JPWO2017010500A1 - β２ＧＰＩの発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチド - Google Patents

Abstract

本発明の目的は、β2GPIの発現を抑制することが可能な新規核酸、並びに、β2GPIの発現に関連する疾患を予防または治療するための医薬組成物を提供することである。本発明は、β2GPIの発現抑制活性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、該アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物ならびに該アンチセンスオリゴヌクレオチドを含むβ2GPIの発現を抑制し、APS、SLEなどの自己免疫疾患ならびに血液透析における血栓症の予防または治療薬を提供することで上記課題を解決する。

Description

本発明は、β2GPIの発現抑制に用いるためのアンチセンスオリゴヌクレオチド又は該アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物に関する。

β2-Glycoprotein 1（β2GPI）（別名apolipoprotein H（apoH）とも言う）は326残基のアミノ酸から構成される可溶性の糖蛋白質であり、主に肝臓で産生される（International Journal of Clinical and Laboratory Research, 1992年, 第21巻, p256-263）。β2GPIは多彩な生理作用を有すると考えられており、血小板凝集反応、凝固・線溶反応、酸化LDLのマクロファージへの取り込みに関与していることが報告されている（非特許文献１）。

疾患との関連については、β2GPIは抗リン脂質抗体症候群(APS)や全身性エリテマトーデス(SLE)といった自己免疫疾患において出現する抗リン脂質抗体の主要な対応抗原であることが知られている。抗β2GPI抗体は疾患の病態形成にも深く関与しており、β2GPIと抗β2GPI抗体によって形成される複合体は血管内皮細胞、単球、血小板、栄養芽細胞(trophoblast)といった様々な細胞の膜上受容体に活性化シグナルを発生させ、その結果、血栓症や妊娠異常といったAPSに特徴的な病態を引き起こし得ることが動物モデルを用いた研究ならびに臨床研究より明らかとなっている（非特許文献２）。β2GPIおよび抗β2GPI抗体からなる免疫複合体の形成を特異的に阻害することにより、上記の疾患を予防あるいは治療できると期待できるが、β2GPIは血中に50-500μg/mLという比較的高濃度で存在しており、これら全てのβ2GPIを例えば一般的な抗体医薬によって阻害し続けることは容易ではない（非特許文献３）。

一方、遺伝子の発現自体を抑制する方法として、例えばアンチセンス法が知られている（特許文献１）。具体的には、標的とする遺伝子のmRNAもしくはmRNA前駆体等に対して相補的なオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、細胞内に導入すると標的とする遺伝子のmRNAもしくはmRNA前駆体と二本鎖を形成し、該標的遺伝子の発現を特異的に抑制することができる。また、アンチセンス法以外の遺伝子の発現を抑制する方法として、RNA干渉(RNA interference、以下、RNAiと呼ぶ)を利用した方法も知られている。この方法では、標的とする遺伝子と同一の配列を有する二本鎖RNA(siRNA)を導入することにより、該標的遺伝子の発現を特異的に抑制することができる(特許文献２)。

ヒトβ2GPIを標的とするsiRNA配列の一部は開示されているが（特許文献３、４）、該遺伝子の発現を抑性することは知られておらず、また、アンチセンスオリゴヌクレオチドがヒトβ2GPI遺伝子の発現を抑制することも知られていない。

国際公開第98/56905号パンフレット 国際公開第2001/75164号パンフレット 国際公開第2005/116204号パンフレット 国際公開第2008/043561号パンフレット

Ann. N. Y. Acad. Sci., 1285, 44-58 (2013) N. Engl. J. Med., 368, 1033-1044 (2013) J. Thromb. Haemost., 9, 1275-1284 (2011)

本発明は、β2GPIの発現を抑制することが可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供することを目的とする。また、本発明はβ2GPIの発現に関連する疾患を予防または治療するための医薬組成物を提供することを目的とする。

本発明は、以下の(1)〜(17)に関する。
(1) 8〜80塩基長からなるアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、配列番号201〜399のいずれかで表される塩基配列からなる核酸(表1-1〜1-4に記載された「標的塩基配列」)にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列を含む、β2GPIの発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチド。
(2) 8〜80塩基長からなるアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、配列番号2〜200のいずれかで表される塩基配列(表1-1〜1-4に記載された「アンチセンス塩基配列」)の連続する少なくとも8塩基を含む、β2GPIの発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチド。
(3) 8〜80塩基長からなるアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、配列番号201〜399のいずれかで表される塩基配列(表1-1〜1-4の「標的塩基配列」に記載された群から選択される塩基配列)と相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
(4) 配列番号2〜200のいずれかで表される塩基配列(表1-1〜1-4の「アンチセンス塩基配列」に記載された群から選択される塩基配列)を含む、(3)に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
(5) 配列番号2〜200のいずれかで表される塩基配列において1もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された配列を含む、(3)に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
(6) 配列番号2〜200のいずれかで表される塩基配列からなるアンチセンスオリゴヌクレオチド。
(7) 配列番号400〜680のいずれかで表される塩基配列からなるアンチセンスオリゴヌクレオチド。
(8) 5’末端近傍及び／又は3’末端近傍が糖部修飾ヌクレオチドで構成される、(1)〜(7)のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
(9) リガンドを含む、(1)〜(8)のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
(10) (1)〜(9)のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、医薬組成物。
(11) 自己免疫疾患又は血栓症の治療又は予防用である、(10)に記載の医薬組成物。
(12) 抗β2GPI抗体により媒介される障害を治療する方法であって、治療上有効量の(1)〜(9)のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は(10)もしくは(11)に記載の医薬組成物を、そのような治療を必要とするヒトに投与するステップを含む方法。
(13) 前記障害が、自己免疫疾患又は血栓症である、(12)に記載の方法。
(14) 抗β2GPI抗体により媒介される障害の予防又は治療用の医薬組成物を製造するための、(1)〜(9)のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用。
(15) 前記障害が、自己免疫疾患又は血栓症である、(14)に記載の使用。
(16) 抗β2GPI抗体により媒介される障害の予防又は治療における使用のための、(1)〜(9)のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
(17) 前記障害が、自己免疫疾患又は血栓症である、(16)に記載のアンチセンスヌクレオチド。

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は該アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を投与することによって、β2GPIの発現を抑制することが可能となる。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は該アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物はβ2GPIの発現に関連する疾患、特に抗β2GPI抗体により媒介される障害の治療又は予防に有用である。

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドが標的とするβ2GPIをコードする遺伝子(以下、β2GPI遺伝子ともいう)は、Genbank Accession No.NM_000042として登録されている、β2GPIの完全長mRNAに対応するcDNA塩基配列(配列番号1)が挙げられる。

1.本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド
本発明において、アンチセンスオリゴヌクレオチドとは標的遺伝子をコードするDNA並びにこのようなDNAから転写されるmRNA前駆体およびmRNAに対して相補的なオリゴヌクレオチドであり、当該アンチセンスオリゴヌクレオチドが標的とするDNA、mRNA前駆体又はmRNAと二本鎖又は三本鎖を形成することによりDNA、mRNA前駆体又はmRNAの働き（転写、転写後編集、翻訳など）を抑制する。アンチセンスオリゴヌクレオチドには、標的となるDNA、mRNA前駆体又はmRNAと完全に相補的であるもののみならず、DNA、mRNA前駆体又はmRNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズできる限り、1もしくは数個のミスマッチが存在するものも含まれる。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドとは、標的遺伝子にハイブリダイズする核酸であれば、ヘアピンオリゴマー、環状オリゴマーの形態中に導入されてもよく、内部または末端のバルジまたはループなどの構造要素を含有してもよい。
本発明は、β2GPIの発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチド（本明細書中、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドともいう）を提供する。

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、ヌクレオチド又は該ヌクレオチドと同等の機能を有する分子が重合した分子であればいかなる分子であってもよく、例えばデオキシリボヌクレオチドの重合体であるDNA、リボヌクレオチドの重合体であるRNA、DNAとRNAとからなるキメラ核酸及びこれらの核酸の少なくとも一つのヌクレオチドが該ヌクレオチドと同等の機能を有する分子で置換されたヌクレオチド重合体が挙げられる。またRNA中のウラシル（U）は、DNAにおいてはチミン（T）に一義的に読み替えることができる。

ヌクレオチドと同等の機能を有する分子としては、例えばヌクレオチド誘導体等が挙げられる。ヌクレオチド誘導体としては、ヌクレオチドに修飾を施した分子であればいかなる分子であってもよいが、例えばDNAまたはRNAと比較して、ヌクレアーゼ耐性の向上もしくは安定化させるため、相補鎖核酸とのアフィニティーを上げるため、細胞透過性を上げるため、又は可視化させるために、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドに修飾を施した分子等が好適に用いられる。

ヌクレオチドに修飾を施した分子としては、例えば糖部修飾ヌクレオチド、リン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチド、塩基修飾ヌクレオチド、ならびに糖部、リン酸ジエステル結合及び塩基の少なくとも一つが修飾されたヌクレオチド等が挙げられる。

糖部修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドの糖の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾もしくは置換したもの、又は任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよいが、2’-修飾ヌクレオチドが好ましく用いられる。

2’-修飾ヌクレオチドとしては、例えばリボースの2’-OH基がR、R’OR、SH、SR、NH₂、NHR、NR₂、N₃、CN、F、Cl、Br及びIからなる群(Rはアルキルまたはアリール、好ましくは炭素数1〜6のアルキルであり、R’はアルキレン、好ましくは炭素数1〜6のアルキレンである)から選択される置換基で置換された2’-修飾ヌクレオチドが挙げられ、該置換基としては好ましくはF、メトキシ基が挙げられる。また、2-(methoxy)ethoxy基、3-aminopropoxy基、2-[(N,N-dimethylamino)oxy]ethoxy基、3-(N,N-dimethylamino)propoxy基、2-[2-(N,N-Dimethylamino)ethoxy]ethoxy基、2-(methylamino)-2-oxoethoxy基、2-(N-methylcarbamoyl)ethoxy基及び2-cyanoethoxy基からなる群から選択される置換基で置換された2’-修飾ヌクレオチド等も好ましい置換基として挙げられる。より好ましくはメトキシ基及び2-(methoxy)ethoxy基からなる群から選択される置換基で置換された2’-修飾ヌクレオチド等が挙げられる。

また、糖部修飾ヌクレオチドとしては、糖部に架橋構造を導入することにより2つの環状構造を有する架橋構造型人工核酸(Bridged Nucleic Acid)(BNA)も好適に用いられる。具体的には、2'位の酸素原子と4'位の炭素原子がメチレンを介して架橋したロックト人工核酸(Locked Nucleic Acid)(LNA) [Tetrahedron Letters, 38, 8735, (1997)及びTetrahedron, 54, 3607,(1998)]、エチレン架橋構造型人工核酸(Ethylene bridged nucleic acid)(ENA)[Nucleic Acid Research, 32, e175(2004)]、Constrained Ethyl (cEt)[The Journal of Organic Chemistry 75, 1569 (2010)]、Amido-Bridged Nucleic Acid (AmNA)[Chem Bio Chem 13, 2513 (2012)]及び2’-O,4’-C-Spirocyclopropylene bridged nucleic acid (scpBNA)[Chem. Commun., 51, 9737 (2015)]等が挙げられる。

さらにペプチド核酸(PNA)[Acc. Chem. Res., 32, 624 (1999)]、オキシペプチド核酸(OPNA)[J. Am. Chem. Soc., 123, 4653 (2001)]、ペプチドリボ核酸(PRNA)[J. Am. Chem. Soc., 122, 6900 (2000)]等も糖部修飾ヌクレオチドとして挙げられる。

リン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾もしくは置換したもの、又は任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよく、例えば、リン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に置換されたヌクレオチド、リン酸ジエステル結合がホスホロジチオエート結合に置換されたヌクレオチド、リン酸ジエステル結合がアルキルホスホネート結合に置換されたヌクレオチド、リン酸ジエステル結合がホスホロアミデート結合に置換されたヌクレオチド等が挙げられ、好ましくはリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に置換されたヌクレオチドが挙げられる。

塩基修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドの塩基の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾もしくは置換したもの、又は任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよく、例えば、塩基内の酸素原子が硫黄原子で置換されたもの、水素原子が炭素数1〜6のアルキル基、ハロゲン基で置換されたもの、メチル基が水素、ヒドロキシメチル、炭素数2〜6のアルキル基で置換されたもの、アミノ基が炭素数1〜6のアルキル基、炭素数1〜6のアルカノイル基、オキソ基、ヒドロキシ基等に置換されたものが挙げられる。なお、シトシン（C）の代わりに5-メチルシトシン（5-mC）を塩基修飾ヌクレオチドとして用いることも、本発明の好ましい形態の一つである。

ヌクレオチド誘導体としては、ヌクレオチド又は糖部、リン酸ジエステル結合もしくは塩基の少なくとも一つが修飾されたヌクレオチド誘導体に、コレステロール、脂肪酸、トコフェロール、レチノイドなどの脂質類、N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)、ガラクトース(Gal)、マンノース(Man)などの糖類、フル抗体、Fab（Fragment antigen-binding抗体）、scFv（Single-chain variable fragment抗体）及びVHH（variable domain of heavy chain抗体）などの抗体、低密度リポタンパク質（LDL）、ヒト血清アルブミンなどのタンパク質、RGD、NGR、R9、CPP（cell penetrating peptide）などのペプチド類、フェナジン、フェナントリジン、アントラキノン、葉酸などの低分子、合成ポリアミノ酸などの合成ポリマー、核酸アプタマー、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリンなどの色素、Cy3シリーズ、Alexaシリーズ、ブラックホールクエンチャーなどの蛍光団等の別の化学物質を、直接又はリンカーを介して付加したものも挙げられる。具体的にはポリアミン付加ヌクレオチド誘導体、コレステロール付加ヌクレオチド誘導体、ステロイド付加ヌクレオチド誘導体、GalNAc付加ヌクレオチド誘導体、胆汁酸付加ヌクレオチド誘導体、脂肪酸付加ヌクレオチド誘導体、ビタミン付加ヌクレオチド誘導体、Cy5付加ヌクレオチド誘導体、Cy3付加ヌクレオチド誘導体、6-FAM付加ヌクレオチド誘導体及びビオチン付加ヌクレオチド誘導体等が挙げられ、好ましくはGalNAc付加ヌクレオチド誘導体が挙げられる。これらは、固相上での伸長反応時に、固相上で反応可能な修飾剤を反応させることで、5’末端、3’末端及び／又は配列内部に修飾を施すことができる。また、アミノ基、メルカプト基、アジド基または３重結合などの官能基を導入した核酸をあらかじめ合成および精製しておき、それらに修飾剤を作用させることで得ることもできる。

ヌクレオチド誘導体は、核酸内の他のヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体とアルキレン構造、ペプチド構造、ヌクレオチド構造、エーテル構造、エステル構造及びこれらの少なくとも一つを組み合わせた構造等の架橋構造を形成してもよい。

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、その分子中の一部あるいは全部の原子が質量数の異なる原子（同位体）で置換されたものも包含する。
本明細書において「相補」とは、2つの塩基間で塩基対合をし得る関係を意味し、例えば、アデニンとチミンまたはウラシルとの関係、並びにグアニンとシトシンとの関係のように緩やかな水素結合を介して、二重鎖領域全体として２重螺旋構造をとるものをいう。

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの長さは、8〜80塩基であり、8〜30塩基が好ましい。例えば、8〜20塩基、10〜20塩基、13〜20塩基、13〜16塩基、13塩基、14塩基、15塩基、16塩基、17塩基、18塩基、19塩基、20塩基であり得る。

特定の好ましい具体的な塩基配列は本明細書中に記載されるが、表1-1〜1-4に記載されたアンチセンス塩基配列の中から選択された少なくとも8個の連続した塩基を含む長さ8〜80塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドもまた、好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドと言える。表１に記載されたアンチセンス塩基配列の中から選択された、より好ましくは９個以上、さらに好ましくは１０個以上、より一層好ましくは１１個以上、特に好ましくは１２個以上、最も好ましくは１３個の連続した塩基を含む、長さ8〜80塩基、好ましくは８〜30塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドもまた、好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドと言える。

典型的な好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドには、表1-1〜1-4に記載されたアンチセンス塩基配列（配列番号2〜200のいずれかで表される配列）の5’末端から少なくとも8個、より好ましくは９個以上、さらに好ましくは１０個以上、より一層好ましくは１１個以上、特に好ましくは１２個以上、最も好ましくは１３個の連続した核酸塩基を含むオリゴヌクレオチドが含まれる。同様に好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、表１に記載されたアンチセンス塩基配列の3’末端から少なくとも8個以上、より好ましくは９個以上、さらに好ましくは１０個以上、より一層好ましくは１１個以上、特に好ましくは１２個以上、最も好ましくは１３個の連続した核酸塩基を含むオリゴヌクレオチドが含まれる。

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、表2-1〜2-3、表3-1〜3-2又は４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号400〜680のいずれかで表される配列）を用いることが好ましい。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、表2-1〜2-3、表3-1〜3-2及び４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、該表に記載のβ2GPI相対発現量が0.5以下であるアンチセンスオリゴヌクレオチド配列（例、配列番号407、408、415、418、424、427〜430、437、440、443、445〜454、456〜460、462、463、465、470、471、481〜484、492、505、506、508、509、511〜519、523、524〜527、529、531〜533、535〜537、539、542、546〜548、550〜554、558〜560、565〜569、574、575、577、578、582〜597、599〜641、643〜680のいずれかで表される配列）を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いることがより好ましく、さらに好ましくはβ2GPI相対発現量が0.3以下であるアンチセンスオリゴヌクレオチド（例、配列番号445、450、456、457、459、462、471、482、509、513、514、518、523、525、526、529、553、565、566、567、584、585、586〜597、599、600、602〜611、613、615〜621、624〜630、633〜641、643、644、645、647、648、649、651〜657、659〜680のいずれかで表される配列）、特に好ましくはβ2GPI相対発現量が0.1以下であるアンチセンスオリゴヌクレオチド（例、配列番号586、587、588、590、591、592、593、602、603、604、605、608、617、618、620、624、625、627、636、640、641、652、656、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、671、672、673、675のいずれかで表される配列）を用いることができる。

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、β2GPI遺伝子の一部の標的塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸を含み、かつβ2GPIの発現を抑制する核酸が用いられるが、該核酸のうち1〜3塩基、好ましくは1〜2塩基、より好ましくは1塩基が欠失、置換または付加したものを用いてもよい。

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞内に導入されると、相補的なmRNA及びmRNA前駆体と結合し、mRNA及びmRNA前駆体が蛋白質に翻訳されるのを立体的に阻害してβ2GPI遺伝子の発現を抑制することができる。
また、細胞内に導入された本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞内において、相補的なmRNA及びmRNA前駆体と結合し、mRNA及びmRNA前駆体を切断することもある。このような例として、RNAとDNAの二重鎖のRNA鎖を切断するエンドヌクレアーゼであるRNaseHを介した作用が知られている。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドが細胞内でmRNA及びmRNA前駆体と二重鎖を形成すると、内在性のRNaseHに認識され、相補的なmRNA鎖を酵素的に分解することができる。

RNaseHによるmRNA及びmRNA前駆体の切断を誘導するには、連続する４〜８０個のヌクレオチドからなるDNA領域を持つアンチセンスオリゴヌクレオチドが好ましい。この場合、アンチセンスオリゴヌクレオチドは0〜80%の糖部修飾ヌクレオチドを持つことが好ましく、10〜60%がより好ましく、20〜50%がさらに好ましい。また、糖部修飾ヌクレオチドを持つ場合、DNA領域は、連続する４〜２０個のヌクレオチドからなることがより好ましく、連続する４〜１５個のヌクレオチドからなることがさらに好ましく、連続する５〜１０個のヌクレオチドからなることが最も好ましい。更に、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおける糖部修飾ヌクレオチドの位置は、5’末端近傍及び／又は3’末端近傍に配置することが好ましく、5’末端から全長の長さの30%以内の位置及び／又は3’末端から全長の長さの30%以内の位置に配置することがより好ましく、糖部修飾ヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチドの5’末端から全長の長さの25%以内の位置及び／又は3’末端から全長の長さの25%以内の位置に配置することがさらに好ましい。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、5’末端近傍及び／又は3’末端近傍が糖部修飾ヌクレオチドで構成されることが特に好ましい。本明細書中、5’末端近傍が糖部修飾ヌクレオチドで構成されるとは、5’末端から１〜４個、好ましくは2〜4個の連続するヌクレオチドが糖部修飾ヌクレオチドであることを意味し、3’末端近傍が糖部修飾ヌクレオチドで構成されるとは、3’末端から１〜４個、好ましくは2〜4個の連続するヌクレオチドが糖部修飾ヌクレオチドであることを意味する。すなわち、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、その5’末端から１〜4個のヌクレオチドが糖部修飾ヌクレオチドであるアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いることが好ましく、より好ましくは5’末端から2〜4個のヌクレオチドが糖部修飾ヌクレオチドであるものを用いることができる。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、その3’末端から1〜４個のヌクレオチドが糖部修飾ヌクレオチドであるアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いることが好ましく、より好ましくは3’末端から2〜4個のヌクレオチドが糖部修飾ヌクレオチドであるものを用いることができる。

本発明において、ストリンジェントな条件とは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドがβ2GPI遺伝子の標的塩基配列に対してはハイブリダイズするが、その他の配列にはハイブリダイズしないか、するとしても標的塩基配列にハイブリダイズする量よりも大幅に少なく、相対的に無視できる程度の微量しかハイブリダイズしない条件を意味する。ハイブリダイゼーション反応および洗浄時の温度や、ハイブリダイゼーション反応液および洗浄液の塩濃度等を変化させることによって、このような条件を容易に選択することができる。具体的には６xＳＳＣ（0.9M NaCl, 0.09M クエン酸三ナトリウム）又は６xＳＳＰＥ（3M NaCl, 0.2M NaH₂PO₄, 20mM EDTA・2Na, pH7.4）中４２℃でハイブリダイズさせ、さらに４２℃で０．５xＳＳＣにより洗浄する条件が、ストリンジェントな条件の一例として挙げられるが、これに限定されるものではない。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えばサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることができる。具体的には、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）等に記載されている方法に準じて行うことができる。

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを製造する方法としては、特に限定されず、公知の化学合成を用いる方法、あるいは、酵素的転写法等が挙げられる。公知の化学合成を用いる方法として、ホスホロアミダイト法、ホスホロチオエート法、ホスホトリエステル法、CEM法[Nucleic Acid Research, 35, 3287 (2007)]等を挙げることができ、例えば、ABI3900ハイスループット核酸合成機(アプライドバイオシステムズ社製)により合成することができる。合成が終了した後は、固相からの脱離、保護基の脱保護および目的物の精製等を行う。精製により、純度90%以上、好ましくは95%以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドを得るのが望ましい。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを製造する酵素的転写法としては、目的の塩基配列を有したプラスミド又はDNAを鋳型としてファージRNAポリメラーゼ、例えば、T7、T3、またはSP6RNAポリメラーゼを用いた転写による方法が挙げられる。

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、トランスフェクション用の担体、好ましくはカチオン性リポソーム等のカチオン性担体を用いて細胞内に導入することができる。また、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法又はマイクロインジェクション法などにより、直接細胞内に導入することもできる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、相補的なオリゴ核酸と二重鎖を形成させ、二重鎖核酸として細胞内に導入することで標的遺伝子の発現抑制を誘導することもできる（特許文献 国際公開第2005/113571号パンフレット）。この場合の二重鎖核酸をリガンドで修飾する位置は、相補的なオリゴ核酸の5’末端又は3’末端が好ましい。

2.β2GPIの発現抑制活性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド
本発明のβ2GPI遺伝子の一部の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、Genbank Accession No.NM_000042として登録されているヒトβ2GPIの完全長mRNAのcDNA塩基配列(配列番号１)あるいはゲノム配列に基づいて設計することができる。ヒトβ2GPIの完全長mRNAのcDNAは例えば、Genbank Accession No.NM_000042として登録されており、またヒトβ2GPIのmRNA前駆体を含むゲノム配列は、例えばGenbank Accession No. NC_000017.11として登録されている。

β2GPI遺伝子の一部の標的塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸のうち、β2GPIの発現抑制活性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、例えば表1〜表４に記載された群から選択される塩基配列で構成されるアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。アンチセンスオリゴヌクレオチドの長さは、8〜80塩基であり、8〜30塩基が好ましい。例えば、8〜20塩基、10〜20塩基、13〜20塩基、13〜16塩基、13塩基、14塩基、15塩基、16塩基、17塩基、18塩基、19塩基、20塩基であり得る。

これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞に導入することにより、β2GPIの発現を抑制することができる。例えば本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、数nM〜数μMの濃度で、細胞に導入した後、24時間以上、例えば48時間培養した段階でβ2GPIの発現を抑制することができる。

また、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドのβ2GPIの発現抑制活性の評価は、該アンチセンスオリゴヌクレオチドをカチオン性リポソームなどを用いて、もしくは該アンチセンスオリゴヌクレオチドをそのまま、あるいは該アンチセンスオリゴヌクレオチドを何らかのリガンドと結合させて、ヒト細胞株などへ導入し、一定時間培養した後、当該ヒト細胞株におけるβ2GPIのmRNAの発現量を定量することにより行うことができる。

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、リガンドを含んでもよい。該リガンドは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの5'末端、3'末端および／または配列内部を、直接修飾するものであってもよい。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドに含まれるリガンドとしては、生体分子と親和性のある分子であれば良いが、例えば、コレステロール、脂肪酸、トコフェロール、レチノイドなどの脂質類、N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)、ガラクトース(Gal)、マンノース(Man)などの糖類、フル抗体、Fab、scFv及びVHHなどの抗体、低密度リポタンパク質（LDL）、ヒト血清アルブミンなどのタンパク質、RGD、NGR、R9、CPPなどのペプチド類、葉酸などの低分子、合成ポリアミノ酸などの合成ポリマー、あるいは核酸アプタマーなどがあげられるがこれらに限定されず、これらを適宜組み合わせて用いることもできる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドにリガンドを付加する方法としては、例えば、固相上での伸張反応時に、固相上で反応可能な修飾剤を反応させることで、5'末端、3'末端および／または配列内部に修飾を施すことができるが、これに限定されない。また、アミノ基、メルカプト基、アジド基または３重結合などの官能基を導入した核酸をあらかじめ合成および精製しておき、それらに修飾剤を作用させることでコンジュゲート核酸を得ることもできる。

3.本発明の医薬組成物
本発明は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する医薬組成物（本明細書中、本発明の医薬組成物ともいう）に関する。
当該医薬組成物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞内に移行させるのに有効な担体をさらに含むことができる。本発明の医薬組成物は、APS、SLEといった自己免疫疾患及び血液透析等における血栓症の治療剤又は予防剤として用いることができる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞内に移行させるのに有効な担体としては、例えばカチオン性担体が挙げられる。カチオン性担体としては、カチオン性リポソームおよびカチオン性ポリマーなどが挙げられる。また、アンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞内に移行させるのに有効な担体として、ウイルスエンベロープを利用した担体を用いてもよい。カチオン性リポソームとしては、2-O-(2-ジエチルアミノエチル)カルバモイル-1,3-O-ジオレオイルグリセロールを含有するリポソーム(以下リポソームAともいう)、オリゴフェクトアミン(Invitrogen社)、リポフェクチン(Invitrogen社)、リポフェクトアミン(Invitrogen社)、リポフェクトアミン2000(Invitrogen社)、DMRIE-C(Invitrogen社)、GeneSilencer(Gene Therapy Systems社)、TransMessenger(QIAGEN社)、TransIT TKO(Mirus社)などが好ましく用いられる。カチオン性ポリマーとしては、JetSI(Qbiogene社)、Jet-PEI(ポリエチレンイミン;Qbiogene社)などが好ましく用いられる。ウイルスエンベロープを利用した担体としては、GenomeOne(HVJ-Eリポソーム;石原産業社)などが好ましく用いられる。

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドに上記担体を含む本発明の医薬組成物は、当業者に既知の方法により調製することができる。例えば、適当な濃度の担体分散液とアンチセンスオリゴヌクレオチド溶液とを混合して調製することができる。カチオン性担体を用いる場合、アンチセンスオリゴヌクレオチドは水溶液中で負電荷を帯びているため、常法により水溶液中で混合することによって容易に調製することができる。該組成物を調製するために用いる水性溶媒としては、注射用水、注射用蒸留水、生理食塩水などの電解質液、ブドウ糖液、マルトース液などの糖液などが挙げられる。また、該組成物を調製する際のpHおよび温度などの条件は当業者が適宜選択できる。例えば、リポソームAの場合、10%マルトース水溶液中の16mg／mlのリポソーム分散液に、10%マルトース水溶液中のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、pH7.4、25℃で撹拌しながら徐々に添加して調製することができる。

該組成物は、必要ならば超音波分散装置や高圧乳化装置などを用いて分散処理を行うことにより、均一な組成物とすることもできる。担体とアンチセンスオリゴヌクレオチドとを含む組成物の調製に最適な方法及び条件は、用いる担体に依存するので、当業者であれば、上記の方法にとらわれることなく、用いる担体に最適な方法を選択できる。

本発明の医薬組成物としては、アンチセンスオリゴヌクレオチドとリード粒子とを構成成分とする複合粒子および該複合粒子を被覆する脂質膜から構成され、該脂質膜の構成成分が可溶な極性有機溶媒を含む液の中に、該脂質膜の構成成分が分散可能で、該複合粒子も分散可能な濃度で該極性有機溶媒を含む液が存在するリポソームも好適に用いられるが、これに限定されない。リード粒子としては、例えば、脂質集合体、リポソーム、エマルジョン粒子、高分子、金属コロイド、微粒子製剤等が挙げられ、好ましくはリポソームが用いられる。本発明におけるリード粒子は、脂質集合体、リポソーム、エマルジョン粒子、高分子、金属コロイド、微粒子製剤等を2つ以上組み合わせた複合体を構成成分としていてもよく、脂質集合体、リポソーム、エマルジョン粒子、高分子、金属コロイド、微粒子製剤等と他の化合物(例えば糖、脂質、無機化合物等)とを組み合わせた複合体を構成成分としていてもよい。

該複合粒子を被覆する脂質膜としては、例えば中性脂質およびポリエチレングリコール-ホスファチジルエタノールアミン等を構成成分とするものが挙げられる。

該リポソームは、例えばWO2006/080118等に記載の方法に従って調製することができる。

本発明の医薬組成物に含まれるアンチセンスオリゴヌクレオチドと担体との配合比は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの1重量部に対して担体1〜200重量部が適当である。好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの1重量部に対して担体2.5〜100重量部、さらに好ましくは担体10〜20重量部である。

本発明の医薬組成物には、上記担体の他に、医薬的に許容できるキャリアー又は希釈剤などを含んでいてもよい。医薬的に許容できるキャリアー又は希釈剤などは、本質的に化学的に不活性及び無害な組成物であり、本発明の医薬組成物の生物学的活性に全く影響を与えないものである。そのようなキャリアー又は希釈剤の例は、塩溶液、糖溶液、グリセロール溶液、エタノールなどがあるが、これらに限定されない。

本発明の医薬組成物は、β2GPIの発現に関連する疾患、特に、抗β2GPI抗体により媒介される障害の治療又は予防用に好適に用いることができる。本明細書中、抗β2GPI抗体により媒介される障害とは、抗リン脂質抗体症候群（APS）、SLEといった自己免疫疾患及び血液透析における血栓症を指す。従って、本発明の医薬組成物は、APS、SLEといった自己免疫疾患及び血液透析における血栓症の治療剤又は予防剤として用いることができる。

本発明の医薬組成物は、疾患の治療又は予防に有効な量の該複合体を含み、かつ、患者に適切に投与できるような形態で提供され得る。本発明の医薬組成物の製剤形態は、例えば注射剤、点眼剤、吸入用などの液剤、例えば軟膏、ローション剤などの外用剤等であってもよい。

液剤の場合、本発明の医薬組成物の濃度範囲は通常、0.001〜25%(w／v)であり、好ましくは0.01〜5%(w／v)であり、より好ましくは0.1〜2%(w／v)である。本発明の医薬組成物は医薬的に許容される任意の添加剤、例えば、乳化補助剤、安定化剤、等張化剤、pH調整剤等を適当量含有していてもよい。医薬的に許容される任意の添加剤は、該複合体の分散前でも分散後でも適当な工程で添加することができる。

本発明の医薬組成物は、凍結乾燥製剤として提供することもできる。凍結乾燥製剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチドと担体とを分散処理した後、凍結乾燥処理することにより調製することができる。凍結乾燥処理は、常法により行うことができる。例えば、上記の分散処理後の複合体溶液を無菌状態にて所定量をバイアル瓶に分注し、約-40〜-20℃の条件で予備乾燥を約2時間程度行い、約0〜10℃で減圧下に一次乾燥を行い、次いで、約15〜25℃で減圧下に二次乾燥して凍結乾燥することができる。そして、例えばバイアル内部を窒素ガスで置換し、打栓することにより、本発明の医薬組成物の凍結乾燥製剤を得ることができる。

本発明の医薬組成物を凍結乾燥製剤として提供する場合、本発明の医薬組成物を任意の適当な溶液の添加によって再溶解し、使用することができる。このような溶液としては、注射用水、生理食塩水などの電解質液、ブドウ糖液、その他一般輸液などを挙げることができる。この溶液の液量は、用途などによって異なり、特に制限されないが、凍結乾燥前の液量の0.5〜2倍量、または500ml以下が好ましい。

本発明の医薬組成物は、ヒトを含む動物に対し、例えば静脈内投与、動脈内投与、経口投与、組織内投与、経皮投与、経粘膜投与又は経直腸投与することができるが、患者の症状に合わせた適切な方法により投与することが好ましい。特に静脈投与、経皮投与、経粘膜投与が好ましく用いられる。また、癌内局所投与など、局所投与をすることもできる。これらの投与方法に適した剤型としては、例えば各種の注射剤、経口剤、点滴剤、吸収剤、点眼剤、軟膏剤、ローション剤、坐剤等が挙げられる。

本発明の医薬組成物の用量は、薬物、剤型、年齢や体重などの患者の状態、投与経路、疾患の性質と程度などを考慮した上で決定することが望ましいが、通常はアンチセンスオリゴヌクレオチドの質量として、成人に対して1日当たり、0.1mg〜10g／日、好ましくは1mg〜500mg／日である。場合によっては、これ以下でも十分であるし、また逆にこれ以上の用量を必要とすることもある。また1日1回〜数回投与することもでき、1日〜数日の間隔をおいて投与することもできる。

4.治療方法
本発明はさらに、β2GPIの発現に関連する疾患、特に、抗β2GPI抗体により媒介される障害を治療する方法であって、治療上有効量の、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は本発明の医薬組成物を、そのような治療を必要とするヒトに投与するステップを含む方法（本発明の治療方法）を提供する。
本発明の治療方法は、好ましくは、自己免疫疾患又は血栓症を治療する方法であって、治療上有効量の本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは本発明の医薬組成物を、該治療を必要とするヒトに投与することが特徴である。その他の工程および条件は、何ら制限されない。

本発明の治療方法は、例えば、前記本発明の医薬組成物の投与方法、用量、調製方法等を援用できる。

以下に、本発明を実施例により説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

β2GPI mRNAのノックダウン活性の測定
96ウェルの培養プレートにヒト肝臓癌由来の細胞株であるHuh7細胞（国立研究開発法人 医薬基盤・健康・栄養研究所 JCRB細胞バンクより入手）を、5,000細胞/80μL/ウェルとなるよう播種した。培地は、10%ウシ胎仔血清(FBS)を含むMEM培地(ライフテクノロジー社製、カタログ番号11095-098)を用いた。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、表２〜表４に記載のものをジーンデザイン社または北海道システムサイエンス社にて合成して利用した。表２のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、小文字はDNAを、大文字は2’-O-メチル化RNAを示す。表３及び表４のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、小文字はDNAを、大文字はLNAを示し、mCは5-メチルシトシンLNAを示す。なお、表２〜表４のいずれのアンチセンスオリゴヌクレオチドも各ヌクレオチドはリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合で置換されている。このアンチセンスオリゴヌクレオチドとLipofectamine LTX & Plus試薬(ライフテクノロジー社製、カタログ番号15338)とをOpti-MEM 培地(ライフテクノロジー社製、カタログ番号11058-021)で希釈して、アンチセンスオリゴヌクレオチドの終濃度が100nMとなるように20μLのアンチセンスオリゴヌクレオチド/Lipofectamine混合液を各々96ウェルの培養プレートに添加し、37℃、5% CO₂条件下で24時間培養した。その後、細胞をPBS（Phosphate buffered saline）で洗浄し、各々のプレートからCells-to-Ctキット（アプライドバイオシステムズ社製、カタログ番号:AM1728）を用いて製品に添付された説明書に記載された方法に従いcDNAを合成した。このcDNA 5μLをMicroAmpOptical 96ウェルプレート（アプライドバイオシステムズ社製、カタログ番号4326659）に加え、更に10μLのTaqMan Gene Expression Master Mix（アプライドバイオシステムズ社製、カタログ番号4369016）、3μLのUltraPure Distilled Water（ライフテクノロジーズ社製、カタログ番号:10977-015）、1μLのhuman β2GPIプローブ、1μLのヒト GAPDHプローブを添加した。ABI7900 HTリアルタイムPCRシステムを用いて、ヒト β2GPI遺伝子およびヒト GAPDH（D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）のリアルタイムPCRを行った。GAPDHは構成的発現遺伝子であり内部対照として測定し、β2GPI発現量を補正した。アンチセンスオリゴヌクレオチドを添加せずにトランスフェクション試薬だけでHuh7細胞を処理した時のβ2GPI mRNA量を1.0として、各アンチセンスオリゴヌクレオチドを導入した時のβ2GPI mRNA相対発現量を算出した。本実験を2回行い、β2GPI mRNA相対発現量の平均値を表２〜表４に示した。

本発明により、β2GPIの発現抑制活性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、該アンチセンスオリゴヌクレオチドを有効成分とする医薬組成物などが提供される。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび医薬組成物は、β2GPIの発現を抑制し、APS、SLEなどの自己免疫疾患ならびに血液透析における血栓症の治療及び予防に有用である。

ここで述べられた特許、特許出願明細書、科学文献を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。

本出願は、日本で出願された特願2015-140081（出願日：2015年7月13日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (17)

1. 8〜80塩基長からなるアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、配列番号201〜399のいずれかで表される塩基配列からなる核酸にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列を含む、β2GPIの発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチド。
2. 8〜80塩基長からなるアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、配列番号2〜200のいずれかで表される塩基配列の連続する少なくとも8塩基を含む、β2GPIの発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチド。
3. 8〜80塩基長からなるアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、配列番号201〜399のいずれかで表される塩基配列と相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
4. 配列番号2〜200のいずれかで表される塩基配列を含む、請求項３に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
5. 配列番号2〜200のいずれかで表される塩基配列において1もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された配列を含む、請求項３に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
6. 配列番号2〜200のいずれかで表される塩基配列からなるアンチセンスオリゴヌクレオチド。
7. 配列番号400〜680のいずれかで表される塩基配列からなるアンチセンスオリゴヌクレオチド。
8. 5’末端近傍及び／又は3’末端近傍が糖部修飾ヌクレオチドで構成される、請求項１〜７のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
9. リガンドを含む、請求項1〜８のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
10. 請求項1〜９のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、医薬組成物。
11. 自己免疫疾患又は血栓症の治療又は予防用である、請求項１０に記載の医薬組成物。
12. 抗β2GPI抗体により媒介される障害を治療する方法であって、治療上有効量の、請求項1〜９のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は請求項１０もしくは１１に記載の医薬組成物を、そのような治療を必要とするヒトに投与するステップを含む方法。
13. 前記障害が、自己免疫疾患又は血栓症である、請求項１２に記載の方法。
14. 抗β2GPI抗体により媒介される障害の予防又は治療用の医薬組成物を製造するための、請求項１〜９のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用。
15. 前記障害が、自己免疫疾患又は血栓症である、請求項１４に記載の使用。
16. 抗β2GPI抗体により媒介される障害の予防又は治療における使用のための、請求項１〜９のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
17. 前記障害が、自己免疫疾患又は血栓症である、請求項１６に記載のアンチセンスヌクレオチド。