ES2904504T3 - Administración mejorada de partículas víricas al cuerpo estriado y a la corteza - Google Patents

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Abstract

Una partícula vírica adenoasociada recombinante (rAVV) para su uso en un método de administración de un rAAV al sistema nervioso central (SNC) de un mamífero, en donde la partícula de rAAV se administra al cuerpo estriado del mamífero por administración mejorada por convección (CED), en donde la partícula de rAAV comprende un vector de rAAV que codifica un ácido nucleico heterólogo que se expresa en al menos la corteza occipital y/o la capa IV de la corteza cerebral y el cuerpo estriado del mamífero, en donde la partícula de rAAV comprende una cápside de AAV de serotipo 2 (AAV2), y en donde la partícula de rAAV se administra a al menos un sitio en el núcleo caudado y dos sitios en el putamen en cada hemisferio del cuerpo estriado.

Description

DESCRIPCIÓN
Administración mejorada de partículas víricas al cuerpo estriado y a la corteza
REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS
La presente solicitud reivindica prioridad a la solicitud provisional de EE. UU. N.° 62/114.544, presentada el 10 de febrero de 2015, y a la solicitud provisional de EE. UU. N.° 62/220.997, presentada el 19 de septiembre de 2015.
PRESENTACIÓN DEL LISTADO DE SECUENCIAS EN ARCHIVO DE TEXTO ASCII
El contenido de la siguiente presentación en archivo de texto ASCII es una forma legible por ordenador (CRF) del Listado de secuencias (nombre de archivo: 159792012740SEQLIST.txt, fecha registrada: 4 de febrero de 2016, tamaño: 1 KB).
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a la administración de vectores de genoterapia de AAV al cerebro, por ejemplo, al cuerpo estriado y/o a la corteza.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
Los vectores basados en virus adenoasociados (AAV) se han convertido en el sistema de vector preferido para la genoterapia neurológica, con un excelente registro de seguridad establecido en múltiples ensayos clínicos (Kaplitt et al., (2007) Lancet 369:2097-2105; Eberling et al., (2008) Neurology 70:1980-1983; Fiandaca et al., (2009) Neuroimage 47 Supl. 2:T27-35). El tratamiento eficaz de trastornos neurológicos ha estado impedido por problemas asociados a la administración de vectores de AAV para afectar poblaciones de células. Este problema de administración ha sido especialmente problemático para trastornos que implican a la corteza cerebral. Las inyecciones simples no distribuyen los vectores de AAV eficazmente, que se basa en la difusión, que es eficaz solo dentro de un radio de 1 a 3 mm. Se ha usado clínicamente un método alternativo, la administración mejorada por convección (CED) (Nguyen et al., (2003) J. Neurosurg. 98:584-590), en la genoterapia (AAV2-hAADC) para la enfermedad de Parkinson (Fiandaca et al., (2008) Exp. Neurol. 209:51-57). El principio subyacente de la CED implica bombear infundido en el parénquima cerebral a presión suficiente para vencer la presión hidrostática del líquido intersticial, lo que fuerza así a las partículas infundidas a entrar en estrecho contacto con la perivasculatura densa del cerebro. La pulsación de estos vasos actúa de bomba, distribuyendo las partículas en grandes distancias en todo el parénquima (Hadaczek et al., (2006) Hum. Gene Ther.
17:291-302). Para aumentar la seguridad y la eficacia de CED se puede emplear una cánula resistente al reflujo (Krauze et al., (2009) Methods Enzymol. 465:349-362), junto con la administración monitorizada con IRM en tiempo real. La administración monitorizada permite la cuantificación y el control de acontecimientos aberrantes, tales como el reflujo de la cánula y la fuga de infundido en los ventrículos (Eberling et al., (2008) Neurology 70:1980-1983; Fiandaca et al., (2009) Neuroimage 47 Suppl. 2:T27-35; Saito et al., (2011) Journal of Neurosurgery Pediatrics 7:522-526). Sin embargo, todavía existe la necesidad de procedimientos mejorados para lograr la expresión generalizada de vectores de AAV en la corteza y/o el cuerpo estriado.
La presente invención se refiere a una partícula vírica adenoasociada recombinante (rAAV) para su uso en un método de administración de un rAAV al sistema nervioso central (SNC) de un mamífero, en donde la partícula de rAAV se administra al cuerpo estriado del mamífero por administración mejorada por convección (CED), en donde la partícula de rAAV comprende un vector de rAAV que codifica un ácido nucleico heterólogo que se expresa en al menos la corteza occipital y/o la capa IV de la corteza cerebral y el cuerpo estriado del mamífero, en donde la partícula de rAAV comprende una cápside de AAV de serotipo 2 (AAV2), y en donde la partícula de rAAV se administra a al menos un sitio en el núcleo caudado y dos sitios en el putamen en cada hemisferio del cuerpo estriado.
La presente invención se refiere además a una partícula vírica adenoasociada recombinante (rAVV) para su uso en un método de tratamiento de un trastorno del SNC en un mamífero, en donde una cantidad eficaz de la partícula de rAAV se administra al cuerpo estriado del mamífero por administración mejorada por convección (CED), en donde la partícula de rAAV comprende un vector de rAAV que codifica un ácido nucleico heterólogo que se expresa en al menos la corteza occipital y/o la capa IV de la corteza cerebral y el cuerpo estriado del mamífero, en donde la partícula de rAAV comprende una cápside de AAV2, y en donde la partícula de rAAV se administra a al menos un sitio en el núcleo caudado y dos sitios en el putamen en cada hemisferio del cuerpo estriado.
En una realización preferida, el trastorno del SNC es enfermedad de Huntington, en donde opcionalmente el ácido nucleico heterólogo codifica un polipéptido terapéutico o un ácido nucleico terapéutico que inhibe la expresión de huntingtina (HTT) o inhibe la acumulación de HTT en células del SNC del mamífero.
En una realización preferida adicional, el ácido nucleico heterólogo codifica un miARN terapéutico que silencia la huntingtina, y en donde opcionalmente la huntingtina comprende una mutación asociada a la enfermedad de Huntington.
En una realización preferida, el trastorno del SNC es enfermedad de Parkinson, y en donde opcionalmente el ácido nucleico heterólogo codifica un polipéptido terapéutico, en donde opcionalmente el polipéptido terapéutico es el factor de crecimiento derivado de la glía (GDNF), el factor de crecimiento derivado del cerebro (BDNF), la tirosina hidroxilasa (TH), la GTP-ciclohidrolasa (GTPCH) y/o la aminoácido descarboxilasa (AADC).
En una realización preferida, el mamífero es un ser humano.
En una realización preferida adicional, la partícula de rAAV se administra al putamen y al núcleo caudado del cuerpo estriado, en donde la relación entre las partículas de rAAV administradas al putamen y las partículas de rAAV administradas al núcleo caudado es al menos aproximadamente 2:1.
En una realización preferida:
(a) el ácido nucleico heterólogo se expresa en las áreas corticales de asociación prefrontal, la corteza premotora, las áreas corticales somatosensoriales primarias, la corteza motora sensorial, la corteza parietal, la corteza occipital y/o la corteza motora primaria;
(b) la partícula de rAAV experimenta transporte retrógrado o anterógrado en la corteza cerebral; y/o
(c) el ácido nucleico heterólogo se expresa además en el tálamo, el núcleo subtalámico, el globo pálido, la sustancia negra y/o el hipocampo.
En una realización preferida, el vector de rAAV comprende el ácido nucleico heterólogo flanqueado por una o más secuencias de repeticiones terminales invertidas (ITR) de AAV, en donde opcionalmente:
(a) el ácido nucleico heterólogo está flanqueado por dos ITR de AAV; y/o
(b) las ITR de AAV son ITR de serotipo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, AAV de cabra, AAV bovino o AAV de ratón.
En una realización preferida adicional:
(a) la una o más secuencias de ITR y la cápside de la partícula de rAAV son del mismo serotipo de AAV; o (b) la una o más secuencias de ITR y la cápside de la partícula vírica de rAAV son de diferentes serotipos de AAV.
La partícula de rAAV para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -10, en donde el ácido nucleico heterólogo está operativamente unido a un promotor, en donde opcionalmente:
(a) el promotor expresa el ácido nucleico heterólogo en una célula del SNC, en donde opcionalmente el promotor expresa el ácido nucleico heterólogo en una célula de cerebro;
(b) el promotor expresa el ácido nucleico heterólogo en una neurona y/o una célula de la glía, en donde opcionalmente la neurona es una neurona mediana espinosa del núcleo caudado, una neurona mediana espinosa de el putamen, una neurona de la capa IV de la corteza y/o una neurona de la capa V de la corteza; (c) el promotor es un promotor de CBA, un promotor mínimo de CBA, un promotor del CMV o un promotor de GUSB; y/o
(d) el promotor es inducible.
En una realización preferida adicional, el vector de rAAV comprende uno o más de un potenciador, un par donante de empalme/aceptor de empalme, un sitio de unión a la matriz y una señal de poliadenilación.
En una realización preferida adicional, el vector de rAAV es un vector de rAAV autocomplementario, en donde opcionalmente el vector comprende una primera secuencia del ácido nucleico que codifica el ácido nucleico heterólogo y una segunda secuencia del ácido nucleico que codifica un complemento del ácido nucleico heterólogo, en donde la primera secuencia del ácido nucleico puede formar pares de bases intracatenarios con la segunda secuencia del ácido nucleico a lo largo de la mayor parte de su longitud o toda ella; y en donde opcionalmente la primera secuencia del ácido nucleico y la segunda secuencia del ácido nucleico están unidas por una ITR de AAV mutada, en donde la ITR de AAV mutada comprende una deleción de la región D y comprende una mutación de la secuencia de resolución terminal.
En una realización preferida, el ácido nucleico heterólogo codifica:
(a) un polipéptido terapéutico; o
(b) un ácido nucleico terapéutico, en donde opcionalmente el ácido nucleico terapéutico es un ARNip, un ARNhp, una iARN, un miARN, un ARN antisentido, una ribozima o una DNAzima.
En una realización preferida adicional:
(a) el polipéptido terapéutico es una enzima, un factor neurotrófico, un polipéptido que es deficiente o está mutado en un individuo con un trastorno relacionado con el SNC, un antioxidante, un factor anti-apoptósico, un factor antiangiogénico y un factor antiinflamatorio, alfa-sinucleína, beta-glucosidasa ácida (GBA), beta-galactosidasa-1 (GLB1), iduronato 2-sulfatasa (IDS), galactosilceramidasa (GALC), una manosidasa, alfa-D-manosidasa (MAN2B1), beta-manosidasa (MANBA), pseudoarilsulfatasa A (ARSA), N-acetilglucosamina-1-fosfotransferasa (GNPTAB), esfingomielinasa ácida (ASM), proteína C de Niemann-Pick (NPC1), alfa-1,4-glucosidasa ácida (GAA), subunidad beta de hexosaminidasa, HEXB, sulfohidrolasa de N-sulfoglucosamina (MPS3A), N-alfaacetilglucosaminidasa (NAGLU), heparin acetil-CoA, alfa-glucosaminidasa N-acetiltransferasa (MPS3C), N-acetilglucosamina-6-sulfatasa (GNS), alfa-N-acetilgalactosaminidasa (NAGA), beta-glucuronidasa (GUSB), subunidad alfa de hexosaminidasa (HEXA), huntingtina (HTT), lipasa ácida lisosómica (LIPA), aspartilglucosaminidasa, alfa-galactosidasa A, palmitoil proteína tioesterasa, tripeptidil peptidasa, proteína transmembranaria lisosómica, transportador de cisteína, ceramidasa ácida, alfa-L-fucosidasa ácida, catepsina A, alfa-L-iduronidasa, arilsulfatasa B, arilsulfatasa A, N-acetilgalactosamina-6-sulfato, beta-galactosidasa ácida o alfa-neuramidasa; o
(b) el polipéptido terapéutico o el ácido nucleico terapéutico se usa para tratar un trastorno del SNC, en donde opcionalmente:
(i) el trastorno del SNC es enfermedad de Huntington, epilepsia, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, accidente cerebrovascular, degeneración corticobasal (CBD), degeneración ganglionar corticobasal (CBGD), demencia frontotemporal (FTD), atrofia multisistémica (MSA), parálisis supranuclear progresiva (PSP) o cáncer del cerebro; o
(ii) el trastorno es una enfermedad de almacenamiento lisosómico seleccionada del grupo que consiste en aspartilglucosaminuria, Fabry, enfermedad infantil de Batten (CNL1), enfermedad infantil de Batten tardía clásica (CNL2), enfermedad juvenil de Batten (CNL3), la forma de Batten CNL4, la forma de Batten CNL5, la forma de Batten CNL6, la forma de Batten CNL7, la forma de Batten CNL8, cistinosis, Farber, fucosidosis, galactosidosialidosis, enfermedad de Gaucher de tipo 1, enfermedad de Gaucher de tipo 2, enfermedad de Gaucher de tipo 3, gangliosidosis GM1, enfermedad de Hunter, enfermedad de Krabbe, enfermedad de amanosidosis, enfermedad de p-manosidosis, Maroteaux-Lamy, enfermedad de leucodistrofia metacromática, Morquio A, Morquio B, enfermedad de mucolipidosis M/IM, enfermedad de Niemann-Pick A, enfermedad de Niemann-Pick B, enfermedad de Niemann-Pick C, enfermedad de Pompe, enfermedad de Sandhoff, enfermedad de Sanfillipo A, enfermedad de Sanfillipo B, enfermedad de Sanfillipo C, enfermedad de Sanfillipo D, enfermedad de Schindler, Schindler-Kanzaki, sialidosis, enfermedad de Sly, enfermedad de Tay-Sachs y enfermedad de Wolman.
Se prefiere además que la partícula de rAAV esté en una composición, en donde opcionalmente la composición es una composición farmacéutica que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Según una realización preferida adicional:
(a) la partícula de rAAV se produjo por transfección triple de un ácido nucleico que codifica el vector de rAAV, un ácido nucleico que codifica rep y cap de AAV y un ácido nucleico que codifica funciones del virus auxiliar AAV en una célula hospedadora, en donde la transfección de los ácidos nucleicos a las células hospedadoras genera una célula hospedadora capaz de producir partículas de rAAV; o
(b) la partícula de rAAV se produjo por una línea celular productora que comprende uno o más ácidos nucleicos que codifican el vector de rAAV, un ácido nucleico que codifica rep y cap de AAV y un ácido nucleico que codifica funciones del virus auxiliar AAV.
En una realización también preferida, la partícula de rAAV se administra usando un sistema de administración CED.
En una realización preferida adicional, el sistema CED comprende:
(a) una cánula, en donde opcionalmente la cánula es una cánula resistente al reflujo o una cánula escalonada; y/o
(b) una bomba, en donde opcionalmente la bomba es:
(i) una bomba manual;
(ii) una bomba osmótica; o
(iii) una bomba de infusión.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La FIG. 1 muestra pesos corporales de macacos de la India, medidos inmediatamente antes de la cirugía (negro) y en el momento de la autopsia (gris), en animales administrados con vectores de AAV1 y AAV2 preparados por procesos de transfección triple (TT) y de línea celular productora (PCL).
Las FIG. 2A-2D muestran secciones representativas del cerebro teñidas por GFP 30 días después de la infusión de AAV1-GFP (TT) en el núcleo caudado y el putamen de macacos de la India. Las secciones en las FIG. 2A-2D se extienden a través del cerebro en la dirección de rostral a caudal. Se presentan en cada panel las secciones de tres animales representativos.
Las FIG. 3A-3D muestran secciones de cerebro representativas que muestran la expresión cortical de GFP en la frontal corteza (FIG. 3A y 3B) y la corteza occipital (FIG. 3C y 3D) en tanto astrocitos (FIG. 3A y 3C) como neuronas corticales (FIG.3B y 3D) después de la infusión de AAV1-GFP (TT) en el núcleo caudado y el putamen de macacos de la India.
Las FIG. 4A-4D muestran secciones de cerebro representativas teñidas por GFP 30 días después de la infusión de AAV2-GFP (TT) en el núcleo caudado y el putamen de macacos de la India. Las secciones en las FIG. 4A-4D se extienden a través del cerebro en la dirección de rostral a caudal. Se presentan en cada panel las secciones de tres animales representativos.
Las FIG. 5A-5D muestran secciones de cerebro representativas teñidas por GFP 30 días después de la infusión de AAV1-GFP hecha por procesos de estirpe celular productora (PCL) (FIG. 5A y 5B) o de transfección triple (TT) (FIG. 5C y 5D) en el núcleo caudado y el putamen de macacos de la India.
Las FIG. 6A-6D muestran secciones de cerebro representativas teñidas por GFP 30 días después de la infusión de AAV2-GFP hecha por procesos de estirpe celular productora (PCL) (FIG. 6A y 6B) o de transfección triple (TT) (FIG. 6C y 6D) en el núcleo caudado y el putamen de macacos de la India.
La FIG. 7 muestra la distribución de GFP en cerebros de primate no humano (NHP) infundidos con AAV1-eGFP y AAV2-eGFP. Los vectores AAV1-eGFP y AAV2-eGFP se infundieron bilateralmente en el cuerpo estriado de 9 macacos de la India. Cuatro semanas después de la cirugía, los cerebros se procesaron por inmunohistoquímica (IHC) contra GFP. Las columnas muestran secciones de cerebro representativas teñidas con GFP de 4 grupos de estudio infundidos con AAV1-eGFP (transfección triple; TT); AAV1-eGFP (línea celular productora; PCL); AAV2-eGFP (TT); AAV2-eGFP (PCL). Las secciones representativas muestran diversos planos coronales del cerebro para demostrar la distribución de la expresión de GFP en todo el cerebro desde la frontal corteza, el cuerpo estriado (sitios de infusión), el mesencéfalo, hasta partes occipitales de la corteza. Todos los grupos mostraron una robusta señal de GFP en los sitios de inyección (el putamen y el núcleo caudado), así como un amplio transporte hasta las regiones corticales y la sustancia negra. Basándose en la tinción con IHC, se calculó la cobertura de la expresión de GFP en tanto la estructura diana (el cuerpo estriado) como las regiones corticales para cada mono y se resume en la Tabla 7.
La FIG. 8 muestra las relaciones entre las áreas primarias de transducción (PAT) y la distribución de vector (Vd). Se delinearon áreas primarias de expresión de GFP en el cuerpo estriado en barridos de las secciones teñidas con GFP y sus valores se dividieron entre valores obtenidos de los barridos de IRM coincidentes con señal de gadolinio. Relaciones > 1,0 indican que el grado de expresión de GFP supera los límites de la señal de gadolinio después de la infusión. Los resultados de monos infundidos con vectores de AAV mostraron que el AAV1 se extiende mejor en el parénquima cerebral que AAV2 (1,21 ± 0,1 frente a 0,74 ± 0,04; p<0,007 con prueba de la t bilateral para datos independientes).
Las FIG. 9A-9H muestran la expresión de GFP en el cerebro de NHP transducido con AAV1-eGFP y AAV2-eGFP. FIG. 9A: Gran aumento (40X) de la estructura diana, el núcleo caudado, transducida con AAV1-eGFP (TT) del sujeto número 1. Neuronas GFP+ marrón oscuro teñidas por DAB son visibles frente a la red densamente teñida de fibras neuronales positivas. Dicha señal robusta se detectó en todos los monos inyectados con el vector AAV1-eGFP producido por tanto los métodos de TT como de PCL. FIG. 9B: Fragmento de corteza prefrontal del sujeto número 1 (FIG. 7) que muestra el enorme transporte de vector AAV1-eGFP desde los sitios de inyección (el cuerpo estriado) hasta las regiones corticales. Basándose en la morfología de las células GFP+, se detectaron tanto neuronas como astrocitos en la corteza. FIG. 9C: Gran aumento (40X) del marco indicado en la FIG. 9B que muestra numerosas neuronas corticales que expresan GFP. FIG. 9D: Gran aumento (40X) de la corteza del sujeto número 1 que muestra células GFP+ de morfología astrocítica. FIG. 9E: Gran aumento (40X) de la estructura diana, el putamen, transducida con AAV2-eGFP (TT) del sujeto número 6. La señal de DAB marrón oscura muestra la expresión de GFP en neuronas y su red densamente teñida de fibras. FIG. 9F: Fragmento de corteza prefrontal del sujeto número 6 (FIG. 7) que muestra el enorme transporte del vector AAV2-eGFP desde el cuerpo estriado (lugar de inyección) hasta las regiones corticales. La gran mayoría de las células GFP-positiva tuvieron morfología neuronal (aumento 2,5X). FIG. 9G: Gran aumento (40X) del marco indicado en la FIG. 9F que muestra numerosas neuronas corticales que expresan GFP. FIG. 9H: Gran aumento (20X) de la cápsula interna del sujeto número 6 que muestra células GFP+ con morfología astrocítica.
Las FIG. 10A-10E muestran el tropismo celular de AAV1-eGFP y AAV2-eGFP inyectado en el cerebro de mono. Se procesaron secciones de cerebro de mono para la tinción de inmunofluorescencia doble frente a GFP y diversos marcadores celulares para determinar el tropismo celular de los vectores inyectados. FIG. 10A: Sección del núcleo caudado (estructura diana) del sujeto número 1 teñido con anticuerpos contra GFP (canal verde para el colorante Dylight™ 488; columna izquierda) y el marcador neuronal NeuN (canal rojo para el colorante Dylight™ 549; columna central). Imágenes combinadas (aumento 20X; columna derecha) de ambos canales muestran numerosas neuronas que expresan GFP, verificando el tropismo neuronal de AAV1-eGFP. FIG. 10B: Se realizó la misma tinción para una sección de corteza prefrontal del sujeto número 1 que muestra transducción neuronal en una estructura distal del cerebro que recibe proyecciones neuronales del cuerpo estriado y es evidencia del transporte retrógrado de AAV1-eGFP. FIG. 10C: Sección desde el núcleo caudado (estructura diana) del sujeto número 1 teñido con anticuerpos contra GFP (canal verde para el colorante Dylight™ 488; columna izquierda) y el marcador astrocítico S-100 (canal rojo para el colorante Dylight™ 549; columna central). Las imágenes combinadas (aumento 20X; columna derecha) de ambos canales muestran numerosos astrocitos que expresan GFP, verificando que AAV1-eGFP también transduce astrocitos. FIG. 10D: Sección del núcleo caudado (estructura diana) del sujeto número 6 teñida con anticuerpos contra GFP (canal verde para el colorante Dylight™ 488; columna izquierda) y el neuronal marcador NeuN (canal rojo para el colorante Dylight™ 549; columna central). Las imágenes combinadas (aumento 20X; columna derecha) de ambos canales muestran numerosas neuronas que expresan GFP, verificando el tropismo neuronal de AAV2-eGFP. FIG. 10E: Sección del núcleo caudado (estructura diana) del sujeto número 3 teñida con anticuerpos contra GFP (canal verde para el colorante Dylight™ 488; columna izquierda) y el marcador de la microglía Iba-1 (canal rojo para el colorante Dylight™ 549; columna central). La ausencia de cotinción de ambos marcadores en la imagen combinada (aumento 20X; columna derecha) indica que AAV1 no transduce la microglía, y esto también fue el caso para AAV2 (datos no mostrados).
Las FIG. 11A-11C muestran la eficiencia de la transducción neuronal en el cuerpo estriado de NHP inyectado con AAV 1-eGFP y AAV2-eGFP. Se realizó tinción de inmunofluorescencia doble contra GFP y el marcador neuronal NeuN de secciones de cerebro de mono para calcular la eficiencia de la transducción neuronal dentro del cuerpo estriado (estructura diana) y las regiones corticales. Para el cuerpo estriado, la eficiencia de transducción se calculó en el área primaria de la transducción de GFP (PAT) donde la señal fue robusta con neuronas GFP+ densamente distribuidas (FIG. 11A). Las neuronas también se detectaron en regiones fuera de las áreas primarias de transducción de GFP (OPAT; FIG. 11C). El esquema para la técnica de recuento de neuronas GFP+ en PAT (sombreado interior) y OPAT (sombreado exterior) se muestra en la FIG. 11B. Los datos de recuentos individuales para cada mono y estructura de cerebro se muestran en la Tabla 8 (PAT) y la Tabla 9 (OPAT).
Las FIG. 12A y 12B muestran resultados histológicos relacionados con el vector. La evaluación independiente de tinción con hematoxilina y eosina (H&E) de secciones coronales de áreas de transducción primaria (PAT) revelaron gliosis normal relacionada con la inserción de la cánula en todos los grupos experimentales. La tinción H&E también reveló infiltrados celulares perivasculares en todos los animales independientemente del vector usado. La incidencia y la intensidad de los infiltrados perivasculares aumentaron en grupos inyectados con AAV1, especialmente cuando el vector se preparó por el método TT. FIG. 12A: la sección teñida con H&E del sujeto número 3 muestra numerosos infiltrados perivasculares en el putamen izquierdo transducido con AAV1-eGFP (TT). Se amplía (5X) un vaso sanguíneo en la esquina inferior derecha. FIG. 12B: la sección teñida con H&E del sujeto número 5 muestra solo algunos infiltrados perivasculares localizados en el núcleo caudado izquierdo cuando se transduce con AAV1-eGFP (PCL). Algunos vasos sanguíneos están ampliados (5X) en la esquina inferior izquierda.
Las FIG. 13A y 13B muestran el análisis de PCT cuantitativa (qPCR) de la expresión de ARNm de eGFP en muestras de hígado, bazo, corazón, riñón y pulmón 1 mes tras la inyección de AAV1-eGFP en el núcleo caudado y el putamen de macacos de la India. (FIG. 13A) Vectores de AAV1 y AAV2-eGFP preparados por un proceso de transfección triple (TT). (FIG. 13B) Vectores de AAV1 y AAV2-eGFP preparados por un proceso de línea celular productora (PCL).
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Como se trata con detalle en el presente documento, los inventores han descubierto que los vectores de AAV (por ejemplo, los vectores de AAV1 y AAV2) se dirigen eficientemente tanto a las estructuras estriatales como corticales en el cerebro de macacos de la India cuando se administran al cuerpo estriado (por ejemplo, por administración mejorada por convección, CED). Estos estudios también evaluaron dos plataformas de fabricación diferentes, y estos estudios demuestran que el AAV generado por transfección triple y las estirpes celulares productoras se dirigen tanto a las estructuras estriatales como corticales en el cerebro de macacos de la India. La administración intraestriatal de partículas de rAAV (por ejemplo, los vectores de AAV1 y AAV2) producidas usando ambas plataformas fue capaz de transducir neuronas localizadas una distancia considerable desde el sitio de infusión (por ejemplo, estructuras corticales), así como neuronas en el cuerpo estriado. Por consiguiente, la presente invención proporciona una partícula vírica adenoasociada recombinante (rAVV) para su uso en un método de administración de un rAAV al sistema nervioso central (SNC) de un mamífero, en donde la partícula de rAAV se administra al cuerpo estriado del mamífero por administración mejorada por convección (CED), en donde la partícula de rAAV comprende un vector de rAAV que codifica un ácido nucleico heterólogo que se expresa en al menos la corteza occipital y/o la capa IV de la corteza cerebral y el cuerpo estriado del mamífero, en donde la partícula de rAAV comprende una cápside de AAV de serotipo 2 (AAV2), y en donde la partícula de rAAV se administra a al menos un sitio en el núcleo caudado y dos sitios en el putamen en cada hemisferio del cuerpo estriado.
La invención también proporciona una partícula vírica adenoasociada recombinante (rAVV) para su uso en un método de tratamiento de un trastorno del SNC en un mamífero, en donde una cantidad eficaz de la partícula de rAAV se administra al cuerpo estriado del mamífero por administración mejorada por convección (CED), en donde la partícula de rAAV comprende un vector de rAAV que codifica un ácido nucleico heterólogo que se expresa en al menos la corteza occipital y/o la capa IV de la corteza cerebral y el cuerpo estriado del mamífero, en donde la partícula de rAAV comprende una cápside de AAV2, y en donde la partícula de rAAV se administra a al menos un sitio en el núcleo caudado y dos sitios en el putamen en cada hemisferio del cuerpo estriado.
I. Técnicas generales
Las técnicas y los procedimientos descritos o referenciados en el presente documento son, en general, bien entendidos y comúnmente empleados usando metodología convencional por los expertos en la técnica, tales como, por ejemplo, las metodologías ampliamente utilizadas descritas en Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook et al., 4a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2012); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., 2003); la serie Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds., 1995); Antibodies, A Laboratory Manual (Harlow and Lane, eds., 1988); Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications (R.I. Freshney, 6a ed., J. Wiley and Sons, 2010); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., Academic Press, 1998); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather y P.E. Roberts, Plenum Press, 1998); Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, y D.G. Newell, eds., J. Wiley and Sons, 1993-8); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds., 1996); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., J. Wiley and Sons, 2002); Immunobiology (C.A. Janeway et al., 2004); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988­ 1989); MonoclonalAntibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti y J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); y Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 2011).
II. Definiciones
Un "vector", como se usa en el presente documento, se refiere a un plásmido recombinante o virus que comprende un ácido nucleico que se va a administrar en una célula hospedadora, ya sea in vitro o in vivo.
El término "polinucleótido" o "ácido nucleico", como se usa en el presente documento, se refiere a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sean ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos. Por lo tanto, este término incluye, pero no se limita a, ADN o ARN monocatenario, bicatenario o multicatenario, ADN genómico, ADNc, híbridos de ADN-ARN, o un polímero que comprende bases de purina y pirimidina, u otras bases de nucleótidos naturales, químicamente o bioquímicamente modificadas, no naturales, o derivatizadas. El esqueleto del polinucleótido puede comprender azúcares y grupos fosfato (como se pueden encontrar normalmente en ARN o ADN), o grupos azúcar o fosfato modificados o sustituidos. Alternativamente, el esqueleto del polinucleótido puede comprender un polímero de subunidades sintéticas, tales como fosforamidatos, y así puede ser un fosforamidato de oligodesoxinucleósido (P-NH2) o un oligómero mixto de fosforamidato-fosfodiéster. Además, se puede obtener un polinucleótido bicatenario a partir del producto de polinucleótido monocatenario de síntesis química ya sea sintetizando la hebra complementaria e hibridando las cadenas en condiciones apropiadas, o sintetizando la hebra complementaria de novo usando una ADN polimerasa con un cebador apropiado.
Los términos "polipéptido" y "proteína" se usan indistintamente para referirse a un polímero de restos de aminoácidos, y no se limitan a una longitud mínima. Dichos polímeros de restos de aminoácidos pueden contener restos de aminoácidos naturales o no naturales, e incluyen, pero no se limitan a, péptidos, oligopéptidos, dímeros, trímeros y multímeros de restos de aminoácidos. Tanto las proteínas de longitud completa como los fragmentos de las mismas están englobados por la definición. Los términos también incluyen modificaciones post-expresión del polipéptido, por ejemplo, glucosilación, sialilación, acetilación, fosforilación y similares. Además, para los fines de la presente invención, un "polipéptido" se refiere a una proteína que incluye modificaciones, tales como deleciones, adiciones y sustituciones (generalmente de naturaleza conservativa), en la secuencia nativa, en tanto que la proteína mantenga la actividad deseada. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, como mediante mutagénesis dirigida al sitio, o pueden ser accidentales, tales como mediante mutaciones de hospedadores que producen las proteínas o errores debidos a amplificación por PCR.
Un "vector vírico recombinante" se refiere a un vector de polinucleótido recombinante que comprende una o más secuencias heterólogas (es decir, secuencia del ácido nucleico no de origen vírico). En el caso de vectores de AAV recombinantes, el ácido nucleico recombinante está flanqueado por al menos una secuencia de repeticiones terminales invertidas (ITR). En algunas realizaciones, el ácido nucleico recombinante está flanqueado por dos ITR.
Un "vector de AAV recombinante (vector de rAAV)" se refiere a un vector de polinucleótido que comprende una o más secuencias heterólogas (es decir, secuencia del ácido nucleico no de origen de AAV) que están flanqueadas por al menos una o dos secuencias de repeticiones terminales invertidas (ITR) de AAV. Dichos vectores de rAAV pueden ser replicados y encapsidados en partículas víricas infecciosas cuando están presentes en una célula hospedadora que ha sido infectada con un virus auxiliar adecuado (o que está expresando funciones auxiliares adecuadas) y que está expresando productos del gen rep y cap de AAV (es decir, proteínas Rep y Cap de AAV). Cuando un vector de rAAV se incorpora en un polinucleótido más grande (por ejemplo, en un cromosoma o en otro vector, tal como un plásmido usado para clonación o transfección), entonces el vector de rAAV se puede denominar un "pro-vector" que puede ser "rescatado" por replicación y encapsidación en presencia de funciones de encapsidación de AAV y funciones auxiliares adecuadas. Un vector de rAAV puede estar en cualquiera de varias formas, que incluyen, pero no se limitan a, plásmidos, cromosomas artificiales lineales, complejado con lípidos, encapsulado dentro de liposomas y encapsidado en una partícula vírica; por ejemplo, una partícula de AAV. Un vector de rAAV se puede encapsidar en una cápside de virus AAV para generar una "partícula vírica adenoasociada recombinante (partícula de rAAV)".
"Heterólogo" significa derivado de una entidad genotípicamente distinta de la del resto de la entidad con la que se compara o en la que se introduce o incorpora. Por ejemplo, un polinucleótido introducido por técnicas de ingeniería genética en un tipo de célula diferente es un polinucleótido heterólogo (y, cuando se expresa, puede codificar un polipéptido heterólogo). Similarmente, una secuencia celular (por ejemplo, un gen o porción del mismo) que se incorpora en un vector vírico es una secuencia heteróloga de nucleótidos con respecto al vector. Un ácido nucleico heterólogo puede referirse a un ácido nucleico derivado de una entidad genotípicamente distinta de la del resto de la entidad con la que se compara o en la que se introduce o incorpora.
El término "ácido nucleico heterólogo" se refiere a un polinucleótido que se introduce en una célula y es capaz de ser transcrito en ARN y opcionalmente traducido y/o expresado en condiciones apropiadas. En algunos aspectos, confiere una propiedad deseada a una célula en la que se introdujo, o de otro modo conduce a un resultado terapéutico o de diagnóstico deseado. En otro aspecto, se puede transcribir en una molécula que media en interferencia por ARN, tal como miARN, ARNip o ARNhp.
"Promotor de p-actina de pollo (CBA)" se refiere a una secuencia de polinucleótidos derivada de un gen de p-actina de pollo (por ejemplo, beta-actina de Gallus gallus, representada por GenBank Entrez Gene ID 396526). Como se usa en el presente documento, "promotor de p-actina de pollo" puede referirse a un promotor que contiene un elemento potenciador temprano del citomegalovirus (CMV), el promotor y primer exón e intrón del gen de p-actina de pollo y el aceptor de empalme del gen de beta-globina de conejo, tales como las secuencias descritas en Miyazaki, J. et al. (1989) Gene 79(2):269-77. Como se usa en el presente documento, se puede usar indistintamente el término "promotor de CAG". Como se usa en el presente documento, se puede usar indistintamente el término "potenciador temprano del CMV/promotor de beta-actina de pollo (CAG)".
Los términos "partículas de genoma (gp)", "equivalentes de genoma" o "copias de genoma", como se usan en referencia a un título vírico, se refieren al número de viriones que contiene el genoma de ADN de AAV recombinante, independientemente de la infectividad o funcionalidad. El número de partículas de genoma en una preparación de vector particular se puede medir mediante procedimientos, tal como se describe en los ejemplos en el presente documento, o por ejemplo, en Clark et al. (1999) Hum. Gene Ther., 10:1031-1039; Veldwijk et al. (2002) Mol. Ther., 6:272-278.
El término "genoma de vector (vg)", como se usa en el presente documento, se puede referir a uno o más polinucleótidos que comprenden un conjunto de las secuencias de polinucleótidos de un vector, por ejemplo, un vector vírico. Un genoma de vector puede estar encapsidado en una partícula vírica. Dependiendo del vector vírico particular, un genoma de vector puede comprender ADN monocatenario, ADN bicatenario, o ARN monocatenario, o ARN bicatenario. Un genoma de vector puede incluir secuencias endógenas asociadas a un vector vírico particular y/o cualquier secuencia heteróloga insertada en un vector vírico particular mediante técnicas recombinantes. Por ejemplo, un genoma de vector de AAV recombinante puede incluir al menos una secuencia de ITR que flanquea un promotor, una secuencia de interés (por ejemplo, un ácido nucleico heterólogo) y una secuencia de poliadenilación. Un genoma de vector completo puede incluir un conjunto completo de las secuencias de polinucleótidos de un vector. En algunas realizaciones, el título de ácido nucleico de un vector vírico se puede medir en términos de vg/ml. Los métodos adecuados para medir este título son conocidos en la técnica (por ejemplo, PCR cuantitativa).
Los términos "unidad de infección (iu)", "partícula infecciosa" o "unidad de replicación", como se usan en referencia a un título vírico, se refieren al número de partículas de vector de AAV recombinante infeccioso y competente en la replicación como se mide por el ensayo de centro infeccioso, también conocido como ensayo de centro de replicación, como se describe, por ejemplo, en McLaughlin et al. (1988) J. Virol., 62:1963-1973.
El término "unidad transductora (tu)", como se usa en referencia a un título vírico, se refiere al número de partículas de vector de AAV recombinante infeccioso que dan como resultado la producción de un producto de ácido nucleico heterólogo funcional como se mide en ensayos funcionales, tal como se describe en Ejemplos en el presente documento o, por ejemplo, en Xiao et al. (1997) Exp. Neurobiol., 144:113-124; o en Fisher et al. (1996) J. Virol., 70:520-532 (ensayo LFU).
Una secuencia de "repeticiones terminales invertidas" o "ITR" es un término bien entendido en la técnica y se refiere a secuencias relativamente cortas encontradas en los extremos de los genomas víricos que están en orientación opuesta.
Una secuencia de "repeticiones terminales invertidas (ITR) de AAV", un término bien entendido en la técnica, es una secuencia de aproximadamente 145 nucleótidos que está presente en ambos extremos del genoma de AAV monocatenario nativo. Los 125 nucleótidos más externos de la ITR pueden estar presentes en cualquiera de dos orientaciones alternativas, que conducen a la heterogeneidad entre diferentes genomas de AAV y entre los dos extremos de un único genoma de AAV. Los 125 nucleótidos más externos también contienen varias regiones más cortas de autocomplementariedad (designadas regiones A, A', B, B', C, C' y D), que permiten que ocurra el emparejamiento de bases intracatenario dentro de esta porción de la ITR.
Una "secuencia de resolución terminal" o "trs" es una secuencia en la región D de la ITR de AAV que se escinde por proteínas rep de AAV durante la replicación de ADN vírico. Una secuencia de resolución terminal mutante es resistente a la escisión por proteínas rep de AAV.
"Funciones auxiliares de AAV" se refiere a funciones que permiten que el AAV se replique y sea encapsidado por una célula hospedadora. Las funciones auxiliares de AAV se pueden proporcionar en cualquiera de varias formas, que incluyen, pero no se limitan a, virus auxiliar o genes de virus auxiliares que ayudan en la replicación y la encapsidación de AAV. Se conocen en la técnica otras funciones auxiliares de AAV, tales como agentes genotóxicos.
Un "virus auxiliar" para AAV se refiere a un virus que permite que el AAV (que es un parvovirus defectuoso) se replique y sea encapsidado por una célula hospedadora. Un virus auxiliar proporciona "funciones auxiliares" que permiten la replicación del AAV. Se han identificado varios de dichos virus auxiliares, que incluyen adenovirus, virus del herpes y poxvirus, tales como variolovacuna y baculovirus. Los adenovirus engloban varios subgrupos diferentes, aunque el tipo 5 de adenovirus del subgrupo C (Ad5) es el más comúnmente usado. Se conocen numerosos adenovirus de origen de mamífero humano, no humano y aviar y están disponibles de depósitos tales como la ATCC. Los virus de la familia del herpes, que también están disponibles de depósitos tales como ATCC, incluyen, por ejemplo, virus del herpes simple (VHS), virus de Epstein-Barr (VEB), citomegalovirus (CMV) y virus de la pseudorrabia (VPS). Los ejemplos de funciones auxiliares de los adenovirus para la replicación de AAV incluyen funciones E1A, funciones E1B, funciones E2A, funciones VA y funciones E4orf6. Los baculovirus disponibles de depósitos incluyen virus de la poliedrosis nuclear de Autographa californica.
Una preparación de rAAV se dice que está "sustancialmente libre" de virus auxiliar si la relación entre partículas de AAV infecciosas y partículas de virus auxiliar infecciosas es al menos aproximadamente 102:1; al menos aproximadamente 104:1, al menos aproximadamente 106:1; o al menos aproximadamente 108:1 o más. En algunas realizaciones, las preparaciones también están libres de cantidades equivalentes de proteínas de virus auxiliar (es decir, proteínas como estarían presentes como resultado de dicho nivel de virus auxiliar si las impurezas de partículas de virus auxiliar observadas anteriormente estuvieran presentes en forma alterada). La contaminación de proteínas virales y/o celulares se puede observar, en general, como la presencia de bandas de tinción de Coomassie sobre geles SDS (por ejemplo, la aparición de bandas distintas de las correspondientes a las proteínas VP1, VP2 y VP3 de la cápside del AAV).
"Funciones auxiliares de AAV" se refiere a funciones que permiten que el AAV sea replicado y encapsidado por una célula hospedadora. Las funciones auxiliares de AAV se pueden proporcionar en cualquiera de varias formas, que incluyen, pero no se limitan a, virus auxiliar o genes de virus auxiliares que ayudan en la replicación y la encapsidación de AAV. Se conocen en la técnica otras funciones auxiliares de AAV, tales como agentes genotóxicos. Un "virus auxiliar" para AAV se refiere a un virus que permite que el AAV (que es un parvovirus defectuoso) se replique y sea encapsidado por una célula hospedadora. Se han identificado varios de dichos virus auxiliares, que incluyen adenovirus, virus del herpes y poxvirus, tales como la variolovacuna. Los adenovirus engloban varios subgrupos diferentes, aunque el tipo 5 de adenovirus del subgrupo C (Ad5) es el más comúnmente usado. Se conocen numerosos adenovirus de origen de mamífero humano, no humano y aviar y están disponibles de depósitos tales como la ATCC. Los virus de la familia del herpes, que también están disponibles de depósitos tales como ATCC, incluyen, por ejemplo, virus del herpes simple (VHS), virus de Epstein-Barr (VEB), citomegalovirus (CMV) y virus de la pseudorrabia (VPS).
"Porcentaje (%) de identidad de secuencia" con respecto a una secuencia de polipéptidos o del ácido nucleico de referencia se define como el porcentaje de restos de aminoácidos o nucleótidos en una secuencia candidata que son idénticos a los restos de aminoácidos o nucleótidos en la secuencia de polipéptidos o del ácido nucleico de referencia, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si fuera necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y sin considerar sustituciones conservativas como parte de la identidad de secuencia. El alineamiento a efectos de determinar el porcentaje de identidad de secuencias de aminoácidos o del ácido nucleico se puede lograr de diversas formas que están dentro de la experiencia en la técnica, por ejemplo, usando programas de software informático públicamente disponibles, por ejemplo, los descritos en Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1987), Sup. 30, sección 7.7.18, Tabla 7.7.1, y que incluye el software BLAST, BLAST-2, ALIg N o Megalign (DNASTAR). Un ejemplo de un programa de alineamiento es ALIGN Plus (Scientific and Educational Software, Pennsilvania). Los expertos en la técnica pueden determinar parámetros apropiados para medir el alineamiento, que incluyen cualquier algoritmo necesario para lograr el máximo alineamiento a lo largo de la longitud completa de las secuencias que se comparan. A efectos del presente documento, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos dada A con respecto a, con o contra una secuencia de aminoácidos B dada (que puede ser expresada alternativamente como una secuencia de aminoácidos A dada que tiene o comprende un cierto % de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a, con o contra una secuencia de aminoácidos B dada) se calcula del siguiente modo: 100 veces la fracción X/Y, donde X es el número de restos de aminoácidos puntuados como coincidencias idénticas por el programa de alineamiento de secuencias en ese alineamiento del programa de A y B, y donde Y es el número total de restos de aminoácidos en B. Se apreciará que donde la longitud de secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A con respecto a B no será igual al % de identidad de secuencia de aminoácidos de B con respecto a A. A efectos del presente documento, el % de identidad de secuencia del ácido nucleico de una secuencia del ácido nucleico C dada con respecto a, con o contra una secuencia del ácido nucleico D dada (que puede expresarse alternativamente como una secuencia del ácido nucleico C dada que tiene o comprende un cierto % de identidad de secuencia del ácido nucleico con respecto a, con o contra una secuencia del ácido nucleico D dada) se calcula del siguiente modo: 100 veces la fracción W/Z, donde W es el número de nucleótidos puntuados como coincidencias idénticas por el programa de alineamiento de secuencias en ese alineamiento de programa de C y D, y donde Z es el número total de nucleótidos en D. Se apreciará que donde la longitud de secuencia del ácido nucleico C no es igual a la longitud de secuencia del ácido nucleico D, el % de identidad de secuencia del ácido nucleico de C con respecto a D no será igual al % de identidad de secuencia del ácido nucleico de D con respecto a C.
Una molécula (por ejemplo, ácido nucleico o proteína) o célula "aislada" significa que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural.
Una "cantidad eficaz" es una cantidad suficiente para efectuar resultados beneficiosos o deseados, que incluyen resultados clínicos (por ejemplo, mejora de los síntomas, logro de criterios de valoración clínicos y similares). Se puede administrar una cantidad eficaz en una o más administraciones. En términos de un estado de enfermedad, una cantidad eficaz es una cantidad suficiente para mejorar, estabilizar o retrasar el desarrollo de una enfermedad.
Como se usa en el presente documento, el término "administración mejorada por convección (CED)" se puede referir a la administración de un agente terapéutico al SNC por infusión a una tasa en la que la presión hidrostática conduce a distribución convectiva. En algunas realizaciones, la infusión se hace a una tasa superior a 0,5 pl/min. Sin embargo, se puede usar cualquier caudal adecuado de forma que se mantenga la presión intracraneal a niveles adecuados para no lesionar el tejido cerebral. La CED se puede llevar a cabo, por ejemplo, usando un catéter o cánula adecuado (por ejemplo, una cánula sin reflujo de diseño en escalones) mediante la colocación de la punta de la cánula al menos en estrecha proximidad al tejido diana del SNC (por ejemplo, la punta se inserta en el tejido del SNC). Después de que la cánula sea colocada, se conecta a una bomba que suministra el agente terapéutico a través de la punta de la cánula al tejido diana del SNC. Se puede mantener un gradiente de presión desde la punta de la cánula durante la infusión. En algunas realizaciones, la infusión se puede monitorizar por un agente de marcado detectable por un método de obtención de imágenes, tal como IRM intraoperatoria (IRMi) u otra técnica de IRM en tiempo real y/o suministrar por equipo y técnicas de inyección estereotáxica habituales (por ejemplo, el sistema ClearPoint® de MRI Interventions, Memphis, TN).
Como se usa en el presente documento, el término "poloxámero" puede referirse a un copolímero de bloque hecho de una cadena de polioxipropileno flanqueada por dos cadenas de polioxietileno. Nombres comerciales con los que se pueden comercializar los poloxámeros incluyen, sin limitación, PLURONIC® (BASF), KOLLIPHOR® (BASF), LUTROL® (BASF) y SYNPERONIC® (Croda International).
Un "individuo" o "sujeto" es un mamífero. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, animales domesticados (por ejemplo, vacas, ovejas, gatos, perros y caballos), primates (por ejemplo, seres humanos y primates no humanos, tales como monos), conejos y roedores (por ejemplo, ratones y ratas). En ciertas realizaciones, el individuo o sujeto es un ser humano.
Como se usa en el presente documento, "tratamiento" es un enfoque para obtener resultados clínicos beneficiosos o deseados. Para los fines de la presente invención, los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, alivio de síntomas, reducción del grado de enfermedad, estado de enfermedad estabilizado (por ejemplo, que no empeora), prevención de la diseminación (por ejemplo, metástasis) de la enfermedad, retraso o ralentizamiento de la progresión de la enfermedad, mejora o paliación del estado de enfermedad, y remisión (tanto parcial como total), tanto detectable como indetectable. "T ratamiento" también puede significar prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento.
Como se usa en el presente documento, el término "tratamiento profiláctico" se refiere al tratamiento en donde se sabe o se sospecha que un individuo tiene el riesgo o está en riesgo de tener un trastorno, pero no ha mostrado síntomas ni síntomas mínimos del trastorno. Un individuo que recibe tratamiento profiláctico se puede tratar antes de la aparición de los síntomas.
"Enfermedad de Huntington (HD)" se refiere al trastorno cerebral progresivo normalmente provocado por mutaciones en el gen HTT (también conocido como huntingtina, HD o IT15). Se puede caracterizar por síntomas que incluyen movimientos anormales (denominado corea), pérdida gradual de la función motora, enfermedades psíquicas o psiquiátricas, y cognición progresivamente alterada. Aunque la mayoría de los síntomas aparecen a los 30 y 40 años, también se han observado formas juveniles de la enfermedad. Para una descripción adicional de la HD, véase la entrada de OMIM N.° 143100.
"Huntingtina (HTT)" se puede referir tanto al gen como a un producto de polipéptido del mismo asociado a la mayoría de los casos de enfermedad de Huntington. La función normal de la huntingtina no es completamente entendida. Sin embargo, se conoce que las mutaciones en el gen huntingtina provocan HD. Estas mutaciones normalmente son heredadas en un modo dominante autosómico e implican la expansión de repeticiones de trinucleótidos CAG en el gen HTT, que conduce a una cola de poliglutamina (poliQ) en la proteína Htt.
Como se usa en el presente documento, un agente "terapéutico" (por ejemplo, un polipéptido terapéutico, ácido nucleico, transgén, o similares) es uno que proporciona un resultado clínico beneficioso o deseado, tal como los resultados clínicos a modo de ejemplo descritos anteriormente. Como tal, un agente terapéutico se puede usar en un tratamiento como se ha descrito anteriormente.
Referencia a "aproximadamente" un valor o parámetro en el presente documento incluye (y describe) realizaciones que se refieren a ese valor o parámetro en sí. Por ejemplo, la descripción con referencia a "aproximadamente X" incluye la descripción de "X."
Como se usa en el presente documento, la forma en singular de los artículos "un", "una", "el" y "la" incluye referencias en plural, a menos que se indique lo contrario.
Se entiende que los aspectos y las realizaciones de la invención descritos en el presente documento incluyen "que comprende", "que consiste" y/o "que consiste esencialmente en" los aspectos y las realizaciones.
III. Administración de partículas de rAAV
En algunos aspectos, la invención proporciona una partícula vírica adenoasociada recombinante (rAVV) para su uso en un método de administración de un rAAV al sistema nervioso central (SNC) de un mamífero, en donde la partícula de rAAV se administra al cuerpo estriado del mamífero por administración mejorada por convección (CED), en donde la partícula de rAAV comprende un vector de rAAV que codifica un ácido nucleico heterólogo que se expresa en al menos la corteza occipital y/o la capa IV de la corteza cerebral y el cuerpo estriado del mamífero, en donde la partícula de rAAV comprende una cápside de AAV de serotipo 2 (AAV2), y en donde la partícula de rAAV se administra a al menos un sitio en el núcleo caudado y dos sitios en el putamen en cada hemisferio del cuerpo estriado. Aspectos adicionales la invención proporcionan una partícula vírica adenoasociada recombinante (rAVV) para su uso en un método de tratamiento de un trastorno del SNC en un mamífero, en donde una cantidad eficaz de la partícula de rAAV se administra al cuerpo estriado del mamífero por administración mejorada por convección (CED), en donde la partícula de rAAV comprende un vector de rAAV que codifica un ácido nucleico heterólogo que se expresa en al menos la corteza occipital y/o la capa IV de la corteza cerebral y el cuerpo estriado del mamífero, en donde la partícula de rAAV comprende una cápside de AAV2, y en donde la partícula de rAAV se administra a al menos un sitio en el núcleo caudado y dos sitios en el putamen en cada hemisferio del cuerpo estriado. En todavía aspectos adicionales, la invención proporciona la partícula de rAAV para su uso para tratar enfermedad de Huntington en un mamífero que comprende administrar una partícula de rAAV al cuerpo estriado, en donde la partícula de rAAV comprende un vector de rAAV que codifica un ácido nucleico heterólogo que se expresa en al menos la corteza cerebral y el cuerpo estriado del mamífero. En algunas realizaciones, el mamífero es un ser humano.
Ciertos aspectos de la presente divulgación se refieren a la administración de una partícula de rAAV a una o más regiones del sistema nervioso central (SNC). En algunas realizaciones, la partícula de rAAV se administra al cuerpo estriado. El cuerpo estriado se conoce como una región del cerebro que recibe entradas de la corteza cerebral (el término "corteza" se puede usar indistintamente en el presente documento) y envía salidas a los ganglios basales (el cuerpo estriado también se denomina el núcleo estriado y el neoestriado). Como se ha descrito anteriormente, el cuerpo estriado controla tanto los movimientos motores como el control/motivación psíquico y participa en muchas enfermedades neurológicas, tales como la enfermedad de Huntington. Varios tipos de células de interés se localizan en el cuerpo estriado, que incluyen, sin limitación, las neuronas de proyección espinosa (también conocidas como neurona mediana espinosas), las interneuronas GABAergicas e interneuronas colinérgicas. Las neuronas medianas espinosas constituyen la mayor parte de las neuronas estriatales. Estas neuronas son GABAérgicas y expresan receptores de dopamina. Cada hemisferio del cerebro contiene un cuerpo estriado.
Las subestructuras importantes del cuerpo estriado incluyen el núcleo caudado y el putamen. En algunas realizaciones, la partícula de rAAV se administra al núcleo caudado (el término "caudado" se puede usar indistintamente en el presente documento). El núcleo caudado se conoce como una estructura del cuerpo estriado dorsal. El núcleo caudado participa en el control de funciones, tales como movimientos dirigidos, memoria de trabajo espacial, memoria, acciones dirigidas a objetivos, emoción, sueño, lenguaje y aprendizaje. Cada hemisferio del cerebro contiene un núcleo caudado.
En algunas realizaciones, la partícula de rAAV se administra al putamen. Junto con el núcleo caudado, el putamen se conoce como una estructura del cuerpo estriado dorsal. El putamen comprende parte del núcleo lenticular y conecta la corteza cerebral con la sustancia negra y el globo pálido. Altamente integrado con muchas otras estructuras del cerebro, el putamen participa en el control de funciones tales como el aprendizaje, el aprendizaje motor, el rendimiento motor, las tareas motoras y los movimientos de extremidades. Cada hemisferio del cerebro contiene un putamen.
Las partículas de rAAV se pueden administrar a uno o más sitios del cuerpo estriado. En algunas realizaciones, la partícula de rAAV se administra al putamen y al núcleo caudado del cuerpo estriado. En algunas realizaciones, la partícula de rAAV se administra al putamen y al núcleo caudado de cada hemisferio del cuerpo estriado. En algunas realizaciones, la partícula de rAAV se administra a al menos un sitio en el núcleo caudado y dos sitios en el putamen.
En algunas realizaciones, la partícula de rAAV se administra a un hemisferio del cerebro. En algunas realizaciones, la partícula de rAAV se administra a ambos hemisferios del cerebro. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la partícula de rAAV se administra al putamen y al núcleo caudado de cada hemisferio del cuerpo estriado. En algunas realizaciones, la composición que contiene partículas de rAAV se administra al cuerpo estriado de cada hemisferio. En otras realizaciones, la composición que contiene partículas de rAAV se administra al cuerpo estriado del hemisferio izquierdo o el cuerpo estriado del hemisferio derecho y/o el putamen del hemisferio izquierdo o el putamen del hemisferio derecho. En algunas realizaciones, la composición que contiene partículas de rAAV se administra a cualquier combinación del núcleo caudado del hemisferio izquierdo, el núcleo caudado del hemisferio derecho, el putamen del hemisferio izquierdo y el putamen del hemisferio derecho.
En algunas realizaciones, la composición que contiene partículas de rAAV se administra a más de una localización simultáneamente o secuencialmente. En algunas realizaciones, múltiples inyecciones de la composición que contiene partículas de rAAV no son más de aproximadamente cualquiera de una hora, dos horas, tres horas, cuatro horas, cinco horas, seis horas, nueve horas, doce horas o 24 horas de diferencia. En algunas realizaciones, múltiples inyecciones de la composición que contiene partículas de rAAV son más de aproximadamente 24 horas de diferencia.
En general, se puede administrar desde aproximadamente 1 gl a aproximadamente 1 ml de una composición (por ejemplo, desde aproximadamente 100 gl hasta aproximadamente 500 gl de una composición). En algunas realizaciones, la cantidad de la composición administrada al putamen es mayor que el volumen administrado al núcleo caudado. En algunas realizaciones, la cantidad de la composición administrada al putamen es aproximadamente dos veces el volumen administrado al núcleo caudado. En otras realizaciones, la cantidad de la composición administrada al putamen es aproximadamente cualquiera de 1X, 1,25X, 1,5X, 1,75X, 2X, 2,25X, 2,5X, 2,75X, 3X, 3,5X, 4X, 4,5X, 5X o 10X (o cualquier relación intermedia) el volumen administrado al núcleo caudado. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la relación entre partículas de rAAV administradas al putamen y las partículas de rAAV administradas al núcleo caudado es al menos aproximadamente 2:1 (por ejemplo, aproximadamente 30 gl de la composición se administra al núcleo caudado de cada hemisferio y aproximadamente 60 gl de la composición se administra al putamen de cada hemisferio). En algunas realizaciones, aproximadamente 20 gl a aproximadamente 50 gl de la composición (o cualquier cantidad intermedia) se administra al núcleo caudado de cada hemisferio, y aproximadamente 40 gl a aproximadamente 100 gl de la composición (o cualquier cantidad intermedia) se administra al putamen de cada hemisferio. En algunas realizaciones, el volumen de la composición administrada al núcleo caudado de cada hemisferio es inferior a aproximadamente cualquiera de los siguientes volúmenes (en gl): 50, 45, 40, 35, 30 o 25. En algunas realizaciones, el volumen de la composición administrada al núcleo caudado de cada hemisferio es mayor que aproximadamente cualquiera de los siguientes volúmenes (en gl): 20, 25, 30, 35, 40 o 45. Es decir, el volumen de la composición administrada al núcleo caudado de cada hemisferio puede ser cualquiera de un intervalo de volúmenes que tienen un límite superior de 50, 45, 40, 35, 30 o 25 y un límite inferior independientemente seleccionado de 20, 25, 30, 35, 40 o 45, en donde el límite inferior es inferior al límite superior. En algunas realizaciones, el volumen de la composición administrada al putamen de cada hemisferio es inferior a aproximadamente cualquiera de los siguientes volúmenes (en gl): 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50 o 45. En algunas realizaciones, el volumen de la composición administrada al putamen de cada hemisferio es mayor que aproximadamente cualquiera de los siguientes volúmenes (en gl): 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 o 95. Es decir, el volumen de la composición administrada al putamen de cada hemisferio puede ser cualquiera de un intervalo de volúmenes que tiene un límite superior de 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, o 45 y un límite inferior independientemente seleccionado de 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 o 95, en donde el límite inferior es inferior al límite superior.
En algunas realizaciones, la composición se administra al cuerpo estriado a una tasa superior a 1 gl/min a aproximadamente 5 gl/min. En algunas realizaciones, la composición se administra al núcleo caudado y al putamen a una tasa superior a 1 gl/min a aproximadamente 5 gl/min. En algunas realizaciones, la composición se administra al cuerpo estriado (el núcleo caudado y/o el putamen) a una tasa superior a aproximadamente cualquiera de 1 gl/min, 2 gl/min, 3 gl/min, 4 gl/min, 5 gl/min, 6 gl/min, 7 gl/min, 8 gl/min, 9 gl/min o 10 gl/min. En algunas realizaciones, la composición se administra al cuerpo estriado (el núcleo caudado y/o el putamen) a una tasa de cualquiera de aproximadamente 1 gl/min a aproximadamente 10 gl/min, aproximadamente 1 gl/min a aproximadamente 9 gl/min, aproximadamente 1 gl/min a aproximadamente 8 gl/min, aproximadamente 1 gl/min a aproximadamente 7 gl/min, aproximadamente 1 gl/min a aproximadamente 6 gl/min, aproximadamente 1 gl/min a aproximadamente 5 gl/min, aproximadamente 1 gl/min a aproximadamente 4 gl/min, aproximadamente 1 gl/min a aproximadamente 3 gl/min, aproximadamente 1 gl/min a aproximadamente 2 gl/min, aproximadamente 2 gl/min a aproximadamente 10 gl/min, aproximadamente 2 gl/min a aproximadamente 9 gl/min, aproximadamente 2 gl/min a aproximadamente 8 gl/min, aproximadamente 2 pl/min a aproximadamente
Figure imgf000013_0001
pl/min, aproximadamente 2 pl/min a aproximadamente 6 pl/min, aproximadamente 2 pl/min a aproximadamente 5 pl/min, aproximadamente 2 pl/min a aproximadamente 4 pl/min, aproximadamente 2 pl/min a aproximadamente 3 pl/min, aproximadamente 3 pl/min a aproximadamente 10 pl/min, aproximadamente 3 pl/min a aproximadamente 9 pl/min, aproximadamente 3 pl/min a aproximadamente 8 pl/min, aproximadamente 3 pl/min a aproximadamente
Figure imgf000013_0002
pl/min, aproximadamente 3 pl/min a aproximadamente 6 pl/min, aproximadamente 3 pl/min a aproximadamente 5 pl/min, aproximadamente 3 pl/min a aproximadamente 4 pl/min, aproximadamente 4 pl/min a aproximadamente 10 pl/min, aproximadamente 4 pl/min a aproximadamente 9 pl/min, aproximadamente 4 pl/min a aproximadamente 8 pl/min, aproximadamente 4 pl/min a aproximadamente 7 pl/min, aproximadamente 4 pl/min a aproximadamente 6 pl/min, aproximadamente 4 pl/min a aproximadamente 5 pl/min, aproximadamente 5 pl/min a aproximadamente 10 pl/min, aproximadamente 5 pl/min a aproximadamente 9 pl/min, aproximadamente 5 pl/min a aproximadamente 8 pl/min, aproximadamente 5 pl/min a aproximadamente 7 pl/min, aproximadamente 5 pl/min a aproximadamente 6 pl/min, aproximadamente 6 pl/min a aproximadamente 10 pl/min, aproximadamente 6 pl/min a aproximadamente 9 pl/min, aproximadamente 6 pl/min a aproximadamente 8 pl/min, aproximadamente 6 pl/min a aproximadamente 7 pl/min, aproximadamente 7 pl/min a aproximadamente 10 pl/min, aproximadamente 7 pl/min a aproximadamente 9 pl/min, aproximadamente 7 pl/min a aproximadamente 8 pl/min, aproximadamente 8 pl/min a aproximadamente 10 pl/min, aproximadamente 8 pl/min a aproximadamente 9 pl/min, o aproximadamente 9 pl/min a aproximadamente 10 pl/min. En algunas realizaciones, la composición se administra en aumentos incrementales en el caudal durante la administración (es decir, "escalonado").
En algunas realizaciones, la administración de la partícula de rAAV se realiza una vez. En otras realizaciones, la administración de la partícula de rAAV se realiza más de una vez. Un experto en la técnica puede determinar cuántas veces se debe realizar la administración de la partícula de rAAV basándose en parte en, por ejemplo, el trastorno que está tratándose y/o la respuesta del paciente al tratamiento.
En algunas realizaciones, la partícula de rAAV comprende la administración al SNC de una cantidad eficaz de partículas víricas recombinantes al cuerpo estriado, en donde la partícula de rAAV comprende un vector de rAAV que codifica un ácido nucleico heterólogo que se expresa en al menos la corteza cerebral y el cuerpo estriado. En algunas realizaciones, el título vírico de las partículas de rAAV es al menos aproximadamente cualquiera de 5 x 1012, 6 x 1012,
7 x 1012, 8 x 1012, 9 x 1012, 10 x 1012, 11 x 1012, 15 x 1012, 20 x 1012, 25 x 1012, 30 x 1012 o 50 x 1012 copias de genoma/ml. En algunas realizaciones, el título vírico de las partículas de rAAV es aproximadamente cualquiera de
5 x 1012 a 6 x 1012, 6 x 1012 a 7 x 1012, 7 x 1012 a 8 x 1012, 8 x 1012 a 9 x 1012, 9 x 1012 a 10 x 1012, 10 x 1012 a
11 x 1012, 11 x 1012 a 15 x 1012, 15 x 1012 a 20 x 1012, 20 x 1012 a 25 x 1012, 25 x 1012 a 30 x 1012, 30 x 1012 a 50 x 1012
, o 50 x 1012 a 100 x 1012 copias de genoma/ml. En algunas realizaciones, el título vírico de las partículas de rAAV es aproximadamente cualquiera de 5 x 1012 a 10 x 1012, 10 x 1012 a 25 x 1012, o 25 x 1012 a 50 x 1012 copias de genoma/ml. En algunas realizaciones, el título vírico de las partículas de rAAV es al menos aproximadamente cualquiera de 5 x 109, 6 x 109, 7 x 109, 8 x 109, 9 x 109, 10 x 109, 11 x 109, 15 x 109, 50 x 109 unidades transductoras/ml. En algunas realizaciones, el título vírico de las partículas de rAAV es aproximadamente cualquiera de 5 x 109 a 6 x 109, 6 x 109 a 7 x 109, 7 x 109 a 8 x 109, 8 x 109 a 9 x 109, 9 x 109 a
10 x 109, 10 x 109 a 11 x 109, 11 x 109 a 15 x 109, 15 x 109 a 20 x 109, 20 x 109 a 25 x 109, 25 x 109 a 30 x 109,
30 x 109 a 50 x 109 o 50 x 109 a 100 x 109 unidades transductoras/ml. En algunas realizaciones, el título vírico de las partículas de rAAV es aproximadamente cualquiera de 5 x 109 a 10 x 109, 10 x 109 a 15 x 109, 15 x 109 a 25 x 109, o
25 x 109 a 50 x 109 unidades transductoras/ml. En algunas realizaciones, el título vírico de las partículas de rAAV es al menos cualquiera de aproximadamente 5 x 1010, 6 x 1010, 7 x 1010, 8 x 1010, 9 x 1010, 10 x 1010, 11 x 1010,
15 x 1010, 20 x 1010, 25 x 1010, 30 x 1010, 40 x 1010, o 50 x 1010 unidades infecciosas/ml. En algunas realizaciones, el título vírico de las partículas de rAAV es al menos cualquiera de aproximadamente 5 x 1010 a 6 x 1010, 6 x 1010 a
7 x 1010, 7 x 1010 a 8 x 1010, 8 x 1010 a 9 x 1010, 9 x 1010 a 10 x 1010, 10 x 1010 a 11 x 1010, 11 x 1010 a 15 x 1010,
15 x 1010 a 20 x 1010, 20 x 1010 a 25 x 1010, 25 x 1010 a 30 x 1010, 30 x 1010 a 40 x 1010, 40 x 1010 a 50 x 1010, o
50 x 1010 a 100 x 1010 unidades infecciosas/ml. En algunas realizaciones, el título vírico de las partículas de rAAV es al menos cualquiera de aproximadamente 5 x 1010 a 10 x 1010, 10 x 1010 a 15 x 1010, 15 x 1010 a 25 x 1010, o 25 x 1010 a 50 x 1010 unidades infecciosas/ml.
En algunas realizaciones, las partículas de rAAV comprenden la administración al SNC de una cantidad eficaz de partículas víricas recombinantes al cuerpo estriado, en donde la partícula de rAAV comprende un vector de rAAV que codifica un ácido nucleico heterólogo que se expresa en al menos la corteza cerebral y el cuerpo estriado. En algunas realizaciones, la dosis de partículas víricas administrada al individuo es al menos aproximadamente cualquiera de
1 x 108 a aproximadamente 1 x 1013 copias de genoma/kg de peso corporal. En algunas realizaciones, la dosis de partículas víricas administrada al individuo es aproximadamente 1 x 108 a 1 x 1013 copias de genoma/kg de peso corporal.
En algunas realizaciones, las partículas de rAAV comprenden la administración al SNC de una cantidad eficaz de partículas víricas recombinantes al cuerpo estriado, en donde la partícula de rAAV comprende un vector de rAAV que codifica un ácido nucleico heterólogo que se expresa en al menos la corteza cerebral y el cuerpo estriado. En algunas realizaciones, la cantidad total de partículas víricas administrada al individuo es al menos aproximadamente 1 x 109 a aproximadamente 1 x 1014 copias de genoma. En algunas realizaciones, la cantidad total de partículas víricas administrada al individuo es aproximadamente 1 x 109 a aproximadamente 1 x 1014 copias de genoma.
Las composiciones (por ejemplo, partículas de rAAV) se pueden usar tanto solas como en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales para tratar cualquiera o todos de los trastornos descritos en el presente documento. El intervalo entre la administración secuencial puede ser en términos de al menos (o, alternativamente, inferior a) minutos, horas o días.
IV. Construcciones de expresión
En algunos aspectos, la divulgación proporciona la administración de partículas de rAAV al SNC de un mamífero administrando las partículas de rAAV al cuerpo estriado. En algunas realizaciones, las partículas de rAAV comprenden un vector de rAAV. El vector de rAAV puede codificar un ácido nucleico heterólogo (por ejemplo, un ácido nucleico heterólogo expresado en al menos la corteza cerebral y el cuerpo estriado). Los vectores de rAAV se describen en mayor detalle a continuación.
En algunas realizaciones, el vector de rAAV codifica un ácido nucleico heterólogo. En algunas realizaciones, un ácido nucleico heterólogo puede codificar un polipéptido terapéutico o ácido nucleico terapéutico. Se puede usar un polipéptido terapéutico o ácido nucleico terapéutico, por ejemplo, para mejorar un síntoma, prevenir o retrasar la progresión, y/o proporcionar el tratamiento de un trastorno (por ejemplo, un trastorno descrito en el presente documento). En algunas realizaciones, el polipéptido terapéutico o el ácido nucleico terapéutico se usa para tratar un trastorno del SNC, como se describen en más detalle a continuación.
El ácido nucleico heterólogo se puede expresar en una o más regiones de interés dentro del SNC. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el ácido nucleico heterólogo se expresa en al menos la corteza cerebral y el cuerpo estriado. El ácido nucleico heterólogo puede ser capaz de expresarse de forma ubicua en todo el SNC, o se puede expresar en un subconjunto de células del SNC.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico heterólogo se expresa en la corteza frontal, la corteza occipital y/o la capa IV del mamífero. La corteza cerebral se conoce como la capa externa del cerebro del mamífero y es importante para el lenguaje, la conciencia, la memoria, la atención y la consciencia. La corteza cerebral se subdivide en varios componentes y regiones diferentes debido a su amplia anatomía y funciones complejas. Se puede dividir en hemisferios izquierdo y derecho. Además, contiene cuatro lóbulos totales: frontal, parietal, temporal y occipital. Corteza frontal se puede referir al lóbulo frontal de la corteza y se sabe que proporciona una amplia variedad de funciones neurológicas relacionadas con la memoria no basada en tareas, interacciones sociales, toma de decisiones y otras funciones cognitivas complejas. Corteza occipital se puede referir al lóbulo occipital de la corteza y se sabe que participa en el procesamiento visual. Corteza parietal se puede referir al lóbulo parietal de la corteza y se sabe que participa en el procesamiento del lenguaje, la propriocepción y las entradas sensoriales relacionadas con el tacto. Corteza temporal se puede referir al lóbulo temporal de la corteza y se sabe que participa en el lenguaje, la memoria y la asociación emocional.
Además, se describen tres tipos generales de áreas de la corteza: sensorial, motora y de asociación. Estas se pueden dividir en 5 subdivisiones funcionales: la corteza motora primaria (implicada en el control de los músculos), la corteza premotora (áreas motoras de orden superior que dan órdenes a las áreas motoras primarias), áreas de asociación (por ejemplo, parietal-temporal-occipital o prefrontal; estas áreas participan en la planificación, la memoria, la atención y otras tareas cognitivas superiores y suponen la mayor parte de la corteza humana), áreas de orden superior (procesamiento sensorial) y áreas sensoriales primarias (por ejemplo, auditivas, visuales y somatosensoriales). En algunas realizaciones, el ácido nucleico heterólogo se expresa en las áreas corticales de asociación prefrontal, la corteza premotora, las áreas corticales somatosensoriales primarias, la corteza motora sensorial, la corteza parietal, la corteza occipital y/o la corteza motora primaria.
Además, la corteza cerebral se puede dividir en diferentes capas corticales (que van de superficiales a profundas), cada una de las cuales contiene un patrón característico de conectividades neuronales y tipos de células. Estas capas se pueden dividir en capas supragranulares (capas I-III), granulares internas (IV) e infragranulares (V y VI). Las capas supragranulares normalmente se proyectan a otras capas corticales, mientras que las capas infragranulares reciben salida de las capas supragranulares y envían la salida a estructuras fuera de la corteza (por ejemplo, regiones motoras, sensoriales y talámicas). La capa V contiene neuronas piramidales con axones que conectan con subestructuras corticales como los ganglios basales. Las neuronas de la capa V en la corteza motora primaria también forman la vía corticoespinal que es crítica para el control motor voluntario. La capa IV recibe entradas del tálamo y conecta con el resto de la columna, proporcionándose así funciones críticas relacionadas con la integración del tálamo y la corteza. Las células características de la capa IV incluyen células estrelladas (por ejemplo, células estrelladas espinosas) y neuronas piramidales.
En algunas realizaciones, la partícula de rAAV experimenta transporte retrógrado o anterógrado en la corteza cerebral. Transporte retrógrado se refiere al fenómeno por el que la carga (por ejemplo, partículas de rAAV) se mueven de un proceso neuronal (por ejemplo, un axón) al cuerpo de la célula. Transporte anterógrado se refiere al movimiento del cuerpo de la célula a la membrana celular (por ejemplo, una sinapsis). Se cree que el transporte retrógrado de partículas de AAV ocurre por la internalización mediada por receptor en el terminal axónico, seguido por el transporte mediado por microtúbulos al núcleo (véanse, por ejemplo, Kaspar et al., (2002) Mol. Ther. 5:50-56; Boulis et al., (2003) Neurobiol. Dis. 14:535-541; Kaspar et al., (2003) Science 301:839-842). Se sabe que el cuerpo estriado contiene proyecciones de otras regiones del cerebro, tales como las regiones de la corteza. Tanto el transporte anterógrado como retrógrado puede permitir que las partículas de rAAV se distribuyan por todo el cerebro, tal como entre la corteza y el tálamo (véase, por ejemplo, Kells, A.P. et al. (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. 106:2407-2411). Por lo tanto, sin desear quedar ligado a teoría alguna, se cree que la inyección de partículas de AAV en una región del cerebro (por ejemplo, el cuerpo estriado, el núcleo caudado y/o el putamen) puede permitir la administración de las partículas de AAV a otras áreas del cerebro (por ejemplo, la corteza) mediante transporte retrógrado.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico heterólogo se expresa además en el tálamo, la sustancia negra y/o el hipocampo. Como se ha descrito anteriormente, mecanismos tales como el transporte anterógrado y/o retrógrado pueden permitir que las partículas de rAAV inyectadas en la corteza cerebral y/o el cuerpo estriado se distribuyan a otras regiones del cerebro, particularmente las que conectan con la corteza. El tálamo está entre la corteza y el mesencéfalo, envía señales (por ejemplo, sensoriales y motoras) a la corteza de áreas subcorticales, y desempeña una función en el estado de alerta y el sueño. El tálamo también conecta con el hipocampo, parte del sistema límbico y un mediador crítico de consolidación de memoria a largo plazo. Una parte de los ganglios basales, la sustancia negra, contiene muchas neuronas dopaminérgicas y es importante para el movimiento y la recompensa. Trastornos del SNC, como la enfermedad de Parkinson, están asociados con la pérdida de neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra. Proporciona además dopamina al cuerpo estriado, que es crítica para la apropiada función estriatal.
En algunos aspectos, la divulgación proporciona vectores de rAAV para su uso en la prevención o el tratamiento de uno o más defectos génicos (por ejemplo, defectos génicos hereditarios, alteraciones génicas somáticas y similares) en un mamífero, tales como, por ejemplo, un defecto génico que produce una deficiencia de polipéptidos o exceso de polipéptidos en un sujeto, o para tratar o reducir la intensidad o el grado de deficiencia en un sujeto que manifiesta un trastorno asociado al SNC ligado a una deficiencia en dichos polipéptidos en células y tejidos. Algunas realizaciones implican la administración de un vector de rAAV que codifica uno o más péptidos terapéuticos, polipéptidos, ARN funcionales, ácidos nucleicos inhibidores, ARNhp, microARN, nucleótidos antisentido, etc., en un vehículo farmacéuticamente aceptable al sujeto en una cantidad y durante un periodo de tiempo suficientes para tratar el trastorno asociado al SNC en el sujeto que tiene o que se sospecha que tiene dicho trastorno.
Un vector de rAAV puede comprender como transgén un ácido nucleico que codifica una proteína o ARN funcional que modula o trata un trastorno asociado al SNC. Lo siguiente es una lista no limitante de genes asociados a trastornos asociados al SNC: proteína inhibidora de la apoptosis neuronal (NAIP), factor de crecimiento nervioso (NGF), factor de crecimiento derivado de la glía (GDNF), factor de crecimiento derivado del cerebro (BDNF), factor neurotrófico ciliar (CNTF), tirosina hidroxilasa (TM), GTP-ciclohidrolasa (GTPCH), aspartoacilasa (ASPA), superóxido dismutasa (SOD1) y aminoácido descarboxilasa (AADC). Por ejemplo, un transgén útil en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson codifica TH, que es una enzima limitante de la velocidad en la síntesis de la dopamina. También se puede usar un transgén que codifica GTPCII, que genera el cofactor de TII tetrahidrobiopterina, en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson. También se puede usar un transgén que codifica GDNF o BDNF o AADC, que facilita la conversión de L-Dopa en DA, para el tratamiento de enfermedad de Parkinson. Para el tratamiento de ALS, un transgén útil puede codificar: GDNF, BDNF o CNTF. También para el tratamiento de ALS, un transgén útil puede codificar un ARN funcional, por ejemplo, ARNhp, miARN, que inhibe la expresión de SOD1. Para el tratamiento de isquemia, un transgén útil puede codificar NAIP o NGF. Un transgén que codifica beta-glucuronidasa (GUS) puede ser útil para el tratamiento de ciertas enfermedades de almacenamiento lisosómico (por ejemplo, mucopolisacaridosis de tipo VII (MPS VII)). Un transgén que codifica un gen de activación de profármacos, por ejemplo, timidina cinasa del VHS que convierte ganciclovir en un nucleótido tóxico que altera la síntesis de ADN y conduce a muerte celular, puede ser útil para tratar ciertos cánceres, por ejemplo, cuando se administran en combinación con el profármaco. Un transgén que codifica un opioide endógeno, tal como p-endorfina, puede ser útil para tratar dolor. Otros ejemplos de transgenes que se pueden usar en los vectores de rAAV de la invención serán evidentes para el experto (véase, por ejemplo, Costantini LC, et al., Gene Therapy (2000) 7, 93-109).
En algunas realizaciones, el ácido nucleico heterólogo puede codificar un ácido nucleico terapéutico. En algunas realizaciones, un ácido nucleico terapéutico puede incluir, sin limitación, un ARNip, un ARNhp, una iARN, un miARN, un ARN antisentido, una ribozima o una DNAzima. Como tal, un ácido nucleico terapéutico puede codificar un ARN que cuando se transcribe de los ácidos nucleicos del vector puede tratar un trastorno (por ejemplo, un trastorno del SNC) por interferencia con la traducción o transcripción de una proteína anormal o exceso de proteína asociada a un trastorno. Por ejemplo, los ácidos nucleicos pueden codificar un ARN que trata un trastorno por eliminación o reducción altamente específica de ARNm que codifica las proteínas anormales y/o el exceso de proteína. Las secuencias de ARN terapéutico incluyen iARN, ARN inhibidor pequeño (ARNip), microARN (miARN) y/o ribozimas (tales como ribozimas en cabeza de martillo y en horquilla) que pueden tratar trastornos por eliminación o reducción altamente específica de ARNm que codifica las proteínas anormales y/o el exceso de proteínas.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico heterólogo puede codificar un polipéptido terapéutico. Un polipéptido terapéutico puede suministrar, por ejemplo, un polipéptido y/o actividad enzimática que está ausente o presente en un nivel reducido en una célula u organismo. Alternativamente, un polipéptido terapéutico puede suministrar un polipéptido y/o actividad enzimática que contrarresta indirectamente un desequilibrio en una célula u organismo. Por ejemplo, un polipéptido terapéutico para un trastorno relacionado con la formación de un metabolito provocado por una deficiencia en una enzima metabólica o actividad puede suministrar una enzima metabólica o actividad ausente, o puede suministrar una enzima metabólica o actividad alternativa que conduce a una reducción del metabolito.
También se puede usar un polipéptido terapéutico para reducir la actividad de un polipéptido (por ejemplo, uno que se expresa en exceso, se activa por una mutación de ganancia de función, o cuya actividad está regulada erróneamente de otro modo) actuando, por ejemplo, como polipéptido dominante negativo.
En algunas realizaciones, el polipéptido terapéutico o ácido nucleico terapéutico se usa para tratar un trastorno del SNC. Sin desear quedar ligado a teoría alguna, se cree que se puede usar un polipéptido terapéutico o ácido nucleico terapéutico para reducir o eliminar la expresión y/o actividad de un polipéptido cuya ganancia de función se ha asociado a un trastorno, o para potenciar la expresión y/o actividad de un polipéptido para complementar una deficiencia que se ha asociado a un trastorno (por ejemplo, una mutación en un gen cuya expresión muestra actividad similar o relacionada). Los ejemplos no limitantes de trastornos del SNC que se pueden tratar por un polipéptido terapéutico o ácido nucleico terapéutico (los genes a modo de ejemplo que pueden ser dirigidos o suministrados se proporcionan entre paréntesis para cada trastorno) incluyen accidente cerebrovascular (por ejemplo, caspasa-3, Beclinl, Ask1, PAR1, HIF1 a, PUMA y/o cualquiera de los genes descritos en Fukuda, A.M. y Badaut, J. (2013) Genes (Basel) 4:435-456), enfermedad de Huntington (HTT mutante), epilepsia (por ejemplo, SCN1A, NMDAR, ADK y/o cualquiera de los genes descritos en Boison, D. (2010) Epilepsia 51:1659-1668), enfermedad de Parkinson (alfa-sinucleína), enfermedad de Lou Gehrig (también conocida como esclerosis lateral amiotrófica; SOD1), enfermedad de Alzheimer (tau, proteína precursora de amiloide), degeneración corticobasal o CBD (tau), degeneración ganglionar corticobasal o CBGD (tau), demencia frontotemporal o FTD (tau), parálisis supranuclear progresiva o PSP (tau), atrofia multisistémica o MSA (alfa-sinucleína), cáncer del cerebro (por ejemplo, un mutante u oncogén expresado en exceso implicado en el cáncer cerebral) y enfermedades de almacenamiento lisosómico (LSD). Los trastornos pueden incluir los que implican a grandes áreas de la corteza, por ejemplo, más de un área funcional de la corteza, más de un lóbulo de la corteza y/o a toda la corteza. Otros ejemplos no limitantes de trastornos que se pueden tratar por un polipéptido terapéutico o ácido nucleico terapéutico incluyen lesión cerebral traumática, trastornos de disfunción enzimática, trastornos psiquiátricos (incluyendo síndrome de estrés postraumático), enfermedades neurodegenerativas y trastornos cognitivos (incluyendo demencias, autismo y depresión). Los trastornos de disfunción enzimática incluyen sin limitación leucodistrofias (incluyendo enfermedad de Canavan) y cualquiera de las enfermedades de almacenamiento lisosómico descritas a continuación.
En algunas realizaciones, el polipéptido terapéutico o ácido nucleico terapéutico se usa para tratar una enfermedad de almacenamiento lisosómico. Como es comúnmente conocido en la técnica, las enfermedades de almacenamiento lisosómico son trastornos metabólicos hereditarios raros caracterizados por defectos en la función lisosómica. Dichos trastornos son causados frecuentemente por una deficiencia en una enzima requerida para el apropiado metabolismo de mucopolisacáridos, glucoproteínas y/o lípidos, que conduce a una acumulación patológica de materiales celulares almacenados de forma lisosómica. Los ejemplos no limitantes de enfermedades de almacenamiento lisosómico que se pueden tratar por un polipéptido terapéutico o ácido nucleico terapéutico (los genes a modo de ejemplo que pueden ser dirigidos o suministrados se proporcionan entre paréntesis para cada trastorno) incluyen enfermedad de Gaucher de tipo 2 o tipo 3 (beta-glucosidasa ácida, GBA), gangliosidosis GM1 (beta-galactosidasa-1, GLB1), enfermedad de Hunter (iduronato 2-sulfatasa, IDS), enfermedad de Krabbe (galactosilceramidasa, GALC), enfermedad de amanosidosis (a-manosidasa, tal como alfa-D-manosidasa, MAN2B1), enfermedad de p-manosidosis (betamanosidasa, MANBA), enfermedad de leucodistrofia metacromática (pseudoarilsulfatasa A, ARSA), enfermedad de mucolipidosis M/MI (N-acetilglucosamina-1-fosfotransferasa, GNPTAB), enfermedad de Niemann-Pick A (esfingomielinasa ácida, ASM), enfermedad de Niemann-Pick C (proteína C de Niemann-Pick, NPC1), enfermedad de Pompe (alfa-1,4-glucosidasa ácida, GAA), enfermedad de Sandhoff (subunidad beta de hexosaminidasa, HEXB), enfermedad de Sanfillipo A (sulfohidrolasa de N-sulfoglucosamina, MPS3A), enfermedad de Sanfillipo B (N-alfaacetilglucosaminidasa, NAGLU), enfermedad de Sanfillipo C (heparin acetil-CoA:alfa-glucosaminidasa N-acetiltransferasa, MPS3C), enfermedad de Sanfillipo D (N-acetilglucosamina-6-sulfatasa, GNS), enfermedad de Schindler (alfa-N-acetilgalactosaminidasa, NAGA), enfermedad de Sly (beta-glucuronidasa, GUSB), enfermedad de Tay-Sachs (subunidad alfa de hexosaminidasa, HEXA) y enfermedad de Wolman (lipasa ácida lisosómica, LIPA).
Las enfermedades de almacenamiento lisosómico adicionales, así como la enzima defectuosa asociada a cada enfermedad, se enumeran en la Tabla 1 a continuación. En algunas realizaciones, una enfermedad enumerada en la tabla a continuación se trata por un polipéptido terapéutico o ácido nucleico terapéutico que complementa o compensa de otro modo el defecto enzimático correspondiente.
Tabla 1. Trastornos de almacenamiento lisosómico y enzimas defectuosas asociadas.
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Como tales, en algunas realizaciones, el polipéptido terapéutico es caspasa-3, Beclinl, Ask1, PARI, HIF1a, PUMA, SCN1A, NMDAR, ADK, alfa-sinucleína, s Od 1, beta-glucosidasa ácida (GbA), beta-galactosidasa-1 (GLB1), iduronato 2-sulfatasa (IDS), galactosilceramidasa (GALC), una manosidasa, alfa-D-manosidasa (MAN2B1), beta-manosidasa (MANBA), pseudoarilsulfatasa A (ARSA), N-acetilglucosamina-1-fosfotransferasa (GNPTAB), esfingomielinasa ácida (ASM), proteína C de Niemann-Pick (NPC1), alfa-1,4-glucosidasa ácida (GAA), subunidad beta de hexosaminidasa, HEXB, sulfohidrolasa de N-sulfoglucosamina (MPS3A), N-alfa-acetilglucosaminidasa (NAGLU), heparin acetil-CoA, alfa-glucosaminidasa N-acetiltransferasa (MPS3C), N-acetilglucosamina-6-sulfatasa (GNS), alfa-N-acetilgalactosaminidasa (NAGA), beta-glucuronidasa (GUSB), subunidad alfa de hexosaminidasa (HEXA), huntingtina (HTT) o lipasa ácida lisosómica (LIPA). El polipéptido terapéutico puede aumentar o disminuir la función del polipéptido diana en el sujeto (por ejemplo, puede suministrar la función que falta en una enfermedad de almacenamiento lisosómico, o reducir el nivel de alfa-sinucleína en MSA, tal como bloqueando su función o disfunción). En algunas realizaciones, el ácido nucleico terapéutico es caspasa-3, Beclin1, Ask1, PAR1, HIF1a, PUMA, SCN1A, NMDAR, ADK, alfa-sinucleína, SOD1, beta-glucosidasa ácida (GBA), beta-galactosidasa-1 (GLB1), iduronato 2-sulfatasa (IDS), galactosilceramidasa (GALC), una manosidasa, alfa-D-manosidasa (MAN2B1), beta-manosidasa (MANBA), pseudoarilsulfatasa A (ARSA), N-acetilglucosamina-1-fosfotransferasa (GNPTAB), esfingomielinasa ácida (ASM), proteína C de Niemann-Pick (NPC1), alfa-1,4-glucosidasa ácida (GAA), subunidad beta de hexosaminidasa, HEXB, sulfohidrolasa de N-sulfoglucosamina (MPS3A), N-alfa-acetilglucosaminidasa (NAGLU), heparin acetil-CoA, alfaglucosaminidasa N-acetiltransferasa (MPS3C), N-acetilglucosamina-6-sulfatasa (GNS), alfa-N-acetilgalactosaminidasa (NAGA), beta-glucuronidasa (GUSB), subunidad alfa de hexosaminidasa (HEXA) o lipasa ácida lisosómica (LIPA). El ácido nucleico terapéutico puede aumentar o disminuir la función del polipéptido diana en el sujeto (por ejemplo, puede suministrar la función que falta en una enfermedad de almacenamiento lisosómico, o reducir el nivel de alfa-sinucleína en MSA, tal como por iARN).
Una enfermedad a modo de ejemplo para la que puede ser útil la expresión de AAV en la corteza y el cuerpo estriado es la enfermedad de Huntington (HD). La enfermedad de Huntington es provocada por una mutación por expansión de repeticiones CAG que codifica una repetición de poliglutamina (poliQ) elongada en la proteína huntingtina mutante (mHTT). HD es un diana particularmente atractiva para las terapias basadas en ADN y ARN ya que es una enfermedad dominante autosómica resultante de la mutación en un único alelo. Los vectores de AAV proporcionan un sistema de administración ideal para los terapéuticos de ácido nucleico y permiten la expresión de larga duración y continua de estas moléculas reductoras de huntingtina en el cerebro. Para lograr la máxima eficacia clínica en HD, probablemente se requerirá la administración a tanto el cuerpo estriado como a la corteza. El análisis cadavérico de cerebros de pacientes con HD reveló una extensa pérdida de neuronas medianas espinosas en el cuerpo estriado, además de pérdida de neuronas piramidales en la corteza cerebral y el hipocampo. Se mostró recientemente usando modelos condicionales en ratones transgénicos de HD que reducir genéticamente la expresión de mHTT en poblaciones neuronales en el cuerpo estriado y la corteza proporciona significativamente más eficacia que reducir mHTT en cualquier sitio solo (Wang et al., (2014) Nature medicine 20:536-541). En total, esta evidencia sugiere que la administración de agentes de genoterapia a tanto las regiones estriatales como corticales puede ser ideal para la máxima eficacia terapéutica.
El uso de vectores de genoterapia para administrar biológicos a las regiones críticas del cerebro implicadas en la patogénesis de la enfermedad de Huntington ha sido un reto, debido en gran parte a las limitaciones físicas de administrar eficazmente un vector específicamente al cuerpo estriado y la corteza cerebral. Aunque pueden ser eficaces múltiples infusiones directas en cerebros de animales pequeños, a medida que aumenta la arquitectura y el volumen de tejido cerebral en los primates, es más difícil lograr una administración estriatal y cortical generalizada a través de infusión en un lugar único. Por lo tanto, el descubrimiento de los inventores de que la administración estriatal puede lograr una distribución generalizada de rAAV, que incluye la corteza y el cuerpo estriado, tiene utilidad en el tratamiento de la enfermedad de Huntington.
Por consiguiente, ciertos aspectos se refieren a una partícula de rAAV para tratar enfermedad de Huntington en un mamífero, que comprende administrar la partícula de rAAV al cuerpo estriado, en donde la partícula de rAAV comprende un vector de rAAV que codifica un ácido nucleico heterólogo que se expresa en al menos la corteza cerebral y el cuerpo estriado del mamífero. La HD se caracteriza por síntomas progresivos relacionados con el movimiento en general y el control motor, la cognición y la salud mental. Aunque la naturaleza precisa y el grado de síntomas varían entre los individuos, los síntomas empeoran, en general, con el tiempo. En la mayoría de los casos, los síntomas empiezan a aparecer entre los 30 y los 40 años de edad con sutiles alteraciones en las habilidades motoras, la cognición y la personalidad. Con el tiempo, éstos empeoran en movimientos erráticos e incontrolables, y pérdida de control de los músculos, demencia y enfermedades psiquiátricas, tales como depresión, agresividad, ansiedad y comportamientos obsesivos-compulsivos. La muerte normalmente ocurre 10-15 años después de la aparición de los síntomas. Menos del 10 % de los casos de HD implican una forma de aparición juvenil de la enfermedad, caracterizada por una progresión más rápida de la enfermedad. Se cree que aproximadamente 1 de cada 10.000 estadounidenses tiene HD.
La mayoría de los casos de HD están asociados con una expansión de repeticiones de trinucleótidos CAG en el gen HTT. El número de repeticiones de CAG en el gen HTT está fuertemente correlacionado con la aparición de HD. Por ejemplo, los individuos con 35 repeticiones o menos no desarrollan normalmente la HD, pero los individuos con entre 27 y 35 repeticiones tienen un mayor riesgo de tener descendencia con HD. Los individuos con entre 36 y 40-42 repeticiones tienen una penetrancia incompleta de la HD, mientras que los individuos con más de 40-42 repeticiones muestran penetrancia completa. Los casos de HD de aparición juvenil se pueden asociar a tamaños de repeticiones de CAG de 60 o más.
La proteína Htt expandida por poliQ resultante de esta expansión de repeticiones de CAG está asociada con agregados celulares o cuerpos de inclusión, perturbaciones en la homeostasis de las proteínas y desregulación transcripcional. Mientras que estos fenotipos tóxicos se pueden asociar a varias partes del cuerpo, lo más normal es que estén asociados a muerte celular neuronal. Los pacientes con HD muestran frecuentemente adelgazamiento cortical y una notable pérdida progresiva de neuronas estriatales. El cuerpo estriado parece ser la región más vulnerable del cerebro para la HD (particularmente las neuronas medianas espinosas estriatales), observándose los primeros efectos en el putamen y el núcleo caudado. La muerte celular en las neuronas espinosas estriatales, los elevados números de astrocitos y la activación de la microglía se observan en los cerebros de pacientes con HD. La HD también puede afectar a ciertas regiones del hipocampo, la corteza cerebral, el tálamo, el hipotálamo y el cerebelo.
Se pueden usar modelos animales de HD para probar las posibles estrategias terapéuticas, tales como las composiciones de la presente divulgación. Los modelos de ratón para HD son conocidos en la técnica. Estos incluyen modelos de ratón con fragmentos de HTT mutante, tales como los ratones R6/1 y N171-82Q HD (Harper et al., (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:5820-5825, Rodriguez-Lebron et al., (2005) Mol. Ther. 12:618-633, Machida et al., (2006) Biochem. Biophys. Res. Commun. 343:190-197). Otro ejemplo de un modelo de HD en ratón descrito en el presente documento es el modelo de ratón YAC128. Este modelo lleva un cromosoma artificial de levadura (YAC) que expresa un gen HTT humano mutante con 128 repeticiones de CAG, y los ratones YAC128 presentan acumulación significativa y generalizada de agregados de Htt en el cuerpo estriado a los 12 meses de edad (Slow et al., (2003) Hum. Mol. Genet. 12:1555-1567, Pouladi et al., (2012) Hum. Mol. Genet. 21:2219-2232).
También se pueden usar otros modelos animales para HD. Por ejemplo, se han descrito modelos de rata transgénica (von Horsten, S. et al. (2003) Hum. Mol. Genet. 12:617-24) y de macaco de la India (Yang, S.H. et al. (2008) Nature 453:921-4). También se conocen modelos no genéticos. Estos implican casi siempre el uso de compuestos excitotóxicos (tales como ácido quinolínico o ácido kaínico) o toxinas mitocóndricas (tales como ácido 3-nitropropiónico y ácido malónico) para inducir la muerte celular de neuronas estriatales en roedores o primates no humanos (para más descripción y referencias, véase Ramaswamy, S. et al. (2007) ILAR J. 48:356-73).
En algunos aspectos, la divulgación proporciona una partícula de rAAV que comprende un vector de rAAV que codifica un ácido nucleico heterólogo que se expresa en al menos la corteza cerebral y el cuerpo estriado para su uso para mejorar un síntoma de la HD, que comprende la administración de una partícula de rAAV que comprende un vector de rAAV al cuerpo estriado. En algunas realizaciones, los síntomas de la HD incluyen, pero no se limitan a, corea, rigidez, movimientos incontrolables del cuerpo, pérdida de control de los músculos, ausencia de coordinación, inquietud, movimientos ralentizados de los ojos, gesticulación anormal, inestabilidad, marcha atáxica, expresión facial anormal, problemas del habla, dificultades para masticar y/o tragar, trastornos del sueño, convulsiones, demencia, déficits cognitivos (por ejemplo, reducción de las capacidades relacionadas con la planificación, el pensamiento abstracto, la flexibilidad, la adquisición de costumbres, la sensibilidad interpersonal, el autocontrol, la atención, el aprendizaje y la memoria), depresión, ansiedad, cambios en la personalidad, agresividad, comportamiento compulsivo, comportamiento obsesivo-compulsivo, hipersexualidad, psicosis, apatía, irritabilidad, ideas de suicidio, pérdida de peso, atrofia muscular, insuficiencia cardíaca, tolerancia reducida a la glucosa, atrofia testicular y osteoporosis.
En algunos aspectos, la divulgación proporciona una partícula de rAAV para su uso en la prevención o el retraso de la progresión de HD. La HD autosómica dominante es una enfermedad genética que puede ser genotipificada. Por ejemplo, el número de repeticiones de CAG en HTT se puede determinar por el tamaño de las repeticiones basándose en PCR. Este tipo de diagnóstico se puede realizar en cualquier etapa de la vida mediante pruebas directas en jóvenes o adultos (por ejemplo, junto con la presentación de síntomas clínicos), reconocimiento prenatal o exclusión prenatal (por ejemplo, por biopsia de vellosidades coriónicas o amniocentesis), o diagnóstico preimplantatorio de embriones. Además, la HD se puede diagnosticar por obtención de imágenes del cerebro, búsqueda de reducción de volumen de los núcleos caudados y/o el putamen y/o dilación de los ventrículos. Estos síntomas, combinados con antecedentes familiares de HD y/o síntomas clínicos, pueden indicar HD.
Se conocen en la técnica medios de determinación de la mejora de los síntomas de la HD. Por ejemplo, se puede usar la escala unificada de valoración de la enfermedad de Huntington (UHDRS) para evaluar la función motora, la función cognitiva, las anomalías del comportamiento y la capacidad funcional (véase, por ejemplo, Huntington Study Group (1996) Movement Disorders 11:136-42). Esta escala de valoración se desarrolló para proporcionar una prueba uniforme y completa de múltiples facetas de la patología de la enfermedad, incorporando elementos de pruebas tales como la escala de actividades de la vida cotidiana de HD, la escala de la intensidad de la corea de Marsden y Quinn, las escalas de incapacidad física e independencia, la escala de valoración motora de HD (HDMRS), la escala de capacidad funcional de HD (HDFCS) y el examen neurológico cuantificado (QNE). Otra prueba útil para determinar la mejora de los síntomas de HD puede incluir, sin limitación, la evaluación cognitiva de Montreal, obtención de imágenes del cerebro (por ejemplo, IRM), prueba de fluidez de categorías, prueba del trazo, búsqueda en mapas, prueba de lectura de la palabra de Stroop, tarea de golpeo acelerado y la prueba de las modalidades digitales simbólicas.
En algunos aspectos, las partículas de rAAV se usan para el tratamiento de seres humanos con HD. Como se ha descrito anteriormente, la HD se hereda de un modo autosómico dominante y es causada por la expansión de repeticiones de CAG en el gen HTT. Las partículas de rAAV pueden incluir, por ejemplo, un ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido terapéutico o ácido nucleico que se dirige a HTT. La HD de aparición juvenil es casi siempre heredada de la parte paterna. Los fenotipos de tipo enfermedad de Huntington también se han correlacionado con otros loci genéticos, tales como HDL1, PRNP, HDL2, HDL3 y HDL4. Se cree que otros loci genéticos pueden modificar la aparición de síntomas de HD, que incluyen mutaciones en los genes GRIN2A, GRIN2B, MSX1, GRIK2 y APOE.
En algunas realizaciones, la administración de partículas víricas recombinantes es por inyección de partículas víricas al cuerpo estriado. La administración intraestriatal administra partículas víricas recombinantes a un área del cerebro, el cuerpo estriado (incluyendo el putamen y el núcleo caudado), que está muy afectada por la HD. Además, y sin desear quedar ligado a teoría alguna, se cree que las partículas víricas recombinantes (por ejemplo, las partículas de rAAV) inyectadas en el cuerpo estriado también se pueden dispersar (por ejemplo, mediante transporte retrógrado) a otras áreas del cerebro, que incluyen, sin limitación, las áreas de proyección (por ejemplo, la corteza cerebral). En algunas realizaciones, las partículas víricas recombinantes se administran por administración mejorada por convección (por ejemplo, administración mejorada por convección al cuerpo estriado).
En algunas realizaciones, el transgén (por ejemplo, un ácido nucleico heterólogo descrito en el presente documento) está operativamente unido a un promotor. Los promotores a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, el promotor temprano inmediato del citomegalovirus (CMV), el promotor de GUSB, la LTR de RSV, la LTR de MoMLV, el promotor de fosfoglicerato cinasa-1 (PGK), un promotor del virus simio 40 (SV40) y un promotor de CK6, un promotor de transtiretina (TTR), un promotor de TK, un promotor sensible a la tetraciclina (TRE), un promotor del VHB, un promotor de hAAT, un promotor de LSP, promotores quiméricos específicos de hígado (LSP), el promotor de E2F, el promotor de la telomerasa (hTERT); el potenciador del citomegalovirus/promotor de beta-actina de pollo/p-globina de conejo (promotor de CAG; Niwa et al., Gene, 1991, 108(2):193-9) y el promotor del factor de elongación 1 -alfa (EFlalfa) (Kim et al., Gene, 1990, 91 (2):217-23 y Guo et al., Gene Ther., 1996, 3(9):802-10). En algunas realizaciones, el promotor comprende un promotor de p-glucuronidasa humana o un potenciador del citomegalovirus unido a un promotor de p-actina de pollo (CBA). El promotor puede ser un promotor constitutivo, inducible o represible. En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un vector recombinante que comprende ácido nucleico que codifica un ácido nucleico heterólogo de la presente divulgación unido operativamente a un promotor de CBA. En algunas realizaciones, el promotor es un promotor de CBA, un promotor mínimo de CBA, un promotor del CMV o un promotor de GUSB.
Los ejemplos de promotores constitutivos incluyen, sin limitación, el promotor de LTR del virus del sarcoma de Rous (VSR) retrovírico (opcionalmente con el potenciador del VSR), el promotor del citomegalovirus (CMV) (opcionalmente con el potenciador del CMV) [véase, por ejemplo, Boshart et al., Cell, 41:521-530 (1985)], el promotor SV40, el promotor de la dihidrofolato reductasa, el promotor de 13-actina, el promotor de fosfoglicerol cinasa (PGK) y el promotor de EFla [Invitrogen] .
Los promotores inducibles permiten la regulación de la expresión génica y se pueden regular por compuestos exógenamente suministrados, factores ambientales tales como la temperatura, o la presencia de un estado fisiológico específico, por ejemplo, fase aguda, un estado de diferenciación particular de la célula, o en células replicantes solo. Los promotores inducibles y los sistemas inducibles están disponibles de una variedad de fuentes comerciales, que incluyen, sin limitación, Invitrogen, Clontech y Ariad. Se han descrito muchos otros sistemas y pueden ser fácilmente seleccionados por un experto en la técnica. Los ejemplos de promotores inducibles regulados por promotores exógenamente suministrados incluyen el promotor de la metalotionina (MT) de oveja inducible por cinc, el promotor del virus del tumor mamario de ratón (MMTV) inducible por dexametasona (Dex), el sistema de promotor de la T7 polimerasa (documento de patente WO 98/10088); el promotor de insecto de ecdisona (No et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:3346-3351 (1996)), el sistema represible por tetraciclina (Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)), el sistema inducible por tetraciclina (Gossen et al., Science, 268:1766-1769 (1995), véase también Harvey et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512-518 (1998)), el sistema inducible por RU486 (Wang et al., Nat. Biotech., 15:239-243 (1997) y Wang et al., Gene Ther., 4:432-441 (1997)) y el sistema inducible por rapamicina (Magari et al., J. Clin. Invest., 100:2865-2872 (1997)). Todavía otros tipos de promotores inducibles que pueden ser útiles en este contexto son los que están regulados por un estado fisiológico específico, por ejemplo, temperatura, fase aguda, un estado de diferenciación particular de la célula, o en células replicantes solo.
En otra realización, se usará el promotor nativo, o un fragmento del mismo, para el transgén. El promotor nativo se puede preferir cuando se desee que la expresión del transgén deba imitar la expresión nativa. El promotor nativo se puede usar cuando la expresión del transgén se deba regular temporalmente o conductualmente, o en un modo específico de tejido, o en respuesta a estímulos transcripcionales específicos. En una realización adicional, también se pueden usar otros elementos de control de la expresión nativos, tales como elementos potenciadores, sitios de poliadenilación o secuencias consenso de Kozak para imitar la expresión nativa.
En algunas realizaciones, las secuencias reguladoras confieren capacidades de expresión génica específica de tejido. En algunos casos, las secuencias reguladoras específicas de tejido se unen a factores de transcripción específicos de tejido que inducen la transcripción en una manera específica de tejido. Dichas secuencias reguladoras específicas de tejido (por ejemplo, promotores, potenciadores, etc.) son muy conocidas en la técnica. Secuencias reguladoras específicas de tejido a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, los siguientes promotores específicos de tejido: neuronales tal como el promotor de enolasa específica de neurona (NSE) (Andersen et al., Cell. Mol. Neurobiol., 13:503-15 (1993)), promotor del gen de la cadena ligera del neurofilamento (Piccioli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5611-5 (1991)) y el promotor del gen vgf específico de neuronas (Piccioli et al., Neuron, 15:373-84 (1995)). En algunas realizaciones, el promotor específico de tejido es un promotor de un gen seleccionado de: núcleos neuronales (NeuN), proteína fibrilar ácida de la glía (GFAP), poliposis adenomatosa del colon (APC) y molécula 1 adaptadora de unión a calcio ionizado (Iba-1). Otros promotores específicos de tejido apropiados serán evidentes para el experto. En algunas realizaciones, el promotor es un promotor de beta-actina de pollo.
En algunas realizaciones, el promotor expresa el ácido nucleico heterólogo en una célula del SNC. Como tal, en algunas realizaciones, se puede usar un polipéptido terapéutico o un ácido nucleico terapéutico para tratar un trastorno del SNC. En algunas realizaciones, el promotor expresa el ácido nucleico heterólogo en una célula de cerebro. Una célula de cerebro puede referirse a cualquier célula del cerebro conocida en la técnica, que incluye sin limitación una neurona (tal como una neurona sensitiva, neurona motora, interneurona, neurona dopaminérgica, neurona mediana espinosa, neurona colinérgica, neurona GABAérgica, neurona piramidal, etc.), una célula de la glía (tal como microglía, macroglía, astrocitos, oligodendrocitos, ependimocitos, glía radial, etc.), una célula del parénquima cerebral, célula de la microglía, ependimocito y/o una célula de Purkinje. En algunas realizaciones, el promotor expresa el ácido nucleico heterólogo en una neurona y/o célula de la glía. En algunas realizaciones, la neurona es una neurona mediana espinosa del núcleo caudado, una neurona mediana espinosa del putamen, una neurona de la capa IV de la corteza y/o una neurona de la capa V de la corteza.
Se conocen en la técnica diversos promotores que expresan transcritos (por ejemplo, un transgén heterólogo) en células del SNC, células del cerebro, neuronas y células de la glía y se describen en el presente documento. Dichos promotores pueden comprender secuencias de control normalmente asociadas al gen seleccionado o secuencias de control heterólogas. Frecuentemente, las secuencias de control heterólogas útiles incluyen las derivadas de secuencias que codifican genes de mamífero o víricos. Los ejemplos incluyen, sin limitación, el promotor temprano del SV40, promotor de LTR del virus del tumor mamario de ratón, promotor tardío principal del adenovirus (Ad MLP), un promotor del virus del herpes simple (VHS), un promotor del citomegalovirus (CMV), tal como la región del promotor temprano inmediato del CMV (CMVIE), un promotor del virus del sarcoma de Rous (VSR), promotores sintéticos, promotores híbridos y similares. Además, también se pueden usar secuencias derivadas de genes no víricos, tales como el gen de la metalotioneína murina. Dichas secuencias promotoras están comercialmente disponibles de, por ejemplo, Stratagene (San Diego, CA). Se pueden usar promotores específicos del SNC y promotores inducibles. Los ejemplos de promotores específicos del SNC incluyen sin limitación los aislados de genes específicos del SNC, tales como proteína básica de mielina (MBP), proteína ácida fibrilar de la glía (GFAP) y enolasa específica de neurona (NSE). Los ejemplos de promotores inducibles incluyen elementos sensibles al ADN para ecdisona, tetraciclina, metalotioneína e hipoxia, entre otros.
En el presente documento se desvela el uso de un genoma vírico recombinante para la introducción de una o más secuencias de ácidos nucleicos que codifican un ácido nucleico heterólogo o la encapsidación en una partícula vírica de AAV. El genoma vírico recombinante puede incluir cualquier elemento para establecer la expresión de un transgén heterólogo, por ejemplo, un promotor, un ácido nucleico heterólogo, una ITR, un elemento de unión al ribosoma, terminador, potenciador, marcador de selección, intrón, señal de poliA y/u origen de replicación. En algunas realizaciones, el vector de rAAV comprende uno o más de un potenciador, un par donante de empalme/aceptor de empalme, un sitio de unión a la matriz o una señal de poliadenilación.
En algunas realizaciones, la administración de una cantidad eficaz de partículas de rAAV que comprende un vector que codifica un ácido nucleico terapéutico o polipéptido transduce células (por ejemplo, células del SNC, células del cerebro, neuronas y/o células de la glía) en o cerca del sitio de administración (por ejemplo, el cuerpo estriado y/o la corteza) o más distal al sitio de administración. En algunas realizaciones, se transducen más de aproximadamente cualquiera del 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 % o 100 % de neuronas. En algunas realizaciones, se transducen aproximadamente del 5 % a aproximadamente el 100 %, aproximadamente el 10 % a aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 10 % a aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 25 % a aproximadamente el 75 %, aproximadamente el 25 % a aproximadamente el 50 %, o aproximadamente el 30 % a aproximadamente el 50 % de las neuronas. Se conocen en la técnica métodos de identificación de neuronas transducidas por partículas víricas recombinantes que expresan miARN; por ejemplo, se puede usar inmunohistoquímica, detección de ARN (por ejemplo, qPCR, transferencia Northern, ARN-seq, hibridación in situ y similares) o el uso de un marcador coexpresado, tal como proteína verde fluorescente potenciada, para detectar la expresión.
En algunos aspectos, la divulgación proporciona partículas víricas que comprenden un genoma autocomplementario recombinante (por ejemplo, un vector de rAAV autocomplementario). Las partículas víricas de AAV con genomas de vector autocomplementarios y los métodos de uso de los genomas de AAV autocomplementarios se describen en las patentes de EE. UU. N.26.596.535; 7.125.717; 7.465.583; 7.785.888; 7.790.154; 7.846.729; 8.093.054; y 8.361.457; y Wang Z., et al., (2003) Gene Ther 10:2105-2111. Un rAAV que comprende un genoma autocomplementario formará rápidamente una molécula de ADN bicatenario en virtud de su secuencias parcialmente complementarias (por ejemplo, cadenas codificantes y no codificantes complementarias de un ácido nucleico heterólogo). En algunas realizaciones, el vector comprende una primera secuencia del ácido nucleico que codifica el ácido nucleico heterólogo y una segunda secuencia del ácido nucleico que codifica un complemento del ácido nucleico, donde la primera secuencia del ácido nucleico puede formar pares de bases intracatenarios con la segunda secuencia del ácido nucleico a lo largo de la mayoría de su longitud o toda su longitud.
En algunas realizaciones, la primera secuencia del ácido nucleico heteróloga y una segunda secuencia del ácido nucleico heteróloga se unen por una ITR mutada (por ejemplo, la ITR izquierda). En algunas realizaciones, la ITR comprende la secuencia de polinucleótidos 5'-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCC GGGCGACCAAAGGTCGCCCACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCG-3' (SEQ ID NO: 1). La ITR mutada comprende una deleción de la región D que comprende la secuencia de resolución terminal. Como resultado, tras la replicación de un genoma vírico de AAV, las proteínas rep no escindirán el genoma vírico en la ITR mutada y, como tal, se encapsidará un genoma vírico recombinante que comprende lo siguiente en el orden de 5' a 3' en una cápside vírica: una ITR de AAV, la primera secuencia de polinucleótidos heteróloga que incluye secuencias reguladoras, la ITR de AAV mutado, el segundo polinucleótido heterólogo en orientación inversa con respecto al primer polinucleótido heterólogo y una tercera ITR de AAV.
V. Partículas víricas y métodos de producción de partículas víricas
Partículas víricas de rAAV
La divulgación proporciona sistemas para administrar partículas de rAAV. En algunas realizaciones, la partícula de rAAV comprende un vector de rAAV. En algunas realizaciones, la partícula vírica es una partícula de AAV recombinante que comprende un ácido nucleico que comprende un ácido nucleico heterólogo flanqueado por una o dos repeticiones terminales invertidas (ITR) de a Av . El ácido nucleico está encapsidado en la partícula de AAV. La partícula de AAV también comprende proteínas de la cápside. En algunas realizaciones, el ácido nucleico comprende la(s) secuencia(s) codificante(s) de interés (por ejemplo, un ácido nucleico heterólogo) unidas operativamente a componentes en la dirección de transcripción, secuencias de control que incluyen la iniciación de la transcripción y secuencias de terminación, formando así un casete de expresión. El casete de expresión está flanqueado en el extremo 5' y 3' por al menos una secuencia de ITR de AAV funcional. Por "secuencia de ITR de AAV funcional" se indica que la secuencia de ITR funciona como está previsto para el rescate, la replicación y la encapsidación del virión de AAV. Véanse Davidson et al., PNAS, 2000, 97(7)3428-32; Passini et al., J. Virol., 2003, 77(12):7034-40; y Pechan et al., Gene Ther., 2009, 16:10-16. Para poner en práctica algunos aspectos, los vectores recombinantes comprenden al menos todas las secuencias de AAV esenciales para la encapsidación y las estructuras físicas para la infección por el rAAV. Para su uso en los vectores, las ITR de AAV no necesitan tener una secuencia de nucleótidos mutante (por ejemplo, como se describe en Kotin, Hum. Gene Ther., 1994, 5:793-801), y se pueden alterar por la inserción, deleción o sustitución de nucleótidos o las ITR de AAV pueden derivar de cualquiera de varios serotipos de AAV. Actualmente se conocen más de 40 serotipos de AAV, y continúan identificándose nuevos serotipos y variantes de serotipos existentes. Véanse Gao et al., PNAS, 2002, 99(18): 11854-6; Gao et al., PNAS, 2003, 100(10):6081-6; y Bossis et al., J. Virol., 2003, 77(12):6799-810. El uso de cualquier serotipo de AAV se considera dentro del alcance de la presente invención. En algunas realizaciones, un vector de rAAV es un vector derivado de un serotipo de AAV, que incluye sin limitación, los ITR de AAV son AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, AAV de cabra, AAV bovino o AAV de ratón, o similares. En algunas realizaciones, el ácido nucleico en las ITR de AAV son ITR de serotipo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, AAV de cabra, AAV bovino o AAV de ratón, o similares. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico en el AAV comprende una ITR de AAV2.
En algunas realizaciones, un vector puede incluir un ácido nucleico de relleno. En algunas realizaciones, el ácido nucleico de relleno puede codificar una proteína verde fluorescente. En algunas realizaciones, el ácido nucleico de relleno se puede localizar entre el promotor y el ácido nucleico que codifica la iARN.
En realizaciones adicionales, las partículas de rAAV comprenden una cápside de AAV1, una cápside de AAV2, una cápside de AAV3, una cápside de AAV4, una cápside de AAV5, una cápside de AAV6 (por ejemplo, una cápside de AAV6 no mutante, o una cápside de AAV6 de variante, tal como ShH10, como se describe en la publicación preconcedida de EE. UU. 2012/0164106), una cápside de AAV7, una cápside de AAV8, una cápside de AAVrh8, una cápside de AAVrh8R, una cápside de AAV9 (por ejemplo, una cápside de AAV9 no mutante, o una cápside de AAV9 modificada como se describe en la publicación preconcedida de EE. UU. 2013/0323226), una cápside de AAV10, una cápside de AAVrh10, una cápside de AAV11, una cápside de AAV12, un mutante de cápside de tirosina, un mutante de cápside de unión a heparina, una cápside de AAV2R471A, una cápside de AAVAAV2/2-7m8, una cápside de AAV DJ (por ejemplo, una cápside de AAV-DJ/8, una cápside de AAV-DJ/9, o cualquier otra de las cápsides descritas en la publicación preconcedida de EE. UU. 2012/0066783), una cápside de AAV2 N587A, una cápside de AAV2 E548A, una cápside de AAV2 N708A, una cápside de AAV V708K, una cápside de AAV de cabra, una cápside quimérica de AAV1/AAV2, una cápside de AAV bovino, una cápside de AAV de ratón, una cápside de rAAV2/HBoV1 o una cápside de AAV descrita en la patente de EE. UU. N° 8.283.151 o la publicación internacional N.° WO/2003/042397. En algunas realizaciones, una proteína de la cápside mutante mantiene la capacidad para formar una cápside de AAV. En algunas realizaciones, la partícula de rAAV comprende la cápside mutante de tirosina de AAV5 (Zhong L. et al., (2008) Proc Natl Acad Sci USA 105(22):7827-7832. En realizaciones adicionales, la partícula de rAAV comprende proteínas de la cápside de un serotipo AAV de los clados A-F (Gao, et al., J. Virol. 2004, 78(12):6381). En algunas realizaciones, la partícula de rAAV comprende una proteína de la cápside de AAV1 o mutante de la misma. En otras realizaciones, la partícula de rAAV comprende un proteína de la cápside de AAV2 o mutante de la misma. En algunas realizaciones, el serotipo de AAV es AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10 o AAVrh10. En algunas realizaciones, la partícula de rAAV comprende una cápside de AAV de serotipo 1 (AAV1). En algunas realizaciones, la partícula de rAAV comprende una cápside de AAV de serotipo 2 (AAV2).
Se usan diferentes serotipos de AAV para optimizar la transducción de células diana particulares o para dirigir los tipos de células específicos dentro de un tejido diana particular (por ejemplo, un tejido del SNC). Una partícula de rAAV puede comprender proteínas víricas y ácidos nucleicos víricos derivados del mismo serotipo o serotipos diferentes (por ejemplo, un serotipo mixto). Por ejemplo, en algunas realizaciones, una partícula de rAAV puede comprender proteínas de la cápside de AAV1 y al menos una ITR de AAV2, o puede comprender proteínas de la cápside de AAV2 y al menos una ITR de AAV1. En el presente documento se proporciona cualquier combinación de serotipos de AAV para la producción de una partícula de rAAV como si cada combinación hubiera sido establecida explícitamente en el presente documento. En algunas realizaciones, la divulgación proporciona partículas de rAAV que comprenden una cápside de AAV1 y un vector de rAAV de la presente divulgación (por ejemplo, un casete de expresión que comprende un ácido nucleico heterólogo), flanqueado por al menos una ITR de AAV2. En algunas realizaciones, la divulgación proporciona partículas de rAAV que comprenden una cápside de AAV2. En algunas realizaciones, la ITR y la cápside derivan de AAV2. En algunas realizaciones, la ITR deriva de AAV2 y la cápside deriva de AAV1.
Producción de partículas de AAV
Se conocen en la técnica numerosos métodos para la producción de vectores de rAAV, que incluyen transfección, producción de estirpes celulares estables sistemas de producción de virus híbridos infecciosos que incluyen híbridos de adenovirus-AAV, híbridos de virus del herpes-AAV (Conway, JE et al., (1997) J. Virology 71(11 ):8780-8789) e híbridos de baculovirus-AAV. Los cultivos de producción de rAAV para la producción de partículas de virus requieren todos: 1) células hospedadoras adecuadas, que incluyen, por ejemplo, líneas celulares derivadas de ser humano, tales como células HeLa, A549, o 293, o líneas celulares derivadas de insecto, tales como SF-9, en el caso de sistemas de producción de baculovirus; 2) función de virus auxiliar adecuada, proporcionada por adenovirus no mutante o mutante (tal como adenovirus sensible a la temperatura), virus del herpes, baculovirus, o una construcción de plásmido que proporciona funciones auxiliares; 3) genes rep y cap de AAV y productos génicos; 4) un ácido nucleico (tal como un ácido nucleico terapéutico) flanqueado por al menos una secuencia de ITR de AAV; y 5) medios y componentes de medios adecuados para soportar la producción de rAAV. En algunas realizaciones, los productos de los genes rep y cap de AAV pueden ser de cualquier serotipo de AAV. En general, pero no es obligatorio, el producto del gen rep de AAV está dentro del mismo serotipo que las ITR del genoma del vector de rAAV en tanto que los productos del gen rep puedan servir para replicar y encapsidar el genoma de rAAV. Se pueden usar medios adecuados conocidos en la técnica para la producción de vectores de rAAV. Estos medios incluyen, sin limitación, medios producidos por Hyclone Laboratories y JRH que incluyen medio Eagle modificado (MEM), medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), formulaciones a medida, tales como las descritas en la patente de EE. UU. N.° 6.566.118, y medios SFM de Sf-900 II como se describe en la patente de EE. UU. N.° 6.723.551, particularmente con respecto a las formulaciones para medios a medida para su uso en la producción de vectores de AAV recombinantes. En algunas realizaciones, las funciones auxiliares de AAV se proporcionan por adenovirus o VHS. En algunas realizaciones, las funciones auxiliares de AAV se proporcionan por baculovirus y la célula hospedadora es una célula de insecto (por ejemplo, células de Spodoptera frugiperda (Sf9)).
En algunas realizaciones, se pueden producir partículas de rAAV por un método de transfección triple, tal como el método de transfección triple a modo de ejemplo proporcionado a continuación. Brevemente, un plásmido que contiene un gen rep y un gen de la cápside, junto con un plásmido adenovírico auxiliar, se puede transfectar (por ejemplo, usando el método de fosfato de calcio) en una línea celular (por ejemplo, células HEK-293), y el virus se puede recoger y purificar opcionalmente. Como tal, en algunas realizaciones, la partícula de rAAV se produjo por transfección triple de un ácido nucleico que codifica el vector de rAAV, un ácido nucleico que codifica rep y cap de AAV, y un ácido nucleico que codifica funciones del virus auxiliar AAV en una célula hospedadora, en donde la transfección de los ácidos nucleicos a las células hospedadoras genera una célula hospedadora capaz de producir partículas de rAAV.
En algunas realizaciones, se pueden producir partículas de rAAV por un método de línea celular productora, tal como el método de línea celular productora a modo de ejemplo proporcionado más adelante (véase también (referenciado en Martin et al., (2013) Human Gene Therapy Methods 24:253-269). Brevemente, se puede transfectar establemente una línea celular (por ejemplo, una línea celular HeLa) con un plásmido que contiene un gen rep, un gen de la cápside y una secuencia del ácido nucleico heterólogo del promotor. Las líneas celulares se pueden cribar para seleccionar un clon principal para la producción de rAAV, que puede entonces expandirse a un biorreactor de producción e infectarse con un adenovirus (por ejemplo, un adenovirus no mutante) como auxiliar para iniciar la producción de rAAV. El virus se puede recoger posteriormente, el adenovirus se puede inactivar (por ejemplo, por calor) y/o retirar, y las partículas de rAAV se pueden purificar. Como tal, en algunas realizaciones, la partícula de rAAV se produjo por una línea celular productora que comprende uno o más de ácido nucleico que codifica el vector de rAAV, un ácido nucleico que codifica rep y cap de AAV y un ácido nucleico que codifica funciones del virus auxiliar AAV.
En algunos aspectos, se proporciona un método para producir cualquier partícula de rAAV como se desvela en el presente documento que comprende (a) cultivar una célula hospedadora en condición tal que las partículas de rAAV se produzcan, en donde la célula hospedadora comprende (i) uno o más genes de encapsidación de AAV, en donde cada dicho gen de encapsidación de AAV codifica una proteína de replicación y/o encapsidación de AAV; (ii) un pro­ vector de rAAV que comprende un ácido nucleico que codifica un ácido nucleico heterólogo como se describe en el presente documento flanqueado por al menos una ITR de AAV, y (iii) una función auxiliar de AAV y (b) recuperar las partículas de rAAV producidas por la célula hospedadora. En algunas realizaciones, dicha al menos una ITR de AAV se selecciona del grupo que consiste en ITR de serotipo AAV1, AAV2, AAV3, a Av 4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471 A, AAV DJ, AAV de cabra, AAV bovino o AAV de ratón, o similares. En algunas realizaciones, dicha proteína de encapsidación se selecciona del grupo que consiste en proteínas de la cápside de serotipo rAAV2/HBoV1 de la cápside de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV V708K, AAV de cabra, AAV1/AAV2 quimérico, AAV bovino o AAV de ratón, o mutantes de las mismas. En algunas realizaciones, la proteína de encapsidación es una proteína de la cápside de AAV5 que incluye proteínas de la cápside de AAV5 que tienen mutaciones en la cápside de tirosina. En algunas realizaciones, la proteína de encapsidación es una proteína de la cápside de AAV5 que incluye proteínas de la cápside de AAV5 que tienen mutaciones en la cápside de tirosina y la ITR es una ITR de AAV2. En realizaciones adicionales, la partícula de rAAV comprende proteínas de la cápside de un serotipo de AAV de los clados A-F. En algunas realizaciones, las partículas de rAAV comprenden una cápside de AAV1 y un genoma recombinante que comprende ITR de AAV2, una ITR de AAV2 mutante y ácido nucleico que codifica un transgén/ácido nucleico terapéutico. En algunas realizaciones, las ITR de AAV son ITR de AAV son ITR de serotipo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, a Av 5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, AAV de cabra, AAV bovino o AAV de ratón. En ciertas realizaciones, las ITR de AAV son ITR de AAV2.
Los medios de cultivo de producción de rAAV adecuados pueden ser complementados con suero o proteínas recombinantes derivadas del suero a un nivel de 0,5 %-20 % (v/v o p/v). Alternativamente, como se conoce en la técnica, se pueden producir vectores de rAAV en condiciones sin suero que también se puede denominar medios sin productos derivados de animal. Un experto habitual en la técnica puede apreciar que los medios comerciales o a medida diseñados para soportar la producción de vectores de rAAV también pueden ser complementados con uno o más componentes de cultivo celular conocidos en la técnica, que incluyen, sin limitación, glucosa, vitaminas, aminoácidos y o factores de crecimiento, para aumentar el título de rAAV en los cultivos de producción.
Los cultivos de producción de rAAV se pueden cultivar en una variedad de condiciones (en un amplio intervalo de temperatura, durante longitudes de tiempo variables, y similares) adecuadas para la célula hospedadora particular que se utiliza. Como se conoce en la técnica, los cultivos de producción de rAAV incluyen cultivos dependientes de fijación que se pueden cultivar en recipientes dependientes de fijación adecuados, tales como, por ejemplo, botellas rotatorias, filtros de fibra hueca, microvehículos y biorreactores de lecho relleno o de lecho fluidizado. Los cultivos de producción de vectores de rAAV también pueden incluir células hospedadoras adaptadas a la suspensión, tales como células HeLa, 293 y SF-9 que se pueden cultivar en una variedad de formas, que incluyen, por ejemplo, matraces de agitación, biorreactores de tanque con agitación y sistemas desechables, tales como el sistema de bolsa Wave.
Se pueden recoger partículas de vector de rAAV de cultivos de producción de rAAV por lisis de las células hospedadoras del cultivo de producción o por recogida de los medios agotados del cultivo de producción, siempre que las células se cultiven en condiciones conocidas en la técnica para provocar la liberación de partículas de rAAV en los medios de células intactas, como se describe más completamente en la patente de EE. UU. N.° 6.566.118). También se conocen en la técnica métodos adecuados de lisado de células e incluyen, por ejemplo, múltiples ciclos de congelación/descongelación, sonicación, microfluidización y tratamiento con productos químicos, tales como detergentes y/o proteasas.
En una realización adicional, las partículas de rAAV se purifican. El término "purificado", como se usa en el presente documento, incluye una preparación de partículas de rAAV que carece de al menos algunos de los otros componentes que también pueden estar presentes, donde las partículas de rAAV ocurren naturalmente o a partir de los que se preparan inicialmente. Por lo tanto, por ejemplo, se pueden preparar partículas de rAAV aisladas usando una técnica de purificación para enriquecerlas a partir de una mezcla fuente, tal como un lisado de cultivo o sobrenadante de cultivo de producción. El enriquecimiento se puede medir en una variedad de formas, tales como, por ejemplo, por la proporción de partículas resistentes a DNasa (DRP) o copias de genoma (gc) presentes en una disolución, o por infectividad, o se puede medir en relación con una segunda sustancia, potencialmente interferente, presente en la mezcla fuente, tal como contaminantes, que incluyen contaminantes del cultivo de producción o contaminantes en el proceso, que incluyen virus auxiliar, componentes del medio y similares.
En algunas realizaciones, la cosecha del cultivo de producción de rAAV se clarifica para retirar el residuo de células hospedadoras. En algunas realizaciones, la cosecha del cultivo de producción se clarifica por filtración a través de una serie de filtros de profundidad que incluyen, por ejemplo, un filtro Millistak+ HC Pod de Millipore de calidad DOHC, un filtro Millistak+ HC Pod de Millipore de calidad a 1h C y un filtro 0,2 |jm Filter Opticap Xl 1o Millipore Express SHC Hydrophilic Membrane. La clarificación también se puede lograr mediante una variedad de otras técnicas convencionales conocidas en la técnica, tales como centrifugación o filtración a través de cualquier filtro de acetato de celulosa de 0,2 ^m o mayor tamaño de poro conocido en la técnica.
En algunas realizaciones, la cosecha del cultivo de producción de rAAV se trata además con Benzonase® para digerir cualquier ADN de alto peso molecular presente en el cultivo de producción. En algunas realizaciones, la digestión con Benzonase® se realiza en condiciones habituales conocidas en la técnica que incluyen, por ejemplo, una concentración final de 1 -2,5 unidades/ml de Benzonase® a una temperatura que varía desde la ambiente hasta 37 °C durante un periodo de 30 minutos a varias horas.
Las partículas de rAAV se pueden aislar o purificar usando una o más de las siguientes etapas de purificación: centrifugación en equilibrio; filtración de intercambio aniónico de flujo a través, filtración de flujo tangencial (TFF) para concentrar las partículas de rAAV; captura de rAAV por cromatografía en apatita; inactivación por calor de virus auxiliar; captura de rAAV por cromatografía de interacción hidrófoba; intercambio de tampón por cromatografía de exclusión por tamaño (SEC); nanofiltración; y captura de rAAV por cromatografía de intercambio aniónico, cromatografía de intercambio catiónico o cromatografía de afinidad. Estas etapas se pueden usar solas, en diversas combinaciones, o en órdenes diferentes. En algunas realizaciones, el método comprende todas las etapas en el orden que se describe a continuación. Los métodos de purificación de partículas de rAAV se encuentran, por ejemplo, en Xiao et al., (1998) Journal of Virology 72:2224-2232; patentes de EE. UU. N.° 6.989.264 y 8.137.948; y documento de patente WO 2010/148143.
En algunas realizaciones, la partícula de rAAV está en una composición farmacéutica. Las composiciones farmacéuticas pueden ser adecuadas para cualquier modo de administración descrito en el presente documento. Una composición farmacéutica de una partícula vírica recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica un transgén/ácido nucleico terapéutico se pueden introducir al SNC (por ejemplo, el cuerpo estriado y/o la corteza cerebral).
En algunas realizaciones, la partícula de rAAV está en una composición farmacéutica que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable. Como se conoce bien en la técnica, los excipientes farmacéuticamente aceptables son sustancias relativamente inertes que facilitan la administración de una sustancia farmacológicamente eficaz y se pueden suministrar como disoluciones o suspensiones líquidas, como emulsiones, o como formas sólidas adecuadas para disolución o suspensión en líquido antes de uso. Por ejemplo, un excipiente puede dar forma o consistencia, o servir de diluyente. Los excipientes adecuados incluyen, pero no se limitan a, estabilizantes, humectantes y emulsionantes, sales para variar la osmolaridad, agentes de encapsulación, sustancias de tamponamiento del pH y tampones. Dichos excipientes incluyen cualquier agente farmacéutico adecuado para la administración directa al ojo que se puede administrar sin excesiva toxicidad. Los excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, sorbitol, cualquiera de los diversos compuestos de TWEEN, y líquidos tales como agua, solución salina, glicerol y etanol. Se pueden incluir sales farmacéuticamente aceptables en ellos, por ejemplo, sales minerales de ácido tales como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos, sulfatos y similares; y sales de ácidos orgánicos, tales como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos y similares. Está disponible una discusión exhaustiva de excipientes farmacéuticamente aceptables en REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N.J. 1991).
En algunas realizaciones, la composición administrada incluye partículas de rAAV y poloxámero. El término "poloxámero" puede englobar muchos compuestos debido a que se pueden usar en combinación diferentes longitudes para las cadenas de polioxipropileno y de polioxietileno. Por ejemplo, un poloxámero puede tener la fórmula química de HO(C2H40)n(C3H60)m(C2H40)nH, donde n (es decir, la longitud de la cadena de polioxietileno) tiene un valor desde aproximadamente 60 hasta aproximadamente 150, y m (es decir, la longitud de la cadena de polioxipropileno) tiene un valor desde aproximadamente 25 hasta aproximadamente 60.
En algunas realizaciones, el poloxámero es poloxámero 188 (por ejemplo, CAS N.° 9003-11-6). Los poloxámeros se pueden describir por un sistema de numeración que designa su peso molecular aproximado y porcentaje de contenido de polioxietileno. Estos valores se refieren frecuentemente a un valor promedio en una composición de poloxámero, en vez de a un valor absoluto de cada molécula de poloxámero en la composición. En esta metodología, los dos primeros dígitos se multiplican por 100 para dar el peso molecular aproximado del bloque de polioxipropileno, y el tercer dígito se multiplica por 10 para dar el porcentaje en peso del bloque de polioxietileno. Por ejemplo, poloxámero 188 se puede referir a un poloxámero, teniendo n un valor de aproximadamente 80 y teniendo m un valor de aproximadamente 27 como en la fórmula representada anteriormente. Poloxámero 188 puede tener un peso molecular medio de desde aproximadamente 7680 hasta aproximadamente 9510 g/mol.
Los poloxámeros comercializados con un nombre comercial, tal como PLURONIC®, pueden ser nombrados en una metodología diferente. Se puede usar una letra para indicar el estado físico (por ejemplo, F para sólido, P para pasta o L para líquido). Se puede usar un número de 2 o 3 dígitos para indicar las propiedades químicas. El primer dígito o los dos dígitos se multiplican por 300 para dar el peso molecular aproximado del bloque de polioxipropileno, y el tercer dígito se multiplica por 10 para dar el porcentaje en peso del bloque de polioxietileno. Por ejemplo, PLURONIC® o LUTROL® F68 se pueden referir a un poloxámero sólido, teniendo n un valor de aproximadamente 80 y teniendo m un valor de aproximadamente 27 como en la fórmula representada anteriormente. Por lo tanto, en algunas realizaciones, el poloxámero 188 puede ser PLURONIC® F68 o LUTROL® F68.
En algunas realizaciones, la concentración de poloxámero en la composición varía desde aproximadamente 0,0001 % hasta aproximadamente 0,01 %. En algunas realizaciones, la concentración de poloxámero en la composición es inferior a aproximadamente cualquiera de los siguientes porcentajes: 0,01, 0,005, 0,001 o 0,0005. En algunas realizaciones, la concentración de poloxámero en la composición es mayor que aproximadamente cualquiera de los siguientes porcentajes: 0,0001, 0,0005, 0,001 o 0,005. Es decir, la concentración de poloxámero en la composición puede ser cualquiera de un intervalo de porcentajes que tiene un límite superior de 0,01, 0,005, 0,001 o 0,0005 y un límite inferior independientemente seleccionado de 0,0001,0,0005, 0,001 o 0,005, en donde el límite inferior es inferior al límite superior. En ciertas realizaciones, la concentración de poloxámero en la composición es aproximadamente del 0,001 %.
En algunas realizaciones, la composición comprende además cloruro sódico. En algunas realizaciones, la concentración de cloruro sódico en la composición varía desde aproximadamente 100 mM hasta aproximadamente 250 mM. En algunas realizaciones, la concentración de cloruro sódico en la composición es inferior a aproximadamente cualquiera de las siguientes concentraciones (en mM): 250, 225, 200, 175, 150 o 125. En algunas realizaciones, la concentración de cloruro sódico en la composición es mayor que aproximadamente cualquiera de las siguientes concentraciones (en mM ): 100, 125, 150, 175, 200 o 225. Es decir, la concentración de cloruro sódico en la composición puede ser cualquiera de un intervalo de concentraciones (en mM) que tiene un límite superior de 250, 225, 200, 175, 150 o 125 y un límite inferior independientemente seleccionado de 100, 125, 150, 175, 200 o 225, en donde el límite inferior es inferior al límite superior. En ciertas realizaciones, la concentración de cloruro sódico en la composición es aproximadamente 180 mM.
En algunas realizaciones, la composición comprende además fosfato de sodio. Fosfato de sodio se puede referir a cualquier especie individual de fosfato de sodio (por ejemplo, fosfato de sodio monobásico, fosfato de sodio dibásico, fosfato de sodio tribásico, etc.), o se puede referir a tampón fosfato de sodio, una mezcla de disoluciones de fosfato de sodio monobásico y dibásico. Las formulaciones para los tampones fosfato de sodio en un intervalo de pH se pueden encontrar en una variedad de protocolos convencionales de biología molecular, tales como los protocolos de Promegel y la guía de aplicaciones "Buffers for Biochemical Reactions", Apéndice B Parte C.
En algunas realizaciones, la concentración de fosfato de sodio en la composición varía desde aproximadamente 5 mM hasta aproximadamente 20 mM. En algunas realizaciones, la concentración de fosfato de sodio en la composición es inferior a aproximadamente cualquiera de las siguientes concentraciones (en mM): 20, 15 o 10. En algunas realizaciones, la concentración de fosfato de sodio en la composición es mayor que aproximadamente cualquiera de las siguientes concentraciones (en mM): 5, 10 o 15. Es decir, la concentración de fosfato de sodio en la composición puede ser cualquiera de un intervalo de concentraciones (en mM) que tiene un límite superior de 20, 15 o 10 y un límite inferior independientemente seleccionado de 5, 10 o 15, en donde el límite inferior es inferior al límite superior. En ciertas realizaciones, la concentración de fosfato de sodio en la composición es aproximadamente 10 mM.
En algunas realizaciones, el pH del fosfato de sodio en la composición es aproximadamente 7,0 a aproximadamente 8,0. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el pH del fosfato de sodio en la composición es aproximadamente 7,0, aproximadamente 7,2, aproximadamente 7,4, aproximadamente 7,5, aproximadamente 7,6, aproximadamente 7,8, o aproximadamente 8,0. En ciertas realizaciones, el pH del fosfato de sodio en la composición es aproximadamente 7,5. Cualquiera de los valores de pH para el fosfato de sodio descrito en el presente documento se puede combinar con cualquiera de los valores de concentración para el fosfato de sodio descritos anteriormente. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la concentración de fosfato de sodio en la composición es aproximadamente 10 mM, y el pH es aproximadamente 7,5.
En algunas realizaciones, la composición farmacéutica que comprende una partícula de rAAV descrita en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable es adecuada para administración a un ser humano. Dichos vehículos se conocen bien en la técnica (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15a edición, pp.
1035-1038 y 1570-1580). En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende además un poloxámero (por ejemplo, poloxámero 188, tal como PLURONIC® o LUTROL® F68). En algunas realizaciones, la composición farmacéutica que comprende un rAAV descrito en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable es adecuada para inyección en el SNC de un mamífero.
Dichos vehículos farmacéuticamente aceptables pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceite, que incluyen los de origen de petróleo, animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral y similares. También se pueden emplear soluciones salinas y dextrosa acuosa, polietilenglicol (PEG) y disoluciones de glicerol como vehículos líquidos, particularmente para disoluciones inyectables. La composición farmacéutica puede comprender además componentes adicionales, por ejemplo, conservantes, tampones, agentes de tonicidad, antioxidantes y estabilizadores, agentes humectantes o clarificantes no iónicos, agentes que aumentan la viscosidad y similares. Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento se pueden envasar en dosis unitarias individuales o en formas multidosis. Las composiciones se formulan, en general, como disolución estéril y sustancialmente isotónica.
VI. Sistemas para la administración de partículas de rAAV
También se proporcionan sistemas para la expresión de un ácido nucleico heterólogo en la corteza cerebral y el cuerpo estriado de un mamífero, que comprenden (a) una composición que comprende partículas de rAAV, en donde las partículas de rAAV comprenden un vector de rAAV que codifica el ácido nucleico heterólogo; y (b) un dispositivo para la administración de las partículas de rAAV al cuerpo estriado. Los sistemas y dispositivos se pueden usar para administrar cualquiera de las partículas de rAAV descritas en el presente documento al SNC (por ejemplo, el cuerpo estriado) de un mamífero. Como se ha descrito anteriormente, una partícula de rAAV administrada al cuerpo estriado se puede usar para introducir un vector de rAAV que codifica un ácido nucleico heterólogo para la expresión en la corteza cerebral y el cuerpo estriado.
En algunas realizaciones, la partícula de rAAV se administra por administración mejorada por convección (CED). La CED se basa en bombear un infundido (por ejemplo, una composición que contiene una partícula de rAAV) en el SNC a presión a la que se vence la presión hidrostática del líquido intersticial. Esto pone en contacto el infundido con la perivasculatura del SNC, que se utiliza como una bomba para distribuir el infundido a través de convección y potenciar el grado de su administración (véase, por ejemplo, Hadaczek et al., (2006) Hum. Gene Ther. 17:291-302; Bankiewicz et al., (2000) Exp. Neurol. 164:2-14; Sanftner, l M et al., (2005) Exp. Neurol. 194(2):476-483; Forsayeth, JR et al., (2006) Mol. Ther. 14(4):571-577; la patente de EE. UU. N.° 6.953.575; la solicitud de patente de EE. UU. N.° 2002/0141980; la solicitud de patente de EE. UU. N.° 2007/0259031; documentos de patente WO 99/61066; y WO 2010/088560).
Como se describe en el presente documento, una ventaja de uso de la CED es la mejorada distribución del infundido a través del cerebro. La CED puede producir una administración mejorada en el sitio de inyección dentro del cerebro (por ejemplo, el cuerpo estriado, el núcleo caudado y/o el putamen). Además, se puede lograr la administración a otras regiones del cerebro (por ejemplo, la corteza cerebral, la corteza frontal, las áreas corticales de asociación prefrontal, la corteza premotora, las áreas corticales somatosensoriales primarias y/o la corteza motora primaria) mediante CED. Sin desear quedar ligado a teoría alguna, también se cree que las partículas víricas recombinantes (por ejemplo, las partículas de rAAV) inyectadas en el cuerpo estriado también se pueden dispersar (por ejemplo, mediante transporte retrógrado) a otras áreas del cerebro, que incluyen, sin limitación, áreas de protección (por ejemplo, la corteza).
En algunas realizaciones, la partícula de rAAV se administra usando un sistema de administración de CED. Las partículas de AAV se pueden administrar por CED (véase, por ejemplo, el documento de patente WO 99/61066). Como se describe en el presente documento, la CED se puede llevar a cabo usando cualquiera de los sistemas descritos en el presente documento. Los dispositivos para CED (por ejemplo, para la administración de una composición que incluye partículas de rAAV) se conocen en la técnica y emplean, en general, una bomba (por ejemplo, una bomba osmótica y/o de infusión, como se describe a continuación) y un dispositivo de inyección (por ejemplo, un catéter, cánula, etc.). Opcionalmente, se puede usar una técnica de obtención de imágenes para guiar el dispositivo de inyección y/o monitorizar la administración del infundido (por ejemplo, una composición que incluye partículas de rAAV). El dispositivo de inyección se puede insertar en el tejido del SNC en el sujeto. Un experto en la técnica es capaz de determinar las coordenadas adecuadas para situar el dispositivo de inyección en el tejido diana del SNC. En algunas realizaciones, el posicionamiento se lleva a cabo mediante un mapa anatómico obtenido, por ejemplo, por TAC y/o IRM del cerebro del sujeto para guiar el dispositivo de inyección al tejido diana del SNC. En algunas realizaciones, se pueden realizar IRMi y/u obtención de imágenes de tiempo real de la administración. En algunas realizaciones, el dispositivo se usa para administrar partículas de rAAV a un mamífero.
En algunas realizaciones, se puede realizar la imagen por resonancia magnética intraoperatoria (IRMi) y/o la obtención de imágenes en tiempo real de la administración. En algunas realizaciones, el dispositivo se usa para administrar partículas de rAAV a un mamífero. La IRMi se conoce en la técnica como una técnica para la obtención de imágenes basada en IRM de un paciente durante cirugía, que ayuda a confirmar un procedimiento quirúrgico satisfactorio (por ejemplo, para administrar partículas de rAAV al SNC) y reduce el riesgo de daño de otras partes del tejido (para descripciones adicionales, véase, por ejemplo, Fiandaca et al., (2009) Neuroimage 47 Suppl. 2:T27-35). En algunas realizaciones, un agente de rastreo (por ejemplo, un agente potenciador del contraste de IRM) puede ser administrado conjuntamente con el infundido (por ejemplo, una composición que incluye partículas de rAAV) para proporcionar la monitorización en tiempo real de la distribución en tejido del infundido. Véase, por ejemplo, Fiandaca et al., (2009) Neuroimage 47 Supl. 2:T27-35; publicación preconcedida de EE. UU. 2007/0259031; y la patente de EE. UU. N.° 7.922.999. El uso de un agente de rastreo puede informar del cese de la administración. También se pueden usar otros medios de rastreo y de obtención de imágenes conocidos en la técnica para seguir la distribución del infundido.
En algunas realizaciones, se pueden administrar partículas de rAAV por inyección estereotáxica habitual usando dispositivos y métodos conocidos en la técnica para la administración de partículas de rAAV. En general, estos métodos pueden usar un dispositivo de inyección, un sistema de planificación para trasladar una región del tejido dirigida para la administración a una serie de coordenadas (por ejemplo, parámetros a lo largo de los ejes latero-lateral, dorso-ventral y rostro-caudal) y un dispositivo para la localización estereotáxica según las coordenadas planeadas (un dispositivo estereotáxico, que incluye opcionalmente la sonda y una estructura para fijar la cabeza en su sitio en alineamiento con el sistema de coordenadas). Un ejemplo no limitante de un sistema que puede ser útil para la cirugía guiada por IRM y/o inyección estereotáxica es el sistema ClearPoint® (MRI Interventions, Memphis, TN).
En algunas realizaciones, el dispositivo para administración mejorada por convección comprende una bomba (por ejemplo, una bomba osmótica y/o una bomba de infusión). Las bombas osmóticas y/o de infusión están comercialmente disponibles (por ejemplo, de ALZET® Corp., Hamilton Corp., ALZA Inc. en Palo Alto, CA). Los sistemas de bombeo pueden ser implantables. Los sistemas de bombeo a modo de ejemplo se pueden encontrar, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. N.27.351.239; 7.341.577; 6.042.579; 5.735.815; y 4.692.147. En algunas realizaciones, la bomba es una bomba manual. Los dispositivos a modo de ejemplo para CED, que incluyen cánulas resistentes al reflujo y escalonadas, se pueden encontrar en los documentos de patente WO 99/61066 y WO 2006/042090.
En algunas realizaciones, el dispositivo para administración mejorada por convección comprende una cánula resistente al reflujo (por ejemplo, una cánula de diseño en etapas sin reflujo). Descripciones adicionales y cánulas resistentes al reflujo a modo de ejemplo se pueden encontrar, por ejemplo, en Krauze et al., (2009) Methods Enzymol.
465:349-362; publicación preconcedida de EE. UU. 2006/0135945; publicación preconcedida de EE. UU.
2007/0088295; y PCT/US08/64011. En algunas realizaciones, solo se usa una cánula. En otras realizaciones, se usa más de una cánula. En algunas realizaciones, el dispositivo para administración mejorada por convección comprende una cánula resistente al reflujo unida con una bomba que produce presión suficiente para causar que el infundido circule a través de la cánula hacia el tejido diana a tasas controladas. Se puede usar cualquier caudal adecuado de forma que la presión intracraneal se mantenga en niveles adecuados para no dañar el tejido cerebral.
En algunas realizaciones, la cánula es una cánula de etapas. Como se describe, por ejemplo, en el documento de patente WO 2006/042090, una cánula escalonada tiene varios escalones (por ejemplo, cuatro en la FIG. 1 del documento de patente WO 2006/042090). Los escalones más próximos al extremo distal de la cánula son los que entran primero en el tejido diana y, por consiguiente, el número de escalones que entran en el tejido diana (por ejemplo, el cuerpo estriado) dependerá de la profundidad de penetración necesaria para alcanzar esa diana en el sujeto. Con respecto a la administración al cerebro, el cirujano puede determinar fácilmente la profundidad de penetración apropiada, teniendo en cuenta tanto el tamaño del sujeto que está tratándose como la localización dentro del cerebro que se elige.
La cánula se puede conectar a una bomba mediante un sistema de tubos. El tubo se extiende a través de la luz de la cánula y el infundido se puede administrar a través de este tubo. En realizaciones que contienen el tubo, el tubo puede estar alineado con el extremo distal de la cánula. Alternativamente, el tubo se extiende desde el extremo distal de la cánula, en dichas realizaciones, la cantidad que el tubo se extiende puede variar dependiendo de la aplicación. En general, el tubo se extenderá desde aproximadamente 1 mm hasta aproximadamente 1 cm desde la cánula (o cualquier longitud intermedia), por ejemplo, desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 50 mm (o cualquier longitud intermedia), o desde aproximadamente 1 mm hasta aproximadamente 25 mm (o cualquier longitud intermedia, que incluye, pero no se limita a, 1 mm, 2 mm, 3 mm, 4 mm, 5 mm, 6 mm, 7 mm, 8 mm, 9 mm, 10 mm, 11 mm, 12 mm, 13 mm, 14 mm, 15 mm, 16 mm, 17 mm, 18 mm, 19 mm, 20 mm, 21 mm, 22 mm, 23 mm, 24 mm o 25 mm), tal como 10 mm más allá del extremo distal de la misma.
El tubo que se extiende a través de la cánula puede tener un recubrimiento o material que lo rodea en una o más regiones, por ejemplo, para proteger el tubo en contacto con el infundido. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, el tubo (por ejemplo, tubo de FEP (teflón)) protege la porción de tubo de sílice fundida que se extiende más allá del extremo proximal de la cánula de acero inoxidable. El tubo de sílice fundida se puede conectar a la jeringa por cualquier medio adecuado, que incluye, pero no se limita a, a accesorios de compresión de Luer, y la jeringa es accionada por una bomba de jeringa (manual, electrónica y/o computerizada). Será evidente que el tamaño de la jeringa puede ser seleccionado por el cirujano para administrar la cantidad apropiada de producto(s). Por lo tanto, se pueden usar jeringas de 1 ml, 2,5 ml, 5 ml, o incluso mayores.
Las cánulas escalonadas se pueden fabricar de una variedad de materiales que son fisiológicamente aceptables, que incluyen, sin limitación, acero inoxidable (por ejemplo, 316SS o 304SS), metal, aleaciones metálicas, polímeros, fibras orgánicas, fibras inorgánicas y/o combinaciones de los mismos.
Opcionalmente, una superficie de contacto con el infundido (por ejemplo, tubo o recubrimiento) se puede extender a través de la luz de la cánula. También se puede usar una variedad de materiales para o la superficie de contacto con el infundido, que incluye, pero no se limita a, metales, aleaciones metálicas, polímeros, fibras orgánicas, fibras inorgánicas y/o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, la superficie de contacto con el producto no es acero inoxidable. En dichas realizaciones, la cánula externa puede seguir fabricándose de un material fisiológicamente compatible con el tejido diana, pero puesto que no existe contacto con el producto no necesita ser compatible con el agente biológicamente activo o formulación de producto.
En algunas realizaciones, la penetración del infundido se aumenta aún más usando un agente facilitador. Un agente facilitador es capaz de facilitar aún más la administración del infundido al tejido diana (por ejemplo, tejido diana del SNC). Un ejemplo no limitante de un agente facilitador es la heparina de bajo peso molecular (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. N.° 7.922.999).
Se conocen en la técnica los envases adecuados para las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento, e incluyen, por ejemplo, viales (tales como viales sellados), recipientes, ampollas, botellas, frascos, envases flexibles (por ejemplo, bolsas Mylar selladas o de plástico), y similares. Estos artículos de fabricación se pueden además esterilizar y/o sellar.
Además, en el presente documento se proporcionan partículas de rAAV para su uso para tratar un trastorno del SNC en un mamífero que comprenden administrar la partícula de rAAV al mamífero como se describe en el presente documento. Todavía se proporcionan además partículas de rAAV para su uso para tratar la enfermedad de Huntington en un mamífero que comprende administrar la partícula de rAAV al mamífero como se describe en el presente documento usando un sistema como se describe en el presente documento.
En el presente documento también se describen kits para administrar una partícula de rAAV descrita en el presente documento a un mamífero. Los kits pueden comprender cualquiera de las partículas de rAAV o composiciones de partículas de rAAV. Por ejemplo, los kits pueden incluir partículas de rAAV con un vector de rAAV que codifica un ácido nucleico heterólogo que se expresa en al menos la corteza cerebral y el cuerpo estriado de un mamífero. En algunas realizaciones, los kits comprenden además cualquiera de los dispositivos o sistemas descritos anteriormente.
En algunas realizaciones, los kits adicional incluyen instrucciones para la administración al SNC (por ejemplo, administración al cuerpo estriado de un mamífero) de la composición de partículas de rAAV. Los kits descritos en el presente documento pueden incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, que incluyen otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas y prospectos con instrucciones. También se pueden incluir materiales de envasado adecuados y puede ser cualquier material de envasado conocido en la técnica, que incluye, por ejemplo, viales (tales como viales sellados), recipientes, ampollas, botellas, frascos, envases flexibles (por ejemplo, bolsas Mylar selladas o de plástico), y similares. Estos artículos de fabricación se pueden además esterilizar y/o sellar. En algunas realizaciones, los kits comprenden instrucciones para tratar un trastorno del SNC descrito en el presente documento usando cualquiera de las partículas de rAAV descritas en el presente documento. Los kits pueden incluir un vehículo farmacéuticamente aceptable adecuado para inyección en el SNC de un individuo, y uno o más de: un tampón, un diluyente, un filtro, una aguja, una jeringa y un prospecto con instrucciones para realizar inyecciones en el cuerpo estriado de un mamífero.
En algunas realizaciones, los kits contienen además uno o más de los tampones y/o excipientes farmacéuticamente aceptables descritos en el presente documento (por ejemplo, como se describe en REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N.J. 1991). En algunas realizaciones, los kits incluyen uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables, vehículos, disoluciones y/o componentes adicionales descritos en el presente documento. Los kits descritos en el presente documento se pueden envasar en dosis unitarias individuales o en formas multidosis. El contenido de los kits se formula, en general, como estéril y se puede liofilizar o proporcionar como una disolución sustancialmente isotónica.
EJEMPLOS
La invención se entenderá más completamente como referencia a los siguientes ejemplos.
Ejemplo 1: Expresión generalizada de GFP después de la administración intraestriatal del vector de AAV1
Se evaluó la capacidad de AAV1 para dirigirse eficientemente tanto a las estructuras estriatales como corticales en el cerebro de macacos de la India cuando se administra por administración mejorada por convección (CED). Se infundieron vectores de AAV que contenían ADNc de GFP bajo el control del potenciador del citomegalovirus / promotor de beta-actina de pollo (CBA) en el núcleo caudado y el putamen de 9 macacos de la India macho adultos usando CED (véase, por ejemplo, Bankiewicz et al., (2000) Exp. Neurol. 164:2-14 y el documento de patente WO 2010/088560).
Métodos
Administración quirúrgica
Se incluyeron nueve macacos de la India macho adultos (Macaca mulatta; 8,9 - 11,9 kg) en este estudio. Todos los animales recibieron una infusión de vector de AAV bilateralmente en el núcleo caudado y el putamen por medio de CED guiada por IRM (Richardson, R.M. et al. (2011) Neurosurgery 69:154-163; Richardson, R.M. et al. (2011) Stereotact. Funct. Neurosurg. 89:141-151; Richardson, R.M. et al. (2011) Mol. Ther. 19:1048-1057). Inmediatamente antes de la cirugía, los animales se anestesiaron con HCl de ketamina (10 mg/kg), se pesaron, se intubaron y se mantuvieron en 1-5 % de isoflurano. La cabeza se montó sobre un marco esterotáxico, y el animal se transportó a IRM (unidad de RM Siemens 3.0 T Trio) para una exploración planificada potenciada en T1. Después de la exploración, los animales se transfirieron al quirófano y se preparó la cabeza para un procedimiento de implantación, y se usó una cánula de sílice fundida resistente al reflujo diseñada a medida cerámica con una punta escalonada de 3 mm para la infusión. Se implantó bilateralmente una cánula guía temporal (una por hemisferio) usando métodos convencionales.
Los animales recibieron infusiones bilaterales en el núcleo caudado y el putamen de cualquiera de los vectores AAV1 -eGFP o AAV2-eGFP obtenidos con 2 métodos de producción diferentes: transfección triple (TT) o línea celular productora (PCL). Las concentraciones y dosis de vector se describen en la Tabla 5. Los animales se probaron para la presencia de anticuerpos neutralizantes anti-AAV1 y anti-AAV2 como se describe previamente y se consideraron seronegativos, ya que presentaron títulos de anticuerpos de < 1:32 (Bevan, A.K. et al. (2011) Mol. Ther. 19:1971-1980). El tiempo de supervivencia fue 1 mes después de la administración de AAV para todos los animales.
Cada animal recibió hasta tres microinyecciones por hemisferio para su direccionamiento a las regiones del núcleo caudado y el putamen (pre-comisural y post-comisural), como se muestra en la Tabla 2. Para visualizar la distribución del infundido durante la IRM, se añadió Prohance (gadoteridol 2 mM) al virus. Se administró aproximadamente 30 pl de AAV al núcleo caudado y 60 pl al putamen usando el método de administración mejorada por convección (CED) (es decir, 90 pl por hemisferio). La tasa de infusión se aumentó hasta un máximo de 5 pl/min.
Tabla 2. Volúmenes de dosis parenquimatosa por sitio.
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El primer grupo de animales recibió 1,7 x 1011 vg de AAV1-eGFP (TT) (n=3), o AAV2-eGFP (TT) (n=2) por hemisferio. El segundo grupo de animales recibió 1,7 x 1011 vg de AAV1-eGFP (PCl ) (n=2), o 1,3 x 1011 vg de AAV2-eGFP (PCL) (n=2). Se adquirió IRM en serie para monitorizar la distribución del infundido dentro de cada sitio diana y proporcionar retroalimentación en tiempo real al equipo. Inmediatamente después del procedimiento de administración intraparenquimatoso, los animales se transfirieron al quirófano, se retiró la cánula guía y se cerró el sitio de la herida en capas anatómicas. Todos los experimentos se realizaron según las pautas de los Institutos Nacionales de Salud y con protocolos autorizados por el Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales. Inmediatamente después de la cirugía, los animales se transfirieron al área de IRM para los procedimientos de administración de AAV. A continuación de dan los comentarios referentes al procedimiento de administración para cada uno de los sujetos representados en la Tabla 2.
Procedimiento de administración - Grupo de tratamiento 2 (AAV1-eGFP TT)
Sujeto número 1. Se administró aproximadamente 60 pl de infundido por hemisferio por dos trayectorias (30 pl/depósito) en cada putamen. Imágenes coronales de infusiones en el putamen anterior mostraron una mayoría de señal de gadolinio dentro de cada una de las estructuras dirigidas. En el hemisferio derecho, se observó un ligero transporte perivascular en el putamen ventral y distribución en la comisura anterior.
Sujeto número 2. Se adquirió la IRM de T1 después de 0,127 ml de infusión en el putamen y 0,207 ml en el tálamo. Después de la infusión la IRM de T1 mostró una amplia distribución del infundido dentro del tálamo derecho que midió aproximadamente 1 cm en la dirección anterior-posterior y 1 cm en la dirección dorso-ventral. T1 coronal mostró distribución de gadolinio dentro del sitio diana que se extendió medialmente hacia la cápsula interna y superiormente hacia el putamen dorsal. La mayoría del infundido estuvo contenido dentro de los márgenes del putamen; sin embargo, el transporte por el espacio perivascular también estuvo presente en los tramos de sustancia blanca de la cápsula interna y la comisura anterior. Los análisis revelaron que la relación entre el volumen de infusión de gadolinio (Vi) y el volumen de distribución (Vd) en el tálamo y el putamen era 1:2.
Observaciones en vida
Se realizaron observaciones detalladas diarias de la salud animal y los síntomas neurológicos durante un periodo de 5 días después de la administración; posteriormente, las observaciones detalladas se realizaron una vez por semana hasta la finalización del estudio. Se realizaron observaciones y las comprobaciones diarias de mortalidad. Se realizaron evaluaciones de los pesos corporales antes de la administración intracraneal, en el momento de los procedimientos de extracción de sangre, y en la autopsia. No se observó diferencia significativa en el peso corporal entre los grupos de tratamiento antes de la cirugía o en el momento de la autopsia (FIG. 1). Se recogieron sangre completa, suero de la sangre y líquido cefalorraquídeo (CSF) para hematología, bioquímica sérica, ensayo de anticuerpos contra la cápside del AAV1 y AAV2 y análisis del nivel de ARNm de eGFP.
Extracción de sangre en vida y procesamiento
Se recogió sangre (aproximadamente 5 ml) antes de la inyección, aproximadamente 72 horas después de la inyección y en la autopsia según el Programa de recogida de muestras de sangre (véase la Tabla 3 a continuación). Se recogieron aproximadamente 0,5-1,0 ml de sangre completa en tubos EDTA para los análisis de hematología. Se recogieron aproximadamente 2,0 ml de sangre completa en tubos separadores de suero (con gel, BD Microtainer) y se procesaron dando suero para obtener aproximadamente suero para el análisis químico y el análisis de anticuerpos de la cápside del AAV1 y a Av 2.
Tabla 3. Programa de recogida de muestras de sangre
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Recogida de CSF y procesamiento
Se recogió CSF en dos momentos de tiempo separados: antes de la administración intracraneal y en la autopsia. La recogida de CSF se realizó con anestesia por punción lumbar cervical con el animal en posición supina. Antes de la administración del producto experimental, se recogió 1 -2 ml de CSF, se congeló sobre nieve carbónica y se almacenó a < -60 °C. En la autopsia (antes de la perfusión de PBS) se recogieron 2-4 ml de CSF, se filtraron a través de un filtro de jeringa de 0,8 micrómetros en un tubo de recogida etiquetado y se transfirieron por duplicado (alícuota de 1 ml para el análisis de anticuerpos de la cápside y alícuota de 2-4 ml para el análisis de GFP) en tubos Eppendorf, se congelaron inmediatamente sobre nieve carbónica y se almacenaron a < -60 °C.
Autopsia y recogida de tejido
Todos los animales se sacrificaron aproximadamente 30 días después del procedimiento de administración intracraneal. Cada animal se sacrificó usando administración intravenosa de pentobarbital sódico. Tras la eutanasia y la recogida de sangre y CSF, el cuerpo se perfundió transcárdicamente con PBS (en condiciones sin RNAsa), seguido por perfusión con PFA. Se pinzó la aorta descendente para reducir la fijación de tejidos periféricos. Este procedimiento se usó para recoger tejido cerebral fijado, además de muestras de tejido periférico fresco para el análisis de GFP por qPCR. La tabla de recogida de tejido enumera los tejidos que se recogieron (Tabla 4). Durante la perfusión de PBS (antes del inicio de la perfusión con 4 % de PFA), se recogieron muestras de biopsia (0,5 - 1,0 cm3) de tejidos seleccionados (también enumerados en la tabla de recogida de tejido) en condiciones sin RNAsa con bisturís estériles desechables (un bisturí nuevo para cada biopsia individual) en tubos sin RNAsa, y se almacenó congelado a < -60 °C.
Tabla 4. Recogida de tejido
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Procesamiento de cerebro y médula espinal
Se extrajo cuidadosamente todo el cerebro del animal y se fotografió junto a una regla para la escala. Una vez extraído del cráneo, el cerebro se puso en una matriz de cerebro y se cortó coronalmente en bloques de 6 mm. Se almacenaron los bloques coronales en PFA y se procesaron para histología. Se seccionaron bloques relevantes que contenían las regiones de la corteza frontal y el mesencéfalo en secciones de flotación libre de 40 micrómetros. Se extrajo cuidadosamente la médula espinal del animal. Se almacenaron segmentos de médula espinal en PFA y se procesaron para histología. Se seccionó un segmento representativo de la región cervical, torácica y lumbar en secciones de flotación libre de 40 micrómetros.
Después de la perfusión con PBS-heparina, seguido por 4 % de paraformaldehído tamponado (PFA), se cortó el cerebro de cada animal en bloques de 6 mm (plano coronal) usando bisturís desechables y matriz de cerebro de mono. Se colocaron horizontalmente los bloques secuenciales (11-12 cortes gruesos de cerebro por animal) en un tablero blanco y se fotografiaron con letras asignadas en orden. Entonces se fijaron posteriormente todos los bloques de cerebro en 4 % de PFA tamponado durante 24 horas. La calidad de la fijación para cada bloque se inspeccionó visualmente (no se observó color rosa dentro de los bloques). Después de la fijación posterior con PFA, cada bloque de cerebro se procesó para secciones de flotación libre aclarando 3X en PBS e inmersión en 30 % de sacarosa (crioconservación) antes de cortar en secciones de flotación libre de 40 gm.
Producción de vectores de AAV
Antes de la evaluación clínica, se producen normalmente vectores de AAV por el método habitual de transfección triple (TT) en el que las células HEK293 se cotransfectan con dos o tres plásmidos que codifican los elementos cis (genoma de vector) y trans (genes rep y cap de AAV; genes auxiliares adenovíricos E2A, E4 y VA) requeridos para la encapsidación de vectores (Hauck et al., (2009) Mol. Ther. 17:144-152). Puesto que la entrada de ADN de plásmido puede ser modificada fácilmente y rápidamente, este método permite la evaluación de vectores basados en diversos serotipos y que alojan una variedad de casetes de expresión. A pesar de su flexibilidad y tiempo de respuesta relativamente rápido, el método de transfección supone un reto con respecto a la escalabilidad, que limita la idoneidad de este método para la producción de vectores de rAAV a gran escala para uso clínico.
Actualmente, se genera rAAV de grado clínico a gran escala por el método de transfección transitorio sin virus auxiliar, los sistemas de producción basados en baculovirus o virus del herpes simple recombinante, o encapsidación/líneas celulares productoras (Ayuso et al., (2010) Curr. Gene Ther. 10:423-436). Las líneas celulares productoras (PCL) de virus adenoasociado son un método eficaz para la producción a gran escala de vectores de AAV de calidad clínica. En este sistema, un único plásmido que contiene tres componentes, la secuencia de vector, los genes rep y cap de AAV y un gen marcador de selección, se transfecta establemente en células HeLaS3. Sin embargo, es conveniente determinar si el vector de AAV derivado de líneas celulares productoras es equivalente en potencia al vector generado por otros métodos, por ejemplo, el método habitual de transfección transitorio.
Se generaron vectores víricos de AAV para este estudio usando dos métodos de producción diferentes: transfección triple (TT) y línea celular productora (PCL). Se produjeron vectores recombinantes de AAV AAV1-GFP (TT) y AAV2-GFP (TT) por transfección triple (usando fosfato de calcio) de células 293 de carcinoma de riñón embrionario humano (HEK-293) (referenciado en Xiao et al., (1998) Journal of Virology 72:2224-2232). Brevemente, para la producción de vectores de AAV por transfección transitoria, se transfectaron células HEK293 usando polietilenimina (PEI) y una relación 1:1:1 de los tres plásmidos (vector de ITR, AAV2rep/cap2 o AAV2rep/cap1 y plásmido auxiliar de pAd). El plásmido del vector de ITR codificó el ADNc para EGFP en la dirección 3' del promotor híbrido del potenciador del citomegalovirus / promotor híbrido de beta-actina de pollo (CBA). El auxiliar pAd usado fue pHelper (Stratagene/Agilent Technologies, Santa Clara, CA).
Se produjeron los vectores recombinantes de AAV AAV1-GFP (PCL) y AAV2-GFP (PCL) usando un proceso de células productoras de AAV (referenciado en Thorne et al., (2009) Human Gene Therapy 20:707-714 y Martin et al., (2013) Human Gene Therapy Methods 24:253-269). Brevemente, se generaron líneas celulares productoras específicas de producto por transfección estable de células Hela-S3 (ATCC CCL-2.2) con un plásmido que contenía el gen rep del serotipo 2 y un gen de la cápside de cualquiera del serotipo 1, o 2, la secuencia del ácido nucleico heterólogo del promotor, el genoma de vector flanqueado por repeticiones terminales invertidas de (ITR) de AAV2 y un gen de resistencia a puromicina. El genoma de vector alojó el ADNc para eGFP en la dirección 3' del potenciador del citomegalovirus / promotor híbrido de beta-actina de pollo, CBA. Las células transfectadas se cultivaron en presencia de puromicina para aislar integrantes estables. Las líneas celulares generadas se cribaron para seleccionar un clon principal. El clon de célula específica de producto se expandió posteriormente en un biorreactor de producción, y se infectó con un adenovirus natural como auxiliar para iniciar la producción de AAV. El virus se recogió 72 horas después de la infección, el adenovirus se inactivó por calor y se retiró por métodos de intercambio aniónico.
La purificación de AAV a partir de ambas plataformas de producción se realizó como se describe previamente (Qu, G. et al. (2007) J. Virol. Methods 140:183-192). Los títulos resultantes de todos los vectores de AAV1 y AAV2-GFP se muestran en la Tabla 5. Todos los vectores se prepararon en agua que contenía cloruro sódico 180 mM; fosfato de sodio 10 mM (NaH2PÜ4- 2 H2 O 5 mM Na2HPÜ4-H2O 5 mM); y 0,001 % de poloxámero 188 (Lutrol F68), pH 7,5.
Tabla 5. Tabla de diseño del estudio y productos experimentales
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Inmunohistoquímica
Se realizó inmunotinción con anticuerpos contra GFP (1:500, AB3080; Chemicon) en secciones coronales de 40 pm fijadas con Zamboni que cubrían la corteza frontal completa y que se extendían en una dirección posterior al nivel del cuerpo estriado. La localización de las neuronas inmunopositivas para GFP se analizó con referencia a The Rhesus Monkey Brain in Stereotactic Coordinates (Paxinos, G.H.X. y Toga, A.W. (2000) San Diego, CA: Academic Press) para identificar áreas de inmunotinción específicas en la corteza y el cuerpo estriado.
Tinción con GFP por 3,3'-diaminobencidina (DAB): Se lavaron 3 veces secciones en PBST (3 por cada bloque de 6 mm: separación de 2 mm) durante 5 min cada una, seguido por tratamiento con 1 % de H2 O2 durante 20 min. Las secciones se incubaron en disolución de bloqueo Sniper (disponible en línea en biocare.net/product/backgroundsniper/) durante 30 min a temperatura ambiente, seguido por incubación durante la noche con el anticuerpo primario anti-GFP (disponible en línea www.lifetechnologies.com/) diluido 1:1000 en diluyente Da Vinci Green (disponible en línea en biocare.net/). Después de 3 aclarados en PBS que contenía 0,1 % de Tween-20 (PBST) durante 5 min, las secciones se incubaron en polímero Mach 2 HRP (http://biocare.net/) durante 1 h, seguido por 3 lavados y desarrollo colorimétrico (DAB). Las secciones inmunoteñidas se contratiñeron con violeta de cresilo y se montaron en portaobjetos y se sellaron con Cytoseal® (disponible en línea en www.thermoscientific.com/).
Cálculo de cobertura de la expresión de GFP en el cerebro de primate no humano (NHP): La tinción con GFP de secciones en serie teñidas con IHC de coincidentes se proyectó sobre barridos de IRM correspondientes individuales de cada cerebro de mono (imágenes de RM potenciadas en T1 en el plano coronal). La distribución/cobertura de la expresión de GFP se realizó con el software de obtención de imágenes OsiriX versión 3.1 (The OsiriX Foundation, Ginebra, Suiza).
Inmunofluorescencia doble para el tropismo de vectores y la eficiencia de transducción neuronal: Para la inmunotinción doble de fluorescencia de diferentes marcadores celulares (NeuN, S-100, Iba1) con GFP, se aplicó una combinación de anticuerpos primarios a secciones como una mezcla de anticuerpos primarios por incubación durante la noche a temperatura ambiente en PBST con 20 % de suero de caballo. Los anticuerpos primarios usados fueron los siguientes: anticuerpo anti-GFP (1:500, como antes); anti-NeuN (1:500, disponible en línea en www.emdmillipore.com/); anti-S-100 (1:300, disponible en línea en biocare.net/), anti-Iba1 (1:500, disponible en línea en biocare.net/); anti-Olig2 (1:50, disponible en línea en www.emdmillipore.com/). Después de 3 lavados en PBST, los anticuerpos primarios se visualizaron por incubación en la oscuridad durante 2 horas con anticuerpos secundarios conjugados con fluorocromo apropiados: Dylight 549 anti-ratón de cabra y Dylight 488 anti-conejo de cabra (disponible en línea en www.biocare.net/). Todos los anticuerpos secundarios se diluyeron 1:1.000 en Fluorescence Antibody Diluent (disponible en línea en biocare.net/). Además, para extinguir la autofluorescencia, las secciones se incubaron en 0,1 % de disolución de negro de Sudán (70 % de etanol). Después de los lavados finales en PBS, las secciones se cubrieron por cubreobjetos con Vectashield Hard Set Mounting Medium for Fluorescence (disponible en línea en www.vectorlabs.com/). Las secciones de control se procesaron sin anticuerpos primarios, y no se observó inmunotinción significativa en estas condiciones.
Se usó el microscopio de fluorescencia Zeiss Axioskop (disponible en línea en www.zeiss.com/) equipado con cámara de vídeo en color CCD y sistema de análisis de imágenes (Axiovision Software, disponible en línea en www.zeiss.com/) para determinar la presencia de células con doble marcado (positivo en tanto los canales rojo como verde). Se obtuvieron fotomicrografías para secciones con doble marcado combinando imágenes de dos canales separados (rojo y verde; la co-localización aparece amarilla) sin alterar la posición de las secciones o el foco (objetivo x 20). Para la tinción tiple con GFP/NeuN, se seleccionaron 3 secciones de cada mono en intervalos de ~ 4 mm de los sitios de infusión de vector. Para la evaluación de la eficiencia de la transducción neuronal por vectores AAV1-eGFP o AAV2-eGFP dentro de las áreas de cerebro dirigidas (núcleo caudado y putamen), se dispusieron aleatoriamente 5 marcos de recuento (700 pm x 550 pm) en el área de GFP+. El área de transducción primaria (PAT) se definió como área positiva para GFP ("nube") que cubrió más del 40 % de la estructura elegida. Similarmente, para evaluar la eficiencia de la transducción neuronal, fuera de PAT (OPAT), se eligieron 5 marcos de recuento (700 pm x 550 pm) de cada sección más allá de los márgenes claros de la "nube" positiva para GFP en las estructuras dirigidas (núcleo caudado y putamen) o en la corteza (FIG. 10C). Para determinar la proporción de células positivas para GFP/NeuN, cada marco de recuento se contó dos veces, primero con el canal rojo para contar el número de células NeuN+ y segundo con un canal rojo y verde combinado para contar el número de células coteñidas (GFP+ y NeuN+). Se contaron al menos 1.500 células NeuN+ para cada una de las 3 secciones elegidas (5 marcos de recuento por sección). Finalmente, se determinó el porcentaje de GFP+/NeuN+ con respecto a NeuN+ total. Todos los cálculos para el cuerpo estriado se hicieron añadiendo resultados de ambos hemisferios de cada animal y combinando valores del putamen y el núcleo caudado puesto que las eficiencias de transducción medias fueron idénticas en ambas estructuras de cada animal.
PCR cuantitativa en tiempo real (TaqMan)
Se midieron los niveles de ARNm de GFP por PCR cuantitativa en tiempo real. Se usaron muestras de hígado, corazón, pulmón, riñón y bazo para todos los análisis por RT-PCR. Se extrajo ARN total usando el minikit miRNeasy de QIAGEN y luego se retrotranscribió y se amplificó usando el kit de retrotranscripción de ADNc de alta capacidad (Applied Biosystems) según las instrucciones del fabricante. Se realizaron reacciones de RT-PCR cuantitativa y se analizaron en un sistema de PCR en tiempo real QuantStudio12K Flex (Applied Biosystems). Cada muestra se realizó por duplicado y se determinó la expresión génica relativa usando una curva patrón.
Análisis de datos de obtención de imágenes por RM
Análisis semicuantitativos (IRM digital Vd/Vi): Se realizó el análisis del volumen de distribución (Vd) con el software de obtención de imágenes OsiriX versión 3.1 (The OsiriX Foundation, Ginebra, Suiza). Se identificaron sitios de infusión, vías de la cánula y punta de la cánula en imágenes de RM potenciadas en T1 en el plano coronal. Se delinearon las regiones de interés (ROI) para esbozar las señales en T1 con gadolinio y sitios diana (es decir, el putamen y el núcleo caudado). Se analizaron las reconstrucciones volumétricas tridimensionales de la serie de imágenes y las ROI para estimar el volumen de distribución (Vd) de infusiones y la relación con el volumen de infundido (Vi).
Análisis histológico de la expresión transgénica: Para evaluar la expresión transgénica, se procesaron secciones de cerebro para análisis inmunohistoquímico (IHC). Los animales se anestesiaron profundamente con pentobarbital sódico (25 mg/kg i.v.) y se sacrificaron 4 semanas después de la administración de los vectores. Se extrajeron los cerebros y se seccionaron coronalmente en bloques de 6 mm. Los bloques se fijaron posteriormente en paraformaldehído tamponado (4 %) durante 24 h, se lavaron brevemente en PBS y se ajustaron en una disolución al 30 % de sacarosa/PBS para la crioconservación. Los bloques de cerebro fijados en formol se cortaron en secciones coronales de 40 gm en un criostato. Se recogieron en series las secciones de flotación libre que abarcaban todo el cerebro y se mantuvieron en disolución anticongelante para el análisis de IHC adicional.
Resultados
Tanto los vectores de AAV1-GFP como de AAV2-GFP impulsaron una expresión abundante de GFP de las neuronas transducidas como se visualizó por inmunohistoquímica. Después de la infusión de AAV1 en el núcleo caudado y el putamen por CED, se detectó una amplia inmunotinción de GFP en el núcleo caudado y el putamen (FIG. 2C y D), así como la sustancia negra (FIG. 2D). Además del cuerpo estriado también se transdujeron un gran número de regiones corticales de el cerebro de macacos de la India (FIG. 2A-D). La expresión de GFP cortical fue la más evidente en áreas corticales de asociación prefrontal, la corteza premotora, áreas corticales somatosensoriales primarias y la corteza motora primaria, así como extensas regiones de la corteza occipital (FIG. 2A-D).
La mayoría de las neuronas positivas para GFP dentro de la corteza se identificaron morfológicamente como neuronas piramidales localizadas en la lámina cortical IV, con proyecciones axónicas en las capas cubrientes. La densidad de neuronas positivas para GFP fue particularmente elevada en la corteza frontal (FIG. 3A y B) y occipital (FIG. 3C y D), donde se transdujeron grandes números de neuronas (FIG. 3B y D), además de astrocitos (FIG. 3A y C).
Ejemplo 2: Expresión generalizada de GFP después de la administración intraestriatal de vector de AAV2.
Se evaluó la capacidad de AAV2 para dirigirse eficientemente tanto a las estructuras estriatales como corticales en el cerebro de macaco de la India cuando se administra por administración mejorada por convección (CED). Los vectores de AAV que contienen ADNc de GFP bajo el control del potenciador del citomegalovirus / promotor de beta-actina de pollo (CBA) se infundieron en el núcleo caudado y el putamen de 8 macacos de la India adultos usando CED según los métodos descritos en el Ejemplo 1 anterior.
La infusión de AAV2 en el cuerpo estriado por CED produjo la expresión de GFP en las regiones inyectadas (núcleo caudado y putamen) (FIG. 4C), la sustancia negra (FIG. 4D) y un gran número de regiones corticales del cerebro de macacos de la India (FIG.4A-D). La expresión de GFP en el cuerpo estriado de animales inyectados con AAV2 pareció ser ligeramente más restringida y localizada cuando se comparó con la cobertura estriatal con vectores de AAV1. La expresión de GFP dentro del cuerpo estriado de NHP fue amplia, pero relativamente contenida dentro de los límites de la sustancia gris de la región elegida, sin evidencia de una fuga significativa relacionada con la infusión o reflujo del vector de AAV2-GFP en áreas no elegidas adyacentes. La expresión de GFP cortical fue evidente en las mismas regiones observadas para AAV1. Se transdujeron bien las áreas corticales de asociación prefrontal, la corteza premotora, las áreas corticales somatosensoriales primarias y la corteza motora primaria, así como amplias regiones de la corteza occipital (FIG. 4A-D).
Ejemplo 3: Comparabilidad de la expresión de GFP después de los vectores de AAV1 y AAV2 intraestriatales hecha por el proceso de transfección triple o de línea celular productora.
Hasta la fecha, la mayoría de los estudios preclínicos utilizan vectores de AAV preparados por transfección triple, seguido por purificación usando gradientes de cloruro de cesio o cromatografía en columna. Por lo tanto, para evaluar el impacto de la producción de vectores sobre la biodistribución in vivo, se compararon dos métodos de producción de vectores, transfección triple (TT) o línea celular productora (PCL). Los vectores de AAV1 y AAV2 generados por estas dos plataformas de fabricación diferentes se administraron por CED, y se comparó su distribución dentro del cerebro de macaco de la India.
La infusión de vectores de AAV1-GFP hecha por transfección triple dio distribución y cobertura de GFP equivalentes cuando se comparó con vectores de AAV1-GFP preparados por el proceso de línea celular productora. La distribución de GFP fue comparable entre vectores de AAV1-GFP (TT) (FIG. 5c y D) y AAV1-GFP (PCL) (FIG. 5A y B) 30 días después de la inyección en el cuerpo estriado de macacos de la India.
Se observaron resultados similares con los vectores de AAV2-GFP. La distribución de GFP fue similar y comparable entre cerebros inyectados con AAV2-GFP (TT) (FIG. 6C y D) y AAV2-GFP (PCL) (FIG. 6A y B).
Para medir el rendimiento de la infusión, se infundió AAV1-eGFP (TT); AAV2-eGFP (TT); AAV1-eGFP (PCL); y AAV2-eGFP (PCL) en cada uno el cuerpo estriado (60 gl en el putamen y 30 gl en el núcleo caudado), usando 90 gl de cada vector mezclado con agente de contraste de gadolinio (Prohance 2 mM; Bracco Diagnostics, Inc.). Las imágenes de resonancia magnética (IRM) de cada infusión confirmaron entonces que la posición de cada cánula era precisa y el infundido cubrió el área diana. Todas las infusiones estuvieron bien contenidas en la estructura diana. Las reconstrucciones tridimensionales de la distribución del infundido generadas a partir de la señal de gadolinio en imágenes de RM mostraron que tanto la colocación como la distribución de infundido fueron muy coherentes en todos los animales. Además, la relación (Vd/Vi) entre el volumen de distribución (Vd) y el volumen de infusión (Vi) se calculó para cada administración y los datos fueron coherentes en todas las infusiones. Vd fue aproximadamente 3 veces mayor (intervalo de 2,1 - 4,6) que Vi (Tablas 6 y 7).
Tabla 6. Infusión de vector y grado de distribución en el cerebro 4 semanas después de la transducción (media ±
DE).
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Tabla 7. Infusión de vector y grado de distribución en el cerebro 4 semanas después de la transducción (valores individuales).
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Después de la inyección bilateral de tanto AAV1-eGFP como AAV2-eGFP (preparados por ambos métodos de producción, TT y PCL) en el cuerpo estriado de NHP, la robusta expresión de eGFP fue evidente en tanto las estructuras diana (el putamen y el núcleo caudado), así como en las regiones de proyección (regiones de globo pálido externo e interno - GPe y GPi, sustancia negra - SN, núcleo subtalámico - STN, regiones corticales - capas neuronales IV y V) (FIG. 7).
Para evaluar la función del gadolinio (Gd) como marcador de la distribución de vector, se calculó la relación entre el área de expresión de GFP (de secciones histológicas) y el área de la señal de gadolinio en barridos de RM correspondientes. Para los monos infundidos con el serotipo AAV1, esta relación fue 1,21 ± 0,10, mientras que para AAV2 fue 0,74 ± 0,04 (FIG. 8). La relación de 1,0 indica una coincidencia perfecta entre la expresión de GFP y la distribución de vector como se ha determinado por IRM. Esta diferencia indicó que el vector AAV1 se distribuyó más allá de la señal de Gd y logró mejor diseminación en el área de transducción primaria que AAV2.
Para evaluar la distribución de los vectores de AAV infundidos dentro del cerebro, se tiñeron secciones de cerebro de flotación libre representativas (3 por cada bloque; espesor 40 pm) de cada animal con un anticuerpo de conejo anti-GFP (Millipore; Cat. N.° 3850, dilución 1:500). La evaluación inmunohistoquímica reveló señal de DAB marrón oscura dentro de las dianas inyectadas (putámenes y núcleos caudados derechos e izquierdos), así como múltiples áreas proyectadas de las áreas inyectadas (regiones corticales).
Proyectando el grado de expresión de GFP sobre barridos de IRM de cerebro de mono, se calculó el porcentaje de cobertura para las regiones corticales (áreas del cerebro relevantes en HD) (véase la Tabla 6 para un resumen y la Tabla 7 para más detalles). En todos los monos, el 24 % del cuerpo estriado se transdujo en promedio, que produjo una expresión sustancial de GFP en la corteza (FIG. 7). El grado de expresión de GFP en la corteza no se correlacionó con el serotipo de AAV usado (AAV1 frente a AAV2) ni con el método de producción de vector (TT frente a PCL). Parece que una distribución más amplia del infundido dentro del sitio de infusión (el cuerpo estriado) fue un iniciador clave del grado de transducción en la corteza. Un NHP (Sujeto N.° 1; AAV1-eGFP [TT]) mostró una diseminación particularmente robusta de la expresión de GFP en las regiones corticales (capa IV y V) de todo el cerebro (tanto frontal como occipital - véase la FIG. 7). Otros animales mostraron una variabilidad en la expresión cortical asociada a variaciones tanto en el grado como en las regiones anatómicas localizadas dentro del núcleo caudado y el putamen. Puesto que se eligieron las regiones pre- y comisurales del cuerpo estriado, la GFP se detectó más en las regiones corticales frontal y parietal y menos en la corteza occipital. El análisis histológico para cada animal se resume a continuación (agrupado por grupo de tratamiento).
Grupo de tratamiento 2 (ssAAV2/ 1-CBA-eGFP TT)
La evaluación inmunohistoquímica de la expresión de eGFP en el cerebro completo reveló una señal robusta en los sitios dirigidos (tanto los putámenes como los núcleos caudados) y estructuras proyectadas (el globo pálido, la sustancia negra, el tálamo, el núcleo subtalámico y las regiones corticales).
Sujeto número 1. El sujeto mostró una diseminación particularmente robusta de la expresión de GFP a las regiones corticales (capa 4 y 5) de todo el cerebro (tanto frontal como occipital). La morfología de las células positivas para GFP implicó tanto transducción neuronal como astrocítica, que se confirmó posteriormente por tinción inmunofluorescente doble (véase a continuación). El cálculo de la cobertura de expresión de GFP mostró que se transdujo el 91 % de toda la corteza (véase la Tabla 7) (este cálculo se hizo proyectando el grado de señal de GFP sobre barridos de IRM del cerebro de mono analizado).
Sujeto número 2. El sujeto mostró una transducción robusta en los putámenes y los núcleos caudados, así como el globo pálido y la sustancia negra de ambos hemisferios. La proyección de la expresión de GFP a la corteza fue menos pronunciada que en el sujeto número 1 y se observó principalmente en las regiones frontales de la corteza. Aunque la señal de GFP también se detectó en la corteza occipital, la densidad de células positivas para GFP fue significativamente menor. La cobertura de la expresión cortical de GFP representó el 50 % (Tabla 7). Similarmente, como en el sujeto número 1, las células positivas para GFP tuvieron tanto morfología neuronal como astrocítica, que se confirmó por inmunofluorescencia doble.
Sujeto número 3. El sujeto mostró una fuerte expresión de GFP en los putámenes y los núcleos caudados, así como todas las estructuras proyectadas (el globo pálido, la sustancia negra, el núcleo subtalámico, el tálamo y la corteza). Aunque la señal de GFP se detectó claramente en algunas regiones de la corteza, la expresión de GFP representó solo el 41 % de su cobertura cortical global (la más baja de todos los monos probados; véase la Tabla 7). Se transdujeron tanto las neuronas como los astrocitos. Una gran parte de la corona radiante anterior derecha también mostró señal positiva para GFP, lo más probablemente como resultado del derramamiento de vector de la cánula que penetra el cuerpo estriado.
Grupo de tratamiento 3 (ssAAV2/2-CBA-eGFP TT)
Sujeto número 6. El sujeto mostró una fuerte señal de GFP en ambas estructuras dirigidas (el putamen y el núcleo caudado). Se detectaron células positivas densamente dispersadas en ambas regiones. La expresión de g Fp también se extiende a las regiones corticales frontales, el globo pálido, la sustancia negra, el núcleo subtalámico, y algunas partes del tálamo. La cobertura de la expresión de GFP en la corteza representó el 75 % (Tabla 7). Las células positivas para GFP tuvieron morfología principalmente neuronal, que se confirmó posteriormente por inmunofluorescencia doble. Se detectaron células positivas para GFP de forma de astrocito en la cápsula interna, así como en algunos puntos corticales y áreas de sustancia blanca estrechamente vecinas con vías claramente visibles de las cánulas de infusión.
Sujeto número 7. El sujeto mostró señal positiva para GFP dentro el cuerpo estriado derecho e izquierdo (tanto el putamen como el núcleo caudado). Su distribución fue bastante escasa y pareció "irregular" en vez de uniforme cuando se comparó con otros monos infundidos. Por consiguiente, la señal de GFP en todas las estructuras de cerebro proyectadas pareció también más débil. La cobertura de expresión de GFP en la corteza representó el 47 % (Tabla 7). Las células positivas para GFP tuvieron morfología principalmente neuronal, que se confirmó posteriormente por inmunofluorescencia doble. Las células positivas para GFP de forma de astrocito se detectaron en la cápsula interna, así como en algunos puntos corticales y áreas de sustancia blanca muy próximas con vías claramente visibles de las cánulas de infusión.
Grupo de tratamiento 4 (ssAAV2/ 1-CBA-eGFP PCL)
Sujeto número 4. El sujeto mostró expresión de GFP muy robusta en las estructuras elegidas, el putamen y el núcleo caudado. La señal positiva para GFP también se detectó en el globo pálido, la sustancia negra, el núcleo subtalámico, el tálamo y las regiones corticales. La cobertura de la expresión de GFP en la corteza representó el 61 % (Tabla 7). La parte anterior de la corona radiante también mostró señal positiva para GFP, lo más probablemente como resultado del derramamiento de vector de las cánulas que penetran en el cuerpo estriado. Las células positivas tuvieron tanto morfología neuronal como astrocítica, que fue después confirmada por inmunofluorescencia doble.
Sujeto número 5. El sujeto mostró expresión de GFP robusta en el cuerpo estriado (tanto el putamen como el núcleo caudado). La señal de GFP también se detectó en estructuras proyectadas (el globo pálido, la sustancia negra, el núcleo subtalámico, el tálamo y las regiones corticales). La cobertura de la expresión de GFP en la corteza representó el 68 % (Tabla 7). La parte anterior de la corona radiante también mostró señal positiva para GFP, lo más probablemente como resultado del derramamiento de vector de las cánulas que penetran en el cuerpo estriado. Las células positivas tuvieron tanto morfología neuronal como astrocítica.
Grupo de tratamiento 5 (ssAAV2/2-CBA-eGFP PCL)
Sujeto número 9. El sujeto mostró expresión de GFP muy robusta en el cuerpo estriado (tanto el putamen como el núcleo caudado). La señal de GFP también se detectó en estructuras proyectadas (el globo pálido, la sustancia negra, el núcleo subtalámico, el tálamo y las regiones corticales). La cobertura de la expresión de GFP en la corteza representó el 73 % (Tabla 7). Las células positivas para GFP tuvieron principalmente morfología neuronal, aunque las células positivas para GFP de forma de astrocito también se detectaron dentro de caminos de sustancia blanca (cápsula interna) y vecindad inmediata de las vías de la cánula.
Sujeto número 8. El sujeto mostró expresión de GFP robusta en el cuerpo estriado y las estructuras proyectadas (el globo pálido, la sustancia negra, el núcleo subtalámico, el tálamo y las regiones corticales). La cobertura de la expresión de GFP en la corteza representó el 50 % (Tabla 7). Las células positivas para GFP tuvieron principalmente morfología neuronal, aunque las células GFP+ de forma de astrocito también se detectaron dentro de tramos de sustancia blanca (cápsula interna, corona radiante) y en la vecindad inmediata de las vías de la cánula.
Inmunofluorescencia doble
Para ambos grupos de NHP transducidos con vectores AAV1-eGFP (TT y PCL), la morfología de células positivas para GFP indicó tanto transducción neuronal como astrocítica (FIG. 9A-9D). Esto se confirmó por tinción de inmunofluorescencia doble con una combinación de anticuerpos contra GFP y NeuN (marcador neuronal) o GFP y S-100 (marcador astrocítico) (FIG. 10A-10C). A diferencia, AAV2-eGFP (tanto TT como PCL) dirigieron predominantemente la transducción neuronal (FIG. 9E-9G y 10D). Células positivas para GFP de linaje astrocítico también se detectaron en la cápsula interna (FIG. 9H), así como en regiones corticales de sustancia blanca donde los caminos de la cánula de infusión fueron visibles.
Basándose en la inmunofluorescencia doble, se calculó la eficiencia de la transducción neuronal en el cuerpo estriado y las regiones corticales (en el plano coronal del sitio de infusión) para todos los NHP. La FIG. 11A resume los resultados en el cuerpo estriado. Cálculos individuales para cada animal se muestran en la Tabla 8 a continuación.
Tabla 8. Eficiencia de transducción neuronal por vectores AAV1-eGFP y AAV2-eGFP dentro de las áreas primarias estriatales de transducción (PAT) y la corteza del cerebro de primate no humano.
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La transducción neurona! estriatal en las regiones de transducción primaria, indicada por IRM, varió del 50 % al 65 %. La mayor eficiencia de transducción se observó en NHP infundidos con AAV1-eGFP (TT) con la media de 64,2 ± 5,9 % y la menor en el grupo AAV2-eGFP (TT) con la media de 46,6 ± 11,7 % (p < 0,05; a No Va bilateral). Esto sugiere que el serotipo AAV1 tiene ~ 18 % mayor eficiencia en transducir neuronas que AAV2. AAV1-eGFP producido por PCL demostró una tendencia más débil (p> 0,05; ANOVA bilateral) hacia la transducción de más neuronas (59,7± 8,1 %) que AAV2-eGFP (50,1± 5,8 %).
Los cálculos anteriores derivaron de áreas de fuerte transducción de GFP como se define por IRM (área de transducción primaria - PAT). Además, la eficiencia de la transducción estriatal neuronal en regiones fuera de PAT se calculó viendo si las células positivas para GFP podrían también ser detectadas fuera del claro límite de señal de GFP fuerte ("fuera del área de transducción primaria"- OPAT), lo que indica quizás que todos los vectores probados se extienden del mismo modo. El esquema de cómo se eligieron estas áreas (selección aleatoria de 5 marcos de recuento) se ilustra en la FIG. 11B. Se observó una espectacular diferencia en la estimación de la eficiencia de transducción en OPAT entre los serotipos AAV1 y AAV2 (FIG. 11C), transduciendo AAV1 mucho más neuronas que AAV2 (8,1 ± 3,8 % frente a 0,74 ± 0,25 % para los grupos TT y 7,2 ± 3,5 % frente a 2,16 ± 1,8 % para los grupos pCl ; p<0,05 en ambas comparaciones ANOVA bilateral). Los cálculos individuales para cada animal se muestran en la Tabla 9 a continuación.
Tabla 9. Eficiencia de la transducción neuronal por vectores AAV1-eGFP y AAV2-eGFP dentro del cuerpo estriado pero fuera de las áreas de transducción primarias (OPAT) del cerebro de primate no humano.
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Además, se calculó la eficiencia de transducción en regiones corticales que se proyectan hacia el cuerpo estriado. Puesto que el grado de cobertura cortical varió entre animales, se contaron áreas corticales aleatorias en secciones con cuerpo estriado positivo para GFP adyacente. Hubo una evidente discrepancia observada entre los animales (Tabla 8) sin una clara correlación con el serotipo usado. La eficiencia de transducción neuronal media para AAV1 fue 13,6 ± 8,3 % frente a 13,4 ± 9,0 % para AAV2 (p > 0,97).
Como se ha mencionado anteriormente, AAV1-eGFP transdujo muchos más astrocitos (marcador S-100) que neuronas. Los astrocitos positivos para GFP se detectaron en los sitios de transducción primaria (el cuerpo estriado), así como en regiones corticales que se proyectan hacia el cuerpo estriado. Los ejemplos de astrocitos transducidos con GFP se muestran en la FIG. 10C. Para vectores de AAV2-eGFP, solo se pudieron detectar astrocitos GFP+ esporádicos que rodeaban el camino de las cánulas de infusión. Para determinar si los vectores transdujeron otras células presentadoras de antígenos en el cerebro, se tiñeron simultáneamente secciones de cerebro representativas de todos los monos con anticuerpos contra GFP y Iba-1, específicos para microglía. Ninguno de los animales mostró células doblemente marcadas, excluyendo esta posibilidad (FIG. 10E). A su vez, en todos los monos probados, la tinción contra Olig-2, el marcador para oligodendrocitos, solo mostró algunas células positivas para tanto GFP como Olig-2. Las células dispersas se detectaron principalmente en la proximidad de los caminos de la cánula (datos no mostrados).
Se tiñeron secciones de cerebro con hematoxilina-eosina (H&E) para determinar si estos vectores desencadenaron la neuroinflamación. Se examinaron las secciones principalmente para la presencia de infiltrado perivascular -acumulación de linfocitos o células plasmáticas en una masa densa alrededor de los vasos sanguíneos. Aunque se detectaron grados variables de dichos infiltrados en todos los monos, no se observaron otros hallazgos histológicos relacionados con el vector/transgén. Sin embargo, se observó que AAV1 causaba una infiltración de macrófagos y linfocitos ligeramente más pronunciada dentro de las áreas primarias de transducción que AAV2 (FIG. 12A y 12B).
Por tanto, pareció que los vectores producidos por transfección triple causaron un infiltrado perivascular más extenso que los vectores generados por el proceso de líneas celulares productoras. De interés, no se detectaron infiltrados en áreas de protección de transducción (regiones corticales).

Claims (19)

REIVINDICACIONES
1. Una partícula vírica adenoasociada recombinante (rAVV) para su uso en un método de administración de un rAAV al sistema nervioso central (SNC) de un mamífero, en donde la partícula de rAAV se administra al cuerpo estriado del mamífero por administración mejorada por convección (CED), en donde la partícula de rAAV comprende un vector de rAAV que codifica un ácido nucleico heterólogo que se expresa en al menos la corteza occipital y/o la capa IV de la corteza cerebral y el cuerpo estriado del mamífero, en donde la partícula de rAAV comprende una cápside de AAV de serotipo 2 (AAV2), y en donde la partícula de rAAV se administra a al menos un sitio en el núcleo caudado y dos sitios en el putamen en cada hemisferio del cuerpo estriado.
2. Una partícula vírica adenoasociada recombinante (rAVV) para su uso en un método de tratamiento de un trastorno del SNC en un mamífero, en donde una cantidad eficaz de la partícula de rAAV se administra al cuerpo estriado del mamífero por administración mejorada por convección (CED), en donde la partícula de rAAV comprende un vector de rAAV que codifica un ácido nucleico heterólogo que se expresa en al menos la corteza occipital y/o la capa IV de la corteza cerebral y el cuerpo estriado del mamífero, en donde la partícula de rAAV comprende una cápside de AAV2, y en donde la partícula de rAAV se administra a al menos un sitio en el núcleo caudado y dos sitios en el putamen en cada hemisferio del cuerpo estriado.
3. La partícula de rAAV para el uso de la reivindicación 2, en donde el trastorno del SNC es enfermedad de Huntington, en donde opcionalmente el ácido nucleico heterólogo codifica un polipéptido terapéutico o un ácido nucleico terapéutico que inhibe la expresión de huntingtina (HTT) o inhibe la acumulación de HTT en células del SNC del mamífero.
4. La partícula de rAAV para el uso de la reivindicación 3, en donde el ácido nucleico heterólogo codifica un miARN terapéutico que silencia a la huntingtina, y en donde opcionalmente la huntingtina comprende una mutación asociada a enfermedad de Huntington.
5. La partícula de rAAV para el uso de la reivindicación 2, en donde el trastorno del SNC es la enfermedad de Parkinson, y en donde opcionalmente el ácido nucleico heterólogo codifica un polipéptido terapéutico, en donde opcionalmente el polipéptido terapéutico es el factor de crecimiento derivado de la glía (GDNF), el factor de crecimiento derivado del cerebro (BDNF), la tirosina hidroxilasa (TH), la GTP-ciclohidrolasa (GTPCH) y/o la aminoácido descarboxilasa (AADC).
6. La partícula de rAAV para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el mamífero es un ser humano.
7. La partícula de rAAV para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde la partícula de rAAV se administra al putamen y el núcleo caudado del cuerpo estriado, en donde la relación entre partículas de rAAV administradas al putamen y partículas de rAAV administradas al núcleo caudado es al menos aproximadamente 2:1.
8. La partícula de rAAV para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -7, en donde:
(a) el ácido nucleico heterólogo se expresa en las áreas corticales de asociación prefrontal, la corteza premotora, las áreas corticales somatosensoriales primarias, la corteza motora sensorial, la corteza parietal, la corteza occipital y/o la corteza motora primaria;
(b) la partícula de rAAV experimenta transporte retrógrado o anterógrado en la corteza cerebral; y/o
(c) el ácido nucleico heterólogo se expresa además en el tálamo, el núcleo subtalámico, el globo pálido, la sustancia negra y/o el hipocampo.
9. La partícula de rAAV para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde el vector de rAAV comprende el ácido nucleico heterólogo flanqueado por una o más secuencias de repeticiones terminales invertidas (ITR) de AAV, en donde opcionalmente:
(a) el ácido nucleico heterólogo está flanqueado por dos ITR de AAV; y/o
(b) las ITR de AAV son ITR de serotipo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, AAV de cabra, AAV bovino o AAV de ratón.
10. La partícula de rAAV para el uso de la reivindicación 9, en donde:
(a) la una o más secuencias de ITR y la cápside de la partícula rAAV son del mismo serotipo de AAV; o
(b) la una o más secuencias de ITR y la cápside de la partícula vírica de rAAV son de diferentes serotipos de AAV.
11. La partícula de rAAV para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde el ácido nucleico heterólogo está operativamente unido a un promotor, en donde opcionalmente:
(a) el promotor expresa el ácido nucleico heterólogo en una célula del SNC, en donde opcionalmente el promotor expresa el ácido nucleico heterólogo en una célula del cerebro;
(b) el promotor expresa el ácido nucleico heterólogo en una neurona y/o una célula de la glía, en donde opcionalmente la neurona es una neurona mediana espinosa del núcleo caudado, una neurona mediana espinosa del putamen, una neurona de la capa IV de la corteza y/o una neurona de la capa V de la corteza;
(c) el promotor es un promotor de CBA, un promotor mínimo de CBA, un promotor del CMV o un promotor de GUSB; y/o
(d) el promotor es inducible.
12. La partícula de rAAV para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde el vector de rAAV comprende uno o más de un potenciador, un par donante de empalme/aceptor de empalme, un sitio de unión a la matriz y una señal de poliadenilación.
13. La partícula de rAAV para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde el vector de rAAV es un vector de rAAV autocomplementario, en donde opcionalmente el vector comprende una primera secuencia del ácido nucleico que codifica el ácido nucleico heterólogo y una segunda secuencia del ácido nucleico que codifica un complemento del ácido nucleico heterólogo, en donde la primera secuencia del ácido nucleico puede formar pares de bases intracatenarios con la segunda secuencia del ácido nucleico a lo largo de la mayoría de su longitud o toda su longitud; y en donde opcionalmente la primera secuencia del ácido nucleico y la segunda secuencia del ácido nucleico están unidas por una ITR de AAV mutada, en donde la ITR de AAV mutada comprende una deleción de la región D y comprende una mutación de la secuencia de resolución terminal.
14. La partícula de rAAV para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2 y 6-13, en donde el ácido nucleico heterólogo codifica:
(a) un polipéptido terapéutico; o
(b) un ácido nucleico terapéutico, en donde opcionalmente el ácido nucleico terapéutico es un ARNip, un ARNhp, una iARN, un miARN, un ARN antisentido, una ribozima o una DNAzima.
15. La partícula de rAAV para el uso de la reivindicación 14, en donde:
(a) el polipéptido terapéutico es una enzima, un factor neurotrófico, un polipéptido que es deficiente o está mutado en un individuo con un trastorno relacionado con el SNC, un antioxidante, un factor anti-apoptósico, un factor antiangiogénico, y un factor antiinflamatorio, alfa-sinucleína, beta-glucosidasa ácida (GBA), beta-galactosidasa-1 (GLB1), iduronato 2-sulfatasa (IDS), galactosilceramidasa (GALC), una manosidasa, alfa-D-manosidasa (MAN2B1), beta-manosidasa (MANBA), pseudoarilsulfatasa A (ARSA), N-acetilglucosamina-1-fosfotransferasa (GNPTAB), esfingomielinasa ácida (ASM), proteína C de Niemann-Pick (NPC1), alfa-1,4-glucosidasa ácida (GAA), subunidad beta de hexosaminidasa, HEXB, sulfohidrolasa de N-sulfoglucosamina (MPS3A), N-alfaacetilglucosaminidasa (NAGLU), heparin acetil-CoA, alfa-glucosaminidasa N-acetiltransferasa (MPS3C), N-acetilglucosamina-6-sulfatasa (GNS), alfa-N-acetilgalactosaminidasa (NAGA), beta-glucuronidasa (GUSB), subunidad alfa de hexosaminidasa (HEXA), huntingtina (HTT), lipasa ácida lisosómica (LIPA), aspartilglucosaminidasa, alfa-galactosidasa A, palmitoil proteína tioesterasa, tripeptidil peptidasa, proteína transmembranaria lisosómica, transportador de cisteína, ceramidasa ácida, alfa-L-fucosidasa ácida, catepsina A, alfa-L-iduronidasa, arilsulfatasa B, arilsulfatasa A, N-acetilgalactosamina-6-sulfato, beta-galactosidasa ácida o alfa-neuramidasa; o
(b) el polipéptido terapéutico o el ácido nucleico terapéutico se usa para tratar un trastorno del SNC, en donde opcionalmente:
(i) el trastorno del SNC es enfermedad de Huntington, epilepsia, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, accidente cerebrovascular, degeneración corticobasal (CBD), degeneración ganglionar corticobasal (CBGD), demencia frontotemporal (FTD), atrofia multisistémica (MSA), parálisis supranuclear progresiva (PSP) o cáncer del cerebro; o
(ii) el trastorno es una enfermedad de almacenamiento lisosómico seleccionada del grupo que consiste en aspartilglucosaminuria, Fabry, enfermedad infantil de Batten (CNL1), enfermedad infantil de Batten tardía clásica (CNL2), enfermedad juvenil de Batten (CNL3), la forma de Batten CNL4, la forma de Batten CNL5, la forma de Batten CNL6, la forma de Batten CNL7, la forma de Batten CNL8, cistinosis, Farber, fucosidosis, galactosidosialidosis , enfermedad de Gaucher de tipo 1, enfermedad de Gaucher de tipo 2, enfermedad de Gaucher de tipo 3, gangliosidosis GM1, enfermedad de Hunter, enfermedad de Krabbe, enfermedad de amanosidosis, enfermedad de p-manosidosis, Maroteaux-Lamy, enfermedad de leucodistrofia metacromática, Morquio A, Morquio B, enfermedad de mucolipidosis II/III, enfermedad de Niemann-Pick A, enfermedad de Niemann-Pick B, enfermedad de Niemann-Pick C, enfermedad de Pompe, enfermedad de Sandhoff, enfermedad de Sanfillipo A, enfermedad de Sanfillipo B, enfermedad de Sanfillipo C, enfermedad de Sanfillipo D, enfermedad de Schindler, Schindler-Kanzaki, sialidosis, enfermedad de Sly, enfermedad de Tay-Sachs y enfermedad de Wolman.
16. La partícula de rAAV para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-15, en donde la partícula de rAAV está en una composición, en donde opcionalmente la composición es una composición farmacéutica que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable.
17. La partícula de rAAV para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -16, en donde:
(a) la partícula de rAAV se produjo por transfección triple de un ácido nucleico que codifica el vector de rAAV, un ácido nucleico que codifica rep y cap de AAV y un ácido nucleico que codifica funciones del virus auxiliar AAV en una célula hospedadora, en donde la transfección de los ácidos nucleicos a las células hospedadoras genera una célula hospedadora capaz de producir partículas de rAAV; o
(b) la partícula de rAAV se produjo por una línea celular productora que comprende uno o más ácidos nucleicos que codifican el vector de rAAV, un ácido nucleico que codifica rep y cap de AAV y un ácido nucleico que codifica funciones del virus auxiliar AAV.
18. La partícula de rAAV para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -17, en donde la partícula de rAAV se administra usando un sistema de administración por CED.
19. La partícula de rAAV para el uso de la reivindicación 18, en donde el sistema de CED comprende:
(a) una cánula, en donde opcionalmente la cánula es una cánula resistente al reflujo o una cánula escalonada; y/o
(b) una bomba, en donde opcionalmente la bomba es:
(i) una bomba manual;
(ii) una bomba osmótica; o
(iii) una bomba de infusión.
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