KR100926096B1

KR100926096B1 - 신규한 바이러스성 유전자전달체

Info

Publication number: KR100926096B1
Application number: KR1020070098863A
Authority: KR
Inventors: 조종수; 조명행; 제연호; 김유경; 최재영
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단
Priority date: 2006-09-29
Filing date: 2007-10-01
Publication date: 2009-11-11
Also published as: KR20080029946A

Abstract

본 발명은 신규한 바이러스성 유전자전달체에 관한 것으로, 폴레이트 리셉터를 표적할 수 있는 리간드로써 폴레이트를 폴리에틸렌 글리콜과 결합시켜 폴레이트-PEG(F-PEG)를 베큘로바이러스 표면에 도입하여 폴레이트 리셉터 매개의 세포이물흡수 (folate receptor-mediated endocytosis)를 유도하도록 함으로써 낮은 세포독성과 높은 안정성을 가지면서 유전자전달 효율을 조절할 수 있는 동시에 폴레이트 리셉터 파지티브 KB 세포에 훨씬 더 높은 트랜스덕션 효율을 가짐으로써 암세포에만 특이적으로 유전자를 전달할 수 있는 시스템을 구축할 수 있는 효과가 있다.

베큘로바이러스, 폴리에틸렌 글리콜, 폴레이트, 바이러스 벡터, 유전자전달체, 트랜스덕션

Description

신규한 바이러스성 유전자전달체{A novel viral gene carrier}

본 발명은 신규한 바이러스성 유전자전달체에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 폴레이트 리셉터를 표적할 수 있는 리간드로써 폴레이트를 폴리에틸렌 글리콜과 결합시켜 폴레이트-PEG(F-PEG)를 베큘로바이러스 표면에 도입하여 폴레이트 리셉터 매개의 세포이물흡수 (folate receptor-mediated endocytosis)를 유도하도록 함으로써 낮은 세포독성과 높은 안정성을 가지면서 유전자전달 효율을 조절할 수 있는 동시에 폴레이트 리셉터 파지티브 KB 세포에 훨씬 더 높은 트랜스덕션 효율을 가짐으로써 암세포에만 특이적으로 유전자를 전달할 수 있는 신규한 바이러스성 유전자전달체에 관한 것이다.

유전자 치료는 기존의 치료 방법으로는 희망을 거의 가질 수 없는 유전적 질병을 치료하기 위한 잠재력을 가지고 있다. 전통적으로 유전자 치료 시스템은 바이러스 벡터를 기초로 한 시스템과 비 바이러스성 시스템으로 구분된다. 바이러스 시스템은 지금까지 유전자를 전달하고 발현시키는 가장 높은 효율을 보이고 있다. 이렇게 잠재적으로 높은 효율을 보이고 있음에도 불구하고 독성, 표적화 할 수 있는 세포의 한계, 결합할 수 있는 유전자 크기의 제한, 생산과 패킹(packing)의 문제, 재조합, 그리고 높은 비용 등의 한계점이 있다(RG.Crystal, Transfer of gene to humans: early lessons and obstacles to success, Science 270 (1995) 404-410). 반면에 비 바이러스성 벡터를 사용한 유전자전달은 낮은 수준의 유전자전달 효율과 유전자 발현이 지속되지 못한다는 보고가 있다(S.Brunner, T.Sauer, S.Carotta, M.Cotten, M.Saltik, E.Wagner, Cell cycle dependence of gene transfer by lipoplex, polyplex and recombinant adenovirus, Gene Ther. 7(200) 401-407).

단백질 또는 효소들에 공유결합을 이용한 PEG 결합은 활발하게 연구되고 있다. PEG는 물에 대한 높은 용해성, 낮은 세포독성, 그리고 증진된 세포 침투성 때문에 친수성 부분 증가를 위한 좋은 후보자로 기대되고 있다. PEG가 결합된 단백질은 플라즈마 내에서 증가된 반감기를 가지며 in vivo에서 면역 발생력이 감소되었음이 증명되었다.

최근에 면역 반응을 감소시키기 위하여 아데노바이러스의 바이러스성 캡시드에 PEG를 결합시키는 시도가 있었다. 이런 연구들을 통하여 아데노바이러스에 PEG 도입은 in vivo에서 항체에 의한 중화로부터 벡터를 보호하며 혈청 내에서의 불활성화를 막아 생체 내 순환시간이 증가됨이 확인되었다.

베큘로바이러스 Autographa califonica multiple nuclear pokyhedrosis virus (AcMNPV)는 세포독성이 없고 복제성이 없으며 전달할 수 있는 유전자의 크기가 크다는 장점 때문에 동물 세포에서 재조합시킨 단백질을 높은 수준으로 발현시키는데 널리 사용되고 있다(V.Sandig, C.Hoffmann, S.Steinert, G.Jennings, P.Schlag, M.Strauss, Gene transfer into hepatocytes and human liver tissue by baculovirus vectors, Hum. Gene Ther. 7 (1996), 1937-1945). AcMNPV는 곤충 바이러스이나 동물 세포에서도 활성을 가지는 프로모터(promoter)를 포함시킴으로써 간이나 신경 같은 동물세포로 유전자를 전달시킬 수 있다.

베큘로바이러스는 바이러스 외피(envelope)와 세포막의 비특이적 정전기적인 결합을 통해 세포 내로 유입되는데 이러한 비특이적이고 빠른 결합은 in vivo에서 유전자를 원하는 특정 조직에 전달하고자 할 때 단점이 된다.

유전자 전달 효율성을 높이기 위한 방법은 바이러스의 표현형을 변형시키는 것이다. 바이러스의 친화성은 바이러스 표면을 유전적으로 또는 화학적으로 변형시킴으로써 변화시킬 수 있다. 이러한 전략들 중 표적을 위한 리간드를 화학적으로 바이러스 표면에 결합시키는 것은 매우 간단하고 융통성있는 방법인 반면 표적을 위한 펩타이드의 유전적 융합 (genetic fusion)을 기초로 하는 유전적 변형은 많은 시간이 소모되며 각 리간드별로 사용에 한계가 있다 (Raty et al., 2004). 더욱이 세포의 리셉터를 통해 표적을 하기 위해서 리간드를 화학적으로 수식하는 것은 표적 유전자 전달을 위한 매우 효율적인 접근으로 여겨지고 있다 (Zhao and Lee, 2004). Kleef 등은 아데노바이러스 (adenovirus)를 FGF2-Fab'로 수식한 결과 증가된 트랜스덕션 효율을 얻었으며 이는 FGF2가 세포 표면과 더 잘 결합하는 것과 상관관계가 있다고 보고하였다 (Kleeff et al., 2002).

표적용 리간드들 중 하나인 폴레이트는 면역원성의 결핍, 사용에 있어 제약이 없는 점, 기능적으로의 안정성, 결합을 위한 화학적 구조나 메카니즘이 잘 알려진 점, 그리고 세포에 내재화 (internalization) 될 때 비파괴적인 것과 같은 많은 장점들을 지니고 있다 (Brzezinska et al., 2000). 또한 folate 결합 단백질로 알려진 폴레이트 리셉터 (folate receptor : FR)은 폴레이트의 산화 형태인 엽산 (folic acid)과 매우 높은 친화력 (Kd ~ 10-10M)을 보인다고 보고되었다 (Sudimack and Lee, 2000). 폴레이트 리셉터는 다양한 종류의 사람 암에서 매우 빈번하게 발현 되는 것이 관찰되는 반면에 대부분의 정상적인 조직에서는 발현을 보이지 않는다. 이렇게 사람의 악성 종양에서만 선택적으로 그 발현이 증폭되는 현상은 약물과 유전자를 특이적으로 표적하여 전달하는 데 있어서 세포적인 지표로써 가능성이 있다는 것을 의미한다 (Sirotnak and Tolner, 1999). 그러므로 최근의 여러 연구들은 폴레이트가 자체적으로 폴레이트 리셉터를 표적하는 리간드로써 높은 잠재력을 가지고 있다고 보고하고 있다 (Hofland et al., 2002; Oh et al., 2006).

베큘로바이러스 계 (Baculoviridae family)의 한 원형 (prototype)인 Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV)은 유전자 치료 적용을 위한 적절한 대응책으로 여겨지고 있다 (Makela et al., 2006). 특히 적당한 진핵 프로모터 (eukaryotic promoter)를 지닌 베큘로바이러스는 in vitro와 in vivo의 여러 종류의 포유 세포 (mammalian cell)에 유전자를 효과적으로 전달하고 발현시킬 수 있다 (Tani et al., 2003; Airenne et al., 2000). 또한 베큘로바이러스는 레트로바이러스 (retrovirus) 나 아데노바이러스 (adenovirus)와 비교하여 (Reddy et al., 2001) 높은 종 특이성과 포유 세포에서 복제 불가능 때문에 안전한 유전자 전달체로써 여겨진다 (Makela et al., 2006). 더욱이 포유 세포에서 이 곤충 바이러스로 인한 세포 독성 효과는 상대적으로 적은 것으로 나타났다 (Makela et al., 2006).

유전자 재조합 베큘로바이러스를 이용한 종래기술로는 재조합 베큘로바이러스를 이용한 살충제(대한민국 등록특허 제10-033630호), 재조합 베큘로바이러스를 이용한 돼지 전염성 위장염바이러스 항체 검출을 위한 효소면역 검사방법(대한민국 등록특허 제10-026774호) 등이 공지되어 있다.

따라서 본 발명은 상기와 같은 점들을 감안하여 안출한 것으로, 폴레이트 리셉터를 표적할 수 있는 리간드로써 폴레이트를 폴리에틸렌 글리콜과 결합시켜 폴레이트-PEG(F-PEG)를 베큘로바이러스 표면에 도입하여 폴레이트 리셉터 매개의 세포이물흡수 (folate receptor-mediated endocytosis)를 유도하도록 함으로써 낮은 세포독성과 높은 안정성을 가지면서 유전자전달 효율을 조절할 수 있는 동시에 폴레이트 리셉터 파지티브 KB 세포에 훨씬 더 높은 트랜스덕션 효율을 가짐으로써 암세포에만 특이적으로 유전자를 전달할 수 있는 시스템을 구축할 수 있음을 확인함으로써 완성하였다.

본 발명의 상기 목적은 녹색형광단백질, 루시퍼라아제(luciferase) 또는 PDCD4 (programmed cell death) 유전자를 포함한 재조합 베큘로바이러스 벡터를 구축하고, 상기 재조합 베큘로바이러스에 PEG를 결합한 유전자전달체(pegylated baculovirus: 이하 P-Bac.)와 폴레이트를 PEG와 결합시킨 다음 폴레이트-PEG(F-PEG)를 상기 재조합 베큘로바이러스 표면에 도입하여 폴레이트 리셉터 매개의 세포이물흡수 (folate receptor-mediated endocytosis)를 유도한 유전자전달체(folate-PEG-baculoviorus; 이하 F-P-Bac)를 각각 제조한 다음, 상기 P-Bac.의 PEG 농도를 정량하고 PEG 결합에 따른 바이러스 타이터 변화, 세포 생존율 및 유전자전달 효율을 in vitro와 in vivo에서 비교 검토한 후, F-P-Bac의 표면 특성(surface characteristics)과 트랜스덕션 효율을 in vitro에서 확인하고 암을 유발시킨 쥐에서 종양 크기 비교를 암 치료 유전자로 알려진 PDCD4 유전자 (programmed cell death 4 gene) 를 포함한 유전자 재조합 베큘로바이러스 벡터를 이용하여 in vivo 실험을 통해 확인함으로써 달성하였다.

이하 본 발명의 구성을 상세히 설명하고자 한다.

본 발명은 녹색형광단백질(Green fluorescent protein), 루시퍼라아제(luciferase) 또는 PDCD4 유전자를 포함하는 재조합 베큘로바이러스 벡터 표면에 폴레이트-폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol) 결합체를 수식함으로서 제조되 는 것을 특징으로 하는 바이러스성 유전자전달체를 제공한다.

본 발명은 또한 녹색형광단백질(Green fluorescent protein), 루시퍼라아제(luciferase) 또는 PDCD4 유전자를 포함하는 재조합 베큘로바이러스 벡터를 제조하는 단계; 폴레이트-폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol) 결합체를 제조하는 단계; 및 상기 재조합 베큘로바이러스 벡터 표면에 상기 폴레이트-폴리에틸렌 글리콜 결합체를 수식하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이러스성 유전자전달체의 제조방법을 제공한다.

더욱 상세하게는 본 발명은 폴레이트 리셉터를 표적할 수 있는 리간드로써 폴레이트를 폴리에틸렌 글리콜과 결합시켜 폴레이트-PEG(F-PEG)를 베큘로바이러스 표면에 도입하여 폴레이트 리셉터 매개의 세포이물흡수 (folate receptor-mediated endocytosis)를 유도하도록 함으로써 낮은 세포독성과 높은 안정성을 가지면서 유전자전달 효율을 조절할 수 있는 동시에 폴레이트 리셉터 파지티브 KB 세포에 훨씬 더 높은 트랜스덕션 효율을 가짐으로써 암세포에만 특이적으로 유전자를 전달할 수 있는 신규한 바이러스성 유전자전달체를 제공하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 사용된 PEG은 친수성이고 유동적인 고분자이며 생체적합(biocompatible)한 독성이 없는 물질이다.

본 발명에서 mPEG-SS는 PEG의 양쪽 말단에 있는 OH기에 석신이미딘 석시네이트(succinimidyl succinate)를 결합하여 말단에 카르복실기를 갖춘 화합물이다. 상 기 mPEG-SS의 말단 카르복실기는 작용기로써 아민 그룹(NH₂)과 아마이드 결합을 간단하고 쉽게 반응되므로 본 발명에서는 PEG의 대표로 mPEG-SS를 사용하였다.

본 발명에서 Hetero-bifunctional polyethylene glycol (NH₂-PEG-COOH, MW 5,000)는 PEG의 양쪽 말단에 있는 OH기에 한 쪽 말단은 석신이미딘 석시네이트(succinimidyl succinate)를 결합하여 카르복실기를 갖추게 하고 다른 한 쪽은 NH₂을 결합하여 아민기를 갖추게 한 화합물이다. 상기 Hetero-bifunctional polyethylene glycol (NH₂-PEG-COOH, MW 5,000)의 말단 카르복실기와 아민기는 작용기로써 아민기는 폴레이트의 카르복실기와 아마니드 결합을 할 수 있고 카르복실기는 베큘로바이러스 표면에 있는 아민 그룹(NH₂)과 아마이드 결합을 간단하고 쉽게 반응되므로 본 발명에서는 Hetero-bifunctional polyethylene glycol (NH₂-PEG-COOH, MW 5,000)을 대표로 사용하였다.

본 발명에서 대조구(control)는 각 실험에서 세포만 배양했을 때의 측정값을 나타낸 것이다.

본 발명에서 Hetero-bifunctional polyethylene glycol (NH₂-PEG-COOH, MW 5,000)과 methoxypolyethylene glycol succinimidyl succinate (mPEG-SS, MW 5,000)은 일본의 NOF Cooperation과 한국의 Sunbio Cooperation에서 각각 구입하였다. 또한, Dicyclohexylcarbodiimide (DCC), N-hydroxysuccinimide (NHS), 그리고 dimethylsulfoxide (DMSO)는 미국의 Sigma-Aldrich로부터 구입하였다. SV40 프로모 터에 의해 발현되는 루시퍼라아제 (luciferase) 유전자를 지닌 pGL3-control 벡터는 미국의 Promega로부터 CMV 프로모터에 의해 발현되는 GFP (green fluorescent protein) 유전자를 지닌 pEGFP-N2 벡터는 미국의 Clontech Laboratories로부터 구입하였다.

본 발명 신규한 바이러스성 유전자전달체는 폴레이트 리셉터를 표적할 수 있는 리간드로써 폴레이트를 폴리에틸렌 글리콜과 결합시켜 폴레이트-PEG(F-PEG)를 베큘로바이러스 표면에 도입하여 폴레이트 리셉터 매개의 세포이물흡수 (folate receptor-mediated endocytosis)를 유도하도록 함으로써 낮은 세포독성과 높은 안정성을 가지면서 유전자전달 효율을 조절할 수 있는 동시에 폴레이트 리셉터 파지티브 KB 세포에 훨씬 더 높은 트랜스덕션 효율을 가짐으로써 암세포에만 특이적으로 유전자를 전달할 수 있는 시스템을 구축할 수 있는 효과가 있다.

이하 본 발명의 구체적인 방법을 실시예 및 실험예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예 및 실험예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 베큘로바이러스의 재조합 벡터 구축

재조합 베큘로바이러스 벡터를 구축하기 위하여 EGFP-N2 또는 루시퍼라제 유전자를 증폭시켰으며 프라이머는 Nsi I site를 포함하는 23개 올리고뉴클레오타이 드 (5'-GCCATGCATTAGTTATTAATAGT-3')와 26개의 올리고 뉴클레오타이드 (5'-GGGCTTAAGATACATTGATGAGTTTG-3')를 이용하였다. 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction: 이하 PCR) 조건은 94℃에서 1분, 55℃에서 2분 및 72℃에서 2분으로 30회 반복 수행하였다. 증폭시킨 프래그먼트(fragment)를 Nsi I으로 자른 후 pBac8-EGN2를 만들기 위해 pBac-PAK8 (BD Biosciences Clontech)의 Pst I과 Sma I 사이트를 삽입시켰다.

상기 EGFP-N2 또는 루시퍼라제 유전자를 포함하는 전달 벡터를 bApGOZA 바이러스성 DNA와 Sf9 세포에 셀펙틴 리에이전트를 이용하여 동반 접종시켰다. 상기와 같은 방법으로 구축된 EGFP-N2 또는 루시퍼라제 유전자를 포함하는 재조합 바이러스 ApEGFP-N2 또는 루시퍼라제 유전자를 포함하는 재조합 바이러스(ApSVLuc)는 대규모로 증식시키기 전에 플라크 정제(plaque-purified)를 했고 증식된 바이러스는 4℃에서 보관했다.

상기 ApEGFP-N2의 구축은 도 1의 도식도와 같다.

실시예 2: ApEGFP - N2 또는 ApSVLuc 에 PEG를 결합한 P- Bac . 제조

상기 실시예 1에서 제조된 ApEGFP-N2 또는 ApSVLuc를 15,000rpm에서 30분 동안 4℃에서 원심분리하여 1.5×10⁷pfu/mL이 되게 농축하였다.

농축된 바이러스에 PEG를 결합하기 위하여 mPEG-SS(methoxy polyethylene glycol succinimidyl succinate, Sunbio, Korea)를 사용했는데 이는 PEG 한쪽 말단 에 succinimidyl succinate를 도입하여 아민그룹과 아마이드 결합을 할 수 있는 작용기(functional group)를 제공한다. 농축시킨 재조합 바이러스 펠릿(pellet)에 mPEG-SS(Mw: 5,000) 용액(10mg/ml)을 원하는 농도로 희석시켜 1ml씩 첨가했다. 바이러스 펠릿을 첨가한 mPEG-SS 용액에 분산 시킨 뒤 4℃에서 48시간 동안 약하게 회전시켰다.

상기 반응은 재조합 바이러스 캡시드(capsid)에 존재하는 아민그룹(-NH2)과 mPEG-SS 말단에 존재하는 카르복실그룹(-COOH)간에 아마이드 결합(amide bond)으로 반응된다.

상기 반응이 끝난 후 미반응 mPEG-SS를 제거하기 위하여 15,000rpm에서 30분 동안 4℃에서 원심분리하여 상층액을 제거함으로써 PEG와 베큘로바이러스 결합체를 수득하였다.

실험예 1: P- Bac .의 PEG 농도 측정

상기 실시예 1 및 실시예 2의 방법으로 제조된 본 발명 PEG와 베큘로바이러스 결합체(이하 P-Bac.)의 PEG의 농도를 플루오레스카민 분석법(fluorescamine assay)으로 정량하였다.

플루오레스카민은 PEG와 아마이드 결합을 하지 않은 바이러스 캡시드의 아민그룹(-NH₂)과 반응하여 형광을 나타내므로 간접적으로 PEG의 농도를 정량할 수 있다. 형광량을 형광 플레이트 리더기(fluorescence plate reader)로 여기파장 (excitation wavelength) 390nm, 방출파장 (emission wavelength) 475nm에서 측정하였고 단백질의 총량은 BCA 분석(pierce, Rockford, IL, USA)으로 보정하였다.

본 발명 P-Bac.의 PEG 농도는 도 2와 같다. 반응 PEG농도가 증가할수록 바이러스 캡시드에 남아있는 아민그룹의 퍼센트가 감소하였다. 상기와 같은 결과는 PEG가 아민그룹과 반응하여 남아있는 아민그룹이 감소했기 때문이다.

실험예 2: 본 발명 P- Bac .의 타이터(titer)에 대한 PEG의 영향

재조합 바이러스가 PEG와 결합함으로써 곤충 세포 감염성에 영향을 미치는지를 알아보기 위해 본 발명 P-Bac.과 PEG를 결합하지 않은 재조합 바이러스를 곤충 세포에 감염시킨 뒤 플락 분석(plaque assay)를 수행했다.

표 1에서와 같이 본 발명 P-Bac.에서 PEG의 농도가 증가할수록 바이러스 타이터는 감소했다. 그러나 낮은 농도의 PEG 결합은(0.1㎎/㎖) 바이러스 타이터를 오히려 증가시키는 결과를 나타내었다. 상기와 같은 결과로 PEG 결합은 베큘로바이러스의 안정성 증가를 가져왔기 때문이다. 그러나 높은 농도의 PEG 결합은 베큘로바이러스가 곤충세포를 인식하는 gp64 단백질을 방해하여 타이터의 감소를 초래하였다.

본 발명 P-Bac.에서 PEG의 농도에 따른 바이러스 타이터 측정

PEG의 농도(mg/mL)	바이러스 타이터(× 10⁵pfu/mL)
0	24.5±0.9
0.1	30.7±1.1
1	20.7±2.2
3	12.6±2.0
5	8.7±4.1

실험예 3: 본 발명 P- Bac .의 관찰

본 발명 P-Bac.의 모양을 투과전자현미경으로 이용하여 관찰하였으며 도 3과 같이 막대모양을 확인할 수 있었으며 베큘로바이러스의 모양이나 크기와 비교해 볼 때 변화되지 않은 것을 알 수 있었다.

실험예 4: 본 발명 P- Bac .의 안정성 검사

(1) 세포주와 세포배양

사람의 폐암 세포 A549를 10% FBS, 스트렙토마이신 100㎍/ml, 페니실린 100U/ml가 포함된 DMEM에서 배양하였으며 37℃에서 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다.

(2) 세포 생존률 검사

본 발명 P-Bac.의 세포독성 검사를 위하여 in vitro에서 상기 세포를 이용하여 MTS 분석을 하였다. 상기 세포를 0.2ml의 배지에 초기농도가 1×10⁴ cells/well 이 되게 하여 96-well plate에 넣은 후 18 내지 20시간 동안 배양한 후 다양한 농도로 PEG 결합한 본 발명 P-Bac. 또는 PEG가 도입되지 않은 베큘로바이러스가 포함되어 있는 배양액을 FBS가 없는 배지로 교환하였다. 24시간 동안 배양한 후에 셀 타이터 96 어큐어스 원 솔루션 시약 20㎕가 포함된 배지로 교환하고 3시간 후에 세포의 대사활성을 측정하기 위하여 ELISA plate reader (GLR 1000, Genelabs Diagnostics, Singapore)를 사용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존률(%)은 하기의 식에 따라 계산하였다:

세포 생존률 (%) = (OD 540 (실험군)/OD 540 (대조군))×100.

본 발명 P-Bac.의 세포독성 결과는 도 4와 같다. PEG를 도입하지 않는 베큘로바이러스 뿐만 아니라 본 발명 P-Bac.에서 90% 이상의 생존률을 보임으로써 세포독성이 존재하지 않음을 알 수 있다. 이는 PEG가 친수성을 가지며 독성이 없는 생체 적합한 물질이기 때문에 PEG 결합이 세포 독성에 어떠한 영향도 미치지 않았기 때문이다. 따라서 본 발명 P-Bac.는 세포 독성이 없는 안정성이 높은 유전자전달체임을 확인하였다.

실험예 5: 본 발명 P- Bac .의 in vitro 상에서의 루시퍼라아제 발현 측정

본 발명 P-Bac.의 루시퍼라아제 활성을 측정하기 위하여 하기와 같은 방법으로 실험하였다. 배지 1mL에 A549 세포 농도를 1×10⁵ cells/well가 되도록 24-well plate에 접종한 후 18 내지 20시간 동안 상기 실험예 4와 같은 조건으로 배양하였다. 배양 후 배지를 다양한 농도의 PEG와 결합한 루시퍼라아제 유전자로 재조합된 베큘로바이러스(이하: PEG-ApSVLuc)가 분산되어 있는 완충용액으로 교환해 준 후 1시간 동안 배양하였다. 이때 PEG-ApSVLuc의 농도는 MOT(multiplicity of transduction) 150이다. 다시 FBS와 10mM의 소듐 부틸레이트 (sodium butyrate)가 포함된 새로운 배지로 교환한 후 24시간 동안 배양하였다. 루시퍼라아제 활성은 루시퍼라아제 리포터 1000 분석계를 이용하여 측정하였다. Relative light unit (RLU)은 화학발광분석기 (Autolumat LB953, EG&G Derthold, Germany)를 이용하여 측정하였다. RLU는 세포 추출물의 단백질의 농도로 나누어 이용하였으며, 단백질 정량은 BCA 방법으로 측정하였다.

본 발명 PEG-ApSVLuc의 PEG 결합 정도에 따른 유전자전달 효율을 조사하기 위하여 세포생존률 검사에 사용한 것과 동일한 세포를 이용하여 in vitro에서 루시퍼라아제 활성을 측정하여 도 5에 나타내었다. 본 발명 PEG-ApSVLuc의 유전자전달 효율은 결합된 PEG 농도가 증가할수록 감소하였다. 이는 베큘로바이러스와 PEG가 결합함으로써 바이러스가 세포를 인식하는 능력이 감소하기 때문이다. 세포의 인식 능력 감소는 PEG 결합이 베큘로바이러스 표면 단백질인 gp64에 있는 핵 표적 시퀀스(sequence)의 융합 능력이 감소되었기 때문일 것이다.

본 발명에서 0.1㎎/㎖ 내지 3㎎/㎖의 농도로 PEG를 결합한 본 발명 PEG-ApSVLuc의 유전자전달효율이 PEG를 결합하지 않은 베큘로바이러스의 전달 효율보다 더 높았다. 상기와 같은 결과는 PEG를 베큘로바이러스에 결합함으로써 바이러스의 안정성이 증가되었기 때문이다.

실험예 6: 본 발명 P- Bac .의 in vitro 상에서의 GFP 발현 측정

(1) 세포주와 세포배양

본 발명에서 사람의 신장세포 293T, 사람의 폐암세포 A549 및 사람의 간암세포 HepG2를 10% FBS, 스트렙토마이신 100㎍/ml, 페니실린 100U/ml가 포함된 DMEM에서 배양하였으며 37℃에서 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다.

(2) GFP 발현 측정

본 발명에서 베큘로바이러스와 본 발명 P-Bac.의 GFP 발현 효율을 측정하기 위하여 하기와 같은 방법으로 실험하였다.

배지 1mL에 상기 세포들의 농도를 1×10⁵ cells/well가 되도록 24-well plate에 접종한 후 18 내지 20시간 동안 배양한 후 PEG와 GFP 유전자로 재조합된 베큘로바이러스(이하: PEG-ApEGFP-N2)가 분산되어 있는 완충용액으로 교환해 준 후 1시간 동안 배양하였다. 이때 PEG-ApEGFP-N2의 농도는 MOT(multiplicity of transduction) 150이다. 다시 FBS와 10mM의 소듐 부틸레이트 (sodium butyrate)가 포함된 새 배지로 교환한 후 24시간 동안 배양하고 상기 본 발명 PEG-ApEGFP-N2의 GFP 발현을 측정하였다.

유전자전달 효율은 FACS caliber system (Becton-Dickinson, San Joes, CA)를 이용하여 GFP 발현율을 측정하였다.

상기 세포주들에서 GFP 발현을 측정한 결과, 도 6과 같이 GFP 발현 역시 세포주들에 따라 차이가 있었지만 상기 실험예 5의 루시퍼라아제 활성 결과와 유사한 결과를 나타내었다. 즉, PEG 결합 농도가 증가할수록 발현 효율은 감소하였으나 0.1㎎/㎖ 내지 3㎎/㎖의 농도로 PEG를 결합한 본 발명 PEG-ApEGFP-N2의 유전자전달 효율이 PEG를 결합하지 않은 베큘로바이러스의 발현 효율보다 더 높았다. 상기와 같은 결과도 PEG 결합으로 인한 안정성이 증가했기 때문이다.

실험예 7: 본 발명 P- Bac .의 PEG 분자량에 따른 in vitro 상에서의 루시퍼라제 발현 측정

본 발명 P-Bac.의 PEG 분자량에 따른 루시퍼라아제 발현을 측정하기 위하여 상기 PEG의 분자량 2K, 5K, 10K 및 20K으로 하여 측정하였다. 농도와 분자량이 다른 각각의 PEG와 루시퍼라아제 유전자 재조합 베큘로바이러스가 결합된 본 발명 P-Bac.의 루시퍼라아제 발현 측정은 실험예5와 동일한 방법으로 수행하였다.

실험 결과 도 7과 같이 PEG의 분자량이 클수록 루시퍼라아제의 활성은 증가하는 것으로 확인되었다. 상기와 같이 결과로 볼 때 PEG의 분자량이 클수록 P-Bac.의 안정성이 높은 것을 알 수 있다.

실험예 8: 본 발명 P- Bac .의 in vivo 상에서의 GFP 발현 측정

본 발명 PEG-ApEGFP-N2의 GFP 전달 효율을 in vivo 상에서 마우스 꼬리 정맥에 주입함으로써 측정하였다. GFP의 마우스 개체 내 분포(biodistribution)를 확인 위하여 6주 된 수컷 마우스에 PEG-ApEGFP-N2 (1.5 X 10⁸pfu, 200㎕) 를 꼬리 정맥에 주입한 48시간 후 여섯 개의 장기 (간, 비장, 폐, 심장, 신장 및 뇌)를 채취하였다. 상기 장기들을 0.1M 완충용액 (pH 7.4)에 세척한 후 4% 파라포름알데하이드 (paraformaldehyde)로 16 내지 18시간 고정화시킨 다음 30% 수크로즈(sucrose) 용액에서 탈수과정을 거쳤다. 동결박편기(cryotome, MICROM, Germany)로 14㎛의 두께로 조직을 추출한 후 형광현미경으로 GFP 발현을 관찰하였다.

마우스 꼬리 정맥에 바이러스를 주입한 후 GFP 발현 효율은 도 8과 같다. in vitro와 마찬가지로 PEG 결합 농도가 증가할수록 GFP 전달 효율이 감소하였다. 그러나 폐(도 8c)의 경우는 PEG-ApEGFP-N2의 경우가 PEG를 도입하지 않은 ApEGFP-N2 보다 더 많은 발현을 보이고 있는데 이는 PEG를 결합함으로써 폐 조직과 강하게 결합하여 폐에서 발현 효율이 높게 나타난 때문이다.

실시예 3: 폴레이트-PEG 결합체 합성

도 9에서 보여지는 것과 같이 폴레이트의 칼복실기 (carboxyl group)와 hetero-bifunctional PEG의 1차 아민기 (primary amine group) 간의 아마이드 결합 (amide linkage)를 통하여 성공적으로 F-PEG를 합성하였다. 합성 된 F-PEG는 핵자기 공명 분광기 (¹H NMR)을 통해 분석하였는데 도 10의 결과와 같이 폴레이트의 구성은 80 mol% 였다.

구체적인 F-PEG 결합체의 합성방법은 오 등의 방법을 변형시켜 사용하였다 (Oh et al., 2006). 간단하게 폴레이트를 DCC와 NHS와의 몰 비가 1:2:2가 되게 DMSO에 녹여 18시간 동안 질소환경에서 교반시키면서 활성화시킨 후 DCC의 반응물인 우라실 (uracil) 형태를 제거하기 위하여 상온에서 15분 동안 13,000 rpm로 원심분리하였다. 활성화 된 폴레이트에 몰비가 4배 과량이 되게 NH₂-PEG-COOH를 더한 후 질소 환경에서 4시간 동안 반응하였다. 반응이 끝난 후 반응물을 분자량 컷오프 (cutoff)가 3,500인 투석막에 넣고 DMSO를 용매로 하여 3일 동안 투석한 후 용매를 증류수로 바꾸어 2일 동안 더 투석하였다. 투석한 F-PEG를 동결건조 시킨 후 핵자기 공명 분광기 (¹H nuclear magnetic resonance; ¹H NMR)로 F-PEG의 조성을 확인하였다.

획득한 F-PEG를 DCC와 NHS와의 몰 비가 1:1.2:1.2가 되게 DMSO에 녹인 후 18시간 동안 질소환경에서 교반시키면서 활성화시킨 후 DCC의 반응물인 우라실 (uracil) 형태를 제거하기 위하여 상온에서 15분 동안 13,000 rpm으로 원심분리 하였다. 활성화 된 F-PEG는 동결건조 후 -20℃에서 보관하였다.

실시예 4: 베큘로바이러스 표면에 F-PEG 또는 PEG 수식

김 등의 방법과 동일하게 베큘로바이러스 표면에 F-PEG 또는 PEG를 수식하였다 (Kim et al., 2006). 간략하게 말하자면 원하는 pfu (plaque forming unit)의 베큘로바이러스로 원심분리 (15,000 rpm, 30 min, 4℃)를 통해 농축시켰고 PBS로 세척하였다. 활성화 된 F-PEG 또는 PEG를 PBS에 녹인 후 농축된 베큘로바이러스에 첨가하였다. 이를 4℃에서 천천히 돌리면서 2일 동안 반응시켰고 반응이 끝난 후 미 반응 F-PEG 또는 PEG를 제거하기 위하여 4℃에서 30분 동안 15,000 rpm으로 원심분리 시켰다. 원심분리 된 베큘로 바이러스 (F-P-Bac X 또는 P-Bac X; 여기서 X는 반응 최초에 첨가한 F-PEG 또는 PEG의 농도를 각각 의미함)는 다시 PBS를 첨가하여 분산시켰다.

실험예 9: 베큘로바이러스 표면에 F-PEG 또는 PEG의 수식 정도를 측정하기 위한 플루오레스카민 분석

활성화 된 F-PEG 또는 PEG에 의해 베큘로바이러스 표면 단백질의 변형 정도를 추정하기 위하여 예전의 방법대로 플루오레스카민 분석을 행하였다 (Kim et al., 2006). 플루오레스카민은 PEG와 아마이드 결합을 하지 않은 바이러스 캡시드의 아민그룹(-NH2)과 반응하여 형광을 나타내므로 간접적으로 PEG 도입정도를 정량해 낼 수 있다. 형광정도를 형광 플레이트 리더기(fluorescence plate reader)로 여기파장 (excitation wavelength) 390nm, 방출파장 (emission wavelength) 475nm에서 측정하였고 단백질의 총량은 BCA 분석(pierce, Rockford, IL, USA)을 통해 보정해 주었다.

도 11에서 보는 바와 같이 바이러스 표면에 남아있는 아미노기 (amino group)의 비율은 반응시킨 F-PEG 또는 PEG의 농도가 증가함에 따라 감소하였다. 또한 F-PEG 와 PEG의 바이러스 표면에의 수식은 비슷한 정도를 보였으며 이는 폴레이트의 작은 분자량 때문에 (440Da) F-PEG가 베큘로바이러스 표면에 수식되는데 폴레이트가 영향을 거의 미치지 않는다는 것을 의미한다.

실험예 10: F-P- Bac 3과 P- Bac 3의 표면전하 측정

F-P-Bac 3과 P-Bac 3의 표면전하를 전기영동 광산란 광도계 (electrophoretic light scattering spectrophotometer; ELS)로 측정하였다.

유전자 전달을 위한 전달체의 표면전하와 크기는 중요한 변수이다. 그러므로 F-PEG 또는 PEG로 변형시킨 베큘로바이러스의 표면전하와 크기를 변형시키지 않은 베큘로바이러스와 비교하였다. 변형되지 않은 베큘로바이러스의 표면전하는 약 -33 mV의 매우 강한 음전하를 띄는 반면 F-P-Bac 3 과 P-Bac 3의 표면전하는 각각 -10.01 ± 1.88 mV 그리고 -4.19 ± 3.06 mV를 나타내었다. 이렇게 낮은 음전하는 친수성의 PEG 수식으로 바이러스 표면의 음전하를 가려주기 때문이다. 반면에 투과전자현미경 (Transmission electro microscope; TEM)으로 관찰 한 결과 변형되지 않은 베큘로바이러스와 변형된 베큘로바이러스 간의 큰 크기 변화는 관찰되지 않았다. 이는 PEG의 유연성과 PEG 또는 F-PEG의 작은 분자량 때문으로 여겨진다.

실험예 11: 세포주와 세포 배양

폴레이트 리셉터가 과발현(over-expression) 되는 KB (human epidermal carcinoma) 세포는 RPMI 1640에서 배양하였고 KB 세포막에 폴레이트 리셉터를 과발현 시키기 위하여 트랜스덕션 실험 2주 전 RPMI 1640 without folate (폴레이트가 불포함 된 RPMI 1640) 배지로 갈아주었다. 폴레이트 리셉터가 발현되지 않는 HepG2 (human hepatoblastoma) 세포는 DMEM 배지에서 배양하였다. 각 세포 배양 배지는 10% FBS, 100 mg/ml의 스트렙토마이신 (streptomycin), 그리고 100 U/ml의 페니실리 (penicillin)을 포함하였다. 모든 세포는 37℃, 5% CO₂ 환경에서 배양되었다.

실험예 12: 트랜스덕션 효율 측정을 위한 루시퍼라제 활성 조사

세포가 처음에 1.5 × 10⁵ (KB) 또는 2 × 10⁵ (HepG2)가 되게 24-well 플레이트에 seeding 하였다. 18시간 배양 후 루시퍼라아제 유전자를 지닌 F-PEG 또는 PEG 수식 된 베큘로바이러스 또는 수식되지 않은 베큘로바이러스를 플레이트에 MOT(multiplicity of transduction) 150이 되게 첨가하였다. 1시간 배양 후 혈청과 10mM의 소듐 뷰틸레이트 (sodium butyrate)가 포함 된 배지로 갈아준 후 24시간 동안 더 배양하였다. 루시퍼라제 활성 측정은 화학 발광계 (chemiluminometer)로 측정하였다. 측정 된 RLUs (relative light units)값은 각 세포의 단백질 양을 BCA 방법 (Smith et al., 1985)으로 측정한 후 보정하였다.

F-P-Bac의 트랜스덕션 효율을 조사하기 위하여 폴레이트 리셉터 파지티브 (folate receptor-positive) 세포주로 알려진 KB 세포를 사용하여 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 도 12에 나타낸 바와 같이 F-P-Bac의 트랜스덕션 효율은 F-PEG의 수식정도가 증가할수록 증가한 반면 P-Bac의 트랜스덕션 효율은 PEG의 수식정도가 증가할수록 감소하였다. 이 결과는 F-P-Bac이 KB 세포에 폴레이트 리셉터를 매개로 전달됨을 의미한다.

유전자 전달에 있어서 폴레이트 리셉터의 필요성을 검증하기 위하여 KB 세포와 HepG2 세포에서 루시퍼라제 활성을 검토하였다 (도 13). F-P-Bac의 루시퍼라제 활성을 KB 세포 그리고 HepG2 세포 모두에서 P-Bac의 루시퍼라세 활성으로 표준화 (normalized) 하였다. F-P-Bac은 P-Bac과 비교하여 KB 세포주에서는 매우 높은 트랜스덕션 효율을 보인 폴레이트 리셉터 네가티브 (folate receptor-negative) 세포주인 HepG2 세포에서는 둘 간의 차이가 거의 없는 것으로 관찰되었다. 더욱이 KB 세포에서 F-P-Bac 3 그리고 F-P-Bac 5의 루시퍼라제 활성은 HepG2 세포에서의 활성에 비해 각각 10배 그리고 7배 증가되었고 이는 바이러스 표면에 수식된 폴레이트 리간드가 폴레이트 리셉터 인식과 KB 세포에서의 트랜스덕션 효율을 증진시키는데 중요한 역할을 한다는 것을 의미한다.

실험예 13: 경쟁 분석

리셉터를 매개로 하는 트랜스덕션 (receptor-mediated transduction)을 확인하기 위하여 루시퍼라제 활성 분석과 GFP 발현 분석 (flow cytometry)을 통하여 경쟁 분석을 하였다. 경쟁 분석을 두 가지 방법으로 행하였다.

첫째로 KB 세포를 실험 2주전부터 폴레이트가 없는 RPMI 1640 배지에서 배양하였는데 이 배지로 인하여 KB 세포막의 폴레이트 리셉터를 과발현 시키게 된다. 트랜스덕션 효율은 폴레이트가 포함 된 (1 mg/L) RPMI 1640 배지로 배양시킨 KB 세포와 비교하였다. 세포는 루시퍼라제 분석을 위하여 24-well 플레이트에 1.5 × 10⁵가 되게 GFP 발현 분석을 위하여 6-well 플레이트에 5 × 10⁵ 이 되게 seeding을 하였다. 18시간 동안 배양한 후 루시퍼라제 유전자 또는 GFP 유전자를 포함하는 베큘로바이러스를 MOT 150이 되게 플레이트에 각각 첨가하여 1시간 동안 배양하였다. 그 후 혈청과 10mM의 소듐 뷰틸레이트를 포함하는 배지로 갈아준 후 24시간 동안 더 배양하였다. 루시퍼라제 활성은 II-VII에서 설명한 바와 같이 측정하였다. GFP 발현 측정은 세포를 PBS로 세척하여 다 긁어 모은 후 FACS Calibur system을 이용하여 GFP가 발현 된 세포의 비율을 측정하였다.

둘째로 KB 세포를 실험 2주전부터 폴레이트가 없는 RPMI 1640 배지에서 배양하여 KB세포막의 폴레이트 리셉터가 과 발현되게 하였다. 세포를 24-well 플레이트에 1.5 × 10⁵가 되게 seeding 한 후 18시간 동안 배양하였다. 배양 후 베큘로바이러스를 첨가시키기 10분 전 free 폴레이트를 경쟁자 (competitio)로써 전 처리하여 전 처리하지 않은 세포에서의 트랜스덕션 효율과 비교하였다.

폴레이트 포함 또는 불포함 RPMI 1640 배지로 배양한 KB 세포를 이용하여 F-P-Bac의 폴레이트 리셉터 매개의 트랜스덕션을 확인하였다. 도 14 (a)에서 보이는 바와 같이 F-P-Bac의 루시퍼라제 활성은 폴레이트가 포함된 배지로 배양한 KB 세포에서 현격히 억제되는 반면 P-Bac의 경우 배지에 폴레이트의 포함여부와 무관하게 루시퍼라제 활성의 차이가 거의 없었다. 도 14 (b)에서와 같이 GFP 발현도 루시퍼라제 활성의 경우와 비슷한 결과를 나타내었다. 또한 도 14 (c)는 F-P-Bac의 루시퍼라제 활성이 free 폴레이트를 전 처리함으로써 급격히 저해됨을 알 수 있다. 이러한 결과들은 폴레이트가 포함된 배지에서 배양한 경우나 free 폴레이트를 리셉터 차단제 (receptor blocking agent)로써 전 처리한 경우 표적 효율이 매우 감소하는 반면 P-Bac의 트랜스덕션 효율에는 영향을 미치지 못하였다. 이는 F-P-Bac이 KB 세포에 리셉터를 매개로 하는 세포이물흡수 (receptor-mediated endocytosis)에 의해 전달됨을 의미한다.

실험예 14: F-P- Bac 의 반복 투여 후 암 진행 추이 조사

in vivo 실험을 위하여 BALB/c (nu/nu) 쥐를 사용하였다. KB 세포를 in vitro 상태에서 배양한 후 각 쥐마다 2 × 10⁶ 세포를 쥐 등 피하지방에 주입하였다. 10일 후 암조직의 크기가 일정한 것들을 선택하여 일주일 마다 한번씩 PDCD4 유전자를 포함하고 있는 F-P-Bac (F-P-Bac-PDCD4)을 암 조직에 직접 투여하였다. 이때 PBS만 투여하는 그룹을 대조군으로 사용하였고 F-P-Bac의 특이적 항암 효과를 보기 위하여 PDCD4 유전자를 포함하지 않은 베큘로바이러스 단독 (Bac), PDCD4 유전자를 포함하는 베큘로바이러스 (Bac-PDCD4) 그리고 PDCD4 유전자를 포함하는 P-Bac (P-Bac-PDCD4)을 함께 비교하였다. 암 조직의 크기는 매 4일마다 한번씩 측정하였다.

F-P-Bac이 in vivo에서도 여전히 리셉터 매개로 (receptor-mediated) 효율적으로 유전자를 전달하는지를 검토하기 위하여 KB 세포를 누드 마우스 (nude mouse)에 이식 시킨 후 PDCD4 유전자를 포함하는 F-P-Bac (F-P-Bac-PDCD4)을 반복 투여하여 암 조직의 크기를 측정하였다. F-P-Bac-PDCD4 을 반복 투여한 그룹에서는 P-Bac-PDCD4 를 반복 투여한 그룹과 다른 대조군들과 비교를 했을 때 암 조직 성장 속도가 현저히 감소됨을 알 수 있다. 도 15에서 보이는 바와 같이 첫 투여 17일 후 F-P-Bac-PDCD4 와 P-Bac-PDCD4 그룹 간의 암 조직 성장 차이가 증가되었다. 이러한 결과는 F-P-Bac이 in vivo에서도 여전히 폴레이트 리셉터를 매개로 하는 표적 전달이 가능하기 때문에 P-Bac 보다 훨씬 효율적인 유전자 전달체이다는 것을 의미한다.

본 발명에서 F-P-Bac은 성공적으로 제조되었고 in vitro와 in vivo에서 암 표적 유전자 전달체로서의 잠재력을 확인할 수 있었다. 바이러스 표면에 F-PEG를 수식함으로써 개선된 표면전하를 보였다. 또한 폴레이트가 표적 리간드 역할을 수행하기 때문에 폴레이트 리셉터 파지티브 (folate receptor-positive) KB 세포에서 F-P-Bac은 P-Bac과 비교하였을 때 현저히 증가된 트랜스덕션 효율을 보였다. 경쟁 분석 (competition assay)을 통하여 F-P-Bac의 리셉터 매개의 세포이물 흡수 (receptor-mediated endocytosis)에 의한 표적 전달을 확인하였다. in vivo에서도 역시 in vitro의 경향과 마찬가지로 F-P-Bac이 P-Bac에 비해 효율적으로 암 성장을 억제하였고 이는 F-P-Bac이 in vivo에서도 표적전달을 함을 의미한다. 따라서 F-P-Bac은 암 표적 유전자 치료를 위한 전달체로써 잠재력을 지니고 있다고 할 것이다.

상기 실시예와 실험예를 통하여 설명한 바와 같이, 본 발명 신규한 바이러스성 유전자전달체는 폴레이트 리셉터를 표적할 수 있는 리간드로써 폴레이트를 폴리에틸렌 글리콜과 결합시켜 폴레이트-PEG(F-PEG)를 베큘로바이러스 표면에 도입하여 폴레이트 리셉터 매개의 세포이물흡수 (folate receptor-mediated endocytosis)를 유도하도록 함으로써 낮은 세포독성과 높은 안정성을 가지면서 유전자전달 효율을 조절할 수 있는 동시에 폴레이트 리셉터 파지티브 KB 세포에 훨씬 더 높은 트랜스덕션 효율을 가짐으로써 암세포에만 특이적으로 유전자를 전달할 수 있는 시스템을 구축할 수 있는 효과가 있으므로 생물·의약산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

도 1은 베큘로바이러스 벡터(pBacPAK8)에 GFP 유전자를 재조합하는 도식으로 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명에서 재조합된 베큘로바이러스 벡터에 PEG의 결합 농도를 플루오레스카민 (fluorescamine)으로 정량한 그래프이다.

도 3은 재조합 베큘로바이러스에 PEG를 다양한 농도로 결합시킨 본 발명 바이러스성 유전자전달체의 형태를 나타내는 투과전자현미경 (transmission electron microscopy: 이하 TEM)의 사진이다.

도 4는 재조합 베큘로바이러스에 PEG를 다양한 농도로 결합시킨 본 발명 바이러스성 유전자전달체의 A549 세포에 대한 세포독성을 나타내는 그래프이다.

도 5는 재조합 베큘로바이러스에 PEG를 다양한 농도로 결합시킨 본 발명 바이러스성 유전자전달체의 루시퍼라제 유전자전달 효율을 나타낸 그래프이다.

도 6은 재조합 베큘로바이러스에 PEG를 다양한 농도로 결합시킨 본 발명 바이러스성 유전자전달체의 GFP 발현을 FACS로 측정하여 나타낸 그래프이다.

도 7은 본 발명 바이러스성 유전자전달체의 PEG 분자량에 따른 루시퍼라아제 발현 효율을 나타낸 그래프이다.

도 8은 본 발명 바이러스성 유전자전달체의 PEG 농도를 다르게 마우스 꼬리 정맥에 주입하여 48시간 동안 발현을 시킨 (a) 간, (b) 비장, (c) 폐, (d) 심장, (e) 신장, (f) 뇌를 동결 박편기(cryotome)을 이용하여 절단한 후 GFP 발현을 관찰한 형광현미경 사진이다.

도 9는 F-PEG의 합성 과정을 간략히 나타내는 것이다.

도 10은 폴레이트와 F-PEG의 핵자기공명분광기 분석 결과를 나타낸다.

도 11은 (a) PEG 또는 (b) F-PEG의 다양한 농도에 따른 바이러스 표면 변형 (modification) 정도를 알아보기 위하여 플루오레스카민 분석으로 결합량을 정량한 결과를 나타낸다. 변형된 정도는 변형되지 않은 벡터의 총 아미노기 (amino group)와 비교하여 남은 아미노기의 비율로 나타낸 것이다.

도 12는 KB 세포주에서 F-P-Bac과 P-Bac의 트랜스덕션 효율을 나타낸다. 24-well 플레이트에 KB 세포를 1.5 × 105 cells을 seeding 한 후 각 well 마다 MOT (multiplicity of transduction)이 150이 되게 처리한 후 24시간 동안 배양하여 분석한 결과이다.

도 13은 KB 세포 또는 HepG2 세포에 MOT 150의 F-P-Bac 3 또는 F-P-Bac 5를 트랜스덕션시켜 P-Bac 3 또는 P-Bac 5를 트랜스덕션 시킨 값으로 보정한 루시퍼라제 활성을 나타낸다.

도 14는 F-P-Bac과 P-Bac을 폴레이트가 포함된 배지에서 배양한 후 (a, b) 또는 free 폴레이트를 전 처리 한 후 (c) 경쟁 분석을 실시한 결과이다. 이는 루시퍼라제 활성 분석 (a, c) 또는 FACS 분석 (b)을 통하여 측정한 것이다.

도 14는 F-P-Bac의 반복 투여 후 종양 성장 진행 추이를 조사한 결과이다. 각 BALB/c mouse에 KB 세포 2 × 10⁶ 세포를 등쪽 피하지방에 이식하여 10일 후 종양이 생성되게 하였고 종양이 생성된 후 F-P-Bac-PDCD4를 매 7일마다 한번씩 투여 하여 종양의 크기를 매 4일마다 한번씩 측정하여 종양 크기 변화 추이를 1달 동안 지속 관찰한 결과이다.

Claims

재조합 베큘로바이러스 벡터 표면에 폴레이트-폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol) 결합체를 수식하여 바이러스성 유전자전달체를 제조하는 방법에 있어서,

상기 재조합 베큘로바이러스 벡터는 도 1에서와 같이 구축되어 녹색형광단백질(Green fluorescent protein), 루시퍼라아제(luciferase) 또는 PDCD4 (programmed cell death 4) 유전자를 포함하고,

상기 폴레이트-폴리에틸렌 글리콜은 폴레이트의 칼복실기 (carboxyl group)와 헤테로-이관능성(hetero-bifunctional) 폴레에틸렌글리콜의 1차 아민기 간의 아마이드 결합를 통하여 합성되고, 획득한 F-PEG를 DCC와 NHS와의 몰 비가 1:1.2:1.2가 되게 DMSO에 녹여 활성화시킨 후 DCC의 반응물인 우라실 (uracil) 형태를 제거한 활성화 된 폴레이트-폴리에틸렌 글리콜

인 것을 특징으로 하는 바이러스성 유전자전달체의 제조방법.
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