JP2022524383A - ハンチントン病を処置するための組成物および方法 - Google Patents

Abstract

ハンチントン病の阻害、処置、および／または予防のための組成物および方法が提供される。【選択図】図１Ａ

Description

本出願は、２０１９年３月８日に出願された米国仮特許出願第６２／８１５，６４７号の米国特許法第１１９条（ｅ）による優先権を主張する。前述の出願は、参照によって本明細書に組み入れられる。

本発明は、一般的に、遺伝子サイレンシングの分野に関する。具体的には、本発明は、ハンチンチン遺伝子の発現を制御するための組成物および方法を提供する。

ハンチントン病（ＨＤ）は、常染色体優性神経変性疾患である。ＨＤは、特定の遺伝子（例えば、ハンチンチン）における可変的に伸長したトリヌクレオチドＣＡＧリピートに起因する少なくとも９つの異なる神経変性疾患を含むポリグルタミン（ポリＱ）障害のファミリーの一部である（非特許文献１；非特許文献２）。その伸長のサイズは、ある程度、発症の年齢（例えば、成人発症対若年発症）と負の相関関係がある。ＨＤは、ハンチンチン遺伝子の第１のエクソン内のＣＡＧリピート伸長（約＞３６リピート）により引き起こされる。

ハンチンチン遺伝子（ｈｔｔ）およびタンパク質（ＨＴＴ）は広範かつ遍在性に発現しているが、その疾患は（例えば、脳内に）選択的神経細胞脆弱性のパターンを有する（特許文献３；非特許文献４）。ｈｔｔについての正常な機能も変異体ｈｔｔについての病理学的機構も完全には理解されていない。毒性機能獲得および野生型機能の喪失を含む複数の機構が存在する可能性がある。特に、ＨＴＴタンパク質の凝集体が、神経細胞の異なる位置および異なる型に見出される可能性がある。

ＨＤについて治療法はなく、処置は、それ症状を管理することに焦点をおいている（非特許文献５）。最近のデータは、完全長およびトランケート型ｍＲＮＡ転写産物ならびにそれらの関連タンパク質産物がＨＤ患者に存在し、神経細胞機能障害および死の機構に寄与することを示している（非特許文献６）。特に、遺伝子改変マウスモデルの使用によって、変異体ハンチンチン発現が排除されたならば、疾患進行期においてさえも、ＨＤ様疾患表現型が消散できることが示された（特許文献７；特許文献８）。したがって、変異体ｈｔｔ ｍＲＮＡ（完全長および／または切り詰め型）を低下させることは、治療介入をもたらすことができる（非特許文献９）。

Ｗａｌｋｅｒ，Ｆ．Ｏ．（２００７）Ｌａｎｃｅｔ、３６９：２１８～２２８頁 Ｗａｌｋｅｒ，Ｆ．Ｏ．（２００７）Ｓｅｍｉｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．、２７：１４３～１５０頁 Ａｍｂｒｏｓｅら（１９９４）Ｓｏｍａｔ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．、２０：２７～３８頁 Ｌａｎｄｌｅｓら（２００４）ＥＭＢＯ Ｒｅｐ．、５：９５８～９６３ Ｊｏｈｎｓｏｎら（２０１０）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．、１９：Ｒ９８～Ｒ１０２頁 Ｓａｔｈａｓｉｖａｍら（２０１３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１１０：２３６６～２３７０頁 Ｙａｍａｍｏｔｏら（２０００）Ｃｅｌｌ、１０１：５７～６６頁 Ｄｉａｚ－Ｈｅｒｎａｎｄｅｚら（２００５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２５：９７７３～９７８１頁 Ｓａｈら（２０１１）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１２１：５００～５０７頁

しかしながら、ｈｔｔ遺伝子発現を制御する改善された方法が必要とされている。

本発明によれば、ハンチンチン遺伝子（ｈｔｔ）の発現を阻害するための核酸分子が提供される。特定の実施形態において、その核酸分子は、少なくとも１つのエフェクタードメインと作動可能に連結されたアニーリングドメインを含み、前記アニーリングドメインがｈｔｔのプレｍＲＮＡとハイブリダイズし、前記エフェクタードメインがＵ１ ｓｎＲＮＰのＵ１ ｓｎＲＮＡとハイブリダイズする。特定の実施形態において、Ｕ１ＡＯは完全長および／またはトランケート型ｈｔｔへ方向づけられる。

本発明の別の態様によれば、核酸分子は、ターゲティング部分と（例えば、直接的にまたはリンカーを介して）コンジュゲートされている。ターゲティング部分は、５’末端および／または３’末端にコンジュゲートされている（例えば、核酸は、同じか異なるかのいずれかの２つのターゲティング部分を含み得る）。特定の実施形態において、核酸分子はアプタマーとコンジュゲートされている。

本発明の別の態様によれば、本発明の核酸分子の少なくとも１つを細胞へ送達する工程を含む、ｈｔｔの発現を阻害するための方法が提供される。

本発明の別の態様によれば、本発明の核酸分子の少なくとも１つおよび少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む組成物が提供される。

さらに別の態様において、本発明の核酸分子をコードするベクターもまた提供される。

本発明の別の態様によれば、対象においてハンチントン病を処置し、阻害し、および／または予防する方法が提供される。方法は、本発明の少なくとも１つの核酸分子（例えば、Ｕ１ＡＯまたはＵ１ＡＯをコードするベクター）の治療有効量を、それを必要としている対象に投与する工程を含む。特定の実施形態において、方法は、１つより多いＵ１ＡＯを投与する工程を含む。特定の実施形態において、方法は、完全長ｈｔｔ、トランケート型ｈｔｔ、または完全長とトランケート型の両方のｈｔｔ（例えば、別々のＵ１ＡＯを用いて）に方向づけられたＵ１ＡＯを投与する工程を含む。

２つのドメイン：標的遺伝子のプレｍＲＮＡとその３’末端エクソンにおいて塩基対形成するアニーリングドメイン、および内因性Ｕ１ ｓｎＲＮＰの結合を介して前記プレｍＲＮＡの成熟を阻害するエフェクタードメインを描く、Ｕ１アダプターオリゴヌクレオチドの概略図である。エフェクタードメインの提供された配列は配列番号１である。 標的プレｍＲＮＡとのＵ１アダプターのアニーリングの概略図である。エフェクタードメインの提供された配列は配列番号１である。 ポリ（Ａ）部位阻害をもたらす、Ｕ１ ｓｎＲＮＰを結合するＵ１アダプターの概略図である。Ψ＝Ｕ１ ｓｎＲＮＰにおけるＵ１ ｓｎＲＮＡのプソイドウリジン。Ｕ１ ｓｎＲＮＰにおけるＵ１ ｓｎＲＮＡの提供された配列は配列番号２である。エフェクタードメインの提供された配列は配列番号１である。 完全長ヒトＨＴＴに対して方向づけられた、２０ｎＭ Ｕ１アダプターオリゴヌクレオチド（Ｕ１ＡＯ）および２０ｎＭ ｓｉＲＮＡの一群を４４時間、トランスフェクションされたＨＤ９１９７細胞における、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ１）に対して標準化されたヒトハンチンチン（ＨＴＴ）ｍＲＮＡのパーセント変化を示すグラフである。 レーン９における７ｎＭおよびレーン７における３０ｎＭを例外として、２０ｎＭの様々なｈＨＴＴ－ＦＬ Ｕ１ＡＯおよびｓｉＲＮＡを４８時間、トランスフェクションされたＤＵ１４５細胞のウェスタンブロットを示す図である。ＧＡＰＤＨはローディング対照として提供されている。Ｕ１Ａ（Ｕ１ ｓｎＲＮＰサブユニット）は、第２のローディング対照として提供されている。１レーンあたり１，５００，００個の細胞等価物がロードされた。レーン４および６は、独立したレプリケートである。ＭＷ：分子量マーカー。 図４Ａは、食塩水またはｈＨＴＴ－ＦＬ－２ Ｕ１ＡＯの左脳室への脳室内（ＩＣＶ）注射後のＹＡＣ１２８前脳におけるｈＨＴＴ－ＦＬ ｍＲＮＡのパーセント変化のグラフを示す図である。ＹＡＣ１２８は、１２８個のＣＡＧリピートを含む約３００，０００個の塩基対のヒトハンチンチン遺伝子を含有するハンチントン病の十分確立されたマウスモデルである。対照マウスの平均が１００％に設定された。Ｎ＝７は、２つの異なる実験（ｎ＝３およびｎ＝４）由来である。図４Ｂは、食塩水またはｈＨＴＴ－ＦＬ－２ Ｕ１ＡＯのＩＣＶ注射後のＹＡＣ１２８前脳におけるｈＨＴＴ－ＴＲ ｍＲＮＡのパーセント変化のグラフを示す図である。対照マウスの平均が１００％に設定された。 食塩水またはｈＨＴＴ－ＦＬ－２ Ｕ１ＡＯの注射後のＹＡＣ１２８前脳由来の全ＲＮＡの８％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）ノーザンブロットの画像を示す図である。プローブは３３ヌクレオチドの^３２Ｐ－抗ｈＨＴＴ－ＦＬ－２オリゴヌクレオチドであった。標準は注射されていないＵ１ＡＯである。 食塩水ＩＣＶ処理マウス（左）またはｈＴＴ－ＦＬ－２ Ｕ１ＡＯ ＩＣＶ処理マウス（右）の線条体におけるｈＨＴＴ－ＦＬのＲＮＡＳｃｏｐｅ（登録商標）検出の画像を示す図である。４日間後、マウスを分析した。核を染色するために４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を用いた。 図７Ａは、示された時間にわたる食塩水またはｈＨＴＴ－ＦＬ－２ Ｕ１ＡＯのＩＣＶ注射後のＹＡＣ１２８前脳におけるｈＨＴＴ－ＦＬ ｍＲＮＡのパーセント変化のグラフを示す図である。対照マウスの平均が１００％に設定された。図７Ｂは、食塩水またはｈＨＴＴ－ＦＬ－２ Ｕ１ＡＯのＩＣＶ注射後の示された時間におけるＹＡＣ１２８前脳由来の全ＲＮＡのノーザンブロットの画像を示す図である。プローブは３３ヌクレオチドの^３２Ｐ－抗ｈＨＴＴ－ＦＬ－２オリゴヌクレオチドであった。標準は注射されていないＵ１ＡＯである。対照の食塩水マウス１～７およびマウス１１～１２および１６～１７は、図４および５に示されたのと同じマウスである。 図８Ａは、食塩水、ｈＨＴＴ－ＴＲ－１ Ｕ１ＡＯ、またはｈＨＴＴ－ＴＲ－２ Ｕ１ＡＯのＩＣＶ注射後のＹＡＣ１２８前脳におけるｈＨＴＴ－ＴＲ ｍＲＮＡのパーセント変化のグラフを示す図である。５日間後、マウス組織を分析した。対照マウスの平均が１００％に設定された。Ｎ＝７は、２つの異なる実験（ｎ＝３およびｎ＝４）由来である。図８Ｂは、食塩水、ｈＨＴＴ－ＴＲ－１ Ｕ１ＡＯ、またはｈＨＴＴ－ＴＲ－２ Ｕ１ＡＯの注射後のＹＡＣ１２８前脳におけるｈＨＴＴ－ＦＬ ｍＲＮＡのパーセント変化のグラフを示す図である。対照マウスの平均が１００％に設定された。Ｎ＝７は、２つの異なる実験（ｎ＝３およびｎ＝４）由来である。 図９Ａは、食塩水、ｍＨＴＴ－ＴＲ－Ａ Ｕ１ＡＯ、またはＮＣ－Ａ対照Ｕ１ＡＯの注射後の月齢８～９カ月のＱ１７５前脳におけるｍＨＴＴ－ＴＲ ｍＲＮＡのパーセント変化のグラフを示す図である。Ｑ１７５は、マウスｈｔｔ遺伝子において約１７５個のＣＡＧリピートを有する、十分確立されたノックインマウスである。対照マウスの平均が１００％に設定された。Ｎ＝７は、２つの異なる実験（ｎ＝３およびｎ＝４）由来である。図９Ｂは、図９Ａと同じ試料を用いた、ｍＨＴＴ－ＦＬ ｍＲＮＡのパーセント変化のグラフを示す図である。対照マウスの平均が１００％に設定された。Ｎ＝７は、２つの異なる実験（ｎ＝３およびｎ＝４）由来である。 ４日間での食塩水処理マウス（左）またはｍＨＴＴ－ＴＲ－Ａ Ｕ１ＡＯ処理マウス（右）の線条体におけるｍＨＴＴ－ＴＲのＲＮＡＳｃｏｐｅ（登録商標）検出の画像を示す図である。 図１１Ａは、食塩水またはｍＨＴＴ－ＴＲ－Ａ Ｕ１ＡＯのＩＣＶ注射から２１日後の月齢８～９カ月のＱ１７５マウス前脳におけるｍＨＴＴ－ＴＲ ｍＲＮＡのパーセント変化のグラフを示す図である。対照マウスの平均が１００％に設定された。図１１Ｂは、食塩水またはｍＨＴＴ－ＴＲ－Ａ Ｕ１ＡＯの注射から２１日後の月齢８～９カ月のＱ１７５マウス前脳におけるｍＨＴＴ－ＦＬ ｍＲＮＡのパーセント変化のグラフを示す図である。対照マウスの平均が１００％に設定された。 図１２Ａは、食塩水、ｍＨＴＴ－ＦＬ－Ａ Ｕ１ＡＯ、またはＮＣ－Ａ対照Ｕ１ＡＯの注射後の月齢８～９カ月のＱ１７５前脳におけるｍＨＴＴ－ＦＬ ｍＲＮＡのパーセント変化のグラフを示す図である。対照マウスの平均が１００％に設定された。Ｎ＝７は、２つの異なる実験（ｎ＝３およびｎ＝４）由来である。図１２Ｂは、食塩水、ｍＨＴＴ－ＦＬ－Ａ Ｕ１ＡＯ、またはＮＣ－Ａ対照Ｕ１ＡＯの注射後のＱ１７５前脳におけるｍＨＴＴ－ＴＲ ｍＲＮＡのパーセント変化のグラフを示す図である。対照マウスの平均が１００％に設定された。Ｎ＝７は、２つの異なる実験（ｎ＝３およびｎ＝４）由来である。 食塩水処理マウス（左）またはｍＨＴＴ－ＦＬ－Ａ Ｕ１ＡＯ処理マウス（右）の線条体におけるｍＨＴＴ－ＦＬのＲＮＡＳｃｏｐｅ（登録商標）検出の画像を示す図である。 図１４Ａ～１４Ｌは、Ｕ１ＡＯについてのヒトｈｔｔにおける標的部位、およびＤＮＡ形式でのＵ１ＡＯ配列の例を示す図である。行５０、２７２、１５１、３、１８７、４、５、１０、および２における標的配列は、それぞれ、配列番号２６～３４である。行１、６～９、１１～４９、５１～１５０、１５２～１８６、１８８～２７１、および２７３～３２５における標的配列は、それぞれ、配列番号４０～３５５である。ＤＮＡ形式で提供されたＵ１ＡＯ配列は、上から下へ配列番号３５６～６８０である。 図１４－１の続き。 図１４－２の続き。 図１４－３の続き。 図１４－４の続き。 図１４－５の続き。 図１４－６の続き。 図１４－７の続き。 図１４－８の続き。 図１４－９の続き。 図１４－１０の続き。 図１４－１１の続き。 ４つの異なる濃度でのｍＨＴＴ－ＦＬ－ａ Ｕ１ＡＯのＱ１７５マウスへのＩＣＶ注射後の１カ月目（図１５Ａ）、２カ月目（図１５Ｂ）、および４カ月目（図１５Ｃ）におけるｍＨＴＴ－ＦｌおよびｍＨＴＴ－Ｔｒのサイレンシングのレベルのグラフを示す図である。 ４つの異なる濃度でのｍＨＴＴ－ＦＬ－ａ Ｕ１ＡＯのＱ１７５マウスへのＩＣＶ注射後の１カ月目（図１５Ａ）、２カ月目（図１５Ｂ）、および４カ月目（図１５Ｃ）におけるｍＨＴＴ－ＦｌおよびｍＨＴＴ－Ｔｒのサイレンシングのレベルのグラフを示す図である。 ４つの異なる濃度でのｍＨＴＴ－ＦＬ－ａ Ｕ１ＡＯのＱ１７５マウスへのＩＣＶ注射後の１カ月目（図１５Ａ）、２カ月目（図１５Ｂ）、および４カ月目（図１５Ｃ）におけるｍＨＴＴ－ＦｌおよびｍＨＴＴ－Ｔｒのサイレンシングのレベルのグラフを示す図である。 ８０μｇでの対照ＮＣ－ａ Ｕ１ＡＯのＱ１７５マウスへのＩＣＶ注射後の１カ月目、２カ月目、および４カ月目におけるｍＨＴＴ－ＦｌおよびｍＨＴＴ－Ｔｒのサイレンシングのレベルのグラフを示す図である。 ４つの異なる濃度でのｍＨＴＴ－Ｔｒ－ａ Ｕ１ＡＯのＱ１７５マウスへのＩＣＶ注射後の１カ月目（図１６Ａ）、２カ月目（図１６Ｂ）、および４カ月目（図１６Ｃ）におけるｍＨＴＴ－ＦｌおよびｍＨＴＴ－Ｔｒのサイレンシングのレベルのグラフを示す図である。 ４つの異なる濃度でのｍＨＴＴ－Ｔｒ－ａ Ｕ１ＡＯのＱ１７５マウスへのＩＣＶ注射後の１カ月目（図１６Ａ）、２カ月目（図１６Ｂ）、および４カ月目（図１６Ｃ）におけるｍＨＴＴ－ＦｌおよびｍＨＴＴ－Ｔｒのサイレンシングのレベルのグラフを示す図である。 ４つの異なる濃度でのｍＨＴＴ－Ｔｒ－ａ Ｕ１ＡＯのＱ１７５マウスへのＩＣＶ注射後の１カ月目（図１６Ａ）、２カ月目（図１６Ｂ）、および４カ月目（図１６Ｃ）におけるｍＨＴＴ－ＦｌおよびｍＨＴＴ－Ｔｒのサイレンシングのレベルのグラフを示す図である。 ｍＨＴＴ－ＦＬ－ａ Ｕ１ＡＯ（上部）、ｍＨＴＴ－Ｔｒ－ａ Ｕ１ＡＯ（中央）、およびＮＣ－ａ Ｕ１ＡＯ（下部）の薬物動態のグラフを示す図である。１カ月目、２カ月目、および４カ月目におけるＲＮＡの量が示されている。４つの異なる濃度のｍＨＴＴ－ＦＬ－ａ Ｕ１ＡＯおよびｍＨＴＴ－Ｔｒ－ａ Ｕ１ＡＯのそれぞれが示され、一方、ＮＣ－ａ Ｕ１ＡＯについての８０μｇ濃度のみが示されている。

Ｕ１アダプター（またはＵ１アダプターオリゴヌクレオチド（Ｕ１ＡＯ））は、アンチセンスまたはｓｉＲＮＡとは機構的に異なる、オリゴヌクレオチド媒介性遺伝子サイレンシングテクノロジーである。Ｕ１アダプターは、ｍＲＮＡ成熟における重要な工程：３’ポリアデノシン（ポリＡ）テールの付加に選択的に干渉することにより作用する。ほとんど全てのタンパク質コードｍＲＮＡはポリＡテールを必要とし、それを付加できなかったことは、結果として、核内での新生ｍＲＮＡの急速な分解を生じ、それにより、タンパク質産物の発現を阻止する。Ｕ１アダプターは、米国特許第９，４４１，２２１号；米国特許第９，０７８，８２３号；米国特許第８，９０７，０７５号；および米国特許第８，３４３，９４１号に記載されている（それらの米国特許のそれぞれは、参照によって本明細書に組み入れられる）。

Ｕ１アダプターオリゴヌクレオチドは、インビボ適用によく適しており、それらが、ヌクレアーゼ抵抗性を向上させるための広範な化学修飾および画像化のためのタグまたは標的細胞による受容体媒介性取り込みのためのリガンドのようなかさ高い基の付着を、サイレンシング活性の損失なしに、受け入れることができるからである。ハンチントン病は、Ｕ１ＡＯを用いる処置に特によく適しているものにさせるいくつかの特性を有する。第１に、変異体ｈｔｔ遺伝子の発現を低下させることは、神経変性を遅らせおよび／または停止させるのに有益である。第２に、その疾患は、遺伝子検査によって確実に診断することができる。第３に、その疾患は、通常、成人で発症する。第４に、その疾患は、ゆっくり進行し、十分立証されており、経過が予測可能である。第５に、疾患の進行を追跡して、介入が有益であるかどうかを決定するために、臨床検査と非侵襲性方法の両方が利用できる。第６に、尾状核が、顕著に冒される領域であり、画像化でモニターすることができ、脳室系に投与された介入からの拡散として、脳室の近くに位置する。最後に、尾状核における非常に脆弱な中型有棘神経細胞は、十分、研究されており、修飾型担体による細胞指向性ターゲティングに有用であり得るマーカーを発現する。

ｈｔｔ、特に、変異体ｈｔｔ（完全長および／またはトランケート型を含む、伸長したトリヌクレオチドＣＡＧリピートを含むｈｔｔ）の発現の調節のための方法および組成物が本明細書に提供される。方法は、Ｕ１アダプターオリゴヌクレオチド／分子（一般的には、図１参照）の使用を含む。それの最も単純な形態において、Ｕ１ＡＯは、２つのドメイン：（１）ｈｔｔ遺伝子のプレｍＲＮＡと（例えば、その末端エクソンにおいて）塩基対形成するようにデザインされたアニーリングドメイン、および（２）標的プレｍＲＮＡの３’末端形成を内因性Ｕ１ ｓｎＲＮＰを結合することにより阻害するエフェクタードメイン（Ｕ１ドメインとも呼ばれる）を有するオリゴヌクレオチドである。理論によって縛られるつもりはないが、Ｕ１アダプターは、内因性Ｕ１ ｓｎＲＮＰを遺伝子特異的プレｍＲＮＡに繋ぎ止め、生じた複合体が適切な３’末端形成をブロックする。特に、Ｕ１ ｓｎＲＮＰは非常に豊富であり（約１００万個／哺乳動物細胞核）、他のスプライソソーム構成要素と比較して化学量論的過剰である。したがって、内因性Ｕ１ ｓｎＲＮＰを排除すること（ｔｉｔｒａｔｉｎｇ ｏｕｔ）の有害な効果はない。

Ｕ１ＡＯは、単独でかまたは送達試薬（例えば、脂質ベースのトランスフェクション試薬）と複合してかのいずれかで細胞へ入ることができる。Ｕ１ＡＯはまた、核に入ってプレｍＲＮＡと結合することができるはずである。実際、この性質は、そのオリゴが核へ入り、プレｍＲＮＡと結合する、リボヌクレアーゼＨ経路を利用するアンチセンスアプローチにおいてのような核酸低分子についてすでに確立されている。さらに、アンチセンスオリゴは核内プレｍＲＮＡと結合し、スプライシング因子のアクセスを立体的にブロックし、スプライシングパターンの変化をもたらすことができることが示されている（Ｉｔｔｉｇら（２００４）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、３２：３４６～５３頁）。

特定の実施形態において、Ｕ１アダプター分子のアニーリングドメインは、（例えば、他のプレｍＲＮＡを除外して）標的プレｍＲＮＡ上の標的部位に対して高い親和性および特異性を有するようにデザインされる。特定の実施形態において、アニーリングドメインを短くし過ぎること（これは親和性を危うくするだろうため）と、長くし過ぎること（これは「オフターゲット」効果を促進し、または他の細胞経路を変化させるだろうため）の間でバランスを達成させるべきである。さらに、アニーリングドメインは、エフェクタードメインの機能に（例えば、塩基対形成およびヘアピン形成により）干渉するべきではない。Ｕ１ＡＯアニーリングドメインは、長さに関して絶対条件はない。しかしながら、アニーリングドメインは、典型的には、約１０ヌクレオチド長から約５０ヌクレオチド長まで、より典型的には約１０ヌクレオチド長から約３０長まで、または約１０ヌクレオチド長から約２０ヌクレオチド長までである。特定の実施形態において、アニーリングドメインは少なくとも約１３ヌクレオチド長または１５ヌクレオチド長である。アニーリングドメインは、関心対象となる遺伝子（ｈｔｔ）と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、またはより特に、１００％相補的であり得る。一実施形態において、アニーリングドメインは、３’末端エクソン内の標的部位とハイブリダイズし、前記３’末端エクソンは、末端コード領域および３’ＵＴＲおよびポリアデニル化シグナル配列（例えば、ポリアデニル化部位まで）を含む。別の実施形態において、標的配列は、ポリ（Ａ）シグナル配列から約５００塩基対以内、２５０塩基対以内、約１００塩基対以内、または約５０ｂｐ以内にある。

ＨＴＴにおけるＣＡＧ（グルタミンをコードする）疾患伸長（典型的には、３６リピートより多い）は、ＨＴＴ遺伝子の第１エクソン内に位置する（Ｔｈｅ Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｒｏｕｐ （１９９３）Ｃｅｌｌ ７２：９７１～９８３頁）。変異体アレルの異常なスプライシングに起因する短いエクソン１ ＨＴＴポリアデニル化ｍＲＮＡは、疾患進行に寄与する病原性エクソン１ ＨＴＴタンパク質へ翻訳される（Ｓａｔｈａｓｉｖａｍら（２０１３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１１０：２３６６～２３７０頁；Ｇｉｐｓｏｎら（２０１３）ＲＮＡ Ｂｉｏｌ．、１０：１６４７～１６５２頁）。ヒトＨＴＴおよびｈｔｔの例示的なアミノ酸およびヌクレオチド配列は、例えば、Ｇｅｎｅ ＩＤ：３０６４ならびにＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００２１１１．８およびＮＰ＿００２１０２．４に見出すことができる。

Ｕ１ＡＯについてのｈｔｔ内の標的部位は、遺伝子サイレンシングのための選択基準を用いて本明細書で同定されている。図１４Ａ～１４Ｌは、Ｕ１ＡＯについてのｈｔｔ内の標的部位を列挙し、最高スコアリングの標的部位が最初に挙げられている。特定の実施形態において、アニーリングドメインは、図１４Ａ～１４Ｌに提供された標的部位とハイブリダイズする。特定の実施形態において、アニーリングドメインは、図１４Ａ～１４Ｌの行１～２７８に提供された標的部位とハイブリダイズする。特定の実施形態において、アニーリングドメインは、図１４Ａ～１４Ｌの行１～１９２に提供された標的部位とハイブリダイズする。特定の実施形態において、アニーリングドメインは、図１４Ａ～１４Ｌの行１～５８に提供された標的部位とハイブリダイズする。特定の実施形態において、アニーリングドメインは、図１４Ａ～１４Ｌの行１～２６に提供された標的部位とハイブリダイズする。特定の実施形態において、アニーリングドメインは、図１４Ａ～１４Ｌの行１～１０に提供された標的部位とハイブリダイズする。特定の実施形態において、アニーリングドメインは、以下から選択される標的部位とハイブリダイズする：
ＣＣＣＡＣＡＴＧＴＣＡＴＣＡＧＣＡＧＧＡ（配列番号２６）；
ＣＡＧＣＡＧＧＡＴＧＧＧＣＡＡＧＣＴＧＧ（配列番号２７）；
ＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＡＣＣＴ（配列番号２８）；
ＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＡＣＣＴＴＴＴＣＴＧ（配列番号２９）；
ＴＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＧＣＣＡＣＡＧＡＣ（配列番号３０）；
ＧＴＣＴＧＴＧＣＴＴＧＡＧＧＴＧＧＴＴＧ（配列番号３１）：
ＧＣＴＧＣＴＧＡＣＴＴＧＴＴＴＡＣＧＡＡ（配列番号３２）；
ＧＧＴＧＧＧＡＧＡＧＡＣＴＧＴＧＡＧＧＣ（配列番号３３）；
ＴＣＣＴＴＴＣＴＣＣＴＧＡＴＡＧＴＣＡＣ（配列番号３４）；
ＧＣＧＧＧＧＡＴＧＧＣＧＧＴＡＡＣＣＣＴ（配列番号３５）；または
ＧＴＣＴＴＣＣＣＴＴＧＴＣＣＴＣＴＣＧＣ（配列番号３６）。

特定の実施形態において、アニーリングドメインは、ＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＡＣＣＴＴＴＴＣＴＧ（配列番号２９）とハイブリダイズする。アニーリングドメインは、図１４Ａ～１４Ｌ内の任意の標的配列または配列番号２６～３６のいずれか１つと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、またはより特に、１００％相補的であり得る。アニーリングドメインは、図１４Ａ～１４Ｌ内の任意の標的配列または配列番号２６～３６のいずれか１つの５’末端および／または３’末端において追加のまたはより少ないヌクレオチドを含み得る。例えば、アニーリングドメインは、（例えば、ｈｔｔ遺伝子の配列由来の）図１４Ａ～１４Ｌ内の任意の標的配列もしくは配列番号２６～３６のいずれか１つの５’末端および／もしくは３’末端に付加された少なくとも１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、もしくは最長１０ヌクレオチドもしくは２０ヌクレオチドを含み得、または図１４Ａ～１４Ｌ内の任意の標的配列もしくは配列番号２６～３６のいずれか１つの５’末端および／もしくは３’末端から少なくとも１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、もしくは５ヌクレオチドの欠失を有し得る。

特定の実施形態において、Ｕ１ＡＯのＵ１ドメインは、Ｕ１ ｓｎＲＮＰと高親和性で結合する。特定の実施形態において、Ｕ１ドメインは、内因性Ｕ１ ｓｎＲＮＡのヌクレオチド２～１１と相補的である。特定の実施形態において、Ｕ１ドメインは、５’－ＣＡＧＧＵＡＡＧＵＡ－３’（配列番号１）；５’－ＣＡＧＧＵＡＡＧＵＡＵ－３’（配列番号４）；５’－ＧＣＣＡＧＧＵＡＡＧＵＡＵ－３’（配列番号５）を含む。特定の実施形態において、Ｕ１ドメインは配列５’－ＣＡＧＧＵＡＡＧＵＡ－３’（配列番号１）を含む。特定の実施形態において、Ｕ１ドメインは配列５’－ＧＣＣＡＧＧＵＡＡＧＵＡＵ－３’（配列番号５）を含む。別の実施形態において、Ｕ１ドメインは、配列番号１、配列番号４、または配列番号５と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、より特に、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％同一性を有する。Ｕ１ドメインは、配列番号１、配列番号４、または配列番号５の５’側または３’側に追加のヌクレオチドを含み得る。例えば、Ｕ１ドメインは、配列番号１、配列番号４、または配列番号５の５’側または３’側に少なくとも１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、または最長１０ヌクレオチドもしくは２０ヌクレオチドを含み得る。実際、Ｕ１ ｓｎＲＮＡのステム１への塩基対形成および／または位置１との塩基対形成を含むようにＵ１ドメインの長さを増加させることは、Ｕ１アダプターのＵ１ ｓｎＲＮＰに対する親和性を向上させる。エフェクタードメインは、約８ヌクレオチド長から約３０ヌクレオチド長まで、約１０ヌクレオチド長から約２０ヌクレオチド長まで、または約１０ヌクレオチド長から約１５ヌクレオチド長までであり得る。例えば、エフェクタードメインは、８ヌクレオチド長、９ヌクレオチド長、１０ヌクレオチド長、１１ヌクレオチド長、１２ヌクレオチド長、１３ヌクレオチド長、１４ヌクレオチド長、１５ヌクレオチド長、１６ヌクレオチド長、１７ヌクレオチド長、１８ヌクレオチド長、１９ヌクレオチド長、または２０ヌクレオチド長であり得る。

Ｕ１ドメインへの点変異の挿入、すなわち、コンセンサス配列の配列番号１、配列番号４、または配列番号５から分岐させることにより、サイレンシングを加減することができる。実際、前記コンセンサス配列を変化させることは、Ｕ１ ｓｎＲＮＡに対する異なる強度および親和性のＵ１ドメインを生じ、それにより、異なるレベルのサイレンシングをもたらす。したがって、いったんアニーリングドメインが関心対象となる遺伝子について決定されたならば、関心対象となる遺伝子の異なるレベルのサイレンシングをもたらすために、異なる強度の異なるＵ１ドメインをアニーリングドメインへ付着させることができる。例えば、ｇＡＧＧＵＡＡＧＵＡ（配列番号３）は、配列番号１より弱くＵ１ ｓｎＲＮＰと結合し、それゆえに、より低いレベルのサイレンシングを生じるだろう。上記で論じられているように、ヌクレオチド類似体を、内因性Ｕ１ ｓｎＲＮＰに対する親和性を増加させるためにＵ１ドメインに含むことができる。ヌクレオチド類似体を加えることは、そのヌクレオチド類似体が、置換されたヌクレオチドと同じヌクレオチドを結合するならば、点変異と見なされない可能性がある。

Ｕ１ＡＯは、ヌクレアーゼに対して抵抗性であるように改変される。特定の実施形態において、Ｕ１ＡＯは、少なくとも１個の非天然ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド類似体を含み得る。ヌクレオチド類似体は、アニーリング親和性、特異性、細胞および生物体における生物学的利用能、細胞内および／もしくは核内輸送、安定性、ならびに／または分解に対する抵抗性を増加させるために用いられる。例えば、オリゴヌクレオチド内のロックド核酸（ＬＮＡ）塩基の包含が、そのオリゴヌクレオチドのそれの標的部位へのアニーリングの親和性および特異性を増加させることは十分、確立されている（Ｋａｕｐｐｉｎｅｎら（２００５）Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ Ｔｅｃｈ．、２：２８７～２９０頁；Ｏｒｕｍら（２００４）Ｌｅｔｔｅｒｓ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉ．、１０：３２５～３３４頁）。ＲＮＡｉおよびリボヌクレアーゼＨに基づいたサイレンシングテクノロジーとは違って、Ｕ１ＡＯ阻害は、酵素活性を含まない。このため、ＲＮＡｉおよびリボヌクレアーゼＨに基づいたサイレンシングテクノロジーについてのオリゴと比較して、Ｕ１ＡＯに用いることができる許容可能なヌクレオチド類似体において有意に高い柔軟性がある。

ヌクレオチド類似体には、非限定的に、１つまたはそれ以上のホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホジエステル、ホスホン酸メチル（ｍｅｔｈｙｌ ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）、ホスホロアミダート、メチルホスホン酸（ｍｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）、ホスホトリエステル、ホスホロアリダート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｒｉｄａｔｅ）、モルホリノ、アミダート（ａｍｉｄａｔｅ）、カルバメート、カルボキシメチル、アセトアミダート（ａｃｅｔａｍｉｄａｔｅ）、ポリアミド、スルホネート、スルホンアミド、スルファメート（ｓｕｌｆａｍａｔｅ）、ホルムアセタル（ｆｏｒｍａｃｅｔａｌ）、チオホルムアセタル（ｔｈｉｏｆｏｒｍａｃｅｔａｌ）、および／またはアルキルシリル置換を含むリン酸修飾を有するヌクレオチド（例えば、ＨｕｎｚｉｋｅｒおよびＬｅｕｍａｎｎ（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、Ｍｏｄｅｒｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ、ＶＣＨ、３３１～４１７頁；Ｍｅｓｍａｅｋｅｒら（１９９４）Ｎｏｖｅｌ Ｂａｃｋｂｏｎｅ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ＡＣＳ、２４～３９頁参照）；修飾糖（例えば、米国特許出願公開第２００５／０１１８６０５号参照）ならびに２’－Ｏ－メチル（２’－Ｏ－メチルヌクレオチド）、２’－Ｏ－メチルオキシエトキシ、および２’－ハロ（例えば、２’－フルオロ）のような糖修飾を有するヌクレオチド；ならびに、非限定的に、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ核酸、シクロヘキセニル核酸、アンヒドロヘキシトール核酸、グリコール核酸、トレオース核酸、およびロックド核酸（ＬＮＡ）（例えば、米国特許出願公開第２００５／０１１８６０５号参照）のようなヌクレオチド模倣体が挙げられる。他のヌクレオチド修飾もまた、米国特許第５，８８６，１６５号；第６，１４０，４８２号；第５，６９３，７７３号；第５，８５６，４６２号；第５，９７３，１３６号；第５，９２９，２２６号；第６，１９４，５９８号；第６，１７２，２０９号；第６，１７５，００４号；第６，１６６，１９７号；第６，１６６，１８８号；第６，１６０，１５２号；第６，１６０，１０９号；第６，１５３，７３７号；第６，１４７，２００号；第６，１４６，８２９号；第６，１２７，５３３号；および第６，１２４，４４５号に提供されている。特定の実施形態において、Ｕ１ＡＯは、少なくとも１個のロックド核酸を含む。特定の実施形態において、アニーリングドメインは、少なくとも１個のロックド核酸を含む（場合により、エフェクタードメインがロックド核酸を含有しない場合）。特定の実施形態において、Ｕ１ＡＯ、特にアニーリングドメインは、２～４ヌクレオチド、特に３ヌクレオチドだけ間隔をあけて、ロックド核酸を有する。

特に、エフェクタードメインがｍＲＮＡの標的部位またはその標的部位とすぐに隣接する部位に対して有意な親和性を有するＵ１アダプターをデザインしないように注意するべきである。言い換えれば、標的部位は、エフェクタードメインの標的プレｍＲＮＡ、特にアニーリング部位の上流に隣接する部分との塩基対形成の可能性を最小限にするように選択されるべきである。

Ｕ１ＡＯのサイレンシング能力を増加させるために、Ｕ１ＡＯはまた、単一のＵ１アダプター内のヘアピンの形成および／または２つもしくはそれ以上のＵ１アダプター間のホモダイマーもしくはホモポリマーの形成を防止するために、低い自己アニーリングを有するようにデザインされるべきである。

Ｕ１ＡＯのアニーリングドメインおよびエフェクタードメインは、エフェクタードメインがアニーリングドメインの５’末端および／または３’末端にあるように連結される。さらに、アニーリングドメインおよびエフェクタードメインは、リンカードメインを介して作動可能に連結される。リンカードメインは、例えば、１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、最長１５ヌクレオチド、最長２０ヌクレオチド、または最長２５ヌクレオチドを含み得る。

Ｕ１ＡＯは、リボヌクレオチドおよび／またはデオキシヌクレオチドを含み得る。本明細書に提供された配列に関して、ウラシル塩基およびチミジン塩基は交換される場合がある。特定の実施形態において、Ｕ１ＡＯは、２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、２’－Ｏ－メチルオキシエトキシヌクレオチド、２’－ハロ（例えば、２’－フルオロ）、および／またはロックド核酸を含む。特定の実施形態において、Ｕ１ＡＯはホスホロチオエートを含む。

特定の実施形態において、Ｕ１ＡＯは、図１４Ａ～１４Ｌに提供されたＵ１ＡＯ（特に、ＲＮＡにおける）を含む。特定の実施形態において、Ｕ１ＡＯは、図１４Ａ～１４Ｌの行１～２７８に提供されたＵ１ＡＯ配列を含む。特定の実施形態において、Ｕ１ＡＯは、図１４Ａ～１４Ｌの行１～１９２に提供されたＵ１ＡＯ配列を含む。特定の実施形態において、Ｕ１ＡＯは、図１４Ａ～１４Ｌの行１～５８に提供されたＵ１ＡＯ配列を含む。特定の実施形態において、Ｕ１ＡＯは、図１４Ａ～１４Ｌの行１～２６に提供されたＵ１ＡＯ配列を含む。特定の実施形態において、Ｕ１ＡＯは、図１４Ａ～１４Ｌの行１～１０に提供されたＵ１ＡＯ配列を含む。特定の実施形態において、Ｕ１ＡＯは以下を含む：
ＵＣＣＵＧＣＵＧＡＵＧＡＣＡＵＧＵＧＧＧＧＣＣＡＧＧＵＡＡＧＵＡＵ（配列番号８）；
ＣＣＡＧＣＵＵＧＣＣＣＡＵＣＣＵＧＣＵＧＧＣＣＡＧＧＵＡＡＧＵＡＵ（配列番号３７）；
ＡＧＧＵＵＣＡＣＧＵＣＣＡＣＣＵＧＣＵＣＧＣＣＡＧＧＵＡＡＧＵＡＵ（配列番号３８）；
ＣＡＧＡＡＡＡＧＧＵＵＣＡＣＧＵＣＣＡＣＧＣＣＡＧＧＵＡＡＧＵＡＵ（配列番号９）；
ＧＵＣＵＧＵＧＧＣＧＡＣＣＡＧＧＣＡＧＡＧＣＣＡＧＧＵＡＡＧＵＡＵ（配列番号３９）；
ＣＡＡＣＣＡＣＣＵＣＡＡＧＣＡＣＡＧＡＣＧＣＣＡＧＧＵＡＡＧＵＡＵ（配列番号１０）：
ＵＵＣＧＵＡＡＡＣＡＡＧＵＣＡＧＣＡＧＣＧＣＣＡＧＧＵＡＡＧＵＡＵ（配列番号１１）；
ＧＣＣＵＣＡＣＡＧＵＣＵＣＵＣＣＣＡＣＣＧＣＣＡＧＧＵＡＡＧＵＡＵ（配列番号１２）；
ＧＵＧＡＣＵＡＵＣＡＧＧＡＧＡＡＡＧＧＡＧＣＣＡＧＧＵＡＡＧＵＡＵ（配列番号１３）；
ＣＡＧＡＡＡＡＧＧＴＵＣＡＣＧＵＣＣＡＣＧＣＣＡＧＧＵＡＡＧＵＡＵ（配列番号１４）；
ＡＧＧＧＵＴＡＣＣＧＣＣＡＴＣＣＣＣＧＣＧＣＣＡＧＧＵＡＡＧＵＡＵ（配列番号１５）；または
ＧＣＧＡＧＡＧＧＡＣＡＡＧＧＧＡＡＧＡＣＧＣＣＡＧＧＵＡＡＧＵＡＵ（配列番号１６）。

特定の実施形態において、Ｕ１ＡＯはＣＡＧＡＡＡＡＧＧＵＵＣＡＣＧＵＣＣＡＣＧＣＣＡＧＧＵＡＡＧＵＡＵ（配列番号９）を含む。別の実施形態において、Ｕ１ＡＯは、上記の配列のまたは図１４Ａ～１４Ｌにおける１つと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、より特に少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％またはそれ以上の同一性を有する。本明細書に提供された配列に関して、ウラシル塩基およびチミジン塩基は交換される場合がある。特定の実施形態において、Ｕ１ＡＯは、少なくとも１個または全部のヌクレオチド類似体を含む。特定の実施形態において、Ｕ１ＡＯは、２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、２’－Ｏ－メチルオキシエトキシヌクレオチド、２’－ハロ（例えば、２’－フルオロ）、および／またはロックド核酸を含む。特定の実施形態において、Ｕ１ＡＯはホスホロチオエートを含む。特定の実施形態において、Ｕ１ＡＯは、実施例に示されているように修飾される。

本発明の別の実施形態において、関心対象となる遺伝子（ｈｔｔ）に方向づけられた１つより多いＵ１ＡＯは、発現を調節するために用いられる。同じプレｍＲＮＡにおける異なる配列にターゲット（アニール）される複数のＵ１ＡＯは阻害増強をもたらすことができる。本発明の組成物は、ｈｔｔ遺伝子（ｈｔｔ遺伝子内の異なる標的）に方向づけられた１つより多いＵ１ＡＯを含み得る。

さらに別の実施形態において、Ｕ１ＡＯは、関心対象となる遺伝子の発現を調節する他の方法と組み合わせることができる。例えば、Ｕ１ＡＯは、阻害増強を与えるために、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボヌクレアーゼＨに基づいた方法、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ、およびモルホリノに基づいた方法のような他の阻害性核酸分子と協調して用いられる。Ｕ１ＡＯがこれらの他のアプローチとは異なる機構を利用する限り、組合せ使用は、単一の阻害剤単独の使用と比較して遺伝子発現の阻害の増加を生じるだろう。実際、ＲＮＡｉおよびある特定のアンチセンスアプローチは一般的にｍＲＮＡの先在するプールの細胞質内安定性または翻訳可能性をターゲットするが、Ｕ１ＡＯは、核における生合成工程をターゲットし得る。

本発明の別の態様において、Ｕ１アダプターのエフェクタードメインは、遺伝子発現を制御するいくつかの核内因子の任意の１つの結合部位と置き換えることができる。例えば、ポリピリミジントラクト結合タンパク質（ＰＴＢ）の結合部位は短く、ＰＴＢは、ポリ（Ａ）部位を阻害することが知られている。したがって、エフェクタードメインを高親和性ＰＴＢ結合部位と置き換えることもまた、標的遺伝子の発現をサイレンスさせるだろう。

上記の基準Ｕ１ ｓｎＲＮＡとは配列の点で異なるＵ１ ｓｎＲＮＡ遺伝子がある。まとめて、これらのＵ１ ｓｎＲＮＡ遺伝子は、Ｕ１バリアント遺伝子と呼ぶことができる。いくつかのＵ１バリアント遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ７８８１０、ＡＣ０２５２６８、ＡＣ０２５２６４、およびＡＬ５９２２０７、ならびにＫｙｒｉａｋｏｐｏｕｌｏｕら（ＲＮＡ（２００６）１２：１６０３～１１頁）（ヒトゲノムにおける２００個近くの可能性のあるＵ１ ｓｎＲＮＡ様遺伝子を同定した）に記載されている。これらのＵ１バリアントの一部は、基準Ｕ１ ｓｎＲＮＡとは異なる５’末端配列を有するため、１つの真実味のある機能は、プレｍＲＮＡスプライシング中にオルタナティブスプライスシグナルを認識することである。したがって、本発明のＵ１ＡＯのＵ１ドメインは、Ｕ１ドメインが本明細書に記載されているように基準Ｕ１ ｓｎＲＮＡとハイブリダイズするようにデザインされたのと同じように、Ｕ１バリアントｓｎＲＮＡの５’末端とハイブリダイズするようにデザインされる。その後、Ｕ１バリアントとハイブリダイズするＵ１ＡＯは、関心対象となる遺伝子の発現を調節するために用いられる。

他の既存のサイレンシングテクノロジーより優った、Ｕ１アダプターテクノロジーの多くの利点がある。これらの利点のいくつかは、以下の通りである。第一に、Ｕ１ＡＯは、２つの独立したドメイン：（１）アニーリング（すなわち、ターゲティング）活性および（２）阻害活性へ分かれ、それにより、阻害活性に影響することなくアニーリングを最適化することが可能になり、逆もまた同様である。第二に、他のテクノロジーと比較して、同じ遺伝子をターゲットする２つのＵ１ＡＯの使用は、相加的、さらに相乗的阻害を与える。第三に、Ｕ１ＡＯは、新規の阻害機構を有する。したがって、他の方法と組み合わせて用いられる場合、適合性がある。第四に、Ｕ１ＡＯは、ポリ（Ａ）テール付加（３’末端プロセシングとも呼ばれる）という、重大な意味をもつ、ほぼ普遍的なプレｍＲＮＡ成熟工程を阻害することにより、ｍＲＮＡの生合成を阻害する。

本発明の組成物は、本発明の少なくとも１つのＵ１ＡＯおよび少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む。組成物は、関心対象となる遺伝子（ｈｔｔ）の発現を阻害する少なくとも１つの他の作用物質をさらに含み得る。例えば、組成物は、関心対象となる遺伝子（ｈｔｔ）に対して方向づけられた少なくとも１つのｓｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドをさらに含み得る。

本発明のＵ１ＡＯは、細胞、または動物およびヒトを含む生物体へ、裸のポリヌクレオチドとして、単独で投与される。Ｕ１ＡＯは、細胞によるそれの取り込みを増強する作用物質と共に投与される。特定の実施形態において、Ｕ１ＡＯは、リポソーム、ナノ粒子、またはポリマー組成物内に含有される。

別の実施形態において、Ｕ１ＡＯは、プラスミドまたはウイルスベクターのような発現ベクターにおいて、細胞、またはヒトを含む動物へ送達される。例えば、Ｕ１ＡＯは、プラスミドまたはウイルスのようなベクターから発現することができる。プラスミドまたはウイルスからのそのような短いＲＮＡの発現は、日常的なことになっており、Ｕ１ＡＯを発現するように容易に適応させることができる。ＲＮＡ分子の発現のための発現ベクターは、構成的または制御性であり得る強いプロモーターを利用し得る。そのようなプロモーターは当技術分野において周知されており、それには、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、ならびにＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターＵ６およびＨ１が挙げられるが、それらに限定されない。ウイルス媒介性送達は、非限定的に、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、レンチウイルス、ポリオウイルス、およびヘルペスウイルスに基づいたベクターの使用を含む。

本発明の薬学的組成物は、任意の適切な経路により、例えば、注射により（例えば、静脈内に、脳室内に、および筋肉内に）、経口、肺、経鼻、直腸、または他の投与様式により、投与することができる。組成物は、ｈｔｔの下方制御を通して処置することができるハンチントン病の処置のために投与することができる。組成物は、インビトロ、インビボ、および／またはエクスビボで用いられる。エクスビボ使用に関して、本発明のＵ１ＡＯ（またはそれを含む組成物）は、自己細胞に送達され（場合により、その細胞を対象から得る工程を含む）、その後、対象に再導入される。本発明の組成物、Ｕ１ＡＯ、および／またはベクターはまた、キットに含まれる。

本発明はまた、対象においてハンチントン病を処置し、阻害し（遅らせまたは低下させ）、および／または予防する方法を包含する。特定の実施形態において、方法は、治療有効量の本発明の少なくとも１つの組成物のそれを必要としている対象（例えば、動物またはヒト）への投与を含む。特定の実施形態において、組成物は、本発明の少なくとも１つのＵ１ＡＯおよび少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む。特定の実施形態において、Ｕ１ＡＯは、ｈｔｔ、特に、完全長および／またはトランケート型であるｈｔｔ（例えば、変異体ｈｔｔ）に方向づけられる。

本方法は、標的ｈｔｔ遺伝子の発現を阻害する少なくとも１つの他の作用物質の投与をさらに含み得る。例えば、方法は、ｈｔｔ遺伝子に対して方向づけられた少なくとも１つのｓｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与をさらに含み得る。方法は、少なくとも１つの他の治療剤（例えば、ハンチントン病についての症状軽減治療剤（例えば、テトラベナジン（Ｘｅｎａｚｉｎｅ（登録商標））またはデューテトラベナジン（Ａｕｓｔｅｄｏ（登録商標）））の投与も含み得る。特定の実施形態において、治療剤は、Ｕ１ＡＯに（例えば、直接的にまたはリンカーを介して；例えば、３’末端および／または５’末端において）コンジュゲートされる。治療剤は、別々の組成物（例えば、少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む）において、または同じ組成物において、投与される。治療剤は、Ｕ１ＡＯと同時におよび／または連続的に投与される。

上記で述べられているように、本発明のＵ１ＡＯは、単独で（裸のポリヌクレオチドとして）投与され、またはそれの細胞による取り込みを増強する作用物質と共に投与される。特定の実施形態において、Ｕ１ＡＯは、ミセル、リポソーム、ナノ粒子、またはポリマー組成物のような送達ビヒクル内に含有される。特定の実施形態において、Ｕ１ＡＯは、デンドリマー、特に、ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーおよびポリプロピレンイミン（ＰＰＩ）デンドリマーのようなカチオンデンドリマー（例えば、第２世代、第３世代、第４世代、または第５世代）と複合体形成する（例えば、それらの内部に含有されまたはそれによりカプセル化される）。特定の実施形態において、Ｕ１ＡＯは、ＰＰＩ－Ｇ２と複合体形成する。

特定の実施形態において、Ｕ１ＡＯは、特定の細胞型（例えば、神経細胞）へターゲットされる。特定の実施形態において、Ｕ１ＡＯは、少なくとも１つのターゲティング部分と（例えば、直接的にまたはリンカーを介して）共有結合性に連結される。ターゲティング部分は、５’末端、３’末端、もしくは両方の末端と、または内部ヌクレオチドと作動可能に連結される。特定の実施形態において、１つまたはそれ以上のターゲティング部分は、Ｕ１ＡＯの１つの末端に（例えば、単一のリンカーを通して）コンジュゲートされる。特定の実施形態において、Ｕ１ＡＯを含む複合体（例えば、デンドリマー、ミセル、リポソーム、ナノ粒子、またはポリマー組成物）は、少なくとも１つのターゲティング部分と（例えば、直接的にまたはリンカーを介して）共有結合性に連結される。

一般的に、リンカーは、Ｕ１ＡＯまたは複合体へのターゲティング部分のような、２つの化合物を共有結合性に付着させる、共有結合または原子鎖を含む化学的部分である。リンカーは、ターゲティング部分およびＵ１ＡＯまたは複合体（ビヒクル）の任意の合成可能な位置に連結することができる。特定の実施形態において、リンカーは、ターゲティング部分およびＵ１ＡＯまたは複合体を、アミン基および／またはスルフィドリル／チオール基、特にスルフィドリル／チオール基を介して接続させる。例えば、Ｕ１ＡＯは、１つまたはそれ以上のアミノ基またはチオ基で（例えば、５’末端において）誘導体化される。特定の実施形態において、リンカーは、ターゲティング部分またはＵ１ＡＯの活性をブロックすることを回避する位置で付着される。例示的なリンカーは、少なくとも１つの、場合により置換型；飽和型もしくは不飽和型；直鎖状、分枝状、もしくは環状アルキル基、または場合により置換型アリル基を含み得る。リンカーはまた、ポリペプチド（例えば、約１アミノ酸から約２０アミノ酸もしくはそれ以上まで、または１～約５アミノ酸）であり得る。リンカーは、生理的環境または条件下で生分解性（切断可能（例えば、ジスルフィド結合を含む））であり得る。特定の実施形態において、リンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を（単独でまたは別のリンカーと組み合わせて）含む。特定の実施形態において、リンカーは、ＬＣ－ＳＰＤＰ（スクシンイミジル６－（３－［２－ピリジルジチオ］－プロピオンアミド）ヘキサン酸）のようなＳＰＤＰ（Ｎ－スクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）－プロピオン酸）リンカー、またはＬＣ－ＳＭＣＣ（スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシ－（６－アミドカプロン酸）のようなＳＭＣＣ（スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸）リンカーである。リンカーはまた、非分解性（非切断性）であり得、生理的環境または条件下で、実質的に切断することができず、または全く切断することができない、共有結合または任意の他の化学構造であり得る。

本発明のターゲティング部分は、優先的に、関連組織（例えば、神経）または器官（例えば、脳）と結合する。特定の実施形態において、ターゲティング部分は、他の細胞と比較して、標的細胞上に特異的に（例えば、唯一）発現したマーカーまたは標的細胞上で上方制御されたマーカーと特異的に結合する。特定の実施形態において、ターゲティング部分は、標的細胞上の表面タンパク質、または他の細胞、組織、もしくは器官より標的細胞上でより高いレベル（またはより高い密度）で発現した表面タンパク質に免疫学的に特異的な抗体または抗体断片である。抗体または抗体断片は治療用抗体（例えば、それ自体、治療効果を有する）であり得る。特定の実施形態において、ターゲティング部分は、標的細胞上の細胞表面受容体のリガンドまたはその結合断片である。特定の実施形態において、ターゲティング部分はアプタマーである。

本発明のＵ１ＡＯはさらに、他の望ましい化合物とコンジュゲートされる。例えば、Ｕ１ＡＯは、検出可能な作用物質、治療用物質（例えば、モノクローナル抗体、ペプチド、タンパク質、阻害性核酸分子、小分子、化学療法剤など）、担体タンパク質、ならびに生物学的利用能、安定性、および／または吸収を向上させる作用物質（例えば、ＰＥＧ）に（直接的にまたは上記のようなリンカーを介して）さらにコンジュゲートされる。追加の化合物は、Ｕ１ＡＯ（またはコンジュゲート）の任意の合成可能な位置へ（例えば、Ｕ１アダプター（例えば、いずれかの末端）またはターゲティング部分へ）付着し得る。あるいは、ターゲティング部分およびＵ１ＡＯは、それぞれ個々に、追加の化合物（例えば、担体タンパク質）に付着する（そのようなものとして、追加の化合物は、Ｕ１ＡＯとターゲティング部分との間のリンカーとしての役割を果たすと考えることができる）。特定の実施形態において、Ｕ１ＡＯは、一方の末端においてターゲティング部分（例えば、神経細胞ターゲティング部分）に、および場合により、他方の末端で治療剤にコンジュゲートされる。優先的には、追加の化合物の付着は、Ｕ１ＡＯの活性またはターゲティング部分に有意には影響しない。検出可能な作用物質は、直接的にまたは間接的に、特に直接的に、アッセイされる任意の化合物またはタンパク質であり得る。検出可能な作用物質には、例えば、化学発光、生物発光、および／または蛍光の化合物またはタンパク質、画像化剤、造影剤、放射性核種、常磁性または超常磁性イオン、同位元素（例えば、放射性同位元素（例えば、^３Ｈ（トリチウム）および^１４Ｃ）または安定同位元素（例えば、^２Ｈ（ジュウテリウム）、^１１Ｃ、^１３Ｃ、^１７Ｏ、および^１８Ｏ）、光学的作用物質、ならびに蛍光剤が挙げられる。

担体タンパク質には、非限定的に、血清アルブミン（例えば、ウシ、ヒト）、オボアルブミン、およびキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）が挙げられる。特定の実施形態において、担体タンパク質はヒト血清アルブミンである。担体タンパク質（および他のタンパク質またはペプチド）は、Ｕ１ＡＯ（またはコンジュゲート）に任意の合成可能な位置でコンジュゲートされる。例えば、リンカー（例えば、ＬＣ－ＳＰＤＰ）は、担体タンパク質のリジン上に見出される遊離アミノ基に付着し得、その後、Ｕ１ＡＯおよびターゲティング部分がリンカーにコンジュゲートされる。いかなる未反応リンカーも、システインでのブロッキングにより不活性化される。

本発明のＵ１ＡＯは、Ｕ１ＡＯを所望の細胞型へターゲットし、および／またはＵ１ＡＯの細胞取り込みを促進する（例えば、細胞透過性部分）化合物（例えば、抗体、ペプチド、タンパク質、核酸分子、小分子など）に（例えば、直接的にまたはリンカーを介して）コンジュゲートされる。ターゲティング部分は、５’末端、３’末端、もしくは両方、または内部のヌクレオチドと作動可能に連結される。特定の実施形態において、ターゲティング部分および／または細胞透過性部分は、５’末端および／または３’末端にコンジュゲートされる。特定の実施形態において、ターゲティング部分および／または細胞透過性部分は、５’末端にコンジュゲートされる。特定の実施形態において、Ｕ１ＡＯは、ターゲティング部分と細胞透過性部分の両方にコンジュゲートされる。本明細書で用いられる場合、用語「細胞透過性物質」または「細胞透過性部分」は、細胞外空間から細胞内への化合物の移動を媒介する化合物または官能基を指す。特定の実施形態において、Ｕ１ＡＯは、アプタマーにコンジュゲートされる。アプタマーは、所望の細胞型の表面化合物またはタンパク質（例えば、受容体）へターゲットされる（例えば、表面化合物またはタンパク質は、ターゲットされるべき細胞型の表面上に優先的にまたはもっぱら、発現し得る）。特定の実施形態において、アプタマーは、細胞透過性アプタマー（例えば、Ｃ１またはＯｔｔｅｒ（例えば、Ｂｕｒｋｅ，Ｄ．Ｈ．（２０１２）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、２０：２５１～２５３参照））である。特定の実施形態において、Ｕ１ＡＯは、細胞透過性ペプチド（例えば、Ｔａｔペプチド（例えば、ＹＧＲＫＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ；配列番号６（場合により、Ｎ末端上でアセチル化されている））、ペネトラチン（Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ）（例えば、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＧＧ；配列番号７）、短い両親媒性ペプチド（例えば、ＰｅｐファミリーおよびＭＰＧファミリー由来）、オリゴアルギニン（例えば、４～１２個連続したアルギニン）、オリゴリジン（例えば、４～１２個連続したリジン））にコンジュゲートされる。特定の実施形態において、Ｕ１ＡＯは、ビオチン（ターゲティング抗体の一部として）もしくは無極性蛍光基（Ｃｙ３またはＣｙ５のようなシアニン）のような小分子、または他の細胞透過性物質にコンジュゲートされる。

特定の実施形態において、Ｕ１ＡＯの３’末端および５’末端の少なくとも１つは、遊離ＳＨ基を含む。

本明細書に記載されたＵ１ＡＯ（それを含むビヒクルを含む）は、一般的に、薬学的調製物として患者へ投与される。本明細書で用いられる場合、用語「患者」および「対象」は、ヒトおよび動物を含む。これらのＵ１アダプターは、医師の指導の下、治療的に用いられる。

本発明のＵ１ＡＯを含む組成物は、好都合には、任意の薬学的に許容される担体と共に、投与のために製剤化される。例えば、Ｕ１ＡＯは、水、緩衝食塩水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール、およびその他同種類のもの）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、油、界面活性剤、懸濁剤、またはそれらの適切な混合物のような許容される媒体と共に製剤化される。選択された媒体におけるＵ１ＡＯの濃度は様々であり得、媒体は、薬学的調製物の所望の投与経路に基づいて選択される。任意の通常の媒体または作用物質が、投与されるべきＵ１ＡＯと適合しない場合を除いて、薬学的調製物におけるそれの使用が企図される。

特定の患者への投与に適している本発明によるＵ１ＡＯの用量および投薬計画は、患者の年齢、性別、体重、全身の健康状態、ならびにＵ１ＡＯが投与されることになっている特定の状態およびその重症度を考慮して、医師により決定される。医師はまた、投与経路、薬学的担体、およびＵ１ＡＯの生物活性も考慮に入れる場合がある。

適切な薬学的調製物の選択はまた、選択された投与様式に依存する。例えば、本発明のＵ１ＡＯは、所望の部位（例えば、脳）への直接的注射により投与される。この場合、薬学的調製物は、注射の部位と適合する媒体中に分散したＵ１ＡＯを含む。本発明のＵ１ＡＯは、任意の方法により投与される。例えば、本発明のＵ１ＡＯは、非限定的に、非経口で、皮下に、経口で、局所的に、肺内に、直腸性に、膣内に、静脈内に、脳室内に、頭蓋内に、腹腔内に、髄腔内に、脳内に、硬膜外に、筋肉内に、皮内に、または頚動脈内に、投与することができる。特定の実施形態において、投与方法は、（例えば、脳への）直接的注射により、または脳室内による。注射用の薬学的調製物は当技術分野において知られている。注射がＵ１ＡＯを投与するための方法として選択される場合には、その分子または細胞の十分な量がそれらの標的細胞に達して、生物学的効果を発揮することを保証するように手段を講じるべきである。

薬学的に許容される担体と完全混和して活性成分として本発明のＵ１ＡＯを含有する薬学的組成物は、通常の薬学的配合技術に従って調製することができる。担体は、投与、例えば、静脈内、経口、直接的注射、頭蓋内、脳室内、および硝子体内の投与に望まれる調製の形態に依存して幅広い種類の形をとり得る。

本発明の薬学的調製物は、投与の簡便さおよび投薬の均一性のために単位剤形で製剤化される。本明細書で用いられる場合、単位剤形は、処置を受ける患者に適切な薬学的調製物の物理的に分離した単位を指す。各投薬は、選択された薬学的担体と共同して所望の効果を生じるように計算された活性成分の量を含有するべきである。適切な単位投薬量を決定する手順は当業者に周知されている。

単位投薬量は、患者の体重に基づいて、比例的に増加または減少される。特定の病理学的状態の軽減のための適切な濃度は、当技術分野において知られているように、投薬濃度曲線計算によって決定される。

本発明によれば、Ｕ１ＡＯの投与についての適切な単位投薬量は、動物モデルにおける分子または細胞の毒性を評価することにより決定される。薬学的調製物におけるＵ１ＡＯの様々な濃度が、マウスに投与され、最小および最大投薬量が、処置の結果として観察された有益な結果および副作用に基づいて決定される。適切な単位投薬量はまた、他の標準薬と組み合わせたＵ１ＡＯ処置の効力を評価することにより決定される場合がある。Ｕ１ＡＯの単位投薬量は、個々にまたは各処置と組み合わせて、検出された効果に従って決定される。

Ｕ１ＡＯを含む薬学的調製物は、病理学的症状が低下または軽減するまで、適切な間隔で、例えば、１日少なくとも２回またはそれ以上で、投与され、その後、投薬量は、維持レベルへ低減される。特定の場合における適切な間隔は、通常、患者の状態に依存する。

定義
単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかに他に規定しない限り、複数の指示対象を含む。

本明細書で用いられる場合、「核酸」または「核酸分子」は、一本鎖かまたは二本鎖のいずれかの任意のＤＮＡまたはＲＮＡ分子、および一本鎖の場合には、直鎖状かまたは環状のいずれかでのそれの相補配列の分子を指す。核酸分子を論じることにおいて、特定の核酸分子の配列または構造は、５’から３’方向で配列を提供する標準の慣習に従って本明細書に記載される。本発明の核酸に関して、用語「単離された核酸」が時々、用いられる。この用語は、ＤＮＡに適用される場合、それの起源である生物体の天然に存在するゲノムにおいてそれがすぐ隣接している配列から分離されているＤＮＡ分子を指す。例えば、「単離された核酸」は、プラスミドもしくはウイルスベクターのようなベクターへ挿入された、または原核細胞もしくは真核細胞もしくは宿主生物体のゲノムＤＮＡへ組み込まれたＤＮＡ分子を含み得る。

ＲＮＡに適用される場合、用語「単離された核酸」は、上記で定義されているような単離されたＤＮＡ分子によりコードされるＲＮＡ分子を指し得る。あるいは、その用語は、それがそれの天然状態で（すなわち、細胞または組織において）関連する他の核酸から十分、分離されているＲＮＡ分子を指し得る。単離された核酸（ＤＮＡかＲＮＡのいずれか）はさらに、生物学的または合成的手段により直接的に産生され、かつそれの産生中に存在する他の構成要素から分離された分子を表し得る。

「ベクター」は、別の遺伝学的配列または因子（ＤＮＡかまたはＲＮＡのいずれか）が付着し得るプラスミド、コスミド、バクミド、ファージ、またはウイルスのような遺伝因子である。ベクターは、付着した配列または因子の複製をもたらすためのレプリコンであり得る。

「発現オペロン」は、宿主細胞または生物体において核酸またはポリペプチドコード配列の発現を促進する、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル（例えば、ＡＴＧまたはＡＵＧコドン）、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、およびその他同種類のもののような転写および翻訳調節配列を有し得る核酸セグメントを指す。「発現ベクター」は、宿主細胞または生物体において核酸またはポリペプチドコード配列の発現を促進するベクターである。

本明細書で用いられる場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、本発明の核酸配列、プライマー、およびプローブを指し、２個以上、好ましくは３個より多いリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドで構成される核酸分子として定義される。オリゴヌクレオチドの正確なサイズは、様々な因子、ならびにそのオリゴヌクレオチドの特定の適用および使用に依存する。

語句「低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）」は、短い（典型的には、３０ヌクレオチド長未満、より典型的には約２１ヌクレオチド長から約２５ヌクレオチド長の間）二本鎖ＲＮＡ分子を指す。典型的には、ｓｉＲＮＡは、そのｓｉＲＮＡがターゲットする遺伝子の発現を調節する。用語「低分子ヘアピン型ＲＮＡ」または「ｓｈＲＮＡ」は、ｓｉＲＮＡ、および少なくとも１ヌクレオチド、典型的には１～１０ヌクレオチドの一本鎖ループ部分を含むヘアピン構造へ折り畳まれた単一のＲＮＡ分子であるｓｉＲＮＡ前駆体を指す。

用語「ＲＮＡ干渉」または「ＲＮＡｉ」は、一般的に、標的分子（例えば、標的遺伝子、タンパク質、またはＲＮＡ）が、二本鎖ＲＮＡによって下方制御される配列特異的または選択的プロセスを指す。典型的にはＲＮＡｉ活性を駆動させる二本鎖ＲＮＡ構造は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、およびＲＮＡ干渉により標的転写産物の発現を阻害する低分子ＲＮＡ種を生じるようにプロセシングされる他の二本鎖構造である。

用語「アンチセンス」は、ＲＮＡにおける標的配列とワトソン・クリック塩基対形成によりハイブリダイズして、標的配列、典型的にはｍＲＮＡとのＲＮＡ：オリゴヌクレオチドヘテロ二重鎖を形成する配列を有するオリゴヌクレオチドを指す。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的配列との正確な配列相補性または極めて近い相補性を有し得る。これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡの翻訳をブロックもしくは阻害し得、および／またはｍＲＮＡのプロセシングを改変して、ｍＲＮＡのスプライスバリアントを生じ得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、典型的には、約５ヌクレオチド長から約１００ヌクレオチド長の間、より典型的には、約７ヌクレオチド長から約５０ヌクレオチド長の間、さらにより典型的には約１０ヌクレオチド長から約３０ヌクレオチド長の間である。

用語「実質的に純粋な」は、所定の材料（例えば、核酸、オリゴヌクレオチド、タンパク質など）の少なくとも５０～６０重量％を含む調製物を指す。より好ましくは、調製物は、所定の化合物の少なくとも７５重量％、最も好ましくは９０～９５重量％を含む。純度は、所定の化合物について適切な方法（例えば、クロマトグラフ的方法、アガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分析、およびその他同種類のもの）により測定される。

用語「単離された」は、それが天然で関連しているだろう他の化合物から十分分離されている化合物または複合体を指し得る。「単離された」は、他の化合物もしくは材料との人工的もしくは合成的混合物、または基本的な活性もしくはアッセイの保証に干渉しない、例えば、不完全な精製もしくは安定剤の添加により存在し得る不純物の存在を排除することを意図するものではない。

用語「遺伝子」は、エクソン配列と（場合により）イントロン配列の両方を含むポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸を指す。核酸はまた、場合により、プロモーターまたはエンハンサー配列のような非コード配列を含み得る。用語「イントロン」は、タンパク質へ翻訳されず、かつ一般的にエクソン間に見出される、所定の遺伝子に存在するＤＮＡ配列を指す。

本明細書で用いられる場合、用語「アプタマー」は、ワトソン・クリック塩基対形成以外の相互作用を通して、タンパク質のような標的と特異的に結合する核酸を指す。特定の実施形態において、アプタマーは、試料中の他の分子は一般的に除外して、１つまたはそれ以上の標的（例えば、タンパク質またはタンパク質複合体）と特異的に結合する。アプタマーは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、修飾核酸、またはそれらの混合物のような核酸であり得る。アプタマーはまた、直鎖型または環状型での核酸であり得、一本鎖または二本鎖であり得る。アプタマーは、少なくとも５ヌクレオチド長、１０ヌクレオチド長、１５ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長、２５ヌクレオチド長、３０ヌクレオチド長、３５ヌクレオチド長、４０ヌクレオチド長またはそれ以上であるオリゴヌクレオチドを含み得る。アプタマーは、４０ヌクレオチド長まで、６０ヌクレオチド長まで、８０ヌクレオチド長まで、１００ヌクレオチド長まで、１５０ヌクレオチド長まで、２００ヌクレオチド長またはそれ以上までである配列を含み得る。アプタマーは、約５ヌクレオチド長から約１５０ヌクレオチド長まで、約１０ヌクレオチド長から約１００ヌクレオチド長まで、または約２０ヌクレオチド長から約７５ヌクレオチド長までであり得る。アプタマーは本明細書では、核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド）アプタマーとして論じられているが、ペプチドアプタマーのようなアプタマー等価物もまた、核酸アプタマーの代わりに用いられる。

本明細書で用いられる場合、語句「作動可能に連結された」は、別の核酸配列との機能的関係へ配置された核酸配列を指し得る。作動可能に連結される核酸配列の例には、非限定的に、プロモーター、転写ターミネーター、エンハンサー、またはアクチベーター、ならびに転写され、および適切な場合、翻訳されたとき、タンパク質、リボザイム、またはＲＮＡ分子のような機能性産物を生じるだろう異種性遺伝子が挙げられる。

「薬学的に許容される」は、連邦政府または州政府の規制機関による認可を示す。「薬学的に許容される」作用物質は、動物、より特にヒトにおける使用として、米国薬局方または他の一般的に認められた薬局方に列挙されている。

「担体」は、本発明の活性物質が一緒に投与される、例えば、希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント、賦形剤、補助剤、またはビヒクルを指す。そのような薬学的担体は、水、ならびに石油、動物、植物、または合成起源のもの、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、ミネラルオイル、ゴマ油、およびその他同種類のものを含む油のような無菌液体であり得る。水または食塩水溶液、ならびにデキストロース水溶液およびグリセリン水溶液が担体として用いられる。適切な薬学的担体は、例えば、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。

「抗体」または「抗体分子」は、特定の抗原と結合する、抗体およびその断片（例えば、免疫学的特異性断片）を含む任意の免疫グロブリンである。本明細書で用いられる場合、抗体または抗体分子は、無傷の免疫グロブリン分子、免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分、および免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分の融合体を企図する。その用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単一ドメイン（Ｄａｂ）抗体、および二重特異性抗体を含む。本明細書で用いられる場合、抗体または抗体分子は、組換え的に作製された、無傷の免疫グロブリン分子、ならびに、非限定的にＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆ（ｖ）、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ_２、およびｓｃＦｖ－Ｆｃのような、免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分を企図する。

抗体に関して、用語「免疫学的特異性の」は、関心対象となるタンパク質または化合物の１つまたはそれ以上のエピトープと結合するが、抗原性生物学的分子の混合集団を含有する試料において他の分子を実質的に認識および結合することはない抗体を指す。

用語「処置する」は、患者の疾患を緩和し、軽減し、および／またはその進行を遅くする化合物の能力を指す。言い換えれば、用語「処置する」は、疾患の進行を阻害しおよび／または逆転させることを指す。

以下の実施例は、本発明を実施する例証的な方法を記載し、本発明の範囲を限定することを決して意図するものではない。

ＨＤ９１９７細胞（Ｃｏｒｉｅｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ＧＭ０９１９７；２１／１８１ ＣＡＧリピート、線維芽細胞 ６歳雄）に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて、完全長ヒトハンチンチン（ＨＴＴ）に対して方向づけられた、Ｕ１アダプターオリゴヌクレオチド（Ｕ１ＡＯ）の一群およびｓｉＲＮＡ（下記参照）をトランスフェクションした。ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ１）に対して標準化されたヒトＨＴＴ ｍＲＮＡのパーセント変化を決定した。図２に見られるように、ヒトＨＴＴ完全長ｍＲＮＡ－２（ｈＨＴＴ－ＦＬ－２）Ｕ１ＡＯは、いかなるｓｉＲＮＡに関して観察されたサイレンシングよりも有意に高い、最高サイレンシング活性を有した。特に、さらなる実験はまた、ｈＨＴＴ－ＦＬ－１ Ｕ１ＡＯが３０％未満までサイレンスさせ得ることを示した。類似した結果が、ＤＵ１４５（ヒト前立腺癌細胞株）およびＭｉａ ＰａＣａ２細胞（ヒト膵癌細胞株）に関して得られた。ＨＴＴのトランケート型バージョン（オルタナティブスプライシング型またはイントロン１トランケート型とも呼ばれる）に関して、ｈＨＴＴ－ＴＲ－１ Ｕ１ＡＯは、最も高いサイレンシング活性を有することが決定された。

本明細書に記載された実験に用いられたＵ１ＡＯおよびｓｉＲＮＡは下記である：
Ｕ１ＡＯ：
ｈＨＴＴ－ｆｌ－１_１：ＵＣＣＵＧＣＵＧＡＵＧＡＣＡＵＧＵＧＧＧＧＣＣＡＧＧＵＡＡＧＵＡＵ（配列番号８）、ただし各ヌクレオチドが２’－Ｏ－メチルである；
ｈＨＴＴ－ｆｌ－２_１：ＣＡＧＡＡＡＡＧＧＵＵＣＡＣＧＵＣＣＡＣＧＣＣＡＧＧＵＡＡＧＵＡＵ（配列番号９）、ただし各ヌクレオチドが２’－Ｏ－メチルである；
ｈＨＴＴ－ｆｌ－３_１：ＣＡＡＣＣＡＣＣＵＣＡＡＧＣＡＣＡＧＡＣＧＣＣＡＧＧＵＡＡＧＵＡＵ（配列番号１０）、ただし各ヌクレオチドが２’－Ｏ－メチルである；
ｈＨＴＴ－ｆｌ－４_１：ＵＵＣＧＵＡＡＡＣＡＡＧＵＣＡＧＣＡＧＣＧＣＣＡＧＧＵＡＡＧＵＡＵ（配列番号１１）、ただし各ヌクレオチドが２’－Ｏ－メチルである；
ｈＨＴＴ－ｆｌ－５_１：ＧＣＣＵＣＡＣＡＧＵＣＵＣＵＣＣＣＡＣＣＧＣＣＡＧＧＵＡＡＧＵＡＵ（配列番号１２）、ただし各ヌクレオチドが２’－Ｏ－メチルである；
ｈＨＴＴ－ｆｌ－６_１：ＧＵＧＡＣＵＡＵＣＡＧＧＡＧＡＡＡＧＧＡＧＣＣＡＧＧＵＡＡＧＵＡＵ（配列番号１３）、ただし各ヌクレオチドが２’－Ｏ－メチルである；
ｈＨＴＴ－ＦＬ－２：ｍＣ＋ＡｍＧｍＡｍＡ＋ＡｍＡｍＧｍＧ＋ＴｍＵｍＣｍＡ＋ＣｍＧｍＵｍＣ＋ＣｍＡｍＣｍＧｍＣｍＣｍＡｍＧｍＧｍＵｍＡｍＡｍＧｍＵｍＡｍＵ（配列番号１４）、ただし、ｍ＝２’－Ｏ－メチルおよび＋＝ロックド核酸；
ｈＨＴＴ－ＴＲ－１：ｍＡ＋ＧｍＧｍＧｍＵ＋ＴｍＡｍＣｍＣ＋ＧｍＣｍＣｍＡ＋ＴｍＣｍＣｍＣ＋ＣｍＧｍＣｍＧｍＣｍＣｍＡｍＧｍＧｍＵｍＡｍＡｍＧｍＵｍＡｍＵ（配列番号１５）、ただし、ｍ＝２’－Ｏ－メチルおよび＋＝ロックド核酸；
ｈＨＴＴ－ＴＲ－２：ｍＧｍＣ＋ＧｍＡｍＧｍＡ＋ＧｍＧｍＡｍＣ＋ＡｍＡｍＧｍＧ＋ＧｍＡｍＡｍＧ＋ＡｍＣｍＧｍＣｍＣｍＡｍＧｍＧｍＵｍＡｍＡｍＧｍＵｍＡｍＵ（配列番号１６）、ただし、ｍ＝２’－Ｏ－メチルおよび＋＝ロックド核酸；
ＮＣ－ａ（対照）：ｍＡＡｍＣｍＧｍＧｍＵｍＵｍＡｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＴｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＧｍＣｍＣｍＡｍＧｍＧｍＵｍＡｍＡｍＧｍＵｍＡｍＵ（配列番号１７）、ただし、ｍ＝２’－Ｏ－メチル；
ｍＨＴＴ－ＦＬ－Ａ：ｍＵｍＧｍＣ＋ＡｍＧｍＣｍＣ＋ＡｍＣｍＣｍＡ＋ＣｍＣｍＵｍＣ＋ＡｍＡｍＡｍＣ＋ＡｍＧｍＣｍＣ＋ＡｍＧｍＧ＋ＴｍＡ＋ＡｍＧｍＵ＋ＡｍＵ（配列番号１８）、ただし、ｍ＝２’－Ｏ－メチルおよび＋＝ロックド核酸；ならびに
ｍＨＴＴ－ＴＲ－Ａ：ｍＡ＋ＧｍＵｍＵｍＣ＋ＴｍＣｍＵｍＵ＋ＣｍＡｍＣｍＡ＋ＡｍＣｍＡｍＧ＋ＴｍＣｍＡｍＧｍＣｍＣ＋ＡｍＧｍＧ＋ＴｍＡ＋ＡｍＧｍＵ＋ＡｍＵ（配列番号１９）、ただし、ｍ＝２’－Ｏ－メチルおよび＋＝ロックド核酸；
ｓｉＲＮＡ：
ｈＨＴＴ－ｓｉＲＮＡ－１（両方の鎖が示されている；ｒ＝ＲＮＡ）：
５’－ｒＧｒＧｒＡ ｒＵｒＡｒＧ ｒＵｒＡｒＧ ｒＡｒＣｒＡ ｒＧｒＣｒＡ ｒＡｒＵｒＡ ｒＡｒＣｒＵ ｒＣｒＧＧ Ｔ－３’（配列番号２０）
５’－ｒＡｒＣｒＣ ｒＧｒＡｒＧ ｒＵｒＵｒＡ ｒＵｒＵｒＧ ｒＣｒＵｒＧ ｒＵｒＣｒＵ ｒＡｒＣｒＵ ｒＡｒＵｒＣ ｒＣｒＧｒＵ－３’（配列番号２１）；
ｈＨＴＴ－ｓｉＲＮＡ－２（両方の鎖が示されている；ｒ＝ＲＮＡ）：
５’－ｒＡｒＧｒＡ ｒＡｒＣｒＵ ｒＵｒＵｒＣ ｒＡｒＧｒＣ ｒＵｒＡｒＣ ｒＣｒＡｒＡ ｒＧｒＡｒＡ ｒＡｒＧＡ Ｃ－３’（配列番号２２）
５’－ｒＧｒＵｒＣ ｒＵｒＵｒＵ ｒＣｒＵｒＵ ｒＧｒＧｒＵ ｒＡｒＧｒＣ ｒＵｒＧｒＡ ｒＡｒＡｒＧ ｒＵｒＵｒＣ ｒＵｒＵｒＵ－３’（配列番号２３）；および
ｈＨＴＴ－ｓｉＲＮＡ－３ （両方の鎖が示されている；ｒ＝ＲＮＡ）：
５’－ｒＡｒＣｒＡ ｒＧｒＣｒＵ ｒＣｒＣｒＡ ｒＧｒＣｒＣ ｒＡｒＧｒＧ ｒＵｒＣｒＡ ｒＧｒＣｒＧ ｒＣｒＣＧ Ｔ－３’（配列番号２４）
５’－ｒＡｒＣｒＧｒ ＧｒＣｒＧ ｒＣｒＴｒＧ ｒＡｒＣｒＣ ｒＴｒＧｒＧ ｒＣｒＴｒＧ ｒＧｒＡｒＧ ｒＣｒＴｒＧ ｒＴｒＴｒＧ－３’（配列番号２５）

図３は、様々な抗ｈＨＴＴ－ＦＬ Ｕ１ＡＯおよびｓｉＲＮＡを４８時間、トランスフェクション（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００）されたヒトＤＵ１４５細胞のウェスタンブロットを提供する（下記参照）。細胞を直接、ｌａｅｍｍｌｉバッファーへ溶解し、その後、６～２０％勾配ゲル上での電気泳動後のウェスタンブロットにより分析した。ここでは、最良の抗ｈＨＴＴ－ＦＬ Ｕ１ＡＯ（ｈＨＴＴ－ＦＬ－１およびｈＨＴＴ－ＦＬ－２）が用いられ、タンパク質レベルにおけるサイレンシング活性を示している。抗ＨＴＴ－ＦＬ ｓｉＲＮＡもまたサイレンシング活性を示した。特に、より少ないＵ１ＡＯを用いることは、より低いサイレンシングを示した（レーン９をレーン７と比較する）。

ＹＡＣ１２８は、１２８個のＣＡＧリピートを有するヒトＨＴＴ遺伝子全体（３００，０００ｂｐ）を含有するマウスである。Ｕ１ＡＯの有効性を決定するために、ｈＨＴＴ－ＦＬ－２ Ｕ１ＡＯ １μｇかもしくは２０μｇのいずれかまたは食塩水をＹＡＣ１２８マウスへ一側性に脳室内（ＩＣＶ）注射した。４８時間後、マウスを灌流しながら屠殺した。左の前脳由来の全ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌに基づいた方法により抽出し、ＲＴ－ｑＰＣＲにより分析し、真核細胞翻訳開始因子４Ａ３（Ｅｉｆ４ａ３）に対して標準化した。図４Ａに見られるように、ｈＨＴＴ－ＦＬ－２ Ｕ１ＡＯの２０μｇ一側性ＩＣＶ注射用量は、食塩水処理マウスと比較して、ＹＡＣ１２８脳におけるｈＨＴＴ－Ｆｌ ｍＲＮＡの６２％低下で、サイレンスさせた。サイレンシングの特異性は、ｈＨＴＴ－Ｔｒ ｍＲＮＡアイソフォーム（図４Ｂ）もＥｉｆ４ａ３ハウスキーピング遺伝子のいずれも発現の観察可能な変化を起こさなかったという事実により確認されている。

ＹＡＣ１２８マウスの前脳由来の全ＲＮＡ（４μｇ／レーン）を、^３２Ｐノーザンブロット（８％ＰＡＧＥ）により分析した（図５）。具体的には、Ｕ１ＡＯレベルを測定するために、ｈＨＴＴ－ＦＬ－２ Ｕ１ＡＯに相補的な３３ｎｔ ^３２Ｐ－抗ｈＨＴＴ－ＦＬ－２オリゴヌクレオチドでそのブロットをプローブした。「標準」とマークされたレーンは、注射されていないＵ１ＡＯであり、それらの包含により、厳密な定量化が可能になる。図５に見られるように、脳組織におけるＵ１ＡＯは、分解も短縮もされていない。注射されたＵ１ＡＯの、たった数個のヌクレオチド分の短縮だけでも、標準に比べて移動度の顕著な変化を生じるだろう。

一種のインサイチューハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）テクノロジーである、ＲＮＡＳｃｏｐｅ（登録商標）分析を用いて、ｈＨＴＴ－ＦＬ転写産物をシングルセル分解能で検出した。簡単に述べれば、ＲＮＡＳｃｏｐｅ（登録商標）方法は、半脳を４％パラホルムアルデヒド中で４８時間、固定し、ＰＢＳへ移し、パラフィン包埋のためにティッシュプロセッサにより処理することを含む。ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）脳を、矢状面で５ミクロン厚に切断し、線条体切片を、ｈＨＴＴ－ＦＬ ｍＲＮＡに特異的なＲＮＡＳｃｏｐｅ（登録商標）プローブを用いるインサイチューハイブリダイゼーションにより追跡した。図６に見られるように、ｈＨＴＴ－ＦＬ－２ Ｕ１ＡＯ処理マウス（右）は、食塩水処理マウス（左）と比較して、より少ないドットおよび低下した強度を有し、それにより、ｈＨＴＴ－ＦＬのサイレンシングを示している。

ｈＨＴＴ－ＦＬ－２ Ｕ１ＡＯの安定性をさらに実証するために、ｈＨＴＴ－ＦＬ－２ Ｕ１ＡＯ ２０μｇまたは食塩水を、ＹＡＣ１２８マウスへ一側性に脳室内（ＩＣＶ）注射した。２日、４日、または７日後、マウスを灌流しながら屠殺した。左の前脳由来の全ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌに基づいた方法により抽出し、ＲＴ－ｑＰＣＲにより分析し、真核細胞翻訳開始因子４Ａ３（Ｅｉｆ４ａ３）に対して標準化した。図７Ａに見られるように、ｈＨＴＴ－ＦＬ－２ Ｕ１ＡＯの２０μｇ一側性ＩＣＶ注射用量は、ＹＡＣ１２８脳におけるｈＨＴＴ－ＦＬ ｍＲＮＡを時間と共に一定して低下させている。図７Ｂは、Ｕ１ＡＯレベルを測定するためにｈＨＴＴ－ＦＬ－２ Ｕ１ＡＯに相補的な３３ｎｔ ^３２Ｐ－抗ｈＨＴＴ－ＦＬ－２オリゴヌクレオチドでプローブされたノーザンブロットを提供する。図７Ｂに見られるように、脳組織におけるＵ１ＡＯは、時間と共に分解されることも短縮されることもない。

ｈＨＴＴ－Ｔｒをサイレンスさせる能力もまた実証されている。２０μｇのｈＨＴＴ－ＴＲ－１ Ｕ１ＡＯ、ｈＨＴＴ－ＴＲ－２ Ｕ１ＡＯ、または食塩水を、ＹＡＣ１２８マウスへ一側性にＩＣＶ注射した。４８時間後、マウスを灌流しながら屠殺した。前脳由来の全ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌに基づいた方法により抽出し、ＲＴ－ｑＰＣＲにより分析し、真核細胞翻訳開始因子４Ａ３（Ｅｉｆ４ａ３）に対して標準化した。図８Ａに見られるように、ｈＨＴＴ－ＴＲ－１ Ｕ１ＡＯはｈＨＴＴ－ＴＲを効果的にはサイレンスさせなかったが、ｈＨＴＴ－ＴＲ－２ Ｕ１ＡＯは、ｈＨＴＴ－ＴＲを約７９％、有意にサイレンスさせた。食塩水処理マウスもｈＨＴＴ－ＴＲ処理マウスのどちらにおいてもｈＨＴＴ－ＦＬ ｍＲＮＡについてのサイレンシングが観察されなかったため（図８Ｂ）、その効果は特異的であった。

抗マウスＨＴＴ Ｕ１ＡＯもまた合成され、培養細胞においてｍＨＴＴをサイレンスさせることが示された。最良の抗マウスＨＴＴ Ｕ１ＡＯはｍＨＴＴ－ＴＲ－ａ（ｍＨＴＴ－ＴＲ ｍＲＮＡ転写産物をターゲットする）およびｍＨＴＴ－ＦＬ－ａ（ｍＨＴＴ－ＦＬ ｍＲＮＡ転写産物をターゲットする）であった。その後、これらのＵ１ＡＯを、Ｑ１７５マウスモデルにおいて試験した。Ｑ１７５マウスは、ヘテロ接合体として、ＨＴＴアレルのうちの１つが１７５個のＣＡＧリピートを有する、ノックインマウスである。Ｕ１ＡＯの有効性を決定するために、食塩水、ｍＨＴＴ－ＴＲ－Ａ Ｕ１ＡＯ ２０μｇ、または非特異的な対照アダプター（ＮＣ－Ａ） Ｕ１ＡＯ ４０μｇをＱ１７５マウスへ一側性にＩＣＶ注射した。ＮＣ－Ａ Ｕ１ＡＯは、いかなるマウス遺伝子もサイレンスさせないようにデザインされた非特異的な対照Ｕ１ＡＯである。４８時間後、マウスを灌流しながら屠殺した。左の前脳由来の全ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌに基づいた方法により抽出し、ＲＴ－ｑＰＣＲにより分析し、真核細胞翻訳開始因子４Ａ３（Ｅｉｆ４ａ３）に対して標準化した。図９Ａに見られるように、ｍＨＴＴ－ＴＲ－Ａ Ｕ１ＡＯの２０μｇ一側性ＩＣＶ注射用量は、対照処理マウスと比較して、Ｑ１７５脳におけるｍＨＴＴ－ＴＲ ｍＲＮＡの７５％低下で、サイレンスさせている。サイレンシングの特異性は、ｍＨＴＴ－ＦＬ ｍＲＮＡアイソフォーム（図９Ｂ）もＥｉｆ４ａ３ハウスキーピング遺伝子のどちらも発現の有意な変化を起こさなかったという事実により確認されている。

ＲＮＡＳｃｏｐｅ（登録商標）分析もまた、ｍＨＴＴ－ＴＲ転写産物をシングルセル分解能で検出するために実施した。簡単に述べれば、ＲＮＡＳｃｏｐｅ（登録商標）方法は、半脳を４％パラホルムアルデヒド中４８時間、固定し、ＰＢＳへ移し、パラフィン包埋のためにティッシュプロセッサにより処理することを含む。ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）脳を、矢状面で５ミクロン厚に切断し、線条体切片を、ｍＨＴＴ－ＴＲ ｍＲＮＡに特異的なＲＮＡＳｃｏｐｅ（登録商標）プローブを用いるインサイチューハイブリダイゼーションにより追跡した。図１０に見られるように、ｍＨＴＴ－ＴＲ Ｕ１ＡＯ処理マウス（右）は、食塩水処理マウス（左）と比較して、より少ないドットおよび低下した強度を有し、それにより、ｍＨＴＴ－ＴＲのサイレンシングを示している。

ｍＨＴＴ－ＴＲ－Ａ Ｕ１ＡＯの安定性をさらに実証するために、ｍＨＴＴ－ＴＲ－Ａ Ｕ１ＡＯ ２０μｇまたは食塩水を、Ｑ１７５マウスへ一側性に脳室内（ＩＣＶ）注射した。２１日後、マウスを灌流しながら屠殺した。左の前脳由来の全ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌに基づいた方法により抽出し、ＲＴ－ｑＰＣＲにより分析し、真核細胞翻訳開始因子４Ａ３（Ｅｉｆ４ａ３）に対して標準化した。図１１Ａに見られるように、ｍＨＴＴ－ＴＲ－Ａ Ｕ１ＡＯの２０μｇ一側性ＩＣＶ注射用量は、Ｑ１７５マウス脳におけるｍＨＴＴ－ＴＲ ｍＲＮＡを、２１日後でさえも低下させている。サイレンシングの特異性は、ｍＨＴＴ－ＦＬ ｍＲＮＡアイソフォーム（図１１Ｂ）もＥｉｆ４ａ３ハウスキーピング遺伝子のどちらも発現の有意な変化を起こさなかったという事実により確認されている。

ｍＨＴＴ－ＦＬ Ｕ１ＡＯの有効性を決定するために、食塩水、ｍＨＴＴ－ＦＬ－Ａ Ｕ１ＡＯ ４０μｇ、または非特異的な対照アダプター（ＮＣ－Ａ）Ｕ１ＡＯ ４０μｇをＱ１７５マウスへ一側性にＩＣＶ注射した。ＮＣ－Ａ Ｕ１ＡＯは、いかなるマウス遺伝子もサイレンスさせないようにデザインされた非特異的な対照Ｕ１ＡＯである。４８時間後、マウスを灌流しながら屠殺した。左の前脳から全ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌに基づいた方法により抽出し、ＲＴ－ｑＰＣＲにより分析し、真核細胞翻訳開始因子４Ａ３（Ｅｉｆ４ａ３）に対して標準化した。図１２Ａに見られるように、ｍＨＴＴ－ＦＬ－Ａ Ｕ１ＡＯの４０μｇ一側性ＩＣＶ注射用量は、対照処理マウスと比較して、Ｑ１７５脳におけるｍＨＴＴ－ＦＬ ｍＲＮＡの６９％低下で、サイレンスさせている。サイレンシングの特異性は、ｍＨＴＴ－ＴＲ ｍＲＮＡアイソフォーム（図１２Ｂ）もＥｉｆ４ａ３ハウスキーピング遺伝子のいずれも発現の有意な変化を起こさなかったという事実により確認されている。

ＲＮＡＳｃｏｐｅ（登録商標）分析もまた、ｍＨＴＴ－ＦＬ転写産物をシングルセル分解能で検出するために実施した。簡単に述べれば、ＲＮＡＳｃｏｐｅ（登録商標）方法は、半脳を４％パラホルムアルデヒド中４８時間、固定し、ＰＢＳへ移し、パラフィン包埋のためにティッシュプロセッサにより処理することを含む。ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）脳を、矢状面で５ミクロン厚に切断し、線条体切片を、ｍＨＴＴ－ＦＬ ｍＲＮＡに特異的なＲＮＡＳｃｏｐｅ（登録商標）プローブを用いるインサイチューハイブリダイゼーションにより追跡した。図１３に見られるように、ｍＨＴＴ－ＦＬ－Ａ Ｕ１ＡＯ処理マウス（右）は、食塩水処理マウス（左）と比較して、より少ないドットおよび低下した強度を有し、それにより、ｍＨＴＴ－ＦＬのサイレンシングを示している。

ｈＨＴＴ－ＦＬ－２ Ｕ１ＡＯについての体内分布研究もまた実施した。簡単に述べれば、脳領域における体内分布をシングルセルレベルで評価するために、Ｃｙ３蛍光標識ｈＨＴＴ－ＦＬ－２ Ｕ１ＡＯ（Ｃｙ３－ｈＨＴＴ－ＦＬ－２ Ｕ１ＡＯ）を用いて一連の実験を実施した。Ｃｙ３－ｈＨＴＴ－ＦＬ－２ Ｕ１ＡＯ ５μｇを、月齢６～８カ月のＹＡＣ１２８マウス７へ一側性にＩＣＶ注射した。注射後１日目、７日目、および２８日目において、マウスを（食塩水で）灌流しながら屠殺して、血液および細胞外Ｕ１ＡＯを除去した。続いて、脳試料を共焦点顕微鏡法により研究した。特に、Ｃｙ３蛍光基自体が毒性であるため、Ｃｙ３－ｈＨＴＴ－ＦＬ－２ Ｕ１ＡＯのより高い用量を用いなかった。実際、それぞれ、Ｃｙ３－ｈＨＴＴ－ＦＬ－２ Ｕ１ＡＯ ３０μｇおよび８０μｇの化学量論的等価物である、遊離Ｃｙ３ １．５μｇおよび４μｇの注射が、ＹＡＣ１２８マウスに対して非常に毒性が高いことが決定された。Ｃｙ３－ｈＨＴＴ－ＦＬ－２ Ｕ１ＡＯ ５μｇの使用は、ＹＡＣ１２８マウスにおいて明白な毒性効果は生じなかった。

体内分布アッセイは、Ｃｙ３－ｈＨＴＴ－ＦＬ－２ Ｕ１ＡＯを左脳室へＩＣＶ注射した後、Ｃｙ３－ｈＨＴＴ－ＦＬ－２ Ｕ１ＡＯは、急速（１日以内に）かつ有意に、左半脳と右半脳の両方にわたって分布し、結果として、７日目および２８日目までに、脳の左側と右側の両方におけるＣｙ３－ｈＨＴＴ－ＦＬ－２ Ｕ１ＡＯの対称性分布を生じた。これらの結果は、Ｃｙ３－ｈＨＴＴ－ＦＬ－２ Ｕ１ＡＯが左脳室注射部位から、注射部位から最も遠い右半脳領域を含む他の脳領域（例えば、線条体、皮質、海馬、小脳）へ迅速に移動することを示している。Ｃｙ３－ｈＨＴＴ－ＦＬ－２ Ｕ１ＡＯはまた、たいていの神経細胞（例えば、皮質神経細胞）および細胞型による広範な取り込みを受けた。さらに、Ｃｙ３－ｈＨＴＴ－ＦＬ－２ Ｕ１ＡＯは、核および核周囲において明瞭に目に見えた。最後に、蛍光強度は、１日目および７日目時点と比較して、２８日目時点においてほんのわずかだけ減弱し、それにより、時間経過に対するＣｙ３－ｈＨＴＴ－ＦＬ－２ Ｕ１ＡＯの安定性を示している。

１カ月目から４カ月目までのｍＨＴＴ－Ｆｌ転写産物の５０％～８０％の持続性低下を実証するために、さらなる実験を実施した。並行実験において、１カ月目から４カ月目までのｍＨＴＴ－Ｔｒ転写産物の５０％～８０％の持続性低下を達成する条件を同定した。

第一に、Ｑ１７５マウスは、４つの異なる濃度：１０μｇ、２０μｇ、４０μｇ、および８０μｇにおけるｍＨＴＴ－ＦＬ－ａ Ｕ１ＡＯでの単一の一側性ＩＣＶ用量（１用量あたりマウスｎ＝９）を受けた（合計３６匹のマウスになる）。各濃度からの３匹のマウスのコホートを１カ月、２カ月、および４カ月後に安楽死させ、その場合、マウスは１×ＰＢＳでの灌流を受け、その後、屠殺された。半脳を収集し、ＲＴ－ｑＰＣＲおよびノーザンブロットによる分析のために処理した。全てのＵ１アダプター処理マウスを、未処理Ｑ１７５マウスと比較した。ｍＨＴＴ－Ｆｌ転写産物のサイレンシングを、ＲＴ－ｑＰＣＲにより評価し、その後、それを、１００％に設定された未処理マウスと比較した。ｍＨＴＴ－Ｔｒ転写産物を検出するためのＲＴ－ｑＰＣＲには、ｍＨＴＴ－Ｔｒ転写産物Ｃｔ値に干渉したであろうイントロン１番のＤＮＡを除去するために必要なデオキシリボヌクレアーゼ処理を含めた。

図１５Ａ、図１５Ｂ、および図１５Ｃに見られるように、ｍＨＴＴ－Ｆｌ転写産物は、それぞれ、処理後１カ月目、２カ月目、および４カ月目において、特異的に低下した。図１５Ｄは、８０μｇの最高濃度における対照ＮＣ－ａ Ｕ１ＡＯ 単一の一側性ＩＣＶ用量で処理された対照処理Ｑ１７５マウスが、ｍＨＴＴ－Ｆｌ転写産物の低下もｍＨＴＴ－Ｔｒ転写産物の低下も生じなかったことを示している。

第二に、Ｑ１７５マウスは、４つの異なる濃度：１０μｇ、２０μｇ、４０μｇ、および８０μｇにおけるｍＨＴＴ－Ｔｒ－ａ Ｕ１ＡＯでの単一の一側性ＩＣＶ用量（１用量あたりマウスｎ＝９）を受けた（合計３６匹のマウスになる）。各濃度からの３匹のマウスのコホートを１カ月、２カ月、および４カ月後に安楽死させ、その場合、マウスは１×ＰＢＳでの灌流を受け、その後、屠殺された。半脳を収集し、ＲＴ－ｑＰＣＲおよびノーザンブロットによる分析のために処理した。全てのＵ１アダプター処理マウスを、未処理Ｑ１７５マウスと比較した。ｍＨＴＴ－Ｔｒ転写産物のサイレンシングを、ＲＴ－ｑＰＣＲにより評価し、その後、それを、１００％に設定された未処理マウスと比較した。ｍＨＴＴ－Ｔｒ転写産物を検出するためのＲＴ－ｑＰＣＲには、ｍＨＴＴ－Ｔｒ転写産物Ｃｔ値に干渉したであろうイントロン１番のＤＮＡを除去するために必要なデオキシリボヌクレアーゼ処理を含めた。

図１６Ａ、図１６Ｂ、および図１６Ｃに見られるように、ｍＨＴＴ－Ｔｒ転写産物は、それぞれ、処理後１カ月目、２カ月目、および４カ月目において、特異的に低下した。

ｍＨＴＴ－Ｔｒ－ａ Ｕ１ＡＯによるｍＨＴＴ－Ｔｒ転写産物のサイレンシングは特異的であると考えられ、理由は以下である：１）ｍＨＴＴ－Ｆｌ転写産物における有意な変化は観察されなかった、および２）ＮＣ－ａ非特異的対照Ｕ１ＡＯは、１カ月間、２カ月間、および４カ月間において最高用量（８０μｇ）でサイレンシングを示さなかった。同様に、ｍＨＴＴ－Ｆｌ－ａ Ｕ１ＡＯによるｍＨＴＴ－Ｆｌ転写産物のサイレンシングは特異的であると考えられ、理由は以下である：１）ｍＨＴＴ－Ｔｒ転写産物における有意な変化は観察されなかった、および２）ＮＣ－ａ非特異的対照Ｕ１ＡＯは、１カ月間、２カ月間、および４カ月間において最高用量（８０μｇ）でサイレンシングを示さなかった。

薬物動態（ＰＫ）研究もまた実施した。ＰＫプロファイルを、上記で列挙された同じマウスの３点の時間経過期間と組み合わせた４点の用量応答に対する^３２Ｐ－ノーザンブロット分析により達成した。ＲＴ－ｑＰＣＲを実施するために用いられた同じＲＮＡのアリコートを、ノーザンブロッティングに用いた。簡単に述べれば、標準および^３２Ｐトレーサーと共に、Ｕ１アダプター処理マウス由来のＲＮＡ試料を、８％変性尿素－ＰＡＧＥゲル上で分離し、続いて、ノーザンブロット膜へ転写した。その後、膜を、同族^３２Ｐ－プローブでプローブし、洗浄し、Ｘ線フィルムに曝露した。同族プローブは、ｍＨＴＴ－Ｆｌ－ａ Ｕ１ＡＯに対するアンチセンスである^３２Ｐ－抗ｍＨＴＴ－ＦＬ－ａと呼ばれる^３２Ｐ標識オリゴヌクレオチド、またはｍＨＴＴ－Ｔｒ－ａ Ｕ１ＡＯに対するアンチセンスである^３２Ｐ－抗ｍＨＴＴ－Ｔｒ－ａと呼ばれる^３２Ｐ標識オリゴヌクレオチド、またはＮＣ－ａ Ｕ１ＡＯに対するアンチセンスである^３２Ｐ－抗ＮＣ－ａと呼ばれる^３２Ｐ標識オリゴヌクレオチドであった。Ｘ線フィルムへの数回の曝露後、ノーザンブロットを、Ｔｙｐｈｏｏｎ（商標）システムにおけるホスフォイメージャー（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）により定量化した。結果は図１７に示される。

Ｕ１ＡＯの病理組織学もまた研究した。簡単に述べれば、ＹＡＣ１２８マウスに、食塩水（ｎ＝３）または、食塩水中ｈＨＴＩ－ＦＬ－２ Ｕ１アダプターオリゴ５０μｇ（ｎ＝５）をＩＣＶ注射した。２匹のマウスは未処理対照として用いた。マウスは全て雄であり、月齢３～５カ月の範囲であった。マウスを７日間、処理した。各マウス由来の脳、腎臓、および肝臓組織からの２つのヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色されたスライドを、病理組織学分析のために調べた。上記のスライドの顕微鏡検査により、ＩＣＶ－５０μｇ Ｕ１アダプターオリゴに関係した毒性の特異的な病理組織学的変化は示されていない。Ｈ＆Ｅスライドの顕微鏡検査により、ＩＣＶ－５０μｇ Ｕ１アダプターオリゴに関係した毒性の特異的な病理組織学的変化は示されなかった。

本発明の好ましい実施形態のいくつかが上記で記載され、かつ具体的に例示されているが、本発明がそのような実施形態に限定されることは意図されない。以下の特許請求の範囲に示されているような本発明の範囲および精神から逸脱することなく、様々な改変がなし得る。

いくつかの刊行物および特許文書は、この発明が関連する技術の状況をより完全に記載するために前述の明細書中に引用されている。これらの引用のそれぞれの開示は、参照によって本明細書に組み入れられている。

Claims (31)

1. ハンチンチン遺伝子の発現を阻害するためのＵ１アダプターオリゴヌクレオチドであって、該Ｕ１アダプターオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのエフェクタードメインと作動可能に連結されたアニーリングドメインを含む核酸分子であり、該アニーリングドメインは、該ハンチンチン遺伝子のプレｍＲＮＡとハイブリダイズし、該エフェクタードメインは、Ｕ１ ｓｎＲＮＰのＵ１ ｓｎＲＮＡとハイブリダイズする、前記Ｕ１アダプターオリゴヌクレオチド。
2. アニーリングドメインは約１０ヌクレオチド長～約３０ヌクレオチド長である、請求項１に記載のＵ１アダプターオリゴヌクレオチド。
3. エフェクタードメインは約８ヌクレオチド長～約２０ヌクレオチド長である、請求項１に記載のＵ１アダプターオリゴヌクレオチド。
4. エフェクタードメインとアニーリングドメインは、結合または約１ヌクレオチド～約１０ヌクレオチドのリンカードメインにより連結されている、請求項１に記載のＵ１アダプターオリゴヌクレオチド。
5. エフェクタードメインは、配列５’－ＣＡＧＧＵＡＡＧＵＡ－３’（配列番号１）、５’－ＣＡＧＧＵＡＡＧＵＡＵ－３’（配列番号４）、または５’－ＧＣＣＡＧＧＵＡＡＧＵＡＵ－３’（配列番号５）を含む、請求項１に記載のＵ１アダプターオリゴヌクレオチド。
6. 少なくとも１つのターゲティング部分および／または細胞透過性部分をさらに含み、該ターゲティング部分および／または細胞透過性部分は、Ｕ１アダプターオリゴヌクレオチドと作動可能に連結されている、請求項１に記載のＵ１アダプターオリゴヌクレオチド。
7. Ｕ１アダプターオリゴヌクレオチドは少なくとも１つのヌクレオチド類似体を含む、請求項１に記載のＵ１アダプターオリゴヌクレオチド。
8. Ｕ１アダプターオリゴヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、２’－Ｏ－メチルオキシエトキシヌクレオチド、２’－ハロ（例えば、２’－フルオロ）、および／またはロックド核酸を含む、請求項１に記載のＵ１アダプターオリゴヌクレオチド。
9. Ｕ１アダプターオリゴヌクレオチドはホスホロチオエートを含む、請求項１に記載のＵ１アダプターオリゴヌクレオチド。
10. アニーリングドメインは、ハンチンチン遺伝子の３’末端エクソンにおける標的配列とハイブリダイズする、請求項１に記載のＵ１アダプターオリゴヌクレオチド。
11. エフェクタードメインは、アニーリングドメインの３’末端、アニーリングドメインの５’末端、またはアニーリングドメインの５’末端と３’末端の両方と作動可能に連結されている、請求項１に記載のＵ１アダプターオリゴヌクレオチド。
12. アニーリングドメインは、少なくとも７デオキシリボヌクレオチドのストレッチを含む、請求項１に記載のＵ１アダプターオリゴヌクレオチド。
13. Ｕ１ ｓｎＲＮＡはＵ１バリアントｓｎＲＮＡである、請求項１に記載のＵ１アダプターオリゴヌクレオチド。
14. Ｕ１アダプターオリゴヌクレオチドとターゲティング部分および／または細胞透過性部分はリンカーを介してコンジュゲートされている、請求項６に記載のＵ１アダプターオリゴヌクレオチド。
15. リンカーは切断可能である、請求項１４に記載のＵ１アダプターオリゴヌクレオチド。
16. ターゲティング部分および／または細胞透過性部分は、Ｕ１アダプターオリゴヌクレオチドの３’末端、５’末端、または５’末端と３’末端の両方と作動可能に連結されている、請求項６に記載のＵ１アダプターオリゴヌクレオチド。
17. ターゲティング部分および／または細胞透過性部分は、Ｕ１アダプターオリゴヌクレオチドの５’末端と作動可能に連結されている、請求項１６に記載のＵ１アダプターオリゴヌクレオチド。
18. Ｕ１アダプターオリゴヌクレオチドは、３’末端において第１のターゲティング部分と、および５’末端において第２のターゲティング部分と作動可能に連結されている、請求項１に記載のＵ１アダプターオリゴヌクレオチド。
19. ターゲティング部分は抗体またはその断片である、請求項６に記載のＵ１アダプターオリゴヌクレオチド。
20. Ｕ１アダプターオリゴヌクレオチドは、完全長および／またはトランケート型ハンチンチンｍＲＮＡの発現を阻害する、請求項１に記載のＵ１アダプターオリゴヌクレオチド。
21. Ｕ１アダプターオリゴヌクレオチドは、配列番号８、配列番号３７、配列番号３８、配列番号９、配列番号３９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、および配列番号１６からなる群から選択される配列を含む、請求項１に記載のＵ１アダプターオリゴヌクレオチド。
22. Ｕ１アダプターオリゴヌクレオチドは、配列番号８、配列番号９、および配列番号１５からなる群から選択される配列を含む、請求項１に記載のＵ１アダプターオリゴヌクレオチド。
23. アニーリングドメインは、配列番号２６～３６からなる群から選択される配列とハイブリダイズする、請求項１に記載のＵ１アダプターオリゴヌクレオチド。
24. アニーリングドメインは、配列番号２６、配列番号２９、および配列番号３５からなる群から選択される配列とハイブリダイズする、請求項１に記載のＵ１アダプターオリゴヌクレオチド。
25. 請求項１～２４のいずれか１項に記載の少なくとも１つのＵ１アダプターオリゴヌクレオチドおよび少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む組成物。
26. ハンチンチン遺伝子に対して方向づけられた少なくとも１つのｓｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項２５に記載の組成物。
27. 請求項１～２４のいずれか１項に記載の少なくとも１つのＵ１アダプターオリゴヌクレオチドを細胞へ送達する工程を含む、ハンチンチン遺伝子の発現を阻害する方法。
28. Ｕ１アダプターオリゴヌクレオチドの少なくとも２つが送達され、該Ｕ１アダプターオリゴヌクレオチドのアニーリングドメインは、ハンチンチン遺伝子における異なる標的配列とハイブリダイズする、請求項２７に記載の方法。
29. 必要としている対象においてハンチントン病を処置する方法であって、請求項１～２４のいずれか１項に記載の少なくとも１つのＵ１アダプターオリゴヌクレオチドを該対象に投与する工程を含む、前記方法。
30. Ｕ１アダプターオリゴヌクレオチドの少なくとも２つが投与され、該Ｕ１アダプターオリゴヌクレオチドのアニーリングドメインは、ハンチンチン遺伝子における異なる標的配列とハイブリダイズする、請求項２９に記載の方法。
31. ハンチンチン遺伝子に対して方向づけられた少なくとも１つのｓｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与をさらに含む、請求項２９に記載の方法。

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