KR20180066252A - 부신척수신경병증의 치료를 위한 abcd1을 코딩하는 핵산 서열의 척추강내 전달 - Google Patents

부신척수신경병증의 치료를 위한 abcd1을 코딩하는 핵산 서열의 척추강내 전달 Download PDF

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케이시 에이. 맥과이어
플로리안 에이흘러
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더 제너럴 하스피탈 코포레이션
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Abstract

본 발명의 방법은 X-연관 부신백질이영양증(X-ALD), 예를 들어 부신척수신경병증(AMN)의 치료를 위한 ABCD1을 코딩하는 핵산 서열의 전달을 포함한다.

Description

부신척수신경병증의 치료를 위한 ABCD1을 코딩하는 핵산 서열의 척추강내 전달
관련 출원
본 출원은 2015년 11월 5일자로 출원된 미국 가출원 제62/251,208호, 및 2016년 2월 26일자로 출원된 미국 가출원 제62/300,691호의 은전을 청구한다. 상기 출원들의 전체 개시내용은 본원에 참고로 포함된다.
연방 후원 연구 또는 개발
본 연구는 국립 보건원(National Institutes of Health)이 부여한 허가번호 R21 NS081374-01 및 R01 NS072446-01에 의해 지원받았다. 정부는 본 발명에 대해 특정 권리를 가지고 있다.
진행성 유전 질환인 X-연관 부신백질이영양증(X-linked adrenoleukodystrophy, X-ALD)은 CoA-활성화된 매우 긴-사슬 지방산(VLCFA)을 퍼옥시좀(peroxisome)으로 분해를 위해 수송하는 것을 담당하는 퍼옥시좀 ATP-결합 카세트 수송체(ABCD1)를 코딩하는 ABCD1 유전자의 돌연변이에 의해 유발되며, 뇌 및 부신피질의 혈장 및 조직에서 높은 수준의 포화된 매우 긴사슬 지방산(VLCFA)을 축적시킨다. 증상은 아동기 또는 성인기에 시작될 수 있다. 성인 ALD 환자는 일반적으로 20대에 쇠약해지는 신경 질환인, 부신척수신경병증(Adrenomyeloneuropathy, AMN)이 발병한다(Engelen et al., Orphanet J Rare Dis. 2012; 7: 51). Abcd1-/-마우스는 AMN과 유사한 표현형을 발달시키며, 감염된 후근신경절 뉴런(DRG)에 의한 말초신경병증 뿐만 아니라 척수 축삭 변성을 나타낸다(Pujol et al., Hum Mol Genet. 2002;11:499-505). 인간 ABCD1 유전자를 전달하기 위한 재조합 아데노-관련 바이러스 혈청형 9(rAAV9) 벡터를 사용한 시험관내 및 생체내에서 중추 신경계 세포의 형질 도입이 이전에 보고되었다. 불행히도 어린 생마우스에서의 정맥내 전달은 이식유전자 과다발현으로 인한 심장 독성과 관련된다. X-ALD 또는 AMN으로 고통받는 환자에게 비-독성 수준의 ABCD1을 제공하는 전달 시스템이 매우 바람직하다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 상세한 설명 및 청구범위로부터 명백해질 것이다. 따라서, 본 발명의 다른 양태는 하기 상세한 설명에 기술되며, 본 발명의 범위 내에 있다.
일 양태에서, 본 발명은 배양물에서 성장된 형질감염된 생산자 세포에서 아데노-관련 바이러스 9(AAV9) 벡터 역가를 증가시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 i) ATP 결합 카세트 서브패밀리 D 멤버 1(ABCD1)을 코딩하는 mRNA에 상보적인 핵산 서열을 세포와 함께 배양하는 단계 및 ii) ABCD1을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 AAV9 벡터(AAV9-ABCD1 벡터)를 세포에 형질감염시키는 단계를 포함하며, 상기 AAV9 벡터로부터 발현된 ABCD1 mRNA의 양이 감소되어, 세포 용해물 및/또는 배지에서 AAV9-ABCD1 벡터 수율을 참조 표준과 비교하여 약 1배 내지 약 50배 증가시킨다.
일 구현예에서, ABCD1을 코딩하는 mRNA에 상보적인 핵산 서열은 간섭 RNA이다.
또 다른 구현예에서, 간섭 RNA는 shRNA 또는 siRNA이다.
또 다른 구현예에서, siRNA는 SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7 또는 이들의 조합을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 참조 표준은 ABCD1을 코딩하는 mRNA에 상보적인 핵산 서열과 함께 배양되지 않은 생산자 세포로부터의 세포 용해물 및/또는 배지에서 AAV9-ABCD1 벡터 수율을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 필요로 하는 개체에 X-연관 부신백질이영양증(X-ALD)을 치료하는 방법으로서, 참조 표준과 비교하여 증가된 AAV9 벡터 역가를 갖는 생산자 세포로부터 수득된 정제된 AAV9-ABCD1 벡터를 포함하는 조성물을 상기 개체에 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일 구현예에서, 정제된 AAV9-ABCD1 벡터를 포함하는 상기 조성물은 척수강내 투여에 의해 개체에게 투여된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 필요로 하는 개체에 X-연관 부신백질이영양증(X-ALD)을 치료하는 방법으로서, ATP 결합 카세트 서브패밀리 D 멤버 1(ABCD1)을 코딩하는 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터를 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 벡터는 척수강내 투여에 의해 개체에게 투여된다.
일 구현예에서, 척수강내 투여는 삼투 펌프에 의해 매개된다.
또 다른 구현예에서, 벡터의 투여량은 0.5×1011GC이다.
또 다른 구현예에서, AAV는 AAV9이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 X-연관 부신백질이영양증(X-ALD)을 갖는 개체에게 ATP 결합 카세트 서브패밀리 D 멤버 1(ABCD1)을 제공하는 방법으로서, ABCD1을 코딩하는 벡터를 개체에 투여하는 단계를 포함하며, 상기 벡터는 척수강내 투여에 의해 개체에게 투여되며, 중추 신경계에서 상기 벡터로부터의 ABCD1 발현은 말초 기관에서 상기 벡터로부터의 ABCD1 발현보다 적다.
일 구현예에서, 척수강내 투여는 삼투 펌프에 의해 매개된다.
또 다른 구현예에서, 벡터의 투여량은 약 1x1013GC 내지 약 10x1013GC이다.
또 다른 구현예에서, 벡터는 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터이다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 방법 및 재료는 본 발명에서 사용하기 위해 본 명세서에 기재되어있으며; 당 분야에 공지된 다른 적합한 방법 및 재료도 또한 사용될 수 있다. 재료, 방법 및 실시예는 단지 예시적인 것이며, 제한하려는 것은 아니다. 본 명세서에 언급된 모든 공보, 특허 출원, 특허, 서열, 데이터베이스 기재 및 기타 참고 문헌은 그 전체가 참고로 포함된다. 분쟁이 있는 경우, 정의를 포함한 본 명세서가 우선할 것이다.
이하의 상세한 설명은 실시예에 의해 제공되지만, 설명된 특정 구현예에 본 발명을 한정하려는 의도는 아니며, 본원에 참고로 포함된, 첨부된 도면과 관련하여 이해될 수 있다.
도 1은 ABCD1 mRNA에 특이적인 siRNA와 함께 배양된 형질감염된 293T 세포로부터 개선된 AAV9-ABCD1 벡터 역가를 도시한다.
도 2는 ABCD1 mRNA에 특이적인 siRNA 풀과 함께 배양된 AAV-ABCD1 형질감염된 세포에서 감소된 ABCD1 단백질을 도시한다.
도 3은 세포 용해물 및 조건 배지 모두에서 ABCD1 mRNA에 특이적인 siRNA와 함께 배양된 형질감염된 293T 세포로부터의 개선된 AAV9-ABCD1 벡터 역가를 도시한다.
도 4는 2분 동안 척수강내 볼루스 전달 후 rAAV9-ABCD1의 분포를 도시한다.
도 5는 24시간 동안 rAAV9-ABCD1의 척수강내 펌프 주입 후 rAAV9-ABCD1의 분포를 도시한다.
도 6은 AAV9-ABCD1의 저용량(0.5x1011gc) 볼루스 및 펌프 전달을 도시한다.
도 7은 AAV9-ABCD1의 펌프 주입과 비교하여 AAV9-ABCD1의 볼루스 주사 2 주 후에 말초 기관(CNS 외부)을 가로 질러 ABCD1의 높은 발현을 도시한다.
도 8은 AAV9-ABCD1의 벡터 지도를 도시한다.
도 9는 상이한 장기에 걸친 내인성 ABCD1의 분포를 도시한다.
도 10은 상이한 장기에 걸친 내인성 ABCD1의 분포를 도시한다.
도 11은 Abcd1-/- 마우스에서의 IT 펌프 후 ABCD1의 발현을 도시한다.
도 12는 Abcd1-/- 마우스에서의 IT 펌프 후 ABCD1의 발현을 도시한다.
도 13은 IT 펌프 및 PT 볼루스 주사 후 15일째의 척수 C26:0 수준을 도시한다.
도 14는 AAV9-hABCD1의 IT 펌프 전달 후 상이한 세포 유형에서의 ABCD1 발현을 도시한다. SC: 척수; DRG: 후근신경절; CD31: 내피세포 마커; GFAP: 성상세포 마커; IBA1: 미세아교세포 마커; TOPRO3: 핵 대조염색; DRG는 뉴런에서 발현 반점 패턴(expression speckled pattern)을 보이고, 뉴런(위성 세포) 주위에서 더욱 두드러지게 나타난다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 분쟁이 있는 경우, 정의를 포함한 본 출원이 우선할 것이다.
"개체"는 인간, 가축 및 농장 동물, 및 동물원, 스포츠 또는 애완 동물, 예컨대 마우스, 토끼, 돼지, 양, 염소, 소 및 고등 동물(higher primate)을 포함하는 분류 포유류의 임의의 구성원을 포함하는 척추 동물이다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료하다", "치료하는", "치료" 등의 용어는 X-ALD, 예를 들어 부신척수신경병증(AMN) 및/또는 그것과 관련된 증상을 감소시키거나 완화시키는 것을 지칭한다. 배제되지는 않았지만, X-ALD 또는 AMN의 치료는 그것과 관련된 장애, 질환 또는 증상을 완전히 제거할 필요가 없다는 것을 이해할 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 문맥에 구체적으로 기재되거나 명확하지 않으면, 용어 "약"은 당 기술 분야에서 통상의 허용 범위 내, 예를 들어 평균의 2 표준 편차 이내로 이해된다. "약"은 명시된 값의 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05% 또는 0.01% 내인 것으로 이해된다. 문맥상 명확하지 않는 한, 본원에 제공된 모든 수치는 용어 약으로 수정된다.
본원에 사용된 "발현 감소"는 본원에 기술된 방법에 따라 ABCD1을 코딩하는 벡터를 투여받은 개체의 중추신경계에서의 ABCD1 유전자 발현 또는 단백질 발현의 양보다 적어도 약 0.05배 미만(예를 들어, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1, 5, 10, 25, 50, 100, 1000, 10,000배 또는 그보다 약간 더 작은 수준)인, 개체의 말초 기관내 ABCD1 유전자 발현 또는 단백질 발현의 양을 지칭한다. 개체의 말초 기관에서의 ABCD1 유전자 발현 또는 단백질 발현을 지칭함에 있어서, "감소된"은 또한 본원에 기술된 방법에 따라 ABCD1을 코딩하는 벡터를 투여받은 개체의 중추신경계에서의 ABCD1 유전자 발현 또는 단백질 발현의 양보다 적어도 약 5%(예를 들어 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 또는 100%) 적은 것을 의미한다. 양은 유전자 발현량 또는 단백질 발현량을 결정하기 위해 당 분야에 공지된 표준 방법에 따라 측정될 수 있다.
본원에 사용된 "벡터 역가의 증가"는 본원에 기술된 방법에 따라 ABCD1을 코딩하는 mRNA에 상보적인 핵산 서열과 함께 배양되지 않은 생산자 세포로부터의 역가 양보다 적어도 약 0.05배(예를 들어, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1, 5, 10, 25, 50, 100, 1000, 10,000-배 또는 그 이상) 많은 ABCD1을 코딩하는 벡터로 형질감염된 생산자 세포로부터의 역가 양을 지칭한다. ABCD1을 코딩하는 벡터로 형질감염된 생산자 세포로부터의 역가(AAV 벡터의 농도, 종종 1 밀리리터 당 게놈 복제수로 기술됨)의 양을 지칭함에 있어서, "증가된"은 또한 본원에 기술된 방법에 따라 ABCD1을 코딩하는 mRNA에 상보적인 핵산 서열과 함께 배양되지 않은 생산자 세포로부터의 역가의 양보다 적어도 약 5%(예를 들어, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 또는 100%) 많은 것을 의미한다. 양은 AAV 게놈, 이식유전자 발현 또는 단백질 발현의 양을 결정하기 위한 당 분야에 공지된 표준 방법에 따라 측정될 수 있다.
본원에서 제공된 범위는 상기 범위 내의 모든 값의 단축형으로 이해된다. 예를 들어, 1 내지 50의 범위는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50(뿐만 아니라 문맥에 달리 명시하지 않는 한 그의 부분)으로 구성된 그룹으로부터 임의의 수, 수 조합 또는 하위-범위를 포함하는 것으로 이해된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "참고 수준"은 다른 시험 샘플이 비교되는 공지된 샘플에서의 역가 수준을 지칭한다. 참고 수준은 예를 들어, ABCD1을 코딩하는 mRNA와 상보적인 핵산 서열, 또는 대조군 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 siRNA와 함께 배양되지 않은 생산자 세포로부터 수득될 수 있다. 참고 수준은 예를 들어 X-ALD를 갖지 않는 치료되지 않은 개체로부터 얻을 수 있다. "치료되지 않은"은 ABCD1 이식유전자를 발현하는 벡터의 투여로부터의 치료가 없는 것을 지칭한다.
본 명세서에서, "포함하다", "포함하는", "함유하는" 및 "갖는" 등은 미국 특허법에서 그들에게 부여된 의미를 가질 수 있으며, "포함한다", "포함하는" 등을 의미할 수 있으며; "본질적으로 구성되는" 또는 "본질적으로 구성하는"은 미국 특허법에서 규정된 의미를 가지며, 상기 용어는 제한을 두지 않으며, 인용된 것의 기본 또는 새로운 특징이 인용된 것 이상의 존재에 의해 변경되지 않는한, 인용된 것 이상의 존재를 허용하지만, 종래 기술의 구현예는 배제된다.
다른 정의는 본 개시내용 전반에 걸쳐 문맥 상으로 나타난다.
조성물 및 방법
본 발명의 조성물 및 방법은 X-연관 부신백질이영양증(X-ALD)에 대한 치료를 제공한다. X-연관 부신백질이영양증은 주로 남성에서 발생하며, 주로 신경계와 부신에 영향을 미치는 ABCD1 유전자의 돌연변이에 기인하는 유전 질환이다. 뇌와 척수의 수초가 악화되고(탈수초화), 신경의 기능적 능력을 저하시킨다. 또한, 부신(부신 피질)의 외층이 손상되면 특정 호르몬이 부족해진다(부신피질 부전). 아동기의 대뇌 형태, 부신척수신경병증(AMN) 유형, 애디슨(Addison) 병이라고 불리는 형태를 포함하는 X-연관 부신백질이영양증의 몇 가지 독특한 유형이 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, X-ALD는 젤웨거(Zellweger) 스펙트럼의 퍼옥시좀 형성장애(biogenesis disorder)에 속하며, ABCD1의 돌연변이와 관련이 없는 "신생아 부신백질이영양증"을 포함하지 않는다. X-ALD 또는 AMN을 갖는 개체를 진단 또는 확인하는 방법은 당 분야에 공지되어 있으며, 혈장 매우 긴사슬 지방산(VLCFA) 수준의 측정 및/또는 유전자 검사를 포함할 수 있다. 예를 들어 Engelen et al., Orphanet J Rare Dis. 2012; 7: 51; Aubourg and Chaussain, Horm Res. 2003;59 Suppl 1:104-5; Steinberg et al., Curr Protoc Hum Genet. 2008 Chapter 17:Unit 17.6; Steinberg SJ, Moser AB, Raymond GV. X-Linked Adrenoleukodystrophy. 1999 Mar 26 [Updated 2015 Apr 9]. In: Pagon RA, Adam MP, Ardinger HH, et al., editors. GeneReviews® [Internet]. Seattle (WA): University of Washington, Seattle; 1993-2016. Available from: ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1315/)를 참조한다.
ABCD1 유전자의 돌연변이는 X-연관 부신백질이영양증을 일으킨다. ABCD1 유전자는 매우 긴사슬 지방산(VLCFAs)을 퍼옥시좀으로 운반하는데 관여하는 부신백질이영양증 단백질(ALDP)을 코딩한다. ABCD1 유전자 돌연변이는 ALDP 결핍을 초래한다. 이 단백질이 결핍되면, VLCFA의 수송 및 후속 파괴가 중단되어, 신체에서 비정상적으로 높은 수준의 상기 지방을 유발한다. VLCFAs의 축적은 부신 피질과 수초에 독성이 될 수 있다.
유전자 치료에 의한 유전적 결함의 수정은 실행가능한 치료법을 제공한다. CNS에 대한 ABCD1 유전자의 표적 특이적 전달은 말초 기관에서의 독성을 피하기 위해 필수적이다. 이는 예를 들어, 척수강내 투여를 통해 ABCD1을 코딩하는 아데노-관련 바이러스(adeno-associated virus, AAV) 벡터를 투여함으로써 달성될 수 있다.
ABCD1 cDNA를 코딩하는 서열 및 이의 발현된 단백질은 잘 알려져 있으며, 예를 들어 Genbank 수탁번호 NG_009022.2 및 NP_000024.2에서 찾을 수 있다.
"AAV"는 아데노-관련 바이러스이고, 재조합 바이러스 벡터 그 자체 또는 그의 유도체를 지칭하는데 사용될 수 있다. 이 용어는 달리 요구되는 경우를 제외하고는 모든 하위 유형, 혈청형 및 위형, 및 자연 발생 및 재조합 형태 모두를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "혈청형"은 그의 혈청학에 기초하여 다른 AAVs에 의해 동정되고 구별되는 AAV, 예를 들어 AAVs의 11가지 혈청형인, AAV1-AAV11을 지칭하며, 이 용어는 동일한 특성을 갖는 위형을 포함한다. 상기 혈청형의 대부분은 다른 AAV 혈청형(예를 들어, 세포 표면 수용체 결합, 세포간 트래피킹(trafficking))으로부터의 독특한 생물학적 특성을 갖는다. 따라서, 예를 들어, AAV5 혈청형은 AAV5의 생물학적 성질을 갖는 AAV, 예를 들어 AAV5 캡시드를 포함하는 위형 AAV 및 AAV5로부터 유도 또는 획득되지 않거나 게놈이 키메라(chimeric)인 AAV 게놈을 포함한다.
"AAV 벡터"는 적어도 하나의 AAV 캡시드 단백질 및 캡시드화된 폴리뉴클레오타이드로 구성된 바이러스 입자를 지칭한다. 입자가 이종 폴리뉴클레오타이드(즉, 포유류 세포에 전달되는 이식유전자와 같은 야생형 AAV 게놈 이외의 폴리뉴클레오타이드)를 포함하는 경우, 이는 "rAAV(재조합 AAV)"로 지칭될 수 있다. AAV "캡시드 단백질"은 야생형 AAV의 캡시드 단백질뿐만 아니라 AAV 게놈을 구조적으로 및/또는 기능적으로 패키징할 수 있고, 야생형 AAV에 의해 사용되는 수용체와 상이할 수 있는 적어도 하나의 특이적 세포 수용체에 결합하는 AAV 캡시드 단백질의 변형된 형태를 포함한다. 변형된 AAV 캡시드 단백질은 AAV의 2개 이상의 혈청형으로부터의 아미노산 서열을 갖는 것과 같은 키메라 AAV 캡시드 단백질, 예를 들어 AA2로부터의 캡시드 단백질의 일부에 융합되거나 연결된 AAV5로부터의 캡시드 단백질의 일부로부터 형성된 캡시드 단백질, 및 AAV 캡시드 단백질에 융합되거나 연결된 태그 또는 다른 검출가능한 비-AAV 캡시드 펩타이드 또는 단백질을 갖는 AAV 캡시드 단백질을 포함하며, 예를 들어 트랜스페린 수용체에 결합하는 항체 분자의 일부는 AAV-2 캡시드 단백질에 재조합 융합될 수 있다.
AAV를 생성할 수 있는 세포는 당 분야에 공지되어 있으며, 293 세포, HeLa 세포 및 곤충 세포를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
특정 구현예에서, 높은 역가의 AAV를 생산하는 방법은 ABCD1의 투여를 최대화하기 위해 사용될 수 있다. 배양에서 성장한 형질감염된 생산자 세포는 ATP 결합 카세트 서브패밀리 D 멤버 1(ABCD1)을 코딩하는 mRNA에 상보적인 핵산 서열과 함께 배양될 수 있고, ii) ABCD1을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 AAV 벡터에 의해 세포로 형질감염될 수 있다(예를 들어, AAV9-ABCD1 벡터). AAV 벡터로부터 발현된 ABCD1 mRNA의 양은 감소되어, 참조 표준과 비교하여 세포 용해물 및/또는 배지에서 AAV-ABCD1 벡터 수율을 약 1배 내지 약 50배 증가시킨다. 특정 구현예에서, 세포 용해물 및/또는 배지에서의 AAV-ABCD1 벡터 수율은 약 4배 증가된다. 벡터 역가는 당 분야에 공지된 방법에 따라 결정될 수 있다. 전형적으로, 이것은 도트 블랏 또는 정량적 PCR을 사용하여 AAV 게놈을 측정하기 위해 수행된다. 일반적으로, AAV 벡터 수율은 세포 용해물 및 배지로부터 약 1 × 1010 게놈 복제/ml(gc/ml) 내지 약 1 × 1016 gc/ml일 수 있다.
특정 구현예에서, 참조 표준은 세포 용해물 및/또는, ABCD1을 코딩하는 mRNA에 상보적인 핵산 서열과 함께 배양되지 않은 생산자 세포로부터의 배지에서 AAV-ABCD1 벡터 수율을 포함한다.
이것은, 예를 들어, ABCD1 mRNA에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 제공함으로써 달성될 수 있다. 본 발명의 방법을 수행하는데 사용하기 위한, ABCD1 mRNA에 상보적인 다른 핵산 서열은 ABCD1의 사후-전사 프로세싱을 억제하는 것, 예컨대 shRNA 또는 siRNA를 포함하지만, 이에 한정되지 않는 간섭 RNA, 또는 안타고미어(antagomir)일 수 있다.
ABCD1 mRNA를 코딩하는 서열은 잘 알려져 있으며, 예를 들어 Genbank 수탁번호 NM_000033.3에서 찾을 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드는 전형적으로 표적에 결합하고 전사, 번역 또는 스플라이싱 수준에서 발현을 정지시킴으로써, DNA 또는 RNA 표적의 발현을 차단하도록 설계된다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 엄격한 조건하에 ABCD1 mRNA에 혼성화하도록 고안된 상보적인 핵산 서열이다. 따라서, 표적에 충분히 상보적인 올리고뉴클레오타이드, 즉 원하는 효능을 부여하기에 충분한 특이성으로 충분히 잘 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드가 선택된다.
본 발명과 관련하여, 혼성화는 상보적인 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드 염기 사이의 왓슨 크릭(Watson-Crick), 호그스틴(Hoogsteen) 또는 역전된 호그스틴 수소 결합일 수 있는 수소 결합을 의미한다. 예를 들어, 아데닌 및 티민은 수소 결합의 형성을 통해 쌍을 이루는 상보적인 핵염기이다. 본원에 사용된 상보적이라는 용어는 2개의 뉴클레오타이드 사이의 정확한 페어링을 위한 능력을 지칭한다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드의 특정 위치의 뉴클레오타이드가 DNA 또는 RNA 분자의 동일한 위치에서 뉴클레오타이드와 수소 결합할 수 있다면, 올리고뉴클레오타이드와 DNA 또는 RNA는 그 위치에서 서로 상보적인 것으로 간주된다. 올리고뉴클레오타이드와 DNA 또는 RNA는 각 분자에서 충분한 수의 상응하는 위치가 서로 수소 결합할 수 있는 뉴클레오타이드에 의해 점유될 때 서로 상보적이다. 따라서, "특이적으로 혼성화가능한" 및 "상보적인"은 올리고뉴클레오타이드와 DNA 또는 RNA 표적간에 안정하고 특이적인 결합이 발생하도록 충분한 정도의 상보성 또는 정확한 페어링을 나타내는데 사용되는 용어이다.
상보적 핵산 서열은 특이적으로 혼성화될 수 있는 그의 표적 핵산의 서열과 100% 상보적일 필요는 없다는 것은 당 분야에서 이해된다. 본 발명의 상보적인 핵산 서열은 표적 DNA 또는 RNA 분자에 대한 서열의 결합이 표적 DNA 또는 RNA의 정상 기능을 방해하여 활성을 상실시킬 때 특이적으로 혼성화될 수 있으며, 특이적 결합이 요구되는 조건, 즉 생체내 분석 또는 치료학적 처리의 경우, 생리적 조건하에, 및 시험관내 분석의 경우, 분석이 적당한 엄격 조건하에 수행되는 조건하에, 비-표적 서열에 대한 서열의 비-특이적인 결합을 피하는데 충분한 정도의 상보성이 있다. 예를 들어, 엄격한 염 농도는 통상적으로 약 750 mM NaCl 및 75 mM 시트르산 삼나트륨 미만, 바람직하게는 약 500 mM NaCl 및 50 mM 시트르산 삼나트륨 미만, 및 보다 바람직하게는 약 250 mM NaCl 및 25 mM 시트르산 삼나트륨 미만일 것이다. 낮은 엄격성 혼성화는 유기 용매, 예를 들어 포름아미드의 부재하에 수득될 수 있는 반면, 높은 엄격성 혼성화는 적어도 약 35%의 포름아미드, 보다 바람직하게는 적어도 약 50%의 포름아미드의 존재하에 수득될 수 있다. 엄격한 온도 조건은 통상적으로 적어도 약 30℃, 보다 바람직하게는 적어도 약 37℃, 가장 바람직하게는 적어도 약 42℃의 온도를 포함할 것이다. 혼성화 시간, 제제, 예를 들어, 도데실 황산나트륨(SDS)의 농도, 및 담체 DNA의 포함 또는 배제와 같은 다양한 추가의 파라미터들은 당업자에게 잘 알려져있다. 필요에 따라 이러한 다양한 조건을 조합하여 다양한 수준의 엄격성을 달성할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 혼성화는 750mM NaCl, 75mM 시트르산 삼나트륨 및 1% SDS에서 30℃에서 일어날 것이다. 더 바람직한 구현예에서, 혼성화는 500 mM NaCl, 50 mM 시트르산 삼나트륨, 1% SDS, 35% 포름아미드 및 100 μg/ml 변성 연어 정자 DNA(ssDNA)에서 37℃에서 일어날 것이다. 가장 바람직한 구현예에서, 혼성화는 250 mM NaCl, 25 mM 시트르산 삼나트륨, 1% SDS, 50% 포름아미드 및 200 μg/ml ssDNA에서 42℃에서 일어날 것이다. 이러한 조건에 대한 유용한 변형은 당업자에게 쉽게 명백할 것이다.
대부분의 용도에서, 혼성화를 따르는 세척 단계는 또한 엄격성이 다양할 것이다. 세척 엄격 조건은 염 농도 및 온도에 의해 정의될 수 있다. 상기와 같이, 염 농도를 감소시키거나 온도를 상승시킴으로써 세척 엄격도를 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 세척 단계를 위한 엄격한 염 농도는 바람직하게는 약 30 mM NaCl 및 3 mM 시트르산 삼나트륨 미만, 가장 바람직하게는 약 15 mM NaCl 및 1.5 mM 시트르산 삼나트륨 미만일 것이다. 세척 단계를 위한 엄격한 온도 조건은 일반적으로 적어도 약 25℃, 보다 바람직하게는 적어도 약 42℃, 및 더욱 바람직하게는 적어도 약 68℃의 온도를 포함할 것이다. 바람직한 구현예에서, 세척 단계는 30 mM NaCl, 3 mM 시트르산 삼나트륨 및 0.1% SDS에서 25℃에서 일어날 것이다. 더욱 바람직한 구현예에서, 세척 단계는 15 mM NaCl, 1.5 mM 시트르산 삼나트륨 및 0.1% SDS에서 42℃에서 일어날 것이다. 더욱 바람직한 구현예에서, 세척 단계는 15 mM NaCl, 1.5 mM 시트르산 삼나트륨 및 0.1% SDS에서 68℃에서 일어날 것이다. 이들 조건에 대한 추가 변형은 당업자에게 쉽게 명백할 것이다. 혼성화 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어 Benton and Davis (Science 196:180, 1977); Grunstein and Hogness (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 72:3961, 1975); Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001); Berger and Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, New York); 및 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York에 기술되어 있다.
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 표적 핵산 내의 표적 부위에 대하여 적어도 80%의 서열 상보성을 포함하는 것이 바람직하고, 또한 이들은 표적으로 하는 표적 핵산 서열 내의 표적 부위에 대하여 90% 서열 상보성을 포함하고, 더욱 바람직하게는 95% 서열 상보성을 포함한다. 예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 20개의 핵염기 중 18개가 상보적이고, 따라서 표적 부위에 특이적으로 혼성화하는 안티센스 화합물은 90% 상보성을 나타낼 것이다. 표적 핵산의 영역과 안티센스 화합물의 퍼센트 상보성은 기본적인 로컬 정렬 검색 도구(BLAST 프로그램)를 사용하여 일상적으로 결정될 수 있다(Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410; Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7, 649-656). ABCD1 mRNA에 혼성화하는 본 발명의 안티센스 및 기타 화합물은 실험을 통해 확인되며, 이들 화합물의 대표적인 서열은 본 발명의 바람직한 구현예로서 이하에서 확인된다.
또 다른 구현예에서, ABCD1 mRNA에 상보적인 핵산 서열은 shRNA 또는 siRNA를 포함하지만 이에 한정되지 않는, 간섭 RNA일 수 있다. 간섭 RNA는 짧은 간섭 RNA(small interfering RNA, "siRNA") 및 짧은 헤어핀 RNA(small hairpin RNA, "shRNA")를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 간섭 RNA를 구축하는 방법은 당 분야에 잘 알려져있다. 예를 들어, 간섭 RNA는 2개의 분리된 올리고뉴클레오타이드로부터 조립될 수 있는데, 여기서 한 가닥은 센스 가닥이고, 다른 하나는 안티센스 가닥이며, 여기서 안티센스 및 센스 가닥은 자기-상보적이며(즉, 각각의 가닥이 다른 가닥의 뉴클레오타이드 서열에 대하여 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하며; 예를 들어, 안티센스 가닥 및 센스 가닥이 듀플렉스 또는 이중 가닥 구조를 형성하는 경우); 안티센스 가닥은 표적 핵산 분자 또는 그의 일부분(즉, 원하지 않는 유전자)의 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 센스 가닥은 표적 핵산 서열 또는 그의 일부분에 상응하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 대안적으로, 간섭 RNA는 단일 올리고뉴클레오타이드로부터 조립되고, 여기서 자기-상보성 센스 및 안티센스 영역은 핵산 기반 또는 비-핵산-기반 링커(들)에 의해 연결된다. 간섭 RNA는 자기-상보적인 센스 및 안티센스 영역을 갖는 듀플렉스, 비대칭 듀플렉스, 헤어핀 또는 비대칭 헤어핀 2차 구조를 갖는 폴리뉴클레오타이드일 수 있으며, 상기 안티센스 영역은 별도의 표적 핵산 분자 또는 그의 일부분에서 뉴클레오타이드 서열, 및 표적 핵산 서열 또는 그의 일부분에 상응하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 센스 영역에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 상기 간섭 물질은 2개 이상의 루프 구조를 갖는 원형의 단일-가닥 폴리뉴클레오타이드 및 자기 상보적인 센스 및 안티센스 영역을 포함하는 스템일 수 있으며, 상기 안티센스 영역은 표적 핵산 분자 또는 그의 일부분의 뉴클레오타이드 서열, 및 표적 핵산 서열 또는 그의 일부분에 상응하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 센스 영역에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 상기 원형 폴리뉴클레오타이드는 생체내 또는 시험관내에서 처리되어 RNA 간섭을 매개할 수 있는 활성 siRNA 분자를 생성할 수 있다.
본 발명의 특정 구현예에서, 간섭 RNA 코딩 영역은 센스 영역, 안티센스 영역 및 루프 영역을 갖는 자기-상보적인 RNA 분자를 코딩한다. 상기 RNA 분자는 바람직하게는 발현될때 "헤어핀(hairpin)"구조를 형성하며, 본 명세서에서 "shRNA"로 언급된다. 루프 영역은 일반적으로 길이가 약 2 내지 약 10개 뉴클레오타이드이다. 바람직한 구현예에서, 루프 영역은 길이가 약 6 내지 약 9개 뉴클레오타이드이다. 본 발명의 상기 일 구현예에서, 센스 영역 및 안티센스 영역은 길이가 약 15 내지 약 20개 뉴클레오타이드이다. 후-전사 프로세싱에 이어, 짧은 헤어핀 RNA는 RNase III 패밀리의 일원인 효소 다이서(Dicer)에 의해 매개되는 분열 이벤트에 의해 siRNA로 전환된다. 그후, siRNA는 상동성을 공유하는 유전자의 발현을 억제할 수 있다. 상세한 내용은 Brummelkamp et al., Science 296:550-553, (2002); Lee et al, Nature Biotechnol., 20, 500-505, (2002); Miyagishi and Taira, Nature Biotechnol 20:497-500, (2002); Paddison et al. Genes & Dev. 16:948-958, (2002); Paul, Nature Biotechnol, 20, 505-508, (2002); Sui, Proc. Natl. Acad. Sd. USA, 99(6), 5515-5520, (2002); Yu et al. Proc NatlAcadSci USA 99:6047-6052, (2002)를 참조한다.
siRNA에 의해 유도된 표적 RNA 절단 반응은 매우 서열 특이적이다. 일반적으로, 표적 유전자(즉, ABCD1)의 일부와 동일한 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 siRNA가 억제에 바람직하다. 그러나, siRNA와 표적 유전자 사이의 100% 서열 동일성은 본 발명을 실시하는데 요구되지 않는다. 따라서, 본 발명은 유전자 돌연변이, 균주 다형성 또는 진화적 발산으로 인해 예상될 수 있는 서열 변이를 허용할 수 있는 이점을 갖는다. 예를 들어, 표적 서열에 대한 삽입, 결실 및 단일 점 돌연변이를 갖는 siRNA 서열 또한 억제에 효과적인 것으로 밝혀졌다. 대안적으로, 뉴클레오타이드 유사체 치환 또는 삽입을 갖는 siRNA 서열이 억제에 효과적일 수 있다.
또 다른 구현예에서, ABCD1 mRNA에 상보적인 핵산 서열은 안타고미어이다. 안타고미어는 microRNA를 표적으로 하는 단일 가닥, 이중 가닥, 부분적으로 이중 가닥 및 헤어핀 구조의 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오타이드이다. 바람직하게는, 본 발명의 특징인 안타고미어는 약 10 내지 25개 뉴클레오타이드, 바람직하게는 약 15 내지 20개 뉴클레오타이드의 miRNA 표적 서열에 혼성화하기에 충분히 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 안타고미어는 RNase 보호 및, 향상된 조직 및 세포 흡수와 같은 약리학적 특성에 대한 다양한 변형을 갖는 RNA-유사 올리고뉴클레오타이드이다. 안타고미어는 당, 포스포로티오에이트 백본 및 3'-말단의 콜레스테롤-잔기의 완전한 2'-O-메틸화를 가짐으로써 정상 RNA와 상이할 수 있다. 포스포로티오에이트 변형은 RNase 활성에 대한 보호를 제공하고, 이들의 친유성은 조직 흡수를 향상시키는데 기여한다. 바람직한 구현예에서, 안타고미어는 6개의 포스포로티오에이트 백본 변형을 포함하며; 2개의 포스포로티오에이트는 5'-말단에 위치하고, 4개는 3'-말단에 위치한다. 본 발명의 안타고미어는 또한 그들의 길이 또는 안타고미어를 구성하는 뉴클레오타이드의 수에 대해 변형될 수 있다.
본 발명을 실시하는데 사용된 핵산 서열은 RNA, cDNA, 게놈 DNA, 벡터, 바이러스 또는 이들의 혼성물들의 유무와 상관없이, 다양한 유전자원으로부터 분리되고, 유전자 조작되고, 증폭되고, 및/또는 재조합 발현/생성될 수 있다. 재조합 핵산 서열은 개별적으로 분리 또는 클로닝될 수 있으며, 원하는 활성을 시험할 수 있다. 예를 들어 시험관내, 박테리아, 균류, 포유 동물, 효모, 곤충 또는 식물 세포 발현 시스템을 포함한 임의의 재조합 발현 시스템이 사용될 수 있다.
본 발명의 핵산 서열은 전달 벡터에 삽입될 수 있고, 벡터(예를 들어, AAV 벡터) 내의 전사 단위로부터 발현될 수 있다. 재조합 벡터는 DNA 플라스미드 또는 바이러스 벡터일 수 있다. 벡터 작제물의 생성은 예를 들어, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (1989)), Coffin et al. (Retroviruses. (1997)) and "RNA Viruses: A Practical Approach" (Alan J. Cann, Ed., Oxford University Press, (2000))에 기술된 바와 같이, PCR, 올리고뉴클레오타이드 합성, 제한 엔도뉴클레아제 분해, 결찰, 형질전환, 플라스미드 정제 및 DNA 시퀀싱의 표준 기술을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 당 분야에 잘 알려져 있는 임의의 적합한 유전공학 기술을 사용하여 달성될 수 있다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 본 발명의 핵산을 세포로 전달하기 위해 다양한 적합한 벡터가 이용가능하다. 핵산을 전달하기 위한 적당한 벡터의 선택 및 선택된 발현 벡터의 세포 내로의 삽입을 위한 조건의 최적화는 과도한 실험을 필요로 하지 않으면서 당업자의 범주 내에 있다. 바이러스 벡터는 패키징 세포에서 재조합 바이러스를 생산하기 위한 서열을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 본 발명의 핵산을 발현하는 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 폭스 바이러스 또는 알파바이러스를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 바이러스 백본을 기초로 하여 구성될 수 있다. 본 발명의 핵산을 발현할 수 있는 재조합 벡터는 본원에 기술된 바와 같이 전달될 수 있고, 표적 세포(예를 들어, 안정한 형질감염체)에서 지속될 수 있다.
본 발명을 실시하는데 사용된 핵산 서열은 예를 들어 Adams (1983) J. Am. Chem. Soc. 105:661; Belousov (1997) Nucleic Acids Res. 25:3440-3444; Frenkel (1995) Free Radic. Biol. Med. 19:373-380; Blommers (1994) Biochemistry 33:7886-7896; Narang (1979) Meth. Enzymol. 68:90; Brown (1979) Meth. Enzymol. 68:109; Beaucage (1981) Tetra. Lett. 22:1859; 미국 특허 제4,458,066호에 기술된 바와 같이, 잘 알려진 화학적 합성 기술들에 의해 시험관내에서 합성될 수 있다.
본 발명의 핵산 서열은 변형, 예를 들어 뉴클레오타이드 변형의 도입에 의한 핵산분해성 분해에 대해 안정화될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 핵산 서열은 뉴클레오타이드 서열의 5' 또는 3' 말단에 적어도 제1, 제2 또는 제3 뉴클레오타이드간 연결기를 갖는 포스포로티오에이트를 포함한다. 또 다른 예로서, 핵산 서열은 2'-변형된 뉴클레오타이드, 예를 들어, 2'-데옥시, 2'-데옥시-2'-플루오로, 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸(2'-O-MOE), 2'-O-아미노프로필(2'-O-AP), 2'-O-디메틸아미노에틸(2'-O-DMAOE), 2'-O-디메틸아미노프로필(2'-O-DMAP), 2'-O-디메틸아미노에틸옥시에틸(2'-O-DMAEOE) 또는 2'-O-N-메틸아세트아미도(2'-O-NMA)를 포함할 수 있다. 다른 예로서, 핵산 서열은 적어도 하나의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있고, 일부 구현예에서는 모든 뉴클레오타이드가 2'-O-메틸 변형을 포함한다.
예를 들어, 서브클로닝, 라벨링 프로브(예를 들어, 클레노브 폴리머라제(klenow polymerase)를 이용한 랜덤-프라이머 라벨링, 닉 번역(nick translation), 증폭), 시퀀싱, 혼성화 등과 같은 본 발명을 실시하기 위해 사용되는 핵산의 조작 기술은 과학 및 특허 문헌에 잘 기술되어 있으며, 예를 들어, Sambrook, ed., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (2ND ED.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel, ed. John Wiley & Sons, Inc., New York (1997); LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY: HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, ed. Elsevier, N.Y. (1993)를 참조한다.
정맥내(IV) 또는 뇌실내(ICV) 투여에 의해 제공되는 ABCD1 벡터 투여는 최근에 심장 독성을 일으키는 것으로 결정되었다. 척수강내 투여는 원하는 제제를 척추관의 지주막하 공간으로 주사하여, 뇌척수액(CSF)에 제제를 제공하는 단계를 포함하는 투여 경로이다. 척수강내 투여를 사용하여, 중추 신경계 내의 벡터로부터의 ABCD1 발현은 심장과 같은 말초 기관 내의 벡터로부터의 ABCD1 발현보다 적다. 말초 기관에서 과도한 ABCD1 발현은 독성을 초래할 수 있으므로, ABCD1 벡터의 척수강내 투여는 X-ALD에 대한, 예를 들어 AMN에 대한 개선된 치료 방법을 포함한다.
일부 구현예에서, 척수강내 투여는 펌프를 통해 이루어진다. 펌프는 외과적으로 이식된 삼투 펌프일 수 있다. 특정 구현예에서, 삼투 펌프는 척추관의 지주막하 공간에 이식되어 척수강내 투여를 용이하게한다.
특정 구현예에서, 인간 개체는 약 24시간 동안 약 1x1013 GC 내지 약 10x1013 GC의 양으로 ABCD1을 포함하는 척수강내 전달 벡터(예를 들어, AAV9)의 1회 치료를 받는다.
AAV9-hABCD1의 느린 연속 척수강내 주입은 DUROS® 이식물, ALZA Corporation(Mountain View, CA)와 같은 삼투압 구동 펌프를 사용하여 인간에게 정률 증가될 수 있다. 또한, J.C. Wright, J. Culwell, Long-term controlled delivery of therapeutic agents by the osmotically driven DUROS® implant, in: M.J. Rathbone, J. Hadgraft, M.S. Roberts (Eds.), Modified-Release Drug Delivery Technology, Informa Healthcare, New York, 2008, pp. 143-149를 참조한다.
삼투 전달 장치 및 그의 구성 요소는 예를 들어, 미국 특허 제5,609,885호; 제5,728,396호; 제5,985,305호; 제5,997,527호; 제6,113,938호; 제6,132,420호; 제6,156,331호; 제6,217,906호; 제6,261,584호; 제6,270,787호; 제6,287,295호; 제6,375,978호; 제6,395,292호; 제6,508,808호; 제6,544,252호; 제6,635,268호; 제6,682,522호; 제6,923,800호; 제6,939,556호; 제6,976,981호; 제6,997,922호; 제7,014,636호; 제7,207,982호; 제7,112,335호; 제7,163,688호; 미국 특허 공개 제2005-0175701호, 제2007-0281024호,및 제2008-0091176호에 기술되어 있다.
DUROS® 전달 장치는 전형적으로 삼투성 엔진, 피스톤 및 약물 제형을 함유하는 원통형 저장소로 구성된다. 상기 저장소는 제어된 속도의 투수성 멤브레인에 의해 한쪽 끝이 캡핑되고, 다른쪽 끝은 약물 제형이 약물 저장소로부터 방출되는 확산 조절제에 의해 캡핑된다. 피스톤은 삼투 엔진으로부터 약물 제형을 분리하고, 밀봉제를 이용하여 삼투 엔진 구획 내의 물이 약물 저장소에 들어가지 못하도록 한다. 확산 조절제는 약물 제형과 함께 체액이 오리피스를 통해 약물 저장소로 들어가지 않도록 설계되었다.
DUROS® 장치는 삼투 원리에 기초하여 소정의 속도로 치료제를 방출한다. 세포외 유체는 반투막을 통해 DUROS® 장치로 직접 유입되어 느리고 균일한 전달 속도로 피스톤을 구동하도록 팽창하는 염 엔진(salt engine)으로 직접 유입된다. 피스톤의 이동은 약물 제형이 오리피스 또는 출구 포트를 통해 소정의 전단속도(sheer rate)로 방출되도록 한다. 본 발명의 일 구현예에서, DUROS® 장치의 저장소는 예를 들어 1x1011gc AAV9-hABCD1을 포함하는 본 발명의 현탁액 제형으로 적재되며, 상기 장치는 현탁액 제형을 사전 결정되고 치료학적으로 효과적인 전달 속도로 연장된 기간동안 개체에게 전달할 수 있다.
다른 이식가능한 약물 전달 장치가 본 발명의 실시에 사용될 수 있으며, 화합물의 일정 흐름, 조절가능한 흐름 또는 프로그래밍가능한 흐름을 제공하는 조절기-유형의 이식가능한 펌프, 예컨대 Codman & Shurtleff, Inc. (Raynham, Mass.), Medtronic, Inc. (Minneapolis, Minn.), 및 Tricumed Medinzintechnik GmbH (Germany)로부터 입수가능한 것들을 포함할 수 있다.
본 발명은 본 발명과 그의 많은 이점에 대한 더 나은 이해를 제공하는 이하의 예시적이고, 비-제한적인 실시예에 의해 추가로 기술된다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 일부 구현예 및 양태를 예시한다. 관련 기술 분야의 당업자는 본 발명의 사상 또는 범위를 변경하지 않으면서 다양한 변형, 부가, 치환 등이 수행될 수 있고, 상기 변형 및 변경이 이하의 청구범위에 정의된 본 발명의 범주 내에 포함됨을 잘 알 것이다. 하기 실시예는 본 발명을 어떤 방식으로든 제한하지 않는다.
실시예 1: ABCD1 mRNA에 특이적인 siRNA의 존재하에 AAV9-ABCD1을 생산하면 형질감염된 293T 세포로부터의 AAV 벡터 역가가 향상된다.
AAV9-ABCD1의 생산동안 다량의 세포 사멸/세포 변성 효과가 생산자 세포내 ABCD1 단백질의 과발현으로 인해 이전에 관찰되었다. 이 독성은 AAV 벡터 수율을 감소시켰다. 독성을 완화하고 벡터 수율을 향상시키기 위해, ABCD1 mRNA는 siRNA 풀을 사용하여 표적화되었다.
AAV 패킹은 다음과 같이 수행되었다. 1 내지 1.5x107 293T 세포를 15cm 플레이트 상에 플레이팅하고, 밤새 배양하였다.
[표 1]
Figure pct00001
2일째에, 형질감염 혼합물을 하기와 같이 제조하였다.
[표 2]
Figure pct00002
튜브 A 및 튜브 B를 1분 동안 볼텍싱(vortexing)하면서 적상 조합하였다. 상기 혼합물을 실온에서 20분 동안 배양하였다. 15cm 플레이트 당 1.5ml의 바이러스 혼합물을 첨가하여, 플레이트 표면 상에 적상으로 분산시켰다. 플레이트를 균일하게 혼합되도록 기울이고, 밤새 배양했다. 3일째에, 배지를 DMEM 2% FBS 1% p/s로 대체하였다. 5일째에, 플레이트 배지 용적의 절반을 각 플레이트에서 제거하였다. 잔류 배지로 세척하거나 셀 스크레이퍼(cell scraper)를 사용하여 부드럽게 플레이트에서 세포를 수집하였다. 세포를 1300 RPM으로 5분 동안 회전시켰다. 상층액을 제거하였다. 튜브 바닥을 튕기고(flicking), 세포 플레이트 당 1ml EDTA PBS를 재현탁하고, 1300RPM에서 5분 동안 스핀하여 세포를 느슨하게 하였다. 세포를 플레이트 당 1ml의 용해 완충액에 재현탁하고, 선택적으로 -80℃에서 저장하였다. 구배 정제 후에, 바이러스를 PBS로 완충액 교환하고, qPCR에 의해 정량화하고, 실험에 사용하였다.
293T 세포 플레이팅하는 날에, 세포를 ABCD1 mRNA 또는 비-표적화 대조군 siRNA에 특이적인 siRNA 풀로 형질감염시켰다. 또 다른 대조군은 ABCD1 siRNA의 존재하에 GFP를 코딩하는 AAV9 벡터(AAV9-GFP)였다. 다음 날, 두 샘플을 AAV 플라스미드로 형질감염시켜, AAV9-ABCD1을 생성시켰다.
siRNA 프로토콜은 다수 단계를 갖는다:
1. 1 x siRNA 완충액(GE Healthcare) 또는, 원액으로부터의 RNase가 없는 다른 적당한 용액에 5 μM의 풀링된(4개의 siRNA 각각 25%) siRNA 용액을 준비한다.
2. 별도의 튜브에서, siRNA(튜브 1에 100ul)와 적당한 DharmaFECT 형질감염 제제(튜브 2에 30ul)를 각각 무혈청 DMEM 배지로 2ml 용량까지 희석한다.
3. 각 튜브의 내용물을 신중하게 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 혼합한다. 실온에서 5분 동안 배양한다.
4. 튜브 1의 내용물을 튜브 2에 첨가하고, 총 부피 4ml로 만든다. 신중하게 위아래로 피펫팅하여 혼합하고 실온에서 20분 동안 배양한다. 12ml의 완전한 DMEM(10% FBS)을 4ml에 첨가한다.
5. 3.75e6 세포/ml(총 1.5E7 세포)의 농도로 있는 완전 배지에 재현탁된 293T 세포 4 ml을 4단계(25nM의 최종 siRNA 농도)에서 형질감염 혼합물 16 ml에 첨가한다.
6. 15cm 접시로 플레이팅하고, 24시간 배양한다.
7. AAV 플라스미드로 인산칼슘 형질감염하기 1시간 전에 배지를 완전한 DMEM 10% FBS로 교환한다.
8. 표준 AAV 생산 및 정제 프로토콜로 진행한다.
형질감염 3일후 세포를 수확하고, 용해시키고, 벡터 수율(게놈 복제시에)을 하기와 같이 qPCR에 의해 측정하였다:
[표 3]
Figure pct00003
qPCR 프로토콜에는 여러 단계가 있다:
1. 뉴클레아제-유리 수에 벡터 1:100-1:1000을 희석하고, 보르텍스한다. qPCR에서 사용한다.
2. 플라스미드 675.5(5999bp)를 게놈 복제(GC) 표준으로 사용한다. 107-102 gc/mL의 표준을 만든다.
3. 표준과 샘플을 3회 측정할 수 있을 만큼 대량의 마스터 혼합물을 준비한다. 마스터 혼합물은 2ul H2O, 1.2ul 프라이머 혼합물(F 및 R = 물 90ul에 100um의 각 스톡 5ul), 1ul 프라이머 혼합물(F 및 R = 88ul의 물에 100um의 각 스톡 6ul), 0.8ul TM FAM 프로브 2.5uM, 1ul TM FAM 프로브 2uM(4ul의 100uM 스톡 + 196ul 물), 및 5ul TaqMan Fast universal PCR 마스터 믹스 2x를 포함한다.
4. 플레이트의 웰에서 9ul을 혼합하고, 소분한다.
5. 물에 희석한 템플릿 1ul을 첨가한다.
6. 스테이지 1이 reps 1, 95℃:20을 갖고, 스테이지 2가 reps 40, 95℃:03; 60℃:30을 갖는 열 순환 파라미터를 갖는 7500 기계를 프로그램한다.
7. 데이터를 분석한다. 표준 기울기는 ~-3.3이어야 한다.
AAV9-GFP 샘플을 임의로 100%로 설정하고, 다른 두 샘플을 이 값으로 정상화한 상대적인 역가로서 수율을 기록하였다. ABCD1 mRNA에 대한 siRNA 풀의 존재하에 AAV9-ABCD1을 생산하면 벡터 역가(및 수율)가 대조군 siRNA(도 1)와 비교하여 약 4배 향상되었다.
[표 4]
Figure pct00004
293T 세포를 대조군 siRNA(도 2, 레인 1, 2), ABCD1 mRNA에 대한 siRNA 풀(도 2, 레인 3-6)로 형질감염시키거나, 형질감염시키지 않았다(도 2, 레인 7, "정상"은 293T 세포에서 내인성 수준의 ABCD1 단백질을 지칭함). AAV-ABCD1 플라스미드(도 2, 레인 1-4) 또는 AAV-GFP 플라스미드(도 2, 레인 5, 6)를 다음 날 형질감염시켰다. 3일 후, 세포 용해물을 SDS PAGE 겔 상에서 전기영동하고, ABCD1 단백질에 대한 면역블롯을 수행하여 siRNA 넉다운을 평가하였다. 로딩 조절을 위해 액틴 블롯팅을 수행하였다. 8s 및 1s는 각각 방사선 필름의 8초 및 1초 노출을 나타낸다. ABCD1 siRNA는 대조군 siRNA와 비교하여 과발현된 ABCD1의 수준을 감소시킨다.
293T 세포는 형질감염되지 않은(siRNA가 없음) 상태로 두거나, 대조군 siRNA 또는 ABCD1 mRNA에 대비되는 siRNA 풀로 형질감염시켰다. 다음날 세포를 AAV 플라스미드로 형질감염시켜 AAV9-ABCD1을 생성시켰다. AAV 플라스미드의 형질감염 후 3일째, 세포 용해물 및 형질감염된 세포의 배지에서 벡터(g.c.)의 양을 측정하기 위해 qPCR을 수행하였다. 세포 용해물 및 배지 모두에서 AAV9-ABCD1 벡터 수율의 대략 3-4배 증가가 관찰되었다(도 3).
실시예 2: 부신척수신경병증의 마우스 모델에서 삼투 펌프에 의한 rAAV9 -ABCD1의 척수강내 전달은 CNS에 보다 균일하고 광범위하게 유전자 전달을 유도한다.
허위 대조군으로 PBS 주사를 사용하여 2분 지속하면서 볼루스 또는 24시간 지속하면서 삼투 펌프로 자기-상보적 AAV9 GFP(scAAV9GFP) 및 ABCD1을 코딩하는 rAAV9(rAAV9-ABCD1)를 Abcd1-/-마우스에게 척수강내로(IT) 전달하였다. 주사 2주 후, 마우스를 희생시키고, 4% PFA로 관류시켰다. 조직을 채취하고, 절편을 만들고, 면역형광 분석을 위해 염색하였다.
삼투 펌프에 의해 IT 전달된 scAAV9-GFP는 투여량-의존적 방식으로 CNS-관련 세포 유형 및 DRG 전반에 광범위한 발현을 유도하였다. 척수와 DRG는 뇌에 비해 발현이 높았지만, 말초 기관(간, 심장 및 부신)에서도 GFP 발현이 검출되었으며, 3×1011GC에서 가장 높은 발현을 보였다.
rAAV9-ABCD1 척수강내 펌프 전달 후 ABCD1 단백질의 유사한 분포 패턴이 검출되었다. 일반적으로, 고용량(2×1011GC 및 1×1011GC)은 저용량(0.5×1011GC)에 비해 CNS 및 말초 기관에서 더 많은 발현을 유도했다. 반면, 2분 동안의 척수강내 볼루스 전달은 흉부에서 가장 많은 양의 ABCD1 발현을 유도했지만, 더 높은 용량(1×1011gc)조차도 자궁경부 및 요부에서 보다 광범위한 전달을 유도하지 못했다(도 4).
특히, CNS를 통한 ABCD1의 광범위한 발현은 저용량, 0.5×1011GC의 직접 척수강내 볼루스 주사 후에도 검출되었다(도 5). 예를 들어, 0.5×1011GC 볼루스와 펌프 전달은 경부 인대내에서 ABCD1의 유사한 발현을 보인 반면, 심장 조직은 볼루스 주사 후 더 높은 발현을 입증했다(도 6). 펌프로 전달된 동일한 용량은 주사 부위와 멀리 떨어져 있는, 뇌와 척수에서 높은 발현을 유도하였으며, 볼루스 주사에 비해 말초 기관으로의 누출이 비교적 적다는 결론을 내렸다(도 7). 뇌실내 투여로 rAAV9-ABCD1을 0.5×1011GC로 전달하면, 뇌에서 국부적인 발현에도 불구하고 Abcd1-/- 마우스에서 거동 개선이 나타난다. 따라서, 상기와 같이 개요가 서술된 척수강내 펌프 전달을 사용하여 이 용량에서 더 나은 성능을 얻을 수 있다. 척수강내 펌프를 통해 투여된 1×1011GC의 투여량에서, 중추 신경계에서의 ABCD1 발현은 X-ALD를 갖지 않는 치료받지않은 개체(예를 들어, 야생형)의 중추 신경계에서 ABCD1의 발현보다 약 3배 더 높았다. 중요하게는, 말초 기관에서의 ABCD1 발현은 X-ALD를 갖지 않는 치료받지않은 개체의 말초 기관에서의 ABCD1 발현보다 약 90% 더 적었다(도 11 참조, 웨스턴 블롯에서 상이한 조직 유형 중 단백질 발현은 내인성 야생형 수준으로 정상화됨).
결론적으로, 척수강내 삼투압 펌프를 통한 rAAV9-매개된 ABCD1 유전자 전달은 척수강내 볼루스 주사에 비해 전신 순환계로의 누출을 감소시키면서 보다 균일하고, 광범위한 CNS로의 유전자 전달을 유도한다.
실시예 3: 척수강내 삼투 펌프를 통한 rAAV9-매개된 ABCD1 유전자 전달은 척수에서 C26:0 수준의 감소를 유도한다.
C26:0은 부신척수신경병증의 생화학적 특징이다. AAV9 유전자 전달 후 매우 길이가 긴 유리 지방산(VLCFA)의 존재를 평가하기 위해, 척수 샘플에 대한 리피도믹(lipidomic) 분석을 수행했다. C26:0과 C24:0의 절대값과 C26:0/C22:0의 비율이 보고된다. 척수강내 삼투 펌프(1×1011gc)를 통한 rAAV9-매개된 ABCD1 유전자 전달이 척수에서 C26:0 수준의 20% 감소를 유도한다는 것이 측정되었다(도 13). 척수강내 삼투 펌프 전달 후 수준은 척수강내 볼루스 전달후 수준과 유사하지만, 전신 누출은 피한다.
면역형광 염색 및 공초점 현미경 이미징을 추가로 수행하였다. 조직 절편 이미징을 위해, 척수 절편(16 μm)을 -25℃에서 저온유지장치(Leica)를 사용하여 절단하고, -80℃에서 보관했다. 절편을 마우스 항인간 ABCD1 항체로 염색한 후, 토끼 항-GFAP(Dako, Carpinteria, CA), 토끼 항-IBA1(Wako, Richmond, VA) 및 토끼 항-CD31(Abcam)을 사용하여 각각 동시염색하여, 세포 유형을 국소화하였다. 핵 역염색을 위한 형광염료로서 TOPRO-3(Thermo Fisher Scientific)을 사용하였다. 슬라이드를 공초점 레이저 현미경으로 이미징하고, 변환된 세포 수를 측정하였다. 각 세포 유형의 ABCD1 형질도입된 세포의 추정치는 20× 및 40×(microglia의 경우) 배율 이미지로 기록되었다. 척수강내 삼투 펌프(1×1011gc)를 통한 rAAV9-매개된 ABCD1 유전자 전달은 주로 성상세포, 내피세포 및 척수의 몇가지 뉴런을 표적으로 삼는다(도 14). 후근신경절 내에서, 그것은 위성 세포와 뉴런을 모두 표적으로 삼는다(도 14).
다른 구현예들
본 발명은 본 발명의 상세한 설명과 함께 설명되었지만, 상기 기술된 설명은 예시하기 위한 것이지 첨부된 청구범위의 범주에 의해 한정되는 본 발명의 범주를 제한하려는 것은 아니다. 다른 양태, 이점 및 변형은 이하의 청구범위의 범주 내에 있다.
SEQUENCE LISTING <110> The General Hospital Corporation <120> INTRATHECAL DELIVERY OF NUCLEIC ACID SEQUENCES ENCODING ABCD1 FOR TREATMENT OF ADRENOMYELONEUROPATHY <130> 29539-0219WO1 <140> PCT/US2016/060375 <141> 2016-11-03 <150> 62/251,208 <151> 2015-11-05 <150> 62/300,691 <151> 2016-02-26 <160> 7 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically generated primer <400> 1 cctcgactgt gccttctag 19 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically generated primer <400> 2 tgcgatgcaa tttcctcat 19 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically generated primer <400> 3 tgccagccat ctgttgtttg cc 22 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA targeting ABCD1 <400> 4 cggaucaugu cgucguaca 19 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA targeting ABCD1 <400> 5 cggaggagau cgccuucua 19 <210> 6 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA targeting ABCD1 <400> 6 guucagcgcu gucacuuca 19 <210> 7 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA targeting ABCD1 <400> 7 gaacgccugu gguauguua 19

Claims (14)

  1. 배양물에서 성장된 형질감염된 생산자 세포에서 아데노-관련 바이러스 9(AAV9) 벡터 역가를 증가시키는 방법으로서, 상기 방법은:
    i) ATP 결합 카세트 서브패밀리 D 멤버 1(ABCD1)을 코딩하는 mRNA에 상보적인 핵산 서열을 세포와 함께 배양하는 단계, 및
    ii) ABCD1을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 AAV9 벡터(AAV9-ABCD1 벡터)를 세포에 형질감염시키는 단계를 포함하며,
    상기 AAV9 벡터로부터 발현된 ABCD1 mRNA의 양이 감소되어, 세포 용해물 및/또는 배지에서 AAV9-ABCD1 벡터 수율을 참조 표준과 비교하여 약 1배 내지 약 50배 증가시키는, 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    ABCD1을 코딩하는 mRNA에 상보적인 핵산 서열은 간섭 RNA인, 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 간섭 RNA는 shRNA 또는 siRNA인, 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 siRNA는 SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 참조 표준은 ABCD1을 코딩하는 mRNA에 상보적인 핵산 서열과 함께 배양되지 않은 생산자 세포로부터의 세포 용해물 및/또는 배지에서 AAV9-ABCD1 벡터 수율을 포함하는, 방법.
  6. 필요로 하는 개체에 X-연관 부신백질이영양증(X-ALD)을 치료하는 방법으로서, 제1항의 생산자 세포로부터 수득된 정제된 AAV9-ABCD1 벡터를 포함하는 조성물을 상기 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    정제된 AAV9-ABCD1 벡터를 포함하는 상기 조성물은 척수강내 투여에 의해 개체에게 투여되는, 방법
  8. 필요로 하는 개체에 X-연관 부신백질이영양증(X-ALD)을 치료하는 방법으로서, ATP 결합 카세트 서브패밀리 D 멤버 1(ABCD1)을 코딩하는 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터를 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 벡터는 척수강내 투여에 의해 개체에게 투여되는, 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 척수강내 투여는 삼투 펌프에 의해 매개되는, 방법.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 벡터의 투여량은 약 1x1013GC 내지 약 10x1013GC인, 방법.
  11. 제8항에 있어서,
    상기 AAV는 AAV9인, 방법.
  12. X-연관 부신백질이영양증(X-ALD)을 갖는 개체에게 ATP 결합 카세트 서브패밀리 D 멤버 1(ABCD1)을 제공하는 방법으로서, ABCD1을 코딩하는 벡터를 개체에 투여하는 단계를 포함하며, 상기 벡터는 척수강내 투여에 의해 개체에게 투여되며, 중추 신경계에서 상기 벡터로부터의 ABCD1 발현은 말초 기관에서 상기 벡터로부터의 ABCD1 발현보다 적은, 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    중추 신경계에서의 상기 벡터로부터의 ABCD1 발현은 X-ALD를 갖지 않는 치료받지않은 개체의 중추 신경계에서 ABCD1의 발현보다 약 3배 더 높은, 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    말초 기관에서의 상기 벡터로부터의 ABCD1 발현은 X-ALD를 갖지 않는 치료받지않은 개체의 말초 기관에서의 ABCD1 발현보다 약 90% 더 적은, 방법.
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