JP2021513840A - 自己免疫疾患の処置のためのパルボウイルス構造タンパク質 - Google Patents
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Abstract
Description
a)適当な条件下で本発明による細胞を培養することによって構造タンパク質を生産し、それによって本発明の核酸分子を発現させ、かつ任意にアセンブリ活性化タンパク質(AAP)をコードする核酸分子を共発現させ、および
b)ステップa)で生産された発現したパルボウイルス突然変異構造タンパク質を任意に単離する。
1.1 細胞株および培養条件
ヒト胚腎臓(HEK)293T細胞を、T175フラスコ中で培養し、10%の熱不活性化ウシ胎仔血清、100Uのペニシリン/mL、および100μgのストレプトマイシン/mLで補足したダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)中で、5%のCO2中37℃で維持した。
AAVLPは、pCIプラスミドのXholIおよびNotI部位にクローニングされた重複AAV2 VP2およびVP3コード配列を含むプラスミド(Promega,Madison,WI)から作製した。VP2の開始コドンは、Quick Change Site−Directed Mutagenesisキット(Agilent Technologies,La Jolla,CA)を用いて点突然変異を導入して、プラスミドpCIVP2mutACGを作製することにより破壊された。点突然変異は、ACGからGAGへの突然変異をもたらした。VP3にペプチドを導入するために、プラスミドpCIV2mutACGを改変した。プラスミドpCIVP2mutACG−I587は、位置587のNotIおよびBspEI部位の導入によって作製した。プラスミドpCIVP2mutACG−I453は、位置453のNotIおよびBspEI部位の導入によって作製した。その後、さらに別の点突然変異が、Quick Change Site−Directed Mutagenesisキットを用いて導入されて、プラスミドpCIVP2mutACG_mutNotI−I587およびプラスミドpCIVP2mutACG_mutNotI−I453を生成するpCIベクターの骨格内の追加のNotI部位が破壊された。
HEK293T細胞を、無血清DMEM+1%P/S中で、AAVLP−HSP70iプラスミドDNA(PEI I(1:4)と混合したT175フラスコあたり36μg)でトランスフェクトした。3〜4日後に上清を採取し、濾過により培地をクリアし、希釈緩衝液(15mMのクエン酸ナトリウム、6mMのEDTA、0.001%のF−68、pH5.5±0.3)で3回希釈し、pH6.0に調整した。クロマトグラフィーにより粒子をさらに精製した。簡単に述べると、AAVLPを含むクリアされた上清を、Capto Sカラム(GE Healthcare)に負荷させ、(10mMのクエン酸ナトリウム、50mMのNaCl、2mMのEDTA、0.001%のF−68、pH6.0±0.3)を含む緩衝液Aで洗浄した後、0〜30%からの勾配溶出を、緩衝液B(50mMのTrisHCl、1MのNaCl、2mMのEDTA、0.001%のF−68、pH8.5±0.3)で適用し、この勾配中に画分を収集した。
精製したAAVLP−HSP70i粒子の画分を解析し、精製したAVLP−HSP70i_Q435Aワクチン粒子の分子量を特定するために、SDS−PAGEおよびクーマシーブルー染色により特定した。SDS PAGEの前に、試料を透析した(試料AAVLP−HSP70i_Q435A_453_DialyseおよびAAVLP−HSP70i_Q435A_587_Dialyse)。透析した試料に加えて、透析のフロースルーからの試料を分析した(試料AAVLP−HSP70i_Q435A_453_FTおよびAAVLP−HSP70i_Q435A_587_FT)。サイズ指標としてChameleon Duo Prestained protein ladder(Licor,#928−60000)を用いた。比較として、国際公開第2012031760(A1)号に開示されているHPVエピトープ挿入を含むAAVLPを用いた。結果を図4に示す。ゲルレーンの装填は、1:DNAサイズラダー、2:空、3:AAVLP−HSP70i_Q435A_453_Dialyse、4:空、5:AAVLP−HSP70i_Q435A_587_Dialyse、6:空、7:透析後AAVLP−HSP70i_Q435A_453_FT;8:透析後空AAVLP−HSP70i_Q435A_587_FT、9:空、10:AAVLP−HPVであった。
1.3の下で記載されているHEK293T細胞中のカプシド力価は、製造者のマニュアルに従って市販のAAV2滴定ELISAキット(Progen,#PRATV)を用いて測定することができる。簡単に説明すると、粒子を連続希釈し、マウスモノクローナル抗体で被覆した96ウェルプレート中でAAV2に対して1時間、37℃でインキュベートする。洗浄後、捕獲されたAAVLP−HSP70i粒子を、抗AAV2ビオチン結合モノクローナル抗体と共に、37℃で1時間インキュベートする。洗浄を繰り返し、ストレプトアビジンペルオキシダーゼ抱合体を加えてビオチン分子と反応させ、続いて37℃で1時間インキュベートする。洗浄後、基質溶液を加え、特異的に結合したウイルス粒子の量に比例する色反応が生じる。RTで15分間培養後に停止液を加える。吸光度(OD)は、450nmのELISAリーダーを用いて測光的に測定する。AAV2粒子を含むキット対照を含み、2倍に連続希釈し、典型的な滴定曲線を生じる。この曲線により、AAVLP−HPS70iカプシド力価の定量的測定が可能である。
AAVLP−HSP70i_587_Q435A:1.67 E+12粒子/mL(1.187mg/mL)
AAVLP−HSP70i_453_Q435A:1.23 E+12粒子/mL(1.532mg/mL)
2.1 免疫化
AAVLP−HSP70i−587Q435AまたはAAVLP−HSP70i−453Q435Aによって導入されたHSP70iの突然変異したエピトープに対する特異的免疫応答を解析するために、4匹のSPFウィスターラット(系統Crl:WI(Han)に、実施例1に従って得られた8μg/mLのタンパク質(8.7〜10.0E9粒子/mL)のAAVLP−HSP70i粒子を2回(1日目および29日目)皮下接種した。血清試料は、最初の2回は舌下法により、最後の血清試料採取は眼窩周囲法により、処理前および各ワクチン接種14日後に得た。
2.2.1 材料
− 8つのラット血清試料
− 一次抗HSP70/72、mAbマウスIgG1(Enzo,#C9F3A−5,Lot.:05021648,1mg/mL)
− ペプチド:JPT,HSP70iwt(pep−1)およびHSP70iQ435A(pep−2)
− ヒト組換えHSP70(Sigma−Aldrich,#H7283−50UG、ストック300.3μg/mL)
− 96ウェルプレートF底(Thermo Scientific Nunc)
− リン酸緩衝生理食塩水(10×).067M(PO4)(HyClone,#SH30258.01,Lot:AAD202603)
− 無菌の1×PBS
− TWEEN(登録商標)20 BioXtra、粘性液体(Sigma−Aldrich,#9005−64−5,P7949−500ml,Lot:SLBQ0097V)
− スキムミルクパウダーSkim Milk Powder(Merck Millipore,#999999−99−4、カタログ番号:1.15363.0500)
− BSA(BSA、HS、標準グレード、Europa Bioproducts #EQBAH62−1000,Lot:62−1381)
− ウサギ抗ラットIgG(H+L)、HRP結合、ThermoFischer,Invitrogen,#61−9520(1:1000)
− ポリクローナルヤギ抗マウス免疫グロブリン、HRP結合体、Dako #P0447(1:5000)
− Ultra TMB−ELISA基質溶液(Thermo Fisher Scientific #12617087、カタログ番号:34029)
− 1.0MのH2SO4(Bie & Berntsen,#222942)
− ELISAリーダー
抗変異HSP70i特異性IgG抗体を、ELISAによって測定した。簡単に述べると、F96マイクロプレート(Nunc,Thermo Scientific)を、ビオチン化HSP70i野生型またはHSP70i突然変異ペプチドのいずれかの1μg/ウェルで4℃で一晩コーティングした。完全な折りたたまれたHSP70タンパク質の認知を実証するために、1μg/ウェルのヒト組換えHSP70(Sigma−Aldrich,#H7283)でコーティングしたプレートも含めた。プレートを、1×PBS/0.1%のTween−20中の5%の脱脂乳でRTで1時間遮断し、続いて1:10または1:100希釈ラット血清のいずれかと共に37℃で1時間インキュベートした。1×PBS/0.1%Tween−20結合AAVLP−HSP70i抗体で洗浄した後、1:1000希釈HRP標識抗ラットIgG(H+L)(Thermo Fischer,Invitrogen,#61−9520)と共にインキュベートした。酵素反応は、発色反応をもたらすTMB−基質溶液(Thermo Fisher Scientific #12617087)を添加することによって検出され、OD値で測定された強度は、450nmでELISAリーダーを使用して分析された。
免疫化の15日後および43日後に得られた免疫前の血清中の抗体価は、HSP70i野生型ペプチドについては図1A、HSP70i突然変異ペプチドについては図1B、および完全な折りたたまれたHSP70タンパク質については図1Cに、様々な希釈でのOD値としてグラフで示される。
樹状細胞の活性化に対するAAVLP−HSP70iに対して生成された抗体の効果を、in−vitroDC活性化アッセイにおいて試験して、本発明の基礎となる細胞機構を証明した。
3.1.1 序文
PBMCは、1個の円形核を含む末梢血からの細胞である。これらの細胞には、すべての種類のリンパ球(T細胞、B細胞およびNK細胞)、単球ならびに樹状細胞が含まれる。PBMC集団におけるこれらの細胞の分布は、典型的には以下の通りである:T細胞、45〜70%、B細胞およびNK細胞、最大15%、単球10〜30%および樹状細胞1〜2%。PBMCは、密度勾配遠心法を用いて、完全血液または軟膜から、ヒト血液から単離することができる。
PBMC−末梢血単核細胞
PBS−リン酸緩衝生理食塩水
A)50mlの培養培地(RPMI1640+10%のFBS+1%のP/S)を、以下によって調製した:
− 50mLプラスチック管に45mLのRPMI培地を移送する
− 滅菌FBS5mLを加える
− 500μlのP/Sを加える
B)Miltenyi緩衝液(PBS+0.5%のBSA+2mMのEDTA)50mlを、以下によって調製した:
− 50mL滅菌PBSを50mL管に移送する
− BSA0.25gを加える
− 500μlのEDTA(ストック200mMから)を加える
− 0.22μmファイラーを用いて溶液を滅菌ろ過する
1件のアッセイでは、約90×106のPBMCが、12本の管の血液から単離された。
− リンホプレップを含む遠心管は、以下によって調製された:
− 15ml管:4mlのリンホプレップを加える
− 50ml管:15mlのリンホプレップを加える
− ヒトドナーからの血液を、7.5mlのヘパリンナトリウム管に採取し/軟膜を得る
− 全血を、RPMI1640で1:2に希釈した
− リンホプレップを含む遠心管に、リンホプレップの上に重ねて管の側面を下に走らせることにより、希釈した血液を注意深く加えた。
− 15mlの試験管については、8mlの希釈した血液を加えた
− 50mlの試験管については、30mlの希釈した血液を加えた
− 細胞を180g、20℃、加速:2、破損:0で20分間遠心分離した。
− 上清の最上層を除去した
− 15mlの試験管については、2mlの上清を除去した
− 50mlの試験管については、7.5mlの上清を除去した
− 細胞を380gで20分間遠心分離し、20℃、加速:2、破損:0であった。
− 8mlの低温PBSでの15mlの遠心管を準備した。
− PBMCを含む中間相を採取し、低温PBSを含む新しい遠心管に移した。
− 15mlの試験管については、2本の試験管から中間相を1本の新しい試験管に採取した
− ml管については、1つの管からの中間相を、2つの新しい管に採取した
− 細胞およびPBSを含む15mlの遠心管に、低温PBSを15mlに充填した
− 細胞を、300g、4℃、加速:9、破損:3で10分間遠心分離した
− 上清を除去し、細胞を残りのPBSに再懸濁した。2本の試験管からの細胞を、15ml遠心管1本に採取した。
− 細胞を、10mlの低温PBSに再懸濁した
− 細胞を300g、4℃、加速:9、破損:3で10分間遠心分離した
− 上清を除去し、細胞を残りのPBSに再懸濁した。2本の試験管からの細胞を、15ml遠心管1本に採取した。
− 細胞を、10mlの低温PBSに再懸濁した
− 細胞を300g、4℃、加速:9、破損:3で10分間遠心分離した
− 上清を除去し、細胞を残りのPBSに再懸濁した。残りのすべての管からの細胞を、15ml遠心管1本に採取した。
− 細胞を、10mlの低温PBSに再懸濁した
− 細胞を、300g、4℃、加速:9、破損:3で10分間遠心分離した
− 上清を除去し、細胞を低温PBSに再懸濁した
− 細胞を、血球計算器で計数した(希釈:10μlの細胞懸濁液+10μlのメチルバイオレット+80μlのPBS)
− 細胞数は、以下のように算出した:
− 1mL当たりのPBMC:(計数した細胞/四分円の数)×希釈×104
総PBMC:(計数した細胞/四分円の数)×希釈×104×細胞懸濁液体積。
PBMCからの単球の単離は、上記のPBMF調製物と同日に行った
単球は白血球の一種であり、マクロファージおよび骨髄系樹状細胞に分化できる。単球は、すべてのPBMCの10〜30%を構成し、CD14発現のレベルが高い。このプロトコルでは、Miltenyiからの単球単離キットII、ヒトを用いて、陰性選択手順でPBMCから単球をどのように単離できるかについて記載する。
PBMC−末梢血単核細胞
EDTA−エチレンジアミン四酢酸
PBS−リン酸緩衝生理食塩水
BSA−ウシ血清アルブミン
Pen/Strep−ペニシリン/ストレプトマイシン
分離は、Miltenyi Monocyte Isolation Kit II、ヒト、プロトコル、1−3に従って、それぞれの順序において以下のステップによって行った:
− 3.1に従って得られた既知量のPBMCを、15ml遠心管中のPBS中で調製した。
− 細胞を300g、4℃、加速:9、切断:3で10分間遠心分離した
− 上清を完全に除去し、細胞をMiltenyi緩衝液(107のPBMC当たり30μl)に再懸濁した。
− FcR遮断試薬を加えた(107PBMC当たり10μl)。
− ビオチン抗体カクテルを加えた(107PBMC当たり10μl)。
− 細胞懸濁液を完全に再懸濁し、4℃で10分間インキュベートした。
− Miltenyi緩衝液を加えた(107PBMC当たり30μl)。
− 抗ビオチンマイクロビーズを加えた(107PBMC当たり20μl)。
− 細胞懸濁液を完全に再懸濁し、4℃で15分間インキュベートした。
− 2mlのmiltenyi緩衝液を加え、細胞を再懸濁した。
− 細胞を、300g、4℃、加速:9、破損:3で10分間遠心分離した
− MACS分離装置を、MACS Multistand上に設置した。
− LSカラムを分離装置に設置し、カラムの下に廃棄管を設置した。
− カラムをMiltenyi緩衝液(LS:3000μl)ですすぎ、廃棄管に採取した。
− 廃液管を抜去し、カラムの下に採取管を設置した。
− 上清を遠心分離した細胞から完全に除去し、細胞をMiltenyi緩衝液(500μlのmiltenyi緩衝液あたり108細胞)に再懸濁させた。
− 細胞懸濁液をカラムの上に加え、沈殿させた。
− カラムをMiltenyi緩衝液(LS:すすぎ当たり3000μl)で3回すすいだ
− 細胞を300g、4℃、加速:9、破損:3で10分間遠心分離した
− 上清を完全に除去し、細胞を1mlの温培地に再懸濁した
− 細胞を血球計算器で計数した(希釈:10μlの細胞懸濁液+10μlのトリパンブルー+使用した107PBMC当たり10μlのPBS)
− 細胞数を以下のように計算した:
(計数した細胞/四分円の数)×希釈×104
ヒト血液単球からの樹状細胞の作製は、単球作製と同日に行った。
樹状細胞は、天然の免疫と適応した免疫との間の関連を生み出す抗原提示細胞である。これらの細胞は、血液中の細胞のごくわずかな百分率を占めるに過ぎず、これらの細胞を直接単離すると、非常に少数の細胞が得られる。樹状細胞を用いたin vitro実験では、このことが課題を生じさせる。単球は白血球の一種であり、in vivoでマクロファージおよび骨髄系樹状細胞に分化できる。単球は、全PBMCの10〜30%を構成する。これらの細胞はまた、IL−4およびGM−CSFを含む培地で培養すると、in vitroで樹状細胞に分化することができる。このプロトコルでは、ヒト血液単球から樹状細胞を作製する方法について説明する(図3)。
PBMC−末梢血単核細胞
PBS−リン酸緩衝生理食塩水
FBS−ウシ胎児血清
BSA−ウシ血清アルブミン
IL−4−インターロイキン4
GM−CSF−顆粒球マクロファージコロニー刺激因子
Pen/Strep−ペニシリン/ストレプトマイシン
LPS−リポ多糖
3.2に従って得た新しく単離した単球を、1×106細胞/mlの密度で温かい培地中で調製した。
− 細胞を、ウェルプレートに播種した(プレートで通常使用される培地の半分のみを加える)。12ウェルプレート中の培地の通常量は、1mlであった。単球細胞懸濁液0.5mlを、加えた。これは、3日目の総培地交換を避けるために行われ、代わりに新鮮な培地のみを添加する必要があった。
− 細胞を、37℃のCO2インキュベーター中で3日間インキュベートした
− 3日目に、サイトカインIL−4(400IU/ml)およびGM−CSF(1000IU/ml)と共に新鮮な温かい培地を加え、ウェル中の培地の量は、このステップによって倍増した。
− 細胞を、CO2インキュベーター中でさらに3日間インキュベートした。
− 6日目に、DCを、以下のようにLPS、ヒト組換えHSP、および抗HSP70/72抗体で刺激した:
− ウェルの総体積は、300μlであった。
− 以下の混合物を調製し、ウェルに加えた:
LPS+1:100処理前血清
1.a,3μlのLPS(10,000ng/ml)を3μlのラット処理前血清と混合する。
2.RTで20〜30分間インキュベートし、対応するウェルに加える。
LPS+1:100処理後血清
1.a,3μlのLPS(10,000ng/ml)を3μlのラット処理後血清と混合する。
2.RTで20〜30分間インキュベートし、対応するウェルに加える。
LPS+1:1000処理後血清
1.a,3μlのLPS(10,000ng/ml)を0.3μlのラット処理後血清と混合する。
2.RTで20〜30分間インキュベートし、対応するウェルに加える。
組換えHSP70(100μg/mL)+1:100処理前血清
1.a,3μlの組換えHSP70を、3μlのラット処理前血清と混合する。
2.RTで20〜30分間インキュベートし、対応するウェルに加える。
組換えHSP70(100μg/mL)+1:100処理後血清
1.a,3μlの組換えHSP70を、3μlのラット処理後血清と混合する。
2.RTで20〜30分間インキュベートし、対応するウェルに加える。
組換えHSP70(100μg/mL)+1:1000処理後血清
1.a,3μlの組換えHSP70を、0.3μlのラット処理後血清と混合する。
2.RTで20〜30分間インキュベートし、対応するウェルに加える。
LPS+1:100抗HSP70/72
1.a,3μlのLPS(10,000ng/ml)を、3μlの抗HSP70/72と混合する。
2.RTで20〜30分間インキュベートし、対応するウェルに加える。
LPS+PBS
1.a,3μlのLPS(10,000ng/ml)を、3μlのPBSと混合する。
2.RTで20〜30分間インキュベートし、対応するウェルに加える。
組換えHSP70(100μg/mL)+1:100抗HSP70/72
1.a,3μlの組換えHSP70を、3μlの抗HSP70/72と混合する。
2.RTで20〜30分間インキュベートし、対応するウェルに加える。
組換えHSP70(100μg/mL)+PBS
1.a,3μlの組換えHSP70を、3μlのPBSと混合する。
2.RTで20〜30分間インキュベートし、対応するウェルに加える。
3.4.1 序文
フローサイトメトリーは、懸濁液中の細胞および粒子の分析に使用されるレーザーベースの技術である。細胞の大きさおよび顆粒度を分析すること、およびまた、典型的には蛍光標識抗体の強度を測定することによって、特異的な細胞外または細胞内分子を検出することが可能である。
PBS−リン酸緩衝生理食塩水
PP管−ポリプロピレン管
PBS
0.1%のBSA
0.01%のアジ化ナトリウム
この溶液を、ブルーキャップ瓶中で混合し、0.22μmの滅菌フィルターを備えたシリンジを調製し、新しいブルーキャップ瓶に集めたフィルターを通して溶液を流し込んだ。
4℃に保存
固定緩衝液:
PBS
1%のホルムアルデヒド
4℃に保存
− 細胞を、3.3に従って調製したウェルから培地中でフラッシュすることによって回収し、対応するPP管に移した。
− 各ウェルに500μlの低温PBSを加え、培地中でフラッシュし、対応するPP管に移すことによって手順を繰り返した。各管から50μlを「アイソタイプ」と印を付けたPP管に移し、各種類50μlを「未染色」と印を付けたPP管に移す。
− 細胞を300g、4℃で5分間、加速:9、破損:3で遠心分離した。
− 上清を除去し、廃液管に廃棄した。
− 細胞を、短時間ボルテックスした
− 固定性生存性色素細胞染色eFluor 780 1:1000を、1×PBS(Fx.1μlの色素〜999μlの1×PBS)に混合した。
− それぞれの試験管に前記混合物0.5mlを加え、細胞を暗所で30分間4℃でインキュベートした。
− 各管に2mlの1×PBSを加え、細胞を再懸濁した。
− 細胞を300g、4℃で5分間、加速:9、破損:3で遠心分離した。
− 上清を除去し、廃液管に廃棄した。
− 2mlの流れ緩衝液を各管に加え、細胞をその中に再懸濁させた。
− 細胞を300g、4℃で5分間、加速:9、破損:3で遠心分離した。
− 上清を除去し、廃液管に廃棄した
− 細胞を、短時間ボルテックスした
− 以下を含む抗体のマスターミックス:
− Fx.20管=200μlのHLA−DR−PE+100μlのPE−Cy7+100μlのBV421を調製した。
− 200μlのHLA−DR−PE+100μlのPE−Cy7+100μlのBV421を含むマスターミックス20μlを、各PP管に加え、さらに10μlのアイソタイプPE+5μlのアイソトープPE−Cy7+5μlのBV421を、アイソタイプ試料に加えたが、対照試料には加えなかった。
− 管を、暗所で4℃で30分間インキュベートした。
− 各管に2mlの流れ緩衝液を加え、細胞をそこに再懸濁した。
− 細胞を300g、4℃で5分間、加速:9、破損:3で遠心分離した。
− 200μlのHLA−DR−PE+100μlのPE−Cy7+100μlのBV421 2mlの流れ緩衝液を、各管に追加し、細胞を再懸濁した。
− 細胞を300g、4℃で5分間、加速:9、破損:3で遠心分離した。
− 上清を除去し、廃液管に廃棄した
− フローベンチで以下を実施する:
− フローベンチ下で、各管に100μlの固定緩衝液を加え、ピペットで5〜10回上下に混合することによって、細胞を固定した。
− 試料を、一晩冷蔵庫に入れた。
− 翌日、試料を、局所排気換気下にFlow−labでV−ボトムを有する96ウェルプレートに移した。
図3は、CD83(A)およびCD86(B)陽性樹状細胞の数で表されるような、DC活性化および阻害の結果を示す。前免疫血清(Pre)の存在下で、樹状細胞は、LPSにより完全に活性化された。免疫化したラット番号2(Post)から得た血清を添加すると、DC活性化の有意な阻害が観察できた。この阻害は、活性化アッセイで組換えHsp70の3分の1のみを用いた場合に増加した(Post(0,3 HSP))。また、陽性阻害対照について予期されるように、組換え抗Hsp70抗体(rec.HSP70 AP)も、DC活性化を有意に阻害した。
4.1 方法
AAVLP−HSP70iワクチンの有効性をin vivoで評価するために、4週齢から自然に表皮色素脱失を発症する白斑易発症マウスモデルを用いた。これらのh3TA2トランスジェニックマウスは、T細胞上にヒト由来のチロシナーゼ反応性T細胞受容体(TCR)および、メラノサイトを認識する整合するHLA−A2トランス遺伝子の両方を発現する(Eby et al.2014; Mehrotra et al.2012)。マウスは、以上のように得られたAAVLP−HSP70i_Q435A_453(1.5mg/ml、注射当たり0.1ml、n=7)を用いて、2週間間隔で2回皮下(s.c.)注射した5週齢からであった。負の対照として、マウスに、国際公開第2012031760 A1号に開示されているように、HPVエピトープ挿入を含むAAVLPをs.c.注射した(83μg/mL、注射当たり0.1mL、n=5)。色素脱失は、平板スキャナー(Hewlett−Packard Company,Palo Alto,CA)およびAdobe Software(Adobe Systems,Inc.、 San Jose,CA)を用いて、5週齢から2週間間隔で11週齢まで記録し、色素脱失は、Denman et al.(2008)が以前に記載したように算出した。簡単に述べると、麻酔したマウスを平坦なスキャナー上に置き、得られた画像をAdobe Photoshopを用いて画像解析に供した。色素脱失は、未処理マウスのピクセルの95%を含むように設定したカットオフ値を超えるルミノシティで評価した150,000超のうちのピクセルの割合として、最大評価可能領域から算出した。データの統計解析は、Sidakの多重比較検定による反復測定二元配置分散分析により解析した。すべての統計量はGrapHPad Prismソフトウェアを用いて行った。データは平均値±SDで示し、0.05のP値を有意とみなした。5週齢(1回目接種時点)で確立された色素脱失を1とする。色素脱失の平均倍率変化は、5週齢での色素脱失に対して計算し、各群のマウスで平均した。
マウスの腹側の脱着における平均しゅう曲変化を、図5に示す。結果は、AAVLP−HSP70i_Q435Aによる脱着の弦抑制を、AAVLP−HPV対照と比較して実証する。
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Claims (15)
- 突然変異パルボウイルス構造タンパク質であって、ヒトHSP70iのアミノ酸320〜641内に含まれる少なくとも6つの連続したアミノ酸の配列を含む少なくとも1つの挿入を含む、突然変異したパルボウイルス構造タンパク質。
- 前記挿入に含まれる前記アミノ酸配列が、HSP70iによる抗原提示細胞の活性化に関与するアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の突然変異したパルボウイルス構造タンパク質。
- 前記挿入の前記アミノ酸配列が、HSP70iにおける対応する配列と比較して少なくとも1つの突然変異を含む、請求項1または2に記載の突然変異したパルボウイルス構造タンパク質。
- 前記挿入の前記アミノ酸配列がアミノ酸配列APGVLIQVYEGおよび/またはQPGVLIQVYEGを含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の突然変異したパルボウイルス構造タンパク質。
- 前記突然変異したパルボウイルス構造タンパク質がAAV、好ましくはAAV2に由来する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の突然変異したパルボウイルス構造タンパク質。
- 前記突然変異したパルボウイルス構造タンパク質が突然変異VP3タンパクである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の突然変異したパルボウイルス構造タンパク質。
- 前記突然変異したパルボウイルス構造タンパク質が請求項1〜6のいずれか一項に記載の2つ以上の挿入を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の突然変異したパルボウイルス構造タンパク質。
- 前記挿入がI−587位および/またはI−453位である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の突然変異したパルボウイルス構造タンパク質。
- 前記突然変異したパルボウイルス構造タンパク質がリンカー配列を含み、かつ/または
挿入、欠失、異種アミノ酸配列のN末端またはC末端融合および置換から選択される1以上の追加の突然変異を含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の突然変異したパルボウイルス構造タンパク質。 - 請求項1〜9のいずれか一項に記載の突然変異したパルボウイルス構造タンパク質を含む、多量体構造、好ましくはウイルス様粒子。
- 突然変異したパルボウイルス構造タンパク質をコードする、核酸。
- 医薬として使用するための、請求項1〜11のいずれか一項に記載の突然変異したパルボウイルス構造タンパク質を含む組成物。
- 前記医薬がワクチンである、請求項12記載の使用のための組成物。
- 前記医薬および/またはワクチンが、自己免疫疾患および/または炎症性疾患を処置または予防するための方法、あるいは免疫抑制の方法に使用するためのものである、請求項12または13に記載の使用のための組成物。
- 前記自己免疫疾患および/または炎症性疾患が、白斑、脱毛症、関節炎、特に慢性関節リウマチ、乾癬、エリテマトーデス、多発性硬化症、パーキンソン病、自己免疫性糖尿病、移植片対宿主移植片反応、ならびにHSP70を発現する視神経脊髄炎(NMO)、急性視神経炎(AON)、卵巣炎、および腫瘍から選択される、請求項14に記載の使用のための組成物。
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