JP4701169B2 - アデノウイルスのポリマーカプセル化 - Google Patents
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Description
(関連出願への相互参照)
本願は、2003年6月30日に出願した米国特許出願第60/484,060号の利益を主張し、これら全ては参考として本明細書中に組み込まれる。
適用なし。
適用なし。
組換えアデノウイルスは、多種多様な増殖性および非増殖性細胞に遺伝子を送達することができるため、遺伝子治療においてベクターとして頻繁に使われている。しかし、アデノウイルスの全身送達は、例えば、血中半減期が短いこと(Morrisseyら、Toxicol Sci.65:266−275(2002);Alemanyら、J Gen Virol.81:2605−2609(2000))、細網内皮組織(RES)による消失(Zieglerら、HumGene Ther.13:935−945(2002);Taoら、Mol Ther.3:28−35(2001))、先天性免疫応答の誘発(Zhangら、Mol Ther.3:697−707(2001);Schnellら、Mol Ther.3:708−722(2001))、未検出の抗体による中和反応(Rahmanら、Mol Ther.3:768−778(2001))、およびある組織および細胞タイプのアデノウイルス亜型の本来の親和性(Bergelson,Biochem Pharmacol.57:975−979(1999))など、いくつかの困難に直面する。さらに、アデノウイルスは強い体液性免疫応答を誘発するので、繰り返し投与するのは難しい(Rahmanら、Mol Ther.3:768−778(2001))。
本発明は、コポリマーとアデノウイルスとの非共有結合錯体を規定する。PEI、ポリリジン、DEAE−デキストランおよびその誘導体のようなカチオンポリマーと、PEGおよびその誘導体のような非イオン性ポリマーとの組合せであるコポリマーは、細胞中のアデノウイルスの送達および導入遺伝子発現の両方を良好にすることができる。本発明の錯体は、カプセル化されていないアデノウイルスよりさらに治療的に効果があり、容易に製造できる材料を提供する。
(式中、mは1〜1,000の整数である)で表される構造を含む。記号iは、2〜mの整数であり、Xiの位置を示す。記号X1、XiおよびXm+lは、独立して、次の要件を満たすモノマーから選択される。すなわち、該モノマーは、(i)第二アミン類および第三アミン類から選択されるアミンを含み、かつ(ii)少なくとも1つのモノマーはQを含む。Qは、式IIaおよび式IIb:
(式中、Zは、OおよびNHからなる群から選択される)から選択される構造である。記号hは、0〜1の整数である。記号R1は、ポリアルキレングリコール部位を含む。また、本発明のコポリマーは、交差重合を含まず、生理的pHでコポリマー中の少なくとも1個の窒素原子がプラスに帯電している。
別段の定義がない限り、本明細書で使用されている全ての技術用語および科学用語は、通常、本発明が属する業界の当業者によって普通に理解されている意味と同じ意味を持つ。通常、本明細書で使用されている学名、ならびに以下に記載される細胞培養、分子遺伝学、有機合成、分析化学ならびに核酸化学およびハイブリダイゼーションにおける実験室法は、業界でよく知られかつ一般的に用いられているものである。技術および技法は、通常、業界における従来の方法およびこの明細書を通して挙げられる種々の一般的参照文献(一般的には、Knipeら、FIELDS VIROLOGY,4th ed.(2001)Lippincott,Williams,and Wilkins,Philadelphia,PA,を参照。これらは参考として本明細書に組み込まれる)に従って行われる。標準的な技術またはその変型が化学合成および分析のために使用される。
(I.序論)
本発明は、ウイルス粒子を非共有結合的にカプセル化し、錯体を形成するコポリマーに関する。該錯体は、容易に製造され(例えば、ウイルスとポリマーとを混合することによって)、細胞内で核酸を発現するために使用することができる。共有結合的に結合しているポリマーとは対照的に、アデノウイルスのような錯体生物学的材料の化学的修飾を必要とせず、それによって、発生可能な反応生成物の大きな特性確認を避けることができる。核酸の細胞への導入は、例えば、治療目的あるいは診断目的(例えば、レポーター遺伝子を使用すること)に有用である。例えば、数種の実験的癌治療にアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターの多種の態様が利用されている。例えば、米国特許第5,846,945号、第5,801,029号、PCT/US99/08592号、米国特許第5,747,469号、PCT/US98/03514号およびPCT/US97/22036号を参照。本発明のウイルス/ポリマー錯体は、インビトロ、インビボ、またはエキソビボのどの形態においても、興味深い核酸を異なるタイプの細胞に移動させるために使用することができる。
(A.コポリマー)
第一の態様で、本発明は、コポリマーに非共有結合的に錯化したアデノウイルスを含む錯体を提供する。コポリマーは、式I:
(式中、mは、1〜1,000の整数である)の構造を含む。記号iは2〜mの整数であり、Xiの位置を示す。記号X1、XiおよびXm+1は、独立して、次の要件を満たすモノマーから選択される。すなわち、該モノマーは、(i)第二アミン類および第三アミン類から選択されるアミンを含み、かつ(ii)該モノマーの少なくとも1つはQを含む。Qは、式IIaおよび式IIb:
(式中、Zは、OおよびNHからなる群から選択される)から選択される構造である。記号hは、0〜1の整数である。記号R1は、ポリアルキレングリコール部位を含む。また、本発明のコポリマーは、交差重合を含まず、生理的pHでコポリマー中の少なくとも1個の窒素原子がプラスに帯電している。
(式中、cは1〜10の整数である)の構造を含む。さらに他の例示的な実施形態としては、Qは式IIaであり、hは0であり、ZはOであり、前記コポリマーは、a)式III(式中、aは1〜10の整数であり、bは1〜10の整数である)の構造を持つモノマーを少なくとも1個と、b)式IV(式中、cは1〜10の整数である)の構造を持つモノマーを少なくとも1個有する。さらに他の例示的な実施形態としては、aは2である。他の例示的な実施形態としては、bは2である。例示的な実施形態としては、cは2である。さらに他の例示的な実施形態としては、aは3である。他の例示的な実施形態としては、bは3である。例示的な実施形態としては、cは3である。他の例示的な実施形態では、前記モノマーはエチレンイミンである。
(式中、R3はH、−(CH2CH2)NH(CH2CH3)2および−(CH2CH2)N(CH2CH3)2CH2CH2NH(CH2CH3)2から選択される基である)の構造を含む。他の例示的な実施形態では、R3は、前記モノマーの3個のうちの約2個についてはHであり、前記モノマーの3個のうちの約1個については、R3は、−(CH2CH2)NH(CH2CH3)2および−(CH2CH2)N(CH2CH3)2CH2CH2NH(CH2CH3)2から選択される基である。他の例示的な実施形態では、前記モノマーはDEAE−デキストランである。
の構造を含むモノマーを少なくとも1個を含む。他の例示的な実施形態において、R3は、前記モノマーの3個のうちの約2個についてはHであり、前記モノマーの3個のうちの約1個については、R3は、−(CH2CH2)NH(CH2CH3)2および(CH2 CH2)N(CH2CH3)2CH2CH2NH(CH2CH3)2から選択される基である。他の例示的な実施形態において、式VIIの構造を含む前記モノマーの割合は、5%と25%との間である。さらに他の例示的な実施形態では、前記モノマーの3個のうちの約2個はHでありおよび前記モノマーの3個のうちの約1個はHであり、残りのR3は、−(CH2CH2)NH(CH2CH3)2および(CH2 CH2)N(CH2CH3)2CH2CH2NH(CH2CH3)2から選択される基であり、式VIIの構造を含む前記モノマーの割合は、5%と25%との間である。
の構造を含む。記号nは2〜2,000の整数である。記号pは1〜8の整数である。R2は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換3〜7員シクロアルキル、置換または非置換5〜7員ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから選択される基である。さらに他の例示的な実施形態では、pは2である。
の構造を持つ。記号nは2〜2,000の整数である。記号pは1〜8の整数である。R2は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換3〜7員シクロアルキル、置換または非置換5〜7員ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから選択される基である。さらに他の例示的な実施形態では、pは2である。他の例示的な実施形態では、Qで置換されているモノマーの割合は、15〜30%である。さらに他の例示的な実施形態において、Qで置換されているモノマーの割合は、17〜22%である。
の構造を持つ。図式XI中、N’が共有結合でN*に結合しており、gは1〜9の整数である。記号R2は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換3〜7員シクロアルキル、置換または非置換5〜7員ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから選択される基である。他の例示的な実施形態では、fは0である。さらに他の例示的な実施形態では、fは1である。さらに他の例示的な実施形態では、gは4である。他の例示的な実施形態では、Qで置換されているモノマーの割合は、15〜30%である。他の例示的な実施形態では、Qで置換されているモノマーの割合は、17〜22%である。
の構造を持つ。記号nは2〜2,000の整数である。記号pは1〜8の整数である。R2は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換3〜7員シクロアルキル、置換または非置換5〜7員ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから選択される基である。他の例示的な実施形態では、Qで置換されているモノマーの割合は15〜30%である。他の例示的な実施形態では、Qで置換されているモノマーの割合は17〜22%である。
以下の例示的なスキーム1〜5で、本発明の化合物の製造方法を説明する。これらの方法は、挙げられた化合物の製造に限定されることはなく、同様に他の化合物を製造するために使用することもできる。また、本発明の化合物は、該スキームに明示的に記載されていない方法によっても製造することができる。化合物は、容易に入手しうる原料や公知の中間体を使用して製造することもできる。
本発明で、ポリアルキレングリコールのような非イオン親水性ポリマーは、共有結合でカチオンポリマーに結合している。適切なポリアルキレングリコールが、アルドリッチケミカル社から市販されているプロピレングリコールおよびポリ(1,2−ブチレングリコール)、およびネクター・セラピューティックス社から市販されているポリエチレングリコールおよびその誘導体を始めとして、多くの供給元から市販されている。ポリアルキレングリコールサブユニットが、第二または第三級アミン、アミド、ジヒドラジド、エステル、尿素、イソ尿素、カルバメート、ウレタンまたはその組み合わせのような基を介してカチオンポリマーと共有結合で結合している場合もある。ポリアルキレングリコールサブユニットの数(n)は、例えば、2〜2,000の間の数でありえる。本発明の化合物のいくつかは、サブユニットの数が45〜1,200の間の数である。本発明の他の化合物のサブユニットの数は250〜1,000の間の数である。
本発明のカチオンポリマーは、プラスに帯電しているモノマーを表す、記号X1、Xi、およびXm+1を含む。これらプラスに帯電しているモノマーは、カチオンポリマーを形成する。これらプラスに帯電しているモノマーは、第二アミンまたは第三級アミンを含み、同様に、第一アミンまたはアルコール官能基も含みうる。本発明のカチオンポリマーの平均分子量は、約800ドルトンと約800,000ドルトンの間でありえる。ある実施形態では、平均分子量は、2,000ドルトンと100,000ドルトンとの間である。他の実施形態では、平均分子量は約15,000ドルトンと約50,000ドルトンとの間である。さらに、mによって表されるカチオンポリマーの長さは、1と1000との間で変更することができる。ある実施形態において、mは10と900との間の自然数である。他の実施形態では、mは50と600との間の自然数である。さらに他の実施形態で、mは75と300との間の自然数である。
例示的な実施形態において、カチオンポリマーはポリアルキレンイミンである。ポリアルキレンイミンは以下のモノマー:
(式中、cは1〜10の間の整数である)を含む場合もある。ある場合は、cは2である。他の場合ではcは3である。さらに他の場合は、ポリアルキレンイミンは、上記したモノマーの混合物である。さらに他の場合では、ポリアルキレンイミンはポリエチレンイミン(PEI)である。
このスキームにおいては、PEI−mPEGコポリマーを製造するために、ホウ酸塩緩衝液を含む水溶液中でPEIを、メチル基でキャッピングされたサクシンイミド−活性化PEGに反応させる。ある実施形態においては、ポリアルキレンイミンは、スキーム1での構造であって、yに対するxの比が1:1と5:1との間である構造のモノマーを含む。該比はまた、例えば、2:1または3:1もとりうる。適切なポリアルキレンイミンが、アルドリッチケミカル社から市販されているポリエチレンイミン、ポリサイエンス社から市販されているポリエチレンイミン、およびBASFから市販されているPOLYMINポリ(エチレンイミン)およびLUPASOL(登録商標)ポリ(エチレンイミン)を始めとして、多くの供給元から市販されている。
本発明で使用される他の例示的なカチオンポリマーは、ポリリジンである。ポリリジンは、シグマケミカル社を始めとして多くの供給元から市販されている。ポリリジンは以下の構造:
このスキームにおいては、ポリリジン−mPEGコポリマーを製造するために、ホウ酸塩緩衝液を含む水溶液中でポリリジンを、メトキシ基でキャッピングされたサクシンイミジルプロピオネート−活性化PEGに反応させる。
本発明で使用される他の例示的なカチオンポリマーは、DEAE−デキストランである。DEAE−デキストラン塩酸塩は、シグマケミカル社を始めとする多くの供給元から市販されている。DEAE−デキストランは、以下に列挙するモノマーの混合物を含むことができる。
このスキームにおいては、活性化サッカライドニトリルを製造するために、アセトン60%、水30%およびトリエチルアミン10%の溶剤中、−15℃でサッカライドを臭化シアンと反応させる。続けて、水性酢酸塩緩衝液中、4℃で24時間、アミン置換mPEGと混合して、DEAE−デキストラン−mPEGイソ尿素を形成する。該実施形態においてDEAE−デキストランがカチオンポリマーである場合、非置換グルコースサブユニットのDEAE−置換グルコース(単数および複数DEAE−置換を含む)サブユニットに対する比は、1:1と5:1との間である。該比は、例えば、2:1または3:1も取りうる。
このスキームにおいて、活性化サッカライドニトリルを製造するために、アセトン60%:水30%:トリエチルアミンl0%溶剤中、−15℃で、サッカライドを臭化シアンと反応させる。活性化ポリマーは、まず、アジピン酸ジヒドラジドと反応させ、続けて、シアノ水素化ホウ素ナトリウムの存在下でアルデヒド官能基を有するmPEGと反応させ、アジペートジヒドラジドリンカーを有するDEAE−デキストラン−PEGコポリマーを得る。該実施形態においてDEAE−デキストランがカチオンポリマーである場合、非置換グルコースサブユニットのDEAE−置換グルコース(単数および複数DEAE−置換を含む)サブユニットに対する比は、1:1と5:1との間である。該比は、例えば、2:1または3:1もとりうる。
他の例示的な実施形態において、あるDEAE−デキストラン−PEGコポリマー変種が製造される。DEAE−デキストラン変種は、上で列挙したモノマーを含むことができる。DEAE−デキストラン−PEGコポリマー変種は、スキーム5の方法によって製造される。
このスキームでは、隣接する水酸基をジアルデヒドに酸化するために、サッカライドを過ヨウ素酸と反応させる。引き続き、アミン−置換mPEGと混合し、DEAE−デキストラン−mPEGイミンコポリマー変種を形成する。続くシアノ水素化ホウ素ナトリウムでの還元によりDEAE−デキストラン−mPEGアミンコポリマー変種を製造する。
ウイルスは、特定の細胞タイプに対する高い核酸送達効率を示すが、感染した宿主の免疫システムによっては、検出されない場合が多い。これらの特徴によって、あるウイルスは遺伝子治療での用途に遺伝子送達ビヒクルとして、魅力的な候補となる。レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス(AAV)および単純ヘルペスウイルスが遺伝子治療において普通使用されるウイルスとして挙げられる例である。前記各ウイルスには、長所と限界があり、したがって、所定の遺伝子治療への適正に応じて選択することができる。
他の態様において、本発明は、アデノウイルスとコポリマーとを含む錯体を提供する。これらのコポリマーとしては、前記A部で記載した種類のものを挙げることができる。これらの錯体において、アデノウイルスとコポリマーとは、互いに非共有結合的に錯体を形成している。
最も単純な形では、本発明のコポリマーが単純にアデノウイルスに接触あるいは混合している(実施例2参照)。錯体の形成は、ほとんど瞬時に起こり、さらに精製することも必要としない。次いで、本発明の錯体は、細胞と接触するために使用することができる。本発明の錯体を細胞に接触させて、ウイルスまたはウイルス核酸を細胞へ導入する。
第四の態様において、本発明は、(a)コポリマーと、(b)アデノウイルスであって、非共有結合錯体を形成するアデノウイルスと、(c)生理学的に許容しうる賦形剤とを含む生理学的製剤を提供する。この生理学的製剤中のコポリマーは、式I(式中、mは1〜1,000の整数である)の構造を含む。記号iは2〜mの整数であり、Xiの位置を示す。記号X1、X i およびXm+1は、独立して、次の要件を満たすモノマーから選択される。すなわち、該モノマーは、(i)第二アミン類および第三アミン類から選択されるアミンを含み、かつ(ii)少なくとも1つのモノマーはQを含む。Qは、式IIaおよび式IIb(式中、Zは、OおよびNHからなる群から選択される)から選択される構造である。記号hは、0〜1の整数である。記号R1は、ポリアルキレングリコール部位を含む。また、本発明のコポリマーは、交差重合を含まず、生理的pHでコポリマー中の少なくとも1個の窒素原子がプラスに帯電している。
錯体の送達は、一般的に、部位特異的な注射か静脈内注射のいずれかによって行う。ベクターの部位特異的注射には、例えば、腹腔内注射、胸膜内注射、動脈内注射、眼内注射、腫瘍内注射または、局所塗布が含まれてもよい。これらの方法は、必要に応じて、錯体と他の剤とを組み合わせて使う治療において簡単に行う。
第五態様においては、本発明は、コポリマーとアデノウイルスとを含み、前記コポリマーとアデノウイルスとは非共有結合的に結合しているキットを提供する。キットのコポリマーは、式I(式中、mは1〜1,000の整数である)の構造を含む。記号iは2〜mの整数であり、Xiの位置を示す。記号X1、XiおよびXm+1は、独立して、次の要件を満たすモノマーから選択される。すなわち、該モノマーは、(i)第二アミン類および第三アミン類から選択されるアミンを含み、かつ(ii)少なくとも1つのモノマーはQを含む。Qは、式IIaおよび式IIb(式中、Zは、OおよびNHからなる群から選択される)から選択される構造である。記号hは、0〜1の整数である。記号R1は、ポリアルキレングリコール部位を含む。また、本発明のコポリマーは、交差重合を含まず、生理的pHでコポリマー中の少なくとも1個の窒素原子がプラスに帯電している。
以下の実施例において、特に明記しない限り、温度は摂氏温度(℃)であり、操作は室温あるいは周辺温度、「rt」、「RT」(通常約18〜25℃の範囲)で行った。溶剤の蒸発は、ロータリーエバポレータを使用して、減圧下(通常4.5〜30mmHg)で、浴温60℃までで行った。反応の進行は、通常、TLCで追跡し、反応時間は説明のためだけに提供する。収量は説明のためだけに提供する。以下の慣用の略記を使用する。L(リットル)、mL(ミリリットル)、mmol(ミリモル)、g(グラム)、mg(ミリグラム)、min(分)およびh(時間)。
特に明記しない限り、合成に使用された全ての試薬は、シグマ(セントルイス、ミズリー)社から購入した。1H−NMR分析は、Numegaレゾナンス研究所(サンディエゴ、カリフォルニア)によって行われた。NMR分析の前に、コポリマーは、10,000MWCO膜(Slide−a−Lizer,ピアス社,ロックフォード,イリノイ)を使用して、脱イオン水に対して透析し、凍結乾燥した。CMV即時初期プロモーター(BGCG)の制御下でLacZ融合たんぱく質(β−Gal)遺伝子を発現する組換えアデノウイルスについては、以前に記載された(Wills,K.N.ら、Hum Gene Ther.5:1079−1088(1994))。同じCMV即時初期プロモーター(GFCB)制御下で緑色蛍光たんぱく質(GFP)遺伝子をコード化する組換えアデノウイルスについても、以前に記載された(Rahman,A.ら、Mol Ther.3:768−778(2001))。記載されたように、BGCGおよびGFCBを製造し精製した(Huyghe,B.G.ら、Hum Gene Ther.6:1403−1416(1995))。
(PEI−mPEGポリマーの製剤)
PEI(25kDa)をアルドリッチ社(ミルウォーキー、ウィスコンシン)から購入し、メトキシPEG−SPA(5kDa)はシェアウォーター社(ハンツビル、アラバマ)から得た。逆相HPLC(100%水中0.1%TFAから100%アセトニトリル中0.1%TFAの線形勾配、20分、流速:0.4mL/分)による出発物質の分析は、10分でPEIの単一ピーク、15分でmPEGの単一ピークを示した。
反応混合物をサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。画分を集め、PEI−mPEGコポリマーを含む画分をプールし、プールしたものを逆相クロマトグラフィーによって分析した。
精製した反応生成物(PEI−mPEGコポリマー)の逆相クロマトグラフィーによる分析は、単一の広範なピークを示した。特徴的なPEIピークとPEGピークの欠乏は、出発物質が無くなったことを示していた。さらに、広範なPEI−mPEGの溶離ピークは、コポリマー中のPEIに対するPEGの比の不均質な分布を示唆していた。
(錯体の製造)
組換えアデノウイルスを、(1)アデノウイルスをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)またはvPBS(1×PBS、3%w/vサッカロース、2mM塩化マグネシウム、pH7.5)で希釈し、最終濃度を1×1011個/mLの粒子とし、(2)PEI−mPEG原料を加え、(3)ピペッティングにより混合することによって、多種の比において、PEI−mPEGコポリマーで処理した。使用の前に、錯体の形成を室温で15分間行った。追加の精製は必要でなかった。
カプセル化前と後のアデノウイルスの特性評価は以下の方法、すなわち、動的光散乱法、ゼータ電位測定法、陰イオン交換クロマトグラフィーおよび等密度CsCl密度勾配遠心法で分析した。分析に先立って、PEI−mPEGでカプセル化されたアデノウイルスを超純水で10倍に希釈した。本発明の錯体の物性を表1に示す。
粒径は動的光散乱法によって測定した。報告されている流体学的径は、水性緩衝液中のアデノウイルス粒子のブラウン運動を測定することにより決定した。PEI−mPEGコポリマーの添加により、用量依存的様式において表面電荷が低減し、より高いポリマー濃度で、中性に近づいた。表面電荷をマスク化されたので、アデノウイルス粒子がPEI−mPEGポリマーでカプセル化されたことが推定された。この結合は、ポリカチオン性PEI骨格と負に帯電したウイルス表面との間の電荷相互作用によって起こった。
(インビトロでの感染力のアッセイ)
感染力と導入遺伝子発現について、アデノウイルスをPEI−mPEGポリマーでカプセル化する効果を、インビトロの2つの異なる細胞株、A549およびT24で調べた。A549細胞、ヒト上皮肺癌細胞は、コクサキーアデノウイルス受容体(CAR)を発現し、したがって、容易にアデノウイルスに感染する。A549細胞を、7%CO2インキュベーター中37℃で、10%FBSを加えたDMEM中に維持した。対照的にT24細胞は、CARネガティブで、A549細胞に比べて感染性にかなり劣っている。T24、ヒト上皮膀胱癌細胞を、10%FBSを加えたHam’s F12/DME高グルコースの1:1混合物中に維持し、同じインキュベーター中で増殖させた。培養物を、約80%コンフルエントまでT−225cm2組織培養フラスコ内で成長させ、0.25%トリプシンを使用して取り外し、6−ウェルプレート中に5×105細胞/ウェルで播種した。アデノウイルスまたはPEI−mPEGでカプセル化されたアデノウイルスで感染させる前に、細胞を一晩(37℃、7%CO2)維持した。感染力を、緑色蛍光たんぱく質(GFP)を発現する組換えアデノウイルスを使用して調べた。形質導入の頻度、すなわち、GFPポジティブ(感染された)細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーによって測定した。形質導入の頻度(GFPポジティブ細胞のパーセント)は、FITC(FL−1)ポジティブ細胞の数を分析した細胞の総数で割ることによって計算した。
インビトロにおける導入遺伝子の発現を、β−ガラクトシダーゼを発現する組換えアデノウイルス(図3B)を使用して、2つの同じ細胞株で調べた。感染力のアッセイと同様の方法で、細胞を、PEI−mPEGでカプセル化されたBGCGまたはBGCGで感染した。細胞を溶解し、導入遺伝子発現を、化学発光β−ガラクトシダーゼ・レポーター遺伝子アッセイキット(ロッシュ、マンハイム、ドイツ)を使用して分析した。要約すると、24h感染終了細胞をPBSで洗浄し、中性洗剤で室温下30分かけて溶解した。遠心分離によって細胞の破片を取り除いた後、50μlの希釈細胞抽出物を96−ウェル化学発光アッセイプレートに移した。これに100μlの化学発光基質(ガラクトン・プラス)を加え、室温で1時間インキュベートした。次いで、アッセイプレートをTR717マイクロプレートルミノメーター(Tropix社、ベッドフォード、マサチューセッツ)で分析した。β−ガラクトシダーゼ濃度を、β−ガラクトシダーゼ標準(キットで提供されている)と比較して決定し、溶解物の総たんぱく質含量で正規化した。両細胞株に関して、導入遺伝子発現の増加は、PEI−mPEGカプセル化アデノウイルスが非カプセル化アデノウイルスを上回っていたことが見られた。増加は、T24細胞について、27%(A)、157%(B)および130%(C)であり、A549細胞について、40%(A)、67%(B)および144%(C)であった。
(生体内分布とインビボにおける導入遺伝子発現)
生体内分布と導入遺伝子発現を、組換えアデノウイルスまたはカプセル化アデノウイルスをBALB/cマウスの尾静脈へ静脈内注射した後評価した。注射後3日で器官/組織を採取し、アデノウイルスDNAの存在を定量的PCRによって分析し、β−ガラクトシダーゼ酵素活性を化学発光β−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子アッセイキットを使用して分析した。
メスのBALB/cマウスの尾静脈に、ゆっくりと(20秒で300μl)PEI−mPEGでカプセル化されたBGCGまたはBGCGを注射した。投与して3日後動物を致死させ、肝臓および組織を切除した。組織は直ちにOCT中に置き、−70℃で素早く凍結した。6μmの切片をカットし、次いで、X−galで染色した。各組織の切片を液体窒素中で素早く凍結した。投与グループ1つにつき3匹の動物とした。
組織サンプルにおけるβ−ガラクトシダーゼ酵素活性:組織サンプルを溶解基質チューブ(QBiogene社、カールズバッド、カリフォルニア)に押し込め、組織100mg当たり0.2mLの洗剤溶解緩衝液にプロテアーゼ阻害剤カクテルを加えたもの(β−Galキットとして提供されている)を加えた。組織サンプルをFastPrep組織ホモジナイザー(QBiogene社、カールズバッド、カリフォルニア)中で溶解した。3回の凍結溶解サイクルにかけた後、溶解物を50℃で1時間インキュベートし、内因性β−ガラクトシダーゼ活性を不活性化した。溶解物を14,000×gで10分間遠心分離することによって清澄にした。上澄み液を取り除き、希釈したアリコートを、β−Gal酵素活性について、化学発光β−ガラクトシダーゼ・レポーター遺伝子アッセイキット(ロッシュ、マンハイム、ドイツ)を使用して分析した。
Claims (105)
- a)非共有結合的に錯化しているアデノウイルスと
b)式I:
を含む、錯体。 - Qが式IIaであり、hが0であり、ZがOであり、前記コポリマーにおいて、
a)前記モノマーの少なくとも1個が式III(式中、aは1〜10の整数であり、bは1〜10の整数である)の構造を含み、
b)前記モノマーの少なくとも1個が式IV(式中、cは1〜10の整数である)の構造を含む、請求項1に記載の錯体。 - aが2である、請求項4に記載の錯体。
- bが2である、請求項5に記載の錯体。
- cが2である、請求項6に記載の錯体。
- aが3である、請求項4に記載の錯体。
- bが3である、請求項8に記載の錯体。
- cが3である、請求項9に記載の錯体。
- 前記モノマーがエチレンイミンである、請求項4に記載の錯体。
- 前記モノマーがリジンである、請求項1に記載の錯体。
- R3は、前記モノマーの3個のうちの2個についてはHであり、前記モノマーの3個のうちの1個については、R3は−(CH2CH2)NH(CH2CH3)2および−(CH2CH2)N(CH2CH3)2CH2CH2NH(CH2CH3)2から選択される基である、請求項14に記載の錯体。
- 前記モノマーがDEAE−デキストランである、請求項1に記載の錯体。
- R3は、前記モノマーの3個のうちの2個についてはHであり、前記モノマーの3個のうちの1個については、残りのR3は−(CH2CH2)NH(CH2CH3)2および−(CH2CH2)N(CH2CH3)2CH2CH2NH(CH2CH3)2から選択される基である、請求項17に記載の錯体。
- 式VIIの構造を含む前記モノマーの割合が、5%と25%との間である、請求項17に記載の錯体。
- 式VIIの構造を含む前記モノマーの割合が5%と25%との間である、請求項18に記載の錯体。
- pが2である、請求項21に記載の錯体。
- Qで置換されているモノマーの割合が少なくとも10%である、請求項1に記載の錯体。
- Qで置換されているモノマーの割合が15〜30%である、請求項1に記載の錯体。
- Qが、式IX(式中、nは2〜2,000の整数であり、pは1〜8の整数であり、R2は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換3〜7員シクロアルキル、置換または非置換5〜7員ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから選択される基である)の構造を有する、請求項12に記載の錯体。
- fが0である、請求項27に記載の錯体。
- fが1である、請求項27に記載の錯体。
- gが4である、請求項29に記載の錯体。
- 錯体の直径が、20nmと300nmとの間である、請求項1に記載の錯体。
- 錯体の直径が、80nmと150nmとの間である、請求項1に記載の錯体。
- R2が、置換および非置換アルキル、置換および非置換アリール、葉酸塩、トランスフェリン、ガラクトース、グルコース、抗体、抗体断片およびペプチドから選択されるものである、請求項23に記載の錯体。
- R2がメチルである、請求項34に記載の錯体。
- pが2であり、aが2であり、bが2であり、cが2である、請求項35に記載の錯体。
- R2が、置換および非置換アルキル、置換および非置換アリール、葉酸塩、トランスフェリン、ガラクトース、グルコース、抗体、抗体断片およびペプチドから選択されるものである、請求項26に記載の錯体。
- R2がメチルである、請求項37に記載の錯体。
- pが2である、請求項38に記載の錯体。
- R2が、置換および非置換アルキル、置換および非置換アリール、葉酸塩、トランスフェリン、ガラクトース、グルコース、抗体、抗体断片およびペプチドから選択されるものである、請求項28に記載の錯体。
- R2がメチルである、請求項40に記載の錯体。
- pが2である、請求項41に記載の錯体。
- R2が、置換および非置換アルキル、置換および非置換アリール、葉酸塩、トランスフェリン、ガラクトース、グルコース、抗体、抗体断片およびペプチドから選択されるものである、請求項29に記載の錯体。
- R2がメチルである、請求項43に記載の錯体。
- pが2である、請求項44に記載の錯体。
- R2が、置換および非置換アルキル、置換および非置換アリール、葉酸塩、トランスフェリン、ガラクトース、グルコース、抗体、抗体断片およびペプチドから選択されるものである、請求項30に記載の錯体。
- R2がメチルである、請求項46に記載の錯体。
- pが2である、請求項47に記載の錯体。
- R2が、置換および非置換アルキル、置換および非置換アリール、葉酸塩、トランスフェリン、ガラクトース、グルコース、抗体、抗体断片およびペプチドから選択されるものである、請求項31に記載の錯体。
- R2がメチルである、請求項49に記載の錯体。
- pが2である、請求項50に記載の錯体。
- アデノウイルスに対するコポリマーの比が、3,500:1と30,000:1との間である、請求項1に記載の錯体。
- アデノウイルスに対するコポリマーの比が、3,600:1と20,000:1との間である、請求項52に記載の錯体。
- アデノウイルスに対するコポリマーの比が、10,000:1と30,000:1との間である、請求項52に記載の錯体。
- コポリマーの分子量が、150kDaと170kDaとの間である、請求項1に記載の錯体。
- mが、10〜900の整数である、請求項1に記載の錯体。
- mが、50〜600の整数である、請求項56に記載の錯体。
- mが、75〜300の整数である、請求項57に記載の錯体。
- 非共有結合的に錯化したアデノウイルスコポリマー錯体を製造する方法であって、
コポリマーをアデノウイルスに接触させることを含み、
前記コポリマーが、式I:
前記コポリマーは交差重合を含まず、前記コポリマー中の少なくとも1個の窒素原子がプラスに帯電しており、コポリマーは、125kDaと150kDaとの間の平均分子量を有し、かつ、前記コポリマーの前記アデノウイルスに対する比率は、3,500:1〜30,000:1である、方法。 - Qが式IIaであり、hが0であり、ZがOであり、前記モノマーは、
a)式III(式中、aは1〜10の整数であり、bは1〜10の整数である)の構造を有するモノマーを少なくとも1個と、
b)式IV(式中、cは1〜10の整数である)の構造を有するモノマーを少なくとも1個とを含み、
前記モノマーの少なくとも10%は、式IX(式中、nは2〜2,000の整数であり、pは1〜8の整数であり、R2は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換3〜7員シクロアルキル、置換または非置換5〜7員ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから選択される基である)の構造で置換されており、
前記コポリマーは交差重合を含まず、前記コポリマー中の少なくとも1個の窒素原子がプラスに帯電している、請求項59に記載の方法。 - pが2であり、aが2であり、bが2であり、cが2であり、R2がメチルである、請求項60に記載の方法。
- Qが式IIaであり、hが0であり、ZがOであり、前記モノマーが、式V〔式中、前記モノマーの少なくとも10%が、式IX(式中、nは2〜2,000の整数であり、pは1〜8の整数であり、R2は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換3〜7員シクロアルキル、置換または非置換5〜7員ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから選択される基である)の構造で置換されている〕の構造を含み、
前記コポリマーは交差重合を含まず、前記コポリマー中の少なくとも1個の窒素原子がプラスに帯電している、請求項59に記載の方法。 - pが2であり、R2がメチルである、請求項62に記載の方法。
- Qが式IIaであり、hが1であり、ZがNHであり、前記モノマーが、式VI〔式中、R3は、前記モノマーの3個のうちの2個についてはHであり、前記モノマーの3個のうちの1個については、R3は−(CH2CH2)NH(CH2CH3)2および−(CH2CH2)N(CH2CH3)2CH2CH2NH(CH2CH3)2から選択される基であり、Qで置換されているモノマーの割合は少なくとも10%であり、Qは、式X(式中、nは2〜2,000の整数であり、pは1〜8の整数であり、fは0であり、R2は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換3〜7員シクロアルキル、置換または非置換5〜7員ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから選択される基である)の構造を有している〕の構造を含み、
前記コポリマーは交差重合を含まず、前記コポリマー中の少なくとも1個の窒素原子がプラスに帯電している、請求項59に記載の方法。 - pが2であり、R2がメチルである、請求項64に記載の方法。
- Qが式IIaであり、hが1であり、ZがNHであり、前記モノマーが、式VI〔式中、R3は、前記モノマーの3個のうちの2個についてはHであり、前記モノマーの3個のうちの1個については、R3は−(CH2CH2)NH(CH2CH3)2および−(CH2CH2)N(CH2CH3)2CH2CH2NH(CH2CH3)2から選択される基であり、Qで置換されているモノマーの割合は少なくとも10%であり、Qは、式X(式中、nは2〜2,000の整数であり、pは1〜8の整数であり、fは1であり、R4は式XIの構造を有し、gは4であり、R2は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換3〜7員シクロアルキル、置換または非置換5〜7員ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから選択される基である)の構造を有している〕の構造を含み、
前記コポリマーは交差重合を含まず、前記コポリマー中の少なくとも1個の窒素原子がプラスに帯電している、請求項59に記載の方法。 - pが2であり、R2がメチルである、請求項66に記載の方法。
- Qが式IIbであり、前記コポリマーが、
a)式VI(式中、R3はH、−(CH2CH2)NH(CH2CH3)2および−(CH2CH2)N(CH2CH3)2CH2CH2NH(CH2CH3)2から選択される基である)の構造を含むモノマーを少なくとも1個と、
b)式VIIの構造を含むモノマーを少なくとも1個とを含み、
Qで置換されているモノマーの割合が少なくとも10%で、Qは、式XII(式中、nは2〜2,000の整数であり、pは1〜8の整数であり、R2は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換3〜7員シクロアルキル、置換または非置換5〜7員ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから選択される基である)の構造を有し、
前記コポリマーは交差重合を含まず、前記コポリマー中の少なくとも1個の窒素原子がプラスに帯電している、請求項59に記載の方法。 - pが2であり、R2がメチルである、請求項68に記載の方法。
- アデノウイルスを細胞中に導入する方法であって、
(a)コポリマーをアデノウイルスに非共有結合的に接触させ、
(b)前記コポリマーと前記アデノウイルスとの錯体を細胞に接触させることを含み、
前記コポリマーは、式I:
前記コポリマーは交差重合を含まず、前記コポリマー中の少なくとも1個の窒素原子がプラスに帯電しており、前記コポリマーは、125kDaと150kDaとの間の平均分子量を有し、かつ、前記コポリマーの前記アデノウイルスに対する比率は、3,500:1〜30,000:1である、方法。 - 前記アデノウイルスが、コポリマーのないアデノウイルスより、感染性がより高い、請求項70に記載の方法。
- 前記アデノウイルスが、コポリマーのないものより、感染性が少なくとも20%高い、請求項71に記載の方法。
- 前記アデノウイルスが、コポリマーのないものより、感染性が少なくとも100%高い、請求項71に記載の方法。
- Qが式IIaであり、hが0であり、ZがOであり、前記モノマーは、
a)式III(式中、aは1〜10の整数であり、bは1〜10の整数である)の構造を有するモノマーを少なくとも1個と、
b)式IV(式中、cは1〜10の整数である)の構造を有するモノマーを少なくとも1個とを含み、
前記モノマーの少なくとも10%は、式IX(式中、nは2〜2,000の整数であり、pは1〜8の整数であり、R2は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換3〜7員シクロアルキル、置換または非置換5〜7員ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから選択される基である)の構造で置換されており、
前記コポリマーは交差重合を含まず、前記コポリマー中の少なくとも1個の窒素原子がプラスに帯電している、請求項70に記載の方法。 - pが2であり、aが2であり、bが2であり、cが2であり、R2がメチルである、請求項74に記載の方法。
- Qが式IIaであり、hが0であり、ZがOであり、前記モノマーが、式V〔式中、前記モノマーの少なくとも10%が、式IX(式中、nは2〜2,000の整数であり、pは1〜8の整数であり、R2は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換3〜7員シクロアルキル、置換または非置換5〜7員ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから選択される基である)の構造で置換されている〕の構造を含み、前記コポリマーは交差重合を含まず、前記コポリマー中の少なくとも1個の窒素原子がプラスに帯電している、請求項70に記載の方法。
- pが2であり、R2がメチルである、請求項76に記載の方法。
- Qが式IIaであり、hが1であり、ZがNHであり、前記モノマーが、式VI〔式中、R3は、前記モノマーの3個のうち2個についてはHであり、前記モノマーの3個のうちの1個については、R3は−(CH2CH2)NH(CH2CH3)2および−(CH2CH2)N(CH2CH3)2CH2CH2NH(CH2CH3)2から選択される基であり、Qで置換されているモノマーの割合は少なくとも10%であり、Qは、式X(式中、nは2〜2,000の整数であり、pは1〜8の整数であり、fは0であり、R2は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換3〜7員シクロアルキル、置換または非置換5〜7員ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから選択される基である)の構造を有している〕の構造を含み、
前記コポリマーは交差重合を含まず、前記コポリマー中の少なくとも1個の窒素原子がプラスに帯電している、請求項70に記載の方法。 - pが2であり、R2がメチルである、請求項78に記載の方法。
- Qが式IIaであり、hが1であり、ZがNHであり、前記モノマーが、式VI〔式中、R3は、前記モノマーの3個のうちの2個についてはHであり、前記モノマーの3個のうちの1個については、R3は−(CH2CH2)NH(CH2CH3)2および−(CH2CH2)N(CH2CH3)2CH2CH2NH(CH2CH3)2から選択される基であり、Qで置換されているモノマーの割合は少なくとも10%であり、Qは、式X(式中、nは2〜2,000の整数であり、pは1〜8の整数であり、fは1であり、R4は式XIの構造を有し、gは4であり、R2は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換3〜7員シクロアルキル、置換または非置換5〜7員ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから選択される基である)の構造を有している〕の構造を含み、
前記コポリマーは交差重合を含まず、前記コポリマー中の少なくとも1個の窒素原子がプラスに帯電している、請求項70に記載の方法。 - pが2であり、R2がメチルである、請求項80に記載の方法。
- Qが式IIbであり、前記コポリマーが、
a)式VI(式中、R3はH、−(CH2CH2)NH(CH2CH3)2および−(CH2CH2)N(CH2CH3)2CH2CH2NH(CH2CH3)2から選択される基である)の構造を含むモノマーを少なくとも1個と、
b)式VIIの構造を含むモノマーを少なくとも1個とを含み、
Qで置換されているモノマーの割合が少なくとも10%で、Qは、式XII(式中、nは2〜2,000の整数であり、pは1〜8の整数であり、R2は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換3〜7員シクロアルキル、置換または非置換5〜7員ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから選択される基である)の構造を有し、
前記コポリマーは交差重合を含まず、前記コポリマー中の少なくとも1個の窒素原子がプラスに帯電している、請求項70に記載の方法。 - pが2であり、R2がメチルである、請求項82に記載の方法。
- (a)式I
iは2〜mの整数であってXiの位置を示し、
X1、XiおよびXm+1は独立して選択されたモノマーであり、前記モノマーは、
(i)第二級アミン類および第三級アミン類から選択されるアミンを含み、かつ
(ii)少なくとも1つのモノマーはQを含み、前記Qは、式IIaおよび式IIb:
交差重合を含まず、前記コポリマー中に少なくとも1個の窒素原子がプラスに帯電しており、前記コポリマーは、125kDaと150kDaとの間の平均分子量を有するコポリマーと、
(b)アデノウイルスであって、前記コポリマーの前記アデノウイルスに対する比率は、3,500:1〜30,000:1である、アデノウイルスと、
(c)生理学的に許容しうる賦形剤と、
を含み、
前記コポリマーは、前記アデノウイルスと非共有結合錯体を形成する、生理学的製剤。 - Qが式IIaであり、hが0であり、ZがOであり、前記モノマーは、
a)式III(式中、aは1〜10の整数であり、bは1〜10の整数である)の構造を有するモノマーを少なくとも1個と、
b)式IV(式中、cは1〜10の整数である)の構造を有するモノマーを少なくとも1個とを含み、
前記モノマーの少なくとも10%は、式IX(式中、nは2〜2,000の整数であり、pは1〜8の整数であり、R2は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換3〜7員シクロアルキル、置換または非置換5〜7員ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから選択される基である)の構造で置換されており、
前記コポリマーは交差重合を含まず、前記コポリマー中の少なくとも1個の窒素原子がプラスに帯電している、請求項84に記載の生理学的製剤。 - pが2であり、aが2であり、bが2であり、cが2であり、R2がメチルである、請求項85に記載の生理学的製剤。
- Qが式IIaであり、hが0であり、ZがOであり、前記モノマーが、式V〔式中、前記モノマーの少なくとも10%が、式IX(式中、nは2〜2,000の整数であり、pは1〜8の整数であり、R2は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換3〜7員シクロアルキル、置換または非置換5〜7員ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから選択される基である)の構造で置換されている〕の構造を含み、
前記コポリマーは交差重合を含まず、前記コポリマー中の少なくとも1個の窒素原子がプラスに帯電している、請求項84に記載の生理学的製剤。 - pが2であり、R2がメチルである、請求項87に記載の生理学的製剤。
- Qが式IIaであり、hが1であり、ZがNHであり、前記モノマーが、式VI〔式中、R3は、前記モノマーの3個のうちの2個についてはHであり、前記モノマーの3個のうちの1個については、R3は−(CH2CH2)NH(CH2CH3)2および−(CH2CH2)N(CH2CH3)2CH2CH2NH(CH2CH3)2から選択される基であり、Qで置換されているモノマーの割合は少なくとも10%であり、Qは、式X(式中、nは2〜2,000の整数であり、pは1〜8の整数であり、fは0であり、R2は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換3〜7員シクロアルキル、置換または非置換5〜7員ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから選択される基である)の構造を有している〕の構造を含み、
前記コポリマーは交差重合を含まず、前記コポリマー中の少なくとも1個の窒素原子がプラスに帯電している、請求項84に記載の生理学的製剤。 - pが2であり、R2がメチルである、請求項89に記載の生理学的製剤。
- Qが式IIaであり、hが1であり、ZがNHであり、前記モノマーが、式VI〔式中、R3は、前記モノマーの3個のうちの2個についてはHであり、前記モノマーの3個のうちの1個については、R3は−(CH2CH2)NH(CH2CH3)2および−(CH2CH2)N(CH2CH3)2CH2CH2NH(CH2CH3)2から選択される基であり、Qで置換されているモノマーの割合は少なくとも10%であり、Qは、式X(式中、nは2〜2,000の整数であり、pは1〜8の整数であり、fは1であり、R4は式XIの構造を有し、gは4であり、R2は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換3〜7員シクロアルキル、置換または非置換5〜7員ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから選択される基である)の構造を有している〕の構造を含み、
前記コポリマーは交差重合を含まず、前記コポリマー中の少なくとも1個の窒素原子がプラスに帯電している、請求項84に記載の生理学的製剤。 - pが2であり、R2がメチルである、請求項91に記載の生理学的製剤。
- Qが式IIbであり、前記コポリマーが、
a)式VI(式中、R3はH、−(CH2CH2)NH(CH2CH3)2および−(CH2CH2)N(CH2CH3)2CH2CH2NH(CH2CH3)2から選択される基である)の構造を含むモノマーを少なくとも1個と、
b)式VIIの構造を含むモノマーを少なくとも1個とを含み、
Qで置換されているモノマーの割合が少なくとも10%で、Qは、式XII(式中、nは2〜2,000の整数であり、pは1〜8の整数であり、R2は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換3〜7員シクロアルキル、置換または非置換5〜7員ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから選択される基である)の構造を有し、
前記コポリマーは交差重合を含まず、前記コポリマー中の少なくとも1個の窒素原子がプラスに帯電している、請求項84に記載の生理学的製剤。 - pが2であり、R2がメチルである、請求項93の生理学的製剤。
- コポリマーとアデノウイルスとを含むキットであって、前記コポリマーとアデノウイルスとは非共有結合的に結合し、前記コポリマーは、式I:
前記コポリマーは、交差重合を含まず、前記少なくとも1個の窒素原子がプラスに帯電しており、前記コポリマーは、125kDaと150kDaとの間の平均分子量を有し、かつ、前記コポリマーの前記アデノウイルスに対する比率は、3,500:1〜30,000:1である、キット。 - Qが式IIaであり、hが0であり、ZがOであり、前記モノマーは、
a)式III(式中、aは1〜10の整数であり、bは1〜10の整数である)の構造を有するモノマーを少なくとも1個と、
b)式IV(式中、cは1〜10の整数である)の構造を有するモノマーを少なくとも1個とを含み、
前記モノマーの少なくとも10%は、式IX(式中、nは2〜2,000の整数であり、pは1〜8の整数であり、R2は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換3〜7員シクロアルキル、置換または非置換5〜7員ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから選択される基である)の構造で置換されており、
前記コポリマーは交差重合を含まず、前記コポリマー中の少なくとも1個の窒素原子がプラスに帯電している、請求項95に記載のキット。 - pが2であり、aが2であり、bが2であり、cが2であり、R2がメチルである、請求項96に記載のキット。
- Qが式IIaであり、hが0であり、ZがOであり、前記モノマーが、式V〔式中、前記モノマーの少なくとも10%が、式IX(式中、nは2〜2,000の整数であり、pは1〜8の整数であり、R2は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換3〜7員シクロアルキル、置換または非置換5〜7員ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから選択される基である)の構造で置換されている〕の構造を含み、
前記コポリマーは交差重合を含まず、前記コポリマー中の少なくとも1個の窒素原子がプラスに帯電している、請求項95に記載のキット。 - pが2であり、R2がメチルである、請求項98に記載のキット。
- Qが式IIaであり、hが1であり、ZがNHであり、前記モノマーが、式VI〔式中、R3は、前記モノマーの3個のうちの2個についてはHであり、前記モノマーの3個のうちの1個については、R3は−(CH2CH2)NH(CH2CH3)2および−(CH2CH2)N(CH2CH3)2CH2CH2NH(CH2CH3)2から選択される基であり、Qで置換されているモノマーの割合は少なくとも10%であり、Qは、式X(式中、nは2〜2,000の整数であり、pは1〜8の整数であり、fは0であり、R2は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換3〜7員シクロアルキル、置換または非置換5〜7員ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから選択される基である)の構造を有している〕の構造を含み、
前記コポリマーは交差重合を含まず、前記コポリマー中の少なくとも1個の窒素原子がプラスに帯電している、請求項95に記載のキット。 - pが2であり、R2がメチルである、請求項100に記載のキット。
- Qが式IIaであり、hが1であり、ZがNHであり、前記モノマーが、式VI〔式中、R3は、前記モノマーの3個のうちの2個についてはHであり、前記モノマーの3個のうちの1個については、R3は−(CH2CH2)NH(CH2CH3)2および−(CH2CH2)N(CH2CH3)2CH2CH2NH(CH2CH3)2から選択される基であり、Qで置換されているモノマーの割合は少なくとも10%であり、Qは、式X(式中、nは2〜2,000の整数であり、pは1〜8の整数であり、fは1であり、R4は式XIの構造を有し、gは4であり、R2は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換3〜7員シクロアルキル、置換または非置換5〜7員ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから選択される基である)の構造を有している〕の構造を含み、
前記コポリマーは交差重合を含まず、前記コポリマー中の少なくとも1個の窒素原子がプラスに帯電している、請求項95に記載のキット。 - pが2であり、R2がメチルである、請求項102に記載のキット。
- Qが式IIbであり、前記コポリマーが、
a)式VI(式中、R3はH、−(CH2CH2)NH(CH2CH3)2および−(CH2CH2)N(CH2CH3)2CH2CH2NH(CH2CH3)2から選択される基である)の構造を含むモノマーを少なくとも1個と、
b)式VIIの構造を含むモノマーを少なくとも1個とを含み、
Qで置換されているモノマーの割合が少なくとも10%で、Qは、式XII(式中、nは2〜2,000の整数であり、pは1〜8の整数であり、R2は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換3〜7員シクロアルキル、置換または非置換5〜7員ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから選択される基である)の構造を有し、
前記コポリマーは交差重合を含まず、前記コポリマー中の少なくとも1個の窒素原子がプラスに帯電している、請求項95に記載のキット。 - pが2であり、R2がメチルである、請求項104に記載のキット。
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