JP2023058630A - 線条体および皮質へのウイルス粒子の強化された送達 - Google Patents

線条体および皮質へのウイルス粒子の強化された送達 Download PDF

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Abstract

【課題】哺乳動物（例えば、ヒト）の中枢神経系に組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を送達するための医薬を提供する。【解決手段】ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）キャプシドを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を含む、該ｒＡＡＶ粒子を哺乳動物の中枢神経系に送達するために使用する医薬であって、該ｒＡＡＶ粒子は、線条体の各半球に投与され、該ｒＡＡＶ粒子は治療用ポリペプチドをコードする異種核酸を含むｒＡＡＶベクターを含み、該異種核酸は哺乳動物の少なくとも皮質構造および線条体において発現される、医薬である。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年２月１０日付けで出願された米国仮出願第６２／１１４，５４４号、および２０１５年９月１９日付けで出願された米国仮出願第６２／２２０，９９７号の優先権を主張し、それぞれの内容は、あらゆる目的のためにその全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列リストの提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの以下の提出物の内容は、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる：配列リストのコンピューター読み取り可能な形態（ＣＲＦ）（ファイル名：１５９７９２０１２７４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔ、記録された日付：２０１６年２月４日、サイズ：１ＫＢ）。
本発明は、脳、例えば線条体および／または皮質へのＡＡＶ遺伝子治療用ベクターの送達に関する。
アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベースのベクターは、神経学的な遺伝子治療にとって、優れた安全記録が複数の臨床試験で確立された好ましいベクター系になりつつある（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。神経学的な障害の有効な処置は、罹患した細胞集団へのＡＡＶベクターの送達に関連する問題によって妨げられてきた。この送達の問題が、大脳皮質が関与する障害にとって、特に解決が困難であった。単純な注射は、拡散に頼ることから１から３ｍｍの半径内でしか効果的ではなく、ＡＡＶベクターを効果的に分布させない。代替方法の対流強化送達（ＣＥＤ）（非特許文献４）が、パーキンソン病のための遺伝子治療（ＡＡＶ２－ｈＡＡＤＣ）において臨床的に使用されてきた（非特許文献５）。ＣＥＤの基礎原理は、間質液の静水圧に打ち勝つのに十分な圧力下で脳実質に輸注液をポンプで送り、それによって脳の密集した血管周辺組織と密接に接触するように仕向けることを含む。これらの管の脈動は、ポンプとして作用して、実質中の長い距離にわたり粒子を分布させる（非特許文献６）。ＣＥＤの安全性および効能を増加させるために、逆流抵抗性（ｒｅｆｌｕｘ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ）カニューレ（非特許文献７）を、リアルタイムＭＲＩを用いた送達のモニターと共に採用することができる。送達のモニターは、カニューレの逆流および空洞への輸注液の漏出などの異常な事象の定量化およびコントロールを可能にする（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献８）。しかしながら、それでもなお皮質および／または線条体におけるＡＡＶベクターの広範にわたる発現を達成するための改善された手順への必要性がある。
Ｋａｐｌｉｔｔら、（２００７）Ｌａｎｃｅｔ ３６９：２０９７～２１０５ Ｅｂｅｒｌｉｎｇら、（２００８）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ７０：１９８０～１９８３ Ｆｉａｎｄａｃａら、（２００９）Ｎｅｕｒｏｉｍａｇｅ ４７、増刊２：Ｔ２７～３５ Ｎｇｕｙｅｎら、（２００３）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．９８：５８４～５９０ Ｆｉａｎｄａｃａら、（２００８）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．２０９：５１～５７ Ｈａｄａｃｚｅｋら、（２００６）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１７：２９１～３０２ Ｋｒａｕｚｅら、（２００９）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．４６５：３４９～３６２ Ｓａｉｔｏら、（２０１１）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ ７：５２２～５２６
本発明は、哺乳動物の中枢神経系に組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を送達するための方法であって、線条体にｒＡＡＶ粒子を投与することを含み、ｒＡＡＶ粒子は、哺乳動物の少なくとも大脳皮質および線条体で発現される異種核酸をコードするｒＡＡＶベクターを含む、方法を提供する。一部の態様において、本発明は、哺乳動物の中枢神経系にｒＡＡＶ粒子を送達するための方法であって、線条体にｒＡＡＶ粒子を投与することを含み、ｒＡＡＶ粒子は、哺乳動物の少なくとも大脳皮質および線条体で発現される異種核酸をコードするｒＡＡＶベクターを含み、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１）キャプシドを含む、方法を提供する。一部の態様において、本発明は、哺乳動物の中枢神経系にｒＡＡＶ粒子を送達するための方法であって、線条体にｒＡＡＶ粒子を投与することを含み、ｒＡＡＶ粒子は、哺乳動物の少なくとも大脳皮質および線条体で発現される異種核酸をコードするｒＡＡＶベクターを含み、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）キャプシドを含む、方法を提供する。一部の実施形態において、哺乳動物は、ヒトである。
一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、少なくとも線条体の被殻および尾状核に投与される。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、線条体の各半球の少なくとも被殻および尾状核に投与される。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、少なくとも尾状核における１つの部位および被殻における２つの部位に投与される。一部の実施形態において、被殻に投与されるｒＡＡＶ粒子と尾状核に投与されるｒＡＡＶ粒子との比率は、少なくとも約２：１である。一部の実施形態において、異種核酸は、哺乳動物の少なくとも前頭皮質、後頭皮質、および／または第ＩＶ層で発現される。一部の実施形態において、異種核酸は、少なくとも前頭連合野皮質領域（ｐｒｅｆｒｏｎｔａｌ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｃｏｒｔｉｃａｌ ａｒｅａ）、前運動皮質、一次体性感覚皮質領域、感覚運動皮質、頭頂葉皮質、後頭皮質、および／または一次運動皮質で発現される。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、大脳皮質において逆行性または順行性輸送を受ける。一部の実施形態において、異種核酸は、視床、視床下核、淡蒼球、黒質および／または海馬でさらに発現される。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、１μＬ／分より速く約５μＬ／分までの速度で尾状核および被殻に投与される。
上記の態様および実施形態の一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２－７ｍ８、ＡＡＶ ＤＪ、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋ、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶキャプシド ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１血清型キャプシドを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、またはＡＡＶｒｈ１０である。一部の実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、１つまたはそれ以上のＡＡＶの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列を端に有する異種核酸を含む。一部の実施形態において、異種核酸は、２つのＡＡＶのＩＴＲを端に有
する。一部の実施形態において、ＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶ血清型ＩＴＲである。一部の実施形態において、ＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶ２のＩＴＲである。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子のＩＴＲおよびキャプシドは、同じＡＡＶ血清型から誘導される。一部の実施形態において、ＩＴＲおよびキャプシドは、ＡＡＶ２から誘導される。他の実施形態において、ｒＡＡＶウイルス粒子のＩＴＲおよびキャプシドは、異なるＡＡＶ血清型から誘導される。一部の実施形態において、ＩＴＲは、ＡＡＶ２から誘導され、キャプシドは、ＡＡＶ１から誘導される。
上記の態様および実施形態の一部の実施形態において、異種核酸は、プロモーターに機能するように連結している。一部の実施形態において、プロモーターは、ＣＮＳの細胞中で異種核酸を発現する。一部の実施形態において、プロモーターは、脳の細胞中で異種核酸を発現する。一部の実施形態において、プロモーターは、ニューロンおよび／またはグリア細胞中で異種核酸を発現する。一部の実施形態において、ニューロンは、尾状核の中型有棘ニューロン、被殻の中型有棘ニューロン、皮質第ＩＶ層のニューロンおよび／または皮質第Ｖ層のニューロンである。一部の実施形態において、グリア細胞は、星状細胞である。一部の実施形態において、プロモーターは、ＣＢＡプロモーター、最小のＣＢＡプロモーター、ＣＭＶプロモーターまたはＧＵＳＢプロモーターである。他の実施形態において、プロモーターは、誘導性である。さらなる実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、エンハンサー、スプライスドナー／スプライスアクセプター対、マトリックスアタッチメント部位、またはポリアデニル化シグナルの１つまたはそれ以上を含む。一部の実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、自己相補的なｒＡＡＶベクターである。一部の実施形態において、ベクターは、異種核酸をコードする第１の核酸配列および異種核酸の相補物をコードする第２の核酸配列を含み、第１の核酸配列は、その長さのほとんどまたは全てにわたり、第２の核酸配列と鎖内の塩基対を形成することができる。一部の実施形態において、第１の核酸配列および第２の核酸配列は、突然変異したＡＡＶのＩＴＲによって連結されており、突然変異したＡＡＶのＩＴＲは、Ｄ領域の欠失を含み、末端分解配列（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の突然変異を含む。
上記の態様および実施形態の一部の実施形態において、異種核酸は、治療用ポリペプチドまたは治療用核酸をコードする。一部の実施形態において、異種核酸は、治療用ポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、治療用ポリペプチドは、酵素、神経栄養因子、ＣＮＳ関連の障害を有する個体において不足しているかまたは突然変異しているポリペプチド、抗酸化剤、抗アポトーシス因子、抗血管新生因子、および抗炎症性因子、アルファ－シヌクレイン、酸ベータ－グルコシダーゼ（ＧＢＡ）、ベータ－ガラクトシダーゼ－１（ＧＬＢ１）、イズロン酸２－スルファターゼ（ＩＤＳ）、ガラクトシルセラミダーゼ（ＧＡＬＣ）、マンノシダーゼ、アルファ－Ｄ－マンノシダーゼ（ＭＡＮ２Ｂ１）、ベータ－マンノシダーゼ（ＭＡＮＢＡ）、プソイドアリールスルファターゼＡ（ｐｓｅｕｄｏａｒｙｌｓｕｌｆａｔａｓｅ Ａ；ＡＲＳＡ）、Ｎ－アセチルグルコサミン－１－ホスホトランスフェラーゼ（ＧＮＰＴＡＢ）、酸スフィンゴミエリナーゼ（ＡＳＭ）、ニーマン－ピックＣ型タンパク質（ＮＰＣ１）、酸性アルファ－１，４－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）、ヘキソサミニダーゼベータサブユニット、ＨＥＸＢ、Ｎ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＭＰＳ３Ａ）、Ｎ－アルファ－アセチルグルコサミニダーゼ（ＮＡＧＬＵ）、ヘパリンアセチル－ＣｏＡ、アルファ－グルコサミニダーゼＮ－アセチルトランスフェラーゼ（ＭＰＳ３Ｃ）、Ｎ－アセチルグルコサミン－６－スルファターゼ（ＧＮＳ）、アルファ－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼ（ＮＡＧＡ）、ベータ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）、ヘキソサミニダーゼアルファサブユニット（ＨＥＸＡ）、ハンチンチン（ＨＴＴ）、リソソーム酸性リパーゼ（ＬＩＰＡ）、アスパルチルグルコサミニダーゼ
、アルファ－ガラクトシダーゼＡ、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ、トリペプチジルペプチダーゼ、リソソーム膜貫通タンパク質、システイン輸送体、酸性セラミダーゼ、酸性アルファ－Ｌ－フコシダーゼ、カテプシンＡ、アルファ－Ｌ－イズロニダーゼ、アリールスルファターゼＢ、アリールスルファターゼＡ、Ｎ－アセチルガラクトサミン－６－スルフェート、酸性ベータ－ガラクトシダーゼ、またはアルファ－ノイラミダーゼである。他の実施形態において、異種核酸は、治療用核酸をコードする。一部の実施形態において、治療用核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムまたはＤＮＡザイムである。一部の実施形態において、治療用ポリペプチドまたは治療用核酸は、ＣＮＳの障害を処置するのに使用される。
上記の態様および実施形態の一部の実施形態において、ＣＮＳの障害は、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）、ハンチントン病、てんかん、パーキンソン病、アルツハイマー病、卒中、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、大脳皮質基底核神経節変性症（ＣＢＧＤ）、前頭側頭認知症（ＦＴＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、進行性核上麻痺（ＰＳＰ）または脳のがんである。一部の実施形態において、障害は、アスパルチルグルコサミン尿症、ファブリー、乳児期バッテン病（ＣＮＬ１）、古典的後期の乳児期バッテン病（ＣＮＬ２）、若年性のバッテン病（ＣＮＬ３）、バッテンＣＮＬ４型、バッテンＣＮＬ５型、バッテンＣＮＬ６型、バッテンＣＮＬ７型、バッテンＣＮＬ８型、シスチン症、ファーバー、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシス、ゴーシェ病１型、ゴーシェ病２型、ゴーシェ病３型、ＧＭ１ガングリオシド症、ハンター病、クラッベ病、αマンノシドーシス病、βマンノシドーシス病、マロトー－ラミー、異染性白質ジストロフィー病、モルキオＡ型、モルキオＢ型、ムコリピドーシスＩＩ／ＩＩＩ疾患、ニーマン－ピック病Ａ型、ニーマン－ピック病Ｂ型、ニーマン－ピック病Ｃ型、ポンペ病、サンドホフ病、サンフィリッポ病Ａ型、サンフィリッポ病Ｂ型、サンフィリッポ病Ｃ型、サンフィリッポ病Ｄ型、シンドラー病、シンドラー－カンザキ、シアリドーシス、スライ病、テイ－サックス病、およびウォールマン病からなる群より選択されるリソソーム蓄積症である。
上記の態様および実施形態の一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、組成物の形態である。さらなる実施形態において、組成物は、医薬的に許容される賦形剤を含む医薬組成物である。
上記の態様および実施形態の一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクターをコードする核酸、ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐをコードする核酸、ならびにＡＡＶヘルパーウイルス機能をコードする核酸の宿主細胞への三重のトランスフェクションによって生産されたものであり、宿主細胞への核酸のトランスフェクションは、ｒＡＡＶ粒子を生産することが可能な宿主細胞を生成する。他の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクターをコードする核酸、ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐをコードする核酸、ならびにＡＡＶヘルパーウイルス機能をコードする核酸の１つまたはそれ以上を含むプロデューサー細胞株によって生産されたものである。
上記の態様および実施形態の一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、定位送達によって送達される。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、対流強化送達によって送達される。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＣＥＤ送達システムを使用して送達される。一部の実施形態において、ＣＥＤシステムは、カニューレを含む。一部の実施形態において、カニューレは、逆流抵抗性カニューレまたは段階的カニューレである。一部の実施形態において、ＣＥＤシステムは、ポンプを含む。一部の実施形態において、ポンプは、手動ポンプである。一部の実施形態において、ポンプは、浸透圧ポンプである。一部の実施形態において、ポンプは、輸注ポンプである。
一部の態様において、本発明は、哺乳動物の中枢神経系にｒＡＡＶ粒子を送達するため
の方法であって、ＣＥＤによって線条体にｒＡＡＶ粒子を含む組成物を投与することを含み、組成物は、１μＬ／分より速く約５μＬ／分までの速度で線条体に投与される、方法を提供する。一部の態様において、本発明は、哺乳動物の中枢神経系にｒＡＡＶ粒子を送達するための方法であって、ＣＥＤによって線条体にｒＡＡＶ粒子を含む組成物を投与することを含み、組成物は、ｒＡＡＶ粒子およびポロキサマーを含む、方法を提供する。一部の実施形態において、ポロキサマーは、ポロキサマー１８８である。一部の実施形態において、組成物中のポロキサマーの濃度は、約０．０００１％～約０．０１％の範囲である。一部の実施形態において、組成物中のポロキサマーの濃度は、約０．００１％である。一部の実施形態において、組成物は、塩化ナトリウムをさらに含み、組成物中の塩化ナトリウムの濃度は、約１００ｍＭ～約２５０ｍＭの範囲である。一部の実施形態において、組成物中の塩化ナトリウムの濃度は、約１８０ｍＭである。一部の実施形態において、組成物は、リン酸ナトリウムをさらに含み、組成物中のリン酸ナトリウムの濃度は、約５ｍＭ～約２０ｍＭの範囲であり、ｐＨは、約７．０～約８．０である。一部の実施形態において、組成物は、リン酸ナトリウムをさらに含み、組成物中のリン酸ナトリウムの濃度は、約１０ｍＭであり、ｐＨは、約７．５である。一部の実施形態において、組成物は、１μＬ／分より速く約５μＬ／分までの速度で尾状核および被殻に投与される。一部の実施形態において、被殻に送達される組成物の量は、尾状核に送達される体積の約２倍である。一部の実施形態において、約２０μＬ～約５０μＬの組成物が、各半球の尾状核に投与され、約４０μＬ～約１００μＬの組成物が、各半球の被殻に投与される。一部の実施形態において、約３０μＬの組成物が、各半球の尾状核に投与され、約６０μＬの組成物が、各半球の被殻に投与される。
一部の実施形態において、本発明は、哺乳動物におけるＣＮＳの障害を処置する方法であって、上述した方法によって哺乳動物にｒＡＡＶ粒子の有効量を投与することを含む、方法を提供する。
一部の態様において、本発明は、哺乳動物におけるハンチントン病を処置する方法であって、線条体にｒＡＡＶ粒子の有効量を投与することを含み、ｒＡＡＶ粒子は、哺乳動物の少なくとも大脳皮質および線条体で発現される異種核酸をコードするｒＡＡＶベクターを含む、方法を提供する。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１キャプシドまたはＡＡＶ２キャプシドを含む。他の態様において、本発明は、哺乳動物におけるパーキンソン病を処置する方法であって、線条体にｒＡＡＶ粒子の有効量を投与することを含み、ｒＡＡＶ粒子は、哺乳動物の少なくとも大脳皮質および線条体で発現される異種核酸をコードするｒＡＡＶベクターを含む、方法を提供する。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２キャプシドを含む。一部の実施形態において、哺乳動物は、ヒトである。
一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、少なくとも線条体の被殻および尾状核に投与される。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、線条体の各半球の少なくとも被殻および尾状核に投与される。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、少なくとも尾状核における１つの部位および被殻における２つの部位に投与される。一部の実施形態において、被殻に投与されるｒＡＡＶ粒子と尾状核に投与されるｒＡＡＶ粒子との比率は、少なくとも約２：１である。一部の実施形態において、異種核酸は、哺乳動物の少なくとも前頭皮質、後頭皮質、および／または第ＩＶ層で発現される。一部の実施形態において、異種核酸は、少なくとも前頭連合野皮質領域、前運動皮質、一次体性感覚皮質領域、感覚運動皮質、頭頂葉皮質、後頭皮質、および／または一次運動皮質で発現される。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、大脳皮質において逆行性または順行性輸送を受ける。一部の実施形態において、異種核酸は、視床、視床下核、淡蒼球、黒質および／または海馬でさらに発現される。
上記の態様および実施形態の一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２－７ｍ８、ＡＡＶ ＤＪ、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋ、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶキャプシド ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１血清型キャプシドを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、またはＡＡＶｒｈ１０である。一部の実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、１つまたはそれ以上のＡＡＶの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列を端に有する異種核酸を含む。一部の実施形態において、異種核酸は、２つのＡＡＶのＩＴＲを端に有する。一部の実施形態において、ＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶ血清型ＩＴＲである。一部の実施形態において、ＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶ２のＩＴＲである。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子のＩＴＲおよびキャプシドは、同じＡＡＶ血清型から誘導される。一部の実施形態において、ＩＴＲおよびキャプシドは、ＡＡＶ２から誘導される。他の実施形態において、ｒＡＡＶウイルス粒子のＩＴＲおよびキャプシドは、異なるＡＡＶ血清型から誘導される。一部の実施形態において、ＩＴＲは、ＡＡＶ２から誘導され、キャプシドは、ＡＡＶ１から誘導される。
上記の態様および実施形態の一部の実施形態において、異種核酸は、プロモーターに機能するように連結されている。一部の実施形態において、プロモーターは、ＣＮＳの細胞中で異種核酸を発現する。一部の実施形態において、プロモーターは、脳の細胞中で異種核酸を発現する。一部の実施形態において、プロモーターは、ニューロンおよび／またはグリア細胞中で異種核酸を発現する。一部の実施形態において、ニューロンは、尾状核の中型有棘ニューロン、被殻の中型有棘ニューロン、皮質第ＩＶ層のニューロンおよび／または皮質第Ｖ層のニューロンである。一部の実施形態において、グリア細胞は、星状細胞である。一部の実施形態において、プロモーターは、ＣＢＡプロモーター、最小のＣＢＡプロモーター、ＣＭＶプロモーターまたはＧＵＳＢプロモーターである。他の実施形態において、プロモーターは、誘導性である。さらなる実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、エンハンサー、スプライスドナー／スプライスアクセプター対、マトリックスアタッチメント部位、またはポリアデニル化シグナルの１つまたはそれ以上を含む。一部の実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、自己相補的なｒＡＡＶベクターである。一部の実施形態において、ベクターは、異種核酸をコードする第１の核酸配列および異種核酸の相補物をコードする第２の核酸配列を含み、第１の核酸配列は、その長さのほとんどまたは全てにわたり、第２の核酸配列と鎖内の塩基対を形成することができる。一部の実施形態において、第１の核酸配列および第２の核酸配列は、突然変異したＡＡＶのＩＴＲによって連結されており、突然変異したＡＡＶのＩＴＲは、Ｄ領域の欠失を含み、末端分解配列の突然変異を含む。
上記の態様および実施形態の一部の実施形態において、異種核酸は、治療用ポリペプチドまたは治療用核酸をコードする。一部の実施形態において、治療用ポリペプチドまたは治療用核酸は、ハンチントン病を有する哺乳動物のＣＮＳの細胞において、ＨＴＴの発現を阻害するかまたはＨＴＴの蓄積を阻害する。一部の実施形態において、異種核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムまたはＤＮＡザイムをコードする。一部の実施形態において、異種核酸は、ハンチンチンを標的化するｍｉＲＮＡをコードする。一部の実施形態において、ハンチンチンは、ハンチントン病に関連する突然変異を含む。
上記の態様および実施形態の一部の実施形態において、異種核酸は、ハンチントン病を処置するための治療用ポリペプチドまたは治療用核酸をコードする。一部の実施形態において、治療用ポリペプチドまたは治療用核酸は、ハンチントン病を有する哺乳動物のＣＮＳの細胞において、ＨＴＴの発現を阻害するかまたはＨＴＴの蓄積を阻害する。一部の実施形態において、異種核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムまたはＤＮＡザイムをコードする。一部の実施形態において、異種核酸は、ハンチンチンを標的化するｍｉＲＮＡをコードする。一部の実施形態において、ハンチンチンは、ハンチントン病に関連する突然変異を含む。
上記の態様および実施形態の一部の実施形態において、異種核酸は、パーキンソン病を処置するための治療用ポリペプチドまたは治療用核酸をコードする。一部の実施形態において、治療用ポリペプチドは、グリア細胞由来増殖因子（ＧＤＮＦ）、脳由来の増殖因子（ＢＤＮＦ）、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、ＧＴＰ－シクロヒドロラーゼ（ＧＴＰＣＨ）、および／またはアミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）である。
上記の態様および実施形態の一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、組成物の形態である。さらなる実施形態において、組成物は、医薬的に許容される賦形剤を含む医薬組成物である。
上記の態様および実施形態の一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクターをコードする核酸、ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐをコードする核酸、ならびにＡＡＶヘルパーウイルス機能をコードする核酸の宿主細胞への三重のトランスフェクションによって生産されたものであり、宿主細胞への核酸のトランスフェクションは、ｒＡＡＶ粒子を生産することが可能な宿主細胞を生成する。他の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクターをコードする核酸、ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐをコードする核酸、ならびにＡＡＶヘルパーウイルス機能をコードする核酸の１つまたはそれ以上を含むプロデューサー細胞株によって生産されたものである。
上記の態様および実施形態の一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、定位送達によって送達される。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、対流強化送達によって送達される。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＣＥＤ送達システムを使用して送達される。一部の実施形態において、ＣＥＤシステムは、カニューレを含む。一部の実施形態において、カニューレは、逆流抵抗性カニューレまたは段階的カニューレである。一部の実施形態において、ＣＥＤシステムは、ポンプを含む。一部の実施形態において、ポンプは、手動ポンプである。一部の実施形態において、ポンプは、浸透圧ポンプである。一部の実施形態において、ポンプは、輸注ポンプである。
一部の態様において、本発明は、哺乳動物の大脳皮質および線条体における異種核酸の発現のためのシステムであって、ａ）ｒＡＡＶ粒子を含む組成物であって、ｒＡＡＶ粒子は、異種核酸をコードするｒＡＡＶベクターを含む、組成物；およびｂ）ｒＡＡＶ粒子を線条体に送達するためのデバイスを含む、システムを提供する。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１キャプシドまたはＡＡＶ２キャプシドを含む。一部の実施形態において、哺乳動物は、ヒトである。
本発明のシステムの一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、線条体の被殻および尾状核に投与される。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、少なくとも尾状核における１つの部位および被殻における２つの部位に投与される。一部の実施形態において、被殻に投与されるｒＡＡＶ粒子と尾状核に投与されるｒＡＡＶ粒子との比率は、少なくとも約２：１である。一部の実施形態において、異種核酸は、哺乳動物の少なくとも前頭皮質
、後頭皮質、および／または第ＩＶ層で発現される。一部の実施形態において、異種核酸は、少なくとも前頭連合野皮質領域、前運動皮質、一次体性感覚皮質領域、感覚運動皮質、頭頂葉皮質、後頭皮質、および／または一次運動皮質で発現される。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、大脳皮質において逆行性または順行性輸送を受ける。一部の実施形態において、異種核酸は、視床、視床下核、淡蒼球、黒質および／または海馬でさらに発現される。
本発明のシステムの一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２－７ｍ８、ＡＡＶ ＤＪ、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋ、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶキャプシド ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１血清型キャプシドを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、またはＡＡＶｒｈ１０である。一部の実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、１つまたはそれ以上のＡＡＶの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列を端に有する異種核酸を含む。一部の実施形態において、異種核酸は、２つのＡＡＶのＩＴＲを端に有する。一部の実施形態において、ＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶ血清型ＩＴＲである。一部の実施形態において、ＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶ２のＩＴＲである。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子のＩＴＲおよびキャプシドは、同じＡＡＶ血清型から誘導される。一部の実施形態において、ＩＴＲおよびキャプシドは、ＡＡＶ２から誘導される。他の実施形態において、ｒＡＡＶウイルス粒子のＩＴＲおよびキャプシドは、異なるＡＡＶ血清型から誘導される。一部の実施形態において、ＩＴＲは、ＡＡＶ２から誘導され、キャプシドは、ＡＡＶ１から誘導される。
本発明のシステムの一部の実施形態において、異種核酸は、プロモーターに機能するように連結されている。一部の実施形態において、プロモーターは、ＣＮＳの細胞中で異種核酸を発現する。一部の実施形態において、プロモーターは、脳の細胞中で異種核酸を発現する。一部の実施形態において、プロモーターは、ニューロンおよび／またはグリア細胞中で異種核酸を発現する。一部の実施形態において、ニューロンは、尾状核の中型有棘ニューロン、被殻の中型有棘ニューロン、皮質第ＩＶ層のニューロンおよび／または皮質第Ｖ層のニューロンである。一部の実施形態において、グリア細胞は、星状細胞である。一部の実施形態において、プロモーターは、ＣＢＡプロモーター、最小のＣＢＡプロモーター、ＣＭＶプロモーターまたはＧＵＳＢプロモーターである。他の実施形態において、プロモーターは、誘導性である。さらなる実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、エンハンサー、スプライスドナー／スプライスアクセプター対、マトリックスアタッチメント部位、またはポリアデニル化シグナルの１つまたはそれ以上を含む。一部の実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、自己相補的なｒＡＡＶベクターである。一部の実施形態において、ベクターは、異種核酸をコードする第１の核酸配列および異種核酸の相補物をコードする第２の核酸配列を含み、第１の核酸配列は、その長さのほとんどまたは全てにわたり、第２の核酸配列と鎖内の塩基対を形成することができる。一部の実施形態において、第１の核酸配列および第２の核酸配列は、突然変異したＡＡＶのＩＴＲによって連結されており、突然変異したＡＡＶのＩＴＲは、Ｄ領域の欠失を含み、末端分解配列の突然変異を含む。
本発明のシステムの一部の実施形態において、異種核酸は、治療用ポリペプチドまたは
治療用核酸をコードする。一部の実施形態において、異種核酸は、治療用ポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、治療用ポリペプチドは、酵素、神経栄養因子、ＣＮＳ関連の障害を有する個体において不足しているかまたは突然変異しているポリペプチド、抗酸化剤、抗アポトーシス因子、抗血管新生因子、および抗炎症性因子、アルファ－シヌクレイン、酸性ベータ－グルコシダーゼ（ＧＢＡ）、ベータ－ガラクトシダーゼ－１（ＧＬＢ１）、イズロン酸２－スルファターゼ（ＩＤＳ）、ガラクトシルセラミダーゼ（ＧＡＬＣ）、マンノシダーゼ、アルファ－Ｄ－マンノシダーゼ（ＭＡＮ２Ｂ１）、ベータ－マンノシダーゼ（ＭＡＮＢＡ）、プソイドアリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）、Ｎ－アセチルグルコサミン－１－ホスホトランスフェラーゼ（ＧＮＰＴＡＢ）、酸性スフィンゴミエリナーゼ（ＡＳＭ）、ニーマン－ピックＣ型タンパク質（ＮＰＣ１）、酸性アルファ－１，４－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）、ヘキソサミニダーゼベータサブユニット、ＨＥＸＢ、Ｎ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＭＰＳ３Ａ）、Ｎ－アルファ－アセチルグルコサミニダーゼ（ＮＡＧＬＵ）、ヘパリンアセチル－ＣｏＡ、アルファ－グルコサミニダーゼＮ－アセチルトランスフェラーゼ（ＭＰＳ３Ｃ）、Ｎ－アセチルグルコサミン－６－スルファターゼ（ＧＮＳ）、アルファ－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼ（ＮＡＧＡ）、ベータ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）、ヘキソサミニダーゼアルファサブユニット（ＨＥＸＡ）、ハンチンチン（ＨＴＴ）、リソソーム酸性リパーゼ（ＬＩＰＡ）、アスパルチルグルコサミニダーゼ、アルファ－ガラクトシダーゼＡ、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ、トリペプチジルペプチダーゼ、リソソーム膜貫通タンパク質、システイン輸送体、酸性セラミダーゼ、酸性アルファ－Ｌ－フコシダーゼ、カテプシンＡ、アルファ－Ｌ－イズロニダーゼ、アリールスルファターゼＢ、アリールスルファターゼＡ、Ｎ－アセチルガラクトサミン－６－スルフェート、酸性ベータ－ガラクトシダーゼ、またはアルファ－ノイラミダーゼである。他の実施形態において、異種核酸は、治療用核酸をコードする。一部の実施形態において、治療用核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムまたはＤＮＡザイムである。一部の実施形態において、治療用ポリペプチドまたは治療用核酸は、ＣＮＳの障害を処置するのに使用される。
本発明のシステムの一部の実施形態において、ＣＮＳの障害は、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）、ハンチントン病、てんかん、パーキンソン病、アルツハイマー病、卒中、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、大脳皮質基底核神経節変性症（ＣＢＧＤ）、前頭側頭認知症（ＦＴＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、進行性核上麻痺（ＰＳＰ）または脳のがんである。一部の実施形態において、障害は、アスパルチルグルコサミン尿症、ファブリー、乳児期バッテン病（ＣＮＬ１）、古典的後期の乳児期バッテン病（ＣＮＬ２）、若年性のバッテン病（ＣＮＬ３）、バッテンＣＮＬ４型、バッテンＣＮＬ５型、バッテンＣＮＬ６型、バッテンＣＮＬ７型、バッテンＣＮＬ８型、シスチン症、ファーバー、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシス、ゴーシェ病１型、ゴーシェ病２型、ゴーシェ病３型、ＧＭ１ガングリオシド症、ハンター病、クラッベ病、αマンノシドーシス病、βマンノシドーシス病、マロトー－ラミー、異染性白質ジストロフィー病、モルキオＡ型、モルキオＢ型、ムコリピドーシスＩＩ／ＩＩＩ疾患、ニーマン－ピック病Ａ型、ニーマン－ピック病Ｂ型、ニーマン－ピック病Ｃ型、ポンペ病、サンドホフ病、サンフィリッポ病Ａ型、サンフィリッポ病Ｂ型、サンフィリッポ病Ｃ型、サンフィリッポ病Ｄ型、シンドラー病、シンドラー－カンザキ、シアリドーシス、スライ病、テイ－サックス病、およびウォールマン病からなる群より選択されるリソソーム蓄積症である。
一部の実施形態において、本発明のｒＡＡＶは、ハンチントン病を処置するための治療用ポリペプチドまたは治療用核酸をコードする異種核酸を含む。一部の実施形態において、治療用ポリペプチドまたは治療用核酸は、ハンチントン病を有する哺乳動物のＣＮＳの細胞において、ＨＴＴの発現を阻害するかまたはＨＴＴの蓄積を阻害する。一部の実施形態において、異種核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ、アンチセン
スＲＮＡ、リボザイムまたはＤＮＡザイムをコードする。一部の実施形態において、異種核酸は、ハンチンチンを標的化するｍｉＲＮＡをコードする。一部の実施形態において、ハンチンチンは、ハンチントン病に関連する突然変異を含む。
一部の実施形態において、本発明のｒＡＡＶ粒子は、パーキンソン病を処置するための治療用ポリペプチドまたは治療用核酸をコードする異種核酸を含む。一部の実施形態において、治療用ポリペプチドは、グリア細胞由来増殖因子（ＧＤＮＦ）、脳由来の増殖因子（ＢＤＮＦ）、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、ＧＴＰ－シクロヒドロラーゼ（ＧＴＰＣＨ）、および／またはアミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）である。
本発明のシステムの一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、組成物の形態である。さらなる実施形態において、組成物は、医薬的に許容される賦形剤を含む医薬組成物である。
本発明のシステムの一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクターをコードする核酸、ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐをコードする核酸、ならびにＡＡＶヘルパーウイルス機能をコードする核酸の宿主細胞への三重のトランスフェクションによって生産されたものであり、宿主細胞への核酸のトランスフェクションは、ｒＡＡＶ粒子を生産することが可能な宿主細胞を生成する。他の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクターをコードする核酸、ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐをコードする核酸、ならびにＡＡＶヘルパーウイルス機能をコードする核酸の１つまたはそれ以上を含むプロデューサー細胞株によって生産されたものである。
本発明のシステムの一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、定位送達によって送達される。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、対流強化送達によって送達される。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＣＥＤ送達システムを使用して送達される。一部の実施形態において、ＣＥＤシステムは、カニューレを含む。一部の実施形態において、カニューレは、逆流抵抗性カニューレまたは段階的カニューレである。一部の実施形態において、ＣＥＤシステムは、ポンプを含む。一部の実施形態において、ポンプは、手動ポンプである。一部の実施形態において、ポンプは、浸透圧ポンプである。一部の実施形態において、ポンプは、輸注ポンプである。
一部の態様において、本発明は、ｒＡＡＶ粒子を含む、上述した方法のいずれかで使用するためのキットであって、哺乳動物の少なくとも大脳皮質および線条体で発現される異種核酸をコードするｒＡＡＶベクターを含むｒＡＡＶ粒子を含む、キットを提供する。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１）キャプシドを含む。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）キャプシドを含む。
一部の態様において、本発明は、ｒＡＡＶ粒子の有効量を含む組成物を含む、哺乳動物におけるハンチントン病を処置するためのキットであって、ｒＡＡＶ粒子は、哺乳動物の少なくとも大脳皮質および線条体で発現される異種核酸をコードするｒＡＡＶベクターを含む、キットを提供する。一部の態様において、本発明は、ｒＡＡＶ粒子の有効量を含む組成物を含む、哺乳動物におけるパーキンソン病を処置するためのキットであって、ｒＡＡＶ粒子は、哺乳動物の少なくとも大脳皮質および線条体で発現される異種核酸をコードするｒＡＡＶベクターを含む、キットを提供する。一部の実施形態において、キットのｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１）キャプシドまたはＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）キャプシドを含む。一部の実施形態において、キットは、ｒＡＡＶ粒子を線条体に送達するためのデバイスをさらに含む。一部の実施形態において、キットのｒＡＡＶ粒子は、組成物の形態である。一部の実施形態において、組成物は、緩衝液および／または医薬的
に許容される賦形剤を含む。さらなる実施形態において、キットは、ｒＡＡＶ粒子の組成物を線条体に送達するための説明書を含む。
一部の態様において、本発明は、上述した方法のいずれかにおいて使用するためのｒＡＡＶ粒子を提供する。一部の態様において、本発明は、哺乳動物の中枢神経系に組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を送達することにおいて使用するためのｒＡＡＶ粒子であって、ｒＡＡＶ粒子は、哺乳動物の少なくとも大脳皮質および線条体で発現される異種核酸をコードするｒＡＡＶベクターを含む、ｒＡＡＶ粒子を提供する。一部の態様において、本発明は、哺乳動物の中枢神経系に組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を送達することにおいて使用するためのｒＡＡＶ粒子であって、ｒＡＡＶ粒子は、哺乳動物の少なくとも大脳皮質および線条体で発現される異種核酸をコードするｒＡＡＶベクターを含み、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１）キャプシドをさらに含む、ｒＡＡＶ粒子を提供する。一部の態様において、本発明は、哺乳動物の中枢神経系に組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を送達することにおいて使用するためのｒＡＡＶ粒子であって、ｒＡＡＶ粒子は、哺乳動物の少なくとも大脳皮質および線条体で発現される異種核酸をコードするｒＡＡＶベクターを含み、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）キャプシドをさらに含む、ｒＡＡＶ粒子を提供する。
一部の態様において、本発明は、哺乳動物におけるハンチントン病を処置することにおいて使用するためのｒＡＡＶ粒子であって、ｒＡＡＶ粒子は、哺乳動物の少なくとも大脳皮質および線条体で発現される異種核酸をコードするｒＡＡＶベクターを含む、ｒＡＡＶ粒子を提供する。一部の態様において、本発明は、哺乳動物におけるパーキンソン病を処置することにおいて使用するためのｒＡＡＶ粒子であって、ｒＡＡＶ粒子は、哺乳動物の少なくとも大脳皮質および線条体で発現される異種核酸をコードするｒＡＡＶベクターを含む、ｒＡＡＶ粒子を提供する。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２キャプシドを含む。一部の実施形態において、哺乳動物は、ヒトである。
一部の実施形態において、本発明のｒＡＡＶ粒子は、少なくとも線条体の被殻および尾状核に投与される。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、線条体の各半球の少なくとも被殻および尾状核に投与される。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、少なくとも尾状核における１つの部位および被殻における２つの部位に投与される。一部の実施形態において、被殻に投与されるｒＡＡＶ粒子と尾状核に投与されるｒＡＡＶ粒子との比率は、少なくとも約２：１である。一部の実施形態において、異種核酸は、哺乳動物の少なくとも前頭皮質、後頭皮質、および／または第ＩＶ層で発現される。一部の実施形態において、異種核酸は、少なくとも前頭連合野皮質領域、前運動皮質、一次体性感覚皮質領域、感覚運動皮質、頭頂葉皮質、後頭皮質、および／または一次運動皮質で発現される。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、大脳皮質において逆行性または順行性輸送を受ける。一部の実施形態において、異種核酸は、視床、視床下核、淡蒼球、黒質および／または海馬でさらに発現される。
上記の態様および実施形態の一部の実施形態において、本発明のｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２－７ｍ８、ＡＡＶ ＤＪ、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋ、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶキャプシド ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１血清型キャプシドを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、またはＡＡＶｒｈ１０である。一部の実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、１つまたはそれ以上のＡＡＶの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列を端
に有する異種核酸を含む。一部の実施形態において、異種核酸は、２つのＡＡＶのＩＴＲを端に有する。一部の実施形態において、ＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶ血清型のＩＴＲである。一部の実施形態において、ＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶ２のＩＴＲである。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子のＩＴＲおよびキャプシドは、同じＡＡＶ血清型から誘導される。一部の実施形態において、ＩＴＲおよびキャプシドは、ＡＡＶ２から誘導される。他の実施形態において、ｒＡＡＶウイルス粒子のＩＴＲおよびキャプシドは、異なるＡＡＶ血清型から誘導される。一部の実施形態において、ＩＴＲは、ＡＡＶ２から誘導され、キャプシドは、ＡＡＶ１から誘導される。
上記の態様および実施形態の一部の実施形態において、異種核酸は、プロモーターに機能するように連結されている。一部の実施形態において、プロモーターは、ＣＮＳの細胞中で異種核酸を発現する。一部の実施形態において、プロモーターは、脳の細胞中で異種核酸を発現する。一部の実施形態において、プロモーターは、ニューロンおよび／またはグリア細胞中で異種核酸を発現する。一部の実施形態において、ニューロンは、尾状核の中型有棘ニューロン、被殻の中型有棘ニューロン、皮質第ＩＶ層のニューロンおよび／または皮質第Ｖ層のニューロンである。一部の実施形態において、グリア細胞は、星状細胞である。一部の実施形態において、プロモーターは、ＣＢＡプロモーター、最小のＣＢＡプロモーター、ＣＭＶプロモーターまたはＧＵＳＢプロモーターである。他の実施形態において、プロモーターは、誘導性である。さらなる実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、エンハンサー、スプライスドナー／スプライスアクセプター対、マトリックスアタッチメント部位、またはポリアデニル化シグナルの１つまたはそれ以上を含む。一部の実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、自己相補的なｒＡＡＶベクターである。一部の実施形態において、ベクターは、異種核酸をコードする第１の核酸配列および異種核酸の相補物をコードする第２の核酸配列を含み、第１の核酸配列は、その長さのほとんどまたは全てにわたり、第２の核酸配列と鎖内の塩基対を形成することができる。一部の実施形態において、第１の核酸配列および第２の核酸配列は、突然変異したＡＡＶのＩＴＲによって連結されており、突然変異したＡＡＶのＩＴＲは、Ｄ領域の欠失を含み、末端分解配列の突然変異を含む。
上記の態様および実施形態の一部の実施形態において、異種核酸は、治療用ポリペプチドまたは治療用核酸をコードする。一部の実施形態において、異種核酸は、治療用ポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、治療用ポリペプチドは、酵素、神経栄養因子、ＣＮＳ関連の障害を有する個体において不足しているかまたは突然変異しているポリペプチド、抗酸化剤、抗アポトーシス因子、抗血管新生因子、および抗炎症性因子、アルファ－シヌクレイン、酸性ベータ－グルコシダーゼ（ＧＢＡ）、ベータ－ガラクトシダーゼ－１（ＧＬＢ１）、イズロン酸２－スルファターゼ（ＩＤＳ）、ガラクトシルセラミダーゼ（ＧＡＬＣ）、マンノシダーゼ、アルファ－Ｄ－マンノシダーゼ（ＭＡＮ２Ｂ１）、ベータ－マンノシダーゼ（ＭＡＮＢＡ）、プソイドアリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）、Ｎ－アセチルグルコサミン－１－ホスホトランスフェラーゼ（ＧＮＰＴＡＢ）、酸性スフィンゴミエリナーゼ（ＡＳＭ）、ニーマン－ピックＣ型タンパク質（ＮＰＣ１）、酸性アルファ－１，４－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）、ヘキソサミニダーゼベータサブユニット、ＨＥＸＢ、Ｎ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＭＰＳ３Ａ）、Ｎ－アルファ－アセチルグルコサミニダーゼ（ＮＡＧＬＵ）、ヘパリンアセチル－ＣｏＡ、アルファ－グルコサミニダーゼＮ－アセチルトランスフェラーゼ（ＭＰＳ３Ｃ）、Ｎ－アセチルグルコサミン－６－スルファターゼ（ＧＮＳ）、アルファ－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼ（ＮＡＧＡ）、ベータ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）、ヘキソサミニダーゼアルファサブユニット（ＨＥＸＡ）、ハンチンチン（ＨＴＴ）、リソソーム酸性リパーゼ（Ｌ
ＩＰＡ）、アスパルチルグルコサミニダーゼ、アルファ－ガラクトシダーゼＡ、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ、トリペプチジルペプチダーゼ、リソソーム膜貫通タンパク質、システイン輸送体、酸性セラミダーゼ、酸性アルファ－Ｌ－フコシダーゼ、カテプシンＡ、アルファ－Ｌ－イズロニダーゼ、アリールスルファターゼＢ、アリールスルファターゼＡ、Ｎ－アセチルガラクトサミン－６－スルフェート、酸性ベータ－ガラクトシダーゼ、またはアルファ－ノイラミダーゼである。他の実施形態において、異種核酸は、治療用核酸をコードする。一部の実施形態において、治療用核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムまたはＤＮＡザイムである。一部の実施形態において、治療用ポリペプチドまたは治療用核酸は、ＣＮＳの障害を処置するのに使用される。
上記の態様および実施形態の一部の実施形態において、ＣＮＳの障害は、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）、ハンチントン病、てんかん、パーキンソン病、アルツハイマー病、卒中、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、大脳皮質基底核神経節変性症（ＣＢＧＤ）、前頭側頭認知症（ＦＴＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、進行性核上麻痺（ＰＳＰ）または脳のがんである。一部の実施形態において、障害は、アスパルチルグルコサミン尿症、ファブリー、乳児期バッテン病（ＣＮＬ１）、古典的後期の乳児期バッテン病（ＣＮＬ２）、若年性のバッテン病（ＣＮＬ３）、バッテンＣＮＬ４型、バッテンＣＮＬ５型、バッテンＣＮＬ６型、バッテンＣＮＬ７型、バッテンＣＮＬ８型、シスチン症、ファーバー、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシス、ゴーシェ病１型、ゴーシェ病２型、ゴーシェ病３型、ＧＭ１ガングリオシド症、ハンター病、クラッベ病、αマンノシドーシス病、βマンノシドーシス病、マロトー－ラミー、異染性白質ジストロフィー病、モルキオＡ型、モルキオＢ型、ムコリピドーシスＩＩ／ＩＩＩ疾患、ニーマン－ピック病Ａ型、ニーマン－ピック病Ｂ型、ニーマン－ピック病Ｃ型、ポンペ病、サンドホフ病、サンフィリッポ病Ａ型、サンフィリッポ病Ｂ型、サンフィリッポ病Ｃ型、サンフィリッポ病Ｄ型、シンドラー病、シンドラー－カンザキ、シアリドーシス、スライ病、テイ－サックス病、およびウォールマン病からなる群より選択されるリソソーム蓄積症である。
上記の態様および実施形態の一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、組成物の形態である。さらなる実施形態において、組成物は、医薬的に許容される賦形剤を含む医薬組成物である。
上記の態様および実施形態の一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクターをコードする核酸、ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐをコードする核酸、ならびにＡＡＶヘルパーウイルス機能をコードする核酸の宿主細胞への三重のトランスフェクションによって生産されたものであり、宿主細胞への核酸のトランスフェクションは、ｒＡＡＶ粒子を生産することが可能な宿主細胞を生成する。他の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクターをコードする核酸、ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐをコードする核酸、ならびにＡＡＶヘルパーウイルス機能をコードする核酸の１つまたはそれ以上を含むプロデューサー細胞株によって生産されたものである。
上記の態様および実施形態の一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、定位送達によって送達される。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、対流強化送達によって送達される。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＣＥＤ送達システムを使用して送達される。一部の実施形態において、ＣＥＤシステムは、カニューレを含む。一部の実施形態において、カニューレは、逆流抵抗性カニューレまたは段階的カニューレである。一部の実施形態において、ＣＥＤシステムは、ポンプを含む。一部の実施形態において、ポンプは、手動ポンプである。一部の実施形態において、ポンプは、浸透圧ポンプである。一部の実施形態において、ポンプは、輸注ポンプである。
本明細書において引用された特許出願および公報を包含する全ての参考文献は、参照によってそれら全体が開示に組み入れられる。
三重のトランスフェクション（ＴＴ）およびプロデューサー細胞株（ＰＣＬ）プロセスによって作製されたＡＡＶ１およびＡＡＶ２ベクターが投与された動物における、外科手術の直前（黒色）および剖検の時間（灰色）に測定されたアカゲザルの体重を示す図である。 図２Ａ～２Ｄは、アカゲザルの尾状核および被殻へのＡＡＶ１－ＧＦＰ（ＴＴ）の輸注から３０日後にＧＦＰに関して染色された代表的な脳断片を示す図である。図２Ａ～２Ｄにおける断片は、脳中の吻側から尾側の方向にわたる。各パネルには３匹の代表的な動物からの断片が表示される。 図３Ａ～３Ｄは、アカゲザルの尾状核および被殻へのＡＡＶ１－ＧＦＰ（ＴＴ）の輸注後の、星状細胞（図３Ａおよび３Ｃ）および皮質ニューロン（図３Ｂおよび３Ｄ）の両方における前頭皮質（図３Ａおよび３Ｂ）および後頭皮質（図３Ｃおよび３Ｄ）におけるＧＦＰの皮質の発現を実証する代表的な脳断片を示す図である。 図４Ａ～４Ｄは、アカゲザルの尾状核および被殻へのＡＡＶ２－ＧＦＰ（ＴＴ）の輸注から３０日後にＧＦＰに関して染色された代表的な脳断片を示す図である。図４Ａ～４Ｄにおける断片は、脳中の吻側から尾側の方向にわたる。各パネルには３匹の代表的な動物からの断片が表示される。 図５Ａ～５Ｄは、アカゲザルの尾状核および被殻へのプロデューサー細胞株（ＰＣＬ）（図５Ａおよび５Ｂ）または三重のトランスフェクション（ＴＴ）（図５Ｃおよび５Ｄ）プロセスによって作製されたＡＡＶ１－ＧＦＰの輸注から３０日後にＧＦＰに関して染色された代表的な脳断片を示す図である。 図６Ａ～６Ｄは、アカゲザルの尾状核および被殻へのプロデューサー細胞株（ＰＣＬ）（図６Ａおよび６Ｂ）または三重のトランスフェクション（ＴＴ）（図６Ｃおよび６Ｄ）プロセスによって作製されたＡＡＶ２－ＧＦＰの輸注から３０日後にＧＦＰに関して染色された代表的な脳断片を示す図である。 ＡＡＶ１－ｅＧＦＰおよびＡＡＶ２－ｅＧＦＰが輸注された非ヒト霊長類（ＮＨＰ）の脳におけるＧＦＰの分布を示す図である。ＡＡＶ１－ｅＧＦＰおよびＡＡＶ２－ｅＧＦＰベクターを９匹のアカゲザル（Ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅ）の両側の線条体に輸注した。外科手術の４週間後、脳を、ＧＦＰに対する免疫組織化学（ＩＨＣ）のために処理した。各列は、ＡＡＶ１－ｅＧＦＰ（三重のトランスフェクション；ＴＴ）；ＡＡＶ１－ｅＧＦＰ（プロデューサー細胞株；ＰＣＬ）；ＡＡＶ２－ｅＧＦＰ（ＴＴ）；ＡＡＶ２－ｅＧＦＰ（ＰＣＬ）が輸注された４つの研究グループからの代表的なＧＦＰで染色された脳断片を示す。代表的な断片は、前頭皮質、線条体（輸注部位）、中脳から皮質の後頭部までの脳全体にわたるＧＦＰ発現の分布を実証するための脳の様々な冠状面を示す。全てのグループは、注射部位（被殻および尾状核）におけるロバストなＧＦＰシグナル、加えて皮質領域および黒質への広範囲な輸送を示した。ＩＨＣ染色に基づいて、標的構造（線条体）および皮質領域の両方におけるＧＦＰ発現の被覆率を各サルにつき計算し、表７に要約した。 図７－１の続き。 形質導入の一次領域（ＰＡＴ）のベクター分布（Ｖｄ）に対する比率を示す図である。線条体におけるＧＦＰ発現の一次領域を、ＧＦＰで染色された断片からのスキャンおよびＭＲＩスキャンをガドリニウムシグナルと一致させることから得られた値で割ったそれらの値の上に描写した。＞１．０の比率は、ＧＦＰ発現の程度が輸注後のガドリニウムシグナルの境界を超えることを示す。ＡＡＶベクターが輸注されたサルからの結果から、ＡＡＶ１は、ＡＡＶ２より良好に脳実質中に広がることが示された（１．２１±０．１対０．７４±０．０４；対応のない両側ｔ検定を用いて、ｐ＜０．００７）。 図９Ａ～９Ｈは、ＡＡＶ１－ｅＧＦＰおよびＡＡＶ２－ｅＧＦＰで形質導入されたＮＨＰの脳におけるＧＦＰ発現を示す図である。図９Ａ：対象番号１のＡＡＶ１－ｅＧＦＰ（ＴＴ）で形質導入された標的構造である尾状核の高倍率像（４０倍）。ＤＡＢで染色された暗褐色のＧＦＰ＋ニューロンが、陽性ニューロン繊維の高密度に染色されたネットワークに対して可視化される。このようなロバストなシグナルは、ＴＴおよびＰＣＬ方法の両方によって生産されたＡＡＶ１－ｅＧＦＰベクターが注射された全てのサルにおいて検出された。図９Ｂ：注射部位（線条体）から皮質領域へのベクターＡＡＶ１－ｅＧＦＰの大量輸送を実証する対象番号１（図７）の前頭前皮質のフラグメント。ＧＦＰ＋細胞の形態学に基づいて、ニューロンおよび星状細胞の両方が皮質で検出された。図９Ｃ：図９Ｂで示されたフレームのより高倍率の像（４０倍）であり、ＧＦＰを発現する多数の皮質ニューロンを示す。図９Ｄ：対象番号１からの皮質の高倍率像（４０倍）であり、星状細胞の形態を有するＧＦＰ＋細胞を示す。図９Ｅ：対象番号６のＡＡＶ２－ｅＧＦＰ（ＴＴ）で形質導入された標的構造である被殻の高倍率像（４０倍）。暗褐色のＤＡＢシグナルは、ニューロンにおけるＧＦＰの発現およびそれらの高密度に染色された繊維のネットワークを示す。図９Ｆ：線条体（注射部位）から皮質領域へのベクターＡＡＶ２－ｅＧＦＰの大量輸送を実証する対象番号６（図７）の前頭前皮質のフラグメント。ＧＦＰ陽性細胞の大部分は、ニューロンの形態を有していた（倍率２．５倍）。図９Ｇ：図９Ｆで示されたフレームのより高倍率の像（４０倍）であり、ＧＦＰを発現する多数の皮質ニューロンを示す。図９Ｈ：対象番号６の内包のより高倍率の像（２０倍）であり、星状細胞の形態を有するＧＦＰ＋細胞を示す。 図９－１の続き。 図１０Ａ～１０Ｅは、サルの脳に注射されたＡＡＶ１－ｅＧＦＰおよびＡＡＶ２－ｅＧＦＰの細胞親和性を示す図である。サルの脳断片を、ＧＦＰおよび様々な細胞マーカーに対する二重免疫蛍光染色のために処理して、注射されたベクターの細胞親和性を決定した。図１０Ａ：ＧＦＰに対する抗体（ＤｙＬｉｇｈｔ（商標）４８８色素に関する緑色のチャネル；左の列）およびニューロンマーカーＮｅｕＮに対する抗体（ＤｙＬｉｇｈｔ（商標）５４９色素に関する赤色のチャネル；中央の列）で染色された対象番号１からの尾状核（標的構造）からの断片。両方のチャネルからの統合された写真（倍率２０倍；右の列）は、ＧＦＰを発現する多数のニューロンを示しており、ＡＡＶ１－ｅＧＦＰのニューロンの親和性が立証される。図１０Ｂ：対象番号１の前頭前皮質からの断片に同じ染色を実行したところ、線条体からのニューロン投射を受けている遠位の脳構造におけるニューロンの形質導入が示され、これは、ＡＡＶ１－ｅＧＦＰの逆行性輸送の証拠である。図１０Ｃ：ＧＦＰに対する抗体（ＤｙＬｉｇｈｔ（商標）４８８色素に関する緑色のチャネル；左の列）および星状細胞マーカーＳ－１００に対する抗体（ＤｙＬｉｇｈｔ（商標）５４９色素に関する赤色のチャネル；中央の列）で染色された対象番号１からの尾状核（標的構造）からの断片。両方のチャネルからの統合された写真（倍率２０倍；右の列）は、ＧＦＰを発現する多数の星状細胞を示しており、ＡＡＶ１－ｅＧＦＰも星状細胞に形質導入されることが立証される。図１０Ｄ：ＧＦＰに対する抗体（ＤｙＬｉｇｈｔ（商標）４８８色素に関する緑色のチャネル；左の列）およびニューロンマーカーＮｅｕＮに対する抗体（ＤｙＬｉｇｈｔ（商標）５４９色素に関する赤色のチャネル；中央の列）で染色された対象番号６からの尾状核（標的構造）からの断片。両方のチャネルからの統合された写真（倍率２０倍；右の列）は、ＧＦＰを発現する多数のニューロンを示しており、ＡＡＶ２－ｅＧＦＰのニューロンの親和性が立証される。図１０Ｅ：ＧＦＰに対する抗体（ＤｙＬｉｇｈｔ（商標）４８８色素に関する緑色のチャネル；左の列）および小グリア細胞マーカーＩｂａ－１に対する抗体（ＤｙＬｉｇｈｔ（商標）５４９色素に関する赤色のチャネル；中央の列）で染色された対象番号３からの尾状核（標的構造）からの断片。統合された写真において両方のマーカーで共に染色されていないことから（倍率２０倍；右の列）、ＡＡＶ１は小グリア細胞に形質導入されないことが示され、これはＡＡＶ２の場合も同様であった（データ示さず）。 図１０－１の続き。 図１１Ａ～１１Ｃは、ＡＡＶ１－ｅＧＦＰおよびＡＡＶ２－ｅＧＦＰが注射されたＮＨＰの線条体におけるニューロンの形質導入の効率を示す図である。サルの脳断片のＧＦＰおよびニューロンマーカーＮｅｕＮに対する二重免疫蛍光染色を実行して、線条体（標的構造）および皮質領域内のニューロンの形質導入の効率を計算した。線条体の場合、形質導入の効率をＧＦＰ形質導入の一次領域（ＰＡＴ）で計算したところ、シグナルはロバストであり、ＧＦＰ＋ニューロンが高密度に分布していた（図１１Ａ）。ＧＦＰ形質導入の一次領域の外側の領域でもニューロンが検出された（ＯＰＡＴ；図１１Ｃ）。図１１Ｂに、ＰＡＴ中のＧＦＰ＋ニューロン（内部の網掛け）およびＯＰＡＴ中のＧＦＰ＋ニューロン（外部の網掛け）を計数する技術に関するスキームを示す。表８（ＰＡＴ）および表９（ＯＰＡＴ）に、各サルおよび脳構造に関する個々の計数からのデータを示す。 図１１－１の続き。 図１１－２の続き。 図１２Ａおよび１２Ｂは、ベクターに関連する組織学的な発見を示す図である。一次形質導入（ＰＡＴ）の領域からの環状断片のヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色の独立した評価から、全ての実験グループにおいてカニューレ挿入に関する通常のグリオーシスが解明された。またＨ＆Ｅ染色から、使用されたベクターに関係なく全ての動物において血管周囲の細胞浸潤も解明された。血管周囲の折り返しの発生率および重症度は、特にＴＴ方法によってベクターを調製した場合、ＡＡＶ１が注射されたグループで増加した。図１２Ａ：対象番号３からのＨ＆Ｅで染色された断片は、ＡＡＶ１－ｅＧＦＰ（ＴＴ）で形質導入された左被殻において多数の血管周囲の折り返しを示す。右下隅に１本の血管を拡大する（５倍）。図１２Ｂ：対象番号５からのＨ＆Ｅで染色された断片は、ＡＡＶ１－ｅＧＦＰ（ＰＣＬ）で形質導入された左尾状核において極めてわずかな局所的な血管周囲の折り返ししか示さない。左下隅に２～３本の血管を拡大する（５倍）。 図１３Ａおよび１３Ｂは、アカゲザルの尾状核および被殻へのＡＡＶ１－ｅＧＦＰ注射から１カ月後の肝臓、脾臓、心臓、腎臓、および肺サンプルにおけるｅＧＦＰのｍＲＮＡ発現の定量的ＰＣＴ（ＱＰＣＲ）分析を示す図である。（図１３Ａ）三重のトランスフェクション（ＴＴ）プロセスによって作製されたＡＡＶ１およびＡＡＶ２－ｅＧＦＰベクター。（図１３Ｂ）プロデューサー細胞株（ＰＣＬ）プロセスによって作製されたＡＡＶ１およびＡＡＶ２－ｅＧＦＰベクター。
本明細書において詳細に論じられるように、本発明者らは、ＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ１およびＡＡＶ２ベクター）は、線条体に送達される場合（例えば、対流強化送達、ＣＥＤによって）、アカゲザルの脳において線条体および皮質構造の両方を効率的に標的化することを発見した。これらの研究において２つの異なる製造プラットフォームも評価したところ、これらの研究から、三重のトランスフェクションおよびプロデューサー細胞株によって生成したＡＡＶは、アカゲザルの脳において線条体および皮質構造の両方を標的化することが実証される。両方のプラットフォームを使用して生産されたｒＡＡＶ粒子（例えば、ＡＡＶ１およびＡＡＶ２ベクター）の線条体内送達は、輸注部位（例えば、皮質構造）から相当な距離に配置されたニューロンに加えて線条体中のニューロンも形質導入することを可能にした。したがって、本発明は、線条体にｒＡＡＶ粒子を投与することによって、哺乳動物の中枢神経系に、異種核酸をコードするｒＡＡＶベクターを含有する組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を送達する方法であって、異種核酸は、哺乳動物の少なくとも大脳皮質および線条体で発現される、方法を提供する。
本発明はまた、線条体に、少なくとも大脳皮質および線条体で発現される異種核酸をコードするｒＡＡＶ粒子を投与することによって、哺乳動物におけるＣＮＳ障害（例えば、ハンチントン病）を処置するための方法、加えて、本明細書で説明されるｒＡＡＶ粒子を使用する、哺乳動物の大脳皮質および線条体における異種核酸の発現のためのシステムお
よびキットも提供する。本発明における方法はまた、哺乳動物の線条体にｒＡＡＶ粒子を送達するための送達デバイス（例えば、ＣＥＤデバイス）を利用してもよいし、同様に、本発明のシステムおよびキットは、哺乳動物の線条体にｒＡＡＶ粒子を送達するためのデバイスをさらに包含していてもよい。
Ｉ．一般的な技術
本明細書で記載または言及される技術および手順は、一般的によく認識され、当業者により従来の手法を使用して一般的に採用されており、このような手法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、第４版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、２０１２）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、２００３）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙのシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ＰＣＲ ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＧ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ編、１９９５）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編、１９８８）；Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、第６版、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、２０１０）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９８）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．ＭａｔｈｅｒおよびＰ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、１９９８）；Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ、およびＤ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ編、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、１９９３～８）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９９６）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、１９９１）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、２００２）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙら、２００４）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ、１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８８～１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．ＳｈｅｐｈｅｒｄおよびＣ．Ｄｅａｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、２０００）；Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｅ．ＨａｒｌｏｗおよびＤ．Ｌａｎｅ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９９）；Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．ＺａｎｅｔｔｉおよびＪ．Ｄ．Ｃａｐｒａ編、Ｈａｒｗｏｏｄ
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９５）；およびＣａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（Ｖ．Ｔ．ＤｅＶｉｔａら編、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏｍｐａｎｙ、２０１１）に記載の広く利用されている手法である。
ＩＩ．定義
「ベクター」は、本明細書で使用される場合、インビトロまたはインビボのいずれかで宿主細胞に送達しようとする核酸を含む組換えプラスミドまたはウイルスを指す。
用語「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、本明細書で使用される場合、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかのあらゆる長さのヌクレオチドの多量体型を指す。したがって、この用語は、これらに限定されないが、一本鎖、二本鎖もしくは多重鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、またはプリンおよびピリミジン塩基を含むポリマー、または他の天然の、化学的もしくは生化学的に修飾された、非天然の、もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を包含する。ポリヌクレオチドの骨格は、糖およびリン酸基を含んでいてもよいし（典型的にＲＮＡまたはＤＮＡで見出されるように）、または修飾または置換された糖またはリン酸基を含んでいてもよい。代替として、ポリヌクレオチドの骨格は、ホスホロアミデートなどの合成サブユニットのポリマーを含んでいてもよく、したがってオリゴデオキシヌクレオシドホスホロアミデート（Ｐ－ＮＨ２）または混成のホスホロアミデート－リン酸ジエステルオリゴマーであってもよい。加えて、二本鎖ポリヌクレオチドは、相補鎖を合成して適切な条件下で鎖をアニーリングすること、または適切なプライマーでのＤＮＡポリメラーゼを使用して相補鎖をデノボ合成することのいずれかによる、化学合成の一本鎖ポリヌクレオチド産物から得ることができる。
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、同義的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指し、最小の長さに限定されない。このようなアミノ酸残基のポリマーは、天然または非天然のアミノ酸残基を含有していてもよく、そのようなものとしては、これらに限定されないが、ペプチド、オリゴペプチド、アミノ酸残基の二量体、三量体、および多量体が挙げられる。全長タンパク質およびそれらのフラグメントはどちらも、この定義に含まれる。この用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、シアル化、アセチル化、リン酸化なども包含する。さらに、本発明の目的に関して、「ポリペプチド」は、タンパク質が所望の活性を維持しさえすれば、ネイティブの配列に対する修飾、例えば欠失、付加、および置換（一般的に保存的な性質を有するもの）を包含するタンパク質も指す。これらの修飾は、例えば部位特異的変異誘発を介して計画的であってもよいし、または例えばＰＣＲ増幅によりタンパク質またはエラーを生じる宿主の突然変異を介して偶発的であってもよい。
「組換えウイルスベクター」は、１つまたはそれ以上の異種配列（すなわち、ウイルス由来ではない核酸配列）を含む組換えポリヌクレオチドベクターを指す。組換えＡＡＶベクターのケースにおいて、組換え核酸に、少なくとも１つの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接する。一部の実施形態において、組換え核酸に、２つのＩＴＲが隣接する。
「組換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶベクター）」は、少なくとも１つまたは２つのＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接する１つまたはそれ以上の異種配列（すなわち、ＡＡＶ由来ではない核酸配列）を含むポリヌクレオチドベクターを指す。このようなｒＡＡＶベクターは、好適なヘルパーウイルスに感染した（または好適なヘルパー機能を発現している）宿主細胞、ならびにＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物（すなわちＡＡＶのＲｅｐおよびＣａｐタンパク質）を発現している宿主細胞中に存在する場合、複製して感染性のウイルス粒子にパッケージ化することができる。ｒＡＡＶベクターが、より大きいポリヌクレオチドに（例えば、染色体中、またはクローニングまたはトランスフェクションに使用されるプラスミドなどの別のベクター中に）取り込まれる場合、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶパッケージ化機能および好適なヘルパー機能の存在下で複製およびキャプシド化により「レスキュー」することができる「プロベクター」と称される場合もある。ｒＡＡＶベクターは、これらに限定されないが、脂質と複合体化した、リポソーム内にカ
プセル封入された、およびウイルス粒子、例えばＡＡＶ粒子中にキャプシド化された、プラスミド、直鎖状人工染色体などの多数の形態のいずれかの形態であってもよい。ｒＡＡＶベクターは、「組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ粒子）」を生成するために、ＡＡＶウイルスのキャプシドにパッケージ化することができる。
「異種」は、比較されるかまたは導入されるかまたは取り込まれる物体の残部の遺伝子型と別個の遺伝子型を有する物体から誘導されたことを意味する。例えば、遺伝子工学技術によって異なる細胞型に導入されたポリヌクレオチドは、異種ポリヌクレオチドである（発現される場合、異種ポリペプチドをコードすることができる）。同様に、ウイルスベクターに取り入れられる細胞性の配列（例えば、遺伝子またはそれらの一部）は、そのベクターに関して異種ヌクレオチド配列である。異種核酸は、比較されるかまたは導入されるかまたは取り込まれる物体の残部の遺伝子型と別個の遺伝子型を有する物体から誘導された核酸を指す場合がある。
用語「異種核酸」は、細胞に導入されて、ＲＮＡに転写させることができ、場合により適切な条件下で翻訳および／または発現させることができるポリヌクレオチドを指す。一部の態様において、導入遺伝子は、それが導入される細胞に所望の特性を付与するか、またはそれ以外の方法で所望の治療または診断結果をもたらす。別の態様において、導入遺伝子は、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡなどのＲＮＡ干渉を媒介する分子に転写することができる。
「ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター」は、ニワトリβ－アクチン遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋのＥｎｔｒｅｚ遺伝子番号３９６５２６で示されるニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ）ベータアクチン）から誘導されたポリヌクレオチド配列を指す。「ニワトリβ－アクチンプロモーター」は、本明細書で使用される場合、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーエレメントを含有するプロモーター、ニワトリβ－アクチン遺伝子のプロモーターならびに第１のエクソンおよびイントロン、ならびにウサギベータ－グロビン遺伝子のスプライスアクセプター、例えばＭｉｙａｚａｋｉ，Ｊ．ら（１９８９）Ｇｅｎｅ ７９（２）：２６９～７７に記載の配列を指す場合がある。用語「ＣＡＧプロモーター」は、本明細書で使用される場合、同義的に使用される場合がある。用語「ＣＭＶ初期エンハンサー／ニワトリベータアクチン（ＣＡＧ）プロモーター」は、本明細書で使用される場合、同義的に使用される場合がある。
用語「ゲノム粒子（ｇｐ）」、「ゲノム等価体」、または「ゲノムコピー」は、ウイルス力価への言及で使用される場合、感染力または機能性に関係なく、組換えＡＡＶのＤＮＡゲノムを含有するビリオンの数を指す。特定のベクター調製物中のゲノム粒子の数は、本明細書の実施例、または例えばＣｌａｒｋら（１９９９）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１０：１０３１～１０３９；Ｖｅｌｄｗｉｊｋら（２００２）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、６：２７２～２７８に記載されるような手順によって測定することができる。
用語「ベクターゲノム（ｖｇ）」は、本明細書で使用される場合、ベクター、例えばウイルスベクターの一連のポリヌクレオチド配列を含む１つまたはそれ以上のポリヌクレオチドを指す場合がある。ベクターゲノムは、ウイルス粒子中にキャプシド化されていてもよい。特定のウイルスベクターに応じて、ベクターゲノムは、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、または一本鎖ＲＮＡ、もしくは二本鎖ＲＮＡを含んでいてもよい。ベクターゲノムは、特定のウイルスベクターに関連する内因性配列、および／または組換え技術を介して特定のウイルスベクターに挿入されたあらゆる異種配列を包含していてもよい。例えば、組換えＡＡＶベクターゲノムは、プロモーターの端にある少なくとも１つのＩＴＲ配列、目的の配列（例えば、異種核酸）、およびポリアデニル化配列を包含していてもよい。完全なベクターゲノムは、ベクターのポリヌクレオチド配列の完全なセットを包含していても
よい。一部の実施形態において、ウイルスベクターの核酸の力価は、ｖｇ／ｍＬを単位として測定することができる。この力価を測定するのに好適な方法は、当業界において公知である（例えば、定量ＰＣＲ）。
用語「感染単位（ｉｕ）」、「感染性粒子」、または「複製単位」は、ウイルス力価への言及で使用される場合、例えばＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら（１９８８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６２：１９６３～１９７３に記載されるような、複製中心のアッセイとしても公知の感染中心のアッセイによって測定した場合、感染性および複製能を有する組換えＡＡＶベクター粒子の数を指す。
用語「形質導入単位（ｔｕ）」は、ウイルス力価への言及で使用される場合、本明細書の実施例、または例えばＸｉａｏら（１９９７）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．、１４４：１１３～１２４；またはＦｉｓｈｅｒら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７０：５２０～５３２（ＬＦＵアッセイ）に記載されるような機能アッセイで測定した場合、機能的な異種核酸産物の生産を引き起こす感染性の組換えＡＡＶベクター粒子の数を指す。
「逆方向末端反復」または「ＩＴＲ」配列は、当業界でよく理解されている用語であり、逆方向でウイルスゲノムの末端で見出される相対的に短い配列を指す。
「ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）」配列は、当業界でよく理解されている用語であり、ネイティブの一本鎖ＡＡＶゲノムの両方の末端に存在するおよそ１４５ヌクレオチドの配列である。ＩＴＲの最も外側の１２５ヌクレオチドは、異なるＡＡＶゲノム間および単一のＡＡＶゲノムの２つの末端の間に不均質性をもたらす２つの択一的な方向のいずれかに存在していてもよい。最も外側の１２５ヌクレオチドはまた、自己相補性を有する数種のより短い領域（Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’およびＤ領域と指定される）も含有し、それによりＩＴＲのこの部分内で鎖内の塩基対形成を起こすことが可能になる。
「末端分解配列」または「ｔｒｓ」は、ウイルスＤＮＡの複製中にＡＡＶのｒｅｐタンパク質によって切断されるＡＡＶのＩＴＲのＤ領域における配列である。突然変異末端分解配列は、ＡＡＶのｒｅｐタンパク質による切断に対して耐性を有する。
「ＡＡＶのヘルパー機能」は、ＡＡＶを宿主細胞により複製してパッケージ化することを可能にする機能を指す。ＡＡＶのヘルパー機能は、これらに限定されないが、ＡＡＶ複製およびパッケージ化に役立つヘルパーウイルスまたはヘルパーウイルス遺伝子などの多数の形態のいずれかで提供することができる。他のＡＡＶのヘルパー機能は、遺伝毒性物質などの分野において公知である。
ＡＡＶのための「ヘルパーウイルス」は、ＡＡＶ（これは、欠陥パルボウイルスである）を宿主細胞により複製してパッケージ化することを可能にするウイルスを指す。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶの複製を可能にする「ヘルパー機能」を提供する。このようなヘルパーウイルスが多数同定されており、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、およびポックスウイルス、例えばワクシニアおよびバキュロウイルスなどが挙げられる。アデノウイルスは、多数の異なるサブグループを包含するが、サブグループＣのアデノウイルス５型（Ａｄ５）が最も一般的に使用される。ヒト、ヒト以外の哺乳類および鳥類由来の数多くのアデノウイルスが公知であり、ＡＴＣＣなどの受託機関より入手可能である。ＡＴＣＣなどの受託機関より同様に入手可能なヘルペス科のウイルスとしては、例えば、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）、エプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）および仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）が挙げられる。ＡＡＶ複製に関するアデノウイルスのヘルパー機能の例としては、Ｅ１Ａ機能、Ｅ１Ｂ機能、Ｅ２Ａ機能、ＶＡ機能およびＥ４ｏｒｆ６機能が挙げられる。受託機関より入手可能なバキュロウイルスとしては
、アウトグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）の核多角体病ウイルスが挙げられる。
ｒＡＡＶの調製は、感染性のＡＡＶ粒子と感染性のヘルパーウイルス粒子との比率が、少なくとも約１０２：１；少なくとも約１０４：１、少なくとも約１０６：１；または少なくとも約１０８：１であるかまたはそれより高い場合、ヘルパーウイルスを「実質的に含まない」と述べられる。一部の実施形態において、調製物も、それに相当する量のヘルパーウイルスタンパク質（すなわち、上記のヘルパーウイルス粒子の不純物が崩壊した形態で存在する場合、このようなレベルのヘルパーウイルスの結果として存在すると予想されるようなタンパク質）を含まない。ウイルスおよび／または細胞タンパク質の汚染は、ＳＤＳゲルにおけるクーマシー染色バンドの存在（例えば、ＡＡＶキャプシドタンパク質ＶＰｌ、ＶＰ２およびＶＰ３に対応するバンド以外のバンドの出現）として一般的に観察することができる。
「ＡＡＶヘルパー機能」は、ＡＡＶを宿主細胞により複製してパッケージ化することを可能にする機能を指す。ＡＡＶヘルパー機能は、これらに限定されないが、ＡＡＶ複製およびパッケージ化に役立つヘルパーウイルスまたはヘルパーウイルス遺伝子などの多数の形態のいずれかで提供することができる。他のＡＡＶヘルパー機能は、当業界において公知であり、例えば遺伝毒性物質などである。ＡＡＶに関する「ヘルパーウイルス」は、ＡＡＶ（これは、欠陥パルボウイルスである）を宿主細胞により複製しパッケージ化することを可能にするウイルスを指す。このようなヘルパーウイルスが多数同定されており、アデノウイルス、ヘルペスウイルスおよびポックスウイルス、例えばワクシニアなどが挙げられる。アデノウイルスは、多数の異なるサブグループを包含するが、サブグループＣのアデノウイルス５型（Ａｄ５）が最も一般的に使用される。ヒト、ヒト以外の哺乳類および鳥類由来の多数のアデノウイルスが公知であり、ＡＴＣＣなどの受託機関より入手可能である。ＡＴＣＣなどの受託機関より同様に入手可能なヘルペス科のウイルスとしては、例えば、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）、エプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）および仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）が挙げられる。
参照ポリペプチドまたは核酸配列に対する「パーセント（％）配列同一性」は、最大のパーセント配列同一性が達成されるように配列を並べ、必要に応じてギャップを導入した後の、配列同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮しない、参照ポリペプチドまたは核酸配列中のアミノ酸残基またはヌクレオチドと同一な候補配列中のアミノ酸残基またはヌクレオチドのパーセンテージと定義される。アミノ酸または核酸配列同一性のパーセントを決定する目的のためのアライメントは、当業界における能力の範囲内の様々な方法で、例えば、公共的に利用可能なコンピューターソフトウェアプログラム、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７）、増刊３０、セクション７．７．１８、表７．７．１に記載されるもの、およびＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどを使用して達成することができる。アライメントプログラムの例は、ＡＬＩＧＮ Ｐｌｕｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ａｎｄ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）である。当業者は、比較される配列の全長にわたり最大のアライメントを達成するのに必要なあらゆるアルゴリズムなど、アライメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。本明細書に記載の目的のために、所与のアミノ酸配列Ｂへの、それとの、またはそれに対する所与のアミノ酸配列Ａの％アミノ酸配列同一性（代替として、所与のアミノ酸配列Ｂへの、それとの、またはそれに対する特定の％アミノ酸配列同一性を有するかまたは含む所与のアミノ酸配列Ａと表すこともできる）は、以下のように計算される：１００×分数Ｘ／Ｙ（式中Ｘは、そのプログラムのＡおよびＢのアライメントにおいて、配列アライメントプログラムによって同一なマッチとスコア付けされたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂ中の
アミノ酸残基の総数である）。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さに等しくない場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性と等しくないと予想されることが理解される。本明細書に記載の目的のために、所与の核酸配列Ｄへの、それとの、またはそれに対する所与の核酸配列Ｃの％核酸配列同一性（代替として、所与の核酸配列Ｄへの、それとの、またはそれに対する特定の％核酸配列同一性を有するかまたは含む所与の核酸配列Ｃと表すこともできる）は、以下のように計算される：１００×分数Ｗ／Ｚ（式中Ｗは、そのプログラムのＣおよびＤのアライメントにおいて、配列アライメントプログラムによって同一なマッチとスコア付けされたヌクレオチドの数であり、Ｚは、Ｄ中のヌクレオチドの総数である）。核酸配列の長さＣが核酸配列Ｄの長さに等しくない場合、ＣのＤに対する％核酸配列同一性は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性と等しくないと予想されることが理解される。
「単離された」分子（例えば、核酸またはタンパク質）または細胞は、それが、その天然の環境の要素から同定され分離および／または回収されていることを意味する。
「有効量」は、臨床結果などの（例えば、症状の緩和、臨床評価項目の達成などの）有益な、または所望の結果をもたらすのに十分な量である。有効量は、１回またはそれ以上の投与で投与することができる。病状の観点から、有効量は、疾患を緩和する、安定化する、またはその発症を遅延させるのに十分な量である。
用語「対流強化送達（ＣＥＤ）」は、本明細書で使用される場合、静水圧が対流による分配を引き起こす速度での輸注によるＣＮＳへの治療剤の送達を指す場合がある。一部の実施形態において、輸注は、０．５μＬ／分より速い速度でなされる。しかしながら、頭蓋内圧が脳の組織を損傷しないような好適なレベルで維持されるように、あらゆる好適な流速を使用することができる。ＣＥＤは、例えば、少なくとも標的ＣＮＳ組織の近くにカニューレの先端の位置決めをすること（例えば、先端をＣＮＳ組織に挿入すること）により好適なカテーテルまたはカニューレ（例えば、段階設計された逆流防止カニューレ）を使用することによって達成することができる。カニューレを位置決めした後、カニューレの先端を介して治療剤を標的ＣＮＳ組織に送達するポンプに、カニューレを連結する。輸注の間、カニューレの先端からの圧力勾配を維持してもよい。一部の実施形態において、輸注は、術中ＭＲＩ（ｉＭＲＩ）または別のリアルタイムＭＲＩ技術などのイメージング方法によって検出可能な、および／または標準的な定位注射器具および技術（例えば、ＭＲＩ Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎｓ、Ｍｅｍｐｈｉｓ、ＴＮからのＣｌｅａｒＰｏｉｎｔ（登録商標）システム）によって送達されるトレーシング剤によってモニターすることができる。
用語「ポロキサマー」は、本明細書で使用される場合、２本のポリオキシエチレン鎖が隣接するポリオキシプロピレン鎖で構成されるブロックコポリマーを指す場合がある。ポロキサマーが販売され得る商標名としては、これらに限定されないが、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）（ＢＡＳＦ）、ＫＯＬＬＩＰＨＯＲ（登録商標）（ＢＡＳＦ）、ＬＵＴＲＯＬ（登録商標）（ＢＡＳＦ）、およびＳＹＮＰＥＲＯＮＩＣ（登録商標）（Ｃｒｏｄａ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）が挙げられる。
「個体」または「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物としては、これらに限定されないが、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、およびウマ）、霊長類（例えば、ヒトおよびサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、およびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）が挙げられる。ある特定の実施形態において、個体または対象は、ヒトである。
「処置」は、本明細書で使用される場合、有益な、または所望の臨床結果を得るためのアプローチである。本発明の目的に関して、有益な、または所望の臨床結果としては、こ
れらに限定されないが、検出可能かまたは検出不可能かにかかわらず、症状の軽減、疾患の程度の低減、疾患の安定化された（例えば、悪化しない）状況、疾患の拡大（例えば、転移）の予防、疾患進行の遅延または減速、病状の緩和または一時的緩和、および寛解（部分的かまたは完全化かどうかにかかわらず）が挙げられる。「処置」はまた、処置を受けない場合に予測される生存と比較した生存の延長を意味する場合もある。
用語「予防的処置」は、本明細書で使用される場合、個体が、障害を有するかまたは障害を有するリスクを有することがわかっているかまたはその疑いがあるが、障害の症状がないかまたは最小の症状を示す場合の処置を指す。予防的処置を受けている個体は、症状の発病の前に処置される。
「ハンチントン病（ＨＤ）」は、典型的にはＨＴＴ遺伝子（ａｋａハンチンチン、ＨＤまたはＩＴ１５）の突然変異によって引き起こされる進行性の脳障害を指す。ハンチントン病は、異常な動き（舞踏病と呼ばれる）、運動機能の段階的な損失、情緒的または精神医学的な疾患、および次第に損なわれていく認知力などの症状によって特徴付けることができる。ほとんどの症状は３０代および４０代で出現するが、疾患の若年型も観察されている。ＨＤのさらなる説明については、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるＯＭＩＭ登録番号１４３１００を参照されたい。
「ハンチンチン（ＨＴＴ）」は、ハンチントン病のほとんどのケースと関連する遺伝子またはそれらのポリペプチド産物のどちらを指すこともできる。ハンチンチンの正常な機能は、十分に理解されていない。しかしながら、ハンチンチン遺伝子の突然変異は、ＨＤを引き起こすことが公知である。これらの突然変異は、典型的には常染色体優性に遺伝し、ＨＴＴ遺伝子におけるトリヌクレオチドＣＡＧリピートの拡大をもたらし、Ｈｔｔタンパク質においてポリグルタミン（ポリＱ）鎖を生じさせる。
「治療」剤（例えば、治療用ポリペプチド、核酸、導入遺伝子、または同種のもの）は、本明細書で使用される場合、有益な、または所望の臨床結果、例えば上述した例示的な臨床結果をもたらすものである。そのようなものとして、治療剤は、上述したような処置で使用することができる。
本明細書における値またはパラメーターに「関して」という言及は、その値またはパラメーターそれ自体を対象とした実施形態を包含する（説明する）。例えば、「Ｘに関して」と言及されている説明は、「Ｘ」の説明を包含する。
単数形の冠詞「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、本明細書で使用される場合、別段の指定がない限り、複数形の指示対象も包含する。
本明細書に記載の発明の態様および実施形態は、態様および実施形態を「含む」、「からなる」、および／または「本質的にからなる」ことを包含することが理解される。
ＩＩＩ．ｒＡＡＶ粒子を送達するための方法
一部の態様において、本発明は、哺乳動物の中枢神経系に組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を送達するための方法であって、線条体にｒＡＡＶ粒子を投与することを含み、ｒＡＡＶ粒子は、哺乳動物の少なくとも大脳皮質および線条体で発現される異種核酸をコードするｒＡＡＶベクターを含む、方法を提供する。さらなる態様において、本発明は、哺乳動物の中枢神経系にｒＡＡＶ粒子を送達するための方法であって、線条体にｒＡＡＶ粒子を投与することを含み、ｒＡＡＶ粒子は、哺乳動物の少なくとも大脳皮質および線条体で発現される異種核酸をコードするｒＡＡＶベクターを含み、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１）キャプシドを含む、方法を提供する。さらなる追加の態様に
おいて、本発明は、哺乳動物の中枢神経系にｒＡＡＶ粒子を送達するための方法であって、線条体にｒＡＡＶ粒子を投与することを含み、ｒＡＡＶ粒子は、哺乳動物の少なくとも大脳皮質および線条体で発現される異種核酸をコードするｒＡＡＶベクターを含み、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）キャプシドを含む、方法を提供する。よりさらなる態様において、本発明は、哺乳動物におけるハンチントン病を処置するための方法であって、線条体にｒＡＡＶ粒子を投与することを含み、ｒＡＡＶ粒子は、哺乳動物の少なくとも大脳皮質および線条体で発現される異種核酸をコードするｒＡＡＶベクターを含む、方法を提供する。一部の実施形態において、哺乳動物は、ヒトである。
本発明の開示のある特定の態様は、中枢神経系（ＣＮＳ）の１つまたはそれ以上の領域へのｒＡＡＶ粒子の投与に関する。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、線条体に投与される。線条体は、大脳皮質（本明細書において、用語「皮質」が同義的に使用される場合がある）からの入力を受け、基底核に出力を送る脳の領域として公知である（線条体は、線条核および新線条体とも称される）。上述したように、線条体は、運動機能と情緒のコントロール／動機付けの両方をコントロールし、ハンチントン病などの多くの神経疾患への関与が示されてきた。これらに限定されないが、有棘投射ニューロン（中型有棘ニューロンとしても公知）、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロン、およびコリン作動性介在ニューロンなどの数種の目的とする細胞型が線条体中に配置されている。中型有棘ニューロンは、線条体ニューロンのほとんどを構成する。これらのニューロンはＧＡＢＡ作動性であり、ドーパミン受容体を発現する。脳の半球のそれぞれが、線条体を含有する。
線条体の重要な基礎構造は、尾状核および被殻を包含する。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、尾状核（ｃａｕｄａｔｅ ｎｕｃｌｅｕｓ）（本明細書において、用語「尾状核（ｃａｕｄａｔｅ）」が同義的に使用される場合がある）に投与される。尾状核は、背側線条体の構造として公知である。尾状核は、指示された動作、空間的な作業記憶、記憶、目的指向の行動、感情、睡眠、言語、および学習などの機能のコントロールへの関与が示されてきた。脳の半球のそれぞれが、尾状核を含有する。
一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、被殻に投与される。尾状核と共に、被殻は、背側線条体の構造として公知である。被殻は、レンズ核の一部を含み、大脳皮質を黒質および淡蒼球と連結する。被殻は、脳の他の多くの構造と高度に統合されていることから、学習、運動学習、運動性能、運動課題、および四肢の動きなどの機能のコントロールへの関与が示されてきた。脳の半球のそれぞれが、被殻を含有する。
ｒＡＡＶ粒子は、線条体の１つまたはそれ以上の部位に投与してもよい。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、線条体の被殻および尾状核に投与される。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、線条体の各半球の被殻および尾状核に投与される。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、少なくとも尾状核における１つの部位および被殻における２つの部位に投与される。
一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、脳の１つの半球に投与される。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、脳の半球の両方に投与される。例えば、一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、線条体の各半球の被殻および尾状核に投与される。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子を含有する組成物は、各半球の線条体に投与される。他の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子を含有する組成物は、左半球の線条体もしくは右半球の線条体、および／または左半球の被殻もしくは右半球の被殻に投与される。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子を含有する組成物は、左半球の尾状核、右半球の尾状核、左半球の被殻および右半球の被殻のあらゆる組合せに投与される。
一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子を含有する組成物は、１つより多くの場所に、
同時にまたは逐次的に投与される。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子を含有する組成物の複数回の注射は、約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、９時間、１２時間または２４時間以下のいずれかの間隔があけられる。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子を含有する組成物の複数回の注射の間隔は、約２４時間より長い。
一般的に、約１μＬ～約１ｍＬの本発明の組成物を送達することができる（例えば、約１００μＬ～約５００μＬの組成物）。一部の実施形態において、被殻に送達される組成物の量は、尾状核に送達される体積より多い。一部の実施形態において、被殻に送達される組成物の量は、尾状核に送達される体積の約２倍である。他の実施形態において、被殻に送達される組成物の量は、尾状核に送達される体積の、約１倍、１．２５倍、１．５倍、１．７５倍、２倍、２．２５倍、２．５倍、２．７５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍または１０倍（またはその間のいずれかの比率）のいずれかである。例えば、一部の実施形態において、被殻に投与されるｒＡＡＶ粒子と尾状核に投与されるｒＡＡＶ粒子との比率は、少なくとも約２：１である（例えば、約３０μＬの組成物が、各半球の尾状核に投与され、約６０μＬの組成物が、各半球の被殻に投与される）。一部の実施形態において、約２０μＬ～約５０μＬ（またはその間のいずれかの量）の組成物が、各半球の尾状核に投与され、約４０μＬ～約１００μＬ（またはその間のいずれかの量）の組成物が、各半球の被殻に投与される。一部の実施形態において、各半球の尾状核に投与される組成物の体積は、およそ以下の体積（μＬで）：５０、４５、４０、３５、３０、または２５のいずれかより少ない。一部の実施形態において、各半球の尾状核に投与される組成物の体積は、およそ以下の体積（μＬで）：２０、２５、３０、３５、４０、または４５のいずれかより多い。すなわち、各半球の尾状核に投与される組成物の体積は、５０、４５、４０、３５、３０、または２５の上限および２０、２５、３０、３５、４０、または４５の独立して選択される下限を有する体積の範囲のいずれかであってもよく、ここで下限は上限より低い。一部の実施形態において、各半球の被殻に投与される組成物の体積は、およそ以下の体積（μＬで）：１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、または４５のいずれかより少ない。一部の実施形態において、各半球の被殻に投与される組成物の体積は、およそ以下の体積（μＬで）：４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または９５のいずれかより多い。すなわち、各半球の被殻に投与される組成物の体積は、１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、または４５の上限および４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または９５の独立して選択される下限を有する体積の範囲のいずれかであってもよく、ここで下限は上限より低い。
一部の実施形態において、組成物は、１μＬ／分より速く約５μＬ／分までの速度で線条体に投与される。一部の実施形態において、組成物は、１μＬ／分より速く約５μＬ／分までの速度で尾状核および被殻に投与される。一部の実施形態において、組成物は、約１μＬ／分、２μＬ／分、３μＬ／分、４μＬ／分、５μＬ／分、６μＬ／分、７μＬ／分、８μＬ／分、９μＬ／分、または１０μＬ／分のいずれかより速い速度で線条体（尾状核および／または被殻）に投与される。一部の実施形態において、組成物は、約１μＬ／分～約１０μＬ／分、約１μＬ／分～約９μＬ／分、約１μＬ／分～約８μＬ／分、約１μＬ／分～約７μＬ／分、約１μＬ／分～約６μＬ／分、約１μＬ／分～約５μＬ／分、約１μＬ／分～約４μＬ／分、約１μＬ／分～約３μＬ／分、約１μＬ／分～約２μＬ／分、約２μＬ／分～約１０μＬ／分、約２μＬ／分～約９μＬ／分、約２μＬ／分～約８μＬ／分、約２μＬ／分～約７μＬ／分、約２μＬ／分～約６μＬ／分、約２μＬ／分～約５μＬ／分、約２μＬ／分～約４μＬ／分、約２μＬ／分～約３μＬ／分、約３μＬ／分～約１０μＬ／分、約３μＬ／分～約９μＬ／分、約３μＬ／分～約８μＬ／分、約３μＬ／分～約７μＬ／分、約３μＬ／分～約６μＬ／分、約３μＬ／分～約５μＬ／分、約３μＬ／分～約４μＬ／分、約４μＬ／分～約１０μＬ／分、約４μＬ／分～約９μＬ／分、約４μＬ／分～約８μＬ／分、約４μＬ／分～約７μＬ／分、約４μＬ／分～約
６μＬ／分、約４μＬ／分～約５μＬ／分、約５μＬ／分～約１０μＬ／分、約５μＬ／分～約９μＬ／分、約５μＬ／分～約８μＬ／分、約５μＬ／分～約７μＬ／分、約５μＬ／分～約６μＬ／分、約６μＬ／分～約１０μＬ／分、約６μＬ／分～約９μＬ／分、約６μＬ／分～約８μＬ／分、約６μＬ／分～約７μＬ／分、約７μＬ／分～約１０μＬ／分、約７μＬ／分～約９μＬ／分、約７μＬ／分～約８μＬ／分、約８μＬ／分～約１０μＬ／分、約８μＬ／分～約９μＬ／分、または約９μＬ／分～約１０μＬ／分のいずれかの速度で線条体（尾状核および／または被殻）に投与される。一部の実施形態において、組成物は、送達の間中、漸増的な（すなわち、「段階的な」）流速で投与される。
一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子の投与は、１回実行される。他の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子の投与は、１回より多く実行される。当業者は、例えば処置される障害および／または処置に対する患者の応答に一部基づいて、ｒＡＡＶ粒子の投与を何回実行するかを決定することができる。
一部の実施形態において、本方法は、線条体に組換えウイルス粒子の有効量をＣＮＳ投与することを含み、ｒＡＡＶ粒子は、少なくとも大脳皮質および線条体で発現される異種核酸をコードするｒＡＡＶベクターを含む。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子のウイルス力価は、少なくとも約５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、９×１０１２、１０×１０１２、１１×１０１２、１５×１０１２、２０×１０１２、２５×１０１２、３０×１０１２、または５０×１０１２ゲノムコピー／ｍＬのいずれかである。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子のウイルス力価は、約５×１０１２～６×１０１２、６×１０１２～７×１０１２、７×１０１２～８×１０１２、８×１０１２～９×１０１２、９×１０１２～１０×１０１２、１０×１０１２～１１×１０１２、１１×１０１２～１５×１０１２、１５×１０１２～２０×１０１２、２０×１０１２～２５×１０１２、２５×１０１２～３０×１０１２、３０×１０１２～５０×１０１２、または５０×１０１２～１００×１０１２ゲノムコピー／ｍＬのいずれかである。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子のウイルス力価は、約５×１０１２～１０×１０１２、１０×１０１２～２５×１０１２、または２５×１０１２～５０×１０１２ゲノムコピー／ｍＬのいずれかである。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子のウイルス力価は、少なくとも約５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１０×１０９、１１×１０９、１５×１０９、２０×１０９、２５×１０９、３０×１０９、または５０×１０９形質導入単位／ｍＬのいずれかである。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子のウイルス力価は、約５×１０９～６×１０９、６×１０９～７×１０９、７×１０９～８×１０９、８×１０９～９×１０９、９×１０９～１０×１０９、１０×１０９～１１×１０９、１１×１０９～１５×１０９、１５×１０９～２０×１０９、２０×１０９～２５×１０９、２５×１０９～３０×１０９、３０×１０９～５０×１０９または５０×１０９～１００×１０９形質導入単位／ｍＬのいずれかである。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子のウイルス力価は、約５×１０９～１０×１０９、１０×１０９～１５×１０９、１５×１０９～２５×１０９、または２５×１０９～５０×１０９形質導入単位／ｍＬのいずれかである。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子のウイルス力価は、少なくとも約５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１０×１０１０、１１×１０１０、１５×１０１０、２０×１０１０、２５×１０１０、３０×１０１０、４０×１０１０、または５０×１０１０感染単位／ｍＬのいずれかである。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子のウイルス力価は、少なくとも約５×１０１０～６×１０１０、６×１０１０～７×１０１０、７×１０１０～８×１０１０、８×１０１０～９×１０１０、９×１０１０～１０×１０１０、１０×１０１０～１１×１０１０、１１×１０１０～１５×１０１０、１５×１０１０～２０×１０１０、２０×１０１０～２５×１０１０、２５×１０１０～３０×１０１０、３０×１０１０～４０×１０１０、４０×１０１０～５０×１０１０、または５０×１０１０～１００×１０１０感染単位／ｍＬのいずれかである。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子のウイルス力価は
、少なくとも約５×１０１０～１０×１０１０、１０×１０１０～１５×１０１０、１５×１０１０～２５×１０１０、または２５×１０１０～５０×１０１０感染単位／ｍＬのいずれかである。
一部の実施形態において、本方法は、線条体に組換えウイルス粒子の有効量をＣＮＳ投与することを含み、ｒＡＡＶ粒子は、少なくとも大脳皮質および線条体で発現される異種核酸をコードするｒＡＡＶベクターを含む。一部の実施形態において、個体に投与されるウイルス粒子の用量は、体重１ｋｇ当たり少なくとも約１×１０８～約１×１０１３ゲノムコピーのいずれかである。一部の実施形態において、個体に投与されるウイルス粒子の用量は、体重１ｋｇ当たり約１×１０８～１×１０１３ゲノムコピーである。
一部の実施形態において、本方法は、線条体に組換えウイルス粒子の有効量をＣＮＳ投与することを含み、ｒＡＡＶ粒子は、少なくとも大脳皮質および線条体で発現される異種核酸をコードするｒＡＡＶベクターを含む。一部の実施形態において、個体に投与されるウイルス粒子の総量は、少なくとも約１×１０９～約１×１０１４ゲノムコピーである。一部の実施形態において、個体に投与されるウイルス粒子の総量は、約１×１０９～約１×１０１４ゲノムコピーである。
本発明の組成物（例えば、ｒＡＡＶ粒子）は、単独で、または本明細書に記載の障害のいずれかまたは全てを処置するための１つまたはそれ以上の追加の治療剤と組み合わせてのいずれかで使用することができる。逐次的な投与間の間隔は、少なくとも数分、数時間、または数日（または、代替としてそれ未満）の単位であってもよい。
ＩＶ．発現コンストラクト
一部の態様において、本発明は、線条体にｒＡＡＶ粒子を投与することによって、哺乳動物のＣＮＳにｒＡＡＶ粒子を送達するための方法を提供する。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクターを含む。ｒＡＡＶベクターは、異種核酸（例えば、少なくとも大脳皮質および線条体で発現される異種核酸）をコードしていてもよい。ｒＡＡＶベクターは、下記でより詳細に説明される。
一部の実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、異種核酸をコードする。一部の実施形態において、異種核酸は、治療用ポリペプチドまたは治療用核酸をコードしていてもよい。治療用ポリペプチドまたは治療用核酸は、例えば、症状を緩和する、進行を予防もしくは遅延する、および／または障害（例えば、本明細書に記載の障害）の処置を提供するのに使用することができる。一部の実施形態において、治療用ポリペプチドまたは治療用核酸は、以下でより詳細に説明されるようにＣＮＳの障害を処置するのに使用される。
異種核酸は、ＣＮＳ内の１つまたはそれ以上の関心領域で発現される。例えば、一部の実施形態において、異種核酸は、少なくとも大脳皮質および線条体で発現される。異種核酸は、ＣＮＳ中で遍在的に発現されるか、またはＣＮＳ細胞のサブセットで発現される。
一部の実施形態において、異種核酸は、哺乳動物の前頭皮質、後頭皮質、および／または第ＩＶ層で発現される。大脳皮質は、言語、意識、記憶、注意力、および認識にとって重要な哺乳類の脳の外層として公知である。大脳皮質は、その広範囲な解剖学的および複合的な機能により多数の異なる構成要素および領域にさらに細分される。大脳皮質は、左および右半球に細分することができる。加えて、大脳皮質は、４つ大まかな葉：前頭皮質、頭頂皮質、側頭皮質、および後頭皮質を含有する。前頭皮質は、皮質の前頭葉を指す場合があり、課題に基づかない記憶、社会的相互作用、意思決定、および他の複合的な認知機能に関する多様な神経学的機能を提供することが公知である。後頭皮質は、皮質の後頭葉を指す場合があり、視覚処理に関与することが公知である。頭頂皮質は、皮質の頭頂葉
を指す場合があり、言語処理、自己受容性感覚、および触角に関する感覚入力に関与することが公知である。側頭皮質は、皮質の側頭葉を指す場合があり、言語、記憶、および感情的な連想（ｅｍｏｔｉｏｎａｌ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）に関与することが公知である。
加えて、皮質領域の３つの一般的なタイプ：感覚、運動、および連合が説明されている。これらは、５つの機能的な下位分類：一次運動皮質（筋肉のコントロールに関与する）、前運動皮質（一次運動皮質に指令を出すより高次の運動野）、連合野（例えば、頭頂－側頭－後頭または前頭；これらの領域は、計画、記憶、注意力、および他のより高度な認知的作業に関与し、ヒト皮質の大部分を想定する）、より高次の領域（感覚の処理）、および一次感覚野（例えば、聴覚、視覚、および体性感覚）に細分することができる。一部の実施形態において、異種核酸は、前頭連合野皮質領域、前運動皮質、一次体性感覚皮質領域、感覚運動皮質、頭頂皮質、後頭皮質、および／または一次運動皮質で発現される。
加えて、大脳皮質は、異なる皮層に（表面から深部にかけて）細分することができ、それぞれニューロンの結合性および細胞型の特徴的なパターンを含有する。これらの層は、顆粒上層（第Ｉ～ＩＩＩ層）、内顆粒層（ＩＶ）、および顆粒下層（ＶおよびＶＩ）に細部することができる。顆粒上層は、典型的には他の皮層に投射し、それに対して顆粒下層は、顆粒上層からの入力を受けて、皮質の外側の構造（例えば、運動、感覚、および視床領域）に出力する。第Ｖ層は、基底核のような皮質下の構造に連結されている軸索を含む錐体ニューロンを含有する。一次運動皮質における第Ｖ層ニューロンはまた、自発的な運動のコントロールにとって重要な皮質脊髄路も形成する。第ＩＶ層は、視床からの入力を受け、灰白柱の残部に連結されていることから、視床および皮質の統合に関する重要な機能を提供する。第ＩＶ層の特徴的な細胞としては、星細胞（例えば、有棘星細胞）および錐体ニューロンが挙げられる。
一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、大脳皮質において逆行性または順行性輸送を受ける。逆行性輸送は、カーゴ（例えば、ｒＡＡＶ粒子）が神経突起（例えば、軸索）から細胞体に移動する現象を指す。順行性輸送は、細胞体から細胞膜（例えば、シナプス）への移動を指す。ＡＡＶ粒子の逆行性輸送は、軸索末端における受容体介在の内在化、それに続く核への微小管介在の輸送を介して起こると考えられる（例えば、Ｋａｓｐａｒら、（２００２）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．５：５０～５６；Ｂｏｕｌｉｓら、（２００３）Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ．１４：５３５～５４１；Ｋａｓｐａｒら、（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１：８３９～８４２を参照）。線条体は、皮質の領域などの他の脳の領域からの投射を含有することが公知である。順行性および逆行性輸送の両方が、脳中に、例えば皮質から視床の間にｒＡＡＶ粒子を分散させることを可能にする（例えば、Ｋｅｌｌｓ，Ａ．Ｐ．ら（２００９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０６：２４０７～２４１１を参照）。それゆえに、理論に縛られることは望まないが、１つの脳の領域（例えば、線条体、尾状核、および／または被殻）へのＡＡＶ粒子の注射は、脳の他の領域（例えば、皮質）に逆行性輸送を介してＡＡＶ粒子を送達することを可能にすると考えられる。
一部の実施形態において、異種核酸は、視床、黒質および／または海馬でさらに発現される。上述したように、順行性および／または逆行性輸送などのメカニズムは、大脳皮質および／または線条体に注射されたｒＡＡＶ粒子を、脳の他の領域、特に皮質に接続されている領域に分散させることを可能にする。視床は、皮質と中脳との間であり、皮質下領域から皮質にシグナル（例えば、感覚および運動）を送り、覚醒および睡眠において役割を果たす。また視床は、大脳辺縁系の一部であり長期の記憶固定の重要な媒介部分である海馬にも接続されている。基底核の一部である黒質は、多くのドーパミン作動性ニューロンを含有し、運動および報酬にとって重要である。パーキンソン病のようなＣＮＳ障害は
、黒質におけるドーパミン作動性ニューロンの損失と関連している。黒質は、さらに、適切な線条体機能にとって重要な線条体にドーパミンを供給する。
一部の態様において、本発明は、哺乳動物における１つまたはそれ以上の遺伝子欠陥（例えば、遺伝性の遺伝子欠陥、体細胞遺伝子の変更、および同種のもの）、例えば対象においてポリペプチドの欠乏またはポリペプチドの過剰を引き起こす遺伝子欠陥などを予防または処置する方法で使用するためのｒＡＡＶベクター、または細胞および組織においてこのようなポリペプチドの欠乏に関連するＣＮＳ関連の障害を呈する対象を処置するかまたは欠乏の重症度もしくは程度を低減するためのｒＡＡＶベクターを提供する。一部の実施形態において、方法は、ＣＮＳ関連の障害を有するかまたは有する疑いのある対象においてそのような障害を処置するのに十分な量および期間で、医薬的に許容される担体中の、１つまたはそれ以上の治療用ペプチド、ポリペプチド、機能的なＲＮＡ、阻害性核酸、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスヌクレオチドなどをコードするｒＡＡＶベクターを対象に投与することを含む。
ｒＡＡＶベクターは、導入遺伝子として、ＣＮＳ関連の障害をモジュレートまたは処置するタンパク質または機能的なＲＮＡをコードする核酸を含んでいてもよい。以下は、ＣＮＳ関連の障害に関連する遺伝子の非限定的な列挙である：ニューロンアポトーシス阻害性タンパク質（ＮＡＩＰ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、グリア細胞由来増殖因子（ＧＤＮＦ）、脳由来の増殖因子（ＢＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＭ、ＧＴＰ－シクロヒドロラーゼ（ＧＴＰＣＨ）、アスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）およびアミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）。例えば、パーキンソン病の処置において有用な導入遺伝子は、ドーパミンの合成において律速の酵素であるＴＨをコードする。ＴＩＩ補因子のテトラヒドロビオプテリンを生成するＧＴＰＣＩＩをコードする導入遺伝子も、パーキンソン病の処置に使用することができる。Ｌ－ドーパからＤＡの変換を容易にするＧＤＮＦもしくはＢＤＮＦ、またはＡＡＤＣをコードする導入遺伝子も、パーキンソン病の処置に使用することができる。ＡＬＳの処置の場合、有用な導入遺伝子は、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦまたはＣＮＴＦをコードしていてもよい。同様にＡＬＳの処置の場合、有用な導入遺伝子は、ＳＯＤ１の発現を阻害する機能的なＲＮＡ、例えば、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡをコードしていてもよい。虚血の処置の場合、有用な導入遺伝子は、ＮＡＩＰまたはＮＧＦをコードしていてもよい。特定のリソソーム蓄積症（例えば、ムコ多糖症ＶＩＩ型（ＭＰＳ ＶＩＩ））の処置の場合、ベータ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードする導入遺伝子が有用であり得る。特定のがんを処置するために、例えばプロドラッグと組み合わせて投与される場合、プロドラッグ活性化遺伝子、例えば、ガンシクロビルを、ＤＮＡ合成を崩壊させて細胞死を引き起こす毒性ヌクレオチドに変換するＨＳＶ－チミジンキナーゼをコードする導入遺伝子が有用であり得る。痛みを処置するために、β－エンドルフィンなどの内因性オピオイドをコードする導入遺伝子が有用であり得る。本発明のｒＡＡＶベクターで使用することができる導入遺伝子の他の例は、当業者に明らかであると予想される（例えば、Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｉ ＬＣら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２０００）７、９３～１０９を参照）。
一部の実施形態において、異種核酸は、治療用核酸をコードしていてもよい。一部の実施形態において、治療用核酸としては、これらに限定されないが、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムまたはＤＮＡザイムを挙げることができる。そのようなものとして、治療用核酸は、ベクターの核酸から転写されたときに、本発明の障害に関連する異常なまたは過剰なタンパク質の翻訳または転写を妨害することによって本発明の障害 （例えば、ＣＮＳの障害）を処置することができるＲＮＡをコードしていてもよい。例えば、本発明の核酸は、異常なおよび／または過剰なタンパク質をコードするｍＲＮＡの高度に特異的な消去または低減によって障害を処置するＲ
ＮＡをコードしていてもよい。治療用ＲＮＡ配列は、異常なおよび／または過剰なタンパク質をコードするｍＲＮＡの高度に特異的な消去または低減によって障害を処置することができる、ＲＮＡｉ、低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、および／またはリボザイム（例えばハンマーヘッドおよびヘアピン型のリボザイム）を包含する。
一部の実施形態において、異種核酸は、治療用ポリペプチドをコードしていてもよい。治療用ポリペプチドは、例えば、細胞または生物において存在しないかまたは低下したレベルで存在するポリペプチドおよび／または酵素活性を供給することができる。代替として、治療用ポリペプチドは、細胞または生物において不均衡を間接的に中和するポリペプチドおよび／または酵素活性を供給することができる。例えば、代謝酵素または活性の欠乏によって引き起こされる代謝産物蓄積に関する障害のための治療用ポリペプチドは、失われた代謝酵素または活性を供給してもよいし、または代謝産物の低減を引き起こす代替の代謝酵素または活性を供給してもよい。治療用ポリペプチドはまた、ポリペプチド（例えば、過剰発現される、機能獲得型変異によって活性化される、またはその活性が別の方法で誤って制御されるポリペプチド）の活性を、例えば優性ネガティブポリペプチドとして作用することによって低減するのに使用することができる。
一部の実施形態において、治療用ポリペプチドまたは治療用核酸は、ＣＮＳの障害を処置するのに使用される。理論に縛られることは望まないが、治療用ポリペプチドまたは治療用核酸は、その機能獲得が障害に関連するポリペプチドの発現および／または活性を低減または消去したり、または障害に関連する欠失（例えば、その発現が類似または関連する活性を示す遺伝子における突然変異）を補足するためにポリペプチドの発現および／または活性を強化したりするのに使用できると考えられる。本発明の治療用ポリペプチドまたは治療用核酸によって処置可能な本発明のＣＮＳ障害の非限定的な例（標的化または供給される可能性がある例示的な遺伝子は、各障害につきかっこ内に示される）としては、卒中（例えば、カスパーゼ－３、ベクリン１、Ａｓｋ１、ＰＡＲ１、ＨＩＦ１α、ＰＵＭＡ、および／またはＦｕｋｕｄａ，Ａ．Ｍ．およびＢａｄａｕｔ，Ｊ．（２０１３）Ｇｅｎｅｓ（Ｂａｓｅｌ）４：４３５～４５６に記載の遺伝子のいずれか）、ハンチントン病（突然変異ＨＴＴ）、てんかん（例えば、ＳＣＮ１Ａ、ＮＭＤＡＲ、ＡＤＫ、および／またはＢｏｉｓｏｎ，Ｄ．（２０１０）Ｅｐｉｌｅｐｓｉａ ５１：１６５９～１６６８に記載の遺伝子のいずれか）、パーキンソン病（アルファ－シヌクレイン）、ルー・ゲーリッグ病（筋萎縮性側索硬化症としても公知；ＳＯＤ１）、アルツハイマー病（タウ、アミロイド前駆タンパク質）、大脳皮質基底核変性症またはＣＢＤ（タウ）、大脳皮質基底核神経節変性症またはＣＢＧＤ（タウ）、前頭側頭認知症またはＦＴＤ（タウ）、進行性核上麻痺またはＰＳＰ（タウ）、多系統萎縮症またはＭＳＡ（アルファ－シヌクレイン）、脳のがん（例えば、脳がんに関与する突然変異または過剰発現した腫瘍遺伝子）、およびリソソーム蓄積症（ＬＳＤ）が挙げられる。本発明の障害としては、皮質の大部分、例えば、皮質の１つより多くの機能的な領域、皮質の１つより多くの葉、および／または皮質全体に関与する障害を挙げることができる。本発明の治療用ポリペプチドまたは治療用核酸によって処置可能な本発明の障害の他の非限定的な例としては、外傷性脳損傷、酵素の機能不全に関する障害、精神障害（心的外傷後ストレス症候群など）、神経変性疾患、および認識障害（認知症、自閉症、およびうつ病など）が挙げられる。酵素の機能不全に関する障害としては、これらに限定されないが、白質萎縮症（カナバン病など）および後述するリソソーム蓄積症のいずれかが挙げられる。
一部の実施形態において、治療用ポリペプチドまたは治療用核酸は、リソソーム蓄積症を処置するのに使用される。一般的に当業界で公知のように、リソソーム蓄積症は、リソソーム機能の欠陥を特徴とするまれな遺伝性代謝性疾患である。このような障害は、リソソームに貯蔵された細胞性物質の病的な蓄積を引き起こす、適切なムコ多糖類、糖タンパ
ク質、および／または脂質代謝に必要な酵素の欠乏によって引き起こされることが多い。本発明の治療用ポリペプチドまたは治療用核酸によって処置可能な本発明のリソソーム蓄積症の非限定的な例（標的化または供給される可能性がある例示的な遺伝子は、各障害につきかっこ内に示される）としては、ゴーシェ病２型または３型（酸性ベータ－グルコシダーゼ、ＧＢＡ）、ＧＭ１ガングリオシド症（ベータ－ガラクトシダーゼ－１、ＧＬＢ１）、ハンター病（イズロン酸２－スルファターゼ、ＩＤＳ）、クラッベ病（ガラクトシルセラミダーゼ、ＧＡＬＣ）、マンノシドーシス病（マンノシダーゼ、例えばアルファ－Ｄ－マンノシダーゼ、ＭＡＮ２Ｂ１）、βマンノシドーシス病（ベータ－マンノシダーゼ、ＭＡＮＢＡ）、異染性白質ジストロフィー病（プソイドアリールスルファターゼＡ、ＡＲＳＡ）、ムコリピドーシスＩＩ／ＩＩＩ疾患（Ｎ－アセチルグルコサミン－１－ホスホトランスフェラーゼ、ＧＮＰＴＡＢ）、ニーマン－ピック病Ａ型（酸性スフィンゴミエリナーゼ、ＡＳＭ）、ニーマン－ピック病Ｃ型（ニーマン－ピックＣ型タンパク質、ＮＰＣ１）、ポンペ病（酸性アルファ－１，４－グルコシダーゼ、ＧＡＡ）、サンドホフ病（ヘキソサミニダーゼベータサブユニット、ＨＥＸＢ）、サンフィリッポ病Ａ型（Ｎ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ、ＭＰＳ３Ａ）、サンフィリッポ病Ｂ型（Ｎ－アルファ－アセチルグルコサミニダーゼ、ＮＡＧＬＵ）、サンフィリッポ病Ｃ型（ヘパリンアセチル－ＣｏＡ：アルファ－グルコサミニダーゼＮ－アセチルトランスフェラーゼ、ＭＰＳ３Ｃ）、サンフィリッポ病Ｄ型（Ｎ－アセチルグルコサミン－６－スルファターゼ、ＧＮＳ）、シンドラー病（アルファ－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼ、ＮＡＧＡ）、スライ病（ベータ－グルクロニダーゼ、ＧＵＳＢ）、テイ－サックス病（ヘキソサミニダーゼアルファサブユニット、ＨＥＸＡ）、およびウォールマン病（リソソーム酸性リパーゼ、ＬＩＰＡ）が挙げられる。
以下の表１に、追加のリソソーム蓄積症、加えて各疾患に関連する欠陥酵素を列挙する。一部の実施形態において、以下の表に列挙した疾患は、対応する酵素の欠陥を補完するかまたはそれ以外の方法で補う本発明の治療用ポリペプチドまたは治療用核酸によって処置される。
Figure 2023058630000001
Figure 2023058630000002
そのようなものとして、一部の実施形態において、治療用ポリペプチドは、カスパーゼ－３、ベクリン１、Ａｓｋ１、ＰＡＲ１、ＨＩＦ１α、ＰＵＭＡ，ＳＣＮ１Ａ、ＮＭＤＡＲ、ＡＤＫ、アルファ－シヌクレイン、ＳＯＤ１、酸性ベータ－グルコシダーゼ（ＧＢＡ）、ベータ－ガラクトシダーゼ－１（ＧＬＢ１）、イズロン酸２－スルファターゼ（ＩＤＳ）、ガラクトシルセラミダーゼ（ＧＡＬＣ）、マンノシダーゼ、アルファ－Ｄ－マンノシダーゼ（ＭＡＮ２Ｂ１）、ベータ－マンノシダーゼ（ＭＡＮＢＡ）、プソイドアリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）、Ｎ－アセチルグルコサミン－１－ホスホトランスフェラーゼ（ＧＮＰＴＡＢ）、酸性スフィンゴミエリナーゼ（ＡＳＭ）、ニーマン－ピックＣ型タンパク質（ＮＰＣ１）、酸性アルファ－１，４－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）、ヘキソサミニダーゼベータサブユニット、ＨＥＸＢ、Ｎ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＭＰＳ３Ａ）、Ｎ－アルファ－アセチルグルコサミニダーゼ（ＮＡＧＬＵ）、ヘパリンアセチル－ＣｏＡ、アルファ－グルコサミニダーゼＮ－アセチルトランスフェラーゼ（ＭＰＳ３Ｃ）、Ｎ－アセチルグルコサミン－６－スルファターゼ（ＧＮＳ）、アルファ－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼ（ＮＡＧＡ）、ベータ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）、ヘキソサミニダーゼアルファサブユニット（ＨＥＸＡ）、ハンチンチン（ＨＴＴ）、またはリソソーム酸性リパーゼ（ＬＩＰＡ）である。治療用ポリペプチドは、対象における標的ポリペプチドの機能を増加または減少させることができる（例えば、治療用ポリペプチドは、例えばその機能または機能障害をブロックすることによって、リソソーム蓄積症において失われた機能を供給することができ、またはＭＳＡにおいてアルファ－シヌクレインのレベルを低減することができる）。一部の実施形態において、治療用核酸は、カスパーゼ－３、ベクリン１、Ａｓｋ１、ＰＡＲ１、ＨＩＦ１α、ＰＵＭＡ，ＳＣＮ１Ａ、ＮＭＤＡＲ、ＡＤＫ、アルファ－シヌクレイン、ＳＯＤ１、酸性ベータ－グルコシダーゼ（ＧＢＡ）、ベータ－ガラクトシダーゼ－１（ＧＬＢ１）、イズロン酸２－スルファターゼ（ＩＤＳ）、ガラクトシルセラミダーゼ（ＧＡＬＣ）、マンノシダーゼ、アルファ－Ｄ－マンノシダーゼ（ＭＡＮ２Ｂ１）、ベータ－マンノシダーゼ（ＭＡＮＢＡ）、プソイドアリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）、Ｎ－アセチルグルコサミン－１－ホスホトランスフェラーゼ（ＧＮＰＴＡＢ）、酸性スフィンゴミエリナーゼ（ＡＳＭ）、ニーマン－ピックＣ型タンパク質（ＮＰＣ１）、酸性アルファ－１，４－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）、ヘキソサミニダーゼベータサブユニット、ＨＥＸＢ、Ｎ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＭＰＳ３Ａ）、Ｎ－アルファ－アセチルグルコサミニダーゼ（ＮＡＧＬＵ）、ヘパリンアセチル－ＣｏＡ、アルファ－グルコサミニダーゼＮ－アセチルトランスフェラーゼ（ＭＰＳ３Ｃ）、Ｎ－アセチルグルコサミン－６－スルファターゼ（ＧＮＳ）、アルファ－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼ（ＮＡＧＡ）、ベータ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）、ヘキソサミニダーゼアルファサブユニット（ＨＥＸＡ）、またはリソソーム酸性
リパーゼ（ＬＩＰＡ）である。治療用核酸は、対象における標的ポリペプチドの機能を増加または減少させることができる（例えば、治療用核酸は、例えばＲＮＡｉによって、リソソーム蓄積症において失われた機能を供給することができ、またはＭＳＡにおいてアルファ－シヌクレインのレベルを低減することができる）。
皮質および線条体におけるＡＡＶ発現が有用であり得る例示的な疾患は、ハンチントン病（ＨＤ）である。ハンチントン病は、突然変異ハンチンチンタンパク質（ｍＨＴＴ）において伸長したポリグルタミン（ポリＱ）リピートをコードするＣＡＧリピート拡大の突然変異によって引き起こされる。ＨＤは、単一の対立遺伝子における突然変異の結果生じる常染色体優性疾患であることから、ＤＮＡおよびＲＮＡベースの療法にとって特に魅力的な標的である。ＡＡＶベクターは、核酸治療物質のための理想的な送達系を提供し、脳においてこれらのハンチンチンを低減する分子の長期間持続し連続的な発現を可能にする。ＨＤにおいて最大の臨床効果を達成するために、線条体および皮質の両方への送達が必要になる可能性があると予想される。ＨＤ患者の脳の事後分析から、大脳皮質および海馬における錐体ニューロンの損失に加えて線条体における広範囲な中型有棘ニューロンの損失が解明された。近年、線条体および皮質におけるニューロン集団のｍＨＴＴ発現を遺伝学的に低減する条件付きのＨＤトランスジェニックマウスモデルを使用することが、いずれかの部位単独でｍＨＴＴを低減することより有意に高い効能をもたらすことが示された（Ｗａｎｇら、（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０：５３６～５４１）。まとめると、この証拠から、線条体および皮質領域の両方への遺伝子治療剤の送達は、最大の治療効能にとって理想的であり得ることが示唆される。
ハンチントン病の病因に関与する重要な脳領域に生物製剤を送達するための遺伝子治療用ベクターの使用は、大部分は効果的にベクターを線条体および大脳皮質へ特異的に送達することの物理的な制約のために、課題であり続けている。小動物の脳では複数回の直接的な輸注が有効であり得るが、霊長類では脳組織の構成および体積が増加するため、単一部位の輸注を介して広範にわたる線条体および皮質への送達を達成することはより難しくなる。それゆえに、線条体への投与は、皮質および線条体を包含する広範にわたるｒＡＡＶ分布を達成することができるという本発明者らの発見は、ハンチントン病の処置において有用性を有する。
したがって、本発明のある特定の態様は、哺乳動物におけるハンチントン病を処置するための方法であって、線条体にｒＡＡＶ粒子を投与することを含み、ｒＡＡＶ粒子は、哺乳動物の少なくとも大脳皮質および線条体で発現される異種核酸をコードするｒＡＡＶベクターを含む、方法に関する。ＨＤは、全体的な運動および運動のコントロール、認知、ならびに精神的健康に関する進行性の症状を特徴とする。症状の正確な性質および程度は個体間で様々であるが、一般的に症状は時間をかけて進行する。ほとんどの場合、症状は、３０歳から４０歳の間に、運動技能、認知、および人格の潜行性の崩壊を伴って出現し始める。時間が経つにつれて、これらは、ぎくしゃくしたコントロール不可能な動きおよび筋肉のコントロールの損失、認知症、ならびにうつ病などの精神医学的な疾患、攻撃性、不安、ならびに強迫行動に進む。典型的には、症状発病から１０～１５年後に死に至る。ＨＤのケースの１０％未満は、より速い疾患の進行を特徴とする疾患の若年発症型を含む。米国人１０，０００人中およそ１人が、ＨＤを有すると考えられる。
ＨＤのほとんどのケースは、ＨＴＴ遺伝子におけるトリヌクレオチドＣＡＧリピートの拡大に関連している。ＨＴＴ遺伝子におけるＣＡＧリピートの数は、ＨＤの症状発現と強く相関する。例えば、３５個またはそれ未満のリピートを有する個体は、典型的にはＨＤを発症しないが、２７～３５個のリピートを有する個体は、子孫がＨＤを有するより高いリスクを有する。３６から４０～４２個のリピートを有する個体は、ＨＤの不完全浸透を示し、それに対して４０～４２個より多くのリピートを有する個体は、完全浸透を示す。
若年発症ＨＤのケースは、６０またはそれより多くのＣＡＧリピートのサイズに関連する可能性がある。
このＣＡＧリピートの拡大の結果生じるポリＱが拡大したＨｔｔタンパク質は、細胞の凝集体または封入体、タンパク質ホメオスタシスにおける不安定さ、および転写調節異常と関連する。これらの毒性の表現型は体の数々の部分と関連し得るが、最も典型的には、これらはニューロン性細胞の死と関連する。ＨＤ患者は、皮質が薄くなること、および線条体ニューロンの著しい進行性消失を示すことが多い。線条体は、脳中のＨＤに対して最も弱い領域（特に線条体の中型有棘ニューロン）と考えられており、初期の作用は被殻および尾状核で見られる。ＨＤ患者の脳では、線条体の有棘ニューロンにおける細胞死、星状細胞数の増加、および小グリア細胞の活性化が観察されている。またＨＤは、海馬、大脳皮質、視床、視床下部、および小脳の特定の領域に影響を与える可能性もある。
考えられる治療戦略、例えば本発明の開示の組成物および方法を試験するために、ＨＤの動物モデルを使用することができる。ＨＤのマウスモデルが当業界において公知である。そのようなものとしては、突然変異ＨＴＴのフラグメントを有するマウスモデル、例えばＲ６／１およびＮ１７１－８２Ｑ ＨＤマウスが挙げられる（Ｈａｒｐｅｒら、（２００５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０２：５８２０～５８２５、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ－Ｌｅｂｒｏｎら、（２００５）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１２：６１８～６３３、Ｍａｃｈｉｄａら、（２００６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３４３：１９０～１９７）。本明細書に記載のマウスＨＤモデルの別の例は、ＹＡＣ１２８マウスモデルである。このモデルは、１２８個のＣＡＧリピートを有する突然変異ヒトＨＴＴ遺伝子を発現する酵母人工染色体（ＹＡＣ）を有し、ＹＡＣ１２８マウスは、１２月齢までに線条体において顕著な広範にわたるＨｔｔ凝集体の蓄積を示す（Ｓｌｏｗら、（２００３）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１２：１５５５～１５６７、Ｐｏｕｌａｄｉら、（２０１２）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２１：２２１９～２２３２）。
ＨＤの他の動物モデルも使用することができる。例えば、トランスジェニックラット（ｖｏｎ Ｈｏｒｓｔｅｎ，Ｓ．ら（２００３）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１２：６１７～２４）およびアカゲザル（Ｙａｎｇ，Ｓ．Ｈ．ら（２００８）Ｎａｔｕｒｅ ４５３：９２１～４）モデルが説明されている。非遺伝的モデルも公知である。これらは、ほとんどの場合、げっ歯類または非ヒト霊長類において線条体ニューロンの細胞死を誘導するための、興奮毒性の化合物（例えばキノリン酸またはカイニン酸）またはミトコンドリアの毒素（例えば３－ニトロプロピオン酸およびマロン酸）の使用を含む（さらなる説明および参考文献については、Ｒａｍａｓｗａｍｙ，Ｓ．ら（２００７）ＩＬＡＲ Ｊ．４８：３５６～７３を参照）。
一部の態様において、本発明は、ＨＤの症状を緩和するための方法であって、少なくとも大脳皮質および線条体で発現される異種核酸をコードするｒＡＡＶベクターを含むｒＡＡＶ粒子を線条体に投与することを含む、方法を提供する。一部の実施形態において、ＨＤの症状としては、これらに限定されないが、舞踏病、硬直、コントロール不可能な体の動き、筋肉コントロールの損失、協調運動障害、情動不安、眼球運動の遅延、異常な身振り、不安定さ、失調歩行、異常な顔の表情、言語障害、咀嚼および／または嚥下の困難さ、睡眠障害、発作、認知症、認知障害（例えば、計画、抽象的思考、柔軟性、ルール獲得、対人感受性、自己コントロール、注意力、学習、および記憶に関する能力の減退）、うつ病、不安、人格の変化、攻撃性、強制行動、強迫行動、性欲過剰、精神病、無感動、興奮性、自殺念慮、体重の減少、筋萎縮、心不全、グルコース耐性の低下、精巣萎縮、および骨粗鬆症が挙げられる。
一部の態様において、本発明は、ＨＤの進行を予防するかまたは遅延させる方法を提供する。常染色体優性のＨＤは、遺伝子型解析することが可能な遺伝病である。例えば、ＨＴＴ中のＣＡＧリピートの数は、ＰＣＲベースのリピートのサイジングによって決定することができる。このタイプの診断は、人生のあらゆる段階で、若い個体または成体を直接試験すること（例えば、臨床症状の出現に合わせて）、出生前スクリーニングまたは出生前除外の検査（例えば、絨毛膜絨毛のサンプリングまたは羊水穿刺によって）、または胎芽の着床前スクリーニングを介して実行することができる。加えて、ＨＤは、脳を撮像して、尾状核および／もしくは被殻の縮小ならびに／または空洞の拡大を探すことによって診断することができる。これらの症状は、ＨＤの家族歴および／または臨床症状と組み合わせて、ＨＤを示す可能性がある。
ＨＤの症状の緩和を決定するための手段は、当業界において公知である。例えば、ハンチントン病統一評価尺度（Ｕｎｉｆｉｅｄ Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ
Ｒａｔｉｎｇ Ｓｃａｌｅ；ＵＨＤＲＳ）を使用して、運動機能、認知機能、行動異常、および機能的能力を評価することができる（例えば、Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ （１９９６） Ｍｏｖｅｍｅｎｔ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ １１：１３６～４２を参照）。この評価尺度は、ＨＤ日常生活動作尺度（ＨＤ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ
ａｎｄ Ｄａｉｌｙ Ｌｉｖｉｎｇ Ｓｃａｌｅ）、マースデンおよびクインの舞踏病重症度尺度（Ｍａｒｓｄｅｎ ａｎｄ Ｑｕｉｎｎ’ｓ ｃｈｏｒｅａ ｓｅｖｅｒｉｔｙ ｓｃａｌｅ）、身体障害および自立性の尺度（Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｄｉｓａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｓｃａｌｅ）、ＨＤ運動性評価尺度（ＨＤ ｍｏｔｏｒ ｒａｔｉｎｇ ｓｃａｌｅ；ＨＤＭＲＳ）、ＨＤ機能的能力尺度（ＨＤ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃａｐａｃｉｔｙ ｓｃａｌｅ；ＨＤＦＣＳ）、および定量的神経学的検査（ｑｕａｎｔｉｔａｔｅｄ ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｘａｍ；ＱＮＥ）などの試験からの要素を取り入れた、疾患の病理の様々な側面に関する一律の包括的試験を提供するために開発された。ＨＤの症状の緩和を決定するのに有用な他の試験としては、これらに限定されないが、モントリオール認知評価検査（Ｍｏｎｔｒｅａｌ Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）、脳の撮像（例えば、ＭＲＩ）、カテゴリー流暢性検査（Ｃａｔｅｇｏｒｙ Ｆｌｕｅｎｃｙ Ｔｅｓｔ）、トレイルメイキングテスト、マップサーチ、ストループの文字読み取り検査（Ｓｔｒｏｏｐ Ｗｏｒｄ Ｒｅａｄｉｎｇ Ｔｅｓｔ）、加速タッピング課題（Ｓｐｅｅｄｅｄ Ｔａｐｐｉｎｇ Ｔａｓｋ）、および符号数字モダリティー検査（Ｓｙｍｂｏｌ Ｄｉｇｉｔ Ｍｏｄａｌｉｔｉｅｓ Ｔｅｓｔ）を挙げることができる。
本発明の一部の態様において、本方法は、ＨＤを有するヒトを処置するために使用される。上述したように、ＨＤは、常染色体優性の方式で遺伝し、ＨＴＴ遺伝子におけるＣＡＧリピートの拡大によって引き起こされる。ｒＡＡＶ粒子は、例えばＨＴＴを標的化する治療用ポリペプチドまたは核酸をコードする異種核酸を包含していてもよい。若年発症ＨＤは、ほとんどの場合、父方から遺伝する。ハンチントン病様の表現型はまた、他の遺伝子座、例えばＨＤＬ１、ＰＲＮＰ、ＨＤＬ２、ＨＤＬ３、およびＨＤＬ４との相関も示されてきた。ＧＲＩＮ２Ａ、ＧＲＩＮ２Ｂ、ＭＳＸ１、ＧＲＩＫ２、およびＡＰＯＥ遺伝子における突然変異など、他の遺伝子座がＨＤの症状の発現を改変する可能性があると考えられる。
一部の実施形態において、組換えウイルス粒子の送達は、線条体へのウイルス粒子の注射によってなされる。線条体内投与は、高度にＨＤの影響を受けている脳、線条体（被殻および尾状核を包含する）の領域に、組換えウイルス粒子を送達することである。それに加えて、理論に縛られることは望まないが、線条体に注射された組換えウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）は、これらに限定されないが、投射野（例えば、大脳皮質）などの脳の他の領域に（例えば、逆行性輸送を介して）分散させることもできると考えられる。
一部の実施形態において、組換えウイルス粒子は、対流強化送達（例えば、線条体への対流強化送達）によって送達される。
一部の実施形態において、導入遺伝子（例えば、本明細書に記載の異種核酸）は、プロモーターに機能するように連結されている。例示的なプロモーターとしては、これらに限定されないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、ＧＵＳＢプロモーター、ＲＳＶ ＬＴＲ、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ、ホスホグリセリン酸キナーゼ－１（ＰＧＫ）プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターおよびＣＫ６プロモーター、トランスチレチンプロモーター（ＴＴＲ）、ＴＫプロモーター、テトラサイクリン応答プロモーター（ＴＲＥ）、ＨＢＶプロモーター、ｈＡＡＴプロモーター、ＬＳＰプロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、Ｅ２Ｆプロモーター、テロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）プロモーター；サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリベータ－アクチン／ウサギβ－グロビンプロモーター（ＣＡＧプロモーター；Ｎｉｗａら、Ｇｅｎｅ、１９９１、１０８（２）：１９３～９）、ならびに延長因子１－アルファプロモーター（ＥＦ１－アルファ）プロモーター（Ｋｉｍら、Ｇｅｎｅ、１９９０、９１（２）：２１７～２３およびＧｕｏら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１９９６、３（９）：８０２～１０）が挙げられる。一部の実施形態において、プロモーターは、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーターに連結されたヒトβ－グルクロニダーゼプロモーターまたはサイトメガロウイルスエンハンサーを含む。プロモーターは、構成的、誘導性または抑制性プロモーターであってもよい。一部の実施形態において、本発明は、ＣＢＡプロモーターに機能するように連結した、本発明の開示の異種核酸をコードする核酸を含む組換えベクターを提供する。一部の実施形態において、プロモーターは、ＣＢＡプロモーター、最小のＣＢＡプロモーター、ＣＭＶプロモーターまたはＧＵＳＢプロモーターである。
構成的プロモーターの例としては、これらに限定されないが、レトロウイルス性のラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（場合によりＲＳＶエンハンサーを有する）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（場合によりＣＭＶエンハンサーを有する）［例えば、Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ、４１：５２１～５３０（１９８５）を参照］、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、１３－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、およびＥＦｌａプロモーター［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］が挙げられる。
誘導性プロモーターは、遺伝子発現の制御を可能にし、外因的に供給された化合物、温度などの環境要因、または具体的な生理学的条件の存在、例えば細胞の急性期、特定の分化状態によって制御される場合もあるし、または細胞の複製においてのみ制御される場合もある。誘導性プロモーターおよび誘導性の系は、これらに限定されないが、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣｌｏｎｔｅｃｈおよびＡｒｉａｄなどの様々な商業的な供給源から入手可能である。他の多くの系が説明されており、当業者により容易に選択することができる。外因的に供給されたプロモーターによって制御される誘導性プロモーターの例としては、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオネイン（ＭＴ）プロモーター、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）誘導性マウス乳がんウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系（ＷＯ９８／１００８８）；エクジソン昆虫プロモーター（Ｎｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３：３３４６～３３５１（１９９６））、テトラサイクリン抑制系（Ｇｏｓｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：５５４７～５５５１（１９９２））、テトラサイクリン誘導性の系（Ｇｏｓｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６８：１７６６～１７６９（１９９５）が挙げられる。Ｈａｒｖｅｙら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、２：５１２～５１８（１９９８））、ＲＵ４８６誘導性の系（Ｗａｎｇら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１５：２３９～２４３（１９９７）ならびにＷａｎｇら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、４：４３２～４４１（１９９７））およびラパマイシン誘導性の系（Ｍａｇａｒｉら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、
１００：２８６５～２８７２（１９９７））も参照されたい。この状況において有用な可能性があるよりさらに他のタイプの誘導性プロモーターは、具体的な生理学的状態、例えば温度、急性期、細胞の特定の分化状態によって制御されるか、または細胞の複製においてのみ制御されるものである。
別の実施形態において、導入遺伝子にとってネイティブのプロモーター、またはそれらのフラグメントが使用されると予想される。導入遺伝子の発現がネイティブの発現を模擬することが望ましい場合、ネイティブのプロモーターが好ましい可能性がある。導入遺伝子の発現が、一時的もしくは発生的に、または組織特異的な方式で、または特異的な転写刺激に応答して制御されなければならない場合、ネイティブのプロモーターが使用される可能性がある。さらなる実施形態において、他のネイティブの発現コントロールエレメント、例えばエンハンサーエレメント、ポリアデニル化部位またはコザックコンセンサス配列も、ネイティブの発現を模擬するのに使用することができる。
一部の実施形態において、制御配列は、組織特異的な遺伝子発現能をもたらす。一部のケースにおいて、組織特異的な制御配列は、組織特異的な方式で転写を誘導する組織特異的な転写因子に結合する。このような組織特異的な制御配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）は当業界において周知である。例示的な組織特異的な制御配列としては、これらに限定されないが、以下の組織特異的なプロモーター：ニューロンの、例えばニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター（Ａｎｄｅｒｓｅｎら、Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．、１３：５０３～１５（１９９３））、ニューロフィラメント軽鎖遺伝子プロモーター（Ｐｉｃｃｉｏｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：５６１１～５（１９９１））、およびニューロン特異的なｖｇｆ遺伝子プロモーター（Ｐｉｃｃｉｏｌｉら、Ｎｅｕｒｏｎ、１５：３７３～８４（１９９５））が挙げられる。一部の実施形態において、組織特異的なプロモーターは、ニューロン核（ＮｅｕＮ）、グリア細胞繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、腺腫性結腸ポリポーシス（ＡＰＣ）、およびイオン化カルシウム結合アダプター分子１（Ｉｂａ－１）から選択される遺伝子のプロモーターである。他の適切な組織特異的なプロモーターは、当業者に明らかであると予想される。一部の実施形態において、プロモーターは、ニワトリベータ－アクチンプロモーターである。
一部の実施形態において、プロモーターは、ＣＮＳの細胞中で異種核酸を発現する。そのようなものとして、一部の実施形態において、本発明の治療用ポリペプチドまたは治療用核酸は、ＣＮＳの障害を処置するのに使用することができる。一部の実施形態において、プロモーターは、脳の細胞において異種核酸を発現する。脳の細胞は、これらに限定されないが、ニューロン（例えば感覚ニューロン、運動ニューロン、介在ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、中型有棘ニューロン、コリン作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、錐体ニューロンなど）、グリア細胞（例えば小グリア細胞、大グリア細胞、星状細胞、希突起膠細胞、上衣細胞、放射状グリアなど）、脳実質細胞、小グリア細胞、上衣細胞、および／またはプルキンエ細胞などの当業界において公知のあらゆる脳の細胞を指すことができる。一部の実施形態において、プロモーターは、ニューロンおよび／またはグリア細胞において異種核酸を発現する。一部の実施形態において、ニューロンは、尾状核の中型有棘ニューロン、被殻の中型有棘ニューロン、皮質第ＩＶ層のニューロンおよび／または皮質第Ｖ層のニューロンである。
ＣＮＳ細胞、脳の細胞、ニューロン、およびグリア細胞において転写物（例えば、異種導入遺伝子）を発現する様々なプロモーターは当業界において公知であり、本明細書で記載される。このようなプロモーターは、通常、選択された遺伝子または異種制御配列と連結された制御配列を含んでいてもよい。多くの場合、有用な異種制御配列としては、哺乳類またはウイルス遺伝子をコードする配列から誘導された配列が挙げられる。例としては
、これらに限定されないが、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳がんウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ）、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えばＣＭＶ前初期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、合成プロモーター、ハイブリッドプロモーターなどが挙げられる。加えて、マウスメタロチオネイン遺伝子などの非ウイルス遺伝子から誘導された配列も使用することができる。このようなプロモーター配列は、例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から市販されている。ＣＮＳ特異的なプロモーターおよび誘導性プロモーターを使用してもよい。ＣＮＳ特異的なプロモーターの例としては、これらに限定されないが、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、およびニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）などのＣＮＳ特異的な遺伝子から単離したプロモーターが挙げられる。誘導性プロモーターの例としては、とりわけエクジソン、テトラサイクリン、メタロチオネイン、および低酸素に関するＤＮＡ応答エレメントが挙げられる。
本発明は、異種核酸をコードする１つまたはそれ以上の核酸配列を導入するため、またはＡＡＶウイルス粒子にパッケージ化するための組換えウイルスゲノムの使用を予期する。組換えウイルスゲノムは、異種導入遺伝子の発現を確立するためのあらゆるエレメント、例えば、プロモーター、異種核酸、ＩＴＲ、リボソーム結合エレメント、ターミネーター、エンハンサー、選択マーカー、イントロン、ポリＡシグナル、および／または複製起点を包含し得る。一部の実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、エンハンサー、スプライスドナー／スプライスアクセプター対、マトリックスアタッチメント部位、またはポリアデニル化シグナルの１つまたはそれ以上を含む。
一部の実施形態において、治療用核酸またはポリペプチドをコードするベクターを含むｒＡＡＶ粒子の有効量を投与することにより、投与部位（例えば、線条体および／または皮質）かもしくはその近くで、または投与部位からより遠位で細胞（例えば、ＣＮＳ細胞、脳の細胞、ニューロン、および／またはグリア細胞）が形質導入される。一部の実施形態において、ニューロンの約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％または１００％のいずれかより多くが形質導入される。一部の実施形態において、ニューロンの約５％～約１００％、約１０％～約５０％、約１０％～約３０％、約２５％～約７５％、約２５％～約５０％、または約３０％～約５０％が形質導入される。ｍｉＲＮＡを発現する組換えウイルス粒子によって形質導入されたニューロンを同定する方法は、当業界において公知であり；例えば、免疫組織化学、ＲＮＡ検出（例えば、ｑＰＣＲ、ノーザンブロッティング、ＲＮＡ－ｓｅｑ、インサイチュハイブリダイゼーションなど）または強化緑色蛍光タンパク質などの共発現されたマーカーの使用が、発現を検出するのに使用することができる。
一部の態様において、本発明は、組換え自己相補性ゲノム（例えば、自己相補的なｒＡＡＶベクター）を含むウイルス粒子を提供する。自己相補性ベクターゲノムを有するＡＡＶウイルス粒子および自己相補性ＡＡＶゲノムの使用方法は、米国特許第６，５９６，５３５号；７，１２５，７１７号；７，４６５，５８３号；７，７８５，８８８号；７，７９０，１５４号；７，８４６，７２９号；８，０９３，０５４号；および８，３６１，４５７号；ならびにＷａｎｇＺ．ら、（２００３）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １０：２１０５～２１１１に記載されており、これらのそれぞれは、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる。自己相補性ゲノムを含むｒＡＡＶは、その部分的に相補的な配列（例えば、異種核酸の相補的なコードおよび非コード鎖）によって二本鎖ＤＮＡ分子を迅速に形成すると予想される。一部の実施形態において、ベクターは、異種核酸をコードする第１の核酸配列およびその核酸の相補物をコードする第２の核酸配列を含み、第１の核酸配列は、その長さのほとんどまたは全てにわたり、第２の核酸配列と鎖内の塩基対を形成することができる。
一部の実施形態において、第１の異種核酸配列および第２の異種核酸配列は、突然変異ＩＴＲ（例えば、右のＩＴＲ）によって連結される。一部の実施形態において、ＩＴＲは、ポリヌクレオチド配列５’－ＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＧ－３’（配列番号１）を含む。突然変異ＩＴＲは、末端分解配列を含むＤ領域の欠失を含む。結果として、ＡＡＶウイルスゲノムの複製時に、ｒｅｐタンパク質は、突然変異ＩＴＲのところでウイルスゲノムを切断しないと予想され、そのようなものとして、以下のもの：ＡＡＶのＩＴＲ、制御配列を包含する第１の異種ポリヌクレオチド配列、突然変異したＡＡＶのＩＴＲ、第１の異種ポリヌクレオチドおよび第３のＡＡＶのＩＴＲと逆方向の第２の異種ポリヌクレオチドを、５’から３’の順で含む組換えウイルスゲノムが、ウイルスのキャプシド中にパッケージ化されると予想される。
Ｖ．ウイルス粒子およびウイルス粒子を生産する方法
ｒＡＡＶウイルス粒子
本発明は、ｒＡＡＶ粒子を投与するための方法およびシステムを提供する。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクターを含む。一部の実施形態において、ウイルス粒子は、１または２つのＡＡＶの逆方向末端反復（ＩＴＲ）が隣接する異種核酸を含む核酸を含む組換えＡＡＶ粒子である。核酸は、ＡＡＶ粒子中にキャプシド化されている。またＡＡＶ粒子は、キャプシドタンパク質も含む。一部の実施形態において、核酸は、転写方向で構成要素に作動可能に連結された目的のコード配列（例えば、異種核酸）、転写開始および終結配列を包含する制御配列を含み、それにより発現カセットが形成される。発現カセットは、５’および３’末端に少なくとも１つの機能的なＡＡＶのＩＴＲ配列を有する。「機能的なＡＡＶのＩＴＲ配列」は、ＡＡＶビリオンのレスキュー、複製およびパッケージ化を目的としたＩＴＲ配列機能を意味する。全て参照によってそれらの全体が本明細書に組み入れられる、Ｄａｖｉｄｓｏｎら、ＰＮＡＳ、２０００、９７（７）３４２８～３２；Ｐａｓｓｉｎｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、２００３、７７（１２）：７０３４～４０；およびＰｅｃｈａｎら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、２００９、１６：１０～１６を参照されたい。本発明の一部の態様を実施するために、組換えベクターは、少なくともキャプシド化に必須なＡＡＶの配列の全て、およびｒＡＡＶによる感染のための物理的構造を含む。本発明のベクターで使用するためのＡＡＶのＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列を有していなくてもよく（例えば、Ｋｏｔｉｎ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１９９４、５：７９３～８０１で説明されている通り）、ヌクレオチドの挿入、欠失または置換によって変更されてもよく、またはＡＡＶのＩＴＲは、数々のＡＡＶ血清型のいずれかからから誘導されてもよい。４０種を超えるＡＡＶ血清型がこれまでに知られており、新しい血清型および既存の血清型のバリアントが同定され続けている。Ｇａｏら、ＰＮＡＳ、２００２、９９（１８）：１１８５４～６；Ｇａｏら、ＰＮＡＳ、２００３、１００（１０）：６０８１～６；およびＢｏｓｓｉｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、２００３、７７（１２）：６７９９～８１０を参照されたい。あらゆるＡＡＶ血清型の使用が、本発明の範囲内であるとみなされる。一部の実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、これらに限定されないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶなどのＡＡＶ血清型から誘導されたベクターである。一部の実施形態において、ＡＡＶのＩＴＲにおける核酸は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ
ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶ血清型ＩＴＲまたは同種のものである。ある特定の実施形態において、ＡＡＶにおける核酸は、ＡＡＶ２のＩＴＲを含む。
一部の実施形態において、ベクターは、スタッファー核酸を包含していてもよい。一部の実施形態において、スタッファー核酸は、緑色蛍光タンパク質をコードしていてもよい。一部の実施形態において、スタッファー核酸は、プロモーターとＲＮＡｉをコードする核酸との間に配置されていてもよい。
さらなる実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１キャプシド、ＡＡＶ２キャプシド、ＡＡＶ３キャプシド、ＡＡＶ４キャプシド、ＡＡＶ５キャプシド、ＡＡＶ６キャプシド（例えば、野生型ＡＡＶ６キャプシド、またはバリアントＡＡＶ６キャプシド、例えば米国付与前公報第２０１２／０１６４１０６号に記載のＳｈＨ１０）、ＡＡＶ７キャプシド、ＡＡＶ８キャプシド、ＡＡＶｒｈ８キャプシド、ＡＡＶｒｈ８Ｒキャプシド、ＡＡＶ９キャプシド（例えば、野生型ＡＡＶ９キャプシド、または米国付与前公報第２０１３／０３２３２２６号に記載の改変されたＡＡＶ９キャプシド）、ＡＡＶ１０キャプシド、ＡＡＶｒｈ１０キャプシド、ＡＡＶ１１キャプシド、ＡＡＶ１２キャプシド、チロシンキャプシド突然変異体、ヘパリン結合キャプシド突然変異体、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａキャプシド、ＡＡＶＡＡＶ２／２－７ｍ８キャプシド、ＡＡＶ ＤＪキャプシド（例えば、ＡＡＶ－ＤＪ／８キャプシド、ＡＡＶ－ＤＪ／９キャプシド、または米国付与前公報第２０１２／００６６７８３号に記載の他のいずれかのキャプシド）、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａキャプシド、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａキャプシド、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａキャプシド、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋキャプシド、ヤギＡＡＶキャプシド、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラキャプシド、ウシＡＡＶキャプシド、マウスＡＡＶキャプシド、ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１キャプシド、または米国特許第８，２８３，１５１号または国際公報ＷＯ／２００３／０４２３９７号に記載のＡＡＶキャプシドを含む。一部の実施形態において、突然変異キャプシドタンパク質は、ＡＡＶキャプシドを形成する能力を維持する。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ５チロシン突然変異キャプシドを含む（Ｚｈｏｎｇ Ｌ．ら、（２００８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０５（２２）：７８２７～７８３２）。さらなる実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、クレードＡ～ＦからのＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質を含む（Ｇａｏ、ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００４、７８（１２）：６３８１）。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１キャプシドタンパク質またはそれらの突然変異体を含む。他の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質またはそれらの突然変異体を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、またはＡＡＶｒｈ１０である。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１）キャプシドを含む。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）キャプシドを含む。
特定の標的細胞の形質導入を最適化するか、または特定の標的組織（例えば、ＣＮＳ組織）内の特異的な細胞型を標的化するのに、異なるＡＡＶ血清型が使用される。ｒＡＡＶ粒子は、同じ血清型または異なる血清型（例えば、混成の血清型）から誘導されたウイルスタンパク質およびウイルス核酸を含んでいてもよい。例えば、一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１キャプシドタンパク質および少なくとも１つのＡＡＶ２のＩＴＲを含んでいてもよいし、またはｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質および少なくとも１つのＡＡＶ１のＩＴＲを含んでいてもよい。ｒＡＡＶ粒子生産のためのＡＡＶ血清型のあらゆる組合せが、本明細書に各組合せが明示的に述べられているものとして本明細書で提供される。一部の実施形態において、本発明は、ＡＡＶ１キャプシドおよび少なくとも１つのＡＡＶ２のＩＴＲが隣接する本発明の開示のｒＡＡＶベクター（例えば、異種核酸を含む発現カセット）を含むｒＡＡＶ粒子を提供する。一部の実施形態において、本発明は、ＡＡＶ２キャプシドを含むｒＡＡＶ粒子を提供する。一部の実施形態において、ＩＴＲおよびキャプシドは、ＡＡＶ２から誘導される。一部の実施形態において、ＩＴＲは、ＡＡＶ２から誘導され、キャプシドは、ＡＡＶ１から誘導される。
ＡＡＶ粒子の生産
トランスフェクション、安定な細胞株の生産、ならびにアデノウイルス－ＡＡＶハイブリッド、ヘルペスウイルス－ＡＡＶハイブリッド（Ｃｏｎｗａｙ，ＪＥら、（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７１（１１）：８７８０～８７８９）およびバキュロウイルス－ＡＡＶハイブリッドなどの感染性のハイブリッドウイルスの生産系を含む、ｒＡＡＶベクターを生産するための数多くの方法が当業界において公知である。ｒＡＡＶウイルス粒子を生産するためのｒＡＡＶ生産培養は全て、１）好適な宿主細胞、例えば、ヒトから誘導された細胞株、例えばＨｅＬａ、Ａ５４９、または２９３細胞、または昆虫から誘導された細胞株、例えばバキュロウイルス生産系のケースではＳＦ－９など；２）野生型または突然変異アデノウイルス（例えば温度感受性アデノウイルス）、ヘルペスウイルス、バキュロウイルス、またはヘルパー機能を提供するプラスミドコンストラクトによって提供される好適なヘルパーウイルス機能；３）ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子および遺伝子産物；４）少なくとも１つのＡＡＶのＩＴＲ配列が隣接する核酸（例えば治療用核酸）；ならびに５）ｒＡＡＶ生産を支持する好適な培地および培地成分を必要とする。一部の実施形態において、ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物は、あらゆるＡＡＶ血清型由来でもよい。一般的に、ただし必須ではないが、ｒｅｐ遺伝子産物が複製されるように機能してｒＡＡＶゲノムをパッケージ化できる限りは、ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子産物は、ｒＡＡＶベクターゲノムのＩＴＲと同じ血清型を有する。ｒＡＡＶベクターを生産するために、当業界において公知の好適な培地を使用することができる。これらの培地としては、これらに限定されないが、Ｈｙｃｌｏｎｅ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓおよびＪＲＨによって生産された培地、例えば改変イーグル培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）など、米国特許第６，５６６，１１８号に記載されたもの、ならびに米国特許第６，７２３，５５１号に記載されているようなＳｆ－９００ ＩＩ ＳＦＭ培地などの特注の調合物が挙げられ、これらのそれぞれは、特に組換えＡＡＶベクターの生産で使用するための特注の培地調合物に関して、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる。一部の実施形態において、ＡＡＶのヘルパー機能は、アデノウイルスまたはＨＳＶによって提供される。一部の実施形態において、ＡＡＶのヘルパー機能は、バキュロウイルスによって提供され、宿主細胞は、昆虫細胞（例えば、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（Ｓｆ９）細胞）である。
一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、三重のトランスフェクション方法、例えば下記に示される例示的な三重のトランスフェクション方法によって生産することができる。簡単に言えば、ｒｅｐ遺伝子およびキャプシド遺伝子を含有するプラスミドを、ヘルパーアデノウイルスプラスミドと共に、（例えば、リン酸カルシウム方法を使用して）細胞株（例えば、ＨＥＫ－２９３細胞）にトランスフェクトしてもよいし、さらに、ウイルスを収集し、場合により精製してもよい。そのようなものとして、一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクターをコードする核酸、ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐをコードする核酸、およびＡＡＶヘルパーウイルス機能をコードする核酸の宿主細胞への三重のトランスフェクションによって生産されたものであり、宿主細胞への核酸のトランスフェクションは、ｒＡＡＶ粒子を生産することが可能な宿主細胞を生成する。
一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、プロデューサー細胞株の方法、例えば下記に示される例示的なプロデューサー細胞株の方法によって生産することができる（Ｍａｒｔｉｎら、（２０１３）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：２５３～２６９で参照されているものも参照されたい）。簡単に言えば、細胞株（例えば、ＨｅＬａ細胞株）は、ｒｅｐ遺伝子、キャプシド遺伝子、およびプロモーター－異種核酸配列を含有するプラスミドで安定してトランスフェクトすることができる。細胞株をスクリーニングしてｒＡＡＶ生産のためのリードクローンを選択してもよいし、次いでこれを生産バイオリアクターに拡大して、ｒＡＡＶ生産を開始させるためのヘルパーとしてアデノウイルス（例えば、野生型アデノウイルス）で感染させることもできる。その後ウ
イルスを回収してもよいし、アデノウイルスを不活性化させるか（例えば、熱によって）および／または除去してもよいし、ｒＡＡＶ粒子を精製してもよい。そのようなものとして、一部の実施形態において、ｒＡＡＶベクターをコードする核酸、ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐをコードする核酸、ならびにＡＡＶヘルパーウイルス機能をコードする核酸の１つまたはそれ以上を含むプロデューサー細胞株によって、ｒＡＡＶ粒子を生産した。
一部の態様において、本明細書で開示されるいずれかのｒＡＡＶ粒子を生産するための方法であって、（ａ）ｒＡＡＶ粒子が生産される条件下で宿主細胞を培養する工程であって、宿主細胞は、（ｉ）１つまたはそれ以上のＡＡＶパッケージ遺伝子であって、前記ＡＡＶパッケージ遺伝子のそれぞれは、ＡＡＶの複製および／またはキャプシド化タンパク質をコードする、ＡＡＶパッケージ遺伝子；（ｉｉ）少なくとも１つのＡＡＶのＩＴＲが隣接する本明細書に記載される異種核酸をコードする核酸を含むｒＡＡＶプロベクター、および（ｉｉｉ）ＡＡＶのヘルパー機能を含む、工程；および（ｂ）宿主細胞によって生産されたｒＡＡＶ粒子を回収する工程を含む、方法が提供される。一部の実施形態において、前記少なくとも１つのＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ
ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶ血清型ＩＴＲなどからなる群より選択される。一部の実施形態において、前記キャプシド化タンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２－７ｍ８、ＡＡＶ ＤＪ、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋ、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶ、もしくはマウスＡＡＶキャプシド ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１血清型キャプシドタンパク質またはそれらの突然変異体からなる群より選択される。一部の実施形態において、キャプシド化タンパク質は、チロシンキャプシド突然変異を有するＡＡＶ５キャプシドタンパク質などのＡＡＶ５キャプシドタンパク質である。一部の実施形態において、キャプシド化タンパク質は、チロシンキャプシド突然変異を有するＡＡＶ５キャプシドタンパク質などのＡＡＶ５キャプシドタンパク質であり、ＩＴＲは、ＡＡＶ２のＩＴＲである。さらなる実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、クレードＡ～ＦからのＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質を含む。一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１キャプシド、ならびにＡＡＶ２のＩＴＲ、突然変異ＡＡＶ２のＩＴＲおよび治療用導入遺伝子／核酸をコードする核酸を含む組換えゲノムを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶ血清型ＩＴＲである。ある特定の実施形態において、ＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶ２のＩＴＲである。
本発明の好適なｒＡＡＶ生産培養培地に、血清または血清由来の組換えタンパク質を０．５％～２０％（ｖ／ｖまたはｗ／ｖ）のレベルで補充してもよい。代替として、当業界において公知のように、ｒＡＡＶベクターは、無血清条件で生産してもよく、この無血清条件は、動物由来産物を含まない培地と称される場合もある。当業者は、生産培養中のｒＡＡＶの力価を増加させるために、ｒＡＡＶベクター生産を維持するように設計された市販または特注の培地にも、これらに限定されないが、グルコース、ビタミン、アミノ酸、およびまたは増殖因子などの当業界公知の１つまたはそれ以上の細胞培養要素を補充してもよいことを認識することができる。
ｒＡＡＶ生産培養物は、利用されている特定の宿主細胞に好適な様々な条件（広範囲の温度範囲、様々な時間の長さ、および同種のもの）下で成長させることができる。当業界
において公知のように、ｒＡＡＶ生産培養物は、例えばローラーボトル、中空糸フィルター、マイクロキャリアー、および充填層または流動層バイオリアクターなどの好適な付着依存性容器中で培養させることができる付着依存性培養物を包含する。ｒＡＡＶベクター生産培養物はまた、例えばスピナーフラスコ、攪拌タンクバイオリアクター、およびウェーブバッグシステムなどの使い捨てのシステムなどの様々な方法で培養できるＨｅＬａ、２９３、およびＳＦ－９細胞などの浮遊適合性の宿主細胞も包含し得る。
本発明のｒＡＡＶベクター粒子は、生産培養物の宿主細胞を溶解させることによってｒＡＡＶ生産培養物から回収してもよいし、または米国特許第６，５６６，１１８号でより詳細に説明されるように、無傷細胞から培地へのｒＡＡＶ粒子の放出を引き起こす当業界において公知の条件下で細胞が培養される場合、生産培養物から使用済みの培地を回収することによってｒＡＡＶ生産培養物から回収してもよい。細胞を溶解させる好適な方法も当業界において公知であり、例えば、複数回の凍結／融解サイクル、超音波破砕、微小流動化、および洗浄剤および／またはプロテアーゼなどの化学物質での処理が挙げられる。
さらなる実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、精製される。用語「精製される」は、本明細書で使用される場合、ｒＡＡＶ粒子が天然に存在するかまたはそれから最初に調製されるときに存在する可能性もある他の要素の少なくとも一部を欠いているｒＡＡＶ粒子の調製物を包含する。したがって、例えば、単離されたｒＡＡＶ粒子は、培養溶解産物または生産培養上清などの源となる混合物からそれを富化するための精製技術を使用して調製することができる。富化は、様々な方法で、例えば、溶液中に存在するＤＮアーゼ耐性粒子（ＤＲＰ）もしくはゲノムコピー（ｇｃ）の比率、または感染力などによって測定してもよいし、または富化は、源となる混合物中に存在する第２の干渉する可能性がある物質、例えば生産培養物の汚染物質などの汚染物質、またはヘルパーウイルス、培地の要素などの製造過程の汚染物質に関して測定することができる。
一部の実施形態において、ｒＡＡＶ生産培養からの回収物は、宿主の細胞片を除去するために清澄化される。一部の実施形態において、生産培養からの回収物は、例えば、グレードＤＯＨＣのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋ＨＣ Ｐｏｄフィルター、グレードＡ１ＨＣのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋ＨＣ Ｐｏｄフィルター、および０．２μｍフィルターであるＯｐｔｉｃａｐ ＸＬ１Ｏ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＳＨＣ親水性膜フィルターなどの一連の深型フィルターを介したろ過によって清澄化される。清澄化はまた、当業界において公知の様々な他の標準的な技術、例えば、遠心分離、または当業界において公知の０．２μｍまたはそれより大きい孔径を有するあらゆる酢酸セルロースフィルターを介したろ過によっても達成することができる。
一部の実施形態において、ｒＡＡＶ生産培養の回収物をＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）でさらに処理して、生産培養物中に存在するあらゆる高分子量のＤＮＡを消化する。一部の実施形態において、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）消化は、例えば、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）１～２．５単位／ｍｌの最終濃度、周囲～３７℃の範囲の温度、３０分～数時間の期間などの当業界において公知の標準条件下で実行される。
ｒＡＡＶ粒子は、以下の精製工程：平衡遠心分離；フロースルー式のアニオン交換ろ過；ｒＡＡＶ粒子を濃縮するためのタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）；アパタイトクロマトグラフィーによるｒＡＡＶ捕獲；ヘルパーウイルスの熱不活性化；疎水性相互作用クロマトグラフィーによるｒＡＡＶ捕獲；サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による緩衝液交換；ナノろ過；およびアニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、またはアフィニティークロマトグラフィーによるｒＡＡＶ捕獲の１つまたはそれ以上を使用して単離または精製することができる。これらの工程は、単独で、様々な組合せで、または異なる順番で使用することができる。一部の実施形態において、本方
法は、全ての工程を後述するような順番で含む。ｒＡＡＶ粒子を精製するための方法は、例えば、Ｘｉａｏら、（１９９８）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２：２２２４～２２３２；米国特許第６，９８９，２６４号および８，１３７，９４８号；ならびにＷＯ２０１０／１４８１４３に見出される。
一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、医薬組成物の形態である。医薬組成物は、本明細書に記載のあらゆる投与様式に適したものであり得る。治療用導入遺伝子／核酸をコードする核酸を含む組換えウイルス粒子の医薬組成物は、ＣＮＳ（例えば、線条体および／または大脳皮質）に導入することができる。
一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、医薬的に許容される賦形剤を含む医薬組成物の形態である。当業界において周知のように、医薬的に許容される賦形剤は、薬理学的に有効な物質の投与を容易にする比較的不活性な物質であり、液状の溶液もしくは懸濁液として、エマルジョンとして、または使用前に液体に溶解または懸濁させるのに好適な固体の形態として供給することができる。例えば、賦形剤は、形状または硬さを付与したり、または希釈剤として作用したりすることができる。好適な賦形剤としては、これらに限定されないが、安定化剤、湿潤剤および乳化剤、浸透圧モル濃度を変更するための塩、カプセル化剤、ｐＨ緩衝剤、および緩衝液が挙げられる。このような賦形剤としては、過度の毒性がなく投与することができる目への直接送達に好適なあらゆる医薬物質が挙げられる。医薬的に許容される賦形剤としては、これらに限定されないが、ソルビトール、様々なＴＷＥＥＮ化合物のいずれか、ならびに水、塩類溶液、グリセロールおよびエタノールなどの液体が挙げられる。そのようなものとして、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの無機酸の塩；および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸の塩などの医薬的に許容される塩も挙げることができる。医薬的に許容される賦形剤の徹底的な議論は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ
ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．、Ｎ．Ｊ．１９９１）で入手することができる。
一部の実施形態において、投与される組成物は、ｒＡＡＶ粒子およびポロキサマーを包含する。用語「ポロキサマー」は、ポリオキシプロピレンおよびポリオキシエチレン鎖の異なる長さを組み合わせて使用することができるため、多くの化合物を包含し得る。例えば、ポロキサマーは、ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｍ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎＨの化学式を有していてもよく、式中ｎ（すなわち、ポリオキシエチレン鎖長）は約６０～約１５０の値を有し、ｍ（すなわち、ポリオキシプロピレン鎖長）は約２５～約６０の値を有する。
一部の実施形態において、ポロキサマーは、ポロキサマー１８８（例えば、ＣＡＳ番号９００３－１１－６）である。ポロキサマーは、それらのおよその分子量およびポリオキシエチレン含量のパーセンテージを明示する番号付けシステムによって記載することができる。これらの値は、組成物中の各ポロキサマー分子の絶対値というよりポロキサマー組成物中の平均値を指すことが多い。この手法に基づけば、上２桁の数値に１００を掛けると、ポリオキシプロピレンブロックのおよその分子量が得られ、３桁の数値に１０を掛けると、ポリオキシエチレンブロックの重量パーセンテージが得られる。例えば、ポロキサマー１８８は、上記で表された式の場合と同様に、ｎが約８０の値でありｍが約２７の値であるポロキサマーを指す場合がある。ポロキサマー１８８は、約７６８０～約９５１０ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有していてもよい。
ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）などの商標名で販売されるポロキサマーは、異なる手法に基づき名付けることができる。物理的な状況を示すために文字を使用することができる（例えば、固体の場合はＦ、ペーストの場合はＰ、または液体の場合はＬ）。２桁または
３桁の数値は、化学特性を示すのに使用することができる。上１桁または２桁に３００を掛けると、ポリオキシプロピレンブロックのおよその分子量が得られ、３桁に１０を掛けると、ポリオキシエチレンブロックの重量パーセンテージが得られる。例えば、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）またはＬＵＴＲＯＬ（登録商標）Ｆ６８は、上記で表された式の場合のように、ｎが約８０の値であり、ｍが約２７の値である固体ポロキサマーを指す場合がある。それゆえに、一部の実施形態において、ポロキサマー１８８は、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）Ｆ６８またはＬＵＴＲＯＬ（登録商標）Ｆ６８であり得る。
一部の実施形態において、組成物中のポロキサマーの濃度は、約０．０００１％～約０．０１％の範囲である。一部の実施形態において、組成物中のポロキサマーの濃度は、およその以下のパーセンテージ：０．０１、０．００５、０．００１、または０．０００５のいずれかより低い。一部の実施形態において、組成物中のポロキサマーの濃度は、およその以下のパーセンテージ：０．０００１、０．０００５、０．００１、または０．００５のいずれかより高い。すなわち、組成物中のポロキサマーの濃度は、０．０１、０．００５、０．００１、または０．０００５の上限および０．０００１、０．０００５、０．００１、または０．００５の独立して選択される下限を有するパーセンテージの範囲のいずれかであってもよく、ここで下限は上限より低い。ある特定の実施形態において、組成物中のポロキサマーの濃度は、約０．００１％である。
一部の実施形態において、組成物は、塩化ナトリウムをさらに含む。一部の実施形態において、組成物中の塩化ナトリウムの濃度は、約１００ｍＭ～約２５０ｍＭの範囲である。一部の実施形態において、組成物中の塩化ナトリウムの濃度は、およその以下の濃度（ｍＭで）：２５０、２２５、２００、１７５、１５０、または１２５のいずれかより低い。一部の実施形態において、組成物中の塩化ナトリウムの濃度は、およその以下の濃度（ｍＭで）：１００、１２５、１５０、１７５、２００、または２２５のいずれかより高い。すなわち、組成物中の塩化ナトリウムの濃度は、２５０、２２５、２００、１７５、１５０、または１２５の上限および１００、１２５、１５０、１７５、２００、または２２５の独立して選択される下限を有する濃度（ｍＭで）の範囲のいずれかであってもよく、ここで下限は上限より低い。ある特定の実施形態において、組成物中の塩化ナトリウムの濃度は、約１８０ｍＭである。
一部の実施形態において、組成物は、リン酸ナトリウムをさらに含む。リン酸ナトリウムは、あらゆる単一種のリン酸ナトリウム（例えば、第一リン酸ナトリウム、第二リン酸ナトリウム、第三リン酸ナトリウムなど）を指す場合があり、またはリン酸ナトリウム緩衝液、第一および第二リン酸ナトリウム溶液の混合物を指す場合がある。様々なｐＨにわたるリン酸ナトリウム緩衝液の配合は、様々な標準的な分子生物学プロトコール、例えばＰｒｏｍｅｇａ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ＆Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｇｕｉｄｅ、「Ｂｕｆｆｅｒｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ」、付録ＢパートＣに見出すことができる。
一部の実施形態において、組成物中のリン酸ナトリウムの濃度は、約５ｍＭ～約２０ｍＭの範囲である。一部の実施形態において、組成物中のリン酸ナトリウムの濃度は、およその以下の濃度（ｍＭで）：２０、１５、または１０のいずれかより低い。一部の実施形態において、組成物中のリン酸ナトリウムの濃度は、およその以下の濃度（ｍＭで）：５、１０、または１５のいずれかより高い。すなわち、組成物中のリン酸ナトリウムの濃度は、２０、１５、または１０の上限および５、１０、または１５の独立して選択される下限を有する濃度（ｍＭで）の範囲のいずれかであってもよく、ここで下限は上限より低い。ある特定の実施形態において、組成物中のリン酸ナトリウムの濃度は、約１０ｍＭである。
一部の実施形態において、組成物中のリン酸ナトリウムのｐＨは、約７．０～約８．０である。例えば、一部の実施形態において、組成物中のリン酸ナトリウムのｐＨは、約７．０、約７．２、約７．４、約７．５、約７．６、約７．８、または約８．０である。ある特定の実施形態において、組成物中のリン酸ナトリウムのｐＨは、約７．５である。本明細書に記載のリン酸ナトリウムのｐＨ値のいずれかは、上述したリン酸ナトリウムの濃度値のいずれかと組み合わせることができる。例えば、一部の実施形態において、組成物中のリン酸ナトリウムの濃度は、約１０ｍＭであり、ｐＨは、約７．５である。
一部の実施形態において、本明細書に記載のｒＡＡＶ粒子および医薬的に許容される担体を含む医薬組成物は、ヒトへの投与に好適である。このような担体は当業界において周知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１５版、１０３５～１０３８頁および１５７０～１５８０頁を参照）。一部の実施形態において、医薬組成物は、ポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８、例えばＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）またはＬＵＴＲＯＬ（登録商標）Ｆ６８）をさらに含む。一部の実施形態において、本明細書に記載のｒＡＡＶおよび医薬的に許容される担体を含む医薬組成物は、哺乳動物のＣＮＳへの注射に好適である。
このような医薬的に許容される担体は、滅菌された液体、例えば水および油、例えば石油、動物、植物または合成由来の油、例えば落花生油、ダイズ油、鉱油などであってもよい。塩類溶液および水性デキストロース、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびグリセロール溶液も、液体担体として、特に注射用溶液のために採用することができる。医薬組成物は、追加成分、例えば保存剤、緩衝液、等張化剤、抗酸化剤および安定剤、非イオン性の湿潤剤または清澄剤、増粘剤などをさらに含んでいてもよい。本明細書に記載の医薬組成物は、単回単位の剤形または複数回投与の剤形でパッケージ化することができる。組成物は、一般的に、滅菌された実質的に等張の溶液として製剤化される。
ＶＩ．ｒＡＡＶ粒子を送達するためのシステム
哺乳動物の大脳皮質および線条体における異種核酸の発現のためのシステムであって、（ａ）ｒＡＡＶ粒子を含む組成物であって、ｒＡＡＶ粒子は、異種核酸をコードするｒＡＡＶベクターを含む、組成物；および（ｂ）ｒＡＡＶ粒子を線条体に送達するためのデバイスを含む、システムも提供される。本発明のシステムおよびデバイスは、本明細書に記載のｒＡＡＶ粒子のいずれかを哺乳動物のＣＮＳ（例えば、線条体）に送達するのに使用することができる。上述したように、線条体に送達されるｒＡＡＶ粒子は、大脳皮質および線条体における発現のために異種核酸をコードするｒＡＡＶベクターを導入するのに使用することができる。
一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、対流強化送達（ＣＥＤ）によって送達される。ＣＥＤは、間質液の静水圧に打ち勝つ加圧下で輸注液（例えば、ｒＡＡＶ粒子を含有する組成物）をＣＮＳにポンプで送ることに基づく。それにより輸注液をＣＮＳの血管周辺組織と接触させ、この接触は、ポンプのように対流を介して輸注液を分配させて、その送達の程度を強化するのに利用される（例えば、Ｈａｄａｃｚｅｋら、（２００６）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１７：２９１～３０２；Ｂａｎｋｉｅｗｉｃｚら、（２０００）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１６４：２～１４；Ｓａｎｆｔｎｅｒ，ＬＭら、（２００５）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１９４（２）：４７６～４８３；Ｆｏｒｓａｙｅｔｈ，ＪＲら、（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１４（４）：５７１～５７７；米国特許第６，９５３，５７５号；米国特許出願公報第２００２／０１４１９８０号；米国特許出願公報第２００７／０２５９０３１号；ＷＯ９９／６１０６６；およびＷＯ２０１０／０８８５６０を参照）。
本明細書に記載されるように、ＣＥＤを使用する利点は、脳中への輸注液の分散が強化
されることである。ＣＥＤは、脳（例えば、線条体、尾状核、および／または被殻）内の注射部位において改善された送達をもたらすことができる。加えて、脳の他の領域（例えば、大脳皮質、前頭皮質、前頭連合野皮質領域、前運動皮質、一次体性感覚皮質領域、および／または一次運動皮質）への送達も、ＣＥＤを介して達成することができる。理論に縛られることは望まないが、線条体に注射された組換えウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）は、これらに限定されないが、投射野（例えば、皮質）などの脳の他の領域に分散させることができる（例えば、逆行性輸送を介して）とも考えられる。
一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＣＥＤ送達システムを使用して送達される。ＡＡＶ粒子は、ＣＥＤによって送達することができる（例えば、ＷＯ９９／６１０６６を参照）。本明細書に記載されるように、ＣＥＤは、本明細書に記載のシステムのいずれかを使用して達成することができる。ＣＥＤのための（例えば、ｒＡＡＶ粒子を包含する組成物を送達するための）デバイスは、当業界において公知であり、一般的に、ポンプ（例えば、後述するような浸透圧および／または輸注ポンプ）および注射デバイス（例えば、カテーテル、カニューレなど）を採用する。場合により、注射デバイスをガイドし、および／または輸注液（例えば、ｒＡＡＶ粒子を包含する組成物）の送達をモニターするために、イメージング技術を使用してもよい。注射デバイスは、対象のＣＮＳ組織に挿入することができる。当業者は、標的ＣＮＳ組織における注射デバイスの位置を定めるために、好適な座標を決定することができる。一部の実施形態において、位置を定めることは、注射デバイスを標的ＣＮＳ組織にガイドするために、例えば対象の脳のＣＴおよび／またはＭＲＩイメージングによって得られた解剖学的なマップにより達成される。一部の実施形態において、送達のｉＭＲＩおよび／またはリアルタイムイメージングを実行することができる。一部の実施形態において、デバイスは、本発明の方法により哺乳動物にｒＡＡＶ粒子を投与するのに使用される。
一部の実施形態において、送達の術中磁気共鳴映像法（ｉＭＲＩ）および／またはリアルタイムイメージングを実行することができる。一部の実施形態において、デバイスは、本発明の方法により哺乳動物にｒＡＡＶ粒子を投与するのに使用される。ｉＭＲＩは、外科手術中における患者のＭＲＩベースのイメージングのための技術として当業界において公知であり、外科手術の成功を確認し（例えば、ＣＮＳにｒＡＡＶ粒子を送達するために）、組織の他の部分に傷害を与えるリスクを低減することを助ける（さらなる説明については、例えば、Ｆｉａｎｄａｃａら、（２００９）Ｎｅｕｒｏｉｍａｇｅ ４７、増刊２：Ｔ２７～３５を参照）。一部の実施形態において、輸注液の組織分布のリアルタイムのモニターをもたらすために、トレーシング剤（例えば、ＭＲＩコントラスト増強剤）を輸注液（例えば、ｒＡＡＶ粒子を包含する組成物）と共に送達してもよい。例えばＦｉａｎｄａｃａら、（２００９）Ｎｅｕｒｏｉｍａｇｅ ４７、増刊２：Ｔ２７～３５；米国付与前公報第２００７／０２５９０３１号；および米国特許第７，９２２，９９９号を参照されたい。トレーシング剤の使用は、送達の中断を知らせることができる。当業界において公知の他のトレーシングおよびイメージング手段も、輸注液分布を追跡するために使用することができる。
一部の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶ粒子を送達するための当業界において公知のデバイスおよび方法を使用する標準的な定位注射によって投与することができる。一般的に、これらの方法は、注射デバイス、一連の座標（例えば、左右軸、背腹軸、および前後軸に沿ったパラメーター）への送達のために標的化される組織の領域を変換するための計画システム、および計画された座標に従って定位局在化するためのデバイス（定位デバイス、場合により座標系とのアライメント中の位置に頭を固定するためのプローブおよび構造を包含する）を使用することができる。ＭＲＩによってガイドされる外科手術および／または定位注射に有用であり得るシステムの非限定的な例は、ＣｌｅａｒＰｏｉｎｔ（登録商標）システム（ＭＲＩ Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎｓ、Ｍｅｍｐｈｉｓ、
ＴＮ）である。
一部の実施形態において、対流強化送達のためのデバイスは、ポンプ（例えば、浸透圧ポンプおよび／または輸注ポンプ）を含む。浸透圧および／または輸注ポンプは、市販されている（例えば、ＡＬＺＥＴ（登録商標）Ｃｏｒｐ．、Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｃｏｒｐ．、ＡＬＺＡ Ｉｎｃ．Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡから）。ポンプシステムは、埋め込み型であってもよい。例示的なポンプシステムは、例えば、米国特許第７，３５１，２３９号；７，３４１，５７７号；６，０４２，５７９号；５，７３５，８１５号；および４，６９２，１４７号に見出すことができる。一部の実施形態において、ポンプは、手動ポンプである。逆流抵抗性および段階的カニューレなどのＣＥＤのための例示的なデバイスは、その全体が参照により本明細書に組み入れられるＷＯ９９／６１０６６およびＷＯ２００６／０４２０９０に見出すことができる。
一部の実施形態において、対流強化送達のためのデバイスは、逆流抵抗性カニューレ（例えば、逆流防止段階設計のカニューレ）を含む。さらなる説明および例示的な逆流抵抗性カニューレは、例えば、Ｋｒａｕｚｅら、（２００９）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．４６５：３４９～３６２；米国付与前公報第２００６／０１３５９４５号；米国付与前公報第２００７／００８８２９５号；およびＰＣＴ／ＵＳ０８／６４０１１に見出すことができる。一部の実施形態において、１つのみのカニューレが使用される。他の実施形態において、１つより多くのカニューレが使用される。一部の実施形態において、対流強化送達のためのデバイスは、輸注液を制御された速度でカニューレを通って標的組織に流動させるのに十分な圧力を生じるポンプと合体した逆流抵抗性カニューレを含む。頭蓋内圧が脳の組織を損傷しないような好適なレベルで維持されるように、あらゆる好適な流速を使用することができる。
一部の実施形態において、カニューレは、段階的カニューレである。例えばＷＯ２００６／０４２０９０で説明されるように、段階的カニューレは、多数の段階（例えば、ＷＯ２００６／０４２０９０の図１では４つ）を有する。カニューレの遠位端に最も近い段階は、最初に標的組織に入る段階であり、したがって、標的組織（例えば、線条体）に入る段階の数は、対象におけるその標的に到達するのに必要な貫通の深さに依存すると予想される。脳への送達に関して、オペレーターは、処置される対象のサイズおよび標的化される脳内の位置の両方を考慮して適切な貫通の深さを容易に決定することができる。
カニューレは、管類のシステムを介してポンプに連結される。管類は、カニューレの内腔を通って伸長し、この管類を通って輸注液は送達される。管類を含有する実施形態において、管類は、カニューレの遠位端でフラッシングされる。代替として、管類は、カニューレの遠位端から伸長し、このような実施形態において、管類が伸長する量は適用に応じて変更できる。一般的に、管類は、カニューレから、それらの遠位端を超えて、約１ｍｍ～約１ｃｍ（またはその間のあらゆる長さ）、例えば、約１～約５０ｍｍ（またはその間のあらゆる長さ）、または約１ｍｍ～約２５ｍｍ（またはその間のあらゆる長さ、これらに限定されないが、１ｍｍ、２ｍｍ、３ｍｍ、４ｍｍ、５ｍｍ、６ｍｍ、７ｍｍ、８ｍｍ、９ｍｍ、１０ｍｍ、１１ｍｍ、１２ｍｍ、１３ｍｍ、１４ｍｍ、１５ｍｍ、１６ｍｍ、１７ｍｍ、１８ｍｍ、１９ｍｍ、２０ｍｍ、２１ｍｍ、２２ｍｍ、２３ｍｍ、２４ｍｍまたは２５ｍｍなどの）、例えば１０ｍｍ伸長すると予想される。
カニューレを通って伸長する管類は、例えば輸注液と接触する管類を保護するために、１つまたはそれ以上の領域中にコーティングまたは取り囲む材料を有していてもよい。したがって、ある特定の実施形態において、管類（例えば、ＦＥＰ（テフロン（登録商標））の管類）は、ステンレス鋼カニューレの近位端を超えて伸長する石英ガラスの管類の一部を保護する。石英ガラスの管類は、これらに限定されないが、ルアー式の圧縮継手など
のあらゆる好適な手段によってシリンジに連結することができ、シリンジは、シリンジポンプ（手動、電子および／またはコンピューター化による）によって駆動する。シリンジのサイズは、オペレーターによって適切な量の製品が送達されるように選択できることは明らかであると予想される。したがって、１ｍＬ、２．５ｍＬ、５ｍＬ、またはそれよりさらに大きいシリンジを使用してもよい。
段階的カニューレは、これらに限定されないが、ステンレス鋼（例えば、３１６ＳＳまたは３０４ＳＳ）、金属、金属合金、ポリマー、有機繊維、無機繊維および／またはそれらの組合せなどの生理学的に許容できる様々な材料から作製することができる。
場合により、輸注液と接触する表面（例えば、管類またはコーティング）は、カニューレの内腔を通って伸長していてもよい。輸注液と接触する表面にも、これらに限定されないが、金属、金属合金、ポリマー、有機繊維、無機繊維および／またはそれらの組合せなどの様々な材料を使用することができる。一部の実施形態において、製品と接触する表面は、ステンレス鋼ではない。このような実施形態において、外部カニューレは、それでもなお標的組織と生理学的に適合する材料で作製されるが、製品との接触がないため、生物学的に活性な薬剤または製品の調合物と適合していなくてもよい。
一部の実施形態において、輸注液の浸透は、促進剤（ｆａｃｉｌｉｔａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）の使用によってさらに増大される。促進剤は、標的組織（例えば、ＣＮＳ標的組織）への輸注液の送達をさらに促進することが可能である。促進剤の非限定的な例は、低分子ヘパリンである（例えば、米国特許第７，９２２，９９９号を参照）。
本明細書に記載の医薬組成物のための好適なパッケージは、当業界において公知であり、例えば、バイアル（例えば密封バイアル）、容器、アンプル、ボトル、ジャー、フレキシブルなパッケージ（例えば、密封したマイラーまたはプラスチックバッグ）などが挙げられる。これらの製造品は、さらに滅菌および／または密封してもよい。
さらに、哺乳動物におけるＣＮＳの障害を処置するための方法であって、本明細書に記載の方法に従って哺乳動物にｒＡＡＶ粒子を投与することを含む、方法が本明細書において提供される。さらに、哺乳動物におけるハンチントン病を処置するための方法であって、本明細書で説明のシステムを使用する本明細書に記載の方法に従って哺乳動物にｒＡＡＶ粒子を投与することを含む、方法が提供される。
本発明はまた、本発明の方法に従って哺乳動物に本明細書に記載のｒＡＡＶ粒子を投与するためのキットも提供する。キットは、本発明のｒＡＡＶ粒子またはｒＡＡＶ粒子組成物のいずれかを含んでいてもよい。例えば、キットは、哺乳動物の少なくとも大脳皮質および線条体で発現される異種核酸をコードするｒＡＡＶベクターを含むｒＡＡＶ粒子を包含していてもよい。一部の実施形態において、キットは、上述したデバイスまたはシステムのいずれかをさらに含む。
一部の実施形態において、キットは、ｒＡＡＶ粒子の組成物をＣＮＳ送達（例えば、哺乳動物の線条体に送達）することに関する説明書をさらに包含する。本明細書に記載のキットは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および本明細書に記載のいずれかの方法を実行するための説明を含む添付文書などの、商業的および使用者の観点から所望の他の材料をさらに包含していてもよい。好適なパッケージ材料も包含され、例えば、バイアル（例えば密封バイアル）、容器、アンプル、ボトル、ジャー、フレキシブルなパッケージ（例えば、密封したマイラーまたはプラスチックバッグ）などの当業界において公知のあらゆるパッケージ材料であってもよい。これらの製造品はさらに、滅菌および／または密封してもよい。一部の実施形態において、キットは、本明細書に記載の方法お
よび／またはｒＡＡＶ粒子のいずれかを使用して本明細書に記載のＣＮＳの障害を処置するための説明書を含む。キットは、個体のＣＮＳへの注射に好適な医薬的に許容される担体、ならびに緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および哺乳動物の線条体への注射を実行するための説明を含む添付文書の１つまたはそれ以上を包含していてもよい。
一部の実施形態において、キットは、本明細書に記載の（例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．、Ｎ．Ｊ．１９９１に記載されるような）緩衝液および／または医薬的に許容される賦形剤の１つまたはそれ以上をさらに含有する。一部の実施形態において、キットは、本明細書に記載の、１つまたはそれ以上の医薬的に許容される賦形剤、担体、溶液、および／または追加成分を包含する。本明細書に記載のキットは、単回単位の剤形または複数回投与の剤形でパッケージ化することができる。キットの内容物は、一般的に、滅菌されたものとして製剤化され、凍結乾燥してもよいし、または実質的に等張の溶液として提供してもよい。
本発明は、以下の実施例を参照することにより、よりよく理解される。しかしながら、これらは本発明の範囲を制限すると解釈されるべきではない。本明細書に記載の実施例および実施形態は単に例示の目的のためであり、それらの観点で様々な改変または変化が当業者に示唆されると予想され、本出願の本質および趣旨ならびに添付の特許請求の範囲のうちに包含されることが理解される。
実施例１：線条体内のＡＡＶ１ベクター送達後の広範にわたるＧＦＰ発現
対流強化送達（ＣＥＤ）を介して送達された場合のアカゲザルの脳において線条体および皮質構造の両方を効率的に標的化するＡＡＶ１の能力を評価した。サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリベータ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーターの制御下にＧＦＰのｃＤＮＡを含有するＡＡＶベクターを、ＣＥＤを使用して９匹の成体雄アカゲザルの尾状核および被殻に輸注した（例えば、Ｂａｎｋｉｅｗｉｃｚら、（２０００）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１６４：２～１４およびＷＯ２０１０／０８８５６０を参照）。
方法
外科的送達
この研究に、９匹の成体雄アカゲザル（Ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅ）（アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）；８．９～１１．９ｋｇ）を入れた。全ての動物に、ＭＲＩによってガイドされるＣＥＤを用いて、尾状核および被殻の両方にＡＡＶベクターを輸注した（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｒ．Ｍ．ら（２０１１）Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ
６９：１５４～１６３；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｒ．Ｍ．ら（２０１１） Ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．８９：１４１～１５１；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｒ．Ｍ．ら（２０１１）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１９：１０４８～１０５７）。外科手術の直前に、動物をケタミンＨＣＬ（１０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、体重を量り、挿管し、１～５％イソフルラン上で維持した。頭を定位フレームに載せ、動物をＴ１強調の計画的スキャンのためにＭＲＩ（Ｓｉｅｍｅｎｓ ３．０ Ｔ Ｔｒｉｏ ＭＲユニット）に運んだ。スキャン後、動物を手術室に移し、頭を埋め込み手順のために調製し、輸注に、３ｍｍの段階的先端を有するセラミックの特注設計された石英ガラス逆流抵抗性カニューレを使用した。標準的な方法を使用して一時的なガイドカニューレを両方に埋め込んだ（半球それぞれにつき１つ）。
２つの異なる生産方法：三重のトランスフェクション（ＴＴ）またはプロデューサー細胞株（ＰＣＬ）により得られたＡＡＶ１－ｅＧＦＰまたはＡＡＶ２－ｅＧＦＰベクターのいずれかを、動物の尾状核および被殻両方に輸注した。表５に、ベクターの濃度および用
量を記載する。これまでに述べられたように、動物を抗ＡＡＶ１および抗ＡＡＶ２中和抗体の存在に関して試験し、動物が＜１：３２の抗体力価を提示した場合、血清反応陰性とみなした（Ｂｅｖａｎ，Ａ．Ｋ．ら（２０１１）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１９：１９７１～１９８０）。全ての動物において生存時間はＡＡＶ送達後１カ月であった。
各動物は、表２で示されるように、尾状核および被殻（前交連および後交連）領域を標的化するために半球それぞれにつき最大３回の微量注射を受けた。ＭＲＩ中に輸注液の分布を可視化するために、ウイルスにプロハンス（２ｍＭガドテリドール）を添加した。対流強化送達（ＣＥＤ）方法を使用して、尾状核にＡＡＶおよそ３０μｌを投与し、被殻に６０μｌを投与した（すなわち、半球それぞれにつき９０μＬ）。輸注速度を最大５μＬ／分に上昇させた。
Figure 2023058630000003
動物の第１のコホートは、半球それぞれにつき１．７×１０１１ｖｇのＡＡＶ１－ｅＧＦＰ（ＴＴ）（ｎ＝３）、またはＡＡＶ２－ｅＧＦＰ（ＴＴ）（ｎ＝２）を受けた。動物の第２のコホートは、１．７×１０１１ｖｇのＡＡＶ１－ｅＧＦＰ（ＰＣＬ）（ｎ＝２）、または１．３×１０１１ｖｇのＡＡＶ２－ｅＧＦＰ（ＰＣＬ）（ｎ＝２）を受けた。連続的なＭＲＩを獲得して、各標的部位内の輸注液の分布をモニターし、チームにリアルタイムのフィードバックを提供した。実質内投与手順の直後に、動物を手術室に移し、ガイドカニューレを除去し、解剖学的な層で創傷部位を閉じた。全ての実験を、国立衛生研究所のガイドラインおよび動物実験倫理委員会によって承認されたプロトコールに従って実行した。外科手術の直後に、動物を、ＡＡＶ投与手順のためにＭＲＩ室に移した。表２に
示した対象のそれぞれに対する投与手順に関するコメントを以下に記載する。
投与手順－処置グループ２（ＡＡＶ１－ｅＧＦＰ ＴＴ）
対象番号１。２つの軌道を介して半球それぞれにつきおよそ６０μＬの輸注液を各被殻に投与した（３０μＬ／沈着）。前方の被殻への輸注からの冠状画像は、それぞれの標的化構造内にガドリニウムシグナルの大部分を示した。右半球において、腹側の被殻にわずかな血管周囲の輸送と前交連への分布が見られた。
対象番号２。被殻に０．１２７ｍＬおよび視床に０．２０７ｍＬ輸注した後にＴ１ ＭＲＩを獲得した。輸注後のＴ１ ＭＲＩから、右視床内に、およそ前後方向に１ｃｍおよび背腹方向に１ｃｍと測定された広範囲な輸注液の分布が示された。冠状Ｔ１から、内包に向かって内側に、背側の被殻に向かって上方に拡がる標的部位内のガドリニウム分布が示された。輸注液の大部分が被殻の縁内に含有されていた；しかしながら、血管周囲のスペースを通る輸送も、内包の白質路および前交連中に中に存在していた。分析から、視床および被殻におけるガドリニウム輸注体積（Ｖｉ）と分布体積（Ｖｄ）との比率は、１：２であったことが解明された。
生存中の観察
動物の健康および神経学な症状の詳細な観察を、投与後５日間にわたり毎日実行した；それに続き、詳細な観察を、研究が終わるまで週１回実行した。観察および日死亡率のチェックを実行した。体重の評価を、頭蓋内投与の前、血液収集手順の時間、および剖検の時間に実行した。外科手術前または剖検の時間において処置グループ間での体重の有意差は観察されなかった（図１）。血液学、血清化学、ＡＡＶ１およびＡＡＶ２キャプシド抗体アッセイならびにｅＧＦＰのｍＲＮＡのレベル分析のために、全血、血清および髄液（ＣＳＦ）を収集した。
生存中の血液収集および処理
血液サンプルの収集スケジュール（以下の表３を参照）に従って、注射の前、注射後およそ７２時間、および剖検時に血液（およそ５ｍＬ）を収集した。血液学的分析のために、ＥＤＴＡチューブに全血およそ０．５～１．０ｍＬを収集した。全血およそ２．０ｍＬを血清セパレーターチューブに（ゲル含有、ＢＤ Ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ）に収集し、血清が得られるように処理して、概ね化学分析ならびにＡＡＶ１およびＡＡＶ２キャプシド抗体分析のための血清を得た。
Figure 2023058630000004
ＣＳＦ収集および処理
２つの別々のタイムポイント：頭蓋内投与の前および剖検時にＣＳＦを収集した。動物を腹臥位に設置して頸部脊椎穿刺することによる麻酔下で、ＣＳＦ収集を実行した。試験物投与の前に、ＣＳＦ１～２ｍＬを収集し、ドライアイス上で凍結し、≦－６０℃で貯蔵した。剖検時に（ＰＢＳ潅流の前に）、ＣＳＦ２～４ｍＬを収集し、０．８マイクロメートルのシリンジフィルターを通過させてラベルを付けた収集チューブにろ過し、２連でエッペンドルフチューブに移し（キャプシド抗体分析のための１ｍＬアリコートおよびＧＦＰ分析のための２～４ｍＬアリコート）、ドライアイス上で即座に凍結し、≦－６０℃で貯蔵した。
剖検および組織収集
頭蓋内投与手順後のおよそ３０日に全ての動物を安楽死させた。ペントバルビタールナトリウムの静脈内投与を使用して各動物を安楽死させた。安楽死ならびに血液およびＣＳＦ収集後、体をＰＢＳで経心臓的に潅流し（ＲＮアーゼ非含有条件下で）、続いてＰＦＡで潅流した。下行大動脈を固定して、末梢組織の固定を減らした。この手順を使用して、ＱＰＣＲによるＧＦＰ分析のために新鮮な末梢組織サンプルに加えて固定した脳の組織を収集した。組織収集表に収集した組織を列挙した（表４）。ＰＢＳ潅流中（４％ＰＦＡ潅流開始前）、選択組織（これも組織収集表に列挙した）の生検サンプル（０．５～１．０ｃｍ３）を、ＲＮアーゼ非含有条件下で使い捨ての滅菌されたメス（それぞれ個々の生検につき新しいメス）を用いてＲＮアーゼ非含有チューブに収集し、≦－６０℃で凍結貯蔵した。
Figure 2023058630000005
脳および脊髄の処理
脳全体を動物から慎重に除去し、スケールのためにルーラーと一緒に撮影した。脳を頭蓋骨から除去したら、脳マトリックスに設置し、６ｍｍのブロックに冠状にスライスした。冠状ブロックをＰＦＡ中で貯蔵し、組織学のために処理した。前頭皮質および中脳領域を含有する関連ブロックを浮動性の４０マイクロメートルの断片に断片化した。脊髄全体を動物から慎重に除去した。脊髄のセグメントをＰＦＡ中で貯蔵し、組織学のために処理した。頸部、胸部、および腰部領域からの代表的なセグメントを浮動性の４０マイクロメートルの断片に断片化した。
ＰＢＳ－ヘパリン、続いて４％緩衝化パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）での潅流後、各動物からの脳を、使い捨てのブレードおよびサルの脳マトリックスを使用して６ｍｍのブロック（冠状面）に切断した。連続したブロック（動物１匹当たり１１～１２枚の脳スラブ）をホワイトボード上に水平に設置し、連続して並べられた文字と共に撮影した。次いで全ての脳ブロックを４％緩衝化ＰＦＡ中で２４時間後固定した。各ブロックの固定の品質を目視で検査した（ブロック内にピンク色は観察されなかった）。ＰＦＡで後固定した後、各脳ブロックを、４０μｍの浮遊断片に切断する前にＰＢＳで３回濯ぎ、３０％スクロース中に浸漬すること（低温保存）によって、浮遊断片のために処理した。
ＡＡＶベクターの生産
臨床評価の前に、ＡＡＶベクターは、典型的には、ベクターのパッケージングに必要なシス（ベクターゲノム）およびトランス（ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子；アデノウイルスヘルパー遺伝子Ｅ２Ａ、Ｅ４、およびＶＡ）エレメントをコードする２または３つのプラスミドと共にＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトする標準的な三重のトランスフェクション方法（ＴＴ）を介して生産される（Ｈａｕｃｋら、（２００９）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７：１４４～１５２）。プラスミドＤＮＡのインプットは容易かつ迅速に改変することができるため、この方法は、多様な血清型に基づくベクターの評価および様々な発現カセットの内包を可能にする。そのフレキシビリティーおよび比較的迅速な転換時間にもかかわらず、トランスフェクション方法は、臨床用途のためのラージスケールのｒＡＡＶベクター生産に対するこの方法の適性を制限する拡張性に関する課題を有する。
現時点で、臨床グレードのｒＡＡＶは、ヘルパーウイルスなしの一過性トランスフェクション方法、組換えバキュロウイルスまたは単純疱疹ウイルスベースの生産系、またはパッケージング／プロデューサー細胞株を介してラージスケールで生成される（Ａｙｕｓｏら、（２０１０）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１０：４２３～４３６）。アデノ関連ウイルスプロデューサー細胞株（ＰＣＬ）は、臨床グレードのＡＡＶベクターのラージスケール生産にとって有効な方法である。この系において、３つの要素、すなわちベクター配列、ＡＡＶ ｒｅｐ、およびｃａｐ遺伝子、ならびに選択可能マーカーの遺伝子を含有する単一のプラスミドは、ＨｅＬａＳ３細胞に安定してトランスフェクトされる。しかしながら、プロデューサー細胞株から誘導されたＡＡＶベクターが、他の方法、例えば標準的な一過性トランスフェクション方法により生成したベクターと、効力において等価であるかどうかを決定することが望ましい。
この研究のために、２つの異なる生産方法：三重のトランスフェクション（ＴＴ）およびプロデューサー細胞株（ＰＣＬ）を使用して、ＡＡＶウイルスベクターを生成した。組換えＡＡＶベクターＡＡＶ１－ＧＦＰ（ＴＴ）およびＡＡＶ２－ＧＦＰ（ＴＴ）を、ヒト胎児腎臓癌２９３細胞（ＨＥＫ－２９３）の三重のトランスフェクション（リン酸カルシウムを使用）によって生産した（Ｘｉａｏら、（１９９８）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２：２２２４～２２３２を参照）。簡単に言えば、一過性トランスフェクションによるＡＡＶベクターの生産のために、ＨＥＫ２９３細胞を、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）および１：１：１の比率の３つのプラスミド（ＩＴＲベクター、ＡＡＶ２ｒｅｐ／ｃａｐ２またはＡＡＶ２ｒｅｐ／ｃａｐ１、およびｐＡｄヘルパープラスミド）を使用してトランスフェクトした。ＩＴＲベクタープラスミドは、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリベータアクチン－ハイブリッドプロモーター（ＣＢＡ）の下流にあるＥＧＦＰのｃＤＮＡをコードしていた。使用されたｐＡｄヘルパーは、ｐＨｅｌｐｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ／Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）であった。
組換えＡＡＶベクターＡＡＶ１－ＧＦＰ（ＰＣＬ）およびＡＡＶ２－ＧＦＰ（ＰＣＬ）を、ＡＡＶプロデューサー細胞プロセスを使用して生産した（Ｔｈｏｒｎｅら、（２００
９）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０：７０７～７１４およびＭａｒｔｉｎら、（２０１３）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：２５３～２６９を参照）。簡単に言えば、ＨｅＬａ－Ｓ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－２．２）を、血清型２からのｒｅｐ遺伝子および血清型１または２のいずれかからのキャプシド遺伝子、プロモーター－異種核酸配列、ＡＡＶ２逆方向末端反復（ＩＴＲ）が隣接するベクターゲノム、ならびにピューロマイシン耐性遺伝子を含有するプラスミドで安定的にトランスフェクトすることによって、生成物特異的なプロデューサー細胞株を生成した。ベクターゲノムは、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリベータアクチン－ハイブリッドプロモーター、ＣＢＡの下流に、ＥＧＦＰに関するｃＤＮＡを内包していた。トランスフェクトされた細胞をピューロマイシンの存在下で成長させ、安定な組み込み体を単離した。生成した細胞株をスクリーニングして、リードクローンを選択した。その後生成物特異的な細胞クローンを生産バイオリアクターに拡張し、ＡＡＶ生産を開始させるためのヘルパーとして野生型アデノウイルスで感染させた。感染後７２時間にウイルスを回収し、アデノウイルスを熱で不活性化し、陰イオン交換方法によって除去した。
両方の生産プラットフォームからのＡＡＶの精製をこれまでに述べられたようにして実行した（Ｑｕ，Ｇ．ら（２００７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １４０：１８３～１９２）。表５に、全てのＡＡＶ１およびＡＡＶ２－ＧＦＰベクターに関して得られた力価を示す。全てのベクターを、１８０ｍＭの塩化ナトリウム；１０ｍＭのリン酸ナトリウム（５ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ＋５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４・Ｈ２Ｏ）；および０．００１％のポロキサマー１８８（Ｌｕｔｒｏｌ Ｆ６８）、ｐＨ７．５を含有する水中で調製した。
Figure 2023058630000006
免疫組織化学
ＧＦＰ（１：５００、ＡＢ３０８０；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）に対する抗体での免疫染色を、前頭皮質全体をカバーし線条体レベルに向かって後方に伸長するＺａｍｂｏｎｉで固定した４０μｍの環状断片に実行した。ＧＦＰ免疫陽性ニューロンの局在化を、Ｔｈｅ Ｒｈｅｓｕｓ Ｍｏｎｋｅｙ Ｂｒａｉｎ ｉｎ Ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ（Ｐａｘｉｎｏｓ，Ｇ．Ｈ．Ｘ．およびＴｏｇａ，Ａ．Ｗ．（２０００）Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）を参照しながら分析し、皮質および線条体における免疫染色の特異的な領域を同定した。
３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）によるＧＦＰ染色：断片（各６ｍｍのブロックにつき３つ：２ｍｍの間隔）を、ＰＢＳＴ中３回、それぞれ５分間洗浄し、続いて１％Ｈ２Ｏ２で２０分間処置した。スナイパーブロッキング溶液（ｂｉｏｃａｒｅ．ｎｅｔ／
ｐｒｏｄｕｃｔ／ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ－ｓｎｉｐｅｒ／においてオンラインで入手可能）中で断片を室温で３０分間インキュベートし、続いてＤａ Ｖｉｎｃｉ Ｇｒｅｅｎ希釈剤（ｂｉｏｃａｒｅ．ｎｅｔ／においてオンラインで入手可能）で１：１０００に希釈した一次抗ＧＦＰ抗体（ｗｗｗ．ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．ｃｏｍ／においてオンラインで入手可能）と共に一晩インキュベートした。０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０（ＰＢＳＴ）を含有するＰＢＳで３回、それぞれ５分間濯いだ後、断片をＭａｃｈ ２ＨＲＰポリマー（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｃａｒｅ．ｎｅｔ／）中で１時間インキュベートし、続いて３回洗浄し、比色展開した（ＤＡＢ）。免疫染色した断片をクレシルバイオレットで対比染色し、スライド上に載せ、Ｃｙｔｏｓｅａｌ（登録商標）（ｗｗｗ．ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ．ｃｏｍ／においてオンラインで入手可能）で密封した。
非ヒト霊長類（ＮＨＰ）の脳におけるＧＦＰ発現の被覆率の計算：一致するＩＨＣで染色された連続的な断片からのＧＦＰ染色を、個々の各サルの対応するＭＲＩスキャンの脳（冠状面におけるＴ１強調ＭＲ画像）上に投影した。ＧＦＰ発現の分布／被覆率を、ＯｓｉｒｉＸ Ｉｍａｇｉｎｇソフトウェアバージョン３．１（Ｔｈｅ ＯｓｉｒｉＸ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｇｅｎｅｖａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて実行した。
ベクター親和性およびニューロンの形質導入の効率のための二重免疫蛍光法：ＧＦＰを用いた異なる細胞マーカー（ＮｅｕＮ、Ｓ－１００、Ｉｂａ１）の二重蛍光免疫染色のために、一次抗体の組合せを、一次抗体のカクテルとして、２０％ウマ血清を含むＰＢＳＴ中で室温で一晩インキュベートすることによって断片に適用した。使用された一次抗体は以下の通りであった：抗ＧＦＰ抗体（１：５００、上記の通り）；抗ＮｅｕＮ（１：５００、ｗｗｗ．ｅｍｄｍｉｌｌｉｐｏｒｅ．ｃｏｍ／においてオンラインで入手可能）；抗Ｓ－１００（１：３００、ｂｉｏｃａｒｅ．ｎｅｔ／においてオンラインで入手可能）、抗Ｉｂａ１（１：５００、ｂｉｏｃａｒｅ．ｎｅｔ／においてオンラインで入手可能）；抗Ｏｌｉｇ２（１：５０、ｗｗｗ．ｅｍｄｍｉｌｌｉｐｏｒｅ．ｃｏｍ／においてオンラインで入手可能）。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、適切な二次蛍光色素コンジュゲート抗体：ヤギ抗マウスＤｙＬｉｇｈｔ５４９およびヤギ抗ウサギＤｙＬｉｇｈｔ４８８（ｗｗｗ．ｂｉｏｃａｒｅ．ｎｅｔ／においてオンラインで入手可能）と共に暗所で２時間インキュベートすることによって一次抗体を可視化した。全ての二次抗体を蛍光抗体希釈剤（ｂｉｏｃａｒｅ．ｎｅｔ／においてオンラインで入手可能）で１：１，０００に希釈した。加えて、自己蛍光を消すために、断片を０．１％スダンブラック溶液（７０％エタノール）中でインキュベートした。ＰＢＳでの最終的な洗浄の後、断片に蛍光用のＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ Ｈａｒｄ Ｓｅｔマウント媒体（ｗｗｗ．ｖｅｃｔｏｒｌａｂｓ．ｃｏｍ／においてオンラインで入手可能）と共にカバーガラスをかけた。対照断片を一次抗体なしで処理したところ、これらの条件下で有意な免疫染色は観察されなかった。
ＣＣＤカラービデオカメラおよび画像分析システム（Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎソフトウェア、ｗｗｗ．ｚｅｉｓｓ．ｃｏｍ／においてオンラインで入手可能）を備えたＺｅｉｓｓ
Ａｘｉｏｓｋｏｐ蛍光顕微鏡（ｗｗｗ．ｚｅｉｓｓ．ｃｏｍ／においてオンラインで入手可能）を使用して、二重標識された細胞（赤色および緑色のチャネルの両方において陽性）の存在を決定した。断片の位置または焦点（対物２０倍）を変更せずに２つの別々のチャネル（赤色および緑色；共局在は黄色に見える）からの画像を統合することによって、二重標識された断片の顕微鏡写真を得た。ＧＦＰ／ＮｅｕＮでの二重染色のために、各サルからの約４ｍｍ間隔での３つの断片を、ベクターの輸注部位から選択した。標的化された脳領域（尾状核および被殻）内のＡＡＶ１－ｅＧＦＰまたはＡＡＶ２－ｅＧＦＰベクターによってニューロンの形質導入の効率を評価するために、ＧＦＰ＋領域中に、５つの計数フレーム（７００μｍ×５５０μｍ）をランダムに設置した。形質導入の一次領域（ＰＡＴ）を、標的化構造の４０％超をカバーするＧＦＰ陽性領域（「クラウド」）と定義した。同様に、ＰＡＴ外側の（ＯＰＡＴ）ニューロンの形質導入の効率を評価するために
、各断片からの５つの計数フレーム（７００μｍ×５５０μｍ）を、標的化構造（尾状核および被殻）または皮質中のＧＦＰ陽性「クラウド」から十分な余白をとって選んだ（図１０Ｃ）。ＧＦＰ／ＮｅｕＮ陽性細胞の比率を決定するために、各計数フレームを２回計数し、１回目はＮｅｕＮ＋細胞の数のために赤色のチャネルで、２回目は共に染色された細胞（ＧＦＰ＋およびＮｅｕＮ＋）の数のために赤色および緑色のチャネルの組合せで計数した。３つの選ばれた断片のそれぞれにつき少なくとも１，５００個のＮｅｕＮ＋細胞を計数した（断片１つ当たり５つの計数フレーム）。最終的に、ＮｅｕＮ＋総数に対するＧＦＰ＋／ＮｅｕＮ＋のパーセンテージを決定した。線条体に関する全ての計算は、各動物の両方の構造で平均形質導入効率が同一であったため、各動物の両方の半球からの結果を足して、被殻および尾状核からの値を組み合わせることによってなされた。
定量リアルタイムＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ）
ＧＦＰのｍＲＮＡレベルを定量リアルタイムＰＣＲによって測定した。全てのＲＴ－ＰＣＲ分析に、肝臓、心臓、肺、腎臓、および脾臓サンプルを使用した。ＱＩＡＧＥＮ ｍｉＲＮｅａｓｙミニキットを使用して全ＲＮＡを抽出し、次いで高性能ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を製造元の説明書に従って使用して、逆転写し増幅した。定量ＲＴ－ＰＣＲ反応を実行し、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ１２Ｋ ＦｌｅｘリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で分析した。各サンプルを２連で試験し、相対的な遺伝子発現を標準曲線を使用して決定した。
磁気共鳴映像データの分析
半定量的分析（デジタルＭＲＩｓＶｄ／Ｖｉ）：分布体積（Ｖｄ）分析を、ＯｓｉｒｉＸ Ｉｍａｇｉｎｇソフトウェアバージョン３．１（Ｔｈｅ ＯｓｉｒｉＸ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｇｅｎｅｖａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて実行した。冠状面でのＴ１強調ＭＲ画像上で、輸注部位、カニューレのトラックおよびカニューレ先端を確認した。関心領域（ＲＯＩ）を描写し、Ｔ１ガドリニウムシグナルおよび標的部位（すなわち被殻および尾状核）の境界を明らかにした。一連の画像およびＲＯＩの３次元の容量式の再構築を分析して、輸注の分布容積（Ｖｄ）および輸注液の体積に対する比率（Ｖｉ）を推測した。
導入遺伝子発現の組織学的な分析：導入遺伝子発現を評価するために、脳断片を免疫組織化学的分析（ＩＨＣ）のために処理した。ベクター投与の４週間後に、動物をペントバルビタールナトリウム（２５ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．）で強く麻酔し、安楽死させた。脳を除去し、冠状に断片化して６ｍｍのブロックにした。ブロックを緩衝化パラホルムアルデヒド（４％）中で２４時間後固定し、短時間でＰＢＳ中で洗浄し、低温保存のために３０％スクロース／ＰＢＳ溶液中で調整した。クライオスタット中で、ホルマリン固定した脳ブロックを４０μｍの環状断片に切断した。脳全体にわたる浮遊断片を連続して収集し、さらなるＩＨＣ分析のために不凍溶液中で維持した。
結果
免疫組織化学によって可視化したところ、ＡＡＶ１－ＧＦＰおよびＡＡＶ２－ＧＦＰベクターの両方が、形質導入されたニューロンからの豊富なＧＦＰの発現をもたらした。ＣＥＤによって尾状核および被殻にＡＡＶ１を輸注した後、尾状核および被殻（図２ＣおよびＤ）に加えて黒質（図２Ｄ）で広範囲なＧＦＰ免疫染色が検出された。線条体に加えて、アカゲザルの脳の多数の皮質領域も形質導入された（図２Ａ～Ｄ）。皮質のＧＦＰ発現は、前頭連合野皮質領域、前運動皮質、一次体性感覚皮質領域、および一次運動皮質、加えて後頭皮質の広範囲な領域で最も明白であった（図２Ａ～Ｄ）。
皮質内のＧＦＰ陽性ニューロンの大部分は、上にある層への軸索投射を伴う皮質第ＩＶ層に配置された錐体ニューロンと形態学的に同定された。ＧＦＰ陽性ニューロンの密度は
前頭（図３ＡおよびＢ）および後頭皮質（図３ＣおよびＤ）で特に高く、そこでは星状細胞（図３ＡおよびＣ）に加えて多数のニューロン（図３ＢおよびＤ）が形質導入されていた。
実施例２：線条体内のＡＡＶ２ベクター送達後の広範にわたるＧＦＰ発現
対流強化送達（ＣＥＤ）を介して送達された場合のアカゲザルの脳において線条体および皮質構造の両方を効率的に標的化するＡＡＶ２の能力を評価した。サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリベータ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーターのコントロール下にＧＦＰのｃＤＮＡを含有するＡＡＶベクターを、上記の実施例１に記載の方法に従ってＣＥＤを使用して８匹の成体アカゲザルの尾状核および被殻に輸注した。
ＣＥＤによる線条体へのＡＡＶ２の輸注は、アカゲザルの脳の注射された領域（尾状核および被殻）（図４Ｃ）、黒質（図４Ｄ）、および多数の皮質領域（図４Ａ～Ｄ）においてＧＦＰ発現をもたらした。ＡＡＶ２が注射された動物の線条体におけるＧＦＰの発現は、ＡＡＶ１ベクターの線条体の被覆率と比較した場合、それよりわずかに限定的であり局所的であるように見えた。ＮＨＰ線条体内のＧＦＰの発現は広範にわたっていたが、比較的標的化領域の灰白質の境界内に含有されており、有意な輸注に関連する隣接する非標的化領域へのＡＡＶ２－ＧＦＰベクターの漏出または逆流の証拠はなかった。ＡＡＶ１で見られたのと同じ領域における皮質のＧＦＰ発現が明らかになった。前頭連合野皮質領域、前運動皮質、一次体性感覚皮質領域、および一次運動皮質、加えて後頭皮質の広範囲な領域がよく形質導入された（図４Ａ～Ｄ）。
実施例３：三重のトランスフェクションまたはプロデューサー細胞株プロセスによって作製された線条体内のＡＡＶ１およびＡＡＶ２ベクター後におけるＧＦＰ発現の比較可能性。
これまで前臨床研究の大部分は、三重のトランスフェクションによって作製されたＡＡＶベクター、続いて塩化セシウム勾配またはカラムクロマトグラフィーを使用した精製を利用してきた。したがって、インビボにおける生体内分布に対するベクター生産の影響を評価するために、ベクター生産の２つの方法、三重のトランスフェクション（ＴＴ）またはプロデューサー細胞株（ＰＣＬ）を比較した。これらの２つの異なる製造プラットフォームによって生成されたＡＡＶ１およびＡＡＶ２ベクターをＣＥＤを介して投与し、それらのアカゲザルの脳内の分布を比較した。
三重のトランスフェクションによって作製されたＡＡＶ１－ＧＦＰベクターの輸注は、プロデューサー細胞株プロセスによって作製されたＡＡＶ１－ＧＦＰベクターと比較した場合、同等のＧＦＰ分布および被覆率をもたらした。ＧＦＰ分布は、アカゲザルの線条体に注射してから３０日後において、ＡＡＶ１－ＧＦＰ（ＴＴ）（図５ＣおよびＤ）ベクターとＡＡＶ１－ＧＦＰ（ＰＣＬ）（図５ＡおよびＢ）ベクターとで同等であった。
ＡＡＶ２－ＧＦＰベクターでも類似の結果が見られた。ＧＦＰ分布は類似しており、ＡＡＶ２－ＧＦＰ（ＴＴ）（図６ＣおよびＤ）が注射された脳とＡＡＶ２－ＧＦＰ（ＰＣＬ）（図６ＡおよびＢ）が注射された脳とで同等であった。
輸注性能を測定するために、ＡＡＶ１－ｅＧＦＰ（ＴＴ）；ＡＡＶ２－ｅＧＦＰ（ＴＴ）；ＡＡＶ１－ｅＧＦＰ（ＰＣＬ）；およびＡＡＶ２－ｅＧＦＰ（ＰＣＬ）を、ガドリニウム造影剤（２ｍＭプロハンス；Ｂｒａｃｃｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）と混合された各ベクター９０μｌを使用して各線条体に輸注した（被殻に６０μｌおよび尾状核に３０μｌ）。各輸注からの磁気共鳴画像（ＭＲＩ）から、各カニューレの位置決めが正確であり、輸注液が標的領域をカバーしていたことが確認された。全ての輸注が標的構造中に十分含有されていた。ＭＲ画像上でのガドリニウムシグナルから生成した輸注液
分布の３次元の再構築から、両方の配置および輸注液の分布は全ての動物でよく一致していたことが示された。加えて、分布容積（Ｖｄ）と輸注体積（Ｖｉ）との比率（Ｖｄ／Ｖｉ）を各送達につき計算したところ、全ての輸注でデータが一致していた。ＶｄはＶｉよりおよそ３倍大きかった（２．１～４．６の範囲）（表６および７）。
Figure 2023058630000007
Figure 2023058630000008
ＮＨＰの線条体にＡＡＶ１－ｅＧＦＰおよびＡＡＶ２－ｅＧＦＰ（両方の生産方法、ＴＴおよびＰＣＬによって調製された）の両方を両側に注射した後、標的構造（被殻および尾状核）に加えて投射野（淡蒼球外節および内節－ＧＰｅおよびＧＰｉ、黒質－ＳＮ、視床下核－ＳＴＮ、皮質領域－ニューロン第ＩＶ層および第Ｖ層）の領域の両方にわたりｅＧＦＰのロバストな発現が明らかになった（図７）。
ベクター分布のマーカーとしてのガドリニウム（Ｇｄ）の役割を評価するために、対応するＭＲスキャンにおけるガドリニウムシグナルの面積に対するＧＦＰ発現の面積（組織切片からの）の比率を計算した。血清型ＡＡＶ１を輸注したサルの場合、この比率は１．
２１±０．１０であり、それに対してＡＡＶ２の場合、０．７４±０．０４であった（図８）。１．０の比率は、ＭＲＩによって決定した場合、ＧＦＰ発現とベクター分布との完全一致を示す。この差から、ＡＡＶ１ベクターはＧｄシグナルを超えて分散し、形質導入の一次領域におけるＡＡＶ２よりより優れた拡がりを達成したことが示された。
脳内の輸注されたＡＡＶベクターの分布を評価するために、各動物からの代表的な浮遊脳断片（各ブロックにつき３つ；厚さ４０μｍ）をウサギ抗ＧＦＰ抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；カタログ番号３８５０、１：５００希釈）で染色した。免疫組織化学的評価から、注射された標的（右および左被殻ならびに尾状核）に加えて注射された領域（皮質領域）から投影された複数の領域内に暗褐色のＤＡＢシグナルが解明された。
ＧＦＰ発現の程度を各サルの脳のＭＲＩスキャン上に投影することによって、皮質領域（ＨＤに関連する脳領域）の被覆率のパーセンテージを計算した（要約については表６、さらなる詳細については表７を参照）。全てのサルにおいて、平均して線条体の２４％が形質導入され、これが皮質において実質的なＧＦＰの発現をもたらした（図７）。皮質におけるＧＦＰ発現の程度は、使用されたＡＡＶ血清型（ＡＡＶ１対ＡＡＶ２）またはベクター生産方法（ＴＴ対ＰＣＬ）と相関していなかった。輸注部位（線条体）内における輸注液のより広い分布は、皮質における形質導入の程度の主要な駆動機構であると考えられる。１つのＮＨＰ（対象番号１；ＡＡＶ１－ｅＧＦＰ［ＴＴ］）は、脳全体の皮質領域（第ＩＶ層およびＶ層）への特にロバストなＧＦＰ発現の拡がりを示した（前頭および後頭の両方－図７を参照）。他の動物から、皮質の発現のばらつきは、尾状核および被殻内の程度および局所的な解剖学的領域の両方における変動と関連していたことが示された。線条体の前および交連領域を標的化したため、ＧＦＰは、前頭および頭頂皮質領域でより多く検出され、後頭皮質でより少なく検出された。以下に各動物の組織学的な分析を要約する（処置グループによってグループ分けした）。
処置グループ２（ｓｓＡＡＶ２／１－ＣＢＡ－ｅＧＦＰ ＴＴ）
全脳におけるｅＧＦＰ発現の免疫組織化学的評価から、標的化された部位（被殻および尾状核の両方）および投射された構造（淡蒼球、黒質、視床、視床下核、および皮質領域）におけるロバストなシグナルが解明された。
対象番号１。対象は、脳全体（前頭および後頭の両方）の皮質領域（４層および５層）へのＧＦＰ発現の特にロバストな拡がりを示した。ＧＦＰ陽性細胞の形態学は、ニューロンおよび星状細胞両方の形質導入を示唆しており、これは、後で二重免疫蛍光染色（以下を参照）によって確認された。ＧＦＰ発現の被覆率の計算から、皮質全体の９１％（表７を参照）が形質導入されたことが示された（この計算は、分析したサルの脳のＭＲＩスキャン上にＧＦＰシグナルの程度を投影することによって行われた）。
対象番号２。対象は、被殻および尾状核に加えて両方の半球の淡蒼球および黒質におけるロバストな形質導入を示した。ＧＦＰ発現の皮質への投射は、対象番号１ほど顕著ではなく、主として皮質の前頭領域で観察された。ＧＦＰシグナルは後頭皮質でも検出されたが、ＧＦＰ陽性細胞の密度はそれより有意に低かった。皮質のＧＦＰ発現の被覆率は５０％を占めていた（表７）。対象番号１と同様に、ＧＦＰ陽性細胞は、ニューロンおよび星状細胞両方の形態を有しており、これは、二重免疫蛍光によって確認された。
対象番号３。対象は、被殻および尾状核に加えて全ての投射された構造（淡蒼球、黒質、視床下核、視床、および皮質）において強いＧＦＰ発現を示した。皮質の一部の領域でＧＦＰシグナルが明らかに検出されたが、ＧＦＰ発現は、その全体の皮質の被覆率の４１％を占めたのみであった（全ての試験したサルで最も低かった；表７を参照）。ニューロンおよび星状細胞の両方が形質導入された。右前方の放射冠の大部分もＧＦＰ陽性シグナ
ルを示したが、これは、主として線条体を通るカニューレからのベクター流出の結果である可能性がある。
処置グループ３（ｓｓＡＡＶ２／２－ＣＢＡ－ｅＧＦＰ ＴＴ）
対象番号６。対象は、両方の標的化構造（被殻および尾状核）で強いＧＦＰシグナルを示した。高密度に散乱した陽性細胞が、これらの領域の両方で検出された。ＧＦＰ発現は、前頭皮質領域、淡蒼球、黒質、視床下核、および視床の一部にも拡がっていた。皮質におけるＧＦＰ発現の被覆率は、７５％を占めた（表７）。ＧＦＰ陽性細胞は、ほとんどニューロンの形態を有しており、これは、後で二重免疫蛍光によって確認された。星状細胞状のＧＦＰ陽性細胞が、内包で、加えて少数の皮質のスポットおよびごく近接する白質領域でも輸注カニューレの明らかに目に見えるトラックと共に検出された。
対象番号７。対象は、右および左線条体（被殻および尾状核の両方）内にＧＦＰ陽性シグナルを示した。その分布は、他の輸注されたサルと比較した場合、どちらかといえばまばらであり、パターンは一様というより「スポット状」に見えた。その結果として、全ての投射された脳構造におけるＧＦＰシグナルも、同様により弱いように見えた。皮質におけるＧＦＰ発現の被覆率は、４７％を占めた（表７）。ＧＦＰ陽性細胞は、ほとんどニューロンの形態を有しており、これは、後で二重免疫蛍光によって確認された。星状細胞状のＧＦＰ陽性細胞が、内包で、加えて少数の皮質のスポットおよびごく近接する白質領域でも輸注カニューレの明らかに目に見えるトラックと共に検出された。
処置グループ４（ｓｓＡＡＶ２／１－ＣＢＡ－ｅＧＦＰ ＰＣＬ）
対象番号４。対象は、標的化構造、被殻および尾状核において非常にロバストなＧＦＰ発現を示した。淡蒼球、黒質、視床下核、視床および皮質領域においてＧＦＰ陽性シグナルも検出された。皮質におけるＧＦＰ発現の被覆率は、６１％を占めていた（表７）。放射冠の前方部分もＧＦＰ陽性シグナルを示したが、これは、主として線条体を通るカニューレからのベクター流出の結果である可能性がある。陽性細胞は、ニューロンおよび星状細胞の形態の両方を有しており、これは、後で二重免疫蛍光によって確認された。
対象番号５。対象は、線条体（被殻および尾状核の両方）においてロバストなＧＦＰ発現を示した。投射された構造（淡蒼球、黒質、視床下核、視床および皮質領域）においてＧＦＰシグナルも検出された。皮質におけるＧＦＰ発現の被覆率は、６８％を占めた（表７）。放射冠の前方部分もＧＦＰ陽性シグナルを示したが、これは、主として線条体を通るカニューレからのベクター流出の結果である可能性がある。陽性細胞は、ニューロンおよび星状細胞の形態の両方を有していた。
処置グループ５（ｓｓＡＡＶ２／２－ＣＢＡ－ｅＧＦＰ ＰＣＬ）
対象番号９。線条体（被殻および尾状核の両方）において対象は、非常にロバストなＧＦＰ発現を示した。投射された構造（淡蒼球、黒質、視床下核、視床および皮質領域）においてＧＦＰシグナルも検出された。皮質におけるＧＦＰ発現の被覆率は、７３％を占めた（表７）。白質路（内包）内およびカニューレのトラックのすぐ隣に星状細胞状のＧＦＰ陽性細胞も検出されたが、ＧＦＰ陽性細胞は、ほとんどニューロンの形態を有していた。
対象番号８。対象は、線条体および投射された構造（淡蒼球、黒質、視床下核、視床および皮質領域）においてロバストなＧＦＰ発現を示した。皮質におけるＧＦＰ発現の被覆率は、５０％を占めた（表７）。白質路（内包、放射冠）内およびカニューレのトラックのすぐ隣に星状細胞状のＧＦＰ＋細胞も検出されたが、ＧＦＰ陽性細胞は、ほとんどニューロンの形態を有していた。
二重免疫蛍光
ＡＡＶ１－ｅＧＦＰベクター（ＴＴおよびＰＣＬ）で形質導入されたＮＨＰの両方のグループに関して、ＧＦＰ陽性細胞の形態学から、ニューロンおよび星状細胞両方の形質導入が示唆された（図９Ａ～９Ｄ）。これは、ＧＦＰおよびＮｅｕＮに対する抗体（ニューロンマーカー）またはＧＦＰおよびＳ－１００に対する抗体（星状細胞マーカー）の組合せを用いた二重免疫蛍光染色によって確認された（図１０Ａ～１０Ｃ）。対照的に、ＡＡＶ２－ｅＧＦＰ（ＴＴおよびＰＣＬの両方）は、優勢にニューロンの形質導入に向けられた（図９Ｅ～９Ｇおよび１０Ｄ）。星状細胞系統のＧＦＰ陽性細胞は、内包で（図９Ｈ）、加えて白質の皮質領域でも検出され、それらにおいて輸注カニューレのトラックが目に見えていた。
二重免疫蛍光に基づき、全てのＮＨＰについて線条体および皮質領域におけるニューロンの形質導入の効率を計算した（輸注部位の冠状面で）。図１１Ａは、線条体における発見を要約する。以下の表８に、各動物の個々の計算を示す。
Figure 2023058630000009
ＭＲＩによって示された一次形質導入の領域における線条体ニューロンの形質導入は、５０％～６５％の範囲であった。形質導入の最大効率は、ＡＡＶ１－ｅＧＦＰ（ＴＴ）が
輸注されたＮＨＰで観察され、平均は６４．２±５．９％であり、最小効率は、グループＡＡＶ２－ｅＧＦＰ（ＴＴ）で観察され、平均は４６．６±１１．７％であった（ｐ＜０．０５；二元配置ＡＮＯＶＡ）。これは、血清型ＡＡＶ１は、ニューロンの形質導入においてＡＡＶ２より約１８％高い効率を有することを示唆する。ＰＣＬによって生産されたＡＡＶ１－ｅＧＦＰは、ＡＡＶ２－ｅＧＦＰ（５０．１±５．８％）より多くのニューロンを形質導入すること（５９．７±８．１％）に対して、より弱い傾向を明示した（ｐ＞０．０５；二元配置ＡＮＯＶＡ）。
上記の計算は、ＭＲＩで定義されるような強いＧＦＰ形質導入の領域（形質導入の一次領域－ＰＡＴ）から導かれた。加えて、ＰＡＴの外側の領域におけるニューロンの線条体の形質導入効率を計算して、ＧＦＰ陽性細胞が強いＧＦＰシグナルの明確な境界の外側（「形質導入の一次領域の外側における」－ＯＰＡＴ）でも検出できるかどうかを調べたところ、おそらく全ての試験されたベクターが同じ方式で拡がることが示唆された。図１１Ｂに、これらの領域をどのように選ぶかのスキーム（５つの計数フレームのランダムな選択）を例示する。血清型ＡＡＶ１とＡＡＶ２との間の、ＯＰＡＴにおける形質導入効率の推測における劇的な差が観察され（図１１Ｃ）、ＡＡＶ１がＡＡＶ２より一層多くのニューロンに形質導入されていた（ＴＴグループの場合、８．１±３．８％対０．７４±０．２５％、ＰＣＬグループの場合、７．２±３．５％対２．１６±１．８％；ｐ＜０．０５、両方の比較で、二元配置ＡＮＯＶＡ）。以下の表９に、各動物の個々の計算を示す。
Figure 2023058630000010
加えて、線条体に投射する皮質領域中の形質導入の効率を計算した。皮質被覆率の程度は動物間で様々であるため、隣接するＧＦＰ陽性線条体を有する断片中のランダムな皮質領域を計数した。動物間で明らかな不一致が観察され（表８）、使用された血清型との明白な相関はなかった。ＡＡＶ１の場合のニューロンの平均形質導入効率は、ＡＡＶ２の場合が１３．４±９．０％であるのに対して、１３．６±８．３％であった（ｐ＞０．９７）。
上述したように、ＡＡＶ１－ｅＧＦＰは、ニューロンより一層多くの星状細胞（Ｓ－１００マーカー）に形質導入された。ＧＦＰ陽性星状細胞が、一次形質導入部位（線条体）に加えて線条体に投射する皮質領域でも検出された。図１０Ｃに、ＧＦＰが形質導入された星状細胞の例を示す。ＡＡＶ２－ｅＧＦＰベクターの場合、輸注カニューレのトラック周辺に散在性のＧＦＰ＋星状細胞しか検出できなかった。ベクターが脳における他の抗原提示細胞に形質導入されたかどうかを決定するために、全てのサルからの代表的な脳断片を、ＧＦＰに対する抗体と小グリア細胞に特異的なＩｂａ－１に対する抗体とで共に染色した。どの動物も二重標識された細胞を示さなかったことから、この可能性は排除された（図１０Ｅ）。したがって、全ての試験したサルにおいて、希突起膠細胞のマーカーであるＯｌｉｇ－２に対して染色したところ、ＧＦＰおよびＯｌｉｇ－２の両方に関して陽性の細胞は極めてわずかしか示されなかった。このようなまばらな細胞は、主としてカニュ
ーレのトラックの近くで検出された（データ示さず）。
脳断片をヘマトキシリン－エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色して、これらのベクターが神経炎症を引き起こしたかどうかを決定する。主として血管周囲の折り返し、すなわち血管の周りの密集した塊におけるリンパ球または形質細胞の蓄積の存在に関して断片を検査した。このような浸潤の様々な程度が全てのサルで検出されたが、他のベクター／導入遺伝子に関連する組織学的な発見は観察されなかった。しかしながら、ＡＡＶ１は、形質導入の一次領域内で、ＡＡＶ２の場合よりわずかに目立つマクロファージおよびリンパ球の浸潤を引き起こしたことが観察された（図１２Ａおよび１２Ｂ）。また、三重のトランスフェクションによって生産されたベクターも、プロデューサー細胞株プロセスによって生成したベクターより広範囲の血管周囲の折り返しを引き起こすようであった。注目すべきことに、形質導入の投射領域（皮質領域）に浸潤は検出されなかった。
実施例４：中枢神経系（ＣＮＳ）の外側の末梢組織における検出可能なＧＦＰ発現の非存在
剖検で、腎臓、肝臓、肺、心臓、および脾臓を包含する末梢器官組織を収集して、ＣＥＤによって投与されたＡＡＶ－ＧＦＰ導入遺伝子の発現がＣＮＳの外側で検出できるかどうかを評価した。
結果
収集した臓器のいずれにおいても検出可能なレベルのＧＦＰは検出されなかった。ＡＡＶ－ＧＦＰ（ＴＴ）（図１３Ａ）およびＡＡＶ－ＧＦＰ（ＰＣＬ）（図１３Ｂ）ベクターは両方とも、検出可能な末梢のＧＦＰの発現を示さなかった。このアッセイの陽性対照として、ＡＡＶ２／１－ＧＦＰ（ＴＴ）ベクターが注射されたマウス脳の組織が使用された。
結論
治療用タンパク質の脳への効率的な送達は、有害作用を最小化しながら臨床有効性を達成することへの深刻な障害であり続けている。遺伝子送達の発展によって、脳実質内での生物製剤生産を確立する機会が提供されてきた。これらの進歩が複数の臨床試験の開始につながり、それにおいてＡＡＶベクターが、神経障害を処置するための好ましいベクター系になってきた。特異的核の局限性の標的化は、定位の脳神経外科的な輸注によって確実に達成できるが、ヒト皮質の広範囲な入り組んだ配置は、ウイルスベクターの直接的な輸注では容易に標的化されない。脳中で広範にわたる遺伝子発現を安全に達成することが困難なために、皮質送達を必要とする神経疾患にとって可能性のある処置の開発が妨げられてきた。
本明細書に記載されるように、ＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ１およびＡＡＶ２）は、霊長類の線条体全体（尾状核および被殻）への広範囲な送達、加えて大脳皮質（前頭皮質、後頭皮質、および第ＩＶ層を包含する）、視床、および海馬内のかなり多数の細胞への送達を提供することが可能である。本明細書で論じられた研究において、ＧＦＰ、大脳皮質における公知の機能がないレポータータンパク質を利用した。ＣＥＤ送達方法を使用して尾状核および被殻に輸注されたＡＡＶ１およびＡＡＶ２－ＧＦＰは、尾状核および被殻の両方に加えて数種の皮質の領域において高レベルのＧＦＰ発現を引き起こした。前頭皮質におけるＧＦＰ陽性ニューロンをＡＡＶ－ＧＦＰ輸注部位から＞２０ｍｍに配置したところ、ＧＦＰタンパク質およびＡＡＶベクターの軸索輸送が実証された。理論に制限されることは望まないが、ＧＦＰは細胞質内に留まり、分泌されたタンパク質ではないため、皮質におけるＧＦＰの存在は、ＡＡＶ２ベクターの直接的な細胞形質導入および単一の軸索投射に沿った能動輸送を示すと考えられる。ハンチントン病は、ＡＡＶの線条体送達（例えば、ＣＥＤの線条体送達）が有用であり得る例示的な疾患である。ハンチントン病
は、線条体および皮質領域の両方に影響を与えるため、両方の領域を標的化する治療方策が理想的である。
本明細書で開示された発見は、線条体の輸注部位からかなりの距離に配置されたニューロンを形質導入するためのＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ１およびＡＡＶ２）の送達の可能性を明確に示すものである。したがって、ＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ１およびＡＡＶ２）の線条体内投与は、これらに限定されないがハンチントン病などの、線条体および皮質への治療的分子の送達を必要とするＣＮＳ障害の処置で使用するのに理想的である。加えて、三重のトランスフェクション方法およびプロデューサー細胞株方法によって生成したＡＡＶベクターは、同等の導入遺伝子発現パターンおよび形質導入レベルを示すことから、三重のトランスフェクションおよびプロデューサー細胞株によりＡＡＶベクターを生成する方法は、本発明で使用するのに好適である。

Claims (222)

  1. 哺乳動物の中枢神経系に組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を送達するための方法であって、線条体に該ｒＡＡＶ粒子を投与することを含み、該ｒＡＡＶ粒子は、該哺乳動物の少なくとも大脳皮質および線条体で発現される異種核酸をコードするｒＡＡＶベクターを含む、前記方法。
  2. 哺乳動物の中枢神経系にｒＡＡＶ粒子を送達するための方法であって、線条体に該ｒＡＡＶ粒子を投与することを含み、該ｒＡＡＶ粒子は、該哺乳動物の少なくとも大脳皮質および線条体で発現される異種核酸をコードするｒＡＡＶベクターを含み、該ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１）キャプシドを含む、前記方法。
  3. 哺乳動物の中枢神経系にｒＡＡＶ粒子を送達するための方法であって、線条体に該ｒＡＡＶ粒子を投与することを含み、該ｒＡＡＶ粒子は、該哺乳動物の少なくとも大脳皮質および線条体で発現される異種核酸をコードするｒＡＡＶベクターを含み、該ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）キャプシドを含む、前記方法。
  4. 哺乳動物は、ヒトである、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. ｒＡＡＶ粒子は、線条体の被殻および尾状核に投与される、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. ｒＡＡＶ粒子は、線条体の各半球の被殻および尾状核に投与される、請求項５に記載の方法。
  7. ｒＡＡＶ粒子は、尾状核における１つの部位および被殻における２つの部位に投与される、請求項５または６に記載の方法。
  8. 被殻に投与されるｒＡＡＶ粒子と尾状核に投与されるｒＡＡＶ粒子との比率は、少なくとも約２：１である、請求項５～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 異種核酸は、哺乳動物の前頭皮質、後頭皮質、および／または第ＩＶ層で発現される、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 異種核酸は、前頭連合野皮質領域、前運動皮質、一次体性感覚皮質領域、感覚運動皮質、頭頂皮質、後頭皮質、および／または一次運動皮質で発現される、請求項９に記載の方法。
  11. ｒＡＡＶ粒子は、大脳皮質において逆行性または順行性輸送を受ける、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 異種核酸は、視床、視床下核、淡蒼球、黒質および／または海馬でさらに発現される、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２－７ｍ８、ＡＡＶ ＤＪ、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋ、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶキャプシド ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１血清型キャプシドを含む、請求項１または４～１２
    のいずれか１項に記載の方法。
  14. ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、またはＡＡＶｒｈ１０である、請求項１３に記載の方法。
  15. ｒＡＡＶベクターは、１つまたはそれ以上のＡＡＶの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列が隣接する異種核酸を含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 異種核酸に、２つのＡＡＶのＩＴＲが隣接する、請求項１５に記載の方法。
  17. ＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、または マウスＡＡＶ血清型ＩＴＲである、請求項１５または１６に記載の方法。
  18. ＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶ２のＩＴＲである、請求項１５～１７のいずれか１項に記載の方法。
  19. ｒＡＡＶ粒子のＩＴＲおよびキャプシドは、同じＡＡＶ血清型から誘導される、請求項１５または１６に記載の方法。
  20. ＩＴＲおよびキャプシドは、ＡＡＶ２から誘導される、請求項３～１２のいずれか１項に記載の方法。
  21. ｒＡＡＶウイルス粒子のＩＴＲおよびキャプシドは、異なるＡＡＶ血清型から誘導される、請求項１５または１６に記載の方法。
  22. ＩＴＲは、ＡＡＶ２から誘導され、キャプシドは、ＡＡＶ１から誘導される、請求項２および４～１２のいずれか１項に記載の方法。
  23. 異種核酸は、プロモーターに機能するように連結されている、請求項１～２２のいずれか１項に記載の方法。
  24. プロモーターは、ＣＮＳの細胞中で異種核酸を発現する、請求項２３に記載の方法。
  25. プロモーターは、脳の細胞中で異種核酸を発現する、請求項２３または２４に記載の方法。
  26. プロモーターは、ニューロンおよび／またはグリア細胞中で異種核酸を発現する、請求項２３～２５のいずれか１項に記載の方法。
  27. ニューロンは、尾状核の中型有棘ニューロン、被殻の中型有棘ニューロン、皮質第ＩＶ層のニューロンおよび／または皮質第Ｖ層のニューロンである、請求項２６に記載の方法。
  28. プロモーターは、ＣＢＡプロモーター、最小のＣＢＡプロモーター、ＣＭＶプロモーターまたはＧＵＳＢプロモーターである、請求項２３～２７のいずれか１項に記載の方法。
  29. プロモーターは、誘導性である、請求項２３～２７のいずれか１項に記載の方法。
  30. ｒＡＡＶベクターは、エンハンサー、スプライスドナー／スプライスアクセプター対、マトリックスアタッチメント部位、またはポリアデニル化シグナルの１つまたはそれ以上を含む、請求項２３～２９のいずれか１項に記載の方法。
  31. ｒＡＡＶベクターは、自己相補的なｒＡＡＶベクターである、請求項１～３０のいずれか１項に記載の方法。
  32. ベクターは、異種核酸をコードする第１の核酸配列および異種核酸の相補物をコードする第２の核酸配列を含み、第１の核酸配列は、その長さのほとんどまたは全てにわたり、第２の核酸配列と鎖内の塩基対を形成することができる、請求項３１に記載の方法。
  33. 第１の核酸配列および第２の核酸配列は、突然変異したＡＡＶのＩＴＲによって連結されており、突然変異したＡＡＶのＩＴＲは、Ｄ領域の欠失を含み、末端分解配列の突然変異を含む、請求項３２に記載の方法。
  34. 異種核酸は、治療用ポリペプチドまたは治療用核酸をコードする、請求項１～３３のいずれか１項に記載の方法。
  35. 異種核酸は、治療用ポリペプチドをコードする、請求項３４に記載の方法。
  36. 治療用ポリペプチドは、酵素、神経栄養因子、ＣＮＳ関連の障害を有する個体において不足しているかまたは突然変異しているポリペプチド、抗酸化剤、抗アポトーシス因子、抗血管新生因子、および抗炎症性因子、アルファ－シヌクレイン、酸性ベータ－グルコシダーゼ（ＧＢＡ）、ベータ－ガラクトシダーゼ－１（ＧＬＢ１）、イズロン酸２－スルファターゼ（ＩＤＳ）、ガラクトシルセラミダーゼ（ＧＡＬＣ）、マンノシダーゼ、アルファ－Ｄ－マンノシダーゼ（ＭＡＮ２Ｂ１）、ベータ－マンノシダーゼ（ＭＡＮＢＡ）、プソイドアリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）、Ｎ－アセチルグルコサミン－１－ホスホトランスフェラーゼ（ＧＮＰＴＡＢ）、酸性スフィンゴミエリナーゼ（ＡＳＭ）、ニーマン－ピックＣ型タンパク質（ＮＰＣ１）、酸性アルファ－１，４－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）、ヘキソサミニダーゼベータサブユニット、ＨＥＸＢ、Ｎ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＭＰＳ３Ａ）、Ｎ－アルファ－アセチルグルコサミニダーゼ（ＮＡＧＬＵ）、ヘパリンアセチル－ＣｏＡ、アルファ－グルコサミニダーゼＮ－アセチルトランスフェラーゼ（ＭＰＳ３Ｃ）、Ｎ－アセチルグルコサミン－６－スルファターゼ（ＧＮＳ）、アルファ－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼ（ＮＡＧＡ）、ベータ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）、ヘキソサミニダーゼアルファサブユニット（ＨＥＸＡ）、ハンチンチン（ＨＴＴ）、リソソーム酸性リパーゼ（ＬＩＰＡ）、アスパルチルグルコサミニダーゼ、アルファ－ガラクトシダーゼＡ、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ、トリペプチジルペプチダーゼ、リソソーム膜貫通タンパク質、システイン輸送体、酸性セラミダーゼ、酸性アルファ－Ｌ－フコシダーゼ、カテプシンＡ、アルファ－Ｌ－イズロニダーゼ、アリールスルファターゼＢ、アリールスルファターゼＡ、Ｎ－アセチルガラクトサミン－６－スルフェート、酸性ベータ－ガラクトシダーゼ、またはアルファ－ノイラミダーゼである、請求項３５に記載の方法。
  37. 異種核酸は、治療用核酸をコードする、請求項３５に記載の方法。
  38. 治療用核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムまたはＤＮＡザイムである、請求項３７に記載の方法。
  39. 治療用ポリペプチドまたは治療用核酸は、ＣＮＳの障害を処置するのに使用される、請求項３４～３８のいずれか１項に記載の方法。
  40. ＣＮＳの障害は、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）、ハンチントン病、てんかん、パーキンソン病、アルツハイマー病、卒中、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、大脳皮質基底核神経節変性症（ＣＢＧＤ）、前頭側頭認知症（ＦＴＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、進行性核上麻痺（ＰＳＰ）または脳のがんである、請求項３９に記載の方法。
  41. 障害は、アスパルチルグルコサミン尿症、ファブリー、乳児期バッテン病（ＣＮＬ１）、古典的後期の乳児期バッテン病（ＣＮＬ２）、若年性のバッテン病（ＣＮＬ３）、バッテン型ＣＮＬ４、バッテン型ＣＮＬ５、バッテン型ＣＮＬ６、バッテン型ＣＮＬ７、バッテン型ＣＮＬ８、シスチン症、ファーバー、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシス、ゴーシェ病１型、ゴーシェ病２型、ゴーシェ病３型、ＧＭ１ガングリオシド症、ハンター病、クラッベ病、αマンノシドーシス病、βマンノシドーシス病、マロトー－ラミー、異染性白質ジストロフィー病、モルキオＡ型、モルキオＢ型、ムコリピドーシスＩＩ／ＩＩＩ疾患、ニーマン－ピック病Ａ型、ニーマン－ピック病Ｂ型、ニーマン－ピック病Ｃ型、ポンペ病、サンドホフ病、サンフィリッポ病Ａ型、サンフィリッポ病Ｂ型、サンフィリッポ病Ｃ型、サンフィリッポ病Ｄ型、シンドラー病、シンドラー－カンザキ、シアリドーシス、スライ病、テイ－サックス病、およびウォールマン病からなる群より選択されるリソソーム蓄積症である、請求項４０に記載の方法。
  42. ｒＡＡＶ粒子は、組成物の形態である、請求項１～４１のいずれか１項に記載の方法。
  43. 組成物は、医薬的に許容される賦形剤を含む医薬組成物である、請求項４２に記載の方法。
  44. ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクターをコードする核酸、ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐをコードする核酸、ならびにＡＡＶヘルパーウイルス機能をコードする核酸の宿主細胞への三重のトランスフェクションによって生産されたものであり、該宿主細胞への該核酸のトランスフェクションは、ｒＡＡＶ粒子を生産することが可能な宿主細胞を生成する、請求項１～４３のいずれか１項に記載の方法。
  45. ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクターをコードする核酸、ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐをコードする核酸、ならびにＡＡＶヘルパーウイルス機能をコードする核酸の１つまたはそれ以上を含むプロデューサー細胞株によって生産されたものである、請求項１～４３のいずれか１項に記載の方法。
  46. ｒＡＡＶ粒子は、定位送達によって送達される、請求項１～４５のいずれか１項に記載の方法。
  47. ｒＡＡＶ粒子は、対流強化送達によって送達される、請求項１～４５のいずれか１項に記載の方法。
  48. ｒＡＡＶ粒子は、ＣＥＤ送達システムを使用して送達される、請求項４７に記載の方法。
  49. ＣＥＤシステムは、カニューレおよび／またはポンプを含む、請求項４８に記載の方法。
  50. カニューレは、逆流抵抗性カニューレまたは段階的カニューレである、請求項４９に記
    載の方法。
  51. ポンプは、手動ポンプである、請求項５０に記載の方法。
  52. ポンプは、浸透圧ポンプである、請求項５０に記載の方法。
  53. ポンプは、輸注ポンプである、請求項５０に記載の方法。
  54. 哺乳動物におけるＣＮＳの障害を処置する方法であって、請求項１～５３のいずれか１項に記載の方法によって該哺乳動物にｒＡＡＶ粒子の有効量を投与することを含む、前記方法。
  55. 哺乳動物におけるハンチントン病を処置する方法であって、線条体にｒＡＡＶ粒子の有効量を投与することを含み、該ｒＡＡＶ粒子は、該哺乳動物の少なくとも大脳皮質および線条体で発現される異種核酸をコードするｒＡＡＶベクターを含む、前記方法。
  56. ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１キャプシドまたはＡＡＶ２キャプシドを含む、請求項５５に記載の方法。
  57. 哺乳動物におけるパーキンソン病を処置する方法であって、線条体にｒＡＡＶ粒子の有効量を投与することを含み、該ｒＡＡＶ粒子は、該哺乳動物の少なくとも大脳皮質および線条体で発現される異種核酸をコードするｒＡＡＶベクターを含む、前記方法。
  58. ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２キャプシドを含む、請求項５７に記載の方法。
  59. 哺乳動物は、ヒトである、請求項５５～５８のいずれか１項に記載の方法。
  60. ｒＡＡＶ粒子は、線条体の被殻および尾状核に投与される、請求項５５～５９のいずれか１項に記載の方法。
  61. ｒＡＡＶ粒子は、線条体の各半球の被殻および尾状核に投与される、請求項５８に記載の方法。
  62. ｒＡＡＶ粒子は、尾状核における１つの部位および被殻における２つの部位に投与される、請求項６０または６１に記載の方法。
  63. 被殻に投与されるｒＡＡＶ粒子と尾状核に投与されるｒＡＡＶ粒子との比率は、少なくとも約２：１である、請求項５５～６２のいずれか１項に記載の方法。
  64. 異種核酸は、哺乳動物の前頭皮質、後頭皮質、および／または第ＩＶ層で発現される、請求項５５～６３のいずれか１項に記載の方法。
  65. 異種核酸は、前頭連合野皮質領域、前運動皮質、一次体性感覚皮質領域、感覚運動皮質、頭頂皮質、後頭皮質、および／または一次運動皮質で発現される、請求項６２に記載の方法。
  66. ｒＡＡＶ粒子は、大脳皮質において逆行性または順行性輸送を受ける、請求項５５～６３のいずれか１項に記載の方法。
  67. 異種核酸は、視床、視床下核、淡蒼球、黒質および／または海馬でさらに発現される、
    請求項５５～６６のいずれか１項に記載の方法。
  68. ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２－７ｍ８、ＡＡＶ ＤＪ、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋ、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶキャプシド ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１血清型キャプシドを含む、請求項５５または５９～６５のいずれか１項に記載の方法。
  69. ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、またはＡＡＶｒｈ１０である、請求項６８に記載の方法。
  70. ｒＡＡＶベクターは、１つまたはそれ以上のＡＡＶの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列が隣接する異種核酸を含む、請求項５５～６９のいずれか１項に記載の方法。
  71. 異種核酸に、２つのＡＡＶのＩＴＲが隣接する、請求項７０に記載の方法。
  72. ＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶ血清型のＩＴＲである、請求項７０または７１に記載の方法。
  73. ＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶ２のＩＴＲである、請求項７０～７２のいずれか１項に記載の方法。
  74. ｒＡＡＶ粒子のＩＴＲおよびキャプシドは、同じＡＡＶ血清型から誘導される、請求項７０または７１に記載の方法。
  75. ＩＴＲおよびキャプシドは、ＡＡＶ２から誘導される、請求項７４に記載の方法。
  76. ｒＡＡＶウイルス粒子のＩＴＲおよびキャプシドは、異なるＡＡＶ血清型から誘導される、請求項７０または７１に記載の方法。
  77. ＩＴＲは、ＡＡＶ２から誘導され、キャプシドは、ＡＡＶ１から誘導される、請求項７６に記載の方法。
  78. 異種核酸は、プロモーターに機能するように連結されている、請求項５５～７７のいずれか１項に記載の方法。
  79. プロモーターは、ＣＮＳの細胞中で異種核酸を発現する、請求項７８に記載の方法。
  80. プロモーターは、脳の細胞中で異種核酸を発現する、請求項７８または７９に記載の方法。
  81. プロモーターは、ニューロンおよび／またはグリア細胞中で異種核酸を発現する、請求項７８～８０のいずれか１項に記載の方法。
  82. ニューロンは、尾状核の中型有棘ニューロン、被殻の中型有棘ニューロン、皮質第ＩＶ層のニューロンおよび／または皮質第Ｖ層のニューロンである、請求項８１に記載の方法。
  83. プロモーターは、ＣＢＡプロモーター、最小のＣＢＡプロモーター、ＣＭＶプロモーターまたはＧＵＳＢプロモーターである、請求項７８～８２のいずれか１項に記載の方法。
  84. プロモーターは、誘導性である、請求項７８～８２のいずれか１項に記載の方法。
  85. ｒＡＡＶベクターは、エンハンサー、スプライスドナー／スプライスアクセプター対、マトリックスアタッチメント部位、またはポリアデニル化シグナルの１つまたはそれ以上を含む、請求項７８～８４のいずれか１項に記載の方法。
  86. ｒＡＡＶベクターは、自己相補的なｒＡＡＶベクターである、請求項５５～８５のいずれか１項に記載の方法。
  87. ベクターは、異種核酸をコードする第１の核酸配列および異種核酸の相補物をコードする第２の核酸配列を含み、第１の核酸配列は、その長さのほとんどまたは全てにわたり、第２の核酸配列と鎖内の塩基対を形成することができる、請求項８６に記載の方法。
  88. 第１の核酸配列および第２の核酸配列は、突然変異したＡＡＶのＩＴＲによって連結されており、突然変異したＡＡＶのＩＴＲは、Ｄ領域の欠失を含み、末端分解配列の突然変異を含む、請求項８７に記載の方法。
  89. 異種核酸は、治療用ポリペプチドまたは治療用核酸をコードする、請求項５５～８８のいずれか１項に記載の方法。
  90. 異種核酸は、哺乳動物のＣＮＳの細胞においてＨＴＴの発現を阻害するかまたはＨＴＴの蓄積を阻害する治療用ポリペプチドまたは治療用核酸をコードする、請求項５５、５６または５８～８８のいずれか１項に記載の方法。
  91. 異種核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムまたはＤＮＡザイムをコードする、請求項８９または９０に記載の方法。
  92. 異種核酸は、ハンチンチンを標的化するｍｉＲＮＡをコードする、請求項５５、５６、または５８～８８のいずれか１項に記載の方法。
  93. ハンチンチンは、ハンチントン病に関連する突然変異を含む、請求項９２に記載の方法。
  94. 異種核酸は、治療用ポリペプチドをコードし、該治療用ポリペプチドは、グリア細胞由来増殖因子（ＧＤＮＦ）、脳由来の増殖因子（ＢＤＮＦ）、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、ＧＴＰ－シクロヒドロラーゼ（ＧＴＰＣＨ）、および／またはアミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）である、請求項５７～８８のいずれか１項に記載の方法。
  95. ｒＡＡＶ粒子は、組成物の形態である、請求項５５～９４のいずれか１項に記載の方法。
  96. 組成物は、医薬的に許容される賦形剤を含む医薬組成物である、請求項９５に記載の方法。
  97. ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクターをコードする核酸、ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐをコードする核酸、ならびにＡＡＶヘルパーウイルス機能をコードする核酸の宿主細胞への三重のトランスフェクションによって生産されたものであり、該宿主細胞への該核酸のトランスフェクションは、ｒＡＡＶ粒子を生産することが可能な宿主細胞を生成する、請求項５５～９６のいずれか１項に記載の方法。
  98. ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクターをコードする核酸、ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐをコードする核酸、ならびにＡＡＶヘルパーウイルス機能をコードする核酸の１つまたはそれ以上を含むプロデューサー細胞株によって生産されたものである、請求項５５～９６のいずれか１項に記載の方法。
  99. ｒＡＡＶ粒子は、定位送達によって送達される、請求項５５～９８のいずれか１項に記載の方法。
  100. ｒＡＡＶ粒子は、対流強化送達によって送達される、請求項５５～９９のいずれか１項に記載の方法。
  101. ｒＡＡＶ粒子は、ＣＥＤ送達システムを使用して送達される、請求項９７に記載の方法。
  102. ＣＥＤシステムは、カニューレおよび／またはポンプを含む、請求項１０１に記載の方法。
  103. カニューレは、逆流抵抗性カニューレまたは段階的カニューレである、請求項１０２に記載の方法。
  104. ポンプは、手動ポンプである、請求項１０２に記載の方法。
  105. ポンプは、浸透圧ポンプである、請求項１０２に記載の方法。
  106. ポンプは、輸注ポンプである、請求項１０２に記載の方法。
  107. 哺乳動物の大脳皮質および線条体における異種核酸の発現のためのシステムであって、
    ａ）ｒＡＡＶ粒子を含む組成物であって、該ｒＡＡＶ粒子は、該異種核酸をコードするｒＡＡＶベクターを含む、組成物；および
    ｂ）該ｒＡＡＶ粒子を線条体に送達するためのデバイス
    を含む、前記システム。
  108. ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１キャプシドまたはＡＡＶ２キャプシドを含む、請求項１０７に記載のシステム。
  109. 哺乳動物は、ヒトである、請求項１０７または１０８に記載のシステム。
  110. ｒＡＡＶ粒子は、線条体の被殻および尾状核に投与される、請求項１０７～１０９のいずれか１項に記載のシステム。
  111. ｒＡＡＶ粒子は、線条体の各半球の被殻および尾状核に投与される、請求項１１０に記載のシステム。
  112. 異種核酸は、哺乳動物の前頭皮質、後頭皮質、および／または第ＩＶ層で発現される、請求項１０７～１１１のいずれか１項に記載のシステム。
  113. 異種核酸は、前頭連合野皮質領域、前運動皮質、一次体性感覚皮質領域、感覚運動皮質、頭頂皮質、後頭皮質、および／または一次運動皮質で発現される、請求項１１２に記載のシステム。
  114. ｒＡＡＶ粒子は、大脳皮質において逆行性または順行性輸送を受ける、請求項１０７～１１３のいずれか１項に記載のシステム。
  115. 異種核酸は、視床、視床下核、淡蒼球、黒質および／または海馬でさらに発現される、請求項１０７～１１４のいずれか１項に記載のシステム。
  116. ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２－７ｍ８、ＡＡＶ ＤＪ、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋ、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶキャプシド ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１血清型キャプシドを含む、請求項１０７または１０９～１１５のいずれか１項に記載のシステム。
  117. ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、またはＡＡＶｒｈ１０である、請求項１１６に記載のシステム。
  118. ｒＡＡＶベクターは、１つまたはそれ以上のＡＡＶの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列が隣接する異種核酸を含む、請求項１０７～１１７のいずれか１項に記載のシステム。
  119. 異種核酸に、２つのＡＡＶのＩＴＲが隣接する、請求項１１８に記載のシステム。
  120. ＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶ血清型のＩＴＲである、請求項１１８または１１９に記載のシステム。
  121. ＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶ２のＩＴＲである、請求項１１８～１２０のいずれか１項に記載のシステム。
  122. ｒＡＡＶ粒子のＩＴＲおよびキャプシドは、同じＡＡＶ血清型から誘導される、請求項１１８または１１９に記載のシステム。
  123. ＩＴＲおよびキャプシドは、ＡＡＶ２から誘導される、請求項１２２に記載のシステム。
  124. ｒＡＡＶウイルス粒子のＩＴＲおよびキャプシドは、異なるＡＡＶ血清型から誘導される、請求項１１８または１１９に記載のシステム。
  125. ＩＴＲは、ＡＡＶ２から誘導され、キャプシドは、ＡＡＶ１から誘導される、請求項１２４に記載のシステム。
  126. 異種核酸は、プロモーターに機能するように連結されている、請求項１０７～１２５のいずれか１項に記載のシステム。
  127. プロモーターは、ＣＮＳの細胞中で異種核酸を発現する、請求項１２６に記載のシステム。
  128. プロモーターは、脳の細胞中で異種核酸を発現する、請求項１２６または１２７に記載のシステム。
  129. プロモーターは、ニューロンまたはグリア細胞中で異種核酸を発現する、請求項１２６～１２８のいずれか１項に記載のシステム。
  130. ニューロンは、尾状核の中型有棘ニューロン、被殻の中型有棘ニューロン、皮質第ＩＶ層のニューロンおよび／または皮質第Ｖ層のニューロンである、請求項１２９に記載のシステム。
  131. プロモーターは、ＣＢＡプロモーター、最小のＣＢＡプロモーター、ＣＭＶプロモーターまたはＧＵＳＢプロモーターである、請求項１２６～１３０のいずれか１項に記載のシステム。
  132. プロモーターは、誘導性である、請求項１２６～１３０のいずれか１項に記載のシステム。
  133. ｒＡＡＶベクターは、エンハンサー、スプライスドナー／スプライスアクセプター対、マトリックスアタッチメント部位、またはポリアデニル化シグナルの１つまたはそれ以上を含む、請求項１２６～１３２のいずれか１項に記載のシステム。
  134. ｒＡＡＶベクターは、自己相補的なｒＡＡＶベクターである、請求項１０７～１３３のいずれか１項に記載のシステム。
  135. ベクターは、異種核酸をコードする第１の核酸配列および異種核酸の相補物をコードする第２の核酸配列を含み、第１の核酸配列は、その長さのほとんどまたは全てにわたり、第２の核酸配列と鎖内の塩基対を形成することができる、請求項１３４に記載のシステム。
  136. 第１の核酸配列および第２の核酸配列は、突然変異したＡＡＶのＩＴＲによって連結されており、突然変異したＡＡＶのＩＴＲは、Ｄ領域の欠失を含み、末端分解配列の突然変異を含む、請求項１３５に記載のシステム。
  137. 異種核酸は、治療用ポリペプチドまたは治療用核酸をコードする、請求項１０７～１３６のいずれか１項に記載のシステム。
  138. 異種核酸は、治療用ポリペプチドをコードする、請求項１３７に記載のシステム。
  139. 治療用ポリペプチドは、酵素、神経栄養因子、ＣＮＳ関連の障害を有する個体において不足しているかまたは突然変異しているポリペプチド、抗酸化剤、抗アポトーシス因子、抗血管新生因子、および抗炎症性因子、アルファ－シヌクレイン、酸性ベータ－グルコシダーゼ（ＧＢＡ）、ベータ－ガラクトシダーゼ－１（ＧＬＢ１）、イズロン酸２－スルファターゼ（ＩＤＳ）、ガラクトシルセラミダーゼ（ＧＡＬＣ）、マンノシダーゼ、アルフ
    ァ－Ｄ－マンノシダーゼ（ＭＡＮ２Ｂ１）、ベータ－マンノシダーゼ（ＭＡＮＢＡ）、プソイドアリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）、Ｎ－アセチルグルコサミン－１－ホスホトランスフェラーゼ（ＧＮＰＴＡＢ）、酸性スフィンゴミエリナーゼ（ＡＳＭ）、ニーマン－ピックＣ型タンパク質（ＮＰＣ１）、酸性アルファ－１，４－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）、ヘキソサミニダーゼベータサブユニット、ＨＥＸＢ、Ｎ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＭＰＳ３Ａ）、Ｎ－アルファ－アセチルグルコサミニダーゼ（ＮＡＧＬＵ）、ヘパリンアセチル－ＣｏＡ、アルファ－グルコサミニダーゼＮ－アセチルトランスフェラーゼ（ＭＰＳ３Ｃ）、Ｎ－アセチルグルコサミン－６－スルファターゼ（ＧＮＳ）、アルファ－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼ（ＮＡＧＡ）、ベータ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）、ヘキソサミニダーゼアルファサブユニット（ＨＥＸＡ）、ハンチンチン（ＨＴＴ）、リソソーム酸性リパーゼ（ＬＩＰＡ）、アスパルチルグルコサミニダーゼ、アルファ－ガラクトシダーゼＡ、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ、トリペプチジルペプチダーゼ、リソソーム膜貫通タンパク質、システイン輸送体、酸性セラミダーゼ、酸性アルファ－Ｌ－フコシダーゼ、カテプシンＡ、アルファ－Ｌ－イズロニダーゼ、アリールスルファターゼＢ、アリールスルファターゼＡ、Ｎ－アセチルガラクトサミン－６－スルフェート、酸性ベータ－ガラクトシダーゼ、またはアルファ－ノイラミダーゼである、請求項１３８に記載のシステム。
  140. 異種核酸は、治療用核酸をコードする、請求項１３８に記載のシステム。
  141. 治療用核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムまたはＤＮＡザイムである、請求項１４０に記載のシステム。
  142. 治療用ポリペプチドまたは治療用核酸は、ＣＮＳの障害を処置するのに使用される、請求項１３７～１４１のいずれか１項に記載のシステム。
  143. ＣＮＳの障害は、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）、ハンチントン病、てんかん、パーキンソン病、アルツハイマー病、卒中、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、大脳皮質基底核神経節変性症（ＣＢＧＤ）、前頭側頭認知症（ＦＴＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、進行性核上麻痺（ＰＳＰ）または脳のがんである、請求項１４２に記載のシステム。
  144. 障害は、アスパルチルグルコサミン尿症、ファブリー、乳児期バッテン病（ＣＮＬ１）、古典的後期の乳児期バッテン病（ＣＮＬ２）、若年性のバッテン病（ＣＮＬ３）、バッテン型ＣＮＬ４、バッテン型ＣＮＬ５、バッテン型ＣＮＬ６、バッテン型ＣＮＬ７、バッテン型ＣＮＬ８、シスチン症、ファーバー、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシス、ゴーシェ病１型、ゴーシェ病２型、ゴーシェ病３型、ＧＭ１ガングリオシド症、ハンター病、クラッベ病、αマンノシドーシス病、βマンノシドーシス病、マロトー－ラミー、異染性白質ジストロフィー病、モルキオＡ型、モルキオＢ型、ムコリピドーシスＩＩ／ＩＩＩ疾患、ニーマン－ピック病Ａ型、ニーマン－ピック病Ｂ型、ニーマン－ピック病Ｃ型、ポンペ病、サンドホフ病、サンフィリッポ病Ａ型、サンフィリッポ病Ｂ型、サンフィリッポ病Ｃ型、サンフィリッポ病Ｄ型、シンドラー病、シンドラー－カンザキ、シアリドーシス、スライ病、テイ－サックス病、およびウォールマン病からなる群より選択されるリソソーム蓄積症である、請求項１４３に記載のシステム。
  145. ｒＡＡＶ粒子は、組成物の形態である、請求項１０７～１４４のいずれか１項に記載のシステム。
  146. 組成物は、医薬的に許容される賦形剤を含む医薬組成物である、請求項１４５に記載のシステム。
  147. ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクターをコードする核酸、ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐをコードする核酸、ならびにＡＡＶヘルパーウイルス機能をコードする核酸の宿主細胞への三重のトランスフェクションによって生産されたものであり、該宿主細胞への該核酸のトランスフェクションは、ｒＡＡＶ粒子を生産することが可能な宿主細胞を生成する、請求項１０７～１４６のいずれか１項に記載のシステム。
  148. ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクターをコードする核酸、ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐをコードする核酸、ならびにＡＡＶヘルパーウイルス機能をコードする核酸の１つまたはそれ以上を含むプロデューサー細胞株によって生産されたものである、請求項１０７～１４６のいずれか１項に記載のシステム。
  149. ｒＡＡＶ粒子は、定位送達によって送達される、請求項１０７～１４８のいずれか１項に記載のシステム。
  150. ｒＡＡＶ粒子は、対流強化送達によって送達される、請求項１０７～１４９のいずれか１項に記載のシステム。
  151. ｒＡＡＶ粒子は、ＣＥＤ送達システムを使用して送達される、請求項１５０に記載のシステム。
  152. ＣＥＤシステムは、カニューレおよび／またはポンプを含む、請求項１５１に記載のシステム。
  153. カニューレは、逆流抵抗性カニューレまたは段階的カニューレである、請求項１５２に記載のシステム。
  154. ポンプは、手動ポンプである、請求項１５２に記載のシステム。
  155. ポンプは、浸透圧ポンプである、請求項１５２に記載のシステム。
  156. ポンプは、輸注ポンプである、請求項１５２に記載のシステム。
  157. ｒＡＡＶ粒子を含む、請求項１～１０６のいずれか１項に記載の方法で使用するためのキットであって、該ｒＡＡＶ粒子は、哺乳動物の少なくとも大脳皮質および線条体で発現される異種核酸をコードするｒＡＡＶベクターを含む、前記キット。
  158. ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１）キャプシドを含む、請求項１５７に記載のキット。
  159. ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）キャプシドを含む、請求項１５８に記載のキット。
  160. ｒＡＡＶ粒子の有効量を含む組成物を含む、哺乳動物におけるハンチントン病を処置するためのキットであって、該ｒＡＡＶ粒子は、該哺乳動物の少なくとも大脳皮質および線条体で発現される異種核酸をコードするｒＡＡＶベクターを含む、前記キット。
  161. ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１）キャプシドまたはＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）キャプシドを含む、請求項１６０に記載のキット。
  162. ｒＡＡＶ粒子の有効量を含む組成物を含む、哺乳動物におけるパーキンソン病を処置す
    るためのキットであって、該ｒＡＡＶ粒子は、該哺乳動物の少なくとも大脳皮質および線条体で発現される異種核酸をコードするｒＡＡＶベクターを含む、前記キット。
  163. ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１）キャプシドをまたはＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）キャプシド含む、請求項１６１に記載のキット。
  164. ｒＡＡＶ粒子を線条体に送達するためのデバイスをさらに含む、請求項１５７～１６３のいずれか１項に記載のキット。
  165. ｒＡＡＶ粒子は、組成物の形態である、請求項１５７～１６４のいずれか１項に記載のキット。
  166. 組成物は、緩衝液および／または医薬的に許容される賦形剤を含む、請求項１６５に記載のキット。
  167. ｒＡＡＶ粒子の組成物を線条体に送達するための説明書をさらに含む、請求項１５７～１６６のいずれか１項に記載のキット。
  168. 請求項１～１０６に記載の方法のいずれか１つにおいて使用するためのｒＡＡＶ粒子。
  169. 哺乳動物の中枢神経系に組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を送達することにおいて使用するためのｒＡＡＶ粒子であって、該哺乳動物の少なくとも大脳皮質および線条体で発現される異種核酸をコードするｒＡＡＶベクターを含む、前記ｒＡＡＶ粒子。
  170. 哺乳動物の中枢神経系に組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を送達することにおいて使用するためのｒＡＡＶ粒子であって、該哺乳動物の少なくとも大脳皮質および線条体で発現される異種核酸をコードするｒＡＡＶベクターを含み、ＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１）キャプシドをさらに含む、前記ｒＡＡＶ粒子。
  171. 哺乳動物の中枢神経系に組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を送達することにおいて使用するためのｒＡＡＶ粒子であって、該哺乳動物の少なくとも大脳皮質および線条体で発現される異種核酸をコードするｒＡＡＶベクターを含み、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）キャプシドをさらに含む、前記ｒＡＡＶ粒子。
  172. 哺乳動物におけるハンチントン病を処置することにおいて使用するためのｒＡＡＶ粒子であって、該哺乳動物の少なくとも大脳皮質および線条体で発現される異種核酸をコードするｒＡＡＶベクターを含む、前記ｒＡＡＶ粒子。
  173. 哺乳動物におけるパーキンソン病を処置することにおいて使用するためのｒＡＡＶ粒子であって、該哺乳動物の少なくとも大脳皮質および線条体で発現される異種核酸をコードするｒＡＡＶベクターを含む、前記ｒＡＡＶ粒子。
  174. ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２キャプシドを含む、請求項１７３に記載のｒＡＡＶ。
  175. 哺乳動物は、ヒトである、請求項１６９～１７４のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  176. 線条体の被殻および尾状核に投与するための、請求項１６９～１７５のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  177. 線条体の各半球の被殻および尾状核に投与するための、請求項１７６に記載のｒＡＡＶ粒子。
  178. 異種核酸は、哺乳動物の前頭皮質、後頭皮質、および／または第ＩＶ層で発現される、請求項１６９～１７７のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  179. 異種核酸は、前頭連合野皮質領域、前運動皮質、一次体性感覚皮質領域、感覚運動皮質、頭頂皮質、後頭皮質、および／または一次運動皮質で発現される、請求項１７８に記載のｒＡＡＶ粒子。
  180. 大脳皮質において逆行性または順行性輸送を受ける、請求項１６９～１７９のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  181. 異種核酸は、視床、視床下核、淡蒼球、黒質および／または海馬でさらに発現される、請求項１６９～１８０のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  182. ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２－７ｍ８、ＡＡＶ ＤＪ、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋ、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶキャプシドｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１血清型キャプシドを含む、請求項１６９、１７０、または１７５～１８１のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  183. ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、またはＡＡＶｒｈ１０である、請求項１８２に記載のｒＡＡＶ粒子。
  184. ｒＡＡＶベクターは、１つまたはそれ以上のＡＡＶの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列が隣接する異種核酸を含む、請求項１６９～１８３のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  185. 異種核酸に、２つのＡＡＶのＩＴＲが隣接する、請求項１８４に記載のｒＡＡＶ粒子。
  186. ＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶ血清型ＩＴＲである、請求項１８４または１８５に記載のｒＡＡＶ粒子。
  187. ＡＡＶのＩＴＲは、ＡＡＶ２のＩＴＲである、請求項１８４～１８６のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  188. ＩＴＲおよびｒＡＡＶ粒子のキャプシドは、同じＡＡＶ血清型から誘導される、請求項１８４または１８５に記載のｒＡＡＶ粒子。
  189. ＩＴＲおよびキャプシドは、ＡＡＶ２から誘導される、請求項１８８に記載のｒＡＡＶ粒子。
  190. ＩＴＲおよびｒＡＡＶウイルス粒子のキャプシドは、異なるＡＡＶ血清型から誘導される、請求項１８４または１８５に記載のｒＡＡＶ粒子。
  191. ＩＴＲは、ＡＡＶ２から誘導され、キャプシドは、ＡＡＶ１から誘導される、請求項１９０に記載のｒＡＡＶ粒子。
  192. 異種核酸は、プロモーターに機能するように連結されている、請求項１６９～１７１のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  193. プロモーターは、ＣＮＳの細胞中で異種核酸を発現する、請求項１９２に記載のｒＡＡＶ粒子。
  194. プロモーターは、脳の細胞中で異種核酸を発現する、請求項１９２または１９３に記載のｒＡＡＶ粒子。
  195. プロモーターは、ニューロンまたはグリア細胞中で異種核酸を発現する、請求項１９１～１９４のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  196. ニューロンは、尾状核の中型有棘ニューロン、被殻の中型有棘ニューロン、皮質第ＩＶ層のニューロンおよび／または皮質第Ｖ層のニューロンである、請求項１９５に記載のｒＡＡＶ粒子。
  197. プロモーターは、ＣＢＡプロモーター、最小のＣＢＡプロモーター、ＣＭＶプロモーターまたはＧＵＳＢプロモーターである、請求項１９２～１９６のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  198. プロモーターは、誘導性である、請求項１９２～１９６のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  199. ｒＡＡＶベクターは、エンハンサー、スプライスドナー／スプライスアクセプター対、マトリックスアタッチメント部位、またはポリアデニル化シグナルの１つまたはそれ以上を含む、請求項１９２～１９８のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  200. ｒＡＡＶベクターは、自己相補的なｒＡＡＶベクターである、請求項１６９～１９９のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  201. ベクターは、異種核酸をコードする第１の核酸配列および異種核酸の相補物をコードする第２の核酸配列を含み、第１の核酸配列は、その長さのほとんどまたは全てにわたり、第２の核酸配列と鎖内の塩基対を形成することができる、請求項２００に記載のｒＡＡＶ粒子。
  202. 第１の核酸配列および第２の核酸配列は、突然変異したＡＡＶのＩＴＲによって連結されており、突然変異したＡＡＶのＩＴＲは、Ｄ領域の欠失を含み、末端分解配列の突然変異を含む、請求項２００に記載のｒＡＡＶ粒子。
  203. 異種核酸は、治療用ポリペプチドまたは治療用核酸をコードする、請求項１６９～２０２のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  204. 異種核酸は、治療用ポリペプチドをコードする、請求項２０３に記載のｒＡＡＶ粒子。
  205. 治療用ポリペプチドは、酵素、神経栄養因子、ＣＮＳ関連の障害を有する個体において不足しているかまたは突然変異しているポリペプチド、抗酸化剤、抗アポトーシス因子、
    抗血管新生因子、および抗炎症性因子、アルファ－シヌクレイン、酸性ベータ－グルコシダーゼ（ＧＢＡ）、ベータ－ガラクトシダーゼ－１（ＧＬＢ１）、イズロン酸２－スルファターゼ（ＩＤＳ）、ガラクトシルセラミダーゼ（ＧＡＬＣ）、マンノシダーゼ、アルファ－Ｄ－マンノシダーゼ（ＭＡＮ２Ｂ１）、ベータ－マンノシダーゼ（ＭＡＮＢＡ）、プソイドアリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）、Ｎ－アセチルグルコサミン－１－ホスホトランスフェラーゼ（ＧＮＰＴＡＢ）、酸性スフィンゴミエリナーゼ（ＡＳＭ）、ニーマン－ピックＣ型タンパク質（ＮＰＣ１）、酸性アルファ－１，４－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）、ヘキソサミニダーゼベータサブユニット、ＨＥＸＢ、Ｎ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＭＰＳ３Ａ）、Ｎ－アルファ－アセチルグルコサミニダーゼ（ＮＡＧＬＵ）、ヘパリンアセチル－ＣｏＡ、アルファ－グルコサミニダーゼＮ－アセチルトランスフェラーゼ（ＭＰＳ３Ｃ）、Ｎ－アセチルグルコサミン－６－スルファターゼ（ＧＮＳ）、アルファ－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼ（ＮＡＧＡ）、ベータ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）、ヘキソサミニダーゼアルファサブユニット（ＨＥＸＡ）、ハンチンチン（ＨＴＴ）、リソソーム酸性リパーゼ（ＬＩＰＡ）、アスパルチルグルコサミニダーゼ、アルファ－ガラクトシダーゼＡ、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ、トリペプチジルペプチダーゼ、リソソーム膜貫通タンパク質、システイン輸送体、酸性セラミダーゼ、酸性アルファ－Ｌ－フコシダーゼ、カテプシンＡ、アルファ－Ｌ－イズロニダーゼ、アリールスルファターゼＢ、アリールスルファターゼＡ、Ｎ－アセチルガラクトサミン－６－スルフェート、酸性ベータ－ガラクトシダーゼ、またはアルファ－ノイラミダーゼである、請求項２０４に記載のｒＡＡＶ粒子。
  206. 異種核酸は、治療用核酸をコードする、請求項２０３に記載のｒＡＡＶ粒子。
  207. 治療用核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムまたはＤＮＡザイムである、請求項２０６に記載のｒＡＡＶ粒子。
  208. 治療用ポリペプチドまたは治療用核酸は、ＣＮＳの障害を処置するのに使用される、請求項２０３～２０７のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  209. ＣＮＳの障害は、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）、ハンチントン病、てんかん、パーキンソン病、アルツハイマー病、卒中、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、大脳皮質基底核神経節変性症（ＣＢＧＤ）、前頭側頭認知症（ＦＴＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、進行性核上麻痺（ＰＳＰ）または脳のがんである、請求項２０８に記載のｒＡＡＶ粒子。
  210. 障害は、アスパルチルグルコサミン尿症、ファブリー、乳児期バッテン病（ＣＮＬ１）、古典的後期の乳児期バッテン病（ＣＮＬ２）、若年性のバッテン病（ＣＮＬ３）、バッテン型ＣＮＬ４、バッテン型ＣＮＬ５、バッテン型ＣＮＬ６、バッテン型ＣＮＬ７、バッテン型ＣＮＬ８、シスチン症、ファーバー、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシス、ゴーシェ病１型、ゴーシェ病２型、ゴーシェ病３型、ＧＭ１ガングリオシド症、ハンター病、クラッベ病、αマンノシドーシス病、βマンノシドーシス病、マロトー－ラミー、異染性白質ジストロフィー病、モルキオＡ型、モルキオＢ型、ムコリピドーシスＩＩ／ＩＩＩ疾患、ニーマン－ピック病Ａ型、ニーマン－ピック病Ｂ型、ニーマン－ピック病Ｃ型、ポンペ病、サンドホフ病、サンフィリッポ病Ａ型、サンフィリッポ病Ｂ型、サンフィリッポ病Ｃ型、サンフィリッポ病Ｄ型、シンドラー病、シンドラー－カンザキ、シアリドーシス、スライ病、テイ－サックス病、およびウォールマン病からなる群より選択されるリソソーム蓄積症である、請求項２０９に記載のｒＡＡＶ粒子。
  211. 組成物の形態である、請求項１６９～２１０のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  212. 組成物は、医薬的に許容される賦形剤を含む医薬組成物である、請求項２１１に記載の
    ｒＡＡＶ粒子。
  213. ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクターをコードする核酸、ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐをコードする核酸、ならびにＡＡＶヘルパーウイルス機能をコードする核酸の宿主細胞への三重のトランスフェクションによって生産されたものであり、該宿主細胞への該核酸のトランスフェクションは、ｒＡＡＶ粒子を生産することが可能な宿主細胞を生成する、請求項１６９～２１２のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  214. ｒＡＡＶベクターをコードする核酸、ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐをコードする核酸、ならびにＡＡＶヘルパーウイルス機能をコードする核酸の１つまたはそれ以上を含むプロデューサー細胞株によって生産されたものである、請求項１６９～２１２のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  215. 定位送達によって送達される、請求項１６９～２１４のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  216. 対流強化送達によって送達される、請求項１６９～２１４のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  217. ＣＥＤ送達システムを使用して送達される、請求項２１６に記載のｒＡＡＶ粒子。
  218. ＣＥＤシステムは、カニューレおよび／またはポンプを含む、請求項２１７に記載のｒＡＡＶ粒子。
  219. カニューレは、逆流抵抗性カニューレまたは段階的カニューレである、請求項２１８に記載のｒＡＡＶ粒子。
  220. ポンプは、手動ポンプである、請求項２１８に記載のｒＡＡＶ粒子。
  221. ポンプは、浸透圧ポンプである、請求項２１８に記載のｒＡＡＶ粒子。
  222. ポンプは、輸注ポンプである、請求項２１８に記載のｒＡＡＶ粒子。
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