CN116096904A - 改进的aav-abcd1构建体和用于治疗或预防肾上腺脑白质营养不良(ald)和/或肾上腺脊髓神经病(amn)的用途 - Google Patents

改进的aav-abcd1构建体和用于治疗或预防肾上腺脑白质营养不良(ald)和/或肾上腺脊髓神经病(amn)的用途 Download PDF

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Abstract

本公开内容一般地涉及多核苷酸和AAV载体，当将其施用于有此需要的对象时提供ALD蛋白在靶(例如，神经元或胶质)细胞中的表达。本公开内容还涉及包含这样的多核苷酸或载体的组合物。这些多核苷酸、载体和组合物可用于在有此需要的对象中治疗和预防ALD或AMN。

Description

改进的AAV-ABCD1构建体和用于治疗或预防肾上腺脑白质营养不良(ALD)和/或肾上腺脊髓神经病(AMN)的用途
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年12月31日提交的题为“IMPROVED AAV-ABCD1 CONSTRUCTSAND USE FOR TREATMENT OR PREVENTION OF ADRENOLEUKODYSTROPHY(ALD)AND/ORADRENOMYELONEUROPATHY(AMN)”的美国临时申请No.:62/955,667的优先权，其内容通过引用整体并入本文。
序列表公开内容
本申请在名为“1160547o001000.txt”的文件中包含序列表，该文件创建于2020年12月31日并且大小为1,124,235字节，其在此通过引用整体并入。
背景技术
本发明描述了治疗X连锁肾上腺脑白质营养不良(X-linkedadrenoleukodystrophy，X-ALD)的基因治疗，X-ALD是由过氧化物酶体膜ATP结合盒转运蛋白(ABCD1)基因的突变引起的进行性单基因神经退行性疾病，该ABCD1基因编码负责将CoA激活的极长链脂肪酸(very long-chain fatty acid，VLCFA)转运到过氧化物酶体中进行降解的肾上腺脑白质营养不良蛋白(ALDP)。人ALDP例如由NCBI参考序列：NM_000033或NM_000033.4标识的核酸序列编码。
ALDP是具有位于过氧化物酶体膜的细胞质表面的ATP结合结构域的完整的过氧化物酶体膜蛋白，并负责将VLCFA-CoA跨过氧化物酶体膜转运到过氧化物酶体基质中。ALDP缺乏导致VLCFA降解受损。因此，X-ALD患者表现出血液(可以从血浆或血清中检测到)以及脑、脊髓、肾上腺皮质的组织和其他组织中高水平的饱和极长链脂肪酸(very long chainfatty acid，VLCFA)(例如链长为大于20个碳的饱和VLCFA(即C>20，例如“C24:0”和“C26:0”))的积累。
X-ALD的临床表型包括肾上腺脊髓神经病(AMN)和脑性肾上腺脑白质营养不良(CCALD)。症状可以在儿童期或成人期开始。成人ALD患者通常在二十多岁时发展成肾上腺脊髓神经病(AMN)，这是一种使人衰弱的神经病症(Engelen et al.,Orphanet J RareDis.2012；7:51)。Abcd1敲除小鼠发展出与AMN相似的表型，表现出脊髓轴突变性以及由于受影响的背根神经节神经元(dorsal root ganglia neuron，DRG)引起的周围神经病(Pujol et al.,Hum Mol Genet.2002；11:499-505)。
儿童脑性肾上腺脑白质营养不良(CCALD)是在男孩(平均发病年龄7岁；范围3至15岁)中的非常罕见的、有时进展迅速的X连锁遗传性神经病症，其不经治疗会导致植物状态并最终在确诊之后5年(中位数)内死亡。CCALD通常最初表现为艾迪生病(Addison'sdisease)，但诊断通常基于注意力、思维、专注和其他脑功能的“突然”下降以及磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)上脑脱髓鞘的确认性发现作出。在脱髓鞘之前，患者脑MRI正常，并且无神经发育异常。临床过程起初可能是“缓慢的”，但随着脑中髓鞘的广泛丧失，可能会迅速进展且不可逆转。术语“缓慢的”和“突然”是相对的，因为脱髓鞘的持续时间尚不清楚，但认知和运动功能的快速下降可随时发生并且原因不明。事实上，MRI的变化先于症状出现，并且可在疾病的临床表现非常少时出现广泛脱髓鞘这样充分发展的异常。在美国，X连锁ALD的发生率为约1:21,000男婴，其中约35％发展为CCALD；每年约有35至40名男孩被诊断出患有CCALD。该疾病的原因是ATP结合盒亚家族D成员1(ATP-bindingcassette,sub-family D,member 1，ABCD1)基因的突变，其导致肾上腺脑白质营养不良蛋白(ALDP)基因产物功能失调或缺失。ALDP定位于细胞过氧化物酶体，在那里ALDP通过β氧化参与将极长链脂肪酸(VLCFA)(链长>20个碳)降解成较短的脂肪酸，其用于维持细胞结构和功能。
目前，ALD通过提供产生功能性ALDP的细胞的同种异体造血干细胞移植(HCT)来治疗，并且使用产生功能性ALDP的细胞进行完全匹配的相关供体人干细胞移植可以潜在地改善或阻止脱髓鞘的进展。然而，同种异体HCT需要12到18个月才能稳定疾病，并且由于疾病的进行性特点，诊断之后应尽快进行移植。这有时是有困难的，因为寻找相关或不相关的匹配骨髓干细胞供体需要提前时间。同种异体干细胞的使用也存在移植失败以及发生急性和慢性移植物抗宿主病(graft versus host disease，GvHD)的风险。当不相关的供体被用作同种异体造血干细胞的来源时，这些并发症会导致死亡并且发生率提高。
ALDP替代的另一个来源是使用匹配的或更典型地部分匹配的脐带血细胞移植物。然而，脐带血干细胞(cord blood stem cell，CBSC)的使用有困难，存在移植失败的风险，并且植入时间延长，需要延长输血支持。事实上，所有形式的同种异体HCT都涉及10％至15％的移植相关死亡率风险，以及高至30％的慢性移植物抗宿主病风险。
腺相关病毒(Adeno-associated virus，AAV)是有缺陷的非致病性人细小病毒，由于其温和的免疫应答和缺乏致病性而通常用于基因递送。AAV病毒可以指导长期转基因表达，但通常不会永久整合到宿主基因组中。鉴于这样的能力，AAV为安全且有效的基因治疗提供了可行的选择。虽然先前报道了使用重组腺相关病毒血清型9(rAAV9)载体在体外和体内转导中枢神经系统细胞以递送人ABCD1基因，但本领域对更安全且更有效的肾上腺脑白质营养不良治疗的需求尚未得到满足。鉴于不同的AAV血清型显示出不同的细胞趋向性，选择最佳血清型以建立基因转移系统是重要的。本发明通过提供安全且有效的改进的腺相关病毒载体和递送系统(即，其可用于在患有X-ALD或AMN的患者中递送无毒水平的ABCD1)而提供了对这些和其他问题的解决方案。
发明内容
本发明的一个特定目的是提供用于治疗或预防ALD或AMN的安全且有效的方法和材料，其涉及施用新的且改进的AAV DNA构建体。
本发明提供了改进的腺相关病毒(AAV)构建体。本发明还提供了通过共转染包含编码ATP结合盒亚家族D成员1(ABCD1)基因的rAAV载体基因组(“rAAV基因组载体”)的质粒以及编码AAV Rep和Cap蛋白的第二质粒(“Rep/Cap质粒”)以及一种或更多种病毒辅助质粒来产生改进的重组AAV(rAAV)载体的方法。本发明还提供了包含这些AAV构建体的细胞和组合物，其可用于在有此需要的对象中治疗和/或预防肾上腺脑白质营养不良和/或肾上腺脊髓神经病。
本发明还提供了用于制备这样的改进的AAV构建体的方法，该构建体编码表达ALD蛋白(“ALDP”，在本文中也称为“ABCD1”蛋白)的ABCD1基因。此外，本发明提供了使用表达ALD蛋白的对象改进的AAV构建体和包含其的细胞和组合物用于在有此需要的对象中治疗和/或预防肾上腺脑白质营养不良和/或肾上腺脊髓神经病的方法，例如，其中这样的改进的AAV构建体例如通过鞘内、脑室内(intracerebroventricular，ICV)、鞘内-腰(intrathecal-lumbar，IT-L)、血管内、肌内或脑池内施用进行施用的方法。
在一些实施方案中，本发明部分地考虑了包含以下的rAAV基因组载体：(a)5’末端反向重复(5’ITR)；(b)与编码人ABCD1基因的多核苷酸可操作地连接的启动子；(c)经修饰的土拨鼠转录后调节元件，其中X-蛋白失活(WPRE x-失活)；(d)至少一个终止子；(e)至少一个polyA信号和(f)3’末端反向重复(3’ITR)。
在一些实施方案中，本发明部分地考虑了包含以下的rAAV基因组载体：(a)5’末端反向重复(5’ITR)；(b)增强子，其与(c)可操作地连接；(c)启动子，其还在3’端包含内含子并且与(d)可操作地连接；(d)编码人ABCD1基因的多核苷酸；(e)经修饰的土拨鼠转录后调节元件，其中X-蛋白失活(WPRE x-失活)；(f)至少一个终止子；(g)至少一个polyA信号和(h)3’末端反向重复(3’ITR)。
在一些实施方案中，本发明部分地考虑了包含以下的rAAV基因组载体：(a)5’末端反向重复(5’ITR)；(b)与编码人ABCD1基因的多核苷酸可操作地连接的启动子，所述启动子还在其5’端包含增强子或在其3’端包含内含子；(c)经修饰的土拨鼠转录后调节元件，其中X-蛋白失活(WPRE x-失活)；(d)至少一个终止子；(e)至少一个polyA信号和(f)3’末端反向重复(3’ITR)。
在一些实施方案中，本发明部分地考虑了包含以下的rAAV基因组载体：(a)5’末端反向重复(5’ITR)；(b)与编码人ABCD1基因的多核苷酸可操作地连接的启动子；(c)至少一个终止子；(d)至少一个polyA信号和(e)3’末端反向重复(3’ITR)。
在一些实施方案中，本发明部分地考虑了包含以下的rAAV基因组载体：(a)5’末端反向重复(5’ITR)；(b)增强子，其与(c)可操作地连接；(c)启动子，其还在其3’端包含内含子；(d)与编码人ABCD1基因的多核苷酸可操作地连接；(e)至少一个终止子；(f)至少一个polyA信号和(g)3’末端反向重复(3’ITR)。
在一些实施方案中，本发明部分地考虑了包含以下的rAAV基因组载体：(a)5’末端反向重复(5’ITR)；(b)与编码人ABCD1基因的多核苷酸可操作地连接的启动子，所述启动子还在其5’端包含增强子或在其3’端包含内含子；(c)至少一个终止子；(d)至少一个polyA信号和(e)3’末端反向重复(3’ITR)。
在一些实施方案中，本发明部分地考虑了包含以下的rAAV基因组载体：(a)5’末端反向重复(5’ITR)；(b)与编码人ABCD1基因的多核苷酸可操作地连接的启动子，所述启动子还在其5’端包含科扎克共有序列(Kozak Consensus Sequence)('CCACC'或'GCCACC'，或代表最佳蛋白质翻译起始的共有序列的近似物(approch)：‘GCCRCCATGG’的任何序列)；(c)至少一个终止子；(d)至少一个polyA信号和(e)3’末端反向重复(3’ITR)。
在一些实施方案中，本发明部分地考虑了包含以下的rAAV基因组载体：(a)5’末端反向重复(5’ITR)；(b)增强子，其与(c)可操作地连接；(c)启动子，其还在其3’端包含内含子并且与(d)可操作地连接；(d)编码人ABCD1基因的多核苷酸，所述多核苷酸还在其5’端包含科扎克共有序列('CCACC'或'GCCACC'，或代表最佳蛋白质翻译起始的共有序列的近似物：‘GCCRCCATGG’的任何序列)；(e)至少一个终止子；(f)至少一个polyA信号和(g)3’末端反向重复(3’ITR)。
在一些实施方案中，本发明部分地考虑了包含以下的rAAV基因组载体：(a)5’末端反向重复(5’ITR)；(b)与编码人ABCD1基因的多核苷酸可操作地连接的启动子，所述启动子还在其5’端包含科扎克共有序列('CCACC'或'GCCACC'，或代表最佳蛋白质翻译起始的共有序列的近似物：‘GCCRCCATGG’的任何序列)；(c)任选地，在科扎克序列5’端的增强子或在启动子3’端的内含子；(d)至少一个终止子；(e)至少一个polyA信号和(f)3’末端反向重复(3’ITR)。
在一些实施方案中，本发明部分地考虑了包含以下的rAAV基因组载体：(a)5’末端反向重复(5’ITR)；(b)与编码人ABCD1基因的在ABCD1编码序列内包含3、6或9个核苷酸变化的多核苷酸上游的科扎克共有序列('CCACC'或'GCCACC'，或代表最佳蛋白质翻译起始的共有序列的近似物：‘GCCRCCATGG’的任何序列)可操作地连接的启动子；(c)至少一个终止子；(d)至少一个polyA信号和(e)3’末端反向重复(3’ITR)。
在一些实施方案中，本发明部分地考虑了包含以下的rAAV基因组载体：(a)5’末端反向重复(5’ITR)；(b)增强子，其与(c)可操作地连接；(c)启动子，其在其3’端包含内含子；(d)在编码人ABCD1基因的在ABCD1编码序列内包含3、6或9个核苷酸变化的多核苷酸上游的科扎克共有序列('CCACC'或'GCCACC'，或代表最佳蛋白质翻译起始的共有序列的近似物：‘GCCRCCATGG’的任何序列)；(e)至少一个终止子；(f)至少一个polyA信号和(g)3’末端反向重复(3’ITR)。
在一些实施方案中，本发明部分地考虑了包含以下的rAAV基因组载体：(a)5’末端反向重复(5’ITR)；(b)与编码人ABCD1基因的在ABCD1编码序列内包含3、6或9个核苷酸变化的多核苷酸上游的科扎克共有序列('CCACC'或'GCCACC'，或代表最佳蛋白质翻译起始的共有序列的近似物：‘GCCRCCATGG’的任何序列)可操作地连接的启动子；(c)任选地，在科扎克序列5’端的增强子或在启动子3’端的内含子；(d)至少一个终止子；(e)至少一个polyA信号和(f)3’末端反向重复(3’ITR)。
在任何实施方案中，至少一个终止子可以包含在ABCD1基因编码多核苷酸中。
在一些实施方案中，rAAV基因组包含增强子、启动子、β-肌动蛋白外显子、内含子和/或β-球蛋白外显子，任选地在从5’端到3’端的方向上。
在一些实施方案中，增强子是CMV增强子。
在一些实施方案中，启动子是鸡β肌动蛋白启动子。
在一些实施方案中，β-肌动蛋白外显子来源于鸡β肌动蛋白的替代转录物之一，并且嵌合内含子由以下组成：来自鸡β肌动蛋白第一内含子的供体和来自兔β-球蛋白第二1内含子的接受体。
在一些实施方案中，内含子是嵌合内含子。
在一些实施方案中，β-球蛋白外显子是兔β-球蛋白外显子，例如兔β-球蛋白第三外显子。
在任何实施方案中，polyA信号可以包含SV40 polyA信号、bGH polyA信号或其组合。polyA信号在本文中也可以称为“pA”。
Figure DA00038169298335640316
在另一些实施方案中，本发明部分地考虑了AAV Rep/Cap质粒，其包含：(a)启动子(b)复制基因；(c)衣壳基因。
在一些实施方案中，Rep/Cap质粒包含p5、p19或p40启动子中的一种或更多种。
在一些实施方案中，复制基因选自编码Rep 78、Rep 68、Rep 52或Rep 40蛋白的AAV血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、或AAVrh.10的复制基因或其变体。
在一些实施方案中，复制基因是或来源于AAV2、AAV9或AAVrh.10的复制基因。
在一些实施方案中，当复制基因(Rep基因)来源于AAV2的复制基因时，两种复制基因产物REP78和REP68可以由p5启动子转录，两种复制基因产物以及REP52和REP40可以由p19启动子转录。在一些实施方案中，衣壳基因选自编码VP1、VP2和/或VP3蛋白的AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或AAVrh.10的衣壳基因或其变体。
在一些实施方案中，衣壳基因是或来源于AAV2、AAV9或AAVrh.10(本文也称为AAVrh10)的衣壳基因。
在一些实施方案中，当衣壳基因(Cap基因)来源于AAV9的衣壳基因时，AAV9的三种复制基因产物VP1、VP2和VP3可由p40启动子转录(即在其控制下转录)。
在一些实施方案中，当衣壳基因(Cap基因)来源于AAV2的衣壳基因时，可以产生AAV2的三种复制基因产物VP1、VP2和VP3。
在一些实施方案中，当衣壳基因(Cap基因)来源于AAVrh.10的衣壳基因时，可以产生AAVrh.10的三种复制基因产物VP1、VP2和VP3。
在一些实施方案中，Rep/Cap质粒可以完全来源于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、或AAVrh.10，而在一些实施方案中，Rep/Cap质粒可具有混合血清型，例如AAV2/9，其包含一种或更多种来自AAV2的元件/基因和一种或更多种来自AAV9的元件/基因。在某些实施方案中，当Rep/Cap质粒具有AAV2/9血清型时，Rep基因可以具有AAV2并且Cap基因可以具有AAV9。
在一些实施方案中，5’和3’末端反向重复(ITRS)天然存在于血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、或AAVrh.10。
在一些实施方案中，5’和3’末端反向重复(ITRS)是AAV2。
在一些实施方案中，相对于天然AAV2 ITR，5’和3’末端反向重复(ITRS)在5’端缩短15个核苷酸('TTGGCCACTCCCTCT')，并在3’端缩短最后15个核苷酸('AGAGGGAGTGGCCAA')。这(两个被去除的15个核苷酸序列的集合)包括几乎所有的A区域。
在另一些实施方案中，本发明部分地考虑了辅助病毒或病毒辅助质粒以帮助rAAV生产。在一些实施方案中，辅助病毒是腺病毒、单纯疱疹病毒或乳头瘤病毒。在一些实施方案中，病毒辅助质粒包含腺病毒、单纯疱疹病毒或乳头瘤病毒的一种或更多种基因。在一些实施方案中，辅助病毒或病毒辅助质粒来源于或包含以下的一种或更多种基因：野生型(WT)或变体腺病毒，例如腺病毒5(Ad5)(例如，登录号AC_000008.1或SEQ ID NO:2000)或腺病毒2(Ad2)(例如登录号J01917.1或SEQ ID NO:3000))；单纯疱疹病毒(herpes simplexvirus，HSV)，例如人HSV I型(例如登录号NC_001806)；乳头瘤病毒；或牛痘病毒(例如，登录号NC_006998)。
在一些实施方案中，辅助病毒或病毒辅助质粒包含来自腺病毒的E1、E2A、E4和/或VA RNA区序列。
在一些实施方案中，这样的辅助病毒或病毒辅助质粒提供有助于rAAV载体包装、产生和/或功能的一种或更多种基因或基因产物(或元件或因子)。
在一些实施方案中，当辅助病毒或病毒辅助质粒来源于Ad5(例如，本文称为“pALD-X80”的质粒)时，辅助病毒或质粒可包含Ad5区域VA-RNA、Ad5区域E2和/或Ad5区域E4。在某些实施方案中，Ad5区域VA-RNA可以包含VA-RNA区域(VA RNA I)和/或VA-RNA区域(VA RNA II)。在某些实施方案中，Ad5区域E2可以编码六邻体(C-端片段)、23K内切蛋白酶、E2A/DBP、六邻体装配体(100K)、六邻体装配体(33K)、六邻体装配体(22K)和/或六邻体相关前体。在某些实施方案中，Ad5区域E4可以编码纤维(Fiber)、E4 ORF1、E4 ORF2、E4 ORF3、E4O RF4、E4 ORF6和/或E4 ORF6/7。
在一些实施方案中，当辅助病毒或质粒来源于Ad2(例如，本文称为“pHELP_KanV4”的质粒)，辅助病毒或质粒可包含Ad2区域VA-RNA、Ad2区域E2和/或Ad2区域E4。在某些实施方案中，Ad2区域VA-RNA可包含VA-RNA区域(VA RNA I)和/或VA-RNA区域(VA RNA II)。在某些实施方案中，Ad2区域E2可不编码六邻体并且可编码23K内切蛋白酶(C-端片段)、E2A/DBP、六邻体装配体(100K)、六邻体装配体(33K)、六邻体装配体(22K)和/或六邻体相关前体。在某些实施方案中，Ad2区域E4可不编码纤维并且可编码E4 ORF1、E4 ORF2、E4 ORF3、E4ORF4、E4 ORF6和/或E4 ORF6/7。
在一些实施方案中，本发明部分地考虑了分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus，rAAV)载体基因组，其可以包装在病毒衣壳中以形成rAAV病毒体，其中所述rAAV载体基因组包含以下或由以下组成：(a)5’AAV末端反向重复(inverted terminal repeat，ITR)；(b)表达盒，其中所述表达盒包含至少(i)在靶细胞中有活性的启动子，其与(ii)可操作地连接，(ii)编码ATP结合盒亚家族D成员1(ABCD1)多肽的多核苷酸，(iii)一个或更多个终止子和(iv)所述ABCD1编码多核苷酸下游的一个或更多个poly A信号；以及(c)3’ITR。rAAV载体基因组可不包含土拨鼠转录后调节元件(woodchuck post-transcriptional regulatory element，WPRE)或可包含经修饰的WPRE，其包含导致X蛋白不表达或以失活形式表达的至少一个突变(WPREx-失活)。
在一些实施方案中，本发明部分地考虑了可以使用任何上述AAV基因组载体连同任何上述Rep/Cap质粒和任何上述病毒辅助质粒产生的rAAV载体。
在一些实施方案中，本发明部分地考虑了包含以下的rAAV载体：(I)任何上述AAV衣壳和(II)任何上述AAV基因组。
在一些实施方案中，本发明部分地考虑了组合物，其包含(A)任何rAAV基因组载体和任选地以下中的一种或更多种：(B)包含任何上述AAV cap基因的多核苷酸；(C)包含任何上述AAV rep基因的多核苷酸；(D)包含任何上述腺病毒辅助基因的多核苷酸；和/或(E)可药用载体或赋形剂。在一些情况下，这样的组合物可用于产生任何上述rAAV载体。
在一些实施方案中，本发明部分地考虑了组合物，其包含：(I)任何上述rAAV载体和(II)可药用载体。在一些情况下，这样的组合物可用于任何治疗和预防本文公开的疾病病症(例如肾上腺脑白质营养不良(ALD)或肾上腺脊髓神经病(AMN))的方法。
在一些实施方案中，本发明部分地考虑了制备任何上述AAV构建体的方法。
在一些实施方案中，本发明部分地考虑了使用或施用任何上述AAV构建体用于在有此需要的对象中治疗肾上腺脑白质营养不良(ALD)或肾上腺脊髓神经病(AMN)的方法。
在一些实施方案中，本发明部分地考虑了使用或施用与可药用载体组合的任何上述AAV构建体的方法。
附图说明
图1A至B包含体内实验结果，该实验比较了施用分别包含WPRE、经修饰的WPRE(包含导致X蛋白失活的突变)的不同AAV9-CBA-ABCD1病毒体(由于使用AAV9衣壳而称为“AAV9”)或者缺乏WPRE的AAV9-CBA-ABCD1病毒体的ABCD1敲除(knock-out，KO)小鼠中的脊髓样品中的ABCD1表达，其中ABCD1表达使用Western印迹方法在脊髓样品中进行检测。
图2A至C包含另外的体内实验的Western印迹数据，其中ABCD1敲除小鼠施用了不同剂量的分别包含WPRE(标识为“原始”)、经修饰的WPRE(包含导致X蛋白失活的突变，标识为“X失活”)的AAV9-CBA-ABCD1病毒体，或者缺乏WPRE的AAV9-CBA-ABCD1病毒体，其中ABCD1表达使用Western印迹方法在从经处理的ABCD1敲除小鼠获得的脊髓样品中进行检测。
图3A至3C比较了ABCD1敲除小鼠的脊髓样品中ABCD1表达的剂量响应，所述小鼠施用了不同剂量(3×1011或1×1011个基因组拷贝/小鼠)的分别包含WPRE(标识为“原始”)、包含经修饰的WPRE(包含导致X蛋白失活的突变，标识为“X失活”)的AAV9-CBA-ABCD1病毒体，或者缺乏WPRE的AAV9-CBA-ABCD1病毒体；其中ABCD1表达再次使用Western印迹法在从施用不同剂量的ABCD1敲除小鼠获得的脊髓样品中进行检测。ABCD1表达在缺乏WPRE的病毒体中较低。
图4A至4B比较了用包含WPRE(“原始”)或包含经修饰的WPRE(包含导致X蛋白失活的突变，“x-失活”)的不同AAV9-ABCD1病毒体转导的混合胶质培养物中的VLCFA水平，其中VLCFA水平是在转导之后4天从收获的细胞中检测的，以进行VLCFA分析。如所示的，VLCFA水平降低至与在用不同AAV9.ABCD1病毒体转导的混合胶质细胞培养物中的大约相同的程度。所有AAV载体均以剂量依赖性方式降低VLCFA。
图5包含pSBT101的示意性图谱，其除了其他序列外还包含5’AAV2 ITR、CMV增强子、鸡β-肌动蛋白启动子、β-肌动蛋白外显子、嵌合内含子、兔β-球蛋白外显子、hABCD1 5’UTR、人ABCD1编码序列、hABCD1 3’UTR、SV40 poly(A)信号序列、bGH poly(A)信号序列、3’AAV2 ITR以及与AmpR启动子可操作地连接的KanR标志物；其中这样的序列包含在pUC57骨架上。
图6包含pOB1005的示意性图谱，其除了其他序列外还包含AAV2 5’ITR变体(比野生型5’ITR或pSBT101的5’ITR短)、CMV增强子、鸡β-肌动蛋白启动子、β-肌动蛋白外显子、β-肌动蛋白外显子、嵌合内含子、兔β-球蛋白外显子、还在其5’端包含科扎克序列的人ABCD1编码序列、SV40 poly(A)信号序列、AAV2 3’ITR变体(比野生型3’ITR或pSBT101的3’ITR短)，以及与AmpR启动子可操作地连接的KanR标志物；其中这样的序列包含在pUC118骨架上。
图7包含pOB1010的示意性图谱，其除了其他序列外还包含AAV2 5’ITR变体(比野生型5’ITR或pSBT101的5’ITR短)、CMV增强子、鸡β-肌动蛋白启动子、β-肌动蛋白外显子、嵌合内含子、兔β-球蛋白外显子、hABCD1 5’UTR、人ABCD1编码序列、hABCD1 3’UTR、SV40 poly(A)信号序列、bGH poly(A)信号序列、3’AAV2 ITR以及与AmpR启动子可操作地连接的KanR标志物；其中这样的序列包含在pUC118骨架上。
图8A至B比较了在用pSBT101或pOB1005转染的HEK293细胞(和未转染的HEK293对照细胞)中进行的瞬时转染实验中的ABCD1表达水平，其中质粒并行转染并且在细胞裂解物中通过Western印迹评价表达，并将印迹使用密度测定法进行量化。将抗ALD蛋白抗体克隆OTI4C2(OriGene)用于Western印迹分析。结果显示pOB1005质粒使得ABCD1表达更好。
图9基于滴度(gc/ml)、生产力(gc/细胞)和产量(gc’s)比较了pSBT101和pOB1005包装到AAV中的能力。
图10A比较了从5’ITR到3’ITR的原始AAV-CBA-hABCD1-WPRE病毒颗粒、AAV-CBA-hABCD1-WPREX失活病毒颗粒和AAV-CBA-hABCD1(无WPRE)病毒颗粒(本文也称为“AAV-CBA-hABCD1”)的5’ITR至3’ITR构建体的示意图。“CMV-e”、“CBA-p”、“BA-ex”、“Chm-int”和“RBG-ex”是分别包含在5’ITR-3’ITR和平均CMV增强子、鸡β肌动蛋白启动子、β肌动蛋白外显子、嵌合内含子以及兔β-球蛋白外显子中的元件。“ABCD1”是编码ABCD1基因的多核苷酸。“SV40pA”和“bGHpA”分别意指SV40 poly A信号和β生长激素poly A信号。
图10B提供了总结了分配给以下的SEQ ID NO的表格：包含在各个rAAV基因组载体的5’ITR至3’ITR中的不同元件(可用于产生指定rAAV病毒颗粒的质粒)的序列；包含在各个rAAV基因组载体中的5’ITR至3’ITR序列；包含在各个rAAV基因组载体中的rAAV载体基因组序列(即包装到指定rAAV病毒颗粒中的序列)；以及各个rAAV基因组载体的完整质粒序列。例如，用于AAV-CBA-hABCD1-X失活的rAAV基因组载体具有SEQ ID NO:10000的核酸序列，其包含SEQ ID NO:10050的5’ITR至3’ITR序列，其包含不同的元件例如5’ITR(SEQ ID NO:10001)、CMV增强子(SEQ ID NO:10005)、β肌动蛋白外显子(SEQ ID NO:10008)等。“总polyA信号”是指跨越从SV40 poly A信号开始到bGH poly A信号结束的区域。rAAV病毒AAV-CBA-hABCD1-X失活的载体基因组具有SEQ ID NO:10060的核酸序列。分配给载体AAV-CBA-hABCD1-X失活和AAV-CBA-hABCD1[无WPRE]的SEQ ID NO在图11A至11B中进一步直观地示出。
图11A提供了AAV-CBA-hABCD1-WPRE X失活构建体的示意图，其中SEQ ID NO分配给以下的核酸序列：5’ITR、CMV增强子、鸡β-肌动蛋白启动子、β-肌动蛋白外显子、嵌合内含子、兔β-球蛋白外显子、ABCD1 5’UTR、ABCD1基因、ABCD1 3’UTR、WPRE X失活(其是经修饰以表达失活的X蛋白部分开放阅读框的WPRE)、SV40 polyA、bGH polyA、3’ITR、ABCD1基因中包含的终止子1、总poly A(即SV40pA至bGHpA)和5’ITR至3’ITR序列。
图11B包含AAV-CBA-hABCD1构建体(无WPRE)从5’ITR至3’ITR的示意图，以及分配给以下的核酸序列的SEQ ID NO：5’ITR、CMV增强子、鸡β-肌动蛋白启动子、β-肌动蛋白外显子、嵌合内含子、兔β-球蛋白外显子、ABCD1 5’UTR、hABCD1 cDNA、ABCD1基因中包含的终止子1、ABCD1 3’UTR、SV40 polyA、bGH poly A、总poly A(即SV40pA至bGHpA)、3’ITR和整个5’ITR至3’ITR序列。
图12A比较了从5’ITR至3’ITR的不同病毒颗粒SBT101、OB1005、OB1010、OB1011、OB1012、OB1013、OB1015、OB10107和OB1008的5’ITR至3’ITR构建体的示意图。“CMV-e”、“CBA-p”、“BA-ex”、“Chm-int”和“RBG-ex”是分别包含在5’ITR至3’ITR和平均CMV增强子、鸡β肌动蛋白启动子、β肌动蛋白外显子、嵌合内含子以及兔β-球蛋白外显子中的元件。“SV40pA”和“bGHpA”分别意指SV40 poly A信号和β生长激素poly A信号。“ABCD1”是编码ABCD1基因的多核苷酸。“ABCD1/3nt”和“ABCD1/9nt”相对于“ABCD1”分别在三个位置和九个位置处包含核酸差异。还示出了编码所指出的rAAV病毒颗粒的载体基因组的质粒(rAAV基因组载体)和质粒骨架的名称。图12B提供了总结了分配给以下的SEQ ID NO的表格：包含在各个rAAV基因组载体的5’ITR-3’ITR中的不同元件(可用于产生指定rAAV病毒颗粒的质粒)的序列；包含在各个rAAV基因组载体中的5’ITR至3’ITR序列；包含在各个rAAV基因组载体中的rAAV载体基因组序列(即包装到指定rAAV病毒颗粒中的序列)；以及各个rAAV基因组载体的完整质粒序列。例如，用于OB1010的rAAV基因组载体(即质粒pOB1010)具有SEQ ID NO:11000的核酸序列，其包含SEQ ID NO:11050的5’ITR至3’ITR序列，其包含不同的元件例如5’ITR(SEQ ID NO:11001)、CMV增强子(SEQ ID NO:11005)、β肌动蛋白外显子(SEQ ID NO:11008)等。“总polyA信号”是指跨越从SV40 poly A信号开始到bGH poly A信号结束的区域。由pOB1010产生的rAAV病毒载体的载体基因组具有SEQ ID NO:11060的核酸序列。图12C至12J进一步直观地示出了各个载体的这些SEQ ID NO分配，这些图直观地说明了分配给以下不同病毒颗粒的基因组的元件的SEQ ID NO：SBT101(图12C)、OB1005(图12D)、OB1010(图12E)、OB1011(图12F)、OB1012(图12G)、OB1013(图12H)、OB1015(图12I)和OB10107(图12J)。
图13A至13E提供了使用不同的根据本公开内容的rAAV在实施例8中获得的示例性ABCD1蛋白表达水平。图13A至13D提供了针对每种AAV载体的相对于MOI绘制的ABCD1蛋白水平以及如每幅图中所述拟合的剂量-表达曲线、估计的相对电位(在图13A至13C中相对于pOB1008并且在图13D中相对于SBT101)、标准误差、95％置信区间和EC50值。用于产生测试rAAV的质粒显示在底部框中。图13E示出了示例性western印迹孔和相对强度数据。
图14比较了在实施例9中观察到的由rAAV载体pOB1010、pOB1015和pOB1017引起的VLCFA的示例性降低。提供了针对每种AAV载体的相对于MOI绘制的Lyso-PC C26/C22比率以及如每幅图中所述拟合的剂量-表达曲线、估计的相对电位(相对于OB1010)、标准误差、95％置信区间和EC50值。用于产生测试rAAV的质粒显示在底部框中。
图15A至15C提供了在实施例10中观察到的ABCD1 KO混合胶质细胞中VLCFA的示例性剂量依赖性降低。图15A示出了低、中和高剂量(分别为3.3×104、1.0×105和5×105个病毒基因组/细胞)的OB1010提供了对C26:0/C22:0比率和C26:0量的rAAV剂量依赖性降低，无论rAAV产生供应商如何(不同的纯化方法)。图15B示出了VLCFA降低作用、C26:0/C22:0比率和C24:0/C22:0比率的降低取决于ABCD1蛋白表达水平。图15C进一步示出了多种VLCFA降低作用、C26:0和C24:0的量以及C26:0/C22:0和C24:0/C22:0比率的降低取决于ABCD1蛋白表达水平。图15C还示出，在另一方面，ABCD1蛋白水平不影响C22:0量并且提高C16:0量。
图16提供了在实施例11中观察到的由SBT101引发的示例性体内作用。提供了脊髓中rAAV剂量依赖性载体基因组水平(左)、脊髓中剂量依赖性ABCD1蛋白表达(中)和脊髓中线粒体DNA(mtDNA)水平的剂量依赖性恢复(右)。mtRNA水平的恢复是VLCLAβ-氧化恢复的替代标志物。
图17提供了来自实施例12中rAAV可包装性比较的示例性结果。提供了通过使用pOB1010、pSBT101和pOB1008质粒的相同产生规模获得的指定方法(ddPCR和qPCR)确定的病毒滴度。
具体实施方式
定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。在冲突的情况下，以本申请(包括定义)为准。
本文中使用的术语“腺病毒相关病毒载体”、“腺病毒相关病毒载体”或“AAV载体”涵盖重组病毒颗粒，其包含：(i)至少一种来源于AAV的衣壳蛋白和(ii)编码目的基因的重组载体基因组。在AAV载体中，重组基因组通常被包装或封装在衣壳中以形成重组AAV病毒体。“AAV载体”在本文中也可称为“AAV颗粒”、“重组AAV”、“rAAV”、“重组AAV载体”、“rAAV载体”、“重组AAV颗粒”或“rAAV颗粒”。rAAV载体的重组载体基因组在本文中可以称为“AAV载体基因组”、“重组AAV基因组”、“rAAV基因组”、“重组AAV载体基因组”、“rAAV载体基因组”或简称为“载体基因组”或“重组载体基因组”。
本文中使用的“表达盒”是指这样的核酸分子，其包含人ABCD1蛋白、启动子的编码序列，并且可以包含其其他调节序列，该盒可以被包装到病毒载体(例如，病毒颗粒)的衣壳中。通常，用于产生AAV载体的这样的表达盒包含本文所述的侧接病毒基因组的ITR或包装信号的序列和其他表达控制序列，例如本文所述的那些。例如，对于AAV病毒载体，包装信号是5’末端反向重复(ITR)和3’ITR。当包装到AAV衣壳中时，与表达盒结合的ITR在本文中可以称为“重组AAV(rAAV)基因组”或“载体基因组”。
本文中使用的术语“调节序列”、“转录控制序列”或“表达控制序列”是指诱导、抑制或以其他方式控制与它们可操作地连接的蛋白质编码核酸序列的转录的DNA序列，例如起始序列、增强子序列和启动子序列。
本文中使用的术语“可操作地连接”或“有效缔合”是指与编码人ABCD1的核酸序列邻接的表达控制序列和/或以反式或远距离起作用来控制其转录和表达的表达控制序列二者。
在一个方面中，提供了包含任何本文所述表达盒的载体。如本文所述，这样的载体可以是多种来源的质粒并且在某些实施方案中可用于产生如本文进一步描述的重组复制缺陷型病毒。
本文中使用的“载体”是这样的核酸分子，可向其中插入外源或异源或经改造的核酸转基因，然后可将其引入合适的宿主细胞中。载体优选地具有一个或更多个复制起点，以及重组DNA可插入其中的一个或更多个位点。载体通常具有这样的部件，通过其可以从没有载体的细胞中选择具有载体的细胞，例如它们编码耐药性基因。常见的载体包括质粒、病毒基因组和(主要在酵母和细菌中)“人工染色体”。本文描述了某些质粒。
在一个实施方案中，载体是非病毒质粒，其包含其描述的表达盒，例如“裸DNA”、“裸质粒DNA”、RNA和mRNA；与多种组合物和纳米颗粒包括例如胶束(micelle)、脂质体、阳离子脂质-核酸组合物、多聚糖组合物和其他聚合物、基于脂质和/或胆固醇的核酸缀合物以及例如本文描述的其他构建体偶联。参见，例如X.Su et al,Mol.Pharmaceutics,2011,8(3),pp 774-787；网页公开：March 21,2011；WO2013/182683，WO 2010/053572和WO 2012/170930，所有这些都通过引用并入本文。这样的非病毒人ABCD1载体可以通过本文所述的途径施用。如本文中所用的，本文中使用的术语“对象”意指哺乳动物，包括人、兽医或农场动物、家养动物或宠物，以及通常用于临床研究的动物。在一个优选的实施方案中，这些方法和组合物的对象是人。其他合适的对象包括但不限于鼠、大鼠、犬、猫、猪、牛、羊、非人灵长类等。本文中使用的术语“对象”与“患者”可互换使用。
所治疗的对象可以包括被诊断出患有肾上腺脑白质营养不良和/或肾上腺脊髓神经病的个体，或可表现出与ALD或AMN发作相关的症状(例如血浆中高水平的饱和极长链脂肪酸(VLCFA)的积累)，或者由于家族史而可能处于发生ALD或AMN的风险之中，或者个体可在遗传测试期间已确定为包含一个或更多个ABCD1基因突变，例如已发现与ALD或AMN的发生相关的突变。
如所提到的，AAV构建中的ABCD1编码序列任选地可以是经密码子优化的，以使得提高数量或百分比的密码子包含人优选密码子。在核酸序列的上下文中，术语“百分比(％)同一性”、“序列同一性”、“百分比序列同一性”或“百分比同一性”是指两个序列中的在比对以对应时相同的残基。序列同一性比较的长度可以是基因组的全长，基因编码序列的全长或至少约500至5000个核苷酸的片段是期望的。然而，较小片段之间的同一性，例如至少约9个核苷酸、通常至少约20至24个核苷酸、至少约28至32个核苷酸、至少约36个或更多个核苷酸的较小片段之间的同一性也可以是期望的。
可以容易地确定蛋白质、多肽、约32个氨基酸、约330个氨基酸或其肽片段或相应核酸序列编码序列的全长上的氨基酸序列的百分比同一性。合适的氨基酸片段可以为至少约8个氨基酸长并且可以为多至约700个氨基酸。通常，当提及两个不同序列之间的“同一性”、“同源性”或“相似性”时，“同一性”、“同源性”或“相似性”是参照“比对”序列来确定的。“比对”序列或“比对”是指这样的多个核酸序列或蛋白质(氨基酸)序列，其与参考序列相比通常包含对缺失或另外的碱基或氨基酸的校正。
同一性可以通过准备序列的比对和通过使用本领域已知的或可商购获得的多种算法和/或计算机程序[例如，BLAST、ExPASy；Clustal；FASTA；使用，例如，Needleman-Wunsch算法、Smith-Waterman算法]来确定。比对使用多种公开或可商购获得的多序列比对程序(Multiple Sequence Alignment Program)中的任一种来进行。序列比对程序可用于氨基酸序列，例如“Clustal Omega”、“Clustal X”、“MAP”、“PIMA”、“MSA”、“BloCKMAKER”、“MEME”和“Match-Box”程序。通常，这些程序中的任一种都以缺省设置(default setting)使用，但是本领域技术人员可以根据需要改变这些设置。或者，本领域技术人员可以利用另一种算法或计算机程序，其至少提供所参照的算法和程序所提供的同一性或比对的水平。参见，例如，J.D.Thomson et al,“A comprehensive comparison of multiple sequencealignments”,Nucl.Acids.Res.,27(l3):2682-2690(1999).。
多序列比对程序也可用于核酸序列。这样的程序的实例包括“Clustal Omega”、“Clustal W”、“CAP序列组装”、“BLAST”、“MAP”和“MEME”，它们可通过互联网上的Web服务器访问。这样的程序的其他来源是本领域技术人员已知的。或者，可以使用SnapGene。还有许多本领域已知的可用于测量核苷酸序列同一性的算法，包括包含在上述程序中的那些。作为另一个实例，可以使用GCG版本6.1中的程序FastaTM比较多核苷酸序列。FastaTM提供查询和检索序列之间最佳重叠区域的比对和百分比序列同一性。例如，核酸序列之间的百分比序列同一性可以使用FastaTM及其缺省参数(字长6和评分矩阵的NOPAM因子)来确定，如GCG版本6.1中提供的，其通过引用并入本文。
用于描述核酸序列或蛋白质的术语“外源的”意指核酸或蛋白质并非天然存在于其在染色体或宿主细胞中所存在的位置。外源核酸序列也指来源于同一宿主细胞或对象并插入其中但以非天然状态(例如不同的拷贝数或受不同调节元件的控制)存在的序列。
用于描述核酸序列或蛋白质的术语“异源的”意指核酸或蛋白质来源于与其在其中表达的宿主细胞或对象不同的生物体或相同生物体的不同物种。当用于提及蛋白质或者质粒、表达盒或载体中的核酸时，术语“异源的”表明该蛋白质或核酸与另外的序列或子序列一起存在，在天然状态下未发现所讨论的蛋白质或核酸与该另外的序列或子序列彼此存在相同的关系。
术语“分离的”意指将材料从其原始环境(例如，如果它是天然存在的，则为天然环境)移出。例如，存在于活动物中的天然存在的多核苷酸或多肽不是分离的，但是与天然系统中的一些或所有共存材料分离的相同多核苷酸或多肽是分离的，即使随后重新引入天然系统中。这样的多核苷酸可以是载体的一部分和/或这样的多核苷酸或多肽可以是组合物的一部分，并且仍然是分离的，因为这样的载体或组合物不是其天然环境的一部分。
本文中使用的术语“终止子”涵盖终止翻译的核酸序列。例如，终止子可以是分别对应于DNA序列“TAG”、“TGA”或“TAA”的RNA序列“UAG”、“UGA”或“UAA”。
本文中使用的术语“替代开放阅读框”、“替代阅读框”或“替代框”各自是指包含在目的基因(例如ABCD1)的编码序列内的潜在蛋白质编码序列。替代开放阅读框通常始于有义(或反义)方向上的起始密码子(ATG)，其与ABCD1基因处于不同的阅读框中，例如在+1或+2框中。与ABCD1在同一方向上的替代开放阅读框可导致具有潜在免疫原性的替代产物的转录和/或可导致ABCD1基因的翻译降低。替代开放阅读框可以通过引入移除存在于替代框中的ATG序列的一个或更多个突变来消除，这些突变优选地相对于ABCD1基因编码序列是沉默的(或者替代地可以在ABCD1序列中引入突变，例如作为保守突变)。作为替代或补充，可以在替代阅读框中，例如在存在于替代开放阅读框中的数个ATG密码子内的下游引入终止密码子(TAA、TGA或TAG)，使得编码的多肽被截短，优选地截短至仅一个或数个氨基酸。此外，关于ABCD1编码序列引入的突变优选地避免引入可能导致翻译减慢或降低的稀有密码子。
在一些示例性实施方案中，ABCD1编码序列包含一个或更多个经密码子优化的区域。经密码子优化的编码区可以通过多种不同的方法设计。这种优化可以使用在线可用的方法(例如，GeneArt)、已发布的方法或提供密码子优化服务的公司(例如，ATUM(Newark,CA))来进行。一种密码子优化方法描述于例如美国国际专利公开No.WO 2015/012924中，其通过引用整体并入本文。另见例如美国专利公开No.2014/0032186和美国专利公开No.2006/0136184。适当地，产物的开放阅读框(open reading frame，ORF)的整个长度是经修饰的。然而，在一些实施方案中，可以仅改变ORF的片段。通过使用这些方法之一，可以将频率应用于任何给定的多肽序列并产生编码多肽的经密码子优化的编码区的核酸片段。
许多从头(de novo)和重组选项可用于对密码子进行实际改变或用于合成经密码子优化的编码区。这样的修饰或合成可以使用本领域普通技术人员公知的标准和常规分子生物学操作来进行。在一种方法中，通过标准方法合成各自长度为80至90个核苷酸且跨越所期望序列的长度的一系列互补寡核苷酸对。合成这些寡核苷酸对以使得它们在退火时形成80至90个碱基对(包含黏性末端)的双链片段，例如合成所述对中的每个寡核苷酸以将3、4、5、6、7、8、9、10或更多个碱基延伸到与所述对中的另一个寡核苷酸互补的区域之外。每个寡核苷酸对的单链末端被设计成与另一个寡核苷酸对的单链末端退火。使寡核苷酸对退火，并随后使这些双链片段中的约5至6个通过黏性单链末端退火在一起，并随后将它们连接在一起并克隆到标准细菌克隆载体中，例如克隆到可从Invitrogen Corporation,Carlsbad,Calif获得的
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载体中。然后通过标准方法对构建体进行测序。制备由连接在一起的80至90个碱基对片段的5至6个片段(即，约500个碱基对的片段)组成的这些构建体中的数个，以使整个所期望序列呈现在一系列质粒构建体中。然后将这些质粒的插入片段用适当的限制酶切割并连接在一起以形成最终构建体。然后将最终构建体克隆到标准细菌克隆载体中并测序。这样的方法也可用于构建其中一个或更多个替代开放阅读框已被消除的编码序列。另外的方法对技术人员来说将是即刻显而易见的。另外，基因合成容易商购获得。
“经改造”意指将本文所述的编码ABCD1蛋白的核酸序列组装并置于任何合适的遗传元件，例如裸DNA、噬菌体、转座子、黏粒、附加体等中，其将其上携带的ABCD1序列转移至宿主细胞，例如以用于产生非病毒递送系统(例如，基于RNA的系统、裸DNA等)或用于在包装宿主细胞中产生病毒载体和/或用于递送至对象中的宿主细胞。在一个实施方案中，遗传元件是质粒。用于制造这样的经改造构建体的方法是核酸操作技术人员已知的并且包括遗传改造、重组改造和合成技术。参见，例如Green and Sambrook,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY(2012)。
本文中使用的术语“宿主细胞”可以指包装细胞系，其中从生产质粒产生重组AAV。或者，术语“宿主细胞”可以指其中期望编码序列表达的任何靶细胞。因此，“宿主细胞”是指包含外源或异源DNA的原核或真核细胞，所述外源或异源DNA已通过任何方式，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、显微注射、转化、病毒感染、转染、脂质体递送、膜融合技术、高速DNA包被的丸粒(high velocity DNA-coated pellet)、病毒感染和原生质体融合引入细胞中。在本文的某些实施方案中，术语“宿主细胞”是指用于产生和包装病毒载体或重组病毒的细胞。在本文的另一些实施方案中，术语“宿主细胞”是指用于体外评估本文所述的组合物的多种哺乳动物物种的CNS细胞的培养物。在又一些实施方案中，术语“宿主细胞”旨在指代在体内进行针对ALD或AMN疾病的治疗的对象的神经系统细胞。
这样的宿主细胞包括CNS的上皮细胞，包括室管膜、脑室系统的上皮衬里。其他宿主细胞包括神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞、背根神经节和小胶质细胞。
本文中使用的术语“治疗”或其变化形式定义为包括向对象施用一种或更多种本文所述的DNA构建体或组合物以用于改善ALD或AMN的一种或更多种症状。因此，“治疗”可以包括减少ALD或AMN的发作或进展、预防疾病、降低疾病症状的严重程度或延缓其进展中的一种或更多种，包括血浆以及脑、脊髓和肾上腺皮质的组织中高水平的饱和极长链脂肪酸(VLCFA)的积累；肾上腺脊髓神经病(AMN)；由受影响的背根神经节神经元(DRG)引起的周围神经病；艾迪生病的发作；注意力、思维、专注和其他脑功能的“突然”下降；脑脱髓鞘等。
术语“表达”在本文中以其最广泛的含义使用并且包括RNA或者RNA和蛋白质的产生。关于RNA，术语“表达”或“翻译”特别涉及肽或蛋白质的产生。表达可以是短暂的或者可以是稳定的。
本发明上下文中的术语“翻译”涉及在核糖体处的过程，其中mRNA链控制氨基酸序列的组装以产生蛋白质或肽。
本文中使用的“疾病”、“障碍”和“病症”可互换使用，以指示对象中的异常状态。
除非另有说明，否则本文中使用的术语“约”或“～”意指相对于给定参考的10％的变异性。
本文中使用的术语“调节”或其变化形式是指组合物抑制生物途径的一种或更多种组分的能力。
如在方法中使用的“施用”意指将组合物递送至靶选定细胞，其特征在于ABCD1基因的缺陷。在一个实施方案中，所述方法涉及通过鞘内注射递送组合物。在另一个实施方案中，对对象采用脑室内(ICV)注射。在另一个实施方案中，对对象采用鞘内-腰(IT-L)注射。在又一种方法中，可以采用血管内注射。在另一个实施方案中，采用肌内注射。通常采用鞘内施用。鉴于本公开内容，本领域技术人员可以选择其他施用方法。
“施用”或“施用途径”是在有或没有药物载体或赋形剂的情况下向对象递送本文所述的组合物。如果期望的话，可以将施用途径组合。在一些实施方案中，定期重复施用。本文所述的药物组合物设计成用于通过任何合适的途径或不同途径的组合递送至有此需要的对象。在一些实施方案中，采用直接递送至脑(任选地通过鞘内、ICV或IT-L注射)，或通过全身途径递送，例如血管内、动脉内、眼内、静脉内、肌内、皮下、皮内和其他肠胃外途径(parental route)的施用。本文所述的核酸分子、表达盒和/或载体可以在单一组合物或多种组合物中递送。任选地，可以递送两种或更多种不同的AAV，或多种病毒[参见例如WO202011/126808和WO 2013/049493]。在另一个实施方案中，多种病毒可以包含不同的复制缺陷型病毒(例如AAV和腺病毒)，单独或与蛋白质组合。
本文中使用的术语“鞘内递送”或“鞘内施用”是指通过注射到椎管中、更特别地注射到蛛网膜下腔以使其到达脑脊液(CSF)的药物施用途径。鞘内递送可包括腰穿刺、室内(intraventricular)(包括脑室内(ICV))、枕下/脑池内和/或C1-2穿刺。例如，可以通过腰穿刺的方法将物质引入以扩散遍及蛛网膜下腔。在另一个实例中，可以注射到大池(cisterna magna)中。
本文中使用的术语“脑池内递送”或“脑池内施用”是指使药物直接进入大池小脑延髓(cerebellomedularis)的脑脊液中的施用途径，更特别地通过枕下穿刺或通过直接注射到大池中或通过永久定位的管。可用于将本文所述的组合物递送到脑脊液中的装置描述于PCT/US2017/16133中，其通过引用并入本文。
其他定义出现在本公开内容全文的上下文中。
组合物和方法
本发明提供了改进的AAV构建体(例如rAAV载体和rAAV基因组载体)以及包含其的细胞和组合物，其中这样的AAV构建体包含编码人ABCD1蛋白的核酸序列(AAV-ABCD1构建体或AAV-hABCD1构建体)，其中这样的改进的AAV-ABCD1构建体可具有以下优点中的一项或更多项：提高的安全性、提高的可包装性、增强的ABCD1表达水平、提高的效力、提高的稳定性或降低的表达非自身抗原的潜力。
本发明的组合物和方法提供了对于由ABCD1基因突变引起的X连锁肾上腺脑白质营养不良(X-ALD)的治疗。预期ABCD1基因向CNS的靶向特异性递送解决肾上腺脑白质营养不良和/或肾上腺脊髓神经病的症状。这可以通过施用编码ABCD1的腺相关病毒(AAV)载体来实现。本文描述的是一些示例性AAV-hABCD1载体，其有时在本文中称为AAV-ABCD1。这些术语的使用可以互换。另外，可预期利用本文所述的组分的替代实施方案。
在本发明的某些实施方案中，包含主题DNA构建体的组合物或包含其的组合物用于在有此需要的对象中治疗和/或预防肾上腺脑白质营养不良和/或肾上腺脊髓神经病和与之相关的症状，这些症状包括血浆以及脑、脊髓和肾上腺皮质的组织中高水平的饱和极长链脂肪酸(VLCFA)的积累，肾上腺脊髓神经病(AMN)，和由受影响的背根神经节神经元引起的周围神经病。
本发明还提供了制备这样的改进的AAV构建体的方法，该构建体包含编码人ABCD1蛋白的核酸序列(AAV-ABCD1构建体)，并且该构建体可以具有以下优点中的一项或更多项：提高的安全性、提高的可包装性、增强的ABCD1表达水平、提高的稳定性或降低的表达非自身抗原的潜力，其可用于在有此需要的对象中治疗和/或预防肾上腺脑白质营养不良(ALD)和/或肾上腺脊髓神经病(AMN)。
本发明还提供了通过例如鞘内、脑室内(ICV)、鞘内-腰(IT-L)、血管内、肌内或脑池内施用来递送这样的改进的AAV构建体的方法，该构建体包含编码人ABCD1蛋白的核酸序列(AAV-ABCD1构建体)，该构建体可具有以下优点中的一项或更多项：提高的安全性、提高的可包装性、增强的ABCD1表达水平、提高的稳定性或降低的表达非自身抗原的潜力，以用于在有此需要的对象中治疗和/或预防肾上腺脑白质营养不良和/或肾上腺脊髓神经病。
在如本文所述的一些实施方案中，这样的改进的AAV-ABCD1构建体将缺少土拨鼠转录后调节元件(WPRE)。
在如本文所述的另一些实施方案中，这样的改进的AAV-ABCD1构建体将包含经修饰的土拨鼠转录后调节元件(WPRE)，其包含消除X蛋白的表达或者导致失活或非功能性X蛋白(例如截短的X蛋白)的表达的至少一个突变。
在如本文所述的一些实施方案中，这样的改进的AAV-ABCD1构建体将缺少土拨鼠转录后调节元件(WPRE)。
在如本文所述的另一些实施方案中，这样的改进的AAV-ABCD1构建体将包含经修饰的土拨鼠转录后调节元件(WPRE)，其包含消除X蛋白的表达或者导致失活或非功能性X蛋白(例如截短的X蛋白)的表达的至少一个突变。
本发明的一个特定目的是提供新的重组AAV DNA构建体，其在本文中理解为涵盖具有rAAV病毒载体基因组编码多核苷酸的rAAV病毒载体，其在体内表达治疗足够量的ALD蛋白，其缺乏潜在的致癌转基因表达增强子(例如土拨鼠转录后调节元件(WPRE))，或者其包含经修饰以减少或消除X蛋白的表达和/或导致失活的(非致癌性)X蛋白变体的表达的WPRE。
本发明的一个特定目的是提供分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含重组腺相关病毒(rAAV)载体基因组，其可以包装在病毒衣壳中以形成rAAV病毒体，其中所述rAAV载体基因组包含以下或由以下组成：(a)5’AAV末端反向重复(ITR)；(b)表达盒，其中所述表达盒包含至少(i)在靶细胞中有活性的启动子，其与(ii)可操作地连接，(ii)编码ATP结合盒亚家族D成员1(ABCD1)多肽的多核苷酸，(iii)一个或更多个终止子和(iv)所述ABCD1编码多核苷酸下游的一个或更多个poly A信号；以及(c)3’ITR。rAAV载体基因组可不包含土拨鼠转录后调节元件(WPRE)或可包含经修饰的WPRE，其包含导致X蛋白不表达或以失活形式表达的至少一个突变(WPREx-失活)。
在一些情况下，在本发明提供的分离的多核苷酸中，5’ITR和3’ITR可以来源于以下中任一个的5’ITR和3’ITR：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.10(本文也称为AAVrh.10)血清型，或其组合。
在一些情况下，5’ITR和3’ITR可以来源于AAV2、AAV9或AAVrh.10的5’ITR和3’ITR。
在一些情况下，分离的多核苷酸不包含土拨鼠转录后调节元件(WPRE)。
在一些情况下，分离的多核苷酸包含经修饰的WPRE(WPREx-失活)，其包含导致X蛋白不表达或以失活形式表达的至少一个突变。
在一些情况下，在本发明提供的分离的多核苷酸中，(i)5’ITR来源于AAV2的5’ITR；和/或(ii)3’ITR来源于AAV2的3’ITR。AAV2的示例性5’ITR和3’ITR序列分别包括但不限于为SEQ ID NO:601和602的参考5’ITR和3’ITR序列，它们位于由登录号：NC_001401.2提供的示例性AAV2完整基因组参考序列中。在一些情况下，在本发明提供的分离的多核苷酸中，(i)5’ITR可以包含SEQ ID NO:301、401、601、611、10001、10101或10201的核酸序列；和/或(ii)3’ITR包含SEQ ID NO:302、402、602、612、10018、10118或10218的核酸序列。
在一些情况下，在本发明提供的分离的多核苷酸中，(i)5’ITR可以是AAV2的5’ITR的截短形式；和/或(ii)3’ITR可以是AAV2的3’ITR的截短形式。例如，(i)5’ITR的截短形式可以包含SEQ ID NO:2、10501、11001、11101、11201、11301、11501或11701的核酸序列；和/或(ii)3’ITR的截短形式可以包含SEQ ID NO:28、10518、11018、11118、11218、11318、11518或11718的核酸序列。
在一些情况下，包含载体基因组的rAAV载体的靶细胞可以是神经元或胶质细胞。
在一些情况下，载体基因组中包含的启动子可以选自巨细胞病毒(CMV)即早期启动子，病毒猿病毒40(SV40)(例如，早期或晚期)，莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)LTR启动子，劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR，单纯疱疹病毒(HSV)(胸苷激酶)启动子，来自牛痘病毒的H5、P7.5和PI 1启动子，延伸因子1-α(EF1a)启动子，早期生长反应1(EGR1)，铁蛋白H(FerH)，铁蛋白L(FerL)，甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)，真核翻译起始因子4A1(EIF4A1)，热休克70kDa蛋白5(HSPA5)，热休克蛋白90kDaβ成员1(HSP90B1)，热休克蛋白70kDa(HSP70)，β-驱动蛋白(β-KΙΝ)，人ROSA 26基因座，泛素C启动子(UBC)，磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子，鸡β-肌动蛋白(CAG)启动子，巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子，β-葡糖醛酸糖苷酶(GUSB)启动子，JeT启动子，β-肌动蛋白启动子、任选的鸡β-肌动蛋白启动子；组织特异性启动子，B29启动子，runt转录因子(CBFa2)启动子，CD14启动子，CD43启动子，CD45启动子，CD68启动子，CYP450 3A4启动子，结蛋白启动子，弹性蛋白酶1启动子，内皮联蛋白启动子，成纤维细胞特异性蛋白1启动子(FSP1)启动子，纤连蛋白启动子，fms相关酪氨酸激酶1(FLT1)启动子，胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)启动子，胰岛素启动子，整合素，α2b(ITGA2B)启动子，胞内黏附分子2(ICAM-2)启动子，干扰素β(IFN-β)启动子，角蛋白5启动子(角质形成细胞表达)，肌红蛋白(MB)启动子，肌原性分化1(MYOD1)启动子，肾病蛋白启动子，骨γ-羧基谷氨酸蛋白2(OG-2)启动子，3-含氧酸CoA转移酶2B(Oxct2B)启动子，表面活性蛋白B(SP-B)启动子，突触蛋白启动子，威斯科特-奥尔德里奇综合征蛋白(Wiskott-Aldrich syndromeprotein，WASP)启动子或MND启动子。EF1a启动子的一个示例性序列可以由例如登录号：J04617提供。UBC启动子的一个示例性序列可以由例如登录号：NG_027722.2提供。巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白启动子的一个示例性序列可以由例如登录号：NC_006273/X00182提供。JeT启动子的一个示例性序列可以由例如
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J,Kusk P,Johansen TE,JensenPR.“Generation of a synthetic mammalian promoter library by modification ofsequences spacing transcription factor binding sites”,Gene.2002Sep 4；297(1-2):21-32(doi:10.1016/s0378-1119(02)00878-8；PMID:12384282)来提供。GUSB启动子的一个示例性序列可以由例如登录号：M65002提供。
在一些情况下，病毒基因组中包含的启动子可以包含鸡β-肌动蛋白启动子(本文也称为CBA启动子)，任选地其中鸡β-肌动蛋白启动子包含SEQ ID NO:10、10007、10107、10207、10507、11007、11107、11207、11307、11507或11707的核酸序列，或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
在一些情况下，病毒基因组中包含的启动子可以与增强子可操作地连接，所述增强子选自CMV增强子、RSV增强子、甲胎蛋白增强子、TTR最小启动子/增强子、LSP增强子、APB增强子、ABPS增强子、αmic/bik增强子、TTR增强子、en34增强子或ApoE增强子。
在一些情况下，病毒基因组中包含的启动子可以与增强子可操作地连接，任选地其中所述增强子是CMV增强子或骨髓增殖性肉瘤病毒增强子。
在一些情况下，病毒基因组中包含的启动子与CMV增强子可操作地连接，任选地其中所述CMV增强子包含SEQ ID NO:7、10005、10105、10205、10505、11005、11105、11205、11305、11505或11705的核酸序列，或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
在一些情况下，病毒基因组中包含的启动子包含CMV增强子、鸡β-肌动蛋白启动子、β-肌动蛋白外显子、嵌合内含子、兔β-球蛋白外显子，任选地在从5’端到3’端的方向上。
在某些情况下，(i)CMV增强子可以包含SEQ ID NO:7、10005、10105、10205、10505、11005、11105、11205、11305、11505或11705的核酸序列，或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列；(ii)鸡β-肌动蛋白启动子可以包含SEQ ID NO:10、10007、10107、10207、10507、11007、11107、11207、11307、11507或11707的核酸序列，或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列；(iii)β-肌动蛋白外显子可包含SEQ IDNO:11、10008、10108、10208、10508、11008、11108、11208、11308、11508或11708的核酸序列，或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列；(iv)嵌合内含子可包含SEQ ID NO:12、10009、10109、10209、10509、11009、11109、11209、11309、11509或11709的核酸序列，或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列；和/或兔β-球蛋白外显子可以包含SEQ ID NO:10085、10185、10285、10585、11085、11185、11285、11385、11585或11785的核酸序列，或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
在一些情况下，由rAAV载体基因组编码的ABCD1多肽可以包含由以下编码的氨基酸序列：SEQ ID NO:14、204、304、404、501、502、503、504、505、506、507、508、509、5010、10012、10112、10212、10512、11012、11112、11212、11312、11512或11712的核酸序列，或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
在一些情况下，rAAV载体基因组中包含的ABCD1编码序列可以包含相对于SEQ IDNO:204的核酸序列降低数量的替代开放阅读框或不包含任何替代开放阅读框。
在一些情况下，ABCD1编码序列可以主要(超过50％、60％、70％、80％、90％或95％)或完全由人优选密码子构成。
在一些情况下，ABCD1编码多核苷酸包含SEQ ID NO:14、204、304、404、501、502、503、504、505、506、507、508、509、5010、10012、10112、10212、10512、11012、11112、11212、11312、11512或11712的核酸序列，或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
在一些情况下，rAAV载体基因组还包含紧邻ABCD1编码多核苷酸上游的科扎克序列，并且任选地科扎克序列可以包含SEQ ID NO:10511、11211或11311的核酸序列或代表最佳蛋白质翻译起始的共有序列的近似物：‘GCCRCCATGG’的任何序列。
在一些情况下，rAAV载体基因组包含分别选自UAG、UAA和/或UGA的一个或更多个终止子。在某些情况下，rAAV载体基因组可包含终止子，其包含SEQ ID NO:10071、10171、10271、10571、11071、11171、11271、11371、11571或11771的核酸序列。在某些情况下，rAAV载体基因组还可以包含另外的终止子，其包含SEQ ID NO:10572、11272或11372的核酸序列。
在一些情况下，rAAV载体基因组中包含的poly A信号可包含由bGH、hGH、SV40、RGB、mRGB或合成poly A信号组成的至少一种poly A信号。在一些情况下，rAAV载体基因组中包含的poly A信号可以包含与ABCD1编码多核苷酸的下游可操作地连接的两个或更多个poly A信号。
在一些情况下，rAAV载体基因组中包含的poly A信号可以包含SV40 poly A信号，并且任选地SV40 poly A信号可以包含SEQ ID NO:27、10014、10114、10214、10514、11014、11214或11714的核酸序列，或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
在一些情况下，rAAV载体基因组中包含的poly A信号可以包含bGH poly A信号，并且任选地bGH poly A信号可以包含SEQ ID NO:10016、10116、10216、11016、11116、11216、11316、11516或101716的核酸序列，或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
在一些情况下，rAAV载体基因组中包含的poly A信号可包含SEQ ID NO:206、306、405、10035、10135、10235、10535、11035、11135、11235、11335、11535或11735的核酸序列，或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
在一些情况下，在rAAV载体基因组中，(a)5’ITR可以包含SEQ ID NO:301、401、10001、10101、10201、2、10501、11001、11101、11201、11301、11501或101701的核酸序列；(b)在表达盒中，(i)启动子可以包含SEQ ID NO:10、10007、10107、10207、10507、11007、11107、11207、11307、11507或11707、303、403的核酸序列，(ii)ABCD1编码多核苷酸可以包含SEQID NO:14、204、304、404、501、502、503、504、505、506、507、508、509、5010、10012、10112、10212、10512、11012、11112、11212、11312、1512或11712的核酸序列，并且(iii)poly A信号可包含SEQ ID NO:27、10014、10114、10214、10514、11014、11214、11714、10016、10116、10216、11016、11116、11216、11316、11516、11716、306、405、10035、10135、10235、11035、11235或11735的核酸序列；以及(c)3’ITR可包含SEQ ID NO:302、402、602、612、28、10018、10118、10218、10518、11018、11118、11218、11318、11518、或11718的核酸序列。
在某些情况下，rAAV载体基因组可以包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:300、400、10050、10150、10250、10550、11050、11150、11250、11350、11550或11750的核酸序列，SEQ ID NO:100的核酸序列的核苷酸1至3713，或SEQ ID NO:10060、10160、10260、10560、11060、11160、11260、11360、11560或101760，或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
在某些情况下，rAAV载体基因组还包含经修饰的土拨鼠转录后调节元件(WPRE)，其包含消除X蛋白的表达或者导致失活或非功能性X蛋白(WPREx-失活)的表达的至少一个突变。例如，失活或非功能性X蛋白是截短的X蛋白。在一个具体实例中，经修饰的WPRE包含SEQ ID NO:305或10075的核酸序列。
在某些情况下，本发明提供的分离的多核苷酸可包含rAAV载体基因组，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:300、10050或10060的核酸序列。
在某些情况下，本发明提供的分离的多核苷酸可以是质粒，优选地是在宿主细胞中在特定生长条件下的高拷贝质粒(500至1000个拷贝/细胞)(例如，pUC18、pUC19、pUC57、或pUC118)。质粒可以任选地编码抗生素抗性基因，其可以任选地是卡那霉素抗性基因。在一些具体实例中，质粒可包含pUC57或pUC118骨架。在某些情况下，本发明提供的分离的多核苷酸可以是质粒，其包含以下、由以下组成或来源于以下：质粒pSBT101、pOB1005、pOB1010、pOB1011、pOB1012、pOB1013、pOB1015或pOB1017，或编码AAV-CBA-ABCD1-WPRE(X失活)的基因组的质粒。
在某些情况下，本发明提供的分离的多核苷酸可以是包含以下或由以下组成的质粒：SEQ ID NO:100、10000、10100、10500、11000、11100、11200、11300、11500、或11700的核酸序列，或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
本发明的一个特定目的是提供包含以下的组合物：(A)根据上述任一种多核苷酸的分离的多核苷酸，任选地还包含以下中的任意一项或更多项：(B)转染试剂；(C)包含AAV衣壳(cap)基因的多核苷酸；(D)包含AAV复制(rep)基因的多核苷酸；(E)包含选自E1区域、E2区域、E4区域和VA RNA区域的腺病毒辅助基因的多核苷酸；和/或(F)可药用载体或赋形剂。
在一些情况下，转染试剂是聚乙烯亚胺(PEI)或PEI衍生物，例如
Figure BDA0003816929830000291
在一些其他情况下，转染试剂可以是lipofectamineTM、
Figure BDA0003816929830000292
或
Figure BDA0003816929830000293
在一些情况下，(i)AAV cap基因可以来源于以下的cap基因：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9和AAVrh.10，优选地AAV2、AAV9或AAVrh.10；和/或(ii)AAV rep基因可以来源于以下的rep基因：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9和AAVrh.10，优选地AAV2、AAV9或AAVrh.10。
在一些实施方案中，rep基因和cap基因可以通过单独的质粒提供给包装细胞。在一些实施方案中，包装细胞经改造以表达cap基因和/或rep基因。在某些情况下，rep基因可以由p5和/或p40启动子转录(即，转录由p5和/或p40启动子控制)，并且cap基因可以由p40启动子转录。
在一些实施方案中，rep基因和cap基因可以由Rep/Cap质粒提供。在某些实施方案中，Rep/Cap质粒包含p5启动子、p19启动子和p40启动子。在某些情况下，rep基因可以由p5和/或p40启动子转录，并且cap基因可以由p40启动子转录。
在一些实施方案中，Rep/Cap质粒可以完全来源于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或AAVrh.10，而在一些实施方案中，Rep/Cap质粒可以具有混合血清型，例如AAV2/9，其包含来自AAV2的元件和来自AAV9的元件。
在某些实施方案中，当Rep/Cap质粒具有AAV2/9血清型时，Rep基因可以具有AAV2并且Cap基因可以具有AAV9。
在这样的一些实施方案中，Rep/Cap质粒可以包含AAV2 p5启动子(其可以包含SEQID NO:710的核酸序列)、AAV2 p19启动子(其可以包含SEQ ID NO:720的核酸序列)和AAVp40启动子(其可以包含SEQ ID NO:730的核酸序列)。
在一些实施方案中，衣壳(cap)基因可以是编码VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白的AAV血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或AAVrh.10的衣壳基因或其变体。
在一些实施方案中，cap基因产物由AAV p40启动子转录。在某些实施方案中，AAVp40启动子可以包含SEQ ID NO:730的核酸序列。
在某些实施方案中，衣壳基因可以是或可以来源于AAV2、AAV9或AAV10rh.10的衣壳基因。
在一些实施方案中，当衣壳基因(Cap基因)来源于AAV9的衣壳基因时，可以编码AAV9的三种衣壳基因产物VP1、VP2和VP3。在某些情况下，AAV9的VP1、VP2和VP3可以由p40启动子转录。在某些情况下，VP1 AAV9可以包含SEQ ID NO:731的氨基酸序列。在某些情况下，AAV9的VP2可以包含SEQ ID NO:732的氨基酸序列。在某些情况下，AAV9的VP3可以包含SEQID NO:733的氨基酸序列。
在一些实施方案中，当衣壳基因(Cap基因)是或来源于AAV2的衣壳基因时，可以产生AAV2的三种衣壳基因产物VP1、VP2和VP3。在某些情况下，AAV2的VP1可以包含SEQ ID NO:831的氨基酸序列。在某些情况下，AAV2的VP2可以包含SEQ ID NO:832的氨基酸序列。在某些情况下，AAV2的VP3可以包含SEQ ID NO:833的氨基酸序列。
在一些实施方案中，当衣壳基因(Cap基因)来源于AAVrh.10的衣壳基因时，可以产生AAVrh.10的三种衣壳基因产物VP1、VP2和VP3。
在某些情况下，AAVrh.10的VP1可以包含SEQ ID NO:931的氨基酸序列。在某些情况下，AAVrh.10的VP2可以包含SEQ ID NO:932的氨基酸序列。在某些情况下，AAVrh.10的VP3可以包含SEQ ID NO:933的氨基酸序列。
在一些情况下，一个示例性AAVrh.10衣壳序列可以由例如GeneBank#AY243015(核酸序列)和/或登录号AA088201.1(氨基酸序列)提供和/或由例如Gao G.et al.,JVirol.2004Jun；78(12):6381-8提供。
在一些实施方案中，复制基因可以是编码Rep 78、Rep 68、Rep 52和/或Rep 40蛋白的AAV血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或AAVrh.10的复制基因或其变体。在一些实施方案中，复制基因可以由p5启动子和/或p19启动子转录。
在一些实施方案中，复制基因可以是AAV2、AAV9或AAVrh.10的复制基因或其变体。
在某些实施方案中，两种复制基因产物REP78和REP68可以由p5启动子转录。在某些实施方案中，两种复制基因产物REP52和REP40可以由p19启动子转录。
在一些实施方案中，当复制基因(rep基因)是或来源于AAV2的复制基因时，可以产生AAV2的复制基因产物Rep78、Rep68、Rep52和/或Rep40。在某些情况下，AAV2的Rep78和/或Rep68可以由AAV2 p5启动子转录，并且Rep52和/或Rep40可以由AAV2 p19启动子转录。
在某些实施方案中，AAV2 p5启动子可以包含SEQ ID NO:710的核酸序列和/或AAV2 p19启动子可以包含SEQ ID NO:720的核酸序列。
在某些实施方案中，AAV2的基因产物Rep78可以包含SEQ ID NO:711的氨基酸序列。在某些情况下，AAV2的基因产物Rep68可以包含SEQ ID NO:712的氨基酸序列。在某些情况下，AAV2的基因产物Rep52可以包含SEQ ID NO:721的氨基酸序列。在某些情况下，AAV2的基因产物Rep40可以包含SEQ ID NO:722的氨基酸序列。
在一些具体实施方案中，当Rep/Cap质粒是AAV2/9质粒，例如本文称为“pAAV2/9”的质粒时，所述质粒可包含：AAV2 p5启动子(SEQ ID NO:710)，可从其产生AAV2 REP78(SEQID NO:711)和AAV2 REP68(SEQ ID NO:712)；AAV2 p19启动子(SEQ ID NO:720)，可从其产生AAV2 REP52(SEQ ID NO:721)和AAV2 REP40(SEQ ID NO:722)；和AAV p40启动子(SEQ IDNO:730)，可从其产生AAV9 VP1(SEQ ID NO:731)、AAV9 VP2(SEQ ID NO:732)和AAV9 VP3(SEQ ID NO:733)。在一些具体情况下，这样的pAAV2/9质粒的完整构建体序列可以具有SEQID NO:700的核酸序列。
在某些情况下，在pAAV2/9Rep/Cap质粒中，REP40和REP68基因可以共有位于CAPVP1序列内的第二外显子。在某些情况下，可能存在由REP 40和REP 68的小的第二外显子编码的最后数个氨基酸(例如三个氨基酸)的变异。例如，当REP40和REP68分别包含SEQ IDNO:722和712的氨基酸序列时，REP40和REP68产物二者均以氨基酸序列LARGQP结尾。这与天然AAV2的REP 40和REP 68序列不同，两者均以氨基酸序列LARGHSL结尾。
在一些情况下，AAV cap基因可以编码SEQ ID NO:731、732和/或733的氨基酸序列，或与其具有至少95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。
在一些情况下，AAV cap基因可以编码SEQ ID NO:831、832和/或833的氨基酸序列，或与其具有至少95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。
在一些情况下，AAV cap基因可以编码SEQ ID NO:931、932和/或933的氨基酸序列，或与其具有至少95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。
在一些情况下，AAV rep基因可以编码SEQ ID NO:711、712、721和/或722的氨基酸序列，或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，包含以下的多核苷酸可包含在可用于产生根据本发明的rAAV病毒载体的组合物中：一种或更多种辅助基因，例如一种或更多种腺病毒辅助基因、一种或更多种单纯疱疹病毒辅助基因、一种或更多种乳头瘤病毒辅助基因、和/或一种或更多种牛痘病毒辅助基因。
在一些实施方案中，当包含一种或更多种腺病毒辅助基因时，腺病毒辅助基因可以来源于腺病毒5(Ad5)和/或腺病毒2(Ad2)。在一些情况下，腺病毒辅助基因可以来源于野生型(wild-type，WT)Ad5，并且在某些情况下，WT Ad5可以包含含有SEQ ID NO:2000的核酸序列的基因组。在一些情况下，腺病毒辅助基因可以来源于野生型(WT)Ad2，并且在某些情况下，WT Ad2可以包含含有SEQ ID NO:3000的核酸序列的基因组。
在一些实施方案中，当包含一种或更多种腺病毒辅助基因时，腺病毒辅助基因可包含E1区域、E2区域、E4区域和/或VA RNA区域。在一些实施方案中，腺病毒辅助基因可以包含VA RNA区域、E2区域和E4区域。
在一些实施方案中，一种或更多种腺病毒辅助基因可由AAV辅助病毒提供，所述AAV辅助病毒可由AAV病毒辅助质粒(或本文简称为“病毒辅助质粒”)提供。
在一些实施方案中，一种或更多种Ad5辅助基因可以由Ad5辅助病毒提供，所述Ad5辅助病毒可以由Ad5病毒辅助质粒提供。这样的Ad5病毒辅助质粒的非限制性实例包括本文称为pALD-X80的质粒。
在一些实施方案中，Ad5病毒辅助质粒可以包含Ad5 VA RNA区域、Ad5 E2区域和/或Ad5 E4区域。在一些情况下，Ad5 VA RNA区域可以包含SEQ ID NO:2010的核酸序列。在一些情况下，Ad5 E2区域可以包含SEQ ID NO:2020的核酸序列。在一些情况下，Ad5 E4区域可以包含SEQ ID NO:2030的核酸序列。例如，示例性质粒pALD-X80包含这些序列。
在一些实施方案中，Ad5 VA RNA区域可以包含Ad5 VA-RNA区域I(VA RNA I)和Ad5VA-RNA区域II(VA RNA II)。在一些情况下，Ad5 VA-RNA区域I(VA RNA I)可以包含SEQ IDNO:2011的核酸序列。在一些情况下，Ad5 VA-RNA区域II(VA RNA II)可以包含SEQ ID NO:2012的核酸序列。
在一些实施方案中，Ad5 E2区域可以编码六邻体(C-端片段)；23K内切蛋白酶；E2A/DBP；六邻体装配体(100K)；六邻体装配体(33K)；六邻体装配体(22K)；和/或六邻体相关前体。在一些情况下，这样的六邻体(C-端片段)可以包含SEQ ID NO:2021的氨基酸序列。在一些情况下，这样的23K内切蛋白酶可以包含SEQ ID NO:2022的氨基酸序列。在一些情况下，这样的E2A/DBP可以包含SEQ ID NO:2023的氨基酸序列。在一些情况下，这样的六邻体装配体(100K)可包含SEQ ID NO:2024的氨基酸序列。在一些情况下，这样的六邻体装配体(33K)可包含SEQ ID NO:2025的氨基酸序列。在一些情况下，这样的六邻体装配体(22K)可包含SEQ ID NO:2026的氨基酸序列。在一些情况下，这样的六邻体相关前体可包含SEQ IDNO:2027的氨基酸序列。
在一些实施方案中，Ad5 E4区域可以编码：纤维；E4 ORF1；E4 ORF2；E4 ORF3；E4ORF4；E4 ORF6；和/或E4 ORF6/7。在一些情况下，纤维可以包含SEQ ID NO:2031的氨基酸序列。在一些情况下，E4 ORF1可以包含SEQ ID NO:2032的氨基酸序列。在一些情况下，E4ORF2可以包含SEQ ID NO:2033的氨基酸序列。在一些情况下，E4 ORF3可以包含SEQ ID NO:2034的氨基酸序列。在一些情况下，E4 ORF4可以包含SEQ ID NO:2035的氨基酸序列。在一些情况下，E4 ORF6可以包含SEQ ID NO:2036的氨基酸序列。在一些情况下，E4 ORF6/7可以包含SEQ ID NO:2037的氨基酸序列。
在一些具体实施方案中，一种或更多种腺病毒辅助基因可以由pALD-X80质粒或Ad5病毒辅助质粒提供。
在一些具体实施方案中，Ad5病毒辅助质粒可以包含：Ad5区域VA-RNA(SEQ ID NO:2010)，其包含VA-RNA区域(VA RNA I)(SEQ ID NO:2011)和/或VA-RNA区域(VA RNA II)(SEQ ID NO:2012)；Ad5区域E2(SEQ ID NO:2020)，其编码六邻体(C-端片段)(SEQ ID NO:2021)、23K内切蛋白酶(SEQ ID NO:2022)、E2A/DBP(SEQ ID NO:2023)、六邻体装配体(100K)(SEQ ID NO:2024)、六邻体装配体(33K)(SEQ ID NO:2025)、六邻体装配体(22K)(SEQ ID NO:2026)和六邻体相关前体(SEQ ID NO:2027)；以及Ad5区域E4(SEQ ID NO:2030)，其编码纤维(SEQ ID NO:2031)、E4 ORF1(SEQ ID NO:2032)、E4 ORF2(SEQ ID NO:2033)、E4 ORF3(SEQ ID NO:2034)、E4 ORF4(SEQ ID NO:2035)、E4 ORF6(SEQ ID NO:2036)、和/或E4 ORF6/7(SEQ ID NO:2037)。
pALD-X80包含：Ad5区域VA-RNA(SEQ ID NO:2010)，其包含VA-RNA区域(VA RNA I)(SEQ ID NO:2011)和/或VA-RNA区域(VA RNA II)(SEQ ID NO:2012)；Ad5区域E2(SEQ IDNO:2020)，其编码六邻体(C-端片段)(SEQ ID NO:2021)、23K内切蛋白酶(SEQ ID NO:2022)、E2A/DBP(SEQ ID NO:2023)、六邻体装配体(100K)(SEQ ID NO:2024)、六邻体装配体(33K)(SEQ ID NO:2025)、六邻体装配体(22K)(SEQ ID NO:2026)和六邻体相关前体(SEQID NO:2027)；以及Ad5区域E4(SEQ ID NO:2030)，其编码纤维(SEQ ID NO:2031)、E4 ORF1(SEQ ID NO:2032)、E4 ORF2(SEQ ID NO:2033)、E4 ORF3(SEQ ID NO:2034)、E4 ORF4(SEQID NO:2035)、E4 ORF6(SEQ ID NO:2036)、和/或E4 ORF6/7(SEQ ID NO:2037)。
在一些实施方案中，一种或更多种Ad2辅助基因可以由Ad2辅助病毒提供，所述Ad2辅助病毒可以由Ad2病毒辅助质粒提供。这样的Ad2病毒辅助质粒的非限制性实例可包括本文称为pHELP-KanV4的质粒。
在一些实施方案中，Ad2病毒辅助质粒可包含Ad2 VA RNA区域、Ad2 E2区域和/或Ad2 E4区域。在一些情况下，Ad2 VA RNA区域可以包含SEQ ID NO:3010的核酸序列。在一些情况下，Ad2 E2区域可以包含SEQ ID NO:3020的核酸序列。在一些情况下，Ad2 E4区域可以包含SEQ ID NO:3030的核酸序列。例如，示例性质粒pHELP-KanV4包含这些序列。
在一些实施方案中，Ad2 VA RNA区域可以包含Ad2 VA-RNA区域I(VA RNA I)和Ad2VA-RNA区域II(VA RNA II)。在一些情况下，Ad2VA-RNA区域I(VA RNA I)可以包含SEQ IDNO:3011的核酸序列。在一些情况下，Ad2 VA-RNA区域II(VA RNA II)可以包含SEQ ID NO:3012的核酸序列。
在一些实施方案中，Ad2 E2区域可以编码23K内切蛋白酶(C-端片段)；E2A/DBP；六邻体装配体(100K)；六邻体装配体(33K)；六邻体装配体(22K)；和/或六邻体相关前体。在一些情况下，这样的23K内切蛋白酶(C-端片段)可以包含SEQ ID NO:3022的氨基酸序列。在一些情况下，这样的E2A/DBP可以包含SEQ ID NO:3023的氨基酸序列。在一些情况下，这样的六邻体装配体(100K)可以包含SEQ ID NO:3024的氨基酸序列。在一些情况下，这样的六邻体装配体(33K)可以包含SEQ ID NO:3025的氨基酸序列。在一些情况下，这样的六邻体装配体(22K)可包含SEQ ID NO:3026的氨基酸序列。在一些情况下，这样的六邻体相关前体可包含SEQ ID NO:3027的氨基酸序列。
在一些实施方案中，Ad2 E4区域可以编码：E4 ORF1；E4 ORF2；E4 ORF3；E4 ORF4；E4 ORF6；和/或E4 ORF6/7。在一些情况下，在一些情况下，这样的E4 ORF1可以包含SEQ IDNO:3032的氨基酸序列。在一些情况下，这样的E4 ORF2可以包含SEQ ID NO:3033的氨基酸序列。在一些情况下，这样的E4 ORF3可以包含SEQ ID NO:3034的氨基酸序列。在一些情况下，这样的E4 ORF4可以包含SEQ ID NO:3035的氨基酸序列。在一些情况下，这样的E4 ORF6可以包含SEQ ID NO:3036的氨基酸序列。在一些情况下，这样的E4 ORF6/7可以包含SEQ IDNO:3037的氨基酸序列。
在一些具体实施方案中，一种或更多种腺病毒辅助基因可以由Ad2病毒辅助质粒pHELP_KanV4质粒提供。
在一些具体实施方案中，Ad2病毒辅助质粒可包含：Ad2区域VA-RNA(SEQ ID NO:3010)，其包含VA-RNA区域(VA RNA I)(SEQ ID NO:3011)和/或VA-RNA区域(VA RNA II)(SEQ ID NO:3012)；Ad2区域E2(SEQ ID NO:3020)，其编码23K内切蛋白酶(C-端片段)(SEQID NO:3022)、E2A/DBP(SEQ ID NO:3023)、六邻体装配体(100K)(SEQ ID NO:3024)、六邻体装配体(33K)(SEQ ID NO:3025)、六邻体装配体(22K)(SEQ ID NO:3026)、和六邻体相关前体(SEQ ID NO:3027)；以及Ad2区域E4(SEQ ID NO:3030)，其编码E4 ORF1(SEQ ID NO:3032)、E4 ORF2(SEQ ID NO:3033)、E4 ORF3(SEQ ID NO:3034)、E4 ORF4(SEQ ID NO:3035)、E4 ORF6(SEQ ID NO:3036)，和/或E4 ORF6/7(SEQ ID NO:3037)。
pHELP_KanV4包含：Ad2区域VA-RNA(SEQ ID NO:3010)，其包含VA-RNA区域(VA RNAI)(SEQ ID NO:3011)和/或VA-RNA区域(VA RNA II)(SEQ ID NO:3012)；Ad2区域E2(SEQ IDNO:3020)，其编码23K内切蛋白酶(C-端片段)(SEQ ID NO:3022)、E2A/DBP(SEQ ID NO:3023)、六邻体装配体(100K)(SEQ ID NO:3024)、六邻体装配体(33K)(SEQ ID NO:3025)、六邻体装配体(22K)(SEQ ID NO:3026)、和六邻体相关前体(SEQ ID NO:3027)；以及Ad2区域E4(SEQ ID NO:3030)，其编码E4 ORF1(SEQ ID NO:3032)、E4 ORF2(SEQ ID NO:3033)、E4ORF3(SEQ ID NO:3034)、E4 ORF4(SEQ ID NO:3035)、E4 ORF6(SEQ ID NO:3036)，和/或E4 ORF6/7(SEQ ID NO:3037)。
在另一些实施方案中，任何辅助病毒基因，例如任何腺病毒辅助基因，可以由经改造以表达任何这样的基因的包装细胞提供。
本发明的一个特定目的是提供这样的重组AAV(rAAV)载体，其包含以下或由以下组成：(I)AAV衣壳；和(II)根据任意上述rAAV载体基因组的rAAV载体基因组。
在一些情况下，AAV衣壳可以是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或AAVrh.10衣壳，优选AAV2、AAV9或AAVrh.10衣壳、或其变体。
在一些情况下，AAV衣壳可以包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:731的氨基酸序列或者与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些情况下，AAV衣壳可以包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:732的氨基酸序列或者与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些情况下，AAV衣壳可以包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:733的氨基酸序列或者与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在某些情况下，rAAV载体(即rAAV病毒颗粒)可以包含AAV9 VP1衣壳蛋白、AAV9VP2衣壳蛋白和AAV9 VP3衣壳蛋白。在一些具体情况下，rAAV载体可以包含：(a)AAV9 VP1衣壳蛋白，其包含SEQ ID NO:731的氨基酸序列或者与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；(b)AAV9 VP2衣壳蛋白，其包含SEQ ID NO:732的氨基酸序列或者与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；以及(c)AAV9 VP3衣壳蛋白，其包含SEQ ID NO:732的氨基酸序列或者与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些情况下，AAV衣壳可以包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:831的氨基酸序列或者与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些情况下，AAV衣壳可以包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:832的氨基酸序列或者与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些情况下，AAV衣壳可以包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:833的氨基酸序列或者与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在某些情况下，rAAV载体(即rAAV病毒颗粒)可以包含AAV2 VP1衣壳蛋白、AAV2VP2衣壳蛋白和AAV2 VP3衣壳蛋白。在一些具体情况下，rAAV载体可包含：(a)AAV2 VP1衣壳蛋白，其包含SEQ ID NO:831的氨基酸序列或者与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；(b)AAV2 VP2衣壳蛋白，其包含SEQ ID NO:832的氨基酸序列或者与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；以及(c)AAV2 VP3衣壳蛋白，其包含SEQ ID NO:832的氨基酸序列或者与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些情况下，AAV衣壳可以包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:931的氨基酸序列或者与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些情况下，AAV衣壳可以包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:932的氨基酸序列或者与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些情况下，AAV衣壳可以包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:933的氨基酸序列或者与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在某些情况下，rAAV载体(即rAAV病毒颗粒)可包含AAVrh.10 VP1衣壳蛋白、AAVrh10 VP2衣壳蛋白和AAVrh.10 VP3衣壳蛋白。在一些具体情况下，rAAV载体可包含：(a)AAVrh.10 VP1衣壳蛋白，其包含SEQ ID NO:931的氨基酸序列或者与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；(b)AAVrh.10 VP2衣壳蛋白，其包含SEQ IDNO:932的氨基酸序列或者与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；以及(c)AAVrh.10 VP3衣壳蛋白，其包含SEQ ID NO:932的氨基酸序列或者与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
本发明的另一个特定目的是提供适合于体内施用的组合物，所述组合物包含：(A)预防或治疗有效量的任意本文所述的rAAV载体；和(B)可药用载体。
在一些情况下，组合物可以包含约1×1013个基因组拷贝(genome copy，GC)至约1×1015GC的rAAV载体剂量。
本发明另一个特定目是提供数种组合物，根据上述组合物的每种组合物总计可包含约1×1013GC至约1×1015GC的rAAV载体总剂量。
在一些情况下，在如上所述的一种或更多种组合物中的任一种中，rAAV载体剂量可以包含在约10mL至约150mL的体积中。
在一些情况下，在如上所述的一种或更多种组合物中的任一种中，rAAV载体剂量可以包含在以下的体积中：约10mL、约20mL、约30mL、约40mL、约50mL、约60mL、约70mL、约80mL、约90mL、约100mL、约110mL、约120mL、约130mL、约140mL、或约150mL。
在一些情况下，如上所述的一种或更多种组合物中的任一种可适合于鞘内、脑室内(ICV)、鞘内-腰(IT-L)、血管内、肌内或脑池内施用。
在一些情况下，如上所述的一种或更多种组合物中的任一种可适合于鞘内施用。
在一些情况下，如上所述的一种或更多种组合物中的任一种可适合于通过泵进行鞘内施用。本发明的另一个特定目的是提供在有此需要的对象中治疗和/或预防ALD或AMN和/或改善与ALD和/或AMN相关的症状的方法，其包括向有此需要的对象施用预防或治疗有效量的任意如上所述多核苷酸中的至少一种、任意如上所述rAAV载体中的至少一种和/或任意如上所述组合物中的至少一种或更多种。
在一些情况下，对象是人。
在一些情况下，所述方法在对象中减轻、减少或稳定一种或更多种症状，例如血浆以及脑、脊髓和肾上腺皮质的组织中高水平的饱和极长链脂肪酸(VLCFA)的积累，肾上腺脊髓神经病(AMN)，或者由受影响的背根神经节神经元引起的周围神经病。
在一些情况下，分离的多核苷酸、rAAV载体或者一种或更多种组合物通过鞘内、脑室内(ICV)、鞘内-腰(IT-L)、血管内、肌内或脑池内施用来递送。
在一些情况下，递送是通过鞘内施用进行。
在一些情况下，鞘内施用由泵介导。
在一些情况下，当施用rAAV载体或包含rAAV的组合物时，rAAV载体的总施用剂量可以为约1×1013GC至约1×1015GC。
在一些情况下，分离的多核苷酸、rAAV载体或者一种或更多种组合物可以以约10mL至约150mL的体积施用。
在一些情况下，分离的多核苷酸、rAAV载体或者一种或更多种组合物可以以以下的体积施用：约10mL、约20mL、约30mL、约40mL、约50mL、约60mL、约70mL、约80mL、约90mL、约100mL、约110mL、约120mL、约130mL、约140mL、或约150mL、优选约100mL。
在一些情况下，分离的多核苷酸、rAAV载体或者一种或更多种组合物可以以单剂量或多剂量递送。
在一些情况下，rAAV载体可以包含AAV9、AAV2或AAVrh.10衣壳。
本发明的另一个特定目的是提供制备病毒载体的方法。
在一些情况下，所述方法可以包括将任意上述分离的多核苷酸引入包装宿主细胞中。任选地，可以包装包含在多核苷酸中的载体基因组的病毒载体可以是包含AAV2、AAV9或AAVrh.10衣壳的rAAV载体。
在一些情况下，所述方法可以包括培养包含任意如上所述的rAAV载体基因组的包装细胞。任选地，病毒载体可以是包含AAV2、AAV9或AAVrh.10衣壳的rAAV载体。还任选地，包装细胞可以包含编码AAV cap和/或AAV rep的多核苷酸。
本发明的另一个特定目的是提供包含任意如上所述rAAV载体基因组的细胞。这样的细胞可用于产生任意本文所述的rAAV载体。任选地，所述细胞包含编码AAV cap和/或AAVrep的多核苷酸。或者，当细胞不包含编码AAV cap和/或AAV rep的多核苷酸时，可在产生任意本文所述的rAAV载体期间将编码AAV cap和/或AAV rep的多核苷酸引入细胞。
本发明的另一个目的是提供AAV 5’ITR变体和/或AAV 3’ITR变体，其包含缩短的A区序列。当这样的AAV 5’ITR和/或AAV 3’ITR变体侧接包含AAV基因组中的目的基因(geneof interest，GOI)的表达盒时，这样的AAV 5’ITR和/或AAV 3’ITR变体可以用于增强(GOI)的表达。
在一些情况下，AAV 5’ITR变体可以包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:2、10501、11001、11101、11201、11301、11501或11701的核酸序列。
在一些情况下，AAV 3’ITR变体可以包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:28、10518、11018、11118、11218、11318、11518或11718的核酸序列。
本发明的另一个目的是提供包含rAAV载体基因组的分离的多核苷酸，所述rAAV载体基因组包含以下或由以下组成：(a)包含如上所述缩短的A区序列的任何AAV 5’ITR变体；(b)表达盒，其包含至少(i)在靶细胞中有活性的启动子，其与(ii)可操作地连接，(ii)编码目的基因(GOI)的多核苷酸，和(iii)所述GOI编码多核苷酸下游的一个或更多个poly A信号；以及(c)包含如上所述缩短的A区序列的任何AAV 3’ITR变体。
在一些情况下，多核苷酸可以是质粒，其任选地包含pUC57或pUC118骨架。
本发明的又一个目的是提供包含以下的组合物：(A)包含rAAV载体基因组的分离的多核苷酸，所述rAAV载体基因组包含以下或由以下组成：(A-a)包含如上所述缩短的A区序列的任何AAV 5’ITR变体；(A-b)表达盒，其包含至少(i)在靶细胞中有活性的启动子，其与(ii)可操作地连接，(ii)编码目的基因(GOI)的多核苷酸，和(iii)所述GOI编码多核苷酸下游的一个或更多个poly A信号；以及(A-c)包含如上所述缩短的A区序列的任何AAV 3’ITR变体。
在一些情况下，所述组合物还可以包含以下中的任一种或更多种：(B)转染试剂；(C)包含AAV衣壳(cap)基因的多核苷酸；(D)包含AAV复制(rep)基因的多核苷酸；(E)包含含有AAV cap基因的多核苷酸的细胞；(F)包含含有AAV rep基因的多核苷酸的细胞；和/或(G)可药用的载体或赋形剂。
在某些情况下，在包含在多核苷酸中的AAV载体基因组中，(i)AAV cap基因可以来源于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9和AAVrh.10，优选AAV2、AAV9或AAVrh.10的cap基因；和/或(ii)AAV rep基因可以来源于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9和AAVrh.10，优选AAV2、AAV9或AAVrh.10的rep基因。
本发明的另一个目的是提供这样的细胞，其包含含有rAAV载体基因组的任何分离的多核苷酸，所述rAAV载体基因组包含以下或由以下组成：(a)包含如上所述缩短的A区序列的任何AAV 5’ITR变体；(b)表达盒，其包含至少(i)在靶细胞中有活性的启动子，其与(ii)可操作地连接，(ii)编码目的基因(GOI)的多核苷酸，和(iii)所述GOI编码多核苷酸下游的一个或更多个poly A信号；以及(c)包含如上所述缩短的A区序列的任何AAV 3’ITR变体。
在一些情况下，所述细胞还可以包含编码AAV cap和/或AAV rep的多核苷酸。
本发明的另一个目的是提供包含以下或由以下组成的rAAV载体：(I)AAV衣壳；以及(II)根据包含以下或由以下组成的rAAV载体基因组的rAAV载体基因组：(a)包含如上所述缩短的A区序列的任何AAV 5’ITR变体；(b)表达盒，其包含至少(i)在靶细胞中有活性的启动子，其与(ii)可操作地连接，(ii)编码目的基因(GOI)的多核苷酸，和(iii)所述GOI编码多核苷酸下游的一个或更多个poly A信号；以及(c)包含如上所述缩短的A区序列的任何AAV 3’ITR变体。
在一些情况下，AAV衣壳是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或AAVrh.10衣壳，优选AAV2、AAV9或AAVrh.10衣壳，或其变体。
本发明的另一个目的是提供一种或更多种适合于体内施用的组合物，其包含预防或治疗有效量的rAAV载体，所述rAAV载体包含以下或由以下组成：(I)AAV衣壳；以及(II)根据包含以下或由以下组成的rAAV载体基因组的rAAV载体基因组：(II-a)包含如上所述缩短的A区序列的任何AAV 5’ITR变体；(II-b)表达盒，其包含至少(i)在靶细胞中有活性的启动子，其与(ii)可操作地连接，(ii)编码目的基因(GOI)的多核苷酸，和(iii)所述GOI编码多核苷酸下游的一个或更多个poly A信号；以及(II-c)包含如上所述缩短的A区序列的任何AAV 3’ITR变体。
在一些情况下，一种或更多种组合物还可以包含可药用载体。
本发明的另一个目的是提供在有此需要的对象中进行基因治疗的方法，其包括向有此需要的对象施用预防或治疗有效量的：(A)至少一种rAAV载体或(B)包含这样的rAAV载体的一种或更多种组合物，所述rAAV载体包含以下或由以下组成：(I)AAV衣壳；以及(II)根据包含以下或由以下组成的rAAV载体基因组的rAAV载体基因组：(II-a)包含如上所述缩短的A区序列的任何AAV 5’ITR变体；(II-b)表达盒，其包含至少(i)在靶细胞中有活性的启动子，其与(ii)可操作地连接，(ii)编码目的基因(GOI)的多核苷酸，和(iii)所述GOI编码多核苷酸下游的一个或更多个poly A信号；和(II-c)包含如上所述缩短的A区序列的任何AAV3’ITR变体。
本发明的另一个目的是提供制备病毒载体的方法，其包括将包含rAAV载体基因组的分离的多核苷酸引入到包装细胞中，所述rAAV载体基因组包含以下或由以下组成：(a)包含如上所述缩短的A区序列的任何AAV 5’ITR变体；(b)表达盒，其包含至少(i)在靶细胞中有活性的启动子，其与(ii)可操作地连接，(ii)编码目的基因(GOI)的多核苷酸，和(iii)所述GOI编码多核苷酸下游的一个或更多个poly A信号；以及(c)包含如上所述缩短的A区序列的任何AAV 3’ITR变体。
在一些情况下，病毒载体是包含AAV2、AAV9或AAVrh.10衣壳的rAAV载体。
本发明的又一个目的是提供制备病毒载体的方法，其包括培养包含rAAV载体基因组的包装细胞，所述rAAV载体基因组包含以下或由以下组成：(a)包含如上所述缩短的A区序列的任何AAV 5’ITR变体；(b)表达盒，其包含至少(i)在靶细胞中有活性的启动子，其与(ii)可操作地连接，(ii)编码目的基因(GOI)的多核苷酸，和(iii)所述GOI编码多核苷酸下游的一个或更多个poly A信号；以及(c)包含如上所述缩短的A区序列的任何AAV 3’ITR变体。
在一些情况下，病毒载体是包含AAV2、AAV9或AAVrh.10衣壳的rAAV载体。
在某些情况下，包装细胞包含编码AAV cap和/或AAV rep的多核苷酸。
在一些实施方案中，这样的改进的AAV-ABCD1构建体将包含ABCD1编码序列，所述ABCD1编码序列经修饰以相对于包含在SEQ ID NO:200中的ABCD1编码序列包含更少的替代开放阅读框或将不包含任何替代开放阅读框。作为替代或补充，可修饰ABCD1编码序列以去除内部科扎克序列或科扎克样序列，优选地通过引入相对于ABCD1编码序列沉默的突变。作为替代或补充，将修饰ABCD1编码序列，优选地通过引入沉默突变，以去除以下中的一个或更多个：(i)TATA-盒(ii)chi-位点，(iii)核糖体进入位点，(iv)ARE序列元件，(v)INS序列元件，(vi)CRS序列元件和/或(vii)隐蔽剪接供体和接受体位点。预计这样的修饰将避免表达非自身抗原的任何潜能和/或提高ABCD1表达。
在一些实施方案中，这样的改进的AAV-ABCD1构建体将包含科扎克序列，例如“CCACC”或“GCCACC”，或代表ABCD1起始位点上游的最佳蛋白质翻译起始的共有序列的近似物：‘GCCRCCATGG)’的任何序列。
在一些实施方案中，这样的改进的AAV-ABCD1构建体将仅包含ABCD1基因下游的单个poly A位点(例如SV40 polyA序列和/或BGH polyA序列，或其他合适的polyA序列，包括合成polyA)以减小ABCD1转基因盒的尺寸。
在一些实施方案中，这样的改进的AAV-ABCD1构建体可包含ABCD1基因下游的多个polyA位点(例如SV40 polyA序列和BGH polyA序列，或其他合适的polyA序列，包括合成polyA)。
在一些实施方案中，这样的改进的AAV-ABCD1构建体将包含缩短或截短的AAV 3’ITR。
在一些实施方案中，这样的改进的AAV-ABCD1构建体将包含在pUC57或pUC118骨架上。
在另一些实施方案中，这样的改进的AAV-ABCD1构建体将包含人ABCD1编码序列，所述ABCD1编码序列主要(超过50％、60％、70％、80％、90％或95％)或完全包含人优选密码子。
在另一些实施方案中，这样的改进的AAV-ABCD1构建体将包含人ABCD1编码序列，所述ABCD1编码序列选自SEQ ID NO:204，SEQ ID NO:304，SEQ ID NO:404，SEQ ID NO:501至510，SEQ ID NO:14，和SEQ ID NO:10012、10112、10212、10512、11012、11112、11212、11312、11512、和11712的序列。
在一些实施方案中，这样的改进的AAV-ABCD1构建体可包含或来源于pSBT101。
在一些实施方案中，这样的改进的AAV-ABCD1构建体(AAV载体、AAV载体基因组或载体基因组编码多核苷酸)可包含或来源于pOB1005、pOB1010、pOB1011、pOB1012、pOB1013、pOB1015或pOB1017。
在一些优选的实施方案中，这样的改进的AAV-ABCD1构建体可包含或来源于pSBT101、pOB1010、pOB1015或pOB1017。
在一些优选的实施方案中，这样的改进的AAV-ABCD1载体基因组可以是在质粒pSBT101、pOB1010、pOB1015或pOB1017中编码的载体基因组。
在一些优选的实施方案中，这样的改进的AAV-ABCD1载体基因组编码多核苷酸可以包含或来源于pSBT101、pOB1010、pOB1015或pOB1017。
在一些优选的实施方案中，这样的改进的AAV-ABCD1载体基因组可以从pSBT101、pOB1010、pOB1015或pOB1017产生。
在一些优选的实施方案中，这样的改进的AAV-ABCD1载体基因组可以是SBT101、OB1010、OB1015或OB1017的载体基因组。
在另一些实施方案中，这样的改进的AAV-ABCD1构建体(AAV载体、AAV载体基因组或载体基因组编码多核苷酸)可包含或来源于AAV-CBA-ABCD1-WPRE(X失活)的基因组，例如AAV-ABCD1载体基因组可以包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:10050或10060的核酸序列。
在另一些实施方案中，这样的改进的AAV-ABCD1构建体(AAV载体、AAV载体基因组或载体基因组编码多核苷酸)可包含或来源于AAV-CBA-ABCD1[无WPRE]的基因组，例如，这样的载体基因组可以包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:10250或10260的核酸序列。
在另一些实施方案中，这样的改进的AAV-ABCD1构建体(AAV载体、AAV载体基因组或载体基因组编码多核苷酸)可包含或来源于pSBT101，例如，AAV-ABCD1载体基因组可以包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:10150或10160的核酸序列。
在另一些实施方案中，这样的改进的AAV-ABCD1构建体(AAV载体、AAV载体基因组或载体基因组编码多核苷酸)可包含或来源于pOB1005，例如，AAV-ABCD1载体基因组可包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:10550或10560的核酸序列或者pOB1005(SEQ ID NO:100)的核苷酸1至3713(包括端值)。
在另一些实施方案中，这样的改进的AAV-ABCD1构建体(AAV载体、AAV载体基因组或载体基因组编码多核苷酸)可包含或来源于pOB1010，例如，AAV-ABCD1载体基因组可以包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:11050或11060的核酸序列。
在另一些实施方案中，这样的改进的AAV-ABCD1构建体(AAV载体、AAV载体基因组或载体基因组编码多核苷酸)可包含或来源于pOB1011，例如，AAV-ABCD1载体基因组可以包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:11150或11160的核酸序列。
在另一些实施方案中，这样的改进的AAV-ABCD1构建体(AAV载体、AAV载体基因组或载体基因组编码多核苷酸)可包含或来源于pOB1012，例如，AAV-ABCD1载体基因组可以包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:11250或11260的核酸序列。
在另一些实施方案中，这样的改进的AAV-ABCD1构建体(AAV载体、AAV载体基因组或载体基因组编码多核苷酸)可包含或来源于pOB1013，例如，AAV-ABCD1载体基因组可以包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:11350或11360的核酸序列。
在另一些实施方案中，这样的改进的AAV-ABCD1构建体(AAV载体、AAV载体基因组或载体基因组编码多核苷酸)可包含或来源于pOB1015，例如，AAV-ABCD1载体基因组可以包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:11550或11560的核酸序列。
在另一些实施方案中，这样的改进的AAV-ABCD1构建体(AAV载体、AAV载体基因组或载体基因组编码多核苷酸)可包含或来源于pOB1017，例如，AAV-ABCD1载体基因组可以包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:11750或11760的核酸序列。
在一些实施方案中，这样的改进的AAV-ABCD1构建体将仅包含ABCD1基因下游的单个polyA位点(例如SV40 polyA序列和/或BGH polyA序列，或其他合适的polyA序列，包括合成polyA)，以减小ABCD1转基因盒的尺寸。
在一些实施方案中，这样的改进的AAV-ABCD1构建体可包含ABCD1基因下游的多个polyA位点(例如SV40 polyA序列和BGH polyA序列，或其他合适的polyA序列，包括合成polyA)。
在一些实施方案中，这样的改进的AAV-ABCD1构建体将包含缩短或截短的AAV 3’ITR。
在一些具体实施方案中，改进的AAV-ABCD1构建体可包含(i)来自任何AAV血清型的5’和3’AAV ITR序列，例如AAV2、AAV9或AAVrh.10ITR序列，所述ITR序列可侧接以下序列(ii)可在中枢神经系统的细胞(例如神经元或胶质细胞)中操作的启动子，例如杂合启动子，所述杂合启动子例如包含鸡β肌动蛋白启动子上游的CMV即早期增强子(本文也称为CMV增强子)，β肌动蛋白外显子，嵌合内含子和兔β-球蛋白外显子，其位于以下的上游：(iii)人ABCD1编码序列，所述ABCD1编码序列任选地可以被修饰例如以去除起始或终止密码子、以由人优选密码子构成和/或可以通过在5’端添加科扎克序列(例如“CCACC”)进行修饰，和/或可以包含选自以下的人ABCD1编码序列：SEQ ID NO:204，SEQ ID NO:304、SEQ ID NO:404、SEQ ID NO:501至510、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:10012、10112、10212、10512、11012、11112、11212、11312、11512和11712的序列，(iv)任选地经修饰的WPRE序列，如果存在的话所述WPRE被修饰以消除X蛋白表达或被突变，使得其编码X蛋白的失活形式，以及(v)经修饰的WPRE序列(如果存在的话)和ABCD1编码序列的下游的至少一个polyA序列，例如SV40polyA序列和/或BGH polyA序列，或其他合适的polyA序列，包括合成polyA。
在一些具体实施方案中，改进的AAV-ABCD1构建体可以包含pOB1005(SEQ ID NO:100或10500)或pOB1005的核苷酸1至3713(包括端值)、AAV-CBA-hABCD1-WPREX失活(SEQ IDNO:300或10000)或AAV-CBA-hABCD1(SEQ ID NO:400或10200)、pSBT101(SEQ ID NO:10100)、pOB1010(SEQ ID NO:11000)、pOB1011(SEQ ID NO:11100)、pOB1012(SEQ ID NO:11200)、pOB1013(SEQ ID NO:11300)、pOB1015(SEQ ID NO:11500)或pOB1017(SEQ ID NO:11700)，或者可包含任何前述的变体，其经修饰例如以包含选自以下的人ABCD1编码序列：SEQ ID NO:204、SEQ ID NO:304、SEQ ID NO:404、SEQ ID NO:501至510、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:10012、10112、10212、10512、11012、11112、11212、11312、11512和11712的序列；或者用于调节ABCD1表达的启动子被可在中枢神经系统细胞(例如神经元或胶质细胞)中操作的另一种启动子(例如选自上述那些的启动子)替换；或者消除WPRE；或者可以插入不同的这样的突变WPRE，其突变成消除了X蛋白表达，或者被修饰以表达失活形式(例如，截短或以其他方式修饰的失活X蛋白)(例如SEQ ID NO:305或10075中的经修饰WPRE)，或者通过插入科扎克序列(例如“CCACC”)或代表ABCD1编码序列之前的最佳蛋白质翻译起始的共有序列的近似物：‘GCCRCCATGG)’的任何序列而进行修饰，或者通过用另一个polyA序列替代包含在任何前述构建体中的polyA信号序列或通过用来源于其他AAV等的ITR序列替代AAV2ITR序列，以及任何前述的组合而进行修饰。
在一个实施方案中，构建体中编码人ABCD1的核酸序列还可以包含编码与其共价连接的标签多肽的核酸。标签多肽可以选自已知的“表位标签”，包括但不限于myc标签多肽、谷胱甘肽-S-转移酶标签多肽、绿色荧光蛋白标签多肽、His6标签多肽、流感病毒血凝素标签多肽、标记标签多肽和麦芽糖结合蛋白标签多肽。
在另一个方面中，提供了包含编码人ABCD1的核酸序列的表达盒。在一个实施方案中，序列是如前所述的密码子或以其他方式优化的序列。
在另一个实施方案中，提供了用于AAV载体的表达盒。在该实施方案中，AAV表达盒包含至少一个AAV末端反向重复(ITR)序列。在另一个实施方案中，表达盒包含5’ITR序列和3’ITR序列。在一个实施方案中，5’和3’ITR侧接编码人ABCD1和任选地经修饰的WPRE的核酸序列，任选地具有指导编码人ABCD1的序列在宿主细胞中的表达的另外的序列。因此，如本文所述，AAV表达盒意在描述如上所述的表达盒，在其5’端侧接5’AAV末端反向重复序列(ITR)并且在其3’端侧接3’AAV ITR。因此，该rAAV基因组包含将表达盒包装到AAV病毒颗粒所需的最小序列，即AAV 5’ITR和3’ITR。AAV ITR可以从例如本文所述的任何AAV的ITR序列中获得。这些ITR可与所得重组AAV中使用的衣壳属于相同的AAV来源，或属于不同的AAV来源(以产生AAV假型)。在一个实施方案中，来自AAV2、AAV9或AAVrh.10的ITR序列或其缺失、缩短或截短形式用于方便和加速调节准许。然而，可以选择来自其他AAV来源的ITR。在ITR的来源来自AAV2并且AAV衣壳来自另一AAV来源的情况下，所得载体可以称为假型。通常，AAV载体基因组包含AAV 5’ITR、人ABCD1编码序列和合适的调节序列，以及AAV 3’ITR。然而，这些元件的其他配置可以是合适的。然后可以将每个rAAV基因组引入到生产质粒中。示例性缩短的5’ITR序列包括但不限于SEQ ID NO:10501、11001、11101、11201、11301、11501和11701的核酸序列。示例性缩短的3’ITR序列包括但不限于SEQ ID NO:10518、11018、11118、11218、11318、11518和11718的核酸序列。
在一个方面中，提供了包含任意本文所述表达盒的载体。如本文所述，这样的载体可以是多种来源的质粒，并且在某些实施方案中可用于产生如本文进一步描述的重组复制缺陷型病毒。
在另一个实施方案中，载体是在其中包含所述表达盒的病毒载体。在一个实施方案中，如本文所述的表达盒可被改造到用于药物递送或用于产生病毒载体的质粒上。合适的病毒载体优选地是复制缺陷型的并且选自靶向脑细胞的那些。病毒载体可以包括适合于基因治疗的任何病毒，包括但不限于腺病毒；疱疹病毒；慢病毒；逆转录病毒；细小病毒等。然而，本文中腺相关病毒是表达的病毒载体(embodied virus vector)。病毒载体或非病毒载体可以与用于基因转移和基因治疗应用的生理上可接受的载体一起配制。
在另一个实施方案中，提供了重组腺相关病毒(rAAV)载体。rAAV包含AAV衣壳和包装在其中的载体基因组。
在一个实施方案中，载体基因组包含：(a)AAV 5’末端反向重复(ITR)序列；(b)启动子；(c)编码人ABCD1的编码序列；和(d)AAV 3’ITR。
腺相关病毒(AAV)作为细小病毒科的成员，是小的无包膜二十面体病毒，具有4.7千碱基(kb)至5kb的单链线性DNA基因组。已知的AAV血清型是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.10等。ITR或其他AAV组件可以使用本领域技术人员可用的技术从AAV容易地分离或改造。这样的AAV可以从学术、商业或公共来源(例如，美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)，Manassas,VA)分离、改造或获得。或者，AAV序列可以通过合成或其他合适的手段通过参考公开序列(例如文献中或数据库(例如GenBank、PubMed等)中可用的)来改造。AAV病毒可以通过常规分子生物学技术来改造，从而可以使这些颗粒优化以用于核酸序列的细胞特异性递送、使免疫原性最小化、调节稳定性和颗粒寿命、有效降解、准确递送至细胞核等。
AAV的片段可以容易地用于多种载体系统和宿主细胞。期望的AAV片段是cap蛋白(包括vp1、vp2、vp3和高变区)、rep蛋白(包括rep 78、rep 68、rep 52和rep 40)，以及编码这些蛋白质的序列。这样的片段可单独使用，与其他AAV血清型序列或片段组合使用，或者与来自其他AAV或非AAV病毒序列的元件组合使用。本文中使用的人工AAV血清型包括但不限于具有非天然存在的衣壳蛋白的AAV。这样的人工衣壳可以通过任何合适的技术使用与异源序列组合的本发明的新的AAV序列(例如，vp1衣壳蛋白的片段)来产生，所述异源序列可以从另一种AAV血清型(已知或新的)、相同AAV血清型的非连续部分、非AAV病毒来源或非病毒来源获得。人工AAV血清型可以是但不限于嵌合AAV衣壳、重组AAV衣壳或“人源化”AAV衣壳。在一个实施方案中，载体包含AAV9 cap和/或rep序列。参见美国专利号7,906,111，其通过引用并入本文。
在一个实施方案中，AAV载体可以包含AAV9衣壳。本文中使用的“AAV9衣壳”的特征在于DNA酶抗性颗粒，其是约60种病毒蛋白(viral protein，vp)的装配体，所述病毒蛋白通常表达为选择性剪接变体，产生不同长度的蛋白质。另参见Genbank登录号AAS99264.1，其通过引用并入本文。另参见US7906111和WO 2005/033321。本文中使用的“AAV9变体”包括例如WO2016/049230、US 8,927,514、US 2015/0344911和US 8,734,809中描述的那些，或与其共有至少约90％、95％、95％、98％或99％同一性的序列。
示例性AAV9衣壳可包含SEQ ID NO:731(AAV9 VP1)、SEQ ID NO:732(AAV9 VP2)或SEQ ID NO:733(AAV9 VP3)的氨基酸序列或者与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些情况下，AAV载体可以包含AAV9 VP1衣壳、AAV9 VP2衣壳和AAV9 VP3衣壳中的一种或更多种。
在一个实施方案中，AAV载体可以包含AAV2衣壳。
示例性AAV2衣壳可以包含：SEQ ID NO:831(AAV2 VP1)、SEQ ID NO:832(AAV2VP2)或SEQ ID NO:833(AAV2 VP3)的氨基酸序列或者与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些情况下，AAV载体可以包含AAV2 VP1衣壳、AAV2 VP2衣壳和AAV2 VP3衣壳中的一种或更多种。
在一个实施方案中，AAV载体可以包含AAVrh.10衣壳。
示例性AAVrh.10衣壳可包含SEQ ID NO:931(AAVrh.10VP1)、SEQ ID NO:932(AAVrh.10 VP2)或SEQ ID NO:933(AAVrh.10VP3)的氨基酸序列或者与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些情况下，AAV载体可以包含AAVrh.10VP1衣壳、AAVrh.10 VP2衣壳和AAVrh.10 VP3衣壳中的一种或更多种。
本文中使用的与AAV的组相关的术语“进化枝”是指这样的AAV组，其在系统发育上彼此相关，如基于AAV vp1氨基酸序列的比对使用邻接算法(Neighbor-Joiningalgorithm)通过至少75％(至少1000次重复)的引导值(bootstrap value)和不超过0.05的泊松校正距离测量值(Poisson correction distance measurement)所确定的。邻接算法已在文献中进行了描述。参见，例如M.Nei and S.Kumar,Molecular Evolution andPhylogenetics,Oxford University Press,New York(2000)。可以使用计算机程序来实施该算法。例如，MEGA v2.1程序实施改进的Nei-Gojobori方法。使用这些技术和计算机程序以及AAV vp1衣壳蛋白的序列，本领域技术人员可以容易地确定所选AAV是否包含在本文确定的进化枝之一中、在另一个进化枝中或在这些进化枝之外。参见，例如G Gao,et al,JVirol,2004Jun；78(10):6381-6388，其确定了进化枝A、B、C、D、E和F，并提供了新AAV的核酸序列，GenBank登录号AY530553至AY530629。另参见WO 2005/033321。AAV9的特征还在于位于进化枝F内。另一些进化枝F AAV包括AAVhu31和AAVhu32。
本文中使用的关于AAV的术语变体意指来源于已知AAV序列的任何AAV序列，包括与氨基酸或核酸序列共有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或更高序列同一性的那些。在另一个实施方案中，AAV衣壳包含变体，其可以包括来自任何描述的或已知的AAV衣壳序列的至多约10％的变化。也就是说，AAV衣壳与本文提供的和/或本领域已知的AAV衣壳共有约90％同一性至约99.9％同一性、约95％至约99％同一性或约97％至约98％同一性。在一个实施方案中，AAV衣壳与AAV9衣壳共有至少95％同一性。在确定AAV衣壳的百分比同一性时，可以对任何可变蛋白(例如vp1、vp2或vp3)进行比较。在一个实施方案中，AAV衣壳与AAV9在vp1、vp2或vp3上共有至少95％同一性。
本文中使用的“人工AAV”意指但不限于具有非天然存在的衣壳蛋白的AAV。这样的人工衣壳可以通过任何合适的技术使用与异源序列组合的选择的AAV序列(例如，vp1衣壳蛋白的片段)来产生，所述异源序列可以从不同的选择的AAV、相同AAV的非连续部分、从非AAV病毒来源、或从非病毒来源获得。人工AAV可以是但不限于假型AAV、嵌合AAV衣壳、重组AAV衣壳或“人源化”AAV衣壳。其中一种AAV的衣壳被异源衣壳蛋白替代的假型载体可用于本发明。在一个实施方案中，AAV2/9和AAV2/rh.10是示例性的假型载体。
在另一个实施方案中，使用自互补AAV。“自互补AAV”是指具有表达盒的质粒或载体，在所述表达盒中重组AAV核酸序列携带的编码区被设计为形成分子内双链DNA模板。在感染之后，无需等待细胞介导的第二条链的合成，scAAV的两个互补部分将缔和以形成为立即复制和转录准备的一个双链DNA(dsDNA)单元。参见，例如D M McCarty et al,"Self-complementary recombinant adeno-associated virus(scAAV)vectors promoteefficient transduction independently of DNA synthesis",Gene Therapy,(August2001),Vol 8,Number 16,Pages 1248-1254。自互补AAV描述于例如美国专利号6,596,535；7,125,717；和7,456,683，其各自均通过引用整体并入本文。
在又一个实施方案中，表达盒(包括本文所述那些中的任一种)用于产生重组AAV基因组。
在一个实施方案中，将本文所述的表达盒改造到合适的遗传元件(载体)中，所述遗传元件(载体)可用于产生病毒载体和/或用于递送至宿主细胞，例如裸DNA、噬菌体、转座子、黏粒、附加体等，其上转移了携带的人ABCD1序列。选择的载体可以通过任何合适的方法递送，包括转染、电穿孔、脂质体递送、膜融合技术、高速DNA包被的丸粒、病毒感染和原生质体融合。用于制造这样的构建体的方法是核酸操作技术人员已知的，并且包括遗传改造、重组改造和合成技术。参见，例如Sambrook et al,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY。
为了将表达盒或rAAV基因组或生产质粒包装到病毒体中，ITR是与表达盒相同的构建体中顺式所需的唯一AAV组件。在一个实施方案中，用于复制(rep)和/或衣壳(cap)的编码序列从AAV基因组中去除并以反式或由包装细胞系提供以产生AAV载体。
用于产生和分离适合于递送至对象的AAV病毒载体的方法是本领域已知的。参见，例如美国专利7790449；美国专利7282199；WO 2003/042397；WO 2005/033321、WO 2006/110689；和美国7588772 B2。在一个系统中，生产细胞系用编码侧接ITR的转基因的构建体，以及编码rep和cap的质粒瞬时转染。在第二系统中，稳定提供rep和cap的包装细胞系用编码侧接ITR的转基因的构建体瞬时转染。在这些系统中的每一个中，都会响应于辅助腺病毒或疱疹病毒的感染而产生AAV病毒体，这需要将rAAV与污染病毒分离。
在用于产生根据本公开内容的AAV病毒载体的一种示例性方法中，可以包括以下步骤：(i)用以下转染细胞，例如HEK293细胞：(1)目的rAAV基因组载体质粒(例如pSBT101、pOB1005、pOB1010、pOB1011、pOB1012、pOB1013、pOB1015或pOB1017，或者编码AAV.ABCD1.WPRE-X失活的AAV基因组的质粒)，(2)编码AAV Rep和Cap蛋白的质粒(“Rep/Cap质粒”)(例如pAAV2/9)和(3)编码一种或更多种病毒辅助基因的质粒(“病毒辅助质粒”)(例如pALD-X80或pHELP_KanV4)；(ii)对上清液或细胞裂解物进行纯化例如柱纯化或CsCl梯度离心；以及(iii)将离心产物脱盐和浓缩。
作为替代地，已经开发了不需要用辅助病毒感染来回收AAV的系统——所需的辅助功能(即，腺病毒E1、E2a、VA和E4或疱疹病毒UL5、UL8、UL52和UL29，以及疱疹病毒聚合酶)也由系统以反式形式提供。在这些较新的系统中，可以通过用编码所需辅助功能的构建体瞬时转染细胞来提供辅助功能，或者可以对细胞进行改造以稳定地包含编码辅助功能的基因，其表达可以在转录水平或转录后水平上进行控制。
在又一个系统中，通过用基于杆状病毒的载体进行感染将侧接ITR和rep/cap基因的表达盒引入到昆虫细胞中。对于这些产生系统的综述，一般参见例如Zhang et al,2009,"Adenovirus-adeno-associated virus hybrid for large-scale recombinantadeno-associated virus production,"Human Gene Therapy 20:922-929，其内容通过引用整体并入本文。制造和使用这些和其他AAV产生系统的方法也在以下美国专利中进行了描述，其各自的内容通过引用整体并入本文：5,139,941；5,741,683；6,057,152；6,204,059；6,268,213；6,491,907；6,660,514；6,951,753；7,094,604；7,172,893；7,201,898；7,229,823；和7,439,065。一般参见例如，Grieger&Samulski,2005,"Adeno-associatedvirus as a gene therapy vector:Vector development,production and clinicalapplications,"Adv.Biochem.Engin/Biotechnol.99:119-145；Buning et al,2008,"Recent developments in adeno-associated virus vector technology,"J.GeneMed.10:717-733；以及下面引用的参考文献，其各自均通过引用整体并入本文。
用于构建本发明任何实施方案的方法是核酸操作技术人员已知的并且包括遗传改造、重组改造和合成技术。参见例如，Green and Sambrook et al,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY(2012)。类似地，产生rAAV病毒体的方法是公知的并且合适方法的选择不是对本发明的限制。参见例如，K.Fisher et al,(1993)J.Virol.,70:520-532和美国专利号5,478,745。
根据本领域技术人员熟悉的标准命名约定，“质粒”在本文中通常由前面小写p和/或后面跟着大写字母和/或数字来命名。许多质粒和可以根据本发明使用的其他克隆和表达载体是本领域技术人员公知的并且容易获得的。此外，本领域技术人员可以容易地构建任何数量的适用于本发明的其他质粒。本发明中这样的质粒以及其他载体的特性、构建和使用对于本公开内容所属领域技术人员来说将是显而易见的。
在一个实施方案中，生产质粒是本文所述的，或如WO2012/158757中所述的，其通过引用并入本文。多种质粒在本领域中已知用于产生rAAV载体并且可用于本文。将生产质粒在表达AAV cap和/或rep蛋白的宿主细胞中培养。在宿主细胞中，每个rAAV基因组都免于损失(rescue)并包装到衣壳蛋白或包膜蛋白中，以形成感染性病毒颗粒。
在一个方面中，提供了包含上述表达盒的生产质粒。在一个实施方案中，生产质粒是图5、6、7、10至12中所示的一种。这些质粒在实施例中举例说明。这样的质粒包含5’AAVITR序列；选定的启动子；polyA信号；和3’ITR；另外，其还包含内含子序列，例如鸡β-肌动蛋白内含子。其示例性示意图和相关的SEQ ID NO示出在图5、6、7和10至12中。在一些实施方案中，选择的内含子序列保持rAAV载体基因组的尺寸为约3千碱基(kb)至约6kb、约4.7kb至约5kb、约3kb至约5.5kb或约4.7kb至5.5kb。包含人ABCD1编码序列的生产质粒的实例可见于SEQ ID NO:100，或者SEQ ID NO:10000、10100、10200、10500、11000、11100、11200、11300、11500和11700中的任一个中。在另一个实施方案中，生产质粒经修饰以优化载体质粒生产效率。这样的修饰包括添加其他中性序列，或者包含λ填充序列(lambda stuffersequence)以调节载体质粒的超螺旋水平。本文中考虑了这样的修饰。在另一些实施方案中，终止子和其他序列包含在质粒中。
在某些实施方案中，rAAV表达盒、载体(例如rAAV载体)、病毒(例如rAAV)和/或生产质粒包含AAV末端反向重复序列、编码人ABCD1的经密码子优化的核酸序列和指导编码的蛋白质在宿主细胞中的表达的表达控制序列。在另一些实施方案中，rAAV表达盒、病毒、载体(例如rAAV载体)和/或生产质粒还包含内含子、科扎克序列、polyA、转录后调节元件等中的一种或更多种。在一个实施方案中，转录后调节元件是经修饰的土拨鼠肝炎病毒(Woodchuck Hepatitis Virus，WHP)转录后调节元件(WPRE)，其中X蛋白不表达或以失活形式表达。
表达盒、载体和质粒包括可以使用本领域已知的技术(包括例如密码子优化)针对特定物种而优化的其他组件，如本文所述。本文所述的盒、载体、质粒和病毒或其他组合物的组件包括启动子序列作为表达控制序列的一部分。在另一个实施方案中，启动子是细胞特异性的。术语“细胞特异性”意指为重组载体选择的特定启动子可以指导人ABCD1编码序列在特定细胞或组织类型(例如神经元或胶质细胞)中的表达。在一个实施方案中，启动子对转基因在室管膜、脑室系统的上皮衬里中的表达是特异性的。在另一个实施方案中，启动子对于在选自神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞、背根神经节和小胶质细胞的脑细胞中表达是特异性的。在一个实施方案中，启动子经修饰以添加一个或更多个限制性位点以促进克隆。
在另一个实施方案中，启动子是遍在型启动子或组成型启动子。合适的启动子的一个实例是杂合启动子，在一些情况下，其包含鸡β肌动蛋白启动子以及巨细胞病毒(CMV)增强子元件，例如CMV增强子序列。这样的杂合启动子例如包含在图5、6、7和10至12中公开的构建体中。在另一个实施方案中，启动子是CB7启动子。其他合适的启动子包括人b-肌动蛋白启动子、人延伸因子-1a启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、猿病毒40启动子和单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子。参见例如，Damdindorj et al,(August 2014)“A ComparativeAnalysis of Constitutive Promoters Located in Adeno-Associated ViralVectors”,PLOS ONE 9(8):e106472。另一些合适的启动子包括病毒启动子、组成型启动子、可调节启动子[参见例如，WO 2011/126808 WO 2013/04943]。或者，可以在本文描述的表达盒、rAAV基因组、载体、质粒和病毒中利用响应于生理信号的启动子。在一个实施方案中，由于AAV载体的尺寸限制，启动子具有小的尺寸，低于1000bp。在另一个实施方案中，启动子低于400bp。本领域技术人员可以选择其他启动子。
在另一个实施方案中，启动子选自SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、λ噬菌体(PL)启动子、单纯疱疹病毒(herpes simplex viral，HSV)启动子、四环素控制的反式激活因子响应性启动子(tet)系统、长末端重复(long terminal repeat，LTR)启动子(例如RSVLTR、MoMLV LTR、BIV LTR或HIV LTR)、莫洛尼鼠肉瘤病毒的U3区启动子、颗粒酶A启动子、金属硫蛋白基因的调节序列、CD34启动子、CD8启动子、胸苷激酶(thymidine kinase，TK)启动子、B 19细小病毒启动子、PGK启动子、糖皮质激素启动子、热休克蛋白(HSP)启动子(例如HSP65和HSP70启动子)、免疫球蛋白启动子、MMTV启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、lac启动子、CaMV 35S启动子、胭脂碱合成酶启动子、MND启动子或MNC启动子。其启动子序列是本领域技术人员已知的或可公开获得的，例如在文献中或数据库中，例如GenBank、PubMed等。
在另一个实施方案中，启动子是诱导型启动子。诱导型启动子可以选自已知的启动子，包括雷帕霉素(rapamycin)/雷帕霉素类似物(rapalog)启动子、蜕皮素启动子、雌激素响应性启动子和四环素响应性启动子，或异二聚体阻遏开关。参见Sochor et al,“AnAutogenously Regulated Expression System for Gene Therapeutic OcularApplications”,Scientific Reports,2015Nov 24；5:17105和Daber R,Lewis M.,“Anovel molecular switch”,J Mol Biol.2009Aug 28；39l(4):661-70,Epub 2009Jun 21，其均通过引用整体并入本文。
在另一些实施方案中，本文所述的表达盒、载体、质粒和病毒包含其他合适的转录起始、终止、增强子序列、有效的RNA加工信号，例如剪接和多腺苷酸化(poly A)信号；TATA序列；稳定细胞质mRNA的序列；提高翻译效率的序列(即科扎克共有序列)；内含子；增强蛋白质稳定性的序列；以及当期望时，增强编码的产物分泌的序列。表达盒或载体可以不包含、包含一个或更多个任意本文所述的元件。
在一些实施方案中，如本文公开的rAAV病毒基因组和编码rAAV病毒基因组的质粒可包含一个终止子，其促进编码的ABCD1基因或ABCD1基因变体的翻译终止。在一些情况下，这样的终止子在本文中可以称为“终止子1”。在一些实施方案中，如本文公开的rAAV病毒基因组和编码rAAV病毒基因组的质粒可以包含另一个终止子，其也促进编码的ABCD1基因或ABCD1基因变体的翻译终止。在一些情况下，这样的终止子在本文中可以被称为“终止子2”并且可以与“终止子1”相同或不同。在一些实施方案中，如本文公开的rAAV病毒基因组和编码rAAV病毒基因组的质粒可包含多于两个终止子。在一些实施方案中，终止子1可以由SEQID NO:10071、10171、10271、10571、11071、11171、11271、11371、11571或11771的核酸序列编码。在一些实施方案中，终止子2可以由SEQ ID NO:10572、11272或11372的核酸序列编码。
合适的polyA(本文也称为“pA”)信号的一些实例包括例如合成polyA或来自牛生长激素(bGH)、人生长激素(hGH)、SV40、兔b-球蛋白(RGB)、或经修饰的RGB(mRGB)。示例性的bGH pA序列可以包含由例如登录号M57764提供的序列。示例性hGH pA序列可以包含由例如登录号NG_011676提供的序列。示例性SV40 pA序列可以包含由例如登录号NC_001669提供的序列。示例性RBG pA序列可以包含由例如登录号V00882提供的序列。在一个示例性实施方案中，poly A是SV40或BGH polyA序列，其包含如本文所述的AAV构建体中所示的核酸序列，例如图5、6、7和10至12中公开的那些。在一些实施方案中，SV40 poly A信号可包含SEQID NO:27、10014、10114、10214、10514、11014、11214或11714的核酸序列。在一些实施方案中，bGH poly A信号可包含SEQ ID NO:10016、10116、10216、11016、11116、11216、11316、11516或11714的核酸序列。在一些实施方案中，SV40 poly A和bGH poly A信号二者可以串联使用。在这样的情况下，poly A信号可包含SEQ ID NO:306、405、10035、10135、10235、11035、11235或11735的核酸序列。
合适的增强子的一些实例包括例如CMV增强子、RSV增强子、甲胎蛋白增强子、TTR最小启动子/增强子、LSP(TH-结合球蛋白启动子/αl-微球蛋白/双库尼茨抑制剂(bikunin)增强子)、APB增强子、ABPS增强子、αmic/bik增强子、TTR增强子、en34、ApoE等。在一些实施方案中，CMV增强子可以包含由登录号NC_006273提供的参考CMV序列。在一些实施方案中，CMV增强子可包含SEQ ID NO:7、10005、10105、10205、10505、11005、11105、11205、11305、11505或11705的核酸序列。
在一个实施方案中，科扎克序列例如“CCACC”或代表最佳蛋白质翻译起始的共有序列的近似物：GCCRCCATGG的序列包含在人ABCD1编码序列的上游以增强从正确起始密码子的翻译。在另一个实施方案中，CBA外显子1和内含子包含在表达盒中。在一个实施方案中，人ABCD1编码序列置于杂合启动子的控制之下。在一些情况下，杂合启动子包含巨细胞病毒(CMV)即早期增强子、近端鸡β肌动蛋白启动子和侧接内含子1序列的CBA外显子1。
在另一个实施方案中，内含子选自CBA、人β球蛋白、IVS2、SV40、bGH、α-球蛋白、β-球蛋白、胶原蛋白、卵白蛋白、p53、兔β球蛋白、或其片段。示例性CBA内含子可以包含由例如登录号X00182提供的序列。示例性兔β球蛋白内含子可包含由例如登录号V00882提供的序列。示例性内含子可包含SEQ ID NO:12、10009、10109、10209、10509、11009、11109、11209、11309、11509或11709的核酸序列。
在一个实施方案中，表达盒、载体、质粒和病毒包含鸡β-肌动蛋白启动子、CMV增强子、鸡β-肌动蛋白外显子1和内含子、人ABCD1序列和SV40和/或BGH poly A。在另一个实施方案中，表达盒包含SEQ ID NO:100的nt 1至3713。
在另一个实施方案中，生产质粒具有SEQ ID NO:100，或者SEQ ID NO:10000、10100、10200、10500、11000、11100、11200、11300、11500或11700中任一个的序列，或其功能等同的任何变体。
在一些优选的实施方案中，生产质粒具有SEQ ID NO:10000、10100、10200、10500、11000、11100、11200、11300、11500或11700的序列。
在另一些优选的实施方案中，生产质粒具有SEQ ID NO:10100、11000、11500或11700的序列。
在另一个方面中，治疗由ABCD1基因缺陷引起的ALD或AMN疾病的方法包括将编码人ABCD1的载体(例如rAAV)递送至有此需要的对象，如本文所述。在一个实施方案中，提供了用本文所述的rAAV治疗患有ALD或AMN疾病的对象的方法。
本文还提供了药物组合物。本文所述的药物组合物设计成用于通过任何合适的途径或不同途径的组合递送至有此需要的对象。
在另一些方面中，这些核酸序列、载体、表达盒和rAAV病毒载体可用于药物组合物，所述药物组合物还包含可药用载体、赋形剂、缓冲剂、稀释剂、表面活性剂、防腐剂和/或辅料等。这样的药物组合物用于稳定rAAV病毒、防止rAAV病毒在递送期间损失、和/或通过这样的重组改造AAV或人工AAV的递送来帮助在宿主细胞中成功表达人ABCD1蛋白。
为了制备这些包含核酸序列、载体、表达盒和rAAV病毒载体的药物组合物，优选地通过常规方法来评估序列或载体或病毒载体的污染，并随后将该序列或载体或病毒载体配制成适合施用于患者的药物组合物。这样的制剂涉及使用药学和/或生理学上可接受的载剂或载体，例如缓冲盐水或其他缓冲剂(例如HEPES)以将pH维持在合适的生理水平，以及任选地其他医用试剂、药用试剂、稳定剂、缓冲剂、载体、辅料、稀释剂、表面活性剂或赋形剂等。对于注射，载体通常是液体。示例性的生理上可接受的载体包括无菌、无热原水和无菌、无热原的磷酸缓冲盐水。多种这样的已知载体提供于美国专利号7,629,322中，其通过引用并入本文。在一个实施方案中，载体是等张氯化钠溶液。在另一个实施方案中，载体是平衡盐溶液。在一个实施方案中，载体包括吐温。如果要长期储存病毒，则可以在甘油或吐温20存在的情况下将其冷冻。
在一个示例性具体实施方案中，载体或赋形剂的组合物可以包含180mM NaCl、10mM NaPi、pH 7.3和0.0001％至0.01％普朗尼克F68(Pluronic F68，PF68)。缓冲液中盐水组分的确切组成范围为160mM至180mM NaCl。任选地，可以使用不同pH的缓冲液(可以是HEPES、碳酸氢钠、TRIS)来代替具体描述的缓冲液。或者，还可以使用包含0.9％NaCl的缓冲液。
本文中使用的术语“剂量”可以指在治疗过程中递送至对象的总剂量，或在单个单位(或多个单位或分开剂量)施用中递送的量。可以将药物病毒组合物配制成包含一定量的复制缺陷型病毒的剂量单位，所述复制缺陷型病毒携带编码如本文所述的人ABCD1的经密码子优化的核酸序列，所述量的范围为约1.0×109GC至约1.0×1016GC/剂量，包括该范围内的所有整数或小数的量。在一个实施方案中，组合物被配制成包含至少1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109或9×109GC/剂量，包括该范围内的所有整数或小数的量。在另一个实施方案中，组合物被配制成包含至少1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010或9×1010GC/剂量，包括该范围内的所有整数或小数的量。在另一个实施方案中，组合物被配制成包含至少1×1011、2×10v、3×1011、4×1011、5×1011、6×1011、7×1011、8×1011或9×1011GC/剂量，包括该范围内的所有整数或小数的量。在另一个实施方案中，组合物被配制成包含至少1×1012、2×1012、3×1012、4×1012、5×1012、6×1012、7×1012、8×1012或9×1012GC/剂量，包括该范围内的所有整数或小数的量。在另一个实施方案中，组合物被配制成包含至少1×1013、2×1013、3×1013、4×1013、5×1013、6×1013、7×1013、8×1013或9×1013GC/剂量，包括该范围内的所有整数或小数的量。在另一个实施方案中，组合物被配制成包含至少1×1014、2×1014、3×1014、4×1014、5×1014、6×1014、7×1014、8×1014或9×1014GC/剂量，包括该范围内的所有整数或小数的量。在另一个实施方案中，组合物被配制成包含至少1×1015、2×1015、3×1015、4×1015、5×1015、6×1015、7×1015、8×1015或9×1015GC/剂量，包括该范围内的所有整数或小数的量。在一个实施方案中，对于人应用，剂量可以为1×1010至约1×1012GC/剂量，包括该范围内的所有整数或小数的量。所有剂量都可以通过任何已知方法测量，包括如通过qPCR或数字微滴PCR(ddPCR)来测量，如例如M.Lock et al,Hum Gene Ther Methods.2014Apr；25(2):l 15-25.doi:10.1089/hgtb.20l3.131中所述，其通过引用并入本文。
在一个实施方案中，提供了适合于施用于ALD或AMN患者的水性悬浮液。悬浮液包含水性助悬液和约7.5×109GC或病毒颗粒至约1×1012GC或病毒颗粒/克脑的本文所述可用作ALD或AMN疾病治疗剂的重组腺相关病毒(rAAV)。
还可以期望施用本发明药物组合物的多个“加强”剂量。例如，根据转基因在CNS中的持续时间，可以在第一次施用之后以6个月间隔或每年递送加强剂量。施用rAAV载体不会产生AAV中和抗体这一事实可允许另外的加强施用。
这样的加强剂量及其需要可以由主治医师使用例如人ABCD1活性和/或神经病学测试来监测。其他类似的测试可用于确定治疗对象随时间的状态。主治医师可以选择合适的测试。或者，本发明的方法还涉及在单次或多次感染中注射更大体积的含病毒溶液，以使ABCD1活性水平接近于正常对象中存在的水平。
这些上述剂量可以以多种体积的载体、赋形剂或缓冲液制剂施用，范围为约100微升到约150mL，包括该范围内的所有数字，这取决于患者的体型、使用的病毒滴度、施用途径和方法的预期效果。在一个实施方案中，载体、赋形剂或缓冲液的体积为至少约500μL。在一个实施方案中，体积为约750μL。在另一个实施方案中，体积为约1mL。在另一个实施方案中，体积为约2mL。在另一个实施方案中，体积为约3mL。在另一个实施方案中，体积为约4mL。在另一个实施方案中，体积为约5mL。在另一个实施方案中，体积为约6mL。在另一个实施方案中，体积为约7mL。在另一个实施方案中，体积为约8mL。在另一个实施方案中，体积为约9mL。在另一个实施方案中，体积为约10mL。在另一个实施方案中，体积为约11mL。在另一个实施方案中，体积为约12mL。在另一个实施方案中，体积为约13mL。在另一个实施方案中，体积为约14mL。在另一个实施方案中，体积为约15mL。在另一个实施方案中，体积为约16mL。在另一个实施方案中，体积为约17mL。在另一个实施方案中，体积为约18mL。在另一个实施方案中，体积为约19mL。在另一个实施方案中，体积为约20mL。在另一个实施方案中，体积为约21mL。在另一个实施方案中，体积为约22mL。在另一个实施方案中，体积为约23mL。在另一个实施方案中，体积为约24mL。在另一个实施方案中，体积为约25mL或更多。在一个实施方案中，最大注射体积为总脑脊液体积的约10％。在另一个实施方案中，体积为约50mL至约150mL。在另一个实施方案中，体积为约50mL。在另一个实施方案中，体积为约60mL。在另一个实施方案中，体积为约70mL。在另一个实施方案中，体积为约80mL。在另一个实施方案中，体积为约90mL。在另一个实施方案中，体积为约100mL。在另一个实施方案中，体积为约110mL。在另一个实施方案中，体积为约120mL。在另一个实施方案中，体积为约130mL。在另一个实施方案中，体积为约140mL。在另一个实施方案中，体积为约150mL。在一个优选实施方案中，体积为约100mL。
在一个实施方案中，对于小动物对象(例如小鼠)，病毒构建体可以以约100微升至约1mL的体积以至少1×109至约至少1×1013GC的剂量递送。对于较大的兽医学对象，上述较大的人剂量和体积是可用的。参见例如Diehl et al,J.Applied Toxicology,21:15-23(2001)，讨论了对多种兽医学动物施用物质的良好实践。该文件通过引用并入本文。
期望的是使用最低有效浓度的病毒或其他递送载剂，以降低不期望作用(例如毒性)的风险。这些范围内的其他剂量仍可由主治医师选择，鉴于所治疗对象(优选人)的身体状态、对象的年龄和病症发展的程度。
本文描述的又一方面是在哺乳动物对象中治疗或预防肾上腺脑白质营养不良(ALD)和/或肾上腺脊髓神经病(AMN)和/或改善与其相关的症状的方法。在一个实施方案中，携带ABCD1天然、经修饰或密码子优化序列的rAAV，优选悬浮于生理相容的载体、稀释剂、赋形剂和/或辅料中，可以以治疗有效量施用于所期望对象(包括人对象)。该方法包括向有此需要的对象施用任何核酸序列、表达盒、rAAV基因组、质粒、载体或rAAV载体或包含它们的组合物。
在一个实施方案中，所述组合物鞘内递送。在另一个实施方案中，所述组合物通过ICV递送。在另一个实施方案中，所述组合物通过脑池内施用递送。在又一个实施方案中，所述组合物使用适合于治疗ALD或AMN疾病的施用途径组合来递送，并且还可以涉及静脉内施用或其他常规施用途径。
对于在这些方法中的使用，每个剂量的体积和病毒滴度单独确定，如本文进一步描述的。剂量、施用和方案可由主治医师根据本说明书的教导来确定。在另一个实施方案中，所述方法涉及以两个或更多个剂量(例如，分开剂量)施用组合物。在另一个实施方案中，包含所选择表达盒(例如，包含ABCD1的盒)的rAAV的第二次施用在稍后的时间点进行。这样的时间点可以在第一次施用之后的数周、数月或数年。在一个实施方案中，这样的第二次施用是用具有与第一次施用的rAAV不同的衣壳的rAAV进行的。在另一个实施方案中，来自第一次和第二次施用的rAAV具有相同的衣壳。
在又一些实施方案中，本文所述的组合物可以以单一组合物或多种组合物递送。任选地，可以递送两种或更多种不同的AAV，或多种病毒(参见例如WO 2011/126808和WO2013/049493)。在另一个实施方案中，多种病毒可包含不同的复制缺陷型病毒(例如，AAV和腺病毒)。
根据本发明，如本文所述递送“治疗有效量”的人ABCD1载体以实现所期望结果，即治疗ALD或AMN疾病或其一种或更多种症状。在一个实施方案中，治疗的目标是限制疾病的进展。这可以通过症状的定量和定性评价来评估，如前所述。
在另一个实施方案中，所述方法包括进行另外的测试，例如测定和神经学测试以确定治疗的效力。这样的测试包括作为UBDRS的一部分进行的测试，包括但不限于评估：言语清晰度、舌头突出、视敏度、紧实度(tone)(臂、腿、颈)、力量(臂、腿)、手敲击、跟跺脚、自发运动(运动不能)、刻板、张力失常、肌阵挛、震颤、舞蹈症、辨距困难、步态、姿势稳定性、抽搐、行为和情绪、以及整体健康。
在本文所述方法的一个实施方案中，一次性递送如本文所述的组合物，例如AAV递送优化的人ABCD1盒，可用于在对象中治疗ALD或AMN疾病。在本文所述方法的另一个实施方案中，一次性递送如本文所述的组合物(例如AAV递送优化的人ABCD1盒)，可用于在具有ABDC1基因缺陷的对象中预防ALD或AMN疾病。
因此，在一个实施方案中，所述组合物在疾病发作之前施用。在另一个实施方案中，所述组合物在神经功能损伤开始之前施用。在另一个实施方案中，组合物在神经功能损伤开始之后施用。在一个实施方案中，新生儿治疗定义为在分娩的8小时内、前12小时、前24小时或前48小时施用如本文所述的ABCD1编码序列、表达盒或载体。在另一个实施方案中，特别是对于灵长类(人或非人)，新生儿递送在约12小时至约1周、2周、3周或约1个月的时期内，或约24小时至约48小时之后。在另一个实施方案中，组合物在症状发作之后递送。在一个实施方案中，患者的治疗(例如，第一次注射)在生命的第一年之前开始。在另一个实施方案中，治疗在最初1岁之后，或在最初2至3岁之后，在5岁之后，在11岁之后，或在更大的年龄开始。在一个实施方案中，从大约4岁至大约12岁的年龄开始治疗。在一个实施方案中，在约4岁时或之后开始治疗。在一个实施方案中，在约5岁时或之后开始治疗。在一个实施方案中，在约6岁时或之后开始治疗。在一个实施方案中，在约7岁时或之后开始治疗。在一个实施方案中，在约8岁时或之后开始治疗。在一个实施方案中，在约9岁时或之后开始治疗。在一个实施方案中，在约10岁时或之后开始治疗。在一个实施方案中，在约11岁时或之后开始治疗。在一个实施方案中，在约12岁时或之后开始治疗。然而，可以在约15岁、约20岁、约25岁、约30岁、约35岁或约40岁时或之后开始治疗。在一个实施方案中，子宫内治疗定义为在胎儿中施用如本文所述的组合物。参见例如，David et al,Recombinant adeno-associated virus-mediated in utero gene transfer gives therapeutic transgeneexpression in the sheep,Hum Gene Ther.2011 Apr；22(4):4l9-26.doi:10.1089/hum.2010.007.Epub 2011Feb 2，其通过引用并入本文。
在另一个实施方案中，所述组合物在以后的日期再施用。任选地，允许超过一次再施用。这样的再施用可以使用相同类型的载体、不同的病毒载体，或通过非病毒递送，如本文所述。
本文所述治疗的目标包括限制或停止ALD或AMN疾病的进展。治疗的期望结果包括但不限于UBDRS的任何评估评分的提高、ABCD1活性或表达水平的提高、VLCFA的量的降低或者VLCFA在对象中提高的稳定或减缓、运动功能提高(或运动功能损伤进展的降低)(如由神经学测试所确定)，以及皮质体积的提高(或皮质体积损伤进展的降低)，通过MRI测得。期望的结果包括减少肌无力、提高肌肉力量和张力、或维持或提高呼吸健康、或减少震颤或颤搐。其他期望的终点可以由医师确定。
在又一个实施方案中，任何上述方法与另一种或第二治疗组合进行。第二治疗可以是任何现在已知或至今未知的有助于预防、阻止或改善这些突变或缺陷或任何与之相关的影响的治疗。第二治疗可以在施用上述组合物之前、同时或之后施用。在一个实施方案中，产生重组rAAV的方法包括获得包含如上所述AAV表达盒的质粒，并在存在足够的病毒序列的情况下培养携带所述质粒的包装细胞以允许将AAV病毒基因组包装到感染性AAV包膜或衣壳中。rAAV载体产生的具体方法在上文中描述并且可以用于产生可以在本文所述的表达盒和基因组中递送ABCD1基因的rAAV载体。
在本发明的某些实施方案中，对象患有ALD或AMN疾病，本发明的组分、组合物和方法被设计成用于治疗这些疾病。如本文中所使用的，本文中所用的术语“对象”意指哺乳动物，包括人、兽医学或农场动物、家养动物或宠物，以及通常用于临床研究的动物。在一个实施方案中，这些方法和组合物的对象是人。另一些合适的对象包括但不限于鼠、大鼠、犬、猫、猪、牛、羊、非人灵长类等。本文中使用的术语“对象”与“患者”可互换使用。
本文中使用的术语“治疗”或其变化形式定义为涵盖向对象施用一种或更多种本文所述的化合物或组合物以改善ALD或AMN疾病的一种或更多种症状。因此，“治疗”可以包括在给定对象中减少ALD或AMN疾病的发作或进展、预防疾病、降低疾病症状的严重程度或延缓其进展(包括神经功能损伤的进展)、消除疾病症状、延迟疾病发作或监测疾病进展或治疗效力中的一种或更多种。
在一个方面中，提供了编码功能性人ABCD1蛋白的AAV载体。“功能性hABCD1”意指编码ABCD1蛋白的基因，所述ABCD1蛋白提供至少约50％、至少约75％、至少约80％、至少约90％、或约相同或大于100％的与疾病无关的天然ABCD1蛋白或其天然变体或多晶型物的生物活性水平。
存在用于体外测量ABCD1表达和活性水平的多种测定。本文所述的方法还可以与用于治疗ALD或AMN疾病或其症状的任何其他治疗组合。
在某些实施方案中，产生了AAV-ABCD1病毒载体。可以选择许多合适的纯化方法。描述了合适的纯化方法的一些实例，例如于2016年12月9日提交的国际专利申请号PCT/US2016/065970及其优先权文件，于2016年4月13日提交的美国专利申请号62/322,071和于2015年12月11日提交的62/226,357，并且标题为“Scalable Purification Method forAAV9”，其通过引用并入本文。
在AAV病毒载体的情况下，基因组拷贝(“GC”)的定量可用作制剂中所含剂量的量度。本领域已知的任何方法都可用于确定本发明的复制缺陷型病毒组合物的基因组拷贝(GC)数。用于进行AAV GC数滴定的一种方法如下：首先将纯化的AAV载体样品用DNA酶处理，以消除产生过程中的宿主DNA污染。然后对DNA酶抗性颗粒进行热处理以从衣壳中释放基因组。然后使用靶向病毒基因组特定区域(例如polyA信号)的引物/探针组通过实时PCR对释放的基因组进行定量。用于确定基因组拷贝的另一种合适的方法是定量PCR(qPCR)，特别是优化的qPCR或数字微滴PCR[Lock Martin,et al,Human Gene Therapy Methods.April2014,25(2):115-125.doi:10.1089/hgtb.2013.131，在2013年12月13日编辑之前在线发布]，或者，ViroCyt3100可用于颗粒定量或流式细胞术。在另一种方法中，携带编码ABCD1编码序列的核酸序列的重组腺相关病毒的有效剂量如S.K.McLaughlin et al,1988,J.Virol.,62:1963中所述测量，其通过引用整体并入。
复制缺陷型病毒组合物可以配制成包含一定量的复制缺陷型病毒的剂量单位，所述量的范围为对于人患者约1.0×109GC至约9×1015GC(治疗平均体重为70kg的对象)，包括该范围内的所有整数或小数的量，并且优选1.0×1012GC至1.0×1015GC。在一个实施方案中，组合物被配制成包含至少1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109或9×109GC/剂量，包括该范围内的所有整数或小数的量。在另一个实施方案中，组合物被配制成包含至少1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010或9×1010GC/剂量，包括该范围内的所有整数或小数的量。在另一个实施方案中，组合物被配制成包含至少1×1011、2×1011、3×1011、4×1011、5×1011、6×1011、7×1011、8×1011或9×1011GC/剂量，包括该范围内的所有整数或小数的量。在另一个实施方案中，组合物被配制成包含至少1×1012、2×1012、3×1012、4×1012、5×1012、6×1012、7×1012、8×1012或9×1012GC/剂量，包括该范围内的所有整数或小数的量。在另一个实施方案中，组合物被配制成包含至少1×1013、2×1013、3×1013、4×1013、5×1013、6×1013、7×1013、8×1013或9×1013GC/剂量，包括该范围内的所有整数或小数的量。在另一个实施方案中，组合物被配制成包含至少1×1014、2×1014、3×1014、4×1014、5×1014、6×1014、7×1014、8×1014或9×1014GC/剂量，包括该范围内的所有整数或小数的量。在另一个实施方案中，组合物被配制成包含至少1×1015、2×1015、3×1015、4×1015、5×1015、6×1015、7×1015、8×1015或9×1015GC/剂量，包括该范围内的所有整数或小数的量。在一个实施方案中，对于人应用，剂量可以在1×1010至约1×1015GC/剂量的范围内，包括该范围内的所有整数或小数的量。
在一个实施方案中，病毒构建体可以按以下的剂量递送：至少约1×109GC至约1×1015GC，或约1×1011GC至1×1015GC。用于递送这些剂量和浓度的合适体积可由本领域技术人员确定。例如，可以选择约1μL至150mL的体积，为成人选择更高的体积。通常，对于新生婴儿，合适的体积为约0.5mL至约10mL，对于年龄较大的婴儿，可选择约0.5mL至约15mL。对于学步儿，可以选择约0.5mL至约20mL的体积。对于儿童，可以选择至多约30mL的体积。对于青少年前(pre-teen)和青少年，可以选择至多约50mL的体积。在另一些实施方案中，患者可以以选择约5mL至约15mL或约7.5mL至约10mL的体积接受鞘内施用。在另一些实施方案中，患者可以接受10至150mL、50mL至150mL、75mL至125mL或约100mL的鞘内施用。可以确定其他合适的体积和剂量。将调整剂量以平衡治疗益处与任何副作用，并且这样的剂量可以根据使用重组载体的治疗应用而变化。
可以根据公开的方法将上述重组载体递送至宿主细胞。在某些实施方案中，对于施用于人患者，将rAAV适当地悬浮于包含盐水、表面活性剂和生理相容盐或盐混合物的水溶液中。适当地，将制剂调节至生理可接受的pH，例如在pH 6至9、或pH 6.5至7.5、pH 7.0至7.7或pH 7.2至7.8的范围内。由于脑脊液的pH为约7.28至约7.32，对于鞘内递送，可期望在此范围内的pH；而对于静脉内递送，可期望6.8至约7.2的pH。然而，可以选择最宽范围内的其他pH和这些子范围用于其他递送途径。
合适的表面活性剂或表面活性剂的组合可选自无毒的非离子型表面活性剂。在一个实施方案中，选择末端为伯羟基的双官能嵌段共聚物表面活性剂，例如，
Figure BDA0003816929830000651
F68(BASF)，也称为泊洛沙姆188(Poloxamer 188)，其具有中性pH，平均分子量为8400。可以选择其他表面活性剂和其他泊洛沙姆，即由侧接聚氧乙烯(聚氧化乙烯)的两条亲水链的聚氧丙烯(聚氧化丙烯)的中央疏水链构成的非离子型三嵌段共聚物，SOLUTOL HS 15(聚乙二醇-15羟基硬脂酸)，LABRASOL(聚氧辛酸甘油酯)、聚氧10油烯基醚、吐温(聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯)、乙醇和聚乙二醇。在一个实施方案中，制剂包含泊洛沙姆。这些共聚物通常以字母“P”(代表泊洛沙姆)后跟三位数字命名：前两位数字×100给出了聚氧丙烯核的近似分子量，以及最后一位数字×10给出了聚氧乙烯含量的百分比。在一个实施方案中，选择泊洛沙姆188。
表面活性剂可以以悬浮液的至多约0.0005％至约0.001％的量存在。
在一个实例中，制剂可包含例如缓冲盐水溶液，其包含在水中的氯化钠、碳酸氢钠、右旋糖、硫酸镁(例如硫酸镁-7H20)、氯化钾、氯化钙(例如钙氯化物-2H2O)、磷酸氢二钠及其混合物的一种或更多种。适当地，对于鞘内递送，渗量在与脑脊液相容的范围内(例如，约275至约290Osm/L)。任选地，对于鞘内递送，可将可商购获得稀释剂用作助悬剂，或与另一种助悬剂和其他任选赋形剂组合使用。参见例如，Elliotts 
Figure BDA0003816929830000661
溶液剂(LukareMedical)。在另一些实施方案中，制剂可以包含一种或更多种渗透增强剂。合适的渗透增强剂的一些实例可以包括例如甘露醇、甘氨胆酸钠、牛胆酸钠、脱氧胆酸钠、水杨酸钠、辛酸钠、癸酸钠、月桂基硫酸钠、聚氧乙烯-9-月桂醚或EDTA。
在另一个实施方案中，组合物包含载体、稀释剂、赋形剂和/或辅料。考虑到转移病毒所针对的适应证，本领域技术人员可以容易地选择合适的载体。例如，一种合适的载体包括盐水，其可以与多种缓冲溶液(例如磷酸缓冲盐水)一起配制。另一些示例性载体包括无菌盐水、乳糖、蔗糖、磷酸钙、明胶、右旋糖酐、琼脂、果胶、花生油、芝麻油和水。缓冲液/载体应包括防止rAAV黏附至输注管但不干扰体内rAAV结合活性的组分。
任选地，除了rAAV和载体之外，本发明的组合物还可以包含另一些常规药物成分，例如防腐剂或化学稳定剂。合适的示例性防腐剂包括氯丁醇、山梨酸钾、山梨酸、二氧化硫、没食子酸丙酯、对羟基苯甲酸酯、乙基香草醛、甘油、苯酚和对氯苯酚。合适的化学稳定剂包括明胶和白蛋白。
根据本发明的组合物可以包含可药用载体，例如如上所定义。适当地，本文所述的组合物包含悬浮于药学上合适的载体中和/或与合适的赋形剂混合的有效量的一种或更多种AAV，其设计成用于通过注射、泵、鞘内导管递送至对象或者通过另外的装置或途径进行递送。在一个实例中，所述组合物配制成用于鞘内递送。在一个实施方案中，鞘内递送涵盖注射到椎管，例如蛛网膜下腔中。在一个实施方案中，递送途径是脑室内注射(ICV)。在另一个实施方案中，递送途径是鞘内-腰(IT-L)递送。在另一个实施方案中，递送途径是脑池内施用。
本文所述的病毒载体可用于制备用于将ABCD1蛋白递送至有此需要的对象(例如，人患者)、向对象提供功能性ABCD1和/或用于治疗ALD或AMN疾病的药物。治疗过程可以任选地涉及重复施用相同的病毒载体(例如，AAV2、AAV9或AAVrh.10载体)或不同的病毒载体(例如，不同的AAV2、AAV9和AAVrh.10)。还可以使用本文所述的病毒载体和非病毒递送系统来选择其他组合。
本文所述的ABCD1 cDNA序列可以使用本领域公知的技术在体外且合成产生。例如，可以使用长DNA序列的基于PCR的精确合成(PAS)方法，如Xiong et al,PCR-basedaccurate synthesis of long DNA sequences,Nature Protocols 1,791-797(2006)所述。将双重非对称PCR和重叠延伸PCR方法组合的方法描述于Young and Dong,Two-steptotal gene synthesis method,Nucleic Acids Res.2004；32(7):e59。还参见Gordeevaet al,J Microbiol Methods.Improved PCR-based gene synthesis method and itsapplication to the Citrobacter freundii phytase gene codon modification.2010May；8l(2):147-52.Epub 2010Mar 10；还参见以下关于寡核苷酸合成和基因合成的专利，Gene Seq.2012Apr；6(l):10-21；US 8008005；和US 7985565。这些文件中的每一个均通过引用并入本文。另外，用于通过PCR产生DNA的试剂盒和方案可商购获得。这些包括使用聚合酶，包括但不限于Taq聚合酶；
Figure BDA0003816929830000671
(New England Biolabs)；
Figure BDA0003816929830000672
高保真DNA聚合酶(New England Biolabs)；以及
Figure BDA0003816929830000673
G2聚合酶(Promega)。DNA也可以从用包含本文所述的hOTC序列的质粒转染的细胞产生。
试剂盒和方案是已知的并且可商购获得并且包括但不限于QIAGEN质粒试剂盒；
Figure BDA0003816929830000674
Pro过滤质粒试剂盒(Invitrogen)；和GenEluteTM质粒试剂盒(SigmaAldrich)。本文可用的其他技术包括消除对热循环的需要的序列特异性等温扩增方法。作为对热的替代，这些方法通常使用链置换DNA聚合酶(如Bst DNA聚合酶、大片段(LargeFragment)(New England Biolabs))来分离双链体DNA。DNA也可以通过使用逆转录酶(Reverse Transcriptase，RT)经由扩增从RNA分子产生，所述逆转录酶是RNA依赖性DNA聚合酶。RT使与原始RNA模板互补并称为cDNA的DNA链聚合。然后可以通过上述PCR或等温方法进一步扩增该cDNA。定制DNA也可以从包括但不限于以下的公司商业化产生：GenScript；
Figure BDA0003816929830000675
(Life Technologies)；和Integrated DNATechnologies。
应当注意，无数量词修饰的名词是指一个/种或更多个/种。因此，无数量词修饰的名词、术语“一个/种或更多个/种”和“至少一个/种”在本文中可互换使用。
词语“包含”及其变化形式将被包含性地解释而不是排他性地解释。词语“组成”、“由……组成”及其变化形式应被排他性地解释，而不是包含性地解释。虽然本说明书中的多种实施方案使用“包含”语言呈现，但在其他情况下，相关实施方案也旨在使用“由……组成”或“基本上由……组成”语言来解释和描述。
本文中使用的“疾病”、“障碍”和“病症”可互换使用，以表示对象的异常状态。
除非另有说明，否则本文中使用的术语“约”或“～”意指相对于给定参考的10％的可变性。
本文中使用的术语“调节”或其变化形式是指组合物抑制生物途径的一种或更多种组分的能力。
除非在本说明书中另有定义，否则本文使用的技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义，并且通过参考公开的文本，这为本领域技术人员提供了对本申请中使用的许多术语的一般指导。
实施例
提供了以下实施例以便举例说明本发明，但不应解释为以任何方式限制权利要求书的范围。本文实施例中使用的质粒序列由在图10至12以及序列表中所示的SEQ ID NO确定。
材料和方法
除非另有说明，否则以下实施例是使用AAV-hABCD1构建体实现的。这些AAV-hABCD1构建体旨在是示例性的并且本发明包括其变体的构建和使用。
实施例1：AAV9载体在ABCD1敲除小鼠中的鞘内施用
在本实施例中，进行了短期体内研究，以便比较不同AAV9对脊髓和CNS中ABCD1表达水平的作用和明显毒性。这些实验的目的是确定用于治疗ALD或AMN的合适候选物。
包含AAV9衣壳的AAV载体如以下中所述简要地产生：Gong Y.et al.,2015May；MolTher.23(5):824-834和Gong Y.et al.,2019May；Hum Gene Ther.30(5):544-555。简言之，最初将人293T细胞用针对ABCD1的siRNA合并物使用DharmaFECT试剂进行转染，并且在24小时之后，将细胞用目的rAAV基因组载体质粒(AAV-CBA-ABCD1-WPRE(原始)、AAV-CBA-ABCD1-WPRE X失活或AAV-CBA-ABCD1(无WPRE)的质粒)、Rep/Cap质粒pAAV2/9和Ad辅助质粒pFd6进行转染。将rAAV载体通过CsCl梯度离心进行纯化，随后脱盐并浓缩。通过qPCR确定rAAV滴度。包含siRNA以在产生过程中降低ABCD1的表达。
使用的pAAV2/9质粒包含SEQ ID NO:700的完整构建体序列，其包含：AAV2 p5启动子(SEQ ID NO:710)，可从其产生AAV2 REP78(SEQ ID NO:711)和AAV2 REP68(SEQ ID NO:712)；AAV2 p19启动子(SEQ ID NO:720)，可从其产生AAV2 REP52(SEQ ID NO:721)和AAV2REP40(SEQ ID NO:722)；以及AAV2 p40启动子(SEQ ID NO:730)，从其得到AAV9 VP1(SEQID NO:731)、AAV9 VP2(SEQ ID NO:732)和AAV9 VP3(SEQ ID NO:733)。
在这些实验中，候选选择标准包括鉴定在没有明显毒性的情况下使CNS中VLCFA的降低等于或大于包含土拨鼠肝炎病毒(WHP)转录后调节元件(WPRE)的载体的载体，以及鉴定在单个细胞中实现与WT大致相等的ABCD1表达水平的同时优化生物分布的构建体。
在该实验中，其结果包含在图1中，将不同组的5只小鼠(大约3月龄的ABCD1敲除(knock-out，KO)小鼠)各自鞘内施用包含在磷酸缓冲盐水(PBS)载剂中的不同AAV载体(参见图10至11)的1.2×1011个基因组拷贝(GC)的推注注射，所述AAV载体即“AAV.ABCD1.WPRE”或“AAV-CBA-hABCD1-WPRE”(包含ABCD1和WPRE编码序列的AAV载体，图10所示)；“AAV.ABCD1.WPRE-X失活”或“AAV-CBA-hABCD1-WPRE-X失活”(经修饰以包含编码失活X蛋白的经修饰WPRE的AAV载体，图10和11A所示)；和“AAV.ABCD1”或“AAV-CBA-hABCD1”(经修饰以去除WPRE的原始AAV载体(AAV-CBA-hABCD1-WPRE)，图10和11B所示)，或者鞘内施用仅PBS载剂载体。选择推注施用作为施用方式，因为发现它比泵输注更有效。此外，5只野生型(WT)小鼠的对照组未进行处理。
在3周之后，将不同组的小鼠处死并收获脑、脊髓、背根节(dorsal rootganglion，DRG)、心脏和肝(将肝冷冻以供以后分析)。通过Western印迹法在收获的组织中检测ABCD1表达水平以及β肌动蛋白表达水平(用于归一化)。这些结果包含在图1中。从其中可以看出，在所有组中都检测到ABCD1表达，但其在施用缺乏WPRE的AAV9病毒的组中较低(图1A)。正如预期的那样，在阴性对照null小鼠中未检测到ABCD1信号。蛋白质表达结果的定量显示，用包含原始WPRE序列的载体(“WPRE-原始”)处理的小鼠与用包含经修饰的X-蛋白序列的载体(“X-失活”)处理的小鼠之间的ABCD1蛋白表达水平相似，而来自无WPRE序列的载体(“无WPRE”)的蛋白质表达降低。
实施例2：不同AAV9构建体的鞘内施用
进行了第二次更长持续时间的体内研究，其中将不同组的ABCD1 KO小鼠(每组n＝5)鞘内注射不同剂量，即1×1011gc/小鼠或3×1011gc/小鼠的图10至11中所示的相同示例性AAV9构建体。产生AAV病毒载体并如实施例1中确定病毒滴度。如实施例1中，将约3月龄的ABCD1 KO小鼠各自鞘内施用AAV9推注，即推注注射“AAV9.ABCD1.WPRE”(包含ABCD1编码序列的原始AAV9载体，图10所示)；“AAV9.ABCD1.WPRE-X失活”(经修饰以包含编码失活X蛋白的经修饰WPRE的原始AAV9载体，图10和11A所示)；或“AAV9.ABCD1”(经修饰以去除WPRE的原始AAV9载体，图10和11B所示)的1×1011个基因组拷贝(GC)或3×1011GC，或者鞘内施用仅PBS载剂载体。与之前的实验一样，5只野生型(WT)小鼠的对照组未进行处理。
将这些小鼠在注射之后5周处死并再次收集组织用于检测脊髓中的ABCD1水平。在这些实验中，再次使用Western印迹技术在来自每组的2只小鼠中检测ABCD1表达水平。这些结果可见于图2中。
在图中，施用了1×1011gc/小鼠和3×1011gc剂量的小鼠的ABCD1表达水平在单独的印迹上。图中标注的2秒和15秒曝光时间是指ABCD1印迹。印迹上的β肌动蛋白水平是针对1011gc/剂量的10秒曝光和针对3×1011gc剂量的5秒曝光时间的。在用包含ABCD1基因的AAV9构建体处理的所有组中均检测出ABCD1表达，但其在施用了缺乏WPRE的AAV9构建体的组中较低。
还评估了ABCD1表达的剂量响应。如图3中所示，对施用了1×1011gc/小鼠或3×1011gc剂量的包含WPRE或X失活的WPRE的AAV9构建体或缺乏WPRE的AAV9构建体的小鼠中ABCD1 Western印迹数据的剂量响应进行了比较。Western印迹结果显示，与施用了1×1011gc剂量的包含WPRE或包含X失活的WPRE的AAV9构建体的小鼠相比，施用了3×1011gc剂量的包含WPRE或包含X失活的WPRE的AAV9构建体的小鼠中ABCD1表达水平更高。结果还显示，施用了缺乏WPRE的AAV9构建体的小鼠的ABCD1表达水平显著降低。
实施例3：构建体差异对体外VLCFA降低作用的作用。
由于在实施例1和2中示出了诱导ABCD1蛋白表达与由AAV9-CBA-ABCD1-WPRE诱导的水平相当的AAV9-CBA-ABCD1-WPRE(X失活)，因此研究了AAV9-CBA-ABCD1-WPRE(X失活)对VLCFA降低的作用。在该实验中，混合胶质培养物由ABCD1 KO小鼠产生。AAV病毒载体AAV9-CBA-ABCD1-WPRE(原始)和AAV9-CBA-ABCD1-WPRE(X失活)如实施例1中产生。在培养之后第12天，将来自混合胶质培养物的细胞用AAV9-CBA-ABCD1载体以不同MOI(1×105、2.5×105、5×105和1×106个基因拷贝/细胞)进行转导。在转导之后4天收获细胞用于VLCFA分析。将孔的子集也用于Western印迹分析，以确定细胞已成功转导。
VLCFA分析结果示出于图4A(C26:0水平)和图4B(C26:0与C22:0的比率)中。结果显示，两种AAV9载体均以剂量依赖性方式降低VLCFA水平，并且AAV9-CBA-ABCD1-WPRE(X失活)对VLCFA的降低与AAV9-CBA-ABCD1-WPRE(原始)对VLCFA的降低相当。结果还显示，最高剂量与野生型VLCFA水平相当。
实施例4：AAV-hABCD1载体修饰
另一个潜在的候选物AAV-hABCD1构建体经改造以试图在不使用WPRE的情况下增强ABCD1表达并改善制造和临床使用所期望的其他特性。特别经修饰的AAV-hABCD1载体SBT101和OB1005来源于亲本AAV构建体AAV-CBA-ABCD1[无WPRE]经由多次修饰。
在从AAV-CBA-ABCD1[无WPRE]设计SBT101时，对5’ITR下游的序列进行修饰；并且分别在hABCD1 cDNA序列的上游和下游添加hABCD1 5’UTR和hABCD1 3’UTR序列。
在从AAV-CBA-ABCD1[无WPRE]设计OB1005时，将5’ITR和3’ITR序列缩短；对ABCD1编码序列进行修饰以消除替代开放阅读框，以消除其表达非自身抗原的潜能；在起始位点上游添加科扎克序列(ccacc)，以潜在地改善ABCD1翻译；消除第二个polyA信号(bGHpolyA)以减小转基因盒的尺寸；以及将包含AAV2载体的骨架从pUC57改变为pUC118，以改善放大期间的ITR稳定性。
在从AAV-CBA-ABCD1[无WPRE]设计OB1010时，将5’ITR和3’ITR序列缩短；分别在hABCD1 cDNA序列的上游和下游添加hABCD1 5’UTR和hABCD1 3’UTR序列；以及将包含AAV2载体的骨架从pUC57改变为pUC118，以改善放大期间的ITR稳定性。
所得AAV载体基因组质粒pSBT101、pOB1005和pOB1010分别在图5、图6和图7中分别示意性地示出。这些构建体的示意图和序列细节也在图12A至E中提供。
实施例5：比较ABCD1表达(pSTB101 vs pOB1005)
然后进行实验以比较pSBT101和pOB1005构建体在HEK293细胞中瞬时转染实验中的性能。这些结果总结在图8中。通过Western印迹测量的ABCD1表达水平显示在图8A中。在图8B中，以条形图以条形2(pSBT101，不包含WPRE)和3(pOB1005)比较了测量的ABCD1表达水平。条形1是未经转染的对照。所有条形对应于凝胶上具有相同编号标签的泳道。相对化学发光代表ABCD1值，其再次相对于β-肌动蛋白进行归一化。
在这些实验中，将HEK293细胞与质粒并行转染，并在转染之后3天在细胞裂解物中通过Western印迹评价表达，且将Western印迹通过使用密度测定法进行量化。从图中的结果可以看出，与用pSBT101转染的HEK293细胞相比，用经修饰的构建体pOB1005转染的HEK293细胞显示出明显更高的ABCD1表达。
实施例6：在黏附细胞中以中试规模(pilot scale)评估从pSBT101和pOB1005构建 体到AAV中的可包装性
进行了另外的实验以比较在HEK293细胞中进行的三重转染实验中缺乏WPRE的pSBT101与pOB1005的性能。在这些实验中，将HEK293细胞用pSBT101或pOB1005质粒、以及rep/cap质粒(pAAV2/9(SEQ ID NO:700))和Ad辅助质粒并行转染，并通过CsCl梯度离心收获rAAV载体，随后脱盐和浓缩。然后，通过使用对转基因盒具有特异性的引物和ddPCR对DNA酶处理之后的载体基因组拷贝进行定量，在细胞裂解物和上清液中评价可包装性。正如所希望的那样，在这些小规模三重转染测试中，pOB1005显示出明显更好的生产力(为2.5倍多一点高，从5.66×109载体gc/prep至1.48×1010载体gc/prep)。图9包含这些可包装性实验的结果。pSBT101和pOB1005二者都表现出令人满意的可包装性。
实施例7：用缩短的AAV2 ITR构建另外的构建体
为了进一步探究没有WPRE的候选构建体(其相对于包含WPRE的原始构建体可以恢复AAV-CBA-ABCD1[无WPRE]中降低的ABCD1表达和/或产量)，设计了包含如pOB1005中的一组缩短的5’ITR和缩短的3’ITR的多种构建体：pOB1010、pOB1011、pOB1012、pOB1013、pOB1015和pOB1017，它们均使用pUC118骨架。将从pOB1010、pOB1011、pOB1012、pOB1013、pOB1015、和pOB1017产生的AAV载体分别命名为OB1010、OB1011、OB1012、OB1013、OB1015和OB1017，或者分别称为v1、v2、v3、v4、v5、v6、v7和v8。
在图12A中示出了包含在每个构建体中的AAV基因组(待被包装在AAV颗粒中)的示意图。pOB1005、pOB1012和pOB1013各自包含紧接在ABCD1起始密码子之前的科扎克序列和相对于包含在pSBT101中的野生型ABCD1编码序列在ABCD1编码序列内的九个突变。相对于包含在pSBT101中的野生型ABCD1编码序列，pOB1015和pOB1017各自在ABCD1编码序列内包含三个突变。pOB1011、pOB1013和pOB1015不具有SV40 poly A信号，但仍包含bGH poly A信号。分配给完整质粒的SEQ ID NO在图12B中示出。所有完整的质粒序列被进一步分成区段，所有区段都如图12B所示命名并分配以SEQ ID NO。当SV40和bGH poly A序列二者都存在时，则从SV40pA开始到bGHpA结束的序列被命名为“总polyA信号”，并分配以另外的SEQ IDNO。还参考图12C至12J中的SEQ ID NO描述了各个构建体的示意图。图12B和12C至12J中提及的序列都包括在序列表中。
实施例8：ABCD1蛋白表达比较
使用实施例7中所述的新质粒构建体来产生AAV载体。简言之，将HEK293细胞用以下转染：(1)目的rAAV基因组载体质粒(pSBT101、pOB1005、pOB1010、pOB1011、pOB1012、pOB1013、pOB1015或pOB1017)，(2)编码AAV Rep和Cap蛋白的质粒(pAAV2/9(SEQ ID NO:700))，以及(3)腺病毒辅助质粒(pALD-X80)。通过CsCl梯度离心收获rAAV载体，随后进行脱盐和浓缩。通过ddPCR来确定rAAV滴度。
评估了不同质粒构建体对ABCD1蛋白表达的作用。简言之，将ABCD1敲除Lec2细胞用以下转导：不同的AAV9-CBA-ABCD1载体(AAV载体SBT101、OB1005、OB1010、OB1011、OB1012、OB1013、OB1015、和OB1017)或对照载体(使用pOB1008质粒产生的AAV9-CBA-空载体“OB1008”，)，MOI为1×103、1×104、1×105、1×106和5×106个基因拷贝/细胞。在转导之后3天，通过细胞内western印迹(in-cell western blot，ICWB)来测量ABCD1蛋白表达水平。将ABCD1蛋白水平相对于MOI作图，并拟合剂量-表达曲线，如图13A至13D中所述。计算每种AAV载体的估计相对电位(在图13A至13C中相对于pOB1008并且在图13D中相对于pSBT101)、标准误差、95％置信区间和EC50值。图13E示出了示例性western印迹孔和相对强度数据。
如图13A至13D所示，实施例7中描述的所有新构建体(v1至v8)均成功地使得ABCD1蛋白表达高于对照构建体(pOB1008)产生的水平。此外，与pSBT101相比，OB1010、OB1015和OB1017使得ABCD1表达显著更高(图13A和13D)，这意味着pOB1010、pOB1015和pOB1017实现了恢复在pSBT101中降低的ABCD1表达的目标，而无需使用WPRE。鉴于在没有引入另一种增强剂代替WPRE的情况下恢复了表达，这是特别令人惊讶和出乎意料的。
实施例9：VLCFA降低比较
为了测试导致高ABCD1表达的AAV载体(OB1010、OB1015和OB1017)是否导致VLCFA降低，将ABCD1 KO Lec2细胞用如实施例8中所述产生的AAV载体OB1010、OB1015和OB1017进行转导，MOI为1×103、1×104、1×105、1×106和5×106个基因拷贝/细胞，并且将VLCFA水平量化。如图14所示，所有OB1010、OB1015和OB1017均成功地降低了VLCFA，如降低的C26:0/C22:0比率所示。令人感兴趣地，VLCFA降低趋势与ABCD1表达趋势一致(参见图13D)，即更高的ABCD1表达子导致更显著的VLCFA降低。
实施例10：VLCFA降低的剂量依赖性
为了更密切地了解VLCFA降低作用与AAV9-CBA-ABCD1(OB系列)剂量或ABCD1表达水平之间的关系，以rAAV载体OB1010为例。并行测试了由不同供应商(“STC”和“VBL”)产生的两组不同的OB1010载体。两家供应商的rAAV载体基本上如实施例8中所述产生，但VBL使用超离心来进行rAAV纯化，而STC使用基于AAV9亲和力的纯化。简言之，由WT或ABCD1 KO小鼠产生混合胶质培养物。在培养之后第12天，将来自ABCD1 KO混合胶质培养物的细胞用三种不同剂量(低、中和高)的OB1010载体进行转导。低、中、高剂量分别为3.3×104、1.0×105和5×105病毒基因组/细胞。WT混合胶质细胞未进行处理。在转导之后5天，收获细胞以用于VLCFA分析并通过Western印迹进行ABCD1蛋白定量。
如图15A所示，无论供应商如何，OB1010均以载体剂量依赖性方式降低C26:0/C22:0比率和C26:0量二者。当C26:0/C22:0比率或C24:0/C22:0比率相对于ABCD1蛋白表达水平作图时，C26:0/C22:0比率和C24:0/C22:0比率二者的降低都与提高的ABCD1蛋白水平相关，如图15B所示。
使用一些其他AAV-CBA-ABCD1载体(例如由不同供应商产生的pOB101011)进行相同的实验，并且观察到类似的剂量-和/或蛋白质水平-依赖性VLCFA降低。图15C中总结了ABCD1表达与多种VLCFA参数(绝对量和比率)之间的关系，其中将来自不同供应商的所有测试的AAV-CBA-ABCD1载体的数据组合。如图15C中的顶部四张图所示，提高的ABCD1水平与较低的VLCFA(C26:0和C24:0)和较高的较短脂肪酸(C16:0)相关，而C22:0显示出不受ABCD1表达影响。当脂肪酸比例相对于ABCD1蛋白表达作图时，提高的ABCD1水平与较低的C26:0/C22:0和C24:0/C22:0比率相关，如图15C底部的两张图所示。
实施例11：SBT101引发的体内作用
为了测试AAV9-CBA-ABCD1载体在体内是否可以恢复ABCD1表达以降低VLCFA，将ABCD1 KO小鼠鞘内施用不同量的如实施例8中所述产生的rAAV SBT101。施用剂量为低、中、高，其分别为6.1×108个载体基因组拷贝(vg)、1.8×109个vg和6.1×109个vg，如由ddPCR所确定。还包括未经处理的WT对照。在施用之后八周，收集脊髓。通过ddPCR来量化载体和二倍体基因组和线粒体DNA(mtDNA)，并且通过与毛细管电泳结合的免疫测定(immuno-CE)使用JESS(Protein SimpleTM)来量化ABCD1蛋白水平。
结果总结在图16中。如左图和中图所示，确定了剂量依赖性载体基因组水平和剂量依赖性ABCD1蛋白表达。关于mtDNA，mtDNA是线粒体数量的代表，并且与野生型小鼠相比，mtDNA在ABCD1敲除小鼠中降低，如右图所示。不希望受理论束缚，ABCD1 KO中降低的mtDNA被认为与过氧化物酶体中VLCFA的β氧化降低有关，并因此mtDNA水平的提高或恢复是VLCFA的β氧化的提高或恢复的替代标志物。如右图所示，mtDNA水平以载体剂量依赖性方式恢复，并且特别地是，相对于未经处理，最高剂量提供了对mtDNA的显著提高，并且补充了约一半的因ABCD1基因敲除而损失的mtDNA。因此，得出了以下结论，无WPRE的ABCD1编码AAV载体成功地在胶质细胞中充分表达了ABCD1，以恢复VLCFA转运到过氧化物酶体中以进行体内β氧化。
实施例12：rAAV载体可包装性比较
为了测试pOB1010是否提供有效的rAAV载体包装，比较了pOB1010、pSBT101和pOB1008质粒。
将HEK293细胞用以下转染：(1)目的rAAV基因组载体质粒(pSBT101、pOB1010或pOB1008)，(2)AAV Rep/Cap质粒(pAAV2/9(SEQ ID NO:700)，和(3)腺病毒辅助质粒(pALD-X80)。通过CsCl梯度离心收获rAAV载体，随后进行脱盐和浓缩。将相同量(拷贝)的基因组载体质粒用于每种AAV载体，并将相同量(拷贝)的Rep/Cap质粒和腺病毒辅助质粒用于每种AAV载体。通过ddPCR针对hABCD1基因(或在pOB1008的情况下针对SV40 polyA)以及通过qPCR针对CMV增强子基因来比较所得病毒滴度。这些结果总结在图17中。
在前述操作中，已经描述了多种方法和材料。然而，将明显的是，可以对其进行多种修改和改变，并且可以实施另外的操作，而不脱离所附权利要求书中阐述的示例性操作的更广泛范围。
等同方案和范围
在权利要求书中，未用数量词限定的名词可以意指一个/种或超过一个/种，除非指示相反情况或从上下文中明显看出。在组的一个或更多个成员之间包含“或”的权利要求或描述被认为满足以下：对于给定的产品或过程，存在、使用或以其他方式相关的一个、多于一个或所有的组成员，除非指示相反情况或从上下文中明显看出。本发明包括其中对于给定产品或过程存在、使用或以其他方式相关的恰好一个组成员的实施方案。本发明包括其中对于给定产品或过程存在、使用或以其他方式相关的多于一个或所有组成员的实施方案。
此外，本发明涵盖其中将来自一个或更多个所列权利要求的限制、元素、条款和描述性术语引入到另一个权利要求中的所有变形、组合和排列。例如，可以对从属于另一权利要求的任何权利要求进行修改，以包含在从属于相同基础权利要求的任何其他权利要求中发现的一个或更多个限制。在元素以列表形式提出时，例如马库什组格式，则还公开了元素的每个子组，并且可以从组中删除任何元素。应当理解，通常，在将本发明或本发明的方面称为包含特定元素和/或特征的情况下，则本发明的某些实施方案或本发明的方面由或基本上由这样的元素和/或特征组成。为了简单起见，这些实施方案未在本文言语中明确给出。
还应注意，术语“包括”和“包含”旨在是开放式的，并允许包括另外的元素或步骤。在给出范围的情况下，包括端点。此外，除非另外指出或者从上下文中或根据本领域普通技术人员的理解另外明显的，作为范围表达的值在本发明的不同实施方案中可以假定为所述范围内的任何特定值或子范围，直到该范围的下限单位的十分之一，除非上下文另有明确规定。
本申请涉及多个已发布的专利、公开的专利申请、期刊文章和其他出版物，所有这些均通过引用并入本文。如果在任何并入的参考文献与本说明书之间存在冲突，则以本说明书为准。另外，落入现有技术范围内的本发明的任何特定实施方案可以明确地从任意一个或更多个权利要求中排除。因为这样的实施方案被认为是本领域普通技术人员已知的，所以即使本文未明确提出排除，也可以将它们排除。本发明的任何特定实施方案可以出于任何原因从任何权利要求中排除，无论与现有技术的存在是否有关。
本领域技术人员将认识到或者仅使用常规实验就能够确定本文所述的具体实施方案的许多等同方案。本文所述的本发明实施方案的范围不旨在限于上述描述，而是在所附权利要求书中给出。本领域普通技术人员将理解，可以在不背离所附权利要求书所限定的本发明的精神或范围的情况下对该描述进行多种改变和修改。

Claims (86)

1.分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含重组腺相关病毒(rAAV)载体基因组，其可以包装在病毒衣壳中以形成rAAV病毒体，其中所述rAAV载体基因组包含以下或由以下组成：
(a)5’AAV末端反向重复(ITR)；
(b)表达盒，其中所述所述表达盒包含至少(i)在靶细胞中有活性的启动子，其与(ii)可操作地连接，(ii)编码ATP结合盒亚家族D成员1(ABCD1)多肽的多核苷酸，(iii)一个或更多个终止子，和(iv)所述ABCD1编码多核苷酸下游的一个或更多个poly A信号；以及
(c)3’ITR，
并且其中所述rAAV载体基因组不包含土拨鼠转录后调节元件(WPRE)或包含经修饰的WPRE，所述经修饰的WPRE包含导致X蛋白不表达或以失活形式表达的至少一个突变，
任选地其中所述5’ITR和3’ITR来源于AAV2、AAV9或AAV AAVrh10的5’ITR和3’ITR。
2.权利要求1所述的分离的多核苷酸，其不包含WPRE。
3.权利要求1或2所述的分离的多核苷酸，其中：
(i)所述5’ITR来源于AAV2的5’ITR；和/或
(ii)所述3’ITR来源于AAV2的3’ITR，
任选地其中：
(i)所述5’ITR包含SEQ ID NO:301、401、601、611、10001、10101或10201的核酸序列；和/或
(ii)所述3’ITR包含SEQ ID NO:302、402、602、612、10018、10118或10218的核酸序列。
4.权利要求1或2所述的分离的多核苷酸，其中：
(i)所述5’ITR是AAV2的5’ITR的截短形式；和/或
(ii)所述3’ITR是AAV2的3’ITR的截短形式，
任选地其中：
(i)所述5’ITR的截短形式包含SEQ ID NO:2、10501、11001、11101、11201、11301、11501或11701的核酸序列；和/或
(ii)所述3’ITR的截短形式包含SEQ ID NO:28、10518、11018、11118、11218、11318、11518或11718的核酸序列。
5.权利要求1至4中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述靶细胞包含神经元或胶质细胞。
6.权利要求1至5中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述启动子选自巨细胞病毒(CMV)即早期启动子，病毒猿病毒40(SV40)(例如，早期或晚期)，莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)LTR启动子，劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR，单纯疱疹病毒(HSV)(胸苷激酶)启动子，来自牛痘病毒的H5、P7.5和PI 1启动子，延伸因子1-α(EF1a)启动子，早期生长反应1(EGR1)，铁蛋白H(FerH)，铁蛋白L(FerL)，甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)，真核翻译起始因子4A1(EIF4A1)，热休克70kDa蛋白5(HSPA5)，热休克蛋白90kDaβ成员1(HSP90B1)，热休克蛋白70kDa(HSP70)，β-驱动蛋白(β-KΙΝ)，人ROSA 26基因座，泛素C启动子(UBC)，磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子，鸡β-肌动蛋白(CAG)启动子，β-肌动蛋白启动子、任选地鸡β-肌动蛋白启动子；组织特异性启动子，B29启动子，runt转录因子(CBFa2)启动子，CD14启动子，CD43启动子，CD45启动子，CD68启动子，CYP450 3A4启动子，结蛋白启动子，弹性蛋白酶1启动子，内皮联蛋白启动子，成纤维细胞特异性蛋白1启动子(FSP1)启动子，纤连蛋白启动子，fms相关酪氨酸激酶1(FLT1)启动子，胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)启动子，胰岛素启动子，整合素，α2b(ITGA2B)启动子，胞内黏附分子2(ICAM-2)启动子，干扰素β(IFN-β)启动子，角蛋白5启动子(角质形成细胞表达)，肌红蛋白(MB)启动子，肌原性分化1(MYOD1)启动子，肾病蛋白启动子，骨γ-羧基谷氨酸蛋白2(OG-2)启动子，3-含氧酸CoA转移酶2B(Oxct2B)启动子，表面活性蛋白B(SP-B)启动子，突触蛋白启动子，威斯科特-奥尔德里奇综合征蛋白(WASP)启动子，Jet启动子，葡糖醛酸糖苷酶β(GUSB)启动子或MND启动子。
7.权利要求1至5中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述启动子包含鸡β-肌动蛋白启动子，任选地其中所述鸡β-肌动蛋白启动子包含SEQ ID NO:10、10007、10107、10207、10507、11007、11107、11207、11307、11507或11707的核酸序列，或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
8.权利要求1至7中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述启动子与增强子可操作地连接，其中所述增强子选自CMV增强子、RSV增强子、LSP增强子、APB增强子、ABPS增强子、en34增强子、ApoE增强子、甲胎蛋白增强子、TTR增强子、αmic/bik增强子或骨髓增殖性肉瘤病毒增强子。
9.权利要求1至8中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述启动子与CMV增强子可操作地连接，任选地其中所述CMV增强子包含SEQ ID NO:7、10005、10105、10205、10505、11005、11105、11205、11305、11505或11705的核酸序列，或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
10.权利要求1至5中任一项所述的分离的多核苷酸，其包含CMV增强子、鸡β-肌动蛋白启动子、β-肌动蛋白外显子、嵌合内含子和兔β-球蛋白外显子，任选地在从5’端到3’端的方向上，其中所述启动子是鸡β-肌动蛋白启动子，
任选地其中：
(i)所述CMV增强子包含SEQ ID NO:7、10005、10105、10205、10505、11005、11105、11205、11305、11505或11705的核酸序列，或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列；
(ii)所述鸡β-肌动蛋白启动子包含SEQ ID NO:10、10007、10107、10207、10507、11007、11107、11207、11307、11507或11707的核酸序列，或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列；
(iii)所述β-肌动蛋白外显子包含SEQ ID NO:11、10008、10108、10208、10508、11008、11108、11208、11308、11508或11708的核酸序列，或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列；和/或
(iv)所述嵌合内含子包含SEQ ID NO:12、10009、10109、10209、10509、11009、11109、11209、11309、11509或11709的核酸序列，或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，
(v)所述兔β-球蛋白外显子包含SEQ ID NO:10085、10185、10285、10585、11085、11185、11285、11385、11585或11785的核酸序列，或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
11.权利要求1至10中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述ABCD1多肽包含由以下编码的氨基酸序列：SEQ ID NO:14、204、304、404、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、10012、10112、10212、10512、11012、11112、11212、11312、11512或11712的核酸序列，或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
12.权利要求1至11中任一项所述的分离的多核苷酸，其中ABCD1编码序列包含相对于SEQ ID NO:204的核酸序列降低数量的替代开放阅读框或不包含任何替代开放阅读框。
13.权利要求1至12中任一项所述的分离的多核苷酸，其中ABCD1编码序列主要(超过50％、60％、70％、80％、90％或95％)或完全由人优选密码子构成。
14.权利要求1至13中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述ABCD1编码多核苷酸包含SEQ ID NO:14、204、304、404、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、10012、10112、10212、10512、11012、11112、11212、11312、11512或11712的核酸序列，或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
15.权利要求1至14中任一项所述的分离的多核苷酸，其还包含紧邻所述ABCD1编码多核苷酸上游的科扎克序列，任选地其中所述科扎克序列包含SEQ ID NO:10511、11211或11311的核酸序列，或代表最佳蛋白质翻译起始的共有序列的近似物：‘GCCRCCATGG的任何序列。
16.权利要求1至15中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述终止子选自UAG、UAA和/或UGA，任选地其中所述终止子包含SEQ ID NO:10071、10171、10271、10571、11071、11171、11271、11371、11571或11771的核酸序列，还任选地其中所述终止子还包含SEQ ID NO:10572、11272或11372的核酸序列。
17.权利要求1至16中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述poly A信号包含SV40poly A信号，任选地其中所述SV40 poly A信号包含SEQ ID NO:27、10014、10114、10214、10514、11014、11214或11714的核酸序列，或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
18.权利要求1至16中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述poly A信号包含bGHpoly A信号，任选地其中所述bGH poly A信号包含SEQ ID NO:10016、10116、10216、11016、11116、11216、11316、11516或11716的核酸序列，或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
19.权利要求1至16中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述poly A信号包含SEQ IDNO:206、306、405、10035、10135、10235、11035、11235或11735的核酸序列，或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
20.权利要求1至19中任一项所述的分离的多核苷酸，其中：
在(a)中，所述5’ITR包含SEQ ID NO:301、401、601、611、10001、10101、10201、2、10501、11001、11101、11201、11301、1501或11701的核酸序列；
在(b)中，
(i)所述启动子包含SEQ ID NO:10、10007、10107、10207、10507、11007、11107、11207、11307、11507或11707的核酸序列，
(ii)所述ABCD1编码多核苷酸包含SEQ ID NO:14、204、304、404、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、10012、10112、10212、10512、11012、11112、11212、11312、11512或11712的核酸序列，并且
(iii)所述poly A信号包含SEQ ID NO:27、10014、10114、10214、10514、11014、11214、11714、10016、10116、10216、11016、11116、11216、11316、11516、11716、206、306、405、10035、10135、10235、11035、11235或11735的核酸序列；以及
在(c)中，所述3’ITR包含SEQ ID NO:302、402、602、612、10018、10118、10218、28、10518、11018、11118、11218、11318、11518或11718的核酸序列。
21.权利要求1至20中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述rAAV载体基因组包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:300、400、10050、10150、10250、10550、11050、11150、11250、11350、11550、11750、10060、10160、10260、10560、11060、11160、11260、11360、11560或11760的核酸序列，或SEQ ID NO:100的核酸序列的核苷酸1至3713，或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
22.权利要求2或3至19中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述rAAV载体基因组还包含经修饰的土拨鼠转录后调节元件(WPRE)，其包含消除所述X蛋白的表达或者导致失活或非功能性X蛋白的表达的至少一个突变，
任选地，其中所述失活或非功能性X蛋白是截短的X蛋白，
还任选地，其中所述经修饰的WPRE包含SEQ ID NO:305或10075的核酸序列。
23.权利要求22所述的分离的多核苷酸，其中所述rAAV载体基因组包含SEQ ID NO:300、10050或10060的核酸序列或由其组成。
24.权利要求1至23中任一项所述的分离的多核苷酸，其是质粒，
任选地所述质粒编码抗生素抗性基因，任选地其中所述抗生素抗性基因是卡那霉素抗性基因，
还任选地，其中所述质粒包含pUC57或pUC118骨架。
25.权利要求1至24中任一项所述的分离的多核苷酸，其包含以下、由以下组成或来源于以下：质粒pSBT101(SEQ ID NO:10100)、pOB1005SEQ ID NO:10500)、pOB1010(SEQ IDNO:11000)、pOB1011(SEQ ID NO:11100)、pOB1012(SEQ ID NO:11200)、pOB1013(SEQ IDNO:11300)、pOB1015(SEQ ID NO:11500)或pOB1017(SEQ ID NO:11700)。
26.权利要求1至25中任一项所述的分离的多核苷酸，其包含以下或由以下组成：SEQID NO:100、10000、10100、10200、10500、11000、11100、11200、11300、11500或11700的核酸序列，或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
27.组合物，其包含：
(A)根据前述权利要求中任一项所述的分离的多核苷酸，
任选地还包含以下中的任意一项或更多项：
(B)转染试剂；
(C)包含AAV衣壳(cap)基因的多核苷酸；
(D)包含AAV复制(rep)基因的多核苷酸；
(E)包含选自E1、E2、E4和VA RNA的腺病毒辅助基因的多核苷酸；或者
(F)可药用载体或赋形剂，
还任选地其中：
(i)所述AAV cap基因是或来源于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9和AAVrh10的cap基因，优选AAV2、AAV9或AAVrh10的cap基因；和/或
(ii)所述AAV rep基因是或来源于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9和AAVrh10的cap基因，优选AAV2、AAV9或AAVrh10的rep基因。
28.权利要求27所述的组合物，其中：
(I)所述AAV cap基因是AAV9的cap基因或来源于AAV9的cap基因，任选地其中所述cap基因编码AAV9 VP1衣壳蛋白、AAV9 VP2衣壳蛋白和/或AAV9 VP3衣壳蛋白，还任选地其中：
(I-1)所述AAV9 VP1衣壳蛋白包含SEQ ID NO:731的氨基酸序列或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，
(I-2)所述AAV9 VP2衣壳蛋白包含SEQ ID NO:732的氨基酸序列或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，和/或
(I-3)所述AAV9 VP3衣壳蛋白包含SEQ ID NO:733的氨基酸序列或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；
(II)所述AAV cap基因是AAV2的cap基因或来源于AAV2的cap基因，任选地其中所述cap基因编码AAV2 VP1衣壳蛋白、AAV2 VP2衣壳蛋白和/或AAV2 VP3衣壳蛋白，还任选地其中：
(II-1)所述AAV2 VP1衣壳蛋白包含SEQ ID NO:831的氨基酸序列或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，
(II-2)所述AAV2 VP2衣壳蛋白包含SEQ ID NO:832的氨基酸序列或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，和/或
(II-3)所述AAV2 VP3衣壳蛋白包含SEQ ID NO:833的氨基酸序列或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；或者
(II)所述AAV cap基因是AAVrh10的cap基因或来源于AAVrh10的cap基因，任选地其中所述cap基因编码AAVrh10 VP1衣壳蛋白、AAVrh10 VP2衣壳蛋白和/或AAVrh10 VP3衣壳蛋白，还任选地其中：
(II-1)所述AAVrh10 VP1衣壳蛋白包含SEQ ID NO:931的氨基酸序列或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，
(II-2)所述AAVrh10 VP2衣壳蛋白包含SEQ ID NO:932的氨基酸序列或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，和/或
(II-3)所述AAVrh10 VP3衣壳蛋白包含SEQ ID NO:933的氨基酸序列或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
29.权利要求27或28所述的组合物，其中所述AAV rep基因：
(i)在AAV p5启动子和/或AAV p19启动子下编码；和/或
(ii)编码AAV REP78复制蛋白、AAV REP68复制蛋白、AAV REP52复制蛋白和/或AAVREP40复制蛋白中的一种或更多种，
任选地其中：
(i)AAV REP78的转录由所述AAVp5启动子控制；
(ii)AAV REP68的转录由所述AAVp5启动子控制；
(iii)AAV REP52的转录由所述AAVp19启动子控制；和/或
(iv)AAV REP40的转录由所述AAVp19启动子控制。
30.权利要求27至29中任一项所述的组合物，其中所述AAV rep基因是AAV2的rep基因或来源于AAV2的rep基因，
任选地其中：
(I)所述rep基因的转录由AAV2 p5启动子和/或AAV2 p19启动子控制；和/或
(II)所述rep基因编码：
(i)AAV2 REP78，任选地其中转录由AAV2 p5启动子控制；
(ii)AAV2 REP68，任选地其中转录由AAV2 p5启动子控制；
(iii)AAV2 REP52，任选地其中转录由AAV2 p19启动子控制；和/或
(iv)AAV2 REP40，任选地其中转录由AAV2 p19启动子控制，还任选地其中：
(I)所述AAV2 p5启动子包含SEQ ID NO:710的核酸序列或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，和/或所述AAV2p19启动子包含SEQ ID NO:720的核酸序列或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列；和/或
(II)(i)所述AAV2 REP78包含SEQ ID NO:711的氨基酸序列或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，(ii)所述AAV2 REP68包含SEQ ID NO:712的氨基酸序列或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，(iii)所述AAV2 REP52包含SEQ ID NO:721的氨基酸序列或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，和/或(iv)所述AAV2 REP40包含SEQ ID NO:722的氨基酸序列或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
31.权利要求27至30中任一项所述的组合物，其中所述cap基因和所述rep基因由质粒编码，任选地其中所述质粒是AAV2/9质粒，还任选地所述质粒包含SEQ ID NO:700的核酸序列或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
32.权利要求27至31中任一项所述的组合物，其中所述腺病毒辅助基因包含：
(I)区域VA-RNA，其任选地包含：(i)VA-RNA区域I和/或(ii)VA-RNA区域II；
(II)区域E2，其任选地编码：(i)六邻体，(ii)23K内切蛋白酶，(iii)E2A/DBP，(iv)六邻体装配体(100K)，(v)六邻体装配体(33K)，(vi)六邻体装配体(22K)，和/或(vii)六邻体相关前体；和/或
(III)区域E4，其任选地编码：(i)纤维，(ii)E4 ORF1，(iii)E4 ORF2，(iv)E4 ORF3，(v)E4 ORF4，(vi)E4 ORF6，和/或(vii)E4 ORF6/7。
33.权利要求32所述的组合物，其中所述腺病毒辅助基因是腺病毒5(Ad5)的基因或来源于腺病毒5(Ad5)的基因，其任选地包含：
(I)Ad5区域VA-RNA，任选地其中所述Ad5区域VA-RNA包含SEQ ID NO:2010的核酸序列和/或包含：(i)VA-RNA区域I，其任选地包含SEQ ID NO:2011的核酸序列；和/或(ii)VA-RNA区域II，其任选地包含SEQ ID NO:2012的核酸序列；
(II)Ad5区域E2，任选地其中所述Ad5区域E2包含SEQ ID NO:2020的核酸序列和/或编码：(i)六邻体，其任选地包含SEQ ID NO:2021的氨基酸序列；(ii)23K内切蛋白酶，其任选地包含SEQ ID NO:2022的氨基酸序列；(iii)E2A/DBP，其任选地包含SEQ ID NO:2023的氨基酸序列；(iv)六邻体装配体(100K)，其任选地包含SEQ ID NO:2024的氨基酸序列；(v)六邻体装配体(33K)，其任选地包含SEQ ID NO:2025的氨基酸序列；(vi)六邻体装配体(22K)，其任选地包含SEQ ID NO:2026的氨基酸序列；和/或(vii)六邻体相关前体，其任选地包含SEQ ID NO:2027的氨基酸序列；和/或
(III)Ad5区域E4，任选地其中所述Ad5区域E4包含SEQ ID NO:2030的核酸序列和/或编码：(i)纤维，其任选地包含SEQ ID NO:2031的氨基酸序列；(ii)E4 ORF1，其任选地包含SEQID NO:2032的氨基酸序列；(iii)E4 ORF2，其任选地包含SEQ ID NO:2033的氨基酸序列；(iv)E4 ORF3，其任选地包含SEQ ID NO:2034的氨基酸序列；(v)E4 ORF4，其任选地包含SEQID NO:2035的氨基酸序列；(vi)E4 ORF6，其任选地包含SEQ ID NO:2036的氨基酸序列；和/或(vii)E4 ORF6/7，其任选地包含SEQ ID NO:2037的氨基酸序列。
34.权利要求32所述的组合物，其中所述腺病毒辅助基因是腺病毒2(Ad2)或来源于腺病毒2(Ad2)，其任选地包含：
(I)Ad2区域VA-RNA，任选地其中所述Ad2区域VA-RNA包含SEQ ID NO:3010的核酸序列和/或包含：(i)VA-RNA区域I，其任选地包含SEQ ID NO:3011的核酸序列；和/或(ii)VA-RN区域II，其任选地包含SEQ ID NO:3012的核酸序列；
(II)Ad2区域E2，任选地其中所述Ad2区域E2包含SEQ ID NO:3020的核酸序列和/或编码：(i)23K内切蛋白酶，其任选地包含SEQ ID NO:3022的氨基酸序列；(ii)E2A/DBP，其任选地包含SEQ ID NO:3023的氨基酸序列；(iii)六邻体装配体(100K)，其任选地包含SEQ IDNO:3024的氨基酸序列；(iv)六邻体装配体(33K)，其任选地包含SEQ ID NO:3025的氨基酸序列；(v)六邻体装配体(22K)，其任选地包含SEQ ID NO:3026的氨基酸序列；和/或(vi)六邻体相关前体，其任选地包含SEQ ID NO:3027的氨基酸序列；和/或
(III)Ad2区域E4，任选地其中所述Ad2区域E4包含SEQ ID NO:3030的核酸序列和/或编码：(i)E4 ORF1，其任选地包含SEQ ID NO:3032的氨基酸序列；(ii)E4 ORF2，其任选地包含SEQ ID NO:3033的氨基酸序列；(iii)E4 ORF3，其任选地包含SEQ ID NO:3034的氨基酸序列；(iv)E4 ORF4，其任选地包含SEQ ID NO:3035的氨基酸序列；(v)E4 ORF6，其任选地包含SEQ ID NO:3036的氨基酸序列；和/或(vi)E4 ORF6/7，其任选地包含SEQ ID NO:3037的氨基酸序列。
35.权利要求32所述的组合物，其中所述腺病毒辅助基因由pALD-X80和/或pHELP_KanV4编码。
36.重组AAV(rAAV)载体，其包含以下或由以下组成：
(I)AAV衣壳；和
(II)根据权利要求1至23所述的rAAV载体基因组的rAAV载体基因组，
任选地，其中所述rAAV载体基因组的核酸序列包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:10050、10150、10550、11050、11150、11250、11350、11550、11750、10060、10160、10560、11060、11160、11260、11360、11560或11760的核酸序列，
还任选地，其中所述AAV衣壳是以下衣壳或来源于以下衣壳：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或AAVrh10衣壳，优选AAV2、AAV9或AAVrh10衣壳，或其变体。
37.权利要求36所述的rAAV载体，其包含：
(i)AAV9衣壳或来源于AAV9衣壳的AAV衣壳，其任选地是AAV9VP1、AAV9 VP2和/或AAV9VP3，还任选地，其中：
(a)所述AAV9 VP1包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:731的氨基酸序列或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；
(b)所述AAV9 VP2包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:732的氨基酸序列或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；和/或
(c)所述AAV9 VP3包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:733的氨基酸序列或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；
(ii)AAV2衣壳或来源于AAV2衣壳的AAV衣壳，其任选地是AAV2VP1、AAV2 VP2和/或AAV2VP3，还任选地其中：
(a)所述AAV2 VP1包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:831的氨基酸序列或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；
(b)所述AAV2 VP2包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:832的氨基酸序列或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；和/或
(c)所述AAV2 VP3包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:833的氨基酸序列或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；
(iii)AAVrh10衣壳或来源于AAVrh10衣壳的AAV衣壳，其任选地是AAVrh10 VP1、AAVrh10 VP2和/或AAVrh10 VP3，还任选地其中：
(a)所述AAVrh10 VP1包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:931的氨基酸序列或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；
(b)所述AAVrh10 VP2包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:932的氨基酸序列或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；和/或
(c)所述AAVrh10 VP3包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:933的氨基酸序列或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
38.适合于体内施用的组合物，其包含：
(A)预防或治疗有效量的根据权利要求36或37所述的rAAV载体；和
(B)可药用载体。
39.权利要求38所述的组合物，其包含约1×1013GC至约1×1015GC的rAAV载体剂量。
40.数种根据权利要求38所述的组合物，其总计包含约1×1013GC至约1×1015GC的rAAV载体总剂量。
41.权利要求38至40中任一项所述的组合物，其中所述rAAV载体剂量包含在约10mL至约150mL的体积中。
42.权利要求38至41中任一项所述的组合物，其中所述rAAV载体剂量包含在约10mL、约20mL、约30mL、约40mL、约50mL、约60mL、约70mL、约80mL、约90mL、约100mL、约110mL、约120mL、约130mL、约140mL、或约150mL的体积中。
43.权利要求38至42中任一项所述的组合物，其适用于鞘内、脑室内(ICV)、鞘内-腰(IT-L)、血管内、肌内或脑池内施用。
44.权利要求38至42中任一项所述的组合物，其适用于鞘内施用。
45.权利要求44所述的组合物，其适合于通过泵进行鞘内施用。
46.在有此需要的对象中治疗或预防肾上腺脑白质营养不良(ALD)和/或肾上腺脊髓神经病(AMN)和/或改善与ALD和/或AMN相关的症状的方法，所述方法包括向有此需要的对象施用预防或治疗有效量的至少一种根据权利要求36或37所述的rAAV载体或者包含其的根据权利要求39至45中任一项所述的组合物。
47.权利要求46所述的方法，其中所述对象是人。
48.权利要求46或47所述的方法，其中所述方法在所述对象中减轻、减少或稳定一种或更多种症状，例如血浆以及脑、脊髓和肾上腺皮质的组织中高水平的饱和极长链脂肪酸(VLCFA)的积累，肾上腺脊髓神经病(AMN)，或由受影响的背根神经节神经元引起的周围神经病。
49.权利要求46至48中任一项所述的方法，其中将所述rAAV载体或包含所述rAAV载体的组合物施用于所述对象。
50.权利要求46至49中任一项所述的方法，其中所述分离的多核苷酸、rAAV载体或组合物通过鞘内、脑室内(ICV)、鞘内-腰(IT-L)、血管内、肌内或脑池内施用来递送。
51.权利要求50所述的方法，其中所述递送是通过鞘内施用进行。
52.权利要求51所述的方法，其中所述鞘内施用由泵介导。
53.权利要求46至52中任一项所述的方法，其中所述rAAV载体的总施用剂量为约1×1013GC至约1×1015GC。
54.权利要求46至53中任一项所述的方法，其中所述分离的多核苷酸、rAAV载体或组合物以约10mL至约150mL的体积施用。
55.权利要求54所述的方法，其中所述分离的多核苷酸、rAAV载体或组合物以约10mL、约20mL、约30mL、约40mL、约50mL、约60mL、约70mL、约80mL、约90mL、约100mL、约110mL、约120mL、约130mL、约140mL、或约150mL、优选约100mL的体积施用。
56.权利要求46至55中任一项所述的方法，其中所述分离的多核苷酸、rAAV载体或组合物以单剂量或多剂量递送。
57.权利要求46至56中任一项所述的方法，其中所述rAAV载体包含AAV9、AAV2或AAVrh10衣壳。
58.权利要求46至57中任一项所述的方法，其中所述分离的多核苷酸的施用使得ABCD1转基因在神经元、神经胶质细胞或者神经元和神经胶质细胞中表达。
59.权利要求46至58中任一项所述的方法，其中所述分离的多核苷酸通过腺病毒载体、单纯疱疹病毒(HSV)载体或腺相关病毒(AAV)载体来递送。
60.权利要求46至59中任一项所述的方法，其中将多剂量的至少一种rAAV载体或包含其的组合物施用于所述对象，其中施用在同一时间或不同时间发生和/或在延长的时间段内发生。
61.制备病毒载体的方法，其包括将根据权利要求1至26中任一项所述的分离的多核苷酸引入包装细胞中，其中任选地所述病毒载体是权利要求36或37所述的rAAV载体，所述方法还包括将以下引入所述包装细胞中：
(a)包含AAV衣壳(cap)基因的多核苷酸；
(b)包含AAV复制(rep)基因的多核苷酸；和/或
(c)包含一种或更多种腺病毒辅助基因，任选地E1、E2、E4和/或VA RNA的多核苷酸。
62.制备病毒载体的方法，其包括培养包含根据权利要求1至26中任一项所述的rAAV载体基因组的包装细胞，任选地其中所述病毒载体是权利要求36或37所述的rAAV载体，还任选地其中所述包装细胞包含：
(a)包含AAV衣壳(cap)基因的多核苷酸；
(b)包含AAV复制(rep)基因的多核苷酸；和/或
(c)包含一种或更多种腺病毒辅助基因，任选地E1、E2、E4和/或VA RNA的多核苷酸。
63.权利要求61或62所述的方法，其中：
(I)所述AAV cap基因是AAV9的cap基因或来源于AAV9的cap基因，任选地其中所述cap基因编码AAV9 VP1衣壳蛋白、AAV9 VP2衣壳蛋白和/或AAV9 VP3衣壳蛋白，还任选地其中：
(I-1)所述AAV9 VP1衣壳蛋白包含SEQ ID NO:731的氨基酸序列或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，
(I-2)所述AAV9 VP2衣壳蛋白包含SEQ ID NO:732的氨基酸序列或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，和/或
(I-3)所述AAV9 VP3衣壳蛋白包含SEQ ID NO:733的氨基酸序列或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；
(II)所述AAV cap基因是AAV2的cap基因或来源于AAV2的cap基因，任选地其中所述cap基因编码AAV2 VP1衣壳蛋白、AAV2 VP2衣壳蛋白和/或AAV2 VP3衣壳蛋白，还任选地其中：
(II-1)所述AAV2 VP1衣壳蛋白包含SEQ ID NO:831的氨基酸序列或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，
(II-2)所述AAV2 VP2衣壳蛋白包含SEQ ID NO:832的氨基酸序列或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，和/或
(II-3)所述AAV2 VP3衣壳蛋白包含SEQ ID NO:833的氨基酸序列或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；或者
(II)所述AAV cap基因是AAVrh10的cap基因或来源于AAVrh10的cap基因，任选地其中所述cap基因编码AAVrh10 VP1衣壳蛋白、AAVrh10 VP2衣壳蛋白和/或AAVrh10 VP3衣壳蛋白，还任选地其中：
(II-1)所述AAVrh10 VP1衣壳蛋白包含SEQ ID NO:931的氨基酸序列或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，
(II-2)所述AAVrh10 VP2衣壳蛋白包含SEQ ID NO:932的氨基酸序列或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，和/或
(II-3)所述AAVrh10 VP3衣壳蛋白包含SEQ ID NO:933的氨基酸序列或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
64.权利要求61至63中任一项所述的方法，其中：
(i)所述AAV rep基因的转录由AAV p5启动子和/或AAV p19启动子控制；和/或
(ii)所述AAV rep基因编码AAV REP78复制蛋白、AAV REP68复制蛋白、AAV REP52复制蛋白和/或AAV REP40复制蛋白中的一种或更多种，
任选地其中：
(i)AAV REP78的转录由所述AAVp5启动子控制；
(ii)所述AAV REP68的转录由所述AAVp5启动子控制；
(iii)所述AAV REP52的转录由所述AAVp19启动子控制；和/或
(iv)所述AAV REP40的转录由所述AAVp19启动子控制。
65.权利要求61至64中任一项所述的方法，其中所述AAV rep基因是AAV2的rep基因或来源于AAV2的rep基因，
任选地其中：
(I)所述rep基因的转录由AAV2 p5启动子和/或AAV2 p19启动子控制；和/或
(II)所述rep基因编码：
(i)AAV2 REP78，任选地其中转录由AAV2 p5启动子控制；
(ii)AAV2 REP68，任选地其中转录由AAV2 p5启动子控制；
(iii)AAV2 REP52，任选地其中转录由AAV2 p19启动子控制；和/或
(iv)AAV2 REP40，任选地其中转录由AAV2 p19启动子控制，
还任选地其中：
(I)所述AAV2 p5启动子包含SEQ ID NO:710的核酸序列或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，和/或所述AAV2p19启动子包含SEQ ID NO:720的核酸序列或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列；和/或
(II)(i)所述AAV2 REP78包含SEQ ID NO:711的氨基酸序列或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，(ii)所述AAV2 REP68包含SEQ ID NO:712的氨基酸序列或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，(iii)所述AAV2 REP52包含SEQ ID NO:721的氨基酸序列或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，和/或(iv)所述AAV2 REP40包含SEQ ID NO:722的氨基酸序列或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
66.权利要求61至65中任一项所述的方法，其中所述cap基因和所述rep基因由质粒编码，任选地其中所述质粒是AAV2/9质粒，还任选地所述质粒包含SEQ ID NO:700的核酸序列或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
67.权利要求61至66中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种腺病毒辅助基因包含：
(I)区域VA-RNA，其任选地包含：(i)VA-RNA区域I和/或(ii)VA-RNA区域II；
(II)区域E2，其任选地编码：(i)六邻体，(ii)23K内切蛋白酶，(iii)E2A/DBP，(iv)六邻体装配体(100K)，(v)六邻体装配体(33K)，(vi)六邻体装配体(22K)，和/或(vii)六邻体相关前体；和/或
(III)区域E4，其任选地编码：(i)纤维，(ii)E4 ORF1，(iii)E4 ORF2，(iv)E4 ORF3，(v)E4 ORF4，(vi)E4 ORF6，和/或(vii)E4 ORF6/7。
68.权利要求61至67中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种腺病毒辅助基因是或来源于腺病毒5(Ad5)，其任选地包含：
(I)Ad5区域VA-RNA，任选地其中所述Ad5区域VA-RNA包含SEQ ID NO:2010的核酸序列和/或包含：(i)VA-RNA区域I，其任选地包含SEQ ID NO:2011的核酸序列；和/或(ii)VA-RNA区域II，其任选地包含SEQ ID NO:2012的核酸序列；
(II)Ad5区域E2，任选地其中所述Ad5区域E2包含SEQ ID NO:2020的核酸序列和/或编码：(i)六邻体，其任选地包含SEQ ID NO:2021的氨基酸序列；(ii)23K内切蛋白酶，其任选地包含SEQ ID NO:2022的氨基酸序列；(iii)E2A/DBP，其任选地包含SEQ ID NO:2023的氨基酸序列；(iv)六邻体装配体(100K)，其任选地包含SEQ ID NO:2024的氨基酸序列；(v)六邻体装配体(33K)，其任选地包含SEQ ID NO:2025的氨基酸序列；(vi)六邻体装配体(22K)，其任选地包含SEQ ID NO:2026的氨基酸序列；和/或(vii)六邻体相关前体，其任选地包含SEQ ID NO:2027的氨基酸序列；和/或
(III)Ad5区域E4，任选地其中所述Ad5区域E4包含SEQ ID NO:2030的核酸序列和/或编码：(i)纤维，其任选地包含SEQ ID NO:2031的氨基酸序列；(ii)E4 ORF1，其任选地包含SEQID NO:2032的氨基酸序列；(iii)E4 ORF2，其任选地包含SEQ ID NO:2033的氨基酸序列；(iv)E4 ORF3，其任选地包含SEQ ID NO:2034的氨基酸序列；(v)E4 ORF4，其任选地包含SEQID NO:2035的氨基酸序列；(vi)E4 ORF6，其任选地包含SEQ ID NO:2036的氨基酸序列；和/或(vii)E4 ORF6/7，其任选地包含SEQ ID NO:2037的氨基酸序列。
69.权利要求61至68中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种腺病毒辅助基因是腺病毒2(Ad2)或来源于腺病毒2(Ad2)，其任选地包含：
(I)Ad2区域VA-RNA，任选地其中所述Ad2区域VA-RNA包含SEQ ID NO:3010的核酸序列和/或包含：(i)VA-RNA区域I，其任选地包含SEQ ID NO:3011的核酸序列；和/或(ii)VA-RN区域II，其任选地包含SEQ ID NO:3012的核酸序列；
(II)Ad2区域E2，任选地其中所述Ad2区域E2包含SEQ ID NO:3020的核酸序列和/或编码：(i)23K内切蛋白酶，其任选地包含SEQ ID NO:3022的氨基酸序列；(ii)E2A/DBP，其任选地包含SEQ ID NO:3023的氨基酸序列；(iii)六邻体装配体(100K)，其任选地包含SEQ IDNO:3024的氨基酸序列；(iv)六邻体装配体(33K)，其任选地包含SEQ ID NO:3025的氨基酸序列；(v)六邻体装配体(22K)，其任选地包含SEQ ID NO:3026的氨基酸序列；和/或(vi)六邻体相关前体，其任选地包含SEQ ID NO:3027的氨基酸序列；和/或
(III)Ad2区域E4，任选地其中所述Ad2区域E4包含SEQ ID NO:3030的核酸序列和/或编码：(i)E4 ORF1，其任选地包含SEQ ID NO:3032的氨基酸序列；(ii)E4 ORF2，其任选地包含SEQ ID NO:3033的氨基酸序列；(iii)E4 ORF3，其任选地包含SEQ ID NO:3034的氨基酸序列；(iv)E4 ORF4，其任选地包含SEQ ID NO:3035的氨基酸序列；(v)E4 ORF6，其任选地包含SEQ ID NO:3036的氨基酸序列；和/或(vi)E4 ORF6/7，其任选地包含SEQ ID NO:3037的氨基酸序列。
70.权利要求61至69中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种腺病毒辅助基因由pALD-X80和/或pHELO_KanV4编码。
71.细胞，其包含根据权利要求1至26中任一项所述的rAAV载体基因组，任选地其中所述细胞包含：(a)包含AAV衣壳(cap)基因的多核苷酸；
(b)包含AAV复制(rep)基因的多核苷酸；和/或
(c)包含一种或更多种腺病毒辅助基因，任选地E1、E2、E4和/或VA RNA的多核苷酸。
72.权利要求71所述的细胞，其中：
(a)所述AAV cap基因是根据权利要求63所述的AAV cap基因；
(b)所述AAV rep基因是根据权利要求64或65所述的AAV rep基因；和/或
(c)所述一种或更多种腺病毒辅助基因是权利要求67至69中任一项所述的一种或更多种腺病毒辅助基因，
任选地其中：
(i)所述cap基因和所述rep基因由质粒编码，任选地其中所述质粒是AAV2/9质粒，还任选地所述质粒包含SEQ ID NO:700的核酸序列或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列；和/或
(ii)所述一种或更多种腺病毒辅助基因由pALD-X80和/或pHELO_KanV4编码。
73.AAV 5’ITR变体，其包含SEQ ID NO:2、10501、11001、11101、11201、11301、11501或11701的核酸序列或由其组成。
74.AAV 3’ITR变体，其包含SEQ ID NO:28、10518、11018、11118、11218、11318、11518或11718的核酸序列或由其组成。
75.分离的多核苷酸，其包含rAAV载体基因组，其中所述rAAV载体基因组包含以下或由以下组成：
(a)权利要求73所述的AAV 5’ITR变体；
(b)表达盒，其中所述表达盒包含至少(i)在靶细胞中有活性的启动子，其与(ii)可操作地连接，(ii)编码目的基因(GOI)的多核苷酸，(iii)一个或更多个终止子，和(iv)所述GOI编码多核苷酸下游的一个或更多个poly A信号；和
(c)权利要求74所述的AAV 3’ITR变体。
76.权利要求75所述的分离的多核苷酸，其是质粒，任选地其中所述质粒包含pUC118骨架。
77.组合物，其包含：
(A)根据权利要求75或76所述的分离的多核苷酸，
任选地还包含以下中的任意一项或更多项：
(B)转染试剂；
(C)包含AAV衣壳(cap)基因的多核苷酸；
(D)包含AAV复制(rep)基因的多核苷酸；
(E)包含选自E1、E2、E4和/或VA RNA的一种或更多种腺病毒辅助基因的多核苷酸；或者
(F)可药用载体或赋形剂，
还任选地其中：
(i)所述AAV cap基因来源于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9和AAVrh10的cap基因，优选AAV2、AAV9或AAVrh10的cap基因；和/或
(ii)所述AAV rep基因来源于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9和AAVrh10的rep基因，优选AAV2、AAV9或AAVrh10的rep基因。
78.权利要求77所述的组合物，其中：
(a)所述AAV cap基因是根据权利要求63所述的AAV cap基因；
(b)所述AAV rep基因是根据权利要求64或65所述的AAV rep基因；和/或
(c)所述一种或更多种腺病毒辅助基因是根据权利要求67至69所述的一种或更多种腺病毒辅助基因，
任选地其中：
(i)所述cap基因和所述rep基因由质粒编码，任选地其中所述质粒是AAV2/9质粒，还任选地所述质粒包含SEQ ID NO:700的核酸序列或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列；和/或
(ii)所述一种或更多种腺病毒辅助基因由pALD-X80和/或pHELO_KanV4编码。
79.包含权利要求75或76所述的分离的多核苷酸的细胞，任选地为包装细胞，还任选地其中所述细胞包含编码AAV cap和/或AAV rep的多核苷酸。
80.rAAV载体，其包含以下或由以下组成：
(I)AAV衣壳；和
(II)根据权利要求75或76中任一项所述的rAAV载体基因组，
任选地，其中所述AAV衣壳是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或AAVrh10衣壳，优选AAV2、AAV9或AAVrh10衣壳，或其变体。
81.rAAV载体，其中所述AAV衣壳是根据权利要求36或37所述的AAV衣壳。
82.适用于体内施用的一种或更多种组合物，其包含：
(A)预防或治疗有效量的根据权利要求80或81所述的rAAV载体；和
(B)可药用载体。
83.在有此需要的对象中进行基因治疗的方法，其包括向有此需要的对象施用预防或治疗有效量的至少一种根据权利要求80或81所述的rAAV载体或者根据权利要求82所述的一种或更多种组合物。
84.制备病毒载体的方法，其包括将根据权利要求75或76所述的分离的多核苷酸引入包装细胞中，
任选地其中所述病毒载体是根据权利要求80或81所述的rAAV，
并且任选地所述方法还包括将以下引入所述包装细胞中：
(a)包含AAV衣壳(cap)基因的多核苷酸；
(b)包含AAV复制(rep)基因的多核苷酸；和/或
(c)包含一种或更多种腺病毒辅助基因，任选地E1、E2、E4和/或VA RNA的多核苷酸。
85.制备病毒载体的方法，其包括培养包含根据权利要求75或76中任一项所述的rAAV载体基因组的包装细胞，
任选地，其中所述病毒载体是权利要求80或81所述的rAAV载体，还任选地其中所述包装细胞包含：
(a)包含AAV衣壳(cap)基因的多核苷酸；
(b)包含AAV复制(rep)基因的多核苷酸；和/或
(c)包含一种或更多种腺病毒辅助基因，任选地E1、E2、E4和/或VA RNA的多核苷酸。
86.权利要求84或85所述的方法，其中：
(a)所述AAV cap基因是根据权利要求63所述的AAV cap基因；
(b)所述AAV rep基因是根据权利要求64或65所述的AAV rep基因；和/或
(c)所述一种或更多种腺病毒辅助基因是权利要求67至69中任一项所述的一种或更多种腺病毒辅助基因，
任选地其中：
(i)所述cap基因和所述rep基因由质粒编码，任选地其中所述质粒是AAV2/9质粒，还任选地所述质粒包含SEQ ID NO:700的核酸序列或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列；和/或
(ii)所述一种或更多种腺病毒辅助基因由pALD-X80和/或pHELO_KanV4编码。
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