JPWO2018221649A1

JPWO2018221649A1 - Ａｐｃｓの発現を抑制する核酸

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Publication number: JPWO2018221649A1
Application number: JP2019521298A
Authority: JP
Inventors: 博之有山; 拓也村上; 隆今枝; 達也宮澤
Original assignee: Kyowa Kirin Co Ltd
Current assignee: Kyowa Kirin Co Ltd
Priority date: 2017-05-31
Filing date: 2018-05-31
Publication date: 2020-04-02
Also published as: EP3633037A1; TW201903149A; CN110832078A; AU2018277476A1; US20200190514A1; CA3065149A1; EP3633037A4; KR20200014320A; WO2018221649A1; US11466272B2

Abstract

本発明は、センス鎖核酸及びアンチセンス鎖核酸からなり、少なくとも11個の塩基対の二重鎖領域を含む二本鎖核酸であって、前記アンチセンス鎖核酸中の、少なくとも17個のヌクレオチドかつ多くとも30個のヌクレオチドの鎖長のオリゴヌクレオチド鎖において、配列番号１２８８〜１９３０のいずれかで表される塩基配列を含む標的APCS mRNA配列と相補的である、APCS遺伝子の発現を抑制させる二本鎖核酸、を提供する。

Description

本発明は、APCSの発現を抑制する核酸又は該核酸を含む医薬組成物に関する。

APCS（amyloid P component, serum）(別名Serum amyloid P、SAPあるいはPentraxin-2とも言う）は223アミノ酸から構成される糖蛋白質の五量体構造を有する。APCSは肝臓で産生される蛋白質であり、血中に30〜50 μg/mLという比較的高濃度で存在する。
また、APCSはカルシウム依存的にすべての種類のアミロイド線維に結合する生化学的特性を持ち、アミロイドを有する患者のアミロイド中にも20,000 mgもの多量のAPCSが含まれていることが知られている（非特許文献１）。
APCSはすべてのアミロイド関連疾患患者におけるアミロイド中に存在することから、アミロイド関連疾患患者における診断マーカーとして用いられている（非特許文献２）。

アミロイド関連疾患は、アミロイド線維として知られている異常な不溶性蛋白質線維が組織に沈着して臓器障害が引き起こされる疾患である。
プロテアーゼによる分解や免疫細胞による貪食に対するAPCSの耐性により、ＡＰＣＳが結合したアミロイドを安定化し得ることが明らかとなっており、また、APCSのアミロイドへの結合を阻害することで臓器へのアミロイド沈着及びそれに伴う組織障害を軽減できることが動物モデルを用いた研究ならびに臨床研究より強く示唆されている（非特許文献３，４）。APCSの発現を特異的に抑制することにより、アミロイド関連疾患を予防又は治療できると期待できるが、APCSの発現を特異的に抑制する医薬品はこれまでに報告されていない。

遺伝子の発現自体を抑制する方法としては、例えばRNA干渉(RNA interference、RNAiとも言う)を利用した方法等が知られている。具体的には、標的とする遺伝子と同一の配列を有する二本鎖RNAを導入することにより、該標的遺伝子の発現が特異的に抑制されることが見出され、short interfering RNA(siRNA)と名づけられている(特許文献１)。また、RNA干渉以外の遺伝子の発現を抑制する方法として、アンチセンス法が知られている（特許文献２）。

ヒトのAPCS mRNAを標的とするsiRNA配列の一部は開示されているが、該siRNA配列がヒトのAPCSの発現を抑制することは知られていない（特許文献３，４）。

国際公開第2001/75164号国際公開第98/56905号国際公開第2005/116204号国際公開第2008/043561号

Amyloid, 4:4, 274-295 (1997) N Engl J Med. 1990;323:508-13 Nature 468: 93-97.(2010) N. Engl. J. Med. 373:1106-14.(2015)

本発明は、APCSの発現を抑制することが可能な核酸を提供することを目的とする。

本発明は、以下の(1)〜(13)に関する。
(1) センス鎖核酸及びアンチセンス鎖核酸からなり、少なくとも11個の塩基対の二重鎖領域を含む二本鎖核酸であって、前記アンチセンス鎖核酸中の、少なくとも17個のヌクレオチドかつ多くとも30個のヌクレオチドの鎖長のオリゴヌクレオチド鎖において、配列番号１２８８〜１９３０のいずれかで表される塩基配列を含む標的APCS mRNA配列と相補的である、APCS遺伝子の発現を抑制する二本鎖核酸。
(2) 前記二重鎖領域が11〜27個の塩基対であり、前記アンチセンス鎖核酸の5’末端から2番目のヌクレオチドが、前記標的APCS mRNA配列の3’末端から2番目のヌクレオチドと相補する、(1)に記載の二本鎖核酸。
(3) 前記センス鎖核酸の3’末端及び前記アンチセンス鎖核酸の5’末端、並びに／又は、前記センス鎖核酸の5’末端及び前記アンチセンス鎖核酸の3’末端が、平滑末端を形成する、(1)又は(2)に記載の二本鎖核酸。
(4) 前記センス鎖核酸は、21個のヌクレオチドの鎖長を有し、かつ前記アンチセンス鎖核酸は、21個のヌクレオチドの鎖長を有する、(1)〜(3)のいずれかに記載の二本鎖核酸。
(5) 19個の塩基対の二重鎖領域を含み、該二重鎖領域内の４０〜６５％のヌクレオチドが2’-O-メチル修飾ヌクレオチドである、(4)に記載の二本鎖核酸。
(6) 前記アンチセンス鎖核酸は、配列番号６４５〜１２８７及び１９７５〜２０１８のいずれかで表される塩基配列を含む、(1)〜(5)のいずれかに記載の二本鎖核酸。
(7) 前記センス鎖核酸は、配列番号２〜６４４及び１９３１〜１９７４のいずれかで表される塩基配列を含む、(1)〜(6)のいずれかに記載の二本鎖核酸。
(8) 前記センス鎖核酸は、配列番号２〜６４４及び１９３１〜１９７４のいずれかで表される塩基配列を含み、それに対応して、前記アンチセンス鎖核酸は、配列番号６４５〜１２８７及び１９７５〜２０１８のいずれかで表される塩基配列を含む、(1)〜(7)のいずれかに記載の二本鎖核酸。
(9) リガンドを含む、(1)〜(8)のいずれか一項に記載の二本鎖核酸。
(10) (1)〜(9)のいずれか一項に記載の二本鎖核酸の、アンチセンス鎖核酸のみからなる一本鎖核酸。
(11) (1)〜(10)のいずれか一項に記載の核酸を含む、医薬組成物。
(12) APCSを含んだアミロイド線維により媒介される障害を治療する方法であって、治療上有効量の、(1)〜(10)のいずれか一項に記載の核酸又は(11)に記載の医薬組成物を、そのような治療を必要とするヒトに投与するステップを含む方法。
(13) 前記障害が、アミロイド関連疾患である、(12)に記載の方法。

本発明によれば、APCSの発現を抑制することが可能な核酸を提供することができる。

本発明において、核酸の標的とするAPCS mRNAは、Genbank Accession No.NM_001639.3として登録されている配列番号1に相同であり、配列番号1におけるTがUと読み替えられた塩基配列を有するAPCSの完全長mRNAである。mRNAの相補DNAを1st strand cDNA、そこから二本鎖にする際に合成されるDNAを2nd strand cDNAと定義する場合に、配列番号１は、APCS 2nd strand cDNAの塩基配列を示す。ここで、APCS mRNAの塩基配列と、APCS 2nd strand cDNAの塩基配列とは、相同な関係にある。

1. 本発明の核酸
本発明において、APCS mRNA配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸をアンチセンス鎖核酸と称し、アンチセンス鎖核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸をセンス鎖核酸と称する。本明細書において「本発明の核酸」という場合、特に断らない限り、アンチセンス鎖核酸又はセンス鎖核酸の一本鎖核酸、並びにアンチセンス鎖核酸及びセンス鎖核酸が対形成した二本鎖核酸を包含する意味で用いられる。

本発明の核酸としては、ヌクレオチド又は該ヌクレオチドと同等の機能を有する分子が重合した分子であればいかなる分子であってもよく、例えばリボヌクレオチドの重合体であるRNA、デオキシリボヌクレオチドの重合体であるDNA、リボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドの重合体であるキメラ核酸、並びにこれらの核酸（RNA、DNA、及びキメラ核酸）の少なくとも一つのヌクレオチドが該ヌクレオチドと同等の機能を有する分子で置換されたヌクレオチド重合体が挙げられる。RNA中のウラシル（U）は、DNAにおいてはチミン（T）に一義的に読み替えられる。

ヌクレオチドと同等の機能を有する分子としては、例えばヌクレオチドに修飾を施したヌクレオチド誘導体等が挙げられる。
ヌクレオチド誘導体を用いることで、特に限定されるものではないが、例えばRNA若しくはDNAと比較して、ヌクレアーゼ耐性を向上若しくは安定化させることができる、相補鎖核酸とのアフィニティーを向上させることができる、細胞透過性を向上させることができる、及び／又は可視化することができるといった利点がある。

ヌクレオチド誘導体としては、例えば糖部修飾ヌクレオチド、リン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチド、塩基修飾ヌクレオチド、並びに糖部、リン酸ジエステル結合、及び塩基の2つ以上が同時に修飾されたヌクレオチド等が挙げられる。

糖部修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドの糖の化学構造の一部又は全てに対し、任意の置換基で修飾若しくは置換したもの又は任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよいが、2’-修飾ヌクレオチドが好ましく用いられる。

2’-修飾ヌクレオチドとしては、例えばリボースの2’-OH基がOR、R、R’OR、SH、SR、NH₂、NHR、NR₂、N₃、CN、F、Cl、Br、及びIからなる群(Rはアルキル又はアリールであり、好ましくは炭素数1〜6のアルキルであり、R’はアルキレンであり、好ましくは炭素数1〜6のアルキレンであり、NR₂の2つのRは同一でも異なっていてもよい)から選択される置換基で置換された2’-修飾ヌクレオチドが挙げられる。
2’-修飾ヌクレオチドとしては、リボースの2’-OH基がF又はメトキシ基で置換された2’-修飾ヌクレオチド（それぞれ、2’-Ｆ修飾ヌクレオチド又は2’-O-メチル修飾ヌクレオチドとも言う）が好ましく用いられる。
2’-修飾ヌクレオチドとしては、リボースの2’-OH基が2-(methoxy)ethoxy基、3-aminopropoxy基、2-[(N,N-dimethylamino)oxy]ethoxy基、3-(N,N-dimethylamino)propoxy基、2-[2-(N,N-dimethylamino)ethoxy]ethoxy基、2-(methylamino)-2-oxoethoxy基、2-(N-methylcarbamoyl)ethoxy 基、及び2-cyanoethoxy 基からなる群から選択される置換基で置換された2’-修飾ヌクレオチド等も挙げられる。

糖部修飾ヌクレオチドとしては、糖部に架橋構造を導入することにより2つの環状構造を有する架橋構造型人工核酸(Bridged Nucleic Acid)(BNA)が挙げられ、具体的には、2’位の酸素原子と4’位の炭素原子がメチレンを介して架橋したロックト人工核酸(Locked Nucleic Acid)(LNA) [Tetrahedron Letters, 38, 8735, (1997)及びTetrahedron, 54, 3607,(1998)]、エチレン架橋構造型人工核酸(Ethylene bridged nucleic acid)(ENA)[Nucleic Acid Research, 32, e175(2004)] 、Constrained Ethyl(cEt)[The Journal of Organic Chemistry 75, 1569 (2010)］、Amido-Bridged Nucleic Acid (AmNA) [Chem Bio Chem 13, 2513(2012)]、及び2'-O, 4'-c-Spirocyclopropylene bridged nucleic acid (scpBNA)[Chem. Commun., 51, 9737 (2015)］等が挙げられる。
糖部修飾ヌクレオチドとしては、ペプチド核酸(PNA)[Acc. Chem. Res., 32, 624 (1999)]、オキシペプチド核酸(OPNA)[J. Am. Chem. Soc., 123, 4653 (2001)]、及びペプチドリボ核酸(PRNA)[J. Am. Chem. Soc., 122, 6900 (2000)]等も挙げられる。

リン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の化学構造の一部又は全てに対し、任意の置換基で修飾若しくは置換したもの又は任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよい。
リン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチドとしては、例えばリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に置換されたヌクレオチド、リン酸ジエステル結合がホスホロジチオエート結合に置換されたヌクレオチド、リン酸ジエステル結合がアルキルホスホネート結合に置換されたヌクレオチド、及びリン酸ジエステル結合がホスホロアミデート結合に置換されたヌクレオチド等が挙げられる。

塩基修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドの塩基の化学構造の一部又は全てに対し、任意の置換基で修飾若しくは置換したもの又は任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよい。
塩基修飾ヌクレオチドとしては、例えば塩基内の酸素原子が硫黄原子で置換されたヌクレオチド、塩基内の水素原子が炭素数1〜6のアルキル基、ハロゲン等で置換されたもの、メチル基が水素、ヒドロキシメチル、炭素数2〜6のアルキル基等で置換されたもの、アミノ基が炭素数1〜6のアルキル基、炭素数1〜6のアルカノイル基、オキソ基、ヒドロキシ基等に置換されたものが挙げられる。なお、シトシン（C）の代わりに5-メチルシトシン（5-mC）を塩基修飾ヌクレオチドとして用いることも、本発明の好ましい形態の一つである。

さらなるヌクレオチド誘導体としては、ヌクレオチド又は前記ヌクレオチド誘導体に、リガンド、コレステロール、脂肪酸、トコフェロール、レチノイド等の脂質類、N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)、ガラクトース(Gal)、マンノース(Man)等の糖類、フル抗体、Fab、scFv、VHH等のフラグメント抗体、低密度リポタンパク質（LDL）、ヒト血清アルブミン等のタンパク質、RGD、NGR、R9、CPP等のペプチド類、フェナジン、フェナントリジン、アントラキノン、葉酸等の低分子、合成ポリアミノ酸等の合成ポリマー、核酸アプタマー、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン等の色素、Cy3シリーズ、Alexaシリーズ（登録商標）、ブラックホールクエンチャー等の蛍光団等の別の化学物質を、直接又はリンカーを介して付加したものも挙げられる。具体的にはポリアミン付加ヌクレオチド誘導体、コレステロール付加ヌクレオチド誘導体、ステロイド付加ヌクレオチド誘導体、GalNAc付加ヌクレオチド誘導体、胆汁酸付加ヌクレオチド誘導体、脂肪酸付加ヌクレオチド誘導体、ビタミン付加ヌクレオチド誘導体、Cy5付加ヌクレオチド誘導体、Cy3付加ヌクレオチド誘導体、6-FAM付加ヌクレオチド誘導体及びビオチン付加ヌクレオチド誘導体等が挙げられ、好ましくはGalNAc付加ヌクレオチド誘導体が挙げられる。これらは、固相上での伸長反応時に、固相上で反応可能な修飾剤を反応させることで、5’末端及び／若しくは3’末端、並びに／又は配列内部に修飾を施すことができる。また、アミノ基、メルカプト基、アジド基又は３重結合等の官能基を導入した核酸をあらかじめ合成及び精製しておき、それらに修飾剤を作用させることで得ることもできる。
ヌクレオチド誘導体は、核酸内の他のヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体とアルキレン構造、ペプチド構造、ヌクレオチド構造、エーテル構造、及びエステル構造、並びにこれらの少なくとも2つを組み合わせた構造等の架橋構造を形成してもよい。

本発明の核酸は、核酸の分子中の一部又は全部の原子が質量数の異なる原子（同位体）で置換されたものも包含する。

本明細書において「相補」とは、2つの塩基間で塩基対合をし得る関係を意味し、例えば、アデニンとチミン又はウラシルとの関係、及びグアニンとシトシンとの関係のように緩やかな水素結合を介して、二重鎖領域全体として二重螺旋構造をとるものをいう。アデニンとチミン又はウラシルとの関係、及びグアニンとシトシンとの関係において、Ａ、Ｔ（Ｕ）、Ｇ、Ｃの各塩基は、一方が、あるいは双方が修飾された塩基である場合にも、2つの塩基間で、緩やかな水素結合を介して塩基対合をし得る場合には、それらの塩基同士の関係も相補といえる。

本明細書において「相補的」とは、2つのヌクレオチド配列が完全に相補する場合だけでなく、該2つのヌクレオチド配列間で0〜30％、好ましくは0〜20％、より好ましくは0〜10％のミスマッチ塩基を有することができ、例えば、APCS mRNA配列に対して相補的なアンチセンス鎖核酸は、該mRNAの部分塩基配列と完全に相補する塩基配列を含むか、完全に相補する塩基配列において1つ又は複数の塩基の置換を含んでよい塩基配列を含むことを意味する。アンチセンス鎖核酸は、標的遺伝子の標的配列に対して1〜8個、好ましくは1〜6個、より好ましくは1〜4個、さらに好ましくは1〜3個、特に好ましくは1〜2個、特により好ましくは1個のミスマッチ塩基を有していてもよい。
具体的には、アンチセンス鎖核酸が21個のヌクレオチドの鎖長（21塩基長）の場合には、標的遺伝子の標的ヌクレオチド配列に対して1〜6個、好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜4個、さらに好ましくは1〜3個、特に好ましくは1〜2個、特により好ましくは1個のミスマッチ塩基を有してもよく、そのミスマッチの位置は、それぞれのアンチセンス鎖におけるヌクレオチド配列の5’末端又は3’末端であってもよい。
本明細書において「相補的」とは、一方のヌクレオチド配列が、他方のヌクレオチド配列と完全に相補する塩基配列において、1つ若しくは複数の塩基が付加及び／又は欠失した配列である場合を包含する。例えば、本発明におけるアンチセンス鎖核酸は、APCS mRNA配列に対して完全に相補する塩基配列における塩基の付加により、標的APCS mRNA配列に1個又は2個のバルジ塩基を有してもよい。
本発明においては、アンチセンス鎖核酸若しくはセンス鎖核酸において、1個又は2個のバルジ塩基を有してもよい。

本発明において、「バルジ塩基」とは、他方のヌクレオチド配列と相補的な塩基対を形成しない塩基を指す。

本発明のアンチセンス鎖核酸としては、標的APCS mRNA配列に対して完全に相補的な塩基配列を含む核酸が用いられるが、該核酸のうち1〜3塩基、好ましくは1〜2塩基、より好ましくは1塩基が欠失、置換又は付加したものを用いてもよい。

APCSの発現を抑制する核酸としては、標的APCS mRNA配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸（アンチセンス鎖核酸）である一本鎖核酸又は標的APCS mRNA配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸（アンチセンス鎖核酸）と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸（センス鎖核酸）とからなる二本鎖核酸が好適に用いられる。
本発明においては、アンチセンス鎖核酸により、APCS遺伝子の発現を抑制することができる。

本発明の二本鎖核酸は、センス鎖核酸及びアンチセンス鎖核酸からなり、少なくとも11個の塩基対の二重鎖領域を含む二本鎖核酸であって、当該アンチセンス鎖核酸中の、少なくとも17個のヌクレオチドかつ多くとも30個のヌクレオチドの鎖長のオリゴヌクレオチド鎖において、配列番号１２８８〜１９３０のいずれかで表される塩基配列を含む標的APCS mRNA配列と相補的である、APCS遺伝子の発現を抑制する二本鎖核酸である。
配列番号１２８８〜１９３０のいずれかで表される塩基配列は、表1に記載される。
本発明の二本鎖核酸において、センス鎖核酸及びアンチセンス鎖核酸は、いずれのヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体から構成されてよい。

本発明の二本鎖核酸におけるアンチセンス鎖核酸としては、標的APCS mRNA配列に対して相補的な塩基配列を含むヌクレオチド鎖が用いられる。
標的APCS mRNA配列は、配列番号１に相同であり、配列番号1におけるTがUと読み替えられたAPCS mRNAの塩基配列のうち、配列番号１２８８〜１９３０のいずれかで表される塩基配列を含む。好ましくは、標的APCS mRNA配列は、配列番号１に相同であり、配列番号1におけるTがUと読み替えられたAPCS mRNAの塩基配列のうち、配列番号１２８８〜１９３０のいずれかで表される塩基配列である。
本発明の二本鎖核酸におけるアンチセンス鎖核酸を構成するヌクレオチドのうち、少なくとも17個のヌクレオチドかつ多くとも30個のヌクレオチドの鎖長のオリゴヌクレオチド鎖が、標的APCS mRNA配列と相補的である。
本発明においてアンチセンス鎖核酸を構成するヌクレオチドのうち、好ましくは11〜27個のヌクレオチド、より好ましくは15〜25個のヌクレオチド、さらに好ましくは15〜23個のヌクレオチド、特に好ましくは17〜21個のヌクレオチド、特により好ましくは17〜19個のヌクレオチド、特にさらに好ましくは19個のヌクレオチドの鎖長のオリゴヌクレオチド鎖において、標的APCS mRNA配列と相補的である。

本発明においてアンチセンス鎖核酸とセンス鎖核酸は、少なくとも11個の塩基対の二重鎖領域を含み、二重鎖領域は、通常11〜30個のヌクレオチド、好ましくは11〜27塩基対であり、より好ましくは15〜25塩基対、さらに好ましくは15〜23塩基対、特に好ましくは17〜21塩基対、特により好ましくは17〜19塩基対、特にさらに好ましくは19塩基対である。

本発明において、二重鎖領域内のヌクレオチドに対して、2’-修飾ヌクレオチドを含むことが好ましく、いずれの部位に含むことであってもよい。また、好適な2’-修飾ヌクレオチドの含有量として、ヌクレオチドの総量（１００％）に対して、１０〜２０％であってもよく、２０〜４０％であってもよく、４０〜６５％であってもよい。
2’-修飾ヌクレオチドを含む二本鎖核酸として具体的には、例えば、表3に記載のセンス鎖／アンチセンス鎖からなる成る群から選択される1対のセンス鎖／アンチセンス鎖の配列からなる二本鎖核酸が挙げられる。
本発明において、センス鎖核酸のヌクレオチドに対して、好適な2’-修飾ヌクレオチドの含有量として、２０〜４０％であってもよく、４０〜６０％であってもよく、６０％〜１００％であってもよい。
本発明において、アンチセンス鎖核酸のヌクレオチドに対して、好適な2’-修飾ヌクレオチドの含有量として、０〜４０％であることが好ましく、１０〜２０％であってもよく、２０〜４０％であってもよい。

二本鎖核酸を構成する一本鎖のアンチセンス鎖核酸及びセンス鎖核酸は、それぞれ、通常17〜30塩基からなるが、17〜27塩基からなることが好ましく、17〜25塩基からなることがより好ましく、17〜25塩基からなることがさらに好ましく、19〜25塩基からなることが特に好ましい。アンチセンス鎖核酸とセンス鎖核酸の塩基長は、同一であっても異なっていてもよい。

本発明においては、アンチセンス鎖核酸は、配列番号６４５〜１２８７及び１９７５〜２０１８のいずれかで表される塩基配列を含むことが好ましく、センス鎖核酸は、配列番号２〜６４４及び１９３１〜１９７４のいずれかで表される塩基配列を含むことが好ましい。
本発明においては、アンチセンス鎖核酸は、配列番号６４５〜１２８７及び１９７５〜２０１８のいずれかで表される塩基配列を有するヌクレオチド鎖であることがより好ましく、センス鎖核酸は、配列番号２〜６４４及び１９３１〜１９７４のいずれかで表される塩基配列を有するヌクレオチド鎖であることがより好ましい。
本発明の二本鎖核酸は、センス鎖核酸は、配列番号２〜６４４及び１９３１〜１９７４のいずれかで表される塩基配列を含み、それに対応して、アンチセンス鎖核酸は、配列番号６４５〜１２８７及び１９７５〜２０１８のいずれかで表される塩基配列を含むことが好ましい。
本明細書において、それに対応してとは、表1又は表3において二本鎖核酸番号として記載される横一列のカラムにおけるセンス鎖核酸とアンチセンス鎖核酸の組み合わせであることを意味し、配列番号ｎ(ｎ＝２〜６４４)に対応する配列番号は、ｎ＋６４３となる。具体的に例示して説明すると、配列番号２に対応する配列番号は６４５である。
本発明の二本鎖核酸は、センス鎖核酸は、配列番号２〜６４４及び１９３１〜１９７４のいずれかで表される塩基配列を有するヌクレオチド鎖であり、それに対応して、アンチセンス鎖核酸は、配列番号６４５〜１２８７及び１９７５〜２０１８のいずれかで表される塩基配列を有するヌクレオチド鎖であることがより好ましい。

本発明の二本鎖核酸において、二重鎖領域に続く3’末端側又は5’末端側に二重鎖を形成しない追加のヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体を有する場合には、この二重鎖を形成しないヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体を突出部(オーバーハング)と呼ぶ。突出部を有する場合には、突出部を構成するヌクレオチドはリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、又はこれらの誘導体であってもよい。

突出部を有する二本鎖核酸としては、センス鎖核酸及びアンチセンス鎖核酸の少なくとも一方の核酸の3’末端又は5’末端に、通常1〜6塩基、好ましくは1〜3塩基からなる突出部を有するものが用いられるが、2塩基からなる突出部を有するものがより好ましく用いられ、例えばdTdT（dTはチミジンを示す）又はUUからなる突出部を有するものが挙げられる。突出部は、アンチセンス鎖核酸にのみ、センス鎖核酸にのみ、及びアンチセンス鎖核酸とセンス鎖核酸の両方に有することができる。また、突出部が、アンチセンス鎖核酸にのみ有する場合、センス鎖核酸にのみ有する場合、及びアンチセンス鎖核酸とセンス鎖核酸の両方に有する場合のいずれの場合についても、核酸の3’末端及び／又は5’末端に突出部を有していてもよい。

本発明において用いられるアンチセンス鎖核酸は、好ましくは、センス鎖核酸との二重鎖領域とそれに続く突出部とを含む、少なくとも17個のヌクレオチドかつ多くとも30個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド鎖において配列番号１２８８〜１９３０のいずれかで表される塩基配列を含む標的APCS mRNA配列と十分に相補的である。
本発明の二本鎖核酸としては、例えばDicer等のリボヌクレアーゼの作用により上記の二本鎖核酸を生成する核酸分子(WO2005/089287)や、3’末端や5’末端の突出部を有さず平滑末端を形成する二本鎖核酸、センス鎖核酸のみが突出した二本鎖核酸（US2012/0040459）等を用いることもできる。本発明において、「平滑末端」とは、2本鎖核酸の末端に突出部を有さないことを指す。平滑末端として、例えば、センス鎖核酸の3’末端及びアンチセンス鎖核酸の5’末端の両方、及び／又は、センス鎖核酸の5’末端及びアンチセンス鎖核酸の3’末端の両方に突出部を有しない2本鎖核酸がある。

本発明においては、センス鎖核酸の3’末端及びアンチセンス鎖核酸の5’末端、並びに／又は、センス鎖核酸の5’末端及びアンチセンス鎖核酸の3’末端が、平滑末端を形成することが好ましい。特に、センス鎖核酸の3’末端及びアンチセンス鎖核酸の5’末端、又は、センス鎖核酸の5’末端及びアンチセンス鎖核酸の3’末端が、平滑末端を形成することがより好ましい。センス鎖核酸の3’末端及びアンチセンス鎖核酸の5’末端、並びに／又は、センス鎖核酸の5’末端及びアンチセンス鎖核酸の3’末端が平滑末端を形成する場合には、センス鎖核酸は、21個のヌクレオチドの鎖長を有し、かつアンチセンス鎖核酸は、23個のヌクレオチドの鎖長を有することが好ましい。

本発明においては、アンチセンス鎖核酸とセンス鎖核酸の両方に突出部を有する二本鎖核酸も好ましい。センス鎖核酸の3’末端及びアンチセンス鎖核酸の3’末端、又は、センス鎖核酸の5’末端及びアンチセンス鎖核酸の5’末端が、突出部を有することが好ましい。アンチセンス鎖核酸とセンス鎖核酸の両方に突出部を有する場合、センス鎖核酸は、21個のヌクレオチドの鎖長を有し、かつアンチセンス鎖核酸は、21個のヌクレオチドの鎖長を有することが好ましい。

本発明においては、センス鎖核酸の3’末端及び5’末端の両方、又は、前記アンチセンス鎖核酸の3’末端及び5’末端の両方が、突出部を有することもより好ましい。

本発明のアンチセンス鎖核酸の5’末端から2番目のヌクレオチドは、標的APCS mRNA配列の3’末端から2番目のリボヌクレオチドと完全に相補であることが好ましく、アンチセンス鎖核酸の5’末端から2〜7番目のリボヌクレオチドが、それぞれ標的APCS mRNA配列の3’末端から2〜7番目のリボヌクレオチドと完全に相補であることがより好ましく、アンチセンス鎖核酸の5’末端から2〜11番目のリボヌクレオチドが、それぞれ標的APCS mRNA配列の3’末端から2〜11番目のリボヌクレオチドと完全に相補であることがさらに好ましい。
本発明におけるアンチセンス鎖核酸の5’末端から11番目のヌクレオチドが、標的APCS mRNA配列の3’末端から11番目のリボヌクレオチドと完全に相補であることが好ましく、アンチセンス鎖核酸の5’末端から9〜13番目のリボヌクレオチドが、それぞれ標的APCS mRNA配列の3’末端から9〜13番目のリボヌクレオチドと完全に相補であることがより好ましく、アンチセンス鎖核酸の5’末端から7〜15番目のリボヌクレオチドが、それぞれ標的APCS mRNA配列の3’末端から7〜15番目のリボヌクレオチドと完全に相補であることがさらに好ましい。

本発明の核酸を製造する方法としては、特に限定されず、公知の化学合成を用いる方法又は酵素的転写法等が挙げられる。
公知の化学合成を用いる方法として、ホスホロアミダイト法、ホスホロチオエート法、ホスホトリエステル法、及びCEM法[Nucleic Acid Research, 35, 3287 (2007)]等が挙げられ、例えば、ABI3900ハイスループット核酸合成機(アプライドバイオシステムズ社製)により本発明の核酸を合成することができる。合成が終了した後は、固相からの脱離、保護基の脱保護、及び目的物の精製等を行う。精製により、純度90%以上、好ましくは95%以上の核酸を得るのが望ましい。
二本鎖核酸の場合には、合成及び精製したセンス鎖核酸及びアンチセンス鎖核酸を適当な比率、例えば、アンチセンス鎖核酸1当量に対して、センス鎖核酸0.1〜10当量、好ましくは0.5〜2当量、より好ましくは0.9〜1.1当量、さらに好ましくは等モル量で混合した後、通常混合したものをアニーリングするが、アニーリングする工程を省いて混合したものを直接用いてもよい。
アニーリングは、二本鎖核酸を形成できる条件であればいかなる条件で行ってもよいが、通常、アンチセンス鎖核酸及びセンス鎖核酸をほぼ等モル量で混合した後、94℃程度で5分程度加熱したのち、室温まで徐冷することにより行われる。
酵素的転写法としては、目的の塩基配列を有したプラスミド又はDNAを鋳型としてファージRNAポリメラーゼ、例えば、T7、T3、又はSP6RNAポリメラーゼを用いた転写による方法が挙げられる。

本発明の核酸は、トランスフェクション用の担体、好ましくはカチオン性リポソーム等のカチオン性担体を用いて細胞内に導入することができる。また、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、又はマイクロインジェクション法等により、直接細胞内に導入することもできる。

本発明の核酸は、リガンドを含んでもよい。本発明の核酸は、5’末端及び／若しくは3’末端において、並びに／又は配列内部において１つ又は複数のリガンドや蛍光団により修飾されていてもよく、リガンドや蛍光団により修飾された核酸をコンジュゲート核酸とも呼ぶ。固相上での伸張反応時に、固相上で反応可能な修飾剤を反応させることで、5’末端及び／若しくは3’末端、並びに／又は配列内部に修飾を施すことができる。また、アミノ基、メルカプト基、アジド基、又は三重結合等の官能基を導入した核酸をあらかじめ合成及び精製しておき、それら官能基に修飾化剤を作用させることでコンジュゲート核酸を得ることもできる。リガンドとしては、生体分子と親和性のある分子であればよいが、例えばコレステロール、脂肪酸、トコフェロール、及びレチノイド等の脂質類、N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)、ガラクトース(Gal)、及びマンノース(Man)等の糖類、フル抗体、scFV、Fab、及びVHH等のフラグメント抗体、低密度リポタンパク質（LDL）及びヒト血清アルブミン等のタンパク質、RGD、NGR、R9、及びCPP等のペプチド類、葉酸等の低分子、合成ポリアミノ酸等の合成ポリマー、並びに核酸アプタマー等が挙げられる、これらを組み合わせて用いることもできる。蛍光団としてはCy3シリーズ、Alexa（登録商標）シリーズ、及びブラックホールクエンチャー（登録商標）等が挙げられる。本発明の核酸にリガンドを付加する方法としては、例えば、固相上での伸張反応時に、固相上で反応可能な修飾剤を反応させることで、5'末端、3'末端及び／又は配列内部に修飾を施すことができるが、これに限定されない。また、アミノ基、メルカプト基、アジド基又は３重結合等の官能基を導入した核酸をあらかじめ合成及び精製しておき、それらに修飾剤を作用させることで得ることもできる。

本発明の核酸の代わりに、細胞内に導入してこれらが発現されるようなベクターを用いてもよい。具体的には、本発明の核酸をコードする配列を発現ベクター内のプロモーター下流に挿入して発現ベクターを構築し、細胞に導入することにより該核酸等を発現させることができる。発現ベクターとしては、pｃDNA6.2-GW/miR(Invitrogen社製)、pSilencer 4.1-CMV(Ambion社製)、pSINsi-hH1 DNA(タカラバイオ社製)、pSINsi-hU6 DNA(タカラバイオ社製)、及びpENTR/U6(Invitrogen社製)等を挙げられる。
細胞内において、本発明の核酸が発現することから、当該ベクターを用いることは、本発明の核酸の技術的範囲に含まれる。

本発明の核酸をコードする配列をウイルスベクター内のプロモーター下流に挿入し、該ベクターをパッケージング細胞に導入して生産した組換えウイルスベクターを用いることもできる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、及びアデノ随伴ウイルスベクター等が挙げられる。

2. APCSの発現抑制活性を有する核酸
本発明におけるアンチセンス鎖核酸及びセンス鎖核酸は、例えば、Genbank Accession No.NM_001639.3として登録されているヒトAPCSの完全長mRNAのAPCS 2nd strand cDNAの塩基配列（配列番号１)に基づいて設計することができる。なお、ヒトのAPCSの完全長mRNAのcDNAの塩基配列とヒト以外の生物種のAPCSの完全長mRNAのcDNAの塩基配列とを比較することにより、ヒト以外の生物種でAPCS mRNAの発現を抑制するアンチセンス鎖核酸及びセンス鎖核酸を設計することもできる。

APCSの発現抑制活性を有する核酸としては、APCS mRNA配列に対して相補的な塩基配列を含む本発明のアンチセンス鎖核酸と、該アンチセンス鎖核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む本発明のセンス鎖核酸とからなり、かつAPCSの発現抑制活性を有する二本鎖核酸が挙げられる。

本発明の二本鎖核酸を細胞に導入することにより、APCSの発現を抑制することができる。例えば本発明の二本鎖核酸は、数pM〜数nMの濃度で、細胞に導入した後、24時間以上、例えば48時間培養した段階でAPCSのmRNAの発現を抑制することができる。

本発明の二本鎖核酸のAPCSのmRNAの発現抑制活性の評価は、該核酸等をヒト細胞株等にカチオン性リポソーム等を用いてトランスフェクションし、一定時間培養した後、当該ヒト細胞株におけるAPCSのmRNAの発現量を定量することにより行うことができる。

本発明の二本鎖核酸のAPCS mRNAの発現抑制活性の評価は、該核酸等をヒト細胞株等にカチオン性リポソーム等を用いてトランスフェクションし、一定時間培養した後、当該ヒト細胞株におけるAPCSのmRNAの発現量を定量することにより行うことができる。

APCSの発現抑制活性を有する核酸としては、上記二本鎖核酸以外にも、APCS mRNAの一部の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸であって、かつAPCSの発現を抑制する一本鎖核酸が挙げられる。該一本鎖核酸は、通常、8〜30塩基からなるが、12〜30塩基からなることが好ましく、12〜20塩基からなることがより好ましい。
また、該一本鎖核酸としては、例えば、本発明の二本鎖核酸におけるアンチセンス鎖核酸である一本鎖核酸が挙げられる。

一本鎖核酸である本発明におけるアンチセンス鎖核酸も細胞に導入することにより、APCSの発現を抑制することができる。例えば本発明の一本鎖核酸は、数pM〜数μMの濃度で、細胞に導入した後、24時間以上、例えば48時間培養した段階でAPCSのmRNAの発現を抑制することができる。

本発明のアンチセンス鎖核酸のAPCSのmRNAの発現抑制活性の評価は、該核酸等をヒト細胞株等にカチオン性リポソーム等を用いてトランスフェクションし、一定時間培養した後、当該ヒト細胞株におけるAPCSのmRNAの発現量を定量することにより行うことができる。

3. 本発明の医薬組成物
本発明は、本発明の二本鎖核酸及び一本鎖核酸等の核酸を有効成分として含有する医薬組成物にも関する。本発明の医薬組成物は、アミロイド関連疾患の治療剤又は予防剤として用いることができる。
また、本発明においては、APCSを含んだアミロイド線維により媒介される障害を治療する方法も提供する。当該治療方法においては、本発明の核酸又は本発明の医薬組成物を、そのような治療を必要とするヒトに投与することにより、APCSを含んだアミロイド線維により媒介される障害を治療することができる。
APCSを含んだアミロイド線維により媒介される障害としては、例えば、アミロイド関連疾患があげられる。本発明の二本鎖核酸は、単独で治療方法に用いることもできるが、以下に示すとおり、本発明の医薬組成物における有効成分としてヒトに投与することにより、薬効を発揮させることができる。

本発明の医薬組成物は、本発明の核酸を細胞内に移行させるのに有効な担体をさらに含むことができる。核酸を細胞内に移行させるのに有効な担体としては、例えばカチオン性担体が挙げられる。カチオン性担体としては、カチオン性リポソーム及びカチオン性ポリマー等が挙げられる。また、核酸を細胞内に移行させるのに有効な担体として、ウイルスエンベロープを利用した担体を用いてもよい。カチオン性ポリマーとしては、例えばJetSI(Qbiogene社)及びJet-PEI(ポリエチレンイミン;Qbiogene社)等が挙げられる。ウイルスエンベロープを利用した担体としては、例えばGenomeOne(HVJ-Eリポソーム;石原産業社)等が挙げられる。

本発明の核酸と上記担体を含む医薬組成物は、当業者に既知の方法により調製することができる。例えば、適当な濃度の担体分散液と核酸溶液とを混合して、本発明の医薬組成物を調製することができる。カチオン性担体を用いる場合、核酸は通常、水溶液中で負電荷を帯びているため、常法により水溶液中で混合することによって、容易に本発明の医薬組成物を調製することができる。医薬組成物を調製するために用いる水性溶媒としては、注射用水、注射用蒸留水、生理食塩水等の電解質液、並びにブドウ糖液及びマルトース液等の糖液等が挙げられる。また、本発明の医薬組成物を調製する際のpH及び温度等の条件は当業者が適宜選択できる。医薬組成物は、必要ならば超音波分散装置や高圧乳化装置等を用いて分散処理を行うことにより、均一な組成物とすることもできる。本発明の核酸と担体とを含む医薬組成物の調製に最適な方法及び条件は、用いる担体に依存するので、上記の方法にとらわれることなく、当業者であれば用いる担体に最適な方法を選択できる。

また、本発明の医薬組成物としては、例えば核酸とリード粒子とを構成成分とする複合粒子及び複合粒子と所望により該複合粒子を被覆する脂質膜から構成される組成物も、好適に用いられる。リード粒子としては、例えば脂質集合体、リポソーム、エマルジョン粒子、高分子、金属コロイド、及び微粒子製剤等が挙げられ、好ましくはリポソームが用いられ、より好ましくはカチオン性リポソームが用いられる。本発明におけるリード粒子は、脂質集合体、リポソーム、エマルジョン粒子、高分子、金属コロイド、及び微粒子製剤等を2つ以上組み合わせた複合体を構成成分としていてもよく、脂質集合体、リポソーム、エマルジョン粒子、高分子、金属コロイド、及び／又は微粒子製剤等と他の化合物(例えば糖、脂質、及び無機化合物等)とを組み合わせた複合体を構成成分としていてもよい。
該複合粒子を被覆する脂質膜としては、例えば非カチオン性脂質、粒子の凝集を阻止する脂質、及びカチオン性脂質等を構成成分とするものが挙げられる。
本発明の医薬組成物は、例えば国際公開第2006/080118号等に記載の方法に従って調製することができる。

本発明の医薬組成物に含まれる核酸と担体との配合比は、通常、核酸1質量部に対して担体1〜200重量部が適当である。該配合比は、核酸1質量部に対して、好ましくは担体2.5〜100質量部であり、より好ましくは担体7〜25質量部である。

本発明の医薬組成物を構成する粒子の大きさは、平均粒子径が約10nm〜300nmであるのが好ましく、約30nm〜200nmであるのがより好ましく、約50nm〜150nmであるのがさらに好ましい。

本発明の医薬組成物には、上記担体の他に、医薬的に許容できるキャリアー又は希釈剤等を含んでいてもよい。医薬的に許容できるキャリアー又は希釈剤等は、本質的に化学的に不活性及び無害な化合物（組成物である場合を含む）であり、本発明の医薬組成物の生物学的活性に影響を与えないものである。医薬的に許容できるキャリアー又は希釈剤としては、例えば塩溶液、糖溶液、グリセロール溶液、及びエタノール等があるが、これらに限定されない。

本発明の医薬組成物は、疾患の治療又は予防に有効な量の核酸を含み、かつ、患者に適切に投与できるような形態で提供される。本発明の医薬組成物の製剤形態は、例えば注射剤、点眼剤、及び吸入用等の液剤並びに例えば軟膏及びローション剤等の外用剤等であってもよい。

液剤の場合、本発明の医薬組成物中の有効成分である本発明の核酸の濃度範囲は通常、0.001〜25%(w／v)であり、好ましくは0.1〜10%(w／v)であり、より好ましくは0.5〜5%(w／v)である。本発明の医薬組成物は医薬的に許容される任意の添加剤、例えば、乳化補助剤、安定化剤、等張化剤、及び／又はpH調整剤等を適当量含有していてもよい。医薬的に許容される任意の添加剤は、該複合体の分散前でも分散後でも適当な工程で添加することができる。
液剤のpHは、通常、約5.0〜約8.5、好ましくは約6.0〜約8.0に調整される。
液剤は、好ましくは、メンブレンフィルター等を用いた濾過滅菌等の滅菌処理を行う。

本発明の医薬組成物は、凍結乾燥製剤として調製することもできる。凍結乾燥製剤は、核酸と担体とを分散処理した後、凍結乾燥処理することにより調製することができる。凍結乾燥処理は、常法により行うことができる。例えば、上記の分散処理後の複合体溶液を無菌状態にて所定量をバイアル瓶に分注し、約-40〜-20℃の条件で予備乾燥を約2時間程度行い、約0〜10℃で減圧下に一次乾燥を行い、次いで、約15〜25℃で減圧下に二次乾燥して凍結乾燥することができる。そして、例えばバイアル内部を窒素ガスで置換し、打栓することにより、本発明の医薬組成物の凍結乾燥製剤を得ることができる。

凍結乾燥製剤は、任意の適当な溶液の添加によって再溶解し、使用することができる。このような溶液としては、例えば注射用水、生理食塩水等の電解質液、ブドウ糖液、及びその他一般輸液等が挙げられる。用いられる溶液の液量は、用途等によって異なり、特に制限されないが、凍結乾燥前の液量の0.5〜2倍量、又は500mＬ以下が好ましい。

本発明の医薬組成物は、ヒトを含む動物に対し、例えば静脈内投与、動脈内投与、経口投与、組織内投与、経皮投与、経粘膜投与、又は経直腸投与することができるが、患者の症状に合わせた適切な方法により投与することが好ましい。特に静脈内投与、経皮投与、及び経粘膜投与が好ましく用いられる。また、癌内局所投与等、局所投与をすることもできる。これらの投与方法に適した剤型としては、例えば各種の注射剤、経口剤、点滴剤、吸収剤、点眼剤、軟膏剤、ローション剤、及び坐剤等が挙げられる。

本発明の医薬組成物の用量は、薬物、剤型、年齢、及び体重等の患者の状態、投与経路、並びに疾患の性質と程度等を考慮した上で決定することが望ましいが、通常は核酸の質量として、成人に対して1日当たり、通常、0.1mg〜10g／日、好ましくは1mg〜500mg／日である。場合によっては、これ以下でも十分であるし、また逆にこれ以上の用量を必要とすることもある。また1日1回〜数回投与することもでき、1日〜数日の間隔をおいて投与することもできる。

以下に、本発明を実施例により説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例1 二本鎖核酸の合成
シグマアルドリッチ社に依頼して、配列番号２〜６４４に示すリボヌクレオチドから成るセンス鎖核酸、配列番号６４５〜１２８７に示すリボヌクレオチドから成るアンチセンス鎖核酸、及びそれらをアニーリングさせた二本鎖核酸（配列番号ｎ(ｎ＝２〜６４４)に示すセンス鎖核酸と配列番号［ｎ＋６４３］に示すアンチセンス鎖核酸とが対をなす）を合成した。

実施例2 APCS mRNAのノックダウン活性の測定
384ウェルの培養プレートに、実施例１で合成した二本鎖核酸とRNAiMaxトランスフェクション試薬(Thermo Fisher Scientific社製、カタログ番号13778150)をOpti-MEM I Reduced Serum Medium培地(Thermo Fisher Scientific社製、カタログ番号31985070)で希釈したsiRNA/RNAiMax混合液20 μLを添加した。ヒト卵巣癌由来の細胞株であるRMG-I細胞（JCRB細胞バンク、JCRB0172）を、10,000細胞/40 μL/ウェルとなるよう各々384ウェルの培養プレートに播種し、37℃、5% CO₂条件下で24時間培養した。培地は、10%ウシ胎仔血清(Thermo Fisher Scientific社製、カタログ番号10091-148)を含むHam’s F-12 Nutrient Mix培地(Thermo Fisher Scientific社製、カタログ番号11765-047)を用いた。二本鎖核酸の終濃度は1 nMとなるようにした。その後、細胞をDPBS, no calcium, no magnesium（Thermo Fisher Scientific社製、カタログ番号14190-144）で洗浄し、各々のプレートからTaqMan（登録商標） Fast Cells-to-CT（商標）キット（Thermo Fisher Scientific社製、カタログ番号4399003）を用いて以下の方法でcDNAを合成した。Lysis solution（キット内容物）とDNase I（キット内容物）を100：1で混合した溶液を10 μLずつ添加し、5分間混合した。Stop Solution（キット内容物）を1 μLずつ添加、2分間混合し、RNA抽出液とした。5 μLの2×RT Buffer（キット内容物）、0.5 μLの20×RT Enzyme Mix（キット内容物）、2.5 μLのNuclease-free Water、2 μLのRNA抽出液を混合し、これを37℃60分、95℃5分で反応させ、cDNAを合成した。このcDNA 2 μLをMicroAmp（登録商標） EnduraPlate（商標） Optical 384-Well Clear Reaction Plates with Barcode（Thermo Fisher Scientific社製、カタログ番号4483285）に加え、更に5 μLのTaqMan（登録商標） Fast Universal PCR Master Mix（Thermo Fisher Scientific社製、カタログ番号4352042）、2.5 μLのDISTILLED WATER (ULTRAPURE)（Thermo Fisher Scientific社製、カタログ番号10977015）、0.25 μLのhuman APCSプローブ、0.25 μLのhuman ACTBプローブを添加した。QuantStudio（商標） 7 Flexを用いて、human APCS遺伝子及びhuman ACTB（actin beta）遺伝子のリアルタイムPCRをおこなった。ACTBは構成的発現遺伝子であり内部対照として測定し、APCS遺伝子発現量を補正した。siRNAを添加せずにトランスフェクション試薬だけでRMG-I細胞を処理した時のAPCS mRNA量を1.0として、各siRNAを導入した時のAPCS mRNA相対発現量値を算出した。本実験を2回おこない、APCS mRNA相対発現量値の最小値を表１に示した。表１は、便宜上、以下のとおり分割して示す。

なお、APCS 2nd strand cDNAの全長の塩基配列を表２に示す。

実施例3 化学修飾した二本鎖核酸のノックダウン活性
ジーンデザイン社に依頼して、配列番号１９３１〜１９７４に示すリボヌクレオチドから成るセンス鎖核酸、配列番号１９７５〜２０１８に示すリボヌクレオチドから成るアンチセンス鎖核酸、及びそれらをアニーリングさせた二本鎖核酸（配列番号ｎ(ｎ＝１９３１〜１９７４)に示すセンス鎖と配列番号［ｎ＋４４］に示すアンチセンス鎖とが対をなす）を合成した。
合成した二本鎖核酸の終濃度は1 nM、又は0.1 nMとなるようにし、当該二本鎖核酸をRMG-1細胞に導入し、24時間培養した以外は、実施例2と同様の操作を行って、APCS mRNA相対発現量を算出した。本実験を4回おこない、APCS mRNA相対発現量値の中央値を表３に示した。表３において、N(M)は2’-O-methyl-RNAを、N(F)は2’-F-RNAを示す。ここで、NはA、C、G又はUを示す。表３は、便宜上、以下のとおり分割して示す。

本出願は、日本国で出願された特願2017−108502（出願日：2017年5月31日）を基礎としており、ここで言及することにより、その内容は本明細書に全て包含される。

本発明により、APCSの発現抑制活性を有する核酸及び該核酸を有効成分とする医薬組成物等が提供される。本発明の核酸及び医薬組成物は、APCSの発現を抑制し、アミロイド関連疾患の治療剤又は予防剤として用いることができる。

配列番号１ APCS 2nd strand cDNAの全長の塩基配列を示す。
配列番号２〜６４４センス鎖核酸の塩基配列を示す。
配列番号６４５〜１２８７アンチセンス鎖核酸の塩基配列を示す。
配列番号１２８８〜１９３０標的APCS mRNA配列の塩基配列を示す。
配列番号１９３１〜１９７４センス鎖核酸の塩基配列を示す。
配列番号１９７５〜２０１８アンチセンス鎖核酸の塩基配列を示す。

Claims

センス鎖核酸及びアンチセンス鎖核酸からなり、少なくとも11個の塩基対の二重鎖領域を含む二本鎖核酸であって、前記アンチセンス鎖核酸中の、少なくとも17個のヌクレオチドかつ多くとも30個のヌクレオチドの鎖長のオリゴヌクレオチド鎖において、配列番号１２８８〜１９３０のいずれかで表される塩基配列を含む標的APCS mRNA配列と相補的である、APCS遺伝子の発現を抑制させる二本鎖核酸。
前記二重鎖領域が11〜27個の塩基対であり、前記アンチセンス鎖核酸の5’末端から2番目のヌクレオチドが、前記標的APCS mRNA配列の3’末端から2番目のデオキシリボヌクレオチドと相補する、請求項１に記載の二本鎖核酸。
前記センス鎖核酸の3’末端及び前記アンチセンス鎖核酸の5’末端、並びに／又は、前記センス鎖核酸の5’末端及び前記アンチセンス鎖核酸の3’末端が、平滑末端を形成する、請求項１又は２に記載の二本鎖核酸。
前記センス鎖核酸は、21個のヌクレオチドの鎖長を有し、かつ前記アンチセンス鎖核酸は、21個のヌクレオチドの鎖長を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の二本鎖核酸。
19個の塩基対の二重鎖領域を含み、該二重鎖領域内の４０〜６５％のヌクレオチドが2’-O-メチル修飾ヌクレオチドである、請求項４に記載の二本鎖核酸。
前記アンチセンス鎖核酸は、配列番号６４５〜１２８７及び１９７５〜２０１８のいずれかで表される塩基配列を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の二本鎖核酸。
前記センス鎖核酸は、配列番号２〜６４４及び１９３１〜１９７４のいずれかで表される塩基配列を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の二本鎖核酸。
前記センス鎖核酸は、配列番号２〜６４４及び１９３１〜１９７４のいずれかで表される塩基配列を含み、それに対応して、前記アンチセンス鎖核酸は、配列番号６４５〜１２８７及び１９７５〜２０１８のいずれかで表される塩基配列を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の二本鎖核酸。
リガンドを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の二本鎖核酸。
請求項１〜９のいずれか一項に記載の二本鎖核酸の、アンチセンス鎖核酸のみからなる一本鎖核酸。
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の核酸を含む、医薬組成物。
APCSを含んだアミロイド線維により媒介される障害を治療する方法であって、治療上有効量の、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の核酸又は請求項１１に記載の医薬組成物を、そのような治療を必要とするヒトに投与するステップを含む方法。
前記障害が、アミロイド関連疾患である、請求項１２に記載の方法。