KR20220002882A - 헌팅톤병을 치료하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents
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Abstract
헌팅톤병의 억제, 치료 및/또는 예방을 위한 조성물 및 방법이 제공된다.
Description
본 출원은 2019년 3월 8일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 62/815,647에 대해 35 U.S.C. §119(e) 하에서의 우선권을 주장한다. 상기 출원은 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 유전자 침묵 분야에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 헌팅틴 유전자의 발현을 조절하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
헌팅톤병 (HD)은 상염색체 우성 신경변성 질환이다. HD는 특정 유전자 (예를 들어, 헌팅틴)에서 다양하게 확장된 트리뉴클레오티드 CAG 반복에 의해 발생하는 적어도 9가지의 상이한 신경변성 질환을 포함하는 폴리글루타민 (폴리Q) 장애 계열의 일부이다 (Walker, F.O. (2007) Lancet, 369:218-228; Walker, F.O. (2007) Semin. Neurol., 27:143-150). 확장의 크기는 발병 연령과 부분적으로 음의 상관관계가 있다 (예를 들어, 성인 발병 vs. 청소년). HD는 헌팅틴 유전자의 제1 엑손 내에서 CAG 반복 확장 (~> 36개 반복)에 의해 유발된다.
헌팅틴 유전자 (htt) 및 단백질 (HTT)은 광범위하게 편재하여 발현되지만, 질환은 (예를 들어, 뇌 내에서) 선택적인 뉴런 취약성 패턴을 갖는다 (Ambrose, et al. (1994) Somat. Cell Mol. Genet., 20:27-38; Landles, et al. (2004) EMBO Rep., 5:958-963). htt의 정상적인 기능 및 돌연변이체 htt의 병리학적 메커니즘 둘 다가 완전히 이해되지 않는다. 독성 기능 획득 및 야생형 기능 손실을 포함한 다수의 메커니즘이 존재할 수 있다. 특히, HTT 단백질의 응집체는 상이한 위치 및 상이한 유형의 뉴런에서 발견될 수 있다.
HD에 대한 치료법은 없으며 치료는 그 증상을 관리하는데 중점을 두고 있다 (Johnson, et al. (2010) Hum. Mol. Genet., 19:R98-R102). 최근 데이터는 전장 및 말단절단된 mRNA 전사체 및 그들의 관련 단백질 생성물이 HD 환자에 존재하고 뉴런 기능장애 및 사망 메커니즘에 기여함을 나타낸다 (Sathasivam, et al. (2013) Proc. Natl. Acad. Sci., 110:2366-2370). 특히, 유전적으로 변형된 마우스 모델의 사용은 돌연변이 헌팅틴 발현이 제거된 경우 심지어 진행된 질환 병기에서도 HD-유사 질환 표현형이 해결될 수 있음을 보여주었다 (Yamamoto, et al. (2000) Cell, 101:57-66; Diaz-Hernandez, et al. (2005) J. Neurosci., 25:9773-9781). 따라서, (전장 및/또는 종결된) 돌연변이체 htt mRNA를 감소시키면 치료적 개입이 유도될 수 있다 (Sah, et al. (2011) J. Clin. Invest., 121:500-507). 그러나, htt 유전자 발현을 조절하는 개선된 방법이 필요하다.
본 발명에 따라, 헌팅틴 유전자 (htt)의 발현을 억제하기 위한 핵산 분자가 제공된다. 특정한 실시양태에서, 핵산 분자는 적어도 하나의 이펙터 도메인에 작동가능하게 연결된 어닐링 도메인을 포함하며, 여기서 어닐링 도메인은 htt의 프리-mRNA에 혼성화되고, 여기서 이펙터 도메인은 U1 snRNP의 U1 snRNA에 혼성화된다. 특정한 실시양태에서, U1AO는 전장 및/또는 말단절단된 htt에 대해 지시될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따라, 핵산 분자는 표적화 모이어티에 (예를 들어, 직접적으로 또는 링커를 통해) 접합될 수 있다. 표적화 모이어티는 5' 단부 및/또는 3' 단부에 접합될 수 있다 (예를 들어, 핵산은 동일하거나 상이한 2개의 표적화 모이어티를 포함할 수 있다). 특정한 실시양태에서, 핵산 분자는 압타머에 접합된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따라, 본 발명의 핵산 분자 중 적어도 하나를 세포에 전달하는 것을 포함하는, htt의 발현을 억제하는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따라, 본 발명의 핵산 분자 중 적어도 하나 및 적어도 하나의 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물이 제공된다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 핵산 분자를 코딩하는 벡터가 또한 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따라, 대상체에서 헌팅톤병을 치료, 억제 및/또는 예방하는 방법이 제공된다. 방법은 치료적 유효량의 본 발명의 적어도 하나의 핵산 분자 (예를 들어, U1AO 또는 U1AO를 코딩하는 벡터)를 그를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 방법은 하나 초과의 U1AO를 투여하는 것을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 방법은 (예를 들어, 별도의 U1AO와 함께) 전장 htt, 말단절단된 htt, 또는 전장 및 말단절단된 htt 둘 다에 대해 지시된 U1AO를 투여하는 것을 포함한다.
도 1a는 2개의 도메인을 나타내는 U1 어댑터 올리고뉴클레오티드의 개략도이다: 3' 말단 엑손 내 표적 유전자의 프리-mRNA에 대한 염기 쌍에 대한 어닐링 도메인 및 내인성 U1 snRNP 결합을 통해 프리-mRNA의 성숙을 억제하는 이펙터 도메인. 이펙터 도메인의 제공된 서열은 서열식별번호(SEQ ID NO): 1이다. 도 1b는 표적 프리-mRNA에 어닐링하는 U1 어댑터의 개략도이다. 이펙터 도메인의 제공된 서열은 서열식별번호: 1이다. 도 1c는 폴리(A) 부위 억제를 유도하는 U1 snRNP에 결합하는 U1 어댑터의 개략도이다. Ψ = U1 snRNP에서 U1 snRNA의 슈도우리딘. U1 snRNP에서 U1 snRNA의 제공된 서열은 서열식별번호: 2이다. 이펙터 도메인의 제공된 서열은 서열식별번호: 1이다.
도 2는 전장 인간 HTT에 대해 지시된 20 nM U1 어댑터 올리고뉴클레오티드 (U1AO) 및 20 nM siRNA의 패널로 44시간 동안 형질감염된 HD9197 세포에서 하이포크산틴 포스포리보실트랜스퍼라제 1 (HPRT1)에 대해 정규화된 인간 헌팅틴 (HTT) mRNA의 변화 퍼센트를 제시하는 그래프를 제공한다.
도 3은 20 nM의 다양한 hHTT-FL U1AO 및 siRNA로 48시간 형질감염된 DU145 세포의 웨스턴 블롯을 제공하며, 단 레인 9의 7 nM 및 레인 7의의 30 nM은 예외로 한다. GAPDH는 로딩 대조군으로 제공된다. U1A (U1 snRNP 서브유닛)는 제2 로딩 대조군으로 제공된다. 레인당 1,500,000개의 세포 등가물이 로딩되었다. 레인 4 및 6은 독립적인 복제물이다. MW: 분자량 마커.
도 4a는 염수 또는 hHTT-FL-2 U1AO의 좌측 뇌실에 뇌실내 (ICV) 주사 후 YAC128 전뇌에서의 hHTT-FL mRNA의 변화 퍼센트에 대한 그래프를 제공한다. YAC128은 128개의 CAG 반복을 갖는 ~300,000개의 염기쌍 인간 헌팅틴 유전자를 함유하는 헌팅톤병의 잘 확립된 마우스 모델이다. 대조군 마우스의 평균은 100%로 설정되었다. N = 7은 2개의 상이한 실험으로부터의 것이다 (n = 3 및 n = 4). 도 4b는 염수 또는 hHTT-FL-2 U1AO의 ICV 주사 후 YAC128 전뇌에서의 hHTT-TR mRNA의 변화 퍼센트에 대한 그래프를 제공한다. 대조군 마우스의 평균은 100%로 설정되었다.
도 5는 염수 또는 hHTT-FL-2 U1AO 주사 후 YAC128 전뇌로부터의 총 RNA의 8% 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (PAGE) 노던 블롯의 영상을 제공한다. 프로브는 33개 뉴클레오티드의 32P-항-hHTT-FL-2 올리고뉴클레오티드였다. 표준은 주사되지 않은 U1AO이다.
도 6은 염수 ICV-처리된 마우스 (좌측) 또는 hTT-FL-2 U1AO ICV-처리된 마우스 (우측)의 선조체에서의 hHTT-FL의 RNA스코프(RNAScope)® 검출의 영상을 제공한다. 4일 지속기간 후에 마우스를 분석하였다. 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI)을 사용하여 핵을 염색하였다.
도 7a는 표시된 시간에 걸쳐 염수 또는 hHTT-FL-2 U1AO의 ICV-주사 후 YAC128 전뇌에서의 hHTT-FL mRNA의 변화 퍼센트에 대한 그래프를 제공한다. 대조군 마우스의 평균은 100%로 설정되었다. 도 7b는 염수 또는 hHTT-FL-2 U1AO 주사 후 표시된 시간에 YAC128 전뇌로부터의 총 RNA의 노던 블롯의 영상을 제공한다. 프로브는 33개 뉴클레오티드의 32P-항-hHTT-FL-2 올리고뉴클레오티드였다. 표준은 주사되지 않은 U1AO이다. 대조군 염수 마우스 1-7 및 마우스 11-12 및 16-17은 도 4 및 5에 제시된 것과 동일한 마우스이다.
도 8a는 염수, hHTT-TR-1 U1AO, 또는 hHTT-TR-2 U1AO의 ICV-주사 후 YAC128 전뇌에서의 hHTT-TR mRNA의 변화 퍼센트에 대한 그래프를 제공한다. 5일 지속기간 후 마우스 조직을 분석하였다. 대조군 마우스의 평균은 100%로 설정되었다. N = 7은 2개의 상이한 실험으로부터의 것이다 (n = 3 및 n = 4). 도 8b는 염수, hHTT-TR-1 U1AO, 또는 hHTT-TR-2 U1AO 주사 후 YAC128 전뇌에서의 hHTT-FL mRNA의 변화 퍼센트에 대한 그래프를 제공한다. 대조군 마우스의 평균은 100%로 설정되었다. N = 7은 2개의 상이한 실험으로부터의 것이다 (n = 3 및 n = 4).
도 9a는 염수, mHTT-TR-A U1AO, 또는 NC-A 대조군 U1AO 주사 후 8-9개월령 Q175 전뇌에서의 mHTT-TR mRNA의 변화 퍼센트에 대한 그래프를 제공한다. Q175는 마우스 htt 유전자에 ~175개의 CAG 반복을 갖는 잘 정립된 녹-인 마우스이다. 대조군 마우스의 평균은 100%로 설정되었다. N = 7은 2개의 상이한 실험으로부터의 것이다 (n = 3 및 n = 4). 도 9b는 도 9a에서와 동일한 샘플을 사용하는 mHTT-FL mRNA의 변화 퍼센트에 대한 그래프를 제공한다. 대조군 마우스의 평균은 100%로 설정되었다. N = 7은 2개의 상이한 실험으로부터의 것이다 (n = 3 및 n = 4).
도 10은 4일 지속기간으로 염수 처리된 마우스 (좌측) 또는 mHTT-TR-A U1AO 처리된 마우스 (우측)의 선조체에서의 mHTT-TR의 RNA스코프® 검출의 영상을 제공한다.
도 11a는 염수 또는 mHTT-TR-A U1AO의 ICV-주사 후 21일에 8-9개월령 Q175 마우스 전뇌에서의 mHTT-TR mRNA의 변화 퍼센트에 대한 그래프를 제공한다. 대조군 마우스의 평균은 100%로 설정되었다. 도 11b는 염수 또는 mHTT-TR-A U1AO 주사 후 21일에 8-9개월령 Q175 마우스 전뇌에서의 mHTT-FL mRNA의 변화 퍼센트에 대한 그래프를 제공한다. 대조군 마우스의 평균은 100%로 설정되었다.
도 12a는 염수, mHTT-FL-A U1AO, 또는 NC-A 대조군 U1AO 주사 후 8-9개월령 Q175 전뇌에서의 mHTT-FL mRNA의 변화 퍼센트에 대한 그래프를 제공한다. 대조군 마우스의 평균은 100%로 설정되었다. N = 7은 2개의 상이한 실험으로부터의 것이다 (n = 3 및 n = 4). 도 12b는 염수, mHTT-FL-A U1AO, 또는 NC-A 대조군 U1AO 주사 후 Q175 전뇌에서의 mHTT-TR mRNA의 변화 퍼센트에 대한 그래프를 제공한다. 대조군 마우스의 평균은 100%로 설정되었다. N = 7은 2개의 상이한 실험으로부터의 것이다 (n = 3 및 n = 4).
도 13은 염수 처리된 마우스 (좌측) 또는 mHTT-FL-A U1AO 처리된 마우스 (우측)의 선조체에서의 mHTT-FL의 RNA스코프® 검출의 영상을 제공한다.
도 14a-14l은 U1AO에 대한 인간 htt의 표적 부위 및 DNA 포맷의 U1AO 서열의 예를 제공한다. 열 50, 272, 151, 3, 187, 4, 5, 10, 및 2의 표적 서열은 각각 서열식별번호: 26-34이다. 열 1, 6-9, 11-49, 51-150, 152-186, 188-271, 및 273-325의 표적 서열은 각각 서열식별번호: 40-355이다. DNA 포맷으로 제공된 U1AO 서열은 위에서부터 아래로 서열식별번호: 356-680이다.
도 15a-15c는 Q175 마우스에 4가지 상이한 농도의 mHTT-FL-a U1AO를 ICV 주사한 후 1개월 (도 15a), 2개월 (도 15b) 및 4개월 (도 15c)에 mHTT-Fl 및 mHTT-Tr의 침묵 수준에 대한 그래프를 제공한다. 도 15d는 Q175 마우스에 80 μg의 대조군 NC-a U1AO를 ICV 주사한 후 1개월, 2개월 및 4개월에 mHTT-Fl 및 mHTT-Tr의 침묵 수준에 대한 그래프를 제공한다.
도 16a-16c는 Q175 마우스에 4가지 상이한 농도의 mHTT-Tr-a U1AO를 ICV 주사한 후 1개월 (도 16a), 2개월 (도 16b) 및 4개월 (도 16c)에 mHTT-Fl 및 mHTT-Tr의 침묵 수준에 대한 그래프를 제공한다.
도 17은 mHTT-FL-a U1AO (상단), mHTT-Tr-a U1AO (중간) 및 NC-a U1AO (하단)의 약동학 그래프를 제공한다. RNA의 양은 1개월, 2개월, 및 4개월에 제시된다. 4가지 상이한 농도의 mHTT-FL-a U1AO 및 mHTT-Tr-a U1AO가 각각 제시되지만, NC-a U1AO의 경우 80 μg 농도만 제시된다.
도 2는 전장 인간 HTT에 대해 지시된 20 nM U1 어댑터 올리고뉴클레오티드 (U1AO) 및 20 nM siRNA의 패널로 44시간 동안 형질감염된 HD9197 세포에서 하이포크산틴 포스포리보실트랜스퍼라제 1 (HPRT1)에 대해 정규화된 인간 헌팅틴 (HTT) mRNA의 변화 퍼센트를 제시하는 그래프를 제공한다.
도 3은 20 nM의 다양한 hHTT-FL U1AO 및 siRNA로 48시간 형질감염된 DU145 세포의 웨스턴 블롯을 제공하며, 단 레인 9의 7 nM 및 레인 7의의 30 nM은 예외로 한다. GAPDH는 로딩 대조군으로 제공된다. U1A (U1 snRNP 서브유닛)는 제2 로딩 대조군으로 제공된다. 레인당 1,500,000개의 세포 등가물이 로딩되었다. 레인 4 및 6은 독립적인 복제물이다. MW: 분자량 마커.
도 4a는 염수 또는 hHTT-FL-2 U1AO의 좌측 뇌실에 뇌실내 (ICV) 주사 후 YAC128 전뇌에서의 hHTT-FL mRNA의 변화 퍼센트에 대한 그래프를 제공한다. YAC128은 128개의 CAG 반복을 갖는 ~300,000개의 염기쌍 인간 헌팅틴 유전자를 함유하는 헌팅톤병의 잘 확립된 마우스 모델이다. 대조군 마우스의 평균은 100%로 설정되었다. N = 7은 2개의 상이한 실험으로부터의 것이다 (n = 3 및 n = 4). 도 4b는 염수 또는 hHTT-FL-2 U1AO의 ICV 주사 후 YAC128 전뇌에서의 hHTT-TR mRNA의 변화 퍼센트에 대한 그래프를 제공한다. 대조군 마우스의 평균은 100%로 설정되었다.
도 5는 염수 또는 hHTT-FL-2 U1AO 주사 후 YAC128 전뇌로부터의 총 RNA의 8% 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (PAGE) 노던 블롯의 영상을 제공한다. 프로브는 33개 뉴클레오티드의 32P-항-hHTT-FL-2 올리고뉴클레오티드였다. 표준은 주사되지 않은 U1AO이다.
도 6은 염수 ICV-처리된 마우스 (좌측) 또는 hTT-FL-2 U1AO ICV-처리된 마우스 (우측)의 선조체에서의 hHTT-FL의 RNA스코프(RNAScope)® 검출의 영상을 제공한다. 4일 지속기간 후에 마우스를 분석하였다. 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI)을 사용하여 핵을 염색하였다.
도 7a는 표시된 시간에 걸쳐 염수 또는 hHTT-FL-2 U1AO의 ICV-주사 후 YAC128 전뇌에서의 hHTT-FL mRNA의 변화 퍼센트에 대한 그래프를 제공한다. 대조군 마우스의 평균은 100%로 설정되었다. 도 7b는 염수 또는 hHTT-FL-2 U1AO 주사 후 표시된 시간에 YAC128 전뇌로부터의 총 RNA의 노던 블롯의 영상을 제공한다. 프로브는 33개 뉴클레오티드의 32P-항-hHTT-FL-2 올리고뉴클레오티드였다. 표준은 주사되지 않은 U1AO이다. 대조군 염수 마우스 1-7 및 마우스 11-12 및 16-17은 도 4 및 5에 제시된 것과 동일한 마우스이다.
도 8a는 염수, hHTT-TR-1 U1AO, 또는 hHTT-TR-2 U1AO의 ICV-주사 후 YAC128 전뇌에서의 hHTT-TR mRNA의 변화 퍼센트에 대한 그래프를 제공한다. 5일 지속기간 후 마우스 조직을 분석하였다. 대조군 마우스의 평균은 100%로 설정되었다. N = 7은 2개의 상이한 실험으로부터의 것이다 (n = 3 및 n = 4). 도 8b는 염수, hHTT-TR-1 U1AO, 또는 hHTT-TR-2 U1AO 주사 후 YAC128 전뇌에서의 hHTT-FL mRNA의 변화 퍼센트에 대한 그래프를 제공한다. 대조군 마우스의 평균은 100%로 설정되었다. N = 7은 2개의 상이한 실험으로부터의 것이다 (n = 3 및 n = 4).
도 9a는 염수, mHTT-TR-A U1AO, 또는 NC-A 대조군 U1AO 주사 후 8-9개월령 Q175 전뇌에서의 mHTT-TR mRNA의 변화 퍼센트에 대한 그래프를 제공한다. Q175는 마우스 htt 유전자에 ~175개의 CAG 반복을 갖는 잘 정립된 녹-인 마우스이다. 대조군 마우스의 평균은 100%로 설정되었다. N = 7은 2개의 상이한 실험으로부터의 것이다 (n = 3 및 n = 4). 도 9b는 도 9a에서와 동일한 샘플을 사용하는 mHTT-FL mRNA의 변화 퍼센트에 대한 그래프를 제공한다. 대조군 마우스의 평균은 100%로 설정되었다. N = 7은 2개의 상이한 실험으로부터의 것이다 (n = 3 및 n = 4).
도 10은 4일 지속기간으로 염수 처리된 마우스 (좌측) 또는 mHTT-TR-A U1AO 처리된 마우스 (우측)의 선조체에서의 mHTT-TR의 RNA스코프® 검출의 영상을 제공한다.
도 11a는 염수 또는 mHTT-TR-A U1AO의 ICV-주사 후 21일에 8-9개월령 Q175 마우스 전뇌에서의 mHTT-TR mRNA의 변화 퍼센트에 대한 그래프를 제공한다. 대조군 마우스의 평균은 100%로 설정되었다. 도 11b는 염수 또는 mHTT-TR-A U1AO 주사 후 21일에 8-9개월령 Q175 마우스 전뇌에서의 mHTT-FL mRNA의 변화 퍼센트에 대한 그래프를 제공한다. 대조군 마우스의 평균은 100%로 설정되었다.
도 12a는 염수, mHTT-FL-A U1AO, 또는 NC-A 대조군 U1AO 주사 후 8-9개월령 Q175 전뇌에서의 mHTT-FL mRNA의 변화 퍼센트에 대한 그래프를 제공한다. 대조군 마우스의 평균은 100%로 설정되었다. N = 7은 2개의 상이한 실험으로부터의 것이다 (n = 3 및 n = 4). 도 12b는 염수, mHTT-FL-A U1AO, 또는 NC-A 대조군 U1AO 주사 후 Q175 전뇌에서의 mHTT-TR mRNA의 변화 퍼센트에 대한 그래프를 제공한다. 대조군 마우스의 평균은 100%로 설정되었다. N = 7은 2개의 상이한 실험으로부터의 것이다 (n = 3 및 n = 4).
도 13은 염수 처리된 마우스 (좌측) 또는 mHTT-FL-A U1AO 처리된 마우스 (우측)의 선조체에서의 mHTT-FL의 RNA스코프® 검출의 영상을 제공한다.
도 14a-14l은 U1AO에 대한 인간 htt의 표적 부위 및 DNA 포맷의 U1AO 서열의 예를 제공한다. 열 50, 272, 151, 3, 187, 4, 5, 10, 및 2의 표적 서열은 각각 서열식별번호: 26-34이다. 열 1, 6-9, 11-49, 51-150, 152-186, 188-271, 및 273-325의 표적 서열은 각각 서열식별번호: 40-355이다. DNA 포맷으로 제공된 U1AO 서열은 위에서부터 아래로 서열식별번호: 356-680이다.
도 15a-15c는 Q175 마우스에 4가지 상이한 농도의 mHTT-FL-a U1AO를 ICV 주사한 후 1개월 (도 15a), 2개월 (도 15b) 및 4개월 (도 15c)에 mHTT-Fl 및 mHTT-Tr의 침묵 수준에 대한 그래프를 제공한다. 도 15d는 Q175 마우스에 80 μg의 대조군 NC-a U1AO를 ICV 주사한 후 1개월, 2개월 및 4개월에 mHTT-Fl 및 mHTT-Tr의 침묵 수준에 대한 그래프를 제공한다.
도 16a-16c는 Q175 마우스에 4가지 상이한 농도의 mHTT-Tr-a U1AO를 ICV 주사한 후 1개월 (도 16a), 2개월 (도 16b) 및 4개월 (도 16c)에 mHTT-Fl 및 mHTT-Tr의 침묵 수준에 대한 그래프를 제공한다.
도 17은 mHTT-FL-a U1AO (상단), mHTT-Tr-a U1AO (중간) 및 NC-a U1AO (하단)의 약동학 그래프를 제공한다. RNA의 양은 1개월, 2개월, 및 4개월에 제시된다. 4가지 상이한 농도의 mHTT-FL-a U1AO 및 mHTT-Tr-a U1AO가 각각 제시되지만, NC-a U1AO의 경우 80 μg 농도만 제시된다.
U1 어댑터 (또는 U1 어댑터 올리고뉴클레오티드 (U1AO))는 안티센스 또는 siRNA와 역학적으로 구별되는 올리고뉴클레오티드-매개된 유전자 침묵 기술이다. U1 어댑터는 mRNA 성숙의 핵심 단계인 3' 폴리아데노신 (폴리A) 테일의 추가를 선택적으로 방해함으로써 작용한다. 거의 모든 단백질-코딩 mRNA는 폴리A 테일을 필요로 하며, 하나를 추가하지 않으면 핵 내부의 신생 mRNA가 빠르게 분해되어 단백질 생성물의 발현이 방지된다. U1 어댑터는 미국 특허 번호 9,441,221; 미국 특허 번호 9,078,823; 미국 특허 번호 8,907,075; 및 미국 특허 번호 8,343,941 (각각 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.
U1 어댑터 올리고뉴클레오티드는 침묵 활성의 손실 없이 뉴클레아제 내성 및 부피가 큰 그룹, 예컨대 영상화를 위한 태그 또는 표적 세포에 의한 수용체-매개된 흡수를 위한 리간드의 부착을 개선하기 위한 광범위한 화학적 변형을 수용할 수 있기 때문에 생체내 적용에 매우 적합하다. 헌팅톤병은 U1AO를 사용한 치료에 특히 적합한 몇 가지 특징을 갖는다. 첫째, 돌연변이체 htt 유전자의 발현을 감소시키는 것은 신경변성을 지연시키고/거나 정지시키는데 유익할 것이다. 둘째, 유전자 시험을 통해 질환을 확실하게 진단할 수 있다. 셋째, 질환은 일반적으로 성인에서 발병한다. 넷째, 질환은 천천히 진행되며 예측가능한 경과와 함께 잘 기록되어 있다. 다섯째, 질환의 진행을 추적하고 중재가 유익한지의 여부를 결정하는데 임상 검사 및 비-침습적 방법 둘 다가 이용가능하다. 여섯째, 미상핵은 현저하게 영향을 받는 영역으로, 영상화로 모니터링될 수 있으며, 뇌실 시스템에서 시행되는 중재로부터 확산을 위해 뇌실에 가까이에 있다. 마지막으로, 미상핵의 매우 취약한 중형 돌기 뉴런이 잘 연구되었으며 변형된 담체에 의한 세포 지시된 표적화에 유용할 수 있는 마커를 발현한다.
htt, 특히 돌연변이체 htt (전장 및/또는 말단절단된 것을 포함하는 확장된 트리뉴클레오티드 CAG 반복을 포함하는 htt)의 발현을 조정하기 위한 방법 및 조성물이 본원에 제공된다. 방법은 U1 어댑터 올리고뉴클레오티드/분자의 사용을 포함한다 (일반적으로 도 1 참조). 가장 간단한 형태에서, U1AO는 2개의 도메인: (1) (예를 들어, 말단 엑손 내) htt 유전자의 프리-mRNA와 염기 쌍형성하도록 설계된 어닐링 도메인 및 (2) 내인성 U1 snRNP 결합을 통해 표적 프리-mRNA의 3'-단부 형성을 억제하는 이펙터 도메인 (또한 U1 도메인으로 지칭됨)을 갖는 올리고뉴클레오티드이다. 이론에 구애됨이 없이, U1 어댑터는 내인성 U1 snRNP를 유전자-특이적 프리-mRNA에 테더링하고 생성된 복합체는 적절한 3' 단부 형성을 차단한다. 특히, U1 snRNP는 매우 풍부하고 (~1백만개/포유류 세포 핵), 다른 스플라이세오솜 성분에 비해 화학량론적 과량이다. 따라서, 내인성 U1 snRNP의 적정에 따른 유해한 효과는 없다.
U1AO는 단독으로 또는 전달 시약 (예를 들어, 지질-기반 형질감염 시약)과 복합체로 세포에 들어갈 수 있다. U1AO는 또한 프리-mRNA에 결합하기 위해 핵에 들어갈 수 있어야 한다. 실제로, 이 특성은 올리고가 핵에 들어가 프리-mRNA에 결합하는 RNase H 경로를 활용하는 안티센스 접근법에서와 같이 소형 핵산 분자에 대해 이미 확립되었다. 추가로, 안티센스 올리고는 핵 프리-mRNA에 결합할 수 있고 변경된 스플라이싱 패턴을 초래하는 스플라이싱 인자의 접근을 입체적으로 차단할 수 있는 것으로 제시된 바 있다 (Ittig et al. (2004) Nuc. Acids Res., 32:346-53).
특정한 실시양태에서, U1 어댑터 분자의 어닐링 도메인은 (예를 들어, 다른 프리-mRNA는 배제되고) 표적 프리-mRNA 상의 표적 부위에 대해 높은 친화성 및 특이성을 갖도록 설계된다. 특정한 실시양태에서, 어닐링 도메인이 너무 짧아서 친화도가 위태로워지거나 너무 길어서 "오프-표적" 효과를 촉진하거나 다른 세포 경로를 변경하는 것 사이의 균형이 달성되어야 한다. 또한, 어닐링 도메인은 (예를 들어, 염기 쌍형성 및 헤어핀 형성에 의해) 이펙터 도메인의 기능을 방해해서는 안된다. U1AO 어닐링 도메인은 길이에 대한 절대적인 요건을 갖지 않는다. 그러나, 어닐링 도메인은 전형적으로 약 10 내지 약 50개의 뉴클레오티드 길이, 보다 전형적으로 약 10 내지 약 30개의 뉴클레오티드 또는 약 10 내지 약 20개의 뉴클레오티드일 것이다. 특정한 실시양태에서, 어닐링 도메인은 적어도 약 13개 또는 15개의 뉴클레오티드 길이이다. 어닐링 도메인은 관심 유전자 (htt)에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 보다 특히 100% 상보적일 수 있다. 한 실시양태에서, 어닐링 도메인은 말단 코딩 영역 및 3'UTR 및 폴리아데닐화 신호 서열 (예를 들어, 폴리아데닐화 부위를 통함)을 포함하는 3' 말단 엑손 내의 표적 부위와 혼성화된다. 또 다른 실시양태에서, 표적 서열은 폴리(A) 신호 서열의 약 500 염기쌍, 약 250 염기쌍, 약 100 염기쌍, 또는 약 50 bp 내에 있다.
HTT에서 (글루타민을 코딩하는) CAG 질환 확장 (전형적으로 36개 초과의 반복)은 HTT 유전자의 1차 엑손 내에 위치된다 (The Huntington's Disease Collaborative Research Group (1993) Cell 72:971-983). 돌연변이 대립유전자의 비정상적 스플라이싱으로 인한 짧은 엑손 1 HTT 폴리아데닐화된 mRNA는 질환 진행에 기여하는 병원성 엑손 1 HTT 단백질로 번역된다 (Sathasivam et al. (2013) Proc. Natl. Acad. Sci., 110:2366-2370; Gipson et al. (2013) RNA Biol., 10:1647-1652). 인간 HTT 및 htt의 예시적인 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은, 예컨대 유전자 ID: 3064 및 진뱅크(GenBank) 수탁 번호 NM_002111.8 및 NP_002102.4에서 찾을 수 있다.
U1AO에 대한 htt 내의 표적 부위는 유전자 침묵을 위한 선택 기준을 사용하여 본원에서 확인되어 있다. 도 14a-14l은 U1AO에 대한 htt 내의 표적 부위를 나열하고, 가장 점수가 높은 표적 부위가 먼저 나열된다. 특정한 실시양태에서, 어닐링 도메인은 도 14a-14l에 제공된 표적 부위와 혼성화된다. 특정한 실시양태에서, 어닐링 도메인은 도 14a-14l의 열 1-278에 제공된 표적 부위와 혼성화된다. 특정한 실시양태에서, 어닐링 도메인은 도 14a-14l의 열 1-192에 제공된 표적 부위와 혼성화된다. 특정한 실시양태에서, 어닐링 도메인은 도 14a-14l의 열 1-58에 제공된 표적 부위와 혼성화된다. 특정한 실시양태에서, 어닐링 도메인은 도 14a-14l의 열 1-26에 제공된 표적 부위와 혼성화된다. 특정한 실시양태에서, 어닐링 도메인은 도 14a-14l의 열 1-10에 제공된 표적 부위와 혼성화된다. 특정한 실시양태에서, 어닐링 도메인은 하기로부터 선택된 표적 부위와 혼성화된다:
CCCACATGTCATCAGCAGGA (서열식별번호: 26);
CAGCAGGATGGGCAAGCTGG (서열식별번호: 27);
GAGCAGGTGGACGTGAACCT (서열식별번호: 28);
GTGGACGTGAACCTTTTCTG (서열식별번호: 29);
TCTGCCTGGTCGCCACAGAC (서열식별번호: 30);
GTCTGTGCTTGAGGTGGTTG (서열식별번호: 31):
GCTGCTGACTTGTTTACGAA (서열식별번호: 32);
GGTGGGAGAGACTGTGAGGC (서열식별번호: 33);
TCCTTTCTCCTGATAGTCAC (서열식별번호: 34);
GCGGGGATGGCGGTAACCCT (서열식별번호: 35); 또는
GTCTTCCCTTGTCCTCTCGC (서열식별번호: 36).
특정한 실시양태에서, 어닐링 도메인은 GTGGACGTGAACCTTTTCTG (서열식별번호 29)와 혼성화된다. 어닐링 도메인은 도 14a-14l 내의 임의의 표적 서열 또는 서열식별번호: 26-36 중 어느 하나에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 보다 특히 100% 상보적일 수 있다. 어닐링 도메인은 도 14a-14l 내의 임의의 표적 서열 또는 서열식별번호: 26-36 중 어느 하나의 5' 및/또는 3' 단부에 추가 또는 더 적은 수의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 어닐링 도메인은 (htt 유전자의 서열로부터) 도 14a-14l 내의 임의의 표적 서열 또는 서열식별번호: 26-36 중 어느 하나의 5' 및/또는 3' 단부에 추가된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 최대 10 또는 20개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있거나, 도 14a-14l 내의 임의의 표적 서열 또는 서열식별번호: 26-36 중 어느 하나의 5' 및/또는 3' 단부로부터 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 뉴클레오티드가 결실될 수 있다.
특정한 실시양태에서, U1AO의 U1 도메인은 U1 snRNP에 대해 높은 친화도로 결합한다. 특정한 실시양태에서, U1 도메인은 내인성 U1 snRNA의 뉴클레오티드 2-11에 상보적이다. 특정한 실시양태에서, U1 도메인은 5'-CAGGUAAGUA-3' (서열식별번호: 1); 5'-CAGGUAAGUAU-3' (서열식별번호: 4); 5'-GCCAGGUAAGUAU-3' (서열식별번호: 5)를 포함한다. 특정한 실시양태에서, U1 도메인은 서열 5'-CAGGUAAGUA-3' (서열식별번호: 1)를 포함한다. 특정한 실시양태에서, U1 도메인은 서열 5'-GCCAGGUAAGUAU-3' (서열식별번호: 5)를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, U1 도메인은 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 4, 또는 서열식별번호: 5에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 및 보다 특히 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 97% 동일성을 갖는다. U1 도메인은 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 4, 또는 서열식별번호: 5에 대해 5' 또는 3'에 추가 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, U1 도메인은 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 4, 또는 서열식별번호: 5에 대해 5' 또는 3'에 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 최대 10 또는 20개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 실제로, 스템 1에 염기 쌍형성 및/또는 U1 snRNA의 위치 1에 염기 쌍형성을 포함하도록 U1 도메인의 길이를 증가시키면 U1 snRNP에 대한 U1 어댑터의 친화도가 개선된다. 이펙터 도메인은 약 8개의 뉴클레오티드 내지 약 30개의 뉴클레오티드, 약 10개의 뉴클레오티드 내지 약 20개의 뉴클레오티드, 또는 약 10개 내지 약 15개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 도메인은 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다.
U1 도메인으로의 점 돌연변이의 삽입, 즉 컨센서스 서열 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 4 또는 서열식별번호: 5로부터 분기는 침묵을 완화할 수 있다. 실제로, 컨센서스 서열을 변경하면 U1 snRNA에 대해 상이한 강도 및 친화도의 U1 도메인이 생성되어 상이한 수준의 침묵이 발생할 것이다. 따라서, 관심 유전자에 대해 어닐링 도메인이 결정되면 상이한 강도의 상이한 U1 도메인이 어닐링 도메인에 부착되어 관심 유전자에 대해 상이한 수준의 침묵을 달성할 수 있다. 예를 들어, gAGGUAAGUA (서열식별번호: 3)는 서열식별번호: 1보다 U1 snRNP에 더 약하게 결합하므로 더 낮은 수준의 침묵을 생성할 것이다. 상기 논의된 바와 같이, 뉴클레오티드 유사체는 내인성 U1 snRNP에 대한 친화도를 증가시키기 위해 U1 도메인에 포함될 수 있다. 뉴클레오티드 유사체의 추가는 뉴클레오티드 유사체가 대체된 뉴클레오티드와 동일한 뉴클레오티드에 결합하는 경우 점 돌연변이로 간주되지 않을 수 있다.
U1AO는 뉴클레아제에 내성을 갖도록 변형될 수 있다. 특정한 실시양태에서, U1AO는 적어도 하나의 비-천연 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 유사체는 어닐링 친화성, 특이성, 세포 및 유기체에서의 생체이용률, 세포 및/또는 핵 수송, 안정성, 및/또는 분해에 대한 내성을 증가시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 내에 잠금 핵산 (LNA) 염기를 포함하면 표적 부위에 대한 올리고뉴클레오티드의 어닐링의 친화성 및 특이성이 증가한다는 것이 잘 확립되어 있다 (Kauppinen et al. (2005) Drug Discov. Today Tech., 2:287-290; Orum et al. (2004) Letters Peptide Sci., 10:325-334). RNAi 및 RNase H-기반 침묵 기술과 달리, U1AO 억제는 효소 활성을 수반하지 않는다. 따라서, RNAi 및 RNase H-기반 침묵 기술을 위한 올리고와 비교할 때 U1AO에 사용될 수 있는 허용가능한 뉴클레오티드 유사체에는 유의하게 더 큰 유연성이 있다.
뉴클레오티드 유사체는, 제한 없이, 하나 이상의 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포디에스테르, 메틸 포스포네이트, 포스포르아미데이트, 메틸포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아리데이트, 모르폴리노, 아미데이트 카르바메이트, 카르복시메틸, 아세트아미데이트, 폴리아미드, 술포네이트, 술폰아미드, 술파메이트, 포름아세탈, 티오포름아세탈, 및/또는 알킬실릴 치환을 포함하는 포스페이트 변형을 갖는 뉴클레오티드 (Hunziker and Leumann (1995) Nucleic Acid Analogues: Synthesis and Properties, in Modern Synthetic Methods, VCH, 331-417; Mesmaeker et al. (1994) Novel Backbone Replacements for Oligonucleotides, in Carbohydrate Modifications in Antisense Research, ACS, 24-39); 변형된 슈가 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2005/0118605 참조) 및 슈가 변형, 예컨대 2'-O-메틸 (2'-O-메틸뉴클레오티드), 2'-O-메틸옥시에톡시, 및 2'-할로 (예를 들어, 2'-플루오로)를 갖는 뉴클레오티드; 및 뉴클레오티드 모방체, 예컨대, 제한 없이, 펩티드 핵산 (PNA), 모르폴리노 핵산, 시클로헥세닐 핵산, 안히드로헥시톨 핵산, 글리콜 핵산, 트레오스 핵산, 및 잠금 핵산 (LNA) (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2005/0118605 참조)을 포함한다. 다른 뉴클레오티드 변형은 또한 미국 특허 번호 5,886,165; 6,140,482; 5,693,773; 5,856,462; 5,973,136; 5,929,226; 6,194,598; 6,172,209; 6,175,004; 6,166,197; 6,166,188; 6,160,152; 6,160,109; 6,153,737; 6,147,200; 6,146,829; 6,127,533; 및 6,124,445에 제공된다. 특정한 실시양태에서, U1AO는 적어도 하나의 잠금 핵산을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 어닐링 도메인은 적어도 하나의 잠금 핵산을 포함한다 (임의적으로 이펙터 도메인이 잠금 핵산을 함유하지 않는 경우). 특정한 실시양태에서, U1AO, 특히 어닐링 도메인은 2-4개의 뉴클레오티드, 특히 3개의 뉴클레오티드에 의해 이격된 잠금 핵산을 갖는다.
특히, 이펙터 도메인이 mRNA의 표적 부위 또는 표적 부위에 바로 플랭킹된 부위에 대해 유의한 친화성을 갖는 U1 어댑터를 설계하지 않도록 주의해야 한다. 다시 말해서, 표적 부위는 이펙터 도메인과 표적 프리-mRNA, 특히 어닐링 부위의 상류에 플랭킹된 부분의 염기 쌍형성 가능성을 최소화하도록 선택되어야 한다.
U1AO의 침묵 능력을 증가시키기 위해, U1AO는 또한 단일 U1 어댑터 내에서 헤어핀의 형성 및/또는 2개 이상의 U1 어댑터 사이의 동종이량체 또는 동종중합체의 형성을 방지하기 위해 낮은 자체 어닐링을 갖도록 설계되어야 한다.
U1AO의 어닐링 및 이펙터 도메인은 이펙터 도메인이 어닐링 도메인의 5' 단부 및/또는 3' 단부에 있도록 연결될 수 있다. 추가로, 어닐링 및 이펙터 도메인은 링커 도메인을 통해 작동가능하게 연결될 수 있다. 링커 도메인은, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 최대 15, 최대 20, 또는 최대 25개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
U1AO는 리보뉴클레오티드 및/또는 데옥시뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본원에 제공된 서열과 관련하여, 우라실 염기 및 티미딘 염기는 교환될 수 있다. 특정한 실시양태에서, U1AO는 2'-O-메틸 뉴클레오티드, 2'-O-메틸옥시에톡시 뉴클레오티드, 2'-할로 (예를 들어, 2'-플루오로), 및/또는 잠금 핵산을 포함한다. 특정한 실시양태에서, U1AO는 포스포로티오에이트를 포함한다.
특정한 실시양태에서, U1AO는 (특히 RNA에서) 도 14a-14l에 제공된 U1AO를 포함한다. 특정한 실시양태에서, U1AO는 도 14a-14l의 열 1-278에 제공된 U1AO 서열을 포함한다. 특정한 실시양태에서, U1AO는 도 14a-14l의 열 1-192에 제공된 U1AO 서열을 포함한다. 특정한 실시양태에서, U1AO는 도 14a-14l의 열 1-58에 제공된 U1AO 서열을 포함한다. 특정한 실시양태에서, U1AO는 도 14a-14l의 열 1-26에 제공된 U1AO 서열을 포함한다. 특정한 실시양태에서, U1AO는 도 14a-14l의 열 1-10에 제공된 U1AO 서열을 포함한다. 특정한 실시양태에서, U1AO는 하기를 포함한다:
UCCUGCUGAUGACAUGUGGGGCCAGGUAAGUAU (서열식별번호: 8);
CCAGCUUGCCCAUCCUGCUGGCCAGGUAAGUAU (서열식별번호: 37);
AGGUUCACGUCCACCUGCUCGCCAGGUAAGUAU (서열식별번호: 38);
CAGAAAAGGUUCACGUCCACGCCAGGUAAGUAU (서열식별번호: 9);
GUCUGUGGCGACCAGGCAGAGCCAGGUAAGUAU (서열식별번호: 39);
CAACCACCUCAAGCACAGACGCCAGGUAAGUAU (서열식별번호: 10):
UUCGUAAACAAGUCAGCAGCGCCAGGUAAGUAU (서열식별번호: 11);
GCCUCACAGUCUCUCCCACCGCCAGGUAAGUAU (서열식별번호: 12);
GUGACUAUCAGGAGAAAGGAGCCAGGUAAGUAU (서열식별번호: 13);
CAGAAAAGGTUCACGUCCACGCCAGGUAAGUAU (서열식별번호: 14);
AGGGUTACCGCCATCCCCGCGCCAGGUAAGUAU (서열식별번호: 15); 또는
GCGAGAGGACAAGGGAAGACGCCAGGUAAGUAU (서열식별번호: 16).
특정한 실시양태에서, U1AO는 CAGAAAAGGUUCACGUCCACGCCAGGUAAGUAU (서열식별번호: 9)를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, U1AO는 상기 서열 또는 도 14a-14l 중 하나와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 및 보다 특히 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97% 또는 그 초과의 동일성을 갖는다. 본원에 제공된 서열과 관련하여, 우라실 염기 및 티미딘 염기는 교환될 수 있다. 특정한 실시양태에서, U1AO는 적어도 하나 또는 모든 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 특정한 실시양태에서, U1AO는 2'-O-메틸 뉴클레오티드, 2'-O-메틸옥시에톡시 뉴클레오티드, 2'-할로 (예를 들어, 2'-플루오로), 및/또는 잠금 핵산을 포함한다. 특정한 실시양태에서, U1AO는 포스포로티오에이트를 포함한다. 특정한 실시양태에서, U1AO는 실시예에 기재된 바와 같이 변형된다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 관심 유전자 (htt)에 대해 지시된 하나 초과의 U1AO를 사용하여 발현을 조정할 수 있다. 동일한 프리-mRNA 내의 상이한 서열에 대한 다중 U1AO 표적화 (어닐링)는 향상된 억제를 제공할 수 있다. 본 발명의 조성물은 htt 유전자 (예를 들어, htt 유전자 내의 상이한 표적)에 대해 지시된 하나 초과의 U1AO를 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, U1AO는 관심 유전자의 발현을 조정하는 다른 방법과 조합될 수 있다. 예를 들어, U1AO는 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 RNase H-기반 방법, RNAi, miRNA, 및 모르폴리노-기반 방법과 같은 다른 억제 핵산 분자와 함께 사용되어 향상된 억제를 제공할 수 있다. U1AO는 이러한 다른 접근 방식과 상이한 메커니즘을 이용하기 때문에, 조합 사용은 단일 억제제 단독 사용과 비교하여 증가된 유전자 발현 억제를 초래할 것이다. 실제로, U1AO는 핵의 생합성 단계를 표적화할 수 있는 반면 RNAi 및 특정 안티센스 접근법은 일반적으로 기존 mRNA 풀의 세포질 안정성 또는 번역성을 표적화한다.
본 발명의 또 다른 측면에서, U1 어댑터의 이펙터 도메인은 유전자 발현을 조절하는 다수의 핵 인자 중 임의의 하나에 대한 결합 부위로 대체될 수 있다. 예를 들어, 폴리피리미딘 트랙 결합 단백질 (PTB)에 대한 결합 부위는 짧고 PTB는 폴리(A) 부위를 억제하는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 이펙터 도메인을 고친화성 PTB 결합 부위로 대체하는 것도 표적 유전자의 발현을 침묵시킬 것이다.
상기 기재된 정규 U1 snRNA와 서열이 상이한 U1 snRNA 유전자가 있다. 일괄하여, 이러한 U1 snRNA 유전자는 U1 변이체 유전자로 불릴 수 있다. 일부 U1 변이체 유전자는 진뱅크 수탁 번호 L78810, AC025268, AC025264 및 AL592207 및 문헌 (Kyriakopoulou et al., RNA (2006) 12:1603-11)에 기재되어 있으며, 이는 인간 게놈에서 거의 200개의 잠재적 U1 snRNA 유사 유전자를 확인하였다. 이러한 U1 변이체 중 일부는 정규 U1 snRNA와 상이한 5' 단부 서열을 갖기 때문에, 하나의 타당한 기능은 프리-mRNA 스플라이싱 동안 대체 스플라이스 신호를 인식하는 것이다. 따라서, 본 발명의 U1AO의 U1 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같이 U1 도메인이 정규 U1 snRNA와 혼성화되도록 설계된 것과 동일한 방식으로 U1 변이체 snRNA의 5' 단부와 혼성화되도록 설계될 수 있다. 이어서, U1 변이체에 혼성화되는 U1AO를 사용하여 관심 유전자의 발현을 조정할 수 있다.
U1 어댑터 기술은 기존의 다른 침묵 기술에 비해 많은 이점이 있다. 이러한 이점 중 일부는 하기와 같다. 첫째, U1AO는 (1) 어닐링 (즉, 표적화) 활성 및 (2) 억제 활성의 2개의 독립적인 도메인으로 분리되어 억제 활성에 영향을 주지 않고 어닐링을 최적화하거나 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 둘째, 다른 기술과 비교하여, 동일한 유전자를 표적화하는 2개의 U1AO의 사용은 부가적, 심지어 상승작용적 억제를 제공한다. 셋째, U1AO는 새로운 억제 메커니즘을 갖는다. 따라서, 다른 방법과 조합하여 사용될 때 양립가능할 것이다. 넷째, U1AO는 폴리(A) 테일 추가 (3' 단부 프로세싱으로도 불림)의 중요하고 거의 보편적인 프리-mRNA 성숙 단계를 억제함으로써 mRNA의 생합성을 억제한다.
본 발명의 조성물은 본 발명의 적어도 하나의 U1AO 및 적어도 하나의 제약상 허용되는 담체를 포함한다. 조성물은 관심 유전자 (htt)의 발현을 억제하는 적어도 하나의 다른 작용제를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 관심 유전자 (htt)에 대해 지시된 적어도 하나의 siRNA 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 U1AO는 네이키드 폴리뉴클레오티드로서 단독으로 세포 또는 동물 및 인간을 포함하는 유기체에 투여될 수 있다. U1AO는 세포에 의한 흡수를 향상시키는 작용제와 함께 투여될 수 있다. 특정한 실시양태에서, U1AO는 리포솜, 나노입자, 또는 중합체 조성물 내에 함유될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, U1AO는 플라스미드 또는 바이러스 벡터와 같은 발현 벡터로 세포 또는 인간을 포함한 동물에 전달될 수 있다. 예를 들어, U1AO는 플라스미드 또는 바이러스와 같은 벡터로부터 발현될 수 있다. 플라스미드 또는 바이러스로부터 이러한 짧은 RNA의 발현은 통상적인 것으로 되었으며 U1AO를 발현하도록 쉽게 적응될 수 있다. RNA 분자의 발현을 위한 발현 벡터는 구성적이거나 조절될 수 있는 강력한 프로모터를 사용할 수 있다. 이러한 프로모터는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, RNA 폴리머라제 II 프로모터, T7 RNA 폴리머라제 프로모터, 및 RNA 폴리머라제 III 프로모터 U6 및 H1을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 바이러스-매개된 전달은, 제한 없이, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 백시니아 바이러스, 렌티바이러스, 폴리오바이러스 및 헤르페스바이러스에 기반한 벡터의 사용을 포함한다.
본 발명의 제약 조성물은 임의의 적합한 경로, 예를 들어, 주사 (예를 들어, 정맥내, 뇌실내 및 근육내), 경구, 폐, 비강, 직장, 또는 다른 투여 방식에 의해 투여될 수 있다. 조성물은 htt의 하향조절을 통해 치료될 수 있는 헌팅톤병의 치료를 위해 투여될 수 있다. 조성물은 시험관내, 생체내 및/또는 생체외에서 사용될 수 있다. 생체외 사용과 관련하여, 본 발명의 U1AO (또는 그를 포함하는 조성물)는 자가 세포에 전달되고 (임의적으로 대상체로부터 세포를 수득하는 단계를 포함함), 이어서 대상체에 재도입될 수 있다. 본 발명의 조성물, U1AO, 및/또는 벡터는 또한 키트에 포함될 수 있다.
본 발명은 또한 대상체에서 헌팅톤병을 치료, 억제 (지연 또는 약화) 및/또는 예방하는 방법을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 방법은 치료적 유효량의 본 발명의 적어도 하나의 조성물을 그를 필요로 하는 대상체 (예를 들어, 동물 또는 인간)에게 투여하는 것을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 조성물은 본 발명의 적어도 하나의 U1AO 및 적어도 하나의 제약상 허용되는 담체를 포함한다. 특정한 실시양태에서, U1AO는 htt, 특히 전장 및/또는 말단절단된 htt (예를 들어, 돌연변이체 htt)에 대한 것이다.
본 방법은 표적 htt 유전자의 발현을 억제하는 적어도 하나의 다른 작용제의 투여를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 방법은 htt 유전자에 대해 지시된 적어도 하나의 siRNA 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 투여를 추가로 포함할 수 있다. 방법은 또한 적어도 하나의 다른 치료제 (예를 들어, 헌팅톤병에 대한 증상-경감 치료제 (예를 들어, 테트라베나진 (제나진(Xenazine)®) 또는 듀테트라베나진 (오스테도(Austedo)®))를 투여하는 것을 포함할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 치료제는 U1AO에 (예를 들어, 직접적으로 또는 링커를 통해; 예를 들어, 3' 단부 및/또는 5' 단부에서) 접합된다. 치료제는 별개의 조성물로 (예를 들어, 적어도 하나의 제약상 허용되는 담체와 함께) 또는 동일한 조성물로 투여될 수 있다. 치료제는 U1AO와 동시에 및/또는 연속적으로 투여될 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 U1AO는 단독으로 (네이키드 폴리뉴클레오티드로서) 투여될 수 있거나, 세포에 의한 흡수를 향상시키는 작용제와 함께 투여될 수 있다. 특정한 실시양태에서, U1AO는 미셀, 리포솜, 나노입자, 또는 중합체 조성물과 같은 전달 비히클 내에 함유될 수 있다. 특정한 실시양태에서, U1AO는 덴드리머, 특히 양이온성 덴드리머, 예컨대 폴리(아미도 아민) (PAMAM) 덴드리머 및 폴리프로필렌이민 (PPI) 덴드리머 (예를 들어, 세대 2, 3, 4 또는 5)와 복합체를 형성한다 (예를 들어, 이에 함유되거나 이에 의해 캡슐화된다). 특정한 실시양태에서, U1AO는 PPI-G2와 복합체를 형성한다.
특정한 실시양태에서, U1AO는 특정한 세포 유형 (예를 들어, 뉴런)에 대해 표적화된다. 특정한 실시양태에서, U1AO는 적어도 하나의 표적화 모이어티에 (예를 들어, 직접적으로 또는 링커를 통해) 공유적으로 연결된다. 표적화 모이어티는 5' 단부, 3' 단부, 또는 양쪽 단부 또는 내부 뉴클레오티드에 작동가능하게 연결될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 하나 이상의 표적화 모이어티는 (예를 들어, 단일 링커를 통해) U1AO의 한쪽 단부에 접합된다. 특정한 실시양태에서, U1AO를 포함하는 복합체 (예를 들어, 덴드리머, 미셀, 리포솜, 나노입자, 또는 중합체 조성물)는 적어도 하나의 표적화 모이어티에 (예를 들어, 직접적으로 또는 링커를 통해) 공유적으로 연결된다.
일반적으로, 링커는 U1AO 또는 복합체에 대해 표적화 모이어티와 같은 2개의 화합물을 공유적으로 부착하는 공유 결합 또는 원자의 쇄를 포함하는 화학적 모이어티이다. 링커는 표적화 모이어티 및 U1AO 또는 복합체 (비히클)의 임의의 합성적으로 실행가능한 위치에 연결될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 링커는 아민기 및/또는 술프히드릴/티올기, 특히 술프히드릴/티올 를 통해 표적화 모이어티와 U1AO 또는 복합체를 연결한다. 예를 들어, U1AO는 (예를 들어, 5' 단부에서) 하나 이상의 아미노 또는 티오기로 유도체화될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 링커는 표적화 모이어티 또는 U1AO의 활성을 차단하는 것을 피하는 위치에 부착된다. 예시적인 링커는 적어도 하나의 임의적으로 치환된; 포화 또는 불포화된; 선형, 분지형 또는 환형 알킬기 또는 임의적으로 치환된 아릴기이다. 링커는 또한 (예를 들어, 약 1 내지 약 20개 또는 그 초과, 또는 1 내지 약 5개의 아미노산의) 폴리펩티드일 수 있다. 링커는 생리학적 환경 또는 조건 하에서 생분해성 (절단성 (예를 들어, 디술피드 결합 포함))일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 링커는 (단독으로 또는 또 다른 링커와 조합하여) 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 링커는 SPDP (N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)-프로피오네이트) 링커, 예컨대 LC-SPDP (숙신이미딜 6-(3-[2-피리딜디티오]-프로피온아미도)헥사노에이트) 또는 SMCC (숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트) 링커, 예컨대 LC-SMCC (숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복시-(6-아미도카프로에이트))이다. 링커는 또한 비-분해성 (비-절단성)일 수 있고, 공유 결합 또는 생리학적 환경 또는 조건 하에 실질적으로 절단 또는 전혀 절단될 수 없는 임의의 다른 화학 구조일 수 있다.
본 발명의 표적화 모이어티는 관련 조직 (예를 들어, 신경) 또는 기관 (예를 들어, 뇌)에 우선적으로 결합한다. 특정한 실시양태에서, 표적화 모이어티는 표적 세포 상에서 특이적으로 (예를 들어, 유일하게) 발현되는 마커 또는 다른 세포와 비교하여 표적 세포 상에서 상향-조절된 마커에 특이적으로 결합한다. 특정한 실시양태에서, 표적화 모이어티는 표적 세포 상의 표면 단백질 또는 다른 세포, 조직 또는 기관보다 표적 세포 상에서 더 높은 수준 (또는 더 큰 밀도)으로 발현되는 표면 단백질에 면역학적으로 특이적인 항체 또는 항체 단편이다. 항체 또는 항체 단편은 (예를 들어, 치료 효과 자체를 보유하는) 치료 항체일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 표적화 모이어티는 표적 세포 상의 세포 표면 수용체에 대한 리간드 또는 그의 결합 단편이다. 특정한 실시양태에서, 표적화 모이어티는 압타머이다.
본 발명의 U1AO는 다른 바람직한 화합물에 추가로 접합될 수 있다. 예를 들어, U1AO는 검출가능한 작용제, 치료제 (예를 들어, 모노클로날 항체, 펩티드, 단백질, 억제 핵산 분자, 소분자, 화학요법제 등), 담체 단백질, 및 생체이용률, 안정성, 및/또는 흡수를 개선하는 작용제 (예를 들어, PEG)에 (직접적으로 또는 상기 기재된 바와 같은 링커를 통해) 추가로 접합될 수 있다. 추가 화합물은 U1AO (또는 접합체 (예를 들어, U1 어댑터 (예를 들어, 어느 한쪽 단부) 또는 표적화 모이어티)의 임의의 합성적으로 실행가능한 위치에 부착될 수 있다. 대안적으로, 표적화 모이어티 및 U1AO는 각각 추가 화합물 (예를 들어, 담체 단백질)에 개별적으로 부착된다 (이와 같이 추가 화합물은 U1AO와 표적화 모이어티 사이의 링커 역할을 하는 것으로 간주될 수 있다). 특정한 실시양태에서, U1AO는 한쪽 단부에서 표적화 모이어티 (예를 들어, 뉴런 표적화 모이어티)에 접합되고, 임의적으로 다른 말단에서 치료제에 접합된다. 우선적으로, 추가 화합물의 부착은 U1AO의 활성 또는 표적화 모이어티에 유의한 영향을 미치지 않는다. 검출가능한 작용제는 직접적으로 또는 간접적으로, 특히 직접적으로 검정될 수 있는 임의의 화합물 또는 단백질일 수 있다. 검출가능한 작용제는, 예를 들어, 화학발광, 생물발광, 및/또는 형광 화합물 또는 단백질, 영상화제, 조영제, 방사성핵종, 상자성 또는 초상자성 이온, 동위원소 (예를 들어, 방사성 동위원소 (예를 들어, 3H (삼중수소) 및 14C) 또는 안정 동위원소 (예를 들어, 2H (중수소), 11C, 13C, 17O 및 18O), 광학제, 및 형광제를 포함한다.
담체 단백질은, 제한 없이, 혈청 알부민 (예를 들어, 소, 인간), 오브알부민, 및 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH)을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 담체 단백질은 인간 혈청 알부민이다. 담체 단백질 (뿐만 아니라 다른 단백질 또는 펩티드)은 임의의 합성적으로 실행가능한 위치에서 U1AO (또는 접합체)에 접합될 수 있다. 예를 들어, 링커 (예를 들어, LC-SPDP)는 담체 단백질의 리신에서 발견되는 유리 아미노기에 부착될 수 있으며, 이어서 U1AO 및 표적화 모이어티는 링커에 접합될 수 있다. 임의의 반응하지 않은 링커는 시스테인으로 차단함으로써 비활성화될 수 있다.
본 발명의 U1AO는 원하는 세포 유형에 대해 U1AO를 표적화하는 화합물 (예를 들어, 항체, 펩티드, 단백질, 핵산 분자, 소분자 등) 및/또는 U1AO의 세포 흡수를 촉진하는 화합물 (예를 들어, 세포 침투 모이어티)에 (예를 들어, 직접적으로 또는 링커를 통해) 접합될 수 있다. 표적화 모이어티는 5' 단부, 3' 단부, 또는 양쪽 단부 또는 내부 뉴클레오티드에 작동가능하게 연결될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 표적화 모이어티 및/또는 세포 침투 모이어티는 5' 단부 및/또는 3' 단부에 접합된다. 특정한 실시양태에서, 표적화 모이어티 및/또는 세포 침투 모이어티는 5' 단부에 접합된다. 특정한 실시양태에서, U1AO는 표적화 모이어티 및 세포 침투 모이어티 둘 다에 접합된다. 본원에 사용된 용어 "세포 침투제" 또는 "세포 침투 모이어티"는 세포외 공간으로부터 세포 내로 화합물의 전달을 매개하는 화합물 또는 작용기를 지칭한다. 특정한 실시양태에서, U1AO는 압타머에 접합된다. 압타머는 원하는 세포 유형의 표면 화합물 또는 단백질 (예를 들어, 수용체)에 대해 표적화될 수 있다 (예를 들어, 표면 화합물 또는 단백질은 표적화될 세포 유형의 표면 상에서 우선적으로 또는 독점적으로 발현될 수 있다). 특정한 실시양태에서, 압타머는 세포 침투 압타머이다 (예를 들어, C1 또는 Otter (예를 들어, 문헌 (Burke, D.H. (2012) Mol. Ther., 20: 251-253) 참조)). 특정한 실시양태에서, U1AO는 세포 침투 펩티드 (예를 들어, Tat 펩티드 (예를 들어, YGRKKKRRQRRRPPQ; 서열식별번호 6 (임의적으로 N-말단에서 아세틸화됨)), 페네트라틴 (예를 들어, RQIKIWFQNRRMKWKKGG; 서열식별번호 7), (예를 들어, Pep- 및 MPG-계열로부터의) 짧은 양친매성 펩티드, 올리고아르기닌 (예를 들어, 4-12개의 연속한 아르기닌), 올리고리신 (예를 들어, 4-12개의 연속한 리신))에 접합된다. 특정한 실시양태에서, U1AO는 (표적화 항체의 일부로서) 비오틴과 같은 소분자 또는 비-극성 형광기 (예를 들어, Cy3 또는 Cy5와 같은 시아닌) 또는 다른 세포 침투제에 접합된다.
특정한 실시양태에서, U1AO의 3' 단부 및 5' 단부 중 적어도 하나는 유리-SH기를 포함한다.
본원에 기재된 U1AO (동일한 것을 포함하는 비히클 포함)는 일반적으로 제약 제제로서 환자에게 투여될 것이다. 본원에 사용된 용어 "환자" 및 "대상체"는 인간 및 동물을 포함한다. 이러한 U1 어댑터는 의사의 지도 하에 치료적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 U1AO를 포함하는 조성물은 임의의 제약상 허용되는 담체(들)와 함께 투여하기 위해 편리하게 제형화될 수 있다. 예를 들어, U1AO는 물, 완충 염수, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 디메틸 술폭시드 (DMSO), 오일, 세제, 현탁제 또는 이들의 적합한 혼합물과 같은 허용가능한 매질과 함께 제형화될 수 있다. 선택된 매질에서 U1AO의 농도는 다양할 수 있고, 매질은 제약 제제의 원하는 투여 경로에 기반하여 선택될 수 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 투여될 U1AO와 맞지 않는 경우를 제외하고는, 제약 제제에서 그의 사용이 고려된다.
특정한 환자에게 투여하기에 적합한 본 발명에 따른 U1AO의 용량 및 투여량 레지멘은 환자의 연령, 성별, 체중, 일반적인 의학적 상태 및 U1AO가 투여되는 특정 병태 및 그의 중증도를 고려하여 의사에 의해 결정될 수 있다. 의사는 또한 투여 경로, 제약 담체 및 U1AO의 생물학적 활성을 고려할 수 있다.
적합한 제약 제제의 선택은 또한 선택된 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 본 발명의 U1AO는 원하는 부위 (예를 들어, 뇌)에 직접 주사에 의해 투여될 수 있다. 이 경우, 제약 제제는 주사 부위에 맞는 매질에 분산된 U1AO를 포함한다. 본 발명의 U1AO는 임의의 방법으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 U1AO는, 제한 없이, 비경구, 피하, 경구, 국소, 폐, 직장, 질, 정맥내, 뇌실내, 두개내, 복강내, 경막내, 뇌내, 경막외, 근육내, 피내, 또는 경동맥내로 투여될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 투여 방법은 (예를 들어, 뇌로의) 직접 주사에 의하거나 뇌실내이다. 주사용 제약 제제는 관련 기술분야에 공지되어 있다. U1AO를 투여하기 위한 방법으로 주사를 선택한 경우, 충분한 양의 분자 또는 세포가 표적 세포에 도달하여 생물학적 효과를 발휘하도록 조치가 취해져야 한다.
활성 성분으로서 본 발명의 U1AO를 제약상 허용되는 담체와 긴밀하게 혼합하여 함유하는 제약 조성물은 통상적인 제약 배합 기술에 따라 제조될 수 있다. 담체는 투여에 필요한 제제의 형태, 예를 들어, 정맥내, 경구, 직접 주사, 두개내, 뇌실내 및 유리체내에 따라 매우 다양한 형태를 취할 수 있다.
본 발명의 제약 제제는 투여의 용이함 및 투여량의 균일성을 위해 투여량 단위 형태로 제형화될 수 있다. 본원에 사용된 투여량 단위 형태는 치료를 받는 환자에 적합한 제약 제제의 물리적으로 분리된 단위를 지칭한다. 각각의 투여량은 선택된 제약 담체와 관련하여 원하는 효과를 생성하도록 계산된 활성 성분의 양을 함유해야 한다. 적절한 투여량 단위를 결정하기 위한 절차는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.
투여량 단위는 환자의 체중에 따라 비례적으로 증가 또는 감소될 수 있다. 특정한 병리학적 상태의 경감을 위한 적절한 농도는 관련 기술분야에 공지된 바와 같이 투여량 농도 곡선 계산에 의해 결정될 수 있다.
본 발명에 따라, U1AO의 투여를 위한 적절한 투여량 단위는 동물 모델에서 분자 또는 세포의 독성을 평가함으로써 결정될 수 있다. 제약 제제 중의 다양한 농도의 U1AO가 마우스에 투여될 수 있으며, 치료의 결과로 관찰되는 유익한 결과 및 부작용에 기반하여 최소 및 최대 투여량을 결정할 수 있다. 적절한 투여량 단위는 다른 표준 약물과 조합하여 U1AO 치료의 효능을 평가함으로써 결정될 수도 있다. U1AO의 투여량 단위는 검출되는 효과에 따라 개별적으로 또는 각각의 치료와 조합하여 결정될 수 있다.
U1AO를 포함하는 제약 제제는 적절한 간격으로, 예를 들어, 병리학적 증상이 감소 또는 경감될 때까지 1일 적어도 2회 또는 그 초과로 투여된 후, 투여량을 유지 수준으로 감량될 수 있다. 특정한 경우에 적절한 간격은 일반적으로 환자의 상태에 따라 다를 것이다.
정의
단수 형태는 문맥이 명백하게 달리 나타내지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다.
본원에 사용된 "핵산" 또는 "핵산 분자"는 단일 또는 이중 가닥인 임의의 DNA 또는 RNA 분자 및, 단일 가닥인 경우, 선형 또는 원형 형태의 상보적 서열의 분자를 지칭한다. 핵산 분자를 논의함에 있어서, 특정한 핵산 분자의 서열 또는 구조는 5'에서 3' 방향으로 서열을 제공하는 일반적인 관례에 따라 본원에 기재될 수 있다. 본 발명의 핵산과 관련하여, 용어 "단리된 핵산"이 때때로 사용된다. 이 용어는 DNA에 적용될 때 이것이 유래된 유기체의 자연 발생 게놈에서 바로 인접한 서열로부터 분리된 DNA 분자를 지칭한다. 예를 들어, "단리된 핵산"은 벡터, 예컨대 플라스미드 또는 바이러스 벡터에 삽입되거나 원핵 또는 진핵 세포 또는 숙주 유기체의 게놈 DNA에 통합된 DNA 분자를 포함할 수 있다.
RNA에 적용될 때, 용어 "단리된 핵산"은 상기 정의된 바와 같은 단리된 DNA 분자에 의해 코딩된 RNA 분자를 지칭할 수 있다. 대안적으로, 용어는 자연 상태(즉, 세포 또는 조직)에서 회합될 다른 핵산으로부터 충분히 분리된 RNA 분자를 지칭할 수 있다. 단리된 핵산 (DNA 또는 RNA)은 또한 생물학적 또는 합성 수단에 의해 직접적으로 생성되고 그의 생성 동안 존재하는 다른 성분으로부터 분리된 분자를 나타낼 수 있다.
"벡터"는 또 다른 유전자 서열 또는 요소 (DNA 또는 RNA)가 부착될 수 있는 플라스미드, 코스미드, 백미드, 파지 또는 바이러스와 같은 유전적 요소이다. 벡터는 부착된 서열 또는 요소의 복제를 야기하도록 레플리콘일 수 있다.
"발현 오페론"은 프로모터, 인핸서, 번역 시작 신호 (예를 들어, ATG 또는 AUG 코돈), 폴리아데닐화 신호, 종결자 등과 같은 전사 및 번역 제어 서열을 보유할 수 있고 숙주 세포 또는 유기체에서 핵산 또는 폴리펩티드 코딩 서열의 발현을 촉진하는 핵산 분절을 지칭한다. "발현 벡터"는 숙주 세포 또는 유기체에서 핵산 또는 폴리펩티드 코딩 서열의 발현을 촉진하는 벡터이다.
본원에 사용된 용어 "올리고뉴클레오티드"는 본 발명의 핵산 서열, 프라이머 및 프로브를 지칭하며, 2개 이상, 바람직하게는 3개 초과의 리보 또는 데옥시리보뉴클레오티드로 구성된 핵산 분자로 정의된다. 올리고뉴클레오티드의 정확한 크기는 다양한 요인 및 올리고뉴클레오티드의 특정한 적용 및 용도에 따라 달라질 것이다.
어구 "소형 간섭 RNA (siRNA)"는 짧은 (전형적으로 30개 미만의 뉴클레오티드 길이, 보다 전형적으로 약 21개 내지 약 25개의 뉴클레오티드 길이) 이중 가닥 RNA 분자를 지칭한다. 전형적으로, siRNA는 siRNA가 표적화되는 유전자의 발현을 조정한다. 용어 "짧은 헤어핀 RNA" 또는 "shRNA"는 siRNA 및 적어도 하나, 전형적으로 1-10개 뉴클레오티드의 단일 가닥 루프 부분을 포함하는 헤어핀 구조로 접힌 단일 RNA 분자인 siRNA 전구체를 지칭한다.
용어 "RNA 간섭" 또는 "RNAi"는 일반적으로 표적 분자 (예를 들어, 표적 유전자, 단백질 또는 RNA)가 이중-가닥 RNA를 통해 하향조절되는 서열-특이적 또는 선택적 프로세스를 지칭한다. 전형적으로 RNAi 활성을 유도하는 이중-가닥 RNA 구조는 siRNA, shRNA, microRNA, 및 RNA 간섭에 의해 표적 전사체의 발현을 억제하는 소형 RNA 종을 생성하도록 프로세싱될 수 있는 다른 이중-가닥 구조이다.
용어 "안티센스"는 왓슨-크릭 염기 쌍형성에 의해 RNA 내 표적 서열에 혼성화되어 표적 서열, 전형적으로 mRNA와 함께 RNA:올리고뉴클레오티드 헤테로듀플렉스를 형성하는 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 거의 상보성을 가질 수 있다. 이들 안티센스 올리고뉴클레오티드는 mRNA의 번역을 차단하거나 억제할 수 있고/거나 mRNA의 스플라이스 변이체를 생성하도록 mRNA의 프로세싱을 변형할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 약 5 내지 약 100개의 뉴클레오티드 길이, 보다 전형적으로 약 7 내지 약 50개의 뉴클레오티드 길이, 보다 더 전형적으로 약 10 내지 약 30개의 뉴클레오티드 길이이다.
용어 "실질적으로 순수한"은 적어도 50-60 중량%의 주어진 물질 (예를 들어, 핵산, 올리고뉴클레오티드, 단백질 등)을 포함하는 제제를 지칭한다. 보다 바람직하게는, 제제는 적어도 75 중량%, 가장 바람직하게는 90-95 중량%의 주어진 화합물을 포함한다. 순도는 주어진 화합물에 적절한 방법 (예를 들어, 크로마토그래피 방법, 아가로스 또는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, HPLC 분석 등)에 의해 측정된다.
용어 "단리된"은 자연적으로 회합되는 다른 화합물로부터 충분히 분리된 화합물 또는 복합체를 지칭할 수 있다. "단리된"은 다른 화합물 또는 물질과의 인공 또는 합성 혼합물, 또는 기본 활성 또는 후속 검정을 방해하지 않고, 예를 들어, 불완전한 정제로 인해 존재할 수 있는 불순물의 존재, 또는 안정화제의 첨가를 배제하는 것을 의미하지 않는다.
용어 "유전자"는 엑손 및 (임의적으로) 인트론 서열 둘 다를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 핵산을 지칭한다. 핵산은 또한 임의적으로 프로모터 또는 인핸서 서열과 같은 비-코딩 서열을 포함할 수 있다. 용어 "인트론"은 단백질로 번역되지 않고 일반적으로 엑손 사이에서 발견되는 주어진 유전자에 존재하는 DNA 서열을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "압타머"는 왓슨-크릭 염기 쌍형성 이외의 상호작용을 통해 단백질과 같은 표적에 특이적으로 결합하는 핵산을 의미한다. 특정한 실시양태에서, 압타머는 샘플 중의 다른 분자를 일반적으로 배제하기 위해 하나 이상의 표적 (예를 들어, 단백질 또는 단백질 복합체)에 특이적으로 결합한다. 압타머는 RNA, DNA, 변형된 핵산 또는 이들의 혼합물과 같은 핵산일 수 있다. 압타머는 또한 선형 또는 원형 형태의 핵산일 수 있으며, 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 압타머는 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40개 또는 그 초과의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 압타머는 최대 40, 최대 60, 최대 80, 최대 100, 최대 150, 최대 200개 또는 그 초과의 뉴클레오티드 길이인 서열을 포함할 수 있다. 압타머는 약 5 내지 약 150개의 뉴클레오티드, 약 10 내지 약 100개의 뉴클레오티드, 또는 약 20 내지 약 75개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 압타머는 본원에서 핵산 분자 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드) 압타머로서 논의되지만, 핵산 압타머 대신에 펩티드 압타머와 같은 압타머 등가물도 사용될 수 있다.
본원에 사용된 어구 "작동가능하게 연결된"은 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 위치되는 핵산 서열을 지칭할 수 있다. 작동가능하게 연결될 수 있는 핵산 서열의 예는, 제한 없이, 프로모터, 전사 종결자, 인핸서 또는 활성자 및 전사되고 적절한 경우 번역되면 단백질, 리보자임 또는 RNA 분자와 같은 기능적 생성물을 생성하는 이종 유전자를 포함한다.
"제약상 허용되는"은 연방 정부 또는 주 정부의 규제 기관의 승인을 나타낸다. "제약상 허용되는" 작용제는 미국 약전 또는 동물, 보다 특히 인간에서 사용하기 위해 일반적으로 인정되는 다른 약전에 나열될 수 있다.
"담체"는, 예를 들어, 이와 함께 본 발명의 활성제가 투여되는 희석제, 보존제, 가용화제, 유화제, 아주반트, 부형제, 보조제 또는 비히클을 지칭한다. 이러한 제약 담체는 멸균 액체, 물 및 오일, 예를 들어, 과 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 기원의 것, 예컨대 땅콩 오일, 대두 오일, 미네랄 오일, 참깨 오일 등일 수 있다. 물 또는 염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이 담체로서 사용될 수 있다. 적합한 제약 담체는, 예컨대 문헌 ("Remington's Pharmaceutical Sciences" by E.W. Martin)에 기재되어 있다.
"항체" 또는 "항체 분자"는 특정 항원에 결합하는 항체 및 그의 단편 (예를 들어, 면역학적으로 특이적인 단편)을 포함하는 임의의 이뮤노글로불린이다. 본원에 사용된 바와 같이, 항체 또는 항체 분자는 온전한 이뮤노글로불린 분자, 이뮤노글로불린 분자의 면역학적 활성 부분, 및 이뮤노글로불린 분자의 면역학적 활성 부분의 융합물을 고려한다. 용어는 폴리클로날, 모노클로날, 키메라, 단일 도메인 (Dab) 및 이중특이적 항체를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 항체 또는 항체 분자는 재조합적으로 생성된 온전한 이뮤노글로불린 분자 및 이뮤노글로불린 분자의 면역학적 활성 부분, 예컨대, 제한 없이, Fab, Fab', F(ab')2, F(v), scFv, scFv2, 및 scFv-Fc를 고려한다.
항체와 관련하여 용어 "면역학적으로 특이적인"은 관심 단백질 또는 화합물의 하나 이상의 에피토프에는 결합하지만 항원성 생물학적 분자의 혼합 집단을 함유하는 샘플 중의 다른 분자는 실질적으로 인식 및 결합하지 않는 항체를 지칭한다.
용어 "치료하다"는 환자의 질환의 진행을 완화, 경감 및/또는 지연시키는 화합물의 능력을 지칭한다. 다시 말해서, 용어 "치료하다"는 질환의 진행을 억제 및/또는 역전시키는 것을 지칭한다.
하기 실시예는 본 발명을 실시하는 예시적인 방법을 설명하고 어떠한 방식으로도 본 발명의 범주를 제한하도록 의도되지 않는다.
실시예
HD9197 세포 (코리엘 인스티튜트 (Coriel Institute) GM09197; 21/181 CAG 반복, 섬유모세포 6세 남성)는 리포펙타민(Lipofectamine)™ RNAiMAX 형질감염 시약 (인비트로겐 (Invitrogen), 캘리포니아주 칼스배드)을 사용하여 전장 인간 헌팅틴 (HTT)에 대해 지시된 U1 어댑터 올리고뉴클레오티드 (U1AO) 및 siRNA (하기 참조) 패널로 형질감염되었다. 하이포크산틴 포스포리보실트랜스퍼라제 1 (HPRT1)에 대해 정규화된 인간 HTT mRNA의 변화 퍼센트가 결정되었다. 도 2에 나타난 바와 같이, 인간 HTT-전장 mRNA-2 (hHTT-FL-2) U1AO는 가장 높은 침묵 활성을 가졌으며, 이는 임의의 siRNA로 관찰된 침묵보다 유의하게 더 컸다. 특히, 추가 실험은 hHTT-FL-1 U1AO가 < 30%로 침묵할 수 있음을 제시하였다. DU145 (인간 전립선암 세포주) 및 Mia PaCa2 세포 (인간 췌장암 세포주)로도 유사한 결과가 얻어졌다. HTT의 말단절단된 버전 (대안적으로 스플라이싱된 또는 인트론 1 말단절단된 형태로도 지칭됨)과 관련하여, hHTT-TR-1 U1AO가 가장 큰 침묵 활성을 갖는 것으로 결정되었다.
본원에 기재된 실험에 사용된 U1AO 및 siRNA는 하기와 같다:
U1AO:
hHTT-fl-11:
UCCUGCUGAUGACAUGUGGGGCCAGGUAAGUAU (서열식별번호: 8), 여기서 각각의 뉴클레오티드는 2'-O-메틸임;
hHTT-fl-21:
CAGAAAAGGUUCACGUCCACGCCAGGUAAGUAU (서열식별번호: 9), 여기서 각각의 뉴클레오티드는 2'-O-메틸임;
hHTT-fl-31:
CAACCACCUCAAGCACAGACGCCAGGUAAGUAU (서열식별번호: 10), 여기서 각각의 뉴클레오티드는 2'-O-메틸임;
hHTT-fl-41:
UUCGUAAACAAGUCAGCAGCGCCAGGUAAGUAU (서열식별번호: 11), 여기서 각각의 뉴클레오티드는 2'-O-메틸임;
hHTT-fl-51:
GCCUCACAGUCUCUCCCACCGCCAGGUAAGUAU (서열식별번호: 12), 여기서 각각의 뉴클레오티드는 2'-O-메틸임;
hHTT-fl-61:
GUGACUAUCAGGAGAAAGGAGCCAGGUAAGUAU (서열식별번호: 13), 여기서 각각의 뉴클레오티드는 2'-O-메틸임;
hHTT-FL-2:
mC+AmGmAmA+AmAmGmG+TmUmCmA+CmGmUmC+CmAmCmGmCmCmAmGmGmUmAmAmGmUmAmU (서열식별번호: 14), 여기서 m = 2'-O-메틸 및 + = 잠금 핵산;
hHTT-TR-1:
mA+GmGmGmU+TmAmCmC+GmCmCmA+TmCmCmC+CmGmCmGmCmCmAmGmGmUmAmAmGmUmAmU (서열식별번호: 15), 여기서 m = 2'-O-메틸 및 + = 잠금 핵산;
hHTT-TR-2:
mGmC+GmAmGmA+GmGmAmC+AmAmGmG+GmAmAmG+AmCmGmCmCmAmGmGmUmAmAmGmUmAmU (서열식별번호: 16), 여기서 m = 2'-O-메틸 및 + = 잠금 핵산;
NC-a (ctrl):
mAAmCmGmGmUmUmAmGmGmCmAmCmCmTmCmUmUmGmAmGmCmCmAmGmGmUmAmAmGmUmAmU (서열식별번호: 17), wherein m = 2'-O-메틸;
mHTT-FL-A:
mUmGmC+AmGmCmC+AmCmCmA+CmCmUmC+AmAmAmC+AmGmCmC+AmGmG+TmA+AmGmU+AmU (서열식별번호: 18), 여기서 m = 2'-O-메틸 및 + = 잠금 핵산; 및
mHTT-TR-A:
mA+GmUmUmC+TmCmUmU+CmAmCmA+AmCmAmG+TmCmAmGmCmC+AmGmG+TmA+AmGmU+AmU (서열식별번호: 19), 여기서 m = 2'-O-메틸 및 + = 잠금 핵산;
siRNA:
hHTT-siRNA-1 (양쪽 가닥이 표시됨; r = RNA):
5'-rGrGrA rUrArG rUrArG rArCrA rGrCrA rArUrA rArCrU rCrGG T-3' (서열식별번호: 20)
5'-rArCrC rGrArG rUrUrA rUrUrG rCrUrG rUrCrU rArCrU rArUrC rCrGrU-3' (서열식별번호: 21);
hHTT-siRNA-2 (양쪽 가닥이 표시됨; r = RNA):
5'-rArGrA rArCrU rUrUrC rArGrC rUrArC rCrArA rGrArA rArGA C-3' (서열식별번호: 22)
5'-rGrUrC rUrUrU rCrUrU rGrGrU rArGrC rUrGrA rArArG rUrUrC rUrUrU-3' (서열식별번호: 23); 및
hHTT-siRNA-3 (양쪽 가닥이 표시됨; r = RNA):
5'-rArCrA rGrCrU rCrCrA rGrCrC rArGrG rUrCrA rGrCrG rCrCG T-3' (서열식별번호: 24)
5'-rArCrGr GrCrG rCrTrG rArCrC rTrGrG rCrTrG rGrArG rCrTrG rTrTrG-3' (서열식별번호: 25).
도 3은 다양한 항-hHTT-FL U1AO 및 siRNA로 48시간 형질감염된 (리포펙타민™ 2000) 인간 DU145 세포의 웨스턴 블롯을 제공한다 (하기 참조). 세포를 램리 버퍼에 직접적으로 용해시킨 다음, 6-20% 구배 겔에서 전기영동한 후 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 최고의 항-hHTT-FL U1AO (hHTT-FL-1 및 hHTT-FL-2)가 여기에 사용되었으며, 단백질 수준에서 침묵 활성을 나타낸다. 항-HTT-FL siRNA도 침묵 활성을 나타내었다. 특히, 더 적은 U1AO의 사용은 더 적은 침묵을 제공하였다 (레인 9를 레인 7과 비교함).
YAC128은 128개의 CAG 반복을 갖는 전체 인간 HTT 유전자 (300,000 bp)를 함유하는 마우스이다. U1AO의 효과를 결정하기 위해, 1 μg 또는 20 μg의 hHTT-FL-2 U1AO 또는 염수를 YAC128 마우스에 편측으로 뇌실내 (ICV) 주사하였다. 48시간 후, 마우스를 관류로 희생시켰다. 좌측 전뇌로부터의 총 RNA를 트리졸-기반 방법으로 추출하고, RT-qPCR로 분석하고, 진핵생물 번역 개시 인자 4A3 (Eif4a3)으로 정규화하였다. 도 4a에 나타난 바와 같이, hHTT-FL-2 U1AO의 20 μg의 편측-ICV-주사된 용량은 염수 처리된 마우스와 비교하여 YAC128 뇌에서 hHTT-Fl mRNA를 62% 감소로 침묵시킨다. 침묵의 특이성은, hHTT-Tr mRNA 이소형 (도 4b) 및 Eif4a3 하우스키핑 유전자는 둘 다 발현에서의 관찰가능한 변화를 겪지 않았다는 사실에 의해 확인된다.
YAC128 마우스의 전뇌로부터의 총 RNA(4 μg / 레인)를 32P 노던 블롯 (8% PAGE)으로 분석하였다 (도 5). 구체적으로, 블롯은 U1AO 수준을 측정하기 위해 hHTT-FL-2 U1AO에 상보적인 33nt 32P-항-hHTT-FL-2 올리고뉴클레오티드로 프로빙되었다. "표준"으로 표시된 레인은 주사되지 않은 U1AO이며, 그들의 포함은 엄격한 정량화를 허용한다. 도 5에 나타난 바와 같이, 뇌 조직의 U1AO는 분해되지도 단축되지도 않는다. 주사된 U1AO의 단축은 단지 몇 개의 뉴클레오티드에 의해서도 표준에 비해 이동에서의 현저한 변화를 초래할 것이다.
제자리 혼성화 (ISH) 기술의 한 유형인 RNA스코프® 분석을 이용하여 단일 셀 해상도로 hHTT-FL 전사체를 검출하였다. 간단히, RNA스코프® 방법은 48시간 동안 4% 파라포름알데히드에서 반뇌를 고정하고, PBS로 옮기고, 파라핀 포매를 위해 조직 프로세서를 통해 프로세싱하는 것을 수반한다. 포르말린-고정된 파라핀-포매된 (FFPE) 뇌를 시상면 및 선조체 섹션을 통해 5 마이크론 두께로 절단한 후, hHTT-FL mRNA에 특이적인 RNA스코프® 프로브를 사용하여 제자리 혼성화를 수행하였다. 도 6에 나타난 바와 같이, hHTT-FL-2 U1AO 처리된 마우스 (우측)는 염수 처리된 마우스 (좌측)에 비해 더 적은 도트 및 감소된 강도를 가지므로, hHTT-FL의 침묵을 입증한다.
hHTT-FL-2 U1AO의 안정성을 추가로 입증하기 위해, 20 μg의 hHTT-FL-2 U1AO 또는 염수를 YAC128 마우스에 편측으로 뇌실내 (ICV) 주사하였다. 2, 4 또는 7일 후, 마우스를 관류로 희생시켰다. 좌측 전뇌로부터의 총 RNA를 트리졸-기반 방법으로 추출하고, RT-qPCR로 분석하고, 진핵생물 번역 개시 인자 4A3 (Eif4a3)으로 정규화하였다. 도 7a에 나타난 바와 같이, hHTT-FL-2 U1AO의 20 μg의 편측-ICV-주사된 용량은 YAC128 뇌에서 hHTT-Fl mRNA를 시간 경과에 따라 지속적으로 감소시킨다. 도 7b는 U1AO 수준을 측정하기 위해 hHTT-FL-2 U1AO에 상보적인 33nt 32P-항-hHTT-FL-2 올리고뉴클레오티드로 프로빙된 노던 블롯 분석을 제공한다. 도 7b에 나타난 바와 같이, 뇌 조직의 U1AO는 시간 경과에 따라 분해되지도 단축되지도 않는다.
hHTT-Tr을 침묵시키는 능력도 입증되었다. 20 μg의 hHTT-TR-1 U1AO, hHTT-TR-2 U1AO 또는 염수를 YAC128 마우스에 편측으로 ICV 주사하였다. 48시간 후, 마우스를 관류로 희생시켰다. 전뇌로부터의 총 RNA를 트리졸-기반 방법으로 추출하고, RT-qPCR로 분석하고, 진핵생물 번역 개시 인자 4A3 (Eif4a3)으로 정규화하였다. 도 8a에 나타난 바와 같이, hHTT-TR-1 U1AO는 hHTT-TR을 효과적으로 침묵시키지 않는 반면, hHTT-TR-2 U1AO는 hHTT-TR을 약 79%까지 유의하게 침묵시킨다. 염수-처리된 또는 hHTT-TR-처리된 마우스에서 hHTT-FL mRNA에 대해 침묵이 관찰되지 않았기 때문에 효과는 특이적이었다 (도 8b).
항-마우스 HTT U1AO도 합성되었으며, 배양된 세포에서 mHTT를 침묵시키는 것으로 나타났다. 최고의 항-마우스 HTT U1AO는 mHTT-TR-a (mHTT-TR mRNA 전사체를 표적화함) 및 mHTT-FL-a (mHTT-FL mRNA 전사체를 표적화함)였다. 이어서, 이들 U1AO를 Q175 마우스 모델에서 시험하였다. Q175 마우스는 이형접합체의 경우 HTT 대립 유전자 중 하나가 175개의 CAG 반복을 갖는 녹-인 마우스이다. U1AO의 효과를 결정하기 위해, 염수, 20 μg의 mHTT-TR-A U1AO 또는 40 μg의 비-특이적 제어 어댑터 (NC-A) U1AO를 Q175 마우스에 편측으로 ICV 주사하였다. NC-A U1AO는 어떠한 마우스 유전자도 침묵시키지 않도록 설계된 비-특이적 대조군 U1AO이다. 48시간 후, 마우스를 관류로 희생시켰다. 좌측 전뇌로부터의 총 RNA를 트리졸-기반 방법으로 추출하고, RT-qPCR로 분석하고, 진핵생물 번역 개시 인자 4A3 (Eif4a3)으로 정규화하였다. 도 9a에 나타난 바와 같이, mHTT-TR-A U1AO의 20 μg의 편측-ICV-주사된 용량은 대조군 처리된 마우스와 비교하여 Q175 뇌에서 mHTT-TR mRNA를 75% 감소로 침묵시킨다. 침묵의 특이성은, mHTT-FL mRNA 이소형 (도 9b) 및 Eif4a3 하우스키핑 유전자는 둘 다 발현에서의 유의한 변화를 겪지 않았다는 사실에 의해 확인된다.
RNA스코프® 분석은 또한 단일 셀 해상도로 mHTT-TR 전사체를 검출하기 위해 수행되었다. 간단히, RNA스코프® 방법은 48시간 동안 4% 파라포름알데히드에서 반뇌를 고정하고, PBS로 옮기고, 파라핀 포매를 위해 조직 프로세서를 통해 프로세싱하는 것을 수반한다. 포르말린-고정된 파라핀-포매된 (FFPE) 뇌를 시상면 및 선조체 섹션을 통해 5 마이크론 두께로 절단한 후, mHTT-TR mRNA에 특이적인 RNA스코프® 프로브를 사용하여 제자리 혼성화를 수행하였다. 도 10에 나타난 바와 같이, mHTT-TR-A U1AO-처리된 마우스 (우측)는 염수 처리된 마우스 (좌측)에 비해 더 적은 도트 및 감소된 강도를 가지므로, mHTT-TR의 침묵을 입증한다.
mHTT-TR-A U1AO의 안정성을 추가로 입증하기 위해 20 μg의 mHTT-TR-A U1AO 또는 염수를 Q175 마우스에 편측으로 뇌실내 (ICV) 주사하였다. 21일 후, 마우스를 관류로 희생시켰다. 좌측 전뇌로부터의 총 RNA를 트리졸-기반 방법으로 추출하고, RT-qPCR로 분석하고, 진핵생물 번역 개시 인자 4A3 (Eif4a3)으로 정규화하였다. 도 11a에 나타난 바와 같이, mHTT-TR-A U1AO의 20 μg의 편측-ICV-주사된 용량은 심지어 21일 후에도 Q175 마우스 뇌에서 mHTT-TR mRNA를 감소시킨다. 침묵의 특이성은, mHTT-FL mRNA 이소형 (도 11b) 및 Eif4a3 하우스키핑 유전자는 둘 다 발현에서의 유의한 변화를 겪지 않았다는 사실에 의해 확인된다.
mHTT-FL U1AO의 효과를 결정하기 위해, 염수, 40 μg의 mHTT-FL-A U1AO, 또는 40 μg의 비-특이적 제어 어댑터 (NC-A) U1AO를 Q175 마우스에 편측으로 ICV 주사하였다. NC-A U1AO는 어떠한 마우스 유전자도 침묵시키지 않도록 설계된 비-특이적 대조군 U1AO이다. 48시간 후, 마우스를 관류로 희생시켰다. 좌측 전뇌로부터의 총 RNA를 트리졸-기반 방법으로 추출하고, RT-qPCR로 분석하고, 진핵생물 번역 개시 인자 4A3 (Eif4a3)으로 정규화하였다. 도 12a에 나타난 바와 같이, 40 μg의 편측-ICV-주사된 용량의 mHTT-FL-A U1AO는 대조군 처리된 마우스와 비교하여 Q175 뇌에서 mHTT-FL mRNA를 69% 감소로 침묵시킨다. 침묵의 특이성은, mHTT-TR mRNA 이소형 (도 12b) 및 Eif4a3 하우스키핑 유전자는 둘 다 발현에서의 유의한 변화를 겪지 않았다는 사실에 의해 확인된다.
RNA스코프® 분석은 또한 단일 셀 해상도로 mHTT-FL 전사체를 검출하기 위해 수행되었다. 간단히, RNA스코프® 방법은 48시간 동안 4% 파라포름알데히드에서 반뇌를 고정하고, PBS로 옮기고, 파라핀 포매를 위해 조직 프로세서를 통해 프로세싱하는 것을 수반한다. 포르말린-고정된 파라핀-포매된 (FFPE) 뇌를 시상면 및 선조체 섹션을 통해 5 마이크론 두께로 절단한 후, mHTT-FL mRNA에 특이적인 RNA스코프® 프로브를 사용하여 제자리 혼성화를 수행하였다. 도 13에 나타난 바와 같이, mHTT-FL-A U1AO-처리된 마우스 (우측)는 염수 처리된 마우스 (좌측)에 비해 더 적은 도트 및 감소된 강도를 가지므로, mHTT-FL의 침묵을 입증한다.
hHTT-FL-2 U1AO에 대한 생체분포 연구도 수행되었다. 간단히, 단일 세포 수준에서 뇌 영역의 생체분포를 평가하기 위해, Cy3-형광 표지된 hHTT-FL-2 U1AO (Cy3-hHTT-FL-2 U1AO)를 사용하여 일련의 실험을 수행하였다. 5 μg의 Cy3-hHTT-FL-2 U1AO를 6-8개월령 YAC128 마우스에 편측으로 ICV 주사하였다. 주사 후 1, 7 및 28일에, 혈액 및 세포외 U1AO를 제거하기 위해 마우스를 관류 (염수 사용)로 희생시켰다. 이후, 뇌 샘플은 공초점 현미경으로 연구되었다. 특히, Cy3 형광 그룹 자체가 독성을 입증했기 때문에 더 높은 용량의 Cy3-hHTT-FL-2 U1AO는 사용되지 않았다. 실제로, 각각 30 μg 및 80 μg Cy3-hHTT-FL-2 U1AO의 화학량론적 당량인 1.5 μg 및 4 μg의 유리 Cy3의 주사는 YAC128 마우스에 매우 독성이 있는 것으로 결정되었다. 5 μg의 Cy3-hHTT-FL-2 U1AO를 사용하면 YAC128 마우스에서 명백한 독성 효과가 나타나지 않았다.
생체분포 검정은 Cy3-hHTT-FL-2 U1AO가 좌측 뇌실에 ICV 주사된 후 Cy3-hHTT-FL-2 U1AO가 빠르게 (1일 이내) 좌측 및 우측 반뇌 둘 다에 걸쳐 유의하게 분포되어 7일 및 28일까지 뇌의 좌측 및 우측 둘 다에서 Cy3-hHTT-FL-2 U1AO의 대칭적 분포가 초래된다는 것을 제시하였다. 이들 결과는 Cy3-hHTT-FL-2 U1AO가 좌뇌실 주사로부터 주사 부위에서 가장 먼 우측 반뇌 영역을 포함하여 다른 뇌 영역 (예를 들어, 선조체, 피질, 해마, 소뇌)으로 빠르게 이동한다는 것을 제시한다. Cy3-hHTT-FL-2 U1AO는 또한 대부분의 뉴런 (예를 들어, 피질 뉴런) 및 세포 유형에 의해 광범위하게 흡수되었다. 또한, Cy3-hHTT-FL-2 U1AO는 핵 및 핵 주위에서 명확하게 볼 수 있었다. 마지막으로, 형광 강도는 1일 및 7일 시점에 비해 28일 시점에서 약간만 감소하였으므로, 시간 경과에 따른 Cy3-hHTT-FL-2 U1AO의 안정성을 입증한다.
추가 실험을 수행하여 1개월부터 4개월까지 mHTT-Fl 전사체의 50% 내지 80% 지속적인 감소를 입증하였다. 병행 실험에서, 1개월부터 4개월까지 mHTT-Tr 전사체의 50% 내지 80%의 지속적인 감소를 달성하는 조건을 확인하였다.
첫째, Q175 마우스는 10, 20, 40 및 80 μg (용량당 마우스 n = 9)의 4가지 상이한 농도의 mHTT-FL-a U1AO의 단일 편측 ICV 용량을 받았다 (총 36마리의 마우스를 제공함). 각각의 농도로부터의 3마리의 마우스 코호트를 1, 2 및 4개월 후에 안락사시켰으며, 여기서 마우스는 1x PBS로 관류를 받은 후 희생되었다. 반뇌를 수집하고, RT-qPCR 및 노던 블롯에 의한 분석을 위해 프로세싱하였다. 모든 U1 어댑터 처리된 마우스를 비처리된 Q175 마우스와 비교하였다. mHTT-Fl 전사체의 침묵을 RT-qPCR에 의해 평가한 다음, 그를 100%로 설정된 비처리 마우스와 비교하였다. mHTT-Tr 전사체를 검출하기 위한 RT-qPCR은 mHTT-Tr 전사체 Ct 값을 방해하는 인트론 #1 DNA를 제거하는데 필요한 Dnase 처리를 포함하였다.
도 15a, 15b 및 15c에 나타난 바와 같이, mHTT-Fl 전사체는 처리 후 각각 1, 2 및 4개월에 특이적으로 감소되었다. 도 15d는 단일 편측 ICV 용량의 대조군 NC-a U1AO로 처리된 대조군-처리된 Q175 마우스는 80 μg의 최고 농도에서 mHTT-Fl 전사체 또는 mHTT-Tr 전사체에 감소가 없음을 제시한다.
둘째, Q175 마우스는 10, 20, 40 및 80 μg (용량당 마우스 n = 9)의 4가지 상이한 농도의 mHTT-Tr-a U1AO의 단일 편측 ICV 용량을 받았다 (총 36마리의 마우스를 제공함). 각각의 농도로부터의 3마리의 마우스 코호트를 1, 2 및 4개월 후에 안락사시켰으며, 여기서 마우스는 1x PBS로 관류를 받은 후 희생되었다. 반뇌를 수집하고, RT-qPCR 및 노던 블롯에 의한 분석을 위해 프로세싱하였다. 모든 U1 어댑터 처리된 마우스를 비처리된 Q175 마우스와 비교하였다. mHTT-Tr 전사체의 침묵을 RT-qPCR에 의해 평가한 다음, 그를 100%로 설정된 비처리된 마우스와 비교하였다. mHTT-Tr 전사체를 검출하기 위한 RT-qPCR은 mHTT-Tr 전사체 Ct 값을 방해하는 인트론 #1 DNA를 제거하는데 필요한 Dnase 처리를 포함하였다.
도 16a, 16b 및 16c에 나타난 바와 같이, mHTT-Tr 전사체는 처리 후 각각 1, 2 및 4개월에 특이적으로 감소되었다.
mHTT-Tr-a U1AO에 의한 mHTT-Tr 전사체의 침묵은 1) mHTT-Fl 전사체에서의 유의한 변화가 관찰되지 않았고 2) NC-a 비-특이적 대조군 U1AO가 최고 용량 (80 μg)에서 1, 2 및 4개월의 지속기간에 침묵을 나타내지 않았기 때문에 특이적으로 간주되었다. 마찬가지로, mHTT-Fl-a U1AO에 의한 mHTT-Fl 전사체의 침묵은 1) mHTT-Tr 전사체에서의 유의한 변화가 관찰되지 않았고 2) NC-a 비-특이적 대조군 U1AO가 최고 용량 (80 μg)에서 1, 2 및 4개월의 지속기간에 침묵을 나타내지 않았기 때문에 특이적으로 간주되었다.
약동학 (PK) 연구도 수행되었다. PK 프로필은 상기 나열된 동일한 마우스의 3-포인트 시간-경과 지속기간과 조합된 4 포인트 용량 반응에 대한 32P-노던 블롯 분석에 의해 달성되었다. RT-qPCR을 수행하는데 사용된 동일한 RNA의 분취량을 노던 블로팅에 사용하였다. 간단히, 표준 및 32P 트레이서와 함께 U1 어댑터-처리된 마우스로부터의 RNA 샘플을 8% 변성 우레아-PAGE 겔에서 분리한 다음, 노던 블롯 막으로 옮겼다. 이어서, 막을 동족 32P-프로브로 프로빙하고, 세척하고, X-선 필름에 노출시켰다. 동족 프로브는 mHTT-Fl-a U1AO에 대한 안티센스인 32P-항-mHTT-FL-a로 불리는 32P-표지된 올리고뉴클레오티드 또는 mHTT-Tr-a U1AO에 대한 안티센스인 32P-항-mHTT-Tr-a로 불리는 32P-표지된 올리고뉴클레오티드 또는 NC-a U1AO에 대한 안티센스인 32P-항-NC-a로 불리는 32P-표지된 올리고뉴클레오티드였다. X선 필름에 여러 번 노출된 후, 노던 블롯은 타이푼(Typhoon)™ 시스템에서 포스포이미저 분석에 의해 정량화되었다. 결과는 도 17에 제공되어 있다.
U1AO의 조직병리학도 연구되었다. 간단히, YAC128 마우스에 염수 (n = 3) 또는 염수 중의 50 μg의 hHTI-FL-2 U1 어댑터 올리고 (n=5)를 ICV 주사하였다. 2마리의 마우스를 비처리 대조군으로 사용하였다. 마우스는 모두 수컷이었고, 연령 범위는 3-5개월이었다. 마우스를 7일 동안 처리하였다. 각각의 마우스로부터의 뇌, 신장 및 간 조직으로부터 2개의 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색 슬라이드를 조직병리학 분석을 위해 검사하였다. 상기 슬라이드의 현미경 검사는 ICV-50 μg U1 어댑터 올리고와 관련된 독성의 특정 조직병리학적 변화를 나타내지 않는다. H&E 슬라이드의 현미경 검사는 ICV-50 μg U1 어댑터 올리고와 관련된 독성의 특정 조직병리학적 변화를 나타내지 않았다.
본 발명의 바람직한 실시양태 중 일부가 상기에서 설명되고 구체적으로 예시되었지만, 본 발명이 이러한 실시양태로 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 하기의 청구범위에 기재된 바와 같이, 본 발명의 범주 및 취지를 벗어나지 않고 다양한 변형이 이루어질 수 있다.
본 발명이 속하는 기술의 상태를 보다 완전하게 설명하기 위해 몇몇 공개문 및 특허 문서가 상기 명세서에서 인용된다. 이들 인용 각각의 개시 내용은 본원에 참조로 포함된다.
SEQUENCE LISTING
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<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 378
agaggggcca acagccagcc gccaggtaag tat 33
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<211> 33
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<213> oligonucleotide
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ctcacggcac cttctactgc gccaggtaag tat 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
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tgctgatgac atgtgggagg gccaggtaag tat 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
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caaagagcac ttctgccaca gccaggtaag tat 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
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gcagggcaca agggcgcaga gccaggtaag tat 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
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ggcagggcac aagggcgcag gccaggtaag tat 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
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ggaggcaggg cacaagggcg gccaggtaag tat 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
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ggaagcccat agggaccaag gccaggtaag tat 33
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<212> DNA
<213> oligonucleotide
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tcagcagccg gtgatatggg gccaggtaag tat 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
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cttgtggaca tttcgtaaac gccaggtaag tat 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
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acaaagagca cttctgccac gccaggtaag tat 33
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<212> DNA
<213> oligonucleotide
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tgactatcag gagaaaggac gccaggtaag tat 33
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<212> DNA
<213> oligonucleotide
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gcaggtgact atcaggagaa gccaggtaag tat 33
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<213> oligonucleotide
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aacaaccagc aggtgactat gccaggtaag tat 33
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<213> oligonucleotide
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ctcaagcaca gactggaagg gccaggtaag tat 33
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<213> oligonucleotide
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caagtcagca gccggtgata gccaggtaag tat 33
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<213> oligonucleotide
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cacaaagagc acttctgcca gccaggtaag tat 33
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<212> DNA
<213> oligonucleotide
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actgccacaa agagcacttc gccaggtaag tat 33
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<212> DNA
<213> oligonucleotide
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gggctgcaac cacctcaagc gccaggtaag tat 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
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aacaagtcag cagccggtga gccaggtaag tat 33
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<212> DNA
<213> oligonucleotide
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agctgccgcc tcacagtctc gccaggtaag tat 33
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<212> DNA
<213> oligonucleotide
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gcgcagactt ccaaaggctc gccaggtaag tat 33
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<212> DNA
<213> oligonucleotide
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ggctcggtgg aggcagggca gccaggtaag tat 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
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tggccactgc cacaaagagc gccaggtaag tat 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
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ccccaccagg actgcagaca gccaggtaag tat 33
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<212> DNA
<213> oligonucleotide
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ggcaacaacc agcaggtgac gccaggtaag tat 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 404
tggcaacaac cagcaggtga gccaggtaag tat 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
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tcctgctgat gacatgtggg gccaggtaag tat 33
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<213> oligonucleotide
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ggggctgcaa ccacctcaag gccaggtaag tat 33
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<213> oligonucleotide
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cagggcacaa gggcgcagac gccaggtaag tat 33
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<213> oligonucleotide
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gctcggtgga ggcagggcac gccaggtaag tat 33
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gtgcggaagc ccatagggac gccaggtaag tat 33
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<213> oligonucleotide
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<213> oligonucleotide
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ccactgccac aaagagcact gccaggtaag tat 33
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<213> oligonucleotide
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caacaaccag caggtgacta gccaggtaag tat 33
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<213> oligonucleotide
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acagcagagg ggccaacagc gccaggtaag tat 33
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<213> oligonucleotide
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tcaagcacag actggaaggc gccaggtaag tat 33
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<213> oligonucleotide
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gccccaccag gactgcagac gccaggtaag tat 33
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<213> oligonucleotide
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agcaggtgac tatcaggaga gccaggtaag tat 33
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<213> oligonucleotide
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cagcaggtga ctatcaggag gccaggtaag tat 33
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<213> oligonucleotide
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ggcccagatg caagagcagc gccaggtaag tat 33
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<213> oligonucleotide
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tctgtagaag tctgtggcga gccaggtaag tat 33
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<212> DNA
<213> oligonucleotide
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cacctcaagc acagactgga gccaggtaag tat 33
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<213> oligonucleotide
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cccagctgcc gcctcacagt gccaggtaag tat 33
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<212> DNA
<213> oligonucleotide
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agggcacaag ggcgcagact gccaggtaag tat 33
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<213> oligonucleotide
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ctcagcccca ccaggactgc gccaggtaag tat 33
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<212> DNA
<213> oligonucleotide
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ggggccaaca gccagcctgc gccaggtaag tat 33
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<212> DNA
<213> oligonucleotide
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gcagaggggc caacagccag gccaggtaag tat 33
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<213> oligonucleotide
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ctgctgatga catgtgggag gccaggtaag tat 33
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<212> DNA
<213> oligonucleotide
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cagcagccgg tgatatgggc gccaggtaag tat 33
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<212> DNA
<213> oligonucleotide
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ccttgtggac atttcgtaaa gccaggtaag tat 33
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<213> oligonucleotide
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agccccacca ggactgcaga gccaggtaag tat 33
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<212> DNA
<213> oligonucleotide
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agatgcaaga gcagctgcaa gccaggtaag tat 33
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<212> DNA
<213> oligonucleotide
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gacagcagag gggccaacag gccaggtaag tat 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
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gtaaacaagt cagcagccgg gccaggtaag tat 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
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gcaggtggtg accttgtgga gccaggtaag tat 33
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<212> DNA
<213> oligonucleotide
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tctcccacca tggcgctcag gccaggtaag tat 33
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<212> DNA
<213> oligonucleotide
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aggctcagcc ccaccaggac gccaggtaag tat 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 436
accagcaggt gactatcagg gccaggtaag tat 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 437
gatgcaagag cagctgcaac gccaggtaag tat 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
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actgcaggac agcagagggg gccaggtaag tat 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
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cacgtccacc tgctccagct gccaggtaag tat 33
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<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 440
tggcgaccag gcagaaaagg gccaggtaag tat 33
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<212> DNA
<213> oligonucleotide
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ggactgcaga cactccctgc gccaggtaag tat 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 442
ctgcaggaca gcagaggggc gccaggtaag tat 33
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<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 443
acaagtcagc agccggtgat gccaggtaag tat 33
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<212> DNA
<213> oligonucleotide
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ctcggtggag gcagggcaca gccaggtaag tat 33
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<212> DNA
<213> oligonucleotide
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gcggcatgtg cggaagccca gccaggtaag tat 33
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<213> oligonucleotide
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gcagagacac gcacgttgcc gccaggtaag tat 33
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<213> oligonucleotide
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ggcagagaca cgcacgttgc gccaggtaag tat 33
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<212> DNA
<213> oligonucleotide
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accaggactg cagacactcc gccaggtaag tat 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
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caccaggact gcagacactc gccaggtaag tat 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 450
atgcaagagc agctgcaacc gccaggtaag tat 33
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<212> DNA
<213> oligonucleotide
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tggcccagat gcaagagcag gccaggtaag tat 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
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cagcctgcag gagggaggac gccaggtaag tat 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
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accttctact gcaggacagc gccaggtaag tat 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
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ggctgcaacc acctcaagca gccaggtaag tat 33
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<212> DNA
<213> oligonucleotide
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ggtggtgacc ttgtggacat gccaggtaag tat 33
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<212> DNA
<213> oligonucleotide
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ccccagctgc cgcctcacag gccaggtaag tat 33
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<213> oligonucleotide
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acttccaaag gctccggccc gccaggtaag tat 33
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<212> DNA
<213> oligonucleotide
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tggctcggtg gaggcagggc gccaggtaag tat 33
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<212> DNA
<213> oligonucleotide
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gccacatggc agagacacgc gccaggtaag tat 33
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<212> DNA
<213> oligonucleotide
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ccaccaggac tgcagacact gccaggtaag tat 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
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cccaccagga ctgcagacac gccaggtaag tat 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
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ccacatgggg tgcagcacag gccaggtaag tat 33
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<212> DNA
<213> oligonucleotide
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gaaggccctg cggtcgagct gccaggtaag tat 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
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tggaaggccc tgcggtcgag gccaggtaag tat 33
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<212> DNA
<213> oligonucleotide
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caagcacaga ctggaaggcc gccaggtaag tat 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
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cagccggtga tatgggcttc gccaggtaag tat 33
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<211> 33
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<213> oligonucleotide
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aaacaagtca gcagccggtg gccaggtaag tat 33
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<213> oligonucleotide
<400> 468
agcaggtggt gaccttgtgg gccaggtaag tat 33
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<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 469
catggcagag acacgcacgt gccaggtaag tat 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 470
acaaccagca ggtgactatc gccaggtaag tat 33
<210> 471
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 471
gccaacagcc agcctgcagg gccaggtaag tat 33
<210> 472
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 472
agaagtctgt ggcgaccagg gccaggtaag tat 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 473
gaagcccata gggaccaagc gccaggtaag tat 33
<210> 474
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 474
caggctcagc cccaccagga gccaggtaag tat 33
<210> 475
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 475
gcctcaggct cagccccacc gccaggtaag tat 33
<210> 476
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 476
ggaaggcctc aggctcagcc gccaggtaag tat 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 477
agcctgcagg agggaggact gccaggtaag tat 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 478
ttgcccatcc tgctgatgac gccaggtaag tat 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 479
ctgctccagc ttgcccatcc gccaggtaag tat 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 480
gacttccaaa ggctccggcc gccaggtaag tat 33
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<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 481
gggcgcagac ttccaaaggc gccaggtaag tat 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 482
tgcggaagcc catagggacc gccaggtaag tat 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 483
cgcggcatgt gcggaagccc gccaggtaag tat 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 484
gaaggcctca ggctcagccc gccaggtaag tat 33
<210> 485
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 485
cacccacatg gggtgcagca gccaggtaag tat 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 486
ctgtggcgac caggcagaaa gccaggtaag tat 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 487
ccacctcaag cacagactgg gccaggtaag tat 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 488
cctggggctg caaccacctc gccaggtaag tat 33
<210> 489
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 489
cagtctctcc caccatggcg gccaggtaag tat 33
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<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 490
cacagtctct cccaccatgg gccaggtaag tat 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 491
cagacttcca aaggctccgg gccaggtaag tat 33
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<212> DNA
<213> oligonucleotide
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gaggcagggc acaagggcgc gccaggtaag tat 33
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<212> DNA
<213> oligonucleotide
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gactgcagac actccctgcc gccaggtaag tat 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 494
gctcagcccc accaggactg gccaggtaag tat 33
<210> 495
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
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tcaggctcag ccccaccagg gccaggtaag tat 33
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<213> oligonucleotide
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tggaaggcct caggctcagc gccaggtaag tat 33
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<213> oligonucleotide
<400> 497
caccttctac tgcaggacag gccaggtaag tat 33
<210> 498
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 498
gctcacggca ccttctactg gccaggtaag tat 33
<210> 499
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 499
tcacgtccac ctgctccagc gccaggtaag tat 33
<210> 500
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 500
accttgtgga catttcgtaa gccaggtaag tat 33
<210> 501
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 501
cagctgccgc ctcacagtct gccaggtaag tat 33
<210> 502
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 502
catggggtgc agcacagctg gccaggtaag tat 33
<210> 503
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 503
aaaggacctg gtcacccaca gccaggtaag tat 33
<210> 504
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 504
cctgctgatg acatgtggga gccaggtaag tat 33
<210> 505
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 505
tccacctgct ccagcttgcc gccaggtaag tat 33
<210> 506
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 506
aggttcacgt ccacctgctc gccaggtaag tat 33
<210> 507
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 507
aaaggttcac gtccacctgc gccaggtaag tat 33
<210> 508
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 508
tgtagaagtc tgtggcgacc gccaggtaag tat 33
<210> 509
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 509
gcagccggtg atatgggctt gccaggtaag tat 33
<210> 510
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 510
ccatggcgct cagcaggtgg gccaggtaag tat 33
<210> 511
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 511
gtctctccca ccatggcgct gccaggtaag tat 33
<210> 512
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 512
aaaggctccg gccccagctg gccaggtaag tat 33
<210> 513
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 513
ctttctggaa ggcctcaggc gccaggtaag tat 33
<210> 514
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 514
cagcttgccc atcctgctga gccaggtaag tat 33
<210> 515
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 515
tctgtggcga ccaggcagaa gccaggtaag tat 33
<210> 516
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 516
ctggtgtctg tagaagtctg gccaggtaag tat 33
<210> 517
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 517
aggccctgcg gtcgagctcc gccaggtaag tat 33
<210> 518
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 518
aaggccctgc ggtcgagctc gccaggtaag tat 33
<210> 519
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 519
gtggtgacct tgtggacatt gccaggtaag tat 33
<210> 520
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 520
ggcgctcagc aggtggtgac gccaggtaag tat 33
<210> 521
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 521
tccaaaggct ccggccccag gccaggtaag tat 33
<210> 522
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 522
ggcacaaggg cgcagacttc gccaggtaag tat 33
<210> 523
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 523
cccgcggcat gtgcggaagc gccaggtaag tat 33
<210> 524
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 524
cacatggggt gcagcacagc gccaggtaag tat 33
<210> 525
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 525
gaaaggacct ggtcacccac gccaggtaag tat 33
<210> 526
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 526
cctgcaggag ggaggacttc gccaggtaag tat 33
<210> 527
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 527
ccagcctgca ggagggagga gccaggtaag tat 33
<210> 528
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 528
cttctactgc aggacagcag gccaggtaag tat 33
<210> 529
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 529
acggcacctt ctactgcagg gccaggtaag tat 33
<210> 530
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 530
cccatcctgc tgatgacatg gccaggtaag tat 33
<210> 531
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 531
cgaccaggca gaaaaggttc gccaggtaag tat 33
<210> 532
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 532
ggcgaccagg cagaaaaggt gccaggtaag tat 33
<210> 533
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 533
ctgtagaagt ctgtggcgac gccaggtaag tat 33
<210> 534
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 534
aggtggtgac cttgtggaca gccaggtaag tat 33
<210> 535
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 535
agacttccaa aggctccggc gccaggtaag tat 33
<210> 536
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 536
gcccataggg accaagctgg gccaggtaag tat 33
<210> 537
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 537
tcacccacat ggggtgcagc gccaggtaag tat 33
<210> 538
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 538
ttctggccca gatgcaagag gccaggtaag tat 33
<210> 539
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 539
ggagggagga cttctggccc gccaggtaag tat 33
<210> 540
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 540
aggagggagg acttctggcc gccaggtaag tat 33
<210> 541
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 541
gccagcctgc aggagggagg gccaggtaag tat 33
<210> 542
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 542
gtctgtggcg accaggcaga gccaggtaag tat 33
<210> 543
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 543
gtgtctgtag aagtctgtgg gccaggtaag tat 33
<210> 544
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 544
aagcacagac tggaaggccc gccaggtaag tat 33
<210> 545
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 545
acatggcaga gacacgcacg gccaggtaag tat 33
<210> 546
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 546
agaaaggacc tggtcaccca gccaggtaag tat 33
<210> 547
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 547
caggagggag gacttctggc gccaggtaag tat 33
<210> 548
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 548
cctgctccag cttgcccatc gccaggtaag tat 33
<210> 549
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 549
ttcacgtcca cctgctccag gccaggtaag tat 33
<210> 550
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 550
agtctgtggc gaccaggcag gccaggtaag tat 33
<210> 551
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 551
cttcctgggg ctgcaaccac gccaggtaag tat 33
<210> 552
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 552
ccagctgccg cctcacagtc gccaggtaag tat 33
<210> 553
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 553
ggccccagct gccgcctcac gccaggtaag tat 33
<210> 554
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 554
ccggccccag ctgccgcctc gccaggtaag tat 33
<210> 555
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 555
ccaaaggctc cggccccagc gccaggtaag tat 33
<210> 556
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 556
gggcacaagg gcgcagactt gccaggtaag tat 33
<210> 557
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 557
agagcacttc tgccacatgg gccaggtaag tat 33
<210> 558
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 558
tatcaggaga aaggacctgg gccaggtaag tat 33
<210> 559
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 559
agactggaag gccctgcggt gccaggtaag tat 33
<210> 560
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 560
ccaccatggc gctcagcagg gccaggtaag tat 33
<210> 561
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 561
gctccggccc cagctgccgc gccaggtaag tat 33
<210> 562
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 562
aaggctccgg ccccagctgc gccaggtaag tat 33
<210> 563
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 563
ctggctcggt ggaggcaggg gccaggtaag tat 33
<210> 564
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 564
gtcacccaca tggggtgcag gccaggtaag tat 33
<210> 565
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 565
ggagaaagga cctggtcacc gccaggtaag tat 33
<210> 566
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 566
gcaacctggc aacaaccagc gccaggtaag tat 33
<210> 567
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 567
ggacttctgg cccagatgca gccaggtaag tat 33
<210> 568
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 568
acagccagcc tgcaggaggg gccaggtaag tat 33
<210> 569
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 569
cggcaccttc tactgcagga gccaggtaag tat 33
<210> 570
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 570
atatgggctt cctggggctg gccaggtaag tat 33
<210> 571
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 571
caagctggct cggtggaggc gccaggtaag tat 33
<210> 572
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 572
tgctcctgct ttctggaagg gccaggtaag tat 33
<210> 573
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 573
gcgaccaggc agaaaaggtt gccaggtaag tat 33
<210> 574
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 574
ctatctggtg tctgtagaag gccaggtaag tat 33
<210> 575
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 575
cgagctcctc ctctatctgg gccaggtaag tat 33
<210> 576
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 576
agtctctccc accatggcgc gccaggtaag tat 33
<210> 577
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 577
ggcgcagact tccaaaggct gccaggtaag tat 33
<210> 578
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 578
tttctggaag gcctcaggct gccaggtaag tat 33
<210> 579
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 579
aggagaaagg acctggtcac gccaggtaag tat 33
<210> 580
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 580
acctggcaac aaccagcagg gccaggtaag tat 33
<210> 581
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 581
caagagcagc tgcaacctgg gccaggtaag tat 33
<210> 582
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 582
ggaaggccct gcggtcgagc gccaggtaag tat 33
<210> 583
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 583
gagcacttct gccacatggc gccaggtaag tat 33
<210> 584
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 584
caggagaaag gacctggtca gccaggtaag tat 33
<210> 585
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 585
cccagatgca agagcagctg gccaggtaag tat 33
<210> 586
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 586
gcctgcagga gggaggactt gccaggtaag tat 33
<210> 587
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 587
tgcccatcct gctgatgaca gccaggtaag tat 33
<210> 588
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 588
cttgcccatc ctgctgatga gccaggtaag tat 33
<210> 589
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 589
aaaaggttca cgtccacctg gccaggtaag tat 33
<210> 590
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 590
tggcgctcag caggtggtga gccaggtaag tat 33
<210> 591
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 591
ccatagggac caagctggct gccaggtaag tat 33
<210> 592
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 592
gcccgcggca tgtgcggaag gccaggtaag tat 33
<210> 593
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 593
gctttctgga aggcctcagg gccaggtaag tat 33
<210> 594
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 594
cctgctttct ggaaggcctc gccaggtaag tat 33
<210> 595
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 595
atcaggagaa aggacctggt gccaggtaag tat 33
<210> 596
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 596
aggggccaac agccagcctg gccaggtaag tat 33
<210> 597
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 597
gtccacctgc tccagcttgc gccaggtaag tat 33
<210> 598
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 598
cctctatctg gtgtctgtag gccaggtaag tat 33
<210> 599
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 599
cagactggaa ggccctgcgg gccaggtaag tat 33
<210> 600
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 600
caggtggtga ccttgtggac gccaggtaag tat 33
<210> 601
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 601
cccataggga ccaagctggc gccaggtaag tat 33
<210> 602
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 602
ccacatggca gagacacgca gccaggtaag tat 33
<210> 603
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 603
gaagtctgtg gcgaccaggc gccaggtaag tat 33
<210> 604
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 604
gcttcctggg gctgcaacca gccaggtaag tat 33
<210> 605
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 605
tgatatgggc ttcctggggc gccaggtaag tat 33
<210> 606
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 606
agctgctcct gctttctgga gccaggtaag tat 33
<210> 607
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 607
tgcaacctgg caacaaccag gccaggtaag tat 33
<210> 608
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 608
gggaggactt ctggcccaga gccaggtaag tat 33
<210> 609
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 609
ctctatctgg tgtctgtaga gccaggtaag tat 33
<210> 610
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 610
gtgatatggg cttcctgggg gccaggtaag tat 33
<210> 611
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 611
tgggcttcct ggggctgcaa gccaggtaag tat 33
<210> 612
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 612
ggctccggcc ccagctgccg gccaggtaag tat 33
<210> 613
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 613
agctcctcct ctatctggtg gccaggtaag tat 33
<210> 614
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 614
ttcctggggc tgcaaccacc gccaggtaag tat 33
<210> 615
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 615
ctcctgcttt ctggaaggcc gccaggtaag tat 33
<210> 616
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 616
ctggcaacaa ccagcaggtg gccaggtaag tat 33
<210> 617
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 617
ccaagctggc tcggtggagg gccaggtaag tat 33
<210> 618
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 618
cagccccacc aggactgcag gccaggtaag tat 33
<210> 619
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 619
agggaggact tctggcccag gccaggtaag tat 33
<210> 620
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 620
ctccggcccc agctgccgcc gccaggtaag tat 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 621
tgccacatgg cagagacacg gccaggtaag tat 33
<210> 622
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 622
gcacttctgc cacatggcag gccaggtaag tat 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
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ggcctcaggc tcagccccac gccaggtaag tat 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
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ccgcggcatg tgcggaagcc gccaggtaag tat 33
<210> 625
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
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ctggccactg ccacaaagag gccaggtaag tat 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
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agctgcaacc tggcaacaac gccaggtaag tat 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 627
ccagcttgcc catcctgctg gccaggtaag tat 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
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tatctggtgt ctgtagaagt gccaggtaag tat 33
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gccgcccgcg gcatgtgcgg gccaggtaag tat 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
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tctgccacat ggcagagaca gccaggtaag tat 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
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ctggaaggcc tcaggctcag gccaggtaag tat 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 632
aggacttctg gcccagatgc gccaggtaag tat 33
<210> 633
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
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gctcctcctc tatctggtgt gccaggtaag tat 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 634
agcagccggt gatatgggct gccaggtaag tat 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 635
ttctgccaca tggcagagac gccaggtaag tat 33
<210> 636
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 636
tgcagacact ccctgcctgg gccaggtaag tat 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 637
gctcctgctt tctggaaggc gccaggtaag tat 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
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cagctgcaac ctggcaacaa gccaggtaag tat 33
<210> 639
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<212> DNA
<213> oligonucleotide
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gggcttcctg gggctgcaac gccaggtaag tat 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 640
tcctgctttc tggaaggcct gccaggtaag tat 33
<210> 641
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 641
gagcagctgc aacctggcaa gccaggtaag tat 33
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<212> DNA
<213> oligonucleotide
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gcttgcccat cctgctgatg gccaggtaag tat 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 643
gagacacgca cgttgcctgg gccaggtaag tat 33
<210> 644
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 644
ccctgcctgg ccactgccac gccaggtaag tat 33
<210> 645
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 645
ggggtgcagc acagctgctc gccaggtaag tat 33
<210> 646
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 646
agagcagctg caacctggca gccaggtaag tat 33
<210> 647
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<213> oligonucleotide
<400> 647
cgtccacctg ctccagcttg gccaggtaag tat 33
<210> 648
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 648
gaccaggcag aaaaggttca gccaggtaag tat 33
<210> 649
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
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gcgctcagca ggtggtgacc gccaggtaag tat 33
<210> 650
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 650
ctcctcctct atctggtgtc gccaggtaag tat 33
<210> 651
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 651
cttctgccac atggcagaga gccaggtaag tat 33
<210> 652
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 652
gaggacttct ggcccagatg gccaggtaag tat 33
<210> 653
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 653
atctggtgtc tgtagaagtc gccaggtaag tat 33
<210> 654
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 654
tagggaccaa gctggctcgg gccaggtaag tat 33
<210> 655
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 655
actccctgcc tggccactgc gccaggtaag tat 33
<210> 656
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 656
atggggtgca gcacagctgc gccaggtaag tat 33
<210> 657
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 657
ggaccaagct ggctcggtgg gccaggtaag tat 33
<210> 658
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 658
ctgcctggcc actgccacaa gccaggtaag tat 33
<210> 659
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 659
ctcccaccat ggcgctcagc gccaggtaag tat 33
<210> 660
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 660
gcagacactc cctgcctggc gccaggtaag tat 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 661
cctgcctggc cactgccaca gccaggtaag tat 33
<210> 662
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 662
agacacgcac gttgcctggc gccaggtaag tat 33
<210> 663
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 663
cagacactcc ctgcctggcc gccaggtaag tat 33
<210> 664
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 664
gacactccct gcctggccac gccaggtaag tat 33
<210> 665
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 665
agacactccc tgcctggcca gccaggtaag tat 33
<210> 666
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<213> oligonucleotide
<400> 666
gcctggccgc ccgcggcatg gccaggtaag tat 33
<210> 667
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 667
ctccctgcct ggccactgcc gccaggtaag tat 33
<210> 668
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 668
cacgcacgtt gcctggccgc gccaggtaag tat 33
<210> 669
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 669
acttctgcca catggcagag gccaggtaag tat 33
<210> 670
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 670
tccctgcctg gccactgcca gccaggtaag tat 33
<210> 671
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 671
acctggtcac ccacatgggg gccaggtaag tat 33
<210> 672
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<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 672
ctggccgccc gcggcatgtg gccaggtaag tat 33
<210> 673
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<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 673
gttgcctggc cgcccgcggc gccaggtaag tat 33
<210> 674
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<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 674
acgcacgttg cctggccgcc gccaggtaag tat 33
<210> 675
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 675
ctggtcaccc acatggggtg gccaggtaag tat 33
<210> 676
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 676
acacgcacgt tgcctggccg gccaggtaag tat 33
<210> 677
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 677
cgttgcctgg ccgcccgcgg gccaggtaag tat 33
<210> 678
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 678
cactccctgc ctggccactg gccaggtaag tat 33
<210> 679
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 679
gcacgttgcc tggccgcccg gccaggtaag tat 33
<210> 680
<211> 33
<212> DNA
<213> oligonucleotide
<400> 680
ttgcctggcc gcccgcggca gccaggtaag tat 33
Claims (31)
- 헌팅틴 유전자의 발현을 억제하기 위한 U1 어댑터 올리고뉴클레오티드로서, 여기서 상기 U1 어댑터 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 이펙터 도메인에 작동가능하게 연결된 어닐링 도메인을 포함하는 핵산 분자이고, 여기서 상기 어닐링 도메인은 상기 헌팅틴 유전자의 프리-mRNA에 혼성화되고, 여기서 상기 이펙터 도메인은 U1 snRNP의 U1 snRNA에 혼성화되는 것인 U1 어댑터 올리고뉴클레오티드.
- 제1항에 있어서, 상기 어닐링 도메인이 약 10 내지 약 30개의 뉴클레오티드 길이인 U1 어댑터 올리고뉴클레오티드.
- 제1항에 있어서, 상기 이펙터 도메인이 약 8 내지 약 20개의 뉴클레오티드 길이인 U1 어댑터 올리고뉴클레오티드.
- 제1항에 있어서, 상기 이펙터 도메인 및 어닐링 도메인이 결합 또는 약 1 내지 약 10개 뉴클레오티드의 링커 도메인에 의해 연결되는 것인 U1 어댑터 올리고뉴클레오티드.
- 제1항에 있어서, 상기 이펙터 도메인이 서열 5'-CAGGUAAGUA-3' (서열식별번호: 1), 5'-CAGGUAAGUAU-3' (서열식별번호: 4), 또는 5'-GCCAGGUAAGUAU-3' (서열식별번호: 5)를 포함하는 것인 U1 어댑터 올리고뉴클레오티드.
- 제1항에 있어서, 적어도 하나의 표적화 모이어티 및/또는 세포 침투 모이어티를 추가로 포함하며, 여기서 상기 표적화 모이어티 및/또는 세포 침투 모이어티는 상기 U1 어댑터 올리고뉴클레오티드에 작동가능하게 연결되는 것인 U1 어댑터 올리고뉴클레오티드.
- 제1항에 있어서, 상기 U1 어댑터 올리고뉴클레오티드가 적어도 하나의 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 것인 U1 어댑터 올리고뉴클레오티드.
- 제1항에 있어서, 상기 U1 어댑터 올리고뉴클레오티드가 2'-O-메틸 뉴클레오티드, 2'-O-메틸옥시에톡시 뉴클레오티드, 2'-할로 (예를 들어, 2'-플루오로), 및/또는 잠금 핵산을 포함하는 것인 U1 어댑터 올리고뉴클레오티드.
- 제1항에 있어서, U1 어댑터 올리고뉴클레오티드가 포스포로티오에이트를 포함하는 것인 U1 어댑터 올리고뉴클레오티드.
- 제1항에 있어서, 상기 어닐링 도메인이 헌팅틴 유전자의 3' 말단 엑손 내 표적 서열과 혼성화되는 것인 U1 어댑터 올리고뉴클레오티드.
- 제1항에 있어서, 이펙터 도메인이 어닐링 도메인의 3' 단부, 어닐링 도메인의 5' 단부, 또는 어닐링 도메인의 5' 및 3' 단부 둘 다에 작동가능하게 연결되는 것인 U1 어댑터 올리고뉴클레오티드.
- 제1항에 있어서, 상기 어닐링 도메인이 적어도 7개의 데옥시리보뉴클레오티드의 스트레치를 포함하는 것인 U1 어댑터 올리고뉴클레오티드.
- 제1항에 있어서, 상기 U1 snRNA가 U1 변이체 snRNA인 U1 어댑터 올리고뉴클레오티드.
- 제6항에 있어서, 상기 U1 어댑터 올리고뉴클레오티드 및 상기 표적화 모이어티 및/또는 세포 침투 모이어티가 링커를 통해 접합되는 것인 U1 어댑터 올리고뉴클레오티드.
- 제14항에 있어서, 상기 링커가 절단가능한 것인 U1 어댑터 올리고뉴클레오티드.
- 제6항에 있어서, 상기 표적화 모이어티 및/또는 세포 침투 모이어티가 U1 어댑터 올리고뉴클레오티드의 3' 단부, 5' 단부, 또는 5' 및 3' 단부 둘 다에 작동가능하게 연결되는 것인 U1 어댑터 올리고뉴클레오티드.
- 제16항에 있어서, 상기 표적화 모이어티 및/또는 세포 침투 모이어티가 U1 어댑터 올리고뉴클레오티드의 5' 단부에 작동가능하게 연결되는 것인 U1 어댑터 올리고뉴클레오티드.
- 제1항에 있어서, 상기 U1 어댑터 올리고뉴클레오티드가 3' 단부에서 제1 표적화 모이어티에 및 5' 단부에서 제2 표적화 모이어티에 작동가능하게 연결되는 것인 U1 어댑터 올리고뉴클레오티드.
- 제6항에 있어서, 상기 표적화 모이어티가 항체 또는 그의 단편인 U1 어댑터 올리고뉴클레오티드.
- 제1항에 있어서, U1 어댑터 올리고뉴클레오티드가 전장 및/또는 말단절단된 헌팅틴 mRNA의 발현을 억제하는 것인 U1 어댑터 올리고뉴클레오티드.
- 제1항에 있어서, U1 어댑터 올리고뉴클레오티드가 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 37, 서열식별번호: 38, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 39, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 14, 서열식별번호: 15, 및 서열식별번호: 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 것인 U1 어댑터 올리고뉴클레오티드.
- 제1항에 있어서, U1 어댑터 올리고뉴클레오티드가 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 9, 및 서열식별번호: 15로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 것인 U1 어댑터 올리고뉴클레오티드.
- 제1항에 있어서, 어닐링 도메인이 서열식별번호: 26-36으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 혼성화되는 것인 U1 어댑터 올리고뉴클레오티드.
- 제1항에 있어서, 어닐링 도메인이 서열식별번호: 26, 서열식별번호: 29, 및 서열식별번호: 35로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 혼성화되는 것인 U1 어댑터 올리고뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 U1 어댑터 올리고뉴클레오티드 및 적어도 하나의 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
- 제25항에 있어서, 상기 조성물이 상기 헌팅틴 유전자에 대해 지시되는 적어도 하나의 siRNA 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 추가로 포함하는 것인 조성물.
- 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 U1 어댑터 올리고뉴클레오티드를 세포에 전달하는 것을 포함하는, 헌팅틴 유전자의 발현을 억제하는 방법.
- 제27항에 있어서, 상기 U1 어댑터 올리고뉴클레오티드 중 적어도 2개가 전달되고, 상기 U1 어댑터 올리고뉴클레오티드의 어닐링 도메인이 상기 헌팅틴 유전자 내 상이한 표적 서열과 혼성화되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 U1 어댑터 올리고뉴클레오티드를 헌팅톤병의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 헌팅톤병을 치료하는 방법.
- 제29항에 있어서, 상기 U1 어댑터 올리고뉴클레오티드 중 적어도 2개가 투여되고, 상기 U1 어댑터 올리고뉴클레오티드의 어닐링 도메인이 상기 헌팅틴 유전자 내 상이한 표적 서열과 혼성화되는 것인 방법.
- 제29항에 있어서, 상기 헌팅틴 유전자에 대해 지시되는 적어도 하나의 siRNA 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 투여를 추가로 포함하는 방법.
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