CN114206352A - 用于治疗神经变性障碍的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

提供了用于抑制、治疗和/或预防退行性脊髓病(DM)或肌萎缩性侧索硬化症(ALS)的组合物和方法。

Description

用于治疗神经变性障碍的组合物和方法

本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求对2019年3月26日提交的美国临时专利申请号62/824,066的优先权。前述申请是通过引用并入本文。

发明领域

本发明总体上涉及基因沉默领域。具体地，本发明提供了用于调节超氧化物歧化酶基因的表达的组合物和方法。

发明背景

退行性脊髓病(DM)是一种缓慢进行性脊髓障碍，其与人的肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS或卢伽雷病(Lou Gehrig’s Disease))非常类似。具体地，DM是老龄狗的神经变性疾病，其影响许多品种并在6-12个月内导致瘫痪(Averill,D.R.,J.Am.Vet.Med.Assoc.(1973)162(12):1045-1051；Coates等人,Vet.Clin.North Am.Small Anim.Prac.(2010)40(5):929-950；Coates等人,J.Vet.Intern.Med.(2007)21(6):1323-1331；Shelton等人,J.Neurol.Sci.(2012)318(1-2):55-64；Braund等人,Am.J.Vet.Res.(1978)39(8):1309-1315)。DM与超氧化物歧化酶的基因SOD1中的突变高度相关。所述突变不会导致功能丧失，但导致SOD1蛋白的错误折叠和聚集，从而导致神经元死亡(Kohyama等人,J.Vet.Med.Sci.(2017)79(2):375-379；Nakamae等人,Neuroscience(2015)303:229-40；Crisp等人,Exp.Neurol.(2013),248:1-9；Turner等人,Prog.Neurobiol.(2008)85:94-134)。类似地，突变体SOD1蛋白导致ALS中的有毒聚集体(Tiwari等人Neurodegener.Dis.(2005)2(3-4):115-27；Rakhit等人,Biochim.Biophys.Acta.(2006)1762(11-12):1025-37；Benkler等人,Sci.Rep.(2018)8(1):16393)。因此，减少该突变基因的表达代表重要的治疗靶标。

发明内容

根据本发明，提供了用于抑制超氧化物歧化酶1基因(SOD)表达的核酸分子。在特定实施方案中，所述核酸分子包含与至少一个效应子结构域可操作地连接的退火结构域，其中所述退火结构域与SOD(例如，犬或人)的前mRNA杂交并且其中所述效应子结构域与U1snRNP的U1 snRNA杂交。

根据本发明的另一方面，所述核酸分子可以与靶向部分缀合(例如，直接地或经由接头)。所述靶向部分可以与包括内部核苷酸在内的任何化学上可行的位置即5'端和/或3'端缀合(例如，所述核酸可以包含两个相同或不同的靶向部分)。在特定实施方案中，所述核酸分子与适配体缀合。

根据本发明的另一方面，提供了用于抑制SOD表达的方法，其包括向细胞递送至少一种本发明的核酸分子。

根据本发明的另一方面，提供组合物，其包含至少一种本发明的核酸分子和至少一种药学上可接受的载体。

在仍另一方面，还提供编码本发明的核酸分子的载体。

根据本发明的另一方面，提供了治疗、抑制和/或预防受试者的神经变性疾病(例如，退行性脊髓病(DM)或肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS))的方法。所述方法包括将治疗有效量的至少一种本发明的核酸分子(例如，U1AO或编码U1AO的载体)施用至有需要的受试者。在特定实施方案中，所述方法包括施用超过一种U1AO。

附图说明

图1A是U1衔接子寡核苷酸的示意图，描绘了其2个结构域：用于与3'末端外显子中靶基因的前体mRNA碱基配对的退火结构域，以及通过内源U1snRNP的结合抑制前体mRNA的成熟的效应子结构域。所提供的效应子结构域序列是SEQ ID NO:1。图1B是与靶前体mRNA退火的U1衔接子的示意图。所提供的效应子结构域序列是SEQ ID NO:1。图1C是结合U1 snRNP的U1衔接子的示意图，其导致多聚(A)位点抑制。Ψ＝U1 snRNP中的U1 snRNA的假尿苷。所提供的在U1 snRNP中的U1 snRNA的序列是SEQ ID NO:2。

图2提供了对MDCK细胞进行犬SOD1的定量逆转录PCR(RT-qPCR)分析的图。cDNA量为50ng、25ng、12.5ng、6.2ng、3.1ng和1.5ng。

图3提供了显示未治疗或用20nM对照U1AO、5nM cSOD1-1或20nM cSOD1-2治疗的MDCK细胞中犬SOD1 mRNA的表达的图。未治疗的MDCK细胞中的犬SOD1 mRNA表达设置为100％。将表达针对犬HPRT1进行归一化。

图4提供了显示未治疗或用20nM对照U1AO或所示量的cSOD1-1或cSOD1-2治疗的MDCK细胞中犬SOD1 mRNA的表达的图。未治疗的MDCK细胞中的犬SOD1 mRNA表达设置为100％。将表达针对犬HPRT1进行归一化。

图5提供了显示未治疗或用所示量的对照U1AO、cSOD1-1或cSOD1-2治疗的MDCK细胞中犬SOD1 mRNA的表达的图。未治疗的MDCK细胞中的犬SOD1 mRNA表达设置为100％。将表达针对犬HPRT1进行归一化。

图6提供了显示用盐水(对照治疗的，n＝2)或cSOD1-1(n＝4)治疗的狗的中枢神经系统和脊髓区域的不同区域中犬SOD1 mRNA的表达的图。经盐水治疗的狗中的犬SOD1 mRNA表达设置为100％。将表达针对犬HPRT1进行归一化。Cbl：小脑；Ctx：顶叶皮层；Hpc：海马体；Str：纹状体；SC：脊髓；T：胸椎；C：宫颈；L：腰椎。

图7A和7B提供了犬SOD1中对于U1AO的靶位点和呈DNA形式的U1AO序列的例子。第4行和第29行中的靶序列分别为SEQ ID NO:11和8。第1-3、5-28和30-84行的靶序列分别为SEQ ID NO:12-93。以DNA形式提供的U1AO序列从顶部至底部是SEQ ID NO:94-177。

图8A-图8C提供了人SOD1中对于U1AO的靶位点和呈DNA形式的U1AO序列的例子。靶序列从上到下是SEQ ID NO:178-295。以DNA形式提供的U1AO序列从顶部至底部是SEQ IDNO:296-413。

图9提供了狗-73A的药代动力学/药效动力学(PK/PD)数据。上图显示了在CNS和脊髓的不同区域中针对HPRT归一化的SOD1的表达水平。经盐水治疗的狗设置为100％。下图显示了CNS和脊髓的不同区域中每个总RNA的U1AO量。Cbl：小脑；Ctx：顶叶皮层；Hpc：海马体；Str：纹状体；SC：脊髓；T：胸椎；C：宫颈；L：腰椎；ROB：大脑的其余部分。

图10提供了狗-73E的药代动力学/药效动力学(PK/PD)数据。上图显示了在CNS和脊髓的不同区域中针对HPRT归一化的SOD1的表达水平。经盐水治疗的狗设置为100％。下图显示了CNS和脊髓的不同区域中每个总RNA的U1AO量。Cbl：小脑；Ctx：顶叶皮层；Hpc：海马体；Str：纹状体；SC：脊髓；T：胸椎；C：宫颈；L：腰椎；ROB：大脑的其余部分。

图11提供了进行为期5天的单次IT治疗的狗-73C的药代动力学/药效动力学(PK/PD)数据。上图显示了在CNS和脊髓的不同区域中针对HPRT归一化的SOD1的表达水平。经盐水治疗的狗设置为100％。下图显示了CNS和脊髓的不同区域中每个总RNA的U1AO量。Cbl：小脑；Ctx：顶叶皮层；Hpc：海马体；Str：纹状体；SC：脊髓；T：胸椎；C：宫颈；L：腰椎；ROB：大脑的其余部分。

具体实施方式

U1衔接子(或U1衔接子寡核苷酸(U1AO))是寡核苷酸介导的基因沉默技术，其在机制上与反义或siRNA不同。U1衔接子通过选择性地干扰mRNA成熟中的关键步骤来发挥作用：3'聚腺苷(多聚A)尾的添加。几乎所有编码蛋白质的mRNA都需要多聚A尾，并且未能添加多聚A尾导致核内的新生mRNA快速降解，从而阻止蛋白质产物的表达。U1衔接子已经描述于以下文献中：美国专利号9,441,221；美国专利号9,078,823；美国专利号8,907,075；以及美国专利号8,343,941(其各自通过引用并入本文)。U1衔接子寡核苷酸非常适合于体内应用，因为它们可以接受用于改进核酸酶抗性的广泛的化学修饰以及大体积基团(如用于成像的标签或用于受体介导的靶细胞摄取的配体)的附接，而不丧失沉默活性。

本文提供了用于调节SOD、特别是SOD1(例如，人或犬)的表达的方法和组合物。所述方法包括U1衔接子寡核苷酸/分子的使用(总体上参见图1)。在其最简单形式中，U1AO是一种具有两个结构域的寡核苷酸：(1)设计为与SOD基因的前体mRNA(例如，在末端外显子中)碱基配对的退火结构域，以及(2)通过结合内源U1 snRNP抑制靶前体mRNA的3'端形成的效应子结构域(也称为U1结构域)。不受理论的束缚，U1衔接子将内源U1 snRNP栓系至基因特异性前体mRNA，并且所得复合物阻断适当的3'端形成。值得注意的是，U1 snRNP是非常丰富的(约1百万/哺乳动物细胞核)，并且与其他剪接体组分相比，处于化学计量过量中。因此，滴定出内源U1 snRNP没有有害影响。

U1AO能够单独地或与递送试剂(例如，基于脂质的转染试剂)复合地进入细胞。U1AO还能够进入细胞核与前体mRNA结合。实际上，对于小核酸分子已经建立这种特性，如在那些利用RNA酶H途径的反义方法中，其中寡聚物进入核并与前体mRNA结合。另外，已经显示反义寡聚物可以与核前体mRNA结合并且在空间上阻挡剪接因子的接近，从而导致改变的剪接模式(Ittig等人(2004)Nuc.Acids Res.,32:346-53)。

在特定实施方案中，U1衔接子分子的退火结构域设计为对靶前体mRNA上的靶位点具有高亲和力和特异性(例如，排除其他前体mRNA)。在特定实施方案中，应在退火结构域过短(因为这会降低亲和力)或过长(因为这会促进“脱靶”作用或改变其他细胞途径)之间达到平衡。此外，退火结构域不应干扰效应子结构域的功能(例如，通过碱基配对和发夹形成)。U1AO退火结构域对长度没有绝对要求。然而，退火结构域的长度通常将为约10至约50个核苷酸，更通常为约10至约30个核苷酸或者约10至约20个核苷酸。在特定实施方案中，退火结构域的长度为至少约13或15个核苷酸。退火结构域可以与目的基因(SOD(例如，犬或人))至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或更特定地100％互补。在一个实施方案中，退火结构域与3'末端外显子内的靶位点杂交，所述3'末端外显子包括末端编码区和3'UTR和多聚腺苷酸化信号序列(例如，经由多聚腺苷酸化位点)。在另一实施方案中，靶序列在多聚(A)信号序列的约500个碱基对、约250个碱基对、约100个碱基对或约50bp内。

犬SOD1的示例性氨基酸和核苷酸序列可以在例如Gene ID：403559和GenBank登录号NM_001003035.1和NP_001003035中找到。人SOD1的示例性氨基酸和核苷酸序列可以在例如Gene ID:6647和GenBank登录号NM_000454和NP_000445.1中找到。

本文中已经使用用于基因沉默的选择标准来鉴定SOD内对于U1AO的靶位点。图7A和图7B列出了犬SOD内对于U1AO的靶位点以及最佳评分靶位点。在特定实施方案中，退火结构域与图7A-图7B中提供的靶位点杂交。图8A-图8C列出了人SOD中对于U1AO的靶位点以及最佳评分靶位点。在特定实施方案中，退火结构域与图8A-图8L中提供的靶位点杂交。在特定实施方案中，退火结构域与GCTTGTGGTGTCATTGGGAT(SEQ ID NO:8)或GAAACGAGATGACTTGGGCA(SEQ ID NO:11)杂交。退火结构域可以与图7A-图7B或图8A-图8C中的任何靶序列或SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:11、特别是SEQ ID NO:8至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或更特别地100％互补。退火结构域可以在图7A-图7B或图8A-图8C中的任何靶序列或SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:11、特别是SEQ ID NO:8的5'和/或3'端包含另外的或更少的核苷酸。例如，退火结构域可以包含添加至图7A-图7B或图8A-图8C中的任何靶序列或SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:11、特别是SEQ ID NO:8的5'和/或3'端的至少1、2、3、4、5或多达10或20个核苷酸(例如，来自SOD基因的序列)或者可以具有图7A-图7B或图8A-图8C中的任何靶序列或SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:11、特别是SEQ ID NO:8的5'和/或3'端的至少1、2、3、4或5个核苷酸的缺失。

在特定实施方案中，U1AO的U1结构域以高亲和力与U1 snRNP结合。在特定实施方案中，U1结构域与内源U1 snRNA的核苷酸2-11互补。在特定实施方案中，U1结构域包含5'-CAGGUAAGUA-3'(SEQ ID NO:1)；5'-CA GGUAAGUAU-3'(SEQ ID NO:4)；5'-GCCAGGUAAGUAU-3'(SEQ ID NO:5)。在特定实施方案中，U1结构域包含序列5'-CAGGUAAGUA-3'(SE Q ID NO:1)。在特定实施方案中，U1结构域包含序列5'-GCCAGGUAAGUAU-3'(SEQ ID NO:5)。在另一实施方案中，U1结构域具有与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、以及更特定地至少90％、至少95％或至少97％同一性。U1结构域可以在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的5'或3'包含另外的核苷酸。例如，U1结构域可以在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的5'或3'包含至少1、2、3、4、5或者多达10或20个核苷酸。实际上，增加U1结构域的长度以包括碱基配对至茎1和/或碱基配对至U1 snRNA的位置1改进U1衔接子对U1 snRNP的亲和力。效应子结构域的长度可以为约8个核苷酸至约30个核苷酸，约10个核苷酸至约20个核苷酸，或者约10至约15个核苷酸。例如，效应子结构域的长度可以为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。

将点突变插入U1结构域中，即，从共有序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:5分岔，可以减轻沉默。实际上，改变共有序列将产生具有不同的强度和对U1 snRNA的亲和力的U1结构域，从而导致不同的沉默水平。因此，一旦已经针对目的基因确定退火结构域，可以将不同强度的不同U1结构域附接至退火结构域，以实现目的基因的不同沉默水平。例如，gAGGUAAGUA(SEQ ID NO:3)将比SEQ ID NO:1更弱地与U1 snRNP结合，并且因此，会产生更低的沉默水平。如上文所讨论，U1结构域中可以包括核苷酸类似物以增加对内源U1snRNP的亲和力。如果核苷酸类似物与所替代的核苷酸结合相同的核苷酸，则核苷酸类似物的添加可以不被认为是点突变。

可以修饰U1AO以对核酸酶具有抗性。在特定实施方案中，U1AO可以包含至少一个非天然核苷酸和/或核苷酸类似物。核苷酸类似物可以用于增加退火亲和力、特异性、在细胞和生物体中的生物利用度、细胞和/或核转运、稳定性和/或对降解的抗性。例如，已经充分确立，在寡核苷酸内包括锁核酸(LNA)碱基增加寡核苷酸与其靶位点的退火的亲和力和特异性(Kauppinen等人.(2005)Drug Discov.Today Tech.,2:287-290；Orum等人.(2004)Letters Peptide Sci.,10:325-334)。与基于RNAi和RNA酶H的沉默技术不同，U1AO抑制不涉及酶活性。因此，在与用于基于RNAi和RNA酶H的沉默技术的寡聚物相比时，可以用于U1AO中的允许的核苷酸类似物的灵活性显著更大。

核苷酸类似物包括但不限于具有磷酸修饰的核苷酸，包括一种或多种硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸二酯、膦酸甲酯、氨基磷酸酯、膦酸甲酯、磷酸三酯、phosphoroaridate、吗啉基、氨基甲酸酰胺酯、羧甲基、乙亚氨酸酯、聚酰胺、磺酸酯、磺酰胺、氨基磺酸酯、甲缩醛(formacetal)、硫代甲缩醛和/或烷基甲硅烷基取代(参见例如，Hunziker和Leumann(1995)Nucle ic Acid Analogues:Synthesis and Properties,在Modern Synthetic Methods,VCH,331-417中；Mesmaeker等人(1994)Novel BackboneReplacements for Oligonucleotides,在Carbohydrate Modifications in AntisenseResearch,ACS,24-39中)；具有经修饰的糖(参见例如，美国专利申请公开号2005/0118605)和糖修饰(如2'-O-甲基(2'-O-甲基核苷酸)、2'-O-甲基氧基乙氧基和2'-卤素(例如，2'-氟))的核苷酸；以及核苷酸模拟物，例如但不限于肽核酸(PNA)、吗啉基核酸、环己烯基核酸、脱水己糖醇核酸、乙二醇核酸、苏糖核酸和锁核酸(LNA)(参见例如，美国专利申请公开号2005/0118605)。其他核苷酸修饰也提供于美国专利号5,886,165；6,140,482；5,693,773；5,856,462；5,973,136；5,929,226；6,194,598；6,172,209；6,175,004；6,166,197；6,166,188；6,160,152；6,160,109；6,153,737；6,147,200；6,146,829；6,127,533；和6,124,445中。在特定实施方案中，U1AO包含至少一个锁核酸。在特定实施方案中，退火结构域包含至少一个锁核酸(任选地其中效应子结构域不含锁核酸)。在特定实施方案中，U1AO(特别是退火结构域)具有间隔2-4个核苷酸(特别是三个核苷酸)的锁核酸。

值得注意的是，应谨慎以不设计出如下U1衔接子：其中效应子结构域具有对mRNA的靶位点或紧接靶位点侧翼的位点的显著亲和力。换言之，应选择靶位点以使效应子结构域与靶前体mRNA，尤其是侧接退火位点上游的部分的碱基配对潜力降至最低。

为了增加U1AO的沉默能力，还应将U1AO设计为具有低自身退火，以防止在单一U1衔接子内形成发夹和/或在两个或更多个U1衔接子之间形成同二聚体或同聚物。

可以连接U1AO的退火结构域和效应子结构域，使得效应子结构域位于退火结构域的5'端和/或3'端。另外，退火结构域与效应子结构域可以经由接头结构域可操作地连接。接头结构域可以包含例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、多达15、多达20或多达25个核苷酸。

U1AO可以包含核糖核苷酸和/或脱氧核苷酸。关于本文提供的序列，尿嘧啶碱基与胸苷碱基可以交换。在特定实施方案中，U1AO包含2'-O-甲基核苷酸、2'-O-甲基氧基乙氧基核苷酸、2'-卤素(例如，2'-氟)和/或锁核酸。在特定实施方案中，U1AO包含2'-O-甲基核苷酸。在特定实施方案中，U1AO包含硫代磷酸酯(例如，硫代磷酸酯可以间隔2-4个核苷酸、特别是三个核苷酸)。

在特定实施方案中，U1AO包含图7A-图7B或图8A-图8C中提供的U1AO(特别是在RNA中)。在特定实施方案中，U1AO包含：AUCCCAAUGACACCACAAGCGCCAGGUAAGUAU(SEQ ID NO:9)或UGCCCAAGUCAUCUCGUUUCGCCAGGUAAGUAU(SEQ ID NO:10)。在另一个实施方案中，U1AO与图7A-图7B或图8A-图8C中提供的U1AO序列或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10、特别是SEQ IDNO:9具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％且更特别地至少90％、至少95％、至少97％或更多同一性。关于本文提供的序列，尿嘧啶碱基与胸苷碱基可以交换。在特定实施方案中，U1AO包含至少一个或所有核苷酸类似物。在特定实施方案中，U1AO包含2'-O-甲基核苷酸、2'-O-甲基氧基乙氧基核苷酸、2'-卤素(例如，2'-氟)和/或锁核酸。在特定实施方案中，U1AO包含2'-O-甲基核苷酸。在特定实施方案中，U1AO包含硫代磷酸酯(例如，硫代磷酸酯可以间隔2-4个核苷酸、特别是三个核苷酸)。在特定实施方案中，U1AO如实施例中所述进行修饰。

在本发明的另一个实施方案中，可以使用针对目的基因(SOD)的多于一种U1AO来调节表达。与同一前体mRNA中的不同序列的多重U1AO靶向(退火)可以提供增强的抑制。本发明的组合物可以包含多于一种针对SOD基因(例如，SOD基因内的不同靶标)的U1AO。

在仍另一个实施方案中，U1AO可以与调节目的基因表达的其他方法组合。例如，U1AO可以与其他抑制性核酸分子(如反义寡核苷酸)或基于RNA酶H的方法、RNAi、miRNA和基于吗啉基的方法协调使用，以产生增强的抑制。由于U1AO利用与这些其他方法不同的机制，与单独使用单一抑制剂相比，组合使用将导致增加的对基因表达的抑制。实际上，U1AO可以靶向核中的生物合成步骤，而RNAi和某些反义方法通常靶向预先存在的mRNA池的胞质稳定性或可译性。

在本发明的另一方面，可以用调节基因表达的多种核因子中任一种的结合位点替代U1衔接子的效应子结构域。例如，聚嘧啶束结合蛋白(PTB)的结合位点较短，并且已知PTB抑制多聚(A)位点。因此，用高亲和力PTB结合位点替代效应子结构域也会使靶基因的表达沉默。

存在相对于上文所述的典范U1 snRNA，序列变化的U1 snRNA基因。总之，这些U1snRNA基因可以称为U1变体基因。一些U1变体基因描述于GenBank登录号L78810,AC025268,AC025264和AL592207以及Kyriakopoulo u等人(RNA(2006)12:1603-11)中，其被鉴定为接近人基因组中的200种潜在U1 snRNA样基因。由于这些U1变体中的一些的5'端序列与典范U1 snRN A不同，一种似乎合理的功能是识别前体mRNA剪接期间的选择性剪接信号。因此，可以以与将U1结构域设计为与如本文所述的典范U1 snRNA杂交相同的方式将本发明的U1AO的U1结构域设计为与U1变体snRNA的5'端杂交。然后可以使用与U1变体杂交的U1AO来调节目的基因的表达。

U1衔接子技术相对于其他现有的沉默技术有许多优点。这些优点中的某些如下。第一，U1AO分离为两个独立的结构域：(1)退火(即，靶向)活性，和(2)抑制性活性，从而允许在不影响抑制性活性的情况下优化退火，或者反之亦然。第二，如与其他技术相比，使用两个U1AO靶向同一基因产生加和性、甚至协同性的抑制。第三，U1AO具有新型抑制机制。因此，其在与其他方法组合使用时将是相容的。第四，U1AO通过抑制关键的几乎普遍存在的多聚(A)尾添加(也称为3'端加工)的前体mRNA成熟步骤来抑制mRNA的生物合成。

本发明的组合物包含至少一个本发明的U1AO和至少一种药学上可接受的载体。组合物还可以包含抑制目的基因(SOD)的表达的至少一种其他药剂。例如，组合物还可以包含针对目的基因(SOD)的至少一种siRNA或反义寡核苷酸。

本发明的U1AO可以作为裸多核苷酸单独施用至细胞或生物体，包括动物和人。U1AO可以与增强其细胞摄取的药剂一起施用。在特定实施方案中，U1AO可以含于脂质体、纳米颗粒或聚合组合物内。

在另一个实施方案中，可以将U1AO以表达载体(如质粒或病毒载体)的形式递送至细胞或动物(包括人或犬)。例如，U1AO可以从载体(如质粒或病毒)表达。来自质粒或病毒的此类短RNA的表达已经成为惯例，并且可以容易地调整以表达U1AO。用于表达RNA分子的表达载体可以采用强启动子，所述启动子可以是组成型的或调节的。此类启动子是本领域中熟知的，并且包括但不限于RNA聚合酶II启动子、T7 RNA聚合酶启动子以及RNA聚合酶III启动子U6和H1。病毒介导的递送包括使用基于但不限于以下的载体：逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、痘苗病毒、慢病毒、脊髓灰质炎病毒和疱疹病毒。

本发明的药物组合物可以通过任何合适的途径来施用，例如，通过注射(例如，静脉内、脑室内和肌内)、通过口服、肺、鼻、直肠或其他施用方式。可以施用所述组合物来治疗可通过下调SOD治疗的疾病或障碍(例如，神经变性疾病，如DM或ALS)。组合物可以在体外、在体内和/或离体使用。关于离体使用，可以将本发明的U1AO(或包含它的组合物)递送至自体细胞(任选地包括从受试者获得所述细胞的步骤)，然后再引入所述受试者体内。本发明的组合物、U1AO和/或载体也可以包含在试剂盒中。

本发明还涵盖治疗、抑制(减缓或减轻)和/或预防受试者的疾病或障碍(例如，神经变性疾病，如DM或ALS)的方法。在特定实施方案中，所述方法包括将治疗有效量的至少一种本发明的组合物施用至有需要的受试者(例如，动物(例如，犬)或人)。在特定实施方案中，组合物包含至少一种本发明的U1AO和至少一种药学上可接受的载体。

本发明方法还可以包括施用抑制靶SOD基因表达的至少一种其他药剂。例如，所述方法还可以包括施用针对SOD基因的至少一种siRNA或反义寡核苷酸。所述方法还可以包括施用至少一种其他治疗剂(例如，用于疾病或障碍(例如，神经变性疾病(如DM或ALS))的症状缓解治疗剂(例如依达拉奉

和/或利鲁唑

))。在特定实施方案中，治疗剂与U1AO缀合(例如，直接地或经由接头；例如，在3'端和/或5'端)。治疗剂可以以单独组合物(例如，具有至少一种药学上可接受的载体)或以同一组合物施用。治疗剂可以与U1AO同时和/或连续施用。

如上文所述，本发明的U1AO可以单独施用(作为裸多核苷酸)，或者可以与增强其细胞摄取的药剂一起施用。在特定实施方案中，U1AO可以含于递送媒介物(如胶束、脂质体、纳米颗粒或聚合组合物)中。在特定实施方案中，U1AO与树枝状聚合物，特定地阳离子树枝状聚合物(如聚(酰胺基胺)(PAMAM)树枝状聚合物和聚丙烯亚胺(PPI)树枝状聚合物(例如，第2代、第3代、第4代或第5代))复合(例如，含于其内或被其包封)。在特定实施方案中，U1AO与PPI-G2复合。

在特定实施方案中，U1AO靶向特定细胞类型(例如，神经元)。在特定实施方案中，U1AO与至少一个靶向部分共价连接(例如，直接地或经由接头)。靶向部分可以与5'端、3'端或两端或与内部核苷酸可操作地连接。在特定实施方案中，一个或多个靶向部分与U1AO的一端缀合(例如，经由单一接头)。在特定实施方案中，包含U1AO的复合物(例如，树枝状聚合物、胶束、脂质体、纳米颗粒或聚合组合物)与至少一个靶向部分共价连接(例如，直接地或经由接头)。

通常，接头是包含将两个化合物(如靶向部分)共价附接至U1AO或复合物的共价键或原子链的化学部分。接头可以连接至靶向部分和U1AO或复合物(媒介物)的任何在合成上可行的位置。在特定实施方案中，接头经由胺基和/或巯基/硫醇基、特别是巯基/硫醇基连接靶向部分和U1AO或复合物。例如，U1AO可被衍生(例如，在5'端)具有一个或多个氨基或硫基。在特定实施方案中，接头附接在避免阻断靶向部分或U1AO的活性的位置。在特定实施方案中，接头附接至内部核苷酸、5'端和/或3'端。示例性接头可以包含至少一个任选地被取代的；饱和的或不饱和的；直链、支链或环状烷基，或任选地被取代的芳基。接头还可以是多肽(例如，约1至约20个氨基酸或更多，或者1至约5个)。接头可以是在生理环境或条件下生物可降解的(可切割的(例如，包含二硫键))。在特定实施方案中，接头包含聚乙二醇(PEG)(单独的或与另一接头组合)。在特定实施方案中，接头是SPDP(N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫基)-丙酸酯)接头，如LC-SPDP(琥珀酰亚胺基6-(3-[2-吡啶基二硫基]-丙酰胺基)己酸酯)；或者SMCC(琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯)接头，如LC-SMCC(琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧基-(6-酰胺基己酸酯))。接头还可以是不可降解的(不可切割的)，并且可以是在生理环境或条件下基本上无法切割或完全无法切割的共价键或任何其他化学结构。

本发明的靶向部分优先与相关组织(例如，神经)或器官(例如，脑)结合。在特定实施方案中，靶向部分与在靶细胞上特异性(例如，仅在靶细胞上)表达的标记或者与其他细胞相比在靶细胞上上调的标记特异性结合。在特定实施方案中，靶向部分是抗体或抗体片段，其对靶细胞上的表面蛋白或者在靶细胞上以比其他细胞、组织或器官更高的水平(或更大的密度)表达的表面蛋白具有免疫特异性。抗体或抗体片段可以是治疗性抗体(例如，本身具有治疗效果)。在特定实施方案中，靶向部分是靶细胞上的细胞表面受体的配体或其结合片段。在特定实施方案中，靶向部分是适配体。

本发明的U1AO可以进一步与其他所需化合物缀合。例如，U1AO可以进一步与可检测药剂、治疗剂(例如，单克隆抗体、肽、蛋白质、抑制性核酸分子、小分子、化学治疗剂等)、载体蛋白以及改进生物利用度、稳定性和/或吸收的药剂(例如，PEG)缀合(直接地或经由如上所述的接头)。所述另外的化合物可以附接至U1AO的任何在合成上可行的位置(或者缀合物，例如，附接至U1衔接子(例如，任一端或内部核苷酸)或靶向部分)。可替代地，靶向部分和U1AO各自单独附接至另外的化合物(例如，载体蛋白)(因此，可以认为所述另外的化合物用作U1AO与靶向部分之间的接头)。在特定实施方案中，U1AO在一端与靶向部分(例如，神经元靶向部分)缀合，并且任选地在另一端与治疗剂缀合。优先地，另外的化合物的附接不会显著影响U1AO或靶向部分的活性。可检测药剂可以是可以直接或间接(特别是直接)测定的任何化合物或蛋白质。可检测药剂包括例如化学发光的、生物发光的和/或荧光化合物或蛋白质、成像剂、造影剂、放射性核素、顺磁性或超顺磁性离子、同位素(例如，放射性同位素(例如，³H(氚)和¹⁴C)或稳定同位素(例如，²H(氘)、¹¹C、¹³C、¹⁷O和¹⁸O))、光学药剂和荧光剂。

载体蛋白包括但不限于白蛋白、血清白蛋白(例如，牛血清白蛋白、人血清白蛋白)、卵白蛋白和钉形贝血蓝蛋白(KLH)。在特定实施方案中，载体蛋白是人血清白蛋白。载体蛋白(以及其他蛋白质或肽)可以在任何合成上可行的位置(例如，直接或经由如上所述的接头)与U1AO(或缀合物)缀合。例如，接头(例如，PEG或LC-SPDP)可以附接至在载体蛋白的赖氨酸上发现的任何游离氨基，然后U1AO和靶向部分可以与接头缀合。可以通过用半胱氨酸阻断来使任何未反应的接头失活。在特定实施方案中，载体蛋白(例如，白蛋白)经由PEG接头附接至U1AO。

本发明的U1AO可以与将U1AO靶向所需细胞类型和/或促进U1AO的细胞摄取(例如，细胞穿透部分)的化合物(例如，抗体、肽、蛋白质、核酸分子、小分子等)缀合(例如，直接地或经由接头)。靶向部分可以与5'端、3'端或两端或与内部核苷酸可操作地连接。在特定实施方案中，靶向部分和/或细胞穿透部分缀合至5'端和/或3'端。在特定实施方案中，靶向部分和/或细胞穿透部分缀合至5'端。在特定实施方案中，U1AO与靶向部分和细胞穿透部分二者缀合。如本文所用，术语“细胞穿透剂”或“细胞穿透部分”是指介导化合物从细胞外空间转移至细胞内的化合物或官能团。在特定实施方案中，U1AO与适配体缀合。适配体可以靶向所需细胞类型的表面化合物或蛋白质(例如，受体)(例如，表面化合物或蛋白质可以优先或仅在要靶向的细胞类型的表面上表达)。在特定实施方案中，适配体是细胞穿透适配体(例如，C1或Otter(参见例如，Burke,D.H.(2012)Mol.Ther.,20:251-253))。在特定实施方案中，U1AO与细胞穿透肽(例如，Tat肽(例如，YGRKKKRRQRRRPPQ；SEQ ID NO:6(任选地在N末端上乙酰化))、穿透素(例如，RQIKIWFQNRRMKWKKGG；SEQ ID NO:7)、短两亲性肽(例如，来自Pep家族和MPG家族)、寡聚精氨酸(例如，4-12个连续精氨酸)、寡聚赖氨酸(例如，4-12个连续赖氨酸))缀合。在特定实施方案中，U1AO与小分子(如生物素，作为靶向抗体的一部分)或非极性荧光基团(例如，菁染料，如Cy3或Cy5)或与其他细胞穿透剂缀合。

在特定实施方案中，U1AO的3'端和5'端中的至少一个包含游离SH基团。

本文所述U1AO(包括包含它的媒介物)通常将作为药学制剂被施用至患者。如本文所用术语“患者”和“受试者”包括人和动物。这些U1衔接子可以在医师或兽医的指导下在治疗时使用。

包含本发明的U1AO的组合物可以用任何一种或多种药学上可接受的载体便捷地配制以供施用。例如，U1AO可以用可接受的介质(如水、缓冲盐水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、二甲亚砜(DMSO)、油、洗涤剂、悬浮剂或其合适的混合物)来配制。U1AO在所选介质中的浓度可变，并且可以基于药学制剂的所需施用途径来选择所述介质。考虑任何常规介质或药剂在药学制剂中的使用，但其与要施用的U1AO不相容的情况除外。

适于施用至特定受试者的根据本发明的U1AO的剂量和剂量方案可以由医师或兽医在考虑以下因素后确定：受试者的年龄、性别、体重、一般健康状况以及施用的U1AO所针对的具体病症及其严重程度。医师或兽医还可以考虑到施用途径、药物载体以及U1AO的生物学活性。

合适的药学制剂的选择还将取决于所选施用方式。例如，本发明的U1AO可以通过直接注射至所需部位(例如，脑)来施用。在此情况下，药学制剂包含分散于与注射部位相容的介质中的U1AO。本发明的U1AO可以通过任何方法施用。例如，本发明的U1AO可以以不限于以下的方式施用：肠胃外、皮下、口服、局部、经肺、经直肠、经阴道、静脉内、脑室内、颅内、腹膜内、鞘内、大脑内、硬膜外、肌内、真皮内或颈动脉内。在特定实施方案中，施用方法是通过直接注射(例如，注射至CNS、脊髓或脑中)或鞘内注射。用于注射的药学制剂是本领域中已知的。如果选择注射作为施用U1AO的方法，应采取步骤以确保足量的分子或细胞到达其靶细胞以发挥生物学作用。

含有本发明的U1AO作为活性成分与药学上可接受的载体紧密混合的药物组合物可以根据常规制药复合技术来制备。载体可以采取众多种形式，根据施用所需的制剂形式而定，例如，静脉内、口服、直接注射、颅内、脑室内、鞘内和玻璃体内。

本发明的药学制剂可以以剂量单位形式来配制，以便于施用和剂量的一致性。如本文所用的剂量单位形式是指适合于经历治疗的患者的药学制剂的物理离散单位。每个剂量应含有经计算与所选药物载体联合产生所需效果的量的活性成分。确定适当剂量单位的程序是本领域技术人员熟知的。

剂量单位可以基于患者体重成比例地增加或减少。用于减轻特定病理学病症的适当浓度可以通过剂量浓度曲线计算来确定，如本领域中已知。

根据本发明，用于施用U1AO的适当剂量单位可以通过在动物模型中评价分子或细胞的毒性来确定。可以将药学制剂中各种浓度的U1AO施用至小鼠，并且可以基于作为处理结果观察到的有益结果和副作用来确定最小和最大剂量。适当剂量单位还可以通过评估U1AO治疗与其他标准药物组合的功效来确定。U1AO的剂量单位可以根据所检测的作用单独地或与每种治疗组合地确定。

包含U1AO的药学制剂可以以适当间隔来施用，例如，至少一天两次或更多，直至病理学症状减少或减轻为止，之后可以减少剂量至维持水平。在特定情况下，适当间隔通常将取决于患者的病症。

定义

单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述”包括复数指代物，除非上下文另外明确说明。

如本文所用的“核酸”或“核酸分子”是指任何DNA或RNA分子，其是单链或双链的，并且如果是单链的，其互补序列的分子呈线性或环状形式。在讨论核酸分子时，特定核酸分子的序列或结构在本文中可以根据以5'至3'方向提供序列的正常惯例来描述。关于本发明的核酸，有时使用术语“分离的核酸”。此术语在应用于DNA时是指DNA分子，所述DNA分子与在其所来源的生物体的天然存在的基因组中与所述DNA分子直接邻接的序列分离。例如，“分离的核酸”可以包含插入载体(如质粒或病毒载体)中或整合至原核或真核细胞或宿主生物体的基因组DNA中的DNA分子。

在应用于RNA时，术语“分离的核酸”可以是指由如上所定义的分离的DNA分子编码的RNA分子。可替代地，所述术语可以是指RNA分子，所述RNA分子已经与在其自然状态中(即，在细胞或组织中)与所述RNA分子相连的其他核酸充分分离。分离的核酸(DNA或RNA)还可以表示通过生物或合成手段直接产生并且与在其产生期间存在的其他组分分离的分子。

“载体”是基因元件，如质粒、粘粒、杆粒、噬菌体或病毒，另一基因序列或元件(DNA或RNA)可以附接至其。载体可以是复制子，以实现所附接序列或元件的复制。

“表达操纵子”是指可以具有转录和翻译控制序列(如启动子、增强子、翻译起始信号(例如，ATG或AUG密码子)、多聚腺苷酸化信号、终止子等)的核酸区段，并且其促进核酸或多肽编码序列在宿主细胞或生物体中的表达。“表达载体”是促进核酸或多肽编码序列在宿主细胞或生物体中的表达的载体。

如本文所用术语“寡核苷酸”是指本发明的核酸序列、引物和探针，并且定义为由两个或更多个(优选地超过三个)核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸构成的核酸分子。寡核苷酸的确切大小将取决于多种因素，以及取决于寡核苷酸的特定应用和用途。

短语“小干扰RNA(siRNA)”是指短(通常长度小于30个核苷酸，更通常长度在约21至约25个核苷酸之间)双链RNA分子。通常，siRNA调节所述siRNA所靶向基因的表达。术语“短发夹RNA”或“shRNA”是指siRNA前体，其是折叠成发夹结构的单一RNA分子，包含siRNA和至少一个(通常1-10个)核苷酸的单链环部分。

术语“RNA干扰”或“RNAi”通常是指序列特异性或选择性过程，通过所述过程经由双链RNA下调靶分子(例如，靶基因、蛋白质或RNA)。通常驱动RNAi活性的双链RNA结构是siRNA、shRNA、微小RNA和可以加工以产生小RNA种类的其他双链结构，它们通过RNA干扰来抑制靶转录物的表达。

术语“反义”是指具有如下序列的寡核苷酸：所述序列通过Watson-Crick碱基配对与RNA中的靶序列杂交，以与靶序列(通常与mRNA)形成RNA:寡核苷酸异源双链体。反义寡核苷酸可以具有与靶序列的精确序列互补性或近互补性。这些反义寡核苷酸可以阻断或抑制mRNA的翻译，和/或修饰mRNA的加工以产生mRNA的剪接变体。反义寡核苷酸的长度通常在约5至约100个核苷酸之间，更通常地，长度在约7与约50个核苷酸之间，甚至更通常地，长度在约10个核苷酸与约30个核苷酸之间。

术语“基本上纯的”是指包含以重量计至少50％-60％的给定材料(例如，核酸、寡核苷酸、蛋白质等)的制剂。更优选地，制剂包含以重量计至少75％，并且最优选地以重量计90％-95％的给定化合物。纯度是通过适合于给定化合物的方法(例如，色谱法、琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳、HPLC分析等)来测量。

术语“分离的”可以是指化合物或复合物，其已经与在自然中与其相连的其他化合物充分分开。“分离的”并不意味着排除与其他化合物或材料的人工或合成混合物，或者不干扰基本活性或随后测定并且可能例如由于不完全纯化或稳定剂的添加而存在的杂质的存在。

术语“基因”是指包含编码多肽的开放阅读框的核酸，其包括外显子和(任选地)内含子序列二者。核酸还可以任选地包括非编码序列，如启动子或增强子序列。术语“内含子”是指给定基因中存在的DNA序列，其不被翻译为蛋白质并且通常发现于外显子之间。

如本文所用，术语“适配体”是指通过除了Watson-Crick碱基配对以外的相互作用与靶标(如蛋白质)特异性结合的核酸。在特定实施方案中，适配体与一个或多个靶标(例如，蛋白质或蛋白质复合物)特异性结合，通常排除样品中的其他分子。适配体可以是核酸，如RNA、DNA、修饰的核酸或其混合物。适配体还可以是呈线性或环状形式的核酸，并且可以是单链或双链的。适配体可以包含长度为至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40或更多个核苷酸的寡核苷酸。适配体可以包含长度为多达40、多达60、多达80、多达100、多达150、多达200或更多个核苷酸的序列。适配体的长度可以为约5至约150个核苷酸、约10至约100个核苷酸或约20至约75个核苷酸。虽然本文中将适配体作为核酸分子(例如，寡核苷酸)适配体来讨论，但是还可以使用适配体等效物来代替核酸适配体，如肽适配体。

如本文所用短语“可操作地连接”可以是指被置于与另一核酸序列具有功能性关系的核酸序列。可以可操作地连接的核酸序列的例子包括但不限于启动子、转录终止子、增强子或激活剂和异源基因，所述异源基因在转录和(如果适当)翻译时将产生功能性产物，如蛋白质、核酶或RNA分子。

“药学上可接受的”表示由联邦政府或州政府的管理机构批准。“药学上可接受的”药剂可以列于美国药典或用于动物且更特定地用于人的其他公认药典中。

“载体”是指例如与本发明的活性剂一起施用的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂、赋形剂、辅助剂或媒介物。此类药物载体可以是无菌液体，如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。水和水性盐水溶液以及水性右旋糖和甘油溶液可以用作载体。合适的药物载体描述于例如E.W.Martin的“Remington'sPharmaceutical Sciences”中。

“抗体”或“抗体分子”是与特定抗原结合的任何免疫球蛋白，包括抗体及其片段(例如，免疫特异性片段)。如本文所用，抗体或抗体分子涵盖完整免疫球蛋白分子、免疫球蛋白分子的免疫活性部分和免疫球蛋白分子的免疫活性部分的融合物。所述术语包括多克隆、单克隆、嵌合、单结构域(Dab)和双特异性抗体。如本文所用，抗体或抗体分子涵盖重组生成的完整免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，例如但不限于：Fab、Fab'、F(ab')₂、F(v)、scFv、scFv₂和scFv-Fc。

关于抗体，术语“免疫特异性的”是指如下抗体：其与目的蛋白质或化合物的一个或多个表位结合，但是基本上不识别并结合含有抗原性生物分子的混合群体的样品中的其他分子。

术语“治疗”是指化合物缓解、减轻和/或减慢患者疾病的进展的能力。换言之，术语“治疗”是指抑制和/或逆转疾病的进展。

以下实施例描述实践本发明的说明性方法，并且不意图以任何方式限制本发明的范围。

实施例1

此处，U1衔接子寡核苷酸(U1AO)技术用于在鞘内施用后使狗的中枢神经系统(CNS)SOD1表达沉默。

进行了初步体外工作以鉴定有效的抗SOD1 U1AO。Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞用于体外研究。MDCK细胞是一种广泛使用的源自正常成年雌性可卡犬的肾脏的永生化犬狗细胞系。图2提供了对MDCK细胞进行犬SOD1的定量逆转录PCR(RT-qPCR)分析。图2中呈现的结果显示，SOD1的mRNA在MDCK细胞中的表达水平足以使得能够检测SOD1的沉默，并且RT-qPCR方法提供了对SOD1基因的表达水平的定量评估。

图3显示，与未治疗(设置为100％)和对照治疗的MDCK细胞相比，两种抗SOD1 U1AO使犬SOD1表达降低至约25％。简而言之，用20nM对照U1AO、5nM cSOD1-1或20nM cSOD1-2模拟转染或转染2x10⁵个MDCK细胞。转染后24小时，对犬SOD1 mRNA表达进行RT-qPCR分析。将表达针对犬HPRT1进行归一化。如图3中所见，cSOD1-1比cSOD1-2更有效力/更有效。

cSOD1-1 U1AO的序列为：

AUCCCAAUGACACCACAAGCGCCAGGUAAGUAU(SEQ ID NO:9)，其中全部为具有2'O-甲基修饰的RNA碱基。

cSOD1-2 U1AO的序列为：

UGCCCAAGUCAUCUCGUUUCGCCAGGUAAGUAU-(PEG₁₂)-白蛋白(SEQ ID NO:10)，其中全部为具有2’O-甲基修饰的RNA碱基。

图4提供了cSOD1-1或cSOD1-2的剂量反应图。简而言之，用20nM对照U1AO或不同量的cSOD1-1或cSOD1-2模拟转染或转染MDCK细胞。转染后24小时，对犬SOD1 mRNA表达进行RT-qPCR分析。将表达针对犬HPRT1进行归一化，并且未治疗的表达设置为100％。如图4中所见，增加cSOD1-1或cSOD1-2的量导致犬SOD1 mRNA沉默的剂量依赖性增加。

图5提供了cSOD1-1或cSOD1-2的另外的剂量反应图。简而言之，用不同量的对照U1AO、cSOD1-1或cSOD1-2模拟转染或转染MDCK细胞。转染后24小时，对犬SOD1 mRNA表达进行RT-qPCR分析。将表达针对犬HPRT1进行归一化，并且未治疗的表达设置为100％。如图5中所见，降低cSOD1-1或cSOD1-2的量最终导致犬SOD1 mRNA的显著沉默的丧失。

基于图3-图5中提供的数据，选择具有硫代磷酸酯基团的cSOD1-1进行体内分析，并重新命名为抗SOD1 U1AO以区别于原始的cSOD1-1。抗SOD1U1AO以适当的数量和纯度制造，经认证不含内毒素，然后如下所述用于狗。在体内使用时，硫代磷酸酯的添加增加了核酸酶抗性。抗SOD1 U1AO的序列为：A*U*CCCA*AUGA*CACC*ACAA*GCGC*CAGG*UAAG*U*A*U(SEQID NO:9)，其中全部为具有2’O-甲基修饰的RNA碱基并且*指示硫代磷酸酯。U1AO可以在其3'端与-(PEG₁₂)-白蛋白缀合。

六只体重在6与8kg之间的年轻健康比格犬(3只雄性，3只雌性)接受了身体和神经系统检查，并进行了常规血清生化检测组套和全血细胞计数。一次评价两只狗，并且在评价接下来2只狗之前进行完整数据分析以确保可以基于结果调整剂量和方案。将狗麻醉，在腰椎5/6间隙处进行腰椎穿刺，并采集脑脊液(CSF)样品以进行常规CSF分析。5天后将狗处死。

在前2只狗中，将小儿硬膜外导管从腰椎穿刺部位鞘内放置，以在一只狗中缓慢输注媒介物且在另一只狗中缓慢输注10mg的抗SOD1 U1AO。在两只狗中输注的体积均为2mL且注射装置中另外损失了0.6mL。由于这些微小导管的扭结问题而将它们撤回，并在10分钟内用20号脊椎针进行注射。这些狗从麻醉中恢复，并重新开始进行实验。他们每天接受两次评价(身体和神经系统检查)，2天后重复血液检查，并在第5天进行人道安乐死时再次进行血液检查。立即解剖腰椎、胸椎和颈椎脊髓以及大脑的区域，并将其置于

RNA稳定溶液(Invitrogen；马萨诸塞州沃尔瑟姆)中。还获得了肝脏、肾脏和脾脏的样品。随后通过RT-qPCR分析冷冻样品的SOD1和次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1(HPRT1；一种管家基因)。将其余组织置于10％福尔马林中，3-5天后修整以在石蜡中包埋，切片，用苏木精和伊红染色以供组织病理学检查。这2只狗在临床上、在血液检查或组织病理学方面没有受到所述程序的显著影响。与对照狗相比，脊髓中的SOD1表达水平降低至45％，但大脑中的表达没有变化。

在接下来的2只狗中，重复相同的方案(1只对照和1只U1AO)，但对施用进行了改进以允许更有效地将U1AO从注射器和导管冲洗至鞘内。简而言之，将20号脊椎针附接至短的给药装置，所述装置转而附接至过滤器和3通阀门。将U1AO置于附接至3通阀门的注射器中，并且将磷酸盐缓冲盐水置于另一个附接至3通阀门的注射器中。磷酸盐缓冲盐水允许将所有治疗剂冲洗至鞘内空间。输注后，将狗倾斜约30°且其头朝下持续15分钟以允许靠重力使药物沿着神经轴传播。这种技术意味着每只狗接受2.6mL(在接受治疗剂的狗中13mgU1AO)。再一次，所述程序耐受性极好且没有不良作用，并且新的注射方案导致改善的沉默：脊髓中35％表达水平，小脑中55％表达水平以及海马体中74％表达水平。

鉴于这些结果，最后的2只狗均使用改善的方案施用10mg的抗SOD1U1AO。两者均未发生不良事件且组织病理学正常。使用改善的方法所达到的SOD1沉默的水平与先前的狗是可比较的。

图6总结了来自用抗SOD1 U1AO治疗的所有狗的SOD1表达数据。脊髓中的平均SOD1沉默在30％-40％的范围内，且在神经轴中的沉默水平向头侧移动逐渐降低至顶叶皮层中的80％。因为病理学主要集中在脊髓上(Braund等人,Am.J.Vet.Res.(1978)39(8):1309-1315；Griffiths等人,J.Small Anim.Pract.(1975)16(8):461-471；March等人,(2009)VetPathol.46(2):241-250)，并且其次是在脑干核上(Johnston等人,Vet.Rec.(2000)146(22):629-633)，所以已经产生了SOD1的临床相关沉默。

实施例2

进行了一项前瞻性1期临床试验以确定图6中使用的抗SOD1 U1AO是否可以安全地用于患有天然存在的退行性脊髓病的宠物狗。试验包括每月鞘内(IT)施用的抗SOD1 U1AO的治疗，其中可选择将频率改为每两个月一次IT施用且剂量加倍。总体目标是通过监测临床体征、血液检查和CSF参数以及明显的变化和监测疾病进展来确定这种治疗的安全性。

本研究包括基于以下参数招募的四只狗。狗年龄>8岁，截瘫且临床上没有局灶性脊髓病的证据(没有脊髓疼痛或皮肤躯干反射被切断)，血液检查和胸片正常，并且与退行性脊髓病相关的SOD1突变经测试为阳性。狗还接受了MRI和CSF分析，以确保它们未出现可能呈现类似临床体征的并发脊柱肿瘤、脊髓炎或椎间盘疾病。此外，每个主人都必须愿意每个月花几天的时间在IT程序的前一天将狗送入医院，在程序期间在医院，然后在程序后的第二天将狗带出医院。

研究终点是主人因个人原因选择退出或因疾病进展而出于个人或同情原因对狗实施安乐死。主人不承担试验的任何方面的费用，包括住院、程序、分析或抗SOD1 U1AO测试化合物。

在整个研究中，通过身体和神经系统检查、血清生化检测组套、全血细胞计数和CSF分析每月对狗进行一次监测，以寻找不良作用的证据。使用建立的有序步态和本体感觉方法，每月评估一次它们的神经系统功能。如果主人因疾病进展而出于个人或同情原因选择安乐死，则将分析组织和血清以获得PK/PD数据，其包括：1)使用RT-qPCR(图6中的盐水狗设置为100％)和免疫组织化学定量SOD1表达和2)使用Northern印迹分析测定组织和血清中抗SOD1 U1AO的量。

对于每月给药，施用的量为1.5mg抗SOD1 U1AO/kg体重。每两个月给药一次，剂量加倍至3.0mg抗SOD1 U1AO/kg体重。IT程序遵循实施例1中描述的方案。

最初，招募两只患有DM的狗，且将其分别称为狗-73A和狗-73B。狗-73A(约11kg，柯基，雄性)接受了六个月的治疗，接着是用双倍剂量的两个月间隔治疗。出于个人原因，主人选择对狗-73A进行安乐死，这发生在最终治疗后约10周。收集组织并进行PK/PD分析，且结果总结在图9中。

狗-73B(约32kg，德国牧羊犬，雄性)接受了六个月的治疗，随后在双倍剂量下以两个月间隔进行治疗直到现在。狗-73B现在处于治疗的第16个月。

对于狗73A和73B，没有遇到任何不良事件，并且两只狗的神经系统体征进展缓慢。

相对于狗-73A和狗-73B，另外两只名为狗-73E和狗-73F的狗的招募被推迟，其目的是生成关于给药和安全性的数据以在适当的情况下调整剂量率和间隔。

狗-73E(约10kg，Jack Russell杂种，雌性)接受了两次间隔30天的治疗，接着是间隔两个月的两次双倍剂量治疗。出于个人原因，主人选择对狗-73E进行安乐死，这发生在最终治疗后约9周。收集组织并进行PK/PD分析，且结果总结在图10中。

狗-73F(约22kg，品种未公开，雄性)接受了两次间隔一个月的治疗，接着是在双倍剂量下以两个月间隔进行治疗直到现在。狗-73F现在处于治疗的第9个月。

对于所有四只狗，都没有观察到不良事件，并且狗的神经系统体征进展缓慢。狗-73B和狗-73F仍处于疾病的第2阶段，在所述阶段它们需要支撑后肢才能四处走动，并且它们的临床体征进展缓慢。疾病的进展明显慢于没有治疗的典型狗，预计后者在此期间已经进展到至少第3阶段。狗-73A和狗-73E在整个治疗期间也一直处于疾病的第2阶段，直到安乐死。

除上述之外，一项单独的单只狗研究狗-73C(约21kg，品种未公开，雄性)是使用几乎完全瘫痪的晚期DM狗(第4阶段)进行的，其主人同意为期5天的单剂量PK/PD研究。除了PK/PD数据外，该研究还允许评估所述治疗用于晚期狗是否安全。在以1.5mg/kg体重剂量进行单次IT治疗后，没有遇到任何不良事件，并且在5天的持续时间后，狗-73C被安乐死，收集组织并将PK/PD结果总结在图11中。

尽管上文已经描述并明确例示本发明的某些优选实施方案，但并未意图将本发明限制于此类实施方案。可以在不背离如以下权利要求中所述的本发明的范围和精神的情况下对所述实施方案进行多种修改。

在前述说明书中引用若干出版物和专利文件以更充分地描述本发明所属领域的最新技术水平。这些引用中每一项的公开内容通过引用并入本文。

序列表

<110> 罗格斯新泽西州立大学

西拉基因公司

<120> 用于治疗神经变性障碍的组合物和方法

<130> 1594-P06649WO00

<150> 62/824,066

<151> 2019-03-26

<160> 413

<170> 用于Windows的 FastSEQ 4.0版

<210> 1

<211> 10

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1 结构域

<400> 1

cagguaagua 10

<210> 2

<211> 10

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1 snRNA

<220>

<221> 尚未分类的RNA

<222> (3)...(4)

<223> n = 假尿苷

<400> 2

uacnnaccug 10

<210> 3

<211> 10

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1 结构域

<400> 3

gagguaagua 10

<210> 4

<211> 11

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1 结构域

<400> 4

cagguaagua u 11

<210> 5

<211> 13

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1 结构域

<400> 5

gccagguaag uau 13

<210> 6

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Tat 肽

<400> 6

Tyr Gly Arg Lys Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln

1 5 10 15

<210> 7

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 穿透（Penetratin）

<400> 7

Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys

1 5 10 15

Gly Gly

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶位点

<400> 8

gcttgtggtg tcattgggat 20

<210> 9

<211> 33

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列

<400> 9

aucccaauga caccacaagc gccagguaag uau 33

<210> 10

<211> 33

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列

<400> 10

ugcccaaguc aucucguuuc gccagguaag uau 33

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 11

gaaacgagat gacttgggca 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 12

gtccacgaga aacgagatga 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 13

tccacgagaa acgagatgac 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 14

ccacgagaaa cgagatgact 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 15

gatgacttgg gcaaaggtga 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 16

atgacttggg caaaggtgac 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 17

tgacttgggc aaaggtgaca 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 18

acttgggcaa aggtgacaat 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 19

cttgggcaaa ggtgacaatg 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 20

gcaaaggtga caatgaagaa 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 21

ggtgacaatg aagaaagtac 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 22

gtacacagac aggaaacgcc 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 23

tacacagaca ggaaacgccg 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 24

acacagacag gaaacgccgg 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 25

gacaggaaac gccgggagtc 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 26

gaaacgccgg gagtcgtttg 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 27

aacgccggga gtcgtttggc 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 28

acgccgggag tcgtttggct 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 29

cgccgggagt cgtttggctt 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 30

ggagtcgttt ggcttgtggt 20

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 31

gagtcgtttg gcttgtggtg 20

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 32

agtcgtttgg cttgtggtgt 20

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 33

gtcgtttggc ttgtggtgtc 20

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 34

tcgtttggct tgtggtgtca 20

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 35

cgtttggctt gtggtgtcat 20

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 36

tttggcttgt ggtgtcattg 20

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 37

ttggcttgtg gtgtcattgg 20

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 38

ggcttgtggt gtcattggga 20

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 39

cttgtggtgt cattgggatc 20

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 40

gtggtgtcat tgggatcgcc 20

<210> 41

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 41

tggtgtcatt gggatcgcca 20

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 42

ggtgtcattg ggatcgccaa 20

<210> 43

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 43

gtgtcattgg gatcgccaag 20

<210> 44

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 44

tgtcattggg atcgccaagt 20

<210> 45

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 45

tcattgggat cgccaagtaa 20

<210> 46

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 46

cattgggatc gccaagtaaa 20

<210> 47

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 47

gggatcgcca agtaaatatt 20

<210> 48

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 48

ggatcgccaa gtaaatattc 20

<210> 49

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 49

gatcgccaag taaatattcc 20

<210> 50

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 50

atcgccaagt aaatattccc 20

<210> 51

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 51

tcgccaagta aatattccct 20

<210> 52

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 52

ccaagtaaat attccctagg 20

<210> 53

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 53

gtaaatattc cctaggatgc 20

<210> 54

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 54

aatattccct aggatgcgat 20

<210> 55

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 55

atattcccta ggatgcgatc 20

<210> 56

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 56

tattccctag gatgcgatct 20

<210> 57

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 57

attccctagg atgcgatctg 20

<210> 58

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 58

ttccctagga tgcgatctga 20

<210> 59

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 59

tccctaggat gcgatctgag 20

<210> 60

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 60

ccctaggatg cgatctgagt 20

<210> 61

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 61

ggatgcgatc tgagttctag 20

<210> 62

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 62

gatgcgatct gagttctagt 20

<210> 63

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 63

tgcgatctga gttctagtta 20

<210> 64

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 64

cgatctgagt tctagttaac 20

<210> 65

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 65

tctgagttct agttaactcc 20

<210> 66

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 66

ctcctatgtt atcttgctag 20

<210> 67

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 67

cctatgttat cttgctagtc 20

<210> 68

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 68

tgttatcttg ctagtcgtag 20

<210> 69

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 69

gttatcttgc tagtcgtaga 20

<210> 70

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 70

agtacctgta atgagaactg 20

<210> 71

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 71

gtacctgtaa tgagaactga 20

<210> 72

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 72

gtatgtttca acgatctctg 20

<210> 73

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 73

acgatctctg tattttgcca 20

<210> 74

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 74

cgatctctgt attttgccag 20

<210> 75

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 75

atctctgtat tttgccaggc 20

<210> 76

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 76

tctctgtatt ttgccaggct 20

<210> 77

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 77

ctgtattttg ccaggcttaa 20

<210> 78

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 78

gtattttgcc aggcttaatc 20

<210> 79

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 79

gccaggctta atcatatatg 20

<210> 80

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 80

ccaggcttaa tcatatatgg 20

<210> 81

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 81

cttcaattct cattcaagcc 20

<210> 82

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 82

tcaattctca ttcaagcccg 20

<210> 83

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 83

caattctcat tcaagcccgc 20

<210> 84

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 84

attctcattc aagcccgcaa 20

<210> 85

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 85

ttctcattca agcccgcaat 20

<210> 86

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 86

tctcattcaa gcccgcaata 20

<210> 87

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 87

ctcattcaag cccgcaataa 20

<210> 88

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 88

cattcaagcc cgcaataaac 20

<210> 89

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 89

ttcaagcccg caataaacaa 20

<210> 90

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 90

tcaagcccgc aataaacaaa 20

<210> 91

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 91

caagcccgca ataaacaaat 20

<210> 92

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 92

tggcactgaa ttcttaacct 20

<210> 93

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 93

ggcactgaat tcttaaccta 20

<210> 94

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 94

tcatctcgtt tctcgtggac gccaggtaag tat 33

<210> 95

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 95

gtcatctcgt ttctcgtgga gccaggtaag tat 33

<210> 96

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 96

agtcatctcg tttctcgtgg gccaggtaag tat 33

<210> 97

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 97

tgcccaagtc atctcgtttc gccaggtaag tat 33

<210> 98

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 98

tcacctttgc ccaagtcatc gccaggtaag tat 33

<210> 99

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 99

gtcacctttg cccaagtcat gccaggtaag tat 33

<210> 100

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 100

tgtcaccttt gcccaagtca gccaggtaag tat 33

<210> 101

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 101

attgtcacct ttgcccaagt gccaggtaag tat 33

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<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 102

cattgtcacc tttgcccaag gccaggtaag tat 33

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<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

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ttcttcattg tcacctttgc gccaggtaag tat 33

<210> 104

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 104

gtactttctt cattgtcacc gccaggtaag tat 33

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<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 105

ggcgtttcct gtctgtgtac gccaggtaag tat 33

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<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 106

cggcgtttcc tgtctgtgta gccaggtaag tat 33

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<213> 人工序列

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<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 107

ccggcgtttc ctgtctgtgt gccaggtaag tat 33

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<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 108

gactcccggc gtttcctgtc gccaggtaag tat 33

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<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 109

caaacgactc ccggcgtttc gccaggtaag tat 33

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 110

gccaaacgac tcccggcgtt gccaggtaag tat 33

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

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agccaaacga ctcccggcgt gccaggtaag tat 33

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<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

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accacaagcc aaacgactcc gccaggtaag tat 33

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

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<213> 人工序列

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acaccacaag ccaaacgact gccaggtaag tat 33

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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tgacaccaca agccaaacga gccaggtaag tat 33

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

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ccaatgacac cacaagccaa gccaggtaag tat 33

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<213> 人工序列

<220>

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tcccaatgac accacaagcc gccaggtaag tat 33

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

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atcccaatga caccacaagc gccaggtaag tat 33

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<213> 人工序列

<220>

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gatcccaatg acaccacaag gccaggtaag tat 33

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

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ggcgatccca atgacaccac gccaggtaag tat 33

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<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 125

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<212> DNA

<213> 人工序列

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ttggcgatcc caatgacacc gccaggtaag tat 33

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<212> DNA

<213> 人工序列

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cttggcgatc ccaatgacac gccaggtaag tat 33

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<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

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acttggcgat cccaatgaca gccaggtaag tat 33

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 129

ttacttggcg atcccaatga gccaggtaag tat 33

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<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 130

tttacttggc gatcccaatg gccaggtaag tat 33

<210> 131

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 131

aatatttact tggcgatccc gccaggtaag tat 33

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<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

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gaatatttac ttggcgatcc gccaggtaag tat 33

<210> 133

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 133

ggaatattta cttggcgatc gccaggtaag tat 33

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 134

gggaatattt acttggcgat gccaggtaag tat 33

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<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

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agggaatatt tacttggcga gccaggtaag tat 33

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<211> 33

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<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 136

cctagggaat atttacttgg gccaggtaag tat 33

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<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 137

gcatcctagg gaatatttac gccaggtaag tat 33

<210> 138

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 138

atcgcatcct agggaatatt gccaggtaag tat 33

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<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 139

gatcgcatcc tagggaatat gccaggtaag tat 33

<210> 140

<211> 33

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<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

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agatcgcatc ctagggaata gccaggtaag tat 33

<210> 141

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 141

cagatcgcat cctagggaat gccaggtaag tat 33

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<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 142

tcagatcgca tcctagggaa gccaggtaag tat 33

<210> 143

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 143

ctcagatcgc atcctaggga gccaggtaag tat 33

<210> 144

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 144

actcagatcg catcctaggg gccaggtaag tat 33

<210> 145

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 145

ctagaactca gatcgcatcc gccaggtaag tat 33

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 146

actagaactc agatcgcatc gccaggtaag tat 33

<210> 147

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 147

taactagaac tcagatcgca gccaggtaag tat 33

<210> 148

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 148

gttaactaga actcagatcg gccaggtaag tat 33

<210> 149

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 149

ggagttaact agaactcaga gccaggtaag tat 33

<210> 150

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 150

ctagcaagat aacataggag gccaggtaag tat 33

<210> 151

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 151

gactagcaag ataacatagg gccaggtaag tat 33

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<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 152

ctacgactag caagataaca gccaggtaag tat 33

<210> 153

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 153

tctacgacta gcaagataac gccaggtaag tat 33

<210> 154

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 154

cagttctcat tacaggtact gccaggtaag tat 33

<210> 155

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 155

tcagttctca ttacaggtac gccaggtaag tat 33

<210> 156

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 156

cagagatcgt tgaaacatac gccaggtaag tat 33

<210> 157

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 157

tggcaaaata cagagatcgt gccaggtaag tat 33

<210> 158

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 158

ctggcaaaat acagagatcg gccaggtaag tat 33

<210> 159

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 159

gcctggcaaa atacagagat gccaggtaag tat 33

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<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

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agcctggcaa aatacagaga gccaggtaag tat 33

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<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

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<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 162

gattaagcct ggcaaaatac gccaggtaag tat 33

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<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

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catatatgat taagcctggc gccaggtaag tat 33

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 164

ccatatatga ttaagcctgg gccaggtaag tat 33

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<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 165

ggcttgaatg agaattgaag gccaggtaag tat 33

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<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 166

cgggcttgaa tgagaattga gccaggtaag tat 33

<210> 167

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 167

gcgggcttga atgagaattg gccaggtaag tat 33

<210> 168

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 168

ttgcgggctt gaatgagaat gccaggtaag tat 33

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<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 169

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<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

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tattgcgggc ttgaatgaga gccaggtaag tat 33

<210> 171

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 171

ttattgcggg cttgaatgag gccaggtaag tat 33

<210> 172

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 172

gtttattgcg ggcttgaatg gccaggtaag tat 33

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<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 173

ttgtttattg cgggcttgaa gccaggtaag tat 33

<210> 174

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 174

tttgtttatt gcgggcttga gccaggtaag tat 33

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<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 175

atttgtttat tgcgggcttg gccaggtaag tat 33

<210> 176

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 176

aggttaagaa ttcagtgcca gccaggtaag tat 33

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<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 177

taggttaaga attcagtgcc gccaggtaag tat 33

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

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tccatgaaaa agcagatgac 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 180

ccatgaaaaa gcagatgact 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 181

gcagatgact tgggcaaagg 20

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<211> 20

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<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 182

cagatgactt gggcaaaggt 20

<210> 183

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 183

gatgacttgg gcaaaggtgg 20

<210> 184

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 184

atgacttggg caaaggtgga 20

<210> 185

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 185

tgacttgggc aaaggtggaa 20

<210> 186

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 186

acttgggcaa aggtggaaat 20

<210> 187

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 187

cttgggcaaa ggtggaaatg 20

<210> 188

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 188

gcaaaggtgg aaatgaagaa 20

<210> 189

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 189

gtacaaagac aggaaacgct 20

<210> 190

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 190

gacaggaaac gctggaagtc 20

<210> 191

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 191

gaaacgctgg aagtcgtttg 20

<210> 192

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 192

aacgctggaa gtcgtttggc 20

<210> 193

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 193

acgctggaag tcgtttggct 20

<210> 194

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 194

cgctggaagt cgtttggctt 20

<210> 195

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 195

gaagtcgttt ggcttgtggt 20

<210> 196

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 196

aagtcgtttg gcttgtggtg 20

<210> 197

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 197

agtcgtttgg cttgtggtgt 20

<210> 198

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 198

gtcgtttggc ttgtggtgta 20

<210> 199

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 199

tcgtttggct tgtggtgtaa 20

<210> 200

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 200

cgtttggctt gtggtgtaat 20

<210> 201

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 201

tttggcttgt ggtgtaattg 20

<210> 202

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 202

ttggcttgtg gtgtaattgg 20

<210> 203

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 203

ggcttgtggt gtaattggga 20

<210> 204

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 204

gcttgtggtg taattgggat 20

<210> 205

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 205

cttgtggtgt aattgggatc 20

<210> 206

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 206

gtggtgtaat tgggatcgcc 20

<210> 207

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 207

tggtgtaatt gggatcgccc 20

<210> 208

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 208

ggtgtaattg ggatcgccca 20

<210> 209

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 209

gtgtaattgg gatcgcccaa 20

<210> 210

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 210

tgtaattggg atcgcccaat 20

<210> 211

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 211

taattgggat cgcccaataa 20

<210> 212

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 212

aattgggatc gcccaataaa 20

<210> 213

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 213

attgggatcg cccaataaac 20

<210> 214

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 214

gggatcgccc aataaacatt 20

<210> 215

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 215

ggatcgccca ataaacattc 20

<210> 216

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 216

gatcgcccaa taaacattcc 20

<210> 217

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 217

atcgcccaat aaacattccc 20

<210> 218

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 218

tcgcccaata aacattccct 20

<210> 219

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 219

cccaataaac attcccttgg 20

<210> 220

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 220

aacattccct tggatgtagt 20

<210> 221

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 221

acattccctt ggatgtagtc 20

<210> 222

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 222

cattcccttg gatgtagtct 20

<210> 223

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 223

ttcccttgga tgtagtctga 20

<210> 224

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 224

tcccttggat gtagtctgag 20

<210> 225

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 225

cccttggatg tagtctgagg 20

<210> 226

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 226

tggatgtagt ctgaggcccc 20

<210> 227

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 227

ggatgtagtc tgaggcccct 20

<210> 228

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 228

gatgtagtct gaggcccctt 20

<210> 229

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 229

atgtagtctg aggcccctta 20

<210> 230

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 230

tgtagtctga ggccccttaa 20

<210> 231

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 231

tagtctgagg ccccttaact 20

<210> 232

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 232

agtctgaggc cccttaactc 20

<210> 233

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 233

gtctgaggcc ccttaactca 20

<210> 234

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 234

tctgaggccc cttaactcat 20

<210> 235

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 235

ctgaggcccc ttaactcatc 20

<210> 236

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 236

gaggcccctt aactcatctg 20

<210> 237

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 237

aggcccctta actcatctgt 20

<210> 238

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 238

ggccccttaa ctcatctgtt 20

<210> 239

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 239

gccccttaac tcatctgtta 20

<210> 240

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 240

ccccttaact catctgttat 20

<210> 241

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 241

taactcatct gttatcctgc 20

<210> 242

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 242

aactcatctg ttatcctgct 20

<210> 243

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 243

actcatctgt tatcctgcta 20

<210> 244

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 244

ctcatctgtt atcctgctag 20

<210> 245

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 245

catctgttat cctgctagct 20

<210> 246

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 246

tctgttatcc tgctagctgt 20

<210> 247

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 247

ctgttatcct gctagctgta 20

<210> 248

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 248

gttatcctgc tagctgtaga 20

<210> 249

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 249

ttatcctgct agctgtagaa 20

<210> 250

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 250

tatcctgcta gctgtagaaa 20

<210> 251

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 251

tcctgctagc tgtagaaatg 20

<210> 252

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 252

cctgctagct gtagaaatgt 20

<210> 253

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 253

gctagctgta gaaatgtatc 20

<210> 254

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 254

ctagctgtag aaatgtatcc 20

<210> 255

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 255

gctgtagaaa tgtatcctga 20

<210> 256

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 256

gtgtgacttt ttcagagttg 20

<210> 257

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 257

tgtgactttt tcagagttgc 20

<210> 258

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 258

gtgacttttt cagagttgct 20

<210> 259

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 259

gagttgcttt aaagtacctg 20

<210> 260

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 260

agtacctgta gtgagaaact 20

<210> 261

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 261

gtacctgtag tgagaaactg 20

<210> 262

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 262

tacctgtagt gagaaactga 20

<210> 263

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 263

acctgtagtg agaaactgat 20

<210> 264

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 264

cctgtagtga gaaactgatt 20

<210> 265

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 265

atgtctgttt caatgacctg 20

<210> 266

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 266

tgtctgtttc aatgacctgt 20

<210> 267

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 267

gtctgtttca atgacctgta 20

<210> 268

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 268

atgacctgta ttttgccaga 20

<210> 269

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 269

tgacctgtat tttgccagac 20

<210> 270

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 270

gacctgtatt ttgccagact 20

<210> 271

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 271

acctgtattt tgccagactt 20

<210> 272

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 272

cctgtatttt gccagactta 20

<210> 273

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 273

ttgccagact taaatcacag 20

<210> 274

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 274

tgccagactt aaatcacaga 20

<210> 275

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 275

gccagactta aatcacagat 20

<210> 276

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 276

ccagacttaa atcacagatg 20

<210> 277

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 277

gacttaaatc acagatgggt 20

<210> 278

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 278

ttctttgtca ttcaagcctg 20

<210> 279

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 279

tctttgtcat tcaagcctgt 20

<210> 280

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 280

ctttgtcatt caagcctgtg 20

<210> 281

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 281

ttgtcattca agcctgtgaa 20

<210> 282

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 282

tgtcattcaa gcctgtgaat 20

<210> 283

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 283

gtcattcaag cctgtgaata 20

<210> 284

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 284

caagcctgtg aataaaaacc 20

<210> 285

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 285

agcctgtgaa taaaaaccct 20

<210> 286

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 286

gcctgtgaat aaaaaccctg 20

<210> 287

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 287

cctgtgaata aaaaccctgt 20

<210> 288

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 288

aaaccctgta tggcacttat 20

<210> 289

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 289

aaccctgtat ggcacttatt 20

<210> 290

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 290

accctgtatg gcacttatta 20

<210> 291

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 291

ccctgtatgg cacttattat 20

<210> 292

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 292

gtatggcact tattatgagg 20

<210> 293

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 293

tatggcactt attatgaggc 20

<210> 294

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 294

tggcacttat tatgaggcta 20

<210> 295

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 295

ggcacttatt atgaggctat 20

<210> 296

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 296

tcatctgctt tttcatggac gccaggtaag tat 33

<210> 297

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 297

gtcatctgct ttttcatgga gccaggtaag tat 33

<210> 298

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 298

agtcatctgc tttttcatgg gccaggtaag tat 33

<210> 299

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 299

cctttgccca agtcatctgc gccaggtaag tat 33

<210> 300

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 300

acctttgccc aagtcatctg gccaggtaag tat 33

<210> 301

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 301

ccacctttgc ccaagtcatc gccaggtaag tat 33

<210> 302

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 302

tccacctttg cccaagtcat gccaggtaag tat 33

<210> 303

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 303

ttccaccttt gcccaagtca gccaggtaag tat 33

<210> 304

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 304

atttccacct ttgcccaagt gccaggtaag tat 33

<210> 305

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 305

catttccacc tttgcccaag gccaggtaag tat 33

<210> 306

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 306

ttcttcattt ccacctttgc gccaggtaag tat 33

<210> 307

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 307

agcgtttcct gtctttgtac gccaggtaag tat 33

<210> 308

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 308

gacttccagc gtttcctgtc gccaggtaag tat 33

<210> 309

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 309

caaacgactt ccagcgtttc gccaggtaag tat 33

<210> 310

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 310

gccaaacgac ttccagcgtt gccaggtaag tat 33

<210> 311

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 311

agccaaacga cttccagcgt gccaggtaag tat 33

<210> 312

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 312

aagccaaacg acttccagcg gccaggtaag tat 33

<210> 313

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 313

accacaagcc aaacgacttc gccaggtaag tat 33

<210> 314

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 314

caccacaagc caaacgactt gccaggtaag tat 33

<210> 315

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 315

acaccacaag ccaaacgact gccaggtaag tat 33

<210> 316

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 316

tacaccacaa gccaaacgac gccaggtaag tat 33

<210> 317

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 317

ttacaccaca agccaaacga gccaggtaag tat 33

<210> 318

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 318

attacaccac aagccaaacg gccaggtaag tat 33

<210> 319

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 319

caattacacc acaagccaaa gccaggtaag tat 33

<210> 320

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 320

ccaattacac cacaagccaa gccaggtaag tat 33

<210> 321

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 321

tcccaattac accacaagcc gccaggtaag tat 33

<210> 322

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 322

atcccaatta caccacaagc gccaggtaag tat 33

<210> 323

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 323

gatcccaatt acaccacaag gccaggtaag tat 33

<210> 324

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 324

ggcgatccca attacaccac gccaggtaag tat 33

<210> 325

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 325

gggcgatccc aattacacca gccaggtaag tat 33

<210> 326

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 326

tgggcgatcc caattacacc gccaggtaag tat 33

<210> 327

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 327

ttgggcgatc ccaattacac gccaggtaag tat 33

<210> 328

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 328

attgggcgat cccaattaca gccaggtaag tat 33

<210> 329

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 329

ttattgggcg atcccaatta gccaggtaag tat 33

<210> 330

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 330

tttattgggc gatcccaatt gccaggtaag tat 33

<210> 331

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 331

gtttattggg cgatcccaat gccaggtaag tat 33

<210> 332

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 332

aatgtttatt gggcgatccc gccaggtaag tat 33

<210> 333

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 333

gaatgtttat tgggcgatcc gccaggtaag tat 33

<210> 334

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 334

ggaatgttta ttgggcgatc gccaggtaag tat 33

<210> 335

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 335

gggaatgttt attgggcgat gccaggtaag tat 33

<210> 336

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 336

agggaatgtt tattgggcga gccaggtaag tat 33

<210> 337

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 337

ccaagggaat gtttattggg gccaggtaag tat 33

<210> 338

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 338

actacatcca agggaatgtt gccaggtaag tat 33

<210> 339

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 339

gactacatcc aagggaatgt gccaggtaag tat 33

<210> 340

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 340

agactacatc caagggaatg gccaggtaag tat 33

<210> 341

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 341

tcagactaca tccaagggaa gccaggtaag tat 33

<210> 342

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 342

ctcagactac atccaaggga gccaggtaag tat 33

<210> 343

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 343

cctcagacta catccaaggg gccaggtaag tat 33

<210> 344

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 344

ggggcctcag actacatcca gccaggtaag tat 33

<210> 345

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 345

aggggcctca gactacatcc gccaggtaag tat 33

<210> 346

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 346

aaggggcctc agactacatc gccaggtaag tat 33

<210> 347

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 347

taaggggcct cagactacat gccaggtaag tat 33

<210> 348

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 348

ttaaggggcc tcagactaca gccaggtaag tat 33

<210> 349

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 349

agttaagggg cctcagacta gccaggtaag tat 33

<210> 350

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 350

gagttaaggg gcctcagact gccaggtaag tat 33

<210> 351

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 351

tgagttaagg ggcctcagac gccaggtaag tat 33

<210> 352

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 352

atgagttaag gggcctcaga gccaggtaag tat 33

<210> 353

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 353

gatgagttaa ggggcctcag gccaggtaag tat 33

<210> 354

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 354

cagatgagtt aaggggcctc gccaggtaag tat 33

<210> 355

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 355

acagatgagt taaggggcct gccaggtaag tat 33

<210> 356

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 356

aacagatgag ttaaggggcc gccaggtaag tat 33

<210> 357

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 357

taacagatga gttaaggggc gccaggtaag tat 33

<210> 358

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 358

ataacagatg agttaagggg gccaggtaag tat 33

<210> 359

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 359

gcaggataac agatgagtta gccaggtaag tat 33

<210> 360

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 360

agcaggataa cagatgagtt gccaggtaag tat 33

<210> 361

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 361

tagcaggata acagatgagt gccaggtaag tat 33

<210> 362

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 362

ctagcaggat aacagatgag gccaggtaag tat 33

<210> 363

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 363

agctagcagg ataacagatg gccaggtaag tat 33

<210> 364

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 364

acagctagca ggataacaga gccaggtaag tat 33

<210> 365

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 365

tacagctagc aggataacag gccaggtaag tat 33

<210> 366

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 366

tctacagcta gcaggataac gccaggtaag tat 33

<210> 367

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 367

ttctacagct agcaggataa gccaggtaag tat 33

<210> 368

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 368

tttctacagc tagcaggata gccaggtaag tat 33

<210> 369

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 369

catttctaca gctagcagga gccaggtaag tat 33

<210> 370

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 370

acatttctac agctagcagg gccaggtaag tat 33

<210> 371

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 371

gatacatttc tacagctagc gccaggtaag tat 33

<210> 372

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 372

ggatacattt ctacagctag gccaggtaag tat 33

<210> 373

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 373

tcaggataca tttctacagc gccaggtaag tat 33

<210> 374

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 374

caactctgaa aaagtcacac gccaggtaag tat 33

<210> 375

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 375

gcaactctga aaaagtcaca gccaggtaag tat 33

<210> 376

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 376

agcaactctg aaaaagtcac gccaggtaag tat 33

<210> 377

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 377

caggtacttt aaagcaactc gccaggtaag tat 33

<210> 378

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 378

agtttctcac tacaggtact gccaggtaag tat 33

<210> 379

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 379

cagtttctca ctacaggtac gccaggtaag tat 33

<210> 380

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 380

tcagtttctc actacaggta gccaggtaag tat 33

<210> 381

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 381

atcagtttct cactacaggt gccaggtaag tat 33

<210> 382

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 382

aatcagtttc tcactacagg gccaggtaag tat 33

<210> 383

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 383

caggtcattg aaacagacat gccaggtaag tat 33

<210> 384

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 384

acaggtcatt gaaacagaca gccaggtaag tat 33

<210> 385

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 385

tacaggtcat tgaaacagac gccaggtaag tat 33

<210> 386

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 386

tctggcaaaa tacaggtcat gccaggtaag tat 33

<210> 387

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 387

gtctggcaaa atacaggtca gccaggtaag tat 33

<210> 388

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 388

agtctggcaa aatacaggtc gccaggtaag tat 33

<210> 389

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 389

aagtctggca aaatacaggt gccaggtaag tat 33

<210> 390

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 390

taagtctggc aaaatacagg gccaggtaag tat 33

<210> 391

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 391

ctgtgattta agtctggcaa gccaggtaag tat 33

<210> 392

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 392

tctgtgattt aagtctggca gccaggtaag tat 33

<210> 393

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 393

atctgtgatt taagtctggc gccaggtaag tat 33

<210> 394

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 394

catctgtgat ttaagtctgg gccaggtaag tat 33

<210> 395

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 395

acccatctgt gatttaagtc gccaggtaag tat 33

<210> 396

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 396

caggcttgaa tgacaaagaa gccaggtaag tat 33

<210> 397

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 397

acaggcttga atgacaaaga gccaggtaag tat 33

<210> 398

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 398

cacaggcttg aatgacaaag gccaggtaag tat 33

<210> 399

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 399

ttcacaggct tgaatgacaa gccaggtaag tat 33

<210> 400

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 400

attcacaggc ttgaatgaca gccaggtaag tat 33

<210> 401

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 401

tattcacagg cttgaatgac gccaggtaag tat 33

<210> 402

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 402

ggtttttatt cacaggcttg gccaggtaag tat 33

<210> 403

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 403

agggttttta ttcacaggct gccaggtaag tat 33

<210> 404

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 404

cagggttttt attcacaggc gccaggtaag tat 33

<210> 405

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 405

acagggtttt tattcacagg gccaggtaag tat 33

<210> 406

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 406

ataagtgcca tacagggttt gccaggtaag tat 33

<210> 407

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 407

aataagtgcc atacagggtt gccaggtaag tat 33

<210> 408

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 408

taataagtgc catacagggt gccaggtaag tat 33

<210> 409

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 409

ataataagtg ccatacaggg gccaggtaag tat 33

<210> 410

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 410

cctcataata agtgccatac gccaggtaag tat 33

<210> 411

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 411

gcctcataat aagtgccata gccaggtaag tat 33

<210> 412

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 412

tagcctcata ataagtgcca gccaggtaag tat 33

<210> 413

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U1AO 序列 (DNA 形式)

<400> 413

atagcctcat aataagtgcc gccaggtaag tat 33

Claims (29)

1.一种用于抑制超氧化物歧化酶基因表达的U1衔接子寡核苷酸，其中所述U1衔接子寡核苷酸是包含与至少一个效应子结构域可操作地连接的退火结构域的核酸分子，其中所述退火结构域与所述超氧化物歧化酶1基因的前体mRNA杂交，并且其中所述效应子结构域与U1 snRNP的U1 snRNA杂交。

2.根据权利要求1所述的U1衔接子寡核苷酸，其中所述退火结构域的长度为约10至约30个核苷酸。

3.根据权利要求1所述的U1衔接子寡核苷酸，其中所述效应子结构域的长度为约8至约20个核苷酸。

4.根据权利要求1所述的U1衔接子寡核苷酸，其中所述效应子结构域和退火结构域通过键或约1至约10个核苷酸的接头结构域来连接。

5.根据权利要求1所述的U1衔接子寡核苷酸，其中所述效应子结构域包含序列5'-CAGGUAAGUA-3'(SEQ ID NO:1)、5'-CAGGUAAGUAU-3'(SEQ ID NO:4)或5'-GCCAGGUAAGUAU-3'(SEQ ID NO:5)。

6.根据权利要求1所述的U1衔接子寡核苷酸，其还包含至少一个靶向部分和/或细胞穿透部分，其中所述靶向部分和/或细胞穿透部分与所述U1衔接子寡核苷酸可操作地连接。

7.根据权利要求1所述的U1衔接子寡核苷酸，其中所述U1衔接子寡核苷酸包含至少一个核苷酸类似物。

8.根据权利要求1所述的U1衔接子寡核苷酸，其中所述U1衔接子寡核苷酸包含2'-O-甲基核苷酸、2'-O-甲基氧基乙氧基核苷酸、2'-卤素(例如，2'-氟)和/或锁核酸。

9.根据权利要求1所述的U1衔接子寡核苷酸，其中U1衔接子寡核苷酸包含硫代磷酸酯。

10.根据权利要求1所述的U1衔接子寡核苷酸，其中所述退火结构域与超氧化物歧化酶1基因3'末端外显子中的靶序列杂交。

11.根据权利要求1所述的U1衔接子寡核苷酸，其中所述效应子结构域与所述退火结构域的3'端、所述退火结构域的5'端或者所述退火结构域的5'和3'端两端可操作地连接。

12.根据权利要求1所述的U1衔接子寡核苷酸，其中所述退火结构域包含一段至少七个脱氧核糖核苷酸。

13.根据权利要求1所述的U1衔接子寡核苷酸，其中所述U1 snRNA是U1变体snRNA。

14.根据权利要求6所述的U1衔接子寡核苷酸，其中所述U1衔接子寡核苷酸与所述靶向部分和/或细胞穿透部分经由接头缀合。

15.根据权利要求14所述的U1衔接子寡核苷酸，其中所述接头是可切割的。

16.根据权利要求6所述的U1衔接子寡核苷酸，其中所述靶向部分和/或细胞穿透部分与所述U1衔接子寡核苷酸的3'端、5'端或5'和3'端两端可操作地连接。

17.根据权利要求16所述的U1衔接子寡核苷酸，其中所述靶向部分和/或细胞穿透部分与所述U1衔接子寡核苷酸的5'端可操作地连接。

18.根据权利要求1所述的U1衔接子寡核苷酸，其中所述U1衔接子寡核苷酸与所述3'端的第一靶向部分和所述5'端的第二靶向部分可操作地连接。

19.根据权利要求6所述的U1衔接子寡核苷酸，其中所述靶向部分是抗体或其片段。

20.根据权利要求1所述的U1衔接子寡核苷酸，其中所述超氧化物歧化酶1基因是犬的。

21.根据权利要求1-20中任一项所述的U1衔接子寡核苷酸，其中所述退火结构域与SEQID NO:8杂交。

22.根据权利要求1-20中任一项所述的U1衔接子寡核苷酸，其中所述U1衔接子寡核苷酸包含SEQ ID NO:9。

23.一种组合物，其包含至少一种根据权利要求1-22中任一项所述的U1衔接子寡核苷酸和至少一种药学上可接受的载体。

24.根据权利要求23所述的组合物，其中所述组合物还包含针对所述超氧化物歧化酶1基因的至少一种siRNA或反义寡核苷酸。

25.一种抑制超氧化物歧化酶1基因的表达的方法，其包括向细胞递送至少一种根据权利要求1-22中任一项所述的U1衔接子寡核苷酸。

26.根据权利要求25所述的方法，其中递送至少两种所述U1衔接子寡核苷酸，并且其中所述U1衔接子寡核苷酸的退火结构域与所述超氧化物歧化酶1基因中的不同靶序列杂交。

27.一种治疗有需要的受试者的退行性脊髓病(DM)或肌萎缩性侧索硬化症(ALS)的方法，所述方法包括向所述受试者施用至少一种权利要求1-22中任一项所述的U1衔接子寡核苷酸。

28.根据权利要求27所述的方法，其中施用至少两种所述U1衔接子寡核苷酸，并且其中所述U1衔接子寡核苷酸的退火结构域与所述超氧化物歧化酶1基因中的不同靶序列杂交。

29.根据权利要求27所述的方法，其还包括施用针对所述超氧化物歧化酶1基因的至少一种siRNA或反义寡核苷酸。

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