CN117881689A - 分离的修饰的aav5衣壳蛋白vp1 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及基因治疗和分子生物学领域。更具体而言，本发明涉及来自腺伴随病毒血清型5(AAV5)的分离的修饰的衣壳蛋白VP1，与野生型AAV5衣壳蛋白VP1相比，所述修饰的衣壳蛋白VP1包含一种或多种氨基酸取代，所述取代增加了转导效率，增加了用基于rAAV5的产物包装AAV病毒基因组的效率，并且还增加了基于重组腺伴随病毒血清型5(rAAV5)的载体的生产(组装)效率；涉及基于上述VP1的衣壳和载体、以及其用途。
Description
技术领域
本申请涉及基因治疗和分子生物学领域。更具体而言，本发明涉及来自腺伴随病毒血清型5(AAV5)的分离的修饰的衣壳蛋白VP1，与野生型AAV5衣壳蛋白VP1相比，所述修饰的衣壳蛋白VP1包含一种或多种氨基酸取代，所述取代增加了转导效率，增加了用基于rAAV5的产物包装AAV病毒基因组的效率，并且还增加了基于重组腺伴随病毒血清型5(rAAV5)的载体的生产(组装)效率；涉及基于上述VP1的衣壳和载体、以及其用途。
背景技术
腺伴随病毒(AAV)是一种小型(25nm)、独立的复制缺陷型无包膜病毒。许多不同的AAV血清型已在人和灵长类动物中得到描述。腺伴随病毒基因组由长约4,700个核苷酸的(+或-)单链DNA(ssDNA)构成。在基因组DNA分子的端部处，存在容纳的末端反向重复(ITR)。基因组包含两个开放读码框(ORF)：包含编码各种蛋白质产物的几个可变读码框的Rep和Cap。rep产物对AAV复制是必需的，而三种衣壳蛋白(VP1、VP2和VP3)连同其它可变产物一起由Cap基因编码。VP1、VP2和VP3蛋白以1:1:10的比率存在，以形成二十面体衣壳(Xie Q.等人The atomic structure of adeno-associated virus(AAV-2)，a vector for human genetherapy.Proc Natl Acad Sci USA，2002；99:10405-10410)。在重组AAV(rAAV)载体生产过程中，将侧翼为ITR的表达盒包装到AAV衣壳内。AAV复制所需的基因并不包括在盒中。重组AAV被视为用于体内基因转移的最安全和最广泛使用的病毒载体之一。载体可以感染多重组织类型的细胞，以提供强烈和持续的转基因表达。它们也是非致病性的，并且具有低免疫原性概况(High KA等人，"rAAV human trial experience"Methods Mol Biol.2011；807:429-57)。
在有效基因治疗的开发领域中的研究的紧迫目的之一是载体的优化，以改善给定载体的某些性质。
各种AAV血清型的特征在于对于不同宿主细胞表面受体的亲和力，它们针对所述受体具有向性。因此，关于AAV2的主要已知受体是硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，共受体是整联蛋白异二聚体aVβ5、成纤维细胞生长因子受体1型和肝细胞生长因子受体c-Met。AAV12与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和唾液酸结合。AAV4和AAV5分别与N-和O-联唾液酸结合。AAV5激活血小板衍生的生长因子受体。进一步地，已在AAV衣壳蛋白的氨基酸序列与其组装过程、基因组的衣壳化、对于宿主细胞的表面上表现的不同类型受体的亲和力之间建立了关系(Govindasamy L.等人Structural insights into adeno-associated virus serotype5.J Virol.2013年10月；87(20):11187-99)。
国际申请WO2012145601描述了具有变体衣壳蛋白的腺伴随病毒(AAV)病毒粒子，其中与野生型AAV相比，当经由玻璃体内注射进行施用时，AAV病毒粒子显示出视网膜细胞的更大感染性。
国际申请WO2013158879描述了用于向受试者递送包含衣壳蛋白VP1的异源核酸序列的腺伴随病毒(AAV)载体，所述衣壳蛋白VP1包含一种或多种赖氨酸取代，其中一种赖氨酸取代是K137R，其中所述赖氨酸取代有效抑制所述衣壳蛋白的遍在蛋白化，从而增加所述AVV载体在靶细胞中的转导效率。
迄今为止，需要与野生型AAV相比具有改善性质的AAV，例如，其具有增加的转导能力、增加的AAV病毒基因组包装效率、以及由于基于重组腺伴随病毒(rAAV)的衣壳化病毒载体的高度有效生产(组装)，增加的生成效率。改善的组织转导允许使施用于受试者的载体剂量降到最低。
发明描述
本发明的作者已惊讶地发现，在野生型AAV5衣壳蛋白VP1中选自以下的一种或多种氨基酸取代的存在：
G226V，
S2A、G226V和T711S，
T614A，
S2A、T614A和T711S，
T614V，
S2A、T614V和T711S，
导致使用具有这种/这些修饰的基于AAV血清型5的载体转导靶细胞的效率增加，以及通过具有上述突变的基于rAAV的载体的转基因递送效率的显著增加。
本发明的作者已惊讶地发现，在野生型AAV5衣壳蛋白VP1中选自以下的一种或多种氨基酸取代的存在：
G226V，
S2A、G226V和T711S，
T614A，
S2A、T614A和T711S，
T614V，
S2A、T614V和T711S，
导致用基于rAAV5的产物包装AAV病毒基因组的效率增加。
本发明的作者已惊讶地发现，在野生型AAV5衣壳蛋白VP1中选自以下的一种或多种氨基酸取代的存在：
G226V，
S2A、G226V和T711S，
T614A，
S2A、T614A和T711S，
T614V，
S2A、T614V和T711S，
导致与基于野生型rAAV5(不含上述突变)的衣壳化病毒载体的组装相比，基于重组腺伴随病毒血清型5(rAAV5)的衣壳化病毒载体的生产(组装)增加，即基于在AAV5衣壳中包含上述修饰的rAAV5的衣壳化病毒载体的组装导致基于rAAV5的病毒载体的产生，所述基于rAAV5的病毒载体与基于野生型rAAV5(不含上述突变)的衣壳化病毒载体的组装相比，显著更经常地含有转基因(衣壳化的异源核酸)。
发明内容
在一个方面，本发明涉及来自腺伴随病毒血清型5(AAV5)的分离的修饰的衣壳蛋白VP1，其用于生产基于重组腺伴随病毒血清型5(rAAV5)的病毒载体，所述分离的修饰的衣壳蛋白VP1包含具有选自以下的一种或多种取代的由Cap基因编码的野生型AAV5衣壳蛋白VP1氨基酸序列：
G226V，
S2A、G226V和T711S，
T614A，
S2A、T614A和T711S，
T614V，
S2A、T614V和T711S，
其中所述野生型AAV5衣壳蛋白VP1氨基酸序列具有由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，分离的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1包含在位置G226V处的取代。
在本发明的一些实施方案中，分离的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1具有由SEQ ID NO:3表示的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，分离的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1包含取代S2A、G226V和T711S。
在本发明的一些实施方案中，分离的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1具有由SEQ ID NO:4表示的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，分离的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1包含取代T614A。
在本发明的一些实施方案中，分离的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1具有由SEQ ID NO:5表示的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，分离的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1包含取代S2A、T614A和T711S。
在本发明的一些实施方案中，分离的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1具有由SEQ ID NO:6表示的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，分离的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1包含取代T614V。
在本发明的一些实施方案中，分离的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1具有由SEQ ID NO:7表示的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，分离的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1包含取代S2A、T614V和T711S。
在本发明的一些实施方案中，分离的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1具有由SEQ ID NO:8表示的氨基酸序列。
在一个方面，本发明涉及编码任何来自腺伴随病毒血清型5的上述修饰的衣壳蛋白VP1的分离的核酸，所述修饰的衣壳蛋白VP1用于生产基于重组腺伴随病毒血清型5的病毒载体。
在本发明的一些实施方案中，分离的核酸编码具有氨基酸取代G226V的来自腺伴随病毒血清型5的修饰的衣壳蛋白VP1，其由具有SEQ ID NO:11的核酸序列或编码各自的氨基酸序列的任何其它序列表示。
在本发明的一些实施方案中，分离的核酸编码具有氨基酸取代S2A、G226V和T711S的来自腺伴随病毒血清型5的修饰的衣壳蛋白VP1，并且由具有SEQ ID NO:12的核酸序列或编码各自的氨基酸序列的任何其它序列表示。
在本发明的一些实施方案中，分离的核酸编码具有氨基酸取代T614A的来自腺伴随病毒血清型5的修饰的衣壳蛋白VP1，并且由具有SEQ ID NO:13的核酸序列或编码各自的氨基酸序列的任何其它序列表示。
在本发明的一些实施方案中，分离的核酸编码具有氨基酸取代S2A、T614A和T711S的来自腺伴随病毒血清型5的修饰的衣壳蛋白VP1，并且由具有SEQ ID NO:14的核酸序列或编码各自的氨基酸序列的任何其它序列表示。
在本发明的一些实施方案中，分离的核酸编码具有氨基酸取代T614V的来自腺伴随病毒血清型5的修饰的衣壳蛋白VP1，并且由具有SEQ ID NO:15的核酸序列或编码各自的氨基酸序列的任何其它序列表示。
在本发明的一些实施方案中，分离的核酸编码具有氨基酸取代S2A、T614V和T711S的来自腺伴随病毒血清型5的修饰的衣壳蛋白VP1，并且由具有SEQ ID NO:16的核酸序列或编码各自的氨基酸序列的任何其它序列表示。
在一个方面，本发明涉及用于生产基于重组腺伴随病毒血清型5的病毒载体的分离的衣壳，其包含任何来自腺伴随病毒血清型5的上述修饰的衣壳蛋白VP1。
在本发明的一些实施方案中，分离的衣壳包括任何来自腺伴随病毒血清型5的上述修饰的衣壳蛋白VP1、AAV5衣壳蛋白VP2或其修饰变体、以及AAV5衣壳蛋白VP3或其修饰变体。
在本发明的一些实施方案中，分离的衣壳包括野生型AAV5衣壳蛋白VP2。
在本发明的一些实施方案中，分离的衣壳包括野生型AAV5衣壳蛋白VP2，其具有由SEQ ID NO:17表示的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，分离的衣壳包括来自腺伴随病毒血清型5的修饰的衣壳蛋白VP2。
在本发明的一些实施方案中，分离的衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，其包含取代G90V。
在本发明的一些实施方案中，分离的衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，其包含取代G90V，并且具有由SEQ ID NO:19表示的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，分离的衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，其包含取代G90V和T575S。
在本发明的一些实施方案中，分离的衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，其包含取代G90V和T575S，并且具有由SEQ ID NO:20表示的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，分离的衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，其包含取代T478A。
在本发明的一些实施方案中，分离的衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，其包含取代T478A，并且具有由SEQ ID NO:21表示的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，分离的衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，其包含取代T478A和T575S。
在本发明的一些实施方案中，分离的衣壳包括修饰的AAV5蛋白，其包含取代T478A和T575S，并且具有由SEQ ID NO:22表示的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，分离的衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，其包含取代T478V。
在本发明的一些实施方案中，分离的衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，其包含取代T478V，并且具有由SEQ ID NO:23表示的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，分离的衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，其包含取代T478V和T575S。
在本发明的一些实施方案中，分离的衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，其包含取代T478V和T575S，并且具有由SEQ ID NO:24表示的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，分离的衣壳包括野生型AAV5衣壳蛋白VP3。
在本发明的一些实施方案中，分离的衣壳包括野生型AAV5衣壳蛋白VP3，其具有由SEQ ID NO:33表示的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，分离的衣壳包括来自腺伴随病毒血清型5的修饰的衣壳蛋白VP3。
在本发明的一些实施方案中，分离的衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，其包含取代G34V。
在本发明的一些实施方案中，分离的衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，其包含取代G34V，并且具有由SEQ ID NO:35表示的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，分离的衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，其包含取代G34V和T519S。
在本发明的一些实施方案中，分离的衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，其包含取代G34V和T519S，并且具有由SEQ ID NO:36表示的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，分离的衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，其包含取代T422A。
在本发明的一些实施方案中，分离的衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，其包含取代T422A，并且具有由SEQ ID NO:37表示的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，分离的衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，其包含取代T422A和T519S。
在本发明的一些实施方案中，分离的衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，其包含取代T422A和T519S，并且具有由SEQ ID NO:38表示的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，分离的衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，其包含取代T422V。
在本发明的一些实施方案中，分离的衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，其包含取代T422V，并且具有由SEQ ID NO:39表示的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，分离的衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，其包含取代T422V和T519S。
在本发明的一些实施方案中，分离的衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，其包含取代T422V和T519S，并且具有由SEQ ID NO:40表示的氨基酸序列。
在一个方面，本发明涉及编码任何上述衣壳的分离的核酸，所述衣壳用于生产基于重组腺伴随病毒血清型5的病毒载体。
在一个方面，本发明涉及基于重组腺伴随病毒血清型5的载体，其用于向受试者递送异源核酸序列，所述载体包含：
1)任何来自腺伴随病毒血清型5的上述修饰的衣壳蛋白VP1或任何上述衣壳，和
2)包含调控序列的异源核酸序列，所述调控序列促进由异源核酸序列编码的产物在靶细胞中的表达。
在本发明的一些实施方案中，rAAV5载体包括包含提供产物表达的调控序列的异源核酸序列，其中所述异源核酸序列的表达产物是治疗性多肽或报道多肽。
在一个方面，本发明涉及用于将基因产物递送至有此需要的受试者的药物组合物，其包含：
a)任何上述rAAV5载体；和
b)药学上可接受的赋形剂。
在一个方面，本发明涉及用于将基因产物递送至有此需要的受试者的方法，其包括向受试者施用任何上述rAAV5载体或上述药物组合物。
在一个方面，本发明涉及任何上述rAAV5载体或上述药物组合物用于治疗有此需要的受试者中的疾病的用途。
在用途的一些实施方案中，疾病选自：血液疾病；中枢神经系统疾病；代谢疾病；肌肉疾病；遗传性疾病。
在一个方面，本发明涉及用于生产任何上述rAAV5载体的方法，其包括分别用包含编码来自腺伴随病毒血清型5(AAV5)的修饰衣壳蛋白VP1的序列的任何上述核酸或编码衣壳的上述核酸转染生产细胞。
附图说明
图1是预期用于克隆AAV血清型9的衣壳基因的随机变体文库的质粒pAAV-接头的圆形示意图。
GFP是编码绿色荧光蛋白的序列，
多聚A是多聚腺苷酸化信号，
ITR是腺伴随病毒的反向末端重复，
T2A是编码来自多肽链的自切割肽的序列，所述多肽链来自明脉扁刺蛾病毒(virus Thosea asigna)，
HBG内含子是人β-珠蛋白内含子，
CMV启动子是人巨细胞病毒启动子，
AmpR是β-内酰胺酶基因的序列，其提供大肠杆菌对氨苄青霉素的抗性，
pUC起点是高拷贝细菌复制起点。
图2是质粒pAAV-GFP的圆形图解。
EGFP是编码修饰的绿色荧光蛋白的序列，
多聚A是多聚腺苷酸化信号，
ITR是腺伴随病毒的反向末端重复，
HBG内含子是人β-珠蛋白内含子，
CMV启动子是人巨细胞病毒启动子，
AmpR是β-内酰胺酶基因的序列，其提供大肠杆菌对氨苄青霉素的抗性，
pUC起点是高拷贝细菌复制起点。
图3是预期用于从随机变体文库产生野生型AAV血清型5的重组病毒产物的质粒pAAV-Rep的圆形示意图。
AmpR是β-内酰胺酶基因的序列，其提供大肠杆菌对氨苄青霉素的抗性，
pUC起点是高拷贝细菌复制起点，
AAVRep基因是编码病毒生命周期所需的Rep蛋白的序列。
图4是预期用于从随机变体文库产生野生型AAV血清型5的重组病毒产物的质粒pHelper的圆形示意图。
AmpR是β-内酰胺酶基因，其提供对氨苄青霉素的抗性，
Ori是细菌中的复制起点，
Adeno E2A是涉及病毒DNA复制的辅助腺病毒基因序列，
Adeno E4是涉及病毒DNA复制的辅助腺病毒基因序列，
Adeno VARNA是负责早期和晚期病毒基因两者的翻译的辅助腺病毒基因序列。
图5是显示了在各种MOI(病毒基因组/细胞)下，用基于rAAV5-GFP的病毒产物对CHO-K1-S细胞进行的转导效率的分析的图，所述rAAV5-GFP具有在蛋白VP1序列中的突变。
AAV5-01Mut-GFP指基于修饰的腺伴随病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S2A和T711S的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-02Mut-GFP指基于修饰的腺伴随病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变T614V、S2A和T711S的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-03Mut-GFP指基于修饰的腺伴随病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变T614A、S2A和T711S的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-04Mut-GFP指基于修饰的腺伴随病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变G226V、S2A和T711S的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-NullMut-GFP指基于修饰的腺伴随病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含野生型AAV5衣壳蛋白VP1。
图6是显示了探针在载体基因组上的杂交位置的图解。
探针1是与负DNA链的3'ITR直接相邻的序列上的ssDNA位点的检测点；
探针3是定位于负DNA链上的表达盒中间(～2400-2500bp)的ssDNA位点的检测点；
探针5是定位与负DNA链的5’ITR直接相邻的ssDNA位点的检测点。
探针2是定位与正DNA链的5’ITR直接相邻的ssDNA位点的检测点。
探针4是定位于正DNA链上的表达盒中间(～2400-2500bp)的ssDNA位点的检测点；
探针6是定位与正链DNA的3’ITR直接相邻的ssDNA位点的检测点。
图7是关于载体DNA的DNA印迹杂交数据。
pDNA-GFP是标准样品，即标准质粒DNA pAAV-GFP的双倍连续稀释物。
vgDNA-NullMut-GFP是对照样品，即从具有野生型衣壳蛋白VP1的对照rAAV5产物中提取的载体基因组DNA的双倍连续稀释物。
vgDNA-02Mut-GFP是从具有衣壳蛋白VP1的rAAV5产物中提取的载体基因组DNA的双倍连续稀释物，所述衣壳蛋白VP1包含突变S2A、T614V和T711S。
vgDNA-04Mut-GFP是从具有衣壳蛋白VP1的rAAV5产物中提取的载体基因组DNA的双倍连续稀释物，所述衣壳蛋白VP1包含突变S2A、G226V和T711S。
图8是显示了AAV5衣壳结构蛋白在Cap基因的氨基酸序列中的位置的图解。
1-725aa–VP1
137-725aa–VP2
193-725aa–VP3
图9是显示了关于基于修饰的腺伴随病毒血清型5(rAAV5)的载体的生成效率的分析的图。
AAV5-01Mut-GFP指基于修饰的腺伴随病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变S2A和T711S的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-02Mut-GFP指基于修饰的腺伴随病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变T614V、S2A和T711S的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-03Mut-GFP指基于修饰的腺伴随病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变T614A、S2A和T711S的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-04Mut-GFP指基于修饰的腺伴随病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含具有突变G226V、S2A和T711S的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1。
AAV5-NullMut-GFP指基于修饰的腺伴随病毒血清型5(rAAV5)的载体，所述rAAV5包含野生型AAV5衣壳蛋白VP1。
Vg/ml cf指每毫升培养液的病毒基因组计数。
定义和一般方法
除非本文另有定义，否则与本发明结合使用的所有技术和科学术语将具有与本领域技术人员通常理解的相同的含义。
此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应该包括复数术语，并且复数术语应该包括单数术语。通常，本文所述的细胞培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学、分析化学、有机合成化学、医学和药物化学、以及蛋白质和核酸的杂交和化学的本文分类和方法是技术人员众所周知以及本领域广泛使用的。酶反应和纯化方法根据制造商的指南，如本领域中常见的，或如本文所述的执行。
“分离的”意指从天然状态改变或取出的。例如，天然存在于活生物中的核酸或肽不是“分离的”，但与其天然状态的共存材料部分或完全分开的相同的核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以基本上以纯化的形式存在，或者可以存在于非天然环境例如遗传修饰的细胞中。
术语“天然存在的”、“自然的”或“野生型”用于描述如与人工生产的不同的、可以在自然界中找到的物体。例如，可以从自然界中的来源分离并且仍未通过实验室人员有意修饰的、存在于生物(包括病毒)中的蛋白质或核苷酸序列是天然存在的。
术语“基因组”指生物的完整遗传材料。
如本说明书和随后的权利要求中使用的，除非上下文另有说明，否则词语“包括(include)”和“包含(comprise)”或其变体例如“包括(includes)”、“包括(including)”、“包含(comprises)”或“包含(comprising)”，应理解为暗示包括所述的整数或整数组，但不排除任何其它整数或整数组。
蛋白质(肽)
如本说明书中使用的，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且它们指由通过肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对可以构成蛋白质或肽序列的氨基酸的最大数目并无限制。多肽包括包含通过肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。如本说明书中使用的，该术语既指短链又指长链，所述短链在本领域中通常也被称为例如肽、寡肽和寡聚物，所述长链在本领域中一般被称为蛋白质，其中存在许多类型。“多肽”尤其包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同源二聚体、异源二聚体、多肽的变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或其组合。
核酸分子
在本说明书中可互换使用的术语“核酸”、“核酸序列(nucleic sequence)”、“核酸序列(nucleic acid sequence)”、“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“多核苷酸序列”和“核苷酸序列”意指核苷酸的精确序列，其是修饰的或未修饰的，确定核酸的片段或区域，含有或未含有非天然核苷酸，并且是双链DNA或RNA、单链DNA或RNA、或所述DNA的转录产物。
如本说明书中使用的，作为非限制性实例，多核苷酸包括通过本领域可用的任何手段获得的所有核酸序列，作为非限制性实例，所述手段包括使用普通的克隆技术和PCR等等的重组手段，即从重组文库或细胞基因组中克隆核酸序列，以及通过合成手段。
此处还应该包括的是本发明并不涉及在其天然染色体环境中(即处于天然状态)的核苷酸序列。本发明的序列已进行分离和/或纯化，即它们例如通过拷贝直接或间接地进行取样，它们的环境已至少部分地进行改变。因此，此处还应该提到通过重组遗传学，例如借助于宿主细胞或通过化学合成获得的分离的核酸。
除非另有说明，否则术语核苷酸序列涵盖其互补体。因此，具有特定序列的核酸应该理解为涵盖具有其互补序列的其互补链的核酸。
腺伴随病毒(AAV)
细小病毒科(Parvoviridae)的病毒是含有小DNA的动物病毒。细小病毒科可以分成两个亚科：其成员感染脊椎动物的细小病毒亚科(Parvovirinae)、以及其成员感染昆虫的浓核病毒亚科(Densovirinae)。到2006年，已描述了腺伴随病毒的11种血清型(Mori，S.等人，2004，"Two novel adeno-associated viruses from cynomolgus monkey:pseudotyping characterization of capsid protein"，Virology，Τ.330(2):375-83)。2008年描述了腺伴随病毒的血清型12(Michael Schmidt等人，Adeno-associated virustype 12(AAV12):a novel AAV serotype with sialic acid-and heparan sulfateproteoglycan-independent transduction activity，J Virol.2008年2月；82(3):1399-406.doi:10.1128/JVI.02012-07)。所有已知的血清型都可以感染来自多重组织类型的细胞。组织特异性由衣壳蛋白血清型决定；因此，基于腺伴随病毒的载体通过指定所需的血清型进行构建。关于细小病毒属和细小病毒科的其它成员的进一步信息已在文献中进行描述(Kenneth I.Berns，《Parvoviridae:The Viruses and Their Replication>>，FieldsVirology中的第69章(第3版1996))。
所有已知AAV血清型的基因组组构是非常相似的。AAV的基因组是长度小于约5000个核苷酸(nt)的线性单链DNA分子。反向末端重复(ITR)侧接对于病毒生命周期必需的蛋白质(Rep)的独特编码核苷酸序列，以及重叠衣壳蛋白(Cap)的序列。Cap基因编码形成衣壳的VP蛋白(VP1、VP2和VP3)，以及AAP(激活腺伴随病毒(AAV)组装的蛋白质(Sonntag F，K，Schmidt K等人The assembly-activating protein promotes capsid assembly ofdifferent adeno-associated virus serotypes.JVirol.2011；85(23):12686-12697.doi:10.1128/JVI.05359-11)和MAAP(膜相关辅助蛋白(Ogden PJ，Kelsic ED，SinaiS，Church GM.Comprehensive AAV capsid fitness landscape reveals a viral geneand enables machine-guided design.Science.2019；366(6469):1139-1143.doi:10.1126/science.aaw2900)。长145个核苷酸的AAV基因组侧翼序列是自互补的，并且进行组构，使得可以形成能量上稳定的分子内双链体，其形成T形发夹。此类发夹结构充当病毒DNA复制的起点，充当细胞DNA聚合酶复合物的引物。在哺乳动物细胞中的野生型AAV(wtAAV)感染之后，Rep基因(例如Rep78和Rep52)分别使用P5启动子和P19启动子进行表达，并且两种Rep蛋白均在病毒基因组的复制中具有一定的功能。Rep开放读码框(Rep ORF)中的剪接事件导致实际上四种Rep蛋白(例如Rep78、Rep68、Rep52和Rep40)的表达。然而，已显示了编码Rep78和Rep52蛋白的未剪接mRNA对于哺乳动物细胞中的AAV载体产生是足够的。
基于重组腺伴随病毒(rAAV)的载体
如本文使用的，术语“载体”意指能够转运它已与之连接的另一种核酸的核酸分子。此外，术语“载体”在本文中指能够转运核酸的病毒颗粒。
如本说明书中使用的，术语“表达”定义为由其启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
用途
“基因疗法”是将基因插入受试者的细胞和/或组织内，以治疗疾病，通常是遗传性疾病，其中缺陷型突变等位基因由功能性等位基因替换。
“治疗(Treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”指减轻或消除生物病症和/或其至少一种伴随症状的方法。进一步地，本文提及“治疗”包括提及治愈性、姑息性和预防性治疗。
在一个方面，治疗的受试者或患者是哺乳动物，优选人受试者。所述受试者可以是任何年龄的雄性或雌性。
术语“病症”意指将受益于根据本发明的治疗的任何状况。
“疾病”是受试者的健康状态，其中所述受试者不能维持体内平衡，并且如果疾病没有得到改善，则受试者的健康继续恶化。
术语“受试者”、“患者”、“个体”等等在本说明书中可互换使用，并且它们指顺应于本说明书中描述的方法的任何动物。在某些非限制性实施方案中，受试者、患者或个体是人。所述受试者可以是任何年龄的雄性或雌性。
具体实施方式
来自腺伴随病毒血清型5(AAV5)的分离的修饰的衣壳蛋白VP1
在一个方面，本发明涉及来自腺伴随病毒血清型5(AAV5)的分离的修饰的衣壳蛋白VP1，其用于生产基于重组腺伴随病毒血清型5(rAAV5)的病毒载体，所述分离的修饰的衣壳蛋白VP1包含具有选自以下的一种或多种取代的由Cap基因编码的野生型AAV5衣壳蛋白VP1氨基酸序列：
G226V，
S2A、G226V和T711S，
T614A，
S2A、T614A和T711S，
T614V，
S2A、T614V和T711S，
其中所述野生型AAV5衣壳蛋白VP1氨基酸序列具有由以下表示的氨基酸序列：MSFVDHPPDWLEEVGEGLREFLGLEAGPPKPKPNQQHQDQARGLVLPGYNYLGPGNGLDRGEPVNRADEVAREHDISYNEQLEAGDNPYLKYNHADAEFQEKLADDTSFGGNLGKAVFQAKKRVLEPFGLVEEGAKTAPTGKRIDDHFPKRKKARTEEDSKPSTSSDAEAGPSGSQQLQIPAQPASSLGADTMSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMGDRVVTKSTRTWVLPSYNNHQYREIKSGSVDGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDWQRLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIANNLTSTVQVFTDDDYQLPYVVGNGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSKMLRTGNNFEFTYNFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAGRYANTYKNWFPGPMGRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTYALENTMIFNSQPANPGTTATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMATNNQSSTTAPATGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQGPIWAKIPETGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLIKNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQYSTGQVTVEMEWELKKENSKRWNPEIQYTNNYNDPQFVDFAPDSTGEYRTTRPIGTRYLTRPL(SEQ ID NO:1)。
在本发明的一些实施方案中，分离的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1包含在位置G226V处的取代。
在本发明的一些实施方案中，分离的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1具有由以下表示的氨基酸序列：MSFVDHPPDWLEEVGEGLREFLGLEAGPPKPKPNQQHQDQARGLVLPGYNYLGPGNGLDRGEPVNRADEVAREHDISYNEQLEAGDNPYLKYNHADAEFQEKLADDTSFGGNLGKAVFQAKKRVLEPFGLVEEGAKTAPTGKRIDDHFPKRKKARTEEDSKPSTSSDAEAGPSGSQQLQIPAQPASSLGADTMSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMVDRVVTKSTRTWVLPSYNNHQYREIKSGSVDGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDWQRLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIANNLTSTVQVFTDDDYQLPYVVGNGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSKMLRTGNNFEFTYNFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAGRYANTYKNWFPGPMGRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTYALENTMIFNSQPANPGTTATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMATNNQSSTTAPATGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQGPIWAKIPETGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLIKNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQYSTGQVTVEMEWELKKENSKRWNPEIQYTNNYNDPQFVDFAPDSTGEYRTTRPIGTRYLTRPL(SEQ ID NO:3)。
在本发明的一些实施方案中，分离的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1包含取代S2A、G226V和T711S。
在本发明的一些实施方案中，分离的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1具有由以下表示的氨基酸序列：MAFVDHPPDWLEEVGEGLREFLGLEAGPPKPKPNQQHQDQARGLVLPGYNYLGPGNGLDRGEPVNRADEVAREHDISYNEQLEAGDNPYLKYNHADAEFQEKLADDTSFGGNLGKAVFQAKKRVLEPFGLVEEGAKTAPTGKRIDDHFPKRKKARTEEDSKPSTSSDAEAGPSGSQQLQIPAQPASSLGADTMSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMVDRVVTKSTRTWVLPSYNNHQYREIKSGSVDGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDWQRLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIANNLTSTVQVFTDDDYQLPYVVGNGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSKMLRTGNNFEFTYNFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAGRYANTYKNWFPGPMGRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTYALENTMIFNSQPANPGTTATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMATNNQSSTTAPATGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQGPIWAKIPETGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLIKNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQYSTGQVTVEMEWELKKENSKRWNPEIQYTNNYNDPQFVDFAPDSTGEYRSTRPIGTRYLTRPL(SEQ ID NO:4)。
在本发明的一些实施方案中，分离的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1包含取代T614A。
在本发明的一些实施方案中，分离的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1具有由以下表示的氨基酸序列：MSFVDHPPDWLEEVGEGLREFLGLEAGPPKPKPNQQHQDQARGLVLPGYNYLGPGNGLDRGEPVNRADEVAREHDISYNEQLEAGDNPYLKYNHADAEFQEKLADDTSFGGNLGKAVFQAKKRVLEPFGLVEEGAKTAPTGKRIDDHFPKRKKARTEEDSKPSTSSDAEAGPSGSQQLQIPAQPASSLGADTMSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMGDRVVTKSTRTWVLPSYNNHQYREIKSGSVDGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDWQRLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIANNLTSTVQVFTDDDYQLPYVVGNGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSKMLRTGNNFEFTYNFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAGRYANTYKNWFPGPMGRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTYALENTMIFNSQPANPGTTATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMATNNQSSTTAPATGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQGPIWAKIPEAGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLIKNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQYSTGQVTVEMEWELKKENSKRWNPEIQYTNNYNDPQFVDFAPDSTGEYRTTRPIGTRYLTRPL(SEQ ID NO:5)。
在本发明的一些实施方案中，分离的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1包含取代S2A、T614A和T711S。
在本发明的一些实施方案中，分离的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1具有由以下表示的氨基酸序列：MAFVDHPPDWLEEVGEGLREFLGLEAGPPKPKPNQQHQDQARGLVLPGYNYLGPGNGLDRGEPVNRADEVAREHDISYNEQLEAGDNPYLKYNHADAEFQEKLADDTSFGGNLGKAVFQAKKRVLEPFGLVEEGAKTAPTGKRIDDHFPKRKKARTEEDSKPSTSSDAEAGPSGSQQLQIPAQPASSLGADTMSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMGDRVVTKSTRTWVLPSYNNHQYREIKSGSVDGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDWQRLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIANNLTSTVQVFTDDDYQLPYVVGNGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSKMLRTGNNFEFTYNFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAGRYANTYKNWFPGPMGRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTYALENTMIFNSQPANPGTTATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMATNNQSSTTAPATGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQGPIWAKIPEAGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLIKNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQYSTGQVTVEMEWELKKENSKRWNPEIQYTNNYNDPQFVDFAPDSTGEYRSTRPIGTRYLTRPL(SEQ ID NO:6)。
在本发明的一些实施方案中，分离的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1包含取代T614V。
在本发明的一些实施方案中，分离的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1具有由以下表示的氨基酸序列：MSFVDHPPDWLEEVGEGLREFLGLEAGPPKPKPNQQHQDQARGLVLPGYNYLGPGNGLDRGEPVNRADEVAREHDISYNEQLEAGDNPYLKYNHADAEFQEKLADDTSFGGNLGKAVFQAKKRVLEPFGLVEEGAKTAPTGKRIDDHFPKRKKARTEEDSKPSTSSDAEAGPSGSQQLQIPAQPASSLGADTMSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMGDRVVTKSTRTWVLPSYNNHQYREIKSGSVDGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDWQRLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIANNLTSTVQVFTDDDYQLPYVVGNGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSKMLRTGNNFEFTYNFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAGRYANTYKNWFPGPMGRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTYALENTMIFNSQPANPGTTATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMATNNQSSTTAPATGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQGPIWAKIPEVGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLIKNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQYSTGQVTVEMEWELKKENSKRWNPEIQYTNNYNDPQFVDFAPDSTGEYRTTRPIGTRYLTRPL(SEQ ID NO:7)。
在本发明的一些实施方案中，分离的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1包含取代S2A、T614V和T711S。
在本发明的一些实施方案中，分离的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1具有由以下表示的氨基酸序列：MAFVDHPPDWLEEVGEGLREFLGLEAGPPKPKPNQQHQDQARGLVLPGYNYLGPGNGLDRGEPVNRADEVAREHDISYNEQLEAGDNPYLKYNHADAEFQEKLADDTSFGGNLGKAVFQAKKRVLEPFGLVEEGAKTAPTGKRIDDHFPKRKKARTEEDSKPSTSSDAEAGPSGSQQLQIPAQPASSLGADTMSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMGDRVVTKSTRTWVLPSYNNHQYREIKSGSVDGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDWQRLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIANNLTSTVQVFTDDDYQLPYVVGNGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSKMLRTGNNFEFTYNFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAGRYANTYKNWFPGPMGRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTYALENTMIFNSQPANPGTTATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMATNNQSSTTAPATGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQGPIWAKIPEVGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLIKNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQYSTGQVTVEMEWELKKENSKRWNPEIQYTNNYNDPQFVDFAPDSTGEYRSTRPIGTRYLTRPL(SEQ ID NO:8)。
来自腺伴随病毒血清型5(AAV5)的分离的修饰的衣壳蛋白VP2和VP3
腺伴随病毒的基因组DNA(+)-链的“右手侧”包含编码三种衣壳蛋白的重叠序列：VP1、VP2和VP3。这些基因的转录从单个启动子p40起始。相应蛋白质的分子量分别为87、72和62kDa。所有三种蛋白质都由单一mRNA进行翻译。在转录之后，前mRNA可以以两种不同的方式进行剪接，其中较长或较短的内含子被切除，以形成长2300或2600核苷酸的mRNA。
因此，将突变引入Cap基因内不仅影响AAV5 VP1衣壳蛋白，而且影响AAV5 VP2和VP3衣壳蛋白。
图8是显示了AAV5衣壳的结构蛋白在AAV Cap基因序列中的位置的示意性表示：
1-725aa–VP1
137-725aa–VP2
193-725aa–VP3
考虑到编码三种衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的重叠序列，VP1中的氨基酸取代T614A将对应于：
VP2中的位置T478A处的氨基酸取代；
VP3中的位置T422A处的氨基酸取代。
考虑到编码三种衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的重叠序列，VP1中的氨基酸取代T614V将对应于：
VP2中的位置T478V处的氨基酸取代；
VP3中的位置T422V处的氨基酸取代。
考虑到编码三种衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的重叠序列，VP1中的氨基酸取代G226V将对应于：
VP2中的位置G90V处的氨基酸取代；
VP3中的位置G34V处的氨基酸取代。
考虑到编码三种衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的重叠序列，VP1中的氨基酸取代S2A在VP2和VP3中将不存在。
考虑到编码三种衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的重叠序列，VP1中的氨基酸取代T711S将对应于：
VP2中的位置T575S处的氨基酸取代；
VP3中的位置T519S处的氨基酸取代。
进一步地，申请人认为通过指示包括VP1/VP2/VP3中的所述突变的短氨基酸序列来指定已发现突变的环境是适当的：
对于VP1中的T614A(VP2中的T478A/VP3中的T422A)：IPEAGAHFHP；
对于VP1中的T614V(VP2中的T478V/VP3中的T422V)：IPEVGAHFHP；
对于VP1中的G226V(VP2中的G90V/VP3中的G34V)：TWMVDRV；
对于VP1中的S2A(VP2和VP3中缺失)：MAFVDHP；
对于VP1中的T711S(VP2中的T575S/VP3中的T519S)：EYRSTRP。
在本发明的一些实施方案中，野生型AAV5衣壳蛋白VP2的氨基酸序列具有由SEQID NO:17表示的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV5衣壳蛋白VP2的氨基酸序列包含取代G90V。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV5衣壳蛋白VP2的氨基酸序列包含取代G90V，并且具有由SEQ ID NO:19表示的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV5衣壳蛋白VP2的氨基酸序列包含取代G90V和T575S。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV5衣壳蛋白VP2的氨基酸序列包含取代G90V和T575S，并且具有由SEQ ID NO:20表示的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV5衣壳蛋白VP2的氨基酸序列包含取代T478A。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV5衣壳蛋白VP2的氨基酸序列包含T478A，并且具有由SEQ ID NO:21表示的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV5衣壳蛋白VP2的氨基酸序列包含取代T478A和T575S。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV5衣壳蛋白VP2的氨基酸序列包含取代T478A和T575S，并且具有由SEQ ID NO:22表示的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV5衣壳蛋白VP2的氨基酸序列包含取代T478V。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV5衣壳蛋白VP2的氨基酸序列包含取代T478V，并且具有由SEQ ID NO:23表示的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV5衣壳蛋白VP2的氨基酸序列包含取代T478V和T575S。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV5衣壳蛋白VP2的氨基酸序列包含取代T478V和T575S，并且具有由SEQ ID NO:24表示的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，野生型AAV5衣壳蛋白VP3的氨基酸序列具有由SEQID NO:33表示的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV5衣壳蛋白VP3的氨基酸序列包含取代G34V。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV5衣壳蛋白VP3的氨基酸序列包含取代G34V，并且具有由SEQ ID NO:35表示的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV5衣壳蛋白VP3的氨基酸序列包含取代G34V和T519S。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV5衣壳蛋白VP3的氨基酸序列包含取代G34V和T519S，并且具有由SEQ ID NO:36表示的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV5衣壳蛋白VP3的氨基酸序列包含取代T422A。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV5衣壳蛋白VP3的氨基酸序列包含取代T422A，并且具有由SEQ ID NO:37表示的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV5衣壳蛋白VP3的氨基酸序列包含取代T422A和T519S。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV5衣壳蛋白VP3的氨基酸序列包含取代T422A和T519S，并且具有由SEQ ID NO:38表示的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV5衣壳蛋白VP3的氨基酸序列包含取代T422V。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV5衣壳蛋白VP3的氨基酸序列包含取代T422V，并且具有由SEQ ID NO:39表示的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV5衣壳蛋白VP3的氨基酸序列包含取代T422V和T519S。
在本发明的一些实施方案中，修饰的AAV5衣壳蛋白VP3的氨基酸序列包含取代T422V和T519S，并且具有由SEQ ID NO:40表示的氨基酸序列。
衣壳
在一个方面，本发明涉及用于生产基于重组腺伴随病毒血清型5的病毒载体的分离的衣壳，其包含任何来自腺伴随病毒血清型5的上述修饰的衣壳蛋白VP1。
在本发明的一些实施方案中，分离的衣壳包括任何来自腺伴随病毒血清型5的上述修饰的衣壳蛋白VP1、AAV5衣壳蛋白VP2或其修饰变体、以及AAV5衣壳蛋白VP3或其修饰变体。
在本发明的一些实施方案中，分离的衣壳包括野生型AAV5衣壳蛋白VP2。
在本发明的一些实施方案中，分离的衣壳包括野生型AAV5衣壳蛋白VP2，其具有由SEQ ID NO:17表示的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，分离的衣壳包括来自腺伴随病毒血清型5的修饰的衣壳蛋白VP2。
在本发明的一些实施方案中，分离的衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，其包含取代G90V。
在本发明的一些实施方案中，分离的衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，其包含取代G90V，并且具有由SEQ ID NO:19表示的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，分离的衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，其包含取代G90V和T575S。
在本发明的一些实施方案中，分离的衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，其包含取代G90V和T575S，并且具有由SEQ ID NO:20表示的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，分离的衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，其包含取代T478A。
在本发明的一些实施方案中，分离的衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，其包含取代T478A，并且具有由SEQ ID NO:21表示的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，分离的衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，其包含取代T478A和T575S。
在本发明的一些实施方案中，分离的衣壳包括修饰的AAV5蛋白，其包含取代T478A和T575S，并且具有由SEQ ID NO:22表示的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，分离的衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，其包含取代T478V。
在本发明的一些实施方案中，分离的衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，其包含取代T478V，并且具有由SEQ ID NO:23表示的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，分离的衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，其包含取代T478V和T575S。
在本发明的一些实施方案中，分离的衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，其包含取代T478V和T575S，并且具有由SEQ ID NO:24表示的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，分离的衣壳包括野生型AAV5衣壳蛋白VP3。
在本发明的一些实施方案中，分离的衣壳包括野生型AAV5衣壳蛋白VP3，其具有由SEQ ID NO:33表示的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，分离的衣壳包括来自腺伴随病毒血清型5的修饰的衣壳蛋白VP3。
在本发明的一些实施方案中，分离的衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，其包含取代G34V。
在本发明的一些实施方案中，分离的衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，其包含取代G34V，并且具有由SEQ ID NO:35表示的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，分离的衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，其包含取代G34V和T519S。
在本发明的一些实施方案中，分离的衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，其包含取代G34V和T519S，并且具有由SEQ ID NO:36表示的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，分离的衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，其包含取代T422A。
在本发明的一些实施方案中，分离的衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，其包含取代T422A，并且具有由SEQ ID NO:37表示的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，分离的衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，其包含取代T422A和T519S。
在本发明的一些实施方案中，分离的衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，其包含取代T422A和T519S，并且具有由SEQ ID NO:38表示的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，分离的衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，其包含取代T422V。
在本发明的一些实施方案中，分离的衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，其包含取代T422V，并且具有由SEQ ID NO:39表示的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，分离的衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，其包含取代T422V和T519S。
在本发明的一些实施方案中，分离的衣壳包括修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，其包含取代T422V和T519S，并且具有由SEQ ID NO:40表示的氨基酸序列。
分离的核酸
在一个方面，本发明涉及编码任何来自腺伴随病毒血清型5的上述修饰的衣壳蛋白VP1的分离的核酸，所述修饰的衣壳蛋白VP1用于生产基于重组腺伴随病毒血清型5的病毒载体。
在本发明的一些实施方案中，分离的核酸编码具有氨基酸取代G226V的来自腺伴随病毒血清型5的修饰的衣壳蛋白VP1，其由具有SEQ ID NO:11的核酸序列或编码各自的氨基酸序列的任何其它序列表示。
“编码具有氨基酸取代G226V的来自腺伴随病毒血清型5(AAV5)的修饰的衣壳蛋白VP1的相应氨基酸序列的其它序列”意指其为具有SEQ ID NO:11的核酸序列的替代物的核酸序列，因为由于遗传密码的简并性，广泛范围的不同DNA序列可以编码本文公开为SEQ IDNO:3的氨基酸序列。产生编码相同氨基酸序列的这些替代DNA序列完全在本领域受过训练的人员的技能内。此类变体DNA序列在本发明的范围内。
在本发明的一些实施方案中，分离的核酸编码具有氨基酸取代S2A、G226V和T711S的来自腺伴随病毒血清型5的修饰的衣壳蛋白VP1，并且由具有SEQ ID NO:12的核酸序列或编码各自的氨基酸序列的任何其它序列表示。
“编码具有氨基酸取代S2A、G226V和T711S的来自腺伴随病毒血清型5(AAV5)的修饰的衣壳蛋白VP1的相应氨基酸序列的其它序列”意指其为具有SEQ ID NO:12的核酸序列的替代物的核酸序列，因为由于遗传密码的简并性，广泛范围的不同DNA序列可以编码本文公开为SEQ ID NO:4的氨基酸序列。产生编码相同氨基酸序列的这些替代DNA序列完全在本领域受过训练的人员的技能内。此类变体DNA序列在本发明的范围内。
在本发明的一些实施方案中，分离的核酸编码具有氨基酸取代T614A的来自腺伴随病毒血清型5的修饰的衣壳蛋白VP1，并且由具有SEQ ID NO:13的核酸序列或编码各自的氨基酸序列的任何其它序列表示。
“编码具有氨基酸取代Τ614A的来自腺伴随病毒血清型5(AAV5)的修饰的衣壳蛋白VP1的相应氨基酸序列的其它序列”意指其为具有SEQ ID NO:13的核酸序列的替代物的核酸序列，因为由于遗传密码的简并性，广泛范围的不同DNA序列可以编码本文公开为SEQID NO:5的氨基酸序列。产生编码相同氨基酸序列的这些替代DNA序列完全在本领域受过训练的人员的技能内。此类变体DNA序列在本发明的范围内。
在本发明的一些实施方案中，分离的核酸编码具有氨基酸取代S2A、T614A和T711S的来自腺伴随病毒血清型5的修饰的衣壳蛋白VP1，并且由具有SEQ ID NO:14的核酸序列或编码各自的氨基酸序列的任何其它序列表示。
“编码具有氨基酸取代S2A、Τ614A和T711S的来自腺伴随病毒血清型5(AAV5)的修饰的衣壳蛋白VP1的相应氨基酸序列的其它序列”意指其为具有SEQ ID NO:14的核酸序列的替代物的核酸序列，因为由于遗传密码的简并性，广泛范围的不同DNA序列可以编码本文公开为SEQ ID NO:6的氨基酸序列。产生编码相同氨基酸序列的这些替代DNA序列完全在本领域受过训练的人员的技能内。此类变体DNA序列在本发明的范围内。
在本发明的一些实施方案中，分离的核酸编码具有氨基酸取代T614V的来自腺伴随病毒血清型5的修饰的衣壳蛋白VP1，并且由具有SEQ ID NO:15的核酸序列或编码各自的氨基酸序列的任何其它序列表示。
“编码具有氨基酸取代Τ614V的来自腺伴随病毒血清型5(AAV5)的修饰的衣壳蛋白VP1的相应氨基酸序列的其它序列”意指其为具有SEQ ID NO:15的核酸序列的替代物的核酸序列，因为由于遗传密码的简并性，广泛范围的不同DNA序列可以编码本文公开为SEQID NO:7的氨基酸序列。产生编码相同氨基酸序列的这些替代DNA序列完全在本领域受过训练的人员的技能内。此类变体DNA序列在本发明的范围内。
在本发明的一些实施方案中，分离的核酸编码具有氨基酸取代S2A、T614V和T711S的来自腺伴随病毒血清型5的修饰的衣壳蛋白
VP1，并且由具有SEQ ID NO:16的核酸序列或编码各自的氨基酸序列的任何其它序列表示。
“编码具有氨基酸取代S2A、Τ614V和T711S的来自腺伴随病毒血清型5(AAV5)的修饰的衣壳蛋白VP1的相应氨基酸序列的其它序列”意指其为具有SEQ ID NO:16的核酸序列的替代物的核酸序列，因为由于遗传密码的简并性，广泛范围的不同DNA序列可以编码本文公开为SEQ ID NO:8的氨基酸序列。产生编码相同氨基酸序列的这些替代DNA序列完全在本领域受过训练的人员的技能内。此类变体DNA序列在本发明的范围内。
在一个方面，本发明涉及分离的核酸，其编码来自腺伴随病毒血清型5(AAV5)的上述修饰的衣壳蛋白VP2。
在本发明的一些实施方案中，分离的核酸编码具有氨基酸取代G90V的来自腺伴随病毒血清型5(AAV5)的修饰的衣壳蛋白VP2，并且由具有SEQ ID NO:27的核酸序列或编码各自的氨基酸序列的任何其它序列表示。
“编码具有氨基酸取代G90V的来自腺伴随病毒血清型5(AAV5)的修饰的衣壳蛋白VP2的相应氨基酸序列的其它序列”意指其为具有SEQ ID NO:27的核酸序列的替代物的核酸序列，因为由于遗传密码的简并性，广泛范围的不同DNA序列可以编码本文公开为SEQ IDNO:19的氨基酸序列。产生编码相同氨基酸序列的这些替代DNA序列完全在本领域受过训练的人员的技能内。此类变体DNA序列在本发明的范围内。
在本发明的一些实施方案中，分离的核酸编码具有氨基酸取代G90V和T575S的来自腺伴随病毒血清型5(AAV5)的修饰的衣壳蛋白VP2，并且由具有SEQ ID NO:28的核酸序列或编码各自的氨基酸序列的任何其它序列表示。
“编码具有氨基酸取代G90V和T575S的来自腺伴随病毒血清型5(AAV5)的修饰的衣壳蛋白VP2的相应氨基酸序列的其它序列”意指其为具有SEQ ID NO:28的核酸序列的替代物的核酸序列，因为由于遗传密码的简并性，广泛范围的不同DNA序列可以编码本文公开为SEQ ID NO:20的氨基酸序列。产生编码相同氨基酸序列的这些替代DNA序列完全在本领域受过训练的人员的技能内。此类变体DNA序列在本发明的范围内。
在本发明的一些实施方案中，分离的核酸编码具有氨基酸取代T478A的来自腺伴随病毒血清型5(AAV5)的修饰的衣壳蛋白VP2，并且由具有SEQ ID NO:29的核酸序列或编码各自的氨基酸序列的任何其它序列表示。
“编码具有氨基酸取代T478A的来自腺伴随病毒血清型5(AAV5)的修饰的衣壳蛋白VP2的相应氨基酸序列的其它序列”意指其为具有SEQ ID NO:29的核酸序列的替代物的核酸序列，因为由于遗传密码的简并性，广泛范围的不同DNA序列可以编码本文公开为SEQ IDNO:21的氨基酸序列。产生编码相同氨基酸序列的这些替代DNA序列完全在本领域受过训练的人员的技能内。此类变体DNA序列在本发明的范围内。
在本发明的一些实施方案中，分离的核酸编码具有氨基酸取代T478A和T575S的来自腺伴随病毒血清型5(AAV5)的修饰的衣壳蛋白VP2，并且由具有SEQ ID NO:30的核酸序列或编码各自的氨基酸序列的任何其它序列表示。
“编码具有氨基酸取代T478A和T575S的来自腺伴随病毒血清型5(AAV5)的修饰的衣壳蛋白VP2的相应氨基酸序列的其它序列”意指其为具有SEQ ID NO:30的核酸序列的替代物的核酸序列，因为由于遗传密码的简并性，广泛范围的不同DNA序列可以编码本文公开为SEQ ID NO:22的氨基酸序列。产生编码相同氨基酸序列的这些替代DNA序列完全在本领域受过训练的人员的技能内。此类变体DNA序列在本发明的范围内。
在本发明的一些实施方案中，分离的核酸编码具有氨基酸取代T478V的来自腺伴随病毒血清型5(AAV5)的修饰的衣壳蛋白VP2，并且由具有SEQ ID NO:31的核酸序列或编码各自的氨基酸序列的任何其它序列表示。
“编码具有氨基酸取代T478V的来自腺伴随病毒血清型5(AAV5)的修饰的衣壳蛋白VP2的相应氨基酸序列的其它序列”意指其为具有SEQ ID NO:31的核酸序列的替代物的核酸序列，因为由于遗传密码的简并性，广泛范围的不同DNA序列可以编码本文公开为SEQ IDNO:23的氨基酸序列。产生编码相同氨基酸序列的这些替代DNA序列完全在本领域受过训练的人员的技能内。此类变体DNA序列在本发明的范围内。
在本发明的一些实施方案中，分离的核酸编码具有氨基酸取代T478V和T575S的来自腺伴随病毒血清型5(AAV5)的修饰的衣壳蛋白VP2，并且由具有SEQ ID NO:32的核酸序列或编码各自的氨基酸序列的任何其它序列表示。
“编码具有氨基酸取代T478V和T575S的来自腺伴随病毒血清型5(AAV5)的修饰的衣壳蛋白VP2的相应氨基酸序列的其它序列”意指其为具有SEQ ID NO:32的核酸序列的替代物的核酸序列，因为由于遗传密码的简并性，广泛范围的不同DNA序列可以编码本文公开为SEQ ID NO:24的氨基酸序列。产生编码相同氨基酸序列的这些替代DNA序列完全在本领域受过训练的人员的技能内。此类变体DNA序列在本发明的范围内。
在一个方面，本发明涉及分离的核酸，其编码来自腺伴随病毒血清型5(AAV5)的上述修饰的衣壳蛋白VP3。
在本发明的一些实施方案中，分离的核酸编码具有氨基酸取代G34V的来自腺伴随病毒血清型5(AAV5)的修饰的衣壳蛋白VP3，并且由具有SEQ ID NO:43的核酸序列或编码各自的氨基酸序列的任何其它序列表示。
“编码具有氨基酸取代G34V的来自腺伴随病毒血清型5(AAV5)的修饰的衣壳蛋白VP3的相应氨基酸序列的其它序列”意指其为具有SEQ ID NO:43的核酸序列的替代物的核酸序列，因为由于遗传密码的简并性，广泛范围的不同DNA序列可以编码本文公开为SEQ IDNO:35的氨基酸序列。产生编码相同氨基酸序列的这些替代DNA序列完全在本领域受过训练的人员的技能内。此类变体DNA序列在本发明的范围内。
在本发明的一些实施方案中，分离的核酸编码具有氨基酸取代G34V和T519S的来自腺伴随病毒血清型5(AAV5)的修饰的衣壳蛋白VP3，并且由具有SEQ ID NO:44的核酸序列或编码各自的氨基酸序列的任何其它序列表示。
“编码具有氨基酸取代G34V和T519S的来自腺伴随病毒血清型5(AAV5)的修饰的衣壳蛋白VP3的相应氨基酸序列的其它序列”意指其为具有SEQ ID NO:44的核酸序列的替代物的核酸序列，因为由于遗传密码的简并性，广泛范围的不同DNA序列可以编码本文公开为SEQ ID NO:36的氨基酸序列。产生编码相同氨基酸序列的这些替代DNA序列完全在本领域受过训练的人员的技能内。此类变体DNA序列在本发明的范围内。
在本发明的一些实施方案中，分离的核酸编码具有氨基酸取代T422A的来自腺伴随病毒血清型5(AAV5)的修饰的衣壳蛋白VP3，并且由具有SEQ ID NO:45的核酸序列或编码各自的氨基酸序列的任何其它序列表示。
“编码具有氨基酸取代T422A的来自腺伴随病毒血清型5(AAV5)的修饰的衣壳蛋白VP3的相应氨基酸序列的其它序列”意指其为具有SEQ ID NO:45的核酸序列的替代物的核酸序列，因为由于遗传密码的简并性，广泛范围的不同DNA序列可以编码本文公开为SEQ IDNO:37的氨基酸序列。产生编码相同氨基酸序列的这些替代DNA序列完全在本领域受过训练的人员的技能内。此类变体DNA序列在本发明的范围内。
在本发明的一些实施方案中，分离的核酸编码具有氨基酸取代T422A和T519S的来自腺伴随病毒血清型5(AAV5)的修饰的衣壳蛋白
VP3，并且由具有SEQ ID NO:46的核酸序列或编码各自的氨基酸序列的任何其它序列表示。
“编码具有氨基酸取代T422A和T519S的来自腺伴随病毒血清型5(AAV5)的修饰的衣壳蛋白VP3的相应氨基酸序列的其它序列”意指其为具有SEQ ID NO:46的核酸序列的替代物的核酸序列，因为由于遗传密码的简并性，广泛范围的不同DNA序列可以编码本文公开为SEQ ID NO:38的氨基酸序列。产生编码相同氨基酸序列的这些替代DNA序列完全在本领域受过训练的人员的技能内。此类变体DNA序列在本发明的范围内。
在本发明的一些实施方案中，分离的核酸编码具有氨基酸取代T422V的来自腺伴随病毒血清型5(AAV5)的修饰的衣壳蛋白VP3，并且由具有SEQ ID NO:47的核酸序列或编码各自的氨基酸序列的任何其它序列表示。
“编码具有氨基酸取代T422V的来自腺伴随病毒血清型5(AAV5)的修饰的衣壳蛋白VP3的相应氨基酸序列的其它序列”意指其为具有SEQ ID NO:47的核酸序列的替代物的核酸序列，因为由于遗传密码的简并性，广泛范围的不同DNA序列可以编码本文公开为SEQ IDNO:39的氨基酸序列。产生编码相同氨基酸序列的这些替代DNA序列完全在本领域受过训练的人员的技能内。此类变体DNA序列在本发明的范围内。
在本发明的一些实施方案中，分离的核酸编码具有氨基酸取代T422V和T519S的来自腺伴随病毒血清型5(AAV5)的修饰的衣壳蛋白VP3，并且由具有SEQ ID NO:48的核酸序列或编码各自的氨基酸序列的任何其它序列表示。
“编码具有氨基酸取代T422V和T519S的来自腺伴随病毒血清型5(AAV5)的修饰的衣壳蛋白VP3的相应氨基酸序列的其它序列”意指其为具有SEQ ID NO:48的核酸序列的替代物的核酸序列，因为由于遗传密码的简并性，广泛范围的不同DNA序列可以编码本文公开为SEQ ID NO:40的氨基酸序列。产生编码相同氨基酸序列的这些替代DNA序列完全在本领域受过训练的人员的技能内。此类变体DNA序列在本发明的范围内。
在一些实施方案中，编码上述衣壳的分离的核酸包括任何上述核酸序列或其组合。
基于重组腺伴随病毒血清型5(rAAV5)的载体
在一个方面，本发明涉及基于重组腺伴随病毒血清型5(rAAV5)的载体，其用于向受试者递送异源核酸序列，所述载体包含：
1)任何来自腺伴随病毒血清型5(AAV5)的上述修饰的衣壳蛋白VP1或任何上述衣壳，和
2)包含调控序列的异源核酸序列，所述调控序列促进由异源核酸序列编码的产物在靶细胞中的表达。
在一个方面，本发明涉及基于重组腺伴随病毒血清型5(rAAV5)的载体，其用于向受试者递送异源核酸序列，所述载体包含：
1)任何来自腺伴随病毒血清型5(AAV5)的上述修饰的衣壳蛋白VP1，和
2)包含调控序列的异源核酸序列，所述调控序列促进由异源核酸序列编码的产物在靶细胞中的表达。
在一个方面，本发明涉及基于重组腺伴随病毒血清型5(rAAV5)的载体，其用于向受试者递送异源核酸序列，所述载体包含：
1)任何上述衣壳，和
2)包含调控序列的异源核酸序列，所述调控序列促进由异源核酸序列编码的产物在靶细胞中的表达。
如本说明书中使用的术语“基于重组腺伴随病毒血清型5的载体”、“基于AAV5的重组病毒”、“基于AAV5的病毒样颗粒”、“重组病毒AAV5毒株”、“重组AAV5载体”或“基于rAAV5的载体”具有相同的含义。
在本发明的一些实施方案中，rAAV5载体包括包含提供产物表达的调控序列的异源核酸序列，其中所述异源核酸序列的表达产物是治疗性多肽或报道多肽。
根据本发明的rAAV载体并不包含以下基因的核苷酸序列，其编码对于病毒生命周期必需的蛋白质(Rep)的序列、以及重叠衣壳蛋白(Cap)的序列。
在说明书的上述节段中详细表征了衣壳。
如本发明中使用的，“提供由异源核酸序列编码的产物在靶细胞中的表达的调控序列”意指影响它们克隆到其中的编码序列的表达和加工所必要的多核苷酸序列。表达控制序列包括适当的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号，如剪接和多聚腺苷酸化信号；稳定细胞质mRNA的序列；增加翻译效率的序列(即Kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；以及当需要时，增强蛋白质分泌的序列。此类控制序列的性质取决于宿主生物而不同；在原核生物中，此类控制序列一般包括核糖体结合位点的启动子和转录终止序列；在真核生物中，此类控制序列通常包括启动子和转录终止序列。术语“调控序列”至少包括其存在对于表达和加工是必需的所有组分，并且还可以包括其存在是有利的另外组分，例如前导肽序列。
如本说明书中使用的，术语“启动子”指这样的核酸片段，其控制一个或多个编码序列的转录，并且通过以下的存在而在结构上进行鉴定：DNA依赖性RNA聚合酶的结合位点、转录起始位点和任何其它DNA序列，包括但不限于转录因子结合位点、阻遏蛋白和激活蛋白结合位点，以及本领域技术人员已知的任何其它核苷酸序列，其直接或间接地调控使用所述启动子的转录水平。“组成型”启动子是在典型的生理和发育条件下，在大多数组织中具有活性的启动子。“诱导型”启动子是生理上或发育上受调控，例如在化学诱导剂的影响下的启动子。“组织特异性”启动子仅在特定类型的组织或细胞中具有活性。
用于真核细胞，且特别是哺乳动物细胞中的多肽的高水平生产的启动子应该是强的，并且优选在广泛范围的细胞类型中具有活性。能够在许多细胞类型中驱动表达的强组成型启动子是本领域众所周知的，并且因此在本文中没有必要对其进行详细描述。按照本发明的概念，使用巨细胞病毒(CMV)启动子是优选的。衍生自人巨细胞病毒(hCMV)的立即早期(IE)区域的启动子或启动子/增强子特别适合作为用于本发明的rAAV5载体的启动子。人巨细胞病毒(hCMV)立即早期(IE)区域以及由其衍生的功能性表达诱导和/或功能性表达增强片段例如已在ΕΡ0173177和ΕΡ0323997中公开，并且是本领域众所周知的。因此，hCMV立即早期(IE)区域的几个片段可以用作启动子和/或启动子/增强子。
如本文使用的，术语“增强子(enhancers)”或“增强子(enhancer)”可以指定位与编码重组产物的DNA序列相邻的DNA序列。增强子元件通常定位于启动子元件的5'方向，或者可以定位于编码DNA序列(例如转录或翻译成一种或多种重组产物的DNA序列)的下游或其内。因此，增强子元件可以定位于编码重组产物的DNA序列上游或所述序列下游的100个碱基对、200个碱基对、或者300个或更多个碱基对处。增强子元件可以增加由DNA序列表达的重组产物的量高于与单一启动子元件相关的表达水平。多重增强子元件对于本领域普通技术人员是容易获得的。
在本发明的一些实施方案中，包含调控序列(其提供由异源核酸序列编码的产物在靶细胞中的表达)的异源核酸序列可以在5'端至3'端方向上包括下述元件：
左手(第一)ITR(反向末端重复)；
CMV(巨细胞病毒)增强子；
CMV(巨细胞病毒)启动子；
hBG1基因(血红蛋白亚基γ1基因)的内含子；
编码产物的核酸；
hGH1多聚腺苷酸化信号(人生长激素基因多聚腺苷酸化信号)；
右手(第二)ITR。
在一些实施方案中，编码产物(转基因)的核酸是至少一种编码蛋白质的基因。在一些实施方案中，转基因编码至少一种小的抑制性核酸。在一些实施方案中，转基因编码至少一种报道分子。在一些实施方案中，小的抑制性核酸是miRNA。在一些实施方案中，小的抑制性核酸是海绵miRNA或TuD-RNA，其抑制动物中的至少一种miRNA的活性。在一些实施方案中，miRNA在靶组织的细胞中表达。在一些实施方案中，靶组织是肝、中枢神经系统(CNS)、眼、胃肠道、呼吸道、乳房、胰腺、泌尿道或子宫组织的组织。
在一些实施方案中，rAAV5载体具有异源核酸序列的表达产物，其是治疗性多肽或报道多肽。
在一些实施方案中，rAAV5载体包含编码其为治疗性多肽的产物的异源核酸序列，其中所述治疗性多肽是选自因子VIII、因子IX或其功能变体的凝血因子。
在一些实施方案中，rAAV5载体包含编码产物的异源核酸序列，所述产物是因子VIII或其功能变体。
在一些实施方案中，rAAV5载体包含编码产物的异源核酸序列，所述产物是因子IX或其功能变体。
在一些实施方案中，rAAV5载体包含编码产物的异源核酸序列，所述产物是SMN1蛋白(运动神经元存活蛋白)
在一些实施方案中，rAAV5载体包含编码产物的异源核酸序列，所述产物是SARS-cov2(严重急性呼吸综合征冠状病毒2)的RBD-S多肽(S糖蛋白的重组受体结合结构域)。
药物组合物
在一个方面，本发明涉及用于将基因产物递送至有此需要的受试者的药物组合物，其包含：
a)任何上述rAAV5载体；和
b)药学上可接受的赋形剂。
在一些实施方案中，药物组合物用于将基因产物递送至有此需要的人。
在特定实施方案中，本发明涉及药物组合物，其包含在药学上可接受的载剂中的本发明的rAAV5病毒颗粒或其它医学试剂、药物试剂、载剂、佐剂、稀释剂等。对于注射，载剂通常是液体载剂。对于其它施用方法，载剂可以是固体或液体，例如无菌无热原水或无菌无热原磷酸盐缓冲盐水溶液。对于吸入施用，载剂是可吸入的，并且优选为固体或液体微粒形式。作为注射介质，优选的是使用含有添加剂的水，所述添加剂对于注射溶液是常用的，例如稳定剂、盐或盐水；和/或缓冲剂。
在其它实施方案中，本发明涉及药物组合物，其包含在药学上可接受的载剂中的细胞或其它医学试剂、药物试剂、载剂、佐剂、稀释剂等，在所述细胞中，rAAV5载体整合到基因组内。
“药物组合物”意指这样的组合物，其包含本发明的上述rAAV5载体以及选自药学上可接受和药理学上相容的赋形剂的至少一种组分，例如填料、溶剂、稀释剂、载剂、助剂、分布剂、递送剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、助悬剂、增稠剂、延长递送控制剂，其选择和比例取决于施用的类型和途径以及剂量。本发明的药物组合物及其制备方法对于本领域技术人员无疑是显而易见的。药物组合物应该优选遵照GMP(良好生产规范)要求进行制造。组合物可以包含缓冲液组合物、张度剂、稳定剂和增溶剂。
“药学上可接受的”意指不具有生物学或其它负面副作用的材料，例如，该材料可以施用于受试者而不引起任何不期望的生物学效应。因此，此类药物组合物可以用于例如离体细胞转染或者病毒颗粒或细胞在体内直接施用于受试者。
术语“赋形剂”在本文中用于描述除本发明的上述成分外的任何成分。这些是具有无机或有机性质的物质，其用于药物生产/制造中，以便给予药物产品必要的物理化学性质。
“稳定剂”指赋形剂或者两种或更多种赋形剂的混合物，其提供活性剂的物理和/或化学稳定性。
术语“缓冲剂”、“缓冲液组合物”、“缓冲试剂”指能够通过其酸碱共轭组分的作用来抵抗pH变化的溶液，其允许rAAV5载体产物抵抗pH变化。一般地，药物组合物优选具有在4.0至8.0范围内的pH。所使用缓冲剂的实例包括但不限于乙酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、组氨酸、琥珀酸盐等缓冲溶液。
如果在例如2-8℃的贮存温度下，在指定的贮存期限过程中，活性剂保持其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物活性，则药物组合物是“稳定的”。优选地，活性剂保持物理稳定性和化学稳定性以及生物活性。贮存时期基于在加速或自然老化条件下的稳定性测试结果进行调整。
根据本发明的药物组合物可以以现成制剂形式的单一单位剂量或多个单一单位剂量的形式进行制造、包装或广泛销售。如本文使用的，术语“单一单位剂量”指含有预定数量的活性成分的药物组合物的离散数量。活性成分的数量通常等于待在受试者中施用的活性成分的剂量，或此类剂量的方便部分，例如此类剂量的一半或三分之一。
用于递送基因产物的方法
在一个方面，本发明涉及用于将基因产物递送至有此需要的受试者的方法，其包括向受试者施用任何上述rAAV5载体或上述药物组合物。
受试者指顺应本说明书中提供的技术的任何活生物。在某些非限制性实施方案中，受试者是人。所述受试者可以是任何年龄的雄性或雌性。
本领域认可的用于施用rAAV5载体的任何方法都可以适当地用于本发明的上述rAAV5载体。
示例性施用模式包括局部应用、鼻内、吸入、经粘膜、经皮、肠内(例如经口、直肠)、肠胃外(例如静脉内、皮下、皮内、肌内)施用、以及直接组织或器官注射。
注射剂可以以常规形式，作为液体溶液或悬浮液、适合于在注射之前在液体中制备溶液或悬浮液的固体形式、或者作为乳状液进行制备。可替代地，可以以局部而非全身方式，例如以贮库或缓释制剂施用本发明的上述基于AAV5的重组病毒。
基于AAV5的重组病毒以有效量引入生物内。优选将基于AAV5的重组病毒以生物学有效量引入生物内。重组病毒的“生物有效”量是足以引起感染(或转导)和核酸序列在细胞中的表达的量。如果病毒在体内施用于细胞(例如，病毒如下所述施用于受试者)，则病毒载体的“生物学有效”量是足以引起核酸序列在靶细胞中的转导和表达的量。
用于施用本发明的上述基于AAV5的重组病毒的细胞可以是任何类型的细胞，包括但不限于运动神经元或神经系统的其它组织、上皮细胞(例如皮肤、呼吸道和肠道上皮细胞)、肝细胞、肌细胞、胰腺细胞(包括胰岛细胞)、肝细胞、脾细胞、成纤维细胞、内皮细胞等等。
本发明的上述基于AAV5的重组病毒并不用于修饰人生殖系细胞的遗传完整性。
用途
在一个方面，本发明涉及任何上述rAAV5载体或上述药物组合物用于治疗有此需要的受试者中的疾病的用途。
在用途的一些实施方案中，疾病选自：血液疾病；中枢神经系统疾病；代谢疾病；肌肉疾病；遗传性疾病。
受试者指顺应本说明书中提供的技术的任何动物。在某些非限制性实施方案中，受试者是人。所述受试者可以是任何年龄的雄性或雌性。
将本发明的rAAV5载体施用于有此需要的人受试者或动物可以通过本领域已知的用于施用病毒载体的任何手段进行。
示例性施用模式包括局部应用、鼻内、吸入、经粘膜、经皮、肠内(例如经口、直肠)、肠胃外(例如静脉内、皮下、皮内、肌内)施用、以及直接组织或器官注射。
注射剂可以以常规形式，作为液体溶液或悬浮液、适合于在注射之前在液体中制备溶液或悬浮液的固体形式、或者作为乳状液进行制备。可替代地，可以以局部而非全身方式，例如以贮库或缓释制剂施用本发明的上述基于AAV5的重组病毒。
在用途的一些实施方案中，疾病选自：血液疾病；中枢神经系统疾病；代谢疾病；肌肉疾病；遗传性疾病。
在用途的一些实施方案中，疾病是血液疾病。
在用途的一些实施方案中，疾病是肌肉疾病。
在用途的一些实施方案中，疾病是遗传性疾病。
在用途的一些实施方案中，异源核酸序列的表达产物是因子IX或其功能变体。
在用途的一些实施方案中，异源核酸序列的表达产物是因子VIII或其功能变体。
在用途的一些实施方案中，异源核酸序列的表达产物是SMN1蛋白(运动神经元存活蛋白)。
在用途的一些实施方案中，异源核酸序列的表达产物是SARS-cov2(严重急性呼吸综合征冠状病毒2)的RBD-S多肽(S糖蛋白的重组受体结合结构域)。
在用途的一些实施方案中，任何上述rAAV5载体或上述药物组合物以治疗有效量使用。
“治疗有效量”应理解为意指足以减轻(例如缓和、降低、减少)与疾病状态相关的至少一种症状的量。可替代地陈述，“治疗有效”量是足以提供受试者的状况中的一些改善的量。
本发明的上述基于AAV5的重组病毒的剂量将取决于施用模式、特定的病毒载体，并且它们可以以常规方式进行确定。用于实现疗效的示例性剂量是至少约105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016个转录单位或更多，优选约109至1015个转导单位，再更优选1014个转导单位/千克的病毒滴度。
因此，本发明的基于AAV5的重组病毒、试剂和方法可以用于将核酸引导至分裂细胞或非分裂细胞，并且在其中稳定地表达异源核酸。使用这种载体系统，目前有可能在体内条件下，将编码影响细胞生理学的蛋白质的基因引入细胞内。本发明的载体因此可以用于疾病状态的基因治疗中。
一般而言，本发明可以用于递送具有生物学效应的任何外源核酸，以治疗或改善与涉及基因表达的任何病症相关的症状。示例性的疾病状态包括但不限于：囊性纤维化(和其它肺疾病)，血友病A、血友病B、地中海贫血、贫血和其它凝血障碍，AID、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、肌萎缩侧索硬化、癫痫和其它神经系统病症，糖尿病、肌营养不良(例如杜兴氏(Duchenne)、贝克型(Becker)、脊髓性肌萎缩(SMA))、戈谢氏病(Gaucher'sdisease)、胡尔勒氏病(Hurler'sdisease)、腺苷脱氨酶缺乏症、糖原贮积病和其它代谢缺陷，实体器官(例如脑、肝、肾、心脏)的疾病等等。
基因转移在理解疾病状态且提供用于其的治疗方面具有巨大的潜在用途。存在对于其缺陷基因是已知的并且已得到克隆的许多遗传性疾病。在一些情况下，这些克隆基因的功能是已知的。一般而言，上述疾病状态落入两个类别内：缺乏状态，通常是酶缺乏，其一般以隐性方式遗传；以及不平衡状态，有时至少涉及调控或结构蛋白，其以显性方式遗传。对于缺乏状态的疾病，基因转移可以用于将正常基因带入受累组织内用于替代治疗。对于不平衡的疾病状态，基因转移可以用于在模型系统中产生疾病状态，所述模型系统然后可以用于对抗该疾病状态的努力中。因此，本发明的方法允许治疗遗传疾病。根据本发明，疾病状态通过部分或完全补救缺乏或不平衡进行治疗，所述缺乏或不平衡导致疾病或使其更严重。使用核酸序列的位点特异性整合来诱导突变或纠正缺陷也是可能的。
用于生产rAAV5载体的方法
在一个方面，本发明涉及用于生产任何上述rAAV5载体的方法，其包括用包含来自腺伴随病毒血清型5(AAV5)的修饰衣壳蛋白VP1的任何上述核酸或编码衣壳的上述核酸转染生产细胞。
衣壳蛋白可以由重组病毒、表达载体或细胞系进行表达，主题修饰的AAV衣壳或编码序列的基因稳定整合到所述细胞系内。此外，本发明提供了由AAV衣壳蛋白在体外生产具有所述突变的AAV衣壳以及在体外构建包装的衣壳。本发明进一步提供了修饰的AAV衣壳的生产，所述修饰的AAV衣壳已进行遗传改造，以表达临床上显著抗原的异源表位，以便引发免疫应答。
用于产生rAAV5载体的方法已在实施例节段中进行详细描述。
转基因动物
根据本公开内容的一些方面，提供的是用于产生体细胞转基因动物模型的方法。在一些实施方案中，该方法包括向非人动物施用任何上述rAAV，其中所述rAAV包含至少一种转基因，并且其中所述rAAV感染非人动物的靶组织的细胞。
在一些实施方案中，使用主题衣壳变体来产生体细胞转基因动物模型是可能的，其包括向非人动物施用任何上述rAAV，其中所述rAAV包含至少一种转基因。在一些实施方案中，转基因是至少一种编码蛋白质的基因。在一些实施方案中，转基因编码至少一种小的抑制性核酸。在一些实施方案中，转基因编码至少一种报道分子。
体细胞转基因动物模型可以是哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔、犬、猫、绵羊、猪、非人灵长类动物。
在一些实施方案中，可以将假定的治疗剂施用于体细胞转基因动物模型，以确定假定的治疗剂对动物中的疾病状态的作用。
实施例
提供下述实施例用于更好地理解本发明。这些实施例仅用于说明的目的，而不应解释为以任何方式限制本发明的范围。
本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请都通过引用并入本文。尽管前述发明已通过说明和实例的方式略微详细地进行描述用于清楚理解的目的，但按照本发明的教导，对于本领域的普通技术人员将显而易见的是，可以对其进行某些变化和修改，而不背离所附实施方案的精神或范围。
材料和一般方法
重组DNA技术
如Sambrook，J.等人，Molecular cloning:A laboratory manual；Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，2012中所述，标准方法用于操纵DNA。根据制造商方案使用分子生物学试剂。
基因合成
所需的基因区段由通过化学合成制备的寡核苷酸进行制备。侧翼为单个限制性位点、长300-4,000bp的基因区段，通过寡核苷酸的退火和连接包括PCR扩增进行组装，并且随后经由指定的限制性位点进行克隆。通过DNA测序确认亚克隆的基因片段的DNA序列。
DNA序列确定
DNA序列通过桑格测序进行确定。
DNA和蛋白质序列分析和序列数据管理
SnapGene软件包版本5.1.4.1用于序列产生、映射、分析、注释和说明。
统计数据分析
结果指示了平均值±标准差(SD)，方差分析(ANOVA)用于比较测试和对照结果，并且它们确定为统计学显著的。
实施例1.rAAV5衣壳变体文库的生产
rAAV5衣壳变体文库通过Cap基因序列的随机诱变而产生(Davidsson M.等人，2016)。简言之，使用尿嘧啶-DNA糖基化酶，使包含VP1中的突变S2A和T711S的血清型5的Cap基因序列片段化，所述突变在前一轮选择中产生(专利申请号RU2019126509)，使用不具有校对活性的DNA聚合酶(导致序列中的随机突变)，将所得到的片段组装成全长Cap基因。将全长突变型变体克隆到载体质粒pAAV-接头(图1)内的AscI/EcoRI限制性位点处，具有绿色荧光蛋白(GFP)的共同读码框中，从而产生AAV5衣壳的多样化随机文库，所述文库此后用于选择具有增加的转导活性的衣壳变体。
具有增加的转导活性的病毒颗粒在CHO-K1-S细胞上在体外进行阳性选择。进一步地，对于转导，我们使用这样的颗粒，其使用在碘克沙醇梯度中的超速离心进行纯化。在48小时后，收获细胞并且分离基因组DNA，用于随后扩增能够有效转导的病毒基因组序列。所得到的序列此后进行再克隆并再产生，用于后续选择迭代以使文库富集具有最高转导效率的变体。在5轮选择后，对100个克隆的衣壳基因进行测序，以确定最成功的突变及其组合。根据测序结果，AAV5 VP1中占优势的突变组合为S2A、T711S、T614V，占克隆的约30％。还选择了包含AAV5 VP1中的突变S2A、T711S、T614A，以及AAV5 VP1中的突变S2A、T711S、G226V的衣壳变体。将这些衣壳变体克隆到用于产生病毒颗粒的载体内，并且进一步用于可视化且比较相对于野生型AAV5的转导谱。
实施例2.从所得到的序列文库中重组病毒颗粒的生成和随后的选择
为了从所得到的序列文库中产生并且随后选择重组病毒颗粒，如下开发了一系列质粒：载体质粒、包含Rep基因序列的质粒、以及包含病毒颗粒复制所需的腺病毒基因的构建体。
预期用于将AAV血清型5的衣壳基因的随机变体文库克隆到具有报道蛋白的一个读码框内的载体质粒pAAV-接头(图1)通过以下产生：使用限制性酶-连接酶方法在HindIII/EcoRI位点处克隆，用具有来自5'端的EcoRI限制性位点以及来自3'端的HindIII限制性位点的添加的从头合成的序列T2A-GFP，取代原始构建体pAAV-GFP(图2)中的修饰的绿色荧光蛋白的序列。
包含Rep基因序列的质粒pAAV-Rep(图3)通过以下产生：在PciI/PsiI限制性位点处，从头克隆AAV血清型2Rep基因(GenBank ID AF043303.1)的合成序列，随后用T4 DNA聚合酶处理，以在同样用PciI/PsiI限制性酶处理的质粒pGem-T Easy(Promega，USA)内生成平端。
用于产生重组病毒颗粒的腺病毒基因来源于构建体pHelper(图4)，其包含AmpR-提供对氨苄青霉素的抗性的β-内酰胺酶基因，Ori-细菌中的复制起点，Adeno E2A-涉及病毒DNA复制的辅助腺病毒基因序列，Adeno E4-涉及病毒DNA复制的辅助腺病毒基因序列，Adeno VARNA-负责早期和晚期病毒基因两者的翻译的辅助腺病毒基因序列。
实施例3.用于生产基于修饰的腺伴随病毒血清型5(rAAV5)的载体的方法
为了生产具有修饰的血清型5衣壳的rAAV颗粒，生产细胞如下用3种质粒同时进行转染：
1)包含腺病毒核苷酸序列的质粒(辅助质粒)，所述腺病毒核苷酸序列编码rAAV颗粒组装所需的蛋白质和RNA；
2)包含腺伴随病毒的Rep基因的天然核苷酸序列、以及修饰的Cap基因的序列的质粒，所述修饰的Cap基因的序列选自：SEQ ID NO:10、11、12、13、14、15、16的核苷酸序列，或者编码具有SEQ IDNo:2、3、4、5、6、7或8的氨基酸序列的VP1蛋白以及来自所使用的核苷酸序列的可变读码框的VP2和VP3蛋白的任何其它核苷酸序列，其中
VP2可以具有SEQ ID No:18、19、20、21、22、23或24的任何氨基酸序列；
VP3可以具有SEQ ID No:34、35、36、37、38、39或40的任何氨基酸序列；
3)包含异源rAAV颗粒基因组的质粒，所述基因组编码预期用于递送到患者的细胞内的靶基因。
这个基因集合提供了在72小时内的rAAV病毒颗粒组装和其中的靶基因组的衣壳化。在转染之后72小时，使生产细胞裂解，以释放rAAV颗粒，用于通过后续过滤和层析步骤的纯化。纯化的rAAV颗粒的滴度通过酶联免疫吸附测定和定量PCR进行验证。
实施例4.在野生型AAV5衣壳蛋白VP1中的突变S2A、T614V/T614A/G226V、T711S的存在下，增加用基于rAAV5的产物的细胞转导效率。
实验设计：
将CHO-K1-S细胞在12孔板的孔内铺平板。接种在下述生长培养基内进行：补充有谷氨酰胺的DMEM/F12，葡萄糖含量为4.5g/l，5％牛血清。细胞接种密度为10,000个细胞/cm2。在转导运行期间，预先制备的细胞以500、1,250和2,500vg/细胞的MOI进行转导。所有样品都一式三份地运行。完整细胞用作阴性对照。
在衣壳蛋白VP1中具有突变S2A和T711S的基于rAAV5的产物和具有野生型衣壳的基于rAAV5的产物用作对照。先前已显示了(专利申请号RU2019126509)，与野生型衣壳相比，AAV5衣壳蛋白VP1中的突变S2A和T711S的存在导致显著更高的CHO-K1-S细胞转导效率。
使用Guava EasyCyteflow细胞计数器和GuavaSoft软件执行转导效率的分析。
本发明的作者惊讶地发现，在野生型rAAV5衣壳蛋白VP1或已经包含突变S2A和T711S的rAAV5衣壳蛋白VP1中选自以下的一种或多种突变的存在：T614V、T614A和G226V，导致通过具有所述突变(T614V、T614A和G226V)的rAAV载体的转基因递送效率的显著增加。例如，流式细胞术允许在用rAAV5产物转导CHO-K1-S系之后48小时，检测到GFP阳性细胞数目的变化，所述rAAV5产物含有野生型蛋白VP1，含有包含突变S2A和T711S的蛋白VP1，或携带突变S2A、T711S和T614V或T614A或G226V的蛋白VP1(图5)。
与具有仅包含突变S2A和T711S的衣壳蛋白VP1的对照rAAV5产物(AAV5-01Mut-GFP)相比，在突变T614V、S2A和T711S(AAV5-02Mut-GFP)的存在下，表达GFP的细胞数目在MOI 500下从24.92％到32.84％增加到1.31倍，在MOI 1,250下从43.44％到63.89％增加到1.47倍，并且在MOI 2,500vg/细胞下从65.56％到78.01％增加到1.17倍。当比较具有包含突变T614V、S2A和T711S的衣壳蛋白VP1(AAV5-02Mut-GFP)和野生型衣壳VP1(AAV5-NullMut-GFP)的rAAV5产物时，表达GFP的细胞数目在MOI 500下从11.97％到32.84％增加到2.74倍，在MOI 1,250下从20.11％到63.89％增加到3.18倍，并且在MOI 2,500下从42.26％到78.01％增加到1.85倍。
与具有仅包含突变S2A和T711S的衣壳蛋白VP1的对照rAAV5产物(AAV5-01Mut-GFP)相比，在突变T614A、S2A和T711S(AAV5-03Mut-GFP)的存在下，表达GFP的细胞数目在MOI 500下从24.92％到29.62％增加到1.18倍，在MOI 1,250下从43.44％到55.22％增加到1.27倍，并且在MOI 2,500vg/细胞下从65.56％到72.05％增加到1.1倍。当比较具有包含突变T614A、S2A和T711S的衣壳蛋白VP1(AAV5-03Mut-GFP)和野生型衣壳VP1(AAV5-NullMut-GFP)的rAAV5产物时，表达GFP的细胞数目在MOI 500下从11.97％到29.62％增加到2.47倍，在MOI 1,250下从20.11％到55.22％增加到2.74倍，并且在MOI 2,500下从42.26％到72.05％增加到1.7倍。
与具有仅包含突变S2A和T711S的衣壳蛋白VP1的对照rAAV5产物(AAV5-01Mut-GFP)相比，在突变G226V、S2A和T711S(AAV5-04Mut-GFP)的存在下，表达GFP的细胞数目在MOI 500下从24.92％到17.67％降低到1/1.41，在MOI 1,250下从43.44％到39.69％降低到1/1.09，并且在MOI 2,500vg/细胞下从65.56％到61.85％降低到1/1.05。当比较具有包含突变T614A、S2A和T711S的衣壳蛋白VP1(AAV5-03Mut-GFP)和野生型衣壳VP1(AAV5-NullMut-GFP)的rAAV5产物时，表达GFP的细胞数目在MOI 500下从11.97％到17.67％增加到1.48倍，在MOI 1,250下从20.11％到39.69％增加到1.97倍，并且在MOI 2,500下从42.26％到61.85％增加到1.46倍。
实施例5.在野生型AAV5衣壳蛋白VP1中的突变S2A、T614V/G226V、T711S的存在下，用基于rAAV5的产物的AAV病毒基因组包装效率。
如本发明中使用的，术语“载体基因组”和“载体DNA”预期意指在重组腺伴随病毒(下文被称为rAAV)的衣壳中包装的ssDNA。此类ssDNA既可以是有义链(下文被称为正DNA链)，也可以是反义链(下文被称为负DNA链)。rAAV产物是衣壳的混合物，其中一些包含正ssDNA链，而一些包含负ssDNA链。rAAV载体基因组是表达盒的核苷酸序列，所述表达盒被反向末端重复或ITR(下文被称为ITR)的序列包围。
如本发明中使用的，术语“样品”或“测试样品”预期意指从相应的rAAV产物中提取的ssDNA。
根据文献，AAV衣壳能够有效包装长达4.8kb的盒，而较大的盒在包装到衣壳内的同时从DNA的5'或3'端片段化，导致较不有效的包装，并且因此形成rAAV病毒基因组的异质群体。进一步地，单链DNA(下文被称为ssDNA)的5'端最经常是缺失的(Zhijian Wu，2010.)。因此，rAAV产物的显著部分含有片段化的ssDNA链，导致表达效率降低。DNA斑点印迹用于测量用rAAV衣壳进行的ssDNA包装效率。为了检查测试样品中的ssDNA的5'和3'端的完整性，就与5’ITR和3’ITR序列相邻的DNA区域选择寡核苷酸探针。探针应该以严格的特异性与所选的ssDNA区域结合。进一步地，我们选择了对应于表达盒中间(～2400-2500bp)的DNA区域的探针；该检测点是测试ssDNA链的对照点，因为该区域在包装到衣壳内时不太可能经受片段化(图6)。对于表达盒的“正”和“负”DNA链选择寡核苷酸探针。探针与传统寡核苷酸的不同之处在于在序列的5'端处存在生物素分子。
在研究过程中，我们将测试样品(即从测试rAAV产物中提取的DNA)应用到预先浸泡在20XSS缓冲液中的硝酸纤维素膜上，并且与所选的探针杂交。对于每个探针使用具有测试样品的分开膜；因此根据文章(Serotype-dependentpackaging oflarge genes inadeno-associated viral vectors results in effective gene delivery in miceMariacarmela Allocca，JClin Invest.2008年5月1日；118(5):1955–1964.)中描述的方案，加工了6个膜，其各自含有从2.5×1010个病毒颗粒(测量为GC-基因组拷贝)中提取的测试DNA样品，其中病毒产物用DNA酶I预处理，以去除未衣壳化DNA的杂质，随后为用蛋白酶K处理。
使用Microfiltration Apparatus(Bio-Rad)真空歧管，将样品应用到膜上。将来自2.3×109个载体基因组的提取的DNA应用于歧管的第一个孔。将样品的两倍连续稀释物应用到歧管的剩余六个孔中，以从而产生对应于其量为7、3.5、1.7、0.86、0.43、0.21和0.11ng的载体DNA的一系列稀释物。通过在SmaI位点处切割pAAV-GOI产生的标准pDNA以相同的方式进行稀释。校准曲线中的标准pDNA的量分别为50、25、12.5、6.25、3.1、1.6、0.78。
如本发明中使用的，术语“标准pDNA”预期意指在SmaI位点处切割的质粒DNA(下文被称为pDNA)，其核苷酸序列确切地对应于处于研究中的载体基因组的核苷酸序列。
用于杂交的探针是合成的并且用生物素进行标记。杂交在低于每个探针的熔点10℃的温度下进行过夜。
第二天，首先用2x SSC/0.1％SDS的溶液，然后用TBSTx1洗涤膜。然后使膜与1％BSA和TBSTx1一起温育40分钟，然后再次用TBSTx1洗涤。接下来，使膜与HRP缀合的链霉抗生物素蛋白一起温育1小时，以使生物素化探针与HRP缀合的链霉抗生物素蛋白结合。在膜用1％BSA TBSTx1的最终洗涤后，添加化学发光检测底物，并且在膜上检测到发光信号(图7)。使用"Image Lab"软件进一步加工所得到的图像。通过标准pDNA发光信号的强度水平测量探针发光信号的强度。将标准pDNA稀释物的发光信号强度视为校准曲线(下文被称为标准样品)。
本发明的作者发现，所选的生物素化的探针以相同的效率与膜上存在的DNA纳米基质结合，这由在每个点处的标准pDNA稀释物的染色是显而易见的。在所有测试样品中检测到对应于处于研究中的DNA正链的5'和3'端以及负链的5'和3'端的DNA片段。对于在膜上的测试样品DNA的相同负载，观察到所检测到的发光信号强度的差异。
在“探针1”的检测区域中，在样品vgDNA-04Mut-GFP的第一稀释点处的发光信号强度对应于标准样品pDNA-GFP的第三稀释度的发光信号强度。样品vgDNA-04Mut-GFP的检测限在第六稀释度下检测到，样品的第七稀释度在背景信号水平下检测到。
在“探针1”的检测区域中，在样品vgDNA-02Mut-GFP的第一稀释点处的发光信号强度在标准样品pDNA-GFP的第三稀释度和第四稀释度的发光信号强度范围内。样品vgDNA-02Mut-GFP的检测限在第五稀释度下检测到，样品的第六稀释度和第七稀释度在背景信号水平下检测到。
在“探针1”的检测区域中，在样品vgDNA-NullMut-GFP的第一稀释点处的发光信号强度对应于标准样品pDNA-GFP的第四稀释度的发光信号强度。样品vgDNA-NullMut-GFP的检测限在第四稀释度下检测到；样品的第五稀释度、第六稀释度和第七稀释度在背景信号水平下检测到。
当比较“探针1”检测区域中的样品的发光信号强度时，与对照样品vgDNA-NullMut-GFP相比，样品vgDNA-04Mut-GFP和vgDNA-02Mut-GFP具有更大的发光信号强度。并且在相对于对照样品vgDNA-NullMut-GFP的进一步稀释度下检测到。
在“探针3”的检测区域中，在样品vgDNA-04Mut-GFP的第一稀释点处的发光信号强度超过了标准样品pDNA-GFP的稀释度。在样品vgDNA-04Mut-GFP的第二稀释点处的发光信号强度在标准样品pDNA-GFP的第一稀释度和第二稀释度的发光信号强度范围内。样品vgDNA-04Mut-GFP的检测限在第五稀释度下检测到，样品的第六稀释度和第七稀释度在背景信号水平下检测到。
在“探针3”的检测区域中，在样品vgDNA-02Mut-GFP的第一稀释点处的发光信号强度超过了标准样品pDNA-GFP的稀释度。在样品vgDNA-02Mut-GFP的第二稀释点处的发光信号强度在标准样品pDNA-GFP的第一稀释度和第二稀释度的发光信号强度范围内。样品vgDNA-02Mut-GFP的检测限在第五稀释度下检测到，样品的第六稀释度和第七稀释度在背景信号水平下检测到。
在“探针3”的检测区域中，在样品vgDNA-NullMut-GFP的第一稀释点处的发光信号强度超过了标准样品pDNA-GFP的稀释度。在样品vgDNA-NullMut-GFP的第二稀释点处的发光信号强度在标准样品pDNA-GFP的第二稀释度和第三稀释度的发光信号强度范围内。样品vgDNA-NullMut-GFP的检测限在第四稀释度下检测到，样品的第五稀释度、第六稀释度和第七稀释度在背景信号水平下检测到。
当比较“探针3”检测区域中的样品的发光信号强度时，与对照样品vgDNA-NullMut-GFP相比，样品vgDNA-04Mut-GFP和vgDNA-02Mut-GFP具有更大的发光信号强度。并且在相对于对照样品vgDNA-NullMut-GFP的进一步稀释度下检测到。
在“探针5”的检测区域中，在样品vgDNA-04Mut-GFP的第一稀释点处的发光信号强度对应于标准样品pDNA-GFP的第五稀释度的发光信号强度。样品vgDNA-04Mut-GFP的检测限在第四稀释度下检测到；样品的第五稀释度、第六稀释度和第七稀释度在背景信号水平下检测到。
在“探针5”的检测区域中，在样品vgDNA-02Mut-GFP的第一稀释点处的发光信号强度对应于标准样品pDNA-GFP的第四稀释度的发光信号强度。样品vgDNA-02Mut-GFP的检测限在第七稀释度下检测到。
在“探针5”的检测区域中，在样品vgDNA-NullMut-GFP的第一稀释点处的发光信号强度对应于标准样品pDNA-GFP的第五稀释度的发光信号强度。样品vgDNA-NullMut-GFP的检测限在第五稀释度下检测到；样品的第六稀释度和第七稀释度在背景信号水平下检测到。
当比较“探针5”检测区域中的样品的发光信号强度时，样品vgDNA-04Mut-GFP与对照样品vgDNA-NullMut-GFP并无不同。与对照样品vgDNA-NullMut-GFP相比，样品vgDNA-02Mut-GFP具有更高的发光信号强度。并且在相对于对照样品vgDNA-NullMut-GFP的进一步稀释度下检测到。
在“探针2”的检测区域中，在样品vgDNA-04Mut-GFP的第一稀释点处的发光信号强度在标准样品pDNA-GFP的第四稀释度和第五稀释度的发光信号强度范围内。样品vgDNA-04Mut-GFP的检测限在第四稀释度下检测到；样品的第五稀释度、第六稀释度和第七稀释度在背景信号水平下检测到。
在“探针2”的检测区域中，在样品vgDNA-02Mut-GFP的第一稀释点处的发光信号强度在标准样品pDNA-GFP的第四稀释度和第五稀释度的发光信号强度范围内。样品vgDNA-02Mut-GFP的检测限在第五稀释度下检测到；样品的第六稀释度和第七稀释度在背景信号水平下检测到。
在“探针2”的检测区域中，在对照样品vgDNA-NullMut-GFP的第一稀释点处的发光信号强度在标准样品pDNA-GFP的第四稀释度和第五稀释度的发光信号强度范围内。样品vgDNA-NullMut-GFP的检测限在第四稀释度下检测到；样品的第五稀释度、第六稀释度和第七稀释度在背景信号水平下检测到。
当比较“探针2”检测区域中的样品的发光信号强度时，样品vgDNA-04Mut-GFP与对照样品vgDNA-NullMut-GFP并无不同。与对照样品vgDNA-NullMut-GFP相比，样品vgDNA-02Mut-GFP具有更高的发光信号强度。并且在相对于对照样品vgDNA-NullMut-GFP的进一步稀释度下检测到。
在“探针4”的检测区域中，在样品vgDNA-04Mut-GFP的第一稀释点处的发光信号强度超过了标准样品pDNA-GFP的稀释度。在样品vgDNA-04Mut-GFP的第二稀释点处的发光信号强度在标准样品pDNA-GFP的第一稀释度和第二稀释度的发光信号强度范围内。样品vgDNA-04Mut-GFP的检测限在第六稀释度下检测到，样品的第七稀释度在背景信号水平下检测到。
在“探针4”的检测区域中，在样品vgDNA-02Mut-GFP的第一稀释点处的发光信号强度在标准样品pDNA-GFP的第一稀释度和第二稀释度的发光信号强度范围内。样品vgDNA-02Mut-GFP的检测限在第六稀释度下检测到，样品的第七稀释度在背景信号水平下检测到。
在“探针4”的检测区域中，在样品vgDNA-NullMut-GFP的第一稀释点处的发光信号强度在标准样品pDNA-GFP的第一稀释度和第二稀释度的发光信号强度范围内。样品vgDNA-NullMut-GFP的检测限在第五稀释度下检测到，样品的第六稀释度和第七稀释度在背景信号水平下检测到。
当比较“探针4”检测区域中的样品的发光信号强度时，与对照样品vgDNA-NullMut-GFP相比，样品vgDNA-04Mut-GFP和vgDNA-02Mut-GFP具有更大的发光信号强度。并且在相对于对照样品vgDNA-NullMut-GFP的进一步稀释度下检测到。
在“探针6”的检测区域中，在样品vgDNA-04Mut-GFP的第一稀释点处的发光信号强度在标准样品pDNA-GFP的第四稀释度和第五稀释度的发光信号强度范围内。样品vgDNA-04Mut-GFP的检测限在第六稀释度下检测到，样品的第六稀释度和第七稀释度在背景信号水平下检测到。
在“探针6”的检测区域中，在样品vgDNA-02Mut-GFP的第一稀释点处的发光信号强度对应于标准样品pDNA-GFP的第四稀释度的发光信号强度。样品vgDNA-02Mut-GFP的检测限在第四稀释度下检测到；样品的第五稀释度、第六稀释度和第七稀释度在背景信号水平下检测到。
在“探针6”的检测区域中，在样品vgDNA-NullMut-GFP的第一稀释点处的发光信号强度对应于标准样品pDNA-GFP的第四稀释度的发光信号强度。样品vgDNA-NullMut-GFP的检测限在第四稀释度下检测到；样品的第五稀释度、第六稀释度和第七稀释度在背景信号水平下检测到。
当比较“探针6”检测区域中的样品的发光信号强度时，样品vgDNA-02Mut-GFP与对照样品vgDNA-NullMut-GFP并无不同，并且样品vgDNA-04Mut-GFP具有更大的发光信号强度，并且与对照样品vgDNA-NullMut-GFP相比，在以后稀释度下检测到。
当比较样品vgDNA-04Mut-GFP在“探针1”(负DNA链的3'区域)和“探针5”(负DNA链的5'区域)的检测点处的发光信号强度时，与对应于标准样品pDNA-GFP的第五稀释度的发光信号强度的负DNA链的可检测5'区域(探针5)相比，负DNA链的3'区域(探针1)具有对应于标准样品pDNA-GFP的第三稀释度的发光信号的最高强度。
当比较样品vgDNA-02Mut-GFP在“探针1”(负DNA链的3'区域)和“探针5”(负DNA链的5'区域)的检测点处的发光信号强度时，与对应于标准样品pDNA-GFP的第四稀释度的发光信号强度的负DNA链的可检测5'区域相比，负DNA链的3'区域具有在标准样品pDNA-GFP的第三稀释度和第四稀释度范围内的发光信号的最高强度。
当比较对照样品vgDNA-NullMut-GFP在“探针1”(负DNA链的3'区域)和“探针5”(负DNA链的5'区域)的检测点处的发光信号强度时，与对应于标准样品pDNA-GFP的第五稀释度的发光信号强度的负DNA链的可检测5'区域相比，负DNA链的3'区域具有对应于标准样品pDNA-GFP的第四稀释度的发光信号的最高强度。
对于样品vgDNA-04Mut-GFP、vgDNA-02Mut-GFP、vgDNA-NullMut-GFP，基于负DNA链的3'端检测区域中的发光信号强度与负DNA链的5'端检测区域中的发光信号强度差异，测量了负链的包装效率。研究的所有样品都显示出负DNA链的3'端检测区域中的发光信号强度优于负DNA链的5'端检测区域中的发光信号强度的趋势。然而，在样品的负DNA链的3'端检测区域和负DNA链的5'端检测区域的发光信号强度之间的比较，揭示了由于对于负DNA链的3'端检测区域和负DNA链的5'端检测区域两者的高发光信号强度，与对照样品vgDNA-NullMut-GFP相比，样品vgDNA-04Mut-GFP和vgDNA-02Mut-GFP显示出负DNA链的更有效包装；并且相对于对照样品vgDNA-NullMut-GFP，在以后稀释度下检测到。与vgDNA-04Mut-GFP和对照样品vgDNA-NullMut-GFP相比，样品vgDNA-02Mut-GFP显示出负DNA链的更有效包装，这是由于以下事实：负DNA链的3'端检测区域中的发光信号强度在标准样品pDNA-GFP的第三稀释度和第四稀释度的发光信号强度的范围内，并且负DNA链的5'端检测区域中的发光信号强度对应于标准样品pDNA-GFP的第四稀释度的发光信号强度，而样品vgDNA-04Mut-GFP和vgDNA-NullMut-GFP显示出在负DNA链的5'端检测区域中的发光信号强度，其显著低于这些样品的负DNA链的3'端检测区域中的发光信号强度。这一事实指示了样品vgDNA-02Mut-GFP中的完全尺寸负DNA链的更有效包装。
样品vgDNA-04Mut-GFP在“探针6”(正DNA链的3'区域)和“探针2”(正DNA链的5'区域)的检测点处的发光信号强度的比较并未显示差异；在这些点处的发光强度在标准样品pDNA-GFP的第四稀释度和第五稀释度的发光信号强度范围内。
样品vgDNA-02Mut-GFP在“探针6”(正DNA链的3'区域)和“探针2”(正DNA链的5'区域)的检测点处的发光信号强度的比较并未显示差异；在这些点处的发光强度在标准样品pDNA-GFP的第四稀释度和第五稀释度的发光信号强度范围内。
样品vgDNA-NullMut-GFP在“探针6”(正DNA链的3'区域)和“探针2”(正DNA链的5'区域)的检测点处的发光信号强度的比较并未显示差异；在这些点处的发光强度在标准样品pDNA-GFP的第四稀释度和第五稀释度的发光信号强度范围内。
对于样品vgDNA-04Mut-GFP、vgDNA-02Mut-GFP、vgDNA-NullMut-GFP，基于正DNA链的3'端检测区域和正DNA链的5'端检测区域中的发光信号强度来测量正链的包装效率。发现正DNA链的3'端检测区域中的所有样品都显示了在标准样品pDNA-GFP的第四稀释度和第五稀释度的发光信号强度范围内可检测到的测试样品的发光信号，以及在标准样品pDNA-GFP的第四稀释度和第五稀释度的发光信号强度范围内检测到来自对测试样品的正DNA链的5'区域的检测的发光信号。相应地，处于研究中的样品中的正DNA链包装具有相等的效率。
实施例6.基于修饰的腺伴随病毒血清型5(rAAV5)的载体生成效率
为了生产具有修饰的血清型5衣壳的rAAV颗粒，HEK293生产细胞使用聚乙烯亚胺用如下3种质粒同时进行转染：
1)包含腺病毒核苷酸序列的质粒(辅助质粒)，所述腺病毒核苷酸序列编码rAAV颗粒组装所需的蛋白质和RNA；
2)包含腺伴随病毒的Rep基因的天然核苷酸序列、以及修饰的Cap基因的序列的质粒，所述修饰的Cap基因的序列选自：SEQ ID NO:10、11、12、13、14、15、16的核苷酸序列，或者编码具有SEQ IDNo:2、3、4、5、6、7或8的氨基酸序列的VP1蛋白以及来自所使用的核苷酸序列的可变读码框的VP2和VP3蛋白的任何其它核苷酸序列，其中
VP2可以具有SEQ ID No:18、19、20、21、22、23或24的任何氨基酸序列；
VP3可以具有SEQ ID No:34、35、36、37、38、39或40的任何氨基酸序列；
3)包含异源rAAV颗粒基因组的质粒，所述基因组编码预期用于递送到患者的细胞内的靶基因。
这个基因集合提供了在72小时内的rAAV病毒颗粒组装和其中的靶基因组的衣壳化。在转染之后72小时，使生产细胞经受裂解，以释放rAAV颗粒，所得到的载体在37℃下用DNA酶I处理2小时，然后在56℃下用蛋白酶K再处理2小时。使用由对于GFP序列特异性的正向引物5’-ACCACATGAAGCAGCACGAC-3’、反向引物5’-TCAGCTCGATGCGGTTCAC-3’和探针5’-HEX-CATGCCCGAAGGCTACGTCCAG-BHQ1-3’组成的寡核苷酸集合，通过定量PCR测定所得到的rAAV颗粒的滴度。
本发明的作者惊讶地发现，在野生型rAAV5衣壳蛋白VP1或已经包含突变S2A和T711S的rAAV5衣壳蛋白VP1中选自T614V、T614A或G226V的一种或多种突变的存在，导致与野生型rAAV5衣壳相比，基于具有所述突变(T614V、T614A和G226V)的rAAV5的衣壳化病毒颗粒产率的显著增加。例如，定量PCR显示了编码靶GFP基因的包装的异源rAAV颗粒基因组的拷贝数变化(图9)。
在突变T614V、S2A和T711S(AAV5-02Mut-GFP)的存在下，与含有野生型衣壳蛋白VP1的对照rAAV5产物(AAV5-NullMut-GFP)相比，包装的病毒基因组的数目从2.51E+09vg/ml到1.78E+10vg/ml增加到7.09倍。当比较含有包含突变T614V、S2A和T711S的衣壳蛋白VP1(AAV5-02Mut-GFP)以及仅包含突变S2A和T711S的衣壳蛋白VP1(AAV5-01Mut-GFP)的rAAV5产物时，包装的病毒基因组的数目从1.36E+10vg/ml到1.78E+10vg/ml增加到1.31倍。
在突变T614A、S2A和T711S(AAV5-03Mut-GFP)的存在下，与含有野生型衣壳蛋白VP1的对照rAAV5产物(AAV5-NullMut-GFP)相比，包装的病毒基因组的数目从2.51E+09vg/ml到1.20E+10vg/ml增加到4.78倍。当比较含有包含突变T614A、S2A和T711S的衣壳蛋白VP1(AAV5-03Mut-GFP)以及仅包含突变S2A和T711S的衣壳蛋白VP1(AAV5-01Mut-GFP)的rAAV5产物时，在包装的病毒基因组的数目方面不存在统计学显著的变化。
在突变G226V、S2A和T711S(AAV5-04Mut-GFP)的存在下，与具有野生型衣壳蛋白VP1的对照rAAV5产物(AAV5-NullMut-GFP)相比，包装的病毒基因组的数目从2.51E+09vg/ml到1.70E+10vg/ml增加到6.77倍。当比较含有包含突变G226V、S2A和T711S的衣壳蛋白VP1(AAV5-04Mut-GFP)以及仅包含突变S2A和T711S的衣壳蛋白VP1(AAV5-01Mut-GFP)的rAAV5产物时，包装的病毒基因组的数目从1.36E+10vg/ml到1.70E+10vg/ml增加到1.25倍。
Claims (60)
1.一种来自腺伴随病毒血清型5(AAV5)的分离的修饰的衣壳蛋白VP1，其用于生产基于重组腺伴随病毒血清型5(rAAV5)的病毒载体，所述分离的修饰的衣壳蛋白VP1包含具有选自以下的一种或多种取代的由Cap基因编码的野生型AAV5衣壳蛋白VP1氨基酸序列：
G226V，
S2A、G226V和T711S，
T614A，
S2A、T614A和T711S，
T614V，或
S2A、T614V和T711S，
其中所述野生型AAV5衣壳蛋白VP1氨基酸序列具有由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1的分离的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1，其包含在位置G226V处的取代。
3.根据权利要求2的分离的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1，其具有由SEQ ID NO:3表示的氨基酸序列。
4.根据权利要求1的分离的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1，其包含取代S2A、G226V和T711S。
5.根据权利要求4的分离的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1，其具有由SEQ ID NO:4表示的氨基酸序列。
6.根据权利要求1的分离的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1，其包含取代T614A。
7.根据权利要求6的分离的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1，其具有由SEQ ID NO:5表示的氨基酸序列。
8.根据权利要求1的分离的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1，其包含取代S2A、T614A和T711S。
9.根据权利要求8的分离的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1，其具有由SEQ ID NO:6表示的氨基酸序列。
10.根据权利要求1的分离的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1，其包含取代T614V。
11.根据权利要求10的分离的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1，其具有由SEQ ID NO:7表示的氨基酸序列。
12.根据权利要求1的分离的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1，其包含取代S2A、T614V和T711S。
13.根据权利要求12的分离的修饰的AAV5衣壳蛋白VP1，其具有由SEQ ID NO:8表示的氨基酸序列。
14.一种分离的核酸，其编码根据权利要求1至13中任一项的来自腺伴随病毒血清型5的修饰的衣壳蛋白VP1，所述衣壳蛋白VP1用于生产基于重组腺伴随病毒血清型5的病毒载体。
15.根据权利要求14的分离的核酸，其编码具有氨基酸取代G226V的来自腺伴随病毒血清型5的修饰的衣壳蛋白VP1，所述分离的核酸由具有SEQ ID NO:11的核酸序列或编码各自的氨基酸序列的任何其它序列表示。
16.根据权利要求14的分离的核酸，其编码具有氨基酸取代S2A、G226V和T711S的来自腺伴随病毒血清型5的修饰的衣壳蛋白VP1，所述分离的核酸由具有SEQ ID NO:12的核酸序列或编码各自的氨基酸序列的任何其它序列表示。
17.根据权利要求14的分离的核酸，其编码具有氨基酸取代T614A的来自腺伴随病毒血清型5的修饰的衣壳蛋白VP1，所述分离的核酸由具有SEQ ID NO:13的核酸序列或编码各自的氨基酸序列的任何其它序列表示。
18.根据权利要求14的分离的核酸，其编码具有氨基酸取代S2A、T614A和T711S的来自腺伴随病毒血清型5的修饰的衣壳蛋白VP1，所述分离的核酸由具有SEQ ID NO:14的核酸序列或编码各自的氨基酸序列的任何其它序列表示。
19.根据权利要求14的分离的核酸，其编码具有氨基酸取代T614V的来自腺伴随病毒血清型5的修饰的衣壳蛋白VP1，所述分离的核酸由具有SEQ ID NO:15的核酸序列或编码各自的氨基酸序列的任何其它序列表示。
20.根据权利要求14的分离的核酸，其编码具有氨基酸取代S2A、T614V和T711S的来自腺伴随病毒血清型5的修饰的衣壳蛋白VP1，所述分离的核酸由具有SEQ ID NO:16的核酸序列或编码各自的氨基酸序列的任何其它序列表示。
21.一种用于生产基于重组腺伴随病毒血清型5的病毒载体的分离的衣壳，所述分离的衣壳包括根据权利要求1至13中任一项的来自腺伴随病毒血清型5的修饰的衣壳蛋白VP1。
22.根据权利要求21的分离的衣壳，其包含根据权利要求1至13中任一项的来自腺伴随病毒血清型5的修饰的衣壳蛋白VP1、AAV5衣壳蛋白VP2或其修饰变体、以及AAV5衣壳蛋白VP3或其修饰变体。
23.根据权利要求22的分离的衣壳，其包含野生型AAV5衣壳蛋白VP2。
24.根据权利要求23的分离的衣壳，其包含野生型AAV5衣壳蛋白VP2，所述VP2具有由SEQ ID NO:17表示的氨基酸序列。
25.根据权利要求22的分离的衣壳，其包含来自腺伴随病毒血清型5的修饰的衣壳蛋白VP2。
26.根据权利要求25的分离的衣壳，其包含修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，所述VP2包含取代G90V。
27.根据权利要求26的分离的衣壳，其包含修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，所述VP2包含取代G90V，并且具有由SEQ ID NO:19表示的氨基酸序列。
28.根据权利要求25的分离的衣壳，其包含修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，所述VP2包含取代G90V和T575S。
29.根据权利要求28的分离的衣壳，其包含修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，所述VP2包含取代G90V和T575S，并且具有由SEQ ID NO:20表示的氨基酸序列。
30.根据权利要求25的分离的衣壳，其包含修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，所述VP2包含取代T478A。
31.根据权利要求30的分离的衣壳，其包含修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，所述VP2包含取代T478A，并且具有由SEQ ID NO:21表示的氨基酸序列。
32.根据权利要求25的分离的衣壳，其包含修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，所述VP2包含取代T478A和T575S。
33.根据权利要求32的分离的衣壳，其包含修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，所述VP2包含取代T478A和T575S，并且具有由SEQ ID NO:22表示的氨基酸序列。
34.根据权利要求25的分离的衣壳，其包含修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，所述VP2包含取代T478V。
35.根据权利要求34的分离的衣壳，其包含修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，所述VP2包含取代T478V，并且具有由SEQ ID NO:23表示的氨基酸序列。
36.根据权利要求25的分离的衣壳，其包含修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，所述VP2包含取代T478V和T575S。
37.根据权利要求36的分离的衣壳，其包含修饰的AAV5衣壳蛋白VP2，所述VP2包含取代T478V和T575S，并且具有由SEQ ID NO:24表示的氨基酸序列。
38.根据权利要求22的分离的衣壳，其包含野生型AAV5衣壳蛋白VP3。
39.根据权利要求38的分离的衣壳，其包含野生型AAV5衣壳蛋白VP3，所述VP3具有由SEQ ID NO:33表示的氨基酸序列。
40.根据权利要求22的分离的衣壳，其包含来自腺伴随病毒血清型5的修饰的衣壳蛋白VP3。
41.根据权利要求40的分离的衣壳，其包含修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，所述VP3包含取代G34V。
42.根据权利要求41的分离的衣壳，其包含修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，所述VP3包含取代G34V，并且具有由SEQ ID NO:35表示的氨基酸序列。
43.根据权利要求40的分离的衣壳，其包含修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，所述VP3包含取代G34V和T519S。
44.根据权利要求43的分离的衣壳，其包含修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，所述VP3包含取代G34V和T519S，并且具有由SEQ ID NO:36表示的氨基酸序列。
45.根据权利要求40的分离的衣壳，其包含修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，所述VP3包含取代T422A。
46.根据权利要求45的分离的衣壳，其包含修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，所述VP3包含取代T422A，并且具有由SEQ ID NO:37表示的氨基酸序列。
47.根据权利要求40的分离的衣壳，其包含修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，所述VP3包含取代T422A和T519S。
48.根据权利要求47的分离的衣壳，其包含修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，所述VP3包含取代T422A和T519S，并且具有由SEQ ID NO:38表示的氨基酸序列。
49.根据权利要求40的分离的衣壳，其包含修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，所述VP3包含取代T422V。
50.根据权利要求49的分离的衣壳，其包含修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，所述VP3包含取代T422V，并且具有由SEQ ID NO:39表示的氨基酸序列。
51.根据权利要求40的分离的衣壳，其包含修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，所述VP3包含取代T422V和T519S。
52.根据权利要求51的分离的衣壳，其包含修饰的AAV5衣壳蛋白VP3，所述VP3包含取代T422V和T519S，并且具有由SEQ ID NO:40表示的氨基酸序列。
53.一种分离的核酸，其编码根据权利要求21至52中任一项的衣壳，所述衣壳用于生产基于重组腺伴随病毒血清型5的病毒载体。
54.一种基于重组腺伴随病毒血清型5的载体，其用于将异源核酸序列递送至受试者，所述载体包含：
1)根据权利要求1至13中任一项的来自腺伴随病毒血清型5的修饰的衣壳蛋白VP1或根据权利要求21至52中任一项的衣壳，和
2)包含调控序列的异源核酸序列，所述调控序列促进由异源核酸序列编码的产物在靶细胞中的表达。
55.根据权利要求54的rAAV5载体，其中所述异源核酸序列的表达产物是治疗性多肽或报道多肽。
56.一种用于将基因产物递送至有此需要的受试者的药物组合物，其包含：
a)根据权利要求54至55中任一项的rAAV5载体；和
b)药学上可接受的赋形剂。
57.一种将基因产物递送至有此需要的受试者的方法，其包括向所述受试者施用根据权利要求54至55中任一项的rAAV5载体或根据权利要求56的药物组合物。
58.根据权利要求54至55中任一项的rAAV5载体或根据权利要求56的药物组合物用于治疗有此需要的受试者中的疾病的用途。
59.根据权利要求58的用途，其中所述疾病选自：血液疾病；中枢神经系统疾病；代谢疾病；肌肉疾病；遗传性疾病。
60.一种用于生产根据权利要求54至55中任一项的rAAV5载体的方法，其包括用根据权利要求14至20中任一项的编码来自腺伴随病毒血清型5的修饰的衣壳蛋白VP1的核酸或根据权利要求53的编码衣壳的核酸转染生产细胞。
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