JP2010500025A

JP2010500025A - 霊長類ハンチントン遺伝子発現をｉｎｖｉｖｏで抑制する方法および配列

Info

Publication number: JP2010500025A
Application number: JP2009523833A
Authority: JP
Inventors: ケンメラー，ウィリアム・エフ; ケイトー，マイケル・ディー
Original assignee: Medtronic Inc
Current assignee: Medtronic Inc
Priority date: 2006-08-09
Filing date: 2007-08-08
Publication date: 2010-01-07
Also published as: EP2056881A2; US7902352B2; US20100325746A9; WO2008021136A3; US20070261126A1; WO2008021136A2; WO2008021136B1; CN101557831A; EP2056881A4

Abstract

マカカ・ムラタ（Ｍａｃａｃａｍｕｌａｔｔａ）およびホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ）を含む霊長類において、ハンチンチン・タンパク質をコードするＨＤ遺伝子の発現を抑制するために用いる配列、分子および方法を本明細書に開示する。これらの配列、分子および方法は、ＨＤの発病機序の研究に役立ち、そしてまた、マカカ・ムラタおよびホモ・サピエンスの死、運動機能障害または細胞改変を引き起こさずに、ＨＤｍＲＮＡを減少させることによって、この疾患の治療を提供することも可能である。

Description

先行出願に対する関係
本出願は、２００６年８月９日出願の米国出願１１／５０１，６３４号の一部継続出願であり；該出願は２００６年５月４日出願の米国出願１１／４２９，４９１号の一部継続出願であり、該出願は２００５年５月６日出願の仮特許出願６０／６７８，７９２号に優先権を請求する。

本出願は、２００６年５月４日出願のＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２００６／１７６０１号の一部継続出願であり、該出願は２００５年５月６日出願の米国仮出願６０／６７８，７２９号に優先権を請求する。

本出願はまた、２００４年５月２５日出願の米国出願１０／８５２，９９７号の一部継続出願であり、該出願は２００３年１１月２５日出願の米国出願１０／７２１，６９３号の一部継続出願であり、該出願は２００３年２月３日出願の仮出願６０／４４４，６１４号に優先権を請求する。
発明の分野
本発明は、アカゲザル（ｒｈｅｓｕｓｍｏｎｋｅｙｓ）（マカカ・ムラタ（Ｍａｃａｃａｍｕｌａｔｔａ））およびヒト（ｈｕｍａｎｓ）（ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ））を含む霊長類において、ハンチントン病遺伝子の発現を抑制する阻害性核酸分子、ならびにその使用法に関する。
発明の背景
ハンチントン病（「ＨＤ」）は、若年または成人発症型の神経変性脳障害である。該疾患は、罹患した個体が歩き、考え、話し、そして判断する能力を緩慢に破壊する。症状には、認知能の変化、例えば短期記憶障害および集中する能力の減少；気分の変化、例えば気分のむら、抑うつおよび興奮性の発展；ならびに協調性および肉体的運動の変化、例えば不器用さ、不随意運動および単収縮が含まれる。これらの症状は、ＨＤ患者が死ぬまで、疾患発症後、およそ１５〜２０年間、次第に悪化する。

ＨＤの生化学的原因は、未だに完全には理解されていないが、現在、ＨＤが常染色体優性形質として遺伝することが知られている。この遺伝特徴は、突然変異（拡大）ＨＤ遺伝子をどちらかの親から受け継いだすべての個体が、該疾患を発症するであろうことを意味する。

ＨＤに関する研究における１つの飛躍的進歩は、ＨＤを引き起こす突然変異遺伝子の同定であった。この飛躍的進歩に基づいて、研究者および医師らは、現在、どの個体がＨＤを発症するかを予測可能である。具体的には、研究者および医師らは、所定の個体のＨＤ遺伝子内に存在する「ＣＡＧ反復」の数を数えることによって、どの個体がＨＤを発症するかを予測可能である。個人が、どちらのＨＤ遺伝子においても３５以下のＣＡＧ反復を有する場合、その個人はＨＤを発症しないであろう。個人が、そのＨＤ遺伝子のいずれかにおいて３５より多いＣＡＧ反復を有する場合、その個人は該疾患を発症するであろう。３５を超えて個人がより多くのＣＡＧ反復を有すれば有するほど、該個人は、ＨＤの症状をより早く発症するであろう。

ＨＤ遺伝子は、「ハンチンチン」と呼ばれるタンパク質をコードする（「ｈｔｔ」としても知られる）。ハンチンチンの正確な機能は知られていない。しかし、突然変異体の拡大ハンチンチン・タンパク質の発現がＨＤの原因であることが知られる。科学者らをこの結論に導いた証拠のいくつかには、マウスにおける拡大ＨＤ導入遺伝子の導入が、ＨＤの病理学的特徴および行動特徴を導き、そして該遺伝子の除去はこれらの影響を消失させうることを示すマウス研究が含まれる。したがって、脳細胞において、ハンチンチンの産生を抑制すると、ＨＤの症状または発症が防止されうるかまたは軽減されうる。

遺伝的技術の最近の発展によって、特定のタンパク質、例えばハンチンチンの選択的な抑制が可能になっている。これらの技術の潜在的な影響を理解するには、当該技術分野のいくつかの背景が必要である。一般的に、タンパク質が効果を発揮するためには、そのタンパク質を使用するであろう細胞が該タンパク質を生成しなければならない。タンパク質を生成するには、細胞はまず、細胞核において、タンパク質の遺伝子配列のコピーを作製する。タンパク質をコードする遺伝子配列のこのコピー（メッセンジャーＲＮＡ（「ｍＲＮＡ」）と呼ばれる）は、核を離れ、そしてリボソームを含有する細胞領域に輸送される。リボソームはｍＲＮＡの配列を読取り、そしてｍＲＮＡがコードするタンパク質を生成する。新規タンパク質合成のこのプロセスは翻訳として知られる。多様な要因がタンパク質翻訳の速度および効率に影響を及ぼす。これらの要因のうち最も重要なものの中には、ｍＲＮＡ自体の生得的な安定性がある。ｍＲＮＡが細胞内で迅速に（リボソームに到達される前などに）分解される場合、ｍＲＮＡが新規タンパク質翻訳のテンプレートとして働くことは不可能であり、したがってｍＲＮＡがコードするタンパク質を細胞が生成する能力が減少する。

前述のことに基づいて、ＲＮＡ干渉の技術（「ＲＮＡｉ」）が出現してきた。ＲＮＡ干渉は、実際、遺伝子発現およびそれに続くタンパク質翻訳を抑制するための天然存在機構である。ＲＮＡ干渉は、翻訳可能になる前にｍＲＮＡを分解するか、またはｍＲＮＡに結合し、そして直接その翻訳を防止することによるか、いずれかによって、タンパク質翻訳を抑制する。ＲＮＡ干渉のこの天然存在機構はまた、細胞において人工的に起こるように誘導可能である。例えば、抑制しようとする遺伝子のｍＲＮＡに対応する、短い二本鎖核酸オリゴヌクレオチドを細胞内に導入することによって、または折り畳まれて、そして短い二本鎖核酸オリゴヌクレオチドを形成する、核酸の短いヘアピン転写物をコードするＤＮＡの配列を細胞内に導入し、その後、細胞においてさらにプロセシングすることによって、ＲＮＡ干渉を達成してもよい。この技術は、細胞において、ハンチンチンの発現を抑制する手段を提供する。細胞におけるハンチンチンの抑制は、ＨＤ発病機序の研究において有用でありうる。患者におけるハンチンチンの抑制はまた、ＨＤの症状を防止するかまたは軽減することも可能である。
発明の概要
本発明は、ＨＤ遺伝子の発現を抑制するためにＲＮＡ干渉（「ＲＮＡｉ」）を用いるための方法、核酸配列および分子、発現カセット、ならびにベクターを記載する。ＨＤ遺伝子の発現の抑制は、細胞内のハンチンチン・レベルを減少させうる。この抑制および減少は、ＨＤ発病機序の研究において、有用でありうる。この抑制および減少はまた、ＨＤ症状の防止および治療にも有用でありうる。具体的には、ＲＮＡｉは、二本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）、短いヘアピンＲＮＡ（「ｓｈＲＮＡ」）または類似の特性を持つ他の核酸分子によって仲介される。これらの核酸分子は、ＤｉｃｅｒおよびＤｒｏｓｈａを含む細胞酵素によって、より小さい片にプロセシングされるかまたは切断される。次いで、核酸分子のより小さい断片は、ｍＲＮＡの分解を仲介する、ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（「ＲＩＳＣ複合体」）と呼ばれるタンパク質複合体によって、取り込まれうる。ＲＩＳＣ複合体は、取り込んだ核酸分子と相補的に塩基対形成するｍＲＮＡを分解するであろう。この方式で、ｍＲＮＡは特異的に破壊され、したがってｍＲＮＡがコードするタンパク質が作製されるのを防止する。

ＲＮＡｉの機構の理解によって、現在、遺伝学者らは、細胞内で特定のタンパク質の発現または形成を抑制するため、既知の遺伝子配列に相同な配列を持つ核酸分子を生成することが可能である。本発明において、霊長類ＨＤｍＲＮＡ配列に相同な核酸配列および分子を細胞内に導入して、ハンチンチン・タンパク質の発現を抑制する。これらの核酸配列および分子は、アカゲザルおよびヒトのハンチンチンを含む、霊長類ハンチンチン・タンパク質をコードするｍＲＮＡ配列の発現を特異的に抑制する。このタンパク質の発現抑制は、ＨＤ発病機序の研究において有用でありうる。この抑制はまた、ＨＤの防止および／または治療においても有用でありうる。

本発明の１つの態様において、本発明には、第一の鎖および第二の鎖を含む核酸分子であって、第一の鎖がヌクレオチド配列を含み、そして第二の鎖が前記の第一の鎖の逆相補体を含み、そして該核酸分子が、ハンチンチンをコードするマカカ・ムラタおよびホモ・サピエンスのｍＲＮＡ配列の両方の発現を抑制する、前記核酸分子が含まれる。

本発明の別の態様において、本発明には、核酸の第一の鎖および核酸の第二の鎖を含む単離核酸二重鎖であって、第一の鎖が配列番号１によってコードされる少なくとも１９の隣接ヌクレオチドを含み、そして第二の鎖が第一の鎖の少なくとも１５の隣接ヌクレオチドに相補的である、前記核酸二重鎖が含まれる。本発明の別の態様において、本発明には、核酸の第一の鎖および核酸の第二の鎖を含む単離核酸二重鎖であって、第一の鎖が配列番号２によってコードされる少なくとも１９の隣接ヌクレオチドを含み、そして第二の鎖が第一の鎖の少なくとも１５の隣接ヌクレオチドに相補的である、前記核酸二重鎖が含まれる。本発明の別の態様において、本発明には、核酸の第一の鎖および核酸の第二の鎖を含む単離核酸二重鎖であって、第一の鎖が配列番号３によってコードされる少なくとも１９の隣接ヌクレオチドを含み、そして第二の鎖が第一の鎖の少なくとも１５の隣接ヌクレオチドに相補的である、前記核酸二重鎖が含まれる。本発明の別の態様において、本発明には、核酸の第一の鎖および核酸の第二の鎖を含む単離核酸二重鎖であって、第一の鎖が配列番号４によってコードされる少なくとも１９の隣接ヌクレオチドを含み、そして第二の鎖が第一の鎖の少なくとも１５の隣接ヌクレオチドに相補的である、前記核酸二重鎖が含まれる。本発明の別の態様において、本発明には、核酸の第一の鎖および核酸の第二の鎖を含む単離核酸二重鎖であって、第一の鎖が配列番号５によってコードされる少なくとも１９の隣接ヌクレオチドを含み、そして第二の鎖が第一の鎖の少なくとも１５の隣接ヌクレオチドに相補的である、前記核酸二重鎖が含まれる。本発明の別の態様において、本発明には、核酸の第一の鎖および核酸の第二の鎖を含む単離核酸二重鎖であって、第一の鎖が配列番号６によってコードされる少なくとも１９の隣接ヌクレオチドを含み、そして第二の鎖が第一の鎖の少なくとも１５の隣接ヌクレオチドに相補的である、前記核酸二重鎖が含まれる。本発明の別の態様において、本発明には、核酸の第一の鎖および核酸の第二の鎖を含む単離核酸二重鎖であって、第一の鎖が配列番号７によってコードされる少なくとも１９の隣接ヌクレオチドを含み、そして第二の鎖が第一の鎖の少なくとも１５の隣接ヌクレオチドに相補的である、前記核酸二重鎖が含まれる。本発明の別の態様において、本発明には、核酸の第一の鎖および核酸の第二の鎖を含む単離核酸二重鎖であって、第一の鎖が配列番号８によってコードされる少なくとも１９の隣接ヌクレオチドを含み、そして第二の鎖が第一の鎖の少なくとも１５の隣接ヌクレオチドに相補的である、前記核酸二重鎖が含まれる。本発明の別の態様において、本発明には、核酸の第一の鎖および核酸の第二の鎖を含む単離核酸二重鎖であって、第一の鎖が配列番号９によってコードされる少なくとも１９の隣接ヌクレオチドを含み、そして第二の鎖が第一の鎖の少なくとも１５の隣接ヌクレオチドに相補的である、前記核酸二重鎖が含まれる。本発明の別の態様において、本発明には、核酸の第一の鎖および核酸の第二の鎖を含む単離核酸二重鎖であって、第一の鎖が配列番号１０によってコードされる少なくとも１９の隣接ヌクレオチドを含み、そして第二の鎖が第一の鎖の少なくとも１５の隣接ヌクレオチドに相補的である、前記核酸二重鎖が含まれる。本発明の別の態様において、本発明には、核酸の第一の鎖および核酸の第二の鎖を含む単離核酸二重鎖であって、第一の鎖が配列番号１１によってコードされる少なくとも１９の隣接ヌクレオチドを含み、そして第二の鎖が第一の鎖の少なくとも１５の隣接ヌクレオチドに相補的である、前記核酸二重鎖が含まれる。本発明の別の態様において、本発明には、核酸の第一の鎖および核酸の第二の鎖を含む単離核酸二重鎖であって、第一の鎖が配列番号１２によってコードされる少なくとも１９の隣接ヌクレオチドを含み、そして第二の鎖が第一の鎖の少なくとも１５の隣接ヌクレオチドに相補的である、前記核酸二重鎖が含まれる。本発明の別の態様において、本発明には、核酸の第一の鎖および核酸の第二の鎖を含む単離核酸二重鎖であって、第一の鎖が配列番号１３によってコードされる少なくとも１９の隣接ヌクレオチドを含み、そして第二の鎖が第一の鎖の少なくとも１５の隣接ヌクレオチドに相補的である、前記核酸二重鎖が含まれる。本発明の別の態様において、本発明には、核酸の第一の鎖および核酸の第二の鎖を含む単離核酸二重鎖であって、第一の鎖が配列番号１４によってコードされる少なくとも１９の隣接ヌクレオチドを含み、そして第二の鎖が第一の鎖の少なくとも１５の隣接ヌクレオチドに相補的である、前記核酸二重鎖が含まれる。本発明の別の態様において、本発明には、核酸の第一の鎖および核酸の第二の鎖を含む単離核酸二重鎖であって、第一の鎖が配列番号１５によってコードされる少なくとも１９の隣接ヌクレオチドを含み、そして第二の鎖が第一の鎖の少なくとも１５の隣接ヌクレオチドに相補的である、前記核酸二重鎖が含まれる。

本発明の別の態様において、本発明には、核酸の第一の鎖および核酸の第二の鎖を含む単離核酸二重鎖であって、第一の鎖が配列番号９によってコードされる少なくとも２７の隣接ヌクレオチドを含み、そして第二の鎖が第一の鎖の少なくとも２３の隣接ヌクレオチドに相補的である、前記核酸二重鎖が含まれる。本発明の別の態様において、本発明には、核酸の第一の鎖および核酸の第二の鎖を含む単離核酸二重鎖であって、第一の鎖が配列番号１０によってコードされる少なくとも２７の隣接ヌクレオチドを含み、そして第二の鎖が第一の鎖の少なくとも２３の隣接ヌクレオチドに相補的である、前記核酸二重鎖が含まれる。本発明の別の態様において、本発明には、核酸の第一の鎖および核酸の第二の鎖を含む単離核酸二重鎖であって、第一の鎖が配列番号１１によってコードされる少なくとも２７の隣接ヌクレオチドを含み、そして第二の鎖が第一の鎖の少なくとも２３の隣接ヌクレオチドに相補的である、前記核酸二重鎖が含まれる。本発明の別の態様において、本発明には、核酸の第一の鎖および核酸の第二の鎖を含む単離核酸二重鎖であって、第一の鎖が配列番号１２によってコードされる少なくとも２７の隣接ヌクレオチドを含み、そして第二の鎖が第一の鎖の少なくとも２３の隣接ヌクレオチドに相補的である、前記核酸二重鎖が含まれる。本発明の別の態様において、本発明には、核酸の第一の鎖および核酸の第二の鎖を含む単離核酸二重鎖であって、第一の鎖が配列番号１３によってコードされる少なくとも２７の隣接ヌクレオチドを含み、そして第二の鎖が第一の鎖の少なくとも２３の隣接ヌクレオチドに相補的である、前記核酸二重鎖が含まれる。本発明の別の態様において、本発明には、核酸の第一の鎖および核酸の第二の鎖を含む単離核酸二重鎖であって、第一の鎖が配列番号１４によってコードされる少なくとも２７の隣接ヌクレオチドを含み、そして第二の鎖が第一の鎖の少なくとも２３の隣接ヌクレオチドに相補的である、前記核酸二重鎖が含まれる。本発明の別の態様において、本発明には、核酸の第一の鎖および核酸の第二の鎖を含む単離核酸二重鎖であって、第一の鎖が配列番号１５によってコードされる少なくとも２７の隣接ヌクレオチドを含み、そして第二の鎖が第一の鎖の少なくとも２３の隣接ヌクレオチドに相補的である、前記核酸二重鎖が含まれる。

本発明の１つの態様において、核酸二重鎖は、長さ１９〜３０塩基対の間である。

本発明の別の態様において、核酸二重鎖の第一および／または第二の鎖はオーバーハング領域を含む。本発明の別の態様において、核酸二重鎖の第一および／または第二の鎖は、３’オーバーハング領域、５’オーバーハング領域、または３’および５’オーバーハング領域の両方を含む。本発明の別の態様において、核酸二重鎖の第一および／または第二の鎖は、長さおよそ１〜およそ１０ヌクレオチドのオーバーハング領域を含む。

本発明の別の態様において、核酸二重鎖の第一および第二の鎖は、二重鎖構造およびループ構造を含むヘアピン構造を形成する、核酸ループ鎖によって、機能可能であるように連結される。本発明の別の態様において、核酸二重鎖の第一および第二の鎖は、４〜１０ヌクレオチドを含有する核酸ループによって機能可能であるように連結される。

本発明の別の態様において、本発明には発現カセットが含まれる。１つの態様において、発現カセットは、配列番号１をコードする核酸配列を含む。別の態様において、発現カセットは、配列番号２をコードする核酸配列を含む。別の態様において、発現カセットは、配列番号３をコードする核酸配列を含む。別の態様において、発現カセットは、配列番号４をコードする核酸配列を含む。別の態様において、発現カセットは、配列番号５をコードする核酸配列を含む。別の態様において、発現カセットは、配列番号６をコードする核酸配列を含む。別の態様において、発現カセットは、配列番号７をコードする核酸配列を含む。別の態様において、発現カセットは、配列番号８をコードする核酸配列を含む。別の態様において、発現カセットは、配列番号９をコードする核酸配列を含む。別の態様において、発現カセットは、配列番号１０をコードする核酸配列を含む。別の態様において、発現カセットは、配列番号１１をコードする核酸配列を含む。別の態様において、発現カセットは、配列番号１２をコードする核酸配列を含む。別の態様において、発現カセットは、配列番号１３をコードする核酸配列を含む。別の態様において、発現カセットは、配列番号１４をコードする核酸配列を含む。別の態様において、発現カセットは、配列番号１５をコードする核酸配列を含む。

本発明の１つの態様において、発現カセットはまた、プロモーターも含む。本発明の別の態様において、発現カセットは制御可能プロモーターを含む。本発明の別の態様において、発現カセットは恒常的プロモーターを含む。本発明の別の態様において、発現カセットは、サイトメガロウイルス（「ＣＭＶ」）プロモーターであるプロモーターを含む。本発明の別の態様において、発現カセットは、ラウス肉腫ウイルス（「ＲＳＶ」）プロモーターであるプロモーターを含む。本発明の別の態様において、発現カセットは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって利用されるプロモーターを含む。本発明の別の態様において、発現カセットは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって利用されるプロモーターを含む。

本発明の１つの態様において、発現カセットは、ポリアデニル化シグナルを含む。本発明の別の態様において、発現カセットは、合成最少ポリアデニル化シグナルであるポリアデニル化シグナルを含む。本発明の別の態様において、発現カセットはマーカー遺伝子を含む。

本発明の１つの態様において、本発明には、前述の発現カセットの１以上を含むベクターが含まれる。本発明の別の態様において、ベクターは、第一および第二の発現カセットを含む。

１つの態様において、ベクターの第一の発現カセットは、配列番号１をコードするヌクレオチド配列をコードし、そしてベクターの第二の発現カセットは、配列番号１の少なくとも１５の隣接ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列をコードする。別の態様において、ベクターの第一の発現カセットは、配列番号２をコードするヌクレオチド配列をコードし、そしてベクターの第二の発現カセットは、配列番号２の少なくとも１５の隣接ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列をコードする。別の態様において、ベクターの第一の発現カセットは、配列番号３をコードするヌクレオチド配列をコードし、そしてベクターの第二の発現カセットは、配列番号３の少なくとも１５の隣接ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列をコードする。別の態様において、ベクターの第一の発現カセットは、配列番号４をコードするヌクレオチド配列をコードし、そしてベクターの第二の発現カセットは、配列番号４の少なくとも１５の隣接ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列をコードする。別の態様において、ベクターの第一の発現カセットは、配列番号５をコードするヌクレオチド配列をコードし、そしてベクターの第二の発現カセットは、配列番号５の少なくとも１５の隣接ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列をコードする。別の態様において、ベクターの第一の発現カセットは、配列番号６をコードするヌクレオチド配列をコードし、そしてベクターの第二の発現カセットは、配列番号６の少なくとも１５の隣接ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列をコードする。別の態様において、ベクターの第一の発現カセットは、配列番号７をコードするヌクレオチド配列をコードし、そしてベクターの第二の発現カセットは、配列番号７の少なくとも１５の隣接ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列をコードする。別の態様において、ベクターの第一の発現カセットは、配列番号８をコードするヌクレオチド配列をコードし、そしてベクターの第二の発現カセットは、配列番号８の少なくとも１５の隣接ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列をコードする。別の態様において、ベクターの第一の発現カセットは、配列番号９をコードするヌクレオチド配列をコードし、そしてベクターの第二の発現カセットは、配列番号９の少なくとも１５の隣接ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列をコードする。別の態様において、ベクターの第一の発現カセットは、配列番号１０をコードするヌクレオチド配列をコードし、そしてベクターの第二の発現カセットは、配列番号１０の少なくとも１５の隣接ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列をコードする。別の態様において、ベクターの第一の発現カセットは、配列番号１１をコードするヌクレオチド配列をコードし、そしてベクターの第二の発現カセットは、配列番号１１の少なくとも１５の隣接ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列をコードする。別の態様において、ベクターの第一の発現カセットは、配列番号１２をコードするヌクレオチド配列をコードし、そしてベクターの第二の発現カセットは、配列番号１２の少なくとも１５の隣接ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列をコードする。別の態様において、ベクターの第一の発現カセットは、配列番号１３をコードするヌクレオチド配列をコードし、そしてベクターの第二の発現カセットは、配列番号１３の少なくとも１５の隣接ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列をコードする。別の態様において、ベクターの第一の発現カセットは、配列番号１４をコードするヌクレオチド配列をコードし、そしてベクターの第二の発現カセットは、配列番号１４の少なくとも１５の隣接ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列をコードする。別の態様において、ベクターの第一の発現カセットは、配列番号１５をコードするヌクレオチド配列をコードし、そしてベクターの第二の発現カセットは、配列番号１５の少なくとも１５の隣接ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列をコードする。

別の態様において、ベクターの第一の発現カセットは、配列番号９をコードするヌクレオチド配列をコードし、そしてベクターの第二の発現カセットは、配列番号９の少なくとも２３の隣接ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列をコードする。別の態様において、ベクターの第一の発現カセットは、配列番号１０をコードするヌクレオチド配列をコードし、そしてベクターの第二の発現カセットは、配列番号１０の少なくとも２３の隣接ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列をコードする。別の態様において、ベクターの第一の発現カセットは、配列番号１１をコードするヌクレオチド配列をコードし、そしてベクターの第二の発現カセットは、配列番号１１の少なくとも２３の隣接ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列をコードする。別の態様において、ベクターの第一の発現カセットは、配列番号１２をコードするヌクレオチド配列をコードし、そしてベクターの第二の発現カセットは、配列番号１２の少なくとも２３の隣接ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列をコードする。別の態様において、ベクターの第一の発現カセットは、配列番号１３をコードするヌクレオチド配列をコードし、そしてベクターの第二の発現カセットは、配列番号１３の少なくとも２３の隣接ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列をコードする。別の態様において、ベクターの第一の発現カセットは、配列番号１４をコードするヌクレオチド配列をコードし、そしてベクターの第二の発現カセットは、配列番号１４の少なくとも２３の隣接ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列をコードする。別の態様において、ベクターの第一の発現カセットは、配列番号１５をコードするヌクレオチド配列をコードし、そしてベクターの第二の発現カセットは、配列番号１５の少なくとも２３の隣接ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列をコードする。

本発明の１つの態様において、ベクターはウイルスベクターである。本発明の別の態様において、ベクターはアデノウイルス・ウイルスベクターである。本発明の別の態様において、ベクターはレンチウイルス・ウイルスベクターである。本発明の別の態様において、ベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）・ウイルスベクターである。本発明の別の態様において、ベクターはポリオウイルスベクターである。本発明の別の態様において、ベクターは単純疱疹ウイルスベクターである。本発明の別の態様において、ベクターはネコ免疫不全ウイルスベクターである。本発明の別の態様において、ベクターはネズミ・マロニー（Ｍｏｌｏｎｅｙ）に基づくウイルスベクターである。

本発明の別の態様において、ベクターはプロモーターを含む。本発明の別の態様において、ベクターは誘導性プロモーターを含む。

本発明の１つの態様において、本発明には、前述の発現カセットを含む細胞が含まれる。本発明の別の態様において、細胞は哺乳動物細胞である。本発明の別の態様には、前述の発現カセットを含む非ヒト哺乳動物が含まれる。

本発明の態様にはまた方法も含まれる。本発明の１つの方法には、細胞において、ハンチンチンの集積を抑制する方法であって、細胞において、ハンチンチンの集積を抑制するのに十分な量の前述の核酸二重鎖を細胞内に導入する工程を含む、前記方法が含まれる。本発明の別の方法において、ハンチンチンの集積は、少なくとも１０％抑制される。

本発明の別の方法には、細胞において、突然変異体ハンチンチンの細胞傷害効果を防止する方法であって、前述の核酸二重鎖が、細胞において、突然変異体ハンチンチンの細胞傷害効果を防止するように、突然変異体ハンチンチンの集積を抑制するのに十分な量の該核酸二重鎖を細胞内に導入する工程を含む、前記方法が含まれる。

本発明の別の方法には、細胞において、ハンチンチン遺伝子の発現を阻害する方法であって、前述の核酸二重鎖が、ハンチンチンの発現を阻害するように、ハンチンチンの発現を阻害するのに十分な量の該核酸二重鎖を細胞内に導入する工程を含む、前記方法が含まれる。

本発明の別の方法には、マカカ・ムラタおよびホモ・サピエンスにおいて、ハンチンチンの発現を阻害する方法であって、ハンチンチン遺伝子を含有し、そして発現し、そして核酸干渉に感受性であるニューロン細胞を含有するマカカ・ムラタまたはホモ・サピエンスを提供し、そしてマカカ・ムラタまたはホモ・サピエンスを前述の核酸二重鎖と接触させ、それによってハンチンチン遺伝子の発現を阻害する工程を含む、前記方法が含まれる。本発明の別の方法において、ハンチンチンの発現は、少なくとも１０％阻害される。

本発明の別の方法には、マカカ・ムラタまたはホモ・サピエンスにおいて、ハンチントン病（「ＨＤ」）の細胞傷害効果を防止する方法であって、生じる核酸二重鎖が、ＨＤの細胞傷害効果を防止するように、ＨＤと関連するタンパク質の集積を抑制するのに十分な量の前述のベクターを細胞内に導入する工程を含む、前記方法が含まれる。

本発明の別の方法には、マカカ・ムラタまたはホモ・サピエンスにおいて、ハンチンチン遺伝子の発現を阻害する方法であって、生じる核酸二重鎖が、ハンチンチン・タンパク質の発現を阻害するように、ハンチンチン遺伝子の発現を阻害するのに十分な量の前述のベクターを細胞内に導入する工程を含む、前記方法が含まれる。

本発明の別の方法には、マカカ・ムラタまたはホモ・サピエンスにおいて、ハンチンチンの発現を阻害する方法であって、ニューロン細胞を含有するマカカ・ムラタまたはホモ・サピエンスを提供し、ここで、該ニューロン細胞はハンチンチン遺伝子を含有し、そして発現し、そして核酸干渉に感受性であり、そしてマカカ・ムラタまたはホモ・サピエンスと前述のベクターを接触させて、それによってハンチンチン遺伝子の発現を阻害する工程を含む、前記方法が含まれる。

本発明のさらなる方法には、マカカ・ムラタまたはホモ・サピエンスにおいて、ハンチントン病（「ＨＤ」）の細胞傷害効果を防止する方法であって、ＨＤと関連するタンパク質の集積を抑制するのに十分な量の、配列番号１または配列番号４を含む単離核酸二重鎖を、細胞内に導入し、そしてここで、該核酸二重鎖がＨＤの細胞傷害効果を防止する工程を含む、前記方法が含まれる。

本発明のさらなる方法には、マカカ・ムラタまたはホモ・サピエンスにおいて、ハンチンチンの発現を阻害する方法であって、ハンチンチンの発現を阻害するのに十分な量の、配列番号１または配列番号４を含む単離核酸二重鎖を、細胞内に導入し、ここで、前記核酸二重鎖がＨＤと関連するタンパク質の発現を阻害する工程を含む、前記方法が含まれる。

本発明の１つの態様において、核酸二重鎖またはベクターを、脊椎のクモ膜下空間に投与する。本発明の別の態様において、核酸二重鎖またはベクターを、脳の１以上の脳室において脳脊髄液に投与する。本発明の別の態様において、核酸二重鎖またはベクターを、大脳皮質の脳組織内に直接投与する。本発明の方法の別の態様において、核酸二重鎖またはベクターを大脳基底核に局所投与する。本発明の別の態様において、核酸二重鎖またはベクターを尾状核および被殻に特異的に投与する。
発明の詳細な説明
用語「配列番号Ｘ」（ここでＸは１〜１５の任意の数字である）は、１つの態様において、表１に定義するような各数字の配列（同定された配列）を指す。配列番号Ｘはまた、配列番号１〜１５に示す配列の相補鎖とハイブリダイズし、そして限定なしに、ＨＥＫ２９３細胞、４ＭＢＲ５細胞、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞、ＨｅＬＡ細胞、あるいはマカカ・ムラタまたはホモ・サピエンスの任意の他の細胞種から選択される細胞種において、特定の配列番号のターゲットｍＲＮＡを減少させるであろう配列を含むとも読み取らなくてはならない。この定義のもとに、請求される配列には、同定された配列との少なくとも９９％の配列相同性；同定された配列との少なくとも９８％の配列相同性；同定された配列との少なくとも９５％の配列相同性；同定された配列との少なくとも９０％の配列相同性；または同定された配列との少なくとも８５％の配列相同性が含まれてもよい。

用語「核酸」または「核酸分子」は、糖、リン酸、およびプリンまたはピリミジンのいずれかである塩基を含有する単量体（ヌクレオチド）で構成される、一本鎖型または二本鎖型いずれかの、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらのポリマーを指す。特に限定しない限り、該用語は、参照核酸と類似の結合特性を有し、そして天然存在ヌクレオチドと類似の方式で代謝される、天然ヌクレオチドの既知の類似体を含有する核酸を含む。別に示さない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的に修飾された変異体も含む。本発明の核酸分子には、限定なしに、短い干渉核酸（ｓｉＮＡ）、短いヘアピン核酸（ｓｈＮＡ）、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、および二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）などの、ＲＮＡ干渉を仲介可能な核酸分子の任意の種類が含まれてもよい。本発明の核酸分子にはまた、類似のＤＮＡ配列も含まれる。さらに、本発明の核酸および核酸分子は、非修飾または修飾ヌクレオチドを含有してもよい。修飾ヌクレオチドは、ヌクレオチド塩基、糖および／またはリン酸の化学構造において修飾を含有するヌクレオチドを指す。こうした修飾を行って、核酸分子の安定性および／または効率を改善してもよく、そしてこうした修飾は、米国特許第（「ＵＳＰＮ」）６，６１７，４３８号、ＵＳＰＮ５，３３４，７１１号；ＵＳＰＮ５，７１６，８２４号；ＵＳＰＮ５，６２７，０５３号；米国特許出願第６０／０８２，４０４号、国際特許協力条約公報第（「ＰＣＴＰＮ」）ＷＯ９８／１３５２６号；ＰＣＴＰＮＷＯ９２／０７０６５号；ＰＣＴＰＮＷＯ０３／０７０８９７号；ＰＣＴＰＮＷＯ９７／２６２７０号；ＰＣＴＰＮＷＯ９３／１５１８７号；Ｂｅｉｇｅｌｍａｎら，１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，２５７０２；ＵｓｍａｎおよびＣｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２，ＴＩＢＳ．１７，３４；Ｕｓｍａｎら，１９９４，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＳｙｍｐ．Ｓｅｒ．３１，１６３；Ｂｕｒｇｉｎら，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５，１４０９０；ＰｅｒｒａｕｌｔらＮａｔｕｒｅ，１９９０，３４４，５６５−５６８；ＰｉｅｋｅｎらＳｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５３，３１４−３１７；ＵｓｍａｎおよびＣｅｄｅｒｇｒｅｎ，ＴｒｅｎｄｓｉｎＢｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１９９２，１７，３３４−３３９；Ｋａｒｐｅｉｓｋｙら，１９９８，ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ，３９，１１３１；ＥａｒｎｓｈａｗおよびＧａｉｔ，１９９８，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＳｃｉｅｎｃｅｓ），４８，３９−５５；ＶｅｒｍａおよびＥｃｋｓｔｅｉｎ，１９９８，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６７，９９−１３４；Ｂｕｒｌｉｎａら，１９９７，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，５，１９９９−２０１０；Ｌｉｍｂａｃｈら，１９９４，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２２，２１８３；ならびにＢｕｒｇｉｎら，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５，１４０９０などの特許および刊行物に記載される。こうした特許および刊行物は、核酸分子を修飾するための一般的な方法および戦略を記載し、そして本明細書に援用される。

句「発現カセット」は、本明細書において、関心対象の核酸配列の適切な転写を促進するさらなる配列とともに、適切な宿主細胞において、特定のヌクレオチド配列の発現を指示することが可能な核酸配列を意味する。関心対象のヌクレオチド配列に加えて、発現カセットには、終結シグナルにもまた機能可能であるように連結されていてもよい、関心対象のヌクレオチド配列に機能可能であるように連結されているプロモーターが含まれてもよい。発現カセットにはまた、発現エンハンサーが含まれていてもよい。関心対象のヌクレオチド配列を含む発現カセットは、キメラ性であってもよい。発現カセットはまた、天然存在であるが、異種発現に有用な組換え型で得られているものであってもよい。発現カセット中のヌクレオチド配列の発現は、恒常的プロモーターの調節下、または宿主細胞が何らかの特定の刺激に曝露された際にのみ転写を開始する、制御可能プロモーターの調節下にあってもよい。多細胞生物の場合、プロモーターはまた、特定の組織または臓器あるいは発生段階に特異的であってもよい。

用語「プロモーター」は、通常、関心対象のヌクレオチド配列の上流（５’）にあり、ＲＮＡポリメラーゼおよび適切な転写に必要な他の因子による認識を提供することによって、関心対象のヌクレオチド配列の発現を指示し、そして／または調節するヌクレオチド配列を指す。本明細書において、用語「プロモーター」には、（限定されるわけではないが）ＴＡＴＡボックス、および転写開始部位を特定するよう働く他の配列で構成される短いＤＮＡ配列である、最少プロモーターが含まれ、これに発現調節のための制御要素が付加される。用語「プロモーター」はまた、最少プロモーターに加えて、コード配列または機能するＲＮＡの発現を調節可能な制御要素を含む、ヌクレオチド配列も指す。この種のプロモーター配列は、近位およびより遠位の上流要素からなり、後者の要素はしばしば、エンハンサーと呼ばれる。用語「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激することも可能であり、そしてプロモーターの生得的な要素、あるいはプロモーターのレベルまたは組織特異性を増進するために挿入される異種要素であってもよい、ＤＮＡ配列を指す。エンハンサーは、どちらの配向（正常または反転）で操作することも可能であり、そしてプロモーターの上流または下流のいずれに移動させた場合であっても機能可能である。エンハンサーおよび他の上流プロモーター要素はどちらも、その効果を仲介する配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質に結合する。プロモーターは、全体として、天然遺伝子から得られることも可能であるし、または天然に見られる異なるプロモーターから得られる、異なる要素で構成されることも可能であるし、または合成ＤＮＡセグメントで構成されることさえ可能である。プロモーターはまた、生理学的条件または発生条件に反応して、転写開始の有効性を調節するタンパク質要素の結合に関与するＤＮＡ配列も含有してもよい。本発明にしたがって用いる特定のプロモーターには、例えば、そして限定なしに、ｐｏｌＩＩプロモーター（限定なしに、サイトメガロウイルス（「ＣＭＶ」）プロモーター、ニワトリβ−アクチン（「ＣＢＡ」）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（「ＲＳＶ」）プロモーターおよびニューロン特異的エノラーゼ（「ＮＳＥ」）プロモーターが含まれる）が含まれてもよい。さらに、本発明にしたがって用いる特定のプロモーターには、例えば、そして限定なしに、ｐｏｌＩＩＩプロモーター（限定なしに、ヒトＨ１、およびヒトまたはネズミＵ６プロモーター、ならびに米国特許出願第２００５／００６４４８９号に記載されるような、制御される方式で発現されるよう操作されたＨ１およびＵ６プロモーターが含まれる）が含まれてもよい。

用語「ベクター」は、自己伝達可能または可動性であってもまたはなくてもよく、そして細胞ゲノム内に組み込まれるか、または染色体外に存在する（例えば複製起点を持つ自律複製プラスミド）か、いずれかによって、真核宿主細胞を形質転換可能である、二本鎖または一本鎖直鎖または環状型の任意のウイルス、ならびに任意のプラスミド、コスミド、ファージ、バイナリーベクターまたは核酸セグメント（ＤＮＡまたはＲＮＡ）が含まれる。

ハンチントン病（「ＨＤ」）に関与する遺伝子（ＩＴ−１５）は、第４染色体の短腕末端に位置する。この遺伝子は、タンパク質ハンチンチン（「ｈｔｔ」としてもまた知られる）をコードする。ＨＤに関与するＨＤ遺伝子における突然変異は、該遺伝子のコード領域内の不安定な拡大ＣＡＧ三ヌクレオチド反復である。この突然変異は、拡大グルタミン配列を持つハンチンチン・タンパク質を生じる。ハンチンチンの正常な機能および異常な機能は知られていないが、ハンチンチンの突然変異型の存在は、ＨＤ症状の発生と相互に関連付けられてきている。さらに、異常なハンチンチン・タンパク質は、ニューロン核において異常に集積するようである。したがって、ハンチンチンの発現の遮断は、ＨＤ発病機序を研究する有用な機構を提供し、そしてまた、ＨＤの潜在的な治療も提供可能でもある。突然変異体ハンチンチン・タンパク質の発現を抑制することが、ＨＤの療法になりうることの原理の証明が、Ｈａｒｐａｒらによって、マウスにおいて示されてきており、Ｈａｒｐｅｒらは、ＲＮＡ干渉の使用による、マウスにおける突然変異体ＨＤ導入遺伝子の抑制が、トランスジェニックマウスの疾患表現型における改善を生じることを示した。ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，２００５，１０２（１６）５８２０−５８２５。しかし、Ｈａｒｐｅｒらによって用いられ、そして開示されるｓｈＮＡ配列が、本発明の核酸配列のあらゆるものと異なる点で、本発明がこの先行技術とは異なることに注目しなければならない。さらに、Ｈａｒｐｅｒらは、彼らの研究の核酸配列が、アカゲザルおよびヒトのＨＤ遺伝子の両方と相同であるかどうかを示さず、一方、本発明の核酸配列は、アカゲザル（マカカ・ムラタ）およびヒト（ホモ・サピエンス）のＨＤ遺伝子の両方と相同であることが知られる。したがって、本発明の１つの重要な利点は、同じ核酸配列を、非ヒト霊長類、マカカ・ムラタにおいて毒性学的および薬理学的特性ならびに安全性に関して研究して、そして性質決定して、そして次いで、改変なしに、この核酸をまた、ホモ・サピエンスにおいて、療法的利点のために使用することも可能であることである。

ＲＮＡ干渉（「ＲＮＡｉ」）を用いて、アカゲザルおよびヒトのハンチンチンの発現を抑制するために、まず、ヒトおよびアカゲザルのＨＤ遺伝子の発現を有効に抑制する核酸配列を同定することが必要であった。この目的に向けて、ＰＣＲ戦略を用いて、アカゲザルＨＤ遺伝子の５’部分の３４３７ｂｐをクローニングし、そして組み立てた。簡潔には、ヒト（ＮＭ＿００２１１１）およびブタ（ＡＢ０１６７９３）のｃＤＮＡ配列の並列において同定される、進化的に保存される配列に基づいて、アカゲザルＨＤｃＤＮＡにアニーリングすると予測される、一連のＰＣＲプライマーを設計した。これらのプライマーを用い、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼを用いて、アカゲザル脳および腎臓組織から調製された第一鎖ｃＤＮＡ（ＢｉｏＣｈａｉｎＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ；それぞれＣ１５３４０３５およびＣ１５３４１４２）から、アカゲザルＨＤ遺伝子の部分的に重複する部分を増幅した。回収したＰＣＲ産物をｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にクローニングし、そして標準法を用いて配列決定した。多数の独立に得たクローン間の配列並列を分析して、潜在的なＰＣＲおよび配列決定エラーの排除を確実にした。また、この配列情報を用いて、回収したＨＤｃＤＮＡ配列中のギャップをクローニングするさらなるプライマーを設計した。ＰＣＲおよび慣用的なクローニング技術を用いて、アカゲザルＨＤｃＤＮＡの３４３７ｂｐを含有する単一の合成クローンを組み立てた。

次に、オンライン・ソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｈａｒｍａｃｏｎ．ｃｏｍ／）を用いて、ヒト配列の部分と対応するアカゲザル・ハンチンチンに対する潜在的な合成核酸抑制配列（すなわちターゲット遺伝子はアカゲザルおよびヒトのＨＤ遺伝子であった）を同定し、そしてやはり、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（登録商標）（ＤｈａｒｍａｃｏｎＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．、コロラド州ボールダー）から得た。これらの核酸配列は、以下の表１中のものを含んだ：
表１．ｓｉＲＮＡ配列

当業者に理解されるであろうように、本発明の核酸分子には、先の表中の配列、これらの配列の逆相補体、および列挙されるチミンの代わりにウラシルを含む、ＲＮＡに基づく配列が含まれることに注目されたい。したがって、先の表中の配列を、ターゲット配列、ならびに本発明の核酸分子中に含まれる配列と見なすことも可能である。配列番号１〜８は、１９ヌクレオチド塩基配列である。配列番号９〜１５は、２７ヌクレオチド塩基配列に拡大された同じ配列である。配列番号７として同定された配列を拡大すると、アカゲザルおよびヒトのＨＤ配列間のミスマッチを生じるため、この配列は、２７ヌクレオチド塩基配列には拡大されなかった。対照配列もまた選択した。対照配列には、どちらもＤｈａｒｍａｃｏｎから購入される、ナンセンス・スクランブル化対照（配列番号１９；ＴＡＧＣＧＡＣＴＡＡＡＣＡＣＡＴＣＡＡ）およびＴＮＦａ配列（配列番号１６；ＡＡＴＣＣＴＣＣＴＴＣＧＴＡＴＴＡＴＡ）が含まれた。

上に同定する１９ヌクレオチド核酸配列のいずれが、最も効果的にアカゲザル・ハンチンチン発現を抑制するかを同定するため、ｉｎｖｉｔｒｏ同時トランスフェクション・アッセイ系を開発した。図１を参照すると、ｐＴｒａｃｅｒ^ＴＭ−ＣＭＶ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃｏｒｐ．、カリフォルニア州カールスバッド）内にアカゲザルＨＤ遺伝子配列をサブクローニングして、ｐＴｒａｃｅｒ−ｒｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ（ｐＴＲＡＣＥＲ−ｒｈＨＤ）を生成した。組換えプラスミドにはまた、トランスフェクション効率基準化のため、ＧＦＰ−ゼオシン・レポーター遺伝子も含まれた。ＣＭＶプロモーターは、ターゲット遺伝子（アカゲザルＨＤ）の恒常的発現を指示し、一方、ＥＦ１プロモーターは、ＧＦＰ−ゼオシン・レポーター遺伝子の恒常的発現を指示した。

生成した組換えプラスミドを用いて、真核細胞株への同時トランスフェクションにより、核酸配列のスクリーニングを容易にした。具体的には、６０〜７０％の集密度（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）のＨＥＫ２９３細胞培養を、適切なターゲットプラスミド（２μｇ／６ウェルプレートのウェル）、およびアカゲザルＨＤ（配列番号１〜配列番号８）、対照としてのＴＮＦａ（配列番号１６）またはナンセンス・スクランブル化対照（配列番号１９）に対して向けられる試験核酸配列（１００ｎＭ）で同時トランスフェクションした。トランスフェクション４８時間後、総細胞ＲＮＡを細胞から採取し、そして標準法によって、ｃＤＮＡを作製するのに用いた。リアルタイムＰＣＲ法を用いて、ターゲット（ＨＤ）およびレポーター（ＧＦＰ）遺伝子発現レベルに関して、ｃＤＮＡを分析した。ＧＦＰ発現レベルに関してデータを基準化して、トランスフェクション効率の変動に関して調節した。

図２は、各試験核酸配列がアカゲザルＨＤｍＲＮＡを抑制する能力に関する、アカゲザルＨＤトランスフェクション研究の結果を示す。リアルタイムＰＣＲによって測定した際、すべての非対照配列は、偽処理対照細胞（１００％発現に設定）に比較すると、ＨＤ遺伝子の発現を有効に抑制した。本実験において評価した核酸配列は、ヒトＨＤ遺伝子配列の部分に対して、完全な配列同一性を有するため、該配列が、ヒトＨＤ遺伝子の発現もまた抑制し、したがって、ヒト・ハンチンチン・タンパク質の産生を抑制すると期待することは妥当である。

次に、２つの異なる用量、１００ｎＭおよび１０ｎＭで、内因性アカゲザルＨＤ遺伝子の発現を抑制する能力に関して、１９ヌクレオチド配列のサブセットの能力を評価した。具体的には、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（「ＡＴＣＣ」）から得られる、７０〜８０％の集密度の４ＭＢｒ５細胞株培養（アカゲザル肺細胞株由来の細胞）を、１００ｎＭまたは１０ｎＭいずれかの、アカゲザルＨＤｍＲＮＡに対して向けられる試験核酸配列（配列番号１；配列番号２；配列番号４；配列番号６；および配列番号７）、あるいは１００ｎＭの対照配列（配列番号１９（スクランブル化）または配列番号１６（オフ・ターゲットＴＮＦａ対照））でトランスフェクションした。トランスフェクション４８時間後、総細胞ＲＮＡを細胞から収集し、そして標準法によって、ｃＤＮＡを生成するのに用いた。リアルタイムＰＣＲ法を用い、アカゲザルＨＤおよび対照遺伝子発現に関して、ｃＤＮＡを用いて分析した。別個のリアルタイムＰＣＲ反応を行って、アカゲザルＧＡＰＤＨ発現レベルを評価した。すべての発現データを、ＧＡＰＤＨ発現に対して基準化して、アカゲザル細胞株においてｓｉＮＡが仲介するアカゲザルＨＤのノックダウン効率の評価を可能にした。図３に示すように、アカゲザルＨＤｍＲＮＡに対して向けられるすべての配列は、対照に比較した際、どちらの用量でも、アカゲザルＨＤ遺伝子発現を抑制した。

次に、提供する核酸配列の長さおよび用量に対するアカゲザルＨＤｍＲＮＡ抑制の依存性を評価する実験を行った。具体的には、４ＭＢｒ５細胞を、上述のように、しかし１００ｎＭ、１０ｎＭ、１．０ｎＭ、０．２ｎＭまたは０．０５ｎＭの配列番号４（１９ヌクレオチド配列）；１００ｎＭ、１０ｎＭ、１．０ｎＭ、０．２ｎＭまたは０．０５ｎＭの配列番号１２（２７ヌクレオチド配列に対応）；１００ｎＭの配列番号１９（スクランブル化）、あるいは１００ｎＭの配列番号１６（オフ・ターゲットＴＮＦａ対照）でトランスフェクションした。図４に示すように、対照に比較した際、両方の長さの配列のすべての用量が、アカゲザルＨＤ遺伝子発現を抑制した。４ＭＢｒ５細胞において、すべての用量が有効であったが、配列の長さに関わりなく、アカゲザルＨＤ遺伝子発現を抑制するには、１００ｎＭ、１０ｎＭおよび１ｎＭが最も有効な用量であった。

ｓｉＮＡが、内因性アカゲザルＨＤ遺伝子の発現を抑制する能力を評価する、続く実験はまた、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞において、先に評価した１９ヌクレオチド配列対応物に比較した際の、２７ヌクレオチド配列の有効性も調べた。この実験では、７０〜８０％の集密度のＬＬＣ−ＭＫ２細胞（やはりＡＴＣＣから得られる、アカゲザル腎臓細胞株）を、２つの用量、１０ｎＭまたは０．２ｎＭの一方の試験核酸配列（配列番号４および配列番号１２）、ならびに１００ｎＭの対照（配列番号１９および配列番号１６）でトランスフェクションした。トランスフェクション４８時間後、総細胞ＲＮＡを細胞から収集し、そして標準法によって、ｃＤＮＡを生成するのに用いた。リアルタイムＰＣＲ法を用い、アカゲザルＨＤおよび対照遺伝子発現に関して、ｃＤＮＡを用いて分析した。別個のリアルタイムＰＣＲ反応を行って、アカゲザルＧＡＰＤＨ発現レベルを評価した。すべての発現データを、ＧＡＰＤＨ発現に対して基準化して、アカゲザル細胞株においてｓｉＮＡが仲介するアカゲザルＨＤのノックダウン効率の評価を可能にした。図５に示すように、アカゲザルＨＤｍＲＮＡに対して向けられるすべての配列は、対照に比較した際、どちらの用量でも、アカゲザルＨＤ遺伝子発現を抑制した。

先の段落に記載する実験の後、さらに低い用量の配列番号４および１２（０．０５ｎＭ）を、０．２ｎＭ用量および対照、配列番号１９（１００ｎＭ）の有効性に対して比較したことを除いて、同一の実験を行った。図６に示すように、すべての配列および用量は、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞において、内因性アカゲザルＨＤ遺伝子発現を抑制した。

また、配列番号１および９も用いて、異なる長さの配列および用量の有効性を比較した。２つの先に記載した実験で用いたものと同じ方法にしたがって、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞を、１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、０．１ｎＭまたは０．０１ｎＭの配列番号１（１９ヌクレオチド配列）；１０ｎＭ、１ｎＭ、０．１ｎＭ、または０．０１ｎＭの配列番号９（２７ヌクレオチド配列に対応）；あるいは対照、配列番号１９または１６（１００ｎＭ）でトランスフェクションした。図７に示すように、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞において、両方の配列のすべての用量が、内因性アカゲザルＨＤ遺伝子発現を抑制し、１ｎＭおよびそれより高い用量の配列番号１および９が最大の抑制を提供した。さらに、この実験から、これらの２つのｓｉＮＡに関するＩＣ５０（５０％抑制に必要な阻害剤濃度）値は、それぞれ、１０ｐＭおよび７５ｐＭであると概算される。

次に、選択した配列が内因性ヒトＨＤ遺伝子の発現を抑制する能力に関して、同定したｓｉＮＡ配列のサブセットを試験した。この実験において、７０〜８０％の集密度のＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣから得られる）を、１００ｎＭの試験核酸配列（配列番号１；配列番号２；配列番号４；配列番号６；または配列番号７）または対照（配列番号１９）でトランスフェクションした。トランスフェクション４８時間後、総細胞ＲＮＡを細胞から収集し、そして標準法によって、ｃＤＮＡを生成するのに用いた。リアルタイムＰＣＲ法を用い、ヒトＨＤおよび対照遺伝子発現に関して、ｃＤＮＡを用いて分析した。別個のリアルタイムＰＣＲ反応を行って、ヒトＧＡＰＤＨ発現レベルを評価した。すべての発現データを、ＧＡＰＤＨ発現に対して基準化して、ＨｅＬａ細胞株においてｓｉＮＡが仲介するヒトＨＤのノックダウン効率の評価を可能にした。図８Ａに示すように、ヒトＨＤｍＲＮＡに対して向けられるすべての配列は、対照に比較した際、ヒトＨＤ遺伝子発現を抑制した。

直前に記載した実験を、次に、１ｎＭ、０．１ｎＭまたは０．０１ｎＭいずれかの用量の配列番号１、２、４、６または７、あるいは１００ｎＭの対照、配列番号１９を用いて反復した。図８Ｂ〜８Ｄに示すように、これらの配列番号１、２、４、６および７の各々のすべての用量は、ＨｅＬａ細胞において、内因性ヒトＨＤ遺伝子発現を抑制する際に有効であった。最低用量（０．０１ｎＭ）の配列番号２のたった１つの例で、ヒトＨＤ抑制が観察されなかった。

先に記載した実験の後、本発明の配列が外因性ハンチンチン・タンパク質発現を抑制するかどうかを決定する研究に着手した。この第一のタンパク質抑制実験において、図１に示すｐＴＲＡＣＥＲプラスミドから発現される、部分的アカゲザル・ハンチンチン・タンパク質の抑制を、ウェスタンブロット分析によって測定した。具体的には、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞を、ｐＴＲＡＣＥＲ−ｒｈＨＤプラスミド（２μｇ／６ウェルプレートのウェル）および１００ｎＭの配列番号１９（対照）；配列番号１または配列番号４のいずれかで同時トランスフェクションした。この実験の対照はまた、ｐＴＲＡＣＥＲ−ｒｈＨＤプラスミドのみでトランスフェクションされたＬＬＣ−ＭＫ２細胞からもなった。トランスフェクション４８時間後、タンパク質を採取し、そしてウェスタンブロット分析を用いて分析した。この分析では、ウェルあたり１０μｇの総タンパク質を装填した。Ｃｈｅｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（カリフォルニア州テメキュラ）ハンチンチン抗体ＭＡＢ２１６８を用いてアカゲザル・ハンチンチン・タンパク質発現を測定し、そしてａｂｃａｍ（登録商標）（マサチューセッツ州ケンブリッジ）抗体２０２７２−１００を用いてβ−アクチンを測定した。ハンチンチン・タンパク質発現を定量化するため、ウェスタンブロットのオートラジオグラム上のハンチンチンおよびβ−アクチンに関して、濃度測定によって、バンドの強度を測定した。ハンチンチン・タンパク質発現を、β−アクチン発現に対して基準化した。図９に見られうるように、ｐＴＲＡＣＥＲ−ｒｈＨＤプラスミドおよび配列番号１９またはｐＴＲＡＣＥＲ−ｒｈＨＤプラスミドのみでトランスフェクションした対照に比較した際、配列番号１および配列番号４の両方が、外因性ハンチンチン・タンパク質発現を抑制するのに有効であった。

次に、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞において、再びウェスタンブロット分析を用いて、配列番号１および配列番号４が、内因性タンパク質発現を抑制する能力を調べた。ＬＬＣ−ＭＫ２細胞を、１００ｎＭの配列番号１、配列番号４または配列番号１９のいずれかでトランスフェクションした。さらなる対照は、非トランスフェクション細胞由来の抽出物からなった。トランスフェクション４８時間後、タンパク質を採取し、そしてウェスタンブロットウェルあたり、１０μｇの総タンパク質を装填して分析した。再び、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（カリフォルニア州テメキュラ）ハンチンチン抗体ＭＡＢ２１６８を用いてアカゲザル・ハンチンチン・タンパク質発現を測定し、そしてａｂｃａｍ（登録商標）（マサチューセッツ州ケンブリッジ）抗体２０２７２−１００を用いてβ−アクチンを測定した。図１０に示すアカゲザル・ハンチンチンおよびβ−アクチンに関するウェスタンブロット上で明らかであるように、配列番号１および配列番号４はどちらも、ハンチンチン・タンパク質発現を抑制する。タンパク質抑制量を定量化するため、β−アクチン発現に対して、アカゲザル・ハンチンチン・タンパク質発現レベルを基準化した。これを行うため、ウェスタンブロットのオートラジオグラム上のバンド強度（図１０）を濃度測定によって測定した。図１１に見られうるように、対照、配列番号１９をトランスフェクションした細胞または非トランスフェクション細胞由来の抽出物に比較した際、配列番号１および配列番号４の両方が、内因性ハンチンチン・タンパク質発現を抑制した。

有効な核酸配列を上述のように同定した後、有効な配列を短いヘアピン核酸（「ｓｈＮＡ」）構造にフォーマットしてもよい。図１２は、抗ハンチンチンｓｈＮＡ配列として再フォーマットされ、そして構築された配列番号４（配列番号１７；図１２Ａ）を示す。図１２はまた、対照ｓｈＮＡ配列（配列番号１８；図１２Ｂ）も示す。ｓｈＮＡ配列は、ｓｉＮＡ核酸配列（黒で示す囲み配列；図１２Ａ中、元来有効な核酸配列）、９ヌクレオチド・ループ（下線）、囲み核酸配列の逆相補体（イタリック体）、およびＰｏｌＩＩＩターミネーター配列（ＴＴＴＴＴＴ（太字））を含有する。４つの部分的に重複した合成オリゴヌクレオチド（図１２Ａ中の−Ａ１、−Ａ３、−Ａ２、および−Ａ４、ならびに図１２Ｂ中の−Ｂ１、−Ｂ３、−Ｂ２、および−Ｂ４）を用いて、ｓｈＮＡを組み立ててもよい。２つの別個の反応において、各ｓｈＮＡの１／３および２／４オリゴヌクレオチドをアニーリングさせてもよい。図１２Ａおよび１２Ｂを参照すると、Ａ１およびＢ１オリゴヌクレオチドには囲み配列が含まれる。Ａ２およびＢ２オリゴヌクレオチドには、下線の９ヌクレオチド・ループ、それぞれ、オリゴヌクレオチドＡ１およびＢ１の逆相補体、太字のＰｏｌＩＩＩターミネーター配列（ＴＴＴＴＴＴ）およびこれらの図に示すＥｃｏＲＩ部位の最初のＧが含まれる。図１２Ａおよび１２ＢのＡ３およびＢ３オリゴヌクレオチドには、それぞれ、ＡｐａＩオーバーハング領域、囲みＡ１／Ｂ１配列の逆相補体、および下線の９ヌクレオチド・ループ配列の逆相補体が含まれる。Ａ４およびＢ４オリゴヌクレオチドには、それぞれ、Ａ２およびＢ２のイタリック体部分の逆相補体、ならびに太字のＰｏｌＩＩＩターミネーター配列の逆相補体（ＡＡＡＡＡＡ）が含まれる。最後に、Ａ４およびＢ４オリゴヌクレオチドは、ＥｃｏＲＩオーバーハング領域を含有する。ネズミＵ６プロモーター含有シャトルベクター（ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ１．０−Ｕ６；Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．、テキサス州オースティン；図１５）内に直接サブクローニングするため、ｓｈＮＡ構造には、ＡｐａＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素適合末端が含まれる。次いで、３方向連結反応を用いて、全長ｓｈＮＡ（配列番号１７および１８）を、ＡｐａＩ／ＥｃｏＲＩ消化したｐＳｉｌｅｎｃｅｒベクター内にクローニングしてもよい。核酸配列の恒常的高レベル発現のため、Ｕ６プロモーター（ネズミまたはヒト）を用いる。本発明にしたがって、ヒトＨ１プロモーターもまた、使用可能である。ヒトＵ６プロモーターを含有するシャトルベクターの１つの限定されない例は、Ｐｒｏｍｅｇａ社（ウィスコンシン州マディソン）のｐｓｉＳＴＲＩＫＥ^ＴＭｈｍＧＦＰである。ヒトＨ１プロモーターを含有するシャトルベクターの１つの限定されない例は、Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．（テキサス州オースティン）のｐＳｉｌｅｎｃｅｒ３．０−Ｈ１である。

本例は、ｓｈＮＡフォーマットの本発明の核酸配列および該配列を生成するための方法の１つの態様を提供するが、他の形態および方法もまた、本発明の範囲内に属する。例えば、１つの態様において、ｓｈＮＡヘアピンのループ構造は、長さ４〜１０ヌクレオチドである。別の態様において、ヘアピン構造のアームは、長さおよそ３０ヌクレオチド未満である。別の態様において、ヘアピン構造のアームは、長さ１９〜２７ヌクレオチドの間である。したがって、特定の例を提供するが、この例は、本発明の範囲を限定すると解釈してはならない。

次に記載する実験では、ｓｈＮＡを発現するプラスミドが、アカゲザルＨＤ遺伝子発現を抑制する能力を調べた。ＬＬＣ−ＭＫ２細胞を、２つのステム長（配列番号４（１９ヌクレオチド）または配列番号１２（２７ヌクレオチド））の一方および２つの異なるループ構造（ＥＢ４またはｍｉｒ２３）の一方を持つ、ｐｓｉＳＴＲＩＫＥ^ＴＭｈｍＧＦＰプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ウィスコンシン州マディソン）でトランスフェクションした。各ループ構造に関して、スクランブル化対照もまた生成した。具体的には、これらのスクランブル化対照配列には、ＥＢ４に関する２７ヌクレオチド配列対照（配列番号２０）（図１３Ａ）およびｍｉｒ２３に対する１９ヌクレオチド配列対照（配列番号２１）（図１３Ｂ；配列番号２１は、対照、配列番号１８の修飾型である）が含まれた。したがって、この研究におけるトランスフェクション配列のすべてには、配列番号２０；配列番号２１；配列番号２２（図１３Ｃ；修飾された配列番号１７−ＥＢ４（一般の当業者に認識されるであろうように、配列番号２２には、異なるベクター内にサブクローニングするための修飾オーバーハング領域を伴う、配列番号１７が含まれる））；配列番号２３（図１３Ｄ；修飾された配列番号１７−ｍｉｒ２３）；配列番号２４（図１３Ｅ；ｓｈＮＡ修飾された配列番号１２−ＥＢ４）；および配列番号２５（図１３Ｆ；ｓｈＮＡ修飾された配列番号１２−ｍｉｒ２３）が含まれる。図１４に見られうるように、対照プラスミドに比較した際、すべての試験プラスミドが、アカゲザルＨＤ遺伝子発現を抑制した。

次に、ウイルス産生プラスミドを調製する方法を記載する。この方法は、上述のｓｈＮＡフォーマットの核酸配列を産生するための方法に基づく。しかし、当業者に理解されるであろうように、記載する技術の多様な既知の修飾法もまた、本発明の範囲内に属する。まず、各ｐＳｉｌｅｎｃｅｒシャトルベクター（ハンチンチンおよび対照）から、ｓｈＮＡ発現カセット（ネズミＵ６プロモーター、ｓｈＮＡ配列、およびＰｏｌＩＩＩターミネーター配列）を含有するＢａｍＨＩ断片（図１５）を回収し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑化し、そしてＡＡＶ１／２発現ベクター（ｄｅｐｒＡＶＥ^ＴＭ；ＧｅｎｅＤｅｔｅｃｔ．ｃｏｍＬｔｄ、フロリダ州ブレイデントン）内にサブクローニングした。図１６に示すように、本例において、最終ウイルス発現ベクター（ウイルス産生に用いる）において、Ｕ６プロモーター（ネズミまたはヒト）は、ｓｈＮＡの発現を駆動可能であり、そしてウッドチャック・エンハンサー／ニワトリβ−アクチン・プロモーターは、増進した緑色蛍光タンパク質（ＷＰＲＥ／ＣＡＧ−ｅＧＦＰ）の発現を駆動可能である。これらの発現カセットには、ウイルス反転末端反復（ＩＴＲ）が隣接してもよい。ウッドチャック転写後制御要素（ＷＰＲＥ）およびウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化配列の存在によって、細胞形質導入後の高い転写が確実になる。本発明の代替法において、発現カセットは、さらに、合成最少ポリアデニル化シグナルなどのポリアデニル化シグナルを含有する。本発明の別の代替態様において、Ｈ１プロモーターを用いてもよい。

図１７は、異なるプラスミドであって、ＡＡＶを生成するために以下の実験で用いるｐＡＡＶベクターを構築するのに用いるプラスミド（ｐＡＡＶ−ｈｒＧＦＰ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホヤ）を示す。６つの異なるプラスミドを構築した；３つはＨ１プロモーターを含み、そして３つはＵ６プロモーターを含む（Ａｍｂｉｏｎ（テキサス州オースティン）のヒトＨ１プロモーターおよびＰｒｏｍｅｇａ（ウィスコンシン州マディソン）のヒトＵ６プロモーター）。具体的には、以下を、示すベクター内にサブクローニングした：（１）Ｕ６−配列番号１７；（２）Ｕ６−配列番号２６（配列番号２６は、ｓｈＲＮＡフォーマットの配列番号１である；図１８Ａを参照されたい）；（３）Ｈ１−配列番号１７；（４）Ｈ１−配列番号２６；（５）Ｕ６−配列番号１８（スクランブル化ｓｈＮＡ対照）；および（６）Ｈ１−配列番号２７（配列番号２７は、スクランブル化した配列番号１ｓｈＮＡ対照である；図１８Ｂを参照されたい）。本例において、ＰｖｕＩＩを含む適切なｐｓｉＳＴＲＩＫＥ^ＴＭまたはｐＳｉｌｅｎｃｅｒ３．０ｓｈＮＡ発現ベクターから、プロモーターおよびｓｈＮＡ配列を含有するカセットを取り除くことによって、これを行った。次いで、このＰｖｕＩＩ断片を、ｐＡＡＶ−ｈｒＧＦＰ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホヤ）の平滑化ＭｌｕＩ部位内にサブクローニングした。制限消化マッピングおよび配列分析によって、方向性を確認した。

これらの６つのｐＡＡＶプラスミドを、ｐＴＲＡＣＥＲ−ｒｈＨＤ（図１）とともに、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内に同時トランスフェクションした。対照として、２つのｓｉＲＮＡ（配列番号１または４）およびナンセンス・スクランブル化対照（配列番号１９）もまた、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内にトランスフェクションした。対照として、ｐＴＲＡＣＥＲ−ｒｈＨＤを単独でもまたトランスフェクションした。トランスフェクション４８時間後にＲＮＡを収集し、そしてリアルタイムＰＣＲによって、アカゲザルＨＤ遺伝子発現の抑制（ｐＴＲＡＣＥＲプラスミドに対する）を測定し、そしてｐＴＲＡＣＥＲ−ｒｈＨＤプラスミドから発現されるＧＦＰの量に対して基準化した。図１９で見られうるように、Ｕ６−配列番号１７；Ｕ６−配列番号２６；Ｈ１−配列番号１７；およびＨ１−配列番号２６を含有するｐＡＡＶプラスミドは、外因性アカゲザルＨＤ遺伝子発現を抑制するにあたって、先に試験した配列番号１および配列番号４と同程度に有効であった。スクランブル化対照配列を発現するｐＡＡＶプラスミドは、外因性アカゲザルＨＤ遺伝子発現を抑制しなかった。

次に、必要なｐＨＥＬＰＥＲおよびＲＥＰＣＡＰプラスミドとともに、記載するｐＡＡＶプラスミドを用いて、血清型１の組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を生成した。５つの別個のＡＡＶウイルスを生成した。これらのウイルスを操作して、Ｕ６−配列番号２６；Ｕ６−配列番号１７；Ｈ１−配列番号２６；Ｕ６−配列番号１８（ｓｈＮＡ対照）またはＨ１−配列番号２７（ｓｈＮＡ対照）を発現させた。これらのウイルスが、ＨｅＬａ細胞およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、内因性ヒトＨＤ遺伝子発現を抑制する能力を調べた。２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補った１ｍｌのダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）細胞培地中、細胞のウェルにウイルスを直接添加することによって、６ウェルプレートのウェル中、５＊１０^５細胞に、５ｘ１０^９ビリオンを形質導入した。このプレートを、３０分ごとに揺り動かすことによって、穏やかに混合しながら、３７℃、５％ＣＯ_２で２時間インキュベーションした。この２時間のインキュベーション後、１８％ＦＢＳを補った１ｍｌのＤＭＥＭ細胞培地を各ウェルに添加して、１０％の最終ＦＢＳ濃度を得た。形質導入細胞の増殖を、３７℃、５％ＣＯ_２で続けた。形質導入７２時間後、ＲＮＡを収集し、そして標準法によって、ｃＤＮＡを作製するのに用いた。リアルタイムＰＣＲ法によって、ＨＤおよびＧＡＰＤＨ発現レベルに関して、ｃＤＮＡを分析した。内因性ＧＡＰＤＨ発現に対して、内因性ＨＤ発現を基準化した。図２０に示すように、Ｕ６−配列番号２６およびＵ６−配列番号１７は、内因性ヒトＨＤ遺伝子発現を抑制するにあたって有効であった。偽形質導入データセットに比較することによって、Ｐ値を決定した。この実験において、Ｈ１−配列番号２６は、ｉｎｖｉｔｒｏで内因性ヒトＨＤ発現を有意には抑制しなかったものの、ｉｎｖｉｖｏのその潜在的な有効性は、特に、ｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏ活性の間の潜在的な断絶を示す文献に鑑みて、軽視すべきでない。例えば、Ｗｏｏｄｄｅｌｌら，３３４Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄＢｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１１７−２７（２００５）を参照されたい。

本発明のｓｉＮＡ配列および分子を操作して、ＲＩＳＣ複合体内への取り込みを増進することも可能である。具体的には、センス鎖の３’末端ヌクレオチドを操作すると、非常に好適でありうる。センス鎖に３’ミスマッチを導入し、一方、アンチセンス鎖の５’末端では（アンチセンス鎖および意図するｍＲＮＡターゲットの）完全な塩基対形成を維持することによって、ＲＩＳＣ内へのガイド鎖またはアンチセンス鎖の優先的な進入を達成することも可能である。これは、ＲＩＳＣ複合体内へのアンチセンス鎖の進入を最大にし、一方でまた、センス鎖による潜在的なオフ・ターゲット阻害を減少させる。

核酸分子および／またはそのキャリアー（すなわちベクター）を真核細胞内に導入する物理的方法が当該技術分野に知られる。これらの方法のいくつかには、限定なしに、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン仲介トランスフェクション、陽イオン性脂質仲介トランスフェクション、リポフェクション、プロトプラスト融合、微粒子銃、マイクロインジェクション、リポソーム融合、遺伝子銃、ならびに例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第２版，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ニューヨーク州コールドスプリングハーバー，１９８９）、および他の実験室マニュアルに見られる他の適切な方法が含まれる。さらに、細胞内に核酸分子を導入する生物学的方法には、ウイルスベクターの使用が含まれる。哺乳動物遺伝子療法のため、ウイルスベクター、そして特にレトロウイルスベクターは、哺乳動物、例えばアカゲザルまたはヒト細胞内に、遺伝子を導入するために最も広く用いられる方法となってきている。他のウイルスベクターが、ポックスウイルス、単純疱疹ウイルスＩ、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス等から得られうる（例えば、本明細書に援用される、Ｂｏｅｎｉｓｃｈら、ＵＳＰＮ５，３５０，６７４号およびＷｉｌｓｏｎら、ＵＳＰＮ５，５８５，３６２号を参照されたい）。本発明の態様はまた、リポソーム、ポリエチレンイミンの使用を通じて、イオン泳動によって、または他のビヒクル、例えばヒドロゲル、シクロデキストリン、生物分解性ナノカプセル、および生物接着性微小球体内への取り込みによって、送達されてもよい。また、前述のビヒクルを用いまたは用いずに、細胞または組織に、核酸分子を直接送達してもよい。カテーテルおよび薬剤ポンプ系によって、核酸分子／ビヒクルの組み合わせを局所送達しても、直接局所注射によって送達しても、またはポリマーおよび／または薬剤溶出ステントの使用を通じて送達してもよい。

一般の当業者は、本出願の別の箇所に記載する方法に加えて、患者脳の望ましい領域を位置決定する、多数の方法が存在することを認識するであろう。手術前ＭＲＩは、適切な方法の１つに過ぎない。例えば、手術中マッピング手段を含む系もまた想定される。こうした系の１つの態様において、本発明の任意の態様にしたがった核酸二重鎖を、遠位端にマーカーを有するデバイス（例えばカテーテル）を通じて、送達する。マーカーは、画像技術に干渉しない。したがって、マーカーの性質は、あらかじめ決定された領域（例えば尾状核または被殻）に配置された際に、カテーテルの遠位端の視覚化のために用いる技術に応じる。Ｘ線照射の何らかの形を用いて、接近および配置を達成する場合、マーカーは、好ましくはＸ線不透過性である。Ｘ線不透過性マーカーは、遠位先端の少なくとも一部を、Ｘ線に対して不透過性にし、カテーテルの接近および配置中に、蛍光透視法を介して、またはＸ線を介して、先端が観察可能であるようにする。

１つの態様において、放射線不透過性マーカーは、生物適合性接着剤で構成されるマトリックス中に分散したタンタル粉末を含む。バリウムまたは白金物質などの他の物質もまた、放射線不透過性マーカー４６に適している可能性もある。あるいは、放射線検査中の視覚化のために十分な放射線濃度を有する物質の放射線マーカーを選択してもよいが、粉末型では、カテーテル先端が形作られる時点で、カテーテル先端で分散させる。

あるいは、マーカーは、核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）に適合する物質で構成されて、ＭＲＩスキャン中に先端が検出されることを可能にしてもよい。こうしたマーカーに好ましい物質は、白金であるが、バリウム、タンタル、および類似の物質もまた、適切である。放射線写真撮影術またはＭＲＩが利用されているかに関わらず、放射線マーカーを提供する目的は、操作者が、先端の正確な配置を正確に検出することを可能にして、カテーテルの遠位端の配置を、そして後に、カテーテルの遠位端の完全性および位置を検証するのを容易にすることである。

別の例において、例えば、ＰｏｌｅＳｔａｒ（登録商標）ｉＭＲＩＮａｖｉｇａｔｉｏｎＳｕｉｔｅまたは匹敵する系などの、手術中ＭＲ画像誘導系の使用により、ＭＲＩによって、カテーテルの遠位端の配置の検証を手術中に行ってもよい。

別の例において、接近および配置プロセス中に遠位端を位置決定するための手段は、カテーテル、または外科医が患者の脳内にカテーテルを挿入するために用いる手術器具の近位部分に、一時的に取り付けた、小さい赤外光反射性球体の使用による。手術台近くに配置された手術室内の赤外線カメラが、赤外シグナルを放出し、そしてこれらの小さい球体から反射される赤外シグナルを追跡する。次いで、検出される反射によって、ソフトウェアおよびコンピュータ系（ＳｔｅａｌｔｈＳｔａｔｉｏｎ（登録商標）など）が、リアルタイムで、手術中に、計算して、そしてこの特定の患者の先に捕捉されたＭＲＩ画像上に、カテーテルの遠位端の位置を重ね合わせてディスプレイすることが可能になる。（これは、カテーテルの遠位端が、赤外光反射性球体が一時的に取り付けられた、カテーテルの近位位置から、既知の直線距離を持つために可能である）。

別の例において、接近および配置プロセス中に遠位端を位置決定するための手段は、カテーテル、または外科医が患者の脳内にカテーテルを挿入するために用いる手術器具の近位部分に、一時的に取り付けた、赤外線発光ダイオード（ＬＥＤ）の使用による。手術台近くに配置された手術室内の赤外線カメラが、これらのＬＥＤから放出される赤外ビームを検出する。これらの検出されたビームによって、ソフトウェアおよびコンピュータ系（ＳｔｅａｌｔｈＳｔａｔｉｏｎ（登録商標）など）が、リアルタイムで、手術中に、計算して、そしてこの特定の患者の先に捕捉されたＭＲＩ画像上に、カテーテルの遠位端の位置を重ね合わせてディスプレイすることが可能になる。（これは、カテーテルの遠位端が、ＬＥＤが一時的に取り付けられた、カテーテルの近位位置から、既知の直線距離を持つために可能である）。

カテーテル、または外科医が患者の脳内にカテーテルを挿入するために用いる手術器具の位置を計算するために、受動的に反射された赤外光または能動的に放出された赤外光が利用されるかに関わらず、赤外三角測量を利用する目的は、操作者が、先端の正確な配置を正確に検出することを可能にして、カテーテルの遠位端の配置を、そしてカテーテルの遠位端の完全性および位置を手術中に検証するのを容易にすることである。

本発明の核酸配列、分子、発現カセットおよびベクターを用いて、ＨＤ遺伝子発現および生じるハンチンチン形成を抑制してもよい。また、本発明の核酸配列、分子、発現カセットおよびベクターを、ＨＤ発病機序の研究に用いてもよい。さらに、また、本発明の核酸配列、分子、発現カセットおよびベクターを投与して、ＨＤの症状を防止するかまたは治療してもよい。潜在的な治療として用いる場合、これらの剤の投与量ならびに送達時期は、例えば、そして限定なしに、選択した組成物、患者の体重、身体的状態、および年齢、ならびに防止または治療が望ましいのか、ならびに当業者に知られる他の要因を含む、多様な要因に応じて、多様であろう。療法剤の投与は連続的でもまたは断続的でもよい。本発明の剤の投与は、あらかじめ選択した期間に渡って、本質的に連続していてもよいし、または間隔を空けた一連の用量であってもよい。さらに、局所投与および全身投与の両方が、本発明内で使用するのに適切でありうる。研究者または治療している医師が、こうした要因を決定してもよい。

正常成体アカゲザル脳において、ハンチンチン・タンパク質発現抑制の安全性の前臨床研究を行った。この研究において、体重およそ３．９ｋｇの６歳の雌アカゲザルを麻酔し、そして定位注射によって、抗ＨＤｓｈＲＮＡ／ＧＦＰ含有組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）（ＡＡＶ−Ｕ６−配列番号１７（血清型ＡＡＶ１；２．０７ｘ１０^１２ｖｇ／ｍｌ；ロット番号Ｊ０５３１））を両側注入した。手術前ＭＲＩによって、定位ターゲットを決定し、そしてこれには被殻（ＡＰ＝１７；Ｌ＝１１；ＤＶ１＝２０およびＤＶ２＝１７）および尾状核（ＡＰ＝２０．５；Ｌ＝５．６；ＤＶ＝１７）部位が含まれた。単一針跡を用いて２つの被殻部位（５０μｌ／部位）に、そして１μｌ／分の速度で１つの尾状核部位（５０μｌ）に、注射（２７Ｇａ針（圧縮取り付け）を伴うＨａｍｉｌｔｏｎシリンジ（１００μｌ））を行った。この注射後、針を少なくとも２０分間、その場に残し、そして次いで１ｍｍ／分の速度で抜き取った。

２８日後、ペントバルビタール（１．５ｍｌ、筋内；２ｍｌ、静脈内）を用いて、動物を深く麻酔し、そしてヘパリン化した氷冷生理食塩水（４〜６ｌ）で経心的に灌流した。灌流および除去後、氷冷生理食塩水容器内に脳を入れた。

脳の右半球を１４の４ｍｍ厚の冠状切片にし、そして１〜１４と番号をふった（吻側から尾側）。次いで、１４Ｇ生検針を用いて、多様な脳領域から、組織パンチを収集した。右半球から総数１０３の組織パンチを収集した。各組織パンチは、約６ｍｇの組織を含有し、そしてこれを液体窒素中で即時凍結し、そしてＲＮＡを単離するまで−８０℃で保存した。
表２．組織パンチ供給源の要約

Ｑｉａｇｅｎ（カリフォルニア州バレンシア）のＲＮｅａｓｙ脂質キットを用いて組織パンチからＲＮＡを単離した。総ＲＮＡを用い、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（カリフォルニア州ラホヤ）のＳｔｒａｔａｓｃｒｉｐｔ（登録商標）第一鎖ｃＤＮＡ合成キットを用いて、ｃＤＮＡを生成した。該ｃＤＮＡを用いて、リアルタイムＰＣＲによってアカゲザルＨＤおよびＧＡＰＤＨの発現レベルを分析した。さらに、ＧＦＰ発現レベルを測定することによって、ＡＡＶ発現を監視した。アカゲザルＧＡＰＤＨ発現に対してアカゲザルＨＤ発現を基準化し、そしてウイルスを発現していない（ＧＦＰ−）領域に対して比較した。

脳の左半球を４つのブロックに分けた（吻側から尾側）。ブロック１は１０ｍｍであり；ブロック２および３は１６ｍｍであり；そしてブロック４は２０ｍｍであった。各ブロックをＯＣＴ中に包埋し、イソペンタン中で即時凍結し、そして−８０℃で保存した。次いで、１０ミクロン切片を収集し、そしてレーザー顕微解剖（ＬＭＤ）適合スライド上に置いた。工程間で風乾しつつ、スライド上の組織をエタノール中で固定した（７５％エタノール中で３０秒間；９５％エタノール中で３０秒間；そして１００％エタノール中で３０秒間）。次いで、スライドをスクリーニングして、関心対象の脳領域（すなわち尾状核および被殻）を含有するものを同定し、そしてマーカー遺伝子（ＧＦＰ）発現を追うことによって、ウイルス伝播に関するデータを得た。尾状核および被殻からのＬＭＤによって、ＧＦＰ陽性領域を収集した。

Ａｒｃｔｕｒｕｓ（カリフォルニア州マウンテンビュー）のＰｉｃｏＰｕｒｅＲＮＡ単離キットを用いて、ＧＦＰ収集物質からＲＮＡを単離した。ｃＤＮＡの生成前にＲＮＡを定量化した。典型的には、ＬＭＤ収集物質由来の総ＲＮＡ約１０〜８０ｎｇを単離した。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（カリフォルニア州ラホヤ）のＳｔｒａｔａｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＱＰＣＲｃＤＮＡ合成キットを用いて、ｃＤＮＡを調製した。リアルタイムＰＣＲによってＨＤ発現を測定し、そして同じ試料中のＧＡＰＤＨ発現に対して基準化した。分析中のウイルス形質導入細胞から収集したＲＮＡを検証するため、ＧＦＰ発現を監視するＧＦＰリアルタイムＰＣＲもまた行った。

図２１に見られうるように、組織パンチから得た試料から測定した際、ｉｎｖｉｖｏＨＤ遺伝子発現は、被殻では抑制されたが、尾状核では抑制されなかった。尾状核で抑制が観察されなかった、ありうる理由は、収集したパンチ内でウイルスを発現している細胞の割合が低すぎて、検出可能なレベルのアカゲザルＨＤ抑制を誘発しなかったことであった。ＬＭＤによってＧＦＰ＋形質導入細胞を収集することによって、これに取り組んだ。ＬＭＤを通じて得た試料から測定した際、ｉｎｖｉｖｏＨＤ遺伝子発現は、被殻、尾状核および放線冠で抑制されていた（図２２；Ｒ１＝複製１；Ｒ２＝複製２）。総合すると、これらのデータは、本発明の方法および配列にしたがったｉｎｖｉｖｏＨＤ遺伝子発現の実現可能性および安全性を立証する。
実施例１：本発明のｓｈＮＡを用いた、アカゲザル脳における、ハンチンチン・タンパク質発現抑制の安全性の前臨床試験
１２ヶ月の期間に渡って、正常成体アカゲザル脳において、ハンチンチン・タンパク質発現抑制の安全性の前臨床研究を行う。研究の最初の３ヶ月間、６匹のアカゲザル（マカカ・ムラタ）をトレーニングして、ヒト神経心理学的試験（ＣＡＮＴＡＢ、ＣｅＮｅＳ、英国ケンブリッジ）に基づく、商業的に入手可能なコンピュータ化行動試験群の課題（サルＣＡＮＴＡＢ、モデル８０６５０、ＬａｆａｙｅｔｔｅＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、インディアナ州ラファイエット）を行わせる。試験群に関するこれらの６頭のサルの成績を、アカゲザルに関する先に公表された成績標準に比較して、サルの認知能が正常限界以内であることを検証する。例えば、Ｗｅｅｄら，ＢｒａｉｎＲｅｓｅａｒｃｈ：ＣｏｇｎｉｔｉｖｅＢｒａｉｎＲｅｓｅａｒｃｈ，１９９９，Ｏｃｔｏｂｅｒ２５；８（３）１８５−２０１を参照されたい。

次に、サルを、２つの実験群の１つにランダムに割り当てる：３頭のサルの第１群には、配列番号１７のｓｈＮＡをコードする短いヘアピンＲＮＡ転写物の発現を駆動するＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを含有する発現カセットを含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの頭蓋内注射を投与する。同じベクター中の第二の発現カセットは、緑色蛍光タンパク質レポーター遺伝子をコードする。３頭のサルの第２群には、対照ｓｈＮＡ配列（配列番号１８）の発現を駆動する同じＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを含有する発現カセットを含む、アデノ随伴ウイルスベクターの頭蓋内注射を投与する。ここでも、このベクター中の第二の発現カセットは、緑色蛍光タンパク質レポーター遺伝子をコードする。各サルの脳の各半球の尾状核および被殻にＡＡＶベクターを投与する。各頭蓋内注射において投与するＡＡＶベクターの量、ならびにこれらの注射を行うための外科的方法および処置は、当業者に周知である。

１週間の手術後回復期間後、残りの１２ヶ月の研究期間、サルＣＡＮＴＡＢコンピュータ化試験群を用いて、定期的に、サルを反復試験する。長期に渡る各サルの認知および行動成績を、そのサル自身の手術前成績に比較する。対照ｓｈＮＡベクターで処置したサル、または抗アカゲザルＨＤｓｈＮＡベクターで処置したサルのいずれに関しても、認知または行動成績測定の統計的に有意な低下は得られない。これは、成体霊長類脳の尾状核および被殻において、ハンチンチン・タンパク質の発現を抑制しても、有意な認知または行動的結果がないことを示す。各サルがどの実験群に属すかを知らない、技術があり、そして適格とされた獣医による、各サルの定期的な神経学的検査もまた、サルにおける神経学的欠陥をまったく示さない。

１２ヶ月の研究期間終了時、サルを人道的に殺し、そして各サルの脳を取り除き、そして訓練された病理学者が、異常に関して調べる。さらに、蛍光顕微鏡法、免疫組織化学法、ならびに分子アッセイおよび生化学アッセイによって、脳を調べる。蛍光顕微鏡法によって、ＡＡＶベクターがｓｈＮＡを有効に送達した脳領域を同定する。これは、各サルの脳の各半球において、尾状核および被殻のかなりの領域で、緑色蛍光タンパク質レポーター遺伝子の発現を明らかにする。当業者に周知の抗体および方法を用いた、ハンチンチン・タンパク質に関する免疫組織化学染色は、対照ｓｈＮＡベクターを投与されたサルに比較して、抗アカゲザルＨＤｓｈＮＡベクターを投与されたサルの尾状核および被殻において、ハンチンチン・タンパク質レベルが減少していることを示し、本発明のｓｈＮＡによって、ハンチンチン・タンパク質発現が抑制されたことを示す。最後に、各サルの脳の尾状核および被殻由来のホモジナイズした脳組織試料を、定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）アッセイによって測定した、アカゲザルＨＤｍＲＮＡレベルに関してアッセイし、そしてアカゲザル・ハンチンチン・タンパク質レベルに関しては、当業者に周知の方法を用いて、ウェスタンブロッティングによって測定する。これらのアッセイによって、ＨＤｍＲＮＡおよびハンチンチン・タンパク質の発現は、対照ｓｈＮＡベクターを投与されたサルに比較して、抗アカゲザルＨＤｓｈＮＡベクターを投与されたサルの尾状核および被殻において、有意に減少することが示される。これらのデータはさらに、本発明のｓｈＮＡベクターが、抗アカゲザルＨＤｓｈＮＡベクターを投与されたサルの尾状核および被殻において、ハンチンチン・タンパク質の発現を抑制することを確認する。アカゲザルの尾状核および被殻におけるハンチンチン・タンパク質のこの抑制は、対応する認知または行動的欠陥、あるいは他の観察可能な神経学的異常または脳組織病理を生じないため、成体霊長類脳のこれらの領域におけるハンチンチン・タンパク質抑制の安全性が確立される。
実施例２：本発明のｓｈＮＡを用いた、ヒト患者におけるハンチントン病（「ＨＤ」）の治療
成体霊長類脳の尾状核および被殻におけるハンチンチン・タンパク質抑制の安全性が、アカゲザルにおいて確立されたならば、当業者に周知の方法を用いて、アカゲザルにおける前臨床安全性試験で用いたものと同じｓｈＮＡ発現カセットを、ＡＡＶベクター内に操作して入れる。このＡＡＶベクターは、配列番号１７のｓｈＮＡをコードする短いヘアピンＲＮＡ転写物の発現を駆動するＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを含有する発現カセットを含む。ＡＡＶベクターは、場合によって、緑色蛍光タンパク質レポーター遺伝子をコードする第二の発現カセットを含有せず、これは、この発現カセットが、患者におけるＨＤの治療には不要であるためである。

配列番号１７によってコードされるｓｈＮＡ配列は、配列番号４のｓｉＮＡターゲット領域を含有するため、そして配列番号４の配列は、マカカ・ムラタおよびホモ・サピエンスＨＤ遺伝子の両方の中の対応する配列と１００％相同であるため、配列番号１７を含有する発現カセットを含むＡＡＶベクターは、ホモ・サピエンスＨＤ遺伝子およびハンチンチン・タンパク質、ならびにマカカ・ムラタＨＤ遺伝子およびハンチンチン・タンパク質の発現を抑制するのに有効であることが、特に理解されるものとする。

配列番号１７を含むＡＡＶベクターを投与する安全性を確立する、ヒト患者における安全性および用量増大試験後、ヒト患者におけるＨＤを治療する際の、本発明の臨床的有効性を評価する、臨床試験を行う。これらの試験において、米国特許出願第２００４０１６２２５５号および第２００４０２２０１３２号に開示される系および方法にしたがって、ヒト患者脳にＡＡＶベクターを投与してもよい。これらの試験は、本発明の核酸分子、発現カセット、またはベクターを用いて、ＨＤに罹患したヒト患者の尾状核および被殻においてハンチンチン・タンパク質を抑制することが、疾患のこれらの症状の発症後、治療される患者において、認知および運動欠陥を抑止し、そして部分的に逆転させる際に有効であることを確立する。これらの結果は、突然変異体ＨＤ導入遺伝子の発現が疾患表現型を生じ、その後、突然変異体ＨＤ導入遺伝子の発現抑制が、マウスの疾患表現型の逆転および改善を生じた、ＨＤの条件的トランスジェニックマウスモデルで得られた知見と一致する。Ｙａｍａｍｏｔｏら，Ｃｅｌｌ，２０００，Ｍａｒ３１；１０１（１）：５７−６６。
実施例１：配列番号１７のｓｈＮＡの注射は、局所的に、そして有意に、ＨＤｍＲＮＡの量を減少させる
上に開示するｓｈＮＡ配列が、ｉｎｖｉｖｏで有効であることを検証するため、ＣＭＶプロモーターの調節下のＧＦＰ配列の上流の、ヒトＵ６プロモーターの制御下にある配列番号２６または配列番号１７のｓｈＮＡあるいは対照ｓｈＮＡ（配列番号１８）を含むＡＡＶベクターを含む、３＊１０^１１ウイルス粒子を以下のようにアカゲザル内に注射した：
表３．実験設計

組織パンチおよびレーザー顕微解剖切片（ＬＭＤ）から単離した総ＲＮＡを用いたｑＰＣＲによって、ハンチントン（ＨＤ）ｍＲＮＡを定量化した。組織パンチから単離した総タンパク質を用いたウェスタンブロット分析によって、ハンチンチン・タンパク質を定量化した。

配列番号１７のｓｈＮＡを含むベクターの注射は、組織パンチから単離したＲＮＡのｑＰＣＲによって測定した際、動物１において、同じ（右）半球中のＧＦＰを発現していない被殻部分に比較して、ＧＦＰを発現している被殻部分において、ＨＤｍＲＮＡの３７％の減少を生じた。

同じ動物の左半球において、ＨＤｍＲＮＡの量は、ＬＭＤ切片から単離されたＲＮＡのｑＰＣＲによって測定した際、ＧＦＰを発現していない領域に比較して、ＧＦＰを発現している領域で、約６５％〜７０％減少した。

さらに、ｓｈＮＡ処置の効果は、処置特異的であった。動物２において、左半球のＧＦＰ発現領域（対照ｓｈＮＡ、配列番号１８を含むベクターを注射）と対照的に、右半球のＧＦＰ発現領域（配列番号１７を含むベクターを注射）では、ＨＤｍＲＮＡの有意な減少が観察された。

したがって、これらのデータは、配列番号１７のｓｈＮＡを含むウイルス構築物が、ＨＤｍＲＮＡの量を局所的に、そして有意に減少させうることを示す。
実施例２：配列番号１７のｓｈＮＡの注射は、大きな解剖学的異常を引き起こさず、そして形質導入細胞の小胞体を損なわない。

先の実施例のプロトコルにしたがって、動物に注射した。ＧＦＰ蛍光、ヘマトキシリン−エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色、ハンチンチン免疫蛍光染色、カルネキシン免疫蛍光染色およびタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）免疫蛍光染色を分析することによって、組織病理学的分析を行った。これらの研究の結果は、ＨＤ抑制が、注射領域において、いかなる検出可能な神経解剖学的異常も引き起こさないことを示す。ウイルス形質導入領域において、血管周囲の袖口様白血球集合のいくつかの証拠が観察されたが、この袖口様白血球集合は、ＨＤ抑制とは相関しなかった。さらに、カルネキシンおよびＰＤＩに関する染色は、形質導入細胞の小胞体（ＥＲ）のいかなる明らかな改変も明らかにしなかった。
実施例３：配列番号１７のｓｈＮＡの注射は、自発的な活動を改変せず、そして細かい運動活動を改善する傾向がある。

実施例１のプロトコルにしたがって、動物に注射した。ＥｔｈｎｏＶｉｓｉｏｎおよびｍＭＡＰ装置によって、それぞれ、自発的な活動および細かい運動活動もまた測定した。ＥｔｈｎｏＶｉｓｉｏｎは、移動した距離、体の運動速度および垂直方向活動を測定するために使用可能なビデオ追跡系である。付随するコンピュータ・ソフトウェアは、これらの各パラメーターを定量化可能である。ｍＭＡＰ（サル運動分析パネル）を用いて、試験動物に提示された食品を取る際の手の小さい筋肉の細かい運動動作の時間を客観的に測定した。

尾状核および被殻内のＨＤ抑制は、動物の自発的な活動の改変を引き起こさなかった。細かい運動活動は、いずれの動物でも損なわれなかった。さらに、すべての動物で、ウイルス注射後、細かい運動技能が改善する傾向があった。
実施例４．配列番号２６の注射は、ハンチンチンｍＲＮＡを抑制する。

動物３および４には、本出願の段落００９２および表３に記載するような処置を与えた。動物３では、配列番号２６の投与は、ハンチンチンｍＲＮＡの３９％の抑制を生じた（ＳＥＭ１７％）。ＧＦＰシグナルを欠くため、右半球に対しては分析を行わなかった。針の行路が同定不能であったため、ＧＦＰシグナルが欠如した理由は、決定が困難である。カテーテルが側脳室および／または白質行路で止まり、注射物質の喪失を生じたためである可能性がある。これは、脳構造の種内変動のために起こった可能性もある。

動物４では、左半球において、配列番号２６は、ハンチンチンｍＲＮＡの４０％の抑制（ＳＥＭ４％）を生じ、一方、右半球において、配列番号１７の注射は、ハンチンチンｍＲＮＡの１８％の抑制（ＳＥＭ８％）を生じた。
実施例５．配列番号２６を注射した動物の行動。

自発的活動の３つの側面を測定した：移動した距離、運動速度および垂直方向活動。動物３（ならびに、上に論じるような動物１および２）は、これらの自発的動物行動のいずれにおいても全体の変化を示さなかった。動物４は、手術後３週および４週に、運動速度および移動距離を増加させ；動物４はまた、第３週に垂直方向活動も増加させた。垂直方向活動の増加は手術後４週で正常レベルに戻った。この時点での、運動速度および移動距離の増加の原因は理解されていない。動物１、２および３はすべて、測定可能なレベルのハンチンチンｍＲＮＡノックダウンを有したが、運動速度および移動距離のこの増加を示さなかったため、ハンチンチンｍＲＮＡの抑制が、根底にある可能性は低いようである。

細かい運動成績に関しては、動物３（ならびに、上に論じるような動物１および２）では、処置後、細かい運動技術が改善される傾向があった。一方、動物４では、ウイルス注射後、細かい運動成績の一貫した変化はなかった。
実施例６．配列番号２６を注射した動物における組織学的データ。

動物３の左半球の放線冠において、また被殻においてもわずかに明らかに、ＩＨＣシグナルおよび細胞形態をよりよく視覚化可能な細胞中で、ＧＦＰが観察された。左半球のＧＦＰ陽性領域において、いくつかの血管周囲の袖口様白血球集合が観察された。右半球では、ＧＦＰが観察されず、形質導入がなかったことが示唆された。血管周囲の袖口様白血球集合は、緑色蛍光タンパク質に反応した結果、またはウイルス調製中のありうる不純物の結果、生じた可能性もある。ともかく、血管周囲の袖口様白血球集合は、スクランブル化対照、配列番号１８を投与された半球において、動物２でもまた観察されたため、ハンチンチンｍＲＮＡノックダウンとは直接相関しない。

動物４では、左半球の尾状核、被殻、淡蒼球、および放線冠に、ＧＦＰが存在した。細胞損失を伴う血管周囲の袖口様白血球集合が、ＧＦＰ陽性領域で明らかであった。放線冠全体で、広範囲に及ぶ炎症性反応もまた観察された。

右半球の尾状核ではＧＦＰおよび細胞損失がないことを除いて、右半球で類似の知見が得られた。ＤＡＲＰＰ３２陽性細胞の分画は、両半球の被殻および左半球の尾状核において、ＧＦＰに対する陽性シグナルを示した。これは、ウイルス構築物の細胞ターゲティングが適切であることを示す。同じ領域において、ＧＦＰおよびｈｔｔ特異的ＩＨＣシグナルに関して、最低限の共局在しかない／共局在がないことが観察された。これは、ウイルスがハンチンチン・タンパク質を有効に抑制していることを示唆する。カルネキシンおよびＰＤＩ染色は、左半球の尾状核内のＧＦＰ陽性細胞のＥＲ形態のいかなる有意な改変も明らかにしなかった。上記の染色結果は、ＩＨＣシグナルおよび細胞形態がよりよく視覚化可能である特定の細胞の代表である。動物４で観察された、炎症反応、細胞損失、ならびに運動速度および移動距離の増加は、ハンチンチンｍＲＮＡの抑制のためである可能性は低い。動物１、２および３におけるハンチンチンｍＲＮＡ抑制の類似のレベルは、これらの反応のいずれも引き起こさなかった。配列番号２６または配列番号１７での処置による直接の効果というよりも、これらの変化は、二次的要因のためである可能性が高い。これらには、手術の合併症、緑色蛍光タンパク質に対する免疫応答、またはウイルス調製中の不純物が含まれうる。

態様、物質、および実施例は多様であることも可能であるため、本発明が、本明細書記載の特定の態様、物質、および実施例に限定されないことが理解されるものとする。例えば、本発明の核酸分子を、多様なフォーマットおよび長さで生成してもよい。実際、本発明の核酸分子の最も重要な特質は、ＲＩＳＣ複合体に進入し、そしてまた関心対象のｍＲＮＡ配列に相補的に結合して、ＲＮＡ干渉効果を誘導し、これらの配列のｍＲＮＡ安定性および／または翻訳速度の減少を生じる能力であることを、当業者は認識するであろう。句「相補的に結合する」は、本明細書において、核酸分子が、伝統的なワトソン−クリック対形成または他の非伝統的な種類の対形成によって、ｍＲＮＡ配列と水素結合（単数または複数）を形成する能力を指す。

本明細書に用いる専門用語は、特定の態様を記載する目的のためのみに用いられ、そして本発明の範囲を限定することは意図されないこともまた、理解されるものとする。本明細書において、そして付随する請求項において、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、文脈が明らかに異なって指示しない限り、複数の言及も含まれることに注目しなければならない。したがって、例えば、「（単数の）配列」または「（単数の）ｓｈＮＡ」に対する言及は、１以上の配列またはｓｈＮＡへの言及であり、そしてこれには、当業者に知られる同等のもの等が含まれる。

別に定義しない限り、本明細書に用いるすべての技術的用語は、本発明が属する当該技術分野の一般の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。特定の方法、デバイスおよび物質を記載するが、本明細書に記載するものと類似のまたは同等のいかなる方法および物質を、本発明の実施または試験に用いてもよい。

図１は、ＨＥＫ２９３細胞における、核酸配列性質決定のためのターゲットプラスミドを示す。図２は、ＨＥＫ２９３細胞における、ｉｎｖｉｔｒｏでの、ｓｉＮＡ配列によるアカゲザルＨＤｍＲＮＡ抑制を示す。図３は、４ＭＢＲ５細胞における、２つの異なるｓｉＮＡ用量での内因性アカゲザルＨＤ遺伝子の抑制を示す。図４は、４ＭＢＲ５細胞における、長さ１９および２７ヌクレオチドのｓｉＮＡ両方を用いた、５つの異なるｓｉＮＡ用量での内因性アカゲザルＨＤ遺伝子の抑制を示す。図５は、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞における、長さ１９および２７ヌクレオチドのｓｉＮＡ両方を用いた、内因性アカゲザルＨＤ遺伝子の抑制を示す。図６は、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞における、長さ１９および２７ヌクレオチドのｓｉＮＡ両方を用いた、内因性アカゲザルＨＤ遺伝子の抑制を示す。図７もまた、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞における、長さ１９および２７ヌクレオチドのｓｉＮＡ両方の異なる用量を用いた、内因性アカゲザルＨＤ遺伝子の抑制を示す。図８Ａは、ＨｅＬａ細胞における、４つの異なるｓｉＮＡ用量での内因性ヒトＨＤ遺伝子の抑制を示す。図８Ｂは、ＨｅＬａ細胞における、４つの異なるｓｉＮＡ用量での内因性ヒトＨＤ遺伝子の抑制を示す。図８Ｃは、ＨｅＬａ細胞における、４つの異なるｓｉＮＡ用量での内因性ヒトＨＤ遺伝子の抑制を示す。図８Ｄは、ＨｅＬａ細胞における、４つの異なるｓｉＮＡ用量での内因性ヒトＨＤ遺伝子の抑制を示す。図９は、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞における、外因性アカゲザル・ハンチンチン・タンパク質発現の抑制を示す。図１０は、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞における、内因性アカゲザル・ハンチンチン・タンパク質発現の抑制を示す。図１１は、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞における、内因性アカゲザル・ハンチンチン・タンパク質発現の抑制を示す。図１２は、抗ＨＤ（図１２Ａ）および対照（図１２Ｂ）ｓｈＮＡ配列（それぞれ出現順に、配列番号２８および２９にアンチセンス鎖を開示する）の構造および構築を示す。図１３Ａ〜Ｃは、本発明記載の態様において用いるさらなるｓｈＮＡ配列（それぞれ出現順に、配列番号３０〜３５にアンチセンス鎖を開示する）を示す。図１３Ｄ〜Ｆは、本発明記載の態様において用いるさらなるｓｈＮＡ配列（それぞれ出現順に、配列番号３０〜３５にアンチセンス鎖を開示する）を示す。図１４は、ＥＢ４またはｍｉｒ２３ループ構造とともに、長さ１９または２７ヌクレオチドのｓｈＮＡを発現するプラスミドでトランスフェクションされたＬＬＣ−ＭＫ２細胞における、内因性アカゲザルＨＤ遺伝子の抑制を示す。図１５は、抗ＨＤおよび対照ｓｈＮＡ配列の調製において使用可能な、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ１．０−Ｕ６プラスミドの模式図を示す。図１６は、ＡＡＶウイルス構築物の例示的な形式を示す。図１７は、本発明にしたがって、ｐＡＡＶベクターを構築し、そしてＡＡＶを生成するのに用いるプラスミドを示す。図１８Ａ〜Ｂは、本発明記載の態様において用いるさらなるｓｈＮＡ配列（それぞれ出現順に、配列番号３６および３７にアンチセンス鎖を開示する）を示す。図１９は、ｐＡＡＶプラスミドによる、外因性アカゲザルＨＤの抑制を示す。図２０は、抗ＨＤｓｈＮＡを発現する組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）による、ＨｅＬａ細胞およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞における、内因性ヒトＨＤの抑制を示す。図２１は、抗ＨＤｓｈＮＡを発現する組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）による、アカゲザルＨＤ遺伝子発現のｉｎｖｉｖｏ抑制を示す。図２２は、抗ＨＤｓｈＮＡを発現する組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）による、アカゲザルＨＤ遺伝子発現のｉｎｖｉｖｏ抑制を示す。

Claims

マカカ・ムラタ（Ｍａｃａｃａｍｕｌａｔｔａ）またはホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ）におけるハンチントン病（「ＨＤ」）の細胞傷害効果を防止する方法であって：
細胞内に、ＨＤと関連するタンパク質の集積を抑制するのに十分な量の単離核酸二重鎖を導入する、ここで、該核酸二重鎖がＨＤの細胞傷害効果を防止し、そして該核酸二重鎖が核酸の第一の鎖および核酸の第二の鎖を含み、第一の鎖が配列番号１および配列番号４からなる群のメンバーによってコードされる少なくとも１９の隣接ヌクレオチドを含み、そして第二の鎖が第一の鎖の少なくとも１５の隣接ヌクレオチドに相補的である
工程を含む、前記方法。
マカカ・ムラタまたはホモ・サピエンスにおけるハンチンチンの発現を阻害する方法であって：
細胞内に、ハンチンチンの発現を阻害するのに十分な量の単離核酸二重鎖を導入する、ここで、前記核酸二重鎖がＨＤと関連するタンパク質の発現を阻害し、該核酸二重鎖が核酸の第一の鎖および核酸の第二の鎖を含み、第一の鎖が配列番号１および配列番号４からなる群のメンバーによってコードされる少なくとも１９の隣接ヌクレオチドを含み、そして第二の鎖が第一の鎖の少なくとも１５の隣接ヌクレオチドに相補的である
工程を含む、前記方法。
単離核酸二重鎖が配列番号１を含む、請求項１または２の方法。
単離核酸二重鎖が配列番号４を含む、請求項１または２の方法。
前記単離核酸二重鎖がベクター内に含まれる、請求項１〜４のいずれか１項の方法。
ベクターがウイルスベクターである、請求項５の方法。
ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項６の方法。
前記マカカ・ムラタまたはホモ・サピエンスが、核酸複合体の導入工程後、少なくとも４週間生存する、請求項１〜７のいずれか１項の方法。
前記マカカ・ムラタまたはホモ・サピエンスが、細かい運動活動の機能障害を示さない、請求項１〜８のいずれか１項の方法。
前記核酸二重鎖を、被殻、尾状核、放線冠、および線条体からなる群より選択される脳構造に位置する少なくとも１つの細胞内に導入する、請求項１〜９のいずれか１項の方法。
前記核酸二重鎖の発現が、少なくとも１つの細胞の小胞体を損なわない、請求項１０の方法。
前記核酸二重鎖の発現が、カルネキシンの発現または分布を損なわない、請求項１〜１１のいずれか１項の方法。
前記核酸二重鎖の発現が、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）の発現または分布を損なわない、請求項１〜１２のいずれか１項の方法。
前記核酸二重鎖が、長さ１９〜３０塩基対の間である、請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法。
前記核酸二重鎖の前記の第一の鎖および／または前記の第二の鎖が、オーバーハング領域をさらに含む、請求項１〜１４のいずれか１項記載の方法。
前記オーバーハング領域が、３’オーバーハング領域、５’オーバーハング領域、または３’および５’オーバーハング領域の両方を含む、請求項１５記載の方法。
前記オーバーハング領域が、長さ１〜１０ヌクレオチドである、請求項１５または１６記載の方法。
核酸二重鎖の前記の第一の鎖および前記の第二の鎖が、核酸ループ鎖によって、機能可能であるように連結されて、二重鎖構造およびループ構造を含むヘアピン構造を形成する、請求項１〜１７のいずれか１項記載の方法。
前記ループ構造が４〜１０ヌクレオチドを含有する、請求項１８記載の方法。
核酸の第一の鎖および核酸の第二の鎖を含む核酸分子であって、前記の第一の鎖がヌクレオチド配列を含み、そして前記の第二の鎖が前記の第一の鎖の前記ヌクレオチド配列の逆相補体を含み、そして前記の核酸分子が、前記核酸分子をマカカ・ムラタまたはホモ・サピエンス細胞に適用した際に、前記のいずれかの種の細胞においてＲＮＡ干渉を誘導することによって、前記細胞においてハンチンチンをコードするマカカ・ムラタおよびホモ・サピエンスｍＲＮＡ配列の両方の発現を抑制する、前記核酸分子。
核酸の前記の第一の鎖が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６からなる群によってコードされる少なくとも１９の隣接ヌクレオチドを含み、そして前記の第二の鎖が、第一の鎖の少なくとも１５の隣接ヌクレオチドに相補的であるか、または核酸の前記の第一の鎖が、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、および配列番号１５からなる群によってコードされる少なくとも２７の隣接ヌクレオチドを含み、そして第二の鎖が第一の鎖の少なくとも２３の隣接ヌクレオチドに相補的である、請求項２０記載の核酸分子。
前記の第一の鎖が長さ１９〜３０塩基対の間である、請求項２０記載の核酸分子。
前記の第一の鎖および／または前記の第二の鎖が、３’オーバーハング領域、５’オーバーハング領域、または３’および５’オーバーハング領域の両方を含む、請求項２０記載の核酸分子。
前記の第一の鎖および前記の第二の鎖が、核酸ループ鎖によって、機能可能であるように連結されて、二重鎖構造およびループ構造を含むヘアピン構造を形成する、請求項２０記載の核酸分子。
前記ループ構造が４〜１３ヌクレオチドを含有する、請求項２４記載の核酸分子。
請求項２０の核酸分子の少なくとも１つの鎖をコードする核酸を含む、発現カセット。
プロモーター、ポリアデニル化シグナル、マーカー遺伝子およびその組み合わせからなる群より選択されるさらなる特徴をさらに含む、請求項２６記載の発現カセット。
前記プロモーターが、制御可能プロモーター、恒常的プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ｐｏｌＩＩプロモーターおよびｐｏｌＩＩＩプロモーターからなる群より選択される、請求項２７記載の発現カセット。
請求項２６の発現カセットを含むベクター。
前記ベクターが２つの発現カセットを含み、第一の発現カセットが、請求項２０の前記核酸分子の前記の第一の鎖をコードするヌクレオチド配列を含み、そして第二の発現カセットが、請求項２０の核酸分子の前記の第二の鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項２９記載のベクター。
前記ベクターがウイルスベクターである、請求項２９記載のベクター。
前記ベクターが、制御可能プロモーター、誘導性プロモーター、恒常的プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ｐｏｌＩＩプロモーターおよびｐｏｌＩＩＩプロモーターからなる群より選択されるプロモーターをさらに含む、請求項２９記載のベクター。
請求項２６の発現カセットを含む、哺乳動物細胞。
請求項２６の発現カセットを含む、非ヒト哺乳動物。
ハンチントン病の療法的治療および／または予防的治療のための薬剤製造における、請求項２０の核酸分子の使用であって、細胞への前記薬剤の導入が、ハンチンチン遺伝子の発現を少なくとも１０％阻害する、前記使用。
前記細胞における突然変異体ハンチンチンの細胞傷害効果を減少させる、請求項３５記載の使用。
前記細胞がマカカ・ムラタまたはホモ・サピエンスのニューロン細胞である、請求項３６記載の使用。
請求項２９のベクターを用いて、前記核酸分子を導入する、請求項３５記載の使用。
ハンチントン病の療法的治療および／または予防的治療のための薬剤の製造における、請求項２９のベクターの使用であって：ニューロン細胞を含有するマカカ・ムラタまたはホモ・サピエンスを提供し、ここで、前記ニューロン細胞がハンチンチン遺伝子を含有し、そして前記ニューロン細胞が核酸干渉に感受性であり、そしてハンチンチン遺伝子が前記ニューロン細胞において発現される；そして前記マカカ・ムラタまたはホモ・サピエンスと前記薬剤を接触させて、それによってハンチンチン遺伝子の発現を阻害する工程を含む、前記使用。