CN108472264A - 编码用于治疗肾上腺脊髓神经病的abcd1的核酸序列的鞘内递送 - Google Patents

编码用于治疗肾上腺脊髓神经病的abcd1的核酸序列的鞘内递送 Download PDF

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Abstract

本发明的方法涵盖编码ABCD1的核酸序列的递送，用于治疗X连锁肾上腺脑白质营养不良(X‑ALD)，例如用于治疗肾上腺脊髓神经病(AMN)。

Description

编码用于治疗肾上腺脊髓神经病的ABCD1的核酸序列的鞘内 递送
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年11月5日提交的美国临时申请序列号62/251,208的权益，和2016年2月26日提交的美国临时申请序列号62/300,691的权益。上述申请的全部披露内容通过援引并入本文。
联邦资助的研究或开发
本工作得到了来自美国国立卫生研究院的以下拨款的支持，拨款号：R21NS081374-01和R01NS072446-01。美国政府享有本发明的一定的权利。
发明背景
X连锁肾上腺脑白质营养不良(X-ALD)是由ABCD1基因突变引起的一种进行性遗传疾病，所述基因编码负责转运CoA激活的超长链脂肪酸(very long-chainfatty acid，VLCFA)进入过氧化物酶体进行降解的过氧化物酶体ATP结合盒转运蛋白(ABCD1)，所述降解导致血浆以及脑和肾上腺皮质组织中饱和的超长链脂肪酸(VLCFA)的高水平积累。症状可以开始于童年或成年。成人ALD患者典型地在二十多岁时发展为肾上腺脊髓神经病(AMN)，这是一种使人虚弱的神经障碍(Engelen等人.，Orphanet J Rare Dis.2012；7:51)。Abcd1-/-小鼠发展成与AMN类似的表型，表现为脊髓轴突退化以及由受影响的背根神经节神经元(DRG)引起的周围神经病(Pujol等人.，Hum Mol Genet.[人类分子遗传学]2002；11:499-505)。先前报道了使用用于递送人类ABCD1基因的重组腺相关病毒血清型9(rAAV9)载体的体外和体内中枢神经系统细胞的转导。不幸地，由于转基因过表达，年轻小鼠的静脉内递送与心脏毒性相关。非常希望在患有X-ALD或AMN的患者中提供无毒水平的ABCD1的递送系统。
发明概述
从详细说明以及权利要求中，本发明的其他特征和优点将是显而易见的。因而，本发明的其他方面在以下披露内容中描述并且处于本发明的范围内。
在一个方面中，本发明提供了增加培养物中生长的转染生产细胞中腺相关病毒9(AAV9)载体滴度的方法，所述方法包括以下步骤：i)将与编码ATP结合盒亚家族D成员1(ABCD1)的mRNA互补的核酸序列与所述细胞一起孵育，和ii)将包含编码ABCD1的核苷酸序列的AAV9载体转染入所述细胞(AAV9-ABCD1载体)，其中从该AAV9载体表达的ABCD1mRNA的量减少，由此与参比标准品相比，细胞裂解物和/或培养基中的AAV9-ABCD1载体产量增加约1倍至约50倍。
在一个实施例中，与编码ABCD1的mRNA互补的核酸序列是干扰RNA。
在一个实施例中，干扰RNA是shRNA或siRNA。
在另一个实施例中，siRNA包括SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.7或其组合。
在另一个实施例中，参比标准品包括自生产细胞的细胞裂解物和/或培养基中产生的AAV9-ABCD1载体，所述生产细胞未和与编码ABCD1的mRNA互补的核酸序列一起孵育。
在又另一方面，本发明提供治疗有需要的受试者中的X连锁肾上腺脑白质营养不良(X-ALD)的方法，其包括与参比标准品相比，向受试者施用包含从具有增加的AAV9载体滴度的生产细胞获得的纯化的AAV9-ABCD1载体的组合物。
在一个实施例中，通过鞘内施用将包含纯化的AAV9-ABCD1载体的组合物施用于受试者。
在又另一方面，本发明提供了治疗有需要的受试者中的X连锁肾上腺脑白质营养不良(X-ALD)的方法，其包括向受试者施用编码ATP结合盒亚家族D成员1(ABCD1)的腺相关病毒(AAV)载体，其中所述载体通过鞘内施用施用给受试者。
在一个实施例中，鞘内施用由渗透泵介导。
在另一个实施例中，载体的剂量是0.5X 1011GC。
在又另一个实施例中，AAV是AAV9。
在又另一方面，本发明提供了向具有X连锁肾上腺脑白质营养不良(X-ALD)的受试者提供ATP结合盒亚家族D成员1(ABCD1)的方法，包括向受试者施用编码ABCD1的载体，其中所述载体通过鞘内施用施用给受试者，并且其中在中枢神经系统中所述载体的ABCD1表达低于在外周器官中所述载体的ABCD1表达。
在一个实施例中，鞘内施用由渗透泵介导。
在另一个实施例中，载体的剂量是约1x 1013GC至约10x 1013GC。
在又另一个实施例中，载体是腺相关病毒(AAV)载体。
除非另外限定，否则在此所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。在此描述了用于本发明的方法和材料；还可使用本领域已知的其他合适的方法和材料。这些材料、方法、以及实例仅是说明性的，并且不旨在进行限制。此处提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其他参考文献通过引用以其整体结合。在有矛盾的情况下，将以本说明书(包括定义)为准。
附图简要说明
以下详细说明可以结合通过引用方式结合在此的附图一起来理解，所述详细说明通过举例给出但不意在将本发明限于所描述的某些实施例。
图1描绘了来自转染的293T细胞的改良AAV9-ABCD1载体滴度，所述转染的293T细胞与对ABCD1mRNA有特异性的siRNA一起孵育。
图2描绘了与对ABCD1mRNA有特异性的siRNA库一起孵育的AAV-ABCD1转染细胞中ABCD1蛋白的减少。
图3描绘了在细胞裂解物和条件培养基中，来自转染的293T细胞的改良AAV9-ABCD1载体滴度，所述转染的293T细胞与对ABCD1mRNA有特异性的siRNA一起孵育。
图4描绘了经过2分钟的鞘内推注递送之后rAAV9-ABCD1的分布。
图5描绘了经过24小时的鞘内泵输注rAAV9-ABCD1之后rAAV9-ABCD1的分布。
图6描绘了AAV9-ABCD1的低剂量(0.5x 1011gc)推注和泵递送。
图7描绘了与泵输注AAV9-ABCD1相比，推注注射AAV9-ABCD1两周后ABCD1跨外周器官(在CNS外)的较高表达。
图8描绘了AAV9-ABCD1的载体图谱。
图9描述了内源性ABCD1跨不同器官的分布。
图10描述了内源性ABCD1跨不同器官的分布。
图11描绘了IT泵后在Abcd1-/-小鼠中ABCD1的表达。
图12描绘了IT泵后在Abcd1-/-小鼠中ABCD1的表达。
图13描绘了IT泵和PT推注注射15天后的脊髓C26:0水平。
图14描绘了IT泵递送AAV9-hABCD1后不同细胞类型中的ABCD1表达。SC：脊髓；DRG：背根神经节；CD31：内皮标记物；GFAP：星形胶质细胞标记物；IBA1：小神经胶质细胞标记物；TOPRO3：核复染；DRG在神经元中显示表达斑点图案，并且在神经元(卫星细胞)周围更显著。
发明详细说明
定义
除非另外限定，否则在此所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。在矛盾的情况下，本申请(包括定义)将居主导。
“受试者”是脊椎动物，包括哺乳动物纲的任何成员，包括人类、家养动物和农场动物、以及动物园动物、体育动物或宠物动物，例如小鼠、兔、猪、绵羊、山羊、牛和高等灵长类。
如在此所使用的，术语“治疗”(treat、treating、treatment)指的是减少或改善X-ALD，例如肾上腺脊髓神经病(AMN)，和/或与其相关的症状。应理解的是，尽管不排除，治疗X-ALD或AMN并不要求完全消除所述障碍、病症或与其相关的症状。
除非明确规定或从上下文清楚可见，否则如在此所使用的，术语“约(about)”被理解为在本领域的正常公差范围内，例如，在平均数的2个标准偏差之内。“约”被理解为在规定的值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％之内。除非另外从上下文清楚可见，否则在此提供的所有数值均被术语约修饰。
如本文所用，“表达下降”是指受试者外周器官中ABCD1基因表达或蛋白质表达的量比根据本文所述的方法已经施用编码ABCD1的载体的受试者的中枢神经系统中的ABCD1基因表达或蛋白质表达的量至少减少约0.05倍(例如0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、5、10、25、50、100、1000、10,000倍或更少)。当“降低”是指受试者外周器官中的ABCD1基因表达或蛋白质表达时，它还意味着比根据本文所述的方法已施用编码ABCD1的载体的受试者的中枢神经系统中的ABCD1基因表达或蛋白质表达量减少至少约5％(例如5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％)。可以根据本领域已知的用于确定基因表达或蛋白质表达的量的标准方法对量进行测定。
如本文所用，“载体滴度增加”是指用编码ABCD1的载体转染的生产细胞的滴度的量比不与根据本文所述的方法与编码ABCD1的mRNA互补的核酸序列孵育的生产细胞的滴度的量至少增加约0.05倍(例如0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、5、10、25、50、100、1000、10,000倍或更多)。当“增加”是指用编码ABCD1的载体转染的生产细胞的滴度的量(AAV载体的浓度，通常用每毫升中基因组拷贝描述)时，它也意味着比不与根据本文所述的方法与编码ABCD1的mRNA互补的核酸序列孵育的生产细胞的滴度的量至少增加约5％(例如5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％)。可以根据本领域已知的用于确定AAV基因组、转基因表达、或蛋白质表达的量的标准方法对量进行测定。
在此提供的范围被理解为对该范围内的所有值的简写。例如，1到50的范围应当被理解为包括来自下组的任何数字、数字组合或子范围，该组由以下组成：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50(还有其分数，除非上下文另外清晰地指明)。
如本文所用，术语“参比水平”是指另一测试样本与之进行比较的已知样本中的滴度水平。参比水平可以从例如未和与编码ABCD1的mRNA互补的核酸序列或和对照无义寡核苷酸或siRNA一起孵育的生产细胞获得。例如，可以从没有X-ALD的未治疗受试者获得参比水平。“未治疗”是指缺乏施用表达ABCD1转基因的载体的治疗。
在本披露中，“包括(comprise)”、“包括(comprising)”、“含有(containing)”以及“具有(having)”等可以具有在美国专利法中归于它们的含义并且可以意指“包括(include)”、“包括(including)”等；“基本上由...组成(consisting essentially of或consists essentially)”同样具有在美国专利法中指定的含义并且该术语是开放性的，允许超出所叙述的存在，只要所叙述的基本或新颖特征不被超过叙述的存在改变，但是排除现有技术实施例。
其他定义呈现在本披露全篇的上下文中。
组合物和方法
本发明的组合物和方法提供X连锁肾上腺脑白质营养不良(X-ALD)的治疗。X连锁肾上腺脑白质营养不良是由ABCD1基因突变引起的一种遗传疾病，主要发生于男性，且主要影响神经系统和肾上腺。脑髓磷脂和脊髓髓磷脂恶化(脱髓鞘)降低了神经的功能能力。此外，肾上腺(肾上腺皮质)外层的损伤导致某些激素(肾上腺皮质功能不全)的短缺。有几种不同类型的X连锁肾上腺脑白质营养不良，包括儿童脑型、肾上腺脊髓神经病(AMN)型和一种叫做艾迪生病(Addison disease)的形式。如本文所用，X-ALD不包括“新生儿肾上腺脑白质营养不良”，其属于Zellweger谱的过氧化物酶体生物合成障碍并且与ABCD1中的突变无关。用于诊断或鉴定患有X-ALD或AMN受试者的方法是本领域已知的，并且可以包括血浆超长链脂肪酸(VLCFA)水平测量和/或遗传测试；参见，例如，Engelen等人，Orphanet J RareDis.2012；7:51；Aubourg和Chaussain,Horm Res.2003；59Suppl 1:104-5；Steinberg等人，Curr Protoc Hum Genet.2008 17章:17.6单元；Steinberg SJ,Moser AB,Raymond GV.X-Linked Adrenoleukodystrophy[X连锁肾上腺脑白质营养不良]，1999年3月26日[2015年4月9日更新].于:Pagon RA,Adam MP,Ardinger HH,等人，编辑.[互联网].西雅图(WA):华盛顿大学，西雅图；1993-2016.可获得于：ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1315/)。
ABCD1基因中的突变引起X连锁肾上腺脑白质营养不良。ABCD1基因编码肾上腺脑白质营养不良蛋白(ALDP)，该蛋白参与超长链脂肪酸(VLCFA)向过氧化物酶体中的运输。ABCD1基因突变导致ALDP缺乏。当缺少这种蛋白质时，VLCFA的运输和随后的分解被破坏，导致体内这些脂肪的异常高水平。VLCFA的积累可能对肾上腺皮质和髓磷脂有毒。
通过基因疗法纠正遗传缺乏是一种可行的疗法。将ABCD1基因靶向特异性递送至CNS对于避免外周器官中的毒性是必不可少的。这可以通过，例如经由鞘内施用编码ABCD1的腺相关病毒(AAV)载体来实现。
编码ABCD1cDNA及其表达蛋白的序列是众所周知的，并且可以在例如Genbank登录号NG_009022.2和NP_000024.2中找到。
“AAV”是腺相关病毒，且可以用于指重组病毒载体本身或其衍生物。该术语涵盖所有亚型、血清型和假型，以及天然存在的和重组形式两者，除非另有要求。如本文所用，术语“血清型”指基于其血清学由其他AAV鉴定并区别于其他AAV的AAV，例如，存在11种AAV血清型，即AAV1-AAV11，并且该术语涵盖具有相同特性的假型。这些血清型中的许多具有来自其他AAV血清型的独特生物学特性(例如细胞表面受体结合、细胞内运输)。因此，例如，AAV5血清型包括具有AAV5的生物学特性的AAV，例如包含AAV5衣壳的假型AAV和不是从AAV5获得或得自AAV5或基因组是嵌合型的AAV基因组。
“AAV载体”是指由至少一种AAV衣壳蛋白和衣壳化多核苷酸组成的病毒颗粒。如果颗粒包含异源多核苷酸(即，除野生型AAV基因组以外的多核苷酸，例如要递送至哺乳动物细胞的转基因)，则其可以被称为“rAAV(重组AAV)”。AAV“衣壳蛋白”包括野生型AAV的衣壳蛋白以及AAV衣壳蛋白的修饰的形式，其在结构和/或功能上能够包装AAV基因组并结合至少一种特异性细胞受体，所述受体可以与野生型AAV采用的受体不同。修饰的AAV衣壳蛋白包括嵌合AAV衣壳蛋白，如具有来自两种或更多种AAV血清型的氨基酸序列的衣壳蛋白，例如由AAV5的衣壳蛋白(与AAV2的一部分衣壳蛋白融合或连接)的一部分形成的衣壳蛋白，以及具有标签或其他可检测的非AAV衣壳肽或蛋白(融合或连接至AAV衣壳蛋白)的AAV衣壳蛋白，例如与转铁蛋白受体结合的抗体分子的一部分可以重组融合至AAV-2衣壳蛋白。
能够产生AAV的细胞是本领域已知的，并且包括但不限于293细胞、HeLa细胞和昆虫细胞。
在某些实施例中，产生高滴度AAV的方法可用于最大化ABCD1的施用。可以将培养物中生长的转染生产细胞和与编码ATP结合盒亚家族D成员1(ABCD1)的mRNA互补的核酸序列一起孵育并且ii)将包含编码ABCD1的核苷酸序列的AAV载体转染入细胞(例如，AAV9-ABCD1载体)。从AAV载体表达的ABCD1mRNA的量减少，由此与参比标准品相比，细胞裂解物和/或培养基中的AAV-ABCD1载体产量增加约1倍至约50倍。在某些实施例中，细胞裂解物和/或培养基中的AAV-ABCD1载体产量增加约4倍。载体滴度可以根据本领域熟知的方法确定。典型地，使用斑点印迹或定量PCR来进行AAV基因组测量。通常，来自细胞裂解物和来自培养基的AAV载体产量可以是约1x 1010基因组拷贝/ml(gc/ml)至约1x 1016gc/ml。
在具体的实施例中，参比标准品包括自生产细胞的细胞裂解物和/或培养基中产生的AAV-ABCD1载体，所述生产细胞未和与编码ABCD1的mRNA互补的核酸序列一起孵育。
这可以通过例如提供与ABCD1mRNA互补的无义寡核苷酸来实现。用于实施本发明方法并且与ABCD1mRNA互补的其他核酸序列可以是抑制ABCD1的转录后加工的那些核酸序列，例如干扰RNA，包括但不限于shRNA或siRNA，或者antagomir。
编码ABCD1mRNA的序列是众所周知的，并且可以在例如Genbank登录号NM_000033.3中找到。
典型地将无义寡核苷酸设计成通过与靶标结合并在转录、翻译或剪接水平停止表达来阻断DNA或RNA靶标的表达。本发明的无义寡核苷酸是设计用于在严格条件下与ABCD1mRNA杂交的互补核酸序列。因此，选择与靶标充分互补的寡核苷酸，即足够好地杂交并具有足够特异性，以产生希望的效果。
在本发明的上下文中，杂交意指互补核苷或核苷酸碱基之间的氢键合，该氢键合可以为沃森-克里克(Watson-Crick)、霍氏(Hoogsteen)或反霍氏(reversed Hoogsteen)氢键合。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是通过氢键的形成进行配对的互补核碱基。互补性，如本文所用的，是指用于两个核苷酸之间精确配对的能力。例如，如果寡核苷酸的在某个位置的核苷酸能够与DNA或RNA分子的相同位置上的核苷酸以氢键结合，则寡核苷酸和DNA或RNA被认为在所述位置处是彼此互补的。当每个分子中足够数量的相应位置被能够彼此氢键合的核苷酸占据时，寡核苷酸和DNA或RNA彼此互补。因此，“可特异性杂交的”和“互补的”是用来指示足够程度的互补性或精确配对使得在寡核苷酸和DNA或RNA靶标之间发生稳定且特异性结合的术语。
本领域理解，互补核酸序列不必与其可特异性杂交的靶核酸具有100％互补性。当序列与靶DNA或RNA分子的结合干扰靶DNA或RNA的正常功能以引起活性丧失时，本发明的互补核酸序列是可特异性杂交的，并且在希望特异性结合的条件下，即在体内测定法或治疗性治疗情况下、以及在体外测定的情况下的生理条件下，在合适的严格条件下进行测定的条件下，存在足够程度的互补性以避免序列与非靶序列的非特异性结合。例如，严格的盐浓度通常将是小于约750mM的NaCl和75mM的柠檬酸三钠，优选小于约500mM的NaCl和50mM的柠檬酸三钠，并且更优选小于约250mM的NaCl和25mM的柠檬酸三钠。在缺少有机溶剂(例如，甲酰胺)下可以获得低严格杂交，而在至少约35％甲酰胺，并且更优选至少约50％甲酰胺存在下可以获得高严格杂交。严格的温度条件将通常包括至少约30℃、更优选地是至少约37℃、并且最优选地是至少约42℃的温度。不同的另外的参数，如杂交时间、洗涤剂(例如，十二烷基硫酸钠(SDS))的浓度以及载体DNA的包含或排除，是本领域的普通技术人员熟知的。根据需要通过组合这些不同的条件实现不同的严格水平。在一个优选的实施例中，杂交将在30℃、在750mM的NaCl、75mM的柠檬酸三钠、以及1％的SDS中发生。在一个更优选的实施例中，杂交将在37℃，在500mM的NaCl、50mM的柠檬酸三钠、1％的SDS、35％的甲酰胺以及100μg/ml的变性鲑鱼精子DNA(ssDNA)中发生。在一个最优选的实施例中，杂交将在42℃、在250mM的NaCl、25mM的柠檬酸三钠、1％的SDS、50％的甲酰胺、以及200μg/ml的ssDNA中发生。这些条件的有用变化对于本领域的普通技术人员应是容易和显而易见的。
对于大多数应用，杂交之后的洗涤步骤也将在严格度方面不同。可以通过盐浓度和温度限定洗涤严格条件。如上所述，通过降低盐浓度或通过增加温度可以增加洗涤严格度。例如，用于洗涤步骤的严格的盐浓度将为优选地小于约30mM的NaCl和3mM的柠檬酸三钠，并且最优选地小于约15mM的NaCl和1.5mM的柠檬酸三钠。用于洗涤步骤的严格的温度条件将通常包括至少约25℃、更优选地是至少约42℃、并且甚至更优选地是至少约68℃的温度。在一个优选的实施例中，洗涤步骤将在25℃、在30mM的NaCl、3mM的柠檬酸三钠、以及0.1％的SDS中发生。在一个更优选的实施例中，洗涤步骤将在42℃、在15mM的NaCl、1.5mM的柠檬酸三钠、以及0.1％的SDS中发生。在一个更优选的实施例中，洗涤步骤将在68℃、在15mM的NaCl、1.5mM的柠檬酸三钠、以及0.1％的SDS中发生。这些条件的另外的变化对于本领域的普通技术人员应是容易和显而易见的。杂交技术是本领域的技术人员熟知的并且描述于例如Benton和Davis(Science[科学]196:180，1977)；Grunstein和Hogness(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA[美国国家科学院院刊]72:3961，1975)；Ausubel等人(CurrentProtocols in Molecular Biology[分子生物学实验手册]，Wiley Interscience[威利国际科学]，纽约，2001)；Berger和Kimmel(Guide to Molecular Cloning Techniques[分子克隆技术指南]，1987，Academic Press[学术出版社]，纽约)；以及Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆实验指南]，Cold Spring HarborLaboratory Press[冷泉港实验室出版社]，纽约中。
优选的是，本发明的无义寡核苷酸与靶核酸内的靶区域具有至少80％的序列互补性，此外它们包含90％的序列互补性，甚至更优选在它们靶向的靶核酸序列内包含95％的与靶区域的序列互补性。例如，其中无义寡核苷酸的20个核碱基中的18个是互补的并因此与靶区域特异性杂交的无义化合物将代表90％的互补性。可以常规地使用基本局部比对搜寻工具(BLAST程序)确定无义化合物与靶核酸的区域的互补性百分比(Altschul等人.,J.Mol.Biol.,1990,215,403-410；Zhang和Madden,Genome Res.,1997,7,649-656)。与ABCD1mRNA杂交的本发明的无义和其他化合物通过实验鉴定，并且这些化合物的代表性序列在下文中被鉴定为本发明的优选实施例。
在另一个实施例中，与ABCD1mRNA互补的核酸序列可以是干扰RNA，包括但不限于shRNA或siRNA。干扰RNA包括但不限于小干扰RNA(“siRNA”)和小发夹RNA(“shRNA”)。用于构建干扰RNA的方法是本领域所熟知的。例如，干扰RNA可以由两个单独的寡核苷酸组装，其中一条链是有义链且另一条是无义链，其中无义链和有义链是自我互补的(即，每条链都包括与另一条链中的核苷酸序列互补的核苷酸序列；例如其中无义链和有义链形成双链体(duplex)或双链结构)；无义链包括与靶核酸分子中的核苷酸序列或其部分(即，不希望的基因)互补的核苷酸序列并且有义链包括对应于靶核酸序列或其部分的核苷酸序列。可替代地，干扰RNA组装自单一寡核苷酸，其中自我互补的有义区和无义区借助基于核酸的或基于非核酸的一个或多个接头进行连接。干扰RNA可以是具有双链体、不对称双链体、发夹或不对称发夹二级结构、具有自我互补的有义区和无义区的多核苷酸，其中无义区包括与分离的靶核酸分子中的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列并且有义区具有对应于靶核酸序列或其部分的核苷酸序列。干扰可以是环状单链多核苷酸，该环状单链多核苷酸具有两个或更多个环结构以及包括自我互补的有义区和无义区的茎，其中无义区包括与靶核酸分子中的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列并且有义区具有对应于靶核酸序列或其部分的核苷酸序列，并且其中该环状多核苷酸可以在体内或在体外进行加工以产生能够介导RNA干扰的活性siRNA分子。
在本发明的某些实施例中，干扰RNA编码区编码具有有义区、无义区和环区的自身互补RNA分子。这种RNA分子在表达时希望形成“发夹”结构，并且在本文中称为“shRNA”。环区的长度通常在约2至约10个核苷酸之间。在一个优选的实施例中，环区长度为约6至约9个核苷酸。在本发明的一个这样的实施例中，有义区和无义区的长度在约15至约20个核苷酸之间。在转录后加工后，小发夹RNA通过切丁酶(Dicer，RNA酶III家族的成员)介导的切割事件转化为siRNA。然后siRNA能够抑制与其共有同源性的基因的表达。关于细节,参见Brummelkamp等人.，Science[科学]296:550-553,(2002)；Lee等人，Nature Biotechnol.[自然生物技术]，20,500-505,(2002)；Miyagishi和Taira，自然生物技术20:497-500,(2002)；Paddison等人.Genes&Dev.[遗传与发育]16:948-958,(2002)；Paul，自然生物技术，20,505-508,(2002)；Sui,美国国家科学院院刊，99(6),5515-5520,(2002)；Yu等人.美国国家科学院院刊99:6047-6052,(2002)。
由siRNA指导的靶RNA切割反应具有高度的序列特异性。通常，含有与靶基因(即，ABCD1)的一部分相同的核苷酸序列的siRNA优选用于抑制。然而，在本发明的实施中并不要求siRNA与靶基因有100％的序列同一性。因此本发明具有以下优势：能够容忍由于遗传突变、株系多态性或进化趋异而引起的能预期到的序列变异。例如，已经发现相对于靶序列的具有插入、缺失以及单点突变的siRNA序列对于抑制是有效的。可替代地，具有核苷酸类似物取代或插入的siRNA序列可以有效用于抑制。
在又另一个实施例中，与ABCD1mRNA互补的核酸序列是antagomir。Antagomir是单链、双链、部分双链和发夹结构化的、靶向微小RNA的化学修饰的寡核苷酸。优选地，本发明所特有的antagomir包括足够互补以与约10至25个核苷酸的、优选约15至20个核苷酸的miRNA靶序列杂交的核苷酸序列。
在某些实施例中，antagomir是RNA样寡核苷酸，其具有用于RNA酶保护的各种修饰和药理学特性，例如增强的组织和细胞摄取。antagomir可以通过在3’末端具有糖、硫代磷酸酯骨架和胆固醇部分的完全2'-O-甲基化而与正常RNA不同。硫代磷酸酯修饰提供对RNA酶活性的保护作用，且它们的亲脂性有助于增强组织摄取。在一个优选的实施例中，antagomir包括六个硫代磷酸酯骨架修饰；两个硫代磷酸酯位于5’末端，四个位于3’末端。本发明的antagomir还可以关于其长度或构成antagomir的核苷酸的数量进行修饰。
用于实施本发明的核酸序列，无论是RNA、cDNA、基因组DNA、载体、病毒或其杂合体，都可以从多种来源分离、基因工程化、扩增、和/或表达/重组生成。重组核酸序列可以单独分离或克隆并测试希望的活性。可以使用任何重组表达系统，包括例如体外、细菌、真菌、哺乳动物、酵母、昆虫或植物细胞表达系统。
可以将本发明的核酸序列插入递送载体中，并从载体(例如，AAV载体)内的转录单位表达。重组载体可以是DNA质粒或病毒载体。载体构建的产生可以使用本领域公知的任何合适的基因工程技术来完成，包括但不限于标准的PCR、寡核苷酸合成、限制性内切酶消化、连接、转化、质粒纯化、和DNA测序技术，例如如Sambrook等人.Molecular Cloning:ALaboratory Manual[分子克隆：实验室手册].(1989)),Coffin等人.(Retroviruses[逆转录病毒].(1997))和“RNA Viruses:A Practical Approach[RNA病毒：实用方法]”(AlanJ.Cann编，牛津大学出版社，(2000))所描述的。对于本领域普通技术人员来说显而易见的是，有多种合适的载体可用于将本发明的核酸转运到细胞中。选择合适的载体来递送核酸并优化将选择的表达载体插入细胞的条件在本领域普通技术人员的知识范围内，不需要进行大量的实验。病毒载体包含具有用于在包装细胞中产生重组病毒的序列的核苷酸序列。表达本发明核酸的病毒载体可基于病毒骨架构建，包括但不限于逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、痘病毒或甲病毒。能够表达本发明核酸的重组载体可以如本文所述递送并且持续存在于靶细胞(例如，稳定转化体)中。
用于实施本发明的核酸序列可以通过公知的化学合成技术在体外合成，如在Adams(1983)J.Am.Chem.Soc.[美国化学学会杂志]105:661；Belousov(1997)NucleicAcids Res.[核酸研究]25:3440-3444；Frenkel(1995)ree Radic.Biol.[自由基生物医学]19:373-380；Blommers(1994)Biochemistry[生物化学]33:7886-7896；Narang(1979)Meth.Enzymol.[酶学方法]68:90；Brown(1979)酶学方法68:109；Beaucage(1981)Tetra.Lett.[四面体通讯]22:1859；美国专利号4,458,066中所描述的。
可以稳定本发明的核酸序列以防核溶解降解，例如通过引入修饰，例如核苷酸修饰。例如，本发明的核酸序列在核苷酸序列的5’或3’末端包含至少第一、第二、或第三核苷酸间键合的硫代磷酸酯。作为另一个实例，该核酸序列可以包含选自下组的2’-修饰的核苷酸，例如，2'-脱氧、2'-脱氧-2'-氟、2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基(2'-O-MOE)、2'-O-氨基丙基(2'-O-AP)、2'-O-二甲基氨基乙基(2'-O-DMAOE)、2'-O-二甲基氨基丙基(2'-O-DMAP)、2'-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2'-O-DMAEOE)或2'-O--N-甲基乙酰胺基(2'-O--NMA)。作为另一个实例，核酸序列可以包括至少一个2'-O-甲基修饰的核苷酸，并且在一些实施例中，所有核苷酸包括2'-O-甲基修饰。
用于操作用于实施本发明的核酸的技术，例如亚克隆、标记探针(例如，使用Klenow聚合酶随机引物标记、切口平移、扩增)、测序、杂交等，在科学和专利文献中都已被很好地描述了，参见例如，Sambrook编，分子克隆：实验室手册(第2版)，1-3卷，冷泉港实验室，(1989)；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY[分子生物学现代方法]，Ausubel编John Wiley&Sons,Inc.，纽约(1997)；LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY ANDMOLECULAR BIOLOGY:HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES,Part I.[生物化学和分子生物学实验室技术：与核酸探针杂交，第I部分]，Theory and Nucleic AcidPreparation[理论与核酸制备]，Tijssen，编Elsevier,N.Y.(1993)。
最近已经确定通过静脉内(IV)或脑室内(ICV)施用提供的ABCD1载体施用导致心脏毒性。鞘内施用是一种施用途径，包括将希望的药剂注射到椎管的蛛网膜下腔中，由此将药剂提供到脑脊液(CSF)中。使用鞘内施用，在中枢神经系统内载体的ABCD1表达低于外周器官(例如心脏)内的载体的ABCD1表达。外周器官中过量的ABCD1表达会导致毒性，因此，鞘内施用ABCD1载体包含改进的X-ALD(例如AMN)治疗方法。
在一些实施例中，该鞘内施用是经由泵。泵可以是手术植入的渗透泵。在某些实施例中，将渗透泵植入椎管的蛛网膜下腔以促进鞘内施用。
在某些实施例中，人类受试者在约24小时的时间段内接受鞘内递送的载体(例如，AAV9)的一次性治疗，所述载体包含约1x 1013GC至约10x 1013GC的量的ABCD1。
AAV9-hABCD1的缓慢连续鞘内输注可通过使用诸如植入物，ALZA公司(山景，加利福尼亚州)的渗透驱动泵来按比例扩大至人类。还参见，J.C.Wright,J.Culwell,Long-term controlled delivery of therapeutic agents by theosmotically drivenimplant[由渗透驱动的植入物长期控制治疗药物的输送]，于：M.J.Rathbone,J.Hadgraft,M.S.Roberts(编辑),Modified-Release DrugDelivery Technology[改良释放药物递送技术]，Informa Healthcare，纽约，2008,pp.143-149中。
已经描述了渗透递送装置及其组成部分，例如在美国专利号5,609,885；5,728,396；5,985,305；5,997,527；6,113,938；6,132,420；6,156,331；6,217,906；6,261,584；6,270,787；6,287,295；6,375,978；6,395,292；6,508,808；6,544,252；6,635,268；6,682,522；6,923,800；6,939,556；6,976,981；6,997,922；7,014,636；7,207,982；7,112,335；7,163,688；美国专利公开号2005-0175701、2007-0281024、和2008-0091176中。
递送装置典型地由包含渗透引擎、活塞和药物配制品的圆柱形储集器组成。储集器的一端用速率受控的水渗透性膜封盖，且另一端用扩散调节器封盖，通过该扩散调节器从药物储集器释放药物配制品。活塞将药物配制品与渗透引擎分开并利用密封件来防止渗透引擎室中的水进入药物储集器。扩散调节剂连同药物配制品一起被设计为防止体液通过孔口进入药物储集器。
装置基于渗透原理以预定的速率释放治疗药物。细胞外液通过半透膜进入装置，直接进入盐引擎(salt engine)，该引擎以缓慢且均匀的递送速率膨胀以驱动活塞。活塞的运动迫使药物配制品通过孔或出口以预定的剪切速率释放。在本发明的一个实施例中，装置的储集器装载有本发明的悬浮液配制品，所述悬浮液配制品包含例如1x 1011gc的AAV9-hABCD1，其中该装置能够在延长的时间段内以预定的治疗有效递送速率将该悬浮液配制品递送至受试者。
其他可植入的药物递送装置可以用于本发明的实施中，并且可以包括提供化合物的恒定流动、可调节流动、或可编程流动的调节器型可植入泵，例如可从Codman&Shurtleff,Inc.公司(Raynham,Mass.)、Medtronic,Inc.公司(Minneapolis,Minn.)、和Tricumed Medinzintechnik GmbH公司(德国)获得的那些。
通过以下说明性、非限制性实例额外地描述本发明，所述实例提供对本发明及其众多优点的更好理解。
实例
以下实例说明了本发明的一些实施例和方面。对相关领域技术人员而言显而易见的是，可在不背离本发明的精神或范围的情况下作出多种修改、添加、替代等，并且这些修改和变化可视为是在所附权利要求所限定的本发明范围之内。以下实例不应该以任何方式限制本发明。
实例1：在对ABCD1mRNA具特异性的siRNA存在下AAV9-ABCD1的产生提高了来自转染的293T细胞的AAV载体滴度。
先前已观察到在产生AAV9-ABCD1期间高量的细胞死亡/细胞病变效应，这可能是由于生产细胞中ABCD1蛋白的过表达。这种毒性降低了AAV载体的产量。为了减轻毒性并提高载体产量，使用siRNA池靶向ABCD1mRNA。
如下进行AAV包装。1-1.5x 107个293T细胞铺在15cm平板上并培养过夜。
表1：包装和收集培养基
DMEM高葡萄糖，HEPES
DMEM 10％FBS 1％p/s
DMEM 2％FBS 1％p/s
2.5mM Hepes缓冲液
2M CaCl
2x Hebs缓冲液，pH 7.04-7.047
PBS
胰蛋白酶
NaCl,50mM HEPES,1.5mM Na2HPO4
5mM EDTA
在第2天，如下制备转染混合物：
表2：转染混合物
将管A和管B滴加混合，同时涡旋1分钟。将该混合物在室温下孵育20分钟。每15cm平板添加1.5ml病毒混合物，逐滴分布在平板表面上。将板倾斜混合均匀并孵育过夜。在第3天，将培养基换成DMEM 2％FBS 1％p/s。在第5天，将平板培养基体积的一半从每个平板移除。通过用剩余培养基洗涤或轻轻使用细胞刮刀从平板收集细胞。在1300RPM，5分钟下短暂离心细胞。上清液被移除。通过轻弹试管底部使细胞松弛，并将其重新悬浮于每个细胞平板1ml EDTA PBS中，并在1300RPM下离心5分钟。将细胞重悬于每个平板1ml裂解缓冲液中并任选地储存在-80℃。梯度纯化后，将病毒缓冲液交换至PBS中，通过qPCR定量并用于实验。
在293T细胞铺板当天，用对ABCD1mRNA具特异性的siRNA池或非靶向对照siRNA转染细胞。另一个对照是ABCD1siRNA存在下，编码GFP(AAV9-GFP)的AAV9载体。第二天，用AAV质粒转染两种样品以产生AAV9-ABCD1。
siRNA方案有多个步骤：
1.在1×siRNA缓冲液(通用电气医疗集团)或在来自储备溶液的另一种适当的无RNA酶溶液中制备5μM汇集的(4个siRNA中的每一个的25％)siRNA溶液。
2.在分开的试管中，用无血清DMEM培养基将siRNA(管1中100ul)和合适的DharmaFECT转染试剂(管2中30ul)分别稀释至2ml体积。
3.小心地上下移液轻轻混合每管的内容物。在室温下孵育5分钟。
4.将管1的内容物添加到管2中，总体积为4ml。小心地上下移液混合并室温孵育20分钟。向所述4ml中添加12ml完全DMEM(10％FBS)。
5.向来自步骤4的16ml转染混合物中添加4ml以浓度3.75e6细胞/ml(总共1.5E7细胞)重悬于完全培养基中的293T细胞(最终siRNA浓度为25nM)。
6.铺进15cm培养皿并孵育24小时。
7.在用AAV质粒磷酸钙转染前1小时更换培养基为完全DMEM 10％FBS。
8.继续使用标准的AAV生产和纯化方案。
转染后三天收获细胞、裂解、并通过如下qPCR确定载体产量(以基因组拷贝计)：
表3：qPCR材料
qPCR方案有多个步骤：
1.在无核酸酶的水中1:100-1:1000稀释载体并涡旋。在qPCR中使用。
2.使用质粒675.5(5999bp)作为基因组拷贝(GC)标准。创建从107-102gc/mL的标准品。
3.准备足够大量的预混合物以测量标准品和样品，一式三份。预混合物包括2ul H2O、1.2ul引物混合物(F和R＝100um储备液各5ul，在90ul水中)、1ul引物混合物(F和R＝100um储备液各6ul，在88ul水中)、0.8ul TM FAM探针2.5uM、1ul TM FAM探针2uM(4ul 100uM储备液+196ul水)、和5ul TaqMan快速通用PCR预混合物2x。
4.混合并等分9ul于板的孔中。
5.添加1ul稀释于水中的模板。
6.将7500仪(7500machine)编程为具有如下热循环参数，其中阶段1为reps1，95℃:20，且阶段2为reps 40，95℃:03；60℃:30。
7.分析数据。标准坡度应为约-3.3。
产量报告为相对滴度，其中AAV9-GFP样品任意设定为100％，另外两个样品归一化为此值。与对照siRNA(图1)相比，在针对ABCD1mRNA的siRNA池存在下AAV9-ABCD1的产生将载体滴度(和产量)提高了近4倍。
表4：靶向ABCD1的siRNA
SEQ ID NO.4 CGGAUCAUGUCGUCGUACA
SEQ ID NO.5 CGGAGGAGAUCGCCUUCUA
SEQ ID NO.6 GUUCAGCGCUGUCACUUCA
SEQ ID NO.7 GAACGCCUGUGGUAUGUUA
用对照siRNA(图2，泳道1、2)、针对ABCD1mRNA(图2，泳道3-6)的siRNA池转染的，或未转染的(图2泳道7，“正常”是指在293T细胞中内源水平的ABCD1蛋白质)293T细胞。在第二天转染AAV-ABCD1质粒(图2，泳道1-4)或AAV-GFP质粒(图2，泳道5、6)。三天后，将细胞裂解物在SDS PAGE凝胶上电泳，并进行ABCD1蛋白免疫印迹以评估siRNA敲低。进行肌动蛋白印迹，用于加载对照。8s和1s分别指射线胶片曝光8秒和1秒。与对照siRNA相比，ABCD1siRNA降低过度表达的ABCD1的水平。
293T细胞未转染(无siRNA)或用对照siRNA或针对ABCD1mRNA的siRNA池转染。第二天，用AAV质粒转染细胞以产生AAV9-ABCD1。在转染AAV质粒后的第3天，进行qPCR以确定细胞裂解物和转染细胞培养基中载体的量(g.c.)。观察到细胞裂解物和培养基中AAV9-ABCD1载体产量增加约3-4倍(图3)。
实例2：在肾上腺脊髓神经病的小鼠模型中通过渗透泵鞘内递送rAAV9-ABCD1导致更均匀和广泛的基因递送至CNS
经2分钟持续时间推注或通过渗透泵经24小时持续时间用PBS注射作为假性对照将自身互补的AAV9GFP(scAAV9GFP)和编码ABCD1的rAAV9(rAAV9-ABCD1)鞘内(IT)递送至Abcd1-/-小鼠。注射后两周，将小鼠处死并用4％PFA灌注。然后收集组织、切片并染色进行免疫荧光分析。
通过渗透泵IT递送scAAV9-GFP导致跨CNS相关细胞类型和DRG以剂量依赖性方式广泛表达。与脑相比，脊髓和DRG具有更高的表达，但是在外周器官(肝脏，心脏和肾上腺)中也检测到GFP表达，在3X 1011GC处观察到最高表达。
在rAAV9-ABCD1鞘内泵递送后检测到类似的ABCD1蛋白分布模式。通常，与较低剂量(0.5X 1011GC)相比，较高剂量(2X 1011GC和1X 1011GC)导致在CNS和外周器官中的更多表达。相比之下，经2分钟鞘内推注递送导致在胸部区域中ABCD1表达量最高，然而，即使较高剂量(1x 1011gc)也不会导致在颈部和腰部区域的更广泛的递送(图4)。
特别地，在低剂量直接鞘内推注注射0.5X 1011GC后，甚至检测到ABCD1跨CNS的广泛表达(图5)。例如，0.5x 1011gc推注和泵递送在颈髓中显示ABCD1的相似表达，而在推注注射后心脏组织展示了更高的表达(图6)。得出的结论是，与推注注射相比，由泵递送的相同剂量导致远离注射部位的脑和脊髓中更高的表达和相对较少的外周器官泄漏(图7)。尽管在脑中存在局部表达，通过脑室内施用以0.5X 1011GC递送rAAV9-ABCD1导致Abcd1-/-小鼠的行为改进。因此，使用概述的鞘内泵递送可以实现在该剂量下甚至更好的性能。在通过鞘内泵施用1X 1011GC的剂量时，中枢神经系统中的ABCD1表达比不具有X-ALD的未治疗受试者(例如，野生型)的中枢神经系统中的ABCD1表达高约3倍。重要的是，外周器官中的ABCD1的表达比不具有X-ALD的未治疗受试者的外周器官中ABCD1的表达低约90％(参见图11，其中Western印迹中不同组织类型中的蛋白质表达被归一化为内源性野生型水平)。
总之，与鞘内推注注射相比，通过鞘内渗透泵的rAAV9-介导的ABCD1基因转运导致更均匀和广泛的基因递送至CNS，同时减少体循环中的泄漏。
实例3：通过鞘内渗透泵转运rAAV9-介导的ABCD1基因导致脊髓中C26:0水平的降低
C26:0是肾上腺脊髓神经病的生化标志。为了评估AAV9基因递送后是否存在游离的超长链脂肪酸(VLCFA)，对脊髓样品进行脂质分析。报告C26:0和C24:0的绝对值以及C26:0/C22:0的比率。确定了通过鞘内渗透泵(1x 1011gc)转运rAAV9-介导的ABCD1基因导致脊髓中C26:0水平降低20％(图13)。鞘内渗透泵递送后的水平与鞘内推注递送后的水平相当，但避免全身泄漏。
另外进行免疫荧光染色和共聚焦显微镜成像。对于组织切片成像，使用低温恒温器(莱卡公司(Leica))在-25℃切割脊髓切片(16μm)并储存在-80℃。将切片用小鼠抗人ABCD1抗体染色，然后分别与兔抗GFAP(Dako，Carpinteria，CA)、兔抗IBA1(Wako，Richmond，VA)、和兔抗CD31(Abcam)共染色以定位细胞类型。TOPRO-3(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific))被用作核复染的荧光染料。通过共聚焦激光显微镜对载玻片进行成像并对转导的细胞进行计数。每种细胞类型的ABCD1转导细胞的估计值记录为20×和40×(对于小神经胶质细胞)放大图像。通过鞘内渗透泵(1x 1011gc)转运rAAV9介导的ABCD1基因主要靶向脊髓中的星形胶质细胞、内皮细胞和少量神经元(图14)。在背根神经节内，它以卫星细胞和神经元两者为靶标(图14)。
其他实施例
应理解，虽然已经结合其详细描述对本发明进行了描述，但前面的描述旨在说明而非限制本发明的范围，本发明的范围由所附的权利要求书的范围限定。其他方面、优点以及修饰都在以下权利要求书的范围之内。

Claims (14)

1.一种增加培养物中生长的转染生产细胞中腺相关病毒9(AAV9)载体滴度的方法，所述方法包括以下步骤：
i)将与编码ATP结合盒亚家族D成员1(ABCD1)的mRNA互补的核酸序列和所述细胞一起孵育，并且
ii)将包含编码ABCD1的核苷酸序列的AAV9载体转染入所述细胞(AAV9-ABCD1载体)，其中从该AAV9载体表达的ABCD1 mRNA的量减少，由此与参比标准品相比，细胞裂解物和/或培养基中的AAV9-ABCD1载体产量增加约1倍至约50倍。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述与编码ABCD1的mRNA互补的核酸序列是干扰RNA。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述干扰RNA是shRNA或siRNA。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述siRNA包括SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.7或其组合。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述参比标准品包括自生产细胞的细胞裂解物和/或培养基中产生的AAV9-ABCD1载体，所述生产细胞未和与编码ABCD1的mRNA互补的核酸序列一起孵育。
6.一种治疗有需要的受试者中的X连锁肾上腺脑白质营养不良(X-ALD)的方法，该方法包括向该受试者施用包含纯化的、从权利要求1的生产细胞中获得的AAV9-ABCD1载体的组合物。
7.如权利要求6所述的方法，其中通过鞘内施用将包含纯化的AAV9-ABCD1载体的所述组合物施用于该受试者。
8.一种治疗有需要的受试者中的X连锁肾上腺脑白质营养不良(X-ALD)的方法，该方法包括向该受试者施用编码ATP结合盒亚家族D成员1(ABCD1)的腺相关病毒(AAV)载体，其中所述载体是通过鞘内施用施用于该受试者。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述鞘内施用是由渗透泵介导的。
10.如权利要求8所述的方法，其中所述载体的剂量是约1x1013GC至约10x1013GC。
11.如权利要求8所述的方法，其中所述AAV是AAV9。
12.一种向具有X连锁肾上腺脑白质营养不良(X-ALD)的受试者提供ATP结合盒亚家族D成员1(ABCD1)的方法，所述方法包括向该受试者施用编码ABCD1的载体，其中所述载体通过鞘内施用施用于该受试者，并且其中在中枢神经系统中所述载体的ABCD1表达低于在外周器官中所述载体的ABCD1表达。
13.如权利要求12所述的方法，其中在中枢神经系统中所述载体的ABCD1表达比不具有X-ALD的未治疗受试者的中枢神经系统中ABCD1的表达高约3倍。
14.如权利要求13所述的方法，其中在外周器官中所述载体的ABCD1表达比不具有X-ALD的未治疗受试者的外周器官中ABCD1的表达低约90％。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR112022013027A2 (pt) * 2019-12-31 2022-09-06 Swanbio Therapeutics Ltd Construtos aav-abcd1 melhorados e uso para tratamento ou prevenção de adrenoleucodistrofia (ald) e/ou adrenomieloeuropatia (amn)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103717240A (zh) * 2011-06-10 2014-04-09 蓝鸟生物公司 用于肾上腺脑白质营养不良症和肾上腺脊髓神经病的基因治疗载体
WO2014186579A1 (en) * 2013-05-15 2014-11-20 Regents Of The University Of Minnesota Adeno-associated virus mediated gene transfer to the central nervous system
WO2015114365A1 (en) * 2014-01-31 2015-08-06 The Secretary Of State For Health High titer production of adeno-associated viral vectors

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1975A (en) 1841-02-12 Manner of constructing corn-shellers
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US5609885A (en) 1992-09-15 1997-03-11 Alza Corporation Osmotic membrane and delivery device
US5869039A (en) * 1993-10-15 1999-02-09 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale X-linked adrenoleukodystrophy gene and corresponding protein
US6261584B1 (en) 1996-02-02 2001-07-17 Alza Corporation Sustained delivery of an active agent using an implantable system
NZ331186A (en) 1996-02-02 2000-04-28 Alza Corp Osmotically driven sustained delivery drug delivery capsule
US6156331A (en) 1996-02-02 2000-12-05 Alza Corporation Sustained delivery of an active agent using an implantable system
US6132420A (en) 1996-02-02 2000-10-17 Alza Corporation Osmotic delivery system and method for enhancing start-up and performance of osmotic delivery systems
US6395292B2 (en) 1996-02-02 2002-05-28 Alza Corporation Sustained delivery of an active agent using an implantable system
US6713300B1 (en) * 1997-02-27 2004-03-30 University Of Utah Research Foundation Nucleic acid and amino acid sequences for ATP-binding cassette transporter and methods of screening for agents that modify ATP-binding cassette transporter
ZA981610B (en) 1997-03-24 1999-08-26 Alza Corp Self adjustable exit port.
MY125849A (en) 1997-07-25 2006-08-30 Alza Corp Osmotic delivery system, osmotic delivery system semipermeable body assembly, and method for controlling delivery rate of beneficial agents from osmotic delivery systems
WO1999032095A1 (en) 1997-12-22 1999-07-01 Alza Corporation Rate controlling membranes for controlled drug delivery devices
AU1828599A (en) 1997-12-29 1999-07-19 Alza Corporation Osmotic delivery system with membrane plug retention mechanism
PT1041974E (pt) 1997-12-30 2007-01-31 Alza Corp Sistema de entrega de agente benéfico como obturador de membrana
ES2196918T3 (es) 1998-12-31 2003-12-16 Alza Corp Sistema de suministro osmotico dotado de piston con economia de espacio..
US6225525B1 (en) * 1999-10-13 2001-05-01 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. ATP-binding cassette transporter (ABC1) modified transgenic mice
CA2402637C (en) 1999-12-21 2007-04-10 Alza Corporation Valve for osmotic devices
US7163688B2 (en) 2001-06-22 2007-01-16 Alza Corporation Osmotic implant with membrane and membrane retention means
WO2003004660A1 (en) * 2001-07-03 2003-01-16 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Methods of administering vectors to synaptically connected neurons
KR101046903B1 (ko) 2002-06-26 2011-07-06 인타르시아 세라퓨틱스 인코포레이티드 삼투성 약물 전달 시스템을 위한, 최소로 튀는 용적효율성 피스톤
US7014636B2 (en) 2002-11-21 2006-03-21 Alza Corporation Osmotic delivery device having a two-way valve and a dynamically self-adjusting flow channel
KR20060017749A (ko) 2003-03-31 2006-02-27 알자 코포레이션 내압 소멸 수단을 갖는 삼투성 펌프
US20050175701A1 (en) 2004-02-10 2005-08-11 Alza Corporation Capillary moderator for osmotic delivery system
CA2651855C (en) 2006-05-30 2011-08-02 Intarcia Therapeutics, Inc. Two-piece, internal-channel osmotic delivery system flow modulator
ES2422864T3 (es) 2006-08-09 2013-09-16 Intarcia Therapeutics, Inc Sistemas de liberación osmótica y unidades de pistón
WO2011106376A2 (en) * 2010-02-23 2011-09-01 The General Hospital Corporation Use of microvesicles in the treatment of medical conditions
EP2833923A4 (en) * 2012-04-02 2016-02-24 Moderna Therapeutics Inc MODIFIED POLYNUCLEOTIDES FOR THE PRODUCTION OF PROTEINS

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103717240A (zh) * 2011-06-10 2014-04-09 蓝鸟生物公司 用于肾上腺脑白质营养不良症和肾上腺脊髓神经病的基因治疗载体
WO2014186579A1 (en) * 2013-05-15 2014-11-20 Regents Of The University Of Minnesota Adeno-associated virus mediated gene transfer to the central nervous system
WO2015114365A1 (en) * 2014-01-31 2015-08-06 The Secretary Of State For Health High titer production of adeno-associated viral vectors

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LIFU WANG ET AL.: "An shRNA Silencing a Non-Toxic Transgene Reduces Nutrient Consumption and Increases Production of Adenoviral Vectors in a Novel Packaging Cell", 《J.CELL.PHYSIOL.》 *
YI GONG ET AL.: "Adenoassociated Virus Serotype 9-Mediated Gene Therapy for X-Linked Adrenoleukodystrophy", 《THE AMERICAN SOCIETY OF GENE & CELL THERAPY》 *

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