TW202111127A - 用於治療亨丁頓舞蹈症之組合物及方法 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於編碼siRNA分子之腺相關病毒(AAV)粒子之醫藥組合物及治療亨丁頓舞蹈症(Huntington’s Disease；HD)之方法。

Description

用於治療亨丁頓舞蹈症之組合物及方法
本文提供用於設計、製備、製造、使用及/或調配AAV粒子之組合物、方法及製程，該等AAV粒子包含調節聚核苷酸，例如編碼靶向亨丁頓蛋白(Huntingtin，HTT)基因(例如野生型或突變型CAG擴增之HTT基因)之小干擾RNA(siRNA)分子之聚核苷酸。對突變型HTT基因之靶向可干擾HTT基因表現及所得HTT蛋白產生。可將包含編碼siRNA分子之調節聚核苷酸的AAV粒子插入至重組腺相關病毒(AAV)載體中。本發明亦揭示使用AAV粒子抑制患有神經退化性疾病(例如亨丁頓舞蹈症(Huntington's Disease，HD))之個體中HTT基因表現的方法。
亨丁頓舞蹈症(HD)係單基因性致命神經退化性疾病，其特徵在於進行性舞蹈病、神經精神及認知功能障礙。已知亨丁頓舞蹈症由編碼在亨丁頓蛋白(HTT)之N端中的聚麩醯胺酸的常染色體顯性三聯體(CAG)重複擴增引起。此重複擴增造成HTT功能之毒性增加且最終引起紋狀體神經退化，其進展為廣泛腦萎縮。症狀通常在35-44歲之間出現且發作之後預期壽命為10-25年。有趣的是，HTT擴增之長度與發作之年齡及疾病進展之速率相關，其中較長擴增與較大之疾病嚴重程度相關。在較小百分比之HD群體(約6%)中，疾病發作發生於2-20歲，且出現運動不能-強直症候群。此等病例傾向於比更晚發作之病例更快地進展且已分類為幼年型或韋士伐(Westphal)變體HD。據估計，在美國及歐洲目前大約有35,000-70,000名患者罹患HD。目前，僅可使用症狀緩解及支撐療法治療HD，並且治癒方案尚待確認。最終，患有HD之個體死於其他疾病(例如肺炎、心衰竭)、氣哽、窒息或其他併發症，諸如來自跌倒之物理損傷。
並未充分瞭解CAG擴增之HTT產生神經毒性之機制。亨丁頓蛋白表現於所有細胞中，但其濃度在腦中最高。HTT之正常功能未知，但在HD患者之腦中，HTT聚集至異常核內涵體中。現認為係此錯誤摺疊及聚集過程以及相關蛋白中間物(亦即可溶性物種及有毒N端片段)產生了神經毒性。
在HD動物模型中之研究已表明表型逆轉為可行的，例如在表現經調控之模型中之基因阻斷(gene shut off)之後。另外，其中測試HTT之靜默之動物模型展現了有前景之結果，其中療法具有良好耐受性且展示潛在的治療益處。此等發現指示HTT靜默可充當治療HD之潛在治療目標。
腺相關病毒(AAV)為細小病毒科(parvovirus family)之成員，且因為此病毒為明顯非病原性的，很大程度上已顯現為用於基因療法之有吸引力的載體；實際上，AAV尚未與任何人類疾病有聯繫。另外之吸引力係歸因於其轉導分裂及非分裂細胞(包括神經元之高效轉導)之能力、在人類中減弱之促炎性及免疫反應、不能在無輔助病毒之情況下自主複製(AAV為屬於依賴病毒(Dependovirus )屬之輔助依賴型DNA細小病毒)，及其長期基因表現。儘管有超過10種重組AAV血清型(rAAV)已經工程改造成載體，但rAAV2為基因療法試驗最常採用的血清型。已在動物模型中開發及測試對神經元轉導更有效之額外rAAV血清型。
本發明研發一種包含編碼新穎雙股RNA (dsRNA)構築體及siRNA構築體之調節聚核苷酸之AAV粒子及其設計方法，以抑制或預防HD患者中之CAG擴增之HTT之表現，以用於治療疾病。本發明進一步揭示包含靶向HTT mRNA之調節聚核苷酸(例如，siRNA)之AAV粒子之調配、給藥及投與，以用於治療HD。
本文描述用於投與包含編碼siRNA分子之調節聚核苷酸的AAV粒子，以治療、預防、緩和及/或改善亨丁頓舞蹈症(HD)相關症狀及病症之組合物、方法、製程、套組及/或裝置。
本發明提供包含AAV粒子之用於治療亨丁頓舞蹈症(HD)的醫藥組合物，其中在醫藥學上可接受之調配物中AAV粒子中之至少一者包含AAV病毒基因體，其包含靶向HTT mRNA的調節聚核苷酸(例如siRNA)。
在一些實施例中，醫藥組合物中AAV病毒基因體之濃度為1×1011 至1×1012 VG/mL。在一些實施例中，AAV病毒基因體之濃度為1×1011 至9×1011 VG/mL。在一些實施例中，AAV病毒基因體之濃度為1.2×1011 至6×1011 VG/mL。在一些實施例中，AAV病毒基因體之濃度為1.8×1011 至6×1011 VG/mL。在一些實施例中，AAV病毒基因體之濃度為5×1011 至8×1011 VG/mL。
在一些實施例中，AAV粒子包含AAV病毒基因體，其包含選自由SEQ ID NO: 1352-1379、1388及1426-1438組成之群的聚核苷酸序列或其具有至少95%一致性之變異體。在一些實施例中，聚核苷酸序列包含SEQ ID NO: 1352。
在一些實施例中，AAV粒子可包含AAV衣殼，該AAV衣殼包含衣殼血清型，諸如但不限於表1中所列之衣殼血清型中之任一者。在一些實施例中，AAV粒子衣殼血清型可為AAV1血清型。
在一些實施例中，醫藥學上可接受之調配物為水性溶液，其包含： a)一或多種鹽，諸如但不限於氯化鈉、氯化鉀及磷酸鉀，或其組合； b)至少一種雙醣，諸如但不限於蔗糖；及 c)可選自以下之緩衝劑：Tris HCl、Tris鹼、磷酸鈉、磷酸鉀、組胺酸、硼酸、檸檬酸、甘胺酸、4-(2-羥乙基)-1-哌𠯤乙磺酸(HEPES)及3-(N-嗎啉基)丙磺酸(MOPS)。
在一些實施例中，醫藥學上可接受之調配物包含的氯化鈉之濃度可為85至110 mM。在一些實施例中，醫藥學上可接受之調配物可包含濃度為95 mM之氯化鈉。
在一些實施例中，醫藥學上可接受之調配物包含的氯化鉀之濃度可為1至3 mM。在一些實施例中，醫藥學上可接受之調配物可包含濃度為1.5 mM之氯化鉀。
在一些實施例中，醫藥學上可接受之調配物包含的磷酸鉀之濃度可為1至3 mM。在一些實施例中，醫藥學上可接受之調配物可包含濃度為1.5 mM之磷酸鉀。
在一些實施例中，醫藥學上可接受之調配物包含的蔗糖之濃度相對於醫藥學上可接受之調配物之總體積可為5至9重量%。在一些實施例中，蔗糖之濃度相對於醫藥學上可接受之調配物之總體積可為7重量%。
在一些實施例中，醫藥學上可接受之調配物包含的緩衝劑之濃度可為10 mM。
在一些實施例中，醫藥組合物可在5℃下緩衝至pH 7.2至8.2。在一些實施例中，緩衝劑可為磷酸鈉，且調配物可在5℃下緩衝至pH 7.2至7.6。在一些實施例中，緩衝劑可為可在5℃下用鹽酸調整至pH 7.3至7.7的Tris鹼。
在一些實施例中，醫藥組合物可進一步包含界面活性劑。在一些實施例中，界面活性劑可為泊洛沙姆(Poloxamer) 188。泊洛沙姆188之濃度相對於醫藥學上可接受之調配物之總體積可為0.01重量% (mg/L)。
在一些實施例中，醫藥學上可接受之調配物可具有400至480 mOsm/kg之重量莫耳滲透濃度。
本文進一步提供治療有需要之患者之亨丁頓舞蹈症的方法，其藉由向患者投與治療有效量之本文所述之醫藥組合物。在一些實施例中，醫藥組合物可經由輸注至患者之紋狀體中投與。輸注可雙側或單側輸注至患者紋狀體中。在一些實施例中，醫藥組合物可經由輸注至患者殼核及丘腦中投與。輸注可獨立地雙側或單側輸注至患者殼核及丘腦中。醫藥組合物可使用磁共振成像(MRI)引導之對流增強遞送(CED)投與。
在一些實施例中，向紋狀體投與之醫藥組合物之體積可為15 µL/半球或更少。在一些實施例中，向紋狀體投與之醫藥組合物之體積可為5至10 µL/半球。
在一些實施例中，向紋狀體投與之劑量可在2×109 至3×1011 VG/半球之間。
在一些實施例中，向殼核投與之醫藥組合物的體積可為1500 µL/半球或更少。在一些實施例中，向殼核投與之醫藥組合物的體積可為100至1500 µL/半球。
在一些實施例中，向殼核投與之劑量可在1×1010 至4×1013 VG/半球之間。
在一些實施例中，向丘腦投與之醫藥組合物之體積可為2500 µL/半球或更少。向丘腦投與之醫藥組合物之體積可為150-2500 µL/半球。
在一些實施例中，向丘腦投與之劑量可在4×1011 至6.8×1013 VG/半球之間。
在一些實施例中，向患者投與之總劑量可在8×109 至2×1014 VG之間。
在一些實施例中，本文所描述之方法抑制或遏制患者之組織，諸如但不限於紋狀體、殼核、尾核、丘腦、大腦皮質、初級運動皮質、初級體覺皮質、顳葉皮質及其組合中之亨丁頓蛋白(HTT)基因產物(RNA或蛋白質)之表現，包含投與治療有效量之本文所揭示之醫藥組合物。
在一些實施例中，HTT基因產物(RNA或蛋白質)之表現可降低至少30%。在一些實施例中，HTT基因產物(RNA或蛋白質)之表現可降低40%至70%。在一些實施例中，HTT基因產物(RNA或蛋白質)之表現可降低50%至80%。
在一些實施例中，HTT基因產物(RNA或蛋白質)之表現在殼核中經抑制或遏制且在殼核中之一或多個中型多棘神經元中經量測。在一些實施例中，HTT基因產物(RNA或蛋白質)之表現在殼核中經抑制或遏制且在殼核中之一或多個星形膠質細胞中經量測。
在一些實施例中，HTT基因產物(RNA或蛋白質)之表現在初級運動皮質、初級體覺皮質及顳葉皮質中之每一者之錐體神經元中經抑制或遏制。在一些實施例中，大腦皮質中之HTT基因產物(RNA或蛋白質)之表現可降低至少20%。
在一些實施例中，HTT基因產物(RNA或蛋白質)之表現在患者之紋狀體及大腦皮質兩者中經抑制或遏制。
在一些實施例中，HTT基因產物為HTT蛋白且HTT蛋白表現在患者之紋狀體、殼核、尾核及/或丘腦中經抑制或遏制。
在某些實施例中，殼核中之HTT蛋白之含量可降低至少10%。在某些其他實施例中，殼核中之HTT蛋白之含量可降低15至65%。
在某些實施例中，尾核中之HTT蛋白之含量可降低至少5%。在某些其他實施例中，尾核中之HTT蛋白之含量可降低5至50%。
在某些實施例中，丘腦中之HTT蛋白之含量可降低至少10%。在某些其他實施例中，丘腦中之HTT蛋白之含量降低15至80%。
在一些實施例中，HTT蛋白之含量在患者之紋狀體及丘腦兩者中降低。
相關申請之交叉參考
本申請案主張以下之權利：2019年7月24日申請之題為COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING HUNTINGTON'S DISEASE的美國臨時專利申請案第62/878,054號；2019年10月10日申請之題為COMPOSITIONS AND METHODS OF TREATING HUNTINGTON'S DISEASE的美國臨時專利申請案第62/913,407號；2019年10月22日申請之題為COMPOSITIONS AND METHODS OF TREATING HUNTINGTON'S DISEASE的美國臨時專利申請案第62/924,400號；2020年5月8日申請之題為COMPOSITIONS AND METHODS OF TREATING HUNTINGTON'S DISEASE的美國臨時專利申請案第63/021,861號；其中之每一者之內容以全文引用之方式併入本文中。 序列表
本申請案與電子格式之序列表一起申請。名稱為2057_1086TW_SL.txt之序列表文件建立於2020年7月24日，且大小為6,683,299位元組。電子格式之序列表中之資訊以全文引用之方式併入本文中。 I. 組合物
根據本發明，提供藉由腺相關病毒(AAV)遞送調節聚核苷酸及/或基於調節聚核苷酸之組合物的組合物。本文中所描述之AAV粒子可經由若干投與途徑中之任一者活體內、離體或活體外提供至細胞、組織、器官或生物體。
如本文所用，「AAV粒子」為病毒，其包括衣殼及具有至少一個酬載區(payload region)及至少一個ITR區之病毒基因體。本發明之AAV粒子可以重組方式產生，且可基於腺相關病毒(AAV)親本或參考序列。AAV粒子可衍生自本文中所描述或此項技術中已知之任何血清型，包括血清型之組合(亦即，「假型(pseudotyped)」AAV)，或衍生自各種基因體(例如，單股或自身互補的)。另外，AAV粒子可為複製缺陷型及/或靶向型的。
如本文所用，「病毒基因體」或「載體基因體」或「病毒載體」係指囊封於AAV粒子內的一或多個核酸序列。病毒基因體包含至少一個編碼多肽或其片段的酬載區。
如本文所用，「酬載」或「酬載區」為編碼本發明之一或多種多肽的任何核酸分子。在最低限度下，酬載區包含編碼有義及反義序列、基於siRNA之組合物或其片段之核酸序列，但亦可視情況包含一或多個功能或調控元件以促進轉錄表現及/或多肽轉譯。
本文揭示之核酸序列及多肽可經工程改造以含有模組化元件及/或序列模體，該等模組化元件及/或序列模體經組裝以允許調節聚核苷酸及/或基於調節聚核苷酸之組合物之表現。在一些實施例中，包含酬載區之核酸序列可包含啟動子區、內含子、Kozak序列、強化子或聚腺苷酸化序列中之一或多者。本文所揭示之酬載區通常彼此組合或與其他多肽部分組合地編碼至少一種有義及反義序列、基於siRNA之組合物或前述各者之片段。
可將本發明AAV粒子之病毒基因體內之酬載區遞送至一或多個目標細胞、組織、器官或生物體。腺相關病毒 (AAV) 及 AAV 粒子
細小病毒科(Parvoviridae family)病毒為特徵在於單股DNA基因體的無包膜二十面體小衣殼病毒。細小病毒科病毒由兩個亞科組成：感染脊椎動物之細小病毒亞科(Parvovirinae)，及感染無脊椎動物之濃核病毒亞科(Densovirinae)。由於其結構相對簡單、使用標準分子生物學技術易於操縱，此病毒科適用作生物學工具。病毒基因體可經修飾以含有用於組裝功能重組病毒或病毒粒子的最少組件，該功能重組病毒或病毒粒子負載有所要酬載或經工程改造以表現或遞送所要酬載，該酬載可被遞送至目標細胞、組織、器官或生物體。
細小病毒及細小病毒科中之其他成員大體描述於Kenneth I. Berns, 「Parvoviridae: The Viruses and Their Replication」, 第69章, FIELDS VIROLOGY (第3版，1996)中，該文獻之內容以全文引用之方式併入本文中。
細小病毒科包含依賴病毒屬，其包括能夠在脊椎動物宿主中複製之腺相關病毒(AAV)，該等脊椎動物宿主包括但不限於人類、靈長類動物、豬、牛、犬、馬及綿羊物種。
AAV病毒基因體(VG)為大約5,000個核苷酸(nt)長之線性單股DNA (ssDNA)分子或自身互補型(scAAV)。AAV病毒基因體可以包含酬載區及至少一個反向末端重複序列(ITR)或ITR區。ITR傳統上側接非結構蛋白(由Rep基因編碼)及結構蛋白(由衣殼基因或Cap基因編碼)之編碼核苷酸序列。雖然不希望受理論束縛，但AAV病毒基因體通常包含兩個ITR序列。AAV病毒基因體包含特徵性T形髮夾結構，該T形髮夾結構由形成能量上穩定的雙股區域的ssDNA之5'及3'端的自身互補末端145 nt定義。雙股髮夾結構包含多種功能，包括但不限於藉由充當宿主病毒複製細胞之內源DNA聚合酶複合體之引子來充當DNA複製之起點。
除所編碼的異源酬載之外，AAV載體亦可包含任何天然存在之及/或重組AAV血清型核苷酸序列或變異體之完整或部分病毒基因體。AAV變異體可具有在核酸(基因體或衣殼)及胺基酸層面(衣殼)具有顯著同源性的序列，以產生在實體及功能上大體等效的構築體，該等構築體藉由類似機制複製且藉由類似機制組裝。Chiorini等人, J. Vir. 71: 6823-33(1997)；Srivastava等人, J. Vir. 45:555-64 (1983)；Chiorini等人, J. Vir. 73:1309-1319 (1999)；Rutledge等人, J. Vir. 72:309-319 (1998)；及Wu等人, J. Vir. 74: 8635-47 (2000)，該等文獻中之每一者的內容均以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，本發明之AAV粒子為複製缺陷型重組AAV載體，其病毒基因體內不具有編碼功能Rep及Cap蛋白之序列。此等缺陷型AAV載體可能不具有大部分或所有親本編碼序列且基本上僅攜帶一或兩種AAV ITR序列及用於遞送至細胞、組織、器官或生物體之相關核酸。
在一些實施例中，本發明之AAV粒子之病毒基因體包含至少一個控制元件，其提供其中編碼之編碼序列之複製、轉錄及轉譯。並非所有控制元件都需要始終存在，只要編碼序列能夠在適當的宿主細胞中進行複製、轉錄及/或轉譯即可。表現控制元件之非限制性實例包括用於轉錄起始及/或終止之序列、啟動子及/或強化子序列、有效RNA處理信號(諸如剪接及聚腺苷酸化信號)、使細胞質mRNA穩定化之序列、增強轉譯功效之序列(例如Kozak共同序列)、增強蛋白質穩定性之序列及/或增強蛋白質處理及/或分泌之序列。
根據本發明，用於治療學及/或診斷學之AAV粒子包含已精簡或縮減至相關核酸酬載或負荷之轉導所必需之最少組件的病毒。以此方式，AAV粒子經工程改造成為用於特異性遞送，同時不具有野生型病毒中存在之有害複製及/或整合特徵之運載工具。
本發明之AAV載體可以重組方式產生且可基於腺相關病毒(AAV)親本或參考序列。如本文所用，「載體」為轉運、轉導或以其他方式充當諸如本文中所描述之核酸的異源分子之載劑的任何分子或部分。
除單股AAV病毒基因體(例如ssAAV)以外，本發明亦提供自身互補型AAV (scAAV)病毒基因體。scAAV病毒基因體含有黏接在一起以形成雙股DNA的DNA股。藉由跳過第二股合成，scAAV在細胞中實現快速表現。
在一些實施例中，本發明之AAV粒子為scAAV。
在一些實施例中，本發明之AAV粒子為ssAAV。
用於產生及/或修飾AAV粒子之方法揭示於此項技術中，諸如假型AAV載體(PCT專利公開案第WO200028004號；第WO200123001號；第WO2004112727號；第WO 2005005610號及第WO 2005072364號，該等公開案中每一者的內容以全文引用之方式併入本文中)。
AAV粒子可經修飾以增強遞送效率。此類經修飾之AAV粒子可有效封裝且用於以高頻率及最小毒性成功地感染目標細胞。在一些實施例中，AAV粒子之衣殼係根據美國公開案第US 20130195801號中所描述之方法工程改造，該公開案之內容以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，可將包含編碼本文所描述之多肽之酬載區的AAV粒子引入哺乳動物細胞中。 AAV血清型
本發明之AAV粒子可包含或衍生自任何天然或重組AAV血清型。根據本發明，AAV粒子可利用或基於選自以下中之任一者的血清型：AAV1、AAV2、AAV2G9、AAV3、AAV3a、AAV3b、AAV3-3、AAV4、AAV4-4、AAV5、AAV6、AAV6.1、AAV6.2、AAV6.1.2、AAV7、AAV7.2、AAV8、AAV9、AAV9.11、AAV9.13、AAV9.16、AAV9.24、AAV9.45、AAV9.47、AAV9.61、AAV9.68、AAV9.84、AAV9.9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV16.3、AAV24.1、AAV27.3、AAV42.12、AAV42-1b、AAV42-2、AAV42-3a、AAV42-3b、AAV42-4、AAV42-5a、AAV42-5b、AAV42-6b、AAV42-8、AAV42-10、AAV42-11、AAV42-12、AAV42-13、AAV42-15、AAV42-aa、AAV43-1、AAV43-12、AAV43-20、AAV43-21、AAV43-23、AAV43-25、AAV43-5、AAV44.1、AAV44.2、AAV44.5、AAV223.1、AAV223.2、AAV223.4、AAV223.5、AAV223.6、AAV223.7、AAV1-7/rh.48、AAV1-8/rh.49、AAV2-15/rh.62、AAV2-3/rh.61、AAV2-4/rh.50、AAV2-5/rh.51、AAV3.1/hu.6、AAV3.1/hu.9、AAV3-9/rh.52、AAV3-11/rh.53、AAV4-8/r11.64、AAV4-9/rh.54、AAV4-19/rh.55、AAV5-3/rh.57、AAV5-22/rh.58、AAV7.3/hu.7、AAV16.8/hu.10、AAV16.12/hu.11、AAV29.3/bb.1、AAV29.5/bb.2、AAV106.1/hu.37、AAV114.3/hu.40、AAV127.2/hu.41、AAV127.5/hu.42、AAV128.3/hu.44、AAV130.4/hu.48、AAV145.1/hu.53、AAV145.5/hu.54、AAV145.6/hu.55、AAV161.10/hu.60、AAV161.6/hu.61、AAV33.12/hu.17、AAV33.4/hu.15、AAV33.8/hu.16、AAV52/hu.19、AAV52.1/hu.20、AAV58.2/hu.25、AAVA3.3、AAVA3.4、AAVA3.5、AAVA3.7、AAVC1、AAVC2、AAVC5、AAV-DJ、AAV-DJ8、AAVF3、AAVF5、AAVH2、AAVrh.72、AAVhu.8、AAVrh.68、AAVrh.70、AAVpi.1、AAVpi.3、AAVpi.2、AAVrh.60、AAVrh.44、AAVrh.65、AAVrh.55、AAVrh.47、AAVrh.69、AAVrh.45、AAVrh.59、AAVhu.12、AAVH6、AAVLK03、AAVH-1/hu.1、AAVH-5/hu.3、AAVLG-10/rh.40、AAVLG-4/rh.38、AAVLG-9/hu.39、AAVN721-8/rh.43、AAVCh.5、AAVCh.5R1、AAVcy.2、AAVcy.3、AAVcy.4、AAVcy.5、AAVCy.5R1、AAVCy.5R2、AAVCy.5R3、AAVCy.5R4、AAVcy.6、AAVhu.1、AAVhu.2、AAVhu.3、AAVhu.4、AAVhu.5、AAVhu.6、AAVhu.7、AAVhu.9、AAVhu.10、AAVhu.11、AAVhu.13、AAVhu.15、AAVhu.16、AAVhu.17、AAVhu.18、AAVhu.20、AAVhu.21、AAVhu.22、AAVhu.23.2、AAVhu.24、AAVhu.25、AAVhu.27、AAVhu.28、AAVhu.29、AAVhu.29R、AAVhu.31、AAVhu.32、AAVhu.34、AAVhu.35、AAVhu.37、AAVhu.39、AAVhu.40、AAVhu.41、AAVhu.42、AAVhu.43、AAVhu.44、AAVhu.44R1、AAVhu.44R2、AAVhu.44R3、AAVhu.45、AAVhu.46、AAVhu.47、AAVhu.48、AAVhu.48R1、AAVhu.48R2、AAVhu.48R3、AAVhu.49、AAVhu.51、AAVhu.52、AAVhu.54、AAVhu.55、AAVhu.56、AAVhu.57、AAVhu.58、AAVhu.60、AAVhu.61、AAVhu.63、AAVhu.64、AAVhu.66、AAVhu.67、AAVhu.14/9、AAVhu.t 19、AAVrh.2、AAVrh.2R、AAVrh.8、AAVrh.8R、AAVrh.10、AAVrh.12、AAVrh.13、AAVrh.13R、AAVrh.14、AAVrh.17、AAVrh.18、AAVrh.19、AAVrh.20、AAVrh.21、AAVrh.22、AAVrh.23、AAVrh.24、AAVrh.25、AAVrh.31、AAVrh.32、AAVrh.33、AAVrh.34、AAVrh.35、AAVrh.36、AAVrh.37、AAVrh.37R2、AAVrh.38、AAVrh.39、AAVrh.40、AAVrh.46、AAVrh.48、AAVrh.48.1、AAVrh.48.1.2、AAVrh.48.2、AAVrh.49、AAVrh.51、AAVrh.52、AAVrh.53、AAVrh.54、AAVrh.56、AAVrh.57、AAVrh.58、AAVrh.61、AAVrh.64、AAVrh.64R1、AAVrh.64R2、AAVrh.67、AAVrh.73、AAVrh.74、AAVrh8R、AAVrh8R A586R突變體、AAVrh8R R533A突變體、AAAV、BAAV、山羊AAV、牛AAV、綿羊AAV、AAVhE1.1、AAVhEr1.5、AAVhER1.14、AAVhEr1.8、AAVhEr1.16、AAVhEr1.18、AAVhEr1.35、AAVhEr1.7、AAVhEr1.36、AAVhEr2.29、AAVhEr2.4、AAVhEr2.16、AAVhEr2.30、AAVhEr2.31、AAVhEr2.36、AAVhER1.23、AAVhEr3.1、AAV2.5T、AAV-PAEC、AAV-LK01、AAV-LK02、AAV-LK03、AAV-LK04、AAV-LK05、AAV-LK06、AAV-LK07、AAV-LK08、AAV-LK09、AAV-LK10、AAV-LK11、AAV-LK12、AAV-LK13、AAV-LK14、AAV-LK15、AAV-LK16、AAV-LK17、AAV-LK18、AAV-LK19、AAV-PAEC2、AAV-PAEC4、AAV-PAEC6、AAV-PAEC7、AAV-PAEC8、AAV-PAEC11、AAV-PAEC12、AAV-2-pre-miRNA-101、AAV-8h、AAV-8b、AAV-h、AAV-b、AAV SM 10-2、AAV改組100-1、AAV改組100-3、AAV改組100-7、AAV改組10-2、AAV改組10-6、AAV改組10-8、AAV改組100-2、AAV SM 10-1、AAV SM 10-8、AAV SM 100-3、AAV SM 100-10、BNP61 AAV、BNP62 AAV、BNP63 AAV、AAVrh.50、AAVrh.43、AAVrh.62、AAVrh.48、AAVhu.19、AAVhu.11、AAVhu.53、AAV4-8/rh.64、AAVLG-9/hu.39、AAV54.5/hu.23、AAV54.2/hu.22、AAV54.7/hu.24、AAV54.1/hu.21、AAV54.4R/hu.27、AAV46.2/hu.28、AAV46.6/hu.29、AAV128.1/hu.43、真型AAV (ttAAV)、UPENN AAV 10、日本AAV 10血清型、AAV CBr-7.1、AAV CBr-7.10、AAV CBr-7.2、AAV CBr-7.3、AAV CBr-7.4、AAV CBr-7.5、AAV CBr-7.7、AAV CBr-7.8、AAV CBr-B7.3、AAV CBr-B7.4、AAV CBr-E1、AAV CBr-E2、AAV CBr-E3、AAV CBr-E4、AAV CBr-E5、AAV CBr-e5、AAV CBr-E6、AAV CBr-E7、AAV CBr-E8、AAV CHt-1、AAV CHt-2、AAV CHt-3、AAV CHt-6.1、AAV CHt-6.10、AAV CHt-6.5、AAV CHt-6.6、AAV CHt-6.7、AAV CHt-6.8、AAV CHt-P1、AAV CHt-P2、AAV CHt-P5、AAV CHt-P6、AAV CHt-P8、AAV CHt-P9、AAV CKd-1、AAV CKd-10、AAV CKd-2、AAV CKd-3、AAV CKd-4、AAV CKd-6、AAV CKd-7、AAV CKd-8、AAV CKd-B1、AAV CKd-B2、AAV CKd-B3、AAV CKd-B4、AAV CKd-B5、AAV CKd-B6、AAV CKd-B7、AAV CKd-B8、AAV CKd-H1、AAV CKd-H2、AAV CKd-H3、AAV CKd-H4、AAV CKd-H5、AAV CKd-H6、AAV CKd-N3、AAV CKd-N4、AAV CKd-N9、AAV CLg-F1、AAV CLg-F2、AAV CLg-F3、AAV CLg-F4、AAV CLg-F5、AAV CLg-F6、AAV CLg-F7、AAV CLg-F8、AAV CLv-1、AAV CLv1-1、AAV Clv1-10、AAV CLv1-2、AAV CLv-12、AAV CLv1-3、AAV CLv-13、AAV CLv1-4、AAV Clv1-7、AAV Clv1-8、AAV Clv1-9、AAV CLv-2、AAV CLv-3、AAV CLv-4、AAV CLv-6、AAV CLv-8、AAV CLv-D1、AAV CLv-D2、AAV CLv-D3、AAV CLv-D4、AAV CLv-D5、AAV CLv-D6、AAV CLv-D7、AAV CLv-D8、AAV CLv-E1、AAV CLv-K1、AAV CLv-K3、AAV CLv-K6、AAV CLv-L4、AAV CLv-L5、AAV CLv-L6、AAV CLv-M1、AAV CLv-M11、AAV CLv-M2、AAV CLv-M5、AAV CLv-M6、AAV CLv-M7、AAV CLv-M8、AAV CLv-M9、AAV CLv-R1、AAV CLv-R2、AAV CLv-R3、AAV CLv-R4、AAV CLv-R5、AAV CLv-R6、AAV CLv-R7、AAV CLv-R8、AAV CLv-R9、AAV CSp-1、AAV CSp-10、AAV CSp-11、AAV CSp-2、AAV CSp-3、AAV CSp-4、AAV CSp-6、AAV CSp-7、AAV CSp-8、AAV CSp-8.10、AAV CSp-8.2、AAV CSp-8.4、AAV CSp-8.5、AAV CSp-8.6、AAV CSp-8.7、AAV CSp-8.8、AAV CSp-8.9、AAV CSp-9、AAV.hu.48R3、AAV.VR-355、AAV3B、AAV4、AAV5、AAVF1/HSC1、AAVF11/HSC11、AAVF12/HSC12、AAVF13/HSC13、AAVF14/HSC14、AAVF15/HSC15、AAVF16/HSC16、AAVF17/HSC17、AAVF2/HSC2、AAVF3/HSC3、AAVF4/HSC4、AAVF5/HSC5、AAVF6/HSC6、AAVF7/HSC7、AAVF8/HSC8、AAVF9/HSC9、AAV-PHP.B (PHP.B)、AAV-PHP.A (PHP.A)、G2B-26、G2B-13、TH1.1-32、TH1.1-35、AAVPHP.B2、AAVPHP.B3、AAVPHP.N/PHP.B-DGT、AAVPHP.B-EST、AAVPHP.B-GGT、AAVPHP.B-ATP、AAVPHP.B-ATT-T、AAVPHP.B-DGT-T、AAVPHP.B-GGT-T、AAVPHP.B-SGS、AAVPHP.B-AQP、AAVPHP.B-QQP、AAVPHP.B-SNP(3)、AAVPHP.B-SNP、AAVPHP.B-QGT、AAVPHP.B-NQT、AAVPHP.B-EGS、AAVPHP.B-SGN、AAVPHP.B-EGT、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-STP、AAVPHP.B-PQP、AAVPHP.B-SQP、AAVPHP.B-QLP、AAVPHP.B-TMP、AAVPHP.B-TTP、AAVPHP.S/G2A12、AAVG2A15/G2A3、AAVG2B4及/或AAVG2B5及其變異體。
在一些實施例中，AAV血清型可為或具有如內容以全文引用之方式併入本文中的美國公開案第US 20160361439號中所描述之修飾，諸如但不限於野生型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12及其雜合體之Y252F、Y272F、Y444F、Y500F、Y700F、Y704F、Y730F、Y275F、Y281F、Y508F、Y576F、Y612G、Y673F及Y720F。
在一些實施例中，AAV血清型可為或具有如內容以全文引用的方式併入本文中的美國專利第US 9546112號中所述的突變，諸如但不限於AAV6 (US 9546112之SEQ ID NO: 4)、AAV1 (US 9546112之SEQ ID NO: 6)、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV7、AAV9、AAV10或AAV11或其衍生物之序列中之F129L、D418E、K531E、L584F、V598A及H642N突變中的至少兩者，但非全部。在又一實施例中，AAV血清型可為或具有包含K531E突變之AAV6序列(US 9546112之SEQ ID NO: 5)。
在一些實施例中，AAV血清型可為或具有AAV1序列中之突變，如內容以全文引用之方式併入本文中的美國公開案第US 20130224836號中所描述，該突變諸如但不限於至少一個表面暴露之酪胺酸殘基(較佳處於AAV1 (US 20130224836之SEQ ID NO: 2)之位置252、273、445、701、705及731處)經另一胺基酸(較佳經苯丙胺酸殘基)取代。在一些實施例中，AAV血清型可為或具有AAV9序列中之突變，諸如但不限於至少一個表面暴露之酪胺酸殘基(較佳處於AAV2 (US 20130224836之SEQ ID NO: 4)之位置252、272、444、500、700、704及730處)經另一胺基酸(較佳經苯丙胺酸殘基)取代。在一些實施例中，處於AAV9 (SEQ ID NO: 6 US 20130224836)之位置446處的酪胺酸殘基經苯丙胺酸殘基取代。
在一些實施例中，血清型可為AAV2或其變異體，如國際公開案第WO2016130589號中所描述，該公開案以全文引用之方式併入本文中。AAV2之胺基酸序列可包含N587A、E548A或N708A突變。在一些實施例中，任何AAV之胺基酸序列可包含V708K突變。
在一些實施例中，AAV血清型可為或具有如內容以全文引用之方式併入本文中的美國公開案第US20030138772號中所描述之序列，諸如但不限於AAV1 (US20030138772之SEQ ID NO: 6及64)、AAV2 (US20030138772之SEQ ID NO: 7及70)、AAV3 (US20030138772之SEQ ID NO: 8及71)、AAV4 (US20030138772之SEQ ID NO: 63)、AAV5 (US20030138772之SEQ ID NO: 114)、AAV6 (US20030138772之SEQ ID NO: 65)、AAV7 (US20030138772之SEQ ID NO: 1-3)、AAV8 (US20030138772之SEQ ID NO: 4及95)、AAV9 (US20030138772之SEQ ID NO: 5及100)、AAV10 (US20030138772之SEQ ID NO: 117)、AAV11 (US20030138772之SEQ ID NO: 118)、AAV12 (US20030138772之SEQ ID NO: 119)、AAVrh10 (US20030138772之SEQ ID NO: 81之胺基酸1至738)、AAV16.3 (US20030138772 SEQ ID NO: 10)、AAV29.3/bb.1 (US20030138772 SEQ ID NO: 11)、AAV29.4 (US20030138772 SEQ ID NO: 12)、AAV29.5/bb.2 (US20030138772 SEQ ID NO: 13)、AAV1.3 (US20030138772 SEQ ID NO: 14)、AAV13.3 (US20030138772 SEQ ID NO: 15)、AAV24.1 (US20030138772 SEQ ID NO: 16)、AAV27.3 (US20030138772 SEQ ID NO: 17)、AAV7.2 (US20030138772 SEQ ID NO: 18)、AAVC1 (US20030138772 SEQ ID NO: 19)、AAVC3 (US20030138772 SEQ ID NO: 20)、AAVC5 (US20030138772 SEQ ID NO: 21)、AAVF1 (US20030138772 SEQ ID NO: 22)、AAVF3 (US20030138772 SEQ ID NO: 23)、AAVF5 (US20030138772 SEQ ID NO: 24)、AAVH6 (US20030138772 SEQ ID NO: 25)、AAVH2 (US20030138772 SEQ ID NO: 26)、AAV42-8 (US20030138772 SEQ ID NO: 27)、AAV42-15 (US20030138772 SEQ ID NO: 28)、AAV42-5b (US20030138772 SEQ ID NO: 29)、AAV42-1b (US20030138772 SEQ ID NO: 30)、AAV42-13 (US20030138772 SEQ ID NO: 31)、AAV42-3a (US20030138772 SEQ ID NO: 32)、AAV42-4 (US20030138772 SEQ ID NO: 33)、AAV42-5a (US20030138772 SEQ ID NO: 34)、AAV42-10 (US20030138772 SEQ ID NO: 35)、AAV42-3b (US20030138772 SEQ ID NO: 36)、AAV42-11 (US20030138772 SEQ ID NO: 37)、AAV42-6b (US20030138772 SEQ ID NO: 38)、AAV43-1 (US20030138772 SEQ ID NO: 39)、AAV43-5 (US20030138772 SEQ ID NO: 40)、AAV43-12 (US20030138772 SEQ ID NO: 41)、AAV43-20 (US20030138772 SEQ ID NO: 42)、AAV43-21 (US20030138772 SEQ ID NO: 43)、AAV43-23 (US20030138772 SEQ ID NO: 44)、AAV43-25 (US20030138772 SEQ ID NO: 45)、AAV44.1 (US20030138772 SEQ ID NO: 46)、AAV44.5 (US20030138772 SEQ ID NO: 47)、AAV223.1 (US20030138772 SEQ ID NO: 48)、AAV223.2 (US20030138772 SEQ ID NO: 49)、AAV223.4 (US20030138772 SEQ ID NO: 50)、AAV223.5 (US20030138772 SEQ ID NO: 51)、AAV223.6 (US20030138772 SEQ ID NO: 52)、AAV223.7 (US20030138772 SEQ ID NO: 53)、AAVA3.4 (US20030138772 SEQ ID NO: 54)、AAVA3.5 (US20030138772 SEQ ID NO: 55)、AAVA3.7 (US20030138772 SEQ ID NO: 56)、AAVA3.3 (US20030138772 SEQ ID NO: 57)、AAV42.12 (US20030138772 SEQ ID NO: 58)、AAV44.2 (US20030138772 SEQ ID NO: 59)、AAV42-2 (US20030138772 SEQ ID NO: 9)或其變異體。
在一些實施例中，AAV血清型可為或具有如內容以全文引用之方式併入本文中的美國公開案第US20150159173號中所描述之序列，諸如但不限於AAV2 (US20150159173之SEQ ID NO: 7及23)、rh20 (US20150159173之SEQ ID NO: 1)、rh32/33 (US20150159173之SEQ ID NO: 2)、rh39 (US20150159173之SEQ ID NO: 3、20及36)、rh46 (US20150159173之SEQ ID NO: 4及22)、rh73 (US20150159173之SEQ ID NO: 5)、rh74 (US20150159173之SEQ ID NO: 6)、AAV6.1 (US20150159173之SEQ ID NO: 29)、rh.8 (US20150159173之SEQ ID NO: 41)、rh.48.1 (US20150159173之SEQ ID NO: 44)、hu.44 (US20150159173之SEQ ID NO: 45)、hu.29 (US20150159173之SEQ ID NO: 42)、hu.48 (US20150159173之SEQ ID NO: 38)、rh54 (US20150159173之SEQ ID NO: 49)、AAV2 (US20150159173之SEQ ID NO: 7)、cy.5 (US20150159173之SEQ ID NO: 8及24)、rh.10 (US20150159173之SEQ ID NO: 9及25)、rh.13 (US20150159173之SEQ ID NO: 10及26)、AAV1 (US20150159173之SEQ ID NO: 11及27)、AAV3 (US20150159173之SEQ ID NO: 12及28)、AAV6 (US20150159173之SEQ ID NO: 13及29)、AAV7 (US20150159173之SEQ ID NO: 14及30)、AAV8 (US20150159173之SEQ ID NO: 15及31)、hu.13 (US20150159173之SEQ ID NO: 16及32)、hu.26 (US20150159173之SEQ ID NO: 17及33)、hu.37 (US20150159173之SEQ ID NO: 18及34)、hu.53 (US20150159173之SEQ ID NO: 19及35)、rh.43 (US20150159173之SEQ ID NO: 21及37)、rh2 (US20150159173之SEQ ID NO: 39)、rh.37 (US20150159173之SEQ ID NO: 40)、rh.64 (US20150159173之SEQ ID NO: 43)、rh.48 (US20150159173之SEQ ID NO: 44)、ch.5 (US20150159173之SEQ ID NO 46)、rh.67 (US20150159173之SEQ ID NO: 47)、rh.58 (US20150159173之SEQ ID NO: 48)或其變異體，包括但不限於Cy5R1、Cy5R2、Cy5R3、Cy5R4、rh.13R、rh.37R2、rh.2R、rh.8R、rh.48.1、rh.48.2、rh.48.1.2、hu.44R1、hu.44R2、hu.44R3、hu.29R、ch.5R1、rh64R1、rh64R2、AAV6.2、AAV6.1、AAV6.12、hu.48R1、hu.48R2及hu.48R3。
在一些實施例中，AAV血清型可為或具有如內容以全文引用之方式併入本文中的美國專利第US 7198951號中所描述之序列，諸如但不限於AAV9 (US 7198951之SEQ ID NO: 1-3)、AAV2 (US 7198951之SEQ ID NO: 4)、AAV1 (US 7198951之SEQ ID NO: 5)、AAV3 (US 7198951之SEQ ID NO: 6)及AAV8 (US7198951之SEQ ID NO: 7)。
在一些實施例中，AAV血清型可為或具有如N Pulicherla等人(Molecular Therapy 19(6):1070-1078 (2011)，其以全文引用之方式併入本文中)所述的AAV9序列中之突變，諸如但不限於AAV9.9、AAV9.11、AAV9.13、AAV9.16、AAV9.24、AAV9.45、AAV9.47、AAV9.61、AAV9.68、AAV9.84。
在一些實施例中，AAV血清型可為或具有如內容以全文引用之方式併入本文中的美國專利第US 6156303號中所描述之序列，諸如但不限於AAV3B (US 6156303之SEQ ID NO: 1及10)、AAV6 (US 6156303之SEQ ID NO: 2、7及11)、AAV2 (US 6156303之SEQ ID NO: 3及8)、AAV3A (US 6156303之SEQ ID NO: 4及9)或其衍生物。
在一些實施例中，AAV血清型可為或具有如內容以全文引用之方式併入本文中的美國公開案第US20140359799號中所描述之序列，諸如但不限於AAV8 (US20140359799之SEQ ID NO: 1)、AAVDJ (US20140359799之SEQ ID NO: 2及3)或其變異體。
在一些實施例中，血清型可為AAVDJ (或AAV-DJ)或其變異體，諸如AAVDJ8 (或AAV-DJ8)，如由Grimm等人(Journal of Virology 82(12): 5887-5911 (2008)，其以全文引用之方式併入本文中)所描述。AAVDJ8之胺基酸序列可包含兩個或更多個突變以移除肝素結合域(HBD)。作為一非限制性實例，在內容以全文引用之方式併入本文中的美國專利第7,588,772號中描述為SEQ ID NO: 1之AAV-DJ序列可包含兩個突變：(1) R587Q，其中胺基酸587處之精胺酸(R；Arg)變為麩醯胺酸(Q；Gln)；及(2) R590T，其中胺基酸590處之精胺酸(R；Arg)變為蘇胺酸(T；Thr)。作為另一非限制性實例，可包含三個突變：(1) K406R，其中胺基酸406處之離胺酸(K；Lys)變為精胺酸(R；Arg)；(2) R587Q，其中胺基酸587處之精胺酸(R；Arg)變為麩醯胺酸(Q；Gln)；及(3) R590T，其中胺基酸590處之精胺酸(R；Arg)變為蘇胺酸(T；Thr)。
在一些實施例中，AAV血清型可為或具有如內容以全文引用之方式併入本文中的國際公開案第WO1998011244號中所描述之AAV4之序列，諸如但不限於AAV4 (WO1998011244之SEQ ID NO: 1-20)。
在一些實施例中，AAV血清型可為或具有AAV2序列中之突變以產生AAV2G9，如國際公開案第WO2014144229號中所描述，且以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，AAV血清型可為或具有如內容以全文引用之方式併入本文中的國際公開案第WO2005033321號中所描述之序列，諸如但不限於AAV3-3 (WO2005033321之SEQ ID NO: 217)、AAV1 (WO2005033321之SEQ ID NO: 219及202)、AAV106.1/hu.37 (WO2005033321之SEQ ID No: 10)、AAV114.3/hu.40 (WO2005033321之SEQ ID No: 11)、AAV127.2/hu.41 (WO2005033321之SEQ ID NO: 6及8)、AAV128.3/hu.44 (WO2005033321之SEQ ID No: 81)、AAV130.4/hu.48 (WO2005033321之SEQ ID NO: 78)、AAV145.1/hu.53 (WO2005033321之SEQ ID No: 176及177)、AAV145.6/hu.56 (WO2005033321之SEQ ID NO: 168及192)、AAV16.12/hu.11 (WO2005033321之SEQ ID NO:: 153及57)、AAV16.8/hu.10 (WO2005033321之SEQ ID NO:: 156及56)、AAV161.10/hu.60 (WO2005033321之SEQ ID No: 170)、AAV161.6/hu.61 (WO2005033321之SEQ ID No: 174)、AAV1-7/rh.48 (WO2005033321之SEQ ID NO: 32)、AAV1-8/rh.49 (WO2005033321之SEQ ID NO: 103及25)、AAV2 (WO2005033321之SEQ ID NO: 211及221)、AAV2-15/rh.62 (WO2005033321之SEQ ID No: 33及114)、AAV2-3/rh.61 (WO2005033321之SEQ ID NO: 21)、AAV2-4/rh.50 (WO2005033321之SEQ ID No: 23及108)、AAV2-5/rh.51 (WO2005033321之SEQ ID NO: 104及22)、AAV3.1/hu.6 (WO2005033321之SEQ ID NO: 5及84)、AAV3.1/hu.9 (WO2005033321之SEQ ID NO: 155及58)、AAV3-11/rh.53 (WO2005033321之SEQ ID NO: 186及176)、AAV3-3 (WO2005033321之SEQ ID NO: 200)、AAV33.12/hu.17 (WO2005033321之SEQ ID NO: 4)、AAV33.4/hu.15 (WO2005033321之SEQ ID No: 50)、AAV33.8/hu.16 (WO2005033321之SEQ ID No: 51)、AAV3-9/rh.52 (WO2005033321之SEQ ID NO: 96及18)、AAV4-19/rh.55 (WO2005033321之SEQ ID NO: 117)、AAV4-4 (WO2005033321之SEQ ID NO: 201及218)、AAV4-9/rh.54 (WO2005033321之SEQ ID NO: 116)、AAV5 (WO2005033321之SEQ ID NO: 199及216)、AAV52.1/hu.20 (WO2005033321之SEQ ID NO: 63)、AAV52/hu.19 (WO2005033321之SEQ ID NO: 133)、AAV5-22/rh.58 (WO2005033321之SEQ ID No: 27)、AAV5-3/rh.57 (WO2005033321之SEQ ID NO: 105)、AAV5-3/rh.57 (WO2005033321之SEQ ID No: 26)、AAV58.2/hu.25 (WO2005033321之SEQ ID No: 49)、AAV6 (WO2005033321之SEQ ID NO: 203及220)、AAV7 (WO2005033321之SEQ ID NO: 222及213)、AAV7.3/hu.7 (WO2005033321之SEQ ID No: 55)、AAV8 (WO2005033321之SEQ ID NO: 223及214)、AAVH-1/hu.1 (WO2005033321之SEQ ID No: 46)、AAVH-5/hu.3 (WO2005033321之SEQ ID No: 44)、AAVhu.1 (WO2005033321之SEQ ID NO: 144)、AAVhu.10 (WO2005033321之SEQ ID NO: 156)、AAVhu.11 (WO2005033321之SEQ ID NO: 153)、AAVhu.12 (WO2005033321 SEQ ID NO: 59)、AAVhu.13 (WO2005033321之SEQ ID NO: 129)、AAVhu.14/AAV9 (WO2005033321之SEQ ID NO: 123及3)、AAVhu.15 (WO2005033321之SEQ ID NO: 147)、AAVhu.16 (WO2005033321之SEQ ID NO: 148)、AAVhu.17 (WO2005033321之SEQ ID NO: 83)、AAVhu.18 (WO2005033321之SEQ ID NO: 149)、AAVhu.19 (WO2005033321之SEQ ID NO: 133)、AAVhu.2 (WO2005033321之SEQ ID NO: 143)、AAVhu.20 (WO2005033321之SEQ ID NO: 134)、AAVhu.21 (WO2005033321之SEQ ID NO: 135)、AAVhu.22 (WO2005033321之SEQ ID NO: 138)、AAVhu.23.2 (WO2005033321之SEQ ID NO: 137)、AAVhu.24 (WO2005033321之SEQ ID NO: 136)、AAVhu.25 (WO2005033321之SEQ ID NO: 146)、AAVhu.27 (WO2005033321之SEQ ID NO: 140)、AAVhu.29 (WO2005033321之SEQ ID NO: 132)、AAVhu.3 (WO2005033321之SEQ ID NO: 145)、AAVhu.31 (WO2005033321之SEQ ID NO: 121)、AAVhu.32 (WO2005033321之SEQ ID NO: 122)、AAVhu.34 (WO2005033321之SEQ ID NO: 125)、AAVhu.35 (WO2005033321之SEQ ID NO: 164)、AAVhu.37 (WO2005033321之SEQ ID NO: 88)、AAVhu.39 (WO2005033321之SEQ ID NO: 102)、AAVhu.4 (WO2005033321之SEQ ID NO: 141)、AAVhu.40 (WO2005033321之SEQ ID NO: 87)、AAVhu.41 (WO2005033321之SEQ ID NO: 91)、AAVhu.42 (WO2005033321之SEQ ID NO: 85)、AAVhu.43 (WO2005033321之SEQ ID NO: 160)、AAVhu.44 (WO2005033321之SEQ ID NO: 144)、AAVhu.45 (WO2005033321之SEQ ID NO: 127)、AAVhu.46 (WO2005033321之SEQ ID NO: 159)、AAVhu.47 (WO2005033321之SEQ ID NO: 128)、AAVhu.48 (WO2005033321之SEQ ID NO: 157)、AAVhu.49 (WO2005033321之SEQ ID NO: 189)、AAVhu.51 (WO2005033321之SEQ ID NO: 190)、AAVhu.52 (WO2005033321之SEQ ID NO: 191)、AAVhu.53 (WO2005033321之SEQ ID NO: 186)、AAVhu.54 (WO2005033321之SEQ ID NO: 188)、AAVhu.55 (WO2005033321之SEQ ID NO: 187)、AAVhu.56 (WO2005033321之SEQ ID NO: 192)、AAVhu.57 (WO2005033321之SEQ ID NO: 193)、AAVhu.58 (WO2005033321之SEQ ID NO: 194)、AAVhu.6 (WO2005033321之SEQ ID NO: 84)、AAVhu.60 (WO2005033321之SEQ ID NO: 184)、AAVhu.61 (WO2005033321之SEQ ID NO: 185)、AAVhu.63 (WO2005033321之SEQ ID NO: 195)、AAVhu.64 (WO2005033321之SEQ ID NO: 196)、AAVhu.66 (WO2005033321之SEQ ID NO: 197)、AAVhu.67 (WO2005033321之SEQ ID NO: 198)、AAVhu.7 (WO2005033321之SEQ ID NO: 150)、AAVhu.8 (WO2005033321 SEQ ID NO: 12)、AAVhu.9 (WO2005033321之SEQ ID NO: 155)、AAVLG-10/rh.40 (WO2005033321之SEQ ID No: 14)、AAVLG-4/rh.38 (WO2005033321之SEQ ID NO: 86)、AAVLG-4/rh.38 (WO2005033321之SEQ ID No: 7)、AAVN721-8/rh.43 (WO2005033321之SEQ ID NO: 163)、AAVN721-8/rh.43 (WO2005033321之SEQ ID No: 43)、AAVpi.1 (WO2005033321 SEQ ID NO: 28)、AAVpi.2 (WO2005033321 SEQ ID NO: 30)、AAVpi.3 (WO2005033321 SEQ ID NO: 29)、AAVrh.38 (WO2005033321之SEQ ID NO: 86)、AAVrh.40 (WO2005033321之SEQ ID NO: 92)、AAVrh.43 (WO2005033321之SEQ ID NO: 163)、AAVrh.44 (WO2005033321 SEQ ID NO: 34)、AAVrh.45 (WO2005033321 SEQ ID NO: 41)、AAVrh.47 (WO2005033321 SEQ ID NO: 38)、AAVrh.48 (WO2005033321之SEQ ID NO: 115)、AAVrh.49 (WO2005033321之SEQ ID NO: 103)、AAVrh.50 (WO2005033321之SEQ ID NO: 108)、AAVrh.51 (WO2005033321之SEQ ID NO: 104)、AAVrh.52 (WO2005033321之SEQ ID NO: 96)、AAVrh.53 (WO2005033321之SEQ ID NO: 97)、AAVrh.55 (WO2005033321 SEQ ID NO: 37)、AAVrh.56 (WO2005033321之SEQ ID NO: 152)、AAVrh.57 (WO2005033321之SEQ ID NO: 105)、AAVrh.58 (WO2005033321之SEQ ID NO: 106)、AAVrh.59 (WO2005033321 SEQ ID NO: 42)、AAVrh.60 (WO2005033321 SEQ ID NO: 31)、AAVrh.61 (WO2005033321之SEQ ID NO: 107)、AAVrh.62 (WO2005033321之SEQ ID NO: 114)、AAVrh.64 (WO2005033321之SEQ ID NO: 99)、AAVrh.65 (WO2005033321 SEQ ID NO: 35)、AAVrh.68 (WO2005033321 SEQ ID NO: 16)、AAVrh.69 (WO2005033321 SEQ ID NO: 39)、AAVrh.70 (WO2005033321 SEQ ID NO: 20)、AAVrh.72 (WO2005033321 SEQ ID NO: 9)或其變異體，包括但不限於AAVcy.2、AAVcy.3、AAVcy.4、AAVcy.5、AAVcy.6、AAVrh.12、AAVrh.17、AAVrh.18、AAVrh.19、AAVrh.21、AAVrh.22、AAVrh.23、AAVrh.24、AAVrh.25、AAVrh.25/42 15、AAVrh.31、AAVrh.32、AAVrh.33、AAVrh.34、AAVrh.35、AAVrh.36、AAVrh.37、AAVrh14。變異體之非限制性實例包括WO2005033321之SEQ ID NO: 13、15、17、19、24、36、40、45、47、48、51-54、60-62、64-77、79、80、82、89、90、93-95、98、100、101、109-113、118-120、124、126、131、139、142、151、154、158、161、162、165-183、202、204-212、215、219、224-236，其內容以全文引用的方式併入本文中。
在一些實施例中，AAV血清型可為或具有如內容以全文引用之方式併入本文中的國際公開案第WO2015168666號中所描述之序列，諸如但不限於AAVrh8R (WO2015168666之SEQ ID NO: 9)、AAVrh8R A586R突變體(WO2015168666之SEQ ID NO: 10)、AAVrh8R R533A突變體(WO2015168666之SEQ ID NO: 11)，或其變異體。
在一些實施例中，AAV血清型可為或具有如內容以全文引用的方式併入本文中的美國專利第US9233131號中所述的序列，諸如但不限於AAVhE1.1 (US9233131之SEQ ID NO: 44)、AAVhEr1.5 (US9233131之SEQ ID NO: 45)、AAVhER1.14 (US9233131之SEQ ID NO: 46)、AAVhEr1.8 (US9233131之SEQ ID NO: 47)、AAVhEr1.16 (US9233131之SEQ ID NO: 48)、AAVhEr1.18 (US9233131之SEQ ID NO: 49)、AAVhEr1.35 (US9233131之SEQ ID NO: 50)、AAVhEr1.7 (US9233131之SEQ ID NO: 51)、AAVhEr1.36 (US9233131之SEQ ID NO: 52)、AAVhEr2.29 (US9233131之SEQ ID NO: 53)、AAVhEr2.4 (US9233131之SEQ ID NO: 54)、AAVhEr2.16 (US9233131之SEQ ID NO: 55)、AAVhEr2.30 (US9233131之SEQ ID NO: 56)、AAVhEr2.31 (US9233131之SEQ ID NO: 58)、AAVhEr2.36 (US9233131之SEQ ID NO: 57)、AAVhER1.23 (US9233131之SEQ ID NO: 53)、AAVhEr3.1 (US9233131之SEQ ID NO: 59)、AAV2.5T (US9233131之SEQ ID NO: 42)或其變異體。
在一些實施例中，AAV血清型可為或具有如內容以全文引用之方式併入本文中的美國專利公開案第US20150376607號中所描述之序列，諸如但不限於AAV-PAEC (US20150376607之SEQ ID NO: 1)、AAV-LK01 (US20150376607之SEQ ID NO: 2)、AAV-LK02 (US20150376607之SEQ ID NO: 3)、AAV-LK03 (US20150376607之SEQ ID NO: 4)、AAV-LK04 (US20150376607之SEQ ID NO: 5)、AAV-LK05 (US20150376607之SEQ ID NO: 6)、AAV-LK06 (US20150376607之SEQ ID NO: 7)、AAV-LK07 (US20150376607之SEQ ID NO: 8)、AAV-LK08 (US20150376607之SEQ ID NO: 9)、AAV-LK09 (US20150376607之SEQ ID NO: 10)、AAV-LK10 (US20150376607之SEQ ID NO: 11)、AAV-LK11 (US20150376607之SEQ ID NO: 12)、AAV-LK12 (US20150376607之SEQ ID NO: 13)、AAV-LK13 (US20150376607之SEQ ID NO: 14)、AAV-LK14 (US20150376607之SEQ ID NO: 15)、AAV-LK15 (US20150376607之SEQ ID NO: 16)、 AAV-LK16 (US20150376607之SEQ ID NO: 17)、AAV-LK17 (US20150376607之SEQ ID NO: 18)、AAV-LK18 (US20150376607之SEQ ID NO: 19)、AAV-LK19 (US20150376607之SEQ ID NO: 20)、AAV-PAEC2 (US20150376607之SEQ ID NO: 21)、AAV-PAEC4 (US20150376607之SEQ ID NO: 22)、AAV-PAEC6 (US20150376607之SEQ ID NO: 23)、AAV-PAEC7 (US20150376607之SEQ ID NO: 24)、AAV-PAEC8 (US20150376607之SEQ ID NO: 25)、AAV-PAEC11 (US20150376607之SEQ ID NO: 26)、AAV-PAEC12 (US20150376607之SEQ ID NO: 27)或其變異體。
在一些實施例中，AAV血清型可為或具有如內容以全文引用之方式併入本文中的美國專利第US9163261號中所描述之序列，諸如但不限於AAV-2-pre-miRNA-101 (SEQ ID NO: 1 US9163261)或其變異體。
在一些實施例中，AAV血清型可為或具有如內容以全文引用之方式併入本文中的美國專利公開案第US20150376240號中所描述之序列，諸如但不限於AAV-8h (US20150376240之SEQ ID NO: 6)、AAV-8b (US20150376240之SEQ ID NO: 5)、AAV-h (US20150376240之SEQ ID NO: 2)、AAV-b (US20150376240之SEQ ID NO: 1)或其變異體。
在一些實施例中，AAV血清型可為或具有如內容以全文引用之方式併入本文中的美國專利公開案第US20160017295號中所描述之序列，諸如但不限於AAV SM 10-2 (US20160017295之SEQ ID NO: 22)、AAV改組100-1 (US20160017295之SEQ ID NO: 23)、AAV改組100-3 (US20160017295之SEQ ID NO: 24)、AAV改組100-7 (US20160017295之SEQ ID NO: 25)、AAV改組10-2 (US20160017295之SEQ ID NO: 34)、AAV改組10-6 (US20160017295之SEQ ID NO: 35)、AAV改組10-8 (US20160017295之SEQ ID NO: 36)、AAV改組100-2 (US20160017295之SEQ ID NO: 37)、AAV SM 10-1 (US20160017295之SEQ ID NO: 38)、AAV SM 10-8 (US20160017295之SEQ ID NO: 39)、AAV SM 100-3 (US20160017295之SEQ ID NO: 40)、AAV SM 100-10 (US20160017295之SEQ ID NO: 41)，或其變異體。
在一些實施例中，AAV血清型可為或具有如內容以全文引用之方式併入本文中的美國專利公開案第US20150238550號中所描述之序列，諸如但不限於BNP61 AAV (US20150238550之SEQ ID NO: 1)、BNP62 AAV (US20150238550之SEQ ID NO: 3)、BNP63 AAV (US20150238550之SEQ ID NO: 4)或其變異體。
在一些實施例中，AAV血清型可為或可具有如內容以全文引用之方式併入本文中的美國專利公開案第US20150315612號中所描述之序列，諸如但不限於AAVrh.50 (US20150315612之SEQ ID NO: 108)、AAVrh.43 (US20150315612之SEQ ID NO: 163)、AAVrh.62 (US20150315612之SEQ ID NO: 114)、AAVrh.48 (US20150315612之SEQ ID NO: 115)、AAVhu.19 (US20150315612之SEQ ID NO: 133)、AAVhu.11 (US20150315612之SEQ ID NO: 153)、AAVhu.53 (US20150315612之SEQ ID NO: 186)、AAV4-8/rh.64 (US20150315612之SEQ ID No: 15)、AAVLG-9/hu.39 (US20150315612之SEQ ID No: 24)、AAV54.5/hu.23 (US20150315612之SEQ ID No: 60)、AAV54.2/hu.22 (US20150315612之SEQ ID No: 67)、AAV54.7/hu.24 (US20150315612之SEQ ID No: 66)、AAV54.1/hu.21 (US20150315612之SEQ ID No: 65)、AAV54.4R/hu.27 (US20150315612之SEQ ID No: 64)、AAV46.2/hu.28 (US20150315612之SEQ ID No: 68)、AAV46.6/hu.29 (US20150315612之SEQ ID No: 69)、AAV128.1/hu.43 (US20150315612之SEQ ID No: 80)或其變異體。
在一些實施例中，AAV血清型可為或具有如內容以全文引用之方式併入本文中的國際公開案第WO2015121501號中所描述之序列，諸如但不限於真型AAV (ttAAV) (WO2015121501之SEQ ID NO: 2)、「UPenn AAV10」(WO2015121501之SEQ ID NO: 8)、「日本AAV10」(WO2015121501之SEQ ID NO: 9)或其變異體。
根據本發明，可選擇或使用來自多種物種的AAV衣殼血清型。在一些實施例中，AAV可為禽AAV (AAAV)。AAAV血清型可為或具有如內容以全文引用之方式併入本文中的美國專利第US 9238800號中所描述之序列，諸如但不限於AAAV (US 9,238,800之SEQ ID NO: 1、2、4、6、8、10、12及14)，或其變異體。
在一些實施例中，AAV可為牛AAV (BAAV)。BAAV血清型可為或具有如內容以全文引用之方式併入本文中的美國專利第US 9,193,769號中所描述之序列，諸如但不限於BAAV (US 9193769之SEQ ID NO: 1及6)，或其變異體。BAAV血清型可為或具有如內容以全文引用之方式併入本文中的美國專利第US7427396號中所描述之序列，諸如但不限於BAAV (US7427396之SEQ ID NO: 5及6)，或其變異體。
在一些實施例中，AAV可為山羊AAV。山羊AAV血清型可為或具有如內容以全文引用之方式併入本文中的美國專利第US7427396號中所描述之序列，諸如但不限於山羊AAV (US7427396之SEQ ID NO: 3)，或其變異體。
在其他實施例中，AAV可由兩種或更多種親本血清型經工程改造成為雜合AAV。在一些實施例中，AAV可為包含來自AAV2及AAV9之序列的AAV2G9。AAV2G9 AAV血清型可為或具有如美國專利公開案第US20160017005號中所描述之序列，該公開案之內容以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，AAV可為由具有胺基酸390-627 (VP1編號)中之突變之AAV9衣殼庫產生之血清型，如Pulicherla等人(Molecular Therapy 19(6):1070-1078 (2011))所描述，其內容以全文引用之方式併入本文中。該血清型以及對應核苷酸及胺基酸取代可為但不限於AAV9.1 (G1594C；D532H)、AAV6.2 (T1418A及T1436X；V473D及I479K)、AAV9.3 (T1238A；F413Y)、AAV9.4 (T1250C及A1617T；F417S)、AAV9.5 (A1235G、A1314T、A1642G、C1760T；Q412R、T548A、A587V)、AAV9.6 (T1231A；F411I)、AAV9.9 (G1203A、G1785T；W595C)、AAV9.10 (A1500G、T1676C；M559T)、AAV9.11 (A1425T、A1702C、A1769T；T568P、Q590L)、AAV9.13 (A1369C、A1720T；N457H、T574S)、AAV9.14 (T1340A、T1362C、T1560C、G1713A；L447H)、AAV9.16 (A1775T；Q592L)、AAV9.24 (T1507C、T1521G；W503R)、AAV9.26 (A1337G、A1769C；Y446C、Q590P)、AAV9.33 (A1667C；D556A)、AAV9.34 (A1534G、C1794T；N512D)、AAV9.35 (A1289T、T1450A、C1494T、A1515T、C1794A、G1816A；Q430L、Y484N、N98K、V606I)、AAV9.40 (A1694T、E565V)、AAV9.41 (A1348T、T1362C；T450S)、AAV9.44 (A1684C、A1701T、A1737G；N562H、K567N)、AAV9.45 (A1492T、C1804T；N498Y、L602F)、AAV9.46 (G1441C、T1525C、T1549G；G481R、W509R、L517V)、9.47 (G1241A、G1358A、A1669G、C1745T；S414N、G453D、K557E、T582I)、AAV9.48 (C1445T、A1736T；P482L、Q579L)、AAV9.50 (A1638T、C1683T、T1805A；Q546H、L602H)、AAV9.53 (G1301A、A1405C、C1664T、G1811T；R134Q、S469R、A555V、G604V)、AAV9.54 (C1531A、T1609A；L511I、L537M)、AAV9.55 (T1605A；F535L)、AAV9.58 (C1475T、C1579A；T492I、H527N)、AAV.59 (T1336C；Y446H)、AAV9.61 (A1493T；N498I)、AAV9.64 (C1531A、A1617T；L511I)、AAV9.65 (C1335T、T1530C、C1568A；A523D)、AAV9.68 (C1510A；P504T)、AAV9.80 (G1441A,；G481R)、AAV9.83 (C1402A、A1500T；P468T、E500D)、AAV9.87 (T1464C、T1468C；S490P)、AAV9.90 (A1196T；Y399F)、AAV9.91 (T1316G、A1583T、C1782G、T1806C；L439R、K528I)、AAV9.93 (A1273G、A1421G、A1638C、C1712T、G1732A、A1744T、A1832T；S425G、Q474R、Q546H、P571L、G578R、T582S、D611V)、AAV9.94 (A1675T；M559L)及AAV9.95 (T1605A；F535L)。
在一些實施例中，AAV血清型可為或具有如內容以全文引用之方式併入本文中的國際公開案第WO2016049230號中所描述之序列，諸如但不限於AAVF1/HSC1 (WO2016049230之SEQ ID NO: 2及20)、AAVF2/HSC2 (WO2016049230之SEQ ID NO: 3及21)、AAVF3/HSC3 (WO2016049230之SEQ ID NO: 5及22)、AAVF4/HSC4 (WO2016049230之SEQ ID NO: 6及23)、AAVF5/HSC5 (WO2016049230之SEQ ID NO: 11及25)、AAVF6/HSC6 (WO2016049230之SEQ ID NO: 7及24)、AAVF7/HSC7 (WO2016049230之SEQ ID NO: 8及27)、AAVF8/HSC8 (WO2016049230之SEQ ID NO: 9及28)、AAVF9/HSC9 (WO2016049230之SEQ ID NO: 10及29)、AAVF11/HSC11 (WO2016049230之SEQ ID NO: 4及26)、AAVF12/HSC12 (WO2016049230之SEQ ID NO: 12及30)、AAVF13/HSC13 (WO2016049230之SEQ ID NO: 14及31)、AAVF14/HSC14 (WO2016049230之SEQ ID NO: 15及32)、AAVF15/HSC15 (WO2016049230之SEQ ID NO: 16及33)、AAVF16/HSC16 (WO2016049230之SEQ ID NO: 17及34)、AAVF17/HSC17 (WO2016049230之SEQ ID NO: 13及35)或其變異體或衍生物。
在一些實施例中，AAV血清型可為或具有如內容以全文引用之方式併入本文中的美國專利第US 8734809號中所描述之序列，諸如但不限於 AAV CBr-E1 (US8734809之SEQ ID NO: 13及87)、AAV CBr-E2 (US8734809之SEQ ID NO: 14及88)、AAV CBr-E3 (US8734809之SEQ ID NO: 15及89)、AAV CBr-E4 (US8734809之SEQ ID NO: 16及90)、AAV CBr-E5 (US8734809之SEQ ID NO: 17及91)、AAV CBr-e5 (US8734809之SEQ ID NO: 18及92)、AAV CBr-E6 (US8734809之SEQ ID NO: 19及93)、AAV CBr-E7 (US8734809之SEQ ID NO: 20及94)、AAV CBr-E8 (US8734809之SEQ ID NO: 21及95)、AAV CLv-D1 (US8734809之SEQ ID NO: 22及96)、AAV CLv-D2 (US8734809之SEQ ID NO: 23及97)、AAV CLv-D3 (US8734809之SEQ ID NO: 24及98)、AAV CLv-D4 (US8734809之SEQ ID NO: 25及99)、AAV CLv-D5 (US8734809之SEQ ID NO: 26及100)、AAV CLv-D6 (US8734809之SEQ ID NO: 27及101)、AAV CLv-D7 (US8734809之SEQ ID NO: 28及102)、AAV CLv-D8 (US8734809之SEQ ID NO: 29及103)、AAV CLv-E1 (US8734809之SEQ ID NO: 13及87)、AAV CLv-R1 (US8734809之SEQ ID NO: 30及104)、AAV CLv-R2 (US8734809之SEQ ID NO: 31及105)、AAV CLv-R3 (US8734809之SEQ ID NO: 32及106)、AAV CLv-R4 (US8734809之SEQ ID NO: 33及107)、AAV CLv-R5 (US8734809之SEQ ID NO: 34及108)、AAV CLv-R6 (US8734809之SEQ ID NO: 35及109)、AAV CLv-R7 (US8734809之SEQ ID NO: 36及110)、AAV CLv-R8 (US8734809之SEQ ID NO: 37及111)、AAV CLv-R9 (US8734809之SEQ ID NO: 38及112)、AAV CLg-F1 (US8734809之SEQ ID NO: 39及113)、AAV CLg-F2 (US8734809之SEQ ID NO: 40及114)、AAV CLg-F3 (US8734809之SEQ ID NO: 41及115)、AAV CLg-F4 (US8734809之SEQ ID NO: 42及116)、AAV CLg-F5 (US8734809之SEQ ID NO: 43及117)、AAV CLg-F6 (US8734809之SEQ ID NO: 43及117)、AAV CLg-F7 (US8734809之SEQ ID NO: 44及118)、AAV CLg-F8 (US8734809之SEQ ID NO: 43及117)、AAV CSp-1 (US8734809之SEQ ID NO: 45及119)、AAV CSp-10 (US8734809之SEQ ID NO: 46及120)、AAV CSp-11 (US8734809之SEQ ID NO: 47及121)、AAV CSp-2 (US8734809之SEQ ID NO: 48及122)、AAV CSp-3 (US8734809之SEQ ID NO: 49及123)、AAV CSp-4 (US8734809之SEQ ID NO: 50及124)、AAV CSp-6 (US8734809之SEQ ID NO: 51及125)、AAV CSp-7 (US8734809之SEQ ID NO: 52及126)、AAV CSp-8 (US8734809之SEQ ID NO: 53及127)、AAV CSp-9 (US8734809之SEQ ID NO: 54及128)、AAV CHt-2 (US8734809之SEQ ID NO: 55及129)、AAV CHt-3 (US8734809之SEQ ID NO: 56及130)、AAV CKd-1 (US8734809之SEQ ID NO: 57及131)、AAV CKd-10 (US8734809之SEQ ID NO: 58及132)、AAV CKd-2 (US8734809之SEQ ID NO: 59及133)、AAV CKd-3 (US8734809之SEQ ID NO: 60及134)、AAV CKd-4 (US8734809之SEQ ID NO: 61及135)、AAV CKd-6 (US8734809之SEQ ID NO: 62及136)、AAV CKd-7 (US8734809之SEQ ID NO: 63及137)、AAV CKd-8 (US8734809之SEQ ID NO: 64及138)、AAV CLv-1 (US8734809之SEQ ID NO: 35及139)、AAV CLv-12 (US8734809之SEQ ID NO: 66及140)、AAV CLv-13 (US8734809之SEQ ID NO: 67及141)、AAV CLv-2 (US8734809之SEQ ID NO: 68及142)、AAV CLv-3 (US8734809之SEQ ID NO: 69及143)、AAV CLv-4 (US8734809之SEQ ID NO: 70及144)、AAV CLv-6 (US8734809之SEQ ID NO: 71及145)、AAV CLv-8 (US8734809之SEQ ID NO: 72及146)、AAV CKd-B1 (US8734809之SEQ ID NO: 73及147)、AAV CKd-B2 (US8734809之SEQ ID NO: 74及148)、AAV CKd-B3 (US8734809之SEQ ID NO: 75及149)、AAV CKd-B4 (US8734809之SEQ ID NO: 76及150)、AAV CKd-B5 (US8734809之SEQ ID NO: 77及151)、AAV CKd-B6 (US8734809之SEQ ID NO: 78及152)、AAV CKd-B7 (US8734809之SEQ ID NO: 79及153)、AAV CKd-B8 (US8734809之SEQ ID NO: 80及154)、AAV CKd-H1 (US8734809之SEQ ID NO: 81及155)、AAV CKd-H2 (US8734809之SEQ ID NO: 82及156)、AAV CKd-H3 (US8734809之SEQ ID NO: 83及157)、AAV CKd-H4 (US8734809之SEQ ID NO: 84及158)、AAV CKd-H5 (US8734809之SEQ ID NO: 85及159)、AAV CKd-H6 (US8734809之SEQ ID NO: 77及151)、AAV CHt-1 (US8734809之SEQ ID NO: 86及160)、AAV CLv1-1 (US8734809之SEQ ID NO: 171)、AAV CLv1-2 (US8734809之SEQ ID NO: 172)、AAV CLv1-3 (US8734809之SEQ ID NO: 173)、AAV CLv1-4 (US8734809之SEQ ID NO: 174)、AAV Clv1-7 (US8734809之SEQ ID NO: 175)、AAV Clv1-8 (US8734809之SEQ ID NO: 176)、AAV Clv1-9 (US8734809之SEQ ID NO: 177)、AAV Clv1-10 (US8734809之SEQ ID NO: 178)、AAV.VR-355 (US8734809之SEQ ID NO: 181)、AAV.hu.48R3 (US8734809之SEQ ID NO: 183)或其變異體或衍生物。
在一些實施例中，AAV血清型可為或具有如內容以全文引用之方式併入本文中的國際公開案第WO2016065001號中所描述之序列，諸如但不限於AAV CHt-P2 (WO2016065001之SEQ ID NO: 1及51)、AAV CHt-P5 (WO2016065001之SEQ ID NO: 2及52)、AAV CHt-P9 (WO2016065001之SEQ ID NO: 3及53)、AAV CBr-7.1 (WO2016065001之SEQ ID NO: 4及54)、AAV CBr-7.2 (WO2016065001之SEQ ID NO: 5及55)、AAV CBr-7.3 (WO2016065001之SEQ ID NO: 6及56)、AAV CBr-7.4 (WO2016065001之SEQ ID NO: 7及57)、AAV CBr-7.5 (WO2016065001之SEQ ID NO: 8及58)、AAV CBr-7.7 (WO2016065001之SEQ ID NO: 9及59)、AAV CBr-7.8 (WO2016065001之SEQ ID NO: 10及60)、AAV CBr-7.10 (WO2016065001之SEQ ID NO: 11及61)、AAV CKd-N3 (WO2016065001之SEQ ID NO: 12及62)、AAV CKd-N4 (WO2016065001之SEQ ID NO: 13及63)、AAV CKd-N9 (WO2016065001之SEQ ID NO: 14及64)、AAV CLv-L4 (WO2016065001之SEQ ID NO: 15及65)、AAV CLv-L5 (WO2016065001之SEQ ID NO: 16及66)、AAV CLv-L6 (WO2016065001之SEQ ID NO: 17及67)、AAV CLv-K1 (WO2016065001之SEQ ID NO: 18及68)、AAV CLv-K3 (WO2016065001之SEQ ID NO: 19及69)、AAV CLv-K6 (WO2016065001之SEQ ID NO: 20及70)、AAV CLv-M1 (WO2016065001之SEQ ID NO: 21及71)、AAV CLv-M11 (WO2016065001之SEQ ID NO: 22及72)、AAV CLv-M2 (WO2016065001之SEQ ID NO: 23及73)、AAV CLv-M5 (WO2016065001之SEQ ID NO: 24及74)、AAV CLv-M6 (WO2016065001之SEQ ID NO: 25及75)、AAV CLv-M7 (WO2016065001之SEQ ID NO: 26及76)、AAV CLv-M8 (WO2016065001之SEQ ID NO: 27及77)、AAV CLv-M9 (WO2016065001之SEQ ID NO: 28及78)、AAV CHt-P1 (WO2016065001之SEQ ID NO: 29及79)、AAV CHt-P6 (WO2016065001之SEQ ID NO: 30及80)、AAV CHt-P8 (WO2016065001之SEQ ID NO: 31及81)、AAV CHt-6.1 (WO2016065001之SEQ ID NO: 32及82)、AAV CHt-6.10 (WO2016065001之SEQ ID NO: 33及83)、AAV CHt-6.5 (WO2016065001之SEQ ID NO: 34及84)、AAV CHt-6.6 (WO2016065001之SEQ ID NO: 35及85)、AAV CHt-6.7 (WO2016065001之SEQ ID NO: 36及86)、AAV CHt-6.8 (WO2016065001之SEQ ID NO: 37及87)、AAV CSp-8.10 (WO2016065001之SEQ ID NO: 38及88)、AAV CSp-8.2 (WO2016065001之SEQ ID NO: 39及89)、AAV CSp-8.4 (WO2016065001之SEQ ID NO: 40及90)、AAV CSp-8.5 (WO2016065001之SEQ ID NO: 41及91)、AAV CSp-8.6 (WO2016065001之SEQ ID NO: 42及92)、AAV CSp-8.7 (WO2016065001之SEQ ID NO: 43及93)、AAV CSp-8.8 (WO2016065001之SEQ ID NO: 44及94)、AAV CSp-8.9 (WO2016065001之SEQ ID NO: 45及95)、AAV CBr-B7.3 (WO2016065001之SEQ ID NO: 46及96)、AAV CBr-B7.4 (WO2016065001之SEQ ID NO: 47及97)、AAV3B (WO2016065001之SEQ ID NO: 48及98)、AAV4 (WO2016065001之SEQ ID NO: 49及99)、AAV5 (WO2016065001之SEQ ID NO: 50及100)或其變異體或衍生物。
在一些實施例中，AAV可為選自表1中存在之血清型中之任一者的血清型。
在一些實施例中，AAV可包含表1中之序列的序列、其片段或變異體。
在一些實施例中，AAV可由如表1中所描述之序列、片段或變異體編碼。 表1. AAV血清型
血清型 SEQ ID NO 參考資訊
AAV1 1 US20150159173 SEQ ID NO: 11，US20150315612 SEQ ID NO: 202
AAV1 2 US20160017295 SEQ ID NO: 1，US20030138772 SEQ ID NO: 64，US20150159173 SEQ ID NO: 27，US20150315612 SEQ ID NO: 219，US7198951 SEQ ID NO: 5
AAV1 3 US20030138772 SEQ ID NO: 6
AAV1.3 4 US20030138772 SEQ ID NO: 14
AAV10 5 US20030138772 SEQ ID NO: 117
AAV10 6 WO2015121501 SEQ ID NO: 9
AAV10 7 WO2015121501 SEQ ID NO: 8
AAV11 8 US20030138772 SEQ ID NO: 118
AAV12 9 US20030138772 SEQ ID NO: 119
AAV2 10 US20150159173 SEQ ID NO: 7，US20150315612 SEQ ID NO: 211
AAV2 11 US20030138772 SEQ ID NO: 70，US20150159173 SEQ ID NO: 23，US20150315612 SEQ ID NO: 221，US20160017295 SEQ ID NO: 2，US6156303 SEQ ID NO: 4，US7198951 SEQ ID NO: 4，WO2015121501 SEQ ID NO: 1
AAV2 12 US6156303 SEQ ID NO: 8
AAV2 13 US20030138772 SEQ ID NO: 7
AAV2 14 US6156303 SEQ ID NO: 3
AAV2.5T 15 US9233131 SEQ ID NO: 42
AAV223.10 16 US20030138772 SEQ ID NO: 75
AAV223.2 17 US20030138772 SEQ ID NO: 49
AAV223.2 18 US20030138772 SEQ ID NO: 76
AAV223.4 19 US20030138772 SEQ ID NO: 50
AAV223.4 20 US20030138772 SEQ ID NO: 73
AAV223.5 21 US20030138772 SEQ ID NO: 51
AAV223.5 22 US20030138772 SEQ ID NO: 74
AAV223.6 23 US20030138772 SEQ ID NO: 52
AAV223.6 24 US20030138772 SEQ ID NO: 78
AAV223.7 25 US20030138772 SEQ ID NO: 53
AAV223.7 26 US20030138772 SEQ ID NO: 77
AAV29.3 27 US20030138772 SEQ ID NO: 82
AAV29.4 28 US20030138772 SEQ ID NO: 12
AAV29.5 29 US20030138772 SEQ ID NO: 83
AAV29.5 (AAVbb.2) 30 US20030138772 SEQ ID NO: 13
AAV3 31 US20150159173 SEQ ID NO: 12
AAV3 32 US20030138772 SEQ ID NO: 71，US20150159173 SEQ ID NO: 28，US20160017295 SEQ ID NO: 3，US7198951 SEQ ID NO: 6
AAV3 33 US20030138772 SEQ ID NO: 8
AAV3.3b 34 US20030138772 SEQ ID NO: 72
AAV3-3 35 US20150315612 SEQ ID NO: 200
AAV3-3 36 US20150315612 SEQ ID NO: 217
AAV3a 37 US6156303 SEQ ID NO: 5
AAV3a 38 US6156303 SEQ ID NO: 9
AAV3b 39 US6156303 SEQ ID NO: 6
AAV3b 40 US6156303 SEQ ID NO: 10
AAV3b 41 US6156303 SEQ ID NO: 1
AAV4 42 US20140348794 SEQ ID NO: 17
AAV4 43 US20140348794 SEQ ID NO: 5
AAV4 44 US20140348794 SEQ ID NO: 3
AAV4 45 US20140348794 SEQ ID NO: 14
AAV4 46 US20140348794 SEQ ID NO: 15
AAV4 47 US20140348794 SEQ ID NO: 19
AAV4 48 US20140348794 SEQ ID NO: 12
AAV4 49 US20140348794 SEQ ID NO: 13
AAV4 50 US20140348794 SEQ ID NO: 7
AAV4 51 US20140348794 SEQ ID NO: 8
AAV4 52 US20140348794 SEQ ID NO: 9
AAV4 53 US20140348794 SEQ ID NO: 2
AAV4 54 US20140348794 SEQ ID NO: 10
AAV4 55 US20140348794 SEQ ID NO: 11
AAV4 56 US20140348794 SEQ ID NO: 18
AAV4 57 US20030138772 SEQ ID NO: 63，US20160017295 SEQ ID NO: 4，US20140348794 SEQ ID NO: 4
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AAVDJ-8 159 US7588772；Grimm等人2008
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AAVhu.44 (AAV128.3) 265 US20150315612 SEQ ID NO: 81
AAVhu.44R1 266 US20150159173
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AAVhu.47 274 US20150315612 SEQ ID NO: 77
AAVhu.47 275 US20150315612 SEQ ID NO: 128
AAVhu.48 276 US20150159173 SEQ ID NO: 38
AAVhu.48 277 US20150315612 SEQ ID NO: 157
AAVhu.48 (AAV130.4) 278 US20150315612 SEQ ID NO: 78
AAVhu.48R1 279 US20150159173
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AAVhu.5 285 US20150315612 SEQ ID NO: 142
AAVhu.51 286 US20150315612 SEQ ID NO: 208
AAVhu.51 287 US20150315612 SEQ ID NO: 190
AAVhu.52 288 US20150315612 SEQ ID NO: 210
AAVhu.52 289 US20150315612 SEQ ID NO: 191
AAVhu.53 290 US20150159173 SEQ ID NO: 19
AAVhu.53 291 US20150159173 SEQ ID NO: 35
AAVhu.53 (AAV145.1) 292 US20150315612 SEQ ID NO: 176
AAVhu.54 293 US20150315612 SEQ ID NO: 188
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AAVhu.55 295 US20150315612 SEQ ID NO: 187
AAVhu.56 296 US20150315612 SEQ ID NO: 205
AAVhu.56 (AAV145.6) 297 US20150315612 SEQ ID NO: 168
AAVhu.56 (AAV145.6) 298 US20150315612 SEQ ID NO: 192
AAVhu.57 299 US20150315612 SEQ ID NO: 206
AAVhu.57 300 US20150315612 SEQ ID NO: 169
AAVhu.57 301 US20150315612 SEQ ID NO: 193
AAVhu.58 302 US20150315612 SEQ ID NO: 207
AAVhu.58 303 US20150315612 SEQ ID NO: 194
AAVhu.6 (AAV3.1) 304 US20150315612 SEQ ID NO: 5
AAVhu.6 (AAV3.1) 305 US20150315612 SEQ ID NO: 84
AAVhu.60 306 US20150315612 SEQ ID NO: 184
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AAVhu.61 308 US20150315612 SEQ ID NO: 185
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AAVrh.55 (AAV4-19) 470 US20150315612 SEQ ID NO: 117
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AAVrh.67 493 US20150315612 SEQ ID NO: 36
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AAVrh.67 495 US20150159173 SEQ ID NO: 47，US20150315612 SEQ ID NO: 113
AAVrh.68 496 US20150315612 SEQ ID NO: 16
AAVrh.68 497 US20150315612 SEQ ID NO: 100
AAVrh.69 498 US20150315612 SEQ ID NO: 39
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AAVrh.70 500 US20150315612 SEQ ID NO: 20
AAVrh.70 501 US20150315612 SEQ ID NO: 98
AAVrh.71 502 US20150315612 SEQ ID NO: 162
AAVrh.72 503 US20150315612 SEQ ID NO: 9
AAVrh.73 504 US20150159173 SEQ ID NO: 5
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AAVrh.8 506 US20150159173 SEQ ID NO: 41
AAVrh.8 507 US20150315612 SEQ ID NO: 235
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AAVrh.8R R533A突變體 510 WO2015168666 SEQ ID NO: 11
牛AAV (BAAV) 511 US9193769 SEQ ID NO: 8
牛AAV (BAAV) 512 US9193769 SEQ ID NO: 10
牛AAV (BAAV) 513 US9193769 SEQ ID NO: 4
牛AAV (BAAV) 514 US9193769 SEQ ID NO: 2
牛AAV (BAAV) 515 US9193769 SEQ ID NO: 6
牛AAV (BAAV) 516 US9193769 SEQ ID NO: 1
牛AAV (BAAV) 517 US9193769 SEQ ID NO: 5
牛AAV (BAAV) 518 US9193769 SEQ ID NO: 3
牛AAV (BAAV) 519 US9193769 SEQ ID NO: 11
牛AAV (BAAV) 520 US7427396 SEQ ID NO: 5
牛AAV (BAAV) 521 US7427396 SEQ ID NO: 6
牛AAV (BAAV) 522 US9193769 SEQ ID NO: 7
牛AAV (BAAV) 523 US9193769 SEQ ID NO: 9
BNP61 AAV 524 US20150238550 SEQ ID NO: 1
BNP61 AAV 525 US20150238550 SEQ ID NO: 2
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山羊AAV 528 US7427396 SEQ ID NO: 3
山羊AAV 529 US7427396 SEQ ID NO: 4
真型AAV (ttAAV) 530 WO2015121501 SEQ ID NO: 2
禽AAV (AAAV) 531 US9238800 SEQ ID NO: 12
禽AAV (AAAV) 532 US9238800 SEQ ID NO: 2
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禽AAV (AAAV) 538 US9238800 SEQ ID NO: 15
禽AAV (AAAV) 539 US9238800 SEQ ID NO: 5
禽AAV (AAAV) 540 US9238800 SEQ ID NO: 9
禽AAV (AAAV) 541 US9238800 SEQ ID NO: 3
禽AAV (AAAV) 542 US9238800 SEQ ID NO: 7
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禽AAV (AAAV) 544 US9238800 SEQ ID NO: 13
禽AAV (AAAV) 545 US9238800 SEQ ID NO: 1
AAV改組100-1 546 US20160017295 SEQ ID NO: 23
AAV改組100-1 547 US20160017295 SEQ ID NO: 11
AAV改組100-2 548 US20160017295 SEQ ID NO: 37
AAV改組100-2 549 US20160017295 SEQ ID NO: 29
AAV改組100-3 550 US20160017295 SEQ ID NO: 24
AAV改組100-3 551 US20160017295 SEQ ID NO: 12
AAV改組100-7 552 US20160017295 SEQ ID NO: 25
AAV改組100-7 553 US20160017295 SEQ ID NO: 13
AAV改組10-2 554 US20160017295 SEQ ID NO: 34
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AAV改組10-8 558 US20160017295 SEQ ID NO: 36
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AAV CLv-L6 834 WO2016065001 SEQ ID NO: 67
AAV CLv-K1 835 WO2016065001 SEQ ID NO: 68
AAV CLv-K3 836 WO2016065001 SEQ ID NO: 69
AAV CLv-K6 837 WO2016065001 SEQ ID NO: 70
AAV CLv-M1 838 WO2016065001 SEQ ID NO: 71
AAV CLv-M11 839 WO2016065001 SEQ ID NO: 72
AAV CLv-M2 840 WO2016065001 SEQ ID NO: 73
AAV CLv-M5 841 WO2016065001 SEQ ID NO: 74
AAV CLv-M6 842 WO2016065001 SEQ ID NO: 75
AAV CLv-M7 843 WO2016065001 SEQ ID NO: 76
AAV CLv-M8 844 WO2016065001 SEQ ID NO: 77
AAV CLv-M9 845 WO2016065001 SEQ ID NO: 78
AAV CHt-P1 846 WO2016065001 SEQ ID NO: 79
AAV CHt-P6 847 WO2016065001 SEQ ID NO: 80
AAV CHt-P8 848 WO2016065001 SEQ ID NO: 81
AAV CHt-6.1 849 WO2016065001 SEQ ID NO: 82
AAV CHt-6.10 850 WO2016065001 SEQ ID NO: 83
AAV CHt-6.5 851 WO2016065001 SEQ ID NO: 84
AAV CHt-6.6 852 WO2016065001 SEQ ID NO: 85
AAV CHt-6.7 853 WO2016065001 SEQ ID NO: 86
AAV CHt-6.8 854 WO2016065001 SEQ ID NO: 87
AAV CSp-8.10 855 WO2016065001 SEQ ID NO: 88
AAV CSp-8.2 856 WO2016065001 SEQ ID NO: 89
AAV CSp-8.4 857 WO2016065001 SEQ ID NO: 90
AAV CSp-8.5 858 WO2016065001 SEQ ID NO: 91
AAV CSp-8.6 859 WO2016065001 SEQ ID NO: 92
AAV CSp-8.7 860 WO2016065001 SEQ ID NO: 93
AAV CSp-8.8 861 WO2016065001 SEQ ID NO: 94
AAV CSp-8.9 862 WO2016065001 SEQ ID NO: 95
AAV CBr-B7.3 863 WO2016065001 SEQ ID NO: 96
AAV CBr-B7.4 864 WO2016065001 SEQ ID NO: 97
AAV3B 865 WO2016065001 SEQ ID NO: 98
AAV4 866 WO2016065001 SEQ ID NO: 99
AAV5 867 WO2016065001 SEQ ID NO: 100
AAVPHP.B或G2B-26 868 WO2015038958 SEQ ID NO: 8及13；GenBankALU85156.1
AAVPHP.B 869 WO2015038958 SEQ ID NO: 9
AAVG2B-13 870 WO2015038958 SEQ ID NO: 12
AAVTH1.1-32 871 WO2015038958 SEQ ID NO: 14
AAVTH1.1-35 872 WO2015038958 SEQ ID NO: 15
PHP.N/PHP.B-DGT 1439 WO2017100671 SEQ ID NO: 46
PHP.S/G2A12 1440 WO2017100671 SEQ ID NO: 47
AAV9/hu.14 K449R 1441 WO2017100671 SEQ ID NO: 45
GPV 1518 US9624274B2 SEQ ID NO: 192
B19 1519 US9624274B2 SEQ ID NO: 193
MVM 1520 US9624274B2 SEQ ID NO: 194
FPV 1521 US9624274B2 SEQ ID NO: 195
CPV 1522 US9624274B2 SEQ ID NO: 196
AAV6 1523 US9546112B2 SEQ ID NO: 5
AAV6 1524 US9457103B2 SEQ ID NO: 1
AAV2 1525 US9457103B2 SEQ ID NO: 2
ShH10 1526 US9457103B2 SEQ ID NO: 3
ShH13 1527 US9457103B2 SEQ ID NO: 4
ShH10 1528 US9457103B2 SEQ ID NO: 5
ShH10 1529 US9457103B2 SEQ ID NO: 6
ShH10 1530 US9457103B2 SEQ ID NO: 7
ShH10 1531 US9457103B2 SEQ ID NO: 8
ShH10 1532 US9457103B2 SEQ ID NO: 9
rh74 1533 US9434928B2 SEQ ID NO: 1，US2015023924A1 SEQ ID NO: 2
rh74 1534 US9434928B2 SEQ ID NO: 2，US2015023924A1 SEQ ID NO: 1
AAV8 1535 US9434928B2 SEQ ID NO: 4
rh74 1536 US9434928B2 SEQ ID NO: 5
rh74 (RHM4-1) 1537 US2015023924A1 SEQ ID NO: 5，US20160375110A1 SEQ ID NO: 4
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rh74 (RHM15-3/RHM15-5) 1540 US2015023924A1 SEQ ID NO: 8，US20160375110A1 SEQ ID NO: 7
rh74 (RHM15-4) 1541 US2015023924A1 SEQ ID NO: 9，US20160375110A1 SEQ ID NO: 8
rh74 (RHM15-6) 1542 US2015023924A1 SEQ ID NO: 10，US20160375110A1 SEQ ID NO: 9
rh74 (RHM4-1) 1543 US2015023924A1 SEQ ID NO: 11
rh74 (RHM15-1) 1544 US2015023924A1 SEQ ID NO: 12
rh74 (RHM15-2) 1545 US2015023924A1 SEQ ID NO: 13
rh74 (RHM15-3/RHM15-5) 1546 US2015023924A1 SEQ ID NO: 14
rh74 (RHM15-4) 1547 US2015023924A1 SEQ ID NO: 15
rh74 (RHM15-6) 1548 US2015023924A1 SEQ ID NO: 16
AAV2 (包含肺特異性多肽) 1549 US20160175389A1 SEQ ID NO: 9
AAV2 (包含肺特異性多肽) 1550 US20160175389A1 SEQ ID NO: 10
Anc80 1551 US20170051257A1 SEQ ID NO: 1
Anc80 1552 US20170051257A1 SEQ ID NO: 2
Anc81 1553 US20170051257A1 SEQ ID NO: 3
Anc80 1554 US20170051257A1 SEQ ID NO: 4
Anc82 1555 US20170051257A1 SEQ ID NO: 5
Anc82 1556 US20170051257A1 SEQ ID NO: 6
Anc83 1557 US20170051257A1 SEQ ID NO: 7
Anc83 1558 US20170051257A1 SEQ ID NO: 8
Anc84 1559 US20170051257A1 SEQ ID NO: 9
Anc84 1560 US20170051257A1 SEQ ID NO: 10
Anc94 1561 US20170051257A1 SEQ ID NO: 11
Anc94 1562 US20170051257A1 SEQ ID NO: 12
Anc113 1563 US20170051257A1 SEQ ID NO: 13
Anc113 1564 US20170051257A1 SEQ ID NO: 14
Anc126 1565 US20170051257A1 SEQ ID NO: 15
Anc126 1566 US20170051257A1 SEQ ID NO: 16
Anc127 1567 US20170051257A1 SEQ ID NO: 17
Anc127 1568 US20170051257A1 SEQ ID NO: 18
Anc80L27 1569 US20170051257A1 SEQ ID NO: 19
Anc80L59 1570 US20170051257A1 SEQ ID NO: 20
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Anc80L36 1575 US20170051257A1 SEQ ID NO: 25
Anc80L44 1576 US20170051257A1 SEQ ID NO: 26
Anc80L1 1577 US20170051257A1 SEQ ID NO: 35
Anc80L1 1578 US20170051257A1 SEQ ID NO: 36
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AAV-X1b 1580 US8283151B2 SEQ ID NO: 12
AAV-X5 1581 US8283151B2 SEQ ID NO: 13
AAV-X19 1582 US8283151B2 SEQ ID NO: 14
AAV-X21 1583 US8283151B2 SEQ ID NO: 15
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AAV-X23 1585 US8283151B2 SEQ ID NO: 17
AAV-X24 1586 US8283151B2 SEQ ID NO: 18
AAV-X25 1587 US8283151B2 SEQ ID NO: 19
AAV-X26 1588 US8283151B2 SEQ ID NO: 20
AAV-X1 1589 US8283151B2 SEQ ID NO: 21
AAV-X1b 1590 US8283151B2 SEQ ID NO: 22
AAV-X5 1591 US8283151B2 SEQ ID NO: 23
AAV-X19 1592 US8283151B2 SEQ ID NO: 24
AAV-X21 1593 US8283151B2 SEQ ID NO: 25
AAV-X22 1594 US8283151B2 SEQ ID NO: 26
AAV-X23 1595 US8283151B2 SEQ ID NO: 27
AAV-X24 1596 US8283151B2 SEQ ID NO: 28
AAV-X25 1597 US8283151B2 SEQ ID NO: 29
AAV-X26 1598 US8283151B2 SEQ ID NO: 30
AAVrh8 1599 WO2016054554A1 SEQ ID NO: 8
AAVrh8VP2FC5 1600 WO2016054554A1 SEQ ID NO: 9
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AAVrh8VP2RVG 1603 WO2016054554A1 SEQ ID NO: 12
AAVrh8VP2血管胜肽素-2 (Angiopep-2) VP2 1604 WO2016054554A1 SEQ ID NO: 13
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AAV9.47VP2A-串 1609 WO2016054554A1 SEQ ID NO: 18
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AAVrh8VP2FC44 VP2 1611 WO2016054554A1 SEQ ID NO: 20
AAVrh8VP2ApoB100 VP2 1612 WO2016054554A1 SEQ ID NO: 21
AAVrh8VP2RVG VP2 1613 WO2016054554A1 SEQ ID NO: 22
AAVrh8VP2血管胜肽素-2 VP2 1614 WO2016054554A1 SEQ ID NO: 23
AAV9.47VP2ICAMg3 VP2 1615 WO2016054554A1 SEQ ID NO: 24
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AAV9.47VP2血管胜肽素-2 VP2 1617 WO2016054554A1 SEQ ID NO: 26
AAV9.47VP2A-串VP2 1618 WO2016054554A1 SEQ ID NO: 27
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rAAV-B2 1620 WO2016054557A1 SEQ ID NO: 2
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rAAV-B3 1625 WO2016054557A1 SEQ ID NO: 7
rAAV-B4 1626 WO2016054557A1 SEQ ID NO: 8
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rAAV-L1 1631 WO2016054557A1 SEQ ID NO: 13
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rAAV-L3 1633 WO2016054557A1 SEQ ID NO: 15
rAAV-L4 1634 WO2016054557A1 SEQ ID NO: 16
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rAAV 1646 WO2016081811A1 SEQ ID NO: 11
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rAAV 1669 WO2016081811A1 SEQ ID NO: 34
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rAAV 1701 WO2016081811A1 SEQ ID NO: 66
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rAAV 1728 WO2016081811A1 SEQ ID NO: 93
rAAV 1729 WO2016081811A1 SEQ ID NO: 94
rAAV 1730 WO2016081811A1 SEQ ID NO: 95
rAAV 1731 WO2016081811A1 SEQ ID NO: 96
rAAV 1732 WO2016081811A1 SEQ ID NO: 97
rAAV 1733 WO2016081811A1 SEQ ID NO: 98
rAAV 1734 WO2016081811A1 SEQ ID NO: 99
rAAV 1735 WO2016081811A1 SEQ ID NO: 100
rAAV 1736 WO2016081811A1 SEQ ID NO: 101
rAAV 1737 WO2016081811A1 SEQ ID NO: 102
rAAV 1738 WO2016081811A1 SEQ ID NO: 103
rAAV 1739 WO2016081811A1 SEQ ID NO: 104
rAAV 1740 WO2016081811A1 SEQ ID NO: 105
rAAV 1741 WO2016081811A1 SEQ ID NO: 106
rAAV 1742 WO2016081811A1 SEQ ID NO: 107
rAAV 1743 WO2016081811A1 SEQ ID NO: 108
rAAV 1744 WO2016081811A1 SEQ ID NO: 109
rAAV 1745 WO2016081811A1 SEQ ID NO: 110
rAAV 1746 WO2016081811A1 SEQ ID NO: 111
rAAV 1747 WO2016081811A1 SEQ ID NO: 112
rAAV 1748 WO2016081811A1 SEQ ID NO: 113
rAAV 1749 WO2016081811A1 SEQ ID NO: 114
rAAV 1750 WO2016081811A1 SEQ ID NO: 115
rAAV 1751 WO2016081811A1 SEQ ID NO: 116
rAAV 1752 WO2016081811A1 SEQ ID NO: 117
rAAV 1753 WO2016081811A1 SEQ ID NO: 118
rAAV 1754 WO2016081811A1 SEQ ID NO: 119
rAAV 1755 WO2016081811A1 SEQ ID NO: 120
rAAV 1756 WO2016081811A1 SEQ ID NO: 121
rAAV 1757 WO2016081811A1 SEQ ID NO: 122
rAAV 1758 WO2016081811A1 SEQ ID NO: 123
rAAV 1759 WO2016081811A1 SEQ ID NO: 124
rAAV 1760 WO2016081811A1 SEQ ID NO: 125
rAAV 1761 WO2016081811A1 SEQ ID NO: 126
rAAV 1762 WO2016081811A1 SEQ ID NO: 127
rAAV 1763 WO2016081811A1 SEQ ID NO: 128
AAV8 E532K 1764 WO2016081811A1 SEQ ID NO: 133
AAV8 E532K 1765 WO2016081811A1 SEQ ID NO: 134
rAAV4 1766 WO2016115382A1 SEQ ID NO: 2
rAAV4 1767 WO2016115382A1 SEQ ID NO: 3
rAAV4 1768 WO2016115382A1 SEQ ID NO: 4
rAAV4 1769 WO2016115382A1 SEQ ID NO: 5
rAAV4 1770 WO2016115382A1 SEQ ID NO: 6
rAAV4 1771 WO2016115382A1 SEQ ID NO: 7
rAAV4 1772 WO2016115382A1 SEQ ID NO: 8
rAAV4 1773 WO2016115382A1 SEQ ID NO: 9
rAAV4 1774 WO2016115382A1 SEQ ID NO: 10
rAAV4 1775 WO2016115382A1 SEQ ID NO: 11
rAAV4 1776 WO2016115382A1 SEQ ID NO: 12
rAAV4 1777 WO2016115382A1 SEQ ID NO: 13
rAAV4 1778 WO2016115382A1 SEQ ID NO: 14
rAAV4 1779 WO2016115382A1 SEQ ID NO: 15
rAAV4 1780 WO2016115382A1 SEQ ID NO: 16
rAAV4 1781 WO2016115382A1 SEQ ID NO: 17
rAAV4 1782 WO2016115382A1 SEQ ID NO: 18
rAAV4 1783 WO2016115382A1 SEQ ID NO: 19
rAAV4 1784 WO2016115382A1 SEQ ID NO: 20
rAAV4 1785 WO2016115382A1 SEQ ID NO: 21
AAV11 1786 WO2016115382A1 SEQ ID NO: 22
AAV12 1787 WO2016115382A1 SEQ ID NO: 23
rh32 1788 WO2016115382A1 SEQ ID NO: 25
rh33 1789 WO2016115382A1 SEQ ID NO: 26
rh34 1790 WO2016115382A1 SEQ ID NO: 27
rAAV4 1791 WO2016115382A1 SEQ ID NO: 28
rAAV4 1792 WO2016115382A1 SEQ ID NO: 29
rAAV4 1793 WO2016115382A1 SEQ ID NO: 30
rAAV4 1794 WO2016115382A1 SEQ ID NO: 31
rAAV4 1795 WO2016115382A1 SEQ ID NO: 32
rAAV4 1796 WO2016115382A1 SEQ ID NO: 33
AAV2/8 1797 WO2016131981A1 SEQ ID NO: 47
AAV2/8 1798 WO2016131981A1 SEQ ID NO: 48
祖先AAV 1799 WO2016154344A1 SEQ ID NO: 7
祖先AAV變異體C4 1800 WO2016154344A1 SEQ ID NO: 13
祖先AAV變異體C7 1801 WO2016154344A1 SEQ ID NO: 14
祖先AAV變異體G4 1802 WO2016154344A1 SEQ ID NO: 15
祖先AAV變異體C4、C7及G4之共同胺基酸序列 1803 WO2016154344A1 SEQ ID NO: 16
祖先AAV變異體C4及C7之共同胺基酸序列 1804 WO2016154344A1 SEQ ID NO: 17
AAV8 (具有AAV2磷脂酶域) 1805 WO2016150403A1 SEQ ID NO: 13
AAV VR-942n 1806 US20160289275A1 SEQ ID NO: 10
AAV5-A (M569V) 1807 US20160289275A1 SEQ ID NO: 13
AAV5-A (M569V) 1808 US20160289275A1 SEQ ID NO: 14
AAV5-A (Y585V) 1809 US20160289275A1 SEQ ID NO: 16
AAV5-A (Y585V) 1810 US20160289275A1 SEQ ID NO: 17
AAV5-A (L587T) 1811 US20160289275A1 SEQ ID NO: 19
AAV5-A (L587T) 1812 US20160289275A1 SEQ ID NO: 20
AAV5-A (Y585V/L587T) 1813 US20160289275A1 SEQ ID NO: 22
AAV5-A (Y585V/L587T) 1814 US20160289275A1 SEQ ID NO: 23
AAV5-B (D652A) 1815 US20160289275A1 SEQ ID NO: 25
AAV5-B (D652A) 1816 US20160289275A1 SEQ ID NO: 26
AAV5-B (T362M) 1817 US20160289275A1 SEQ ID NO: 28
AAV5-B (T362M) 1818 US20160289275A1 SEQ ID NO: 29
AAV5-B (Q359D) 1819 US20160289275A1 SEQ ID NO: 31
AAV5-B (Q359D) 1820 US20160289275A1 SEQ ID NO: 32
AAV5-B (E350Q) 1821 US20160289275A1 SEQ ID NO: 34
AAV5-B (E350Q) 1822 US20160289275A1 SEQ ID NO: 35
AAV5-B (P533S) 1823 US20160289275A1 SEQ ID NO: 37
AAV5-B (P533S) 1824 US20160289275A1 SEQ ID NO: 38
AAV5-B (P533G) 1825 US20160289275A1 SEQ ID NO: 40
AAV5-B (P533G) 1826 US20160289275A1 SEQ ID NO: 41
AAV5-環VII中之突變 1827 US20160289275A1 SEQ ID NO: 43
AAV5-環VII中之突變 1828 US20160289275A1 SEQ ID NO: 44
AAV8 1829 US20160289275A1 SEQ ID NO: 47
Mut A (LK03/AAV8) 1830 WO2016181123A1 SEQ ID NO: 1
Mut B (LK03/AAV5) 1831 WO2016181123A1 SEQ ID NO: 2
Mut C (AAV8/AAV3B) 1832 WO2016181123A1 SEQ ID NO: 3
Mut D (AAV5/AAV3B) 1833 WO2016181123A1 SEQ ID NO: 4
Mut E (AAV8/AAV3B) 1834 WO2016181123A1 SEQ ID NO: 5
Mut F (AAV3B/AAV8) 1835 WO2016181123A1 SEQ ID NO: 6
AAV44.9 1836 WO2016183297A1 SEQ ID NO: 4
AAV44.9 1837 WO2016183297A1 SEQ ID NO: 5
AAVrh8 1838 WO2016183297A1 SEQ ID NO: 6
AAV44.9 (S470N) 1839 WO2016183297A1 SEQ ID NO: 9
rh74 VP1 1840 US20160375110A1 SEQ ID NO: 1
AAV-LK03 (L125I) 1841 WO2017015102A1 SEQ ID NO: 5
AAV3B (S663V+T492V) 1842 WO2017015102A1 SEQ ID NO: 6
Anc80 1843 WO2017019994A2 SEQ ID NO: 1
Anc80 1844 WO2017019994A2 SEQ ID NO: 2
Anc81 1845 WO2017019994A2 SEQ ID NO: 3
Anc81 1846 WO2017019994A2 SEQ ID NO: 4
Anc82 1847 WO2017019994A2 SEQ ID NO: 5
Anc82 1848 WO2017019994A2 SEQ ID NO: 6
Anc83 1849 WO2017019994A2 SEQ ID NO: 7
Anc83 1850 WO2017019994A2 SEQ ID NO: 8
Anc84 1851 WO2017019994A2 SEQ ID NO: 9
Anc84 1852 WO2017019994A2 SEQ ID NO: 10
Anc94 1853 WO2017019994A2 SEQ ID NO: 11
Anc94 1854 WO2017019994A2 SEQ ID NO: 12
Anc113 1855 WO2017019994A2 SEQ ID NO: 13
Anc113 1856 WO2017019994A2 SEQ ID NO: 14
Anc126 1857 WO2017019994A2 SEQ ID NO: 15
Anc126 1858 WO2017019994A2 SEQ ID NO: 16
Anc127 1859 WO2017019994A2 SEQ ID NO: 17
Anc127 1860 WO2017019994A2 SEQ ID NO: 18
Anc80L27 1861 WO2017019994A2 SEQ ID NO: 19
Anc80L59 1862 WO2017019994A2 SEQ ID NO: 20
Anc80L60 1863 WO2017019994A2 SEQ ID NO: 21
Anc80L62 1864 WO2017019994A2 SEQ ID NO: 22
Anc80L65 1865 WO2017019994A2 SEQ ID NO: 23
Anc80L33 1866 WO2017019994A2 SEQ ID NO: 24
Anc80L36 1867 WO2017019994A2 SEQ ID NO: 25
Anc80L44 1868 WO2017019994A2 SEQ ID NO: 26
Anc80L1 1869 WO2017019994A2 SEQ ID NO: 35
Anc80L1 1870 WO2017019994A2 SEQ ID NO: 36
AAVrh10 1871 WO2017019994A2 SEQ ID NO: 41
Anc110 1872 WO2017019994A2 SEQ ID NO: 42
Anc110 1873 WO2017019994A2 SEQ ID NO: 43
AAVrh32.33 1874 WO2017019994A2 SEQ ID NO: 45
AAVrh74 1875 WO2017049031A1 SEQ ID NO: 1
AAV2 1876 WO2017053629A2 SEQ ID NO: 49
AAV2 1877 WO2017053629A2 SEQ ID NO: 50
AAV2 1878 WO2017053629A2 SEQ ID NO: 82
細小樣病毒 1879 WO2017070476A2 SEQ ID NO: 1
細小樣病毒 1880 WO2017070476A2 SEQ ID NO: 2
細小樣病毒 1881 WO2017070476A2 SEQ ID NO: 3
細小樣病毒 1882 WO2017070476A2 SEQ ID NO: 4
細小樣病毒 1883 WO2017070476A2 SEQ ID NO: 5
細小樣病毒 1884 WO2017070476A2 SEQ ID NO: 6
AAVrh.10 1885 WO2017070516A1 SEQ ID NO: 7
AAVrh.10 1886 WO2017070516A1 SEQ ID NO: 14
AAV2tYF 1887 WO2017070491A1 SEQ ID NO: 1
AAV-SPK 1888 WO2017075619A1 SEQ ID NO:28
AAV2.5 1889 US20170128528A1 SEQ ID NO: 13 
AAV1.1 1890 US20170128528A1 SEQ ID NO: 15
AAV6.1 1891 US20170128528A1 SEQ ID NO: 17
AAV6.3.1 1892 US20170128528A1 SEQ ID NO: 18
AAV2i8 1893 US20170128528A1 SEQ ID NO: 28
AAV2i8 1894 US20170128528A1 SEQ ID NO: 29
ttAAV 1895 US20170128528A1 SEQ ID NO: 30
ttAAV-S312N 1896 US20170128528A1 SEQ ID NO: 32
ttAAV-S312N 1897 US20170128528A1 SEQ ID NO: 33
AAV6 (Y705、Y731及T492) 1898 WO2016134337A1 SEQ ID NO: 24
AAV2 1899 WO2016134375A1 SEQ ID NO: 9
AAV2 1900 WO2016134375A1 SEQ ID NO: 10
表1中所列之專利、申請案及/或公開案中之每一者以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，AAV血清型可為或可具有如內容以全文引用的方式併入本文中的國際專利公開案WO2015038958中所述的序列，諸如但不限於AAV9 (WO2015038958之SEQ ID NO: 2及11或分別本文中的SEQ ID NO: 127及126)、PHP.B (WO2015038958之SEQ ID NO: 8及9，本文中的SEQ ID NO: 868及869)、G2B-13 (WO2015038958之SEQ ID NO: 12，本文中的SEQ ID NO: 870)、G2B-26 (WO2015038958之SEQ ID NO: 13，本文中的SEQ ID NO: 868及869)、TH1.1-32 (WO2015038958之SEQ ID NO: 14，本文中的SEQ ID NO: 871)、TH1.1-35 (WO2015038958之SEQ ID NO: 15，本文中的SEQ ID NO: 872)或其變異體。另外，可以將WO2015038958中所述的靶向肽或胺基酸插入序列中之任一者插入任何親本AAV血清型，諸如但不限於AAV9 (對於DNA序列，SEQ ID NO: 126及對於胺基酸序列，SEQ ID NO: 127)。在一些實施例中，胺基酸插入序列係插入於親本AAV (例如AAV9)之胺基酸586-592之間。在另一實施例中，胺基酸插入序列係插入於親本AAV序列之胺基酸588-589之間。胺基酸插入序列可為但不限於以下胺基酸序列中之任一者：TLAVPFK (WO2015038958之SEQ ID NO: 1；本文之SEQ ID NO: 873)、KFPVALT (WO2015038958之SEQ ID NO: 3；本文之SEQ ID NO: 874)、LAVPFK (WO2015038958之SEQ ID NO: 31；本文之SEQ ID NO: 875)、AVPFK (WO2015038958之SEQ ID NO: 32；本文之SEQ ID NO: 876)、VPFK (WO2015038958之SEQ ID NO: 33；本文之SEQ ID NO: 877)、TLAVPF (WO2015038958之SEQ ID NO: 34；本文之SEQ ID NO: 878)、TLAVP (WO2015038958之SEQ ID NO: 35；本文之SEQ ID NO: 879)、TLAV (WO2015038958之SEQ ID NO: 36；本文之SEQ ID NO: 880)、SVSKPFL (WO2015038958之SEQ ID NO: 28；本文之SEQ ID NO: 881)、FTLTTPK (WO2015038958之SEQ ID NO: 29；本文之SEQ ID NO: 882)、MNATKNV (WO2015038958之SEQ ID NO: 30；本文之SEQ ID NO: 883)、QSSQTPR (WO2015038958之SEQ ID NO: 54；本文之SEQ ID NO: 884)、ILGTGTS (WO2015038958之SEQ ID NO: 55；本文之SEQ ID NO: 885)、TRTNPEA (WO2015038958之SEQ ID NO: 56；本文之SEQ ID NO: 886)、NGGTSSS (WO2015038958之SEQ ID NO: 58；本文之SEQ ID NO: 887)或YTLSQGW (WO2015038958之SEQ ID NO: 60；本文之SEQ ID NO: 888)。可編碼胺基酸插入序列之核苷酸序列之非限制性實例包括以下：AAGTTTCCTGTGGCGTTGACT (WO2015038958之SEQ ID NO: 3；本文之SEQ ID NO: 889)、ACTTTGGCGGTGCCTTTTAAG (WO2015038958之SEQ ID NO: 24及49；本文之SEQ ID NO: 890)、AGTGTGAGTAAGCCTTTTTTG (WO2015038958之SEQ ID NO: 25；本文之SEQ ID NO: 891)、TTTACGTTGACGACGCCTAAG (WO2015038958之SEQ ID NO: 26；本文之SEQ ID NO: 892)、ATGAATGCTACGAAGAATGTG (WO2015038958之SEQ ID NO: 27；本文之SEQ ID NO: 893)、CAGTCGTCGCAGACGCCTAGG (WO2015038958之SEQ ID NO: 48；本文之SEQ ID NO: 894)、ATTCTGGGGACTGGTACTTCG (WO2015038958之SEQ ID NO: 50及52；本文之SEQ ID NO: 895)、ACGCGGACTAATCCTGAGGCT (WO2015038958之SEQ ID NO: 51；本文之SEQ ID NO: 896)、AATGGGGGGACTAGTAGTTCT (WO2015038958之SEQ ID NO: 53；本文之SEQ ID NO: 897)或TATACTTTGTCGCAGGGTTGG (WO2015038958之SEQ ID NO: 59；本文之SEQ ID NO: 898)。
在一些實施例中，AAV血清型可經工程改造以包含AAV2之至少一種AAV衣殼CD8+ T細胞抗原決定基，諸如但不限於SADNNNSEY (SEQ ID NO: 899)、LIDQYLYYL (SEQ ID NO: 900)、VPQYGYLTL (SEQ ID NO: 901)、TTSTRTWAL (SEQ ID NO: 902)、YHLNGRDSL (SEQ ID NO: 903)、SQAVGRSSF (SEQ ID NO: 904)、VPANPSTTF (SEQ ID NO: 905)、FPQSGVLIF (SEQ ID NO: 906)、YFDFNRFHCHFSPRD (SEQ ID NO: 907)、VGNSSGNWHCDSTWM (SEQ ID NO: 908)、QFSQAGASDIRDQSR (SEQ ID NO: 909)、GASDIRQSRNWLP (SEQ ID NO: 910)及GNRQAATADVNTQGV (SEQ ID NO: 911)。
在一些實施例中，AAV血清型可經工程改造以包含AAV1的至少一種AAV衣殼CD8+ T細胞抗原決定基，諸如但不限於LDRLMNPLI (SEQ ID NO: 912)、TTSTRTWAL (SEQ ID NO: 902)及QPAKKRLNF (SEQ ID NO: 913))。
在一些實施例中，可使用Hui等人(Molecular Therapy - Methods & Clinical Development (2015) 2, 15029 doi:10.1038/mtm.2015.29；其內容以全文引用之方式併入本文中)所描述之方法鑑別包括於AAV血清型中之肽。作為一非限制性實例，程序包括分離人類脾細胞，使用AAV衣殼蛋白之胺基酸序列中的個別肽活體外再刺激脾細胞，使用用於活體外再刺激之個別肽進行IFN-γ ELISpot，進行生物資訊分析以測定藉由IFN-γ ELISpot所鑑別的15聚體(15-mer)之HLA限制， 鑑別給定HLA對偶基因之候選反應性9聚體抗原決定基，合成候選9聚體，對來自攜帶預測與所鑑別之AAV抗原決定基結合之HLA對偶基因的個體之脾細胞進行第二IFN-γ ELISpot篩選， 確定AAV衣殼反應性CD8+ T細胞抗原決定基，且測定個體對給定AAV抗原決定基起反應之頻率。
在一些實施例中，AAV可為藉由基於Cre重組之AAV靶向演化(Cre-recombination-based AAV targeted evolution，CREATE)所產生的血清型，如Deverman等人(Nature Biotechnology 34(2):204-209 (2016))所描述，其內容以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，以此方式產生的AAV血清型與其他AAV血清型相比具有經改良之CNS轉導及/或神經元及星形膠質細胞向性。作為非限制性實例，AAV血清型可為PHP.B、PHP.B2、PHP.B3、PHP.A、G2A12、G2A15。在一些實施例中，此等AAV血清型可為在胺基酸588-589之間具有7胺基酸插入序列之AAV9 (SEQ ID NO: 126及127)衍生物。此等7胺基酸插入序列之非限制性實例包括TLAVPFK (SEQ ID NO: 873)、SVSKPFL (SEQ ID NO: 881)、FTLTTPK (SEQ ID NO: 882)、YTLSQGW (SEQ ID NO: 888)、QAVRTSL (SEQ ID NO: 1176)及/或LAKERLS (SEQ ID NO: 1177)。
在一些實施例中，AAV血清型可為或可具有如內容以全文引用之方式併入本文中的國際專利公開案WO2017100671中所描述之序列，諸如但不限於AAV9 (WO2017100671之SEQ ID NO: 45，本文之SEQ ID NO: 1441)、PHP.N (WO2017100671之SEQ ID NO: 46，本文之SEQ ID NO: 1439)、PHP.S (WO2017100671之SEQ ID NO: 47，本文之SEQ ID NO: 1440)或其變異體。此外，WO2017100671中所描述之靶向肽或胺基酸插入序列中之任一者可插入任何親本AAV血清型，諸如但不限於AAV9 (SEQ ID NO: 122或SEQ ID NO: 1441)。在一些實施例中，胺基酸插入序列係插入於親本AAV (例如AAV9)之胺基酸586-592之間。在另一實施例中，胺基酸插入序列係插入於親本AAV序列之胺基酸588-589之間。胺基酸插入序列可為但不限於以下胺基酸序列中之任一者：AQTLAVPFKAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 1；本文之SEQ ID NO: 1442)、AQSVSKPFLAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 2；本文之SEQ ID NO: 1443)、AQFTLTTPKAQ (WO2017100671之序列表中之SEQ ID NO: 3；本文之SEQ ID NO: 1444)、DGTLAVPFKAQ (WO2017100671之序列表中之SEQ ID NO: 4；本文之SEQ ID NO: 1445)、ESTLAVPFKAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 5；本文之SEQ ID NO: 1446)、GGTLAVPFKAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 6；本文之SEQ ID NO: 1447)、AQTLATPFKAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 7及33；本文之SEQ ID NO: 1448)、ATTLATPFKAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 8；本文之SEQ ID NO: 1449)、DGTLATPFKAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 9；本文之SEQ ID NO: 1450)、GGTLATPFKAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 10；本文之SEQ ID NO: 1451)、SGSLAVPFKAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 11；本文之SEQ ID NO: 1452)、AQTLAQPFKAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 12；本文之SEQ ID NO: 1453)、AQTLQQPFKAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 13；本文之SEQ ID NO: 1454)、AQTLSNPFKAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 14；本文之SEQ ID NO: 1455)、AQTLAVPFSNP (WO2017100671之SEQ ID NO: 15；本文之SEQ ID NO: 1456)、QGTLAVPFKAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 16；本文之SEQ ID NO: 1457)、NQTLAVPFKAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 17；本文之SEQ ID NO: 1458)、EGSLAVPFKAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 18；本文之SEQ ID NO: 1459)、SGNLAVPFKAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 19；本文之SEQ ID NO: 1460)、EGTLAVPFKAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 20；本文之SEQ ID NO: 1461)、DSTLAVPFKAQ (WO2017100671之表1中之SEQ ID NO: 21；本文之SEQ ID NO: 1462)、AVTLAVPFKAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 22；本文之SEQ ID NO: 1463)、AQTLSTPFKAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 23；本文之SEQ ID NO: 1464)、AQTLPQPFKAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 24及32；本文之SEQ ID NO: 1465)、AQTLSQPFKAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 25；本文之SEQ ID NO: 1466)、AQTLQLPFKAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 26；本文之SEQ ID NO: 1467)、AQTLTMPFKAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 27及34，及WO2017100671之序列表中之SEQ ID NO: 35；本文之SEQ ID NO: 1468)、AQTLTTPFKAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 28；本文之SEQ ID NO: 1469)、AQYTLSQGWAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 29；本文之SEQ ID NO: 1470)、AQMNATKNVAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 30；本文之SEQ ID NO: 1471)、AQVSGGHHSAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 31；本文之SEQ ID NO: 1472)、AQTLTAPFKAQ (WO2017100671之表1中之SEQ ID NO: 35；本文之SEQ ID NO: 1473)、AQTLSKPFKAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 36；本文之SEQ ID NO: 1474)、QAVRTSL (WO2017100671之SEQ ID NO: 37；本文之SEQ ID NO: 1475)、YTLSQGW (WO2017100671之SEQ ID NO: 38；本文之SEQ ID NO: 888)、LAKERLS (WO2017100671之SEQ ID NO: 39；本文之SEQ ID NO: 1476)、TLAVPFK (WO2017100671之序列表中之SEQ ID NO: 40；本文之SEQ ID NO: 873)、SVSKPFL (WO2017100671之SEQ ID NO: 41；本文之SEQ ID NO: 881)、FTLTTPK (WO2017100671之SEQ ID NO: 42；本文之SEQ ID NO: 882)、MNSTKNV (WO2017100671之SEQ ID NO: 43；本文之SEQ ID NO: 1477)、VSGGHHS (WO2017100671之SEQ ID NO: 44；本文之SEQ ID NO: 1478)、SAQTLAVPFKAQAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 48；本文之SEQ ID NO: 1479)、SXXXLAVPFKAQAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 49，其中X可為任何胺基酸；本文之SEQ ID NO: 1480)、SAQXXXVPFKAQAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 50，其中X可為任何胺基酸；本文之SEQ ID NO: 1481)、SAQTLXXXFKAQAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 51，其中X可為任何胺基酸；本文之SEQ ID NO: 1482)、SAQTLAVXXXAQAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 52，其中X可為任何胺基酸；本文之SEQ ID NO: 1483)、SAQTLAVPFXXXAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 53，其中X可為任何胺基酸；本文之SEQ ID NO: 1484)、TNHQSAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 65；本文之SEQ ID NO: 1485)、AQAQTGW (WO2017100671之SEQ ID NO: 66；本文之SEQ ID NO: 1486)、DGTLATPFK (WO2017100671之SEQ ID NO: 67；本文之SEQ ID NO: 1487)、DGTLATPFKXX (WO2017100671之SEQ ID NO: 68，其中X可為任何胺基酸；本文之SEQ ID NO: 1488)、LAVPFKAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 80；本文之SEQ ID NO: 1489)、VPFKAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 81；本文之SEQ ID NO: 1490)、FKAQ (WO2017100671之SEQ ID NO: 82；本文之SEQ ID NO: 1491)、AQTLAV (WO2017100671之SEQ ID NO: 83；本文之SEQ ID NO: 1492)、AQTLAVPF (WO2017100671之SEQ ID NO: 84；本文之SEQ ID NO: 1493)、QAVR (WO2017100671之SEQ ID NO: 85；本文之SEQ ID NO: 1494)、AVRT (WO2017100671之SEQ ID NO: 86；本文之SEQ ID NO: 1495)、VRTS (WO2017100671之SEQ ID NO: 87；本文之SEQ ID NO: 1496)、RTSL (WO2017100671之SEQ ID NO: 88；本文之SEQ ID NO: 1497)、QAVRT (WO2017100671之SEQ ID NO: 89；本文之SEQ ID NO: 1498)、AVRTS (WO2017100671之SEQ ID NO: 90；本文之SEQ ID NO: 1499)、VRTSL (WO2017100671之SEQ ID NO: 91；本文之SEQ ID NO: 1500)、QAVRTS (WO2017100671之SEQ ID NO: 92；本文之SEQ ID NO: 1501)或AVRTSL (WO2017100671之SEQ ID NO: 93；本文之SEQ ID NO: 1502)。
可編碼胺基酸插入序列之核苷酸序列之非限制性實例包括以下：GATGGGACTTTGGCGGTGCCTTTTAAGGCACAG (WO2017100671之SEQ ID NO: 54；本文之SEQ ID NO: 1503)、GATGGGACGTTGGCGGTGCCTTTTAAGGCACAG (WO2017100671之SEQ ID NO: 55；本文之SEQ ID NO: 1504)、CAGGCGGTTAGGACGTCTTTG (WO2017100671之SEQ ID NO: 56；本文之SEQ ID NO: 1505)、CAGGTCTTCACGGACTCAGACTATCAG (WO2017100671之SEQ ID NO: 57及78；本文之SEQ ID NO: 1506)、CAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTAAAATCG (WO2017100671之SEQ ID NO: 58；本文之SEQ ID NO: 1507)、ACTCATCGACCAATACTTGTACTATCTCTCTAGAAC (WO2017100671之SEQ ID NO: 59；本文之SEQ ID NO: 1508)、GGAAGTATTCCTTGGTTTTGAACCCA (WO2017100671之SEQ ID NO: 60；本文之SEQ ID NO: 1509)、GGTCGCGGTTCTTGTTTGTGGAT (WO2017100671之SEQ ID NO: 61；本文之SEQ ID NO: 1510)、CGACCTTGAAGCGCATGAACTCCT (WO2017100671之SEQ ID NO: 62；本文之SEQ ID NO: 1511)、GTATTCCTTGGTTTTGAACCCAACCGGTCTGCGCCTGTGCMNNMNNMNNMNNMNNMNNMNNTTGGGCACTCTGGTGGTTTGTC (WO2017100671之SEQ ID NO: 63，其中N可為A、C、T或G；本文之SEQ ID NO: 1512)、GTATTCCTTGGTTTTGAACCCAACCGGTCTGCGCMNNMNNMNNAAAAGGCACCGCCAAAGTTTG (WO2017100671之SEQ ID NO: 69，其中N可為A、C、T或G；本文之SEQ ID NO: 1513)、GTATTCCTTGGTTTTGAACCCAACCGGTCTGCGCCTGTGCMNNMNNMNNCACCGCCAAAGTTTGGGCACT (WO2017100671之SEQ ID NO: 70，其中N可為A、C、T或G；本文之SEQ ID NO: 1514)、GTATTCCTTGGTTTTGAACCCAACCGGTCTGCGCCTGTGCCTTAAAMNNMNNMNNCAAAGTTTGGGCACTCTGGTGG (WO2017100671之SEQ ID NO: 71，其中N可為A、C、T或G；本文之SEQ ID NO: 1515)、GTATTCCTTGGTTTTGAACCCAACCGGTCTGCGCCTGTGCCTTAAAAGGCACMNNMNNMNNTTGGGCACTCTGGTGGTTTGTG (WO2017100671之SEQ ID NO: 72，其中N可為A、C、T或G；本文之SEQ ID NO: 1516)、ACTTTGGCGGTGCCTTTTAAG (WO2017100671之SEQ ID NO: 74；本文之SEQ ID NO: 890)、AGTGTGAGTAAGCCTTTTTTG (WO2017100671之SEQ ID NO: 75；本文之SEQ ID NO: 891)、TTTACGTTGACGACGCCTAAG (WO2017100671之SEQ ID NO: 76；本文之SEQ ID NO: 892)、TATACTTTGTCGCAGGGTTGG (WO2017100671之SEQ ID NO: 77；本文之SEQ ID NO: 898)或CTTGCGAAGGAGCGGCTTTCG (WO2017100671之SEQ ID NO: 79；本文之SEQ ID NO: 1517)。
在一些實施例中，AAV血清型可為或可具有如內容以全文引用之方式併入本文中的美國專利第US 9624274號中所描述之序列，諸如但不限於AAV1 (US9624274之SEQ ID NO: 181)、AAV6 (US9624274之SEQ ID NO: 182)、AAV2 (US9624274之SEQ ID NO: 183)、AAV3b (US9624274之SEQ ID NO: 184)、AAV7 (US9624274之SEQ ID NO: 185)、AAV8 (US9624274之SEQ ID NO: 186)、AAV10 (US9624274之SEQ ID NO: 187)、AAV4 (US9624274之SEQ ID NO: 188)、AAV11 (US9624274之SEQ ID NO: 189)、bAAV (US9624274之SEQ ID NO: 190)、AAV5 (US9624274之SEQ ID NO: 191)、GPV (US9624274之SEQ ID NO: 192；本文之SEQ ID NO: 1518)、B19 (US9624274之SEQ ID NO: 193；本文之SEQ ID NO: 1519)、MVM (US9624274之SEQ ID NO: 194；本文之SEQ ID NO: 1520)、FPV (US9624274之SEQ ID NO: 195；本文之SEQ ID NO: 1521)、CPV (US9624274之SEQ ID NO: 196；本文之SEQ ID NO: 1522)或其變異體。此外，US 9624274中所描述之任何結構蛋白質插入序列可插入但不限於任何親本AAV血清型，諸如但不限於AAV2 (US9624274之SEQ ID NO: 183)之I-453及I-587中。胺基酸插入序列可為但不限於以下胺基酸序列中之任一者：VNLTWSRASG (US9624274之SEQ ID NO: 50；本文之SEQ ID NO: 1901)、EFCINHRGYWVCGD (US9624274之SEQ ID NO: 55；本文之SEQ ID NO: 1902)、EDGQVMDVDLS (US9624274之SEQ ID NO: 85；本文之SEQ ID NO: 1903)、EKQRNGTLT (US9624274之SEQ ID NO: 86；本文之SEQ ID NO: 1904)、TYQCRVTHPHLPRALMR (US9624274之SEQ ID NO: 87；本文之SEQ ID NO: 1905)、RHSTTQPRKTKGSG (US9624274之SEQ ID NO: 88；本文之SEQ ID NO: 1906)、DSNPRGVSAYLSR (US9624274之SEQ ID NO: 89；本文之SEQ ID NO: 1907)、TITCLWDLAPSK (US9624274之SEQ ID NO: 90；本文之SEQ ID NO: 1908)、KTKGSGFFVF (US9624274之SEQ ID NO: 91；本文之SEQ ID NO: 1909)、THPHLPRALMRS (US9624274之SEQ ID NO: 92；本文之SEQ ID NO: 1910)、GETYQCRVTHPHLPRALMRSTTK (US9624274之SEQ ID NO: 93；本文之SEQ ID NO: 1911)、LPRALMRS (US9624274之SEQ ID NO: 94；本文之SEQ ID NO: 1912)、INHRGYWV (US9624274之SEQ ID NO: 95；本文之SEQ ID NO: 1913)、CDAGSVRTNAPD (US9624274之SEQ ID NO: 60；本文之SEQ ID NO: 1914)、AKAVSNLTESRSESLQS (US9624274之SEQ ID NO: 96；本文之SEQ ID NO: 1915)、SLTGDEFKKVLET (US9624274之SEQ ID NO: 97；本文之SEQ ID NO: 1916)、REAVAYRFEED (US9624274之SEQ ID NO: 98；本文之SEQ ID NO: 1917)、INPEIITLDG (US9624274之SEQ ID NO: 99；本文之SEQ ID NO: 1918)、DISVTGAPVITATYL (US9624274之SEQ ID NO: 100；本文之SEQ ID NO: 1919)、DISVTGAPVITA (US9624274之SEQ ID NO: 101；本文之SEQ ID NO: 1920)、PKTVSNLTESSSESVQS (US9624274之SEQ ID NO: 102；本文之SEQ ID NO: 1921)、SLMGDEFKAVLET (US9624274之SEQ ID NO: 103；本文之SEQ ID NO: 1922)、QHSVAYTFEED (US9624274之SEQ ID NO: 104；本文之SEQ ID NO: 1923)、INPEIITRDG (US9624274之SEQ ID NO: 105；本文之SEQ ID NO: 1924)、DISLTGDPVITASYL (US9624274之SEQ ID NO: 106；本文之SEQ ID NO: 1925)、DISLTGDPVITA (US9624274之SEQ ID NO: 107；本文之SEQ ID NO: 1926)、DQSIDFEIDSA (US9624274之SEQ ID NO: 108；本文之SEQ ID NO: 1927)、KNVSEDLPLPTFSPTLLGDS (US9624274之SEQ ID NO: 109；本文之SEQ ID NO: 1928)、KNVSEDLPLPT (US9624274之SEQ ID NO: 110；本文之SEQ ID NO: 1929)、CDSGRVRTDAPD (US9624274之SEQ ID NO: 111；本文之SEQ ID NO: 1930)、FPEHLLVDFLQSLS (US9624274之SEQ ID NO: 112；本文之SEQ ID NO: 1931)、DAEFRHDSG (US9624274之SEQ ID NO: 65；本文之SEQ ID NO: 1932)、HYAAAQWDFGNTMCQL (US9624274之SEQ ID NO: 113；本文之SEQ ID NO: 1933)、YAAQWDFGNTMCQ (US9624274之SEQ ID NO: 114；本文之SEQ ID NO: 1934)、RSQKEGLHYT (US9624274之SEQ ID NO: 115；本文之SEQ ID NO: 1935)、SSRTPSDKPVAHWANPQAE (US9624274之SEQ ID NO: 116；本文之SEQ ID NO: 1936)、SRTPSDKPVAHWANP (US9624274之SEQ ID NO: 117；本文之SEQ ID NO: 1937)、SSRTPSDKP (US9624274之SEQ ID NO: 118；本文之SEQ ID NO: 1938)、NADGNVDYHMNSVP (US9624274之SEQ ID NO: 119；本文之SEQ ID NO: 1939)、DGNVDYHMNSV (US9624274之SEQ ID NO: 120；本文之SEQ ID NO: 1940)、RSFKEFLQSSLRALRQ (US9624274之SEQ ID NO: 121；本文之SEQ ID NO: 1941)；FKEFLQSSLRA (US9624274之SEQ ID NO: 122；本文之SEQ ID NO: 1942)或QMWAPQWGPD (US9624274之SEQ ID NO: 123；本文之SEQ ID NO: 1943)。
在一些實施例中，AAV血清型可為或可具有如內容以全文引用之方式併入本文中的美國專利第US 9475845號中所描述之序列，諸如但不限於包含原生AAV2衣殼蛋白之胺基酸位置585至590處之一或多個胺基酸之修飾之AAV衣殼蛋白。此外，修飾可產生但不限於以下胺基酸序列：RGNRQA (US9475845之SEQ ID NO: 3；本文之SEQ ID NO: 1944)、SSSTDP (US9475845之SEQ ID NO: 4；本文之SEQ ID NO: 1945)、SSNTAP (US9475845之SEQ ID NO: 5；本文之SEQ ID NO: 1946)、SNSNLP (US9475845之SEQ ID NO: 6；本文之SEQ ID NO: 1947)、SSTTAP (US9475845之SEQ ID NO: 7；本文之SEQ ID NO: 1948)、AANTAA (US9475845之SEQ ID NO: 8；本文之SEQ ID NO: 1949)、QQNTAP (US9475845之SEQ ID NO: 9；本文之SEQ ID NO: 1950)、SAQAQA (US9475845之SEQ ID NO: 10；本文之SEQ ID NO: 1951)、QANTGP (US9475845之SEQ ID NO: 11；本文之SEQ ID NO: 1952)、NATTAP (US9475845之SEQ ID NO: 12；本文之SEQ ID NO: 1953)、SSTAGP (US9475845之SEQ ID NO: 13及20；本文之SEQ ID NO: 1954)、QQNTAA (US9475845之SEQ ID NO: 14；本文之SEQ ID NO: 1955)、PSTAGP (US9475845之SEQ ID NO: 15；本文之SEQ ID NO: 1956)、NQNTAP (US9475845之SEQ ID NO: 16；本文之SEQ ID NO: 1957)、QAANAP (US9475845之SEQ ID NO: 17；本文之SEQ ID NO: 1958)、SIVGLP (US9475845之SEQ ID NO: 18；本文之SEQ ID NO: 1959)、AASTAA (US9475845之SEQ ID NO: 19及27；本文之SEQ ID NO: 1960)、SQNTTA (US9475845之SEQ ID NO: 21；本文之SEQ ID NO: 1961)、QQDTAP (US9475845之SEQ ID NO: 22；本文之SEQ ID NO: 1962)、QTNTGP (US9475845之SEQ ID NO: 23；本文之SEQ ID NO: 1963)、QTNGAP (US9475845之SEQ ID NO: 24；本文之SEQ ID NO: 1964)、QQNAAP (US9475845之SEQ ID NO: 25；本文之SEQ ID NO: 1965)或AANTQA (US9475845之SEQ ID NO: 26；本文之SEQ ID NO: 1966)。在一些實施例中，胺基酸修飾為原生AAV2衣殼蛋白中之胺基酸位置262至265處或具有靶向序列之另一AAV之衣殼蛋白中的對應位置處之取代。靶向序列可為但不限於以下胺基酸序列中之任一者：NGRAHA (US9475845之SEQ ID NO: 38；本文之SEQ ID NO: 1967)、QPEHSST (US9475845之SEQ ID NO: 39及50；本文之SEQ ID NO: 1968)、VNTANST (US9475845之SEQ ID NO: 40；本文之SEQ ID NO: 1969)、HGPMQKS (US9475845之SEQ ID NO: 41；本文之SEQ ID NO: 1970)、PHKPPLA (US9475845之SEQ ID NO: 42；本文之SEQ ID NO: 1971)、IKNNEMW (US9475845之SEQ ID NO: 43；本文之SEQ ID NO: 1972)、RNLDTPM (US9475845之SEQ ID NO: 44；本文之SEQ ID NO: 1973)、VDSHRQS (US9475845之SEQ ID NO: 45；本文之SEQ ID NO: 1974)、YDSKTKT (US9475845之SEQ ID NO: 46；本文之SEQ ID NO: 1975)、SQLPHQK (US9475845之SEQ ID NO: 47；本文之SEQ ID NO: 1976)、STMQQNT (US9475845之SEQ ID NO: 48；本文之SEQ ID NO: 1977)、TERYMTQ (US9475845之SEQ ID NO: 49；本文之SEQ ID NO: 1978)、DASLSTS (US9475845之SEQ ID NO: 51；本文之SEQ ID NO: 1979)、DLPNKKT (US9475845之SEQ ID NO: 52；本文之SEQ ID NO: 1980)、DLTAARL (US9475845之SEQ ID NO: 53；本文之SEQ ID NO: 1981)、EPHQFNY (US9475845之SEQ ID NO: 54；本文之SEQ ID NO: 1982)、EPQSNHT (US9475845之SEQ ID NO: 55；本文之SEQ ID NO: 1983)、MSSWPSQ (US9475845之SEQ ID NO: 56；本文之SEQ ID NO: 1984)、NPKHNAT (US9475845之SEQ ID NO: 57；本文之SEQ ID NO: 1985)、PDGMRTT (US9475845之SEQ ID NO: 58；本文之SEQ ID NO: 1986)、PNNNKTT (US9475845之SEQ ID NO: 59；本文之SEQ ID NO: 1987)、QSTTHDS (US9475845之SEQ ID NO: 60；本文之SEQ ID NO: 1988)、TGSKQKQ (US9475845之SEQ ID NO: 61；本文之SEQ ID NO: 1989)、SLKHQAL (US9475845之SEQ ID NO: 62；本文之SEQ ID NO: 1990)、SPIDGEQ (US9475845之SEQ ID NO: 63；本文之SEQ ID NO: 1991)、WIFPWIQL (US9475845之SEQ ID NO: 64及112；本文之SEQ ID NO: 1992)、CDCRGDCFC (US9475845之SEQ ID NO: 65；本文之SEQ ID NO: 1993)、CNGRC (US9475845之SEQ ID NO: 66；本文之SEQ ID NO: 1994)、CPRECES (US9475845之SEQ ID NO: 67；本文之SEQ ID NO: 1995)、CTTHWGFTLC (US9475845之SEQ ID NO: 68及123；本文之SEQ ID NO: 1996)、CGRRAGGSC (US9475845之SEQ ID NO: 69；本文之SEQ ID NO: 1997)、CKGGRAKDC (US9475845之SEQ ID NO: 70；本文之SEQ ID NO: 1998)、CVPELGHEC (US9475845之SEQ ID NO: 71及115；本文之SEQ ID NO: 1999)、CRRETAWAK (US9475845之SEQ ID NO: 72；本文之SEQ ID NO: 2000)、VSWFSHRYSPFAVS (US9475845之SEQ ID NO: 73；本文之SEQ ID NO: 2001)、GYRDGYAGPILYN (US9475845之SEQ ID NO: 74；本文之SEQ ID NO: 2002)、XXXYXXX (US9475845之SEQ ID NO: 75；本文之SEQ ID NO: 2003)、YXNW (US9475845之SEQ ID NO: 76；本文之SEQ ID NO: 2004)、RPLPPLP (US9475845之SEQ ID NO: 77；本文之SEQ ID NO: 2005)、APPLPPR (US9475845之SEQ ID NO: 78；本文之SEQ ID NO: 2006)、DVFYPYPYASGS (US9475845之SEQ ID NO: 79；本文之SEQ ID NO: 2007)、MYWYPY (US9475845之SEQ ID NO: 80；本文之SEQ ID NO: 2008)、DITWDQLWDLMK (US9475845之SEQ ID NO: 81；本文之SEQ ID NO: 2009)、CWDDXWLC (US9475845之SEQ ID NO: 82；本文之SEQ ID NO: 2010)、EWCEYLGGYLRCYA (US9475845之SEQ ID NO: 83；本文之SEQ ID NO: 2011)、YXCXXGPXTWXCXP (US9475845之SEQ ID NO: 84；本文之SEQ ID NO: 2012)、IEGPTLRQWLAARA (US9475845之SEQ ID NO: 85；本文之SEQ ID NO: 2013)、LWXXX (US9475845之SEQ ID NO: 86；本文之SEQ ID NO: 2014)、XFXXYLW (US9475845之SEQ ID NO: 87；本文之SEQ ID NO: 2015)、SSIISHFRWGLCD (US9475845之SEQ ID NO: 88；本文之SEQ ID NO: 2016)、MSRPACPPNDKYE (US9475845之SEQ ID NO: 89；本文之SEQ ID NO: 2017)、CLRSGRGC (US9475845之SEQ ID NO: 90；本文之SEQ ID NO: 2018)、CHWMFSPWC (US9475845之SEQ ID NO: 91；本文之SEQ ID NO: 2019)、WXXF (US9475845之SEQ ID NO: 92；本文之SEQ ID NO: 2020)、CSSRLDAC (US9475845之SEQ ID NO: 93；本文之SEQ ID NO: 2021)、CLPVASC (US9475845之SEQ ID NO: 94；本文之SEQ ID NO: 2022)、CGFECVRQCPERC (US9475845之SEQ ID NO: 95；本文之SEQ ID NO: 2023)、CVALCREACGEGC (US9475845之SEQ ID NO: 96；本文之SEQ ID NO: 2024)、SWCEPGWCR (US9475845之SEQ ID NO: 97；本文之SEQ ID NO: 2025)、YSGKWGW (US9475845之SEQ ID NO: 98；本文之SEQ ID NO: 2026)、GLSGGRS (US9475845之SEQ ID NO: 99；本文之SEQ ID NO: 2027)、LMLPRAD (US9475845之SEQ ID NO: 100；本文之SEQ ID NO: 2028)、CSCFRDVCC (US9475845之SEQ ID NO: 101；本文之SEQ ID NO: 2029)、CRDVVSVIC (US9475845之SEQ ID NO: 102；本文之SEQ ID NO: 2030)、MARSGL (US9475845之SEQ ID NO: 103；本文之SEQ ID NO: 2031)、MARAKE (US9475845之SEQ ID NO: 104；本文之SEQ ID NO: 2032)、MSRTMS (US9475845之SEQ ID NO: 105；本文之SEQ ID NO: 2033)、KCCYSL (US9475845之SEQ ID NO: 106；本文之SEQ ID NO: 2034)、MYWGDSHWLQYWYE (US9475845之SEQ ID NO: 107；本文之SEQ ID NO: 2035)、MQLPLAT (US9475845之SEQ ID NO: 108；本文之SEQ ID NO: 2036)、EWLS (US9475845之SEQ ID NO: 109；本文之SEQ ID NO: 2037)、SNEW (US9475845之SEQ ID NO: 110；本文之SEQ ID NO: 2038)、TNYL (US9475845之SEQ ID NO: 111；本文之SEQ ID NO: 2039)、WDLAWMFRLPVG (US9475845之SEQ ID NO: 113；本文之SEQ ID NO: 2040)、CTVALPGGYVRVC (US9475845之SEQ ID NO: 114；本文之SEQ ID NO: 2041)、CVAYCIEHHCWTC (US9475845之SEQ ID NO: 116；本文之SEQ ID NO: 2042)、CVFAHNYDYLVC (US9475845之SEQ ID NO: 117；本文之SEQ ID NO: 2043)、CVFTSNYAFC (US9475845之SEQ ID NO: 118；本文之SEQ ID NO: 2044)、VHSPNKK (US9475845之SEQ ID NO: 119；本文之SEQ ID NO: 2045)、CRGDGWC (US9475845之SEQ ID NO: 120；本文之SEQ ID NO: 2046)、XRGCDX (US9475845之SEQ ID NO: 121；本文之SEQ ID NO: 2047)、PXXX (US9475845之SEQ ID NO: 122；本文之SEQ ID NO: 2048)、SGKGPRQITAL (US9475845之SEQ ID NO: 124；本文之SEQ ID NO: 2049)、AAAAAAAAAXXXXX (US9475845之SEQ ID NO: 125；本文之SEQ ID NO: 2050)、VYMSPF (US9475845之SEQ ID NO: 126；本文之SEQ ID NO: 2051)、ATWLPPR (US9475845之SEQ ID NO: 127；本文之SEQ ID NO: 2052)、HTMYYHHYQHHL (US9475845之SEQ ID NO: 128；本文之SEQ ID NO: 2053)、SEVGCRAGPLQWLCEKYFG (US9475845之SEQ ID NO: 129；本文之SEQ ID NO: 2054)、CGLLPVGRPDRNVWRWLC (US9475845之SEQ ID NO: 130；本文之SEQ ID NO: 2055)、CKGQCDRFKGLPWEC (US9475845之SEQ ID NO: 131；本文之SEQ ID NO: 2056)、SGRSA (US9475845之SEQ ID NO: 132；本文之SEQ ID NO: 2057)、WGFP (US9475845之SEQ ID NO: 133；本文之SEQ ID NO: 2058)、AEPMPHSLNFSQYLWYT (US9475845之SEQ ID NO: 134；本文之SEQ ID NO: 2059)、WAYXSP (US9475845之SEQ ID NO: 135；本文之SEQ ID NO: 2060)、IELLQAR (US9475845之SEQ ID NO: 136；本文之SEQ ID NO: 2061)、AYTKCSRQWRTCMTTH (US9475845之SEQ ID NO: 137；本文之SEQ ID NO: 2062)、PQNSKIPGPTFLDPH (US9475845之SEQ ID NO: 138；本文之SEQ ID NO: 2063)、SMEPALPDWWWKMFK (US9475845之SEQ ID NO: 139；本文之SEQ ID NO: 2064)、ANTPCGPYTHDCPVKR (US9475845之SEQ ID NO: 140；本文之SEQ ID NO: 2065)、TACHQHVRMVRP (US9475845之SEQ ID NO: 141；本文之SEQ ID NO: 2066)、VPWMEPAYQRFL (US9475845之SEQ ID NO: 142；本文之SEQ ID NO: 2067)、DPRATPGS (US9475845之SEQ ID NO: 143；本文之SEQ ID NO: 2068)、FRPNRAQDYNTN (US9475845之SEQ ID NO: 144；本文之SEQ ID NO: 2069)、CTKNSYLMC (US9475845之SEQ ID NO: 145；本文之SEQ ID NO: 2070)、CXXTXXXGXGC (US9475845之SEQ ID NO: 146；本文之SEQ ID NO: 2071)、CPIEDRPMC (US9475845之SEQ ID NO: 147；本文之SEQ ID NO: 2072)、HEWSYLAPYPWF (US9475845之SEQ ID NO: 148；本文之SEQ ID NO: 2073)、MCPKHPLGC (US9475845之SEQ ID NO: 149；本文之SEQ ID NO: 2074)、RMWPSSTVNLSAGRR (US9475845之SEQ ID NO: 150；本文之SEQ ID NO: 2075)、SAKTAVSQRVWLPSHRGGEP (US9475845之SEQ ID NO: 151；本文之SEQ ID NO: 2076)、KSREHVNNSACPSKRITAAL (US9475845之SEQ ID NO: 152；本文之SEQ ID NO: 2077)、EGFR (US9475845之SEQ ID NO: 153；本文之SEQ ID NO: 2078)、AGLGVR (US9475845之SEQ ID NO: 154；本文之SEQ ID NO: 2079)、GTRQGHTMRLGVSDG (US9475845之SEQ ID NO: 155；本文之SEQ ID NO: 2080)、IAGLATPGWSHWLAL (US9475845之SEQ ID NO: 156；本文之SEQ ID NO: 2081)、SMSIARL (US9475845之SEQ ID NO: 157；本文之SEQ ID NO: 2082)、HTFEPGV (US9475845之SEQ ID NO: 158；本文之SEQ ID NO: 2083)、NTSLKRISNKRIRRK (US9475845之SEQ ID NO: 159；本文之SEQ ID NO: 2084)、LRIKRKRRKRKKTRK (US9475845之SEQ ID NO: 160；本文之SEQ ID NO: 2085)、GGG、GFS、LWS、EGG、LLV、LSP、LBS、AGG、GRR、GGH及GTV。
在一些實施例中，AAV血清型可為或可具有如內容以全文引用之方式併入本文中的美國公開案第US 20160369298號中所描述之序列，諸如但不限於AAV2之定點突變型衣殼蛋白(US 20160369298之SEQ ID NO: 97；本文中之SEQ ID NO: 2086)或其變異體，其中定點之位點為至少一個選自VP1或其片段之位點R447、G453、S578、N587、N587+1、S662之位點。
此外，US 20160369298中所描述之任何突變型序列可為或可具有但不限於以下序列中之任一者：SDSGASN (US20160369298之SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 231；本文之SEQ ID NO: 2087)、SPSGASN (US20160369298之SEQ ID NO: 2；本文之SEQ ID NO: 2088)、SHSGASN (US20160369298之SEQ ID NO: 3；本文之SEQ ID NO: 2089)、SRSGASN (US20160369298之SEQ ID NO: 4；本文之SEQ ID NO: 2090)、SKSGASN (US20160369298之SEQ ID NO: 5；本文之SEQ ID NO: 2091)、SNSGASN (US20160369298之SEQ ID NO: 6；本文之SEQ ID NO: 2092)、SGSGASN (US20160369298之SEQ ID NO: 7；本文之SEQ ID NO: 2093)、SASGASN (US20160369298之SEQ ID NO: 8、175及221；本文之SEQ ID NO: 2094)、SESGTSN (US20160369298之SEQ ID NO: 9；本文之SEQ ID NO: 2095)、STTGGSN (US20160369298之SEQ ID NO: 10；本文之SEQ ID NO: 2096)、SSAGSTN (US20160369298之SEQ ID NO: 11；本文之SEQ ID NO: 2097)、NNDSQA (US20160369298之SEQ ID NO: 12；本文之SEQ ID NO: 2098)、NNRNQA (US20160369298之SEQ ID NO: 13；本文之SEQ ID NO: 2099)、NNNKQA (US20160369298之SEQ ID NO: 14；本文之SEQ ID NO: 2100)、NAKRQA (US20160369298之SEQ ID NO: 15；本文之SEQ ID NO: 2101)、NDEHQA (US20160369298之SEQ ID NO: 16；本文之SEQ ID NO: 2102)、NTSQKA (US20160369298之SEQ ID NO: 17；本文之SEQ ID NO: 2103)、YYLSRTNTPSGTDTQSRLVFSQAGA (US20160369298之SEQ ID NO: 18；本文之SEQ ID NO: 2104)、YYLSRTNTDSGTETQSGLDFSQAGA (US20160369298之SEQ ID NO: 19；本文之SEQ ID NO: 2105)、YYLSRTNTESGTPTQSALEFSQAGA (US20160369298之SEQ ID NO: 20；本文之SEQ ID NO: 2106)、YYLSRTNTHSGTHTQSPLHFSQAGA (US20160369298之SEQ ID NO: 21；本文之SEQ ID NO: 2107)、YYLSRTNTSSGTITISHLIFSQAGA (US20160369298之SEQ ID NO: 22；本文之SEQ ID NO: 2108)、YYLSRTNTRSGIMTKSSLMFSQAGA (US20160369298之SEQ ID NO: 23；本文之SEQ ID NO: 2109)、YYLSRTNTKSGRKTLSNLSFSQAGA (US20160369298之SEQ ID NO: 24；本文之SEQ ID NO: 2110)、YYLSRTNDGSGPVTPSKLRFSQRGA (US20160369298之SEQ ID NO: 25；本文之SEQ ID NO: 2111)、YYLSRTNAASGHATHSDLKFSQPGA (US20160369298之SEQ ID NO: 26；本文之SEQ ID NO: 2112)、YYLSRTNGQAGSLTMSELGFSQVGA (US20160369298之SEQ ID NO: 27；本文之SEQ ID NO: 2113)、YYLSRTNSTGGNQTTSQLLFSQLSA (US20160369298之SEQ ID NO: 28；本文之SEQ ID NO: 2114)、YFLSRTNNNTGLNTNSTLNFSQGRA (US20160369298之SEQ ID NO: 29；本文之SEQ ID NO: 2115)、SKTGADNNNSEYSWTG (US20160369298之SEQ ID NO: 30；本文之SEQ ID NO: 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2252)、CCACTTAGGGCCTGGTCGATACCGTTCGGTG (US20160369298之SEQ ID NO: 269；本文之SEQ ID NO: 2253)及TCTCGCCCCAAGAGTAGAAACCCTTCSTTYYG (US20160369298之SEQ ID NO: 270；本文之SEQ ID NO: 2254)。
在一些實施例中，AAV血清型可包含如內容以全文引用之方式併入本文中的國際專利公開案WO2016134375中所描述之靶向眼細胞之肽，諸如但不限於WO2016134375之SEQ ID NO: 9及SEQ ID NO: 10。此外，WO2016134375中所描述之任何靶向眼細胞之肽或胺基酸可插入任何親本AAV血清型，諸如但不限於AAV2 (WO2016134375之SEQ ID NO: 8；本文中之SEQ ID NO: 2255)，或AAV9 (WO2016134375之SEQ ID NO: 11；本文中之SEQ ID NO: 2256)。在一些實施例中，諸如插入之修飾在P34-A35、T138-A139、A139-P140、G453-T454、N587-R588及/或R588-Q589處發生於AAV2蛋白質中。在某些實施例中，插入發生於AAV9之D384、G385、1560、T561、N562、E563、E564、E565、N704及/或Y705處。靶向眼細胞之肽可為但不限於以下胺基酸序列中之任一者：GSTPPPM (WO2016134375之SEQ ID NO: 1；本文中為SEQ ID NO: 2257)，或GETRAPL (WO2016134375之SEQ ID NO: 4；本文中為SEQ ID NO: 2258)。
在一些實施例中，AAV血清型可如美國公開案US 20170145405中所描述加以修飾，該公開案之內容以全文引用之方式併入本文中。AAV血清型可包括經修飾之AAV2 (例如在Y444F、Y500F、Y730F及/或S662V處之修飾)、經修飾之AAV3 (例如在Y705F、Y731F及/或T492V處之修飾)及經修飾之AAV6 (例如在S663V及/或T492V處之修飾)。
在一些實施例中，AAV血清型可如國際公開案WO2017083722中所描述加以修飾，該公開案之內容以全文引用之方式併入本文中。AAV血清型可以包括AAV1 (Y705+731F+T492V)、AAV2 (Y444+500+730F+T491V)、AAV3 (Y705+731F)、AAV5、AAV 5 (Y436+693+719F)、AAV6 (VP3變異體Y705F/Y731F/T492V)、AAV8 (Y733F)、AAV9、AAV9 (VP3變異體Y731F)及AAV10 (Y733F)。
在一些實施例中，如內容以全文引用之方式併入本文中的國際專利公開案WO2017015102中所描述，AAV血清型可包含經工程改造之抗原決定基，其包含胺基酸SPAKFA (WO2017015102之SEQ ID NO: 24；本文中之SEQ ID NO: 2259)或NKDKLN (WO2017015102之SEQ ID NO: 2；本文中之SEQ ID NO: 2260)。抗原決定基可插入於AAV8 (WO2017015102之SEQ ID NO: 3)之胺基酸665至670 (根據VP1衣殼之編號)及/或AAV3B (SEQ ID NO: 3)之殘基664至668的區域中。
在一些實施例中，AAV血清型可為或可具有如內容以全文引用之方式併入本文中的國際專利公開案第WO2017058892號中所描述之序列，諸如但不限於具有衣殼蛋白之AAV變異體，該等衣殼蛋白可包含呈任何組合的AAV1之胺基酸殘基262-268、370-379、451-459、472-473、493-500、528-534、547-552、588-597、709-710或716-722中之一或多者(例如2、3、4、5、6或7者)或AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、牛AAV或禽AAV中之等效胺基酸殘基處之取代。胺基酸取代可為但不限於WO2017058892中所描述之胺基酸序列中之任一者。在一些實施例中，AAV可包含呈任何組合的AAV1 (WO2017058892之SEQ ID NO: l)之殘基256L、258K、259Q、261S、263A、264S、265T、266G、272H、385S、386Q、S472R、V473D、N500E 547S、709A、710N、716D、717N、718N、720L、A456T、Q457T、N458Q、K459S、T492S、K493A、S586R、S587G、S588N、T589R及/或722T；呈任何組合的AAV5 (WO2017058892之SEQ ID NO: 5)之殘基244N、246Q、248R、249E、250I、251K、252S、253G、254S、255V、256D、263Y、377E、378N、453L、456R、532Q、533P、535N、536P、537G、538T、539T、540A、541T、542Y、543L、546N、653V、654P、656S、697Q、698F、704D、705S、706T、707G、708E、709Y及/或710R；呈任何組合的AAV5 (WO2017058892之SEQ ID NO: 5)之殘基248R、316V、317Q、318D、319S、443N、530N、531S、532Q 533P、534A、535N、540A、541 T、542Y、543L、545G、546N、697Q、704D、706T、708E、709Y及/或710R；呈任何組合的AAV6 (WO2017058892之SEQ ID NO: 6)之殘基264S、266G、269N、272H、457Q、588S及/或589I；呈任何組合的AAV8 (WO2017058892之SEQ ID NO: 8)之殘基457T、459N、496G、499N、500N、589Q、590N及/或592A；呈任何組合的AAV9 (WO2017058892之SEQ ID NO: 9)之殘基451I、452N、453G、454S、455G、456Q、457N及/或458Q處的胺基酸取代。
在一些實施例中，AAV可包括VP1之位置155、156及157處或VP2之位置17、18、19及20處之胺基酸的序列，如國際公開案第WO 2017066764號中所描述，該公開案之內容以全文引用之方式併入本文中。胺基酸序列可為但不限於N-S-S、S-X-S、S-S-Y、N-X-S、N-S-Y、S-X-Y及N-X-Y，其中N、X及Y獨立地為但不限於非絲胺酸或非蘇胺酸之胺基酸，其中AAV可為但不限於AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11及AAV12。在一些實施例中，AAV可包括VP1之位置156、157或158處或VP2之位置19、20或21處之至少一個胺基酸的缺失，其中AAV可為但不限於AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11及AAV12。
在一些實施例中，AAV血清型可如Jackson等人(Frontiers in Molecular Neuroscience 9:154 (2016))中所描述，該文獻之內容以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，AAV血清型為PHP.B或AAV9。在一些實施例中，與使用更普遍存在的啟動子(亦即CBA或CMV)時相比，AAV血清型與突觸蛋白啟動子配對以增強神經元轉導。
在一些實施例中，包括於AAV血清型中之肽可藉由以下鑑別：分離人類脾細胞，使用AAV衣殼蛋白之胺基酸序列中的個別肽活體外再刺激脾細胞，使用用於活體外再刺激之個別肽進行IFN-γ ELISpot，進行生物資訊分析以測定藉由IFN-γ ELISpot所鑑別的15聚體之給定對偶基因限制，鑑別給定對偶基因之候選反應性9聚體抗原決定基，合成候選9聚體，對來自攜帶預測與所鑑別之AAV抗原決定基結合之特定對偶基因的個體之脾細胞進行第二IFN-γ ELISpot篩選，確定AAV衣殼反應性CD8+ T細胞抗原決定基，且測定個體對給定AAV抗原決定基起反應之頻率。
包含編碼siRNA分子之調節聚核苷酸的AAV粒子可以由AAV的各種血清型製備或衍生自AAV的各種血清型，包括但不限於AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV9.47、AAV9 (hu14)、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAV-DJ8及AAV-DJ。在一些情況下，不同的AAV血清型可以混合在一起或與其他類型的病毒混合以產生嵌合AAV粒子。作為一非限制性實例，AAV粒子衍生自AAV9血清型。 病毒基因體
在一些實施例中，如所示，AAV粒子包含具有酬載區之病毒基因體。
在一些實施例中，病毒基因體可以包含如圖1中所示的組件。酬載區110 位於病毒基因體100 內。在病毒基因體100 之5'及/或3'端，可以存在至少一個反向末端重複序列(ITR)120 。在5' ITR120 與酬載區110 之間，可存在啟動子區130 。在一些實施例中，酬載區可包含至少一個調節聚核苷酸。
在一些實施例中，病毒基因體100 可以包含如圖2中所示的組件。酬載區110 位於病毒基因體100 內。在病毒基因體100 之5'及/或3'端，可以存在至少一個反向末端重複序列(ITR)120 。在5' ITR120 與酬載區110 之間，可存在啟動子區130 。在啟動子區130 與酬載區110 之間，可存在內含子區140 。在一些實施例中，酬載區可包含至少一個調節聚核苷酸。
在一些實施例中，病毒基因體100 可以包含如圖3中所示的組件。在病毒基因體100 之5'及/或3'端，可以存在至少一個反向末端重複序列(ITR)120 。在病毒基因體100 內，可以存在強化子區150 、啟動子區130 、內含子區140 及酬載區110 。在一些實施例中，酬載區可包含至少一個調節聚核苷酸。
在一些實施例中，病毒基因體100 可以包含如圖4中所示的組件。在病毒基因體100 之5'及/或3'端，可以存在至少一個反向末端重複序列(ITR)120 。在病毒基因體100 內，可以存在強化子區150 、啟動子區130 、內含子區140 、酬載區110 及聚腺苷酸化信號序列區160 。在一些實施例中，酬載區可包含至少一個調節聚核苷酸。
在一些實施例中，病毒基因體100 可以包含如圖5中所示的組件。在病毒基因體100 之5'及/或3'端，可以存在至少一個反向末端重複序列(ITR)120 。在病毒基因體100 內，可以存在至少一個MCS區170 、強化子區150 、啟動子區130 、內含子區140 、酬載區110 及聚腺苷酸化信號序列區160 。在一些實施例中，酬載區可包含至少一個調節聚核苷酸。
在一些實施例中，病毒基因體100 可以包含如圖6中所示的組件。在病毒基因體100 之5'及/或3'端，可以存在至少一個反向末端重複序列(ITR)120 。在病毒基因體100 內，可以存在至少一個MCS區170 、強化子區150 、啟動子區130 、至少一個外顯子區180 、至少一個內含子區140 、酬載區110 及聚腺苷酸化信號序列區160 。在一些實施例中，酬載區可包含至少一個調節聚核苷酸。
在一些實施例中，病毒基因體100 可以包含如圖7及圖8中所示的組件。在病毒基因體100 內，可以存在至少一個啟動子區130 及酬載區110 。在一些實施例中，酬載區可包含至少一個調節聚核苷酸。
在一些實施例中，病毒基因體100 可以包含如圖9中所示的組件。在病毒基因體100 內，可以存在至少一個啟動子區130 、酬載區110 及聚腺苷酸化信號序列區160 。在一些實施例中，酬載區可包含至少一個調節聚核苷酸。病毒基因體大小
在一些實施例中，包含本文所述之酬載的病毒基因體可為單股或雙股病毒基因體。病毒基因體之大小可為小型、中型、大型或最大型。另外，病毒基因體可包含啟動子及polyA尾。
在一些實施例中，包含本文所述之酬載的病毒基因體可為小型單股病毒基因體。小型單股病毒基因體之大小可為2.7至3.5 kb，諸如大小為約2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4及3.5 kb。作為一非限制性實例，小型單股病毒基因體之大小可為3.2 kb。另外，病毒基因體可包含啟動子及polyA尾。
在一些實施例中，包含本文所述之酬載的病毒基因體可為小型雙股病毒基因體。小型雙股病毒基因體之大小可為1.3至1.7 kb，諸如大小為約1.3、1.4、1.5、1.6及1.7 kb。作為一非限制性實例，小型雙股病毒基因體之大小可為1.6 kb。另外，病毒基因體可包含啟動子及polyA尾。
在一些實施例中，包含本文所述之酬載的病毒基因體可為中型單股病毒基因體。中型單股病毒基因體之大小可為3.6至4.3 kb，諸如大小為約3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2及4.3 kb。作為一非限制性實例，中型單股病毒基因體之大小可為4.0 kb。另外，病毒基因體可包含啟動子及polyA尾。
在一些實施例中，包含本文所述之酬載的病毒基因體可為中型雙股病毒基因體。中型雙股病毒基因體之大小可為1.8至2.1 kb，諸如大小為約1.8、1.9、2.0及2.1 kb。作為一非限制性實例，中型雙股病毒基因體之大小可為2.0 kb。另外，病毒基因體可包含啟動子及polyA尾。
在一些實施例中，包含本文所述之酬載的病毒基因體可為大型單股病毒基因體。大型單股病毒基因體之大小可為4.4至6.0 kb，諸如大小為約4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9及6.0 kb。作為一非限制性實例，大型單股病毒基因體之大小可為4.7 kb。作為另一非限制性實例，大型單股病毒基因體之大小可為4.8 kb。作為又一非限制性實例，大型單股病毒基因體之大小可為6.0 kb。另外，病毒基因體可包含啟動子及polyA尾。
在一些實施例中，包含本文所述之酬載的病毒基因體可為大型雙股病毒基因體。大型雙股病毒基因體之大小可為2.2至3.0 kb，諸如大小為約2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9及3.0 kb。作為一非限制性實例，大型雙股病毒基因體之大小可為2.4 kb。另外，病毒基因體可包含啟動子及polyA尾。 病毒基因體組件：反向末端重複序列(ITR)
本發明之AAV粒子包含具有至少一個ITR區及酬載區之病毒基因體。在一些實施例中，病毒基因體具有兩個ITR。這兩個ITR在5'及3'端處側接酬載區。ITR充當複製起點，包含用於複製之識別位點。ITR包含可以互補且對稱地佈置的序列區。併入本發明之病毒基因體中的ITR可由天然存在之聚核苷酸序列或以重組方式衍生之聚核苷酸序列構成。
ITR可以衍生自與衣殼相同的血清型，選自表1中所列之血清型中之任一者，或其衍生物。ITR可具有與衣殼不同的血清型。在一些實施例中，AAV粒子具有超過一個ITR。在一非限制性實例中，AAV粒子具有包含兩個ITR的病毒基因體。在一些實施例中，ITR具有彼此相同之血清型。在另一實施例中，ITR具有不同血清型。非限制性實例包括ITR中之零個、一個或兩個具有與衣殼相同之血清型。在一些實施例中，AAV粒子之病毒基因體之兩個ITR皆為AAV2 ITR。
獨立地，各ITR之長度可為約100至約150個核苷酸。ITR的長度可為約100至105個核苷酸、長度為106至110個核苷酸、長度為111至115個核苷酸、長度為116至120個核苷酸、長度為121至125個核苷酸、長度為126至130個核苷酸、長度為131至135個核苷酸、長度為136至140個核苷酸、長度為141至145個核苷酸或長度為146至150個核苷酸。在一些實施例中，ITR之長度為140至142個核苷酸。ITR長度之非限制性實例為102、140、141、142、145個核苷酸的長度，及與其具有至少95%一致性者。
在一些實施例中，AAV粒子包含編碼siRNA分子之核酸序列，其可在表現載體中位於反ITR (flip ITR)之5'端附近。在另一實施例中，AAV粒子包含編碼siRNA分子之核酸序列，其可在表現載體中位於反ITR的3'端附近。在又一實施例中，AAV粒子包含編碼siRNA分子之核酸序列，其可在表現載體中位於正ITR (flop ITR)的5'端附近。在又一實施例中，AAV粒子包含編碼siRNA分子的核酸序列，其可在表現載體中位於正ITR的3'端附近。在一些實施例中，AAV粒子包含編碼siRNA分子之核酸序列，其可在表現載體中位於反ITR之5'端與正ITR之3'端之間。在一些實施例中，AAV粒子包含編碼siRNA分子之核酸序列，其可在表現載體中位於反ITR之3'端與反ITR之5'端之間(例如，在反ITR之5'端及正ITR之3'端或正ITR之3'端及反ITR之5'端之間一半處)。作為一非限制性實例，AAV粒子包含編碼siRNA分子之核酸序列，其可在表現載體中位於ITR (例如反或正ITR)之5'或3'端下游1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或超過30個核苷酸內。作為一非限制性實例，AAV粒子包含編碼siRNA分子之核酸序列，其可在表現載體中位於ITR (例如反或正ITR)之5'或3'端上游1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或超過30個核苷酸內。作為另一非限制性實例，AAV粒子包含編碼siRNA分子之核酸序列，其可在表現載體中位於ITR (例如反或正ITR)之5'或3'端下游1-5、1-10、1-15、1-20、1-25、1-30、5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、10-15、10-20、10-25、10-30、15-20、15-25、15-30、20-25、20-30或25-30個核苷酸內。作為另一非限制性實例，AAV粒子包含編碼siRNA分子之核酸序列，其可在表現載體中位於ITR (例如反或正ITR)之5'或3'端上游1-5、1-10、1-15、1-20、1-25、1-30、5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、10-15、10-20、10-25、10-30、15-20、15-25、15-30、20-25、20-30或25-30個核苷酸內。作為一非限制性實例，AAV粒子包含編碼siRNA分子之核酸序列，其可在表現載體中位於ITR (例如反或正ITR)之5'或3'端上游前1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%或超過25%核苷酸內。作為另一非限制性實例，AAV粒子包含編碼siRNA分子之核酸序列，其可在表現載體中位於ITR (例如反或正ITR)之5'或3'端下游前1-5%、1-10%、1-15%、1-20%、1-25%、5-10%、5-15%、5-20%、5-25%、10-15%、10-20%、10-25%、15-20%、15-25%或20-25%核苷酸內。 病毒基因體組件：啟動子
在一些實施例中，病毒基因體之酬載區包含至少一個增強轉基因目標特異性及表現之元件(參見例如Powell等人Viral Expression Cassette Elements to Enhance Transgene Target Specificity and Expression in Gene Therapy, 2015；其內容以全文引用之方式併入本文中)。增強轉基因目標特異性及表現之元件的非限制性實例包括啟動子、內源miRNA、轉錄後調控元件(PRE)、聚腺苷酸化(PolyA)信號序列及上游強化子(USE)、CMV強化子及內含子。
熟習此項技術者可認識到，本發明之多肽於目標細胞中之表現可能需要特定啟動子，包括但不限於物種特異性、誘導性、組織特異性或細胞週期特異性的啟動子(Parr等人,Nat. Med. 3:1145-9 (1997)；其內容以全文引用之方式併入本文中)。
在一些實施例中，當啟動子驅動AAV粒子之病毒基因體之酬載區中編碼之一或多種多肽之表現時，認為啟動子有效。
在一些實施例中，啟動子為被認為有效驅動調節聚核苷酸之表現的啟動子。
在一些實施例中，啟動子為當驅動所靶向之細胞中之表現時被認為有效之啟動子。
在一些實施例中，啟動子驅動酬載在所靶向組織中之表現一段時間。由啟動子驅動之表現可持續1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、11小時、12小時、13小時、14小時、15小時、16小時、17小時、18小時、19小時、20小時、21小時、22小時、23小時、1天、2天、3天、4天、5天、6天、1週、8天、9天、10天、11天、12天、13天、2週、15天、16天、17天、18天、19天、20天、3週、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、1年、13個月、14個月、15個月、16個月、17個月、18個月、19個月、20個月、21個月、22個月、23個月、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年或超過10年之時段。表現可持續1至5小時、1至12小時、1至2天、1至5天、1至2週、1至3週、1至4週、1至2個月、1至4個月、1至6個月、2至6個月、3至6個月、3至9個月、4至8個月、6至12個月、1至2年、1至5年、2至5年、3至6年、3至8年、4至8年或5至10年。
在一些實施例中，啟動子驅動酬載之表現持續至少1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、11年、12年、13年、14年、15年、16年、17年、18年、19年、20年、21年、22年、23年、24年、25年、26年、27年、28年、29年、30年、31年、32年、33年、34年、35年、36年、37年、38年、39年、40年、41年、42年、43年、44年、45年、46年、47年、48年、49年、50年、55年、60年、65年或超過65年。
啟動子可為天然存在的或非天然存在的。啟動子之非限制性實例包括病毒啟動子、植物啟動子及哺乳動物啟動子。在一些實施例中，啟動子可為人類啟動子。在一些實施例中，啟動子可為截短的。
驅動或促進大部分組織中之表現的啟動子包括但不限於人類延長因子1α-次單位(EF1α)、細胞巨大病毒(CMV)即刻早期強化子及/或啟動子、雞β-肌動蛋白(CBA)及其衍生物CAG、β葡糖醛酸酶(GUSB)或泛素C (UBC)。組織特異性表現元件可用於將表現限制於某些細胞類型，諸如但不限於肌肉特異性啟動子、B細胞啟動子、單核球啟動子、白血球啟動子、巨噬細胞啟動子、胰臟腺泡細胞啟動子、內皮細胞啟動子、肺組織啟動子、星形膠質細胞啟動子，或可用於將表現限制於神經元、星形膠質細胞或寡樹突神經膠質細胞之神經系統啟動子。
肌肉特異性啟動子之非限制性實例包括哺乳動物肌肉肌酸激酶(MCK)啟動子、哺乳動物肌間線蛋白(DES)啟動子、哺乳動物肌鈣蛋白I (TNNI2)啟動子及哺乳動物骨骼α-肌動蛋白(ASKA)啟動子(參見例如美國專利公開案US 20110212529，其內容以全文引用之方式併入本文中)。
神經元之組織特異性表現元件之非限制性實例包括神經元特異性烯醇酶(NSE)、血小板衍生之生長因子(PDGF)、血小板衍生之生長因子B鏈(PDGF-β)、突觸蛋白(Syn)、甲基-CpG結合蛋白2 (MeCP2)、Ca2+ /鈣調蛋白依賴性蛋白激酶II (CaMKII)、代謝型麩胺酸受體2 (mGluR2)、神經纖毛輕鏈(NFL)或重鏈(NFH)、β-血球蛋白袖珍基因nβ2、前腦啡肽原(PPE)、腦啡肽(Enk)及激動性胺基酸轉運體2 (EAAT2)啟動子。星形膠質細胞之組織特異性表現元件之非限制性實例包括膠質原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)及EAAT2啟動子。寡樹突神經膠質細胞之組織特異性表現元件之非限制性實例包括髓磷脂鹼性蛋白(MBP)啟動子。
在一些實施例中，啟動子可小於1 kb。啟動子之長度可為200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800或超過800個核苷酸。啟動子之長度可介於200-300、200-400、200-500、200-600、200-700、200-800、300-400、300-500、300-600、300-700、300-800、400-500、400-600、400-700、400-800、500-600、500-700、500-800、600-700、600-800或700-800之間。
在一些實施例中，啟動子可為相同或不同起始或親本啟動子(諸如但不限於CMV及CBA)之兩個或更多個組件之組合。各組件之長度可為200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800或超過800。各組件之長度可介於200-300、200-400、200-500、200-600、200-700、200-800、300-400、300-500、300-600、300-700、300-800、400-500、400-600、400-700、400-800、500-600、500-700、500-800、600-700、600-800或700-800之間。在一些實施例中，啟動子為382核苷酸CMV-強化子序列及260核苷酸CBA-啟動子序列之組合。
在一些實施例中，病毒基因體包含普遍存在的啟動子。普遍存在的啟動子之非限制性實例包括CMV、CBA (包括衍生物CAG、CBh等)、EF-1α、PGK、UBC、GUSB (hGBp)及UCOE (HNRPA2B1-CBX3之啟動子)。
Yu等人(Molecular Pain 2011, 7:63；該文獻之內容以全文引用之方式併入本文中)評價在大鼠DRG細胞及初代DRG細胞中使用慢病毒載體在CAG、EFIα、PGK及UBC啟動子存在下的eGFP之表現，且發現UBC所展示之表現比其他3種啟動子弱且對所有啟動子均僅觀察到10-12%神經膠質表現。Soderblom等人(E. Neuro 2015；其內容以全文引用之方式併入本文中)評價在運動皮質中注射之後，eGFP在具有CMV及UBC啟動子之AAV8中之表現及在具有CMV啟動子之AAV2中之表現。鼻內投與含有UBC或EFIα啟動子之質體展示持續的呼吸道表現，其大於在CMV啟動子情況下之表現(參見例如Gill等人, Gene Therapy 2001, 第8卷, 1539-1546；其內容以全文引用之方式併入本文中)。Husain等人(Gene Therapy 2009；其內容以全文引用之方式併入本文中)評價具有hGUSB啟動子、HSV-1LAT啟動子及NSE啟動子之HβH構築體，且發現HβH構築體在小鼠腦中所展示之表現比NSE弱。Passini及Wolfe (J. Virol. 2001, 12382-12392，其內容以全文引用之方式併入本文中)評價在新生小鼠中，HβH載體在心室內注射之後的長期作用且發現存在至少1年之持續表現。Xu等人(Gene Therapy 2001, 8, 1323-1332；其內容以全文引用之方式併入本文中)發現，與CMV-lacZ、CMV-luc、EF、GFAP、hENK、nAChR、PPE、PPE+wpre、NSE (0.3 kb)、NSE (1.8 kb)及NSE (1.8 kb + wpre)相比，在使用NFL及NFH啟動子時，所有腦區域中之表現較低。Xu等人發現，啟動子活性按降序為NSE (1.8 kb)、EF、NSE (0.3 kb)、GFAP、CMV、hENK、PPE、NFL及NFH。NFL為650核苷酸啟動子且NFH為920核苷酸啟動子，此兩種啟動子在肝中皆不存在，但在感覺性本體感受性神經元、腦及脊髓中富含NFH且NFH存在於心中。scn8a為表現於整個DRG、脊髓及腦中的470核苷酸啟動子，其中在海馬體神經元及小腦浦金埃氏細胞(Purkinje cell)、皮質、丘腦及下丘腦中觀察到表現尤其高(參見例如Drews等人,Identification of evolutionary conserved, functional noncoding elements in the promoter region of the sodium channel gene SCN8A , Mamm Genome (2007) 18:723-731；及Raymond等人,Expression of Alternatively Spliced Sodium Channel α-subunit genes , Journal of Biological Chemistry (2004) 279(44) 46234-46241；該等文獻中之每一者的內容均以全文引用之方式併入本文中)。
前述Yu、Soderblom、Gill、Husain、Passini、Xu、Drews或Raymond教示之啟動子中之任一者均可用於本文所描述之本發明AAV粒子中。
在一些實施例中，啟動子不為細胞特異性的。
在一些實施例中，啟動子為泛素c (UBC)啟動子。UBC啟動子之大小可為300-350個核苷酸。作為一非限制性實例，UBC啟動子為332個核苷酸。
在一些實施例中，啟動子為β-葡萄糖醛酸苷酶(GUSB)啟動子。GUSB啟動子之大小可為350-400個核苷酸。作為一非限制性實例，GUSB啟動子為378個核苷酸。
在一些實施例中，啟動子為神經纖毛輕鏈(NFL)啟動子。NFL啟動子之大小可為600-700個核苷酸。作為一非限制性實例，NFL啟動子為650個核苷酸。作為一非限制性實例，構築體可為AAV-啟動子-CMV/血球蛋白內含子-調節聚核苷酸-RBG，其中AAV可為自身互補型且AAV可為DJ血清型。
在一些實施例中，啟動子為神經纖毛重鏈(NFH)啟動子。NFH啟動子之大小可為900-950個核苷酸。作為一非限制性實例，NFH啟動子為920個核苷酸。作為一非限制性實例，構築體可為AAV-啟動子-CMV/血球蛋白內含子-調節聚核苷酸-RBG，其中AAV可為自身互補型且AAV可為DJ血清型。
在一些實施例中，啟動子為scn8a啟動子。scn8a啟動子之大小可為450-500個核苷酸。作為一非限制性實例，scn8a啟動子為470個核苷酸。作為一非限制性實例，構築體可為AAV-啟動子-CMV/血球蛋白內含子-調節聚核苷酸-RBG，其中AAV可為自身互補型且AAV可為DJ血清型。
在一些實施例中，病毒基因體包含Pol III啟動子。
在一些實施例中，病毒基因體包含P1啟動子。
在一些實施例中，病毒基因體包含FXN啟動子。
在一些實施例中，啟動子為磷酸甘油酸激酶1 (PGK)啟動子。
在一些實施例中，啟動子為雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子。
在一些實施例中，啟動子為CAG啟動子，其為包含細胞巨大病毒(CMV)強化子與雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子融合的構築體。
在一些實施例中，啟動子為細胞巨大病毒(CMV)啟動子。
在一些實施例中，病毒基因體包含H1啟動子。
在一些實施例中，病毒基因體包含U6啟動子。
在一些實施例中，啟動子為肝或骨骼肌啟動子。肝啟動子之非限制性實例包括人類α-1-抗胰蛋白酶(hAAT)及甲狀腺素結合球蛋白(TBG)。骨胳肌肉啟動子之非限制性實例包括肌間線蛋白、MCK或合成C5-12。
在一些實施例中，啟動子為RNA pol III啟動子。作為一非限制性實例，RNA pol III啟動子為U6。作為一非限制性實例，RNA pol III啟動子為H1。
在一些實施例中，病毒基因體包含兩個啟動子。作為一非限制性實例，啟動子為EF1α啟動子及CMV啟動子。
在一些實施例中，病毒基因體包含強化子元件、啟動子及/或5'UTR內含子。強化子元件，在本文中亦稱為「強化子」，可為但不限於CMV強化子，啟動子可為但不限於CMV、CBA、UBC、GUSB、NSE、突觸蛋白、MeCP2及GFAP啟動子且5'UTR/內含子可為但不限於SV40及CBA-MVM。作為一非限制性實例，組合使用的強化子、啟動子及/或內含子可為：(1) CMV強化子、CMV啟動子、SV40 5'UTR內含子；(2) CMV強化子、CBA啟動子、SV 40 5'UTR內含子；(3) CMV強化子、CBA啟動子、CBA-MVM 5'UTR內含子；(4) UBC啟動子；(5) GUSB啟動子；(6) NSE啟動子；(7)突觸蛋白啟動子；(8) MeCP2啟動子、(9) GFAP啟動子、(10) H1啟動子；及(11) U6啟動子。
在一些實施例中，病毒基因體包含經工程改造之啟動子。
在另一實施例中，病毒基因體包含來自天然表現之蛋白質的啟動子。 病毒基因體組件：非轉譯區(UTR)
根據定義，基因之野生型非轉譯區(UTR)經轉錄，但不經轉譯。一般而言，5' UTR起始於轉錄起始位點且結束於起始密碼子，且3' UTR緊隨終止密碼子之後起始且持續直至轉錄終止信號為止。
通常發現於特定目標器官之充分表現之基因中的特徵可經工程改造至UTR中以增強穩定性及蛋白質產生。作為一非限制性實例，來自通常表現於肝中之mRNA (例如白蛋白、血清澱粉狀蛋白A、脂蛋白元A/B/E、運鐵蛋白、α胎蛋白、紅血球生成素或因子VIII)的5' UTR可用於本發明之AAV粒子之病毒基因體中，以增強肝細胞株或肝中之表現。
雖然不希望受理論束縛，但野生型5'非轉譯區(UTR)包括在轉譯起始中起作用的特徵。通常在5' UTR中包括Kozak序列，Kozak序列通常已知涉及核糖體藉以引發許多基因之轉譯的過程。Kozak序列具有共同CCR(A/G)CCAUGG，其中R為起始密碼子(ATG)上游三個鹼基處之嘌呤(腺嘌呤或鳥嘌呤)，其之後為另一個『G』。
在一些實施例中，病毒基因體中之5'UTR包括Kozak序列。
在一些實施例中，病毒基因體中之5'UTR不包括Kozak序列。
雖然不希望受理論束縛，但已知野生型3' UTR中嵌有腺苷及尿苷的片段。此等富含AU之標誌在周轉率較高之基因中尤其普遍。富含AU之元件(ARE)基於其序列特徵及功能特性可分成三類(Chen等人, 1995，其內容以全文引用之方式併入本文中)：I類ARE，諸如但不限於c-Myc及MyoD，在富含U之區域內含有若干分散之AUUUA模體複本。II類ARE，諸如但不限於GM-CSF及TNF-a，具有兩個或更多個重疊的UUAUUUA(U/A)(U/A)九聚體。III類ARES，諸如但不限於c-Jun及成肌素，定義則較不明確。此等富含U之區域不含AUUUA模體。已知結合至ARE的大部分蛋白質使信使去穩定化，而已記錄ELAV家族成員(最顯著地，HuR)增加mRNA穩定性。HuR結合於所有三類ARE。將HuR特異性結合位點工程改造至核酸分子之3' UTR中將引起HuR結合，從而使得活體內訊息穩定。
3' UTR富含AU之元件(ARE)之引入、移除或修飾可用於調節聚核苷酸之穩定性。在對特定聚核苷酸(例如病毒基因體之酬載區)進行工程改造時，可引入ARE之一或多個複本以降低聚核苷酸穩定性，且藉此減少所得蛋白質之轉譯且減少其產量。同樣，可鑑別ARE且將其移除或使其突變以提高細胞內穩定性，且因此增加所得蛋白質之轉譯及產量。
在一些實施例中，病毒基因體之3' UTR可包括用於模板化添加poly-A尾之寡聚(dT)序列。
在一些實施例中，病毒基因體可包括至少一個miRNA種子、結合位點或完全序列。微RNA (或miRNA或miR)為19-25核苷酸非編碼RNA，其結合至核酸目標位點且藉由降低核酸分子穩定性或藉由抑制轉譯來下調基因表現。微RNA序列包含「種子」區，亦即成熟微RNA之位置2-8之區域中之序列，該序列相對於核酸之miRNA目標序列具有完美的沃森-克里克互補性(Watson-Crick complementarity)。
在一些實施例中，病毒基因體可經工程改造以包括、改變或移除至少一個miRNA結合位點、序列或種子區。
可將來自此項技術中已知之任何基因的任何UTR併入AAV粒子之病毒基因體中。此等UTR或其部分可以與基因中相同之定向置放，其中該等UTR或其部分係選自該基因，或其定向或位置可變化。在一些實施例中，用於AAV粒子之病毒基因體中之UTR可經倒轉、縮短、拉長或製成具有此項技術中已知的一或多個其他5' UTR或3' UTR。如本文所用，術語「改變」在與UTR相關時意謂UTR已以某種方式相對於參考序列發生變化。舉例而言，3'或5' UTR可如上文所教示藉由定向或位置的變化而相對於野生型或原生UTR發生改變，或可藉由包括額外核苷酸、核苷酸缺失、核苷酸調換或轉位而發生改變。
在一些實施例中，AAV粒子之病毒基因體包含至少一個人工UTR，其不為野生型UTR之變異體。
在一些實施例中，AAV粒子之病毒基因體包含UTR，該等UTR係選自其中蛋白質共有共同功能、結構、特徵或特性之轉錄物之家族。 病毒基因體組件：聚腺苷酸化序列
在一些實施例中，本發明之AAV粒子之病毒基因體包含至少一個聚腺苷酸化序列。AAV粒子之病毒基因體可以包含位於酬載編碼序列之3'端與3'ITR之5'端之間的聚腺苷酸化序列。
在一些實施例中，聚腺苷酸化序列或「polyA序列」之長度可在不存在至約500個核苷酸之範圍內。聚腺苷酸化序列之長度可為但不限於1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499及500個核苷酸。
在一些實施例中，聚腺苷酸化序列之長度為50-100個核苷酸。
在一些實施例中，聚腺苷酸化序列之長度為50-150個核苷酸。
在一些實施例中，聚腺苷酸化序列之長度為50-160個核苷酸。
在一些實施例中，聚腺苷酸化序列之長度為50-200個核苷酸。
在一些實施例中，聚腺苷酸化序列之長度為60-100個核苷酸。
在一些實施例中，聚腺苷酸化序列之長度為60-150個核苷酸。
在一些實施例中，聚腺苷酸化序列之長度為60-160個核苷酸。
在一些實施例中，聚腺苷酸化序列之長度為60-200個核苷酸。
在一些實施例中，聚腺苷酸化序列之長度為70-100個核苷酸。
在一些實施例中，聚腺苷酸化序列之長度為70-150個核苷酸。
在一些實施例中，聚腺苷酸化序列之長度為70-160個核苷酸。
在一些實施例中，聚腺苷酸化序列之長度為70-200個核苷酸。
在一些實施例中，聚腺苷酸化序列之長度為80-100個核苷酸。
在一些實施例中，聚腺苷酸化序列之長度為80-150個核苷酸。
在一些實施例中，聚腺苷酸化序列之長度為80-160個核苷酸。
在一些實施例中，聚腺苷酸化序列之長度為80-200個核苷酸。
在一些實施例中，聚腺苷酸化序列之長度為90-100個核苷酸。
在一些實施例中，聚腺苷酸化序列之長度為90-150個核苷酸。
在一些實施例中，聚腺苷酸化序列之長度為90-160個核苷酸。
在一些實施例中，聚腺苷酸化序列之長度為90-200個核苷酸。
在一些實施例中，AAV粒子包含編碼siRNA分子之核酸序列，該核酸序列可在表現載體中位於聚腺苷酸化序列上游。另外，AAV粒子包含編碼siRNA分子之核酸序列，該核酸序列可在表現載體中位於啟動子下游，該啟動子諸如但不限於CMV、U6、CAG、CBA或具有SV40內含子或人類β-血球蛋白內含子之CBA啟動子。作為一非限制性實例，AAV粒子包含編碼siRNA分子的核酸序列，該核酸序列可在表現載體中位於啟動子下游及/或聚腺苷酸化序列上游1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或超過30個核苷酸內。作為另一非限制性實例，AAV粒子包含編碼siRNA分子之核酸序列，該核酸序列可在表現載體中位於啟動子下游及/或聚腺苷酸化序列上游1-5、1-10、1-15、1-20、1-25、1-30、5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、10-15、10-20、10-25、10-30、15-20、15-25、15-30、20-25、20-30或25-30個核苷酸內。作為一非限制性實例，AAV粒子包含編碼siRNA分子之核酸序列，該核酸序列可在表現載體中位於啟動子下游及/或聚腺苷酸化序列上游前1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%或超過25%核苷酸內。作為另一非限制性實例，AAV粒子包含編碼siRNA分子之核酸序列，該核酸序列可在表現載體中位於啟動子下游及/或聚腺苷酸化序列上游前1-5%、1-10%、1-15%、1-20%、1-25%、5-10%、5-15%、5-20%、5-25%、10-15%、10-20%、10-25%、15-20%、15-25%或20-25%內。
在一些實施例中，AAV粒子包含兔血球蛋白聚腺苷酸化(polyA)信號序列。
在一些實施例中，AAV粒子包含人類生長激素聚腺苷酸化(polyA)信號序列。 病毒基因體組件：內含子
在一些實施例中，酬載區包含至少一個用於增強表現之元件，諸如一或多個內含子或其部分。內含子之非限制性實例包括MVM (67-97 bp)、F.IX截短型內含子1 (300 bp)、β-血球蛋白SD/免疫球蛋白重鏈剪接受體(250 bp)、腺病毒剪接供體/免疫球蛋白剪接受體(500 bp)、SV40晚期剪接供體/剪接受體(19S/16S) (180 bp)及雜交腺病毒剪接供體/IgG剪接受體(230 bp)。
在一些實施例中，內含子或內含子部分長度可為100至500個核苷酸。內含子之長度可為80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490或500。內含子之長度可介於80-100、80-120、80-140、80-160、80-180、80-200、80-250、80-300、80-350、80-400、80-450、80-500、200-300、200-400、200-500、300-400、300-500或400-500之間。
在一些實施例中，AAV病毒基因體可包含啟動子，諸如但不限於CMV或U6。作為一非限制性實例，包含本發明之siRNA分子之核酸序列的AAV的啟動子為CMV啟動子。作為另一非限制性實例，包含本發明之siRNA分子之核酸序列的AAV的啟動子為U6啟動子。
在一些實施例中，AAV病毒基因體可包含CMV啟動子。
在一些實施例中，AAV病毒基因體可包含U6啟動子。
在一些實施例中，AAV病毒基因體可包含CMV及U6啟動子。
在一些實施例中，AAV病毒基因體可包含H1啟動子。
在一些實施例中，AAV病毒基因體可包含CBA啟動子。
在一些實施例中，所編碼之siRNA分子可在表現載體中位於啟動子下游，該啟動子諸如但不限於CMV、U6、H1、CBA、CAG或具有內含子(諸如SV40或此項技術中已知之其他內含子)的CBA啟動子。此外，所編碼之siRNA分子亦可在表現載體中位於聚腺苷酸化序列之上游。作為一非限制性實例，所編碼之siRNA分子可在表現載體中位於啟動子下游及/或聚腺苷酸化序列上游1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或超過30個核苷酸內。作為另一非限制性實例，所編碼之siRNA分子可在表現載體中位於啟動子下游及/或聚腺苷酸化序列上游1-5、1-10、1-15、1-20、1-25、1-30、5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、10-15、10-20、10-25、10-30、15-20、15-25、15-30、20-25、20-30或25-30個核苷酸內。作為一非限制性實例，所編碼之siRNA分子可在表現載體中位於啟動子下游及/或聚腺苷酸化序列上游前1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%或超過25%核苷酸內。作為另一非限制性實例，所編碼之siRNA分子可在表現載體中位於啟動子下游及/或聚腺苷酸化序列上游前1-5%、1-10%、1-15%、1-20%、1-25%、5-10%、5-15%、5-20%、5-25%、10-15%、10-20%、10-25%、15-20%、15-25%或20-25%之內。 病毒基因體組件：填充序列
在一些實施例中，病毒基因體包含一或多個填充序列。
在一些實施例中，病毒基因體包含一或多個填充序列以便使病毒基因體之長度為最佳封裝大小。作為一非限制性實例，病毒基因體包含至少一個填充序列以便使病毒基因體之長度為約2.3 kb。作為一非限制性實例，病毒基因體包含至少一個填充序列以便使病毒基因體之長度為約4.6 kb。
在一些實施例中，病毒基因體包含一或多個填充序列以便降低載體基因體(例如本文所述之調節聚核苷酸)之髮夾結構可在表現及/或封裝期間作為反向末端重複序列(ITR)經讀取之可能性。作為一非限制性實例，病毒基因體包含至少一個填充序列以便使病毒基因體之長度為約2.3 kb。作為一非限制性實例，病毒基因體包含至少一個填充序列以便使病毒基因體之長度為約4.6 kb。
在一些實施例中，病毒基因體為單股(ss)病毒基因體且包含長度約在0.1 kb至3.8 kb之間，諸如但不限於0.1 kb、0.2 kb、0.3 kb、0.4 kb、0.5 kb、0.6 kb、0.7 kb、0.8 kb、0.9 kb、1 kb、1.1 kb、1.2 kb、1.3 kb、1.4 kb、1.5 kb、1.6 kb、1.7 kb、1.8 kb、1.9 kb、2 kb、2.1 kb、2.2 kb、2.3 kb、2.4 kb、2.5 kb、2.6 kb、2.7 kb、2.8 kb、2.9 kb、3 kb、3.1 kb、3.2 kb、3.3 kb、3.4 kb、3.5 kb、3.6 kb、3.7 kb或3.8 kb的一或多個填充序列。作為一非限制性實例，載體基因體中的全長填充序列為3.1 kb。作為一非限制性實例，載體基因體中的全長填充序列為2.7 kb。作為一非限制性實例，載體基因體中的全長填充序列為0.8 kb。作為一非限制性實例，載體基因體中的全長填充序列為0.4 kb。作為一非限制性實例，載體基因體中的各填充序列長度為0.8 kb。作為一非限制性實例，載體基因體中的各填充序列長度為0.4 kb。
在一些實施例中，病毒基因體為自身互補型(sc)病毒基因體且包含長度約在0.1 kb至1.5 kb之間，諸如但不限於0.1 kb、0.2 kb、0.3 kb、0.4 kb、0.5 kb、0.6 kb、0.7 kb、0.8 kb、0.9 kb、1 kb、1.1 kb、1.2 kb、1.3 kb、1.4 kb或1.5 kb的一或多個填充序列。作為一非限制性實例，載體基因體中的全長填充序列為0.8 kb。作為一非限制性實例，載體基因體中的全長填充序列為0.4 kb。作為一非限制性實例，載體基因體中的各填充序列長度為0.8 kb。作為一非限制性實例，載體基因體中的各填充序列長度為0.4 kb。
在一些實施例中，病毒基因體包含填充序列之任何部分。病毒基因體可包含填充序列之1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。
在一些實施例中，病毒基因體為單股(ss)病毒基因體且包含一或多個填充序列以便使病毒基因體之長度為約4.6 kb。作為一非限制性實例，病毒基因體包含至少一個填充序列且該填充序列位於5' ITR序列的3'。作為一非限制性實例，病毒基因體包含至少一個填充序列且該填充序列位於啟動子序列的5'。作為一非限制性實例，病毒基因體包含至少一個填充序列且該填充序列位於聚腺苷酸化信號序列的3'。作為一非限制性實例，病毒基因體包含至少一個填充序列且該填充序列位於3' ITR序列的5'。作為一非限制性實例，病毒基因體包含至少一個填充序列，且該填充序列位於兩個內含子序列之間。作為一非限制性實例，病毒基因體包含至少一個填充序列，且該填充序列位於內含子序列內。作為一非限制性實例，病毒基因體包含兩個填充序列，且第一填充序列位於5' ITR序列的3'且第二填充序列位於聚腺苷酸化信號序列的3'。作為一非限制性實例，病毒基因體包含兩個填充序列，且第一填充序列位於啟動子序列之5'且第二填充序列位於聚腺苷酸化信號序列之3'。作為一非限制性實例，病毒基因體包含兩個填充序列，且第一填充序列位於5' ITR序列的3'且第二填充序列位於5' ITR序列的5'。
在一些實施例中，病毒基因體為自身互補型(sc)病毒基因體且包含一或多個填充序列以便使病毒基因體之長度為約2.3 kb。作為一非限制性實例，病毒基因體包含至少一個填充序列且該填充序列位於5' ITR序列的3'。作為一非限制性實例，病毒基因體包含至少一個填充序列且該填充序列位於啟動子序列的5'。作為一非限制性實例，病毒基因體包含至少一個填充序列且該填充序列位於聚腺苷酸化信號序列的3'。作為一非限制性實例，病毒基因體包含至少一個填充序列且該填充序列位於3' ITR序列的5'。作為一非限制性實例，病毒基因體包含至少一個填充序列，且該填充序列位於兩個內含子序列之間。作為一非限制性實例，病毒基因體包含至少一個填充序列，且該填充序列位於內含子序列內。作為一非限制性實例，病毒基因體包含兩個填充序列，且第一填充序列位於5' ITR序列的3'且第二填充序列位於聚腺苷酸化信號序列的3'。作為一非限制性實例，病毒基因體包含兩個填充序列，且第一填充序列位於啟動子序列之5'且第二填充序列位於聚腺苷酸化信號序列之3'。作為一非限制性實例，病毒基因體包含兩個填充序列，且第一填充序列位於5' ITR序列的3'且第二填充序列位於5' ITR序列的5'。
在一些實施例中，病毒基因體可以包含位於病毒基因體之一或多個區域之間的一或多個填充序列。在一些實施例中，填充區可位於諸如但不限於以下之區域之前：酬載區、反向末端重複序列(ITR)、啟動子區、內含子區、強化子區、聚腺苷酸化信號序列區、多選殖位點(MCS)區及/或外顯子區。在一些實施例中，填充區可位於諸如但不限於以下之區域之後：酬載區、反向末端重複序列(ITR)、啟動子區、內含子區、強化子區、聚腺苷酸化信號序列區、多選殖位點(MCS)區及/或外顯子區。在一些實施例中，填充區可位於諸如但不限於以下之區域之前及之後：酬載區、反向末端重複序列(ITR)、啟動子區、內含子區、強化子區、聚腺苷酸化信號序列區、多選殖位點(MCS)區及/或外顯子區。
在一些實施例中，病毒基因體可包含一或多個將病毒基因體之至少一個區域分開的填充序列。病毒基因體的分開之區域可包含填充序列區之5'之區域的1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。作為一非限制性實例，填充序列可以將至少一個區域分開，使得該區域的10%位於填充序列的5'且該區域的90%位於填充序列的3'。作為一非限制性實例，填充序列可以將至少一個區域分開，使得該區域的20%位於填充序列的5'且該區域的80%位於填充序列的3'。作為一非限制性實例，填充序列可將至少一個區域分開，使得該區域之30%位於填充序列之5'且該區域之70%位於填充序列之3'。作為一非限制性實例，填充序列可以將至少一個區域分開，使得該區域的40%位於填充序列的5'且該區域的60%位於填充序列的3'。作為一非限制性實例，填充序列可以將至少一個區域分開，使得該區域的50%位於填充序列的5'且該區域的50%位於填充序列的3'。作為一非限制性實例，填充序列可以將至少一個區域分開，使得該區域的60%位於填充序列的5'且該區域的40%位於填充序列的3'。作為一非限制性實例，填充序列可以將至少一個區域分開，使得該區域的70%位於填充序列的5'且該區域的30%位於填充序列的3'。作為一非限制性實例，填充序列可以將至少一個區域分開，使得該區域的80%位於填充序列的5'且該區域的20%位於填充序列的3'。作為一非限制性實例，填充序列可以將至少一個區域分開，使得該區域的90%位於填充序列的5'且該區域的10%位於填充序列的3'。
在一些實施例中，病毒基因體在5' ITR之後包含填充序列。
在一些實施例中，病毒基因體在啟動子區之後包含填充序列。在一些實施例中，病毒基因體在酬載區之後包含填充序列。在一些實施例中，病毒基因體在內含子區之後包含填充序列。在一些實施例中，病毒基因體在強化子區之後包含填充序列。在一些實施例中，病毒基因體在聚腺苷酸化信號序列區之後包含填充序列。在一些實施例中，病毒基因體在MCS區之後包含填充序列。在一些實施例中，病毒基因體在外顯子區之後包含填充序列。
在一些實施例中，病毒基因體在啟動子區之前包含填充序列。在一些實施例中，病毒基因體在酬載區之前包含填充序列。在一些實施例中，病毒基因體在內含子區之前包含填充序列。在一些實施例中，病毒基因體在強化子區之前包含填充序列。在一些實施例中，病毒基因體在聚腺苷酸化信號序列區之前包含填充序列。在一些實施例中，病毒基因體在MCS區之前包含填充序列。在一些實施例中，病毒基因體在外顯子區之前包含填充序列。
在一些實施例中，病毒基因體在3' ITR之前包含填充序列。
在一些實施例中，填充序列可位於兩個區域之間，諸如但不限於5' ITR與啟動子區之間。在一些實施例中，填充序列可位於兩個區域之間，諸如但不限於5' ITR與酬載區之間。在一些實施例中，填充序列可位於兩個區域之間，諸如但不限於5' ITR與內含子區之間。在一些實施例中，填充序列可位於兩個區域之間，諸如但不限於5' ITR與強化子區之間。在一些實施例中，填充序列可位於兩個區域之間，諸如但不限於5' ITR與聚腺苷酸化信號序列區之間。在一些實施例中，填充序列可位於兩個區域之間，諸如但不限於5' ITR與MCS區之間。
在一些實施例中，填充序列可位於兩個區域之間，諸如但不限於5' ITR與外顯子區之間。
在一些實施例中，填充序列可位於兩個區域之間，諸如但不限於啟動子區與酬載區之間。在一些實施例中，填充序列可位於兩個區域之間，諸如但不限於啟動子區與內含子區之間。在一些實施例中，填充序列可位於兩個區域之間，諸如但不限於啟動子區與強化子區之間。在一些實施例中，填充序列可位於兩個區域之間，諸如但不限於啟動子區與聚腺苷酸化信號序列區之間。在一些實施例中，填充序列可位於兩個區域之間，諸如但不限於啟動子區與MCS區之間。在一些實施例中，填充序列可位於兩個區域之間，諸如但不限於啟動子區與外顯子區之間。在一些實施例中，填充序列可位於兩個區域之間，諸如但不限於啟動子區與3' ITR之間。
在一些實施例中，填充序列可位於兩個區域之間，諸如但不限於酬載區與內含子區之間。在一些實施例中，填充序列可位於兩個區域之間，諸如但不限於酬載區與強化子區之間。在一些實施例中，填充序列可位於兩個區域之間，諸如但不限於酬載區與聚腺苷酸化信號序列區之間。在一些實施例中，填充序列可位於兩個區域之間，諸如但不限於酬載區與MCS區之間。在一些實施例中，填充序列可位於兩個區域之間，諸如但不限於酬載區與外顯子區之間。
在一些實施例中，填充序列可位於兩個區域之間，諸如但不限於酬載區與3' ITR之間。
在一些實施例中，填充序列可位於兩個區域之間，諸如但不限於內含子區與強化子區之間。在一些實施例中，填充序列可位於兩個區域之間，諸如但不限於內含子區與聚腺苷酸化信號序列區之間。在一些實施例中，填充序列可位於兩個區域之間，諸如但不限於內含子區與MCS區之間。在一些實施例中，填充序列可位於兩個區域之間，諸如但不限於內含子區與外顯子區之間。在一些實施例中，填充序列可位於兩個區域之間，諸如但不限於內含子區與3' ITR之間。在一些實施例中，填充序列可位於兩個區域之間，諸如但不限於強化子區與聚腺苷酸化信號序列區之間。在一些實施例中，填充序列可位於兩個區域之間，諸如但不限於強化子區與MCS區之間。在一些實施例中，填充序列可位於兩個區域之間，諸如但不限於強化子區與外顯子區之間。在一些實施例中，填充序列可位於兩個區域之間，諸如但不限於強化子區與3' ITR之間。
在一些實施例中，填充序列可位於兩個區域之間，諸如但不限於聚腺苷酸化信號序列區與MCS區之間。在一些實施例中，填充序列可位於兩個區域之間，諸如但不限於聚腺苷酸化信號序列區與外顯子區之間。在一些實施例中，填充序列可位於兩個區域之間，諸如但不限於聚腺苷酸化信號序列區與3' ITR之間。
在一些實施例中，填充序列可位於兩個區域之間，諸如但不限於MCS區與外顯子區之間。在一些實施例中，填充序列可位於兩個區域之間，諸如但不限於MCS區與3' ITR之間。
在一些實施例中，填充序列可位於兩個區域之間，諸如但不限於外顯子區與3' ITR之間。
在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與啟動子區之間，且第二填充序列可位於啟動子區與酬載區之間。在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與啟動子區之間，且第二填充序列可位於啟動子區與內含子區之間。在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與啟動子區之間，且第二填充序列可位於啟動子區與強化子區之間。在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與啟動子區之間，且第二填充序列可位於啟動子區與聚腺苷酸化信號序列區之間。在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與啟動子區之間，且第二填充序列可位於啟動子區與MCS區之間。在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與啟動子區之間，且第二填充序列可位於啟動子區與外顯子區之間。在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與啟動子區之間，且第二填充序列可位於啟動子區與3' ITR之間。在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與啟動子區之間，且第二填充序列可位於酬載區與內含子區之間。在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與啟動子區之間，且第二填充序列可位於酬載區與強化子區之間。在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與啟動子區之間，且第二填充序列可位於酬載區與聚腺苷酸化信號序列區之間。在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與啟動子區之間，且第二填充序列可位於酬載區與MCS區之間。在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與啟動子區之間，且第二填充序列可位於酬載區與外顯子區之間。在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與啟動子區之間，且第二填充序列可位於酬載區與3' ITR之間。在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與啟動子區之間，且第二填充序列可位於內含子區與強化子區之間。在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與啟動子區之間，且第二填充序列可位於內含子區與聚腺苷酸化信號序列區之間。在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與啟動子區之間，且第二填充序列可位於內含子區與MCS區之間。在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與啟動子區之間，且第二填充序列可位於內含子區與外顯子區之間。在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與啟動子區之間，且第二填充序列可位於內含子區與3' ITR之間。在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與啟動子區之間，且第二填充序列可位於強化子區與聚腺苷酸化信號序列區之間。在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與啟動子區之間，且第二填充序列可位於強化子區與MCS區之間。在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與啟動子區之間，且第二填充序列可位於強化子區與外顯子區之間。在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與啟動子區之間，且第二填充序列可位於強化子區與3' ITR之間。在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與啟動子區之間，且第二填充序列可位於聚腺苷酸化信號序列區與MCS區之間。在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與啟動子區之間，且第二填充序列可位於聚腺苷酸化信號序列區與外顯子區之間。在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與啟動子區之間，且第二填充序列可位於聚腺苷酸化信號序列區與3' ITR之間。在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與啟動子區之間，且第二填充序列可位於MCS區與外顯子區之間。在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與啟動子區之間，且第二填充序列可位於MCS區與3' ITR之間。在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與啟動子區之間，且第二填充序列可位於外顯子區與3' ITR之間。
在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與酬載區之間，且第二填充序列可位於啟動子區與酬載區之間。在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與酬載區之間，且第二填充序列可位於啟動子區與內含子區之間。在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與酬載區之間，且第二填充序列可位於啟動子區與強化子區之間。在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與酬載區之間，且第二填充序列可位於啟動子區與聚腺苷酸化信號序列區之間。在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與酬載區之間，且第二填充序列可位於啟動子區與MCS區之間。在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與酬載區之間，且第二填充序列可位於啟動子區與外顯子區之間。在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與酬載區之間，且第二填充序列可位於啟動子區與3' ITR之間。在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與酬載區之間，且第二填充序列可位於酬載區與內含子區之間。在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與酬載區之間，且第二填充序列可位於酬載區與強化子區之間。在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與酬載區之間，且第二填充序列可位於酬載區與聚腺苷酸化信號序列區之間。在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與酬載區之間，且第二填充序列可位於酬載區與MCS區之間。在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與酬載區之間，且第二填充序列可位於酬載區與外顯子區之間。在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與酬載區之間，且第二填充序列可位於酬載區與3' ITR之間。在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與酬載區之間，且第二填充序列可位於內含子區與強化子區之間。在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與酬載區之間，且第二填充序列可位於內含子區與聚腺苷酸化信號序列區之間。在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與酬載區之間，且第二填充序列可位於內含子區與MCS區之間。在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與酬載區之間，且第二填充序列可位於內含子區與外顯子區之間。在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與酬載區之間，且第二填充序列可位於內含子區與3' ITR之間。在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與酬載區之間，且第二填充序列可位於強化子區與聚腺苷酸化信號序列區之間。在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與酬載區之間，且第二填充序列可位於強化子區與MCS區之間。在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與酬載區之間，且第二填充序列可位於強化子區與外顯子區之間。在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與酬載區之間，且第二填充序列可位於強化子區與3' ITR之間。在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與酬載區之間，且第二填充序列可位於聚腺苷酸化信號序列區與MCS區之間。在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與酬載區之間，且第二填充序列可位於聚腺苷酸化信號序列區與外顯子區之間。在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與酬載區之間，且第二填充序列可位於聚腺苷酸化信號序列區與3' ITR之間。在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與酬載區之間，且第二填充序列可位於MCS區與外顯子區之間。在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與酬載區之間，且第二填充序列可位於MCS區與3' ITR之間。在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於5' ITR與酬載區之間，且第二填充序列可位於外顯子區與3' ITR之間。
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在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於強化子區與外顯子區之間，且第二填充序列可位於聚腺苷酸化信號序列區與MCS區之間。在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於強化子區與外顯子區之間，且第二填充序列可位於聚腺苷酸化信號序列區與外顯子區之間。在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於強化子區與外顯子區之間，且第二填充序列可位於聚腺苷酸化信號序列區與3' ITR之間。在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於強化子區與外顯子區之間，且第二填充序列可位於MCS區與外顯子區之間。在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於強化子區與外顯子區之間，且第二填充序列可位於MCS區與3' ITR之間。在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於強化子區與外顯子區之間，且第二填充序列可位於外顯子區與3' ITR之間。
在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於強化子區與3' ITR之間，且第二填充序列可位於聚腺苷酸化信號序列區與MCS區之間。在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於強化子區與3' ITR之間，且第二填充序列可位於聚腺苷酸化信號序列區與外顯子區之間。在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於強化子區與3' ITR之間，且第二填充序列可位於聚腺苷酸化信號序列區與3' ITR之間。在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於強化子區與3' ITR之間，且第二填充序列可位於MCS區與外顯子區之間。在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於強化子區與3' ITR之間，且第二填充序列可位於MCS區與3' ITR之間。在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於強化子區與3' ITR之間，且第二填充序列可位於外顯子區與3' ITR之間。
在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於聚腺苷酸化信號序列區與MCS區之間，且第二填充序列可位於MCS區與外顯子區之間。在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於聚腺苷酸化信號序列區與MCS區之間，且第二填充序列可位於MCS區與3' ITR之間。在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於聚腺苷酸化信號序列區與MCS區之間，且第二填充序列可位於外顯子區與3' ITR之間。
在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於聚腺苷酸化信號序列區與外顯子區之間，且第二填充序列可位於MCS區與外顯子區之間。在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於聚腺苷酸化信號序列區與外顯子區之間，且第二填充序列可位於MCS區與3' ITR之間。在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於聚腺苷酸化信號序列區與外顯子區之間，且第二填充序列可位於外顯子區與3' ITR之間。
在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於聚腺苷酸化信號序列區與3' ITR之間，且第二填充序列可位於MCS區與外顯子區之間。在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於聚腺苷酸化信號序列區與3' ITR之間，且第二填充序列可位於MCS區與3' ITR之間。在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於聚腺苷酸化信號序列區與3' ITR之間，且第二填充序列可位於外顯子區與3' ITR之間。
在一些實施例中，病毒基因體可包含兩個填充序列，第一填充序列可位於MCS區與外顯子區之間，且第二填充序列可位於外顯子區與3' ITR之間。本發明之酬載
本發明之AAV粒子包含至少一個酬載區。如本文所用，「酬載」或「酬載區」係指一或多個由病毒基因體編碼或在病毒基因體內編碼之聚核苷酸或聚核苷酸區或此類聚核苷酸或聚核苷酸區之表現產物，例如轉基因、編碼多肽或多元多肽之聚核苷酸或調節核酸或調控核酸。本發明之酬載通常編碼調節聚核苷酸或其片段或變異體。
酬載區可以反映與mRNA之天然組織類似或與其成鏡像之區域之方式構築。
酬載區可包含編碼及非編碼核酸序列之組合。
在一些實施例中，AAV酬載區可對編碼或非編碼RNA進行編碼。
在一些實施例中，AAV粒子包含具有包含編碼siRNA、miRNA或其他RNAi劑之核酸序列的酬載區之病毒基因體。在此類實施例中，編碼超過一種多肽之病毒基因體可複製及封裝於病毒粒子中。經病毒粒子轉導的目標細胞可在單個細胞內部表現所編碼之siRNA、miRNA或其他RNAi劑。 調節聚核苷酸
在一些實施例中，調節聚核苷酸，例如RNA或DNA分子，可用於治療神經退化性疾病，尤其亨丁頓舞蹈症(HD)。如本文所用，「調節聚核苷酸」為用以調節(增加或降低)目標基因之含量或量，例如mRNA或蛋白質含量的任何一或多種核酸序列。
在一些實施例中，調節聚核苷酸可包含至少一個編碼至少一種siRNA分子之核酸序列。若存在超過一種，則核酸可獨立地編碼1、2、3、4、5、6、7、8、9或超過9種siRNA分子。
在一些實施例中，分子骨架可位於CMV啟動子、其片段或變異體下游。
在一些實施例中，分子骨架可位於CBA啟動子、其片段或變異體下游。
在一些實施例中，分子骨架可為位於CMV啟動子之下游之天然pri-miRNA骨架。作為一非限制性實例，天然pri-miRNA骨架衍生自人類miR155骨架。
在一些實施例中，分子骨架可為位於CBA啟動子之下游之天然pri-miRNA骨架。
在一些實施例中，分子骨架及調節聚核苷酸之選擇係藉由比較pri-miRNA中之調節聚核苷酸的方法確定(參見例如由Miniarikova等人，Design, Characterization, and Lead Selection of Therapeutic miRNAs Targeting Huntingtin for Development of Gene Therapy for Huntington ' s Disease. Molecular Therapy-Nucleic Acids (2016) 5, e297及國際公開案第WO2016102664號所述之方法；該等文獻中之每一者的內容以全文引用之方式併入本文中)。調節聚核苷酸可但不限於靶向外顯子1、CAG重複序列、外顯子50中之SNP rs362331及/或外顯子67中之SNP rs362307。為評價調節聚核苷酸之活性，可使用的所用分子骨架為人類pri-miRNA骨架(例如miR155骨架)且啟動子可為CMV。可使用HEK293T細胞及報導體(例如螢光素酶)活體外測定活性。對於外顯子1靶向，若減弱為80%或更大，則判定調節聚核苷酸HTT減弱為有效的。對於CAG靶向，若減弱為至少60%，則判定調節聚核苷酸HTT減弱為有效的。對於SNP靶向，若減弱為至少60%，則判定調節聚核苷酸HTT減弱為有效的。對於CAG重複序列或SNP靶向之對偶基因選擇率，調節聚核苷酸可包含至少1個取代以提高對偶基因選擇率。作為一非限制性實例，取代可為G或C經T或相應U及A置換或T/U經C置換。
為評價調節聚核苷酸之最佳分子骨架，將調節聚核苷酸用於具有CAG啟動子之pri-miRNA骨架中。構築體經50 ng之報導體(例如螢光素酶報導體)共轉染。將在50 ng共轉染下具有大於80%減弱之構築體視為有效的。在一個態樣中，具有強引導股活性之構築體係較佳的。分子骨架可在HEK293T細胞中藉由NGS處理以測定引導-隨從比率及處理可變性。
為評價活體內分子骨架及調節聚核苷酸，將包含調節聚核苷酸之分子骨架封裝於AAV中(例如，血清型可為AAV5 (參見例如WO2015060722中所述之方法及構築體，該文獻之內容以全文引用之方式併入本文中))，且向活體內模型(例如Hu128/21 HD小鼠)投與，且可在模型之不同區域中測定引導-隨從比率、5'及3'端處理、引導及隨從股之逆轉及減弱。
在一些實施例中，分子骨架及調節聚核苷酸之選擇係藉由比較天然pri-miRNA及合成pri-miRNA中之調節聚核苷酸的方法確定。調節聚核苷酸可但不限於靶向除外顯子1外之外顯子。為評價調節聚核苷酸之活性，與CBA啟動子一起使用分子骨架。在一個態樣中，活性可使用HEK293T細胞、海拉細胞(HeLa cell)及報導體(例如螢光素酶)活體外測定，且減弱有效之調節聚核苷酸在所測試細胞中展示至少80%的HTT減弱。另外，視為最有效之調節聚核苷酸展示較低至不顯著的隨從股(p股)活性。在另一態樣中，內源性HTT減弱功效係藉由使用HEK293T細胞、海拉細胞及報導體活體外轉染而評價。有效調節聚核苷酸展示超過50%的內源性HTT減弱。在又一態樣中，藉由感染(例如，AAV2)在不同細胞類型(例如，HEK293、海拉、初級星形膠質細胞、U251星形膠質細胞、SH-SY5Y神經元細胞、FRhK-4恆河獼猴(rhesus macaque) (普通獼猴(Macaca mulatta ))腎細胞及來自HD患者之纖維母細胞)中評價內源性HTT減弱功效。有效調節聚核苷酸展示超過60%的內源性HTT減弱。
為評價活體內分子骨架及調節聚核苷酸，將包含調節聚核苷酸之分子骨架封裝於AAV中，且向活體內模型(例如YAC128 HD小鼠)投與，且可在模型之不同區域(例如組織區域)中測定引導-隨從比率、5'及3'端處理、引導與隨從股之比率及減弱。分子骨架可自活體內樣品藉由NGS處理以測定引導-隨從比率及處理可變性。
在一些實施例中，調節聚核苷酸係使用以下特性中之至少一者設計：環變異體、種子失配/凸出/擺動變異體、莖失配、環變異體及附屬莖(vassal stem)失配變異體、種子失配及基部莖(basal stem)失配變異體、莖失配及基部莖失配變異體、種子擺動及基部莖擺動變異體或莖序列變異體。siRNA 分子
本發明係關於用於治療神經退化性病症的RNA干擾(RNAi)誘導之基因表現的抑制。本文提供siRNA雙螺旋體或所編碼之dsRNA，其靶向HTT基因(本文統稱為「siRNA分子」)。此類siRNA雙螺旋體或所編碼之dsRNA可降低或靜默細胞，例如中型多棘神經元、皮質神經元及/或星形膠質細胞中之HTT基因表現，由此改善亨丁頓舞蹈症(HD)之症狀。
RNAi (亦稱為轉錄後基因靜默(PTGS)、壓製或共遏制)為轉錄後基因靜默過程，其中RNA分子以序列特異性方式抑制基因表現，通常藉由使特定mRNA分子損壞來進行。RNAi之活性組分為短/小雙股RNA (dsRNA)，稱為小干擾RNA (siRNA)，其通常含有15-30個核苷酸(例如，19至25、19至24或19-21個核苷酸)及2個核苷酸3'懸垂物(overhang)，且其匹配目標基因之核酸序列。此等短RNA物種可藉由較大dsRNA的Dicer介導之裂解而在活體內天然產生，且其在哺乳動物細胞中具功能性。
天然表現之小RNA分子，稱為微RNA (miRNA)，藉由調控mRNA之表現引發基因靜默。含有RNA誘導靜默複合體(RISC)的miRNA靶向與miRNA之稱為種子區的5'區中之核苷酸2-7及其3'區之其他鹼基對呈現完美序列互補性的mRNA。miRNA介導的基因表現之下調可由目標mRNA之裂解、目標mRNA之轉譯抑制或mRNA分解引起。miRNA靶向序列通常位於目標mRNA之3'-UTR中。單一miRNA可靶向超過100種來自各種基因之轉錄物，且一種mRNA可被不同miRNA所靶向。
靶向特定mRNA之siRNA雙螺旋體或dsRNA可在活體外設計及合成，且引入細胞中以用於活化RNAi過程。Elbashir等人證明，21核苷酸siRNA雙螺旋體(稱為小干擾RNA)能夠在哺乳動物細胞中實現強效且特異性的基因減弱而不誘發免疫反應(Elbashir SM等人,Nature , 2001, 411, 494-498)。自此初始報導以來，藉由siRNA進行之轉錄後基因靜默很快成為了哺乳動物細胞中基因分析之有效工具，且具有產生新穎治療劑之潛力。
經設計以靶向編碼聚麩醯胺酸重複蛋白(其引起聚麩醯胺酸擴增疾病，諸如亨丁頓舞蹈症)之核酸序列的RNAi分子描述於美國專利第9,169,483號及第9,181,544號及國際專利公開案第WO2015179525號中，該等文獻中之每一者的內容以全文引用之方式併入本文中。美國專利第9,169,483號及第9,181,544號及國際專利公開案第WO2015179525號各自提供包含RNA之第一股(例如15個連續核苷酸)及RNA之第二股(例如與至少12個第一股之連續核苷酸互補)的分離RNA雙螺旋體，其中RNA雙螺旋體之長度為約15至30個鹼基對。RNA之第一股及RNA之第二股可操作地藉由RNA環(約4至50個核苷酸)連接以形成髮夾結構，其可插入表現卡匣中。環部分之非限制性實例包括美國專利第9,169,483號的SEQ ID NO: 9-14，該專利之內容以全文引用之方式併入本文中。可用於形成RNA雙螺旋體的RNA之股(完全序列或序列之一部分)之非限制性實例包括美國專利第9,169,483號之SEQ ID NO: 1-8及美國專利第9,181,544號之SEQ ID NO: 1-11、33-59、208-210、213-215及218-221，該等專利中之每一者之內容以全文引用之方式併入本文中。RNAi分子之非限制性實例包括美國專利第9,169,483號之SEQ ID NO: 1-8、美國專利第9,181,544號之SEQ ID NO: 1-11、33-59、208-210、213-215及218-221及國際專利公開案第WO2015179525號之SEQ ID NO: 1、6、7及35-38，該等專利中之每一者之內容以全文引用之方式併入本文中。
活體外合成之siRNA分子可引入細胞中以活化RNAi。類似於內源性dsRNA，外源性siRNA雙螺旋體當引入至細胞中時可經組裝而形成RNA誘導靜默複合體(RISC)，RNA誘導靜默複合體是一種與RNA序列(其互補於siRNA雙螺旋體之兩股中之一者(亦即反義股))相互作用的多單元複合體。在該過程期間，siRNA之有義股(或隨從股)會從複合體丟失，而siRNA之反義股(或引導股)與其互補RNA匹配。特定言之，含有siRNA之RISC複合體的目標為呈現完美序列互補性的mRNA。隨後，會藉由裂解、釋放及降解該目標而發生siRNA介導之基因靜默。
包含與目標mRNA同源的有義股及與目標mRNA互補的反義股的siRNA雙螺旋體在目標RNA破壞效率方面可提供的優勢比使用單股(ss)-siRNA (例如，反義股RNA或反義寡核苷酸)多得多。在許多情況下，需要較高濃度之ss-siRNA才能達到對應雙螺旋體之有效基因靜默效能。
前述分子中之任一者可由病毒基因體編碼。 靶向HTT基因之siRNA雙螺旋體之設計及序列
本發明提供小干擾RNA (siRNA)雙螺旋體(及編碼其之調節聚核苷酸)，其靶向HTT mRNA以干擾HTT基因表現及/或HTT蛋白產生。
本發明之經編碼siRNA雙螺旋體含有雜交在一起形成雙螺旋結構的反義股及有義股，其中反義股與靶向之HTT基因的核酸序列互補，且其中有義股與靶向之HTT基因的核酸序列同源。在一些態樣中，反義股之5'端具有5'磷酸酯基，且有義股之3'端含有3'羥基。在其他態樣中，在各股之3'端沒有、有一個或2個核苷酸懸垂物。
已在此項技術中提出設計siRNA之一些規範。此等規範一般建議產生靶向待靜默基因中之區域的19核苷酸雙螺旋區、對稱2-3核苷酸3'懸垂物、5'-磷酸酯基及3'-羥基。可控管siRNA序列偏好之其他規則包括但不限於：(i)反義股5'端之存在A/U；(ii)有義股5'端之存在G/C；(iii)反義股5'端三分之一處存在至少五個A/U殘基；及(iv)不存在長度超過9個核苷酸之任何GC片段。根據此類考慮因素，連同目標基因之特定序列，可輕易地設計出遏制哺乳動物目標基因表現所必需的高效siRNA分子。
根據本發明，設計靶向HTT基因之siRNA分子(例如，siRNA雙螺旋體或所編碼之dsRNA)。此類siRNA分子可特異性地遏制HTT基因表現及蛋白質產生。在一些態樣中，siRNA分子經設計且用於選擇性「基因剔除」細胞中之HTT基因變異體，亦即，在患有HD疾病之患者中鑑別到的突變型HTT轉錄物。在一些態樣中，siRNA分子經設計且用於選擇性「減弱」細胞中之HTT基因變異體。在其他態樣中，siRNA分子能夠抑制或遏制野生型及突變型HTT基因。
在一些實施例中，本發明之siRNA分子包含有義股及互補反義股，其中兩股雜交在一起以形成雙螺旋結構。反義股與HTT mRNA序列具有足夠的互補性以引導目標特異性RNAi，亦即，siRNA分子具有足以藉由RNAi機制或過程觸發目標mRNA之破壞的序列。
在一些實施例中，本發明之siRNA分子包含有義股及互補反義股，其中兩股雜交在一起以形成雙螺旋結構，且其中HTT mRNA之雜交起始位點在HTT mRNA序列上之核苷酸100與7000之間。作為一非限制性實例，起始位點可在以下之間：HTT mRNA序列上之核苷酸100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、700-70、750-800、800-850、850-900、900-950、950-1000、1000-1050、1050-1100、1100-1150、1150-1200、1200-1250、1250-1300、1300-1350、1350-1400、1400-1450、1450-1500、1500-1550、1550-1600、1600-1650、1650-1700、1700-1750、1750-1800、1800-1850、1850-1900、1900-1950、1950-2000、2000-2050、2050-2100、2100-2150、2150-2200、2200-2250、2250-2300、2300-2350、2350-2400、2400-2450、2450-2500、2500-2550、2550-2600、2600-2650、2650-2700、2700-2750、2750-2800、2800-2850、2850-2900、2900-2950、2950-3000、3000-3050、3050-3100、3100-3150、3150-3200、3200-3250、3250-3300、3300-3350、3350-3400、3400-3450、3450-3500、3500-3550、3550-3600、3600-3650、3650-3700、3700-3750、3750-3800、3800-3850、3850-3900、3900-3950、3950-4000、4000-4050、4050-4100、4100-4150、4150-4200、4200-4250、4250-4300、4300-4350、4350-4400、4400-4450、4450-4500、4500-4550、4550-4600、4600-4650、4650-4700、4700-4750、4750-4800、4800-4850、4850-4900、4900-4950、4950-5000、5000-5050、5050-5100、5100-5150、5150-5200、5200-5250、5250-5300、5300-5350、5350-5400、5400-5450、5450-5500、5500-5550、5550-5600、5600-5650、5650-5700、5700-5750、5750-5800、5800-5850、5850-5900、5900-5950、5950-6000、6000-6050、6050-6100、6100-6150、6150-6200、6200-6250、6250-6300、6300-6350、6350-6400、6400-6450、6450-6500、6500-6550、6550-6600、6600-6650、6650-6700、6700-6750、6750-6800、6800-6850、6850-6900、6900-6950、6950-7000、7000-7050、7050-7100、7100-7150、7150-7200、7200-7250、7250-7300、7300-7350、7350-7400、7400-7450、7450-7500、7500-7550、7550-7600、7600-7650、7650-7700、7700-7750、7750-7800、7800-7850、7850-7900、7900-7950、7950-8000、8000-8050、8050-8100、8100-8150、8150-8200、8200-8250、8250-8300、8300-8350、8350-8400、8400-8450、8450-8500、8500-8550、8550-8600、8600-8650、8650-8700、8700-8750、8750-8800、8800-8850、8850-8900、8900-8950、8950-9000、9000-9050、9050-9100、9100-9150、9150-9200、9200-9250、9250-9300、9300-9350、9350-9400、9400-9450、9450-9500、9500-9550、9550-9600、9600-9650、9650-9700、9700-9750、9750-9800、9800-9850、9850-9900、9900-9950、9950-10000、10000-10050、10050-10100、10100-10150、10150-10200、10200-10250、10250-10300、10300-10350、10350-10400、10400-10450、10450-10500、10500-10550、10550-10600、10600-10650、10650-10700、10700-10750、10750-10800、10800-10850、10850-10900、10900-10950、10950-11000、11050-11100、11100-11150、11150-11200、11200-11250、11250-11300、11300-11350、11350-11400、11400-11450、11450-11500、11500-11550、11550-11600、11600-11650、11650-11700、11700-11750、11750-11800、11800-11850、11850-11900、11900-11950、11950-12000、12000-12050、12050-12100、12100-12150、12150-12200、12200-12250、12250-12300、12300-12350、12350-12400、12400-12450、12450-12500、12500-12550、12550-12600、12600-12650、12650-12700、12700-12750、12750-12800、12800-12850、12850-12900、12900-12950、12950-13000、13050-13100、13100-13150、13150-13200、13200-13250、13250-13300、13300-13350、13350-13400、13400-13450及13450-13500。作為又一非限制性實例，起始位點可為HTT mRNA序列上之核苷酸315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、715、716、717、718、719、720、721、722、723、724、725、875、876、877、878、879、880、881、882、883、884、885、886、887、888、889、890、891、892、893、894、895、896、897、898、899、900、1375、1376、1377、1378、1379、1380、1381、1382、1383、1384、1385、1386、1387、1388、1389、1390、1391、1392、1393、1394、1395、1396、1397、1398、1399、1400、1401、1402、1403、1404、1405、1406、1407、1408、1409、1410、1411、1412、1413、1414、1415、1416、1417、1418、1419、1420、1421、1422、1423、1424、1425、1426、1427、1428、1429、1430、1431、1432、1433、1434、1435、1436、1437、1438、1439、1440、1441、1442、1443、1444、1445、1446、1447、1448、1449、1450、1660、1661、1662、1663、1664、1665、1666、1667、1668、1669、1670、1671、1672、1673、1674、1675、2050、2051、2052、2053、2054、2055、2056、2057、2058、2059、2060、2061、2062、2063、2064、2065、2066、2067、2068、2069、2070、2071、2072、2073、2074、2075、2076、2077、2078、2079、2080、2081、2082、2083、2084、2085、2086、2087、2088、2089、2090、2091、2092、2093、2094、2095、2096、2097、2098、2099、2100、2580、2581、2582、2583、2584、2585、2586、2587、2588、2589、2590、2591、2592、2593、2594、2595、2596、2597、2598、2599、2600、2601、2602、2603、2604、2605、4525、4526、4527、4528、4529、4530、4531、4532、4533、4534、4535、4536、4537、4538、4539、4540、4541、4542、4543、4544、4545、4546、4547、4548、4549、4550、4575、4576、4577、4578、4579、4580、4581、4582、4583、4584、4585、4586、4587、4588、4589、4590、4591、4592、4593、4594、4595、4596、4597、4598、4599、4600、4850、4851、4852、4853、4854、4855、4856、4857、4858、4859、4860、4861、4862、4863、4864、4865、4866、4867、4868、4869、4870、4871、4872、4873、4874、4875、4876、4877、4878、4879、4880、4881、4882、4883、4884、4885、4886、4887、4888、4889、4890、4891、4892、4893、4894、4895、4896、4897、4898、4899、4900、5460、5461、5462、5463、5464、5465、5466、5467、5468、5469、5470、5471、5472、5473、5474、5475、5476、5477、5478、5479、5480、6175、6176、6177、6178、6179、6180、6181、6182、6183、6184、6185、6186、6187、6188、6189、6190、6191、6192、6193、6194、6195、6196、6197、6198、6199、6200、6315、6316、6317、6318、6319、6320、6321、6322、6323、6324、6325、6326、6327、6328、6329、6330、6331、6332、6333、6334、6335、6336、6337、6338、6339、6340、6341、6342、6343、6344、6345、6600、6601、6602、6603、6604、6605、6606、6607、6608、6609、6610、6611、6612、6613、6614、6615、6725、6726、6727、6728、6729、6730、6731、6732、6733、6734、6735、6736、6737、6738、6739、6740、6741、6742、6743、6744、6745、6746、6747、6748、6749、6750、6751、6752、6753、6754、6755、6756、6757、6758、6759、6760、6761、6762、6763、6764、6765、6766、6767、6768、6769、6770、6771、6772、6773、6774、6775、7655、7656、7657、7658、7659、7660、7661、7662、7663、7664、7665、7666、7667、7668、7669、7670、7671、7672、8510、8511、8512、8513、8514、8515、8516、8715、8716、8717、8718、8719、8720、8721、8722、8723、8724、8725、8726、8727、8728、8729、8730、8731、8732、8733、8734、8735、8736、8737、8738、8739、8740、8741、8742、8743、8744、8745、9250、9251、9252、9253、9254、9255、9256、9257、9258、9259、9260、9261、9262、9263、9264、9265、9266、9267、9268、9269、9270、9480、9481、9482、9483、9484、9485、9486、9487、9488、9489、9490、9491、9492、9493、9494、9495、9496、9497、9498、9499、9500、9575、9576、9577、9578、9579、9580、9581、9582、9583、9584、9585、9586、9587、9588、9589、9590、10525、10526、10527、10528、10529、10530、10531、10532、10533、10534、10535、10536、10537、10538、10539、10540、11545、11546、11547、11548、11549、11550、11551、11552、11553、11554、11555、11556、11557、11558、11559、11560、11875、11876、11877、11878、11879、11880、11881、11882、11883、11884、11885、11886、11887、11888、11889、11890、11891、11892、11893、11894、11895、11896、11897、11898、11899、11900、11915、11916、11917、11918、11919、11920、11921、11922、11923、11924、11925、11926、11927、11928、11929、11930、11931、11932、11933、11934、11935、11936、11937、11938、11939、11940、13375、13376、13377、13378、13379、13380、13381、13382、13383、13384、13385、13386、13387、13388、13389及13390。
在一些實施例中，反義股及目標mRNA序列具有100%互補性。反義股可與目標mRNA序列之任何部分互補。
在其他實施例中，反義股及目標mRNA序列包含至少一種失配。作為一非限制性實例，反義股及目標mRNA序列具有至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-99%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-99%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-99%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-99%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-99%、70-80%、70-90%、70-95%、70-99%、80-90%、80-95%、80-99%、90-95%、90-99%或95-99%互補性。
在一些實施例中，siRNA或dsRNA包括至少兩個彼此互補的序列。
根據本發明，所編碼siRNA分子之長度為約10至50或更多個核苷酸，亦即各股包含10至50個核苷酸(或核苷酸類似物)。較佳地，siRNA分子在各股中長度為約15至30個，例如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸，其中各股中之一者與目標區域充分互補。在一些實施例中，siRNA分子之各股之長度為約19至25、19至24或19至21個核苷酸。在一些實施例中，siRNA分子之至少一股長度為19個核苷酸。在一些實施例中，siRNA分子之至少一股長度為20個核苷酸。在一些實施例中，siRNA分子之至少一股長度為21個核苷酸。在一些實施例中，siRNA分子之至少一股長度為22個核苷酸。在一些實施例中，siRNA分子之至少一股長度為23個核苷酸。在一些實施例中，siRNA分子之至少一股長度為24個核苷酸。在一些實施例中，siRNA分子之至少一股長度為25個核苷酸。
在一些實施例中，本發明之所編碼之siRNA分子可為合成RNA雙螺旋體，其包含約19個核苷酸至約25個核苷酸，及兩個在3'端處之懸垂核苷酸。在一些態樣中，siRNA分子可為未經修飾之RNA分子。在其他態樣中，siRNA分子可含有至少一個經修飾之核苷酸，諸如鹼基、糖或主鏈修飾。
在一些實施例中，本發明之所編碼之siRNA分子可包含核苷酸序列，諸如但不限於表2中之反義(引導)序列或其片段或變異體。作為一非限制性實例，用於本發明之siRNA分子中之反義序列為表2中之核苷酸序列之至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-99%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-99%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-99%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-99%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-99%、70-80%、70-90%、70-95%、70-99%、80-90%、80-95%、80-99%、90-95%、90-99%或95-99%。作為另一非限制性實例，用於本發明之siRNA分子中之反義序列包含表2中之核苷酸序列的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或超過21個連續核苷酸。作為又一非限制性實例，用於本發明之siRNA分子中之反義序列包含表2中之序列之核苷酸1至22、1至21、1至20、1至19、1至18、1至17、1至16、1至15、1至14、1至13、1至12、1至11、1至10、1至9、1至8、2至22、2至21、2至20、2至19、2至18、2至17、2至16、2至15、2至14、2至13、2至12、2至11、2至10、2至9、2至8、3至22、3至21、3至20、3至19、3至18、3至17、3至16、3至15、3至14、3至13、3至12、3至11、3至10、3至9、3至8、4至22、4至21、4至20、4至19、4至18、4至17、4至16、4至15、4至14、4至13、4至12、4至11、4至10、4至9、4至8、5至22、5至21、5至20、5至19、5至18、5至17、5至16、5至15、5至14、5至13、5至12、5至11、5至10、5至9、5至8、6至22、6至21、6至20、6至19、6至18、6至17、6至16、6至15、6至14、6至13、6至12、6至11、6至10、7至22、7至21、7至20、7至19、7至18、7至17、7至16、7至15、7至14、7至13、7至12、8至22、8至21、8至20、8至19、8至18、8至17、8至16、8至15、8至14、8至13、8至12、9至22、9至21、9至20、9至19、9至18、9至17、9至16、9至15、9至14、10至22、10至21、10至20、10至19、10至18、10至17、10至16、10至15、10至14、11至22、11至21、11至20、11至19、11至18、11至17、11至16、11至15、11至14、12至22、12至21、12至20、12至19、12至18、12至17、12至16、13至22、13至21、13至20、13至19、13至18、13至17、13至16、14至22、14至21、14至20、14至19、14至18、14至17、15至22、15至21、15至20、15至19、15至18、16至22、16至21、16至20、17至22、17至21或18至22。 表2. 反義序列
反義 ID 序列 SEQ ID NO
A-2000 UUAACGUCAGUUCAUAAACUU 914
A-2000dt UUAACGUCAGUUCAUAAACdTdT 915
A-2001 UGUCGGUACCGUCUAACACUU 916
A-2001dt UGUCGGUACCGUCUAACACdTdT 917
A-2002 UAAGCAUGGAGCUAGCAGGUU 918
A-2002dt UAAGCAUGGAGCUAGCAGGdTdT 919
A-2003 UACAACGAGACUGAAUUGCUU 920
A-2003dt UACAACGAGACUGAAUUGCdTdT 921
A-2004 UUCAGUUCAUAAACCUGGAUU 922
A-2004dt UUCAGUUCAUAAACCUGGAdTdT 923
A-2005 UAACGUCAGUUCAUAAACCUU 924
A-2005dt UAACGUCAGUUCAUAAACCdTdT 925
A-2006 UCCGGUCACAACAUUGUGGUU 926
A-2006dt UCCGGUCACAACAUUGUGGdTdT 927
A-2007 UUGCACGGUUCUUUGUGACUU 928
A-2007dt UUGCACGGUUCUUUGUGACdTdT 929
A-2008 UUUUAUAACAAGAGGUUCAUU 930
A-2008dt UUUUAUAACAAGAGGUUCAdTdT 931
A-2009 UCCAAAUACUGGUUGUCGGUU 932
A-2009dt UCCAAAUACUGGUUGUCGGdTdT 933
A-2010 UAUUUUAGGAAUUCCAAUGUU 934
A-2010dt UAUUUUAGGAAUUCCAAUGdTdT 935
A-2011 UUUAGGAAUUCCAAUGAUCUU 936
A-2011dt UUUAGGAAUUCCAAUGAUCdTdT 937
A-2012dt UUAAUCUCUUUACUGAUAUdTdT 938
A-2013dt GAUUUUAGGAAUUCCAAUGdTdT 939
A-2014 UAAGCAUGGAGCUAGCAGGCUU 940
A-2015 UAAGCAUGGAGCUAGCAGGGU 941
A-2016 AAGGACUUGAGGGACUCGAAGU 942
A-2017 AAGGACUUGAGGGACUCGAAG 943
A-2018 AAGGACUUGAGGGACUCGA 944
A-2019 AGGACUUGAGGGACUCGAAGU 945
A-2020 GAGGACUUGAGGGACUCGAAGU 946
A-2021 AAGGACUUGAGGGACUCGAAGU 947
A-2022 AAGGACUUGAGGGACUCGAAGUU 948
A-2023 AAGGACUUGAGGGACUCGAAG 949
A-2024 AAGGACUUGAGGGACUCGA 950
A-2025 AAGGACUUGAGGGACUCGAAGG 951
A-2026 AAGGACUUGAGGGACUCGAAU 952
A-2027 AAGGACUUGAGGGACUCGAAGA 953
A-2028 AAGGACUUGAGGGACUCGAAGG 954
A-2029 AAGGACUUGAGGGACUCGAAGGU 955
A-2030 AAGGACUUGAGGGACUCGAAGGA 956
A-2031 AAGGACUUGAGGGACUCGAAG 957
A-2032 AAGGACUUGAGGGACUCGAAGU 958
A-2033 AAGGACUUGAGGGACUCGA 959
A-2034 AAGGACUUGAGGGACUCGAAGGA 960
A-2035 AAGGACUUGAGGGACUCGAAGG 961
A-2036 AAGGACUUGAGGGACUCGAAGGAU 962
A-2037 AAGGACUUGAGGGACUCGAAGGAUU 963
A-2038 AAGGACUUGAGGGACUCGAAG 964
A-2039 AAGGACUUGAGGGACUCGAAGGAA 965
A-2040 GAUGAAGUGCACACAUUGGAUGA 966
A-2041 GAUGAACUGCACACAUUGGAUG 967
A-2042 GAUGAAUUGCACACAGUAGAUGA 968
A-2043 AAGGACUUGAGGGACUCGAAGGUU 969
A-2044 AAGGACUUGAGGGACUCGAAGGUUU 970
A-2045 AAGGACUUGAGGGACUCGAAGGU 971
A-2046 AAGGACUUGAGGGACUCGAAGGUUUU 972
A-2047 AAGGACUUGAGGGACUCGAAGGUUUUU 973
A-2048 AAGGACUUGAGGGACUCGAAGG 974
A-2049 UAAGGACUUGAGGGACUCGAAG 975
A-2050 AAGGACUUGAGGGACUCGAAG 976
A-2051 AAGGACUUGAGGGACUCGAAGU 977
A-2052 AAGGACUUGAGGGACUCGAAGACGAGUCCC 978
A-2053 AAGGACUUGAGGGACUCGAAGACGAGUCCCA 979
A-2054 AAGGACUUGAGGGACUCGAAGACGAGUCCCU 980
A-2055 GAUGAAGUGCACACAUUGGAUAC 981
A-2056 GAUGAAGUGCACACAUUGGAUACA 982
A-2057 GAUGAAGUGCACACAUUGGAUACAAUGUGU 983
A-2058 GAUGAAGUGCACACAUUGGAU 984
A-2059 GAUGAAGUGCACACAUUGGAUA 985
A-2060 GAUGAAUUGCACACAGUAGAUAU 986
A-2061 GAUGAAUUGCACACAGUAGAUAUAC 987
A-2062 GAUGAAUUGCACACAGUAGAUAUACUGUGU 988
A-2063 GAUGAAUUGCACACAGUAGAUAUA 989
A-2064 AUGAAUUGCACACAGUAGAUAUAC 990
A-2065 GAUGAAUUGCACACAGUAGAUA 991
A-2066 GAUGAAUUGCACACAGUAGAUAUACUGUGU 992
A-2067 UACAACGAGACUGAAUUGCU 993
A-2068 ACAACGAGACUGAAUUGCUU 994
A-2069 UCCGGUCACAACAUUGUGGUUC 995
A-2070 UCCGGUCACAACAUUGUGGU 996
A-2071 UCCGGUCACAACAUUGUG 997
A-2072 CCGGUCACAACAUUGUGGUU 998
A-2073 UUUUAUAACAAGAGGUUCAU 999
A-2074 UUUAUAACAAGAGGUUCAUU 1000
A-2075 UAAGCAUGGAGCUAGCAGGU 1001
A-2076 AAGCAUGGAGCUAGCAGGUU 1002
A-2077 CCAAAUACUGGUUGUCGGUU 1003
A-2078 UACAACGAGACUGAAUUGCUUU 1004
A-2079 UAACGUCAGUUCAUAAACCUUU 1005
A-2080 GUCCGGUCACAACAUUGUGGUU 1006
A-2081 UCCGGUCACAACAUUGUGGUUUG 1007
A-2082 UCCGGUCACAACAUUGUGGUUU 1008
A-2083 UCCGGUCACAACAUUGUGG 1009
A-2084 UAAGCAUGGAGCUAGCAGGUUU 1010
A-2085 AAGCAUGGAGCUAGCAGGUUU 1011
A-2086 UCCAAAUACUGGUUGUCGGUUU 1012
A-2087 CCAAAUACUGGUUGUCGGUUU 1013
在一些實施例中，本發明之所編碼之siRNA分子可包含核苷酸序列，諸如但不限於表3中之有義(隨從)序列或其片段或變異體。作為一非限制性實例，用於本發明之siRNA分子中之有義序列為表3中之核苷酸序列之至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-99%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-99%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-99%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-99%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-99%、70-80%、70-90%、70-95%、70-99%、80-90%、80-95%、80-99%、90-95%、90-99%或95-99%。作為另一非限制性實例，用於本發明之siRNA分子中之有義序列包含表3中之核苷酸序列的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或超過21個連續核苷酸。作為又一非限制性實例，用於本發明之siRNA分子中之有義序列包含表3中之序列之核苷酸1至22、1至21、1至20、1至19、1至18、1至17、1至16、1至15、1至14、1至13、1至12、1至11、1至10、1至9、1至8、2至22、2至21、2至20、2至19、2至18、2至17、2至16、2至15、2至14、2至13、2至12、2至11、2至10、2至9、2至8、3至22、3至21、3至20、3至19、3至18、3至17、3至16、3至15、3至14、3至13、3至12、3至11、3至10、3至9、3至8、4至22、4至21、4至20、4至19、4至18、4至17、4至16、4至15、4至14、4至13、4至12、4至11、4至10、4至9、4至8、5至22、5至21、5至20、5至19、5至18、5至17、5至16、5至15、5至14、5至13、5至12、5至11、5至10、5至9、5至8、6至22、6至21、6至20、6至19、6至18、6至17、6至16、6至15、6至14、6至13、6至12、6至11、6至10、7至22、7至21、7至20、7至19、7至18、7至17、7至16、7至15、7至14、7至13、7至12、8至22、8至21、8至20、8至19、8至18、8至17、8至16、8至15、8至14、8至13、8至12、9至22、9至21、9至20、9至19、9至18、9至17、9至16、9至15、9至14、10至22、10至21、10至20、10至19、10至18、10至17、10至16、10至15、10至14、11至22、11至21、11至20、11至19、11至18、11至17、11至16、11至15、11至14、12至22、12至21、12至20、12至19、12至18、12至17、12至16、13至22、13至21、13至20、13至19、13至18、13至17、13至16、14至22、14至21、14至20、14至19、14至18、14至17、15至22、15至21、15至20、15至19、15至18、16至22、16至21、16至20、17至22、17至21或18至22。 表3. 有義序列
有義 ID 序列 SEQ ID NO
S-1000 GUUUAUGAACUGAUCUUACCC 1014
S-1001 GUGUUAGACGGUACUGAUCCC 1015
S-1002 CCUGCUAGCUCCAUGCUUCCC 1016
S-1003 GUUUAUGAACUGAUCUUAGCC 1017
S-1004 GUGUUAGACGGUACUGAUGCC 1018
S-1005 CCUGCUAGCUCCAUGCUUGCC 1019
S-1006 GUUUAUGAAGUGAUCUUAACC 1020
S-1007 GUGUUAGACCGUACUGAUACC 1021
S-1008 CCUGCUAGCACCAUGCUUACC 1022
S-1009 GUUUAUGAACUGAUCUUAACC 1023
S-1010 GUGUUAGACGGUACUGAUACC 1024
S-1011 CCUGCUAGCUCCAUGCUUACC 1025
S-1011dt CCUGCUAGCUCCAUGCUUAdTdT 1026
S-1012 GUUUAUGAACUGAUCUUGCCC 1027
S-1013 GUUUAUGAACUGAUCUUGGCC 1028
S-1014 GUUUAUGAACUGAUCUUGACC 1029
S-1015 GCAAUUCAGUCUCGUUGUCCC 1030
S-1016 UCCAGGUUUAUGAACUGACCC 1031
S-1017 GGUUUAUGAACUGACGUUCCC 1032
S-1018 CCACAAUGUUGUGACUGGCCC 1033
S-1019 GUCACAAAGAACCGUGUACCC 1034
S-1020 UGAACCUCUUGUUAUAAACCC 1035
S-1021 CCGACAACCAGUAUUUGGCCC 1036
S-1022 GCAAUUCAGUCUCGUUGUGCC 1037
S-1023 UCCAGGUUUAUGAACUGAGCC 1038
S-1024 GGUUUAUGAACUGACGUUGCC 1039
S-1025 CCACAAUGUUGUGACUGGGCC 1040
S-1026 GUCACAAAGAACCGUGUAGCC 1041
S-1027 UGAACCUCUUGUUAUAAAGCC 1042
S-1028 CCGACAACCAGUAUUUGGGCC 1043
S-1029 GCAAUUCAGUCUCGUUGUACC 1044
S-1029dt GCAAUUCAGUCUCGUUGUAdTdT 1045
S-1030 UCCAGGUUUAUGAACUGAACC 1046
S-1030dt UCCAGGUUUAUGAACUGAAdTdT 1047
S-1031 GGUUUAUGAACUGACGUUACC 1048
S-1032 CCACAAUGUUGUGACUGGACC 1049
S-1033 GUCACAAAGAACCGUGUAACC 1050
S-1034 UGAACCUCUUGUUAUAAAACC 1051
S-1034dt UGAACCUCUUGUUAUAAAAdTdT 1052
S-1035 CCGACAACCAGUAUUUGGACC 1053
S-1035dt CCGACAACCAGUAUUUGGAdTdT 1054
S-1036 GCAAUUCAGACUCGUUGUACC 1055
S-1037 UCCAGGUUUUUGAACUGAACC 1056
S-1038 GGUUUAUGAUCUGACGUUACC 1057
S-1039 CCACAAUGUAGUGACUGGACC 1058
S-1040 GUCACAAAGUACCGUGUAACC 1059
S-1041 UGAACCUCUAGUUAUAAAACC 1060
S-1042 CCGACAACCUGUAUUUGGACC 1061
S-1043 CAUUGGAAUUCCUAAAAUUCC 1062
S-1044 GAUCAUUGGAAUUCCUAAUCC 1063
S-1045 CAUUGGAAUUCCUAAAAUGCC 1064
S-1046 GAUCAUUGGAAUUCCUAAGCC 1065
S-1047 CAUUGGAAUUCCUAAAAUACC 1066
S-1047dt CAUUGGAAUUCCUAAAAUAdTdT 1067
S-1048 GAUCAUUGGAAUUCCUAAACC 1068
S-1048dt GAUCAUUGGAAUUCCUAAAdTdT 1069
S-1049 CAUUGGAAUACCUAAAAUACC 1070
S-1050 GAUCAUUGGUAUUCCUAAACC 1071
S-1051dt GUUUAUGAACUGACGUUAAdTdT 1072
S-1052dt GUGUUAGACGGUACCGACAdTdT 1073
S-1053dt AUAUCAGUAAAGAGAUUAAdTdT 1074
S-1054dt GGUUUAUGAACUGACGUUAdTdT 1075
S-1055dt CCACAAUGUUGUGACCGGAdTdT 1076
S-1056dt GUCACAAAGAACCGUGCAAdTdT 1077
S-1057dt CAUUGGAAUUCCUAAAAUCdTdT 1078
S-1058 CCUGCUAGCUCCAUGCUUGCU 1079
S-1059 CCUGCUAGCUCCAUGCUUGAU 1080
S-1060 CCUGCUAGCUCCAUGCUUAUU 1081
S-1061 CCUGCUAGCUCCAUGCUUGUU 1082
S-1062 UUCGAGUCCCUCAAGUAGCU 1083
S-1063 UUCGAGUCCCUCAAGUAGCUUU 1084
S-1064 UCGAGUCCCUCAAGUCCAUUCU 1085
S-1065 UUCCAGUCCAUCAAGUCAAUU 1086
S-1066 UUCCGAGUCUAAAAGUCCUUGG 1087
S-1067 UUCCGAGUCUAAAAGUCCUUGGC 1088
S-1068 CUUCCGAGUCUAAAAGUCCUUGG 1089
S-1069 UUCCGAGUCUAAAAGUCCUUGGU 1090
S-1070 UUCCGAGUCUAAAAGUCCUUGGCU 1091
S-1071 UCCAAUGUGAAACUUCAUCGGCU 1092
S-1072 UCCAAUGUGAAACUUCAUCGGC 1093
S-1073 AUCCAAUGUGAAACUUCAUCGU 1094
S-1074 AUCCAAUGUGAAACUUCAUCGGU 1095
S-1075 UCCAAUGUGAAACUUCAUCGGU 1096
S-1076 UCCAAUGUGAAACUUCAUCGGCUU 1097
S-1077 AUCUACUGUGAAAAUUCAUCGG 1098
S-1078 UCUACUGUGAAAAUUCAUCGG 1099
S-1079 UCUACUGUGAAAAUUCAUCGGC 1100
S-1080 AUCUACUGUGAAAAUUCAUCGGU 1101
S-1081 UCUACUGUGAAAAUUCAUCGGU 1102
S-1082 UCUACUGUGAAAAUUCAUCGGCU 1103
S-1083 CCUUCGGUCCUCAAGUCCUUCA 1104
S-1084 UUCGAGUCCAUCAAAUCCUAUAGU 1105
S-1085 UACAAUGUGUGCACUUCAUAU 1106
S-1086 UAUACUGUGUGCAAUUCAUUUCU 1107
S-1087 GCAAUUCAGUCUCGUUGUCC 1108
S-1088 GCAAUUCAGUCUCGUUGUC 1109
S-1089 CAAUUCAGUCUCGUUGUCCC 1110
S-1090 CAAUUCAGUCUCGUUGUCC 1111
S-1091 GCAAUUCAGUCUCGUUGUGC 1112
S-1092 CAAUUCAGUCUCGUUGUGCC 1113
S-1093 CCACAAUGUUGUGACUGGGCCU 1114
S-1094 CCACAAUGUUGUGACUGGGC 1115
S-1095 CACAAUGUUGUGACUGGGCC 1116
S-1096 UGAACCUCUUGUUAUAAAGCCU 1117
S-1097 UGAACCUCUUGUUAUAAAGC 1118
S-1098 GAACCUCUUGUUAUAAAGCC 1119
S-1099 CCUGCUAGCUCCAUGCUUGCCU 1120
S-1100 CCUGCUAGCUCCAUGCUUGC 1121
S-1101 CCUGCUAGCUCCAUGCUUG 1122
S-1102 CUGCUAGCUCCAUGCUUGCC 1123
S-1103 CCGACAACCAGUAUUUGGGCCU 1124
S-1104 CCGACAACCAGUAUUUGGGC 1125
S-1105 CCGACAACCAGUAUUUGGG 1126
S-1106 CGACAACCAGUAUUUGGGCC 1127
S-1107 CGACAACCAGUAUUUGGGC 1128
S-1108 GCAAUUCAGUCUCGUUGUACCU 1129
S-1109 GCAAUUCAGUCUCGUUGUAC 1130
S-1110 GCAAUUCAGUCUCGUUGUA 1131
S-1111 CAAUUCAGUCUCGUUGUACC 1132
S-1112 GCAAUUCAGACUCGUUGUACCU 1133
S-1113 GCAAUUCAGACUCGUUGUAC 1134
S-1114 GCAAUUCAGACUCGUUGUA 1135
S-1115 CAAUUCAGACUCGUUGUACC 1136
S-1116 AGCAAUUCAGUCUCGUUGUACC 1137
S-1117 AGCAAUUCAGUCUCGUUGUAC 1138
S-1118 AGGUUUAUGAACUGACGUUAC 1139
S-1119 AGGUUUAUGAACUGACGUUACC 1140
S-1120 ACCACAAUGUUGUGACUGGAC 1141
S-1121 ACCACAAUGUUGUGACUGGACC 1142
S-1122 CCACAAUGUUGUGACUGGACCGU 1143
S-1123 CCACAAUGUUGUGACUGGACCG 1144
S-1124 CCACAAUGUUGUGACUGGAC 1145
S-1125 CACAAUGUUGUGACUGGACC 1146
S-1126 ACCUGCUAGCUCCAUGCUUCCC 1147
S-1127 ACCUGCUAGCUCCAUGCUUCC 1148
S-1128 ACCUGCUAGCUCCAUGCUUC 1149
S-1129 CCUGCUAGCUCCAUGCUUCC 1150
S-1130 CCUGCUAGCUCCAUGCUUC 1151
S-1131 CUGCUAGCUCCAUGCUUCCC 1152
S-1132 CUGCUAGCUCCAUGCUUCC 1153
S-1133 ACCGACAACCAGUAUUUGGACC 1154
S-1134 ACCGACAACCAGUAUUUGGAC 1155
S-1135 CCGACAACCAGUAUUUGGACCGU 1156
S-1136 CCGACAACCAGUAUUUGGACCGU 1157
S-1137 CCGACAACCAGUAUUUGGAC 1158
S-1138 CGACAACCAGUAUUUGGACC 1159
S-1139 CCUGCUAGCACCGUGCUUACC 1160
在一些實施例中，本發明之siRNA分子可包含來自表2之反義序列及來自表3之有義序列或其片段或變異體。作為一非限制性實例，反義序列及有義序列具有至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-99%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-99%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-99%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-99%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-99%、70-80%、70-90%、70-95%、70-99%、80-90%、80-95%、80-99%、90-95%、90-99%或95-99%的互補性。
在一些實施例中，本發明之siRNA分子可包含如表4-表6中所描述之有義及反義siRNA雙螺旋體。作為一非限制性實例，可測試此等siRNA雙螺旋體對內源性HTT基因表現之活體外抑制活性。有義及反義序列之起始位點係與已知為來自NCBI之NM_002111.7 (SEQ ID NO: 1425)的HTT基因序列相比。 表4. HTT dsRNA之有義股及反義股序列
siRNA 雙螺旋體 ID SS ID 起始 SS 有義股序列 (5 ' -3 ' ) SS SEQ ID AS ID 起始 AS 反義股序列 (5 ' -3 ' ) AS SEQ ID
D-3566 S-1058 6751 CCUGCUAGCUCCAUGCUUGCU 1079 A-2002 6751 UAAGCAUGGAGCUAGCAGGUU 918
D-3567 S-1058 6751 CCUGCUAGCUCCAUGCUUGCU 1079 A-2014 6748 UAAGCAUGGAGCUAGCAGGCUU 940
D-3568 S-1059 6751 CCUGCUAGCUCCAUGCUUGAU 1080 A-2002 6751 UAAGCAUGGAGCUAGCAGGUU 918
D-3569 S-1060 6751 CCUGCUAGCUCCAUGCUUAUU 1081 A-2015 6751 UAAGCAUGGAGCUAGCAGGGU 941
D-3570 S-1061 6751 CCUGCUAGCUCCAUGCUUGUU 1082 A-2002 6751 UAAGCAUGGAGCUAGCAGGUU 918
D-3500 S-1016 1386 UCCAGGUUUAUGAACUGACCC 1031 A-2004 1386 UUCAGUUCAUAAACCUGGAUU 922
D-3501 S-1023 1386 UCCAGGUUUAUGAACUGAGCC 1038 A-2004 1386 UUCAGUUCAUAAACCUGGAUU 922
D-3502 S-1030 1386 UCCAGGUUUAUGAACUGAACC 1046 A-2004 1386 UUCAGUUCAUAAACCUGGAUU 922
D-3503 S-1037 1386 UCCAGGUUUUUGAACUGAACC 1056 A-2004 1386 UUCAGUUCAUAAACCUGGAUU 922
D-3504 S-1030 1386 UCCAGGUUUAUGAACUGAACC 1046 A-2001 2066 UGUCGGUACCGUCUAACACUU 916
D-3505 S-1017 1390 GGUUUAUGAACUGACGUUCCC 1032 A-2005 1389 UAACGUCAGUUCAUAAACCUU 924
D-3506 S-1024 1390 GGUUUAUGAACUGACGUUGCC 1039 A-2005 1389 UAACGUCAGUUCAUAAACCUU 924
D-3507 S-1031 1390 GGUUUAUGAACUGACGUUACC 1048 A-2005 1389 UAACGUCAGUUCAUAAACCUU 924
D-3508 S-1038 1390 GGUUUAUGAUCUGACGUUACC 1057 A-2005 1389 UAACGUCAGUUCAUAAACCUU 924
D-3509 S-1000 1391 GUUUAUGAACUGAUCUUACCC 1014 A-2000 1391 UUAACGUCAGUUCAUAAACUU 914
D-3510 S-1003 1391 GUUUAUGAACUGAUCUUAGCC 1017 A-2000 1391 UUAACGUCAGUUCAUAAACUU 914
D-3511 S-1006 1391 GUUUAUGAAGUGAUCUUAACC 1020 A-2000 1391 UUAACGUCAGUUCAUAAACUU 914
D-3512 S-1009 1391 GUUUAUGAACUGAUCUUAACC 1023 A-2000 1391 UUAACGUCAGUUCAUAAACUU 914
D-3513 S-1012 1391 GUUUAUGAACUGAUCUUGCCC 1027 A-2000 1391 UUAACGUCAGUUCAUAAACUU 914
D-3514 S-1013 1391 GUUUAUGAACUGAUCUUGGCC 1028 A-2000 1391 UUAACGUCAGUUCAUAAACUU 914
D-3515 S-1014 1391 GUUUAUGAACUGAUCUUGACC 1029 A-2000 1391 UUAACGUCAGUUCAUAAACUU 914
D-3516 S-1018 1429 CCACAAUGUUGUGACUGGCCC 1033 A-2006 1428 UCCGGUCACAACAUUGUGGUU 926
D-3517 S-1025 1429 CCACAAUGUUGUGACUGGGCC 1040 A-2006 1428 UCCGGUCACAACAUUGUGGUU 926
D-3518 S-1032 1429 CCACAAUGUUGUGACUGGACC 1049 A-2006 1428 UCCGGUCACAACAUUGUGGUU 926
D-3519 S-1039 1429 CCACAAUGUAGUGACUGGACC 1058 A-2006 1428 UCCGGUCACAACAUUGUGGUU 926
D-3520 S-1001 2066 GUGUUAGACGGUACUGAUCCC 1015 A-2001 2066 UGUCGGUACCGUCUAACACUU 916
D-3521 S-1004 2066 GUGUUAGACGGUACUGAUGCC 1018 A-2001 2066 UGUCGGUACCGUCUAACACUU 916
D-3522 S-1007 2066 GUGUUAGACCGUACUGAUACC 1021 A-2001 2066 UGUCGGUACCGUCUAACACUU 916
D-3523 S-1010 2066 GUGUUAGACGGUACUGAUACC 1024 A-2001 2066 UGUCGGUACCGUCUAACACUU 916
D-3524 S-1021 2079 CCGACAACCAGUAUUUGGCCC 1036 A-2009 2078 UCCAAAUACUGGUUGUCGGUU 932
D-3525 S-1028 2079 CCGACAACCAGUAUUUGGGCC 1043 A-2009 2078 UCCAAAUACUGGUUGUCGGUU 932
D-3526 S-1035 2079 CCGACAACCAGUAUUUGGACC 1053 A-2009 2078 UCCAAAUACUGGUUGUCGGUU 932
D-3527 S-1042 2079 CCGACAACCUGUAUUUGGACC 1061 A-2009 2078 UCCAAAUACUGGUUGUCGGUU 932
D-3528 S-1019 4544 GUCACAAAGAACCGUGUACCC 1034 A-2007 4544 UUGCACGGUUCUUUGUGACUU 928
D-3529 S-1026 4544 GUCACAAAGAACCGUGUAGCC 1041 A-2007 4544 UUGCACGGUUCUUUGUGACUU 928
D-3530 S-1033 4544 GUCACAAAGAACCGUGUAACC 1050 A-2007 4544 UUGCACGGUUCUUUGUGACUU 928
D-3531 S-1040 4544 GUCACAAAGUACCGUGUAACC 1059 A-2007 4544 UUGCACGGUUCUUUGUGACUU 928
D-3532 S-1020 4597 UGAACCUCUUGUUAUAAACCC 1035 A-2008 4597 UUUUAUAACAAGAGGUUCAUU 930
D-3533 S-1027 4597 UGAACCUCUUGUUAUAAAGCC 1042 A-2008 4597 UUUUAUAACAAGAGGUUCAUU 930
D-3534 S-1034 4597 UGAACCUCUUGUUAUAAAACC 1051 A-2008 4597 UUUUAUAACAAGAGGUUCAUU 930
D-3535 S-1041 4597 UGAACCUCUAGUUAUAAAACC 1060 A-2008 4597 UUUUAUAACAAGAGGUUCAUU 930
D-3536 S-1044 4861 GAUCAUUGGAAUUCCUAAUCC 1063 A-2011 4860 UUUAGGAAUUCCAAUGAUCUU 936
D-3537 S-1046 4861 GAUCAUUGGAAUUCCUAAGCC 1065 A-2011 4860 UUUAGGAAUUCCAAUGAUCUU 936
D-3538 S-1048 4861 GAUCAUUGGAAUUCCUAAACC 1068 A-2011 4860 UUUAGGAAUUCCAAUGAUCUU 936
D-3539 S-1050 4861 GAUCAUUGGUAUUCCUAAACC 1071 A-2011 4860 UUUAGGAAUUCCAAUGAUCUU 936
D-3540 S-1043 4864 CAUUGGAAUUCCUAAAAUUCC 1062 A-2010 4864 UAUUUUAGGAAUUCCAAUGUU 934
D-3541 S-1045 4864 CAUUGGAAUUCCUAAAAUGCC 1064 A-2010 4864 UAUUUUAGGAAUUCCAAUGUU 934
D-3542 S-1047 4864 CAUUGGAAUUCCUAAAAUACC 1066 A-2010 4864 UAUUUUAGGAAUUCCAAUGUU 934
D-3543 S-1049 4864 CAUUGGAAUACCUAAAAUACC 1070 A-2010 4864 UAUUUUAGGAAUUCCAAUGUU 934
D-3544 S-1015 6188 GCAAUUCAGUCUCGUUGUCCC 1030 A-2003 6188 UACAACGAGACUGAAUUGCUU 920
D-3545 S-1022 6188 GCAAUUCAGUCUCGUUGUGCC 1037 A-2003 6188 UACAACGAGACUGAAUUGCUU 920
D-3546 S-1029 6188 GCAAUUCAGUCUCGUUGUACC 1044 A-2003 6188 UACAACGAGACUGAAUUGCUU 920
D-3547 S-1036 6188 GCAAUUCAGACUCGUUGUACC 1055 A-2003 6188 UACAACGAGACUGAAUUGCUU 920
D-3548 S-1002 6751 CCUGCUAGCUCCAUGCUUCCC 1016 A-2002 6751 UAAGCAUGGAGCUAGCAGGUU 918
D-3549 S-1005 6751 CCUGCUAGCUCCAUGCUUGCC 1019 A-2002 6751 UAAGCAUGGAGCUAGCAGGUU 918
D-3550 S-1008 6751 CCUGCUAGCACCAUGCUUACC 1022 A-2002 6751 UAAGCAUGGAGCUAGCAGGUU 918
D-3551 S-1011 6751 CCUGCUAGCUCCAUGCUUACC 1025 A-2002 6751 UAAGCAUGGAGCUAGCAGGUU 918
表5. HTT dsRNA之有義股及反義股序列
siRNA 雙螺旋體 ID SS ID 起始 SS 有義股序列 (5 ' -3 ' ) SS SEQ ID AS ID 起始 AS 反義股序列 (5 ' -3 ' ) AS SEQ ID
D-3552 S-1051dt 1391 GUUUAUGAACUGACGUUAAdTdT 1072 A-2000dt 1391 UUAACGUCAGUUCAUAAACdTdT 915
D-3553 S-1052dt 2066 GUGUUAGACGGUACCGACAdTdT 1073 A-2001dt 2066 UGUCGGUACCGUCUAACACdTdT 917
D-3554 S-1011dt 6751 CCUGCUAGCUCCAUGCUUAdTdT 1026 A-2002dt 6751 UAAGCAUGGAGCUAGCAGGdTdT 919
D-3555 S-1053dt 10322 AUAUCAGUAAAGAGAUUAAdTdT 1074 A-2012dt 10322 UUAAUCUCUUUACUGAUAUdTdT 938
D-3556 S-1030dt 1386 UCCAGGUUUAUGAACUGAAdTdT 1047 A-2004dt 1386 UUCAGUUCAUAAACCUGGAdTdT 923
D-3557 S-1054dt 1390 GGUUUAUGAACUGACGUUAdTdT 1075 A-2005dt 1390 UAACGUCAGUUCAUAAACCdTdT 925
D-3558 S-1055dt 1429 CCACAAUGUUGUGACCGGAdTdT 1076 A-2006dt 1429 UCCGGUCACAACAUUGUGGdTdT 927
D-3559 S-1035dt 2079 CCGACAACCAGUAUUUGGAdTdT 1054 A-2009dt 2079 UCCAAAUACUGGUUGUCGGdTdT 933
D-3560 S-1056dt 4544 GUCACAAAGAACCGUGCAAdTdT 1077 A-2007dt 4544 UUGCACGGUUCUUUGUGACdTdT 929
D-3561 S-1034dt 4597 UGAACCUCUUGUUAUAAAAdTdT 1052 A-2008dt 4597 UUUUAUAACAAGAGGUUCAdTdT 931
D-3562 S-1029dt 6188 GCAAUUCAGUCUCGUUGUAdTdT 1045 A-2003dt 6188 UACAACGAGACUGAAUUGCdTdT 921
D-3563 S-1047dt 4864 CAUUGGAAUUCCUAAAAUAdTdT 1067 A-2010dt 4864 UAUUUUAGGAAUUCCAAUGdTdT 935
D-3564 S-1048dt 4861 GAUCAUUGGAAUUCCUAAAdTdT 1069 A-2011dt 4861 UUUAGGAAUUCCAAUGAUCdTdT 937
D-3565 S-1057dt 4864 CAUUGGAAUUCCUAAAAUCdTdT 1078 A-2013dt 4864 GAUUUUAGGAAUUCCAAUGdTdT 939
表6. HTT dsRNA之反義股及有義股序列
siRNA 雙螺旋體 ID AS ID 起始 AS 反義股序列 (5 ' -3 ' ) AS SEQ ID SS ID 起始 SS 有義股序列 (5 ' -3 ' ) SS SEQ ID
D-3569 S-1060 6751 CCUGCUAGCUCCAUGCUUAUU 1081 A-2015 6751 UAAGCAUGGAGCUAGCAGGGU 941
D-3570 S-1061 6751 CCUGCUAGCUCCAUGCUUGUU 1082 A-2002 6751 UAAGCAUGGAGCUAGCAGGUU 918
在其他實施例中，本發明之siRNA分子可在質體載體、AAV粒子、病毒基因體或其他核酸表現載體中經編碼以遞送至細胞。
DNA表現質體可用於在細胞中穩定地表現本發明之siRNA雙螺旋體或dsRNA且達成目標基因表現之長期抑制。在一個態樣中，siRNA雙螺旋體之有義股及反義股通常藉由短間隔序列連接，使得表現稱為短髮夾RNA (shRNA)之莖環結構。髮夾係藉由Dicer識別及裂解，由此產生成熟siRNA分子。
根據本發明，產生包含編碼靶向HTT mRNA之siRNA分子之核酸的AAV粒子，AAV血清型可為表1中所列出之血清型中之任一者。AAV血清型之非限制性實例包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV9.47、AAV9(hu14)、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAV-DJ8、AAV-DJ、AAV-PHP.A及/或AAV-PHP.B及其變異體。
在一些實施例中，本發明之siRNA雙螺旋體或所編碼之dsRNA遏制(或降解)目標mRNA(例如HTT)。因此，siRNA雙螺旋體或所編碼之dsRNA可用於實質上抑制細胞，例如神經元中之HTT基因表現。在一些態樣中，抑制HTT基因表現係指抑制至少約20%，較佳至少約30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%及100%或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-100%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-100%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-100%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-100%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-100%、70-80%、70-90%、70-95%、70-100%、80-90%、80-95%、80-100%、90-95%、90-100%或95-100%。相應地，所靶向基因之蛋白質產物可抑制至少約20%，較佳至少約30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%及100%或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-100%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-100%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-100%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-100%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-100%、70-80%、70-90%、70-95%、70-100%、80-90%、80-95%、80-100%、90-95%、90-100%或95-100%。
根據本發明，設計siRNA分子且測試其減少經培養細胞中之HTT mRNA含量的能力。經培養細胞之非限制性實例包括HEK293、海拉、初級星形膠質細胞、U251星形膠質細胞、SH-SY5Y神經元細胞、FRhK-4恆河獼猴(普通獼猴)腎細胞及來自HD患者之纖維母細胞。此類siRNA分子可形成雙螺旋體，諸如但不限於包括表4、表5或表6中所列之彼等雙螺旋體。作為一非限制性實例，siRNA雙螺旋體可為siRNA雙螺旋體ID：D-3500至D-3570。
在一些實施例中，siRNA分子包含位於引導股中之目標(例如HTT)的miRNA種子匹配。在另一實施例中，siRNA分子包含位於隨從股中之目標(例如HTT)的miRNA種子匹配。在又一實施例中，靶向HTT基因之siRNA雙螺旋體或所編碼之dsRNA不包含位於引導股或隨從股中之目標(例如HTT)的種子匹配。
在一些實施例中，靶向HTT基因之siRNA雙螺旋體或所編碼之dsRNA對於引導股可幾乎無顯著全長脫靶作用。在另一實施例中，靶向HTT基因之siRNA雙螺旋體或所編碼之dsRNA對於隨從股可幾乎無顯著全長脫靶作用。靶向HTT基因的siRNA雙螺旋體或所編碼之dsRNA對於隨從股可具有小於1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%,11%、12%、13%、14%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、1-5%、2-6%、3-7%、4-8%、5-9%、5-10%、6-10%、5-15%、5-20%、5-25%、5-30%、10-20%、10-30%、10-40%、10-50%、15-30%、15-40%、15-45%、20-40%、20-50%、25-50%、30-40%、30-50%、35-50%、40-50%、45-50%的全長脫靶作用。在又一實施例中，靶向HTT基因之siRNA雙螺旋體或所編碼之dsRNA對於引導股或隨從股可幾乎無顯著全長脫靶作用。靶向HTT基因的siRNA雙螺旋體或所編碼之dsRNA對於引導股或隨從股可具有小於1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%,11%、12%、13%、14%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、1-5%、2-6%、3-7%、4-8%、5-9%、5-10%、6-10%、5-15%、5-20%、5-25%、5-30%、10-20%、10-30%、10-40%、10-50%、15-30%、15-40%、15-45%、20-40%、20-50%、25-50%、30-40%、30-50%、35-50%、40-50%、45-50%的全長脫靶作用。
在一些實施例中，靶向HTT基因之siRNA雙螺旋體或所編碼之dsRNA可具有高活體外活性。在另一實施例中，siRNA分子可具有低活體外活性。在又一實施例中，靶向HTT基因之siRNA雙螺旋體或dsRNA可具有高活體外引導股活性及低活體外隨從股活性。
在一些實施例中，siRNA分子具有高活體外引導股活性及低活體外隨從股活性。藉由引導股實現之目標減弱(KD)可為至少30%、40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、99.5%或100%。藉由引導股實現之目標減弱可為30-40%、35-40%、40-50%、45-50%、50-55%、50-60%、60-65%、60-70%、60-75%、60-80%、60-85%、60-90%、60-95%、60-99%、60-99.5%、60-100%、65-70%、65-75%、65-80%、65-85%、65-90%、65-95%、65-99%、65-99.5%、65-100%、70-75%、70-80%、70-85%、70-90%、70-95%、70-99%、70-99.5%、70-100%、75-80%、75-85%、75-90%、75-95%、75-99%、75-99.5%、75-100%、80-85%、80-90%、80-95%、80-99%、80-99.5%、80-100%、85-90%、85-95%、85-99%、85-99.5%、85-100%、90-95%、90-99%、90-99.5%、90-100%、95-99%、95-99.5%、95-100%、99-99.5%、99-100%或99.5-100%。作為一非限制性實例，藉由引導股實現之目標減弱(KD)大於70%。作為一非限制性實例，藉由引導股實現之目標減弱(KD)大於60%。
在一些實施例中，siRNA雙螺旋體經設計以使得不存在有義或反義序列與非Htt序列之miRNA種子匹配。
在一些實施例中，針對最近脫靶的引導股之IC50 大於針對中靶基因Htt的引導股之IC50 的100倍。作為一非限制性實例，若針對最近脫靶的引導股之IC50 大於針對目標的引導股之IC50 的100倍，則稱siRNA分子具有活體外抑制Htt之高引導股選擇率。
在一些實施例中，活體外或活體內至少75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%之時間，引導股之5'處理在5'端具有正確的起始(n)。作為一非限制性實例，引導股之5'處理為精確的，且活體外至少99%之時間，在5'端具有正確的起始(n)。作為一非限制性實例，引導股之5'處理為精確的，且活體內至少99%之時間，在5'端具有正確的起始(n)。作為一非限制性實例，引導股之5'處理為精確的，且活體外至少90%之時間，在5'端具有正確的起始(n)。作為一非限制性實例，引導股之5'處理為精確的，且活體內至少90%之時間，在5'端具有正確的起始(n)。作為一非限制性實例，引導股之5'處理為精確的，且活體外至少85%之時間，在5'端具有正確的起始(n)。作為一非限制性實例，引導股之5'處理為精確的，且活體內至少85%之時間，在5'端具有正確的起始(n)。
在一些實施例中，所表現之引導:隨從(G:P) (亦稱為反義:有義)股比率活體外或活體內為1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1;1、2:10、2:9、2:8、2:7、2:6、2:5、2:4、2:3、2:2、2:1、3:10、3:9、3:8、3:7、3:6、3:5、3:4、3:3、3:2、3:1、4:10、4:9、4:8、4:7、4:6、4:5、4:4、4:3、4:2、4:1、5:10、5:9、5:8、5:7、5:6、5:5、5:4、5:3、5:2、5:1、6:10、6:9、6:8、6:7、6:6、6:5、6:4、6:3、6:2、6:1、7:10、7:9、7:8、7:7、7:6、7:5、7:4、7:3、7:2、7:1、8:10、8:9、8:8、8:7、8:6、8:5、8:4、8:3、8:2、8:1、9:10、9:9、9:8、9:7、9:6、9:5、9:4、9:3、9:2、9:1、10:10、10:9、10:8、10:7、10:6、10:5、10:4、10:3、10:2、10:1、1:99、5:95、10:90、15:85、20:80、25:75、30:70、35:65、40:60、45:55、50:50、55:45、60:40、65:35、70:30、75:25、80:20、85:15、90:10、95:5或99:1。引導:隨從比係指在細胞內處理pri-miRNA之後引導股與隨從股之比率。舉例而言，80:20引導:隨從比將指，自前驅體處理，對於每2個隨從股有8個引導股。作為一非限制性實例，活體外引導股:隨從股比為8:2。作為一非限制性實例，活體內引導股:隨從股比為8:2。作為一非限制性實例，活體外引導股:隨從股比為9:1。作為一非限制性實例，活體內引導股:隨從股比為9:1。
在一些實施例中，所表現之引導:隨從(G:P) (亦稱為反義:有義)股比率大於1。
在一些實施例中，所表現之引導:隨從(G:P) (亦稱為反義:有義)股比率大於2。
在一些實施例中，所表現之引導:隨從(G:P) (亦稱為反義:有義)股比率大於5。
在一些實施例中，所表現之引導:隨從(G:P) (亦稱為反義:有義)股比率大於10。
在一些實施例中，所表現之引導:隨從(G:P) (亦稱為反義:有義)股比率大於20。
在一些實施例中，所表現之引導:隨從(G:P) (亦稱為反義:有義)股比率大於50。
在一些實施例中，所表現之引導:隨從(G:P) (亦稱為反義:有義)股比率至少為3:1。
在一些實施例中，所表現之引導:隨從(G:P) (亦稱為反義:有義)股比率至少為5:1。
在一些實施例中，所表現之引導:隨從(G:P) (亦稱為反義:有義)股比率至少為10:1。
在一些實施例中，所表現之引導:隨從(G:P) (亦稱為反義:有義)股比率至少為20:1。
在一些實施例中，所表現之引導:隨從(G:P) (亦稱為反義:有義)股比率至少為50:1。
在一些實施例中，所表現之隨從:引導(P:G) (亦稱為有義:反義)股比率活體外或活體內為1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1;1、2:10、2:9、2:8、2:7、2:6、2:5、2:4、2:3、2:2、2:1、3:10、3:9、3:8、3:7、3:6、3:5、3:4、3:3、3:2、3:1、4:10、4:9、4:8、4:7、4:6、4:5、4:4、4:3、4:2、4:1、5:10、5:9、5:8、5:7、5:6、5:5、5:4、5:3、5:2、5:1、6:10、6:9、6:8、6:7、6:6、6:5、6:4、6:3、6:2、6:1、7:10、7:9、7:8、7:7、7:6、7:5、7:4、7:3、7:2、7:1、8:10、8:9、8:8、8:7、8:6、8:5、8:4、8:3、8:2、8:1、9:10、9:9、9:8、9:7、9:6、9:5、9:4、9:3、9:2、9:1、10:10、10:9、10:8、10:7、10:6、10:5、10:4、10:3、10:2、10:1、1:99、5:95、10:90、15:85、20:80、25:75、30:70、35:65、40:60、45:55、50:50、55:45、60:40、65:35、70:30、75:25、80:20、85:15、90:10、95:5或99:1。隨從:引導比係指在細胞內處理pri-miRNA之後隨從股與引導股之比率。舉例而言，80:20隨從:引導比將指，自前驅體處理，對於每2個引導股有8個隨從股。作為一非限制性實例，活體外隨從股:引導股比為80:20。作為一非限制性實例，活體內隨從股:引導股比為80:20。作為一非限制性實例，活體外隨從股:引導股比為8:2。作為一非限制性實例，活體內隨從股:引導股比為8:2。作為一非限制性實例，活體外隨從股:引導股比為9:1。作為一非限制性實例，活體內隨從股:引導股比為9:1。
在一些實施例中，所表現之隨從:引導(P:G) (亦稱為有義:反義)股比率大於1。
在一些實施例中，所表現之隨從:引導(P:G) (亦稱為有義:反義)股比率大於2。
在一些實施例中，所表現之隨從:引導(P:G) (亦稱為有義:反義)股比率大於5。
在一些實施例中，所表現之隨從:引導(P:G) (亦稱為有義:反義)股比率大於10。
在一些實施例中，所表現之隨從:引導(P:G) (亦稱為有義:反義)股比率大於20。
在一些實施例中，所表現之隨從:引導(P:G) (亦稱為有義:反義)股比率大於50。
在一些實施例中，所表現之隨從:引導(P:G) (亦稱為有義:反義)股比率至少為3:1。
在一些實施例中，所表現之隨從:引導(P:G) (亦稱為有義:反義)股比率至少為5:1。
在一些實施例中，所表現之隨從:引導(P:G) (亦稱為有義:反義)股比率至少為10:1。
在一些實施例中，所表現之隨從:引導(P:G) (亦稱為有義:反義)股比率至少為20:1。
在一些實施例中，所表現之隨從:引導(P:G) (亦稱為有義:反義)股比率至少為50:1。
在一些實施例中，在量測處理時，當pri-miRNA或pre-miRNA藉由此項技術中已知及本文所述之方法展現大於2倍引導股:隨從股比時，將隨從-引導股雙螺旋體視為有效的。作為一非限制性實例，當量測處理時，pri-miRNA或pre-miRNA展現大於2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍或2至5倍、2至10倍、2至15倍、3至5倍、3至10倍、3至15倍、4至5倍、4至10倍、4至15倍、5至10倍、5至15倍、6至10倍、6至15倍、7至10倍、7至15倍、8至10倍、8至15倍、9至10倍、9至15倍、10至15倍、11至15倍、12至15倍、13至15倍或14至15倍引導股:隨從股比。
在一些實施例中，編碼dsRNA之載體基因體包含為構築體之全長的至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或超過99%之序列。作為一非限制性實例，載體基因體包含為構築體之全長序列的至少80%的序列。
在一些實施例中，siRNA分子可用於藉由靶向htt序列上之至少一個外顯子靜默野生型及/或突變HTT。外顯子可為外顯子1、外顯子2、外顯子3、外顯子4、外顯子5、外顯子6、外顯子7、外顯子8、外顯子9、外顯子10、外顯子11、外顯子12、外顯子13、外顯子14、外顯子15、外顯子16、外顯子17、外顯子18、外顯子19、外顯子20、外顯子21、外顯子22、外顯子23、外顯子24、外顯子25、外顯子26、外顯子27、外顯子28、外顯子29、外顯子30、外顯子31、外顯子32、外顯子33、外顯子34、外顯子35、外顯子36、外顯子37、外顯子38、外顯子39、外顯子40、外顯子41、外顯子42、外顯子43、外顯子44、外顯子45、外顯子46、外顯子47、外顯子48、外顯子49、外顯子50、外顯子51、外顯子52、外顯子53、外顯子54、外顯子55、外顯子56、外顯子57、外顯子58、外顯子59、外顯子60、外顯子61、外顯子62、外顯子63、外顯子64、外顯子65、外顯子66及/或外顯子67。作為一非限制性實例，siRNA分子可用於藉由靶向外顯子1靜默野生型及/或突變HTT。作為另一非限制性實例，siRNA分子可用於藉由靶向除外顯子1外的外顯子靜默野生型及/或突變HTT。作為另一非限制性實例，siRNA分子可用於藉由靶向外顯子50靜默野生型及/或突變HTT。作為另一非限制性實例，siRNA分子可用於藉由靶向外顯子67靜默野生型及/或突變HTT。分子骨架
在一些實施例中，siRNA分子可於亦包含分子骨架的調節聚核苷酸中編碼。如本文所用，「分子骨架」為形成針對其設計或製造後續分子之序列或結構性基礎之構架或起始分子。
在一些實施例中，分子骨架包含至少一個5'側接區。作為一非限制性實例，5'側接區可包含5'側接序列，其可具有任何長度且可整體地或部分地衍生自野生型微RNA序列，或為完全人工序列。
在一些實施例中，分子骨架包含至少一個3'側接區。作為一非限制性實例，3'側接區可包含3'側接序列，其可具有任何長度且可整體地或部分地衍生自野生型微RNA序列，或為完全人工序列。
在一些實施例中，5'及3'側接序列中之一或兩者不存在。
在一些實施例中，5'及3'側接序列長度相同。
在一些實施例中，5'側接序列之長度為1-10個核苷酸，長度為5-15個核苷酸，長度為10-30個核苷酸，長度為20-50個核苷酸，長度為超過40個核苷酸，長度為超過50個核苷酸，長度為超過100個核苷酸或長度為超過200個核苷酸。
在一些實施例中，5'側接序列長度可為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499或500個核苷酸。
在一些實施例中，3'側接序列之長度為1-10個核苷酸，長度為5-15個核苷酸，長度為10-30個核苷酸，長度為20-50個核苷酸，長度為超過40個核苷酸，長度為超過50個核苷酸，長度為超過100個核苷酸或長度為超過200個核苷酸。
在一些實施例中，3'側接序列長度可為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499或500個核苷酸。
在一些實施例中，分子骨架包含至少一個環模體區。作為一非限制性實例，環模體區可包含可具有任何長度之序列。
在一些實施例中，分子骨架包含5'側接區、環模體區及/或3'側接區。
在一些實施例中，至少一種本文所述之siRNA、miRNA或其他RNAi劑可由亦可包含至少一種分子骨架之調節聚核苷酸編碼。分子骨架可包含5'側接序列，其可具有任何長度且可整體地或部分地衍生自野生型微RNA序列，或為完全人工的。3'側接序列可在大小及來源上與5'側接序列及/或3'側接序列成鏡像。可不存在任一側接序列。3'側接序列可視情況含有一或多個CNNC模體，其中「N」表示任何核苷酸。
形成莖環結構之莖為編碼至少一種本文所述之siRNA、miRNA或其他RNAi劑的調節聚核苷酸的最低限度。在一些實施例中，本文所述之siRNA、miRNA或其他RNAi劑包含至少一種核酸序列，其部分地與目標序列互補或將與其雜交。在一些實施例中，酬載為siRNA分子或siRNA分子之片段。
在一些實施例中，調節聚核苷酸之莖環結構之5'臂包含編碼有義序列的核酸序列。可由調節聚核苷酸編碼之有義序列或其片段或變異體之非限制性實例描述於表3中。
在一些實施例中，調節聚核苷酸之莖環之3'臂包含編碼反義序列之核酸序列。在一些情況下，反義序列在5'最末端包含「G」核苷酸。可由調節聚核苷酸編碼之反義序列或其片段或變異體之非限制性實例描述於表2中。
在其他實施例中，有義序列可存在於調節聚核苷酸之莖環結構之莖的3'臂上，而反義序列存在於5'臂上。可由調節聚核苷酸編碼之有義序列及反義序列之非限制性實例描述於表2及表3中。
在一些實施例中，有義序列及反義序列可在其大部分長度中完全互補。在其他實施例中，有義序列及反義序列可在獨立地至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或99%的各股之長度中呈至少70%、80%、90%、95%或99%互補性。
有義序列之一致性或反義序列之同源性均不需要與目標序列100%互補。
在一些實施例中，分隔調節聚核苷酸之莖環結構之有義序列與反義序列的為環序列(亦稱為環模體、連接子或連接子模體)。環序列可具有任何長度：在4-30個核苷酸之間、在4-20個核苷酸之間、在4-15個核苷酸之間、在5-15個核苷酸之間、在6-12個核苷酸之間、6個核苷酸、7個核苷酸、8個核苷酸、9個核苷酸、10個核苷酸、11個核苷酸、12個核苷酸、13個核苷酸、14個核苷酸及/或15個核苷酸。
在一些實施例中，環序列包含編碼至少一種UGUG模體之核酸序列。在一些實施例中，編碼UGUG模體之核酸序列位於環序列之5'端。
在一些實施例中，間隔區可存在於調節聚核苷酸中以將一或多個模組(例如，5'側接區、環模體區、3'側接區、有義序列、反義序列)彼此分隔。可存在一或多個此類間隔區。
在一些實施例中，具有在8至20個之間，亦即8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個核苷酸的間隔區可存在於有義序列與側接區序列之間。
在一些實施例中，間隔區之長度為13個核苷酸且位於有義序列之5'端與側接序列之3'端之間。在一些實施例中，間隔子具有足夠的長度以形成序列之大約一個螺旋形轉彎(helical turn)。
在一些實施例中，具有在8至20個之間，亦即8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個核苷酸的間隔區可存在於反義序列與側接序列之間。
在一些實施例中，間隔序列為在10至13個，亦即10、11、12或13個核苷酸之間，且位於反義序列之3'端與側接序列之5'端之間。在一些實施例中，間隔子具有足夠的長度以形成序列之大約一個螺旋形轉彎。
在一些實施例中，調節聚核苷酸之分子骨架在5'至3'方向上包含5'側接序列、5'臂、環模體、3'臂及3'側接序列。作為一非限制性實例，5'臂可包含編碼有義序列之核酸序列，且3'臂包含編碼反義序列之核酸序列。在另一非限制性實例中，5'臂包含編碼反義序列之核酸序列，且3'臂包含編碼有義序列之核酸序列。
在一些實施例中，5'臂、有義序列及/或反義序列、環模體及/或3'臂序列可有所改變(例如取代1或更多個核苷酸、添加核苷酸及/或缺失核苷酸)。改變可引起構築體之功能的有益變化(例如增加目標序列之減弱、減少構築體之降解、減少脫靶作用、提高酬載之效率及減少酬載之降解)。
在一些實施例中，對準調節聚核苷酸之分子骨架以便使引導股(在本文中亦稱為反義股)之切除率大於隨從股(在本文中亦稱為有義股)之切除率。引導股或隨從股之切除率可獨立地為1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或超過99%。作為一非限制性實例，引導股之切除率為至少80%。作為另一非限制性實例，引導股之切除率為至少90%。
在一些實施例中，引導股之切除率大於隨從股之切除率。在一個態樣中，引導股之切除率可比隨從股大至少1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或超過99%。
在一些實施例中，引導股之切除效率為至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或超過99%。作為一非限制性實例，引導股之切除效率大於80%。
在一些實施例中，自分子骨架之引導股之切除效率大於隨從股之切除效率。自分子骨架之引導股之切除可比隨從股之切除高效2、3、4、5、6、7、8、9、10或超過10倍。
在一些實施例中，分子骨架包含雙重功能靶向調節聚核苷酸。如本文所用，「雙重功能靶向」調節聚核苷酸為引導股及隨從股減弱相同目標或引導股及隨從股減弱不同目標的聚核苷酸。
在一些實施例中，本文所述之調節聚核苷酸之分子骨架可包含5'側接區、環模體區及3'側接區。本文所述之調節聚核苷酸中之可使用的5'側接區、環模體區(亦可稱為連接區域)及3'側接區之序列或其所用片段之非限制性實例展示於表7至表9中。 表7. 分子骨架之5'側接區
5 ' 側接區名稱 5 ' 側接區序列 5 ' 側接區 SEQ ID
5F3 GTGCTGGGCGGGGGGCGGCGGGCCCTCCCGCAGAACACCATGCGCTCCACGGAA 1163
5F1 GTGCTGGGCGGGGGGCGGCGGGCCCTCCCGCAGAACACCATGCGCTCTTCGGAA 1161
5F2 GAAGCAAAGAAGGGGCAGAGGGAGCCCGTGAGCTGAGTGGGCCAGGGACTGGGAGAAGGAGTGAGGAGGCAGGGCCGGCATGCCTCTGCTGCTGGCCAGA 1162
5F4 GGGCCCTCCCGCAGAACACCATGCGCTCCACGGAA 1164
5F5 CTCCCGCAGAACACCATGCGCTCCACGGAA 1165
5F6 GTGCTGGGCGGGGGGCGGCGGGCCCTCCCGCAGAACACCATGCGCTCCACGGAAG 1166
5F7 GTGCTGGGCGGGGGGCGGCGGGCCCTCCCGCAGAACACCATGCGCTCCTCGGAA 1167
表8. 分子骨架之環模體區
環模體區名稱 環模體區序列 環模體區 SEQ ID
L5 GTGGCCACTGAGAAG 1172
L1 TGTGACCTGG 1168
L2 TGTGATTTGG 1169
L3 GTCTGCACCTGTCACTAG 1170
L4 GTGACCCAAG 1171
L6 GTGACCCAAT 1173
L7 GTGACCCAAC 1174
L8 GTGGCCACTGAGAAA 1175
表9. 分子骨架之3'側接區
3 ' 側接區 名稱 3 ' 側接區序列 3 ' 側接區 SEQ ID
3F1 CTGAGGAGCGCCTTGACAGCAGCCATGGGAGGGCCGCCCCCTACCTCAGTGA 1178
3F2 CTGTGGAGCGCCTTGACAGCAGCCATGGGAGGGCCGCCCCCTACCTCAGTGA 1179
3F3 TGGCCGTGTAGTGCTACCCAGCGCTGGCTGCCTCCTCAGCATTGCAATTCCTCTCCCATCTGGGCACCAGTCAGCTACCCTGGTGGGAATCTGGGTAGCC 1180
3F4 CTGAGGAGCGCCTTGACAGCAGCCATGGGAGGGCC 1181
3F5 CTGCGGAGCGCCTTGACAGCAGCCATGGGAGGGCCGCCCCCTACCTCAGTGA 1182
在一些實施例中，分子骨架可包含表7中所列之至少一個5'側接區、其片段或變異體。作為一非限制性實例，5'側接區可為5F1、5F2、5F3、5F4、5F5、5F6或5F7。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個5F1側接區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個5F2側接區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個5F3側接區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個5F4側接區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個5F5側接區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個5F6側接區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個5F7側接區。
在一些實施例中，分子骨架可包含表8中所列之至少一個環模體區、其片段或變異體。作為一非限制性實例，環模體區可為L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7或L8。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個L1環模體區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個L2環模體區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個L3環模體區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個L4環模體區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個L5環模體區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個L6環模體區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個L7環模體區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個L8環模體區。
在一些實施例中，分子骨架可包含表9中所列之至少一個3'側接區、其片段或變異體。作為一非限制性實例，3'側接區可為3F1、3F2、3F3、3F4或3F5。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個3F1側接區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個3F2側接區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個3F3側接區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個3F4側接區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個3F5側接區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個5'側接區、其片段或變異體及至少一個環模體區、其片段或變異體，如表7及表8中所述。作為一非限制性實例，5'側接區及環模體區可為5F1及L1、5F1及L2、5F1及L3、5F1及L4、5F1及L5、5F1及L6、5F1及L7、5F1及L8、5F2及L1、5F2及L2、5F2及L3、5F2及L4、5F2及L5、5F2及L6、5F2及L7、5F2及L8、5F3及L1、5F3及L2、5F3及L3、5F3及L4、5F3及L5、5F3及L6、5F3及L7、5F3及L8、5F4及L1、5F4及L2、5F4及L3、5F4及L4、5F4及L5、5F4及L6、5F4及L7、5F4及L8、5F5及L1、5F5及L2、5F5及L3、5F5及L4、5F5及L5、5F5及L6、5F5及L7、5F5及L8、5F6及L1、5F6及L2、5F6及L3、5F6及L4、5F6及L5、5F6及L6、5F6及L7、5F6及L8、5F7及L1、5F7及L2、5F7及L3、5F7及L4、5F7及L5、5F7及L6、5F7及L7以及5F7及L8。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個5F2側接區及至少一個L1環模體區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個5F1側接區及至少一個L4環模體區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個5F7側接區及至少一個L8環模體區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個5F3側接區及至少一個L4環模體區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個5F3側接區及至少一個L5環模體區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個5F4側接區及至少一個L4環模體區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個5F3側接區及至少一個L7環模體區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個5F5側接區及至少一個L4環模體區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個5F6側接區及至少一個L4環模體區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個5F3側接區及至少一個L6環模體區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個5F7側接區及至少一個L4環模體區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個5F2側接區及至少一個L2環模體區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個5F1側接區及至少一個L1環模體區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個5F1側接區及至少一個L2環模體區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個3'側接區、其片段或變異體及至少一個模體區、其片段或變異體，如表8及表9中所述。作為一非限制性實例，3'側接區及環模體區可為3F1及L1、3F1及L2、3F1及L3、3F1及L4、3F1及L5、3F1及L6、3F1及L7、3F1及L8、3F2及L1、3F2及L2、3F2及L3、3F2及L4、3F2及L5、3F2及L6、3F2及L7、3F2及L8、3F3及L1、3F3及L2、3F3及L3、3F3及L4、3F3及L5、3F3及L6、3F3及L7、3F3及L8、3F4及L1、3F4及L2、3F4及L3、3F4及L4、3F4及L5、3F4及L6、3F4及L7、3F4及L8、3F5及L1、3F5及L2、3F5及L3、3F5及L4、3F5及L5、3F5及L6、3F5及L7以及3F5及L8。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個L1環模體區及至少一個3F2側接區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個L4環模體區及至少一個3F1側接區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個L8環模體區及至少一個3F5側接區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個L5環模體區及至少3F1側接區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個L4環模體區及至少一個3F4側接區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個L7環模體區及至少一個3F1側接區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個L6環模體區及至少一個3F1側接區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個L4環模體區及至少一個3F5側接區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個L2環模體區及至少一個3F2側接區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個L1環模體區及至少一個3F3側接區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個L5環模體區及至少一個3F4側接區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個L1環模體區及至少一個3F1側接區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個L2環模體區及至少一個3F1側接區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個5'側接區、其片段或變異體及至少一個3'側接區、其片段或變異體，如表7及表9中所述。作為一非限制性實例，該等側接區可為5F1及3F1、5F1及3F2、5F1及3F3、5F1及3F4、5F1及3F5、5F2及3F1、5F2及3F2、5F2及3F3、5F2及3F4、5F2及3F5、5F3及3F1、5F3及3F2、5F3及3F3、5F3及3F4、5F3及3F5、5F4及3F1、5F4及3F2、5F4及3F3、5F4及3F4、5F4及3F5、5F5及3F1、5F5及3F2、5F5及3F3、5F5及3F4、5F5及3F5、5F6及3F1、5F6及3F2、5F6及3F3、5F6及3F4、5F6及3F5、5F7及3F1、5F7及3F2、5F7及3F3、5F7及3F4以及5F7及3F5。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個5F2 5'側接區及至少一個3F2 3'側接區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個5F1 5'側接區及至少一個3F1 3'側接區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個5F7 5'側接區及至少一個3F5 3'側接區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個5F3 5'側接區及至少一個3F1 3'側接區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個5F4 5'側接區及至少一個3F4 3'側接區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個5F5 5'側接區及至少一個3F4 3'側接區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個5F6 5'側接區及至少一個3F1 3'側接區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個5F2 5'側接區及至少一個3F3 3'側接區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個5F3 5'側接區及至少一個3F4 3'側接區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個5F1 5'側接區及至少一個3F2 3'側接區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個5'側接區、其片段或變異體、至少一個環模體區、其片段或變異體及至少一個3'側接區，如表7至表9中所述。作為一非限制性實例，該等側接及環模體區可為5F1、L1及3F1；5F1、L1及3F2；5F1、L1及3F3；5F1、L1及3F4；5F1、L1及3F5；5F2、L1及3F1；5F2、L1及3F2；5F2、L1及3F3；5F2、L1及3F4；5F2、L1及3F5；5F3、L1及3F3；5F3、L1及3F2；5F3、L1及3F3；5F3、L1及3F4；5F3、L1及3F5；5F4、L1及3F4；5F4、L1及3F2；5F4、L1及3F3；5F4、L1及3F4；5F4、L1及3F5；5F5、L1及3F1；5F5、L1及3F2；5F5、L1及3F3；5F5、L1及3F4；5F5、L1及3F5；5F6、L1及3F1；5F6、L1及3F2；5F6、L1及3F3；5F6、L1及3F4；5F6、L1及3F5；5F7、L1及3F1；5F7、L1及3F2；5F7、L1及3F3；5F7、L1及3F4；5F7、L1及3F5；5F1、L2及3F1；5F1、L2及3F2；5F1、L2及3F3；5F1、L2及3F4；5F1、L2及3F5；5F2、L2及3F1；5F2、L2及3F2；5F2、L2及3F3；5F2、L2及3F4；5F2、L2及3F5；5F3、L2及3F1；5F3、L2及3F2；5F3、L2及3F3；5F3、L2及3F4；5F3、L2及3F5；5F4、L2及3F1；5F4、L2及3F2；5F4、L2及3F3；5F4、L2及3F4；5F4、L2及3F5；5F5、L2及3F1；5F5、L2及3F2；5F5、L2及3F3；5F5、L2及3F4；5F5、L2及3F5；5F6、L2及3F1；5F6、L2及3F2；5F6、L2及3F3；5F6、L2及3F4；5F6、L2及3F5；5F7、L2及3F1；5F7、L2及3F2；5F7、L2及3F3；5F7、L2及3F4；5F7、L2及3F5；5F1、L3及3F1；5F1、L3及3F2；5F1、L3及3F3；5F1、L3及3F4；5F1、L3及3F5；5F2、L3及3F1；5F2、L3及3F2；5F2、L3及3F3；5F2、L3及3F4；5F2、L3及3F5；5F3、L3及3F1；5F3、L3及3F2；5F3、L3及3F3；5F3、L3及3F4；5F3、L3及3F5；5F4、L3及3F1；5F4、L3及3F2；5F4、L3及3F3；5F4、L3及3F4；5F4、L3及3F5；5F5、L3及3F1；5F5、L3及3F2；5F5、L3及3F3；5F5、L3及3F4；5F5、L3及3F5；5F6、L3及3F1；5F6、L3及3F2；5F6、L3及3F3；5F6、L3及3F4；5F6、L3及3F5；5F7、L3及3F1；5F7、L3及3F2；5F7、L3及3F3；5F7、L3及3F4；5F7、L3及3F5；5F1、L4及3F1；5F1、L4及3F2；5F1、L4及3F3；5F1、L4及3F4；5F1、L4及3F5；5F2、L4及3F1；5F2、L4及3F2；5F2、L4及3F3；5F2、L4及3F4；5F2、L4及3F5；5F3、L4及3F1；5F3、L4及3F2；5F3、L4及3F3；5F3、L4及3F4；5F3、L4及3F5；5F4、L4及3F1；5F4、L4及3F2；5F4、L4及3F3；5F4、L4及3F4；5F4、L4及3F5；5F5、L4及3F1；5F5、L4及3F2；5F5、L4及3F3；5F5、L4及3F4；5F5、L4及3F5；5F6、L4及3F1；5F6、L4及3F2；5F6、L4及3F3；5F6、L4及3F4；5F6、L4及3F5；5F7、L4及3F1；5F7、L4及3F2；5F7、L4及3F3；5F7、L4及3F4；5F7、L4及3F5；5F1、L5及3F1；5F1、L5及3F2；5F1、L5及3F3；5F1、L5及3F4；5F1、L5及3F5；5F2、L5及3F1；5F2、L5及3F2；5F2、L5及3F3；5F2、L5及3F4；5F2、L5及3F5；5F3、L5及3F1；5F3、L5及3F2；5F3、L5及3F3；5F3、L5及3F4；5F3、L5及3F5；5F4、L5及3F1；5F4、L5及3F2；5F4、L5及3F3；5F4、L5及3F4；5F4、L5及3F5；5F5、L5及3F1；5F5、L5及3F2；5F5、L5及3F3；5F5、L5及3F4；5F5、L5及3F5；5F6、L5及3F1；5F6、L5及3F2；5F6、L5及3F3；5F6、L5及3F4；5F6、L5及3F5；5F7、L5及3F1；5F7、L5及3F2；5F7、L5及3F3；5F7、L5及3F4；5F7、L5及3F5；5F1、L6及3F1；5F1、L6及3F2；5F1、L6及3F3；5F1、L6及3F4；5F1、L6及3F5；5F2、L6及3F1；5F2、L6及3F2；5F2、L6及3F3；5F2、L6及3F4；5F2、L6及3F5；5F3、L6及3F1；5F3、L6及3F2；5F3、L6及3F3；5F3、L6及3F4；5F3、L6及3F5；5F4、L6及3F1；5F4、L6及3F2；5F4、L6及3F3；5F4、L6及3F4；5F4、L6及3F5；5F5、L6及3F1；5F5、L6及3F2；5F5、L6及3F3；5F5、L6及3F4；5F5、L6及3F5；5F6、L6及3F1；5F6、L6及3F2；5F6、L6及3F3；5F6、L6及3F4；5F6、L6及3F5；5F7、L6及3F1；5F7、L6及3F2；5F7、L6及3F3；5F7、L6及3F4；5F7、L6及3F5；5F1、L7及3F1；5F1、L7及3F2；5F1、L7及3F3；5F1、L7及3F4；5F1、L7及3F5；5F2、L7及3F1；5F2、L7及3F2；5F2、L7及3F3；5F2、L7及3F4；5F2、L7及3F5；5F3、L7及3F1；5F3、L7及3F2；5F3、L7及3F3；5F3、L7及3F4；5F3、L7及3F5；5F4、L7及3F1；5F4、L7及3F2；5F4、L7及3F3；5F4、L7及3F4；5F4、L7及3F5；5F5、L7及3F1；5F5、L7及3F2；5F5、L7及3F3；5F5、L7及3F4；5F5、L7及3F5；5F6、L7及3F1；5F6、L7及3F2；5F6、L7及3F3；5F6、L7及3F4；5F6、L7及3F5；5F7、L7及3F1；5F7、L7及3F2；5F7、L7及3F3；5F7、L7及3F4；5F7、L7及3F5；5F1、L8及3F1；5F1、L8及3F2；5F1、L8及3F3；5F1、L8及3F4；5F1、L8及3F5；5F2、L8及3F1；5F2、L8及3F2；5F2、L8及3F3；5F2、L8及3F4；5F2、L8及3F5；5F3、L8及3F1；5F3、L8及3F2；5F3、L8及3F3；5F3、L8及3F4；5F3、L8及3F5；5F4、L8及3F1；5F4、L8及3F2；5F4、L8及3F3；5F4、L8及3F4；5F4、L8及3F5；5F5、L8及3F1；5F5、L8及3F2；5F5、L8及3F3；5F5、L8及3F4；5F5、L8及3F5；5F6、L8及3F1；5F6、L8及3F2；5F6、L8及3F3；5F6、L8及3F4；5F6、L8及3F5；5F7、L8及3F1；5F7、L8及3F2；5F7、L8及3F3；5F7、L8及3F4；及5F7、L8及3F5。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個5F2 5'側接區、至少一個L1環模體區及至少一個3F2 3'側接區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個5F1 5'側接區、至少一個L4環模體區及至少一個3F1 3'側接區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個5F7 5'側接區、至少一個L8環模體區及至少一個3F5 3'側接區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個5F3 5'側接區、至少一個L4環模體區及至少一個3F1 3'側接區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個5F3 5'側接區、至少一個L5環模體區及至少一個3F1 3'側接區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個5F4 5'側接區、至少一個L4環模體區及至少一個3F4 3'側接區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個5F3 5'側接區、至少一個L7環模體區及至少一個3F1 3'側接區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個5F5 5'側接區、至少一個L4環模體區及至少一個3F4 3'側接區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個5F6 5'側接區、至少一個L4環模體區及至少一個3F1 3'側接區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個5F3 5'側接區、至少一個L6環模體區及至少一個3F1 3'側接區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個5F7 5'側接區、至少一個L4環模體區及至少一個3F5 3'側接區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個5F2 5'側接區、至少一個L2環模體區及至少一個3F2 3'側接區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個5F2 5'側接區、至少一個L1環模體區及至少一個3F3 3'側接區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個5F3 5'側接區、至少一個L5環模體區及至少一個3F4 3'側接區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個5F1 5'側接區、至少一個L1環模體區及至少一個3F1 3'側接區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個5F1 5'側接區、至少一個L2環模體區及至少一個3F1 3'側接區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個5F1 5'側接區、至少一個L1環模體區及至少一個3F2 3'側接區。
在一些實施例中，分子骨架可包含至少一個5F2 5'側接區、至少一個L3環模體區及至少一個3F3 3'側接區。
在一些實施例中，分子骨架可為天然pri-miRNA骨架。作為一非限制性實例，分子骨架可為衍生自人類miR155骨架之骨架。
在一些實施例中，分子骨架可包含一或多個此項技術中已知之連接子。連接子可使各區域分隔開或使一個分子骨架與另一分子骨架分隔開。作為一非限制性實例，分子骨架可為多順反子的。包含分子骨架及 siRNA 分子之調節聚核苷酸
在一些實施例中，調節聚核苷酸可包含5'及3'側接區、環模體區及編碼有義序列及反義序列之核酸序列，如表10及表11中所描述。在表10及表11中，描述隨從股及引導股之DNA序列識別符以及5'及3'側接區及環區域(亦稱為連接區域)。在表10及表11中，序列名稱之「miR」組成部分不必對應於miRNA基因之序列編號(例如，VOYHTmiR-102為序列之名稱，且不必意謂miR-102為序列之一部分)。 表10. 調節聚核苷酸序列區(5'至3')
調節聚核苷酸構築體名稱 5 ' 側接至3 ' 側接 SEQ ID NO 5 ' 側接 SEQ ID NO 隨從SEQ ID NO 環SEQ ID NO 引導SEQ ID NO 3 ' 側接 SEQ ID NO
VOYHTmiR-102.214 1183 1161 1296 1168 1337 1178
VOYHTmiR-104.214 1184 1161 1303 1168 1337 1178
VOYHTmiR-109.214 1185 1161 1310 1169 1337 1178
VOYHTmiR-114.214 1186 1161 1317 1168 1337 1179
VOYHTmiR-116.214 1187 1161 1310 1168 1337 1179
VOYHTmiR-127.214 1188 1162 1310 1170 1334 1180
VOYHTmiR-102.218 1189 1161 1297 1168 1338 1178
VOYHTmiR-104.218 1190 1161 1304 1168 1338 1178
VOYHTmiR-109.218 1191 1161 1311 1169 1338 1178
VOYHTmiR-114.218 1192 1161 1318 1168 1338 1179
VOYHTmiR-116.218 1193 1161 1311 1168 1338 1179
VOYHTmiR-127.218 1194 1162 1311 1170 1338 1180
VOYHTmiR-102.219.o 1195 1161 1280 1168 1333 1178
VOYHTmiR-104.219.o 1196 1161 1283 1168 1333 1178
VOYHTmiR-109.219.o 1197 1161 1280 1169 1333 1178
VOYHTmiR-114.219 1198 1161 1286 1168 1333 1179
VOYHTmiR-116.219.o 1199 1161 1289 1168 1333 1179
VOYHTmiR-127.219.o 1200 1162 1280 1170 1333 1180
VOYHTmiR-102.219.n 1201 1161 1292 1168 1333 1178
VOYHTmiR-104.219.n 1202 1161 1293 1168 1333 1178
VOYHTmiR-109.219.n 1203 1161 1292 1169 1333 1178
VOYHTmiR-116.219.n 1204 1161 1294 1168 1333 1179
VOYHTmiR-127.219.n 1205 1162 1292 1170 1333 1180
VOYHTmiR-102.257 1206 1161 1298 1168 1339 1178
VOYHTmiR-104.257 1207 1161 1305 1168 1339 1178
VOYHTmiR-109.257 1208 1161 1312 1169 1339 1178
VOYHTmiR-114.257 1209 1161 1319 1168 1339 1179
VOYHTmiR-116.257 1210 1161 1312 1168 1339 1179
VOYHTmiR-127.257 1211 1162 1312 1170 1339 1180
VOYHTmiR-102.894 1212 1161 1281 1168 1334 1178
VOYHTmiR-104.894 1213 1161 1284 1168 1334 1178
VOYHTmiR-109.894 1214 1161 1281 1169 1334 1178
VOYHTmiR-114.894 1215 1161 1287 1168 1334 1179
VOYHTmiR-116.894 1216 1161 1290 1168 1334 1179
VOYHTmiR-127.894 1217 1162 1281 1170 1334 1180
VOYHTmiR-102.907 1218 1161 1301 1168 1342 1178
VOYHTmiR-104.907 1219 1161 1308 1168 1342 1178
VOYHTmiR-109.907 1220 1161 1315 1169 1342 1178
VOYHTmiR-114.907 1221 1161 1322 1168 1342 1179
VOYHTmiR-116.907 1222 1161 1315 1168 1342 1179
VOYHTmiR-127.907 1223 1162 1315 1170 1342 1180
VOYHTmiR-102.372 1224 1161 1299 1168 1340 1178
VOYHTmiR-104.372 1225 1161 1306 1168 1340 1178
VOYHTmiR-109.372 1226 1161 1313 1169 1340 1178
VOYHTmiR-114.372 1227 1161 1320 1168 1340 1179
VOYHTmiR-116.372 1228 1161 1313 1168 1340 1179
VOYHTmiR-127.372 1229 1162 1313 1170 1340 1180
VOYHTmiR-102.425 1230 1161 1300 1168 1341 1178
VOYHTmiR-104.425 1231 1161 1307 1168 1341 1178
VOYHTmiR-109.425 1232 1161 1314 1169 1341 1178
VOYHTmiR-114.425 1233 1161 1321 1168 1341 1179
VOYHTmiR-116.425 1234 1161 1314 1168 1341 1179
VOYHTmiR-127.425 1235 1162 1314 1170 1341 1180
VOYHTmiR-102.032 1236 1161 1324 1168 1344 1178
VOYHTmiR-104.032 1237 1161 1326 1168 1344 1178
VOYHTmiR-109.032 1238 1161 1328 1169 1344 1178
VOYHTmiR-114.032 1239 1161 1330 1168 1344 1179
VOYHTmiR-116.032 1240 1161 1328 1168 1344 1179
VOYHTmiR-127.032 1241 1162 1328 1170 1344 1180
VOYHTmiR-102.020 1242 1161 1323 1168 1343 1178
VOYHTmiR-104.020 1243 1161 1325 1168 1343 1178
VOYHTmiR-109.020 1244 1161 1327 1169 1343 1178
VOYHTmiR-114.020 1245 1161 1329 1168 1343 1179
VOYHTmiR-116.020 1246 1161 1327 1168 1343 1179
VOYHTmiR-127.020 1247 1162 1327 1170 1343 1180
VOYHTmiR-102.016 1248 1161 1295 1168 1336 1178
VOYHTmiR-104.016 1249 1161 1302 1168 1336 1178
VOYHTmiR-109.016 1250 1161 1309 1169 1336 1178
VOYHTmiR-114.016 1251 1161 1316 1168 1336 1179
VOYHTmiR-116.016 1252 1161 1309 1168 1336 1179
VOYHTmiR-127.016 1253 1162 1309 1170 1336 1180
VOYHTmiR-102.579 1254 1161 1282 1168 1335 1178
VOYHTmiR-104.579 1255 1161 1285 1168 1335 1178
VOYHTmiR-109.579 1256 1161 1282 1169 1335 1178
VOYHTmiR-114.579 1257 1161 1288 1168 1335 1179
VOYHTmiR-116.579 1258 1161 1291 1168 1335 1179
VOYHTmiR-127.579 1259 1162 1282 1170 1335 1180
VOYHTmiR-104.579.1 1260 1161 1331 1171 1335 1178
VOYHTmiR-104.579.2 1261 1163 1331 1171 1335 1178
VOYHTmiR-104.579.3 1262 1163 1331 1172 1335 1178
VOYHTmiR-104.579.4 1263 1164 1331 1171 1335 1181
VOYHTmiR-104.579.6 1264 1165 1331 1171 1335 1181
VOYHTmiR-104.579.7 1265 1166 1331 1171 1345 1178
VOYHTmiR-104.579.8 1266 1163 1332 1173 1335 1178
VOYHTmiR-104.579.9 1267 1167 1331 1171 1335 1182
VOYHTmiR-102.020 1268 1161 1323 1168 1343 1178
VOYHTmiR-102.032 1269 1161 1324 1168 1344 1178
VOYHTmiR-104.020 1270 1161 1325 1168 1343 1178
VOYHTmiR-104.032 1271 1161 1326 1168 1344 1178
VOYHTmiR-109.020 1272 1161 1327 1169 1343 1178
VOYHTmiR-109.032 1273 1161 1328 1169 1344 1178
VOYHTmiR-114.020 1274 1161 1329 1168 1343 1179
VOYHTmiR-114.032 1275 1161 1330 1168 1344 1179
VOYHTmiR-116.020 1276 1161 1327 1168 1343 1179
VOYHTmiR-116.032 1277 1161 1328 1168 1344 1179
VOYHTmiR-127.020 1278 1162 1327 1170 1343 1180
VOYHTmiR-127.032 1279 1162 1328 1170 1344 1180
表11. 調節聚核苷酸序列區(5'至3')
名稱 5 ' 側接至3 ' 側接 SEQ ID NO 5 ' 側接 SEQ ID NO 引導 SEQ ID NO 環 SEQ ID NO 隨從SEQ ID NO 3 ' 側接 SEQ ID NO
VOYHTmiR-104.579.5 1346 1163 1350 1174 1348 1178
VOYHTmiR-104.579.10 1347 1167 1351 1175 1349 1182
包含調節聚核苷酸之 AAV 粒子
在一些實施例中，AAV粒子包含具有包含調節聚核苷酸序列之酬載區之病毒基因體。在此類實施例中，編碼超過一種多肽之病毒基因體可複製及封裝於病毒粒子中。經包含調節聚核苷酸之病毒粒子轉導的目標細胞可在單個細胞中表現所編碼之有義序列及/或反義序列。
在一些實施例中，AAV粒子適用於治療、預防、緩和或改善神經疾病及/或病症之藥品的領域。
包含具有包含調節聚核苷酸序列的酬載區之病毒基因體的AAV粒子之ITR至ITR序列之非限制性實例描述於表12中。 表12. 包含調節聚核苷酸之AAV粒子之ITR至ITR序列
ITR 至 ITR 構築體名稱 ITR 至 ITR SEQ ID NO 調節聚核苷酸 SEQ ID NO
VOYHT1 1352 1262
VOYHT2 1353 1262
VOYHT3 1354 1250
VOYHT4 1355 1347
VOYHT5 1356 1262
VOYHT6 1357 1262
VOYHT7 1358 1250
VOYHT8 1359 1347
VOYHT9 1360 1262
VOYHT10 1361 1262
VOYHT11 1362 1250
VOYHT12 1363 1347
VOYHT13 1364 1262
VOYHT14 1365 1249
VOYHT15 1366 1259
VOYHT16 1367 1249
VOYHT17 1368 1262
VOYHT18 1369 1262
VOYHT19 1370 1262
VOYHT20 1371 1262
VOYHT21 1372 1262
VOYHT22 1373 1262
VOYHT23 1374 1262
VOYHT24 1375 1262
VOYHT25 1376 1249
VOYHT26 1377 1262
VOYHT27 1378 1259
VOYHT28 1379 1249
VOYHT35 1388 1255
VOYHT36 1426 1248
VOYHT37 1427 1231
VOYHT38 1428 1219
VOYHT39 1429 1207
VOYHT40 1430 1250
VOYHT41 1431 1251
VOYHT42 1432 1252
VOYHT43 1433 1253
VOYHT44 1434 1194
VOYHT45 1435 1223
VOYHT46 1436 1211
VOYHT47 1437 1262
VOYHT48 1438 1347
在一些實施例中，AAV粒子包含有包含與SEQ ID NO: 1352-1379、1388及1426-1438中之任一者具有一定一致性百分比之序列的病毒基因體。病毒基因體可與SEQ ID NO: 1352-1379、1388及1426-1438中之任一者具有1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%一致性。病毒基因體可與SEQ ID NO: 1352-1379、1388及1426-1438中之任一者具有1-10%、10-20%、30-40%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-99%、50-100%、60-70%、60-80%、60-90%、60-99%、60-100%、70-80%、70-90%、70-99%、70-100%、80-85%、80-90%、80-95%、80-99%、80-100%、90-95%、90-99%或90-100%一致性。作為一非限制性實例，病毒基因體包含與SEQ ID NO: 1352-1379、1388及1426-1438中之任一者具有80%一致性之序列。作為另一非限制性實例，病毒基因體包含與SEQ ID NO: 1352-1379、1388及1426-1438中之任一者具有85%一致性之序列。作為另一非限制性實例，病毒基因體包含與SEQ ID NO: 1352-1379、1388及1426-1438中之任一者具有90%一致性之序列。作為另一非限制性實例，病毒基因體包含與SEQ ID NO: 1352-1379、1388及1426-1438中之任一者具有95%一致性之序列。作為另一非限制性實例，病毒基因體包含與SEQ ID NO: 1352-1379、1388及1426-1438中之任一者具有99%一致性之序列。
在一些實施例中，AAV粒子包含有包含對應於SEQ ID NO: 1352之序列或其具有至少95%一致性之變異體的病毒基因體。AAV粒子可包含AAV1血清型。
在一些實施例中，可將包含調節聚核苷酸序列之AAV粒子引入哺乳動物細胞中，該調節聚核苷酸序列包含編碼至少一種siRNA分子之核酸序列。
在AAV粒子酬載區包含調節聚核苷酸之情況下，調節聚核苷酸可包含有義序列及/或反義序列以減弱目標基因。編碼本文所述之調節聚核苷酸的AAV病毒基因體可適用於人類疾病、病毒、感染獸醫應用及各種活體內及活體外環境的領域。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體可包含至少一個反向末端重複序列(ITR)區。一或多個ITR區可獨立地具有諸如但不限於以下的長度：75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174及175個核苷酸。病毒基因體之ITR區之長度可為75-80、75-85、75-100、80-85、80-90、80-105、85-90、85-95、85-110、90-95、90-100、90-115、95-100、95-105、95-120、100-105、100-110、100-125、105-110、105-115、105-130、110-115、110-120、110-135、115-120、115-125、115-140、120-125、120-130、120-145、125-130、125-135、125-150、130-135、130-140、130-155、135-140、135-145、135-160、140-145、140-150、140-165、145-150、145-155、145-170、150-155、150-160、150-175、155-160、155-165、160-165、160-170、165-170、165-175及170-175個核苷酸。作為一非限制性實例，病毒基因體包含長度為約105個核苷酸之ITR。作為一非限制性實例，病毒基因體包含長度為約141個核苷酸之ITR。作為一非限制性實例，病毒基因體包含長度為約130個核苷酸之ITR。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體可包含兩個反向末端重複序列(ITR)區。ITR區中之每一者可獨立地具有諸如但不限於以下的長度：75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174及175個核苷酸。病毒基因體之ITR區之長度可為75-80、75-85、75-100、80-85、80-90、80-105、85-90、85-95、85-110、90-95、90-100、90-115、95-100、95-105、95-120、100-105、100-110、100-125、105-110、105-115、105-130、110-115、110-120、110-135、115-120、115-125、115-140、120-125、120-130、120-145、125-130、125-135、125-150、130-135、130-140、130-155、135-140、135-145、135-160、140-145、140-150、140-165、145-150、145-155、145-170、150-155、150-160、150-175、155-160、155-165、160-165、160-170、165-170、165-175及170-175個核苷酸。作為一非限制性實例，病毒基因體包含長度為約105個核苷酸及長度為約141個核苷酸之ITR。作為一非限制性實例，病毒基因體包含長度為約105個核苷酸及長度為約130個核苷酸之ITR。作為一非限制性實例，病毒基因體包含長度為約130個核苷酸及長度為約141個核苷酸之ITR。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體可包含至少一個如表13至表20中所描述之序列區。該等區域可位於本文所述之其他序列區中之任一者之前或之後。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含至少一個反向末端重複序列(ITR)序列區。ITR序列區之非限制性實例描述於表13中。 表13. 反向末端重複序列(ITR)序列區
序列區名稱 SEQ ID NO
ITR1 1380
ITR2 1381
ITR3 1382
ITR4 1383
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含兩個ITR序列區。在一些實施例中，ITR序列區為ITR1序列區及ITR3序列區。在一些實施例中，ITR序列區為ITR1序列區及ITR4序列區。在一些實施例中，ITR序列區為ITR2序列區及ITR3序列區。在一些實施例中，ITR序列區為ITR2序列區及ITR4序列區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體可包含至少一個多選殖位點(MCS)序列區。一或多個MCS區可獨立地具有諸如但不限於以下的長度：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149及150個核苷酸。病毒基因體之MCS區之長度可為2-10、5-10、5-15、10-20、10-30、10-40、15-20、15-25、20-30、20-40、20-50、25-30、25-35、30-40、30-50、30-60、35-40、35-45、40-50、40-60、40-70、45-50、45-55、50-60、50-70、50-80、55-60、55-65、60-70、60-80、60-90、65-70、65-75、70-80、70-90、70-100、75-80、75-85、80-90、80-100、80-110、85-90、85-95、90-100、90-110、90-120、95-100、95-105、100-110、100-120、100-130、105-110、105-115、110-120、110-130、110-140、115-120、115-125、120-130、120-140、120-150、125-130、125-135、130-140、130-150、135-140、135-145、140-150及145-150個核苷酸。作為一非限制性實例，病毒基因體包含長度為約5個核苷酸之MCS區。作為一非限制性實例，病毒基因體包含長度為約10個核苷酸之MCS區。作為一非限制性實例，病毒基因體包含長度為約14個核苷酸之MCS區。作為一非限制性實例，病毒基因體包含長度為約18個核苷酸之MCS區。作為一非限制性實例，病毒基因體包含長度為約73個核苷酸之MCS區。作為一非限制性實例，病毒基因體包含長度為約121個核苷酸之MCS區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含至少一個多選殖位點(MCS)序列區。MCS序列區之非限制性實例描述於表14中。 表14. 多選殖位點(MCS)序列區
序列區名稱 SEQ ID NO 或序列
MCS1 1384
MCS2 1385
MCS3 1386
MCS4 1387
MCS5 TCGAG
MCS6 1389
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含一個MCS序列區。在一些實施例中，MCS序列區為MCS1序列區。在一些實施例中，MCS序列區為MCS2序列區。在一些實施例中，MCS序列區為MCS3序列區。在一些實施例中，MCS序列區為MCS4序列區。在一些實施例中，MCS序列區為MCS5序列區。在一些實施例中，MCS序列區為MCS6序列區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含兩個MCS序列區。在一些實施例中，兩個MCS序列區為MCS1序列區及MCS2序列區。在一些實施例中，兩個MCS序列區為MCS1序列區及MCS3序列區。在一些實施例中，兩個MCS序列區為MCS1序列區及MCS4序列區。在一些實施例中，兩個MCS序列區為MCS1序列區及MCS5序列區。在一些實施例中，兩個MCS序列區為MCS1序列區及MCS6序列區。在一些實施例中，兩個MCS序列區為MCS2序列區及MCS3序列區。在一些實施例中，兩個MCS序列區為MCS2序列區及MCS4序列區。在一些實施例中，兩個MCS序列區為MCS2序列區及MCS5序列區。在一些實施例中，兩個MCS序列區為MCS2序列區及MCS6序列區。在一些實施例中，兩個MCS序列區為MCS3序列區及MCS4序列區。在一些實施例中，兩個MCS序列區為MCS3序列區及MCS5序列區。在一些實施例中，兩個MCS序列區為MCS3序列區及MCS6序列區。在一些實施例中，兩個MCS序列區為MCS4序列區及MCS5序列區。在一些實施例中，兩個MCS序列區為MCS4序列區及MCS6序列區。在一些實施例中，兩個MCS序列區為MCS5序列區及MCS6序列區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含兩個或更多個MCS序列區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含三個MCS序列區。在一些實施例中，三個MCS序列區為MCS1序列區、MCS2序列區及MCS3序列區。在一些實施例中，三個MCS序列區為MCS1序列區、MCS2序列區及MCS4序列區。在一些實施例中，三個MCS序列區為MCS1序列區、MCS2序列區及MCS5序列區。在一些實施例中，三個MCS序列區為MCS1序列區、MCS2序列區及MCS6序列區。在一些實施例中，三個MCS序列區為MCS1序列區、MCS3序列區及MCS4序列區。在一些實施例中，三個MCS序列區為MCS1序列區、MCS3序列區及MCS5序列區。在一些實施例中，三個MCS序列區為MCS1序列區、MCS3序列區及MCS6序列區。在一些實施例中，三個MCS序列區為MCS1序列區、MCS4序列區及MCS5序列區。在一些實施例中，三個MCS序列區為MCS1序列區、MCS4序列區及MCS6序列區。在一些實施例中，三個MCS序列區為MCS1序列區、MCS5序列區及MCS6序列區。在一些實施例中，三個MCS序列區為MCS2序列區、MCS3序列區及MCS4序列區。在一些實施例中，三個MCS序列區為MCS2序列區、MCS3序列區及MCS5序列區。在一些實施例中，三個MCS序列區為MCS2序列區、MCS3序列區及MCS6序列區。在一些實施例中，三個MCS序列區為MCS2序列區、MCS4序列區及MCS5序列區。在一些實施例中，三個MCS序列區為MCS2序列區、MCS4序列區及MCS6序列區。在一些實施例中，三個MCS序列區為MCS2序列區、MCS5序列區及MCS6序列區。在一些實施例中，三個MCS序列區為MCS3序列區、MCS4序列區及MCS5序列區。在一些實施例中，三個MCS序列區為MCS3序列區、MCS4序列區及MCS6序列區。在一些實施例中，三個MCS序列區為MCS3序列區、MCS5序列區及MCS6序列區。在一些實施例中，三個MCS序列區為MCS4序列區、MCS5序列區及MCS6序列區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體可包含至少一個填充序列區。一或多個填充區可獨立地具有諸如但不限於以下的長度：50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、698、699、700、701、702、703、704、705、706、707、708、709、710、711、712、713、714、715、716、717、718、719、720、721、722、723、724、725、726、727、728、729、730、731、732、733、734、735、736、737、738、739、740、741、742、743、744、745、746、747、748、749、750、751、752、753、754、755、756、757、758、759、760、761、762、763、764、765、766、767、768、769、770、771、772、773、774、775、776、777、778、779、780、781、782、783、784、785、786、787、788、789、790、791、792、793、794、795、796、797、798、799、800、801、802、803、804、805、806、807、808、809、810、811、812、813、814、815、816、817、818、819、820、821、822、823、824、825、826、827、828、829、830、831、832、833、834、835、836、837、838、839、840、841、842、843、844、845、846、847、848、849、850、851、852、853、854、855、856、857、858、859、860、861、862、863、864、865、866、867、868、869、870、871、872、873、874、875、876、877、878、879、880、881、882、883、884、885、886、887、888、889、890、891、892、893、894、895、896、897、898、899、900、901、902、903、904、905、906、907、908、909、910、911、912、913、914、915、916、917、918、919、920、921、922、923、924、925、926、927、928、929、930、931、932、933、934、935、936、937、938、939、940、941、942、943、944、945、946、947、948、949、950、951、952、953、954、955、956、957、958、959、960、961、962、963、964、965、966、967、968、969、970、971、972、973、974、975、976、977、978、979、980、981、982、983、984、985、986、987、988、989、990、991、992、993、994、995、996、997、998、999、1000、1001、1002、1003、1004、1005、1006、1007、1008、1009、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017、1018、1019、1020、1021、1022、1023、1024、1025、1026、1027、1028、1029、1030、1031、1032、1033、1034、1035、1036、1037、1038、1039、1040、1041、1042、1043、1044、1045、1046、1047、1048、1049、1050、1051、1052、1053、1054、1055、1056、1057、1058、1059、1060、1061、1062、1063、1064、1065、1066、1067、1068、1069、1070、1071、1072、1073、1074、1075、1076、1077、1078、1079、1080、1081、1082、1083、1084、1085、1086、1087、1088、1089、1090、1091、1092、1093、1094、1095、1096、1097、1098、1099、1100、1101、1102、1103、1104、1105、1106、1107、1108、1109、1110、1111、1112、1113、1114、1115、1116、1117、1118、1119、1120、1121、1122、1123、1124、1125、1126、1127、1128、1129、1130、1131、1132、1133、1134、1135、1136、1137、1138、1139、1140、1141、1142、1143、1144、1145、1146、1147、1148、1149、1150、1151、1152、1153、1154、1155、1156、1157、1158、1159、1160、1161、1162、1163、1164、1165、1166、1167、1168、1169、1170、1171、1172、1173、1174、1175、1176、1177、1178、1179、1180、1181、1182、1183、1184、1185、1186、1187、1188、1189、1190、1191、1192、1193、1194、1195、1196、1197、1198、1199、1200、1201、1202、1203、1204、1205、1206、1207、1208、1209、1210、1211、1212、1213、1214、1215、1216、1217、1218、1219、1220、1221、1222、1223、1224、1225、1226、1227、1228、1229、1230、1231、1232、1233、1234、1235、1236、1237、1238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、2239、2240、2241、2242、2243、2244、2245、2246、2247、2248、2249、2250、2251、2252、2253、2254、2255、2256、2257、2258、2259、2260、2261、2262、2263、2264、2265、2266、2267、2268、2269、2270、2271、2272、2273、2274、2275、2276、2277、2278、2279、2280、2281、2282、2283、2284、2285、2286、2287、2288、2289、2290、2291、2292、2293、2294、2295、2296、2297、2298、2299、2300、2301、2302、2303、2304、2305、2306、2307、2308、2309、2310、2311、2312、2313、2314、2315、2316、2317、2318、2319、2320、2321、2322、2323、2324、2325、2326、2327、2328、2329、2330、2331、2332、2333、2334、2335、2336、2337、2338、2339、2340、2341、2342、2343、2344、2345、2346、2347、2348、2349、2350、2351、2352、2353、2354、2355、2356、2357、2358、2359、2360、2361、2362、2363、2364、2365、2366、2367、2368、2369、2370、2371、2372、2373、2374、2375、2376、2377、2378、2379、2380、2381、2382、2383、2384、2385、2386、2387、2388、2389、2390、2391、2392、2393、2394、2395、2396、2397、2398、2399、2400、2401、2402、2403、2404、2405、2406、2407、2408、2409、2410、2411、2412、2413、2414、2415、2416、2417、2418、2419、2420、2421、2422、2423、2424、2425、2426、2427、2428、2429、2430、2431、2432、2433、2434、2435、2436、2437、2438、2439、2440、2441、2442、2443、2444、2445、2446、2447、2448、2449、2450、2451、2452、2453、2454、2455、2456、2457、2458、2459、2460、2461、2462、2463、2464、2465、2466、2467、2468、2469、2470、2471、2472、2473、2474、2475、2476、2477、2478、2479、2480、2481、2482、2483、2484、2485、2486、2487、2488、2489、2490、2491、2492、2493、2494、2495、2496、2497、2498、2499、2500、2501、2502、2503、2504、2505、2506、2507、2508、2509、2510、2511、2512、2513、2514、2515、2516、2517、2518、2519、2520、2521、2522、2523、2524、2525、2526、2527、2528、2529、2530、2531、2532、2533、2534、2535、2536、2537、2538、2539、2540、2541、2542、2543、2544、2545、2546、2547、2548、2549、2550、2551、2552、2553、2554、2555、2556、2557、2558、2559、2560、2561、2562、2563、2564、2565、2566、2567、2568、2569、2570、2571、2572、2573、2574、2575、2576、2577、2578、2579、2580、2581、2582、2583、2584、2585、2586、2587、2588、2589、2590、2591、2592、2593、2594、2595、2596、2597、2598、2599、2600、2601、2602、2603、2604、2605、2606、2607、2608、2609、2610、2611、2612、2613、2614、2615、2616、2617、2618、2619、2620、2621、2622、2623、2624、2625、2626、2627、2628、2629、2630、2631、2632、2633、2634、2635、2636、2637、2638、2639、2640、2641、2642、2643、2644、2645、2646、2647、2648、2649、2650、2651、2652、2653、2654、2655、2656、2657、2658、2659、2660、2661、2662、2663、2664、2665、2666、2667、2668、2669、2670、2671、2672、2673、2674、2675、2676、2677、2678、2679、2680、2681、2682、2683、2684、2685、2686、2687、2688、2689、2690、2691、2692、2693、2694、2695、2696、2697、2698、2699、2700、2701、2702、2703、2704、2705、2706、2707、2708、2709、2710、2711、2712、2713、2714、2715、2716、2717、2718、2719、2720、2721、2722、2723、2724、2725、2726、2727、2728、2729、2730、2731、2732、2733、2734、2735、2736、2737、2738、2739、2740、2741、2742、2743、2744、2745、2746、2747、2748、2749、2750、2751、2752、2753、2754、2755、2756、2757、2758、2759、2760、2761、2762、2763、2764、2765、2766、2767、2768、2769、2770、2771、2772、2773、2774、2775、2776、2777、2778、2779、2780、2781、2782、2783、2784、2785、2786、2787、2788、2789、2790、2791、2792、2793、2794、2795、2796、2797、2798、2799、2800、2801、2802、2803、2804、2805、2806、2807、2808、2809、2810、2811、2812、2813、2814、2815、2816、2817、2818、2819、2820、2821、2822、2823、2824、2825、2826、2827、2828、2829、2830、2831、2832、2833、2834、2835、2836、2837、2838、2839、2840、2841、2842、2843、2844、2845、2846、2847、2848、2849、2850、2851、2852、2853、2854、2855、2856、2857、2858、2859、2860、2861、2862、2863、2864、2865、2866、2867、2868、2869、2870、2871、2872、2873、2874、2875、2876、2877、2878、2879、2880、2881、2882、2883、2884、2885、2886、2887、2888、2889、2890、2891、2892、2893、2894、2895、2896、2897、2898、2899、2900、2901、2902、2903、2904、2905、2906、2907、2908、2909、2910、2911、2912、2913、2914、2915、2916、2917、2918、2919、2920、2921、2922、2923、2924、2925、2926、2927、2928、2929、2930、2931、2932、2933、2934、2935、2936、2937、2938、2939、2940、2941、2942、2943、2944、2945、2946、2947、2948、2949、2950、2951、2952、2953、2954、2955、2956、2957、2958、2959、2960、2961、2962、2963、2964、2965、2966、2967、2968、2969、2970、2971、2972、2973、2974、2975、2976、2977、2978、2979、2980、2981、2982、2983、2984、2985、2986、2987、2988、2989、2990、2991、2992、2993、2994、2995、2996、2997、2998、2999、3000、3001、3002、3003、3004、3005、3006、3007、3008、3009、3010、3011、3012、3013、3014、3015、3016、3017、3018、3019、3020、3021、3022、3023、3024、3025、3026、3027、3028、3029、3030、3031、3032、3033、3034、3035、3036、3037、3038、3039、3040、3041、3042、3043、3044、3045、3046、3047、3048、3049、3050、3051、3052、3053、3054、3055、3056、3057、3058、3059、3060、3061、3062、3063、3064、3065、3066、3067、3068、3069、3070、3071、3072、3073、3074、3075、3076、3077、3078、3079、3080、3081、3082、3083、3084、3085、3086、3087、3088、3089、3090、3091、3092、3093、3094、3095、3096、3097、3098、3099、3100、3101、3102、3103、3104、3105、3106、3107、3108、3109、3110、3111、3112、3113、3114、3115、3116、3117、3118、3119、3120、3121、3122、3123、3124、3125、3126、3127、3128、3129、3130、3131、3132、3133、3134、3135、3136、3137、3138、3139、3140、3141、3142、3143、3144、3145、3146、3147、3148、3149、3150、3151、3152、3153、3154、3155、3156、3157、3158、3159、3160、3161、3162、3163、3164、3165、3166、3167、3168、3169、3170、3171、3172、3173、3174、3175、3176、3177、3178、3179、3180、3181、3182、3183、3184、3185、3186、3187、3188、3189、3190、3191、3192、3193、3194、3195、3196、3197、3198、3199、3200、3201、3202、3203、3204、3205、3206、3207、3208、3209、3210、3211、3212、3213、3214、3215、3216、3217、3218、3219、3220、3221、3222、3223、3224、3225、3226、3227、3228、3229、3230、3231、3232、3233、3234、3235、3236、3237、3238、3239、3240、3241、3242、3243、3244、3245、3246、3247、3248、3249及3250個核苷酸。病毒基因體之任何填充區之長度可為50-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、700-750、750-800、800-850、850-900、900-950、950-1000、1000-1050、1050-1100、1100-1150、1150-1200、1200-1250、1250-1300、1300-1350、1350-1400、1400-1450、1450-1500、1500-1550、1550-1600、1600-1650、1650-1700、1700-1750、1750-1800、1800-1850、1850-1900、1900-1950、1950-2000、2000-2050、2050-2100、2100-2150、2150-2200、2200-2250、2250-2300、2300-2350、2350-2400、2400-2450、2450-2500、2500-2550、2550-2600、2600-2650、2650-2700、2700-2750、2750-2800、2800-2850、2850-2900、2900-2950、2950-3000、3000-3050、3050-3100、3100-3150、3150-3200及3200-3250個核苷酸。作為一非限制性實例，病毒基因體包含長度為約55個核苷酸之填充區。作為一非限制性實例，病毒基因體包含長度為約56個核苷酸之填充區。作為一非限制性實例，病毒基因體包含長度為約97個核苷酸之填充區。作為一非限制性實例，病毒基因體包含長度為約103個核苷酸之填充區。作為一非限制性實例，病毒基因體包含長度為約105個核苷酸之填充區。作為一非限制性實例，病毒基因體包含長度為約357個核苷酸之填充區。作為一非限制性實例，病毒基因體包含長度為約363個核苷酸之填充區。作為一非限制性實例，病毒基因體包含長度為約712個核苷酸之填充區。作為一非限制性實例，病毒基因體包含長度為約714個核苷酸之填充區。作為一非限制性實例，病毒基因體包含長度為約1203個核苷酸之填充區。作為一非限制性實例，病毒基因體包含長度為約1209個核苷酸之填充區。作為一非限制性實例，病毒基因體包含長度為約1512個核苷酸之填充區。作為一非限制性實例，病毒基因體包含長度為約1519個核苷酸之填充區。作為一非限制性實例，病毒基因體包含長度為約2395個核苷酸之填充區。作為一非限制性實例，病毒基因體包含長度為約2403個核苷酸之填充區。作為一非限制性實例，病毒基因體包含長度為約2405個核苷酸之填充區。作為一非限制性實例，病毒基因體包含長度為約3013個核苷酸之填充區。作為一非限制性實例，病毒基因體包含長度為約3021個核苷酸之填充區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體可包含至少一個強化子序列區。一或多個強化子序列區可獨立地具有諸如但不限於以下的長度：300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399及400個核苷酸。病毒基因體之強化子區之長度可為300-310、300-325、305-315、310-320、315-325、320-330、325-335、325-350、330-340、335-345、340-350、345-355、350-360、350-375、355-365、360-370、365-375、370-380、375-385、375-400、380-390、385-395及390-400個核苷酸。作為一非限制性實例，病毒基因體包含長度為約303個核苷酸之強化子區。作為一非限制性實例，病毒基因體包含長度為約382個核苷酸之強化子區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含至少一個強化子序列區。強化子序列區之非限制性實例描述於表15中。 表15. 強化子序列區
序列區名稱 SEQ ID NO
強化子1 1408
強化子2 1409
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含一個強化子序列區。在一些實施例中，強化子序列區為強化子1序列區。在一些實施例中，強化子序列區為強化子2序列區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含兩個強化子序列區。在一些實施例中，強化子序列區係強化子1序列區及強化子2序列區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體可包含至少一個啟動子序列區。一或多個啟動子序列區可獨立地具有諸如但不限於以下之長度：4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599及600個核苷酸。病毒基因體之啟動子區之長度可為4-10、10-20、10-50、20-30、30-40、40-50、50-60、50-100、60-70、70-80、80-90、90-100、100-110、100-150、110-120、120-130、130-140、140-150、150-160、150-200、160-170、170-180、180-190、190-200、200-210、200-250、210-220、220-230、230-240、240-250、250-260、250-300、260-270、270-280、280-290、290-300、300-310、300-350、310-320、320-330、330-340、340-350、350-360、350-400、360-370、370-380、380-390、390-400、400-410、400-450、410-420、420-430、430-440、440-450、450-460、450-500、460-470、470-480、480-490、490-500、500-510、500-550、510-520、520-530、530-540、540-550、550-560、550-600、560-570、570-580、580-590及590-600個核苷酸。作為一非限制性實例，病毒基因體包含長度為約4個核苷酸之啟動子區。作為一非限制性實例，病毒基因體包含長度為約17個核苷酸之啟動子區。作為一非限制性實例，病毒基因體包含長度為約204個核苷酸之啟動子區。作為一非限制性實例，病毒基因體包含長度為約219個核苷酸之啟動子區。作為一非限制性實例，病毒基因體包含長度為約260個核苷酸之啟動子區。作為一非限制性實例，病毒基因體包含長度為約303個核苷酸之啟動子區。作為一非限制性實例，病毒基因體包含長度為約382個核苷酸之啟動子區。作為一非限制性實例，病毒基因體包含長度為約588個核苷酸之啟動子區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含至少一個啟動子序列區。啟動子序列區之非限制性實例描述於表16中。 表16. 啟動子序列區
序列區名稱 SEQ ID NO 或序列
啟動子1 1410
啟動子2 1411
啟動子3 GTTG
啟動子4 1412
啟動子5 1413
啟動子6 1414
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含一個啟動子序列區。在一些實施例中，啟動子序列區為啟動子1。在一些實施例中，啟動子序列區為啟動子2。在一些實施例中，啟動子序列區為啟動子3。在一些實施例中，啟動子序列區為啟動子4。在一些實施例中，啟動子序列區為啟動子5。在一些實施例中，啟動子序列區為啟動子6。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含兩個啟動子序列區。在一些實施例中，啟動子序列區為啟動子1序列區及啟動子2序列區。在一些實施例中，啟動子序列區為啟動子1序列區及啟動子3序列區。在一些實施例中，啟動子序列區為啟動子1序列區及啟動子4序列區。在一些實施例中，啟動子序列區為啟動子1序列區及啟動子5序列區。在一些實施例中，啟動子序列區為啟動子1序列區及啟動子6序列區。在一些實施例中，啟動子序列區為啟動子2序列區及啟動子3序列區。在一些實施例中，啟動子序列區為啟動子2序列區及啟動子4序列區。在一些實施例中，啟動子序列區為啟動子2序列區及啟動子5序列區。在一些實施例中，啟動子序列區為啟動子2序列區及啟動子6序列區。在一些實施例中，啟動子序列區為啟動子3序列區及啟動子4序列區。在一些實施例中，啟動子序列區為啟動子3序列區及啟動子5序列區。在一些實施例中，啟動子序列區為啟動子3序列區及啟動子6序列區。在一些實施例中，啟動子序列區為啟動子4序列區及啟動子5序列區。在一些實施例中，啟動子序列區為啟動子4序列區及啟動子6序列區。在一些實施例中，啟動子序列區為啟動子5序列區及啟動子6序列區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體可包含至少一個外顯子序列區。一或多個外顯子區可獨立地具有諸如但不限於以下之長度：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149及150個核苷酸。病毒基因體之外顯子區之長度可為2-10、5-10、5-15、10-20、10-30、10-40、15-20、15-25、20-30、20-40、20-50、25-30、25-35、30-40、30-50、30-60、35-40、35-45、40-50、40-60、40-70、45-50、45-55、50-60、50-70、50-80、55-60、55-65、60-70、60-80、60-90、65-70、65-75、70-80、70-90、70-100、75-80、75-85、80-90、80-100、80-110、85-90、85-95、90-100、90-110、90-120、95-100、95-105、100-110、100-120、100-130、105-110、105-115、110-120、110-130、110-140、115-120、115-125、120-130、120-140、120-150、125-130、125-135、130-140、130-150、135-140、135-145、140-150及145-150個核苷酸。作為一非限制性實例，病毒基因體包含長度為約53個核苷酸之外顯子區。作為一非限制性實例，病毒基因體包含長度為約134個核苷酸之外顯子區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含至少一個外顯子序列區。外顯子序列區之非限制性實例描述於表17中。 表17. 外顯子序列區
序列區名稱 SEQ ID NO
外顯子1 1415
外顯子2 1416
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含一個外顯子序列區。在一些實施例中，外顯子序列區為外顯子1序列區。在一些實施例中，外顯子序列區為外顯子2序列區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含兩個外顯子序列區。在一些實施例中，外顯子序列區為外顯子1序列區及外顯子2序列區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體可包含至少一個內含子序列區。一或多個內含子區可獨立地具有諸如但不限於以下之長度：25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349及350個核苷酸。病毒基因體之內含子區之長度可為25-35、25-50、35-45、45-55、50-75、55-65、65-75、75-85、75-100、85-95、95-105、100-125、105-115、115-125、125-135、125-150、135-145、145-155、150-175、155-165、165-175、175-185、175-200、185-195、195-205、200-225、205-215、215-225、225-235、225-250、235-245、245-255、250-275、255-265、265-275、275-285、275-300、285-295、295-305、300-325、305-315、315-325、325-335、325-350及335-345個核苷酸。作為一非限制性實例，病毒基因體包含長度為約32個核苷酸之內含子區。作為一非限制性實例，病毒基因體包含長度為約172個核苷酸之內含子區。作為一非限制性實例，病毒基因體包含長度為約201個核苷酸之內含子區。作為一非限制性實例，病毒基因體包含長度為約347個核苷酸之內含子區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含至少一個內含子序列區。內含子序列區之非限制性實例描述於表18中。 表18. 內含子序列區
序列區名稱 SEQ ID NO
內含子1 1417
內含子2 1418
內含子3 1419
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含一個內含子序列區。在一些實施例中，內含子序列區為內含子1序列區。在一些實施例中，內含子序列區為內含子2序列區。在一些實施例中，內含子序列區為內含子3序列區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含兩個內含子序列區。在一些實施例中，內含子序列區為內含子1序列區及內含子2序列區。在一些實施例中，內含子序列區為內含子2序列區及內含子3序列區。在一些實施例中，內含子序列區為內含子1序列區及內含子3序列區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含三個內含子序列區。在一些實施例中，內含子序列區為內含子1序列區、內含子2序列區及內含子3序列區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體可包含至少一個聚腺苷酸化信號序列區。一或多個聚腺苷酸化信號區序列區可獨立地具有諸如但不限於以下之長度：4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599及600個核苷酸。病毒基因體之聚腺苷酸化信號序列區之長度可為4-10、10-20、10-50、20-30、30-40、40-50、50-60、50-100、60-70、70-80、80-90、90-100、100-110、100-150、110-120、120-130、130-140、140-150、150-160、150-200、160-170、170-180、180-190、190-200、200-210、200-250、210-220、220-230、230-240、240-250、250-260、250-300、260-270、270-280、280-290、290-300、300-310、300-350、310-320、320-330、330-340、340-350、350-360、350-400、360-370、370-380、380-390、390-400、400-410、400-450、410-420、420-430、430-440、440-450、450-460、450-500、460-470、470-480、480-490、490-500、500-510、500-550、510-520、520-530、530-540、540-550、550-560、550-600、560-570、570-580、580-590及590-600個核苷酸。作為一非限制性實例，病毒基因體包含長度為約127個核苷酸之聚腺苷酸化信號序列區。作為一非限制性實例，病毒基因體包含長度為約225個核苷酸之聚腺苷酸化信號序列區。作為一非限制性實例，病毒基因體包含長度為約476個核苷酸之聚腺苷酸化信號序列區。作為一非限制性實例，病毒基因體包含長度為約477個核苷酸之聚腺苷酸化信號序列區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含至少一個聚腺苷酸化(polyA)信號序列區。polyA信號序列區之非限制性實例描述於表19中。 表19. PolyA信號序列區
序列區名稱 SEQ ID NO
PolyA1 1420
PolyA2 1421
PolyA3 1422
PolyA4 1423
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含一個polyA信號序列區。在一些實施例中，polyA信號序列區為PolyA1序列區。在一些實施例中，polyA信號序列區為PolyA2序列區。在一些實施例中，polyA信號序列區為PolyA3序列區。在一些實施例中，polyA信號序列區為PolyA4序列區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含超過一個polyA信號序列區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含至少一個反向末端重複序列(ITR)區、至少一個多選殖位點(MCS)序列區、至少一個強化子序列區、至少一個啟動子序列區、至少一個外顯子序列區、至少一個內含子序列區、至少一個調節聚核苷酸區、至少一個聚腺苷酸化信號序列區及至少一個填充序列區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含5'反向末端重複序列(ITR)區及3' ITR序列區、兩個多選殖位點(MCS)序列區、強化子序列區、啟動子序列區、內含子序列區、調節聚核苷酸區、聚腺苷酸化信號序列區及填充序列區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含5'反向末端重複序列(ITR)區及3' ITR序列區、兩個多選殖位點(MCS)序列區、CMV強化子序列區、CBA啟動子序列區、SV40內含子序列區、調節聚核苷酸區、兔血球蛋白聚腺苷酸化信號序列區及填充序列區。具有所有上述序列模組之用於本發明AAV粒子中的ITR至ITR序列之非限制性實例描述於表20中。在表20中，描述序列區之序列識別符或序列(區域SEQ ID NO)及序列區之長度(區域長度)以及ITR至ITR序列之名稱及序列識別符(例如VOYHT1 (SEQ ID NO: 1352))。 表20. ITR至ITR序列中之序列區
序列區 VOYHT1 (SEQ ID NO: 1352) VOYHT2 (SEQ ID NO: 1353) VOYHT3 (SEQ ID NO: 1354) VOYHT4 (SEQ ID NO: 1355)
區域SEQ ID NO 區域長度 區域SEQ ID NO 區域長度 區域SEQ ID NO 區域長度 區域SEQ ID NO 區域長度
5' ITR 1380 141 1380 141 1380 141 1380 141
MCS 1384 10 1384 10 1384 10 1384 10
CMV強化子 1408 382 1408 382 1408 382 1408 382
CBA啟動子 1410 260 1410 260 1410 260 1410 260
SV40內含子 1417 172 1417 172 1417 172 1417 172
調節聚核苷酸 1262 163 1262 163 1250 158 1347 163
MCS TCGAG 5 TCGAG 5 TCGAG 5 TCGAG 5
兔血球蛋白PolyA信號 1420 127 1420 127 1420 127 1420 127
3' ITR 1382 141 1382 141 1382 141 1382 141
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含SEQ ID NO: 1352 (VOYHT1)，其包含5'反向末端重複序列(ITR)區及3' ITR序列區、兩個多選殖位點(MCS)序列區、CMV強化子序列區、CBA啟動子序列區、SV40內含子序列區、調節聚核苷酸區、兔血球蛋白聚腺苷酸化信號序列區及填充序列區。
在一些實施例中，VOYHT1被稱為VY-HTT01。在一些實施例中，VY-HTT01之化學摘要服務社(CAS)登記號為2288462-09-2。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含SEQ ID NO: 1353 (VOYHT2)，其包含5'反向末端重複序列(ITR)區及3' ITR序列區、兩個多選殖位點(MCS)序列區、CMV強化子序列區、CBA啟動子序列區、SV40內含子序列區、調節聚核苷酸區、兔血球蛋白聚腺苷酸化信號序列區及填充序列區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含SEQ ID NO: 1354 (VOYHT3)，其包含5'反向末端重複序列(ITR)區及3' ITR序列區、兩個多選殖位點(MCS)序列區、CMV強化子序列區、CBA啟動子序列區、SV40內含子序列區、調節聚核苷酸區、兔血球蛋白聚腺苷酸化信號序列區及填充序列區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含SEQ ID NO: 1355 (VOYHT4)，其包含5'反向末端重複序列(ITR)區及3' ITR序列區、兩個多選殖位點(MCS)序列區、CMV強化子序列區、CBA啟動子序列區、SV40內含子序列區、調節聚核苷酸區、兔血球蛋白聚腺苷酸化信號序列區及填充序列區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含5'反向末端重複序列(ITR)區及3' ITR序列區、兩個多選殖位點(MCS)序列區、CMV強化子序列區、CBA啟動子序列區、SV40內含子序列區、調節聚核苷酸區、兔血球蛋白聚腺苷酸化信號序列區及填充序列區。具有所有上述序列模組之用於本發明AAV粒子中的ITR至ITR序列之非限制性實例描述於表21中。在表21中，描述序列區之序列識別符或序列(區域SEQ ID NO)及序列區之長度(區域長度)以及ITR至ITR序列之名稱及序列識別符(例如VOYHT5 (SEQ ID NO: 1356))。 表21. ITR至ITR序列中之序列區
序列區 VOYHT5 (SEQ ID NO: 1356) VOYHT6 (SEQ ID NO: 1357) VOYHT7 (SEQ ID NO: 1358) VOYHT8 (SEQ ID NO: 1359)
區域SEQ ID NO 區域長度 區域SEQ ID NO 區域長度 區域SEQ ID NO 區域長度 區域SEQ ID NO 區域長度
5' ITR 1380 141 1380 141 1380 141 1380 141
MCS 1384 10 1384 10 1384 10 1384 10
CMV強化子 1408 382 1408 382 1408 382 1408 382
CBA啟動子 1410 260 1410 260 1410 260 1410 260
SV40內含子 1417 172 1417 172 1417 172 1417 172
調節聚核苷酸 1262 163 1262 163 1250 158 1347 163
MCS TCGAG 5 TCGAG 5 TCGAG 5 TCGAG 5
兔血球蛋白PolyA信號 1420 127 1420 127 1420 127 1420 127
3' ITR 1382 141 1382 141 1382 141 1382 141
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含SEQ ID NO: 1356 (VOYHT5)，其包含5'反向末端重複序列(ITR)區及3' ITR序列區、兩個多選殖位點(MCS)序列區、CMV強化子序列區、CBA啟動子序列區、SV40內含子序列區、調節聚核苷酸區、兔血球蛋白聚腺苷酸化信號序列區及填充序列區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含SEQ ID NO: 1357 (VOYHT6)，其包含5'反向末端重複序列(ITR)區及3' ITR序列區、兩個多選殖位點(MCS)序列區、CMV強化子序列區、CBA啟動子序列區、SV40內含子序列區、調節聚核苷酸區、兔血球蛋白聚腺苷酸化信號序列區及填充序列區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含SEQ ID NO: 1358 (VOYHT7)，其包含5'反向末端重複序列(ITR)區及3' ITR序列區、兩個多選殖位點(MCS)序列區、CMV強化子序列區、CBA啟動子序列區、SV40內含子序列區、調節聚核苷酸區、兔血球蛋白聚腺苷酸化信號序列區及填充序列區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含SEQ ID NO: 1359 (VOYHT8)，其包含5'反向末端重複序列(ITR)區及3' ITR序列區、兩個多選殖位點(MCS)序列區、CMV強化子序列區、CBA啟動子序列區、SV40內含子序列區、調節聚核苷酸區、兔血球蛋白聚腺苷酸化信號序列區及填充序列區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含5'反向末端重複序列(ITR)區及3' ITR序列區、兩個多選殖位點(MCS)序列區、強化子序列區、啟動子序列區、內含子序列區、調節聚核苷酸區、聚腺苷酸化信號序列區及兩個填充序列區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含5'反向末端重複序列(ITR)區及3' ITR序列區、兩個多選殖位點(MCS)序列區、CMV強化子序列區、CBA啟動子序列區、SV40內含子序列區、調節聚核苷酸區、兔血球蛋白聚腺苷酸化信號序列區及兩個填充序列區。具有所有上述序列模組之用於本發明AAV粒子中的ITR至ITR序列之非限制性實例描述於表22中。在表22中，描述序列區之序列識別符或序列(區域SEQ ID NO)及序列區之長度(區域長度)以及ITR至ITR序列之名稱及序列識別符(例如VOYHT9 (SEQ ID NO: 1360))。 表22. ITR至ITR序列中之序列區
序列區 VOYHT9 (SEQ ID NO: 1360) VOYHT10 (SEQ ID NO: 1361) VOYHT11 (SEQ ID NO: 1362) VOYHT12 (SEQ ID NO: 1363)
區域SEQ ID NO 區域長度 區域SEQ ID NO 區域長度 區域SEQ ID NO 區域長度 區域SEQ ID NO 區域長度
5' ITR 1380 141 1380 141 1380 141 1380 141
MCS 1384 10 1384 10 1384 10 1384 10
CMV強化子 1408 382 1408 382 1408 382 1408 382
CBA啟動子 1410 260 1410 260 1410 260 1410 260
SV40內含子 1417 172 1417 172 1417 172 1417 172
調節聚核苷酸 1262 163 1262 163 1250 158 1347 163
MCS TCGAG 5 TCGAG 5 TCGAG 5 TCGAG 5
兔血球蛋白PolyA信號 1420 127 1420 127 1420 127 1420 127
3' ITR 1382 141 1382 141 1382 141 1382 141
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含SEQ ID NO: 1360 (VOYHT9)，其包含5'反向末端重複序列(ITR)區及3' ITR序列區、兩個多選殖位點(MCS)序列區、CMV強化子序列區、CBA啟動子序列區、SV40內含子序列區、調節聚核苷酸區、兔血球蛋白聚腺苷酸化信號序列區及兩個填充序列區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含SEQ ID NO: 1361 (VOYHT10)，其包含5'反向末端重複序列(ITR)區及3' ITR序列區、兩個多選殖位點(MCS)序列區、CMV強化子序列區、CBA啟動子序列區、SV40內含子序列區、調節聚核苷酸區、兔血球蛋白聚腺苷酸化信號序列區及兩個填充序列區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含SEQ ID NO: 1362 (VOYHT11)，其包含5'反向末端重複序列(ITR)區及3' ITR序列區、兩個多選殖位點(MCS)序列區、CMV強化子序列區、CBA啟動子序列區、SV40內含子序列區、調節聚核苷酸區、兔血球蛋白聚腺苷酸化信號序列區及兩個填充序列區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含SEQ ID NO: 1363 (VOYHT12)，其包含5'反向末端重複序列(ITR)區及3' ITR序列區、兩個多選殖位點(MCS)序列區、CMV強化子序列區、CBA啟動子序列區、SV40內含子序列區、調節聚核苷酸區、兔血球蛋白聚腺苷酸化信號序列區及兩個填充序列區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含5'反向末端重複序列(ITR)區及3' ITR序列區、兩個多選殖位點(MCS)序列區、強化子序列區、啟動子序列區、內含子序列區、調節聚核苷酸區及聚腺苷酸化信號序列區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含5'反向末端重複序列(ITR)區及3' ITR序列區、兩個多選殖位點(MCS)序列區、CMV強化子序列區、CBA啟動子序列區、SV40內含子序列區、調節聚核苷酸區及兔血球蛋白聚腺苷酸化信號序列區。具有所有上述序列模組之用於本發明AAV粒子中的ITR至ITR序列之非限制性實例描述於表23中。在表23中，描述序列區之序列識別符或序列(區域SEQ ID NO)及序列區之長度(區域長度)以及ITR至ITR序列之名稱及序列識別符(例如VOYHT13 (SEQ ID NO: 1364))。 表23. ITR至ITR序列中之序列區
序列區 VOYHT13 (SEQ ID NO: 1364) VOYHT14 (SEQ ID NO: 1365)
區域SEQ ID NO 區域長度 區域SEQ ID NO 區域長度
5' ITR 1380 141 1380 141
MCS 1384 10 1384 10
CMV強化子 1408 382 1408 382
CBA啟動子 1410 260 1410 260
SV40內含子 1417 172 1417 172
調節聚核苷酸 1262 163 1249 158
MCS TCGAG 5 TCGAG 5
兔血球蛋白PolyA信號 1420 127 1420 127
3' ITR 1382 141 1382 141
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含SEQ ID NO: 1364 (VOYHT13)，其包含5'反向末端重複序列(ITR)區及3' ITR序列區、兩個多選殖位點(MCS)序列區、CMV強化子序列區、CBA啟動子序列區、SV40內含子序列區、調節聚核苷酸區及兔血球蛋白聚腺苷酸化信號序列區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含SEQ ID NO: 1365 (VOYHT14)，其包含5'反向末端重複序列(ITR)區及3' ITR序列區、兩個多選殖位點(MCS)序列區、CMV強化子序列區、CBA啟動子序列區、SV40內含子序列區、調節聚核苷酸區及兔血球蛋白聚腺苷酸化信號序列區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含5'反向末端重複序列(ITR)區及3' ITR序列區、強化子序列區、啟動子序列區、內含子序列區、調節聚核苷酸區及聚腺苷酸化信號序列區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含5'反向末端重複序列(ITR)區及3' ITR序列區、CMV強化子序列區、CBA啟動子序列區、SV40內含子序列區、調節聚核苷酸區及兔血球蛋白聚腺苷酸化信號序列區。具有所有上述序列模組之用於本發明AAV粒子中的ITR至ITR序列之非限制性實例描述於表24至表28中。在表24-表28中，描述序列區之序列識別符或序列(區域SEQ ID NO)及序列區之長度(區域長度)以及ITR至ITR序列之名稱及序列識別符(例如VOYHT15 (SEQ ID NO: 1366))。 表24. ITR至ITR序列中之序列區
序列區 VOYHT15 (SEQ ID NO: 1366) VOYHT16 (SEQ ID NO: 1367)
區域SEQ ID NO 區域長度 區域SEQ ID NO 區域長度
5' ITR 1381 105 1381 105
CMV強化子 1408 382 1408 382
CBA啟動子 1410 260 1410 260
SV40內含子 1417 172 1417 172
調節聚核苷酸 1259 260 1249 158
兔血球蛋白PolyA信號 1420 127 1420 127
3' ITR 1383 130 1383 130
表25. ITR至ITR序列中之序列區
序列區 VOYHT35 (SEQ ID NO: 1388) VOYHT36 (SEQ ID NO: 1426) VOYHT37 (SEQ ID NO: 1427) VOYHT38 (SEQ ID NO: 1428)
區域SEQ ID NO 區域長度 區域SEQ ID NO 區域長度 區域SEQ ID NO 區域長度 區域SEQ ID NO 區域長度
5' ITR 1381 105 1381 105 1381 105 1381 105
CMV強化子 1408 382 1408 382 1408 382 1408 382
CBA啟動子 1410 260 1410 260 1410 260 1410 260
SV40內含子 1417 172 1417 172 1417 172 1417 172
調節聚核苷酸 1255 158 1248 158 1231 158 1219 158
兔血球蛋白PolyA信號 1420 127 1420 127 1420 127 1420 127
3' ITR 1383 130 1383 130 1383 130 1383 130
表26. ITR至ITR序列中之序列區
序列區 VOYHT39 (SEQ ID NO: 1429) VOYHT40 (SEQ ID NO: 1430) VOYHT41 (SEQ ID NO: 1431) VOYHT42 (SEQ ID NO: 1432)
區域SEQ ID NO 區域長度 區域SEQ ID NO 區域長度 區域SEQ ID NO 區域長度 區域SEQ ID NO 區域長度
5' ITR 1381 105 1381 105 1381 105 1381 105
CMV強化子 1408 382 1408 382 1408 382 1408 382
CBA啟動子 1410 260 1410 260 1410 260 1410 260
SV40內含子 1417 172 1417 172 1417 172 1417 172
調節聚核苷酸 1207 158 1250 158 1251 158 1252 158
兔血球蛋白PolyA信號 1420 127 1420 127 1420 127 1420 127
3' ITR 1383 130 1383 130 1383 130 1383 130
表27. ITR至ITR序列中之序列區
序列區 VOYHT43 (SEQ ID NO: 1433) VOYHT44 (SEQ ID NO: 1434) VOYHT45 (SEQ ID NO: 1435) VOYHT46 (SEQ ID NO: 1436)
區域SEQ ID NO 區域長度 區域SEQ ID NO 區域長度 區域SEQ ID NO 區域長度 區域SEQ ID NO 區域長度
5' ITR 1381 105 1381 105 1381 105 1381 105
CMV強化子 1408 382 1408 382 1408 382 1408 382
CBA啟動子 1410 260 1410 260 1410 260 1410 260
SV40內含子 1417 172 1417 172 1417 172 1417 172
調節聚核苷酸 1253 260 1194 260 1223 260 1211 260
兔血球蛋白PolyA信號 1420 127 1420 127 1420 127 1420 127
3' ITR 1383 130 1383 130 1383 130 1383 130
表28. ITR至ITR序列中之序列區
序列區 VOYHT47 (SEQ ID NO: 1437) VOYHT48 (SEQ ID NO: 1438)
區域SEQ ID NO 區域長度 區域SEQ ID NO 區域長度
5' ITR 1381 105 1381 105
CMV強化子 1408 382 1408 382
CBA啟動子 1410 260 1410 260
SV40內含子 1417 172 1417 172
調節聚核苷酸 1262 163 1347 163
兔血球蛋白PolyA信號 1420 127 1420 127
3' ITR 1383 130 1383 130
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含SEQ ID NO: 1366 (VOYHT15)，其包含5'反向末端重複序列(ITR)區及3' ITR序列區、CMV強化子序列區、CBA啟動子序列區、SV40內含子序列區、調節聚核苷酸區及兔血球蛋白聚腺苷酸化信號序列區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含SEQ ID NO: 1367 (VOYHT16)，其包含5'反向末端重複序列(ITR)區及3' ITR序列區、CMV強化子序列區、CBA啟動子序列區、SV40內含子序列區、調節聚核苷酸區及兔血球蛋白聚腺苷酸化信號序列區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含SEQ ID NO: 1388 (VOYHT35)，其包含5'反向末端重複序列(ITR)區及3' ITR序列區、CMV強化子序列區、CBA啟動子序列區、SV40內含子序列區、調節聚核苷酸區及兔血球蛋白聚腺苷酸化信號序列區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含SEQ ID NO: 1426 (VOYHT36)，其包含5'反向末端重複序列(ITR)區及3' ITR序列區、CMV強化子序列區、CBA啟動子序列區、SV40內含子序列區、調節聚核苷酸區及兔血球蛋白聚腺苷酸化信號序列區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含SEQ ID NO: 1427 (VOYHT37)，其包含5'反向末端重複序列(ITR)區及3' ITR序列區、CMV強化子序列區、CBA啟動子序列區、SV40內含子序列區、調節聚核苷酸區及兔血球蛋白聚腺苷酸化信號序列區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含SEQ ID NO: 1428 (VOYHT38)，其包含5'反向末端重複序列(ITR)區及3' ITR序列區、CMV強化子序列區、CBA啟動子序列區、SV40內含子序列區、調節聚核苷酸區及兔血球蛋白聚腺苷酸化信號序列區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含SEQ ID NO: 1429 (VOYHT39)，其包含5'反向末端重複序列(ITR)區及3' ITR序列區、CMV強化子序列區、CBA啟動子序列區、SV40內含子序列區、調節聚核苷酸區及兔血球蛋白聚腺苷酸化信號序列區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含SEQ ID NO: 1430 (VOYHT40)，其包含5'反向末端重複序列(ITR)區及3' ITR序列區、CMV強化子序列區、CBA啟動子序列區、SV40內含子序列區、調節聚核苷酸區及兔血球蛋白聚腺苷酸化信號序列區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含SEQ ID NO: 1431 (VOYHT41)，其包含5'反向末端重複序列(ITR)區及3' ITR序列區、CMV強化子序列區、CBA啟動子序列區、SV40內含子序列區、調節聚核苷酸區及兔血球蛋白聚腺苷酸化信號序列區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含SEQ ID NO: 1432 (VOYHT42)，其包含5'反向末端重複序列(ITR)區及3' ITR序列區、CMV強化子序列區、CBA啟動子序列區、SV40內含子序列區、調節聚核苷酸區及兔血球蛋白聚腺苷酸化信號序列區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含SEQ ID NO: 1433 (VOYHT43)，其包含5'反向末端重複序列(ITR)區及3' ITR序列區、CMV強化子序列區、CBA啟動子序列區、SV40內含子序列區、調節聚核苷酸區及兔血球蛋白聚腺苷酸化信號序列區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含SEQ ID NO: 1434 (VOYHT44)，其包含5'反向末端重複序列(ITR)區及3' ITR序列區、CMV強化子序列區、CBA啟動子序列區、SV40內含子序列區、調節聚核苷酸區及兔血球蛋白聚腺苷酸化信號序列區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含SEQ ID NO: 1435 (VOYHT45)，其包含5'反向末端重複序列(ITR)區及3' ITR序列區、CMV強化子序列區、CBA啟動子序列區、SV40內含子序列區、調節聚核苷酸區及兔血球蛋白聚腺苷酸化信號序列區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含SEQ ID NO: 1436 (VOYHT46)，其包含5'反向末端重複序列(ITR)區及3' ITR序列區、CMV強化子序列區、CBA啟動子序列區、SV40內含子序列區、調節聚核苷酸區及兔血球蛋白聚腺苷酸化信號序列區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含SEQ ID NO: 1437 (VOYHT47)，其包含5'反向末端重複序列(ITR)區及3' ITR序列區、CMV強化子序列區、CBA啟動子序列區、SV40內含子序列區、調節聚核苷酸區及兔血球蛋白聚腺苷酸化信號序列區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含SEQ ID NO: 1438 (VOYHT48)，其包含5'反向末端重複序列(ITR)區及3' ITR序列區、CMV強化子序列區、CBA啟動子序列區、SV40內含子序列區、調節聚核苷酸區及兔血球蛋白聚腺苷酸化信號序列區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含5'反向末端重複序列(ITR)區及3' ITR序列區、MCS序列區、強化子序列區、啟動子序列區、兩個外顯子序列區、兩個內含子序列區、調節聚核苷酸區、聚腺苷酸化信號序列區及填充序列區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含5'反向末端重複序列(ITR)區及3' ITR序列區、MCS序列區、CMV強化子序列區、CMV啟動子序列區、兩個外顯子序列區(ie1外顯子1及人類β血球蛋白(hb血球蛋白)外顯子3或其片段)、兩個內含子序列區(ie1內含子1及hb血球蛋白內含子2或其片段)、調節聚核苷酸區、人類生長激素(hGH)聚腺苷酸化信號序列區及填充序列區。具有所有上述序列模組之用於本發明AAV粒子中的ITR至ITR序列之非限制性實例描述於表29中。在表29中，描述序列區之序列識別符或序列(區域SEQ ID NO)及序列區之長度(區域長度)以及ITR至ITR序列之名稱及序列識別符(例如VOYHT17 (SEQ ID NO: 1368))。 表29. ITR至ITR序列中之序列區
序列區 VOYHT17 (SEQ ID NO: 1368)
區域SEQ ID NO 區域長度
5' ITR 1380 141
MCS 1387 18
CMV強化子 1409 303
CMV啟動子 1412 204
Ie1外顯子1 1415 134
Ie1內含子1 1418 32
hb血球蛋白內含子2 1419 347
hb血球蛋白外顯子3 1416 53
調節聚核苷酸 1262 163
hGH PolyA信號 1422 477
3' ITR 1382 141
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含SEQ ID NO: 1368 (VOYHT17)，其包含5'反向末端重複序列(ITR)區及3' ITR序列區、MCS序列區、CMV強化子序列區、CMV啟動子序列區、兩個外顯子序列區(ie1外顯子1及人類β血球蛋白(hb血球蛋白)外顯子3或其片段)、兩個內含子序列區(ie1內含子1及hb血球蛋白內含子2或其片段)、調節聚核苷酸區、人類生長激素(hGH)聚腺苷酸化信號序列區及填充序列區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含5'反向末端重複序列(ITR)區及3' ITR序列區、MCS序列區、CMV強化子序列區、CMV啟動子序列區、兩個外顯子序列區(ie1外顯子1及人類β血球蛋白(hb血球蛋白)外顯子3或其片段)、兩個內含子序列區(ie1內含子1及hb血球蛋白內含子2或其片段)、調節聚核苷酸區、人類生長激素(hGH)聚腺苷酸化信號序列區及填充序列區。具有所有上述序列模組之用於本發明AAV粒子中的ITR至ITR序列之非限制性實例描述於表30中。在表30中，描述序列區之序列識別符或序列(區域SEQ ID NO)及序列區之長度(區域長度)以及ITR至ITR序列之名稱及序列識別符(例如VOYHT19 (SEQ ID NO: 1370))。 表30. ITR至ITR序列中之序列區
序列區 VOYHT19 (SEQ ID NO: 1370)
區域SEQ ID NO 區域長度
5' ITR 1380 141
CMV強化子 1409 303
CMV啟動子 1412 204
Ie1外顯子1 1415 134
Ie1內含子1 1418 32
hb血球蛋白內含子2 1419 347
hb血球蛋白外顯子3 1416 53
調節聚核苷酸 1262 163
hGH PolyA信號 1389 14
MCS 1422 477
3' ITR 1382 141
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含SEQ ID NO: 1370 (VOYHT19)，其包含5'反向末端重複序列(ITR)區及3' ITR序列區、MCS序列區、CMV強化子序列區、CMV啟動子序列區、兩個外顯子序列區(ie1外顯子1及人類β血球蛋白(hb血球蛋白)外顯子3或其片段)、兩個內含子序列區(ie1內含子1及hb血球蛋白外顯子3或其片段)、調節聚核苷酸區、人類生長激素(hGH)聚腺苷酸化信號序列區及填充序列區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含5'反向末端重複序列(ITR)區及3' ITR序列區、兩個MCS序列區、強化子序列區、啟動子序列區、兩個外顯子序列區、兩個內含子序列區、調節聚核苷酸區、聚腺苷酸化信號序列區及填充序列區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含5'反向末端重複序列(ITR)區及3' ITR序列區、兩個MCS序列區、CMV強化子序列區、CMV啟動子序列區、兩個外顯子序列區(ie1外顯子1及人類β血球蛋白(hb血球蛋白)外顯子3或其片段)、兩個內含子序列區(ie1內含子1及hb血球蛋白外顯子3或其片段)、調節聚核苷酸區、人類生長激素(hGH)聚腺苷酸化信號序列區及填充序列區。具有所有上述序列模組之用於本發明AAV粒子中的ITR至ITR序列之非限制性實例描述於表31中。在表31中，描述序列區之序列識別符或序列(區域SEQ ID NO)及序列區之長度(區域長度)以及ITR至ITR序列之名稱及序列識別符(例如VOYHT18 (SEQ ID NO: 1369))。 表31. ITR至ITR序列中之序列區
序列區 VOYHT18 (SEQ ID NO: 1369)
區域SEQ ID NO 區域長度
5' ITR 1380 141
MCS 1387 18
CMV強化子 1409 303
CMV啟動子 1412 204
Ie1外顯子1 1415 134
Ie1內含子1 1418 32
hb血球蛋白內含子2 1419 347
hb血球蛋白外顯子3 1416 53
調節聚核苷酸 1262 163
MCS 1389 14
hGH PolyA信號 1422 477
3' ITR 1382 141
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含SEQ ID NO: 1369 (VOYHT18)，其包含5'反向末端重複序列(ITR)區及3' ITR序列區、兩個MCS序列區、CMV強化子序列區、CMV啟動子序列區、兩個外顯子序列區(ie1外顯子1及人類β血球蛋白(hb血球蛋白)外顯子3或其片段)、兩個內含子序列區(ie1內含子1及hb血球蛋白外顯子3或其片段)、調節聚核苷酸區、人類生長激素(hGH)聚腺苷酸化信號序列區及填充序列區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含5'反向末端重複序列(ITR)區及3' ITR序列區、兩個MCS序列區、CMV強化子序列區、CMV啟動子序列區、兩個外顯子序列區(ie1外顯子1及人類β血球蛋白(hb血球蛋白)外顯子3或其片段)、兩個內含子序列區(ie1內含子1及hb血球蛋白外顯子3或其片段)、調節聚核苷酸區、人類生長激素(hGH)聚腺苷酸化信號序列區及填充序列區。具有所有上述序列模組之用於本發明AAV粒子中的ITR至ITR序列之非限制性實例描述於表32中。在表32中，描述序列區之序列識別符或序列(區域SEQ ID NO)及序列區之長度(區域長度)以及ITR至ITR序列之名稱及序列識別符(例如VOYHT20 (SEQ ID NO: 1371))。 表32. ITR至ITR序列中之序列區
序列區 VOYHT20 (SEQ ID NO: 1371)
區域SEQ ID NO 區域長度
5' ITR 1380 141
MCS 1385 121
CMV強化子 1409 303
CMV啟動子 1412 204
Ie1外顯子1 1415 134
Ie1內含子1 1418 32
hb血球蛋白內含子2 1419 347
hb血球蛋白外顯子3 1416 53
調節聚核苷酸 1262 163
MCS 1389 14
hGH PolyA信號 1422 477
3' ITR 1382 141
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含SEQ ID NO: 1371 (VOYHT20)，其包含5'反向末端重複序列(ITR)區及3' ITR序列區、兩個MCS序列區、CMV強化子序列區、CMV啟動子序列區、兩個外顯子序列區(ie1外顯子1及人類β血球蛋白(hb血球蛋白)外顯子3或其片段)、兩個內含子序列區(ie1內含子1及hb血球蛋白外顯子3或其片段)、調節聚核苷酸區、人類生長激素(hGH)聚腺苷酸化信號序列區及填充序列區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含5'反向末端重複序列(ITR)區及3' ITR序列區、兩個MCS序列區、CMV強化子序列區、CMV啟動子序列區、兩個外顯子序列區(ie1外顯子1及人類β血球蛋白(hb血球蛋白)外顯子3或其片段)、兩個內含子序列區(ie1內含子1及hb血球蛋白外顯子3或其片段)、調節聚核苷酸區、人類生長激素(hGH)聚腺苷酸化信號序列區及填充序列區。具有所有上述序列模組之用於本發明AAV粒子中的ITR至ITR序列之非限制性實例描述於表33中。在表33中，描述序列區之序列識別符或序列(區域SEQ ID NO)及序列區之長度(區域長度)以及ITR至ITR序列之名稱及序列識別符(例如VOYHT21 (SEQ ID NO: 1372))。 表33. ITR至ITR序列中之序列區
序列區 VOYHT21 (SEQ ID NO: 1372) VOYHT22 (SEQ ID NO: 1373)
區域SEQ ID NO 區域長度 區域SEQ ID NO 區域長度
5' ITR 1380 141 1380 141
MCS 1387 18 1387 18
CMV強化子 1409 303 1409 303
CMV啟動子 1412 204 1412 204
Ie1外顯子1 1415 134 1415 134
Ie1內含子1 1418 32 1418 32
hb血球蛋白內含子2 1419 347 1419 347
hb血球蛋白外顯子3 1416 53 1416 53
調節聚核苷酸 1262 163 1262 163
MCS 1389 14 1389 14
hGH PolyA信號 1422 477 1422 477
3' ITR 1382 141 1382 141
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含SEQ ID NO: 1372 (VOYHT21)，其包含5'反向末端重複序列(ITR)區及3' ITR序列區、兩個MCS序列區、CMV強化子序列區、CMV啟動子序列區、兩個外顯子序列區(ie1外顯子1及人類β血球蛋白(hb血球蛋白)外顯子3或其片段)、兩個內含子序列區(ie1內含子1及hb血球蛋白外顯子3或其片段)、調節聚核苷酸區、人類生長激素(hGH)聚腺苷酸化信號序列區及填充序列區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含SEQ ID NO: 1373 (VOYHT22)，其包含5'反向末端重複序列(ITR)區及3' ITR序列區、兩個MCS序列區、CMV強化子序列區、CMV啟動子序列區、兩個外顯子序列區(ie1外顯子1及人類β血球蛋白(hb血球蛋白)外顯子3或其片段)、兩個內含子序列區(ie1內含子1及hb血球蛋白外顯子3或其片段)、調節聚核苷酸區、人類生長激素(hGH)聚腺苷酸化信號序列區及填充序列區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含5'反向末端重複序列(ITR)區及3' ITR序列區、MCS序列區、強化子序列區、啟動子序列區、兩個外顯子序列區、兩個內含子序列區、調節聚核苷酸區、聚腺苷酸化信號序列區及兩個填充序列區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含5'反向末端重複序列(ITR)區及3' ITR序列區、MCS序列區、CMV強化子序列區、CMV啟動子序列區、兩個外顯子序列區(ie1外顯子1及人類β血球蛋白(hb血球蛋白)外顯子3或其片段)、兩個內含子序列區(ie1內含子1及hb血球蛋白外顯子3或其片段)、調節聚核苷酸區、人類生長激素(hGH)聚腺苷酸化信號序列區及兩個填充序列區。具有所有上述序列模組之用於本發明AAV粒子中的ITR至ITR序列之非限制性實例描述於表34中。在表34中，描述序列區之序列識別符或序列(區域SEQ ID NO)及序列區之長度(區域長度)以及ITR至ITR序列之名稱及序列識別符(例如VOYHT23 (SEQ ID NO: 1374))。 表34. ITR至ITR序列中之序列區
序列區 VOYHT23 (SEQ ID NO: 1374)
區域SEQ ID NO 區域長度
5' ITR 1380 141
CMV強化子 1409 303
CMV啟動子 1412 204
Ie1外顯子1 1415 134
Ie1內含子1 1418 32
hb血球蛋白內含子2 1419 347
hb血球蛋白外顯子3 1416 53
調節聚核苷酸 1262 163
MCS 1389 14
hGH PolyA信號 1422 477
3' ITR 1382 141
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含SEQ ID NO: 1374 (VOYHT23)，其包含5'反向末端重複序列(ITR)區及3' ITR序列區、MCS序列區、CMV強化子序列區、CMV啟動子序列區、兩個外顯子序列區(ie1外顯子1及人類β血球蛋白(hb血球蛋白)外顯子3或其片段)、兩個內含子序列區(ie1內含子1及hb血球蛋白外顯子3或其片段)、調節聚核苷酸區、人類生長激素(hGH)聚腺苷酸化信號序列區及兩個填充序列區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含5'反向末端重複序列(ITR)區及3' ITR序列區、兩個MCS序列區、強化子序列區、啟動子序列區、兩個外顯子序列區、兩個內含子序列區、調節聚核苷酸區、聚腺苷酸化信號序列區及兩個填充序列區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含5'反向末端重複序列(ITR)區及3' ITR序列區、兩個MCS序列區、CMV強化子序列區、CMV啟動子序列區、兩個外顯子序列區(ie1外顯子1及人類β血球蛋白(hb血球蛋白)外顯子3或其片段)、兩個內含子序列區(ie1內含子1及hb血球蛋白外顯子3或其片段)、調節聚核苷酸區、人類生長激素(hGH)聚腺苷酸化信號序列區及兩個填充序列區。具有所有上述序列模組之用於本發明AAV粒子中的ITR至ITR序列之非限制性實例描述於表35中。在表35中，描述序列區之序列識別符或序列(區域SEQ ID NO)及序列區之長度(區域長度)以及ITR至ITR序列之名稱及序列識別符(例如VOYHT24 (SEQ ID NO: 1375))。 表35. ITR至ITR序列中之序列區
序列區 VOYHT24 (SEQ ID NO: 1375)
區域SEQ ID NO 區域長度
5' ITR 1380 141
MCS 1386 73
CMV強化子 1409 303
CMV啟動子 1412 204
Ie1外顯子1 1415 134
Ie1內含子1 1418 32
hb血球蛋白內含子2 1419 347
hb血球蛋白外顯子3 1416 53
調節聚核苷酸 1262 163
MCS 1389 14
hGH PolyA信號 1423 476
3' ITR 1382 141
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含SEQ ID NO: 1375 (VOYHT24)，其包含5'反向末端重複序列(ITR)區及3' ITR序列區、兩個MCS序列區、CMV強化子序列區、CMV啟動子序列區、兩個外顯子序列區(ie1外顯子1及人類β血球蛋白(hb血球蛋白)外顯子3或其片段)、兩個內含子序列區(ie1內含子1及hb血球蛋白外顯子3或其片段)、調節聚核苷酸區、人類生長激素(hGH)聚腺苷酸化信號序列區及兩個填充序列區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含5'反向末端重複序列(ITR)區及3' ITR序列區、兩個MCS序列區、強化子序列區、啟動子序列區、兩個外顯子序列區、兩個內含子序列區、調節聚核苷酸區及聚腺苷酸化信號序列區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含5'反向末端重複序列(ITR)區及3' ITR序列區、兩個MCS序列區、CMV強化子序列區、CMV啟動子序列區、兩個外顯子序列區(ie1外顯子1及人類β血球蛋白(hb血球蛋白)外顯子3或其片段)、兩個內含子序列區(ie1內含子1及hb血球蛋白外顯子3或其片段)、調節聚核苷酸區及人類生長激素(hGH)聚腺苷酸化信號序列區。具有所有上述序列模組之用於本發明AAV粒子中的ITR至ITR序列之非限制性實例描述於表36中。在表36中，描述序列區之序列識別符或序列(區域SEQ ID NO)及序列區之長度(區域長度)以及ITR至ITR序列之名稱及序列識別符(例如VOYHT25 (SEQ ID NO: 1376))。 表36. ITR至ITR序列中之序列區
序列區 VOYHT25 (SEQ ID NO: 1376) VOYHT26 (SEQ ID NO: 1377)
區域SEQ ID NO 區域長度 區域SEQ ID NO 區域長度
5' ITR 1380 141 1380 141
MCS 1387 18 1387 18
CMV強化子 1409 303 1409 303
CMV啟動子 1412 204 1412 204
Ie1外顯子1 1415 134 1415 134
Ie1內含子1 1418 32 1418 32
hb血球蛋白內含子2 1419 347 1419 347
hb血球蛋白外顯子3 1416 53 1416 53
調節聚核苷酸 1249 158 1262 163
MCS 1389 14 1389 14
hGH PolyA信號 1422 477 1422 477
3' ITR 1382 141 1382 141
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含SEQ ID NO: 1376 (VOYHT25)，其包含5'反向末端重複序列(ITR)區及3' ITR序列區、兩個MCS序列區、CMV強化子序列區、CMV啟動子序列區、兩個外顯子序列區(ie1外顯子1及人類β血球蛋白(hb血球蛋白)外顯子3或其片段)、兩個內含子序列區(ie1內含子1及hb血球蛋白外顯子3或其片段)、調節聚核苷酸區及人類生長激素(hGH)聚腺苷酸化信號序列區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含SEQ ID NO: 1377 (VOYHT26)，其包含5'反向末端重複序列(ITR)區及3' ITR序列區、兩個MCS序列區、CMV強化子序列區、CMV啟動子序列區、兩個外顯子序列區(ie1外顯子1及人類β血球蛋白(hb血球蛋白)外顯子3或其片段)、兩個內含子序列區(ie1內含子1及hb血球蛋白外顯子3或其片段)、調節聚核苷酸區及人類生長激素(hGH)聚腺苷酸化信號序列區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含5'反向末端重複序列(ITR)區及3' ITR序列區、啟動子序列區及調節聚核苷酸區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含5'反向末端重複序列(ITR)區及3' ITR序列區、H1啟動子序列區及調節聚核苷酸區。具有所有上述序列模組之用於本發明AAV粒子中的ITR至ITR序列之非限制性實例描述於表37中。在表37中，描述序列區之序列識別符或序列(區域SEQ ID NO)及序列區之長度(區域長度)以及ITR至ITR序列之名稱及序列識別符(例如VOYHT27 (SEQ ID NO: 1378))。 表37. ITR至ITR序列中之序列區
序列區 VOYHT27 (SEQ ID NO: 1378) VOYHT28 (SEQ ID NO: 1379)
區域SEQ ID NO 區域長度 區域SEQ ID NO 區域長度
5' ITR 1381 105 1381 105
H1啟動子 1413 219 1413 219
調節聚核苷酸 1259 260 1249 158
3' ITR 1383 130 1383 130
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含SEQ ID NO: 1378 (VOYHT27)，其包含5'反向末端重複序列(ITR)區及3' ITR序列區、H1啟動子序列區及調節聚核苷酸區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含SEQ ID NO: 1379 (VOYHT28)，其包含5'反向末端重複序列(ITR)區及3' ITR序列區、H1啟動子序列區及調節聚核苷酸區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含一或兩個啟動子序列區、調節聚核苷酸序列區及牛生長激素(bGH)聚腺苷酸化信號序列區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含兩個啟動子序列區、調節聚核苷酸區及聚腺苷酸化信號序列區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含CMV及T7啟動子序列區、調節聚核苷酸區及bGH聚腺苷酸化信號序列區。具有所有上述序列模組的用於本發明AAV粒子中之序列的非限制性實例描述於表38中。在表38中，描述序列區之序列識別符或序列(區域SEQ ID NO)及序列區之長度(區域長度)以及序列之名稱(例如VOYHT29)。 表38. 序列區
序列區 VOYHT29 VOYHT30 VOYHT31 VOYHT32
區域SEQ ID NO 區域長度 區域SEQ ID NO 區域長度 區域SEQ ID NO 區域長度 區域SEQ ID NO 區域長度
CMV啟動子 1411 588 1411 588 1411 588 1411 588
T7啟動子 1414 17 1414 17 1414 17 1414 17
調節聚核苷酸 1249 158 1259 260 1255 158 1253 260
bGH PolyA信號 1421 225 1421 225 1421 225 1421 225
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含CMV啟動子序列區(SEQ ID NO: 1411)、T7啟動子序列區(SEQ ID NO: 1414)、調節聚核苷酸序列區(SEQ ID NO: 1249)及bGH聚腺苷酸化信號序列區(SEQ ID NO: 1421)。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含CMV啟動子序列區(SEQ ID NO: 1411)、T7啟動子序列區(SEQ ID NO: 1414)、調節聚核苷酸序列區(SEQ ID NO: 1259)及bGH聚腺苷酸化信號序列區(SEQ ID NO: 1421)。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含CMV啟動子序列區(SEQ ID NO: 1411)、T7啟動子序列區(SEQ ID NO: 1414)、調節聚核苷酸序列區(SEQ ID NO: 1255)及bGH聚腺苷酸化信號序列區(SEQ ID NO: 1421)。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含CMV啟動子序列區(SEQ ID NO: 1411)、T7啟動子序列區(SEQ ID NO: 1414)、調節聚核苷酸序列區(SEQ ID NO: 1253)及bGH聚腺苷酸化信號序列區(SEQ ID NO: 1421)。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含一或兩個啟動子序列區及調節聚核苷酸序列區。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含CMV及T7啟動子序列區及調節聚核苷酸區。具有所有上述序列模組的用於本發明AAV粒子中之序列的非限制性實例描述於表39中。在表39中，描述序列區之序列識別符或序列(區域SEQ ID NO)及序列區之長度(區域長度)以及序列之名稱(例如VOYHT33)。 表39. 序列區
序列區 VOYHT33 VOYHT34
區域SEQ ID NO 區域長度 區域SEQ ID NO 區域長度
CMV啟動子 GTTG 4 - -
H1啟動子 1413 219 1413 219
調節聚核苷酸 1249 158 1259 260
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含CMV啟動子序列區(序列：GTTG)、H1啟動子序列區(SEQ ID NO: 1413)及調節聚核苷酸序列區(SEQ ID NO: 1249)。
在一些實施例中，AAV粒子病毒基因體包含H1啟動子序列區(SEQ ID NO: 1413)及調節聚核苷酸序列區(SEQ ID NO: 1259)。
AAV粒子可經修飾以增強遞送效率。包含編碼本發明之siRNA分子之核酸序列的此類經修飾之AAV粒子可有效封裝且可用於成功地以高頻率及最小毒性感染目標細胞。
在一些實施例中，包含編碼本發明之siRNA分子之核酸序列的AAV粒子可為人類血清型AAV粒子。此類人類AAV粒子可衍生自任何已知血清型，例如血清型AAV1-AAV11中之任一者。作為非限制性實例，AAV粒子可為：AAV1衍生之衣殼中包含AAV1衍生之基因體之載體；AAV2衍生之衣殼中包含AAV2衍生之基因體之載體；AAV4衍生之衣殼中包含AAV4衍生之基因體之載體；AAV6衍生之衣殼中包含AAV6衍生之基因體之載體；或AAV9衍生之衣殼中包含AAV9衍生之基因體之載體。
在其他實施例中，包含編碼本發明之siRNA分子之核酸序列的AAV粒子可為含有源自至少兩種不同AAV血清型之序列及/或組件之假型雜交或嵌合AAV粒子。假型AAV粒子可為包含以下之載體：衍生自一種AAV血清型之AAV基因體及至少部分衍生自不同AAV血清型之衣殼蛋白。作為非限制性實例，此類假型AAV粒子可為：AAV1衍生之衣殼中包含AAV2衍生之基因體之載體；或AAV6衍生之衣殼中包含AAV2衍生之基因體之載體；或AAV4衍生之衣殼中包含AAV2衍生之基因體之載體；或AAV9衍生之衣殼中包含AAV2衍生之基因體之載體。以類似方式，本發明涵蓋任何雜交或嵌合AAV粒子。
在其他實施例中，包含編碼本發明之siRNA分子之核酸序列的AAV粒子可用於將siRNA分子遞送至中樞神經系統(例如美國專利第6,180,613號；其內容以全文引用之方式併入本文中)。
在一些態樣中，包含編碼本發明之siRNA分子之核酸序列的AAV粒子可進一步包含包括來自非病毒來源之肽的經修飾之衣殼。在其他態樣中，AAV粒子可含有CNS特異性嵌合衣殼以促進將所編碼之siRNA雙螺旋體遞送至腦及脊髓中。舉例而言，可構築來自展現CNS向性之AAV變異體之cap核苷酸序列的對準以鑑別可變區(VR)序列及結構。
在本文中所提及及/或描述之任何DNA及RNA序列中，單字母符號具有如下描述：A代表腺嘌呤；C代表胞嘧啶；G代表鳥嘌呤；T代表胸腺嘧啶；U代表尿嘧啶；W代表弱鹼基，諸如腺嘌呤或胸腺嘧啶；S代表強核苷酸，諸如胞嘧啶及鳥嘌呤；M代表胺基核苷酸，諸如腺嘌呤及胞嘧啶；K代表酮基核苷酸，諸如鳥嘌呤及胸腺嘧啶；R代表嘌呤，如腺嘌呤及鳥嘌呤；Y代表嘧啶，胞嘧啶及胸腺嘧啶；B代表任何非A鹼基(例如胞嘧啶、鳥嘌呤及胸腺嘧啶)；D代表任何非C鹼基(例如腺嘌呤、鳥嘌呤及胸腺嘧啶)；H代表任何非G鹼基(例如腺嘌呤、胞嘧啶及胸腺嘧啶)；V代表任何非T鹼基(例如腺嘌呤、胞嘧啶及鳥嘌呤)；N代表任何核苷酸(其不為空位)；且Z代表零。
在本文中所提及及/或描述之任何胺基酸序列中，單字母符號具有以下描述：G (Gly)代表甘胺酸；A (Ala)代表丙胺酸；L (Leu)代表白胺酸；M (Met)代表甲硫胺酸；F (Phe)代表苯丙胺酸；W (Trp)代表色胺酸；K (Lys)代表離胺酸；Q (Gln)代表麩醯胺酸；E (Glu)代表麩胺酸；S (Ser)代表絲胺酸；P (Pro)代表脯胺酸；V (Val)代表纈胺酸；I (Ile)代表異白胺酸；C (Cys)代表半胱胺酸；Y (Tyr)代表酪胺酸；H (His)代表組胺酸；R (Arg)代表精胺酸；N (Asn)代表天冬醯胺；D (Asp)代表天冬胺酸；T (Thr)代表蘇胺酸；B (Asx)代表天冬胺酸或天冬醯胺；J (Xle)代表白胺酸或異白胺酸；O (Pyl)代表吡咯離胺酸；U (Sec)代表硒半胱胺酸；X (Xaa)代表任何胺基酸；且Z (Glx)代表麩醯胺酸或麩胺酸。病毒產生
本發明提供一種藉由在病毒複製細胞中進行病毒基因體複製來產生細小病毒粒子，例如AAV粒子之方法，該方法包含使病毒複製細胞與AAV聚核苷酸或AAV基因體接觸。
本發明提供一種用於產生具有增強(增加、提高)之轉導效率之AAV粒子的方法，其包含以下步驟：1)用穿梭載體及病毒構築體載體及/或AAV酬載構築體載體共轉染勝任細菌細胞；2)分離所得病毒構築體表現載體及AAV酬載構築體表現載體且分別轉染病毒複製細胞；3)分離及純化包含病毒構築體表現載體或AAV酬載構築體表現載體之所得酬載及病毒構築體粒子；4)用包含病毒構築體表現載體或AAV酬載構築體表現載體之AAV酬載及病毒構築體粒子兩者共感染病毒複製細胞；5)收集及純化包含細小病毒基因體之病毒粒子。
在一些實施例中，本發明提供一種用於產生AAV粒子之方法，其包含以下步驟：1)用酬載區、表現rep及cap基因之構築體及輔助構築體同時共轉染哺乳動物細胞，諸如但不限於HEK293細胞，2)收集及純化包含病毒基因體之AAV粒子。 細胞
本發明提供一種包含AAV聚核苷酸及/或AAV基因體之細胞。
本文所揭示之病毒產生描述用於產生AAV粒子之製程及方法，該等AAV粒子接觸目標細胞以遞送酬載構築體，例如重組病毒構築體，其包含編碼酬載分子之聚核苷酸序列。
在一些實施例中，AAV粒子可在包含昆蟲細胞之病毒複製細胞中產生。
培養物中昆蟲細胞之生長條件及培養物中昆蟲細胞中之異源產物之產生為此項技術中熟知的，參見美國專利第6,204,059號，其內容以全文引用之方式併入本文中。
可根據本發明使用允許細小病毒之複製且可維持於培養物中之任何昆蟲細胞。可使用來自草地黏蟲(Spodoptera frugiperda )之細胞株，包括但不限於Sf9或Sf21細胞株、果蠅(Drosophila )細胞株、或諸如白紋伊蚊(Aedes albopictus )來源之細胞株的蚊子細胞株。使用昆蟲細胞表現異源蛋白質有據可查，將核酸(諸如載體，例如昆蟲細胞相容載體)引入至此類細胞中之方法及將此類細胞維持於培養物中之方法亦有據可查。參見例如Methods in Molecular Biology, Richard編, Humana Press, NJ (1995)；O'Reilly等人, Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, Oxford Univ. Press (1994)；Samulski等人,J. Vir. 63:3822-8 (1989)；Kajigaya等人,Proc. Nat ' l. Acad. Sci. USA 88: 4646-50 (1991)；Ruffing等人, J. Vir. 66:6922-30 (1992)；Kimbauer等人,Vir. 219:37-44 (1996)；Zhao等人, Vir.272:382-93 (2000)；及Samulski等人，美國專利第6,204,059號，其中每一者之內容以全文引用之方式併入本文中。
病毒複製細胞可選自任何生物生物體，包括原核(例如細菌)細胞，及真核細胞，包括昆蟲細胞、酵母細胞及哺乳動物細胞。病毒複製細胞可包含哺乳動物細胞，諸如A549、WEH1、3T3、10T1/2、BHK、MDCK、COS 1、COS 7、BSC 1、BSC 40、BMT 10、VERO. W138、海拉、HEK293、Saos、C2C12、L細胞、HT1080、HepG2及來源於哺乳動物之初級纖維母細胞、肝細胞及肌母細胞。病毒複製細胞包含來源於哺乳動物物種(包括但不限於人類、猴、小鼠、大鼠、兔及倉鼠)之細胞或細胞類型，包括但不限於纖維母細胞、肝細胞、腫瘤細胞、細胞株轉型之細胞等。 AAV粒子之小規模產生
本文所揭示之病毒產生描述用於產生AAV粒子之製程及方法，該等AAV粒子接觸目標細胞以遞送酬載，例如重組病毒構築體，其包含編碼酬載之聚核苷酸序列。
在一些實施例中，AAV粒子可在包含哺乳動物細胞之病毒複製細胞中產生。
常用於產生重組AAV粒子之病毒複製細胞包括但不限於293細胞、COS細胞、海拉細胞、KB細胞及如以下中所述之其他哺乳動物細胞株：美國專利第6,156,303號、美國專利第5,387,484號、美國專利第5,741,683號、美國專利第5,691,176號及美國專利第5,688,676號；美國專利申請案2002/0081721及國際專利申請案WO 00/47757、WO 00/24916及WO 96/17947，該等文獻中之每一者之內容以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，AAV粒子在哺乳動物細胞中產生，其中全部三種VP蛋白質以接近1:1:10 (VP1:VP2:VP3)之化學計量表現。允許此受控之表現量之調控機制包括兩種mRNA之產生，一種針對VP1且另一種針對VP2及VP3，其藉由差別剪接產生。
在另一實施例中，AAV粒子使用三重轉染方法在哺乳動物細胞中產生，其中酬載構築體、細小病毒Rep及細小病毒Cap以及輔助構築體包含於三種不同構築體內。AAV粒子產生之三個組成部分之三重轉染方法可用於產生小批量病毒以用於進行包括轉導效率、目標組織(向性)評價及穩定性之分析。
AAV粒子可由三重轉染或桿狀病毒介導之病毒產生或此項技術中已知的任何其他方法產生。可採用此項技術中已知的任何適合之容許病毒感染細胞(permissive cell)或封裝細胞來產生載體。哺乳動物細胞通常為較佳的。提供自複製缺陷型輔助病毒缺失之功能的反式互補封裝細胞株，例如293細胞或其他E1a反式互補細胞亦為較佳的。
基因卡匣可含有細小病毒(例如AAV) cap及rep基因中之一些或全部。然而，較佳藉由將編碼衣殼及/或Rep蛋白質之一或多個封裝載體引入細胞中來反式提供cap及rep功能中之一些或所有。最佳地，基因卡匣不編碼衣殼或Rep蛋白質。或者，使用經穩定轉型以表現cap及/或rep基因之封裝細胞株。
在一些情況下，根據如US20160032254中所述之程序產生且自培養物上清液純化重組AAV病毒粒子，該文獻之內容以引用之方式併入。產生亦可涉及此項技術中已知之方法，包括使用293T細胞、sf9昆蟲細胞、三重轉染或任何適合的產生方法之方法。
在一些情況下，用聚乙烯亞胺(PEI)及產生AAV所需之質體(亦即AAV2 rep、腺病毒輔助構築體及ITR側接之轉基因卡匣)轉染293T細胞(黏附/懸浮)。AAV2 rep質體亦含有正在研究中之特定病毒之cap序列。在具有/不具有血清之DMEM/F17中進行轉染之後二十四小時(對於懸浮液無培養基變化)，用具有或不具有血清之新鮮培養基替換培養基。在轉染後三(3)天，自293黏附細胞之培養基獲得樣品。接著，刮下細胞或集結懸浮細胞且轉移至收容器中。對於黏附細胞，在離心以移除細胞集結粒之後，在刮下後自上清液取得第二樣品。隨後，藉由三個連續凍融循環(-80C至37C)或添加清潔劑曲拉通(triton)來達成細胞溶解。藉由離心或深度過濾來移除細胞碎片，且自培養基取得樣品3。藉由DNA qPCR，藉由抗DNA酶基因體滴定針對AAV粒子對樣品進行定量。來自此類轉染之總產量與樣品3之粒子濃度相等。
根據基因體複本數(基因體粒子數/毫升)量測AAV粒子效價。基因體粒子濃度係基於載體DNA之DNA qPCR，如先前所報導(Clark等人(1999) Hum. Gene Ther., 10:1031-1039；Veldwijk等人(2002) Mol. Ther., 6:272-278)。 桿狀病毒
本文所揭示之粒子產生描述用於產生AAV粒子之製程及方法，該等AAV粒子接觸目標細胞以遞送包含編碼酬載之聚核苷酸序列的酬載構築體。
簡言之，病毒構築體載體及AAV酬載構築體載體係藉由熟習此項技術者已知且執行之標準分子生物學技術藉由轉座子供體/接受體系統各自併入至亦稱為桿狀病毒質體之穿梭載體中。單獨病毒複製細胞群體之轉染產生兩種桿狀病毒，一種包含病毒構築體表現載體，且另一種包含AAV酬載構築體表現載體。兩種桿狀病毒可用於感染用於產生AAV粒子之單一病毒複製細胞群體。
用於在昆蟲細胞(包括但不限於草地黏蟲(Sf9)細胞)中產生病毒粒子之桿狀病毒表現載體提供高效價之病毒粒子產物。編碼病毒構築體表現載體及AAV酬載構築體表現載體之重組桿狀病毒引發病毒複製細胞之產毒性感染(productive infection)。自原發性感染釋放之感染性桿狀病毒粒子二次感染培養物中之額外細胞，在多個感染循環中按指數律成比例感染整個細胞培養物群體，其為初始感染倍率之函數，參見Urabe, M.等人, J Virol. 2006年2月; 80 (4):1874-85，其內容以全文引用之方式併入本文中。
在昆蟲細胞系統中產生具有桿狀病毒之AAV粒子可解決已知之桿狀病毒基因及物理不穩定性。在一些實施例中，產生系統藉由利用無效價之經感染細胞保存及按比例擴大系統歷經多個繼代解決桿狀病毒不穩定性。產生病毒之細胞之小規模種子培養物用編碼病毒粒子之結構性、非結構性組件之病毒表現構築體轉染。將產生桿狀病毒感染之病毒之細胞收集至可在液氮中低溫保藏之等分試樣中；等分試樣保留存活性及感染性以用於感染產生大規模病毒之細胞培養物，Wasilko DJ等人, Protein Expr Purif. 2009年6月; 65(2):122-32，其內容以全文引用之方式併入本文中。
基因穩定之桿狀病毒可用於產生用以在無脊椎動物細胞中產生AAV粒子之組件中的一或多者之來源。在一些實施例中，缺陷性桿狀病毒表現載體可游離地維持在昆蟲細胞中。在此類實施例中，穿梭載體用複製控制元件，包括但不限於啟動子、強化子及/或細胞週期調控之複製元件工程改造。
在一些實施例中，桿狀病毒可用(非)可選標記物工程改造以用於重組至殼質酶/組織蛋白酶基因座中。chia/v-cath基因座對於在組織培養物中繁殖桿狀病毒為非必要的，且V-cath (EC 3.4.22.50)係在含有Arg-Arg二肽之受質上活性最強之半胱胺酸內切蛋白酶。Arg-Arg二肽存在於濃核病毒及細小病毒衣殼結構蛋白中但在依賴病毒VP1中出現得並不頻繁。
在一些實施例中，容許桿狀病毒感染之穩定病毒複製細胞經AAV複製及病毒粒子產生所需之元件中之任一者之至少一個穩定整合複本工程改造，該等元件包括但不限於整個AAV基因體、Rep及Cap基因、Rep基因、Cap基因、呈單獨轉錄卡匣形式之各Rep蛋白質、呈單獨轉錄卡匣形式之各VP蛋白質、組裝活化蛋白(AAP)或具有原生或非原生啟動子之桿狀病毒輔助基因中之至少一者。 大規模產生
在一些實施例中，AAV粒子產生可經修改以增加產生規模。根據本發明之大規模病毒產生方法可包括教示於以下文獻中之任一者：美國專利第5,756,283號、第6,258,595號、第6,261,551號、第6,270,996號、第6,281,010號、第6,365,394號、第6,475,769號、第6,482,634號、第6,485,966號、第6,943,019號、第6,953,690號、第7,022,519號、第7,238,526號、第7,291,498號及第7,491,508號或國際公開案第WO1996039530號、第WO1998010088號、第WO1999014354號、第WO1999015685號、第WO1999047691號、第WO2000055342號、第WO2000075353號及第WO2001023597號，其中每一者之內容以全文引用之方式併入本文中。增大病毒粒子產生規模之方法通常包含增加病毒複製細胞之數目。在一些實施例中，病毒複製細胞包含黏附細胞。為增大藉由黏附病毒複製細胞進行之病毒粒子產生之規模，需要較大細胞培養物表面。在一些情況下，大規模產生方法包含使用滾瓶(roller bottle)以增加細胞培養物表面。具有增加之表面積的其他細胞培養物受質係此項技術中已知的。具有增加之表面積的額外黏附細胞培養物產物的實例包括但不限於CELLSTACK® 、CELLCUBE® (Corning公司, Corning, NY)及NUNCTM CELL FACTORYTM (Thermo Scientific, Waltham, MA.)。在一些情況下，大規模黏附細胞表面可包含約1,000 cm2 至約100,000 cm2 。在一些情況下，大規模黏附細胞培養物可包含約107 至約109 個細胞、約108 至約1010 個細胞、約109 至約1012 個細胞或至少1012 個細胞。在一些情況下，大規模黏附培養物可產生約109 至約1012 個、約1010 至約1013 個、約1011 至約1014 個、約1012 至約1015 個或至少1015 個病毒粒子。
在一些實施例中，本發明之大規模病毒產生方法可包含使用懸浮液細胞培養物。懸浮液細胞培養物允許顯著增加之細胞數目。通常，可在約10-50 cm2 表面積上生長之一定數目的黏附細胞可在懸浮液中約1 cm3 體積中生長。
呈大規模培養物形式之複製細胞之轉染可根據此項技術中已知之任何方法進行。對於大規模黏附細胞培養物，轉染方法可包括但不限於使用無機化合物(例如磷酸鈣)、有機化合物[例如聚乙二亞胺(PEI)]或使用非化學方法(例如電穿孔)。在細胞在懸浮液中生長之情況下，轉染方法可包括但不限於使用磷酸鈣及使用PEI。在一些情況下，大規模懸浮液培養物之轉染可根據Feng, L.等人, 2008. Biotechnol Appl. Biochem. 50:121-32中所描述之標題為「Transfection Procedure」之章節進行，其內容以全文引用之方式併入本文中。根據此類實施例，可形成PEI-DNA複合體以用於引入待轉染之質體。在一些情況下，用PEI-DNA複合體轉染之細胞可在轉染之前『休克(shock)』。此包含將細胞培養物溫度降低至4℃持續約1小時之時段。在一些情況下，細胞培養物可休克持續約10分鐘至約5小時之時段。在一些情況下，細胞培養物可在約0℃至約20℃之溫度下休克。
在一些情況下，轉染可包括用於表現RNA效應分子的一或多種載體以減少來自一或多個AAV酬載構築體之核酸之表現。此類方法可藉由減少在表現酬載構築體上浪費之細胞資源來增加病毒粒子之產生。在一些情況下，此類方法可根據美國公開案第US2014/0099666號中所教示之內容進行，該公開案之內容以全文引用之方式併入本文中。 生物反應器
在一些實施例中，細胞培養物生物反應器可用於大規模病毒產生。在一些情況下，生物反應器包含攪拌槽反應器。此類反應器一般包含具有攪拌器(例如葉輪)之容器，其形狀通常為圓柱形。在一些實施例中，此類生物反應器容器可置放於水套中以控制容器溫度及/或將環境溫度變化之影響最小化。生物反應器容器體積之尺寸可在以下範圍：約500 ml至約2 L、約1 L至約5 L、約2.5 L至約20 L、約10 L至約50 L、約25 L至約100 L、約75 L至約500 L、約250 L至約2,000 L、約1,000 L至約10,000 L、約5,000 L至約50,000 L或至少50,000 L。容器底部可為圓形或平坦的。在一些情況下，動物細胞培養物可維持在具有圓形容器底部之生物反應器中。
在一些情況下，生物反應器容器可經由使用熱循環器升溫。熱循環器環繞水套泵送經加熱之水。在一些情況下，經加熱之水可經由存在於生物反應器容器中之管道(例如蛇形管)泵送。在一些情況下，暖氣可在生物反應器周圍循環，包括但不限於培養基正上方之空氣空間。另外，可維持pH值及CO2 含量以最佳化細胞存活率。
在一些情況下，生物反應器可包含中空纖維反應器。中空纖維生物反應器可支撐依賴貼壁及不依賴貼壁細胞兩者之培養物。其他生物反應器可包括但不限於填充床或固定床生物反應器。此類生物反應器可包含具有用於黏附細胞附著之玻璃珠的容器。其他填充床反應器可包含陶瓷珠。
在一些情況下，病毒粒子經由使用拋棄式生物反應器產生。在一些實施例中，此類生物反應器可包括WAVETM 拋棄式生物反應器。
在一些實施例中，動物細胞生物反應器培養物中之AAV粒子產生可根據美國專利第5,064764號、第6,194,191號、第6,566,118號、第8,137,948號或美國專利申請案第US2011/0229971號中所教示之方法進行，該等文獻中之每一者之內容以全文引用之方式併入本文中。 細胞溶解
本發明之細胞，包括但不限於病毒產生細胞可根據此項技術中已知之任何方法經受細胞溶解。可進行細胞溶解，以獲得任何本發明之細胞內存在之一或多種試劑(例如病毒粒子)。在一些實施例中，細胞溶解可根據以下中所列之方法中之任一者進行：美國專利第7,326,555號、第7,579,181號、第7,048,920號、第6,410,300號、第6,436,394號、第7,732,129號、第7,510,875號、第7,445,930號、第6,726,907號、第6,194,191號、第7,125,706號、第6,995,006號、第6,676,935號、第7,968,333號、第5,756,283號、第6,258,595號、第6,261,551號、第6,270,996號、第6,281,010號、第6,365,394號、第6,475,769號、第6,482,634號、第6,485,966號、第6,943,019號、第6,953,690號、第7,022,519號、第7,238,526號、第7,291,498號及第7,491,508號，或國際公開案第WO1996039530號、第WO1998010088號、第WO1999014354號、第WO1999015685號、第WO1999047691號、第WO2000055342號、第WO2000075353號及第WO2001023597號，該等文獻中之每一者之內容以全文引用之方式併入本文中。細胞溶解方法可為化學或機械的。化學細胞溶解通常包含使一或多種細胞與一或多種溶解試劑接觸。機械溶解通常包含使一或多種細胞經受一或多種溶解條件及/或一或多種溶解力。
在一些實施例中，化學溶解可用於溶解細胞。如本文所用，術語「溶解試劑」係指可有助於破壞細胞之任何試劑。在一些情況下，將溶解試劑引入溶液中，稱為溶解溶液或溶解緩衝液。如本文所用，術語「溶解溶液」係指包含一或多種溶解試劑之溶液(通常為水性的)。除了溶解試劑之外，溶解溶液可包括一或多種緩衝劑、增溶劑、界面活性劑、防腐劑、低溫保護劑、酶、酶抑制劑及/或螯合劑。溶解緩衝液為包含一或多種緩衝劑之溶解溶液。溶解溶液之額外組分可包括一或多種增溶劑。如本文所用，術語「增溶劑」係指提高溶液之一或多種組分之溶解度及/或施用溶液之一或多種實體之溶解度的化合物。在一些情況下，增溶劑提高蛋白質溶解度。在一些情況下，基於其提高蛋白質溶解度同時維持蛋白質構形及/或活性之能力選擇增溶劑。
例示性溶解試劑可包括描述於以下中之溶解試劑中之任一者：美國專利第8,685,734號、第7,901,921號、第7,732,129號、第7,223,585號、第7,125,706號、第8,236,495號、第8,110,351號、第7,419,956號、第7,300,797號、第6,699,706號及第6,143,567號，該等專利中之每一者之內容以全文引用之方式併入本文中。在一些情況下，溶解試劑可選自溶解鹽、兩性試劑、陽離子型試劑、離子型清潔劑及非離子型清潔劑。溶解鹽可包括但不限於氯化鈉(NaCl)及氯化鉀(KCl)。其他溶解鹽可包括描述於以下中之溶解鹽中之任一者：美國專利第8,614,101號、第7,326,555號、第7,579,181號、第7,048,920號、第6,410,300號、第6,436,394號、第7,732,129號、第7,510,875號、第7,445,930號、第6,726,907號、第6,194,191號、第7,125,706號、第6,995,006號、第6,676,935號及第7,968,333號，該等專利中之每一者之內容以全文引用之方式併入本文中。可提高或降低鹽濃度以獲得使細胞膜破裂之有效濃度。如本文中所提及之兩性試劑為能夠呈酸或鹼形式進行反應之化合物。兩性試劑可包括但不限於溶血磷脂醯膽鹼、3-((3-膽醯胺基丙基)二甲基銨)-1-丙磺酸鹽(CHAPS)、ZWITTERGENT®及其類似物。陽離子型試劑可包括但不限於溴化鯨蠟基三甲銨(C (16) TAB)及苯紮氯銨。包含清潔劑之溶解試劑可包括離子型清潔劑或非離子型清潔劑。清潔劑可用以分裂或溶解細胞結構，包括但不限於細胞膜、細胞壁、脂質、碳水化合物、脂蛋白及糖蛋白。例示性離子型清潔劑包括美國專利第7,625,570號及第6,593,123號或美國公開案第US2014/0087361號中所教示之離子型清潔劑中之任一者，該等文獻中之每一者之內容以全文引用之方式併入本文中。一些離子型清潔劑可包括但不限於十二烷基硫酸鈉(SDS)、膽酸鹽及去氧膽酸鹽。在一些情況下，離子型清潔劑可作為增溶劑包括於溶解溶液中。非離子型清潔劑可包括但不限於辛基葡糖苷、毛地黃皂苷、蘆布若爾(lubrol)、C12E8、TWEEN®-20、TWEEN®-80、曲拉通X-100及諾尼戴特(Noniodet) P-40。非離子型清潔劑通常為較弱溶解試劑，但可作為增溶劑包括在內以溶解細胞及/或病毒蛋白。其他溶解試劑可包括酶及脲。在一些情況下，一或多種溶解試劑可在溶解溶液中組合以便增強細胞溶解及蛋白質溶解度中之一或多者。在一些情況下，酶抑制劑可包括於溶解溶液中以便防止可能由細胞膜破壞觸發之蛋白分解。
在一些實施例中，進行機械細胞溶解。機械細胞溶解方法可包括使用一或多種溶解條件及/或一或多種溶解力。如本文所用，術語「溶解條件」係指促進細胞破壞之狀態或情況。溶解條件可包含某些溫度、壓力、滲透純度、鹽度及其類似條件。在一些情況下，溶解條件包含上升或降低之溫度。根據一些實施例，溶解條件包含溫度變化以促進細胞破壞。根據此類實施例進行之細胞溶解可包括凍融溶解。如本文所用，術語「凍融溶解」係指其中細胞溶液經受一或多個凍融循環之細胞溶解。根據凍融溶解方法，溶液中之細胞經冷凍以誘導由冰晶體之形成及擴張引起之細胞膜的機械破壞。根據凍融溶解方法使用之細胞溶液可進一步包含一或多種溶解試劑、增溶劑、緩衝劑、低溫保護劑、界面活性劑、防腐劑、酶、酶抑制劑及/或螯合劑。一旦經受冷凍之細胞溶液解凍，此類組分可促進所要細胞產物之回收。在一些情況下，一或多種低溫保護劑包括於經歷凍融溶解之細胞溶液中。如本文所用，術語「低溫保護劑」係指用於保護一或多種物質免於由冷凍引起之損壞的試劑。低溫保護劑可包括美國公開案第US2013/0323302號或美國專利第6,503,888號、第6,180,613號、第7,888,096號、第7,091,030號中所教示之低溫保護劑中之任一者，該等專利中之每一者之內容以全文引用之方式併入本文中。在一些情況下，低溫保護劑可包括但不限於二甲亞碸、1,2-丙二醇、2,3-丁二醇、甲醯胺、丙三醇、乙二醇、1,3-丙二醇及n-二甲基甲醯胺、聚乙烯吡咯啶酮、羥乙基澱粉、瓊脂糖、聚葡萄糖、肌醇、葡萄糖、羥乙基澱粉、乳糖、山梨糖醇、甲基葡萄糖、蔗糖及脲。在一些實施例中，可根據美國專利第7,704,721號中所述之方法中之任一者進行凍融溶解，該專利之內容以全文引用之方式併入本文中。
如本文所用，術語「溶解力」係指用於破壞細胞之物理活動。溶解力可包括但不限於機械力、音波力、重力、光學力、電力及其類似力。藉由機械力進行之細胞溶解在本文中稱為「機械溶解」。可根據機械溶解使用之機械力可包括高剪切流體力。根據此類機械溶解方法，可使用微流化床。微流化床通常包含其中可施加細胞溶液之入口儲集器。隨後可經由泵(例如高壓泵)在高速及/或高壓下將細胞溶液泵送至相互作用腔室中以產生剪切流體力。所得溶解物隨後可收集於一或多個輸出儲集器中。可調整泵速度及/或壓力以調節細胞溶解且促進產物(例如病毒粒子)之回收。其他機械溶解方法可包括藉由刮擦進行的細胞之物理破壞。
可基於待溶解之細胞之細胞培養物形式選擇細胞溶解方法。舉例而言，對於黏附細胞培養物，可使用一些化學及機械溶解方法。此類機械溶解方法可包括凍融溶解或刮擦。在另一實例中，黏附細胞培養物之化學溶解可經由與包含界面活性劑(諸如曲拉通-X-100)之溶解溶液一起培育來進行。在一些情況下，由黏附細胞培養物產生之細胞溶解物可用一種多種核酸酶處理以降低由釋放之DNA產生之溶解物的黏度。
在一些實施例中，用於在無溶解之情況下收集AAV粒子之方法可用於有效及可調式AAV粒子產生。在一非限制性實例中，AAV粒子可藉由以下產生：培養不具有肝素結合位點之AAV粒子，由此允許AAV粒子進入細胞培養物中之上清液中，自培養物收集上清液；及使AAV粒子與上清液分離，如美國專利申請案20090275107中所描述，該申請案之內容以全文引用之方式併入本文中。 澄清
包含病毒粒子之細胞溶解物可經受澄清。澄清係指在純化來自細胞溶解物之病毒粒子中所採取之初始步驟。澄清藉由移除較大的不溶性碎片用來準備溶解物進行進一步純化。澄清步驟可包括但不限於離心及過濾。在澄清期間，離心可在低速下進行以僅移除較大碎片。類似地，過濾可使用具有較大孔隙尺寸之過濾器進行以使得僅移除較大碎片。在一些情況下，可在澄清期間使用切向流過濾。病毒澄清之目的包括高通量處理細胞溶解物及最佳化最終病毒回收。包括澄清步驟之優勢包括處理較大體積之溶解物之可調能力。在一些實施例中，澄清可根據以下中所呈現之方法中之任一者進行：美國專利第8,524,446號、第5,756,283號、第6,258,595號、第6,261,551號、第6,270,996號、第6,281,010號、第6,365,394號、第6,475,769號、第6,482,634號、第6,485,966號、第6,943,019號、第6,953,690號、第7,022,519號、第7,238,526號、第7,291,498號、第7,491,508號，美國公開案第US2013/0045186號、第US2011/0263027號、第US2011/0151434號、第US2003/0138772號，及國際公開案第WO2002012455號、第WO1996039530號、第WO1998010088號、第WO1999014354號、第WO1999015685號、第WO1999047691號、第WO2000055342號、第WO2000075353號及第WO2001023597號，該等文獻中之每一者之內容以全文引用之方式併入本文中。
藉由過濾進行細胞溶解物澄清之方法為此項技術中所充分理解且可根據包括但不限於被動過濾及流式過濾之多種可用方法進行。所用過濾器可包含多種材料及孔隙尺寸。舉例而言，細胞溶解物過濾器可包含約1 µM至約5 µM、約0.5 µM至約2 µM、約0.1 µM至約1 µM、約0.05 µM至約0.05 µM及約0.001 µM至約0.1 µM之孔隙尺寸。細胞溶解物過濾器之例示性孔隙尺寸可包括但不限於2.0、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.95、0.9、0.85、0.8、0.75、0.7、0.65、0.6、0.55、0.5、0.45、0.4、0.35、0.3、0.25、0.2、0.15、0.1、0.05、0.22、0.21、0.20、0.19、0.18、0.17、0.16、0.15、0.14、0.13、0.12、0.11、0.1、0.09、0.08、0.07、0.06、0.05、0.04、0.03、0.02、0.01、0.02、0.019、0.018、0.017、0.016、0.015、0.014、0.013、0.012、0.011、0.01、0.009、0.008、0.007、0.006、0.005、0.004、0.003、0.002、0.001及0.001 µM。在一些實施例中，澄清可包含經由孔隙尺寸為2.0 µM之過濾器進行過濾以移除較大碎片，接著穿過孔隙尺寸為0.45 µM之過濾器以移除完整細胞。
過濾器材料可由多種材料構成。此類材料可包括但不限於聚合材料及金屬材料(例如燒結金屬及多孔鋁)。例示性材料可包括但不限於耐綸、纖維素材料(例如乙酸纖維素)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚醚碸、聚醯胺、聚碸、聚丙烯及聚對苯二甲酸伸乙酯。在一些情況下，適用於澄清細胞溶解物之過濾器可包括但不限於ULTIPLEAT PROFILE™過濾器(Pall公司, Port Washington, NY)、SUPOR™膜過濾器(Pall公司, Port Washington, NY)。
在一些情況下，可進行流式過濾以提高過濾速度及/或有效性。在一些情況下，流式過濾可包含真空過濾。根據此類方法，在與待過濾之細胞溶解物側相對的過濾器側上產生真空。在一些情況下，細胞溶解物可藉由離心力穿過過濾器。在一些情況下，使用泵迫使細胞溶解物穿過澄清過濾器。細胞溶解物穿過一或多個過濾器之流動速率可藉由調整通道尺寸及/或流體壓力中之一者來調節。
根據一些實施例，細胞溶解物可藉由離心澄清。可使用離心使溶解物中之不溶性粒子集結。在澄清期間，離心強度[以重力單位(g)表示，其表示標準重力之倍數]可低於後續純化步驟中之離心強度。在一些情況下，可以約200 g至約800 g、約500 g至約1500 g、約1000 g至約5000 g、約1200 g至約10000 g或約8000 g至約15000 g對細胞溶解物進行離心。在一些實施例中，細胞溶解物離心在8000 g下進行15分鐘。在一些情況下，可進行密度梯度離心以便藉由沈降速率分隔細胞溶解物中之微粒。根據本發明之方法使用之梯度可包括但不限於氯化銫梯度及碘克沙醇階段梯度。 純化：層析
在一些情況下，AAV粒子可藉由一或多種層析方法自經澄清之細胞溶解物純化。層析係指用於自混合物分離出一或多種元素之此項技術中已知之任何數目的方法。此類方法可包括但不限於離子交換層析(例如陽離子交換層析及陰離子交換層析)、免疫親和層析及尺寸排阻層析。在一些實施例中，病毒層析方法可包括教示於以下中之方法中之任一者：美國專利第5,756,283號、第6,258,595號、第6,261,551號、第6,270,996號、第6,281,010號、第6,365,394號、第6,475,769號、第6,482,634號、第6,485,966號、第6,943,019號、第6,953,690號、第7,022,519號、第7,238,526號、第7,291,498號及第7,491,508號或國際公開案第WO1996039530號、第WO1998010088號、第WO1999014354號、第WO1999015685號、第WO1999047691號、第WO2000055342號、第WO2000075353號及第WO2001023597號，該等文獻中之每一者之內容以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，可使用離子交換層析分離病毒粒子。使用離子交換層析以基於存在於固定相(通常為病毒製備物(例如經澄清溶解物)穿過之管柱)上之衣殼蛋白與帶電位點之間的電荷-電荷相互作用結合病毒粒子。在施加病毒製備物之後，隨後可藉由施加溶離溶液溶離經結合之病毒粒子以破壞電荷-電荷相互作用。溶離溶液可藉由調整鹽濃度及/或pH值最佳化以促進經結合之病毒粒子的回收。視所分離之病毒衣殼之電荷而定，可選擇陽離子或陰離子交換層析法。離子交換層析之方法可包括但不限於美國專利第7,419,817號、第6,143,548號、第7,094,604號、第6,593,123號、第7,015,026號及第8,137,948號中所教示之方法中之任一者，該等專利中之每一者之內容以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，可使用免疫親和層析。免疫親和層析係利用一或多種免疫化合物(例如抗體或抗體相關結構)保留病毒粒子之層析形式。免疫化合物可特異性地結合於病毒粒子表面上之一或多種結構，包括但不限於一或多種病毒鞘蛋白。在一些情況下，免疫化合物可對特定病毒變異體具有特異性。在一些情況下，免疫化合物可與多種病毒變異體結合。在一些實施例中，免疫化合物可包括重組單鏈抗體。此類重組單鏈抗體可包括Smith, R.H.等人, 2009. Mol. Ther. 17(11):1888-96中所述之重組單鏈抗體，該文獻之內容以全文引用之方式併入本文中。此類免疫化合物能夠與包括但不限於AAV1、AAV2、AAV6及AAV8之若干AAV衣殼變異體結合。
在一些實施例中，可使用尺寸排阻層析(SEC)。SEC可包含使用凝膠以根據尺寸分離粒子。在病毒粒子純化中，SEC過濾有時稱作「精製(polishing)」。在一些情況下，可進行SEC以產生幾乎均質之最終產物。此類最終產物可在某些情況下用於臨床前研究及/或臨床研究(Kotin, R.M. 2011. Human Molecular Genetics. 20(1):R2-R6，其內容以全文引用之方式併入本文中)。在一些情況下，SEC可根據以下中所教示之方法中之任一者進行：美國專利第6,143,548號、第7,015,026號、第8,476,418號、第6,410,300號、第8,476,418號、第7,419,817號、第7,094,604號、第6,593,123號及第8,137,948號，其中每一者之內容以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，包含至少一種AAV粒子之組合物可使用美國專利第US 6146874號中所述之方法分離或純化，該專利之內容以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，包含至少一種AAV粒子之組合物可使用美國專利第US 6660514號中所述之方法分離或純化，該專利之內容以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，包含至少一種AAV粒子之組合物可使用美國專利第US 8283151號中所述之方法分離或純化，該專利之內容以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，包含至少一種AAV粒子之組合物可使用美國專利第US 8524446號中所述之方法分離或純化，該專利之內容以全文引用之方式併入本文中。 II. 調配及遞送醫藥組合物及調配物
除了醫藥組合物(包含編碼siRNA分子之調節聚核苷酸序列之AAV粒子)之外，本文提供適用於向人類投與之醫藥組合物，熟習此項技術者應理解此類組合物一般適用於向任何其他動物(例如非人類動物，例如非人類哺乳動物)投與。充分理解為使適合於向人類投與之醫藥組合物適合於向各種動物投與，對該等組合物進行之修改，且一般熟練的獸醫藥理學家可僅藉由普通實驗(若存在)設計及/或進行此類修改。醫藥組合物之投與所涵蓋的個體包括但不限於人類及/或其他靈長類動物；哺乳動物，包括商業相關之哺乳動物，諸如牛、豬、馬、綿羊、貓、狗、小鼠及/或大鼠；及/或鳥類，包括商業相關之鳥類，諸如家禽、雞、鴨、鵝及/或火雞。
在一些實施例中，向有需要之個體、人類或人類患者投與組合物。出於本發明之目的，片語「活性成分」一般指合成siRNA雙螺旋體、編碼siRNA雙螺旋體之調節聚核苷酸，或包含編碼本文中所描述之siRNA雙螺旋體之調節聚核苷酸的AAV粒子。
本文所描述之醫藥組合物的調配物可藉由藥理學技術中已知或此後開發之任何方法來製備。一般而言，此類製備方法包括以下步驟：使活性成分與賦形劑及/或一或多種其他附屬成分結合，且隨後在必要及/或需要時，將產物分割、成型及/或封裝成所要單劑量或多劑量單元。
根據本發明之醫藥組合物中活性成分、醫藥學上可接受之賦形劑及/或任何額外成分之相對量將視治療之個體之身分、體型及/或病狀且進一步視組合物投與之途徑而變化。
可使用一或多種賦形劑調配包含編碼本發明之siRNA分子之調節聚核苷酸序列的AAV粒子以：(1)增加穩定性；(2)增加細胞轉染或轉導；(3)准許持續或延遲釋放；或(4)改變生物分佈(例如，使AAV粒子靶向諸如腦及神經元之特定組織或細胞類型)。
本發明之調配物可包括但不限於生理鹽水、類脂質(lipidoid)、脂質體、脂質奈米粒子、聚合物、脂複合體、核殼奈米粒子、肽、蛋白質、用AAV粒子轉染之細胞(例如用於移植於個體中)、奈米粒子模擬物及其組合。另外，本發明之AAV粒子可使用自組裝之核酸奈米粒子調配。
本文所描述之醫藥組合物的調配物可藉由藥理學技術中已知或此後開發之任何方法來製備。一般而言，此類製備方法包括使活性成分與賦形劑及/或一或多種其他附屬成分結合之步驟。
根據本發明之醫藥組合物可以散裝、以單一單位劑量形式及/或以複數個單一單位劑量形式製備、封裝及/或出售。如本文所用，「單位劑量」係指包含預定量之活性成分之醫藥組合物的離散量。活性成分之量一般等於將向個體投與之活性成分之劑量及/或此類劑量之適宜分數，諸如此類劑量之二分之一或三分之一。
根據本發明之醫藥組合物中之活性成分、醫藥學上可接受之賦形劑及/或任何額外成分的相對量可視治療之個體之身分、體型及/或病狀且進一步視組合物投與之途徑而變化。舉例而言，組合物可包含0.1%與99% (w/w)之間的活性成分。舉例而言，組合物可包含0.1%與100%之間、例如.5與50%之間、1-30%之間、5-80%之間、至少80% (w/w)的活性成分。
在一些實施例中，醫藥學上可接受之賦形劑可為至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%純的。在一些實施例中，賦形劑經批准用於人類及用於獸醫學用途。在一些實施例中，賦形劑可經美國食品及藥物管理局(United States Food and Drug Administration)批准。在一些實施例中，賦形劑可為醫藥級的。在一些實施例中，賦形劑可滿足美國藥典(United States Pharmacopoeia，USP)、歐洲藥典(European Pharmacopoeia，EP)、英國藥典(British Pharmacopoeia)及/或國際藥典(International Pharmacopoeia)之標準。
如本文所用，賦形劑包括但不限於適用於所要特定劑型的任何及全部溶劑、分散介質、稀釋劑或其他液體媒劑、分散或懸浮助劑、表面活性劑、等張劑、增稠或乳化劑、防腐劑及其類似物。用於調配醫藥組合物之各種賦形劑及用於製備該組合物之技術為此項技術中已知的(參見Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第21版, A. R. Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006；以全文引用之方式併入本文中)。除非任何習知賦形劑介質可能與物質或其衍生物不相容，諸如產生任何不合需要的生物作用或以其他方式與醫藥組合物之任何其他一或多種組分以有害的方式相互作用，否則習知賦形劑介質之使用可涵蓋於本發明之範疇內。
例示性稀釋劑包括但不限於碳酸鈣、碳酸鈉、磷酸鈣、磷酸二鈣、硫酸鈣、磷酸氫鈣、磷酸鈉乳糖、蔗糖、纖維素、微晶纖維素、高嶺土、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、氯化鈉、乾燥澱粉、玉米澱粉、粉末狀糖等，及/或其組合。
在一些實施例中，可用於調配醫藥組合物之額外賦形劑可包括MgCl2 、精胺酸、山梨糖醇及/或海藻糖。
在一些實施例中，調配物可包含至少一種非活性成分。如本文所用，術語「非活性成分」係指包括於調配物中之一或多種非活性試劑。在一些實施例中，可用於本發明之調配物中之非活性成分可全部、皆未或其中一些經美國食品及藥物管理局(FDA)批准。
包含本發明之siRNA分子之核酸序列的載體之調配物可包括陽離子或陰離子。在一些實施例中，調配物包括金屬陽離子，諸如但不限於Zn2+、Ca2+、Cu2+、Mg+及其組合。
如本文所用，「醫藥學上可接受之鹽」係指本發明化合物之衍生物，其中藉由將存在之酸或鹼部分轉化為其鹽形式(例如藉由使游離鹼基團與適合之有機酸反應)來修飾親本化合物。醫藥學上可接受之鹽的實例包括但不限於鹼性殘基(諸如胺)之無機酸鹽或有機酸鹽；酸性殘基(諸如羧酸)之鹼金屬鹽或有機鹽；及其類似鹽。代表性酸加成鹽包括乙酸鹽、乙酸、己二酸鹽、海藻酸鹽、抗壞血酸鹽、天冬胺酸鹽、苯磺酸鹽、苯磺酸、苯甲酸鹽、硫酸氫鹽、硼酸鹽、丁酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、檸檬酸鹽、環戊烷丙酸鹽、二葡糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙磺酸鹽、反丁烯二酸鹽、葡庚糖酸鹽、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、氫溴酸鹽、鹽酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基-乙磺酸鹽、乳糖酸鹽、乳酸鹽、月桂酸鹽、月桂基硫酸鹽、蘋果酸鹽、順丁烯二酸鹽、丙二酸鹽、甲磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、菸鹼酸鹽、硝酸鹽、油酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、雙羥萘酸鹽、果膠酸鹽、過硫酸鹽、3-苯基丙酸鹽、磷酸鹽、苦味酸鹽、特戊酸鹽、丙酸鹽、硬脂酸鹽、丁二酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、甲苯磺酸鹽、十一烷酸鹽、戊酸鹽及其類似物。代表性鹼金屬或鹼土金屬鹽包括鈉、鋰、鉀、鈣、鎂及其類似物，以及無毒性銨、四級銨及胺陽離子，包括但不限於銨、四甲銨、四乙銨、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺及其類似物。本發明之醫藥學上可接受之鹽包括例如由無毒無機酸或有機酸形成之親本化合物的習知無毒鹽。本發明之醫藥學上可接受之鹽可藉由習知化學方法由含有鹼性或酸性部分之親本化合物合成。一般而言，此類鹽可藉由使此等化合物之游離酸或鹼形式與化學計算量之合適鹼或酸在水中或在有機溶劑中或在兩者之混合物中反應來製備；一般而言，非水性介質(如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、異丙醇或乙腈)較佳。適合之鹽的清單見於Remington ' s Pharmaceutical Sciences , 第17版, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985, 第1418頁；Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, P.H. Stahl及C.G. Wermuth (編), Wiley-VCH, 2008，及Berge等人,Journal of Pharmaceutical Science , 66, 1-19 (1977)中；該等文獻中之每一者的內容以全文引用之方式併入本文中。
如本文所用，術語「醫藥學上可接受之溶劑合物」意謂在晶格中併入有適合溶劑分子的本發明化合物。適合的溶劑在所投與之劑量下為生理學上可耐受的。舉例而言，溶劑合物可自包括有機溶劑、水或其混合物之溶液藉由結晶、再結晶或沈澱製備。適合溶劑之實例為乙醇、水(例如單水合物、二水合物及三水合物)、N- 甲基吡咯啶酮(NMP)、二甲亞碸(DMSO)、N ,N ' -二甲基甲醯胺(DMF)、N ,N ' -二甲基乙醯胺(DMAC)、1,3-二甲基-2-咪唑啶酮(DMEU)、1,3-二甲基-3,4,5,6-四氫-2-(1H)-嘧啶酮(DMPU)、乙腈(ACN)、丙二醇、乙酸乙酯、苯甲醇、2-吡咯啶酮、苯甲酸苯甲酯及其類似物。當水為溶劑時，溶劑合物稱為「水合物」。
根據本發明，包含編碼siRNA分子之調節聚核苷酸序列之AAV粒子可經調配用於CNS遞送。可使用穿過腦血障壁之試劑。舉例而言，可使siRNA分子靶向腦血障壁內皮之一些細胞穿透肽可用於調配靶向HTT基因之siRNA雙螺旋體。 磷酸鈉
在一些實施例中，調配物中之組分中之至少一者為磷酸鈉。調配物可包括磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉或磷酸二氫鈉與磷酸氫二鈉之組合。
在一些實施例中，調配物中磷酸鈉之濃度可為但不限於0.1 mM、0.2 mM、0.3 mM、0.4 mM、0.5 mM、0.6 mM、0.7 mM、0.8 mM、0.9 mM、1 mM、1.1 mM、1.2 mM、1.3 mM、1.4 mM、1.5 mM、1.6 mM、1.7 mM、1.8 mM、1.9 mM、2 mM、2.1 mM、2.2 mM、2.3 mM、2.4 mM、2.5 mM、2.6 mM、2.7 mM、2.8 mM、2.9 mM、3 mM、3.1 mM、3.2 mM、3.3 mM、3.4 mM、3.5 mM、3.6 mM、3.7 mM、3.8 mM、3.9 mM、4 mM、4.1 mM、4.2 mM、4.3 mM、4.4 mM、4.5 mM、4.6 mM、4.7 mM、4.8 mM、4.9 mM、5 mM、5.1 mM、5.2 mM、5.3 mM、5.4 mM、5.5 mM、5.6 mM、5.7 mM、5.8 mM、5.9 mM、6 mM、6.1 mM、6.2 mM、6.3 mM、6.4 mM、6.5 mM、6.6 mM、6.7 mM、6.8 mM、6.9 mM、7 mM、7.1 mM、7.2 mM、7.3 mM、7.4 mM、7.5 mM、7.6 mM、7.7 mM、7.8 mM、7.9 mM、8 mM、8.1 mM、8.2 mM、8.3 mM、8.4 mM、8.5 mM、8.6 mM、8.7 mM、8.8 mM、8.9 mM、9 mM、9.1 mM、9.2 mM、9.3 mM、9.4 mM、9.5 mM、9.6 mM、9.7 mM、9.8 mM、9.9 mM、10 mM、10.1 mM、10.2 mM、10.3 mM、10.4 mM、10.5 mM、10.6 mM、10.7 mM、10.8 mM、10.9 mM、11 mM、11.1 mM、11.2 mM、11.3 mM、11.4 mM、11.5 mM、11.6 mM、11.7 mM、11.8 mM、11.9 mM、12 mM、12.1 mM、12.2 mM、12.3 mM、12.4 mM、12.5 mM、12.6 mM、12.7 mM、12.8 mM、12.9 mM、13 mM、13.1 mM、13.2 mM、13.3 mM、13.4 mM、13.5 mM、13.6 mM、13.7 mM、13.8 mM、13.9 mM、14 mM、14.1 mM、14.2 mM、14.3 mM、14.4 mM、14.5 mM、14.6 mM、14.7 mM、14.8 mM、14.9 mM或15 mM。
調配物可包括在以下範圍內之磷酸鈉：0-0.5 mM、0.1-0.6 mM、0.2-0.7 mM、0.3-0.8 mM、0.4-0.9 mM、0.5-1 mM、0.6-1.1 mM、0.7-1.2 mM、0.8-1.3 mM、0.9-1.4 mM、1-1.5 mM、1.1-1.6 mM、1.2-1.7 mM、1.3-1.8 mM、1.4-1.9 mM、1.5-2 mM、1.6-2.1 mM、1.7-2.2 mM、1.8-2.3 mM、1.9-2.4 mM、2-2.5 mM、2.1-2.6 mM、2.2-2.7 mM、2.3-2.8 mM、2.4-2.9 mM、2.5-3 mM、2.6-3.1 mM、2.7-3.2 mM、2.8-3.3 mM、2.9-3.4 mM、3-3.5 mM、3.1-3.6 mM、3.2-3.7 mM、3.3-3.8 mM、3.4-3.9 mM、3.5-4 mM、3.6-4.1 mM、3.7-4.2 mM、3.8-4.3 mM、3.9-4.4 mM、4-4.5 mM、4.1-4.6 mM、4.2-4.7 mM、4.3-4.8 mM、4.4-4.9 mM、4.5-5 mM、4.6-5.1 mM、4.7-5.2 mM、4.8-5.3 mM、4.9-5.4 mM、5-5.5 mM、5.1-5.6 mM、5.2-5.7 mM、5.3-5.8 mM、5.4-5.9 mM、5.5-6 mM、5.6-6.1 mM、5.7-6.2 mM、5.8-6.3 mM、5.9-6.4 mM、6-6.5 mM、6.1-6.6 mM、6.2-6.7 mM、6.3-6.8 mM、6.4-6.9 mM、6.5-7 mM、6.6-7.1 mM、6.7-7.2 mM、6.8-7.3 mM、6.9-7.4 mM、7-7.5 mM、7.1-7.6 mM、7.2-7.7 mM、7.3-7.8 mM、7.4-7.9 mM、7.5-8 mM、7.6-8.1 mM、7.7-8.2 mM、7.8-8.3 mM、7.9-8.4 mM、8-8.5 mM、8.1-8.6 mM、8.2-8.7 mM、8.3-8.8 mM、8.4-8.9 mM、8.5-9 mM、8.6-9.1 mM、8.7-9.2 mM、8.8-9.3 mM、8.9-9.4 mM、9-9.5 mM、9.1-9.6 mM、9.2-9.7 mM、9.3-9.8 mM、9.4-9.9 mM、9.5-10 mM、9.6-10.1 mM、9.7-10.2 mM、9.8-10.3 mM、9.9-10.4 mM、10-10.5 mM、10.1-10.6 mM、10.2-10.7 mM、10.3-10.8 mM、10.4-10.9 mM、10.5-11 mM、10.6-11.1 mM、10.7-11.2 mM、10.8-11.3 mM、10.9-11.4 mM、11-11.5 mM、11.1-11.6 mM、11.2-11.7 mM、11.3-11.8 mM、11.4-11.9 mM、11.5-12 mM、11.6-12.1 mM、11.7-12.2 mM、11.8-12.3 mM、11.9-12.4 mM、12-12.5 mM、12.1-12.6 mM、12.2-12.7 mM、12.3-12.8 mM、12.4-12.9 mM、12.5-13 mM、12.6-13.1 mM、12.7-13.2 mM、12.8-13.3 mM、12.9-13.4 mM、13-13.5 mM、13.1-13.6 mM、13.2-13.7 mM、13.3-13.8 mM、13.4-13.9 mM、13.5-14 mM、13.6-14.1 mM、13.7-14.2 mM、13.8-14.3 mM、13.9-14.4 mM、14-14.5 mM、14.1-14.6 mM、14.2-14.7 mM、14.3-14.8 mM、14.4-14.9 mM、14.5-15 mM、0-1 mM、1-2 mM、2-3 mM、3-4 mM、4-5 mM、5-6 mM、6-7 mM、7-8 mM、8-9 mM、9-10 mM、10-11 mM、11-12 mM、12-13 mM、13-14 mM、14-15 mM、15-16 mM、0-2 mM、1-3 mM、2-4 mM、3-5 mM、4-6 mM、5-7 mM、6-8 mM、7-9 mM、8-10 mM、9-11 mM、10-12 mM、11-13 mM、12-14 mM、13-15 mM、0-3 mM、1-4 mM、2-5 mM、3-6 mM、4-7 mM、5-8 mM、6-9 mM、7-10 mM、8-11 mM、9-12 mM、10-13 mM、11-14 mM、12-15 mM、0-4 mM、1-5 mM、2-6 mM、3-7 mM、4-8 mM、5-9 mM、6-10 mM、7-11 mM、8-12 mM、9-13 mM、10-14 mM、11-15 mM、0-5 mM、1-6 mM、2-7 mM、3-8 mM、4-9 mM、5-10 mM、6-11 mM、7-12 mM、8-13 mM、9-14 mM、10-15 mM、0-6 mM、1-7 mM、2-8 mM、3-9 mM、4-10 mM、5-11 mM、6-12 mM、7-13 mM、8-14 mM、9-15 mM、0-7 mM、1-8 mM、2-9 mM、3-10 mM、4-11 mM、5-12 mM、6-13 mM、7-14 mM、8-15 mM、0-8 mM、1-9 mM、2-10 mM、3-11 mM、4-12 mM、5-13 mM、6-14 mM、7-15 mM、0-9 mM、1-10 mM、2-11 mM、3-12 mM、4-13 mM、5-14 mM、6-15 mM、0-10 mM、1-11 mM、2-12 mM、3-13 mM、4-14 mM、5-15 mM、0-11 mM、1-12 mM、2-13 mM、3-14 mM、4-15 mM、0-12 mM、1-13 mM、2-14 mM、3-15 mM、0-13 mM、1-14 mM、2-15 mM、0-14 mM、1-15 mM或0-15 mM。
在一些實施例中，調配物可包括0-10 mM之磷酸鈉。
在一些實施例中，調配物可包括2-3 mM之磷酸鈉。
在一些實施例中，調配物可包括2.7 mM之磷酸鈉。
在一些實施例中，調配物可包括9-10 mM之磷酸鈉。
在一些實施例中，調配物可包括10-11 mM之磷酸鈉。
在一些實施例中，調配物可包括10 mM之磷酸鈉。 磷酸鉀
在一些實施例中，調配物中組分中之至少一者為磷酸鉀。調配物可包括磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀或磷酸二氫鉀與磷酸氫二鉀之組合。
在一些實施例中，調配物中磷酸鉀之濃度可為但不限於0.1 mM、0.2 mM、0.3 mM、0.4 mM、0.5 mM、0.6 mM、0.7 mM、0.8 mM、0.9 mM、1 mM、1.1 mM、1.2 mM、1.3 mM、1.4 mM、1.5 mM、1.6 mM、1.7 mM、1.8 mM、1.9 mM、2 mM、2.1 mM、2.2 mM、2.3 mM、2.4 mM、2.5 mM、2.6 mM、2.7 mM、2.8 mM、2.9 mM、3 mM、3.1 mM、3.2 mM、3.3 mM、3.4 mM、3.5 mM、3.6 mM、3.7 mM、3.8 mM、3.9 mM、4 mM、4.1 mM、4.2 mM、4.3 mM、4.4 mM、4.5 mM、4.6 mM、4.7 mM、4.8 mM、4.9 mM、5 mM、5.1 mM、5.2 mM、5.3 mM、5.4 mM、5.5 mM、5.6 mM、5.7 mM、5.8 mM、5.9 mM、6 mM、6.1 mM、6.2 mM、6.3 mM、6.4 mM、6.5 mM、6.6 mM、6.7 mM、6.8 mM、6.9 mM、7 mM、7.1 mM、7.2 mM、7.3 mM、7.4 mM、7.5 mM、7.6 mM、7.7 mM、7.8 mM、7.9 mM、8 mM、8.1 mM、8.2 mM、8.3 mM、8.4 mM、8.5 mM、8.6 mM、8.7 mM、8.8 mM、8.9 mM、9 mM、9.1 mM、9.2 mM、9.3 mM、9.4 mM、9.5 mM、9.6 mM、9.7 mM、9.8 mM、9.9 mM、10 mM、10.1 mM、10.2 mM、10.3 mM、10.4 mM、10.5 mM、10.6 mM、10.7 mM、10.8 mM、10.9 mM、11 mM、11.1 mM、11.2 mM、11.3 mM、11.4 mM、11.5 mM、11.6 mM、11.7 mM、11.8 mM、11.9 mM、12 mM、12.1 mM、12.2 mM、12.3 mM、12.4 mM、12.5 mM、12.6 mM、12.7 mM、12.8 mM、12.9 mM、13 mM、13.1 mM、13.2 mM、13.3 mM、13.4 mM、13.5 mM、13.6 mM、13.7 mM、13.8 mM、13.9 mM、14 mM、14.1 mM、14.2 mM、14.3 mM、14.4 mM、14.5 mM、14.6 mM、14.7 mM、14.8 mM、14.9 mM或15 mM。
調配物可包括以下範圍內之磷酸鉀：0-0.5 mM、0.1-0.6 mM、0.2-0.7 mM、0.3-0.8 mM、0.4-0.9 mM、0.5-1 mM、0.6-1.1 mM、0.7-1.2 mM、0.8-1.3 mM、0.9-1.4 mM、1-1.5 mM、1.1-1.6 mM、1.2-1.7 mM、1.3-1.8 mM、1.4-1.9 mM、1.5-2 mM、1.6-2.1 mM、1.7-2.2 mM、1.8-2.3 mM、1.9-2.4 mM、2-2.5 mM、2.1-2.6 mM、2.2-2.7 mM、2.3-2.8 mM、2.4-2.9 mM、2.5-3 mM、2.6-3.1 mM、2.7-3.2 mM、2.8-3.3 mM、2.9-3.4 mM、3-3.5 mM、3.1-3.6 mM、3.2-3.7 mM、3.3-3.8 mM、3.4-3.9 mM、3.5-4 mM、3.6-4.1 mM、3.7-4.2 mM、3.8-4.3 mM、3.9-4.4 mM、4-4.5 mM、4.1-4.6 mM、4.2-4.7 mM、4.3-4.8 mM、4.4-4.9 mM、4.5-5 mM、4.6-5.1 mM、4.7-5.2 mM、4.8-5.3 mM、4.9-5.4 mM、5-5.5 mM、5.1-5.6 mM、5.2-5.7 mM、5.3-5.8 mM、5.4-5.9 mM、5.5-6 mM、5.6-6.1 mM、5.7-6.2 mM、5.8-6.3 mM、5.9-6.4 mM、6-6.5 mM、6.1-6.6 mM、6.2-6.7 mM、6.3-6.8 mM、6.4-6.9 mM、6.5-7 mM、6.6-7.1 mM、6.7-7.2 mM、6.8-7.3 mM、6.9-7.4 mM、7-7.5 mM、7.1-7.6 mM、7.2-7.7 mM、7.3-7.8 mM、7.4-7.9 mM、7.5-8 mM、7.6-8.1 mM、7.7-8.2 mM、7.8-8.3 mM、7.9-8.4 mM、8-8.5 mM、8.1-8.6 mM、8.2-8.7 mM、8.3-8.8 mM、8.4-8.9 mM、8.5-9 mM、8.6-9.1 mM、8.7-9.2 mM、8.8-9.3 mM、8.9-9.4 mM、9-9.5 mM、9.1-9.6 mM、9.2-9.7 mM、9.3-9.8 mM、9.4-9.9 mM、9.5-10 mM、9.6-10.1 mM、9.7-10.2 mM、9.8-10.3 mM、9.9-10.4 mM、10-10.5 mM、10.1-10.6 mM、10.2-10.7 mM、10.3-10.8 mM、10.4-10.9 mM、10.5-11 mM、10.6-11.1 mM、10.7-11.2 mM、10.8-11.3 mM、10.9-11.4 mM、11-11.5 mM、11.1-11.6 mM、11.2-11.7 mM、11.3-11.8 mM、11.4-11.9 mM、11.5-12 mM、11.6-12.1 mM、11.7-12.2 mM、11.8-12.3 mM、11.9-12.4 mM、12-12.5 mM、12.1-12.6 mM、12.2-12.7 mM、12.3-12.8 mM、12.4-12.9 mM、12.5-13 mM、12.6-13.1 mM、12.7-13.2 mM、12.8-13.3 mM、12.9-13.4 mM、13-13.5 mM、13.1-13.6 mM、13.2-13.7 mM、13.3-13.8 mM、13.4-13.9 mM、13.5-14 mM、13.6-14.1 mM、13.7-14.2 mM、13.8-14.3 mM、13.9-14.4 mM、14-14.5 mM、14.1-14.6 mM、14.2-14.7 mM、14.3-14.8 mM、14.4-14.9 mM、14.5-15 mM、0-1 mM、1-2 mM、2-3 mM、3-4 mM、4-5 mM、5-6 mM、6-7 mM、7-8 mM、8-9 mM、9-10 mM、10-11 mM、11-12 mM、12-13 mM、13-14 mM、14-15 mM、15-16 mM、0-2 mM、1-3 mM、2-4 mM、3-5 mM、4-6 mM、5-7 mM、6-8 mM、7-9 mM、8-10 mM、9-11 mM、10-12 mM、11-13 mM、12-14 mM、13-15 mM、0-3 mM、1-4 mM、2-5 mM、3-6 mM、4-7 mM、5-8 mM、6-9 mM、7-10 mM、8-11 mM、9-12 mM、10-13 mM、11-14 mM、12-15 mM、0-4 mM、1-5 mM、2-6 mM、3-7 mM、4-8 mM、5-9 mM、6-10 mM、7-11 mM、8-12 mM、9-13 mM、10-14 mM、11-15 mM、0-5 mM、1-6 mM、2-7 mM、3-8 mM、4-9 mM、5-10 mM、6-11 mM、7-12 mM、8-13 mM、9-14 mM、10-15 mM、0-6 mM、1-7 mM、2-8 mM、3-9 mM、4-10 mM、5-11 mM、6-12 mM、7-13 mM、8-14 mM、9-15 mM、0-7 mM、1-8 mM、2-9 mM、3-10 mM、4-11 mM、5-12 mM、6-13 mM、7-14 mM、8-15 mM、0-8 mM、1-9 mM、2-10 mM、3-11 mM、4-12 mM、5-13 mM、6-14 mM、7-15 mM、0-9 mM、1-10 mM、2-11 mM、3-12 mM、4-13 mM、5-14 mM、6-15 mM、0-10 mM、1-11 mM、2-12 mM、3-13 mM、4-14 mM、5-15 mM、0-11 mM、1-12 mM、2-13 mM、3-14 mM、4-15 mM、0-12 mM、1-13 mM、2-14 mM、3-15 mM、0-13 mM、1-14 mM、2-15 mM、0-14 mM、1-15 mM或0-15 mM。
在一些實施例中，調配物可包括0-10 mM磷酸鉀。
在一些實施例中，調配物可包括1-3 mM磷酸鉀。
在一些實施例中，調配物可包括1-2 mM磷酸鉀。
在一些實施例中，調配物可包括2-3 mM磷酸鉀。
在一些實施例中，調配物可包括1.5 mM磷酸鉀。在一些實施例中，調配物可包括1.54 mM磷酸鉀。
在一些實施例中，調配物可包括2 mM磷酸鉀。 氯化鈉
在一些實施例中，調配物中組分中之至少一者為氯化鈉。
在一些實施例中，調配物中氯化鈉之濃度可為但不限於75 mM、76 mM、77 mM、78 mM、79 mM、80 mM、81 mM、82 mM、83 mM、84 mM、85 mM、86 mM、87 mM、88 mM、89 mM、90 mM、91 mM、92 mM、93 mM、94 mM、95 mM、96 mM、97 mM、98 mM、99 mM、100 mM、101 mM、102 mM、103 mM、104 mM、105 mM、106 mM、107 mM、108 mM、109 mM、110 mM、111 mM、112 mM、113 mM、114 mM、115 mM、116 mM、117 mM、118 mM、119 mM、120 mM、121 mM、122 mM、123 mM、124 mM、125 mM、126 mM、127 mM、128 mM、129 mM、130 mM、131 mM、132 mM、133 mM、134 mM、135 mM、136 mM、137 mM、138 mM、139 mM、140 mM、141 mM、142 mM、143 mM、144 mM、145 mM、146 mM、147 mM、148 mM、149 mM、150 mM、151 mM、152 mM、153 mM、154 mM、155 mM、156 mM、157 mM、158 mM、159 mM、160 mM、161 mM、162 mM、163 mM、164 mM、165 mM、166 mM、167 mM、168 mM、169 mM、170 mM、171 mM、172 mM、173 mM、174 mM、175 mM、176 mM、177 mM、178 mM、179 mM、180 mM、181 mM、182 mM、183 mM、184 mM、185 mM、186 mM、187 mM、188 mM、189 mM、190 mM、191 mM、192 mM、193 mM、194 mM、195 mM、196 mM、197 mM、198 mM、199 mM、200 mM、201 mM、202 mM、203 mM、204 mM、205 mM、206 mM、207 mM、208 mM、209 mM、210 mM、211 mM、212 mM、213 mM、214 mM、215 mM、216 mM、217 mM、218 mM、219 mM或220 mM。
調配物可包括以下範圍內之氯化鈉：75-85 mM、80-90 mM、85-95 mM、90-100 mM、95-105 mM、100-110 mM、105-115 mM、110-120 mM、115-125 mM、120-130 mM、125-135 mM、130-140 mM、135-145 mM、140-150 mM、145-155 mM、150-160 mM、155-165 mM、160-170 mM、165-175 mM、170-180 mM、175-185 mM、180-190 mM、185-195 mM、190-200 mM、75-95 mM、80-100 mM、85-105 mM、90-110 mM、95-115 mM、100-120 mM、105-125 mM、110-130 mM、115-135 mM、120-140 mM、125-145 mM、130-150 mM、135-155 mM、140-160 mM、145-165 mM、150-170 mM、155-175 mM、160-180 mM、165-185 mM、170-190 mM、175-195 mM、180-200 mM、75-100 mM、80-105 mM、85-110 mM、90-115 mM、95-120 mM、100-125 mM、105-130 mM、110-135 mM、115-140 mM、120-145 mM、125-150 mM、130-155 mM、135-160 mM、140-165 mM、145-170 mM、150-175 mM、155-180 mM、160-185 mM、165-190 mM、170-195 mM、175-200 mM、75-105 mM、80-110 mM、85-115 mM、90-120 mM、95-125 mM、100-130 mM、105-135 mM、110-140 mM、115-145 mM、120-150 mM、125-155 mM、130-160 mM、135-165 mM、140-170 mM、145-175 mM、150-180 mM、155-185 mM、160-190 mM、165-195 mM、170-200 mM、75-115 mM、80-120 mM、85-125 mM、90-130 mM、95-135 mM、100-140 mM、105-145 mM、110-150 mM、115-155 mM、120-160 mM、125-165 mM、130-170 mM、135-175 mM、140-180 mM、145-185 mM、150-190 mM、155-195 mM、160-200 mM、75-120 mM、80-125 mM、85-130 mM、90-135 mM、95-140 mM、100-145 mM、105-150 mM、110-155 mM、115-160 mM、120-165 mM、125-170 mM、130-175 mM、135-180 mM、140-185 mM、145-190 mM、150-195 mM、155-200 mM、75-125 mM、80-130 mM、85-135 mM、90-140 mM、95-145 mM、100-150 mM、105-155 mM、110-160 mM、115-165 mM、120-170 mM、125-175 mM、130-180 mM、135-185 mM、140-190 mM、145-195 mM、150-200 mM、75-125 mM、80-130 mM、85-135 mM、90-140 mM、95-145 mM、100-150 mM、105-155 mM、110-160 mM、115-165 mM、120-170 mM、125-175 mM、130-180 mM、135-185 mM、140-190 mM、145-195 mM、150-200 mM、75-135 mM、80-140 mM、85-145 mM、90-150 mM、95-155 mM、100-160 mM、105-165 mM、110-170 mM、115-175 mM、120-180 mM、125-185 mM、130-190 mM、135-195 mM、140-200 mM、75-145 mM、80-150 mM、85-155 mM、90-160 mM、95-165 mM、100-170 mM、105-175 mM、110-180 mM、115-185 mM、120-190 mM、125-195 mM、130-200 mM、75-155 mM、80-160 mM、85-165 mM、90-170 mM、95-175 mM、100-180 mM、105-185 mM、110-190 mM、115-195 mM、120-200 mM、75-165 mM、80-170 mM、85-175 mM、90-180 mM、95-185 mM、100-190 mM、105-195 mM、110-200 mM、75-175 mM、80-180 mM、85-185 mM、90-190 mM、95-195 mM、100-200 mM、80-220 mM、90-220 mM、100-220 mM、110-220 mM、120-220 mM、130-220 mM、140-220 mM、150-220 mM、160-220 mM、170-220 mM、180-220 mM、190-220 mM、200-220 mM或210-220 mM。
在一些實施例中，調配物可包括80-220 mM氯化鈉。
在一些實施例中，調配物可包括80-150 mM氯化鈉。
在一些實施例中，調配物可包括75 mM氯化鈉。
在一些實施例中，調配物可包括83 mM氯化鈉。
在一些實施例中，調配物可包括92 mM氯化鈉。
在一些實施例中，調配物可包括95 mM氯化鈉。
在一些實施例中，調配物可包括98 mM氯化鈉。
在一些實施例中，調配物可包括100 mM氯化鈉。
在一些實施例中，調配物可包括107 mM氯化鈉。
在一些實施例中，調配物可包括109 mM氯化鈉。
在一些實施例中，調配物可包括118 mM氯化鈉。
在一些實施例中，調配物可包括125 mM氯化鈉。
在一些實施例中，調配物可包括127 mM氯化鈉。
在一些實施例中，調配物可包括133 mM氯化鈉。
在一些實施例中，調配物可包括142 mM氯化鈉。
在一些實施例中，調配物可包括150 mM氯化鈉。
在一些實施例中，調配物可包括155 mM氯化鈉。
在一些實施例中，調配物可包括192 mM氯化鈉。
在一些實施例中，調配物可包括210 mM氯化鈉。 氯化鉀
在一些實施例中，調配物中組分中之至少一者為氯化鉀。
在一些實施例中，調配物中氯化鉀之濃度可為但不限於0.1 mM、0.2 mM、0.3 mM、0.4 mM、0.5 mM、0.6 mM、0.7 mM、0.8 mM、0.9 mM、1 mM、1.1 mM、1.2 mM、1.3 mM、1.4 mM、1.5 mM、1.6 mM、1.7 mM、1.8 mM、1.9 mM、2 mM、2.1 mM、2.2 mM、2.3 mM、2.4 mM、2.5 mM、2.6 mM、2.7 mM、2.8 mM、2.9 mM、3 mM、3.1 mM、3.2 mM、3.3 mM、3.4 mM、3.5 mM、3.6 mM、3.7 mM、3.8 mM、3.9 mM、4 mM、4.1 mM、4.2 mM、4.3 mM、4.4 mM、4.5 mM、4.6 mM、4.7 mM、4.8 mM、4.9 mM、5 mM、5.1 mM、5.2 mM、5.3 mM、5.4 mM、5.5 mM、5.6 mM、5.7 mM、5.8 mM、5.9 mM、6 mM、6.1 mM、6.2 mM、6.3 mM、6.4 mM、6.5 mM、6.6 mM、6.7 mM、6.8 mM、6.9 mM、7 mM、7.1 mM、7.2 mM、7.3 mM、7.4 mM、7.5 mM、7.6 mM、7.7 mM、7.8 mM、7.9 mM、8 mM、8.1 mM、8.2 mM、8.3 mM、8.4 mM、8.5 mM、8.6 mM、8.7 mM、8.8 mM、8.9 mM、9 mM、9.1 mM、9.2 mM、9.3 mM、9.4 mM、9.5 mM、9.6 mM、9.7 mM、9.8 mM、9.9 mM、10 mM、10.1 mM、10.2 mM、10.3 mM、10.4 mM、10.5 mM、10.6 mM、10.7 mM、10.8 mM、10.9 mM、11 mM、11.1 mM、11.2 mM、11.3 mM、11.4 mM、11.5 mM、11.6 mM、11.7 mM、11.8 mM、11.9 mM、12 mM、12.1 mM、12.2 mM、12.3 mM、12.4 mM、12.5 mM、12.6 mM、12.7 mM、12.8 mM、12.9 mM、13 mM、13.1 mM、13.2 mM、13.3 mM、13.4 mM、13.5 mM、13.6 mM、13.7 mM、13.8 mM、13.9 mM、14 mM、14.1 mM、14.2 mM、14.3 mM、14.4 mM、14.5 mM、14.6 mM、14.7 mM、14.8 mM、14.9 mM或15 mM。
調配物可包括以下範圍內之氯化鉀：0-0.5 mM、0.1-0.6 mM、0.2-0.7 mM、0.3-0.8 mM、0.4-0.9 mM、0.5-1 mM、0.6-1.1 mM、0.7-1.2 mM、0.8-1.3 mM、0.9-1.4 mM、1-1.5 mM、1.1-1.6 mM、1.2-1.7 mM、1.3-1.8 mM、1.4-1.9 mM、1.5-2 mM、1.6-2.1 mM、1.7-2.2 mM、1.8-2.3 mM、1.9-2.4 mM、2-2.5 mM、2.1-2.6 mM、2.2-2.7 mM、2.3-2.8 mM、2.4-2.9 mM、2.5-3 mM、2.6-3.1 mM、2.7-3.2 mM、2.8-3.3 mM、2.9-3.4 mM、3-3.5 mM、3.1-3.6 mM、3.2-3.7 mM、3.3-3.8 mM、3.4-3.9 mM、3.5-4 mM、3.6-4.1 mM、3.7-4.2 mM、3.8-4.3 mM、3.9-4.4 mM、4-4.5 mM、4.1-4.6 mM、4.2-4.7 mM、4.3-4.8 mM、4.4-4.9 mM、4.5-5 mM、4.6-5.1 mM、4.7-5.2 mM、4.8-5.3 mM、4.9-5.4 mM、5-5.5 mM、5.1-5.6 mM、5.2-5.7 mM、5.3-5.8 mM、5.4-5.9 mM、5.5-6 mM、5.6-6.1 mM、5.7-6.2 mM、5.8-6.3 mM、5.9-6.4 mM、6-6.5 mM、6.1-6.6 mM、6.2-6.7 mM、6.3-6.8 mM、6.4-6.9 mM、6.5-7 mM、6.6-7.1 mM、6.7-7.2 mM、6.8-7.3 mM、6.9-7.4 mM、7-7.5 mM、7.1-7.6 mM、7.2-7.7 mM、7.3-7.8 mM、7.4-7.9 mM、7.5-8 mM、7.6-8.1 mM、7.7-8.2 mM、7.8-8.3 mM、7.9-8.4 mM、8-8.5 mM、8.1-8.6 mM、8.2-8.7 mM、8.3-8.8 mM、8.4-8.9 mM、8.5-9 mM、8.6-9.1 mM、8.7-9.2 mM、8.8-9.3 mM、8.9-9.4 mM、9-9.5 mM、9.1-9.6 mM、9.2-9.7 mM、9.3-9.8 mM、9.4-9.9 mM、9.5-10 mM、9.6-10.1 mM、9.7-10.2 mM、9.8-10.3 mM、9.9-10.4 mM、10-10.5 mM、10.1-10.6 mM、10.2-10.7 mM、10.3-10.8 mM、10.4-10.9 mM、10.5-11 mM、10.6-11.1 mM、10.7-11.2 mM、10.8-11.3 mM、10.9-11.4 mM、11-11.5 mM、11.1-11.6 mM、11.2-11.7 mM、11.3-11.8 mM、11.4-11.9 mM、11.5-12 mM、11.6-12.1 mM、11.7-12.2 mM、11.8-12.3 mM、11.9-12.4 mM、12-12.5 mM、12.1-12.6 mM、12.2-12.7 mM、12.3-12.8 mM、12.4-12.9 mM、12.5-13 mM、12.6-13.1 mM、12.7-13.2 mM、12.8-13.3 mM、12.9-13.4 mM、13-13.5 mM、13.1-13.6 mM、13.2-13.7 mM、13.3-13.8 mM、13.4-13.9 mM、13.5-14 mM、13.6-14.1 mM、13.7-14.2 mM、13.8-14.3 mM、13.9-14.4 mM、14-14.5 mM、14.1-14.6 mM、14.2-14.7 mM、14.3-14.8 mM、14.4-14.9 mM、14.5-15 mM、0-1 mM、1-2 mM、2-3 mM、3-4 mM、4-5 mM、5-6 mM、6-7 mM、7-8 mM、8-9 mM、9-10 mM、10-11 mM、11-12 mM、12-13 mM、13-14 mM、14-15 mM、15-16 mM、0-2 mM、1-3 mM、2-4 mM、3-5 mM、4-6 mM、5-7 mM、6-8 mM、7-9 mM、8-10 mM、9-11 mM、10-12 mM、11-13 mM、12-14 mM、13-15 mM、0-3 mM、1-4 mM、2-5 mM、3-6 mM、4-7 mM、5-8 mM、6-9 mM、7-10 mM、8-11 mM、9-12 mM、10-13 mM、11-14 mM、12-15 mM、0-4 mM、1-5 mM、2-6 mM、3-7 mM、4-8 mM、5-9 mM、6-10 mM、7-11 mM、8-12 mM、9-13 mM、10-14 mM、11-15 mM、0-5 mM、1-6 mM、2-7 mM、3-8 mM、4-9 mM、5-10 mM、6-11 mM、7-12 mM、8-13 mM、9-14 mM、10-15 mM、0-6 mM、1-7 mM、2-8 mM、3-9 mM、4-10 mM、5-11 mM、6-12 mM、7-13 mM、8-14 mM、9-15 mM、0-7 mM、1-8 mM、2-9 mM、3-10 mM、4-11 mM、5-12 mM、6-13 mM、7-14 mM、8-15 mM、0-8 mM、1-9 mM、2-10 mM、3-11 mM、4-12 mM、5-13 mM、6-14 mM、7-15 mM、0-9 mM、1-10 mM、2-11 mM、3-12 mM、4-13 mM、5-14 mM、6-15 mM、0-10 mM、1-11 mM、2-12 mM、3-13 mM、4-14 mM、5-15 mM、0-11 mM、1-12 mM、2-13 mM、3-14 mM、4-15 mM、0-12 mM、1-13 mM、2-14 mM、3-15 mM、0-13 mM、1-14 mM、2-15 mM、0-14 mM、1-15 mM或0-15 mM。
在一些實施例中，調配物可包括0-10 mM氯化鉀。
在一些實施例中，調配物可包括1-3 mM氯化鉀。
在一些實施例中，調配物可包括1-2 mM氯化鉀。
在一些實施例中，調配物可包括2-3 mM氯化鉀。
在一些實施例中，調配物可包括1.5 mM氯化鉀。
在一些實施例中，調配物可包括2.7 mM氯化鉀。 氯化鎂
在一些實施例中，調配物中組分中之至少一者為氯化鎂。
在一些實施例中，氯化鎂之濃度可為但不限於1 mM、2 mM、3 mM、4 mM、5 mM、6 mM、7 mM、8 mM、9 mM、10 mM、11 mM、12 mM、13 mM、14 mM、15 mM、16 mM、17 mM、18 mM、19 mM、20 mM、21 mM、22 mM、23 mM、24 mM、25 mM、26 mM、27 mM、28 mM、29 mM、30 mM、31 mM、32 mM、33 mM、34 mM、35 mM、36 mM、37 mM、38 mM、39 mM、40 mM、41 mM、42 mM、43 mM、44 mM、45 mM、46 mM、47 mM、48 mM、49 mM、50 mM、51 mM、52 mM、53 mM、54 mM、55 mM、56 mM、57 mM、58 mM、59 mM、60 mM、61 mM、62 mM、63 mM、64 mM、65 mM、66 mM、67 mM、68 mM、69 mM、70 mM、71 mM、72 mM、73 mM、74 mM、75 mM、76 mM、77 mM、78 mM、79 mM、80 mM、81 mM、82 mM、83 mM、84 mM、85 mM、86 mM、87 mM、88 mM、89 mM、90 mM、91 mM、92 mM、93 mM、94 mM、95 mM、96 mM、97 mM、98 mM、99 mM或100 mM。
調配物可包括以下範圍內之氯化鎂：0-5 mM、1-5 mM、2-5 mM、3-5 mM、4-5 mM、0-10 mM、1-10 mM、2-10 mM、3-10 mM、4-10 mM、5-10 mM、6-10 mM、7-10 mM、8-10 mM、9-10 mM、0-25 mM、1-25 mM、2-25 mM、3-25 mM、4-25 mM、5-25 mM、6-25 mM、7-25 mM、8-25 mM、9-25 mM、10-25 mM、11-25 mM、12-25 mM、13-25 mM、14-25 mM、15-25 mM、16-25 mM、17-25 mM、18-25 mM、19-25 mM、20-25 mM、21-25 mM、22-25 mM、23-25 mM、24-25 mM、0-50 mM、1-50 mM、2-50 mM、3-50 mM、4-50 mM、5-50 mM、6-50 mM、7-50 mM、8-50 mM、9-50 mM、10-50 mM、11-50 mM、12-50 mM、13-50 mM、14-50 mM、15-50 mM、16-50 mM、17-50 mM、18-50 mM、19-50 mM、20-50 mM、21-50 mM、22-50 mM、23-50 mM、24-50 mM、25-50 mM、26-50 mM、27-50 mM、28-50 mM、29-50 mM、30-50 mM、31-50 mM、32-50 mM、33-50 mM、34-50 mM、35-50 mM、36-50 mM、37-50 mM、38-50 mM、39-50 mM、40-50 mM、41-50 mM、42-50 mM、43-50 mM、44-50 mM、45-50 mM、46-50 mM、47-50 mM、48-50 mM、49-50 mM、0-75 mM、1-75 mM、2-75 mM、3-75 mM、4-75 mM、5-75 mM、6-75 mM、7-75 mM、8-75 mM、9-75 mM、10-75 mM、11-75 mM、12-75 mM、13-75 mM、14-75 mM、15-75 mM、16-75 mM、17-75 mM、18-75 mM、19-75 mM、20-75 mM、21-75 mM、22-75 mM、23-75 mM、24-75 mM、25-75 mM、26-75 mM、27-75 mM、28-75 mM、29-75 mM、30-75 mM、31-75 mM、32-75 mM、33-75 mM、34-75 mM、35-75 mM、36-75 mM、37-75 mM、38-75 mM、39-75 mM、40-75 mM、41-75 mM、42-75 mM、43-75 mM、44-75 mM、45-75 mM、46-75 mM、47-75 mM、48-75 mM、49-75 mM、50-75 mM、51-75 mM、52-75 mM、53-75 mM、54-75 mM、55-75 mM、56-75 mM、57-75 mM、58-75 mM、59-75 mM、60-75 mM、61-75 mM、62-75 mM、63-75 mM、64-75 mM、65-75 mM、66-75 mM、67-75 mM、68-75 mM、69-75 mM、70-75 mM、71-75 mM、72-75 mM、73-75 mM、74-75 mM、50-100 mM、60-100 mM、75-100 mM、80-100 mM或90-100 mM。 糖
在一些實施例中，調配物可包括至少一種糖及/或糖替代物。
在一些實施例中，調配物可包括至少一種糖及/或糖替代物以提高調配物之穩定性。穩定性的提高可為過程內庫提供更長的保持時間，提供更長「壽命」，增加溶液中AAV粒子之濃度(例如，調配物能夠具有較高濃度AAV粒子而無rAAV析出溶液)及/或減少調配物中之聚集的產生或形成。
在一些實施例中，相比於不含糖及/或糖替代物之相同調配物，調配物中包括至少一種糖及/或糖替代物可將調配物之穩定性增加1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或超過95%，1-5%、5-15%、5-20%、5-25%、5-30%、5-35%、5-40%、5-45%、5-50%、5-55%、5-60%、5-65%、5-70%、5-75%、5-80%、5-85%、5-90%、5-95%、10-20%、10-25%、10-30%、10-35%、10-40%、10-45%、10-50%、10-55%、10-60%、10-65%、10-70%、10-75%、10-80%、10-85%、10-90%、10-95%、15-25%、15-30%、15-35%、15-40%、15-45%、15-50%、15-55%、15-60%、15-65%、15-70%、15-75%、15-80%、15-85%、15-90%、15-95%、20-30%、20-35%、20-40%、20-45%、20-50%、20-55%、20-60%、20-65%、20-70%、20-75%、20-80%、20-85%、20-90%、20-95%、25-35%、25-40%、25-45%、25-50%、25-55%、25-60%、25-65%、25-70%、25-75%、25-80%、25-85%、25-90%、25-95%、30-40%、30-45%、30-50%、30-55%、30-60%、30-65%、30-70%、30-75%、30-80%、30-85%、30-90%、30-95%、35-45%、35-50%、35-55%、35-60%、35-65%、35-70%、35-75%、35-80%、35-85%、35-90%、35-95%、40-50%、40-55%、40-60%、40-65%、40-70%、40-75%、40-80%、40-85%、40-90%、40-95%、45-55%、45-60%、45-65%、45-70%、45-75%、45-80%、45-85%、45-90%、45-95%、50-60%、50-65%、50-70%、50-75%、50-80%、50-85%、50-90%、50-95%、55-65%、55-70%、55-75%、55-80%、55-85%、55-90%、55-95%、60-70%、60-75%、60-80%、60-85%、60-90%、60-95%、65-75%、65-80%、65-85%、65-90%、65-95%、70-80%、70-85%、70-90%、70-95%、75-85%、75-90%、75-95%、80-90%、80-95%或90-95%。
在一些實施例中，糖及/或糖替代物與磷酸酯緩衝劑組合使用以便增加穩定性。相比於不含糖及/或糖取代物之相同調配物，糖及/或糖替代物與磷酸酯脂之組合可使穩定性增加1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或超過95%，1-5%、5-15%、5-20%、5-25%、5-30%、5-35%、5-40%、5-45%、5-50%、5-55%、5-60%、5-65%、5-70%、5-75%、5-80%、5-85%、5-90%、5-95%、10-20%、10-25%、10-30%、10-35%、10-40%、10-45%、10-50%、10-55%、10-60%、10-65%、10-70%、10-75%、10-80%、10-85%、10-90%、10-95%、15-25%、15-30%、15-35%、15-40%、15-45%、15-50%、15-55%、15-60%、15-65%、15-70%、15-75%、15-80%、15-85%、15-90%、15-95%、20-30%、20-35%、20-40%、20-45%、20-50%、20-55%、20-60%、20-65%、20-70%、20-75%、20-80%、20-85%、20-90%、20-95%、25-35%、25-40%、25-45%、25-50%、25-55%、25-60%、25-65%、25-70%、25-75%、25-80%、25-85%、25-90%、25-95%、30-40%、30-45%、30-50%、30-55%、30-60%、30-65%、30-70%、30-75%、30-80%、30-85%、30-90%、30-95%、35-45%、35-50%、35-55%、35-60%、35-65%、35-70%、35-75%、35-80%、35-85%、35-90%、35-95%、40-50%、40-55%、40-60%、40-65%、40-70%、40-75%、40-80%、40-85%、40-90%、40-95%、45-55%、45-60%、45-65%、45-70%、45-75%、45-80%、45-85%、45-90%、45-95%、50-60%、50-65%、50-70%、50-75%、50-80%、50-85%、50-90%、50-95%、55-65%、55-70%、55-75%、55-80%、55-85%、55-90%、55-95%、60-70%、60-75%、60-80%、60-85%、60-90%、60-95%、65-75%、65-80%、65-85%、65-90%、65-95%、70-80%、70-85%、70-90%、70-95%、75-85%、75-90%、75-95%、80-90%、80-95%或90-95%。作為一非限制性實例，糖為蔗糖。
在一些實施例中，本文所述之醫藥組合物之調配物可包含雙醣。可用於本文所述之調配物中適合的雙醣可包括蔗糖、乳油糖、乳糖、麥芽糖、海藻糖、纖維二糖、殼二糖、麴二糖、黑麯黴糖、異麥芽糖、β,β-海藻糖、α,β-海藻糖、槐二糖、海帶二糖、龍膽二糖、松二糖、麥芽酮糖、巴拉金糖、龍膽二酬糖、甘露二糖、蜜二糖、蜜二糖、芸香糖、蘆丁酮糖及木二糖。調配物中使用的雙醣之濃度(w/v)可在1%-15%之間，例如在1%-5%之間、在3%-6%之間、在5%-8%之間、在7%-10%之間或在10%-15%之間。
在一些實施例中，調配物可包括至少一種為蔗糖之雙醣。
在一些實施例中，調配物可包括處於以下濃度之蔗糖：0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、1.1%、1.2%、1.3%、1.4%、1.5%、1.6%、1.7%、1.8%、1.9%、2%、2.1%、2.2%、2.3%、2.4%、2.5%、2.6%、2.7%、2.8%、2.9%、3%、3.1%、3.2%、3.3%、3.4%、3.5%、3.6%、3.7%、3.8%、3.9%、4%、4.1%、4.2%、4.3%、4.4%、4.5%、4.6%、4.7%、4.8%、4.9%、5%、5.1%、5.2%、5.3%、5.4%、5.5%、5.6%、5.7%、5.8%、5.9%、6%、6.1%、6.2%、6.3%、6.4%、6.5%、6.6%、6.7%、6.8%、6.9%、7%、7.1%、7.2%、7.3%、7.4%、7.5%、7.6%、7.7%、7.8%、7.9%、8%、8.1%、8.2%、8.3%、8.4%、8.5%、8.6%、8.7%、8.8%、8.9%、9%、9.1%、9.2%、9.3%、9.4%、9.5%、9.6%、9.7%、9.8%、9.9%或10% w/v。
在一些實施例中，調配物可包括在以下濃度範圍內之蔗糖：0-1%、0.1-1%、0.2-1%、0.3-1%、0.4-1%、0.5-1%、0.6-1%、0.7-1%、0.8-1%、0.9-1%、0-1.5%、0.1-1.5%、0.2-1.5%、0.3-1.5%、0.4-1.5%、0.5-1.5%、0.6-1.5%、0.7-1.5%、0.8-1.5%、0.9-1.5%、1-1.5%、1.1-1.5%、1.2-1.5%、1.3-1.5%、1.4-1.5%、0-2%、0.1-2%、0.2-2%、0.3-2%、0.4-2%、0.5-2%、0.6-2%、0.7-2%、0.8-2%、0.9-2%、1-2%、1.1-2%、1.2-2%、1.3-2%、1.4-2%、1.5-2%、1.6-2%、1.7-2%、1.8-2%、1.9-2%、0-2.5%、0.1-2.5%、0.2-2.5%、0.3-2.5%、0.4-2.5%、0.5-2.5%、0.6-2.5%、0.7-2.5%、0.8-2.5%、0.9-2.5%、1-2.5%、1.1-2.5%、1.2-2.5%、1.3-2.5%、1.4-2.5%、1.5-2.5%、1.6-2.5%、1.7-2.5%、1.8-2.5%、1.9-2.5%、2-2.5%、2.1-2.5%、2.2-2.5%、2.3-2.5%、2.4-2.5%、0-3%、0.1-3%、0.2-3%、0.3-3%、0.4-3%、0.5-3%、0.6-3%、0.7-3%、0.8-3%、0.9-3%、1-3%、1.1-3%、1.2-3%、1.3-3%、1.4-3%、1.5-3%、1.6-3%、1.7-3%、1.8-3%、1.9-3%、2-3%、2.1-3%、2.2-3%、2.3-3%、2.4-3%、2.5-3%、2.6-3%、2.7-3%、2.8-3%、2.9-3%、0-3.5%、0.1-3.5%、0.2-3.5%、0.3-3.5%、0.4-3.5%、0.5-3.5%、0.6-3.5%、0.7-3.5%、0.8-3.5%、0.9-3.5%、1-3.5%、1.1-3.5%、1.2-3.5%、1.3-3.5%、1.4-3.5%、1.5-3.5%、1.6-3.5%、1.7-3.5%、1.8-3.5%、1.9-3.5%、2-3.5%、2.1-3.5%、2.2-3.5%、2.3-3.5%、2.4-3.5%、2.5-3.5%、2.6-3.5%、2.7-3.5%、2.8-3.5%、2.9-3.5%、3-3.5%、3.1-3.5%、3.2-3.5%、3.3-3.5%、3.4-3.5%、0-4%、0.1-4%、0.2-4%、0.3-4%、0.4-4%、0.5-4%、0.6-4%、0.7-4%、0.8-4%、0.9-4%、1-4%、1.1-4%、1.2-4%、1.3-4%、1.4-4%、1.5-4%、1.6-4%、1.7-4%、1.8-4%、1.9-4%、2-4%、2.1-4%、2.2-4%、2.3-4%、2.4-4%、2.5-4%、2.6-4%、2.7-4%、2.8-4%、2.9-4%、3-4%、3.1-4%、3.2-4%、3.3-4%、3.4-4%、3.5-4%、3.6-4%、3.7-4%、3.8-4%、3.9-4%、0-4.5%、0.1-4.5%、0.2-4.5%、0.3-4.5%、0.4-4.5%、0.5-4.5%、0.6-4.5%、0.7-4.5%、0.8-4.5%、0.9-4.5%、1-4.5%、1.1-4.5%、1.2-4.5%、1.3-4.5%、1.4-4.5%、1.5-4.5%、1.6-4.5%、1.7-4.5%、1.8-4.5%、1.9-4.5%、2-4.5%、2.1-4.5%、2.2-4.5%、2.3-4.5%、2.4-4.5%、2.5-4.5%、2.6-4.5%、2.7-4.5%、2.8-4.5%、2.9-4.5%、3-4.5%、3.1-4.5%、3.2-4.5%、3.3-4.5%、3.4-4.5%、3.5-4.5%、3.6-4.5%、3.7-4.5%、3.8-4.5%、3.9-4.5%、4-4.5%、4.1-4.5%、4.2-4.5%、4.3-4.5%、4.4-4.5%、0-5%、0.1-5%、0.2-5%、0.3-5%、0.4-5%、0.5-5%、0.6-5%、0.7-5%、0.8-5%、0.9-5%、1-5%、1.1-5%、1.2-5%、1.3-5%、1.4-5%、1.5-5%、1.6-5%、1.7-5%、1.8-5%、1.9-5%、2-5%、2.1-5%、2.2-5%、2.3-5%、2.4-5%、2.5-5%、2.6-5%、2.7-5%、2.8-5%、2.9-5%、3-5%、3.1-5%、3.2-5%、3.3-5%、3.4-5%、3.5-5%、3.6-5%、3.7-5%、3.8-5%、3.9-5%、4-5%、4.1-5%、4.2-5%、4.3-5%、4.4-5%、4.5-5%、4.6-5%、4.7-5%、4.8-5%、4.9-5%、0-5.5%、0.1-5.5%、0.2-5.5%、0.3-5.5%、0.4-5.5%、0.5-5.5%、0.6-5.5%、0.7-5.5%、0.8-5.5%、0.9-5.5%、1-5.5%、1.1-5.5%、1.2-5.5%、1.3-5.5%、1.4-5.5%、1.5-5.5%、1.6-5.5%、1.7-5.5%、1.8-5.5%、1.9-5.5%、2-5.5%、2.1-5.5%、2.2-5.5%、2.3-5.5%、2.4-5.5%、2.5-5.5%、2.6-5.5%、2.7-5.5%、2.8-5.5%、2.9-5.5%、3-5.5%、3.1-5.5%、3.2-5.5%、3.3-5.5%、3.4-5.5%、3.5-5.5%、3.6-5.5%、3.7-5.5%、3.8-5.5%、3.9-5.5%、4-5.5%、4.1-5.5%、4.2-5.5%、4.3-5.5%、4.4-5.5%、4.5-5.5%、4.6-5.5%、4.7-5.5%、4.8-5.5%、4.9-5.5%、5-5.5%、5.1-5.5%、5.2-5.5%、5.3-5.5%、5.4-5.5%、0-6%、0.1-6%、0.2-6%、0.3-6%、0.4-6%、0.5-6%、0.6-6%、0.7-6%、0.8-6%、0.9-6%、1-6%、1.1-6%、1.2-6%、1.3-6%、1.4-6%、1.5-6%、1.6-6%、1.7-6%、1.8-6%、1.9-6%、2-6%、2.1-6%、2.2-6%、2.3-6%、2.4-6%、2.5-6%、2.6-6%、2.7-6%、2.8-6%、2.9-6%、3-6%、3.1-6%、3.2-6%、3.3-6%、3.4-6%、3.5-6%、3.6-6%、3.7-6%、3.8-6%、3.9-6%、4-6%、4.1-6%、4.2-6%、4.3-6%、4.4-6%、4.5-6%、4.6-6%、4.7-6%、4.8-6%、4.9-6%、5-6%、5.1-6%、5.2-6%、5.3-6%、5.4-6%、5.5-6%、5.6-6%、5.7-6%、5.8-6%、5.9-6%、0-6.5%、0.1-6.5%、0.2-6.5%、0.3-6.5%、0.4-6.5%、0.5-6.5%、0.6-6.5%、0.7-6.5%、0.8-6.5%、0.9-6.5%、1-6.5%、1.1-6.5%、1.2-6.5%、1.3-6.5%、1.4-6.5%、1.5-6.5%、1.6-6.5%、1.7-6.5%、1.8-6.5%、1.9-6.5%、2-6.5%、2.1-6.5%、2.2-6.5%、2.3-6.5%、2.4-6.5%、2.5-6.5%、2.6-6.5%、2.7-6.5%、2.8-6.5%、2.9-6.5%、3-6.5%、3.1-6.5%、3.2-6.5%、3.3-6.5%、3.4-6.5%、3.5-6.5%、3.6-6.5%、3.7-6.5%、3.8-6.5%、3.9-6.5%、4-6.5%、4.1-6.5%、4.2-6.5%、4.3-6.5%、4.4-6.5%、4.5-6.5%、4.6-6.5%、4.7-6.5%、4.8-6.5%、4.9-6.5%、5-6.5%、5.1-6.5%、5.2-6.5%、5.3-6.5%、5.4-6.5%、5.5-6.5%、5.6-6.5%、5.7-6.5%、5.8-6.5%、5.9-6.5%、6-6.5%、6.1-6.5%、6.2-6.5%、6.3-6.5%、6.4-6.5%、0-7%、0.1-7%、0.2-7%、0.3-7%、0.4-7%、0.5-7%、0.6-7%、0.7-7%、0.8-7%、0.9-7%、1-7%、1.1-7%、1.2-7%、1.3-7%、1.4-7%、1.5-7%、1.6-7%、1.7-7%、1.8-7%、1.9-7%、2-7%、2.1-7%、2.2-7%、2.3-7%、2.4-7%、2.5-7%、2.6-7%、2.7-7%、2.8-7%、2.9-7%、3-7%、3.1-7%、3.2-7%、3.3-7%、3.4-7%、3.5-7%、3.6-7%、3.7-7%、3.8-7%、3.9-7%、4-7%、4.1-7%、4.2-7%、4.3-7%、4.4-7%、4.5-7%、4.6-7%、4.7-7%、4.8-7%、4.9-7%、5-7%、5.1-7%、5.2-7%、5.3-7%、5.4-7%、5.5-7%、5.6-7%、5.7-7%、5.8-7%、5.9-7%、6-7%、6.1-7%、6.2-7%、6.3-7%、6.4-7%、6.5-7%、6.6-7%、6.7-7%、6.8-7%、6.9-7%、0-7.5%、0.1-7.5%、0.2-7.5%、0.3-7.5%、0.4-7.5%、0.5-7.5%、0.6-7.5%、0.7-7.5%、0.8-7.5%、0.9-7.5%、1-7.5%、1.1-7.5%、1.2-7.5%、1.3-7.5%、1.4-7.5%、1.5-7.5%、1.6-7.5%、1.7-7.5%、1.8-7.5%、1.9-7.5%、2-7.5%、2.1-7.5%、2.2-7.5%、2.3-7.5%、2.4-7.5%、2.5-7.5%、2.6-7.5%、2.7-7.5%、2.8-7.5%、2.9-7.5%、3-7.5%、3.1-7.5%、3.2-7.5%、3.3-7.5%、3.4-7.5%、3.5-7.5%、3.6-7.5%、3.7-7.5%、3.8-7.5%、3.9-7.5%、4-7.5%、4.1-7.5%、4.2-7.5%、4.3-7.5%、4.4-7.5%、4.5-7.5%、4.6-7.5%、4.7-7.5%、4.8-7.5%、4.9-7.5%、5-7.5%、5.1-7.5%、5.2-7.5%、5.3-7.5%、5.4-7.5%、5.5-7.5%、5.6-7.5%、5.7-7.5%、5.8-7.5%、5.9-7.5%、6-7.5%、6.1-7.5%、6.2-7.5%、6.3-7.5%、6.4-7.5%、6.5-7.5%、6.6-7.5%、6.7-7.5%、6.8-7.5%、6.9-7.5%、7-7.5%、7.1-7.5%、7.2-7.5%、7.3-7.5%、7.4-7.5%、0-8%、0.1-8%、0.2-8%、0.3-8%、0.4-8%、0.5-8%、0.6-8%、0.7-8%、0.8-8%、0.9-8%、1-8%、1.1-8%、1.2-8%、1.3-8%、1.4-8%、1.5-8%、1.6-8%、1.7-8%、1.8-8%、1.9-8%、2-8%、2.1-8%、2.2-8%、2.3-8%、2.4-8%、2.5-8%、2.6-8%、2.7-8%、2.8-8%、2.9-8%、3-8%、3.1-8%、3.2-8%、3.3-8%、3.4-8%、3.5-8%、3.6-8%、3.7-8%、3.8-8%、3.9-8%、4-8%、4.1-8%、4.2-8%、4.3-8%、4.4-8%、4.5-8%、4.6-8%、4.7-8%、4.8-8%、4.9-8%、5-8%、5.1-8%、5.2-8%、5.3-8%、5.4-8%、5.5-8%、5.6-8%、5.7-8%、5.8-8%、5.9-8%、6-8%、6.1-8%、6.2-8%、6.3-8%、6.4-8%、6.5-8%、6.6-8%、6.7-8%、6.8-8%、6.9-8%、7-8%、7.1-8%、7.2-8%、7.3-8%、7.4-8%、7.5-8%、7.6-8%、7.7-8%、7.8-8%、7.9-8%、0-8.5%、0.1-8.5%、0.2-8.5%、0.3-8.5%、0.4-8.5%、0.5-8.5%、0.6-8.5%、0.7-8.5%、0.8-8.5%、0.9-8.5%、1-8.5%、1.1-8.5%、1.2-8.5%、1.3-8.5%、1.4-8.5%、1.5-8.5%、1.6-8.5%、1.7-8.5%、1.8-8.5%、1.9-8.5%、2-8.5%、2.1-8.5%、2.2-8.5%、2.3-8.5%、2.4-8.5%、2.5-8.5%、2.6-8.5%、2.7-8.5%、2.8-8.5%、2.9-8.5%、3-8.5%、3.1-8.5%、3.2-8.5%、3.3-8.5%、3.4-8.5%、3.5-8.5%、3.6-8.5%、3.7-8.5%、3.8-8.5%、3.9-8.5%、4-8.5%、4.1-8.5%、4.2-8.5%、4.3-8.5%、4.4-8.5%、4.5-8.5%、4.6-8.5%、4.7-8.5%、4.8-8.5%、4.9-8.5%、5-8.5%、5.1-8.5%、5.2-8.5%、5.3-8.5%、5.4-8.5%、5.5-8.5%、5.6-8.5%、5.7-8.5%、5.8-8.5%、5.9-8.5%、6-8.5%、6.1-8.5%、6.2-8.5%、6.3-8.5%、6.4-8.5%、6.5-8.5%、6.6-8.5%、6.7-8.5%、6.8-8.5%、6.9-8.5%、7-8.5%、7.1-8.5%、7.2-8.5%、7.3-8.5%、7.4-8.5%、7.5-8.5%、7.6-8.5%、7.7-8.5%、7.8-8.5%、7.9-8.5%、8-8.5%、8.1-8.5%、8.2-8.5%、8.3-8.5%、8.4-8.5%、0-9%、0.1-9%、0.2-9%、0.3-9%、0.4-9%、0.5-9%、0.6-9%、0.7-9%、0.8-9%、0.9-9%、1-9%、1.1-9%、1.2-9%、1.3-9%、1.4-9%、1.5-9%、1.6-9%、1.7-9%、1.8-9%、1.9-9%、2-9%、2.1-9%、2.2-9%、2.3-9%、2.4-9%、2.5-9%、2.6-9%、2.7-9%、2.8-9%、2.9-9%、3-9%、3.1-9%、3.2-9%、3.3-9%、3.4-9%、3.5-9%、3.6-9%、3.7-9%、3.8-9%、3.9-9%、4-9%、4.1-9%、4.2-9%、4.3-9%、4.4-9%、4.5-9%、4.6-9%、4.7-9%、4.8-9%、4.9-9%、5-9%、5.1-9%、5.2-9%、5.3-9%、5.4-9%、5.5-9%、5.6-9%、5.7-9%、5.8-9%、5.9-9%、6-9%、6.1-9%、6.2-9%、6.3-9%、6.4-9%、6.5-9%、6.6-9%、6.7-9%、6.8-9%、6.9-9%、7-9%、7.1-9%、7.2-9%、7.3-9%、7.4-9%、7.5-9%、7.6-9%、7.7-9%、7.8-9%、7.9-9%、8-9%、8.1-9%、8.2-9%、8.3-9%、8.4-9%、8.5-9%、8.6-9%、8.7-9%、8.8-9%、8.9-9%、0-9.5%、0.1-9.5%、0.2-9.5%、0.3-9.5%、0.4-9.5%、0.5-9.5%、0.6-9.5%、0.7-9.5%、0.8-9.5%、0.9-9.5%、1-9.5%、1.1-9.5%、1.2-9.5%、1.3-9.5%、1.4-9.5%、1.5-9.5%、1.6-9.5%、1.7-9.5%、1.8-9.5%、1.9-9.5%、2-9.5%、2.1-9.5%、2.2-9.5%、2.3-9.5%、2.4-9.5%、2.5-9.5%、2.6-9.5%、2.7-9.5%、2.8-9.5%、2.9-9.5%、3-9.5%、3.1-9.5%、3.2-9.5%、3.3-9.5%、3.4-9.5%、3.5-9.5%、3.6-9.5%、3.7-9.5%、3.8-9.5%、3.9-9.5%、4-9.5%、4.1-9.5%、4.2-9.5%、4.3-9.5%、4.4-9.5%、4.5-9.5%、4.6-9.5%、4.7-9.5%、4.8-9.5%、4.9-9.5%、5-9.5%、5.1-9.5%、5.2-9.5%、5.3-9.5%、5.4-9.5%、5.5-9.5%、5.6-9.5%、5.7-9.5%、5.8-9.5%、5.9-9.5%、6-9.5%、6.1-9.5%、6.2-9.5%、6.3-9.5%、6.4-9.5%、6.5-9.5%、6.6-9.5%、6.7-9.5%、6.8-9.5%、6.9-9.5%、7-9.5%、7.1-9.5%、7.2-9.5%、7.3-9.5%、7.4-9.5%、7.5-9.5%、7.6-9.5%、7.7-9.5%、7.8-9.5%、7.9-9.5%、8-9.5%、8.1-9.5%、8.2-9.5%、8.3-9.5%、8.4-9.5%、8.5-9.5%、8.6-9.5%、8.7-9.5%、8.8-9.5%、8.9-9.5%、9-9.5%、9.1-9.5%、9.2-9.5%、9.3-9.5%、9.4-9.5%、0-10%、0.1-10%、0.2-10%、0.3-10%、0.4-10%、0.5-10%、0.6-10%、0.7-10%、0.8-10%、0.9-10%、1-10%、1.1-10%、1.2-10%、1.3-10%、1.4-10%、1.5-10%、1.6-10%、1.7-10%、1.8-10%、1.9-10%、2-10%、2.1-10%、2.2-10%、2.3-10%、2.4-10%、2.5-10%、2.6-10%、2.7-10%、2.8-10%、2.9-10%、3-10%、3.1-10%、3.2-10%、3.3-10%、3.4-10%、3.5-10%、3.6-10%、3.7-10%、3.8-10%、3.9-10%、4-10%、4.1-10%、4.2-10%、4.3-10%、4.4-10%、4.5-10%、4.6-10%、4.7-10%、4.8-10%、4.9-10%、5-10%、5.1-10%、5.2-10%、5.3-10%、5.4-10%、5.5-10%、5.6-10%、5.7-10%、5.8-10%、5.9-10%、6-10%、6.1-10%、6.2-10%、6.3-10%、6.4-10%、6.5-10%、6.6-10%、6.7-10%、6.8-10%、6.9-10%、7-10%、7.1-10%、7.2-10%、7.3-10%、7.4-10%、7.5-10%、7.6-10%、7.7-10%、7.8-10%、7.9-10%、8-10%、8.1-10%、8.2-10%、8.3-10%、8.4-10%、8.5-10%、8.6-10%、8.7-10%、8.8-10%、8.9-10%、9-10%、9.1-10%、9.2-10%、9.3-10%、9.4-10%、9.5-10%、9.6-10%、9.7-10%、9.8-10%或9.9-10% w/v。
在一些實施例中，調配物可包括0-10% w/v蔗糖。
在一些實施例中，調配物可包括1% w/v蔗糖。
在一些實施例中，調配物可包括2% w/v蔗糖。
在一些實施例中，調配物可包括3% w/v蔗糖。
在一些實施例中，調配物可包括4% w/v蔗糖。
在一些實施例中，調配物可包括5% w/v蔗糖。
在一些實施例中，調配物可包括6% w/v蔗糖。
在一些實施例中，調配物可包括7% w/v蔗糖。
在一些實施例中，調配物可包括8% w/v蔗糖。
在一些實施例中，調配物可包括9% w/v蔗糖。
在一些實施例中，調配物可包括10% w/v蔗糖。 緩衝劑
在一些實施例中，本文所述之醫藥組合物之調配物可包含緩衝劑以維持溶液酸度(pH)接近所需值。在一些實施例中，本文所述之調配物之pH在7.0至8.5範圍內。本文所述之醫藥組合物之調配物可具有7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1或8.2之pH。在一些實施例中，本文所描述之醫藥組合物之調配物可具有7.2-8.2、7.2-7.6、7.3-7.7或7.8-8.2之pH。在一些實施例中，當調配物在5℃下時測定pH。在一些實施例中，當調配物在25℃下時測定pH。
適合之緩衝劑可包括但不限於Tris HC適合之緩衝劑可包括但不限於Tris HCl、Tris鹼、磷酸鈉(磷酸一鈉及/或磷酸二鈉)、磷酸鉀(磷酸一鉀及/或磷酸二鉀)、組胺酸、硼酸、檸檬酸、甘胺酸HEPES (4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸)及MOPS (3-(N-嗎啉基)丙磺酸)。
調配物中之緩衝劑的濃度可在1-50 mM之間、在1-25 mM之間、在5-30 mM之間、在5-20 mM之間、在5-15 mM之間、在10-40 mM或在15-30 mM之間。調配物中之緩衝劑的濃度可為約1 mM、5 mM、7.5 mM、10 mM、12.5 mM、15 mM、20 mM、25 mM、30 mM、35 mM、40 mM或50 mM。
在一些實施例中，調配物可包括但不限於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。作為一非限制性實例，PBS可包括氯化鈉、氯化鉀、磷酸二鈉、磷酸一鉀及蒸餾水。在一些情況下，PBS不含鉀或鎂。在其他情況下，PBS含有鈣及鎂。
在一些實施例中，用於本文所述之醫藥組合物之調配物的緩衝劑可包含磷酸鈉(磷酸一鈉及/或磷酸二鈉)。作為一非限制性實例，磷酸鈉可調整至7.4±0.2範圍內之pH值(在5℃下)。在一些實施例中，用於本文所描述之醫藥組合物之調配物之緩衝劑可包含Tris鹼。Tris鹼可用鹽酸調整至7.1至9.1範圍內之任何pH。作為一非限制性實例，用於本文所描述之調配物的Tris鹼可調整至8.0±0.2。作為一非限制性實例，用於本文所描述之調配物的Tris鹼可調整至7.5±0.2。
在一些實施例中，調配物中之緩衝劑可為鹽酸。鹽酸可單獨或與其他緩衝劑一起使用以調整調配物之pH。
在一些實施例中，調配物中之鹽酸之濃度可為但不限於0.1 mM、0.2 mM、0.3 mM、0.4 mM、0.5 mM、0.6 mM、0.7 mM、0.8 mM、0.9 mM、1 mM、1.1 mM、1.2 mM、1.3 mM、1.4 mM、1.5 mM、1.6 mM、1.7 mM、1.8 mM、1.9 mM、2 mM、2.1 mM、2.2 mM、2.3 mM、2.4 mM、2.5 mM、2.6 mM、2.7 mM、2.8 mM、2.9 mM、3 mM、3.1 mM、3.2 mM、3.3 mM、3.4 mM、3.5 mM、3.6 mM、3.7 mM、3.8 mM、3.9 mM、4 mM、4.1 mM、4.2 mM、4.3 mM、4.4 mM、4.5 mM、4.6 mM、4.7 mM、4.8 mM、4.9 mM、5 mM、5.1 mM、5.2 mM、5.3 mM、5.4 mM、5.5 mM、5.6 mM、5.7 mM、5.8 mM、5.9 mM、6 mM、6.1 mM、6.2 mM、6.3 mM、6.4 mM、6.5 mM、6.6 mM、6.7 mM、6.8 mM、6.9 mM、7 mM、7.1 mM、7.2 mM、7.3 mM、7.4 mM、7.5 mM、7.6 mM、7.7 mM、7.8 mM、7.9 mM、8 mM、8.1 mM、8.2 mM、8.3 mM、8.4 mM、8.5 mM、8.6 mM、8.7 mM、8.8 mM、8.9 mM、9 mM、9.1 mM、9.2 mM、9.3 mM、9.4 mM、9.5 mM、9.6 mM、9.7 mM、9.8 mM、9.9 mM、10 mM、10.1 mM、10.2 mM、10.3 mM、10.4 mM、10.5 mM、10.6 mM、10.7 mM、10.8 mM、10.9 mM、11 mM、11.1 mM、11.2 mM、11.3 mM、11.4 mM、11.5 mM、11.6 mM、11.7 mM、11.8 mM、11.9 mM、12 mM、12.1 mM、12.2 mM、12.3 mM、12.4 mM、12.5 mM、12.6 mM、12.7 mM、12.8 mM、12.9 mM、13 mM、13.1 mM、13.2 mM、13.3 mM、13.4 mM、13.5 mM、13.6 mM、13.7 mM、13.8 mM、13.9 mM、14 mM、14.1 mM、14.2 mM、14.3 mM、14.4 mM、14.5 mM、14.6 mM、14.7 mM、14.8 mM、14.9 mM或15 mM。
調配物可包括以下範圍內之鹽酸：0-0.5 mM、0.1-0.6 mM、0.2-0.7 mM、0.3-0.8 mM、0.4-0.9 mM、0.5-1 mM、0.6-1.1 mM、0.7-1.2 mM、0.8-1.3 mM、0.9-1.4 mM、1-1.5 mM、1.1-1.6 mM、1.2-1.7 mM、1.3-1.8 mM、1.4-1.9 mM、1.5-2 mM、1.6-2.1 mM、1.7-2.2 mM、1.8-2.3 mM、1.9-2.4 mM、2-2.5 mM、2.1-2.6 mM、2.2-2.7 mM、2.3-2.8 mM、2.4-2.9 mM、2.5-3 mM、2.6-3.1 mM、2.7-3.2 mM、2.8-3.3 mM、2.9-3.4 mM、3-3.5 mM、3.1-3.6 mM、3.2-3.7 mM、3.3-3.8 mM、3.4-3.9 mM、3.5-4 mM、3.6-4.1 mM、3.7-4.2 mM、3.8-4.3 mM、3.9-4.4 mM、4-4.5 mM、4.1-4.6 mM、4.2-4.7 mM、4.3-4.8 mM、4.4-4.9 mM、4.5-5 mM、4.6-5.1 mM、4.7-5.2 mM、4.8-5.3 mM、4.9-5.4 mM、5-5.5 mM、5.1-5.6 mM、5.2-5.7 mM、5.3-5.8 mM、5.4-5.9 mM、5.5-6 mM、5.6-6.1 mM、5.7-6.2 mM、5.8-6.3 mM、5.9-6.4 mM、6-6.5 mM、6.1-6.6 mM、6.2-6.7 mM、6.3-6.8 mM、6.4-6.9 mM、6.5-7 mM、6.6-7.1 mM、6.7-7.2 mM、6.8-7.3 mM、6.9-7.4 mM、7-7.5 mM、7.1-7.6 mM、7.2-7.7 mM、7.3-7.8 mM、7.4-7.9 mM、7.5-8 mM、7.6-8.1 mM、7.7-8.2 mM、7.8-8.3 mM、7.9-8.4 mM、8-8.5 mM、8.1-8.6 mM、8.2-8.7 mM、8.3-8.8 mM、8.4-8.9 mM、8.5-9 mM、8.6-9.1 mM、8.7-9.2 mM、8.8-9.3 mM、8.9-9.4 mM、9-9.5 mM、9.1-9.6 mM、9.2-9.7 mM、9.3-9.8 mM、9.4-9.9 mM、9.5-10 mM、9.6-10.1 mM、9.7-10.2 mM、9.8-10.3 mM、9.9-10.4 mM、10-10.5 mM、10.1-10.6 mM、10.2-10.7 mM、10.3-10.8 mM、10.4-10.9 mM、10.5-11 mM、10.6-11.1 mM、10.7-11.2 mM、10.8-11.3 mM、10.9-11.4 mM、11-11.5 mM、11.1-11.6 mM、11.2-11.7 mM、11.3-11.8 mM、11.4-11.9 mM、11.5-12 mM、11.6-12.1 mM、11.7-12.2 mM、11.8-12.3 mM、11.9-12.4 mM、12-12.5 mM、12.1-12.6 mM、12.2-12.7 mM、12.3-12.8 mM、12.4-12.9 mM、12.5-13 mM、12.6-13.1 mM、12.7-13.2 mM、12.8-13.3 mM、12.9-13.4 mM、13-13.5 mM、13.1-13.6 mM、13.2-13.7 mM、13.3-13.8 mM、13.4-13.9 mM、13.5-14 mM、13.6-14.1 mM、13.7-14.2 mM、13.8-14.3 mM、13.9-14.4 mM、14-14.5 mM、14.1-14.6 mM、14.2-14.7 mM、14.3-14.8 mM、14.4-14.9 mM、14.5-15 mM、0-1 mM、1-2 mM、2-3 mM、3-4 mM、4-5 mM、5-6 mM、6-7 mM、7-8 mM、8-9 mM、9-10 mM、10-11 mM、11-12 mM、12-13 mM、13-14 mM、14-15 mM、15-16 mM、0-2 mM、1-3 mM、2-4 mM、3-5 mM、4-6 mM、5-7 mM、6-8 mM、7-9 mM、8-10 mM、9-11 mM、10-12 mM、11-13 mM、12-14 mM、13-15 mM、0-3 mM、1-4 mM、2-5 mM、3-6 mM、4-7 mM、5-8 mM、6-9 mM、7-10 mM、8-11 mM、9-12 mM、10-13 mM、11-14 mM、12-15 mM、0-4 mM、1-5 mM、2-6 mM、3-7 mM、4-8 mM、5-9 mM、6-10 mM、7-11 mM、8-12 mM、9-13 mM、10-14 mM、11-15 mM、0-5 mM、1-6 mM、2-7 mM、3-8 mM、4-9 mM、5-10 mM、6-11 mM、7-12 mM、8-13 mM、9-14 mM、10-15 mM、0-6 mM、1-7 mM、2-8 mM、3-9 mM、4-10 mM、5-11 mM、6-12 mM、7-13 mM、8-14 mM、9-15 mM、0-7 mM、1-8 mM、2-9 mM、3-10 mM、4-11 mM、5-12 mM、6-13 mM、7-14 mM、8-15 mM、0-8 mM、1-9 mM、2-10 mM、3-11 mM、4-12 mM、5-13 mM、6-14 mM、7-15 mM、0-9 mM、1-10 mM、2-11 mM、3-12 mM、4-13 mM、5-14 mM、6-15 mM、0-10 mM、1-11 mM、2-12 mM、3-13 mM、4-14 mM、5-15 mM、0-11 mM、1-12 mM、2-13 mM、3-14 mM、4-15 mM、0-12 mM、1-13 mM、2-14 mM、3-15 mM、0-13 mM、1-14 mM、2-15 mM、0-14 mM、1-15 mM或0-15 mM。
在一些實施例中，調配物可包括0-10 mM鹽酸。
在一些實施例中，調配物可包括6.2-6.3 mM鹽酸。
在一些實施例中，調配物可包括8.9-9 mM鹽酸。
在一些實施例中，調配物可包括6.2 mM鹽酸。
在一些實施例中，調配物可包括6.3 mM鹽酸。
在一些實施例中，調配物可包括8.9 mM鹽酸。
在一些實施例中，調配物可包括9 mM鹽酸。 界面活性劑
在一些實施例中，本文所述之醫藥組合物之調配物可包含界面活性劑。界面活性劑可幫助控制懸浮培養物中之剪切力。本文中所使用之界面活性劑可為陰離子型、兩性離子型或非離子型界面活性劑，及可包括此項技術中已知適用於醫藥調配物中之界面活性劑。陰離子型界面活性劑之實例包括但不限於硫酸鹽、磺酸鹽、磷酸酯及羧酸鹽。非離子型界面活性劑之實例包括但不限於乙氧基化物、脂肪醇乙氧基化物、烷基酚乙氧基化物(例如壬苯醇醚、Triton X-100)、脂肪酸乙氧基化物、乙氧基化胺及/或脂肪酸醯胺(例如聚乙氧基化動物脂胺、椰油醯胺單乙醇胺、椰油醯胺二乙醇胺)、環氧乙烷/環氧丙烷共聚物(例如泊洛沙姆(Poloxamers)，諸如Pluronic® F-68或F-127)、脂肪酸及多元醇之酯、 脂肪酸烷醇醯胺、乙氧基化脂族酸、乙氧基化脂肪醇、乙氧基化山梨糖醇脂肪酸酯、乙氧基化甘油酯、與EDTA (乙烯二胺四乙酸)之乙氧基化嵌段共聚物、乙氧基化環醚加合物、乙氧基化醯胺及咪唑啉加合物、乙氧基化胺加合物、乙氧基化硫醇加合物、與烷基酚之乙氧基化縮合物、乙氧基化氮基疏水物、乙氧基化聚氧丙烯、聚合聚矽氧、氟化界面活性劑及可聚合界面活性劑。兩性離子型界面活性劑之實例包括但不限於烷基醯胺基甜菜鹼及其氧化胺、烷基甜菜鹼及其氧化胺、磺基甜菜鹼、羥基磺基甜菜鹼、兩性甘胺酸鹽、兩性丙酸鹽、平衡兩性聚羧基甘胺酸鹽及烷基聚胺基甘胺酸鹽。蛋白質具有取決於pH而帶電荷或不帶電之能力；因此，在正確pH下，蛋白質，較佳pH為約8至9，諸如經修飾牛血清白蛋白或胰凝乳蛋白酶原，可充當兩性離子型界面活性劑。需要時可使用界面活性劑之各種混合物。
在一些實施例中，本文所述之醫藥組合物之調配物中所用的界面活性劑包括至少一種環氧乙烷/環氧丙烷共聚物。
在一些實施例中，調配物可包括泊洛沙姆。在一些實施例中，調配物可包括以下範圍內之泊洛沙姆：0.00001%-0.0001%、0.00001%-0.001%、0.00001%-0.01%、0.00001%-0.1%、0.00001%-1%、0.0001%-0.001%、0.0001%-0.01%、0.0001%-0.1%、0.0001%-1%、0.001%-0.01%、0.001%-0.1%、0.001%-1%、0.01%-0.1%、0.01%-1%或0.1-1% w/v。
在一些實施例中，調配物可包括0.001% w/v泊洛沙姆。
在一些實施例中，調配物可包括泊洛沙姆188 (例如Pluronic® F-68)。在一些實施例中，調配物可包括濃度為0.00001%、0.0001%、0.001%、0.01%、0.1%或1% w/v之泊洛沙姆188。
在一些實施例中，調配物可包括以下範圍內之泊洛沙姆188：0.00001%-0.0001%、0.00001%-0.001%、0.00001%-0.01%、0.00001%-0.1%、0.00001%-1%、0.0001%-0.001%、0.0001%-0.01%、0.0001%-0.1%、0.0001%-1%、0.001%-0.01%、0.001%-0.1%、0.001%-1%、0.01%-0.1%、0.01%-1%或0.1-1% w/v。
在一些實施例中，調配物可包括0.001% w/v泊洛沙姆188。
在一些實施例中，調配物可包括Pluronic® F-68。在一些實施例中，調配物可包括濃度為0.00001%、0.0001%、0.001%、0.01%、0.1%或1% w/v之Pluronic® F-68。
在一些實施例中，調配物可包括以下範圍內之Pluronic® F-68：0.00001%-0.0001%、0.00001%-0.001%、0.00001%-0.01%、0.00001%-0.1%、0.00001%-1%、0.0001%-0.001%、0.0001%-0.01%、0.0001%-0.1%、0.0001%-1%、0.001%-0.01%、0.001%-0.1%、0.001%-1%、0.01%-0.1%、0.01%-1%或0.1-1% w/v。
在一些實施例中，調配物可包括0.001% w/v Pluronic® F-68。 重量莫耳滲透濃度
在一些實施例中，調配物可針對特定重量莫耳滲透濃度最佳化。調配物之重量莫耳滲透濃度可為但不限於350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499或500 mOsm/kg (毫滲量/公斤)。
在一些實施例中，調配物可針對特定範圍之重量莫耳滲透濃度最佳化。該範圍可為但不限於350-360、360-370、370-380、380-390、390-400、400-410、410-420、420-430、430-440、440-450、450-460、460-470、470-480、480-490、490-500、350-370、360-380、370-390、380-400、390-410、400-420、410-430、420-440、430-450、440-460、450-470、460-480、470-490、480-500、350-375、375-400、400-425、425-450、450-475、475-500、350-380、360-390、370-400、380-410、390-420、400-430、410-440、420-450、430-460、440-470、450-480、460-490、470-500、350-390、360-400、370-410、380-420、390-430、400-440、410-450、420-460、430-470、440-480、450-490、460-500、350-400、360-410、370-420、380-430、390-440、400-450、410-460、420-470、430-480、440-490、450-500、350-410、360-420、370-430、380-440、390-450、400-460、410-470、420-480、430-490、440-500、350-420、360-430、370-440、380-450、390-460、400-470、410-480、420-490、430-500、350-430、360-440、370-450、380-460、390-470、400-480、410-490、420-500、350-440、360-450、370-460、380-470、390-480、400-490、410-500、350-450、360-460、370-470、380-480、390-490、400-500、350-460、360-470、370-480、380-490、390-500、350-470、360-480、370-490、380-500、350-480、360-490、370-500、350-490、360-500或350-500 mOsm/kg。
在一些實施例中，調配物之重量莫耳滲透濃度在350-500 mOsm/kg之間。
在一些實施例中，調配物之重量莫耳滲透濃度在400-500 mOsm/kg之間。
在一些實施例中，調配物之重量莫耳滲透濃度在400-480 mOsm/kg之間。
在一些實施例中，調配物之最大重量莫耳滲透濃度為約500 mOsm/kg。
在一些實施例中，對流增強遞送(CED)輸注至腦中之重量莫耳滲透濃度為約400-480 mOsm/kg。
在一些實施例中，對流增強遞送(CED)輸注至腦中之最大重量莫耳滲透濃度為約400-480 mOsm/kg。
在一些實施例中，對流增強遞送(CED)輸注至腦中之最大重量莫耳滲透濃度為約500 mOsm/kg。 AAV粒子之濃度
在一些實施例中，調配物中AAV粒子之濃度可在約1×106 VG/mL與約1×1016 VG/mL之間。如本文所用，「VG/mL」表示載體基因體(VG)/毫升(mL)。VG/mL亦可描述基因體複本/毫升或抗DNA酶粒子/毫升。
在一些實施例中，調配物可包括以下AAV粒子濃度：約1×106 、2×106 、3×106 、4×106 、5×106 、6×106 、7×106 、8×106 、9×106 、1×107 、2×107 、3×107 、4×107 、5×107 、6×107 、7×107 、8×107 、9×107 、1×108 、2×108 、3×108 、4×108 、5×108 、6×108 、7×108 、8×108 、9×108 、1×109 、2×109 、3×109 、4×109 、5×109 、6×109 、7×109 、8×109 、9×109 、1×1010 、2×1010 、3×1010 、4×1010 、5×1010 、6×1010 、7×1010 、8×1010 、9×1010 、1×1011 、2×1011 、2.1×1011 、2.2×1011 、2.3×1011 、2.4×1011 、2.5×1011 、2.6×1011 、2.7×1011 、2.8×1011 、2.9×1011 、3×1011 、4×1011 、5×1011 、6×1011 、7×1011 、7.1×1011 、7.2×1011 、7.3×1011 、7.4×1011 、7.5×1011 、7.6×1011 、7.7×1011 、7.8×1011 、7.9×1011 、8×1011 、9×1011 、1×1012 、1.1×1012 、1.2×1012 、1.3×1012 、1.4×1012 、1.5×1012 、1.6×1012 、1.7×1012 、1.8×1012 、1.9×1012 、2×1012 、2.1×1012 、2.2×1012 、2.3×1012 、2.4×1012 、2.5×1012 、2.6×1012 、2.7×1012 、2.8×1012 、2.9×1012 、3×1012 、4×1012 、4.1×1012 、4.2×1012 、4.3×1012 、4.4×1012 、4.5×1012 ,4.6×1012 、4.7×1012 、4.8×1012 、4.9×1012 、5×1012 、6×1012 、7×1012 、7.1×1012 、7.2×1012 、7.3×1012 、7.4×1012 、7.5×1012 、7.6×1012 、7.7×1012 、7.8×1012 、7.9×1012 、8×1012 、8.1×1012 、8.2×1012 、8.3×1012 、8.4×1012 、8.5×1012 、8.6×1012 、8.7×1012 、8.8×1012 、8.9×1012 、9×1012 、1×1013 、1.1×1013 、1.2×1013 、1.3×1013 、1.4×1013 、1.5×1013 、1.6×1013 、1.7×1013 、1.8×1013 、1.9×1013 、2×1013 、2.7×1013 、3×1013 、3.1×1013 、3.2×1013 、3.3×1013 、3.4×1013 、3.5×1013 、3.6×1013 、3.7×1013 、3.8×1013 、3.9×1013 、4×1013 、5×1013 、6×1013 、6.7×1013 、7×1013 、8×1013 、9×1013 、1×1014 、2×1014 、3×1014 、4×1014 、5×1014 、6×1014 、7×1014 、8×1014 、9×1014 、1×1015 、2×1015 、3×1015 、4×1015 、5×1015 、6×1015 、7×1015 、8×1015 、9×1015 或1×1016 VG/mL。
在一些實施例中，調配物中AAV粒子之濃度可在AAV粒子的濃度在1×1011 與5×1013 之間、在1×1012 與5×1012 之間、在2×1012 與1×1013 之間、在5×1012 與1×1013 之間、在1×1013 與2×1013 之間、在2×1013 與3×1013 之間、在2×1013 與2.5×1013 之間、在2.5×1013 與3×1013 之間或不超過5×1013 VG/mL。
在一些實施例中，調配物中AAV粒子之濃度為2.7×1011 VG/mL。
在一些實施例中，調配物中AAV粒子之濃度為9×1011 VG/mL。
在一些實施例中，調配物中AAV粒子之濃度為2.7×1012 VG/mL。
在一些實施例中，調配物中AAV粒子之濃度為4×1012 VG/mL。
在一些實施例中，調配物中AAV粒子之濃度為7.9×1012 VG/mL。
在一些實施例中，調配物中AAV粒子之濃度為1.0×1013 VG/mL。
在一些實施例中，調配物中AAV粒子之濃度為2.2×1013 VG/mL。
在一些實施例中，調配物中AAV粒子之濃度為2.7×1013 VG/mL。
在一些實施例中，調配物中AAV粒子之濃度為3.5×1013 VG/mL。
在一些實施例中，調配物中AAV粒子之濃度可在約1×106 個總衣殼/毫升與約1×1016 個總衣殼/毫升之間。在一些實施例中，遞送可包含以下組合物濃度：約1×106 、2×106 、3×106 、4×106 、5×106 、6×106 、7×106 、8×106 、9×106 、1×107 、2×107 、3×107 、4×107 、5×107 、6×107 、7×107 、8×107 、9×107 、1×108 、2×108 、3×108 、4×108 、5×108 、6×108 、7×108 、8×108 、9×108 、1×109 、2×109 、3×109 、4×109 、5×109 、6×109 、7×109 、8×109 、9×109 、1×1010 、2×1010 、3×1010 、4×1010 、5×1010 、6×1010 、7×1010 、8×1010 、9×1010 、1×1011 、2×1011 、3×1011 、4×1011 、5×1011 、6×1011 、7×1011 、8×1011 、9×1011 、1×1012 、1.1×1012 、1.2×1012 、1.3×1012 、1.4×1012 、1.5×1012 、1.6×1012 、1.7×1012 、1.8×1012 、1.9×1012 、2×1012 、2.1×1012 、2.2×1012 、2.3×1012 、2.4×1012 、2.5×1012 、2.6×1012 、2.7×1012 、2.8×1012 、2.9×1012 、3×1012 、3.1×1012 、3.2×1012 、3.3×1012 、3.4×1012 、3.5×1012 、3.6×1012 、3.7×1012 、3.8×1012 、3.9×1012 、 4×1012 、4.1×1012 、4.2×1012 、4.3×1012 、4.4×1012 、4.5×1012 、4.6×1012 、4.7×1012 、4.8×1012 、4.9×1012 、5×1012 、6×1012 、7×1012 、8×1012 、9×1012 、1×1013 、2×1013 、2.7×1013 、3×1013 、4×1013 、5×1013 、6×1013 、6.7×1013 、7×1013 、8×1013 、9×1013 、1×1014 、2×1014 、3×1014 、4×1014 、5×1014 、6×1014 、7×1014 、8×1014 、9×1014 、1×1015 、2×1015 、3×1015 、4×1015 、5×1015 、6×1015 、7×1015 、8×1015 、9×1015 或1×1016 個總衣殼/毫升。 AAV粒子之總劑量
在一些實施例中，調配物中AAV粒子之總劑量可在約1×106 個VG與約1×1016 個VG之間。在一些實施例中，調配物可包括以下AAV粒子總劑量：約1×106 、2×106 、3×106 、4×106 、5×106 、6×106 、7×106 、8×106 、9×106 、1×107 、2×107 、3×107 、4×107 、5×107 、6×107 、7×107 、8×107 、9×107 、1×108 、2×108 、3×108 、4×108 、5×108 、6×108 、7×108 、8×108 、9×108 、1×109 、2×109 、3×109 、4×109 、5×109 、6×109 、7×109 、8×109 、9×109 、1×1010 、2×1010 、3×1010 、4×1010 、5×1010 、6×1010 、7×1010 、8×1010 、9×1010 、1×1011 、2×1011 、2.1×1011 、2.2×1011 、2.3×1011 、2.4×1011 、2.5×1011 、2.6×1011 、2.7×1011 、2.8×1011 、2.9×1011 、3×1011 、4×1011 、5×1011 、6×1011 、7×1011 、7.1×1011 、7.2×1011 、7.3×1011 、7.4×1011 、7.5×1011 、7.6×1011 、7.7×1011 、7.8×1011 、7.9×1011 、8×1011 、9×1011 、1×1012 、1.1×1012 、1.2×1012 、1.3×1012 、1.4×1012 、1.5×1012 、1.6×1012 、1.7×1012 、1.8×1012 、1.9×1012 、2×1012 、2.1×1012 、2.2×1012 、2.3×1012 、2.4×1012 、2.5×1012 、2.6×1012 、2.7×1012 、2.8×1012 、2.9×1012 、3×1012 、4×1012 、4.1×1012 、4.2×1012 、4.3×1012 、4.4×1012 、4.5×1012 ,4.6×1012 、4.7×1012 、4.8×1012 、4.9×1012 、5×1012 、6×1012 、7×1012 、7.1×1012 、7.2×1012 、7.3×1012 、7.4×1012 、7.5×1012 、7.6×1012 、7.7×1012 、7.8×1012 、7.9×1012 、8×1012 、8.1×1012 、8.2×1012 、8.3×1012 、8.4×1012 、8.5×1012 、8.6×1012 、8.7×1012 、8.8×1012 、8.9×1012 、9×1012 、1×1013 、1.1×1013 、1.2×1013 、1.3×1013 、1.4×1013 、1.5×1013 、1.6×1013 、1.7×1013 、1.8×1013 、1.9×1013 、2×1013 、2.7×1013 、3×1013 、3.1×1013 、3.2×1013 、3.3×1013 、3.4×1013 、3.5×1013 、3.6×1013 、3.7×1013 、3.8×1013 、3.9×1013 、4×1013 、5×1013 、6×1013 、6.7×1013 、7×1013 、8×1013 、9×1013 、1×1014 、2×1014 、3×1014 、4×1014 、5×1014 、6×1014 、7×1014 、8×1014 、9×1014 、1×1015 、2×1015 、3×1015 、4×1015 、5×1015 、6×1015 、7×1015 、8×1015 、9×1015 或1×1016 個VG。
在一些實施例中，調配物中AAV粒子之總劑量在1×1011 與2×1014 個VG之間。 例示性調配物
在一些實施例中，調配物可包括磷酸鈉、磷酸鉀、氯化鈉、氯化鉀及視情況選用之界面活性劑，諸如泊洛沙姆188 (例如Pluronic® F-68)。作為一非限制性實例，調配物可包括10 mM磷酸鈉、2 mM磷酸鉀、192 mM氯化鈉、2.7 mM氯化鉀及0.001% (w/v)泊洛沙姆188。調配物可用於調配濃度為約2.7×1012 VG/mL之AAV粒子。
在一些實施例中，調配物可包括磷酸鹽緩衝鹽水、蔗糖及視情況選用之界面活性劑，諸如泊洛沙姆188。作為一非限制性實例，調配物可包括磷酸鹽緩衝鹽水、5%蔗糖及0.001% (w/v)泊洛沙姆188。調配物可用於調配濃度為約2.2×1012 VG/mL之AAV粒子。
在一些實施例中，調配物可包括磷酸鈉、磷酸鉀、氯化鈉、蔗糖及視情況選用之界面活性劑，諸如泊洛沙姆188。作為一非限制性實例，調配物可包括2.7 mM磷酸鈉、1.54 mM磷酸鉀、155 mM氯化鈉及5% (w/v)蔗糖，pH為7.2，且重量莫耳滲透濃度為450 mOsm/kg。
在一些實施例中，調配物可包括磷酸鈉、磷酸鉀、氯化鈉、蔗糖及視情況選用之界面活性劑，諸如泊洛沙姆188。作為一非限制性實例，調配物可包括10 mM磷酸鈉、1.5 mM磷酸鉀、95 mM氯化鈉、7% (w/v)蔗糖及0.001% (w/v)泊洛沙姆188，pH在5℃下為7.4±0.2。調配物可用於調配濃度為約2.7×1013 VG/mL之AAV粒子。
在一些實施例中，調配物可包括Tris鹼、鹽酸、氯化鉀、氯化鈉、蔗糖及視情況選用之界面活性劑，諸如泊洛沙姆188。作為一非限制性實例，調配物可包括10 mM Tris鹼、6.3 mM HCl、1.5 mM氯化鉀、100 mM氯化鈉、7% (w/v)蔗糖及0.001% (w/v)泊洛沙姆188，pH在5℃下為8.0±0.2。作為另一非限制性實例，調配物可包括10 mM Tris鹼、9 mM HCl、1.5 mM氯化鉀、100 mM氯化鈉、7% (w/v)蔗糖及0.001% (w/v)泊洛沙姆188，在5℃下pH為7.5±0.2。調配物可用於調配濃度為約2.7×1013 VG/mL之AAV粒子。遞送
在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子可使用歐洲專利申請案第EP1857552號(其內容以全文引用之方式併入本文中)中所描述之遞送AAV病毒顆粒之方法投與或遞送。
在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子可使用歐洲專利申請案第EP2678433號(其內容以全文引用之方式併入本文中)中所描使用AAV載體遞送蛋白質之方法投與或遞送。
在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子可使用美國專利第US 5,858,351號(其內容以全文引用之方式併入本文中)中所描述之使用AAV載體遞送DNA分子之方法投與或遞送。
在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子可使用美國專利第US 6,211,163號(其內容以全文引用之方式併入本文中)中所描述之將DNA遞送至血流中之方法投與或遞送。
在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子可使用美國專利第US 6,325,998號(其內容以全文引用之方式併入本文中)中所描述之遞送AAV病毒顆粒之方法投與或遞送。
在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子可使用美國專利第US 7,588,757號(其內容以全文引用之方式併入本文中)中所描述之將酬載遞送至中樞神經系統之方法投與或遞送。
在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子可使用美國專利第US 8283151號(其內容以全文引用之方式併入本文中)中所描述之遞送酬載之方法投與或遞送。
在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子可使用國際專利公開案第WO2001089583號(其內容以全文引用之方式併入本文中)中所描述之使用麩胺酸去羧酶(GAD)遞送載體來遞送酬載之方法投與或遞送。
在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子可使用國際專利公開案第WO2012057363號(其內容以全文引用之方式併入本文中)中所描述之使用將酬載遞送至神經細胞之方法投與或遞送。向細胞遞送
本發明提供將上文所描述之AAV聚核苷酸或AAV基因體中之任一者遞送至細胞或組織的方法，其包含使細胞或組織與該AAV聚核苷酸或AAV基因體接觸或使細胞或組織與包含該AAV聚核苷酸或AAV基因體之粒子接觸，或使細胞或組織與包括醫藥組合物之所描述之組合物中的任一者接觸。將AAV聚核苷酸或AAV基因體遞送至細胞或組織之方法可活體外、離體或活體內實現。 引入細胞中-AAV粒子
本發明之經編碼之siRNA分子(例如siRNA雙螺旋)可藉由經AAV粒子之載體基因體(VG)編碼而引入細胞中。此等AAV粒子經工程改造及最佳化以促進siRNA分子進入可被輕易修改轉染之細胞。此外，一些合成AAV粒子能夠將shRNA整合至細胞基因體中，進而引起目標基因之穩定siRNA表現及長期減弱。以此方式，AAV粒子經工程改造為用於特異性遞送、同時缺乏發現於野生型病毒中之有害複製及/或整合特徵的運載工具。
在一些實施例中，本發明之經編碼siRNA分子藉由使細胞與包含編碼siRNA分子之調節聚核苷酸序列之AAV粒子及親脂性載劑接觸而引入細胞中。在其他實施例中，可藉由用包含在轉錄於細胞中時能夠產生siRNA分子之核酸序列之AAV粒子使細胞轉染或感染來將siRNA分子引入細胞中。在一些實施例中，藉由將AAV粒子注射至細胞中，該AAV粒子包含在細胞中轉錄時能夠產生siRNA分子之核酸序列，從而將siRNA分子引入細胞中。
在一些實施例中，在轉染前，可將本發明之包含編碼siRNA分子之核酸序列的AAV粒子轉染至細胞中。
在其他實施例中，可藉由電穿孔將本發明之包含編碼siRNA分子之核酸序列的AAV粒子遞送至細胞中(例如美國專利公開案第20050014264號；其內容以全文引用之方式併入本文中)。
本文中所描述之用於引入包含編碼siRNA分子之核酸序列之AAV粒子的其他方法可包括如美國專利公開案第20120264807號(其內容以全文引用之方式併入本文中)中所描述之光化學內化。
在一些實施例中，本文所述之調配物可含有至少一個本文所述之包含編碼siRNA分子之核酸序列的AAV粒子。在一些實施例中，siRNA分子可靶向一個目標位點處之HTT基因。在另一實施例中，調配物包含複數個AAV粒子，各AAV粒子包含編碼靶向不同目標位點處之HTT基因之siRNA分子的核酸序列。HTT可靶向2、3、4、5個或超過5個位點。
在一些實施例中，可將來自任何相關物種(諸如但不限於人類、豬、狗、小鼠、大鼠或猴)之AAV粒子引入細胞中。
在一些實施例中，可將AAV粒子引入與待治療之疾病相關之細胞中。作為一非限制性實例，疾病係HD且目標細胞係神經元及星形膠質細胞。作為另一非限制性實例，疾病係HD且目標細胞係中型多棘神經元、皮質神經元及星形膠質細胞。
在一些實施例中，可將AAV粒子引入具有高含量目標序列內源性表現的細胞中。
在另一實施例中，可將AAV粒子引入具有低含量目標序列內源性表現的細胞中。
在一些實施例中，細胞可為具有高AAV轉導效率之細胞。向個體遞送
本發明另外提供一種將上述AAV聚核苷酸或AAV基因體中之任一者遞送至個體(包括哺乳動物個體，諸如但不限於有需要之患者)之方法，其包含向該個體投與該AAV聚核苷酸或AAV基因體，或向該個體投與包含該AAV聚核苷酸或AAV基因體之粒子，或向該個體投與所描述之組合物中之任一者，包括醫藥組合物。
本文所描述之AAV粒子的醫藥組合物可由生物可用性、治療窗及/或分佈體積中之一或多者加以表徵。 III.投與及給藥投與
包含編碼本發明siRNA分子之核酸序列的AAV粒子可藉由產生治療有效結果之任何途徑投與。此等包括但不限於器官之軟組織內，諸如但不限於腦(例如腦實質內)、紋狀體(紋狀體內)、腸內(至腸中)、胃腸病學、硬膜外、口服(藉助於嘴)、經皮、硬膜外、腦內(至大腦中)、腦室內(至腦室內)、軟膜下(在軟腦膜下)、上表皮(塗覆至皮膚上)、皮內(至皮膚自身中)、皮下(在皮膚下)、經鼻投與(經由鼻)、靜脈內(至靜脈中)、靜脈內推注、靜脈內滴液、動脈內(至動脈中)、肌肉內(肌肉中)、心內(心臟中)、骨內輸注(至骨髓中)、鞘內(至脊髓管中)、神經節內(至神經節中)、腹膜內(輸注或注射至腹膜中)、膀胱內輸注、玻璃體內(經由眼睛)、海綿竇內注射(至病理性凹穴中)、腔內(至陰莖底部)、陰道內投與、子宮內、羊膜外投與、經皮(經由全身分佈之完整皮膚擴散)、經黏膜(經由黏膜擴散)、經陰道、吹入(噴鼻息)、舌下、唇下、灌腸、滴眼(至結膜上)、耳內滴液、經耳(在耳中或藉助於耳)、頰內(指向頰部)、結膜、皮膚、牙齒(至一或多個牙齒)、電滲透、子宮頸內、竇內、氣管內、體外、血液透析、滲入、間質、腹內、羊膜內、關節內、膽內、支氣管內、囊內、軟骨內(軟骨內)、尾部內(馬尾內)、腦池內(小腦延髓池小腦髓)、角膜內(角膜內部)、牙齒冠內、冠狀動脈內(冠狀動脈內部)、海綿體內孔(陽莖之海綿體之可膨脹空間)、椎間盤內(盤內)、管內(腺體之管道內)、十二指腸內(十二指腸內部)、硬膜內(硬腦膜內或下方)、表皮內(至表皮)、食管內(至食道)、胃內(胃內部)、齒齦內(齒齦內部)、回腸內(小腸之遠端部分內)、病灶內(局部病變內或直接引入局部病變)、邊緣內(管腔內)、淋巴管內(淋巴內部)、髓內(骨之骨髓腔內)、腦脊膜內(腦膜內)、眼內(眼睛內部)、卵巢內(卵巢內部)、心包內(心包內部)、胸膜內(胸膜內部)、前列腺內(前列腺腺體內部)、肺內(肺部或其支氣管內部)、竇內(經鼻或眶周竇)、脊柱內(脊柱內部)、滑膜內(關節之滑液腔內)、腱內(肌腱內)、睾丸內(睾丸內部)、鞘內(在腦脊髓之任何水準下之腦脊髓液內部)、胸內(胸部內)、小管內(器官之小管內)、瘤內(腫瘤內部)、內鼓膜(中膜內)、血管內(一或多種血管內)、室內(腦室內)、離子電滲(藉助於電流，其中可溶性鹽之離子遷移至身體組織中)、沖洗(沖洗或沖刷開放性傷口或體腔)、喉部(直接在喉上)、鼻胃管(經由鼻且進入胃中)、包紮療法技術(隨後由堵塞區域之包紮覆蓋之局部途徑投與)、經眼(至外眼)、口咽(直接至嘴及咽)、非經腸、經皮、關節周、硬膜外、神經周、牙周、經直腸、呼吸(藉由口服或經鼻吸入以實現局部或全身效果之呼吸道內)、眼球後(腦橋後方或眼球後方)、軟組織、蛛膜下、結膜下、黏膜下層、局部、經胎盤(經由或穿過胎盤)、經氣管(穿過氣管壁)、經鼓膜(穿過或經由鼓腔)、輸尿管(至輸尿管)、尿道(至尿道)、陰道、骶管阻滯、診斷、神經阻斷、膽道灌注、心肌灌注、光除去法或脊髓。
在特定實施例中，包含編碼本發明siRNA分子之核酸序列的AAV粒子之組合物可以促進載體或siRNA分子進入中樞神經系統且穿透至中型多棘神經元及/或皮質神經元及/或星形膠質細胞中之方式投與。
在一些實施例中，包含編碼本發明siRNA分子之核酸序列的AAV粒子可藉由肌肉內注射投與。
在一些實施例中，包含編碼本發明siRNA分子之核酸序列的AAV粒子可藉由腦實質內注射投與。
在一些實施例中，包含編碼本發明siRNA分子之核酸序列的AAV粒子可經由腦實質內注射及鞘內注射投與。
在一些實施例中，包含編碼本發明siRNA分子之核酸序列的AAV粒子可經由紋狀體內注射投與。
在一些實施例中，包含編碼本發明siRNA分子之核酸序列的AAV粒子可經由紋狀體內注射及本文所述之另一投與途徑投與。
在一些實施例中，表現本發明之siRNA雙螺旋之AAV粒子可藉由外周注射(例如靜脈內)及/或鼻內遞送向個體投與。此項技術中揭示可將針對siRNA雙螺旋之AAV粒子之外周投與傳輸至中樞神經系統，例如至神經元(例如美國專利公開案第20100240739號及第20100130594號；其各自內容以全文引用之方式併入本文中)。
在其他實施例中，包含至少一種包含編碼本發明siRNA分子之核酸序列之AAV粒子的組合物可藉由顱內遞送向個體投與(參見例如美國專利第8,119,611號；其內容以全文引用的方式併入本文中)。
包含編碼本發明siRNA分子之核酸序列的AAV粒子可以任何適合之形式(以液體溶液或懸浮液形式、以適合於液體溶液或液體溶液中之懸浮液的固體形式)投與。siRNA雙螺旋可使用任何適當及醫藥學上可接受的賦形劑調配。
包含編碼本發明siRNA分子之核酸序列的AAV粒子可以「治療有效」量，亦即足以緩解及/或預防至少一種與疾病相關之症狀，或提供個體狀況改善的量投與。
在一些實施例中，AAV粒子可以治療有效量投與至CNS以改良患有亨丁頓舞蹈症(HD)之個體之功能及/或存活期。作為一非限制性實例，載體可藉由直接輸注至紋狀體中進行投與。
在一些實施例中，AAV粒子可以針對siRNA雙螺旋或dsRNA之治療有效量投與至個體(例如經由鞘內投與之個體之CNS)以靶向中型多棘神經元、皮質神經元及/或星形膠質細胞。作為一非限制性實例，siRNA雙螺旋或dsRNA可降低HTT蛋白或mRNA之表現。作為另一非限制性實例，siRNA雙螺旋或dsRNA可遏制HTT且降低HTT介導之毒性。HTT蛋白及/或mRNA以及HTT介導之毒性的降低可伴以近似無促進之炎症實現。
在一些實施例中，AAV粒子可以治療有效量投與至個體(例如至個體之CNS)，以減緩個體之功能減退(例如使用已知評估方法，諸如統一亨丁頓舞蹈症評定量表(UHDRS)確定)。作為一非限制性實例，載體可經由腦實質內注射投與。
在一些實施例中，可以治療有效量向小腦延髓池投與AAV粒子以轉導中型多棘神經元、皮質神經元及/或星形膠質細胞。作為一非限制性實例，載體可經鞘內投與。
在一些實施例中，AAV粒子可使用鞘內輸注以治療有效量投與，以轉導中型多棘神經元、皮質神經元及/或星形膠質細胞。作為一非限制性實例，載體可經鞘內投與。
在一些實施例中，可調配包含調節聚核苷酸之AAV粒子。作為一非限制性實例，調配物之比重及/或重量莫耳滲透濃度可經最佳化與確保中樞神經系統或中樞神經系統之區域或組分中之最優藥物分佈。
在一些實施例中，包含調節聚核苷酸之AAV粒子可經由單個投與途徑遞送至個體。
在一些實施例中，包含調節聚核苷酸之AAV粒子可經由多部位投與途徑遞送至個體。可在2、3、4、5或超過5個部位處向個體投與包含調節聚核苷酸之AAV粒子。
在一些實施例中，可使用快速注射向個體投與包含本文所述之調節聚核苷酸之AAV粒子。
在一些實施例中，可使用歷經數分鐘、數小時或數天時段之持續遞送向個體投與包含本文所述之調節聚核苷酸之AAV粒子。輸注速率可視個體、分佈、調配物或另一遞送參數而改變。
在一些實施例中，本文所述之AAV粒子係經由殼核及尾核輸注投與。作為一非限制性實例，雙重輸注提供廣泛的紋狀體分佈以及額葉及顳葉皮質分佈。
在一些實施例中，AAV粒子為經由單側殼核輸注投與之AAV-DJ8。作為一非限制性實例，所投與之AAV-DJ8之分佈類似於經由單側殼核輸注遞送之AAV1之分佈。
在一些實施例中，本文所述之AAV粒子係經由C1處之鞘內(IT)輸注投與。輸注可持續1、2、3、4、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或超過15小時。
在一些實施例中，用於投與本文所述之AAV粒子之個體及/或劑量效果、投與途徑及/或投與體積的選擇可使用亦稱為Virchow-Robin空間之血管周圍間隙(PVS)之成像評估。PVS在其穿孔腦實質且經腦脊髓液(CSF)/間質液填充時包圍小動脈及小靜脈。PVS在中腦、基底節及半卵圓中心中常見。雖然不希望受理論束縛，但PVS可在代謝物之正常清除中起作用且與較差之認知及若干疾病病況(包括帕金森氏症(Parkinson's disease))相關聯。PVS之尺寸通常為正常的但其尺寸在許多疾病病況中增加。Potter等人(Cerebrovasc Dis. 2015年1月;39(4): 224-231；其內容以全文引用之方式併入本文中)研發出一種分級法，其中其研究全範圍之PVS且分級基底節、半卵圓中心及中腦PVS。其使用Mac及Lullich等人(J Neurol Neurosurg Psychiatry. 2004年11月;75(11):1519-23；該文獻之內容以全文引用之方式併入本文中)所使用的PVS之頻率及範圍，且Potter等人為基底節及半卵圓中心PVS提供5個等級：0 (無)、1 (1-10)、2 (11-20)、3 (21-40)及4 (＞40)且為中腦PVS提供2個等級：0 (非可見)或1 (可見)。Potter等人所提供之評級系統的用戶手冊可見於：www.sbirc.ed.ac.uk/documents/epvs-rating-scale-user-guide.pdf。
在一些實施例中，本文所述之AAV粒子係經由丘腦輸注投與。輸注至丘腦中可為雙側或單側的。
在一些實施例中，本文所述之AAV粒子係經由殼核輸注投與。輸注至丘腦中可為雙側或單側的。
在一些實施例中，本文所述之AAV粒子係經由殼核及丘腦輸注投與。雙重輸注至殼核及丘腦中可經由軸突傳輸而使腦分佈最大化至皮質區。Evers等人觀測到在將AAV5-GFP雙側注射至tgHD小型豬之殼核及丘腦中之後，神經元於運動皮質及部分頂葉皮質中之陽性轉導(Molecular Therapy (2018), doi: 10.1016/j.ymthe.2018.06.021)。輸注至殼核及丘腦中可獨立地為雙側或單側的。作為一非限制性實例，AAV粒子可自腦兩側輸注至殼核及丘腦中。作為另一非限制性實例，AAV粒子可輸注至左殼核及左丘腦，或右殼核及右丘腦中。作為另一非限制性實例，AAV粒子可輸注至左殼核及右丘腦，或右殼核及左丘腦中。雙重輸注可連續或同時進行。
在一些實施例中，包含調節聚核苷酸之AAV粒子可在不存在體重之基因療法相關變化的情況下遞送至個體。
在一些實施例中，包含調節聚核苷酸之AAV粒子可在不存在基因療法相關之臨床症狀，包括但不限於協調不能、食慾不振、進食減少及全身無力的情況下遞送至個體。
在一些實施例中，包含調節聚核苷酸之AAV粒子可在不存在個體血液之基因療法相關變化的情況下遞送至個體。在某些實施例中，個體血液之變化為血清化學及凝血參數。
在一些實施例中，包含調節聚核苷酸之AAV粒子可在不存在個體組織(例如個體之腦)之病理變化的情況下遞送至個體。在某些實施例中，病理變化為總體病理變化，諸如但不限於萎縮。在某些實施例中，病理變化為組織病理學變化，包括但不限於HTT包涵體。 給藥
可使用任何對降低、預防及/或治療HTT相關病症(例如亨丁頓舞蹈症(HD))有效之量向個體投與本發明醫藥組合物。視個體之物種、年齡及一般狀況、疾病之嚴重程度、特定組合物、其投與模式、其活動模式及其類似因素而定，所需之精確量將因個體而異。
本發明之組合物通常以單位劑型調配以便於投與及劑量均勻。然而，應理解，本發明之組合物的每日總用量可由主治醫師在合理醫學判斷範疇內決定。對於任何特定患者之特定治療性效果可視多種因素而定，該等因素包括所治療之病症及該病症之嚴重度；所採用之特定化合物之活性；所採用之特定組合物；患者之年齡、體重、總體健康狀況、性別及飲食；投與時間、投與途徑及所採用之siRNA雙螺旋之排泄速率；治療持續時間；與所採用之特定化合物組合或同時使用之藥物及醫學技術中熟知之類似因素。
在一些實施例中，個體之年齡及性別可用於測定本發明之組合物之劑量。作為一非限制性實例，較大齡個體相比於較年輕個體可接受較大劑量(例如多5-10%、10-20%、15-30%、20-50%、25-50%或至少1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、或超過90%)之組合物。作為另一非限制性實例，較年輕個體相比於較大齡個體可接受較大劑量(例如多5-10%、10-20%、15-30%、20-50%、25-50%或至少1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、或超過90%)之組合物。作為又一非限制性實例，女性個體相比於男性個體可接受較大劑量(例如多5-10%、10-20%、15-30%、20-50%、25-50%或至少1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、或超過90%)之組合物。作為又一非限制性實例，男性個體相比於女性個體可接受較大劑量(例如多5-10%、10-20%、15-30%、20-50%、25-50%或至少1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、或超過90%)之組合物。
在一些特定實施例中，視疾病狀況、個體及治療策略而定，可調適用於遞送本發明siRNA雙螺旋的AAV粒子之劑量。
在一些實施例中，向細胞遞送根據本發明之組合物包含由[VG/小時=毫升/小時*VG/毫升]定義之遞送速率，其中VG為病毒基因體，VG/毫升為組合物濃度，且毫升/小時為長期遞送速率。
在一些實施例中，向細胞遞送根據本發明之組合物可包含每個體約1×106 個VG與約1×1016 個VG之間的總濃度。在一些實施例中，遞送可包含以下組合物濃度：約1×106 、2×106 、3×106 、4×106 、5×106 、6×106 、7×106 、8×106 、9×106 、1×107 、2×107 、3×107 、4×107 、5×107 、6×107 、7×107 、8×107 、9×107 、1×108 、2×108 、3×108 、4×108 、5×108 、6×108 、7×108 、8×108 、9×108 、1×109 、2×109 、3×109 、4×109 、5×109 、6×109 、7×109 、8×109 、9×109 、1×1010 、2×1010 、3×1010 、4×1010 、5×1010 、6×1010 、7×1010 、8×1010 、9×1010 、1×1011 、1.1×1011 、1.2×1011 、1.3×1011 、1.4×1011 、1.5×1011 、1.6×1011 、1.7×1011 、1.8×1011 、1.9×1011 、2×1011 、2.1×1011 、2.2×1011 、2.3×1011 、2.4×1011 、2.5×1011 、2.6×1011 、2.7×1011 、2.8×1011 、2.9×1011 、3×1011 、4×1011 、5×1011 、6×1011 、7×1011 、7.1×1011 、7.2×1011 、7.3×1011 、7.4×1011 、7.5×1011 、7.6×1011 、7.7×1011 、7.8×1011 、7.9×1011 、8×1011 、9×1011 、1×1012 、1.1×1012 、1.2×1012 、1.3×1012 、1.4×1012 、1.5×1012 、1.6×1012 、1.7×1012 、1.8×1012 、1.9×1012 、2×1012 、2.1×1012 、2.2×1012 、2.3×1012 、2.4×1012 、2.5×1012 、2.6×1012 、2.7×1012 、2.8×1012 、2.9×1012 、3×1012 、3.1×1012 、3.2×1012 、3.3×1012 、3.4×1012 、3.5×1012 、3.6×1012 、3.7×1012 、3.8×1012 、3.9×1012 、4×1012 、4.1×1012 、4.2×1012 、4.3×1012 、4.4×1012 、4.5×1012 ,4.6×1012 、4.7×1012 、4.8×1012 、4.9×1012 、5×1012 、6×1012 、6.1×1012 、6.2×1012 、6.3×1012 、6.4×1012 、6.5×1012 、6.6×1012 、6.7×1012 、6.8×1012 、6.9×1012 、7×1012 、8×1012 、8.1×1012 、8.2×1012 、8.3×1012 、8.4×1012 、8.5×1012 、8.6×1012 、8.7×1012 、8.8×1012 、8.9×1012 、9×1012 、1×1013 、1.1×1013 、1.2×1013 、1.3×1013 、1.4×1013 、1.5×1013 、1.6×1013 、1.7×1013 、1.8×1013 、1.9×1013 、2×1013 、2.7×1013 、3×1013 、4×1013 、5×1013 、6×1013 、6.7×1013 、7×1013 、8×1013 、9×1013 、1×1014 、2×1014 、3×1014 、4×1014 、5×1014 、6×1014 、7×1014 、8×1014 、9×1014 、1×1015 、2×1015 、3×1015 、4×1015 、5×1015 、6×1015 、7×1015 、8×1015 、9×1015 或1×1016 VG/個體或VG/劑量。
在一些實施例中，向細胞遞送根據本發明之組合物可包含每個體約1×106 VG/kg與約1×1016 VG/kg之間的總濃度。在一些實施例中，遞送可包含約以下之組合物濃度：1×106 、2×106 、3×106 、4×106 、5×106 、6×106 、7×106 、8×106 、9×106 、1×107 、2×107 、3×107 、4×107 、5×107 、6×107 、7×107 、8×107 、9×107 、1×108 、2×108 、3×108 、4×108 、5×108 、6×108 、7×108 、8×108 、9×108 、1×109 、2×109 、3×109 、4×109 、5×109 、6×109 、7×109 、8×109 、9×109 、1×1010 、2×1010 、3×1010 、4×1010 、5×1010 、6×1010 、7×1010 、8×1010 、9×1010 、1×1011 、1.1×1011 、1.2×1011 、1.3×1011 、1.4×1011 、1.5×1011 、1.6×1011 、1.7×1011 、1.8×1011 、1.9×1011 、2×1011 、2.1×1011 、2.2×1011 、2.3×1011 、2.4×1011 、2.5×1011 、2.6×1011 、2.7×1011 、2.8×1011 、2.9×1011 、3×1011 、4×1011 、5×1011 、6×1011 、7×1011 、7.1×1011 、7.2×1011 、7.3×1011 、7.4×1011 、7.5×1011 、7.6×1011 、7.7×1011 、7.8×1011 、7.9×1011 、8×1011 、9×1011 、1×1012 、1.1×1012 、1.2×1012 、1.3×1012 、1.4×1012 、1.5×1012 、1.6×1012 、1.7×1012 、1.8×1012 、1.9×1012 、2×1012 、2.1×1012 、2.2×1012 、2.3×1012 、2.4×1012 、2.5×1012 、2.6×1012 、2.7×1012 、2.8×1012 、2.9×1012 、3×1012 、3.1×1012 、3.2×1012 、3.3×1012 、3.4×1012 、3.5×1012 、3.6×1012 、3.7×1012 、3.8×1012 、3.9×1012 、4×1012 、4.1×1012 、4.2×1012 、4.3×1012 、4.4×1012 、4.5×1012 ,4.6×1012 、4.7×1012 、4.8×1012 、4.9×1012 、5×1012 、6×1012 、6.1×1012 、6.2×1012 、6.3×1012 、6.4×1012 、6.5×1012 、6.6×1012 、6.7×1012 、6.8×1012 、6.9×1012 、7×1012 、8×1012 、8.1×1012 、8.2×1012 、8.3×1012 、8.4×1012 、8.5×1012 、8.6×1012 、8.7×1012 、8.8×1012 、8.9×1012 、9×1012 、1×1013 、1.1×1013 、1.2×1013 、1.3×1013 、1.4×1013 、1.5×1013 、1.6×1013 、1.7×1013 、1.8×1013 、1.9×1013 、2×1013 、2.7×1013 、3×1013 、4×1013 、5×1013 、6×1013 、6.7×1013 、7×1013 、8×1013 、9×1013 、1×1014 、2×1014 、3×1014 、4×1014 、5×1014 、6×1014 、7×1014 、8×1014 、9×1014 、1×1015 、2×1015 、3×1015 、4×1015 、5×1015 、6×1015 、7×1015 、8×1015 、9×1015 或1×1016 VG/kg。
在一些實施例中，向細胞遞送根據本發明之組合物可包含約1×106 VG/mL與約1×1016 VG/mL之間的總濃度。在一些實施例中，遞送可包含約以下之組合物濃度：1×106 、2×106 、3×106 、4×106 、5×106 、6×106 、7×106 、8×106 、9×106 、1×107 、2×107 、3×107 、4×107 、5×107 、6×107 、7×107 、8×107 、9×107 、1×108 、2×108 、3×108 、4×108 、5×108 、6×108 、7×108 、8×108 、9×108 、1×109 、2×109 、3×109 、4×109 、5×109 、6×109 、7×109 、8×109 、9×109 、1×1010 、2×1010 、3×1010 、4×1010 、5×1010 、6×1010 、7×1010 、8×1010 、9×1010 、1×1011 、1.1×1011 、1.2×1011 、1.3×1011 、1.4×1011 、1.5×1011 、1.6×1011 、1.7×1011 、1.8×1011 、1.9×1011 、2×1011 、3×1011 、4×1011 、5×1011 、6×1011 、7×1011 、8×1011 、9×1011 、1×1012 、1.1×1012 、1.2×1012 、1.3×1012 、1.4×1012 、1.5×1012 、1.6×1012 、1.7×1012 、1.8×1012 、1.9×1012 、2×1012 、2.1×1012 、2.2×1012 、2.3×1012 、2.4×1012 、2.5×1012 、2.6×1012 、2.7×1012 、2.8×1012 、2.9×1012 、3×1012 、3.1×1012 、3.2×1012 、3.3×1012 、3.4×1012 、3.5×1012 、3.6×1012 、3.7×1012 、3.8×1012 、3.9×1012 、 4×1012 、4.1×1012 、4.2×1012 、4.3×1012 、4.4×1012 、4.5×1012 、4.6×1012 、4.7×1012 、4.8×1012 、4.9×1012 、5×1012 、6×1012 、6.1×1012 、6.2×1012 、6.3×1012 、6.4×1012 、6.5×1012 、6.6×1012 、6.7×1012 、6.8×1012 、6.9×1012 、7×1012 、8×1012 、9×1012 、1×1013 、1.1×1013 、1.2×1013 、1.3×1013 、1.4×1013 、1.5×1013 、1.6×1013 、1.7×1013 、1.8×1013 、1.9×1013 、2×1013 、2.7×1013 、3×1013 、4×1013 、5×1013 、6×1013 、6.7×1013 、7×1013 、8×1013 、9×1013 、1×1014 、2×1014 、3×1014 、4×1014 、5×1014 、6×1014 、7×1014 、8×1014 、9×1014 、1×1015 、2×1015 、3×1015 、4×1015 、5×1015 、6×1015 、7×1015 、8×1015 、9×1015 或1×1016 VG/mL。
在一些實施例中，待遞送之根據本發明之組合物可包含9×1011 VG/mL-2.7×1013 VG/mL之間的濃度。在一些實施例中，待遞送之根據本發明之組合物可包含2.7×1013 VG/mL之濃度。
在一些實施例中，向細胞遞送根據本發明之組合物可包含約1×106 總衣殼/毫升與約1×1016 總衣殼/毫升之間的總濃度。在一些實施例中，遞送可包含約以下之組合物濃度：1×106 、2×106 、3×106 、4×106 、5×106 、6×106 、7×106 、8×106 、9×106 、1×107 、2×107 、3×107 、4×107 、5×107 、6×107 、7×107 、8×107 、9×107 、1×108 、2×108 、3×108 、4×108 、5×108 、6×108 、7×108 、8×108 、9×108 、1×109 、2×109 、3×109 、4×109 、5×109 、6×109 、7×109 、8×109 、9×109 、1×1010 、2×1010 、3×1010 、4×1010 、5×1010 、6×1010 、7×1010 、8×1010 、9×1010 、1×1011 、2×1011 、3×1011 、4×1011 、5×1011 、6×1011 、7×1011 、8×1011 、9×1011 、1×1012 、1.1×1012 、1.2×1012 、1.3×1012 、1.4×1012 、1.5×1012 、1.6×1012 、1.7×1012 、1.8×1012 、1.9×1012 、2×1012 、2.1×1012 、2.2×1012 、2.3×1012 、2.4×1012 、2.5×1012 、2.6×1012 、2.7×1012 、2.8×1012 、2.9×1012 、3×1012 、3.1×1012 、3.2×1012 、3.3×1012 、3.4×1012 、3.5×1012 、3.6×1012 、3.7×1012 、3.8×1012 、3.9×1012 、 4×1012 、4.1×1012 、4.2×1012 、4.3×1012 、4.4×1012 、4.5×1012 、4.6×1012 、4.7×1012 、4.8×1012 、4.9×1012 、5×1012 、6×1012 、7×1012 、8×1012 、9×1012 、1×1013 、2×1013 、2.7×1013 、3×1013 、4×1013 、5×1013 、6×1013 、6.7×1013 、7×1013 、8×1013 、9×1013 、1×1014 、2×1014 、3×1014 、4×1014 、5×1014 、6×1014 、7×1014 、8×1014 、9×1014 、1×1015 、2×1015 、3×1015 、4×1015 、5×1015 、6×1015 、7×1015 、8×1015 、9×1015 或1×1016 總衣殼/毫升。
在某些實施例中，所需siRNA雙螺旋劑量可使用多次投與遞送(例如兩次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次、十二次、十三次、十四次或超過十四次投與)。當採用多次投與時，可使用分次給藥方案，諸如本文所述之分次給藥方案。如本文所用，「分次劑量」係將單個單位劑量或總日劑量分為兩次或更多次劑量，例如單個單位劑量之兩次或更多次投與。如本文所用，「單個單位劑量」係以一個劑量/一次性/單個途徑/單個接觸點(亦即單個投與事件)投與之任何調節聚核苷酸治療劑的劑量。如本文所用，「總日劑量」為24小時時段中給與或開處之量。其可以單個單位劑量形式進行投與。在一些實施例中，包含本發明調節聚核苷酸之AAV粒子係以分次劑量向個體投與。其可僅在緩衝液中或在本文中所述之調配物中調配。
在一些實施例中，本文所描述之組合物之劑量、濃度及/或體積可視投與之後尾核或殼核與皮質及皮質下分佈之比重而調整。投與可為腦室內、紋狀體內、殼核內、丘腦內、腦實質內、軟膜下及/或鞘內投與。
在一些實施例中，本文所描述之組合物之劑量、濃度及/或體積可視在藉由腦室內、紋狀體內、殼核內、丘腦內、腦實質內、軟膜下及/或鞘內遞送投與後皮質及腦脊髓分佈而調整。
待投與之醫藥組合物之體積可基於個體、目標結構之體積及/或組合物之劑量來確定。在一些實施例中，個體為嚙齒動物，諸如但不限於小鼠或大鼠。小鼠或大鼠可為野生型(WT)或轉殖基因大鼠或小鼠。作為一非限制性實例，轉殖基因小鼠為YAC128小鼠。作為另一非限制性實例，轉殖基因小鼠為BACHD小鼠。在一些實施例中，個體為靈長類動物。在一些實施例中，個體為非人類靈長類動物。在一些實施例中，個體為人類。
在一些實施例中，待輸注至個體之殼核或丘腦中的醫藥組合物之體積可在每側約0.5-3000 µL之間。在一些實施例中，待輸注至殼核或丘腦中之組合物的體積可為每側約5 µl、10 µl、25 µl、50 µl、75 µl、100 µl、125 µl、150 µl、175 µl、200 µl、225 µl、250 µl、275 µl、300 µl、325 µl、350 µl、375 µl、400 µl、425 µl、450 µl、475 µl、500 µl、525 µl、550 µl、575 µl、600 µl、625 µl、650 µl、675 µl、700 µl、725 µl、750 µl、775 µl、800 µl、825 µl、850 µl、875 µl、900 µl、925 µl、950 µl、975 µl、1000 µl、1025 µl、1050 µl、1075 µl、1100 µl、1125 µl、1150 µl、1175 µl、1200 µl、1225 µl、1250 µl、1275 µl、1300 µl、1325 µl、1350 µl、1375 µl、1400 µl、1425 µl、1450 µl、1475 µl、1500 µl、1600 µl、1700 µl、1800 µl、1900 µl、2000 µl、2250 µl、2500 µl、2750 µl或3000 µl。
在一些實施例中，待輸注至個體之紋狀體中的醫藥組合物之體積可在每側約5-3000 µL之間。在一些實施例中，待輸注至殼核或丘腦中的組合物之體積可為每側約5 µl、10 µl、25 µl、50 µl、75 µl、100 µl、125 µl、150 µl、175 µl、200 µl、225 µl、250 µl、275 µl、300 µl、325 µl、350 µl、375 µl、400 µl、425 µl、450 µl、475 µl、500 µl、525 µl、550 µl、575 µl、600 µl、625 µl、650 µl、675 µl、700 µl、725 µl、750 µl、775 µl、800 µl、825 µl、850 µl、875 µl、900 µl、925 µl、950 µl、975 µl、1000 µl、1025 µl、1050 µl、1075 µl、1100 µl、1125 µl、1150 µl、1175 µl、1200 µl、1225 µl、1250 µl、1275 µl、1300 µl、1325 µl、1350 µl、1375 µl、1400 µl、1425 µl、1450 µl、1475 µl、1500 µl、1600 µl、1700 µl、1800 µl、1900 µl、2000 µl、2250 µl、2500 µl、2750 µl或3000 µl。
在一些實施例中，向小鼠個體投與本文所述之醫藥組合物。在一些實施例中，待輸注至小鼠之紋狀體中的組合物之體積為每側1-10 µL。在一些實施例中，待輸注至小鼠之紋狀體中的組合物之體積可為每側約1 µl、2 µl、3 µl、4 µl、5 µl、6 µl、7 µl、8 µl、9 µl或10 µl。在一些實施例中，待輸注至小鼠之紋狀體中的組合物之體積為每側5 µl。
在一些實施例中，本文所描述之醫藥組合物投與至非人類靈長類動物個體。在一些實施例中，待輸注至非人類靈長類動物之殼核中的組合物之體積為每側50-150 µL。在一些實施例中，待輸注至非人類靈長類動物之殼核中的組合物之體積為每側100-200 µL。在一些實施例中，待輸注至非人類靈長類動物之殼核中的組合物之體積為每側175-525 µL。
在一些實施例中，待輸注至非人類靈長類動物之丘腦中的組合物之體積為每側70-250 L。在一些實施例中，待輸注至非人類靈長類動物之丘腦中的組合物之體積為每側100-250 µL。在一些實施例中，待輸注至非人類靈長類動物之丘腦中的組合物之體積為每側200-300 µL。在一些實施例中，待輸注至非人類靈長類動物之丘腦中的組合物之體積為每側450-1500 µL。
在一些實施例中，本文所描述之醫藥組合物投與至人類個體。在一些實施例中，投與至人類之殼核中的醫藥組合物之體積可不超過2000 µL/半球。在一些實施例中，待輸注至人類之殼核中的組合物之體積為每側不超過1500 µL/半球。
在一些實施例中，待輸注至人類之殼核中的組合物之體積為每側300-1500 µL。在一些實施例中，待輸注至人類之殼核中的組合物之體積可為每側約300 µl、325 µl、350 µl、375 µl、400 µl、425 µl、450 µl、475 µl、500 µl、525 µl、550 µl、575 µl、600 µl、625 µl、650 µl、675 µl、700 µl、725 µl、750 µl、775 µl、800 µl、825 µl、850 µl、875 µl、900 µl、925 µl、950 µl、975 µl、1000 µl、1025 µl、1050 µl、1075 µl、1100 µl、1125 µl、1150 µl、1175 µl、1200 µl、1225 µl、1250 µl、1275 µl、1300 µl、1325 µl、1350 µl、1375 µl、1400 µl、1425 µl、1450 µl、1475 µl或1500 µl。在一些實施例中，待輸注至人類之殼核中的組合物之體積為每側900 µl。
在一些實施例中，投與至人類之丘腦中的醫藥組合物之體積可不超過3000 µL/半球。在一些實施例中，待輸注至人類之丘腦中的組合物之體積不超過每側2500 µL。
在一些實施例中，待輸注至人類之丘腦中的組合物之體積為每側1300-2500 µL。在一些實施例中，待輸注至人類之丘腦中的組合物之體積可為每側1300 µL、1325 µL、1350 µL、1375 µL、1400 µL、1425 µL、1450 µL、1475 µL、1500 µL、1525 µL、1550 µL、1575 µL、1600 µL、1625 µL、1650 µL、1675 µL、1700 µL、1725 µL、1750 µL、1775 µL、1800 µL、1825 µL、1850 µL、1875 µL、1900 µL、1925 µL、1950 µL、1975 µL、2000 µL、2025 µL、2050 µL、2075 µL、2100 µL、2125 µL、2150 µL、2175 µL、2200 µL、2225 µL、2250 µL、2275 µL、2300 µL、2325 µL、2350 µL、2375 µL、2400 µL、2425 µL、2450 µL、2475 µL或2500 µL。在一些實施例中，待輸注至人類之丘腦中的組合物之體積為每側1700 µl。
在一些實施例中，投與至個體之紋狀體中之劑量可為每側約1×109 至1×1015 個VG。在一些實施例中，投與至個體之紋狀體中之劑量可為每側約1×109 、2×109 、3×109 、4×109 、5×109 、6×109 、7×109 、8×109 、9×109 、1×1010 、2×1010 3×1010 、4×1010 、5×1010 、6×1010 、7×1010 、8×1010 、9×1010 、1×1011 、2×1011 、3×1011 、4×1011 、5×1011 、6×1011 、7×1011 、8×1011 、9×1011 、1×1012 、1.5×1012 、2×1012 、2.5×1012 、3×1012 、3.5×1012 、4×1012 、4.5×1012 、5×1012 、5.5×1012 、6×1012 、6.5×1012 、7×1012 、7.5×1012 、8×1012 、8.5×1012 、9×1012 、9.5×1012 、1×1013 、1.5×1013 、2×1013 、2.5×1013 、3×1013 、3.5×1013 、4×1013 、4.5×1013 、5×1013 、5.5×1013 、6×1013 、6.5×1013 、7×1013 、7.5×1013 、8×1013 、8.5×1013 、9×1013 、1×1014 、2×1014 、3×1014 、4×1014 、5×1014 、6×1014 、7×1014 、8×1014 、9×1014 或1×1015 個VG。
在一些實施例中，投與至個體之殼核中之劑量可為每側約1×1010 至1×1015 個VG。在一些實施例中，投與至個體之殼核中之劑量可為每側約1×1010 、5×1010 、1×1011 、2×1011 、3×1011 、4×1011 、5×1011 、6×1011 、7×1011 、8×1011 、9×1011 、1×1012 、1.5×1012 、2×1012 、2.5×1012 、3×1012 、3.5×1012 、4×1012 、4.5×1012 、5×1012 、5.5×1012 、6×1012 、6.5×1012 、7×1012 、7.5×1012 、8×1012 、8.5×1012 、9×1012 、9.5×1012 、1×1013 、1.5×1013 、2×1013 、2.5×1013 、3×1013 、3.5×1013 、4×1013 、4.5×1013 、5×1013 、5.5×1013 、6×1013 、6.5×1013 、7×1013 、7.5×1013 、8×1013 、8.5×1013 、9×1013 、1×1014 、2×1014 、3×1014 、4×1014 、5×1014 、6×1014 、7×1014 、8×1014 、9×1014 或1×1015 個VG。
在一些實施例中，投與至個體之丘腦中之劑量可為每側約1×1010 至1×1015 個VG。在一些實施例中，投與至個體之丘腦中之劑量可為每側約1×1010 、5×1010 、1×1011 、2×1011 、3×1011 、4×1011 、5×1011 、6×1011 、7×1011 、8×1011 、9×1011 、1×1012 、1.5×1012 、2×1012 、2.5×1012 、3×1012 、3.5×1012 、4×1012 、4.5×1012 、5×1012 、5.5×1012 、6×1012 、6.5×1012 、7×1012 、7.5×1012 、8×1012 、8.5×1012 、9×1012 、9.5×1012 、1×1013 、1.5×1013 、2×1013 、2.5×1013 、3×1013 、3.5×1013 、4×1013 、4.5×1013 、5×1013 、5.5×1013 、6×1013 、6.5×1013 、7×1013 、7.5×1013 、8×1013 、8.5×1013 、9×1013 、1×1014 、2×1014 、3×1014 、4×1014 、5×1014 、6×1014 、7×1014 、8×1014 、9×1014 或1×1015 個VG。
在一些實施例中，投與至個體之紋狀體中之總劑量可為約1×109 至5×1015 個VG。在一些實施例中，投與至個體之紋狀體中之劑量可為約1×109 、2×109 、3×109 、4×109 、5×109 、6×109 、7×109 、8×109 、9×109 、1×1010 、2×1010 3×1010 、4×1010 、5×1010 、6×1010 、7×1010 、8×1010 、9×1010 、1×1011 、2×1011 、3×1011 、4×1011 、5×1011 、6×1011 、7×1011 、8×1011 、9×1011 、1×1012 、1.5×1012 、2×1012 、2.5×1012 、3×1012 、3.5×1012 、4×1012 、4.5×1012 、5×1012 、5.5×1012 、6×1012 、6.5×1012 、7×1012 、7.5×1012 、8×1012 、8.5×1012 、9×1012 、9.5×1012 、1×1013 、1.5×1013 、2×1013 、2.5×1013 、3×1013 、3.5×1013 、4×1013 、4.5×1013 、5×1013 、5.5×1013 、6×1013 、6.5×1013 、7×1013 、7.5×1013 、8×1013 、8.5×1013 、9×1013 、1×1014 、2×1014 、3×1014 、4×1014 、5×1014 、6×1014 、7×1014 、8×1014 、9×1014 或1×1015 2×1015 、3×1015 、4×1015 或5×1015 個VG。
在一些實施例中，經由殼核及丘腦輸注向個體投與之總劑量為1×1010 至5×1015 個VG。在一些實施例中，經由殼核及丘腦輸注向個體投與之總劑量可為約1×1010 、5×1010 、1×1011 、2×1011 、3×1011 、4×1011 、5×1011 、6×1011 、7×1011 、8×1011 、9×1011 、1×1012 、1.5×1012 、2×1012 、2.5×1012 、3×1012 、3.5×1012 、4×1012 、4.5×1012 、5×1012 、5.5×1012 、6×1012 、6.5×1012 、7×1012 、7.5×1012 、8×1012 、8.5×1012 、9×1012 、9.5×1012 、1×1013 、1.5×1013 、2×1013 、2.5×1013 、3×1013 、3.5×1013 、4×1013 、4.5×1013 、5×1013 、5.5×1013 、6×1013 、6.5×1013 、7×1013 、7.5×1013 、8×1013 、8.5×1013 、9×1013 、1×1014 、2×1014 、3×1014 、4×1014 、5×1014 、6×1014 、7×1014 、8×1014 、9×1014 、1×1015 、2×1015 、3×1015 、4×1015 或5×1015 個VG。
在一些實施例中，投與小鼠之紋狀體中之劑量可為每側約4×109 至2×1011 個VG。在一些實施例中，投與小鼠之紋狀體中之劑量可為每側約4×109 、5×109 、6×109 、7×109 、8×109 、9×109 、1×1010 、2×1010 3×1010 、4×1010 、5×1010 、6×1010 、7×1010 、8×1010 、9×1010 、1×1011 或2×1011 個VG。在一些實施例中，投與小鼠之紋狀體中之劑量可為每側4.4×109 個VG。在一些實施例中，投與至小鼠之紋狀體中之劑量可為每側1.4×1010 個VG。在一些實施例中，投與至小鼠之紋狀體中之劑量可為每側4.4×1010 個VG。在一些實施例中，投與小鼠之紋狀體中之劑量可為每側1.4×1011 個VG。
在一些實施例中，投與至非人類靈長類動物之殼核中之劑量可為每側約9×1010 至5.5×1012 個VG。在一些實施例中，投與至非人類靈長類動物之殼核中之劑量可為每側約9×1010 、1×1011 、2×1011 、3×1011 、4×1011 、5×1011 、6×1011 、7×1011 、8×1011 、9×1011 、1×1012 、1.5×1012 、2×1012 、2.5×1012 、3×1012 、3.5×1012 、4×1012 、4.5×1012 、5×1012 或5.5×1012 。
在一些實施例中，投與至非人類靈長類動物之殼核中之劑量可為每側約2×1010 至5×1011 個VG。在一些實施例中，投與至非人類靈長類動物之殼核中之劑量可為每側約2.0×1010 、2.2×1010 、2.4×1010 、2.6×1010 、2.8×1010 、3.0×1010 、3.2×1010 、3.4×1010 、3.6×1010 、3.8×1010 、4.0×1010 、4.2×1010 、4.4×1010 、4.6×1010 、4.8×1010 、5.0×1010 、5.2×1010 、5.4×1010 、5.6×1010 、5.8×1010 、6.0×1010 、6.2×1010 、6.4×1010 、6.6×1010 、6.8×1010 、7.0×1010 、7.2×1010 、7.4×1010 、7.6×1010 、7.8×1010 、8.0×1010 、8.2×1010 、8.4×1010 、8.6×1010 、8.8×1010 、9.0×1010 、9.2×1010 、9.4×1010 、9.6×1010 、9.8×1010 、1.0×1011 、1.2×1011 、1.4×1011 、1.6×1011 、1.8×1011 、2.0×1011 、2.2×1011 、2.4×1011 、2.6×1011 、2.8×1011 、3.0×1011 、3.2×1011 、3.4×1011 、3.6×1011 、3.8×1011 、4.0×1011 、4.2×1011 、4.4×1011 、4.6×1011 、4.8×1011 或5.0×1011 個VG。
在一些實施例中，投與至非人類靈長類動物之丘腦中之劑量可為每側約1.5×1011 至8.5×1012 個VG。在一些實施例中，投與至非人類靈長類動物之丘腦中之劑量可為每側約1.5×1011 、1.8×1011 、2×1011 、3×1011 、4×1011 、5×1011 、6×1011 、7×1011 、8×1011 、9×1011 、1×1012 、1.5×1012 、2×1012 、2.5×1012 、3×1012 、3.5×1012 、4×1012 、4.5×1012 、5×1012 、5.5×1012 、6×1012 、6.5×1012 、7×1012 、7.5×1012 、8×1012 或8.5×1012 個VG。
在一些實施例中，投與至非人類靈長類動物之丘腦中之劑量可為每側約4.0×1010 個VG至7.0×1011 個VG。在一些實施例中，投與至非人類靈長類動物之丘腦中之劑量可為每側約4.0×1010 、4.2×1010 、4.4×1010 、4.6×1010 、4.8×1010 、5.0×1010 、5.2×1010 、5.4×1010 、5.6×1010 、5.8×1010 、6.0×1010 、6.2×1010 、6.4×1010 、6.6×1010 、6.8×1010 、7.0×1010 、7.2×1010 、7.4×1010 、7.6×1010 、7.8×1010 、8.0×1010 、8.2×1010 、8.4×1010 、8.6×1010 、8.8×1010 、9.0×1010 、9.2×1010 、9.4×1010 、9.6×1010 、9.8×1010 、1.0×1011 、1.2×1011 、1.4×1011 、1.6×1011 、1.8×1011 、2.0×1011 、2.2×1011 、2.4×1011 、2.6×1011 、2.8×1011 、3.0×1011 、3.2×1011 、3.4×1011 、3.6×1011 、3.8×1011 、4.0×1011 、4.2×1011 、4.4×1011 、4.6×1011 、4.8×1011 、5.0×1011 、5.2×1011 、5.4×1011 、5.6×1011 、5.8×1011 、6.0×1011 、6.2×1011 、6.4×1011 、6.6×1011 、6.8×1011 或7.0×1011 個VG。
在一些實施例中，經由紋狀體輸注投與至小鼠之總劑量為8×109 至3×1011 個VG。在一些實施例中，經由紋狀體輸注投與至小鼠中之總劑量可為約8.0×1010 、8.2×1010 、8.4×1010 、8.6×1010 、8.8×1010 、9.0×1010 、9.2×1010 、9.4×1010 、9.6×1010 、9.8×1010 、1.0×1011 、1.2×1011 、1.4×1011 、1.6×1011 、1.8×1011 、2.0×1011 、2.2×1011 、2.4×1011 、2.6×1011 、2.8×1011 、3.0×1011 個VG。在一些實施例中，經由紋狀體輸注投與至小鼠之總劑量為8.8×109 個VG。在一些實施例中，經由紋狀體輸注投與至小鼠之總劑量為2.8×1010 個VG。在一些實施例中，經由紋狀體輸注投與至小鼠之總劑量為8.8×1010 個VG。在一些實施例中，經由紋狀體輸注投與至小鼠之總劑量為2.8×1011 個VG。
在一些實施例中，經由殼核及丘腦輸注投與至非人類靈長類動物之總劑量為5×1011 至3×1013 個VG。在一些實施例中，經由殼核及丘腦輸注投與至非人類靈長類動物之總劑量可為約5×1011 、6×1011 、7×1011 、8×1011 、9×1011 、1×1012 、1.5×1012 、2×1012 、2.5×1012 、3×1012 、3.5×1012 、4×1012 、4.5×1012 、5×1012 、5.5×1012 、6×1012 、6.5×1012 、7×1012 、7.5×1012 、8×1012 、8.5×1012 、9×1012 、9.5×1012 、1×1013 、1.5×1013 、2×1013 、2.5×1013 或3×1013 個VG。
在一些實施例中，經由殼核及丘腦輸注投與至非人類靈長類動物之總劑量為1×1011 至2×1013 個VG。在一些實施例中，經由殼核及丘腦輸注投與至非人類靈長類動物之總劑量可為約1×1011 、1.5×1011 、2×1011 、2.5×1011 、3×1011 、3.5×1011 、4×1011 、4.5×1011 、5×1011 、5.5×1011 、6×1011 、6.5×1011 、7×1011 、7.5×1011 、8×1011 、8.5×1011 、9×1011 、9.5×1011 、1×1012 、1.5×1012 、2×1012 、2.5×1012 、3×1012 、3.5×1012 、4×1012 、4.5×1012 、5×1012 、5.5×1012 、6×1012 、6.5×1012 、7×1012 、7.5×1012 、8×1012 、8.5×1012 、9×1012 、9.5×1012 、1×1013 、1.5×1013 、2×1013 個VG。在某些實施例中，經由殼核及丘腦輸注投與至非人類靈長類動物之總劑量為1.5×1011 個VG。在某些實施例中，經由殼核及丘腦輸注投與至非人類靈長類動物之總劑量為1.4×1011 個VG。在某些實施例中，經由殼核及丘腦輸注投與至非人類靈長類動物之總劑量為4.5×1011 個VG。在某些實施例中，經由殼核及丘腦輸注投與至非人類靈長類動物之總劑量為1.4×1012 個VG。在某些實施例中，經由殼核及丘腦輸注投與至非人類靈長類動物之總劑量為2.2×1012 個VG。在某些實施例中，經由殼核及丘腦輸注投與至非人類靈長類動物之總劑量為1.8×1013 個VG。
在一些實施例中，投與至人類之殼核中之劑量可為每側約2.5×1011 至4.5×1013 個VG。在一些實施例中，投與至人類之殼核中之劑量可為每側約2.5×1011 、3×1011 、4×1011 、5×1011 、6×1011 、7×1011 、8×1011 、9×1011 、1×1012 、1.5×1012 、2×1012 、2.5×1012 、3×1012 、3.5×1012 、4×1012 、4.5×1012 、5×1012 、5.5×1012 、6×1012 、6.5×1012 、7×1012 、7.5×1012 、8×1012 、8.5×1012 、9×1012 、9.5×1012 、1×1013 、1.5×1013 、2×1013 、2.5×1013 、3×1013 、3.5×1013 、4×1013 或4.5×1013 個VG。在一些實施例中，投與至人類之殼核中之劑量可在每側8×1011 至4×1013 個VG之間。
在一些實施例中，投與至人類之丘腦中之劑量可為每側約1×1012 至7×1013 個VG。在一些實施例中，投與至人類之丘腦中之劑量可為每側約1×1012 、1.5×1012 、2×1012 、2.5×1012 、3×1012 、3.5×1012 、4×1012 、4.5×1012 、5×1012 、5.5×1012 、6×1012 、6.5×1012 、7×1012 、7.5×1012 、8×1012 、8.5×1012 、9×1012 、9.5×1012 、1×1013 、1.5×1013 、2×1013 、2.5×1013 、3×1013 、3.5×1013 、4×1013 、4.5×1013 、5×1013 、5.5×1013 、6×1013 、6.5×1013 、6.8×1013 、7×1013 個VG。在一些實施例中，投與至丘腦中之劑量在每側3.5×1012 與6.8×1013 個VG之間。
在一些實施例中，經由殼核及丘腦輸注投與至人類之總劑量為2.5×1012 至2.5×1014 個VG。在一些實施例中，經由殼核及丘腦輸注投與至人類之總劑量可為約2.5×1012 、3×1012 、3.5×1012 、4×1012 、4.5×1012 、5×1012 、5.5×1012 、6×1012 、6.5×1012 、7×1012 、7.5×1012 、8×1012 、8.5×1012 、8.6×1012 、9×1012 、9.5×1012 、1×1013 、1.5×1013 、2×1013 、2.5×1013 、3×1013 、3.5×1013 、4×1013 、4.5×1013 、5×1013 、5.5×1013 、6×1013 、6.5×1013 、7×1013 、7.5×1013 、8×1013 、8.5×1013 、9×1013 、1×1014 、2×1014 、2.1×1014 、2.2×1014 、2.3×1014 、2.4×1014 或2.5×1014 個VG。在一些實施例中，投與至個體之總劑量在8.6×1012 至2×1014 個VG之間。
在一些實施例中，劑量體積可使用遞增輸注速率沈積至輸注部位中。作為一非限制性實例，劑量體積可在3個不同階段(例如，以1、3、5 µL/min之劑量速率)中以完成總劑量體積之適當持續時間沈積至輸注部位中。
在一些實施例中，劑量體積可使用一系列輸注速率沈積至輸注部位中。作為一非限制性實例，劑量體積可以1 µL/min至5 µL/min範圍內之劑量速率、以完成總劑量體積之適當持續時間沈積至輸注部位中。
在一些實施例中，劑量體積可使用0.5 µL/min之輸注速率、以完成總劑量體積之適當持續時間沈積至輸注部位中。 IV.套組及裝置套組
在一些實施例中，本發明提供多種用於便利地及/或有效地進行本發明之方法之套組。通常，套組將包含足以允許使用者對個體進行多次治療及/或進行多個實驗的量及/或數目之組分。
本發明之AAV粒子中的任一者可包含於套組中。在一些實施例中，套組可進一步包括用於產生及/或合成本發明之化合物及/或組合物的試劑及/或說明書。在一些實施例中，套組亦可包括一或多種緩衝液。在一些實施例中，本發明之套組可包括用於製成蛋白質或核酸陣列或庫之組分，且因此可包括例如固體支撐物。
在一些實施例中，套組組分可封裝於水性介質中或以凍乾形式封裝。套組之容器構件一般將包括至少一個小瓶、試管、燒瓶、瓶、注射器或其他容器構件，可將組分置放，且較佳適當等分於該等容器構件中。在存在超過一種套組組分(標記試劑及標記可封裝在一起)的情況下，套組一般亦可含有第二、第三或其他額外容器，額外組分可分開置放在該等容器中。在一些實施例中，套組亦可包含用於容納醫藥學上可接受之無菌緩衝劑及/或其他稀釋劑的第二容器構件。在一些實施例中，組分之各種組合可包含於一或多個小瓶中。本發明之套組亦可通常包括密封存放以用於商業銷售的用於容納本發明之化合物及/或組合物(例如蛋白質、核酸)的構件及任何其他試劑容器。此類容器可包括固持所需小瓶的注射模製或吹塑模製之塑膠容器。
在一些實施例中，套組組分以一種及/或多種液體溶液形式來提供。在一些實施例中，液體溶液為水溶液，其中無菌水溶液尤其較佳。在一些實施例中，套組組分可呈乾粉形式提供。當試劑及/或組分以乾粉形式來提供時，此類粉末可藉由添加適合體積之溶劑來加以復原。在一些實施例中，預想亦可在另一容器構件中提供溶劑。在一些實施例中，標記染料以乾燥粉末形式來提供。在一些實施例中，預期在本發明之套組中提供10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、400、500、600、700、800、900、1000微克或至少或至多彼等量之乾燥染料。在此類實施例中，染料可隨後再懸浮於任何適合之溶劑，諸如DMSO中。
在一些實施例中，套組可包括採用套組組分以及使用未包括於套組中之任何其他試劑的說明書。說明書可包括可實施之變化形式。 裝置
在一些實施例中，可使用遞送AAV粒子之裝置及頭部固定組件向個體遞送AAV粒子。頭部固定組件可為但不限於由MRI interventions出售之任一頭部固定組件。作為一非限制性實例，頭部固定組件可為美國專利第8,099,150號、第8,548,569號及第9,031,636號以及國際專利公開案第WO201108495號及第WO2014014585號中所描述之組件中之任一者，該等文獻中之每一者的內容均以其全文引用之方式併入本文中。頭部固定組件可與MRI相容性鑽孔器組合使用，諸如但不限於國際專利公開案第WO2013181008號及美國專利公開案第US20130325012號中所描述之MRI相容性鑽孔器，其內容以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，AAV粒子可使用用於將設備定位於個體上之目標點以遞送AAV粒子的方法、系統及/或電腦程式來進行遞送。作為一非限制性實例，方法、系統及/或電腦程式可為美國專利第8,340,743號中所述之方法、系統及/或電腦程式，其內容以全文引用之方式併入本文中。該方法可包括：確定體內目標點及參考點，其中該目標點及該參考點界定延伸穿過各點之規劃軌跡線(planned trajectory line，PTL)；確定可視化平面，其中該PTL與該可視化平面在觀察點處相交；相對於身體安裝引導裝置以使引導裝置參照PTL移動，其中該引導裝置不與可視化平面相交；確定引導軸與可視化平面之間的相交點(GPP)；及在可視化平面中使GPP與觀察點比對。
在一些實施例中，可使用習知對流增強遞送裝置向個體遞送AAV粒子。使用對流來進行藥物靶向遞送之非限制性實例描述於美國專利公開案第US20100217228號、第US20130035574號及第US20130035660號以及國際專利公開案第WO2013019830號及第WO2008144585號中，該等公開案中之每一者的內容均以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，可在遞送AAV粒子之前、期間及/或之後對個體進行成像。成像方法可為此項技術中已知及/或本文所描述之方法，諸如但不限於磁共振成像(MRI)。作為一非限制性實例，成像可用於評估治療效果。作為另一非限制性實例，成像可用於輔助遞送AAV粒子。
在某些實施例中，AAV粒子可使用MRI引導裝置進行遞送。MRI引導裝置的非限制性實例描述於美國專利第9,055,884號、第9,042,958號、第8,886,288號、第8,768,433號、第8,396,532號、第8,369,930號、第8,374,677號及第8,175,677號以及美國專利申請案第US20140024927號中，該等文獻中之每一者的內容均以全文引用之方式併入本文中。作為一非限制性實例，MRI引導裝置可能夠提供實時資料，諸如美國專利第8,886,288號及第8,768,433號中所描述之彼等資料，該等專利中之每一者的內容均以全文引用之方式併入本文中。作為另一個非限制性實例，MRI引導裝置或系統可與靶向插管一起使用，諸如美國專利第8,175,677號及第8,374,677號中所描述之系統，該等專利中之每一者的內容均以全文引用之方式併入本文中。作為又另一個非限制性實例，MRI引導裝置包括如例如美國專利第9,055,884號及美國專利申請案第US20140024927號中所描述的用於引導干預裝置之軌跡引導框架，該等文獻中之每一者的內容均以全文引用之方式併入本文中。
在某些實施例中，AAV粒子可使用MRI相容性端組件進行遞送。MRI相容性端部組件之非限制性實例描述於美國專利公開案第US20140275980號中，其內容以全文引用之方式併入本文中。
在某些實施例中，可使用MRI相容性插管來遞送AAV粒子。MRI相容性插管之非限制性實例包括國際專利公開案第WO2011130107號中所教示之彼等，該公開案之內容以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，插管或其一部分或與插管相關之管附接、安裝、膠合、貼附或以其他方式可逆地接觸手術部位/區域周圍之組織。在程序之全部或一部分期間，此接觸可定位及/或穩定在一個位置中。
在一些實施例中，AAV粒子可使用MRI相容性導管來進行遞送。MRI相容性導管之非限制性實例包括國際專利公開案第WO2012116265號、美國專利公開案第8,825,133號及美國專利公開案第US20140024909號中所教示之導管，該等公開案中之每一者的內容均以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，可使用如美國專利公開案第US20140276582號及第US20140276614號中所描述的具有細長管式主體及隔膜之器件來遞送AAV粒子，其內容各自以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，AAV粒子可使用MRI相容性定位及/或引導系統來進行遞送，該系統諸如但不限於美國專利公開案第US20150223905號及第US20150230871號中所述之彼等系統，其各者之內容以全文引用之方式併入本文中。作為一非限制性實例，MRI相容性定位及/或引導系統可包含適宜於對患者進行固定之安裝件、經配置以附接至該安裝件以便能夠在至少三個維度中可控制地平移的具有內腔之定向插管、及經配置以在定向插管內腔中經由滑道貼合地前進及縮回的細長探針，該細長探針包含刺激或記錄電極中之至少一者。
在一些實施例中，AAV粒子可使用如美國專利公開案第US20150031982號及第US20140066750號以及國際專利公開案第WO2015057807號及第WO2014039481號中所描述之軌跡框架來遞送至個體，其內容各自以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，可使用基因槍向個體遞送AAV粒子。 V.本發明組合物之方法及用途亨丁頓舞蹈症 (HD)
亨丁頓舞蹈症(HD)係單基因性致命神經退化性疾病，其表徵為進行性舞蹈症、神經精神及認知功能障礙。已知亨丁頓舞蹈症由亨丁頓(HTT)基因中之常染色體顯性三聯體(CAG)重複擴增引起，該亨丁頓蛋白質(HTT)基因編碼HTT蛋白之N端處之聚麩醯胺酸。此重複擴增引起HTT之功能之有毒獲得且最終引起進展為廣泛腦萎縮之紋狀體神經退化。紋狀體之中型多棘神經元在HD中呈現為尤其脆弱，高達95%損失，而中間神經元大部分倖免。
亨丁頓舞蹈症對生活品質具有深刻影響。症狀通常在35-44歲之間出現且發作之後預期壽命為10-25年。在小百分比之HD群體(約6%)中，疾病發作出現在21歲之前，伴隨運動不能-強直症候群之外觀。此等病例傾向於比更晚發作種類之病例更快地進展且已分類為幼年型或Westphal變異體HD。據估計，在美國及歐洲目前大致35,000-70,000名患者罹患HD。目前，僅症狀緩解及支撐療法可用於治療HD，其中治癒方案尚待鑑別。最終，患有HD之個體死於肺炎、心臟衰竭或諸如來自跌倒之物理損傷之其他併發症。
不希望受理論束縛，野生型HTT蛋白之功能可充當骨架以協調其他蛋白質之錯合物。HTT係極大蛋白質(67個外顯子、3144個胺基酸、約350kDa)，其經歷廣泛的轉譯後修飾且具有用於與其他蛋白質，尤其在其N端(同時攜帶HD中之重複序列之區域)處相互作用之大量位點。HTT主要定位於細胞質但已展示穿梭至其中其可調控基因轉錄之細胞核中。亦已表明HTT在囊泡傳輸及調控RNA遷移中起作用。
作為一非限制性實例，HTT蛋白序列為SEQ ID NO: 1424 (NCBI NP_002102.4)且HTT核酸序列為SEQ ID NO: 1425 (NCBI NM_002111.7)。
起初認為，CAG擴增之HTT干擾正常HTT功能且引起神經毒性所藉由之機制為單倍劑量不足之疾病，此理論在人類中之HTT基因之末端缺失未引起HD出現時證明有誤，從而表明完全表現之HTT蛋白對存活率並非至關重要。然而，小鼠中之HTT之條件性基因敲除使得神經退化，從而指示一些量之HTT為細胞存活所需。亨丁頓蛋白質在全部細胞中均表現，但其濃度在腦中最高，其中異常HTT之大量聚集發現於神經元核中。在HD患者之腦中，HTT聚集至異常細胞核內涵體中。現認為其為錯誤摺疊及聚集過程以及引起神經毒性之相關蛋白中間產物(亦即可溶性物種及有毒N端片段)。實際上，HD屬於九種額外人類基因病症之家族，其表徵皆為CAG擴增之基因及所得多麩醯胺酸(聚-Q)蛋白質產物，後續形成神經元內聚集體。引起關注地，在全部此等疾病中，擴增長度與發作年齡及疾病進展速率相關，其中較長擴增與疾病之較高嚴重程度相關。
對以下之假設廣泛分佈：分子機制引起CAG擴增之HTT及其所得聚集體之神經毒性，但包括卡斯蛋白酶活化、轉錄途徑之失調、增加之活性氧物種之生產、粒線體功能障礙、破壞之軸突傳輸及/或細胞內之蛋白質降解系統之抑制。CAG擴增之HTT可能不僅具有功能之有毒獲得，且亦藉由干擾其他細胞蛋白質及過程之正常功能發揮主要的負面影響。HTT亦與非細胞自發神經毒性有關，其中容納HTT之細胞將HTT擴散至鄰近其他神經元。
在一些實施例中，個體具有完全外顯HD，其中HTT基因具有41個或更多個CAG重複序列(例如41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90或超過90個CAG重複序列)。
在一些實施例中，個體具有不完全外顯率，其中HTT基因具有在36與40個之間的CAG重複序列(例如36、37、38、39及40個CAG重複序列)。
HD之症狀可包括歸因於CNS退化之特徵，諸如但不限於舞蹈症、肌肉緊張不足、運動徐緩、協調不能、易怒及抑鬱、解決困難之問題、個人在其正常日常生活中工作之能力的降低、言語減弱及吞咽困難，以及並非歸因於CNS退化之特徵，諸如但不限於體重減輕、肌肉萎縮、代謝功能障礙及內分泌紊亂。
可用於本文中所描述之調節聚核苷酸及AAV粒子之用於研究亨丁頓舞蹈症的模型系統包括但不限於細胞模型(例如初級神經元及誘導多能幹細胞)、無脊椎動物模型(例如果蠅或秀麗隱桿線蟲)、小鼠模型(例如YAC128小鼠模型；R6/2小鼠模型；BAC及基因嵌入小鼠模型)、大鼠模型(例如BAC)及大哺乳動物模型(例如小型豬、綿羊或猴子)。
HD之動物模型中之研究已表明表型逆轉為可實行的，例如在調控之表現模型中之基因切斷之後。在允許94-多麩醯胺酸重複HTT蛋白之表現之切斷的小鼠模型中，不僅逆轉臨床症候群且亦解決胞內聚集體。另外，其中測試HTT之靜默之動物模型證明有前景之結果，其中該療法具有良好耐受性且展示潛在的治療益處。
此類siRNA介導之HTT表現抑制可用於治療HD。根據本發明，用於治療及/或改善患者之HD的方法包含向患者投與有效量之AAV粒子，該等AAV粒子包含將本發明之siRNA分子編碼至細胞中之核酸序列。包含此類核酸序列之AAV粒子之投與將編碼引起HTT基因表現之抑制/靜默之siRNA分子。
在一些實施例中，本文中所描述之AAV粒子可用於減少有需要之個體或患者中之HTT的量且因此提供如本文中所描述之治療益處。
在某些態樣中，HD之症狀包括行為困難及諸如但不限於以下之症狀：神氣呆滯或缺乏主動性、煩躁不安、易怒、躁動或焦慮、不良的自我照護、判斷力差、僵化、抑制解除、抑鬱、自殺觀念欣快症、攻擊性、妄想、強迫症、性慾亢進、幻覺、言語退化、言語不清、吞咽困難、體重減輕、損害執行功能(例如組織、規劃、檢查或適應替代方式及獲得新運動技能之延遲)之認知功能障礙、不穩定步態及非自主運動(舞蹈症)。在其他態樣中，將本發明之組合物施加至腦及脊髓中之一者或兩者。在一些實施例中，個體之存活藉由治療本文所述之HD之症狀中之任一者而延長。
本發明揭示用於治療需要治療之個體或患者的與HTT蛋白相關之亨丁頓舞蹈症(HD)的方法。該方法視情況包含向個體投與治療有效量之組合物，該組合物至少包含AAV粒子，該等AAV粒子包含編碼本發明siRNA分子之核酸序列。作為一非限制性實例，siRNA分子可靜默HTT基因表現，抑制HTT蛋白生產且降低個體中之HD之一或多種症狀使得治療上治療HD。 亨丁頓舞蹈症之治療方法
本發明提供包含編碼靶向HTT基因之siRNA分子之調節聚核苷酸的AAV粒子，及用於其設計及製造之方法。儘管不希望受可操作性之單一理論束縛，但本文所述之AAV粒子提供干擾HTT表現之調節聚核苷酸，包括siRNA，包括HTT突變型及/或野生型HTT基因表現。詳言之，本發明採用病毒基因體，諸如腺相關病毒(AAV)病毒基因體，其包含編碼本發明siRNA分子之調節聚核苷酸序列。包含編碼本發明siRNA分子之調節聚核苷酸的AAV載體可增加活性劑遞送至所關注之神經元(諸如紋狀體之中型多棘神經元及皮質神經元)中。靶向HTT基因之siRNA雙螺旋或經編碼之dsRNA能夠顯著抑制細胞內部之HTT基因表現(例如mRNA含量)；因此，降低HTT表現誘導細胞內部之應激，諸如蛋白質之聚集及包涵物之形成、增加之自由基、粒線體功能障礙及RNA代謝。
本發明中提供用於將包含編碼本發明siRNA分子之調節聚核苷酸序列的AAV粒子引入細胞中之方法，該方法包含將AAV粒子中之任一者以足以使目標HTT mRNA發生降解之量引入該等細胞中，由此活化細胞中之目標特異性RNAi。在一些態樣中，細胞可為幹細胞、諸如中型多棘神經元或皮質神經元之神經元、肌肉細胞及諸如星形膠質細胞之膠細胞。在另一態樣中，細胞可為來自HD患者之FRhK-4恆河獼猴(普通獼猴)腎細胞及纖維母細胞。
在一些實施例中，本發明提供藉由向有需要之個體或患者投與治療有效量之本文所述質體或AAV載體來治療或改善亨丁頓舞蹈症(HD)之方法。
在一些實施例中，包含編碼本發明siRNA分子之調節聚核苷酸的AAV粒子可用於治療及/或改善HD。
在一些實施例中，包含編碼本發明siRNA分子之調節聚核苷酸的AAV粒子可用於降低患有HD之個體之認知及/或運動減退，其中減退量係藉由標準評估系統，諸如但不限於統一亨丁頓舞蹈症評定量表(UHDRS)及分項分數，及認知測試。
在一些實施例中，包含編碼本發明siRNA分子之調節聚核苷酸的AAV粒子可用於減少患有HD之個體之運動減退，其中該減退量係藉由標準行為測試確定，諸如但不限於旋桿測試、平衡樑測試及/或曠場試驗。
在一些實施例中，包含編碼本發明siRNA分子之調節聚核苷酸的AAV粒子可用於減少患有HD之個體之焦慮，其中焦慮量藉由標準行為測試確定，諸如但不限於曠場試驗及/或明/暗箱測試。
在一些實施例中，包含編碼本發明siRNA分子之調節聚核苷酸的AAV粒子可用於減少功能能力及日常生活活動之減退，如藉由標準評估系統(諸如但不限於總功能能力(TFC)量表)所量測。
在一些實施例中，本發明提供用於治療或改善需要治療之個體或患者的與HTT基因及/或HTT蛋白相關之亨丁頓舞蹈症的方法，該方法包含向個體投與醫藥學上有效量之AAV粒子，該等AAV粒子包含編碼靶向HTT基因之至少一個siRNA雙螺旋的調節聚核苷酸，抑制HTT基因表現及蛋白質產生，且改善個體之HD症狀。
在一些實施例中，本發明之AAV載體可用作治療需要治療之個體或患者之亨丁頓舞蹈症的方法。此項技術中已知用於界定需要治療之個體或患者之任何方法均可用於鑑別該(等)個體。個體可具有亨丁頓舞蹈症之臨床診斷，或可為症狀前的。可利用用於診斷HD之任何已知方法，該方法包括但不限於認知評估及/或神經或神經精神檢查、動作測試、感官測試、精神評估、腦成像、家族病史及/或基因測試。
在一些實施例中，使用用於亨丁頓舞蹈症或其衍生物之預後指數測定HD個體選擇(Long JD等人,Movement Disorders , 2017, 32(2), 256-263，其內容以全文引用之方式併入本文中)。此預後指數使用四個組分預測運動診斷之機率：(1)來自統一亨丁頓舞蹈症評定量表(UHDRS)之總運動評分(TMS)；(2) 符號數位模式測驗(SDMT)；(3)基準年齡；(4)胞嘧啶-腺嘌呤-鳥嘌呤(CAG)擴增。
在一些實施例中，亨丁頓舞蹈症之預後指數利用下式計算：PIHD =51×TMS+(-34)×SDMT+7×年齡×(CAG-34)，其中PIHD之較大值指示診斷或症狀發作風險較高。
在另一實施例中，亨丁頓舞蹈症之預後指數用以下提供在50% 10年存活率之情形下解釋之標準差(stdev或SD)單位之歸一化公式計算：PINHD =(PIHD -883)/1044，其中PINHD＜0指示大於50% 10年存活率，且PINHD＞0表明小於50% 10年存活率。
在一些實施例中，預後指數可用於鑑別將在若干年內罹患HD之症狀但尚未具有臨床上可診斷之症狀的個體。另外，此等無症狀患者可在無症狀時段期間選擇及接受使用本發明之AAV載體及組合物之治療。
在一些實施例中，可向已進行生物標記物評定之個體投與AAV粒子。用於HD之顯示前及早期進展之血液中的潛在生物標記物包括但不限於8-OhdG氧化應激標記物、代謝標記物(例如肌酸激酶、分支股胺基酸)、膽固醇代謝物(例如24 -OH膽固醇)、免疫及炎性蛋白(例如群集素、補體組分、介白素6及8)、基因表現變化(例如轉錄組標記物)、內分泌標記物(例如皮質醇、胃內激素及瘦素)、BDNF、腺苷2A受體。用於HD之顯示前及早期進展之腦成像的潛在生物標記物包括但不限於紋狀體體積、皮質下白質體積、皮質厚度、全腦及腦室容積、功能成像(例如功能MRI)、PET (例如用氟去氧葡萄糖)及磁共振光譜學(例如乳酸鹽)。除亨丁頓蛋白質之量測之外，在其他潛在生物標記物為神經纖毛輕鏈，其為神經退化之潛在標記物且可在諸如腦脊髓液之生物流體中或使用神經成像方法評定。用於HD之顯示前及早期進展之定量臨床工具的潛在生物標記物包括但不限於定量運動評定、運動生理學評定(例如經顱磁刺激)及定量眼球運動量測。定量臨床生物標記物評定之非限制性實例包括舌片力變化性、節拍器引導之輕敲、夾持力、眼球運動評定及認知測試。多中心觀測研究之非限制性實例包括PREDICT-HD及TRACK-HD。個體可具有HD之症狀，診斷患有HD或可無HD症狀。
在一些實施例中，可向已使用神經成像進行生物標記物評定之個體投與AAV粒子。個體可具有HD之症狀，診斷患有HD或可無HD症狀。
在一些實施例中，AAV粒子可向無HD症狀之個體投與。個體可為無症狀的但可已進行預測性基因測試或生物標記評估以判定其是否處於HD風險下及/或個體是否可能具有已診斷患有HD之家族成員(例如母親、父親、兄弟、姐妹、阿姨、叔叔、祖父母)。
在一些實施例中，可向處於HD早期之個體投與AAV粒子。在早期，個體具有協調之細微變化、一些非自主運動(舞蹈症)、諸如易怒及抑鬱之情緒變化、問題解決困難、個人在其正常日常生活中工作之能力的降低。
在一些實施例中，可向處於HD中期之個體投與AAV粒子。在中期中，個體運動障礙增加、言語減弱、吞咽困難且正常活動變得更難以執行。在此階段，個體可使職業及物理治療家幫助維持自發運動之控制且個體可具有語音語言病理學家。
在一些實施例中，可向處於HD晚期之個體投與AAV粒子。在晚期，患有HD之個體近似完全或完全依賴於他人護理，因為個體不再能夠行走且無法說話。個體一般仍可理解語言且認識家人及朋友，但窒息為主要問題。
在一些實施例中，AAV粒子可用於治療患有HD之幼年形式之個體，該HD之幼年形式係在20歲之前HD發作且早至2歲。
在一些實施例中，AAV粒子可用於治療患有HD之個體，該個體具有完全外顯HD，其中HTT基因具有41個或更多個CAG重複序列(例如41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90或超過90個CAG重複序列)。
在一些實施例中，AAV粒子可用於治療具有不完全外顯率之個體，其中HTT基因具有在36與40個之間的CAG重複序列(例如36、37、38、39及40個CAG重複序列)。
在一些實施例中，向個體之中樞神經系統投與包含AAV粒子之組合物，該等AAV粒子包含編碼本發明siRNA分子之調節聚核苷酸。在其他實施例中，向個體之組織(例如個體之腦)投與包含AAV粒子之組合物，該等AAV粒子包含編碼本發明siRNA分子之調節聚核苷酸。
在一些實施例中，可將包含編碼本發明之siRNA分子之調節聚核苷酸的AAV粒子遞送至所靶向細胞之特定類型，該等特定類型包括但不限於：神經元，包括中型多棘神經元或皮質神經元；膠細胞，包括寡樹突神經膠質細胞、星形膠質細胞及微神經膠質細胞；及/或神經元周圍之其他細胞，諸如T細胞。
在一些實施例中，包含編碼本發明之siRNA分子之調節聚核苷酸的AAV粒子可遞送至紋狀體中之神經元及/或皮質之神經元。
在一些實施例中，向有需要之個體或患者靜脈內、肌肉內、皮下、腹膜內、腦實質內、軟膜下、鞘內及/或腦室內投與用於治療HD之本發明之組合物，從而使包含siRNA分子之siRNA分子或載體穿過血腦障壁及血液脊髓障壁一或兩者，或直接進入大腦及/或脊髓。在一些態樣中，方法包括向個體之中樞神經系統(CNS)直接投與(例如腦實質內投與、軟膜下投與、室內投與及/或鞘內投與) (使用例如輸注泵及/或遞送骨架)治療有效量之組合物，該組合物包含編碼本發明之siRNA分子之核酸序列的AAV粒子。載體可用於靜默或遏制HTT基因表現，及/或減少個體中之HD之一或多種症狀，使得治療上治療HD。
在一些實施例中，siRNA分子或包含此類siRNA分子之AAV載體可例如藉由輸注至個體之白質中而直接引入個體之中樞神經系統中。不希望受理論束縛，經由直接白質輸注之分佈可與軸突傳輸機制無關，該等軸突傳輸機制在患有亨丁頓舞蹈症之個體中可受損傷，此意謂白質輸注可允許AAV載體之更多傳輸。
在一些實施例中，經由腦實質內注射向個體之中樞神經系統投與包含AAV粒子之組合物，該等AAV粒子包含編碼本發明siRNA分子之調節聚核苷酸。
在一些實施例中，經由腦實質內注射及鞘內注射向個體之中樞神經系統投與包含編碼本發明siRNA分子之調節聚核苷酸的AAV粒子組合物。
在一些實施例中，經由腦實質內注射及腦室內注射向個體之中樞神經系統投與包含編碼本發明siRNA分子之調節聚核苷酸的AAV粒子組合物。
在一些實施例中，藉由腦實質內投與向有需要之個體或患者投與用於治療HD之本發明組合物。
在一些實施例中，包含編碼本發明siRNA分子之調節聚核苷酸的AAV粒子組合物可例如藉由輸注至殼核中而直接引入至個體中樞神經系統中。
在一些實施例中，包含編碼本發明siRNA分子之調節聚核苷酸的AAV粒子組合物可例如藉由輸注至個體丘腦中而直接引入至個體中樞神經系統中。不希望受理論束縛，丘腦係患有亨丁頓舞蹈症之個體中相對倖免之大腦區，此意謂其可允許經由AAV載體之軸突傳輸使皮質轉導更加廣泛。
在一些實施例中，包含編碼本發明siRNA分子之調節聚核苷酸的AAV粒子組合物可例如藉由靜脈內投與而間接引入至個體之中樞神經系統中。
在一些實施例中，本文所述之AAV粒子係經由殼核及丘腦輸注投與。雙重輸注至殼核及丘腦中可獨立地為雙側或單側的。作為一非限制性實例，AAV粒子可自腦兩側輸注至殼核及丘腦中。作為另一非限制性實例，AAV粒子可輸注至左殼核及左丘腦，或右殼核及右丘腦中。作為另一非限制性實例，AAV粒子可輸注至左殼核及右丘腦，或右殼核及左丘腦中。雙重輸注可連續或同時進行。 HTT表現之調節
在一些實施例中，向個體投與AAV粒子將降低個體中HTT之表現且HTT表現降低將減低個體中HD之影響。
在一些實施例中，諸如當藉由如本文所述之方法分析時，經編碼之dsRNA一經表現且接觸表現HTT蛋白之細胞，將HTT蛋白之表現抑制至少10%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%或至少40%或更多。
在一些實施例中，向個體投與包含編碼本發明siRNA之調節聚核苷酸序列的AAV粒子可減少個體中之HTT (例如突變型HTT、野生型HTT及/或突變型及野生型HTT)。在一些實施例中，向個體投與AAV粒子可減少個體中之野生型HTT。在又一實施例中，向個體投與AAV粒子可減少個體中之突變型HTT及野生型HTT兩者。突變型及/或野生型HTT可在個體，諸如但不限於個體之CNS、CNS區域或CNS的特定細胞中減少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%及100%，或至少10-20%、10-30%、10-40%、10-50%、10-60%、10-70%、10-80%、10-90%、10-95%、10-100%、20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-100%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-100%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-100%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-100%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-100%、70-80%、70-90%、70-95%、70-100%、80-90%、80-95%、80-100%、90-95%、90-100%或95-100%。突變型HTT可在個體，諸如但不限於個體之CNS、CNS區域或CNS的特定細胞中減少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%及100%，或至少10-20%、10-30%、10-40%、10-50%、10-60%、10-70%、10-80%、10-90%、10-95%、10-100%、20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-100%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-100%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-100%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-100%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-100%、70-80%、70-90%、70-95%、70-100%、80-90%、80-95%、80-100%、90-95%、90-100%或95-100%。野生型HTT可在個體，諸如但不限於個體之CNS、CNS區域或CNS的特定細胞中減少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%及100%，或至少10-20%、10-30%、10-40%、10-50%、10-60%、10-70%、10-80%、10-90%、10-95%、10-100%,20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-100%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-100%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-100%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-100%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-100%、70-80%、70-90%、70-95%、70-100%、80-90%、80-95%、80-100%、90-95%、90-100%或95-100%。突變型及野生型HTT可在個體，諸如但不限於個體之CNS、CNS區域或CNS的特定細胞中減少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%及100%，或至少10-20%、10-30%、10-40%、10-50%、10-60%、10-70%、10-80%、10-90%、10-95%、10-100%、20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-100%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-100%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-100%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-100%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-100%、70-80%、70-90%、70-95%、70-100%、80-90%、80-95%、80-100%、90-95%、90-100%或95-100%。作為一非限制性實例，AAV粒子可將中型多棘神經元中之HTT之表現降低至少50%。作為一非限制性實例，載體，例如AAV載體可將中型多棘神經元中之HTT之表現降低至少40%。作為一非限制性實例，AAV粒子可將殼核之中型多棘神經元中之HTT的表現降低至少40%。作為一非限制性實例，AAV粒子可將殼核之中型多棘神經元中之HTT的表現降低至少30%。作為又一非限制性實例，AAV粒子可將殼核及皮質中之HTT之表現降低至少40%。作為又一非限制性實例，AAV粒子可將殼核及皮質中之HTT之表現降低至少30%。作為又一非限制性實例，AAV粒子可將殼核中之HTT之表現降低至少30%。作為又一非限制性實例，AAV粒子可將殼核中之HTT之表現降低至少30%且將皮質中之HTT之表現降低至少15%。
在一些實施例中，AAV粒子可用於將HTT蛋白之表現降低至少約10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、85%、90%、95%及100%，或至少10-20%、20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-100%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-100%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-100%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-100%、55-60%、55-70%、55-80%、55-90%、55-95%、55-100%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-100%、70-80%、70-90%、70-95%、70-100%、80-90%、80-95%、80-100%、90-95%、90-100%或95-100%。作為一非限制性實例，HTT蛋白表現之表現可降低50-90%。作為一非限制性實例，HTT蛋白表現之表現可降低30-70%。
在一些實施例中，siRNA雙螺旋或經編碼之dsRNA可用於將HTT mRNA之表現降低至少約10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、85%、90%、95%及100%，或至少10-30%、20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-100%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-100%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-100%、50-60%、50-70%、50-80%、50-85%、50-90%、50-95%、50-100%、55-60%、55-70%、55-80%、55-90%、55-95%、55-100%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-100%、70-80%、70-90%、70-95%、70-100%、80-90%、80-95%、80-100%、90-95%、90-100%或95-100%。作為一非限制性實例，HTT mRNA之表現可降低50-90%。作為一非限制性實例，HTT mRNA表現之表現可降低30-70%。作為一非限制性實例，HTT mRNA表現之表現可降低40-70%。作為一非限制性實例，HTT mRNA表現之表現可降低50-80%。作為一非限制性實例，HTT mRNA表現之表現可降低50-85%。作為一非限制性實例，HTT mRNA表現之表現可降低60-90%。
在一些實施例中，AAV粒子可用於減少個體中之HTT蛋白。該減少可獨立地為5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或超過95%，5-15%、5-20%、5-25%、5-30%、5-35%、5-40%、5-45%、5-50%、5-55%、5-60%、5-65%、5-70%、5-75%、5-80%、5-85%、5-90%、5-95%、10-20%、10-25%、10-30%、10-35%、10-40%、10-45%、10-50%、10-55%、10-60%、10-65%、10-70%、10-75%、10-80%、10-85%、10-90%、10-95%、15-25%、15-30%、15-35%、15-40%、15-45%、15-50%、15-55%、15-60%、15-65%、15-70%、15-75%、15-80%、15-85%、15-90%、15-95%、20-30%、20-35%、20-40%、20-45%、20-50%、20-55%、20-60%、20-65%、20-70%、20-75%、20-80%、20-85%、20-90%、20-95%、25-35%、25-40%、25-45%、25-50%、25-55%、25-60%、25-65%、25-70%、25-75%、25-80%、25-85%、25-90%、25-95%、30-40%、30-45%、30-50%、30-55%、30-60%、30-65%、30-70%、30-75%、30-80%、30-85%、30-90%、30-95%、35-45%、35-50%、35-55%、35-60%、35-65%、35-70%、35-75%、35-80%、35-85%、35-90%、35-95%、40-50%、40-55%、40-60%、40-65%、40-70%、40-75%、40-80%、40-85%、40-90%、40-95%、45-55%、45-60%、45-65%、45-70%、45-75%、45-80%、45-85%、45-90%、45-95%、50-60%、50-65%、50-70%、50-75%、50-80%、50-85%、50-90%、50-95%、55-65%、55-70%、55-75%、55-80%、55-85%、55-90%、55-95%、60-70%、60-75%、60-80%、60-85%、60-90%、60-95%、65-75%、65-80%、65-85%、65-90%、65-95%、70-80%、70-85%、70-90%、70-95%、75-85%、75-90%、75-95%、80-90%、80-95%或90-95%。作為一非限制性實例，個體HTT蛋白可減少50%。作為一非限制性實例，個體HTT蛋白可減少70%且野生型HTT蛋白降低10%。作為一非限制性實例，殼核之中型多棘神經元中之HTT可減少約40%。作為一非限制性實例，尾核之神經元中之HTT可減少約30%。作為一非限制性實例，丘腦之神經元中之HTT可減少約40%。作為一非限制性實例，皮質中之HTT可減少約20%。作為一非限制性實例，初級運動及體覺皮質之錐體神經元中之HTT可減少約30%。作為一非限制性實例，殼核及皮質中之HTT可減少約40%。作為一非限制性實例，殼核、尾核及皮質中之HTT可減少約40%。作為一非限制性實例，殼核、尾核、皮質及丘腦中之HTT可減少約40%。作為一非限制性實例，殼核之中型多棘神經元中之HTT之減少可在40%-70%之間。作為一非限制性實例，尾核之神經元中之HTT之減少可在30%至70%之間。作為一非限制性實例，殼核及皮質中之HTT之減少可在40%-70%之間。作為一非限制性實例，殼核、尾核及皮質中之HTT之減少可在40%至70%之間。作為一非限制性實例，殼核、尾核、皮質及丘腦中之HTT之減少可在40%至80%之間。
在一些實施例中，AAV粒子可用於減少個體中之野生型HTT蛋白。該減少可獨立地為5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或超過95%，5-15%、5-20%、5-25%、5-30%、5-35%、5-40%、5-45%、5-50%、5-55%、5-60%、5-65%、5-70%、5-75%、5-80%、5-85%、5-90%、5-95%、10-20%、10-25%、10-30%、10-35%、10-40%、10-45%、10-50%、10-55%、10-60%、10-65%、10-70%、10-75%、10-80%、10-85%、10-90%、10-95%、15-25%、15-30%、15-35%、15-40%、15-45%、15-50%、15-55%、15-60%、15-65%、15-70%、15-75%、15-80%、15-85%、15-90%、15-95%、20-30%、20-35%、20-40%、20-45%、20-50%、20-55%、20-60%、20-65%、20-70%、20-75%、20-80%、20-85%、20-90%、20-95%、25-35%、25-40%、25-45%、25-50%、25-55%、25-60%、25-65%、25-70%、25-75%、25-80%、25-85%、25-90%、25-95%、30-40%、30-45%、30-50%、30-55%、30-60%、30-65%、30-70%、30-75%、30-80%、30-85%、30-90%、30-95%、35-45%、35-50%、35-55%、35-60%、35-65%、35-70%、35-75%、35-80%、35-85%、35-90%、35-95%、40-50%、40-55%、40-60%、40-65%、40-70%、40-75%、40-80%、40-85%、40-90%、40-95%、45-55%、45-60%、45-65%、45-70%、45-75%、45-80%、45-85%、45-90%、45-95%、50-60%、50-65%、50-70%、50-75%、50-80%、50-85%、50-90%、50-95%、55-65%、55-70%、55-75%、55-80%、55-85%、55-90%、55-95%、60-70%、60-75%、60-80%、60-85%、60-90%、60-95%、65-75%、65-80%、65-85%、65-90%、65-95%、70-80%、70-85%、70-90%、70-95%、75-85%、75-90%、75-95%、80-90%、80-95%或90-95%。作為一非限制性實例，個體之野生型HTT蛋白可減少50%。作為一非限制性實例，殼核之中型多棘神經元中之野生型HTT可減少約40%。作為一非限制性實例，尾核之神經元中之野生型HTT可減少約30%。作為一非限制性實例，丘腦之神經元中之野生型HTT可減少約40%。作為一非限制性實例，皮質中野生型HTT可降低約20%。作為一非限制性實例，初級運動及體覺皮質之錐體神經元中之野生型HTT可減少約30%。作為一非限制性實例，殼核及皮質中野生型HTT可減少約40%。作為一非限制性實例，殼核、尾核及皮質中之野生型HTT可減少約40%。作為一非限制性實例，殼核、尾核、皮質及丘腦中之野生型HTT可減少約40%。作為一非限制性實例，殼核之中型多棘神經元中之野生型HTT之減少可在40%-70%之間。作為一非限制性實例，尾核之神經元中之野生型HTT之減少可在30%-70%之間。作為一非限制性實例，殼核及皮質中之野生型HTT之減少可在40%-70%之間。作為一非限制性實例，殼核、尾核及皮質中之野生型HTT之減少可在40%至70%之間。作為一非限制性實例，殼核、尾核、皮質及丘腦中之野生型HTT之減少可在40%-80%之間。
在一些實施例中，AAV粒子可用於減少個體中之突變型HTT蛋白。該減少可獨立地為5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或超過95%，5-15%、5-20%、5-25%、5-30%、5-35%、5-40%、5-45%、5-50%、5-55%、5-60%、5-65%、5-70%、5-75%、5-80%、5-85%、5-90%、5-95%、10-20%、10-25%、10-30%、10-35%、10-40%、10-45%、10-50%、10-55%、10-60%、10-65%、10-70%、10-75%、10-80%、10-85%、10-90%、10-95%、15-25%、15-30%、15-35%、15-40%、15-45%、15-50%、15-55%、15-60%、15-65%、15-70%、15-75%、15-80%、15-85%、15-90%、15-95%、20-30%、20-35%、20-40%、20-45%、20-50%、20-55%、20-60%、20-65%、20-70%、20-75%、20-80%、20-85%、20-90%、20-95%、25-35%、25-40%、25-45%、25-50%、25-55%、25-60%、25-65%、25-70%、25-75%、25-80%、25-85%、25-90%、25-95%、30-40%、30-45%、30-50%、30-55%、30-60%、30-65%、30-70%、30-75%、30-80%、30-85%、30-90%、30-95%、35-45%、35-50%、35-55%、35-60%、35-65%、35-70%、35-75%、35-80%、35-85%、35-90%、35-95%、40-50%、40-55%、40-60%、40-65%、40-70%、40-75%、40-80%、40-85%、40-90%、40-95%、45-55%、45-60%、45-65%、45-70%、45-75%、45-80%、45-85%、45-90%、45-95%、50-60%、50-65%、50-70%、50-75%、50-80%、50-85%、50-90%、50-95%、55-65%、55-70%、55-75%、55-80%、55-85%、55-90%、55-95%、60-70%、60-75%、60-80%、60-85%、60-90%、60-95%、65-75%、65-80%、65-85%、65-90%、65-95%、70-80%、70-85%、70-90%、70-95%、75-85%、75-90%、75-95%、80-90%、80-95%或90-95%。作為一非限制性實例，個體之突變型HTT蛋白可減少50%。作為一非限制性實例，殼核之中型多棘神經元中之突變型HTT可減少約40%。作為一非限制性實例，尾核之神經元中之突變型HTT可減少約30%。作為一非限制性實例，丘腦之神經元中之突變型HTT可減少約40%。作為一非限制性實例，皮質中之突變型HTT可減少約20%。作為一非限制性實例，初級運動及體覺皮質之錐體神經元中之突變型HTT可減少約30%。作為一非限制性實例，殼核及皮質中之突變型HTT可減少約40%。作為一非限制性實例，殼核、尾核及皮質中之突變型HTT可減少約40%。作為一非限制性實例，殼核、尾核、皮質及丘腦中之突變型HTT可減少約40%。作為一非限制性實例，殼核之中型多棘神經元中之突變型HTT之減少可在40%-70%之間。作為一非限制性實例，尾核之神經元中之突變型HTT之減少可在30%-70%之間。作為一非限制性實例，殼核及皮質中之突變型HTT之減少可在40%-70%之間。作為一非限制性實例，殼核、尾核及皮質中之突變型HTT之減少可在40%至70%之間。作為一非限制性實例，殼核、尾核、皮質及丘腦中之突變型HTT之減少可在40%-80%之間。
在一些實施例中，本發明提供用於抑制/靜默細胞中之HTT基因表現之方法。因此，siRNA雙螺旋或經編碼之dsRNA可用於實質上抑制細胞，尤其神經元中之HTT基因表現。在一些態樣中，抑制HTT基因表現係指抑制至少約20%，諸如至少約30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、85%、90%、95%及100%，或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-100%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-100%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-100%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-100%、55-60%、55-70%、55-80%、55-90%、55-95%、55-100%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-100%、70-80%、70-90%、70-95%、70-100%、80-90%、80-95%、80-100%、90-95%、90-100%或95-100%。因此，可將目標基因的蛋白質產物抑制至少約20%，較佳至少約30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、85%、90%、95%及100%，或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-100%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-100%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-100%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-100%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-100%、70-80%、70-90%、70-95%、70-100%、80-90%、80-95%、80-100%、90-95%、90-100%或95-100%。
在一些實施例中，本發明提供用於抑制/靜默細胞，尤其中棘神經元中之HTT基因表現之方法。在一些態樣中，抑制HTT基因表現係指抑制至少約20%，諸如至少約30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、85%、90%、95%及100%，或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-100%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-100%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-100%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-100%、55-60%、55-70%、55-80%、55-90%、55-95%、55-100%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-100%、70-80%、70-90%、70-95%、70-100%、80-90%、80-95%、80-100%、90-95%、90-100%或95-100%。因此，可將目標基因的蛋白質產物抑制至少約20%，較佳至少約30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、85%、90%、95%及100%，或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-100%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-100%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-100%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-100%、55-60%、55-70%、55-80%、55-90%、55-95%、55-100%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-100%、70-80%、70-90%、70-95%、70-100%、80-90%、80-95%、80-100%、90-95%、90-100%或95-100%。
在一些實施例中，本發明提供抑制/靜默細胞，特定言之膠細胞，諸如但不限於星形膠質細胞、寡樹突細胞或微神經膠質細胞中之HTT基因表現之方法。在一些態樣中，抑制HTT基因表現係指抑制至少約20%，諸如至少約30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、85%、90%、95%及100%，或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-100%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-100%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-100%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-100%、55-60%、55-70%、55-80%、55-90%、55-95%、55-100%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-100%、70-80%、70-90%、70-95%、70-100%、80-90%、80-95%、80-100%、90-95%、90-100%或95-100%。因此，可將目標基因的蛋白質產物抑制至少約20%，較佳至少約30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、85%、90%、95%及100%，或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-100%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-100%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-100%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-100%、55-60%、55-70%、55-80%、55-90%、55-95%、55-100%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-100%、70-80%、70-90%、70-95%、70-100%、80-90%、80-95%、80-100%、90-95%、90-100%或95-100%。
在一些實施例中，本發明提供用於抑制/靜默細胞，特定言之星形膠質細胞中之HTT基因表現的方法。在一些態樣中，抑制HTT基因表現係指抑制至少約20%，諸如至少約30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、85%、90%、95%及100%，或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-100%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-100%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-100%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-100%、55-60%、55-70%、55-80%、55-90%、55-95%、55-100%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-100%、70-80%、70-90%、70-95%、70-100%、80-90%、80-95%、80-100%、90-95%、90-100%或95-100%。因此，可將目標基因的蛋白質產物抑制至少約20%，較佳至少約30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、85%、90%、95%及100%，或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-100%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-100%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-100%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-100%、55-60%、55-70%、55-80%、55-90%、55-95%、55-100%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-100%、70-80%、70-90%、70-95%、70-100%、80-90%、80-95%、80-100%、90-95%、90-100%或95-100%。
在一些實施例中，本發明提供用於抑制/靜默細胞，尤其寡樹突細胞中之HTT基因表現之方法。在一些態樣中，抑制HTT基因表現係指抑制至少約20%，諸如至少約30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、85%、90%、95%及100%，或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-100%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-100%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-100%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-100%、55-60%、55-70%、55-80%、55-90%、55-95%、55-100%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-100%、70-80%、70-90%、70-95%、70-100%、80-90%、80-95%、80-100%、90-95%、90-100%或95-100%。因此，可將目標基因的蛋白質產物抑制至少約20%，較佳至少約30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、85%、90%、95%及100%，或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-100%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-100%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-100%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-100%、55-60%、55-70%、55-80%、55-90%、55-95%、55-100%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-100%、70-80%、70-90%、70-95%、70-100%、80-90%、80-95%、80-100%、90-95%、90-100%或95-100%。
在一些實施例中，本發明提供用於抑制/靜默細胞，尤其微神經膠質細胞中之HTT基因表現之方法。在一些態樣中，抑制HTT基因表現係指抑制至少約20%，諸如至少約30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、85%、90%、95%及100%，或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-100%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-100%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-100%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-100%、55-60%、55-70%、55-80%、55-90%、55-95%、55-100%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-100%、70-80%、70-90%、70-95%、70-100%、80-90%、80-95%、80-100%、90-95%、90-100%或95-100%。因此，可將目標基因的蛋白質產物抑制至少約20%，較佳至少約30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、85%、90%、95%及100%，或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-100%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-100%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-100%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-100%、55-60%、55-70%、55-80%、55-90%、55-95%、55-100%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-100%、70-80%、70-90%、70-95%、70-100%、80-90%、80-95%、80-100%、90-95%、90-100%或95-100%。
在一些實施例中，siRNA雙螺旋或經編碼之dsRNA可用於降低CNS之至少一個區域(諸如但不限於中腦)中之HTT蛋白及/或mRNA之表現。HTT蛋白及/或mRNA在CNS之至少一個區域中之表現降低至少約30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、85%、90%、95%及100%，或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-100%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-100%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-100%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-100%、55-60%、55-70%、55-80%、55-90%、55-95%、55-100%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-100%、70-80%、70-90%、70-95%、70-100%、80-90%、80-95%、80-100%、90-95%、90-100%或95-100%。作為一非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白及mRNA之表現降低50-90%。作為一非限制性實例，紋狀體中之HTT蛋白及mRNA之表現降低40-50%。作為一非限制性實例，皮質中之HTT蛋白及mRNA之表現降低40-50%。作為一非限制性實例，皮質中之HTT蛋白及mRNA之表現降低30-70%。作為一非限制性實例，皮質中之HTT蛋白及mRNA之表現降低至少30%。作為一非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白及mRNA之表現降低40-70%。作為一非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白及mRNA之表現降低40-50%。作為一非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白及mRNA之表現降低50-70%。作為一非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白及mRNA之表現降低50-60%。作為一非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白及mRNA之表現降低50%。作為一非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白及mRNA之表現降低51%。作為一非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白及mRNA之表現降低52%。作為一非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白及mRNA之表現降低53%。作為一非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白及mRNA之表現降低54%。作為一非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白及mRNA之表現降低55%。作為一非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白及mRNA之表現降低56%。作為一非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白及mRNA之表現降低57%。作為一非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白及mRNA之表現降低58%。作為一非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白及mRNA之表現降低59%。作為一非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白及mRNA之表現降低60%。作為一非限制性實例，紋狀體、丘腦及/或皮質中之HTT蛋白及mRNA之表現降低至少20%。作為一非限制性實例，紋狀體、丘腦及/或皮質中之HTT蛋白及mRNA之表現降低30%。作為一非限制性實例，紋狀體、丘腦及/或皮質中之HTT蛋白及mRNA之表現降低30-70%。作為一非限制性實例，紋狀體、丘腦及/或皮質中之HTT蛋白及mRNA之表現降低40-80%。作為一非限制性實例，紋狀體、丘腦及/或皮質中之HTT蛋白及mRNA之表現降低40-70%。作為一非限制性實例，紋狀體、丘腦及/或皮質中之HTT蛋白及mRNA之表現降低40-60%。作為一非限制性實例，紋狀體、丘腦及/或皮質中之HTT蛋白及mRNA之表現降低50-80%。作為一非限制性實例，紋狀體、丘腦及/或皮質中之HTT蛋白及mRNA之表現降低50-70%。
在一些實施例中，本發明提供用於抑制/靜默細胞，特定言之初級運動皮質或初級體覺皮質或顳葉皮質之神經元中之HTT基因表現的方法。在一些態樣中，抑制HTT基因表現係指抑制至少約20%，諸如至少約30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、85%、90%、95%及100%，或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-100%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-100%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-100%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-100%、55-60%、55-70%、55-80%、55-90%、55-95%、55-100%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-100%、70-80%、70-90%、70-95%、70-100%、80-90%、80-95%、80-100%、90-95%、90-100%或95-100%。因此，可將目標基因的蛋白質產物抑制至少約20%，較佳至少約30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、85%、90%、95%及100%，或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-100%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-100%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-100%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-100%、55-60%、55-70%、55-80%、55-90%、55-95%、55-100%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-100%、70-80%、70-90%、70-95%、70-100%、80-90%、80-95%、80-100%、90-95%、90-100%或95-100%。
在一些實施例中，siRNA雙螺旋或經編碼之dsRNA可用於降低CNS之至少一個區域(諸如但不限於前腦)中之HTT蛋白及/或mRNA之表現。HTT蛋白及/或mRNA在CNS之至少一個區域中之表現降低至少約30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、85%、90%、95%及100%，或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-100%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-100%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-100%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-100%、55-60%、55-70%、55-80%、55-90%、55-95%、55-100%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-100%、70-80%、70-90%、70-95%、70-100%、80-90%、80-95%、80-100%、90-95%、90-100%或95-100%。作為一非限制性實例，殼核中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低50-90%。作為一非限制性實例，紋狀體中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低40-50%。作為一非限制性實例，皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低40-50%。作為一非限制性實例，皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低30-70%。
作為一非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低40-70%。作為一非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低40-50%。作為一非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低50-70%。作為一非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低50-60%。作為一非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低50%。作為一非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低51%。作為一非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低52%。作為一非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低53%。作為一非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低54%。作為一非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低55%。作為一非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低56%。作為一非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低57%。作為一非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低58%。作為一非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低59%。作為一非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低60%。作為一非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低61%。作為一非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低62%。作為一非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低63%。作為一非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低64%。作為一非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低65%。作為一非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低66%。作為一非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低67%。作為一非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低68%。作為一非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低69%。作為一非限制性實例，紋狀體及/或皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低70%。
在一些實施例中，siRNA雙螺旋或經編碼之dsRNA可用於降低紋狀體中之HTT蛋白及/或mRNA之表現。HTT蛋白及/或mRNA之表現降低至少約30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、85%、90%、95%及100%，或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-100%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-100%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-100%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-100%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-100%、70-80%、70-90%、70-95%、70-100%、80-90%、80-95%、80-100%、90-95%、90-100%或95-100%。作為一非限制性實例，紋狀體中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低40-50%。作為一非限制性實例，紋狀體中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低30-70%。作為一非限制性實例，紋狀體中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低至少30%。作為一非限制性實例，紋狀體中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低40-70%。作為一非限制性實例，紋狀體中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低40-50%。作為一非限制性實例，紋狀體中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低50-70%。作為一非限制性實例，紋狀體中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低50-60%。作為一非限制性實例，紋狀體中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低50%。作為一非限制性實例，紋狀體中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低51%。作為一非限制性實例，紋狀體中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低52%。作為一非限制性實例，紋狀體中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低53%。作為一非限制性實例，紋狀體中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低54%。作為一非限制性實例，紋狀體中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低55%。作為一非限制性實例，紋狀體中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低56%。作為一非限制性實例，紋狀體中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低57%。作為一非限制性實例，紋狀體中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低58%。作為一非限制性實例，紋狀體中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低59%。作為一非限制性實例，紋狀體中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低60%。作為一非限制性實例，紋狀體中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低61%。作為一非限制性實例，紋狀體中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低62%。作為一非限制性實例，紋狀體中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低63%。作為一非限制性實例，紋狀體中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低64%。作為一非限制性實例，紋狀體中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低65%。作為一非限制性實例，紋狀體中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低66%。作為一非限制性實例，紋狀體中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低67%。作為一非限制性實例，紋狀體中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低68%。作為一非限制性實例，紋狀體中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低69%。作為一非限制性實例，紋狀體中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低70%。
在一些實施例中，包含編碼本發明siRNA分子之調節聚核苷酸的AAV粒子可用於遏制紋狀體及/或皮質之神經元及/或星形膠質細胞中之HTT蛋白。作為一非限制性實例，HTT蛋白之遏制處於紋狀體之中型多棘神經元及/或皮質之神經元中。作為一非限制性實例，HTT蛋白之遏制在初級運動皮質及初級體覺皮質之紋狀體之中型多棘神經元及/或錐體神經元中。
在一些實施例中，包含編碼本發明siRNA分子之調節聚核苷酸的AAV粒子可用於遏制紋狀體及/或皮質之神經元及/或星形膠質細胞中之HTT蛋白，且降低相關神經元毒性。遏制紋狀體及/或皮質之神經元及/或星形膠質細胞中之HTT蛋白可獨立地遏制5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或超過95%，5-15%、5-20%、5-25%、5-30%、5-35%、5-40%、5-45%、5-50%、5-55%、5-60%、5-65%、5-70%、5-75%、5-80%、5-85%、5-90%、5-95%、10-20%、10-25%、10-30%、10-35%、10-40%、10-45%、10-50%、10-55%、10-60%、10-65%、10-70%、10-75%、10-80%、10-85%、10-90%、10-95%、15-25%、15-30%、15-35%、15-40%、15-45%、15-50%、15-55%、15-60%、15-65%、15-70%、15-75%、15-80%、15-85%、15-90%、15-95%、20-30%、20-35%、20-40%、20-45%、20-50%、20-55%、20-60%、20-65%、20-70%、20-75%、20-80%、20-85%、20-90%、20-95%、25-35%、25-40%、25-45%、25-50%、25-55%、25-60%、25-65%、25-70%、25-75%、25-80%、25-85%、25-90%、25-95%、30-40%、30-45%、30-50%、30-55%、30-60%、30-65%、30-70%、30-75%、30-80%、30-85%、30-90%、30-95%、35-45%、35-50%、35-55%、35-60%、35-65%、35-70%、35-75%、35-80%、35-85%、35-90%、35-95%、40-50%、40-55%、40-60%、40-65%、40-70%、40-75%、40-80%、40-85%、40-90%、40-95%、45-55%、45-60%、45-65%、45-70%、45-75%、45-80%、45-85%、45-90%、45-95%、50-60%、50-65%、50-70%、50-75%、50-80%、50-85%、50-90%、50-95%、55-65%、55-70%、55-75%、55-80%、55-85%、55-90%、55-95%、60-70%、60-75%、60-80%、60-85%、60-90%、60-95%、65-75%、65-80%、65-85%、65-90%、65-95%、70-80%、70-85%、70-90%、70-95%、75-85%、75-90%、75-95%、80-90%、80-95%或90-95%。相關神經元毒性可降低5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或超過95%，5-15%、5-20%、5-25%、5-30%、5-35%、5-40%、5-45%、5-50%、5-55%、5-60%、5-65%、5-70%、5-75%、5-80%、5-85%、5-90%、5-95%、10-20%、10-25%、10-30%、10-35%、10-40%、10-45%、10-50%、10-55%、10-60%、10-65%、10-70%、10-75%、10-80%、10-85%、10-90%、10-95%、15-25%、15-30%、15-35%、15-40%、15-45%、15-50%、15-55%、15-60%、15-65%、15-70%、15-75%、15-80%、15-85%、15-90%、15-95%、20-30%、20-35%、20-40%、20-45%、20-50%、20-55%、20-60%、20-65%、20-70%、20-75%、20-80%、20-85%、20-90%、20-95%、25-35%、25-40%、25-45%、25-50%、25-55%、25-60%、25-65%、25-70%、25-75%、25-80%、25-85%、25-90%、25-95%、30-40%、30-45%、30-50%、30-55%、30-60%、30-65%、30-70%、30-75%、30-80%、30-85%、30-90%、30-95%、35-45%、35-50%、35-55%、35-60%、35-65%、35-70%、35-75%、35-80%、35-85%、35-90%、35-95%、40-50%、40-55%、40-60%、40-65%、40-70%、40-75%、40-80%、40-85%、40-90%、40-95%、45-55%、45-60%、45-65%、45-70%、45-75%、45-80%、45-85%、45-90%、45-95%、50-60%、50-65%、50-70%、50-75%、50-80%、50-85%、50-90%、50-95%、55-65%、55-70%、55-75%、55-80%、55-85%、55-90%、55-95%、60-70%、60-75%、60-80%、60-85%、60-90%、60-95%、65-75%、65-80%、65-85%、65-90%、65-95%、70-80%、70-85%、70-90%、70-95%、75-85%、75-90%、75-95%、80-90%、80-95%或90-95%。
在一些實施例中，siRNA雙螺旋或經編碼之dsRNA可用於降低皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現。HTT蛋白及/或mRNA之表現降低至少約30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、85%、90%、95%及100%，或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-100%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-100%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-100%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-100%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-100%、70-80%、70-90%、70-95%、70-100%、80-90%、80-95%、80-100%、90-95%、90-100%或95-100%。作為一非限制性實例，皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低40-50%。作為一非限制性實例，皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低30-70%。作為一非限制性實例，皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低至少30%。作為一非限制性實例，皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低40-70%。作為一非限制性實例，皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低40-50%。作為一非限制性實例，皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低50-70%。作為一非限制性實例，皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低50-60%。作為一非限制性實例，皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低50%。作為一非限制性實例，皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低51%。作為一非限制性實例，皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低52%。作為一非限制性實例，皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低53%。作為一非限制性實例，皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低54%。作為一非限制性實例，皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低55%。作為一非限制性實例，皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低56%。作為一非限制性實例，皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低57%。作為一非限制性實例，皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低58%。作為一非限制性實例，皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低59%。作為一非限制性實例，皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低60%。
在一些實施例中，siRNA雙螺旋或經編碼之dsRNA可用於降低運動皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現。HTT蛋白及/或mRNA之表現降低至少約30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、85%、90%、95%及100%，或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-100%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-100%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-100%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-100%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-100%、70-80%、70-90%、70-95%、70-100%、80-90%、80-95%、80-100%、90-95%、90-100%或95-100%。作為一非限制性實例，運動皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低20-30%。作為一非限制性實例，運動皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低40-50%。作為一非限制性實例，運動皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低30-70%。作為一非限制性實例，運動皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低至少30%。作為一非限制性實例，運動皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低40-70%。作為一非限制性實例，運動皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低40-50%。作為一非限制性實例，運動皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低50-70%。作為一非限制性實例，運動皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低50-60%。作為一非限制性實例，運動皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低50%。作為一非限制性實例，運動皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低51%。作為一非限制性實例，運動皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低52%。作為一非限制性實例，運動皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低53%。作為一非限制性實例，運動皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低54%。作為一非限制性實例，運動皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低55%。作為一非限制性實例，運動皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低56%。作為一非限制性實例，運動皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低57%。作為一非限制性實例，運動皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低58%。作為一非限制性實例，運動皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低59%。作為一非限制性實例，運動皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低60%。
在一些實施例中，siRNA雙螺旋或經編碼之dsRNA可用於降低體覺皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現。HTT蛋白及/或mRNA之表現降低至少約30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、85%、90%、95%及100%，或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-100%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-100%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-100%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-100%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-100%、70-80%、70-90%、70-95%、70-100%、80-90%、80-95%、80-100%、90-95%、90-100%或95-100%。作為一非限制性實例，體覺皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低20-30%。作為一非限制性實例，體覺皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低40-50%。作為一非限制性實例，體覺皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低30-70%。作為一非限制性實例，體覺皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低至少30%。作為一非限制性實例，體覺皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低40-70%。作為一非限制性實例，體覺皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低40-50%。作為一非限制性實例，體覺皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低50-70%。作為一非限制性實例，體覺皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低50-60%。作為一非限制性實例，體覺皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低50%。作為一非限制性實例，體覺皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低51%。作為一非限制性實例，體覺皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低52%。作為一非限制性實例，體覺皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低53%。作為一非限制性實例，體覺皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低54%。作為一非限制性實例，體覺皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低55%。作為一非限制性實例，體覺皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低56%。作為一非限制性實例，體覺皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低57%。作為一非限制性實例，體覺皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低58%。作為一非限制性實例，體覺皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低59%。作為一非限制性實例，體覺皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低60%。
在一些實施例中，siRNA雙螺旋或經編碼之dsRNA可用於降低顳葉皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現。HTT蛋白及/或mRNA之表現降低至少約30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、85%、90%、95%及100%，或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-100%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-100%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-100%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-100%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-100%、70-80%、70-90%、70-95%、70-100%、80-90%、80-95%、80-100%、90-95%、90-100%或95-100%。作為一非限制性實例，顳葉皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低40-50%。作為一非限制性實例，顳葉皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低30-70%。作為一非限制性實例，顳葉皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低至少30%。作為一非限制性實例，顳葉皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低40-70%。作為一非限制性實例，顳葉皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低40-50%。作為一非限制性實例，顳葉皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低50-70%。作為一非限制性實例，顳葉皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低50-60%。作為一非限制性實例，顳葉皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低50%。作為一非限制性實例，顳葉皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低51%。作為一非限制性實例，顳葉皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低52%。作為一非限制性實例，顳葉皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低53%。作為一非限制性實例，顳葉皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低54%。作為一非限制性實例，顳葉皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低55%。作為一非限制性實例，顳葉皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低56%。作為一非限制性實例，顳葉皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低57%。作為一非限制性實例，顳葉皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低58%。作為一非限制性實例，顳葉皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低59%。作為一非限制性實例，顳葉皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低60%。
在一些實施例中，siRNA雙螺旋或經編碼之dsRNA可用於組合在一起時之降低運動皮質、體覺皮質及顳葉皮質中之HTT蛋白及/或mRNA的表現。HTT蛋白及/或mRNA之表現降低至少約30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、85%、90%、95%及100%，或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-100%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-100%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-100%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-100%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-100%、70-80%、70-90%、70-95%、70-100%、80-90%、80-95%、80-100%、90-95%、90-100%或95-100%。作為一非限制性實例，組合在一起時之運動皮質、體覺皮質及顳葉皮質中之HTT蛋白及/或mRNA的表現降低40-50%。。作為一非限制性實例，組合在一起時之運動皮質、體覺皮質及顳葉皮質中之HTT蛋白及/或mRNA的表現降低30-70%。作為一非限制性實例，組合在一起時之運動皮質、體覺皮質及顳葉皮質中之HTT蛋白及/或mRNA的表現降低至少30%。作為一非限制性實例，組合在一起時之運動皮質、體覺皮質及顳葉皮質中之HTT蛋白及/或mRNA的表現降低40-70%。作為一非限制性實例，組合在一起時之運動皮質、體覺皮質及顳葉皮質中之HTT蛋白及/或mRNA的表現降低40-50%。作為一非限制性實例，組合在一起時之運動皮質、體覺皮質及顳葉皮質中之HTT蛋白及/或mRNA的表現降低50-70%。作為一非限制性實例，組合在一起時之運動皮質、體覺皮質及顳葉皮質中之HTT蛋白及/或mRNA的表現降低50-60%。作為一非限制性實例，組合在一起時之運動皮質、體覺皮質及顳葉皮質中之HTT蛋白及/或mRNA的表現降低50%。作為一非限制性實例，組合在一起時之運動皮質、體覺皮質及顳葉皮質中之HTT蛋白及/或mRNA的表現降低51%。作為一非限制性實例，組合在一起時之運動皮質、體覺皮質及顳葉皮質中之HTT蛋白及/或mRNA的表現降低52%。作為一非限制性實例，組合在一起時之運動皮質、體覺皮質及顳葉皮質中之HTT蛋白及/或mRNA的表現降低53%。作為一非限制性實例，組合在一起時之運動皮質、體覺皮質及顳葉皮質中之HTT蛋白及/或mRNA的表現降低54%。作為一非限制性實例，組合在一起時之運動皮質、體覺皮質及顳葉皮質中之HTT蛋白及/或mRNA的表現降低55%。作為一非限制性實例，組合在一起時之運動皮質、體覺皮質及顳葉皮質中之HTT蛋白及/或mRNA的表現降低56%。作為一非限制性實例，組合在一起時之運動皮質、體覺皮質及顳葉皮質中之HTT蛋白及/或mRNA的表現降低57%。作為一非限制性實例，組合在一起時之運動皮質、體覺皮質及顳葉皮質中之HTT蛋白及/或mRNA的表現降低58%。作為一非限制性實例，組合在一起時之運動皮質、體覺皮質及顳葉皮質中之HTT蛋白及/或mRNA的表現降低59%。作為一非限制性實例，顳葉皮質中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低60%。
在一些實施例中，siRNA雙螺旋或經編碼之dsRNA可用於降低殼核中之HTT蛋白及/或mRNA之表現。HTT蛋白及/或mRNA在殼核中之表現降低至少約30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、85%、90%、95%及100%，或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-100%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-100%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-100%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-100%、55-60%、55-70%、55-80%、55-90%、55-95%、55-100%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-100%、70-80%、70-90%、70-95%、70-100%、80-90%、80-95%、80-100%、90-95%、90-100%或95-100%。作為一非限制性實例，殼核中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低40-70%。作為一非限制性實例，殼核中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低30-40%。作為一非限制性實例，殼核中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低40-50%。作為一非限制性實例，殼核中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低50-80%。作為一非限制性實例，殼核中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低50-70%。作為一非限制性實例，殼核中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低50-60%。作為一非限制性實例，殼核中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低60-70%。作為一非限制性實例，殼核中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低50%。作為一非限制性實例，殼核中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低51%。作為一非限制性實例，殼核中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低52%。作為一非限制性實例，殼核中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低53%。作為一非限制性實例，殼核中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低54%。作為一非限制性實例，殼核中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低55%。作為一非限制性實例，殼核中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低56%。作為一非限制性實例，殼核中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低57%。作為一非限制性實例，殼核中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低58%。作為一非限制性實例，殼核中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低59%。作為一非限制性實例，殼核中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低60%。作為一非限制性實例，殼核中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低61%。作為一非限制性實例，殼核中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低62%。作為一非限制性實例，殼核中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低63%。作為一非限制性實例，殼核中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低64%。作為一非限制性實例，殼核中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低65%。作為一非限制性實例，殼核中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低66%。作為一非限制性實例，殼核中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低67%。作為一非限制性實例，殼核中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低68%。作為一非限制性實例，殼核中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低69%。作為一非限制性實例，殼核中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低70%。
在一些實施例中，siRNA雙螺旋或經編碼之dsRNA可用於降低尾核中之HTT蛋白及/或mRNA之表現。HTT蛋白及/或mRNA在尾核中之表現降低至少約30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、85%、90%、95%及100%，或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-100%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-100%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-100%、50-60%、50-70%、50-80%、50-85%、50-90%、50-95%、50-100%、55-60%、55-70%、55-80%、55-90%、55-95%、55-100%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-100%、70-80%、70-90%、70-95%、70-100%、80-90%、80-95%、80-100%、90-95%、90-100%或95-100%。作為一非限制性實例，尾核中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低40-70%。作為一非限制性實例，尾核中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低40-50%。作為一非限制性實例，尾核中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低50-85%。作為一非限制性實例，尾核中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低50-80%。作為一非限制性實例，尾核中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低50-70%。作為一非限制性實例，尾核中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低50-60%。作為一非限制性實例，尾核中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低60-70%。作為一非限制性實例，尾核中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低50%。作為一非限制性實例，尾核中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低51%。作為一非限制性實例，尾核中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低52%。作為一非限制性實例，尾核中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低53%。作為一非限制性實例，尾核中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低54%。作為一非限制性實例，尾核中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低55%。作為一非限制性實例，尾核中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低56%。作為一非限制性實例，尾核中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低57%。作為一非限制性實例，尾核中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低58%。作為一非限制性實例，尾核中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低59%。作為一非限制性實例，尾核中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低60%。作為一非限制性實例，尾核中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低61%。作為一非限制性實例，尾核中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低62%。作為一非限制性實例，尾核中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低63%。作為一非限制性實例，尾核中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低64%。作為一非限制性實例，尾核中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低65%。作為一非限制性實例，尾核中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低66%。作為一非限制性實例，尾核中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低67%。作為一非限制性實例，尾核中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低68%。作為一非限制性實例，尾核中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低69%。作為一非限制性實例，尾核中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低70%。
在一些實施例中，siRNA雙螺旋或經編碼之dsRNA可用於降低丘腦中之HTT蛋白及/或mRNA之表現。HTT蛋白及/或mRNA在丘腦中之表現降低至少約30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、85%、90%、95%及100%，或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-100%、30-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-100%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-100%、50-60%、50-70%、50-80%、50-85%、50-90%、50-95%、50-100%、55-60%、55-70%、55-80%、55-90%、55-95%、55-100%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-100%、70-80%、70-90%、70-95%、70-100%、80-90%、80-95%、80-100%、90-95%、90-100%或95-100%。作為一非限制性實例，丘腦中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低至少30%。作為一非限制性實例，丘腦中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低至少40-70%。作為一非限制性實例，丘腦中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低至少40-80%。作為一非限制性實例，丘腦中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低至少60-90%。作為一非限制性實例，丘腦中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低至少60-80%。作為一非限制性實例，丘腦中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低至少60-70%。作為一非限制性實例，丘腦中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低至少60%。作為一非限制性實例，丘腦中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低至少61%。作為一非限制性實例，丘腦中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低至少62%。作為一非限制性實例，丘腦中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低至少63%。作為一非限制性實例，丘腦中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低至少64%。作為一非限制性實例，丘腦中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低至少65%。作為一非限制性實例，丘腦中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低至少66%。作為一非限制性實例，丘腦中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低至少67%。作為一非限制性實例，丘腦中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低至少68%。作為一非限制性實例，丘腦中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低至少69%。作為一非限制性實例，丘腦中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低至少70%。作為一非限制性實例，丘腦中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低至少71%。作為一非限制性實例，丘腦中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低至少72%。作為一非限制性實例，丘腦中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低至少73%。作為一非限制性實例，丘腦中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低至少74%。作為一非限制性實例，丘腦中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低至少75%。作為一非限制性實例，丘腦中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低至少76%。作為一非限制性實例，丘腦中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低至少77%。作為一非限制性實例，丘腦中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低至少78%。作為一非限制性實例，丘腦中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低至少79%。作為一非限制性實例，丘腦中之HTT蛋白及/或mRNA之表現降低至少80%。
在一些實施例中，編碼siRNA雙螺旋之AAV粒子或其醫藥組合物具有約1-300個VG/細胞之半數最大有效濃度(EC50 )。如本文所用，半數最大有效濃度(EC50 )係指編碼引起細胞中50% HTT表現降低之siRNA雙螺旋的AAV載體之濃度。HTT表現可為HTT mRNA或蛋白質表現。編碼siRNA雙螺旋之AAV粒子或其醫藥組合物可具有以下之EC50 ：1-10、1-20、1-30、1-40、1-50、10-20、10-30、10-40、10-50、10-60、15-30、20-30、20-40、20-50、20-60、20-70、30-40、30-50、30-60、30-70、30-80、35-50、40-50、40-60、40-70、40-80、40-90、50-60、50-70、50-80、50-90、50-100、60-70、60-80、60-90、60-100、70-90、70-100、70-120、80-100、80-120、80-140、90-120、90-150、90-180、100-120、100-150、100-180、100-200、120-160、120-180、150-200、200-250、200-300或250-300個VG/細胞。舉例而言，編碼siRNA雙螺旋之AAV粒子或其醫藥組合物可具有以下之EC50 ：約20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250或300個VG/細胞。作為一非限制性實例，編碼siRNA雙螺旋之AAV粒子或其醫藥組合物在殼核中可具有約35-50個VG/細胞之EC50 。作為另一非限制性實例，編碼siRNA雙螺旋之AAV粒子或其醫藥組合物在尾核中可具有約15-30個VG/細胞之EC50 。HTT 蛋白聚集體及細胞
在一些實施例中，向個體投與AAV粒子將調節個體中之HTT蛋白聚集體及/或細胞之數量，例如含量及/或數目。作為一非限制性實例，HTT蛋白聚集體可為細胞核HTT蛋白聚集體。細胞核HTT蛋白聚集體可為表現EM48 mRNA及/或蛋白質之EM48陽性細胞核HTT蛋白聚集體。在特定實施例中，EM48 mRNA及/或蛋白質可偵測及量測為細胞核HTT蛋白聚集體數量指數或代替值。作為一非限制性實例，EM48 mRNA及/或蛋白質可使用此項技術中已知之任何方法偵測及量測，包括定量反轉錄聚合酶鏈反應(RT-qPCR)及免疫組織化學。細胞可為神經系統細胞，諸如但不限於神經元、中等尺寸之多棘神經元及膠細胞，例如星形膠質細胞、寡樹突神經膠質細胞及/或微神經膠質細胞。
在一些實施例中，向個體投與AAV粒子將調節個體內神經元的數量。作為一非限制性實例，神經元為神經元細胞核抗原(NeuN)陽性神經元，其表現NeuN mRNA及/或蛋白質。在特定實施例中，NeuN mRNA及/或蛋白質可偵測及量測為神經元數量指數或代替值。作為一非限制性實例，NeuN mRNA及/或蛋白質可使用此項技術中已知之任何方法來偵測及量測，包括定量反轉錄聚合酶鏈反應(RT-qPCR)及免疫組織化學。
在一些實施例中，向個體投與AAV粒子將調節個體之中等尺寸之多棘神經元的數量。作為一非限制性實例，中等尺寸之多棘神經元為多巴胺調節及cAMP調控之磷蛋白Mr 32 kDa (DARPP32)陽性中等尺寸之多棘神經元，其表現DARPP32 mRNA 及/或蛋白質。在特定實施例中，DARPP32 mRNA及/或蛋白質可偵測及量測為中等尺寸之多棘神經元之數量指數或代替值。作為一非限制性實例，DARPP32 mRNA及/或蛋白質可使用此項技術中已知之任何方法來偵測及量測，包括定量反轉錄聚合酶鏈反應(RT-qPCR)及免疫組織化學。
在一些實施例中，向個體投與AAV粒子將調節個體之星形膠質細胞的數量。作為一非限制性實例，星形膠質細胞為表現GFAP mRNA及/或蛋白質之膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)陽性星形膠質細胞。在特定實施例中，GFAP mRNA及/或蛋白質可偵測及/或測量為星形膠質細胞數量指數或代替值。作為一非限制性實例，GFAP mRNA及/或蛋白質可使用此項技術中已知之任何方法來偵測及/或量測，包括定量反轉錄聚合酶鏈反應(RT-qPCR)及免疫組織化學。
在一些實施例中，向個體投與AAV粒子將調節個體中之微神經膠質細胞之含量及/或數目。作為一非限制性實例，微神經膠質細胞為離子化鈣結合承接分子1 (Iba1)陽性微神經膠質細胞，其表現Iba1 mRNA及/或蛋白質。在特定實施例中，Iba1 mRNA及/或蛋白質可偵測及/或量測為星形膠質細胞之數量指數或代替值。作為一非限制性實例，GFAP mRNA及/或蛋白質可使用此項技術中已知之任何方法來偵測及/或量測，包括定量反轉錄聚合酶鏈反應(RT-qPCR)及免疫組織化學。單獨及組合療法
在一些實施例中，本發明組合物以單獨療法或組合療法形式投與以用於治療HD。
在一些實施例中，本發明之醫藥組合物用作單獨療法。在其他實施例中，本發明之醫藥組合物用於組合療法中。組合療法可與已針對其對神經元退化之神經保護作用進行測試之一或多種神經保護劑組合，該等神經保護劑諸如小分子化合物、生長因子及激素。
編碼靶向HTT基因之siRNA雙螺旋之AAV粒子可與一種或多種其他治療劑組合使用。「與……組合」不意欲暗示藥劑必須同時投與及/或調配成一起遞送，但此等遞送方法屬於本發明之範疇內。組合物可與一或多種其他所需治療或醫療程序同時投與、在一或多種其他所需治療或醫療程序之前投與、或在一或多種其他所需治療或醫療程序之後投與。一般而言，各藥劑將以根據彼藥劑所確定的劑量及/或時程來投與。
可與編碼本發明siRNA分子之核酸序列的AAV粒子組合使用之治療劑可為小分子化合物，其為抗氧化劑、消炎劑、抗細胞凋亡劑、鈣調節劑、抗麩胺酸激導性劑、結構蛋白抑制劑、涉及肌肉功能之化合物及涉及金屬離子調控之化合物。
可與本文中所描述之載體組合使用之針對治療HD所測試的化合物包括但不限於：多巴胺耗竭劑(例如用於舞蹈症之四苯喹嗪)、苯并二氮呯(例如用於肌陣攣、舞蹈症、肌肉緊張不足、僵硬及/或痙攣之氯硝西泮)、抗驚厥劑(例如用於肌陣攣之丙戊酸鈉及左乙拉西坦)、多巴胺之胺基酸前驅體(例如用於與幼年型HD或年輕成年發作巴金森式表型尤其相關之僵硬)、骨骼肌鬆弛劑(例如用於僵硬及/或痙攣之氯苯胺丁酸、替紮尼定(tizanidine))、用於在肌神經接合點處乙醯膽鹼釋放以引起肌肉麻痹之抑制劑(例如用於睡中磨牙及/或肌肉緊張不足之肉毒桿菌毒素)、非典型精神安定劑(例如用於精神病及/或易怒之奧氮平及喹硫平、利培酮、舒必利及用於精神病、舞蹈症及/或易怒之氟哌啶醇、用於抗治療性精神病之氯氮平、用於具有明顯負性症狀之精神病之阿立哌唑)、用以提高ATP/細胞能量學之試劑(例如肌酸)、選擇性血清素再吸收抑制劑(selective serotonin reuptake inhibitors；SSRI) (例如用於抑鬱、焦慮、強迫行為及/或易怒之西他普蘭(citalopram)、氟西汀(fluoxetine)、帕羅西汀(paroxetine)、舍曲林(sertraline)、米氮平、文拉法辛(venlafaxine))、安眠藥(例如用於變化之睡眠-覺醒週期之佐匹克隆(xopiclone)及/或唑吡坦)、抗驚厥劑(例如用於躁症或輕躁症之丙戊酸鈉及卡馬西平)及情緒穩定劑(例如用於躁症或輕躁症之鋰)。
神經營養因子可與編碼本發明siRNA分子之核酸序列的AAV粒子一起用於組合療法中以治療HD。一般而言，神經營養因子定義為促進神經元之存活、生長、分化、增殖及/或成熟或刺激增加的神經元之活性的物質。在一些實施例中，本發明方法進一步包含將一或多種營養因子遞送至需要治療之個體或患者中。營養因子可包括但不限於IGF-I、GDNF、BDNF、CTNF、VEGF、科里弗林(Colivelin)、紮利羅登(Xaliproden)、促甲狀腺素釋放激素及ADNF及其變異體。
在一些態樣中，包含靶向HTT基因之siRNA雙螺旋之調節聚核苷酸的AAV載體可與表現神經營養因子之AAV粒子共同投與，該等AAV粒子諸如AAV-IGF-I (參見例如Vincent等人,Neuromolecular medicine , 2004, 6, 79-85；其內容以全文引用之方式併入本文中)及AAV-GDNF (參見例如Wang等人,J Neurosci. , 2002, 22, 6920-6928；其內容以全文引用之方式併入本文中)。 VI. 定義
在本發明中的不同位置，以組或範圍來揭示本發明化合物之取代物或特性。特別預期本發明包括此類群及範圍之成員之每個單獨組合或子組合。
除非另有說明，否則以下術語及片語具有下文描述之含義。定義本質上並不意謂為限制性的且用以提供對本發明之某些態樣之更清晰理解。
約 ： 如本文所用，術語「約」意謂所引述之值的+/-10%。
腺相關病毒 ： 如本文所用，術語「腺相關病毒」或「AAV」係指包含或源自腺相關載體之組分且適合於感染哺乳動物細胞、較佳人類細胞之任何載體。術語AAV載體通常表明包含酬載之AAV型病毒粒子或病毒顆粒。AAV載體可源自各種血清型，包括血清型(亦即「假型」AAV)之組合，或源自各種基因體(例如單股或自互補)。另外，AAV載體可為複製缺陷型及/或靶向型的。
AAV 粒子： 如本文所用，「AAV粒子」為病毒，其包括衣殼及具有至少一個酬載區及至少一個ITR區之病毒基因體。本發明之AAV粒子可以重組方式生產，且可基於腺相關病毒(AAV)親本或參考序列。AAV粒子可衍生自本文所述或此項技術中已知之任何血清型，包括血清型之組合(亦即，「假型」AAV)或各種基因體(例如單股的或自補的)。另外，AAV粒子可為複製缺陷型及/或靶向型的。
活性 ： 如本文所用，術語「活性」係指其中事件發生或進行之情況。本發明之組合物可具有活性，且此活性可涉及一或多個生物學事件。
投與 ： 如本文所用，術語「投與」係指向個體提供藥劑或組合物。
以組合形式投與 ： 如本文所用，術語「以組合形式投與」或「組合投與」意謂同時或在一定時間間隔內向個體投與兩種或更多種藥劑，使得每種藥劑對患者之作用發生重疊。在某些實施例中，其係在彼此之約60、30、15、10、5或1分鐘內投與。在某些實施例中，藥劑之投與係以在一起足夠緊密的程度間隔開以達成組合(例如協同)作用。
改善 ： 如本文所用，術語「改善(amelioration)」或「改善(ameliorating)」係指病況或疾病之至少一種指標的嚴重程度減輕。舉例而言，在神經退化病症之情形下，改善包括減少神經元損失。
動物 ： 如本文所用，術語「動物」係指動物界的任何成員。在某些實施例中，「動物」係指任何發育階段之人類。在某些實施例中，「動物」係指任何發育階段之非人類動物。在某些實施例中，非人類動物為哺乳動物(例如，嚙齒動物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、貓、羊、牛、靈長類動物或豬)。在某些實施例中，動物包括但不限於哺乳動物、鳥類、爬行動物、兩棲動物、魚類及蠕蟲。在某些實施例中，動物為轉殖基因動物、經基因工程改造之動物或純系。
反義股 ： 如本文所用，術語siRNA分子之「反義股」或「第一股」或「引導股」係指與所靶向以用於沉默之基因的mRNA之約10-50個核苷酸，例如約15-30、16-25、18-23或19-22個核苷酸之鏈段實質上互補的股。反義股或第一股具有與所需目標mRNA序列充分互補以引導目標特異性靜默的序列，例如互補性足以讓RNAi機制或過程觸發對所需目標mRNA之破壞。
大致 ： 如本文所用，在應用於一或多個所關注之值時，術語「大致」或「約」係指與所陳述之參考值類似的值。在某些實施例中，除非另有說明或另外自上下文顯而易見(除了此類數目將超過可能值之100%的情況)，否則術語「大致」係指在陳述之參考值的任一方向(大於或小於)落入25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更小百分比內的一系列值。
與 … 締合 ： 如本文所用，當關於兩個或超過兩個部分使用時，術語「與…締合」、「結合」、「連接」、「附接」及「繫栓」意謂該等部分直接或經由一或多個充當連接劑之額外部分而在物理上彼此締合或連接，以形成足夠穩定之結構以使得該等部分在使用該結構之條件(例如生理學條件)下保持在物理上締合。「締合」不必嚴格經由直接共價化學鍵結進行。其亦可表明離子鍵結或氫鍵結或基於雜化之連接性足夠穩定以使得「締合的」實體保持物理締合。
桿狀病毒表現載體 (BEV) ： 如本文所用，BEV為桿狀病毒表現載體，亦即桿狀病毒來源之聚核苷酸載體。使用BEV之系統係稱為桿狀病毒表現載體系統(BEVS)。
mBEV 或經修飾之 BEV ： 如本文所用，經修飾之BEV為桿狀病毒來源之表現載體，其已藉由以下一或多者之添加及/或缺失及/或複製及/或倒置而相對於起始BEV (無論野生型抑或人工的)改變：基因；基因片段；裂解位點；限制位點；序列區域；編碼酬載或所關注之基因的序列；或前述之組合。
雙功能性 ： 如本文所用，術語「雙功能性」係指任何能夠具有或維持至少兩種功能的物質、分子或部分。該等功能可實現相同結果或不同結果。產生功能之結構可相同或不同。
BIIC ： 如本文所用，BIIC為桿狀病毒感染之昆蟲細胞。
生物相容性 ： 如本文所用，術語「生物相容性」意謂與活的細胞、組織、器官或系統相容，幾乎不引起損傷、毒性或被免疫系統排斥的風險。
生物可降解 ： 如本文所用，術語「生物可降解」意謂能夠藉由活物之作用分解成無害產物。
具生物活性 ：如本文所用，片語「具生物活性」係指任何在生物系統及/或生物體中具有活性之物質的特點。舉例而言，當向生物體投與時對彼生物體具有生物學作用之物質視為具有生物學活性。在特定實施例中，若經編碼之酬載的即使一部分具有生物活性或模擬被視為生物學相關的活性，則可認為本發明之AAV粒子具有生物活性。
衣殼 ：如本文所用，術語「衣殼」係指病毒粒子之蛋白質外殼。
經密碼子最佳化 ：如本文所用，術語「經密碼子最佳化」或「密碼子最佳化」係指經修飾之核酸序列編碼與親本/參考序列相同的胺基酸序列，但已改變，使得經修飾之核酸序列的密碼子針對在特定系統(諸如特定物種或物種群)中之表現最佳化或改良。作為一非限制性實例，包括AAV衣殼蛋白之核酸序列可針對在昆蟲細胞中或在一特定昆蟲細胞(諸如草地黏蟲細胞)中之表現經密碼子最佳化。密碼子最佳化可使用熟習此項技術者已知之方法及資料庫完成。
互補及實質上互補 ：如本文所用，術語「互補」係指聚核苷酸彼此形成鹼基對之能力。鹼基對通常由反平行聚核苷酸股中之核苷酸單元之間的氫鍵形成。互補聚核苷酸股可以沃森-克里克方式(例如A至T、A至U、C至G)，或以允許形成雙螺旋之任何其他方式形成鹼基對。熟習此項技術者將瞭解，當相對於DNA使用RNA時，尿嘧啶而非胸腺嘧啶為視為與腺苷互補之鹼基。然而，除非另有說明，否則當在本發明之上下文中表示為U時，暗示能夠取代T。完美互補性或100%互補性係指一個聚核苷酸股之各核苷酸單元可與第二聚核苷酸股之核苷酸單元形成氫鍵之情況。次完美互補性係指兩股之一些但並非所有核苷酸單元可彼此形成氫鍵的情況。舉例而言，對於兩個20聚體，若各股上僅兩個鹼基對可彼此形成氫鍵，則該等聚核苷酸股呈現10%互補性。在相同實例中，若各股上之18個鹼基對可彼此形成氫鍵，則聚核苷酸股呈現90%互補性。如本文所用，術語「實質上互補」意謂siRNA之序列(例如在反義股中)足以結合所需目標mRNA及觸發該目標mRNA之RNA靜默。
化合物 ： 本發明之化合物包括存在於中間化合物或最終化合物中之原子的所有同位素。「同位素」係指具有相同原子數但因為原子核中之中子數不同而具有不同質量數之原子。舉例而言，氫同位素包括氚及氘。
本發明之化合物及鹽可藉由常規方法與溶劑或水分子組合製備以形成溶劑合物及水合物。
條件活性 ：如本文所用，術語「條件活性」係指野生型多肽之突變體或變異體，其中與親本多肽相比，該突變體或變異體在生理學條件下之活性更大或更小。此外，條件性活性多肽在異常條件下相比於親本多肽具有增加或減小的活性。條件活性多肽在普通生理學條件或異常條件下可以可逆或不可逆方式不活化。
保守： 如本文所用，術語「保守」係指在所比較的兩個或更多個序列之相同位置保持不變的聚核苷酸序列或多肽序列之相應的核苷酸或胺基酸殘基。相對保守之核苷酸或胺基酸為與序列中其他地方出現之核苷酸或胺基酸相比而言相關性較高之序列中之保守性核苷酸或胺基酸。
在某些實施例中，若兩個或更多個序列為彼此100%相同，則將其稱為「完全保守的」。在某些實施例中，若兩個或更多個序列為彼此至少70%一致、至少80%一致、至少90%一致或至少95%一致，則將其稱為「高度保守的」。在某些實施例中，若兩個或更多個序列為彼此約70%相同、約80%相同、約90%相同、約95%、約98%或約99%相同，則將其稱為「高度保守的」。在某些實施例中，若兩個或更多個序列為彼此至少30%一致、至少40%一致、至少50%一致、至少60%一致、至少70%一致、至少80%一致、至少90%一致或至少95%一致，則將其稱為「保守的」。在某些實施例中，若兩個或更多個序列為彼此約30%相同、約40%相同、約50%相同、約60%相同、約70%相同、約80%相同、約90%相同、約95%相同、約98%相同或約99%相同，則將其稱為「保守的」。序列之保守可應用於聚核苷酸或多肽之整個長度，或可應用於其一部分、區域或特徵。
控制元件 ：如本文所用，「控制元件」、「調控控制元件」或「調控序列」係指提供接受者細胞中之編碼序列之複製、轉錄及轉譯的啟動子區、聚腺苷酸化信號、轉錄終止序列、上游調控域、複製起點、內部核糖體進入位點(「IRES」)、增強子及其類似物。此等控制元件並非全部都需要始終存在，只要所選編碼序列能夠在適當的宿主細胞中進行複製、轉錄及/或轉譯即可。
控制釋放 ： 如本文所用，術語「控制釋放」係指符合特定釋放模式以實現治療結果的醫藥組合物或化合物釋放曲線。
細胞抑制 ：如本文所用，「細胞抑制」係指抑制、減少、抑止細胞(例如，哺乳動物細胞(例如，人類細胞))、細菌、病毒、真菌、原生動物、寄生蟲、朊病毒或其組合之生長、分裂或倍增。
細胞毒性 ：如本文所用，「細胞毒性」係指將細胞(例如，哺乳動物細胞(例如，人類細胞))、細菌、病毒、真菌、原生動物、寄生蟲、朊病毒或其組合殺死或對其造成有害、有毒或致命的影響。
遞送 ： 如本文所用，「遞送」係指遞送AAV粒子、化合物、物質、實體、部分、貨物或酬載的動作或方式。
遞送劑 ：如本文所用，「遞送劑」係指任何至少部分地有助於將AAV粒子活體內遞送至所靶向細胞的物質。
去穩定 ：如本文所用，術語「去穩定」、「去穩定化」或「去穩定化區域」意謂使某個區域或分子之穩定性比相同區域或分子之起始、野生型或原生形式小。
可偵測標記 ：如本文所用，「可偵測標記」係指一或多種與另一實體附接、併入另一實體中或與另一實體締合的標記物、信號或部分，該另一實體易於藉由此項技術中已知之方法偵測，該等方法包括放射線照相術、螢光、化學發光、酶活性、吸光度及其類似方法。可偵測標記包括放射性同位素、螢光團、發色團、酶、染料、金屬離子、配位體(諸如生物素、抗生物素蛋白、鏈黴親和素及半抗原)、量子點及其類似物。可偵測標記可位於本文中所揭示之肽或蛋白質中之任何位置。其可在胺基酸、肽或蛋白質內，或位於N端或C端。
消化 ：如本文所用，術語「消化」意謂分裂成較小的碎片或組分。在提及多肽或蛋白質時，消化引起肽的生產。
遠端 ：如本文所用，術語「遠端」意謂位於遠離中心或遠離所關注之點或區域處。
給藥方案 ：如本文所用，「給藥方案」為投與時程或由醫師確定之治療、防治或緩解性照護方案。
囊封 ：如本文所用，術語「囊封」意謂圍封、包圍或包覆。
經工程改造 ： 如本文所用，當本發明之實施例經設計以具有與起始點、野生型或原生分子不同的特徵或特性(無論結構上抑或化學上)時，該等實施例「經工程改造」。
有效量 ：如本文所用，術語藥劑之「有效量」為足以實現有益的或所需的結果，例如臨床結果的量，且因此「有效量」視其應用情形而定。舉例而言，在投與治療HD之藥劑之情形下，藥劑之有效量係例如相比於在未投與藥劑下所獲得之反應，足以達成HD之如本文所定義之治療的量。
表現 ：如本文所用，核酸序列之「表現」係指以下事件中之一或多者：(1)自DNA序列產生RNA模板(例如，藉由轉錄)；(2)加工RNA轉錄物(例如，藉由剪接、編輯、5'帽形成及/或3'端加工)；(3)將RNA轉譯成多肽或蛋白質；及(4)多肽或蛋白質之轉譯後修飾。
特徵 ： 如本文所用，「特徵」係指特點、特性或獨特要素。
調配物 ：如本文所用，「調配物」包括至少一種AAV粒子及遞送劑或賦形劑。
片段 ：如本文所用，「片段」係指一個部分。舉例而言，蛋白質之片段可包括藉由使自經培養細胞分離之全長蛋白質消化而獲得的多肽。
功能性 ：如本文所用，「功能性」生物分子為呈現出某種特性及/或活性的生物分子形式，其以該特性及/或活性為特點。
基因表現 ： 術語「基因表現」係指核酸序列進行成功轉錄且在大部分情況下進行成功轉譯以產生蛋白質或肽的過程。為了清楚起見，在提及量測「基因表現」時，此應該理解為意謂量測可針對核酸轉錄產物，例如對RNA或mRNA，或針對胺基酸轉譯產物，例如多肽或肽。量測RNA、mRNA、多肽及肽之量或含量之方法在此項技術中熟知。
同源性 ：如本文所用，術語「同源性」係指聚合分子之間，例如聚核苷酸分子(例如DNA分子及/或RNA分子)之間及/或多肽分子之間的總體相關性。在某些實施例中，若聚合分子之序列為至少25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%一致或類似，則將聚合分子視為彼此「同源」。術語「同源」必然係指在至少兩個序列(聚核苷酸或多肽序列)之間的比較。根據本發明，若對於至少約20個胺基酸之至少一個延伸段，兩個聚核苷酸序列編碼之多肽為至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%或甚至99%，則將兩個聚核苷酸序列視為同源。在某些實施例中，同源聚核苷酸序列之特點在於編碼具有至少4-5個特別指定之胺基酸的延伸段的能力。對於長度小於60個核苷酸之聚核苷酸序列，同源性由編碼具有至少4-5個特別指定之胺基酸的延伸部分之能力來確定。根據本發明，若對於至少約20個胺基酸之至少一個延伸部，蛋白質為至少約50%、60%、70%、80%或90%相同，則將兩個蛋白質序列視為同源。
異源區 ：如本文所用，術語「異源區」係指不被視為同源區之區域。
同源區 ： 如本文所用,術語「同源區」係指在位置、結構、進化起源、特點、形式或功能形式類似的區域。
一致性： 如本文所用，術語「一致性」係指聚合分子之間，例如聚核苷酸分子(例如DNA分子及/或RNA分子)之間及/或多肽分子之間的總體相關性。舉例而言，兩個聚核苷酸序列之一致性百分比的計算可藉由出於最佳比較目的而比對兩個序列來進行(例如，可將間隙引入第一及第二核酸序列中之一者或兩者中以便最佳比對且出於比較目的可忽略非一致序列)。在某些實施例中，出於比較目的比對之序列的長度為參考序列之長度的至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或100%。隨後比較在對應核苷酸位置處之核苷酸。當第一序列中之位置被與第二序列中之對應位置相同的核苷酸佔據時，則分子在該位置處一致。在考慮到為求兩個序列之最佳比對而需要引入之間隙數目及各間隙長度的情況下，該兩個序列之間的一致性百分比與該等序列共有的一致位置之數目有關。可使用數學演算法實現序列比較及兩個序列之間的一致性百分比的測定。舉例而言，兩個核苷酸序列之間的一致性百分比可使用一些方法來確定，諸如以下各者中所描述之方法：Computational Molecular Biology, Lesk, A. M.編, Oxford University Press, New York, 1988；Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W.編, Academic Press, New York, 1993；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987；Computer Analysis of Sequence Data, 第I部分, Griffin, A. M.及Griffin, H. G.編, Humana Press, New Jersey, 1994；及Sequence Analysis Primer, Gribskov, M.及Devereux, J.編, M Stockton Press, New York, 1991，該等文獻中之每一者均以全文引用之方式併入本文中。舉例而言，兩個核苷酸序列之間的一致性百分比可使用Meyers及Miller (CABIOS, 1989, 4:11-17)之演算法來確定，該演算法已併入使用PAM120權重殘基表、空隙長度罰分12及空隙罰分4之ALIGN程式(2.0版)中。替代地，兩個核苷酸序列之間的一致性百分比可使用GCG套裝軟體中之GAP程式，使用NWSgapdna. CMP矩陣來確定。常用以確定序列之間的一致性百分比的方法包括但不限於Carillo, H.及Lipman, D., SIAM J Applied Math., 48:1073 (1988)中所揭示之方法，該文獻以引用之方式併入本文中。用於測定一致性之技術編碼於公開可獲得之電腦程式中。確定兩個序列之間同源性的例示性電腦軟體包括但不限於GCG套裝程式(Devereux, J.等人,Nucleic Acids Research , 12(1), 387 (1984))、BLASTP、BLASTN及FASTA (Altschul, S. F.等人,J. Molec. Biol. , 215, 403 (1990))。
抑制基因表現 ： 如本文所用，片語「抑制基因表現」意謂引起基因表現產物之量減少。表現產物可為自基因轉錄之RNA (例如mRNA)或自mRNA轉譯之多肽，該mRNA自基因轉錄。通常，mRNA含量之減少引起自其轉譯之多肽的含量減少。表現量可使用用於量測mRNA或蛋白質之標準技術來確定。
活體外 ：如本文所用，術語「活體外」係指發生在人工環境中(例如試管或反應容器中、細胞培養物中、皮氏(Petri)培養皿中等)而非發生在生物體(例如動物、植物或微生物)內的事件。
活體內 ：如本文所用，術語「活體內」係指發生在生物體(例如動物、植物、或微生物、或其細胞或組織)內之事件。
經分離 ：如本文所用，術語「經分離」係指物質或實體已與至少一些與其締合(無論是在自然界中抑或在實驗環境中)的組分分離。經分離之物質關於其所締合之物質之純度水準可不同。經分離之物質及/或實體可與其最初締合之其他組分的至少約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%或更多分離。在某些實施例中，經分離之藥劑之純度超過約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或超過約99%。如本文所用，若物質實質上不含其他組分，則該物質為「純的」。
實質上經分離 ：「實質上經分離」意謂物質自形成或偵測該物質之環境實質上分離。部分分離可包括例如富含本發明之物質或AAV粒子的組合物。實質性分離可包括含有至少約50重量%、至少約60重量%、至少約70重量%、至少約80重量%、至少約90重量%、至少約95重量%、至少約97重量%或至少約99重量%之本發明之化合物或其鹽之組合物。用於分離化合物及其鹽之方法為此項技術中之工藝路線。
連接子 ：如本文所用，「連接子」係指連接兩個分子之分子或分子之基團。連接子可為連接編碼兩種不同多肽的兩個核酸序列之核酸序列。連接子可經轉譯或可未經轉譯。連接子可為可裂解連接子。
微 RNA (miRNA) 結合位點 ：如本文所用，微RNA (miRNA)結合位點表示核酸轉錄物中至少由miRNA之「種子」區域結合之核苷酸位置或區域。
經修飾 ：如本文所用，術語「經修飾」係指改變本發明之分子之狀態或結構。可以多種方式修飾分子，包括在化學上、結構上及功能上修飾分子。如本文所用，當本發明之實施例具有或擁有與起始點、野生型或原生分子不同的特徵或特性(結構上或化學上)時，該等實施例「經修飾」。
突變 ：如本文所用，術語「突變」係指基因結構之任何變化，該變化產生可傳遞至後代之變異(亦稱為「突變」)形式。基因突變可由DNA中之單鹼基之交替、或基因或染色體之較大鏈段之缺失、插入或重排引起。
天然存在 ：如本文所用，「天然存在」或「野生型」意謂存在於自然界中而沒有人工輔助或人的手的參與。
神經退化 ： 如本文所用，術語「神經退化」係指引起神經細胞死亡之病理狀態。大量神經病症共有呈常見病理狀態形式之神經退化。舉例而言，阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)、帕金森氏病、亨丁頓舞蹈症及肌萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)均會引起慢性神經退化，其特徵為經若干年之時段緩慢的進行性神經細胞死亡，而急性神經退化之特徵在於由諸如中風之局部缺血或諸如創傷性腦損傷之外傷引起，或由例如脊髓損傷或多發性硬化症引起之脫髓鞘或外傷所造成之軸突橫斷引起的神經細胞死亡之突然發作。在一些神經病症中，主要地神經元細胞之一種類型為退化性的，例如早期HD中之中棘神經元退化。
非人類脊椎動物 ：如本文所用，「非人類脊椎動物」包括除了智人(Homo sapiens )之外的所有脊椎動物，包括野生及家養物種。非人類脊椎動物之實例包括但不限於哺乳動物，諸如羊駝、爪哇牛、野牛、駱駝、貓、家牛、鹿、犬、驢、大額牛、山羊、天竺鼠、馬、駱馬、騾、豬、兔、馴鹿、綿羊、水牛及犛牛。
核酸 ：如本文所用，術語「核酸」、「聚核苷酸」及「寡核苷酸」係指由以下構成之任何核酸聚合物：聚脫氧核糖核苷酸(含有2-脫氧-D-核糖)、或聚核糖核苷酸(含有D-核糖)，或任何其他類型之聚核苷酸(其為嘌呤或嘧啶鹼基或經修飾嘌呤或嘧啶鹼基之N醣苷)。在術語「核酸」、「聚核苷酸」及「寡核苷酸」之間不存在預期長度區別，且此等術語將可互換使用。此等術語僅指分子之一級結構。因此，此等術語包括雙股及單股DNA，以及雙股及單股RNA。
脫靶 ：如本文所用，「脫靶」係指對任何一或多個目標、基因或細胞轉錄物之任何非預期作用。
開放閱讀框架 ： 如本文所用，「開放閱讀框架」或「ORF」係指除了閱讀框架之末端以外，在既定閱讀框架內不含終止密碼子之序列。
可操作地連接 ：如本文所用，片語「可操作地連接」係指在兩個或超過兩個分子、構築體、轉錄物、實體、部分或其類似物之間的功能性連接。
患者 ：如本文所用，「患者」係指可能尋求或需要治療、要求治療、正在接受治療、即將接受治療之個體，或受到經過訓練的專業人員針對特定疾病或病況之照護之個體。
酬載 ：如本文所用，「酬載」或「酬載區」係指一或多個由病毒基因體編碼或在病毒基因體內編碼之聚核苷酸或聚核苷酸區或此類聚核苷酸或聚核苷酸區之表現產物，例如轉殖基因、編碼多肽或多元多肽之聚核苷酸或調節核酸或調控核酸。
酬載構築體 ：如本文所用，「酬載構築體」為包括聚核苷酸區之一或多個載體構築體，該聚核苷酸區編碼或包含在一側或兩側上側接有反向末端重複(ITR)序列的酬載。酬載構築體呈遞在病毒產生細胞中複製之模板，以產生治療性病毒基因體。
酬載構築體載體 ：如本文所用，「酬載構築體載體」為編碼或包含酬載構築體，及用於在細菌細胞中複製及表現酬載構築體之調控區的載體。
酬載構築體表現載體 ：如本文所用，「酬載構築體表現載體」為編碼或包含酬載構築體的載體，且其進一步包含一或多個編碼或包含用於在病毒複製細胞中進行病毒表現之組分的聚核苷酸區。
肽 ：如本文所用，「肽」之長度小於或等於50個胺基酸，例如長度為約5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個胺基酸。
醫藥學上可接受 ：片語「醫藥學上可接受」在本文中用於指在合理醫學判斷範疇內的彼等化合物、物質、組合物及/或劑型適用於與人類及動物之組織接觸而無過度毒性、刺激、過敏反應或其他問題或併發症，與合理益處/風險比相匹配。
醫藥學上可接受之賦形劑 ：如本文所用，片語「醫藥學上可接受之賦形劑」係指除本文所述之化合物以外的任何成分(例如，能夠懸浮或溶解活性化合物之媒劑)，且其特性為在患者中實質上無毒且非炎性的。賦形劑可包括例如：抗黏劑、抗氧化劑、黏合劑、包衣、壓縮助劑、崩解劑、染料(顏料)、潤膚劑、乳化劑、填充劑(稀釋劑)、成膜劑或包衣、調味劑、芳香劑、助滑劑(流動增強劑)、潤滑劑、防腐劑、印刷油墨、吸附劑、懸浮劑或分散劑、甜味劑及水合用水。例示性賦形劑包括但不限於：丁基化羥基甲苯(BHT)、碳酸鈣、磷酸鈣(磷酸氫二鈣)、硬脂酸鈣、交聯羧甲纖維素、交聯聚乙烯吡咯啶酮、檸檬酸、交聯普維酮、半胱胺酸、乙基纖維素、明膠、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、乳糖、硬脂酸鎂、麥芽糖醇、甘露糖醇、甲硫胺酸、甲基纖維素、對羥基苯甲酸甲酯、微晶纖維素、聚乙二醇、聚乙烯吡咯啶酮、普維酮、預膠凝化澱粉、對羥基苯甲酸丙酯、棕櫚酸視黃酯、蟲膠、二氧化矽、羧甲基纖維素鈉、檸檬酸鈉、羥基乙酸澱粉鈉、山梨糖醇、澱粉(玉米)、硬脂酸、蔗糖、滑石、二氧化鈦、維生素A、維生素E、維生素C及木糖醇。
醫藥學上可接受之鹽 ：本發明亦包括本文所描述之化合物的醫藥學上可接受之鹽。如本文所用，「醫藥學上可接受之鹽」指代所揭示之化合物之衍生物，其中母體化合物藉由將現有酸或鹼部分轉化為其鹽形式(例如藉由使游離鹼基團與適合有機酸反應)來修飾。醫藥學上可接受之鹽的實例包括但不限於鹼性殘基(諸如胺)之無機或有機酸鹽；酸性殘基(諸如羧酸)之鹼鹽或有機鹽；及其類似鹽。代表性酸加成鹽包括乙酸鹽、乙酸、己二酸鹽、海藻酸鹽、抗壞血酸鹽、天冬胺酸鹽、苯磺酸鹽、苯磺酸、苯甲酸鹽、硫酸氫鹽、硼酸鹽、丁酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、檸檬酸鹽、環戊烷丙酸鹽、二葡糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙磺酸鹽、反丁烯二酸鹽、葡庚糖酸鹽、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、氫溴酸鹽、鹽酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基-乙磺酸鹽、乳糖酸鹽、乳酸鹽、月桂酸鹽、月桂基硫酸鹽、蘋果酸鹽、順丁烯二酸鹽、丙二酸鹽、甲磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、菸鹼酸鹽、硝酸鹽、油酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、雙羥萘酸鹽、果膠酸鹽、過硫酸鹽、3-苯基丙酸鹽、磷酸鹽、苦味酸鹽、特戊酸鹽、丙酸鹽、硬脂酸鹽、丁二酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、甲苯磺酸鹽、十一烷酸鹽、戊酸鹽及其類似物。代表性鹼或鹼土金屬鹽包括鈉、鋰、鉀、鈣、鎂及其類似物，以及無毒性銨、四級銨及胺陽離子，包括但不限於銨、四甲銨、四乙銨、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺及其類似物。本發明之醫藥學上可接受之鹽包括例如由無毒無機酸或有機酸形成之母體化合物的習知無毒鹽。本發明之醫藥學上可接受之鹽可藉由習知化學方法由含有鹼性或酸性部分之母體化合物合成。一般而言，可藉由使此等化合物之游離酸或鹼形式與化學計算量之適當鹼或酸於水中或有機溶劑中，或兩者之混合物中反應來製備此類鹽；一般而言，可使用非水性介質，如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、異丙醇或乙腈。適合之鹽的清單見於Remington ' s Pharmaceutical Sciences , 第17版, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985, 第1418頁；Pharmaceutical Salts: Properties , Selection, and Use , P.H. Stahl及C.G. Wermuth (編), Wiley-VCH, 2008，及Berge等人,Journal of Pharmaceutical Science , 66, 1-19 (1977)中；該等文獻中之每一者均以全文引用之方式併入本文中。
醫藥學上可接受之溶劑合物 ：如本文所用，術語「醫藥學上可接受之溶劑合物」意謂本發明化合物，其中適合之溶劑的分子併入晶格中。適合的溶劑在所投與之劑量下為生理學上可耐受的。舉例而言，溶劑合物可自包括有機溶劑、水或其混合物之溶液藉由結晶、再結晶或沈澱製備。適合的溶劑之實例為乙醇、水(例如單水合物、二水合物及三水合物)、N-甲基吡咯啶酮(NMP)、二甲亞碸(DMSO)、N ,N ' -二甲基甲醯胺(DMF)、N ,N ' -二甲基乙醯胺(DMAC)、1,3-二甲基-2-咪唑啶酮(DMEU)、1,3-二甲基-3,4,5,6-四氫-2-(1H)嘧啶酮(DMPU)、乙腈(ACN)、丙二醇、乙酸乙酯、苯甲醇、2-吡咯啶酮、苯甲酸苯甲酯及其類似物。當水為溶劑時，溶劑合物稱為「水合物」。
藥物動力學 ：如本文所用，「藥物動力學」係指分子或化合物在涉及確定向活生物體投與之物質的結局時的任何一或多種特性。藥物動力學分成若干領域，包括吸收、分佈、代謝及排泄之程度及速率。此通常稱為ADME，其中：(A)吸收為物質進入血液循環之過程；(D)分佈為物質在整個體液及身體組織中之分散或擴散；(M)代謝(或生物轉化)為母體化合物變成子體代謝物之不可逆轉化；及(E)排泄(或消除)係指自身體消除物質。在罕見情況下，一些藥物在身體組織中不可逆地聚積。
物理化學 ：如本文所用，「物理化學」意謂具有或涉及物理及/或化學特性。
預防 (preventing) ：如本文所用，術語「預防(preventing)」或「預防(prevention)」係指部分或完全地延遲感染、疾病、病症及/或病況之發作；部分或完全地延遲特定感染、疾病、病症及/或病況之一或多種症狀、特徵或臨床表現的發作；部分或完全地延遲特定感染、疾病、病症及/或病況之一或多種症狀、特徵或表現的發作；部分或完全地延遲感染、特定疾病、病症及/或病況之進展；及/或降低罹患與感染、疾病、病症及/或病況相關之病變的風險。
增 殖 ：如本文所用，術語「增殖」意謂生長、擴增或增加或引起快速生長、擴增或增加。「增殖性」意謂具有增殖能力。「抗增殖性」意謂具有與增殖特性相對或相反之特性。
防治 (prophylactic) ：如本文所用，「防治」係指用於預防疾病擴散之治療或作用時程。
防治 (prophylaxis) ：如本文所用，「防治」係指為維持健康並預防疾病擴散而採用之措施。
所關注蛋白質 ：如本文所用，術語「所關注蛋白質」或「所需蛋白質」包括本文所提供之蛋白質及其片段、突變體、變異體及改變形式。
近端 ：如本文所用，術語「近端」意謂位於較靠近中心或所關注之點或區域處。
經純化 ：如本文所用，「純化(purify)」、「經純化(purified)」、「純化(purification)」意謂自不合需要之組分、材料污物、混雜物或缺陷品變得實質上純的或乾淨的。「經純化」係指純的狀態。「純化(purification)」係指變純的過程。
區域 (region) ：如本文所用，術語「區域」係指區段或一般區。在某些實施例中，當提及蛋白質或蛋白質模組時，區域可包括沿蛋白質或蛋白質模組之線性胺基酸序列，或可包括三維區、抗原決定基及/或抗原決定基集群。在某些實施例中，區域包括末端區域。如本文所用，術語「末端區域」係指位於既定藥劑之端部或末端處之區域。當提及蛋白質時，末端區域可包括N端及/或C端。N端係指包含具有游離胺基之胺基酸之蛋白質末端。C端係指包含具有游離羧基之胺基酸的蛋白質末端。N端及/或C端區域可因此包括N端及/或C端以及周圍胺基酸。在某些實施例中，N端及/或C端區域包括約3個胺基酸至約30個胺基酸、約5個胺基酸至約40個胺基酸、約10個胺基酸至約50個胺基酸、約20個胺基酸至約100個胺基酸及/或至少100個胺基酸。在某些實施例中，N端區域可包括任何長度之胺基酸，其包括N端但不包括C端。在某些實施例中，C端區域可包括任何長度之胺基酸，其包括C端但不包括N端。
在某些實施例中，當提及聚核苷酸時，區域可包括沿聚核苷酸之線性核酸序列，或可包括三維區域、二級結構或三級結構。在某些實施例中，區域包括末端區域。如本文所用，術語「末端區域」係指位於既定藥劑之端部或末端處之區域。當提及聚核苷酸時，末端區域可包括5'端及3'端。5'端係指包含具有游離磷酸酯基團之核酸的聚核苷酸末端。3'端係指包含具有游離羥基之核酸的聚核苷酸端部。5'及3'區域可因此包括5'端及3'端以及周圍核酸。在某些實施例中，5'端及3'端區域包括約9個核酸至約90個核酸、約15個核酸至約120個核酸、約30個核酸至約150個核酸、約60個核酸至約300個核酸及/或至少300個核酸。在某些實施例中，5'區域可包括任何長度之核酸，其包括5'端但不包括3'端。在某些實施例中，3'區域可包括任何長度之核酸，其包括3'端但不包括5'端。
RNA 或 RNA 分子 ：如本文所用，術語「RNA」或「RNA分子」或「核糖核酸分子」係指核糖核苷酸之聚合物；術語「DNA」或「DNA分子」或「去氧核糖核酸分子」係指去氧核糖核苷酸之聚合物。DNA及RNA可分別例如藉由DNA複製及DNA轉錄天然合成；或化學合成。DNA及RNA可為單股(亦即分別為ssRNA或ssDNA)或多股(例如雙股，亦即分別為dsRNA及dsDNA)。如本文所用，術語「mRNA」或「信使RNA」指代編碼一或多種多肽股之胺基酸序列之單股RNA。
RNA 干擾或 RNAi ：如本文所用，術語「RNA干擾」或「RNAi」係指由RNA分子介導的引起對應蛋白質編碼基因之表現受到抑制或干擾或「靜默」的序列特異性調控機制。已在許多類型之生物體中觀測到RNAi，該等生物體包括植物、動物及真菌。RNAi出現在天然移除外源RNA (例如病毒RNA)之細胞中。天然RNAi經由自游離dsRNA裂解之片段前進，其將降解機制引導至其他類似RNA序列。RNAi受RNA誘導靜默複合物(RNA-induced silencing complex；RISC)控制且由細胞質中之短/小dsRNA分子起始，其中其與催化RISC組分阿爾戈(argonaute)相互作用。可將dsRNA分子外源地引入細胞中。外源性dsRNA藉由活化核糖核酸酶蛋白Dicer起始RNAi，該Dicer結合且裂解dsRNA以產生具有21-25個鹼基對之雙股片段，其中各端上具有若干未配對突出鹼基。此等短雙股片段被稱為小干擾RNA (siRNA)。
樣品 ：如本文所用，術語「樣品」或「生物樣品」係指其組織、細胞或組成部分之子組(例如，體液，包括但不限於血液、黏液、淋巴液、滑液、腦脊髓液、唾液、羊水、羊膜臍帶血、尿液、陰道液及精液)。樣品進一步可包括由完整生物體或其組織、細胞或組分部分之子組或其級分或部分製備的勻漿、溶胞物或提取物，包括但不限於例如血漿；血清；脊髓液；淋巴液；皮膚、呼吸道、腸道及生殖泌尿道之外部切片；淚液；唾液；乳汁；血球；腫瘤；器官。樣品亦指培養基，諸如營養培養液或凝膠，其可含有細胞組分，諸如蛋白質或核酸分子。
自補病毒粒子 ：如本文所用，「自補病毒粒子」為包括至少兩種組分，即蛋白質衣殼及封入衣殼內之編碼自補基因體之聚核苷酸序列的粒子。
有義股 ：如本文所用之術語siRNA分子之「有義股」或「第二股」或「隨從股」係指與反義股或第一股互補之股。siRNA分子之反義股及有義股經混雜以形成雙螺旋結構。如本文所用，「siRNA雙螺旋」包括與所靶向以用於靜默之基因的mRNA之約10-50個核苷酸之鏈段具有足夠互補性的siRNA股及具有足夠互補性以與另一siRNA股形成雙螺旋的siRNA股。
短干擾 RNA 或 siRNA ：如本文所用，術語「短干擾RNA」、「小干擾RNA」或「siRNA」係指包含在約5-60個之間的能夠引導或介導RNAi之核苷酸(或核苷酸類似物)的RNA分子(或RNA類似物)。在某些實施例中，siRNA分子包括約15-30個之間的核苷酸或核苷酸類似物，諸如約16-25個之間的核苷酸(或核苷酸類似物)、約18-23個之間的核苷酸(或核苷酸類似物)、約19-22個之間的核苷酸(或核苷酸類似物) (例如19、20、21或22個之間的核苷酸或核苷酸類似物)、約19-25個之間的核苷酸(或核苷酸類似物)，及約19-24個之間的核苷酸(或核苷酸類似物)。術語「短」siRNA係指包含5-23個核苷酸，諸如21個核苷酸(或核苷酸類似物)，例如19、20、21或22個核苷酸之siRNA。術語「長」siRNA係指包含24至60個核苷酸，諸如約24-25個核苷酸，例如23、24、25或26個核苷酸之siRNA。短siRNA在一些情況下可包括少於19個核苷酸，例如16、17或18個核苷酸、或少至5個核苷酸，其限制條件為較短的siRNA保留介導RNAi之能力。同樣地，長siRNA在一些實例中可包括超過26個核苷酸，例如27、28、29、30、35、40、45、50、55或甚至60個核苷酸，其限制條件為較長siRNA保留介導RNAi或轉譯阻遏而不需進一步處理，例如酶處理為短siRNA之能力。siRNA可為單股RNA分子(ss-siRNA)或包含有義股及反義股之雙股RNA分子(ds-siRNA)，有義股與反義股雜交形成雙螺旋結構，該雙螺旋結構被稱為siRNA雙螺旋。
信號序列 ：如本文所用，片語「信號序列」係指可引導蛋白質之轉運或定位的序列。
單個單位劑量 ：如本文所用，「單個單位劑量」係以一個劑量/一次性/單個途徑/單個接觸點(亦即單個投與事件)投與的任何治療劑之劑量。在某些實施例中，單個單位劑量以離散劑型(例如錠劑、膠囊、貼片、裝藥注射器、小瓶等)提供。
類似性 ：如本文所用，術語「類似性」係指聚合性分子之間，例如聚核苷酸分子(例如DNA分子及/或RNA分子)之間及/或多肽分子之間的整體相關性。聚合分子彼此之類似性百分比的計算可按與一致性百分比之計算相同的方式進行，不同之處在於計算類似性百分比時要考慮如此項技術中所理解之保守性取代。
分次劑量 ：如本文所用，「分次劑量」為將單個單位劑量或總日劑量分成兩個或更多個劑量。
穩定的 ： 如本文所用，「穩定的」係指化合物足夠穩固以經受住自反應混合物中分離得到適用純度，且在某些實施例中能夠調配成有效治療劑。
經穩定 ：如本文所用，術語「使……穩定」、「經穩定」、「經穩定區域」意謂使之穩定或變得穩定。
個體 ：如本文所用，術語「個體」或「患者」係指可例如出於實驗、診斷、預防及/或治療目的向其投與根據本發明之組合物的任何生物體。典型個體包括動物(例如哺乳動物，諸如小鼠、大鼠、兔、非人類靈長類及人類)及/或植物。
實質上 ：如本文所用，術語「實質上」係指呈現出所關注特點或特性之總的或近總的程度或等級之定性狀況。生物技術中之一般技術者應理解生物及化學現象很少(若曾經)進行完全及/或繼續進行至完全或達成或避免絕對結果。因而本文中使用術語「實質上」以獲得許多生物及化學現象中所固有的完整性之潛在缺乏。
實質上相等 ：如本文所用，在其與各劑量之間的時間差異相關時，該術語意謂加/減2%。
實質上同時 ：如本文所用且在在其與複數個劑量相關時，該術語意謂在2秒之內。
罹患 ：「罹患」疾病、病症及/或病況之個體已診斷患有該疾病、病症及/或病況或呈現其一或多種症狀。
易患 ：「易患」疾病、病症及/或病況之個體尚未診斷患有該疾病、病症及/或病況及/或可能未展現其症狀，但具有罹患疾病或其症狀之傾向。在某些實施例中，易患疾病、病症及/或病況(例如癌症)之個體可由以下中之一或多者表徵：(1)與疾病、病症及/或病況產生相關之基因突變；(2)與疾病、病症及/或病況產生相關之基因多形性；(3)與疾病、病症及/或病況相關之蛋白質及/或核酸的表現及/或活性增加及/或減少；(4)與疾病、病症及/或病況產生相關之習慣及/或生活方式；(5)疾病、病症及/或病況之家族病史；及(6)暴露於與疾病、病症及/或病況產生相關之微生物及/或經該微生物感染。在某些實施例中，易患疾病、病症及/或病況之個體將罹患該疾病、病症及/或病況。在某些實施例中，易患疾病、病症及/或病況之個體將不罹患該疾病、病症及/或病況。
持續釋放 ：如本文所用，術語「持續釋放」係指醫藥組合物或化合物在特定時段內的釋放曲線符合一定釋放速率。
合成 ：術語「合成」意謂藉由人的手產生、製備及/或製造。本發明之聚核苷酸或多肽或其他分子的合成可為化學合成或酶合成。
靶向 ：如本文所用，「靶向」意謂設計及選擇將與靶核酸雜交且誘導所需作用之核酸序列的過程。
所靶向細胞 ：如本文所用，「所靶向細胞」係指任何一或多種相關細胞。細胞可見於活體外、活體內、原位或生物體之組織或器官中。生物體可為動物，諸如哺乳動物、人類或人類患者。
末端區域 ： 如本文所用，術語「末端區域」係指連接之核苷或胺基酸區域(分別為聚核苷酸或多肽)之5'或3'端上之區域。
末端最佳化 ：當提及核酸時，術語「末端最佳化」意謂核酸之末端區域相比於原生或野生型末端區域以一些方式改良，例如經密碼子最佳化。
治療劑 ：術語「治療劑」係指當向個體投與時，具有治療、診斷及/或預防作用及/或引起所需生物學及/或藥理學作用之任何藥劑。
治療有效量 ： 如本文所用，術語「治療有效量」意謂當向罹患或易患感染、疾病、病症及/或病況之個體投與時，足以治療該感染、疾病、病症及/或病況，改善其症狀、診斷其、預防其及/或延緩其發作的遞送之藥劑(例如核酸、藥物、治療劑、診斷劑、預防劑等)的量。在某些實施例中，治療有效量將以單個劑量提供。在某些實施例中，治療有效量以包含複數個劑量之給藥方案投與。熟習此項技術者應瞭解，在某些實施例中，若單位劑型包括當作為此類給藥方案之部分投與時有效的量，則可將其視為包括治療有效量之特定藥劑或實體。
治療有效結果 ：如本文所用，術語「治療有效結果」意謂在罹患或易患感染、疾病、病症及/或病況之個體中足以治療該感染、疾病、病症及/或病況、改善其症狀、對其進行診斷、預防及/或延遲其發作的結果。
總日劑量 ：如本文所用，「總日劑量」為在24小時時段內給予或以處方開具之量。其可以單個單位劑量形式進行投與。
轉染 ：如本文所用，術語「轉染」係指將外源性核酸引入細胞中之方法。轉染方法包括但不限於化學方法、物理治療及陽離子型脂質或混合物。可轉染至細胞中之藥劑清單較長且包括但不限於siRNA、有義及/或反義序列、編碼一或多種基因及組織成表現質體之DNA、蛋白質、蛋白質片段及更多。
治療 ：如本文所用之術語「治療」係指部分或完全地緩解、改善、改良、減輕特定感染、疾病、病症及/或病況，延遲其發作、抑制其進展、減小其嚴重程度及/或降低其一或多種症狀或特徵的發生率。舉例而言，「治療」癌症可指抑制腫瘤之存活、生長及/或擴散。出於降低罹患與某種疾病、病症及/或病況相關之病變的風險的目的，可向未呈現出該疾病、病症及/或病況之病徵的個體及/或向僅呈現出該疾病、病症及/或病況之早期病徵的個體投與治療。
未經修飾 ：如本文所用，「未經修飾」係指任何尚未以任何方式改變前的物質、化合物或分子。未經修飾可以指，但並不始終指生物分子之野生型或原生形式。分子可以進行一系列修飾，由此，各經修飾分子可以充當後一修飾之「未經修飾」的起始分子。
載體 ：如本文所用，「載體」為轉運、轉導或以其他方式充當異源分子運載體的任何分子或部分。本發明之載體可以重組方式產生且可基於及/或可包括腺相關病毒(AAV)親本或參考序列。此類親本或參考AAV序列可充當用於對載體進行工程改造之原始、第二、第三或後續序列。在非限制性實例中，此類親本或參考AAV序列可包括以下序列中之任何一或多者：編碼多肽或多元多肽之聚核苷酸序列，該序列可為野生型或自野生型修飾，且該序列可編碼蛋白質、蛋白質域或蛋白質之一或多個次單位的全長或部分序列；包含調節或調控核酸之聚核苷酸，該序列可為野生型或自野生型修飾；及可自或可未自野生型序列修飾之轉殖基因。此等AAV序列可充當一或多個密碼子(在核酸層面)或胺基酸(在多肽層面)之「供體」序列或一或多個密碼子(在核酸層面)或胺基酸(在多肽層面)之「受體」序列。
病毒基因體：如本文所用，「病毒基因體」或「載體基因體」或「病毒載體」係指囊封於AAV粒子中之核酸序列。病毒基因體包含至少一個編碼多肽或其片段的酬載區。 實例  實例1.劑量最佳化研究Ii. 研究設計
此研究之主要目標為評估遞送參數，以使包含ITR至ITR序列VOYHT1 (下文稱為AAV1-VOYHT1或VY-HTT01；VOYHT1之SEQ ID NO: 1352)的AAV1封裝之AAV1-miRNA表現載體在恆河猴之紋狀體、皮質及丘腦內之分佈最佳化，以及提供建立未來給藥參數及外插至臨床給藥範式之基礎。次要目標為進行遞送參數之有限安全性及耐受性評定。
由於恆河獼猴(普通獼猴)作為藥理學及毒理學研究之模型，尤其當使用基因療法遞送至中樞神經系統(CNS)時而確立的有用性及接受性，選擇該獼猴作為測試系統。相對於其他非人類靈長類動物(NHP)，恆河猴基因體圖譜之較完全理解對於RNA干擾產物之評定尤其相關。當選擇此物質以解決研究目標時，考慮較大大腦體積及解剖結構亦為重要因素。
此研究涉及篩選34隻動物，獲得18隻用於給藥及2隻替代。如表40中所概述，將18隻動物分配至6隻處理組。選擇雙側腦實質內輸注至殼核及丘腦中，以經由軸突傳輸使大腦分佈最大化至皮質區。此外，殼核及丘腦為較佳輸注部位，因為早期HD人類患者中之殼核及丘腦比恆河猴大4-5倍，且尾核之嚴重萎縮將妨礙直接輸注至尾核中。 表40.研究設計
組 描述 動物數量 體積 ( 微升 / 側 ) 給藥效價 (vg/ml) 總劑量 (vg)
殼核 丘腦
組A1 小體積；高濃度 3 50 75 2.7e12 6.8e11
組A2 中等體積；高濃度 3 100 150 2.7e12 1.4e12
組A3 大體積；高濃度 3 150 250 2.7e12 2.2e12
組A4 中等體積；中等濃度 3 100 150 9.0e11 4.5e11
組A5 中等體積；低濃度 3 100 150 2.7e11 1.4e11
組A6 媒劑對照物 3 左：100 右：150 左：150 右：250 N/A N/A
表40中對應於各組的所計算之人類等效劑量展現於表41中。 表41.人類等效劑量
組 描述 人類等效劑量
殼核 ( 微升 / 側 ) 丘腦 ( 微升 / 側 ) 總劑量 (vg)
組A1 小體積；高濃度 175 450 3.4e12
組A2 中等體積；高濃度 350 900 6.8e12
組A3 大體積；高濃度 525 1500 1.1e13
組A4 中等體積；中等濃度 350 900 2.3e12
組A5 中等體積；低濃度 350 900 6.8e11
組A6 媒劑對照物 左：350 右：525 左：900 右：1500 N/A
各動物使用磁共振成像(MRI)引導之對流增強遞送(CED)來接受雙側顱內輸注含有AAV1-VOYHT1之測試物品或媒劑對照物至殼核及丘腦中。給藥後5週(第36天±3天)使動物安樂死，且收集組織用於事後分析。ii. 動物護理及樣品收集
選擇三十四(N=34)隻健康成年雄性或雌性恆河獼猴(4-10歲)用於預先篩選。動物稱重4-10 kg。動物在自疾病控制與預防中心(CDC)檢疫過關之後適應最少2週。動物具有用於抗AAV1中和抗體(nAb)效價之篩選而收集的項目前期血液樣品。如表40中所指示，選擇具有抗AAV1 NAb血清效價≤1:16之十八(N=18)隻動物，稱量，且隨機分組至研究組中以供給藥。選擇額外2隻動物作為替代研究動物。動物維持在哈蘭公司(Harlan) 20%靈長類飼料上面，同時任意獲取水。通常分析水樣品之指定微生物及環境污染物。將動物房間之環境對照設定為維持70±6℉、最少10次空氣變化/小時及12小時亮/12小時暗循環。每天兩次進行籠側監測，且每天一次進行食物消耗量評定。每週一次量測體重。在整個研究中，將動物圈養於單獨籠中。
在給藥前(亦即在開始給藥第一隻動物接受AAV1-VOYHT1輸注之前7天)、第15±2天及緊接著在第36±3天屍檢前，收集血液樣品用於臨床病理學評估及中和抗體(nAb)分析。臨床病理學評估包括血液學(CBC)、血清臨床化學(Chem)及凝血(Coag)分析。在給藥前(第1天)及緊接著在第36±3天屍檢前，自宮頸區收集腦脊髓液(CSF)樣品以用於nAb分析。屍檢後，收集腦、脊髓、背根神經節及主要器官，且隨後進行新鮮冷凍或藉由浸沒經4%多聚甲醛(PFA)進行事後固定。iii. 測試物品製備及給藥程序
該研究中所用之測試物品含有調配於含有192 mM氯化鈉、10 mM磷酸鈉、2 mM磷酸鉀、2.7 mM氯化鉀及0.001%泊洛沙姆188 (Pluronic® F-68)之水溶液中的AAV1-VOYHT1基因轉移載體(2.7e12 vg/mL)。媒劑對照物僅含有調配物緩衝液。樣品儲存在-60℃或以下且在給藥當天解凍至2-8℃並維持在此溫度下。以1:250之比率添加ProHance® (Bracco Diagnostics, Inc)，亦即釓特醇(每250 µL測試物品或對照物1 µL ProHance)，且藉由倒置管謹慎地混合，隨後裝載至輸注系統中。給藥溶液含有測試物品或對照物以及2 mM濃度之釓特醇。給藥溶液之稀釋概述於表42中。「N/A」指示資料不適用。 表42.給藥溶液之稀釋
組 最終載體濃度 (vg/mL) 載體儲備液 (µL) 稀釋劑 (µL) ProHance (µL) 最終體積 (µL)
A1，A2，A3 2.7e12 2250 0 9 2259
A4 9.0e11 700 1392 8.4 2100
A5 2.7e11 210 1882 8.4 2100
A6 N/A N/A 15000 60 15060
在手術前立即用肌肉內(IM)氯胺酮(10 mg/kg)及IM迪美得托咪汀(dexmedetomidine) (15 µg/kg)麻醉各動物，稱量，插管且維持在1-5%異氟烷上。將頭部固定至立體定位框架上且上覆皮膚經製備以用於神經手術植入程序。使用無菌技術，在解剖層中打開傷口部位以暴露頭骨。在位於各側上之前端及/或頂葉上方之進入部位處進行雙側頭剖開術。使用鈦螺釘將頭骨安裝之插管引導滾珠陣列暫時固定至各鑽孔上方之頭骨處。在手術植入插管引導件之後立即將動物轉移至MRI套件。MR成像用於將插管引導件與各插管引導件同側之殼核及丘腦目標對齊。投與測試物品或對照物，用重複MR成像目視監測大腦內之輸注，如上表40中所指定。各動物在各殼核及丘腦中使用對流增強遞送(CED)接受測試物品或對照物之至多2次輸注(部位)。經由頭骨安裝之插管陣列將可調整尖端16G插管(MRI Interventions Inc.)引導至各目標部位中。插管連接至安裝在注射泵(哈佛設備(Harvard Apparatus))上之注射器。使用遞增輸注速率(至多10微升/分鐘)將劑量體積(每半球50-400 µL)沈積至各殼核或丘腦中。獲取連續MRI掃描以監測各目標部位內之輸液分佈且提供給藥之即時監測。在一些情況下，在輸注期間插管更深入進殼核或丘腦中以使殼核或丘腦內之輸液分配最大化。在MRI CED給藥程序之後，立即將動物轉移回至操作室，外植插管引導系統，且在具有可吸收薇喬縫合線(vicryl suture)之解剖層中縫合傷口部位且使用簡單的間斷縫合圖案。手術前及手術後藥品包括丁基原啡因(0.03 mg/kg，IM，b.i.d.)、卡洛芬(carprofen) (2.2 mg/kg SQ，b.i.d.)、酮基布洛芬(ketoprofen) (2 mg/kg，IM，s.i.d)及頭孢唑啉(cefazolin) (100 mg IV，手術前及手術後，繼之以25 mg/kg，IM，b.i.d)或頭孢曲松(ceftriaxone) (50 mg/kg，IM，s.i.d.)。監測動物自麻醉完全恢復且返回至其飼養籠。iv. 跨越不同輸注體積 ，在 來自 NHP 紋狀體、皮質及丘腦之沖取物中之 HTT 減弱及載體基因體 (VG) 量測
此分析經設計以評估不同輸注體積對載體分佈及覆蓋率之影響。使用含有來自組A1 (小體積)、組A2 (中等體積)、組A3 (大體積)及組A6 (對照組)之運動及體覺皮質及前殼核的所選腦板來收集2 mm沖取物。自大腦各側收集六個皮質、8個殼核、2個尾核及5個丘腦沖取物(每隻動物總共42個)，其中自所有四個組收集總數504個沖取物。樣品在QuantiGene®均質化緩衝液中均質化且經歷蛋白酶K消化。在額外DNA純化步驟(Qiagen，目錄#69506)之後，產生經清理之細胞溶胞物，並對其處理用於使用分支鏈DNA (bDNA)分析進行之HTT mRNA量測及使用液滴式數位PCR (ddPCR)進行之載體基因體(VG)量測。bDNA分析係根據QuantiGene® Plex 分析(ThermoFisher Scientific)方案使用特定針對恆河猴HTT之探針集進行。一式兩份分析細胞溶胞物。HTT mRNA含量歸一化至三種恆河猴管家基因，亦即AARS、TBP及XPNPEP1之幾何平均值。將結果校準至媒劑組之歸一化平均值且展現為：相對剩餘HTT mRNA之平均值(%)±標準差(stdev)。對於ddPCR，全細胞DNA係由用於bDNA分析中之相同組織勻漿製備。用探針集(CBA啟動子)偵測之載體基因體之含量歸一化至宿主探針集(核糖核酸酶P)。在分析期間所有樣品均採用盲法。
在殼核中，所有組展示HTT mRNA減弱，其中相對於組A1、組A2及組A3之媒劑分別剩餘63%、48%及39% HTT mRNA (參見圖10A-C)。在每隻動物16個沖取物(每組總共3隻動物)中，組A1、組A2及組A3之52%、79%及92%沖取物的平均值分別達到至少30% HTT mRNA減弱。在歸一化至媒劑對照組之後，對每隻動物求取的來自各AAV1-VOYHT1處理組殼核中之HTT mRNA含量的平均值展現於表43中。 表43.對每隻動物求取的跨越輸注體積之殼核沖取物中HTT mRNA減弱的平均值
組 描述 動物數量 HTT mRNA 相對於媒劑 (%± 標準差 )
組A1 小體積；高濃度 3 63 ± 12
組A2 中等體積；高濃度 3 48 ± 7
組A3 大體積；高濃度 3 39 ± 8
組A6 媒劑對照物 3 100 ± 1
當在自三個組中之每一者取樣的所有殼核沖取物中分析VG複本時，觀測到跨越不同載體輸注體積之差異VG分佈。在組A3中觀測到最高且最穩定的VG分佈圖案，隨後組A2及組A1 (參見圖10A-C)。在左半球及右半球中觀測到此差異性載體分佈模式。VG含量用殼核HTT減弱追蹤，其中組A3具有最高VG呈像及最大HTT mRNA減弱兩者。針對VG含量，對每隻動物求取的來自各組殼核沖取物中偵測到之VG複本數目的平均值展現於表44中。 表44.對每隻動物求取的跨越輸注體積之殼核沖取物中VG複本的平均值
組 描述 樣品尺寸 VG 複本 / 細胞 ( 平均值 ± 標準差 )
組A1 小體積；高濃度 3 327.2 ± 191.2
組A2 中等體積；高濃度 3 527.5 ± 207.0
組A3 大體積；高濃度 3 710.5 ± 163.8
組A6 媒劑對照物 3 0.2 ± 0.2
應用格拉布氏測試(Grubbs' test) (Q=0.1%)移除離群值且重新計算VG複本/細胞。在此事後統計分析之後，針對組A1及組A3，每隻動物殼核沖取物中之VG複本不變，但針對組A2，VG複本/細胞重新計算為489.7±204.0。
在尾核中，組A3展示最大HTT mRNA減弱，其中70% HTT mRNA相對於媒劑剩餘(參見圖11A-C)。組A1及組A2展示相對於媒劑分別剩餘91%及87% HTT mRNA。VG含量與HTT mRNA減弱相關(參見圖11A-C)。在歸一化至媒劑對照組之後，對每隻動物求取的來自各AAV1-VOYHT1處理組尾核中之HTT mRNA含量的平均值展現於表45中。 表45.對每隻動物求取的跨越輸注體積之尾核沖取物中HTT mRNA減弱的平均值
組 描述 動物數量 HTT mRNA 相對於媒劑 (%± 標準差 )
組A1 小體積；高濃度 3 91 ± 2
組A2 中等體積；高濃度 3 87 ± 18
組A3 大體積；高濃度 3 70 ± 23
組A6 媒劑對照物 3 100 ± 1
當在自三個組中之每一者取樣的所有尾核沖取物中分析VG複本時，用HTT mRNA減弱追蹤VG含量(參見圖11A-C)。因此，組A3呈現最高VG呈像及最大HTT mRNA減弱。針對VG含量，對每隻動物求取的來自各組尾核沖取物中偵測到之VG複本數目的平均值展現於表46中。 表46.對每隻動物求取的跨越輸注體積之尾核沖取物中VG複本的平均值
組 描述 樣品尺寸 VG 複本 / 細胞 ( 平均值 ± 標準差 )
組A1 小體積；高濃度 3 1.6 ± 0.3
組A2 中等體積；高濃度 3 4.9 ± 5.4
組A3 大體積；高濃度 3 18.8 ± 24.2
組A6 媒劑對照物 3 00.0 ± 0.1
當應用格拉布氏測試(Q=0.1%)移除離群值時，對於組A1，在尾核沖取物中偵測到之VG複本/細胞之平均數目保持不變，但對於組A2及組A3分別重新定量為1.8±0.5及10.7±10.3。自三個皮質區分析沖取物：運動皮質(mCTX)、體覺皮質(ssCTX)及顳葉皮質(tCTX)。在mCTX中，對於組A3及組A2觀測到顯著HTT減弱，組A3比組A2具有較大減弱，相對於媒劑分別引起86%及91% HTT mRNA剩餘(參見圖12A-C)。在歸一化至媒劑對照組之後，對每隻動物求取的來自各AAV1-VOYHT1處理組mCTX中之HTT mRNA含量的平均值展現於表47中。 表47.對每隻動物求取的跨越輸注體積之mCTX沖取物中HTT mRNA減弱的平均值
組 描述 動物數量 HTT mRNA 相對於媒劑 (%± 標準差 )
組A1 小體積；高濃度 3 95 ± 1
組A2 中等體積；高濃度 3 91 ± 3
組A3 大體積；高濃度 3 86 ± 6
組A6 媒劑對照物 3 100 ± 3
當在自三個組中之每一者取樣的所有mCTX沖取物中分析VG複本時，在所有組中mCTX中之VG含量比殼核中之VG含量低，其中組A3展示最高VG呈像(參見圖12A-C)。在mCTX之左側與右側之間觀察到VG變化。對於VG含量，對每隻動物求取的來自各組之mCTX沖取物中偵測到之VG複本數目的平均值展現於表48中。對於組A6 (媒劑對照物)，VG複本在定量極限(BLQ)以下。 表48.對每隻動物求取的跨越輸注體積之mCTX沖取物中VG複本的平均值
組 描述 樣品尺寸 VG 複本 / 細胞 ( 平均值 ± 標準差 )
組A1 小體積；高濃度 3 1.36 ± 0.8
組A2 中等體積；高濃度 3 1.34 ± 1.03
組A3 大體積；高濃度 3 2.35 ± 0.3
組A6 媒劑對照物 3 BLQ
在ssCTX中，僅在組A3之體覺皮質中看到HTT減弱，其中相對於媒劑剩餘93%之HTT mRNA (參見圖13A-C)。在歸一化至媒劑對照組之後，對每隻動物求取的來自各AAV1-VOYHT1處理組ssCTX中之HTT mRNA含量的平均值展現於表49中。 表49.對每隻動物求取的跨越輸注體積之ssCTX沖取物中HTT mRNA減弱的平均值
組 描述 動物數量 HTT mRNA 相對於媒劑 (%± 標準差 )
組A1 小體積；高濃度 3 96 ± 4
組A2 中等體積；高濃度 3 97 ± 3
組A3 大體積；高濃度 3 94 ± 6
組A6 媒劑對照物 3 100 ± 2
當在自三個組中之每一者取樣的所有ssCTX沖取物中分析VG複本時，在所有組中偵測到之VG含量低於mCTX中觀測到之含量，且組A3具有比組A1及組A2相對較高的VG呈像(參見圖13A-C)。對於VG含量，對每隻動物求取的來自各組之mCTX沖取物中偵測到之VG複本數目的平均值展現於表50中。對於組A6 (媒劑對照物)，VG複本在定量極限(BLQ)以下。 表50.對每隻動物求取的跨越輸注體積之ssCTX沖取物取物中VG複本的平均值
組 描述 樣品尺寸 VG 複本 / 細胞 ( 平均值 ± 標準差 )
組A1 小體積；高濃度 3 0.61 ± 0.3
組A2 中等體積；高濃度 3 0.67 ± 0.3
組A3 大體積；高濃度 3 1.13 ± 0.3
組A6 媒劑對照物 3 BLQ
組合之mCTX及ssCTX樣品亦包括於皮質沖取物分析中。當mCTX及ssCTX樣品組合時，相對於媒劑，組A1、組A2及組A3的HTT mRNA剩餘分別為95±3% (平均值±標準差)、94±5%及90±5%。媒劑對照組A6剩餘之HTT mRNA相對於對照組為100±2%。因此，組A1之HTT mRNA減弱為約5%，組A2為6%，且組A3為10%。在歸一化至媒劑對照組之後，對每隻動物求取的來自各AAV1-VOYHT1處理組之組合mCTX及ssCTX樣品中HTT mRNA含量的平均值亦展現於表51中。 表51.對每隻動物求取的跨越輸注體積之組合mCTX及ssCTX沖取物中HTT mRNA減弱的平均值
組 描述 動物數量 HTT mRNA 相對於媒劑 (%± 標準差 )
組A1 小體積；高濃度 3 95 ± 3
組A2 中等體積；高濃度 3 94 ± 5
組A3 大體積；高濃度 3 90 ± 5
組A6 媒劑對照物 3 100 ± 2
對於組合mCTX及ssCTX沖取物中之VG含量，組A3展示1.74±0.3個VG複本/細胞(對每隻動物求取的平均值)，VG呈像比來自組A2及組A1之沖取物中觀測到的(其分別含有1.01±0.7及0.99±0.4個VG複本/細胞)高。對於組A6 (媒劑對照物)，VG複本在定量極限(BLQ)以下。對於VG含量，對每隻動物求取的來自各組之組合mCTX及ssCTX沖取物中偵測到之VG複本平均數目呈現在表52中。 表52.對每隻動物求取的跨越輸注體積之組合mCTX及ssCTX沖取物中VG複本的平均值
組 描述 動物數量 VG 複本 / 細胞 ( 平均值 ± 標準差 )
組A1 小體積；高濃度 3 0.99 ± 0.4
組A2 中等體積；高濃度 3 1.01 ± 0.7
組A3 大體積；高濃度 3 1.74 ± 0.3
組A6 媒劑對照物 3 BLQ
總之，對於mCTX及ssCTX組合樣品，用增強之HTT減弱及較高VG呈像追蹤增加之輸注體積。
在tCTX中，當所有tCTX沖取物作為個別資料點包括在分析中時，三個組中之任一者均未見到統計學上顯著之HTT KD (參見圖14A-C)。當在自三個組中之每一者取樣的所有tCTX沖取物中類似地分析VG複本時，在所有組中相對於其他皮質區偵測到較低VG呈像，但組A3具有比組A1及組A2相對較高的VG呈像(參見圖14A-C)。對於組A6 (媒劑對照物)，VG複本在定量極限(BLQ)以下。
當對每隻動物跨越來自tCTX之組織沖取物求取VG複本平均值時，在小體積下觀測到0.54±0.31個VG複本/細胞之平均載體基因體含量，在中等體積下觀測到0.39±0.05個VG複本/細胞，且在最大體積下觀測到0.96±0.03個VG複本/細胞之平均載體基因體含量。對於組A6 (媒劑對照物)，VG複本在定量極限(BLQ)以下。對每隻動物求取的來自各組之tCTX沖取物中偵測到之VG複本平均數目展現於表53中。 表53.對每隻動物求取的跨越輸注體積之tCTX沖取物中VG複本的平均值
組 描述 動物數量 VG 複本 / 細胞 ( 平均值 ± 標準差 )
組A1 小體積；高濃度 3 0.54 ± 0.31
組A2 中等體積；高濃度 3 0.39 ± 0.05
組A3 大體積；高濃度 3 0.96 ± 0.03
組A6 媒劑對照物 3 BLQ
總之，相對於所有其他組，大體積組(組A3)呈現每個細胞較大數目之VG複本(p＜0.05)。在小體積與中等體積組(分別為組A1及組A2)之間，每個細胞之VG複本不存在差異。
總而言之，在皮質中始終偵測到VG，其中最高呈像在mCTX中，隨後為ssCTX。在沖取物、皮質區以及左半球及右半球之間觀測到變化。相比於ssCTX及tCTX，在mCTX中觀測到相對較大HTT mRNA減弱。在該等組中，組A3呈現最高VG呈像及最大HTT mRNA減弱。在皮質中觀測到增加之VG含量與增強之HTT mRNA減弱之間的關係，如其在殼核及尾核中觀測到的。
在丘腦中，所有組證明相對於組A1、組A2及組A3之媒劑，HTT mRNA減弱分別剩餘35%、38%及30% HTT。在歸一化至媒劑對照組之後，來自AAV1-VOYHT1處理之組的丘腦中之HTT mRNA含量展現於表54中。 表54.對每隻動物求取的跨越輸注體積之丘腦沖取物中HTT mRNA減弱的平均值
組 描述 動物數量 HTT mRNA 相對於媒劑 (%± 標準差 )
組A1 小體積；高濃度 3 35 ± 10
組A2 中等體積；高濃度 3 38 ± 6
組A3 大體積；高濃度 3 30 ± 1
組A6 媒劑對照物 3 100 ± 2
針對VG含量，對每隻動物求取的來自各組之丘腦沖取物中偵測到之VG複本的平均數目展現於表55中。丘腦呈現具有最大輸注體積之最大VG呈像。因此，組A3具有比組A1及組A2大之VG呈像。對於組A6 (媒劑對照物)，VG複本在定量極限(BLQ)以下。 表55.對每隻動物求取的跨越輸注體積之丘腦沖取物中VG複本的平均值
組 描述 樣品尺寸 VG 複本 / 細胞 ( 平均值 ± 標準差 )
組A1 小體積；高濃度 3 849.9 ± 112.6
組A2 中等體積；高濃度 3 773.0 ± 655.3
組A3 大體積；高濃度 3 1136.5 ± 270.8
組A6 媒劑對照物 3 BLQ
總體而言，此等觀測證明載體體積影響活體內載體生物分佈。在測試區域中，所有組顯示殼核中實質性HTT mRNA減弱，而尾核組A3引起實質性HTT減弱。在皮質中，mCTX (組A3及組A2)及ssCTX (組A3)展示統計學上顯著之HTT mRNA減弱，其對應於較高載體分佈。所有組證明丘腦中之HTT mRNA減弱，其中VG呈像在所取樣之所有區域中最高。與殼核相比，在皮質中偵測到較低VG呈像，但在mCTX中觀察到比在其他皮質區中更多的VG複本。高VG含量與殼核、尾核、皮質及丘腦中之增強的HTT減弱相關。組A3展示最高VG分佈且證明所取樣之四個大腦區中之每一者的最大HTT mRNA減弱。最後，AAV1-VOYHT1以體積依賴性方式減少紋狀體及初級運動皮質中之HTT mRNA含量。
為評估皮質中之載體基因體(VG)含量，自各動物(每半球9個沖取物)收集18個組織沖取物，包括各來自皮質之運動區、軀體感覺區及顳葉區(分別為mCTX、ssCTX及tCTX)之6個沖取物。針對每組載體基因體(VG)生物分佈，評估總共五十四個皮質沖取物。計算每隻動物之所有18個皮質沖取物的每個細胞VG複本之平均數目，該等皮質沖取物由各自來自mCTX、ssCTX及tCTX之6個沖取物構成。在最大體積下觀測到皮質中1.48±0.18個VG複本/細胞之平均載體基因體含量(組A3)、在中等體積下0.80±0.45個VG複本/細胞(組A2)及在小體積下0.84±0.35個VG複本/細胞(組A1)。對於組A6 (媒劑對照物)，VG複本在定量極限(BLQ)以下。對每隻動物求取的來自各組之組合mCTX、ssCTX及tCTX沖取物中偵測到之每個細胞的VG複本平均數目展現於表56中。 表56.對每隻動物求取的跨越輸注體積之組合mCTX、ssCTX及tCTX沖取物中載體基因體複本的平均值
組 描述 樣品尺寸 VG 複本 / 細胞 ( 平均值 ± 標準差 )
組A1 小體積；高濃度 3 0.84 ± 0.35
組A2 中等體積；高濃度 3 0.80 ± 0.45
組A3 大體積；高濃度 3 1.48 ± 0.18
組A6 媒劑對照物 3 BLQ
總之，與媒劑組(組A6；p＜0.05)相比，各AAV1-VOYHT1組(組A1、組A2及組A3)呈現較高數目之VG複本/細胞，但不呈現彼此(p＞0.05)。相比於中等體積及小體積組(分別為組A2及組A1)，大體積組(組A3)呈現數值較大的VG複本/細胞之數目，而中等體積及小體積組展示彼此類似的VG複本/細胞。v. 在中等濃度及低濃度下 ，在 來自 NHP 紋狀體及丘腦之沖取物中之 HTT 減弱及載體基因體 (VG) 量測
此分析經設計以評估中等劑量濃度(其亦可稱為中度劑量濃度)及地劑量濃度對載體分佈及覆蓋率之影響。使用含有來自組A4 (中等濃度)、組A5 (低濃度)及組A6 (對照組)的運動及體覺皮質及前殼核的所選腦板來收集2 mm沖取物。自大腦各側收集六個皮質、8個殼核、2個尾核及5個丘腦沖取物(每隻動物總共42個)，其中自所有四個組收集總數504個沖取物。樣品在QuantiGene®均質化緩衝液中均質化且經歷蛋白酶K消化。在額外DNA純化步驟(Qiagen，目錄#69506)之後，產生經清理之細胞溶胞物，並對其處理用於使用分支鏈DNA (bDNA)分析進行之HTT mRNA量測及使用數位液滴PCR (ddPCR)進行之載體基因體(VG)量測。bDNA分析係根據QuantiGene® Plex 分析(ThermoFisher Scientific)方案使用特定針對恆河猴HTT之探針集進行。一式兩份地分析細胞溶胞物。HTT mRNA含量歸一化至三種恆河猴管家基因，亦即AARS、TBP及XPNPEP1之幾何平均值。將結果校準至媒劑組之歸一化平均值且展現為：相對剩餘HTT mRNA之平均值(%)±標準差。對於ddPCR，全細胞DNA係由用於bDNA分析中之相同組織勻漿製備。用探針集(CBA啟動子)偵測之載體基因體之含量歸一化至宿主探針集(核糖核酸酶P)。在分析期間所有樣品均採用盲法。
在殼核中，組A4 (中等濃度)及組A5 (低濃度)均展示HTT mRNA減弱，其中相對於對照組分別剩餘63±9% (平均值±標準差)及73±9% HTT mRNA。因此，mRNA含量以與劑量相關之方式減少，其中中等濃度及低濃度組之HTT mRNA減少分別大致37%及27%。針對VG含量，對組A4及組A5之殼核沖取物中偵測到之VG複本的平均數目分別為119.4±18.1及66.9±21.5個VG複本/細胞。
亦在尾核中觀測到HTT mRNA減弱，其中相對於組A4及組A5之對照物，分別88±6% (平均值±標準差)及91±10%之減弱。因此，mRNA含量以與劑量相關之方式減少，其中中等濃度及低濃度組之HTT mRNA減少分別大致12%及9%。對於組A4及組A5兩者，尾核中之HTT mRNA減少量比殼核低約20%。針對VG含量，在來自組A4及組A5之尾核沖取物中偵測到之VG複本的平均數目分別為0.4±0.1及9.3±15.4個VG複本/細胞。當應用格拉布氏測試(Q=0.1%)移除離群值時，在來自組A5之尾核沖取物中偵測到之VG複本的平均數目為9.3至0.3±0.2。組A4之平均VG在格拉布氏測試後保持不變。VG複本呈像在尾核中比在殼核中低幾倍，其在中度(低約300倍)及低(低約7倍)劑量濃度兩者下比較。
最後，在丘腦中觀測到HTT mRNA減弱，其中相對於組A4及組A5之對照物，分別59±20% (平均值±標準差)及52±13%減弱。分別對於中等及低濃度組，丘腦中之HTT mRNA含量減少大致41%及48%。儘管紋狀體中觀測到HTT mRNA減弱與劑量濃度之間的新興關係，但此並非丘腦中之情況，其中與低劑量濃度相比，中等劑量濃度與較低mRNA減弱相關。針對VG含量，在來自組A4及組A5之丘腦沖取物中偵測到之VG複本的平均數目分別為416.0±149.3及246.7±87個VG複本/細胞。丘腦中之VG呈像高於中等濃度及低劑量濃度下之紋狀體中之VG呈像。
總之，中間及低AAV1-VOYHT1濃度與紋狀體(殼核及尾核)及丘腦中之減少之HTT mRNA含量相關。相比於殼核及尾核兩者，丘腦中之HTT mRNA減弱較高。在紋狀體中，殼核中之HTT mRNA減弱比尾核大大致20%。與AAV1-VOYHT1劑量相比，中等AAV1-VOYHT1劑量與紋狀體中(但不在丘腦中)的較大HTT減弱相關，其中不管劑量如何，減弱為約45%。在所評定之三個腦區域中，每個細胞之VG複本數目在丘腦中最高且在尾核中最低。vi. 在來自 NHP 皮質之雷射捕獲 (LC) 神經元中之 HTT 減弱及載體基因體 (VG) 量測
處理來自組A3 (大體積；高濃度)及組A6 (媒劑對照物)之所選腦板來分離初級運動皮質(mCTX)及體覺皮質(ssCTX)樣品。將樣品切成14 µm區段且用1%甲苯酚紫染色。使用雷射捕獲顯微切割(laser capture microdissection，LCM)來捕獲皮質層錐體神經元。對於第1 LCM分析，自腦之各側收集一個mCTX及一個ssCTX樣品(每隻動物4個樣品)，收集總共24個樣品。雷射捕捉(LC)皮質層V及VI中兩組750錐體神經元且在50 µl溶解緩衝液中均質化，混合至總共100 µl。對於第2 LCM分析，自腦之各側(每隻動物12個樣品)收集兩個mCTX及四個ssCTX樣品，收集總共72個樣品。自各樣品之皮質層V及VI雷射捕捉九百個錐體神經元。最初使用ARCTURUS® PicoPure® RNA分離套組(Thermo Fisher Scientific，目錄號：KIT0204)分離各樣品，且隨後在另一DNA純化步驟(Qiagen, catalog#56304)之後，針對HTT mRNA含量使用定量反轉錄PCR (RT-qPCR)及針對載體基因體(VG)含量使用數位液滴PCR (ddPCR)進行處理。對於RT-qPCR，所有樣品用TaqMan™ PreAmp Master Mix (Thermo Fisher Scientific, 目錄號：4391128)分析。根據Vandesompele J等人, Genome Biol. 2002;3(7):RESEARCH0034，對整個資料集進行計算。HTT mRNA含量歸一化至三種恆河猴管家基因，亦即AARS、TBP及XPNPEP1之幾何平均值。結果計算為相對於既定組織中所有媒劑樣品之平均值的倍數HTT mRNA。對於ddPCR，用探針集(CBA啟動子)偵測之載體基因體之含量歸一化至宿主探針集(核糖核酸酶P)。在分析期間所有樣品均採用盲法。
根據第1 LCM分析，在組A3 (最大體積及濃度)中達成適度HTT mRNA減弱(mCTX為19%且ssCTX為23%) (參見圖15A)。每個細胞大致3-7個VG複本與mCTX及ssCTX錐體神經元中之適度HTT mRNA KD相關(參見圖15B)。與來自mCTX及ssCTX之組織沖取物(參見上文)相比，在LCM樣品中偵測到更多HTT減弱及載體基因體複本。
根據第2 LCM分析，歸一化至媒劑之HTT mRNA含量及VG含量展現於表57-60中。所展示資料為來自一組或說明一組中之個別動物的所有mCTX或ssCTX樣品之平均值±標準差(每組3個NHP)。亦評定一組中之個別動物的組合mCTX及ssCTX錐體神經元樣品，如表57及表59中所示。在組A3中達成適度但顯著HTT mRNA減弱(mCTX為21%且ssCTX為23%)。分別在來自mCTX及ssCTX之LC錐體神經元中偵測到每個細胞平均2.79及1.36個VG複本。相比於組織沖取物，在LCM樣品中見到較佳HTT mRNA減弱(mCTX為14%及ssCTX為6%)。第2 LCM分析中之HTT mRNA減弱之讀數與第1 LCM結果一致，而第2 LCM中所量測之VG複本數目略微低於第1 LCM分析中之複本數目。 表57. mCTX及ssCTX之所有LC神經元中之HTT mRNA含量(第2 LCM)
組 描述 相對 HTT mRNA 含量 ( 媒劑之 %) ( 平均值 ± 標準差 )
mCTX (n=12) ssCTX (n=24)
組A3 大體積；高濃度 76 ± 11 77 ± 14
組A6 媒劑對照物 100 ± 37 100 ± 18
表58.各動物之mCTX及ssCTX之LC神經元中之HTT mRNA含量(第2 LCM)
組 描述 相對 HTT mRNA 含量 ( 媒劑之 %) ( 平均值 ± 標準差 ， N=3)
mCTX ssCTX mCTX + ssCTX
組A3 大體積；高濃度 79 ± 11 77 ± 8 77 ± 13
組A6 媒劑對照物 100 ± 37 100 ± 17 100  ± 25
表59. mCTX及ssCTX 之所有LC神經元中之VG含量(第2 LCM)
組 描述 VG 複本 / 細胞 ( 平均值 ± 標準差 )
mCTX (n=12) ssCTX (n=24)
組A3 大體積；高濃度 2.79 ± 1.55 1.36 ± 0.97
組A6 媒劑對照物 0.18 ± 0.11 0.46 ± 0.3
表60.各動物之mCTX及ssCTX之LC神經元中之VG含量(第2 LCM)
組 描述 VG 複本 / 細胞 ( 平均值 ± 標準差， N=3)
mCTX ssCTX mCTX + ssCTX
組A3 大體積；高濃度 2.79 ± 0.08 1.36 ± 0.28 1.84 ± 0.17
組A6 媒劑對照物 0.17 ± 0.05 0.45 ± 0.17 0.37 ± 0.12
vii. NHP 運動及軀體感覺中 VG 及 HTT mRNA 之原位雜交 (in situ hybridization ， ISH)
使用BaseScope™分析處理含有來自組A3 (大體積；高濃度)及組A6 (媒劑對照物)動物之運動及體覺皮質的所選腦切片以用於原位雜交(ISH)，從而偵測載體基因體DNA及HTT mRNA。將五個微米厚的經福馬林固定、石蠟包埋(FFPE)之腦切片與用於普通獼猴HTT mRNA (GenBank寄存編號：XM_015137840.1)及AAV1載體基因體之BaseScope™ ISH目標特定探針一起培育。將三對雙Z探針用於HTT mRNA，且此等探針針對HTT基因中之3個外顯子接合點設計。四對用於載體基因體，且此等探針針對多個非pri-miRNA區域設計。亦添加陽性對照探針BA-Mmu-PPIB-3zz (肽基脯胺醯基異構酶B (親環素B)，目錄號：708161)及陰性對照探針BA-dapB-3zz (目錄號：701011)。使用BaseScope™紅色試劑套組(目錄號：322910)進行信號擴增及組織染色。在顯微鏡下偵測並分析影像之載體基因體及HTT mRNA含量。
用ImageJ成像分析軟體進行BaseScope™ ISH結果之定量。用於評估BaseScope™染色之評分準則列於表61中。在40倍放大率下進行評分。基於每個細胞之斑點數目而非信號強度進行評分，因為斑點與個別目標分子數目相關，而斑點強度反映結合至各分子之探針對數目。AAV載體生物分佈計算為具有斑點之細胞相對於特定皮質區中之細胞總數的百分比。對於載體基因體讀數，僅計數細胞核信號。 表61. ISH染色之評分準則
評分 準則
0 無染色或＜1斑點/10個細胞
1 1-3個斑點/細胞
2 4-9個斑點/細胞，無或極少斑點集群
3 10-15個斑點/細胞及集群中＜10%斑點
4 ＞15個斑點/細胞及集群中＞10%斑點
對於載體生物分佈，在組A3中之注射部位(丘腦及殼核)偵測廣泛載體基因體。在皮質中，在組A3中達成在細胞核中具有可偵測AAV載體的平均18% mCTX及9% ssCTX細胞。在mCTX中比在ssCTX中觀測到更多具有可偵測載體基因體之細胞，其中12.48% vg+細胞之組合平均數在NHP中之mCTX與ssCTX兩者中。基於載體基因體ISH的NHP皮質中之載體生物分佈結果展現於表62及表63中。 表62. mCTX及ssCTX中之每個皮質區之VG分佈
組 描述 具有 VG 之細胞 % ( 平均值 ± 標準差 )
mCTX (n=18) ssCTX (n=30)
組A3 大體積；高濃度 17.87 ± 7.04 9.35 ± 2.80
組A6 媒劑對照物 0.75 ± 1.51 0.72 ± 0.92
表63. mCTX及ssCTX中每隻動物之VG分佈
組 描述 具有 VG 之細胞 % ( 平均值 ± 標準差 ， N=3)
mCTX ssCTX
組A3 大體積；高濃度 17.87 ± 2.94 9.36 ± 0.29
組A6 媒劑對照物 0.75 ± 1.12 0.72 ± 0.53
針對VG含量，組A3 (大體積；高濃度)NHP中之mCTX及ssCTX兩者中的細胞之平均載體基因體評分為約1，該等NHP藉由雙側丘腦及殼核輸注用AAV1-VOYHT1給藥。使用上述評分準則的NHP皮質中之VG評分結果展現於表64及表65中。 表64. mCTX及ssCTX中之每個皮質區之VG評分
組 描述 VG 評分 ( 平均值 ± 標準差 )
mCTX (n=18) ssCTX (n=31)
組A3 大體積；高濃度 1.01 ± 0.02 1.08 ± 0.13
組A6 媒劑對照物 0 0
表65. mCTX及ssCTX中每隻動物之VG評分
組 描述 VG 評分 ( 平均值 ± 標準差 ， N=3)
mCTX ssCTX
組A3 大體積；高濃度 1.01 ± 0.01 1.08 ± 0.07
組A6 媒劑對照物 0 0
對於HTT mRNA含量，AAV1-VOYHT1處理組之mCTX及ssCTX兩者中之HTT mRNA評分展示比媒劑組中之評分顯著更低之評分，指示由AAV1-VOYHT1處理所引起之HTT mRNA含量顯著減少。使用上述評分準則的NHP皮質中之HTT mRNA評分結果展現於表66及表67中。 表66. mCTX及ssCTX中之每個皮質區之HTT mRNA評分
組 描述 HTT mRNA 評分 ( 平均值 ± 標準差 )
mCTX (n=18) ssCTX (n=30)
組A3 大體積；高濃度 1.51 ± 0.22 1.91 ± 0.28
組A6 媒劑對照物 2.24 ± 0.38 2.26 ± 0.28
表67. mCTX及ssCTX中每隻動物之HTT mRNA評分
組 描述 HTT mRNA 評分 ( 平均值 ± 標準差 ， N=3)
mCTX ssCTX
組A3 大體積；高濃度 1.51 ± 0.15 1.91 ± 0.25
組A6 媒劑對照物 2.24 ± 0.28 2.26 ± 0.2
viii. 臨床症狀及組織病理學
在18個測試動物中之7個中觀測到最小至輕度臨床症狀，包括輕度協調不能、食慾不振、進食減少及全身無力。組織病理學分析總體展示在測試劑量下之安全性。在殼核及丘腦中偵測到低含量之單核細胞浸潤。單核細胞之浸潤度與輸注體積成比例對應。壞死在媒劑組中最明顯。在頂葉皮質及枕葉皮質中觀測到最小損傷。ix. 概述
此等資料表明，在使用最佳給藥範式後，可達成經由丘腦內及/或殼核內輸注獲得皮質中HTT減弱之目標含量。基於腦臨床症狀及組織學評定，AAV1-VOYHT1具有良好耐受性。 實例2.劑量最佳化研究II
進行此研究以進一步評估遞送參數，以最佳化NHP腦中AAV1-VOYHT1之覆蓋率，及向臨床給藥範式之外推參數。此研究利用總共10隻動物，其分配至4個處理組，如表68中所概述。與實例1相比，動物接受雙側腦實質輸注(4次輸注)以增加之給藥的AAV1-VOYHT1至殼核及丘腦中。實驗程序類似於實例1中所描述之實驗程序。給藥後5週使動物安樂死，且收集組織用於事後分析。 表68.研究設計
組 描述 動物數量 體積 ( 微升 / 側 ) 給藥效價 (vg/ml) 總劑量 (vg)
殼核 丘腦
組B1 大體積媒劑 2 350 500 0 0
組B2 中等體積中等濃度 3 250 325 4e12 4.6e12
組B3 中等體積高濃度 3 250 325 7.9e12 9.1e12
組B4 中等體積媒劑 2 250 325 0 0
對應於表67之各給藥組的經計算之人類等效劑量展現於表69中。 表69.人類等效劑量
組 描述 人類等效劑量
殼核 ( 微升 / 側 ) 丘腦 ( 微升 / 側 ) 劑量 (vg)
組B1 大體積媒劑 1225 3000 0
組B2 中等體積中等濃度 875 1950 2.3e13
組B3 中等體積高濃度 875 1950 4.5e13
組B4 中等體積媒劑 875 1950 0
給藥後觀測到副作用，其可能歸因於對較大輸注體積之不耐受性。在用大體積媒劑對照物給藥之動物中觀測到一或兩個後肢廢用(組B1)。在接受中度體積AAV1-VOYHT1處理之兩隻動物(組B2、B3)中，觀測到臨床症狀，諸如兩支腿輕癱，俯臥/走動遲緩，頭部傾斜。MRI觀測展示在三隻動物中沿著兩個插管管道的一些回流。
組織病理學分析展示媒劑組之殼核中的輕微神經膠瘤病及壞死(由於導管之置放而不可避免)。在組B2動物中，在殼核及丘腦輸注部位兩者處發現單核細胞浸潤顯著增加，但預期此等情形不引起臨床症狀。觀測到兩個結構中之神經膠瘤病及壞死q情況輕微增加，但預期均不產生任何臨床症狀。亦觀測到水腫。在組B3動物中，相對於對照，在兩個結構中可見神經膠瘤病及壞死輕微增加，但認為無生物相關性。相比於媒劑組，單核細胞浸潤增加。亦觀測到水腫增加，但此預期不引起任何臨床症狀。 實例3.劑量最佳化研究IIIi. 研究設計
此研究之主要目標為在具有AAV1-VOYHT1之NHP皮質中證明HTT mRNA減弱，且為僅丘腦及組合之丘腦及殼核輸注範式證明安全性。次要目標為展示來自初級運動及體覺皮質之雷射捕獲(LC)錐體神經元中的VG與HTT mRNA含量之間的相關性；證明來自殼核、丘腦及尾核之組織沖取物中的HTT mRNA與VG含量之間的相關性；證明殼核中之HTT蛋白與HTT mRNA含量之間的相關性；量測來自殼核及尾核之組織沖取物中的AAV1-VOYHT1特異性miRNA表現量； 證明來自殼核及尾核之組織沖取物中之載體基因體(VG)與AAV1-VOYHT1特異性miRNA表現量之間的相關性；且證明來自殼核及尾核之組織沖取物中之HTT mRNA與AAV1-VOYHT1特異性miRNA表現量之間的相關性。
此研究以兩個階段實施。總共15隻雄性及雌性恆河獼猴分配至5個組，每組3隻動物(參見表57)。在階段I中，第一組動物(組C1a)藉由使用MRI引導之對流增強遞送(CED)進行雙側腦實質內注射至丘腦及殼核中而用媒劑對照物給藥，以在進入研究階段II之前建立輸注參數(例如速率、體積及持續時間)。第二組(組C1b)用優化手術程序給藥且充當處理組的對照組。在階段I中建立輸注參數之後，該等參數用於在三個處理組中給藥含有AAV1-VOYHT1之測試物品。第一處理組(組C2)僅使用MRI引導之CED接受測試物品至丘腦中之雙側輸注。在僅丘腦輸注後藉由雷射捕獲顯微切割(LCM)給藥此組，以證明初級運動及體覺皮質中皮質錐體神經元之安全性及亨丁頓蛋白質(HTT) mRNA減弱(KD)。接著，在其他兩個處理組(組C3及組C4)中，將測試物品以2種不同劑量雙側輸注至丘腦及殼核中以使劑量最佳化。
研究時程如下。在階段I中，第一媒劑組(組C1a)使用預先選擇之輸注參數給藥。聚焦於神經狀態之功能觀測組(Functional Observation Battery，FOB)評估在輸注後5±2天及結束前3±天進行。根據組C1a，在給藥後5±2天及結束前3±天給藥額外3隻動物(組C1b)且隨後用FOB評估。在階段II中，根據階段I中所建立之輸注參數，向所有動物(N=9)給藥含有AAV1-VOYHT1之測試物品。首先給藥組C2 (僅丘腦)，繼之以中度劑量之組C3，且隨後以高劑量之組C4。除其中動物僅接受雙側丘腦給藥之組C2以外，各動物接受媒劑或測試物品至殼核及丘腦中之雙側顱內輸注。採用腦實質內給藥範式，其中以至多5 µL/min之速度給與2-4次輸注(每一結構1次輸注)。在給藥前對各動物進行基線神經FOB評估，隨後在給藥後5±2天時對各動物進行第二次FOB評估。當第二次FOB令人滿意時，在第36±3天使動物安樂死(約5週生命期)且在屍檢前3±2天進行第三次FOB評估。收集組織用於事後分析。
研究設計之概述展示於表70中。對於高劑量組(組C4)，基於所達成之最大效價(2.2e13 vg/ml)計算1.8e13 vg之總劑量。 表70.研究設計
階段 組 動物數量 描述 體積 ( 微升 / 側 ) 給藥效價 (vg/ml) 總劑量 (vg)
殼核 丘腦
I 組C1 (a/b) 3+3 媒劑 150 250 0.0 0.0
II 組C2 3 僅丘腦 - 250 2.2e13 1.1e13
組C3 3 中度劑量 150 250 1.0e13 8.0e12
組C4 3 高劑量 150 250 2.2e13 1.8e13
ii. 動物護理及樣品收集
在開始步行訓練之前15天，基於抗AAV1中和抗體(nAb)的血清效價，選擇十八(N=18)隻成年雄性或雌性恆河獼猴(4-11歲)。組C2、C3及C4之所選候選物一般呈現低AAV1 nAb。動物稱重5-14 kg。在動物入選前每天進行步行訓練持續長達連續4週。動物經稱重且藉由nAb狀態分配至研究組，如表57中所概述。將3隻選擇作為備用之動物作為備用保留直至給藥完成。動物飼養情況與實例1中所述類似。
在第1天(給藥前)、第15±2天及緊接著在第36±3天屍檢前收集血液樣品用於臨床病理學評估及中和抗體(nAb)分析。臨床病理學評估包括血液學(CBC)、血清臨床化學(Chem)及凝血(Coag)分析。在第1天(給藥前)、第15±2天及緊接著在第36±3天屍檢前，自宮頸區收集腦脊髓液(CSF)樣品以用於nAb分析。屍檢後，收集腦及所選周邊器官，且隨後進行新鮮冷凍或藉由浸沒經4%多聚甲醛(PFA)進行事後固定。iii. 測試物品製備及給藥程序
用於研究中之測試物品含有AAV1-VOYHT1基因轉移載體，該載體用5%蔗糖及0.001%泊洛沙姆188 (Pluronic® F-68)在磷酸鹽緩衝鹽水中調配。媒劑對照物僅含有調配物緩衝液。樣品儲存在-60℃或以下且在給藥當天解凍至2-8℃並維持在此溫度下。以1:250之比率添加ProHance® (Bracco Diagnostics, Inc)，亦即釓特醇(每250 µL測試物品或對照物1 µL ProHance)，且藉由倒置管謹慎地混合，隨後裝載至輸注系統中。給藥溶液含有測試物品或對照物以及2 mM濃度之釓特醇。
在手術前立即用肌肉內(IM)氯胺酮(10 mg/kg)及IM迪美得托咪汀(15 µg/kg)麻醉各動物，稱量，對頭頸部刮毛，插管，且維持在1-5%異氟醚上。將動物頭部固定至在耳棒各側上含有一個MRI表面線圈的立體定位框架上，且隨後轉移至MRI以獲取基線掃描。獲取經T1及T2稱重之MRI序列且用於確定中央腦溝之座標。接著，將動物轉移回至手術套件及針對神經手術植入程序製備之頭部。使用無菌技術，在解剖層中打開傷口部位以暴露頭骨。視哪一劑量組而定，在位於各側上之頂葉及/或枕葉上方的進入部位處進行頭剖開術。使用鈦螺釘將頭骨安裝之插管引導滾珠陣列暫時固定至各鑽孔上方之頭骨處。在植入滾珠陣列後，立即將動物轉移至MRI套件。MR成像用於將插管引導件與各插管引導件同側之殼核及/或丘腦目標對齊。投與測試物品或對照物，用重複MR成像目視監測大腦內之輸注，如表57 (上文)中所規定。各動物在各殼核(組C2除外)及丘腦中使用對流增強遞送(CED)接受測試物品或對照物之輸注(部位)。16G插管(MRI Interventions Inc.)用給藥溶液預塗佈，且經由頭骨安裝之滾珠陣列引導至各目標部位中。各插管經由微孔延伸線(Smiths Medical)連接至安裝在注射泵(Harvard Apparatus)上之3-6cc注射器。在3個不同腦實質內輸注階段中使用遞增輸注速率向各殼核及丘腦中投與之劑量速率、持續時間及體積列舉於表71中。「N/A」指示資料不適用。 表71.輸注參數
輸注階段 殼核 丘腦
速率(µl/min) 持續時間(min) 體積(µl) 速率(µl/min) 持續時間(min) 體積(µl)
1 1 16 16 1 25 25
2 3 28 84 3 50 150
3 5 20 50 5 15 75
總計 N/A 64 150 N/A 90 250
獲取連續MRI掃描以監測各目標部位內之輸液分佈且提供給藥之即時監測。在一些情況下，在輸注期間插管更深入進殼核或丘腦中以使殼核或丘腦內之輸液分配最大化。歸因於每個部位遞送之總體積，輸液分配至鄰近殼核及丘腦之CNS結構中預期且既定發生。在MRI CED給藥程序之後，立即將動物轉移回至手術套件，外植滾珠陣列系統，且使用簡單的間斷縫合圖案在具有可吸收薇喬縫合線之解剖層中縫合傷口部位。手術前及手術後藥品包括阿替美唑(atipamezole) (0.03 mL/kg，IM)、丁基原啡因(0.03 mg/kg，IM，b.i.d.)、卡洛芬(2.2 mg/kg SQ，b.i.d.)、酮基布洛芬(2 mg/kg，IM，s.i.d.)及頭孢唑啉(100 mg IV，手術前及手術後，繼之以25 mg/kg，IM，b.i.d)或頭孢曲松(50 mg/kg，IM，s.i.d.)。監測動物自麻醉完全恢復且返回至其飼養籠。iv. 在來自組合 NHP mCTX 及 ssCTX 之 LC 神經元中之 HTT 減弱及 VG 量測
處理來自三個組(組C1、組C3及組C4)之所選腦板以藉由雷射捕獲顯微切割(LCM)分離初級運動皮質(mCTX)及體覺皮質(ssCTX)樣品。收集總共54個mCTX樣品及90個ssCTX LCM樣品。各LCM樣品含有自皮質層V及VI雷射捕獲(LC)之900個錐體神經元，其中總共捕獲129,600個神經元。如實例1中所描述，針對HTT mRNA含量使用RT-qPCR及針對載體基因體(VG)含量使用ddPCR處理樣品。在分析期間所有樣品均採用盲法。
針對HTT mRNA減弱，在歸一化至媒劑對照組之後，來自AAV1-VOYHT1處理組之組合mCTX及ssCTX之LC神經元中的相對HTT mRNA含量展現於表71中。在組C4 (高劑量雙側殼核+丘腦組)中觀測到來自mCTX及ssCTX之LC錐體神經元之組合樣品中的最大HTT減弱(32%)，其中組C3 (中度劑量雙側殼核+丘腦組)中之HTT減弱(13%)較少。在組C4中之mCTX中觀測到平均30%HTT mRNA減弱及ssCTX中33% HTT mRNA減弱。HTT減弱大致與劑量成比例(2.25×較大劑量引起2.9×較高減弱)。呈現超過30% HTT減弱的LC皮質神經元之樣品百分比亦展示於表72中。在LC運動及體覺皮質神經元中，組C4 (高劑量殼核+丘腦組)中之58%樣品展示≥30% HTT減弱且27%樣品展示≥40% HTT減弱，而組C3 (中度劑量殼核+丘腦組)中之36%樣品展示≥30% HTT減弱且7%樣品展示≥40% HTT減弱。因此，運動及體覺皮質神經元中之HTT mRNA減弱視輸注至丘腦及殼核中之AAV1-VOYHT1之濃度而定。另外，中度劑量及高劑量組中之超過40%之LCM mCTX樣品展示≥30% HTT mRNA減弱，而高劑量組中之60%之LCM ssCTX樣品展示≥30% HTT mRNA減弱。 表72.來自組合mCTX及ssCTX之LC神經元中之HTT減弱
組 描述 相對於媒劑之 HTT mRNA (%+ 標準差 ， N=3) LCM% ≥ 30% KD LCM% ≥ 40% KD
組C1 媒劑 100 ± 10 5 0
組C3 中度劑量 87 ± 26 36 7
組C4 高劑量 68 ± 3 58 27
針對VG含量，來自組合mCTX及ssCTX之LC神經元樣品展示每個細胞之VG複本之劑量依賴性增加，如表73中所示。在高劑量組中每個細胞VG複本之數目為大致30個複本/細胞。VG複本用HTT mRNA減弱追蹤，使得較高數目之VG複本對應於較高HTT mRNA減弱。 表73.來自組合mCTX及ssCTX之LC神經元中之VG含量
組 描述 VG 複本 / 細胞 ( 平均值 ± 標準差， N=3)
組C1 媒劑 0.54 ± 0.55
組C3 中度劑量 8.00 ± 0.71
組C4 高劑量 28.55 ± 23.16
v. 在來自 NHP mCTX 之 LC 神經元中之 HTT 減弱及 VG 量測
處理來自三個組(組C1、組C3及組C4)之所選腦板以藉由雷射捕獲顯微切割(LCM)分離初級運動皮質(mCTX)樣品。收集總共54 mCTX樣品。各LCM樣品含有自皮質層V及VI雷射捕獲(LC)之900個錐體神經元。如實例1中所描述，針對HTT mRNA含量使用RT-qPCR及針對載體基因體(VG)含量使用ddPCR處理樣品。在分析期間所有樣品均採用盲法。
針對HTT mRNA減弱，在歸一化至媒劑對照組之後，來自AAV1-VOYHT1處理組之mCTX的LC神經元中的相對HTT mRNA含量展現於表74中。在組C4 (高劑量雙側殼核+丘腦組)中觀測到來自mCTX之LC錐體神經元中之最大HTT減弱(30%)，其中組C3 (中度劑量雙側殼核+丘腦組)中之HTT減弱(13%)較少。 表74.來自mCTX之LC神經元中之HTT減弱
組 描述 相對於媒劑之 HTT mRNA ( 平均值 + 標準差 ， N=3)
組C1 媒劑 100 ± 11
組C3 中度劑量 87 ± 27
組C4 高劑量 70 ± 7
針對VG含量，來自mCTX之LC神經元展示每個細胞之VG複本之劑量相關之增加，如表75中所示。組C4 (高劑量雙側殼核+丘腦組)中每個細胞之VG複本數目達到大致20個複本/細胞，且組C3 (中度劑量雙側殼核+丘腦組)中10個複本/細胞。因此，用HTT mRNA減弱追蹤VG複本，使得較高數目之VG複本對應於較高HTT mRNA減弱。 表75.來自mCTX之LC神經元中之VG含量
組 描述 VG 複本 / 細胞 ( 平均值 ± 標準差， N=3)
組C1 媒劑 0.15 ± 0.03
組C3 中度劑量 9.61 ± 1.59
組C4 高劑量 21.6 ± 0.74
vi. 在來自 NHP ssCTX 之 LC 神經元中之 HTT 減弱及 VG 量測
處理來自三個組(組C1、組C3及組C4)之所選腦板以藉由雷射捕獲顯微切割(LCM)分離體覺皮質(ssCTX)樣品。收集總共90個ssCTX LCM樣品。各LCM樣品含有自皮質層V及VI雷射捕獲(LC)之900個錐體神經元。如實例1中所描述，針對HTT mRNA含量使用RT-qPCR，且針對載體基因體(VG)含量使用ddPCR處理樣品。在分析期間所有樣品均採用盲法。
針對HTT mRNA減弱，在歸一化至媒劑對照組之後，來自AAV1-VOYHT1處理組之ssCTX之LC神經元中的相對HTT mRNA含量展現於表76中。在組C4 (高劑量雙側殼核+丘腦組)中觀測到來自ssCTX之LC錐體神經元中之最大HTT減弱(33%)，其中組C3 (中度劑量雙側殼核+丘腦組)中之HTT減弱(13%)較少。 表76.來自ssCTX之LC神經元中之HTT減弱
組 描述 相對於媒劑之 HTT mRNA ( 平均值 + 標準差 ， N=3)
組C1 媒劑 100 ± 8
組C3 中度劑量 86 ± 24
組C4 高劑量 67 ± 11
針對VG含量，來自ssCTX之LC神經元展示每個細胞之VG複本之劑量相關之增加，如表77中所示。組C4 (高劑量雙側殼核+丘腦組)中每個細胞之VG複本數目達到大致33個複本/細胞，且組C3 (中度劑量雙側殼核+丘腦組)中7個複本/細胞。因此，VG複本用HTT mRNA減弱追蹤，使得較高數目之VG複本對應於較高HTT mRNA減弱。 表77.來自ssCTX之LC神經元中之VG含量
組 描述 VG 複本 / 細胞 ( 平均值 ± 標準差， N=3)
組C1 媒劑 0.77 ± 0.89
組C3 中度劑量 7.01 ± 2.98
組C4 高劑量 32.72 ± 37.37
LCM結果證明，中度劑量及高劑量組中AAV1-VOYHT1之組合雙側殼核及丘腦輸注引起運動及體覺皮質錐體神經元中之VG遞送及HTT mRNA減弱，其中高劑量組中載體基因體遞送較多且HTT mRNA減弱較高。vii. 在來自組合 NHP mCTX 及 ssCTX 之沖取物中之 HTT 減弱及 VG 量測
使用含有來自所有四個組之運動及體覺皮質的兩個所選腦板來收集2 mm初級運動皮質(mCTX)及體覺皮質(ssCTX)沖取物。每隻動物收集六個mCTX及6個ssCTX沖取物，其中收集總數144個沖取物。自皮質之每一側收集相等數目之沖取物。分別使用bDNA及ddPCR處理樣品且分析樣品之HTT mRNA及載體基因體(VG)。bDNA及ddPCR如實例1中所述進行。在分析期間所有樣品均採用盲法。
對於HTT mRNA減弱，在歸一化至媒劑對照組之後，來自AAV1-VOYHT1處理組之組合mCTX及ssCTX之LC神經元中的相對HTT mRNA含量展現於表77中。在來自組C4 (高劑量雙側殼核+丘腦組)之皮質沖取物中觀測到平均16% HTT減弱。基於組C3及組C4，HTT減弱與劑量成比例(2.25×較大劑量引起2.28×較高減弱)。在各組中呈現超過20% HTT減弱的沖取物之百分比亦展示於表78中。組合mCTX及ssCTX沖取物之39%展示≥20% HTT減弱，但mCTX沖取物之72%展示≥20% HTT減弱。與在僅丘腦組C2中相比，在高劑量殼核+丘腦組C4中觀測到較大HTT減弱，表明AAV1-VOYHT1之殼核輸注促成運動及體覺皮質中之HTT減弱。在僅丘腦輸注AAV1-VOYHT1 (組C2)之情況下，在運動及體覺皮質中不存在顯著HTT減弱。 表78.組合mCTX及ssCTX沖取物中之HTT減弱
組 描述 相對於媒劑之 HTT mRNA (%+ 標準差 ， N=3) 沖取物% ≥ 20% KD
組C1 媒劑 100 ± 8 0
組C2 僅丘腦 93 ± 3 14
組C3 中度劑量 93 ± 13 11
組C4 高劑量 84 ± 5 39
針對VG含量，結果概述於表79中。殼核+丘腦組C3及C4之VG含量為劑量依賴性的且與劑量成比例的(2.25×較大劑量引起3×較高載體基因體含量)。各組中在mCTX中偵測到比在ssCTX中更高的VG複本。在組C4 (高劑量殼核+丘腦)組中偵測到比在組C2組中更高的VG複本(僅丘腦)，表明AAV1-VOYHT1之殼核輸注促成運動及體覺皮質中之VG複本。VG複本與沖取物分析中之HTT mRNA減弱相關。 表79.組合mCTX及ssCTX沖取物中之VG含量
組 描述 VG 複本 / 細胞 ( 平均值 ± 標準差， N=3)
組C1 媒劑 0.02 ± 0.04
組C2 僅丘腦 10.15 ± 4.14
組C3 中度劑量 10.98 ± 6.69
組C4 高劑量 22.67 ±10.69
viii. 在來自 NHP mCTX 之沖取物中之 HTT 減弱及 VG 量測
使用含有來自所有四個組之運動皮質的兩個所選腦板來收集2 mm初級運動皮質(mCTX)沖取物。每隻動物收集六個mCTX沖取物，其中收集總數72個沖取物。自皮質之每一側收集相等數目之沖取物。分別使用bDNA及ddPCR處理樣品且分析樣品之HTT mRNA及載體基因體(VG)。bDNA及ddPCR如實例1中所述進行。在分析期間所有樣品均採用盲法。
針對HTT mRNA減弱，在歸一化至媒劑對照組之後，AAV1-VOYHT1處理組之mCTX沖取物中之相對HTT mRNA含量展現於表80中。在組C4 (高劑量雙側殼核+丘腦組)中觀測到最大HTT減弱(28%)，其中組C3 (中度劑量雙側殼核+丘腦組)中之HTT減弱(9%)及組C2 (10%；僅丘腦)較少。雖然在高劑量輸注至雙側殼核及丘腦中之情況下觀測到HTT mRNA中之大致三分之一降低，但在中度劑量輸注至雙側殼核中以及僅在丘腦輸注中之情況下可見僅約10%降低。 表80. mCTX沖取物中之HTT減弱
組 描述 相對於媒劑之 HTT mRNA ( 平均值 + 標準差 ， N=3)
組C1 媒劑 100 ± 11
組C2 僅丘腦 90 ± 2
組C3 中度劑量 91 ± 11
組C4 高劑量 78 ± 7
針對VG含量，mCTX沖取物展示VG複本/細胞之劑量相關之增加，如表81中所示。組C4 (高劑量雙側殼核+丘腦組)中每個細胞之VG複本數目為大致32個複本/細胞，且組C3 (中度劑量雙側殼核+丘腦組)中14個複本/細胞。與組C3類似，在組C2中可見大致13個vg複本/細胞(僅丘腦)。一般而言，在mCTX沖取物中，用HTT mRNA減弱追蹤VG含量，使得較高數目之VG複本對應於較高HTT mRNA減弱。 表81. mCTX沖取物中之VG含量
組 描述 VG 複本 / 細胞 ( 平均值 ± 標準差， N=3)
組C1 媒劑 0.0 ± 0.00
組C2 僅丘腦 12.5 ± 4.8
組C3 中度劑量 13.8 ± 7.1
組C4 高劑量 31.8 ± 5.7
ix. 在來自 NHP ssCTX 之沖取物中之 HTT 減弱及 VG 量測
使用含有來自所有四個組之體覺皮質的兩個所選腦板來收集2 mm體覺皮質(ssCTX)沖取物。每隻動物收集六個ssCTX沖取物，收集總數72個沖取物。自皮質之每一側收集相等數目之沖取物。分別使用bDNA及ddPCR處理並分析樣品之HTT mRNA及載體基因體(VG)。bDNA及ddPCR如實例1中所述進行。在分析期間所有樣品均採用盲法。
針對HTT mRNA減弱，在歸一化至媒劑對照組之後，AAV1-VOYHT1處理組之ssCTX沖取物中之相對HTT mRNA含量展現於表82中。在組C4 (高劑量雙側殼核+丘腦組)中觀測到最大HTT減弱(9%)，其中組C3 (中度劑量雙側殼核+丘腦組)中之HTT減弱(5%)及組C2 (4%；僅丘腦)較少。組C4中之HTT mRNA減弱為組C3及組C2中觀測到的大致兩倍。 表82. ssCTX沖取物中之HTT減弱
組 描述 相對於媒劑之 HTT mRNA ( 平均值 + 標準差 ， N=3)
組C1 媒劑 100 ± 7
組C2 僅丘腦 96 ± 6
組C3 中度劑量 95 ± 16
組C4 高劑量 91 ± 6
針對VG含量，mCTX沖取物展示每個細胞之VG複本之劑量相關之增加，如表83中所示。組C4中之VG複本/細胞之數目為大致14個複本/細胞(高劑量雙側殼核+丘腦組)，及組C3中之8個複本/細胞(中度劑量雙側殼核+丘腦組)。如同組C3，在組C2 (僅丘腦)中可見大致8個VG複本/細胞。通常用mCTX沖取物中之HTT mRNA減弱追蹤VG含量，使得較高數目之VG複本對應於較高HTT mRNA減弱。 表83. ssCTX沖取物中之VG含量
組 描述 VG 複本 / 細胞 ( 平均值 ± 標準差， N=3)
組C1 媒劑 0.0 ± 0.15
組C2 僅丘腦 7.8 ± 1.8
組C3 中度劑量 8.1 ± 6.1
組C4 高劑量 13.5 ± 1.5
x. NHP 運動及體覺皮質中 VG 及 HTT mRNA 之原位雜交 (ISH)
如實例1中所描述，使用BaseScope™分析處理含有來自組C1 (媒劑組)及組C4 (高劑量殼核+丘腦組)動物之運動及體覺皮質的所選腦板以用於原位雜交(ISH)，從而偵測載體基因體DNA及HTT mRNA。在顯微鏡下偵測並分析影像之載體基因體及HTT mRNA含量。
在輸注部位(丘腦)處的細胞之細胞核中偵測到大量VG。亦在多個不同的運動神經元及體覺皮質(主要為錐體神經元)層中偵測到VG。在AAV1-VOYHT1處理之後，在運動及感覺皮質神經元層I-VI之細胞核中偵測到實質性VG信號。
在輸注部位(丘腦)處的細胞中觀測到實質性HTT mRNA減少。在分析用於ISH之腦切片內並未顯著含有殼核。ISH結果證明在所有NHP皮質層及輸注部位中之廣泛AAV1-VOYHT1分佈，且證實此等區域中之HTT mRNA減少。ISH結果支持HTT在運動及體覺皮質中之降低及神經元在此等區域之多個層中之轉導。xi. 在來自 NHP 殼核之沖取物中之 HTT 減弱、 VG 量測及 AAV1-VOYHT1 特異性 miRNA 表現
使用含有來自所有四個組之殼核的兩個所選腦板來收集2 mm殼核沖取物。自一個板之每一側收集五個沖取物且自另一板之每一側收集3個沖取物，自每隻動物收集總共16個沖取物。自所有12隻動物收集總共192個殼核沖取物。分別使用bDNA及ddPCR處理樣品且分析樣品之HTT mRNA含量及VG含量。bDNA及ddPCR如實例1中所述進行。使用深度測序及/或兩步驟莖環即時定量PCR (RT-qPCR)方法處理及分析樣品之AAV1-VOYHT1特異性miRNA含量。針對莖環RT-qPCR，自用於分析HTT mRNA及VG之相同沖取物溶胞物純化總RNA (miRvana，目錄號AM1560, ThermoFisher Scientific)，且與AAV1-VOYHT1特異性miRNA引導股同源之莖環寡核苷酸用於引發逆轉錄酶反應以產生cDNA。隨後，將與AAV1-VOYHT1特異性miRNA及莖環同源之正向及反向引子用於傳統qPCR反應(第二)步驟。莖環引子及qPCR探針集兩者經常規設計以用於特異性偵測AAV1-VOYHT1 miRNA引導股。在分析期間所有樣品均採用盲法。使用單向ANOVA以及杜凱氏多重比較檢定(Tukey's multiple comparison test)來進行資料之統計比較。小於0.05之P值指示統計學上顯著之差異。
針對HTT mRNA減弱，在媒劑對照組歸一化之後，來自各AAV1-VOYHT1處理組之所有殼核沖取物中之相對HTT mRNA含量展現於表84中。分別經由雙側僅丘腦給藥(組C2)及中度劑量(組C3)及高劑量(組C4)之雙側殼核及丘腦給藥而在殼核沖取物中達成平均12%、61%及67% HTT mRNA減弱。雙側僅丘腦給藥引起殼核中統計學上顯著之HTT mRNA減弱。各組中呈現超過30% HTT減弱之沖取物的百分比亦展示於表83中。中度劑量及高劑量之雙側殼核及丘腦給藥引起超過60%殼核沖取物呈現超過30% HTT mRNA減弱，其中高劑量組之所有沖取物超出30% HTT mRNA減弱。 表84.所有殼核沖取物中之HTT減弱
組 描述 樣品尺寸 HTT mRNA 相對於媒劑 (%± 標準差 ) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於媒劑 ) 沖取物 % ≥ 30% KD
組C1 媒劑 48 100 ± 8 - 0
組C2 僅丘腦 48 88 ± 11 ＜0.0001 6.3
組C3 中度劑量 48 39 ± 17 ＜0.0001 89.6
組C4 高劑量 48 33 ± 10 ＜0.0001 100
在歸一化媒劑對照組之後，自AAV1-VOYHT1處理組中之各動物所分析之相對HTT mRNA含量展現於表85中。 表85.對每隻動物求取的殼核沖取物中HTT減弱的平均值
組 描述 樣品尺寸 HTT mRNA 相對於媒劑 (%± 標準差 ) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於媒劑 ) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於僅丘腦 ) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於中度劑量 )
組C1 媒劑 3 100 ± 6 - - -
組C2 僅丘腦 3 88 ± 3 0.1178 - -
組C3 中度劑量 3 39 ± 8 ＜0.0001 ＜0.0001 -
組C4 高劑量 3 33 ± 4 ＜0.0001 ＜0.0001 0.6295
對於VG含量，在來自各組之所有殼核沖取物中偵測到的載體基因體複本之平均數目展現於表86中。在殼核沖取物中經由僅雙側丘腦達成平均每個二倍體細胞21、869及1211個VG複本，且雙側殼核及丘腦給藥分別中度劑量及高劑量。與僅雙側丘腦給藥相比，中度劑量及高劑量之雙側殼核及丘腦給藥引起至殼核中之顯著較高VG分佈。 表86.所有殼核沖取物中之VG複本
組 描述 樣品尺寸 VG 複本 / 細胞 ( 平均值 ± 標準差 )
組C1 媒劑 48 0.43 ± 1.33
組C2 僅丘腦 48 21.03 ± 9.05
組C3 中度劑量 48 869.3 ± 846.6
組C4 高劑量 48 1211 ± 1047.0
自各動物分析之載體基因體複本之數目展現於表87中。 表87.對每隻動物求取的殼核沖取物中VG複本的平均值
組 描述 樣品尺寸 VG 複本 / 細胞 ( 平均值 ± 標準差 )
組C1 媒劑 3 0.39 ± 0.53
組C2 僅丘腦 3 21.03 ± 3.72
組C3 中度劑量 3 869.3 ± 338.0
組C4 高劑量 3 1211 ± 540.1
應用格拉布氏測試(Grubbs' test) (Q=0.1%)移除離群值且重新計算VG複本/細胞。在此事後統計分析之後，針對組C2、C3及C4，每隻動物殼核沖取物中之VG複本分別定量為21.0±6.5、869.3±283.0及1210.8±387.3。
圖16A中展示殼核沖取物中之HTT mRNA減弱相對於載體基因體含量之相關性。來自所有給藥組之所有殼核沖取物的相關曲線產生劑量-反應曲線，其中媒劑組在曲線之頂部，僅丘腦組主要在頂部肩部，中度劑量組沿斜坡及底部均勻分佈，及高劑量組主要在底部。在每個二倍體細胞大致40個VG (該範圍為每個二倍體細胞20-50個VG)下計算HTT減弱之EC50 (Graphpad Prism，非線性回歸4參數曲線擬合) 。
對於miRNA分析，每個細胞之AAV1-VOYHT1特異性miRNA複本之平均數量及每個細胞之對應平均VG複本、相對於對照物之HTT mRNA含量及對每隻動物計算求取的AAV1-VOYHT1特異性miRNA的平均值展現於表88中。此等分析係使用殼核沖取物之子組進行，且因此展現於表88中之值係指來自每隻動物(每半球3個) 6個殼核沖取物的資料，總共72個總樣品。 表88.對每隻動物求取的殼核沖取物中AAV1-VOYHT1特異性miRNA表現的平均值
組 描述 樣品尺寸 miRNA 複本 / 細胞 ( 平均值 ± 標準差 ) VG 複本 / 細胞 ( 平均值 ± 標準差 ) HTT mRNA 相對於媒劑 (%± 標準差 ) HTT miRNA/VG ( 平均值 ± 標準差 )
組C1 媒劑 3 2.9 ± 4.44 0.08 ± 0.21 100 ± 9 15 ± 32
組C2 僅丘腦 3 2283 ± 1495 21 ± 7 91 ± 8 128 ± 107
組C3 中度劑量 3 8808 ± 7955 793 ± 773 44 ± 18 44 ± 55
組C4 高劑量 3 8869 ± 7568 1258 ± 1118 35 ± 10 11 ± 7
圖16B中展示來自各處理組之所有殼核沖取物中的AAV1-VOYHT1特異性miRNA表現相對於載體基因體含量之相關性(r=0.8606，p＜0.001))。增強的VG生物分佈對應於AAV1-VOYHT1處理組中增加的AAV1-VOYHT1特異性miRNA表現。
圖16C中展示來自各處理組之所有殼核沖取物中的AAV1-VOYHT1特異性miRNA表現相對於載體HTT mRNA降低之相關性(r=-0.6788，p＜0.0001)。增加之AAV1-VOYHT1特異性miRNA表現對應於增強之HTT mRNA降低AAV1-VOYHT1處理組。
總之，僅丘腦給藥產生較適度的VG生物分佈、AAV1-VOYHT1特異性miRNA表現及殼核中之HTT mRNA降低。相對於僅丘腦給藥，組合殼核及丘腦給藥在殼核中產生較大VG生物分佈、AAV1-VOYHT1特異性miRNA表現及穩固HTT mRNA降低。最後，AAV1-VOYHT1特異性miRNA表現與VG生物分佈及HTT mRNA降低相關。xii. 在來自 NHP 尾核之沖取物中之 HTT 減弱、 VG 量測及 AAV1-VOYHT1 特異性 miRNA 表現
使用含有來自所有四個組之尾核沖取物的所選腦板來收集2 mm尾核沖取物。自板之每一側收集兩個沖取物，其中自每隻動物收集總共4個沖取物。自所有12隻動物收集總共48個尾核沖取物。分別使用bDNA及ddPCR處理樣品且分析樣品之HTT mRNA含量及VG含量。bDNA及ddPCR如實例1中所述進行。使用深度測序及/或兩步驟莖環即時定量PCR (RT-qPCR)方法處理及分析樣品之AAV1-VOYHT1特異性miRNA含量。針對莖環RT-qPCR，自用於分析HTT mRNA及VG之相同沖取物溶胞物純化總RNA (miRvana，目錄號AM1560, ThermoFisher Scientific)，且與AAV1-VOYHT1特異性miRNA引導股同源之莖環寡核苷酸用於引發逆轉錄酶反應以產生cDNA。隨後，將與AAV1-VOYHT1特異性miRNA及莖環同源之正向及反向引子用於傳統qPCR反應(第二)步驟。莖環引子及qPCR探針集兩者經常規設計以用於特異性偵測AAV1-VOYHT1 miRNA引導股。在分析期間所有樣品均採用盲法。使用單向ANOVA以及杜凱氏多重比較檢定來進行資料之統計比較。小於0.05之P值指示統計學上顯著之差異。
針對HTT mRNA減弱，在媒劑對照組歸一化之後，來自各AAV1-VOYHT1處理組之所有尾核沖取物中之相對HTT mRNA含量展現於表89中。分別經由雙側僅丘腦給藥(組C2)及中度劑量(組C3)及高劑量(組C4)之雙側殼核及丘腦給藥而在尾核沖取物中達成平均51%、61%及68% HTT mRNA減弱。雙側僅丘腦給藥引起尾核沖取物中之穩固及顯著HTT mRNA減弱(51%)。在各組中呈現超過30% HTT減弱之沖取物的百分比亦展示於表88中。所有三個給藥組(雙側僅丘腦給藥，中度劑量及高劑量之雙側殼核及丘腦給藥)具有92%之尾核沖取物達成至少30% HTT mRNA減弱。 表89.所有尾核沖取物中之HTT減弱
組 描述 樣品尺寸 HTT mRNA 相對於媒劑 (%± 標準差 ) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於媒劑 ) 沖取物 % ≥ 30% KD
組C1 媒劑 12 100 ± 6 - 0
組C2 僅丘腦 12 49 ± 16 ＜0.0001 92
組C3 中度劑量 12 39 ± 15 ＜0.0001 92
組C4 高劑量 12 32 ± 15 ＜0.0001 92
在歸一化媒劑對照組之後，自AAV1-VOYHT1處理組中之各動物所分析之相對HTT mRNA含量展現於表90中。 表90.對每隻動物求取的尾核沖取物中HTT減弱的平均值
組 描述 樣品尺寸 HTT mRNA 相對於媒劑 (%± 標準差 ) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於媒劑 ) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於僅丘腦 ) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於中度劑量 )
組C1 媒劑 3 100 ± 6 - - -
組C2 僅丘腦 3 49 ± 13 0.0012 - -
組C3 中度劑量 3 39 ± 11 0.0004 0.6889 -
組C4 高劑量 3 32 ± 9 0.0002 0.2786 0.8347
對於VG含量，在來自各組之所有尾核沖取物中偵測到的載體基因體複本之平均數目展現於表91中。平均每個二倍體細胞44、146及99個載體基因體複本分別經由雙側僅丘腦給藥、中度劑量及高劑量之雙側殼核及丘腦給藥在尾核沖取物中達成。 表91.所有尾核沖取物中之VG複本
組 描述 樣品尺寸 VG 複本 / 細胞 ( 平均值 ± 標準差 )
組C1 媒劑 12 0.12 ± 0.15
組C2 僅丘腦 12 44.18 ± 22.86
組C3 中度劑量 12 146.2 ± 200.9
組C4 高劑量 12 99.22 ± 45.01
自各動物分析之載體基因體複本之數目展現於表92中。 表92.每隻動物之尾核沖取物中之VG複本
組 描述 樣品尺寸 VG 複本 / 細胞 ( 平均值 ± 標準差 )
組C1 媒劑 3 0.10 ± 0.05
組C2 僅丘腦 3 44.18 ± 10.16
組C3 中度劑量 3 146.2 ± 182.9
組C4 高劑量 3 99.22 ± 29.22
應用格拉布氏測試(Q=0.1%)以移除離群值且重新計算尾核中之VG複本/細胞。在此事後統計分析之後，針對組C2、C3及C4，尾核沖取物中之VG複本分別定量為44.2±10.2、107.4±116.0及99.2±29.2。
圖17A中展示尾核沖取物中之HTT mRNA減弱相對於載體基因體含量之相關性。來自所有給藥組之所有尾核沖取物的相關曲線產生劑量-反應曲線，且所有其他給藥組沿斜坡及底部開端分散。在每個二倍體細胞大致23個VG (該範圍為每個二倍體細胞20-50個VG)下計算HTT減弱之EC50 (Graphpad Prism，非線性回歸4參數曲線擬合) 。
對於miRNA分析，每個細胞之AAV1-VOYHT1特異性miRNA複本之平均數量及每個細胞之對應平均VG複本、相對於對照物之HTT mRNA含量及對每隻動物計算求取的AAV1-VOYHT1特異性miRNA的平均值展現於表93中。此等分析係使用尾核沖取物之子組來執行，且因此表93中展現之值係指來自每隻動物(每半球2個) 4個殼核沖取物的資料，總共48個總樣品。 表93.對每隻動物求取的尾核沖取物中AAV1-VOYHT1特異性miRNA表現的平均值
組 描述 樣品尺寸 miRNA 複本 / 細胞 ( 平均值 ± 標準差 ) VG 複本 / 細胞 ( 平均值 ± 標準差 ) HTT mRNA 相對於媒劑 (%± 標準差 ) HTT miRNA/VG ( 平均值 ± 標準差 )
組C1 媒劑 3 1.5 ± 0.53 0.05 ± 0.11 100 ± 6 10 ± 19
組C2 僅丘腦 3 3535 ± 1050 44 ± 10 49 ± 13 90 ± 35
組C3 中度劑量 3 3730 ± 1944 146 ± 183 39 ± 11 62 ± 55
組C4 高劑量 3 4468 ± 1356 99 ± 29 32 ± 9 51 ± 20
圖17B中展示來自各處理組之所有尾核沖取物中的AAV1-VOYHT1特異性miRNA表現相對於載體基因體含量之相關性(r=0.6782，p＜0.0001)。增強的VG生物分佈對應於AAV1-VOYHT1處理組中增加的AAV1-VOYHT1特異性miRNA表現。如上，當來自劑最佳化研究III中之動物組之載體基因體含量資料與來自劑量最佳化研究I之彼等資料組合時，格拉布氏測試(Q=0.1%)用於偵測顯著離群值。在自圖17B中所示之相關性分析移除一個離群值後，來自各處理組之尾核沖取物中之AAV1-VOYHT1特異性miRNA表現相對於載體基因體含量之間的正關係仍存在(r=0.7452，p＜0.001)。在移除所有離群值之後，組A2、組A3、組A5及組C3之尾核沖取物中之VG複本/細胞(平均值±標準差)分別至1.8±0.5、10.7±10.3、0.3±0.2及107.4±116.0個VG複本/細胞。
圖17C中展示來自各處理組之所有尾核沖取物中的AAV1-VOYHT1特異性miRNA表現相對於載體HTT mRNA降低之相關性(r=-0.8798，p＜0.0001)。增加的AAV1-VOYHT1特異性miRNA表現對應於增強的HTT mRNA降低AAV1-VOYF1處理組。
總之，僅丘腦給藥產生尾核中之顯著VG生物分佈、顯著AAV1-VOYHT1特異性miRNA表現及實質性HTT mRNA降低。與僅丘腦給藥相比，組合殼核及丘腦給藥在尾核中產生較大VG生物分佈、AAV1-VOYHT1特異性miRNA表現及穩固HTT mRNA降低。最後，AAV1-VOYHT1特異性miRNA表現與VG生物分佈及HTT mRNA降低相關。xiii. 在來自 NHP 丘腦之沖取物中之 HTT 減弱及 VG 量測
使用含有來自所有四個組之丘腦的所選腦板來收集2 mm丘腦沖取物。自板之每一側收集五個沖取物，其中自每隻動物收集總共10個沖取物。自所有12隻動物收集總數120個丘腦沖取物。分別使用bDNA及ddPCR處理樣品且分析樣品之HTT mRNA含量及VG含量。bDNA及ddPCR如實例1中所述進行。在分析期間所有樣品均採用盲法。使用單向ANOVA以及杜凱氏多重比較檢定來進行資料之統計比較。小於0.05之P值指示統計學上顯著之差異。
針對HTT mRNA減弱，在歸一化至媒劑對照組之後，來自AAV1-VOYHT1處理組之所有丘腦沖取物中之相對HTT mRNA含量展現於表94中。分別經由雙側僅丘腦給藥(組C2)及中度劑量(組C3)及高劑量(組C4)之雙側殼核及丘腦給藥而在丘腦沖取物中達成平均76%、76%及73%之HTT mRNA減弱。在各組中呈現超過30% HTT減弱之沖取物的百分比亦展示於表94中。對於所有三個給藥組，100%之丘腦沖取物達成至少30%之HTT mRNA KD。 表94.所有丘腦沖取物中之HTT減弱
組 描述 樣品尺寸 HTT mRNA 相對於媒劑 (%± 標準差 ) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於媒劑 ) 沖取物 % ≥ 30% KD
組C1 媒劑 30 100 ± 8 - 0
組C2 僅丘腦 30 24 ± 5 ＜0.0001 100
組C3 中度劑量 30 24 ± 9 ＜0.0001 100
組C4 高劑量 30 27 ± 5 ＜0.0001 100
在歸一化媒劑對照組之後，自AAV1-VOYHT1處理組中之各動物所分析之相對HTT mRNA含量展現於表95中。 表95.對每隻動物求取的丘腦沖取物中HTT減弱的平均值
組 描述 樣品尺寸 HTT mRNA 相對於媒劑 (%± 標準差 ) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於媒劑 ) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於僅丘腦 ) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於中度劑量 )
組C1 媒劑 3 100 ± 3 - - -
組C2 僅丘腦 3 24 ± 4 ＜0.0001 - -
組C3 中度劑量 3 24 ± 5 ＜0.0001 0.9995 -
組C4 高劑量 3 27 ± 2 ＜0.0001 0.7505 0.8081
對於VG含量，在來自各組之所有丘腦沖取物中偵測到的載體基因體複本之平均數目展現於表96中。觀測到所有3個處理組中之載體基因體複本之類似含量。平均每個二倍體細胞2015、1704、2747個載體基因體複本分別經由雙側僅丘腦給藥、中度劑量及高劑量之雙側殼核及丘腦給藥在丘腦沖取物中達成。 表96.所有丘腦沖取物中之VG複本
組 描述 樣品尺寸 VG 複本 / 細胞 ( 平均值 ± 標準差 )
組C1 媒劑 30 0.13 ± 0.27
組C2 僅丘腦 30 2015 ± 1088
組C3 中度劑量 30 1704 ± 741.9
組C4 高劑量 30 2747 ± 896.1
自各動物分析之載體基因體複本之數目展現於表97中。 表97.對每隻動物求取的丘腦沖取物中VG複本的平均值
組 描述 樣品尺寸 VG 複本 / 細胞 ( 平均值 ± 標準差 )
組C1 媒劑 3 0.13 ± 0.07
組C2 僅丘腦 3 2015 ± 310.9
組C3 中度劑量 3 1704 ± 467.3
組C4 高劑量 3 2747 ± 691.2
丘腦沖取物中之HTT mRNA減弱相對於載體基因體含量之相關性展示於圖18中。所有給藥組達成在來自丘腦之沖取物中每個細胞類似的載體基因體複本及類似的減弱效率。來自所有給藥組之所有丘腦沖取物之相關繪圖展示媒劑組在左上部，且所有其他給藥組大部分在底部之極右側彼此重疊。EC50 計算由於主要存在完全陽性及陰性群體而為不明確的。
總而言之，對殼核、尾核及丘腦之沖取物分析揭示，在輸注部位(殼核及丘腦)以及所有三個給藥組(僅丘腦給藥，及中度劑量及高劑量之雙側殼核及丘腦給藥)中之尾核中達成實質性HTT mRNA減弱。另外，載體基因體含量與殼核、尾核及丘腦中之HTT mRNA減弱充分相關，證明了高載體基因體含量下減弱中之平線區。xiv. 臨床症狀及組織病理學
在接受AAV1-VOYHT1的9個中之7個NHP中，在輸注後未觀測到臨床症狀或肢體發現。在其他兩個NHP中，觀測到縮短之步驟及少量肢體發現。然而，未發現組織病理學變化，其將引起此等臨床症狀或與此等臨床症狀相關。歸因於手術程序，預期有與導管尖及/或跡線相關之組織病理學發現，但無一者產生任何特定臨床症狀。預期在丘腦輸注部位處有基本發現且該等發現包括神經膠瘤病、神經元退化、神經膠質細胞空泡形成及分佈比殼核略多廣泛的單核細胞浸潤。預期無一者產生任何臨床症狀。僅在鄰近導管道處觀測到水腫，表明體積具有良好耐受性。未在任何組中發現對軀體感覺或運動皮質之神經元具有不利影響之跡象。此等發現表明，未觀測到之不良影響水準(no-observed-adverse-effect-level，NOAEL)係在最低限度下，經由殼核及丘腦輸注以高劑量投與之AAV1-VOYHT1 (參見組C4)。 實例4.調配物最佳化
初始調配物篩選將磷酸鹽/蔗糖/NaCl調配物(2.7 mM磷酸鈉(二元)、1.54 mM磷酸鉀(單)、155 mM NaCl及5% (w/v)蔗糖(pH 7.2，450 mOsm/kg)鑑別為用於AAV1-VOYHT1載體之可接受地穩定調配物。亦將高鹽調配物鑑別為穩定化的。
調配物進一步針對賦形劑、Na/K比率、pH及重量莫耳滲透濃度最佳化，同時調整適於CNS投與之因素。可用於調配AAV1-VOYHT1載體之三種溶液展現於表98中。 表98.用於AAV1-VOYHT1載體之調配物
調配物 1 調配物 2 調配物 3
10 mM磷酸鈉 1.5 mM磷酸鉀 95 mM氯化鈉 7% (w/v)蔗糖 0.001% (w/v) Pluronic® F-68 在5℃下pH 7.4 ± 0.2 10 mM Tris鹼              6.25 mM HCl 1.5 mM氯化鉀 100 mM氯化鈉 7% (w/v)蔗糖 0.001% (w/v) Pluronic® F-68 在5℃下pH 8.0 ± 0.2 10 mM Tris鹼              8.95 mM HCl 1.5 mM氯化鉀 100 mM氯化鈉 7% (w/v)蔗糖 0.001% (w/v) Pluronic® F-68 在5℃下pH 7.5 ± 0.2
待調配於以上所鑑別之溶液中之AAV1-VOYHT1載體之濃度為約2.7e13 vg/mL，但濃度可增加至5e13 vg/ml。展示高濃度AAV1-VOYHT1載體在不存在聚集之情況下難以穩定化。對調配物篩選之分析指示蔗糖含量之增加通常改良載體穩定性且防止聚集。約5%至9%之蔗糖含量提供AAV1-VOYHT1載體良好穩定性，其中最佳濃度為用於測試載體之約7%蔗糖以及所需調配物濃度。蔗糖使用含量可受生理重量莫耳滲透濃度限制。此外，展示較高重量莫耳滲透濃度及/或較多NaCl有利於載體穩定性。 實例5.向HD患者投與AAV1-VOYHT1
在實例4中所鑑別之適當調配物中調配之AAV1-VOYHT1載體經由雙側腦實質輸注至殼核及丘腦中，使用MRI引導對流增強遞送(CED)投與至階段1 HD患者中。待輸注之調配溶液中之AAV1-VOYHT1載體之濃度在2.7e12至2.7e13 vg/mL之間。輸注至殼核及丘腦之AAV1-VOYHT1之體積分別為300-1500 µL/半球及1300-2500 µL/半球。向殼核及丘腦投與之劑量分別為8e11至4e13 vg/半球及3.5e12至6.8e13 vg/半球。向患者投與之總劑量為約8.6e12至2e14 vg。AAV1-VOYHT1治療使得患者之紋狀體及皮質中之HTT mRNA含量顯著降低。 實例6.最低有效劑量(MED)研究i. 研究設計
作為以上實例1 (劑量最佳化研究I)之延伸，此研究探討在恆河獼猴之紋狀體、皮質及丘腦內含有7%蔗糖之水溶液中調配之低劑量之AAV1-VOYHT1 (VOYHT1之SEQ ID NO: 1352)的藥理學活性曲線，以鑑別最小有效劑量或最低有效劑量(MED)或最小有效濃度(MEC)，以用於外插至臨床給藥範式。針對用於治療早期症狀性及/或前驅性亨丁頓舞蹈症(HD)之治療劑的特定發展評定MED/MEC安全裕度。研究目的包括在腦區域，例如紋狀體、皮質及丘腦，且尤其具有MED之皮質神經元中達成目標HTT降低(mRNA減弱)。
為指導MED研究參數及評估VY-HTT01之安全性及生物分佈，在成年恆河獼猴(普通獼猴)中評估及鑑別未觀測到之不良影響水準(NOEFL)劑量。使用衣殼特異性抗AAV1抗體對動物(N=48)進行預篩選以納入NOEFL評估中。藉由用於臨床試驗之預定投與途徑遞送含有AAV1-VOYHT1或媒劑對照物之測試物品，例如使用磁共振成像(MRI)引導之對流增強遞送(CED)及立體定位裝置雙側腦實質內輸注至殼核(後部)及丘腦(前額)中。待測試之測試物品之劑量在0 vg/動物(媒劑)至2.24×1013 vg/mL (AAV1-VOYHT1)範圍內。總之，三個AAV1-VOYHT1劑量(低劑量、中等劑量及高劑量)為2.24×1012 vg/動物(4.2×1011 vg/殼核，7.0×1011 vg/丘腦)、6.44×1012 vg/mL (1.22×1012 vg/殼核，2.0×1012 vg/丘腦)及2.24e13 vg/mL (4.2×1012 vg/殼核，7.0×1012 vg/丘腦)。殼核之輸注參數為：1-5 µL/min (速率)；10-28 min (持續時間)，總和54分鐘；及16-84 µL (體積)，總和150 µL。丘腦之輸注參數為：1-5 µL/min (速率)；15-50 min (持續時間)，總和為90分鐘；及25-150 µL，總和250 µL。在整個壽命中週期性評估臨床症狀。在給藥之後5、13、26或53週使動物安樂死，且收集神經及其他組織用於事後分析。在各時間點評估病毒基因體之生物分佈、微RNA含量、HTT mRNA之減少量、HTT蛋白之減少量及腦組織學。
針對MED研究，使用總共12隻動物。各動物分配至4個處理組中之1個處理組，如表99中所概述。動物使用磁共振成像(MRI)引導之對流增強遞送(CED)接受雙側腦實質內輸注含有AAV1-VOYHT1或媒劑對照物之測試物品至殼核(後部)及丘腦(前額)中。在給藥測試物品或媒劑之前，進行聚焦於神經狀態之功能觀測組(FOB)評估。若必要，則在輸注後時間點，例如7天及93天，以及在壽命期間每週進行相同FOB。給藥後13週使動物安樂死，且收集組織用於事後分析。表 99. 稀釋劑及給藥溶液
測試物品 動物數量 給藥效價 (vg/ml) 每半球之目標部位 ( 體積及總 vg) 總劑量 (vg/ 動物 )
殼核 (150 µL) 丘腦 (250 µL)
媒劑 1M/2F 0 0 0 0
VY-HTT01 2M/1F 1.9e11 2.85e10 4.75e10 1.5e11
1M/2F 5.7e11 8.6e10 1.4e11 4.5e11
2M/1F 2.8e12 4.2e11 7e11 2.2e12
針對組織之事後分析，在22個腦切片、雷射捕獲之皮質神經元中及在高度灌注組織(例如心臟、肺、肝、脾、腎臟及引流淋巴結)中評定載體基因體之生物分佈。亦在包括自紋狀體(尾核及殼核)、丘腦及皮質取樣之22個腦切片中評定微RNA及mRNA。mRNA在雷射捕獲之皮質神經元中量測。在紋狀體、丘腦、皮質及生物流體(例如腦脊髓液(CSF))中量測HTT蛋白。在具有至少50個複本/微克之基因體DNA之腦及高度灌注組織中進行組織學。
可基於此研究之結果計算人類等效劑量。
詳細方法如上文實例1中所描述。 實例7. NHP殼核、丘腦及尾核中之HTT蛋白及mRNA評估i. 研究設計
作為上文詳細描述的實例1 (劑量最佳化研究I)及實例3 (劑量最佳化研究III)之延伸，此研究經設計以在非人類靈長類(NHP)恆河獼猴(普通獼猴)中之雙側組合殼核內及丘腦內輸注不同劑量之AAV1-VOYHT1 (本文稱為AAV1-VOYHT1或VY-HTT01；VOYHT1之SEQ ID NO: 1352)之後的五週，量測來自殼核、尾核及丘腦之組織沖取物中的HTT蛋白及mRNA含量。
此研究涉及五組選自實例1及實例3 (上文)之動物，以便跨越總VY-HTT01之大致100倍範圍，以及劑量增量大致10倍。動物研究組，包括f給藥參數，展現於表100中。 表100.研究設計
組 動物數量 描述 體積 ( 微升 / 側 ) 給藥效價 (VG/mL) 總劑量 (VG)
殼核 丘腦
組A6 3 媒劑 左：100 右：150 左：150 右：250 0.0 0.0
組A5 3 中等體積，低濃度 100 150 2.7e11 1.35e11
組A2 3 中等體積，高濃度 100 150 2.7e12 1.35e12
組C1b 3 媒劑 150 250 0.0 0.0
組C4 3 大體積，高濃度 150 250 2.2e13 1.78e13
除如下文所概述的藉由UPLC-MS/MS (超高效液相層析質譜分析及液相層析聯合質譜分析)或LC-MS/MS定量HTT蛋白以外，詳細方法如上文在實例1中所描述。ii. 用於定量 HTT 蛋白之 LC-MS/MS
來自殼核、尾核及丘腦之猴腦組織沖取物在雙側組合脊柱內及丘腦內注射VY-HTT01劑量(如上文在實例1中所描述)之後，進行稱取，且粉碎成乾燥組織粉末用於後續藉由UPLC-MS/MS或LC-MS/MS定量HTT蛋白。HTT蛋白含量係基於來源於胰蛋白酶消化程序之代表性HTT肽來量測，且歸一化至肌動蛋白含量。簡言之，在組織蛋白質提取試劑中均質化經粉碎之腦組織粉末。離心勻漿且隨後使上清液(溶胞物)還原，變性，且用碘乙醯胺烷基化。用胰蛋白酶處理烷基化樣品以產生HTT肽。在消化樣品中藉由LC-MS/MS量測HTT肽之濃度。用合成肽製備LC-MS/MS方法之校準曲線。採用對應經質移的穩定的同位素標記之肽作為內標。使用具有Analyst and MultiQuant軟體之高解析度SCIEX Triple TOF 6600 LC-MS/MS系統進行定量。在消化樣品中量測之標誌肽含量(ng/mL)藉由分子量轉化成蛋白質濃度。糾正HTT蛋白濃度用於樣品處理，且以ng/mg肌動蛋白報導。iii. 殼核 HTT 蛋白及 mRNA 含量
為評估殼核中之HTT蛋白及mRNA含量，自右半球中之殼核收集4個組織沖取物，產生每個VY-HTT01組總共12個沖取物及兩個媒劑組24個沖取物。如上文所述，將殼核組織沖取物粉末用於藉由LC-MS/MS之HTT及肌動蛋白蛋白質分析。HTT蛋白含量歸一化至肌動蛋白含量，且接著進一步歸一化至媒劑組。表101中展現表示為媒劑(veh)之百分比的平均相對剩餘殼核HTT蛋白及相對殼核HTT蛋白減弱(KD)，以及藉由單向ANOVA及杜凱氏多重比較而產生之p值。 表101. NHP殼核中之HTT蛋白降低
組 動物數量 總劑量 (VG) 相對剩餘 HTT 蛋白 ( 媒劑 ± 標準差 之 %) HTT 蛋白 KD ( 媒劑 ± 標準差之 %) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於組 A5) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於組 A2) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於組 C4)
組A6 3 0.0 100 ± 6 0 ± 6 0.0265 ＜0.0001 ＜0.0001
組C1b 3 0.0
組A5 3 1.35e11 81 ± 12 19 ± 12 - 0.0002 0.0001
組A2 3 1.35e12 38 ± 2 62 ± 2 - - 0.9966
組C4 3 1.78e13 37 ± 11 63 ± 11 - - -
在雙側殼核內及丘腦內輸注不同總劑量之VY-HTT01之後，在殼核中達成顯著且劑量依賴性HTT蛋白降低。特定言之，相對於媒劑組(組A6及組C1b)，組C4 (1.78×1013 個VG或VG/動物)、組A2 (1.35×1012 個VG)及組A5 (1.35×1011 個VG)分別存在平均63%、62%及19% HTT蛋白KD。
相對於媒劑，HTT蛋白KD在VY-HTT01之所有劑量下為統計學上顯著的(P＜0.05，藉由單向ANOVA以及杜凱氏多重比較檢定)，其中最高劑量為1.78×1013 個VG或VG/動物(組C4)，使得HTT蛋白KD (P＜0.001，藉由單向ANOVA以及杜凱氏多重比較檢定)在統計學上比用每隻動物1.35×1011 個VG之總劑量(組A5)達成的要更高。另外，每隻動物1.35×1012 個VG之第二最高劑量(組A2)使得HTT蛋白KD (P＜0.001，藉由單向ANOVA以及杜凱氏多重比較檢定)在統計學上比所評估之最低劑量(每隻動物1.35×1011 個VG)的更高。在所測試之兩個最高總劑量(每隻動物1.78×1013 及1.35×1012 個VG)之間，HTT蛋白KD不存在統計學上顯著之差異。
在用於HTT蛋白定量之相同殼核沖取物中，使用針對恆河猴HTT、TBP、AARS及XPNPEP1之特定探針集，如實例1中所述，藉由bDNA分析量測殼核中之HTT mRNA含量。HTT mRNA含量歸一化至三個管家基因TBP、AARS及XPNPEP1之幾何平均值，且隨後進一步歸一化至媒劑組。表102中展現表示為媒劑(veh)之百分比的平均相對剩餘殼核HTT mRNA及相對殼核HTT mRNA減弱(KD)，以及藉由單向ANOVA及杜凱氏多重比較產生之p值。 表102. NHP殼核中之HTT mRNA降低
組 動物數量 總劑量 (VG) 相對剩餘 HTT mRNA ( 媒劑 ± 標準差之 %) HTT mRNA KD ( 媒劑 ± 標準差之 %) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於組 A5) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於組 A2) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於組 C4)
組A6 3 0.0 100 ± 4 0 ± 4 0.004 ＜0.0001 ＜0.0001
組C1b 3 0.0
組A5 3 1.35e11 77 ± 7 23 ± 7 - 0.0007 0.0006
組A2 3 1.35e12 43 ± 14 57 ± 14 - - 0.9995
組C4 3 1.78e13 42 ± 3 58 ± 3 - - -
在雙側殼核內及丘腦內輸注不同總劑量之VY-HTT01之後，在殼核中達成顯著且劑量依賴性HTT mRNA減少。特定言之，相對於媒劑組(組A6及組C1b)，組C4 (每隻動物總共1.78×1013 個VG)、組A2 (每隻動物總共1.35×1012 個VG)及組A5 (每隻動物總共1.35×1011 個VG)分別存在平均58%、57%及23% HTT mRNA KD。相對於媒劑，HTT mRNA KD在VY-HTT01之所有劑量下為統計學上顯著的(P＜0.01，藉由單向ANOVA以及杜凱氏多重比較檢定)，其中最高劑量為每隻動物1.78×1013 個VG，使得HTT mRNA KD (P＜0.001，藉由單向ANOVA以及杜凱氏多重比較檢定)在統計學上比用每隻動物1.35×1011 個VG之總劑量達成的要更高。另外，每隻動物1.35×1012 個VG之第二最高劑量使得HTT mRNA KD (P＜0.001，藉由單向ANOVA以及杜凱氏多重比較檢定)在統計學上比所評估之最低劑量(每隻動物1.35×1011 個VG)的更高。在所評估之兩個最高總劑量(每隻動物1.35×1012 及1.78×1013 個VG)之間，HTT mRNA KD不存在統計學上顯著之差異。iv. 尾核 HTT 蛋白及 mRNA 含量
為了評估尾核中之HTT蛋白及mRNA含量，自各動物收集4個沖取物(每半球2個)用於藉由LC-MS/MS之HTT及肌動蛋白蛋白質分析，產生每個VY-HTT01處理組總共12個沖取物及兩個媒劑組24個沖取物。HTT蛋白含量歸一化至肌動蛋白含量，且接著進一步歸一化至媒劑組。表103中展現表示為媒劑之百分比(veh)的平均相對剩餘尾核HTT蛋白及相對尾核HTT蛋白減弱(KD)，以及藉由單向ANOVA及杜凱氏多重比較產生之p值。 表103. NHP尾核中之HTT蛋白降低
組 動物數量 總劑量 (VG) 相對剩餘 HTT 蛋白 ( 媒劑 ± 標準差之 %) HTT 蛋白 KD ( 媒劑 ± 標準差之 %) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於組 A5) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於組 A2) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於組 C4)
組A6 3 0.0 100 ± 8 0 ± 8 0.8702 0.204 0.0004
組C1b 3 0.0
組A5 3 1.35e11 94 ± 12 6 ± 12 - 0.649 0.0037
組A2 3 1.35e12 84 ± 16 16 ± 16 - - 0.0256
組C4 3 1.78e13 54 ± 9 46 ± 9 - - -
在雙側殼核內及丘腦內輸注不同總劑量之VY-HTT01之後，在尾核中達成顯著且劑量依賴性HTT蛋白降低。特定言之，相對於媒劑組(組A6及組C1b)，組C4 (每隻動物總共1.78×1013 個VG)、組A2 (每隻動物總共1.35×1012 個VG)及組5A (每隻動物總共1.35×1011 個VG)分別存在平均46%、16%及6% HTT蛋白KD。相對於媒劑，HTT蛋白KD在1.78×1013 個vg/動物之最高劑量下為統計學上顯著的(P＜0.001，藉由單向ANOVA以及杜凱氏多重比較檢定)。每隻動物1.78×1013 個VG之最高劑量在統計學上呈現比分別用每隻動物1.35×1011 及1.35×1012 個VG之總劑量所達成的更高之HTT蛋白KD (對於每隻動物1.78×1013 個VG相對於每隻動物1.35×1011 個VG，P＜0.01，對於每隻動物1.78×1013 個VG相對於每隻動物1.35×1012 個VG，P＜0.05，藉由單向ANOVA以及杜凱氏多重比較檢定)。另外，在兩個最低總劑量(每隻動物1.35×1011 及1.35×1012 個VG)之間或在兩個最低劑量(每隻動物1.35×1011 及1.35×1012 個VG)中之每一者與所測試之媒劑組之間，HTT蛋白KD存在統計學上顯著之差異。
在用於HTT蛋白定量之相同尾核沖取物中，使用針對恆河猴HTT、TBP、AARS及XPNPEP1之特定探針集，如實例1中所述，藉由bDNA分析量測尾核中之HTT mRNA含量。HTT mRNA含量歸一化至三個管家基因TBP、AARS及XPNPEP1之幾何平均值，且隨後進一步歸一化至媒劑組。表104中展現表示為媒劑之百分比(veh)的平均相對剩餘尾核HTT mRNA及相對尾核HTT mRNA減弱(KD)，以及藉由單向ANOVA及杜凱氏多重比較產生之p值。 表104. NHP尾核中之HTT mRNA降低
組 動物數量 總劑量 (VG) 相對剩餘 HTT mRNA ( 媒劑 ± 標準差之 %) HTT mRNA KD ( 媒劑 ± 標準差之 %) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於組 A5) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於組 A2) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於組 C4)
組A6 3 0.0 100 ± 6 0 ± 6 0.9121 0.7377 ＜0.0001
組C1b 3 0.0
組A5 3 1.35e11 95 ± 11 5 ± 11 - 0.9877 0.0002
組A2 3 1.35e12 93 ± 9 7 ± 9 - - 0.0003
組C4 3 1.78e13 41 ± 16 59 ± 16 - - -
在雙側殼核內及丘腦內輸注不同總劑量之VY-HTT01之後，在尾核中達成劑量依賴性HTT mRNA減少。特定言之，相對於媒劑組(組A6及組C1b)，組C4 (每隻動物總共1.78×1013 個VG)、組A2 (每隻動物總共1.35×1012 個VG)及組A5 (每隻動物總共1.35×1011 個VG)分別存在平均59%、7%及5% HTT mRNA KD。相對於媒劑，在每隻動物1.78×1013 個VG之最高劑量下，尾核HTT mRNA KD為統計學上顯著的(P＜0.001，藉由單向ANOVA及杜凱氏多重比較檢定)。每隻動物1.78×1013 個VG之最高劑量在統計學上呈現比分別用每隻動物1.35×1011 及1.35×1012 個VG之總劑量所達成的更高之HTT mRNA KD (對於每隻動物1.78×1013 個VG相對於每隻動物1.35×1011 個VG，及對於每隻動物1.78×1013 個VG相對於每隻動物1.35×1012 個VG，P＜0.001，藉由單向ANOVA以及杜凱氏多重比較檢定)。另外，在兩個最低總劑量(每隻動物1.35×1011 及1.35×1012 個VG)之間或在兩個最低劑量(每隻動物1.35×1011 及1.35×1012 個VG)中之每一者與所測試之媒劑組(P＞0.05，藉由單向ANOVA以及杜凱氏多重比較檢定)之間，HTT mRNA KD不存在統計學上顯著之差異。v. 丘腦 HTT 蛋白及 mRNA 含量
為評估丘腦中之HTT蛋白及mRNA降低，自各動物(每半球2個)收集4個沖取物以用於藉由LC-MS/MS之HTT及肌動蛋白蛋白質分析，產生每VY-HTT01處理組(每組3隻動物)總共12個沖取物，且兩個媒劑組(每組3隻動物)24個沖取物。丘腦HTT蛋白含量歸一化至肌動蛋白含量，且接著進一步歸一化至媒劑組。表105中展現表示為媒劑之百分比(veh)的平均相對剩餘丘腦HTT蛋白及相對丘腦HTT蛋白減弱(KD)，以及藉由具有杜凱氏多重比較之單向ANOVA產生之p值。 表105. NHP丘腦中之HTT蛋白降低
組 動物數量 總劑量 (VG) 相對剩餘 HTT 蛋白 ( 媒劑 ± 標準差之 %) HTT 蛋白 KD ( 媒劑 ± 標準差之 %) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於組 A5) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於組 A2) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於組 C4)
組A6 3 0.0 100 ± 12 0 ± 12 0.2319 0.0694 ＜0.0001
組C1b 3 0.0
組A5 3 1.35e11 82 ± 20 18 ± 20 - 0.9068 0.0009
組A2 3 1.35e12 74 ± 12 26 ± 20 - - 0.0026
組C4 3 1.78e13 24 ± 3 76 ± 3 - - -
在雙側組合殼核內及丘腦內輸注不同總劑量之VY-HTT01之後，在丘腦中達成顯著且劑量依賴性HTT蛋白降低。特定言之，相對於媒劑(組A6及 組C1b)，組C4 (每隻動物1.78×1013 個VG)、組A2 (每隻動物1.35×1012 個VG)及組A5 (每隻動物1.35×1011 個VG)分別存在平均76%、26%及18% HTT蛋白KD。相對於媒劑，丘腦中之HTT蛋白KD在1.78×1013 個vg/動物之最高劑量下為統計學上顯著的(P＜0.0001，藉由單向ANOVA及杜凱氏多重比較檢定)。每隻動物1.78×1013 個VG之最高劑量在統計學上呈現比分別用每隻動物1.35×1011 及1.35×1012 個VG之總劑量所達成的更高之HTT蛋白KD (對於每隻動物1.78×1013 個VG相對於每隻動物1.35×1011 個VG，P＜0.001，對於每隻動物1.78×1013 個VG相對於每隻動物1.35×1012 個VG，P＜0.01，藉由單向ANOVA以及杜凱氏多重比較檢定)。另外，在兩個最低總劑量(每隻動物1.35×1011 及1.35×1012 個VG)之間或在兩個最低劑量(每隻動物1.35×1011 及1.35×1012 個VG)中之每一者與所測試之媒劑組之間，HTT蛋白KD存在統計學上顯著之差異。
在用於HTT蛋白定量之相同丘腦沖取物中，使用針對恆河猴HTT、TBP、AARS及XPNPEP1之特定探針集，如實例1中所述，藉由bDNA分析量測丘腦中之HTT mRNA含量。HTT mRNA含量歸一化至三個管家基因TBP、AARS及XPNPEP1之幾何平均值，且隨後進一步歸一化至媒劑組。表106中展現表示為媒劑之百分比(veh)的平均相對剩餘丘腦HTT mRNA及相對丘腦HTT mRNA減弱(KD)，以及藉由具有杜凱氏多重比較之單向ANOVA產生之p值。 表106. NHP丘腦中之HTT mRNA降低
組 動物數量 總劑量 (VG) 相對剩餘 HTT mRNA ( 媒劑 ± 標準差之 %) HTT mRNA KD ( 媒劑 ± 標準差之 %) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於組 A5) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於組 A2) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於組 C4)
組A6 3 0.0 100 ± 13 0 ± 13 0.0041 0.0002 ＜0.0001
組C1b 3 0.0
組A5 3 1.35e11 59 ± 21 41 ± 21 - 0.3533 0.0611
組A2 3 1.35e12 41 ± 4 59 ± 4 - - 0.6651
組C4 3 1.78e13 29 ± 6 71 ± 6 - - -
在雙側殼核內及丘腦內輸注不同總劑量之VY-HTT01之後，在丘腦中達成顯著的丘腦HTT mRNA減少。特定言之，相對於媒劑(組A6及組C1b)，組C4 (每隻動物1.78×1013 個VG)、組A2 (每隻動物1.35×1012 個VG)及組A5 (每隻動物1.35×1011 個VG)分別存在平均71%、59%及41% HTT mRNA KD。相對於媒劑，丘腦中之HTT mRNA KD在VY-HTT01之所有劑量下為統計學上顯著的(P＜0.01，藉由單向ANOVA以及杜凱氏多重比較檢定)。存在HTT mRNA KD之劑量依賴性趨勢，儘管在VY-HTT01之不同劑量之間，丘腦HTT mRNA KD不存在統計學上顯著之差異(P＞0.05，藉由單向ANOVA以及杜凱氏多重比較檢定)。此外，所量測之丘腦HTT mRNA之含量與相同丘腦樣品中之HTT蛋白含量良好對應，因為相比於較低劑量之VY-HTT01，較高劑量之VY-HTT01傾向於較多HTT mRNA及較高蛋白質KD。vi. HTT 蛋白與 mRNA 含量之間的關係
使用皮爾森相關法(Pearson correlation method)評定來自組C4 (每隻動物1.78×1013 個VG)、組A2 (每隻動物1.35×1012 個VG)、組A5 (每隻動物1.35×1011 個VG)及媒劑組(組A6及組C1b)之殼核、尾核及丘腦之所有樣品中的相對HTT蛋白含量與相對HTT mRNA含量之間的關係。殼核、尾核及丘腦中之相對剩餘NHP HTT蛋白與mRNA含量之相關性的圖式展示於圖19中。
如藉由LC-MS/MS分析所量測之相對HTT蛋白含量與如藉由bDNA分析所量測之相對HTT mRNA含量充分相關(皮爾森r=0.8897，P＜0.001)。舉例而言，相對於媒劑之59%剩餘HTT mRNA含量對應於相對於媒劑之50%剩餘HTT蛋白含量。
總之，在給藥5週之後NHP中雙側組合殼核內及丘腦內投與VY-HTT01之結果得到證明：NHP殼核、尾核及丘腦中之劑量依賴性HTT蛋白降低；殼核及尾核中之劑量依賴性HTT mRNA KD，具有朝向丘腦中之劑量依賴性HTT mRNA KD之傾向；以及殼核、尾核及丘腦中之相對剩餘NHP HTT殼核與mRNA含量之間的正相關性。 實例8.對亨丁頓舞蹈症之YAC128小鼠模型中之VY-HTT01劑量反應藥理學之活體內研究. i.研究設計
此研究之主要目標為鑑別AAV1封裝之AAV1-miRNA表現載體之劑量，該載體在亨丁頓舞蹈症之YAC128小鼠模型中的紋狀體內輸注之後使得人類突變型HTT mRNA及蛋白質之劑量依賴性降低，該疾病表現人類全長突變型亨丁頓蛋白質(HTT)。將病毒基因體VYHT1 (SEQ ID NO: 1352)封裝至AAV1衣殼中，產生VY-HTT01粒子(亦可稱為AAV1-VOYHT1)，並調配用於遞送。在此研究中，僅評估在輸注部位(紋狀體)處之腦組織的人類突變型HTT mRNA及給藥4週之後的蛋白質含量。基於先前研究選擇4週時間點，其指示在大致此時間在紋狀體內給藥VY-HTT01之後在YAC128小鼠紋狀體中達到最大人類突變型HTT mRNA降低。
此研究涉及三十隻小家鼠FVB/YAC Tg(+)小鼠(YAC128；如Slow等人,Hum Mol Genet. 12:1555-1567 (2003)中及Van Raamsdonk等人Hum Mol Genet. 14(24):3823-35 (2005)中所述，其中之每一者之內容以全文引用之方式併入本文中)，2-3月齡，根據性別及年齡藉由均勻分佈而隨機分配至各組。在第1天，所有動物經由連接至注射器之立體定位二氧化矽導管接受媒劑(組第1)或VY-HTT01 (組2-5)以0.5微升/分鐘雙側注射至左右紋狀體中持續10分鐘。評估四種劑量：每隻動物8.8×109 、2.8×1010 、8.8×1010 及2.8×1011 個載體基因體(vg或VG)(總劑量)。2.8×1011 個VG總劑量為最大可行劑量(MFD)。動物研究組，包括詳細給藥參數，展現於表107中。 表107.研究設計
組 動物數量 描述 載體劑量 總劑量 (VG)
體積注射 ( 微升 / 側 ) 給藥效價 (VG/mL) VG/ 側
組1 6 媒劑 5 0.0 0.0 0.0
組2 6 VY-HTT01，低劑量 5 8.8e11 4.4e9 8.8e9
組3 6 VY-HTT01，中等劑量 5 2.8e12 1.4e10 2.8e10
組4 6 VY-HTT01，高劑量 5 8.8e12 4.4e10 8.8e10
組5 6 VY-HTT01，MFD 5 2.8e13 1.4e11 2.8e11
ii.測試物品製備及投與
用於該研究之測試物品含有調配於含有10 mM磷酸鈉、1.5 mM磷酸鉀、100 mM氯化鈉、7% (w/v)蔗糖、0.001% (w/v)泊洛沙姆188 (pH 7.5)之水溶液中之VY-HTT01。媒劑對照物僅含有調配物緩衝液。自-65℃或更低移除VY-HTT01且使其在室溫下解凍。解凍後，VY-HTT01隨後上下吸取以混合且隨後放置在濕冰上直至稀釋時間。VY-HTT01用如上文所詳述製備之調配物緩衝液稀釋。在稀釋完成之後，將所有給藥溶液儲存在2-8℃下直至投與為止。在注射之前使給藥溶液升溫至室溫。在完成對所有研究動物之給藥程序之後，劑量保持維持在2-8℃下。保留載體藉由液滴式數位PCR (ddPCR)滴定。
在手術之前，使用3%異氟醚麻醉動物且將其置放於立體定位框架中。顱內注射如下進行：將五微升(5 µL)重組病毒載體或媒劑注射至紋狀體(AP，+0.50；ML，±2.2；DV，−3.0，來自前囟及硬腦膜；門齒桿(incisor bar)，0.0)中，以0.5 µL/min之速率使用10 µL 漢彌爾頓注射器(Hamilton syringe)進行。在輸注完成之後將針留在適當位置1分鐘，隨後將其向上從大腦取出。手術前一小時及手術後24小時，向小鼠皮下投與持續釋放丁基原啡因SR-LAB (1.0 mg/kg)用於鎮痛。 iii.籠側觀測及體重
在注射前進行籠側觀測且在手術後開始每日執行。監測所有小鼠之一般健康狀況及每天疼痛及/或疾病之跡象。籠側觀測展示在研究期間所有劑量組中之所有動物均無異常。
對於體重，在測試物品即將投與之前且在給藥之後每週一次對小鼠稱重。體重量測指示經媒劑及VY-HTT01注射之動物隨時間具有正常體重增加且在給藥之後1或2週展示無體重變化差異(p＞0.05，藉由雙向ANOVA以及杜凱氏多重比較檢定)。然而，在給藥3週及第4週之後MFD組與中等劑量組或高劑量組相比具有更多體重增加(p＜0.01，藉由雙向ANOVA以及杜凱氏多重比較檢定)。 iv.組織收集
小鼠接受苯妥英(Euthasol®)腹膜內注射(270 mg/kg)且接著用冷的1×PBS經賁門灌注，且移除大腦。使用小鼠腦基質沿著冠狀面軸線切割大腦且使用3 mm活檢體沖取物自2 mm腦板切割紋狀體區。亦收集上覆皮質區。接著將腦組織在液氮中快速冷凍且儲存在-80℃下用於後續處理及分析。
自各小鼠收集0.4 cm剪尾樣品且儲存在-60℃或更低溫度下直至驗證基因型分析。小鼠尾剪尾樣品之基因型分析證實研究中之所有動物對人類突變型HTT基因呈陽性。 v.HTT mRNA 定量
藉由定量(實時)反轉錄聚合酶鏈反應(RT-qPCR)塔克曼分析(TaqMan assay)測定人類HTT mRNA含量及小鼠X-脯胺醯基胺基肽酶1 (XPNPEP1) mRNA含量。簡言之，使用根據製造商之方案的mirVana™ miRNA分離套組(QIAGEN)，自紋狀體組織樣品提取總RNA。藉由反轉錄使用QuantiTect®反轉錄套組(QIAGEN)進行互補DNA合成。所有塔克曼分析及母體混合物均訂購自Life Technologies且根據製造商建議使用。使用CFX384即時PCR系統(BIO-RAD)進行qPCR且用2- ΔΔ Ct 方法分析資料。HTT mRNA含量歸一化至XPNPEP1 mRNA含量，且隨後進一步歸一化至媒劑對照組。 vi.HTT 蛋白定量
根據先前所描述之方案進行中型標度發現(Meso Scale Discovery，MSD)分析(Macdonald等人,PLoS One. 5月9日;9(5):e96854 (2014)，其內容以全文引用之方式併入本文中)。簡言之，使用FastPrep系統(MP Biomedicals)，藉由在MSD分析緩衝液(Tris溶解緩衝液-中型標度發現，補充有磷酸酶抑制劑II (Sigma)、磷酸酶抑制劑III (Sigma)、2 mM PMSF、蛋白酶抑制劑(完全的，EDTA游離；羅氏診斷學(Roche Diagnostics))及10 mM NaF)中溶解組織來產生組織樣品勻漿。溶解物在20,000 g下在4℃下離心20分鐘。收集上清液，等分，在乾冰上快速冷凍，儲存在-80℃下，且在3-4天內使用以限制儲存時間對此等樣品之任何可能不利影響。總蛋白質濃度係使用二喹啉甲酸分析(BCA，Thermo Scientific)根據標準程序測定。
MSD板(MSD產物#L15XA)在4℃下用親和力純小鼠單株抗體2B7塗佈隔夜，該抗體針對人類HTT之胺基酸1-17升高。該板用洗滌緩衝液洗滌3次且接著在震盪下在室溫下用阻斷溶液封閉60分鐘。藉由反轉移除阻斷溶液，且隨後藉由反向吸取以裝載25 µL人類HTT蛋白標準物、QC樣品(單獨製備之人類HTT蛋白標準物)及經稀釋之小鼠大腦樣品。在室溫下在震盪下培育板60分鐘。隨後用洗滌緩衝液洗滌該板4次且與針對HTT蛋白之擴增多麩醯胺酸域的經生物素標記之小鼠單株抗體MW1一起培育。在室溫下在震盪下培育板60分鐘。隨後用洗滌緩衝液洗滌該板3次且添加25 µL磺基標籤抗生蛋白鏈菌素結合物。在室溫下在震盪下培育板60分鐘。隨後用洗滌緩衝液洗滌該板3次，且添加150 µL讀取緩衝液。在MSD讀取器上讀取該板。隨後量測光強度以定量樣品中之分析物。藉由來自校準曲線之電腦內插法測定研究樣品中之人類HTT蛋白之濃度。 vii.接受準則
對於qPCR反應，無模板對照物之平均Ct值通常等於或大於35。因此，將具有等於或大於35之Ct值之樣品定義為負且自資料分析排除。在cDNA合成及qPCR之前，在QuantiTect®反轉錄套組中用基因體DNA去除試劑(DNA Wipeout reagent)消除任何潛在的DNA污染。若在qPCR反應中用作無RT對照之對應RNA樣品的Ct值等於或大於35，則任何cDNA樣品視為不具有組織基因體DNA污染。
對於MSD分析，標準曲線在移除排斥標準物之後需要含有至少六個非零標準物。標準相對誤差(觀測到濃度-理論濃度)/理論濃度×100)在工作標準之±25%內。品質控制樣品之相對誤差在±25%內。重複濃度之間的CV%為25%或更低。需要至少67%之QC樣品滿足接受準則，在各水準下具有50%可接受之QC樣品。研究樣品槽濃度之間的CV%為25%或更低。 viii.藉由 VY-HTT01 之劑量依賴性突變型人類 HTT mRNA 減弱
為評估在紋狀體內給藥VY-HTT01之後人類突變型HTT mRNA降低之劑量依賴性，藉由RT-qPCR量測紋狀體樣品中之人類HTT及小鼠XPNPEP1 mRNA含量。針對HTT及XPNPEP1計算平均Ct值及標準差(SD)，且針對各樣品測定ΔCt (CtHTT-CtXPNPEP1)。隨後計算ΔΔCt (VY-HTT01注射之樣品之ΔCt-平均媒劑ΔCT)。藉由2-ΔΔCt 方法計算各樣品之相對HTT mRNA含量且表示為相對於媒劑對照組之百分比。VY-HTT01投與在YAC128小鼠中之紋狀體內注射4週後引起紋狀體中之人類突變型HTT mRNA減弱(KD)。表108中展現在以不同劑量投與VY-HTT01之後，YAC128小鼠紋狀體中之平均相對剩餘HTT mRNA及相對HTT mRNA減弱(KD)，以及藉由統計分析產生之p值。 表108. YAC128紋狀體中之HTT mRNA降低
組 劑量 總劑量 (VG) 相對剩餘 HTT mRNA ( 媒劑之 % ；平均值 ±SD) HTT mRNA KD ( 媒劑之 % ；平均值 ±SD) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於組 2) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於組 3) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於組 4) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於組 5)
組1 媒劑 0.0 100 ± 9 0 ± 9 0.0008 ＜0.0001 ＜0.0001 ＜0.0001
組2 低 8.8e9 64 ± 18 36 ± 18 - 0.3827 0.0195 0.0023
組3 中等 2.8e10 49 ± 18 51 ± 18 - - 0.5527 0.1469
組4 高 8.8e10 37 ± 13 63 ± 13 - - - 0.9038
組5 MFD 2.8e11 30 ± 5 70 ± 5 - - - -
平均而言，在最大可行劑量下觀測到70±5%人類HTT mRNA KD (相對於媒劑組，p＜0.0001)，在高劑量下63±13%人類HTT mRNA KD (相對於媒劑組，p＜0.0001)，在中等劑量下51±18%人類HTT mRNA KD (相對於媒劑組，p＜0.0001)及在低劑量下36±18%人類HTT mRNA KD (相對於媒劑組，p＜0.001)。在低劑量組與高劑量組之間及在低劑量組與最大可行劑量組之間可見不同人類HTT mRNA KD。此等資料證明，在HD之YAC128小鼠模型中，VY-HTT01以劑量依賴性方式遏制紋狀體人類HTT mRNA含量。 ix.藉由 VY-HTT01 減弱之劑量依賴性突變型人類 HTT 蛋白
為了評估在紋狀體內給藥VY-HTT01之後人類突變型HTT蛋白降低之劑量依賴性，進行MSD分析以定量量測紋狀體組織沖取物中之人類突變型HTT蛋白。在YAC128小鼠中紋狀體內注射之後4週，VY-HTT01投與引起紋狀體中之人類突變型HTT蛋白KD。
表109中展現以不同劑量投與VY-HTT01之後，YAC128小鼠紋狀體中之平均相對剩餘HTT蛋白及相對HTT蛋白減弱(KD)以及藉由統計分析產生之p值。 表109. YAC128紋狀體中之HTT蛋白降低
組 劑量 總劑量 (VG) 相對 HTT 蛋白 ( 媒劑之 % ；平均值 ±SD) HTT 蛋白 KD ( 媒劑之 % ；平均值 ±SD) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於組 2) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於組 3) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於組 4) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於組 5)
組1 媒劑 0.0 100 ± 20 0 ± 20 0.0554 0.0282 ＜0.0001 ＜0.0001
組2 低 8.8e9 73 ± 21 27 ± 21 - 0.9980 0.0145 0.0038
組3 中等 2.8e10 70 ± 14 30 ± 14 - - 0.0294 0.0079
組4 高 8.8e10 41 ± 15 59 ± 15 - - - 0.9801
組5 MFD 2.8e11 36 ± 7 64 ± 7 - - - -
平均而言，在最大可行劑量下觀測到64±7%人類HTT蛋白KD (相對於媒劑組，p＜0.0001)，在高劑量下59±15%人類HTT蛋白KD (相對於媒劑組，p＜0.0001)，在低劑量下30±14%人類HTT蛋白KD (相對於媒劑組，p＜0.05)及在低劑量下27±21%人類HTT蛋白KD (相對於媒劑組，p＜0.0554)。在最大可行劑量組與中等劑量組、最大可行劑量組與低劑量組、高劑量組及中等劑量組以及高劑量組及低劑量組之間可見不同人類HTT蛋白KD。此等資料證明，在HD之YAC128小鼠模型中，VY-HTT01以劑量依賴性方式遏制紋狀體中之人類HTT蛋白含量。
此研究證明，紋狀體內注射VY-HTT01以劑量依賴性方式產生紋狀體人類突變型HTT mRNA及蛋白質KD，範圍為平均最大可實行劑量下70% HTT mRNA KD至低劑量下36% HTT mRNA KD，及平均最大可實行劑量下64%人類HTT蛋白KD至低劑量下27% HTT蛋白KD。在研究中，未偵測到所有動物之異常籠側觀測結果，且對於所有動物組可見可比體重增加。此等資料表明以每隻動物8.8×109 個VG至2.8×1011 個VG範圍內之紋狀體內給藥之VY-HTT01以多劑量依賴性方式遏制HD之YAC128小鼠模型中的人類突變型HTT mRNA及蛋白質表現，其中以每隻動物8.8×1010 個VG之劑量獲得最大人類突變型HTT蛋白降低。 實例9.亨丁頓舞蹈症之YAC128小鼠模型中的VY-HTT01功效之活體內研究 i.研究設計
此研究之主要目標為探究AAV1封裝之病毒基因體VOYHT1 (SEQ ID NO: 1352；下文統稱為AAV1-VOYHT1或VY-HTT01))在YAC128小鼠中之雙側紋狀體內輸注之後對運動功能之功效，該小鼠為表現人類全長突變型亨丁頓蛋白質(HTT)之亨丁頓舞蹈症之模型。此外，此研究經設計以評估VY-HTT01投與對運動功能之功效及VY-HTT01劑量以及HTT mRNA及蛋白質降低之間的關係。進行使用各種細胞及生物化學標記物之免疫組織化學分析，從而提供對神經系統組織完整性之深刻理解。亦記錄下籠側觀測及體重及腦重量資料。
基於獲自實例8 (上文)中所述之劑量反應藥理學實驗之資料，且為了提供最大及分級減少量之人類突變型HTT蛋白，選擇三種劑量之VY-HTT01用於本研究中之評估，如下：8.8×1010 個VG/動物(高劑量)、2.8×1010 個VG/動物(中度劑量或中等劑量)及8.8×109 個VG/動物(低劑量)。簡言之，來自實例8之資料證明在雙側紋狀體內投與VY-HTT01之後4週，此等劑量分別降低59%、30%及27%人類突變型HTT蛋白。在此研究中，在投與後16週及24週(給藥後)評估輸注部位(紋狀體)處之大腦組織之人類突變型HTT mRNA及蛋白質含量。
此研究涉及五十二(52)隻雄性及四十四(44)隻雌性小家鼠FVB/YAC Tg(+)小鼠(YAC128；如Slow等人, Hum Mol Genet.12:1555-1567 (2003)中及Van Raamsdonk等人 Hum Mol Genet. 14(24):3823-35 (2005)中所描述，其中之每一者之內容以全文引用之方式併入本文中)，以及十三(13)隻雄性及十一(11)隻雌性C57BL/6 (WT)小鼠(2-3月齡)，其藉由性別、年齡及體重及自基線行為測試之結果均勻分佈而隨機分配至各組。在第1天，動物經由連接至注射器之立體定位之二氧化矽導管以0.5微升/分鐘歷經10分鐘接受媒劑(組1及組2)或VY-HTT01 (組3-5)中之每一者至左右紋狀體中之雙側注射5 µL。對於此研究，使在組1-5中之每一者中包含六(6)隻雄性及六(6)隻雌性的第一小組小鼠在給藥後24週安樂死，且用於組織學評估以及生命期觀測(例如籠側及體重)及行為測試。對於此研究，使在組1-5中之每一者中包含7隻雄性及5隻雌性之第二小組小鼠在給藥後16週安樂死，且用於生命期觀測、行為測試及藥理學評估。組、動物基因型、測試物品及給藥範式之細節展現於表110中。 表110.研究設計
組 基因型 動物數量 描述 載體劑量 總劑量 (VG) 生命期 ( 週 )
體積注射 ( 微升 / 側 ) 給藥效價 (VG/mL) VG/ 側
組1 WT 24 媒劑 5 0.0 0.0 0.0 16, 24
組2 YAC128 24 媒劑 5 0.0 0.0 0.0 16, 24
組3 YAC128 24 VY-HTT01，低劑量 5 8.8e11 4.4e9 8.8e9 16, 24
組4 YAC128 24 VY-HTT01，中等劑量 5 2.8e12 1.4e10 2.8e10 16, 24
組5 YAC128 24 VY-HTT01，高劑量 5 8.8e12 4.4e10 8.8e10 16, 24
ii.測試物品製備及投與
用於該研究之測試物品含有調配於含有10 mM磷酸鈉、1.5 mM磷酸鉀、100 mM氯化鈉、7% (w/v)蔗糖、0.001% (w/v)泊洛沙姆188 (pH 7.5)之水溶液中之VY-HTT01。媒劑對照物僅含有調配物緩衝液。自-65℃或更低移除VY-HTT01且使其在室溫下解凍。解凍後，VY-HTT01隨後上下吸取以混合且隨後放置在濕冰上直至稀釋時間。VY-HTT01用如上文所詳述製備之調配物緩衝液稀釋。在稀釋完成之後，將所有給藥溶液儲存在2-8℃下直至投與為止。在注射之前使給藥溶液升溫至室溫。在完成對所有研究動物之給藥程序之後，劑量保持維持在2-8℃下。保留載體藉由液滴式數位PCR (ddPCR)滴定。
藉由注射氯胺酮(10 mg/mL)、甲苯噻嗪(1 mg/mL)及乙醯丙嗪(0.3 mg/mL)溶液(160-200 µL/20 g)麻醉動物且置於立體定位框架中。顱內注射如下進行：將五微升(5 µL)重組病毒載體或媒劑注射至來自前囟及硬腦膜之紋狀體(AP，+0.5；ML，±2.0，DV，-3.8)中；門齒桿，0.0)，使用10 µL漢彌爾頓注射器以0.5 µL/min之速率注射。在輸注完成之後將針留在適當位置3分鐘，隨後將其從大腦上方取出。乙醯胺苯酚作為手術前及手術後止痛劑在手術前3天及手術後3天於飲用水中提供。 iii.籠側觀測、體重及腦重量
在注射前進行籠側觀測且在手術後開始每日執行。監測所有小鼠之一般健康狀況及每天疼痛及/或疾病之跡象。在研究期間所有劑量組中之所有動物均未展示異常，但在注射後13週發現一隻雌性WT小鼠死亡。
對於體重，在測試物品即將投與之前且在給藥之後每週對小鼠稱重。在自動物移出之後記錄腦重量。給藥後0週至16週之體重量測值指示，一般而言，隨時間推移YAC128小鼠比其WT同胎鼠仔增重較多體重。然而，藉由單向ANOVA以及杜凱氏事後檢定，投與媒劑或任何劑量之VY-HTT01的YAC128組間體重變化不存在差異(p＞0.05)。在給藥後16週，使各組中之11-12隻小鼠安樂死以進行藥理學分析。對其餘小鼠繼續每週體重量測，其展示各組之體重及體重增加之類似變化。藉由單向ANOVA以及杜凱氏事後檢定，腦重量量測亦展示在給藥後16週或24週各組之間無差異。 iv.生命期行為測試
進行加速旋桿測試以評估VY-HTT01對小鼠運動功能及運動協調之作用。在旋桿上將YAC128小鼠連續訓練兩天(第1天及第2天)且在第3天測試。在訓練第一天，將旋桿設定為5 RPM之恆定速度持續300秒。將在300秒時段完成之前掉落下該桿之小鼠放回桿上直至300秒時段充分到時。在訓練第二天，將旋桿設定為在300秒內自5 rpm加速至40 rpm。將脫落該桿之小鼠放回桿上直至其完成300秒之訓練時段。在第3天(測試日)，將小鼠置放於旋桿上，該旋桿經300秒內自5 rpm加速至40 rpm。在三個試驗中記錄掉落等待時間，該等待時間界定為直至動物自旋桿掉落之時間。在給藥前進行旋桿測試以進行基線量測且在屍檢後每4週重複一次。所有動物經歷在給藥前及給藥後4週、8週、12週及16週進行之旋桿測試(每組n=23-24)，且其子組在給藥後20週及24週繼續旋桿測試(每組n=12)。 v.組織收集
在VY-HTT01投與後十六週，來自各組(6-7隻雄性及5隻雌性)之11-12隻動物之子組接腹膜內注射受氯胺酮(10 mg/mL)、甲苯噻嗪(1 mg/mL)及乙醯丙嗪(0.3 mg/mL)溶液(160～200 µL/20 g)。一旦麻醉，將小鼠稱重且記錄體重。使用腳趾捏壓反應方法測定麻醉程度。一旦無反應，小鼠經賁門灌注冷1×PBS，且小心地移除大腦。記錄腦重量且接著使用小鼠腦基質沿冠狀面軸線切割大腦。使用3 mm活檢體沖取物自2 mm厚的腦板之左右紋狀體收集組織樣品。亦收集上覆皮質區用於潛在生物化學分析。此等紋狀體及皮質樣品隨後在液氮中快速冷凍，且儲存在-80℃下用於處理及mRNA或蛋白質分析。
在給藥之後24週使來自各組之剩餘12隻動物(6隻雄性及6隻雌性)安樂死。如上文(切割及速凍)收集各組中來自6隻小鼠(3隻雄性及3隻雌性)之紋狀體組織沖取物，用於藉由qRT-PCR之HTT mRNA量測及藉由MSD之HTT蛋白量測。切割來自每組剩餘6隻動物(3隻雄性及3隻雌性)之大腦，且在用1×PBS及4% PFA灌注以用於免疫組織化學分析之後，經4%多聚甲醛(PFA)進行事後固定。
收集來自各小鼠之0.4 cm尾區樣品且儲存在-60℃或更低溫度下直至驗證基因型分析。如所預期，小鼠剪尾樣品之基因型分析證實研究中之所有96種YAC128動物之人類突變型HTT基因均為陽性，且所有24種WT小鼠的均為陰性。 vi.HTT mRNA 定量
根據實例8 (上文)中描述之程序測定人類HTT mRNA含量。 vii.HTT 蛋白定量
根據實例8 (上文)中描述之程序測定人類HTT蛋白含量。 viii.免疫組織化學 (IHC) 分析
使用標準方案對小鼠大腦進行HTT聚集體(EM48)、神經退化(氟-Jade C)、紋狀體中型多棘神經元(DARPP32)、神經元(NeuN)及神經膠質特異性標記物(星形膠質細胞之GFAP及微神經膠質細胞之Iba1)的免疫組織化學(IHC)染色。 ix.接受準則
用於此研究中的qPCR反應及MSD分析之接受準則與實例8 (上文)中所描述之彼等準則一致。 x.VY-HTT01 對 YAC128 小鼠運動功能及運動協調之作用
在給藥前及給藥後每4週重複旋桿測試，直至給藥後16週(每組n=23-24隻小鼠)。其後，在給藥後20週及24週用一子組小鼠(每組n=12隻小鼠)繼續旋桿測試。記錄各動物之掉落等待時間且計算掉落等待時間變化百分比(%) (給藥後等待時間/給藥前等待時間×100%)。與WT同胎鼠仔相比，YAC128小鼠之運動功能受損。基於絕對掉落等待時間，YAC128小鼠在基線展示比WT同胎鼠仔短的掉落等待時間(p＜0.0001，雙向ANOVA以及鄧尼特氏事後檢定(Dunnett's post hoc test))。在給藥後16週，VY-HTT01高劑量及低劑量組改良YAC128小鼠絕對掉落等待時間(相對於媒劑，分別p=0.025及0.034)，而VY-HTT01中等劑量組展示改良的掉落等待時間之趨勢(相對於媒劑p=0.052)。旋桿測試絕對掉落等待時間(秒)資料展現於表111中。 表111.旋桿測試中掉落等待時間(秒)
基因型 描述 給藥前基線 ( 平均值 ±SD ， n=24/ 組 ) 給藥後 4 週 ( 平均值 ±SD ， n=24/ 組 ) 給藥後 8 週 ( 平均值 ±SD ， n=24/ 組 ) 給藥後 12 週 ( 平均值 ±SD ， n=24/ 組 給藥後 16 週 ( 平均值 ±SD ， n=23-24/ 組
WT 媒劑 264 ± 59 224 ± 65 247 ± 47 239 ± 61 239 ± 62
YAC128 媒劑 124 ± 80 138 ± 55 127 ± 44 108 ± 44 113 ± 38
YAC128 VY-HTT01，高劑量 121 ± 72 133 ± 60 157 ± 49 147 ± 55 155 ± 64
YAC128 VY-HTT01，中等劑量 120 ± 86 133 ± 70 141 ± 84 134 ± 73 154 ± 72
YAC128 VY-HTT01，低劑量 122 ± 67 118 ± 63 125 ± 63 130 ± 62 151 ± 61
如藉由掉落等待時間之變化百分比所評定，VY-HTT01高劑量(每隻動物8.8×1010 個VG)給藥(相對於媒劑)後使掉落等待時間在12週增加約21% (p=0.023)且在16週增加約27% (p=0.021) (單向ANOVA以及鄧尼特氏事後檢定)，指示運動缺陷得解。VY-HTT01中度劑量組及低劑量組亦展示在給藥(相對於媒劑)後16週掉落等待時間分別增加28% (p=0.037)及24% (p=0.033) (單向ANOVA以及鄧尼特氏事後檢定)。旋桿測試掉落等待時間百分比(%)資料展現於表112中。 表112.旋桿測試中掉落等待時間變化百分比(%)
基因型 描述 給藥前基線 ( 平均值 ±SD ， n=24/ 組 ) 給藥後 4 週 ( 平均值 ±SD ， n=24/ 組 ) 給藥後 8 週 ( 平均值 ±SD ， n=24/ 組 ) 給藥後 12 週 ( 平均值 ±SD ， n=24/ 組 給藥後 16 週 ( 平均值 ±SD ， n=23-24/ 組
WT 媒劑 100 ± 22 85 ± 25 94 ± 18 90 ± 23 91 ± 23
YAC128 媒劑 100 ± 65 112 ± 44 103 ± 36 87 ± 35 91 ± 31
YAC128 VY-HTT01，高劑量 100 ± 59 110 ± 49 129 ± 41 121 ± 46 127 ± 53
YAC128 VY-HTT01，中等劑量 100 ± 72 111 ± 58 118 ± 70 112 ± 61 128 ± 60
YAC128 VY-HTT01，低劑量 100 ± 55 96 ± 51 102 ± 52 106 ± 50 124 ± 50
此等結果表明在投與所有三種劑量之VY-HTT01之後在16週運動功能改善，且高劑量組之運動改善起始較快。另外，在給藥後20週及24週，用一子組小鼠(每組12隻小鼠)繼續旋桿測試，且維持VY-HTT01功效。 xi.藉由 VY-HTT01 之劑量依賴性人類突變型 HTT mRNA 減弱
完成如上文所述之行為評定後，在紋狀體內給藥VY-HTT01之後，分別在16週或24週在來自每組11-12隻動物或6隻動物之左半球的紋狀體樣品中評定人類HTT mRNA降低之劑量依賴性。藉由RT qPCR量測人類HTT及小鼠XPNPEP1 mRNA (作為內部對照)含量。針對qPCR，所有樣品一式兩份地操作。針對HTT及XPNPEP1計算平均Ct值及標準差(SD)，且針對各樣品測定ΔCt (CtHTT-CtXPNPEP1)。隨後計算ΔΔCt (VY-HTT01注射之樣品之ΔCt-平均媒劑ΔCT)。藉由2 ΔΔCt方法計算各樣品之相對人類HTT mRNA含量且表示為相對於媒劑對照組之百分比。在對YAC128小鼠進行紋狀體內注射之後16週及24週，VY-HTT01投與在紋狀體中產生人類HTT mRNA KD。
在給藥後16週，在高劑量下觀測到48±19%人類HTT mRNA KD (相對於媒劑組，p＜0.0001)，在中等劑量下57±24%人類HTT mRNA KD (相對於媒劑組，p＜0.0001)及低劑量下64±6%人類HTT mRNA KD (相對於媒劑組，p＜0.0001)。在給藥後16週，高劑量組、中等劑量組等及低劑量組中之HTT mRNA含量不存在差異。表113中展現在不同劑量下投與VY-HTT01後16週，YAC128小鼠紋狀體中之人類HTT mRNA含量以及藉由統計分析產生之p值。 表113.在給藥後16週YAC128紋狀體中之HTT mRNA降低
基因型 劑量 給藥後 16 週 ( 媒劑之 % ；平均值 ±SD ， n=11-12/ 組 ) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於媒劑 ) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於高劑量 ) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於中等劑量 ) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於低劑量 )
相對剩餘 HTT mRNA HTT mRNA KD
YAC128 媒劑 100 ± 12 0 ± 12 - ＜0.0001 ＜0.0001 ＜0.0001
YAC128 VY-HTT01，高劑量 52 ± 19 48 ± 19 - - 0.599 0.113
YAC128 VY-HTT01，中等劑量 43 ± 24 57 ± 24 - - - 0.719
YAC128 VY-HTT01，低劑量 36 ± 6 64 ± 6 - - - -
在給藥後24週，相對於媒劑組，高劑量、中等劑量及低劑量投與之VY-HTT01在YAC128小鼠紋狀體中分別產生67±4%、61±4%及53±11%之人類HTT mRNA KD。在給藥後24週，高劑量組、中等劑量組等及低劑量組中之HTT mRNA含量不存在差異。表114中展現在不同劑量下投與VY-HTT01後24週，YAC128小鼠紋狀體中之人類HTT mRNA含量以及藉由統計分析產生之p值。 表114.在給藥後24週YAC128紋狀體中之HTT mRNA降低
基因型 劑量 在給藥後 24 週 ( 媒劑之 % ；平均值 ±SD ， n=6/ 組 ) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於媒劑 ) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於高劑量 ) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於中等劑量 ) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於低劑量 )
相對剩餘 HTT mRNA HTT mRNA KD
YAC128 媒劑 100 ± 17 0 ± 17 - ＜0.0001 ＜0.0001 ＜0.0001
YAC128 VY-HTT01，高劑量 33 ± 4 67 ± 4 - - 0.749 0.104
YAC128 VY-HTT01，中等劑量 39 ± 4 61 ± 4 - - - 0.502
YAC128 VY-HTT01，低劑量 47 ± 11 53 ± 11 - - - -
總體而言，在YAC128小鼠中，以8.8×109 至8.8×1010 個vg/動物紋狀體內投與VY-HTT01在給藥後16週引起類似48-64%紋狀體人類HTT mRNA遏制，且在給藥後24週引起53-67%紋狀體人類HTT mRNA遏制。 xii.藉由 VY-HTT01 減弱之劑量依賴性人類突變型 HTT 蛋白
完成如上文所述之行為評定後，在紋狀體內給藥VY-HTT01後，分別在16週或24週，在來自每組11-12隻動物或6隻動物之右半球的紋狀體樣品中評定人類突變型HTT蛋白降低。VY-HTT01注射引起紋狀體中之人類突變型HTT蛋白KD。平均而言，在給藥後16週，人類突變型HTT蛋白含量在高劑量下遏制了65±10% (p＜0.0001)，在中等劑量下52±13% (p＜0.0001)及在低劑量下38±13% (p＜0.0001)，其中使用單向ANOVA以及杜凱氏事後檢定評定顯著性。此人類突變型HTT蛋白降低為劑量依賴性的，其中高劑量相對於中等劑量(p＜0.05)、高劑量相對於低劑量(p＜0.0001)及中等劑量相對於低劑量(p＜0.05)組之間存在差異。表115中展現在不同劑量下投與VY-HTT01後16週，YAC128小鼠紋狀體中之人類HTT蛋白含量以及藉由統計分析產生之p值。 表115.在給藥後16週YAC128紋狀體中之HTT蛋白降低
基因型 劑量 給藥後 16 週 ( 媒劑之 % ；平均值 ±SD ， n=11-12/ 組 ) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於媒劑 ) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於高劑量 ) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於中等劑量 ) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於低劑量 )
相對剩餘 HTT 蛋白 HTT 蛋白 KD
YAC128 媒劑 100 ± 11 0 ± 11 - ＜0.0001 ＜0.0001 ＜0.0001
YAC128 VY-HTT01，高劑量 35 ± 10 65 ± 10 - - 0.043 ＜0.0001
YAC128 VY-HTT01，中等劑量 48 ± 13 52 ± 13 - - - 0.025
YAC128 VY-HTT01，低劑量 62 ± 13 38 ± 13 - - - -
在給藥後24週，人類突變型HTT蛋白含量在高劑量下遏制71±8% (p＜0.0001)，在中等劑量下遏制50±15% (p＜0.0001)且在低劑量下遏制47±9% (p＜0.0001)，其中顯著性藉由單向ANOVA以及杜凱氏事後檢定來評定。在給藥後24週降低之人類HTT蛋白亦具有劑量依賴性，其中高劑量相對於中劑量組之間的差異(p＜0.05)及高劑量相對於低劑量組(p＜0.01)，但在中劑量組與低劑量組之間無差異。在不同劑量下投與VY-HTT01後24週，YAC128小鼠紋狀體中之人類HTT蛋白含量以及藉由統計分析產生之p值展示於表116中。 表116.在給藥後24週，YAC128紋狀體中之HTT蛋白降低
基因型 劑量 給藥後 24 週 ( 媒劑之 % ；平均值 ±SD ， n=6/ 組 ) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於媒劑 ) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於高劑量 ) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於中等劑量 ) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於低劑量 )
相對剩餘 HTT 蛋白 HTT 蛋白 KD
YAC128 媒劑 100 ± 13 0 ± 13 - ＜0.0001 ＜0.0001 ＜0.0001
YAC128 VY-HTT01，高劑量 29 ± 8 71 ± 8 - - 0.027 0.009
YAC128 VY-HTT01，中等劑量 50 ± 15 50 ± 15 - - - 0.962
YAC128 VY-HTT01，低劑量 53 ± 9 47 ± 9 - - - -
總之，此等結果證明在給藥後16週及24週HD之YAC128小鼠模型中，紋狀體內給藥VY-HTT01以劑量依賴性方式在紋狀體中降低人類突變型HTT蛋白表現。 xiii.在用 VY-HTT01 紋狀體給藥之後 ， HTT 聚集體及細胞標記物之免疫組織化學分析
在紋狀體內給藥VY-HTT01之後24週，來自每組6隻動物之紋狀體藉由免疫組織化學(IHC)分析HTT聚集體(EM48)、神經元細胞核抗原(NeuN)、神經元退化(氟-Jade C)、星形膠質細胞(膠質原纖維酸性蛋白；GFAP)、微神經膠質細胞(離子化鈣結合承接分子1；Iba1)及中等尺寸之多棘神經元(DARPP32)之標記物來評估。
對於任何標記物，在媒劑及VY-HTT01注射之YAC128小鼠組中均未觀測到免疫反應性之差異。使用EM48之IHC展示YAC128小鼠之紋狀體中之擴散細胞核染色；然而，未觀測到細胞核聚集體，其與公開文獻相一致(Slow等人，Proc. Natl Acad. Sci. USA 102:11402 -11407 (2005)，其內容以全文引用之方式併入本文中)。紋狀體中之NeuN陽性細胞之密度在所有組中均類似，展示NeuN陽性細胞密度無變化。基於氟-Jade C免疫反應性，在任何組中未鑑別出神經元退化。未鑑別出Iba1陽性微神經膠質細胞密度或GFAP陽性星形膠質細胞增殖之變化。基於DARPP32染色，在所有組中偵測到中等尺寸之多棘神經元，其中免疫反應性無顯著差異。
在此研究中，在YAC128小鼠中未鑑別出神經元細胞密度、神經膠瘤病或體重之處理相關差異。
此研究證明，在YAC128小鼠中，VY-HTT01之紋狀體內注射(每隻動物8.8×109 至8.8×1010 個VG)引起在48%至64%範圍內的紋狀體人類HTT mRNA降低，伴有在給藥後16週之38-65%的劑量依賴性紋狀體人類突變型HTT蛋白降低。另外，VY-HTT01之紋狀體內注射(每隻動物8.8×109 至8.8×1010 個VG)引起在53%至67%範圍內的紋狀體人類HTT mRNA降低，伴有在對YAC128小鼠給藥後24週之47-71%的劑量依賴性紋狀體人類突變型HTT蛋白降低。在YAC128小鼠給藥後16週以及以高劑量使用VY-HTT01給藥後12週，在旋桿測試中之所有三個劑量改善運動協調缺陷之VY-HTT01。VY-HTT01之高劑量(每隻動物8.8×1010 個VG)使得在給藥後16週及24週在紋狀體中人類突變型HTT蛋白降低65%及71%。在對YAC128小鼠給藥後16週及24週，VY-HTT01之中等劑量(每隻動物2.8×1010 個VG)使人類突變型HTT蛋白在紋狀體中降低52%及50%，對應於給藥後16週之運動功能改良。VY-HTT01之低劑量(每隻動物8.8×109 個VG)使得人類突變型HTT蛋白在YAC128小鼠給藥後16週及24週在紋狀體中降低38%及47%，且在給藥後16週改良運動功能。在研究中之任何動物中未發現異常籠側觀測結果。在16週後，對於所有組可見相當的體重增益，且在給藥後16週或24週，腦重量無差異。總之，此等資料證明：(1) VY-HTT01之紋狀體內輸注以劑量依賴性方式降低YAC128小鼠紋狀體中之人類HTT mRNA及人類突變型HTT蛋白表現；(2)與人類突變型HTT蛋白降低相匹配，VY-HTT01改良YAC128小鼠中之運動功能；及(3) VY-HTT01注射不與動物或神經元損傷之一般健康之任何變化相關。 實例10.亨丁頓舞蹈症之BACHD小鼠模型中之VY-HTT01劑量反應藥理學之活體內研究 i.研究設計
此研究之主要目標為鑑別AAV1封裝之病毒基因體VOYHT1 (SEQ ID NO: 1352) (下文稱為AAV1-VOYHT1或VY-HTT01)之劑量，其在亨丁頓舞蹈症之BACHD小鼠模型中在紋狀體內輸注之後引起人類突變型HTT mRNA及蛋白質之劑量依賴性降低，其表現人類全長突變型亨丁頓蛋白質(HTT)。在此研究中，僅評估在輸注部位(紋狀體)處之腦組織的人類突變型HTT mRNA及給藥4週之後的蛋白質含量。基於先前研究選擇4週時間點，其指示在大致此時間在紋狀體內給藥VY-HTT01之後在YAC128小鼠紋狀體中達到最大人類突變型HTT mRNA降低。實驗程序類似於實例8中所描述之實驗程序。
此研究涉及四十五(45)隻雌性小家鼠C57BL/6-Tg(HTT*97Q)IXwy/J (BACHD)小鼠，2-3月齡，其藉由年齡及體重均勻分佈而隨機分配至各組。在第1天，所有動物經由連接至注射器之立體定位之二氧化矽導管接受0.5 µL/min之媒劑或VY-HTT01之雙側注射至左肌及右肌中。藉由小鼠中之紋狀體內注射之最大可達成的載體效價及最大體積(5微升/側)來測定最大可行劑量(MFD)。動物研究組，包括詳細給藥參數，展現於表117中。 表117.研究設計
組 動物數量 劑量 載體劑量 總劑量 (VG)
體積注射 ( 微升 / 側 ) 給藥效價 (VG/mL) VG/ 側
組1 9 媒劑 5 0.0 0.0 0.0
組2 9 VY-HTT01，低劑量 5 8.8e11 4.4e9 8.8e9
組3 9 VY-HTT01，中等劑量 5 2.8e12 1.4e10 2.8e10
組4 9 VY-HTT01，高劑量 5 8.8e12 4.4e10 8.8e10
組5 9 VY-HTT01，MFD 5 2.8e13 1.4e11 2.8e11
ii.測試物品製備及投與
測試物品製備程序與實例8中所述類似。
在手術之前，藉由注射氯胺酮(10 mg/mL)、甲苯噻嗪(1 mg/mL)及乙醯丙嗪(0.3 mg/mL)溶液(160-200 µL/20 g)麻醉動物且置於立體定位框架中。顱內注射如下進行：將五微升(5 µL)重組病毒載體或媒劑注射至紋狀體(A/P+0.5，M/L±2.0，DV-3.8，來自前囟及硬腦膜；門齒桿，0.0)中，以0.5 µL/min之速率使用10 µL漢彌爾頓注射器進行。在輸注完成之後將針留在適當位置3分鐘，隨後將其從大腦上方取出。乙醯胺苯酚作為手術前及手術後止痛劑在手術前3天及手術後3天於飲用水中提供。 iii.籠側觀測、體重及腦重量
在注射前進行籠側觀測且在手術後開始每日執行。每日監測所有小鼠之整體健康及疼痛及/或疾病跡象。籠側觀測展示在研究期間所有劑量組中之所有動物均無異常。
對於體重，在測試物品即將投與之前且在給藥之後每週對小鼠稱重。在自動物移出之後記錄腦重量。體重量測指示注射媒劑或VY-HTT01之動物隨時間具有正常體重增加且展示無體重變化差異。腦重量量測展示在媒劑及VY-HTT01組均無差異。 iv.組織收集
小鼠接受氯胺酮(10 mg/mL)、甲苯噻嗪(1 mg/mL)及乙醯丙嗪(0.3 mg/mL)溶液(160-200 mC L/20 g)之腹膜內注射。一旦麻醉，將小鼠稱重且記錄體重。使用腳趾捏壓反應方法測定麻醉程度。一旦無反應，小鼠經賁門灌注冷1×PBS，且小心地移除大腦且記錄大腦重量。使用小鼠腦基質沿著冠狀面軸線切割大腦且使用3 mm活檢體沖取物自2 mm厚之腦板切割紋狀體區。亦收集上覆皮質區。接著將腦組織在液氮中快速冷凍且儲存在-80℃下用於處理及分析。
使用小鼠剪尾進行DNA純化及基因型分析。簡言之，對於基因型，反應混合物含有900 nM正向及反向引子、250 nM探針及50-100 ng/µL DNA。在50℃下初始活化/變性步驟2分鐘且隨後在95℃下10分鐘之後，在95℃下15秒，隨後60℃下1分鐘之40次循環期間進行擴增。此研究中之所有小鼠證實為HTT*Q97載劑。 v.HTT mRNA 定量
HTT mRNA定量程序與實例8中所述之程序類似。 vi.HTT 蛋白定量
HTT蛋白定量程序與實例8中所述之程序類似。 vii.接受準則
接受準則類似於實例8中所描述之準則。 x.藉由 VY-HTT01 之劑量依賴性突變型人類 HTT mRNA 減弱
為評估在紋狀體內給藥VY-HTT01之後HTT mRNA降低之劑量依賴性，藉由RT-qPCR量測紋狀體樣品(來自左半腦之3 mm沖取物)中之人類HTT及小鼠XPNPEP1 mRNA (作為內部對照)含量。針對qPCR，所有樣品一式兩份地操作。針對HTT及XPNPEP1計算平均Ct值及標準差(SD)，且針對各樣品測定ΔCt (CtHTT-CtXPNPEP1)。隨後計算ΔΔCt (VY-HTT01注射之樣品之ΔCt-平均媒劑ΔCT)。藉由2-ΔΔCt方法計算各樣品之相對HTT mRNA含量且表示為相對於媒劑對照組之百分比。VY-HTT01在BACHD小鼠中之紋狀體內注射4週後引起紋狀體中之人類HTT mRNA減弱(KD)。
表118中展現在以不同劑量投與VY-HTT01，YAC128小鼠紋狀體中之平均相對剩餘HTT mRNA及相對HTT mRNA減弱(KD)，以及藉由統計分析產生之p值。 表118. BACHD紋狀體中之HTT mRNA降低
組 劑量 總劑量 (VG) 相對剩餘 HTT mRNA ( 媒劑之 % ；平均值 ±SD) HTT mRNA KD ( 媒劑之 % ；平均值 ±SD) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於組 2) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於組 3) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於組 4) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於組 5)
組1 媒劑 0.0 100 ± 5 0 ± 5 ＜0.0001 ＜0.0001 ＜0.0001 ＜0.0001
組2 低劑量 8.8e9 62 ± 13 38 ± 13 - ＜0.0001 ＜0.0001 ＜0.0001
組3 中等劑量 2.8e10 42 ± 4 58 ± 4 - - 0.0005 0.1686
組4 高劑量 8.8e10 28 ± 6 72 ± 6 - - - 0.1892
組5 MFD 2.8e11 62 ± 13 65 ± 3 - - - -
平均而言，在最大可行劑量下觀測到65±3%人類HTT mRNA KD (相對於媒劑組，p＜0.0001)，高劑量下72±6%人類HTT mRNA KD (相對於媒劑組，p＜0.0001)，低劑量下58±4%人類HTT mRNA KD (相對於媒劑組，p＜0.0001)及低劑量下38±13%人類HTT mRNA KD (相對於媒劑組，p＜0.0001)。發現劑量依賴性人類HTT mRNA KD在低劑量組、中等劑量組及高劑量組中之HTT mRNA含量，及在低劑量組相對於最大可行劑量組中之間的差異。然而，MFD與高劑量之間，或MFD與中間劑量之間，不存在HTT mRNA含量之差異。
總之，此等資料證明在HD之BACHD小鼠模型中，VY-HTT01以劑量依賴性方式遏制紋狀體人類HTT mRNA含量，且在高劑量(每隻動物8.8×1010 個VG)下達到最大HTT mRNA降低。 xi.藉由 VY-HTT01 減弱之劑量依賴性突變型人類 HTT 蛋白
為評估在紋狀體內給藥VY-HTT01之後HTT蛋白降低之劑量依賴性，藉由MSD量測右側紋狀體組織沖取物中之人類HTT蛋白含量。所有樣品與捕捉抗體2B7 (針對人類HTT之小鼠單株抗體)及偵測抗體MW1 (抗聚Q特異性抗體)一式兩份地操作MS。根據標準曲線將人類HTT蛋白含量計算為每毫克總蛋白質(fmol/mg蛋白質)之人類HTT蛋白濃度。各VY-HTT01注射之基團中之相對HTT蛋白減弱為媒劑對照組中之HTT蛋白之百分比。VY-HTT01投與引起紋狀體中之人類突變型HTT蛋白KD。
表119中展現以不同劑量投與VY-HTT01之後，BACHD小鼠紋狀體中之平均相對剩餘HTT蛋白及相對HTT蛋白減弱(KD)以及藉由統計分析產生之p值。 表119. BACHD紋狀體中之HTT蛋白降低
組 劑量 總劑量 (VG) 相對剩餘 HTT 蛋白 ( 媒劑之 % ；平均值 ±SD) HTT 蛋白 KD ( 媒劑之 % ；平均值 ±SD) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於組 2) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於組 3) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於組 4) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於組 5)
組1 媒劑 0.0 100 ± 6 0 ± 6 p＜0.0001 p＜0.0001 p＜0.0001 p＜0.0001
組2 低劑量 8.8e9 55 ± 8 45 ± 8 - 0.3737 p＜0.0001 p＜0.0001
組3 中等劑量 2.8e10 48 ± 13 52 ± 13 - - 0.0006 p＜0.0001
組4 高劑量 8.8e10 30 ± 7 70 ± 7 - - - 0.316
組5 MFD 2.8e11 22 ± 5 78 ± 5 - - - -
平均而言，在給藥後4週，人類突變型HTT蛋白含量在MFD下遏制78±5% (p＜0.0001)，高劑量下70±7% (p＜0.0001)，中等劑量下52±13% (p＜0.0001)及低劑量下45±8% (p＜0.0001)。此人類HTT蛋白降低為劑量依賴性的，其中在MFD相對於中等劑量(p＜0.0001)或低劑量(p＜0.0001)組及高劑量相對於中等劑量(p=0.0006)或低劑量(p＜0.0001)組之間的人類HTT蛋白含量方面存在差異。在MFD與高劑量之間，人類HTT蛋白含量不存在差異。
總之，此等結果證明VY-HTT01在HD之BACHD小鼠模型中以劑量依賴性方式遏制人類突變型HTT蛋白表現，且在給藥後4週，在每隻動物8.8×1010 個VG之劑量下達到紋狀體中之最大人類HTT蛋白降低。
此研究證明，在注射4週之後，VY-HTT01之紋狀體內注射以劑量依賴性方式產生紋狀體人類突變型HTT mRNA及蛋白質KD，範圍介於在最大可行或高劑量下之65-72% HTT mRNA及70-78% HTT蛋白KD至在低劑量下之38% HTT mRNA及45%蛋白質KD。在研究中在任何動物中未偵測到異常籠側觀測結果。對於所有組均可見比較體重增益，且在媒劑注射組與VY-HTT01注射組之間不存在腦重量差異。此等資料證明，藉由紋狀體內輸注投與之VY-HTT01在第4週內以劑量依賴性方式遏制BACHD小鼠紋狀體中之人類突變型HTT mRNA及人類突變型HTT蛋白含量，其中以每隻動物8.8×1010 個VG之劑量獲得最大人類突變型HTT蛋白降低。 實例11.亨丁頓舞蹈症之BACHD小鼠模型中的VY-HTT01功效之活體內研究 i.測試物品製備及投與
此研究之主要目標為探究AAV1封裝之病毒基因體VOYHT1 (SEQ ID NO: 1352；在下文中共同稱為AAV1-VOYHT1或VY-HTT01)在BACHD小鼠中之雙側紋狀體內輸注之後歷經16週時段之運動功能、一般運動及焦慮樣行為上之功效，該小鼠為表現人類全長突變型亨丁頓蛋白質的亨丁頓舞蹈症之模型(HTT)。此外，此研究經設計以評估VY-HTT01投與對以上行為指數及VY-HTT01劑量以及HTT mRNA及蛋白質降低之功效之間的關係。亦記錄下籠側觀測及體重及腦重量資料。
基於獲自實例10 (上文)中所述之劑量反應藥理學實驗之資料，且為了提供最大及分級減少量之人類突變型HTT蛋白，選擇三種劑量之VY-HTT01用於本研究中之評估，如下：8.8×1010 個VG/動物(高劑量)、2.8×1010 個VG/動物(中度劑量或中等劑量)及8.8×109 個VG/動物(低劑量)。簡言之，來自實例10之資料證明在VY-HTT01之雙側紋狀體內投與之後4週此等劑量下分別70%、52%及45%人類突變型HTT蛋白降低。在此研究中，在投與後16週(給藥後)評估輸注部位(紋狀體)處之人類突變型HTT mRNA及蛋白質含量之大腦組織。
此研究涉及四十八(48)隻雌性小家鼠FVB/N-Tg(HTT*97Q)IXwy/J-C57BL/6J (BACHD)小鼠及十二(12)隻FVB/N-C57BL/6 (WT)小鼠(2-3月齡)，其藉由年齡、體重及由基線行為測試產生之結果均勻分佈而隨機分配至各實驗組。在第1天，經由連接至注射器之立體定位之二氧化矽導管，所有動物均接受媒劑(組1及組2)或VY-HTT01 (組3-組5)以0.5 µL/min之雙側注射至左骨及右骨中。組、動物基因型、測試物品及給藥範式之細節展現於表120中。 表120.研究設計
組 基因型 動物數量 劑量 載體劑量 總劑量 (VG) 生命期 ( 週 )
體積注射 ( 微升 / 側 ) 給藥效價 (VG/mL) VG/ 側
組1 WT 12 媒劑 5 0.0 0.0 0.0 16
組2 BACHD 12 媒劑 5 0.0 0.0 0.0 16
組3 BACHD 12 VY-HTT01，低劑量 5 8.8e11 4.4e9 8.8e9 16
組4 BACHD 12 VY-HTT01，中等劑量 5 2.8e12 1.4e10 2.8e10 16
組5 BACHD 12 VY-HTT01，高劑量 5 8.8e12 4.4e10 8.8e10 16
ii.測試物品製備及投與
測試物品製備程序與實例8中所述類似。
藉由注射氯胺酮(10 mg/mL)、甲苯噻嗪(1 mg/mL)及乙醯丙嗪(0.3 mg/mL)溶液(160-200 µL/20 g)麻醉動物且置於立體定位框架中。顱內注射如下進行：將五微升(5 µL)重組病毒載體或媒劑注射至紋狀體(A/P+0.5，M/L±2.0，DV-3.8，來自前囟及硬腦膜；門齒桿，0.0)中，以0.5 µL/min之速率使用10 µL漢彌爾頓注射器進行。在輸注完成之後將針留在適當位置3分鐘，隨後將其從大腦上方取出。乙醯胺苯酚作為手術前及手術後止痛劑在手術前3天及手術後3天於飲用水中提供。 iii.籠側觀測、體重及大腦重量
在注射前進行籠側觀測且在手術後開始每日執行。監測所有小鼠之一般健康狀況及每天疼痛及/或疾病之跡象。
對於體重，在測試物品即將投與之前且在給藥之後每週對小鼠稱重。體重量測指示BACHD小鼠隨時間推移體重增加比其WT同胎鼠仔更多。然而，藉由單向ANOVA以及杜凱氏事後檢定，給藥媒劑或任何劑量之VY-HTT01的BACHD組之間無體重變化差異。
在自動物移出之後記錄腦重量。籠側觀測展示在研究期間所有劑量組中之所有動物均無異常。腦重量量測亦展示，藉由單向ANOVA給藥媒劑或任何劑量之VY-HTT01的BACHD組之間無差異。
基於籠側觀測、體重增加及大腦重量，在研究之16週生命期內，所有劑量之VY-HTT01為良好耐受的。 iv.生命期行為測試
進行四(4)種行為測試以共同評定VY-HTT01對BACHD小鼠運動功能及協調、平衡、運動活動及焦慮樣行為之效應。下文詳細描述之此等測試如下進行：加速旋桿測試；平衡樑測試；曠場試驗；及明/暗箱測試。
進行加速旋桿測試以評估VY-HTT01對小鼠運動功能及運動協調之作用。在旋桿上將BACHD小鼠連續訓練兩天(第1天及第2天)且在第3天測試。在訓練第一天，將旋桿設定為5 RPM之恆定速度持續300秒。將在300秒時段完成之前掉落下該桿之小鼠放回桿上直至300秒時段充分到時。在訓練第二天，將旋桿設定為在300秒內自5 rpm加速至40 rpm。將脫落該桿之小鼠放回桿上直至其完成300秒之訓練時段。在第3天(測試日)，將小鼠置放於旋桿上，該旋桿經300秒內自5 rpm加速至40 rpm。在三個試驗中記錄掉落等待時間，該等待時間界定為直至動物自旋桿掉落下之時間。在給藥前進行旋桿測試以進行基線量測，且在給藥之後每4週重複一次(第28、56、84及113天)直至屍檢。
進行平衡樑測試以評定VY-HTT01對小鼠細微運動協調及平衡之作用。在給藥之前，在第1天在升高之樑(1公尺長，21 mm寬)上訓練BACHD小鼠，且在第2天在1公尺長、9 mm寬之樑上測試以用於基線量測。在給藥之後8週(第57天)及16週(第114天)，在1公尺長、9 mm寬之樑上重複測試。在各測試中，對其中小鼠在樑上未停留的兩個成功試驗之橫穿樑之等待時間(橫跨時間)求平均值。亦記錄滑倒及掉落之次數。
給藥之後在第112天進行曠場試驗以評定運動活動及焦慮樣行為。測試在27.3×27.3×20.3 cm混凝土底層室內進行。將小鼠置放於測試室之中心且使其自由探索60分鐘。使用具有運算出總行進距離(cm)及垂直計數之電腦輔助紅外追蹤系統的俯攝攝影機追蹤且量測包括步行路徑及垂直移動之運動活動。亦針對焦慮樣行為評定所耗費之時間百分比及在曠場室中心行進之距離。
在給藥之後8週(第58天)及16週(第115天)進行明/暗箱測試以評定焦慮樣行為。用於明/暗轉變測試之設備由具有用以分隔暗隔室(暗區域)及透明隔室(亮區域)之黑色塑膠插入物之曠場室組成。將小鼠置放在曠場室之中心中，面對暗隔室入口且使其在暗隔室與亮隔室之間自由移動，其中連接門打開10分鐘。藉由電腦輔助影像程式記錄每一室中行進之距離、轉變之總數目、每一腔室中耗費之時間及進入明室之等待時間。藉由計算在亮區域中行進之距離百分比(在明箱中行進之距離%)及在亮區域中耗費之時間百分比(在明箱中耗費之時間%)來評定焦慮樣行為。
在收集且分析資料之後，行為結果揭露。 v.組織收集
VY-HTT01給藥後十六週，小鼠接受氯胺酮(10 mg/mL)、甲苯噻嗪(1 mg/mL)及乙醯丙嗪(0.3 mg/mL)溶液(160~200 µL/20 g)之腹膜內注射。一旦麻醉，將小鼠稱重且記錄體重。使用腳趾捏壓反應方法測定麻醉程度。一旦無反應，每組8隻小鼠之子組灌注冷1×PBS，且小心地移除大腦。記錄腦重量且接著使用小鼠腦基質(Harvard Apparatus, Holliston, MA)沿著冠狀面軸線切割大腦。使用3 mm活檢體沖取物自2 mm厚的腦板之左右紋狀體收集組織樣品。亦收集上覆皮質區用於潛在生物化學分析。此等紋狀體及皮質樣品隨後在液氮中快速冷凍且儲存在-80℃下用於處理及mRNA或蛋白質分析。
來自每組剩餘4隻動物之大腦在用1×PBS灌注免疫組織化學分析之後立即用4%多聚甲醛固定。
另外，收集來自各小鼠之0.4 cm尾區樣品且儲存在-60℃或更低溫度下直至驗證基因型分析。簡言之，對於基因型，反應混合物含有900 nM正向及反向引子、250 nM探針及50-100 ng/µL DNA。在50℃下初始活化/變性步驟2分鐘且隨後95℃下10分鐘之後，在95℃下15秒，隨後60℃下1分鐘之40次循環期間進行擴增。如所預期，小鼠剪尾樣品之基因型分析證實研究中之所有48種BACHD動物之人類突變型HTT基因均為陽性，且所有12種WT小鼠的均為陰性。 vi.藉由 RT-qPCR 定量之 HTT mRNA
紋狀體組織沖取物處理、總RNA提取及定量即時PCR (RT-qPCR)係使用自左側紋狀體收集之組織沖取物進行。藉由RT-qPCR塔克曼分析，使用與實例8中所述類似之程序測定人類HTT及小鼠X-脯胺醯基胺基肽酶1 (XPNPEP1) mRNA含量。HTT mRNA含量歸一化至XPNPEP1 mRNA含量，且隨後進一步歸一化至媒劑對照組。在分析資料之後，RT-qPCR結果揭露。 vii.HTT 蛋白定量
HTT蛋白定量程序與實例8中所述之程序類似。 viii.免疫組織化學分析
使用標準程序對小鼠大腦進行NeuN、GFAP、Iba1、DARPP32及氟Jade C之免疫組織化學(IHC)染色。 ix.接受準則
接受準則類似於實例8中所描述之準則。 x.VY-HTT01 對 BACHD 小鼠運動功能及運動協調之作用
如先前所描述，執行加速旋桿測試以評定VY-HTT01對運動功能及運動協調之作用，同時執行平衡樑測試以評定VY-HTT01細微運動協調及平衡之作用。對應於此等行為指數之資料詳細展現於下文中。
旋桿測試在給藥前進行，且在給藥後每4週重複一次直至16週給藥後。記錄各動物掉落之絕對等待時間。旋桿測試絕對掉落等待時間(秒)資料之展現於表121中。 表121.旋桿測試中掉落等待時間(秒)
基因型 劑量 給藥前基線 ( 平均值 ±SD ， n=12/ 組 ) 給藥後 4 週 ( 平均值 ±SD ， n=12/ 組 ) 給藥後 8 週 ( 平均值 ±SD ， n=12/ 組 ) 給藥後 12 週 ( 平均值 ±SD ， n=12/ 組 給藥後 16 週 ( 平均值 ±SD ， n=23-12/ 組
WT 媒劑 277 ± 51 281 ± 16 242 ± 47 238 ± 46 236 ± 42
BACHD 媒劑 182 ± 73 139 ± 41 105 ± 38 98 ± 34 90 ± 33
BACHD VY-HTT01，高劑量 199 ± 67 113 ± 72 63 ± 35 50 ± 30 44 ± 31
BACHD VY-HTT01，中等劑量 181 ± 50 118 ± 36 85 ± 27 80 ± 29 73 ± 25
BACHD VY-HTT01，低劑量 189 ± 68 136 ± 32 107 ± 38 84 ± 33 86 ± 31
掉落等待時間資料亦表示為給藥前基線之百分比(%) (給藥後等待時間/給藥前等待時間×100%)或掉落等待時間之變化百分比。旋桿測試掉落等待時間百分比(%)資料展現於表122中。 表122.旋桿測試中掉落等待時間變化百分比(%)
基因型 劑量 給藥前基線 ( 平均值 ±SD ， n=12/ 組 ) 給藥後 4 週 ( 平均值 ±SD ， n=12/ 組 ) 給藥後 8 週 ( 平均值 ±SD ， n=12/ 組 ) 給藥後 12 週 ( 平均值 ±SD ， n=12/ 組 給藥後 16 週 ( 平均值 ±SD ， n=23-12/ 組
WT 媒劑 100 ± 22 85 ± 25 94 ± 18 90 ± 23 91 ± 23
BACHD 媒劑 100 ± 65 112 ± 44 103 ± 36 87 ± 35 91 ± 31
BACHD VY-HTT01，高劑量 100 ± 59 110 ± 49 129 ± 41 121 ± 46 127 ± 53
BACHD VY-HTT01，中等劑量 100 ± 72 111 ± 58 118 ± 70 112 ± 61 128 ± 60
BACHD VY-HTT01，低劑量 100 ± 55 96 ± 51 102 ± 52 106 ± 50 124 ± 50
總之，相比於WT同胎鼠仔，BACHD小鼠之運動功能受損，如藉由較短的掉落等待時間所指示。在給藥後直至16週未前，觀測不到任何劑量下VY-HTT01之有益效果，但藉由雙向ANOVA分析以及杜凱氏多重比較檢定，相對於媒劑、VY-HTT01中度劑量或低劑量BACHD小鼠，VY-HTT01高劑量(每隻動物8.8×1010 個VG) BACHD小鼠展示掉落等待時間較大減少。對應於對等待時間(給藥前基線之%)或掉落等待時間變化百分比、旋桿資料進行之統計分析的P值展現於表123中。 表123.在旋桿測試中掉落等待時間變化百分比(%)之統計分析
利用單向 ANOVA 以及杜凱氏多重比較檢定 ( veh = 媒劑 ； 高 = 高劑量 ， 中 = 中等劑量 ， 低 = 低劑量 VY-HTT01) 給藥前基線 ( 平均值 ±SD ， n=12/ 組 ) 給藥後 4 週 ( 平均值 ±SD ， n=12/ 組 ) 給藥後 8 週 ( 平均值 ±SD ， n=12/ 組 ) 給藥後 12 週 ( 平均值 ±SD ， n=12/ 組 給藥後 16 週 ( 平均值 ±SD ， n=12/ 組
WT-Veh相對於BACHD-Veh 0.016 0.044 0.032 0.067 0.004
BACHD-Veh相對於BACHD-高 ＞0.999 0.408 0.017 0.003 0.004
BACHD-Veh相對於BACHD-中 ＞0.999 0.595 0.457 0.561 0.545
BACHD-Veh相對於BACHD-低 ＞0.999 0.950 0.999 0.592 0.953
BACHD-高相對於BACHD-中 ＞0.999 0.886 0.140 0.033 0.029
BACHD-高相對於BACHD-低 ＞0.999 0.565 0.020 0.047 0.009
BACHD-中相對於BACHD-低 ＞0.999 0.817 0.528 ＞0.999 0.841
在給藥前進行平衡樑測試且隨後在給藥後8週及16週重複以評定VY-HTT01對BACHD小鼠之細微運動協調及平衡之作用。在各平衡樑測試中，動物橫穿三個試驗之較高的1-公尺長、9-mm寬之樑。記錄橫穿樑所需之絕對橫跨時間(秒)。給藥前基線之百分比(%)形式的橫跨時間計算為給藥後橫跨時間/給藥前橫跨時間×100%。在表124中展現橫跨平衡樑所耗費之時間資料(表示為絕對橫跨時間(秒))。 表124.在該平衡樑測試中橫跨樑所耗費之時間(秒)
基因型 劑量 給藥前基線 ( 平均值 ±SD ， n=12/ 組 ) 給藥後 8 週 ( 平均值 ±SD ， n=12/ 組 ) 給藥後 16 週 ( 平均值 ±SD ， n=12/ 組 )
WT 媒劑 10 ± 3 8 ± 2 7 ± 3
BACHD 媒劑 16 ± 5 20 ± 8 18 ± 7
BACHD VY-HTT01，高劑量 19 ± 7 19 ± 6 16 ± 7
BACHD VY-HTT01，中等劑量 22 ± 11 24 ± 17 14 ± 8
BACHD VY-HTT01，低劑量 17 ± 8 21 ± 9 15 ± 6
表125中展現橫跨平衡樑所耗費之時間資料(表示為給藥前基線之百分比(%))。 表125.在平衡樑測試中橫跨樑所耗費之時間變化百分比(%)
基因型 劑量 給藥前基線 ( 平均值 ±SD ， n=12/ 組 ) 給藥後 8 週 ( 平均值 ±SD ， n=12/ 組 ) 給藥後 16 週 ( 平均值 ±SD ， n=12/ 組 )
WT 媒劑 100 ± 29 79 ± 21 70 ± 28
BACHD 媒劑 100 ± 34 123 ± 50 113 ± 42
BACHD VY-HTT01，高劑量 100 ± 34 101 ± 33 84 ± 39
BACHD VY-HTT01，中等劑量 100 ± 49 107 ± 75 65 ± 37
BACHD VY-HTT01，低劑量 100 ± 49 120 ± 54 87 ± 34
總之，在給藥後16週相對於WT小鼠，注射媒劑之BACHD小鼠需要更多時間跨越平衡樑，表明細微運動協調之缺陷(藉由雙向ANOVA以及杜凱氏多重比較檢定，p＜0.05)。在BACHD小鼠中，給藥後16週，相對於媒劑，中等劑量VY-HTT01 (每隻動物2.8×1010 個VG)注射縮短橫跨時間，提供針對細微運動功能及平衡之VY-HTT01相關改良的支持(藉由雙向ANOVA以及杜凱氏多重比較檢定，p＜0.05)。然而，在高劑量或低劑量VY-HTT01下，橫跨時間不變(p＞0.05)。
亦記錄在橫穿平橫樑期間肢體滑倒次數。藉由單向ANOVA以及杜凱氏多重比較檢定，在任何測試劑量之VY-HTT01之情況下不存在滑倒次數變化。關於平衡樑測試中之滑倒次數之資料展現於表126中。 表126.在平衡樑測試中之滑倒次數
基因型 劑量 給藥前基線 ( 平均值 ±SD ， n=12/ 組 ) 給藥後 8 週 ( 平均值 ±SD ， n=12/ 組 ) 給藥後 16 週 ( 平均值 ±SD ， n=12/ 組 )
WT 媒劑 0.2 ± 0.3 0.1 ± 0.2 0.1 ± 0.3
BACHD 媒劑 0.3 ± 0.6 4.0 ± 4.8 3.2 ± 3.7
BACHD VY-HTT01，高劑量 1.3 ± 2.8 6.1 ± 6.6 4.3 ± 5.2
BACHD VY-HTT01，中等劑量 0.3 ± 0.5 7.1 ± 7.6 6.0 ± 7.1
BACHD VY-HTT01，低劑量 0.6 ± 0.8 4.6 ± 3.6 4.6 ± 6.4
xi.VY-HTT01 對 BACHD 小鼠運動活動及焦慮樣行為之影響
如先前所描述，進行曠場試驗以評定運動活動及焦慮樣行為。明/暗工作箱測試作為焦慮樣行為之額外度量進行。對應於此等行為指數之資料詳細展現於下文中。
為量測一般運動活性，在給藥後16週對BACHD小鼠及WT同胎鼠仔進行曠場試驗(約6.5月齡)。簡言之，將各小鼠置放於曠場室之中心中且使其自由探索該室60分鐘。藉由在1小時自由探索期間行進之總距離(cm)評定小鼠運動活動。藉由在曠場之中心區域中所耗費之時間百分比(%)及在曠場之中心區域中行進之距離%來評定焦慮樣行為。曠場試驗之行進之總距離(cm)、中心區域中之時間百分比(%)及中心區域中行進之距離百分比(%)的資料展現於表127中。 表127.曠場試驗運動活動及焦慮
基因型 劑量 運動 焦慮
總距離 (cm ；平均值 ±SD ， n=12/ 組 ) 中心距離 % ( 平均值 ±SD ， n=12/ 組 ) 中心時間 % ( 平均值 ±SD ， n=12/ 組 )
WT 媒劑 6054 ± 2248 44 ± 6 22 ± 9
BACHD 媒劑 2385 ± 762 35 ± 10 13 ± 9
BACHD VY-HTT01，高劑量 2486 ± 836 24 ± 14 7 ± 7
BACHD VY-HTT01，中等劑量 2965 ± 1597 30 ± 12 10 ± 6
BACHD VY-HTT01，低劑量 2096 ± 444 25±11 10 ± 6
總之，如藉由行進之總距離所量測，與WT同胎鼠仔相比，注射媒劑之BACHD小鼠具有低活性(p＜0.0001，單向ANOVA以及杜凱氏多重比較檢定)。任何劑量下之VY-HTT01紋狀體內注射對曠場試驗中所行進之總距離無影響。另外，在給藥後16週，相對於WT同胎鼠仔，注射媒劑之BACHD小鼠在曠場試驗中展示增加之焦慮，如藉由中心區域中所耗費之時間百分比所評定(p＜0.05，單向ANOVA以及杜凱氏多重比較檢定)。在給藥後8週或16週，紋狀體內注射VY-HTT01對曠場試驗焦慮指數無影響。
在給藥後8及16週，藉由評估明/暗箱中行進之總距離之百分比(%)以及明箱中所耗費之總時間之百分比(%)，在明/暗箱測試中額外評定焦慮樣表型。燈箱中所行進之總距離(cm)之百分比(%)之資料以及明箱中所耗費之用於明/暗箱測試之總時間之百分比(%)展現於表128中。 表128.在明/暗箱測試中之明箱中行進之距離及時間百分比(%)
基因型 劑量 給藥後 8 週 給藥後 16 週
明箱中距離 % ( 平均值 ±SD ， 12/ 組 ) 明箱中時間 % ( 平均值 ±SD ， 12/ 組 ) 明箱中距離 % ( 平均值 ±SD ， 12/ 組 ) 明箱中時間 % ( 平均值 ±SD ， 12/ 組 )
WT 媒劑 32.4 ± 3.8 35.7 ± 7.8 33.5 ± 5.8 36.4 ± 9.7
BACHD 媒劑 22.3 ± 7.2 24.2 ± 11.5 25.1 ± 6.1 23.9 ± 10.1
BACHD VY-HTT01，高劑量 18.7 ± 7.0 17.9 ± 11.1 27.8 ± 4.6 22.7 ± 6.7
BACHD VY-HTT01，中等劑量 18.3 ± 6.7 18.4 ± 13.8 23.5 ± 7.3 19.1 ± 7.6
BACHD VY-HTT01，低劑量 19.0 ± 6.3 17.3 ± 8.8 26.1 ± 6.9 21.7 ± 8.7
總之，注射媒劑之BACHD小鼠在給藥後8週及16週於明/暗箱測試中展示增加之焦慮，如藉由在與注射媒劑之WT小鼠相比較時，明箱中之總行進距離(cm)百分比(%)以及在明箱中耗費之總時間百分比(%)所評定(p＜0.05，使用單向ANOVA以及杜凱氏多重比較檢定)。在給藥後8週或16週，紋狀體內注射VY-HTT01對明/暗箱測試中之此等端點無影響。另外，在給藥後16週相對於8週，在高劑量(每隻動物8.8×1010 個VG)及低劑量(每隻動物8.8×109 個VG)下之VY-HTT01使在明箱中行進之距離分別增加48.0% (p＜0.01，雙向ANOVA西達克氏多重比較檢定(two-way ANOVA Sidak's multiple comparisons test))及36.5% (p＜0.05，雙向ANOVA西達克氏多重比較檢定)，表明隨時間推移VY-HTT01減少焦慮。 xii.藉由 VY-HTT01 之劑量依賴性人類 HTT mRNA 減弱
在紋狀體內給藥VY-HTT01後16週時完成行為評定後，評定來自每BACHD組8隻動物之左半球之紋狀體樣品中之人類突變型HTT mRNA降低之劑量依賴性。藉由RT-qPCR量測人類HTT及小鼠XPNPEP1 mRNA (作為內部對照)含量。針對qPCR，所有樣品一式兩份地操作。針對HTT及XPNPEP1計算平均Ct值及標準差(SD)，且針對各樣品測定ΔCt (CtHTT-CtXPNPEP1)。隨後計算ΔΔCt (VY-HTT01注射之樣品之ΔCt-平均媒劑ΔCT)。藉由2-ΔΔCt方法計算各樣品之相對人類突變型HTT mRNA含量且表示為相對於媒劑對照BACHD組之百分比。在紋狀體內注射之後16週，所有劑量之VY-HTT01在BACHD小鼠中產生紋狀體中之人類突變型HTT mRNA KD。表129中展現在不同劑量下投與VY-HTT01後16週，BACHD小鼠紋狀體中之人類HTT mRNA含量以及藉由統計分析產生之p值。 表129.在給藥後16週，BACHD紋狀體中之HTT mRNA降低
基因型 劑量 給藥後 16 週 ( 媒劑之 % ；平均值 ±SD ， n=8/ 組 ) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於媒劑 ) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於高劑量 ) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於中等劑量 ) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於低劑量 )
相對剩餘 HTT mRNA HTT mRNA KD
BACHD 媒劑 100 ± 26 0 ± 26 - ＜0.0001 ＜0.0001 ＜0.0001
BACHD VY-HTT01，高劑量 55 ± 10 45 ± 10 - - 0.9992 0.4248
BACHD VY-HTT01，中等劑量 54 ± 10 46 ± 10 - - - 0.4994
BACHD VY-HTT01，低劑量 43 ± 7 57 ± 7 - - - -
平均而言，高劑量下存在45±10%人類突變型HTT mRNA KD (相對於BACHD媒劑組，p＜0.0001)，中等劑量下存在46±10%人類突變型HTT mRNA KD (相對於BACHD媒劑組，p＜0.0001)及低劑量下存在57±7%人類突變型HTT mRNA KD (相對於BACHD媒劑組，p＜0.0001)。在給藥後16週，跨越高劑量、中等劑量及低劑量BACHD組之HTT mRNA含量不存在差異。因此，在給藥後16週，以8.8×109 、2.8×1010 及8.8×1010 個VG/動物在紋狀體內投與VY-HTT01使得BACHD小鼠中之類似45-57%紋狀體人類突變型HTT mRNA遏制。
在紋狀體內給藥VY-HTT01後16週時完成行為評定後，使用MSD分析，評定來自每組8隻動物之右半球之紋狀體樣品中之人類突變型HTT蛋白降低之劑量依賴性。所有劑量之VY-HTT01產生紋狀體中之人類突變型HTT蛋白KD。表130中展現在不同劑量下投與VY-HTT01後16週，BACHD小鼠紋狀體中之人類HTT蛋白含量以及藉由統計分析產生之p值。 表130.在給藥後16週，BACHD紋狀體中之HTT蛋白降低
基因型 劑量 給藥後 16 週 ( 媒劑之 % ；平均值 ±SD ， n=8/ 組 ) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於媒劑 ) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於高劑量 ) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於中等劑量 ) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於低劑量 )
相對剩餘 HTT 蛋白 HTT 蛋白 KD
BACHD 媒劑 100 ± 23 0 ± 23 - ＜0.0001 ＜0.0001 ＜0.0001
BACHD VY-HTT01，高劑量 23 ± 3 77 ± 3 - - 0.2745 0.0003
BACHD VY-HTT01，中等劑量 34 ± 7 66 ± 7 - - - 0.0295
BACHD VY-HTT01，低劑量 53 ± 8 47 ± 8 - - - -
平均而言，在給藥後16週，使用單向ANOVA以及杜凱氏事後檢定，人類突變型HTT蛋白含量在高劑量下遏制77±3% (p＜0.0001)，在中等劑量下66±7% (p＜0.0001)且在低劑量下47±8% (p＜0.0001)。此人類突變型HTT蛋白降低為劑量依賴性的，其中在高劑量相對於低劑量(p＜0.001)及中等相對於低劑量(p＜0.05)組之間的人類HTT蛋白含量存在差異。高劑量及中等劑量VY-HTT01組之間的人類突變型HTT蛋白含量方面不存在差異。此等結果證明，紋狀體內給藥VY-HTT01在HD之BACHD小鼠模型中以劑量依賴性方式遏制紋狀體中之人類突變型HTT蛋白表現，且在給藥後16週使紋狀體中之最大人類突變型HTT蛋白降低達到每隻動物2.8×1010 個VG。 xiii.在使用 VY-HTT01 之紋狀體給藥之後的細胞標記物之免疫組織化學分析
在紋狀體內給藥VY-HTT01後16週時行為評定完成之後，來自每組4隻動物之大腦用於免疫組織化學。進行免疫組織化學(IHC)分析以研究VY-HTT01是否影響BACHD小鼠紋狀體中之NeuN、DARPP32、Fluoro-Jade C、GFAP及Iba1染色。
在媒劑BACHD與WT小鼠之間，或跨越媒劑及VY-HTT01 BACHD小鼠，NeuN陽性細胞之紋狀體密度不存在差異。另外，在注射媒劑之BACHD與WT小鼠之間，或跨越媒劑及VY-HTT01 BACHD小鼠，在紋狀體中DARPP32、Iba1或GFAP免疫反應性不存在差異。基於氟-Jade C免疫反應性，在任何組中未鑑別出神經元退化。
在此研究中，在BACHD小鼠中未鑑別出神經元細胞密度、神經膠瘤病或體重之處理相關差異。
此研究證明，紋狀體內注射VY-HTT01 (每隻動物8.8×109 、2.8×1010 或8.8×1010 個VG)使得紋狀體人類突變型HTT mRNA KD在45%至57%範圍內，伴有在BACHD小鼠中在給藥後16週劑量依賴性47-77%紋狀體人類突變型HTT蛋白KD。在BACHD小鼠中在給藥後16週，VY-HTT01 (每隻動物2.8×1010 個VG)改良平衡樑測試之運動協調缺陷。在明/暗箱測試中，在對BACHD小鼠給藥後8週與16週之間，VY-HTT01 (每隻動物8.8×109 及8.8×1010 個VG)改善焦慮。
與投與媒劑之BACHD小鼠相比，紋狀體中高劑量之VY-HTT01 (每隻動物8.8×1010 個VG)使得HTT蛋白KD為77%；在給藥後16週引起旋桿測試中掉落等待時間減少；以及在BACHD小鼠中，在給藥後8至16週明/暗箱測試中改善焦慮。與投與媒劑之BACHD相比，VY-HTT01之中度(中等)劑量(每隻動物2.8×1010 個VG)引起紋狀體中之HTT蛋白KD降低66%，以及在給藥後16週之平衡樑測試中改善細微運動協調。相比於投與媒劑之BACHD小鼠，低劑量之VY-HTT01 (每動物8.8×109 個VG)在紋狀體中產生人類突變型HTT蛋白KD 47%，伴隨有在給藥後8至16週明/暗箱測試中焦慮樣行為之改善。VY-HTT01對神經元或神經膠質標記物不具有明顯作用。
此等資料證明，藉由紋狀體內輸注投與之VY-HTT01以劑量依賴性方式降低BACHD小鼠紋狀體中之人類突變型HTT表現；且如藉由在中等(每隻動物2.8×1010 個VG)劑量之VY-HTT01下平衡樑測試中所評定，改善細微運動協調；及如藉由在低(每隻動物8.8×109 個VG)劑量及高(每隻動物8.8×1010 個VG)劑量之VY-HTT01下明/暗箱測試中所評定，改善BACHD小鼠焦慮。 實例12.在殼核內及丘腦內輸注VY-HTT01之後用不同遞送參數進行NHP殼核、尾核及丘腦中之HTT蛋白評估i. 研究設計
作為上文詳細描述之實例1 (劑量最佳化研究I)之延伸，此研究之首要目標為，在非人類靈長類動物(NHP)恆河獼猴(普通獼猴)中進行雙側組合殼核內及丘腦內輸注AAV1-VOYHT1之後5週，量測來自殼、尾核及丘腦之組織沖取物中之HTT蛋白含量，以表徵HTT蛋白含量之不同AAV1-VOYHT1遞送參數((例如輸注體積及濃度)之作用，及作為建立未來HTT給藥參數之基礎。亦自相同組織樣品量測NHP HTT mRNA以便探討來自相同樣品之相對HTT蛋白與相對HTT mRNA含量之間的關係。研究實施之一般態樣，包括動物護理/組、測試物品製備及給藥時程，與實例1 (上文)中所述相同。表40中所概述之研究設計類似地反映本發明研究之研究設計。i. 組織樣品收集及製備
使用猴腦基質收集各動物之大致兩個冠狀腦切片(3 mm厚)。接著新鮮冷凍腦切片且在-60℃下儲存用於潛在藥理學分析或經固定以用於病理組織學評估。
用於隨後定量HTT蛋白之腦組織樣品收集之程序類似於實例7 (上文)中所述之彼等程序。簡言之，在室溫下(約1分鐘)使冷凍腦切片溫熱，且隨後使用配備有柱塞之2 mm活檢體沖取物快速收集組織樣品，並立即轉移至乾冰上之預冷卻收集管。所有組織沖取物在收集期間均維持在乾冰上，且接著儲存在-80℃下直至組織分析。
用於隨後定量HTT蛋白之組織樣品製備之程序如實例7 (上文)中所述。簡言之，稱取腦組織沖取物，使用組織撞擊器粉碎，轉移至預冷凍收集瓶中，且儲存在乾冰上。將經粉碎乾燥組織粉末等分分成兩個部分：藉由分支鏈DNA (bDNA)分析將四分之一之組織粉末轉移至用於HTT mRNA量測之新穎預冷卻管中，且將組織粉末之其餘四分之三轉移至用於藉由LC-MS/MS定量之HTT蛋白的另一預冷卻管中。ii. 用於定量 HTT mRNA 之分支鏈 DNA 分析
藉由分支鏈DNA (bDNA)分析定量HTT mRNA之方法如上文在實例1 (上文)中所述。iii. 用於定量HTT蛋白之LC-MS/MS
如上文在實例7 (上文)中所描述，藉由UPLC-MS/MS (超高效液相層析質譜分析及液相層析聯合質譜分析)或LC-MS/MS定量HTT蛋白之方法。所有樣品均同時操作用於藉由LC-MS/MS定量HTT蛋白。iv. 殼核 HTT 蛋白及 mRNA 含量
為評估殼核中之HTT蛋白及mRNA降低，自來自所有組之所有動物的右半球中之殼核收集4個沖取物，產生每組總共12個沖取物。藉由LC-MS/MS將經粉碎殼核沖取物粉末之等分試樣用於HTT及β-肌動蛋白蛋白分析。HTT蛋白含量歸一化至b-肌動蛋白(內部對照)之含量，且接著進一步歸一化至媒劑組。表131中展現跨越總VG劑量(VG/動物或VG)且以媒劑(veh)、對應標準差(stdev)值之百分比表示的平均相對剩餘殼核HTT蛋白及相對殼核HTT蛋白減弱(KD)以及藉由單向ANOVA以及杜凱氏多重比較產生的P值。應注意，下表131中所列之動物之各組(grp)由每組3隻動物組成，除組A3以外，其每組僅具有2隻動物。 表131.在雙側殼核內及丘腦內輸注AAV1-VOYHT1之後，NHP殼核中劑量依賴性HTT蛋白降低
組 (Grp) 總劑量 (VG) 相對剩餘 HTT 蛋白 ( 媒劑 ± 標準差之 %) 相對 HTT 蛋白 KD ( 媒劑 ± 標準差之 %) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於 Grp A1) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於 Grp A2) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於 Grp A3) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於 Grp A4) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於 Grp A5)
Grp A6 0.00 100 ± 4 0 ± 4 0.2951 0.0006 0.0023 0.2259 0.8209
Grp A5 1.35e11 90 ± 8 10 ± 8 0.9014 0.0033 0.012 0.8217 -
Grp A4 4.50e11 79 ± 19 21 ± 19 ＞0.9999 0.0221 0.068 - -
Grp A1 6.75e11 81 ± 11 19 ± 11 - 0.0162 0.0516 - -
Grp A2 1.35e12 46 ± 4 54 ± 4 - - 0.9997 - -
Grp A3 2.16e12 48 ± 4 52 ± 4 - - - - -
在雙側殼核內及丘腦內輸注不同總劑量之AAV1-VOYHT1之後，在殼核中達成顯著及劑量依賴性HTT蛋白降低。特定言之，相對於媒劑(veh)組(組A6)，組A5 (每隻動物1.35×1011 個VG)、組A4 (每隻動物4.50×1011 個VG)、組A1 (每隻動物6.75×1011 個VG)、組A2 (每隻動物1.35×1012 個VG)及組A3 (每隻動物2.16×1012 個VG)分別存在平均10%、21%、19%、54%及52% HTT蛋白KD。在每隻動物1.35×1012 及2.16×1012 之兩個最高劑量下，HTT蛋白KD相對於媒劑(組A6)為統計學上顯著的(P＜0.01，藉由單向ANOVA以及杜凱氏多重比較檢定)，且相比最低劑量組(每隻動物1.35×1011 個VG)為統計學上較大的(P＜0.05，藉由單向ANOVA以及杜凱氏多重比較檢定)。兩個最高劑量(1.35×1012 及2.16×1012 個VG/動物)亦產生在統計學上比由4.50×1011 及6.75×1011 個VG/動物劑量產生之HTT蛋白KD大的HTT蛋白KD (P＜0.05，藉由單向ANOVA以及杜凱氏多重比較檢定)。在兩個最高劑量(1.35×1012 及2.16×1012 個VG/動物)下在HTT蛋白KD之間不存在統計學差異(P=0.9997，藉由單向ANOVA以及杜凱氏多重比較檢定)。
接著在組A1 (殼核/50 µL，丘腦/75 µL)、組A2 (殼核/100 µL，丘腦/150 µL)及組A3 (殼核/150 µL，丘腦/250 µL)之最高載體濃度(2.7×1012 vg/mL)下評估輸注體積對殼核中之HTT蛋白降低之作用。表132中展現跨越輸注體積且以媒劑(veh)、對應標準差(stdev)值之百分比表示之平均相對剩餘殼核HTT蛋白及相對殼核HTT蛋白減弱(KD)，以及藉由單向ANOVA以及杜凱氏多重比較產生之P值。應注意，表132中所列之動物之各組(grp)由每組3隻動物組成，除組A3以外，其每組僅具有2隻動物。 表132.在雙側殼核內及丘腦內輸注AAV1-VOYHT1之後，NHP殼核中體積依賴性HTT蛋白降低
組 (Grp) 總劑量 (VG) 相對剩餘 HTT 蛋白 ( 媒劑 ± 標準差之 %) 相對 HTT 蛋白 KD ( 媒劑 ± 標準差之 %) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於 Grp A1) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於 Grp A2) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於 Grp A3)
Grp A6 0.00 100 ± 4 0 ± 4 0.0454 0.0001 0.0004
Grp A1 6.75e11 81 ± 11 19 ± 11 - 0.0019 0.0057
Grp A2 1.35e12 46 ± 4 54 ± 4 - - 0.9707
Grp A3 2.16e12 48 ± 4 52 ± 4 - - -
在最高載體濃度下以體積依賴性方式雙側組合殼核內及丘腦內輸注AAV1-VOYHT1在殼核中產生實質性HTT蛋白KD (2.7×1012 vg/mL)。分別在組A3 (殼核/150 µL，丘腦/250 µL)、組A2 (殼核/100 µL，丘腦/150 µL)及組A1 (殼核/50 µL，丘腦/75 µL)之殼核中達成52%、54%及19%之平均HTT蛋白KD，其相對於媒劑(組A6)在統計學上為顯著的(P＜0.05)，具有用於組A2及組A3之較大輸注體積，使得其HTT蛋白KD (P＜0.05)比組A1之最小體積的要大。用於組A2 (殼核/100 µL、丘腦/150 µL)及組A3 (殼核/150 µL、丘腦/250 µL)之輸注體積之間不存在統計學上顯著之差異(P=0.9707)。
亦相對於媒劑對照組(組A6)，評估在相同給藥體積(殼核/100 µL，丘腦/150 µL)下在雙側殼核內及丘腦內投與AAV1-VOYHT1之後組A5 (2.7×1011 vg/mL)、組A4 (9.0×1011 vg/mL)及組A2 (2.7×1012 vg/mL)的載體濃度對NHP殼核中之HTT蛋白KD之影響。表133中展現跨越載體濃度且以媒劑(veh)、對應標準差(stdev)值之百分比表示之平均相對剩餘殼核HTT蛋白及相對殼核HTT蛋白減弱(KD)，以及藉由藉由單向ANOVA以及杜凱氏多重比較產生之P值。應注意，表132中所列之動物之各組(grp)由每組3隻動物組成。 表133.在雙側殼核內及丘腦內輸注AAV1-VOYHT1之後，NHP殼核中之濃度依賴性HTT蛋白降低
組 總劑量 (VG) 相對剩餘 HTT 蛋白 ( 媒劑 ± 標準差之 %) 相對 HTT 蛋白 KD ( 媒劑 ± 標準差之 %) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於 Grp A5) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於 Grp A4) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於 Grp A2)
Grp A6 0.00 100 ± 4 0 ± 4 0.6537 0.1626 0.0012
Grp A5 1.35e11 90 ± 8 10 ± 8 - 0.6545 0.0047
Grp A4 4.50e11 79 ± 19 21 ± 19 - - 0.0215
Grp A2 1.4e12 46 ± 4 54 ± 4 - - -
此等結果展示在相同給藥體積(殼核/100 µL，丘腦/150 µL)下，分別在A2 (2.7×1012 vg/mL)、組A4 (9.0×1011 vg/mL)及組A5 (2.7×1011 vg/mL)中之殼核中達成平均54%、21%及10% HTT蛋白KD。另外，最高HTT蛋白KD在組A2中在最高AAV1-VOYHT1濃度(2.7×1012 vg/mL)下達成，其相對於媒劑及相對於兩種較低AAV1-VOYHT1濃度9.0×1011 vg/mL及2.7×1011 vg/mL在統計學上為顯著的(P＜0.05)。
在用於HTT蛋白定量之相同殼核沖取物中，使用針對恆河猴HTT、TBP、AARS及XPNPEP1之特定探針集，如實例1 (上述)中所述，藉由bDNA分析量測殼核中之HTT mRNA含量。HTT mRNA含量歸一化至三個管家基因TBP、AARS及XPNPEP1之幾何平均值，且隨後進一步歸一化至媒劑組。表134中展現跨越VG劑量(VG/動物或VG)且以媒劑(veh)、對應標準差(stdev)值之百分比表示的平均相對剩餘殼核HTT mRNA及相對殼核HTT mRNA減弱(KD)以及藉由單向ANOVA以及杜凱氏多重比較產生的P值。應注意，表134中所列之動物之各組(grp)由每組3隻動物組成，除組A3以外，其每組僅具有2隻動物。 表134.在雙側殼核內及丘腦內輸注AAV1-VOYHT1之後，NHP殼核劑量依賴性HTT mRNA降低
組 (Grp) 總劑量 (VG) 相對剩餘 mRNA 蛋白 ( 媒劑 ± 標準差之 %) 相對 HTT mRNA KD ( 媒劑 ± 標準差之 %) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於 Grp A1) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於 Grp A2) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於 Grp A3) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於 Grp A4) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於 Grp A5)
Grp A6 0.00 100 ± 6 0 ± 6 0.0928 0.0013 0.0011 0.0217 0.2672
Grp A5 1.35e11 77 ± 7 23 ± 7 0.9766 0.0454 0.0251 0.6037 -
Grp A4 4.50e11 61 ± 21 39 ± 21 0.9363 0.4755 0.2386 - -
Grp A1 6.75e11 70 ± 10 30 ± 10 - 0.1391 0.0695 - -
Grp A2 1.35e12 43 ± 14 57 ± 14 - - 0.9728 - -
Grp A3 2.16e12 34 ± 3 66 ± 3 - - - - -
在雙側殼核內及丘腦內輸注不同總劑量之AAV1-VOYHT1之後，在殼核中達成顯著且劑量依賴性HTT mRNA減少。特定言之，相對於媒劑組(組A6)，組A5 (每隻動物1.35×1011 個VG)、組A4 (每隻動物4.50×1011 個VG)、組A1 (每隻動物6.75×1011 個VG)、組A2 (每隻動物1.35×1012 個VG)及組A3 (每隻動物2.16×1012 個VG)分別存在平均23%、39%、30%、57%及66% HTT mRNA KD。在每隻動物1.35×1012 個VG及每隻動物2.16×1012 個VG之兩個最高劑量及每隻動物4.50×1011 個VG之劑量下，相對於媒劑(組A6)，HTT mRNA KD在統計學上為顯著的(P＜0.05，藉由單向ANOVA以及杜凱氏多重比較檢定)。另外，兩個最高劑量產生在統計學上比最低劑量組(每隻動物1.35×1011 個VG)更大之HTT mRNA KD (P＜0.05，藉由單向ANOVA以及杜凱氏多重比較檢定)。在兩個最高劑量(1.35×1012 及2.16×1012 個VG/動物)下之HTT mRNA KD之間不存在統計學差異(P=0.9728，藉由單向ANOVA以及杜凱氏多重比較檢定)。
隨後在組A1 (殼核/50 µL，丘腦/75 µL)、組A2 (殼核/100 µL，丘腦/150 µL)及組A3 (殼核/150 µL，丘腦/250 µL)之最高載體濃度(2.7×1012 vg/mL)下評估載體體積對殼核中之HTT mRNA降低之作用。表135中展現跨越輸注體積且以媒劑、對應標準差(stdev)值之百分比表示之平均相對剩餘殼核HTT mRNA及相對殼核HTT mRNA減弱(KD)，以及藉由藉由單向ANOVA以及杜凱氏多重比較產生之P值。應注意，表135中所列之動物之各組(grp)由每組3隻動物組成，除組A3以外，其每組僅具有2隻動物。 表135.在雙側殼核內及丘腦內輸注AAV1-VOYHT1之後，NHP殼核中體積依賴性HTT mRNA降低
組 (Grp) 總劑量 (VG) 相對剩餘 HTT mRNA ( 媒劑 ± 標準差之 %) 相對 HTT mRNA KD ( 媒劑 ± 標準差之 %) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於 Grp A1) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於 Grp A2) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於 Grp A3)
Grp A6 0.00 100 ± 6 0 ± 6 0.0303 0.0009 0.0007
Grp A1 6.75e11 70 ± 10 30 ± 10 - 0.0456 0.0229
Grp A2 1.35e12 43 ± 14 57 ± 14 - - 0.8043
Grp A3 2.16e12 34 ± 3 66 ± 3 - - -
分別在組A3 (殼核/150 µL，丘腦/250 µL)、組A2 (殼核/100 µL，丘腦/150 µL)及組A1 (殼核/50 µL，丘腦/75 µL)之殼核中達成66%、57%及30%之平均HTT mRNA KD，其相對於媒劑(組A6)在統計學上為顯著的(P＜0.05，藉由單向ANOVA以及杜凱氏多重比較檢定)，具有組A2及組A3之較大體積輸注，使得其HTT mRNA KD (P＜0.05，藉由單向ANOVA以及杜凱氏多重比較檢定)比組A1之最小體積的要大。在組A2與組A3中之HTT mRNA KD之間不存在統計學差異(P=0.8043，藉由單向ANOVA以及杜凱氏多重比較檢定)。在組A2與組A3中之HTT mRNA KD之間不存在統計學差異(P=0.8043，藉由單向ANOVA以及杜凱氏多重比較檢定)。
亦相對於媒劑對照組(組A6)，評估在相同給藥體積(殼核/100 µL，丘腦/150 µL)下在雙側殼核內及丘腦內投與AAV1-VOYHT1之後組A5 (2.7×1011 vg/mL)、組A4 (9.0×1011 vg/mL)及組A2 (2.7×1012 vg/mL)的載體濃度對NHP殼核中之HTT mRNA KD之影響。表136中展現跨越載體濃度且以媒劑(veh)、對應標準差(stdev)值之百分比表示之平均相對剩餘殼核HTT mRNA及相對殼核HTT mRNA減弱(KD)，以及藉由藉由單向ANOVA以及杜凱氏多重比較產生之P值。應注意，下表136中所列之動物之各組(grp)由每組3隻動物組成。 表136.在雙側殼核內及丘腦內輸注AAV1-VOYHT1之後，NHP殼核中濃度依賴性HTT mRNA降低
組 總劑量 (VG) 相對剩餘 mRNA 蛋白 ( 媒劑 ± 標準差之 %) 相對 HTT mRNA KD ( 媒劑 ± 標準差之 %) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於 Grp A5) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於 Grp A4) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於 Grp A2)
Grp A6 0.00 100 ± 6 0 ± 6 0.2284 0.0291 0.0033
Grp A5 1.35e11 77 ± 7 23 ± 7 - 0.4906 0.0523
Grp A4 4.50e11 61 ± 21 39 ± 21 - - 0.3871
Grp A2 1.4e12 43 ± 14 57 ± 14 - - -
此等結果展示在相同給藥體積(殼核/100 µL，丘腦/150 µL)下，分別在組A2 (2.7×1012 vg/mL)、組A4 (9.0×1011 vg/mL)及組A5 (2.7×1011 vg/mL)中之殼核中獲得平均57%、39%及23% HTT蛋白KD。最高HTT mRNA KD在兩種最高濃度(2.7×1012 vg/mL，組A2，及4.50×1011 vg/mL，組A4)下達成，相對於媒劑(組A6)，其在統計學上為顯著的(P＜0.05，藉由單向ANOVA以及杜凱氏多重比較檢定)。在不同AAV1-VOYHT1濃度之間在HTT mRNA KD方面不存在統計學上顯著之差異，但藉由單向ANOVA以及杜凱氏多重比較檢定最低(2.7×1011 vg/mL)及最高(2.7×1012 vg/mL)濃度傾向於不同(P=0.0523)。v. 尾核 HTT 蛋白及 mRNA 含量
為了評估尾核中之HTT蛋白及mRNA降低，收集來自各動物之尾核之4個沖取物(每半球2個)，產生每組總共12個沖取物。藉由LC-MS/MS將經粉碎尾核沖取物粉末之等分試樣用於HTT及b-肌動蛋白蛋白分析。HTT蛋白含量歸一化至b-肌動蛋白(內部對照)之含量，且接著進一步歸一化至媒劑組。表137中展現跨越總VG劑量(VG/動物或VG)且以媒劑(veh)、對應標準差(stdev)值之百分比表示的平均相對剩餘尾核HTT蛋白及相對尾核HTT蛋白減弱(KD)以及藉由單向ANOVA以及杜凱氏多重比較產生的P值。應注意，表137中所列之動物之各組(grp)由每組3隻動物組成。 表137.在雙側殼核內及丘腦內輸注AAV1-VOYHT1之後，NHP尾核中之HTT蛋白含量
組 (Grp) 總劑量 (VG) 相對剩餘 HTT 蛋白 ( 媒劑 ± 標準差之 %) 相對 HTT 蛋白 KD ( 媒劑 ± 標準差之 %) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於 Grp A1) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於 Grp A2) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於 Grp A3) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於 Grp A4) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於 Grp A5)
Grp A6 0.00 100 ± 4 0 ± 4 0.8607 0.4446 0.1858 0.502 0.9995
Grp A5 1.35e11 98 ± 11 2 ± 11 0.9587 0.6179 0.2914 0.679 -
Grp A4 4.50e11 87 ± 11 13 ± 11 0.9823 ＞0.9999 0.9714 - -
Grp A1 6.75e11 92 ± 2 8 ± 2 - 0.9667 0.718 - -
Grp A2 1.35e12 86 ± 9 14 ± 9 - - 0.9853 - -
Grp A3 2.16e12 82 ± 11 18 ± 11 - - - - -
平均而言，相對於媒劑組(組A6)，組A5 (每隻動物1.35×1011 個VG)、組A4 (每隻動物4.5×1011 個VG)、組A1 (每隻動物總共6.75×1011 個VG)、組A2 (每隻動物總共1.35×1012 個VG)及組A3 (每隻動物2.16×1012 個VG)，分別存在2%、13%、8%、14%及18% HTT蛋白KD 。此等HTT蛋白降低在統計學上不顯著(P＞0.05，藉由單向ANOVA以及杜凱氏多重比較檢定)。
在用於HTT蛋白定量之相同尾核沖取物中，使用針對恆河猴HTT、TBP、AARS及XPNPEP1之特定探針集，如實例1 (上述)中所述，藉由bDNA分析量測尾核中之HTT mRNA含量。HTT mRNA含量歸一化至三個管家基因TBP、AARS及XPNPEP1之幾何平均值，且隨後進一步歸一化至媒劑組。表138中展現跨越VG劑量(VG/動物或VG)且以媒劑(veh)、對應標準差(stdev)值之百分比表示的平均相對剩餘尾核HTT mRNA及相對尾核HTT mRNA減弱(KD)以及藉由單向ANOVA以及杜凱氏多重比較產生的P值。應注意，表138中所列之動物之各組(grp)由每組3隻動物組成。 表138.在雙側殼核內及丘腦內輸注AAV1-VOYHT1之後，NHP尾核中之HTT mRNA含量
組 (Grp) 總劑量 (VG) 相對剩餘 mRNA 蛋白 ( 媒劑 ± 標準差之 %) 相對 HTT mRNA KD ( 媒劑 ± 標準差之 %) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於 Grp A1) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於 Grp A2) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於 Grp A3) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於 Grp A4) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於 Grp A5)
Grp A6 0.00 100 ± 2 0 ± 2 0.9984 0.9861 0.6234 0.9997 0.9984
Grp A5 1.35e11 96 ± 10 4 ± 10 0.9638 0.9999 0.8348 0.9811 -
Grp A4 4.50e11 103 ± 7 -3 ± 7 ＞0.9999 0.9349 0.4644 - -
Grp A1 6.75e11 104 ± 3 -4 ± 3 - 0.8993 0.4062 - -
Grp A2 1.35e12 93 ± 8 7 ± 8 - - 0.9252 - -
Grp A3 2.16e12 83 ± 29 17 ± 29 - - - - -
平均而言，相對於媒劑組(組A6)，組A3 (每隻動物2.16×1012 個VG)、組A2 (每隻動物1.35×1012 個VG)、組A1 (每隻動物6.75×1011 個VG)、組A4 (每隻動物4.50×1011 個VG)及組A5 (每隻動物1.35×1011 個VG)分別存在17%、7%、4%、3%及4% HTT mRNA KD。vi. 丘腦 HTT 蛋白及 mRNA 含量
為了評估丘腦中之HTT蛋白及mRNA降低，收集來自各動物之丘腦之4個沖取物(每半球2個)，產生每組總共12個沖取物。藉由LC-MS/MS將經粉碎丘腦沖取物粉末之等分試樣用於HTT及b-肌動蛋白蛋白分析。HTT蛋白含量歸一化至b-肌動蛋白(內部對照)之含量，且接著進一步歸一化至媒劑組。表139中展現跨越總VG劑量(VG/動物或VG)且以媒劑(veh)、對應標準差(stdev)值之百分比表示的平均相對剩餘丘腦HTT蛋白及相對丘腦HTT蛋白減弱(KD)以及藉由單向ANOVA以及杜凱氏多重比較產生的P值。應注意，表139中所列之動物之各組(grp)由每組3隻動物組成。 表139.在雙側殼核內及丘腦內輸注AAV1-VOYHT1之後，NHP丘腦中劑量依賴性HTT蛋白降低
組 (Grp) 總劑量 (VG) 相對剩餘 HTT 蛋白 ( 媒劑 ± 標準差之 %) 相對 HTT 蛋白 KD ( 媒劑 ± 標準差之 %) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於 Grp A1) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於 Grp A2) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於 Grp A3) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於 Grp A4) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於 Grp A5)
Grp A6 0.00 100 ± 12 0 ± 12 0.7683 0.2119 0.0247 0.9982 0.3459
Grp A5 1.35e11 74 ± 13 26 ± 13 0.9654 0.9991 0.5714 0.556 -
Grp A4 4.50e11 95 ± 10 5 ± 10 0.9345 0.3709 0.0488 - -
Grp A1 6.75e11 84 ± 27 16 ± 27 - 0.8584 0.2119 - -
Grp A2 1.35e12 69 ± 12 31 ± 12 - - 0.7683 - -
Grp A3 2.16e12 53 ± 9 47 ± 9 - - - - -
在雙側組合殼核內及丘腦內輸注不同總劑量之AAV1-VOYHT1之後，丘腦中達成劑量依賴性HTT蛋白降低。特定言之，相對於媒劑組(組A6)，組A3 (2.16×1012 VG/動物)、組A2 (每隻動物1.35×1012 個VG)、組A1 (每隻動物6.75×1011 個VG)、組A4 (每隻動物4.50×1011 個VG)及組A5 (每隻動物1.35×1011 個VG)分別存在平均47%、31%、16%、5%及26% HTT蛋白KD。在相對於媒劑(組A6)之最高劑量2.16×1012 個VG/動物(組A3)以及相對於每隻動物(組A4)之4.50×1011 個VG之第2最低劑量下，丘腦中之HTT蛋白KD在統計學上為顯著的(P＜0.05，藉由單向ANOVA以及杜凱氏多重比較檢定)。
在用於HTT蛋白定量之相同丘腦沖取物中，使用針對恆河猴HTT、TBP、AARS及XPNPEP1之特定探針集，如實例1 (上述)中所述，藉由bDNA分析量測丘腦中之HTT mRNA含量。HTT mRNA含量歸一化至三個管家基因TBP、AARS及XPNPEP1之幾何平均值，且隨後進一步歸一化至媒劑組。表140中展現跨越VG劑量(VG/動物或VG)且以媒劑(veh)、對應標準差(stdev)值之百分比表示的平均相對剩餘丘腦HTT mRNA及相對丘腦HTT mRNA減弱(KD)以及藉由單向ANOVA以及杜凱氏多重比較產生的P值。應注意，表140中所列之動物之各組(grp)由每組3隻動物組成。 表140.在雙側殼核內及丘腦內輸注AAV1-VOYHT1之後，NHP丘腦中之HTT mRNA降低
組 (Grp) 總劑量 (VG) 相對剩餘 mRNA 蛋白 ( 媒劑 ± 標準差之 %) 相對 HTT mRNA KD ( 媒劑 ± 標準差之 %) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於 Grp A1) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於 Grp A2) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於 Grp A3) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於 Grp A4) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於 Grp A5)
Grp A6 0.00 100 ± 10 0 ± 10 0.0062 0.0015 0.0003 0.0249 0.0171
Grp A5 1.35e11 55 ± 19 45 ± 19 0.988 0.674 0.162 ＞0.9999 -
Grp A4 4.50e11 57 ± 16 43 ± 16 0.9555 0.5482 0.1147 - -
Grp A1 6.75e11 48 ± 21 52 ± 21 - 0.9439 0.3849 - -
Grp A2 1.35e12 38 ± 4 62 ± 4 - - 0.8558 - -
Grp A3 2.16e12 25 ± 3 75 ± 3 - - - - -
在雙側殼核內及丘腦內輸注不同總劑量之AAV1-VOYHT1之後，在丘腦中達成顯著的丘腦HTT mRNA減少。特定言之，相對於媒劑組(組A6)，組A3 (每隻動物2.16×1012 個VG)、組A2 (每隻動物1.35×1012 個VG)、組A1 (每隻動物6.75×1011 個VG)、組A4 (每隻動物4.50×1011 個VG)及組A5 (每隻動物1.35×1011 個VG)分別存在平均75%、62%、52%、43%及45% HTT mRNA KD。相對於媒劑，丘腦中之HTT mRNA KD在AAV1-VOYHT1之所有劑量下為統計學上顯著的(P＜0.05，藉由單向ANOVA以及杜凱氏多重比較檢定)。相對於兩個最低劑量組，最高劑量組存在朝向HTT mRNA KD之劑量依賴性的趨勢(P＜0.2，藉由單向ANOVA以及杜凱氏多重比較檢定)，但在不同劑量之AAV1-VOYHT1之間的丘腦HTT mRNA KD中不存在統計學上顯著之差異(P＞0.05，藉由單向ANOVA以及杜凱氏多重比較檢定)。
隨後在組A1 (殼核/50 µL、丘腦/75 µL)、組A2 (殼核/100 µL，丘腦/150 µL)及組A3 (殼核/150 µL，丘腦/250 µL)之最高載體濃度(2.7×1012 vg/mL)下評估載體體積對丘腦中之HTT mRNA降低之作用。表141中展現跨越輸注體積且以媒劑、對應標準差(stdev)值之百分比表示之平均相對剩餘丘腦HTT mRNA及相對丘腦HTT mRNA減弱(KD)，以及藉由藉由單向ANOVA以及杜凱氏多重比較產生之P值。應注意，表141中所列之動物之各組(grp)由每組3隻動物組成。 表141.以相同濃度在雙側殼核內及丘腦內輸注不同體積之AAV1-VOYHT1之後，NHP丘腦中之HTT mRNA含量
組 (Grp) 總劑量 (VG) 相對剩餘 HTT mRNA ( 媒劑 ± 標準差之 %) 相對 HTT mRNA KD ( 媒劑 ± 標準差之 %) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於 Grp A1) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於 Grp A2) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於 Grp A3)
Grp A6 0.00 100 ± 10 0 ± 10 0.0029 0.0009 0.0003
Grp A1 6.75e11 48 ± 21 52 ± 21 - 0.7367 0.1618
Grp A2 1.35e12 38 ± 4 62 ± 4 - - 0.569
Grp A3 2.16e12 25 ± 3 75 ± 3 - - -
相對於媒劑(組A6)，分別在組A3 (殼核/150 µL，丘腦/250 µL)、組A2 (殼核/100 µL，丘腦/150 µL)及組A1 (殼核/50 µL，丘腦/75 µL)之丘腦中達成75%、62%及52%之平均HTT mRNA KD，其為統計學上顯著的(P＜0.01，藉由單向ANOVA以及杜凱氏多重比較檢定)。在最高載體濃度下，在不同體積之AAV1-VOYHT1處理中在HTT mRNA KD方面不存在統計學差異(P＞0.05，藉由單向ANOVA以及杜凱氏多重比較檢定)。
亦相對於媒劑對照組(組A6)，評估在相同給藥體積(殼核/100 µL，丘腦/150 µL)下在雙側殼核內及丘腦內投與AAV1-VOYHT1之後組A5 (2.7×1011 vg/mL)、組A4 (9.0×1011 vg/mL)及組A2 (2.7×1012 vg/mL)的載體濃度對NHP丘腦中之HTT mRNA KD之影響。表142中展現跨越載體濃度且以媒劑(veh)、對應標準差(stdev)值之百分比表示之平均相對剩餘丘腦HTT mRNA及相對丘腦HTT mRNA減弱(KD)，以及藉由藉由單向ANOVA以及杜凱氏多重比較產生之P值。應注意，下表142中所列之動物之各組(grp)由每組3隻動物組成。 表142.以相同體積在雙側殼核內及丘腦內輸注不同濃度之AAV1-VOYHT1之後，NHP丘腦中之HTT mRNA含量
組 (Grp) 總劑量 (VG) 相對剩餘 mRNA 蛋白 ( 媒劑 ± 標準差之 %) 相對 HTT mRNA KD ( 媒劑 ± 標準差之 %) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於 Grp A5) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於 Grp A4) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於 Grp A2)
Grp A6 0.00 100 ± 10 0 ± 10 0.0134 0.0182 0.002
Grp A5 1.35e11 55 ± 19 45 ± 19 - 0.9954 0.4507
Grp A4 4.50e11 57 ± 16 43 ± 16 - - 0.3452
Grp A2 1.4e12 38 ± 4 62 ± 4 - - -
此等結果展示在相同給藥體積(殼核/100 µL，丘腦/150 µL)下，分別在組A2 (2.7×1012 vg/mL)、組A4 (9.0×1011 vg/mL)及組A5 (2.7×1011 vg/mL)之丘腦中達成平均62%、43%及45% HTT mRNA KD。相對於媒劑，在所有濃度之AAV1-VOYHT1 (對於組A2，2.7×1012 vg/mL，對於組A4，9.0×1011 vg/mL，及對於組A5，2.7×1011 vg/mL)下達成統計上顯著之HTT mRNA KD (P＜0.05，藉由單向ANOVA以及杜凱氏多重比較檢定)。跨越以相同體積投與之AAV1-VOYHT1的不同濃度，在HTT mRNA KD中不存在統計顯著性(P＞0.05，藉由單向ANOVA以及杜凱氏多重比較檢定)。vii. 相對 HTT 蛋白與相對 mRNA 含量之間的關係
使用皮爾森相關法評定來自全部AAV1-VOYHT1處理組之殼核、尾核及丘腦的所有樣品中之相對HTT蛋白含量與相對HTT mRNA含量之間的關係。如藉由LC-MS/MS分析所量測之相對HTT蛋白含量與如藉由bDNA分析所量測之相對HTT mRNA含量相關(皮爾森r=0.7863，P＜0.001)。
總之，此研究證明在雙側側組合殼核內及丘腦內投與AAV1-VOYHT1之後的第5週，在殼核中存在顯著且劑量依賴性HTT蛋白KD。殼核中之HTT蛋白KD以每隻動物1.35×1012 個VG之劑量最大，而在丘腦中，最高劑量產生顯著HTT蛋白KD。在所有劑量下，HTT蛋白KD不如殼核及丘腦兩者中之HTT mRNA KD顯而易見。在此研究中測試之所有劑量下，在尾核中未觀測到顯著HTT蛋白KD。相對於媒劑，在AAV1-VOYHT1投與後剩餘HTT蛋白含量與來自殼核、尾核及丘腦之所有樣品之相對剩餘之HTT mRNA含量相關。 實例13.以不同劑量在殼核內及丘腦內輸注VY-HTT01之後，對NHP殼核、尾核及丘腦中之HTT蛋白評估i. 研究設計
作為上文詳細描述之實例3 (劑量最佳化研究III)之延伸，此研究之主要目的為，在非人類靈長類動物(NHP)恆河獼猴(普通獼猴)中以不同劑量在雙側(僅丘腦內或組合殼核內及丘腦內)輸注AAV1-VOYHT1之後5週，量測殼核、尾核及丘腦之組織沖取物中之HTT蛋白含量。作為次要目標，在相同組織樣品中量測HTT mRNA含量以便評估來自相同組織之相對HTT蛋白與相對HTT mRNA含量之間的潛在關係。研究實施之一般態樣，包括動物護理/組、測試物品製備及給藥時程，與實例3 (上文)中所述相同。表70中所概述之研究設計類似地反映本發明研究之研究設計，除省略此處群C1a以外。在此研究中，僅組C1b (用改良的手術程序給藥，如上文所提及)充當治療組的對照組。ii. 組織樣品收集及製備
使用猴腦基質收集各動物之大致兩個冠狀腦切片(3 mm厚)。接著新鮮冷凍腦切片且在-60℃下儲存用於潛在藥理學分析或經固定用於病理組織學研究。
用於隨後定量HTT蛋白之腦組織樣品收集之程序類似於實例7 (上文)中所述之彼等程序。簡言之，在室溫下(約1分鐘)使冷凍腦切片溫熱，且隨後使用配備有柱塞之2 mm活檢體沖取物快速收集組織樣品，並立即轉移至乾冰上之預冷卻收集管。所有組織沖取物在收集期間均維持在乾冰上，且接著儲存在-80℃下直至組織分析。
用於隨後定量HTT蛋白之組織樣品製備之程序如實例7 (上文)中所述。簡言之，稱取腦組織沖取物，使用組織撞擊器粉碎，轉移至預冷凍收集瓶中，且儲存在乾冰上。將經粉碎乾燥組織粉末等分分成兩個部分：藉由分支鏈DNA (bDNA)分析將四分之一之組織粉末轉移至用於HTT mRNA量測之新穎預冷卻管中，且將組織粉末之其餘四分之三轉移至用於藉由LC-MS/MS定量之HTT蛋白的另一預冷卻管中。iii. 用於定量 HTT mRNA 之分支鏈 DNA 分析
藉由分支鏈DNA (bDNA)分析定量HTT mRNA之方法如上文在實例1 (上文)中所述。iv. 用於定量HTT蛋白之LC-MS/MS
如上文在實例7 (上文)中所描述，藉由UPLC-MS/MS (超高效液相層析質譜分析及液相層析聯合質譜分析)或LC-MS/MS定量HTT蛋白之方法。所有樣品均同時操作用於藉由LC-MS/MS定量HTT蛋白。v. 殼核 HTT 蛋白及 mRNA 含量
為評估殼核中之HTT蛋白及mRNA含量，自右半球中之殼核收集4個組織沖取物，產生總計12個沖取物組。如上文所述，將等分之經粉碎殼核組織沖取物粉末用於藉由LC-MS/MS之HTT及肌動蛋白蛋白質分析。HTT蛋白含量歸一化至β-肌動蛋白含量，且接著進一步歸一化至媒劑(veh)組。表143中展現跨越總VG劑量(VG/動物或VG)且以媒劑(veh)、對應標準差(stdev)值之百分比表示的平均相對剩餘HTT殼核蛋白質及相對殼核HTT蛋白減弱(KD)以及藉由單向ANOVA以及杜凱氏多重比較產生的P值。應注意，表143中所列之動物之各組(grp)由每組3隻動物組成。 表143. NHP殼核中之HTT蛋白降低
組 (Grp) 總劑量 (VG) 相對剩餘 HTT 蛋白 ( 媒劑 ± 標準差之 %) 相對 HTT 蛋白 KD ( 媒劑 ± 標準差之 %) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於 Grp C2) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於 Grp C3) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於 Grp C4)
Grp C1b 0.0 100 ± 5 0 ± 5 0.9001 ＜0.0001 ＜0.0001
Grp C2 1.11e13 96 ± 8 4 ± 8 - ＜0.0001 ＜0.0001
Grp C3 8.00e12 35 ± 8 65 ± 8 - - 0.9447
Grp C4 1.78e13 39 ± 9 61 ± 9 - - -
在雙側殼核內及丘腦內輸注不同劑量之AAV1-VOYHT1之後，在殼核中達成顯著HTT蛋白降低。特定言之，相對於媒劑組(組C1b)，在8.00×1012 VG/動物(組C3)及1.78×1013 VG/動物(組C4)之組合殼核內及丘腦內劑量下分別存在65%及61% HTT蛋白KD，其不呈現HTT蛋白KD (P＜0.0001，藉由單向ANOVA以及杜凱氏多重比較檢定)。在組合殼核內及丘腦內給藥8.00×1012 及1.78×1013 VG/動物之後，與僅丘腦內給藥之後(組2C，每隻動物1.11×1013 個VG)相比，HTT蛋白KD亦較大(P＜0.0001，藉由單向ANOVA以及杜凱氏多重比較檢定)。在每隻動物8.00×1012 個VG相對於1.78×1013 個VG之雙側殼核內及丘腦內劑量下的HTT蛋白KD之間不存在顯著差異。另外，相對於媒劑(組C1b)，在僅丘腦內給藥(組C2)之後未觀測到顯著HTT蛋白KD (P＞0.05，藉由單向ANOVA以及杜凱氏多重比較檢定)。
在用於HTT蛋白定量之相同殼核沖取物中，使用針對恆河猴HTT、TBP、AARS及XPNPEP1之特定探針集，如實例1中所述，藉由bDNA分析量測殼核中之HTT mRNA含量。HTT mRNA含量歸一化至三個管家基因TBP、AARS及XPNPEP1之幾何平均值，且隨後進一步歸一化至媒劑組。表144中展現跨越VG劑量(VG/動物或VG)且以媒劑(veh)、對應標準差(stdev)值之百分比表示的平均相對剩餘殼核HTT mRNA及相對殼核HTT mRNA減弱(KD)以及藉由單向ANOVA以及杜凱氏多重比較產生的P值。應注意，表144中所列之動物之各組(grp)由每組3隻動物組成。 表144. NHP殼核中之HTT mRNA降低
組 (Grp) 總劑量 (VG) 相對剩餘 HTT mRNA ( 媒劑 ± 標準差之 %) 相對 HTT mRNA KD ( 媒劑 ± 標準差之 %) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於 Grp C2) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於 Grp C3) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於 Grp C4)
Grp C1b 0.0 100 ± 5 0 ± 5 0.0109 ＜0.0001 ＜0.0001
Grp C2 1.11e13 83 ± 7 17 ± 7 - ＜0.0001 ＜0.0001
Grp C3 8.00e12 34 ± 2 66 ± 2 - - 0.213
Grp C4 1.78e13 42 ± 3 58 ± 3 - - -
在雙側丘腦內或雙側組合殼核內及丘腦內輸注不同總劑量之AAV1-VOYHT1之後在殼核內達成顯著HTT mRNA減少。特定言之，相對於媒劑組(組C1b)，組C2 (僅丘腦：每隻動物1.11×1013 個VG)、組C3 (組合殼核內及丘腦內給藥：每隻動物8.00×1012 個VG)及組C4 (組合殼核內及丘腦內給藥：每隻動物1.78×1013 個VG)分別存在平均17%、66%及58% HTT mRNA KD，其在統計學上為顯著的(P ＜0.05，藉由單向ANOVA以及杜凱氏多重比較檢定)。在組合之殼核內及丘腦內給藥8.00×1012 及1.78×1013 VG/動物之後，與僅丘腦內給藥之後(組C2，每隻動物1.11×1013 個VG)相比，HTT mRNA KD亦較大(P＜0.0001，藉由單向ANOVA以及杜凱氏多重比較檢定)。在每隻動物8.00×1012 相對於1.78×1013 個VG之雙側殼核內及丘腦內劑量下的HTT mRNA KD之間不存在之顯著差異(P＞0.05，藉由單向ANOVA以及杜凱氏多重比較檢定)。vi. 尾核 HTT 蛋白及 mRNA 含量
為了評估尾核中之HTT蛋白及mRNA降低，收集來自各動物(每半球2個)之4個沖取物以用於藉由LC-MS/MS之HTT及肌動蛋白蛋白質分析，產生每組總共12個沖取物。HTT蛋白含量歸一化至肌動蛋白之含量(內部對照)，且接著進一步歸一化至媒劑組。表145中展現跨越總VG劑量(VG/動物或VG)且以媒劑(veh)、對應標準差(stdev)值之百分比表示的平均相對剩餘尾核HTT蛋白及相對尾核HTT蛋白減弱(KD)以及藉由單向ANOVA以及杜凱氏多重比較產生的P值。應注意，表145中所列之動物之各組(grp)由每組3隻動物組成。 表145. NHP尾核中之HTT蛋白降低
組 (Grp) 總劑量 (VG) 相對剩餘 HTT 蛋白 ( 媒劑 ± 標準差之 %) 相對 HTT 蛋白 KD ( 媒劑 ± 標準差之 %) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於 Grp C2) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於 Grp C3) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於 Grp C4)
Grp C1b 0.0 100 ± 6 0 ± 6 0.015 0.0011 0.0006
Grp C2 1.11e13 74 ± 7 26 ± 7 - 0.2025 0.1024
Grp C3 8.00e12 60 ± 9 40 ± 9 - - 0.9584
Grp C4 1.78e13 56 ± 9 44 ± 9 - - -
在雙側丘腦內或雙側組合殼核內及丘腦內輸注不同總劑量之AAV1-VOYHT1之後在尾核內達成顯著HTT蛋白減少。特定言之，相對於媒劑組(組C1b)，組C2 (僅丘腦給藥，每隻動物1.11×1013 個VG)、組C3 (組合殼核內及丘腦內給藥，每隻動物8.00×1012 個VG)及組C4 (組合殼核內及丘腦內給藥，每隻動物1.78×1013 個VG)分別存在26%、40%及44% HTT蛋白KD，其在統計學上為顯著的(P＜0.05，藉由單向ANOVA以及杜凱氏多重比較檢定)。跨越所有AAV1-VOYHT1處理組，HTT蛋白KD不存在差異(P＞0.05，藉由單向ANOVA以及杜凱氏多重比較檢定)
NHP尾核HTT mRNA含量亦藉由在用於HTT蛋白定量之相同尾核沖取物中進行之bDNA分析，使用針對恆河猴HTT、TBP、AARS及XPNPEP1之特定探針組來量測。HTT mRNA含量歸一化至三個管家基因TBP、AARS及XPNPEP1之幾何平均值，且隨後進一步歸一化至媒劑組。表146中展現跨越VG劑量(VG/動物或VG)且以媒劑(veh)、對應標準差(stdev)值之百分比表示的平均相對剩餘尾核HTT mRNA及相對尾核HTT mRNA減弱(KD)以及藉由單向ANOVA以及杜凱氏多重比較產生的P值。應注意，表146中所列之動物之各組(grp)由每組3隻動物組成。 表146. NHP尾核中之HTT mRNA降低
組 (Grp) 總劑量 (VG) 相對剩餘 HTT mRNA ( 媒劑 ± 標準差之 %) 相對 HTT mRNA KD ( 媒劑 ± 標準差之 %) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於 Grp C2) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於 Grp C3) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於 Grp C4)
Grp C1b 0.0 100 ± 8 0 ± 8 0.027 0.0024 0.0018
Grp C2 1.11e13 63 ± 13 37 ± 13 - 0.296 0.2152
Grp C3 8.00e12 43 ± 12 57 ± 12 - - 0.9944
Grp C4 1.78e13 41 ± 16 59 ± 16 - - -
在雙側丘腦內或雙側組合殼核內及丘腦內輸注不同劑量之AAV1-VOYHT1之後，在尾核中觀測到顯著HTT mRNA減少。特定言之，相對於媒劑組(組C1b)，組C2 (僅丘腦給藥，每組動物1.11×1013 個VG)、組C3 (組合殼核內及丘腦內輸注，每隻動物8.00×1012 個VG)及組4 (組合殼核內及丘腦內輸注，每隻動物1.78×1013 個VG)分別存在平均37%、57%及59% HTT mRNA KD，其在統計學上為顯著的(P＜0.05，藉由單向ANOVA以及杜凱氏多重比較檢定)。跨越AAV1-VOYHT1處理組，尾核HTT mRNA KD不存在顯著差異(P＞0.05，藉由單向ANOVA以及杜凱氏多重比較檢定)vii. 丘腦HTT蛋白及mRNA含量
為評估丘腦中之HTT蛋白及mRNA降低，收集來自各動物(每半球2個)之4個沖取物以用於藉由LC-MS/MS之HTT及肌動蛋白蛋白質分析，產生每組總共12個沖取物(每組3隻動物)。丘腦HTT蛋白含量歸一化至肌動蛋白含量(內部對照)，且接著進一步歸一化至媒劑組。表147中展現跨越總VG劑量(VG/動物或VG)且以媒劑(veh)、對應標準差(stdev)值之百分比表示的平均相對剩餘丘腦HTT蛋白及相對丘腦HTT蛋白減弱(KD)以及藉由單向ANOVA以及杜凱氏多重比較產生的P值。應注意，表147中所列之動物之各組(grp)由每組3隻動物組成。 表147. NHP丘腦中之HTT蛋白降低
組 (Grp) 總劑量 (VG) 相對剩餘 HTT 蛋白 ( 媒劑 ± 標準差之 %) 相對 HTT 蛋白 KD ( 媒劑 ± 標準差之 %) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於 Grp C2) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於 Grp C3) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於 Grp C4)
Grp C1b 0.0 100 ± 1 0 ± 1 ＜0.0001 ＜0.0001 ＜0.0001
Grp C2 1.11e13 46 ± 4 54 ± 4 - 0.4428 0.0072
Grp C3 8.00e12 52 ± 9 48 ± 9 - - 0.0012
Grp C4 1.78e13 26 ± 3 74 ± 3 - - -
在雙側組合殼核內及丘腦內輸注不同總劑量之AAV1-VOYHT1之後，丘腦中達成劑量依賴性HTT蛋白降低。特定言之，相對於媒劑組(組C1b)，組C2 (僅丘腦給藥，每隻動物1.11×1013 個VG)、組C3 (組合殼核內及丘腦內輸注，每隻動物8.00×1012 個VG)及組C4 (組合殼核內及丘腦內輸注，每隻動物1.78×1013 個VG)分別存在54%、48%及74% HTT蛋白KD，其在統計學上為顯著的(P＜0.0001，藉由單向ANOVA以及杜凱氏多重比較檢定)。相對於以每隻動物1.11×1013 個VG之劑量(組C2)在組合殼核內及丘腦內投與AAV1-VOYHT1之後，以每隻動物1.78×1013 個VG之劑量(組C4)投與之後丘腦中之HTT蛋白KD較大(P＜0.05，藉由單向ANOVA以及杜凱氏多重比較檢定)。丘腦中之HTT蛋白KD係劑量依賴性的，其中相對於以8.00×1012 個VG (組C3)之劑量在組合殼核內及丘腦內投與AAV1-VOYHT1之後，以每隻動物1.78×1013 個VG (組C4)投與之後KD顯著更大(P＜0.01，藉由單向ANOVA以及杜凱氏多重比較檢定)。
NHP丘腦HTT mRNA含量亦藉由在用於HTT蛋白定量之相同丘腦沖取物中之bDNA分析，使用針對恆河猴HTT、TBP、AARS及XPNPEP1之特定探針組來量測。丘腦HTT mRNA含量歸一化至三個管家基因TBP、AARS及XPNPEP1之幾何平均值，且隨後進一步歸一化至媒劑組。表148中展現跨越VG劑量(VG/動物或VG)且以媒劑(veh)、對應標準差(stdev)值之百分比表示的平均相對剩餘丘腦HTT mRNA及相對丘腦HTT mRNA減弱(KD)以及藉由單向ANOVA以及杜凱氏多重比較產生的P值。應注意，表148中所列之動物之各組(grp)由每組3隻動物組成。 表148. NHP丘腦中之HTT mRNA降低
組 (Grp) 總劑量 (VG) 相對剩餘 HTT mRNA ( 媒劑 ± 標準差之 %) 相對 HTT mRNA KD ( 媒劑 ± 標準差之 %) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於 Grp C2) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於 Grp C3) 藉由單向 ANOVA 之 P 值 ( 相對於 Grp C4)
Grp C1b 0.0 100 ± 3 0 ± 3 ＜0.0001 ＜0.0001 ＜0.0001
Grp C2 1.11e13 29 ± 3 71 ± 3 - 0.9988 0.8485
Grp C3 8.00e12 29 ± 6 71 ± 6 - - 0.7768
Grp C4 1.78e13 32 ± 7 68 ± 7 - - -
在雙側丘腦內或雙側組合殼核內及丘腦內輸注不同總劑量之AAV1-VOYHT1之後在丘腦內達成顯著HTT mRNA減少。特定言之，相對於媒劑(組C1b)，組C2 (僅丘腦給藥，每隻動物1.11×1013 個VG)、組C3 (組合殼核內及丘腦內給藥，每隻動物8.00×1012 個VG)及組C4 (組合殼核內及丘腦內給藥，每隻動物1.78×1013 個VG)分別存在平均71%、71%及68% HTT mRNA KD ，其在統計學上為顯著的(P＜0.0001，藉由單向ANOVA以及杜凱氏多重比較檢定)。跨越AAV1-VOYHT1處理組，丘腦HTT mRNA KD不存在顯著差異(P＞0.05，藉由單向ANOVA以及杜凱氏多重比較檢定)viii. 相對HTT蛋白與相對mRNA含量之間的關係
使用皮爾森相關法評定來自組C2 (每隻動物1.11×1013 個VG)、組C3 (每隻動物8.00×1012 個VG)、組C4 (每隻動物1.78×1013 個VG)及媒劑組(組C1b)之殼核、尾核及丘腦之所有樣品中之相對HTT蛋白含量與相對HTT mRNA含量之間的關係。如藉由LC-MS/MS分析所量測之相對HTT蛋白含量與如藉由bDNA分析所量測之相對HTT mRNA含量相關(皮爾森r=0.9334，P＜0.0001)。
總之，此研究證明，在雙側組合殼核內及丘腦內投與VY-AAV1-VOYHT1之後的5週，在殼核、尾核及丘腦中存在顯著HTT蛋白KD。殼核及尾核中之HTT蛋白KD在此研究中所測試之每隻動物8.00×1012 個VG下最大。組合丘腦內及殼核內輸注VY-HTT01在殼核及丘腦中產生之HTT蛋白KD大於經由僅丘腦投與之HTT蛋白KD。在尾核中，相對於僅丘腦內給藥，HTT蛋白KD與組合丘腦內及殼核內輸注VY-HTT01類似。自殼核、尾核及丘腦測試之所有樣品之相對剩餘HTT蛋白含量與相對剩餘HTT mRNA含量相關。 實例14. FRhK-4細胞中之VY-HTT01介導之HTT mRNA及蛋白質減弱
此研究經設計以量測經AAV1-VOYHT1轉導之FRhK-4恆河獼猴(普通獼猴)腎臟細胞中之HTT mRNA及蛋白質減弱。對於AAV載體轉導，將細胞以5e6個細胞/孔之密度接種在P150盤中且隨後經由浴液(亦即培養基)以以下載體劑量施加AAV1-VOYHT1 (以感染倍率或MOI表示，在vg/細胞中)：0、5.0e2、1.6e3、5.0e3、1.6e4、5.0e4、1.6e5及5.0e5 vg/E。48小時之後，收集經AAV1-VOYHT1轉導之細胞且再分成三個細胞團用於藉由qRT-PCR量測相對HTT mRNA，且用於藉由LC-MS/MS及西方墨點法量測相對HTT蛋白。
HTT mRNA定量程序與實例8中所述之程序類似。簡言之，藉由將HTT mRNA含量歸一化至管家基因mRNA含量來獲得相對HTT mRNA表現；接著如藉由qRT-PCR所測定，相對於經處理及/或未經處理之細胞中之歸一化HTT mRNA含量表示此歸一化HTT mRNA含量。表149中提供表示為跨越AAV1-VOYHT1劑量(MOI)之媒劑(veh)百分比(如藉由qRT-PCR所測定的)的平均相對剩餘FRhK-4細胞HTT mRNA及相對FRhK-4細胞HTT mRNA減弱(KD)。 表149. FRhK-4細胞中藉由AAV1-VOYHT1之HTT mRNA減弱
劑量 (MOI) 相對剩餘 HTT mRNA ( 媒劑 ± 標準差之 %)
5.0e5 13.2  ± 0.0
1.6e5 15.1 ± 2.0
5.0e4 20.7 ± 7.6
1.6e4 40.6 ± 0.0
5.0e3 46.3 ± 6.8
1.6e3 88.0 ± 38.2
5.0e2 109.3 ± 3.2
0 100.0 ± 30.1
此等發現證明劑量依賴性FRhK-4 HTT mRNA減弱，其中在MOI 5e5下達成87% HTT mRNA減弱。
藉由LC-MS/MS定量HTT蛋白之程序類似於實例7中所述之彼等程序。HTT蛋白含量亦藉由熟習此項技術者已知且執行之標準西方墨點法評估。表150中展現表示為跨越AAV1-VOYHT1劑量(MOI)之媒劑(veh)百分比(如藉由LC-MS及西方墨點方法所測定)的相對剩餘FRhK-4細胞HTT蛋白及相對FRhK-4細胞HTT蛋白減弱(KD)。對於LC-MS分析，出於明晰及完整性，在FRhK-4細胞中所量測之HTT蛋白(ng/mg總蛋白質)之濃度(conc)亦包括於表150中。 表150. FRhK-4細胞中藉由AAV1-VOYHT1之HTT蛋白減弱
劑量 (MOI) LC-MS/MS Western Blot
均質物中之 HTT 蛋白之濃度 (ng/mg 總蛋白質 ) 相對剩餘 HTT 蛋白 ( 媒劑 %) 相對剩餘 HTT 蛋白 ( 媒劑 %)
5.0e5 14.1 12.5 31.9
1.6e5 21.7 19.1 46.0
5.0e4 30.6 27.0 55.2
1.6e4 46.2 40.7 84.6
5.0e3 60.7 53.5 143.3
1.6e3 85.2 75.1 197.7
5.0e2 100.8 88.8 234.8
0 113.5 100.0 100.0
共同地，HTT蛋白定量分析揭示無論蛋白質定量方法如何，亦即當蛋白質藉由LC-MS/MS或藉由西方墨點定量時，藉由FRhK-4細胞中AAV1-VOYHT1之劑量依賴性HTT蛋白減弱。
FRhK-4 HTT中之相對剩餘HTT蛋白與mRNA含量之間的關係係使用皮爾森相關分析證實。當HTT蛋白含量藉由LC-MS/MS量測時，在相對剩餘HTT蛋白與mRNA含量之間出現正線性關係(皮爾森r=0.96，P＜0.0001)。類似地，當藉由西方墨點法量測HTT蛋白含量時，在相對HTT蛋白與mRNA含量之間亦出現正線性關係(皮爾森r=0.55，P＜0.05)。因此，不管所應用之蛋白質定量方法，較高HTT蛋白含量對應於較高HTT mRNA含量。
此研究揭示在經AAV1-VOYHT1轉導之FRhK-4恆河獼猴(普通獼猴)腎臟細胞中之劑量依賴性相對HTT mRNA及蛋白質減弱，其中在最高劑量(MOI 5e5 vg/細胞)下達成幾乎90%之HTT mRNA減弱。不管所應用之蛋白質定量方法，當藉由LC-MS/MS及西方墨點法兩者量測蛋白質減弱，且在HTT蛋白與HTT mRNA含量之間出現強正關係時，觀測到蛋白質減弱。等效物及範疇
熟習此項技術者將認識到或能夠僅使用常規實驗即可確定根據本文中所描述之AAV粒子的特定實施例之許多等效物。本發明之範疇不意欲受限於以上描述，而實際上如隨附申請專利範圍中所闡述。
在申請專利範圍中，除非相反地指示或另外自上下文顯而易見，否則諸如「一(a/an)」及「該」之冠詞可意謂一或大於一。除非相反地指示或以其他方式自上下文顯而易見，否則若一個、超過一個或所有群成員存在於給定產物或方法中、用於給定產物或方法中或以其他方式與給定產物或方法相關，則在該群的一或多個成員之間包括「或」的申請專利範圍或描述視為滿足。本發明包括組中恰好一個成員存在於、用於給定產物或製程中或以其他方式與給定產物或製程相關之實施例。本發明包括超過一個或所有的組成員存在於、用於給定產物或製程中或以其他方式與給定產物或製程有關的實施例。
亦應注意，術語「包含」意欲為開放的且准許但不要求包括額外要素或步驟。當本文使用術語「包含」時，亦因此涵蓋及揭示術語「由……組成」。
當給出範圍時，包括端點。此外，應理解，除非另有指示或以其他方式自上下文及一般熟習此項技術者之理解顯而易見，否則表示為範圍之值可在本發明之不同實施例中採用所陳述範圍內之任何特定值或子範圍，除非上下文另外明確規定，否則達到該範圍下限之單位的十分之一。
另外，應理解，屬於先前技術內之本發明之任何特定實施例可自任何一或多個技術方案中明確排除。因為認為此類實施例為一般熟習此項技術者已知的，所以可對其進行排除，即使未在本文中明確地闡述該排除亦可。出於任何原因，無論是否與先前技術之存在有關，本發明之組合物之任何特定實施例(例如任何抗生素、治療或活性成分；任何產生方法；任何使用方法；等)可自任何一或多個請求項中排除。
應理解，已使用之字語係描述性而非限制性字語，且可在不背離本發明在其較廣泛態樣中之真實範疇及精神的情況下，在隨附申請專利範圍之範圍內作出改變。
儘管已相對於所描述之若干實施例以一定的長度及一些特殊性描述了本發明，但並非意指本發明應受限於任何此類細節或實施例或任何特定實施例，而是應參考隨附申請專利範圍進行解釋，以便考慮到先前技術提供對此類申請專利範圍之儘可能最廣泛的解釋，並因此有效地涵蓋本發明之預期範疇。
100:病毒基因體 110:酬載區 120:反向末端重複序列 130:啟動子區 140:內含子區 150:強化子區 160:聚腺苷酸化信號序列區 170:MCS區 180:外顯子區
前述及其他目標、特徵及優勢將自如隨附圖式中所說明的本文中所描述之特定實施例的以下描述而顯而易見。圖式不一定按比例繪製，而是側重於說明本文所描述之各種實施例的原理。
圖1為本發明之病毒基因體之示意圖。
圖2為本發明之病毒基因體之示意圖。
圖3為本發明之病毒基因體之示意圖。
圖4為本發明之病毒基因體之示意圖。
圖5為本發明之病毒基因體之示意圖。
圖6為本發明之病毒基因體之示意圖。
圖7為本發明之病毒基因體之示意圖。
圖8為本發明之病毒基因體之示意圖。
圖9為本發明之病毒基因體之示意圖。
圖10A為展示自左非人類靈長類動物(NHP)殼核收集之組織沖取物中之HTT mRNA減弱及載體基因體含量的一組圖式。
圖10B為展示自右非人類靈長類動物(NHP)殼核收集之組織沖取物中之HTT mRNA減弱及載體基因體含量的一組圖式。
圖10C為展示自非人類靈長類動物(NHP)殼核收集之所有組織沖取物中之HTT mRNA減弱及載體基因體含量的一組圖式。
圖11A為展示自左及右NHP尾核收集之組織沖取物中之HTT mRNA減弱及載體基因體含量的一組圖式(hCN-1)。
圖11B為展示自左及右NHP尾核收集之組織沖取物中之HTT mRNA減弱及載體基因體含量的一組圖式(hCN-2)。
圖11C為展示自左及右NHP尾核收集之組織沖取物中之HTT mRNA減弱及載體基因體含量的一組圖式(組合hCN-1及hCN-2)。
圖12A為展示自左NHP運動皮質(mCTX)收集之組織沖取物中之HTT mRNA減弱及載體基因體含量的一組圖式。
圖12B為展示自右NHP運動皮質(mCTX)收集之組織沖取物中之HTT mRNA減弱及載體基因體含量的一組圖式。
圖12C為展示自NHP運動皮質(mCTX)收集之所有組織沖取物中之HTT mRNA減弱及載體基因體含量的一組圖式。
圖13A為展示自左NHP體覺皮質(ssCTX)收集之組織沖取物中之HTT mRNA減弱及載體基因體含量的一組圖式。
圖13B為展示自右NHP體覺皮質(ssCTX)收集之組織沖取物中之HTT mRNA減弱及載體基因體含量的一組圖式。
圖13C為展示自右NHP體覺皮質(ssCTX)收集之所有組織沖取物中之HTT mRNA減弱及載體基因體含量的一組圖式。
圖14A為展示自左NHP顳葉皮質(tCTX)收集之組織沖取物中之HTT mRNA減弱及載體基因體含量的一組圖式。
圖14B為展示自右NHP顳葉皮質(tCTX)收集之組織沖取物中之HTT mRNA減弱及載體基因體含量的一組圖式。
圖14C為展示自NHP顳葉皮質(tCTX)收集之所有組織沖取物中之HTT mRNA減弱及載體基因體含量的一組圖式。
圖15A為展示來自NHP皮質之雷射捕獲之皮質錐體神經元中之HTT mRNA減弱的圖式。
圖15B為展示來自NHP皮質之雷射捕獲之皮質錐體神經元中之HTT mRNA減弱及載體基因體含量的圖式。
圖16A展示取自殼核之組織沖取物中之HTT mRNA減弱相對於載體基因體含量之相關性。
圖16B展示取自殼核之組織沖取物中載體基因體相對於AAV1-VOYHT1 miRNA含量之相關性。
圖16C展示取自殼核之組織沖取物中AAV1-VOYHT1 miRNA相對於HTT mRNA含量之相關性。
圖17A展示取自尾核之組織沖取物中HTT mRNA減弱相對於載體基因體含量之相關性。
圖17B展示取自尾核之組織沖取物中載體基因體相對於AAV1-VOYHT1 miRNA含量之相關性。
圖17C展示取自尾核之組織沖取物中AAV1-VOYHT1 miRNA相對於HTT mRNA含量之相關性。
圖18展示取自丘腦之組織沖取物中HTT mRNA減弱相對於載體基因體含量之相關性。
圖19展示殼核、尾核及丘腦中相對剩餘NHP HTT蛋白及mRNA含量之線性相關性。
在以下隨附描述中闡述本發明之一或多個實施例之細節。儘管可使用與本文所述類似或等效之任何材料及方法來實踐或測試本發明，但現描述較佳材料及方法。本發明之其他特徵、目標及優勢將自該描述而顯而易見。在描述中，除非上下文另外明確指示，否則單數形式亦包括複數。除非另作定義，否則本文中所用之所有技術及科學術語具有與一般熟習本發明所屬技術者通常所理解之含義相同的含義。在有衝突的情況下，以本說明書為準。
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Claims (52)

  1. 一種用於治療亨丁頓舞蹈症(Huntington's Disease)之醫藥組合物，該組合物包含呈醫藥學上可接受之調配物中之腺相關病毒(AAV)粒子； 其中AAV粒子中之至少一者包含AAV病毒基因體，該AAV病毒基因體包含選自由SEQ ID NO: 1352至1379、1388及1426至1438組成之群的聚核苷酸序列或與前述聚核苷酸序列具有至少95%一致性的該前述聚核苷酸序列之變異體； 且其中該醫藥組合物中之該AAV病毒基因體之濃度為1×1011 至1×1012 VG/mL。
  2. 如請求項1之醫藥組合物，其中該AAV病毒基因體之濃度為1×1011 至9×1011 VG/mL。
  3. 如請求項1之醫藥組合物，其中該AAV病毒基因體之濃度為1.2×1011 至6×1011 VG/mL。
  4. 如請求項1之醫藥組合物，其中該AAV病毒基因體之濃度為1.8×1011 至6×1011 VG/mL。
  5. 如請求項1之醫藥組合物，其中該AAV病毒基因體之濃度為5×1011 至8×1011 VG/mL。
  6. 如請求項4之醫藥組合物，其中該聚核苷酸序列包含SEQ ID NO: 1352。
  7. 如請求項6之醫藥組合物，其中該等AAV粒子包含AAV衣殼且該衣殼血清型選自由以下組成之群：AAV1、AAV2、AAV2G9、AAV3、AAV3a、AAV3b、AAV3-3、AAV4、AAV4-4、AAV5、AAV6、AAV6.1、AAV6.2、AAV6.1.2、AAV7、AAV7.2、AAV8、AAV9、AAV9.11、AAV9.13、AAV9.16、AAV9.24、AAV9.45、AAV9.47、AAV9.61、AAV9.68、AAV9.84、AAV9.9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV16.3、AAV24.1、AAV27.3、AAV42.12、AAV42-1b、AAV42-2、AAV42-3a、AAV42-3b、AAV42-4、AAV42-5a、AAV42-5b、AAV42-6b、AAV42-8、AAV42-10、AAV42-11、AAV42-12、AAV42-13、AAV42-15、AAV42-aa、AAV43-1、AAV43-12、AAV43-20、AAV43-21、AAV43-23、AAV43-25、AAV43-5、AAV44.1、AAV44.2、AAV44.5、AAV223.1、AAV223.2、AAV223.4、AAV223.5、AAV223.6、AAV223.7、AAV1-7/rh.48、AAV1-8/rh.49、AAV2-15/rh.62、AAV2-3/rh.61、AAV2-4/rh.50、AAV2-5/rh.51、AAV3.1/hu.6、AAV3.1/hu.9、AAV3-9/rh.52、AAV3-11/rh.53、AAV4-8/r11.64、AAV4-9/rh.54、AAV4-19/rh.55、AAV5-3/rh.57、AAV5-22/rh.58、AAV7.3/hu.7、AAV16.8/hu.10、AAV16.12/hu.11、AAV29.3/bb.1、AAV29.5/bb.2、AAV106.1/hu.37、AAV114.3/hu.40、AAV127.2/hu.41、AAV127.5/hu.42、AAV128.3/hu.44、AAV130.4/hu.48、AAV145.1/hu.53、AAV145.5/hu.54、AAV145.6/hu.55、AAV161.10/hu.60、AAV161.6/hu.61、AAV33.12/hu.17、AAV33.4/hu.15、AAV33.8/hu.16、AAV52/hu.19、AAV52.1/hu.20、AAV58.2/hu.25、AAVA3.3、AAVA3.4、AAVA3.5、AAVA3.7、AAVC1、AAVC2、AAVC5、AAV-DJ、AAV-DJ8、AAVF3、AAVF5、AAVH2、AAVrh.72、AAVhu.8、AAVrh.68、AAVrh.70、AAVpi.1、AAVpi.3、AAVpi.2、AAVrh.60、AAVrh.44、AAVrh.65、AAVrh.55、AAVrh.47、AAVrh.69、AAVrh.45、AAVrh.59、AAVhu.12、AAVH6、AAVLK03、AAVH-1/hu.1、AAVH-5/hu.3、AAVLG-10/rh.40、AAVLG-4/rh.38、AAVLG-9/hu.39、AAVN721-8/rh.43、AAVCh.5、AAVCh.5R1、AAVcy.2、AAVcy.3、AAVcy.4、AAVcy.5、AAVCy.5R1、AAVCy.5R2、AAVCy.5R3、AAVCy.5R4、AAVcy.6、AAVhu.1、AAVhu.2、AAVhu.3、AAVhu.4、AAVhu.5、AAVhu.6、AAVhu.7、AAVhu.9、AAVhu.10、AAVhu.11、AAVhu.13、AAVhu.15、AAVhu.16、AAVhu.17、AAVhu.18、AAVhu.20、AAVhu.21、AAVhu.22、AAVhu.23.2、AAVhu.24、AAVhu.25、AAVhu.27、AAVhu.28、AAVhu.29、AAVhu.29R、AAVhu.31、AAVhu.32、AAVhu.34、AAVhu.35、AAVhu.37、AAVhu.39、AAVhu.40、AAVhu.41、AAVhu.42、AAVhu.43、AAVhu.44、AAVhu.44R1、AAVhu.44R2、AAVhu.44R3、AAVhu.45、AAVhu.46、AAVhu.47、AAVhu.48、AAVhu.48R1、AAVhu.48R2、AAVhu.48R3、AAVhu.49、AAVhu.51、AAVhu.52、AAVhu.54、AAVhu.55、AAVhu.56、AAVhu.57、AAVhu.58、AAVhu.60、AAVhu.61、AAVhu.63、AAVhu.64、AAVhu.66、AAVhu.67、AAVhu.14/9、AAVhu.t 19、AAVrh.2、AAVrh.2R、AAVrh.8、AAVrh.8R、AAVrh.10、AAVrh.12、AAVrh.13、AAVrh.13R、AAVrh.14、AAVrh.17、AAVrh.18、AAVrh.19、AAVrh.20、AAVrh.21、AAVrh.22、AAVrh.23、AAVrh.24、AAVrh.25、AAVrh.31、AAVrh.32、AAVrh.33、AAVrh.34、AAVrh.35、AAVrh.36、AAVrh.37、AAVrh.37R2、AAVrh.38、AAVrh.39、AAVrh.40、AAVrh.46、AAVrh.48、AAVrh.48.1、AAVrh.48.1.2、AAVrh.48.2、AAVrh.49、AAVrh.51、AAVrh.52、AAVrh.53、AAVrh.54、AAVrh.56、AAVrh.57、AAVrh.58、AAVrh.61、AAVrh.64、AAVrh.64R1、AAVrh.64R2、AAVrh.67、AAVrh.73、AAVrh.74、AAVrh8R、AAVrh8R A586R突變體、AAVrh8R R533A突變體、AAAV、BAAV、山羊AAV、牛AAV、綿羊AAV、AAVhE1.1、AAVhEr1.5、AAVhER1.14、AAVhEr1.8、AAVhEr1.16、AAVhEr1.18、AAVhEr1.35、AAVhEr1.7、AAVhEr1.36、AAVhEr2.29、AAVhEr2.4、AAVhEr2.16、AAVhEr2.30、AAVhEr2.31、AAVhEr2.36、AAVhER1.23、AAVhEr3.1、AAV2.5T、AAV-PAEC、AAV-LK01、AAV-LK02、AAV-LK03、AAV-LK04、AAV-LK05、AAV-LK06、AAV-LK07、AAV-LK08、AAV-LK09、AAV-LK10、AAV-LK11、AAV-LK12、AAV-LK13、AAV-LK14、AAV-LK15、AAV-LK16、AAV-LK17、AAV-LK18、AAV-LK19、AAV-PAEC2、AAV-PAEC4、AAV-PAEC6、AAV-PAEC7、AAV-PAEC8、AAV-PAEC11、AAV-PAEC12、AAV-2-pre-miRNA-101、AAV-8h、AAV-8b、AAV-h、AAV-b、AAV SM 10-2、AAV改組100-1、AAV改組100-3、AAV改組100-7、AAV改組10-2、AAV改組10-6、AAV改組10-8、AAV改組100-2、AAV SM 10-1、AAV SM 10-8、AAV SM 100-3、AAV SM 100-10、BNP61 AAV、BNP62 AAV、BNP63 AAV、AAVrh.50、AAVrh.43、AAVrh.62、AAVrh.48、AAVhu.19、AAVhu.11、AAVhu.53、AAV4-8/rh.64、AAVLG-9/hu.39、AAV54.5/hu.23、AAV54.2/hu.22、AAV54.7/hu.24、AAV54.1/hu.21、AAV54.4R/hu.27、AAV46.2/hu.28、AAV46.6/hu.29、AAV128.1/hu.43、真型AAV (ttAAV)、UPENN AAV 10、日本AAV 10血清型、AAV CBr-7.1、AAV CBr-7.10、AAV CBr-7.2、AAV CBr-7.3、AAV CBr-7.4、AAV CBr-7.5、AAV CBr-7.7、AAV CBr-7.8、AAV CBr-B7.3、AAV CBr-B7.4、AAV CBr-E1、AAV CBr-E2、AAV CBr-E3、AAV CBr-E4、AAV CBr-E5、AAV CBr-e5、AAV CBr-E6、AAV CBr-E7、AAV CBr-E8、AAV CHt-1、AAV CHt-2、AAV CHt-3、AAV CHt-6.1、AAV CHt-6.10、AAV CHt-6.5、AAV CHt-6.6、AAV CHt-6.7、AAV CHt-6.8、AAV CHt-P1、AAV CHt-P2、AAV CHt-P5、AAV CHt-P6、AAV CHt-P8、AAV CHt-P9、AAV CKd-1、AAV CKd-10、AAV CKd-2、AAV CKd-3、AAV CKd-4、AAV CKd-6、AAV CKd-7、AAV CKd-8、AAV CKd-B1、AAV CKd-B2、AAV CKd-B3、AAV CKd-B4、AAV CKd-B5、AAV CKd-B6、AAV CKd-B7、AAV CKd-B8、AAV CKd-H1、AAV CKd-H2、AAV CKd-H3、AAV CKd-H4、AAV CKd-H5、AAV CKd-H6、AAV CKd-N3、AAV CKd-N4、AAV CKd-N9、AAV CLg-F1、AAV CLg-F2、AAV CLg-F3、AAV CLg-F4、AAV CLg-F5、AAV CLg-F6、AAV CLg-F7、AAV CLg-F8、AAV CLv-1、AAV CLv1-1、AAV Clv1-10、AAV CLv1-2、AAV CLv-12、AAV CLv1-3、AAV CLv-13、AAV CLv1-4、AAV Clv1-7、AAV Clv1-8、AAV Clv1-9、AAV CLv-2、AAV CLv-3、AAV CLv-4、AAV CLv-6、AAV CLv-8、AAV CLv-D1、AAV CLv-D2、AAV CLv-D3、AAV CLv-D4、AAV CLv-D5、AAV CLv-D6、AAV CLv-D7、AAV CLv-D8、AAV CLv-E1、AAV CLv-K1、AAV CLv-K3、AAV CLv-K6、AAV CLv-L4、AAV CLv-L5、AAV CLv-L6、AAV CLv-M1、AAV CLv-M11、AAV CLv-M2、AAV CLv-M5、AAV CLv-M6、AAV CLv-M7、AAV CLv-M8、AAV CLv-M9、AAV CLv-R1、AAV CLv-R2、AAV CLv-R3、AAV CLv-R4、AAV CLv-R5、AAV CLv-R6、AAV CLv-R7、AAV CLv-R8、AAV CLv-R9、AAV CSp-1、AAV CSp-10、AAV CSp-11、AAV CSp-2、AAV CSp-3、AAV CSp-4、AAV CSp-6、AAV CSp-7、AAV CSp-8、AAV CSp-8.10、AAV CSp-8.2、AAV CSp-8.4、AAV CSp-8.5、AAV CSp-8.6、AAV CSp-8.7、AAV CSp-8.8、AAV CSp-8.9、AAV CSp-9、AAV.hu.48R3、AAV.VR-355、AAV3B、AAV4、AAV5、AAVF1/HSC1、AAVF11/HSC11、AAVF12/HSC12、AAVF13/HSC13、AAVF14/HSC14、AAVF15/HSC15、AAVF16/HSC16、AAVF17/HSC17、AAVF2/HSC2、AAVF3/HSC3、AAVF4/HSC4、AAVF5/HSC5、AAVF6/HSC6、AAVF7/HSC7、AAVF8/HSC8、AAVF9/HSC9、AAV-PHP.B、AAV-PHP.A、G2B-26、G2B-13、TH1.1-32、TH1.1-35、AAVPHP.B2、AAVPHP.B3、AAVPHP.N/PHP.B-DGT、AAVPHP.B-EST、AAVPHP.B-GGT、AAVPHP.B-ATP、AAVPHP.B-ATT-T、AAVPHP.B-DGT-T、AAVPHP.B-GGT-T、AAVPHP.B-SGS、AAVPHP.B-AQP、AAVPHP.B-QQP、AAVPHP.B-SNP(3)、AAVPHP.B-SNP、AAVPHP.B-QGT、AAVPHP.B-NQT、AAVPHP.B-EGS、AAVPHP.B-SGN、AAVPHP.B-EGT、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-STP、AAVPHP.B-PQP、AAVPHP.B-SQP、AAVPHP.B-QLP、AAVPHP.B-TMP、AAVPHP.B-TTP、AAVPHP.S/G2A12、AAVG2A15/G2A3、AAVG2B4及/或AAVG2B5及其變異體。
  8. 如請求項7之醫藥組合物，其中AAV粒子衣殼血清型為AAV1血清型。
  9. 如請求項1之醫藥組合物，其中該醫藥學上可接受之調配物包含： a)一或多種選自氯化鈉、氯化鉀及磷酸鉀之鹽； b)至少一種雙醣，其中該至少一種雙醣包含蔗糖；及 c)選自以下之緩衝劑：Tris HCl、Tris鹼、磷酸鈉、磷酸鉀、組胺酸、硼酸、檸檬酸、甘胺酸、HEPES (4-(2-羥乙基)-1-哌𠯤乙磺酸)及MOPS (3-(N-嗎啉基)丙磺酸)； 其中該醫藥組合物為水性溶液。
  10. 如請求項9之醫藥組合物，其中該醫藥學上可接受之調配物包含： a)濃度為85至110 mM之氯化鈉； b)濃度為1至3 mM之氯化鉀； c)濃度為1至3 mM之磷酸鉀； d)相對於該調配物之總體積為5至9重量%的蔗糖；及 e)濃度為1至20 mM之緩衝劑。
  11. 如請求項10之醫藥組合物，其中該醫藥學上可接受之調配物包含： a)濃度為95 mM之氯化鈉； b)濃度為1.5 mM之氯化鉀； c)濃度為1.5 mM之磷酸鉀； b)相對於該調配物之總體積濃度為7重量%之蔗糖；及 e)濃度為10 mM之該緩衝劑。
  12. 如請求項11之醫藥組合物，其在5℃下係經緩衝至pH 7.2至8.2。
  13. 如請求項11之醫藥組合物，其中該緩衝劑為磷酸鈉，且該調配物在5℃下係經緩衝至pH 7.2至7.6。
  14. 如請求項11之醫藥組合物，其中該緩衝劑為Tris鹼，且在5℃下用鹽酸調整至pH 7.3至7.7。
  15. 如請求項7之醫藥組合物，其中該醫藥學上可接受之調配物進一步包含界面活性劑。
  16. 如請求項15之醫藥組合物，其中該界面活性劑為泊洛沙姆188 (Poloxamer 188)。
  17. 如請求項16之醫藥組合物，其中泊洛沙姆188之濃度相對於該醫藥學上可接受之調配物之總體積為0.001重量%。
  18. 如請求項11之醫藥組合物，其中該醫藥學上可接受之調配物具有400至480 mOsm/kg之重量莫耳滲透濃度。
  19. 一種如請求項1至18中任一項之醫藥組合物的用途，其係用於製造用以治療有需要之患者之亨丁頓舞蹈症的藥劑。
  20. 如請求項19之用途，其中該醫藥組合物係藉由輸注來投與至該患者之紋狀體中。
  21. 如請求項20之用途，其中該醫藥組合物係藉由雙側輸注來投與至該患者之該紋狀體中。
  22. 如請求項19之用途，其中該醫藥組合物係藉由輸注來投與至該患者之殼核及丘腦中。
  23. 如請求項22之用途，其中該醫藥組合物係藉由雙側輸注來投與至該患者之該殼核及丘腦中。
  24. 如請求項22之用途，其中該醫藥組合物係使用磁共振成像(magnetic resonance imaging；MRI)引導之對流增強遞送(convection enhanced delivery；CED)來投與。
  25. 如請求項20之用途，其中向該紋狀體投與之該醫藥組合物之體積為每半球15 µL或更少。
  26. 如請求項25之用途，其中向該紋狀體投與之該醫藥組合物之體積為每半球5至10 µL。
  27. 如請求項20之用途，其中向該紋狀體投與之劑量為每半球介於2×109 至3×1011 VG之間。
  28. 如請求項22之用途，其中向該殼核投與之該醫藥組合物的體積為每半球1500 µL或更少。
  29. 如請求項28之用途，其中向該殼核投與之該醫藥組合物的體積為每半球100至1500 µL。
  30. 如請求項22之用途，其中向該殼核投與之劑量為每半球介於1×1010 至4×1013 VG之間。
  31. 如請求項22之用途，其中向該丘腦投與之該醫藥組合物的體積為每半球2500 µL或更少。
  32. 如請求項31之用途，其中向該丘腦投與之該醫藥組合物的體積為每半球150至2500 µL。
  33. 如請求項22之用途，其中向該丘腦投與之劑量為每半球介於4×1010 至6.8×1013 VG之間。
  34. 如請求項20之用途，其中向該患者投與之總劑量為每半球介於8×109 至2×1014 VG之間。
  35. 如請求項22之用途，其中向該患者投與之總劑量為介於8×109 至2×1014 VG之間。
  36. 一種如請求項1至18中任一項之醫藥組合物之用途，其用於製造用以抑制或遏制患者之選自由以下組成之群之組織中的亨丁頓蛋白(Huntingtin，HTT)基因產物(RNA或蛋白質)之表現的藥劑：紋狀體、殼核、尾核、丘腦、大腦皮質、初級運動皮質、初級體覺皮質、顳葉皮質及其組合。
  37. 如請求項36之用途，其中HTT基因產物(RNA或蛋白質)之表現降低至少30%。
  38. 如請求項36之用途，其中該HTT基因產物(RNA或蛋白質)之表現降低40至70%。
  39. 如請求項36之用途，其中該HTT基因產物(RNA或蛋白質)之表現降低50至80%。
  40. 如請求項36之用途，其中該HTT基因產物(RNA或蛋白質)之表現在該殼核中係經抑制或遏制，且其中該抑制或遏制係在該殼核中之一或多個中型多棘神經元中量測的。
  41. 如請求項36之用途，其中該HTT基因產物(RNA或蛋白質)之表現在該殼核中係經抑制或遏制，且其中該抑制或遏制係在該殼核中之一或多個星形膠質細胞中量測的。
  42. 如請求項36之用途，其中該HTT基因產物(RNA或蛋白質)之表現在該初級運動皮質、初級體覺皮質及該顳葉皮質中之每一者之錐體神經元中係經抑制或遏制。
  43. 如請求項36之用途，其中該HTT基因產物(RNA或蛋白質)之表現在該大腦皮質中降低至少20%。
  44. 如請求項36之用途，其中該HTT基因產物(RNA或蛋白質)之表現在該患者之該紋狀體與該大腦皮質兩者中係經抑制或遏制。
  45. 如請求項36之用途，其中該HTT基因產物為HTT蛋白且該HTT蛋白表現在該患者之該紋狀體、殼核、尾核及/或丘腦中係經抑制或遏制。
  46. 如請求項45之用途，其中該殼核中之該HTT蛋白之含量降低至少10%。
  47. 如請求項46之用途，其中該殼核中之該HTT蛋白之含量降低15至65%。
  48. 如請求項45之用途，其中該尾核中之該HTT蛋白之含量降低至少5%。
  49. 如請求項48之用途，其中該尾核中之該HTT蛋白之含量降低5至50%。
  50. 如請求項45之用途，其中該丘腦中之該HTT蛋白之含量降低至少10%。
  51. 如請求項50之用途，其中該丘腦中之該HTT蛋白之含量降低15至80%。
  52. 如請求項45之用途，其中該HTT蛋白之含量在該患者之該紋狀體及該丘腦兩者中係降低的。
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