KR20170110718A - 선조체 및 피질로의 바이러스 입자의 향상된 전달 - Google Patents

선조체 및 피질로의 바이러스 입자의 향상된 전달 Download PDF

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KR20170110718A
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Abstract

본 명세서에는 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV) 입자를 포유동물(예를 들어, 인간)의 중추 신경계에 전달하기 위한 신규한 방법이 제공된다. 양태들에서, 상기 방법은 이종성 핵산을 함유하는 rAAV 입자를 선조체(striatum)에 투여하여 포유동물의 적어도 대뇌 피질과 선조체에서 상기 이종성 핵산의 발현을 일으키는 단계를 포함한다.

Description

선조체 및 피질로의 바이러스 입자의 향상된 전달
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2015년 2월 10일자로 출원된 미국 가출원 제62/114,544호 및 2015년 9월 19일자로 출원된 미국 가출원 제62/220,997호에 대해 우선권을 주장하며, 이들 가출원의 내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함된다.
ASCII 텍스트 파일 형식의 서열 목록의 제출
ASCII 텍스트 파일 형식의 하기 제출물의 내용은 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함된다: 컴퓨터 판독 가능한 형태(CRF)의 서열 목록(파일명: 159792012740SEQLIST.txt, 기록일: 2016년 2월 4일, 크기: 1 KB).
발명의 분야
본 발명은 뇌, 예를 들어 선조체 및/또는 피질로의 AAV 유전자 치료용 벡터의 전달에 관한 것이다.
발명의 개요
아데노 관련 바이러스(AAV) 기반 벡터는 다수의 임상 실험에서 탁월한 안전성 기록을 수립하면서 신경 유전자 치료를 위한 바람직한 벡터 시스템이 되었다(문헌[Kaplitt et al., (2007) Lancet 369:2097-2105]; 문헌[Eberling et al., (2008) Neurology 70:1980-1983]; 문헌[Fiandaca et al., (2009) Neuroimage 47 Suppl. 2:T27-35]). 신경 장애의 효과적인 치료는 이환 세포 집단으로의 AAV 벡터의 전달과 관련된 문제에 의해 방해받아 왔다. 이러한 전달 문제는 대뇌 피질과 관련된 장애에 대해 특히 문제가 되어 왔다. 단순 주입은 확산에 의존하여 AAV 벡터를 효과적으로 분포시키지 못하는데, 확산은 반경 1 mm 내지 3 mm 이내에서만 유효하다. 대안적인 방법인 대류 강화 전달(convection-enhanced delivery, CED)(문헌[Nguyen et al., (2003) J. Neurosurg . 98:584-590])이 파킨슨병의 유전자 치료(AAV2-hAADC)에서 임상적으로 사용되었다(문헌[Fiandaca et al., (2008) Exp . Neurol. 209:51-57]). CED의 기본 원리는 간질액의 정수압을 극복하기에 충분한 압력 하에 주입액을 뇌 실질(brain parenchyma) 내로 펌핑하여 주입된 입자가 뇌의 조밀한 주변혈관구조(perivasculature)와 밀접한 접촉을 이루게 하는 것을 포함한다. 이러한 혈관의 맥동은 펌프로서 작용하여 먼 거리를 지나 실질 전반에 걸쳐 입자를 분포시킨다(문헌[Hadaczek et al., (2006) Hum. Gene Ther. 17:291-302]). CED의 안전성과 효율을 증가시키기 위해, 실시간 MRI를 사용한 모니터링된 전달과 함께 역류 저항 캐뉼러(cannula)(문헌[Krauze et al., (2009) Methods Enzymol. 465:349-362])가 사용될 수 있다. 모니터링된 전달은 캐뉼러 역류 및 뇌실 내로의 주입액의 누출과 같은 비정상적인 이벤트(event)의 정량화 및 제어를 가능하게 한다(문헌[Eberling et al., (2008) Neurology 70:1980-1983]; 문헌[Fiandaca et al., (2009) Neuroimage 47 Suppl. 2:T27-35]; 문헌[Saito et al., (2011) Journal of Neurosurgery Pediatrics 7:522-526]). 그러나, 피질 및/또는 선조체에서 AAV 벡터의 광범위한 발현을 달성하기 위한 개선된 절차가 여전히 필요하다.
본 발명은 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV) 입자를 선조체에 투여하는 단계를 포함하여 rAAV 입자를 포유동물의 중추 신경계에 전달하는 방법을 제공하며, 여기서 rAAV 입자는 포유동물의 적어도 대뇌 피질과 선조체에서 발현되는 이종성 핵산을 인코딩하는 rAAV 벡터를 포함한다. 일부 양태에서, 본 발명은 rAAV 입자를 선조체에 투여하는 단계를 포함하여 rAAV 입자를 포유동물의 중추 신경계에 전달하는 방법을 제공하며, 여기서 rAAV 입자는 포유동물의 적어도 대뇌 피질과 선조체에서 발현되는 이종성 핵산을 인코딩하는 rAAV 벡터를 포함하고, rAAV 입자는 AAV 혈청형 1(AAV1) 캡시드를 포함한다. 일부 양태에서, 본 발명은 rAAV 입자를 선조체에 투여하는 단계를 포함하여 rAAV 입자를 포유동물의 중추 신경계에 전달하는 방법을 제공하며, 여기서 rAAV 입자는 포유동물의 적어도 대뇌 피질과 선조체에서 발현되는 이종성 핵산을 인코딩하는 rAAV 벡터를 포함하고, rAAV 입자는 AAV 혈청형 2(AAV2) 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, 포유동물은 인간이다.
일부 구현예에서, rAAV 입자는 선조체의 적어도 피각(putamen)과 꼬리핵(caudate nucleus)에 투여된다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 선조체의 각 반구의 적어도 피각과 꼬리핵에 투여된다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 꼬리핵의 적어도 1개 부위 및 피각의 2개 부위에 투여된다. 일부 구현예에서, 피각에 투여되는 rAAV 입자 대 꼬리핵에 투여되는 rAAV 입자의 비는 적어도 약 2:1이다. 일부 구현예에서, 이종성 핵산은 포유동물의 적어도 전두 피질, 후두 피질 및/또는 IV층에서 발현된다. 일부 구현예에서, 이종성 핵산은 적어도 전전두 연합 피질 영역, 전운동 피질, 1차 체성감각 피질 영역, 감각 운동 피질, 두정 피질, 후두 피질 및/또는 1차 운동 피질에서 발현된다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 대뇌 피질에서 역행(retrograde) 또는 순행(anterograde) 수송된다. 일부 구현예에서, 이종성 핵산은 시상, 시상 하부 핵, 창백핵, 흑색질 및/또는 해마에서 추가로 발현된다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 1 ㎕/분 초과 내지 약 5 ㎕/분의 속도로 꼬리핵과 피각에 투여된다.
상기 양태와 구현예의 일부 구현예에서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV V708K, 염소 AAV, AAV1/AAV2 키메라, 소 AAV, 또는 마우스 AAV 캡시드 rAAV2/HBoV1 혈청형 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 혈청형은 AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10 또는 AAVrh10이다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터는 하나 이상의 AAV 역위 말단 반복부(inverted terminal repeat, ITR) 서열에 의해 플랭킹된 이종성 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 이종성 핵산은 2개의 AAV ITR에 의해 플랭킹되어 있다. 일부 구현예에서, AAV ITR은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, 염소 AAV, 소 AAV, 또는 마우스 AAV 혈청형 ITR이다. 일부 구현예에서, AAV ITR은 AAV2 ITR이다. 일부 구현예에서, rAAV 입자의 ITR과 캡시드는 동일한 AAV 혈청형으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, ITR과 캡시드는 AAV2로부터 유래된다. 다른 구현예에서, rAAV 바이러스 입자의 ITR과 캡시드는 상이한 AAV 혈청형으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, ITR은 AAV2로부터 유래되고, 캡시드는 AAV1로부터 유래된다.
상기 양태과 구현예의 일부 구현예에서, 이종성 핵산은 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 CNS의 세포에서 이종성 핵산을 발현시킨다. 일부 구현예에서, 프로모터는 뇌 세포에서 이종성 핵산을 발현시킨다. 일부 구현예에서, 프로모터는 신경세포 및/또는 신경아교세포에서 이종성 핵산을 발현시킨다. 일부 구현예에서, 신경세포는 꼬리핵의 중형 가시 신경세포(medium spiny neuron), 피각의 중형 가시 신경세포, 피질 IV층의 신경세포 및/또는 피질 V층의 신경세포이다. 일부 구현예에서, 신경아교세포는 별아교세포이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 CBA 프로모터, 최소 CBA 프로모터, CMV 프로모터 또는 GUSB 프로모터이다. 다른 구현예에서, 프로모터는 유도성이다. 추가의 구현예에서, rAAV 벡터는 인핸서, 스플라이스 공여체/스플라이스 수용체 쌍, 매트릭스 부착 부위 또는 폴리아데닐화 신호 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터는 자기 상보성 rAAV 벡터이다. 일부 구현예에서, 벡터는 이종성 핵산을 인코딩하는 제1 핵산 서열과 이종성 핵산의 상보체를 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하며, 여기서 제1 핵산 서열은 그 길이의 대부분 또는 전부에 걸쳐 제2 핵산 서열과 가닥내 염기쌍을 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 제1핵산 서열과 제2 핵산 서열은 돌연변이된 AAV ITR에 의해 연결되어 있으며, 여기서 돌연변이된 AAV ITR은 D 영역의 결실을 포함하고, 말단 분해 서열(terminal resolution sequence)의 돌연변이를 포함한다.
상기 양태와 구현예의 일부 구현예에서, 이종성 핵산은 치료용 폴리펩티드 또는 치료용 핵산을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 이종성 핵산은 치료용 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 치료용 폴리펩티드는 효소, 신경영양 인자, CNS 관련 장애가 있는 개체에서 결핍되거나 돌연변이된 폴리펩티드, 항산화제, 항-아폽토시스 인자, 항-혈관신생 인자, 및 항-염증 인자, 알파-시뉴클레인(alpha-synuclein), 산 베타-글루코시다제(GBA), 베타-갈락토시다제-1(GLB1), 이두로네이트 2-설파타제(IDS), 갈락토실세라미다제(GALC), a 만노시다제, 알파-D-만노시다제(MAN2B1), 베타-만노시다제(MANBA), 슈도아릴설파타제 A(ARSA), N-아세틸글루코사민-1-포스포트랜스퍼라제(GNPTAB), 산 스핑고미엘리나제(ASM), 니만-픽(Niemann-Pick) C 단백질(NPC1), 산 알파-1,4-글루코시다제(GAA), 헥소사미니다제 베타 서브유닛, HEXB, N-설포글루코사민 설포하이드롤라제(MPS3A), N-알파-아세틸글루코사미니다제(NAGLU), 헤파린 아세틸-CoA, 알파-글루코사미니다제 N-아세틸트랜스퍼라제(MPS3C), N-아세틸글루코사민-6-설파타제(GNS), 알파-N-아세틸갈락토사미니다제(NAGA), 베타-글루쿠로니다제(GUSB), 헥소사미니다제 알파 서브유닛(HEXA), 헌팅틴(HTT), 리소좀 산 리파제(LIPA), 아스파르틸글루코사미니다제, 알파-갈락토시다제 A, 팔미토일 단백질 티오에스터라제, 트리펩티딜 펩티다제, 리소좀 막횡단 단백질, 시스테인 수송체(Cysteine transporter), 산 세라미다제, 산 알파-L-푸코시다제, 카텝신 A, 알파-L-이두로니다제, 아릴설파타제 B, 아릴설파타제 A, N-아세틸갈락토사민-6-설페이트, 산 베타-갈락토시다제, 또는 알파-뉴라미다제이다. 다른 구현예에서, 이종성 핵산은 치료용 핵산을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 치료용 핵산은 siRNA, shRNA, RNAi, miRNA, 안티센스 RNA, 리보자임 또는 DNA자임(DNAzyme)이다. 일부 구현예에서, 치료용 폴리펩티드 또는 치료용 핵산은 CNS 장애를 치료하는데 사용된다.
상기 양태과 구현예의 일부 구현예에서, CNS 장애는 리소좀 축적병(LSD), 헌팅톤병, 간질, 파킨슨병, 알츠하이머병, 뇌졸중, 피질기저핵 변성(CBD), 피질기저핵 신경절 변성(CBGD), 전두측두엽 치매(FTD), 다계통 위축증(MSA), 진행성 핵상 마비(PSP) 또는 뇌암이다. 일부 구현예에서, 장애는 아스파르틸글루소아미뉴리아(Aspartylglusoaminuria), 파브리병(Fabry), 영아 배튼병(CNL1), 전형적 후기 영아 배튼병(CNL2), 소아 배튼병(CNL3), 배튼병 형태 CNL4, 배튼병 형태 CNL5, 배튼병 형태 CNL6, 배튼병 형태 CNL7, 배튼병 형태 CNL8, 시스틴증, 파아버병(Farber), 푸코시드축적증(Fucosidosis), 갈락토시도시알산증(Galactosidosialidosis), 1형 고셔병, 2형 고셔병, 3형 고셔병, GM1 강글리오시드증, 헌터병, 크라베병, α 만노시드증병, β 만노시드증병, 마로토-라미병(Maroteaux-Lamy), 이염성 백질이영양증병, 모르퀴오병(Morquio) A, 모르퀴오병 B, 점액지질증 II/III 질병, 니만-픽 A 질병, 니만-픽 B 질병, 니만-픽 C 질병, 폼페병, 샌드호프병, 센필리포(Sanfillipo) A 질병, 센필리포 B 질병, 센필리포 C 질병, 센필리포 D 질병, 쉰들러병, 쉰들러-칸자키병(Schindler-Kanzaki), 시알산증, 슬라이병(Sly disease), 테이-삭스병(Tay-Sachs disease) 및 월만병(Wolman disease)으로 구성된 군으로부터 선택된 리소좀 축적병이다.
상기 양태와 구현예의 일부 구현예에서, rAAV 입자는 조성물로 존재한다. 추가의 구현예에서, 조성물은 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물이다.
상기 양태와 구현예의 일부 구현예에서, rAAV 입자는 숙주 세포 내로의, rAAV 벡터를 인코딩하는 핵산, AAV rep 및 cap를 인코딩하는 핵산, 및 AAV 헬퍼 바이러스 기능을 인코딩하는 핵산의 삼중 트랜스펙션에 의해 생성되었으며, 여기서 숙주 세포로의 핵산의 트랜스펙션은 rAAV 입자를 생성할 수 있는 숙주 세포를 발생시킨다. 다른 구현예에서, rAAV 입자는 rAAV 벡터를 인코딩하는 핵산, AAV rep 및 cap를 인코딩하는 핵산, 및 AAV 헬퍼 바이러스 기능을 인코딩하는 핵산 중 하나 이상을 포함하는 생산 세포주(producer cell line)에 의해 생성되었다.
상기 양태와 구현예의 일부 구현예에서, rAAV 입자는 정위(stereotactic) 전달에 의해 전달된다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 대류 강화 전달에 의해 전달된다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 CED 전달 시스템을 이용하여 전달된다. 일부 구현예에서, CED 시스템은 캐뉼러를 포함한다. 일부 구현예에서, 캐뉼러는 역류 저항 캐뉼러 또는 단계식(stepped) 캐뉼러이다. 일부 구현예에서, CED 시스템은 펌프를 포함한다. 일부 구현예에서, 펌프는 수동 펌프이다. 일부 구현예에서, 펌프는 삼투 펌프이다. 일부 구현예에서, 펌프는 주입 펌프이다.
일부 양태에서, 본 발명은 rAAV 입자를 포함하는 조성물을 CED에 의해 선조체에 투여하는 단계를 포함하여 rAAV 입자를 포유동물의 중추 신경계에 전달하는 방법을 제공하며, 여기서 조성물은 1 ㎕/분 초과 내지 약 5 ㎕/분의 속도로 선조체에 투여된다. 일부 양태에서, 본 발명은 rAAV 입자를 포함하는 조성물을 CED에 의해 선조체에 투여하는 단계를 포함하여 rAAV 입자를 포유동물의 중추 신경계에 전달하는 방법을 제공하며, 여기서 조성물은 rAAV 입자와 폴록사머를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴록사머는 폴록사머 188이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 폴록사머의 농도는 약 0.0001% 내지 약 0.01%의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 폴록사머의 농도는 약 0.001%이다. 일부 구현예에서, 조성물은 염화나트륨을 추가로 포함하며, 여기서 조성물 중 염화나트륨의 농도는 약 100 mM 내지 약 250 mM의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물 중 염화나트륨의 농도는 약 180 mM이다. 일부 구현예에서, 조성물은 인산나트륨을 포함하며, 여기서 조성물 중 인산나트륨의 농도는 약 5 mM 내지 약 20 mM의 범위이고, pH는 약 7.0 내지 약 8.0이다. 일부 구현예에서, 조성물은 인산나트륨을 추가로 포함하며, 여기서 조성물 중 인산나트륨의 농도는 약 10 mM이고, pH는 약 7.5이다. 일부 구현예에서, 조성물은 1 ㎕/분 초과 내지 약 5 ㎕/분의 속도로 꼬리핵과 피각에 투여된다. 일부 구현예에서, 피각에 전달되는 조성물의 양은 꼬리핵에 전달되는 부피의 약 2배이다. 일부 구현예에서, 약 20 ㎕ 내지 약 50 ㎕의 조성물이 각 반구의 꼬리핵에 투여되고, 약 40 ㎕ 내지 약 100 ㎕의 조성물이 각 반구의 피각에 투여된다. 일부 구현예에서, 약 30 ㎕의 조성물이 각 반구의 꼬리핵에 투여되고, 약 60 ㎕의 조성물이 각 반구의 피각에 투여된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 상기 기재된 방법에 의해 유효량의 rAAV 입자를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하여 포유동물의 CNS 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
일부 양태에서, 본 발명은 유효량의 rAAV 입자를 선조체에 투여하는 단계를 포함하여 포유동물의 헌팅톤병을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 rAAV 입자는 포유동물의 적어도 대뇌 피질과 선조체에서 발현되는 이종성 핵산을 인코딩하는 rAAV 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 AAV1 캡시드 또는 AAV2 캡시드를 포함한다. 다른 양태에서, 본 발명은 유효량의 rAAV 입자를 선조체에 투여하는 단계를 포함하여 포유동물의 파킨슨병을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 rAAV 입자는 포유동물의 적어도 대뇌 피질과 선조체에서 발현되는 이종성 핵산을 인코딩하는 rAAV 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 AAV2 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, 포유동물은 인간이다.
일부 구현예에서, rAAV 입자는 선조체의 적어도 피각과 꼬리핵에 투여된다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 선조체의 각 반구의 적어도 피각과 꼬리핵에 투여된다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 꼬리핵의 적어도 1개 부위 및 피각의 2개 부위에 투여된다. 일부 구현예에서, 피각에 투여되는 rAAV 입자 대 꼬리핵에 투여되는 rAAV 입자의 비는 적어도 약 2:1이다. 일부 구현예에서, 이종성 핵산은 포유동물의 적어도 전두 피질, 후두 피질 및/또는 IV층에서 발현된다. 일부 구현예에서, 이종성 핵산은 적어도 전전두 연합 피질 영역, 전운동 피질, 1차 체성감각 피질 영역, 감각 운동 피질, 두정 피질, 후두 피질 및/또는 1차 운동 피질에서 발현된다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 대뇌 피질에서 역행 또는 순행 수송된다. 일부 구현예에서, 이종성 핵산은 시상, 시상 하부 핵, 창백핵, 흑색질 및/또는 해마에서 추가로 발현된다.
상기 양태와 구현예의 일부 구현예에서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV V708K, 염소 AAV, AAV1/AAV2 키메라, 소 AAV, 또는 마우스 AAV 캡시드 rAAV2/HBoV1 혈청형 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 혈청형은 AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10 또는 AAVrh10이다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터는 하나 이상의 AAV 역위 말단 반복부(ITR) 서열에 의해 플랭킹된 이종성 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 이종성 핵산은 2개의 AAV ITR에 의해 플랭킹되어 있다. 일부 구현예에서, AAV ITR은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, 염소 AAV, 소 AAV, 또는 마우스 AAV 혈청형 ITR이다. 일부 구현예에서, AAV ITR은 AAV2 ITR이다. 일부 구현예에서, rAAV 입자의 ITR과 캡시드는 동일한 AAV 혈청형으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, ITR과 캡시드는 AAV2로부터 유래된다. 다른 구현예에서, rAAV 바이러스 입자의 ITR과 캡시드는 상이한 AAV 혈청형으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, ITR은 AAV2로부터 유래되고, 캡시드는 AAV1로부터 유래된다.
상기 양태과 구현예의 일부 구현예에서, 이종성 핵산은 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 CNS의 세포에서 이종성 핵산을 발현시킨다. 일부 구현예에서, 프로모터는 뇌 세포에서 이종성 핵산을 발현시킨다. 일부 구현예에서, 프로모터는 신경세포 및/또는 신경아교세포에서 이종성 핵산을 발현시킨다. 일부 구현예에서, 신경세포는 꼬리핵의 중형 가시 신경세포, 피각의 중형 가시 신경세포, 피질 IV층의 신경세포 및/또는 피질 V층의 신경세포이다. 일부 구현예에서, 신경아교세포는 별아교세포이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 CBA 프로모터, 최소 CBA 프로모터, CMV 프로모터 또는 GUSB 프로모터이다. 다른 구현예에서, 프로모터는 유도성이다. 추가의 구현예에서, rAAV 벡터는 인핸서, 스플라이스 공여체/스플라이스 수용체 쌍, 매트릭스 부착 부위 또는 폴리아데닐화 신호 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터는 자기 상보성 rAAV 벡터이다. 일부 구현예에서, 벡터는 이종성 핵산을 인코딩하는 제1 핵산 서열과 이종성 핵산의 상보체를 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하며, 여기서 제1 핵산 서열은 그 길이의 대부분 또는 전부에 걸쳐 제2 핵산 서열과 가닥내 염기쌍을 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 제1핵산 서열과 제2 핵산 서열은 돌연변이된 AAV ITR에 의해 연결되어 있으며, 여기서 돌연변이된 AAV ITR은 D 영역의 결실을 포함하고, 말단 분해 서열의 돌연변이를 포함한다.
상기 양태와 구현예의 일부 구현예에서, 이종성 핵산은 치료용 폴리펩티드 또는 치료용 핵산을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 치료용 폴리펩티드 또는 치료용 핵산은 헌팅톤병에 걸린 포유동물의 CNS의 세포에서 HTT의 발현을 저해하거나 HTT의 축적을 저해한다. 일부 구현예에서, 이종성 핵산은 siRNA, shRNA, RNAi, miRNA, 안티센스 RNA, 리보자임 또는 DNA자임을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 이종성 핵산은 헌팅틴을 표적화하는 miRNA를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 헌팅틴은 헌팅톤병과 관련된 돌연변이를 포함한다.
상기 양태와 구현예의 일부 구현예에서, 이종성 핵산은 헌팅톤병을 치료하기 위한 치료용 폴리펩티드 또는 치료용 핵산을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 치료용 폴리펩티드 또는 치료용 핵산은 헌팅톤병에 걸린 포유동물의 CNS의 세포에서 HTT의 발현을 저해하거나 HTT의 축적을 저해한다. 일부 구현예에서, 이종성 핵산은 siRNA, shRNA, RNAi, miRNA, 안티센스 RNA, 리보자임 또는 DNA자임을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 이종성 핵산은 헌팅틴을 표적화하는 miRNA를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 헌팅틴은 헌팅톤병과 관련된 돌연변이를 포함한다.
상기 양태와 구현예의 일부 구현예에서, 이종성 핵산은 파킨슨병을 치료하기 위한 치료용 폴리펩티드 또는 치료용 핵산을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 치료용 폴리펩티드는 신경아교세포 유래 성장 인자(GDNF), 뇌 유래 성장 인자(BDNF), 티로신 하이드록실라제(TH), GTP-사이클로하이드롤라제(GTPCH) 및/또는 아미노산 데카르복실라제(AADC)이다.
상기 양태와 구현예의 일부 구현예에서, rAAV 입자는 조성물로 존재한다. 추가의 구현예에서, 조성물은 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물이다.
상기 양태와 구현예의 일부 구현예에서, rAAV 입자는 숙주 세포 내로의, rAAV 벡터를 인코딩하는 핵산, AAV rep 및 cap를 인코딩하는 핵산, 및 AAV 헬퍼 바이러스 기능을 인코딩하는 핵산의 삼중 트랜스펙션에 의해 생성되었으며, 여기서 숙주 세포로의 핵산의 트랜스펙션은 rAAV 입자를 생성할 수 있는 숙주 세포를 발생시킨다. 다른 구현예에서, rAAV 입자는 rAAV 벡터를 인코딩하는 핵산, AAV rep 및 cap를 인코딩하는 핵산, 및 AAV 헬퍼 바이러스 기능을 인코딩하는 핵산 중 하나 이상을 포함하는 생산 세포주에 의해 생성되었다.
상기 양태와 구현예의 일부 구현예에서, rAAV 입자는 정위 전달에 의해 전달된다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 대류 강화 전달에 의해 전달된다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 CED 전달 시스템을 이용하여 전달된다. 일부 구현예에서, CED 시스템은 캐뉼러를 포함한다. 일부 구현예에서, 캐뉼러는 역류 저항 캐뉼러 또는 단계식 캐뉼러이다. 일부 구현예에서, CED 시스템은 펌프를 포함한다. 일부 구현예에서, 펌프는 수동 펌프이다. 일부 구현예에서, 펌프는 삼투 펌프이다. 일부 구현예에서, 펌프는 주입 펌프이다.
일부 양태에서, 본 발명은 a) rAAV 입자를 포함하는 조성물(여기서, rAAV 입자는 이종성 핵산을 인코딩하는 rAAV 벡터를 포함함); 및 b) 선조체로의 rAAV 입자의 전달을 위한 장치를 포함하는, 포유동물의 대뇌 피질과 선조체에서의 이종성 핵산의 발현을 위한 시스템을 제공한다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 AAV1 캡시드 또는 AAV2 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, 포유동물은 인간이다.
본 발명의 시스템의 일부 구현예에서, rAAV 입자는 선조체의 피각과 꼬리핵에 투여된다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 꼬리핵의 적어도 1개 부위 및 피각의 2개 부위에 투여된다. 일부 구현예에서, 피각에 투여되는 rAAV 입자 대 꼬리핵에 투여되는 rAAV 입자의 비는 적어도 약 2:1이다. 일부 구현예에서, 이종성 핵산은 포유동물의 적어도 전두 피질, 후두 피질 및/또는 IV층에서 발현된다. 일부 구현예에서, 이종성 핵산은 적어도 전전두 연합 피질 영역, 전운동 피질, 1차 체성감각 피질 영역, 감각 운동 피질, 두정 피질, 후두 피질 및/또는 1차 운동 피질에서 발현된다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 대뇌 피질에서 역행 또는 순행 수송된다. 일부 구현예에서, 이종성 핵산은 시상, 시상 하부 핵, 창백핵, 흑색질 및/또는 해마에서 추가로 발현된다.
본 발명의 시스템의 일부 구현예에서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV V708K, 염소 AAV, AAV1/AAV2 키메라, 소 AAV, 또는 마우스 AAV 캡시드 rAAV2/HBoV1 혈청형 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 혈청형은 AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10 또는 AAVrh10이다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터는 하나 이상의 AAV 역위 말단 반복부(ITR) 서열에 의해 플랭킹된 이종성 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 이종성 핵산은 2개의 AAV ITR에 의해 플랭킹되어 있다. 일부 구현예에서, AAV ITR은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, 염소 AAV, 소 AAV, 또는 마우스 AAV 혈청형 ITR이다. 일부 구현예에서, AAV ITR은 AAV2 ITR이다. 일부 구현예에서, rAAV 입자의 ITR과 캡시드는 동일한 AAV 혈청형으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, ITR과 캡시드는 AAV2로부터 유래된다. 다른 구현예에서, rAAV 바이러스 입자의 ITR과 캡시드는 상이한 AAV 혈청형으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, ITR은 AAV2로부터 유래되고, 캡시드는 AAV1로부터 유래된다.
본 발명의 시스템의 일부 구현예에서, 이종성 핵산은 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 CNS의 세포에서 이종성 핵산을 발현시킨다. 일부 구현예에서, 프로모터는 뇌 세포에서 이종성 핵산을 발현시킨다. 일부 구현예에서, 프로모터는 신경세포 및/또는 신경아교세포에서 이종성 핵산을 발현시킨다. 일부 구현예에서, 신경세포는 꼬리핵의 중형 가시 신경세포, 피각의 중형 가시 신경세포, 피질 IV층의 신경세포 및/또는 피질 V층의 신경세포이다. 일부 구현예에서, 신경아교세포는 별아교세포이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 CBA 프로모터, 최소 CBA 프로모터, CMV 프로모터 또는 GUSB 프로모터이다. 다른 구현예에서, 프로모터는 유도성이다. 추가의 구현예에서, rAAV 벡터는 인핸서, 스플라이스 공여체/스플라이스 수용체 쌍, 매트릭스 부착 부위 또는 폴리아데닐화 신호 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터는 자기 상보성 rAAV 벡터이다. 일부 구현예에서, 벡터는 이종성 핵산을 인코딩하는 제1 핵산 서열과 이종성 핵산의 상보체를 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하며, 여기서 제1 핵산 서열은 그 길이의 대부분 또는 전부에 걸쳐 제2 핵산 서열과 가닥내 염기쌍을 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 제1핵산 서열과 제2 핵산 서열은 돌연변이된 AAV ITR에 의해 연결되어 있으며, 여기서 돌연변이된 AAV ITR은 D 영역의 결실을 포함하고, 말단 분해 서열의 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 시스템의 일부 구현예에서, 이종성 핵산은 치료용 폴리펩티드 또는 치료용 핵산을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 이종성 핵산은 치료용 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 치료용 폴리펩티드는 효소, 신경영양 인자, CNS 관련 장애가 있는 개체에서 결핍되거나 돌연변이된 폴리펩티드, 항산화제, 항-아폽토시스 인자, 항-혈관신생 인자, 및 항-염증 인자, 알파-시뉴클레인, 산 베타-글루코시다제(GBA), 베타-갈락토시다제-1(GLB1), 이두로네이트 2-설파타제(IDS), 갈락토실세라미다제(GALC), a 만노시다제, 알파-D-만노시다제(MAN2B1), 베타-만노시다제(MANBA), 슈도아릴설파타제 A(ARSA), N-아세틸글루코사민-1-포스포트랜스퍼라제(GNPTAB), 산 스핑고미엘리나제(ASM), 니만-픽 C 단백질(NPC1), 산 알파-1,4-글루코시다제(GAA), 헥소사미니다제 베타 서브유닛, HEXB, N-설포글루코사민 설포하이드롤라제(MPS3A), N-알파-아세틸글루코사미니다제(NAGLU), 헤파린 아세틸-CoA, 알파-글루코사미니다제 N-아세틸트랜스퍼라제(MPS3C), N-아세틸글루코사민-6-설파타제(GNS), 알파-N-아세틸갈락토사미니다제(NAGA), 베타-글루쿠로니다제(GUSB), 헥소사미니다제 알파 서브유닛(HEXA), 헌팅틴(HTT), 리소좀 산 리파제(LIPA), 아스파르틸글루코사미니다제, 알파-갈락토시다제 A, 팔미토일 단백질 티오에스터라제, 트리펩티딜 펩티다제, 리소좀 막횡단 단백질, 시스테인 수송체, 산 세라미다제, 산 알파-L-푸코시다제, 카텝신 A, 알파-L-이두로니다제, 아릴설파타제 B, 아릴설파타제 A, N-아세틸갈락토사민-6-설페이트, 산 베타-갈락토시다제, 또는 알파-뉴라미다제이다. 다른 구현예에서, 이종성 핵산은 치료용 핵산을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 치료용 핵산은 siRNA, shRNA, RNAi, miRNA, 안티센스 RNA, 리보자임 또는 DNA자임이다. 일부 구현예에서, 치료용 폴리펩티드 또는 치료용 핵산은 CNS 장애를 치료하는데 사용된다.
본 발명의 시스템의 일부 구현예에서, CNS 장애는 리소좀 축적병(LSD), 헌팅톤병, 간질, 파킨슨병, 알츠하이머병, 뇌졸중, 피질기저핵 변성(CBD), 피질기저핵 신경절 변성(CBGD), 전두측두엽 치매(FTD), 다계통 위축증(MSA), 진행성 핵상 마비(PSP) 또는 뇌암이다. 일부 구현예에서, 장애는 아스파르틸글루소아미뉴리아, 파브리병, 영아 배튼병(CNL1), 전형적 후기 영아 배튼병(CNL2), 소아 배튼병(CNL3), 배튼병 형태 CNL4, 배튼병 형태 CNL5, 배튼병 형태 CNL6, 배튼병 형태 CNL7, 배튼병 형태 CNL8, 시스틴증, 파아버병, 푸코시드축적증, 갈락토시도시알산증, 1형 고셔병, 2형 고셔병, 3형 고셔병, GM1 강글리오시드증, 헌터병, 크라베병, α 만노시드증병, β 만노시드증병, 마로토-라미병, 이염성 백질이영양증병, 모르퀴오병 A, 모르퀴오병 B, 점액지질증 II/III 질병, 니만-픽 A 질병, 니만-픽 B 질병, 니만-픽 C 질병, 폼페병, 샌드호프병, 센필리포 A 질병, 센필리포 B 질병, 센필리포 C 질병, 센필리포 D 질병, 쉰들러병, 쉰들러-칸자키병, 시알산증, 슬라이병, 테이-삭스병 및 월만병으로 구성된 군으로부터 선택된 리소좀 축적병이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 rAAV는 헌팅톤병을 치료하기 위한 치료용 폴리펩티드 또는 치료용 핵산을 인코딩하는 이종성 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 치료용 폴리펩티드 또는 치료용 핵산은 헌팅톤병에 걸린 포유동물의 CNS의 세포에서 HTT의 발현을 저해하거나 HTT의 축적을 저해한다. 일부 구현예에서, 이종성 핵산은 siRNA, shRNA, RNAi, miRNA, 안티센스 RNA, 리보자임 또는 DNA자임을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 이종성 핵산은 헌팅틴을 표적화하는 miRNA를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 헌팅틴은 헌팅톤병과 관련된 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 rAAV 입자는 파킨슨병을 치료하기 위한 치료용 폴리펩티드 또는 치료용 핵산을 인코딩하는 이종성 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 치료용 폴리펩티드는 신경아교세포 유래 성장 인자(GDNF), 뇌 유래 성장 인자(BDNF), 티로신 하이드록실라제(TH), GTP-사이클로하이드롤라제(GTPCH) 및/또는 아미노산 데카르복실라제(AADC)이다.
본 발명의 시스템의 일부 구현예에서, rAAV 입자는 조성물로 존재한다. 추가의 구현예에서, 조성물은 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물이다.
본 발명의 시스템의 일부 구현예에서, rAAV 입자는 숙주 세포 내로의, rAAV 벡터를 인코딩하는 핵산, AAV rep 및 cap를 인코딩하는 핵산, 및 AAV 헬퍼 바이러스 기능을 인코딩하는 핵산의 삼중 트랜스펙션에 의해 생성되었으며, 여기서 숙주 세포로의 핵산의 트랜스펙션은 rAAV 입자를 생성할 수 있는 숙주 세포를 발생시킨다. 다른 구현예에서, rAAV 입자는 rAAV 벡터를 인코딩하는 핵산, AAV rep 및 cap를 인코딩하는 핵산, 및 AAV 헬퍼 바이러스 기능을 인코딩하는 핵산 중 하나 이상을 포함하는 생산 세포주에 의해 생성되었다.
본 발명의 시스템의 일부 구현예에서, rAAV 입자는 정위 전달에 의해 전달된다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 대류 강화 전달에 의해 전달된다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 CED 전달 시스템을 이용하여 전달된다. 일부 구현예에서, CED 시스템은 캐뉼러를 포함한다. 일부 구현예에서, 캐뉼러는 역류 저항 캐뉼러 또는 단계식 캐뉼러이다. 일부 구현예에서, CED 시스템은 펌프를 포함한다. 일부 구현예에서, 펌프는 수동 펌프이다. 일부 구현예에서, 펌프는 삼투 펌프이다. 일부 구현예에서, 펌프는 주입 펌프이다.
일부 양태에서, 본 발명은 상기 기재된 임의의 방법에 사용하기 위한 키트를 제공하며, 여기서 키트는 rAAV 입자를 포함하고, rAAV 입자는 포유동물의 적어도 대뇌 피질과 선조체에서 발현되는 이종성 핵산을 인코딩하는 rAAV 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 AAV 혈청형 1(AAV1) 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 AAV 혈청형 2(AAV2) 캡시드를 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명은 유효량의 rAAV 입자를 포함하는 조성물을 포함하는, 포유동물의 헌팅톤병을 치료하기 위한 키트를 제공하며, 여기서 rAAV 입자는 포유동물의 적어도 대뇌 피질과 선조체에서 발현되는 이종성 핵산을 인코딩하는 rAAV 벡터를 포함한다. 일부 양태에서, 본 발명은 유효량의 rAAV 입자를 포함하는 조성물을 포함하는, 포유동물의 파킨슨병을 치료하기 위한 키트를 제공하며, 여기서 rAAV 입자는 포유동물의 적어도 대뇌 피질과 선조체에서 발현되는 이종성 핵산을 인코딩하는 rAAV 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트의 rAAV 입자는 AAV 혈청형 1(AAV1) 캡시드 또는 AAV 혈청형 2(AAV2) 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 선조체로의 rAAV 입자의 전달을 위한 장치를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 키트의 rAAV 입자는 조성물로 존재한다. 일부 구현예에서, 조성물은 완충제 및/또는 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함한다. 추가의 구현예에서, 키트는 선조체로의 rAAV 입자의 조성물의 전달을 위한 설명서를 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명은 상기 기재된 임의의 방법에 사용하기 위한 rAAV 입자를 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV) 입자를 포유동물의 중추 신경계에 전달하는데 사용하기 위한 rAAV 입자를 제공하며, 여기서 rAAV 입자는 포유동물의 적어도 대뇌 피질과 선조체에서 발현되는 이종성 핵산을 인코딩하는 rAAV 벡터를 포함한다. 일부 양태에서, 본 발명은 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV) 입자를 포유동물의 중추 신경계에 전달하는데 사용하기 위한 rAAV 입자를 제공하며, 여기서 rAAV 입자는 포유동물의 적어도 대뇌 피질과 선조체에서 발현되는 이종성 핵산을 인코딩하는 rAAV 벡터를 포함하고, rAAV 입자는 AAV 혈청형 1(AAV1) 캡시드를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 본 발명은 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV) 입자를 포유동물의 중추 신경계에 전달하는데 사용하기 위한 rAAV 입자를 제공하며, 여기서 rAAV 입자는 포유동물의 적어도 대뇌 피질과 선조체에서 발현되는 이종성 핵산을 인코딩하는 rAAV 벡터를 포함하고, rAAV 입자는 AAV 혈청형 1(AAV2) 캡시드를 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명은 포유동물의 헌팅톤병을 치료하는데 사용하기 위한 rAAV 입자를 제공하며, 여기서 rAAV 입자는 포유동물의 적어도 대뇌 피질과 선조체에서 발현되는 이종성 핵산을 인코딩하는 rAAV 벡터를 포함한다. 일부 양태에서, 본 발명은 포유동물의 파킨슨병을 치료하는데 사용하기 위한 rAAV 입자를 제공하며, 여기서 rAAV 입자는 포유동물의 적어도 대뇌 피질과 선조체에서 발현되는 이종성 핵산을 인코딩하는 rAAV 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 AAV2 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, 포유동물은 인간이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 rAAV 입자는 선조체의 적어도 피각과 꼬리핵에 투여된다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 선조체의 각 반구의 적어도 피각과 꼬리핵에 투여된다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 꼬리핵의 적어도 1개 부위 및 피각의 2개 부위에 투여된다. 일부 구현예에서, 피각에 투여되는 rAAV 입자 대 꼬리핵에 투여되는 rAAV 입자의 비는 적어도 약 2:1이다. 일부 구현예에서, 이종성 핵산은 포유동물의 적어도 전두 피질, 후두 피질 및/또는 IV층에서 발현된다. 일부 구현예에서, 이종성 핵산은 적어도 전전두 연합 피질 영역, 전운동 피질, 1차 체성감각 피질 영역, 감각 운동 피질, 두정 피질, 후두 피질 및/또는 1차 운동 피질에서 발현된다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 대뇌 피질에서 역행 또는 순행 수송된다. 일부 구현예에서, 이종성 핵산은 시상, 시상 하부 핵, 창백핵, 흑색질 및/또는 해마에서 추가로 발현된다.
상기 양태와 구현예의 일부 구현예에서, 본 발명의 rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV V708K, 염소 AAV, AAV1/AAV2 키메라, 소 AAV, 또는 마우스 AAV 캡시드 rAAV2/HBoV1 혈청형 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 혈청형은 AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10 또는 AAVrh10이다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터는 하나 이상의 AAV 역위 말단 반복부(ITR) 서열에 의해 플랭킹된 이종성 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 이종성 핵산은 2개의 AAV ITR에 의해 플랭킹되어 있다. 일부 구현예에서, AAV ITR은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, 염소 AAV, 소 AAV, 또는 마우스 AAV 혈청형 ITR이다. 일부 구현예에서, AAV ITR은 AAV2 ITR이다. 일부 구현예에서, rAAV 입자의 ITR과 캡시드는 동일한 AAV 혈청형으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, ITR과 캡시드는 AAV2로부터 유래된다. 다른 구현예에서, rAAV 바이러스 입자의 ITR과 캡시드는 상이한 AAV 혈청형으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, ITR은 AAV2로부터 유래되고, 캡시드는 AAV1로부터 유래된다.
상기 양태와 구현예의 일부 구현예에서, 이종성 핵산은 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 CNS의 세포에서 이종성 핵산을 발현시킨다. 일부 구현예에서, 프로모터는 뇌 세포에서 이종성 핵산을 발현시킨다. 일부 구현예에서, 프로모터는 신경세포 및/또는 신경아교세포에서 이종성 핵산을 발현시킨다. 일부 구현예에서, 신경세포는 꼬리핵의 중형 가시 신경세포, 피각의 중형 가시 신경세포, 피질 IV층의 신경세포 및/또는 피질 V층의 신경세포이다. 일부 구현예에서, 신경아교세포는 별아교세포이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 CBA 프로모터, 최소 CBA 프로모터, CMV 프로모터 또는 GUSB 프로모터이다. 다른 구현예에서, 프로모터는 유도성이다. 추가의 구현예에서, rAAV 벡터는 인핸서, 스플라이스 공여체/스플라이스 수용체 쌍, 매트릭스 부착 부위 또는 폴리아데닐화 신호 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터는 자기 상보성 rAAV 벡터이다. 일부 구현예에서, 벡터는 이종성 핵산을 인코딩하는 제1 핵산 서열과 이종성 핵산의 상보체를 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하며, 여기서 제1 핵산 서열은 그 길이의 대부분 또는 전부에 걸쳐 제2 핵산 서열과 가닥내 염기쌍을 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 제1핵산 서열과 제2 핵산 서열은 돌연변이된 AAV ITR에 의해 연결되어 있으며, 여기서 돌연변이된 AAV ITR은 D 영역의 결실을 포함하고, 말단 분해 서열의 돌연변이를 포함한다.
상기 양태와 구현예의 일부 구현예에서, 이종성 핵산은 치료용 폴리펩티드 또는 치료용 핵산을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 이종성 핵산은 치료용 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 치료용 폴리펩티드는 효소, 신경영양 인자, CNS 관련 장애가 있는 개체에서 결핍되거나 돌연변이된 폴리펩티드, 항산화제, 항-아폽토시스 인자, 항-혈관신생 인자, 및 항-염증 인자, 알파-시뉴클레인, 산 베타-글루코시다제(GBA), 베타-갈락토시다제-1(GLB1), 이두로네이트 2-설파타제(IDS), 갈락토실세라미다제(GALC), a 만노시다제, 알파-D-만노시다제(MAN2B1), 베타-만노시다제(MANBA), 슈도아릴설파타제 A(ARSA), N-아세틸글루코사민-1-포스포트랜스퍼라제(GNPTAB), 산 스핑고미엘리나제(ASM), 니만-픽 C 단백질(NPC1), 산 알파-1,4-글루코시다제(GAA), 헥소사미니다제 베타 서브유닛, HEXB, N-설포글루코사민 설포하이드롤라제(MPS3A), N-알파-아세틸글루코사미니다제(NAGLU), 헤파린 아세틸-CoA, 알파-글루코사미니다제 N-아세틸트랜스퍼라제(MPS3C), N-아세틸글루코사민-6-설파타제(GNS), 알파-N-아세틸갈락토사미니다제(NAGA), 베타-글루쿠로니다제(GUSB), 헥소사미니다제 알파 서브유닛(HEXA), 헌팅틴(HTT), 리소좀 산 리파제(LIPA), 아스파르틸글루코사미니다제, 알파-갈락토시다제 A, 팔미토일 단백질 티오에스터라제, 트리펩티딜 펩티다제, 리소좀 막횡단 단백질, 시스테인 수송체, 산 세라미다제, 산 알파-L-푸코시다제, 카텝신 A, 알파-L-이두로니다제, 아릴설파타제 B, 아릴설파타제 A, N-아세틸갈락토사민-6-설페이트, 산 베타-갈락토시다제, 또는 알파-뉴라미다제이다. 다른 구현예에서, 이종성 핵산은 치료용 핵산을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 치료용 핵산은 siRNA, shRNA, RNAi, miRNA, 안티센스 RNA, 리보자임 또는 DNA자임이다. 일부 구현예에서, 치료용 폴리펩티드 또는 치료용 핵산은 CNS 장애를 치료하는데 사용된다.
상기 양태와 구현예의 일부 구현예에서, CNS 장애는 리소좀 축적병(LSD), 헌팅톤병, 간질, 파킨슨병, 알츠하이머병, 뇌졸중, 피질기저핵 변성(CBD), 피질기저핵 신경절 변성(CBGD), 전두측두엽 치매(FTD), 다계통 위축증(MSA), 진행성 핵상 마비(PSP) 또는 뇌암이다. 일부 구현예에서, 장애는 아스파르틸글루소아미뉴리아, 파브리병, 영아 배튼병(CNL1), 전형적 후기 영아 배튼병(CNL2), 소아 배튼병(CNL3), 배튼병 형태 CNL4, 배튼병 형태 CNL5, 배튼병 형태 CNL6, 배튼병 형태 CNL7, 배튼병 형태 CNL8, 시스틴증, 파아버병, 푸코시드축적증, 갈락토시도시알산증, 1형 고셔병, 2형 고셔병, 3형 고셔병, GM1 강글리오시드증, 헌터병, 크라베병, α 만노시드증병, β 만노시드증병, 마로토-라미병, 이염성 백질이영양증병, 모르퀴오병 A, 모르퀴오병 B, 점액지질증 II/III 질병, 니만-픽 A 질병, 니만-픽 B 질병, 니만-픽 C 질병, 폼페병, 샌드호프병, 센필리포 A 질병, 센필리포 B 질병, 센필리포 C 질병, 센필리포 D 질병, 쉰들러병, 쉰들러-칸자키병, 시알산증, 슬라이병, 테이-삭스병 및 월만병으로 구성된 군으로부터 선택된 리소좀 축적병이다.
상기 양태와 구현예의 일부 구현예에서, rAAV 입자는 조성물로 존재한다. 추가의 구현예에서, 조성물은 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물이다.
상기 양태와 구현예의 일부 구현예에서, rAAV 입자는 숙주 세포 내로의, rAAV 벡터를 인코딩하는 핵산, AAV rep 및 cap를 인코딩하는 핵산, 및 AAV 헬퍼 바이러스 기능을 인코딩하는 핵산의 삼중 트랜스펙션에 의해 생성되었으며, 여기서 숙주 세포로의 핵산의 트랜스펙션은 rAAV 입자를 생성할 수 있는 숙주 세포를 발생시킨다. 다른 구현예에서, rAAV 입자는 rAAV 벡터를 인코딩하는 핵산, AAV rep 및 cap를 인코딩하는 핵산, 및 AAV 헬퍼 바이러스 기능을 인코딩하는 핵산 중 하나 이상을 포함하는 생산 세포주에 의해 생성되었다.
상기 양태와 구현예의 일부 구현예에서, rAAV 입자는 정위 전달에 의해 전달된다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 대류 강화 전달에 의해 전달된다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 CED 전달 시스템을 이용하여 전달된다. 일부 구현예에서, CED 시스템은 캐뉼러를 포함한다. 일부 구현예에서, 캐뉼러는 역류 저항 캐뉼러 또는 단계식 캐뉼러이다. 일부 구현예에서, CED 시스템은 펌프를 포함한다. 일부 구현예에서, 펌프는 수동 펌프이다. 일부 구현예에서, 펌프는 삼투 펌프이다. 일부 구현예에서, 펌프는 주입 펌프이다.
특허 출원 및 간행물을 비롯한 본 명세서에 인용된 모든 참고문헌은 그 전체가 참고로 포함된다.
도 1은 삼중 트랜스펙션(TT) 및 생산 세포주(PCL) 과정에 의해 제조된 AAV1 및 AAV2 벡터가 투여된 동물에서 수술 직전(검은색) 및 부검시(회색) 측정된 붉은털원숭이 체중을 도시한다.
도 2a 내지 도 2d는 붉은털원숭이 미상핵(caudate)과 피각 내로의 AAV1-GFP(TT) 주입 후 30일째의 GFP에 대해 염색된 대표적인 뇌 절편을 도시한다. 도 2a 내지 도 2d의 절편은 입쪽에서 꼬리쪽 방향으로 뇌를 통해 이어진다. 3마리의 대표적인 동물로부터의 절편이 각 패널에 디스플레이되어 있다.
도 3a 내지 도 3d는 붉은털원숭이 미상핵과 피각 내로의 AAV1-GFP(TT) 주입 후 별아교세포(도 3a 및 도 3c)와 피질 신경세포(도 3b 및 도 3d) 둘 모두의 경우 전두 피질(도 3a 및 도 3b)과 후두 피질(도 3c 및 도 3d)에서의 GFP의 피질 발현을 나타내는 대표적인 뇌 절편을 도시한다.
도 4a 내지 도 4d는 붉은털원숭이 미상핵과 피각 내로의 AAV2-GFP(TT) 주입 후 30일째의 GFP에 대해 염색된 대표적인 뇌 절편을 도시한다. 도 4a 내지 도 4d의 절편은 입쪽에서 꼬리쪽 방향으로 뇌를 통해 이어진다. 3마리의 대표적인 동물로부의 절편이 각 패널에 디스플레이되어 있다.
도 5a 내지 도 5d는 붉은털원숭이 미상핵과 피각 내로의 생산 세포주(PCL)(도 5a 및 도 5b) 또는 삼중 트랜스펙션(TT)(도 5c 및 도 5d) 과정에 의해 제조된 AAV1-GFP 주입 후 30일째의 GFP에 대해 염색된 대표적인 뇌 절편을 도시한다.
도 6a 내지 도 6d는 붉은털원숭이 꼬리핵과 피각 내로의 생산 세포주(PCL)(도 6a 및 도 6b) 또는 삼중 트랜스펙션(TT)(도 6c 및 도 6d) 과정에 의해 제조된 AAV2-GFP 주입 후 30일째의 GFP에 대해 염색된 대표적인 뇌 절편을 도시한다.
도 7은 AAV1-eGFP 및 AAV2-eGFP가 주입된 비-인간 영장류(NHP) 뇌에서의 GFP의 분포를 도시한다. AAV1-eGFP 및 AAV2-eGFP 벡터를 9마리의 레서스 마카크(Rhesus macaque)의 선조체 내로 양측 주입하였다. 수술 후 4주째에, GFP에 대한 면역조직화학(IHC)을 위해 뇌를 처리하였다. 컬럼은 AAV1-eGFP(삼중 트랜스펙션; TT); AAV1-eGFP(생산 세포주; PCL); AAV2-eGFP(TT); AAV2-eGFP(PCL)로 주입된 4개의 연구 그룹으로부터의 대표적인 GFP 염색 뇌 절편을 도시한다. 대표적인 절편은 전두 피질로부터, 선조체(주입 부위), 중뇌, 피질의 후두부에 이르는 전체 뇌 전반에 걸친 GFP 발현의 분포를 나타내는 뇌의 다양한 관상면을 도시한다. 모든 그룹은 주입 부위(피각과 꼬리핵)에서의 강력한 GFP 신호뿐만 아니라 피질 영역과 흑색질로의 광범위한 이동을 나타내었다. IHC 염색에 기초하여, 표적 구조(선조체)와 피질 영역 둘 모두에서의 GFP 발현의 적용범위를 각각의 원숭이에 대해 계산하였고, 이는 표 7에 요약되어 있다.
도 8은 1차 형질도입 영역(PAT) 대 벡터 분포(Vd)의 비를 도시한다. 선조체에서의 1차 GFP 발현 영역을 GFP 염색 절편으로부터의 스캔 상에 표시하였고, 그 값을 가돌리늄(Gadolinium) 신호를 사용하여 매칭 MRI 스캔으로부터 얻은 값으로 나누었다. 1.0보다 큰 비는 GFP 발현 정도가 주입 후 가돌리늄 신호의 경계를 초과함을 나타낸다. AAV 벡터가 주입된 원숭이로부터의 결과는 AAV1이 AAV2보다 뇌 실질에서 더 잘 확산됨을 나타내었다(1.21±0.1 대 0.74±0.04; 양측 독립표본 t-검정(2-tailed unpaired t-test)을 사용하여 p < 0.007).
도 9a 내지 도 9h는 AAV1-eGFP 및 AAV2-eGFP로 형질도입된 NHP 뇌에서의 GFP 발현을 도시한다. 도 9a: 1번 대상체의 AAV1-eGFP(TT)으로 형질도입된 표적 구조인 꼬리핵의 고배율(40X). DAB에 의해 염색된 짙은 갈색 GFP+ 신경세포는 조밀하게 염색된 양성 신경 섬유망에 대해 가시적이다. 이러한 강력한 신호는 TT법과 PCL법 둘 모두에 의해 생성된 AAV1-eGFP가 주입된 모든 원숭이에서 검출되었다. 도 9b: 주입 부위(선조체)로부터 피질 영역으로의 벡터 AAV1-eGFP의 대량 수송을 나타내는 1번 대상체(도 7)의 전전두 피질의 단편. GFP+ 세포의 형태에 기초하여, 신경세포와 별아교세포 둘 모두가 피질에서 검출되었다. 도 9c: GFP를 발현하는 많은 피질 신경세포를 도시하는 도 9b에 표시된 프레임의 고배율(40X). 도 9d: 별아교세포 형태의 GFP+ 세포를 나타내는 1번 대상체로부터의 피질의 고(40X)배율. 도 9e: 6번 대상체의 AAV2-eGFP(TT)로 형질도입된 표적 구조인 피각의 고배율(40X). 짙은 갈색 DAB 신호는 신경세포 및 이들의 조밀하게 염색된 섬유망에서의 GFP의 발현을 도시한다. 도 9f: 선조체(주입 부위)로부터 피질 영역으로의 벡터 AAV2-eGFP의 대량 수송을 나타내는 6번 대상체(도 7)의 전전두 피질의 단편. 대다수의 GFP 양성 세포는 신경세포 형태를 지녔다(배율 2.5X). 도 9g: GFP를 발현하는 많은 피질 신경세포를 도시하는 도 9f에 표시된 프레임의 고배율(40X). 도 9h: 별아교세포 형태를 지닌 GFP+ 세포를 나타내는 6번 대상체의 속섬유막(internal capsule)의 고배율(20X).
도 10a 내지 도 10e는 원숭이 뇌 내로 주입된 AAV1-eGFP 및 AAV2-GFP의 세포 향성(tropism)을 도시한다. GFP 및 다양한 세포 마커에 대해 원숭이 뇌 절편을 이중 면역형광 염색처리하여 주입된 벡터의 세포 향성을 결정하였다. 도 10a: GFP(DyLightTM 488 염료에 대한 녹색 채널; 좌측 컬럼) 및 신경세포 마커 NeuN(DyLightTM 549 염료에 대한 적색 채널; 중간 컬럼)에 대한 항체로 염색된 1번 대상체의 꼬리핵(표적 구조)으로부터의 절편. 둘 모두의 채널이 병합된 사진(배율 20X; 우측 컬럼)은 GFP를 발현하는 많은 신경세포를 보여주는데, 이는 AAV1-eGFP의 신경세포 향성을 입증한다. 도 10b: 1번 대상체의 전전두 피질의 절편에 대해 동일한 염색을 수행하였는데, 이는 선조체로부터 신경세포 투사(projection)를 받는 원위 뇌 구조에서의 신경세포 형질도입을 나타내며, AAV1-eGFP의 역행 수송의 증거이다. 도 10c: GFP(DyLightTM 488 염료에 대한 녹색 채널; 좌측 컬럼) 및 별아교세포 마커 S-100(DyLightTM 549 염료에 대한 적색 채널; 중간 컬럼)에 대한 항체로 염색된 1번 대상체의 꼬리핵(표적 구조)으로부터의 절편. 둘 모두의 채널이 병합된 사진(배율 20X; 우측 컬럼)은 GFP를 발현하는 많은 별아교세포를 보여주는데, 이는 AAV1-eGFP가 또한 별아교세포를 형질도입시킴을 입증한다. 도 10d: GFP(DyLightTM 488 염료에 대한 녹색 채널; 좌측 컬럼) 및 신경세포 마커 NeuN(DyLightTM 549 염료에 대한 적색 채널; 중간 컬럼)에 대한 항체로 염색된 6번 대상체의 꼬리핵(표적 구조)으로부터의 절편. 둘 모두의 채널이 병합된 사진(배율 20X; 우측 컬럼)은 GFP를 발현하는 많은 신경세포를 보여주는데, 이는 AAV2-eGFP의 신경세포 향성을 입증한다. 도 10e: GFP(DyLightTM 488 염료에 대한 녹색 채널; 좌측 컬럼) 및 미세아교세포 마커 Iba-1(DyLightTM 549 염료에 대한 적색 채널; 중간 컬럼)에 대한 항체로 염색된 3번 대상체의 꼬리핵(표적 구조)으로부터의 절편. 병합된 사진(배율 20X; 우측 컬럼)에서 둘 모두의 마커의 공동 염색의 결여는 AAV1가 미세아교세포를 형질도입시키지 않음을 나타내며, 이는 AAV2의 경우에도 마찬가지였다(데이터는 제시되지 않음).
도 11a 내지 도 11c는 AAV1-eGFP 및 AAV2-eGFP가 주입된 NHP의 선조체에서의 신경세포 형질도입의 효율을 도시한다. 원숭이 뇌 절편의 GFP 및 신경세포 마커 NeuN에 대한 이중 면역형광 염색을 수행하여 선조체(표적 구조) 및 피질 영역 내에서의 신경세포 형질도입의 효율을 계산하였다. 선조체의 경우, 형질도입의 효율은 GFP+ 신경세포가 조밀하게 분포되어 신호가 강력한 1차 GFP 형질도입 영역(PAT)에서 계산하였다(도 11a). 1차 GFP 형질도입 영역 바깥의 영역에서도 신경세포가 검출되었다(OPAT; 도 11c). PAT(내측 음영) 및 OPAT(외측 음영)에서 GFP+ 신경세포를 카운팅하는 기법에 대한 도식이 도 11b에 도시되어 있다. 각 원숭이 및 뇌 구조에 대한 개별 카운트로부터의 데이터를 표 8(PAT) 및 표 9(OPAT)에 나타낸다.
도 12a 및 도 12b는 벡터 관련 조직학적 결과를 도시한다. 1차 형질도입 영역(PAT)로부터의 관상 절편의 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색의 독립적인 평가는 모든 실험 그룹에서 캐뉼러 삽입과 관련된 정상적인 신경아교증을 나타내었다. H&E 염색은 사용된 벡터와 무관하게 모든 동물에서 혈관주위 세포 침윤물을 또한 나타내었다. 혈관주위 세포침윤(perivascular cuff)의 발생률 및 중증도는, 특히 벡터가 TT법에 의해 제조된 경우, AAV1이 주입된 그룹에서 증가하였다. 도 12a: 3번 대상체로부터의 H&E 염색 절편은 AAV1-eGFP(TT)로 형질도입된 좌측 피각에서 많은 혈관주위 세포침윤을 나타낸다. 하나의 혈관이 우측 하단 구석에서 확대(5X)되어 있다. 도 12b: 5번 대상체로부터의 H&E 염색 절편은 AAV1-eGFP(PCL)로 형질도입된 좌측 꼬리핵에서 단지 몇 개의 국소화된 혈관주위 세포침윤을 나타낸다. 몇 개의 혈관이 좌측 하단 구석에서 확대(5X)되어 있다.
도 13a 및 도 13b는 붉은털원숭이 미상핵 및 피각 내로의 AAV1-eGFP의 주입 후 1개월째의 간, 비장, 심장, 신장 및 폐 샘플에서의 eGFP mRNA 발현의 정량 PCR(QPCR) 분석을 도시한다. (도 13a) 삼중 트랜스펙션(TT) 과정에 의해 제조된 AAV1 및 AAV2-eGFP 벡터. (도 13b) 생산 세포주(PCL) 과정에 의해 제조된 AAV1 및 AAV2-eGFP 벡터.
상세한 설명
본 명세서에 상세히 논의되는 바와 같이, 본 발명자들은 AAV 벡터(예를 들어, AAV1 벡터 및 AAV2 벡터)가 (예를 들어, 대류 강화 전달인 CED에 의해) 선조체에 전달된 경우 붉은털원숭이 뇌에서 선조체와 피질 구조 둘 모두를 효율적으로 표적화함을 발견하였다. 이러한 연구는 또한 2가지의 상이한 제조 플랫폼(platform)을 평가하였으며, 이러한 연구는 삼중 트랜스펙션과 생산 세포주에 의해 생성된 AAV가 붉은털원숭이 뇌에서 선조체와 피질 구조 둘 모두를 표적화함을 나타낸다. 둘 모두의 플랫폼을 이용하여 생성된 rAAV 입자(예를 들어, AAV1 벡터 및 AAV2 벡터)의 선조체내 전달은 선조체 내의 신경세포뿐만 아니라 주입 부위(예를 들어, 피질 구조)로부터 상당한 거리에 위치하는 신경세포도 형질도입시킬 수 있었다. 따라서, 본 발명은 이종성 핵산을 인코딩하는 rAAV 벡터를 함유하는 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV) 입자를 선조체에 투여함으로써 rAAV 입자를 포유동물의 중추 신경계에 전달하는 방법을 제공하며, 여기서 이종성 핵산은 포유동물의 적어도 대뇌 피질과 선조체에서 발현된다.
또한, 본 발명은 적어도 대뇌 피질과 선조체에서 발현되는 이종성 핵산을 인코딩하는 rAAV 입자를 선조체에 투여함으로써 포유동물의 CNS 장애(예를 들어, 헌팅톤병)을 치료하는 방법뿐만 아니라 본 명세서에 기재된 rAAV 입자를 사용하는 포유동물의 대뇌 피질과 선조체에서의 이종성 핵산의 발현을 위한 시스템 및 키트를 제공한다. 본 발명의 방법은 포유동물의 선조체로의 rAAV 입자의 전달을 위한 전달 장치(예를 들어, CED 장치)를 또한 이용할 수 있고, 마찬가지로 본 발명의 시스템 및 키트는 포유동물의 선조체로의 rAAV 입자의 전달을 위한 장치를 추가로 포함할 수 있다.
I. 일반 기법
본 명세서에 기재되거나 언급된 기법 및 절차는 당업자에게 의해 일반적으로 잘 이해되어 있고, 예를 들어, 하기 문헌에 기재된 널리 이용되는 방법과 같은 종래의 방법을 사용하여 통상적으로 이용된다: 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook et al., 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2012)]; 문헌[Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., 2003); 문헌[the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.)]; 문헌[PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds., 1995)]; 문헌[Antibodies, A Laboratory Manual (Harlow and Lane, eds., 1988)]; 문헌[Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications (R.I. Freshney, 6th ed., J. Wiley and Sons, 2010)]; 문헌[Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984)]; 문헌[Methods in Molecular Biology, Humana Press]; 문헌[Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., Academic Press, 1998)]; 문헌[Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, Plenum Press, 1998)]; 문헌[Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., J. Wiley and Sons, 1993-8)]; 문헌[Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds., 1996)]; 문헌[Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987)]; 문헌[PCR : The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994)]; 문헌[Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991)]; 문헌[Short Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., J. Wiley and Sons, 2002)]; 문헌[Immunobiology (C.A. Janeway et al., 2004)]; 문헌[Antibodies (P. Finch, 1997)]; 문헌[Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989)]; 문헌[Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000)]; 문헌[Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)]; 문헌[The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)]; 및 문헌[Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 2011)].
II. 정의
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "벡터"는 시험관내 또는 생체내에서 숙주 세포 내로 전달될 핵산을 포함하는 재조합 플라스미드 또는 바이러스를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드인 임의의 길이의 중합체 형태의 뉴클레오티드를 지칭한다. 따라서, 이러한 용어는 단일 가닥, 이중 가닥 또는 다중 가닥 DNA 또는 RNA, 유전체 DNA, cDNA, DNA-RNA 하이브리드, 또는 퓨린 염기와 피리미딘 염기, 다른 천연 뉴클레오티드 염기, 화학적 또는 생화학적으로 변형된 뉴클레오티드 염기, 비천연 뉴클레오티드 염기 또는 유도체화 뉴클레오티드 염기를 포함하는 중합체를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 폴리뉴클레오티드의 백본(backbone)은 당 및 포스페이트기(RNA 또는 DNA에서 전형적으로 발견될 수 있는 바와 같음), 또는 변형되거나 치환된 당 또는 포스페이트기를 포함할 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오티드의 백본은 포스포라미데이트와 같은 합성 서브유닛의 중합체를 포함할 수 있고, 이에 따라 올리고데옥시뉴클레오시드 포스포라미데이트(P-NH2) 또는 혼합형 포스포라미데이트-포스포디에스테르 올리고머일 수 있다. 또한, 이중 가닥 폴리뉴클레오티드는, 상보적 가닥을 합성하고 적절한 조건 하에서 가닥을 어닐링하거나, 적절한 프라이머와 함께 DNA 중합효소를 이용하여 상보적 가닥을 새로 합성함으로써 화학적 합성의 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 생성물로부터 얻을 수 있다.
용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 상호 교환적으로 사용되며, 최소 길이로 한정되지 않는다. 이러한 아미노산 잔기의 중합체는 천연 또는 비천연 아미노산 잔기를 함유할 수 있으며, 아미노산 잔기의 펩티드, 올리고펩티드, 이합체, 삼합체 및 다합체를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 전장 단백질 및 이의 단편 둘 모두가 정의에 포함된다. 이러한 용어는 또한 폴리펩티드의 발현후 변형, 예를 들어, 당화, 시알화, 아세틸화, 인산화 등을 포함한다. 또한, 본 발명의 목적상, "폴리펩티드"는 단백질이 요망되는 활성을 유지하는 한 천연 서열에 대한 변형, 예를 들어 결실, 첨가 및 치환(일반적으로 사실상 보존성 치환)을 포함하는 단백질을 지칭한다. 이러한 변형은 부위 특이적 돌연변이유발을 통해 이루어지는 것과 같이 계획적일 수 있거나, 단백질을 생성하는 숙주의 돌연변이 또는 PCR 증폭으로 인한 오류를 통해 이루어지는 것과 같이 우발적일 수 있다.
"재조합 바이러스 벡터"는 하나 이상의 이종성 서열(즉, 바이러스 기원이 아닌 핵산 서열)을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드 벡터를 지칭한다. 재조합 AAV 벡터의 경우, 재조합 핵산은 적어도 하나의 역위 말단 반복부 서열(ITR)에 의해 플랭킹되어 있다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 2개의 ITR에 의해 플랭킹되어 있다.
"재조합 AAV 벡터(rAAV 벡터)"는 적어도 하나 또는 2개의 AAV 역위 말단 반복부 서열(ITR)에 의해 플랭킹되어 있는 하나 이상의 이종성 서열(즉, AAV 기원이 아닌 핵산 서열)을 포함하는 폴리뉴클레오티드 벡터를 지칭한다. 이러한 rAAV 벡터는, 적합한 헬퍼 바이러스로 감염되었고(또는 적합한 헬퍼 기능을 발현하고) AAV rep 및 cap 유전자 생성물(즉, AAV Rep 및 Cap 단백질)을 발현하는, 숙주 세포에 존재하는 경우 복제되어 감염성 바이러스 입자 내로 패키징될 수 있다. rAAV 벡터가 더 큰 폴리뉴클레오티드 내로(예를 들어, 염색체 또는 또 다른 벡터, 예를 들어, 클로닝 또는 트랜스펙션에 사용되는 플라스미드에) 혼입되는 경우, rAAV 벡터는 AAV 패키징 기능 및 적합한 헬퍼 기능의 존재 하에 복제 및 캡시드화에 의해 "구제(rescue)"될 수 있는 "프로-벡터(pro-vector)"로 지칭될 수 있다. rAAV 벡터는 플라스미드, 선형 인공 염색체, 지질과 복합체화된 형태, 리포솜 내에 캡슐화된 형태, 및 바이러스 입자, 예를 들어 AAV 입자에 캡시드화된 형태를 포함하지만 이에 한정되지 않는 다수의 형태 중 임의의 형태로 존재할 수 있다. rAAV 벡터는 AAV 바이러스 캡시드 내로 패키징되어 "재조합 아데노 관련 바이러스 입자(rAAV 입자)"를 생성시킬 수 있다.
"이종성"은 비교되거나, 또는 도입되거나 혼입되는 나머지 엔티티(entity)와 유전자형적으로 별개인 엔티티로부터 유래됨을 의미한다. 예를 들어, 상이한 세포 유형 내로 유전 공학 기법에 의해 도입된 폴리뉴클레오티드는 이종성 폴리뉴클레오티드이다(그리고, 발현된 경우, 이종성 폴리펩티드를 인코딩할 수 있음). 유사하게, 바이러스 벡터 내로 혼입된 세포 서열(예를 들어, 유전자 또는 이의 일부)은 벡터에 대하여 이종성 뉴클레오티드 서열이다. 이종성 핵산은 비교되거나, 또는 도입되거나 혼입되는 나머지 엔티티와 유전자형적으로 별개인 엔티티로부터 유래된 핵산을 지칭할 수 있다.
용어 "이종성 핵산"은 세포 내로 도입되어 RNA로 전사될 수 있고, 선택적으로, 적절한 조건 하에서 번역되고/되거나 발현될 수 있는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 일부 양태에서, 이는 그것이 도입된 세포에 요망되는 특성을 부여하거나, 그렇지 않은 경우 요망되는 치료 또는 진단 결과를 생성시킨다. 또 다른 양태에서, 이는 RNA 간섭을 매개하는 분자, 예를 들어 miRNA, siRNA, 또는 shRNA로 전사될 수 있다.
"닭 β-액틴(CBA) 프로모터"는 닭 β-액틴 유전자(예를 들어, GenBank Entrez Gene ID 396526으로 표시되는 갈루스 갈루스(Gallus gallus) 베타 액틴)로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "닭 β-액틴 프로모터"는 사이토메갈로바이러스(CMV) 초기 인핸서 요소, 닭 β-액틴 유전자의 프로모터 및 제1 엑손과 인트론, 및 토끼 베타-글로빈 유전자의 스플라이스 수용체를 함유하는 프로모터, 예를 들어 문헌[Miyazaki, J., et al. (1989) Gene 79(2):269-77]에 기재된 서열을 지칭할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "CAG 프로모터"가 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "CMV 초기 인핸서/닭 베타 액틴(CAG) 프로모터"가 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
바이러스 역가와 관련하여 사용되는 바와 같은 용어 "유전체 입자(gp)", "유전체 당량" 또는 "유전체 카피"는 감염성 또는 기능성과 무관하게 재조합 AAV DNA 유전체를 함유하는 비리온의 개수를 지칭한다. 특정 벡터 제조물 내의 유전체 입자의 개수는 본 명세서의 실시예, 또는 예를 들어, 문헌[Clark et al. (1999) Hum. Gene Ther ., 10:1031-1039]; 문헌[Veldwijk et al. (2002) Mol . Ther ., 6:272-278]에 기재된 바와 같은 절차에 의해 측정될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "벡터 유전체(vg)"는 벡터, 예를 들어, 바이러스 벡터의 일련의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 지칭할 수 있다. 벡터 유전체는 바이러스 입자에 캡시드화될 수 있다. 특정 바이러스 벡터에 따라, 벡터 유전체는 단일 가닥 DNA, 이중 가닥 DNA, 또는 단일 가닥 RNA, 또는 이중 가닥 RNA를 포함할 수 있다. 벡터 유전체는 특정 바이러스 벡터와 관련된 내인성 서열 및/또는 재조합 기법을 통해 특정 바이러스 벡터 내로 삽입되는 임의의 이종성 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 재조합 AAV 벡터 유전체는 프로모터를 플랭킹하는 적어도 하나의 ITR 서열, 관심 서열(예를 들어, 이종성 핵산) 및 폴리아데닐화 서열을 포함할 수 있다. 완전한 벡터 유전체는 벡터의 완전한 세트의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터의 핵산 역가는 vg/㎖로 측정될 수 있다. 이러한 역가를 측정하기에 적합한 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 정량 PCR).
바이러스 역가와 관련하여 사용되는 바와 같은 용어 "감염 단위(iu)", "감염성 입자" 또는 "복제 단위"는, 예를 들어, 문헌[McLaughlin et al. (1988) J. Virol., 62:1963-1973]에 기재된 바와 같이 복제 중심 검정으로도 알려진 감염성 중심 검정에 의해 측정되는 바와 같은 감염성 및 복제 능력이 있는 재조합 AAV 벡터 입자의 개수를 지칭한다.
바이러스 역가와 관련하여 사용되는 바와 같은 용어 "형질도입 단위(tu)"는 본 명세서의 실시예 또는 예를 들어, 문헌[Xiao et al. (1997) Exp . Neurobiol ., 144:113-124]; 또는 문헌[Fisher et al. (1996) J. Virol ., 70:520-532 (LFU assay)]에 기재된 바와 같은 기능 검정에서 측정되는 바와 같은 기능성 이종성 핵산 생성물을 생성시키는 감염성 재조합 AAV 벡터 입자의 개수를 지칭한다.
"역위 말단 반복부" 또는 "ITR" 서열은 당업계에서 잘 이해되어 있는 용어로서, 반대 배향으로 존재하는 바이러스 유전체의 말단에서 발견되는 비교적 짧은 서열을 지칭한다.
당업계에서 잘 이해되어 있는 용어인 "AAV 역위 말단 반복부(ITR)" 서열은 천연 단일 가닥 AAV 유전체의 양 말단에 존재하는 대략 145개의 뉴클레오티드 서열이다. ITR의 가장 바깥쪽의 125개의 뉴클레오티드는 2가지의 택일적 배향 중 어느 하나로 존재하여 다양한 AAV 유전체 사이에 그리고 단일 AAV 유전체의 2개의 말단 사이에 이질성을 가져올 수 있다. 가장 바깥쪽의 125개의 뉴클레오티드는 또한 여러 개의 더 짧은 자기 상보성 영역(A, A', B, B', C, C' 및 D 영역으로 표시됨)을 함유하여, ITR의 이러한 부분 내에서 가닥내 염기쌍 형성이 일어날 수 있게 한다.
"말단 분해 서열" 또는 "trs"는 바이러스 DNA 복제 동안 AAV rep 단백질에 의해 절단되는 AAV ITR의 D 영역에 있는 서열이다. 돌연변이 말단 분해 서열은 AAV rep 단백질에 의한 절단이 어렵다.
"AAV 헬퍼 기능"은 AAV가 숙주 세포에 의해 복제되고 패키징될 수 있게 하는 기능을 지칭한다. AAV 헬퍼 기능은, AAV 복제 및 패키징을 돕는 헬퍼 바이러스 또는 헬퍼 바이러스 유전자를 포함하지만 이에 한정되지 않는 다수의 형태 중 임의의 형태로 제공될 수 있다. 유전독성인자(genotoxic agent)와 같은 다른 AAV 헬퍼 기능이 당업계에 알려져 있다.
AAV에 대한 "헬퍼 바이러스"는 AAV(결손 파보바이러스임)가 숙주 세포에서 복제되고 패키징될 수 있게 하는 바이러스를 지칭한다. 헬퍼 바이러스는 AAV의 복제를 가능하게 하는 "헬퍼 기능"을 제공한다. 아데노바이러스, 헤르페스바이러스 및 폭스바이러스, 예를 들어, 백시니아 및 바큘로바이러스를 비롯한 다수의 이러한 헬퍼 바이러스가 확인되었다. 아데노바이러스는 다수의 상이한 서브그룹을 포함하지만, 서브그룹 C의 아데노바이러스 5형(Ad5)이 가장 통상적으로 사용된다. 인간, 비-인간 포유동물 및 조류 기원의 많은 아데노바이러스가 공지되어 있으며, ATCC와 같은 기탁기관으로부터 이용 가능하다. ATCC와 같은 기탁기관으로부터 또한 이용 가능한 헤르페스과의 바이러스는, 예를 들어, 단순 헤르페스 바이러스(HSV), 엡스타인-바 바이러스(EBV), 사이토메갈로바이러스(CMV) 및 가성광견병 바이러스(PRV)를 포함한다. AAV의 복제를 위한 아데노바이러스 헬퍼 기능의 예는 E1A 기능, E1B 기능, E2A 기능, VA 기능 및 E4orf6 기능을 포함한다. 기탁기관으로부터 이용 가능한 바큘로바이러스는 아우토그라파 칼리포르니카(Autographa californica) 핵 다각체병 바이러스(nuclear polyhedrosis virus)를 포함한다.
rAAV의 제조물은, 감염성 AAV 입자 대 감염성 헬퍼 바이러스 입자의 비가 적어도 약 102:1; 적어도 약 104:l, 적어도 약 106:l; 또는 적어도 약 108:l 또는 그 이상인 경우 헬퍼 바이러스가 "실질적으로 없다"고 한다. 일부 구현예에서, 제조물은 등가량의 헬퍼 바이러스 단백질(즉, 상기 언급된 헬퍼 바이러스 입자 불순물이 붕괴된 형태로 존재하는 경우 그러한 수준의 헬퍼 바이러스의 결과로서 존재할 것인 단백질)이 또한 없다. 바이러스 및/또는 세포 단백질 오염은 일반적으로 SDS 겔 상의 쿠마시 염색 밴드의 존재(예를 들어, AAV 캡시드 단백질 VPl, VP2 및 VP3에 상응하는 밴드가 아닌 밴드의 출현)로서 관찰될 수 있다.
"AAV 헬퍼 기능"은 AAV가 숙주 세포에 의해 복제되고 패키징될 수 있게 하는 기능을 지칭한다. AAV 헬퍼 기능은, AAV 복제 및 패키징을 돕는 헬퍼 바이러스 또는 헬퍼 바이러스 유전자를 포함하지만 이에 한정되지 않는 다수의 형태 중 임의의 형태로 제공될 수 있다. 유전독성인자와 같은 다른 AAV 헬퍼 기능이 당업계에 알려져 있다. AAV에 대한 "헬퍼 바이러스"는 AAV(결손 파보바이러스임)가 숙주 세포에서 복제되고 패키징될 수 있게 하는 바이러스를 지칭한다. 아데노바이러스, 헤르페스바이러스 및 폭스바이러스, 예를 들어, 백시니아를 비롯한 다수의 이러한 헬퍼 바이러스가 확인되었다. 아데노바이러스는 다수의 상이한 서브그룹을 포함하지만, 서브그룹 C의 아데노바이러스 5형(Ad5)이 가장 통상적으로 사용된다. 인간, 비-인간 포유동물 및 조류 기원의 많은 아데노바이러스가 공지되어 있으며, ATCC와 같은 기탁기관으로부터 이용 가능하다. ATCC와 같은 기탁기관으로부터 또한 이용 가능한 헤르페스과의 바이러스는, 예를 들어, 단순 헤르페스 바이러스(HSV), 엡스타인-바 바이러스(EBV), 사이토메갈로바이러스(CMV) 및 가성광견병 바이러스(PRV)를 포함한다.
참조 폴리펩티드 또는 핵산 서열에 대한 "서열 동일성 퍼센트(%)"는, 서열들을 정렬시키고, 필요에 따라, 최대 서열 동일성 퍼센트를 달성하기 위해 갭을 도입하고, 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존성 치환을 고려하지 않은 후의, 참조 폴리펩티드 또는 핵산 서열의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드와 동일한 후보 서열의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 백분율로 정의된다. 아미노산 또는 핵산 서열 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 정렬은 당업계의 기술에 속하는 다양한 방식으로, 예를 들어, 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어 프로그램, 예컨대, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어를 비롯해 문헌[Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1987), Supp. 30, section 7.7.18, Table 7.7.1]에 기재된 것을 이용하여 달성될 수 있다. 정렬 프로그램의 한 예는 ALIGN Plus(Scientific and Educational Software, Pennsylvania)이다. 당업자는 비교되는 서열들의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여 정렬을 측정하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 본 발명의 목적상, 주어진 아미노산 서열 B에 대한, 또는 이와의, 또는 이에 비한, 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 %(이는 주어진 아미노산 서열 B에 대해, 또는 이와, 또는 이에 비해 특정한 아미노산 서열 동일성 %를 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로 대안적으로 표현될 수 있음)는 다음과 같이 계산된다: 100 × 분율 X/Y, 여기서 X는 A 및 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램에 의해 동일한 매치로 기록된 아미노산 잔기의 개수이고, Y는 B 의 총 아미노산 잔기 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 %는 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 %와 동일하지 않을 것임이 인식될 것이다. 본 발명의 목적상, 주어진 핵산 서열 D에 대한, 또는 이와의, 또는 이에 비한, 주어진 핵산 서열 C의 핵산 서열 동일성 %(이는 주어진 핵산 서열 D에 대해, 또는 이와, 또는 이에 비해 특정한 핵산 서열 동일성 %를 갖거나 포함하는 주어진 핵산 서열 C로 대안적으로 표현될 수 있음)는 다음과 같이 계산된다: 100 × 분율 W/Z, 여기서 W는 C 및 D의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램에 의해 동일한 매치로 기록된 뉴클레오티드의 개수이고, Z는 D의 총 뉴클레오티드 수이다. 핵산 서열 C의 길이가 핵산 서열 D의 길이와 동일하지 않은 경우, D에 대한 C의 핵산 서열 동일성 %는 C에 대한 D의 핵산 서열 동일성 %와 동일하지 않을 것임이 인식될 것이다.
"단리된" 분자(예를 들어, 핵산 또는 단백질) 또는 세포는 이것이 확인되고, 이의 천연 환경의 성분으로부터 분리되고/되거나 회수된 것을 의미한다.
"유효량"은 임상 결과(예를 들어, 증상의 개선, 임상 종점의 달성 등)를 포함하는 유익하거나 요망되는 결과를 가져오기에 충분한 양이다. 유효량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다. 질병 상태의 측면에서, 유효량은 질병을 개선하거나, 안정시키거나, 질병의 발달을 지연시키기에 충분한 양이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "대류 강화 전달(CED)"은 정수압이 대류성 분포를 발생시키는 속도의 주입에 의한 CNS로의 치료제의 전달을 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, 주입은 0.5 ㎕/분 초과의 속도로 이루어진다. 그러나, 두개내 압력을 적합한 수준으로 유지하여 뇌 조직을 손상시키지 않도록 하는 임의의 적합한 유량이 이용될 수 있다. CED는, 예를 들어 적합한 카테터 또는 캐뉼러(예컨대, 단계 설계식 역류 방지형 캐뉼러)를 이용하여 캐뉼러의 첨단을 표적 CNS 조직에 적어도 매우 근접하게 포지셔닝(positioning)시킴(예를 들어, 첨단이 CNS 조직 내로 삽입됨)으로써 CED가 달성될 수 있다. 캐뉼러가 위치된 후, 이는 치료제를 캐뉼러 첨단을 통해 표적 CNS 조직으로 전달하는 펌프에 연결된다. 캐뉼러의 첨단으로부터의 압력 구배는 주입 동안 유지될 수 있다. 일부 구현예에서, 주입은 영상화 방법, 예를 들어, 수술중 MRI(iMRI) 또는 또 다른 실시간 MRI 기법에 의해 검출 가능하고/하거나 표준 입체공간적(stereotaxic) 주입 장비 및 기법(예를 들어, MRI Interventions, Memphis, TN의 ClearPoint® 시스템)에 의해 전달되는 추적제에 의해 모니터링될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "폴록사머"는 2개의 폴리옥시에틸렌 사슬에 의해 플랭킹된 폴리옥시프로필렌 사슬로 이루어진 블록 공중합체를 지칭할 수 있다. 판매될 수 있는 폴록사머의 상표명은 제한 없이 PLURONIC®(BASF), KOLLIPHOR®(BASF), LUTROL®(BASF) 및 SYNPERONIC®(Croda International)을 포함한다.
"개체" 또는 "대상체"는 포유동물이다. 포유동물은 가축(예를 들어, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류(예를 들어, 인간 및 비-인간 영장류, 예를 들어 원숭이), 토끼 및 설치류(예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 특정 구현예에서, 개체 또는 대상체는 인간이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "치료"는 유익하거나 요망되는 임상 결과를 얻기 위한 접근법이다. 본 발명의 목적상, 유익하거나 요망되는 임상 결과는 검출 가능하거나 검출 가능하지 않건 간에 증상의 경감, 질병 정도의 감소, 질병의 안정된(예를 들어, 악화되지 않은) 상태, 질병 확산(예를 들어, 전이)의 예방, 질병 진행의 지연 또는 둔화, 질병 상태의 개선 또는 완화, 및 관해(remission)(부분적 또는 전체적)를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. "치료"는 또한 치료를 받지 않은 경우의 예상 생존기간에 비해 생존기간을 연장시킴을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "예방적 치료"는 치료를 지칭하며, 여기서 개체는 장애를 갖거나 장애에 걸릴 위험이 있는 것으로 알려져 있거나 의심되지만, 장애의 증상을 나타내지 않거나 최소의 증상을 나타내는 개체이다. 예방적 치료를 받는 개체는 증상의 발생 전에 치료될 수 있다.
"헌팅톤병(HD)"은 HTT 유전자(aka 헌팅틴, HD 또는 IT15)의 돌연변이에 의해 전형적으로 야기되는 진행성 뇌 장애를 지칭한다. 이는 비정상적인 움직임(무도병으로 일컬어짐), 운동 기능의 점진적 상실, 정서 또는 정신 질환, 및 점진적 인지력 손상을 포함하는 증상을 특징으로 할 수 있다. 대부분의 증상은 30대 및 40대에서 나타나지만, 질병의 소아(juvenile) 형태가 또한 관찰되었다. HD의 추가의 설명에 대해서는, 문헌[OMIM Entry No. 143100]을 참조하며, 이 문헌은 그 전체가 본 명세서에 참조로 포함된다.
"헌팅틴(HTT)"은 대부분의 헌팅톤병 사례와 관련된 유전자 또는 이의 폴리펩티드 생성물을 지칭할 수 있다. 헌팅틴의 정상적인 기능은 완전히 이해되어 있지 않다. 그러나, 헌팅틴 유전자의 돌연변이가 HD를 야기하는 것으로 알려져 있다. 이러한 돌연변이는 전형적으로 상염색체 우성 방식으로 유전되며, HTT 유전자에서 트리뉴클레오티드(trinucleotide) CAG 반복부의 확장을 수반하여 Htt 단백질에서 폴리글루타민(polyQ) 지대(tract)를 생성시킨다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "치료"제(예를 들어, 치료용 폴리펩티드, 핵산, 트랜스진 등)는 이롭거나 요망되는 임상 결과, 예를 들어 상기 기재된 예시적인 임상 결과를 제공하는 것이다. 따라서, 치료제는 상기 기재된 바와 같은 치료에 사용될 수 있다.
본 명세서에서 값 또는 파라미터 앞의 "약"에 대한 언급은 그러한 값 또는 파라미터 자체에 관한 구현예를 포함(및 설명)한다. 예를 들어, "약 X"와 관련된 설명은 "X"의 설명을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태는 달리 지시되지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다.
본 명세서에 기재된 본 발명의 양태 및 구현예는 양태 및 구현예를 "포함하고/하거나", 이로 "구성되고/되거나", "이를 필수적으로 포함하는" 것을 포함하는 것으로 이해된다.
III. rAAV 입자를 전달하는 방법
일부 양태에서, 본 발명은 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV) 입자를 선조체에 투여하는 단계를 포함하여 rAAV 입자를 포유동물의 중추 신경계에 전달하는 방법을 제공하며, 여기서 rAAV 입자는 포유동물의 적어도 대뇌 피질과 선조체에서 발현되는 이종성 핵산을 인코딩하는 rAAV 벡터를 포함한다. 추가의 양태에서, 본 발명은 rAAV 입자를 선조체에 투여하는 단계를 포함하여 rAAV 입자를 포유동물의 중추 신경계에 전달하는 방법을 제공하며, 여기서 rAAV 입자는 포유동물의 적어도 대뇌 피질과 선조체에서 발현되는 이종성 핵산을 인코딩하는 rAAV 벡터를 포함하고, rAAV 입자는 AAV 혈청형 1(AAV1) 캡시드를 포함한다. 다른 추가의 양태에서, 본 발명은 rAAV 입자를 선조체에 투여하는 단계를 포함하여 rAAV 입자를 포유동물의 중추 신경계에 전달하는 방법을 제공하며, 여기서 rAAV 입자는 포유동물의 적어도 대뇌 피질과 선조체에서 발현되는 이종성 핵산을 인코딩하는 rAAV 벡터를 포함하고, rAAV 입자는 AAV 혈청형 2(AAV2) 캡시드를 포함한다. 또 다른 추가의 양태에서, 본 발명은 rAAV 입자를 선조체에 투여하는 단계를 포함하여 포유동물의 헌팅톤병을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 rAAV 입자는 포유동물의 적어도 대뇌 피질과 선조체에서 발현되는 이종성 핵산을 인코딩하는 rAAV 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 포유동물은 인간이다.
본 발명의 특정 양태는 중추 신경계(CNS)의 하나 이상의 영역으로의 rAAV 입자의 투여에 관한 것이다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 선조체에 투여된다. 선조체는 대뇌 피질(용어 "피질"이 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용될 수 있음)로부터 입력를 받아 기저핵으로 출력을 보내는 뇌의 영역으로 알려져 있다(선조체는 줄무늬핵(striate nucleus) 및 새줄무늬체(neostriatum)로도 지칭됨). 상기 기재된 바와 같이, 선조체는 운동 동작과 감정 제어/동기부여 둘 모두를 제어하며, 헌팅톤병과 같은 많은 신경 질병에 관련되어 있다. 제한 없이 가시 투사 신경세포(중형 가시 신경세포로도 알려져 있음), GABA성 사이신경세포(GABAergic interneuron) 및 콜린성 사이신경세포를 비롯한 여러 관심 세포 유형이 선조체에 위치하고 있다. 중형 가시 신경세포가 선조체 신경세포의 대부분을 구성한다. 이러한 신경세포는 GABA성이며, 도파민 수용체를 발현한다. 뇌의 각 반구는 선조체를 함유한다.
선조체의 중요한 하부구조는 꼬리핵과 피각을 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 꼬리핵(용어 "미상핵(caudate)"이 본 명세서에서 상호교환적으로 사용될 수 있음)에 투여된다. 꼬리핵은 등쪽 선조체의 구조로 알려져 있다. 꼬리핵은 지시된 움직임, 공간 작업 기억, 기억, 목적 지향적 행동, 감정, 수면, 언어 및 학습과 같은 기능의 제어에 관련되어 있다. 뇌의 각 반구는 꼬리핵을 함유한다.
일부 구현예에서, rAAV 입자는 피각에 투여된다. 피각은 꼬리핵과 함께 등쪽 선조체의 구조로 알려져 있다. 피각은 렌즈핵의 일부를 포함하고, 대뇌 피질을 흑색질 및 창백핵과 연결시킨다. 뇌의 많은 다른 구조와 고도로 통합되어, 피각은 학습, 운동 학습, 운동 수행, 운동 과제 및 사지 움직임과 같은 기능의 제어에 관련되어 있다. 뇌의 각 반구는 피각을 함유한다.
rAAV 입자는 선조체의 하나 이상의 부위에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 선조체의 피각과 꼬리핵에 투여된다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 선조체의 각 반구의 피각과 꼬리핵에 투여된다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 꼬리핵의 적어도 1개 부위 및 피각의 2개 부위에 투여된다.
일부 구현예에서, rAAV 입자는 뇌의 하나의 반구에 투여된다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 뇌의 양쪽 반구에 투여된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, rAAV 입자는 선조체의 각 반구의 피각과 꼬리핵에 투여된다. 일부 구현예에서, rAAV 입자를 함유하는 조성물은 각 반구의 선조체에 투여된다. 다른 구현예에서, rAAV 입자를 함유하는 조성물은 좌반구의 선조체 또는 우반구의 선조체에 투여되고/되거나 좌반구의 피각 또는 우반구의 피각에 투여된다. 일부 구현예에서, rAAV 입자를 함유하는 조성물은 좌반구의 꼬리핵, 우반구의 꼬리핵, 좌반구의 피각 및 우반구의 피각의 임의의 조합에 투여된다.
일부 구현예에서, rAAV 입자를 함유하는 조성물은 1개 초과의 위치에 동시에 또는 순차적으로 투여된다. 일부 구현예에서, rAAV 입자를 함유하는 조성물의 다중 주입은 약 1시간 이하, 약 2시간 이하, 약 3시간 이하, 약 4시간 이하, 약 5시간 이하, 약 6시간 이하, 약 9시간 이하, 약 12시간 이하 또는 약 24시간 이하의 간격 중 임의의 간격이다. 일부 구현예에서, rAAV 입자를 함유하는 조성물의 다중 주입은 약 24시간을 초과하는 간격이다.
일반적으로, 약 1 ㎕ 내지 약 1 ㎖의 본 발명의 조성물(예를 들어, 약 100 ㎕ 내지 약 500 ㎕의 조성물)이 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 피각에 전달되는 조성물의 양은 꼬리핵에 전달되는 부피보다 많다. 일부 구현예에서, 피각에 전달되는 조성물의 양은 꼬리핵에 전달되는 부피의 약 2배이다. 다른 구현예에서, 피각에 전달되는 조성물의 양은 꼬리핵에 전달되는 부피의 약 1X, 약 1.25X, 약 1.5X. 약 1.75X, 약 2X, 약 2.25X, 약 2.5X. 약 2.75X, 약 3X, 약 3.5X, 약 4X, 약 4.5X, 약 5X 또는 10X(또는 그 사이의 임의의 비) 중 임의의 배수이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 피각에 투여되는 rAAV 입자 대 꼬리핵에 투여되는 rAAV 입자의 비는 적어도 약 2:1이다(예를 들어, 약 30 ㎕의 조성물이 각 반구의 꼬리핵에 투여되고, 약 60 ㎕의 조성물이 각 반구의 피각에 투여됨). 일부 구현예에서, 약 20 ㎕ 내지 약 50 ㎕(또는 그 사이의 임의의 양)의 조성물이 각 반구의 꼬리핵에 투여되고, 약 40 ㎕ 내지 약 100 ㎕(또는 그 사이의 임의의 양)의 조성물이 각 반구의 피각에 투여된다. 일부 구현예에서, 각 반구의 꼬리핵에 투여되는 조성물의 부피는 하기 부피(㎕) 중 임의의 부피이다: 약 50 미만, 약 45 미만, 약 40 미만, 약 35 미만, 약 30 미만 또는 약 25 미만. 일부 구현예에서, 각 반구의 꼬리핵에 투여되는 조성물의 부피는 하기 부피(㎕) 중 임의의 부피이다: 약 20 초과, 약 25 초과, 약 30 초과, 약 35 초과, 약 40 초과 또는 약 45 초과. 즉, 각 반구의 꼬리핵에 투여되는 조성물의 부피는 50, 45, 40, 35, 30 또는 25인 상한 및 20, 25, 30, 35, 40 또는 45인 독립적으로 선택된 하한을 갖는 부피의 범위 중 임의의 부피일 수 있으며, 여기서 하한은 상한보다 작다. 일부 구현예에서, 각 반구의 피각에 투여되는 조성물의 부피는 하기 부피(㎕) 중 임의의 부피이다: 약 100 미만, 약 95 미만, 약 90 미만, 약 85 미만, 약 80 미만, 약 75 미만, 약 70 미만, 약 65 미만, 약 60 미만, 약 55 미만, 약 50 미만 또는 약 45 미만. 일부 구현예에서, 각 반구의 피각에 투여되는 조성물의 부피는 하기 부피(㎕) 중 임의의 부피이다: 약 40 초과, 약 45 초과, 약 50 초과, 약 55 초과, 약 60 초과, 약 65 초과, 약 70 초과, 약 75 초과, 약 80 초과, 약 85 초과, 약 90 초과 또는 약 95 초과. 즉, 각 반구의 피각에 투여되는 조성물의 부피는 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50 또는 45인 상한 및 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 또는 95인 독립적으로 선택된 하한을 갖는 부피의 범위 중 임의의 부피일 수 있으며, 여기서 하한은 상한보다 작다.
일부 구현예에서, 조성물은 1 ㎕/분 초과 내지 약 5 ㎕/분의 속도로 선조체에 투여된다. 일부 구현예에서, 조성물은 1 ㎕/분 초과 내지 약 5 ㎕/분의 속도로 꼬리핵과 피각에 투여된다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 1 ㎕/분 초과, 약 2 ㎕/분 초과 , 약 3 ㎕/분 초과, 약 4 ㎕/분 초과, 약 5 ㎕/분 초과, 약 6 ㎕/분 초과, 약 7 ㎕/분 초과, 약 8 ㎕/분 초과, 약 9 ㎕/분 초과 또는 약 10 ㎕/분 초과 중 임의의 속도로 선조체(꼬리핵 및/또는 피각)에 투여된다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 1 ㎕/분 내지 약 10 ㎕/분, 약 1 ㎕/분 내지 약 9 ㎕/분, 약 1 ㎕/분 내지 약 8 ㎕/분, 약 1 ㎕/분 내지 약 7 ㎕/분, 약 1 ㎕/분 내지 약 6 ㎕/분, 약 1 ㎕/분 내지 약 5 ㎕/분, 약 1 ㎕/분 내지 약 4 ㎕/분, 약 1 ㎕/분 내지 약 3 ㎕/분, 약 1 ㎕/분 내지 약 2 ㎕/분, 약 2 ㎕/분 내지 약 10 ㎕/분, 약 2 ㎕/분 내지 약 9 ㎕/분, 약 2 ㎕/분 내지 약 8 ㎕/분, 약 2 ㎕/분 내지 약 7 ㎕/분, 약 2 ㎕/분 내지 약 6 ㎕/분, 약 2 ㎕/분 내지 약 5 ㎕/분, 약 2 ㎕/분 내지 약 4 ㎕/분, 약 2 ㎕/분 내지 약 3 ㎕/분, 약 3 ㎕/분 내지 약 10 ㎕/분, 약 3 ㎕/분 내지 약 9 ㎕/분, 약 3 ㎕/분 내지 약 8 ㎕/분, 약 3 ㎕/분 내지 약 7 ㎕/분, 약 3 ㎕/분 내지 약 6 ㎕/분, 약 3 ㎕/분 내지 약 5 ㎕/분, 약 3 ㎕/분 내지 약 4 ㎕/분, 약 4 ㎕/분 내지 약 10 ㎕/분, 약 4 ㎕/분 내지 약 9 ㎕/분, 약 4 ㎕/분 내지 약 8 ㎕/분, 약 4 ㎕/분 내지 약 7 ㎕/분, 약 4 ㎕/분 내지 약 6 ㎕/분, 약 4 ㎕/분 내지 약 5 ㎕/분, 약 5 ㎕/분 내지 약 10 ㎕/분, 약 5 ㎕/분 내지 약 9 ㎕/분, 약 5 ㎕/분 내지 약 8 ㎕/분, 약 5 ㎕/분 내지 약 7 ㎕/분, 약 5 ㎕/분 내지 약 6 ㎕/분, 약 6 ㎕/분 내지 약 10 ㎕/분, 약 6 ㎕/분 내지 약 9 ㎕/분, 약 6 ㎕/분 내지 약 8 ㎕/분, 약 6 ㎕/분 내지 약 7 ㎕/분, 약 7 ㎕/분 내지 약 10 ㎕/분, 약 7 ㎕/분 내지 약 9 ㎕/분, 약 7 ㎕/분 내지 약 8 ㎕/분, 약 8 ㎕/분 내지 약 10 ㎕/분, 약 8 ㎕/분 내지 약 9 ㎕/분, 또는 약 9 ㎕/분 내지 약 10 ㎕/분 중 임의의 속도로 선조체(꼬리핵 및/또는 피각)에 투여된다. 일부 구현예에서, 조성물은 전달 동안 점진적인 유량 증가 형태(즉, "단계형(stepping)")로 투여된다.
일부 구현예에서, rAAV 입자의 투여는 1회 수행된다. 다른 구현예에서, rAAV 입자의 투여는 1회 초과로 수행된다. 당업자는, 예를 들어 치료될 장애 및/또는 치료에 대한 환자 반응에 부분적으로 기초하여 rAAV 입자의 투여를 수행할 횟수를 결정할 수 있다.
일부 구현예에서, 방법은 선조체로의 유효량의 재조합 바이러스 입자의 CNS로의 투여를 포함하며, 여기서 rAAV 입자는 적어도 대뇌 피질과 선조체에서 발현되는 이종성 핵산을 인코딩하는 rAAV 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 입자의 바이러스 역가는 적어도 약 5 × 1012개, 적어도 약 6 × 1012개, 적어도 약 7 × 1012개, 적어도 약 8 × 1012개, 적어도 약 9 × 1012개, 적어도 약 10 × 1012개, 적어도 약 11 × 1012개, 적어도 약 15 × 1012개, 적어도 약 20 × 1012개, 적어도 약 25 × 1012개, 적어도 약 30 × 1012개, 또는 적어도 약 50 × 1012개의 유전체 카피/㎖ 중 임의의 개수의 유전체 카피/㎖이다. 일부 구현예에서, rAAV 입자의 바이러스 역가는 약 5 × 1012개 내지 약 6 × 1012개, 약 6 × 1012개 내지 약 7 × 1012개, 약 7 × 1012개 내지 약 8 × 1012개, 약 8 × 1012개 내지 약 9 × 1012개, 약 9 × 1012개 내지 약 10 × 1012개, 약 10 × 1012개 내지 약 11 × 1012개, 약 11 × 1012개 내지 약 15 × 1012개, 약 15 × 1012개 내지 약 20 × 1012개, 약 20 × 1012개 내지 약 25 × 1012개, 약 25 × 1012개 내지 약 30 × 1012개, 약 30 × 1012개 내지 약 50 × 1012개, 또는 약 50 × 1012개 내지 약 100 × 1012개의 유전체 카피/㎖ 중 임의의 개수의 유전체 카피/㎖이다. 일부 구현예에서, rAAV 입자의 바이러스 역가는 약 5 × 1012개 내지 약 10 × 1012개, 약 10 × 1012개 내지 약 25 × 1012개, 또는 약 25 × 1012개 내지 약 50 × 1012개의 유전체 카피/㎖ 중 임의의 개수의 유전체 카피/㎖이다. 일부 구현예에서, rAAV 입자의 바이러스 역가는 적어도 약 5 × 109개, 적어도 약 6 × 109개, 적어도 약 7 × 109개, 적어도 약 8 × 109개, 적어도 약 9 × 109개, 적어도 약 10 × 109개, 적어도 약 11 × 109개, 적어도 약 15 × 109개, 적어도 약 20 × 109개, 적어도 약 25 × 109개, 적어도 약 30 × 109개, 또는 적어도 약 50 × 109개의 형질도입 단위/㎖ 중 임의의 개수의 형질도입 단위/㎖이다. 일부 구현예에서, rAAV 입자의 바이러스 역가는 약 5 × 109개 내지 약 6 × 109개, 약 6 × 109개 내지 약 7 × 109개, 약 7 × 109개 내지 약 8 × 109개, 약 8 × 109개 내지 약 9 × 109개, 약 9 × 109개 내지 약 10 × 109개, 약 10 × 109개 내지 약 11 × 109개, 약 11 × 109개 내지 약 15 × 109개, 약 15 × 109개 내지 약 20 × 109개, 약 20 × 109개 내지 약 25 × 109개, 약 25 × 109개 내지 약 30 × 109개, 약 30 × 109개 내지 약 50 × 109개, 또는 약 50 × 109개 내지 약 100 × 109개의 형질도입 단위/㎖ 중 임의의 개수의 형질도입 단위/㎖이다. 일부 구현예에서, rAAV 입자의 바이러스 역가는 약 5 × 109개 내지 약 10 × 109개, 약 10 × 109개 내지 약 15 × 109개, 약 15 × 109개 내지 약 25 × 109개, 또는 약 25 × 109개 내지 약 50 × 109개의 형질도입 단위/㎖ 중 임의의 개수의 형질도입 단위/㎖이다. 일부 구현예에서, rAAV 입자의 바이러스 역가는 적어도 약 5 × 1010개, 적어도 약 6 × 1010개, 적어도 약 7 × 1010개, 적어도 약 8 × 1010개, 적어도 약 9 × 1010개, 적어도 약 10 × 1010개, 적어도 약 11 × 1010개, 적어도 약 15 × 1010개, 적어도 약 20 × 1010개, 적어도 약 25 × 1010개, 적어도 약 30 × 1010개, 적어도 약 40 × 1010개, 또는 적어도 약 50 × 1010개의 감염 단위/㎖ 중 임의의 개수의 감염 단위/㎖이다. 일부 구현예에서, rAAV 입자의 바이러스 역가는 적어도 약 5 × 1010개 내지 적어도 약 6 × 1010개, 적어도 약 6 × 1010개 내지 적어도 약 7 × 1010개, 적어도 약 7 × 1010개 내지 적어도 약 8 × 1010개, 적어도 약 8 × 1010개 내지 적어도 약 9 × 1010개, 적어도 약 9 × 1010개 내지 적어도 약 10 × 1010개, 적어도 약 10 × 1010개 내지 적어도 약 11 × 1010개, 적어도 약 11 × 1010개 내지 적어도 약 15 × 1010개, 적어도 약 15 × 1010개 내지 적어도 약 20 × 1010개, 적어도 약 20 × 1010개 내지 적어도 약 25 × 1010개, 적어도 약 25 × 1010개 내지 적어도 약 30 × 1010개, 적어도 약 30 × 1010개 내지 적어도 약 40 × 1010개, 적어도 약 40 × 1010개 내지 적어도 약 50 × 1010개, 또는 적어도 약 50 × 1010개 내지 적어도 약 100 × 1010개의 감염 단위/㎖ 중 임의의 개수의 감염 단위/㎖이다. 일부 구현예에서, rAAV 입자의 바이러스 역가는 적어도 약 5 × 1010개 내지 적어도 약 10 × 1010개, 적어도 약 10 × 1010개 내지 적어도 약 15 × 1010개, 적어도 약 15 × 1010개 내지 적어도 약 25 × 1010개, 또는 적어도 약 25 × 1010개 내지 적어도 약 50 × 1010개의 감염 단위/㎖ 중 임의의 개수의 감염 단위/㎖이다.
일부 구현예에서, 방법은 선조체로의 유효량의 재조합 바이러스 입자의 CNS로의 투여를 포함하며, 여기서 rAAV 입자는 적어도 대뇌 피질과 선조체에서 발현되는 이종성 핵산을 인코딩하는 rAAV 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 개체에 투여되는 바이러스 입자의 용량은 체중 kg당 적어도 약 1 × 108개 내지 적어도 약 1 × 1013개의 유전체 카피 중 임의의 개수의 유전체 카피이다. 일부 구현예에서, 개체에 투여되는 바이러스 입자의 용량은 체중 kg당 약 1 × 108개 내지 약 1 × 1013개의 유전체 카피 중 임의의 개수의 유전체 카피이다.
일부 구현예에서, 방법은 선조체로의 유효량의 재조합 바이러스 입자의 CNS로의 투여를 포함하며, 여기서 rAAV 입자는 적어도 대뇌 피질과 선조체에서 발현되는 이종성 핵산을 인코딩하는 rAAV 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 개체에 투여되는 바이러스 입자의 총량은 적어도 약 1 × 109 내지 적어도 약 1 × 1014개의 유전체 카피이다. 일부 구현예에서, 개체에 투여되는 바이러스 입자의 총량은 약 1 × 109 내지 약 1 × 1014개의 유전체 카피이다.
본 발명의 조성물(예를 들어, rAAV 입자)은 단독으로 또는 본 명세서에 기재된 장애 중 임의의 장애 또는 모든 장애를 치료하기 위한 하나 이상의 추가의 치료제와 병용하여 사용될 수 있다. 순차적 투여 사이의 간격은 적어도 수 분, 수 시간 또는 수 일 (또는 대안적으로 그 미만) 단위일 수 있다.
IV. 발현 작제물 .
일부 양태에서, 본 발명은 rAAV 입자를 선조체에 투여함으로써 rAAV 입자를 포유동물의 CNS에 전달하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 rAAV 벡터를 포함한다. rAAV 벡터는 이종성 핵산(예를 들어, 적어도 대뇌 피질과 선조체에서 발현되는 이종성 핵산)을 인코딩할 수 있다. rAAV 벡터는 하기에 더 상세히 설명된다.
일부 구현예에서, rAAV 벡터는 이종성 핵산을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 이종성 핵산은 치료용 폴리펩티드 또는 치료용 핵산을 인코딩할 수 있다. 치료용 폴리펩티드 또는 치료용 핵산은, 예를 들어 장애(예를 들어, 본 명세서에 기재된 장애)의 증상을 개선시키고/시키거나, 장애를 예방 또는 이의 진행을 지연시키고/시키거나, 장애의 치료를 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, 하기에 더 상세히 설명되는 바와 같이 치료용 폴리펩티드 또는 치료용 핵산을 사용하여 CNS 장애를 치료한다.
이종성 핵산은 CNS 내의 하나 이상의 관심 영역에서 발현될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 이종성 핵산은 적어도 대뇌 피질과 선조체에서 발현된다. 이종성 핵산은 CNS 전반에 걸쳐 편재하여 발현 가능할 수 있거나 CNS 세포의 서브세트(subset)에서 발현될 수 있다.
일부 구현예에서, 이종성 핵산은 포유동물의 전두 피질, 후두 피질 및/또는 IV층에서 발현된다. 대뇌 피질은 언어, 의식, 기억, 주의력 및 인식에 중요한 포유동물 뇌의 외층으로 알려져 있다. 대뇌 피질은 이의 광범위한 해부학적 구조 및 복잡한 기능으로 인해 다수의 상이한 구성 요소 및 영역으로 세분된다. 이는 좌반구 및 우반구로 나뉠 수 있다. 또한, 이는 4개의 전체 엽을 함유한다: 전두엽, 두정엽, 측두엽 및 후두엽. 전두 피질은 피질의 전두엽을 지칭할 수 있고, 비-작업 기반(non-task-based) 기억, 사회적 상호작용, 의사 결정, 및 다른 복합한 인지 기능과 관련된 광범위한 신경 기능을 제공하는 것으로 알려져 있다. 후두 피질은 피질의 후두엽을 지칭할 수 있고, 시각 처리에 관여하는 것으로 알려져 있다. 두정 피질은 피질의 두정엽을 지칭할 수 있고, 언어 처리, 고유감각, 및 촉각과 관련된 감각 입력에 관여하는 것으로 알려져 있다. 측두 피질은 피질의 측두엽을 지칭할 수 있고, 언어, 기억 및 정서 연합(emotional association)에 관여하는 것으로 알려져 있다.
또한, 3가지 일반적인 유형의 피질 영역이 기술되어 있다: 감각, 운동 및 연합. 이들은 5가지 기능적 세부영역으로 나뉠 수 있다: 1차 운동 피질(근육 제어에 관여함), 전운동 피질(1차 운동 영역에 명령을 내리는 고차 운동 영역), 연합 영역(예를 들어, 두정-측두-후두 또는 전전두; 이들 영역은 계획, 기억, 주의력 및 다른 고급 인지 작업에 관여하며, 인간 피질의 대부분을 차지함), 고차 영역(감각 처리), 및 1차 감각 영역(예를 들어, 청각, 시각 및 체성감각). 일부 구현예에서, 이종성 핵산은 전전두 연합 피질 영역, 전운동 피질, 1차 체성감각 피질 영역, 감각 운동 피질, 두정 피질, 후두 피질, 및/또는 1차 운동 피질에서 발현된다.
또한, 대뇌 피질은 (표면으로부터 깊은 곳으로 나아가며) 다양한 피질층으로 나뉠 수 있고, 각각 신경 연결도(neuronal connectivity)와 세포 유형의 특징적인 패턴을 함유한다. 이들 층은 과립상층(I층 내지 III층), 내과립층(IV) 및 과립하층(V 및 VI)으로 나뉠 수 있다. 과립상층은 전형적으로 다른 피질층으로 투사되는 반면, 과립하층은 과립상층으로부터 입력을 받아 피질 바깥의 구조(예를 들어, 운동, 감각 및 시상 영역)로 출력을 보낸다. V층은 기저핵과 같은 피질하 구조에 연결되는 축삭을 갖는 피라미드 신경세포를 함유한다. 1차 운동 피질에 있는 V층 신경세포는 자발적 운동 제어에 중요한 피질척수로를 또한 형성한다. IV층은 시상으로부터 입력을 받고 원주(column)의 나머지와 연결되어, 시상과 피질의 통합과 관련된 중요한 기능을 제공한다. IV층의 특징적인 세포는 성상 세포(stellate cell)(예를 들어, 가시 성상 세포) 및 피라미드 신경세포를 포함한다.
일부 구현예에서, rAAV 입자는 대뇌 피질에서 역행 또는 순행 수송된다. 역행 수송은 화물(예를 들어, rAAV 입자)이 신경 돌기(예를 들어, 축삭)에서 세포체로 이동하는 현상을 지칭한다. 순행 수송은 세포체에서 세포막(예를 들어, 시냅스)으로의 이동을 지칭한다. AAV 입자의 역행 수송은 축삭 말단에서의 수용체 매개 내재화에 이은 핵으로의 미세소관 매개 수송에 의해 발생하는 것으로 여겨진다(예를 들어, 문헌[Kaspar et al., (2002) Mol . Ther. 5:50-56]; 문헌[Boulis et al., (2003) Neurobiol . Dis . 14:535-541]; 문헌[Kaspar et al., (2003) Science 301:839-842] 참조). 선조체는 피질의 영역과 같은 다른 뇌 영역으로부터의 투사를 함유하는 것으로 알려져 있다. 순행 수송과 역행 수송 둘 모두는 rAAV 입자가 뇌 전반에 걸쳐, 예를 들어 피질과 시상 사이에 분포될 수 있게 한다(예를 들어, 문헌[Kells, A.P. et al. (2009) Proc . Natl . Acad . Sci. 106:2407-2411] 참조). 따라서, 이론에 구속하고자 함이 없이, 하나의 뇌 영역(예를 들어, 선조체, 꼬리핵 및/또는 피각) 내로의 AAV 입자의 주입은 AAV 입자가 역행 수송을 통해 뇌의 다른 영역(예를 들어, 피질)에 전달될 수 있게 하는 것으로 여겨진다.
일부 구현예에서, 이종성 핵산은 시상, 흑색질 및/또는 해마에서 추가로 발현된다. 상기 기재된 바와 같이, 순행 수송 및/또는 역행 수송과 같은 메커니즘은 대뇌 피질 및/또는 선조체 내로 주입된 rAAV 입자가 뇌의 다른 영역, 특히 피질에 연결되는 영역에 분포될 수 있게 한다. 시상은 피질과 중뇌 사이에 있고, 피질하 영역으로부터 피질로 신호(예를 들어, 감각 및 운동)를 보내며, 각성과 수면에서 역할을 한다. 시상은 변연계의 일부이며 장기 기억 응고화의 중요한 매개자인 해마에 또한 연결된다. 기저핵의 일부인 흑색질은 많은 도파민성 신경세포를 함유하며, 움직임과 보상에 중요하다. 파킨슨병과 같은 CNS 장애는 흑색질에서의 도파민성 신경세포의 손실과 관련된다. 이는 적절한 선조체 기능에 중요한 도파민을 선조체에 또한 제공한다.
일부 양태에서, 본 발명은 포유동물의 하나 이상의 유전자 결함(예를 들어, 유전성 유전자 결함, 체세포 유전자 변형 등), 예를 들어 대상체에서 폴리펩티드 결핍 또는 폴리펩티드 과량을 초래하는 유전자 결함을 예방하거나 치료하거나, 또는 세포 및 조직에서 이러한 폴리펩티드의 결핍과 연관된 CNS 관련 장애를 발현하는 대상체에서 결핍의 중증도 또는 정도를 치료하거나 감소시키는 방법에서 사용하기 위한 rAAV 벡터를 제공한다. 일부 구현예에서, 방법은 CNS 관련 장애에 걸렸거나 걸린 것으로 의심되는 대상체에서 이러한 장애를 치료하기에 충분한 양으로 그리고 그렇게 하기에 충분한 기간 동안 대상체로의 약제학적으로 허용되는 담체 중의 하나 이상의 치료용 펩티드, 폴리펩티드, 기능성 RNA, 저해성 핵산, shRNA, 마이크로RNA, 안티센스 뉴클레오티드 등을 인코딩하는 rAAV 벡터의 투여를 포함한다.
rAAV 벡터는 CNS 관련 장애를 조절하거나 치료하는 트랜스진, 단백질을 인코딩하는 핵산 또는 기능성 RNA를 포함할 수 있다. 하기는 CNS 관련 장애와 관련된 유전자의 비제한적인 목록이다: 신경세포 아폽토시스 저해 단백질(NAIP), 신경 성장 인자(NGF), 신경아교세포 유래 성장 인자(GDNF), 뇌 유래 성장 인자(BDNF), 섬모 신경영양 인자(CNTF), 티로신 하이드록실라제(TM, GTP-사이클로하이드롤라제(GTPCH), 아스파르토아실라제(ASPA), 수퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD1) 및 아미노산 데카르복실라제(AADC). 예를 들어, 파킨슨병의 치료에 유용한 트랜스진은 도파민 합성에서 속도 제한 효소인 TH를 인코딩한다. TII 보조 인자인 테트라하이드로비옵테린을 생성하는 GTPCII를 인코딩하는 트랜스진이 또한 파킨슨병의 치료에 사용될 수 있다. L-Dopa에서 DA로의 전환을 용이하게 하는 GDNF 또는 BDNF, 또는 AADC를 인코딩하는 트랜스진이 또한 파킨슨병의 치료에 사용될 수 있다. ALS의 치료를 위해, 유용한 트랜스진은 GDNF, BDNF 또는 CNTF를 인코딩할 수 있다. 또한, ALS의 치료를 위해, 유용한 트랜스진은 SOD1의 발현을 저해하는 기능성 RNA, 예를 들어 shRNA, miRNA를 인코딩할 수 있다. 허혈의 치료를 위해, 유용한 트랜스진은 NAIP 또는 NGF를 인코딩할 수 있다. 베타-글루쿠로니다제(GUS)를 인코딩하는 트랜스진은 특정 리소좀 축적병(예를 들어, 점액다당류증 VII형(MPS VII))의 치료에 유용할 수 있다. 간시클로비어를, DNA 합성을 붕괴시켜 세포 치사를 일으키는 독성 뉴클레오티드로 전환시키는, HSV-티미딘 키나제와 같은 전구약물 활성화 유전자를 인코딩하는 트랜스진은, 예를 들어 전구약물과 병용하여 투여된 경우, 특정 암을 치료하는데 유용할 수 있다. 내인성 아편유사제, 예를 들어 β-엔도르핀을 인코딩하는 트랜스진은 통증을 치료하는데 유용할 수 있다. 본 발명의 rAAV 벡터에 사용될 수 있는 트랜스진의 다른 예는 당업자에게 명백할 것이다(예를 들어, 문헌[Costantini LC, et al., Gene Therapy (2000) 7, 93-109] 참조).
일부 구현예에서, 이종성 핵산은 치료용 핵산을 인코딩할 수 있다. 일부 구현예에서, 치료용 핵산은 제한 없이 siRNA, shRNA, RNAi, miRNA, 안티센스 RNA, 리보자임 또는 DNA자임을 포함할 수 있다. 이와 같이, 치료용 핵산은 벡터의 핵산으로부터 전사되는 경우 본 발명의 장애(예를 들어, CNS 장애)와 관련된 비정상이거나 과량의 단백질의 번역 또는 전사를 방해함으로써 본 발명의 장애를 치료할 수 있는 RNA를 인코딩할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 핵산은 비정상적이고/이거나 과량의 단백질을 인코딩하는 mRNA의 고도로 특이적인 제거 또는 감소에 의해 장애를 치료하는 RNA를 인코딩할 수 있다. 치료용 RNA 서열은 비정상적이고/이거나 과량의 단백질을 인코딩하는 mRNA의 고도로 특이적인 제거 또는 감소에 의해 장애를 치료할 수 있는 RNAi, 작은 저해성 RNA(siRNA), 마이크로 RNA(miRNA), 및/또는 리보자임(예를 들어, 망치머리 및 헤어핀 리보자임)을 포함한다.
일부 구현예에서, 이종성 핵산은 치료용 폴리펩티드를 인코딩할 수 있다. 치료용 폴리펩티드는, 예를 들어 세포 또는 유기체에 없거나 감소된 수준으로 존재하는 폴리펩티드 및/또는 효소 활성을 공급할 수 있다. 대안적으로, 치료용 폴리펩티드는 세포 또는 유기체에서 불균형을 간접적으로 상쇄시키는 폴리펩티드 및/또는 효소 활성을 공급할 수 있다. 예를 들어, 대사 효소 또는 활성의 결핍에 의해 야기되는 대사산물의 축적과 관련된 장애를 위한 치료용 폴리펩티드는 없어진 대사 효소 또는 활성을 공급할 수 있거나 대사산물의 감소를 일으키는 대안적 대사 효소 또는 활성을 공급할 수 있다. 치료용 폴리펩티드는, 예를 들어 우성 음성 폴리펩티드로서 작용함으로써 폴리펩티드(과발현되거나, 기능획득 돌연변이에 의해 활성화되거나, 활성이 다른 방식으로 잘못 조절되는 폴리펩티드)의 활성을 감소시키는데 또한 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 치료용 폴리펩티드 또는 치료용 핵산은 CNS 장애를 치료하는데 사용된다. 이론에 구속하고자 함이 없이, 치료용 폴리펩티드 또는 치료용 핵산은 기능획득이 장애와 관련된 폴리펩티드의 발현 및/또는 활성을 감소시키거나 제거하거나, 또는 장애와 관련된 결핍(예를 들어, 발현이 유사하거나 관련된 활성을 나타내는 유전자의 돌연변이)을 보완하는 폴리펩티드의 발현 및/또는 활성을 향상시키는데 사용될 수 있는 것으로 여겨진다. 본 발명의 치료용 폴리펩티드 또는 치료용 핵산에 의해 치료될 수 있는 본 발명의 CNS 장애의 비제한적인 예(표적화되거나 공급될 수 있는 예시적인 유전자는 각 장애에 대하여 괄호 안에 제공됨)는 뇌졸중(예를 들어, 카스파제 -3, Beclin1 , Ask1 , PAR1 , HIF1α , PUMA, 및/또는 문헌[Fukuda, A.M. and Badaut, J. (2013) Genes ( Basel ) 4:435-456]에 기재된 임의의 유전자), 헌팅톤병(돌연변이 HTT), 간질(예를 들어, SCN1A , NMDAR , ADK, 및/또는 문헌[Boison, D. (2010) Epilepsia 51:1659-1668]에 기재된 임의의 유전자), 파킨슨병(알파-시뉴클레인(alpha-synuclein)), 루게릭병(근위축성 측삭 경화증으로도 알려져 있음; SOD1), 알츠하이머병(tau, 아밀로이드 전구체 단백질), 피질기저핵 변성 또는 CBD(tau), 피질기저핵 신경절 변성 또는 CBGD(tau), 전두측두엽 치매 또는 FTD(tau), 진행성 핵상 마비 또는 PSP(tau), 다계통 위축증 또는 MSA(알파-시뉴클레인), 뇌암(예를 들어, 뇌암과 관련된 돌연변이 또는 과발현 종양유전자) 및 리소좀 축적병(LSD)을 포함한다. 본 발명의 장애는 피질의 넓은 영역, 예를 들어 피질의 1개 초과의 기능적 영역, 피질의 1개 초과의 엽 및/또는 전체 피질을 포함하는 장애를 포함할 수 있다. 본 발명의 치료용 폴리펩티드 또는 치료용 핵산에 의해 치료될 수 있는 본 발명의 장애의 다른 비제한적인 예는 외상성 뇌 손상, 효소 기능이상 장애, 정신 장애(외상후 스트레스 증후군을 포함함), 신경변성 질병 및 인지 장애(치매, 자폐증 및 우울증을 포함함)를 포함한다. 효소 기능이상 장애는 제한 없이 백혈구감소증(카나반병(Canavan's disease)을 포함함) 및 하기 기재된 임의의 리소좀 축적병을 포함한다.
일부 구현예에서, 치료용 폴리펩티드 또는 치료용 핵산은 리조좀 축적병을 치료하는데 사용된다. 당업계에 통상적으로 공지되어 있는 바와 같이, 리소좀 축적병은 리소좀 기능의 결함을 특징으로 하는 희귀한 유전성 대사 장애이다. 이러한 장애는 리소좀에 저장된 세포 물질의 병리학적 축적을 가져오는, 적절한 점액다당류, 당단백질 및/또는 지질 대사에 필요한 효소의 결핍에 의해 흔히 야기된다. 본 발명의 치료용 폴리펩티드 또는 치료용 핵산에 의해 치료될 수 있는 본 발명의 리소좀 축적병의 비제한적인 예(표적화되거나 공급될 수 있는 예시적인 유전자는 각 장애에 대하여 괄호 안에 제공됨)는 2형 또는 3형 고셔병(산 베타-글루코시다제, GBA), GM1 강글리오시드증(베타-갈락토시다제-1, GLB1), 헌터병(이두로네이트 2-설파타제, IDS), 크라베병(갈락토실세라미다제, GALC), a 만노시드증병(a 만노시다제, 예를 들어 알파-D-만노시다제, MAN2B1), β 만노시드증병(베타-만노시다제, MANBA), 이염성 백질이영양증병(슈도아릴설파타제 A, ARSA), 점액지질증 II/III 질병(N-아세틸글루코사민-1-포스포트랜스퍼라제, GNPTAB), 니만-픽 A 질병(산 스핑고미엘리나제, ASM), 니만-픽 C 질병(니만-픽 C 단백질, NPC1), 폼페병(산 알파-1,4-글루코시다제, GAA), 샌드호프병(헥소사미니다제 베타 서브유닛, HEXB), 센필리포 A 질병(N-설포글루코사민 설포하이드롤라제, MPS3A), 센필리포 B 질병(N-알파-아세틸글루코사미니다제, NAGLU), 센필리포 C 질병(헤파린 아세틸-CoA:알파-글루코사미니다제 N-아세틸트랜스퍼라제, MPS3C), 센필리포 D 질병(N-아세틸글루코사민-6-설파타제, GNS), 쉰들러병(알파-N-아세틸갈락토사미니다제, NAGA), 슬라이병(베타-글루쿠로니다제, GUSB), 테이-삭스병(헥소사미니다제 알파 서브유닛, HEXA) 및 월만병(리소좀 산 리파제, LIPA)을 포함한다.
추가의 리소좀 축적병뿐만 아니라 각 질병과 관련된 결함 효소가 하기 표 1에 열거되어 있다. 일부 구현예에서, 하기 표에 열거된 질병은 상응하는 효소 결함을 보완하거나 다른 방식으로 보상하는 본 발명의 치료용 폴리펩티드 또는 치료용 핵산에 의해 치료된다.
Figure pct00001
Figure pct00002
따라서, 일부 구현예에서, 치료용 폴리펩티드는 카스파제-3, Beclin1, Ask1, PAR1, HIF1α, PUMA, SCN1A, NMDAR, ADK, 알파-시뉴클레인, SOD1, 산 베타-글루코시다제(GBA), 베타-갈락토시다제-1(GLB1), 이두로네이트 2-설파타제(IDS), 갈락토실세라미다제(GALC), a 만노시다제, 알파-D-만노시다제(MAN2B1), 베타-만노시다제(MANBA), 슈도아릴설파타제 A(ARSA), N-아세틸글루코사민-1-포스포트랜스퍼라제(GNPTAB), 산 스핑고미엘리나제(ASM), 니만-픽 C 단백질(NPC1), 산 알파-1,4-글루코시다제(GAA), 헥소사미니다제 베타 서브유닛, HEXB, N-설포글루코사민 설포하이드롤라제(MPS3A), N-알파-아세틸글루코사미니다제(NAGLU), 헤파린 아세틸-CoA, 알파-글루코사미니다제 N-아세틸트랜스퍼라제(MPS3C), N-아세틸글루코사민-6-설파타제(GNS), 알파-N-아세틸갈락토사미니다제(NAGA), 베타-글루쿠로니다제(GUSB), 헥소사미니다제 알파 서브유닛(HEXA), 헌팅틴(HTT) 또는 리소좀 산 리파제(LIPA)이다. 치료용 폴리펩티드는 대상체에서 표적 폴리펩티드의 기능을 증가시키거나 감소시킬 수 있다(예를 들어, 이는 리소좀 축적병에서 없어진 기능을 공급할 수 있거나, MSA에서, 예를 들어 알파-시뉴클레인의 기능 또는 기능이상을 차단함으로써 알파-시뉴클레인의 수준을 감소시킬 수 있음). 일부 구현예에서, 치료용 핵산은 카스파제-3, Beclin1, Ask1, PAR1, HIF1α, PUMA, SCN1A, NMDAR, ADK, 알파-시뉴클레인, SOD1, 산 베타-글루코시다제(GBA), 베타-갈락토시다제-1(GLB1), 이두로네이트 2-설파타제(IDS), 갈락토실세라미다제(GALC), a 만노시다제, 알파-D-만노시다제(MAN2B1), 베타-만노시다제(MANBA), 슈도아릴설파타제 A(ARSA), N-아세틸글루코사민-1-포스포트랜스퍼라제(GNPTAB), 산 스핑고미엘리나제(ASM), 니만-픽 C 단백질(NPC1), 산 알파-1,4-글루코시다제(GAA), 헥소사미니다제 베타 서브유닛, HEXB, N-설포글루코사민 설포하이드롤라제(MPS3A), N-알파-아세틸글루코사미니다제(NAGLU), 헤파린 아세틸-CoA, 알파-글루코사미니다제 N-아세틸트랜스퍼라제(MPS3C), N-아세틸글루코사민-6-설파타제(GNS), 알파-N-아세틸갈락토사미니다제(NAGA), 베타-글루쿠로니다제(GUSB), 헥소사미니다제 알파 서브유닛(HEXA) 또는 리소좀 산 리파제(LIPA)이다. 치료용 핵산은 대상체에서 표적 폴리펩티드의 기능을 증가시키거나 감소시킬 수 있다(예를 들어, 이는 리소좀 축적병에서 없어진 기능을 공급할 수 있거나, MSA에서, 예를 들어 RNAi에 의해 알파-시뉴클레인의 수준을 감소시킬 수 있음).
피질과 선조체에서의 AAV 발현이 유용할 수 있는 예시적인 질병은 헌팅톤병(HD)이다. 헌팅톤병은 돌연변이 헌팅틴 단백질(mHTT)에서 신장된 폴리글루타민(polyQ) 반복부를 인코딩하는 CAG 반복부 확장 돌연변이에 의해 야기된다. HD는 단일 대립형질 상에서의 돌연변이로 인한 상염색체 우성 질병이므로 DNA 기반 및 RNA 기반 치료를 위하여 특히 관심을 끄는 표적이다. AAV 벡터는 핵산 치료제를 위한 이상적인 전달 시스템을 제공하며, 뇌에서 이러한 헌팅틴 감소 분자의 장기적이고 지속적인 발현을 가능하게 한다. HD에서 최대 임상 효능을 달성하기 위해서는, 선조체와 피질 둘 모두로의 전달이 필요할 것으로 예상된다. HD 환자 뇌의 사후 분석은 대뇌 피질과 해마에서의 피라미드 신경세포의 손실 이외에 선조체에서의 광범위한 중형 가시 신경세포 손실을 밝혀내었다. 선조체 및 피질의 신경세포 집단에서 mHTT 발현을 유전적으로 감소시키는 것이 어느 한 부위에서만 mHTT를 감소시키는 것보다 유의하게 큰 효능을 제공한다는 것이 최근 HD의 조건부 트랜스제닉 마우스 모델을 사용하여 밝혀졌다(문헌[Wang et al., (2014) Nature medicine 20:536-541]). 종합해 보면, 이러한 증거는 선조체와 피질 영역 둘 모두로의 유전자 치료제의 전달이 최대 치료 효능을 위해 이상적일 수 있음을 암시한다.
헌팅톤병 발병기전에 관련된 중요한 뇌 영역에 생물학적 제제를 전달하기 위한 유전자 치료 벡터의 사용은 대부분 선조체와 대뇌 피질에 특이적으로 벡터를 효과적으로 전달하는데 있어서의 물리적인 제약으로 인해 문제였다. 다수의 직접 주입이 작은 동물 뇌에서는 효과적일 수 있지만, 뇌 조직의 구조와 부피가 영장류에서 증가함에 따라 단일 부위 주입을 통해 광범위한 선조체 및 피질 전달을 달성하기가 더 어려워진다. 따라서, 선조체 투여가 피질과 선조체를 포함하는 광범위한 rAAV 분포를 달성할 수 있다는 본 발명자들의 발견은 헌팅톤병을 치료하는데 있어서 유용성을 가진다.
따라서, 본 발명의 특정 양태는 rAAV 입자를 선조체에 투여하는 단계를 포함하여 포유동물의 헌팅톤병을 치료하는 방법에 관한 것이며, 여기서 rAAV 입자는 포유동물의 적어도 대뇌 피질과 선조체에서 발현되는 이종성 핵산을 인코딩하는 rAAV 벡터를 포함한다. HD는 전체 움직임 및 운동 제어, 인지, 및 정신 건강과 관련된 진행성 증상을 특징으로 한다. 증상의 정확한 특성과 정도는 개체마다 다르지만, 일반적으로 증상은 시간이 지남에 따라 진행된다. 대부분의 경우, 증상은 운동 기능, 인지력 및 성격에서의 미묘한 붕괴와 함께 30세와 40세 사이에 나타나기 시작한다. 시간이 지남에 따라, 이러한 증상은 갑작스럽고 통제할 수 없는 움직임과 근육 통제 상실, 치매, 및 정신 질환, 예를 들어 우울증, 공격성, 불안 및 강박충동적 행동으로 진행된다. 사망은 전형적으로 증상 발생 후 10년 내지 15년째에 일어난다. HD 사례의 10% 미만은 더 빠른 질병 진행을 특징으로 하는 질병의 소아 발병형을 포함한다. 10,000명의 미국인 중 대략 1명이 HD에 걸리는 것으로 여겨진다.
대부분의 HD 사례는 HTT 유전자에서의 트리뉴클레오티드 CAG 반복부의 확장과 관련되어 있다. HTT 유전자 내의 CAG 반복부의 개수는 HD의 발현과 강하게 상호 관련되어 있다. 예를 들어, 35개 이하의 반복부를 갖는 개체는 전형적으로 HD를 발병하지 않지만, 27개 내지 35개의 반복부를 갖는 개체는 HD에 걸릴 자손을 가질 위험이 더 크다. 36개에서 40개 내지 42개의 반복부를 갖는 개체는 불완전한 HD 침투율(penetrance)을 갖는 반면, 40개 내지 42개를 초과하는 반복부를 갖는 개체는 완전한 침투율을 나타낸다. 소아 발병 HD의 사례는 60개 이상의 CAG 반복부 크기와 관련될 수 있다.
이러한 CAG 반복부 확장으로부터 생성된 polyQ 확장 Htt 단백질은 세포 응집체 또는 봉입체, 단백질 항상성의 교란, 및 전사 조절이상과 관련된다. 이러한 독성 표현형은 신체의 여러 부분과 관련될 수 있지만, 가장 전형적으로는 신경세포 치사와 관련된다. HD 환자는 흔히 피질 두께감소 및 현저한 진행성 선조체 신경세포 손실을 나타낸다. 선조체는 HD에 대한 뇌의 가장 취약한 영역(특히, 선조체 중형 가시 신경세포)인 것으로 나타나며, 초기 영향은 피각 및 꼬리핵에서 관찰된다. 선조체 가시 신경세포에서의 세포 치사, 별아교세포 수의 증가, 및 미세아교세포의 활성화가 HD 환자의 뇌에서 관찰된다. HD는 또한 해마, 대뇌 피질, 시상, 시상 하부 및 소뇌의 특정 영역에 영향을 줄 수 있다.
HD의 동물 모델은 잠재적인 치료 전략, 예를 들어 본 발명의 조성물 및 방법을 시험하는데 이용될 수 있다. HD의 마우스 모델은 당업계에 알려져 있다. 이는 돌연변이 HTT의 단편을 갖는 마우스 모델, 예를 들어 R6/1 및 N171-82Q HD 마우스를 포함한다(문헌[Harper et al., (2005) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 102:5820-5825], 문헌[Rodriguez-Lebron et al., (2005) Mol . Ther . 12:618-633], 문헌[Machida et al., (2006) Biochem . Biophys . Res. Commun . 343:190-197]). 본 명세서에 기재된 마우스 HD 모델의 또 다른 예는 YAC128 마우스 모델이다. 이 모델은 128개의 CAG 반복부를 갖는 돌연변이 인간 HTT 유전자를 발현하는 효모 인공 염색체(YAC)를 지니며, YAC128 마우스는 12개월령까지 선조체에서 Htt 응집체의 유의하고 광범위한 축적을 나타낸다(문헌[Slow et al., (2003) Hum. Mol . Genet. 12:1555-1567], 문헌[Pouladi et al., (2012) Hum. Mol . Genet. 21:2219-2232]).
HD의 다른 동물 모델이 또한 이용될 수 있다. 예를 들어, 트랜스제닉(transgenic) 래트(문헌[von Horsten, S. et al. (2003) Hum. Mol . Genet. 12:617-24]) 및 붉은털 원숭이(문헌[Yang, S.H. et al. (2008) Nature 453:921-4]) 모델이 기술되었다. 비유전적 모델이 또한 알려져 있다. 이는 설치류 또는 비인간 영장류에서 선조체 신경세포 세포 치사를 유도하기 위한 흥분독성(excitotoxic) 화합물(예를 들어, 퀴놀린산 또는 카인산) 또는 미토콘드리아 독소(예를 들어, 3-니트로프로피온산 및 말론산)의 이용을 가장 많이 포함한다(추가의 설명 및 참고문헌에 대해서는 문헌[Ramaswamy, S. et al. (2007) ILAR J. 48:356-73]을 참조함).
일부 양태에서, 본 발명은 선조체로의, 적어도 대뇌 피질과 선조체에서 발현되는 이종성 핵산을 인코딩하는 rAAV 벡터를 포함하는 rAAV 입자의 투여를 포함하는 HD의 증상을 개선시키는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, HD의 증상은 무도병, 경직, 통제할 수 없는 신체 움직임, 근육 통제 상실, 조정력 결여, 초조(restlessness), 느려진 안구 움직임, 비정상적인 자세, 불안정, 실조성 보행, 비정상적인 안면 표정, 언어능력 문제, 저작 및/또는 삼키기의 어려움, 수면 장애, 발작, 치매, 인지력 결손(예를 들어, 계획, 추상적 사고, 유연성, 규칙 습득, 대인 민감성(interpersonal sensitivity), 자기 통제, 주의력, 학습 및 기억과 관련된 능력 저하), 우울증, 불안, 성격 변화, 공격성, 충동적 행동, 강박충동적 행동, 성욕과다증, 정신병 증상, 무감동(apathy), 과민성, 자살 생각, 체중 감소, 근육 위축, 심장 마비, 내당력 저하, 고환 위축 및 골다공증을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
일부 양태에서, 본 발명은 HD를 예방하거나 이의 진행을 지연시키는 방법을 제공한다. 상염색체 우성 HD는 유전자형이 판별될 수 있는 유전병이다. 예를 들어, HTT 내의 CAG 반복부의 개수는 PCR 기반 반복부 크기결정에 의해 결정될 수 있다. 이러한 유형의 진단은 (예를 들어, 임상 증상의 제시와 함께) 소아 또는 성인의 직접 검사, (예를 들어, 융모막 융모 샘플링 또는 양수천자에 의한) 태아 스크리닝 또는 태아 배제 검사, 또는 착상전 배아 스크리닝을 통해 생애의 어떠한 단계에서도 수행될 수 있다. 추가로, HD는 뇌 영상화에 의해 꼬리핵 및/또는 피각 및/또는 확장된 뇌실의 수축을 찾아냄으로써 진단될 수 있다. 이러한 증상은 HD의 가족력 및/또는 임상적 증상과 조합되어 HD를 나타낼 수 있다.
HD의 증상의 개선을 결정하는 수단은 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 통합형 헌팅톤병 평가 척도(Unified Huntington's Disease Rating Scale, UHDRS)를 이용하여 운동 기능, 인지 기능, 행동 비정상 및 기능적 능력(functional capacity)을 평가할 수 있다(예를 들어, 문헌[Huntington Study Group (1996) Movement Disorders 11:136-42] 참조). 이러한 평가 척도는 HD 활동 및 일상 생활 척도(HD Activities and Daily Living Scale), Marsden과 Quinn의 무도병 중증도 척도, 신체 장애 및 독립성 척도(Physical Disability and Independence scale), HD 운동 평가 척도(HDMRS), HD 기능적 능력 척도(HDFCS) 및 정량화 신경학적 검사(quantitated neurological exam, QNE)와 같은 시험으로부터의 요소를 포함하는, 질병 병리의 다수의 양상에 대한 균일하고 포괄적인 시험을 제공하도록 개발되었다. HD 증상의 개선을 결정하는데 유용한 다른 시험은 제한 없이 몬트리올 인지력 평가(Montreal Cognitive Assessment), 뇌 영상화(예를 들어, MRI), 범주 유창성 시험(Category Fluency Test), 선로 잇기 시험(Trail Making Test), 지도 찾기(Map Search), 스트룹 단어 읽기 시험(Stroop Word Reading Test), 빨리 두드리기 작업(Speeded Tapping Task), 및 기호 숫자 양식 시험(Symbol Digit Modalities Test)을 포함할 수 있다.
본 발명의 일부 양태에서, 방법은 HD에 걸린 인간의 치료에 이용된다. 상기 기재된 바와 같이, HD는 상염색체 우성 방식으로 유전되며, HTT 유전자 내의 CAG 반복부 확장에 의해 야기된다. rAAV 입자는, 예를 들어 HTT를 표적화하는 치료용 폴리펩티드 또는 핵산을 인코딩하는 이종성 핵산을 포함할 수 있다. 소아 발병 HD는 부계로부터 가장 많이 유전된다. 헌팅톤병 유사 표현형은 또한 다른 유전자좌, 예를 들어, HDL1 , PRNP , HDL2 , HDL3 및 HDL4와 상호 관련되어 있다. GRIN2A , GRIN2B, MSX1 , GRIK2 , 및 APOE 유전자에서의 돌연변이를 비롯한 다른 유전자좌가 HD 증상의 발현을 변형시킬 수 있는 것으로 여겨진다.
일부 구현예에서, 재조합 바이러스 입자의 전달은 선조체로의 바이러스 입자의 주입에 의해 이루어진다. 선조체내 투여는 재조합 바이러스 입자를 HD에 의해 크게 영향을 받는 뇌의 영역인 선조체(피각 및 꼬리핵을 포함함)에 전달한다. 추가로 그리고 이론에 구속하고자 함이 없이, 선조체 내로 주입된 재조합 바이러스 입자(예를 들어, rAAV 입자)는 제한 없이 투사 영역(예를 들어, 대뇌 피질)을 포함하는 뇌의 다른 영역으로 (예를 들어, 역행 수송을 통해) 또한 분산될 수 있는 것으로 여겨진다. 일부 구현예에서, 재조합 바이러스 입자는 대류 강화 전달(예를 들어, 선조체로의 대류 강화 전달)에 의해 전달된다.
일부 구현예에서, 트랜스진(예를 들어, 본 명세서에 기재된 이종성 핵산)은 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있다. 예시적인 프로모터는 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉시형 초기 프로모터, GUSB 프로모터, RSV LTR, MoMLV LTR, 포스포글리세레이트 키나제-1(PGK) 프로모터, 시미안 바이러스 40(SV40) 프로모터 및 CK6 프로모터, 트랜스티레틴 프로모터(TTR), TK 프로모터, 테트라사이클린 반응성 프로모터(TRE), HBV 프로모터, hAAT 프로모터, LSP 프로모터, 키메라 간 특이적 프모터(LSP), E2F 프로모터, 텔로머라제(hTERT) 프로모터; 사이토메갈로바이러스 인핸서/닭 베타-액틴/토끼 β-글로빈(CAG) 프로모터(CAG 프로모터; 문헌[Niwa et al., Gene, 1991, 108(2):193-9]) 및 신장 인자 1-알파 프로모터(EFl-알파) 프로모터(문헌[Kim et al., Gene, 1990, 91(2):217-23] 및 문헌[Guo et al., Gene Ther ., 1996, 3(9):802-10])를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 프로모터는 인간 β-글루쿠로니다제 프로모터, 또는 닭 β-액틴(CBA) 프로모터에 연결된 사이토메갈로바이러스 인핸서를 포함한다. 프로모터는 항시적, 유도성 또는 억제성 프로모터일 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명은 CBA 프로모터에 작동가능하게 연결된 본 발명의 이종성 핵산을 인코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 일부 구현예에서, 프로모터는 CBA 프로모터, 최소 CBA 프로모터, CMV 프로모터 또는 GUSB 프로모터이다.
항시적 프로모터의 예는 제한 없이 레트로바이러스 라우스 육종 바이러스(RSV) LTR 프로모터(선택적으로 RSV 인핸서를 가짐), 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터(선택적으로 CMV 인핸서를 가짐)[예를 들어, 문헌[Boshart et al., Cell, 41:521-530 (1985)] 참조], SV40 프로모터, 디히드로폴레이트 환원효소 프로모터, 13-액틴 프로모터, 포스포글리세롤 키나제(PGK) 프로모터 및 EFla 프로모터[Invitrogen]를 포함한다.
유도성 프로모터는 유전자 발현의 조절을 가능하게 하며, 외인적으로 공급된 화합물, 환경 요인, 예를 들어 온도, 또는 특정 생리학적 상태의 존재, 예를 들어, 급성기, 세포의 특정 분화 상태에 의해, 또는 복제하는 세포에서만 조절될 수 있다. 유도성 프로모터 및 유도성 시스템은 제한 없이 Invitrogen, Clontech 및 Ariad를 포함하는 다양한 상업적 공급처로부터 구입 가능하다. 많은 다른 시스템이 기술되어 있으며, 당업자에 의해 용이하게 선택될 수 있다. 외인적으로 공급된 프로모터에 의해 조절되는 유도성 프로모터의 예는 아연 유도성 양 메탈로티오닌(MT) 프로모터, 덱사메타손(Dex) 유도성 마우스 유암 바이러스(MMTV) 프로모터, T7 중합효소 프로모터 시스템(WO 98/10088호); 탈피호르몬 곤충 프로모터(문헌[No et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,93:3346-3351 (1996)]), 테트라사이클린 억제성 시스템(문헌[Gossen et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 89:5547-5551 (1992)]), 테트라사이클린 유도성 시스템(문헌[Gossen et al., Science, 268:1766-1769 (1995)], 또한 문헌[Harvey et al., Curr . Opin . Chem . Biol., 2:512-518 (1998)]을 참조함), RU486 유도성 시스템(문헌[Wang et al., Nat. Biotech., 15:239-243 (1997)] 및 문헌[Wang et al., Gene Ther., 4:432-441 (1997)]) 및 라파마이신 유도성 시스템(Magari et al., J. Clin . Invest., 100:2865-2872 (1997))을 포함한다. 이와 관련하여 유용할 수 있는 유도성 프로모터의 또 다른 유형은 특정 생리학적 상태, 예를 들어 온도, 급성기, 세포의 특정 분화 상태에 의해, 또는 복제하는 세포에서만 조절되는 프로모터이다.
또 다른 구현예에서, 트랜스진에 대한 천연 프로모터 또는 이의 단편이 사용될 것이다. 천연 프로모터는 트랜스진의 발현이 천연 발현을 모방해야 하는 것이 요망되는 경우에 바람직할 수 있다. 천연 프로모터는 트랜스진의 발현이 일시적 또는 발달적으로, 또는 조직 특이적 방식으로, 또는 특정 전사 자극에 반응하여 조절되어야 하는 경우에 사용될 수 있다. 추가의 구현예에서, 다른 천연 발현 제어 요소, 예를 들어, 인핸서 요소, 폴리아데닐화 부위 또는 코작(Kozak) 컨센서스 서열을 또한 사용하여 천연 발현을 모방할 수 있다.
일부 구현예에서, 조절 서열은 조직 특이적 유전자 발현 능력을 부여한다. 일부 경우에, 조직 특이적 조절 서열은 조직 특이적 방식으로 전사를 유도하는 조직 특이적 전사 인자와 결합한다. 이러한 조직 특이적 조절 서열(예를 들어, 프로모터, 인핸서 등)은 당업계에 잘 공지되어 있다. 예시적 조직 특이적 조절 서열은 다음과 같은 조직 특이적 프로모터를 포함하지만 이에 한정되지 않는다: 신경세포성, 예를 들어, 신경세포 특이적 에놀라제(NSE) 프로모터(문헌[Andersen et al., Cell. Mol . Neurobiol., 13:503-15 (1993)]), 신경미세섬유 경쇄 유전자 프로모터(문헌[Piccioli et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 88:5611-5 (1991)]), 및 신경세포 특이적 vgf 유전자 프로모터(문헌[Piccioli et al., Neuron, 15:373-84 (1995)]). 일부 구현예에서, 조직 특이적 프로모터는 신경세포 핵(NeuN), 아교 섬유 산성 단백질(GFAP), 선종성 결장폴립증(APC), 및 이온화 칼슘 결합 어댑터 분자 1(Iba-1)로부터 선택된 유전자의 프로모터이다. 다른 적절한 조직 특이적 프로모터는 당업자에게 명백할 것이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 닭 베타-액틴 프로모터이다.
일부 구현예에서, 프로모터는 CNS의 세포에서 이종성 핵산을 발현시킨다. 이와 같이, 일부 구현예에서, 본 발명의 치료용 폴리펩티드 또는 치료용 핵산은 CNS 장애를 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 뇌 세포에서 이종성 핵산을 발현시킨다. 뇌 세포는 제한 없이 신경세포(예를 들어, 감각 신경세포, 운동 신경세포, 사이신경세포(interneuron), 도파민성 신경세포, 중형 가시 신경세포, 콜린성 신경세포, GABA성(GABAergic) 신경세포, 피라미드 신경세포 등), 신경아교세포(예를 들어, 미세아교세포, 큰아교세포, 별아교세포, 희소돌기아교세포, 뇌실막세포, 방사 아교세포(radial glia) 등), 뇌 실질 세포(brain parenchyma cell), 미세아교세포, 뇌실막세포, 및/또는 푸르킨예(Purkinje) 세포를 포함하는 당업계에 공지된 임의의 뇌세포를 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 신경세포 및/또는 신경아교세포에서 이종성 핵산을 발현시킨다. 일부 구현예에서, 신경세포는 꼬리핵의 중형 가시 신경세포, 피각의 중형 가시 신경세포, 피질 IV층의 신경세포 및/또는 피질층 V의 신경세포이다.
CNS 세포, 뇌 세포, 신경세포 및 신경아교세포에서 전사체(예를 들어, 이종성 트랜스진)를 발현시키는 다양한 프로모터가 당업계에 공지되어 있으며, 본 명세서에 기재되어 있다. 이러한 프로모터는 선택된 유전자와 통상적으로 관련된 제어 서열 또는 이종성 제어 서열을 포함할 수 있다. 흔히, 유용한 이종성 제어 서열은 포유동물 또는 바이러스 유전자를 인코딩하는 서열로부터 유래된 것을 포함한다. 예는 제한 없이 SV40 초기 프로모터, 마우스 유암 바이러스 LTR 프로모터, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(Ad MLP), 단순 헤르페스 바이러스(HSV) 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 예를 들어 CMV 즉시형 초기 프로모터 영역(CMVIE), 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터, 합성 프로모터, 하이브리드 프로모터 등을 포함한다. 또한, 뮤린 메탈로티오네인 유전자와 같은 비바이러스 유전자로부터 유래된 서열이 또한 사용될 수 있다. 이러한 프로모터 서열은, 예를 들어 Stratagene(San Diego, CA)으로부터 상업적으로 구입 가능하다. CNS 특이적 프로모터 및 유도성 프로모터가 사용될 수 있다. CNS 특이적 프로모터의 예는 제한 없이 CNS 특이적 유전자, 예를 들어 미엘린 염기성 단백질(MBP), 아교 섬유 산성 단백질(GFAP) 및 신경세포 특이적 에놀라제(NSE)로부터 단리된 것을 포함한다. 유도성 프로모터의 예는, 특히 탈피호르몬, 테트라사이클린, 메탈로티오네인 및 저산소증에 대한 DNA 반응성 요소를 포함한다.
본 발명은 AAV 바이러스 입자 내로의 이종성 핵산을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열의 도입 또는 패키징을 위한 재조합 바이러스 유전체의 사용을 고려한다. 재조합 바이러스 유전체는 이종성 트랜스진의 발현을 확립하기 위한 임의의 요소, 예를 들어 프로모터, 이종성 핵산, ITR, 리보솜 결합 요소, 종결인자, 인핸서, 선택 마커, 인트론, polyA 신호 및/또는 복제 원점을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터는 인핸서, 스플라이스 공여체/스플라이스 수용체 쌍, 매트릭스 부착 부위 또는 폴리아데닐화 신호 중 하나 이상을 포함한다.
일부 구현예에서, 치료용 핵산 또는 폴리펩티드를 인코딩하는 벡터를 포함하는 유효량의 rAAV 입자의 투여는 투여 부위(예를 들어, 선조체 및/또는 피질) 또는 그 근처에 있거나 투여 부위로부터 더 멀리 떨어져 있는 세포(예를 들어, CNS 세포, 뇌 세포, 신경세포 및/또는 신경아교세포)를 형질도입시킨다. 일부 구현예에서, 신경세포의 약 5% 초과, 약 10% 초과, 약 15% 초과, 약 20% 초과, 약 25% 초과, 약 30% 초과, 약 35% 초과, 약 40% 초과, 약 45% 초과, 약 50% 초과, 약 55% 초과, 약 60% 초과, 약 65% 초과, 약 70% 초과, 약 75% 초과 또는 약 100% 중 임의의 %가 형질도입된다. 일부 구현예에서, 신경세포의 약 5% 내지 약 100%, 약 10% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 30%, 약 25% 내지 약 75%, 약 25% 내지 약 50%, 또는 약 30% 내지 약 50%가 형질도입된다. miRNA를 발현하는 재조합 바이러스 입자에 의해 형질도입된 신경세포를 확인하는 방법은 당업계에 알려져 있으며; 예를 들어, 면역조직화학, RNA 검출(예를 들어, qPCR, 노던 블롯팅, RNA-seq, 원위치 하이브리드화 등) 또는 강화 녹색 형광 단백질과 같은 공동 발현되는 마커의 사용을 이용하여 발현을 검출할 수 있다.
일부 양태에서, 본 발명은 재조합 자기 보완성(self-complementing) 유전체(예를 들어, 자기 상보성 rAAV 벡터)를 포함하는 바이러스 입자를 제공한다. 자기 보완성 벡터 유전체를 갖는 AAV 바이러스 입자 및 자기 보완성 AAV 유전체의 사용 방법은 미국 특허 제6,596,535호; 미국 특허 제7,125,717호; 미국 특허 제7,465,583호; 미국 특허 제7,785,888호; 미국 특허 제7,790,154호; 미국 특허 제7,846,729호; 미국 특허 제8,093,054호; 및 미국 특허 제8,361,457호; 및 문헌[Wang Z., et al., (2003) Gene Ther 10:2105-2111]에 기재되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함되어 있다. 자기 보완성 유전체를 포함하는 rAAV는 이의 부분적으로 보완성인 서열(예를 들어, 이종성 핵산의 코딩 및 비코딩 가닥을 보완함)에 의해 이중 가닥 DNA 분자를 신속히 형성할 것이다. 일부 구현예에서, 벡터는 이종성 핵산을 인코딩하는 제1 핵산 서열 및 그 핵산의 상보체를 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하며, 여기서 제1 핵산 서열은 그 길이의 대부분 또는 전부를 따라 제2 핵산 서열과 가닥내 염기쌍을 형성할 수 있다.
일부 구현예에서, 제1 이종성 핵산 서열과 제2 이종성 핵산 서열은 돌연변이된 ITR(예를 들어, 우측 ITR)에 의해 연결되어 있다. 일부 구현예에서, ITR은 폴리뉴클레오티드 서열 5'-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCC GGGCGACCAAAGGTCGCCCACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCG-3'(SEQ ID NO:1)를 포함한다. 돌연변이된 ITR은 말단 분해 서열을 포함하는 D 영역의 결실을 포함한다. 결과적으로, AAV 바이러스 유전체의 복제 시에, rep 단백질은 돌연변이된 ITR에서 바이러스 유전체를 절단하지 않을 것이며, 따라서 5'에서 3' 순서로 하기를 포함하는 재조합 바이러스 유전체가 바이러스 캡시드에 패키징될 것이다: AAV ITR, 조절 서열을 포함하는 제1 이종성 폴리뉴클레오티드 서열, 돌연변이된 AAV ITR, 제1 이종성 폴리뉴클레오티드에 대해 역배향인 제2 이종성 폴리뉴클레오티드 및 제3 AAV ITR.
V. 바이러스 입자 및 바이러스 입자를 생성시키는 방법
rAAV 바이러스 입자
본 발명은 rAAV 입자를 투여하기 위한 방법 및 시스템을 제공한다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 rAAV 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스 입자는 1개 또는 2개의 AAV 역위 말단 반복부(ITR)에 의해 플랭킹된 이종성 핵산을 포함하는 핵산을 포함하는 재조합 AAV 입자이다. 핵산은 AAV 입자에 캡시드화된다. AAV 입자는 또한 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 관심 코딩 서열(들)(예를 들어, 이종성 핵산)과 전사 방향으로 작동적으로 연결된 성분, 전사 개시 서열과 전사 종결 서열을 포함하는 제어 서열을 포함하여 발현 카세트를 형성한다. 발현 카세트는 적어도 하나의 기능적 AAV ITR 서열에 의해 5' 및 3' 말단에서 플랭킹되어 있다. "기능적 AAV ITR 서열"이란 ITR 서열이 AAV 비리온의 구제, 복제 및 패키징을 위해 의도된 바와 같이 기능함을 의미한다. 문헌[Davidson et al., PNAS, 2000, 97(7)3428-32]; 문헌[Passini et al., J. Virol., 2003, 77(12):7034-40]; 및 문헌[Pechan et al., Gene Ther., 2009, 16:10-16]을 참조하며, 이들 문헌은 모두 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함되어 있다. 본 발명의 일부 양태를 실시하기 위해, 재조합 벡터는 캡시드화에 필수적인 AAV의 모든 서열 및 rAAV에 의한 감염을 위한 물리적 구조를 적어도 포함한다. 본 발명의 벡터에 사용하기 위한 AAV ITR은 야생형 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 문헌[Kotin, Hum. Gene Ther., 1994, 5:793-801]에 기재된 바와 같음)를 가질 필요가 없고, 뉴클레오티드의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 변경될 수 있거나 AAV ITR은 여러 AAV 혈청형 중 임의의 혈청형으로부터 유래될 수 있다. 현재 40가지가 넘는 AAV 혈청이 알려져 있고, 새로운 혈청 및 기존 혈청형의 변이형이 계속 확인되고 있다. 문헌[Gao et al., PNAS, 2002, 99(18): 11854-6]; 문헌[Gao et al., PNAS, 2003, 100(10):6081-6]; 및 문헌[Bossis et al., J. Virol ., 2003, 77(12):6799-810]을 참조한다. 임의의 AAV 혈청형의 사용이 본 발명의 범주 내에서 고려된다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터는 AAV 혈청형으로부터 유래된 벡터이고, 이 AAV 혈청형은 제한 없이 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, 염소 AAV, 소 AAV, 또는 마우스 AAV 등인 AAV ITR을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV ITR의 핵산은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, 염소 AAV, 소 AAV, 또는 마우스 AAV 혈청형 ITR 등이다. 특정 구현예에서, AAV의 핵산은 AAV2 ITR을 포함한다.
일부 구현예에서, 벡터는 스터퍼 핵산을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 스터퍼 핵산은 녹색 형광 단백질을 인코딩할 수 있다. 일부 구현예에서, 스터퍼 핵산은 프로모터와, RNAi를 인코딩하는 핵산 사이에 위치할 수 있다.
일부 구현예에서, rAAV 입자는 AAV1 캡시드, AAV2 캡시드, AAV3 캡시드, AAV4 캡시드, AAV5 캡시드, AAV6 캡시드(예를 들어, 야생형 AAV6 캡시드, 또는 미국 특허 출원 공개 제2012/0164106호에 기재된 바와 같은, ShH10과 같은 변이체 AAV6 캡시드), AAV7 캡시드, AAV8 캡시드, AAVrh8 캡시드, AAVrh8R 캡시드, AAV9 캡시드(예를 들어, 야생형 AAV9 캡시드, 또는 미국 특허 출원 공개 제2013/0323226호에 기재된 바와 같은 변형된 AAV9 캡시드), AAV10 캡시드, AAVrh10 캡시드, AAV11 캡시드, AAV12 캡시드, 티로신 캡시드 돌연변이체, 헤파린 결합 캡시드 돌연변이체, AAV2R471A 캡시드, AAVAAV2/2-7m8 캡시드, AAV DJ 캡시드(예를 들어, AAV-DJ/8 캡시드, AAV-DJ/9 캡시드, 또는 미국 특허 출원 공개 제2012/0066783호에 기재된 임의의 다른 캡시드), AAV2 N587A 캡시드, AAV2 E548A 캡시드, AAV2 N708A 캡시드, AAV V708K 캡시드, 염소 AAV 캡시드, AAV1/AAV2 키메라 캡시드, 소 AAV 캡시드, 마우스 AAV 캡시드, rAAV2/HBoV1 캡시드, 또는 미국 특허 제8,283,151호 또는 국제특허 공개 WO/2003/042397호에 기재된 AAV 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, 돌연변이 캡시드 단백질은 AAV 캡시드를 형성하는 능력을 유지한다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 AAV5 티로신 돌연변이 캡시드 단백질을 포함한다(문헌[Zhong L. et al., (2008) Proc Natl Acad Sci U S A 105(22):7827-7832]). 추가의 구현예에서, rAAV 입자는 클레이드 A 내지 클레이드 F로부터의 AAV 혈청형의 캡시드 단백질을 포함한다(문헌[Gao, et al., J. Virol . 2004, 78(12):6381]). 일부 구현예에서, rAAV 입자는 AAV1 캡시드 단백질 또는 이의 돌연변이체를 포함한다. 다른 구현예에서, rAAV 입자는 AAV2 캡시드 단백질 또는 이의 돌연변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 혈청형은 AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10 또는 AAVrh10이다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 AAV 혈청형 1(AAV1) 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 AAV 혈청형 2(AAV2) 캡시드를 포함한다.
다양한 AAV 혈청을 사용하여 특정 표적 세포의 형질도입을 최적화하거나 특정 표적 조직(예를 들어, CNS 조직) 내의 특정 세포 유형을 표적화한다. rAAV 입자는 동일한 혈청형 또는 상이한 혈청형들(예를 들어, 혼합 혈청형)로부터 유래한 바이러스 단백질 및 바이러스 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, rAAV 입자는 AAV1 캡시드 단백질과 적어도 하나의 AAV2 ITR을 포함할 수 있거나 AAV2 캡시드 단백질과 적어도 하나의 AAV1 ITR을 포함할 수 있다. rAAV 입자의 생성을 위한 AAV 혈청형의 임의의 조합은 각각의 조합이 본 명세서에 명확히 언급되어 있기라도 한 것처럼 본 명세서에 제공된다. 본 발명은 적어도 하나의 AAV2 ITR에 의해 플랭킹된 본 발명의 rAAV 벡터(예를 들어, 이종성 핵산을 포함하는 발현 카세트) 및 AAV1 캡시드를 포함하는 rAAV 입자를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 AAV2 캡시드를 포함하는 rAAV 입자를 제공한다. 일부 구현예에서, ITR과 캡시드는 AAV2로부터 유래된다. 일부 구현예에서, ITR은 AAV2로부터 유래되고, 캡시드는 AAV1으로부터 유래된다.
AAV 입자의 생성
트랜스펙션, 안정한 세포주 생성, 및 아데노바이러스-AAV 하이브리드, 헤르페스바이러스-AAV 하이브리드(문헌[Conway, JE et al., (1997) J. Virology 71(11):8780-8789]) 및 바큘로바이러스-AAV 하이브리드를 포함하는 감염성 하이브리드 바이러스 생성 시스템을 포함하는 많은 방법이 rAAV 벡터의 생성을 위해 당업계에 공지되어 있다. rAAV 바이러스 입자의 생성을 위한 rAAV 생성 배양물은 모두 1) 예를 들어, 인간 유래 세포주, 예컨대 HeLa, A549 또는 293 세포, 또는 바큘러바이러스 생성 시스템의 경우에는 곤충 유래 세포주, 예컨대 SF-9를 포함하는 적합한 숙주 세포; 2) 야생형 또는 돌연변이 아데노바이러스(예를 들어, 온도 민감성 아데노바이러스), 헤르페스 바이러스, 바큘로바이러스, 또는 헬퍼 기능을 제공하는 플라스미드 작제물에 의해 제공되는, 적합한 헬퍼 바이러스 기능; 3) AAV rep 및 cap 유전자 및 유전자 생성물; 4) 적어도 하나의 AAV ITR 서열에 의해 플랭킹된 핵산(예를 들어, 치료용 핵산); 및 5) rAAV 생성을 지지하기 위한 적합한 배지 및 배지 성분을 필요로 한다. 일부 구현예에서, AAV rep 및 cap 유전자 생성물은 임의의 AAV 혈청형으로부터 유래될 수 있다. 일반적으로, AAV rep 유전자 생성물은 rep 유전자 생성물이 복제하여 rAAV 유전체를 패키징하도록 기능할 수 있는 한 rAAV 벡터 유전체의 ITR과 동일한 혈청형을 갖지만, 반드시 그러한 것은 아니다. 당업계에 공지된 적합한 배지가 rAAV 벡터의 생성을 위해 사용될 수 있다. 이러한 배지는 제한 없이, 변형 이글 배지(MEM), 둘베코 변형 이글 배지(DMEM), 미국 특허 제6,566,118호에 기재된 것과 같은 맞춤형 제형(custom formulation) 및 미국 특허 제6,723,551호에 기재된 바와 같은 Sf-900 II SFM 배지를 비롯한 Hyclone Laboratories 및 JRH에 의해 생산되는 배지를 포함하고, 이들 미국 특허는 각각 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함되며, 특히 재조합 AAV 벡터의 생성에 사용하기 위한 맞춤형 배지 제형에 관하여 그러하다. 일부 구현예에서, AAV 헬퍼 기능은 아데노바이러스 또는 HSV에 의해 제공된다. 일부 구현예에서, AAV 헬퍼 기능은 바큘로바이러스에 의해 제공되며, 숙주 세포는 곤충 세포(예를 들어, 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)(Sf9) 세포)이다.
일부 구현예에서, rAAV 입자는 삼중 트랜스펙션법, 예를 들어 하기 제공되는 예시적인 삼중 트랜스펙션법에 의해 생성될 수 있다. 간략하게 말하면, 헬퍼 아데노바이러스 플라스미드과 함께 rep 유전자 및 캡시드 유전자를 함유하는 플라스미드를 (예를 들어, 칼슘 포스페이트법을 사용하여) 세포주(예를 들어, HEK-293 세포) 내로 트랜스펙션시킬 수 있고, 바이러스를 수집하고 선택적으로 정제할 수 있다. 이와 같이, 일부 구현예에서, rAAV 입자는 숙주 세포 내로의, rAAV 벡터를 인코딩하는 핵산, AAV rep 및 cap를 인코딩하는 핵산, 및 AAV 헬퍼 바이러스 기능을 인코딩하는 핵산의 삼중 트랜스펙션에 의해 생성되었으며, 여기서 숙주 세포로의 핵산의 트랜스펙션은 rAAV 입자를 생성할 수 있는 숙주 세포를 발생시킨다.
일부 구현예에서, rAAV 입자는 생산 세포주 방법, 예를 들어 하기 제공되는 예시적인 생산 세포주 방법(또한, 문헌[Martin et al., (2013) Human Gene Therapy Methods 24:253-269]에서 언급된 방법 참조)에 의해 생성될 수 있다. 간략하게 말하면, 세포주(예를 들어, HeLa 세포주)를 rep 유전자, 캡시드 유전자 및 프로모터 이종성 핵산 서열을 함유하는 플라스미드로 안정하게 트랜스펙션시킬 수 있다. 세포주를 스크리닝하여 rAAV 생성을 위한 선도 클론(lead clone)을 선택할 수 있고, 이어서 이를 생산용 생물반응기로 증식시키고, 헬퍼로서 아데노바이러스(예를 들어, 야생형 아데노바이러스)로 감염시켜 rAAV 생성을 개시할 수 있다. 후속하여 바이러스를 수거할 수 있고, 아데노바이러스를 (예를 들어, 열에 의해) 비활성화시키고/시키거나 제거할 수 있고, rAAV 입자를 정제할 수 있다. 이와 같이, 일부 구현예에서, rAAV 벡터를 인코딩하는 핵산, AAV rep 및 cap을 인코딩하는 핵산, 및 AAV 헬퍼 바이러스 기능을 인코딩하는 핵산 중 하나 이상을 포함하는 생산 세포주에 의해 rAAV 입자를 생성하였다.
일부 양태에서, (a) rAAV 입자가 생성되는 조건 하에서 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 숙주 세포는 (i) 하나 이상의 AAV 패키지 유전자(여기서, 상기 각각의 AAV 패키징 유전자는 AAV 복제 및/또는 캡시드화 단백질을 인코딩함); (ii) 적어도 하나의 AAV ITR에 의해 플랭킹된 본 명세서에 기재된 바와 같은 이종성 핵산을 인코딩하는 핵산을 포함하는 rAAV 프로-벡터, 및 (iii) AAV 헬퍼 기능을 포함하는, 단계; 및 (b) 숙주 세포에 의해 생성된 rAAV 입자를 회수하는 단계를 포함하여 본 발명에 개시된 바와 같은 임의의 rAAV 입자를 생성하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 적어도 하나의 AAV ITR은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, 염소 AAV, 소 AAV, 또는 마우스 AAV 혈청형 ITR 등으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 캡시드화 단백질은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAVAAV2/2-7m8, AAV DJ, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV V708K, 염소 AAV, AAV1/AAV2 키메라, 소 AAV, 마우스 AAV 캡시드 rAAV2/HBoV1 혈청형 캡시드 단백질 또는 이의 돌연변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 캡시드화 단백질은 티로신 캡시드 돌연변이를 갖는 AAV5 캡시드 단백질을 포함하는 AAV5 캡시드 단백질이다. 일부 구현예에서, 캡시드화 단백질은 티로신 캡시드 돌연변이를 갖는 AAV5 캡시드 단백질을 포함하는 AAV5 캡시드 단백질이고, ITR은 AAV2 ITR이다. 추가의 구현예에서, rAAV 입자는 클레이드 A 내지 클레이드 F로부터의 AAV 혈청형의 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 AAV1 캡시드, 및 AAV2 ITR, 돌연변이 AA2 ITR 및 치료용 트랜스진/핵산을 인코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 유전체를 포함한다. 일부 구현예에서, AAV ITR은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, 염소 AAV, 소 AAV, 또는 마우스 AAV 혈청형 ITR이다. 특정 구현예에서, AAV ITR은 AAV2 ITR이다.
본 발명의 적합한 rAAV 생성 배양 배지는 0.5% 내지 20%(v/v 또는 w/v) 수준의 혈청 또는 혈청 유래 재조합 단백질로 보충될 수 있다. 대안적으로, 당업계에 공지된 바와 같이, rAAV 벡터는 동물 유래 생성물이 없는 배지로 또한 지칭될 수 있는 무혈청 조건에서 생성될 수 있다. 당업자는 rAAV 벡터의 생성을 지지하도록 설계된 상업용 또는 맞춤형 배지가, 생성 배양물에서 rAAV의 역가를 증가시키기 위해, 제한 없이 포도당, 비타민, 아미노산 및 또는 성장 인자를 포함하는 당업계에 공지된 하나 이상의 세포 배양 성분으로 또한 보충될 수 있음을 인식할 수 있다.
rAAV 생성 배양물은 이용되는 특정 숙주 세포에 적합한 다양한 조건하에서(넓은 온도 범위에 걸쳐, 다양한 길이의 시간 동안 등) 성장될 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, rAAV 생성 배양물은 적합한 부착 의존성 용기, 예를 들어 롤러병, 중공 섬유 필터, 마이크로캐리어(microcarrier), 및 충전층 또는 유동층 생물반응기에서 배양될 수 있는 부착 의존성 배양물을 포함한다. rAAV 벡터 생성 배양물은, 예를 들어 스피너 플라스크, 교반 탱크 생물반응기, 및 웨이브 백(Wave bag) 시스템과 같은 1회용 시스템을 비롯하여 다양한 방식으로 배양될 수 있는 현탁액 적응 숙주 세포, 예를 들어, HeLa, 293 및 SF-9 세포를 또한 포함할 수 있다.
본 발명의 rAAV 벡터 입자는 생성 배양물의 숙주 세포의 용해에 의해 rAAV 생성 배양물로부터 수거될 수 있거나 생성 배양물로부터 소비된 배지의 수거에 의해 수거될 수 있으며, 단, 세포는 미국 특허 제6,566,118호에 더 상세히 기재되어 있는 바와 같이 무손상 세포로부터 배지 내로의 rAAV 입자의 방출을 일으키도록 당업계에 공지된 조건 하에서 배양된다. 세포를 용해시키는 적합한 방법은 또한 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 다수의 동결/해동 사이클, 초음파처리, 미세유동화, 및 표면활성제(detergent) 및/또는 프로테아제와 같은 화학물질에 의한 처리를 포함한다.
추가의 구현예에서, rAAV 입자는 정제된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "정제된"은 rAAV 입자가 자연적으로 발생하거나 처음 제조되는 경우에 또한 존재할 수 있는 다른 성분 중 적어도 일부가 없는 rAAV 입자의 제조물을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 단리된 rAAV 입자는 공급원 혼합물, 예를 들어, 배양물 용해질 또는 생성 배양물 상층액으로부터 이를 농축시키는 정제 기법을 이용하여 제조될 수 있다. 농축은 다양한 방식, 예를 들어, 용액에 존재하는 DNase 내성 입자(DRP) 또는 유전체 카피(gc)의 비율, 또는 감염도에 의해 측정될 수 있거나, 이는 공급원 혼합물에 존재하는 제2의 잠재적 방해 물질, 예를 들어, 생성 배양물 오염물질 또는 헬퍼 바이러스를 포함하는 공정내(in-process) 오염물질을 포함하는 오염물질, 배지 성분 등과 관련하여 측정될 수 있다.
일부 구현예에서, rAAV 생성 배양 수거물을 정화하여 숙주 세포 조직파편을 제거한다. 일부 구현예에서, 생성 배양 수거물은, 예를 들어 등급 DOHC Millipore Millistak+ HC Pod 필터, 등급 A1HC Millipore Millistak+ HC Pod 필터, 및 0.2 ㎛ Filter Opticap XL1O Millipore Express SHC 친수성 막 필터를 포함하는 일련의 심층 필터를 통한 여과에 의해 정화된다. 정화는 또한 당업계에 공지된 다양한 다른 표준 기법, 예를 들어, 원심분리 또는 당업계에 공지된 0.2 ㎛ 이상의 포어 크기의 임의의 셀룰로스 아세테이트 필터를 통한 여과에 의해 달성될 수 있다.
일부 구현예에서, rAAV 생성 배양 수거물을 Benzonase®로 추가로 처리하여 생성 배양물에 존재하는 임의의 고분자량 DNA를 분해시킨다. 일부 구현예에서, Benzonase® 분해는, 예를 들어 30분 내지 수 시간의 기간 동안 주위 온도 내지 37℃ 범위의 온도에서 1 내지 2.5 유닛/㎖의 Benzonase®의 최종 농도를 포함하는 당업계에 공지된 표준 조건 하에서 수행된다.
rAAV 입자는 평형 원심분리; 유통(flow-through) 음이온 교환 여과; rAAV 입자를 농축시키기 위한 접선 유동 여과(TFF); 아파타이트 크로마토그래피에 의한 rAAV 포획; 헬퍼 바이러스의 열 비활성화; 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의한 rAAV 포획; 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의한 완충액 교환; 나노여과; 및 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피 또는 친화성 크로마토그래피에 의한 rAAV 포획의 정제 단계 중 하나 이상을 이용하여 단리되거나 정제될 수 있다. 이들 단계는 단독으로, 다양한 조합으로, 또는 다양한 순서로 이용될 수 있다. 일부 구현예에서, 방법은 하기 기재된 바와 같은 순서로 모든 단계를 포함한다. rAAV 입자를 정제하는 방법은, 예를 들어 문헌[Xiao et al., (1998) Journal of Virology 72:2224-2232]; 미국 특허 제6,989,264호 및 미국 특허 제8,137,948호; 및 WO 2010/148143호에서 발견된다.
일부 구현예에서, rAAV 입자는 약제학적 조성물로 존재한다. 약제학적 조성물은 본 명세서에 기재된 임의의 투여 방식에 적합할 수 있다. 치료용 트랜스진/핵산을 인코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 바이러스 입자의 약제학적 조성물은 CNS(예를 들어, 선조체 및/또는 대뇌 피질)에 도입될 수 있다.
일부 구현예에서, rAAV 입자는 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물로 존재한다. 당업계에 잘 알려져 있는 바와 같이, 약제학적으로 허용되는 부형제는 약리학적으로 유효한 물질의 투여를 용이하게 하는 비교적 비활성인 물질이며, 액체 용액 또는 현탁액, 에멀젼, 또는 사용 전 액체 중의 용해 또는 현탁에 적합한 고체 형태로 공급될 수 있다. 예를 들어, 부형제는 형태 또는 일관성을 제공할 수 있거나, 희석제로 작용할 수 있다. 적합한 부형제는 안정제, 습윤제 및 에멀젼화제, 오스몰농도를 변화시키기 위한 염, 캡슐화 작용제, pH 완충 물질, 및 완충제를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 이러한 부형제는 과도한 독성 없이 투여될 수 있는 눈으로의 직접 전달에 적합한 임의의 약제학적 작용제를 포함한다. 약제학적으로 허용되는 부형제는 소르비톨, 다양한 TWEEN 화합물 중 임의의 화합물, 및 액체, 예를 들어 물, 식염수, 글리세롤 및 에탄올을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 약제학적으로 허용되는 염은 그 안에, 예를 들어 광산염, 예를 들어 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 포스페이트, 설페이트 등; 및 유기산의 염, 예를 들어, 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트, 벤조에이트 등이 포함될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 부형제의 철저한 논의는 문헌[REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N.J. 1991)]에서 이용 가능하다.
일부 구현예에서, 투여되는 조성물은 rAAV 입자 및 폴록사머를 포함한다. 용어 "폴록사머"는 폴리옥시프로필렌 사슬과 폴리옥시에틸렌 사슬에 대한 다양한 길이가 조합으로 사용될 수 있기 때문이 많은 화합물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴록사머는 화학식 HO(C2H4O)n(C3H6O)m(C2H4O)nH를 가질 수 있으며, 여기서 n(즉, 폴리옥시에틸렌 사슬 길이)는 약 60 내지 약 150의 값이고, m(즉, 폴리옥시프로필렌 사슬 길이)은 약 25 내지 약 60의 값을 갖는다.
일부 구현예에서, 폴록사머는 폴록사머 188(예를 들어, CAS No. 9003-11-6)이다. 폴록사머는 이의 대략적인 분자량과 폴리옥시에틸렌 함량의 비율을 표시하는 번호 표기 시스템으로 기술될 수 있다. 이러한 값은 흔히 폴록사머 조성물 내의 각 폴록사머 분자의 절대값보다는 폴록사머 조성물 내의 평균값을 지칭한다. 이러한 방법에서는, 처음 두 자리에 100을 곱하여 폴리옥시프로필렌 블록의 대략적인 분자량을 제공하고, 세 번째 자리에 10을 곱하여 폴리옥시에틸렌 블록의 중량 퍼센트를 제공한다. 예를 들어, 폴록사머 188은 상기 표현된 화학식에서와 같이 n이 약 80의 값이고 m이 약 27의 값인 폴록사머를 지칭할 수 있다. 폴록사머 188은 평균 분자량이 약 7680 내지 약 9510 g/mol일 수 있다.
PLURONIC®과 같은 상표명으로 판매되는 폴록사머는 상이한 방법으로 명명될 수 있다. 문자를 이용하여 물리적 상태를 나타낼 수 있다(예를 들어, 고체의 경우 F, 페이스트의 경우 P, 또는 액체의 경우 L). 2자리 또는 3자리 숫자를 이용하여 화학적 특성을 나타낼 수 있다. 처음 1자리 또는 2자리에 300을 곱하여 폴리옥시프로필렌 블록의 대략적인 분자량을 제공하고, 세 번째 자리에 10을 곱하여 폴리옥시에틸렌 블록의 중량 퍼센트를 제공하다. 예를 들어, PLURONIC® 또는 LUTROL® F68은 상기 표현된 화학식에서와 같이 n이 약 80의 값이고 m이 약 27의 값인 고체 폴록사머를 지칭할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 폴록사머 188은 PLURONIC® F68 또는 LUTROL® F68일 수 있다.
일부 구현예에서, 조성물 중의 폴록사머의 농도는 약 0.0001% 내지 약 0.01%의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물 중의 폴록사머의 농도는 약 0.01% 미만, 약 0.005% 미만, 약 0.001% 미만 또는 약 0.0005% 미만 중 임의의 농도이다. 일부 구현예에서, 조성물 중의 폴록사머의 농도는 약 0.0001% 초과, 약 0.0005% 초과, 약 0.001% 초과 또는 약 0.005% 초과 중 임의의 농도이다. 즉, 조성물 중의 폴록사머의 농도는 상한이 0.01%, 0.005%, 0.001% 또는 0.0005%이고 독립적으로 선택되는 하한이 0.0001%, 0.0005%, 0.001% 또는 0.005%인 범위 중 임의의 범위일 수 있으며, 여기서 하한은 상한보다 작다. 특정 구현예에서, 조성물 중의 폴록사머의 농도는 약 0.001%이다.
일부 구현예에서, 조성물은 염화나트륨을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물 중의 염화나트륨의 농도는 약 100 mM 내지 약 250 mM의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물 중의 염화나트륨의 농도는 약 250 mM 미만, 약 225 mM 미만, 약 200 mM 미만, 약 175 mM 미만, 약 150 mM 미만 또는 약 125 mM 미만 중 임의의 농도이다. 일부 구현예에서, 조성물 중의 염화나트륨의 농도는 약 100 mM 초과, 약 125 mM 초과, 약 150 mM 초과, 약 175 mM 초과, 약 200 mM 초과 또는 약 225 mM 초과 중 임의의 농도이다. 즉, 조성물 중의 염화나트륨의 농도는 상한이 250 mM, 225 mM, 200 mM, 175 mM, 150 mM 또는 125 mM이고 독립적으로 선택되는 하한이 100 mM, 125 mM, 150 mM, 175 mM, 200 mM 또는 225 mM인 농도 범위 중 임의의 범위일 수 있으며, 여기서 하한은 상한보다 작다. 특정 구현예에서, 조성물 중의 염화나트륨의 농도는 약 180 mM이다.
일부 구현예에서, 조성물은 인산나트륨을 추가로 포함한다. 인산나트륨은 임의의 단일 종의 인산나트륨(예를 들어, 제1인산나트륨, 제2인산나트륨, 제3인산나트륨 등)을 지칭할 수 있거나 제1인산나트륨 용액과 제2인산나트륨 용액의 혼합물인 인산나트륨 완충액을 지칭할 수 있다. pH 범위에 걸친 인산나트륨 완충액의 제조법은 문헌[Promega Protocols & Applications Guide, "Buffers for Biochemical Reactions," Appendix B part C]과 같은 다양한 표준 분자생물학 프로토콜에서 찾아볼 수 있다.
일부 구현예에서, 조성물 중의 인산나트륨의 농도는 약 5 mM 내지 약 20 mM의 범위이다. 일부 구현예에서, 조성물 중의 인산나트륨의 농도는 약 20 mM 미만, 약 15 mM 미만 또는 약 10 mM 미만 중 임의의 농도이다. 일부 구현예에서, 조성물 중의 인산나트륨의 농도는 약 5 mM 초과, 약 10 mM 초과 또는 약 15 mM 초과 중 임의의 농도이다. 즉, 조성물 중의 인산나트륨의 농도는 상한이 20 mM, 15 mM 또는 10 mM이고 독립적으로 선택되는 하한이 5 mM, 10 mM 또는 15 mM인 농도 범위 중 임의의 범위일 수 있으며, 여기서 하한은 상한보다 작다. 특정 구현예에서, 조성물 중의 인산나트륨의 농도는 약 10 mM이다.
일부 구현예에서, 조성물 중의 인산나트륨의 pH는 약 7.0 내지 약 8.0이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 조성물 중의 인산나트륨의 pH는 약 7.0, 약 7.2, 약 7.4, 약 7.5, 약 7.6, 약 7.8 또는 약 8.0이다. 특정 구현예에서, 조성물 중의 인산나트륨의 pH는 약 7.5이다. 본 명세서에 기재된 인산나트륨의 pH 값 중 임의의 값이 상기 기재된 인산나트륨의 농도 값 중 임의의 값과 조합될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 조성물 중의 인산나트륨의 농도는 약 10 mM이고, pH는 약 7.5이다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 rAAV 입자와 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물은 인간으로의 투여에 적합하다. 이러한 담체는 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Edition, pp. 1035-1038 and 1570-1580] 참조). 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 폴록사머(예를 들어, 폴록사머 188, 예컨대 PLURONIC® 또는 LUTROL® F68)를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 rAAV 입자와 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물은 포유동물의 CNS 내로의 주입에 적합하다.
이러한 약제학적으로 허용되는 담체는 멸균 액체, 예를 들어 물 및 오일, 예컨대 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 오일, 예컨대 땅콩유, 대두유, 광유 등일 수 있다. 식염수 용액 및 수성 덱스트로스, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 글리세롤 용액이 또한 액체 담체, 특히 주사용 용액을 위한 액체 담체로서 사용될 수 있다. 약제학적 조성물은 추가 성분, 예를 들어 보존제, 완충제, 장성(tonicity) 작용제, 항산화제 및 안정제, 비이온성 습윤제 또는 정화제, 점도 증가제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 단일 단위 투여량 또는 다회투여량 형태로 패키징될 수 있다. 일반적으로 조성물은 멸균성이고 실질적으로 등장성인 용액으로 제형화된다.
VI. rAAV 입자의 전달을 위한 시스템
또한, a) rAAV 입자를 포함하는 조성물(여기서, rAAV 입자는 이종성 핵산을 인코딩하는 rAAV 벡터를 포함함); 및 b) 선조체로의 rAAV 입자의 전달을 위한 장치를 포함하는, 포유동물의 대뇌 피질과 선조체에서의 이종성 핵산의 발현을 위한 시스템이 제공된다. 본 발명의 시스템 및 장치를 사용하여 본 명세서에 기재된 임의의 rAAV 입자를 포유동물의 CNS(예를 들어, 선조체)에 전달할 수 있다. 상기 기재된 바와 같이, 선조체에 전달되는 rAAV 입자를 사용하여 대뇌 피질과 선조체에서의 발현을 위한 이종성 핵산을 인코딩하는 rAAV 벡터를 도입시킬 수 있다.
일부 구현예에서, rAAV 입자는 대류 강화 전달(CED)에 의해 전달된다. CED는 간질액의 정수압이 극복되는 압력 하에 주입액(예를 들어, rAAV 입자를 함유하는 조성물)을 CNS 내로 펌핑하는 것을 기초로 한다. 이것은 주입액이 CNS 주변혈관구조와 접촉하게 하며, 이는 대류를 통해 주입액을 분포시키고 이의 전달 범위를 향상시키는 펌프와 같이 이용된다(예를 들어, 문헌[Hadaczek et al., (2006) Hum. Gene Ther. 17:291-302]; 문헌[Bankiewicz et al., (2000) Exp . Neurol. 164:2-14]; 문헌[Sanftner, LM et al., (2005) Exp . Neurol . 194(2):476-483]; 문헌[Forsayeth, JR et al., (2006) Mol . Ther . 14(4):571-577]; 미국 특허 제6,953,575호; 미국 특허 출원 공개 제2002/0141980호; 미국 특허 출원 공개 제2007/0259031호; WO 99/61066호; 및 WO 2010/088560호 참조).
본 명세서에 기재된 바와 같이, CED를 이용하는 이점은 뇌 전반에 걸친 주입액의 향상된 분포이다. CED는 뇌 내의 주입 부위(예를 들어, 선조체, 꼬리핵 및/또는 피각)에서 개선된 전달을 가져올 수 있다. 또한, 뇌의 다른 영역(예를 들어, 대뇌 피질, 전두 피질, 전전두 연합 피질 영역, 전운동 피질, 1차 체성 피질 영역 및/또는 1차 운동 피질)으로의 전달이 CED를 통해 달성될 수 있다. 이론에 구속하고자 함이 없이, 선조체 내로 주입된 재조합 바이러스 입자(예를 들어, rAAV 입자)는 제한 없이 투사 영역(예를 들어, 피질)을 포함하는 뇌의 다른 영역에 (예를 들어, 역행 수송을 통해) 또한 분산될 수 있는 것으로 또한 여겨진다.
일부 구현예에서, rAAV 입자는 CED 전달 시스템을 이용하여 전달된다. AAV 입자는 CED에 의해 전달될 수 있다(예를 들어, WO 99/61066호 참조). 본 명세서에 기재된 바와 같이, CED는 본 명세서에 기재된 임의의 시스템을 이용하여 달성될 수 있다. (예를 들어, rAAV 입자를 포함하는 조성물의 전달을 위한) CED용 장치는 당업계에 공지되어 있으며, 일반적으로 펌프(예를 들어, 하기 기재된 바와 같은 삼투 펌프 및/또는 주입 펌프) 및 주입 장치(예를 들어, 카테터, 캐뉼러 등)를 이용한다. 선택적으로, 영상화 기법을 이용하여 주입 장치를 안내하고/하거나 주입액(예를 들어, rAAV 입자를 포함하는 조성물)의 전달을 모니터링할 수 있다. 주입 장치는 대상체의 CNS 조직 내로 삽입될 수 있다. 당업자는 주입 장치를 표적 CNS 조직에 포지셔닝시키기에 적합한 좌표를 결정할 수 있다. 일부 구현예에서, 포지셔닝은, 예를 들어 주입 장치를 표적 CNS 조직에 안내하기 위해 대상체 뇌의 CT 및/또는 MRI 영상화에 의해 얻어진 해부학적 지도를 통해 달성된다. 일부 구현예에서, 전달의 iMRI 및/또는 실시간 영상화가 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 장치를 사용하여 본 발명의 방법에 의해 rAAV 입자를 포유동물에게 투여한다.
일부 구현예에서, 전달의 수술중 자기 공명 영상화(iMRI) 및/또는 실시간 영상화가 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 장치를 사용하여 본 발명의 방법에 의해 rAAV 입자를 포유동물에게 투여한다. iMRI는 (예를 들어, CNS에 rAAV 입자를 전달하기 위한) 성공적인 수술 절차를 확인하는 것을 돕고, 조직의 다른 부분을 손상시킬 위험을 감소시키는, 수술 동안 환자의 MRI 기반 영상화를 위한 기법으로 당업계에 공지되어 있다(추가 설명에 대해서는, 예를 들어 문헌[Fiandaca et al., (2009) Neuroimage 47 Suppl. 2:T27-35] 참조). 일부 구현예에서, 추적제(예를 들어, MRI 조영증강제)가 주입액의 조직 분포의 실시간 모니터링을 제공하기 위해 주입액(예를 들어, rAAV 입자를 포함하는 조성물)과 공동 전달될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Fiandaca et al., (2009) Neuroimage 47 Suppl. 2:T27-35]; 미국 특허 출원 공개 제2007/0259031호; 및 미국 특허 제7,922,999호를 참조한다. 추적제의 사용은 전달의 중지를 알려줄 수 있다. 당업계에 공지된 다른 추적 및 영상화 수단을 또한 이용하여 주입액 분포를 추적할 수 있다.
일부 구현예에서, rAAV 입자는 rAAV 입자의 전달을 위해 당업계에 공지된 장치 및 방법을 이용하여 표준 입체공간적 주입에 의해 투여될 수 있다. 일반적으로, 이들 방법은 주입 장치, 일련의 좌표로의 전달을 위해 표적화 조직의 영역을 해석하기 위한 계획 시스템(예를 들어, 측측(latero-lateral), 등배(dorso-ventral), 및 문미측(rostro-caudal) 축에 따른 파라미터), 및 계획된 좌표에 따른 입체공간적 국소화를 위한 장치(프로브 및 좌표 시스템과 정렬하여 적소에 머리를 고정시키기 위한 구조를 선택적으로 포함하는 정위 장치)를 이용할 수 있다. MRI 안내 수술 및/또는 입체공간적 주입에 유용할 수 있는 시스템의 비제한적인 예는 ClearPoint® 시스템(MRI Interventions, Memphis, TN)이다.
일부 구현예에서, 대류 강화 전달을 위한 장치는 펌프(예를 들어, 삼투 펌프 및/또는 주입 펌프)를 포함한다. 삼투 및/또는 주입 펌프는 상업적으로 구입 가능하다(예를 들어, ALZET® Corp., Hamilton Corp., ALZA Inc. in Palo Alto, CA). 펌프 시스템은 이식 가능할 수 있다. 예시적 펌프 시스템은, 예를 들어 미국 특허 제7,351,239호; 미국 특허 제7,341,577호; 미국 특허 제6,042,579호; 미국 특허 제5,735,815호; 및 미국 특허 제4,692,147호에서 찾아볼 수 있다. 일부 구현예에서, 펌프는 수동 펌프이다. 역류 저항 및 단계식 캐뉼러를 포함하는 CED를 위한 예시적 장치는 전체가 본 명세서에 참고로 포함되는 WO 99/61066호 및 WO 2006/042090호에서 찾아볼 수 있다.
일부 구현예에서, 대류 강화 전달을 위한 장치는 역류 저항 캐뉼러(예를 들어, 단계 설계식 역류 방지형 캐뉼러)을 포함한다. 추가의 설명 및 예시적 역류 저항 캐뉼러는, 예를 들어 문헌[Krauze et al., (2009) Methods Enzymol. 465:349-362]; 미국 특허 출원 공개 제2006/0135945호; 미국 특허 출원 공개 제2007/0088295호; 및 PCT/US08/64011호에서 찾아볼 수 있다. 일부 구현예에서, 단지 하나의 캐뉼러가 이용된다. 다른 구현예에서, 하나 초과의 캐뉼러가 이용된다. 일부 구현예에서, 대류 강화 전달을 위한 장치는 주입액이 제어된 속도로 캐뉼러를 통해 표적 조직으로 유동되도록 하기에 충분한 압력을 생성시키는 펌프와 연결된 역류 저항 캐뉼러를 포함한다. 두개내 압력을 적합한 수준으로 유지하여 뇌 조직을 손상시키지 않도록 하는 임의의 적합한 유량이 이용될 수 있다.
임의의 구현예에서, 캐뉼러는 단계식 캐뉼러이다. 예를 들어 WO 2006/042090호에 기재된 바와 같이, 단계식 캐뉼러는 다수의 단계를 가진다(예를 들어, WO 2006/042090호의 도 1의 경우 4개). 캐뉼러의 원위 단부에 가장 가까운 단계는 먼저 표적 조직에 들어가는 단계이고, 따라서 표적 조직(예를 들어, 선조체)에 들어가는 단계의 수는 대상체의 그 표적에 도달하는데 필요한 침투 깊이에 좌우될 것이다. 뇌로의 전달과 관련하여, 조작자는 치료될 대상체의 크기 및 표적화되고 있는 뇌 내의 위치 둘 모두를 고려하여 적절한 침투 깊이를 용이하게 결정할 수 있다.
캐뉼러는 배관 시스템을 통해 펌프에 연결될 수 있다. 배관은 캐뉼러의 내강을 통해 연장되며, 주입액이 이러한 배관을 통해 전달될 수 있다. 배관을 함유하는 구현예에서, 배관은 캐뉼러의 원위 단부와 수평을 이룰 수 있다. 대안적으로, 배관은 캐뉼러의 원위 단부를 통해 연장되며, 이러한 구현예에서, 배관이 연장되는 양은 적용에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로, 배관은 캐뉼러로부터 약 1 mm 내지 약 1 cm(또는 그 사이의 임의의 길이), 예를 들어, 약 1 내지 약 50 mm(또는 그 사이의 임의의 길이), 또는 약 1 mm 내지 약 25 mm(또는 1 mm, 2 mm, 3 mm, 4 mm, 5 mm, 6 mm, 7 mm, 8 mm, 9 mm, 10 mm, 11 mm, 12 mm, 13 mm, 14 mm, 15 mm, 16 mm, 17 mm, 18 mm, 19 mm, 20 mm, 21 mm, 22 mm, 23 mm, 24 mm 또는 25 mm를 포함하지만 이에 한정되지 않는 그 사이의 임의의 길이), 예컨대 캐뉼러의 원위 단부를 지나 10 mm 만큼 연장될 것이다.
캐뉼러를 통해 연장되는 배관은, 예를 들어 주입액과 접촉하는 배관을 보호하기 위해 하나 이상의 영역에 코팅 또는 에워싸는 물질을 가질 수 있다. 따라서, 특정 구현예에서, 배관(예를 들어, FEP(Teflon) 배관)은 스테인리스 스틸 캐뉼러의 근위 단부를 지나 연장되는 용융 실리카 배관의 일부를 보호한다. 용융 실리카 배관은 Luer 압축 피팅을 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 적합한 수단에 의해 주사기에 연결될 수 있고, 주사기는 주사기 펌프(수동, 전자식 및/또는 컴퓨터화)에 의해 구동된다. 적절한 양의 생성물(들)을 전달하기 위해 주사기 크기가 조작자에 의해 선택될 수 있다는 것은 명백할 것이다. 따라서, 1 ㎖, 2.5 ㎖, 5 ㎖ 또는 심지어 더 큰 주사기가 이용될 수 있다.
단계식 캐뉼러는 제한 없이 스테인리스 스틸(예를 들어, 316SS 또는 304SS), 금속, 금속 합금, 중합체, 유기 섬유, 무기 섬유 및/또는 이들의 조합을 포함하는 생리학적으로 허용되는 다양한 재료로 제조될 수 있다.
선택적으로, 주입액 접촉 표면(예를 들어, 배관 또는 코팅)은 캐뉼러의 내강을 통해 연장될 수 있다. 금속, 금속 합금, 중합체, 유기 섬유, 무기 섬유 및/또는 이들의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 재료가 o 주입액 접촉 표면에 또한 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 생성물 접촉 표면은 스테인리스 스틸이 아니다. 이러한 구현예에서, 외부 캐뉼러는 표적 조직과 생리학적으로 양립 가능한 재료로 여전히 제조될 수 있지만, 생성물 접촉이 없기 때문에 이는 생물학적 활성제 또는 생성물 제형과 양립 가능할 필요가 없다.
일부 구현예에서, 주입액의 침투는 촉진제의 사용에 의해 추가로 증강된다. 촉진제는 표적 조직(예를 들어, CNS 표적 조직)으로의 주입액의 전달을 추가로 용이하게 할 수 있다. 촉진제의 비제한적인 예는 저분자량 헤파린이다(예를 들어, 미국 특허 제7,922,999호 참조).
본 명세서에 기재된 약제학적 조성물을 위한 적합한 패키징은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 바이알(예를 들어, 밀봉 바이알), 용기(vessel), 앰풀, 병, 자아(jar), 가요성 패키징(예를 들어, 밀봉 Mylar 또는 플라스틱 백) 등을 포함한다. 이러한 제조 물품은 추가로 멸균되고/되거나 밀봉될 수 있다.
본 명세서에는 본 명세서에 기재된 방법에 따라 rAAV 입자를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하여 포유동물의 CNS 장애를 치료하는 방법이 추가로 제공된다. 또한, 본 명세서에 기재된 바와 같은 시스템을 이용하여 본 명세서에 기재된 방법에 따라 rAAV 입자를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하여 포유동물의 헌팅톤병을 치료하는 방법이 추가로 제공된다.
또한, 본 발명은 본 발명의 방법에 따라 본 명세서에 기재된 rAAV 입자를 포유동물에게 투여하기 위한 키트를 제공한다. 키트는 임의의 본 발명의 rAAV 입자 또는 rAAV 입자 조성물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 키트는 포유동물의 적어도 대뇌 피질과 선조체에서 발현되는 이종성 핵산을 인코딩하는 rAAV 벡터와 함께 rAAV 입자를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 키트는 상기 기재된 임의의 장치 또는 시스템을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 키트는 rAAV 입자의 조성물의 CNS 전달(예를 들어, 포유동물의 선조체로의 전달)을 위한 설명서를 추가로 포함한다. 본 명세서에 기재된 키트는, 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 주사기, 및 본 명세서에 기재된 임의의 방법을 수행하기 위한 설명서가 함유된 패키지 삽입물을 포함하는, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 재료를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 패키징 물질이 또한 포함될 수 있으며, 이는, 예를 들어, 바이알(예를 들어, 밀봉된 바이알), 용기, 앰풀, 병, 자아, 가요성 패키징(예를 들어, 밀봉 Mylar 또는 플라스틱 백) 등을 포함하는 당업계에 공지된 임의의 패키징 물질일 수 있다. 이러한 제조 물품은 추가로 멸균되고/되거나 밀봉될 수 있다. 일부 구현예에서, 키트는 본 명세서에 기재된 임의의 방법 및/또는 rAAV 입자를 이용하여 본 명세서에 기재된 CNS 장애를 치료하기 위한 설명서를 포함한다. 키트는 개체의 CNS 내로의 주입에 적합한 약제학적으로 허용되는 담체, 및 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 주사기, 및 포유동물의 선조체 내로의 주입를 수행하기 위한 설명서가 함유된 패키지 삽입물 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 키트는 본 명세서에 기재된 완충제 및/또는 약제학적으로 허용되는 부형제(예를 들어, 문헌[REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N.J. 1991]에 기재된 바와 같음) 중 하나 이상을 추가로 함유한다. 일부 구현예에서, 키트는 본 명세서에 기재된 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제, 담체, 용액 및/또는 추가의 성분을 포함한다. 본 명세서에 기재된 키트는 단일 단위 투여량 또는 다회투여량 형태로 패키징될 수 있다. 키트의 내용물은 일반적으로 무균 상태로 제형화되며, 동결 건조되거나 실질적으로 등장성인 용액으로 제공될 수 있다.
실시예
본 발명은 하기 실시예를 참조로 하여 더욱 충분히 이해될 것이다. 그러나, 이러한 실시예는 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 본 명세서에 기재된 실시예 및 구현예는 단지 예시 목적을 위한 것으로, 이에 비추어 다양한 변형 또는 변화가 당업자에게 암시될 것이고, 이는 본 출원의 사상 및 범위 및 첨부된 청구항의 범주 내에 포함되는 것으로 이해된다.
실시예 1: 선조체내 AAV1 벡터 전달 후 광범위한 GFP 발현
대류 강화 전달(CED)에 의해 전달된 경우 붉은털원숭이 뇌의 선조체와 피질 구조 둘 모두를 효율적으로 표적화하는 AAV1의 능력을 평가하였다. 사이토메갈로바이러스 인핸서/닭 베타-액틴(CBA) 프로모터의 제어 하에 GFP cDNA를 함유하는 AAV 벡터를 CED를 이용하여 9마리의 성체 수컷 붉은털원숭이의 미상핵과 피각 내로 주입하였다(예를 들어, 문헌[Bankiewicz et al., (2000) Exp . Neurol. 164:2-14] 및 WO 2010/088560호 참조).
방법
수술적 전달
9마리의 성체 수컷 레서스 마카크(Macaca mulatta; 8.9 kg 내지 11.9 kg)를본 연구에 포함시켰다. 모든 동물에 MRI 안내 CED에 의해 AAV 벡터를 꼬리핵과 피각 내로 양측으로 주입하였다(문헌[Richardson, R.M. et al. (2011) Neurosurgery 69:154-163]; 문헌[Richardson, R.M. et al. (2011) Stereotact . Funct . Neurosurg . 89:141-151]; 문헌[Richardson, R.M. et al. (2011) Mol . Ther. 19:1048-1057]). 수술 직전에, 동물을 케타민 HCL(10 mg/kg)로 마취시키고, 칭량하고, 삽관하고, 1% 내지 5% 이소플루란으로 유지시켰다. 머리를 입체공간적 프레임 상에 올려 놓고, 동물을 T1 가중 계획 스캔(T1-weighted planning scan)을 위해 MRI(Siemens 3.0 T Trio MR unit)로 이송시켰다. 스캐닝 후, 동물을 수술실로 옮기고, 이식 절차를 위해 머리를 준비시키고, 3-mm 단계식 첨단이 있는 세라믹 맞춤형 용융 실리카 역류 저항 캐뉼러를 주입에 이용하였다. 임시적인 안내 캐뉼러를 표준 방법을 이용하여 양측(반구당 하나)에 이식하였다.
삼중 트랜스펙션(TT) 또는 생산 세포주(PCL)의 2가지 상이한 생성 방법으로 얻은 AAV1-eGFP 또는 AAV2-eGFP 벡터를 동물에 꼬리핵과 피각 내로 양측 주입하였다. 벡터 농도와 투여량은 표 5에 기재되어 있다. 동물을 이전에 기재된 바와 같이 항-AAV1 및 항-AAV2 중화 항체의 존재에 대해 시험하고, 1:32 미만의 항체 역가를 나타낸 경우 혈청음성으로 간주하였다(문헌[Bevan, A.K. et al. (2011) Mol . Ther. 19:1971-1980]). 생존 시간은 모든 동물에 대해 AAV 전달 후 1개월이었다.
표 2에 나타낸 바와 같이, 각각의 동물에 반구당 3회 이하로 미세주입하여 미상핵과 피각(전교련 및 후교련) 영역을 표적화하였다. MRI 동안 주입액 분포를 가시화하기 위해, Prohance(2 mM 가도테리돌)를 바이러스에 첨가하였다. 대류 강화 전달(CED)법을 이용하여 대략 30 ㎕의 AAV을 미상핵 내로 그리고 60 ㎕를 피각 내로 투여하였다(즉, 반구당 90 ㎕). 주입 속도를 최대 5 ㎕/분까지 증가시켰다.
Figure pct00003
동물의 제1 코호트(cohort)에 반구당 1.7 x 1011 vg의 AAV1-eGFP(TT)(n=3) 또는 AAV2-eGFP(TT)(n=2)를 투여하였다. 동물의 제2 코호트에는 1.7 x 1011 vg의 AAV1-eGFP(PCL)(n=2) 또는 1.3 x 1011 vg의 AAV2-eGFP(PCL)(n=2)를 투여하였다. 연속 MRI를 획득하여 각 표적 부위 내의 주입액 분포를 모니터링하고 실시간 피드백을 팀에 제공하였다. 실질내 투여 절차 직후, 동물을 수술실로 옮기고, 안내 캐뉼러를 제거하고, 상처 부위를 해부학적 층에서 봉합하였다. 모든 실험을 미국 국립보건원(National Institutes of Health) 가이드라인 및 미국 동물 실험 윤리 위원회(institutional Animal Care and Use Committee)에 의해 승인된 프로토콜에 따라 수행하였다. 수술 직후, 동물을 AAV 투여 절차를 위해 MRI실로 옮겼다. 표 2에 표시된 각 대상체에 대한 투여 절차에 관한 언급은 하기에 제공된다.
투여 절차 - 처리 그룹 2( AAV1 - eGFP TT )
1번 대상체. 대략 60 ㎕의 주입액을 각각의 피각 내로 2개의 궤적(trajectory)(30 ㎕/디포짓(deposit))에 의해 반구당 투여하였다. 전측 피각 내로의 주입액으로부터의 관상면 영상은 각 표적화 구조 내에서 대다수의 가돌리늄 신호를 나타내었다. 우반구의 경우, 배쪽 피각에서 약간의 혈관주위 수송이 관찰되었고, 전교련 내로의 분포가 관찰되었다.
2번 대상체. 0.127 ㎖를 피각 내로 그리고 0.207 ㎖를 시상 내로 주입한 후에 T1 MRI를 획득하였다. 주입 후 T1 MRI는 전후 방향으로 대략 1 cm 그리고 등배 방향으로 1 cm인 크기로 우측 시상 내에서 광범위한 주입액 분포를 나타내었다. 관상면 T1는 내측으로는 속섬유막을 향하여 그리고 상측으로는 등쪽 피각을 향하여 연장된 표적 부위 내에서의 가돌리늄 분포를 나타내었다. 대다수의 주입액은 피각 가장자리 내에 들어 있었지만; 혈관주위 공간을 통한 수송이 속섬유막과 전교련의 백질 신경로(white matter tract)에 또한 존재하였다. 분석은 시상 및 피각에서의 가돌리늄 주입 부피(Vi) 대 분포 부피(Vd)의 비가 1:2임을 나타내었다.
생전(In-Life) 관찰
동물 건강 및 신경학적 증상의 상세한 관찰을 투여 후 5일의 기간 동안 매일 수행하였고; 이어서, 상세한 관찰을 연구 종료시까지 주당 1회 수행하였다. 관찰과 일일 사망률 검사를 수행하였다. 두개내 투여 전, 혈액 수집 절차시, 및 부검시에 체중 평가를 수행하였다. 수술 전 또는 부검시에 처리 그룹들 간에 유의한 체중 차이는 관찰되지 않았다(도 1). 혈액학, 혈청 화학, AAV1 및 AAV2 캡시드 항체 검정 및 eGFP mRNA 수준 분석을 위해 전혈, 혈청 및 뇌척수액(CSF)을 수집하였다.
생전 혈액 수집 및 처리
혈액(대략 5 ㎖)을 혈액 샘플 수집 스케줄(하기 표 3 참조)에 따라 주입 전, 주입 후 대략 72시간째 및 부검시에 수집하였다. 혈액학 분석을 위해 대략 0.5 내지 1.0 ㎖의 전혈을 EDTA 튜브에 수집하였다. 대략 2.0 ㎖의 전혈을 혈청 분리 튜브(겔을 함유함, BD Microtainer)에 수집하고, 혈청이 분리되도록 처리하여 화학 분석 및 AAV1 및 AAV2 캡시드 항체 분석을 위한 대략적인 혈청을 얻었다.
Figure pct00004
CSF 수집 및 처리
CSF를 두개내 투여 전 및 부검시의 2개의 별개의 시점에서 수집하였다. 동물을 엎드린 자세로 있게 한 상태에서 경추 척추 천자에 의한 마취 하에 CSF 수집을 수행하였다. 시험 품목 투여 전에, 1 내지 2 ㎖의 CSF를 수집하고, 드라이아이스 상에서 동결시키고, -60℃ 이하에서 보관하였다. 부검시(PBS 관류 전), 2 내지 4 ㎖의 CSF를 수집하고, 0.8 마이크로미터 주사기 필터를 통해 표지된 수집 튜브 내로 여과시키고, 이중으로(캡시드 항체 분석을 위한 1 ㎖ 분취액 및 GFP 분석을 위한 2 내지 4 ㎖ 분취액) 에펜도르프 튜브 내로 옮기고, 드라이아이스 상에서 즉시 동결시키고, -60℃ 이하에서 보관하였다.
부검 및 조직 수집
두개내 투여 절차 후 대략 30일째에 모든 동물을 안락사시켰다. 펜토바르비탈나트륨의 정맥내 투여를 이용하여 각각의 동물을 안락사시켰다. 안락사 및 혈액과 CSF의 수집 후, 사체를 (RNAse 비함유 조건 하에서) PBS로 경심 관류하고, 이어서 PFA로 관류하였다. 하행 대동맥을 겸자로 집어서 주변 조직의 고정을 감소시켰다. 이러한 절차를 이용하여 QPCR에 의한 GFP 분석을 위한 신선한 주변 조직 샘플 이외에 고정된 뇌 조직을 수집하였다. 조직 수집 표는 수집된 조직을 열거한다(표 4). PBS 관류 동안(4% PFA 관류의 개시 전), 선택 조직(조직 수집 표에 또한 열거되어 있음)의 생검 샘플(0.5 내지 1.0 ㎤)을 일회용 무균 메스(각각의 개별 생검에 대해 새로운 메스)를 이용하여 RNAse 비함유 조건 하에서 RNAse 비함유 튜브에 수집하고, -60℃ 이하에서 동결 보관하였다.
Figure pct00005
뇌 및 척수 처리
전체 뇌를 동물로부터 조심스럽게 분리하여 눈금 자와 함께 사진 촬영하였다. 두개골로부터 분리되면, 뇌를 뇌 매트릭스에 넣고, 6 mm 블록으로 관상 절단하였다. 관상 블록을 PFA에 보관하고, 조직학을 위해 처리하였다. 전두 피질 및 중뇌 영역을 함유하는 관련 블록을 자유 부유성성(free floating) 40 마이크로미터 절편으로 절편화하였다. 전체 척수를 동물로부터 조심스럽게 분리하였다. 척수 분절을 PFA에 보관하고, 조직학을 위해 처리하였다. 경추, 흉부 및 요추 영역으로부터의 대표적인 분절을 자유 부유성 40 마이크로미터 절편으로 절편화하였다.
PBS-헤파린, 이어서 4% 완충 파라포름알데하이드(PFA)로 관류한 후, 일회용 블레이드와 원숭이 뇌 매트릭스를 이용하여 각각의 동물의 뇌를 6-mm 블록(관상면)으로 절단하였다. 순차적인 블록(동물당 11개 내지 12개의 뇌 슬랩(slab))을 화이트 보드 상에 수평으로 놓고, 순차적으로 할당된 문자와 함께 사진 촬영하였다. 그 후, 모든 뇌 블록을 4% 완충 PFA에서 24시간 동안 후고정시켰다. 각 블록에 대한 고정 품질을 육안으로 검사하였다(블록 내에서 핑크색은 관찰되지 않았음). PFA-후고정 후, 각 뇌 블록을 40-㎛ 자유 부유성 절편으로 절단하기 전에 PBS 중에서 3회 린싱하고, 30% 수크로스에 침지시킴(냉동보존)으로써 자유 부유성 절편을 위해 처리하였다.
AAV 벡터의 생성
임상 평가 전에, 전형적으로 AAV 벡터를, HEK293 세포가 벡터 패키징에 필요한 cis(벡터 유전체) 및 trans(AAV rep 및 cap 유전자; 아데노바이러스 헬퍼 유전자 E2A, E4 및 VA) 요소를 인코딩하는 2개 또는 3개의 플라스미드로 공동 트랜스펙션되는, 표준 삼중 트랜스펙션법(TT)에 의해 생성한다(문헌[Hauck et al., (2009) Mol. Ther. 17:144-152]). 플라스미드 DNA의 투입이 용이하고 신속하게 수정될 수 있기 때문에, 이 방법은 다양한 혈청형을 기반으로 하고 다양한 발현 카세트를 지니는 벡터의 평가를 가능하게 한다. 유연성과 비교적 빠른 턴어라운드(turn-around) 시간에도 불구하고, 트랜스펙션법은 확장성과 관련하여 문제점을 나타내는데, 이는 임상 사용을 위한 대규모 rAAV 벡터 생성에 대한 이 방법의 적합성을 제한한다.
현재, 임상 등급의 rAAV는 헬퍼 바이러스 불포함 일시적 트랜스펙션법, 재조합 바큘러바이러스 또는 단순 헤르페스 바이러스 기반 생성 시스템, 또는 패키징/생산 세포주에 의해 대규모로 생성된다(문헌[Ayuso et al., (2010) Curr . Gene Ther. 10:423-436]). 아데노 관련 바이러스 생산 세포주(PCL)는 임상 등급의 AAV 벡터의 대규모 생성을 위한 효과적인 방법이다. 이 시스템에서, 벡터 서열, AAV rep 유전자 및 AAV cap 유전자의 3개의 구성요소, 및 선택 가능 마커 유전자를 함유하는 단일 플라스미드가 HeLaS3 세포 내로 안정하게 트랜스펙션된다. 그러나, 생산 세포주로부터 유래된 AAV 벡터가 다른 방법, 예를 들어 표준 일시적 트랜스펙션법에 의해 생성된 벡터와 효능면에서 동등한지를 결정하는 것이 바람직하다.
본 연구를 위해 삼중 트랜스펙션(TT) 및 생산 세포주(PCL)의 2가지 상이한 생성 방법을 이용하여 AAV 바이러스 벡터를 생성하였다. 재조합 AAV 벡터 AAV1-GFP(TT) 및 AAV2-GFP(TT)는 인간 배아 신장 암종 293 세포(HEK-293)의 삼중 트랜스펙션(인산칼슘을 이용함)에 의해 생성하였다(문헌[Xiao et al., (1998) Journal of Virology 72:2224-2232]에 언급되어 있음). 간략하게 말하면, 일시적 트랜스펙션에 의한 AAV 벡터의 생성을 위해, 폴리에틸렌이민(PEI) 및 1:1:1 비의 3개의 플라스미드(ITR 벡터, AAV2rep/cap2 또는 AAV2rep/cap1, 및 pAd 헬퍼 플라스미드)를 이용하여 HEK293 세포를 트랜스펙션시켰다. ITR 벡터 플라스미드는 사이토메갈로바이러스 인핸서/닭 베타 액틴 - 하이브리드 프로모터(CBA)의 다운스트림에서 EGFP에 대한 cDNA를 인코딩하였다. 사용된 pAd 헬퍼는 pHelper(Stratagene/Agilent Technologies, Santa Clara, CA)였다.
AAV 생산 세포 과정을 이용하여 재조합 AAV 벡터 AAV1-GFP(PCL) 및 AAV2-GFP(PCL)를 생성하였다(문헌[Thorne et al., (2009) Human Gene Therapy 20:707-714] 및 문헌[Martin et al., (2013) Human Gene Therapy Methods 24:253-269]에 언급되어 있음). 간략하게 말하면, 혈청형 2의 rep 유전자 및 혈청형 1 또는 혈청형 2의 캡시드 유전자, 프로모터 이종성 핵산 서열, AAV2 역위 말단 반복부(ITR)에 의해 플랭킹된 벡터 유전체, 및 퓨로마이신 내성 유전자를 함유하는 플라스미드에 의한 Hela-S3 세포(ATCC CCL-2.2)의 안정한 트랜스펙션에 의해 생성물 특이적 생산 세포주를 생성하였다. 벡터 유전체는 사이토메갈로바이러스 인핸서/닭 베타 액틴-하이브리드 프로모터인 CBA의 다운스트림에 EGFP에 대한 cDNA를 지녔다. 트랜스펙션된 세포를 퓨로마이신의 존재 하에 성장시켜 안정한 통합체를 분리하였다. 생성된 세포주를 스크리닝하여 선도 클론(lead clone)을 선택하였다. 이어서, 생성물 특이적 세포 클론을 생산용 생물반응기로 증식시키고, 헬퍼로서 야생형 아데노바이러스로 감염시켜 AAV 생성을 개시하였다. 감염 후 72시간째에 바이러스를 수거하고, 아데노바이러스를 열에 의해 비활성화시키고, 음이온 교환법에 의해 제거하였다.
둘 모두의 생성 플랫폼으로부터의 AAV의 정제를 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다(문헌[Qu, G. et al. (2007) J. Virol . Methods 140:183-192]). 모든 AAV1 및 AAV2-GFP 벡터의 결과적인 역가를 표 5에 나타낸다. 모든 벡터를 180 mM 염화나트륨; 10 mM 인산나트륨(5 mM NaH2PO4·2 H2O + 5 mM Na2HPO4·H2O); 및 0.001% 폴록사머 188(Lutrol F68), pH 7.5을 함유하는 물에 준비시켰다.
Figure pct00006
면역조직화학
GFP에 대한 항체(1:500, AB3080; Chemicon)를 이용한 면역염색은 전체 전두 피질을 덮고 있고 후방 방향으로 선조체의 수준까지 연장된 Zamboni 고정 40-㎛ 관상 절편 상에서 수행하였다. GFP 면역양성 신경세포의 국소화를 붉은털원숭이 뇌 정위 좌표(The Rhesus Monkey Brain in Stereotactic Coordinates)(문헌[Paxinos, G.H.X. and Toga, A.W. (2000) San Diego, CA: Academic Press])를 참조로 분석하여 피질과 선조체에서의 특정 면역염색 영역을 확인하였다.
3,3'- 디아미노벤지딘(DAB)에 의한 GFP 염색: 절편(각 6-mm 블록당 3개: 2 mm 간격)을 PBST 중에서 각 5분 동안 3회 세척한 후, 1% H2O2로 20분 동안 처리하였다. 절편을 실온에서 30분 동안 스나이퍼(Sniper) 블로킹 용액(biocare.net/product/background-sniper/에서 온라인으로 구입 가능)에서 인큐베이션한 후, Da Vinci Green Diluent(biocare.net/에서 온라인으로 구입 가능)에 1:1000으로 희석된 1차 항-GFP 항체(www.lifetechnologies.com/에서 온라인으로 구입 가능)와 함께 밤새 인큐베이션하였다. 0.1% Tween-20(PBST)을 함유하는 PBS 중에서 각 5분 동안 3회 린싱한 후, 절편을 Mach 2 HRP 중합체(http://biocare.net/)에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 3회 세척하고, 비색반응으로 발색시켰다(DAB). 면역염색된 절편을 크레실 바이올렛(cresyl violet)으로 대조 염색하고, 슬라이드 상에 올려 놓고 Cytoseal®(www.thermoscientific.com/에서 온라인으로 구입 가능)을 이용하여 밀봉하였다.
비-인간 영장류( NHP ) 뇌에서의 GFP 발현의 적용범위의 계산: 매칭되는 IHC 염색 연속 절편으로부터의 GFP 염색을 각 원숭이 뇌의 개별적인 상응하는 MRI 스캔(관상면에서의 T1 가중 MR 영상) 상으로 투영시켰다. GFP 발현의 분포/적용범위는 OsiriX Imaging Software 버전 3.1(The OsiriX Foundation, Geneva, Switzerland)을 이용하여 수행하였다.
벡터 향성 및 신경세포 형질도입 효율에 대한 이중- 면역형광: GFP를 이용한 다양한 세포 마커(NeuN, S-100, Iba1)의 이중 형광 면역염색을 위해, 20% 말 혈청과 함께 PBST 중에서 실온에서 밤새 인큐베이션함으로써 1차 항체들의 칵테일로서 1차 항체들의 조합을 절편에 적용하였다. 사용된 1차 항체는 하기와 같았다: 항-GFP 항체(상기와 같이 1:500); 항-NeuN(1:500, www.emdmillipore.com/에서 온라인으로 구입 가능); 항-S-100(1:300, biocare.net/에서 온라인으로 구입 가능), 항-Iba1(1:500, biocare.net/에서 온라인으로 구입 가능); 항-Olig2(1:50, www.emdmillipore.com/에서 온라인으로 구입 가능). PBST 중에서 3회 세척한 후, 적절한 2차 플루오로크롬 접합 항체인 염소 항-마우스 DyLight 549 및 염소 항-토끼 DyLight 488(www.biocare.net/에서 온라인으로 구입 가능)과 함께 어두운 곳에서 2시간 동안 인큐베이션함으로써 1차 항체를 가시화하였다. 모든 2차 항체를 Fluorescence Antibody Diluent(biocare.net/에서 온라인으로 구입 가능)에 1:1,000으로 희석하였다. 또한, 자가형광(autofluorescence)을 소광시키기 위해, 절편을 0.1% Sudan Black 용액(70% 에탄올)에서 인큐베이션하였다. PBS 중에서 최종 세척한 후, 절편에 형광용 Vectashield Hard Set Mounting Medium(www.vectorlabs.com/에서 온라인으로 구입 가능)과 함께 커버 슬립을 덮었다. 대조 절편을 1차 항체 없이 처리하였고, 이러한 조건 하에서 유의한 면역염색은 관찰되지 않았다.
CCD 컬러 비디오 카메라와 이미지 분석 시스템(Axiovision Software, www.zeiss.com/에서 온라인으로 구입 가능)이 장착된 Zeiss Axioskop 형광 현미경(www.zeiss.com/에서 온라인으로 구입 가능)을 이용하여 이중 표지 세포(적색 및 녹색 채널 둘 모두에서 양성)의 존재를 결정하였다. 절편의 위치 또는 초점(대물렌즈 X 20)을 변경하지 않고 2개의 별개의 채널(적색 및 녹색; 공동 국소화는 황색으로 나타남)으로부터의 영상을 병합함으로써 이중 표지 절편에 대한 현미경사진을 얻었다. GFP/NeuN 이중 염색을 위해, 각 원숭이로부터의 약 4-mm 간격의 3개의 절편을 벡터 주입 부위로부터 선택하였다. 표적화 뇌 영역(미상핵과 피각) 내에서의 AAV1-eGFP 또는 AAV2-eGFP 벡터에 의한 신경세포 형질도입 효율의 평가를 위해, 5개의 카운팅 프레임(700 ㎛ x 550 ㎛)을 GFP+ 영역에 무작위로 배치하였다. 1차 형질도입 영역(PAT)는 표적화 구조의 40% 초과를 커버하는 GFP 양성 영역("클라우드(cloud)")으로 정의하였다. 유사하게, 신경세포 형질도입의 효율을 평가하기 위해, PAT 바깥(OPAT)에서, 각 절편으로부터의 5개의 카운팅 프레임(700 ㎛ x 550 ㎛)을 표적화 구조(미상핵과 피각) 또는 피질에서의 GFP 양성 "클라우드"의 명확한 가장자리를 지나서 선택하였다(도 10c). GFP/NeuN 양성 세포의 비율을 결정하기 위해, 각 카운팅 프레임을 2회 카운팅하였는데, 먼저 NeuN+ 세포 수에 대하여 적색 채널로 카운팅하고 두 번째로 공동 염색된 세포(GFP+ 및 NeuN+) 수에 대하여 적색 채널과 녹색 채널을 합쳐서 카운팅하였다. 적어도 1,500개의 NeuN+ 세포를 3개의 선택된 절편 각각에 대해 카운팅하였다(절편당 5개의 카운팅 프레임). 마지막으로, GFP+/NeuN+ 대 총 NeuN+의 비율을 결정하였다. 선조체에 대한 모든 계산은 각각의 동물의 둘 모두의 반구로부터의 결과를 추가하고 피각과 꼬리핵으로부터의 값을 합침으로써 이루어졌는데, 이는 평균 형질도입 효율이 각각의 동물의 두 구조 모두에서 동일하였기 때문이다.
정량 실시간 PCR ( TaqMan )
GFP mRNA 수준을 정량 실시간 PCR에 의해 측정하였다. 모든 RT-PCR 분석을 위해 간, 심장, 폐, 신장 및 비장 샘플을 이용하였다. QIAGEN miRNeasy 미니 키트를 이용하여 총 RNA를 추출한 후, 역전사시키고, 제조업체의 지시에 따라 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Applied Biosystems)를 이용하여 증폭시켰다. 정량 RT-PCR 반응을 QuantStudio12K Flex Real-Time PCR System(Applied Biosystems)에서 수행하고 분석하였다. 각각의 샘플을 이중으로 실행시키고, 표준 곡선을 이용하여 상대 유전자 발현을 결정하였다.
MR 영상화 데이터 분석
반정량 분석(Digital MRI Vd /Vi): OsiriX Imaging Software 버전 3.1(The OsiriX Foundation, Geneva, Switzerland)을 이용하여 분포 부피(Vd) 분석을 수행하였다. 관상면의 T1 가중 MR 영상에서 주입 부위, 캐뉼러 트랙(track) 및 캐뉼러 첨단을 확인하였다. 관심 영역(ROI)을 표시하여 T1 가돌리늄 신호 및 표적 부위(즉, 피각 및 꼬리핵)의 윤곽을 나타내었다. 영상 시리즈와 ROI의 3차원 부피 재구성을 분석하여 주입액의 분포 부피(Vd) 및 주입액의 부피(Vi)에 대한 비를 산정하였다.
트랜스진 발현의 조직학적 분석: 트랜스진 발현을 평가하기 위하여, 뇌 절편을 면역조직화학적 분석(IHC)을 위해 처리하였다. 동물을 펜토바르비탈나트륨(25 mg/kg i.v.)으로 깊이 마취시키고, 벡터 투여 후 4주째에 안락시켰다. 뇌를 분리하고, 6-mm 블록으로 관상 절편화하였다. 블록을 완충 파라포름알데하이드(4%)에서 24시간 동안 후고정하고, PBS 중에서 간단히 세척하고, 동결 보존을 위해 30% 수크로스/PBS 용액 중에서 조정하였다. 포르말린 고정 뇌 블록을 냉동미세절단기(cryostat)에서 40-㎛ 관상 절편으로 절단하였다. 전체 뇌에 걸쳐 있는 자유 부유성 절편을 연속적으로 수집하고, 추가 IHC 분석을 위해 동결방지 용액에 보관하였다.
결과
AAV1- GFP 및 AAV2-GFP 벡터 둘 모두는 면역조직화학에 의해 가시화된 바와 같이 형질도입된 신경세포로부터 풍부한 GFP 발현을 유발하였다. CED에 의한 미상핵과 피각 내로의 AAV1의 주입 후, 광범위한 GFP 면역염색이 미상핵과 피각(도 2c 및 도 2d)뿐만 아니라 흑색질(도 2d)에서도 검출되었다. 선조체 이외에, 붉은털원숭이 뇌의 다수의 피질 영역이 또한 형질도입되었다(도 2a 내지 도 2d). 피질 GFP 발현은 전전두 연합 피질 영역, 전운동 피질, 1차 체성 피질 영역 및 1차 운동 피질뿐만 아니라 후두 피질의 광범위한 영역에서도 가장 분명하였다(도 2a 내지 도 2d).
피질 내의 대다수의 GFP 양성 신경세포는, 위에 놓인 층 내로 축삭 투사(axonal projection)가 일어나는, 피질 IV층에 위치한 피라미드 신경세포로 형태학적으로 확인되었다. GFP 양성 신경세포의 밀도는 전두 피질(도 3a 및 도 3b) 및 후두 피질(도 3c 및 도 3d)에서 특히 높았으며, 여기서 별아교세포(도 3a 및 도 3c) 이외에 다수의 신경세포(도 3b 및 도 3d)가 형질도입되었다.
실시예 2: 선조체내 AAV2 벡터 전달 후 광범위한 GFP 발현.
대류 강화 전달(CED)에 의해 전달된 경우 붉은털원숭이 뇌의 선조체와 피질 구조 둘 모두를 효율적으로 표적화하는 AAV2의 능력을 평가하였다. 상기 실시예 1에 기재된 방법에 따라 사이토메갈로바이러스 인핸서/닭 베타-액틴(CBA) 프로모터의 제어 하에 GFP cDNA를 함유하는 AAV 벡터를 CED를 이용하여 8마리의 성체 붉은털원숭이의 미상핵과 피각 내로 주입하였다
CED에 의한 선조체 내로의 AAV2의 주입은 주입된 영역(미상핵과 피각)(도 4c), 흑색질(도 4d), 및 붉은털원숭이 뇌의 다수의 피질 영역(도 4a 내지 도 4d)에서 GFP 발현을 가져왔다. AAV2 주입 동물의 선조체에서의 GFP의 발현은 AAV1 벡터에 의한 선조체 적용범위와 비교한 경우 약간 더 제한적이고 국소화된 것으로 나타났다. NHP 선조체 내에서의 GFP의 발현은 포괄적이었지만, 비교적 표적화 영역의 회색질 경계 내에 들어 있었으며, 인접 비표적화 영역 내로의 AAV2-GFP 벡터의 유의한 주입 관련 누출 또는 역류의 증거는 없었다. 피질 GFP 발현은 AAV1에 대해 관찰된 동일한 영역에서 분명하였다. 전전두 연합 피질 영역, 전운동 피질, 1차 체성감각 피질 영역 및 1차 운동 피질뿐만 아니라 후두 피질의 광범위한 영역도 잘 형질도입되었다(도 4a 내지 도 4d).
실시예 3: 삼중 트랜스펙션 또는 생산 세포주 과정에 의해 제조된 선조체내 AAV1 및 AAV2 벡터 후 GFP 발현의 필적 가능성
현재까지 대다수의 전임상 연구는 삼중 트랜스펙션에 이어 염화세슘 구배 또는 컬럼 크로마토그래피를 이용한 정제에 의해 제조된 AAV 벡터를 이용하고 있다. 따라서, 생체내 생체분포에 대한 벡터 생성의 영향을 평가하기 위해, 2가지의 벡터 생성 방법인 삼중 트랜스펙션(TT) 또는 생산 세포주(PCL)를 비교하였다. 이러한 2가지 상이한 제조 플랫폼에 의해 생성된 AAV1 및 AAV2 벡터를 CED에 의해 투여하고, 붉은털원숭이 뇌 내에서의 이들의 분포를 비교하였다.
삼중 트랜스펙션에 의해 제조된 AAV1-GFP 벡터의 주입은 생산 세포주 과정에 의해 제조된 AAV1-GFP 벡터와 비교한 경우 동등한 GFP 분포 및 적용범위를 생성시켰다. GFP 분포는 붉은털원숭이의 선조체 내로의 주입 후 30일째에 AAV1-GFP(TT) 벡터(도 5c 및 도 5d)와 AAV1-GFP(PCL) 벡터(도 5a 및 도 5b) 사이에서 필적할 만하였다.
유사한 결과가 AAV2-GFP 벡터에서 관찰되었다. AAV2-GFP(TT) 주입 뇌(도 6c 및 도 6d)와 AAV2-GFP(PCL) 주입 뇌(도 6a 및 도 6b) 사이에서 GFP 분포는 유사하고 필적할 만하였다.
주입 성능을 측정하기 위해, 가돌리늄 조영제(2 mM Prohance; Bracco Diagnostics, Inc.)와 혼합된 90 ㎕의 각각의 벡터를 이용하여 AAV1-eGFP(TT); AAV2-eGFP(TT); AAV1-eGFP(PCL); 및 AAV2-eGFP(PCL)를 각각의 선조체내로(피각 내로 60 ㎕를 그리고 꼬리핵 내로 30 ㎕를) 주입하였다. 각각의 주입으로부터의 자기 공명 영상(MRI)은 각각의 캐뉼러의 포지셔닝이 정확하고 주입액이 표적 영역을 커버함을 확인해 주었다. 모든 주입액은 표적 구조에 잘 들어 있었다. MR 영상에서 가돌리늄 신호로부터 생성된 주입액 분포의 3차원 재구성은 주입액의 배치와 분포 둘 모두가 모든 동물에 걸쳐 매우 일관적임을 보여주었다. 또한, 분포 부피(Vd)와 주입 부피(Vi) 사이의 비(Vd/Vi)를 각각의 전달에 대해 계산하였고, 데이터는 모든 주입에 걸쳐 일관적이었다. Vd는 Vi보다 대략 3배 더 컸다(2.1 내지 4.6의 범위)(표 6 및 표 7).
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
NHP의 선조체 내로의 AAV1-eGFP와 AAV2-eGFP(TT와 PCL의 두 생성 방법 모두에 의해 제조됨) 둘 모두의 양측 주입 후, 두 표적 구조(피각과 꼬리핵)뿐만 아니라 투사 영역(외측 및 내측 창백핵 - GPe 및 GPi, 흑색질 - SN, 시상 하부 핵 - STN, 피질 영역 - 신경세포 IV층 및 V층) 영역 전반에 걸쳐 eGFP의 강력한 발현이 분명하였다(도 7).
벡터 분포의 마커로서의 가돌리늄(Gd)의 역할을 평가하기 위해, (조직학적 절편으로부터의) GFP 발현 면적 대 상응하는 MR 스캔 상의 가돌리늄 신호 면적의 비를 계산하였다. 혈청형 AAV1이 주입된 원숭이의 경우, 이 비는 1.21±0.10인 반면, AAV2의 경우 이는 0.74±0.04였다(도 8). 1.0의 비는 MRI에 의해 결정되는 바와 같이 GFP 발현과 벡터 분포 사이의 완벽한 일치를 나타낸다. 이 차이는 AAV1 벡터가 Gd 신호 이상으로 분포하고, 1차 형질도입 영역에서 AAV2보다 더 나은 확산을 달성함을 나타내었다.
뇌 내에서의 주입된 AAV 벡터의 분포를 평가하기 위해, 각각의 동물로부터의 대표적인 자유 부유성 뇌 절편(각 블록당 3개; 40-㎛ 두께)을 토끼 항-GFP 항체(Millipore; Cat. No. 3850, 희석 1:500)로 염색하였다. 면역조직화학적 평가는 주입된 표적(우측 및 좌측 피각과 미상핵)뿐만 아니라 주입된 영역으로부터 투사된 다수의 영역(피질 영역) 내에서의 짙은 갈색 DAB 신호를 나타내었다.
GFP 발현 정도를 각각의 원숭이 뇌의 MRI 스캔 상에 투영함으로써, 피질 영역(HD와 관련된 뇌 영역)에 대한 적용범위의 비율을 계산하였다(요약을 위해서는 표 6을 그리고 추가의 세부사항에 대해서는 표 7을 참조). 모든 원숭이에서, 선조체의 24%가 평균적으로 형질도입되었고, 이는 피질에서 실질적인 GFP 발현을 가져왔다(도 7). 피질에서의 GFP 발현의 정도는 사용된 AAV 혈청형(AAV1 대 AAV2) 또는 벡터 생성 방법(TT 대 PCL)과 상호 관련되지 않았다. 주입 부위(선조체) 내에서의 주입액의 더 광범위한 분포가 피질에서의 형질도입 정도의 핵심적인 유발인자인 것으로 여겨진다. 1마리의 NHP(1번 대상체; AAV1-eGFP [TT])는 전체 뇌(전두와 후두 둘 모두 - 도 7 참조)의 피질 영역(IV층 및 V층) 내로의 GFP 발현의 특히 강력한 확산을 나타내었다. 다른 동물들은 미상핵과 피각 내에서의 정도 및 국소화된 해부학적 영역 둘 모두에서 변이와 관련된 피질 발현의 가변성을 보여주었다. 선조체의 전교련 및 교련 영역이 표적화되었기 때문에, GFP는 전두 및 두정 피질 영역에서 더 검출되었고 후두 피질에서 덜 검출되었다. 각각의 동물에 대한 조직학적 분석은 하기에 요약되어 있다(처리 그룹별로 그룹화됨).
처리 그룹 2( ssAAV2 /1- CBA - eGFP TT )
전뇌에서의 eGFP 발현의 면역조직화학적 평가는 표적화 부위(피각과 꼬리핵 둘 모두) 및 투사된 구조(창백핵, 흑색질, 시상, 시상 하부 핵, 및 피질 영역)에서의 강력한 신호를 나타내었다.
1번 대상체. 대상체는 전체 뇌(전두와 후두 둘 모두)의 피질 영역(4층 및 5층)으로의 GFP 발현의 특히 강력한 확산을 나타내었다. GFP 양성 세포의 형태는 신경세포 및 별아교세포 형질도입 둘 모두를 암시하였고, 이는 이후 이중 면역형광 염색에 의해 확인되었다(하기 참조). GFP 발현 적용범위의 계산은 전체 피질의 91%(표 7 참조)가 형질도입되었음을 나타내었다(이 계산은 GFP 신호의 정도를 분석된 원숭이 뇌의 MRI 스캔 상으로 투영함으로써 수행되었음).
2번 대상체. 대상체는 피각과 꼬리핵에서뿐만 아니라 두 반구의 창백핵과 흑색질에서도 강력학 형질도입을 나타내었다. 피질로의 GFP 발현의 투사는 1번 대상체보다 덜 뚜렷하였고, 주로 피질의 전두 영역에서 관찰되었다. GFP 신호가 후두 피질에서 또한 검출되었지만, GFP 양성 세포의 밀도는 유의하게 더 낮았다. 피질 GFP 발현 적용범위는 50%를 차지하였다(표 7). 1번 대상체에서와 유사하게, GFP 양성 세포는 신경세포 및 별아교세포 형태 둘 모두를 나타냈는데, 이는 이중 면역형광에 의해 확인되었다.
3번 대상체. 대상체는 피각과 꼬리핵에서뿐만 아니라 모든 투사된 구조((창백핵, 흑색질, 시상 하부 핵, 시상 및 피질)에서도 강력한 GFP 발현을 나타내었다. GFP 신호가 피질의 일부 영역에서 명확히 검출되었지만, GFP 발현은 이의 전체 피질 적용범위의 41%만을 차지하였다(시험된 모든 원숭이 중에서 최저임; 표 7 참조). 신경세포와 별아교세포 둘 모두가 형질도입되었다. 대부분의 우측 전방 방사관(corona radiate)이 또한 GFP 양성 신호를 나타내었는데, 이는 선조체로 침투하는 캐뉼러로부터의 벡터 유출의 결과로서일 가능성이 높다.
처리 그룹 3( ssAAV2 /2- CBA - eGFP TT )
6번 대상체. 대상체는 표적화 구조(피각과 꼬리핵) 둘 모두에서 강력한 GFP 신호를 나타내었다. 조밀하게 흩어진 양성 세포가 그러한 영역 둘 모두에서 검출되었다. GFP 발현은 또한 전두 피질 영역, 창백핵, 흑색질, 시상 하부 핵, 및 시상의 일부로 확산되었다. 피질에서의 GFP 발현 적용범위는 75%를 차지하였다(표 7). GFP 양성 세포는 주로 신경세포 형태를 가졌고, 이는 이후 이중 면역형광에 의해 확인되었다. 별아교세포 형태의 GFP 양성 세포가 속섬유막뿐만 아니라 몇몇 피질 반점 및 주입 캐뉼러의 명확히 가시적인 트랙이 있는 밀접하게 인접한 백질 영역에서도 검출되었다.
7번 대상체. 대상체는 우측 및 좌측 선조체(피각과 꼬리핵 둘 모두) 내에서 GFP 양성 신호를 나타내었다. 이의 분포는 약간 불량하였고, 패턴은 다른 주입된 원숭이들과 비교한 경우 균일하다기보다는 "불규칙적(spotty)"이었다. 결과적으로, 모든 투사된 뇌 구조에서의 GFP 신호가 또한 더 약하게 나타났다. 피질에서의 GFP 발현 적용범위는 47%를 차지하였다(표 7). GFP 양성 세포는 주로 신경세포 형태를 가졌고, 이는 이후 이중 면역형광에 의해 확인되었다. 별아교세포 형태의 GFP 양성 세포는 속섬유막에서뿐만 아니라 몇몇 피질 반점 및 주입 캐뉼러의 명확히 가시적인 트랙이 있는 밀접하게 인접한 백질 영역에서도 검출되었다.
처리 그룹 4( ssAAV2 /1- CBA - eGFP PCL )
4번 대상체. 대상체는 표적화 구조인 피각과 꼬리핵에서 매우 강력한 GFP 발현을 나타내었다. GFP 양성 신호는 창백핵, 흑색질, 시상 하부 핵, 시상 및 피질 영역에서 또한 검출되었다. 피질에서의 GFP 발현 적용범위는 61%를 차지하였다(표 7). 방사관의 전방부가 또한 GFP 양성 신호를 나타내었는데, 이는 선조체로 침투하는 캐뉼러로부터의 벡터 유출의 결과로서일 가능성이 높다. 양성 세포는 신경세포 형태와 별아교세포 형태 둘 모두를 가졌고, 이는 이후 이중 면역형광에 의해 확인되었다.
5번 대상체. 대상체는 선조체(피각과 꼬리핵 둘 모두)에서 강력한 GFP 발현을 나타내었다. GFP 신호는 투사된 구조(창백핵, 흑색질, 시상 하부 핵, 시상 및 피질 영역)에서 또한 검출되었다. 피질에서의 GFP 발현 적용범위는 68%를 차지하였다(표 7). 방사관의 전방부가 또한 GFP 양성 신호를 나타내었는데, 이는 선조체로 침투하는 캐뉼러로부터의 벡터 유출의 결과로서일 가능성이 높다. 양성 세포는 신경세포 형태와 별아교세포 형태 둘 모두를 가졌다.
처리 그룹 5( ssAAV2 /2- CBA - eGFP PCL )
9번 대상체. 대상체는 선조체(피각과 꼬리핵 둘 모두)에서 매우 강력한 GFP 발현을 나타내었다. GFP 신호는 투사된 구조(창백핵, 흑색질, 시상 하부 핵, 시상 및 피질 영역)에서 또한 검출되었다. 피질에서의 GFP 발현 적용범위는 73%를 차지하였다(표 7). GFP 양성 세포는 주로 신경세포 형태를 가졌지만, 별아교세포 형태의 GFP 양성 세포가 백질 신경로(속섬유막) 내에서 그리고 캐뉼러 트랙의 바로 근처에서 또한 검출되었다.
8번 대상체. 대상체는 선조체 및 투사된 구조(창백핵, 흑색질, 시상 하부 핵, 시상 및 피질 영역)에서 강력한 GFP 발현을 나타내었다. 피질에서의 GFP 발현 적용범위는 50%를 차지하였다(표 7). GFP 양성 세포는 주로 신경세포 형태를 가졌지만, 별아교세포 형태의 GFP+ 세포가 백질 신경로(속섬유막, 방사관) 내에서 그리고 캐뉼러 트랙의 바로 근처에서 또한 검출되었다.
이중 면역형광
AAV1-eGFP 벡터(TT 및 PCL)로 형질도입된 둘 모두의 NHP 그룹의 경우, GFP 양성 세포의 형태는 신경세포 및 별아교세포 형질도입 둘 모두를 암시하였다(도 9a 내지 도 9d). 이는 GFP와 NeuN(신경세포 마커) 또는 GFP와 S-100(별아교세포 마커)에 대한 항체의 조합에 의한 이중 면역형광 염색에 의해 확인되었다(도 10a 내지 도 10c). 대조적으로, AAV2-eGFP(TT와 PCL 둘 모두)는 신경세포 형질도입을 우세하게 유도하였다(도 9e 내지 도 9g 및 도 10d). 별아교세포 계통의 GFP 양성 세포가 속섬유막(도 9h)에서뿐만 아니라 주입 캐뉼러 트랙이 가시적인 백질의 피질 영역에서도 또한 검출되었다.
이중 면역형광에 기초하여, 선조체 및 피질 영역에서의 신경세포 형질도입의 효율을 모든 NHP에 대하여 (주입 부위의 관상면에서) 계산하였다. 도 11a는 선조체에서의 발견을 요약한 것이다. 각각의 동물에 대한 개별적인 계산은 하기 표 8에 나타낸다.
Figure pct00010
MRI에 의해 나타나는 1차 형질도입 영역에서의 선조체 신경세포 형질도입은 50% 내지 65%의 범위였다. 형질도입의 최고 효율은 AAV1-eGFP(TT)가 주입된 NHP에서 평균 64.2±5.9%로 관찰되었고, 최저는 그룹 AAV2-eGFP(TT)에서 평균 46.6±11.7%로 관찰되었다(p < 0.05; 이원 ANOVA). 이는 신경세포를 형질도입시키는데 있어서 혈청형 AAV1이 AAV2보다 약 18% 더 높은 효율을 가짐을 암시한다. PCL에 의해 생성된 AAV1-eGFP는 AAV2-eGFP(50.1± 5.8%)보다 더 많은 신경세포(59.7± 8.1%)를 형질도입시킨다는 쪽으로는 더 약한 경향을 나타내었다(p> 0.05; 이원 ANOVA).
상기 계산은 MRI에 의해 규정된 바와 같은 강력한 GFP 형질도입 영역(1차 형질도입 영역 - PAT)으로부터 유도되었다. 또한, PAT 바깥의 영역에서의 신경세포 선조체 형질도입의 효율을 계산하여 GFP 양성 세포가 강력한 GFP 신호의 명확한 경계 바깥("1차 형질도입 영역 바깥" - OPAT)에서 또한 검출될 수 있는지를 알아보았는데, 이는 아마도 시험된 모든 벡터가 동일한 방식으로 확산됨을 암시할 것이다. 이러한 영역이 선택되는 방식(5개의 카운팅 프레임의 무작위 선택)의 도식은 도 11b에 도시되어 있다. 혈청형 AAV1과 AAV2 사이에 OPAT에서의 형질도입 효율의 평가치의 극적인 차이가 관찰되었는데(도 11c), AAV1는 AAV2보다 더 많은 신경세포를 형질도입시켰다(TT 그룹의 경우 8.1±3.8% 대 0.74±0.25%이고, PCL 그룹의 경우 7.2±3.5% 대 2.16±1.8%임; 둘 모두의 비교에서 p<0.05 이원 ANOVA;). 각각의 동물에 대한 개별적인 계산은 하기 표 9에 나타낸다.
Figure pct00011
또한, 선조체로 투사하는 피질 영역에서의 형질도입의 효율을 계산하였다. 피질 적용범위의 정도가 동물에 따라 달랐기 때문에, 인접 GFP 양성 선조체를 지닌 절편에서 무작위 피질 영역을 카운팅하였다. 동물들 사이에 분명한 불일치가 관찰되었는데(표 8), 사용된 혈청과는 명확한 상관 관계가 없었다. AAV2의 경우의 13.4±9.0%에 비해 AAV1에 대한 평균 신경세포 형질도입 효율은 13.6±8.3%이었다(p > 0.97).
상기 언급된 바와 같이, AAV1-eGFP는 신경세포보다 더 많은 별아교세포(S-100 마커)를 형질도입시켰다. GFP 양성 별아교세포는 1차 형질도입 부위(선조체)뿐만 아니라 선조체로 투사하는 피질 영역에서도 검출되었다. GFP 형질도입 별아교세포의 예는 도 10c에 도시되어 있다. AAV2-eGFP 벡터의 경우, 단지 산발적인 GFP+ 별아교세포가 주입 캐뉼러의 트랙 주위에서 검출될 수 있었다. 벡터가 뇌에서 다른 항원 제시 세포를 형질도입시키는지를 결정하기 위해, 모든 원숭이로부터의 대표적인 뇌 절편을 미세아교세포에 특이적인 Iba-1와 GFP에 대한 항체로 공동 염색하였다. 어떠한 동물도 이중 표지 세포를 나타내지 않았는데, 이는 이러한 가능성을 배제한다(도 10e). 결과적으로, 시험된 모든 원숭이에서, 희소돌기아교세포에 대한 마커인 Olig-2에 대한 염색은 GFP와 Olig-2 둘 모두에 대해 양성인 몇몇 세포만을 나타내었다. 이러한 희박한 세포는 주로 캐뉼러 트랙 근처에서 검출되었다(데이터는 제시되지 않음).
뇌 절편을 헤마톡실린-에오신(H&E)으로 염색하여 이러한 벡터가 신경염증을 촉발하는지를 결정하였다. 절편은 혈관 주변의 고밀도 덩어리 형태의 림프구 또는 혈장 세포의 축적물인 혈관주위 세포침윤의 존재에 대해 주로 검사하였다. 다양한 정도의 이러한 침윤물이 모든 원숭이에서 검출되었지만, 다른 벡터/트랜스진 관련 조직학적 발견은 관찰되지 않았다. 그러나, AAV1은 AAV2보다 1차 형질도입 영역 내에서 약간 더 뚜렷한 대식세포와 림프구의 침윤을 야기하는 것으로 관찰되었다(도 12a 및 도 12b). 또한, 삼중 트랜스펙션에 의해 생성된 벡터는 생산 세포주 과정에 의해 생성된 벡터보다 더 광범위한 혈관주위 세포침윤을 야기하는 것으로 여겨졌다. 주목할 만하게도, 형질도입의 투사 영역(피질 영역)에서는 침윤물이 검출되지 않았다.
실시예 4: 중추 신경계(CNS) 바깥의 주변 조직에서의 검출 가능한 GFP 발현의 부재.
부검시에 신장, 간, 폐, 심장 및 비장을 포함하는 주변 장기 조직을 수집하여 CED 투여 AAV-GFP 트랜스진의 발현이 CNS 바깥에서 검출될 수 있는지를 평가하였다.
결과
수집된 장기 중 어느 것에서도 검출 가능한 수준의 GFP가 검출되지 않았다. AAV-GFP(TT) 벡터(도 13a)와 AAV-GFP(PCL) 벡터(도 13b) 둘 모두는 검출 가능한 수준의 GFP를 나타내지 않았다. AAV2/1-GFP(TT) 벡터가 주입된 마우스 뇌 조직을 본 검정에 대한 양성 대조군으로 사용하였다.
결론
뇌로의 치료용 단백질의 효율적인 전달은 임상 효능을 달성하면서 불리한 효과를 최소화하는데에 있어서 심각한 장애물로 남아 있다. 유전자 전달의 발달은 뇌 실질 내에서의 생물학적 제제의 생성을 확립할 기회를 제공하였다. 이러한 진보는 AAV 벡터가 신경 장애를 치료하기 위한 바람직한 벡터 시스템이 되게 한 다수의 임상 실험의 개시를 가져왔다. 특정 핵의 국소 표적화는 정위 신경외과적 주입에 의해 신뢰성 있게 달성될 수 있지만, 인간 피질의 대규모의 복잡한 배열은 바이러스 벡터의 직접 주입에 의해 쉽게 표적화되지 않는다. 뇌에서의 광범위한 유전자 발현을 안전하게 달성하는데 있어서의 어려움은 피질 전달을 필요로 하는 신경 질병에 대한 잠재적인 치료제의 개발을 방해하여 왔다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, AAV 벡터(예를 들어, AAV1 및 AAV2)는 전체 영장류 선조체(미상핵과 피각)로의 광범위한 전달뿐만 아니라 대뇌 피질(전두 피질, 후두 피질 및 IV층을 포함함), 시상 및 해마 내의 유의한 수의 세포로의 전달을 제공할 수 있다. 대뇌 피질에서의 기능이 알려져 있지 않은 리포터 단백질인 GFP를 본 명세서에서 논의된 연구에 이용하였다. CED 전달법을 이용하여 미상핵과 피각 내로 주입된 AAV1-GFP 및 AAV2-GFP는 미상핵과 피각 둘 모두에서뿐만 아니라 피질의 여러 영역에서 높은 수준의 GFP 발현을 가져왔다. 전두 피질의 GFP 양성 신경세포는 AAV-GFP 주입 부위로부터 20 mm를 초과한 거리에 위치하여, GFP 단백질과 AAV 벡터의 축삭 수송을 입증하였다. 이론에 구속하고자 함이 없이, GFP가 세포질에 남아 있고 분비 단백질이 아니기 때문에, 피질에서의 GFP의 존재는 단일 축삭 투사를 따른 AAV2 벡터의 직접적인 세포 형질도입 및 능동 수송을 나타내는 것으로 여겨진다. 헌팅톤병은 AAV의 선조체 전달(예를 들어, CED 선조체 전달)이 유용할 수 있는 예시적인 질병이다. 헌팅톤병은 선조체 영역과 피질 영역 둘 모두에 영향을 미치며, 이에 따라 둘 모두의 영역을 표적화하는 치료 전략이 이상적이다.
본 명세서에 개시된 발견은 AAV 벡터(예를 들어, AAV1 및 AAV2)의 전달이 선조체 주입 부위로부터 상당한 거리에 위치한 신경세포를 형질도입시킬 가능성을 강조한다. 따라서, AAV 벡터(예를 들어, AAV1 및 AAV2)의 선조체내 투여는 헌팅톤병을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 선조체 및 피질로의 치료용 분자의 전달을 필요로 하는 CNS 장애를 치료하는데 사용하기에 이상적이다. 또한, 삼중 트랜스펙션법 및 생산 세포주법에 의해 생성된 AAV 벡터는 필적할 만한 트랜스진 발현 패턴 및 형질도입 수준을 나타내기 때문에, AAV 벡터를 생성하는 삼중 트랜스펙션법 및 생산 세포주법은 본 발명에 사용하기에 적합하다.
SEQUENCE LISTING <110> STANEK, Lisa M. SHIHABUDDIN, Lamya <120> ENHANCED DELIVERY OF VIRAL PARTICLES TO THE STRIATUM AND CORTEX <130> 159792012740 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> US 62/114,544 <151> 2015-02-10 <150> US 62/220,997 <151> 2015-02-19 <160> 1 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1 cactccctct ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccggg cgaccaaagg tcgcccacgc 60 ccgggctttg cccgggcg 78

Claims (222)

  1. 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV) 입자를 선조체(striatum)에 투여하는 단계를 포함하여 rAAV 입자를 포유동물의 중추 신경계에 전달하는 방법으로서, rAAV 입자는 포유동물의 적어도 대뇌 피질과 선조체에서 발현되는 이종성 핵산을 인코딩하는 rAAV 벡터를 포함하는, 방법.
  2. rAAV 입자를 선조체에 투여하는 단계를 포함하여 rAAV 입자를 포유동물의 중추 신경계에 전달하는 방법으로서, rAAV 입자는 포유동물의 적어도 대뇌 피질과 선조체에서 발현되는 이종성 핵산을 인코딩하는 rAAV 벡터를 포함하고, rAAV 입자는 AAV 혈청형 1(AAV1) 캡시드를 포함하는, 방법.
  3. rAAV 입자를 선조체에 투여하는 단계를 포함하여 rAAV 입자를 포유동물의 중추 신경계에 전달하는 방법으로서, rAAV 입자는 포유동물의 적어도 대뇌 피질과 선조체에서 발현되는 이종성 핵산을 인코딩하는 rAAV 벡터를 포함하고, rAAV 입자는 AAV 혈청형 2(AAV2) 캡시드를 포함하는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물은 인간인, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 입자는 선조체의 피각(putamen)과 꼬리핵(caudate nucleus)에 투여되는, 방법.
  6. 제5항에 있어서, rAAV 입자는 선조체의 각 반구의 피각과 꼬리핵에 투여되는, 방법.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, rAAV 입자는 꼬리핵의 1개 부위 및 피각의 2개 부위에 투여되는, 방법.
  8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 피각에 투여되는 rAAV 입자 대 꼬리핵에 투여되는 rAAV 입자의 비는 적어도 약 2:1인, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 이종성 핵산은 포유동물의 전두 피질, 후두 피질 및/또는 IV층에서 발현되는, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 이종성 핵산은 전전두 연합 피질 영역, 전운동 피질, 1차 체성감각 피질 영역, 감각 운동 피질, 두정 피질, 후두 피질 및/또는 1차 운동 피질에서 발현되는, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 입자는 대뇌 피질에서 역행(retrograde) 또는 순행(anterograde) 수송되는, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 이종성 핵산은 시상, 시상 하부 핵, 창백핵, 흑색질 및/또는 해마에서 추가로 발현되는, 방법.
  13. 제1항 또는 제4항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV V708K, 염소 AAV, AAV1/AAV2 키메라, 소 AAV, 또는 마우스 AAV 캡시드 rAAV2/HBoV1 혈청형 캡시드를 포함하는, 방법.
  14. 제13항에 있어서, AAV 혈청형은 AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10 또는 AAVrh10인, 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 벡터는 하나 이상의 AAV 역위 말단 반복부(inverted terminal repeat, ITR) 서열에 의해 플랭킹된 이종성 핵산을 포함하는, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 이종성 핵산은 2개의 AAV ITR에 의해 플랭킹되어 있는, 방법.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, AAV ITR은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, 염소 AAV, 소 AAV, 또는 마우스 AAV 혈청형 ITR인, 방법.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, AAV ITR은 AAV2 ITR인, 방법.
  19. 제15항 또는 제16항에 있어서, rAAV 입자의 ITR과 캡시드는 동일한 AAV 혈청형으로부터 유래되는, 방법.
  20. 제3항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, ITR과 캡시드는 AAV2로부터 유래되는, 방법.
  21. 제15항 또는 제16항에 있어서, rAAV 바이러스 입자의 ITR과 캡시드는 상이한 AAV 혈청형으로부터 유래되는, 방법.
  22. 제2항 및 제4항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, ITR은 AAV2로부터 유래되고, 캡시드는 AAV1로부터 유래되는, 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 이종성 핵산은 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있는, 방법.
  24. 제23항에 있어서, 프로모터는 CNS의 세포에서 이종성 핵산을 발현시키는, 방법.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 프로모터는 뇌 세포에서 이종성 핵산을 발현시키는, 방법.
  26. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터는 신경세포 및/또는 신경아교세포에서 이종성 핵산을 발현시키는, 방법.
  27. 제26항에 있어서, 신경세포는 꼬리핵의 중형 가시 신경세포(medium spiny neuron), 피각의 중형 가시 신경세포, 피질 IV층의 신경세포 및/또는 피질 V층의 신경세포인, 방법.
  28. 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터는 CBA 프로모터, 최소 CBA 프로모터, CMV 프로모터 또는 GUSB 프로모터인, 방법.
  29. 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터는 유도성인, 방법.
  30. 제23항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 벡터는 인핸서, 스플라이스 공여체/스플라이스 수용체 쌍, 매트릭스 부착 부위 또는 폴리아데닐화 신호 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 벡터는 자기 상보성 rAAV 벡터인, 방법.
  32. 제31항에 있어서, 벡터는 이종성 핵산을 인코딩하는 제1 핵산 서열과 이종성 핵산의 상보체를 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하며, 여기서 제1 핵산 서열은 그 길이의 대부분 또는 전부에 걸쳐 제2 핵산 서열과 가닥내 염기쌍을 형성할 수 있는, 방법.
  33. 제32항에 있어서, 제1 핵산 서열과 제2 핵산 서열은 돌연변이된 AAV ITR에 의해 연결되어 있으며, 여기서 돌연변이된 AAV ITR은 D 영역의 결실을 포함하고, 말단 분해 서열(terminal resolution sequence)의 돌연변이를 포함하는, 방법.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 이종성 핵산은 치료용 폴리펩티드 또는 치료용 핵산을 인코딩하는, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 이종성 핵산은 치료용 폴리펩티드를 인코딩하는, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 치료용 폴리펩티드는 효소, 신경영양 인자, CNS 관련 장애가 있는 개체에서 결핍되거나 돌연변이된 폴리펩티드, 항산화제, 항-아폽토시스 인자, 항-혈관신생 인자, 및 항-염증 인자, 알파-시뉴클레인(alpha-synuclein), 산 베타-글루코시다제(GBA), 베타-갈락토시다제-1(GLB1), 이두로네이트 2-설파타제(IDS), 갈락토실세라미다제(GALC), a 만노시다제, 알파-D-만노시다제(MAN2B1), 베타-만노시다제(MANBA), 슈도아릴설파타제 A(ARSA), N-아세틸글루코사민-1-포스포트랜스퍼라제(GNPTAB), 산 스핑고미엘리나제(ASM), 니만-픽(Niemann-Pick) C 단백질(NPC1), 산 알파-1,4-글루코시다제(GAA), 헥소사미니다제 베타 서브유닛, HEXB, N-설포글루코사민 설포하이드롤라제(MPS3A), N-알파-아세틸글루코사미니다제(NAGLU), 헤파린 아세틸-CoA, 알파-글루코사미니다제 N-아세틸트랜스퍼라제(MPS3C), N-아세틸글루코사민-6-설파타제(GNS), 알파-N-아세틸갈락토사미니다제(NAGA), 베타-글루쿠로니다제(GUSB), 헥소사미니다제 알파 서브유닛(HEXA), 헌팅틴(HTT), 리소좀 산 리파제(LIPA), 아스파르틸글루코사미니다제, 알파-갈락토시다제 A, 팔미토일 단백질 티오에스터라제, 트리펩티딜 펩티다제, 리소좀 막횡단 단백질, 시스테인 수송체(Cysteine transporter), 산 세라미다제, 산 알파-L-푸코시다제, 카텝신 A, 알파-L-이두로니다제, 아릴설파타제 B, 아릴설파타제 A, N-아세틸갈락토사민-6-설페이트, 산 베타-갈락토시다제, 또는 알파-뉴라미다제인, 방법.
  37. 제35항에 있어서, 이종성 핵산은 치료용 핵산을 인코딩하는, 방법.
  38. 제37항에 있어서, 치료용 핵산은 siRNA, shRNA, RNAi, miRNA, 안티센스 RNA, 리보자임 또는 DNA자임(DNAzyme)인, 방법.
  39. 제34항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 치료용 폴리펩티드 또는 치료용 핵산은 CNS 장애를 치료하는데 사용되는, 방법.
  40. 제39항에 있어서, CNS 장애는 리소좀 축적병(LSD), 헌팅톤병, 간질, 파킨슨병, 알츠하이머병, 뇌졸중, 피질기저핵 변성(CBD), 피질기저핵 신경절 변성(CBGD), 전두측두엽 치매(FTD), 다계통 위축증(MSA), 진행성 핵상 마비(PSP) 또는 뇌암인, 방법.
  41. 제40항에 있어서, 장애는 아스파르틸글루소아미뉴리아(Aspartylglusoaminuria), 파브리병(Fabry), 영아 배튼병(CNL1), 전형적 후기 영아 배튼병(CNL2), 소아 배튼병(CNL3), 배튼병 형태 CNL4, 배튼병 형태 CNL5, 배튼병 형태 CNL6, 배튼병 형태 CNL7, 배튼병 형태 CNL8, 시스틴증, 파아버병(Farber), 푸코시드축적증(Fucosidosis), 갈락토시도시알산증(Galactosidosialidosis), 1형 고셔병, 2형 고셔병, 3형 고셔병, GM1 강글리오시드증, 헌터병, 크라베병, α 만노시드증병, β 만노시드증병, 마로토-라미병(Maroteaux-Lamy), 이염성 백질이영양증병, 모르퀴오병(Morquio) A, 모르퀴오병 B, 점액지질증 II/III 질병, 니만-픽 A 질병, 니만-픽 B 질병, 니만-픽 C 질병, 폼페병, 샌드호프병, 센필리포(Sanfillipo) A 질병, 센필리포 B 질병, 센필리포 C 질병, 센필리포 D 질병, 쉰들러병, 쉰들러-칸자키병(Schindler-Kanzaki), 시알산증, 슬라이병(Sly disease), 테이-삭스병(Tay-Sachs disease) 및 월만병(Wolman disease)으로 구성된 군으로부터 선택된 리소좀 축적병인, 방법.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 입자는 조성물로 존재하는, 방법.
  43. 제42항에 있어서, 조성물은 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물인, 방법.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 입자는 숙주 세포 내로의, rAAV 벡터를 인코딩하는 핵산, AAV rep 및 cap를 인코딩하는 핵산, 및 AAV 헬퍼 바이러스 기능을 인코딩하는 핵산의 삼중 트랜스펙션에 의해 생성되었으며, 여기서 숙주 세포로의 핵산의 트랜스펙션은 rAAV 입자를 생성할 수 있는 숙주 세포를 발생시키는, 방법.
  45. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 입자는 rAAV 벡터를 인코딩하는 핵산, AAV rep 및 cap를 인코딩하는 핵산, 및 AAV 헬퍼 바이러스 기능을 인코딩하는 핵산 중 하나 이상을 포함하는 생산 세포주(producer cell line)에 의해 생성된, 방법.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 입자는 정위(stereotactic) 전달에 의해 전달되는, 방법.
  47. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 입자는 대류 강화 전달(convection enhanced delivery)에 의해 전달되는, 방법.
  48. 제47항에 있어서, rAAV 입자는 CED 전달 시스템을 이용하여 전달되는, 방법.
  49. 제48항에 있어서, CED 시스템은 캐뉼러(cannula) 및/또는 펌프를 포함하는, 방법.
  50. 제49항에 있어서, 캐뉼러는 역류 저항 캐뉼러 또는 단계식(stepped) 캐뉼러인, 방법.
  51. 제50항에 있어서, 펌프는 수동 펌프인, 방법.
  52. 제50항에 있어서, 펌프는 삼투 펌프인, 방법.
  53. 제50항에 있어서, 펌프는 주입 펌프인, 방법.
  54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항의 방법에 의해 유효량의 rAAV 입자를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하여 포유동물의 CNS 장애를 치료하는 방법.
  55. 유효량의 rAAV 입자를 선조체에 투여하는 단계를 포함하여 포유동물의 헌팅톤병을 치료하는 방법으로서, rAAV 입자는 포유동물의 적어도 대뇌 피질과 선조체에서 발현되는 이종성 핵산을 인코딩하는 rAAV 벡터를 포함하는, 방법.
  56. 제55항에 있어서, rAAV 입자는 AAV1 캡시드 또는 AAV2 캡시드를 포함하는, 방법.
  57. 유효량의 rAAV 입자를 선조체에 투여하는 단계를 포함하여 포유동물의 파킨슨병을 치료하는 방법으로서, rAAV 입자는 포유동물의 적어도 대뇌 피질과 선조체에서 발현되는 이종성 핵산을 인코딩하는 rAAV 벡터를 포함하는, 방법.
  58. 제57항에 있어서, rAAV 입자는 AAV2 캡시드를 포함하는, 방법.
  59. 제55항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물은 인간인, 방법.
  60. 제55항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 입자는 선조체의 피각과 꼬리핵에 투여되는, 방법.
  61. 제58항에 있어서, rAAV 입자는 선조체의 각 반구의 피각과 꼬리핵에 투여되는, 방법.
  62. 제60항 또는 제61항에 있어서, rAAV 입자는 꼬리핵의 1개 부위 및 피각의 2개 부위에 투여되는, 방법.
  63. 제55항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 피각에 투여되는 rAAV 입자 대 꼬리핵에 투여되는 rAAV 입자의 비는 적어도 약 2:1인, 방법.
  64. 제55항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 이종성 핵산은 포유동물의 전두 피질, 후두 피질 및/또는 IV층에서 발현되는, 방법.
  65. 제62항에 있어서, 이종성 핵산은 전전두 연합 피질 영역, 전운동 피질, 1차 체성감각 피질 영역, 감각 운동 피질, 두정 피질, 후두 피질 및/또는 1차 운동 피질에서 발현되는, 방법.
  66. 제55항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 입자는 대뇌 피질에서 역행 또는 순행 수송되는, 방법.
  67. 제55항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 이종성 핵산은 시상, 시상 하부 핵, 창백핵, 흑색질 및/또는 해마에서 추가로 발현되는, 방법.
  68. 제55항 또는 제59항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV V708K, 염소 AAV, AAV1/AAV2 키메라, 소 AAV, 또는 마우스 AAV 캡시드 rAAV2/HBoV1 혈청형 캡시드를 포함하는, 방법.
  69. 제68항에 있어서, AAV 혈청형은 AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10 또는 AAVrh10인, 방법.
  70. 제55항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 벡터는 하나 이상의 AAV 역위 말단 반복부(ITR) 서열에 의해 플랭킹된 이종성 핵산을 포함하는, 방법.
  71. 제70항에 있어서, 이종성 핵산은 2개의 AAV ITR에 의해 플랭킹되어 있는, 방법.
  72. 제70항 또는 제71항에 있어서, AAV ITR은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, 염소 AAV, 소 AAV, 또는 마우스 AAV 혈청형 ITR인, 방법.
  73. 제70항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, AAV ITR은 AAV2 ITR인, 방법.
  74. 제70항 또는 제71항에 있어서, rAAV 입자의 ITR과 캡시드는 동일한 AAV 혈청형으로부터 유래되는, 방법.
  75. 제74항에 있어서, ITR과 캡시드는 AAV2로부터 유래되는, 방법.
  76. 제70항 또는 제71항에 있어서, rAAV 바이러스 입자의 ITR과 캡시드는 상이한 AAV 혈청형으로부터 유래되는, 방법.
  77. 제76항에 있어서, ITR은 AAV2로부터 유래되고, 캡시드는 AAV1로부터 유래되는, 방법.
  78. 제55항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 이종성 핵산은 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있는, 방법.
  79. 제78항에 있어서, 프로모터는 CNS의 세포에서 이종성 핵산을 발현시키는, 방법.
  80. 제78항 또는 제79항에 있어서, 프로모터는 뇌 세포에서 이종성 핵산을 발현시키는, 방법.
  81. 제78항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터는 신경세포 및/또는 신경아교세포에서 이종성 핵산을 발현시키는, 방법.
  82. 제81항에 있어서, 신경세포는 꼬리핵의 중형 가시 신경세포, 피각의 중형 가시 신경세포, 피질 IV층의 신경세포 및/또는 피질 V층의 신경세포인, 방법.
  83. 제78항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터는 CBA 프로모터, 최소 CBA 프로모터, CMV 프로모터 또는 GUSB 프로모터인, 방법.
  84. 제78항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터는 유도성인, 방법.
  85. 제78항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 벡터는 인핸서, 스플라이스 공여체/스플라이스 수용체 쌍, 매트릭스 부착 부위 또는 폴리아데닐화 신호 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
  86. 제55항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 벡터는 자기 상보성 rAAV 벡터인, 방법.
  87. 제86항에 있어서, 벡터는 이종성 핵산을 인코딩하는 제1 핵산 서열과 이종성 핵산의 상보체를 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하며, 여기서 제1 핵산 서열은 그 길이의 대부분 또는 전부에 걸쳐 제2 핵산 서열과 가닥내 염기쌍을 형성할 수 있는, 방법.
  88. 제87항에 있어서, 제1 핵산 서열과 제2 핵산 서열은 돌연변이된 AAV ITR에 의해 연결되어 있으며, 여기서 돌연변이된 AAV ITR은 D 영역의 결실을 포함하고, 말단 분해 서열의 돌연변이를 포함하는, 방법.
  89. 제55항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 이종성 핵산은 치료용 폴리펩티드 또는 치료용 핵산을 인코딩하는, 방법.
  90. 제55항, 제56항 또는 제58항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 이종성 핵산은 포유동물의 CNS의 세포에서 HTT의 발현을 저해하거나 HTT의 축적을 저해하는 치료용 폴리펩티드 또는 치료용 핵산을 인코딩하는, 방법.
  91. 제89항 또는 제90항에 있어서, 이종성 핵산은 siRNA, shRNA, RNAi, miRNA, 안티센스 RNA, 리보자임 또는 DNA자임을 인코딩하는, 방법.
  92. 제55항, 제56항, 또는 제58항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 이종성 핵산은 헌팅틴을 표적화하는 miRNA를 인코딩하는, 방법.
  93. 제92항에 있어서, 헌팅틴은 헌팅톤병과 관련된 돌연변이를 포함하는, 방법.
  94. 제57항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 이종성 핵산은 치료용 폴리펩티드를 인코딩하며, 여기서 치료용 폴리펩티드는 신경아교세포 유래 성장 인자(GDNF), 뇌 유래 성장 인자(BDNF), 티로신 하이드록실라제(TH), GTP-사이클로하이드롤라제(GTPCH) 및/또는 아미노산 데카르복실라제(AADC)인, 방법.
  95. 제55항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 입자는 조성물로 존재하는, 방법.
  96. 제95항에 있어서, 조성물은 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물인, 방법.
  97. 제55항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 입자는 숙주 세포 내로의, rAAV 벡터를 인코딩하는 핵산, AAV rep 및 cap를 인코딩하는 핵산, 및 AAV 헬퍼 바이러스 기능을 인코딩하는 핵산의 삼중 트랜스펙션에 의해 생성되었으며, 여기서 숙주 세포로의 핵산의 트랜스펙션은 rAAV 입자를 생성할 수 있는 숙주 세포를 발생시키는, 방법.
  98. 제55항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 입자는 rAAV 벡터를 인코딩하는 핵산, AAV rep 및 cap를 인코딩하는 핵산, 및 AAV 헬퍼 바이러스 기능을 인코딩하는 핵산 중 하나 이상을 포함하는 생산 세포주에 의해 생성된, 방법.
  99. 제55항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 입자는 정위 전달에 의해 전달되는, 방법.
  100. 제55항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 입자는 대류 강화 전달에 의해 전달되는, 방법.
  101. 제97항에 있어서, rAAV 입자는 CED 전달 시스템을 이용하여 전달되는, 방법.
  102. 제101항에 있어서, CED 시스템은 캐뉼러 및/또는 펌프를 포함하는, 방법.
  103. 제102항에 있어서, 캐뉼러는 역류 저항 캐뉼러 또는 단계식 캐뉼러인, 방법.
  104. 제102항에 있어서, 펌프는 수동 펌프인, 방법.
  105. 제102항에 있어서, 펌프는 삼투 펌프인, 방법.
  106. 제102항에 있어서, 펌프는 주입 펌프인, 방법.
  107. a) rAAV 입자를 포함하는 조성물(여기서, rAAV 입자는 이종성 핵산을 인코딩하는 rAAV 벡터를 포함함); 및
    b) 선조체로의 rAAV 입자의 전달을 위한 장치를 포함하는, 포유동물의 대뇌 피질과 선조체에서의 이종성 핵산의 발현을 위한 시스템.
  108. 제107항에 있어서, rAAV 입자는 AAV1 캡시드 또는 AAV2 캡시드를 포함하는, 시스템.
  109. 제107항 또는 제108항에 있어서, 포유동물은 인간인, 시스템.
  110. 제107항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 입자는 선조체의 피각과 꼬리핵에 투여되는, 시스템.
  111. 제110항에 있어서, rAAV 입자는 선조체의 각 반구의 피각과 꼬리핵에 투여되는, 시스템.
  112. 제107항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 이종성 핵산은 포유동물의 전두 피질, 후두 피질 및/또는 IV층에서 발현되는, 시스템.
  113. 제112항에 있어서, 이종성 핵산은 전전두 연합 피질 영역, 전운동 피질, 1차 체성감각 피질 영역, 감각 운동 피질, 두정 피질, 후두 피질 및/또는 1차 운동 피질에서 발현되는, 시스템.
  114. 제107항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 입자는 대뇌 피질에서 역행 또는 순행 수송되는, 시스템.
  115. 제107항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, 이종성 핵산은 시상, 시상 하부 핵, 창백핵, 흑색질 및/또는 해마에서 추가로 발현되는, 시스템.
  116. 제107항 또는 제109항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV V708K, 염소 AAV, AAV1/AAV2 키메라, 소 AAV, 또는 마우스 AAV 캡시드 rAAV2/HBoV1 혈청형 캡시드를 포함하는, 시스템.
  117. 제116항에 있어서, AAV 혈청형은 AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10 또는 AAVrh10인, 시스템.
  118. 제107항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 벡터는 하나 이상의 AAV 역위 말단 반복부(ITR) 서열에 의해 플랭킹된 이종성 핵산을 포함하는, 시스템.
  119. 제118항에 있어서, 이종성 핵산은 2개의 AAV ITR에 의해 플랭킹되어 있는, 시스템.
  120. 제118항 또는 제119항에 있어서, AAV ITR은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, 염소 AAV, 소 AAV, 또는 마우스 AAV 혈청형 ITR인, 시스템.
  121. 제118항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, AAV ITR은 AAV2 ITR인, 시스템.
  122. 제118항 또는 제119항에 있어서, rAAV 입자의 ITR과 캡시드는 동일한 AAV 혈청형으로부터 유래되는, 시스템.
  123. 제122항에 있어서, ITR과 캡시드는 AAV2로부터 유래되는, 시스템.
  124. 제118항 또는 제119항에 있어서, rAAV 바이러스 입자의 ITR과 캡시드는 상이한 AAV 혈청형으로부터 유래되는, 시스템.
  125. 제124항에 있어서, ITR은 AAV2로부터 유래되고, 캡시드는 AAV1로부터 유래되는, 시스템.
  126. 제107항 내지 제125항 중 어느 한 항에 있어서, 이종성 핵산은 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있는, 시스템.
  127. 제126항에 있어서, 프로모터는 CNS의 세포에서 이종성 핵산을 발현시키는, 시스템.
  128. 제126항 또는 제127항에 있어서, 프로모터는 뇌 세포에서 이종성 핵산을 발현시키는, 시스템.
  129. 제126항 내지 제128항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터는 신경세포 또는 신경아교세포에서 이종성 핵산을 발현시키는, 시스템.
  130. 제129항에 있어서, 신경세포는 꼬리핵의 중형 가시 신경세포, 피각의 중형 가시 신경세포, 피질 IV층의 신경세포 및/또는 피질 V층의 신경세포인, 시스템.
  131. 제126항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터는 CBA 프로모터, 최소 CBA 프로모터, CMV 프로모터 또는 GUSB 프로모터인, 시스템.
  132. 제126항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터는 유도성인, 시스템.
  133. 제126항 내지 제132항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 벡터는 인핸서, 스플라이스 공여체/스플라이스 수용체 쌍, 매트릭스 부착 부위 또는 폴리아데닐화 신호 중 하나 이상을 포함하는, 시스템.
  134. 제107항 내지 제133항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 벡터는 자기 상보성 rAAV 벡터인, 시스템.
  135. 제134항에 있어서, 벡터는 이종성 핵산을 인코딩하는 제1 핵산 서열과 이종성 핵산의 상보체를 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하며, 여기서 제1 핵산 서열은 그 길이의 대부분 또는 전부에 걸쳐 제2 핵산 서열과 가닥내 염기쌍을 형성할 수 있는, 시스템.
  136. 제135항에 있어서, 제1 핵산 서열과 제2 핵산 서열은 돌연변이된 AAV ITR에 의해 연결되어 있으며, 여기서 돌연변이된 AAV ITR은 D 영역의 결실을 포함하고, 말단 분해 서열의 돌연변이를 포함하는, 시스템.
  137. 제107항 내지 제136항 중 어느 한 항에 있어서, 이종성 핵산은 치료용 폴리펩티드 또는 치료용 핵산을 인코딩하는, 시스템.
  138. 제137항에 있어서, 이종성 핵산은 치료용 폴리펩티드를 인코딩하는, 시스템.
  139. 제138항에 있어서, 치료용 폴리펩티드는 효소, 신경영양 인자, CNS 관련 장애가 있는 개체에서 결핍되거나 돌연변이된 폴리펩티드, 항산화제, 항-아폽토시스 인자, 항-혈관신생 인자, 및 항-염증 인자, 알파-시뉴클레인, 산 베타-글루코시다제(GBA), 베타-갈락토시다제-1(GLB1), 이두로네이트 2-설파타제(IDS), 갈락토실세라미다제(GALC), a 만노시다제, 알파-D-만노시다제(MAN2B1), 베타-만노시다제(MANBA), 슈도아릴설파타제 A(ARSA), N-아세틸글루코사민-1-포스포트랜스퍼라제(GNPTAB), 산 스핑고미엘리나제(ASM), 니만-픽 C 단백질(NPC1), 산 알파-1,4-글루코시다제(GAA), 헥소사미니다제 베타 서브유닛, HEXB, N-설포글루코사민 설포하이드롤라제(MPS3A), N-알파-아세틸글루코사미니다제(NAGLU), 헤파린 아세틸-CoA, 알파-글루코사미니다제 N-아세틸트랜스퍼라제(MPS3C), N-아세틸글루코사민-6-설파타제(GNS), 알파-N-아세틸갈락토사미니다제(NAGA), 베타-글루쿠로니다제(GUSB), 헥소사미니다제 알파 서브유닛(HEXA), 헌팅틴(HTT), 리소좀 산 리파제(LIPA), 아스파르틸글루코사미니다제, 알파-갈락토시다제 A, 팔미토일 단백질 티오에스터라제, 트리펩티딜 펩티다제, 리소좀 막횡단 단백질, 시스테인 수송체, 산 세라미다제, 산 알파-L-푸코시다제, 카텝신 A, 알파-L-이두로니다제, 아릴설파타제 B, 아릴설파타제 A, N-아세틸갈락토사민-6-설페이트, 산 베타-갈락토시다제, 또는 알파-뉴라미다제인, 시스템.
  140. 제138항에 있어서, 이종성 핵산은 치료용 핵산을 인코딩하는, 시스템.
  141. 제140항에 있어서, 치료용 핵산은 siRNA, shRNA, RNAi, miRNA, 안티센스 RNA, 리보자임 또는 DNA자임인, 시스템.
  142. 제137항 내지 제141항 중 어느 한 항에 있어서, 치료용 폴리펩티드 또는 치료용 핵산은 CNS 장애를 치료하는데 사용되는, 시스템.
  143. 제142항에 있어서, CNS 장애는 리소좀 축적병(LSD), 헌팅톤병, 간질, 파킨슨병, 알츠하이머병, 뇌졸중, 피질기저핵 변성(CBD), 피질기저핵 신경절 변성(CBGD), 전두측두엽 치매(FTD), 다계통 위축증(MSA), 진행성 핵상 마비(PSP) 또는 뇌암인, 시스템.
  144. 제143항에 있어서, 장애는 아스파르틸글루소아미뉴리아, 파브리병, 영아 배튼병(CNL1), 전형적 후기 영아 배튼병(CNL2), 소아 배튼병(CNL3), 배튼병 형태 CNL4, 배튼병 형태 CNL5, 배튼병 형태 CNL6, 배튼병 형태 CNL7, 배튼병 형태 CNL8, 시스틴증, 파아버병, 푸코시드축적증, 갈락토시도시알산증, 1형 고셔병, 2형 고셔병, 3형 고셔병, GM1 강글리오시드증, 헌터병, 크라베병, α 만노시드증병, β 만노시드증병, 마로토-라미병, 이염성 백질이영양증병, 모르퀴오병 A, 모르퀴오병 B, 점액지질증 II/III 질병, 니만-픽 A 질병, 니만-픽 B 질병, 니만-픽 C 질병, 폼페병, 샌드호프병, 센필리포 A 질병, 센필리포 B 질병, 센필리포 C 질병, 센필리포 D 질병, 쉰들러병, 쉰들러-칸자키병, 시알산증, 슬라이병, 테이-삭스병 및 월만병으로 구성된 군으로부터 선택된 리소좀 축적병인, 시스템.
  145. 제107항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 입자는 조성물로 존재하는, 시스템.
  146. 제145항에 있어서, 조성물은 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물인, 시스템.
  147. 제107항 내지 제146항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 입자는 숙주 세포 내로의, rAAV 벡터를 인코딩하는 핵산, AAV rep 및 cap를 인코딩하는 핵산, 및 AAV 헬퍼 바이러스 기능을 인코딩하는 핵산의 삼중 트랜스펙션에 의해 생성되었으며, 여기서 숙주 세포로의 핵산의 트랜스펙션은 rAAV 입자를 생성할 수 있는 숙주 세포를 발생시키는, 시스템.
  148. 제107항 내지 제146항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 입자는 rAAV 벡터를 인코딩하는 핵산, AAV rep 및 cap를 인코딩하는 핵산, 및 AAV 헬퍼 바이러스 기능을 인코딩하는 핵산 중 하나 이상을 포함하는 생산 세포주에 의해 생성된, 시스템.
  149. 제107항 내지 제148항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 입자는 정위 전달에 의해 전달되는, 시스템.
  150. 제107항 내지 제149항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 입자는 대류 강화 전달에 의해 전달되는, 시스템.
  151. 제150항에 있어서, rAAV 입자는 CED 전달 시스템을 이용하여 전달되는, 시스템.
  152. 제151항에 있어서, CED 시스템은 캐뉼러 및/또는 펌프를 포함하는, 시스템.
  153. 제152항에 있어서, 캐뉼러는 역류 저항 캐뉼러 또는 단계식 캐뉼러인, 시스템.
  154. 제152항에 있어서, 펌프는 수동 펌프인, 시스템.
  155. 제152항에 있어서, 펌프는 삼투 펌프인, 시스템.
  156. 제152항에 있어서, 펌프는 주입 펌프인, 시스템.
  157. rAAV 입자를 포함하는, 제1항 내지 제106항 중 어느 한 항의 방법에 사용하기 위한 키트로서, rAAV 입자는 포유동물의 적어도 대뇌 피질과 선조체에서 발현되는 이종성 핵산을 인코딩하는 rAAV 벡터를 포함하는, 키트.
  158. 제157항에 있어서, rAAV 입자는 AAV 혈청형 1(AAV1) 캡시드를 포함하는, 키트.
  159. 제158항에 있어서, rAAV 입자는 AAV 혈청형 2(AAV2) 캡시드를 포함하는, 키트.
  160. 유효량의 rAAV 입자를 포함하는 조성물을 포함하는, 포유동물의 헌팅톤병을 치료하기 위한 키트로서, rAAV 입자는 포유동물의 적어도 대뇌 피질과 선조체에서 발현되는 이종성 핵산을 인코딩하는 rAAV 벡터를 포함하는, 키트.
  161. 제160항에 있어서, rAAV 입자는 AAV 혈청형 1(AAV1) 캡시드 또는 AAV 혈청형 2(AAV2) 캡시드를 포함하는, 키트.
  162. 유효량의 rAAV 입자를 포함하는 조성물을 포함하는, 포유동물의 파킨슨병을 치료하기 위한 키트로서, rAAV 입자는 포유동물의 적어도 대뇌 피질과 선조체에서 발현되는 이종성 핵산을 인코딩하는 rAAV 벡터를 포함하는, 키트.
  163. 제161항에 있어서, rAAV 입자는 AAV 혈청형 1(AAV1) 캡시드 또는 AAV 혈청형 2(AAV2) 캡시드를 포함하는, 키트.
  164. 제157항 내지 제163항 중 어느 한 항에 있어서, 선조체로의 rAAV 입자의 전달을 위한 장치를 추가로 포함하는, 키트.
  165. 제157항 내지 제164항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 입자는 조성물로 존재하는, 키트.
  166. 제165항에 있어서, 조성물은 완충제 및/또는 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 키트.
  167. 제157항 내지 제166항 중 어느 한 항에 있어서, 선조체로의 rAAV 입자의 조성물의 전달을 위한 설명서를 추가로 포함하는, 키트.
  168. 제1항 내지 제106항의 방법 중 어느 하나에 사용하기 위한 rAAV 입자.
  169. 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV) 입자를 포유동물의 중추 신경계에 전달하는데 사용하기 위한 rAAV 입자로서, rAAV 입자는 포유동물의 적어도 대뇌 피질과 선조체에서 발현되는 이종성 핵산을 인코딩하는 rAAV 벡터를 포함하는, rAAV 입자.
  170. 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV) 입자를 포유동물의 중추 신경계에 전달하는데 사용하기 위한 rAAV 입자로서, rAAV 입자는 포유동물의 적어도 대뇌 피질과 선조체에서 발현되는 이종성 핵산을 인코딩하는 rAAV 벡터를 포함하고, rAAV 입자는 AAV 혈청형 1(AAV1) 캡시드를 추가로 포함하는, rAAV 입자.
  171. 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV) 입자를 포유동물의 중추 신경계에 전달하는데 사용하기 위한 rAAV 입자로서, rAAV 입자는 포유동물의 적어도 대뇌 피질과 선조체에서 발현되는 이종성 핵산을 인코딩하는 rAAV 벡터를 포함하고, rAAV 입자는 AAV 혈청형 1(AAV2) 캡시드를 추가로 포함하는, rAAV 입자.
  172. 포유동물의 헌팅톤병을 치료하는데 사용하기 위한 rAAV 입자로서, rAAV 입자는 포유동물의 적어도 대뇌 피질과 선조체에서 발현되는 이종성 핵산을 인코딩하는 rAAV 벡터를 포함하는, rAAV 입자.
  173. 포유동물의 파킨슨병을 치료하는데 사용하기 위한 rAAV 입자로서, rAAV 입자는 포유동물의 적어도 대뇌 피질과 선조체에서 발현되는 이종성 핵산을 인코딩하는 rAAV 벡터를 포함하는, rAAV 입자.
  174. 제173항에 있어서, rAAV 입자는 AAV2 캡시드를 포함하는, rAAV 입자.
  175. 제169항 내지 제174항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물은 인간인, rAAV 입자.
  176. 제169항 내지 제175항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 입자는 선조체의 피각과 꼬리핵으로의 투여를 위한, rAAV 입자.
  177. 제176항에 있어서, rAAV 입자는 선조체의 각 반구의 피각과 꼬리핵으로의 투여를 위한, rAAV 입자.
  178. 제169항 내지 제177항 중 어느 한 항에 있어서, 이종성 핵산은 포유동물의 전두 피질, 후두 피질 및/또는 IV층에서 발현되는, rAAV 입자.
  179. 제178항에 있어서, 이종성 핵산은 전전두 연합 피질 영역, 전운동 피질, 1차 체성감각 피질 영역, 감각 운동 피질, 두정 피질, 후두 피질 및/또는 1차 운동 피질에서 발현되는, rAAV 입자.
  180. 제169항 내지 제179항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 입자는 대뇌 피질에서 역행 또는 순행 수송되는, rAAV 입자.
  181. 제169항 내지 제180항 중 어느 한 항에 있어서, 이종성 핵산은 시상, 시상 하부 핵, 창백핵, 흑색질 및/또는 해마에서 추가로 발현되는, rAAV 입자.
  182. 제169항, 제170항 또는 제175항 내지 제181항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV V708K, 염소 AAV, AAV1/AAV2 키메라, 소 AAV, 또는 마우스 AAV 캡시드 rAAV2/HBoV1 혈청형 캡시드를 포함하는, rAAV 입자.
  183. 제182항에 있어서, AAV 혈청형은 AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10 또는 AAVrh10인, rAAV 입자.
  184. 제169항 내지 제183항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 벡터는 하나 이상의 AAV 역위 말단 반복부(ITR) 서열에 의해 플랭킹된 이종성 핵산을 포함하는, rAAV 입자.
  185. 제184항에 있어서, 이종성 핵산은 2개의 AAV ITR에 의해 플랭킹되어 있는, rAAV 입자.
  186. 제184항 또는 제185항에 있어서, AAV ITR은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, 염소 AAV, 소 AAV, 또는 마우스 AAV 혈청형 ITR인, rAAV 입자.
  187. 제184항 내지 제186항 중 어느 한 항에 있어서, AAV ITR은 AAV2 ITR인, rAAV 입자.
  188. 제184항 또는 제185항에 있어서, rAAV 입자의 ITR과 캡시드는 동일한 AAV 혈청형으로부터 유래되는, rAAV 입자.
  189. 제188항에 있어서, ITR과 캡시드는 AAV2로부터 유래되는, rAAV 입자.
  190. 제184항 또는 제185항에 있어서, rAAV 바이러스 입자의 ITR과 캡시드는 상이한 AAV 혈청형으로부터 유래되는, rAAV 입자.
  191. 제190항에 있어서, ITR은 AAV2로부터 유래되고, 캡시드는 AAV1로부터 유래되는, rAAV 입자.
  192. 제169항 내지 제171항 중 어느 한 항에 있어서, 이종성 핵산은 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있는, rAAV 입자.
  193. 제192항에 있어서, 프로모터는 CNS의 세포에서 이종성 핵산을 발현시키는, rAAV 입자.
  194. 제192항 또는 제193항에 있어서, 프로모터는 뇌 세포에서 이종성 핵산을 발현시키는, rAAV 입자.
  195. 제191항 내지 제194항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터는 신경세포 또는 신경아교세포에서 이종성 핵산을 발현시키는, rAAV 입자.
  196. 제195항에 있어서, 신경세포는 꼬리핵의 중형 가시 신경세포, 피각의 중형 가시 신경세포, 피질 IV층의 신경세포 및/또는 피질 V층의 신경세포인, rAAV 입자.
  197. 제192항 내지 제196항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터는 CBA 프로모터, 최소 CBA 프로모터, CMV 프로모터 또는 GUSB 프로모터인, rAAV 입자.
  198. 제192항 내지 제196항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터는 유도성인, rAAV 입자.
  199. 제192항 내지 제198항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 벡터는 인핸서, 스플라이스 공여체/스플라이스 수용체 쌍, 매트릭스 부착 부위 또는 폴리아데닐화 신호 중 하나 이상을 포함하는, rAAV 입자.
  200. 제169항 내지 제199항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 벡터는 자기 상보성 rAAV 벡터인, rAAV 입자.
  201. 제200항에 있어서, 벡터는 이종성 핵산을 인코딩하는 제1 핵산 서열과 이종성 핵산의 상보체를 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하며, 여기서 제1 핵산 서열은 그 길이의 대부분 또는 전부에 걸쳐 제2 핵산 서열과 가닥내 염기쌍을 형성할 수 있는, rAAV 입자.
  202. 제200항에 있어서, 제1 핵산 서열과 제2 핵산 서열은 돌연변이된 AAV ITR에 의해 연결되어 있으며, 여기서 돌연변이된 AAV ITR은 D 영역의 결실을 포함하고, 말단 분해 서열의 돌연변이를 포함하는, rAAV 입자.
  203. 제169항 내지 제202항 중 어느 한 항에 있어서, 이종성 핵산은 치료용 폴리펩티드 또는 치료용 핵산을 인코딩하는, rAAV 입자.
  204. 제203항에 있어서, 이종성 핵산은 치료용 폴리펩티드를 인코딩하는, rAAV 입자.
  205. 제204항에 있어서, 치료용 폴리펩티드는 효소, 신경영양 인자, CNS 관련 장애가 있는 개체에서 결핍되거나 돌연변이된 폴리펩티드, 항산화제, 항-아폽토시스 인자, 항-혈관신생 인자, 및 항-염증 인자, 알파-시뉴클레인, 산 베타-글루코시다제(GBA), 베타-갈락토시다제-1(GLB1), 이두로네이트 2-설파타제(IDS), 갈락토실세라미다제(GALC), a 만노시다제, 알파-D-만노시다제(MAN2B1), 베타-만노시다제(MANBA), 슈도아릴설파타제 A(ARSA), N-아세틸글루코사민-1-포스포트랜스퍼라제(GNPTAB), 산 스핑고미엘리나제(ASM), 니만-픽 C 단백질(NPC1), 산 알파-1,4-글루코시다제(GAA), 헥소사미니다제 베타 서브유닛, HEXB, N-설포글루코사민 설포하이드롤라제(MPS3A), N-알파-아세틸글루코사미니다제(NAGLU), 헤파린 아세틸-CoA, 알파-글루코사미니다제 N-아세틸트랜스퍼라제(MPS3C), N-아세틸글루코사민-6-설파타제(GNS), 알파-N-아세틸갈락토사미니다제(NAGA), 베타-글루쿠로니다제(GUSB), 헥소사미니다제 알파 서브유닛(HEXA), 헌팅틴(HTT), 리소좀 산 리파제(LIPA), 아스파르틸글루코사미니다제, 알파-갈락토시다제 A, 팔미토일 단백질 티오에스터라제, 트리펩티딜 펩티다제, 리소좀 막횡단 단백질, 시스테인 수송체, 산 세라미다제, 산 알파-L-푸코시다제, 카텝신 A, 알파-L-이두로니다제, 아릴설파타제 B, 아릴설파타제 A, N-아세틸갈락토사민-6-설페이트, 산 베타-갈락토시다제, 또는 알파-뉴라미다제인, rAAV 입자.
  206. 제203항에 있어서, 이종성 핵산은 치료용 핵산을 인코딩하는, rAAV 입자.
  207. 제206항에 있어서, 치료용 핵산은 siRNA, shRNA, RNAi, miRNA, 안티센스 RNA, 리보자임 또는 DNA자임인, rAAV 입자.
  208. 제203항 내지 제207항 중 어느 한 항에 있어서, 치료용 폴리펩티드 또는 치료용 핵산은 CNS 장애를 치료하는데 사용되는, rAAV 입자.
  209. 제208항에 있어서, CNS 장애는 리소좀 축적병(LSD), 헌팅톤병, 간질, 파킨슨병, 알츠하이머병, 뇌졸중, 피질기저핵 변성(CBD), 피질기저핵 신경절 변성(CBGD), 전두측두엽 치매(FTD), 다계통 위축증(MSA), 진행성 핵상 마비(PSP) 또는 뇌암인, rAAV 입자.
  210. 제209항에 있어서, 장애는 아스파르틸글루소아미뉴리아, 파브리병, 영아 배튼병(CNL1), 전형적 후기 영아 배튼병(CNL2), 소아 배튼병(CNL3), 배튼병 형태 CNL4, 배튼병 형태 CNL5, 배튼병 형태 CNL6, 배튼병 형태 CNL7, 배튼병 형태 CNL8, 시스틴증, 파아버병, 푸코시드축적증, 갈락토시도시알산증, 1형 고셔병, 2형 고셔병, 3형 고셔병, GM1 강글리오시드증, 헌터병, 크라베병, α 만노시드증병, β 만노시드증병, 마로토-라미병, 이염성 백질이영양증병, 모르퀴오병 A, 모르퀴오병 B, 점액지질증 II/III 질병, 니만-픽 A 질병, 니만-픽 B 질병, 니만-픽 C 질병, 폼페병, 샌드호프병, 센필리포 A 질병, 센필리포 B 질병, 센필리포 C 질병, 센필리포 D 질병, 쉰들러병, 쉰들러-칸자키병, 시알산증, 슬라이병, 테이-삭스병 및 월만병으로 구성된 군으로부터 선택된 리소좀 축적병인, rAAV 입자.
  211. 제169항 내지 제210항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 입자는 조성물로 존재하는, rAAV 입자.
  212. 제211항에 있어서, 조성물은 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물인, rAAV 입자.
  213. 제169항 내지 제212항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 입자는 숙주 세포 내로의, rAAV 벡터를 인코딩하는 핵산, AAV rep 및 cap를 인코딩하는 핵산, 및 AAV 헬퍼 바이러스 기능을 인코딩하는 핵산의 삼중 트랜스펙션에 의해 생성되었으며, 여기서 숙주 세포로의 핵산의 트랜스펙션은 rAAV 입자를 생성할 수 있는 숙주 세포를 발생시키는, rAAV 입자.
  214. 제169항 내지 제212항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 입자는 rAAV 벡터를 인코딩하는 핵산, AAV rep 및 cap를 인코딩하는 핵산, 및 AAV 헬퍼 바이러스 기능을 인코딩하는 핵산 중 하나 이상을 포함하는 생산 세포주에 의해 생성된, rAAV 입자.
  215. 제169항 내지 제214항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 입자는 정위 전달에 의해 전달되는, rAAV 입자.
  216. 제169항 내지 제214항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 입자는 대류 강화 전달에 의해 전달되는, rAAV 입자.
  217. 제216항에 있어서, rAAV 입자는 CED 전달 시스템을 이용하여 전달되는, rAAV 입자.
  218. 제217항에 있어서, CED 시스템은 캐뉼러 및/또는 펌프를 포함하는, rAAV 입자.
  219. 제218항에 있어서, 캐뉼러는 역류 저항 캐뉼러 또는 단계식 캐뉼러인, rAAV 입자.
  220. 제218항에 있어서, 펌프는 수동 펌프인, rAAV 입자.
  221. 제218항에 있어서, 펌프는 삼투 펌프인, rAAV 입자.
  222. 제218항에 있어서, 펌프는 주입 펌프인, rAAV 입자.
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