ES2916325T3 - Administración intratecal de secuencias de ácidos nucleicos codificantes de ABCD1 para el tratamiento de la adrenomieloneuropatía - Google Patents

Administración intratecal de secuencias de ácidos nucleicos codificantes de ABCD1 para el tratamiento de la adrenomieloneuropatía Download PDF

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Abstract

Método para incrementar los títulos de vector virus adenoasociado 9 (VAA9) en células productoras transfectadas en cultivo, en el que dicho método comprende las etapas de: i) incubar un ARN interfiriente que es complementario a un ARNm codificante de miembro 1 de la subfamilia D de casete de unión a ATP (ABCD1) con las células, y ii) transfectar un vector VAA9 que comprende una secuencia de nucleótidos codificante de ABCD1 en las células (vector VAA9-ABCD1), en el que la cantidad de ARNm de ABCD1 expresado a partir del vector VAA9 se reduce, incrementando de esta manera el rendimiento de vector VAA9-ABCD1 en el lisado celular y/o medio en un factor de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50 veces en comparación con un estándar de referencia, en el que el estándar de referencia comprendía un rendimiento de vector VAA9-ABCD1 en el lisado celular y/o medio a partir de las células productoras que no han sido incubadas con una secuencia de ácidos nucleicos que es complementaria a un ARNm codificante de ABCD1.

Description

DESCRIPCIÓN
Administración intratecal de secuencias de ácidos nucleicos codificantes de ABCD1 para el tratamiento de la adrenomieloneuropatía
Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
Solicitudes relacionadas
La presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de patente US n° de serie 62/251.208, presentada el 5 de noviembre de 2016 y la solicitud provisional de patente US n° de serie 62/300.691, presentada el 26 de febrero de 2016.
Investigación o desarrollo de investigación financiada con fondos federales
El presente trabajo fue financiado por las subvenciones n° R21 NS081374-01 y n° R01 NS072446-01 concedidas al National Institutes of Health. El gobierno posee determinados derechos en la invención.
Antecedentes de la invención
La adrenoleucodistrofia ligada al X (X-ALD), un trastorno genético progresivo, está causado por mutaciones en el gen ABCD1, que codifica un transportador peroxisomal de casete de unión al ATP (ABCD1) responsable del transporte de ácidos grasos de cadena muy larga activados por CoA (VLCFA, por sus siglas en inglés) hasta el interior de los peroxisomas para la degradación que conduce a la acumulación de niveles elevados de ácidos grasos de cadena muy larga saturados (VLCFA) en el plasma y los tejidos del cerebro y el corteza adrenal. Los síntomas pueden iniciarse en la infancia o en la adultez. Los pacientes adultos de ALD típicamente desarrollan adrenomieloneuropatía (AMN), un trastorno neurológico debilitante, entre los 20 y 30 años (Engelen et al., Orphanet J. Rare Dis. 2012; 7: 51, 1974). El ratón Abcd1-/" desarrolla un fenotipo similar a la AMN, que se manifiesta en la degeneración de los axones de la médula espinal, así como la neuropatía periférica debida a la afectación de las neuronas ganglionares de la raíz dorsal (DRG) (Pujol et al., Hum Mol Genet. 2002;11:499-505). Se ha informado anteriormente de la transducción de células del sistema nervioso central in vitro e in vivo mediante la utilización del vector de serotipo 9 del virus adenoasociado recombinante (VAA9r) para la administración del gen ABCD1 humano. Desafortunadamente, la administración intravenosa en ratones jóvenes está asociada a toxicidad cardiaca debido a la sobreexpresión del transgén. Los sistemas de administración que proporcionan niveles no tóxicos de ABCD1 en pacientes que sufren de X-ALD o AMN resultarían altamente deseables.
Descripción resumida de la invención
Otras características y ventajas de la invención resultarán evidentes a partir de la descripción detallada y de las reivindicaciones. De esta manera, se describen otros aspectos de la invención en la exposición siguiente y se encuentran comprendidos dentro del alcance de la invención.
La invención se define en las reivindicaciones. En un aspecto, la invención proporciona un método para incrementar los títulos de vector de virus adenoasociado 9 (VAA9) en células productoras transfectadas en cultivo, en el que dicho método comprende las etapas de: i) incubar un ARN interfiriente que es complementario a un ARNm codificante del miembro 1 de la subfamilia D de casete de unión a ATP (ABCD1) en las células, y ii) transfectar un vector VAA9 que comprende una secuencia de nucleótidos codificante de ABCD1 en las células (vector VAA9-ABCD1), en el que la cantidad de ARNm de ABCD1 expresado a partir del vector VAA9 se reduce, incrementando de esta manera el rendimiento de vector VAA9-ABCD1 en el lisado y/o medio celular en un factor entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50 en comparación con un estándar de referencia, en el que el estándar de referencia comprende el rendimiento de vector VAA9-ABCD1 en el lisado y/o medio celular a partir de células productoras que no han sido incubadas con una secuencia de ácidos nucleicos que es complementaria a un ARNm codificante de ABCD1.
En una realización, el ARN interfiriente es un ARNhc o un ARNip.
En todavía otra realización, el ARNip comprende la SEC ID n° 4, la SEC ID n° 5, la SEC ID n° 6, la SEC ID n° 7 o una combinación de las mismas.
En todavía otro aspecto, la invención proporciona una composición para la utilización en un método de tratamiento de adrenoleucodistrofia ligada a X (X-ALD) en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar dicha composición en el sujeto, en el que la composición comprende vector VAA9-ABCD1 purificado que se ha obtenido mediante el método de la invención, en el que la composición que comprende vector VAA9-ABCD1 purificado se administra en el sujeto mediante administración intratecal.
En todavía otro aspecto, la invención proporciona un vector para la utilización en un método de tratamiento de adrenoleucodistrofia ligada a X (X-ALD) en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar dicho vector en el sujeto, en el que el vector comprende un vector de virus adenoasociado (VAA) de serotipo 9 codificante de miembro 1 de la subfamilia D de casete de unión a ATP (ABCD1), en el que dicho vector se administra en el sujeto mediante administración intratecal.
En una realización del vector para la utilización, la administración intratecal está mediada por una bomba osmótica.
En otra realización del vector para la utilización, la dosis de vector es de 0,5X1011CG.
En todavía otra realización del vector para la utilización, la expresión de ABCD1 a partir de dicho vector en el sistema nervioso central es superior a la expresión de ABCD1 a partir de dicho vector en órganos periféricos. En otra realización, la expresión de ABCD1 a partir de dicho vector en el sistema nervioso central del sujeto es aproximadamente 3 veces superior a la expresión de ABCD1 en el sistema nervioso central de un sujeto no tratado que no presenta X-ALD. En otra realización, la expresión de ABCD1 a partir de dicho vector en los órganos periféricos del sujeto es aproximadamente 90 % inferior a la expresión de ABCD1 en órganos periféricos de un sujeto no tratado que no presenta X-ALD.
En una realización del vector para la utilización, la administración intratecal está mediada por una bomba osmótica.
En otra realización del vector para la utilización, la dosis de vector es de entre 1*1013 y aproximadamente 10*1013 CG.
A menos que se indique lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria presentan los mismos significados entendidos comúnmente por el experto ordinario en la materia a la que se refiere la presente invención. En la presente memoria se describen métodos y materiales para la utilización en la presente invención; también pueden utilizarse otros métodos y materiales adecuados que son conocidos de la técnica. Los materiales, métodos y ejemplos son meramente ilustrativos y no pretenden ser limitativos. En caso de contradicción, la presente especificación, incluyendo las definiciones, será determinante.
Breve descripción de los dibujos
La descripción detallada siguiente, proporcionada a modo de ejemplo, pero que no pretende ser limitativa de la exposición a determinadas realizaciones descritas, puede entenderse junto con las figuras adjuntas.
La figura 1 ilustra títulos mejorados de vector VAA9-ABCD1 a partir de células 293T transfectadas que han sido incubadas con ARNip específico para ARNm de ABCD1.
La figura 2 ilustra niveles reducidos de proteína ABCD1 en células transfectadas con VAA-ABCD1 que han sido incubadas con una agrupación de ARNip específica para el ARNm de ABCD1.
La figura 3 ilustra títulos mejorados de vector VAA9-ABCD1 a partir de células 293T transfectadas que han sido incubadas con ARNip específico para ARNm de ABCD1 tanto en lisados celulares como en medios acondicionados.
La figura 4 ilustra la distribución de VAA9r-ABCD1 tras la administración de un bolo intratecal durante 2 minutos. La figura 5 ilustra la distribución de VAA9r-ABCD1 tras la infusión con bomba intratecal de VAA9r-ABCD1 durante 24 horas.
La figura 6 ilustra un bolo de dosis baja (0,5x1011 cg) y la administración con bomba de VAA9-ABCD1.
La figura 7 ilustra una expresión más alta de ABCD1 en diferentes órganos periféricos (fuera del SNC) dos semanas después de la inyección de un bolo de VAA9-ABCD1 en comparación con la infusión con bomba de VAA9-ABCD1. La figura 8 lustra un mapa del vector de VAA9-ABCD1.
La figura 9 ilustra la distribución de ABCD1 endógeno en diferentes órganos.
La figura 10 ilustra la distribución de ABCD1 endógeno en diferentes órganos.
La figura 11 ilustra la expresión de ABCD1 tras el bombeo IT en ratones Abcdl-/-.
La figura 12 ilustra la expresión de ABCD1 tras el bombeo IT en ratones Abcd1-/-.
La figura 13 ilustra el nivel de C26:0 en la médula espinal 15 días después del uso de la bomba IT y la inyección de bolo PT.
La figura 14 ilustra la expresión de ABCD1 en diferentes tipos celulares después de la administración con bomba IT de VAA9-ABCD1_h. ME: médula espinal; GRD: ganglio de la raíz dorsal; CD31: marcador endotelial; GFAP: marcador de astrocitos; IBA1: marcador microglial; TOPRO3: contratinción nuclear; DRG muestra el patrón moteado de expresión en las neuronas y más prominentemente circundando a las mismas (células satélite).
Descripción detallada de la invención
Definiciones
A menos que se indique lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria presentan los mismos significados entendidos comúnmente por el experto ordinario en la materia a la que se refiere la presente invención. En caso de contradicción, la presente solicitud, incluyendo las definiciones, será determinante.
Un "sujeto" es un vertebrado, incluyendo cualquier miembro de la clase de los mamíferos, incluyendo seres humanos, animales domésticos y de granja, y animales de zoológico, de competición o de compañía, tales como el ratón, el conejo, el cerdo, la oveja, la cabra, la vaca y los primates superiores.
Tal como se utilizan en la presente memoria, los términos "tratar", "tratando", "tratamiento" y similares se refieren a reducir o aliviar la X-ALD, p. ej., la adrenomieloneuropatía (AMN), y/o lo síntomas asociados a la misma. Se apreciará que, aunque no se encuentra excluido, el tratamiento de X-ALD o AMN no requiere que el trastorno, condición o síntomas asociados a la misma sean eliminados por completo.
A menos que se indique específicamente o resulte evidente a partir del contexto, tal como se utiliza en la presente memoria, el término "aproximadamente" se entiende como comprendido dentro de un intervalo de tolerancia normal en la técnica, por ejemplo dentro de las 2 desviaciones estándares de la media. "Aproximadamente" se entiende como dentro de 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 % o 0,01 % del valor indicado. A menos que resulte evidente a partir del contexto, todos los valores numéricos proporcionados en la presente memoria están modificados por el término "aproximadamente".
Tal como se utiliza en la presente memoria, "una reducción de la expresión" se refiere a una cantidad de expresión génica o expresión proteica de ABCD1 en órganos periféricos de un sujeto que es por lo menos aproximadamente 0,05 veces inferior (por ejemplo, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1, 5, 10, 25, 50, 100, 1000 o 10.000 veces o más inferior) a la cantidad de expresión génica o expresión proteica de ABCD1 en el sistema nervioso central de un sujeto en el que se ha administrado un vector codificante de ABCD1 según los métodos descritos en la presente memoria. "Reducida" en referencia a la expresión génica o expresión proteica de ABCD1 en órganos periféricos de un sujeto también se refiere a por lo menos aproximadamente 5 % (por ejemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 o 100 %) inferior al nivel de expresión génica o expresión proteica de ABCD1 en el sistema nervioso central de un sujeto en el que se ha administrado un vector codificante de ABCD1 según los métodos descritos en la presente memoria. Los niveles pueden medirse según métodos estándares conocidos de la técnica para la determinación de los niveles de expresión génica o de expresión proteica.
Tal como se utiliza en la presente memoria, "un incremento de los títulos de vector" se refiere a un nivel de título de las células productoras transfectadas con un vector codificante de ABCD1 que es por lo menos aproximadamente 0,05 veces superior (por ejemplo, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1, 5, 10, 25, 50, 100, 1000 o 10.000 veces o más superior) al nivel de título de células productoras que no han sido incubadas con una secuencia de ácidos nucleicos que es complementaria a un ARNm codificante de ABCD1 según los métodos descritos en la presente memoria. "Incrementado" en referencia a un nivel de título (concentración de vector VAA, con frecuencia expresado en copias de genoma por mililitro) de células productoras transfectadas con un vector codificante de ABCD1 también se refiere a por lo menos aproximadamente 5 % superior (por ejemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 o 100 % superior) al nivel de título de células productoras que no han sido incubadas con una secuencia de ácidos nucleicos que es complementaria a un ARNm codificante de ABCD1 según los métodos descritos en la presente memoria. Los niveles pueden medirse según métodos estándares conocidos de la técnica para la determinación de las cantidades de genomas de VAA, la expresión de transgenes o la expresión de proteínas.
Los intervalos proporcionados en la presente memoria deben entenderse que son la abreviatura de todos los valores comprendidos dentro del intervalo. Por ejemplo, se entiende que un intervalo de 1 a 50 incluye cualquier combinación de números o subintervalos del grupo que consiste en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50 (así como fracciones de los mismos, a menos que el contexto indique claramente lo contrario).
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "nivel de referencia" se refiere al nivel de título en una muestra conocida con el que se compara otra muestra de ensayo. Puede obtenerse un nivel de referencia, por ejemplo, a partir de células productoras que no han sido incubadas con una secuencia de ácidos nucleicos que es complementaria a un ARNm codificante de ABCD1 o con un oligonucleótido antisentido de control o ARNip. Puede obtenerse un nivel de referencia, por ejemplo, a partir de sujetos no tratados que no presentan X-ALD. "No tratado" se refiere a la falta de terapia por la administración de un vector que expresa un transgén de ABCD1.
En la presente exposición, "comprende", "que contiene" y "que presenta" y similares pueden presentar el significado atribuido a ellas en la legislación de patentes estadounidense y pueden significar "incluye", "que incluye" y similares; "que consiste esencialmente en" o "consiste esencialmente" de manera similar presentan el significado atribuido a ellas en la legislación de patentes estadounidense y la expresión es abierta, permitiendo la presencia de lo indicado con la condición de que las características básicas o nuevas de lo que se indica no resulten modificadas por la presencia de más de lo que se indica, aunque excluye las realizaciones de la técnica anterior.
Otras definiciones aparecen en contexto durante toda la presente exposición.
Composición para la utilización en métodos de tratamiento
Las composiciones de la invención pueden utilizarse en métodos de tratamiento para la adrenoleucodistrofia ligada al X (X-ALD). La adrenoleucodistrofia ligada al X es un trastorno genético, causado por mutaciones en el gen de ABCD1, que se produce principalmente en varones y que afecta principalmente al sistema nervioso y a las glándulas adrenales. La mielina en el cerebro y la médula espinal se deteriora (desmielinización), lo que reduce la capacidad funcional de los nervios. Además, el daño a la capa externa de las glándulas adrenales (corteza adrenal) causa una escasez de determinadas hormonas (insuficiente adrenocortical). Existen varios tipos diferentes de adrenoleucodistrofia ligada al X, incluyendo una forma cerebral infantil, un tipo de adrenomieloneuropatía (AMN) y una forma denominada enfermedad de Addison. Tal como se utiliza en la presente memoria, X-ALD no incluye la "adrenoleucodistrofia neonatal", que pertenece a los trastornos de biogénesis peroxisomal del espectro de Zellweger y no está relacionada con mutaciones en ABCD1. Los métodos para diagnosticar o identificar los sujetos con X-ALD o AMN son conocidos de la técnica y pueden incluir la medición de los niveles plasmáticos de ácidos grasos de cadena muy larga (VLCFA) y/o los ensayos genéticos; ver, p. ej., Engelen et al., Orphanet J. Rare Dis. 2012; 7: 51; Aubourg y Chaussain, Horm Res. 2003;59 supl. 1:104-5; Steinberg et al., Curr. Protoc. Hum. Genet. 2008 capítulo 17:unidad 17.6; Steinberg SJ, Moser AB, Raymond GV. X-Linked Adrenoleukodystrophy. 26 de marzo de 1999 [Actualización el 9 de abril de 2015]. en: Pagon r A , Adam MP, Ardinger HH, et al., editores. GeneReviews® [Internet]. Seattle (WA): University of Washington, Seattle; 1993-2016. Disponible en: ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1315/).
Las mutaciones en el gen de ABCD1 causan la adrenoleucodistrofia ligada al X. El gen de ABCD1 codifica la proteína de la adrenoleucodistrofia (ALDP), que participa en el transporte de ácidos grasos de cadena muy larga (VLCFA) al interior de los peroxisomas. Las mutaciones del gen de ABCD1 resultan en una deficiencia en ALDP. Cuando falta esta proteína, se altera el transporte y posterior degradación de los VLCFA, causando niveles anormalmente elevados de estas grasas en el cuerpo. La acumulación de VLCFA puede resultar tóxica para la corteza adrenal y la mielina.
La corrección del defecto genético mediante terapia génica representa una terapia viable. La administración específica dirigida del gen de ABCD1 en el SNC resulta esencial para evitar toxicidad en órganos periféricos. Lo anterior puede conseguir, por ejemplo, mediante la administración de un vector virus adenoasociado (VAA) codificante de ABCD1 mediante la administración intratecal, que no forma parte de la invención.
Las secuencias codificantes del ADNC de ABCD1 y su proteína expresada son bien conocidas, y pueden encontrarse en, por ejemplo, GenBank n° de acceso NG_009022.2 y NP_000024.2.
"VAA" es virus adenoasociado y puede utilizarse para referirse al vector virus recombinante mismo o derivados del mismo. El término cubre todos los subtipos, serotipos y pseudotipos, y tanto formas naturales como recombinantes, excepto en donde se requiera de otro modo. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "serotipo" se refiere a un VAA que se identifica y distingue de otros VAA basándose en su serología, p. ej., existen once serotipos de VAA: VAA1-VAA11, y el término comprende pseudotipos con las mismas propiedades. Muchos de dichos serotipos presentan propiedades biológicas únicas respecto a otros serotipos de VAA (p. ej., unión a receptores de superficie celular, tráfico intracelular, etc.). De esta manera, por ejemplo, entre los serotipos de VAA5 se incluyen los VAA con las propiedades biológicas del VAA5, p. ej., el VAA pseudotipado que comprende la cápside del VAA5 y un genoma de VAA que no se deriva u obtiene de VAA5 o cuyo genoma es quimérico.
Un "vector VAA" se refiere a una partícula vírica compuesta de por lo menos una proteína de cápside de VAA y un polinucleótido dentro de cápside. En el caso de que la partícula comprenda un polinucleótido heterólogo (es decir, un polinucleótido diferente de un genoma de VAA de tipo salvaje, tal como un transgén que se administrará en una célula de mamífero), puede denominarse "VAAr (VAA recombinante)". Una "proteína de cápside" de VAA incluye una proteína de cápside de un VAA de tipo salvaje, así como formas modificadas de una proteína de cápside de VAA que son estructural y/o funcionalmente capaces de empaquetar un genoma de VAA y se unirse a por lo menos un receptor celular específico que puede ser diferente de un receptor utilizado por el VAA de tipo salvaje. Una proteína de cápside de VAA modificada incluye una proteína de cápside de VAA quimérica, tal como una que presenta secuencias de aminoácidos de dos o más serotipos de VAA, p. ej., una proteína de cápside formada de una parte de la proteína de cápside de VAA5 fusionada o unida a una parte e la proteína de cápside de VAA2, y una proteína de cápside de VAA que presenta una etiqueta u otro péptido o proteína de cápside no VAA detectable fusionado o unido a la proteína de cápside de VAA, p. ej., una parte de una molécula de anticuerpo que se une al receptor de transferrina puede fusionarse recombinantemente con la proteína de cápside de VAA2.
Las células capaces de producir VAA son conocidas de la técnica y entre ellas se incluyen, aunque sin limitación, las células 293, las células HeLa y las células de insecto.
En determinados aspectos de la exposición, pueden utilizarse métodos de producción de títulos elevados de VAA para maximizar la administración de ABCD1. Las células productoras transfectadas en cultivo pueden incubarse con una secuencia de ácidos nucleicos que es complementaria a un ARNm codificante del miembro 1 de la subfamilia D de casete de unión a ATP (ABCD1) transfectado con un vector de VAA que comprende una secuencia de nucleótidos codificante de ABCD1 en las células (p. ej., el vector VAA9-ABCD1). La cantidad de ARNm de ABCD1 expresada a partir del vector VAA se reduce, incrementando de esta manera el rendimiento de vector VAA-ABCD1 en el lisado y/o medio celular en un factor de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50 veces en comparación con un estándar de referencia. En determinados aspectos de la exposición, el rendimiento de vector de VAA-ABCD1 en el lisado y/o medio celular se incrementa en aproximadamente 4 veces. Los títulos de vector pueden determinarse según métodos bien conocidos de la técnica. Típicamente, lo anterior se lleva a cabo mediante la utilización de transferencia por puntos o la PCR cuantitativa para medir los genomas de VAA. En general, los rendimientos de vector VAA puede ser de entre aproximadamente 1x1010 copias de genoma/ml (cg/ml) y aproximadamente 1*1016 cg/ml a partir de lisados celulares y de medios.
En aspectos específicos de la exposición, el estándar de referencia comprende un rendimiento de vector VAA-ABCD1 en el lisado y/o medio celular de células productoras que no habían sido incubadas con una secuencia de ácidos nucleicos que es complementaria a un ARNm codificante de ABCD1.
Lo anterior puede conseguirse mediante, por ejemplo, la provisión de un oligonucleótido antisentido que es complementario al ARNm de ABCD1. Otras secuencias de ácidos nucleicos para la utilización en la práctica de los métodos de la exposición y que son complementarias al ARNm de ABCD1 pueden ser aquellas que inhiben el procesamiento post-transcripcional de ABC D l, tal como un ARN interfiriente, incluyendo, aunque sin limitación, ARNhc o ARNip, o un antagomir.
Las secuencias codificantes del ARNm de ABCD1 son bien conocidas y pueden encontrarse en, por ejemplo, GenBank n° de acceso NM_000033.3.
Los oligonucleótidos antisentido típicamente se diseñan para bloquear la expresión de una diana de ADN o ARN mediante la unión a la diana y deteniendo la expresión al nivel de la transcripción, traducción o procesamiento. Los oligonucleótidos antisentido de la presente exposición son secuencias de ácidos nucleicos complementarias diseñadas para hibridarse bajo condiciones restrictivas a ARNm de ABCD1. De esta manera, se seleccionan oligonucleótidos que son suficientemente complementarios de la diana, es decir, se hibridan suficientemente bien y con suficiente especificidad, para proporcionar el efecto deseado.
En el contexto de la presente exposición, hibridación se refiere a la formación de enlaces de hidrógeno, que pueden ser enlaces de hidrógeno de tipo Watson-Crick, Hoogsteen u Hoogsteen inverso, entre bases nucleósidas o nucleótidas complementarias. Por ejemplo, la adenina y la timina son nucleobases complementarias que se emparejan mediante la formación de enlaces de hidrógeno. Complementario, tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a la capacidad de emparejamiento preciso entre dos nucleótidos. Por ejemplo, en el caso de que un nucleótido en una determinada posición de un oligonucleótido sea capaz de formar enlaces de hidrógeno con un nucleótido en la misma posición de una molécula de ADN o ARN, el oligonucleótido y el ADN o ARN se considera que son complementarios entre sí en esa posición. El oligonucleótido y el ADN o ARN son complementarios entre sí en el caso de que un número suficiente de posiciones correspondientes en cada molécula esté ocupado por nucleótidos que pueden establecer un enlace de hidrógeno entre sí. De esta manera, "hibridable específicamente" y "complementario" son términos que se utilizan para indicar un grado suficiente de complementariedad o emparejamiento preciso, de manera que se produce una unión estable y específica entre el oligonucleótido y la diana de ADN o ARN.
Se entiende en la técnica que una secuencia de ácidos nucleicos complementaria no necesita ser 100 % complementaria a la secuencia de su ácido nucleico diana para ser específicamente hibridable. Una secuencia de ácidos nucleicos complementaria de la invención es específicamente hibridable en el caso de que la unión de la secuencia a la molécula diana de ADN o ARN interfiera con la función normal del ADN o ARN diana causando una pérdida de actividad, y haya un grado suficiente de complementariedad para evitar una unión no específica de la secuencia y secuencias no diana bajo condiciones en las que se desea la unión específica, es decir, bajo condiciones fisiológicas en el caso de ensayos in vivo o el tratamiento terapéutico, y en el caso de ensayos in vitro, bajo condiciones en las que se llevan a cabo los ensayos bajo condiciones adecuadas de rigurosidad. Por ejemplo, una concentración salina rigurosa ordinariamente será inferior a aproximadamente 750 mM de NaCl y 75 mM de citrato trisódico, preferentemente inferior a aproximadamente 500 mM de NaCl y 50 mM de citrato trisódico, y más preferentemente inferior a aproximadamente 250 mM de NaCl y 25 mM de citrato trisódico. Puede conseguirse la hibridación de baja rigurosidad en ausencia de solvente orgánico, p. ej., formamida, mientras que puede conseguirse la hibridación de alta rigurosidad en presencia de por lo menos aproximadamente 35 % de formamida, y más preferentemente de por lo menos aproximadamente 50 % de formamida. Las condiciones de temperatura rigurosas habitualmente incluyen temperaturas de por lo menos aproximadamente 30°C, más preferentemente de por lo menos aproximadamente 37°C, y lo más preferentemente de por lo menos aproximadamente 42°C. Parámetros adicionales variables, tales como el tiempo de hibridación, la concentración de detergente, p. ej., dodecilsulfato sódico (SDS) y la inclusión o exclusión de ADN portador son bien conocidos por el experto en la materia. Se consiguen diversos niveles de rigurosidad mediante la combinación de dichas diversas condiciones. En un aspecto preferente de la exposición, la hibridación se produce a 30°C en NaCl 750 mM, citrato trisódico 75 mM y SDS al 1 %. En un aspecto más preferente de la exposición, la hibridación se produce a 37°C en NaCl 500 mM, citrato trisódico 50 mM, s Ds al 1 %, formamida al 35 % y 100 pg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado (ADNmc). En un aspecto más preferente de la exposición, la hibridación se produce a 42°C en NaCl 250 mM, citrato trisódico 25 mM, SDS al 1 %, formamida al 50 % y 200 pg/ml de ADNmc. Las variaciones útiles de dichas condiciones resultarán evidentes para el experto en la materia.
Para la mayoría de aplicaciones, las etapas de lavado después de la hibridación también variarán en rigurosidad. Las condiciones de rigurosidad de lavado pueden definirse a partir de la concentración salina y la temperatura. Tal como anteriormente, puede incrementarse la rigurosidad del lavado mediante la reducción de la concentración salina o mediante el incremento de la temperatura. Por ejemplo, una concentración salina rigurosa de las etapas de lavado preferentemente será inferior a aproximadamente 30 mM de NaCl y 3 mM de citrato trisódico, y lo más preferentemente inferior a aproximadamente 15 mM de NaCl y 15 mM de citrato trisódico. Las condiciones de temperatura rigurosas para las etapas de lavado habitualmente incluirán una temperatura de por lo menos aproximadamente 25°C, más preferentemente de por lo menos aproximadamente 42°C y todavía más preferentemente de por lo menos aproximadamente 68°C. En una realización preferente, las etapas de lavado se producirán a 25°C en NaCl 30 mM, citrato trisódico 3 mM y SDS al 0,1 %. En un aspecto más preferente, las etapas de lavado se producirán a 42°C en NaCl 15 mM, citrato trisódico 1,5 mM y SDS al 0,1 %. En una realización más preferente, las etapas de lavado se producirán a 68°C en NaCl 15 mM, citrato trisódico 1,5 mM y SDS al 0,1 %. Variaciones adicionales de dichas condiciones resultarán evidentes para el experto en la materia. Las técnicas de hibridación son bien conocidas por el experto en la materia y se describen en, por ejemplo, Benton y Davis (Science 196:180, 1977); Grunstein y Hogness (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 72:3961, 1975); Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001); Berger y Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, New York); y Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
Resulta preferente que los oligonucleótidos antisentido de la presente exposición comprendan una complementariedad de secuencia de por lo menos 80 % respecto a una región diana dentro del ácido nucleico diana, además de comprender una complementariedad de secuencia de 90 % y todavía más preferentemente una complementariedad de secuencia de 95 % respecto a la región diana dentro de la secuencia del ácido nucleico diana que es la diana de los mismos. Por ejemplo, un compuesto antisentido en el que 18 a 20 nucleobases del oligonucleótido antisentido son complementarios y, por lo tanto, se hibridarían específicamente, con una región diana representaría una complementariedad del 90 por ciento. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido respecto a una región del ácido nucleico diana puede determinarse rutinariamente utilizando herramientas básicas de búsqueda de alineación local (programas BLAST) (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410; Zhang y Madden, Genome Res., 1997, 7, 649-656). Los compuestos antisentido y otros compuestos de la exposición, que se hibridan con el ARNm de ABCD1, se identifican mediante experimentación y posteriormente en la presente memoria se identifican secuencias representativas de dichos compuestos como aspectos preferentes de la exposición.
En la invención, la secuencia de ácidos nucleicos que es complementaria al ARNm de ABCD1 es un ARN interfiriente, incluyendo, aunque sin limitación, ARNhc o ARNip. El ARN interfiriente incluye, aunque sin limitación, ARN interfiriente pequeño ("ARNip") y ARN de horquilla corto ("ARNhc"). Los métodos para construir ARN interfirientes son bien conocidos de la técnica. Por ejemplo, el ARN interfiriente puede ensamblarse a partir de dos oligonucleótidos separados, en donde una cadena es la cadena de sentido y la otra es la cadena antisentido, en donde las cadenas antisentido y de sentido son autocomplementarias (es decir, cada cadena comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos en la otra cadena, tal como donde la cadena antisentido y la cadena de sentido forman un dúplex o estructura de doble cadena); la cadena antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos en una molécula diana de ácidos nucleicos o una parte de la misma (es decir, un gen no deseado) y la cadena de sentido comprende una secuencia de nucleótidos correspondiente a la secuencia diana de ácidos nucleicos o una parte de la misma. Alternativamente, el ARN interfiriente se ensambla a partir de un único oligonucleótido, en el que las zonas de sentido y antisentido autocomplementarias se unen mediante uno o más conectores basados o no en ácidos nucleicos. El ARN interfiriente puede ser un polinucleótido con una estructura secundaria dúplex, dúplex asimétrica, de horquilla o de horquilla asimétrica, que presenta zonas de sentido y antisentido autocomplementarias, en el que la región antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos en una molécula diana separada de ácidos nucleicos o una parte de la misma, y la región de sentido que presenta una secuencia de nucleótidos correspondiente a la secuencia diana de ácidos nucleicos o una parte de la misma. La molécula interfiriente puede ser un polinucleótido de cadena sencilla circular que presenta dos o más estructuras de bucle y un tallo que comprenden regiones de sentido y antisentido autocomplementarias, en la que la región antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos en la molécula diana de ácidos nucleicos o una parte de la misma, y la región de sentido presenta una secuencia de nucleótidos correspondiente a la secuencia diana de ácidos nucleicos o una parte de la misma, y en la que el polinucleótido circular puede procesarse in vivo o in vitro para generar una molécula de ARNip activa capaz de mediar en la interferencia del ARN.
En determinadas realizaciones de la invención, la región codificante del ARN interfiriente codifica una molécula de ARN autocomplementario que presenta una región de sentido, una región antisentido y una región de bucle. Dicha molécula de ARN, al expresarse deseablemente forma una estructura de "horquilla" y se denomina en la presente memoria "ARNhc". La región de bucle generalmente presenta una longitud de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 10 nucleótidos. En una realización preferente, la región de bucle presenta una longitud de entre aproximadamente 6 y aproximadamente 9 nucleótidos. En una de dichas realizaciones de la invención, la región de sentido y la región antisentido presentan una longitud de entre aproximadamente 15 y aproximadamente 20 nucleótidos. Tras el procesamiento post-transcripcional, el ARN de horquilla pequeño se convierte en un ARNip mediante un suceso de corte mediado por el enzima Dicer, que es un miembro de la familia de la ARNasa III. A continuación, el ARNip es capaz de inhibir la expresión de un gen con el que comparte homología. Para más información, ver Brummelkamp et al., Science 296:550-553, (2002); Lee et al, Nature Biotechnol., 20, 500-505, (2002); Miyagishi y Taira, Nature Biotechnol 20:497-500, (2002); Paddison et al. Genes & Dev. 16:948-958, (2002); Paul, Nature Biotechnol, 20, 505-508, (2002); Sui, Proc. Natl. Acad. Sd. USA, 99(6), 5515-5520, (2002); Yu et al. Proc NatlAcadSci USA 99:6047-6052, (2002).
La reacción de corte de la diana de ARN guiada por los ARNip es altamente específica de secuencia. En general, los ARNip que contienen secuencias de nucleótidos idénticas a una parte del gen diana (es decir, ABCD1) resultan preferentes para la inhibición. Sin embargo, no resulta necesaria para la puesta en práctica de la presente invención una identidad de secuencia de 100 % entre el ARNip y el gen diana. De esta manera, la invención presenta la ventaja de poder tolerar variaciones de secuencia que podrían esperarse debido a mutación genética, polimorfismo de cepa o divergencia evolutiva. Por ejemplo, las secuencias de ARNip con inserciones, deleciones y mutaciones puntuales respecto a la secuencia diana también se ha encontrado que resultan eficaces para la inhibición. Alternativamente, las secuencias de ARNip con sustituciones o inserciones de análogos de nucleótidos también pueden resultar eficaces para la inhibición.
En todavía otros aspectos de la exposición, la secuencia de ácidos nucleicos que es complementaria al ARNM de ABCD1 es un antagomir. Los antagomir son oligonucleótidos de cadena sencilla, de doble cadena, parcialmente de doble cadena y de estructura de horquilla modificados químicamente con diana en un microARN. Preferentemente, un antagomir proporcionado en la exposición incluye una secuencia de nucleótidos que es suficientemente complementaria para hibridarse con una secuencia diana de ARNmi de aproximadamente 10 a 25 nucleótidos, preferentemente de 15 a 20 nucleótidos.
En determinados aspectos de la exposición, los antagomirs son oligonucleótidos de tipo ARN que incluyen diversas modificaciones para la protección frente a ARNasa y propiedades farmacológicas tales como una incorporación incrementada en tejidos y células. Un antagomir puede diferir del ARN normal en que presenta una 2'-O-metilación completa de los azúcares, un esqueleto fosforotioato y una fracción colesterol en el extremo 3'. Las modificaciones fosforotioato proporcionan protección frente a la actividad de ARNasa y su lipofilicidad contribuye a una incorporación potenciada en los tejidos. En una exposición preferente, el antagomir incluye seis modificaciones del esqueleto fosforotioato; dos fosforotioatos están localizados en el extremo 5' y cuatro en el extremo 3'. Los antagomirs de la presente exposición también pueden modificarse con respecto a su longitud o alternativamente, el número de nucleótidos que constituye el antagomir.
Las secuencias de ácidos nucleicos utilizadas para la puesta en práctica de la presente exposición, sea de ARN, ADNc, ADN genómico, vectores, virus o híbridos de los mismos, pueden aislarse a partir de una diversidad de fuentes, manipularse genéticamente, amplificarse y/o expresarse/generarse recombinantemente. Las secuencias de ácidos nucleicos recombinantes pueden aislarse o clonarse individualmente y someterse a ensayo para una actividad deseada. Puede utilizarse cualquier sistema de expresión recombinante, incluyendo, p. ej., sistemas in vitro de expresión celular bacterianos, fúngicos, de mamífero, de levadura, de insecto o vegetales.
Las secuencias de ácidos nucleicos de la exposición pueden insertarse en vectores de administración y expresarse a partir de unidades de transcripción dentro de los vectores (p. ej., vectores VAA). Los vectores recombinantes pueden ser plásmidos de ADN o vectores víricos. La generación del constructo vector puede llevarse a cabo mediante la utilización de cualesquiera técnicas de ingeniería genética adecuadas y bien conocidas de la técnica, incluyendo, aunque sin limitarse a ellas, las técnicas estándares de PCR, síntesis de oligonucleótidos, digestión con endonucleasa de restricción, ligación, transformación, purificación de plásmidos y secuenciación del ADN, por ejemplo tal como se indica en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (1989)), Coffin et al. (Retroviruses. (1997)) y "RNA Viruses: A Practical Approach" (Alan J. Cann, Ed., Oxford University Press, (2000)). Tal como resultará evidente para el experto ordinario en la materia, se encuentra disponible una diversidad de vectores adecuados para transferir ácidos nucleicos de la exposición al interior de las células. La selección de un vector apropiado para administrar ácidos nucleicos y la optimización de las condiciones para la inserción del vector de expresión seleccionado en la célula, se encuentran comprendidos dentro del alcance del experto ordinario en la materia sin necesidad de experimentación indebida. Los vectores víricos comprenden una secuencia de nucleótidos que presenta secuencias para la producción de virus recombinantes en una célula de empaquetamiento. Pueden construirse vectores víricos que expresan ácidos nucleicos de la exposición basándose en esqueletos víricos, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, retrovirus, lentivirus, adenovirus, virus adenoasociados, poxvirus o alfavirus. Los vectores recombinantes capaces de expresar los ácidos nucleicos de la exposición pueden administrarse tal como se indica en la presente memoria, y persisten en las células diana (p. ej., transformantes estables).
Las secuencias de ácidos nucleicos utilizadas para la puesta en práctica de la presente exposición pueden sintetizarse in vitro mediante técnicas bien conocidas de síntesis química, tal como se indica en, p. ej., Adams (1983) J. Am. Chem. Soc. 105:661; Belousov (1997) Nucleic Acids Res. 25:3440-3444; Frenkel (1995) Free Radic. Biol. Med. 19:373-380; Blommers (1994) Biochemistry 33:7886-7896; Narang (1979) Meth. Enzymol. 68:90; Brown (1979) Meth. Enzymol. 68:109; Beaucage (1981) Tetra. Lett. 22:1859; patente US n° 4.458.066.
Las secuencias de ácidos nucleicos de la exposición pueden estabilizarse frente a la degradación nucleolítica, tal como mediante la incorporación de una modificación, p. ej., una modificación de nucleótido. Por ejemplo, entre las secuencias de ácidos nucleicos de la exposición se incluyen un fosforotioato en por lo menos el primer, segundo o tercer enlace internucleótido en el extremo 5' o 3' de la secuencia de nucleótidos. A modo de otro ejemplo, la secuencia de ácidos nucleicos puede incluir un nucleótido modificado en 2', p. ej., un grupo 2'-desoxi, 2'-desoxi-2'-fluoro, 2'-O-metilo, 2'-O-metoxietilo (2'-O-MOE), 2'-O-aminopropilo (2'-O-AP), 2'-O-dimetilaminoetilo (2'-O-DMAOE), 2'-O-dimetilaminopropilo (2'-O-DmAP), 2'-O-dimetilaminoetiloxietilo (2'-O-DMAEOE) o 2'-O-N-metilacetamido (2'-O-NMA). A modo de otro ejemplo, la secuencia de ácidos nucleicos puede incluir por lo menos un nucleótido modificado con 2'-O-metilo, y en algunos aspectos, todos los nucleótidos incluyen una modificación 2'-O-metilo.
Las técnicas para la manipulación de ácidos nucleicos utilizadas para la puesta en práctica de la presente exposición, tales como, p. ej., la subclonación, las sondas de marcaje (p. ej., el marcaje con cebadores aleatorios utilizando la polimerasa Klenow, la traslación por muescas, la amplificación), la secuenciación, la hibridación y similares, están bien descritas en la literatura científica y de patentes; ver, p. ej., Sambrook, ed., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (2a ED.), vols. 1 a 3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel, ed. John Wiley & Sons, Inc., New York (1997); LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY: HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, ed. Elsevier, N.Y. (1993).
La administración de vector de ABCD1 proporcionada mediante la administración intravenosa (IV) o intracerebroventricular (ICV) se ha determinado recientemente que causa toxicidad cardiaca. La administración intratecal es una vía de administración que comprende la inyección de agentes deseados en el espacio subaracnoideo del canal espinal, introduciendo de esta manera los agentes en el líquido cefalorraquídeo (LCR). Mediante la utilización de la administración intratecal, la expresión de ABCD1 a partir de un vector en el sistema nervioso central es superior a la expresión de ABCD1 a partir de un vector dentro de órganos periféricos, tales como el corazón. El exceso de expresión de ABCD1 en órganos periféricos puede resultar en toxicidad y, por lo tanto, la administración intratecal de vectores de ABCD1 comprende un método mejorado de terapia para X-ALD, p. ej., para AMN.
En algunas realizaciones, la administración intratecal es mediante una bomba. La bomba puede ser una bomba osmótica implantada quirúrgicamente. En determinados aspectos de la exposición, la bomba osmótica se implanta en el espacio subaracnoideo del canal espinal a fin de facilitar la administración intratecal.
En determinados aspectos de la exposición, los sujetos humanos reciben un tratamiento único de vector administrado por vía intratecal (p. ej., VAA9) que comprende ABCD1 en una cantidad de entre aproximadamente 1x1013 CG y aproximadamente 10x1013 CG durante un periodo de aproximadamente 24 horas.
La infusión intratecal continua lenta de VAA9-ABCD1_h puede escalarse al ser humano mediante la utilización de una bomba regulada osmóticamente, tal como el implante DUROS®, ALZA Corporation (Mountain View, CA). Ver también J.C. Wright, J. Culwell, Long-term controlled delivery of therapeutic agents by the osmotically driven DUROS® implant, in: M.J. Rathbone, J. Hadgraft, M.S. Roberts (Eds.), Modified-Release Drug Delivery Technology, Informa Healthcare, New York, 2008, páginas 143-149.
Los dispositivos de administración osmótica y sus partes componentes se han descrito en, por ejemplo, las patentes US n° 5.609.885, n° 5.728.396, n° 5.985.305, n° 5.997.527, n° 6.113.938, n° 6.132.420, n° 6.156.331, n° 6.217.906, n° 6.261.584, n° 6.270.787, n° 6.287.295, n° 6.375.978, n° 6.395.292, n° 6.508.808, n° 6.544.252, n° 6.635.268, n° 6.682.522, n° 6.923.800, n° 6.939.556, n° 6.976.981, n° 6.997.922, n° 7.014.636, n° 7.207.982, n° 7.112.335, n° 7.163.688, y las publicaciones de patente US n° 2005-0175701 y 2007-0281024 n° 2008-0091176.
El dispositivo de administración DUROS® típicamente consiste en un reservorio cilíndrico que contiene un motor osmótico, un pistón y la formulación de fármaco. El reservorio es tapa en un extremo con una membrana permeable al agua de tasa controlada y se tapa en el otro extremo con un moderador de difusión a través del cual se libera la formulación de fármaco a partir del reservorio de fármaco. El pistón separa la formulación de fármaco respecto del motor osmótico y utiliza un sello para impedir que el agua en el compartimiento del motor osmótico llegue a entrar en el reservorio de fármaco. El moderador de difusión está diseñado, junto con la formulación de fármaco, para impedir que líquidos corporales entren en el reservorio de fármaco por el orificio.
El dispositivo DUROS® libera un agente terapéutico a una tasa predeterminada basándose en el principio de ósmosis. El líquido extracelular entra en el dispositivo DUROS® a través de una membrana semipermeable directamente al interior de un motor salino que se expande, desplazando el pistón a una tasa de administración lenta y uniforme. El desplazamiento del pistón fuerza la liberación de la formulación de fármaco por el orificio o puerto de salida a una tasa de cizalla predeterminada. En una realización de la presente invención, el reservorio del dispositivo DUROS® está cargado con una formulación en suspensión de la presente invención, que comprende, por ejemplo, 1*1011cg de VAA9-ABCD1_h, en el que el dispositivo es capaz de administrar la formulación en suspensión en un sujeto durante un periodo de tiempo prolongado a una tasa de administración terapéuticamente eficaz predeterminada.
Pueden utilizarse otros dispositivos de administración de fármaco implantables en la puesta en práctica de la presente invención y entre ellos pueden incluirse bombas implantables de tipo regulador que proporcionan un flujo constante, un flujo ajustable o un flujo programare del compuesto, tal como los disponibles de Codman & Shurtleff, Inc. (Raynham, Mass.), Medtronic, Inc. (Minneapolis, Minn.) y Tricumed Medinzintechnik GmbH (Alemania).
La presente invención se describe adicionalmente mediante los Ejemplos no limitativos ilustrativos siguientes que proporcionan una mejor comprensión de la presente invención y de sus muchas ventajas.
Ejemplos
Los Ejemplos a continuación ilustran algunas realizaciones y aspectos de la invención. Los Ejemplos siguientes en modo alguno son limitativos de la invención. Cualesquiera ejemplos que caigan fuera del alcance según las reivindicaciones se proporciona con fines exclusivamente comparativos.
Ejemplo 1: producción de VAA9-ABCD1 en presencia de ARNip específico para ARNm de ABCD1 mejora los títulos de vector VAA a partir de células 293T transfectadas.
Anteriormente se ha observado un elevado número de efectos de muerte celular/citopáticos durante la producción de VAA9-ABCD1, probablemente debidos a la sobreexpresión de la proteína ABCD1 en las células productoras. Dicha toxicidad reduce los rendimientos de vector VAA. Para mitigar la toxicidad y mejorar los rendimientos de vector, se ha utilizado como diana el ARNm de ABCD1 utilizando una agrupación de ARNip.
El empaquetamiento de los VAA se llevó a cabo de la manera siguiente. Se sembraron 1-1,5x107 células 293T en placas de 15 cm y se cultivaron durante la noche.
Tabla 1: medios de empaquetamiento y recolección
Figure imgf000010_0002
El día 2, se preparó la mezcla de transfección de la manera siguiente:
Tabla 2: mezcla de transfección
Figure imgf000010_0001
Se agruparon gota a gota el tubo A y el tubo B bajo agitación con vórtex durante 1 minuto. Se incubó la mezcla a temperatura ambiente durante 20 minutos. Se añadieron 1,5 ml de mezcla de virus por cada placa de 15 cm, distribuidos gota a gota por la superficie de la placa. Las placas se inclinaron para una mezcla uniforme y se incubaron durante la noche. El día 3, se sustituyó el medio por DMEM al 2 %, FBS al 1 % p/s. El día 5, de cada placa se eliminó la mitad del volumen de medio de la placa. Se recogieron las células de las placas mediante lavado con el medio restante o suavemente utilizando un raspador celular. Las células se peletizaron a 1300 rpm durante 5 minutos. Se eliminó el sobrenadante. Se desprendieron las células mediante golpecitos suaves en el fondo del tubo y se resuspendieron en 1 ml de EDTA PBS en cada placa de células y se centrifugaron a 1300 rpm durante 5 minutos. Las células se resuspendieron en 1 ml de tampón de lisis por placa y se almacenaron opcionalmente a -80°C. Tras la purificación en gradiente, se intercambió el tampón del virus por PBS, se cuantificó mediante qPCR y se utilizaron para la experimentación.
El día de la siembra de células 293T, las células se transfectaron con la agrupación de ARNip específicos para ARNm de ABCD1 o un ARNip de control sin diana. Otro control fue un vector v Aa 9 codificante de Gf P (VAA9-GFP) en presencia de ARNip de ABCD1. Al dÍA siguiente se transfectaron ambas muestras con plásmidos VAA para producir VAA9-ABCD1.
El protocolo de ARNip presenta múltiples etapas:
1. Preparación de 5 pM de solución agrupada de ARNip (25 % de cada uno de los 4 ARNip) en 1x tampón de ARNip (GE Healthcare) u otra solución apropiada sin ARNasa a partir de solución madre.
2. Dilución en tubos separados del ARNip (100 pl en el tubo 1) y el reactivo de transfección DharmaFECT apropiado (30 pl en el tubo 2) con medio DMEM sin suero en un volumen de 2 ml, respectivamente.
3. Mezcla suave del contenido e cada tubo mediante pipeteado cuidadoso hacia arriba y hacia abajo. Incubación durante 5 minutos a temperatura ambiente.
4. Adición del contenido del tubo 1 al tubo 2 para un volumen total de 4 ml. Mezcla mediante pipeteado cuidadoso hacia arriba y hacia abajo e incubación durante 20 minutos a temperatura ambiente. Adición de 12 ml de DMEM completo (f Bs al 10 %) a los 4 ml.
5. Adición de 4 ml de células 293T resuspendidas en medio completo que están a una concentración de 3,75x106 células/ml (total: 1,5x107 células) a los 16 ml de la mezcla de transfección de la etapa 4 (concentración final de ARNip: 25 nM).
6. Siembra en una placa de 15 cm e incubación durante 24 h.
7. Cambio del medio a DMEM completo, FBS al 10 % 1 h antes de la transfección con fosfato cálcico con plásmidos de VAA.
8. Continuación con el protocolo estándar de producción y purificación de VAA.
Tres días después de la transfección se recolectaron las células, se lisaron y se determinaron los rendimientos de vector (en copias genómicas) mediante qPCR, de la manera siguiente:
Tabla 3: materiales de qPCR
Figure imgf000011_0001
El protocolo de qPCR presenta múltiples etapas:
1. Dilución del vector 1:100-1:1000 en agua libre de nucleasas y agitación con vórtex. Utilización en qPCR. 2. Utilización del plásmido 675.5 (5999 pb) como estándar de copia genómica (CG). Creación de un estándar de 107-102 cg/ml.
3. Preparación de la mezcla maestra en una cantidad suficientemente grande para medir los estándares y muestras por triplicado. La mezcla maestra incluye 2 pl de H2O, 12 pl de mezcla de cebadores (F y R=5 pl de cada solución madre 100 pM en 90 pl de agua), 1 pl de mezcla de cebadores (F y R=6 pl de cada solución madre 100 pM en 88 pl de agua), 0,8 pl de sonda TM Fa M 2,5 pM, 1 pl de sonda TM fA m 2 pM (4 pl de solución madre 100 pM 196 pl de agua) y 5 pl de maestra de PCR TaqMan Fast Universal 2x.
4. Mezcla y división en alícuotas de 9 pl en pocillos de la placa.
5. Adición de 1 pl de molde diluido en agua.
6. Programación del aparato 7500 con los parámetros de ciclado térmico: estadio 1 con reps 195°C: 20 y estadio 2 con reps 4095°C: 03; 60°C: 30.
7. Análisis de los datos. La pendiente para el estándar debería ser —3,3.
El rendimiento se expresa en título relativo en el que se ha fijado arbitrariamente como 100 % la muestra de VAA9-GFP y las otras dos muestras se han normalizado respecto a este valor. La producción de VAA9-ABCD1 en presencia de la agrupación de ARNip frente a ARNm de ABCD1 mejoró el título (y rendimiento) de vector en aproximadamente 4 veces en comparación con el ARNip de control (figura 1).
Tabla 4: ARNip con diana en ABCD1
Figure imgf000011_0002
Se transfectaron células 293T con ARNip de control (figura 2, carriles 1 y 2), agrupación de ARNip contra ARNm de ABCD1 (figura 2, carriles 3 a 6) o no transfectadas (figura 2, carril 7, "normal" se refiere a niveles endógenos de proteína ABCD1 en células 293T). Se transfectó al día siguiente el plásmido VAA-ABCD1 (figura 2, carriles 1 a 4) o el plásmido VAA-GFP (figura 2, carriles 5 y 6). Tres días después, los lisados celulares se sometieron a electroforesis en un gel SDS-PAGE y a una inmunotransferencia de la proteína ABCD1 para evaluar la inactivación del ARNip. Como control de carga se llevó a cabo la transferencia de actina. 8s y 1s se refieren a la exposición de 8 segundos y 1 segundo de la película radiográfica, respectivamente. El ARNip de ABCD1 reduce el nivel de ABCD1 sobreexpresado en comparación con el ARNip de control.
Las células 293T se dejaron sin transfectar (sin ARNip) o transfectadas con ARNip de control o la agrupación de ARNip contra el ARNm de ABCD1. Al día siguiente se transfectaron las células con plásmidos VAA para producir VAA9-ABCD1. El día 3 después de la transfección de los plásmidos de VAA, se llevó a cabo la qPCR para determinar la cantidad de vector (g.c.) en el lisado celular y en el medio de las células transfectadas. Se observó un incremento de aproximadamente 3 a 4 veces del rendimiento de vector VAA9-ABCD1 tanto en lisado celular como en el medio (figura 3).
Ejemplo 2: Administración intratecal de VAA9r-ABCD1 mediante bomba osmótica en un modelo de ratón de adrenomieloneuropatía conduce a una administración génica más uniforme y generalizada en el SNC.
Se administraron VAA9 GFP(scVAA9GFP) autocomplementarios y VAA9r codificantes de ABCD1 (VAA9r-ABCD1) en ratones Abcd1-/- por vía intratecal (IT) mediante bolo durante un periodo de 2 minutos o mediante bomba osmótica a lo largo de un periodo de 24 horas con inyección de PBS como control simulado. Dos semanas después de la inyección, los ratones fueron sacrificados y perfundidos con PFA al 4 %. A continuación, se recolectaron los tejidos, se realizaron secciones de los mismos y se tiñeron para el análisis de inmunofluorescencia.
VAA9sc-GFP administrado por vía IT mediante bomba osmótica condujo a una expresión generalizada en todos los tipos celulares relevantes para el SNC y ganglios de la raíz dorsal (GRD) de una manera dependiente de la dosis. La médula espinal y GRD presentaron la expresión más alta en comparación con el cerebro, aunque la expresión de GFP también se detectó en órganos periféricos (hígado, corazón y glándula adrenal), con una expresión máxima observada de 3x1011 CG.
Se detectó un patrón de distribución similar de la proteína ABCD1 después de la administración intratecal con bomba de VAA9r-ABCD1. En general, las dosis más altas (2X1011CG y 1X1011 CG) condujeron a mayor expresión en el SNC y órganos periféricos que dosis inferiores (0,5X1011 CG). En comparación, la administración de bolo intratecal durante 2 minutos condujo a la cantidad máxima de expresión de ABCD1 en la región torácica; sin embargo, incluso una dosis superior (1x1011cg) no condujo a una administración más generalizada en las regiones cervical y lumbar (figura 4).
Especialmente, la expresión generalizada de ABCD1 en todo el SNC se detectó incluso después de una inyección de bolo intratecal directo de dosis baja, de 0,5X1011CG (figura 5). Por ejemplo, la administración de un bolo y con bomba de 0,5X1011 CG mostraron una expresión similar de ABCD1 en la médula cervical, mientras que el tejido cardiaco mostró una expresión más alta después de la inyección de un bolo (figura 6). Se concluyó que la misma dosis administrada mediante bomba conducía a una expresión más alta en el cerebro y la médula espinal más distante del sitio de inyección y comparativamente menos fuga a órganos periféricos que la inyección de un bolo (figura 7). La administración de VAA9r-ABCD1 a una dosis de 0.5X1011CG mediante administración intracerebroventricular resultó en una mejora conductual en los ratones Abcdl-/- a pesar de la expresión localizada en el cerebro. Por lo tanto, puede conseguirse un rendimiento incluso mejor a dicha dosis utilizando la administración intratecal con bomba señalada. A una dosis de 1x1011 CG administrada mediante bomba intratecal, la expresión de ABCD1 en el sistema nervioso central fue aproximadamente 3 veces superior a la expresión de ABCD1 en el sistema nervioso central de un sujeto no tratado que no presenta X-ALD (p. ej., de tipo salvaje). Resulta importante que la expresión de ABCD1 en órganos periféricos era aproximadamente 90 % inferior que la expresión de ABCD1 en órganos periféricos de un sujeto no tratado que no presentaba X-ALD (ver la figura 11, en la que la expresión de proteína en los diferentes tipos tisulares en transferencias Western se ha normalizado respecto a los niveles de tipo salvaje endógenos).
En conclusión, la transferencia génica de ABCD1 medida por VAA9r mediante bomba osmótica intratecal conduce a una administración génica más uniforme y generalizada en el SNC con fugas reducidas a la circulación sistémica en comparación con la inyección de bolo intratecal.
Ejemplo 3: la transferencia génica de ABCD1 mediada por VAA9r mediante bomba osmótica intratecal conduce a una reducción de los niveles de C26:0 en la médula espinal.
C26:0 es un hito bioquímico de la adrenomieloneuropatía. Con el fin de evaluar la presencia de ácidos grasos de cadena muy larga libres (VLCFA, por sus siglas en inglés) tras la administración génica con VAA9, se llevó a cabo el análisis lipidómico en muestras de médula espinal. Se informan los valores absolutos de C26:0 y C24:0, así como la proporción C26:0/C22:0. Se determinó que la transferencia génica de ABCD1 mediada por VAA9r mediante bomba osmótica intratecal (1x1o11 cg) conduce a una reducción de 20 % de los niveles de C26:0 en la médula espinal (figura 13). Los niveles tras la administración con bomba osmótica intratecal eran comparables a los observados después de la administración de bolo intratecal, aunque evitan las fugas sistémicas.
Se llevó a cabo adicionalmente tinción de inmunofluorescencia y obtención de imágenes de microscopía confocal. Para la obtención de imágenes de secciones de tejidos, se realizaron secciones de la médula espinal (16 |jm) a -25°C utilizando un criostato (Leica) y se almacenaron a -80°C. Las secciones se tiñeron con anticuerpo de ratón anti-ABCDI humano y después se cotiñeron con anticuerpo de conejo anti-GFAP (Dako, Carpinteria, CA), anti-IBAI de conejo (Wako, Richmond, VA) y anticuerpo anti-CD31 de ratón (Abcam), respectivamente, para localizar los tipos celulares. Se utilizó TOPRO-3 (Thermo Fisher Scientific) como pigmento fluorescente para la contratinción nuclear. Se obtuvieron imágenes de los portaobjetos mediante microscopía láser confocal y se contaron las células transducidas. Se documentaron estimaciones de las células transducidas con ABCD1 de cada tipo celular en imágenes de ampliación 20x y 40x (para la microglía). Transferencia del gen de ABCD1 mediada por VAA9r mediante bomba osmótica intratecal (1x1011 cg de las dianas, principalmente astrocitos, células endoteliales y unas cuantas neuronas en la médula espinal, figura 14). Dentro de los ganglios de la raíz dorsal presenta como diana tanto células satélite como neuronas (figura 14).
Otras realizaciones
Debe entenderse que, aunque la invención ha sido descrita junto con la descripción detallada de la misma, la descripción anteriormente proporcionada pretende ser ilustrativa y no limitativa del alcance de la invención, que se define a partir del alcance según las reivindicaciones adjuntas. Otros aspectos, ventajas y modificaciones se encuentran comprendidos dentro del alcance según las reivindicaciones a continuación.

Claims (12)

  1. REIVINDICACIONES
    i. Método para incrementar los títulos de vector virus adenoasociado 9 (VAA9) en células productoras transfectadas en cultivo, en el que dicho método comprende las etapas de:
    i) incubar un ARN interfiriente que es complementario a un ARNm codificante de miembro 1 de la subfamilia D de casete de unión a ATP (ABCD1) con las células, y
    ii) transfectar un vector VAA9 que comprende una secuencia de nucleótidos codificante de ABCD1 en las células (vector VAA9-ABCD1),
    en el que la cantidad de ARNm de ABCD1 expresado a partir del vector VAA9 se reduce, incrementando de esta manera el rendimiento de vector VAA9-ABCD1 en el lisado celular y/o medio en un factor de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50 veces en comparación con un estándar de referencia, en el que el estándar de referencia comprendía un rendimiento de vector VAA9-ABCD1 en el lisado celular y/o medio a partir de las células productoras que no han sido incubadas con una secuencia de ácidos nucleicos que es complementaria a un ARNm codificante de ABCD1.
  2. 2. Método según la reivindicación 1, en el que el ARN interfiriente es un ARNhc o ARNip.
  3. 3. Método según la reivindicación 2, en el que el ARNip comprende la SEC ID n° 4, la SEC ID n° 5, la SEC ID n° 6, la SEC ID n° 7 o una combinación de las mismas.
  4. 4. Composición para la utilización en un método de tratamiento de la adrenoleucodistrofia ligada a X (X-ALD) en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar en el sujeto dicha composición, en el que la composición comprende vector VAA9-ABCD1 purificado que se ha obtenido mediante el método según la reivindicación 1, en el que la composición que comprende vector VAA9-ABCD1 purificado se administra en el sujeto mediante administración intratecal.
  5. 5. Vector para la utilización en un método de tratamiento de la adrenoleucodistrofia ligada a X (X-ALD) en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar dicho vector en el sujeto, en el que el vector comprende un vector de virus adenoasociado (VAA) de serotipo 9 codificante de miembro 1 de la subfamilia D de casete de unión a ATP (ABCD1), y en el que dicho vector se administra en el sujeto mediante administración intratecal.
  6. 6. Vector para la utilización según la reivindicación 5, en el que la administración intratecal está mediada por una bomba.
  7. 7. Vector para la utilización según la reivindicación 5 o 6, en el que la dosis de vector es de entre aproximadamente 1*1013 CG y aproximadamente 10*1013 CG.
  8. 8. Vector para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en el que la expresión de ABCD1 a partir de dicho vector en el sistema nervioso central de un sujeto es superior a la expresión de ABCD1 a partir de dicho vector en órganos periféricos del sujeto.
  9. 9. Vector para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en el que la expresión de ABCD1 a partir de dicho vector en el sistema nervioso central del sujeto es aproximadamente 3 veces superior a la expresión de ABCD1 en el sistema nervioso central de un sujeto no tratado que no presenta X-ALD.
  10. 10. Vector para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en el que la expresión de ABCD1 a partir de dicho vector en los órganos periféricos del sujeto es aproximadamente 90 % inferior a la expresión de ABCD1 en órganos periféricos de un sujeto no tratado que no presenta X-ALD.
  11. 11. Vector para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10, en el que el gen ABCD1 codifica una secuencia de ARN que comprende NM_000033.3.
  12. 12. Vector para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 11, en el que el gen ABCD1 codifica una secuencia de proteína que comprende NM_000024.2.
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