que a perda de neurônios motores é profunda no período pós-natal inicial (ou pode até começar no período pré-natal, especialmente para pacientes com SMA Tipo I que se apresenta nos primeiros três meses de vida). A superexpressão de SMN mostrou ser bem tolerada em camundongos e primatas não humanos, e no alto número de cópias de SMN2 em seres humanos não apresenta risco (como observado em pacientes do Tipo II, III e IV que têm alto número de cópias de SMN2). O aumento dos níveis de SMN em pacientes com SMA, por exemplo, SMA Tipos II e III apresenta uma opção terapêutica.

[0012] Os esforços terapêuticos em SMA, por exemplo, SMA tipos II e III, até agora se concentraram principalmente no potencial de pequenas moléculas para aumentar os níveis de SMN. Esses incluem inibidores de desacetilase, como ácido valproico, butirato de sódio, butirato de fenila e tricostatina A. Esses agentes ativam o promotor de SMN2, resultando em proteína de SMN de comprimento total aumentada em modelos animais com SMA, com o objetivo de modificar o fenótipo da doença para as características mais brandas observadas em pacientes com SMA Tipo III. Riessland et al., "SAHA ameliorates the SMA phenotype in two mouse models for spinal muscular atrophy". Human molecular genetics, 19(8): 1492-506; Dayangac-Erden et al., "Carboxylic acid derivatives of histone deacetylase inhibitors induce full length SMN2 transcripts: a promising target for spinal muscular atrophy therapeutics". Arch Med Sci, 7(2): 230-4 2011.

[0013] Os ensaios clínicos que empregam vários desses agentes, principalmente butirato de fenila, ácido valproico e hidroxiureia, não resultaram em benefício clínico suficiente. Darbar et al., "Evaluation of muscle strength and motor abilities in children with Type II and III spinal muscle atrophy treated with valproic acid". BMC Neurol, 11: 36; www.ClinicalTrials.gov. A FDA aprovou recentemente o nusinersen, um fármaco de oligonucleotídeo antissenso (ASO) projetado para aumentar a produção da proteína de SMN por meio da modulação do splicing do gene SMN2, compensando assim o defeito genético subjacente. Os estudos clínicos mostraram alguma promessa modesta na melhora da função motora; no entanto, o tratamento deve ser administrado indefinidamente em uma base trimestral por meio de injeção intratecal, exige um longo período de indução antes da eficácia e tem considerações de segurança que exigem monitoramento clínico.

Consequentemente, existe uma necessidade de tratamento aprimorado de SMA, incluindo SMA tipo II e III, usando alternativas como aquelas divulgadas no presente documento.

[0014] São divulgadas no presente documento composições que compreendem vetores virais AAV9 e métodos de uso das mesmas para tratar pacientes com SMA, por exemplo, SMA Tipo II e Tipo III. Em algumas modalidades, os métodos compreendem injetar por via intratecal um vetor viral AAV9 que tem a capacidade de modificar SMA, por exemplo, fenótipos de SMA Tipo II e Tipo III, por exemplo, levando a um curso mais leve da progressão da doença, progressão interrompida da doença e/ou desenvolvimento funcional aprimorado.

SUMÁRIO

[0015] A presente divulgação fornece composições e métodos para tratar SMA, por exemplo, SMA Tipo II ou Tipo III. Os vetores virais recombinantes, por exemplo, o scAAV que expressa um transgene de SMN divulgado no presente documento, podem fornecer um método terapêutico para aumentar os níveis de SMN. Visto que o transgene de SMN é pequeno, o mesmo pode ser eficientemente empacotado com um scAAV, permitindo títulos virais mais baixos em comparação com vetores virais AVV prototípicos de fita simples. Entretanto, os pacientes com SMA Tipos II e III são frequentemente diagnosticados em uma idade mais avançada, em que os mesmos podem ser potencialmente muito grandes para receber uma dosagem intravenosa segura e eficaz baseada em peso de rAAV. Dessa forma, a administração intratecal, em que o vetor viral AAV é entregue antes da barreira hematoencefálica diretamente para o líquido cefalorraquidiano, pode fornecer uma forma alternativa segura e eficiente para transferir títulos virais mais baixos.

[0016] A presente divulgação fornece um método de tratamento de atrofiamuscular espinhal (SMA) Tipo II ou Tipo III em um paciente que precisa do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar por via intratecal um vetor viral AAV9 que compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína de sobrevivência do neurônio motor (SMN), em que o vetor viral é administrado em uma dose de cerca de 1 x 1013 vg a 5 x 1014 vg. Em tal modalidade, o vetor viral AAV9 compreende uma ITR de AAV2 modificado, um promotor da beta-actina de galinha (CB), um intensificador imediato/inicial de citomegalovírus (CMV), um íntron 16S tardio de SV40 modificado, um sinal de poliadenilação de hormônio do crescimento bovino (BGH) e uma ITR de AAV2 não modificado. Em uma outra modalidade, o polinucleotídeo codifica a proteína de SMN da SEQ ID Nº: 2. Em uma outra modalidade, o vetor viral AAV9 compreende a SEQ ID Nº: 1. Em algumas modalidades, o paciente tem seis meses ou mais no momento da administração. Em outras modalidades, o paciente tem 24 meses ou menos no momento da administração, opcionalmente entre 6 meses e 24 meses de idade. Em outras modalidades, o paciente tem 60 meses ou menos no momento da administração, opcionalmente entre 24 e 60 meses de idade. Em algumas modalidades, o vetor viral AAV9 é administrado em uma dose de cerca de 5,0 x 1013 vg a 3,0 x 1014 vg. Em algumas modalidades, o vetor viral AAV9 é administrado em uma dose de até cerca de 6,0 x 1013 vg. Em algumas modalidades, o vetor viral AAV9 é administrado em uma dose de cerca de 6,0 x 1013 vg. Em algumas modalidades, o vetor viral AAV9 é administrado em uma dose de até cerca de 1,2 x 1014 vg. Em algumas modalidades, o vetor viral AAV9 é administrado em uma dose de cerca de 1,2 x 1014 vg. Em algumas modalidades, o vetor viral AAV9 é administrado em uma dose de até cerca de 2,4 x 1014 vg. Em algumas modalidades, o vetor viral AAV9 é administrado em uma dose de cerca de 2,4 x 1014 vg.

[0017] Em algumas modalidades, o vetor viral AAV9 é administrado em uma dose unitária que compreende cerca de 1,0 x 1013 vg a 9,9 x 1014 vg. Em algumas modalidades, o vetor viral AAV9 é administrado em uma dose unitária que compreende cerca de 1,0 x 1013 vg a 5,0 x 1014 vg. Em algumas modalidades, o vetor viral AAV9 é administrado em uma dose unitária que compreende cerca de 5,0 x 1013 vg a 3,0 x 1014 vg. Em algumas modalidades, o vetor viral AAV9 é administrado em uma dose unitária que compreende cerca de 6,0 x 1013 vg. Em algumas modalidades, o vetor viral AAV9 é administrado em uma dose unitária que compreende cerca de 1,2 x 1014 vg. Em algumas modalidades, o vetor viral AAV9 é administrado em uma dose unitária que compreende cerca de 2,4 x 1014 vg.

[0018] Em algumas modalidades, o paciente compreende mutações ou deleções inativadoras nulas bialélicas de SMN1, opcionalmente em que as mutações compreendem a deleção de éxon sete de SMN1. Em algumas modalidades, o paciente tem três cópias de SMN2. Em algumas modalidades, o paciente não tem uma substituição de c.859G>C no éxon 7 em pelo menos uma cópia do gene SMN2. Em algumas modalidades, o paciente que precisa da mesma é determinado por uma ou mais testes genômicos. Em algumas modalidades, o paciente mostra o início da doença antes de cerca de 12 meses de idade. Em algumas modalidades, o paciente tem a capacidade de se sentar sem auxílio por cerca de 10 ou mais segundos, mas não consegue ficar de pé ou andar no momento da administração. Em algumas modalidades, o paciente tem a capacidade de se sentar sem auxílio no momento da administração, por exemplo, conforme definido pelos critérios de World Health Organization Multicentre Growth Reference Study (WHO-MGRS). Em algumas modalidades, o paciente tem a capacidade de ficar de pé sem suporte por pelo menos cerca de três segundos após a administração, por exemplo, conforme definido pela Bayley Scales of Infant and Toddler Development®, por exemplo, como avaliado cerca de 1 a 24 meses, por exemplo, 12 meses após a administração. Em algumas modalidades, o paciente tem a capacidade de andar sem auxílio após a administração, por exemplo, conforme definido pela Bayley Scales of Infant and Toddler Development®, por exemplo, como avaliado cerca de 1 a 24 meses, por exemplo, cerca de 12 meses após a administração. Em algumas modalidades, o paciente tem a capacidade de dar pelo menos cinco passos independentemente após a administração, por exemplo, conforme definido pela Bayley Scales of Infant and Toddler Development®, como avaliado cerca de 1 a 24 meses, por exemplo, cerca de 12 meses após a administração. Em algumas modalidades, o paciente mostra uma mudança após o tratamento a partir de uma medição de linha de base no momento de tratamento, por exemplo, conforme definido pela Bayley Scales of Infant and Toddler Development®, como avaliado cerca de 1 a 24 meses, por exemplo, cerca de 12 meses após a administração.

[0019] Em algumas modalidades, o paciente não tem escoliose severa após a administração, por exemplo, ≥50° de curvatura da coluna vertebral evidente no exame de raios X, como avaliado cerca de 1 a 24 meses, por exemplo, cerca de 12 meses após a administração. Em algumas modalidades, o paciente não é contraindicado para procedimento de punção lombar ou administração de terapia intratecal. Em algumas modalidades, o paciente não foi anteriormente submetido a uma cirurgia ou procedimento de reparo de escoliose e, opcionalmente, em que o paciente não foi submetido a uma cirurgia ou procedimento de reparo de escoliose dentro de 6 meses a 3 anos, por exemplo, dentro de 1 ano após a administração. Em algumas modalidades, o paciente não precisa do uso de suporte ventilatório invasivo antes e/ou após a administração. Em algumas modalidades, o paciente não tem um histórico de ficar de pé ou andar independentemente antes da administração. Em algumas modalidades, o paciente não usa um tubo de alimentação gástrica antes e/ou após a administração. Em algumas modalidades, o paciente não tem uma infecção viral ativa no momento do tratamento (incluindo vírus da imunodeficiência humana (HIV) ou sorologia positiva para hepatite B ou C ou vírus Zika). Em algumas modalidades, o paciente não teve uma infecção grave do trato não pulmonar/respiratório (por exemplo, pielonefrite ou meningite) dentro de quatro semanas antes da administração. Em algumas modalidades, o paciente não tem doença concomitante, por exemplo, insuficiência renal ou hepática importante, distúrbio convulsivo conhecido, diabetes mellitus, hipocalciúria idiopática ou cardiomiopatia sintomática antes da administração. Em algumas modalidades, o paciente não tem um histórico de meningite bacteriana ou doença cerebral ou da medula espinhal antes da administração. Em algumas modalidades, o paciente não tem uma alergia ou hipersensibilidade conhecida à prednisolona ou outros glicocorticoides ou excipientes antes da administração. Em algumas modalidades, o paciente não tem uma alergia ou hipersensibilidade conhecida a iodo ou produtos contendo iodo antes da administração. Em algumas modalidades, o paciente não está tomando medicamentos para tratar miopatia ou neuropatia. Em algumas modalidades, o paciente não está recebendo terapia imunossupressora, plasmaférese, imunomoduladores, como adalimumabe, dentro de 3 meses antes da administração.

[0020] Em algumas modalidades, o paciente tem títulos de anticorpo anti-AAV9 iguais ou abaixo de 1:25, 1:50, 1:75 ou 1:100, por exemplo, como determinado por um imunoensaio de ligação ELISA, antes da administração. Em algumas modalidades, o paciente tem um ou mais níveis de gama-glutamil transferase menores que cerca de 3 vezes o limite superior do normal, níveis de bilirrubina menores que cerca de 3,0 mg/dl, níveis de creatinina menores que cerca de 1,0 mg/dl, níveis de Hgb entre cerca de 8 a 18 g/dl, e/ou contagens de leucócitos menores que cerca de 20.000 por mm3 antes da administração. Em algumas modalidades, o paciente não recebeu um produto composto experimental ou aprovado ou terapia com a intenção de tratar SMA antes da administração.

Em algumas modalidades, o vetor viral AAV9 é administrado juntamente com um meio de contraste, opcionalmente em que o meio de contraste compreende ioexol.

Em algumas modalidades, o volume de meio de contraste administrado é cerca de 1,0 a 2,0 ml, por exemplo, cerca de 1,5 ml, opcionalmente em que o meio de contraste é misturado com o vetor viral AAV9 antes da administração, por exemplo, menos de 24 horas, menos de 12 horas, menos de 6 h, menos de 5 horas, menos de 4 horas, menos de 3 horas, menos de duas horas, menos de uma hora, menos de 30 minutos ou imediatamente antes da administração.

Em algumas modalidades, o meio de contraste e o vetor viral AAV9 são administradas sequencialmente, por exemplo, em que um meio de contraste é administrado (por exemplo, por via intratecal) primeiro e o vetor viral AAV9 é administrado (por exemplo, por via intratecal) subsequente à administração do meio de contraste.

Em algumas modalidades, o meio de contraste e o vetor viral AAV9 são administradas sequencialmente, por exemplo, em que um vetor viral AAV9 é administrado (por exemplo, por via intratecal) primeiro e o meio de contraste é administrado (por exemplo, por via intratecal) subsequente à administração do vetor viral AAV9. Em modalidades em que o vetor viral AAV9 e o meio de contraste são administrados sequencialmente, a administração do vetor viral AAV9 e do meio de contraste é administrada dentro de duas horas, dentro de uma hora, dentro de 45 minutos, dentro de 30 minutos, dentro de 15 minutos, dentro de 10 minutos ou dentro de 5 minutos um do outro.

Em algumas modalidades, o volume total de vetor viral AAV9 e do meio de contraste administrado ao paciente não excede cerca de 10 ml, cerca de 9 ml ou cerca de 8 ml.

Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente sedação ou anestesia.

Em algumas modalidades, o paciente é colocado na posição Trendelenburg durante e/ou após a administração do vetor viral AAV9. Em algumas modalidades, o paciente é colocado com a cabeça inclinada para baixo a cerca de 30° por cerca de 10 a 60 minutos, por exemplo, cerca de 15 minutos, após a administração do vetor viral AAV9.

[0021] Em algumas modalidades, é administrado ao paciente um esteroide oral pelo menos cerca de 1 a 48 horas, por exemplo, cerca de 24 horas antes da administração do vetor viral AAV9. Em algumas modalidades, é administrado ao paciente um esteroide por pelo menos cerca de 10 a 60 dias, por exemplo, cerca de 30 dias, após a administração do vetor viral. Em algumas modalidades, o esteroide oral é administrado uma vez ao dia. Em algumas modalidades, o esteroide oral é administrado duas vezes ao dia. Em algumas modalidades, o paciente é monitorado quanto a níveis de ALT e/ou AST após a administração do vetor viral, e em que o esteroide oral continua a ser administrado após 30 dias até que os níveis de AST e/ou ALT estejam abaixo de duas vezes o limite superior do normal ou abaixo de cerca de 120 IU/l. Em algumas modalidades, o paciente é monitorado quanto a níveis de resposta de células T após a administração do vetor viral AAV9, e em que o esteroide oral continua a ser administrado após 30 dias até a resposta de células T em uma amostra do paciente, por exemplo, uma amostra sanguínea, ficar abaixo de 100 células formadoras de spot (SFC) por 106 células mononucleares de sangue periférico (CMSPs).

[0022] Em algumas modalidades, o esteroide oral é administrado em uma dose de cerca de 1 mg/kg.

[0023] Em algumas modalidades, o esteroide oral é reduzido gradualmente após AST e ALT estarem abaixo de duas vezes o limite superior do normal ou abaixo de cerca de 120 IU/l. Em algumas modalidades, a redução gradual compreende incrementos escalonados para cerca de 0,5 mg/kg/dia por duas semanas seguido de cerca de 0,25 mg/kg/dia por mais duas semanas. Em algumas modalidades, o esteroide oral é administrado por 30 dias em uma dose de cerca de 1 mg/kg e, então, reduzir gradualmente para 0,5 mg/kg/dia por duas semanas seguido de 0,25 mg/kg/dia por mais duas semanas. Em algumas modalidades, o esteroide oral é prednisolona ou um equivalente.

[0024] Em algumas modalidades, a eficácia de tratamento é determinada com o uso da escala Bayley Scales of Infant and Toddler Development® e/ou da Escala Motora Funcional Expandida de Hammersmith (HFMSE). Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente administrar um segundo agente terapêutico ao paciente de forma concomitante ou consecutiva com a administração do vetor viral AAV9. Em algumas dessas modalidades, o segundo agente terapêutico compreende um intensificador muscular ou neuroprotetor. Em outras modalidades, o segundo agente terapêutico compreende um oligonucleotídeo antissenso ou oligonucleotídeos antissenso que alvejam SMN1 e/ou SMN2. Em algumas modalidades, o segundo agente terapêutico compreende nusinersen e/ou estamulumabe. Em algumas modalidades, em que a quantidade de genoma do vetor viral AAV9 é medida com o uso de ddPCR. Em algumas modalidades, o paciente tem títulos de anticorpo anti-AAV9 iguais ou acima de 1:25, 1:50, 1:75 ou 1:100, por exemplo, como determinado por um imunoensaio de ligação ELISA, após a administração e é monitorado por cerca de 1 a 8 semanas ou até que os títulos diminuam abaixo de 1:25, 1:50, 1:75 ou 1:100. Em algumas modalidades, o paciente tem títulos de anticorpo anti-AAV9 iguais ou acima de 1:25, 1:50, 1:75 ou 1:100, por exemplo, como determinado por um imunoensaio de ligação ELISA, após a administração e é administrado um esteroide, por exemplo, prednisolona, até que os títulos diminuam abaixo de 1:25, 1:50, 1:75 ou 1:100. Em algumas modalidades, o paciente tem contagens de plaquetas acima de cerca de 67.000 células/ml antes da administração ou acima de cerca de

100.000 células/ml ou acima de cerca de 150.000 células/ml. Em algumas modalidades, o paciente tem contagens de plaquetas abaixo de cerca de 67.000 células/ml após a administração, ou abaixo de cerca de 100.000 células/ml ou abaixo de cerca de 150.000 células/ml, e é monitorado por cerca de uma a 8 semanas ou até que as contagens de plaquetas aumentem para cerca de 67.000 células/ml ou acima de cerca de 100.000 células/ml ou acima de cerca de 150.000 células/ml. Em algumas modalidades, o paciente tem contagens de plaquetas abaixo de cerca de 67.000 células/ml após a administração e é tratado com uma transfusão de plaquetas. Em algumas modalidades, o paciente tem função hepática normal antes da administração do vetor viral AAV9. Em algumas modalidades, o paciente tem níveis de transaminase hepática menores que cerca de 8 a 40 U/l antes da administração.

[0025] Em algumas modalidades, a transaminase hepática é selecionada dentre AST, ALT, e uma combinação das mesmas. Em algumas modalidades, o vetor viral AAV9 está em uma formulação farmacêutica adequada para administração intratecal.

[0026] A presente divulgação fornece também o uso de um vetor viral AAV9 no tratamento de SMA, por exemplo, atrofia muscular espinhal (SMA) Tipo II ou Tipo III de acordo com os métodos descritos no presente documento.

[0027] A presente divulgação fornece uma composição farmacêutica que compreende um vetor viral AAV9 e um veículo farmaceuticamente aceitável para administração intratecal, em que o vetor viral AAV9 compreende uma ITR de AAV2 modificado, um promotor da beta-actina de galinha (CB), um intensificador imediato/inicial de citomegalovírus (CMV), um íntron 16S tardio de SV40 modificado, um sinal de poliadenilação de hormônio do crescimento bovino (BGH) e uma ITR de AAV2 não modificado. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo codifica a proteína de SMN da SEQ ID Nº: 2. Em algumas modalidades, o vetor viral AAV9 compreende a SEQ ID Nº: 1. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende adicionalmente um agente de contraste. Em algumas modalidades, o agente de contraste está presente em uma quantidade de cerca de 1,0 a 2,0 ml, por exemplo, cerca de 1,5 ml.

[0028] Em algumas modalidades, o volume total de vetor viral AAV9 e do meio de contraste não excede cerca de 10 ml, cerca de 9 ml ou cerca de 8 ml. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende adicionalmente um agente terapêutico adicional. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica serve para uso em qualquer um dos métodos de tratamento descritos no presente documento.

[0029] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é uma dose unitária que compreende cerca de 1,0 x 1013 vg a 9,9 x 1014 vg. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é uma dose unitária que compreende cerca de 1,0 x 1013 vg a 5,0 x 1014 vg. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é uma dose unitária que compreende cerca de 5,0 x 1013 vg a 3,0 x 1014 vg.

[0030] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é uma dose unitária que compreende cerca de 6,0 x 1013 vg. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é uma dose unitária que compreende cerca de 1,2 x 1014 vg. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é uma dose unitária que compreende cerca de 2,4 x 1014 vg.

[0031] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende pelo menos um dos seguintes: (a) cerca de pH 7,7 a 8,3, (b) cerca de 390 a 430 mOsm/kg, (c) menos de cerca de 600 partículas que são ≥ 25 µm de tamanho por recipiente, (d) menos de cerca de

6.000 partículas que são ≥ 10 µm de tamanho por recipiente, (e) cerca de 1,7 x 1013 a 5,3 x 1013 vg/ml de título genômico, (f) título infeccioso de cerca de 3,9 x 108 a 8,4 x 1010 IU por 1,0 x 1013 vg, (g) proteína total de cerca de 100 a 300 µg por 1,0 x 1013 vg, (h) teor de Pluronic F-68 de cerca de 20 a 80 ppm, (i) potência relativa de cerca de 70 a 130%, (j) sobrevivência mediana em um modelo de camundongo de SMNΔ7 maior ou igual a 24 dias em uma dose de 7,5 x 1013 vg/kg, (k) menos de cerca de 5% de capsídeo vazio, (l) e uma pureza total maior ou igual a cerca de 95%, e (m) menor ou igual a cerca de 0,13 EU/ml de Endotoxina.

[0032] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende pelo menos uma das seguintes condições: (a) menos de cerca de 0,09 ng de benzonase por 1,0x1013 vg, (b) menos de cerca de 30 µg/g (ppm) de césio, (c) cerca de 20 a 80 ppm de Poloxâmero 188, (d) menos de cerca de 0,22 ng de BSA por 1,0x1013 vg, (e) menos de cerca de 6,8x105 pg de DNA plasmidial residual por 1,0x1013 vg, (f) menos de cerca de 1,1x105 pg de hcDNA residual por 1,0x1013 vg, (g) menos de cerca de 4 ng de rHCP por 1,0x1013 vg, (h) cerca de pH 7,7 a 8,3, (i) cerca de 390 a 430 mOsm/kg, (j) menos de cerca de 600 partículas que são ≥ 25 µm de tamanho por recipiente, (k) menos de cerca de 6.000 partículas que são ≥ 10 µm de tamanho por recipiente, (l) cerca de 1,7 x 1013 a 5,3 x 1013 vg/ml de título genômico, (m) título infeccioso de cerca de 3,9 x 10 8 a 8,4 x 1010 IU por 1,0 x 1013 vg, (n) proteína total de cerca de 100 a 300 µg por 1,0 x 1013 vg, (o) potência relativa de cerca de 70 a 130%, e (p) menos de cerca de 5% de capsídeo vazio.

[0033] Em algumas modalidades, os métodos ou uso de composições descritos no presente documento resultam em um escore aprimorado na Escala Motora Funcional Expandida de Hammersmith,

em relação a escores de pré-administração. Em algumas modalidades, os métodos ou uso de composições descritos no presente documento resultam em um escore aprimorado na Bayley Scales of Infant and Toddler Development®, Terceira Edição (Bayley®-III), em relação a escores de pré-administração.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0034] A Figura 1 mostra a massa corporal de camundongos tratados e controle após a administração de AAV.

[0035] A Figura 2 mostra o projeto de estudo inicial do estudo aberto de administração de dose única Fase I de bebês e crianças com SMA Tipo II ou Tipo III. Os pacientes recebem AVXS-101 em um estudo de segurança de comparação de dose.

[0036] A Figura 3 mostra um gráfico em cascata de mudança da linha de base, classificado do mais alto para o mais baixo, para a Escala Motora Funcional Expandida de Hammersmith (HFMSE) em pacientes com SMA Tipo 2 que receberam a Dose A (6,0 x 1013 vg; assinalado por diamante) ou Dose B (1,2 x 1014 vg) de AVXS-101 por via intratecal avaliados após 24 meses de idade. Os resultados para pacientes com idade entre seis meses e dois anos no momento da infusão são representados por barras cinzas; as barras pretas indicam idades entre 2 e 5 anos no momento da infusão.

[0037] A Figura 4 mostra os escores HFMSE de pacientes individuais com SMA Tipo 2.

[0038] A Figura 5 mostra a resposta ao tratamento com AVXS-101, conforme medido pelo HFMSE, em pacientes com idade entre seis meses e cinco anos no momento do tratamento.

[0039] A Figura 6 mostra a resposta ao tratamento com AVXS-101, conforme medido pelo HFMSE, em pacientes com idade entre dois anos e cinco anos no momento do tratamento que receberam uma dose de 1,2 x 1014 vg.

[0040] A Figura 7 mostra um gráfico espaguete de mudança da linha de base nos escores de HFMSE até o Mês 12 para o grupo de idade ≥ 24 meses e < 60 meses (Análise PNCR Primária) - Conjunto ITT.

[0041] A Figura 8 mostra um gráfico espaguete de mudança da linha de base nos escores de HFMSE até o Mês 12 para o grupo de idade ≥ 24 meses e < 60 meses (Análise PNCR de Sensibilidade) - Conjunto ITT.

[0042] A Figura 9 mostra um gráfico espaguete de mudança da linha de base no escore motor fino conforme determinado por Bayley Scales® em cada visita pós-linha de base até 12 meses para pacientes <24 meses de idade no momento da dosagem - Conjunto ITT.

[0043] A Figura 10 mostra um gráfico espaguete de mudança da linha de base no escore motor bruto conforme determinado por Bayley Scales® em cada visita pós-linha de base até 12 meses para pacientes <24 meses de idade no momento da dosagem - Conjunto ITT.

[0044] A Figura 11 mostra um gráfico espaguete de mudança da linha de base no escore motor fino conforme determinado por Bayley Scales® em cada visita pós-linha de base até 12 meses para pacientes ≥24 meses e <60 meses de idade no momento da dosagem - Conjunto ITT.

[0045] A Figura 12 mostra um gráfico espaguete de mudança da linha de base no escore motor bruto conforme determinado por Bayley Scales® em cada visita pós-linha de base até 12 meses para pacientes ≥24 meses e <60 meses de idade no momento da dosagem - Conjunto ITT.

[0046] A Figura 13 mostra um gráfico espaguete de mudança da linha de base em HFMSE em cada visita pós-linha de base para pacientes <24 meses de idade no momento da dosagem que continuam no estudo após 24 meses de idade – Conjunto ITT.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0047] Para compreender melhor a divulgação, certas modalidades exemplificativas são discutidas no presente documento. Além disso, certos termos são discutidos para auxiliar a compreensão.

[0048] Em algumas modalidades, por "vetor" entende-se qualquer elemento genético, como um plasmídeo, fago, transpóson, cosmídeo, cromossomo, vírus, vírion, etc., que tenha capacidade de replicação quando associado aos elementos de controle adequados e que possa transferir sequências de genes entre as células. Dessa forma, o termo inclui veículos de clonagem e expressão, bem como vetores virais.

[0049] Em algumas modalidades, por um "vetor AAV" entende-se um vetor derivado de um sorotipo de vírus adenoassociado, incluindo sem limitação, AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8 e AAV-9. Os vetores AAV podem ter um ou mais genes tipo selvagem de AAV deletados no todo ou em parte, por exemplo, os genes rep e/ou cap, porém retêm as sequências de ITR flanqueadoras funcionais. As sequências de ITR funcionais são necessárias para o resgate, replicação e empacotamento do vírion AAV. Dessa forma, um vetor AAV é definido no presente documento para incluir pelo menos aquelas sequências que em cis fornecem a replicação e empacotamento (por exemplo, ITRs funcionais) do vírus. As ITRs não precisam ser as sequências de nucleotídeos tipo selvagem, e podem ser alteradas, por exemplo, pela inserção, deleção ou substituição de nucleotídeos, contanto que as sequências forneçam resgate funcional, replicação e empacotamento. Em uma modalidade, o vetor é um vetor AAV-9, com ITRs derivadas de AAV-2. Também, por um "vetor AAV" entende-se o invólucro ou capsídeo de proteína, que fornece um veículo eficiente para a entrega de ácido nucleico de vetor ao núcleo de células- alvo.

[0050] Em algumas modalidades, por "scAAV" entende-se um vírus adenoassociado autocomplementar (scAAV), que é um vetor viral geneticamente modificado do vírus adenoassociado (AAV) de ocorrência natural para uso na terapia gênica. scAAV é denominado "autocomplementar", pois a região de codificação foi projetada para formar um modelo de DNA de fita dupla intramolecular.

[0051] Em algumas modalidades, por "vírus recombinante" entende-se um vírus que foi geneticamente alterado, por exemplo, pela adição ou inserção de um construto de ácido nucleico heterólogo na partícula. "Recombinante" pode ser abreviado como "r", por exemplo, rAAV pode se referir a AAV recombinante. O termo "AAV" como usado no presente documento se destina a abranger "AAV recombinante" ou "rAAV."

[0052] Em algumas modalidades, por "vírion AAV" entende-se uma partícula viral completa, como uma partícula viral AAV tipo selvagem (wt) (que compreende um genoma de ácido nucleico de AAV de fita simples linear associado a uma cobertura de proteína capsidial de AAV). Nesse sentido, as moléculas de ácido nucleico de AAV de fita simples de qualquer das fitas senso complementares, por exemplo, "senso" ou "antissenso", podem ser empacotadas em qualquer vírion de AAV e ambas as fitas são igualmente infecciosas.

[0053] Em algumas modalidades, os termos "vírion de AAV recombinante", "vírion de rAAV", "partícula de vetor AAV", "capsídeos completos" e "partículas completas" são definidos no presente documento como um vírus infeccioso de replicação imperfeita incluindo um invólucro de proteínas de AAV, que encapsida uma sequência de nucleotídeos heteróloga de interesse que é flanqueada em ambos os lados por ITRs de AAV. Um vírion de rAAV é produzido em uma célula hospedeira adequada que tem sequências que especificam um vetor AAV, funções auxiliares de AAV e funções acessórias introduzidas no mesmo. Desta maneira, a célula hospedeira se torna capaz de codificar polipeptídeos de AAV que fornecem o empacotamento do vetor AAV (contendo uma sequência de nucleotídeos recombinante de interesse) em partículas de vírion recombinantes infecciosas para entrega de gene subsequente.

[0054] Exceto onde definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado como comumente entendido por uma pessoa versada na técnica à qual essa divulgação pertence. Todas as referências citadas no presente documento estão incorporadas a título de referência em sua totalidade. Na medida em que os termos ou discussão nas referências conflitem com essa divulgação, o último prevalecerá.

[0055] Conforme usado no presente documento, as formas no singular de uma palavra também incluem a forma no plural da palavra, exceto onde o contexto ditar claramente em contrário; como exemplos, os termos "um", "uma" e "o" são entendidos no singular ou no plural. A título de exemplo, "um elemento" significa um elemento ou mais de um elemento. O termo "ou" deve significar "e/ou", exceto onde o contexto específico indicar em contrário.

[0056] O termo "compreendendo" ou variações como "compreende" serão entendidos para implicar a inclusão de um elemento, integração ou etapa mencionada ou grupo de elementos, integrações ou etapas, mas não a exclusão de qualquer outro elemento, integração ou etapa ou grupo de elementos, integrações ou etapas. Ao longo do relatório descritivo, entende-se que a palavra "consistindo em" ou variações como "consiste em" implica a inclusão de um elemento, número inteiro ou etapa mencionado ou grupo de elementos, números inteiros ou etapas, mas não a exclusão de qualquer outro elemento, número inteiro ou etapa ou grupo de elementos, números inteiros ou etapas. Ao longo do relatório descritivo, entende-se que a palavra "consistindo essencialmente em" ou variações como "consiste essencialmente em"

implica a inclusão de um elemento, número inteiro ou etapa mencionado ou grupo de elementos, números inteiros ou etapas, e qualquer outro elemento, número inteiro ou etapa ou grupo de elementos, números inteiros ou etapas que não afetam materialmente as características básicas e inovadoras da divulgação e/ou reivindicação.

[0057] "Cerca de" pode ser entendido como dentro de +/-10%, por exemplo, +/-10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1%, 0,05%, ou 0,01% do valor referido. Quando usado em referência a uma porcentagem de valor, "cerca de" pode ser entendido como dentro de ± 1% (por exemplo, "cerca de 5%" pode ser entendido como dentro de 4% a 6%) ou ± 0,5% (por exemplo, "cerca de 5%" pode ser entendido como dentro de 4,5% a 5,5%). A menos que seja, de outro modo, claro a partir do contexto, todos os valores numéricos fornecidos no presente documento são modificados pelo termo "cerca de". Todas as faixas usadas no presente documento abrangem os pontos finais. Vetor Viral rAAV

[0058] Em um aspecto, são divulgados no presente documento genomas de rAAV. Em algumas modalidades, um genoma de rAAV compreende uma ou mais ITRs de AAV que flanqueiam um polinucleotídeo que codifica um polinucleotídeo de SMN. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo está ligado de maneira funcional a elementos de DNA de controle transcricional, por exemplo, um DNA promotor, um ou mais DNAs intensificadores e/ou um DNA de sequência de sinal de poliadenilação que são funcionais em células-alvo para formar um cassete de gene. O cassete de gene pode também incluir sequências de íntrons para facilitar o processamento de uma transcrição de RNA quando expresso em células de mamífero.

[0059] Em algumas modalidades, os genomas de rAAV divulgados no presente documento são desprovidos de rep de AAV e DNA cap. O DNA de AAV nos genomas de rAAV (por exemplo, ITRs) pode ser de qualquer sorotipo de AAV do qual um vírus recombinante pode ser derivado incluindo, porém sem limitação, sorotipos de AAV AAV-1, AAV- 2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10 e AAV-

11. As sequências de nucleotídeos dos genomas dos sorotipos de AAV são conhecidas na técnica. Por exemplo, o genoma completo de AAV- 1 é fornecido no Gebank, Nº de acesso NC_002077; o genoma completo de AAV-2 é fornecido no Gebank, Nº de acesso NC 001401 e Srivastava et al., Virol., 45: 555-564 {1983): o genoma completo de AAV- 3 é fornecido no Gebank, Nº de acesso NC_1829; o genoma completo de AAV-4 é fornecido no Gebank, Nº de acesso NC_001829; o genoma de AAV-5 é fornecido no Gebank, Nº de acesso AF085716; o genoma completo de AAV-6 é fornecido no Gebank, Nº de acesso NC_00 1862; pelo menos as porções de genomas de AAV-7 e AAV-8 são fornecidas no Genbank, Nos de acesso AX753246 e AX753249, respectivamente; o genoma de AAV-9 é fornecido em Gao et al., J. Virol., 78: 6381-6388 (2004); o genoma de AAV-10 é fornecido em Mol. Ther., 13(1): 67-76 (2006); e o genoma de AAV-11 é fornecido em Virology, 330(2): 375- 383 (2004).

[0060] Como usado no presente documento, o plasmídeo de vetor de "pSMN" compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína de SMN, ou seja, um cassete de expressão de cDNA de SMN, em que o cassete é flanqueado por sequências de repetição terminal invertida (ITR) de vírus adenoassociado, por exemplo, "à esquerda" e "à direita" do polinucleotídeo que codifica o gene SMN. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo que codifica SMN é uma sequência de SMN humana, por exemplo, uma sequência de SMN humana de ocorrência natural ou isoformas, variantes ou mutantes da mesma. Em algumas modalidades, as sequências de ITR são sequências de ITR de AAV nativas, variantes ou modificadas. Em algumas modalidades, pelo menos uma sequência de ITR é uma sequência de ITR de AAV2 nativa, variante ou modificada.

Em algumas modalidades, as duas sequências de ITR são sequências de ITR de AAV2 nativas, variantes ou modificadas. Em algumas modalidades, a ITR "esquerda" é uma sequência de ITR de AAV2 modificada que permite a produção de genomas autocomplementares e a ITR "direita" é uma sequência de ITR de AAV2 nativa. Em algumas modalidades, a ITR "direita" é uma sequência de ITR de AAV2 modificada que permite a produção de genomas autocomplementares e a ITR "esquerda" é uma sequência de ITR de AAV2 nativa. Em algumas modalidades, o plasmídeo de pSMN compreende adicionalmente um intensificador de CMV/promotor de beta-actina de galinha ("CB"). Em algumas modalidades, o plasmídeo de pSMN compreende adicionalmente um íntron de Vírus Símio 40 (SV40). Em algumas modalidades, o plasmídeo de pSMN compreende adicionalmente um sinal de terminação de poliadenilação (polyA) de hormônio do crescimento bovino (BGH). Sequências exemplificativas que podem ser usadas para um ou mais componentes discutidos acima são mostradas na Tabela 1 abaixo. Em algumas modalidades, todas as sequências mostradas na Tabela 1 abaixo são usadas. Em algumas modalidades, "AVXS-101" é um exemplo não limitante de um construto de vetor que usa todas as sequências na Tabela 1 e é abrangido pelo escopo do termo pSMN. As modalidades desses vetores e os métodos de preparação e purificação dos mesmos são fornecidos, por exemplo, no documento PCT/US2018/058744, que está incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade.

[0061] Em algumas modalidades, um vetor de pSMN pode compreender um cassete de expressão de cDNA de SMN, uma ITR de AAV2 modificada, um promotor da beta-actina de galinha (CB), um intensificador imediato/inicial de citomegalovírus (CMV), um íntron 16s tardio de SV40 modificado, um sinal de poliadenilação de Hormônio do crescimento bovino (BGH) e uma ITR de AAV2 não modificada. As ITRs modificadas e não modificadas podem se apresentar em qualquer orientação (ou seja, 5' ou 3') em relação ao cassete de expressão de cDNA de SMN.

Tabela 1: Componente de Sumário de Sequência de DNA de Construto de Vetor de AVXS-101 (todas as posições de partida e parada são em relação à SEQ ID Nº: 1). Posição de Posição Tamanho Descrição Descrição não limitante de Partida de Parada (nt) potenciais benefícios ITR de AAV2 Mutada 1 106 106 Modificação da ITR Sem se ater à teoria, essa ITR "Esquerda" "esquerda", mutada pode permitir que um excluindo o local de vetor autocomplementar de resolução terminal segunda geração maximize a para permitir a potência de vetor, permitindo formação em doses sistêmicas mais baixas grampo do genoma Intensificador de CMV 153 432 280 Porção do Sem se ater à teoria, isso / Promotor de CB intensificador pode permitir uma expressão imediato/inicial de de SMN de alto nível CMV constitutiva 439 704 266 Promotor de núcleo de CB Íntron de SV40 774 870 97 Íntron do SV40 Sem se ater à teoria, isso (para aumentar o pode permitir uma expressão acúmulo de nível de gene aumentada estável de mRNA para tradução) cDNA de SMN 1003 1887 885 Modificado do Sem se ater à teoria, isso Humano Gebank, Nº de pode permitir a expressão de acesso uma proteína de SMN de #NM_017411 comprimento total Sinal de Terminação 1973 2204 232 Sinal de Poli A de Sem se ater à teoria, isso de Poli A de BGH BGH pode fornecer uma Poli A do mRNA de SMN (sinal de terminação de transcrição) para expressão de genes eficiente de alto nível ITR AAV2 "Direita" 2217 2359 143 ITR de AAV2 Não Sem se ater à teoria, essa ITR modificada de AAV2 em cis pode fornecer tanto a replicação de DNA viral como o empacotamento do genoma de vetor AAV

[0062] Em algumas modalidades, a sequência de construto de vetor é encapsidada, por exemplo, em vírions de AAV9. Nessas modalidades, a encapsidação está em um capsídeo de AAV9 recombinante não replicante com capacidade de entregar um transgene de função estável, por exemplo, um transgene de SMN humano completamente funcional. Em algumas modalidades, o capsídeo é compreendido de 60 proteínas virais (VP1, VP2, VP3), por exemplo, em uma razão de 1:1:10 produzida por splicing alternativo de modo que VP2 e VP3 sejam duas formas truncadas de VP1, todas com sequências C-terminais comuns. Em algumas modalidades, o produto do processo de fabricação, por exemplo, um produto de fármaco, pode compreender um capsídeo de AAV9 recombinante não replicante para entregar um transgene de SMN humano completamente funcional estável. Em algumas modalidades, o capsídeo é compreendido de 60 proteínas virais (VP1, VP2, VP3) em uma razão de 1:1:10 produzida por splicing alternativo de modo que VP2 e VP3 sejam duas formas truncadas de VP1, todas com sequências C- terminais comuns. As modalidades desses construtos de vetor e os métodos de preparação e purificação dos mesmos são fornecidos, por exemplo, no documento PCT/US2018/058744, que está incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade.

[0063] Em várias modalidades, a sequência de DNA de um construto de vetor de pSMN, por exemplo, construto de vetor de AVXS- 101, compreende a SEQ ID Nº: 1: ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg 50

[0064] ggcgaccttt ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg 100 gagtggaatt cacgcgtgga tctgaattca attcacgcgt ggtacctctg 150 gtcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga 200 cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa 250 tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc 300 cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga 350 cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct 400 tatgggactt tcctacttgg cagtacatct actcgaggcc acgttctgct 450 tcactctccc catctccccc ccctccccac ccccaatttt gtatttattt 500 attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg ggggggggcg 550 cgcgccaggc ggggcggggc ggggcgaggg gcggggcggg gcgaggcgga 600 gaggtgcggc ggcagccaat cagagcggcg cgctccgaaa gtttcctttt 650 atggcgaggc ggcggcggcg gcggccctat aaaaagcgaa gcgcgcggcg 700 ggcgggagcg ggatcagcca ccgcggtggc ggcctagagt cgacgaggaa 750 ctgaaaaacc agaaagttaa ctggtaagtt tagtcttttt gtcttttatt 800 tcaggtcccg gatccggtgg tggtgcaaat caaagaactg ctcctcagtg 850 gatgttgcct ttacttctag gcctgtacgg aagtgttact tctgctctaa 900 aagctgcgga attgtacccg cggccgatcc accggtccgg aattcccggg 950 atatcgtcga cccacgcgtc cgggccccac gctgcgcacc cgcgggtttg 1000 ctatggcgat gagcagcggc ggcagtggtg gcggcgtccc ggagcaggag 1050 gattccgtgc tgttccggcg cggcacaggc cagagcgatg attctgacat 1100 ttgggatgat acagcactga taaaagcata tgataaagct gtggcttcat 1150 ttaagcatgc tctaaagaat ggtgacattt gtgaaacttc gggtaaacca 1200 aaaaccacac ctaaaagaaa acctgctaag aagaataaaa gccaaaagaa 1250 gaatactgca gcttccttac aacagtggaa agttggggac aaatgttctg 1300 ccatttggtc agaagacggt tgcatttacc cagctaccat tgcttcaatt 1350 gattttaaga gagaaacctg tgttgtggtt tacactggat atggaaatag 1400 agaggagcaa aatctgtccg atctactttc cccaatctgt gaagtagcta 1450 ataatataga acagaatgct caagagaatg aaaatgaaag ccaagtttca 1500 acagatgaaa gtgagaactc caggtctcct ggaaataaat cagataacat 1550 caagcccaaa tctgctccat ggaactcttt tctccctcca ccacccccca 1600 tgccagggcc aagactggga ccaggaaagc caggtctaaa attcaatggc 1650 ccaccaccgc caccgccacc accaccaccc cacttactat catgctggct 1700 gcctccattt ccttctggac caccaataat tcccccacca cctcccatat 1750 gtccagattc tcttgatgat gctgatgctt tgggaagtat gttaatttca 1800 tggtacatga gtggctatca tactggctat tatatgggtt ttagacaaaa 1850 tcaaaaagaa ggaaggtgct cacattcctt aaattaagga gaaatgctgg 1900 catagagcag cactaaatga caccactaaa gaaacgatca gacagatcta 1950 gaaagcttat cgataccgtc gactagagct cgctgatcag cctcgactgt 2000 gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg cccctccccc gtgccttcct 2050 tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa 2100 attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt 2150 ggggcaggac agcaaggggg aggattggga agacaatagc aggcatgctg 2200 gggagagatc gatctgagga acccctagtg atggagttgg ccactccctc 2250 tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaaag gtcgcccgac 2300 gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag 2350 ggagtggcc 2359 (SEQ ID Nº: 1).

[0065] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos da proteína de SMN codificada pelo plasmídeo de pSMN, por exemplo, AVX101, compreende:

MAMSSGGSGGGVPEQEDSVLFRRGTGQSDDSDIWDDTALIKAYDKAVASF KHALKNGDICETSGKPKTTPKRKPAKKNKSQKKNTAASLQQWKVGDKCSAI WSEDGCIYPATIASIDFKRETCVVVYTGYGNREEQNLSDLLSPICEVANNIE QNAQENENESQVSTDESENSRSPGNKSDNIKPKSAPWNSFLPPPPPMPG

PRLGPGKPGLKFNGPPPPPPPPPPHLLSCWLPPFPSGPPIIPPPPPICPDSL DDADALGSMLISWYMSGYHTGYYMGFRQNQKEGRCSHSLN (SEQ ID Nº: 2).

[0066] Em algumas modalidades, as proteínas capsidiais de AAV VP1, VP2, VP3 são entregues a partir do mesmo transcrito. Essas têm sítios de início alternativos, porém compartilham uma terminação carbóxi. Abaixo, sequências de aminoácidos específicas de VP1 são mostradas em preto e estão em negrito. As sequências de aminoácidos comuns a VP1 e VP2 estão sublinhadas e em itálico. Os aminoácidos comuns a todas as três proteínas capsidiais estão em negrito e em itálico. 1 MAADGYLPDW LEDNLSEGIR EWWALKPGAP QPKANQQHQD NARGLVLPGY KYLGPGNGLD 61 KGEPVNAADA AALEHDKAYD QQLKAGDNPY LKYNHADAEF QERLKEDTSF GGNLGRAVFQ 121 AKKRLLEPLG LVEEAAKTAP GKKRPVEQSP QEPDSSAGIG KSGAQPAKKR LNFGQTGDTE 181 SVPDPQPIGE PPAAPSGVGS LTMASGGGAP VADNNEGADG VGSSSGNWHC DSQWLGDRVI 241 TTSTRTWALP TYNNHLYKQI SNSTSGGSSN DNAYFGYSTP WGYFDFNRFH CHFSPRDWQR 301 LINNNWGFRP KRLNFKLFNI QVKEVTDNNG VKTIANNLTS TVQVFTDSDY QLPYVLGSAH 361 EGCLPPFPAD VFMIPQYGYL TLNDGSQAVG RSSFYCLEYF PSQMLRTGNN FQFSYEFENV 421 PFHSSYAHSQ SLDRLMNPLI DQYLYYLSKT INGSGQNQQT LKFSVAGPSN MAVQGRNYIP 481 GPSYRQQRVS TTVTQNNNSE FAWPGASSWA LNGRNSLMNP GPAMASHKEG EDRFFPLSGS 541 LIFGKQGTGR DNVDADKVMI TNEEEIKTTN PVATESYGQV ATNHQSAQAQ AQTGWVQNQG 601 ILPGMVWQDR DVYLQGPIWA KIPHTDGNFH PSPLMGGFGM KHPPPQILIK NTPVPADPPT 661 AFNKDKLNSF ITQYSTGQVS VEIEWELQKE NSKRWNPEIQ YTSNYYKSNN VEFAVNTEGV 721 YSEPRPIGTR YLTRNL (SEQ ID Nº: 3).

[0067] Em uma modalidade, as proteínas capsidiais de AAV são derivadas de um transcrito que codifica a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID Nº: 3.

[0068] Em várias modalidades, são divulgados no presente documento plasmídeos de DNA que compreendem genomas de rAAV. Os plasmídeos de DNA são transferidos para células permissíveis para infecção com um vírus auxiliar de AAV (por exemplo, adenovírus, adenovírus deletado em E1 ou herpesvírus) para montagem do genoma de rAAV em partículas virais infecciosas com proteínas capsidiais de AAV9. Técnicas para produzir partículas de rAAV, em que um genoma de AAV que será empacotado, genes rep e cap e funções de vírus auxiliar são fornecidos a uma célula estão disponíveis na técnica. Em algumas modalidades, a produção de rAAV envolve os seguintes componentes presentes dentro de uma única célula (denotada no presente documento como uma célula empacotadora): um genoma de rAAV, genes rep e cap de AAV separado (ou seja, não dentro) do genoma de rAAV e funções de vírus auxiliar. A produção de rAAV pseudotipado é divulgada, por exemplo, no documento Nº WO 01/83692 que está incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade. Em várias modalidades, as proteínas capsidiais de AAV podem ser modificadas para aumentar a entrega do vetor recombinante. Modificações nas proteínas capsidiais são geralmente conhecidas na técnica. Consultar, por exemplo, US 2005/0053922 e US 2009/0202490, cujas divulgações estão incorporadas a título de referência no presente documento em sua totalidade.

[0069] Os princípios gerais de produção de rAAV são analisados, por exemplo, em Carter, 1992, Current Opinions in Biotechnology, 1533- 539; e Muzyczka, 1992, CUM Topics in Microbial. and Immunol., 158:97- 129). Várias abordagens são descritas em Ratschin et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072 (1984); Hennonat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6466 (1984); Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251 (1985); McLaughlin et al.,

J. Virol., 62:1963 (1988); e Lebkowski et al., 1988 Mol. Cell. Biol., 7:349 (1988). Samulski et al. (1989, J. Virol., 63:3822-3828); Patente US Nº

5.173.414; WO 95/13365 e Patente correspondente US Nº 5.658.776; WO 95/13392; WO 96/17947; PCT/US98/18600; WO 97/09441 (PCT/US96/14423); WO 97/08298 (PCT/US96/13872); WO 97/21825 (PCT/US96/20777); WO 97/06243 (PCT/FR96/01064); WO 99/11764; Perrin et al. (1995) Vaccine 13:1244-1250; Paul et al. (1993) Human Gene Therapy 4:609-615; Clark et al. (1996) Gene Therapy 3:1124- 1132; Patente US Nº 5.786.211, Patente US Nº 5.871.982 e Patente US Nº 6.258.595. Além disso, o rAAV divulgado no presente documento pode ser preparado, purificado, fabricado e/ou formulado de acordo com a divulgação de PCT/US2018/058744. Os documentos anteriores estão incorporados no presente documento a título de referência em sua totalidade, com ênfase específica nas seções dos documentos relacionados à preparação, purificação, produção, fabricação e formulação de rAAV.

[0070] Em outro aspecto, o rAAV que compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína de SMN, como o rAAV9 discutido no presente documento, são chamados de "SMN de rAAV". Em algumas modalidades, o genoma de SMN de rAAV tem na sequência uma primeira ITR de AAV2, o promotor de β actina de galinha com um intensificador de citomegalovírus, um íntron SV40, um polinucleotídeo que codifica SMN, uma sequência de sinal de poliadenilação de hormônio de crescimento bovino e uma segunda ITR de AAV2. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo que codifica SMN é um gene humano de SMN, por exemplo, apresentado ou derivado de Genbank, Nº de acesso MN_000344.2, Genbank, Nº de acesso #NM_017411, ou qualquer outra isoforma de SMN humana adequada. Uma sequência de SMN exemplificativa compreende uma sequência de: 1 CCACAAATGT GGGAGGGCGA TAACCACTCG TAGAAAGCGT GAGAAGTTAC TACAAGCGGT

61 CCTCCCGGCC ACCGTACTGT TCCGCTCCCA GAAGCCCCGG GCGGCGGAAG TCGTCACTCT 121 TAAGAAGGGA CGGGGCCCCA CGCTGCGCAC CCGCGGGTTT GCTATGGCGA TGAGCAGCGG 181 CGGCAGTGGT GGCGGCGTCC CGGAGCAGGA GGATTCCGTG CTGTTCCGGC GCGGCACAGG 241 CCAGAGCGAT GATTCTGACA TTTGGGATGA TACAGCACTG ATAAAAGCAT ATGATAAAGC 301 TGTGGCTTCA TTTAAGCATG CTCTAAAGAA TGGTGACATT TGTGAAACTT CGGGTAAACC 361 AAAAACCACA CCTAAAAGAA AACCTGCTAA GAAGAATAAA AGCCAAAAGA AGAATACTGC 421 AGCTTCCTTA CAACAGTGGA AAGTTGGGGA CAAATGTTCT GCCATTTGGT CAGAAGACGG 481 TTGCATTTAC CCAGCTACCA TTGCTTCAAT TGATTTTAAG AGAGAAACCT GTGTTGTGGT 541 TTACACTGGA TATGGAAATA GAGAGGAGCA AAATCTGTCC GATCTACTTT CCCCAATCTG 601 TGAAGTAGCT AATAATATAG AACAGAATGC TCAAGAGAAT GAAAATGAAA GCCAAGTTTC 661 AACAGATGAA AGTGAGAACT CCAGGTCTCC TGGAAATAAA TCAGATAACA TCAAGCCCAA 721 ATCTGCTCCA TGGAACTCTT TTCTCCCTCC ACCACCCCCC ATGCCAGGGC CAAGACTGGG 781 ACCAGGAAAG CCAGGTCTAA AATTCAATGG CCCACCACCG CCACCGCCAC CACCACCACC 841 CCACTTACTA TCATGCTGGC TGCCTCCATT TCCTTCTGGA CCACCAATAA TTCCCCCACC 901 ACCTCCCATA TGTCCAGATT CTCTTGATGA TGCTGATGCT TTGGGAAGTA TGTTAATTTC 961 ATGGTACATG AGTGGCTATC ATACTGGCTA TTATATGGGT TTCAGACAAA ATCAAAAAGA 1021 AGGAAGGTGC TCACATTCCT TAAATTAAGG AGAAATGCTG GCATAGAGCA GCACTAAATG 1081 ACACCACTAA AGAAACGATC AGACAGATCT GGAATGTGAA GCGTTATAGA AGATAACTGG 1141 CCTCATTTCT TCAAAATATC AAGTGTTGGG AAAGAAAAAA GGAAGTGGAA TGGGTAACTC 1201 TTCTTGATTA AAAGTTATGT AATAACCAAA TGCAATGTGA AATATTTTAC TGGACTCTTT 1261 TGAAAAACCA TCTGTAAAAG ACTGGGGTGG GGGTGGGAGG CCAGCACGGT GGTGAGGCAG 1321 TTGAGAAAAT TTGAATGTGG ATTAGATTTT GAATGATATT GGATAATTAT TGGTAATTTT 1381 ATGGCCTGTG AGAAGGGTGT TGTAGTTTAT AAAAGACTGT CTTAATTTGC ATACTTAAGC 1441 ATTTAGGAAT GAAGTGTTAG AGTGTCTTAA AATGTTTCAA ATGGTTTAAC AAAATGTATG 1501 TGAGGCGTAT GTGGCAAAAT GTTACAGAAT CTAACTGGTG GACATGGCTG TTCATTGTAC 1561 TGTTTTTTTC TATCTTCTAT ATGTTTAAAA GTATATAATA AAAATATTTA ATTTTTTTTT 1621 A (SEQ ID Nº: 4).

[0071] Substituições de nucleotídeo conservativas de DNA de SMN são também contempladas (por exemplo, uma mudança de guanina para adenina na posição 625 de GenBank, Nº de acesso NM_000344.2). Em algumas modalidades, o genoma é desprovido de DNA rep e cap de AAV, ou seja, não há DNA rep ou cap de AAV entre as ITRs do genoma. Os polipeptídeos de SMN contemplados incluem, porém sem limitação, o polipeptídeo de SMN1 humano estabelecido no banco de dados de proteínas NCBI número NP_000335.1. Nas modalidades, o DNA de SMN compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de SMN humano (por exemplo, a proteína de SMN humana identificada por Uniprot número de acesso Q16637,

isoforma 1 (Q16637-1)). Também é contemplado o polipeptídeo modificador de SMN1, plastina-3 (PLS3) [Oprea et al., Science 320(5875): 524-527 (2008)]. As sequências que codificam outros polipeptídeos podem ser substituídas pelo DNA de SMN. Composições Farmacêuticas

[0072] Em várias modalidades, as partículas de vírus da presente divulgação (chamadas de partículas virais) podem ser fornecidas em composições farmacêuticas adequadas para administração intratecal. As composições podem ser fornecidas em formulações que compreendem um ou mais ingredientes inativos e/ou um ou mais ingredientes ativos adicionais além das partículas virais. Em algumas modalidades, as composições da divulgação podem ser formuladas em formulações adequadas para administração intratecal em um indivíduo mamífero, por exemplo, um ser humano, usando componentes e técnicas conhecidas na técnica.

[0073] Em algumas modalidades, a formulação farmacêutica compreende (a) um vetor viral AAV9 que compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína de sobrevivência do neurônio motor (SMN), (b) um tampão Tris, (c) cloreto de magnésio, (d) cloreto de sódio, e (e) um poloxâmero (por exemplo, poloxâmero 188), em que a composição farmacêutica não compreende um conservante. Em uma modalidade da formulação, o vetor viral AAV9 compreende adicionalmente uma ITR de AAV2 modificado, um promotor da beta- actina de galinha (CB), um intensificador imediato/inicial de citomegalovírus (CMV), um íntron 16s tardio de SV40 modificado, um sinal de poliadenilação de Hormônio do crescimento bovino (BGH) e uma ITR de AAV2 não modificado. Em uma modalidade da formulação, a concentração de tampão Tris é cerca de 10 a 30 nM, por exemplo, cerca de 20 mM. Em uma modalidade, o pH da formulação é cerca de 7,7 a cerca de 8,3, por exemplo, cerca de pH 8,0 (por exemplo, como medido por USP <791> (incorporado a título de referência em sua totalidade)). Em uma modalidade da formulação, a concentração de cloreto de magnésio é cerca de 0,5 a 1,5 nM, por exemplo, cerca de 1 mM. Em uma modalidade da formulação, a concentração de cloreto de sódio cerca de 100 a 300 nM, por exemplo, cerca de 200 mM. Em uma modalidade, a formulação compreende cerca de 0,001 a 0,15% em p/v de Poloxâmero 188, por exemplo, cerca de 0,005% em p/v de poloxâmero 188. Em algumas modalidades, a formulação compreende cerca de 1 a 8 x 1013 vg/ml, por exemplo, cerca de 1,9 a 4,2 x 1013 vg/ml do vetor viral AAV9. Em algumas modalidades, a formulação compreende cerca de 1 a 8 x 1013 vg/ml e o vetor viral AAV9 é administrado em uma dose unitária de cerca de 6,0 x 1013 vg. Em algumas modalidades, a formulação compreende cerca de 1,9 a 4,2 x 1013 vg/ml e o vetor viral AAV9 é administrado em uma dose unitária de cerca de 6,0 x 1013 vg. Em algumas modalidades, a formulação compreende cerca de 1 a 8 x 1013 vg/ml e o vetor viral AAV9 é administrado em uma dose unitária de cerca de 1,2 x 1014 vg. Em algumas modalidades, a formulação compreende cerca de 1,9 a 4,2 x 1013 vg/ml e o vetor viral AAV9 é administrado em uma dose unitária de cerca de 1,2 x 1014 vg. Em algumas modalidades, a formulação compreende cerca de 1 a 8 x 1013 vg/ml e o vetor viral AAV9 é administrado em uma dose unitária de cerca de 2,4 x 1014 vg. Em algumas modalidades, a formulação compreende cerca de 1,9 a 4,2 x 1013 vg/ml e o vetor viral AAV9 é administrado em uma dose unitária de cerca de 2,4 x 1014 vg.

[0074] Quando formulado como uma solução ou suspensão, o sistema de entrega pode compreender um veículo aceitável, por exemplo, um veículo aquoso. Uma variedade de veículos aquosos pode ser usada, por exemplo, água, água tamponada e/ou solução salina. A formulação pode compreender também tonificantes para tornar a solução iso-osmótico ou isotônica, por exemplo, NaCl, açúcares, manitol e similares. A formulação pode compreender também tensoativos para estabilizar a composição contra interfaces e cisalhamento, por exemplo, polissorbato 20, polissorbato 80 e similares. A formulação pode ser tamponada para manter pH e estabilidade ideais, por exemplo, usando tampões de acetato, succinato, citrato, histidina, fosfato ou Tris e similares. Essas composições podem ser esterilizadas com o uso de técnicas de esterilização ou podem ser filtradas até a esterilização. As soluções aquosas resultantes podem ser empacotadas para uso como são, ou liofilizadas, sendo que a preparação liofilizada é combinada com uma solução estéril antes da administração.

[0075] As composições, por exemplo, composições farmacêuticas, podem conter substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis para aproximar as condições fisiológicas, como agentes de ajuste e tamponamento de pH, agentes de ajuste de tonicidade, agentes umectantes e similares, por exemplo, acetato de sódio, lactato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio, monolaurato de sorbitano, oleato de trietanolamina, etc. Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica compreende um conservante. Em algumas outras modalidades, a composição farmacêutica não compreende um conservante.

[0076] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica opcionalmente compreende também um ou mais componentes ativos ou inativos adicionais, por exemplo, um agente de contraste (por exemplo, OmnipaqueTM 180). Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende um vetor viral que compreende um polinucleotídeo de SMN divulgado no presente documento e compreende também um agente de contraste (por exemplo, OmnipaqueTM, ou agente contendo ioexol). Em algumas dessas modalidades, o agente de contraste é pré-misturado com a composição farmacêutica. Em algumas outras modalidades, o agente de contraste não é pré-misturado com a composição farmacêutica. Em algumas modalidades, o agente de contraste é misturado com a composição farmacêutica pouco antes da administração intratecal. Em algumas modalidades, o agente de contraste (por exemplo, OmnipaqueTM, ioexol e similares) aumenta a transdução de neurônio motor. Em algumas modalidades, o agente de contraste (por exemplo, OmnipaqueTM, ioexol e similares) ajuda a guiar a agulha intratecal no espaço subaracnoide.

[0077] Em algumas modalidades, o meio de contraste é administrado em combinação com u vetor viral que compreende um polinucleotídeo de SMN divulgado no presente documento, em que o meio de contraste não é pré-misturado ou coformulado com o vetor viral antes da administração. Por exemplo, em algumas modalidades, um meio de contraste e um vetor viral que compreende um polinucleotídeo de SMN divulgado no presente documento são administrados sequencialmente. Em algumas modalidades, o meio de contraste é misturado com o vetor viral que compreende um polinucleotídeo de SMN imediatamente antes da administração como um único bolo.

[0078] Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica pode ser preparada e purificada de acordo com os métodos conhecidos na técnica, por exemplo, aqueles descritos no documento PCT/US2018/058744, que está incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade. Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica tem menos de cerca de 7% de capsídeos vazios (por exemplo, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% ou menos, ou qualquer porcentagem entre as mesmas de capsídeos vazios), por exemplo, como avaliado, por exemplo, por qPCR ou ddPCR. Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica tem uma ou mais das seguintes características de pureza: menos de 0,09 ng de benzonase por 1,0x1013 vg, menos de 30 µg/g (ppm) de césio, cerca de

20 a 80 ppm de Poloxâmero 188, menos de 0,22 ng de BSA por 1,0x1013 vg, menos de 6,8x105 pg de DNA plasmidial residual por 1,0x1013 vg, menos de 1,1x105 pg de hcDNA residual por 1,0x1013 vg e menos de 4 ng de rHCP por 1,0x1013 vg.

[0079] Em várias modalidades, uma composição farmacêutica retém uma potência entre +/-20%, entre +/-15%, entre +/-10% ou entre +/-5%, de um padrão de referência. Em uma modalidade, a potência é avaliada contra um padrão de referência usando os métodos em Foust et al., Nat. Biotechnol., 28(3), páginas 271-274 (2010). Qualquer padrão de referência adequado pode ser usado. Em uma modalidade, a composição farmacêutica tem uma potência in vivo, como testado por camundongos com SMAΔ7. Em uma modalidade, um camundongo testado que recebeu uma dose de 7,5x1013 vg/kg tem uma sobrevivência mediana de mais de 15 dias, mais de 20 dias, mais de 22 dias ou mais de 24 dias. Em uma modalidade, a composição farmacêutica tem uma potência, como testado por um ensaio baseado em células in vitro, de 50 a 150%, 60 a 140% ou 70 a 130% de um padrão de referência e/ou controle adequado.

[0080] Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica tem vetores virais rAAV a uma concentração entre cerca de 1 x 1013 vg/ml e 1 x 1015 vg/ml, por exemplo, entre cerca de 1 a 8 x 1013 vg/ml. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica tem menos de cerca de 10%, menos de cerca de 8%, menos de cerca de 7% ou menos de cerca de 5% de capsídeos virais vazios. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica tem menos de cerca de 100 ng/ml de proteína de célula hospedeira por 1 x 1013 vg/ml. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica tem menos de cerca de 5 x 106 pg/ml, menos de cerca de 1 x 106 pg/ml, menos de cerca de 7,5 x 105 pg/ml ou menos de cerca de 6,8 x 105 pg/ml de DNA de célula hospedeira residual (hcDNA) por 1 x 1013 vg/ml. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica tem menos de cerca de 10 ng, menos de cerca de 8 ng, menos de cerca de 6 ng ou menos de cerca de 4 ng de proteína de célula hospedeira residual (rHCP) por 1,0x1013 vg/ml.

Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95% ou pelo menos cerca de 100% dos genomas de vetor viral rAAV/ml (por exemplo, AAV9) nacomposição farmacêutica são funcionais.

Em algumas modalidades, a composição farmacêutica tem DNA plasmidial residual menor ou igual a 1,7 X 106 pg/ml por 1 X 1013 vg/ml, ou 1 X 105 pg/ml por 1 X 1013 vg/ml a 1,7 X 106 pg/ml por 1 X 1013 vg/ml.

Em algumas modalidades, a composição farmacêutica tem concentrações de benzonase menores que 0,2 ng por 1,0 x 1013 vg, menores que 0,1 ng por 1,0 x 1013 vg ou menores que 0,09 ng por 1,0 x 1013 vg.

Em algumas modalidades, a composição farmacêutica tem concentrações de albumina sérica bovina (BSA) menores que 0,5 ng por 1,0 x 1013 vg, menores que 0,3 ng por 1,0 x 1013 vg ou menores que 0,22 ng por 1,0 x 1013 vg.

Em algumas modalidades, a composição farmacêutica tem níveis de endotoxina menores que cerca de 1 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que 0,75 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,5 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,4 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,35 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,3 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,25 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,2 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,13 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,1 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,05 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, ou , menores que cerca de 0,02 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml.

Em algumas modalidades, a composição farmacêutica tem concentrações de césio menores que 100 µg/g (ppm), menores que 50 µg/g (ppm) ou menores que 30 µg/g (ppm). Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm cerca de 10 a 100 ppm, 15 a 90 ppm ou cerca de 20 a 80 ppm de Poloxâmero

188. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica tem menos de 2.000, menos de 1.500, menos de 1.000 ou menos de 600 partículas que são ≥25 µm de tamanho por recipiente. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica tem menos de 10000, menos de 8000, menos de 1.000 ou menos de 6000 partículas que são ≥10 µm de tamanho por recipiente. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica tem pH entre 7,5 a 8,5, entre 7,6 a 8,4 ou entre 7,8 a 8,3. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica tem osmolalidade entre 330 a 490 mOsm/kg, entre 360 a 460 mOsm/kg ou entre 390 a 430 mOsm/kg. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica tem título infeccioso de cerca de 1,0x108 a 10,0x1010 IU por 1,0x1013 vg, cerca de 2,5x108 a 9,0x1010 IU por 1,0x1013 vgou cerca de 3,9x108 a 8,4x1010 IU por 1,0x1013 vg. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica tem cerca de 30 a 150%, cerca de 60 a 140% ou cerca de 70 a 130% de potência relativa com base em um ensaio baseado em células in vitro em relação a um padrão de referência e/ou controle adequado. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica tem níveis proteicos totais de cerca de 10 a 500 µg por 1,0x1013 vg, cerca de 50 a 400 µg por 1,0x1013 vg ou cerca de 100 a 300 µg por 1,0x1013 vg. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica tem uma potência in vivo como determinado por sobrevivência mediana em um camundongo de SMNΔ7 que recebeu uma dose de 7,5x1013 vg/kg por mais de 15 dias, mais de 20 dias, mais de 22 dias ou mais de 24 dias. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica satisfaz uma combinação de um ou mais (por exemplo, todos) critérios anteriores.

[0081] A divulgação no presente documento fornece também um kit para tratar SMA, por exemplo, SMA Tipo II ou Tipo III, em um paciente que precisa do mesmo, em que o kit compreende uma ou mais doses de uma composição farmacêutica divulgada no presente documento, por exemplo, uma que compreende uma quantidade eficaz ou dose de um vetor viral que compreende um polinucleotídeo de SMN divulgado no presente documento e opcionalmente também compreende um ou mais componentes ativos ou inativos adicionais, por exemplo, um agente de contraste (por exemplo, OmnipaqueTM 180), e instruções sobre como usar a preparação ou composição farmacêutica. Em algumas modalidades, o kit compreende uma ou mais doses de uma composição farmacêutica divulgada no presente documento, por exemplo, um que compreende uma quantidade eficaz ou dose de um vetor viral que compreende um polinucleotídeo de SMN divulgado no presente documento e também opcionalmente que compreende um agente de contraste (por exemplo, OmnipaqueTM, ou agente contendo ioexol).

[0082] Em algumas modalidades, um kit compreende um agente de contraste pré-misturado no mesmo recipiente que a composição farmacêutica. Em algumas modalidades, um kit compreende um agente de contraste fornecido em um ou mais recipientes no kit e a composição farmacêutica fornecida em um ou mais recipientes adicionais. Em algumas modalidades, o agente de contraste é misturado com a composição farmacêutica antes da administração intratecal.

[0083] Em algumas modalidades, o kit contém um ou mais frascos de uma composição farmacêutica de vetor viral. Em algumas modalidades, cada frasco contém a composição farmacêutica de vetor viral em uma dose (por exemplo, uma dose unitária) de até ou cerca de 6,0 x 1013 vg. Em algumas modalidades, cada frasco de um vetor viral (por exemplo, cada dose unitária) do kit contém a composição farmacêutica em uma dose de cerca de 6,0 x 1013 vg. Em algumas modalidades, cada frasco de um vetor viral (por exemplo, cada dose unitária) do kit contém a composição farmacêutica em uma dose de até ou cerca de 1,2 x 1014 vg. Em algumas modalidades, cada frasco de um vetor viral (por exemplo, cada dose unitária) do kit contém a composição farmacêutica em uma dose de cerca de 1,2 x 1014 vg. Em algumas modalidades, cada frasco de um vetor viral (por exemplo, cada dose unitária) do kit contém a composição farmacêutica em uma dose de até ou cerca de 2,4 x 1014 vg. Em algumas modalidades, cada frasco de um vetor viral (por exemplo, cada dose unitária) do kit contém a composição farmacêutica em uma dose de cerca de 2,4 x 1014 vg. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica de vetor viral está a uma concentração de cerca de 0,1 a 5,0 x 1013 vg/ml. Em algumas modalidades, cada frasco contém uma dose única de vetor viral rAAV. Em algumas modalidades, cada frasco contém mais de uma dose única de vetor viral rAAV. Em algumas modalidades, cada frasco contém menos de uma dose única de vetor viral rAAV. Usos de Vetor Viral rAAV9

[0084] Em várias modalidades, são divulgados no presente documento métodos de entrega de um polinucleotídeo a um paciente que precisa de tratamento para SMA, por exemplo, SMA tipo II ou III, que compreende administrar um rAAV9 com um genoma incluindo um polinucleotídeo de SMN de rAAV. Em algumas modalidades, a entrega é entrega intratecal ao sistema nervoso central de um paciente, que compreende administrar um rAAV9 divulgado no presente documento. Em algumas modalidades, o rAAV9 é administrado com um agente de contraste. Em algumas dessas modalidades, o rAAV9 e o agente de contraste são administrados simultaneamente, por exemplo, em uma única composição farmacêutica. Em outras dessas modalidades, o rAAV9 e o agente de contraste são administrados sequencialmente. Por exemplo, em algumas modalidades, um meio de contraste é administrado primeiro e o rAAV9 é administrado subsequente à administração do meio de contraste. Em algumas modalidades, o rAAV9 é administrado primeiro e o meio de contraste é administrado subsequente à administração do vetor viral AAV9. Em modalidades em que o vetor viral AAV9 e o meio de contraste são administrados sequencialmente, a administração do vetor viral AAV9 e do meio de contraste pode administrada dentro de, por exemplo, cerca de 2 horas, dentro de 1 hora, dentro de 45 minutos, dentro de 30 minutos, dentro de 15 minutos, dentro de 10 minutos ou dentro de 5 minutos um do outro. Em algumas modalidades, pelo menos um agente de contraste e rAAV9 é administrado por via intratecal. Em algumas modalidades, tanto o agente de contraste como o rAAV9 (se administrados simultânea ou sequencialmente) são administrados por via intratecal.

[0085] Em algumas modalidades, o agente de contraste é um agente de contraste não iônico e de baixa osmolaridade. Em algumas modalidades, o agente de contraste pode aumentar a transdução de células-alvo no sistema nervoso central do paciente. Em algumas modalidades, o agente de contraste pode ajudar a alvejar a entrega diretamente ao espaço subaracnoide. Em algumas modalidades, o genoma de rAAV9 é um genoma autocomplementar. Em outras modalidades, o genoma de rAAV9 é um genoma de fita simples.

[0086] Em algumas modalidades, o vetor viral rAAV é entregue por via intratecal no canal espinhal ou no espaço subaracnoide de modo que o mesmo atinja o líquido cefalorraquidiano (LCR). Em algumas modalidades, o vetor viral rAAV pode se difundir dentro do LCR para regiões distais ao local de entrega. Em algumas modalidades, o vetor viral rAAV é entregue a uma região do cérebro. Em algumas modalidades, o vetor viral rAAV é entregue ao córtex motor e/ou ao tronco encefálico. Em algumas modalidades, o vetor viral rAAV é entregue à medula espinhal. Em algumas modalidades, o vetor viral rAAV é entregue a um neurônio motor inferior. As modalidades da divulgação empregam o vetor viral rAAV a células nervosas e gliais. Em algumas modalidades, a célula glial é uma célula microglial, um oligodendrócito ou um astrócito. Em algumas modalidades, o rAAV9 é usado para entregar um vetor viral rAAV a uma célula de Schwann.

[0087] Os títulos de vetor viral rAAV que serão administrados podem variar dependendo, por exemplo, do rAAV específico, do modo de administração, do objetivo do tratamento, da idade e outras características do indivíduo que está sendo tratado e do tipo (ou tipos) de célula que está sendo alvejado. O título pode ser determinado por métodos conhecidos. Os títulos de rAAV podem estar na faixa de cerca de 1 X 106, cerca de 1 X 107, cerca de 1 X 108, cerca de 1 X 109, cerca de 1 X 1010, cerca de 1 X 1011, cerca de 1 X 1012, cerca de 1 X 1013, cerca de 1 X 1014, cerca de 1 X 1015 ou mais partículas resistentes à DNase (DRP) por ml. As dosagens podem também ser expressas em unidades de genomas vetoriais (vg). O título genômico pode ser determinado com o uso de ddPCR conforme descrito nesse pedido, em Lock et al., ou quaisquer outros métodos conhecidos na técnica. As dosagens podem também variar com base no momento da administração a um ser humano. Essas dosagens de rAAV podem estar na faixa de cerca 1 X 1011 vg/kg, cerca de 1 X 1012 vg/kg, cerca de 1 X 1013 vg/kg, cerca de 1 X 1014 vg/kg, cerca de 1 X 1015 vg/kg, cerca de 1 X 1016 vg/kg ou mais genomas vetoriais por quilograma de peso corporal em um adulto ou recém-nascido.

[0088] Em algumas modalidades, o rAAV9 é administrado em uma dose de 1,0 X 1013 vg a 9,9 X 1014 vg. Em algumas modalidades, o rAAV9 é administrado em uma dose de 5,0 X 1013 vg a 3,0 X 1014 vg. Em algumas modalidades, o rAAV9 é administrado em uma dose de até 6,0 X 1013 vg. Em algumas modalidades, o rAAV9 é administrado em uma dose de cerca de 6,0 x 1013 vg. Em algumas modalidades, o rAAV9 é administrado em uma dose de até 1,2 X 1014 vg. Em algumas modalidades, o rAAV9 é administrado em uma dose de cerca de 1,2 x 1014 vg. Em algumas modalidades, o rAAV9 é administrado em uma dose de até 2,4 X 1014 vg. Em algumas modalidades, o rAAV9 é administrado em uma dose de cerca de 2,4 x 1014 vg.

[0089] Em algumas modalidades, o rAAV9 é administrado em uma dose unitária de cerca de 1,0 x 1013 vg a 9,9 x 1014 vg. Em algumas modalidades, o rAAV9 é administrado em uma dose unitária de cerca de 1,0 x 1013 vg a 5,0 x 1014 vg. Em algumas modalidades, o rAAV9 é administrado em uma dose unitária de cerca de 5,0 x 1013 vg a 3,0 x 1014 vg.

[0090] Em algumas modalidades, o rAAV9 é administrado em uma dose unitária de cerca de 6,0 X 1013 vg. Em algumas modalidades, o rAAV9 é administrado em uma dose unitária de cerca de 1,2 X 1014 vg. Em algumas modalidades, o rAAV9 é administrado em uma dose unitária de cerca de 2,4 X 1014 vg.

[0091] A dose pode ser determinada por qualquer método adequado. Por exemplo, a PCR com iniciadores específicos para o vetor viral pode fornecer medições relativas, enquanto a qPCR pode ser usada para amostras menores e medições absolutas. Em algumas modalidades, ddPCR é usado. ddPCR é um método para realizar a PCR digital que se baseia na tecnologia de gotículas de emulsão água-óleo. Baker et al., "Digital PCR hits its stride". Nature Methods, 9(6):541-544. Sykes et al., "Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution". Biotechniques, 13(3)444-449. Uma amostra é fracionada em dezenas de milhares de gotículas e a amplificação por PCR das moléculas modelo ocorre em cada gotícula individual. Não é necessário fazer uma curva padrão ou ter iniciadores com alta eficiência de amplificação, portanto, a ddPCR tipicamente não usa tanta amostra quanto as técnicas tradicionais baseadas em PCR. Exemplos de máquinas de ddPCR comercialmente disponíveis incluem, porém sem limitação, a ddPCR BioRad QX100 e a PCR Digital RainDance Raindrop.

Em uma modalidade, a dose é determinada com o uso de PCR.

Em outra modalidade, a dose é determinada com o uso de qPCR.

Em outra modalidade, a dose é determinada com o uso de PCR digital em gotículas (ddPCR). Em algumas modalidades, múltiplos métodos são usados.

Em algumas modalidades, os métodos baseados em PCR detectam e quantificam o genoma viral de AAV9 encapsidado usando iniciadores e sondas especificamente projetados que alvejam o gene SMN.

Em outras modalidades, os métodos baseados em PCR detectam e quantificam o genoma viral de AAV9 encapsidado usando iniciadores e sondas especificamente projetados que alvejam o promotor de beta- actina de galinha.

Em outras modalidades, os métodos baseados em PCR detectam e quantificam o genoma viral de AAV9 encapsidado usando iniciadores e sondas especificamente projetados que alvejam o intensificador de CMV.

Em outras modalidades, os métodos baseados em PCR detectam e quantificam o genoma viral de AAV9 encapsidado usando iniciadores e sondas especificamente projetados que alvejam as sequências de ITR.

Em outras modalidades, os métodos baseados em PCR detectam e quantificam o genoma viral de AAV9 encapsidado usando iniciadores e sondas especificamente projetados que alvejam o sinal de poliadenilação de hormônio do crescimento bovino.

Em algumas modalidades, a potência é medida usando um ensaio celular in vitro ou modelo animal in vivo adequado.

Por exemplo, a potência ou % de partículas virais de SMN de AAV funcionais pode ser determinada usando um modelo de SMA, por exemplo, o camundongo com SMNΔ7, ou um ensaio baseado em célula quantitativo usando uma linhagem celular adequada, por exemplo, células progenitoras neurais primárias (NPCs) isoladas do córtex de camundongos com SMAΔ7. Em uma modalidade, a potência é avaliada contra um padrão de referência usando os métodos em Foust et al., Nat.

Biotechnol., 28(3), páginas

271-274 (2010). Qualquer padrão de referência adequado pode ser usado. Além disso, métodos exemplificativos para determinar a dose, pureza e porcentagem de vetores virais funcionais dos vetores virais rAAV divulgados no presente documento também são fornecidos na divulgação de PCT/US2018/058744, que está incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade.

[0092] A formulação de vetor viral rAAV que será administrado pode variar dependendo, por exemplo, do método de administração intratecal, do volume de dose e do excipiente farmacêutico. Grouls et al, "General considerations in the formulation of drugs for spinal delivery". Spinal Drug Delivery, Chapter 15, Elsevier Science, edição Yaksh. Em algumas modalidades, o vetor viral rAAV pode ser administrado em uma formulação terapêutica adequada para administração intratecal. Em algumas modalidades, o vetor viral rAAV pode ser administrado por via intratecal como uma injeção em bolus. Em algumas modalidades, o vetor viral rAAV pode ser administrado por via intratecal como uma infusão lenta. Em algumas modalidades, o vetor viral rAAV pode ser formulado em uma solução de fármaco isotônica estéril. Em algumas modalidades, o vetor viral rAAV pode ser formulado em solução salina. Em algumas modalidades, o vetor viral rAAV pode ser formulado em um LCR artificial, por exemplo, solução de Elliott. Em algumas modalidades, a formulação terapêutica é filtrada antes da administração.

[0093] Em várias modalidades, os métodos e materiais divulgados no presente documento são indicados e podem ser usados no tratamento de SMA, por exemplo, por administração intratecal a um paciente desprovido de uma cópia funcional de SMN1. Os seres humanos também carregam uma segunda cópia quase idêntica do gene SMN chamada SMN2. Lefebvre et al. "Identification and characterization of a spinal muscular atrophy-determining gene". Cell, 80(1):155-65. Monani et al. "Spinal muscular atrophy: a deficiency in a ubiquitous protein; a motor-neuron specific disease". Neuron, 48(6):885-896. Ambos os genes SMN1 e SMN2 expressam a proteína de SMN, entretanto, SMN2 contém uma mutação traducionalmente silenciosa no éxon 7, o que resulta na inclusão ineficiente do éxon 7 nos transcritos de SMN2. Assim, SMN2 produz a proteína de SMN de comprimento total e uma versão truncada de SMN desprovida de éxon 7, com a versão truncada como a forma predominante.

Como resultado, a quantidade de proteína de comprimento total funcional produzida por SMN2 é muito menor (em 70 a 90%) do que a produzida por SMN1. Lorson et al. "A single nucleotide in the SMN gene regulates splicing and is responsible for spinal muscular atrophy". PNAS, 96(11) 6307-6311. Monani et al, "A single nucleotide difference that alters splicing patterns distinguishes the SMA gene SMN1 from the copy gene SMN2". Hum Mol Genet 8(7):1177-1183. Embora o SMN2 não possa compensar completamente a perda do gene SMN1, os pacientes com formas mais leves de SMA geralmente têm números de cópias de SMN2 mais altos.

Lefebvre et al., "Correlation between severity and SMN protein level in spinal muscular atrophy". Nat Genet 16(3):265-269. Park et al., "Spinal muscular atrophy: new and emerging insights from model mice". Curr Neurol Neurosci Rep 10(2):108-117. Mais de 95% dos indivíduos com SMA retêm pelo menos uma cópia do gene SMN2. Uma ressalva é que o número de cópias de SMN2 não é o único modificador fenotípico.

Em particular, a variante c.859G> C no éxon 7 do gene SMN2 foi relatada como um modificador de doença positivo.

O paciente com essa mutação específica tem fenótipos da doença menos graves.

Prior et al., "A positive modified of spinal muscular atrophy in the SMN2 gene". Am J Hum Genet 85(3):408-413. Em algumas modalidades, a SMN de rAAV divulgada no presente documento é administrada a pacientes com SMA Tipo II com mais de uma cópia, mais de duas cópias, mais de três cópias, mais de quatro cópias ou mais de cinco cópias do gene SMN2 e/ou desprovidos de uma variante c.859G>C no éxon 7 do gene SMN2. Em algumas modalidades, a SMN de rAAV divulgada no presente documento é administrada a pacientes com SMA Tipo III com mais de duas cópias, mais de três cópias, mais de quatro cópias ou mais de cinco cópias do gene SMN2 e/ou desprovidos de uma variante c.859G>C no éxon 7 do gene SMN2. Em algumas modalidades, a SMN de rAAV divulgada no presente documento é administrada a pacientes com SMA Tipo II. Em algumas modalidades, a SMN de rAAV divulgada no presente documento é administrada a pacientes com SMA Tipo III.

[0094] A SMA Tipo I (também chamada de doença de início infantil ou de Werdnig-Hoffmann) é quando os sintomas de SMA estão presentes no nascimento ou aos 6 meses de idade. Nesse tipo, os bebês geralmente apresentam baixo tônus muscular (hipotonia), choro fraco e dificuldade de respiração. Os mesmos frequentemente têm dificuldade para engolir e sugar e não atingem o marco de desenvolvimento de serem capazes de se sentar sem auxílio. Os mesmos frequentemente mostram um ou mais sintomas de SMA selecionados dentre hipotonia, atraso nas habilidades motoras, mau controle da cabeça, postura de rotação do ombro e hipermobilidade das articulações. Tipicamente, esses bebês têm duas cópias do gene SMN2, uma em cada cromossomo 5. Mais da metade de todos os novos casos de SMA são SMA tipo I. Para SMA Tipo I, cerca de 80% dos pacientes têm uma ou duas cópias do gene SMN2.

[0095] A SMA Tipo II ou intermediária é quando a SMA tem seu início entre as idades de 7 e 18 meses e antes que a criança consiga ficar de pé ou andar independentemente. Crianças com SMA Tipo II geralmente têm pelo menos três genes SMN2, e cerca de 82% dos pacientes com SMA Tipo II têm 3 cópias dos genes SMN2. A SMA de início tardio (também conhecida como SMA tipos III e IV, SMA leve, SMA de início na idade adulta e doença de Kugelberg-Welander) resulta em níveis variáveis de fraqueza. A SMA Tipo III tem seu início após os 18 meses, e as crianças podem ficar de pé e andar independentemente, embora possam precisar de auxílio. Entre os pacientes com SMA Tipo III, cerca de 96% têm 3 ou 4 cópias dos genes SMN2. A SMA Tipo IV tem seu início na idade adulta, e as pessoas são capazes de andar durante sua idade adulta. Pessoas com SMA Tipo III ou IV geralmente têm entre quatro e oito genes SMN2, a partir dos quais uma quantidade razoável de proteína de SMN de comprimento total pode ser produzida.

[0096] Em uma modalidade, o rAAV, por exemplo, vetores de rAAV9 divulgados no presente documento, pode ser administrado por via intratecal para tratar SMA, por exemplo, SMA tipo II ou tipo III. Os termos "tratar", "tratamento" e outras formas relacionadas do termo compreendem uma etapa de administração, por exemplo, por via intratecal, de uma dose eficaz ou doses múltiplas eficazes, de uma composição que compreende um rAAV conforme divulgado no presente documento a um animal (incluindo um ser humano) que precisa do mesmo. Se a dose for administrada antes do início dos sintomas de um distúrbio/doença, a administração é profilática. Se a dose for administrada após o desenvolvimento de um distúrbio/doença, a administração é terapêutica. Nas modalidades, uma dose eficaz é uma dose que alivia parcial ou completamente (ou seja, elimina ou reduz) pelo menos um sintoma associado ao distúrbio/estado de doença que está sendo tratado, que retarda ou impede a progressão para um estado de distúrbio/doença, que retarda ou impede a progressão de um estado de distúrbio/doença, que diminui a extensão da doença, que resulta na remissão (parcial ou total) da doença e/ou que prolonga a sobrevivência. Exemplos de estados da doença contemplados para o tratamento são apresentados no presente documento.

[0097] Em uma modalidade, as composições de rAAV9 da divulgação são administradas por via intratecal a um paciente que precisa de tratamento para SMA, por exemplo, SMA Tipo II ou Tipo III.

[0098] Em algumas modalidades, o paciente tem 0 a 72 meses de idade. Em algumas outras modalidades, o paciente tem 6 a 60 meses de idade. Em algumas modalidades, o paciente tem 6 a 24 meses de idade. Em algumas modalidades, o paciente tem pelo menos 6 meses de idade. Em algumas modalidades, o paciente tem mais de 24 meses de idade.

[0099] Em algumas modalidades, o paciente tem uma ou mais mutações, por exemplo, uma mutação nula, em uma cópia do gene de SMN1 (abrangendo qualquer mutação que torne a proteína de SMN1 codificada não funcional). Em algumas modalidades, o paciente tem uma ou mais mutações, por exemplo, uma mutação nula, em duas cópias do gene SMN1. Em algumas modalidades, o paciente tem uma ou mais mutações, por exemplo, uma mutação nula, em todas as cópias do gene SMN1. Em algumas modalidades, o paciente tem uma deleção em uma cópia do gene SMN1. Em algumas modalidades, o paciente tem uma deleção em duas cópias do gene SMN1. Em algumas modalidades, o paciente tem mutações bialélicas de SMN1, ou seja, uma deleção ou substituição de SMN1 em ambos os alelos do cromossomo. Em algumas modalidades, o paciente tem pelo menos uma cópia funcional do gene SMN2. Em algumas modalidades, o paciente tem pelo menos duas cópias funcionais do gene SMN2. Em algumas modalidades, o paciente tem pelo menos três cópias funcionais do gene SMN2. Em algumas modalidades, o paciente tem pelo menos quatro cópias funcionais do gene SMN2. Em algumas modalidades, o paciente tem pelo menos cinco cópias funcionais do gene SMN2. Em algumas modalidades, o paciente tem mutações ou deleções nulas bialélicas de SMN1 e tem três cópias de SMN2. Em algumas modalidades, o paciente não tem uma substituição de c.859G>C no éxon 7 de pelo menos uma cópia do gene SMN2. Em algumas modalidades, o paciente tem mutações ou deleções nulas bialélicas de SMN1, tem três cópias de SMN2 e não tem uma substituição de c.859G>C no éxon 7 de pelo menos uma cópia do gene SMN2. Em algumas modalidades, a sequência genética do gene SMN1 ou SMN2 pode ser determinada, por exemplo, por hibridização, amplificação de PCR e/ou sequenciamento parcial ou total de cromossomo ou genoma. Em outras modalidades, a sequência genética e o número de cópias do gene SMN1 ou SMN2 podem ser determinados por sequenciamento de alto desempenho. Em algumas modalidades, a sequência genética e o número de cópias do gene SMN1 ou SMN2 podem ser determinados por análise de microarranjo. Em algumas modalidades, a sequência genética e o número de cópias do gene SMN1 ou SMN2 podem ser determinados por sequenciamento de Sanger. Em algumas modalidades, o número de cópias do gene SMN1 ou SMN2 pode ser determinado por hibridização fluorescente in-situ (FISH).

[0100] Em algumas modalidades, o paciente foi ou concomitantemente é diagnosticado com SMA, por exemplo, SMA Tipo II ou Tipo III antes do tratamento, por exemplo, por um teste genômico e/ou um teste de função motora e/ou um exame físico. Em algumas modalidades, a SMA Tipo II ou Tipo III é diagnosticada por avaliação clínica de sintomas, por exemplo, CHOP INTEND, Bayley Scales of Infant and Toddler Development® ou Escala Motora Funcional Expandida de Hammersmith (HFMSE). Em algumas modalidades, a SMA Tipo II ou Tipo III é diagnosticada por um exame físico. Em algumas modalidades, um paciente com SMA Tipo II como tratado pelos métodos divulgados no presente documento é ou mostra o início dos sintomas da doença antes de 24 meses, 22 meses, 20 meses, 18 meses, 16 meses, 14 meses, 12 meses, 10 meses, 8 meses ou 6 meses de idade, ou qualquer idade entre as mesmas. Em algumas modalidades, um paciente com SMA Tipo III como tratado pelos métodos divulgados no presente documento é ou mostra o início dos sintomas da doença após 12 meses, 14 meses, 16 meses, 18 meses, 20 meses, 22 meses ou 24 meses de idade, ou qualquer idade entre as mesmas. Em algumas modalidades, os pacientes são tratados antes de mostrarem sintomas de SMA Tipo II ou Tipo III (por exemplo, um ou mais sintomas), e em vez disso, o paciente é determinado como precisando de tratamento, por exemplo, com o uso dos testes genéticos descritos no presente documento. Em algumas modalidades, os pacientes são tratados após mostrarem sintomas de SMA Tipo II ou Tipo III (por exemplo, um ou mais sintomas), por exemplo, como determinado usando um dos testes descritos no presente documento. Em algumas modalidades, os pacientes são tratados antes de mostrarem sintomas de SMA Tipo II ou Tipo III. Em algumas modalidades, os pacientes são diagnosticados com SMA Tipo II ou Tipo III com base no teste genético, antes de serem sintomáticos.

[0101] Em algumas modalidades, o paciente mostra um ou mais sintomas de SMA. Os sintomas de SMA podem incluir hipotonia, atraso nas habilidades motoras, mau controle da cabeça, postura de rotação do ombro e hipermobilidade das articulações. Em algumas modalidades, o mau controle da cabeça é determinado colocando-se o paciente em uma posição sentada em anel com auxílio dos ombros (frente e costas). O controle da cabeça é avaliado pela capacidade do paciente de manter a cabeça ereta. Em algumas modalidades, o movimento espontâneo é observado quando o paciente está em uma posição supina e as habilidades motoras são avaliadas pela capacidade do paciente de levantar os cotovelos, joelhos, mãos e pés da superfície. Em algumas modalidades, a força de preensão do paciente é medida colocando-se um dedo na palma do paciente e levantando o paciente até que o ombro saia da superfície. A hipotonia e a força de preensão são medidas por quanto tempo o paciente mantém a preensão. Em algumas modalidades, o controle da cabeça é avaliado colocando-se a cabeça do paciente em uma rotação máxima disponível e medindo-se a capacidade do paciente de virar a cabeça para trás em direção à linha média. Em algumas modalidades, a postura do ombro pode ser avaliada sentando-se o paciente com apoio de cabeça e tronco e observando-se se o paciente flexiona os cotovelos ou ombro para alcançar um estímulo que é colocado no nível dos ombros e no comprimento dos braços. Em algumas modalidades, a postura do ombro pode também ser avaliada colocando-se o paciente em uma posição deitada de lado e observando- se se o paciente flexiona os cotovelos ou ombro para alcançar um estímulo que é colocado no nível dos ombros e no comprimento dos braços. Em algumas modalidades, as habilidades motoras são avaliadas observando-se se os pacientes flexionam seus quadris ou joelhos quando seus pés são manipulados, estimulados ou beliscados. Em algumas modalidades, flexão de ombro, flexão de cotovelo, adução de quadril, flexão de pescoço, extensão de cabeça, extensão de pescoço e/ou encurvamento da coluna podem ser avaliados por medições clínicas conhecidas, por exemplo, CHOP INTEND. Outros sintomas de SMA podem ser avaliados de acordo com medições clínicas conhecidas, por exemplo, CHOP INTEND.

[0102] Em algumas modalidades, o paciente mostra a capacidade de se sentar, porém não andar. Em algumas modalidades, o paciente mostra a capacidade de se sentar sem auxílio por cerca de 10 ou mais segundos, mas não consegue ficar de pé ou andar. Em algumas modalidades, o paciente mostra a capacidade de se sentar sem auxílio com a cabeça erguida por 10 segundos ou mais, mas não consegue andar ou ficar de pé. Em algumas modalidades, o paciente mostra a capacidade de se sentar de forma independente conforme definido pelos critérios de World Health Organization Multicentre Growth Reference Study (WHO-MGRS).

[0103] Sem se ater à teoria, a administração intratecal pode permitir que os fármacos ultrapassem a barreira hematoencefálica.

Como resultado, para fármacos em que o sistema nervoso central é o alvo, a entrega direta por administração intratecal pode permitir a redução da dose total e/ou volume da composição farmacêutica necessária (por exemplo, em comparação com a administração IV), reduzindo assim o risco de hepatotoxicidade.

Além disso, a entrega direta no espaço subaracnoide pode permitir maior eficiência de transdução de células no sistema nervoso central, por exemplo, neurônios motores inferiores, células gliais e similares.

O volume do líquido cefalorraquidiano (LCR) no espaço subaracnoide pode influenciar a concentração da dose eficaz escolhida para entrega intratecal.

Uma vez que o volume do LCR em um ser humano permanece relativamente constante após cerca de 3 anos de idade, a dose em um paciente pode ser controlada de maneira mais fácil e uniforme em diferentes pacientes.

Em algumas modalidades, a administração intratecal é usada para atravessar a barreira hematoencefálica.

Em algumas modalidades, um vetor viral rAAV9 divulgado no presente documento é entregue por via intratecal a um paciente que precisa do mesmo, por exemplo, um identificado como precisando de tratamento para SMA tipo II ou tipo III.

Em algumas modalidades, o rAAV9 é injetado no canal vertebral.

Em algumas modalidades, o rAAV9 é injetado no espaço subaracnoide.

Em algumas modalidades, o vetor viral rAAV9 é injetado sob condições estéreis no quarto de um paciente da UTIP ou outros ambientes adequados (por exemplo, sala de intervenção, sala de cirurgia, sala de procedimento dedicado) com acesso imediato ao gerenciamento de cuidados intensivos.

Em algumas modalidades, os sinais vitais do paciente são monitorados a cada 15 ± 5 minutos por 4 horas, e a cada hora ± 15 minutos por 24 horas após a administração do vetor viral.

Em algumas modalidades, o vetor viral rAAV9 não compreende um conservante.

Em algumas modalidades, a sedação ou anestesia é administrada aos pacientes antes da administração do vetor viral rAAV9. Em algumas modalidades, a administração intratecal de vetor viral rAAV9 pode ser realizada em pacientes colocados em uma posição prona, em uma posição genupeitoral, em uma posição lateral, em uma posição de Sim, ou em uma posição de decúbito lateral.

Em algumas modalidades, o vetor viral rAAV9 é administrado em uma seringa ou em um cateter.

Em algumas modalidades, um cateter pode ser inserido no espaço interespinhoso L1-L2, L2-L3, L3-L4 ou L4-L5 no espaço subaracnoide.

Em algumas modalidades, uma punção lombar é realizada, coletando até 10 ml, até 9 ml, até 8 ml, até 7 ml, até 6 ml, até 5 ml, até 4 ml, até 3 ml, até 2 ml ou até 1 ml de líquido cefalorraquidiano.

Em algumas modalidades, o vetor viral rAAV9 é injetado diretamente no espaço subaracnoide.

Em algumas modalidades, o vetor viral rAAV9 é pré- misturado com uma solução de contraste radiográfica adequada (por exemplo, metrizamida, iopamidol, ioexol, ioversol, OmnipaqueTM etc.) e diretamente injetado diretamente no espaço subaracnoide.

Em algumas modalidades, uma solução de contraste (por exemplo, metrizamida, iopamidol, ioexol, ioversol, OmnipaqueTM etc.) é administrada por via intratecal antes da administração intratecal do vetor viral rAAV9. Em algumas modalidades, a solução de contraste é administrada por via intratecal dentro de duas horas, dentro de uma hora, dentro de 45 minutos, dentro de 30 minutos, dentro de 15 minutos, dentro de 10 minutos ou dentro de 5 minutos antes da administração intratecal do vetor viral rAAV9. Em algumas modalidades, uma solução de contraste (por exemplo, metrizamida, iopamidol, ioexol, ioversol, OmnipaqueTM etc.) é administrada por via intratecal após a administração intratecal do vetor viral rAAV9. Em algumas modalidades, a solução de contraste é administrada por via intratetical dentro de duas horas, dentro de uma hora, dentro de 45 minutos, dentro de 30 minutos, dentro de 15 minutos,

dentro de 10 minutos ou dentro de 5 minutos após a administração intratecal ou do vetor viral rAAV9.

[0104] Em algumas modalidades, o volume de agente de contraste administrado é de até cerca de 0,5 ml, até cerca de 1,0 ml, até cerca de 1,5 ml, até cerca de 2,0 ml ou até cerca de 2,5 ml. Em algumas modalidades, o volume total administrado (vetor viral rAAV9 e agente de contraste) é não mais que cerca de 5 ml, não mais que cerca de 6 ml, não mais que cerca de 7 ml, não mais que cerca de 8 ml, não mais que cerca de 9 ml ou não mais que cerca de 10 ml. Em algumas modalidades, o paciente é colocado em uma posição diferente após administração de vetor viral rAAV9. Em algumas modalidades, o paciente é colocado em uma posição de Trendelenburg ou com a cabeça inclinada para baixo a 20°-40°, por exemplo, 30°, após a administração do vetor viral rAAV9. Em algumas modalidades, o paciente é colocado em uma posição de Trendelenburg ou com cabeça inclinada para baixo a 30° por 10 a 30 minutos, por exemplo, cerca de 15 minutos, após a administração do vetor viral rAAV9.

[0105] Em algumas modalidades, o tratamento é eficaz na prevenção, redução, alívio, retardo e/ou reversão parcial ou total de um ou mais sintomas de SMA, por exemplo, SMA tipo II ou tipo III. A eficácia do método de tratamento pode ser determinada com o uso de uma variedade de testes de habilidades motoras antes e após o tratamento. Em particular, a Bayley Scales of Infant and Toddler Development® é uma série de medições padrão usadas para avaliar o desenvolvimento de bebês e crianças pequenas. Bayley N. "Bayley Scales of Infant and Toddler Development". 3a edição, Harcourt Assessment Inc., 2006. Em particular, o Motor Scale component of Version III (Terceira Edição) da Bayley Scales® mede as habilidades motoras grossas e finas como agarrar, sentar, empilhar blocos e subir escadas. Em algumas modalidades, o paciente é avaliado para saber se suas mãos estão erguidas na maior parte do tempo. Em algumas modalidades, o paciente é avaliado para verificar se seus olhos seguem uma pessoa em movimento. Em algumas modalidades, o paciente é avaliado para saber se o mesmo tenta propositalmente colocar a mão na boca. Em algumas modalidades, o paciente é avaliado para verificar se o mesmo mantém as mãos abertas na maior parte do tempo quando não está tentando realizar uma tarefa. Em algumas modalidades, o paciente é avaliado para verificar se o mesmo consegue girar livremente o pulso da palma para baixo para palma para cima ao manipular um pequeno objeto. Em algumas modalidades, o paciente recebe blocos e é avaliado para verificar se o paciente pega os blocos usando uma ou ambas as mãos, transfere o bloco de uma mão para a outra, pega o bloco com a ponta do polegar ou dedo e se o paciente pega o bloco com o polegar parcialmente oposto aos dedos. Em algumas modalidades, o paciente recebe uma pelota de alimento e é avaliado para verificar se o mesmo pega o bloco com a ponta do polegar ou dedo e se o paciente pega o bloco com o polegar parcialmente oposto aos dedos. Em algumas modalidades, o paciente recebe um livro e é avaliado para verificar se tenta virar uma página ou várias páginas de uma vez. Em algumas modalidades, o paciente recebe um giz de cera ou lápis e papel e é avaliado para verificar se o paciente pega o giz de cera ou lápis usando uma preensão palmar, uma preensão trípode estática ou uma preensão quadrúpede enquanto faz uma marca no papel. Em modalidades adicionais, o paciente é avaliado para verificar se sua preensão está madura, controlada e dinâmica enquanto faz uma marca no papel. Em algumas modalidades, o paciente é avaliado para verificar se o mesmo segura o papel no lugar com uma das mãos enquanto rabisca ou desenha com a outra.

[0106] Em algumas modalidades, o paciente é avaliado para verificar se o mesmo empurra seus braços ou pernas várias vezes durante o jogo. Em algumas modalidades, o paciente é avaliado para verificar se o mesmo consegue levantar intermitentemente a cabeça sem um apoio. Em algumas modalidades, o paciente é avaliado para verificar se o mesmo consegue manter a cabeça ereta por pelo menos 3 segundos sem apoio. Em algumas modalidades, o paciente é avaliado para verificar se o mesmo tem capacidade de dar pelo menos 5 passos com coordenação e equilíbrio. Em algumas modalidades, o paciente é avaliado para verificar se o mesmo tem capacidade de dar pelo menos 5 passos com coordenação e equilíbrio de acordo com o item 43 da Bayley®-III - Habilidade Motora Bruta. Em algumas modalidades, o paciente é avaliado para verificar se o mesmo tem a capacidade de ficar de pé sem auxílio ou superfície de apoio, e se o mesmo tem controle postural de feedback. Em algumas modalidades, o paciente é avaliado para verificar se o mesmo tem capacidade de ficar de pé sem auxílio, de acordo com o item 40 da Bayley®-III - Habilidade Motora Bruta. Em algumas modalidades, um paciente é considerado como tendo recebido um tratamento eficaz se atingir a capacidade de ficar de pé sem apoio cerca de 24 meses, 12 meses, 9 meses ou 6 meses após a administração do tratamento. Em algumas modalidades, um paciente é considerado como tendo recebido um tratamento eficaz se atingir a capacidade de andar sem assistência, conforme definido por dar pelo menos cinco passos, exibindo independentemente coordenação e equilíbrio cerca de 24 meses, 12 meses, 9 meses ou 6 meses após a administração do tratamento.

[0107] Outra medição comumente usada de desenvolvimento infantil é a Escala Motora Funcional Expandida de Hammersmith (HFMSE). O'Hagen et al., "An expanded version of the Hammersmith Functional Motor Scale for SMA II and III patients". Neuromuscul Disord, 17(9-10):693-7; Glanzman et al., "Validation of the Expanded Hammersmith Functional Motor Scale in spinal muscular atrophy type II and III". J Child Neurol, 26(12):1499-1507. Enquanto a Hammersmith Functional Motor Scale foi bem-sucedida na avaliação da capacidade de indivíduos não ambuladores com SMA, a HFMSE forneceu um complemento de 13 itens adicionais que pode distinguir com sucesso as habilidades motoras entre indivíduos com SMA Tipo II e Tipo III.

Em algumas modalidades, o paciente é avaliado quanto à sua capacidade de se sentar em uma cadeira ou no chão sem apoio.

Em algumas modalidades, o paciente é avaliado quanto à sua capacidade de tocar a cabeça com a mão enquanto está sentado sem apoio em uma cadeira ou no chão.

Em algumas modalidades, o paciente é avaliado quanto à sua capacidade de tocar a cabeça com as duas mãos enquanto está sentado sem apoio em uma cadeira ou no chão.

Em algumas modalidades, o paciente é avaliado para verificar se o mesmo pode rolar para o lado enquanto está deitado.

Em algumas modalidades, o paciente é avaliado para verificar se o mesmo pode rolar com o rosto para cima e para baixo ou vice-versa enquanto está deitado.

Em algumas modalidades, o paciente é avaliado para verificar se o mesmo pode se deitar a partir de uma posição sentada de maneira controlada.

Em algumas modalidades, o paciente é avaliado para verificar se o mesmo pode se apoiar nos antebraços enquanto está de bruços.

Em algumas modalidades, o paciente é avaliado para verificar se o mesmo pode levantar a cabeça enquanto está em uma posição prona.

Em algumas modalidades, o paciente é avaliado para verificar se o mesmo pode se apoiar com os braços esticados por uma contagem de 3 enquanto está de bruços.

Em algumas modalidades, o paciente é avaliado para verificar se o mesmo consegue passar da posição deitada para a posição sentada sem rolar sobre a barriga.

Em algumas modalidades, o paciente é avaliado para verificar se o mesmo consegue se apoiar nas mãos e nos joelhos enquanto mantém a cabeça erguida por uma contagem de 3. Em algumas modalidades, o paciente é avaliado para verificar se o mesmo pode engatinhar para a frente com as mãos e joelhos.

Em algumas modalidades, o paciente é avaliado para verificar se o mesmo consegue levantar a cabeça enquanto está deitado em decúbito dorsal com os braços cruzados sobre o peito.

Em algumas modalidades, o paciente é avaliado para verificar se o mesmo pode ficar de pé por uma contagem de 3 com uma das mãos ou sem as mãos como apoio.

Em algumas modalidades, o paciente é avaliado para verificar se o mesmo consegue andar sem ajuda.

Em algumas modalidades, o paciente é avaliado para verificar se o mesmo pode levar o joelho ao peito enquanto está deitado em decúbito dorsal.

Em algumas modalidades, o paciente é avaliado para verificar se o mesmo consegue passar de uma posição ajoelhada elevada para uma posição semiajoelhada sem usar os braços.

Em algumas modalidades, o paciente é avaliado para verificar se o mesmo consegue ficar de pé de uma posição ajoelhada elevada sem usar os braços.

Em algumas modalidades, o paciente é avaliado para verificar se o mesmo consegue passar de uma posição ereta para uma posição sentada sem usar os braços.

Em algumas modalidades, o paciente é avaliado para verificar se o mesmo consegue passar de uma posição ereta para uma posição agachada sem usar os braços.

Em algumas modalidades, o paciente é avaliado para verificar se o mesmo consegue pular 30,48 centímetros (12 polegadas) para a frente a partir da posição ereta.

Em algumas modalidades, o paciente é avaliado para verificar se o mesmo consegue subir ou descer 4 degraus sem ajuda ou com a ajuda de um corrimão.

Em algumas modalidades, um paciente é considerado como tendo recebido tratamento eficaz se o paciente exibir um aumento de 5 a 10 pontos, por exemplo, um aumento de 8 pontos, a partir da linha de base na HFMSE cerca de 24 meses, 12 meses, 9 meses ou 6 meses após a administração de tratamento.

Em algumas modalidades, um paciente é considerado como tendo recebido tratamento eficaz se o paciente exibir um aumento de 9 pontos da linha de base na HFMSE cerca de 24 meses, 12 meses, 9 meses ou 6 meses após a administração do tratamento. Em algumas modalidades, um paciente é considerado como tendo recebido tratamento eficaz se o paciente exibir um aumento de 10 pontos da linha de base na HFMSE cerca de 24 meses, 12 meses, 9 meses ou 6 meses após a administração do tratamento.

[0108] Em algumas modalidades, a eficácia de tratamento é medida por mudanças nas habilidades de desenvolvimento. Em algumas modalidades, uma medição de linha de base é feita antes da administração do vetor viral rAAV9. Em algumas modalidades, a medição da linha de base compreende medir os componentes motores finos e brutos da Bayley Scales of Infant and Toddler Development®. Em algumas modalidades, a medição da linha de base compreende a medição do item 43 (dar pelo menos 5 passos sem assistência) dos componentes motores brutos da Bayley Scales of Infant and Toddler Development®. Em algumas modalidades, a medição da linha de base compreende a medição do item 40 (ficar de pé sem apoio por pelo menos 3 segundos) dos componentes motores brutos da Bayley Scales of Infant and Toddler Development®. Em algumas modalidades, a medição da linha de base compreende a avaliação do paciente de acordo com a Escala Motora Funcional Expandida de Hammersmith (HFMSE). Em algumas modalidades, a eficácia do tratamento é avaliada pela medição do item 43 (dar pelo menos 5 passos sem assistência) dos componentes motores brutos da Bayley Scales of Infant and Toddler Development® e comparação com a linha de base. Em algumas modalidades, a eficácia do tratamento é avaliada pela medição do item 40 (ficar de pé sem apoio por pelo menos 3 segundos) dos componentes motores brutos da Bayley Scales of Infant and Toddler Development® e comparação com a linha de base. Em algumas modalidades, a eficácia do tratamento é avaliada pela avaliação do paciente na HFMSE e comparação com a linha de base antes do tratamento.

Em algumas modalidades, a linha de base é estabelecida por medições dentro de 30 dias antes do tratamento.

Em algumas modalidades, a eficácia do tratamento é avaliada dentro de 30 dias de tratamento.

Em algumas modalidades, a eficácia do tratamento é avaliada uma vez por mês durante doze meses após o tratamento.

Em algumas modalidades, as avaliações de eficácia são gravadas em vídeo.

Em algumas modalidades, marcos motores significativos são avaliados por uma Pesquisa de Desenvolvimento de Marco Motor padrão mostrada na Tabela 2. Em algumas modalidades, a eficácia do tratamento é avaliada pelo menos 12 meses após, pelo menos 24 meses após, pelo menos 48 meses após, pelo menos 72 meses após ou até 10 anos após o tratamento.

Tabela 2: Pesquisa de Desenvolvimento de Marco Motor Marco de Desenvolvimento - Critérios de Desempenho Número de Item na Bayley Scale® Controle da Cabeça - Motor Bruto A criança mantém a cabeça ereta por pelo menos 3 Item de Subteste Nº 4 segundos sem apoio Rola de Costas para os Lados - A criança vira de costas para os lados direito e Motor Bruto Item de Subteste Nº 20 esquerdo Se Senta Sem Apoio - Motor Bruto A criança fica sentada sozinha sem apoio por pelo Item de Subteste Nº 26 menos 30 segundos Fica de Pé com Auxílio - Motor Bruto A criança suporta seu próprio peso por pelo menos Item de Subteste Nº 33 2 segundos Engatinha - Motor Bruto Item de A criança avança pelo menos 1,5 m (5 pés) Subteste Nº 34 engatinhando sobre as mãos e joelhos Tenta Ficar de Pé - Motor Bruto Item A criança se levanta para a posição ereta usando de Subteste Nº 35 uma cadeira ou outro objeto conveniente para apoio Anda com Auxílio - Motor Bruto Item A criança anda fazendo movimentos de passos de Subteste Nº 37 alternados e coordenados Fica de Pé Sozinha - Motor Bruto A criança fica de pé sozinha por pelo menos 3 Item de Subteste Nº 40 segundos após soltar suas mãos Anda Sozinha - Motor Bruto Item de A criança dá pelo menos cinco passos Subteste Nº 43 independentemente, exibindo coordenação e equilíbrio

[0109] Em algumas modalidades, o teste para avaliar a eficácia do tratamento não se limita à Bayley Scales of Infant and Toddler Development®, à Escala Motora Funcional Expandida de Hammersmith (HFMSE) ou à Motor Milestone Development Survey, porém pode também incluir outros testes de habilidades motoras conhecidos na técnica, incluindo, porém sem limitação, CHOP INTEND, TIMP, CHOP TOSS, a Peabody Development Motor Scales, o teste Brazelton Neonatal Behavior Assessment, Ability Captured Through Interactive Video Evaluation (ACTIVE) e medições de potenciais de ação motora composta (CMAP).

[0110] A pré-triagem de pacientes passíveis de tratamento também é contemplada, por exemplo, de acordo com os métodos de identificação de SMA, por exemplo, SMA tipo II ou tipo III divulgados no presente documento, bem como a administração de tratamento a pacientes identificados de acordo com os critérios divulgados no presente documento.

[0111] Os AAVs podem dar origem a uma resposta imunológica humoral celular e humoral. Como resultado, uma fração de potenciais pacientes para terapia gênica baseada em AAV contém anticorpos pré- existentes contra AAV. Jeune et al., "Pre-existing anti-Adeno-Associated Virus antibodies as a challenge in AAV gene therapy". Hum Gene Ther Methods, 24(2):59-67. Boutin et al., "Prevalence of serum IgG and neutralizing factors against adeno-associated virus (AAV) types 1, 2, 5, 6, 8, and 9 in the healthy population: implications for gene therapy using AAV vectors". Hum Gene Ther, 21:704-712. Visto que mesmo níveis muito baixos de anticorpos podem impedir a transdução bem-sucedida, os anticorpos anti-AAV antecedentes representam um sério obstáculo para a aplicação universal da terapia gênica de AAV. Em algumas modalidades, os níveis de títulos de anticorpo anti-AAV9 em um paciente são determinados antes da administração do vetor viral AAV e o paciente recebe o AAV por administração intratecal apenas se os títulos de anticorpo estiverem abaixo de um nível de limiar. Em algumas modalidades, os níveis de títulos de anticorpo anti-AAV9 em um paciente são determinados por um imunoensaio de ligação ELISA. Em algumas modalidades, o paciente tem títulos de anticorpo anti-AAV9 iguais ou abaixo de 1:100 como determinado por um imunoensaio de ligação ELISA, antes da administração do tratamento. Em algumas modalidades, o paciente tem títulos de anticorpo anti-AAV9 iguais ou abaixo de 1:50 como determinado por um imunoensaio de ligação ELISA, antes da administração do tratamento. Em algumas modalidades, o paciente tem títulos de anticorpo anti-AAV9 acima de 1:100 como determinado por um imunoensaio de ligação ELISA, após o tratamento e é monitorado por uma a 8 semanas ou até que os títulos diminuam abaixo de 1:100. Em algumas modalidades, o paciente tem títulos de anticorpo anti-AAV9 acima de 1:100 como determinado por um imunoensaio de ligação ELISA após a administração e é monitorado por 1 a 8 semanas ou até que os títulos diminuam abaixo de 1:50.

[0112] Em algumas modalidades, aos pacientes com alto título de anticorpo anti-AAV podem ser administrados um ou mais fármacos imunossupressores. Por exemplo, os anticorpos monoclonais anti-CD20 como rituximabe, em combinação com ciclosporina A, pode reduzir os títulos de anti-AAV. Mingozzi et al., "Pharmacological modulation of humoral immunity in a nonhuman primate model of AAV gene transfer for hemophilia B". Mol Ther, 20:1410-1416. Em algumas modalidades, o paciente tem títulos de anticorpo anti-AAV9 acima de 1:100 como determinado por um imunoensaio de ligação ELISA antes ou após o tratamento e é tratado com um ou mais fármacos imunossupressores, por exemplo, esteroides semelhantes à prednisolona. Em algumas modalidades, o paciente tem títulos de anticorpo anti-AAV9 acima de 1:50 como determinado por um imunoensaio de ligação ELISA antes ou após o tratamento e é tratado com um ou mais fármacos imunossupressores, por exemplo, esteroides semelhantes à prednisolona.

[0113] Em algumas modalidades, um paciente com alto título de anticorpo anti-AAV pode ser submetido à plasmaférese para depletar anticorpos neutralizantes antes e/ou após a administração de vetor. Monteilhet et al., "A 10 patient case report on the impact of plasmapheresis upon neutralizing factors against adeno-associated virus (AAV) types 1, 2, 6, and 8". Mol Ther, 19(11):2084-2091. Durante a plasmaférese, o sangue é coletado de um paciente e as células do plasma e do sangue são separadas por centrifugação ou filtração de fibra oca. As células sanguíneas são, então, retornadas para o paciente juntamente com plasma tratado ou fluidos de reposição, como albumina humana a 4,5% em solução salina. Um uso comum de aférese terapêutica é a remoção de imunoglobulinas indesejadas como anticorpos anti-AAV. Em algumas modalidades, o paciente tem títulos de anticorpo anti-AAV9 acima de 1:100 como determinado por um imunoensaio de ligação ELISA antes ou após o tratamento e é tratado com plasmaférese. Em algumas modalidades, o paciente tem títulos de anticorpo anti-AAV9 acima de 1:50 como determinado por um imunoensaio de ligação ELISA antes ou após o tratamento e é tratado com plasmaférese.

[0114] Os anticorpos maternos pré-existentes para AAV9 podem ser transferidos para um paciente jovem através do leite materno ou transferência placentária no útero. Em algumas modalidades, o paciente tem títulos de anticorpo anti-AAV9 acima de 1:100 como determinado por um imunoensaio de ligação ELISA antes ou após o tratamento e a alimentação foi trocada para fórmula. Em algumas modalidades, o paciente tem títulos de anticorpo anti-AAV9 acima de 1:50 como determinado por um imunoensaio de ligação ELISA antes ou após o tratamento e a alimentação foi trocada para fórmula.

[0115] Antes e após a administração de tratamento, a condição do paciente pode ser monitorada. Em algumas modalidades, um paciente que recebeu um tratamento baseado em AAV pode experimentar baixas contagens de plaquetas ou trombocitopenia, que é uma afecção caracterizada particularmente por baixa contagem de plaquetas. A trombocitopenia pode ser detectada por um hemograma completo com o uso de uma amostra de sangue diluída em um hemocitômetro. A trombocitopenia pode também ser detectada observando-se uma lâmina preparada com o sangue do paciente (um filme fino de sangue ou esfregaço periférico) sob um microscópio. As contagens de plaquetas humanas normais estão na faixa de 150.000 células/ml a cerca de 450.000 células/ml.

[0116] Em algumas modalidades, o paciente tem contagens de plaquetas acima de cerca de 67.000 células/ml antes da administração ou acima de cerca de 100.000 células/ml ou acima de cerca de 150.000 células/ml. Em algumas modalidades, o paciente tem contagens de plaquetas abaixo de cerca de 150.000 células/ml antes da administração, ou abaixo de cerca de 100.000 células/ml ou abaixo de cerca de 67.000 células/ml, e é monitorado por uma a 8 semanas ou até que as contagens de plaquetas aumentem acima de cerca de 67.000 células/ml ou acima de cerca de 100.000 células/ml ou acima de cerca de 150.000 células/ml. Em algumas modalidades, quando as contagens de plaquetas estiverem abaixo de cerca de

67.000 células/ml após a administração do vetor viral, o paciente pode ser tratado com transfusão de plaquetas. Em algumas modalidades, o paciente não tem trombocitopenia antes da administração do vetor viral. Em algumas modalidades, o paciente tem trombocitopenia após a administração do vetor viral e é monitorado por cerca de uma a 8 semanas ou até que o paciente não tenha trombocitopenia. Em algumas modalidades, o paciente tem trombocitopenia após a administração do vetor viral e é tratado com uma transfusão de plaquetas.

[0117] O monitoramento da condição dos pacientes pode também envolver exames de sangue padrão que medem os níveis de uma ou mais plaquetas, eletroforese de proteínas séricas, gama-glutamil transferase (GGT) sérica, aspartato transaminase (AST) e alanina aminotransferase (ALT), bilirrubina total, glicose, creatina quinase (CK), creatinina, nitrogênio ureico no sangue (BUN), eletrólitos, fosfatase alcalina e amilase. Os níveis de troponina I são uma medida geral de saúde do coração, e níveis elevados refletem danos ao coração ou afecções relacionadas ao coração. Em algumas modalidades, os níveis de troponina I são monitorados após a administração do vetor viral. Em algumas modalidades, os pacientes podem ter níveis de troponina I menores que cerca de 0,3, 0,2, 0,15 ou 0,1 µg/ml antes da administração do vetor viral. Em algumas modalidades, os pacientes podem ter níveis de troponina I menores que cerca de 0,176 µg/ml antes da administração do vetor viral. Em algumas modalidades, os pacientes podem ter níveis de troponina I acima de cerca de 0,176 µg/ml após a administração do vetor viral. Em algumas modalidades, os pacientes recebem monitoramento cardíaco após a administração do vetor viral até que os níveis de troponina I sejam menores que cerca de 0,176 µg/ml.

[0118] A aspartato transaminase (AST) e alanina aminotransferase (ALT) e bilirrubina total são uma medida geral de função hepática, enquanto a creatinina acompanha a função renal. Níveis elevados de AST, ALT ou bilirrubina total podem indicar mau funcionamento hepático. Em algumas modalidades, o paciente tem função hepática normal antes da administração do vetor viral. Em algumas modalidades, o paciente tem níveis de transaminase hepática menores que cerca de 8 a 40 U/l antes da administração do vetor viral. Em algumas modalidades, o paciente tem níveis de AST ou ALT menores que cerca de 8 a 40 U/l antes da administração do vetor viral. Em algumas modalidades, o paciente tem gama-glutamil transferase (GGT) menor que 3 vezes o limite superior do normal, por exemplo, como determinado por padrões clínicos e métodos conhecidos na técnica, por exemplo, padrões de CLIA. Em algumas modalidades, o paciente tem níveis de bilirrubina menores que cerca de 3,0 mg/dl antes da administração do vetor viral. Em algumas modalidades, os pacientes têm níveis de creatinina menores que 1,8 mg/dl, menores que 1,4 mg/dl ou menores que 1,0 mg/dl antes da administração do vetor viral. Em algumas modalidades, os pacientes têm níveis de hemoglobina (Hgb) entre 8 a 18 g/dl antes da administração do vetor viral. Em algumas modalidades, o paciente tem contagens de leucócitos (WBC) menores que 20.000 por mm3 antes da administração do vetor viral.

[0119] Em várias modalidades, a terapia gênica usando vetores AAV conforme descrito no presente documento pode produzir uma resposta de células T antígeno-específicas ao vetor AAV, por exemplo, entre duas a 4 semanas após a transferência de gene. Uma possível consequência para tal resposta de célula T antígeno-específica é a depuração das células transduzidas e a perda da expressão de transgene. Em uma tentativa de atenuar a resposta imunológica do hospedeiro à terapia baseada em AAV, os pacientes podem receber imunossupressores. Em algumas modalidades, a resposta de células T pode ser medida por ensaio ELISPOT. Em algumas modalidades, a resposta de células T antes da administração do vetor é de 100 células formadoras de spot (SFC) por 106 de células mononucleares de sangue periférico (CMSPs). Em algumas modalidades, os pacientes podem receber glicocorticoides antes da administração de vetor viral. Em algumas modalidades, os pacientes podem receber corticoesteroide antes da administração de vetor viral. Em algumas modalidades, os pacientes podem receber um esteroide oral antes da administração de vetor viral. Exemplos de esteroides orais incluem, porém sem limitação, prednisona, prednisolona, metil prednisolona, triamcinolona, betametasona, dexametasona e hidrocortisona. Em algumas modalidades, o esteroide oral é ou compreende prednisolona.

[0120] Em algumas modalidades, o paciente começou a tomar esteroide profilático pelo menos 12 a 48 horas, por exemplo, pelo menos 24 horas, antes da administração do vetor viral. Em algumas modalidades, o paciente recebe esteroide oral pelo menos 10 a 60 dias, por exemplo, pelo menos 30 dias, após a administração do vetor viral. Em algumas modalidades, o esteroide oral é administrado uma vez ao dia. Em algumas modalidades, o esteroide oral é administrado duas vezes ao dia. Em algumas modalidades, o esteroide oral é dado em uma dose de cerca de 0,1 a 10 mg/kg, por exemplo, cerca de 1 mg/kg. Em algumas modalidades, o esteroide oral é dado em uma dose de cerca de 0,1a 10 mg/kg/dia, por exemplo, cerca de 1 mg/kg/dia. Em algumas modalidades, os níveis de AST e ALT são monitorados após a administração do vetor viral. Em tais modalidades, o tratamento com esteroide oral é administrado quando os níveis de AST e ALT excedem duas vezes o limite superior do normal, por exemplo, como determinado por padrões clínicos e métodos conhecidos na técnica, ou cerca de 120 IU/l. Em algumas modalidades, o tratamento com esteroide oral é administrado por mais de 30 dias e enquanto os níveis de AST e ALT excederem duas vezes o limite superior do normal, por exemplo, como determinado por padrões clínicos e métodos conhecidos na técnica, ou enquanto os níveis excederem cerca de 120 IU/l. Em algumas modalidades, o tratamento com esteroide oral é administrado por mais de 30 dias desde que a resposta de células T esteja acima de 100 SFC por 106 CMSPs. Em algumas modalidades, o tratamento com esteroide oral é administrado por mais de 30 dias até que a resposta de células T fique abaixo de 100 SFC por 106 CMSPs. Durante o tratamento sustentado com corticoesteroides, as glândulas adrenais diminuem naturalmente a produção de cortisol. Se o tratamento com corticosteroide for interrompido abruptamente, o corpo pode experimentar deficiência de cortisol. Em algumas modalidades em que o esteroide oral é administrado a um paciente por pelo menos 30 dias, a dose de esteroide é lentamente reduzida em um programa. Em algumas modalidades, a dose de esteroide oral é gradualmente reduzida quando os níveis de AST e ALT ficam abaixo de duas vezes o limite superior do normal, por exemplo, como determinado por padrões clínicos e métodos conhecidos na técnica, ou cerca de 120 IU/l. Em algumas modalidades, a redução gradual compreende decrementos escalonados para 0,5 mg/kg/dia por cerca de duas semanas seguido de 0,25 mg/kg/dia por cerca de mais duas semanas. Em algumas outras modalidades, a redução gradual do esteroide oral ocorre a critério do médico. Em algumas modalidades, amostras sanguíneas são coletadas e testadas quanto a anticorpos séricos para AAV9 por ELISA, anticorpos séricos para SMN por ELISA ou interferon gama (IFN-g) por ELISpots.

[0121] Os métodos de seleção de pacientes que se beneficiarão do tratamento divulgado aqui são também contemplados no presente documento. Em algumas modalidades, o paciente não é contraindicado para procedimento de punção lombar ou administração de terapia intratecal. Em algumas modalidades, o paciente não tem escoliose, ou escoliose severa, por exemplo, como definido por uma curvatura ≥50° da coluna que é evidente em um exame de raios X. Em algumas modalidades, o paciente não tem uma cirurgia ou procedimento de reparo da escoliose anterior, planejado ou esperado, programado dentro de 2 anos, dentro de 1 ano ou dentro de 6 meses após a administração do vetor viral rAAV9. Em algumas modalidades, o paciente não precisa de suporte ventilatório invasivo ou um tubo de alimentação gástrica. Em algumas modalidades, o paciente não tem um histórico de ficar de pé ou andar independentemente. Em algumas modalidades, o paciente não tem uma infecção viral ativa no momento da administração do vetor viral rAAV9. Em modalidades adicionais, essas infecções virais incluem, porém sem limitação, vírus da imunodeficiência humana (HIV) ou sorologia positiva para hepatite B ou C ou para o vírus Zika. Em algumas modalidades, o paciente não tem doença concomitante, por exemplo, insuficiência renal ou hepática importante, distúrbio convulsivo conhecido, diabetes mellitus, hipocalciúria idiopática ou cardiomiopatia sintomática. Em algumas modalidades, o paciente não tem infecções não pulmonares ou infecções do trato respiratório graves (por exemplo, pielonefrite ou meningite) dentro de quatro semanas de administração de vetor viral rAAV9. Em algumas modalidades, o paciente não tem um histórico de meningite bacteriana, doença cerebral ou da medula espinhal. Em algumas modalidades, o paciente não tem uma alergia ou hipersensibilidade conhecida a gliococorticosteroides, por exemplo, prednisona ou prednisolona, ou seus excipientes. Em algumas modalidades, o paciente não tem uma alergia ou hipersensibilidade conhecida a iodo ou produtos contendo iodo. Em algumas modalidades, o paciente não está tomando concomitantemente medicamentos para tratar miopatia ou neuropatia. Em algumas modalidades, o paciente não está recebendo terapia imunossupressora, plasmaférese, imunomoduladores, como adalimumabe, dentro de três meses após a administração de vetor viral rAAV9.

[0122] As terapias de combinação são também contempladas no presente documento. A combinação como usada no presente documento inclui tratamento simultâneo ou tratamentos sequenciais. As combinações de métodos podem incluir a adição de certos tratamentos médicos padrão (por exemplo, riluzol em ALS), e/ou combinações com terapias inovadoras. Por exemplo, outras terapias para SMA que podem ser usadas nas terapias de combinação divulgadas incluem oligonucleotídeos antissenso (ASOs) que alteram a ligação a pré-mRNA e alteram seus padrões de splicing. Singh. et al., "A multi-exon-skipping detection assay reveals surprising diversity of splice isoforms of spinal muscular atrophy genes". Plos One, 7(11):e49595. Em algumas modalidades, nusinersen (US Patentes 8.361.977 e US 8.980.853, incorporadas no presente documento a título de referência) pode ser usado. Nusinersen é um ASO aprovado que alveja o íntron 6, o éxon 7 ou o íntron 7 de pré-mRNA de SMN2, modulando o splicing de SMN2 para produzir com mais eficiência a proteína de SMN de comprimento total. Em algumas modalidades, o método de tratamento que compreende o vetor viral AAV9 é administrado em combinação com um intensificador muscular. Em algumas modalidades, um método de tratamento divulgado compreende administrar um vetor viral AAV9 em combinação com um neuroprotetor. Em algumas modalidades, um método de tratamento divulgado compreende administrar um vetor viral AAV9 em combinação com um fármaco à base de oligonucleotídeo antissenso que alveja SMN. Em algumas modalidades, um método de tratamento divulgado compreende administrar um vetor viral AAV9 em combinação com nusinersen. Em algumas modalidades, um método de tratamento divulgado compreende administrar um vetor viral AAV9 em combinação com um fármaco inibidor de miostatina. Em algumas modalidades, um método de tratamento divulgado compreende administrar um vetor viral AAV9 em combinação com estamulumabe. Em algumas modalidades, um método de tratamento divulgado compreende administrar um vetor viral AAV9 em combinação com mais de um tratamento adicional.

[0123] Os vetores virais rAAV divulgados no presente documento podem ser preparados de acordo com métodos de preparação e purificação conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, os métodos de purificação procuram remover contaminantes das células hospedeiras e produtos químicos adicionados durante a coleta de vetores virais. Em algumas modalidades, os métodos divulgados no documento PCT/US2018/058744 são usados, e esse PCT está incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade. Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV a uma concentração entre cerca de 1 x 1013 vg/ml e 1 x 1015 vg/ml, por exemplo, entre cerca de 1 a 8 x 1013 vg/ml. Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV em uma dose (por exemplo, uma dose unitária) de cerca de 1,0 x 1013 vg a 9,9 x 1014 vg. Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV em uma dose (por exemplo, uma dose unitária) de cerca de 1,0 x 1013 vg a 5,0 x 1014 vg. Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV em uma dose (por exemplo, uma dose unitária) de cerca de 5,0 x 1013 vg a 3,0 x 1014 vg. Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV em uma dose (por exemplo, uma dose unitária) de cerca de 6,0 x 1013 vg. Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV em uma dose (por exemplo, uma dose unitária) de cerca de 1,2 x 1014 vg. Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV em uma dose (por exemplo, uma dose unitária) de cerca de 2,4 x 1014 vg.

[0124] Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm menos de cerca de 10%, menos de cerca de 8%, menos de cerca de 7% ou menos de cerca de 5% de capsídeos virais vazios. Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm menos de cerca de 100 ng/ml de proteína de célula hospedeira por 1 x 1013 vg/ml. Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm menos de cerca de 5 x 106 pg/ml, menos de cerca de 1 x 106 pg/ml, menos de cerca de 7,5 x 105 pg/ml ou menos de cerca de 6,8 x 105 pg/ml de DNA de célula hospedeira residual (hcDNA) por 1 x 1013 vg/ml.

Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm menos de cerca de 10 ng, menos de cerca de 8 ng, menos de cerca de 6 ng ou menos de cerca de 4 ng de proteína de célula hospedeira residual (rHCP) por 1,0x1013 vg/ml.

Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95% ou pelo menos cerca de 100% dos genomas/ml que são funcionais.

Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm DNA plasmidial residual menor ou igual a 1,7 X 106 pg/ml por 1 X 1013 vg/ml, ou 1 X 105 pg/ml por 1 X 1013 vg/ml a 1,7 X 106 pg/ml por 1 X 1013 vg/ml.

Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm concentrações de benzonase menores que 0,2 ng por 1,0 x 1013 vg, menores que 0,1 ng por 1,0 x 1013 vg ou menores que 0,09 ng por 1,0 x 1013 vg.

Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm concentrações de albumina sérica bovina (BSA) menores que 0,5 ng por 1,0 x 1013 vg, menores que 0,3 ng por 1,0 x 1013 vg ou menores que 0,22 ng por 1,0 x 1013 vg.

Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm níveis de endotoxina menores que cerca de 1 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que 0,75 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,5 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,4 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,35 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,3 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,25 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,2 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,13 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,1 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,05 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, ou menores que cerca de 0,02 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml.

Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm concentrações de césio menores que 100 µg/g (ppm), menores que 50 µg/g (ppm) ou menores que 30 µg/g (ppm). Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm cerca de 10 a 100 ppm, 15 a 90 ppm ou cerca de 20 a 80 ppm de Poloxâmero 188. Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm menos de 2.000, menos de 1.500, menos de 1.000 ou menos de 600 partículas que são ≥25 µm de tamanho por recipiente.

Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm menos de 10000, menos de 8000, menos de 1.000 ou menos de 6000 partículas que são ≥10 µm de tamanho por recipiente.

Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm pH entre 7,5 a 8,5, entre 7,6 a 8,4 ou entre 7,8 a 8,3. Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm osmolalidade entre 330 a 490 mOsm/kg, entre 360 a 460 mOsm/kg ou entre 390 a 430 mOsm/kg.

Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm título infeccioso de cerca de 1,0x108 a 10,0x1010 IU por 1,0x1013 vg, cerca de 2,5x108 a 9,0x1010 IU por 1,0x1013 vgou cerca de 3,9x108 a 8,4x1010 IU por 1,0x1013 vg.

Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm cerca de 30 a 150%, cerca de 60 a 140% ou cerca de 70 a 130% de potência relativa com base em um ensaio baseado em células in vitro em relação a um padrão de referência e/ou controle adequado.

Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm níveis proteicos totais de cerca de 10 a 500 µg por 1,0x1013 vg, cerca de 50 a 400 µg por 1,0x1013 vg ou cerca de 100 a 300 µg por 1,0x1013 vg.

Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm uma potência in vivo como determinado por sobrevivência mediana em um camundongo de SMNΔ7 que recebeu uma dose de 7,5x1013 vg/kg por mais de 15 dias, mais de 20 dias, mais de 22 dias ou mais de 24 dias.

[0125] Em qualquer uma das modalidades acima, o método de preparação e/ou purificação pode produzir vetores virais rAAV que podem ser formulados para administração e/ou estão presentes em uma composição farmacêutica em uma dose unitária de cerca de 6,0 x 1013 vg. Em qualquer uma das modalidades acima, o método de preparação e/ou purificação pode produzir vetores virais rAAV que podem ser formulados para administração e/ou estão presentes em uma composição farmacêutica em uma dose unitária de cerca de 1,2 x 1014 vg. Em qualquer uma das modalidades acima, o método de preparação e/ou purificação pode produzir vetores virais rAAV que podem ser formulados para administração e/ou estão presentes em uma composição farmacêutica em uma dose unitária de cerca de 2,4 x 1014 vg.

[0126] Por exemplo, em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm menos de cerca de 10%, menos de cerca de 8%, menos de cerca de 7% ou menos de cerca de 5% de capsídeos virais vazios, em que os vetores virais rAAV são formulados para administração e/ou estão presentes em uma composição farmacêutica em uma dose unitária de cerca de 6,0 x 1013 vg. Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm menos de cerca de 10%, menos de cerca de 8%, menos de cerca de 7% ou menos de cerca de 5% de capsídeos virais vazios, em que os vetores virais rAAV são formulados para administração e/ou estão presentes em uma composição farmacêutica em uma dose unitária de cerca de 1,2 x 1014 vg. Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm menos de cerca de 10%, menos de cerca de 8%, menos de cerca de 7% ou menos de cerca de 5% de capsídeos virais vazios, em que os vetores virais rAAV são formulados para administração e/ou estão presentes em uma composição farmacêutica em uma dose unitária de cerca de 2,4 x 1014 vg. Em algumas modalidades, uma formulação ou composição farmacêutica compreende uma dosagem unitária de vetores virais rAAV de cerca de 6,0 x 1013 vg, em que os vetores virais rAAV têm menos de cerca de 10%, menos de cerca de 8%, menos de cerca de 7% ou menos de cerca de 5% de capsídeos virais vazios. Em algumas modalidades, uma formulação ou composição farmacêutica compreende uma dosagem unitária de vetores virais rAAV de cerca de 1,2 x 1014 vg, em que os vetores virais rAAV têm menos de cerca de 10%, menos de cerca de 8%, menos de cerca de 7% ou menos de cerca de 5% de capsídeos virais vazios. Em algumas modalidades, uma formulação ou composição farmacêutica compreende uma dosagem unitária de vetores virais rAAV de cerca de 2,4 x 1014 vg, em que os vetores virais rAAV têm menos de cerca de 10%, menos de cerca de 8%, menos de cerca de 7% ou menos de cerca de 5% de capsídeos virais vazios.

[0127] Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm menos de cerca de 100 ng/ml de proteína de célula hospedeira por 1 x 1013 vg/ml e os vetores virais rAAV são formulados para administração e/ou estão presentes em uma composição farmacêutica em uma dose unitária de cerca de 6,0 x 1013 vg. Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm menos de cerca de 100 ng/ml de proteína de célula hospedeira por 1 x 1013 vg/ml e os vetores virais rAAV são formulados para administração e/ou estão presentes em uma composição farmacêutica em uma dose unitária de cerca de 1,2 x 1014 vg. Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm menos de cerca de 100 ng/ml de proteína de célula hospedeira por 1 x 1013 vg/ml e os vetores virais rAAV são formulados para administração e/ou estão presentes em uma composição farmacêutica em uma dose unitária de cerca de 2,4 x 1014 vg. Em algumas modalidades, uma formulação ou composição farmacêutica compreende uma dosagem unitária de vetores virais rAAV de cerca de 6,0 x 1013 vg, em que os vetores virais rAAV têm menos de cerca de 100 ng/ml de proteína de célula hospedeira por 1 x 1013 vg/ml. Em algumas modalidades, uma formulação ou composição farmacêutica compreende uma dosagem unitária de vetores virais rAAV de cerca de 1,2 x 1014 vg, em que os vetores virais rAAV têm menos de cerca de 100 ng/ml de proteína de célula hospedeira por 1 x 1013 vg/ml. Em algumas modalidades, uma formulação ou composição farmacêutica compreende uma dosagem unitária de vetores virais rAAV de cerca de 2,4 x 1014 vg, em que os vetores rAAV têm menos de cerca de 100 ng/ml de proteína de célula hospedeira por 1 x 1013 vg/ml.

[0128] Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm menos de cerca de 5 x 106 pg/ml, menos de cerca de 1 x 106 pg/ml, menos de cerca de 7,5 x 105 pg/ml ou menos de cerca de 6,8 x 105 pg/ml de DNA de célula hospedeira residual (hcDNA) por 1 x 1013 vg/ml, em que os vetores virais rAAV são formulados para administração e/ou estão presentes em uma composição farmacêutica em uma dose unitária de cerca de 6,0 x 1013 vg. Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm menos de cerca de 5 x 106 pg/ml, menos de cerca de 1 x 106 pg/ml, menos de cerca de 7,5 x 105 pg/ml ou menos de cerca de 6,8 x 105 pg/ml de DNA de célula hospedeira residual (hcDNA) por 1 x 1013 vg/ml, em que os vetores virais rAAV são formulados para administração e/ou estão presentes em uma composição farmacêutica em uma dose unitária de cerca de 1,2 x 1014 vg. Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm menos de cerca de 5 x 106 pg/ml, menos de cerca de 1 x 106 pg/ml, menos de cerca de 7,5 x 105 pg/ml ou menos de cerca de 6,8 x 105 pg/ml de DNA de célula hospedeira residual (hcDNA) por 1 x 1013 vg/ml, em que os vetores virais rAAV são formulados para administração e/ou estão presentes em uma composição farmacêutica em uma dose unitária de cerca de 2,4 x 1014 vg. Em algumas modalidades, uma formulação ou composição farmacêutica compreende uma dosagem unitária de vetores virais rAAV de cerca de 6,0 x 1013 vg, em que os vetores virais rAAV têm menos de cerca de 5 x 106 pg/ml, menos de cerca de 1 x 106 pg/ml, menos de cerca de 7,5 x 105 pg/ml ou menos de cerca de 6,8 x 105 pg/ml de DNA de célula hospedeira residual (hcDNA) por 1 x 1013 vg/ml. Em algumas modalidades, uma formulação ou composição farmacêutica compreende uma dosagem unitária de vetores virais rAAV de cerca de 1,2 x 1014 vg, em que os vetores virais rAAV têm menos de cerca de 5 x 106 pg/ml, menos de cerca de cerca de 1 x 106 pg/ml, menos de cerca de 7,5 x 105 pg/ml ou menos de cerca de 6,8 x 105 pg/ml de DNA de célula hospedeira residual (hcDNA) por 1 x 1013 vg/ml. Em algumas modalidades, uma formulação ou composição farmacêutica compreende uma dosagem unitária de vetores virais rAAV de cerca de 2,4 x 1014 vg, em que os vetores virais rAAV têm menos de cerca de 5 x 106 pg/ml, menos de cerca de 1 x 106 pg/ml, menos de cerca de 7,5 x 105 pg/ml ou menos de cerca de 6,8 x 105 pg/ml de DNA de célula hospedeira residual (hcDNA) por 1 x 1013 vg/ml.

[0129] Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm menos de cerca de 10 ng, menos de cerca de 8 ng, menos de cerca de 6 ng ou menos de cerca de 4 ng de proteína de célula hospedeira residual (rHCP) por 1,0x1013 vg/ml, em que os vetores virais rAAV são formulados para administração e/ou estão presentes em uma composição farmacêutica em uma dose unitária de cerca de 6,0 x 1013 vg. Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm menos de cerca de 10 ng, menos de cerca de 8 ng, menos de cerca de 6 ng ou menos de cerca de 4 ng de proteína de célula hospedeira residual (rHCP) por 1,0x1013 vg/ml, em que os vetores virais rAAV são formulados para administração e/ou estão presentes em uma composição farmacêutica em uma dose unitária de cerca de 1,2 x 1014 vg. Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm menos de cerca de 10 ng, menos de cerca de 8 ng, menos de cerca de 6 ng ou menos de cerca de 4 ng de proteína de célula hospedeira residual (rHCP) por 1,0x1013 vg/ml, em que os vetores virais rAAV são formulados para administração e/ou estão presentes em uma composição farmacêutica em uma dose unitária de cerca de 2,4 x 1014 vg. Em algumas modalidades, uma formulação ou composição farmacêutica compreende uma dosagem unitária de vetores virais rAAV de cerca de 6,0 x 1013 vg, em que os vetores virais rAAV têm menos de cerca de 10 ng, menos de cerca de 8 ng, menos de cerca de 6 ng ou menos de cerca de 4 ng de proteína de célula hospedeira residual (rHCP) por 1,0x1013 vg/ml. Em algumas modalidades, uma formulação ou composição farmacêutica compreende uma dosagem unitária de vetores virais rAAV de cerca de 1,2 x 1014 vg, em que os vetores virais rAAV têm menos de cerca de 10 ng, menos de cerca de 8 ng, menos de cerca de 6 ng ou menos de cerca de 4 ng de proteína de célula hospedeira residual (rHCP) por 1,0x1013 vg/ml. Em algumas modalidades, uma formulação ou composição farmacêutica compreende uma dosagem unitária de vetores virais rAAV de cerca de 2,4 x 1014 vg, em que os vetores virais rAAV têm menos de cerca de 10 ng, menos de cerca de 8 ng, menos de cerca de 6 ng ou menos de cerca de 4 ng de proteína de célula hospedeira residual (rHCP) por 1,0x1013 vg/ml.

[0130] Em algumas modalidades, os métodos produzem pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95% ou pelo menos cerca de 100% dos genomas de vetor viral AAV9/ml são funcionais, em que os vetores virais rAAV são formulados para administração e/ou estão presentes em uma composição farmacêutica em uma dose unitária de cerca de 6,0 x 1013 vg.

Em algumas modalidades, os métodos produzem pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95% ou pelo menos cerca de 100% dos genomas de vetor viral AAV9/ml são funcionais, em que os vetores virais rAAV são formulados para administração e/ou estão presentes em uma composição farmacêutica em uma dose unitária de cerca de 1,2 x 1014 vg.

Em algumas modalidades, os métodos produzem pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95% ou pelo menos cerca de 100% dos genomas de vetor viral AAV9/ml são funcionais, em que os vetores virais rAAV são formulados para administração e/ou estão presentes em uma composição farmacêutica em uma dose unitária de cerca de 2,4 x 1014 vg.

Em algumas modalidades, uma formulação ou composição farmacêutica compreende uma dosagem unitária de vetores virais rAAV de cerca de 6,0 x 1013 vg, em que cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95% ou pelo menos cerca de 100% dos genomas de vetor viral rAAV/ml (por exemplo, rAAV9) são funcionais.

Em algumas modalidades, uma formulação ou composição farmacêutica compreende uma dosagem unitária de vetores virais rAAV de cerca de 1,2 x 1014 vg, em que cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95% ou pelo menos cerca de 100% dos genomas de vetor viral rAAV/ml (por exemplo, rAAV9) são funcionais.

Em algumas modalidades, uma formulação ou composição farmacêutica compreende uma dosagem unitária de vetores virais rAAV de cerca de 2,4 x 1014 vg, em que os vetores virais rAAV, em que cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95% ou pelo menos cerca de 100% dos genomas de vetor viral rAAV/ml (por exemplo, rAAV9) são funcionais.

[0131] Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm DNA plasmidial residual menor ou igual a 1,7 X 106 pg/ml por 1 X 1013 vg/ml, ou 1 X 105 pg/ml por 1 X 1013 vg/ml a 1,7 X 106 pg/ml por 1 X 1013 vg/ml, em que os vetores virais rAAV são formulados para administração e/ou estão presentes em uma composição farmacêutica em uma dose unitária de cerca de 6,0 x 1013 vg. Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm DNA plasmidial residual menor ou igual a 1,7 X 106 pg/ml por 1 X 1013 vg/ml, ou 1 X 105 pg/ml por 1 X 1013 vg/ml a 1,7 X 106 pg/ml por 1 X 1013 vg/ml, em que os vetores virais rAAV são formulados para administração e/ou estão presentes em uma composição farmacêutica em uma dose unitária de cerca de 1,2 x 1014 vg. Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm DNA plasmidial residual menor ou igual a 1,7 X 106 pg/ml por 1 X 1013 vg/ml, ou 1 X 105 pg/ml por 1 X 1013 vg/ml a 1,7 X 106 pg/ml por 1 X 1013 vg/ml, em que os vetores virais rAAV são formulados para administração e/ou estão presentes em uma composição farmacêutica em uma dose unitária de cerca de 2,4 x 1014 vg. Em algumas modalidades, uma formulação ou composição farmacêutica compreende uma dosagem unitária de vetores virais rAAV de cerca de 6,0 x 1013 vg, em que os vetores virais rAAV têm DNA plasmidial residual menor ou igual a 1,7 X 106 pg/ml por 1 X 1013 vg/ml, ou 1 X 105 pg/ml por 1 X 1013 vg/ml a 1,7 X 106 pg/ml por 1 X 1013 vg/ml. Em algumas modalidades, uma formulação ou composição farmacêutica compreende uma dosagem unitária de vetores virais rAAV de cerca de 1,2 x 1014 vg, em que os vetores virais rAAV têm DNA plasmidial residual menor ou igual a 1.7 X

106 pg/ml por 1 X 1013 vg/ml, ou 1 X 105 pg/ml por 1 X 1013 vg/ml a 1,7 X 106 pg/ml por 1 X 1013 vg/ml. Em algumas modalidades, uma formulação ou composição farmacêutica compreende uma dosagem unitária de vetores virais rAAV de cerca de 2,4 x 1014 vg, em que os vetores virais rAAV têm DNA plasmidial residual menor ou igual a 1,7 X 106 pg/ml por 1 X 1013 vg/ml, ou 1 X 105 pg/ml por 1 X 1013 vg/ml a 1,7 X 106 pg/ml por 1 X 1013 vg/ml.

[0132] Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm concentrações de benzonase menores que 0,2 ng por 1,0 x 1013 vg, menores que 0,1 ng por 1,0 x 1013 vg ou menores que 0,09 ng por 1,0 x 1013 vg, em que os vetores virais rAAV são formulados para administração e/ou estão presentes em uma composição farmacêutica em uma dose unitária de cerca de 6,0 x 1013 vg. Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm concentrações de benzonase menores que 0,2 ng por 1,0 x 1013 vg, menores que 0,1 ng por 1,0 x 1013 vg ou menores que 0,09 ng por 1,0 x 1013 vg, em que os vetores virais rAAV são formulados para administração e/ou estão presentes em uma composição farmacêutica em uma dose unitária de cerca de 1,2 x 1014 vg. Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm concentrações de benzonase menores que 0,2 ng por 1,0 x 1013 vg, menores que 0,1 ng por 1,0 x 1013 vg ou menores que 0,09 ng por 1,0 x 1013 vg, em que os vetores virais rAAV são formulados para administração e/ou estão presentes em uma composição farmacêutica em uma dose unitária de cerca de 2,4 x 1014 vg. Em algumas modalidades, uma formulação ou composição farmacêutica compreende uma dosagem unitária de vetores virais rAAV de cerca de 6,0 x 1013 vg, em que os vetores virais rAAV têm concentrações de benzonase menores que 0,2 ng por 1,0 x 1013 vg, menores que 0,1 ng por 1,0 x 1013 vg ou menores que 0,09 ng por 1,0 x 1013 vg. Em algumas modalidades, uma formulação ou composição farmacêutica compreende uma dosagem unitária de vetores virais rAAV de cerca de 1,2 x 1014 vg, em que os vetores virais rAAV têm concentrações de benzonase menores que 0,2 ng por 1,0 x 1013 vg, menores que 0,1 ng por 1,0 x 1013 vg ou menores que 0,09 ng por 1,0 x 1013 vg. Em algumas modalidades, uma formulação ou composição farmacêutica compreende uma dosagem unitária de vetores virais rAAV de cerca de 2,4 x 1014 vg, em que os vetores virais rAAV têm concentrações de benzonase menores que 0,2 ng por 1,0 x 1013 vg, menores que 0,1 ng por 1,0 x 1013 vg ou menores que 0,09 ng por 1,0 x 1013 vg.

[0133] Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm concentrações de albumina sérica bovina (BSA) menores que 0,5 ng por 1,0 x 1013 vg, menores que 0,3 ng por 1,0 x 1013 vg ou menores que 0,22 ng por 1,0 x 1013 vg, em que os vetores virais rAAV são formulados para administração e/ou estão presentes em uma composição farmacêutica em uma dose unitária de cerca de 6,0 x 1013 vg. Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm concentrações de albumina sérica bovina (BSA) menores que 0,5 ng por 1,0 x 1013 vg, menores que 0,3 ng por 1,0 x 1013 vg ou menores que 0,22 ng por 1,0 x 1013 vg, em que os vetores virais rAAV são formulados para administração e/ou estão presentes em uma composição farmacêutica em uma dose unitária de cerca de 1,2 x 1014 vg. Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm concentrações de albumina sérica bovina (BSA) menores que 0,5 ng por 1,0 x 1013 vg, menores que 0,3 ng por 1,0 x 1013 vg ou menores que 0,22 ng por 1,0 x 1013 vg, em que os vetores virais rAAV são formulados para administração e/ou estão presentes em uma composição farmacêutica em uma dose unitária de cerca de 2,4 x 1014 vg. Em algumas modalidades, uma formulação ou composição farmacêutica compreende uma dosagem unitária de vetores virais rAAV de cerca de 6,0 x 1013 vg, em que os vetores virais rAAV têm concentrações de albumina sérica bovina (BSA) menores que 0,5 ng por 1,0 x 1013 vg, menores que 0,3 ng por 1,0 x 1013 vg ou menores que 0,22 ng por 1,0 x 1013 vg. Em algumas modalidades, uma formulação ou composição farmacêutica compreende uma dosagem unitária de vetores virais rAAV de cerca de 1,2 x 1014 vg, em que os vetores virais rAAV têm concentrações de albumina sérica bovina (BSA) menores que 0,5 ng por 1,0 x 1013 vg, menores que 0,3 ng por 1,0 x 1013 vg ou menores que 0,22 ng por 1,0 x 1013 vg. Em algumas modalidades, uma formulação ou composição farmacêutica compreende uma dosagem unitária de vetores virais rAAV de cerca de 2,4 x 1014 vg, em que os vetores virais rAAV têm concentrações de albumina sérica bovina (BSA) menores que 0,5 ng por 1,0 x 1013 vg, menores que 0,3 ng por 1,0 x 1013 vg ou menores que 0,22 ng por 1,0 x 1013 vg.

[0134] Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm níveis de endotoxina menores que cerca de 1 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,75 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,5 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,4 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,35 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,3 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,25 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,2 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,13 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,1 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,05 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml ou menores que cerca de 0,02 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, em que os vetores virais rAAV são formulados para administração e/ou estão presentes em uma composição farmacêutica em uma dose unitária de cerca de 6,0 x 1013 vg. Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm níveis de endotoxina menores que cerca de 1 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,75 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml,

menores que cerca de 0,5 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,4 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,35 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,3 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,25 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,2 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,13 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,1 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,05 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml ou menores que cerca de 0,02 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, em que os vetores virais rAAV são formulados para administração e/ou estão presentes em uma composição farmacêutica em uma dose unitária de cerca de 1,2 x 1014 vg.

Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm níveis de endotoxina menores que cerca de 1 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,75 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,5 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,4 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,35 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,3 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,25 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,2 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,13 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,1 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,05 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml ou menores que cerca de 0,02 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, em que os vetores virais rAAV são formulados para administração e/ou estão presentes em uma composição farmacêutica em uma dose unitária de cerca de 2,4 x 1014 vg.

Em algumas modalidades, uma formulação ou composição farmacêutica compreende uma dosagem unitária de vetores virais rAAV de cerca de 6,0 x 1013 vg, em que os vetores virais rAAV têm níveis de endotoxina menores que 1 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que 0,75 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,5 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,4 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,35 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,3

EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,25 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,2 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,13 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,1 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,05 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml ou menores que cerca de 0,02 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml.

Em algumas modalidades, uma formulação ou composição farmacêutica compreende uma dosagem unitária de vetores virais rAAV de cerca de 1,2 x 1014 vg, em que os vetores virais rAAV têm níveis de endotoxina menores que cerca de 1 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que 0,75 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,5 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,4 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,35 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,3 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,25 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,2 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,13 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,1 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,05 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml ou menores que cerca de 0,02 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml.

Em algumas modalidades, uma formulação ou composição farmacêutica compreende uma dosagem unitária de vetores virais rAAV de cerca de 2,4 x 1014 vg, em que os vetores virais rAAV têm níveis de endotoxina menores que cerca de 1 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que 0,75 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,5 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,4 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,35 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,3 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,25 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,2 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,13 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,1 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,05 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml ou menores que cerca de 0,02 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml.

[0135] Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm concentrações de césio menores que 100 µg/g (ppm), menores que 50 µg/g (ppm) ou menores que 30 µg/g (ppm), em que os vetores virais rAAV são formulados para administração e/ou estão presentes em uma composição farmacêutica em uma dose unitária de cerca de 6,0 x 1013 vg.

Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm concentrações de césio menores que 100 µg/g (ppm), menores que 50 µg/g (ppm) ou menores que 30 µg/g (ppm), em que os vetores virais rAAV são formulados para administração e/ou estão presentes em uma composição farmacêutica em uma dose unitária de cerca de 1,2 x 1014 vg.

Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm concentrações de césio menores que 100 µg/g (ppm), menores que 50 µg/g (ppm) ou menores que 30 µg/g (ppm), em que os vetores virais rAAV são formulados para administração e/ou estão presentes em uma composição farmacêutica em uma dose unitária de cerca de 2,4 x 1014 vg.

Em algumas modalidades, uma formulação ou composição farmacêutica compreende uma dosagem unitária de vetores virais rAAV de cerca de 6,0 x 1013 vg, em que os vetores virais rAAV têm concentrações de césio menores que 100 µg/g (ppm), menores que 50 µg/g (ppm) ou menores que 30 µg/g (ppm). Em algumas modalidades, uma formulação ou composição farmacêutica compreende uma dosagem unitária de vetores virais rAAV de cerca de 12 x 1014 vg, em que os vetores virais rAAV têm concentrações de césio menores que 100 µg/g (ppm), menores que 50 µg/g (ppm) ou menores que 30 µg/g (ppm). Em algumas modalidades, uma formulação ou composição farmacêutica compreende uma dosagem unitária de vetores virais rAAV de cerca de 2,4 x 1014 vg, em que os vetores virais rAAV têm concentrações de césio menores que 100 µg/g (ppm), menores que 50 µg/g (ppm) ou menores que 30 µg/g (ppm).

[0136] Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm cerca de 10 a 100 ppm, 15 a 90 ppm ou cerca de 20 a 80 ppm de Poloxâmero 188, em que os vetores virais rAAV são formulados para administração e/ou estão presentes em uma composição farmacêutica em uma dose unitária de cerca de 6,0 x 1013 vg. Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm cerca de 10 a 100 ppm, 15 a 90 ppm ou cerca de 20 a 80 ppm de Poloxâmero 188, em que os vetores virais rAAV são formulados para administração e/ou estão presentes em uma composição farmacêutica em uma dose unitária de cerca de 1,2 x 1014 vg. Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm cerca de 10 a 100 ppm, 15 a 90 ppm ou cerca de 20 a 80 ppm de Poloxâmero 188, em que os vetores virais rAAV são formulados para administração e/ou estão presentes em uma composição farmacêutica em uma dose unitária de cerca de 2,4 x 1014 vg. Em algumas modalidades, uma formulação ou composição farmacêutica compreende uma dosagem unitária de vetores virais rAAV de cerca de 6,0 x 1013 vg, em que os vetores virais rAAV têm cerca de 10 a 100 ppm, 15 a 90 ppm ou cerca de 20 a 80 ppm de Poloxâmero 188. Em algumas modalidades, uma formulação ou composição farmacêutica compreende uma dosagem unitária de vetores virais rAAV de cerca de 1,2 x 1014 vg, em que os vetores virais rAAV têm cerca de 10 a 100 ppm, 15 a 90 ppm ou cerca de 20 a 80 ppm de Poloxâmero 188. Em algumas modalidades, uma formulação ou composição farmacêutica compreende uma dosagem unitária de vetores virais rAAV de cerca de 2,4 x 1014 vg, em que os vetores virais rAAV têm cerca de 10 a 100 ppm, 15 a 90 ppm ou cerca de 20 a 80 ppm de Poloxâmero 188.

[0137] Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm menos de 2.000, menos de 1.500, menos de 1.000 ou menos de 600 partículas que são ≥25 µm de tamanho por recipiente,

em que os vetores virais rAAV são formulados para administração e/ou estão presentes em uma composição farmacêutica em uma dose unitária de cerca de 6,0 x 1013 vg. Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm menos de 2.000, menos de 1.500, menos de 1.000 ou menos de 600 partículas que são ≥25 µm de tamanho por recipiente, em que os vetores virais rAAV são formulados para administração e/ou estão presentes em uma composição farmacêutica em uma dose unitária de cerca de 1,2 x 1014 vg. Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm menos de 2.000, menos de 1.500, menos de 1.000 ou menos de 600 partículas que são ≥25 µm de tamanho por recipiente, em que os vetores virais rAAV são formulados para administração e/ou estão presentes em uma composição farmacêutica em uma dose unitária de cerca de 2,4 x 1014 vg. Em algumas modalidades, uma formulação ou composição farmacêutica compreende uma dosagem unitária de vetores virais rAAV de cerca de 6,0 x 1013 vg, em que os vetores virais rAAV têm menos de 2.000, menos de 1.500, menos de

1.000 ou menos de 600 partículas que são ≥25 µm de tamanho por recipiente. Em algumas modalidades, uma formulação ou composição farmacêutica compreende uma dosagem unitária de vetores virais rAAV de cerca de 1,2 x 1014 vg, em que os vetores virais rAAV têm menos de

2.000, menos de 1.500, menos de 1.000 ou menos de 600 partículas que são ≥25 µm de tamanho por recipiente. Em algumas modalidades, uma formulação ou composição farmacêutica compreende uma dosagem unitária de vetores virais rAAV de cerca de 2,4 x 1014 vg, em que os vetores virais rAAV têm menos de 2.000, menos de 1.500, menos de 1.000 ou menos de 600 partículas que são ≥25 µm de tamanho por recipiente.

[0138] Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm menos de 10.000, menos de 8.000, menos de 1.000 ou menos de 6000 partículas que são ≥10 µm de tamanho por recipiente, em que os vetores virais rAAV são formulados para administração e/ou estão presentes em uma composição farmacêutica em uma dose unitária de cerca de 6,0 x 1013 vg. Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm menos de 10.000, menos de 8.000, menos de 1.000 ou menos de 6000 partículas que são ≥10 µm de tamanho por recipiente, em que os vetores virais rAAV são formulados para administração e/ou estão presentes em uma composição farmacêutica em uma dose unitária de cerca de 1,2 x 1014 vg. Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm menos de 10.000, menos de 8.000, menos de 1.000 ou menos de 6000 partículas que são ≥10 µm de tamanho por recipiente, em que os vetores virais rAAV são formulados para administração e/ou estão presentes em uma composição farmacêutica em uma dose unitária de cerca de 2,4 x 1014 vg. Em algumas modalidades, uma formulação ou composição farmacêutica compreende uma dosagem unitária de vetores virais rAAV de cerca de 6,0 x 1013 vg, em que os vetores virais rAAV têm menos de 10.000, menos de 8.000, menos de 1.000 ou menos de 6000 partículas que são ≥10 µm de tamanho por recipiente. Em algumas modalidades, uma formulação ou composição farmacêutica compreende uma dosagem unitária de vetores virais rAAV de cerca de 1,2 x 1014 vg, em que os vetores virais rAAV têm menos de 10.000, menos de 8.000, menos de

1.000 ou menos de 6000 partículas que são ≥10 µm de tamanho por recipiente. Em algumas modalidades, uma formulação ou composição farmacêutica compreende uma dosagem unitária de vetores virais rAAV de cerca de 2,4 x 1014 vg, em que os vetores virais rAAV têm menos de

10.000, menos de 8.000, menos de 1.000 ou menos de 6000 partículas que são ≥10 µm de tamanho por recipiente.

[0139] Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm pH entre 7,5 a 8,5, entre 7,6 a 8,4 ou entre 7,8 a 8,3, em que os vetores virais rAAV são formulados para administração e/ou estão presentes em uma composição farmacêutica em uma dose unitária de cerca de 6,0 x 1013 vg. Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm pH entre 7,5 a 8,5, entre 7,6 a 8,4 ou entre 7,8 a 8,3, em que os vetores virais rAAV são formulados para administração e/ou estão presentes em uma composição farmacêutica em uma dose unitária de cerca de 1,2 x 1014 vg. Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm pH entre 7,5 a 8,5, entre 7,6 a 8,4 ou entre 7,8 a 8,3, em que os vetores virais rAAV são formulados para administração e/ou estão presentes em uma composição farmacêutica em uma dose unitária de cerca de 2,4 x 1014 vg. Em algumas modalidades, uma formulação ou composição farmacêutica compreende uma dosagem unitária de vetores virais rAAV de cerca de 6,0 x 1013 vg, em que os vetores virais rAAV têm pH entre 7,5 a 8,5, entre 7,6 a 8,4 ou entre 7,8 a 8,3. Em algumas modalidades, uma formulação ou composição farmacêutica compreende uma dosagem unitária de vetores virais rAAV de cerca de 1,2 x 1014 vg, em que os vetores virais rAAV têm pH entre 7,5 a 8,5, entre 7,6 a 8,4 ou entre 7,8 a 8,3. Em algumas modalidades, uma formulação ou composição farmacêutica compreende uma dosagem unitária de vetores virais rAAV de cerca de 2,4 x 1014 vg, em que os vetores virais rAAV têm pH entre 7,5 a 8,5, entre 7,6 a 8,4 ou entre 7,8 a 8,3.

[0140] Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm osmolalidade entre 330 a 490 mOsm/kg, entre 360 a 460 mOsm/kg ou entre 390 a 430 mOsm/kg, em que os vetores virais rAAV são formulados para administração e/ou estão presentes em uma composição farmacêutica em uma dose unitária de cerca de 6,0 x 1013 vg. Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm osmolalidade entre 330 a 490 mOsm/kg, entre 360 a 460 mOsm/kg ou entre 390 a 430 mOsm/kg, em que os vetores virais rAAV são formulados para administração e/ou estão presentes em uma composição farmacêutica em uma dose unitária de cerca de 1,2 x 1014 vg. Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm osmolalidade entre 330 a 490 mOsm/kg, entre 360 a 460 mOsm/kg ou entre 390 a 430 mOsm/kg, em que os vetores virais rAAV são formulados para administração e/ou estão presentes em uma composição farmacêutica em uma dose unitária de cerca de 2,4 x 1014 vg. Em algumas modalidades, uma formulação ou composição farmacêutica compreende uma dosagem unitária de vetores virais rAAV de cerca de 6,0 x 1013 vg, em que os vetores virais rAAV têm osmolalidade entre 330 a 490 mOsm/kg, entre 360 a 460 mOsm/kg ou entre 390 a 430 mOsm/kg. Em algumas modalidades, uma formulação ou composição farmacêutica compreende uma dosagem unitária de vetores virais rAAV de cerca de 1,2 x 1014 vg, em que os vetores virais rAAV têm osmolalidade entre 330 a 490 mOsm/kg, entre 360 a 460 mOsm/kg ou entre 390 a 430 mOsm/kg. Em algumas modalidades, uma formulação ou composição farmacêutica compreende uma dosagem unitária de vetores virais rAAV de cerca de 2,4 x 1014 vg, em que os vetores virais rAAV têm osmolalidade entre 330 a 490 mOsm/kg, entre 360 a 460 mOsm/kg ou entre 390 a 430 mOsm/kg.

[0141] Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm título infeccioso de cerca de 1,0x108 a 10,0x1010 IU por 1,0x1013 vg, cerca de 2,5x108 a 9,0x1010 IU por 1,0x1013 vgou cerca de 3,9x108 a 8,4x1010 IU por 1,0x1013 vg, em que os vetores virais rAAV são formulados para administração e/ou estão presentes em uma composição farmacêutica em uma dose unitária de cerca de 6,0 x 1013 vg. Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm título infeccioso de cerca de 1,0x108 a 10,0x1010 IU por

1,0x1013 vg, cerca de 2,5x108 a 9,0x1010 IU por 1,0x1013 vgou cerca de 3,9x108 a 8,4x1010 IU por 1,0x1013 vg, em que os vetores virais rAAV são formulados para administração e/ou estão presentes em uma composição farmacêutica em uma dose unitária de cerca de 1,2 x 1014 vg. Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm título infeccioso de cerca de 1,0x108 a 10,0x1010 IU por 1,0x1013 vg, cerca de 2,5x108 a 9,0x1010 IU por 1,0x1013 vgou cerca de 3,9x108 a 8,4x1010 IU por 1,0x1013 vg, em que os vetores virais rAAV são formulados para administração e/ou estão presentes em uma composição farmacêutica em uma dose unitária de cerca de 2,4 x 1014 vg. Em algumas modalidades, uma formulação ou composição farmacêutica compreende uma dosagem unitária de vetores virais rAAV de cerca de 6,0 x 1013 vg, em que os vetores virais rAAV têm título infeccioso de cerca de 1,0x108 a 10,0x1010 IU por 1,0x1013 vg, cerca de 2,5x108 a 9,0x1010 IU por 1,0x1013 vgou cerca de 3,9x108 a 8,4x1010 IU por 1,0x1013 vg. Em algumas modalidades, uma formulação ou composição farmacêutica compreende uma dosagem unitária de vetores virais rAAV de cerca de 1,2 x 1014 vg, em que os vetores virais rAAV têm título infeccioso de cerca de 1,0x108 a 10,0x1010 IU por 1,0x1013 vg, cerca de 2,5x108 a 9,0x1010 IU por 1,0x1013 vgou cerca de 3,9x108 a 8,4x1010 IU por 1,0x1013 vg. Em algumas modalidades, uma formulação ou composição farmacêutica compreende uma dosagem unitária de vetores virais rAAV de cerca de 2,4 x 1014 vg, em que os vetores virais rAAV têm título infeccioso de cerca de 1,0x108 a 10,0x1010 IU por 1,0x1013 vg, cerca de 2,5x108 a 9,0x1010 IU por 1,0x1013 vgou cerca de 3,9x108 a 8,4x1010 IU por 1,0x1013 vg.

[0142] Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm cerca de 30 a 150%, cerca de 60 a 140% ou cerca de 70 a 130% de 70 a 130% de potência relativa com base em um ensaio baseado em células in vitro em relação a um padrão de referência e/ou controle adequado, em que os vetores virais rAAV são formulados para administração e/ou estão presentes em uma composição farmacêutica em uma dose unitária de cerca de 6,0 x 1013 vg.

Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm cerca de 30 a 150%, cerca de 60 a 140% ou cerca de 70 a 130% de 70 a 130% de potência relativa com base em um ensaio baseado em células in vitro em relação a um padrão de referência e/ou controle adequado, em que os vetores virais rAAV são formulados para administração e/ou estão presentes em uma composição farmacêutica em uma dose unitária de cerca de 1,2 x 1014 vg.

Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm cerca de 30 a 150%, cerca de 60 a 140% ou cerca de 70 a 130% de 70 a 130% de potência relativa com base em um ensaio baseado em células in vitro em relação a um padrão de referência e/ou controle adequado, em que os vetores virais rAAV são formulados para administração e/ou estão presentes em uma composição farmacêutica em uma dose unitária de cerca de 2,4 x 1014 vg.

Em algumas modalidades, uma formulação ou composição farmacêutica compreende uma dosagem unitária de vetores virais rAAV de cerca de 6,0 x 1013 vg, em que os vetores virais rAAV têm cerca de 30 a 150%, cerca de 60 a 140% ou cerca de 70 a 130% de potência relativa com base em um ensaio baseado em células in vitro em relação a um padrão de referência e/ou controle adequado.

Em algumas modalidades, uma formulação ou composição farmacêutica compreende uma dosagem unitária de vetores virais rAAV de cerca de 1,2 x 1014 vg, em que os vetores virais rAAV têm cerca de 30 a 150%, cerca de 60 a 140% ou cerca de 70 a 130% de potência relativa com base em um ensaio baseado em células in vitro em relação a um padrão de referência e/ou controle adequado.

Em algumas modalidades, uma formulação ou composição farmacêutica compreende uma dosagem unitária de vetores virais rAAV de cerca de 2,4 x 1014 vg, em que os vetores virais rAAV têm cerca de 30 a 150%, cerca de 60 a 140% ou cerca de 70 a 130% de potência relativa com base em um ensaio baseado em células in vitro em relação a um padrão de referência e/ou controle adequado.

[0143] Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm níveis proteicos totais de cerca de 10 a 500 µg por 1,0x1013 vg, cerca de 50 a 400 µg por 1,0x1013 vg ou cerca de 100 a 300 µg por 1,0x1013 vg, em que os vetores virais rAAV são formulados para administração e/ou estão presentes em uma composição farmacêutica em uma dose unitária de cerca de 6,0 x 1013 vg. Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm níveis proteicos totais de cerca de 10 a 500 µg por 1,0x1013 vg, cerca de 50 a 400 µg por 1,0x1013 vg ou cerca de 100 a 300 µg por 1,0x1013 vg, em que os vetores virais rAAV são formulados para administração e/ou estão presentes em uma composição farmacêutica em uma dose unitária de cerca de 1,2 x 1014 vg. Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm níveis proteicos totais de cerca de 10 a 500 µg por 1,0x1013 vg, cerca de 50 a 400 µg por 1,0x1013 vg ou cerca de 100 a 300 µg por 1,0x1013 vg, em que os vetores virais rAAV são formulados para administração e/ou estão presentes em uma composição farmacêutica em uma dose unitária de cerca de 2,4 x 1014 vg. Em algumas modalidades, uma formulação ou composição farmacêutica compreende uma dosagem unitária de vetores virais rAAV de cerca de 6,0 x 1013 vg, em que os vetores virais rAAV têm níveis proteicos totais de cerca de 10 a 500 µg por 1,0x1013 vg, cerca de 50 a 400 µg por 1,0x1013 vg ou cerca de 100 a 300 µg por 1,0x1013 vg. Em algumas modalidades, uma formulação ou composição farmacêutica compreende uma dosagem unitária de vetores virais rAAV de cerca de 1,2 x 1014 vg, em que os vetores virais rAAV têm níveis proteicos totais de cerca de 10 a 500 µg por 1,0x1013 vg, cerca de 50 a 400 µg por 1,0x1013 vg ou cerca de 100 a 300 µg por 1,0x1013 vg. Em algumas modalidades, uma formulação ou composição farmacêutica compreende uma dosagem unitária de vetores virais rAAV de cerca de 2,4 x 1014 vg, em que os vetores virais rAAV têm níveis proteicos totais de cerca de 10 a 500 µg por 1,0x1013 vg, cerca de 50 a 400 µg por 1,0x1013 vg ou cerca de 100 a 300 µg por 1,0x1013 vg.

[0144] Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm uma potência in vivo como determinado por sobrevivência mediana em um camundongo de SMNΔ7 que recebeu uma dose de 7,5x1013 vg/kg por mais de 15 dias, mais de 20 dias, mais de 22 dias ou mais de 24 dias, em que os vetores virais rAAV são formulados para administração e/ou estão presentes em uma composição farmacêutica em uma dose unitária de cerca de 6,0 x 1013 vg. Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm uma potência in vivo como determinado por sobrevivência mediana em um camundongo de SMNΔ7 que recebeu uma dose de 7,5x1013 vg/kg por mais de 15 dias, mais de 20 dias, mais de 22 dias ou mais de 24 dias, em que os vetores virais rAAV são formulados para administração e/ou estão presentes em uma composição farmacêutica em uma dose unitária de cerca de 1,2 x 1014 vg. Em algumas modalidades, os métodos produzem vetores virais rAAV que têm uma potência in vivo como determinado por sobrevivência mediana em um camundongo de SMNΔ7 que recebeu uma dose de 7,5x1013 vg/kg por mais de 15 dias, mais de 20 dias, mais de 22 dias ou mais de 24 dias, em que os vetores virais rAAV são formulados para administração e/ou estão presentes em uma composição farmacêutica em uma dose unitária de cerca de 2,4 x 1014 vg. Em algumas modalidades, uma formulação ou composição farmacêutica compreende uma dosagem unitária de vetores virais rAAV de cerca de 6,0 x 1013 vg, em que os vetores virais rAAV têm uma potência in vivo como determinado por sobrevivência mediana em um camundongo de SMNΔ7 que recebeu uma dose de 7,5x1013 vg/kg por mais de 15 dias, mais de 20 dias, mais de 22 dias ou mais de 24 dias. Em algumas modalidades, uma formulação ou composição farmacêutica compreende uma dosagem unitária de vetores virais rAAV de cerca de 1,2 x 1014 vg, em que os vetores virais rAAV têm uma potência in vivo como determinado por sobrevivência mediana em um camundongo de SMNΔ7 que recebeu uma dose de 7,5x1013 vg/kg por mais de 15 dias, mais de 20 dias, mais de 22 dias ou mais de 24 dias. Em algumas modalidades, uma formulação ou composição farmacêutica compreende uma dosagem unitária de vetores virais rAAV de cerca de 2,4 x 1014 vg, em que os vetores virais rAAV têm uma potência in vivo como determinado por sobrevivência mediana em um camundongo de SMNΔ7 que recebeu uma dose de 7,5x1013 vg/kg por mais de 15 dias, mais de 20 dias, mais de 22 dias ou mais de 24 dias.

[0145] Em algumas modalidades, uma formulação ou composição farmacêutica compreende uma dosagem unitária de vetores virais rAAV de cerca de 6,0 x 1013 vg e um ou mais dos seguintes critérios de liberação: menos de cerca de 10%, menos de cerca de 8%, menos de cerca de 7% ou menos de cerca de 5% de capsídeos virais vazios; menos de cerca de 100 ng/ml de proteína de célula hospedeira por 1 x 1013 vg/ml; menos de cerca de 5 x 106 pg/ml, menos de cerca de 1 x 106 pg/ml, menos de cerca de 7,5 x 105 pg/ml ou menos de cerca de 6,8 x 105 pg/ml de DNA de célula hospedeira residual (hcDNA) por 1 x 1013 vg/ml; menos de cerca de 10 ng, menos de cerca de 8 ng, menos de cerca de 6 ng ou menos de cerca de 4 ng de proteína de célula hospedeira residual (rHCP) por 1,0x1013 vg/ml; pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95% ou pelo menos cerca de 100% de genomas de vetor viral rAAV/ml que são funcionais; DNA plasmidial residual menor ou igual a 1,7 X 106 pg/ml por 1 X 1013 vg/ml ou 1 X 105 pg/ml por 1 X 1013 vg/ml a 1,7 X 106 pg/ml por 1 X 1013 vg/ml; concentrações de benzonase menores que 0,2 ng por 1,0 x 1013 vg, menores que 0,1 ng por 1,0 x 1013 vg ou menores que 0,09 ng por 1,0 x 1013 vg; concentrações de albumina sérica bovina (BSA) menores que 0,5 ng por 1,0 x 1013 vg, menores que 0,3 ng por 1,0 x 1013 vg ou menores que 0,22 ng por 1,0 x 1013 vg; níveis de endotoxina menores que cerca de 1 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,75 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,5 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,4 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,35 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,3 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,25 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,2 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,13 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,1 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,05 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml ou menores que cerca de 0,02 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml; concentrações de césio menores que 100 µg/g (ppm), menores que 50 µg/g (ppm) ou menores que 30 µg/g (ppm); cerca de 10 a 100 ppm, 15 a 90 ppm ou cerca de 20 a 80 ppm de Poloxâmero 188; menos de 2.000, menos de 1.500, menos de 1.000 ou menos de 600 partículas que são ≥25 µm de tamanho por recipiente; menos de

10.000, menos de 8.000, menos de 1.000 ou menos de 6.000 partículas que são ≥10 µm de tamanho por recipiente; pH entre 7,5 a 8,5, entre 7,6 a 8,4 ou entre 7,8 a 8,3; osmolalidade entre 330 a 490 mOsm/kg, entre 360 a 460 mOsm/kg ou entre 390 a 430 mOsm/kg; título infeccioso de cerca de 1,0x108 a 10,0x1010 IU por 1,0x1013 vg, cerca de 2,5x108 a 9,0x1010 IU por 1,0x1013 vgou cerca de 3,9x108 a 8,4x1010 IU por 1,0x1013 vg; cerca de 30 a 150%, cerca de 60 a 140% ou cerca de 70 a 130% de potência relativa com base em um ensaio baseado em células in vitro em relação a um padrão de referência e/ou controle adequado;

níveis proteicos totais de cerca de 10 a 500 µg por 1,0x1013 vg, cerca de 50 a 400 µg por 1,0x1013 vg ou cerca de 100 a 300 µg por 1,0x1013 vg; uma potência in vivo como determinado pela sobrevivência mediana em um camundongo de SMNΔ7 que recebeu uma dose de 7,5x1013 vg/kg por mais de 15 dias, mais de 20 dias, mais de 22 dias ou mais de 24 dias.

[0146] Em algumas modalidades, uma formulação ou composição farmacêutica compreende uma dosagem unitária de vetores virais rAAV de cerca de 6,0 x 1013 vg e um ou mais dos seguintes critérios de liberação: pH de cerca de 7,7 a 8,3; osmolalidade de cerca de 390 a 430 mOsm/kg; menos de cerca de 600 partículas que são ≥ 25 µm de tamanho por recipiente; menos de cerca de 6.000 partículas que são ≥ 10 µm de tamanho por recipiente, cerca de 1,7 x 1013 a 5,3 x 1013 vg/ml de título genômico; título infeccioso de cerca de 3,9 x 108 a 8,4 x 1010 IU por 1,0 x 1013 vg; níveis proteicos totais de cerca de 100 a 300 µg por 1,0 x 1013 vg; teor de Pluronic F-68 de cerca de 20 a 80 ppm; potência relativa de cerca de 70 a 130% com base em um ensaio baseado em células in vitro, em que a potência é relativa a um padrão de referência e/ou controle adequado; potência in vivo caracterizada por sobrevivência mediana em um modelo de camundongo de SMNΔ7 maior ou igual a 24 dias em uma dose de 7,5 x 1013 vg/kg; menor que cerca de 5% de capsídeo vazio; uma pureza total maior ou igual a cerca de 95%; menor ou igual a cerca de 0,13 EU/ml de endotoxina.

[0147] Em algumas modalidades, uma formulação ou composição farmacêutica compreende uma dosagem unitária de vetores virais rAAV de cerca de 6,0 x 1013 vg e um ou mais dos seguintes critérios de liberação: menos de cerca de 0,09 ng de benzonase por 1,0x1013 vg; menos de cerca de 30 µg/g (ppm) de césio; cerca de 20 a 80 ppm de Poloxâmero 188; menos de cerca de 0,22 ng de BSA por 1,0x1013 vg; menos de cerca de 6,8x105 pg de DNA plasmidial residual por 1,0x1013 vg; menos de cerca de 1,1x105 pg de hcDNA residual por 1,0x1013 vg; menos de cerca de 4 ng de rHCP por 1,0x1013 vg; pH de cerca de 7,7 a 8,3; osmolalidade de cerca de 390 a 430 mOsm/kg; menos de cerca de 600 partículas que são ≥ 25 µm de tamanho por recipiente; menos de cerca de 6.000 partículas que são ≥ 10 µm de tamanho por recipiente; cerca de 1,7 x 1013 a 5,3 x 1013 vg/ml de título genômico; título infeccioso de cerca de 3,9 x 108 a 8,4 x 1010 IU por 1,0 x 1013 vg; níveis proteicos totais de cerca de 100 a 300 µg por 1,0 x 1013 vg; potência relativa de cerca de 70 a 130% com base em um ensaio baseado em células in vitro, em que a potência é relativa a um padrão de referência e/ou controle adequado; menos de cerca de 5% de capsídeo vazio.

[0148] Em algumas modalidades, uma formulação ou composição farmacêutica compreende uma dosagem unitária de vetores virais rAAV de cerca de 1,2 x 1014 vg e um ou mais dos seguintes critérios de liberação: menos de cerca de 10%, menos de cerca de 8%, menos de cerca de 7% ou menos de cerca de 5% de capsídeos virais vazios; menos de cerca de 100 ng/ml de proteína de célula hospedeira por 1 x 1013 vg/ml; menos de cerca de 5 x 106 pg/ml, menos de cerca de 1 x 106 pg/ml, menos de cerca de 7,5 x 105 pg/ml ou menos de cerca de 6,8 x 105 pg/ml de DNA de célula hospedeira residual (hcDNA) por 1 x 1013 vg/ml; menos de cerca de 10 ng, menos de cerca de 8 ng, menos de cerca de 6 ng ou menos de cerca de 4 ng de proteína de célula hospedeira residual (rHCP) por 1,0x1013 vg/ml; pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95% ou pelo menos cerca de 100% de genomas de vetor viral rAAV/ml que são funcionais; DNA plasmidial residual menor ou igual a 1,7 X 106 pg/ml por 1 X 1013 vg/ml ou 1 X 105 pg/ml por 1 X 1013 vg/ml a 1,7 X 106 pg/ml por 1 X 1013 vg/ml; concentrações de benzonase menores que 0,2 ng por 1,0 x 1013 vg, menores que 0,1 ng por 1,0 x 1013 vg ou menores que 0,09 ng por 1,0 x 1013 vg; concentrações de albumina sérica bovina (BSA) menores que 0,5 ng por 1,0 x 1013 vg, menores que 0,3 ng por 1,0 x 1013 vg ou menores que 0,22 ng por 1,0 x 1013 vg; níveis de endotoxina menores que cerca de 1 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,75 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,5 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,4 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,35 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,3 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,25 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,2 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,13 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,1 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,05 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml ou menores que cerca de 0,02 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml; concentrações de césio menores que 100 µg/g (ppm), menores que 50 µg/g (ppm) ou menores que 30 µg/g (ppm); cerca de 10 a 100 ppm, 15 a 90 ppm ou cerca de 20 a 80 ppm de Poloxâmero 188; menos de 2.000, menos de 1.500, menos de 1.000 ou menos de 600 partículas que são ≥25 µm de tamanho por recipiente; menos de

10.000, menos de 8.000, menos de 1.000 ou menos de 6.000 partículas que são ≥10 µm de tamanho por recipiente; pH entre 7,5 a 8,5, entre 7,6 a 8,4 ou entre 7,8 a 8,3; osmolalidade entre 330 a 490 mOsm/kg, entre 360 a 460 mOsm/kg ou entre 390 a 430 mOsm/kg; título infeccioso de cerca de 1,0x108 a 10,0x1010 IU por 1,0x1013 vg, cerca de 2,5x108 a 9,0x1010 IU por 1,0x1013 vgou cerca de 3,9x108 a 8,4x1010 IU por 1,0x1013 vg; cerca de 30 a 150%, cerca de 60 a 140% ou cerca de 70 a 130% de potência relativa com base em um ensaio baseado em células in vitro em relação a um padrão de referência e/ou controle adequado; níveis proteicos totais de cerca de 10 a 500 µg por 1,0x1013 vg, cerca de 50 a 400 µg por 1,0x1013 vg ou cerca de 100 a 300 µg por 1,0x1013 vg; uma potência in vivo como determinado pela sobrevivência mediana em um camundongo de SMNΔ7 que recebeu uma dose de 7,5x1013 vg/kg por mais de 15 dias, mais de 20 dias, mais de 22 dias ou mais de 24 dias.

[0149] Em algumas modalidades, uma formulação ou composição farmacêutica compreende uma dosagem unitária de vetores virais rAAV de cerca de 1,2 x 1014 vg e um ou mais dos seguintes critérios de liberação: pH de cerca de 7,7 a 8,3; osmolalidade de cerca de 390 a 430 mOsm/kg; menos de cerca de 600 partículas que são ≥ 25 µm de tamanho por recipiente; menos de cerca de 6.000 partículas que são ≥ 10 µm de tamanho por recipiente, cerca de 1,7 x 1013 a 5,3 x 1013 vg/ml de título genômico; título infeccioso de cerca de 3,9 x 108 a 8,4 x 1010 IU por 1,0 x 1013 vg; níveis proteicos totais de cerca de 100 a 300 µg por 1,0 x 1013 vg; teor de Pluronic F-68 de cerca de 20 a 80 ppm; potência relativa de cerca de 70 a 130% com base em um ensaio baseado em células in vitro, em que a potência é relativa a um padrão de referência e/ou controle adequado; potência in vivo caracterizada por sobrevivência mediana em um modelo de camundongo de SMNΔ7 maior ou igual a 24 dias em uma dose de 7,5 x 1013 vg/kg; menor que cerca de 5% de capsídeo vazio; uma pureza total maior ou igual a cerca de 95%; menor ou igual a cerca de 0,13 EU/ml de endotoxina.

[0150] Em algumas modalidades, uma formulação ou composição farmacêutica compreende uma dosagem unitária de vetores virais rAAV de cerca de 1,2 x 1014 vg e um ou mais dos seguintes critérios de liberação: menos de cerca de 0,09 ng de benzonase por 1,0x1013 vg; menos de cerca de 30 µg/g (ppm) de césio; cerca de 20 a 80 ppm de Poloxâmero 188; menos de cerca de 0,22 ng de BSA por 1,0x1013 vg; menos de cerca de 6,8x105 pg de DNA plasmidial residual por 1,0x1013 vg; menos de cerca de 1,1x105 pg de hcDNA residual por 1,0x1013 vg; menos de cerca de 4 ng de rHCP por 1,0x1013 vg; pH de cerca de 7,7 a 8,3; osmolalidade de cerca de 390 a 430 mOsm/kg; menos de cerca de 600 partículas que são ≥ 25 µm de tamanho por recipiente; menos de cerca de 6.000 partículas que são ≥ 10 µm de tamanho por recipiente; cerca de 1,7 x 1013 a 5,3 x 1013 vg/ml de título genômico; título infeccioso de cerca de 3,9 x 108 a 8,4 x 1010 IU por 1,0 x 1013 vg; níveis proteicos totais de cerca de 100 a 300 µg por 1,0 x 1013 vg; potência relativa de cerca de 70 a 130% com base em um ensaio baseado em células in vitro, em que a potência é relativa a um padrão de referência e/ou controle adequado; menos de cerca de 5% de capsídeo vazio.

[0151] Em algumas modalidades, uma formulação ou composição farmacêutica compreende uma dosagem unitária de vetores virais rAAV de cerca de 2,4 x 1014 vg e um ou mais dos seguintes critérios de liberação: menos de cerca de 10%, menos de cerca de 8%, menos de cerca de 7% ou menos de cerca de 5% de capsídeos virais vazios; menos de cerca de 100 ng/ml de proteína de célula hospedeira por 1 x 1013 vg/ml; menos de cerca de 5 x 106 pg/ml, menos de cerca de 1 x 106 pg/ml, menos de cerca de 7,5 x 105 pg/ml ou menos de cerca de 6,8 x 105 pg/ml de DNA de célula hospedeira residual (hcDNA) por 1 x 1013 vg/ml; menos de cerca de 10 ng, menos de cerca de 8 ng, menos de cerca de 6 ng ou menos de cerca de 4 ng de proteína de célula hospedeira residual (rHCP) por 1,0x1013 vg/ml; pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95% ou pelo menos cerca de 100% de genomas de vetor viral rAAV/ml que são funcionais; DNA plasmidial residual menor ou igual a 1,7 X 106 pg/ml por 1 X 1013 vg/ml ou 1 X 105 pg/ml por 1 X 1013 vg/ml a 1,7 X 106 pg/ml por 1 X 1013 vg/ml; concentrações de benzonase menores que 0,2 ng por 1,0 x 1013 vg, menores que 0,1 ng por 1,0 x 1013 vg ou menores que 0,09 ng por 1,0 x 1013 vg; concentrações de albumina sérica bovina (BSA) menores que 0,5 ng por 1,0 x 1013 vg, menores que 0,3 ng por 1,0 x 1013 vg ou menores que 0,22 ng por 1,0 x 1013 vg; níveis de endotoxina menores que cerca de 1 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,75 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,5 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,4 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,35 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,3 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,25 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,2 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,13 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,1 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml, menores que cerca de 0,05 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml ou menores que cerca de 0,02 EU/ml por 1,0x1013 vg/ml; concentrações de césio menores que 100 µg/g (ppm), menores que 50 µg/g (ppm) ou menores que 30 µg/g (ppm); cerca de 10 a 100 ppm, 15 a 90 ppm ou cerca de 20 a 80 ppm de Poloxâmero 188; menos de 2.000, menos de 1.500, menos de 1.000 ou menos de 600 partículas que são ≥25 µm de tamanho por recipiente; menos de

[0152] Em algumas modalidades, uma formulação ou composição farmacêutica compreende uma dosagem unitária de vetores virais rAAV de cerca de 2,4 x 1014 vg e um ou mais dos seguintes critérios de liberação: pH de cerca de 7,7 a 8,3; osmolalidade de cerca de 390 a 430 mOsm/kg; menos de cerca de 600 partículas que são ≥ 25 µm de tamanho por recipiente; menos de cerca de 6.000 partículas que são ≥ 10 µm de tamanho por recipiente, cerca de 1,7 x 1013 a 5,3 x 1013 vg/ml de título genômico; título infeccioso de cerca de 3,9 x 108 a 8,4 x 1010 IU por 1,0 x 1013 vg; níveis proteicos totais de cerca de 100 a 300 µg por 1,0 x 1013 vg; teor de Pluronic F-68 de cerca de 20 a 80 ppm; potência relativa de cerca de 70 a 130% com base em um ensaio baseado em células in vitro, em que a potência é relativa a um padrão de referência e/ou controle adequado; potência in vivo caracterizada por sobrevivência mediana em um modelo de camundongo de SMNΔ7 maior ou igual a 24 dias em uma dose de 7,5 x 1013 vg/kg; menor que cerca de 5% de capsídeo vazio; uma pureza total maior ou igual a cerca de 95%; menor ou igual a cerca de 0,13 EU/ml de endotoxina.

[0153] Em algumas modalidades, uma formulação ou composição farmacêutica compreende uma dosagem unitária de vetores virais rAAV de cerca de 2,4 x 1014 vg e um ou mais dos seguintes critérios de liberação: menos de cerca de 0,09 ng de benzonase por 1,0x1013 vg; menos de cerca de 30 µg/g (ppm) de césio; cerca de 20 a 80 ppm de Poloxâmero 188; menos de cerca de 0,22 ng de BSA por 1,0x1013 vg; menos de cerca de 6,8x105 pg de DNA plasmidial residual por 1,0x1013 vg; menos de cerca de 1,1x105 pg de hcDNA residual por 1,0x1013 vg; menos de cerca de 4 ng de rHCP por 1,0x1013 vg; pH de cerca de 7,7 a 8,3; osmolalidade de cerca de 390 a 430 mOsm/kg; menos de cerca de 600 partículas que são ≥ 25 µm de tamanho por recipiente; menos de cerca de 6.000 partículas que são ≥ 10 µm de tamanho por recipiente; cerca de 1,7 x 1013 a 5,3 x 1013 vg/ml de título genômico; título infeccioso de cerca de 3,9 x 108 a 8,4 x 1010 IU por 1,0 x 1013 vg; níveis proteicos totais de cerca de 100 a 300 µg por 1,0 x 1013 vg; potência relativa de cerca de 70 a 130% com base em um ensaio baseado em células in vitro, em que a potência é relativa a um padrão de referência e/ou controle adequado; menos de cerca de 5% de capsídeo vazio.

[0154] A presente divulgação é adicionalmente ilustrada pelos seguintes exemplos que não devem ser interpretados como limitantes. O conteúdo de todas as referências, patentes e pedidos de patentes publicados citados ao longo deste pedido, bem como as figuras, estão incorporados no presente documento a título de referência em sua totalidade para todos os propósitos.

EXEMPLOS Exemplo Pré-Clínico

[0155] O camundongo de SMNΔ7 é um modelo adequado para estudar a transferência de gene. Butchbach et al., "Abnormal motor phenotype in the SMNΔ7 mouse model of spinal muscular atrophy". Neurobiology of disease, 27(2): 207-19. Injeção de 5 × 1011 genomas virais de scAAV9.CB.SMN na veia facial nos camundongos no dia 1 resgata o modelo de camundongo de SMNΔ7. Foust et al., "Rescue of the spinal muscular atrophy phenotype in a mouse model by early postnatal delivery of SMN". Nature biotechnology, 28(3): 271-4. Aproximadamente 42 ± 2% de neurônios motores espinhais lombares foram transduzidos em camundongos tratados com scAAV9.CB.SMN. Os níveis de SMN aumentaram também, no cérebro, medula espinhal e músculo de animais tratados com scAAV9.CB.SMN, em comparação com camundongos com SMA não tratados (embora mais baixos do que os controles WT). Os animais com SMA tratados com scAAV9.CB.SMN ou scAAV9.CB.GFP em P1 foram avaliados quanto à sua capacidade de voltar à posição normal e foram comparados com camundongos controle do Tipo Selvagem (WT) e camundongos não tratados. Os controles WT puderam voltar à sua posição normal rapidamente, enquanto os animais com SMA tratados com SMN e Proteína Verde

Fluorescente (GFP) mostraram dificuldade em P5. Entretanto, por P13, 90% de animais tratados com SMN puderam voltar à sua posição normal em comparação com 20% de controles tratados com GFP e 0% de animais com SMA não tratados. Em P18, os animais tratados com SMN eram maiores que os animais tratados com GFP, porém menores que os controles WT. A capacidade locomotiva dos camundongos tratados com SMN foi quase idêntica aos controles WT, conforme testado por testes de campo aberto e roda de corrida.

[0156] A sobrevivência de animais com SMA tratados com SMN em comparação com animais com SMA tratados com GFP foi significativamente melhorada. Nenhum animal de controle tratado com GFP sobreviveu após P22 e teve um tempo de vida mediano de 15,5 dias. Os pesos dos camundongos GFP atingiram o pico em P10 e, então, diminuíram precipitadamente até a morte, enquanto os camundongos SMN mostraram um ganho de peso constante até cerca de P40 com estabilização em 17 g (cerca de metade do peso de controles WT). O menor tamanho dos animais corrigidos está provavelmente relacionado ao tropismo e à transdução incompleta de scAAV9, resultando em um animal "quimérico" em que algumas células não foram transduzidas. Adicionalmente, o menor tamanho sugere uma função embrionária para SMN. Mais notavelmente, os camundongos tratados com SMN sobreviveram bem após 250 dias de idade.

[0157] A biodistribuição de toxicologia também foi estudada. Nos estudos de não boas práticas de laboratório (não BPL), 24 camundongos e 4 primatas não humanos (NHPs) foram injetados, por meio de entrega vascular, com scAAV9.CB.SMN. Para avaliar a toxicidade e a segurança, scAAV9.CB.SMN foi injetado em camundongos tipo friend virus b (FVB) tipo selvagem P1 com veículo (STF) (3 machos/6 fêmeas) ou 3,3 × 1014 vg/kg de scAAV9.CB.SMN (6 machos/9 fêmeas) através da veia temporal facial. Essa dose anteriormente revelou ser mais eficaz no modelo de camundongo SMNΔ7 de SMA16. Os camundongos P1 foram usados em antecipação à simulação de estudos clínicos potenciais em bebês, que é a população planejada para o primeiro ensaio clínico em seres humanos. Todos os camundongos sobreviveram ao procedimento de injeção e ao período inicial de observação de 24 horas sem quaisquer sinais de angústia ou perda de peso. A massa corporal foi medida e observações práticas foram realizadas semanalmente durante o restante do estudo; nenhum revelou qualquer diferença entre as coortes de controle e tratadas (Figura 1).

[0158] Aos 60, 90 e 180 dias após a injeção, o sangue dos camundongos foi coletado por estudos hematológicos e avaliação de produtos químicos clínicos (ALT, AST, ALK Phos, creatinina, BUN, eletrólitos e CK). Todos estavam normais, exceto para uma variante no ponto de tempo de 90 dias. Essa diferença parecia ser devido a um problema técnico relacionado ao local de coleta de sangue, que era diferente de todos os outros camundongos. Para histopatologia, 13 camundongos foram necropsiados 120 dias após a injeção e 8 camundongos aos 180 dias. Todos os órgãos estavam normais; em particular não houve inflamação observada em qualquer seção de qualquer órgão (coração, fígado, rins, músculo, gônadas, cérebro, pulmão, nódulos linfáticos e intestinos).

[0159] No estudo de segurança para os quatro macacos cinomolgos (Cynomolgus Macaques) machos, os indivíduos foram injetados aos 90 dias de idade para simular a idade provável de administração de tratamento em bebês com SMA Tipo I. O vetor scAAV9.CB.SMN foi administrado uma vez por cateterização da veia safena com uma dose de 6,7 × 1013/kg, que corresponde à menor dose testada para a qual os camundongos SMN-Δ7 mostraram um aumento s de sobrevivência. Os animais foram acompanhados por seis meses até serem sacrificados com aproximadamente 9 meses de idade. Nenhum efeito adverso foi observado, e todos os produtos químicos eram normais. A resposta imunológica das células T foi testada usando ELISpot em células mononucleares do sangue periférico (CMSPs), e todas foram negativas 6 meses após a injeção.

[0160] Nestes estudos não-GLP, os estudos de química sérica e hematologia foram pouco notáveis, assim como a avaliação histopatológica. Os indivíduos NHP montaram respostas imunológicas adequadas a capsídeo (porém não a transgene), com expressão de transgene muito alta persistindo 6 meses após a injeção. Esses estudos fornecem forte evidência de que o scAAV9.CB.SMN entregue sistemicamente é seguro e bem tolerado, mesmo em altas doses usadas para a penetração da barreira hematoencefálica. Foust et al. Nat. Biotechnol., 28(3), páginas 271-274 (2010).

[0161] Quando camundongos FVB recém-nascidos receberam uma única injeção intravenosa de scAAV9.CB.SMN em níveis de até 3,3 × 1014 vg/kg no Dia 1, não houve mortalidade relacionada ao artigo de teste nem evidência de toxicidade observada em pontos de tempo até 24 semanas após a administração. Reduções relacionadas ao tratamento no peso corporal médio e ganho de peso corporal médio, bem como valores mais baixos do tempo de tromboplastina parcial ativada (APTT), foram efeitos leves de tratamento, porém não produziram toxicidade.

[0162] A atividade de scAAV9.CB.SMN foi demonstrada pela biodistribuição e pela presença de uma expressão de ácido ribonucleico (RNA) transgene específico no cérebro e na medula espinhal, os principais tecidos terapêuticos alvejados. Baixos níveis de anticorpos para o capsídeo de AAV9 foram encontrados após 12 e 24 semanas em indivíduos do sexo masculino e feminino que receberam 3,3 × 1014/kg (Grupo 3). Nenhuma alteração foi observada em análises de patologia e histopatologia clínicas. Com base nesses resultados, o nível sem efeitos adversos observáveis (NOAEL) de scAAV9.CB.SMN em camundongos machos e fêmeas recém-nascidos é considerado como 3,3 × 1014 vg/kg.

[0163] Nesses estudos, a administração intratecal de scAAV9.CB.SMN ao LCR foi segura e bem tolerada em camundongos (até a Semana 12) e macacos (até 14 meses após a injeção). A entrega de LCR em camundongos provavelmente reduziu a exposição periférica de scAAV9.CB.SMN e os resultados da reação em cadeia da polimerase qualitativa (qPCR) indicam que a expressão do transgene foi maior nas regiões cervical e lombar em comparação com a região torácica. Os macacos foram mantidos na posição de Trendelenburg por 5 minutos na injeção e foram confirmados soronegativos para anticorpos anti-AAV9 antes da injeção. Todos os primatas não humanos foram altamente positivos para anticorpos de AAV9 até 6 meses após a injeção. Nenhuma resposta citotóxica de linfócitos T ao capsídeo de AAV9 ou transgene SMN foi observada 6 meses após a injeção. Nenhuma degradação do tecido ou resposta reativa no cérebro ou medula espinhal foi observada.

[0164] Em estudos fundamentais de toxicologia em camundongos de 3 meses de acordo com as Boas Práticas de Laboratório (BPL), os principais órgãos-alvo de toxicidade foram o coração e o fígado. Após a infusão IV no camundongo, o vetor e o transgene foram amplamente distribuídos com a expressão mais alta geralmente observada no coração e no fígado, e expressão substancial no cérebro e na medula espinhal. Os achados relacionados a AVXS-101 nos ventrículos do coração foram compreendidos de inflamação, edema e fibrose relacionados à dose, e no átrio, inflamação e trombose. Os achados hepáticos foram compreendidos de hipertrofia hepatocelular, ativação de células de Kupffer e necrose hepatocelular espalhada. Um NOAEL não foi identificado para achados cardíacos e hepáticos relacionados a AVXS-101 no camundongo, e a Dose Máxima Tolerada foi definida como 1,5 × 1014 vg/kg, fornecendo uma margem de segurança de aproximadamente 1,4 vez em relação à dose terapêutica recomendada de 1,1 × 1014 vg/kg. A traduzibilidade dos achados observados em camundongos para primatas não é conhecida nesse momento.

[0165] Esses dados sustentam o avanço para testes clínicos.

[0166] Para determinar se a entrega de LCR pode reduzir a transdução de órgãos periféricos em comparação com as injeções intravenosas (IV), uma análise de biodistribuição detalhada foi realizada no tecido dos primatas não humanos que foram colocados de cabeça para baixo na posição de Trendelenburg por 5 ou 10 minutos (n =5). Esses animais foram selecionados em vez dos primatas não humanos que não foram colocados de cabeça para baixo, pois o tratamento melhorou muito a distribuição na medula espinhal e no cérebro, favorecendo essa abordagem para testes clínicos. Duas semanas após a injeção, os macacos cinomolgos foram sacrificados e vários tecidos foram coletados para realizar análises detalhadas de biodistribuição de Ácido Desoxirribonucleico (DNA) e RNA. scAAV9.CBA.GFP foi mais baixo na maioria dos tecidos periféricos, exceto no baço e no fígado, em comparação com os níveis elevados no cérebro e na medula espinhal. Esses achados estão de acordo com relatórios anteriores de outros grupos. Dirren et al., "Intracerebroventricular injection of adeno- associated virus 6 and 9 vectors for cell type specific transgene expression in the spinal cord". Hum Gene Ther 25: 109–120; Gray et al., "Global CNS gene delivery and evasion of anti-AAV-neutralizing antibodies by intrathecal AAV administration in non-human primates". Gene Ther 20: 450–459. Nos músculos esqueléticos e no SNC, há uma forte correlação entre os níveis de DNA e RNA, enquanto nos tecidos moles e glândulas, os níveis de RNA são geralmente mais baixos do que o esperado para os genomas virais detectados. Em particular, testículos, intestinos e baço mostram 1.000 vezes menos moléculas de RNA do que de DNA. Apesar da detecção de AAV em órgãos periféricos, houve uma diminuição significativa na quantidade de vetor perifericamente detectado em comparação com a injeção sistêmica. Dirren et al.; Gray et al. Além disso, observações similares foram feitas comparando-se camundongos que foram injetados por via intravenosa ou intracerebroventricular em P1 24 semanas após o tratamento. Assim, a entrega de LCR está adicionando um componente de segurança potencial significativo para futuros testes clínicos com AVXS-101.

[0167] Em algumas modalidades, o posicionamento de Trendelenburg melhora a entrega de LCR. A dosagem e a eficácia de scAAV9-SMN foram avaliadas em camundongos e primatas não humanos com SMA, entregue diretamente ao LCR por meio de injeção única. A expressão de transgene amplamente distribuída foi observada em toda a medula espinhal em camundongos e primatas não humanos quando se utiliza uma dose 10 vezes menor em comparação com a aplicação IV. Em primatas não humanos, doses mais baixas do que em camundongos podem ser usadas para eficiência de alvejamento de neurônio motor similar. Foi verificado que a eficácia da transdução melhorou ainda mais quando os indivíduos foram mantidos na posição de Trendelenburg para facilitar o espalhamento do vetor. Meyer et al., "Improving single injection CSF delivery of AAV9-mediated gene therapy for SMA: a dose-response study in mice and nonhuman primates". Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy 23, 477-487. A inclinação dos animais melhorou significativamente a transdução na região torácica e cervical da medula espinhal, conforme demonstrado por imunofluorescência e quantificação de neurônios motores duplamente positivos GFP/ChAT. A inclinação por 10 minutos foi suficiente para aumentar a transdução do neurônio motor para 55,

62 e 80% na região cervical, torácica e lombar, respectivamente, o que implica grandes benefícios para os pacientes de acordo com o resgate observado no modelo de camundongo. As contagens de neurônios motores fortemente correlacionadas com a quantificação do transcrito de GFP em cada um dos segmentos da medula espinhal. Exemplo 1 - Protocolo de Teste Clínico

[0168] Um teste clínico aberto de administração de dose única de Fase 1 é realizado em bebês e crianças com um diagnóstico genético consistente com SMA, deleção bialélica de SMN1 e 3 cópias de SMN2 sem o modificador genético que têm capacidade de se sentar, porém podem ficar de pé ou andar no momento de entrada no estudo. Os pacientes recebem AVXS-101 em um estudo de segurança de comparação de dose de até três (3) doses terapêuticas potenciais, conforme descrito abaixo. Os pacientes são estratificados em dois grupos, aqueles ≥6 meses e < 24 meses de idade no momento de dosagem e aqueles ≥ 24 meses e < 60 meses de idade no momento de dosagem. Pelo menos quinze (15) pacientes ≥6 meses e < 24 meses são inscritos e doze (12) pacientes ≥ 24 e < 60 meses são inscritos.

[0169] A primeira coorte inscreve três (3) pacientes (Coorte 1) ≥6 meses e < 24 meses de idade que receberão a administração de 6,0 × 1013 vg de AVXS-101 (Dose A). Há pelo menos um intervalo de quatro (4) semanas entre a dosagem de cada paciente dentro da coorte. Os investigadores consultam o Comitê de Monitoramento de Segurança de Dados (DSMB) sobre todos os AEs de Grau III ou mais altos dentro de 48 horas de consciência que estão possivelmente, provavelmente ou definitivamente relacionados ao agente do estudo antes de continuar a inscrição. Após a inscrição dos três primeiros pacientes e com base nos dados de segurança disponíveis, uma decisão é tomada se: a) parar devido à toxicidade ou b) prosseguir para a Coorte 2 usando a Dose B.

[0170] Para a Dose B, três (3) pacientes < 60 meses de idade são inscritos para receber administração de 1,2 × 1014 vg de AVXS-101 (Dose B). Novamente, há um intervalo de pelo menos 4 semanas entre a dosagem dos três pacientes dentro da coorte. Com base nos dados de segurança disponíveis dos três pacientes da Coorte 2 e de todos os pacientes da Coorte 1, mais intervalos de 4 semanas entre a dosagem de pacientes podem ser desnecessários. Os investigadores consultam o DSMB sobre todos os AEs de Grau III ou mais altos dentro de 48 horas que estão possivelmente, provavelmente ou definitivamente relacionados ao agente do estudo antes de continuar a inscrição. Após a inscrição dos seis (6) primeiros pacientes e com base nos dados de segurança disponíveis, uma decisão é tomada se a) parar devido à toxicidade ou b) continuar a inscrever mais 21 pacientes até doze (12) pacientes ≥6 meses e < 24 meses e doze (12) pacientes ≥ 24 meses e < 60 meses receberam a Dose B.

[0171] Com base em uma avaliação contínua de dados de segurança e eficácia de pacientes tratados com a dose de 1,2 × 1014 vg, é considerado o teste de uma terceira dose (Dose C). Três (3) pacientes < 60 meses de idade receberam a Dose C, que será de até 2,4 × 1014 vg administrada por via intratecal. Há novamente um intervalo de quatro semanas entre a dosagem dos três primeiros pacientes que receberam a Dose C, como nas Coortes 1 e 2. Após a inscrição dos três (3) primeiros pacientes que receberam a Dose C e com base nos dados de segurança disponíveis, uma decisão é tomada se a) parar devido à toxicidade ou b) continuar a inscrever mais 21 pacientes até haver um total de doze (12) pacientes > 6 meses e < 24 meses e doze (12) pacientes ≥ 24 e < 60 meses que receberam a Dose C.

[0172] A seleção da dose adequada e a justificativa para o teste de Dose C podem ser apoiadas por análises contínuas de segurança e eficácia de achados clínicos dos pacientes que receberam a Dose B (1,2 × 1014 vg). A dose selecionada é de até 2,4 × 1014 vg entregue por via intratecal. Doses de até 1,1 × 1014 vg/kg foram administradas com segurança por via sistêmica (intravenosa) a crianças pesando até 8,4 kg (dose total de 9,24 × 1014 vg). Além disso, em estudos pré-clínicos, a administração intratecal de scAAV9.CB.SMN foi segura e bem tolerada até 14 meses após a injeção em grandes primatas não humanos em uma dose de 2 × 1013 vg/kg.

[0173] O projeto geral do estudo está resumido na Figura 2

[0174] A segurança é avaliada através de monitoramento de relatórios de eventos adversos (AE) e do uso concomitante de medicamentos, e pela realização de exames físicos, avaliações de sinais vitais, avaliações cardiovasculares e avaliações laboratoriais. Os pacientes são observados no hospital por 48 horas após a injeção intratecal. Os pacientes retornam para visitas de acompanhamento nos dias 7, 14, 21 e 30. Os pacientes retornam mensalmente depois disso, após a visita do Dia 30, por 12 meses a partir da administração da dose. Após a conclusão do estudo, solicita-se que os pacientes do estudo se inscrevam em um estudo vital de acompanhamento de longo prazo para examinar a segurança duradoura do AVXS-101 por até 15 anos. Número de Pacientes

[0175] Pelo menos 27 pacientes estão inscritos; até 51 pacientes podem ser inscritos se o escalonamento de Dose C for determinado como necessário. Atribuição de Tratamento

[0176] Esse é um estudo aberto comparativo de dose única. O tratamento é atribuído de acordo com o programa de escalonamento de dose especificado no presente documento. Critérios de Ajuste de Dose

[0177] O estudo investiga uma injeção intratecal única de AVXS-

101.

Critérios para Encerramento do Estudo

[0178] Um Comitê de Monitoramento de Segurança de Dados (DSMB) independente e um monitor médico monitora a segurança de dados em uma base contínua ao longo do teste. O DSMB pode recomendar o encerramento antecipado do teste por razões de segurança. A inscrição no estudo é interrompida pelos investigadores se qualquer paciente apresentar uma toxicidade de AE de Grau III ou mais alta que seja imprevista e possivelmente, provavelmente ou definitivamente relacionada ao produto do estudo que se apresenta com sintomas clínicos e exija tratamento médico. Isso inclui qualquer morte do paciente, achado laboratorial clínico importante ou qualquer complicação local grave na área injetada relacionada à administração do agente do estudo.

[0179] O teste pode ser encerrado se o DSMB recomendar o encerramento antecipado do estudo por razões de segurança. O teste também pode ser encerrado por recomendação da Autoridade Reguladora. Por fim, o teste pode também ser encerrado se os pacientes desenvolverem níveis inaceitáveis de toxicidade, definidos como a ocorrência de qualquer AE/toxicidade de Grau 3 ou mais alto imprevisto por CTCAE que esteja possivelmente, provavelmente ou definitivamente relacionado à terapia de substituição gênica e esteja associado a sintomas e/ou exija tratamento médico. Critérios de Inclusão de Pacientes

[0180] Os pacientes cumprem todos os seguintes critérios de inclusão:

1. Pacientes ≥6 meses de idade e até 60 meses (1.800 dias) de idade no momento da dosagem após a confirmação do diagnóstico durante o período de triagem por genótipo que demonstram a capacidade de se sentar sem auxílio por 10 ou mais segundos, porém não conseguem ficar de pé ou andar

− A confirmação de diagnóstico por genótipo inclui documentação de laboratório de ausência homozigótica de éxon 7 de SMN1; com exatamente três cópias de SMN2.

2. Teste de gene negativo para mutação modificadora de gene SMN2 (c.859G> C).

3. Início de sinais e sintomas clínicos compatíveis com SMA aos < 12 meses de idade.

4. Capaz de se sentar independentemente e não fica de pé ou anda independentemente. A definição de se sentar independentemente é definida pelos critérios da Organização Mundial da Saúde (OMS) -MGRS de ser capaz de se sentar sem apoio com a cabeça ereta por pelo menos 10 segundos. A criança não deve usar braços ou mãos para equilibrar o corpo ou sustentar a posição (Wijnhoven 2004).

5. Cumprir os critérios institucionais adequados à idade para uso de anestesia e sedação, conforme determinado pelo investigador.

6. Estar atualizado sobre as vacinas na infância. Vacinações sazonais que incluem profilaxia com palivizumabe (também conhecido como Synagis) para prevenir infecções pelo vírus sincicial respiratório (RSV) são também recomendadas de acordo com American Academy of Pediatrics (AAP 2009).

7. Pais/responsáveis legais dispostos e capazes de concluir o processo de consentimento informado. Critérios de Exclusão de Pacientes

[0181] Os pacientes não devem cumprir nenhum dos seguintes critérios de exclusão:

1. Capacidade atual ou histórica de ficar de pé ou andar independentemente.

2. Contraindicações para procedimento de punção lombar ou administração de terapia intratecal (por exemplo, espinha bífida,

meningite, comprometimento ou anormalidades de coagulação ou hardware espinhal obstrutivo impedindo o acesso efetivo ao espaço de LCR) ou presença de um shunt implantado para a drenagem de LCR ou de um cateter implantado no SNC.

3. Contraturas graves, conforme determinado pelo fisioterapeuta (ou fisioterapeutas) designado na triagem, que interferem na capacidade de obter/demonstrar medições funcionais (por exemplo, ficar de pé, andar) ou interferem na capacidade de receber a dosagem IT 10. Escoliose grave (definida como ≥ 50° de curvatura da coluna) evidente no exame de raios X.

4. Cirurgia/procedimento de reparo de escoliose anterior, planejado ou esperado dentro de 1 ano após a administração da dose.

5. Uso de suporte ventilatório invasivo (traqueostomia com pressão positiva) ou oximetria de pulso < 95% de saturação na triagem enquanto o paciente está acordado, ou para altas altitudes >

1.000 m, saturação de oxigênio < 92% enquanto o paciente está acordado − A saturação da oximetria de pulso não deve diminuir ≥ quatro (4) pontos percentuais entre a triagem e o valor mais alto no dia da dosagem.

6. Uso ou necessidade de suporte ventilatório não invasivo por 12 ou mais horas por dia nas duas semanas anteriores à dosagem.

7. Necessidade médica de sonda de alimentação gástrica, em que a maioria das alimentações é dada por métodos não orais (ou seja, sonda nasogástrica ou sonda nasojejunal) ou pacientes cujo peso para a idade esteja abaixo do 3º percentil com base nos Padrões de Crescimento Infantil da OMS (Onis 2006). Colocação de uma gastrostomia permanente antes da triagem não é uma exclusão.

8. Infecção viral ativa (inclui HIV ou sorologia positiva para hepatite B ou C ou vírus Zika).

9. Doença do trato não respiratório grave que exige tratamento sistêmico e/ou hospitalização dentro de duas (2) semanas antes da entrada no estudo.

10. Infecção respiratória que exige atenção médica, intervenção médica ou aumento nos cuidados de suporte de qualquer maneira dentro de quatro (4) semanas antes da entrada no estudo.

11. Infecção do trato respiratório/não pulmonar grave (por exemplo, pielonefrite ou meningite) dentro de quatro (4) semanas antes da dosagem do estudo ou doença concomitante que, na opinião do PI, cria riscos desnecessários para a transferência de genes, como: − Insuficiência renal ou hepática grave − Distúrbio convulsivo conhecido − Diabetes mellitus − Hipocalciúria idiopática − Cardiomiopatia sintomática

12. Histórico de meningite bacteriana ou doença do cérebro ou da medula espinhal, incluindo tumores, ou anormalidades por IRM ou TC que podem interferir nos procedimentos de LP ou na circulação de LCR.

13. Alergia ou hipersensibilidade conhecida à prednisolona ou outros glicocorticosteroides ou seus excipientes.

14. Alergia ou hipersensibilidade conhecida ao iodo ou produtos contendo iodo.

15. Uso concomitante de qualquer um dos seguintes: fármacos para o tratamento de miopatia ou neuropatia, agentes usados para tratar diabetes mellitus ou terapia imunossupressora contínua, plasmaférese, imunomoduladores como adalimumabe ou terapia imunossupressora dentro de 3 meses de dosagem de estudo (por exemplo, corticosteroides, ciclosporina, tacrolimo, metotrexato, ciclofosfamida, imunoglobulina intravenosa, rituximabe).

16. Incapacidade de suspender o uso de laxantes ou diuréticos nas 24 horas anteriores à administração da dose.

17. Títulos de anticorpo anti-AAV9 > 1:50 conforme determinado por imunoensaio de ligação ELISA − Se um paciente em potencial demonstrar título de anticorpo anti-AAV9 > 1:50, o mesmo pode receber um reteste dentro de 30 dias do período de triagem e será elegível para participar se o título de anticorpo anti- AAV9 no reteste for ≤ 1:50.

18. Valores laboratoriais anormais considerados clinicamente significativos (INR > 1,4), GGT > 3X LSN, Bilirrubina ≥ 3,0 mg/dl, Creatinina ≥ 1,0 mg/dl, Hgb <8 ou >18 g/dl; WBC > 20.000 por cm) antes da dosagem do estudo.

19. Participação em teste clínico de tratamento de SMA recente ou recebimento de um produto composto ou terapia experimental ou aprovado recebido com a intenção de tratar SMA (por exemplo, ácido valproico, nusinersen) a qualquer momento antes da triagem para esse estudo − Os beta-agonistas orais devem ser descontinuados 30 dias antes da dosagem − Salbutamol inalado especificamente prescrito com os propósitos de tratamento respiratório (broncodilatador) é aceitável e não é uma contraindicação a qualquer momento antes da triagem para esse estudo.

20. Expectativa de procedimentos cirúrgicos importantes durante o período de avaliação do estudo de 1 ano (por exemplo, cirurgia espinhal ou traqueostomia).

21. Incapacidade ou relutância para cumprir os procedimentos do estudo ou incapacidade de se deslocar para visitas repetidas.

22. Relutância em manter os resultados/observações confidenciais do estudo ou se abster de publicar resultados/observações confidenciais do estudo em sites de mídia social.

23. Recusa em assinar o formulário de consentimento. Critérios de Retirada e Descontinuação do Paciente

[0182] Os pacientes podem ser descontinuados do estudo se os mesmos desenvolverem níveis inaceitáveis de toxicidade, definidos como a ocorrência de qualquer Evento Adverso/toxicidade de Grau 3 ou mais alto imprevisto por CTCAE que esteja possivelmente, provavelmente ou definitivamente relacionado à terapia de substituição gênica e esteja associado a sintomas e/ou exija tratamento médico. Os pacientes são retirados se morrerem, nesse caso serão solicitadas autópsias de todos os pacientes, com exceção de pacientes não tratados, que expiram após a participação em um estudo de transferência de genes. Os pacientes podem também ser retirados se não cumprirem as visitas exigidas pelo protocolo ou os procedimentos do estudo por 3 ou mais visitas consecutivas que não sejam reprogramadas, exceto devido à hospitalização. Pacientes cujos pais ou responsáveis legais retirem o consentimento são também retirados do estudo. Por fim, os pacientes podem ser retirados a critério do investigador. Os procedimentos de encerramento antecipado devem ser concluídos em 14 dias para qualquer paciente que descontinuou prematuramente o estudo por qualquer motivo. Descrição de Prisioneiro de Estudo

[0183] O produto biológico é um vírus adenoassociado autocomplementar recombinante não replicante sorotipo 9 (AAV9) contendo o cDNA do gene SMN humano sob o controle do intensificador de citomegalovírus (CMV)/promotor híbrido de β-actina de galinha (CB) A repetição terminal invertida (ITR) de AAV foi modificada para promover o anelamento intramolecular do transgene, formando assim um transgene de fita dupla pronto para transcrição. Essa ITR modificada, denominada ITR "autocomplementar" (sc), mostrou aumentar significativamente a velocidade de transcrição do transgene e a produção da proteína resultante. As células transduzidas com AVXS- 101 (scAAV9.CB.hSMN) expressam a proteína humana de SMN. Tabela 3: Produto Investigacional Produto Investigacional Nome do Produto AVXS-101 Dose Unitária 6,0 × 1013 vg (Dose A) 1,2 × 1014 vg (Dose B) Não mais que 2,4 × 1014 vg (Dose C) Via de Administração Injeção Intratecal Descrição Física Uma vez descongelado, AVXS-101 é uma solução transparente a ligeiramente opaca, incolor a branca desbotada, isenta de partículas visíveis Medicamentos Anteriores e Concomitantes

[0184] Os medicamentos anteriores e concomitantes são coletados em um Formulário de Relatório de Caso eletrônico (eCRF) de duas semanas antes da dosagem do estudo até a visita de Fim do Estudo. Administração Profilática de Prednisolona

[0185] Uma resposta de célula T antígeno-específica ao vetor AAV foi observada no estudo clínico de Fase 1 em andamento que investiga o tratamento com AVXS-101 por infusão intravenosa. Essa é uma resposta esperada entre 2 a 4 semanas após a transferência de genes. Uma possível consequência para tal resposta de célula T antígeno- específica é a depuração das células transduzidas e a perda da expressão de transgene.

[0186] Em uma tentativa de atenuar a resposta imunológica do hospedeiro à terapia baseada em AAV, os pacientes recebem predniso- lona profilática (glicocorticoide) (aproximadamente 1 mg/kg/dia) 24 horas antes da dosagem de AVXS-101. O tratamento continua por aproximada- mente 30 dias, de acordo com a seguinte diretriz de tratamento: • Até pelo menos 30 dias após a infusão: 1 mg/kg/dia • Semanas 5 e 6: 0,5 mg/kg/dia • Semanas 7 e 8: 0,25 mg/kg/dia • Semana 9: prednisolona descontinuada

[0187] Se os valores de aspartato aminotransferase (AST) ou alanina aminotransferase (ALT) forem > 2 X o limite superior de normali- dade (ULN), ou se a resposta de células T for ≥ 100 SFC/106 CMSPs após 30 dias de tratamento, a dose de prednisolona é mantida até que os valores de AST e ALT diminuam abaixo do limite. Se a resposta de células T continuar após o Dia 60, o critério do investigador deve ser usado considerando o risco-benefício para manter a prednisolona. A variação dessas recomendações fica a critério do investigador com base em possíveis problemas de segurança para cada paciente. Medicamentos Proibidos

[0188] O uso concomitante de qualquer um dos seguintes medicamentos é proibido: • Fármacos para tratamento de miopatia ou neuropatia • Agentes usados para tratar diabetes mellitus • Terapia recebida com a intenção de tratar SMA (por exemplo, ácido valproico, nusinersen). - Beta-agonistas orais devem ser descontinuados pelo menos 30 dias antes da dosagem da terapia gênica. - Beta-agonistas inalados podem ser usados para tratar complicações respiratórias de SMA, desde que tais medicamentos sejam dosados em níveis clinicamente adequados

• Terapia imunossupressora em andamento, plasmaférese, imunomoduladores como adalimumabe ou terapia imunossupressora dentro de 3 meses do início do teste (por exemplo, corticosteroides, ciclosporina, tacrolimo, metotrexato, ciclofosfamida, imunoglobulina intravenosa, rituximabe)

[0189] O uso de corticosteroides após a conclusão da redução gradual de prednisolona é permitido, a critério do médico responsável, como parte do gerenciamento clínico de rotina. O uso de prednisona em tais circunstâncias deve ser documentado adequadamente como um medicamento concomitante, e o evento que precipita seu uso deve ser documentado adequadamente como um AE.

[0190] O uso de corticosteroides (além de corticosteroides inalados para broncoespasmo) deve ser considerado parte do cuidado durante o curso da redução gradual de prednisolona, esse gerenciamento médico deve ser discutido com o monitor médico patrocinador, que é responsável por quaisquer ajustes de medicação indicados relacionados à redução gradual da dose. Adesão ao Tratamento

[0191] AVXS-101 é administrado como uma injeção intratecal única. Randomização e Cegamento

[0192] Esse é um estudo aberto. Dose e Justificação de Dose de Produto de Estudo

[0193] Os pacientes recebem uma dose única de AVXS-101 de 6,0 × 1013 vg,1,2 × 1014 vg, ou uma terceira dose de até 2,4 × 1014 vg, se determinado como necessário por injeção intratecal. A entrega direta no LCR por injeção intratecal permite a redução da quantidade de vetor viral aproximadamente por um fator de dez, com distribuição e eficácia iguais por todo o SNC, reduzindo as cargas de vetor viral e otimizando ainda mais. A seleção da dose adequada e a justificativa para estudar todos os escalonamentos de dose são adicionalmente sustentadas por análises contínuas de segurança e eficácia de achados clínicos dos pacientes que receberam doses anteriores, conforme descrito. A dose mais alta selecionada é de até 2,4 × 1014 vg entregue por via intratecal. Doses de até 1,1 × 1014 vg/kg foram administradas com segurança por via sistêmica (intravenosa) a crianças pesando até 8,4 kg (dose total de 9,24 × 1014 vg). Além disso, em estudos pré-clínicos, a administração intratecal de scAAV9.CB.SMN foi segura e bem tolerada até 14 meses após a injeção em grandes primatas não humanos em uma dose de 2 × 1013 vg/kg. Preparação de Produto de Estudo

[0194] A preparação de AVXS-101 é feita assepticamente sob condições estéreis por um farmacêutico.

[0195] AVXS-101 é pré-misturado com um meio de contraste adequado aprovado e rotulado para uso pediátrico para monitoramento radiográfico da injeção via injeção intratecal lombar. O volume total de AVXS-101 + meio de contraste não excede 8 ml.

[0196] O vaso de entrega da dose é entregue no quarto do paciente da unidade de terapia intensiva pediátrica (UTIP) ou outro ambiente adequado (por exemplo, sala de intervenção, sala de cirurgia, sala de procedimento dedicado) com acesso imediato ao gerenciamento de cuidados intensivos.

[0197] Os pacientes recebem injeção intratecal de AVXS-101 sob condições estéreis no quarto de um paciente da UTIP ou outro ambiente adequado (por exemplo, sala de intervenção, sala de cirurgia, sala de procedimento dedicado) com acesso imediato ao gerenciamento de cuidados intensivos. Os pacientes são admitidos e os sinais vitais são monitorados a cada 15 (+/- 5) minutos por quatro horas e a cada hora (+/- 15 minutos) por 24 horas após o procedimento de dosagem de AVXS-101.

[0198] Os locais são instruídos a usar uma agulha atraumática inserida com o bisel paralelo às fibras da dura-máter; isso demonstrou reduzir consideravelmente os danos à dura-máter e, consequentemente, reduzir o risco de vazamento do líquido cefalorraquidiano após a punção lombar, inclusive em crianças. Ebinger et al., "Headache and backache after lumbar puncture in children and adolescents: a prospective study". Pediatrics, 113:1588–1592; Kiechl- Kohlendorfer et al., "Cerebrospinal fluid leakage after lumbar puncture in neonates: incidence and sonographic appearance". Am J Roentgenol, 181:231–234.

[0199] Sedação/anestesia é necessária para todos os pacientes que recebem AVXS-101. O método e os medicamentos ficam a critério do anestesiologista local, porém devem incorporar um grau suficiente de sedação ou ansiólise para garantir analgesia e falta de movimento para o procedimento e a colocação no posicionamento de Trendelenburg após o procedimento. Os pacientes são colocados na posição de Trendelenburg, com cabeça inclinada para baixo a 30° por 15 minutos após a administração do vetor para melhorar a distribuição nas regiões cervical e cerebral.

[0200] AVXS-101 é administrado por um investigador ou radiologista intervencionista ou outro médico adequadamente treinado e experiente sob condições estéreis com orientação fluoroscópica/radiográfica como diretrizes institucionais. Os pacientes são colocados em decúbito lateral e um cateter com estilete é inserido por uma punção lombar no espaço interespinhoso L3-L4 ou L4-L5 no espaço subaracnoide. A canulação subaracnoide é confirmada com o fluxo de líquido cefalorraquidiano (LCR) transparente do cateter. Aproximadamente quatro (4) ml de LCR são removidos para a Dose A e Dose B, um volume de LCR muito próximo do volume de AVXS-101 mais contraste injetado (até sete (7) ml) é removido para a Dose C e descartado como por diretrizes institucionais. AVXS-101 na solução de contraste pré-misturada é injetada diretamente no espaço subaracnoide. A lavagem das agulhas de injeção com 0,5 ml de solução salina é permitida de acordo com os padrões/diretrizes institucionais. Procedimentos Pós-Administração

[0201] Após a administração de AVXS-101, os pacientes retornam ao leito designado da UTIP, ou outro local adequado, com monitoramento permanente dos sinais vitais. Os medicamentos concomitantes e todos os AEs/AEs graves são também monitorados e documentados após os procedimentos de dosagem.

[0202] Os pacientes são mantidos na sala de pacientes da UTIP ou em outro ambiente adequado (por exemplo, sala de intervenção, sala de cirurgia, sala de procedimentos dedicada) com acesso imediato ao gerenciamento de cuidados intensivos agudos por 48 horas para maior monitoramento do estado mental. Durante a internação, o pessoal deve seguir as precauções de segurança adequadas, conforme os padrões institucionais para controle de infecção; os padrões devem exigir equipamentos de proteção individual (EPI), como aventais, luvas, máscaras, óculos e sapatos fechados. As famílias dos pacientes recebem folhetos padronizados e aprovados pelo IRB com relação ao monitoramento de alterações do estado mental, o que inclui monitoramento de febre, irritabilidade, dor no pescoço, sensibilidade à luz e vômito. Os pacientes podem receber alta do hospital quando os seguintes critérios são cumpridos: • Afebril • Ausência de reações de hipersensibilidade • Ausência de meningismo • Ausência de valores laboratoriais anormais sugestivos de possível infecção ou complicação do SNC Escalonamento de Dose

[0203] Há um intervalo de dosagem de 4 semanas entre todos os pacientes na Coorte 1 para permitir a revisão da análise de segurança em seis pontos de tempo (Dias 1, 2, 7, 14, 21, 30) antes da dosagem do próximo paciente.

[0204] Os investigadores consultam o DSMB sobre todos os AEs de Grau III ou mais altos dentro de 48 horas de consciência que estão possivelmente, provavelmente ou definitivamente relacionados ao agente do estudo antes de continuar a inscrição. Após a inscrição dos três (3) primeiros pacientes ≥6 meses e < 24 meses de idade no momento de dosagem e com base nos dados de segurança disponíveis, uma decisão é tomada se: a) parar devido à toxicidade ou b) prosseguir para a Coorte 2 usando a Dose B.

[0205] Para a Dose B, há um intervalo de pelo menos 4 semanas entre a dosagem dos três (3) primeiros pacientes < 60 meses de idade no momento de dosagem na coorte. Com base nos dados de segurança disponíveis dos três (3) primeiros pacientes da Coorte 2 e de todos os pacientes da Coorte 1, mais intervalos de 4 semanas entre a dosagem de pacientes podem ser desnecessários. Os investigadores consultam o DSMB sobre todos os AEs de Grau III ou mais altos dentro de 48 horas que estão possivelmente, provavelmente ou definitivamente relacionados ao agente do estudo antes de continuar a inscrição. Após a inscrição dos seis (6) primeiros pacientes e com base nos dados de segurança disponíveis, uma decisão é tomada se a) parar devido à toxicidade ou b) continuar a inscrever mais 21 pacientes até doze (12) pacientes ≥6 meses e < 24 meses de idade no momento de dosagem e doze (12) pacientes > 24 meses < 60 meses de idade no momento de dosagem receberam a Dose B.

[0206] Com base em uma avaliação contínua de dados de segurança e eficácia de pacientes tratados com a dose de 1,2 × 1014 vg, pode ser considerado o teste de uma terceira dose (Dose C). Três (3) pacientes < 60 meses de idade receberam a Dose C, que será de até

2,4 × 1014 vg administrada por via intratecal. Haverá novamente um intervalo de quatro semanas entre a dosagem dos três primeiros pacientes que receberam a Dose C, como nas Coortes 1 e 2. Após a inscrição dos três (3) primeiros pacientes que receberam a Dose C e com base nos dados de segurança disponíveis, uma decisão é tomada se a) parar a dosagem de Dose C devido à preocupação com segurança ou b) continuar a inscrever mais 21 pacientes até haver um total de doze (12) pacientes ≥ 6 meses e < 24 meses e doze (12) pacientes ≥ 24 e < 60 meses que receberam a Dose C. Avaliações de Fisioterapia: Escala Motora Funcional Expandida de Hammersmith

[0207] A Escala Motora Funcional Expandida de Hammersmith foi desenvolvida para uso em crianças com atrofia muscular espinhal Tipo 2 e Tipo 3, para fornecer informações objetivas sobre a capacidade motora e progressão clínica.

[0208] A Escala Motora Funcional Expandida de Hammersmith é administrada por um fisioterapeuta de acordo com a Tabela 4 dentro de 30 dias da dosagem e mensalmente até doze (12) meses para todos os pacientes ≥ 24 meses de idade. Pacientes <24 meses de idade no momento da dosagem começam a ter avaliações na escala motora funcional expandida de Hammersmith no momento em que os 24 meses de idade são completados. As sessões de Escala Motora Funcional Expandida Hammersmith são gravadas. Avaliações de Fisioterapia: Bayley Scales of Infant and Toddler Development®

[0209] Bayley Scales of Infant and Toddler Development®, Terceira Edição é uma avaliação infantil padronizada e referenciada por norma. Os subtestes motores bruto e fino foram concluídos 30 dias antes da dosagem na linha de base e, então, mensalmente até o Mês 12. As avaliações da Bayley Scales® são gravadas.

Avaliações de Fisioterapia: Pesquisa de Desenvolvimento de Marco Motor

[0210] A conquista de marcos motores significativos é avaliada pelo fisioterapeuta usando uma Pesquisa de Desenvolvimento de Marcos Motores padrão mostrada na Tabela 2 com definições de cada marco orientadas pela Bayley Scales® (consultar o Manual de Fisioterapia). O fisioterapeuta registra se o paciente alcançou cada um dos marcos na Pesquisa de Desenvolvimento de Marcos Motores de acordo com a Tabela 4. Uma vez observado, um marco motor é considerado alcançado. A data de realização de cada marco motor é determinada pela data da visita em que o marco é observado. Durante a visita de triagem, o fisioterapeuta conclui uma avaliação da conquista do marco da linha de base de acordo com a Tabela 4; essa avaliação é gravada em vídeo e os achados documentados. Como as Bayley Scales® não exigem necessariamente que a criança repita marcos anteriormente alcançados, cada marco pode ser capturado em vídeo. As sessões de avaliação de marcos de desenvolvimento são documentadas.

Tabela 4: Cronograma de Avaliações Intervalo de Estudo Triagem Injeção de vetor de Linha (AVXS-101) de Base (Paciente internado) Nº Visita 1 2 3 4 5 6 Mensalmente Mês 12 ou (7 a 16) EOS (17) Nº Dias/Mês no Estudo -60 a -2 -1 1 2a3 7 14 21 30 Até o mês 11 Mês 12 Janela +/- 2 +/- 7 +/- 7 Consentimento Informado X Raio X espinhal X Histórico Demográfico/Médico X X X X X X X X X Exame Físico X X X X X X X X X Sinais Vitais/Peso/Comprimento/Altura X X X X X X X X X Oximetria de Pulso X X X X X X X X Exame Pulmonar X X X X ECG de 12 Derivações X X X X X Monitor Holter de 12 Derivações X X X X X X X Ecocardiograma X X X Gasometria Capilar X X HFMS-Expandida (com vídeo) X X X X Bayley ®-III (com vídeo) X X X X Pesquisa de Desenvolvimento de X X X X Marco Motor (com vídeo) Hematologia/Química X X X X X X X X X CK-MB X X X X X Troponina I X X X X X Coagulação X X X X X X X X X Urinálise X X X X X X X X X Sorologia do Vírus X Sangue para teste de confirmação de X diagnóstico Amostras de Saliva, Urina e Fezes X X X X X (para liberação viral) Triagem de linha de base da Mãe (Ab X anti-AAV9) Laboratórios de Imunologia (anti- X X X X X AAV9/SMN) Laboratórios de Imunologia (células T X X X X de IFN-γ) Dosagem de prednisolona X X X X X X X Administração do Produto do Estudo com X orientação fluoroscópica/radiográfica Fotografia de local de injeção X X X X X Eventos Adversos X X X X X X X X X X Medicamentos Anteriores e A ser coletado a partir de 2 semanas antes da dosagem do estudo até a visita final do Concomitantes estudo

Evidência de Vídeo

[0211] As avaliações de fisioterapia em cada visita do estudo são gravadas em um esforço para produzir evidências convincentes, demonstráveis e documentadas de eficácia, conforme determinado por mudanças nas habilidades funcionais. Os pais/responsáveis legais podem também compartilhar vídeos caseiros demonstrando a conquista de habilidades funcionais com o local de estudo.

[0212] Os vídeos são fornecidos a um revisor independente e centralizado para avaliação imparcial da conquista de marcos. O revisor independente usa a Pesquisa de Desenvolvimento de Marco Motor para documentar se o vídeo exibe evidências de conquista de cada marco motor. A data de conquista do marco motor é computada como a primeira das datas do vídeo em que a conquista do marco foi demonstrada. Outras Avaliações Clínicas: Histórico Demográfico/Médico

[0213] As informações de histórico demográfico e médico do paciente são coletadas na linha de base e capturadas em um Formulário de Relatório de Caso (CRF). O histórico médico ao longo do estudo é coletado em cada visita. As informações de histórico médico incluem, porém sem limitação: histórico familiar de atrofia muscular espinhal incluindo irmãos afetados ou genitores portadores, idade gestacional no nascimento, comprimento/altura/circunferência da cabeça no nascimento, informações de hospitalização desde o momento do nascimento, incluindo número, duração e motivo de hospitalizações, incluindo códigos CID-10, se disponíveis, histórico de suporte ventilatório, se houver, e histórico de suporte alimentar, se houver. Outras Avaliações Clínicas: Sinais Vitais

[0214] Os sinais vitais incluem pressão sanguínea, frequência respiratória, pulso e temperatura axilar dentro de 30 dias de dosagem e nos pontos de tempo especificados na Tabela 4. Os sinais vitais,

incluindo oximetria de pulso e frequência cardíaca, são continuamente monitorados e registrados por um membro da equipe durante a injeção. Na Visita 2, os sinais vitais, incluindo pressão arterial, frequência respiratória, temperatura axilar de pulso, oximetria de pulso e frequência cardíaca são monitorados e registrados a cada 15 minutos (+/- 5 minutos) por quatro horas e a cada hora (+/- 15 minutos) por 24 horas após o procedimento de dosagem de AVXS-101. Outras Avaliações Clínicas: Peso e Comprimento/Altura

[0215] O peso e comprimento e/ou altura, conforme adequado, são medidos de acordo com os pontos de tempo especificados na Tabela 4. Outras Avaliações Clínicas: Exame Físico

[0216] O exame físico inclui a análise dos seguintes sistemas: cabeça, olhos, ouvidos, nariz e garganta (HEENT), pulmões/tórax, cardiovascular, abdômen, musculoesquelético, neurológico, dermatológico, linfático e geniturinário. A circunferência da cabeça é medida com cada exame físico. Para medir a circunferência da cabeça, o examinador enrola com segurança uma fita métrica flexível ao redor da circunferência da cabeça, acima das sobrancelhas, na parte mais larga da testa, acima das orelhas e na parte mais proeminente do occipício. A medição deve ser feita 3 vezes, e a maior medição deve ser registrada com uma precisão de 0,1 cm. Os exames físicos de linha de base são concluídos dentro de 30 dias de dosagem e de acordo com os pontos de tempo especificados na Tabela 4. Outras Avaliações Clínicas: Recomendações de Vacinação

[0217] Os pacientes são incentivados a seguir todas as imunizações programadas de rotina, conforme recomendado pelo Center for Disease Control (CDC). Vacinações sazonais que incluem profilaxia com palivizumabe (também conhecido como Synagis) para prevenir infecções pelo vírus sincicial respiratório (RSV) são também recomendadas de acordo com American Academy of Pediatrics (AAP 2009).

Outras Avaliações Clínicas: Eletrocardiograma de 12 Derivações (ECG)

[0218] Um ECG de 12 derivações é realizado na triagem/linha de base, Dia 1, Dia 2, Dia 3, Mês 3, Mês 6, Mês 9 e Mês 12 (ou Término Antecipado). Os traçados de ECG ou os dados da máquina de ECG são coletados para análise centralizada por um cardiologista. Um ECG de 12 derivações é realizado (simultaneamente com o Monitor Holter) no dia de entrega de gene e no Dia 2 e Dia 3 após a entrega de gene. O monitoramento eletrofisiológico adicional fica a critério do investigador de acordo com as diretrizes institucionais locais. Outras Avaliações Clínicas: Holter de 12 derivações

[0219] Os pacientes têm um monitor Holter contínuo de 12 derivações fixado 24 horas antes da administração da dose no Dia -1. O monitor Holter permanece até 48 horas (Dia 3). Os dados de ECG em série são extraídos em triplicata dos dados de monitor Holter nos seguintes pontos de tempo: pré-dose, duas horas, 4 horas, 6 horas, 8 horas, 12 horas, 24 horas, 36 horas e 48 horas. O monitoramento Holter de vinte e quatro horas é realizado na triagem e nas visitas dos Meses 1, 2, 3, 6, 9 e 12 (ou Término Antecipado). Outras Avaliações Clínicas: Ecocardiograma

[0220] Um ecocardiograma é realizado na triagem/linha de base e nas visitas do Mês 3, Mês 6, Mês 9 e Mês 12 (ou Término Antecipado). Outras Avaliações Clínicas: Raio X espinhal

[0221] Um raio X espinhal é realizado na triagem/linha de base para descartar pacientes com escoliose grave ou aqueles que exigiriam procedimentos cirúrgicos substanciais da coluna durante o período de avaliação do estudo de 1 ano. Outras Avaliações Clínicas: Exame Pulmonar

[0222] Os pacientes são avaliados por um pneumologista nos pontos de tempo especificados na Tabela 4 e podem ser equipados com um ventilador de pressão positiva não invasivo (por exemplo, BiPAP) a critério do pneumologista e/ou investigador. Os pacientes que exigem suporte ventilatório não invasivo devem levar a máquina para cada visita do estudo, de modo que a equipe do estudo possa remover um cartão SD que registra os dados de uso reais. Os dados de uso são transferidos para o banco de dados clínico. Os pacientes que exigem suporte ventilatório não invasivo devem remover o cartão SD e enviar o mesmo para o local do estudo em caso de visitas de estudo não realizadas. Orientação Fluoroscópica/Radiográfica de Injeção de AVXS-101

[0223] O procedimento de injeção intratecal de AVXS-101 é realizado sob condições estéreis sob fluoroscopia por um radiologista intervencionista ou outro médico adequadamente treinado e experiente de acordo com as diretrizes institucionais. A captura de imagens radiográficas pode não ser necessária para esse procedimento. Outras Avaliações Clínicas: Fotografias de Local de Injeção

[0224] São tiradas fotografias do local da injeção até o Dia 30 nos pontos de tempo especificados na Tabela 4 para monitorar a cicatrização da ferida de injeção Outras Avaliações Clínicas: Avaliações Laboratoriais

[0225] As amostras biológicas são coletadas ao longo do teste nos pontos de tempo especificados na Tabela 4. As amostras biológicas são coletadas e enviadas para um laboratório central. As amostras para exames laboratoriais no dia anterior à dosagem (Dia -1) são coletadas antes da dosagem e são processadas localmente pelo laboratório local certificado pela Clinical Laboratory Improvement Amendment (CLIA). Em alguns casos, as amostras podem ser coletadas localmente para resultados imediatos ou outras preocupações de segurança ou logística.

Tabela 5: Volume de Sangue Total

Visita Testes Volume Total

Triagem Hematologia, química/CK-MB ou Coagulação de Troponina 19,3-19,6 mL I, sorologia de vírus, amostra de imunologia (apenas Ab de AAV9/SMN), amostra de confirmação diagnóstica

Dia 1 Hematologia, química, coagulação, gasometria capilar 6,0 mL

Dia 2 Hematologia, química, coagulação, gasometria capilar 6,0 mL

Dia 7 Hematologia, química/CK-MB3 ou Troponina I, coagulação, 10,0-12,3 mL amostra de imunologia

Dia 14 Hematologia, química, coagulação, amostra de imunologia 9,0-11,0 mL

Dia 21 Hematologia, química, coagulação, amostra de imunologia 9,0-11,0 mL

Dia 30 Hematologia, química/CK-MB3 ou Troponina I, coagulação, 11,0-12,3 mL amostra de imunologia

Mês 2 Hematologia, química/CK-MB3 ou Troponina I, coagulação 6,0-6,3 mL

Mês 3 Hematologia, química, coagulação 5 mL

Mês 4 Hematologia, química, coagulação 5 mL

Mês 5 Hematologia, química, coagulação 5 mL

Mês 6 Hematologia, química/CK-MB3 ou Troponina I, coagulação 6,0-6,3 mL

Mês 7 Hematologia, química, coagulação 5 mL

Mês 8 Hematologia, química, coagulação 5 mL

Mês 9 Hematologia, química/CK-MB3 ou Troponina I, coagulação 6,0-6,3 mL

Mês 10 Hematologia, química, coagulação 5 mL

Mês 11 Hematologia, química, coagulação 5 mL

Última Visita de Hematologia, química/CK-MB3 ou Troponina I, coagulação 6,0-6,3 mL Estudo (Mês 12)

Volume Total para Duração de Estudo de 1 Ano 135-137,1 mL

[0226] Em um caso em que sangue suficiente não pode ser coletado de um paciente, o sangue é usado na seguinte ordem de prioridade, com o primeiro tendo a maior prioridade e o último tendo a menor prioridade:

1. Safety blood labs: química > hematologia > coagulação > CK-MB ou Troponina

2. ELISpots de IFN-γ para detectar respostas de células T

3. Anticorpo sérico para AAV9 e SMN

4. Teste de reconfirmação genética

[0227] Se não houver volume de sangue suficiente para incluir a amostra de teste de reconfirmação genética na visita de triagem, o paciente retorna antes da Visita 2. Todos os pacientes têm o teste de reconfirmação genética concluído. Outras Avaliações Clínicas: Hematologia

[0228] A análise hematológica inclui um CBC com diferencial e contagem de plaquetas com esfregaço. As amostras são coletadas e enviadas de acordo com o manual do laboratório fornecido pelo laboratório central. As análises hematológicas imediatas/no mesmo dia durante a dosagem no paciente, conforme determinado pelo investigador, são realizadas como procedimentos padrão do local de investigação no laboratório local. Outras Avaliações Clínicas: Química do Soro

[0229] As amostras são coletadas e enviadas de acordo com o manual do laboratório fornecido pelo laboratório central.

[0230] As análises químicas imediatas/no mesmo dia durante a dosagem no paciente, conforme determinado pelo investigador, são realizadas como procedimentos padrão do local de investigação no laboratório local.

[0231] As análises químicas incluem os seguintes em todas as visitas de estudo: Gama glutamil transferase (GGT), AST/ALT séricas,

Bilirrubina total sérica, Bilirrubina direta, Albumina, Glicose, Creatina quinase total, Creatinina, BUN, Eletrólitos, Fosfatase alcalina.

[0232] CK-MB ou Troponina I é coletada na triagem, Dia 7, Dia 30, Dia 60 e nos Meses 6, 9 e 12/Fim do Estudo. Troponina I é medida em vez de CK-MB em novos pacientes que são selecionados e inscritos após a emenda 5 (protocolo versão 6.0) entrar em vigor. Os participantes que foram examinados e inscritos, porém que ainda não receberam terapia de substituição genética (visita # 2) no momento em que a emenda 5 (protocolo versão 6.0) entrou em vigor, realizaram teste de troponina I de linha de base antes do tratamento com AVXS-101 e realizaram teste de troponina I no lugar de CK-MB. CK-MB é coletada de todos os outros participantes. Os investigadores recebem resultados de laboratório de todas as visitas de estudo do laboratório central (exceto no Dia -1). Outras Avaliações Clínicas: Sorologia do Vírus

[0233] A administração de um vetor AAV apresenta o risco de causar hepatite imunomediada. Para pacientes com HIV ou sorologia positiva para hepatite B ou C ou vírus Zika, a administração do vetor AAV pode representar um risco injustificado; portanto, os testes de sorologia negativos são confirmados na triagem, antes do tratamento. Essas amostras são coletadas e enviadas de acordo com o manual do laboratório fornecido pelo laboratório central. Outras Avaliações Clínicas: Estudos de Coagulação

[0234] Os estudos de coagulação incluem tempo de protrombina (PT), tempo de protrombina parcial (PTT) e razão normalizada internacional (INR) que são coletados de acordo com o manual de laboratório fornecido pelo laboratório central. Os estudos de coagulação são realizados de acordo com os pontos de tempo especificados na Tabela 4.

Outras Avaliações Clínicas: Urinálise

[0235] As amostras de urina são coletadas de acordo com o manual de laboratório fornecido pelo laboratório central conforme os pontos de tempo especificados na Tabela 4. Urinálises do Dia 1 e imediatas/no mesmo dia durante a dosagem no paciente, conforme determinado pelo investigador, são realizadas como procedimentos padrão do centro de investigação no laboratório local. A urinálise inclui os seguintes parâmetros: Cor, Clareza/turbidez, pH, Gravidade específica, Glicose, Cetonas, Nitritos, Esterase leucocitária, Bilirrubina, Sangue, Proteína, Hemácias, Leucócitos, Células epiteliais escamosas, Cilindros, Cristais, Bactérias, Levedura. Outras Avaliações Clínicas: Gasometria Capilar

[0236] A gasometria capilar é concluída de acordo com os pontos de tempo especificados na Tabela 4. Uma punção ou pequena incisão é feita com um bisturi ou dispositivo similar na camada cutânea da pele do paciente em uma área altamente vascularizada (calcanhar, dedo, dedo do pé). Para acelerar o fluxo sanguíneo e reduzir a diferença entre as pressões de gás arterial e venoso, a área é aquecida antes da punção. À medida que o sangue flui livremente do local da punção, a amostra é coletada em um tubo capilar. Outras Avaliações Clínicas: ELISA: Ab anti-AAV9

[0237] As amostras sanguíneas são coletadas e enviadas para o laboratório central de acordo com o manual do laboratório para teste de anticorpos séricos para AAV9 na triagem e de acordo com os pontos de tempo especificados na Tabela 4. Outras Avaliações Clínicas: ELISA: Ab Anti-SMN

[0238] As amostras sanguíneas são coletadas e enviadas para o laboratório central de acordo com o manual do laboratório para teste de anticorpos séricos para SMN de acordo com os pontos de tempo especificados na Tabela 4.

Outras Avaliações Clínicas: ELISpots de IFN-γ

[0239] O sangue é coletado e enviado para o laboratório central de acordo com o manual do laboratório para realizar ELISpots de interferon gama (IFN-γ) para detectar respostas de células T a AAV9 e SMN de acordo com os pontos de tempo especificados na Tabela 4. Outras Avaliações Clínicas: Triagem de Linha de Base da Mãe

[0240] É possível que a mãe do paciente inscrito possa ter anticorpos pré-existentes para AAV9 que podem ser transferidos para a paciente por meio de transferência placentária no útero ou teoricamente através do leite materno. O consentimento informado é solicitado à mãe do paciente para examinar a mãe quanto a anticorpos circulantes para AAV9. Uma vez que o consentimento informado é obtido, o sangue da mãe será coletado de uma veia periférica e enviado para o laboratório central para triagem de anticorpos anti-AAV9. Se forem identificados anticorpos para AAV9, o investigador deve discutir com a mãe se deve continuar ou interromper a amamentação. Pacientes que consomem leite materno conservado em bancos de fontes doadoras que não podem ser testados quanto a anticorpos anti-AAV9 são transicionados para fórmula antes da participação. Outras Avaliações Clínicas: Sangue para Teste de Confirmação de Diagnóstico

[0241] Uma amostra sanguínea é coletada durante a visita de triagem e enviada para o laboratório central de acordo com o manual do laboratório para reconfirmação de deleções de SMN1, número de cópias de SMN2 e ausência de mutação modificadora do gene do éxon 7 (c.859G>C). Isso é feito para garantir a consistência nas práticas de teste de diagnóstico. Outras Avaliações Clínicas: Coleta de Saliva, Urina e Fezes

[0242] Os estudos demonstraram que alguns vetores podem ser excretados do corpo por até algumas semanas após a injeção; isso é chamado de "liberação viral". A liberação de vetores pode ser encontrada no sangue, urina, saliva e fezes por até uma semana após a injeção. Os riscos associados ao vetor liberado não são conhecidos no momento; no entanto, é improvável, pois o vetor não é infeccioso e não pode se replicar. Independentemente, as instruções aprovadas pelo IRB são fornecidas aos familiares dos pacientes e cuidadores em relação ao uso de luvas de proteção se/quando entrarem em contato direto com fluidos corporais e/ou resíduos do paciente, bem como boa higiene das mãos por um mínimo de duas semanas após a injeção. Adicionalmente, os pacientes estão proibidos de doar sangue por dois anos após a injeção do vetor.

[0243] Amostras de saliva, urina e fezes são coletadas de acordo com o manual de laboratório para estudos de liberação viral, de acordo com a Tabela 4, incluindo 24 horas e 48 após as doses. Pacientes em todos os locais ≥ 48 meses que não usam mais fraldas fornecem amostras de urina de volume total e de fezes de volume total no Dia 7, Dia 14 e Dia 30 para pelo menos uma micção e uma defecação. As amostras são preparadas de acordo com o manual do laboratório, armazenadas em um congelador a -80°C e enviadas para o laboratório central de acordo com o manual do laboratório. Um subconjunto de pacientes em locais que optam por participar do subestudo de liberação viral tem um volume total de amostras de urina e fezes de 24 horas coletadas 24 horas após a dose e 48 horas após a dose (para incluir todas as excreções nesses períodos de tempo). Exemplo 2 - Estudos de AVXS-101 em Pacientes com SMA (Resultados Provisórios de Testes Clínicos I)

[0244] Os pacientes foram identificados, tratados e avaliados de acordo com o protocolo descrito no Exemplo 1. AVXS-101 foi administrado por via intratecal a pacientes com atrofia muscular espinhal (SMA) que podiam se sentar, porém não podiam ficar de pé ou andar no momento da entrada no estudo. Os pacientes tinham 3 cópias do gene SMN2, além da deleção bialélica de SMN1. Os pacientes foram estratificados em dois grupos, aqueles > 6 meses e < 24 meses de idade no momento de dosagem e aqueles ≥ 24 meses e < 60 meses de idade no momento de dosagem. Dezesseis pacientes > 6 meses e < 24 meses, e doze pacientes ≥ 24 < 60 meses foram inscritos. Dentro do grupo mais jovem, três pacientes receberam a administração de 6,0 x 1013 vg de AVXS-101 (Dose A). O restante dos pacientes mais jovens e todos os pacientes mais velhos receberam 1,2 x 1014 vg de AVXS-101 (Dose B).

[0245] Os doentes receberam AVXS-101 pré-misturado com 1,5 ml de um meio de contraste adequado para monitoramento radiográfico como uma administração única por injeção lombar intratecal (IT). Os pacientes receberam prednisolona profilática durante os primeiros dois meses após o tratamento para atenuar a resposta imunológica do hospedeiro. A segurança e a eficácia são avaliadas periodicamente ao longo de um período de 12 meses após o tratamento. Para pacientes > 6 meses e < 24 meses de idade no momento da dosagem, uma medida de eficácia foi a proporção de pacientes que alcançaram a capacidade de ficarem de pé sozinhos (Bayley Scales of Infant and Toddler Development®- Gross Motor Subconjunto #40). Marcos adicionais, definidos pelo critério do World Health Organization Multicentre Growth Reference Study (WHO-MGRS) (Wijnhoven 2004), incluindo rolar de costas para os lados, engatinhar, ficar de pé com apoio, tentar ficar de pé e andar com ou sem ajuda, foram avaliados. Para pacientes ≥ 24 meses e < 60 meses de idade no momento da dosagem, uma medida de resultado foi a mudança da linha de base na Escala Motora Funcional Expandida de Hammersmith (HFMSE). A porcentagem de respondedores (definida como atingindo escore de HFMSE> 3 pontos; Swoboda, et al 2010) foi avaliada mensalmente.

[0246] Pacientes com idades entre 6 e 24 meses com SMA Tipo 2 foram avaliados entre cinco e 12 meses após o recebimento da Dose A (6,0 x 1013 vg; n=3) ou Dose B (1,2 x 1014 vg; n=13) de AVXS-101 por via intratecal.

Conforme mostrado na Tabela 6, as mudanças nos escores da Escala Motora Bruta de Bayley® variaram entre -1 e 14 pontos (aumento médio + SD de 3,6 + 3,5 pts), com 14 de 16 pacientes (87,5%) apresentando melhoras a partir da linha de base.

Sete de 16 pacientes alcançaram pelo menos um novo item Bayley® após o tratamento.

Dois pacientes - um em cada grupo de dose - alcançaram o ponto final do estudo de ficarem de pé independentemente (E02, E24); um paciente (E24) conseguiu ficar de pé antes dos 20 meses de idade e agora anda independentemente.

Tabela 6: Itens selecionados da Bayley Scales of Infant and Toddler Development - Escala Motora Bruta em pacientes com SMA Tipo 2 com idade entre 6 meses a 24 meses.

Senta-se sem Apoio (Item Nº 26) Idade no momento da Injeção Rola de Costas para os Lados Fica de Pé Sozinho (Item Nº 40) Tenta Ficar de Pé (Item Nº 35) Anda com Auxílio (Item Nº 37) Senta-se*Independentemente Suporta o Peso (Item Nº 33) Tenta se Sentar (Item Nº 23) Meses após o Tratamento Engatinha (Item Nº 34) Mudança em Bayley® (Item#20) Paciente (mos) E-01+ 18,8 X X O X O 12 5 E-02+ 20,2 X X X X X O O X O 12 5 E-03* 12,5 X X X X 12 7 E-04 14,7 X O O X 11 11 E-06 23,2 X X X 8 3 E-09 20 X X X 7 3 E-12 19,8 X X X X 7 2 E-14 14,3 X O O 7 3 E-15 12 X X X 7 -1 E-20 19,9 X X X 6 2 E-21 20,3 X X X 5 4 E-23 19,8 X X X 5 1 E-24 7 X X X X O O O O O 5 17 E-25 17,1 X O O O O X 4 2 E-27 11,9 X X X X 5 6 E-28 15,1 X X O O 5 0 (X) denota a capacidade de realizar o item independentemente antes do tratamento; (O) representa nova capacidade de realizar o item independentemente após o tratamento.

[0247] Pacientes com idades entre dois e cinco anos com SMA Tipo 2 foram avaliados entre cinco e nove meses após o recebimento Dose B (1,2 x 1014vg; n=12) de AVXS-101 por via intratecal.

Conforme mostrado na Tabela 7, as mudanças nos escores da Escala Motora Bruta de Bayley® variaram entre -8 e 10 pontos (aumento médio + SD de 2,1 + 1,3 pts), com nove dos 12 pacientes (75%) apresentando melhora a partir da linha de base.

Cinco dos 12 pacientes (42%) alcançaram pelo menos um novo item Bayley® após o tratamento.

Dois pacientes (E07; E13) demonstraram capacidade de ficar de pé com apoio após o tratamento.

Um paciente (E07) agora é capaz de andar com auxílio.

Tabela 7: Itens selecionados da Bayley Scales of Infant and Toddler Development® - Escala Motora Bruta em pacientes com SMA Tipo 2 com idade entre 2 anos a 5 anos.

Tenta Ficar de Pé (Item Nº 35) Senta-se* Independentemente

Rola de Costas para os Lados

Fica de Pé Sozinho (Item Nº Idade no momento da Idade

Meses após o Tratamento

Mudança em Bayley® Senta-se sem Apoio

Anda com Auxílio Tenta se Sentar

Suporta o Peso (Item Nº 33) (Item Nº 20)

(Item Nº 23)

(Item Nº 26)

(Item Nº 34)

(Item Nº 37) Engatinha Paciente

(mos)

40)

E-05 29,5 X X X 9 1

E-07 50 X X X X O X X O 6 3

E-08 35,6 X X O X 7 8

E-10 45,3 X X X X 7 2

E-11 53,7 X X X 7 1

E-13 30,7 X X X O 7 10

E-16 28 X X O X X 6 3

E-17 32 X X 6 0

E-18 54,5 X X X 6 0

E-19 26,2 X X X 6 -8

E-22 37,2 X X X 6 -1

E-26 27,3 X O O X 5 4

(X) denota a capacidade de realizar o item independentemente antes do tratamento; (O) representa nova capacidade de realizar o item independentemente após o tratamento.

[0248] A Escala Motora Funcional Expandida de Hammersmith (HFMSE) foi realizada em pacientes a partir dos dois anos de idade (faixa etária de 6 a 24 meses) e em pacientes mais velhos (faixa etária de 2 a 5 anos). Mudanças nos escores de HFMSW variaram entre -4 e 14 pontos (aumento médio + SD de 4,3 + 5,3 pts), com 12 dos 19 pacientes (63,1%) apresentando melhora a partir da linha de base. Sete de 12 pacientes (58%) na faixa etária mais velha (2 a 5 anos) mostraram melhoras na HFMSE, enquanto cinco de sete pacientes (71%) na faixa etária mais jovem (6 a 24 meses) melhoraram. Um paciente (E02), tratado aos 20,3 meses de idade, atingiu a capacidade de ficar de pé sem apoio. Doze de 19 pacientes (63%) foram considerados respondedores (alcançando uma melhora na HFMSE de três pontos ou mais) (Figura 3). Uma correlação entre o escore de HFMSE e a idade do paciente no momento do tratamento não foi encontrada. Swoboda et al. (2010) "SMA CARNI-VAL Trial Part I: Double-Blind, Randomized, Placebo-Controlled Trial of L-Carnitine and Valproic Acid in Spinal Muscular Atrophy", PLOS ONE 5(8): e12140.

Tabela 8: Escala Motora Funcional Expandida de Hammersmith (HFMSE) selecionada em pacientes com SMA Tipo 2 com idades entre 2 e 5 anos no momento da avaliação.

o Outro (Itens Nº 6 a 9) Rola de um Lado para Idade no momento da Mudança em HFMSE Sentado para Deitado Independentemente Ajoelhado em Quatro De Pé Sem Apoio De Pé Apoiado Meses após o Engatinhando Injeção (mos) (Item Nº 16) (Item Nº 18) (Item Nº 19) Tratamento (Item Nº 1) Senta-se Paciente (Item Nº 10) (Item Nº 15) Pontos E-01+ 18,8 XX X XX XX O 12 -2 E-02+ 20,3 XX XO XO XO OO XO OO 12 8 E-04 14,7 XX XX XO O 11 5 E-05 29,5 XX XX O 9 7 E-06 23,2 XX XO O 8 11 E-07 50 XX XO XO XX XX OO 6 7 E-08 35,1 XX XO O 7 8 E-09 49,6 XX XX O 7 4 E-10 45 XX XX X XX XX O 7 0 E-11 53,6 XX X 7 0 E12 19,8 XX O 7 3 E-13 30,7 XX XO OO OO O OO 7 14 E-16 28 XX XO XO XX XX 6 8 E-17 31,9 XX 6 -1 E-18 54 XX X X X 6 -3 E-19 26 XX XX 6 -4 E-20 19,9 XX XX X 6 -1 E-22 37,2 XX O O 6 7 E-26 27,2 XX O 5 9 (X) denota a capacidade de realizar o item com auxílio antes do tratamento; (XX) denota a capacidade de realizar o item independentemente antes do tratamento. (O) representa nova capacidade de realizar o item com auxílio após o tratamento; (OO) representa nova capacidade de realizar o item independentemente após o tratamento. (XO) denota a capacidade de realizar o com auxílio antes do tratamento e nova capacidade de realizar o item sem auxílio após o tratamento.

[0249] A Figura 3 mostra os escores de HFMSE de pacientes individuais como uma função de idade do paciente. O teste de HFMSE não começou em pacientes na faixa etária de 6 a 24 meses até os mesmos completarem 24 meses de idade. Sessenta e três por cento dos pacientes (12 de 19) mostraram melhoras na HFMSE. Um paciente no grupo de Dose A (6,0 x 1013 vg) apresentou melhora de oito pontos em oito meses de tratamento; um segundo paciente no grupo de Dose A diminuiu dois pontos após sete meses de avaliação.

[0250] Os pacientes que alcançaram pelo menos uma melhora de 3 pontos de HFMSE foram caracterizados como respondedores nesse estudo. Para a coorte mais velha (dois a cinco anos de idade), a HFMSE foi avaliada a partir da linha de base até 5 meses de tratamento para 12 pacientes e para 10 e 5 pacientes aos seis e sete meses, respectivamente. Para a coorte mais nova (seis meses a dois anos), um paciente foi avaliado aos três e quatro meses, e cinco pacientes foram avaliados aos seis e sete meses após receberem tratamento com AVXS-101. Todos os pacientes na coorte mais velha e os pacientes na coorte mais nova que atingiram dois anos de idade e mais são mostrados na Figura 5 Uma taxa de respondedores rápida de 50% foi observada um mês após o tratamento. A taxa de respondedores foi mantida em ou acima de 50% durante sete meses de estudo, com uma tendência de aumento das taxas de resposta ao longo do tempo.

[0251] Para a coorte completa (n=12) a partir da linha de base até cinco meses de tratamento, as taxas mensais de respondedores para pacientes na coorte de faixa etária mais velha (dois a cinco anos de idade) para quem as avaliações de HFMSE foram realizadas são mostradas na Figura 6. Uma taxa de respondedores de 50% foi observada um mês após o tratamento. Com exceção do sexto mês após o tratamento, as taxas de respondedores foram mantidas em ou acima de 50% durante sete meses de estudo. Um respondedor inicial teve uma queda na HFMSE na avaliação de seis meses, reduzindo a taxa de respondedores abaixo de 50% nesse ponto de tempo.

[0252] Ao todo, vinte e três novos marcos motores foram observados em 11 de 24 pacientes durante o período de observação de quatro a doze meses (Tabelas 6 a 8). Na coorte mais velha, o escore médio de HFMSE aumentou 4,3 pontos entre 5 e 9 meses de estudo (Tabela 8). A maioria dos pacientes em ambas as coortes de idade (63%) teve melhoras nas pontuações de HFMSE após o tratamento, independentemente da dose (Figuras 3, 4). Cinquenta por cento dos pacientes nesse estudo tiveram melhoras clinicamente significativas em HFMSE (ou seja, respondedores, com escores > 3 pontos) após apenas um mês de terapia, com taxas de respondedores aumentando gradualmente ao longo do tempo. O tratamento com AVXS-101 foi mais eficaz do que o relatado para outras terapias, como, por exemplo, padrão de cuidados. Esses resultados demonstram que a maioria dos pacientes teve respostas precoces a uma dose única de AVXS-101 intratecal e mostram um rápido início de resposta, com manutenção do efeito ao longo do período durante o qual o AVXS-101 administrado por via intratecal foi estudado. Exemplo 3 - Estudos de AVXS-101 em Pacientes com SMA (Resultados Provisórios de Testes Clínicos II)

[0253] Resultados provisórios adicionais dos testes clínicos conforme detalhado no Exemplo 1 e 2 são apresentados aqui. AVXS- 101 foi administrado por via intratecal (IT) a pacientes com atrofia muscular espinhal (SMA) que podiam se sentar sem apoio por ≥10 segundos, porém não podiam ficar de pé ou andar independentemente no momento da entrada no estudo. Os pacientes tinham 3 cópias do gene SMN2, além da deleção bialélica de SMN1. Os pacientes foram estratificados em dois grupos, aqueles ≥6 meses e <24 meses de idade no momento de dosagem e aqueles ≥24 meses e <60 meses de idade no momento de dosagem. Avaliações de linha de base pré-tratamento foram realizadas para todos os pacientes do estudo (≥6 meses e <60 meses de idade) usando a Bayley Scales® e avaliações adicionais de linha de base foram realizadas para o grupo ≥24 meses e <60 meses de idade usando a HFMSE.

[0254] Dentro desses dois grupos de idade, três doses terapêuticas diferentes foram administradas conforme descrito: Três pacientes ≥6 meses e <24 meses de idade no momento da dosagem receberam uma única administração IT de 6,0 x 1013 vg de AVXS-101 (Dose A). Quinze pacientes ≥6 meses e <24 meses de idade e doze pacientes ≥24 meses e <60 meses de idade receberam uma única administração IT de 1,2 x 1014 vg de AVXS-101 (Dose B). Três pacientes ≥6 meses e <24 meses de idade no momento da dosagem receberam uma única administração IT de 2,4 x 1014 vg de AVXS-101 (Dose C). Em estudos futuros, 21 pacientes adicionais receberão a Dose C, com 9 desses pacientes com idade ≥6 meses e <24 meses no momento da dosagem, e 12 desses pacientes do grupo ≥24 meses e <60 meses de idade no momento da dosagem.

[0255] A população do estudo atual incluiu também 31 pacientes no Conjunto de Intenção de Tratar (ITT), que foi definido como todos os pacientes que receberam AVXS-101 IT, dos quais 19 pacientes eram ≥6 meses e <24 meses de idade, e 12 pacientes eram ≥24 meses e <60 meses de idade no momento da inscrição. Além disso, 4 pacientes (3 pacientes com Dose A e 1 com Dose B) foram incluídos no Conjunto de Análise Completa de Eficácia (ECAS), que foi definido como todos os pacientes que completaram 12 meses de acompanhamento pós-dose. Todas as análises de eficácia foram conduzidas usando o conjunto ITT como a população primária e ECAS como uma população de suporte nos resultados provisórios.

[0256] Os dados de pacientes tratados com AVXS-101 foram comparados com dados em nível de paciente coletados de um conjunto de dados de história natural revisado por pares e amplamente citado, coletados pela rede da Pediatric Neuromuscular Clinical Research

(PNCR). Kaufmann et al., "Prospective cohort study of spinal muscular atrophy types 2 and 3". (2012) Neurology, 79(18):1889-1897. A PNCR é um grande estudo de história natural desenvolvido a partir de uma coorte de 337 pacientes com qualquer forma de SMA, acompanhados em 3 grandes centros médicos terciários reconhecidos internacionalmente com experiência significativa no gerenciamento de SMA (Harvard University/Boston Children's Hospital, Columbia University e a University of Pennsylvania/Children's Hospital of Philadelphia). Os dados não contêm avaliações usando a Bayley Scales of Infant and Toddler Development®, o que limita o uso de dados de PNCR para o grupo ≥6 meses e <24 meses de idade. A mutação modificadora de SMN2 (c.859G>C) descrita por Prior e colegas não foi avaliada na coorte de estudo de PNCR. Prior et al., "A positive modifier of spinal muscular atrophy in the SMN2 gee". (2009) A. J. Hum. Genet., 85(3):408-441.

[0257] PNCR N=51 grupo de controle de história natural: Para pacientes ≥6 meses e <24 meses de idade, uma coorte de 51 pacientes retirada do estudo de história natural PNCR foi designada uma coorte de controle "correlacionada à população". Esta coorte de comparação inclui todos os 51 pacientes inscritos no estudo de PNCR que cumpriram os critérios de: (1) ter SMA tipos 2 ou 3, (2) 3 cópias de SMN2, (3) início dos sintomas antes dos 12 meses de idade e (4) ter pelo menos uma visita aos 36 meses de idade ou antes. Dessa coorte, 7/51 pacientes (13,74%) alcançaram a capacidade de ficar de pé, o que foi definido como alcançando um escore de 2 no item #19 da HFMSE a qualquer momento aos 36 meses de idade ou antes. A capacidade de andar sozinho foi alcançada em 5/51 pacientes (10%) e foi definida como alcançando um escore de HFMSE de 2 no item #20 a qualquer momento aos 36 meses de idade ou antes.

[0258] Grupo de controle de história natural PNCR N=15: Para pacientes ≥24 meses e <60 meses de idade, dados de nível de paciente, uma coorte de 15 pacientes retirada do estudo de história natural PNCR foi selecionada como uma coorte de controle "correlacionada à população". Esse grupo de controle foi usado para as análises primárias. Esse grupo de controle de história natural tinha: (1) SMA tipos 2 ou 3, (2) 3 cópias de SMN2, (3) início de sintomas antes de 12 meses de idade, (4) um diagnóstico de SMA antes de 24 meses de idade e (5) incapacidade de ficar de pé ou andar na inscrição no estudo de PNCR. Os membros da coorte receberam uma avaliação de HFMS ou HFMSE entre 24 e 60 meses de idade, que foi usada como a linha de base para comparação de avaliações de acompanhamento. Nesse grupo de PNCR de 15 pacientes tinha um paciente que teve um escore HFMSE de 0 registrado na linha de base e em todas as visitas de acompanhamento. Em 5/15 (33%) indivíduos da coorte, os escores HFMSE foram coletados por um período mais longo que 12 meses. A visita final foi de 18 meses para 2/15 pacientes (13%), 42 meses para 2/15 pacientes (13%) e 48 meses para 1/15 pacientes (7%).

[0259] PNCR N=17 grupo de controle de história natural: Para pacientes ≥24 meses e <60 meses de idade, dados em nível de paciente de uma coorte de 17 pacientes retirados do estudo PNCR foram identificados para melhorar a correspondência entre o grupo de pacientes e os controles de história natural. Esse grupo de controle foi usado para análises de sensibilidade. Doze pacientes originalmente no grupo de controle de PNCR N=15 estavam no grupo controle de história natural PNCR N=17. Três pacientes originalmente no grupo de controle de PNCR N=15 não foram incluídos (um indivíduo com HFMSE = 0 para visitas de linha de base e de acompanhamento, 2 indivíduos com visitas finais > 12 meses). Esses 17 indivíduos tinham critérios de idade, clínicos e genéticos correlacionados tanto quanto possível com o grupo de estudo. A primeira visita dentro da faixa de idade ≥24 meses e <60 meses foi definida como a visita de linha de base. Visitas subsequentes dentro de um intervalo de 12 meses foram usadas para determinar a mudança da linha de base para HFMSE. Clinicamente, esses indivíduos eram capazes de se sentar, porém não podiam ficar de pé ou andar independentemente. Geneticamente, os pacientes continham deleções bialélicas de SMN1 e 3 cópias de SMN2. Uma limitação do uso de controles de história natural PNCR foi que os intervalos de avaliação não foram consistentes entre os participantes. Então, alguns indivíduos nesse grupo de controle tinham ≤12 meses de dados (Consultar, por exemplo, a Tabela 13).

[0260] A disposição do paciente por tratamento e por idade para todos os pacientes inscritos é detalhada na Tabela 9. Um sumário de características demográficas e de linha de base por tratamento por faixa etária para o Conjunto de Análise de Segurança é fornecido na Tabela

10. Tabela 9: Pré-Disposição do Paciente - Todos os pacientes (corte de Resultados Provisórios II) Dose A Dose B Dose C Total Idade Idade < Idade ≥24 Idade < Idade ≥24 e <24 24 meses e <60 24 <60 meses meses meses meses Pacientes Examinados 36 Falhas no Exame de Pacientes 5 Pacientes no Conjunto Inscrito (n 3 13 12 3 0 31 (%)) Pacientes no Conjunto ITT (n (%)) 3 (100) 13 (100) 12 (100) 3 (100) 0 31 (100) Pacientes no Conjunto de Análise 3 (100) 13 (100) 12 (100) 3 (100) 0 31 (100) Completa (n (%)) Pacientes no Conjunto de Análise 3 (100) 13 (100) 12 (100) 3 (100) 0 31 (100) de Segurança (n (%)) Pacientes no Conjunto de Análise 3 (100) 1 (7,7) 0 0 0 4 (12,9) Completa de Eficácia (n (%)) Pacientes que concluíram o 3 (100) 1 (7,7) 0 0 0 4 (12,9) estudo até agora (n (%)) Pacientes descontinuados do 0 0 0 0 0 0 estudo (n (%))

Tabela 10: Características Demográficas e de Linha de Base - Conjunto de Análise de Segurança Categoria Demográfica/ Dose A Dose B Dose C Total Características/ Estatística Idade Idade Idade ≥24 Idade <24 Idade e <60 meses <24 meses < 24 meses < 24 meses meses Idade (meses) n 3 13 12 3 - 31 Média (DP) 15,67 15,46 35,92 18,00 - 23,65 (4,041) (4,427) (10,483) (3,464) (12,200) Mediana (Mín, Máx) 18,00 (11,0, 16,00 (6,0, 32,00 (25,0, 16,0 (16,0, - 19,00 (6,0, 18,00) 22,0) 53,0) 22,0) 53,0) Gênero (n (%)) Masculino 1 (33,3) 7 (53,8) 6 (50,0) 3 (100) 17 (54,8) Feminino 2 (66,7) 6 (46,2) 6 (50,0) 0 14 (45,2) Etnia (n (%)) Hispânico ou Latino 2 (66,7) 3 (23,1) 0 0 0 5 (16,1) Não Hispânico ou Latino 1 (33,3) 10 (76,9) 12 (100) 3 (100) 0 26 (83,9) Raça (n (%)) Branco 2 (66,7) 10 (76,9) 8 (66,7) 2 (66,7) 0 22 (71,0) Asiático 0 1 (7,7) 4 (33,3) 1 (33,3) 0 6 (19,4) Outra 0 1 (7,7) 0 0 0 1 (3,2) Múltiplo 1 (33,3) 1 (7,7) 0 0 0 2 (6,5)

Peso de linha de base (kg) n 3 13 12 3 - 31 Média (DP) 9,90 (1,900) 9,67 (0,778) 13,36 9,23 - 11,08 (2,783) (3,235) (0,252) Mediana (Mín, Máx) 9,90 (8,0, 9,50 (8,3, 12,70 (9,8, 9,20 (9,0, - 10,10 (8,0, 11,8) 10,8) 20,2) 9,5) 20,2) Comprimento/altura de linha de base (cm)

n 3 13 12 3 - 31 Média (DP) 76,63 77,12 92,28 74,50 - 82,68 (9,998) (4,744) (5,308) (8,449) (2,500) Mediana (Mín, Máx) 74,90 (73,0, 75,50 (69,0, 89,00 (82,5, 74,50 - 81,00 (69,0, 82,0) 87,0) 112,0) (72,0, 77,0) 112,0) IMC de Linha de Base (kg/m2) n 3 13 12 3 - 31 Média (DP) 16,736 16,363 15,530 16,653 - 16,105 (1,4937) (1,6485) (1,9429) (0,6724) (1,6973) Mediana (Mín, Máx) 17,549 16,576 15,223 16,576 - 16,139 (15,01, (12,55, (12,78, (16,02, (12,55, 18,90) 17,65) 18,90) 18,66) 17,36)

Histórico Familiar de SMA incluindo irmãos afetados ou genitores portadores (n [%]) Sim (n (%)) 1 (33,3) 1 (7,7) 1 (8,3) 0 0 3 (9,7) Não (n (%)) 1 (33,3) 12 (92,3) 11 (91,7) 2 (66,7) 0 26 (83,9) Desconhecido (n (%)) 1 (33,3) 0 0 1 (33,3) 0 2 (6,5) Idade gestacional no nascimento (semanas) n 3 13 11 3 - 30 Média (DP) 38,33 39,15 39,45 40,00 - 39,27 (1,507) (1,155) (0,899) (2,162) (1,000) Mediana (Mín, Máx) 39,00 (37,0, 39,00 (38,0, 40,00 (35,0, 40,00 - 39,00 (35,0, 39,0) 41,0) 42,0) (39,0, 41,0) 42,0) Peso ao Nascer (kg) n 3 12 11 3 - 29 Média (DP) 3,193 3,699 3,248 3,483 - 3,453 (0,3722) (0,8065) (0,5360) (0,2937) (0,6507) Mediana (Mín, Máx) 3,240 (2,80, 3,590 (3,10, 3,200 (2,55, 3,430 - 3,410 (2,55, 3,54) 6,13) 4,20) (3,22, 3,80) 6,13) Comprimento ao Nascer (cm) n 3 9 7 3 - 22 Média (DP) 50,557 50,459 51,261 49,520 - 50,600 (2,2748) (1,9058) (2,2702) (2,1478) (2,0272) Mediana (Mín, Máx) 50,170 51,000 51,000 48,300 - 51,000 (48,50, (47,00, (48,26, (48,26, (47,00, 55,50) 53,00) 52,07) 55,50) 52,00) Circunferência da Cabeça ao nascer (cm) n 3 5 7 2 - 17 Média (DP) 36,880 34,464 34,814 34,750 - 35,068 (3,4063) (0,8328) (1,5356) (1,0607) (1,8300) Mediana (Mín, Máx) 36,000 34,800 34,000 34,750 - 34,800 (34,00, (33,02, (33,00, (34,00, (33,00, 40,64) 40,64) 35,00) 36,70) 35,50) Paciente relatou hospitalizações (n [%]) Sim (n (%)) 1 (33,3) 4 (30,8) 5 (41,7) 1 (33,3) 0 11 (35,5) Não (n (%)) 2 (66,7) 9 (69,2) 7 (58,3) 2 (66,7) 0 20 (64,5) Paciente relatou suporte alimentar (n [%]) Sim (n (%)) 0 0 0 0 0 0 Não (n (%)) 3 (100) 13 (100) 12 (100) 3 (100) 0 31 (100) Paciente relatou suporte ventilatório (n [%]) Sim (n (%)) 0 0 1 (8,3) 0 0 1 (3,2) Não (n (%)) 3 (100) 13 (100) 11 (91,7) 3 (100) 0 30 (96,8) Resultados Provisórios: Avaliação provisória de grupo ≥6 meses e <24 meses de ponto final primário de eficácia (Doses A, B e C; total n = 19)

[0261] O ponto final primário de eficácia para esse grupo etário foi a obtenção de Bayley Scales of Infant and Toddler Development® - Subconjunto Motor Bruto Item #40, "ficar de pé sem apoio por pelo menos 3 segundos". Os pacientes foram considerados como tendo alcançado esse marco se o marco fosse alcançado em qualquer momento durante o acompanhamento pós-dose de 12 meses. As gravações de vídeo da avaliação dos marcos do local de estudo foram confirmadas por um revisor central independente. Os resultados de eficácia primária por dose para o Conjunto ITT estão resumidos abaixo e na Tabela 11:

[0262] Para a Dose A (6,0 x 1013 vg de AVXS-101), 1 de 3 pacientes (33,3%), paciente 007-001, conseguiu ficar de pé com apoio 11 meses após o tratamento. Esse paciente tinha aproximadamente 20 meses de idade quando dosado. Embora o paciente não ficasse de pé sozinho, este paciente alcançou as seguintes habilidades na entrada do estudo: suportar o peso (Bayley® # 33), caminhar com apoio (Bayley® # 37) e andar lateralmente com apoio (Bayley® # 38).

[0263] Para a Dose B (1,2 x 1014 vg de AVXS-101), 1 de 13 pacientes (7,7%), paciente 007-002, conseguiu ficar de pé sem apoio 3 meses após o tratamento. Esse paciente tinha aproximadamente 7 meses de idade quando dosado. De acordo com o médico do estudo, esse paciente não tinha manifestações de SMA identificadas com o exame neurológico. Como o paciente tinha um irmão afetado, o paciente foi diagnosticado no início da vida com testes genéticos e acompanhado com estudos de condução nervosa. Antes da entrada no estudo, o potencial de ação muscular composto (CMAP) do paciente era anormal.

[0264] Para a Dose C (2,4 x 1014 vg de AVXS-101), nenhum paciente (0 de 3) alcançou o marco de ficar de pé sem apoio nas avaliações até 12 meses após o tratamento (Tabela 11).

[0265] Para a Dose B + Dose C, 1 de 16 pacientes (6,3%), paciente

007-002 (descrito acima), alcançou o marco de ficar de pé sem apoio 3 meses após o tratamento. Tabela 11: A proporção de pacientes com <24 meses de idade no momento da dosagem, alcançando a capacidade de ficar de pé sozinho em qualquer visita pós-linha de base até 12 meses - conjunto ITT Avaliação Estatística Controles de Dose A Dose B Dose C (n=3) Dose B+C História Natural (n=3) (n=13) (n=16) de PNCR (n=51) Proporção de Sim 7 (13,7) 1 1 (7,7) 0 1 (6,3) pacientes que (33,3) alcançaram a Não 44 (86,3) 2 12 (92,3) 3 (100,0) 15 (93,8) capacidade de ficar de (66,7) pé sozinho Teste de diferença de Diferença nas proporções (95% de CI) -6,0 (-21,8, -13,7 (-28,9, -7,5 (-22,0, proporção* 22,8) 56,5) 17,2) valor p (teste exato de Fisher) >0,9999 >0,9999 0,6687 * O teste exato de Fisher foi realizado apenas para as Doses B, C e B+C.

[0266] Para controles de história natural com SMA tipos 2 e 3 do conjunto de dados de PNCR N=51, 7 dos 51 pacientes (13,7%) alcançaram o marco de ficar de pé sem apoio (conforme mostrado na Tabela 11).

[0267] A análise estatística foi realizada de acordo com o protocolo usando um teste exato de Fisher para a comparação entre grupos da proporção de pacientes que alcançaram o marco (ponto final primário de eficácia) e uma análise de Kaplan-Meier para o ponto final de eficácia de suporte. O ponto final primário de eficácia de alcançar a capacidade de ficar de pé independentemente em qualquer visita pós-linha de base até 12 meses está resumido na Tabela 11.

[0268] O tempo para alcançar a capacidade de ficar de pé sozinho foi resumido para todos os pacientes no grupo PNCR, bem como por dose no Conjunto ITT. Com o uso de um modelo de riscos proporcionais de Cox para avaliar a diferença de tratamento com a idade do paciente no início do estudo como uma covariável, a razão dos riscos (95% de

CI) foi de 0,43 (0,05, 3,93) para grupos de Dose B, 0 (0, não avaliável) para Dose C, e 0,37 (0,04, 3,39) para Dose B + Dose C, com valores p de 0,4576, 0,9951 e 0,3826, respectivamente. A maioria dos pacientes do estudo não alcançou o marco de ficar de pé de independentemente a partir do relatório dos resultados provisórios, proibindo o cálculo de valores como o 25º percentil, a mediana e o 75º percentil. Resultados Provis órios: Avaliação provis ória de grupo ≥24 meses e <60 meses de ponto final primário de eficácia (Dose B; total n = 12) a. Análise de eficácia primária com grupo de controle de História Natural PNCR N=15

[0269] O ponto final primário de eficácia para esse grupo etário foi a mudança da linha de base em HFMSE no Mês 12. A linha de base, a pós-linha de base e a mudança dos valores da linha de base na HFMSE são resumidas e analisadas usando o Conjunto ITT. O grupo de controle de história natural PNCR N=15 é usado como a coorte de controle primário "correlacionada à população" para as análises especificadas no protocolo.

[0270] Um gráfico espaguete da mudança de linha de base nos escores HFMSE até o Mês 12 para indivíduos tratados com AVXS-101 Dose B e nos controles de história natural PNCR N=15 é exibido na Figura 7 Estatísticas descritivas para os pacientes tratados e controles são fornecidas na Tabela 12.

[0271] Nos controles de história natural PNCR N=15, o desvio padrão da média ± (SD) para o escore HFMSE de linha de base foi de 11,8 ± 7,34. Nesse grupo de controle PNCR, a mudança de escore HFMSE de linha de base pode ser calculada no Mês 2 (-0,6 ± 1,35), Mês 4 (0,4 ± 0,98), Mês 6 (0,2 ± 1,72), Mês 9 (1,0 ± 2,16) e Mês 12 (0,8 ± 2,86).

[0272] No grupo de tratamento com AVXS-101 Dose B, o valor HFMSE de linha de base foi de 14,8 ± 9,98. A maioria dos pacientes tratados tinha até 8 meses de dados HFMSE (11/12). A mudança de escore HFMSE de linha de base nos Meses 2, 4, 6, 9 e 12 foi de 3,5 ± 4,38, 3,6 ± 5,07, 3,9 ± 5,85, 5,7 ± 6,72 e 7, respectivamente.

O grupo de tratamento com Dose B mostrou um aumento robusto nos escores HFMSE em comparação com o grupo de controle de história natural PNCR N=15. Tabela 12: Valores HFMSE em pontos de tempo especificados (pacientes ≥24 meses e <60 meses de idade) - Conjunto ITT - Dose B

Controles de História Natural Dose B (N = 12) PNCR (N=15)

n Média (DP) Mediana n Média (DP) Mediana Avaliação de Visita (Mín, Máx) (Mín, Máx)

Linha de base

Escores observados 15 11,8 (7,34) 9,0 (0, 22) 12 14,8 (9,98) 12,0 (3,32)

Mês 1

Escores observados NA NA NA 12 17,2 (10,05) 15,0 (2,36)

Mudança de escores de NA NA NA 12 2,4 (3,34) 3,0 (-4, 8) linha de base

Mês 2

Escores observados 10 -13,9 (6,30) 15,5 (5, 21) 12 18,3 (11,04) 14,5 (5, 38)

Mudança de escores de 10 -0,6 (1,35) -1,0 (-2, 2) 12 3,5 (4,38) 3,0 (-4, 14) linha de base

Mês 3

Escores observados NA NA NA 12 18,5 (10,94) 15,5 (4, 39)

Mudança de escores de NA NA NA 12 3,8 (3,93) 5,0 (-4, 11) linha de base

Mês 4

Escores observados 7 14,1 (7,15) 15,0 (4, 23) 12 18,3 (11,83) 15,5 (4, 40)

Mudança de escores de 7 0,4 (0,98) 0,0 (-1, 2) 12 3,6 (5,07) 5,0 (-4, 12) linha de base

Mês 5

Escores observados NA NA NA 12 19,3 (11,69) 16,5 (4, 40)

Mudança de escores de NA NA NA 12 4,5 (5,79) 5,5 (-3, 16) linha de base

Mês 6

Escores observados 6 10,5 (7,69) 9,5 (0, 22) 12 18,7 (11,72) 15,5 (2, 39)

Mudança de escores de 6 0,2 (1,72) 0,0 (-2, 3) 12 3,9 (5,85) 4,5 (-4, 16) linha de base

Mês 7

Escores observados 1 21,0 21 (21, 21) 11 17,5 (10,14) 16,0 (4, 32)

Mudança de escores de 1 -1,0 -1,0 (-1, -1) 11 4,3 (5,35) 4,0 (-3. 14) linha de base

Mês 8

Escores observados 1 20 20 (20, 20) 11 20,5 (11,89) 17,0 (7, 39)

Mudança de escores de 1 2,0 2,0 (2, 2) 11 4,7 (6,48) 4,0 (-7, 16) linha de base

Mês 9

Escores observados 7 13,7 (7,78) 16,0 (2, 22) 10 22,3 (11,76) 19,5 (7, 39)

Mudança de escores de 7 1,0 (2,16) 1,0 (-2, 5) 10 5,7 (6,72) 5,5 (-4, 20) linha de base

Mês 10

Escores observados 1 21,0 21 (21, 21) 3 26,3 (12,10) 22,0 (17, 40)

Mudança de escores de 1 -1,0 -1,0 (-1, -1) 3 8,3 (0,58) 8,0 (8, 9) linha de base

Mês 11

Escores observados NA NA NA 1 17,0 17,0 (17, 17)

Mudança de escores de NA NA NA 1 9,0 9,0 (9, 9) linha de base

Mês 12

Escores observados 9 10,2 (7,36) 10,0 (0, 22) 1 15,0 15,0 (15, 15)

Mudança de escores de 9 0,8 (2,86) 0,0 (-2, 6) 1 7,0 7,0 (7, 7) linha de base b.

Análise de sensibilidade usando o grupo de controle de História Natural PNCR N=17

[0273] Estatísticas descritivas e gráficos espaguete para a Dose B e os controles de história natural PNCR N=17 são fornecidos na Tabela 13 e Figura 8

[0274] No grupo de controle com história natural PNCR N=17, o escore HFMSE de linha de base foi de 12,1 ± 9,21. As mudanças de escore HFMSE de linha de base podem ser calculadas no Mês 2 (-0,2 ± 1,56), Mês 4 (0,5 ± 1,05), Mês 6 (-0,4 ± 5,32), Mês 9 (1,1 ± 2,03) e Mês 12 (-0,2 ± 8,11). Quarenta e um por cento (7/17) dos pacientes PNCR não tinham um escore HFMSE de 12 meses.

[0275] O grupo de tratamento com AVXS-101 Dose B teve um escore de linha de base HFMSE de 14,8 ± 9,98. A mudança média de escore HFMSE de linha de base nos Meses 2, 4, 6, 9 e 12 foi de 3,5 ± 4,38, 3,6 ± 5,07, 3,9 ± 5,85, 5,7 ± 6,72 e 7, respectivamente.

[0276] O grupo de tratamento com Dose B mostrou um aumento robusto nos escores HFMSE em comparação com o grupo de controle de história natural PNCR N=17. Tabela 13: Valores HFMSE em pontos de tempo especificados (pacientes ≥24 meses e <60 meses de idade) - Conjunto ITT (PNCR de Sensibilidade) - Dose B Controles de História Natural Dose B (N = 12) PNCR (N=17) n Média (DP) Mediana n Média (DP) Mediana Avaliação de Visita (Mín, Máx) (Mín, Máx) Linha de base Escores observados 17 12,1 (9,21) 8,0 (2, 39) 12 14,8 (9,98) 12,0 (3,32) Mês 1 Escores observados NA NA NA 12 17,2 (10,05) 15,0 (2,36) Mudança de escores de NA NA NA 12 2,4 (3,34) 3,0 (-4, 8) linha de base Mês 2 Escores observados 9 12,1 (6,21) 8,0 (5, 21) 12 18,3 (11,04) 14,5 (5, 38) Mudança de escores de 9 -0,2 (1,56) -1,0 (-2, 2) 12 3,5 (4,38) 3,0 (-4, 14) linha de base Mês 3 Escores observados 1 2,0 2,0 (2, 2) 12 18,5 (10,94) 15,5 (4, 39)

Mudança de escores de 1 -2,0 -2,0 (-2, -2) 12 3,8 (3,93) 5,0 (-4, 11) linha de base Mês 4 Escores observados 6 12,8 (6,85) 12,5 (4, 23) 12 18,3 (11,83) 15,5 (4, 40) Mudança de escores de 6 0,5 (1,05) 0,5 (-1, 2) 12 3,6 (5,07) 5,0 (-4, 12) linha de base Mês 5 Escores observados NA NA NA 12 19,3 (11,69) 16,5 (4, 40) Mudança de escores de NA NA NA 12 4,5 (5,79) 5,5 (-3, 16) linha de base Mês 6 Escores observados 8 13,6 (7,42) 10,5 (6, 27) 12 18,7 (11,72) 15,5 (2, 39) Mudança de escores de 8 -0,4 (5,32) 0,5 (-12, 6) 12 3,9 (5,85) 4,5 (-4, 16) linha de base Mês 7 Escores observados NA NA NA 11 17,5 (10,14) 16,0 (4, 32) Mudança de escores de NA NA NA 11 4,3 (5,35) 4,0 (-3. 14) linha de base Mês 8 Escores observados NA NA NA 11 20,5 (11,89) 17,0 (7, 39) Mudança de escores de NA NA NA 11 4,7 (6,48) 4,0 (-7, 16) linha de base Mês 9 Escores observados 8 12,8 (7,70) 13,0 (2, 22) 10 22,3 (11,76) 19,5 (7, 39) Mudança de escores de 8 1,1 (2,03) 1,0 (-2, 5) 10 5,7 (6,72) 5,5 (-4, 20) linha de base Mês 10 Escores observados NA NA NA 3 26,3 (12,10) 22,0 (17, 40) Mudança de escores de NA NA NA 3 8,3 (0,58) 8,0 (8, 9) linha de base Mês 11 Escores observados NA NA NA 1 17,0 17,0 (17, 17) Mudança de escores de NA NA NA 1 9,0 9,0 (9, 9) linha de base Mês 12 Escores observados 10 13,6 (7,53) 14,0 (1, 25) 1 15,0 15,0 (15, 15) Mudança de escores de 10 -0,2 (8,11) 0,0 (-20, 11) 1 7,0 7,0 (7, 7) linha de base

Resultados Provisórios: Ponto final secundário de eficácia - Marco Motor, andar independentemente pelo menos 5 passos

[0277] O ponto final secundário de eficácia foi uma Bayley Scales of Infant and Toddler Development®– Subconjunto Motor Bruto Item #43 ("anda independentemente ≥5 passos") para os grupos ≥6 meses e <24 meses de idade e o grupo ≥24 e <60 meses de idade. Este marco foi pontuado em qualquer visita após o tratamento até a visita de estudo de 12 meses. A evidência de vídeo da avaliação do marco inicial foi analisada e confirmada por um revisor central independente.

[0278] Para pacientes ≥6 meses e <24 meses de idade no momento da dosagem, um único paciente (007-002) que recebeu a Dose B (1,2 x 1014 vg) andou sem auxílio na visita do Mês 4 (Consultar a descrição do paciente na seção anterior). A proporção de pacientes que alcançou a capacidade de andar sem auxílio foi de 0% (0/3) para Dose A (6,0 x 1013 vg), 7,7% (1/13) para Dose B (1,2 x 1014 vg) e 0% (0/3) para Dose C (2,4 x 1014 vg). O grupo de controle de história natural PNCR N=51 foi usado para essa análise. Cinco de 51 (9,8%) pacientes desse grupo de controle andaram independentemente na linha de base. Durante o período de acompanhamento, nenhum paciente nesse grupo de controle andou independentemente.

[0279] Para pacientes ≥24 meses e <60 meses de idade no momento da dosagem, todos os pacientes receberam a Dose B (1,2 x 1014 vg). Nenhum paciente nessa faixa etária recebeu a Dose C. Nenhum dos pacientes tratados com a Dose B andou independentemente. Nenhum paciente no grupo de controle de história natural PNCR primário N=15 ou no grupo de controle de sensibilidade PNCR N=17 andou independentemente. Resultados Provisórios: Ponto final exploratório de eficácia - Avaliação de Bayley Scales of Infant and Toddler Development®

[0280] Para o grupo ≥6 meses e <24 meses de idade e o grupo ≥24 e <60 meses de idade, a mudança da linha de base nos componentes motores finos e brutos da Bayley Scales of Infant and Toddler

Development®, Terceira Edição (Bayley®-III) foi avaliada. Para o grupo ≥6 meses e <24 meses de idade, o segundo ponto final exploratório é a mudança na HFMSE da linha de base entre aqueles pacientes que continuam no estudo após 24 meses de idade e tiveram pelo menos 6 meses de avaliações de HFMSE pós-linha de base gravados. Visto que as Bayley Scales® não foram avaliadas no conjunto de dados PNCR, apenas estatísticas descritivas são fornecidas para os pacientes <24 meses de idade.

[0281] Embora os pacientes com SMA tipo 1 tenham comprometimento motor fino grave com bebês incapazes de agarrar usando toda a mão, a função motora fina é relativamente bem preservada em SMA tipo 2 e SMA tipo 3, conforme refletido nos escores Bayley® para desenvolvimento motor fino. De Sanctis et al., "Developmental milestones in type I spinal muscular atrophy". (2016) Neuromuscul. Disord. 26(11):754-759; Chabanon et al., "Prospective and longitudinal natural history study of patients with Type 2 and 3 spinal muscular atrophy: Baseline data NatHis-SMA study". (2018) PLoS ONE ,13(7): e0201004. Na SMA tipo 2 e tipo 3, a disfunção muscular proximal é significativamente maior do que a disfunção muscular distal, conforme refletido nos escores Bayley® para desenvolvimento motor bruto. a. Pacientes ≥6 meses e <24 meses de idade no momento da dosagem

[0282] Dose A (6,0 x 1013 vg): Todos os 3 pacientes nesse grupo concluíram o período de avaliação de 12 meses após a dosagem. A mudança de linha de base nas Bayley Scales® no Mês 12 foi de 12,3 ± 6,51 para o subteste motor fino e 5,7 ± 1,15 para o subteste motor bruto.

[0283] Dose B (1,2 x 1014 vg): A mudança da linha de base no subteste de motor fino estava disponível para todos os 13 pacientes no Mês 6 (5,4 ± 3,57). Os dados disponíveis estavam incompletos para os meses subsequentes: Mês 7 (n=11; 7,8 ± 3,03), Mês 8 (n=10; 7,4 ± 3,60), Mês 9 (n=6; 8,2 ± 3,25), Mês 10 (n=3; 11,7 ± 3,06), Mês 11 (n=2;

12,5 ± 4,95). O mês 12 teve um único paciente com uma mudança de linha de base de 16,0. As habilidades motoras finas continuaram a melhorar nesses pacientes, conforme previsto pelos estudos de história natural. Chabanon et al., "Prospective and longitudinal natural history study of patients with Type 2 and 3 spinal muscular atrophy: Baseline data NatHis-SMA study". (2018) PLoS ONE. 13(7): e0201004.

[0284] A mudança da linha de base no subteste de motor bruto estava disponível para todos os 13 pacientes no Mês 6 (3,8 ± 5,01). Os dados disponíveis estavam incompletos para os meses subsequentes: Mês 7 (n=12; 4,7 ± 4,29), Mês 8 (n=10; 4,9 ± 6,45), Mês 9 (n=6; 3,5 ± 2,07), Mês 10 (n=3; 5,7 ± 4,73), Mês 11 (n=2; 8,0 ± 4,24) e Mês 12 (n=1; 11,0). Os pacientes continuavam a ganhar marcos motores brutos. Nenhum paciente perdeu marcos.

[0285] Dose C (2,4 x 1014 vg): Dados limitados para a mudança da linha de base no subteste de motor fino estavam disponíveis: Mês 2 (n = 3; 0,7 ± 0,58), Mês 3 (n = 2; 3,5 ± 0,71); Mês 4 teve um único paciente com uma mudança de linha de base de 6,0. A mudança da linha de base no subteste de motor bruto estava disponível até 4 meses: Mês 2 (n=3; 0,3 ± 1,53), Mês 3 (n=2; 0,5 ± 3,54) e Mês 4 (n=1; 4,0).

[0286] Dose B + Dose C: O gráfico espaguete para a mudança de linha de base em Bayley Scales® até 12 meses para a Dose B + Dose C é fornecido na Figura 9 (Motor Fino) e Figura 10 (Motor Bruto). Estatísticas descritivas para as Bayley Scales® são fornecidas na Tabela 14.

Tabela 14: Análise da mudança máxima da linha de base nos escores motores brutos e finos da Bayley Scale for Infant and Toddler Development® em qualquer visita pós-linha de base até 12 meses para pacientes <24 meses de idade no momento da dosagem - Conjunto ITT Estatísticas de Visita Dose A (N=3) Dose B (N=13) Dose C (N=3) Dose B+C de Categoria (N=16)

Motor Bruto

Linha de base n 3 13 3 16

Média (DP) 26,3 (8,62) 20,8 (4,46) 25,0 (7,00) 21,6 (5,03)

Mediana (Mín, Máx) 28,0 (17, 34) 20,0 (14, 3) 25,0 (18, 32) 20,0 (14, 32)

Valor pós-linha de base para a visita com valor máximo de CFB observado n 3 13 3 16

Média (DP) 32,0 (7,55) 26,3 (8,48) 26,0 (5,29) 26,3 (7,83)

Mediana (Mín, Máx) 33 (24, 39) 24,0 (18, 51) 24,0 (22, 32) 24,0 (18, 51)

Mudança de linha de base n 3 13 3 16

Média (DP) 5,7 (1,15) 5,5 (5,43) 1,0 (2,65) 4,7 (5,28)

Mediana (Mín, Máx) 5,0 (5, 7) 4,0 (1, 21) 0,0 (-1, 4) 4,0 (-1, 21)

Motor Fino

Linha de base n 3 13 3 16

Média (DP) 31,3 (2,89) 31,2 (4,64) 36,0 (6,08) 32,1 (5,08)

Mediana (Mín, Máx) 33,0 (28, 33) 31,0 (22, 38) 33,0 (32, 43) 31,5 (22,43)

Média (DP) 46,7 (5,03) 40,5 (5,97) 39,0 (3,61) 40,3 (5,53)

Mediana (Mín, Máx) 46,0 (42, 52) 41,0 (32, 50) 38,0 (36, 43) 40,0 (32, 50)

Mudança de linha de base n 3 13 3 16

Média (DP) 15,3 (5,51) 9,3 (3,75) 3,0 (3,00) 8,1 (4,35)

Mediana (Mín, Máx) 18,0 (9, 19) 11,0 (3, 16) 3,0 (0, 6) 9,0 (0, 16)

b. Pacientes ≥4 meses e <60 meses de idade no momento da dosagem

[0287] O grupo ≥24 e <60 meses de idade é composto por 12 pacientes que receberam a Dose B (1,2 x 1014 vg). Ganhos em subconjuntos motores finos e brutos foram observados. A mudança da linha de base no subteste de motor fino estava disponível para todos os 12 pacientes no Mês 6 (7,6 ± 5,62). Os dados disponíveis estavam incompletos para os meses subsequentes: Mês 7 (n=11; 6,6 ± 5,33), Mês 8 (n=11; 8,0 ± 5,74), Mês 9 (n=10; 7,9 ± 5,53) e Mês 10 (n=2; 10,5 ± 0,71). Um único paciente teve dados no Mês 11 (n = 1) e no Mês 12 (n = 1) com escores de 9,0 e 10,0, respectivamente.

[0288] Para o subconjunto motor bruto, a mudança de linha de base estava disponível para todos os 12 pacientes durante o Mês 6 (1,8 ± 4,47). Os dados disponíveis estavam incompletos para os meses subsequentes: Mês 7 (n=11; 2,0 ± 4,36), Mês 8 (n=11; 2,3 ± 4,47), Mês 9 (n=10; 2,4 ± 5,08), Mês 10 (n=2; 5,5 ± 6,36). Nenhum paciente perdeu marcos motores brutos Bayley®.

[0289] O gráfico espaguete para a mudança de linha de base em Bayley Scales® até 12 meses para a Dose B é fornecido na Figura 11 e Figura 12. A curva para o paciente 008-003 está incorreta. O escore de linha de base para o paciente 008-003 foi 20, não 28 (como inicialmente relatado). Portanto, a mudança no Escore de Motor Bruto entre a medição de linha de base e o Mês 1 foi "0", não "-8". Além disso, a mudança do paciente 008-003 no Escore de Motor Bruto da medição de linha de base foi "0" para os Meses 2 e 3, "+1" para o Mês 4, "0" para os Meses 5 e 6, "+1" para os Meses 7 a11 e "+2" para o Mês 12.

[0290] Esses dados provisórios resumem os resultados de eficácia do teste clínico descrito no Exemplo 1 a partir de 12 meses após o tratamento. Estatísticas descritivas para as Bayley Scales® são fornecidas na Tabela 15.

Tabela 15: Análise de mudança máxima da linha de base nos escores motores brutos e finos da Bayley Scales for Infant and Toddler Development® em qualquer visita pós-linha de base até 12 meses para pacientes ≥ 24 e <60 meses de idade no momento da dosagem - Conjunto ITT Estatísticas de Visita de Categoria Dose B (N=12) Motor Bruto Linha de base n 12 Média (DP) 23,2 (6,15) Mediana (Mín, Máx) 20,5 (16, 35) Valor pós-linha de base para a visita com valor máximo de CFB observado n 12 Média (DP) 26,2 (6,83) Mediana (Mín, Máx) 24,5 (18, 38) Mudança de linha de base n 12 Média (DP) 3,0 (4,51) Mediana (Mín, Máx) 3,0 (-7, 11) Motor Fino Linha de base n 12 Média (DP) 46,2 (8,77) Mediana (Mín, Máx) 47 (32, 60) Valor pós-linha de base para a visita com valor máximo de CFB observado n 12 Média (DP) 55,6 (5,66) Mediana (Mín, Máx) 55,0 (46, 65) Mudança de linha de base n 12 Média (DP) 9,4 (5,32) Mediana (Mín, Máx) 10,0 (1, 23)

Resultados Provisórios: Mudança nos Escores HFMSE entre pacientes ≥6 meses e <24 meses de idade que continuam no estudo após 24 meses de idade

[0291] O escore HFMSE foi registrado para o grupo de pacientes ≥6 e <24 meses de idade que completaram 24 meses de idade. Como uma linha de base pré-tratamento não estava disponível para nenhum paciente, o primeiro registro de HFMSE é definido como a linha de base. As designações de meses abaixo são relativas ao primeiro registro de HFMSE aos ≥24 meses de idade, não ao mês do estudo.

[0292] Dose A (6,0 x 1013 vg): Dois pacientes completaram 24 meses de idade. A mudança do primeiro registro de HFMSE é fornecida: Mês 1 (n=2; -0,5 ± 4,95), Mês 2 (n=2; 4,0 ± 0,00), Mês 3 (n=2; 3,5 ± 0,71), Mês 4 (n=2; 3,0 ± 2,83), Mês 5 (n=1; 5,0) e Mês 6 (n=2; 2,0 ± 5,66).

[0293] Dose B (1,2 x 1014 vg): Oito pacientes completaram 24 meses de idade. A mudança do primeiro registro de HFMSE é fornecida: Mês 1 (n=7; 2,0 ± 2,83), Mês 2 (n=7; 2,7 ± 2,69), Mês 3 (n=6; 1,3 ± 4,97), Mês 4 (n=3; 4,7 ± 4,51) e Mês 5 (n=2; 7,5 ± 0,71).

[0294] O gráfico espaguete para a mudança de linha de base em escores HFMSE até 12 meses para a Dose B é fornecido na Figura 13. A mudança máxima (média ± SD) da linha de base nos valores de HFMSE em qualquer visita pós-linha de base até 12 meses para a Dose B foi de 17,7 ± 5,28 (n = 7), conforme mostrado na Tabela 16.

[0295] Dose C (2,4 x 1014 vg): Um único paciente atingiu o primeiro registro de HFMSE com ≥24 meses de idade. Apenas esse único ponto de dados de "linha de base" estava disponível.

Tabela 16: Mudança máxima de linha de base em HFMSE em qualquer visita pós-linha de base até 12 meses para pacientes <24 meses no momento da dosagem que continuaram no estudo nos últimos 24 meses de idade - conjunto ITT Estatísticas de Visita de Dose B (N=13) Dose C (N=3) Categoria Linha de base definida como a primeira avaliação de HFMSE durante o estudo quando os pacientes completam 24 meses de idade n 8 1 Média (DP) 13,0 (5,61) 33,0 Mediana (Mín, Máx) 13,0 (6, 21) 33,0 (33, 33) Valor pós-linha de base para a visita com valor máximo de CFB observado n 7 0 Média (DP) 17,7 (5,28) - Mediana (Mín, Máx) 17 (11, 25) - Mudança de linha de base n 7 0 Média (DP) 5,9 (5,34) - Mediana (Mín, Máx) 4,0 (2, 17) - Conclusões Provisórias

[0296] O teste clínico descrito no presente documento é um estudo em andamento de Fase 1, aberto de administração intratecal (IT) de dose única em bebês e crianças ≥6 meses e <60 meses de idade que são diagnosticados com atrofia muscular espinhal (SMA). Os dados obtidos até agora nos pacientes tratados mostram mudanças clinicamente significativas na função motora que incluem habilidades de avanço, marcos de avanço e estabilização da doença que são descritos nos sumários de cada faixa etária abaixo.

grupo ≥6 meses e <24 meses de idade

[0297] Dezenove pacientes ≥6 meses e <24 meses de idade foram inscritos no teste clínico. Três pacientes receberam uma única dose de 6,0 x 1013 vg de AVXS-101 (Dose A), 13 pacientes receberam uma única dose de 1,2 x 1014 vg de AVXS-101 (Dose B) e 3 pacientes receberam uma única dose de 2,4 x 1014 vg de AVXS-101 (Dose C). Quatro pacientes concluíram as avaliações pós-dose de 12 meses: 3 pacientes no grupo de Dose A e 1 paciente no grupo de Dose B.

[0298] O ponto final primário de eficácia para esse grupo etário foi a obtenção de Bayley Scales of Infant and Toddler Development® - Subconjunto Motor Bruto #40, "ficar de pé sem apoio por pelo menos 3 segundos". Dois pacientes alcançaram pontos finais desfechos primários de eficácia. O paciente 007-001 que recebeu a Dose A ficou de pé sem apoio por pelo menos 3 segundos 11 meses após o tratamento. O paciente 007-002 que recebeu a Dose B ficou de pé sem apoio 3 meses após o tratamento.

[0299] O ponto final secundário de eficácia foi a Bayley Scales of Infant and Toddler Development®–Motor Bruto Subconjunto #43 ("anda independentemente ≥5 passos"). Um paciente (007-002) que recebeu a Dose B andou sem auxílio pelo menos 5 passos, 4 meses após o tratamento.

[0300] O ponto final exploratório foi a mudança de linha de base nos componentes motores finos e brutos da Bayley Scales of Infant and Toddler Development®, Terceira Edição (Bayley®-III). Visto que as Bayley Scales® não foram avaliadas no conjunto de dados PNCR, apenas estatísticas descritivas são fornecidas para os pacientes <24 meses de idade. Entretanto, os pacientes continuavam a ganhar marcos motores brutos. Nenhum paciente perdeu marcos. grupo ≥24 meses e <60 meses de idade

[0301] Doze pacientes ≥24 meses e <60 meses de idade foram inscritos no teste clínico e receberam a Dose B. Nenhum paciente nesse grupo etário recebeu a Dose C. Um único paciente completou as avaliações pós-tratamento de 12 meses.

[0302] O ponto final primário de eficácia para esse grupo etário foi a mudança da linha de base em HFMSE. Para contextualizar as mudanças observadas no grupo da Dose B, uma melhora ≥3 pontos no escore HFMSE é considerada significativa e importante para as partes interessadas, como cuidadores e médicos, e é usada como o limiar para detectar mudanças significativas em testes clínicos. Mercuri et al., "Nusinersen versus sham control in later-onset spinal muscular atrophy". N Engl J Med. 378(7): 625-635. O grupo de tratamento com Dose B mostrou um aumento robusto nos escores HFMSE em relação ao grupo de controle de história natural PNCR N=15. Para o grupo de controle com história natural PNCR N=15, uma mudança máxima no escore HFMSE foi observada no Mês 9 (n=7) de 1,0 ± 2,16. Resultados similares foram observados quando se realiza a Análise de Sensibilidade usando o grupo de controle de história natural PNCR N=17 com uma mudança máxima no escore HFMSE no Mês 9 (n=8) de 1,1 ± 2,03.

[0303] O grupo de tratamento com Dose B mostrou um aumento clinicamente significativo de 5,7 ± 6,72 para a mudança no escore HFMSE no Mês 9 (n=10).

[0304] O ponto final exploratório foi a mudança de linha de base nos componentes motores finos e brutos da Bayley®-III. Similar ao grupo etário mais jovem, os pacientes continuam a ganhar marcos motores brutos. Nenhum paciente perdeu marcos.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Uso de um vetor viral AAV9, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para o tratamento de atrofia muscular espinhal (SMA) em um paciente que precisa do mesmo, em que o vetor viral AAV9 compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína de sobrevivência do neurônio motor (SMN), e adicionalmente particularizado por o vetor viral AAV9 ser formulado para administração intratecal em uma dose de cerca de 1 x 1013 vg - 5 x 1014 vg.

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o vetor viral AAV9 compreende adicionalmente uma ITR de AAV2 modificado, um promotor da beta-actina de galinha (CB), um intensificador imediato/inicial de citomegalovírus (CMV), um íntron 16S tardio de SV40 modificado, um sinal de poliadenilação de hormônio do crescimento bovino (BGH) e uma ITR de AAV2 não modificado.

3. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a proteína SMN compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Nº: 2 e/ou o vetor viral AAV9 compreende a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID Nº: 1.

4. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o vetor viral AAV9 compreende um capsídeo que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Nº: 3.

5. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o medicamento é adicionalmente caracterizado por compreender um veículo farmaceuticamente aceitável adequado para administração intratecal.

6. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o medicamento é adicionalmente particularizado por compreender um meio de contraste.

7. Uso, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o meio de contraste compreende ioexol.

8. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o vetor viral AAV9 é formulado para administração em uma dose de cerca de 1,2 x 1014 vg.

9. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o vetor viral AAV9 é formulado para administração em uma dose de cerca de 2,4 x 1014 vg.

10. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a SMA é SMA Tipo II ou SMA Tipo III.

11. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o paciente no momento da administração do medicamento tem: a) seis meses de idade ou mais; b) entre seis meses e vinte e quatro meses de idade; c) entre vinte e quatro meses e sessenta meses de idade; d) vinte e quatro meses de idade ou menos; ou e) sessenta meses de idade ou menos.

12. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o paciente antes ou no momento da administração do medicamento: a) tem mutações ou deleções inativadoras nulas bialélicas de SMN1; b) tem uma deleção de éxon sete de SMN1; c) tem três ou mais cópias de SMN2; d) não tem uma substituição de c.859G>C no éxon sete em pelo menos uma cópia do gene SMN2; e) mostra o início da doença antes de cerca de 12 meses de idade; f) tem a capacidade de se sentar sem auxílio no momento da administração do medicamento, como definido pelos critérios de World Health Organization Multicentre Growth Reference Study (WHO-MGRS), por cerca de 10 ou mais segundos, mas não consegue ficar de pé ou andar; g) tem um ou mais níveis de gama-glutamil transferase menores que cerca de 3 vezes o limite superior do normal, níveis de bilirrubina menores que cerca de 3,0 mg/dl, níveis de creatinina menores que cerca de 1,0 mg/dl, níveis de Hgb entre cerca de 8 – 18 g/dl, e/ou contagens de leucócitos menores que cerca de 20000 por mm3; h) tem contagens de plaquetas acima de cerca de 67000 células/ml, opcionalmente acima de cerca de 100000 células/ml, de preferência, acima de 150000 células/ml; i) tem função hepática normal; j) tem níveis de transaminase hepática menores que cerca de 8 – 40 U/l; k) tem títulos de anticorpo anti-AAV9 a ou abaixo de 1:25, 1:50, 1:75 ou 1:100, conforme determinado por um Ensaio de Imunossorvente Ligado à Enzima (ELISA); l) não tem escoliose grave (definida como ≥ 50° de curvatura da coluna) evidente no exame de raios X; m) não é contraindicado para procedimento de punção lombar ou administração de terapia intratecal; n) não foi anteriormente submetido a uma cirurgia ou procedimento de reparo de escoliose; o) não precisa do uso de suporte ventilatório invasivo; p) não tem um histórico de ficar de pé ou andar independentemente; q) não usa uma sonda de alimentação gástrica; r) não tem uma infecção viral ativa, opcionalmente vírus da imunodeficiência humana (HIV), hepatite B, hepatite C e/ou vírus Zika;

s) não teve uma infecção grave do trato não pulmonar/respiratório, opcionalmente pielonefrite e/ou meningite, dentro de quatro semanas; t) não tem doença concomitante, insuficiência renal ou hepática importante, distúrbio convulsivo conhecido, diabetes mellitus, hipocalciúria idiopática ou cardiomiopatia sintomática; u) não tem um histórico de meningite bacteriana ou doença cerebral ou da medula espinhal; v) não tem uma alergia ou hipersensibilidade conhecida à prednisolona ou outros glicocorticoides ou excipientes; w) não tem uma alergia ou hipersensibilidade conhecida a iodo ou produtos contendo iodo; x) não está tomando medicamentos para tratar miopatia ou neuropatia; y) não está recebendo terapia imunossupressora, plasmaférese, imunomoduladores, como adalimumabe, dentro de 3 meses; e/ou z) não recebeu um produto composto experimental ou aprovado ou terapia para tratar SMA.

13. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o paciente é colocado na posição Trendelenburg durante e/ou após a administração do medicamento.

14. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o medicamento é administrado pelo menos cerca de 1-48 horas, opcionalmente 24 horas, após a administração de um esteroide oral, e em que ao paciente é administrado o esteroide oral: a) em uma dose de cerca de 1 mg/kg; b) em uma dose de cerca de 1 mg/kg e, então, reduzida gradualmente para 0,5 mg/kg/dia por duas semanas seguido de 0,25 mg/kg/dia por mais duas semanas; c) por pelo menos cerca de 10-60 dias, opcionalmente 30 dias; d) por mais de 30 dias e até os níveis de aspartato transaminase (AST) e/ou alanina aminotransferase (ALT) estarem abaixo de duas vezes o limite superior do normal ou abaixo de cerca de 120 IU/l; e) por mais de 30 dias e até uma resposta de células T em uma amostra sanguínea do paciente ficar abaixo de 100 células formadoras de spot (SFC) por 106 células mononucleares de sangue periférico (CMSPs); e/ou f) até os títulos de anticorpo anti-AAV9 do paciente diminuírem abaixo de 1:25, 1:50, 1:75 ou 1:100, como determinado por um ELISA, opcionalmente em que o esteroide oral é administrado ao paciente uma vez ou duas vezes ao dia; de preferência, em que o esteroide oral é prednisolona ou um equivalente.

15. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o medicamento deve ser administrado de forma concomitante ou consecutiva com um segundo agente terapêutico, e em que opcionalmente o segundo agente terapêutico compreende um oligonucleotídeo antissenso que alveja SMN1 e/ou SMN2, um intensificador muscular e/ou um neuroprotetor.

16. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que, após a administração do medicamento, o paciente: a) não tem escoliose grave (definida como ≥ 50° de curvatura da coluna) evidente no exame de raios X, opcionalmente cerca de 1-24 meses após a administração, de preferência, avaliada cerca de 12 meses após a administração; b) não foi submetido a uma cirurgia ou procedimento de reparo de escoliose dentro de 6 meses a 3 anos, opcionalmente dentro de 1 ano após a administração; c) não precisa do uso de suporte ventilatório invasivo; d) não usa uma sonda de alimentação gástrica; e) tem títulos de anticorpo anti-AAV9 iguais ou acima de 1:25, 1:50, 1:75 ou 1:100, como determinado por um ELISA, e é monitorado por cerca de 1-8 semanas ou até que os títulos diminuam abaixo de 1:25, 1:50, 1:75 ou 1:100; f) tem contagens de plaquetas abaixo de cerca de 67000 células/ml, ou abaixo de cerca de 100000 células/ml ou abaixo de cerca de 150000 células/ml, e é monitorado por cerca de 1-8 semanas ou até que as contagens de plaquetas aumentem para cerca de 67000 células/ml, ou acima de cerca de 100000 células/ml ou acima de cerca de 150000 células/ml; e/ou g) tem contagens de plaquetas abaixo de cerca de 67000 células/ml e é tratado com uma transfusão de plaquetas.

17. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que o medicamento é eficaz para aprimorar o escore do paciente na Escala Motora Funcional Expandida de Hammersmith em relação a um escore de pré-administração; e/ou o paciente atinge um escore aprimorado na Bayley Scales of Infant and Toddler Development®, em relação a um escore de pré-administração, opcionalmente em que o medicamento é adicionalmente particularizado por compreender o vetor viral AAV9 em uma dose de 6 x 1013 vg - 2,4 x 1014 vg.

18. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que, 1-24 meses após a administração,

opcionalmente cerca de 12 meses após a administração, o paciente atinge: a) a capacidade de ficar de pé sem apoio por pelo menos cerca de três segundos; b) a capacidade de andar sem auxílio; c) a capacidade de dar pelo menos cinco passos independentemente; e/ou d) uma mudança após o tratamento a partir de uma medição de linha de base no momento de tratamento; opcionalmente em que a), b), c) e/ou d) são definidos pela Bayley Scales of Infant and Toddler Development®.

19. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que o paciente atinge: a) uma melhora de pelo menos três pontos na Escala Motora Funcional Expandida de Hammersmith 9 meses após a administração em relação a um escore de pré-administração; b) uma melhora de pelo menos quatro pontos na Escala Motora Funcional Expandida de Hammersmith 9 meses após a administração em relação a um escore de pré-administração; c) uma melhora de pelo menos cinco pontos na Escala Motora Funcional Expandida de Hammersmith 9 meses após a administração em relação a um escore de pré-administração; d) uma melhora de pelo menos 3 pontos no componente Motor Bruto da Bayley Scales of Infant and Toddler Development® após a administração em relação a um escore de pré-administração; e) a capacidade de ficar de pé sem apoio por pelo menos três segundos até 12 meses após a administração; e/ou f) a capacidade de andar independentemente pelo menos cinco passos até 12 meses após a administração.

20. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um vetor viral AAV9, em que o vetor viral AAV9 compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína de sobrevivência do neurônio motor (SMN), e adicionalmente particularizado pelo vetor viral AAV9 ser formulado para administração intratecal em uma dose de cerca de 1 x 1013 vg - 5 x 1014 vg.

21. Composição, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que o vetor viral AAV9 compreende uma ITR de AAV2 modificado, um promotor da beta-actina de galinha (CB), um intensificador imediato/inicial de citomegalovírus (CMV), um íntron 16S tardio de SV40 modificado, um sinal de poliadenilação de hormônio do crescimento bovino (BGH) e uma ITR de AAV2 não modificado.

22. Composição, de acordo com a reivindicação 20 ou 21, caracterizada pelo fato de que o vetor viral AAV9 compreende a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID Nº: 1 e/ou em que o vetor viral AAV9 compreende um capsídeo que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Nº: 3.

23. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 22, caracterizada adicionalmente pelo fato de que compreende um meio de contraste, opcionalmente em que o meio de contraste compreende ioexol.

24. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 23, caracterizada adicionalmente pelo fato de que compreende um recipiente e pelo menos um dos seguintes: a) um pH de cerca de 7,7-8,3, b) uma osmolaridade de cerca de 390-430 mOsm/kg, c) menos de cerca de 600 partículas que são ≥ 25 µm de tamanho por recipiente, d) menos de cerca de 6000 partículas que são ≥ 10 µm de tamanho por recipiente,

e) um título genômico de cerca de 1,7 x 1013 - 5,3 x 1013 vg/ml, f) um título infeccioso de cerca de 3,9 x 108 - 8,4 x 1010 IU por 1,0 x 1013 vg, g) uma proteína total de cerca de 100-300 µg por 1,0 x 1013 vg, h) um teor de Pluronic F-68 (Poloxâmero 188) de cerca de 20-80 ppm, i) uma potência relativa de cerca de 70-130% com base em um ensaio baseado em células in vitro, em que a potência é relativa a um padrão de referência e/ou controle adequado, j) uma potência particularizada por sobrevivência mediana em um modelo de camundongo de SMNΔ7 maior ou igual a 24 dias em uma dose de 7,5 x 1013 vg/kg, k) menos de cerca de 5% de capsídeo vazio, l) uma pureza total maior ou igual a cerca de 95%, m) menor ou igual a cerca de 0,13 EU/ml de endotoxina, n) menos de cerca de 0,09 ng de benzonase por 1,0 x 1013 vg, o) menos de cerca de 30 µg/g (ppm) de césio, p) menos de cerca de 0,22 ng de albumina sérica bovina (BSA) por 1,0 x 1013 vg, q) menos de cerca de 6,8 x 105 pg de DNA plasmidial residual por 1,0 x 1013 vg, r) menos de cerca de 1,1 x 105 pg de hcDNA residual por 1,0 x 1013 vg, e s) menos de cerca de 4 ng de rHCP por 1,0 x 1013 vg.