JP2023523429A

JP2023523429A - ナチュラルキラー（ｎｋ）細胞組成物およびそれを生成させるための方法

Info

Publication number: JP2023523429A
Application number: JP2022564508A
Authority: JP
Inventors: オースティンビグリー; ガイディピエロ
Original assignee: インダプタセラピューティクスインコーポレイテッド
Priority date: 2020-04-22
Filing date: 2021-04-21
Publication date: 2023-06-05
Also published as: CA3180658A1; KR20230088306A; EP4139439A1; CN116368221A; WO2021216790A1; AU2021258194A1; US20230190801A1

Abstract

本明細書においては、ナチュラルキラー（NK）細胞の特殊化したサブセットのエクスビボでの増大のための方法、およびそのようなNK細胞を含有する組成物が提供される。NK細胞の特殊化したサブセットを同定または検出するための方法も提供される。腫瘍細胞または感染細胞などの疾患関連組織または疾患関連細胞に結合することができる抗体との併用を含む、提供される組成物を使用してがんなどの疾患および状態を処置するための方法も提供される。TIFF2023523429000027.tif79134

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2020年4月22日に出願された「NATURAL KILLER（NK）CELL COMPOSITIONS AND METHODS FOR GENERATING SAME」と題する米国仮出願第63/014,056号に基づく優先権を主張し、この仮出願の内容は参照によりその全体があらゆる目的で本明細書に組み入れられる。

配列表の参照による組入れ
本出願は電子形式の配列表と共に出願されている。配列表は、2021年4月21日に作成された776032000740SeqList.Txtという名称のファイルとして提供され、サイズは7,850バイトである。配列表の電子形式での情報は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。

分野
本開示は、ナチュラルキラー（NK）細胞の特殊化したサブセットのエクスビボでの増大のための方法およびそのようなNK細胞を含有する組成物を提供する。腫瘍細胞または感染細胞などの疾患関連組織または疾患関連細胞に結合する異ができる抗体との併用を含む、本開示の組成物を使用してがんまたはウイルス感染などの疾患および状態を処置するための方法も提供される。

背景
抗体ベースの療法は、がんおよび他の疾患の処置にしばしば用いられるようになっている。抗体療法に対する応答は、典型的には、腫瘍細胞に対するこれらの抗体の直接的阻害効果（例えば成長因子受容体の阻害とそれに続くアポトーシスの誘導）に集中していたが、これらの抗体のインビボでの効果はもっと複雑であると思われ、それには宿主免疫系が関与しうる。ナチュラルキラー（NK）細胞は、抗原保持細胞に結合した抗体のFc部分にFc受容体（CD16;FcγRIII）が結合した時に抗体依存性細胞性細胞傷害を媒介する免疫エフェクター細胞である。NK細胞は、その特別な特殊化したサブセットを含めて、治療方法において、例えば抗体療法に対する応答を改良するためなどの目的で、使用することができる。しかし、養子細胞療法などの細胞療法におけるNK細胞の応用にとって大きな障害は、ヒト末梢血におけるそれらの存在量が比較的低いことと、特定の特殊化したサブセットの表面表現型特徴がないことである。治療用途のためのNK細胞組成物を得るために、改良された方法が必要とされている。そのようなニーズを充足する態様が本明細書において提供される。

概要
FcRγ欠損NK細胞（g-NK）を増大させるための方法が本明細書において提供され、該方法は、（a）ナチュラルキラー（NK）細胞について濃縮された初代ヒト細胞の集団を得る工程であって、NK細胞について濃縮された該集団がヒト対象からの生物学的試料から選択される、工程、および（b）濃縮NK細胞の該集団を、（i）照射HLA-E+フィーダー細胞対濃縮NK細胞の比が1:10～10:1である、HLAクラスIおよびHLAクラスIIが欠損している照射HLA-E+フィーダー細胞と、（ii）少なくとも1つの組換えサイトカインがインターロイキン（IL）-2であり、少なくとも1つの組換えサイトカインがIL-21である、有効量の、NK細胞を増大させるための2種以上の組換えサイトカインとを含む培養培地において培養する工程を含み、ここで該方法により、g-NK細胞に富む増大されたNK細胞集団が産生される。

FcRγ欠損NK細胞（g-NK）を増大させるための方法が本明細書において提供され、該方法は、（a）ナチュラルキラー（NK）細胞について濃縮された初代ヒト細胞の集団を得る工程であって、NK細胞について濃縮された該集団がヒト対象からの生物学的試料から選択される、工程、および（b）濃縮NK細胞の該集団を、（i）照射HLA-E+フィーダー細胞対濃縮NK細胞の比が1:10～10:1である、HLAクラスIおよびHLAクラスIIが欠損している照射HLA-E+フィーダー細胞と、（ii）少なくとも1つの組換えサイトカインがインターロイキン（IL）-21である、有効量の、1種または複数種の組換えサイトカインとを含む培養培地において培養する工程を含み、ここで該方法により、g-NK細胞に富む増大されたNK細胞集団が産生される。

提供される態様のいずれかの一部において、対象はCMV血清陽性である。

いくつかの態様において、対象からの生物学的試料中のNK細胞におけるg-NK細胞のパーセンテージは5％超または約5％超であり、任意で、該対象は、該生物学的試料中のNK細胞におけるg-NK細胞のパーセンテージが5％超または約5％超であるということについて選択された対象である。いくつかの態様において、対象からの生物学的試料中のNK細胞におけるg-NK細胞のパーセンテージは10％超または約10％超であり、任意で、該対象は、該生物学的試料中のNK細胞におけるg-NK細胞のパーセンテージが10％超または約10％超であるということについて選択された対象である。いくつかの態様において、対象からの生物学的試料中のNK細胞におけるg-NK細胞のパーセンテージは30％超または約30％超であり、任意で、該対象は、該生物学的試料中のNK細胞におけるg-NK細胞のパーセンテージが30％超または約30％超であるということについて選択された対象である。

また、FcRγ欠損NK細胞（g-NK）を増大させるための方法が本明細書において提供され、該方法は、（a）対象からの末梢血試料中のナチュラルキラー（NK）細胞の少なくとも20％または約20％がNKG2Cについて陽性（NKG2C^pos）であり、該末梢血試料中のNK細胞の少なくとも70％がNKG2Aについて陰性または低発現（NKG2A^neg）である対象を選択する工程、（b）ナチュラルキラー（NK）細胞について濃縮された初代ヒト細胞の集団を該対象から得る工程であって、NK細胞について濃縮された該集団が、該対象からの生物学的試料から選択された、（i）CD3について陰性または低発現でありかつCD57について陽性（CD3^negCD57^pos）であるか、または（ii）CD3について陰性または低発現でありかつCD56について陽性（CD3^negCD56^pos）であるかのどちらかである細胞である、工程、および（c）照射HLA-E+フィーダー細胞対濃縮NK細胞の比が1:10～10:1である、HLAクラスIおよびHLAクラスIIが欠損している照射HLA-E+フィーダー細胞を含む培養培地において、濃縮NK細胞の該集団を培養する工程であって、該培養する工程がNK細胞の増大のための条件下にある、工程を含み、ここで該方法により、g-NK細胞に富む増大されたNK細胞集団が産生される。前記態様のいずれかの一部において、NK細胞について濃縮された集団は、生物学的試料から選択された、CD3について陰性または低発現でありかつCD57について陽性（CD3^negCD57^pos）である細胞である。前記態様のいずれかの一部において、NK細胞について濃縮された集団は、生物学的試料から選択された、CD3について陰性または低発現でありかつCD56について陽性（CD3^negCD56^pos）である細胞である。前記態様のいずれかの一部において、本方法は、増大されたNK細胞集団から、NKG2Cについて陽性（NKG2C^pos）でありかつ/またはNKG2Aについて陰性もしくは低発現（NKG2A^neg）である細胞を選択する工程を、さらに含む。

また、FcRγ欠損NK細胞（g-NK）を増大させるための方法が本明細書において提供され、該方法は、（a）ナチュラルキラー（NK）細胞について濃縮された初代ヒト細胞の集団を得る工程であって、NK細胞について濃縮された該集団が、ヒト対象からの生物学的試料から選択された、（i）CD3について陰性もしくは低発現でありかつCD57について陽性（CD3^negCD57^pos）であるか、または（ii）CD3について陰性もしくは低発現でありかつCD56について陽性（CD3^negCD56^pos）であるかのどちらかである細胞である、工程、（b）照射HAL-E+フィーダー細胞対濃縮NK細胞の比が1:10～10:1である、HLAクラスIおよびHLAクラスIIが欠損している照射HLA-E+フィーダー細胞を含む培養培地において、濃縮NK細胞の該集団を培養する工程であって、該培養する工程がNK細胞の増大のための条件下にある、工程、および（c）増大された集団から、NKG2Cについて陽性でありかつNKG2Aについて陰性もしくは低発現（NKG2C^posNKG2A^neg）であるNK細胞を選択する工程を含み、ここで該方法により、g-NK細胞に富む増大されたNK細胞集団が産生される。前記態様のいずれかの一部において、NK細胞について濃縮された集団は、NKG2Cについて陽性（NKG2C^pos）である細胞についてさらに選択された細胞である。前記態様のいずれかの一部において、NK細胞について濃縮された集団は、NKG2Aについて陰性もしくは低発現（NKG2A^neg）である細胞についてさらに選択された細胞である。前記態様のいずれかの一部において、NK細胞について濃縮された集団は、NKG2Cについて陽性でありかつNKG2Aについて陰性もしくは低発現（NKG2C^posNKG2A^neg）である細胞についてさらに選択された細胞である。

また、FcRγ欠損NK細胞（g-NK）を増大させるための方法が本明細書において提供され、該方法は、（a）ナチュラルキラー（NK）細胞について濃縮された初代ヒト細胞の集団を得る工程であって、NK細胞について濃縮された該集団が、ヒト対象からの生物学的試料から選択された、NKG2Cについて陽性（NKG2C^pos）でありかつ/またはNKG2Aについて陰性もしくは低発現（NKG2A^neg）であり、かつ（i）CD3について陰性もしくは低発現でありかつCD57について陽性（CD3^negCD57^pos）であるか、または（ii）CD3について陰性もしくは低発現でありかつCD56について陽性（CD3^negCD56^pos）であるかのどちらかである細胞である、工程、および（b）照射HLA-E+フィーダー細胞対濃縮NK細胞の比が1:10～10:1である、HLAクラスIおよびHLAクラスIIが欠損している照射HLA-E+フィーダー細胞を含む培養培地において、濃縮NK細胞の該集団を培養する工程であって、該培養する工程がNK細胞の増大のための条件下にある、工程を含み、ここで該方法により、g-NK細胞に富む増大されたNK細胞集団が産生される。いくつかの態様において、NK細胞について濃縮された集団は、生物学的試料から選択された、NKG2Cについて陽性でありかつNKG2Aについて陰性もしくは低発現（NKG2C^posNKG2A^neg）である細胞である。前記態様のいずれかの一部において、対象はCMV血清陽性である。

前記態様のいずれかの一部において、対象からの生物学的試料中のNK細胞におけるg-NK細胞のパーセンテージは5％超または約5％超であり、任意で、該対象は、該生物学的試料中のNK細胞におけるg-NK細胞のパーセンテージが5％超または約5％超であるということについて選択された対象である。前記態様のいずれかの一部において、対象からの生物学的試料中のNK細胞におけるg-NK細胞のパーセンテージは10％超または約10％超であり、任意で、該対象は、該生物学的試料中のNK細胞におけるg-NK細胞のパーセンテージが10％超または約10％超であるということについて選択された対象である。前記態様のいずれかの一部において、対象からの生物学的試料中のNK細胞におけるg-NK細胞のパーセンテージは30％超または約30％超であり、任意で、該対象は、該生物学的試料中のNK細胞におけるg-NK細胞のパーセンテージが30％超または約30％超であるということについて選択された対象である。

前記態様のいずれかの一部において、濃縮NK細胞の集団におけるg-NK細胞のパーセンテージは、20％または約20％から、90％または約90％である。前記態様のいずれかの一部において、濃縮NK細胞の集団におけるg-NK細胞のパーセンテージは、40％または約40％から、90％または約90％である。前記態様のいずれかの一部において、濃縮NK細胞の集団におけるg-NK細胞のパーセンテージは、60％または約60％から、90％または約90％である。

前記態様のいずれかの一部において、NK細胞について濃縮された集団は、生物学的試料から選択された、CD3について陰性または低発現でありかつCD57について陽性（CD3^negCD57^pos）である細胞である。前記態様のいずれかの一部において、NK細胞について濃縮された集団は、（a）前記生物学的試料から、（1）CD3について陰性もしくは低発現（CD3^neg）である細胞または（2）CD57について陽性（CD57^pos）である細胞を選択し、これにより、第1選択集団を濃縮する、選択することと、（b）該第1選択集団から、（1）CD3について陰性もしくは低発現（CD3^neg）である細胞または（2）CD57について陽性（CD57^pos）である細胞のうちのもう一方について細胞を選択し、これにより、CD3について陰性もしくは低発現でありかつCD57について陽性（CD3^negCD57^pos）である細胞について濃縮する、選択することとを含むプロセスによって、前記生物学的試料から選択され、任意で該プロセスは、前記生物学的試料から、CD3について陰性もしくは低発現（CD3^neg）である細胞を選択し、これにより、第1選択集団を濃縮する、選択することと、該第1選択集団から、CD57について陽性（CD57^pos）である細胞を選択することとを含む。

前記態様のいずれかの一部において、NK細胞について濃縮された集団は、生物学的試料から選択された、CD3について陰性または低発現でありかつCD56について陽性（CD3^negCD56^pos）である細胞である。前記態様のいずれかの一部において、NK細胞について濃縮された集団は、（a）前記生物学的試料から、（1）CD3について陰性もしくは低発現（CD3^neg）である細胞または（2）CD56について陽性（CD56^pos）である細胞を選択し、これにより、第1選択集団を濃縮する、選択することと、（b）該第1選択集団から、（1）CD3について陰性もしくは低発現（CD3^neg）である細胞または（2）CD56について陽性（CD56^pos）である細胞のうちのもう一方について細胞を選択し、これにより、CD3について陰性もしくは低発現でありかつCD56について陽性（CD3^negCD56^pos）である細胞について濃縮する、選択することとを含むプロセスによって、前記生物学的試料から選択され、任意で該プロセスは、前記生物学的試料から、CD3について陰性もしくは低発現（CD3^neg）である細胞を選択し、これにより、第1選択集団を濃縮する、選択することと、該第1選択集団から、CD56について陽性（CD56^pos）である細胞を選択することとを含む。

前記態様のいずれかの一部において、対象は、対象からの末梢血試料中に、少なくとも20％または少なくとも約20％の、NKG2Cについて陽性（NKG2C^pos）であるNK細胞を有するということについて選択された対象である。前記態様のいずれかの一部において、対象は、対象からの末梢血試料中に、少なくとも70％または少なくとも約70％の、NKG2Aについて陰性もしくは低発現（NKG2A^neg）であるNK細胞を有するということについて選択された対象である。

前記態様のいずれかの一部において、得られた濃縮NK細胞集団は、凍結された凍結保存生物学的試料であり、該凍結保存生物学的試料は、前記培養する工程に先立って解凍される。前記態様のいずれかの一部において、得られた濃縮NK細胞集団は、前記培養する工程に先立って、凍結も凍結保存もされない。

前記態様のいずれかの一部において、増大のための条件は、有効量の、1種または複数種の組換えサイトカインを含む。いくつかの態様において、前記1種または複数種の組換えサイトカインは、有効量のSCF、GSK3i、FLT3、IL-2、IL-6、IL-7、IL-15、IL-12、IL-18、IL-21、IL-27、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様において、前記1種または複数種の組換えサイトカインは、有効量のIL-2、IL-7、IL-15、IL-12、IL-18、IL-21、IL-27、またはそれらの組み合わせを含む。

前記態様のいずれかの一部において、前記1種または複数種の組換えサイトカインのうちの少なくとも1つはIL-21である。前記態様のいずれかの一部において、組換えサイトカインは、IL-2、IL-7、IL-15、IL-12、IL-18もしくはIL-27、またはそれらの組み合わせを、さらに含む。前記態様のいずれかの一部において、組換えサイトカインのうちの少なくとも1つはIL-2である。前記態様のいずれかの一部において、組換えサイトカインはIL-21およびIL-2である。前記態様のいずれかの一部において、組換えサイトカインはIL-21、IL-2およびIL-15である。前記態様のいずれかの一部において、組換えサイトカインはIL-21、IL-12、IL-15およびIL-18である。前記態様のいずれかの一部において、組換えサイトカインはIL-21、IL-2、IL-12、IL-15およびIL-18である。前記態様のいずれかの一部において、組換えサイトカインはIL-21、IL-15、IL-18およびIL-27である。前記態様のいずれかの一部において、組換えサイトカインはIL-21、IL-2、IL-15、IL-18およびIL-27である。前記態様のいずれかの一部において、組換えサイトカインはIL-2およびIL-15である。

前記態様のいずれかの一部において、組換えIL-21は、前記培養する工程の少なくとも一部分の期間中、前記培養培地に加えられ、任意で、前記培養する工程の開始時もしくはほぼ開始時に、および/または前記培養する工程の期間中に1回もしくは複数回、10ng/mLまたは約10ng/mLから、100ng/mLまたは約100ng/mLの濃度で加えられる。前記態様のいずれかの一部において、組換えIL-21は、前記培養する工程の少なくとも一部分の期間中、前記培養培地に加えられ、任意で、前記培養する工程の開始時もしくはほぼ開始時に、および/または前記培養する工程の期間中に1回もしくは複数回、25ng/mLまたは約25ng/mLの濃度で加えられる。

前記態様のいずれかの一部において、組換えIL-2は、前記培養する工程の少なくとも一部分の期間中、前記培養培地に加えられ、任意で、前記培養する工程の開始時もしくはほぼ開始時に、および/または前記培養する工程の期間中に1回もしくは複数回、10IU/mLまたは約10IU/mLから、500IU/mLまたは約500IU/mLの濃度で加えられる。前記態様のいずれかの一部において、組換えIL-2は、前記培養する工程の少なくとも一部分の期間中、前記培養培地に加えられ、任意で、前記培養する工程の開始時もしくはほぼ開始時に、および/または前記培養する工程の期間中に1回もしくは複数回、100IU/mLまたは約100IU/mLの濃度で加えられる。前記態様のいずれかの一部において、組換えIL-2は、前記培養する工程の少なくとも一部分の期間中、前記培養培地に加えられ、任意で、前記培養する工程の開始時もしくはほぼ開始時に、および/または前記培養する工程の期間中に1回もしくは複数回、500IU/mLまたは約500IU/mLの濃度で加えられる。

前記態様のいずれかの一部において、組換えIL-15は、前記培養する工程の少なくとも一部分の期間中、前記培養培地に加えられ、任意で、前記培養する工程の開始時もしくはほぼ開始時に、および/または前記培養する工程の期間中に1回もしくは複数回、1ng/mL～50ng/mLまたは約1ng/mL～50ng/mLの濃度で加えられる。前記態様のいずれかの一部において、組換えIL-15は、前記培養する工程の少なくとも一部分の期間中、前記培養培地に加えられ、任意で、前記培養する工程の開始時もしくはほぼ開始時に、および/または前記培養する工程の期間中に1回もしくは複数回、10ng/mLまたは約10ng/mLの濃度で加えられる。

前記態様のいずれかの一部において、組換えIL-12は、前記培養する工程の少なくとも一部分の期間中、前記培養培地に加えられ、任意で、前記培養する工程の開始時もしくはほぼ開始時に、および/または前記培養する工程の期間中に1回もしくは複数回、1ng/mL～50ng/mLまたは約1ng/mL～50ng/mLの濃度で加えられる。前記態様のいずれかの一部において、組換えIL-12は、前記培養する工程の少なくとも一部分の期間中、前記培養培地に加えられ、任意で、前記培養する工程の開始時もしくはほぼ開始時に、および/または前記培養する工程の期間中に1回もしくは複数回、10ng/mLまたは約10ng/mLの濃度で加えられる。

前記態様のいずれかの一部において、組換えIL-18は、前記培養する工程の少なくとも一部分の期間中、前記培養培地に加えられ、任意で、前記培養する工程の開始時もしくはほぼ開始時に、および/または前記培養する工程の期間中に1回もしくは複数回、1ng/mL～50ng/mLまたは約1ng/mL～50ng/mLの濃度で加えられる。前記態様のいずれかの一部において、組換えIL-18は、前記培養する工程の少なくとも一部分の期間中、前記培養培地に加えられ、任意で、前記培養する工程の開始時もしくはほぼ開始時に、および/または前記培養する工程の期間中に1回もしくは複数回、10ng/mLまたは約10ng/mLの濃度で加えられる。

前記態様のいずれかの一部において、組換えIL-27は、前記培養する工程の少なくとも一部分の期間中、前記培養培地に加えられ、任意で、前記培養する工程の開始時もしくはほぼ開始時に、および/または前記培養する工程の期間中に1回もしくは複数回、1ng/mL～50ng/mLまたは約1ng/mL～50ng/mLの濃度で加えられる。前記態様のいずれかの一部において、組換えIL-27は、前記培養する工程の少なくとも一部分の期間中、前記培養培地に加えられ、任意で、前記培養する工程の開始時もしくはほぼ開始時に、および/または前記培養する工程の期間中に1回もしくは複数回、10ng/mLまたは約10ng/mLの濃度で加えられる。

前記態様のいずれかの一部において、組換えサイトカインは、前記培養する工程の開始時またはほぼ開始時を始まりとして、前記培養培地に加えられる。いくつかの態様において、組換えサイトカインは、前記培養する工程の期間中、さらに1回または複数回、培養培地に加えられる。

前記態様のいずれかの一部において、本方法は、前記培養する工程の期間中、培養培地を1回または複数回交換することをさらに含む。いくつかの態様において、培養培地の交換は、前記培養する工程の継続期間にわたって2または3日ごとに、任意で最大5日間にわたる培地交換なしの初期増大後に、実行される。いくつかの態様では、培養培地の各交換時に、前記組換えサイトカインを含有する新鮮培地が加えられる。

前記態様のいずれかの一部において、組換えサイトカインはIL-21を含み、IL-21は、前記培養する工程の少なくとも一部分の期間中、抗IL-21抗体との複合体として加えられ、任意で、前記培養する工程の開始時もしくはほぼ開始時に加えられる、および/または前記培養する工程の期間中に1回もしくは複数回、加えられる。いくつかの態様では、培養する工程に先立って、抗IL-21抗体と組換えIL-21とをインキュベートしてIL-21/抗IL-21複合体を形成させ、該IL-21/抗IL-21複合体が培養培地に加えられる。いくつかの態様において、抗IL-21抗体の濃度は、100ng/mL～500ng/mLまたは約100ng/mL～500ng/mLである。前記態様のいずれかの一部において、抗IL-21抗体の濃度は250ng/mLまたは約250ng/mLである。前記態様のいずれかの一部において、組換えIL-21の濃度は、10ng/mL～100ng/mLまたは約10ng/mL～100ng/mLである。前記態様のいずれかの一部において、組換えIL-21の濃度は25ng/mLまたは約25ng/mLである。

前記態様のいずれかの一部において、ヒト対象は、CD16 158V/V NK細胞遺伝子型またはCD16 158V/F NK細胞遺伝子型を有し、任意で、前記生物学的試料は、CD16 158V/V NK細胞遺伝子型またはCD16 158V/F NK細胞遺伝子型について選択されたヒト対象に由来する。前記態様のいずれかの一部において、生物学的試料は末梢血単核球（PBMC）であるか、または末梢血単核球（PBMC）を含む。前記態様のいずれかの一部において、生物学的試料は血液試料である。前記態様のいずれかの一部において、生物学的試料はアフェレーシス試料または白血球アフェレーシス試料である。

前記態様のいずれかの一部において、生物学的試料は、凍結された凍結保存試料であり、該凍結保存試料は、前記培養する工程に先立って解凍される。前記態様のいずれかの一部において、生物学的試料は、前記培養する工程に先立って、凍結も凍結保存もされない。

前記態様のいずれかの一部において、前記選択する工程は、免疫親和性に基づく選択を含む。

前記態様のいずれかの一部において、HLA-E+フィーダー細胞はK562細胞である。いくつかの態様において、K562細胞は、膜結合型IL-15（K562-mb15）または膜結合型IL-21（K562-mb21）を発現する。前記態様のいずれかの一部において、HLA-E+フィーダー細胞は221.AEH細胞である。

前記態様のいずれかの一部において、照射HLA-E+フィーダー細胞対NK細胞の比は、1:1もしくは約1:1またはそれより大きい。前記態様のいずれかの一部において、照射HLA-E+フィーダー細胞対NK細胞の比は1:1～5:1（両端の値を含む）である。前記態様のいずれかの一部において、照射HLA-E+フィーダー細胞対濃縮NK細胞の比は1:1～3:1（両端の値を含む）である。前記態様のいずれかの一部において、照射HLA-E+フィーダー細胞対濃縮NK細胞の比は2.5:1または約2.5:1である。前記態様のいずれかの一部において、照射HLA-E+フィーダー細胞対濃縮NK細胞の比は2:1または約2:1である。前記態様のいずれかの一部において、照射HLA-E+フィーダー細胞対濃縮NK細胞の比は1:1または約1:1である。

前記態様のいずれかの一部において、濃縮NK細胞の集団は、凍結保存のために凍結された後に解凍されている。前記態様のいずれかの一部において、濃縮NK細胞の集団は、新しく単離されている、または前もって凍結および解凍されていない。

前記態様のいずれかの一部において、前記培養する工程の少なくとも一部分の期間中、前記培養培地に加えられる組換えサイトカインは、500IU/mL IL-2、10ng/mL IL-15、および25ng/mL IL-21である。

前記態様のいずれかの一部において、濃縮NK細胞の集団は、少なくとも2.0×10⁵個もしくは少なくとも約2.0×10⁵個の濃縮NK細胞、少なくとも1.0×10⁶個もしくは少なくとも約1.0×10⁶個の濃縮NK細胞、または少なくとも1.0×10⁷個もしくは少なくとも約1.0×10⁷個の濃縮NK細胞を含む。

前記態様のいずれかの一部において、濃縮NK細胞の集団は、2.0×10⁵個もしくは約2.0×10⁵個の濃縮NK細胞から、5.0×10⁷個もしくは約5.0×10⁷個の濃縮NK細胞、1.0×10⁶個もしくは約1.0×10⁶個の濃縮NK細胞から、1.0×10⁸個もしくは約1.0×10⁸個の濃縮NK細胞、1.0×10⁷個もしくは約1.0×10⁷個の濃縮NK細胞から、5.0×10⁸個もしくは約5.0×10⁸個の濃縮NK細胞、または1.0×10⁷個もしくは約1.0×10⁷個の濃縮NK細胞から、1.0×10⁹個もしくは約1.0×10⁹個の濃縮NK細胞を含む。前記態様のいずれかの一部において、前記培養する工程の開始時の濃縮NK細胞の集団は、0.05×10⁶個の濃縮NK細胞/mL～1.0×10⁶個の濃縮NK細胞/mLまたは約0.05×10⁶個の濃縮NK細胞/mL～1.0×10⁶個の濃縮NK細胞/mLの濃度である。前記態様のいずれかの一部において、前記培養する工程の開始時の濃縮NK細胞の集団は、0.05×10⁶個の濃縮NK細胞/mL～0.5×10⁶個の濃縮NK細胞/mLまたは約0.05×10⁶個の濃縮NK細胞/mL～0.5×10⁶個の濃縮NK細胞/mLの濃度である。前記態様のいずれかの一部において、前記培養する工程の開始時の濃縮NK細胞の集団は、0.2×10⁶個または約0.2×10⁶個の濃縮NK細胞/mLの濃度を含む。

前記態様のいずれかの一部において、前記培養する工程は閉鎖システムにおいて実行される。前記態様のいずれかの一部において、前記培養する工程は無菌培養バッグにおいて実行される。前記態様のいずれかの一部において、前記培養する工程はガス透過性培養容器を使って実行される。前記態様のいずれかの一部において、前記培養する工程はバイオリアクターを使って実行される。

前記態様のいずれかの一部において、前記培養する工程は、前記方法によって少なくとも2.50×10⁸個または少なくとも約2.50×10⁸個のg-NK細胞の増大が達成される時点まで実行される。前記態様のいずれかの一部において、前記培養する工程は、前記方法によって少なくとも5.00×10⁸個または少なくとも約5.00×10⁸個のg-NK細胞の増大が達成される時点まで実行される。前記態様のいずれかの一部において、前記培養する工程は、前記方法によって少なくとも1.0×10⁹個または少なくとも約1.0×10⁹個のg-NK細胞の増大が達成される時点まで実行される。前記態様のいずれかの一部において、前記培養する工程は、前記方法によって少なくとも5.0×10⁹個または少なくとも約5.0×10⁹個のg-NK細胞の増大が達成される時点まで実行される。

前記態様のいずれかの一部において、前記培養する工程は、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、15日、16日、17日、18日、19日、20日、21日、22日、23日、24日もしくは25日、または約5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、15日、16日、17日、18日、19日、20日、21日、22日、23日、24日もしくは25日、または少なくとも5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、15日、16日、17日、18日、19日、20日、21日、22日、23日、24日もしくは25日、または少なくとも約5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、15日、16日、17日、18日、19日、20日、21日、22日、23日、24日もしくは25日間にわたって実行される。前記態様のいずれかの一部において、前記培養する工程は、14日、または約14日、または少なくとも14日、または少なくとも約14日間にわたって実行される。前記態様のいずれかの一部において、前記培養する工程は、21日、または約21日、または少なくとも21日、または少なくとも約21日間にわたって実行される。

前記態様のいずれかの一部において、本方法は、前記培養する工程の終了時に、前記培養する工程の開始時と比較して増加した数のg-NK細胞を産生する。いくつかの態様において、前記増加は、100倍超もしくは約100倍超、200倍超もしくは約200倍超、300倍超もしくは約300倍超、400倍超もしくは約400倍超、500倍超もしくは約500倍超、600倍超もしくは約600倍超、700倍超もしくは約700倍超、または800倍超もしくは約800倍超である。いくつかの態様において、前記増加は1000倍超もしくは約1000倍超である。いくつかの態様において、前記増加は、2000倍超もしくは約2000倍超、3000倍超もしくは約3000倍超、または3500倍超もしくは約3500倍超である。

前記態様のいずれかの一部において、本方法は、本方法によって産生されたg-NK細胞に富む増大された集団を収集する工程をさらに含む。前記態様のいずれかの一部において、g-NK細胞に富む増大された集団のうち、該集団の50％超は、FcRγ^negである。前記態様のいずれかの一部において、g-NK細胞に富む増大された集団のうち、該集団の60％超は、FcRγ^negである。前記態様のいずれかの一部において、g-NK細胞に富む増大された集団のうち、該集団の70％超は、FcRγ^negである。前記態様のいずれかの一部において、g-NK細胞に富む増大された集団のうち、該集団の80％超は、FcRγ^negである。前記態様のいずれかの一部において、g-NK細胞に富む増大された集団のうち、該集団の90％超は、FcRγ^negである。前記態様のいずれかの一部において、g-NK細胞に富む増大された集団のうち、該集団の95％超は、FcRγ^negである。

前記態様のいずれかの一部において、g-NK細胞に富む増大された集団のうち、30％超もしくは約30％超は、NKG2Cについて陽性（NKG2C^pos）であり、および/または50％超もしくは約50％超は、NKG2Aについて陰性もしくは低発現（NKG2A^neg）である。前記態様のいずれかの一部において、g-NK細胞に富む増大された集団のうち、35％超もしくは約35％超は、NKG2Cについて陽性（NKG2C^pos）であり、および/または60％超もしくは約60％超は、NKG2Aについて陰性もしくは低発現（NKG2A^neg）である。前記態様のいずれかの一部において、g-NK細胞に富む増大された集団のうち、40％超もしくは約40％超は、NKG2Cについて陽性（NKG2C^pos）であり、および/または70％超もしくは約70％超は、NKG2Aについて陰性もしくは低発現（NKG2A^neg）である。前記態様のいずれかの一部において、g-NK細胞に富む増大された集団のうち、45％超もしくは約45％超は、NKG2Cについて陽性（NKG2C^pos）であり、および/または80％超もしくは約80％超は、NKG2Aについて陰性もしくは低発現（NKG2A^neg）である。前記態様のいずれかの一部において、g-NK細胞に富む増大された集団のうち、50％超もしくは約50％超は、NKG2Cについて陽性（NKG2C^pos）であり、および/または85％超もしくは約85％超は、NKG2Aについて陰性もしくは低発現（NKG2A^neg）である。前記態様のいずれかの一部において、g-NK細胞に富む増大された集団のうち、55％超もしくは約55％超は、NKG2Cについて陽性（NKG2C^pos）であり、および/または90％超もしくは約90％超は、NKG2Aについて陰性もしくは低発現（NKG2A^neg）である。前記態様のいずれかの一部において、g-NK細胞に富む増大された集団のうち、60％超もしくは約60％超は、NKG2Cについて陽性（NKG2C^pos）であり、および/または95％超もしくは約95％超は、NKG2Aについて陰性もしくは低発現（NKG2A^neg）である。

前記態様のいずれかの一部において、ヒト対象はCD16 158V/V NK細胞遺伝子型を有し、g-NK細胞はCD16 158V/V（V158）であるか、またはヒト対象はCD16 158V/F NK細胞遺伝子型を有し、g-NK細胞はCD16 158V/F（V158）である。

前記態様のいずれかの一部において、本方法は、g-NK細胞に富む増大された集団から、もう一つの表面マーカーNKG2C^pos、NKG2C^neg、CD16^pos、CD57^pos、CD7^dim/neg、CD161^neg、CD38^neg、または前記のいずれかの組み合わせに基づいて、細胞の集団を精製する工程を、さらに含む。いくつかの態様において、前記精製する工程は、NKG2C^posかつNKG2A^negである細胞について選択することを含む。いくつかの態様において、前記精製する工程は、CD16^pos/CD57^pos/CD7^dim/neg/CD161^negである細胞について選択する工程を含む。いくつかの態様において、前記精製する工程は、NKG2A^neg/CD161^negである細胞について選択することを含む。いくつかの態様において、前記精製する工程は、CD38^negである細胞について選択することを含む。

前記態様のいずれかの一部において、g-NK細胞に富む増大された集団のうち、g-NK細胞の70％超または約70％超は、パーフォリンについて陽性である。前記態様のいずれかの一部において、g-NK細胞に富む増大された集団のうち、g-NK細胞の80％超または約80％超は、パーフォリンについて陽性である。前記態様のいずれかの一部において、g-NK細胞に富む増大された集団のうち、g-NK細胞の85％超または約85％超は、パーフォリンについて陽性である。前記態様のいずれかの一部において、g-NK細胞に富む増大された集団のうち、g-NK細胞の90％超または約90％超は、パーフォリンについて陽性である。前記態様のいずれかの一部において、g-NK細胞に富む増大された集団のうち、g-NK細胞の70％超または約70％超は、グランザイムBについて陽性である。前記態様のいずれかの一部において、g-NK細胞に富む増大された集団のうち、g-NK細胞の80％超または約80％超は、グランザイムBについて陽性である。前記態様のいずれかの一部において、g-NK細胞に富む増大された集団のうち、g-NK細胞の85％超または約85％超は、グランザイムBについて陽性である。前記態様のいずれかの一部において、g-NK細胞に富む増大された集団のうち、g-NK細胞の90％超または約90％超は、グランザイムBについて陽性である。

前記態様のいずれかの一部において、g-NK細胞に富む増大された集団のうち、細胞の10％超は、任意でCD107aによって測定された場合に、腫瘍標的細胞に対して脱顆粒することができる。前記態様のいずれかの一部において、前記脱顆粒は前記腫瘍標的細胞に対する抗体の非存在下で測定される。任意の態様の一部において、g-NK細胞に富む増大された集団のうち、15％超もしくは約15％超、20％超もしくは約20％超、30％超もしくは約30％超、40％超もしくは約40％超、または50％超もしくは約50％超は、標的抗原を発現する細胞（標的細胞）および該標的抗原に対する抗体（抗標的抗体）の存在下、任意でCD107a発現によって測定された場合に、脱顆粒を呈する。例えば標的細胞はCD38を発現する腫瘍細胞株であることができ、抗体は抗CD38抗体（例えばダラツムマブ）である。

前記態様のいずれかの一部において、g-NK細胞に富む増大された集団のうち、細胞の10％超は、腫瘍標的細胞に対してインターフェロンγまたはTNF-αを産生することができる。前記態様のいずれかの一部において、インターフェロンγまたはTNF-αは、腫瘍標的細胞に対する抗体の非存在下で測定される。前記態様のいずれかの一部において、g-NK細胞に富む増大された集団のうち、15％超もしくは約15％超、20％超もしくは約20％超、30％超もしくは約30％超、40％超もしくは約40％超、または50％超もしくは約50％超は、標的抗原を発現する細胞（標的細胞）および該標的抗原に対する抗体（抗標的抗体）の存在下で、エフェクターサイトカインを産生する。いくつかの態様において、エフェクターサイトカインはIFN-γまたはTNF-αである。いくつかの態様において、エフェクターサイトカインはIFN-γおよびTNF-αである。いくつかの態様において、例えば、標的細胞はCD38を発現する腫瘍細胞株であることができ、抗体は抗CD38抗体（例えばダラツムマブ）である。

前記態様のいずれかの一部において、本方法は、増大された濃縮g-NK細胞集団を、薬学的に許容される賦形剤中に製剤化する工程をさらに含む。いくつかの態様において、本方法は、増大された濃縮g-NK細胞集団を、凍結保護物質を含む無血清凍結保存培地と共に製剤化する工程を含む。いくつかの態様において、凍結保護物質はDMSOである。いくつかの態様において、凍結保護物質はDMSOであり、凍結保存培地は5％～10％DMSO（v/v）であり、任意で10％または約10％DMSO（v/v）である。

また、前記態様のいずれかの方法によって産生されるg-NK細胞を含む組成物が、本明細書において提供される。

増大されたナチュラルキラー（NK）細胞の組成物が本明細書において提供され、該組成物中の細胞の少なくとも50％または少なくとも約50％はFcRγ欠損NK細胞（g-NK）であり、g-NK細胞の70％超または約70％超はパーフォリンについて陽性であり、g-NK細胞の70％超または約70％超はグランザイムBについて陽性である。いくつかの態様において、g-NK細胞の80％超または約80％超はパーフォリンについて陽性であり、g-NK細胞の80％超または約80％超はグランザイムBについて陽性である。いくつかの態様において、g-NK細胞の90％超または約90％超はパーフォリンについて陽性であり、g-NK細胞の90％超または約90％超はグランザイムBについて陽性である。いくつかの態様において、g-NK細胞の95％超または約95％超はパーフォリンについて陽性であり、g-NK細胞の95％超または約95％超はグランザイムBについて陽性である。いくつかの態様において、g-NK細胞はFcRγ^negである。

任意の態様の一部において、パーフォリンについて陽性である細胞では、細胞が、細胞内フローサイトメトリーによって測定された場合に、平均蛍光強度（MFI）に基づいて、FcRγ^posである細胞によって発現されるパーフォリンの平均レベルの少なくとも2倍または少なくとも約2倍である平均レベルのパーフォリンを発現する。任意の態様の一部において、グランザイムBについて陽性である細胞では、細胞が、細胞内フローサイトメトリーによって測定された場合に、平均蛍光強度（MFI）に基づいて、FcRγ^posである細胞によって発現されるグランザイムBの平均レベルの少なくとも2倍または少なくとも約2倍である平均レベルのグランザイムBを発現する。

任意の態様の一部において、組成物中の細胞の10％超が、任意でCD107a発現によって測定された場合に、腫瘍標的細胞に対して脱顆粒することができ、任意で、該脱顆粒は該腫瘍標的細胞に対する抗体の非存在下で測定される。任意の態様の一部において、組成物中の細胞のうち、15％超もしくは約15％超、20％超もしくは約20％超、30％超もしくは約30％超、40％超もしくは約40％超、または50％超もしくは約50％超は、標的抗原を発現する細胞（標的細胞）および該標的抗原に対する抗体（抗標的抗体）の存在下、任意でCD107a発現によって測定された場合に、脱顆粒を呈する。任意のそのような態様の一部において、組成物中の細胞の10％超は、腫瘍標的細胞に対してインターフェロンγまたはTNF-αを産生することができ、任意で、インターフェロンγまたはTNF-αは該腫瘍標的細胞に対する抗体の非存在下で測定される。いくつかの態様において、組成物中の細胞のうち、15％超もしくは約15％超、20％超もしくは約20％超、30％超もしくは約30％超、40％超もしくは約40％超、または50％超もしくは約50％超は、標的抗原を発現する細胞（標的細胞）および該標的抗原に対する抗体（抗標的抗体）の存在下で、エフェクターサイトカインを産生する。いくつかの態様において、例えば、標的細胞はCD38を発現する腫瘍細胞株であることができ、抗体は抗CD38抗体（例えばダラツムマブ）である。

増大されたナチュラルキラー（NK）細胞の組成物が本明細書において提供され、該組成物中の細胞の少なくとも50％または少なくとも約50％はFcRγ欠損（FcRγ^neg）NK細胞（g-NK）であり、該組成物中の細胞の15％超または約15％超は、標的抗原を発現する細胞（標的細胞）および該標的抗原に対する抗体（抗標的抗体）の存在下で、エフェクターサイトカインを産生する。いくつかの態様では、20％超もしくは約20％超、30％超もしくは約30％超、40％超もしくは約40％超、または50％超もしくは約50％超が、標的抗原を発現する細胞（標的細胞）および該標的抗原に対する抗体（抗標的抗体）の存在下で、エフェクターサイトカインを産生する。いくつかの態様において、例えば、標的細胞はCD38を発現する腫瘍細胞株であることができ、抗体は抗CD38抗体（例えばダラツムマブ）である。

任意の態様の一部において、エフェクターサイトカインはIFN-γまたはTNF-αである。任意の態様の一部において、エフェクターサイトカインはIFN-γおよびTNF-αである。

任意の態様の一部において、組成物中の細胞のうち、15％超もしくは約15％超、20％超もしくは約20％超、30％超もしくは約30％超、40％超もしくは約40％超、または50％超もしくは約50％超は、標的抗原を発現する細胞（標的細胞）および該標的抗原に対する抗体（抗標的抗体）の存在下、任意でCD107a発現によって測定された場合に、脱顆粒を呈する。いくつかの態様において、例えば、標的細胞はCD38を発現する腫瘍細胞株であることができ、抗体は抗CD38抗体（例えばダラツムマブ）である。

増大されたナチュラルキラー（NK）細胞の組成物が本明細書において提供され、該組成物中の細胞の少なくとも50％または少なくとも約50％はFcRγ欠損（FcRγ^neg）NK細胞（g-NK）であり、該組成物中の細胞の15％超または約15％超は、標的抗原を発現する細胞（標的細胞）および該標的抗原に対する抗体（抗標的抗体）の存在下、任意でCD107a発現によって測定された場合に、脱顆粒を呈する。いくつかの態様において、20％超もしくは約20％超、30％超もしくは約30％超、40％超もしくは約40％超、または50％超もしくは約50％超は、標的抗原を発現する細胞（標的細胞）および該標的抗原に対する抗体（抗標的抗体）の存在下、任意でCD107a発現によって測定された場合に、脱顆粒を呈する。いくつかの態様において、例えば、標的細胞はCD38を発現する腫瘍細胞株であることができ、抗体は抗CD38抗体（例えばダラツムマブ）である。

提供される態様のいずれかの一部において、組成物中の細胞の60％超または約60％超は、g-NK細胞である。提供される態様のいずれかの一部において、組成物中の細胞の70％超または約70％超は、g-NK細胞である。提供される態様のいずれかの一部において、組成物中の細胞の80％超または約80％超は、g-NK細胞である。提供される態様のいずれかの一部において、組成物中の細胞の90％超または約90％超は、g-NK細胞である。提供される態様のいずれかの一部において、組成物中の細胞の95％超または約95％超は、g-NK細胞である。

いくつかの態様において、g-NK細胞はg-NK細胞代用マーカープロファイルを呈する。いくつかの態様において、g-NK細胞代用マーカープロファイルはCD16^pos/CD57^pos/CD7^dim/neg/CD161^negである。いくつかの態様において、g-NK細胞代用マーカープロファイルはNKG2A^neg/CD161^negである。いくつかの態様において、g-NK細胞代用マーカープロファイルはCD38^negである。いくつかの態様において、g-NK細胞代用表面マーカープロファイルはさらにCD45^pos/CD3^neg/CD56^posである。

前記態様のいずれかの一部において、細胞の60％超または約60％超は、g-NK細胞である。前記態様のいずれかの一部において、細胞の70％超または約70％超は、g-NK細胞である。前記態様のいずれかの一部において、細胞の80％超または約80％超は、g-NK細胞である。前記態様のいずれかの一部において、細胞の90％超または約90％超は、g-NK細胞である。前記態様のいずれかの一部において、細胞の95％超または約95％超は、g-NK細胞である。

前記態様のいずれかの一部において、細胞の80％超または約80％超は、パーフォリンについて陽性である。前記態様のいずれかの一部において、細胞の90％超または約90％超は、パーフォリンについて陽性である。前記態様のいずれかの一部において、パーフォリンについて陽性である細胞では、細胞が、細胞内フローサイトメトリーによって測定された場合に、平均蛍光強度（MFI）に基づいて、FcRγ^posである細胞によって発現されるパーフォリンの平均レベルの少なくとも2倍または少なくとも約2倍である平均レベルのパーフォリンを発現する。

前記態様のいずれかの一部において、細胞の80％超または約80％超は、グランザイムBについて陽性である。前記態様のいずれかの一部において、細胞の90％超または約90％超は、グランザイムBについて陽性である。前記態様のいずれかの一部において、グランザイムBについて陽性である細胞では、細胞が、細胞内フローサイトメトリーによって測定された場合に、平均蛍光強度（MFI）に基づいて、FcRγ^posである細胞によって発現されるグランザイムBの平均レベルの少なくとも2倍または少なくとも約2倍である平均レベルのグランザイムBを発現する。

前記態様のいずれかの一部において、組成物は、少なくとも10⁸個または少なくとも約10⁸個の細胞を含む。前記態様のいずれかの一部において、組成物中のg-NK細胞の数は、10⁸個もしくは約10⁸個から、10¹²個もしくは約10¹²個の細胞、10⁸個もしくは約10⁸個から、10¹¹個もしくは約10¹¹個の細胞、10⁸個もしくは約10⁸個から、10¹⁰個もしくは約10¹⁰個の細胞、10⁸個もしくは約10⁸個から、10⁹個もしくは約10⁹個の細胞、10⁹個もしくは約10⁹個から、10¹²個もしくは約10¹²個の細胞、10⁹個もしくは約10⁹個から、10¹¹個もしくは約10¹¹個の細胞、10⁹個もしくは約10⁹個から、10¹⁰個もしくは約10¹⁰個の細胞、10¹⁰個もしくは約10¹⁰個から、10¹²個もしくは約10¹²個の細胞、10¹⁰個もしくは約10¹⁰個から、10¹¹個もしくは約10¹¹個の細胞、または10¹¹個もしくは約10¹¹個から、10¹²個もしくは約10¹²個の細胞である。前記態様のいずれかの一部において、組成物中のg-NK細胞の数は、5×10⁸個もしくは約5×10⁸個の細胞、1×10⁹個もしくは約1×10⁹個の細胞、5×10⁹個または約5×10⁹個の細胞、または1×10¹⁰個もしくは約1×10¹⁰個の細胞である。前記態様のいずれかの一部において、組成物の体積は、50mLまたは約50mLから、500mLまたは約500mL、任意で200mLまたは約200mLである。

前記態様のいずれかの一部において、組成物中の細胞は、同じ生物学的試料から増大された、単一ドナー対象からのものである。

前記態様のいずれかの一部において、組成物は薬学的組成物である。前記態様のいずれかの一部において、組成物は薬学的に許容される賦形剤を含む。前記態様のいずれかの一部において、組成物は、凍結保護物質を含む無血清凍結保存培地中に製剤化される。いくつかの態様において、凍結保護物質はDMSOであり、凍結保存培地は5％～10％DMSO（v/v）である。いくつかの態様において、凍結保護物質は10％または約10％DMSO（v/v）である。前記態様のいずれかの一部において、組成物は無菌である。

前記態様のいずれかの組成物を含む無菌バッグが、本明細書において提供される。いくつかの態様において、バッグは凍結保存適合バッグである。

前記態様のいずれかの組成物を含むキットが、本明細書において提供される。いくつかの態様において、キットは、疾患または状態を処置するための単独療法として前記組成物を投与することに関する説明書を、さらに含む。いくつかの態様において、キットは、疾患または状態を処置するための追加の作用物質をさらに含む。

前記態様のいずれかの一部において、疾患または状態は、炎症状態、感染症、およびがんからなる群より選択される。前記態様のいずれかの一部において、疾患または状態は感染症であり、感染症はウイルスまたは細菌によって引き起こされる。いくつかの態様において、感染症はウイルスによって引き起こされる。いくつかの態様において、ウイルスはRNAウイルス、任意でコロナウイルスである。いくつかの態様において、ウイルスはDNAウイルスである。いくつかの態様において、ウイルスはSARS-CoV-2であり、感染症はCOVID-19である。

前記態様のいずれかの一部において、追加の作用物質は、ウイルスに対する抗体を含有する血清である。前記態様のいずれかの一部において、血清は、ウイルスが引き起こす感染症から回復している患者からの回復期血清である。前記態様のいずれかの一部において、追加の作用物質は、抗体またはFc融合タンパク質、任意で組換えACE2-Fc融合タンパク質である。

前記態様のいずれかの一部において、疾患または状態はがんであり、がんは白血病、リンパ腫、または骨髄腫である。前記態様のいずれかの一部において、疾患または状態はがんであり、がんは固形腫瘍を含む。いくつかの態様において、がんは、胃または胃食道接合部の腺癌、膀胱がん、乳がん、脳のがん、子宮頸がん、結腸直腸がん、内分泌/神経内分泌がん、頭頸部がん、消化管間質がん、骨巨細胞腫、腎がん、肝がん、肺がん、神経芽細胞腫、卵巣上皮/卵管/原発性腹膜がん、膵がん、前立腺がん、皮膚がん、および軟部組織癌の中から選択される。

いくつかの態様において、追加の作用物質は抗体またはFc融合タンパク質である。前記態様のいずれかの一部において、追加の作用物質は、腫瘍関連抗原を認識するかまたはそれに特異的に結合する抗体である。前記態様のいずれかの一部において、抗体は、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD52、CD56、CD70、CD74、CD140、EpCAM、CEA、gpA33、メソテリン、α-フェトプロテイン、ムチン、PDGFR-α、TAG-72、CAIX、PSMA、葉酸結合タンパク質、細胞分散因子（scatter factor）受容体キナーゼ、ガングリオシド、サイトケライン（cytokerain）、frizzled受容体、VEGF、VEGFR、インテグリンαVβ3、インテグリンα5β1、EGFR、EGFL7、ERBB2（HER2）、ERBB3、フィブロネクチン、HGF、HER3、LOXL2、MET、IGF1R、IGLF2、EPHA3、FR-α、ホスファチジルセリン、シンデカン1、SLAMF7（CD319）、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP、ビメンチン、またはテネイシンを認識するかまたはそれに結合する。前記態様のいずれかの一部において、キットは、細胞毒性作用物質またはがん治療薬をさらに含む。

前記態様のいずれかの一部において、追加の作用物質は細胞毒性作用物質またはがん治療薬である。前記態様のいずれかの一部において、追加の作用物質は腫瘍溶解性ウイルスである。前記態様のいずれかの一部において、追加の作用物質は、免疫細胞上の活性化受容体に特異的に結合する少なくとも1つの結合ドメインと腫瘍関連抗原に特異的に結合する少なくとも1つの結合ドメインとを含む二重特異性抗体である。いくつかの態様において、免疫細胞はNK細胞である。前記態様のいずれかの一部において、活性化受容体はCD16（CD16a）である。前記態様のいずれかの一部において、腫瘍関連抗原は、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD52、CD56、CD70、CD74、CD140、EpCAM、CEA、gpA33、メソテリン、α-フェトプロテイン、ムチン、PDGFR-α、TAG-72、CAIX、PSMA、葉酸結合タンパク質、細胞分散因子受容体キナーゼ、ガングリオシド、サイトケライン、frizzled受容体、VEGF、VEGFR、インテグリンαVβ3、インテグリンα5β1、EGFR、EGFL7、ERBB2（HER2）、ERBB3、フィブロネクチン、HGF、HER3、LOXL2、MET、IGF1R、IGLF2、EPHA3、FR-α、ホスファチジルセリン、シンデカン1、SLAMF7（CD319）、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP、ビメンチン、またはテネイシンである。

前記態様のいずれかのキットを含む製造品が本明細書において提供される。

前記態様のいずれかの組成物を、その必要がある個体に投与する工程を含む、疾患または状態を処置する方法が、本明細書において提供される。また、対象における疾患または状態を処置するのに使用するための、本明細書において提供される薬学的組成物のいずれかも、本明細書において提供される。また、対象における疾患または状態を処置するための医薬の製造における、本明細書において提供される薬学的組成物のいずれかの使用も、本明細書において提供される。

いくつかの態様において、疾患または状態は、炎症状態、感染症、およびがんからなる群より選択される。いくつかの態様において、疾患または状態は感染症であり、感染症はウイルスまたは細菌によって引き起こされる。いくつかの態様において、感染症はウイルスによって引き起こされる。いくつかの態様において、ウイルスはDNAウイルスである。いくつかの態様において、ウイルスはRNAウイルスである。いくつかの態様において、ウイルスはコロナウイルスである。いくつかの態様において、コロナウイルスはSARS-CoV-2であり、感染症はCOVID-19である。

いくつかの態様において、疾患または状態はがんであり、がんは白血病、リンパ腫、または骨髄腫である。いくつかの態様において、疾患または状態はがんであり、がんは固形腫瘍を含む。いくつかの態様において、がんは、胃または胃食道接合部の腺癌、膀胱がん、乳がん、脳のがん、子宮頸がん、結腸直腸がん、内分泌/神経内分泌がん、頭頸部がん、消化管間質がん、骨巨細胞腫、腎がん、肝がん、肺がん、神経芽細胞腫、卵巣上皮/卵管/原発性腹膜がん、膵がん、前立腺がん、皮膚がん、および軟部組織癌の中から選択される。

前記態様のいずれかの一部において、組成物は単独療法として投与される。提供される態様のいずれかの一部において、本方法は、疾患または状態を処置するために追加の作用物質を個体に投与する工程を、さらに含む。

いくつかの態様において、疾患または状態はウイルスであり、追加の作用物質は、ウイルスに対する抗体を含有する血清である。いくつかの態様において、血清は、ウイルスが引き起こす感染症から回復している患者からの回復期血清である。

いくつかの態様において、追加の作用物質は抗体またはFc融合タンパク質である。いくつかの態様において、抗体はFcドメインを含みかつ/または完全長抗体である。いくつかの態様において、疾患または状態はウイルスであり、追加の作用物質は組換えACE2-Fc融合タンパク質である。いくつかの態様において、疾患または状態はがんであり、抗体はがんに関連する腫瘍抗原を認識する。いくつかの態様において、抗体は、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD52、CD56、CD70、CD74、CD140、EpCAM、CEA、gpA33、メソテリン、α-フェトプロテイン、ムチン、PDGFR-α、TAG-72、CAIX、PSMA、葉酸結合タンパク質、細胞分散因子受容体キナーゼ、ガングリオシド、サイトケライン、frizzled受容体、VEGF、VEGFR、インテグリンαVβ3、インテグリンα5β1、EGFR、EGFL7、ERBB2（HER2）、ERBB3、フィブロネクチン、HGF、HER3、LOXL2、MET、IGF1R、IGLF2、EPHA3、FR-α、ホスファチジルセリン、シンデカン1、SLAMF7（CD319）、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP、ビメンチンもしくはテネイシンを認識するかまたはそれに特異的に結合する。

いくつかの態様において、追加の作用物質は腫瘍溶解性ウイルスである。いくつかの態様において、追加の作用物質は、免疫細胞上の活性化受容体に特異的に結合する少なくとも1つの結合ドメインと腫瘍関連抗原に特異的に結合する少なくとも1つの結合ドメインとを含む二重特異性抗体である。いくつかの態様において、免疫細胞はマクロファージである。いくつかの態様において、免疫細胞はNK細胞である。前記態様のいずれかの一部において、活性化受容体はCD16（CD16a）である。前記態様のいずれかの一部において、腫瘍関連抗原は、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD52、CD56、CD70、CD74、CD140、EpCAM、CEA、gpA33、メソテリン、α-フェトプロテイン、ムチン、PDGFR-α、TAG-72、CAIX、PSMA、葉酸結合タンパク質、細胞分散因子受容体キナーゼ、ガングリオシド、サイトケライン、frizzled受容体、VEGF、VEGFR、インテグリンαVβ3、インテグリンα5β1、EGFR、EGFL7、ERBB2（HER2）、ERBB3、フィブロネクチン、HGF、HER3、LOXL2、MET、IGF1R、IGLF2、EPHA3、FR-α、ホスファチジルセリン、シンデカン1、SLAMF7（CD319）、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP、ビメンチン、またはテネイシンである。前記態様のいずれかの一部において、本方法は、疾患または状態を処置するためにがん治療薬または細胞毒性作用物質を対象に投与する工程を、さらに含む。

前記態様のいずれかの一部において、本方法は、1×10⁵個または約1×10⁵個のNK細胞/kgから、1×10⁷個または約1×10⁷個のNK細胞/kgを、個体に投与する工程を含む。前記態様のいずれかの一部において、本方法は、5×10⁷個または約5×10⁷個のNK細胞から、10×10⁹個または約10×10⁹個のNK細胞を、個体に投与する工程を含む。前記態様のいずれかの一部において、個体はヒトである。前記態様のいずれかの一部において、組成物中のNK細胞は個体にとって同種異系である。前記態様のいずれかの一部において、組成物中のNK細胞は対象にとって自家である。

代用細胞外表面表現型CD45^pos/CD3^neg/CD56^pos/CD16^pos/CD57^pos/CD7^dim/neg/CD161^negまたはCD45^pos/CD3^neg/CD56^pos/NKG2A^neg/CD161^negのどちらか一方を有する細胞サブセット内のg-NK（CD45^pos/CD3^neg/CD56^pos/FcRγ^neg）のパーセンテージを表している。値は平均±標準誤差である。図2Aは、実施例2に記載するような、CD3枯渇とそれに続くCD57濃縮を伴う例示的増大プロトコールのフロー図である。この概略図では、増大相中に、照射221.AEH細胞だけでなく、照射PBMCもフィーダー細胞として含めることができる。図2Bおよび2Cは、CMV^posドナーからの末梢血単核球から単離された濃縮NK細胞からのg-NKの増大を表している。示されている結果はすべて、さまざまな方法で濃縮された新鮮NK細胞からの14日間の増大によるものである。ただし、CD3枯渇によって濃縮された解凍NK細胞は例外で、21日間の増大が実行された。図2Bは、実施例2に記載のさまざまな方法による増大後のg-NK細胞の総数を表している。図2Cは、実施例2に記載のさまざまな方法による増大の前および後のg-NK細胞のパーセンテージを表している。値は平均±標準誤差である。CMV^posCD3^neg/CD57^pos14日間増大対他の増大の比較について、＃p＜0.001。CMV^pos増大対CMV^negCD3^neg14日間増大の比較について、＊p＜0.05。増大後の値対増大前の値について、＾p＜0.001。図2Dおよび2Eは、CMV^posドナーからの末梢血単核球から単離された濃縮NK細胞からのg-NKの増大を表している。示されている結果はすべて、さまざまな方法で濃縮された新鮮NK細胞またはCD3枯渇によって濃縮された解凍NK細胞の14日間の増大によるものである。図2Dは、実施例2に記載のさまざまな方法による増大後のg-NK細胞の総数を表している。図2Eは、実施例2に記載のさまざまな方法による増大の前および後のg-NK細胞のパーセンテージを表している。値は平均±標準誤差である。CMV^posCD3^neg/CD57^pos14日間増大対他の増大の比較について、＃p＜0.001。CMV^pos増大対CMV^negCD3^neg14日間増大の比較について、＊p＜0.05。増大後の値対増大前の値について、＾p＜0.001。図2Aの説明を参照のこと。図2Aの説明を参照のこと。図2Aの説明を参照のこと。図2Aの説明を参照のこと。 CD3^negCD57^posNK細胞の濃縮を伴う実施例2に記載の方法または代替法によって増大されたNK細胞の、221.AEH細胞株およびK562細胞株（n＝8）に対するNK細胞の細胞傷害活性（5:1のNK細胞対標的比）を表している。値は平均±標準誤差である。CD3^neg/CD57^pos増大対代替法の比較について、＃p＜0.001。図4Aおよび4Bは、リンパ腫細胞株RAJIに対する、抗CD20抗体（リツキシマブ）と組み合わされたg-NK細胞のADCC活性を通常型（conventional）NK細胞と比較して表している。図4Aは、高g-NKであるドナー中の濃縮CD3^negCD57^pos細胞から出発するプロセスによって増大されたg-NK細胞のADCC活性を、g-NK比率が低いドナーと比較して示している（n＝4）。図4Bは、同じドナー（n＝4）からの新鮮NK細胞または前もって凍結（および解凍）されたNK細胞から増大されたg-NK細胞、通常型NK細胞（cNK）およびNKG2C^pos（適応型）NK細胞のADCC（1:1のNK細胞対標的比）活性を示している。値は平均±標準誤差である。g-NK細胞とcNK細胞との比較について、＊p＜0.05、＊＊p＜0.01、および＊＊＊p＜0.001。図5Aおよび5Bは、g-NK細胞のADCC活性を、通常型（cNK）NK細胞と比較して表している。図5Aは、乳がん細胞株SKBR3に対する、抗HER2（トラスツズマブ）と組み合わされたg-NK細胞およびcNK細胞のADCC活性を示している。図5Bは、頭頸部がん細胞株CAL27に対する、抗EGFR（セツキシマブ）と組み合わされたg-NK細胞およびcNK細胞のADCC活性を示している。値は平均±SEである。g-NK細胞とcNK細胞との比較について、＊p＜0.05および＊＊＊p＜0.001。図5Aの説明を参照のこと。図6A～6Cは、g-NK細胞のADCC活性を通常型NK細胞（cNK）と比較して表している。図6Aは、結腸直腸がん細胞株HT29に対する、抗EGFR（セツキシマブ）と組み合わされたg-NK細胞およびcNK細胞のADCC活性を示している。図6Bは、結腸直腸がん細胞株SW480に対する、抗EGFR（セツキシマブ）と組み合わされたg-NK細胞およびcNK細胞のADCC活性を示している。図6Cは、肺がん細胞株A549に対する、抗EGFR（セツキシマブ）と組み合わされたg-NK細胞およびcNK細胞のADCC活性を示している。値は平均±SEである。g-NK細胞とcNK細胞との比較について、＊p＜0.05、＊＊p＜0.01、および＊＊＊p＜0.001。g-NK細胞とcNK細胞との比較について、＊p＜0.05、＊＊p＜0.01、および＊＊＊p＜0.001。図6Aの説明を参照のこと。図6Aの説明を参照のこと。図7A～7Cは、1×10⁷個のg-NK細胞またはcNK細胞を注入した後の、NSGマウスにおけるg-NK（新鮮または凍結）およびcNK（凍結）の持続性を表している。図7Aは、注入後5、8、14、15および22日目にNSGマウスの全血中に存在するヒトNK細胞の数を示している。図7Bは、NK細胞注入の22日後にNSGマウスの脾臓中に存在するヒトNK細胞の数を示している。図7Cは、NK細胞注入の22日後にNSGマウスの骨髄中に存在するヒトNK細胞の数を示している。3つのアーム（arm）はいずれもN＝3である。値は平均±SEである。g-NK細胞とcNK細胞との比較について、＃p＜0.001および＊p＜0.05。図7Aの説明を参照のこと。図7Aの説明を参照のこと。図8Aおよび8Bは、リンパ腫の異種移植片モデルにおける腫瘍量および生存率に対するg-NKおよびリツキシマブの効果を表している。図8Aは、NSGマウスにおいて生物ルミネセンス（BLI）によって測定されるRaji腫瘍量に対するg-NKおよびリツキシマブによる処置の効果（リツキシマブ＋g-NK）を、無処置のマウスまたはリツキシマブのみで処置したマウスとの比較で示している。値は平均±SEである。図8Bは、Raji接種NSGマウスにおける生存率に対するg-NKおよびリツキシマブによる処置の効果（リツキシマブ＋g-NK）を、無処置のマウスまたはリツキシマブのみで処置したマウスとの比較で示している。どのアームもN＝8である。g-NK＋リツキシマブ群対無処置群の比較について、＊p＜0.05、およびg-NK＋リツキシマブ群対リツキシマブのみの群の比較について、＃p＜0.05。図8Aの説明を参照のこと。図9Aおよび9Bは、g-NK細胞のADCC活性を通常型NK細胞（cNK）と比較して表している。図9Aは、多発性骨髄腫細胞株MM.1S（n＝16）に対する、抗CD38（ダラツムマブ;Dara）または抗SLAMF7（エロツズマブ;Elo）と組み合わされた新鮮単離g-NK細胞およびcNK細胞のADCC活性を示している。図9Bは、多発性骨髄腫細胞株MM.1S（n＝5）に対する、抗CD38（ダラツムマブ;Dara）または抗SLAMF7（エロツズマブ;Elo）と組み合わされた増大されたg-NK細胞およびcNK細胞のADCC活性を示している。値は平均±SEである。g-NK細胞とcNK細胞との比較について、＃p＜0.001。g-NK細胞とcNK細胞との比較について、＊＊p＜0.01および＊＊＊p＜0.001。図9Aの説明を参照のこと。図10Aおよび10Bは、多発性骨髄腫の異種移植片モデルにおける、ダラツムマブ（Dara）およびエロトズマブ（elotozumab）（Elo）のインビボでの効力に対するg-NKの効果を表している。図10Aは、NSGマウスにおけるMM.1S腫瘍量（BLI）に対するg-NKおよびダラツムマブによる処置の効果（Dara＋g-NK）を、無処置のマウスまたはcNKおよびダラツムマブ（Dara＋cNK）、Daraのみ、ビヒクル、もしくはg-NKのみで処置されたマウスとの比較で示している。図10Bは、NSGマウスにおけるMM.1S腫瘍量（BLI）に対するg-NKおよびエロツズマブによる処置の効果（Elo＋g-NK）を、無処置のマウスまたはcNKおよびエロツズマブ（Elo＋cNK）、Eloのみ、ビヒクル、もしくはg-NKのみで処置されたマウスとの比較で示している。どのアームもN＝6である。値は平均±SEである。g-NK＋ダラツムマブまたはg-NK＋エロツズマブと他のすべての群との比較について、＊p＜0.05および＊＊＊p＜0.001。図11Aおよび11Bは、ダラツムマブ（Dara）またはエロツズマブ（Elo）で処置されたMM.1S接種NSGマウスの生存率に対するg-NKの効果を表している。図11Aは、MM.1S接種NSGマウスにおける生存率に対するg-NKおよびダラツムマブによる処置の効果（Dara＋g-NK）を、無処置のマウスまたはcNKおよびダラツムマブ（Dara＋cNK）、Daraのみ、ビヒクル、もしくはg-NKのみで処置されたマウスとの比較で示している。図11Bは、MM.1S接種NSGマウスにおける生存率に対するg-NKおよびエロツズマブによる処置の効果（Elo＋g-NK）を、無処置のマウスまたはcNKおよびエロツズマブ（Elo＋cNK）、Eloのみ、ビヒクル、もしくはg-NKのみで処置されたマウスとの比較で示している。どのアームもN＝6である。図12A～12Cは、多発性骨髄腫の異種移植片モデルにおいて、ダラツムマブ（dara）またはエロツズマブ（elo）と組み合わせた場合の、g-NKおよびcNKの持続性ならびに骨髄および脾臓へのホーミングを表している。図12Aは、ダラツムマブまたはエロツズマブで処置されたMM.1S接種NSGマウスの脾臓におけるg-NKおよびcNKの数を示している。図12Bは、ダラツムマブまたはエロツズマブで処置されたMM.1S接種NSGマウスの骨髄におけるg-NKおよびcNKの数を示している。図12Cは、ダラツムマブまたはエロツズマブで処置されたMM.1S接種NSGマウスの血液におけるg-NKおよびcNKの数を示している。どのアームもN＝6である。値は平均±SEである。g-NK＋ダラツムマブ群対他のすべての群の比較について、＃p＜0.001。cNK＋エロツズマブ群との比較について、＊p＜0.05。g-NKのみの群対他のすべての群の比較について、＾p＜0.001。図12Aの説明を参照のこと。図12Aの説明を参照のこと。図13A～13Dは、g-NKおよびcNKにおけるCD20（リツキシマブの標的）、CD38（ダラツムマブの標的）およびSLAMF7（エロツズマブの標的）の発現を表している。図13Aは、CD20を発現する増大されたg-NK細胞、非増大NK細胞（CD3^neg/CD56^pos）およびMM.1S細胞のパーセンテージを示している。図13Bは、CD38を発現する増大されたg-NK細胞、非増大NK細胞（CD3^neg/CD56^pos）およびMM.1S細胞のパーセンテージを示している。図13Cは、SLAMF7を発現する増大されたg-NK細胞、非増大NK細胞（CD3^neg/CD56^pos）およびMM.1S細胞のパーセンテージを示している。図13Dは、増大前および増大後にCD38を発現するcNKおよびg-NKのパーセンテージを示している。どのアームもN＝3である。図13Eは、増大前および増大後のCD38^posNK細胞（n＝4）について平均強度（MFI）を表している。図13Fは、cNK細胞およびMM.1S細胞との比較で低減している、g-NK細胞のCD38発現を表す代表的ヒストグラムである。値は平均±SEである。g-NK細胞対他のすべての細胞の比較について、＃p＜0.001。図13Aの説明を参照のこと。図13Aの説明を参照のこと。図13Aの説明を参照のこと。図13Aの説明を参照のこと。図13Aの説明を参照のこと。図14A～14Cはg-NK細胞のADCC活性を通常型NK細胞（cNK）と比較して表している。図14Aは、卵巣がん細胞株SKOV3（n＝16）に対する、抗Her2（トラスツズマブ;Tras）と組み合わされた新鮮単離g-NKおよびcNK細胞のADCC活性を示している。図14Bは、卵巣がん細胞株SKOV3（n＝5）に対する、抗Her2（トラスツズマブ;Tras）と組み合わされた増大されたg-NKおよびcNK細胞のADCC活性を示している。図14Cは、卵巣がん細胞株SKOV3（n＝4）に対する、抗EGFR（セツキシマブ）と組み合わされた増大されたg-NKおよびcNK細胞のADCC活性を示している。値は平均±SEである。g-NK＋トラスツズマブまたはg-NK＋セツキシマブと他のすべての群との比較について、＊p＜0.05および＊＊＊p＜0.001。g-NKとcNKとの比較について、＊p＜0.05、＊＊p＜0.01、および＊＊＊p＜0.001。図14Aの説明を参照のこと。図14Aの説明を参照のこと。図15A～15Cは、卵巣がんの異種移植片モデルにおける、トラスツズマブ（Tras）のインビボでの効力に対するg-NKの効果を表している。図15Aは、NSGマウスにおけるSKOV3腫瘍量に対するg-NKおよびトラスツズマブによる処置の効果（Tras＋g-NK）を、トラスツズマブのみで処置したマウス（Trasのみ）との比較で示している。図15Bは、SKOV3接種NSGマウスにおける生存率に対するg-NKおよびトラスツズマブによる処置の効果（Tras＋g-NK）を、cNKおよびトラスツズマブで処置したマウス（Tras＋cNK）との比較で示している。どのアームもN＝10である。図15Cは、SKOV3接種NSGマウスにおける生存率に対するg-NKおよびトラスツズマブによる処置の効果（Tras＋g-NK）を、cNKおよびトラスツズマブ（Tras＋cNK）、Trasのみ、またはビヒクルで処置したマウスとの比較で示している。図15Aの説明を参照のこと。図15Aの説明を参照のこと。図16A～16Cは、卵巣がんの異種移植片モデルにおける、トラスツズマブと組み合わせた場合のg-NKおよびcNKの持続性を表している。図16Aは、トラスツズマブで処置されたSKOV3接種NSGマウスの血液におけるg-NKおよびcNKの数を示している。図16Bは、トラスツズマブで処置されたSKOV3接種NSGマウスの脾臓におけるg-NKおよびcNKの数を示している。図16Cは、トラスツズマブで処置されたSKOV3接種NSGマウスの骨髄におけるg-NKおよびcNKの数を示している。どのアームもN＝6である。値は平均±SEである。g-NK対cNK細胞の比較について、＃p＜0.05。図16Aの説明を参照のこと。図16Aの説明を参照のこと。図17Aおよび17Bは、g-NK細胞のADCC活性を通常型NK細胞（cNK）と比較して表している。図17Aは、多発性骨髄腫細胞株ARH-77（n＝4）に対する、抗CD38（ダラツムマブ;Dara）と組み合わされた増大されたg-NKおよびcNK細胞のADCC活性を示している。図17Bは、多発性骨髄腫細胞株MM.1R（n＝4）に対する、抗CD38（ダラツムマブ;Dara）と組み合わされた増大されたg-NKおよびcNK細胞のADCC活性を示している。値は平均±SEである。g-NK対cNK細胞の比較について、＊p＜0.05および＊＊＊p＜0.001。図17Aの説明を参照のこと。図18Aおよび18Bは、g-NK細胞のADCC活性を通常型NK細胞（cNK）と比較して表している。図18Aは、結腸直腸がん細胞株SW-480（n＝16）に対する、抗EGFR（セツキシマブ;Cet）と組み合わされた新鮮単離g-NK細胞およびcNK細胞のADCC活性を示している。図18Bは、結腸直腸がん細胞株SW-480（n＝5）に対する、抗EGFR（セツキシマブ）と組み合わされた増大されたg-NK細胞およびcNK細胞のADCC活性を示している。値は平均±SEである。g-NK対cNK細胞の比較について、＃p＜0.05。図18Aの説明を参照のこと。 SW-480（セツキシマブ、Cetによる）、SKOV3（トラスツズマブ、Trasまたはセツキシマブ、Cetによる）、およびMM.1S細胞（ダラツムマブ、Daraまたはエロツズマブ、Eloによる）に対するADCCを、cNK（n＝4）、g-NK（n＝7）およびCD16 158V g-NK細胞（n＝5）の間で比較している。値は平均±SEである。g-NKまたは158V g-NK細胞対cNK細胞の比較について、＃p＜0.05。158V g-NK対g-NK細胞の比較について、＾p＜0.05。図20A～20Dは、g-NK細胞によるCD16遺伝子の発現と多発性骨髄腫細胞株および固形腫瘍細胞株に対するADCCとの関係を表している。図20Aは、g-NKのCD16発現とMM.1S細胞（ダラツムマブ、Daraによる）に対するADCCとの間の正の相関を示している。図20Bは、g-NKのCD16発現とMM.1S細胞（エロツズマブ、Eloによる）に対するADCCとの間の正の相関を示している。図20Cは、g-NKのCD16発現と卵巣がんSKOV3（トラスツズマブ、Trasによる）に対するADCCとの間の正の相関を示している。図20Dは、g-NKのCD16発現と結腸直腸がんSW-480細胞株（セツキシマブ、Cetによる）に対するADCCとの間の正の相関を示している。N＝4 g-NK細胞株。図20Aの説明を参照のこと。図20Aの説明を参照のこと。図20Aの説明を参照のこと。図21Aおよび図21Bは、6種の多発性骨髄腫（MM）細胞株（AM01、KMS11、KMS18、KMS34、LP1、およびMM.1S）におけるCD38（図21A）およびSLAMF（図21B）の発現レベルを表している。図22A～22Eは、6種のMM細胞株に対するg-NK細胞の細胞傷害活性を、通常型NK細胞と比較して表している。図22Aは、ダラツムマブと組み合わされたg-NKおよび通常型NK細胞の細胞傷害活性を、CD38の発現が増加する順にMM細胞株を並べて示している。図22Bは、エロツズマブと組み合わされたg-NKおよび通常型NK細胞の細胞傷害活性を、SLAMF7の発現が増加する順にMM細胞株を並べて示している。図22Cは、MM細胞株のCD38発現とg-NK細胞におけるダラツムマブ媒介性細胞傷害活性との間の関係を示している。図22Dは、MM細胞株のSLAMF7発現とg-NK細胞におけるエロツズマブ媒介性細胞傷害活性との間の関係を示している。図22Eは、g-NK細胞におけるダラツムマブ媒介性細胞傷害活性とエロツズマブ媒介性細胞傷害活性とを比較している。値は平均±SEである。g-NK対cNK細胞の比較について、＃p＜0.001。g-NK＋ダラツムマブまたはg-NK＋エロツズマブ対g-NKのみの比較について、＾p＜0.001、およびg-NK＋ダラツムマブ対g-NK＋エロツズマブの比較について、＆p＜0.05。図22F～Gは、ダラツムマブ（図22F）またはエロツズマブ（図22G）のどちらかと組み合わせた場合の、患者由来骨髄腫細胞に対する増大されたg-NK細胞の細胞傷害性を、cNK細胞と比較して表している。図22-1の説明を参照のこと。図22-1の説明を参照のこと。図23A～23Eは、6種のMM細胞株に対するg-NK細胞の脱顆粒レベル（CD107a^pos）を、通常型NK細胞と比較して表している。値は平均±SEである。g-NK対cNK細胞の比較について、＃p＜0.01。g-NK＋ダラツムマブまたはg-NK＋エロツズマブ対g-NKのみの比較について、＾p＜0.01。g-NK＋ダラツムマブ対g-NK＋エロツズマブの比較について、＆p＜0.05。図23Aは、ダラツムマブと組み合わされたg-NKおよび通常型NK細胞の脱顆粒レベルを、CD38の発現が増加する順にMM細胞株を並べて示している。図23Bは、エロツズマブと組み合わされたg-NKおよび通常型NK細胞の脱顆粒レベルを、SALMF7の発現が増加する順にMM細胞株を並べて示している。図23Cは、MM細胞株のCD38発現とg-NK細胞におけるダラツムマブ媒介性脱顆粒レベルとの間の関係を示している。図23Dは、MM細胞株のSLAMF7発現とg-NK細胞におけるエロツズマブ媒介性脱顆粒レベルとの間の関係を示している。図23Eは、g-NK細胞におけるダラツムマブ媒介性脱顆粒レベルとエロツズマブ媒介性脱顆粒レベルとを比較している。図23Fおよび図23Gは、NKG2C^pos/NKG2A^negg-NK細胞の脱顆粒レベル（CD107a^pos）を、NKG2C^neg/NKG2A^posg-NK細胞と比較して表している。値は平均±SEである。NKG2C^pos/NKG2A^negg-NK細胞対NKG2C^neg/NKG2A^posg-NK細胞の比較について、＃p＜0.05。図23Fは、ダラツムマブと組み合わされたg-NK細胞の脱顆粒レベルを、CD38の発現が増加する順にMM細胞株を並べて示している。図23Gは、エロツズマブと組み合わされたg-NK細胞の脱顆粒レベルを、SLAMF7の発現が増加する順にMM細胞株を並べて示している。図23-1の説明を参照のこと。図23-1の説明を参照のこと。図24Aおよび図24Bは、g-NK細胞におけるパーフォリンおよびグランザイムBの発現のレベルを、通常型NK細胞と比較して表している。値は平均±SEである。g-NK対cNK細胞の比較について、＃p＜0.05。図24Aは、パーフォリンおよびグランザイムBの発現をNK細胞のパーセンテージとして示している。図24Bは、パーフォリンおよびグランザイムBの総発現量を示している。図25A～25Eは、6種のMM細胞株に対するg-NK細胞のインターフェロンγ発現レベルを、通常型NK細胞と比較して表している。値は平均±SEである。g-NK対cNK細胞の比較について、＃p＜0.05。g-NK＋ダラツムマブまたはg-NK＋エロツズマブ対g-NKのみの比較について、＾p＜0.05。g-NK＋ダラツムマブ対g-NK＋エロツズマブの比較について、＆p＜0.05。図25Aは、ダラツムマブと組み合わされたg-NKおよび通常型NK細胞のインターフェロンγ発現レベルを、CD38の発現が増加する順にMM細胞株を並べて示している。図25Bは、エロツズマブと組み合わされたg-NKおよび通常型NK細胞のインターフェロンγ発現レベルを、SLAMF7の発現が増加する順にMM細胞株を並べて示している。図25Cは、MM細胞株のCD38発現とg-NK細胞におけるダラツムマブ媒介性インターフェロンγ発現レベルとの間の関係を示している。図25Dは、MM細胞株のSLAMF7発現とg-NK細胞におけるエロツズマブ媒介性インターフェロンγ発現レベルとの間の関係を示している。図25Eは、g-NK細胞におけるダラツムマブ媒介性インターフェロンγ発現レベルとエロツズマブ媒介性インターフェロンγ発現レベルとを比較している。図25Fは、6時間のインキュベーション後のg-NKおよびcNK細胞について、1μg/mLダラツムマブの存在下でLP1細胞株（1:1 E:T）に応答して起こるインターフェロンγ発現の代表的フロープロットである。図25Gおよび図25Hは、NKG2C^pos/NKG2A^negg-NK細胞のインターフェロンγ発現レベルを、NKG2C^neg/NKG2A^posg-NK細胞と比較して表している。値は平均±SEである。NKG2C^pos/NKG2A^negg-NK細胞対NKG2C^neg/NKG2A^posg-NK細胞の比較について、＃p＜0.05。図25Gは、ダラツムマブと組み合わされたg-NK細胞のインターフェロンγ発現レベルを、CD38の発現が増加する順にMM細胞株を並べて示している。図25Hは、エロツズマブと組み合わされたg-NK細胞のインターフェロンγ発現レベルを、SLAMF7の発現が増加する順にMM細胞株を並べて示している。図25-1の説明を参照のこと。図25-1の説明を参照のこと。図26A～26Eは、6種のMM細胞株に対するg-NK細胞のTNF-α発現レベルを、通常型NK細胞と比較して表している。値は平均±SEである。g-NK対cNK細胞の比較について、＃p＜0.05。g-NK＋ダラツムマブまたはg-NK＋エロツズマブ対g-NKのみの比較について、＾p＜0.05。g-NK＋ダラツムマブ対g-NK＋エロツズマブの比較について、＆p＜0.05。図26Aは、ダラツムマブと組み合わされたg-NKおよび通常型NK細胞のTNF-α発現レベルを、CD38の発現が増加する順にMM細胞株を並べて示している。図26Bは、エロツズマブと組み合わされたg-NKおよび通常型NK細胞のTNF-α発現レベルを、SLAMF7の発現が増加する順にMM細胞株を並べて示している。図26Cは、MM細胞株のCD38発現とg-NK細胞におけるダラツムマブ媒介性TNF-α発現レベルとの間の関係を示している。図26Dは、MM細胞株のSLAMF7発現とg-NK細胞におけるエロツズマブ媒介性TNF-α発現レベルとの間の関係を示している。図26Eは、g-NK細胞におけるダラツムマブ媒介性TNF-α発現レベルとエロツズマブ媒介性TNF-α発現レベルとを比較している。図26Fは、6時間のインキュベーション後のg-NKおよびcNK細胞について、1μg/mLダラツムマブの存在下または非存在下でLP1（1:1 E:T）に応答して起こるTNF-α発現の代表的フロープロットである。図26Gおよび図26Hは、NKG2C^pos/NKG2A^negg-NK細胞のTNF-α発現レベルを、NKG2C^neg/NKG2A^posg-NK細胞と比較して表している。値は平均±SEである。NKG2C^pos/NKG2A^negg-NK細胞対NKG2C^neg/NKG2A^posg-NK細胞の比較について、＃p＜0.05。図26Gは、ダラツムマブと組み合わされたg-NK細胞のTNF-α発現レベルを、CD38の発現が増加する順にMM細胞株を並べて示している。図26Hは、エロツズマブと組み合わされたg-NK細胞のTNF-α発現レベルを、SLAMF7の発現が増加する順にMM細胞株を並べて示している。図26-1の説明を参照のこと。図26-1の説明を参照のこと。図27Aおよび図27Bは、NK細胞培地にIL-21を組み入れて、または組み入れることなく、221.AEHまたはK562-mbIL15-41BBLフィーダー細胞の存在下で増大させた、g-NK細胞の増大を表している。図27Aは総NK細胞カウントを示している。図27Bは21日間の増大後のg-NK細胞カウントを示している。図28Aおよび図28Bは、NK細胞培地にIL-21を組み入れて、または組み入れることなく、221.AEHまたはK562-mbIL15-41BBLフィーダー細胞の存在下で増大させた、g-NK細胞の増大21日後の、ダラツムマブ媒介制細胞傷害活性およびエロツズマブ媒介性細胞傷害活性を表している。図28Aは、LP1細胞株に対するg-NK細胞の細胞傷害性を示している。図28Bは、MM.1S細胞株に対するg-NK細胞の細胞傷害性を示している。図29A～29Dは、NK細胞培地にIL-21を組み入れて、または組み入れることなく、221.AEHまたはK562-mbIL15-41BBLフィーダー細胞の存在下で増大させた、g-NK細胞のダラツムマブ媒介性およびエロツズマブ媒介性の脱顆粒レベル（CD107a^pos）を表している。図29Aは、LP1細胞株に対する、増大13日後のg-NK細胞脱顆粒レベルを示している。図29Bは、MM.1S細胞株に対する、増大13日後のg-NK細胞脱顆粒レベルを示している。図29Cは、LP1細胞株に対する、増大21日後のg-NK細胞脱顆粒レベルを示している。図29Dは、MM.1S細胞株に対する、増大21日後のg-NK細胞脱顆粒レベルを示している。図29Aの説明を参照のこと。図29Aの説明を参照のこと。図29Aの説明を参照のこと。図30A～30Dは、NK細胞培地にIL-21を組み入れて、または組み入れることなく、221.AEHまたはK562-mbIL15-41BBLフィーダー細胞の存在下で増大させた、g-NK細胞におけるパーフォリンおよびグランザイムBの発現のレベルを表している。図30Aは、増大13日後のパーフォリンおよびグランザイムBの発現を、g-NK細胞のパーセンテージとして示している。図30Bは、増大13日後のパーフォリンおよびグランザイムBの総発現量を示している。図30Cは、増大21日後のパーフォリンおよびグランザイムBの発現を、g-NK細胞のパーセンテージとして示している。図30Dは、増大21日後のパーフォリンおよびグランザイムBの総発現量を示している。図30Aの説明を参照のこと。図30Aの説明を参照のこと。図30Aの説明を参照のこと。図31A～31Dは、NK細胞培地にIL-21を組み入れて、または組み入れることなく、221.AEHまたはK562-mbIL15-41BBLフィーダー細胞の存在下で増大させた、g-NK細胞のダラツムマブ媒介性およびエロツズマブ媒介性のインターフェロンγ発現レベルを表している。図31Aは、LP1細胞株に対する、増大13日後のg-NK細胞のインターフェロンγ発現レベルを示している。図31Bは、MM.1S細胞株に対する、増大13日後のg-NK細胞のインターフェロンγ発現レベルを示している。図31Cは、LP1細胞株に対する、増大21日後のg-NK細胞のインターフェロンγ発現レベルを示している。図31Dは、MM.1S細胞株に対する、増大21日後のg-NK細胞のインターフェロンγ発現レベルを示している。図31Aの説明を参照のこと。図31Aの説明を参照のこと。図31Aの説明を参照のこと。図32A～32Dは、NK細胞培地にIL-21を組み入れて、または組み入れることなく、221.AEHまたはK562-mbIL15-41BBLフィーダー細胞の存在下で増大させた、g-NK細胞のダラツムマブ媒介性およびエロツズマブ媒介性のTNF-α発現レベルを表している。図32Aは、LP1細胞株に対する、増大13日後のg-NK細胞のTNF-α発現レベルを示している。図32Bは、MM.1S細胞株に対する、増大13日後のg-NK細胞のTNF-α発現レベルを示している。図32Cは、LP1細胞株に対する、増大21日後のg-NK細胞のTNF-α発現レベルを示している。図32Dは、MM.1S細胞株に対する、増大21日後のg-NK細胞のTNF-α発現レベルを示している。図32Aの説明を参照のこと。図32Aの説明を参照のこと。図32Aの説明を参照のこと。さまざまなサイトカイン混合物およびサイトカイン濃度の存在下で15日間増大させたNK細胞のg-NK細胞増大を表している。図34A～34Jは、さまざまなサイトカイン混合物およびサイトカイン濃度の存在下で増大させたg-NK細胞の細胞エフェクター機能を示している。図34Aおよび図34Bは、さまざまなサイトカイン混合物およびサイトカイン濃度の存在下で増大させたg-NK細胞のダラツムマブ媒介性およびエロツズマブ媒介性の細胞傷害活性を表している。図34Aは、LP1細胞株に対するg-NK細胞の細胞傷害性を示している。図34Bは、MM.1S細胞株に対するg-NK細胞の細胞傷害性を示している。図34Cおよび図34Dは、さまざまなサイトカイン混合物およびサイトカイン濃度の存在下で増大させたg-NK細胞のダラツムマブ媒介性およびエロツズマブ媒介性の脱顆粒レベル（CD107a^pos）を表している。図34Cは、LP1細胞株に対するg-NK細胞の脱顆粒レベルを示している。図34Dは、MM.1S細胞株に対するg-NK細胞の脱顆粒レベルを示している。図34Eおよび図34Fは、さまざまなサイトカイン混合物およびサイトカイン濃度の存在下で増大させたg-NK細胞におけるパーフォリンおよびグランザイムBの発現のレベルを表している。図34Eは、パーフォリンおよびグランザイムBの発現を、g-NK細胞のパーセンテージとして示している。図34Fは、パーフォリンおよびグランザイムBの総発現量を示している。図34Gおよび図34Hは、さまざまなサイトカイン混合物およびサイトカイン濃度の存在下で増大させたg-NK細胞のダラツムマブ媒介性およびエロツズマブ媒介性のインターフェロンγ発現レベルを表している。図34Gは、LP1細胞株に対するg-NK細胞のインターフェロンγ発現レベルを示している。図34Hは、MM.1S細胞株に対するg-NK細胞のインターフェロンγ発現レベルを示している。図34Iおよび図34Jは、さまざまなサイトカイン混合物およびサイトカイン濃度の存在下で増大させたg-NK細胞のダラツムマブ媒介性およびエロツズマブ媒介性のTNF-α発現レベルを表している。図34Iは、LP1細胞株に対するg-NK細胞のTNF-α発現レベルを示している。図34Jは、MM.1S細胞株に対するg-NK細胞のTNF-α発現レベルを示している。図34Aの説明を参照のこと。図34Aの説明を参照のこと。図34Aの説明を参照のこと。図34Aの説明を参照のこと。図34Aの説明を参照のこと。図34Aの説明を参照のこと。図34Aの説明を参照のこと。図34Aの説明を参照のこと。図34Aの説明を参照のこと。図35A～35Lは、IL-21の存在下で14日間増大させたg-NK細胞の増大および細胞エフェクター機能を、IL-21なしで増大させたg-NK細胞と比較して示している（n＝6）。図35Aおよび図35Bは、IL-21の存在下で増大させたg-NK細胞の増大を、IL-21なしで増大させたg-NK細胞と比較して表している。図35Aは、増大前後のg-NK細胞のパーセンテージを示している。図35Bは、NK細胞1000万個あたりの増大したg-NK細胞の数を示している。値は平均±SEである。CD3^neg/CD57^pos＋IL-21の増大対IL-21なしでのCD3^neg/CD57^posの増大の比較について、＃p＜0.001。CD3^neg/CD57^posの増大対他のCMV^posの増大の比較について、＾p＜0.05。CMV^posの増大対CMV^negCD3^negの増大の比較について、＊p＜0.001。図35Cは、増大前後のg-NKの比率（CMV+ドナー（n＝8）およびCMV-ドナー（n＝6）からの全NK細胞の％）の比較を表している。図35Dは、CMV+ドナーおよびCMV-ドナーからのg-NKのn倍増大率（n-fold expansion rate）の比較を表している。図35Eは、CMV+ドナーに関するFcεR1γ対CD56の代表的フロープロットである。図35Fは、CMV+ドナーおよびCMV-ドナーに関する、CD3-/CD56+NK細胞での、FcεR1γ発現の代表的ヒストグラムである。独立標本t検定を使って、増大前後のCMV+ドナーとCMV-ドナーの差を決定した（図35Cおよび図35D）。値は平均±SEである。＊p＜0.05、＊＊p＜0.01、および＊＊＊p＜0.001。図35Gおよび図35Hは、IL-21の存在下で増大させたg-NK細胞の増大14日後のダラツムマブ媒介性およびエロツズマブ媒介性の細胞傷害活性を、IL-21なしで増大させたg-NK細胞と比較して表している。図35Gは、LP1細胞株に対するg-NK細胞の細胞傷害性を示している。図35Hは、MM.1S細胞株に対するg-NK細胞の細胞傷害性を示している。値は平均±SEである。CD3^neg/CD57^pos＋IL-21の増大対IL-21なしでのCD3^neg/CD57^posの増大の比較について、＊p＜0.05、＊＊p＜0.01、および＊＊＊p＜0.001。図35Iおよび図35Jは、IL-21の存在下で増大させたg-NK細胞のダラツムマブ媒介性およびエロツズマブ媒介性の脱顆粒レベル（CD107a^pos）を、IL-21なしで増大させたg-NK細胞と比較して表している。図35Iは、LP1細胞株に対する、増大14日後のg-NK細胞の脱顆粒レベルを示している。図35Jは、MM.1S細胞株に対する、増大14日後のg-NK細胞の脱顆粒レベルを示している。値は平均±SEである。CD3^neg/CD57^pos＋IL-21の増大対IL-21なしでのCD3^neg/CD57^posの増大の比較について、＊p＜0.05、＊＊p＜0.01、および＊＊＊p＜0.001。図35Kおよび図35Lは、IL-21の存在下で増大させたg-NK細胞におけるパーフォリンおよびグランザイムBの発現のレベルを、IL-21なしで増大させたg-NK細胞と比較して表している。図35Kは、増大14日後のパーフォリンおよびグランザイムBの発現を、NK細胞のパーセンテージとして示している。図35Lは、増大14日後のパーフォリンおよびグランザイムBの総発現量を示している。値は平均±SEである。CD3^neg/CD57^pos＋IL-21の増大対IL-21なしでのCD3^neg/CD57^posの増大の比較について、＊p＜0.05、＊＊p＜0.01、および＊＊＊p＜0.001。図35Mは、cNK細胞と比べた、増大されたg-NK細胞における、パーフォリン（左）およびグランザイムB（右）のベースライン発現を表している（n＝5）。g-NKとcNKとの間でエフェクターであるパーフォリンおよびグランザイムBの発現を比較するには、独立標本t検定を使用した。値は平均±SEである。cNK細胞との統計的有意差は＊＊＊p＜0.001で示される。図35Nは、g-NK細胞およびcNK細胞について、パーフォリンおよびグランザイムBの発現の代表的ヒストグラムを表している。図35Oおよび図35Pは、IL-21の存在下で増大させたg-NK細胞のダラツムマブ媒介性およびエロツズマブ媒介性のインターフェロンγ発現レベルを、IL-21なしで増大させたg-NK細胞と比較して表している。図35Oは、LP1細胞株に対する、増大14日後のg-NK細胞のインターフェロンγ発現レベルを示している。図35Pは、MM.1S細胞株に対する、増大14日後のg-NK細胞のインターフェロンγ発現レベルを示している。値は平均±SEである。CD3^neg/CD57^pos＋IL-21の増大対IL-21なしでのCD3^neg/CD57^posの増大の比較について、＊p＜0.05、＊＊p＜0.01、および＊＊＊p＜0.001。図35Qおよび図35Rは、IL-21の存在下で増大させたg-NK細胞のダラツムマブ媒介性およびエロツズマブ媒介性のTNF-α発現レベルを、IL-21なしで増大させたg-NK細胞と比較して表している。図35Qは、LP1細胞株に対する、増大14日後のg-NK細胞のTNF-α発現レベルを示している。図35Rは、MM.1S細胞株に対する、増大14日後のg-NK細胞のTNF-α発現レベルを示している。値は平均±SEである。CD3^neg/CD57^pos＋IL-21の増大対IL-21なしでのCD3^neg/CD57^posの増大の比較について、＊p＜0.05、＊＊p＜0.01、および＊＊＊p＜0.001。図35Sは、異なるドナー間で、MM.1S細胞株に対する、増大されたg-NK細胞のダラツムマブ媒介性およびエロツズマブ媒介性のインターフェロンγ発現レベルを、cNK細胞と比較して表している。図35Tは、異なるドナー間で、MM.1S細胞株に対する、増大されたg-NK細胞のダラツムマブ媒介性およびエロツズマブ媒介性のTNF-α発現レベルを、cNK細胞と比較して表している。図35-1の説明を参照のこと。図35-1の説明を参照のこと。図35-1の説明を参照のこと。図35-1の説明を参照のこと。図35-1の説明を参照のこと。図35-1の説明を参照のこと。 IL-21/抗IL-21複合体の存在下で増大させたg-NKの増大を表している（n＝4）。値は平均±SEである。IL-21による増大対IL-21/抗IL-21複合体による増大の比較について、＃p＜0.001。図37A～37Hは、前もって凍結保存されたg-NK細胞のNK細胞エフェクター機能を、新鮮濃縮g-NK細胞のものと比較して示している（n＝4）。値は平均±SEである。新鮮濃縮g-NK細胞対前もって凍結保存されたg-NK細胞の比較について、＃p＜0.05。図37Aおよび図37Bは、前もって凍結保存されたg-NK細胞のダラツムマブ媒介性およびエロツズマブ媒介性の脱顆粒レベル（CD107a^pos）を、新鮮濃縮g-NK細胞と比較して表している。図37Aは、LP1細胞株に対するg-NK細胞の脱顆粒レベルを示している。図37Bは、MM.1S細胞株に対するg-NK細胞の脱顆粒レベルを示している。図37Cおよび図37Dは、前もって凍結保存されたg-NK細胞におけるパーフォリンおよびグランザイムBの発現のレベルを、新鮮濃縮g-NK細胞と比較して表している。図37Cは、g-NK細胞の総パーフォリン発現量を示している。図37Dは、g-NK細胞の総グランザイムB発現量を示している。図37Eおよび図37Fは、前もって凍結保存されたg-NK細胞のダラツムマブ媒介性およびエロツズマブ媒介性のインターフェロンγ発現レベルを、新鮮濃縮g-NK細胞と比較して表している。図37Eは、LP1細胞株に対するg-NK細胞のインターフェロンγ発現レベルを示している。図37Fは、MM.1S細胞株に対するg-NK細胞のインターフェロンγ発現レベルを示している。図37Gおよび図37Hは、前もって凍結保存されたg-NK細胞のダラツムマブ媒介性およびエロツズマブ媒介性のTNF-α発現レベルを、新鮮濃縮g-NK細胞と比較して表している。図37Gは、LP1細胞株に対するg-NK細胞のTNF-α発現レベルを示している。図37Hは、MM.1S細胞株に対するg-NK細胞のTNF-α発現レベルを示している。図37-1の説明を参照のこと。図38A～Cは、NSGマウスにおける、1×10⁷個の増大された細胞を単回注入した後の、cNK（凍結保存）細胞およびg-NK（凍結保存または新鮮）細胞の持続性を表している。図38Aは、注入後、6、16、26および31日目に収集された末梢血中のcNK細胞およびg-NK細胞の数を示している。図38Bは、注入後31日目、屠殺時に、脾臓中に存在するNK細胞の数を示している。図38Cは、屠殺時に骨髄中に存在するNK細胞の数を示している。3つのアーム（arm）はいずれもN＝3である。値は平均±SEである。凍結保存cNK細胞と新鮮または凍結保存g-NK細胞との比較について、＊p＜0.05および＊＊＊p＜0.001。増大されたg-NK細胞とcNK細胞によるダラツムマブ誘導性フラトリサイドの比較を表している。図40A～Fは、多発性骨髄腫のマウスモデルにおける腫瘍量および生存率に対する、cNKおよびダラツムマブ（cNK＋Dara）またはg-NKおよびダラツムマブ（g-NK＋Dara）による処置の効果を示している。5×10⁵個のルシフェラーゼ標識MM.1Sヒト骨髄腫細胞を雌NSGマウスの尾静脈に静脈内（I.V.）注射した。5週間にわたって毎週、NSGマウスに、増大されたNK細胞をI.V.投与し（1匹あたり6.0×10⁶細胞）、ダラツムマブをI.P.注射した（1匹あたり10μg）。図40Aは、腫瘍接種後、20、27、37、41、48および57日目における、週2回のマウスのBLIイメージングを示している（左）。対応する処置後の日数は図の右側に示されている。色はBLIの強さを示している（青色、最低;赤色、最高）。図40Bは、g-NK＋Daraにおける腫瘍BLI（光子/秒）を、対照群およびcNK＋Dara群との比較で、経時的に示している。g-NK群と対照群またはcNK群との比較について、＊p＜0.05。図40Cは、パーセント生存率を経時的に示しており、矢印はcNK＋Daraまたはg-NK＋Daraによる療法の投与を示す。図40Dは、対照群、cNK＋Dara群、およびg-NK＋Dara群におけるマウスの体重の変化を経時的に表す。図40Eは、cNK＋Dara処置マウスおよびg-NK＋Dara処置マウスにおいて屠殺時の骨髄中に存在するCD138⁺腫瘍細胞の数を表している。g-NK細胞とcNK細胞との比較について、＊＊＊p＜0.001。値は平均±SEである。図40Fは、対照群における、およびcNK＋Daraまたはg-NK＋Daraのどちらかで処置されたマウスにおける、NK細胞および腫瘍細胞の存在を解析するためのゲーティング戦略を使った、代表的フロープロットを示している。対照群についてはN＝8、g-NK群またはcNK群についてはN＝7。図40Gは、すべての対照、cNK＋Daraおよびg-NK＋Dara処置マウスについて、研究全体にわたって収集されたすべてのBLI像を表す。色はBLIの強さを示している（青色、最低;赤色、最高）。図40Hは、屠殺に先立って、対照群、cNK＋Dara群およびg-NK＋Dara群内のすべてのマウスについて得られたX線像を表している。矢印は骨折と骨変形を示す。屠殺の日が各マウスの下に示されている。図40Aの説明を参照のこと。図40Aの説明を参照のこと。図40Aの説明を参照のこと。図40Aの説明を参照のこと。図40Aの説明を参照のこと。図40Aの説明を参照のこと。図40Aの説明を参照のこと。図41A～Cは、NSGマウスにおける、cNK＋Daraまたはg-NK＋Daraによる処置後の、持続性NK細胞の比較データを提示している。どのデータも、屠殺時にフローサイトメトリーを使って検出された細胞の量を提示している。図41Aは、血中のcNKおよびg-NK細胞の数を示している。図41Bは、脾臓中に存在するNK細胞の数を示している。図41Cは、骨髄中のNK細胞の数を示している。値は平均±SEである。g-NK細胞とcNK細胞との比較について、＊＊＊p＜0.001。

詳細な説明
FceRIγ（FcRγ）鎖が欠如または欠損しているナチュラルキラー（NK）細胞の特殊化したサブセット（g-NK細胞という）を含む、NK細胞のエクスビボでの増大のための方法が、本明細書において提供される。本開示におけるg-NK細胞への言及は、FcRγ鎖が欠損しているNK細胞またはそのような細胞の代用表面マーカープロファイルを有する細胞を包含する。いくつかの態様において、g-NK細胞はFcRγ鎖が欠損しているNK細胞である。いくつかの態様において、g-NK細胞は、本明細書記載の一定の代用マーカーの表面発現に基づいて同定することができる。

ナチュラルキラー（NK）細胞は、サイトカインおよびケモカインの分泌による、そして細胞傷害性顆粒の放出による、抗ウイルス免疫および抗がん免疫の媒介にとって重要な自然リンパ球である（Vivier et al.Science 331（6013）:44-49（2011）、Caligiuri,Blood 112（3）:461-469（2008）、Roda et al.,Cancer Res.66（1）:517-526（2006））。NK細胞は、リンパ球の3番目に大きい集団を構成するエフェクター細胞であり、腫瘍細胞および病原体感染細胞に対する宿主の免疫監視にとって重要である。しかし、Tリンパ球およびBリンパ球とは異なり、NK細胞は、生殖細胞系にコードされた活性化受容体を使用し、標的認識については限られた能力しか有しないと考えられている（Bottino et al.,Curr Top Microbiol Immunol.298:175-182（2006）、Stewart et al.,Curr Top Microbiol Immunol.298:1-21（2006））。

NK細胞の活性化は、直接的な腫瘍細胞殺傷で見られるように、標的細胞上のリガンドへのNK細胞受容体の直接的結合を介して起こるか、または抗原保持細胞に結合した抗体のFc部分への結合によるFc受容体（CD16、CD16aまたはFcγRIIIaとしても公知である）の架橋を介して起こることができる。活性化すると、NK細胞はサイトカインおよびケモカインを豊富に産生し、同時に強力な細胞溶解活性を呈する。NK細胞は抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）によって腫瘍細胞を殺傷することができる。いくつかの事例では、ADCCは、細胞の表面に結合しているIgG1またはIgG3抗体をNK細胞表面の受容体（CD16など）が認識した時に、トリガーされる。これは、パーフォリンおよびグランザイムを含有する細胞質顆粒の放出をトリガーし、それが標的細胞の死につながる。NK細胞は、IgG被覆標的細胞を認識する活性化Fc受容体CD16を発現するので、標的認識が広くなっている（Ravetch＆Bolland,Annu Rev Immunol.19:275-290（2001）、Lanier Nat.Immunol.9（5）:495-502（2008）、Bryceson＆Long,Curr Opin Immunol.20（3）:344-352（2008））。ADCCおよび抗体依存性サイトカイン/ケモカイン産生は主としてNK細胞によって媒介される。

CD16はグリコシルホスファチジルイノシトールアンカー型でも存在する（FcγRIIIBまたはCD16Bとしても公知である）。本明細書にいうCD16は、NK細胞上に発現して抗体依存性応答（NK細胞媒介性ADCCなど）に関与するCD16a型に関し、グリコシルホスファチジルイノシトールアンカー型は指さないものとする。

CD16受容体は、アダプターであるTCR-CD3複合体のζ鎖（CD3ζ）および/またはFcRγ鎖と会合して、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ITAM）を介したシグナル伝達を行うことができる。一定の局面において、CD16エンゲージメント（CD16架橋）は、CD16関連アダプター鎖FcRγまたはCD3ζの一方または両方によって生成する細胞内シグナルを介して、NK細胞応答を開始する。CD16のトリガリングはγ鎖またはζ鎖のリン酸化につながり、次にそれがチロシンキナーゼ、sykおよびZAP-70を動員して、迅速かつ強力なエフェクター機能につながるシグナル伝達のカスケードを開始する。最も周知のエフェクター機能は、抗体依存性細胞性細胞傷害のプロセスによって近くの標的細胞を殺傷するための、毒性タンパク質を運ぶ細胞質顆粒の放出である。CD16架橋は、サイトカインおよびケモカインの産生ももたらし、次にそれが一連の免疫応答を活性化し、結集させる。

サイトカインおよびケモカインのこの放出は、インビボでのNK細胞の抗がん活性に役割を果たすことができる。NK細胞は、その細胞質中に、パーフォリンおよびプロテアーゼ（グランザイム）を含有する小さな顆粒も有する。NK細胞から放出されると、パーフォリンは、標的とする細胞の細胞膜に小孔を形成し、グランザイムおよび関連分子はその小孔を通って進入して、アポトーシスを誘導することができる。NK細胞が標的細胞の壊死ではなくアポトーシスを誘導するという事実は重要である-ウイルス感染細胞の壊死はビリオンを放出することになるだろうが、アポトーシスなら細胞内でのウイルスの破壊につながる。

g-NK細胞とも呼ばれる、FcRγアダプタータンパク質を欠くNK細胞の特殊化したサブセットは、ロバストなADCC応答を媒介することができる（例えば特許出願番号US2013/0295044参照）。応答増加の機序は、FcRγの発現に影響を及ぼすエピジェネティック修飾の変化によるものでありうる。g-NK細胞は、シグナリングアダプターζ鎖を豊富に発現するが、シグナリングアダプターγ鎖の発現は欠失している。通常型NK細胞と比較すると、これらのγ欠損g-NK細胞は、抗体によって活性化された時に、劇的に増強された活性を呈する。例えばg-NK細胞は、CD16の抗体媒介性架橋によって、または抗体被覆腫瘍細胞によって、活性化されうる。いくつかの局面においてg-NK細胞は、γ鎖を発現する通常型NK細胞よりも、多量のサイトカイン（例えばIFN-γまたはTNF-α）およびケモカイン（例えばMIP-1α、MIP-1βおよびRANTES）を産生し、かつ/またはより高度な脱顆粒応答を示す。g-NK細胞では、ナチュラルキラー細胞の細胞傷害機構の一構成要素であるグランザイムBの発現量が高くなる。そのうえ、g-NK細胞は通常型NK細胞と比較して寿命が長く、それらの存在は長期間維持される。いくつかの態様において、g-NK細胞は機能的にも表現型的にも安定である。

いくつかの態様において、g-NK細胞は、ADCC応答を引き出すのに、通常型NK細胞、例えばγ鎖が欠損していないNK細胞よりも効果的である。いくつかの態様において、g-NK細胞は、細胞媒介性細胞傷害を引き出すのに、抗体の非存在下でさえ、通常型NK細胞よりも効果的である。いくつかの事例では、ADCCは、抗がん抗体を含む治療用抗体の作用機序である。いくつかの局面では、NK細胞を投与することによる細胞療法を、治療目的および関連する目的のための抗体と合わせて使用することができる。

例えば、CD38を標的とするダラツムマブやSLAMF7を標的とするエロツズマブなど、一定の治療用モノクローナル抗体は、多発性骨髄腫（MM）などの疾患の処置についてFDAの承認を得ている。治療用抗体の臨床的応答は有望であるが、それらは理想的でない場合が多い。例えば初期の臨床的応答は、特にダラツムマブについては、概して期待の持てるものであったが、本質的にすべての患者が、結局は、進行性疾患を発症する。したがって、より深い寛解を引き出すかまたはこれらの作用物質に対する耐性を克服するための新しい戦略が、大いに必要とされている。提供される態様は、組成物を含めて、これらのニーズに対処する。

g-NK細胞を含有する組成物、例えば、提供される方法によって産生された組成物と、抗体、例えば抗がん抗体との併用投与を伴う方法が、本明細書において提供される。いくつかの態様において、g-NK細胞の抗体指向性ターゲティングは、g-NK細胞サブセットの改良された親和性、細胞傷害性および/またはサイトカイン媒介性エフェクト機能により、患者にとって改良されたアウトカムにつながる。

いくつかの態様において、治療薬としてのモノクローナル抗体の作用の潜在的機序は、補体依存性細胞傷害、抗体依存性細胞貪食および/または抗体依存性細胞性細胞傷害による抗腫瘍作用による。場合により、NK細胞が媒介するADCCは、抗体が結合した腫瘍細胞を、特に多発性骨髄腫（MM）腫瘍の場合には、強力に排除することができると考えられる。

NK細胞は、抗体のFc部分がそれぞれのFc受容体（FcγRIIIaまたはCD16a）に結合して、アダプタータンパク質CD3ζおよびFcεR1γが関与するプロセスによって活性化および脱顆粒をトリガーすると、活性化される。MM抗体を含む抗体に対する臨床的ADCC応答を増強する取り組みは難題だった。なぜならNK細胞はCD38およびSLAMF7（それぞれ、例えばダラツムマブおよびエロツズマブの標的）も発現するからである。高いCD38発現は、特に、ダラツムマブ処置過程の早い時期にNK細胞の迅速な枯渇をもたらして、潜在的に、より一層完全な腫瘍根絶を引き出しうる自然免疫細胞のこの供給源を、ほとんど排除してしまう。

提供されるg-NK細胞およびそれを含有する組成物、提供される方法によって産生されるものは、これらの課題を克服するいくつかの特徴を呈する。g-NK細胞はCMV血清陽性の個体のわずか25～30％における全NK細胞の約3～10％というレベルでしか検出できないので、g-NK細胞は比較的稀なサブセットである。提供される方法は、g-NK細胞を特にロバストに増大させ濃縮することができ、よってインビボでの使用に必要な十分な増大を可能にする方法に関する。

いくつかの態様において、g^-NK細胞は、FcRγを発現するナチュラルキラー細胞よりも有意に多量のサイトカインを産生する。別の態様において、サイトカインは、インターフェロンγ（IFN-γ）、腫瘍壊死因子-α（TNF-α）、またはそれらの組み合わせである。一態様において、g^-NK細胞は有意に多量のケモカインを産生する。一態様において、ケモカインは、MIP-1α、MIP-1βまたはそれらの組み合わせである。別の態様において、g^-NK細胞は、Fc受容体CD16を介して刺激されると、サイトカインまたはケモカインを産生する。

g-NK細胞は末梢血中のNK細胞において比較的小さなパーセンテージを占め、これにより、治療方法におけるこれらの細胞の利用可能性が制限される。具体的には、臨床においてg-NK細胞を利用するには、g-NK細胞が一般に希少な集団であることから、高い優先的増大率が必要になる。NK細胞を増大させる他の方法では、14日で1000倍のNK細胞増大率を達成することができるが、それらは低分化のNKG2C^neg、FceRIγ^pos（FcRγ^pos）NK細胞を与える（Fujisaki et al.（2009）Cancer Res.,69:4010-4017、Shah et al.（2013）PLoS One,8:e76781）。さらに、表現型がg-NK細胞と一部重複するNK細胞を増大させるために最適化された増大は、g-NK細胞を治療用途に対応できる量まで優先的に増大させないことが、本明細書においてわかる。具体的には、HLA-Eがトランスフェクトされた221.AEH細胞を使用し、培養培地にIL-15を組み入れると、表現型がg-NK細胞と一部重複するNKG2C^posNK細胞を優先的に増大させうることは、以前に報告されている（Bigley et al.（2016）Clin.Exp.Immunol.,185:239-251）。HLA-Eを構成的に発現するそのようなHLA発現細胞との培養は、NK細胞をNKG2C^pos/NKG2A^neg表現型の方向に押す（NKG2CはHLA-Eに対する活性化受容体であり、一方、NKG2AはHLA-Eに対する抑制性受容体である）。そのような細胞はその中にg-NKを含むので、g-NK細胞を増大させるにはそのような方法で十分であるだろうと考えられた。しかし、本明細書の実施例で示すとおり、この方法ではg-NK細胞のロバストな増大は達成されない。

提供される方法はこれらの制限を克服する。提供される方法では、HLAクラスIおよびHLAクラスIIが欠損しているHLA-E+フィーダー細胞、例えば221.AEH細胞を、NK細胞に対して、以前の方法と比較して、より大きな比で利用する。具体的には、以前の方法では、例えばNK細胞対221.AEHの比を10:1にするなど、221.AEH細胞を低い比で使用していた。より大きな比のHLA-E発現フィーダー細胞、例えば221.AEH細胞は、より強くg-NK表現型に偏った、より大きな全体的増大をもたらすことが、本明細書においてわかる。いくつかの態様において、HLA-E+フィーダー細胞、例えば221.AEH細胞の、より大きな比は、フィーダー細胞を照射することによって可能になる。いくつかの局面において、照射フィーダー細胞株の使用は、それがGMPに適合する方法を与えることからも有利である。増大の期間中、組換えIL-2、IL-7、IL-15、IL-12、IL-18、IL-21、IL-27、またはそれらの組み合わせを組み入れることも、ロバストな増大を支えることがわかる。提供される方法の特定の態様において、少なくとも1つの組換えサイトカインはIL-2である。いくつかの態様では、2種以上の組換えサイトカインが存在し、ここで、少なくとも1つの組換えサイトカインはIL-2であり、少なくとも1つの組換えサイトカインはIL-21である。

本明細書において提供される方法は、IL-21の存在下での、増大のためのNK細胞の培養は、NK細胞によるサイトカインまたはエフェクター分子、例えばパーフォリンおよびグランザイムBの産生をさらに増強するという知見に基づく。本明細書の拡張されたプロセスによって産生されたNK細胞を含有する組成物は、高度に機能的であり、ロバストな増殖を呈し、冷凍された後でさえ、レスキューなしでうまく機能する。例えば、提供されるプロセスによって産生されたNK細胞は、IL-21の存在下で増大させた場合に、強いADCC活性を呈するだけでなく、抗体非依存的細胞傷害活性も呈する。例えばエフェクター分子（例えばパーフォリンおよびグランザイム）は、提供される方法によって増大させたNK細胞には自然に存在し、これにより、高い細胞傷害能を呈する細胞を与える。本明細書において示されるとおり、IL-21（例えばIL-2、IL-15およびIL-21）を含む提供されるプロセスによって産生されたNK細胞組成物は、パーフォリンまたはグランザイムBについて陽性であるNK細胞のパーセンテージが、IL-2のみを含みIL-21が添加されていないプロセスによって産生されるNK細胞組成物よりも高いだけでなく、細胞におけるそれらの分子の発現のレベルまたは程度も高い。さらに、IL-21（例えばIL-2、IL-15およびIL-12）を含む、本明細書において提供される方法によって産生されるNK細胞は、標的抗原（例えばCD38）に対する抗体（例えばダラツムマブ）と組み合わせた場合に、標的細胞に応答して、脱顆粒ならびにより多くのIFN-γおよびTNF-αを発現する能力を含む、相当なエフェクター活性を呈するg-NK細胞組成物ももたらす。この機能的活性は、増大されたNK細胞の凍結保存および解凍後でさえ、高く保たれる。細胞溶解酵素の顕著な増加は、よりロバストな活性化表現型と共に、CD16架橋によって抗体とエンゲージされた時に腫瘍標的のアポトーシスを誘導する、増大されたg-NK細胞の増強された能力を補強する。顕著な抗体非依存的エフェクター表現型は、g-NK細胞の単独療法としての潜在的有用性も支持する。

さらに、本明細書における知見は、IL-21の存在下で増大させた、提供されるNK細胞が、例えばIL-21を添加することなくIL-2のみの存在下で増大させた細胞よりも長期間にわたって持続し、よく増殖する潜在能力を持つことも実証している。さらにまた、結果は、凍結保存されたg-NK細胞が新鮮g-NK細胞に匹敵するレベルで持続することも示した。この著しく改良された持続性により、抗体媒介性ADCCを増強するための「オフ・ザ・シェルフ（off-the-shelf）」型の細胞療法としての、新鮮なまたは凍結保存されたg-NKの潜在的有用性が強調される。持続性が改良されているというこの知見は有利である。というのも、多くのNK細胞療法の臨床的有用性は、NK細胞の限られた持続性によって損なわれてきたからである。

さらに、本明細書における結果は、g-NK細胞が発現するCD38（これはダラツムマブなどの治療用抗体の標的である）は低レベルであるという、驚くべき知見を実証している。CD38などの一定の標的抗原に対する多くの既存のNK細胞療法に伴う課題は、NK細胞が標的抗原を発現しうることにより、ADCC活性が腫瘍だけでなくNK細胞の排除にもつながることになる「フラトリサイド（fratricide）」をもたらすということである。実際、他の既報のNK細胞組成物は、高いパーセンテージ（例えば＞90％）のCD38high NK細胞を発現すると報告されている。対照的に、本明細書における知見は、ドナー単離g-NK細胞およびそこから増大させたg-NK細胞では、通常型NK細胞またはMM標的細胞株よりも、CD38pos細胞のパーセンテージが著しく低かったことを、実証している。CD38発現の低下は、g-NK細胞による抗CD38（例えばダラツムマブ）媒介性フラトリサイドが通常型NK細胞と比べて著しく低減することにつながった。これらの結果は、MMにおいて、フラトリサイド関連枯渇を起こすことなく、増強された抗体抗腫瘍活性を付与するための、提供されるg-NK細胞組成物の有用性を裏付けている。これらの結果は、g-NK細胞組成物がダラツムマブ抵抗性患者にとって最適でありうることを、さらに示唆している。というのも、増大されたg-NK細胞はダラツムマブ誘導性フラトリサイドに対して耐性であり、CD38を微弱に発現する（dimly CD38 expressing）骨髄腫細胞に対してさえ、ダラツムマブ特異的細胞媒介性胞傷害性を増強するからである。

その上、g-NK細胞が示す上記の活性は、抗体の効力を増強するために細胞をさらに操作する必要なく、達成することができる。例えば、ダラツムマブフラトリサイドを回避するためにCD38ノックアウトNK細胞株が作出され、抗腫瘍ADCCを増強するために切断可能でないCD16を持つNK細胞株が開発されている。しかし、臨床使用にとっての潜在的短所として、遺伝子操作および不死化細胞株の照射の必要性が挙げられる。

提供される方法によって産生されるものを含む、提供されるg-NK細胞組成物の優位性は、g-NK細胞のインビボでの活性を評価する研究において、さらに実証された。MMの例示的マウスモデルにおける活性は、抗体（例えばダラツムマブ）と組み合わされたg-NK細胞が、大部分のマウスにおいて骨髄腫腫瘍負荷を排除し、持続的で有意な腫瘍退縮を伴うことを示した。これらの結果は、インビボでの抗体効果の増強に関するg-NK細胞の優位性を、特にFcεR1γ+である通常型NK細胞との比較で浮き彫りにし、このNK細胞療法の治療的潜在能力を裏付ける。このモデルにおけるNK細胞の高い持続性および増強された生存率ならびにそれらのフラトリサイドに対する耐性は、g-NK細胞の優れた抗腫瘍効果と持続性の裏付けになりうる。

増大方法に先立つ細胞試料からのNK細胞の濃縮、例えば増大に先立つCD16細胞またはCD57細胞についての濃縮によるものが、最初にCD3枯渇のみに基づいてNK細胞を濃縮する方法と比較して、達成できるg-NK細胞増大の量をさらに実質的に増加させることもわかる。別の態様において、増大に先立って実行することができる別の濃縮は、CD56に関する正の選択およびCD38に関する負の選択または枯渇により、NK細胞について濃縮することである。さらなる態様において、増大に先立って実行することができる別の濃縮は、CD56に関する正の選択と、それに続く、NKG2A^negのための負の選択または枯渇およびCD161^negのための負の選択または枯渇によって、NK細胞を濃縮することである。別の態様において、増大に先立って実行することができる別の濃縮は、CD57に関する正の選択と、それに続く、NKG2Aに関する負の選択もしくは枯渇および/またはNKG2Cに関する正の選択によって、NK細胞について濃縮することである。別の態様において、増大に先立って実行することができる別の濃縮は、CD56に関する正の選択と、それに続く、NKG2Aに関する負の選択もしくは枯渇および/またはNKG2Cに関する正の選択によって、NK細胞について濃縮することである。そのような態様のいずれにおいても、NKG2C^posおよび/またはNKG2A^negNK細胞についての濃縮は、増大後に実行することができる。

そのような態様のいずれにおいても、濃縮NK細胞は、NK細胞を含有する細胞試料から、例えば末梢血単核球（PBMC）から、濃縮することができる。いくつかの態様では、細胞試料からのNK細胞の濃縮に先立って、CD3に関する負の選択または枯渇によってT細胞を除去することができる。そのような態様のいずれにおいても、濃縮NK細胞は、NK細胞を含有するヒト対象からの生物学的試料（例えばPBMC）から、比較的高いg-NK細胞の比率で、例えばNK細胞中のg-NK細胞のパーセンテージが高いということについて選択されたヒト対象から、濃縮することができる。そのような態様のいずれにおいても、濃縮NK細胞は、試料が比較的高い比率のNKG2C^posNK細胞（例えば20％または約20％または20％超のNKG2C^posNK細胞）および/またはNKG2A^negNK細胞（例えば70％または約70％または70％超のNKG2A^negNK細胞）を含有する、NK細胞を含有するヒト対象からの生物学的試料、例えばPBMCから、濃縮することができる。そのような態様のいずれにおいても、濃縮NK細胞は、試料が比較的高い比率のNKG2C^posNK細胞（例えば20％または約20％または20％超のNKG2C^posNK細胞）およびNKG2A^negNK細胞（例えば70％または約70％または70％超のNKG2A^negNK細胞）を含有する、NK細胞を含有するヒト対象からの生物学的試料、例えばPBMCから、濃縮することができる。

総合すると、g-NK細胞を増大させるための提供されるアプローチは、培養開始時における最初は1000万個の濃縮NK細胞から、10億個超の細胞、場合によっては最大80億個またはそれ以上の細胞を上回るNK細胞の増大を達成することができる。特に、提供される方法は、高収量（＞1000倍）の増大率をもたらすことができると共に、g-NK細胞の機能性は増大後も維持され、場合によっては増加する。いくつかの態様において、提供される方法は、高レベルのパーフォリンおよびグランザイムBを発現するg-NK細胞集団をもたらすことができる。さらに、解凍NK細胞のレスキューを伴う多くの既存方法では一般に達成されない前もって凍結されたNK細胞を増大させるのにも、提供される方法は十分であることがわかる。いくつかの態様において、これは、増大プロトコールの継続期間を増やすことによって達成される。いくつかの態様において、これは、HLA-E+フィーダー細胞対NK細胞の比を、例えば約1:1の221.AEH対NK細胞へと減少させることによって達成される。いくつかの態様において、これは、増大の期間中、組換えIL-2、IL-7、IL-15、IL-12、IL-18、IL-21、IL-27、またはそれらの組み合わせのいずれかを組み入れることで達成される。特定の態様において、少なくとも1つの組換えサイトカインはIL-2である。いくつかの態様において、増大は、2種以上の組換えサイトカインの存在下で実行され、ここで、少なくとも1つは組換えIL-21であり、少なくとも1つは組換えIL-2である。本明細書において示されるとおり、提供される方法は、治療的応用に関するそのような細胞の有用性の裏付けとなる強力な抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）および抗体非依存的細胞媒介性細胞傷害を呈するg-NK細胞を与える。

本明細書において示されるとおり、提供されるg-NK細胞およびそれを含有する組成物、提供される方法によって産生されるものは、がん療法に使用することができる。いくつかの局面において、提供される研究は、腫瘍抗原に対する標的抗体（例えば抗骨髄腫抗体）と組み合わせた場合に、g-NK細胞が著しく増強されたADCC/エフェクター機能を有すること、および増大されたg-NK細胞の養子移入が治療用抗体（例えばダラツムマブ）と組み合わせた場合に腫瘍負荷を排除することを、実証している。重要なことに、同種異系NK細胞の養子移入は重度の移植片対宿主病（GVHD）をもたらさないので、抗体指向性NK細胞療法としての抗体との組み合わせを含むそのような細胞療法は、臨床使用のために「オフ・ザ・シェルフ」的に投与することができる。

本明細書において言及される参考文献は、特許出願、特許公報ならびに科学文献およびデータベースを含めてすべて、個々の参考文献が参照により本明細書に組み入れられることを具体的かつ個別に示した場合と同じ程度に、あらゆる目的で、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。

限定としてではなく、明快な開示のために、詳細な説明を以下のサブセクションに分割する。本明細書において使用されるセクション見出しには構成上の目的しかなく、記載されている主題を限定すると解釈してはならない。

I. 定義
別段の定義がある場合を除き、本明細書において使用される専門用語、表記ならびに他の技術的および科学的な用語および術語はすべて、本願請求項の対象が属する技術分野の当業者が一般に理解している意味と同じ意味を有するものとする。場合によっては、一般に理解されている意味を持つ用語を、明確な記述のためにかつ/またはすぐに参照できるように、本明細書において定義するが、そのような定義を本明細書に含めることは、必ずしも、当技術分野において一般に理解されているものとの実質的相違を表すと解釈されるべきではない。

本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「1つの（a）」、「1つの（an）」および「その（the）」は、内容上そうでないことが明らかである場合を除き、複数の指示対象を包含する。したがって、例えば「1つの分子（a molecule）」といえば、それは任意で、2つ以上のそのような分子の組み合わせを包含することになる。

本明細書において使用される「約」という用語は、この技術分野の当業者にはすぐにわかるそれぞれの値にとっての通常の誤差範囲を指す。本明細書において、ある値またはパラメータについて「約」という場合は、その値またはパラメータそのものに向けられる態様が包含される（そして記載される）。

本明細書に記載される本発明の局面および態様は、局面および態様「を含む」、「からなる」および「から本質的になる」を包含すると理解される。

本明細書でいう「任意の」または「任意で」とは、その後に記載される事象または状況が起こることまたは起きないこと、およびその記載は、該事象または状況が起こる場合と、それが起こらない場合とを包含することを意味する。例えば、任意で置換された基とは、その基が無置換であることまたは置換されていることを意味する。

本明細書でいう「抗体」とは、天然物であるか、部分的にまたは全体が合成的に、例えば組換え的に産生されたものであるかを問わず、免疫グロブリンおよび免疫グロブリンフラグメントを指し、その免疫グロブリン分子の可変重鎖領域および/または可変軽鎖領域のうち、抗原結合部位を形成するのに十分でありかつ集合した時に抗原に特異的に結合するのに十分である部分を少なくとも含有する、それらの任意のフラグメントを含む。したがって抗体は、免疫グロブリン抗原結合ドメイン（抗体結合部位）に相同なまたは実質的に相同な結合ドメインを有する任意のタンパク質を包含する。通例、抗体は、最小限、可変重（V_H）鎖および/または可変軽（V_L）鎖のすべてまたは少なくとも一部を含む。一般に、V_HとV_Lは互いにペアリングして抗原結合部位を形成するが、いくつかの事例では、単一のV_HドメインまたはV_Lドメインでも抗原結合には十分である。抗体は定常領域の全部または一部も含むことができる。本明細書でいう抗体には、完全長抗体および抗原結合フラグメントが含まれる。「免疫グロブリン」（Ig）という用語は本明細書では「抗体」と相互可換的に使用される。

「完全長抗体」、「インタクト抗体」または「全抗体」という用語は、抗体フラグメントではなく、実質上無傷の形態にある抗体を指すために相互可換的に使用される。完全長抗体は、典型的には2つの完全長重鎖（例えばVH-CH1-CH2-CH3またはVH-CH1-CH2-CH3-CH4）と2つの完全長軽鎖（VL-CL）とヒンジ領域とを有する抗体、例えば抗体分泌B細胞によって哺乳動物種（例えばヒト、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類など）から産生される抗体、および同じドメインを持つ合成的に産生された抗体である。特に全抗体は、Fc領域を含めて重鎖および軽鎖を持つものである。定常ドメインは、ネイティブ配列定常ドメイン（例えばヒトネイティブ配列定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列変異体でありうる。いくつかの事例において、インタクト抗体は、1種または複数種のエフェクター機能を有しうる。

「抗体フラグメント」は、インタクト抗体の一部、インタクト抗体の抗原結合および/または可変領域を含む。抗体フラグメントとして、Fabフラグメント、Fab'フラグメント、F(ab')₂フラグメント、Fvフラグメント、ジスルフィド連結Fv（dsFv）、Fdフラグメント、Fd'フラグメント、ダイアボディ、線状抗体（米国特許第5,641,870号の実施例2、Zapata et al.,Protein Eng.8（10）:1057-1062［１９９５］参照）、一本鎖抗体分子、例えば一本鎖Fv（scFv）または一本鎖Fab（scFab）、上記のいずれかの抗原結合フラグメント、および抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。本明細書に関して、抗体フラグメントは、典型的には、NK細胞の表面でCD16をエンゲージまたは架橋するのに十分なものを含む。

「自家」という用語は、個体自身の組織内に起源を持つまたは個体自身の組織から採取された細胞または組織を指す。例えば、NK細胞の自家移入または自家移植では、ドナーとレシピエントが同じ人物である。

「同種異系」という用語は、同じ種に属するまたは同じ種から取得されるが遺伝的には異なり、いくつかの事例では、それゆえに免疫学的に不適合である、細胞または組織を指す。典型的には「同種異系」という用語は、ドナーから同じ種のレシピエントに移植される細胞を規定するために使用される。

細胞組成物に関して「濃縮された」という用語は、細胞タイプまたは細胞集団の数またはパーセンテージが、同じ体積の出発組成物、例えば対象から直接取得または単離された出発組成物における当該細胞タイプの数またはパーセンテージと比較して増加している組成物を指す。この用語は、組成物からの他の細胞、細胞タイプまたは細胞集団の完全な除去を必要とせず、そのように濃縮された細胞が濃縮組成物中に100％存在することを必要とせず、100％近く存在することさえ必要としない。

「発現」という用語は、ポリヌクレオチドがDNAテンプレートから（例えばmRNAまたは他のRNA転写産物などに）転写されるプロセス、および/または転写されたmRNAが、次いでペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。転写産物とコードされているポリペプチドとを「遺伝子産物」と総称しうる。ポリヌクレオチドがゲノムDNAに由来する場合、発現は真核細胞におけるmRNAのスプライシングを含みうる。

タンパク質または核酸に関して「異種」という用語は、異なる遺伝子源に由来するタンパク質または核酸を指す。例えば、ある細胞にとって異種であるタンパク質または核酸は、それを発現させる細胞とは異なる生物または個体に由来する。

本明細書において使用される「導入する」という用語は、インビトロまたはインビボのどちらかで細胞中にDNAを導入するさまざまな方法を包含し、そのような方法には、形質転換、形質導入、トランスフェクション（例えばエレクトロポレーション）および感染が含まれる。ベクターは、細胞中にDNAコード分子（DNA encoding molecule）を導入するのに役立つ。考えうるベクターとしてプラスミドベクターおよびウイルスベクターが挙げられる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、または他のベクター、例えばアデノウイルスベクターもしくはアデノ随伴ベクターが挙げられる。

「組成物」という用語は、細胞または抗体を含む2種以上の産物、物質または化合物の任意の混合物を指す。これは、水性、非水性またはそれらの任意の組み合わせである、溶液、懸濁液、液状物、粉末、ペーストでありうる。調製物は、一般的には、活性成分（例えば抗体）の生物学的活性が有効であることを許すような形態にある。

「薬学的に許容される担体」とは、対象にとって無毒である、活性成分以外の薬学的製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体としては、緩衝剤、賦形剤、安定剤または保存剤が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。

本明細書において使用される組み合わせとは、2種以上のアイテムの間の任意の関連を指す。組み合わせは、2種以上の別々のアイテム、例えば2種の組成物または2種の収集物であることができ、それらの混合物、例えば2種以上のアイテムの単一の混合物であるか、またはそれらの任意の変形であることもできる。組み合わせの要素は一般的には機能的に関連または関係する。

本明細書でいうキットとは、梱包された組み合わせであって、任意で他の要素、例えば追加の作用物質と、限定するわけではないが例えば治療的使用などの目的でのその組み合わせまたはその要素の使用に関する説明書とを含む。

本明細書において使用される「処置」または「処置する」という用語は、臨床病理の経過中に処置される個体または細胞の自然の経過を変化させるように計画された臨床的介入を指す。処置の望ましい効果としては、疾患進行の速度を減じること、疾患状態を改善または軽減すること、および寛解または予後の改良が挙げられる。個体は、例えば障害（例えば好酸球媒介性疾患）に関連する1つまたは複数の症状が和らぐか除去されるのであれば、うまく「処置」されたことになる。例えば個体は、処置が疾患を患っている者の生活の質を向上させ、疾患を処置するのに必要な他の薬物投与の用量を減少させ、疾患の再発の頻度を低減し、疾患の重症度を下げ、疾患の発生または進行を遅延させ、かつ/または個体の生存期間を延長するのであれば、うまく「処置」されたことになる。

「有効量」とは、少なくとも、必要な投薬量および期間において、治療結果または予防結果を含む所望の効果または表示した効果を達成するのに有効な量を指す。有効量は1回または複数回で提供することができる。「治療有効量」とは、少なくとも、特定障害の測定可能な改善を達成するのに必要な細胞の最小の用量である。いくつかの態様において、治療有効量は、動物におけるがん、ウイルス感染症、微生物感染症、または敗血症性ショックに関連する重症度、持続時間および/または症状を低減する組成物の量である。本明細書における治療有効量は、患者の疾患状態、年齢、性別および体重などの因子に応じて変動しうる。治療有効量は、抗体の治療上有益な効果が抗体のいかなる毒性効果または有害効果をも凌ぐ量でもありうる。「予防有効量」とは、所望の予防結果を達成するのに、必要な投薬量および期間において、有効な量を指す。予防用量は罹患前の対象または疾患の初期段階にある対象に使用されるので、必ずというわけではないが典型的には、予防有効量は治療有効量よりも少ない場合がある。

本明細書でいう「個体」または「対象」は哺乳動物である。処置に関して、「哺乳動物」としては、ヒト、家畜および農用動物、ならびに動物園の動物、スポーツ動物またはペット動物、例えばイヌ、ウマ、ウサギ、ウシ、ブタ、ハムスター、アレチネズミ、マウス、フェレット、ラット、ネコなどが挙げられる。いくつかの態様において、個体または対象はヒトである。

II. ナチュラルキラー細胞サブセットを増大させるための方法
ヒト対象からの生物学的試料からNK細胞のサブセットを増大させるための方法が、本明細書において提供される。いくつかの態様において、本方法は、ヒト対象からの生物学的試料から、FcRγ欠損NK細胞（g^-NK）である細胞のサブセットを増大させる工程を含むことができる。いくつかの態様において、本方法は、ヒト対象からの生物学的試料から、NKG2C^posであるNK細胞のサブセットを増大させる工程を含むことができる。いくつかの態様において、本方法は、ヒト対象からの生物学的試料から、NKG2A^negであるNK細胞のサブセットを増大させる工程を含むことができる。いくつかの態様において、本方法は、ヒト対象からの生物学的試料から、ナチュラルキラー（NK）細胞について濃縮された細胞の集団を単離し、それらの細胞を、g-NK細胞対象の優先的成長および/もしくは増大、ならびに/または細胞外表面マーカーがg-NK細胞サブセットと一部重複するか共通しているNK細胞サブセットの優先的成長および/もしくは増大が起こりうる条件下で培養する工程を含む。例えば、g-NK細胞対象の成長および/もしくは増大、ならびに/または細胞外表面マーカーがg-NK細胞サブセットと一部重複するか共通しているNK細胞サブセットの成長および/もしくは増大を増強するために、NK細胞をフィーダー細胞を使って、またはサイトカインの存在下で、培養しうる。いくつかの局面において、提供される方法は、NKG2C^posおよび/またはNKG2A^negである任意のNK細胞など、NK細胞の他のサブセットを増大させることもできる。

いくつかの態様において、試料、例えば生物学的試料は、NK細胞集団を含む複数の細胞集団を含有するものである。いくつかの態様において、生物学的試料は血液細胞、例えば末梢血単核球であるか、またはそれらを含む。いくつかの局面において、生物学的試料は全血試料、アフェレーシス産物または白血球アフェレーシス産物である。いくつかの態様において、試料は、末梢血単核球（PBMC）の試料である。したがって、提供される方法のいくつかの態様では、末梢血単核球（PBMC）の集団を取得することができる。NK細胞集団を含む複数の細胞集団を含有する試料は、提供される方法に従って増大用のNK細胞サブセットを濃縮または選択するための細胞として使用することができる。

いくつかの態様において、生物学的試料は、健康な対象である対象に由来する。いくつかの態様において、生物学的試料は、がんなどの状態の疾患を有する対象に由来する。

いくつかの態様において、細胞は、試料、例えば生物学的試料から、例えば対象、例えば特定の疾患または状態を有する対象、または細胞療法を必要とする対象もしくは細胞療法が投与されることになる対象から取得されまたはそれに由来する生物学的試料から、単離または選択される。いくつかの局面において、対象はヒト、例えば特定の治療的介入を必要とする患者、例えば養子細胞療法であってそのための細胞が単離、処理および/または操作されている療法を必要とする患者である対象である。したがって細胞は、いくつかの態様において、初代細胞、例えば初代ヒト細胞である。試料は、組織、体液、および対象から直接採取される他の試料を含む。生物学的試料は、生物学的供給源から直接取得される試料、または処理された試料であることができる。生物学的試料としては、体液、例えば血液、血漿、血清、脳脊髄液、滑液、尿および汗、組織および器官の試料が挙げられ、それらに由来する処理された試料も含まれるが、それらに限定されるわけではない。いくつかの局面において、試料は、血液もしくは血液由来の試料であるか、またはアフェレーシス産物もしくは白血球アフェレーシス産物であり、またはそれらに由来する。

いくつかの例では、対象の循環血から細胞が取得される。試料は、いくつかの局面において、NK細胞、T細胞、単球、顆粒球、B細胞を含むリンパ球、他の有核白血球、赤血球および/または血小板を含有し、いくつかの局面では、赤血球および血小板以外の細胞を含有する。いくつかの態様では、対象から収集された血液細胞が、例えば血漿画分を除去し、後続の処理工程にとって適当な緩衝液または培地に細胞を入れるために、洗浄される。いくつかの態様において、細胞はリン酸緩衝食塩水（PBS）で洗浄される。いくつかの態様において、洗浄溶液はカルシウムおよび/またはマグネシウムを欠き、かつ/または多くのもしくはあらゆる二価カチオンを欠く。一定の態様では、血液細胞試料の構成要素が取り出され、細胞が培養培地に直接懸濁される。いくつかの態様において、本方法は、密度ベースの細胞分離法、例えば赤血球を溶解し、PercollまたはFicoll勾配を使った遠心分離による、例えばHistopaque（登録商標）密度遠心分離を使用することによる、末梢血からの白血球の調製を含む。

いくつかの態様において、生物学的試料は、正常末梢血から収集された濃縮白血球アフェレーシス産物に由来する。いくつかの態様において、濃縮白血球アフェレーシス産物は新鮮細胞を含有することができる。いくつかの態様において、濃縮白血球アフェレーシス産物は、提供される方法において使用するために解凍される凍結保存試料である。

いくつかの態様において、生物学的細胞の供給源は、5×10⁵または約5×10⁵から、5×10⁸または約5×10⁸個のNK細胞、またはg-NK細胞サブセット、またはg-NK細胞のための代用マーカーと関連するかg-NK細胞のための代用マーカーを含むNK細胞サブセットを含有する。いくつかの態様において、生物学的試料中のNK細胞、またはg-NK細胞サブセット、またはg-NK細胞のための代用マーカーと関連するかg-NK細胞のための代用マーカーを含むNK細胞サブセットの数は、5×10⁵もしくは約5×10⁵から、1×10⁸もしくは約1×10⁸、5×10⁵もしくは約5×10⁵から、5×10⁷もしくは約5×10⁷、5×10⁵もしくは約5×10⁵から、1×10⁷もしくは約1×10⁷、5×10⁵もしくは約5×10⁵から、5×10⁶もしくは約5×10⁶、5×10⁵もしくは約5×10⁵から、1×10⁶もしくは約1×10⁶、1×10⁶もしくは約1×10⁶から、1×10⁸もしくは約1×10⁸、1×10⁶もしくは約1×10⁶から、5×10⁷もしくは約5×10⁷、1×10⁶もしくは約1×10⁶から、1×10⁷もしくは約1×10⁷、1×10⁶もしくは約1×10⁶から、5×10⁶もしくは約5×10⁶、5×10⁶もしくは約5×10⁶から、1×10⁸もしくは約1×10⁸、5×10⁶もしくは約5×10⁶から、5×10⁷もしくは約5×10⁷、5×10⁶もしくは約5×10⁶から、1×10⁷もしくは約1×10⁷、1×10⁷もしくは約1×10⁷から、1×10⁸もしくは約1×10⁸、1×10⁷もしくは約1×10⁷から、5×10⁷もしくは約5×10⁷または5×10⁷もしくは約5×10⁷から、1×10⁸もしくは約1×10⁸個である。

いくつかの態様において、生物学的試料中のNK細胞における、g-NK細胞の、またはg-NK細胞のための代用マーカーと関連するかもしくはそれを含むNK細胞サブセットの、パーセンテージは、3％超または約3％超である。いくつかの態様において、生物学的試料中のNK細胞における、g-NK細胞の、またはg-NK細胞のための代用マーカーと関連するかもしくはそれを含むNK細胞サブセットの、パーセンテージは、5％超または約5％超である。いくつかの態様において、生物学的試料中のNK細胞における、g-NK細胞の、またはg-NK細胞のための代用マーカーと関連するかもしくはそれを含むNK細胞サブセットの、パーセンテージは、10％超または約10％超である。いくつかの態様において、生物学的試料中のNK細胞における、g-NK細胞の、またはg-NK細胞のための代用マーカーと関連するかもしくはそれを含むNK細胞サブセットの、パーセンテージは、12％超または約12％超である。いくつかの態様において、生物学的試料中のNK細胞における、g-NK細胞の、またはg-NK細胞のための代用マーカーと関連するかもしくはそれを含むNK細胞サブセットの、パーセンテージは、14％超または約14％超である。いくつかの態様において、生物学的試料中のNK細胞における、g-NK細胞の、またはg-NK細胞のための代用マーカーと関連するかもしくはそれを含むNK細胞サブセットの、パーセンテージは、16％超または約16％超である。いくつかの態様において、生物学的試料中のNK細胞における、g-NK細胞の、またはg-NK細胞のための代用マーカーと関連するかもしくはそれを含むNK細胞サブセットの、パーセンテージは、18％超または約18％超である。いくつかの態様において、生物学的試料中のNK細胞における、g-NK細胞の、またはg-NK細胞のための代用マーカーと関連するかもしくはそれを含むNK細胞サブセットの、パーセンテージは、20％超または約20％超である。いくつかの態様において、生物学的試料中のNK細胞における、g-NK細胞の、またはg-NK細胞のための代用マーカーと関連するかもしくはそれを含むNK細胞サブセットの、パーセンテージは、22％超または約22％超である。いくつかの態様において、生物学的試料中のNK細胞における、g-NK細胞の、またはg-NK細胞のための代用マーカーと関連するかもしくはそれを含むNK細胞サブセットの、パーセンテージは、24％超または約24％超である。いくつかの態様において、生物学的試料中のNK細胞における、g-NK細胞の、またはg-NK細胞のための代用マーカーと関連するかもしくはそれを含むNK細胞サブセットの、パーセンテージは、26％超または約26％超である。いくつかの態様において、生物学的試料中のNK細胞における、g-NK細胞の、またはg-NK細胞のための代用マーカーと関連するかもしくはそれを含むNK細胞サブセットの、パーセンテージは、28％超または約28％超である。いくつかの態様において、生物学的試料中のNK細胞における、g-NK細胞の、またはg-NK細胞のための代用マーカーと関連するかもしくはそれを含むNK細胞サブセットの、パーセンテージは、30％超または約30％超である。

いくつかの態様において、対象は、生物学的試料中のNK細胞における、g-NK細胞の、またはg-NK細胞のための代用マーカーと関連するかもしくはそれを含むNK細胞サブセットの、パーセンテージが、3％超または約3％超であるなら、選択される。いくつかの態様において、対象は、生物学的試料中のNK細胞における、g-NK細胞の、またはg-NK細胞のための代用マーカーと関連するかもしくはそれを含むNK細胞サブセットの、パーセンテージが、5％超または約5％超であるなら、選択される。いくつかの態様において、対象は、生物学的試料中のNK細胞における、g-NK細胞の、またはg-NK細胞のための代用マーカーと関連するかもしくはそれを含むNK細胞サブセットの、パーセンテージが、10％超または約10％超であるなら、選択される。いくつかの態様において、対象は、生物学的試料中のNK細胞における、g-NK細胞の、またはg-NK細胞のための代用マーカーと関連するかもしくはそれを含むNK細胞サブセットの、パーセンテージが、12％超または約12％超であるなら、選択される。いくつかの態様において、対象は、生物学的試料中のNK細胞における、g-NK細胞の、またはg-NK細胞のための代用マーカーと関連するかもしくはそれを含むNK細胞サブセットの、パーセンテージが、14％超または約14％超であるなら、選択される。いくつかの態様において、対象は、生物学的試料中のNK細胞における、g-NK細胞の、またはg-NK細胞のための代用マーカーと関連するかもしくはそれを含むNK細胞サブセットの、パーセンテージが、16％超または約16％超であるなら、選択される。いくつかの態様において、対象は、生物学的試料中のNK細胞における、g-NK細胞の、またはg-NK細胞のための代用マーカーと関連するかもしくはそれを含むNK細胞サブセットの、パーセンテージが、18％超または約18％超であるなら、選択される。いくつかの態様において、対象は、生物学的試料中のNK細胞における、g-NK細胞の、またはg-NK細胞のための代用マーカーと関連するかもしくはそれを含むNK細胞サブセットの、パーセンテージが、20％超または約20％超であるなら、選択される。いくつかの態様において、対象は、生物学的試料中のNK細胞における、g-NK細胞の、またはg-NK細胞のための代用マーカーと関連するかもしくはそれを含むNK細胞サブセットの、パーセンテージが、22％超または約22％超であるなら、選択される。いくつかの態様において、対象は、生物学的試料中のNK細胞における、g-NK細胞の、またはg-NK細胞のための代用マーカーと関連するかもしくはそれを含むNK細胞サブセットの、パーセンテージが、24％超または約24％超であるなら、選択される。いくつかの態様において、対象は、生物学的試料中のNK細胞における、g-NK細胞の、またはg-NK細胞のための代用マーカーと関連するかもしくはそれを含むNK細胞サブセットの、パーセンテージが、26％超または約26％超であるなら、選択される。いくつかの態様において、対象は、生物学的試料中のNK細胞における、g-NK細胞の、またはg-NK細胞のための代用マーカーと関連するかもしくはそれを含むNK細胞サブセットの、パーセンテージが、28％超または約28％超であるなら、選択される。いくつかの態様において、対象は、生物学的試料中のNK細胞における、g-NK細胞の、またはg-NK細胞のための代用マーカーと関連するかもしくはそれを含むNK細胞サブセットの、パーセンテージが、30％超または約30％超であるなら、選択される。

いくつかの態様において、生物学的試料は、CMV血清陽性である対象に由来する。CMV感染はNK細胞の表現型と機能の分化をもたらすことができ、これには、増強された抗ウイルス活性を呈するNKG2C発現NK細胞の高い分率での発生が含まれる。NKG2Cを発現するCMV関連NK細胞は、改変されたDNAメチル化パターンを示し、FcRγなどのシグナリング分子の発現が低減している（Schlums et al.,Immunity（2015）42:443-56）。これらのNK細胞は、通常型NK細胞サブセットとの比較で、より強力な抗体依存的活性化、増大および機能に関連づけられる。FcRγの発現が低減しているNK細胞はCMV血清陰性個体でも、低レベルではあるものの、検出することができるので、場合により、生物学的試料はCMV血清陰性である対象に由来することができる。場合により、生物学的試料はCMV血清陽性個体に由来することができる。

いくつかの態様において、対象は、末梢血試料中の、NKG2Cについて陽性であるNK細胞のパーセンテージに基づいて選択される。いくつかの態様において、対象は、末梢血試料中のNK細胞の少なくとも20％または少なくとも約20％が、NKG2Cについて陽性であるなら、選択される。いくつかの態様において、対象は、末梢血試料中のNK細胞の少なくとも25％または少なくとも約25％が、NKG2Cについて陽性であるなら、選択される。いくつかの態様において、対象は、末梢血試料中のNK細胞の少なくとも30％または少なくとも約30％が、NKG2Cについて陽性であるなら、選択される。いくつかの態様において、対象は、末梢血試料中のNK細胞の少なくとも35％または少なくとも約35％が、NKG2Cについて陽性であるなら、選択される。いくつかの態様において、対象は、末梢血試料中のNK細胞の少なくとも40％または少なくとも約40％が、NKG2Cについて陽性であるなら、選択される。いくつかの態様において、対象は、末梢血試料中のNK細胞の少なくとも45％または少なくとも約45％が、NKG2Cについて陽性であるなら、選択される。いくつかの態様において、対象は、末梢血試料中のNK細胞の少なくとも50％または少なくとも約50％が、NKG2Cについて陽性であるなら、選択される。いくつかの態様において、対象は、末梢血試料中のNK細胞の少なくとも55％または少なくとも約55％が、NKG2Cについて陽性であるなら、選択される。いくつかの態様において、対象は、末梢血試料中のNK細胞の少なくとも60％または少なくとも約60％が、NKG2Cについて陽性であるなら、選択される。

いくつかの態様において、対象は、末梢血試料中の、NKG2Aについて陰性もしくは低発現であるNK細胞のパーセンテージに基づいて選択される。いくつかの態様において、対象は、末梢血試料中のNK細胞の少なくとも70％または少なくとも約70％が、NKG2Aについて陰性または低発現であるなら、選択される。いくつかの態様において、対象は、末梢血試料中のNK細胞の少なくとも75％または少なくとも約75％が、NKG2Aについて陰性または低発現であるなら、選択される。いくつかの態様において、対象は、末梢血試料中のNK細胞の少なくとも80％または少なくとも約80％が、NKG2Aについて陰性または低発現であるなら、選択される。いくつかの態様において、対象は、末梢血試料中のNK細胞の少なくとも85％または少なくとも約85％が、NKG2Aについて陰性または低発現であるなら、選択される。いくつかの態様において、対象は、末梢血試料中のNK細胞の少なくとも90％または少なくとも約90％が、NKG2Aについて陰性または低発現であるなら、選択される。

いくつかの態様において、対象は、末梢血試料中の、NKG2Cについて陽性であるNK細胞のパーセンテージと、末梢血試料中の、NKG2Aについて陰性もしくは低発現であるNK細胞のパーセンテージとの、両方に基づいて選択される。いくつかの態様において、対象は、末梢血試料中のNK細胞の少なくとも20％または少なくとも約20％が、NKG2Cについて陽性であり、かつ末梢血試料のNK細胞の少なくとも70％または少なくとも約70％が、NKG2Aについて陰性もしくは低発現であるなら、選択される。いくつかの態様において、対象は、末梢血試料中のNK細胞の少なくとも30％または少なくとも約30％が、NKG2Cについて陽性であり、かつ末梢血試料のNK細胞の少なくとも75％または少なくとも約75％が、NKG2Aについて陰性もしくは低発現であるなら、選択される。いくつかの態様において、対象は、末梢血試料中のNK細胞の少なくとも40％または少なくとも約40％が、NKG2Cについて陽性であり、かつ末梢血試料のNK細胞の少なくとも80％または少なくとも約80％が、NKG2Aについて陰性もしくは低発現であるなら、選択される。いくつかの態様において、対象は、末梢血試料中のNK細胞の少なくとも50％または少なくとも約50％が、NKG2Cについて陽性であり、かつ末梢血試料のNK細胞の少なくとも85％または少なくとも約85％が、NKG2Aについて陰性もしくは低発現であるなら、選択される。いくつかの態様において、対象は、末梢血試料中のNK細胞の少なくとも60％または少なくとも約60％が、NKG2Cについて陽性であり、かつ末梢血試料のNK細胞の少なくとも90％または少なくとも約90％が、NKG2Aについて陰性もしくは低発現であるなら、選択される。いくつかの態様において、対象は、末梢血試料中のNK細胞の少なくとも60％または少なくとも約60％が、NKG2Cについて陽性であり、かつ末梢血試料のNK細胞の少なくとも95％または少なくとも約95％が、NKG2Aについて陰性もしくは低発現であるなら、選択される。

いくつかの態様において、対象は、対象がCMV血清陽性であり、かつ対象からの末梢血試料中のNK細胞において、g-NK細胞のパーセンテージが30％超または約30％超であり、NKG2C^pos細胞のパーセンテージが20％超または約20％超であり、NKG2A^neg細胞のパーセンテージが70％超または約70％超であるなら、提供される方法による細胞の増大のために選択される。

いくつかの態様において、対象からのNK細胞は、CD16遺伝子中に一塩基多型（SNP rs396991）、成熟（プロセシングされた）型のタンパク質の158番目のフェニルアラニン（F）のバリン（V）によるアミノ酸（aa）置換（F158V）をもたらすヌクレオチド526［チミジン（T）→グアニン（G）］を保持する。いくつかの態様において、NK細胞は、両方のアレルにCD16 158V多型を保持する（本明細書ではこれを158V/Vという）。いくつかの態様において、NK細胞は、単一のアレルにCD16 158V多型を保持する（本明細書ではこれを158V/Fという）。本明細書における158V+遺伝子型への言及は、158V/V遺伝子型と158V/F遺伝子型との両方を指すと理解される。CD16 F158V多型はIgG1抗体に対する実質的に高い親和性と関連し、よりロバストなNK細胞媒介性ADCC応答を惹起することができることが見いだされている（Mellor et al.（2013）Journal of Hematology＆Oncology,6:1、Musolino et al.（2008）Journal of Clinical Oncology,26:1789-1796およびHatjiharissi et al.（2007）Blood,110:2561-2564）。いくつかの態様において、CD16 158V+/g-NK細胞の抗体指向性ターゲティングは、CD16 158V+/g-NK細胞サブセットの改良された親和性、細胞傷害性および/またはサイトカイン媒介性エフェクト機能により、患者にとって改良されたアウトカムにつながる。

いくつかの態様において、提供される方法は、CD16 158V+NK細胞遺伝子型を有すると同定された対象の生物学的試料から、NK細胞またはそのサブセットを濃縮または単離する工程を含む。いくつかの態様において、本方法は、CD16 158V+NK細胞遺伝子型の存在について対象をスクリーニングする工程を含む。いくつかの態様において、ゲノムDNAは、NK細胞であるかそれらを含む対象からの試料、例えば血液試料または骨髄試料から抽出される。いくつかの態様において、試料は血液細胞、例えば末梢血単核球であるか、またはそれらを含む。いくつかの態様において、試料は単離されたNK細胞であるか、またはそれらを含む。いくつかの態様において、試料は健康なドナー対象からの試料である。試料からDNAを抽出するための任意の方法を使用することができる。例えば核酸は、試料、例えば細胞から、グアニジウムチオシアネート-フェノール-クロロホルム抽出（Chomocyznski et al.（1987）Anal. Biochem. 162:156）などの標準的技法を使って、容易に単離することができる。WizardゲノムDNA精製キット（Promega、ウィスコンシン州マディソン）など、ゲノムDNAを抽出するための市販のキットも、容易に入手することができる。

ジェノタイピングは任意の適切な試料で行うことができる。本明細書に記載する態様のいずれにおいても、ジェノタイピング反応は、例えばパイロシーケンシング反応、DNAシーケンシング反応、MassARRAY MALDI-TOF、RFLP、アレル特異的PCR、リアルタイムアレル識別、またはマイクロアレイであることができる。いくつかの態様において、ゲノムDNAのPCRベースの技法、例えばRT-PCRは、多型に関してアレル特異的なプライマーを使って実行される。試料中の標的核酸配列を増幅するためのPCR法は当技術分野では周知であり、例えばInnis et al.（eds.）PCR Protocols（Academic Press,NY 1990）、「PCR:A Practical Approach」（McPherson et al.（eds.）IRL Press,オックスフォード）のTaylor（1991）「Polymerase chain reaction:basic principles and automation」、Saiki et al.（1986）Nature 324:163、ならびに米国特許第4,683,195号、同第4,683,202号および同第4,889,818号などに記載されており、これらはすべて参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。

158V+多型を検出するためのプライマーは公知であるか、当業者であれば容易に設計することができる。例えば国際公開公報WO2012/061814、Kim et al.（2006）Blood,108:2720-2725、Cartron et al.（2002）Blood,99:754-758、Koene et al.（1997）Blood,90:1109-1114、Hatijiharissi et al.（2007）Blood,110:2561-2564、Somboonyosdech et al.（2012）Asian Biomedicine,6:883-889）を参照されたい。いくつかの態様では、ネステッドプライマーを使ってPCRを行った後、アレル特異的制限酵素消化を行うことができる。いくつかの態様において、第1PCRプライマーは核酸配列

を含み、一方、第2PCRプライマーは

である。これは、場合により、アレルの性質に依存して、94bpフラグメントを生成させる。いくつかの態様において、プライマーペアは、

に示す核酸配列を含む。いくつかの態様において、プライマーペアは、

に示す核酸配列を含む。いくつかの態様において、ジェノタイピングは以下のプライマー配列を使って、RNAの抽出に続く定量的リアルタイムRT-PCRによって実行することができる:

に示すCD16センスおよび

に示すアンチセンス、ならびに

に示すTaqManプローブ。

ジェノタイピングを確認するために、Vアレル特異的プライマー（例えば、SEQ ID NO:13に示すフォワードプライマー

、およびSEQ ID NO:14に示すリバースプライマー

）またはFアレル特異的プライマー（例えば、SEQ ID NO:15に示すフォワードプライマー

、およびSEQ ID NO:14に示すリバースプライマー

）によるアレル特異的増幅を使用することができる。

CD16aのゲノム配列はNCBIデータベースのNG＿009066.1で入手できる。CD16Aの遺伝子IDは2214である。CD16に関する配列情報は、遺伝子多型を含めて、UniProtアクセッション番号P08637で入手できる。CD16（F158）の配列をSEQ ID NO:16に示す（残基F158を太字にして下線を付す）。いくつかの態様において、CD16（F158）は、

として示されるシグナルペプチドを、さらに含む。

CD16 158V+（F158Vをもたらす多型）の配列はVAR＿003960として公知であり、SEQ ID NO:18に示す配列を有する（158V+多型を太字にして下線を付す）。いくつかの態様において、CD16（158V+）は、

として示されるシグナルペプチドを、さらに含む。

いくつかの態様では、特異的一塩基多型（SNP）標的を検出するために、5’端に蛍光色素標識（例えばFAMまたはVIC）を含有し、3’端に副溝バインダー（MGB）および非蛍光クエンチャー（nonfluorescent quencher）（NFQ）を含有するアレル特異的プローブと、非標識PCRプライマーとを使用するSNP解析が、ゲノムデオキシリボ核酸（DNA）試料に対して使用される。いくつかの態様において、このアッセイは、プローブに付随する色素の蛍光の変化によって、SNPの存在を測定または検出する。そのような態様では、プローブが2つの非標識プライマー間で標的DNAにハイブリダイズし、5’端の蛍光色素からのシグナルを、その3’端のNFQが、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）によって消光する。PCR中は、Taqポリメラーゼがテンプレートをガイドとして使用して非標識プライマーを伸長し、ポリメラーゼが標識されたプローブに到達すると、それはその分子を切断して色素をクエンチャーから分離する。いくつかの局面において、qPCR機器は、消光されていない標識からの蛍光を検出することができる。例示的試薬は市販のSNPアッセイ、例えばrs396991用のコードC＿25815666＿10（Applied Biosystems、カタログ番号4351379、CD16中のF158VのSNPジェノタイピング用）である。

いくつかの態様では、CD16 158V+（F158V）多型についてヘテロ接合またはホモ接合の対象が同定される。いくつかの態様では、CD16 158V+（F158V）多型についてホモ接合の対象が同定される。いくつかの態様では、NK細胞またはNK細胞サブセットが、CD16 158V多型についてヘテロ接合またはホモ接合であると同定された対象からの生物学的試料から単離され、または濃縮される。いくつかの態様では、NK細胞またはNK細胞サブセットが、CD16 158V多型についてホモ接合であると同定された対象からの生物学的試料から単離され、または濃縮される。

いくつかの態様において、本方法は、生物学的試料、例えば対象から単離または取得されたPBMCの集団から、NK細胞を濃縮する工程を含む。いくつかの態様において、NK細胞について濃縮された細胞集団は、1種または複数種のナチュラルキラー細胞特異的マーカーに基づく単離または選択によって濃縮される。特定のマーカーまたは表面マーカーの組み合わせを選ぶことは当業者の水準内にある。いくつかの態様において、表面マーカーは、以下の表面抗原のうちの任意の1つまたは複数である:CD11a、CD3、CD7、CD14、CD16、CD19、CD25、CD27、CD56、CD57、CD161、CD226、NKB1、CD62L、CD244、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2A、NKG2C、KIR2DL1および/またはKIR2DL3。いくつかの態様において、表面マーカーは、以下の表面抗原のうちの任意の1つまたは複数である:CD11a、CD3、CD7、CD14、CD16、CD19、CD25、CD27、CD38 CD56、CD57、CD161、CD226、NKB1、CD62L、CD244、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2A、NKG2C、SLAMF7（CD319）、KIR2DL1および/またはKIR2DL3。特定の態様において、1種または複数種の表面抗原は、CD3と、以下の表面抗原CD16、CD56またはCD57のうちの1種または複数種とを含む。いくつかの態様において、1種または複数種の表面抗原はCD3およびCD57である。いくつかの態様において、1種または複数種の表面抗原はCD3、CD56およびCD16である。他の態様において、1種または複数種の表面抗原はCD3、CD56およびCD38である。さらなる態様において、1種または複数種の表面抗原はCD3、CD56、NKG2AおよびCD161である。いくつかの態様において、前記1種または複数種の表面抗原は、CD3、CD57およびNKG2Cである。いくつかの態様において、前記1種または複数種の表面抗原は、CD3、CD57およびNKG2Aである。いくつかの態様において、前記1種または複数種の表面抗原は、CD3、CD57、NKG2CおよびNKG2Aである。いくつかの態様において、前記1種または複数種の表面抗原は、CD3およびCD56である。いくつかの態様において、前記1種または複数種の表面抗原は、CD3、CD56およびNKG2Cである。いくつかの態様において、前記1種または複数種の表面抗原は、CD3、CD56およびNKG2Aである。いくつかの態様において、前記1種または複数種の表面抗原は、CD3、CD56、NKG2CおよびNKG2Aである。そのような表面抗原を検出するための作用物質は、蛍光色素コンジュゲート抗体を含めて、当業者には周知であり、利用可能である。

いくつかの態様において、提供される方法によって試料から、例えば単離または選択などにより、濃縮されるNK細胞集団は、1種もしくは複数種の特定マーカー、例えば表面マーカーについて陽性である細胞（マーカー+またはマーカー^pos）、または高レベルの1種もしくは複数種の特定マーカー、例えば表面マーカーを発現する細胞（マーカー^high）であるか、または1種もしくは複数種のマーカーについて陰性である細胞、または相対的に低レベルの1種もしくは複数種のマーカーを発現する細胞（マーカー-またはマーカー^neg）である。したがって、細胞上にまたは細胞中で発現するマーカーまたはタンパク質に関して、陽性、posまたは+という用語は、本明細書では相互可換的に使用されると理解される。同様に、細胞上にまたは細胞中で発現するマーカーまたはタンパク質に関して、陰性、negまたは-という用語は、本明細書では相互可換的に使用されると理解される。さらに、本明細書におけるマーカー^negである細胞への言及は、そのマーカーについて陰性である細胞と、そのマーカーを比較的低レベルに、例えば対照またはバックグラウンドレベルと比較して容易には検出できないであろう低レベルに、発現する細胞とを指しうると理解される。場合により、そのようなマーカーは、NK細胞の一定の集団には存在しないか相対的に低レベルに発現するが、リンパ球の他の一定の集団（T細胞など）には存在しまたは相対的に高レベルに発現するものである。場合により、そのようなマーカーは、NK細胞の一定の集団には存在しまたは相対的に高レベルに発現するが、リンパ球の他の一定の集団（T細胞またはそのサブセットなど）には存在しないか相対的に低レベルに発現するものである。

いくつかの態様では、そのようなマーカーに基づく公知の分離方法をいずれも使用しうる。いくつかの態様において、分離は、親和性に基づくまたは免疫親和性に基づく分離である。例えば分離は、いくつかの局面において、1種または複数種のマーカー、典型的には細胞表面マーカーの発現または発現レベルに基づく、例えば当該マーカーに特異的に結合する抗体または結合パートナーとのインキュベーションと、それに続く、一般的には洗浄工程および前記抗体または結合パートナーに結合している細胞の、前記抗体または結合パートナーに結合していない細胞からの分離とによる、細胞および細胞集団の分離を含む。いくつかの態様において、インキュベーションは静的（混合なし）である。いくつかの態様において、インキュベーションは動的（混合あり）である。

そのような分離工程は、試薬に結合した細胞がさらなる使用のために保持される正の選択に基づくか、または抗体もしくは結合パートナーに結合していない細胞が保持される負の選択に基づくことができる。いくつかの例では、両方の画分がさらなる使用のために保持される。分離が、特定細胞集団または特定マーカーを発現する細胞の100％の濃縮または除去をもたらす必要はない。例えば、特定タイプの細胞、例えばあるマーカーを発現する細胞についての正の選択または濃縮とは、そのような細胞の数またはパーセンテージを増加させることを指すが、そのマーカーを発現しない細胞の完全な欠如をもたらす必要はない。同様に、特定タイプの細胞、例えばあるマーカーを発現する細胞の負の選択、除去または枯渇とは、そのような細胞の数またはパーセンテージを減少させることを指すが、すべてのそのような細胞の完全な除去をもたらす必要はない。例えばいくつかの局面において、CD3に関する負の選択は、CD3^negである細胞の集団を濃縮するが、多少の残余または小さなパーセンテージの他の選択されなかった細胞も含有することができ、場合によっては、CD3^posである濃縮された集団中に依然として存在する小さなパーセンテージの細胞を含むことができる。いくつかの例において、CD57^posまたはCD16^pos集団の正の選択は、当該集団、すなわちCD57^pos集団またはCD16^pos集団のどちらか一方を濃縮するが、多少の残余または小さなパーセンテージの選択されなかった他の細胞も含有することができ、場合によっては、濃縮された集団中に依然として存在するCD57集団またはCD16集団のうちの他方を含有することができる。

いくつかの例では、複数ラウンドの分離工程が実行され、この場合は、ある工程からの正または負に選択された画分が、別の分離工程、例えば後続の正または負の選択に供される。いくつかの例では、細胞を、それぞれが負の選択のための標的となるマーカーに特異的な複数の抗体または結合パートナーと共にインキュベートすることなどにより、単一の分離工程で、複数のマーカーを発現する細胞を同時に枯渇させることができる。同様に、細胞を、さまざまな細胞タイプ上に発現する複数の抗体または結合パートナーと共にインキュベートすることにより、複数の細胞タイプを同時に正に選択することもできる。

いくつかの局面において、選択は、例えばPBMC試料からの細胞などにおける、表面抗原のうちの1種または複数種の発現に基づく正および/または負の選択工程を含む。いくつかの態様において、単離は、CD56を発現する細胞、CD16を発現する細胞もしくはCD57を発現する細胞の正の選択、および/またはCD38を発現する細胞の負の選択、および/または非NK細胞マーカー、例えばT細胞マーカーを発現する細胞の負の選択、例えばCD3を発現する細胞の負の選択（CD3^neg）を含む。例えばいくつかの態様において、単離は、CD56を発現する細胞、CD16を発現する細胞もしくはCD57を発現する細胞の正の選択、および/または非NK細胞マーカー、例えばT細胞マーカーを発現する細胞の負の選択、例えばCD3を発現する細胞の負の選択（CD3^neg）を含む。いくつかの態様において、単離は、CD56を発現する細胞、CD16を発現する細胞もしくはCD57を発現する細胞の正の選択、および/またはCD38（CD38^neg）、CD161（CD161^neg）、NKG2A（NKG2A^neg）を発現する細胞の負の選択、および/またはCD3を発現する細胞の負の選択（CD3^neg）を含む。いくつかの態様において選択はCD3陰性（CD3^neg）である細胞の単離を含む。

いくつかの態様において、単離は、CD3を発現する細胞の負の選択（CD3^neg）およびCD56を発現する細胞の正の選択（CD56^pos）を含む。いくつかの態様において、選択は、CD38を発現する細胞の負の選択（CD38^neg）をさらに含むことができる。特定の態様において、単離または選択される細胞はCD3^negCD56^posCD38^negである。

いくつかの態様において、選択は、CD3を発現する細胞の負の選択（CD3^neg）、CD56を発現する細胞の正の選択（CD56^pos）と、それに続くNKG2A（NKG2A^neg）およびCD161（CD161^neg）を発現する細胞の負の選択を含む。特定の態様において、単離または選択される細胞はCD3^negCD56^posNKG2A^negCD161^negである。

いくつかの態様において、選択は、CD3を発現する細胞の負の選択（CD3^neg）およびCD57を発現する細胞の正の選択（CD57^pos）を含む。特定の態様において、単離または選択される細胞はCD3^negCD57^posである。

いくつかの態様において、選択は、CD3を発現する細胞の負の選択（CD3^neg）およびCD16を発現する細胞の正の選択（CD16^pos）を含む。特定の態様において、単離または選択される細胞はCD3^negCD16^posである。

いくつかの態様において、選択は、CD3を発現する細胞の負の選択（CD3^neg）およびCD57を発現する細胞の正の選択（CD57^pos）を含む。特定の態様において、単離または選択される細胞はCD3^negCD57^posである。例えばNK細胞は、CD3^pos細胞の枯渇（CD3^pos細胞に関する負の選択）と、それに続くCD57^pos細胞選択とを行い、これにより、CD57^posNK細胞を単離および濃縮することによって、濃縮されうる。分離は、免疫親和性に基づく方法により、例えばMACS（商標）マイクロビーズを使って、実行することができる。例えばCD3マイクロビーズは、CD3^neg細胞に関する負の選択において、CD3^pos細胞を枯渇させるために使用することができる。続いて、CD57マイクロビーズを、CD3細胞枯渇PBMCのCD57濃縮に使用することができる。CD3^neg/CD57^pos濃縮NK細胞は、次に、提供される方法における増大に使用することができる。

いくつかの態様において、選択は、NKG2Cを発現する細胞に関する正の選択（NKG2C^pos）および/またはNKG2Aを発現する細胞に関する負の選択（NKG2A^neg）を、さらに含みうる。いくつかの態様において、選択は、CD3を発現する細胞に関する負の選択（CD3^neg）、CD57を発現する細胞に関する正の選択（CD57^pos）、およびNKG2Cを発現する細胞に関する正の選択（NKG2C^pos）を含む。特定の態様において、単離または選択される細胞はCD3^negCD57^posNKG2C^posである。いくつかの態様において、選択は、CD3を発現する細胞に関する負の選択（CD3^neg）、CD57を発現する細胞に関する正の選択（CD57^pos）、およびNKG2Aを発現する細胞に関する負の選択（NKG2A^neg）を含む。特定の態様において、単離または選択される細胞はCD3^negCD57^posNKG2A^negである。いくつかの態様において、選択は、CD3を発現する細胞に関する負の選択（CD3^neg）、CD57を発現する細胞に関する正の選択（CD57^pos）、NKG2Cを発現する細胞に関する正の選択（NKG2C^pos）、およびNKG2Aを発現する細胞に関する負の選択（NKG2A^neg）を含む。特定の態様において、単離または選択される細胞はCD3^negCD57^posNKG2C^posNKG2A^negである。

提供される態様のいずれかの一部において、選択は、CD38を発現する細胞に関する負の選択（CD38^neg）をさらに含むことができる。特定の態様において、単離または選択される細胞はCD3^negCD57^posCD38^negである。特定の態様において、単離または選択される細胞はCD3^negCD57^posCD38^negNKG2C^posである。特定の態様において、単離または選択される細胞はCD3^negCD57^posCD38^negNKG2A^negである。特定の態様において、単離または選択される細胞はCD3^negCD57^posCD38^negNKG2C^posNKG2A^negである。

いくつかの態様において、選択は、CD3を発現する細胞に関する負の選択（CD3^neg）およびCD56を発現する細胞に関する正の選択（CD56^pos）を含む。特定の態様において、単離または選択される細胞はCD3^negCD56^posを含む。いくつかの態様において、選択は、CD3を発現する細胞に関する負の選択（CD3^neg）、CD56を発現する細胞に関する正の選択（CD56^pos）、およびNKG2Cを発現する細胞に関する正の選択（NKG2C^pos）を含む。特定の態様において、単離または選択される細胞はCD3^negCD56^posNKG2C^posである。いくつかの態様において、選択は、CD3を発現する細胞に関する負の選択（CD3^neg）、CD56を発現する細胞に関する正の選択（CD56^pos）、およびNKG2Aを発現する細胞に関する負の選択（NKG2A^neg）を含む。特定の態様において、単離または選択される細胞はCD3^negCD56^posNKG2A^negである。いくつかの態様において、選択は、CD3を発現する細胞に関する負の選択（CD3^neg）、CD56を発現する細胞に関する正の選択（CD56^pos）、NKG2Cを発現する細胞に関する正の選択（NKG2C^pos）、およびNKG2Aを発現する細胞に関する負の選択（NKG2A^neg）を含む。特定の態様において、単離または選択される細胞はCD3^negCD56^posNKG2C^posNKG2A^negである。

提供される態様のいずれかの一部において、選択は、CD38を発現する細胞に関する負の選択（CD38^neg）をさらに含むことができる。特定の態様において、単離または選択される細胞はCD3^negCD56^posCD38^negである。特定の態様において、単離または選択される細胞はCD3^negCD56^posCD38^negNKG2C^posである。特定の態様において、単離または選択される細胞はCD3^negCD56^posCD38^negNKG2A^negである。特定の態様において、単離または選択される細胞はCD3^negCD56^posCD38^negNKG2C^posNKG2A^negである。

提供される態様のいずれかの一部において、g-NK細胞は、g-NK代用表面マーカープロファイルを有する細胞である。いくつかの態様において、g-NK細胞代用表面マーカープロファイルはCD16^pos/CD57^pos/CD7^dim/neg/CD161^negである。いくつかの態様において、g-NK細胞代用表面マーカープロファイルはNKG2A^neg/CD161^negである。任意のそのような態様の一部において、g-NK細胞代用表面マーカープロファイルはCD38^negである。任意のそのような態様の一部では、CD45^pos/CD3^neg/CD56^posが、NK細胞のための代用表面マーカープロファイルとして使用される。任意のそのような態様の一部において、g-NK細胞代用表面マーカープロファイルは、NK細胞代用表面マーカープロファイルをさらに含む。任意のそのような態様の一部において、g-NK細胞代用表面マーカープロファイルはCD45^pos/CD3^neg/CD56^posをさらに含む。特定の態様において、g-NK細胞代用表面マーカープロファイルはCD45^pos/CD3^neg/CD56^pos/CD16^pos/CD57^pos/CD7^dim/neg/CD161^negを含む。別の特定態様において、g-NK細胞代用表面マーカープロファイルはCD45^pos/CD3^neg/CD56^pos/NKG2A^neg/CD161^negを含む。別の特定態様において、g-NK細胞代用表面マーカープロファイルはCD45^pos/CD3^neg/CD56^pos/CD38^negを含む。

いくつかの態様において、細胞を、例えば1種または複数種の細胞表面マーカーの発現に基づく正の選択または負の選択などによって、単離、選択および/または濃縮する方法は、免疫親和性に基づく選択を含むことができる。いくつかの態様において、免疫親和性に基づく選択は、PBMCなどの細胞を含有する試料を、1種または複数種の細胞表面マーカーに特異的に結合する抗体または結合パートナーと接触させる工程を含む。いくつかの態様では、正の選択および/または負の選択のための細胞の分離が可能になるように、抗体または結合パートナーは、固形支持体またはマトリックス、例えば球体またはビーズ、例えばアガロースを含むマイクロビーズ、ナノビーズ、磁気ビーズまたは常磁性ビーズに結合される。いくつかの態様において、球体またはビーズは、免疫親和性クロマトグラフィーを達成するためにカラムに充填することができ、この場合は、PBMCなどの細胞を含有する試料をカラムのマトリックスと接触させ、次に、そこから溶出または遊離させる。

インキュベーションは、一般的には、磁気粒子または磁気ビーズに取り付けられた、そのような抗体または結合パートナーに特異的に結合する抗体または結合パートナーが、試料内の細胞上に細胞表面分子がもし存在するのであれば、それに特異的に結合するような条件下で、実行される。

いくつかの局面では、試料を磁場に置くと、磁気応答性粒子または磁化可能粒子が取り付けられた細胞は磁石に引き寄せされ、非標識細胞から分離されることになる。正の選択の場合は、磁石に引き寄せられた細胞が保持され、負の選択の場合は引き寄せられなかった細胞（非標識細胞）が保持される。いくつかの局面では、同じ選択工程中に正の選択と負の選択の組み合わせが行われ、その場合は、正の画分と負の画分が保持されて、さらに処理されるか、さらなる分離工程に供される。

いくつかの態様では、続いてインキュベートおよび/または培養される細胞に磁気応答性粒子を取り付けたままにしておき、いくつかの局面では、患者に投与される細胞に粒子を取り付けたままにしておく。いくつかの態様では、磁化可能粒子または磁気応答性粒子が細胞から除去される。磁化可能粒子を細胞から除去するための方法は公知であり、例えば競合非標識抗体、切断可能リンカーにコンジュゲートされた磁化可能粒子または抗体の使用が挙げられる。いくつかの態様において、磁化可能粒子は生分解性である。

いくつかの態様において、親和性に基づく選択は、磁気活性化細胞選別（magnetic-activated cell sorting）（MACS）（Miltenyi Biotech、カリフォルニア州オーバーン）による。磁気活性化細胞選別（MACS）システムでは、磁化粒子が取り付けられている細胞の高純度選択が可能である。一定の態様において、MACSは、外部磁場の適用後に非標的種と標的種とを逐次的に溶出させるモードで作動する。すなわち、磁化粒子に取り付けられた細胞は、取り付けられていない種が溶出される間は、その場に保持される。次に、この第1溶出工程が完了した後に、磁場に捕捉されて溶出が妨げられていた種が、それらを溶出させ回収することができるように、何らかの方法で解放される。一定の態様では、非標的細胞を標識して、不均一な細胞集団から枯渇させる。

そのような態様のいずれかの一部において、本方法は、NK細胞またはそのサブセットを、濃縮、例えば選択しおよび/または単離する前に、IL-12、IL-15、IL-18、IL-2および/またはCCL5を対象に投与する工程を含む。

提供される方法の諸態様において、濃縮NK細胞はフィーダー細胞の存在下で、例えばNK細胞サブセットの、特にg-NK細胞サブセットの、増殖および増大を支援するための条件下で、インキュベートまたは培養される。

特定局面において、フィーダー細胞は、NKG2C^pos細胞の増大を刺激もしくは促進しおよび/またはNKG2A^pos細胞の増大を抑制する細胞を含む。いくつかの態様において、フィーダー細胞は、HLA-EまたはHLA-A2シグナル配列を含有するハイブリッドHLA-Eを発現しまたはトランスフェクトされた細胞である。例えば、そのようなハイブリッドの典型例は、HLA-A2などのMHCクラスIプロモーターおよびシグナル配列、ならびにHLA-E成熟タンパク質配列を含有するAEHハイブリッド遺伝子であり、これは、場合によっては、HLA-E遺伝子がコードするものと同一であるが、細胞表面上に安定に発現されうる成熟タンパク質をもたらすことができる（例えばLee et al.（1998）Journal of Immunology,160:4951-4960参照）。いくつかの態様において、細胞は、HLA-A2などのMHCクラスIリーダー配列の存在下で安定化されたMHC-E分子を発現するようにトランスフェクトされたLCL 721.221、K562細胞またはRMA-S細胞である。HLA-A2などのMHCクラスIリーダー配列ペプチドの存在下で安定化された細胞表面HLA-Eを発現するように工学的に操作された細胞株は、当技術分野において公知である（Lee et al.（1998）Journal of Immunology,160:4951-4960、Zhongguo et al.（2005）13:464-467、Garcia et al.（2002）Eur J. Immunol.,32:936-944）。いくつかの態様では、221.AEH細胞、例えば照射221.AEH細胞、または本来であればHLA陰性であるK562などの他の任意のHLA-E発現細胞株もしくは照射HLA-E発現細胞株を、フィーダー細胞として使用することができる。いくつかの態様において、細胞株はHLA-Eを発現するようにトランスフェクトすることができる。いくつかの態様では、膜結合型IL-15（K562-mb15）または膜結合型IL-21（K562-mb21）を発現するK562細胞を、フィーダー細胞として使用することができる。本明細書において提供される方法において使用するためのそのような細胞株の典型例は、221-AEH細胞である。

諸態様において、HLA発現フィーダー細胞は凍結保存され、使用前に解凍される。いくつかの態様において、細胞がHLA-Eを発現するようにトランスフェクトされている場合、例えば221.AEH細胞の場合、細胞は、本方法におけるそれらの使用に先立って、例えば血清または他の適当な血清代替品を含む適当な栄養素および選択剤の存在下で成長させることができる。例えば、221.AEH細胞の場合、高レベルのプラスミドHLA-Eを維持するための、細胞に対する選択圧が維持されるように、ハイグロマイシンB（例えば0.1％～10％、例えば1％または約1％）を補足した細胞培養培地において、細胞を培養することができる。細胞は、使用するまで、1×10⁵細胞/mL～1×10⁶細胞/mLの密度で維持することができる。

特定の態様において、培養に加えられるHLA-E発現フィーダー細胞、例えば221.AEH細胞は、例えばX線照射またはガンマ照射などにより、非分裂性である。HLA-E発現フィーダー細胞、例えば221.AEHは、提供される方法におけるそれらの使用の日にまたは使用直前に、照射することができる。いくつかの態様において、HLA-E発現フィーダー細胞には、細胞分裂を阻止するために、約1000～10000ラド、例えば1000～5000ラドの範囲のガンマ線が照射される。いくつかの態様において、HLA-E発現フィーダー細胞には、細胞分裂を阻止するために、約10Gy～100Gy、例えば10～50Gyの範囲のガンマ線が照射される。いくつかの態様において、細胞は100Gyで照射される。別の態様において、照射はx線照射によって実行される。いくつかの態様において、HLA-E発現フィーダー細胞には、細胞分裂を阻止するために、約10Gy～100Gy、例えば10～50Gyの範囲のx線が照射される。いくつかの態様では、明確な視覚による照射の確認を提供するために、A Rad-Sure（商標）血液照射用インジケータ（blood irradiation indicator）を使用することができる。提供される方法の諸局面において、フィーダー細胞は決して除去されず、照射の結果として、NK細胞は、フィーダー細胞に対して直接的に細胞傷害性であり、フィーダー細胞は増大の期間中に死ぬことになる。

いくつかの態様において、濃縮され、選択されおよび/または単離されたNK細胞は、HLA-E発現フィーダー細胞（例えば221.AEH細胞）、例えば照射されたその集団の存在下、1:10超または約1:10超のHLA-Eフィーダー細胞（例えば221.AEH細胞）、例えば照射されたその集団、対濃縮NK細胞である、フィーダー細胞対濃縮NK細胞の比で、例えば1:10または約1:10から、10:1または約10:1の前記フィーダー細胞対濃縮NK細胞で、インキュベートまたは培養される。

いくつかの態様において、HLA-E発現フィーダー細胞（例えば221.AEH細胞）、例えば照射されたその集団の比は、1:10もしくは約1:10から、10:1もしくは約10:1、1:10もしくは約1:10から、5:1もしくは約5:1、1:10もしくは約1:10から、2.5:1もしくは約2.5:1、1:10もしくは約1:10から、1:1もしくは約1:1、1:10もしくは約1:10から、1:2.5もしくは約1:2.5、1:10もしくは約1:10から、1:5もしくは約1:5、1:5もしくは約1:5から、10:1もしくは約10:1、1:5もしくは約1:5から、5:1もしくは約5:1、1:5もしくは約1:5から、2.5:1もしくは約2.5:1、1:5もしくは約1:5から、1:1もしくは約1:1、1:5もしくは約1:5から、1:2.5もしくは約1:2.5、1:2.5もしくは約1:2.5から、10:1もしくは約10:1、1:2.5もしくは約1:2.5から、5:1もしくは約5:1、1:2.5もしくは約1:2.5から、2.5:1もしくは約2.5:1、1:2.5もしくは約1:2.5から、1:1もしくは約1:1、1:1もしくは約1:1から、10:1もしくは約10:1、1:1もしくは約1:1から、5:1もしくは約5:1、1:1もしくは約1:1から、3:1もしくは約3:1、1:1もしくは約1:1から、2.5:1もしくは約2.5:1、2.5:1もしくは約2.5:1から、10:1もしくは約10:1、2.5:1もしくは約2.5:1から、5:1もしくは約5:1、または5:1もしくは約5:1から、10:1もしくは約10:1（それぞれ両端の値を含む）である前記フィーダー細胞対濃縮NK細胞の比である。

いくつかの態様において、HLA発現フィーダー細胞（例えば221.AEH細胞）、例えば照射されたその集団の比は、1.25:1、1.5:1、1.75:1、2.0:1、2.25:1、2:5:1、2.75:1、3.0:1、3.25:1、3.5.:1、3.75:1、4.0:1、4.25:1、4.5:1、4.75:1もしくは5:1、または約1.25:1、1.5:1、1.75:1、2.0:1、2.25:1、2:5:1、2.75:1、3.0:1、3.25:1、3.5.:1、3.75:1、4.0:1、4.25:1、4.5:1、4.75:1もしくは5:1、または前記のいずれかの間の任意の値である前記フィーダー細胞対濃縮NK細胞の比である。いくつかの態様において、HLA発現フィーダー細胞（例えば221.AEH細胞）、例えば照射されたその集団の比は、5:1未満または約5:1未満である前記フィーダー細胞対濃縮細胞の比である。いくつかの態様において、HLA発現フィーダー細胞（例えば221.AEH細胞）、例えば照射されたその集団の比は、1:1～2.5:1または約1:1～2.5:1（両端の値を含む）の比である。いくつかの態様において、HLA発現フィーダー細胞（例えば221.AEH細胞）、例えば照射されたその集団の比は、2.5:1または約2.5:1の比である。いくつかの態様において、HLA発現フィーダー細胞（例えば221.AEH細胞）、例えば照射されたその集団の比は、2:1または約2:1の比である。

いくつかの事例において、出発NK細胞集団が増大前に凍結保存されていた場合、すなわち凍結/解凍を受けている場合は、新鮮NK細胞を使用する方法の場合よりも低い221.AEH対NK細胞比を使用することができる。ここでは、1:1の221.AEH対凍結解凍NK細胞が、2.5:1の221.AEH対新鮮NK細胞比を含有する培養における増大に匹敵する増大をもたらしたことがわかる。いくつかの局面において、この低い比は、培養中のより多数のNK細胞が、より多くの細胞間接触を許すことを保証し、これは、初期の成長および増大を促進するのに役割を果たしうる。いくつかの態様において、試料からのNK細胞の初期濃縮集団が凍結/解凍を受けているものである場合には、2:1～1:2または約2:1～1:2の221.AEH対凍結/解凍NK細胞比が使用される。特定の態様において、比は1:1である。より高い比、例えば2.5:1の221.AEH対凍結/解凍NK細胞を使用することはできるが、その場合は、所望のしきい密度またはしきい数に到達するのに、より長い培養、例えば21日または約21日が必要になりうると理解される。

いくつかの態様において、NK細胞は、培養に非分裂末梢血単核球（PBMC）をさらに加えることによって増大される。いくつかの局面において、非分裂フィーダー細胞は、X線照射PBMCフィーダー細胞を含むことができる。いくつかの局面において、非分裂フィーダー細胞は、ガンマ照射PBMCフィーダー細胞を含むことができる。いくつかの態様において、PBMCには、細胞分裂を阻止するために、約1000～10000ラド、例えば1000～5000ラドの範囲のガンマ線が照射される。いくつかの態様において、PBMCには、細胞分裂を阻止するために、約10Gy～100Gy、例えば10～50Gyの範囲のガンマ線が照射される。いくつかの局面において、インキュベーションの少なくとも一部分の期間中、照射フィーダー細胞が、非分裂（例えば照射）HLA-E発現フィーダー細胞と同時に、培養培地中に存在する。いくつかの局面において、非分裂（例えば照射）PBMCフィーダー細胞、HLA-E発現フィーダー細胞および濃縮NK細胞は、同じ日に、例えばインキュベーションを開始する日に、例えば同じ時間、またはほぼ同じ時間、またはほとんど同じ時間に、培養に加えられる。

いくつかの態様において、インキュベーションまたは培養は、フィーダー細胞としての照射PBMCの存在下で、さらに行われる。いくつかの態様において、照射PBMCフィーダー細胞は、濃縮NK細胞が単離または選択された対象にとって自家である、または濃縮NK細胞が単離または選択された対象と同じ対象に由来する。特定の態様において、PBMCは、NK細胞を濃縮するために使用したものと同じ生物学的試料、例えば全血または白血球アフェレーシス産物もしくはアフェレーシス産物から得られる。いったん得られたら、上述したNK細胞の濃縮に先立って、PBMCの一部を照射用にとっておく。

いくつかの態様において、照射PBMCは、フィーダー細胞として、1:10もしくは約1:10から、10:1もしくは約10:1、1:10もしくは約1:10から、5:1もしくは約5:1、1:10もしくは約1:10から、2.5:1もしくは約2.5:1、1:10もしくは約1:10から、1:1もしくは約1:1、1:10もしくは約1:10から、1:2.5もしくは約1:2.5、1:10もしくは約1:10から、1:5もしくは約1:5、1:5もしくは約1:5から、10:1もしくは約10:1、1:5もしくは約1:5から、5:1もしくは約5:1、1:5もしくは約1:5から、2.5:1もしくは約2.5:1、1:5もしくは約1:5から、1:1もしくは約1:1、1:5もしくは約1:5から、1:2.5もしくは約1:2.5、1:2.5もしくは約1:2.5から、10:1もしくは約10:1、1:2.5もしくは約1:2.5から、5:1もしくは約5:1、1:2.5もしくは約1:2.5から、2.5:1もしくは約2.5:1、1:2.5もしくは約1:2.5から、1:1もしくは約1:1、1:1もしくは約1:1から、10:1もしくは約10:1、1:1もしくは約1:1から、5:1もしくは約5:1、1:1もしくは約1:1から、2.5:1もしくは約2.5:1、2.5:1もしくは約2.5:1から、10:1もしくは約10:1、2.5:1もしくは約2.5:1から、5:1もしくは約5:1、または5:1もしくは約5:1から、10:1.もしくは約10:1である前記フィーダー細胞対濃縮NK細胞の比で存在する。

いくつかの態様において、照射PBMCは、フィーダー細胞として、1:1または約1:1から、5:1または約5:1、例えば1.25:1、1.5:1、1.75:1、2.0:1、2.25:1、2:5:1、2.75:1、3.0:1、3.25:1、3.5.:1、3.75:1、4.0:1、4.25:1、4.5:1、4.75:1もしくは5:1、または約1.25:1、1.5:1、1.75:1、2.0:1、2.25:1、2:5:1、2.75:1、3.0:1、3.25:1、3.5.:1、3.75:1、4.0:1、4.25:1、4.5:1、4.75:1もしくは5:1、または前記のいずれかの間の任意の値である前記フィーダー細胞対濃縮NK細胞の比で存在する。いくつかの態様において、照射PBMCは、5:1または約5:1である前記フィーダー細胞対濃縮細胞の比で存在する。

特定の態様において、インキュベーションまたは培養の少なくとも一部分の期間中、照射PBMCのうちの1種または複数種の細胞または細胞タイプ、例えばT細胞が活性化され、および/またはインキュベーションもしくは培養は、PBMCフィーダー細胞のうちの1種または複数種のT細胞の活性化を刺激することができる少なくとも1つの刺激作用物質の存在下で実行される。いくつかの態様において、少なくとも1つの刺激作用物質は、TCR複合体のメンバーに特異的に結合する。いくつかの態様において、少なくとも1つの刺激作用物質は、CD3、任意でCD3イプシロンに特異的に結合する。いくつかの局面において、少なくとも1つの刺激作用物質は抗CD3抗体または抗原結合フラグメントである。例示的な抗CD3抗体としてマウス抗ヒトCD3（OKT3）が挙げられる。

いくつかの態様において、照射PBMCフィーダー細胞を含むインキュベーションの少なくとも一部分の期間中、抗CD3抗体または抗原結合フラグメントが存在する。いくつかの態様において、抗CD3抗体または抗原結合フラグメントは、照射PBMCと同時またはほぼ同時に、培養またはインキュベーションに加えられる。例えば抗CD3抗体または抗原結合フラグメントは、インキュベーションまたは培養の開始時またはほぼ開始時に加えられる。特定局面において、抗CD3抗体または抗原結合フラグメントは、培養またはインキュベーションの経過中に、例えば培養培地を交換することまたは培養培地を洗い流すことなどによって、除去されるか、その濃度が低減されうる。特定の態様において、本方法は、交換または洗浄後に、抗CD3抗体または抗原結合フラグメントを含む培養培地を再び加えることも補充することも含まない。

いくつかの態様において、抗CD3抗体または抗原結合フラグメントは、培養またはインキュベーションの少なくとも一部分の期間中、10ng/mLもしくは約10ng/mLから、5μg/mLもしくは約5μg/mL、例えば10ng/mLもしくは約10ng/mLから、2μg/mLもしくは約2μg/mL、10ng/mLもしくは約10ng/mLから、1μg/mLもしくは約1μg/mL、10ng/mLもしくは約10ng/mLから、500ng/mLもしくは約500ng/mL、10ng/mLもしくは約10ng/mLから、100ng/mLもしくは約100ng/mL、10ng/mLもしくは約10ng/mLから、50ng/mLもしくは約50ng/mL、50ng/mLもしくは約50ng/mLから、5μg/mLもしくは約5μg/mL、例えば50ng/mLもしくは約50ng/mLから、2μg/mLもしくは約2μg/mL、50ng/mLもしくは約50ng/mLから、1μg/mLもしくは約1μg/mL、50ng/mLもしくは約50ng/mLから、500ng/mLもしくは約500ng/mL、50ng/mLもしくは約50ng/mLから、100ng/mLもしくは約100ng/mL、100ng/mLもしくは約100ng/mLから、5μg/mLもしくは約5μg/mL、100ng/mLもしくは約100ng/mLから、2μg/mLもしくは約2μg/mL、100ng/mLもしくは約100ng/mLから、1μg/mLもしくは約1μg/mL、100ng/mLもしくは約100ng/mLから、500ng/mLもしくは約500ng/mL、500ng/mLもしくは約500ng/mLから、5μg/mLもしくは約5μg/mL、500ng/mLもしくは約500ng/mLから、2μg/mLもしくは約2μg/mL、500ng/mLもしくは約500ng/mLから、1μg/mLもしくは約1μg/mL、1μg/mLもしくは約1μg/mLから、5μg/mLもしくは約5μg/mL、1μg/mLもしくは約1μg/mLから、2μg/mLもしくは約2μg/mL、または2μg/mLもしくは約2μg/mLから、5μg/mLもしくは約5μg/mL（それぞれ両端の値を含む）である濃度で加えられ、または存在する。いくつかの態様において、抗CD3抗体または抗原結合フラグメントの濃度は、10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mLもしくは100ng/mL、または約10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mLまたは100ng/mL、または前記のいずれかの間の任意の値である。いくつかの態様において、抗CD3抗体または抗原結合フラグメントの濃度は、50ng/mLまたは約50ng/mLである。

いくつかの態様において、「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン（Ig）分子の抗原結合部分またはフラグメント、すなわち抗原に特異的に結合する（抗原と免疫反応する）抗原結合部位を含有する分子を指す。抗体という用語は、無傷のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体だけでなく、そのフラグメント、例えばdAb、Fab、Fab’、F（ab’）₂、Fv）、一本鎖抗体（scFv）または単一ドメイン抗体（sdAb）も包含する。通例、「抗原結合フラグメント」は、関心対象の抗原の少なくとも1つのエピトープに結合する免疫グロブリン重鎖および/または軽鎖のCDRを少なくとも1つは含有する。この点に関して、抗原結合フラグメントは、抗原に結合する可変重鎖（VH）配列および可変軽鎖（VL）配列の1つ、2つ、3つ、4つ、5つまたは6つすべてのCDRを、例えばVHとVLとを含有する抗体の場合は一般に6つのCDR（重鎖と軽鎖のそれぞれについて「CDR1」、「CDR2」および「CDR3」）を、また単一可変ドメインを含有する抗体の場合は3つのCDRを含みうる。

「抗体フラグメント」とは、インタクト抗体のうち、インタクト抗体が結合する抗原に結合する部分を含む、インタクト抗体以外の分子を指す。抗体フラグメントの例として、Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F（ab’）₂、ダイアボディ、線状抗体、可変重鎖（V_H）領域、一本鎖抗体分子、例えばscFvおよび単一ドメインV_H単一抗体、ならびに抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。特定の態様において、抗体は、可変重鎖領域および/または可変軽鎖領域を含む一本鎖抗体フラグメント、例えばscFvである。

いくつかの態様において、インキュベーションまたは培養は、0.05×10⁶もしくは約0.05×10⁶または少なくとも0.05×10⁶もしくは約0.05×10⁶個の濃縮NK細胞/mL、0.1×10⁶もしくは約0.1×10⁶個の濃縮NK細胞/mL、0.2×10⁶もしくは約0.2×10⁶個の濃縮NK細胞/mL、0.5×10⁶もしくは約0.5×10⁶個の濃縮NK細胞/mL、または1.0×10⁶もしくは約1.0×10⁶個の濃縮NK細胞/mLである濃度の上記濃縮NK細胞、例えば選択されおよび/または単離されたNK細胞の存在下で開始される。提供される方法の諸態様において、インキュベーションまたは培養は、0.05×10⁶もしくは約0.05×10⁶個の濃縮NK細胞/mLから、1.0×10⁶もしくは約1.0×10⁶個の濃縮NK細胞/mL、例えば0.05×10⁶もしくは約0.05×10⁶個の濃縮NK細胞/mLから、0.75×10⁶もしくは約0.75×10⁶、0.05×10⁶もしくは約0.05×10⁶個の濃縮NK細胞/mLから、0.5×10⁶もしくは約0.5×10⁶、0.05×10⁶もしくは約0.05×10⁶個の濃縮NK細胞/mLから、0.20×10⁶もしくは約0.20×10⁶個の濃縮NK細胞/mL、0.05×10⁶もしくは約0.05×10⁶個の濃縮NK細胞/mLから、0.1×10⁶もしくは約0.1×10⁶個の濃縮NK細胞/mL、0.1×10⁶もしくは約0.1×10⁶個の濃縮NK細胞/mLから、1.0×10⁶もしくは約1.0×10⁶個の濃縮NK細胞/mL、0.1×10⁶もしくは約0.1×10⁶個の濃縮NK細胞/mLから、0.75×10⁶もしくは約0.75×10⁶、0.1×10⁶もしくは約0.1×10⁶個の濃縮NK細胞/mLから、0.5×10⁶もしくは約0.5×10⁶、0.1×10⁶もしくは約0.1×10⁶個の濃縮NK細胞/mLから、0.20×10⁶もしくは約0.20×10⁶個の濃縮NK細胞/mL、0.20×10⁶もしくは約0.20×10⁶個の濃縮NK細胞/mLから、1.0×10⁶もしくは約1.0×10⁶個の濃縮NK細胞/mL、0.20×10⁶もしくは約0.20×10⁶個の濃縮NK細胞/mLから、0.75×10⁶もしくは約0.75×10⁶、0.20×10⁶もしくは約0.20×10⁶個の濃縮NK細胞/mLから、0.5×10⁶もしくは約0.5×10⁶、0.5×10⁶もしくは約0.5×10⁶個の濃縮NK細胞/mLから、1.0×10⁶もしくは約1.0×10⁶個の濃縮NK細胞/mL、0.5×10⁶もしくは約0.5×10⁶個の濃縮NK細胞/mLから、0.75×10⁶もしくは約0.75×10⁶、0.75×10⁶もしくは約0.75×10⁶個の濃縮NK細胞/mLから、1.0×10⁶もしくは約1.0×10⁶個の濃縮NK細胞/mL（それぞれ両端の値を含む）である濃度の上記濃縮NK細胞、例えば選択されおよび/または単離されたNK細胞の存在下で開始される。いくつかの態様において、インキュベーションまたは培養は、0.2×10⁶または約0.2×10⁶個の濃縮NK細胞/mLである濃度の上記濃縮NK細胞、例えば選択されおよび/または単離されたNK細胞の存在下で開始される。

任意のそのような態様の一部において、インキュベーションまたは培養の開始時に加えられるまたは存在する濃縮NK細胞、例えば上述のようにPBMCから選択されまたは単離されたものの量は、少なくとも1×10⁵もしくは少なくとも約1×10⁵個の細胞、少なくとも2×10⁵もしくは少なくとも約2×10⁵個の細胞、少なくとも3×10⁵もしくは少なくとも約3×10⁵個の細胞、少なくとも4×10⁵もしくは少なくとも約4×10⁵個の細胞、少なくとも5×10⁵もしくは少なくとも約5×10⁵個の細胞、少なくとも6×10⁵もしくは少なくとも約6×10⁵個の細胞、少なくとも7×10⁵もしくは少なくとも約7×10⁵個の細胞、少なくとも8×10⁵もしくは少なくとも約8×10⁵個の細胞、少なくとも9×10⁵もしくは少なくとも約9×10⁵個の細胞、少なくとも1×10⁶もしくは少なくとも約1×10⁶個の細胞、またはそれ以上である。特定の態様において、濃縮NK細胞、例えば上述のようにPBMCから選択または単離されたものの量は、少なくとも1×10⁶、または少なくとも約1×10⁶、または1×10⁶、または約1×10⁶個の細胞である。

いくつかの態様において、濃縮NK細胞の集団は、少なくとも2.0×10⁶個もしくは少なくとも約2.0×10⁶個の濃縮NK細胞、少なくとも3.0×10⁶個もしくは少なくとも約3.0×10⁶個の濃縮NK細胞、少なくとも4.0×10⁶個もしくは少なくとも約4.0×10⁶個の濃縮NK細胞、少なくとも5.0×10⁶個もしくは少なくとも約5.0×10⁶個の濃縮NK細胞、少なくとも6.0×10⁶個もしくは少なくとも約6.0×10⁶個の濃縮NK細胞、少なくとも7.0×10⁶個もしくは少なくとも約7.0×10⁶個の濃縮NK細胞、少なくとも8.0×10⁶個もしくは少なくとも約8.0×10⁶個の濃縮NK細胞、少なくとも9.0×10⁶個もしくは少なくとも約9.0×10⁶個の濃縮NK細胞、少なくとも1.0×10⁷個もしくは少なくとも約1.0×10⁷個の濃縮NK細胞、少なくとも5.0×10⁷個もしくは少なくとも約5.0×10⁷個の濃縮NK細胞、少なくとも1.0×10⁸個もしくは少なくとも約1.0×10⁸個の濃縮NK細胞、少なくとも5.0×10⁸個もしくは少なくとも約5.0×10⁸個の濃縮NK細胞、または少なくとも1.0×10⁹個もしくは少なくとも約1.0×10⁹個の濃縮NK細胞を含む。いくつかの態様において、濃縮NK細胞の集団は、少なくとも2.0×10⁵個または少なくとも約2.0×10⁵個の濃縮NK細胞を含む。いくつかの態様において、濃縮NK細胞の集団は、少なくとも1.0×10⁶個または少なくとも約1.0×10⁶個の濃縮NK細胞を含む。いくつかの態様において、濃縮NK細胞の集団は、少なくとも1.0×10⁷個または少なくとも約1.0×10⁷個の濃縮NK細胞を含む。

いくつかの態様において、濃縮NK細胞の集団は、2.0×10⁵個もしくは約2.0×10⁵個の濃縮NK細胞から、1.0×10⁹個もしくは約1.0×10⁹個の濃縮NK細胞、2.0×10⁵個もしくは約2.0×10⁵個の濃縮NK細胞から、5.0×10⁸個もしくは約5.0×10⁸個の濃縮NK細胞、2.0×10⁵個もしくは約2.0×10⁵個の濃縮NK細胞から、1.0×10⁸個もしくは約1.0×10⁸個の濃縮NK細胞、2.0×10⁵個もしくは約2.0×10⁵個の濃縮NK細胞か、5.0×10⁷個もしくは約5.0×10⁷個の濃縮NK細胞、2.0×10⁵個もしくは約2.0×10⁵個の濃縮NK細胞か、1.0×10⁷個もしくは約1.0×10⁷個の濃縮NK細胞、2.0×10⁵個もしくは約2.0×10⁵個の濃縮NK細胞から、5.0×10⁶個もしくは約5.0×10⁶個の濃縮NK細胞、2.0×10⁵個もしくは約2.0×10⁵個の濃縮NK細胞から、1.0×10⁶個もしくは約1.0×10⁶個の濃縮NK細胞、1.0×10⁶個もしくは約1.0×10⁶個の濃縮NK細胞から、1.0×10⁹個もしくは約1.0×10⁹個の濃縮NK細胞、1.0×10⁶個もしくは約1.0×10⁶個の濃縮NK細胞から、5.0×10⁸個もしくは約5.0×10⁸個の濃縮NK細胞、1.0×10⁶個もしくは約1.0×10⁶個の濃縮NK細胞から、1.0×10⁸個もしくは約1.0×10⁸個の濃縮NK細胞から、1.0×10⁶個もしくは約1.0×10⁶個の濃縮NK細胞から、5.0×10⁷個もしくは約5.0×10⁷個の濃縮NK細胞、1.0×10⁶個もしくは約1.0×10⁶個濃縮NK細胞から、1.0×10⁷個もしくは約1.0×10⁷個の濃縮NK細胞、1.0×10⁶個もしくは約1.0×10⁶個の濃縮NK細胞から、5.0×10⁶個もしくは約5.0×10⁶個の濃縮NK細胞、5.0×10⁶個もしくは約5.0×10⁶個の濃縮NK細胞から、1.0×10⁹個もしくは約1.0×10⁹個の濃縮NK細胞、5.0×10⁶個もしくは約5.0×10⁶個の濃縮NK細胞から、5.0×10⁸個もしくは約5.0×10⁸個の濃縮NK細胞、5.0×10⁶個もしくは約5.0×10⁶個の濃縮NK細胞から、1.0×10⁸個もしくは約1.0×10⁸個の濃縮NK細胞、5.0×10⁶個もしくは約5.0×10⁶個の濃縮NK細胞から、5.0×10⁷個もしくは約5.0×10⁷個の濃縮NK細胞、5.0×10⁶個もしくは約5.0×10⁶個の濃縮NK細胞から、1.0×10⁷個もしくは約1.0×10⁷個の濃縮NK細胞、1.0×10⁷個もしくは約1.0×10⁷個の濃縮NK細胞から、1.0×10⁹個もしくは約1.0×10⁹個の濃縮NK細胞、1.0×10⁷個もしくは約1.0×10⁷個の濃縮NK細胞から、5.0×10⁸個もしくは約5.0×10⁸個の濃縮NK細胞、1.0×10⁷個もしくは約1.0×10⁷個の濃縮NK細胞から、1.0×10⁸個もしくは約1.0×10⁸個の濃縮NK細胞、1.0×10⁷個もしくは約1.0×10⁷個の濃縮NK細胞から、5.0×10⁷個もしくは約5.0×10⁷個の濃縮NK細胞、5.0×10⁷個もしくは約5.0×10⁷個の濃縮NK細胞から、1.0×10⁹個もしくは約1.0×10⁹個の濃縮NK細胞、5.0×10⁷個もしくは約5.0×10⁷個の濃縮NK細胞から、5.0×10⁸個もしくは約5.0×10⁸個の濃縮NK細胞、5.0×10⁷個もしくは約5.0×10⁷個の濃縮NK細胞から、1.0×10⁸個もしくは約1.0×10⁸個の濃縮NK細胞、1.0×10⁸個もしくは約1.0×10⁸個の濃縮NK細胞から、1.0×10⁹個もしくは約1.0×10⁹個の濃縮NK細胞、1.0×10⁸個もしくは約1.0×10⁸個の濃縮NK細胞から、5.0×10⁸個もしくは約5.0×10⁸個の濃縮NK細胞、または5.0×10⁸個もしくは約5.0×10⁸個の濃縮NK細胞から、1.0×10⁹個もしくは約1.0×10⁹個の濃縮NK細胞を含む。いくつかの態様において、濃縮NK細胞の集団は、2.0×10⁵個または約2.0×10⁵個の濃縮NK細胞から、5.0×10⁷個または約5.0×10⁷個の濃縮NK細胞を含む。いくつかの態様において、濃縮NK細胞の集団は、1.0×10⁶個または約1.0×10⁶個の濃縮NK細胞から、1.0×10⁸個または約1.0×10⁸個の濃縮NK細胞を含む。いくつかの態様において、濃縮NK細胞の集団は、1.0×10⁷個または約1.0×10⁷個の濃縮NK細胞から、5.0×10⁸個または約5.0×10⁸個の濃縮NK細胞を含む。いくつかの態様において、濃縮NK細胞の集団は、1.0×10⁷個または約1.0×10⁷個の濃縮NK細胞から、1.0×10⁹個または約1.0×10⁹個の濃縮NK細胞を含む。

いくつかの態様において、濃縮NK細胞の集団におけるg-NK細胞のパーセンテージは、20％もしくは約20％から、90％もしくは約90％、20％もしくは約20％から、80％もしくは約80％、20％もしくは約20％から、70％もしくは約70％、20％もしくは約20％から、60％もしくは約60％、20％もしくは約20％から、50％もしくは約50％、20％もしくは約20％から、40％もしくは約40％、20％もしくは約20％から、30％もしくは約30％、30％もしくは約30％から、90％もしくは約90％、30％もしくは約30％から、80％もしくは約80％、30％もしくは約30％から、70％もしくは約70％、30％もしくは約30％から、60％もしくは約60％、30％もしくは約30％から、50％もしくは約50％、30％もしくは約30％から、40％もしくは約40％、40％もしくは約40％から、90％もしくは約90％、40％もしくは約40％から、80％もしくは約80％、40％もしくは約40％から、70％もしくは約70％、40％もしくは約40％から、60％もしくは約60％、40％もしくは約40％から、50％もしくは約50％、50％もしくは約50％から、90％もしくは約90％、50％もしくは約50％から、80％もしくは約80％、50％もしくは約50％から、70％もしくは約70％、50％もしくは約50％から、60％もしくは約60％、60％もしくは約60％から、90％もしくは約90％、60％もしくは約60％から、80％もしくは約80％、60％もしくは約60％から、70％もしくは約70％、70％もしくは約70％から、90％もしくは約90％、70％もしくは約70％から、80％もしくは約80％、または80％もしくは約80％から、90％もしくは約90％である。いくつかの態様において、濃縮NK細胞の集団におけるg-NK細胞のパーセンテージは、20％または約20％から、90％または約90％である。いくつかの態様において、濃縮NK細胞の集団におけるg-NK細胞のパーセンテージは、40％または約40％から、90％または約90％である。いくつかの態様において、濃縮NK細胞の集団におけるg-NK細胞のパーセンテージは、60％または約60％から、90％または約90％である。

これらの態様の一部では、NK細胞を成長因子と共に培養することができる。いくつかの態様によれば、少なくとも1種の成長因子は、SCF、GSK3i、FLT3、IL-2、IL-6、IL-7、IL-15、IL-12、IL-18およびIL-21からなる群より選択される成長因子を含む。いくつかの態様によれば、少なくとも1種の成長因子は、IL-2またはIL-7およびIL-15である。いくつかの態様によれば、少なくとも1種の成長因子は、IL-2、IL-21またはIL-7およびIL-15である。いくつかの態様において、成長因子は組換えサイトカイン、例えば組換えIL-2、組換えIL-7、組換えIL-21または組換えIL-15である。

いくつかの態様において、NK細胞は1種または複数種の組換えサイトカインの存在下で培養される。いくつかの態様において、前記1種または複数種の組換えサイトカインは、SCF、GSK3i、FLT3、IL-2、IL-6、IL-7、IL-15、IL-12、IL-18、IL-21、IL-27、またはそれらの組み合わせのいずれかを含む。いくつかの態様において、前記1種または複数種の組換えサイトカインは、IL-2、IL-7、IL-15、IL-12、IL-18、IL-21、IL-27、またはそれらの組み合わせのいずれかを含む。いくつかの態様において、前記1種または複数種の組換えサイトカインのうちの少なくとも1つはIL-21である。いくつかの態様において、前記1種または複数種の組換えサイトカインは、IL-2、IL-7、IL-15、IL-12、IL-18、もしくはIL-27、またはそれらの組み合わせを、さらに含む。いくつかの態様において、前記1種または複数種の組換えサイトカインのうちの少なくとも1つはIL-2である。いくつかの態様において、前記1種または複数種の組換えサイトカインは、少なくともIL-2およびIL-21である。いくつかの態様において、前記1種または複数種の組換えサイトカインは、IL-21およびIL-2である。いくつかの態様において、前記1種または複数種の組換えサイトカインは、IL-21、IL-2、およびIL-15である。いくつかの態様において、前記1種または複数種の組換えサイトカインは、IL-21、IL-12、IL-15、およびIL-18である。いくつかの態様において、前記1種または複数種の組換えサイトカインは、IL-21、IL-2、Il-12、IL-15、およびIL-18である。いくつかの態様において、前記1種または複数種の組換えサイトカインは、IL-21、IL-15、IL-18、およびIL-27である。いくつかの態様において、前記1種または複数種の組換えサイトカインは、IL-21、IL-2、IL-15、IL-18、およびIL-27である。いくつかの態様において、前記1種または複数種の組換えサイトカインは、IL-2およびIL-15である。

特定の態様において、提供される方法は、組換えIL-2の存在下での濃縮NK細胞およびフィーダー細胞のインキュベーションまたは培養を含む。いくつかの態様において、インキュベーションの少なくとも一部分の期間中、例えば培養する工程の開始時および任意で培養する工程の期間中に1回または複数回加えられる、組換えIL-2は、1IU/mLもしくは約1IU/mLから、500IU/mLもしくは約500IU/mL、例えば1IU/mLもしくは約1IU/mLから、250IU/mLもしくは約250IU/mL、1IU/mLもしくは約1IU/mLから、100IU/mLもしくは約100IU/mL、1IU/mLもしくは約1IU/mLから、50IU/mLもしくは約50IU/mL、50IU/mLもしくは約50IU/mLから、500IU/mLもしくは約500IU/mL、50IU/mLもしくは約50IU/mLから、250IU/mLもしくは約250IU/mL、50IU/mLもしくは約50IU/mLから、100IU/mLもしくは約100IU/mL、100IU/mLもしくは約100IU/mLから、500IU/mLもしくは約500IU/mL、100IU/mLもしくは約100IU/mLから、250IU/mLもしくは約250IU/mL、または250IU/mLもしくは約250IU/mLから、500IU/mLもしくは約500IU/mL（それぞれ両端の値を含む）の濃度で存在する。いくつかの態様において、インキュベーションの少なくとも一部分の期間中、例えば培養する工程の開始時および任意で培養する工程の期間中に1回または複数回加えられる、IL-2の濃度は、50IU/mL、60IU/mL、70IU/mL、80IU/mL、90IU/mL、100IU/mL、125IU/mL、150IU/mL、200IU/mL、または約50IU/mL、60IU/mL、70IU/mL、80IU/mL、90IU/mL、100IU/mL、125IU/mL、150IU/mL、200IU/mL、または前記のいずれかの間の任意の値である。特定の態様において、培養する工程の開始時および任意で培養する工程の期間中に1回または複数回加えられる組換えIL-2の濃度は、100IU/mLまたは約100IU/mLである。特定の態様において、培養する工程の開始時および任意で培養する工程の期間中に1回または複数回加えられる組換えIL-2の濃度は、500IU/mLまたは約500IU/mLである。

特定の態様において、提供される方法は、組換えIL-21の存在下での濃縮NK細胞およびフィーダー細胞のインキュベーションまたは培養を含む。いくつかの態様において、インキュベーションの少なくとも一部分の期間中、例えば培養する工程の開始時および任意で培養する工程の期間中に1回または複数回加えられる、組換えIL-21は、1IU/mLもしくは約1IU/mLから、500IU/mLもしくは約500IU/mL、例えば1IU/mLもしくは約1IU/mLから、250IU/mLもしくは約250IU/mL、1IU/mLもしくは約1IU/mLから、100IU/mLもしくは約100IU/mL、1IU/mLもしくは約1IU/mLから、50IU/mLもしくは約50IU/mL、50IU/mLもしくは約50IU/mLから、500IU/mLもしくは約500IU/mL、50IU/mLもしくは約50IU/mLから、250IU/mLもしくは約250IU/mL、50IU/mLもしくは約50IU/mLから、100IU/mLもしくは約100IU/mL、100IU/mLもしくは約100IU/mLから、500IU/mLもしくは約500IU/mL、100IU/mLもしくは約100IU/mLから、250IU/mLもしくは約250IU/mL、または250IU/mLもしくは約250IU/mLから、500IU/mLもしくは約500IU/mL（それぞれ両端の値を含む）の濃度で存在する。いくつかの態様において、インキュベーションの少なくとも一部分の期間中、例えば培養する工程の開始時および任意で培養する工程の期間中に1回または複数回加えられる、IL-21の濃度は、50IU/mL、60IU/mL、70IU/mL、80IU/mL、90IU/mL、100IU/mL、125IU/mL、150IU/mL、200IU/mL、または約50IU/mL、60IU/mL、70IU/mL、80IU/mL、90IU/mL、100IU/mL、125IU/mL、150IU/mL、200IU/mL、または前記のいずれかの間の任意の値である。特定の態様において、培養する工程の開始時および任意で培養する工程の期間中に1回または複数回加えられる組換えIL-21の濃度は、100IU/mLまたは約100IU/mLである。

特定の態様において、提供される方法は、組換えIL-21の存在下での濃縮NK細胞およびフィーダー細胞のインキュベーションまたは培養を含む。特定の態様において、培養する工程の少なくとも一部分の期間中、例えば培養する工程の開始時および任意で培養する工程の期間中に1回または複数回加えられる、組換えIL-21の濃度は、約10ng/mL～約100ng/mL、約10ng/mL～約90ng/mL、約10ng/mL～約80ng/mL、約10ng/mL～約70ng/mL、約10ng/mL～約60ng/mL、約10ng/mL～約50ng/mL、約10ng/mL～約40ng/mL、約10ng/mL～約30ng/mL、約10ng/mL～約20ng/mL、約20ng/mL～約100ng/mL、約20ng/mL～約90ng/mL、約20ng/mL～約80ng/mL、約20ng/mL～約70ng/mL、約20ng/mL～約60ng/mL、約20ng/mL～約50ng/mL、約20ng/mL～約40ng/mL、約20ng/mL～約30ng/mL、約30ng/mL～約100ng/mL、約30ng/mL～約90ng/mL、約30ng/mL～約80ng/mL、約30ng/mL～約70ng/mL、約30ng/mL～約60ng/mL、約30ng/mL～約50ng/mL、約30ng/mL～約40ng/mL、約40ng/mL～約100ng/mL、約40ng/mL～約90ng/mL、約40ng/mL～約80ng/mL、約40ng/mL～約70ng/mL、約40ng/mL～約60ng/mL、約40ng/mL～約50ng/mL、約50ng/mL～約100ng/mL、約50ng/mL～約90ng/mL、約50ng/mL～約80ng/mL、約50ng/mL～約70ng/mL、約50ng/mL～約60ng/mL、約60ng/mL～約100ng/mL、約60ng/mL～約90ng/mL、約60ng/mL～約80ng/mL、約60ng/mL～約70ng/mL、約70ng/mL～約100ng/mL、約70ng/mL～約90ng/mL、約70ng/mL～約80ng/mL、約80ng/mL～約100ng/mL、約80ng/mL～約90ng/mL、または約90ng/mL～約100ng/mL（両端の値を含む）である。特定の態様において、培養する工程の少なくとも一部分の期間中、例えば培養する工程の開始時および任意で培養する工程の期間中に1回または複数回加えられる、組換えIL-21の濃度は、約10ng/mL～約100ng/mL（両端の値を含む）である。特定の態様において、培養する工程の少なくとも一部分の期間中、例えば培養する工程の開始時および任意で培養する工程の期間中に1回または複数回加えられる、組換えIL-21の濃度は、25ng/mLまたは約25ng/mLである。

特定の態様において、培養する工程の少なくとも一部分の期間中、例えば培養する工程の開始時および任意で培養する工程の期間中に1回または複数回加えられる、組換えIL-15の濃度は、約1ng/mL～約50ng/mL、約1ng/mL～約40ng/mL、約1ng/mL～約30ng/mL、約1ng/mL～約20ng/mL、約1ng/mL～約10ng/mL、約1ng/mL～約5ng/mL、約5ng/mL～約50ng/mL、約5ng/mL～約40ng/mL、約5ng/mL～約30ng/mL、約5ng/mL～約20ng/mL、約5ng/mL～約10ng/mL、約10ng/mL～約50ng/mL、約10ng/mL～約40ng/mL、約10ng/mL～約30ng/mL、約10ng/mL～約20ng/mL、約20ng/mL～約50ng/mL、約20ng/mL～約40ng/mL、約20ng/mL～約30ng/mL、約30ng/mL～約50ng/mL、約30ng/mL～約40ng/mL、または約40ng/mL～約50ng/mLである。特定の態様において、培養する工程の少なくとも一部分の期間中、例えば培養する工程の開始時および任意で培養する工程の期間中に1回または複数回加えられる、組換えIL-15の濃度は約1ng/mL～約50ng/mLである。特定の態様において、培養する工程の少なくとも一部分の期間中、例えば培養する工程の開始時および任意で培養する工程の期間中に1回または複数回加えられる、組換えIL-15の濃度は10ng/mLまたは約10ng/mLである。

特定の態様において、本方法は、IL-2、IL-15およびIL-21の存在下での培養を含む。提供される方法の諸態様において、例えば培養する工程の開始時および任意で培養する工程の期間中に1回または複数回、培養に加えられる、組換えサイトカインの濃度は、50IU/mLまたは約50IU/mLから、500IU/mまたは約500IU/mLのIL-2、例えば100IU/mLもしくは約100U/mLまたは500IU/mLもしくは約500IU/mLのIL-2、1ng/mL～50ng/mLまたは約1ng/mL～50ng/mLのIL15、例えば10ng/mLまたは約10ng/mL、および10ng/mLまたは約10ng/mLから、100ng/mLまたは約100ng/mLのIL-21、例えば25ng/mLまたは約25ng/mLである。特定の態様では、500IU/mLのIL-2、10ng/mLのIL-15、および25ng/mLのIL-21が、培養する工程の少なくとも一部分の期間中、例えば培養する工程の開始時および任意で培養する工程の期間中に1回または複数回、加えられる。特定の態様では、100IU/mLのIL-2、10ng/mLのIL-15、および25ng/mLのIL-21が、培養する工程の少なくとも一部分の期間中、例えば培養する工程の開始時および任意で培養する工程の期間中に1回または複数回、加えられる。

いくつかの態様において、提供される方法は、組換えIL-21の存在下での濃縮NK細胞およびフィーダー細胞のインキュベーションまたは培養を含み、組換えIL-21は抗IL-21抗体との複合体として加えられる。いくつかの態様では、培養する工程に先立って、抗IL-21抗体を組換えIL-21と接触させ、これにより、IL-21/抗IL-21複合体を形成させ、該IL-21/抗IL-21複合体が培養培地に加えられる。いくつかの態様において、IL-21/抗IL-21複合体を形成させるために組換えIL-21と抗IL-21抗体とを接触させる工程は、複合体の形成に適した温度および時間を含む条件下で実行される。いくつかの態様において、培養する工程は37℃±2で30分間実行される。

いくつかの態様において、抗IL-21抗体は、100ng/mLもしくは約100ng/mLから、500ng/mLもしくは約500ng/mL、100ng/mLもしくは約100ng/mLから、400ng/mLもしくは約400ng/mL、100ng/mLもしくは約100ng/mLから、300ng/mLもしくは約300ng/mL、100ng/mLもしくは約100ng/mLから、200ng/mLもしくは約200ng/mL、200ng/mLもしくは約200ng/mLから、500ng/mLもしくは約500ng/mL、200ng/mLもしくは約200ng/mLから、400ng/mLもしくは約400ng/mL、200ng/mLもしくは約200ng/mLから、300ng/mLもしくは約300ng/mL、300ng/mLもしくは約300ng/mLから、500ng/mLもしくは約500ng/mL、300ng/mLもしくは約300ng/mLから、400ng/mLもしくは約400ng/mL、または400ng/mLもしくは約400ng/mLから、500ng/mLもしくは約500ng/mLの濃度で加えられる。いくつかの態様において、抗IL-21抗体は、100ng/mLまたは約100ng/mLから、500ng/mLまたは約500ng/mLの濃度で加えられる。いくつかの態様において、抗IL-21抗体は250ng/mLの濃度で加えられる。

特定の態様において、抗IL-21抗体との複合体を形成させるために使用される組換えIL-21の濃度は、約10ng/mL～約100ng/mL、約10ng/mL～約90ng/mL、約10ng/mL～約80ng/mL、約10ng/mL～約70ng/mL、約10ng/mL～約60ng/mL、約10ng/mL～約50ng/mL、約10ng/mL～約40ng/mL、約10ng/mL～約30ng/mL、約10ng/mL～約20ng/mL、約20ng/mL～約100ng/mL、約20ng/mL～約90ng/mL、約20ng/mL～約80ng/mL、約20ng/mL～約70ng/mL、約20ng/mL～約60ng/mL、約20ng/mL～約50ng/mL、約20ng/mL～約40ng/mL、約20ng/mL～約30ng/mL、約30ng/mL～約100ng/mL、約30ng/mL～約90ng/mL、約30ng/mL～約80ng/mL、約30ng/mL～約70ng/mL、約30ng/mL～約60ng/mL、約30ng/mL～約50ng/mL、約30ng/mL～約40ng/mL、約40ng/mL～約100ng/mL、約40ng/mL～約90ng/mL、約40ng/mL～約80ng/mL、約40ng/mL～約70ng/mL、約40ng/mL～約60ng/mL、約40ng/mL～約50ng/mL、約50ng/mL～約100ng/mL、約50ng/mL～約90ng/mL、約50ng/mL～約80ng/mL、約50ng/mL～約70ng/mL、約50ng/mL～約60ng/mL、約60ng/mL～約100ng/mL、約60ng/mL～約90ng/mL、約60ng/mL～約80ng/mL、約60ng/mL～約70ng/mL、約70ng/mL～約100ng/mL、約70ng/mL～約90ng/mL、約70ng/mL～約80ng/mL、約80ng/mL～約100ng/mL、約80ng/mL～約90ng/mL、または約90ng/mL～約100ng/mL（両端の値を含む）である。特定の態様において、抗IL-21抗体との複合体を形成させるために使用される組換えIL-21の濃度は、約10ng/mL～約100ng/mL（両端の値を含む）である。特定の態様において、抗IL-21抗体との複合体を形成させるために使用される組換えIL-21の濃度は、25ng/mLまたは約25ng/mLである。

特定の態様において、培養する工程の少なくとも一部分の期間中、例えば培養する工程の開始時および任意で培養する工程の期間中に1回または複数回加えられる、組換えIL-12の濃度は、約1ng/mL～約50ng/mL、約1ng/mL～約40ng/mL、約1ng/mL～約30ng/mL、約1ng/mL～約20ng/mL、約1ng/mL～約10ng/mL、約1ng/mL～約5ng/mL、約5ng/mL～約50ng/mL、約5ng/mL～約40ng/mL、約5ng/mL～約30ng/mL、約5ng/mL～約20ng/mL、約5ng/mL～約10ng/mL、約10ng/mL～約50ng/mL、約10ng/mL～約40ng/mL、約10ng/mL～約30ng/mL、約10ng/mL～約20ng/mL、約20ng/mL～約50ng/mL、約20ng/mL～約40ng/mL、約20ng/mL～約30ng/mL、約30ng/mL～約50ng/mL、約30ng/mL～約40ng/mL、または約40ng/mL～約50ng/mLである。特定の態様において、培養する工程の少なくとも一部分の期間中、例えば培養する工程の開始時および任意で培養する工程の期間中に1回または複数回加えられる、組換えIL-12の濃度は約1ng/mL～約50ng/mLである。特定の態様において、培養する工程の少なくとも一部分の期間中、例えば培養する工程の開始時および任意で培養する工程の期間中に1回または複数回加えられる、組換えIL-12の濃度は10ng/mLまたは約10ng/mLである。

特定の態様において、培養する工程の少なくとも一部分の期間中、例えば培養する工程の開始時および任意で培養する工程の期間中に1回または複数回加えられる、組換えIL-18の濃度は、約1ng/mL～約50ng/mL、約1ng/mL～約40ng/mL、約1ng/mL～約30ng/mL、約1ng/mL～約20ng/mL、約1ng/mL～約10ng/mL、約1ng/mL～約5ng/mL、約5ng/mL～約50ng/mL、約5ng/mL～約40ng/mL、約5ng/mL～約30ng/mL、約5ng/mL～約20ng/mL、約5ng/mL～約10ng/mL、約10ng/mL～約50ng/mL、約10ng/mL～約40ng/mL、約10ng/mL～約30ng/mL、約10ng/mL～約20ng/mL、約20ng/mL～約50ng/mL、約20ng/mL～約40ng/mL、約20ng/mL～約30ng/mL、約30ng/mL～約50ng/mL、約30ng/mL～約40ng/mL、または約40ng/mL～約50ng/mLである。特定の態様において、培養する工程の少なくとも一部分の期間中、例えば培養する工程の開始時および任意で培養する工程の期間中に1回または複数回加えられる、組換えIL-18の濃度は約1ng/mL～約50ng/mLである。特定の態様において、培養する工程の少なくとも一部分の期間中、例えば培養する工程の開始時および任意で培養する工程の期間中に1回または複数回加えられる、組換えIL-18の濃度は10ng/mLまたは約10ng/mLである。

特定の態様において、培養する工程の少なくとも一部分の期間中、例えば培養する工程の開始時および任意で培養する工程の期間中に1回または複数回加えられる、組換えIL-27の濃度は、約1ng/mL～約50ng/mL、約1ng/mL～約40ng/mL、約1ng/mL～約30ng/mL、約1ng/mL～約20ng/mL、約1ng/mL～約10ng/mL、約1ng/mL～約5ng/mL、約5ng/mL～約50ng/mL、約5ng/mL～約40ng/mL、約5ng/mL～約30ng/mL、約5ng/mL～約20ng/mL、約5ng/mL～約10ng/mL、約10ng/mL～約50ng/mL、約10ng/mL～約40ng/mL、約10ng/mL～約30ng/mL、約10ng/mL～約20ng/mL、約20ng/mL～約50ng/mL、約20ng/mL～約40ng/mL、約20ng/mL～約30ng/mL、約30ng/mL～約50ng/mL、約30ng/mL～約40ng/mL、または約40ng/mL～約50ng/mLである。特定の態様において、培養する工程の少なくとも一部分の期間中、例えば培養する工程の開始時および任意で培養する工程の期間中に1回または複数回加えられる、組換えIL-27の濃度は約1ng/mL～約50ng/mLである。特定の態様において、培養する工程の少なくとも一部分の期間中、例えば培養する工程の開始時および任意で培養する工程の期間中に1回または複数回加えられる、組換えIL-27の濃度は10ng/mLまたは約10ng/mLである。

いくつかの態様において、本方法は、培養培地を交換する工程を含み、これはいくつかの局面では、細胞を洗浄する工程を含む。例えば培養またはインキュベーションの少なくとも一部分の期間中、培養培地は間欠的に、例えば毎日、1日おき、3日ごと、または1週間に1回、交換しまたは洗い流すことができる。特定の態様において、培養培地の交換または洗い流しは、培養の開始後3日～7日以内または約3日～7日以内に、例えば3日目、4日目、5日目、6日目もしくは7日目または約3日目、4日目、5日目、6日目もしくは7日目に開始される。特定の態様において、培養培地の交換または洗い流しは、5日目または約5日目から開始される。例えば培地は、5日目に交換され、その後は2～3日ごとに交換される。

培養培地が除去されまたは洗い流されたら、培養培地が補充される。いくつかの態様において、補充される培養培地は、1種または複数種の成長因子またはサイトカイン、例えば上述のいずれかを含む。したがって、いくつかの態様では、インキュベーションまたは培養の期間中、1種または複数種の成長因子またはサイトカイン、例えば組換えIL-2、IL-15および/またはIL-21が間欠的に加えられる。いくつかのそのような局面において、前記1種または複数種の成長因子またはサイトカイン、例えば組換えIL-2、IL-15および/またはIL-21は、培養またはインキュベーションの開始時またはほぼ開始時に加えられ、その後、培養またはインキュベーションの期間中は間欠的に、例えば培養培地を交換または洗い流すたびに加えられる。いくつかの態様において、前記1種または複数種の成長因子またはサイトカイン、例えば組換えIL-2、IL-15および/またはIL-21は、0日目（インキュベーションの開始日）を始まりとして培養またはインキュベーションに添加され、培養培地の交換または洗い流しごとに、1種または複数種の成長因子またはサイトカイン、例えば組換えIL-2、IL-15および/またはIL-21を培養またはインキュベーションに補充するために、さらに加えられる。いくつかの態様において、本方法は、インキュベーションの開始時（0日目）と、インキュベーションの継続期間中は培養培地の洗浄または交換のたびに2または3日ごとに、例えば培養またはインキュベーションの5日目、7日目、9日目、11日目および14日目または約5日目、7日目、9日目、11日目および14日目に、1種または複数種の成長因子またはサイトカイン、例えば組換えIL-2、IL-15および/またはIL-21を加える工程を含む。

特定の態様において、培養する工程は、IL-2、IL-15およびIL-21のうちの少なくとも1つの存在下で実行され、IL-2、IL-15およびIL-21のうちの少なくとも1つを含むように、培養培地が補充される。いくつかの態様において、培養する工程は、IL-2およびIL-21の存在下で実行され、IL-2およびIL-21を含むように培養培地が補充される。いくつかの態様において、培養する工程は、IL-2およびIL-15の存在下で実行され、IL-2およびIL-15を含むように培養培地が補充される。いくつかの態様において、培養する工程は、IL-15およびIL-21の存在下で実行され、IL-15およびIL21を含むように培養培地が補充される。いくつかの態様において、培養する工程は、IL-2、IL-15およびIL-21の存在下で実行され、IL-2、IL-15およびIL-21を含むように培養培地が補充される。いくつかの態様では、NK細胞の増大において、1種または複数種の追加サイトカイン、例えば限定するわけではないが組換えIL-18、組換えIL-7、および/または組換えIL-12を、利用することができる。

いくつかの態様において、補充される培養培地は、組換えIL-2などの1種または複数種の成長因子またはサイトカインを含む。したがって、いくつかの態様では、インキュベーションまたは培養の期間中、成長因子またはサイトカイン、例えば組換えIL-2が間欠的に加えられる。いくつかのそのような局面において、成長因子またはサイトカイン、例えば組換えIL-2は、培養またはインキュベーションの開始時またはほぼ開始時に加えられ、その後、培養またはインキュベーションの期間中は間欠的に、例えば培養培地を交換または洗い流すたびに加えられる。いくつかの態様において、成長因子またはサイトカイン、例えば組換えIL-2は、0日目（インキュベーションの開始日）を始まりとして培養またはインキュベーションに加えられ、培養培地の交換または洗い流しごとに、成長因子またはサイトカイン、例えば組換えIL-2を培養またはインキュベーションに補充するために、さらに加えられる。いくつかの態様において、本方法は、インキュベーションの開始時（0日目）と、インキュベーションの継続期間中は培養培地の洗浄または交換のたびに2または3日ごとに、例えば培養またはインキュベーションの5日目、7日目、9日目、11日目および14日目または約5日目、7日目、9日目、11日目および14日目に、組換えIL-2を加える工程を含む。そのような態様のいずれにおいても、組換えIL-2は、1IU/mLもしくは約1IU/mLから、500IU/mLもしくは約500IU/mL、例えば1IU/mLもしくは約1IU/mLから、250IU/mLもしくは約250IU/mL、1IU/mLもしくは約1IU/mLから、100IU/mLもしくは約100IU/mL、1IU/mLもしくは約1IU/mLから、50IU/mLもしくは約50IU/mL、50IU/mLもしくは約50IU/mLから、500IU/mLもしくは約500IU/mL、50IU/mLもしくは約50IU/mLから、250IU/mLもしくは約250IU/mL、50IU/mLもしくは約50IU/mLから、100IU/mLもしくは約100IU/mL、100IU/mLもしくは約100IU/mLから、500IU/mLもしくは約500IU/mL、100IU/mLもしくは約100IU/mLから、250IU/mLもしくは約250IU/mL、または250IU/mLもしくは約250IU/mLから、500IU/mLもしくは約500IU/mL（それぞれ両端の値を含む）の濃度で、培養またはインキュベーションに加えられる。いくつかの態様において、組換えIL-2は、50IU/mL、60IU/mL、70IU/mL、80IU/mL、90IU/mL、100IU/mL、125IU/mL、150IU/mL、200IU/mL、または約50IU/mL、60IU/mL、70IU/mL、80IU/mL、90IU/mL、100IU/mL、125IU/mL、150IU/mL、200IU/mL、または前記のいずれかの間の任意の値である濃度で、培養またはインキュベーションに加えられる。特定の態様において、組換えIL-2の濃度は100IU/mLまたは約100IU/mLである。特定の態様において、組換えIL-2の濃度は500IU/mLまたは約500IU/mLである。

いくつかの態様において、補充される培養培地は、組換えIL-21などの1種または複数種の成長因子またはサイトカインを含む。したがって、いくつかの態様では、インキュベーションまたは培養の期間中、成長因子またはサイトカイン、例えば組換えIL-21が間欠的に加えられる。いくつかのそのような局面において、成長因子またはサイトカイン、例えば組換えIL-21は、培養またはインキュベーションの開始時またはほぼ開始時に加えられ、その後、培養またはインキュベーションの期間中は間欠的に、例えば培養培地を交換または洗い流すたびに加えられる。いくつかの態様において、成長因子またはサイトカイン、例えば組換えIL-21は、0日目（インキュベーションの開始日）を始まりとして培養またはインキュベーションに加えられ、培養培地の交換または洗い流しごとに、成長因子またはサイトカイン、例えば組換えIL-21を培養またはインキュベーションに補充するために、さらに加えられる。いくつかの態様において、本方法は、インキュベーションの開始時（0日目）と、インキュベーションの継続期間中は培養培地の洗浄または交換のたびに2または3日ごとに、例えば培養またはインキュベーションの5日目、7日目、9日目、11日目および14日目または約5日目、7日目、9日目、11日目および14日目に、組換えIL-21を加える工程を含む。そのような態様のいずれにおいても、組換えIL-21は、約10ng/mL～約100ng/mL、約10ng/mL～約90ng/mL、約10ng/mL～約80ng/mL、約10ng/mL～約70ng/mL、約10ng/mL～約60ng/mL、約10ng/mL～約50ng/mL、約10ng/mL～約40ng/mL、約10ng/mL～約30ng/mL、約10ng/mL～約20ng/mL、約20ng/mL～約100ng/mL、約20ng/mL～約90ng/mL、約20ng/mL～約80ng/mL、約20ng/mL～約70ng/mL、約20ng/mL～約60ng/mL、約20ng/mL～約50ng/mL、約20ng/mL～約40ng/mL、約20ng/mL～約30ng/mL、約30ng/mL～約100ng/mL、約30ng/mL～約90ng/mL、約30ng/mL～約80ng/mL、約30ng/mL～約70ng/mL、約30ng/mL～約60ng/mL、約30ng/mL～約50ng/mL、約30ng/mL～約40ng/mL、約40ng/mL～約100ng/mL、約40ng/mL～約90ng/mL、約40ng/mL～約80ng/mL、約40ng/mL～約70ng/mL、約40ng/mL～約60ng/mL、約40ng/mL～約50ng/mL、約50ng/mL～約100ng/mL、約50ng/mL～約90ng/mL、約50ng/mL～約80ng/mL、約50ng/mL～約70ng/mL、約50ng/mL～約60ng/mL、約60ng/mL～約100ng/mL、約60ng/mL～約90ng/mL、約60ng/mL～約80ng/mL、約60ng/mL～約70ng/mL、約70ng/mL～約100ng/mL、約70ng/mL～約90ng/mL、約70ng/mL～約80ng/mL、約80ng/mL～約100ng/mL、約80ng/mL～約90ng/mL、または約90ng/mL～約100ng/mL（両端の値を含む）の濃度で、培養またはインキュベーションに加えられる。特定の態様において、組換えIL-21は、約10ng/mL～約100ng/mL（両端の値を含む）の濃度で、培養またはインキュベーションに加えられる。組換えIL-21は、25ng/mLまたは約25ng/mLの濃度で、培養またはインキュベーションに加えられる。

いくつかの態様において、補充される培養培地は、抗IL-21抗体などの抗体との複合体として加えられる、組換えIL-21などの1種または複数種の成長因子またはサイトカインを含む。したがって、いくつかの態様において、IL-21/抗IL-21抗体複合体などの複合体は、培養またはインキュベーションの期間中、間欠的に加えられる。いくつかのそのような局面において、IL-21/抗IL-21抗体複合体などの複合体は、培養またはインキュベーションの開始時またはほぼ開始時に加えられ、その後、培養またはインキュベーションの期間中は間欠的に、例えば培養培地を交換または洗い流すたびに加えられる。いくつかの態様において、IL-21/抗IL-21抗体複合体などの複合体は、0日目（インキュベーションの開始日）を始まりとして培養またはインキュベーションに加えられ、培養培地の交換または洗い流しごとに、IL-21/抗IL-21抗体複合体などの複合体を培養またはインキュベーションに補充するために、さらに加えられる。いくつかの態様において、本方法は、インキュベーションの開始時（0日目）と、インキュベーションの継続期間中は培養培地の洗浄または交換のたびに2または3日ごとに、例えば培養またはインキュベーションの5日目、7日目、9日目、11日目および14日目または約5日目、7日目、9日目、11日目および14日目に、IL-21/抗IL-21抗体複合体などの複合体を加える工程を含む。そのような態様のいずれにおいても、抗IL-21抗体を組換えIL-21と接触させ、これにより、IL-21/抗IL-21複合体を形成させ、該IL-21/抗IL-21複合体が培養培地に加えられる。そのような態様のいずれにおいても、IL-21/抗IL-21複合体を形成させるために組換えIL-21と抗IL-21抗体とを接触させる工程は、複合体の形成に適した温度および時間を含む条件下で実行される。そのような態様のいずれにおいても、培養する工程は37℃±2で30分間実行される。そのような態様のいずれにおいても、抗IL-21抗体は、100ng/mLもしくは約100ng/mLから、500ng/mLもしくは約500ng/mL、100ng/mLもしくは約100ng/mLから、400ng/mLもしくは約400ng/mL、100ng/mLもしくは約100ng/mLから、300ng/mLもしくは約300ng/mL、100ng/mLもしくは約100ng/mLから、200ng/mLもしくは約200ng/mL、200ng/mLもしくは約200ng/mLから、500ng/mLもしくは約500ng/mL、200ng/mLもしくは約200ng/mLから、400ng/mLもしくは約400ng/mL、200ng/mLもしくは約200ng/mLから、300ng/mLもしくは約300ng/mL、300ng/mLもしくは約300ng/mLから、500ng/mLもしくは約500ng/mL、300ng/mLもしくは約300ng/mLから、400ng/mLもしくは約400ng/mL、または400ng/mLもしくは約400ng/mLから、500ng/mLもしくは約500ng/mLの濃度で加えられる。いくつかの態様において、抗IL-21抗体は、100ng/mLまたは約100ng/mLから、500ng/mLまたは約500ng/mLの濃度で加えられる。いくつかの態様において、抗IL-21抗体は250ng/mLの濃度で加えられる。そのような態様のいずれにおいても、抗IL-21抗体との複合体を形成させるために使用される組換えIL-21の濃度は、約10ng/mL～約100ng/mL、約10ng/mL～約90ng/mL、約10ng/mL～約80ng/mL、約10ng/mL～約70ng/mL、約10ng/mL～約60ng/mL、約10ng/mL～約50ng/mL、約10ng/mL～約40ng/mL、約10ng/mL～約30ng/mL、約10ng/mL～約20ng/mL、約20ng/mL～約100ng/mL、約20ng/mL～約90ng/mL、約20ng/mL～約80ng/mL、約20ng/mL～約70ng/mL、約20ng/mL～約60ng/mL、約20ng/mL～約50ng/mL、約20ng/mL～約40ng/mL、約20ng/mL～約30ng/mL、約30ng/mL～約100ng/mL、約30ng/mL～約90ng/mL、約30ng/mL～約80ng/mL、約30ng/mL～約70ng/mL、約30ng/mL～約60ng/mL、約30ng/mL～約50ng/mL、約30ng/mL～約40ng/mL、約40ng/mL～約100ng/mL、約40ng/mL～約90ng/mL、約40ng/mL～約80ng/mL、約40ng/mL～約70ng/mL、約40ng/mL～約60ng/mL、約40ng/mL～約50ng/mL、約50ng/mL～約100ng/mL、約50ng/mL～約90ng/mL、約50ng/mL～約80ng/mL、約50ng/mL～約70ng/mL、約50ng/mL～約60ng/mL、約60ng/mL～約100ng/mL、約60ng/mL～約90ng/mL、約60ng/mL～約80ng/mL、約60ng/mL～約70ng/mL、約70ng/mL～約100ng/mL、約70ng/mL～約90ng/mL、約70ng/mL～約80ng/mL、約80ng/mL～約100ng/mL、約80ng/mL～約90ng/mL、または約90ng/mL～約100ng/mL（両端の値を含む）である。特定の態様において、抗IL-21抗体との複合体を形成させるために使用される組換えIL-21の濃度は、約10ng/mL～約100ng/mL（両端の値を含む）である。特定の態様において、抗IL-21抗体との複合体を形成させるために使用される組換えIL-21の濃度は、25ng/mLまたは約25ng/mLである。

いくつかの態様において、補充される培養培地は1種または複数種の成長因子またはサイトカイン、例えば組換えIL-15を含む。したがって、いくつかの態様では、インキュベーションまたは培養の期間中、成長因子またはサイトカイン、例えば組換えIL-15が間欠的に加えられる。いくつかのそのような局面において、成長因子またはサイトカイン、例えば組換えIL-15は、培養またはインキュベーションの開始時またはほぼ開始時に加えられ、その後、培養またはインキュベーションの期間中は間欠的に、例えば培養培地を交換または洗い流すたびに加えられる。いくつかの態様において、成長因子またはサイトカイン、例えば組換えIL-15は、0日目（インキュベーションの開始日）を始まりとして培養またはインキュベーションに加えられ、培養培地の交換または洗い流しごとに、成長因子またはサイトカイン、例えば組換えIL-15を培養またはインキュベーションに補充するために、さらに加えられる。いくつかの態様において、本方法は、インキュベーションの開始時（0日目）と、インキュベーションの継続期間中は培養培地の洗浄または交換のたびに2または3日ごとに、例えば培養またはインキュベーションの5日目、7日目、9日目、11日目および14日目または約5日目、7日目、9日目、11日目および14日目に、組換えIL-15を加える工程を含む。そのような態様のいずれにおいても、組換えIL-15は、約1ng/mL～約50ng/mL、約1ng/mL～約40ng/mL、約1ng/mL～約30ng/mL、約1ng/mL～約20ng/mL、約1ng/mL～約10ng/mL、約1ng/mL～約5ng/mL、約5ng/mL～約50ng/mL、約5ng/mL～約40ng/mL、約5ng/mL～約30ng/mL、約5ng/mL～約20ng/mL、約5ng/mL～約10ng/mL、約10ng/mL～約50ng/mL、約10ng/mL～約40ng/mL、約10ng/mL～約30ng/mL、約10ng/mL～約20ng/mL、約20ng/mL～約50ng/mL、約20ng/mL～約40ng/mL、約20ng/mL～約30ng/mL、約30ng/mL～約50ng/mL、約30ng/mL～約40ng/mL、または約40ng/mL～約50ng/mLの濃度で、培養またはインキュベーションに加えられる。そのような態様のいずれにおいても、組換えIL-15は、約1ng/mL～約50ng/mLの濃度で、培養またはインキュベーションに加えられる。そのような態様のいずれにおいても、組換えIL-15は、10ng/mLまたは約10ng/mLの濃度で、培養またはインキュベーションに加えられる。特定の態様では、500IU/mLのIL-2、10ng/mLのIL-15、および25ng/mLのIL-21が、培養またはインキュベーションに加えられる。

いくつかの態様において、補充される培養培地は1種または複数種の成長因子またはサイトカイン、例えば組換えIL-12を含む。したがって、いくつかの態様では、インキュベーションまたは培養の期間中、成長因子またはサイトカイン、例えば組換えIL-12が間欠的に加えられる。いくつかのそのような局面において、成長因子またはサイトカイン、例えば組換えIL-12は、培養またはインキュベーションの開始時またはほぼ開始時に加えられ、その後、培養またはインキュベーションの期間中は間欠的に、例えば培養培地を交換または洗い流すたびに加えられる。いくつかの態様において、成長因子またはサイトカイン、例えば組換えIL-12は、0日目（インキュベーションの開始日）を始まりとして培養またはインキュベーションに加えられ、培養培地の交換または洗い流しごとに、成長因子またはサイトカイン、例えば組換えIL-12を培養またはインキュベーションに補充するために、さらに加えられる。いくつかの態様において、本方法は、インキュベーションの開始時（0日目）と、インキュベーションの継続期間中は培養培地の洗浄または交換のたびに2または3日ごとに、例えば培養またはインキュベーションの5日目、7日目、9日目、11日目および14日目または約5日目、7日目、9日目、11日目および14日目に、組換えIL-12を加える工程を含む。そのような態様のいずれにおいても、組換えIL-12は、約1ng/mL～約50ng/mL、約1ng/mL～約40ng/mL、約1ng/mL～約30ng/mL、約1ng/mL～約20ng/mL、約1ng/mL～約10ng/mL、約1ng/mL～約5ng/mL、約5ng/mL～約50ng/mL、約5ng/mL～約40ng/mL、約5ng/mL～約30ng/mL、約5ng/mL～約20ng/mL、約5ng/mL～約10ng/mL、約10ng/mL～約50ng/mL、約10ng/mL～約40ng/mL、約10ng/mL～約30ng/mL、約10ng/mL～約20ng/mL、約20ng/mL～約50ng/mL、約20ng/mL～約40ng/mL、約20ng/mL～約30ng/mL、約30ng/mL～約50ng/mL、約30ng/mL～約40ng/mL、または約40ng/mL～約50ng/mLの濃度で、培養またはインキュベーションに加えられる。そのような態様のいずれにおいても、組換えIL-12は、約1ng/mL～約50ng/mLの濃度で、培養またはインキュベーションに加えられる。そのような態様のいずれにおいても、組換えIL-12は、10ng/mLまたは約10ng/mLの濃度で、培養またはインキュベーションに加えられる。

いくつかの態様において、補充される培養培地は1種または複数種の成長因子またはサイトカイン、例えば組換えIL-18を含む。したがって、いくつかの態様では、インキュベーションまたは培養の期間中、成長因子またはサイトカイン、例えば組換えIL-18が間欠的に加えられる。いくつかのそのような局面において、成長因子またはサイトカイン、例えば組換えIL-18は、培養またはインキュベーションの開始時またはほぼ開始時に加えられ、その後、培養またはインキュベーションの期間中は間欠的に、例えば培養培地を交換または洗い流すたびに加えられる。いくつかの態様において、成長因子またはサイトカイン、例えば組換えIL-18は、0日目（インキュベーションの開始日）を始まりとして培養またはインキュベーションに加えられ、培養培地の交換または洗い流しごとに、成長因子またはサイトカイン、例えば組換えIL-18を培養またはインキュベーションに補充するために、さらに加えられる。いくつかの態様において、本方法は、インキュベーションの開始時（0日目）と、インキュベーションの継続期間中は培養培地の洗浄または交換のたびに2または3日ごとに、例えば培養またはインキュベーションの5日目、7日目、9日目、11日目および14日目または約5日目、7日目、9日目、11日目および14日目に、組換えIL-18を加える工程を含む。そのような態様のいずれにおいても、組換えIL-18は、約1ng/mL～約50ng/mL、約1ng/mL～約40ng/mL、約1ng/mL～約30ng/mL、約1ng/mL～約20ng/mL、約1ng/mL～約10ng/mL、約1ng/mL～約5ng/mL、約5ng/mL～約50ng/mL、約5ng/mL～約40ng/mL、約5ng/mL～約30ng/mL、約5ng/mL～約20ng/mL、約5ng/mL～約10ng/mL、約10ng/mL～約50ng/mL、約10ng/mL～約40ng/mL、約10ng/mL～約30ng/mL、約10ng/mL～約20ng/mL、約20ng/mL～約50ng/mL、約20ng/mL～約40ng/mL、約20ng/mL～約30ng/mL、約30ng/mL～約50ng/mL、約30ng/mL～約40ng/mL、または約40ng/mL～約50ng/mLの濃度で、培養またはインキュベーションに加えられる。そのような態様のいずれにおいても、組換えIL-18は、約1ng/mL～約50ng/mLの濃度で、培養またはインキュベーションに加えられる。そのような態様のいずれにおいても、組換えIL-18は、10ng/mLまたは約10ng/mLの濃度で、培養またはインキュベーションに加えられる。

いくつかの態様において、補充される培養培地は1種または複数種の成長因子またはサイトカイン、例えば組換えIL-27を含む。したがって、いくつかの態様では、インキュベーションまたは培養の期間中、成長因子またはサイトカイン、例えば組換えIL-27が間欠的に加えられる。いくつかのそのような局面において、成長因子またはサイトカイン、例えば組換えIL-27は、培養またはインキュベーションの開始時またはほぼ開始時に加えられ、その後、培養またはインキュベーションの期間中は間欠的に、例えば培養培地を交換または洗い流すたびに加えられる。いくつかの態様において、成長因子またはサイトカイン、例えば組換えIL-27は、0日目（インキュベーションの開始日）を始まりとして培養またはインキュベーションに加えられ、培養培地の交換または洗い流しごとに、成長因子またはサイトカイン、例えば組換えIL-27を培養またはインキュベーションに補充するために、さらに加えられる。いくつかの態様において、本方法は、インキュベーションの開始時（0日目）と、インキュベーションの継続期間中は培養培地の洗浄または交換のたびに2または3日ごとに、例えば培養またはインキュベーションの5日目、7日目、9日目、11日目および14日目または約5日目、7日目、9日目、11日目および14日目に、組換えIL-27を加える工程を含む。そのような態様のいずれにおいても、組換えIL-27は、約1ng/mL～約50ng/mL、約1ng/mL～約40ng/mL、約1ng/mL～約30ng/mL、約1ng/mL～約20ng/mL、約1ng/mL～約10ng/mL、約1ng/mL～約5ng/mL、約5ng/mL～約50ng/mL、約5ng/mL～約40ng/mL、約5ng/mL～約30ng/mL、約5ng/mL～約20ng/mL、約5ng/mL～約10ng/mL、約10ng/mL～約50ng/mL、約10ng/mL～約40ng/mL、約10ng/mL～約30ng/mL、約10ng/mL～約20ng/mL、約20ng/mL～約50ng/mL、約20ng/mL～約40ng/mL、約20ng/mL～約30ng/mL、約30ng/mL～約50ng/mL、約30ng/mL～約40ng/mL、または約40ng/mL～約50ng/mLの濃度で、培養またはインキュベーションに加えられる。そのような態様のいずれにおいても、組換えIL-27は、約1ng/mL～約50ng/mLの濃度で、培養またはインキュベーションに加えられる。そのような態様のいずれにおいても、組換えIL-27は、10ng/mLまたは約10ng/mLの濃度で、培養またはインキュベーションに加えられる。

提供される方法の諸態様において、培養またはインキュベートする工程は、NK細胞の維持に必要または有用な化学的および物理的条件（例えば温度、気体）を提供することを含む。NK細胞の増殖を支援しうる化学的条件の例としては、典型的には成長（すなわち培養）培地に入れて提供される緩衝液、栄養素、血清、ビタミンおよび抗生物質が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。一態様では、NK培養培地は、10％FCSを含むMEMα、または5％ヒト血清/LiforCell（登録商標）FBS代替品（Lifeblood Products）を含むCellGro SCGM（Cell Genix）を含む。本発明での使用に適した他の培地としては、グラスコー培地（Glascow’s medium）（Gibco、カリフォルニア州カールズバッド）、RPMI培地（Sigma-Aldrich、ミズーリ州セントルイス）またはDMEM（Sigma-Aldrich、ミズーリ州セントルイス）が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。例えばMEMα（8.19μMニコチンアミド）、RPMI（8.19μMニコチンアミド）、DMEM（32.78μMニコチンアミド）およびグラスコー培地（16.39μMニコチンアミド）など、培養培地の多くが、ニコチンアミドをビタミン補給物として含有することに留意されたい。

いくつかの態様では、例えば細胞がヒト対象に導入（または再導入）される応用などにおいて、培養は、リンパ球培養用のAIM V（商標）無血清培地、MARROWMAX（商標）骨髄培地、または無血清幹細胞成長培地（SCGM）（例えばCellGenix（登録商標）GMP SCGM）などの無血清製剤を使って実行される。そのような培地製剤および補給物は商業的供給源から入手できる。培養物には、最適な生存能、増殖、機能性および/または生残を助長するためにアミノ酸、抗生物質、および/または記述したように他の成長因子サイトカインを補足することができる。いくつかの態様において、無血清培地には、低いパーセンテージのヒト血清、例えば0.5％～10％ヒト血清、例えば5％または約5％ヒト血清も補足しうる。そのような態様において、ヒト血清は、ヒトAB血漿からのヒト血清（ヒトAB血清）または自家血清であることができる。

いくつかの態様において、フィーダー細胞および任意でサイトカイン（例えば組換えIL-2またはIL-21）との培養は、ヒトNK細胞の成長または増大に適した温度、例えば少なくとも摂氏約25度、一般的には少なくとも約30度、一般的には摂氏37度または約37度を含む条件下で実行される。いくつかの態様において、培養は5％CO₂中、37℃±2で実行される。

提供される方法の諸態様において、培養する工程は、GMP条件下で実行されるインキュベーションを含む。いくつかの態様において、インキュベーションは閉鎖システムで行われ、いくつかの局面において、前記閉鎖システムは閉鎖自動システムでありうる。いくつかの態様において、前記1種または複数種の組換えサイトカインまたは成長因子を含有する培養培地は、無血清培地である。いくつかの態様において、インキュベーションは閉鎖自動システムにおいて無血清培地を使って実行される。

いくつかの態様において、NK細胞の増大は、細胞増大に適した培養容器において実行される。いくつかの態様において、培養容器はガス透過性培養容器、例えばG-Rexシステム（例えばG-Rex 10、G-Rex 10M、G-Rex 100 M/100M-CSまたはG-Rex 500 M/500M-CS）である。いくつかの態様において、培養容器は、閉鎖システムにおける細胞の増大に適したマイクロプレート、バッグまたは他の培養容器である。いくつかの態様において、増大はバイオリアクターにおいて実行することができる。いくつかの態様において、増大は、細胞増大システム（cell expansion system）を使用し、ガス透過性バッグ、例えばバイオリアクター（例えばXuri Cell Expansion System W25（GE Healthcare））と接続されたガス透過性バッグへの細胞の移送によって、実行される。一態様において、細胞増大システムは、約50mL、約100mL、約200mL、約300mL、約400mL、約500mL、約600mL、約700mL、約800mL、約900mL、約1L、約2L、約3L、約4L、約5L、約6L、約7L、約8L、約9L、および約10L、または前記のいずれかの間の任意の値である容積を持つ培養容器、例えばガス透過性細胞バッグなどのバッグを含む。いくつかの態様において、このプロセスは自動化または半自動化される。いくつかの局面において、増大培養は静置条件下で実行される。いくつかの態様において、増大培養は揺動条件下で実行される。培地は一度に加えるか、または灌流スケジュールで加えることができる。いくつかの態様において、バイオリアクターは、0.01L/分、0.05L/分、0.1L/分、0.2L/分、0.3L/分、0.4L/分、0.5L/分、1.0L/分、1.5L/分もしくは2.0L/分もしくは2.0L/分超、または約0.01L/分、0.05L/分、0.1L/分、0.2L/分、0.3L/分、0.4L/分、0.5L/分、1.0L/分、1.5L/分もしくは2.0L/分もしくは2.0L/分超、または少なくとも0.01L/分、0.05L/分、0.1L/分、0.2L/分、0.3L/分、0.4L/分、0.5L/分、1.0L/分、1.5L/分もしくは2.0L/分もしくは2.0L/分超の定常空気流で、37℃または37℃前後の温度および5％または5％前後のCO2レベルを維持する。一定の態様において、培養する工程の少なくとも一部は、290ml/日、580ml/日および/または1160ml/日の流量での灌流で行われる。

いくつかの局面において、細胞は、灌流に対応した自動閉鎖増大システムにおいて増大される。灌流は、最適な成長率が達成されることを確実にするために、細胞に培地を連続的に加えることができる。

本増大方法は、閉鎖自動システムにおける無血清培地の使用を含む、GMP条件下で実行することができる。いくつかの態様では、本方法の工程の任意の1つまたは複数を、閉鎖システムにおいて、またはGMP条件下で、実行することができる。一定の態様において、すべてのプロセス操作はGMPスイートで行われる。いくつかの態様では、細胞療法を製造、生成または産生するための方法の他の処理工程の1つまたは複数を実行するために、閉鎖システムが使用される。いくつかの態様では、処理工程、例えば単離、選択および/または濃縮、処理、細胞の増大に関連するインキュベーションを含む培養工程、ならびに製剤化工程のうちの1つもしくは複数または全部が、統合型もしくは独立型システム中のシステム、デバイスもしくは装置を使って、かつ/または自動的に、もしくはプログラム可能な形で、実行される。いくつかの局面において、システムまたは装置は、そのシステムまたは装置と連絡しているコンピュータおよび/またはコンピュータプログラムを含み、ユーザーはそれを使って、処理、単離、工学的操作および製剤化工程をプログラムし、制御し、そのアウトカムを評価し、ならびに/またはそのさまざまな局面を調節することができる。

提供される態様のいずれかの一部において、培養する工程は、本方法が少なくとも2.50×10⁸個または少なくとも約2.50×10⁸個のg-NK細胞の増大を達成する時点まで実行される。提供される態様のいずれかの一部において、培養する工程は、本方法が少なくとも5.0×10⁸個または少なくとも約5.0×10⁸個のg-NK細胞の増大を達成する時点まで実行される。提供される態様のいずれかの一部において、培養する工程は、本方法が少なくとも1.0×10⁹個または少なくとも約1.0×10⁹個のg-NK細胞の増大を達成するまで実行される。提供される態様のいずれかの一部において、培養する工程は、本方法が少なくとも5.0×10⁹個または少なくとも約5.0×10⁹個のg-NK細胞の増大を達成する時点まで実行される。

提供される態様のいずれかの一部において、培養する工程は、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、15日、16日、17日、18日、19日、20日、21日、22日、23日、24日もしくは25日、または約5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、15日、16日、17日、18日、19日、20日、21日、22日、23日、24日もしくは25日、または少なくとも5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、15日、16日、17日、18日、19日、20日、21日、22日、23日、24日もしくは25日、または少なくとも約5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、15日、16日、17日、18日、19日、20日、21日、22日、23日、24日もしくは25日間にわたって実行される。いくつかの態様において、培養する工程は、14日、または約14日、または少なくとも14日、または少なくとも約14日間にわたって実行される。いくつかの態様において、培養する工程は、21日、または約21日、または少なくとも21日、または少なくとも約21日間にわたって実行される。

提供される態様のいずれかの一部において、提供される方法のいずれかによる培養またはインキュベーションは、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、15日、16日、17日、18日、19日、20日、21日、22日、23日、24日もしくは25日、または約5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、15日、16日、17日、18日、19日、20日、21日、22日、23日、24日もしくは25日、または少なくとも5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、15日、16日、17日、18日、19日、20日、21日、22日、23日、24日もしくは25日、または少なくとも約5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、15日、16日、17日、18日、19日、20日、21日、22日、23日、24日もしくは25日間にわたって実行される。いくつかの態様において、培養する工程は、14日、または約14日、または少なくとも14日、または少なくとも約14日間にわたって実行される。いくつかの態様において、培養する工程は、21日、または約21日、または少なくとも21日、または少なくとも約21日間にわたって実行される。一定の態様において、培養する工程の開始時の濃縮NK細胞が前もって凍結または凍結保存された後に解凍されたものである場合、典型的には、より長い培養継続期間が必要である。細胞の最適な培養日数を、例えば培養開始時の細胞の状態、培養開始時または培養する工程の期間中の細胞の健康状態または生存能力、および/または培養する工程の終了時に、例えば所望する細胞の応用に依存して、例えば治療目的で対象に投与されるべき細胞の用量などに依存して所望される、しきい細胞数などといった要因に応じて、実験的に決定することは、当業者の水準内にある。

培養する工程の終了時に細胞は採取される。細胞の収集または採取は、培養する工程の終了後に、培養容器からの細胞の遠心分離によって、達成することができる。例えば細胞は、約14日間の培養後に遠心分離によって採取される。細胞を採取した後、細胞を洗浄する。機能試験または表現型試験のために細胞の試料を収集することができる。機能試験にも表現型試験にも使用しない他の細胞はいずれも、別途、製剤化することができる。場合により、細胞は、細胞の凍結保存のために、凍結保護物質と共に製剤化される。

いくつかの態様において、提供される方法は、単離、選択および/または濃縮の前または後のどちらかにおいて、細胞を凍結する、例えば凍結保存する工程を含む。いくつかの態様において、提供される方法は、インキュベーションおよび/または培養の前または後のどちらかにおいて、細胞を凍結する、例えば凍結保存する工程を含む。いくつかの態様において、本方法は、凍結保護物質の存在下で細胞を凍結保存し、これにより、凍結保存組成物を産生する工程を含む。いくつかの局面において、本方法は、インキュベーションに先だっておよび/または対象への投与に先立って、凍結保存組成物を、凍結保護物質を低減または除去するための条件下で洗浄する工程を含む。いくつかの局面では、さまざまな公知の凍結溶液およびパラメータをいずれも使用しうる。いくつかの態様において、細胞は、最終濃度が12.5％、12.0％、11.5％、11.0％、10.5％、10.0％、9.5％、9.0％、8.5％、8.0％、7.5％、7.0％、6.5％、6.0％、5.5％もしくは5.0％または約12.5％、12.0％、11.5％、11.0％、10.5％、10.0％、9.5％、9.0％、8.5％、8.0％、7.5％、7.0％、6.5％、6.0％、5.5％もしくは5.0％DMSO、または1％～15％、6％～12％、5％～10％もしくは6％～8％DMSOである培地および/または溶液中で、凍結、例えば冷凍または凍結保存される。特定の態様において、細胞は、最終濃度が5.0％、4.5％、4.0％、3.5％、3.0％、2.5％、2.0％、1.5％、1.25％、1.0％、0.75％、0.5％もしくは0.25％または約5.0％、4.5％、4.0％、3.5％、3.0％、2.5％、2.0％、1.5％、1.25％、1.0％、0.75％、0.5％もしくは0.25％HSA、または0.1％～-5％、0.25％～4％、0.5％～2％もしくは1％～2％HSAである培地および/または溶液中で、凍結、例えば冷凍または凍結保存される。ある例では、20％DMSOおよび8％ヒト血清アルブミン（HSA）を含有するPBS、または他の適切な細胞凍結培地が使用される。次にこれを、DMSOおよびHSAの最終濃度がそれぞれ10％および4％になるように、培地で1:1希釈する。次いで、一般的には、細胞を、毎分1度または約1度の速度で-80℃または約-80℃まで凍結し、液体窒素貯蔵タンクの気相中で貯蔵する。いくつかの態様において、細胞は、凍結保護物質を含む無血清凍結保存培地中で凍結される。いくつかの態様において、凍結保護物質はDMSOである。いくつかの態様において、凍結保存培地は、5％または約5％から、10％または約10％DMSO（v/v）である。いくつかの態様において、凍結保存培地は5％または約5％DMSO（v/v）である。いくつかの態様において、凍結保存培地は6％または約6％DMSO（v/v）である。いくつかの態様において、凍結保存培地は7％または約7％DMSO（v/v）である。いくつかの態様において、凍結保存培地は8％または約8％DMSO（v/v）である。いくつかの態様において、凍結保存培地は9％または約9％DMSO（v/v）である。いくつかの態様において、凍結保存培地は10％または約10％DMSO（v/v）である。いくつかの態様において、凍結保存培地は市販の凍結保存溶液（CryoStor（商標）CS10またはCS5）を含有する。CryoStor（商標）CS10は、10％ジメチルスルホキシド（DMSO）を含有する凍結保存培地である。CryoStor（商標）CS5は、5％ジメチルスルホキシド（DMSO）を含有する凍結保存培地である。いくつかの態様において、凍結保存培地は、1種または複数種の追加の賦形剤、例えばplasmalyte Aまたはヒト血清アルブミン（HSA）を含有する。

いくつかの態様において、細胞は、5×10⁶～1×10⁸細胞/mLの密度で凍結保存される。例えば細胞は、5×10⁶細胞/mLもしくは約5×10⁶細胞/mL、10×10⁶細胞/mLもしくは約10×10⁶細胞/mL、15×10⁶細胞/mLもしくは約15×10⁶細胞/mL、20×10⁶細胞/mLもしくは約20×10⁶細胞/mL、25×10⁶細胞/mLもしくは約25×10⁶細胞/mL、30×10⁶細胞/mLもしくは約30×10⁶細胞/mL、40×10⁶細胞/mLもしくは約40×10⁶細胞/mL、50×10⁶細胞/mLもしくは約50×10⁶細胞/mL、60×10⁶細胞/mLもしくは約60×10⁶細胞/mL、70×10⁶細胞/mLもしくは約70×10⁶細胞/mL、80×10⁶細胞/mLもしくは約80×10⁶細胞/mL、または90×10⁶細胞/mLもしくは約90×10⁶細胞/mL、または前記のいずれかの間の任意の値の密度で凍結保存される。細胞は、凍結保存容器に適した任意の体積で凍結保存することができる。いくつかの態様において、細胞はバイアルに凍結保存される。凍結保存培地の体積は、1mLまたは約1mLから、50mLまたは約50mL、例えば1mLまたは約1mLから、5mLまたは約5mLでありうる。いくつかの態様において、細胞はバッグ中で凍結保存される。凍結保存培地の体積は10mLまたは約10mLから、500mLまたは約500mL、例えば100mLもしくは約100mLから、200mLもしくは約200mLでありうる。採取され増大された細胞は、低い温度環境、例えば-80℃～-196℃の温度において凍結保存することができる。提供される方法のいずれかの一部において、本方法は、培養する工程の終了時に、培養する工程の開始時と比較して増加した数のNKG2C^pos細胞を産生する。例えば、培養する工程の開始時と比較した培養する工程の終了時におけるNKG2C^pos細胞の増加は、100倍超もしくは約100倍超、200倍超もしくは約200倍超、300倍超もしくは約300倍超、400倍超もしくは約400倍超、500倍超もしくは約500倍超、600倍超もしくは約600倍超、700倍超もしくは約700倍超、または800倍超もしくは約800倍超であることができる。任意の態様の一部において、増加は1000倍または約1000倍である。任意の態様の一部において、増加は2000倍または約2000倍である。任意の態様の一部において、増加は2500倍または約2500倍である。任意の態様の一部において、増加は3000倍または約3000倍である。任意の態様の一部において、増加は5000倍または約5000倍である。任意の態様の一部において、増加は10000倍または約10000倍である。任意の態様の一部において、増加は15000倍または約15000倍である。任意の態様の一部において、増加は20000倍または約20000倍である。任意の態様の一部において、増加は25000倍または約25000倍である。任意の態様の一部において、増加は30000倍または約30000倍である。任意の態様の一部において、増加は35000倍または約35000倍である。いくつかの態様において、提供される方法のいずれかによる培養またはインキュベーションは、少なくとも2.50×10⁸個もしくは約2.50×10⁸個のNKG2C^pos細胞、少なくとも3.0×10⁸個もしくは約3.0×10⁸個のNKG2C^pos細胞、少なくとも4.0×10⁸個もしくは約4.0×10⁸個のNKG2C^pos細胞、少なくとも5.0×10⁸個もしくは約5.0×10⁸個のNKG2C^pos細胞、少なくとも6.0×10⁸個もしくは約6.0×10⁸個のNKG2C^pos細胞、少なくとも7.0×10⁸個もしくは約7.0×10⁸個のNKG2C^pos細胞、少なくとも8.0×10⁸個もしくは約8.0×10⁸個のNKG2C^pos細胞、少なくとも9.0×10⁸個もしくは約9.0×10⁸個のNKG2C^pos細胞、少なくとも1.0×10⁹個もしくは約1.0×10⁹個のNKG2C^pos細胞、少なくとも1.5×10⁹個もしくは約1.5×10⁹個のNKG2C^pos細胞、少なくとも2.0×10⁹個もしくは約2.0×10⁹個のNKG2C^pos細胞、少なくとも3.0×10⁹個もしくは約3.0×10⁹個のNKG2C^pos細胞、少なくとも4.0×10⁹個もしくは約4.0×10⁹個のNKG2C^pos細胞、少なくとも5.0×10⁹個もしくは約5.0×10⁹個のNKG2C^pos細胞、少なくとも1.0×10¹⁰個もしくは約1.0×10¹⁰個のNKG2C^pos細胞、少なくとも1.5×10¹⁰個もしくは約1.5×10¹⁰個のNKG2C^pos細胞、少なくとも2.0×10¹⁰個もしくは約2.0×10¹⁰個のNKG2C^pos細胞、少なくとも2.5×10¹⁰個もしくは約2.5×10¹⁰個のNKG2C^pos細胞、またはそれ以上の増大が本方法によって達成される時点まで、実行される。

提供される方法のいずれかの一部において、本方法は、培養する工程の終了時に、培養する工程の開始時と比較して増加した数のNKG2A^neg細胞を産生する。例えば、培養する工程の開始時と比較した培養する工程の終了時におけるNKG2A^neg細胞の増加は、100倍超もしくは約100倍超、200倍超もしくは約200倍超、300倍超もしくは約300倍超、400倍超もしくは約400倍超、500倍超もしくは約500倍超、600倍超もしくは約600倍超、700倍超もしくは約700倍超、または800倍超もしくは約800倍超であることができる。任意の態様の一部において、増加は1000倍または約1000倍である。任意の態様の一部において、増加は2000倍または約2000倍である。任意の態様の一部において、増加は3000倍または約3000倍である。任意の態様の一部において、増加は2500倍または約2500倍である。任意の態様の一部において、増加は5000倍または約5000倍である。任意の態様の一部において、増加は10000倍または約10000倍である。任意の態様の一部において、増加は15000倍または約15000倍である。任意の態様の一部において、増加は20000倍または約20000倍である。任意の態様の一部において、増加は25000倍または約25000倍である。任意の態様の一部において、増加は30000倍または約30000倍である。任意の態様の一部において、増加は35000倍または約35000倍である。いくつかの態様において、提供される方法のいずれかによる培養またはインキュベーションは、少なくとも2.50×10⁸個もしくは約2.50×10⁸個のNKG2A^neg細胞、少なくとも3.0×10⁸個もしくは約3.0×10⁸個のNKG2A^neg細胞、少なくとも4.0×10⁸個もしくは約4.0×10⁸個のNKG2A^neg細胞、少なくとも5.0×10⁸個もしくは約5.0×10⁸個のNKG2A^neg細胞、少なくとも6.0×10⁸個もしくは約6.0×10⁸個のNKG2A^neg細胞、少なくとも7.0×10⁸個もしくは約7.0×10⁸個のNKG2A^neg細胞、少なくとも8.0×10⁸個もしくは約8.0×10⁸個のNKG2A^neg細胞、少なくとも9.0×10⁸個もしくは約9.0×10⁸個のNKG2A^neg細胞、少なくとも1.0×10⁹個もしくは約1.0×10⁹個のNKG2A^neg細胞、少なくとも1.5×10⁹個もしくは約1.5×10⁹個のNKG2A^neg細胞、少なくとも2.0×10⁹個もしくは約2.0×10⁹個のNKG2A^neg細胞、少なくとも3.0×10⁹個もしくは約3.0×10⁹個のNKG2A^neg細胞、少なくとも4.0×10⁹個もしくは約4.0×10⁹個のNKG2A^neg細胞、少なくとも5.0×10⁹個もしくは約5.0×10⁹個のNKG2A^neg細胞、少なくとも1.0×10¹⁰個もしくは約1.0×10¹⁰個のNKG2A^neg細胞、少なくとも1.5×10¹⁰個もしくは約1.5×10¹⁰個のNKG2A^neg細胞、少なくとも2.0×10¹⁰個もしくは約2.0×10¹⁰個のNKG2A^neg細胞、少なくとも2.5×10¹⁰個もしくは約2.5×10¹⁰個のNKG2A^neg細胞、またはそれ以上の増大が本方法によって達成される時点まで、実行される。

提供される方法のいずれかの一部において、本方法は、培養する工程の終了時に、培養する工程の開始時と比較して増加した数のNKG2C^posNKG2A^neg細胞を産生する。例えば、培養する工程の開始時と比較した培養する工程の終了時におけるNKG2C^posNKG2A^neg細胞の増加は、100倍超もしくは約100倍超、200倍超もしくは約200倍超、300倍超もしくは約300倍超、400倍超もしくは約400倍超、500倍超もしくは約500倍超、600倍超もしくは約600倍超、700倍超もしくは約700倍超、または800倍超もしくは約800倍超であることができる。任意の態様の一部において、増加は1000倍または約1000倍である。任意の態様の一部において、増加は2000倍または約2000倍である。任意の態様の一部において、増加は2500倍または約2500倍である。任意の態様の一部において、増加は3000倍または約3000倍である。任意の態様の一部において、増加は5000倍または約5000倍である。任意の態様の一部において、増加は10000倍または約10000倍である。任意の態様の一部において、増加は15000倍または約15000倍である。任意の態様の一部において、増加は20000倍または約20000倍である。任意の態様の一部において、増加は25000倍または約25000倍である。任意の態様の一部において、増加は30000倍または約30000倍である。任意の態様の一部において、増加は35000倍または約35000倍である。いくつかの態様において、提供される方法のいずれかによる培養またはインキュベーションは、少なくとも2.50×10⁸個もしくは約2.50×10⁸個のNKG2C^posNKG2A^neg細胞、少なくとも3.0×10⁸個もしくは約3.0×10⁸個のNKG2C^posNKG2A^neg細胞、少なくとも4.0×10⁸個もしくは約4.0×10⁸個のNKG2C^posNKG2A^neg細胞、少なくとも5.0×10⁸個もしくは約5.0×10⁸個のNKG2C^posNKG2A^neg細胞、少なくとも6.0×10⁸個もしくは約6.0×10⁸個のNKG2C^posNKG2A^neg細胞、少なくとも7.0×10⁸個もしくは約7.0×10⁸個のNKG2C^posNKG2A^neg細胞、少なくとも8.0×10⁸個もしくは約8.0×10⁸個のNKG2C^posNKG2A^neg細胞、少なくとも9.0×10⁸個もしくは約9.0×10⁸個のNKG2C^posNKG2A^neg細胞、少なくとも1.0×10⁹個もしくは約1.0×10⁹個のNKG2C^posNKG2A^neg細胞、少なくとも1.5×10⁹個もしくは約1.5×10⁹個のNKG2C^posNKG2A^neg細胞、少なくとも2.0×10⁹個もしくは約2.0×10⁹個のNKG2C^posNKG2A^neg細胞、少なくとも3.0×10⁹個もしくは約3.0×10⁹個のNKG2C^posNKG2A^neg細胞、少なくとも4.0×10⁹個もしくは約4.0×10⁹個のNKG2C^posNKG2A^neg細胞、少なくとも5.0×10⁹個もしくは約5.0×10⁹個のNKG2C^posNKG2A^neg細胞、少なくとも1.0×10¹⁰個もしくは約1.0×10¹⁰個のNKG2C^posNKG2A^neg細胞、少なくとも1.5×10¹⁰個もしくは約1.5×10¹⁰個のNKG2C^posNKG2A^neg細胞、少なくとも2.0×10¹⁰個もしくは約2.0×10¹⁰個のNKG2C^posNKG2A^neg細胞、少なくとも2.5×10¹⁰個もしくは約2.5×10¹⁰個のNKG2C^posNKG2A^neg細胞、またはそれ以上の増大が本方法によって達成される時点まで、実行される。

提供される方法のいずれかの一部において、本方法は、培養する工程の終了時に、培養する工程の開始時と比較して増加した数のg-NK細胞を産生する。例えば、培養する工程の開始時と比較した培養する工程の終了時におけるg-NK細胞の増加は、100倍超もしくは約100倍超、200倍超もしくは約200倍超、300倍超もしくは約300倍超、400倍超もしくは約400倍超、500倍超もしくは約500倍超、600倍超もしくは約600倍超、700倍超もしくは約700倍超、または800倍超もしくは約800倍超であることができる。任意の態様の一部において、増加は1000倍または約1000倍である。任意の態様の一部において、増加は2000倍または約2000倍である。任意の態様の一部において、増加は2500倍または約2500倍である。任意の態様の一部において、増加は3000倍または約3000倍である。任意の態様の一部において、増加は5000倍または約5000倍である。任意の態様の一部において、増加は10000倍または約10000倍である。任意の態様の一部において、増加は15000倍または約15000倍である。任意の態様の一部において、増加は20000倍または約20000倍である。任意の態様の一部において、増加は25000倍または約25000倍である。任意の態様の一部において、増加は30000倍または約30000倍である。任意の態様の一部において、増加は35000倍または約35000倍である。いくつかの態様において、提供される方法のいずれかによる培養またはインキュベーションは、少なくとも2.50×10⁸個もしくは約2.50×10⁸個のg-NK細胞、少なくとも3.0×10⁸個もしくは約3.0×10⁸個のg-NK細胞、少なくとも4.0×10⁸個もしくは約4.0×10⁸個のg-NK細胞、少なくとも5.0×10⁸個もしくは約5.0×10⁸個のg-NK細胞、少なくとも6.0×10⁸個もしくは約6.0×10⁸個のg-NK細胞、少なくとも7.0×10⁸個もしくは約7.0×10⁸個のg-NK細胞、少なくとも8.0×10⁸個もしくは約8.0×10⁸個のg-NK細胞、少なくとも9.0×10⁸個もしくは約9.0×10⁸個のg-NK細胞、少なくとも1.0×10⁹個もしくは約1.0×10⁹個のg-NK細胞、少なくとも1.5×10⁹個もしくは約1.5×10⁹個のg-NK細胞、少なくとも2.0×10⁹個もしくは約2.0×10⁹個のg-NK細胞、少なくとも3.0×10⁹個もしくは約3.0×10⁹個のg-NK細胞、少なくとも4.0×10⁹個もしくは約4.0×10⁹個のg-NK細胞、少なくとも5.0×10⁹個もしくは約5.0×10⁹個のg-NK細胞もしくはそれ以上、少なくとも1.0×10¹⁰個もしくは約1.0×10¹⁰個のg-NK細胞もしくはそれ以上、少なくとも1.5×10¹⁰個もしくは約1.5×10¹⁰個のg-NK細胞もしくはそれ以上、少なくとも2.0×10¹⁰個もしくは約2.0×10¹⁰個のg-NK細胞もしくはそれ以上、または少なくとも2.5×10¹⁰個もしくは約2.5×10¹⁰個のg-NK細胞もしくはそれ以上の増大が本方法によって達成される時点まで、実行される。

いくつかの態様において、提供される方法は、g-NK細胞の優先的増大をもたらす。いくつかの局面において、g-NK細胞は、NK細胞を他のリンパ球または免疫細胞と区別し、g-NK細胞を通常型NK細胞と区別する、1種または複数種のさまざまなマーカーの表面発現の有無またはレベルによって同定される。諸態様において、表面発現は、フローサイトメトリーによって、例えばマーカーに特異的に結合する抗体で染色し、マーカーへの抗体の結合を検出することによって、決定することができる。類似する方法を実行して細胞内マーカーの発現を評価することもできるが、そのような方法が、典型的には、フローサイトメトリーによって細胞内タンパク質を検出するために、染色に先立って固定化および透過処理のための方法を含む点は異なる。いくつかの態様において、固定化はホルムアルデヒド（例えば0.01％）を使って達成され、続いて、Triton、NP-50、Tween 20、サポニン、ジギトニンまたはLeucopermなどの洗剤（例えば0.1％～1％の洗剤、例えば0.5％または約0.5％）を使って膜を破壊する。

抗体および他の結合実体を使ってマーカータンパク質の発現レベルを検出することで、g^-NK細胞を同定し、検出しおよび/または単離することができる。適切な抗体としては、ポリクローナル、モノクローナル、フラグメント（例えばFabフラグメント）、一本鎖抗体および他の形態の特異的結合分子を挙げることができる。

いくつかの態様において、細胞（例えばNK細胞サブセット）は、細胞内マーカーまたは表面マーカーであることができる特定マーカーの検出可能な存在が、細胞上または細胞中にあるなら、その特定マーカーについて陽性（pos）である。諸態様において、染色が、アイソタイプ対応対照を使ってその他は同一の条件下で同じ手順を実行して検出される染色を実質的に上回るレベルで検出可能であり、および/またはそのマーカーについて陽性であることが公知である細胞と実質的に類似するレベルであり、もしくはいくつかの事例では、それより高いレベルであり、および/またはそのマーカーについて陰性であることが公知である細胞のレベルよりも高いレベルであるなら、表面発現は陽性である。

いくつかの態様において、細胞（例えばNK細胞サブセット）は、細胞内マーカーまたは表面マーカーであることができる特定マーカーの検出可能な存在が細胞上または細胞中にないなら、その特定マーカーについて陰性（neg）である。諸態様において、染色が、アイソタイプ対応対照を使ってその他は同一の条件下で同じ手順を実行して検出される染色を実質的に上回るレベルで検出することができず、および/またはそのマーカーについて陽性であることが公知である細胞より実質的に低いレベルであり、および/またはそのマーカーについて陰性であることが公知である細胞と実質的に類似するレベルであるなら、表面発現は陰性である。

いくつかの態様において、細胞（例えばNK細胞サブセット）は、細胞上または細胞中での特定マーカーの検出可能な存在が、そのマーカーについて陽性であることが公知の細胞と比較して低いレベルであるなら、その特定マーカーについて低（loまたはmin）発現である。諸態様において、表面発現は、フローサイトメトリーによって、例えばマーカーに特異的に結合する抗体で染色し、マーカーへの抗体の結合を検出することによって、決定することができ、ここで、染色がそのマーカーについて陽性であることが公知の細胞よりも低いレベルであるならば、使用した方法に依存して表面発現または細胞内発現のいずれかである発現は、低発現である。

いくつかの態様において、g-NK細胞は、NK細胞の表現型（例えばCD45^pos、CD3^negおよび/またはCD56^pos）を有し、g-NK細胞サブセットを同定するまたはg-NK細胞サブセットと関連する1種または複数種のマーカーを発現する細胞である。

いくつかの態様において、g-NK細胞は、特許出願公開US2013/0295044またはZhang et al.（2013）J. Immunol.,190:1402-1406に記載されているように同定される。

いくつかの態様において、g-NK細胞は、実質的なFcRγを発現しないが、ナチュラルキラー細胞のマーカーを少なくとも1種は発現する細胞である。FcRγ鎖（ヒト（Homo sapiens）、高親和性免疫グロブリンγFc受容体Iともいう）のアミノ酸配列はNCBIデータベースにおいてアクセッション番号NP＿004097.1（GI:4758344）として入手することができ、SEQ ID NO:1として以下に再掲する。

いくつかの態様において、NK細胞のg-NK細胞サブセットは、NK細胞の集団またはNK細胞の部分集団によってFcRγが発現されるかどうかを観察することによって検出することができる。場合により、g-NK細胞はFcRγを発現しない細胞として同定される。FcRγタンパク質は細胞内タンパク質である。したがっていくつかの局面において、FcRγの有無は、細胞内タンパク質の検出を可能にする固定化および透過処理などによる細胞の処理後に検出することができる。いくつかの態様において、細胞は、細胞内検出に先立って、例えば細胞の固定に先立って、1種または複数種の表面マーカー（CD45、CD3および/またはCD56）についてさらに評価される。いくつかの態様において、g-NK細胞は、CD45^pos/CD3^neg/CD56^pos/FcRγ^negである細胞として同定され、検出され、濃縮されおよび/または単離される。

いくつかの態様では、増大された集団中のNK細胞の50％超または約50％超が、FcRγ^negである。いくつかの態様では、増大された集団中のNK細胞の60％超または約60％超が、FcRγ^negである。いくつかの態様では、増大された集団中のNK細胞の70％超または約70％超が、FcRγ^negである。いくつかの態様では、増大された集団中のNK細胞の80％超または約80％超が、FcRγ^negである。いくつかの態様では、増大された集団中のNK細胞の90％超または約90％超が、FcRγ^negである。いくつかの態様では、増大された集団中のNK細胞の95％超または約95％超が、FcRγ^negである。例えば、本明細書における方法は、一般に、高度に純粋な、例えば70～90％の、g-NK細胞産物をもたらす。

いくつかの態様において、細胞内染色を使用することなくg-NK細胞の発現を検出することは、例えば試料の細胞を細胞選別または機能アッセイに供する予定がある場合などに役立ちうる。実質的に純粋な細胞集団の正体を確認するために、FcRγの細胞内染色を可能にするための処理、例えば固定および透過処理などを使用することはできるものの、g^-NK細胞を同定し、検出しまたは単離する時には、多くの場合、細胞を傷つけずに検出することができる細胞表面マーカーを使用することができる。したがっていくつかの態様において、g-NK細胞は、NK細胞のサブセット間でFcRγの欠如と相関する代用マーカープロファイルを使って同定される。いくつかの態様において、代用マーカープロファイルは、FcRγなどの細胞内タンパク質の有無を評価することが、その細胞の特定の応用に依存して、困難であるか不可能である場合には、特に有用である。

本明細書において、細胞表面マーカーの一定の組み合わせは、g-NK細胞表現型、すなわちFcRγの細胞内発現を欠くまたは欠損している細胞と相関し、これにより、細胞を傷つけない方法でg-NK細胞を同定または検出するための代用マーカープロファイルを提供することが見いだされる。いくつかの態様において、本明細書において提供されるg-NK細胞の代用マーカープロファイルは、1種もしくは複数種のマーカーCD16（CD16^pos）、NKG2C（NKG2C^pos）、もしくはCD57（CD57pos）の陽性表面発現ならびに/または1種もしくは複数種のマーカーCD7（CD7^dim/neg）、CD161（CD161^neg）および/もしくはNKG2A（NKG2A^neg）の低もしくは陰性表面発現に基づく。いくつかの態様において、細胞はさらに、NK細胞の1種または複数種の表面マーカー、例えばCD45、CD3および/またはCD56について評価される。いくつかの態様において、g-NK細胞は、代用マーカープロファイルCD45^pos/CD3^neg/CD56^pos/CD16^pos/CD57^pos/CD7^dim/neg/CD161^negで同定され、検出され、濃縮されおよび/または単離される。いくつかの態様において、g-NK細胞は、代用マーカープロファイルCD45^pos/CD3^neg/CD56^pos/NKG2A^neg/CD161^negで同定され、検出され、濃縮されおよび/または単離される。いくつかの態様において、NKG2C^posおよび/またはNKG2A^negであるg-NK細胞が、同定され、検出され、濃縮されおよび/または単離される。

いくつかの態様において、増大された集団中のNK細胞の30％超もしくは約30％超はNKG2Cについて陽性であり、および/または増大された集団中のNK細胞の50％超もしくは約50％超はNKG2Aについて陰性もしくは低発現である。いくつかの態様において、増大された集団中のNK細胞の35％超もしくは約35％超はNKG2Cについて陽性であり、および/または増大された集団中のNK細胞の60％超もしくは約60％超はNKG2Aについて陰性もしくは低発現である。いくつかの態様において、増大された集団中のNK細胞の40％超もしくは約40％超はNKG2Cについて陽性であり、および/または増大された集団中のNK細胞の70％超もしくは約70％超はNKG2Aについて陰性もしくは低発現である。いくつかの態様において、増大された集団中のNK細胞の45％超もしくは約45％超はNKG2Cについて陽性であり、および/または増大された集団中のNK細胞の80％超もしくは約80％超はNKG2Aについて陰性もしくは低発現である。いくつかの態様において、増大された集団中のNK細胞の50％超もしくは約50％超はNKG2Cについて陽性であり、および/または増大された集団中のNK細胞の85％超もしくは約85％超はNKG2Aについて陰性もしくは低発現である。いくつかの態様において、増大された集団中のNK細胞の55％超もしくは約55％超はNKG2Cについて陽性であり、および/または増大された集団中のNK細胞の90％超もしくは約90％超はNKG2Aについて陰性もしくは低発現である。いくつかの態様において、増大された集団中のNK細胞の60％超もしくは約60％超はNKG2Cについて陽性であり、および/または増大された集団中のNK細胞の95％超もしくは約95％超はNKG2Aについて陰性もしくは低発現である。

いくつかの態様において、増大された集団中のg-NK細胞の70％超または約70％超はパーフォリンについて陽性であり、かつ増大された集団中のg-NK細胞の70％超または約70％超はグランザイムBについて陽性である。いくつかの態様において、増大された集団中のg-NK細胞の75％超または約75％超はパーフォリンについて陽性であり、かつ増大された集団中のg-NK細胞の75％超または約75％超はグランザイムBについて陽性である。いくつかの態様において、増大された集団中のg-NK細胞の80％超または約80％超はパーフォリンについて陽性であり、かつ増大された集団中のg-NK細胞の80％超または約80％超はグランザイムBについて陽性である。いくつかの態様において、増大された集団中のg-NK細胞の85％超または約85％超はパーフォリンについて陽性であり、かつ増大された集団中のg-NK細胞の85％超または約85％超はグランザイムBについて陽性である。いくつかの態様において、増大された集団中のg-NK細胞の90％超または約90％超はパーフォリンについて陽性であり、かつ増大された集団中のg-NK細胞の90％超または約90％超はグランザイムBについて陽性である。いくつかの態様において、増大された集団中のg-NK細胞の95％超または約95％超はパーフォリンについて陽性であり、かつ増大された集団中のg-NK細胞の95％超または約95％超はグランザイムBについて陽性である。

提供される方法によって増大された細胞は、数ある機能的または表現型的活性のいずれか、例えば限定するわけではないが細胞傷害活性、脱顆粒（dengranulation）、サイトカインを産生または分泌する能力、および1種または複数種の細胞内または表面表現型マーカーの発現のいずれかについて、評価することができる。そのような活性を評価するための方法は公知であり、本明細書および実施例において例示する。

いくつかの態様では、標的細胞に対する抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）細胞傷害活性を、機能性の尺度として使用することができる。ADCC細胞傷害性アッセイのために、増大によって得られた細胞を、適当な標的細胞と、その標的細胞上の標的抗原に特異的な抗体の存在下または非存在下で、共培養することができる。例えば抗骨髄腫細胞傷害性の場合、数ある多発性骨髄腫（MM）標的細胞（例えばAM01、KMS11、KMS18、KMS34、LP1またはMM.1S）をいずれも使用することができ、抗CD38抗体（例えばダラツムマブ）または抗CD319抗体（例えばエロツズマブ）を使ってアッセイを行うことができる。細胞殺傷は数多くの方法で決定することができる。例えば細胞をヨウ化プロピジウム（PI）で染色し、NK細胞、生標的細胞、および死標的細胞の数を、例えばフローサイトメトリーによって、解析することができる。

いくつかの態様において、増大された集団中のg-NK細胞の10％超または約10％超は、腫瘍細胞に対して脱顆粒することができる。脱顆粒はCD107Aの発現を評価することによって測定することができる。例えばいくつかの態様において、増大された集団中のg-NK細胞の20％超または約20％超は、腫瘍細胞に対して脱顆粒することができる。いくつかの態様において、増大された集団中のg-NK細胞の30％超または約30％超は、腫瘍細胞に対して脱顆粒することができる。いくつかの態様において、増大された集団中のg-NK細胞の40％超または約40％超は、腫瘍細胞に対して脱顆粒することができる。いくつかの態様において、脱顆粒能は、腫瘍細胞に対して、抗体の非存在下で測定される。

いくつかの態様において、増大された集団中のg-NK細胞の10％超または約10％超は、腫瘍細胞に対してインターフェロンγまたはTNF-αなどのエフェクターサイトカインを産生することができる。いくつかの態様において、増大された集団中のg-NK細胞の20％超または約20％超は、腫瘍細胞に対してエフェクターサイトカイン、例えばインターフェロンγまたはTNF-αを産生することができる。いくつかの態様において、増大された集団中のg-NK細胞の30％超または約30％超は、腫瘍細胞に対してエフェクターサイトカイン、例えばインターフェロンγまたはTNF-αを産生することができる。いくつかの態様において、増大された集団中のg-NK細胞の40％超または約40％超は、腫瘍細胞に対してエフェクターサイトカイン、例えばインターフェロンγまたはTNF-αを産生することができる。いくつかの態様において、インターフェロンγまたはTNF-αを産生する能力は、腫瘍細胞に対する抗体の非存在下で測定される。

g-NK細胞の代用マーカープロファイルを使用することによって、細胞の集団を含有する試料中のg-NK細胞を同定または検出するための方法が、本明細書において提供される。いくつかの態様において、本方法は、細胞の試料を、1種または複数種のマーカーCD16、CD57、CD7、CD161、NKG2C、および/またはNKG2Aに特異的な結合分子、例えば抗体または抗原結合フラグメントと接触させる工程を含む。いくつかの態様において、本方法は、細胞の試料を、CD45、CD3および/またはCD56に特異的な結合分子、例えば抗体または抗原結合フラグメントと接触させる工程を、さらに含む。本方法のいくつかの態様では、1つまたは複数の結合分子を試料と同時に接触させることができる。本方法のいくつかの態様では、1つまたは複数の結合分子を試料と逐次的に接触させることができる。いくつかの態様において、本方法は、接触後に、1つまたは複数の結合分子に結合している細胞を保持しおよび/または結合していない結合分子を試料から分離除去するための条件下での1回または複数回の洗浄を含むことができる。

いくつかの態様において、前記1つまたは複数の結合分子、例えば抗体のそれぞれは、マーカー陽性またはマーカー陰性の細胞を検出するために、ラベルに直接的または間接的に取り付けることができる。例えば、抗体などの結合分子は、ラベルにコンジュゲートし、カップリングしまたは連結しうる。ラベルは当業者に周知である。本明細書において想定されるラベルとしては、蛍光色素、蛍光タンパク質、放射性同位体、発色団、金属イオン、金粒子（例えば金コロイド粒子）、銀粒子、強い光散乱特性を持つ粒子、磁性粒子（例えばDynabeads（登録商標）磁気ビーズなどの磁気ビーズ粒子）、ポリペプチド（例えばFLAG（商標）タグ、ヒトインフルエンザヘマグルチニン（HA）タグなど）、ペルオキシダーゼ（例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ）またはホスファターゼ（例えばアルカリホスファターゼ）などの酵素、ストレプトアビジン、ビオチン、発光化合物（例えば化学発光基質）、オリゴヌクレオチド、特異的結合ペア（例えばリガンドとその受容体）のメンバー、および結合分子、例えば抗体を、その抗体に直接的または間接的に取り付けられた場合に、可視化しまたは検出するために使用される当技術分野において周知の他のラベルが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。

親和性に基づく方法、例えば免疫親和性に基づく方法、例えば表面マーカーとの関連ではフローサイトメトリーによるものなど、表面マーカーまたは表面タンパク質の発現レベルを評価するためのいくつもの周知の方法を使用しうる。いくつかの態様において、ラベルは発蛍光団であり、g-NK細胞の検出または同定のための方法はフローサイトメトリーによる。いくつかの態様では、多色フローサイトメトリーにより、異なるマーカーのそれぞれに異なるラベルが使用される。

いくつかの態様において、本方法は、試料を、CD45、CD3、CD56、CD57、CD7およびCD161に特異的な結合分子と接触させる工程を含む。いくつかのそのような態様において、g-NK細胞は、g-NK細胞代用マーカープロファイルCD45^pos/CD3^neg/CD56^pos/CD16^pos/CD57^pos/CD7^dim/neg/CD161^negを有する細胞として同定されまたは検出される。

いくつかの態様において、本方法は、試料を、CD45、CD3、CD56、NKG2AおよびCD161に特異的な結合分子と接触させる工程を含む。いくつかのそのような態様において、g-NK細胞は、g-NK細胞代用マーカープロファイルCD45^pos/CD3^neg/CD56^pos/NKG2A^neg/CD161^negを有する細胞として同定されまたは検出される。

いくつかの態様において、提供される方法は、g-NKを、例えば提供される方法のいずれかに従って優先的に増大させたg-NK細胞を、単離または濃縮する工程も含むことができる。いくつかのそのような態様では、g-NK細胞の実質的に純粋な集団、例えば90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上を上回るまたは約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはそれ以上を上回るg-NK細胞、例えば記載するマーカーのパネルまたは組み合わせのいずれかを使って決定されるものを含有する細胞集団を得ることができる。抗体および他の結合分子は、g^-NK細胞を単離または濃縮する際に使用されるマーカータンパク質の発現レベルの有無を検出するために使用することができる。いくつかの態様において、単離または濃縮は、蛍光活性化細胞選別（FACs）によって実行される。そのような方法の例において、g-NK細胞は、上述の方法を使って複数の細胞表面マーカーについて細胞を染色するフローサイトメトリーによって同定または検出され、g-NK細胞に関連するマーカーについて陽性または陰性である細胞を収集するために、染色された細胞が流体流で運ばれる。

III. 組成物および薬学的製剤
増大されたNK細胞、例えば提供される方法のいずれかによって産生されるものを含有する組成物が、本明細書において提供される。いくつかの態様において、組成物はNKG2C^pos細胞またはそのサブセットを含有する。いくつかの態様において、組成物はNKG2A^neg細胞またはそのサブセットを含有する。いくつかの態様において、組成物は、NKG2C^pos/NKG2A^neg細胞またはそのサブセットを含有する。いくつかの態様において、組成物は、g-NK細胞を含有する。特に、提供される組成物には、g-NK細胞について濃縮された細胞の組成物が含まれる。

いくつかの態様において、組成物は、約5～99％のNKG2C^pos細胞もしくはそのサブセット、または5～99％（両端の値を含む）の任意のパーセンテージのNKG2C^pos細胞またはそのサブセットを含む。いくつかの態様において、組成物は、細胞の単離源となった対象において自然に存在する全NK細胞または全細胞に対するNKG2C^pos細胞またはそのサブセットのパーセンテージと比較して、全NK細胞または全細胞に対して増加したパーセンテージまたはより大きなパーセンテージのNKG2C^posまたはそのサブセットを含むことができる。いくつかの態様では、パーセンテージが、少なくとも2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、150倍、200倍もしくはそれ以上、または少なくとも約2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、150倍、200倍もしくはそれ以上、増加している。

いくつかの態様において、組成物は、少なくとも20％もしくは少なくとも約20％、少なくとも30％もしくは少なくとも約30％、少なくとも40％もしくは少なくとも約40％、少なくとも50％もしくは少なくとも約50％、少なくとも60％もしくは少なくとも約60％、少なくとも65％もしくは少なくとも約65％、少なくとも70％もしくは少なくとも約70％、少なくとも75％もしくは少なくとも約75％、少なくとも80％もしくは少なくとも約80％、少なくとも81％もしくは少なくとも約81％、少なくとも82％もしくは少なくとも約82％、少なくとも83％もしくは少なくとも約83％、少なくとも84％もしくは少なくとも約84％、少なくとも85％もしくは少なくとも約85％、少なくとも86％もしくは少なくとも約86％、少なくとも87％もしくは少なくとも約87％、少なくとも88％もしくは少なくとも約88％、少なくとも89％もしくは少なくとも約89％、少なくとも90％もしくは少なくとも約90％、少なくとも91％もしくは少なくとも約91％、少なくとも92％もしくは少なくとも約92％、少なくとも93％もしくは少なくとも約93％、少なくとも94％もしくは少なくとも約94％、少なくとも95％もしくは少なくとも約95％、少なくとも96％もしくは少なくとも約96％、少なくとも97％もしくは少なくとも約97％、少なくとも98％もしくは少なくとも約98％、少なくとも99％もしくは少なくとも約99％、または実質的に100％のNKG2C^pos細胞またはそのサブセットを含むことができる。いくつかの態様において、組成物は50％超のNKG2C^pos細胞またはそのサブセットを含む。別の態様において、組成物は60％超のNKG2C^pos細胞またはそのサブセットを含む。別の態様において、組成物は70％超のNKG2C^pos細胞またはそのサブセットを含む。別の態様において、組成物は80％超のNKG2C^pos細胞またはそのサブセットを含む。いくつかの態様において、提供される組成物には、NKG2C^pos細胞またはそのサブセットが、組成物中の細胞の、または組成物中のNK細胞の、少なくとも60％もしくは少なくとも約60％、少なくとも70％もしくは少なくとも約70％、少なくとも80％もしくは少なくとも約80％、少なくとも85％もしくは少なくとも約85％、少なくとも90％もしくは少なくとも約90％、少なくとも95％もしくは少なくとも約95％またはそれ以上を構成するものが含まれる。

いくつかの態様において、組成物は、約5～99％のNKG2A^neg細胞もしくはそのサブセット、または5～99％（両端の値を含む）の任意のパーセンテージのNKG2A^neg細胞もしくはそのサブセットを含む。いくつかの態様において、組成物は、細胞の単離源となった対象において自然に存在する全NK細胞または全細胞に対するNKG2A^neg細胞またはそのサブセットのパーセンテージと比較して、全NK細胞または全細胞に対して増加したパーセンテージまたはより大きなパーセンテージのNKG2A^neg細胞またはそのサブセットを含むことができる。いくつかの態様では、パーセンテージが、少なくとも2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、150倍、200倍もしくはそれ以上、または少なくとも約2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、150倍、200倍もしくはそれ以上、増加している。

いくつかの態様において、組成物は、少なくとも20％もしくは少なくとも約20％、少なくとも30％もしくは少なくとも約30％、少なくとも40％もしくは少なくとも約40％、少なくとも50％もしくは少なくとも約50％、少なくとも60％もしくは少なくとも約60％、少なくとも65％もしくは少なくとも約65％、少なくとも70％もしくは少なくとも約70％、少なくとも75％もしくは少なくとも約75％、少なくとも80％もしくは少なくとも約80％、少なくとも81％もしくは少なくとも約81％、少なくとも82％もしくは少なくとも約82％、少なくとも83％もしくは少なくとも約83％、少なくとも84％もしくは少なくとも約84％、少なくとも85％もしくは少なくとも約85％、少なくとも86％もしくは少なくとも約86％、少なくとも87％もしくは少なくとも約87％、少なくとも88％もしくは少なくとも約88％、少なくとも89％もしくは少なくとも約89％、少なくとも90％もしくは少なくとも約90％、少なくとも91％もしくは少なくとも約91％、少なくとも92％もしくは少なくとも約92％、少なくとも93％もしくは少なくとも約93％、少なくとも94％もしくは少なくとも約94％、少なくとも95％もしくは少なくとも約95％、少なくとも96％もしくは少なくとも約96％、少なくとも97％もしくは少なくとも約97％、少なくとも98％もしくは少なくとも約98％、少なくとも99％もしくは少なくとも約99％、または実質的に100％のNKG2A^neg細胞またはそのサブセットを含むことができる。いくつかの態様において、組成物は50％超のNKG2A^neg細胞またはそのサブセットを含む。いくつかの態様において、組成物は60％超のNKG2A^neg細胞またはそのサブセットを含む。別の態様において、組成物は70％超のNKG2A^neg細胞またはそのサブセットを含む。別の態様において、組成物は80％超のNKG2A^neg細胞またはそのサブセットを含む。いくつかの態様において、提供される組成物には、NKG2A^neg細胞またはそのサブセットが、組成物中の細胞の、または組成物中のNK細胞の、少なくとも60％もしくは少なくとも約60％、少なくとも70％もしくは少なくとも約70％、少なくとも80％もしくは少なくとも約80％、少なくとも85％もしくは少なくとも約85％、少なくとも90％もしくは少なくとも約90％、少なくとも95％もしくは少なくとも約95％またはそれ以上を構成するものが含まれる。

いくつかの態様において、組成物は、約5～99％のNKG2C^posNKG2A^neg細胞もしくはそのサブセット、または5～99％（両端の値を含む）の任意のパーセンテージのNKG2C^posNKG2A^neg細胞もしくはそのサブセットを含む。いくつかの態様において、組成物は、細胞の単離源となった対象において自然に存在する全NK細胞または全細胞に対するNKG2C^posNKG2A^neg細胞またはそのサブセットのパーセンテージと比較して、全NK細胞または全細胞に対して増加したパーセンテージまたはより大きなパーセンテージのNKG2C^posNKG2A^negまたはそのサブセットを含むことができる。いくつかの態様では、前記パーセンテージが、少なくとも2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、150倍、200倍もしくはそれ以上、または少なくとも約2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、150倍、200倍もしくはそれ以上、増加している。

いくつかの態様において、組成物は、少なくとも20％または少なくとも約20％、少なくとも30％または少なくとも約30％、少なくとも40％または少なくとも約40％、少なくとも50％または少なくとも約50％、少なくとも60％または少なくとも約60％、少なくとも65％または少なくとも約65％、少なくとも70％または少なくとも約70％、少なくとも75％または少なくとも約75％、少なくとも80％または少なくとも約80％、少なくとも81％または少なくとも約81％、少なくとも82％または少なくとも約82％、少なくとも83％または少なくとも約83％、少なくとも84％または少なくとも約84％、少なくとも85％または少なくとも約85％、少なくとも86％または少なくとも約86％、少なくとも87％または少なくとも約87％、少なくとも88％または少なくとも約88％、少なくとも89％または少なくとも約89％、少なくとも90％または少なくとも約90％、少なくとも91％または少なくとも約91％、少なくとも92％または少なくとも約92％、少なくとも93％または少なくとも約93％、少なくとも94％または少なくとも約94％、少なくとも95％または少なくとも約95％、少なくとも96％または少なくとも約96％、少なくとも97％または少なくとも約97％、少なくとも98％または少なくとも約98％、少なくとも99％または少なくとも約99％、または実質的に100％のNKG2C^posNKG2A^neg細胞またはそのサブセットを含むことができる。いくつかの態様において、組成物は50％超のNKG2C^posNKG2A^neg細胞またはそのサブセットを含む。別の態様において、組成物は60％超のNKG2C^posNKG2A^neg細胞またはそのサブセットを含む。別の態様において、組成物は70％超のNKG2C^posNKG2A^neg細胞またはそのサブセットを含む。別の態様において、組成物は80％超のNKG2C^posNKG2A^neg細胞またはそのサブセットを含む。いくつかの態様において、提供される組成物には、NKG2C^posNKG2A^neg細胞またはそのサブセットが、組成物中の細胞の、または組成物中のNK細胞の、少なくとも60％もしくは少なくとも約60％、少なくとも70％もしくは少なくとも約70％、少なくとも80％もしくは少なくとも約80％、少なくとも85％もしくは少なくとも約85％、少なくとも90％もしくは少なくとも約90％、少なくとも95％もしくは少なくとも約95％またはそれ以上を構成するものが含まれる。

いくつかの態様において、組成物は、約5～99％のg-NK細胞、または5～99％（両端の値を含む）の任意のパーセンテージのg-NK細胞を含む。いくつかの態様において、組成物は、細胞の単離源となった対象において自然に存在する全NK細胞または全細胞に対するg-NKのパーセンテージと比較して、全NK細胞または全細胞に対して増加したパーセンテージまたはより大きなパーセンテージのg-NK細胞を含むことができる。いくつかの態様では、前記パーセンテージが、少なくとも2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、150倍、200倍もしくはそれ以上、または少なくとも約2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、150倍、200倍もしくはそれ以上、増加している。

いくつかの態様において、組成物は、少なくとも20％もしくは少なくとも約20％、少なくとも30％もしくは少なくとも約30％、少なくとも40％もしくは少なくとも約40％、少なくとも50％もしくは少なくとも約50％、少なくとも60％もしくは少なくとも約60％、少なくとも65％もしくは少なくとも約65％、少なくとも70％もしくは少なくとも約70％、少なくとも75％もしくは少なくとも約75％、少なくとも80％もしくは少なくとも約80％、少なくとも81％もしくは少なくとも約81％、少なくとも82％もしくは少なくとも約82％、少なくとも83％もしくは少なくとも約83％、少なくとも84％もしくは少なくとも約84％、少なくとも85％もしくは少なくとも約85％、少なくとも86％もしくは少なくとも約86％、少なくとも87％もしくは少なくとも約87％、少なくとも88％もしくは少なくとも約88％、少なくとも89％もしくは少なくとも約89％、少なくとも90％もしくは少なくとも約90％、少なくとも91％もしくは少なくとも約91％、少なくとも92％もしくは少なくとも約92％、少なくとも93％もしくは少なくとも約93％、少なくとも94％もしくは少なくとも約94％、少なくとも95％もしくは少なくとも約95％、少なくとも96％もしくは少なくとも約96％、少なくとも97％もしくは少なくとも約97％、少なくとも98％もしくは少なくとも約98％、少なくとも99％もしくは少なくとも約99％、または実質的に100％のg-NK細胞を含むことができる。いくつかの態様において、組成物は50％超のg-NK細胞を含む。別の態様において、組成物は70％超のg-NK細胞を含む。別の態様において、組成物は80％超のg-NK細胞を含む。いくつかの態様において、提供される組成物には、g-NK細胞が、組成物中の細胞の、または組成物中のNK細胞の、少なくとも60％もしくは少なくとも約60％、少なくとも70％もしくは少なくとも約70％、少なくとも80％もしくは少なくとも約80％、少なくとも85％もしくは少なくとも約85％、少なくとも90％もしくは少なくとも約90％、少なくとも95％もしくは少なくとも約95％またはそれ以上を構成するものが含まれる。

いくつかの態様において、組成物はナチュラルキラー（NK）細胞サブセットの集団を含み、組成物中の細胞の少なくとも40％もしくは少なくとも約40％、少なくとも50％もしくは少なくとも約50％、少なくとも55％もしくは少なくとも約55％、少なくとも60％もしくは少なくとも約60％、少なくとも65％もしくは少なくとも約65％、少なくとも70％もしくは少なくとも約70％、少なくとも75％もしくは少なくとも約75％、少なくとも少なくとも80％もしくは少なくとも約80％、少なくとも85％もしくは少なくとも約85％、少なくとも90％もしくは少なくとも約90％、または少なくとも95％もしくは少なくとも約95％は、CD57^posであるg-NK細胞代用マーカープロファイルを有する。いくつかの態様では、組成物中の細胞の70％または約70％から、90％または約90％が表現型CD57^posである。いくつかの態様では、組成物中の細胞の少なくとも72％もしくは少なくとも約72％、少なくとも74％もしくは少なくとも約74％、少なくとも76％もしくは少なくとも約76％、少なくとも78％もしくは少なくとも約78％、少なくとも80％もしくは少なくとも約80％、少なくとも82％もしくは少なくとも約82％、少なくとも84％もしくは少なくとも約84％、少なくとも86％もしくは少なくとも約86％、少なくとも88％もしくは少なくとも約88％、少なくとも90％もしくは少なくとも約90％、少なくとも92％もしくは少なくとも約92％、少なくとも94％もしくは少なくとも約94％、少なくとも96％もしくは少なくとも約96％、または少なくとも98％もしくは少なくとも約98％が表現型CD57^posを有する。提供される態様のいずれかの一部では、組成物中の細胞の少なくとも60％または少なくとも約60％が表現型CD57^posを含む。提供される態様のいずれかの一部では、組成物中の細胞の少なくとも70％または少なくとも約70％が表現型CD57^posを含む。いくつかの態様において、表現型は表面表現型CD3^negをさらに含む。いくつかの態様において、表現型は表面表現型CD45^pos/CD3^neg/CD56^posをさらに含む。提供される態様のいずれかの一部では、そのような表現型を有する細胞のうち、50％超がFcRγ^negであり、任意で50％～90％または約50％～90％がFcRγ^negである。提供される態様のいずれかの一部では、そのような表現型を有する細胞のうち、70％がFcRγ^negであり、任意で70％～90％または約70％～90％がFcRγ^negである。

いくつかの態様において、組成物はナチュラルキラー（NK）細胞サブセットの集団を含み、組成物中の細胞の少なくとも40％もしくは少なくとも約40％、少なくとも50％もしくは少なくとも約50％、少なくとも55％もしくは少なくとも約55％、少なくとも60％もしくは少なくとも約60％、少なくとも65％もしくは少なくとも約65％、少なくとも70％もしくは少なくとも約70％、少なくとも75％もしくは少なくとも約75％、少なくとも少なくとも80％もしくは少なくとも約80％、少なくとも85％もしくは少なくとも約85％、少なくとも90％もしくは少なくとも約90％、または少なくとも95％もしくは少なくとも約95％は、CD16^pos/CD57^pos/CD7^dim/neg/CD161^negであるg-NK細胞代用マーカープロファイルを有する。いくつかの態様では、組成物中の細胞の70％または約70％から、90％または約90％が、表現型CD16^pos/CD57^pos/CD7^dim/neg/CD161^negを有する。いくつかの態様では、組成物中の細胞の少なくとも72％もしくは少なくとも約72％、少なくとも74％もしくは少なくとも約74％、少なくとも76％もしくは少なくとも約76％、少なくとも78％もしくは少なくとも約78％、少なくとも80％もしくは少なくとも約80％、少なくとも82％もしくは少なくとも約82％、少なくとも84％もしくは少なくとも約84％、少なくとも86％もしくは少なくとも約86％、少なくとも88％もしくは少なくとも約88％、少なくとも90％もしくは少なくとも約90％、少なくとも92％もしくは少なくとも約92％、少なくとも94％もしくは少なくとも約94％、少なくとも96％もしくは少なくとも約96％、または少なくとも98％もしくは少なくとも約98％が、表現型CD16^pos/CD57^pos/CD7^dim/neg/CD161^negを有する。提供される態様のいずれかの一部では、組成物中の細胞の少なくとも60％または少なくとも約60％が表現型CD16^pos/CD57^pos/CD7^dim/neg/CD161^negを含む。提供される態様のいずれかの一部では、組成物中の細胞の少なくとも70％または少なくとも約70％が表現型CD16^pos/CD57^pos/CD7^dim/neg/CD161^negを含む。いくつかの態様において、表現型は表面表現型CD3^negをさらに含む。いくつかの態様において、表現型は表面表現型CD45^pos/CD3^neg/CD56^posをさらに含む。提供される態様のいずれかの一部では、そのような表現型を有する細胞のうち、50％超がFcRγ^negであり、任意で50％～90％または約50％～90％がFcRγ^negである。提供される態様のいずれかの一部では、そのような表現型を有する細胞のうち、70％がFcRγ^negであり、任意で70％～90％または約70％～90％がFcRγ^negである。

いくつかの態様において、組成物はナチュラルキラー（NK）細胞サブセットの集団を含み、組成物中の細胞の少なくとも40％もしくは少なくとも約40％、少なくとも50％もしくは少なくとも約50％、少なくとも55％もしくは少なくとも約55％、少なくとも60％もしくは少なくとも約60％、少なくとも65％もしくは少なくとも約65％、少なくとも70％もしくは少なくとも約70％、少なくとも75％もしくは少なくとも約75％、少なくとも少なくとも80％もしくは少なくとも約80％、少なくとも85％もしくは少なくとも約85％、少なくとも90％もしくは少なくとも約90％、または少なくとも95％もしくは少なくとも約95％は、CD38^negである表現型を有する。いくつかの態様では、組成物中の細胞の70％または約70％から、90％または約90％が表現型CD38^negを有する。いくつかの態様では、組成物中の細胞の少なくとも72％もしくは少なくとも約72％、少なくとも74％もしくは少なくとも約74％、少なくとも76％もしくは少なくとも約76％、少なくとも78％もしくは少なくとも約78％、少なくとも80％もしくは少なくとも約80％、少なくとも82％もしくは少なくとも約82％、少なくとも84％もしくは少なくとも約84％、少なくとも86％もしくは少なくとも約86％、少なくとも88％もしくは少なくとも約88％、少なくとも90％もしくは少なくとも約90％、少なくとも92％もしくは少なくとも約92％、少なくとも94％もしくは少なくとも約94％、少なくとも96％もしくは少なくとも約96％、または少なくとも98％もしくは少なくとも約98％が、表現型CD38^negを有する。提供される態様のいずれかの一部では、組成物中の細胞の少なくとも60％または少なくとも約60％が表現型CD38^negを含む。提供される態様のいずれかの一部では、組成物中の細胞の少なくとも70％または少なくとも約70％が表現型CD38^negを含む。いくつかの態様において、表現型は表面表現型CD3^negをさらに含む。いくつかの態様において、表現型は表面表現型CD45^pos/CD3^neg/CD56^posをさらに含む。提供される態様のいずれかの一部では、そのような表現型を有する細胞のうち、50％超がFcRγ^negであり、任意で50％～90％または約50％～90％がFcRγ^negである。提供される態様のいずれかの一部では、そのような表現型を有する細胞のうち、70％がFcRγ^negであり、任意で70％～90％または約70％～90％がFcRγ^negである。

いくつかの態様において、組成物はナチュラルキラー（NK）細胞サブセットの集団を含み、組成物中の細胞の少なくとも40％もしくは少なくとも約40％、少なくとも50％もしくは少なくとも約50％、少なくとも55％もしくは少なくとも約55％、少なくとも60％もしくは少なくとも約60％、少なくとも65％もしくは少なくとも約65％、少なくとも70％もしくは少なくとも約70％、少なくとも75％もしくは少なくとも約75％、少なくとも少なくとも80％もしくは少なくとも約80％、少なくとも85％もしくは少なくとも約85％、少なくとも90％もしくは少なくとも約90％、または少なくとも95％もしくは少なくとも約95％は、CD16^posである表現型を有する。いくつかの態様では、組成物中の細胞の70％または約70％から、90％または約90％が表現型CD16^posを有する。いくつかの態様では、組成物中の細胞の少なくとも72％もしくは少なくとも約72％、少なくとも74％もしくは少なくとも約74％、少なくとも76％もしくは少なくとも約76％、少なくとも78％もしくは少なくとも約78％、少なくとも80％もしくは少なくとも約80％、少なくとも82％もしくは少なくとも約82％、少なくとも84％もしくは少なくとも約84％、少なくとも86％もしくは少なくとも約86％、少なくとも88％もしくは少なくとも約88％、少なくとも90％もしくは少なくとも約90％、少なくとも92％もしくは少なくとも約92％、少なくとも94％もしくは少なくとも約94％、少なくとも96％もしくは少なくとも約96％、または少なくとも98％もしくは少なくとも約98％が表現型CD16^posを有する。提供される態様のいずれかの一部では、組成物中の細胞の少なくとも60％または少なくとも約60％が表現型CD16^posを含む。提供される態様のいずれかの一部では、組成物中の細胞の少なくとも70％または少なくとも約70％が表現型CD16^posを含む。いくつかの態様において、表現型は表面表現型CD3^negをさらに含む。いくつかの態様において、表現型は表面表現型CD45^pos/CD3^neg/CD56^posをさらに含む。提供される態様のいずれかの一部では、そのような表現型を有する細胞のうち、50％超がFcRγ^negであり、任意で50％～90％または約50％～90％がFcRγ^negである。提供される態様のいずれかの一部では、そのような表現型を有する細胞のうち、70％がFcRγ^negであり、任意で70％～90％または約70％～90％がFcRγ^negである。

いくつかの態様において、組成物はナチュラルキラー（NK）細胞サブセットの集団を含み、組成物中の細胞の少なくとも40％もしくは少なくとも約40％、少なくとも50％もしくは少なくとも約50％、少なくとも55％もしくは少なくとも約55％、少なくとも60％もしくは少なくとも約60％、少なくとも65％もしくは少なくとも約65％、少なくとも70％もしくは少なくとも約70％、少なくとも75％もしくは少なくとも約75％、少なくとも少なくとも80％もしくは少なくとも約80％、少なくとも85％もしくは少なくとも約85％、少なくとも90％もしくは少なくとも約90％、または少なくとも95％もしくは少なくとも約95％は、NKG2A^neg/CD161^negであるg-NK細胞代用マーカープロファイルを有する。いくつかの態様では、組成物中の細胞の70％または約70％から、90％または約90％が表現型 NKG2A^neg/CD161^negを含む。いくつかの態様では、組成物中の細胞の少なくとも72％もしくは少なくとも約72％、少なくとも74％もしくは少なくとも約74％、少なくとも76％もしくは少なくとも約76％、少なくとも78％もしくは少なくとも約78％、少なくとも80％もしくは少なくとも約80％、少なくとも82％もしくは少なくとも約82％、少なくとも84％もしくは少なくとも約84％、少なくとも86％もしくは少なくとも約86％、少なくとも88％もしくは少なくとも約88％、少なくとも90％もしくは少なくとも約90％、少なくとも92％もしくは少なくとも約92％、少なくとも94％もしくは少なくとも約94％、少なくとも96％もしくは少なくとも約96％、または少なくとも98％もしくは少なくとも約98％が表現型NKG2A^neg/CD161^negを有する。提供される態様のいずれかの一部では、組成物中の細胞の少なくとも60％または少なくとも約60％が表現型NKG2A^neg/CD161^negを含む。提供される態様のいずれかの一部では、組成物中の細胞の少なくとも70％または少なくとも約70％が表現型NKG2A^neg/CD161^negを含む。いくつかの態様において、表現型は表面表現型CD3^negをさらに含む。いくつかの態様において、表現型は表面表現型CD45^pos/CD3^neg/CD56^posをさらに含む。提供される態様のいずれかの一部では、そのような表現型を有する細胞のうち、50％超がFcRγ^negであり、任意で50％～90％または約50％～90％がFcRγ^negである。提供される態様のいずれかの一部では、そのような表現型を有する細胞のうち、70％がFcRγ^negであり、任意で70％～90％または約70％～90％がFcRγ^negである。

いくつかの態様において、組成物はNK細胞の集団を含み、前記組成物中のNK細胞の50％超または約50％超は、g-NK細胞（FcRγ^neg）またはその代用マーカープロファイルを発現するNK細胞である。いくつかの態様において、組成物はNK細胞の集団を含み、前記組成物中のNK細胞の55％超または約55％超は、g-NK細胞（FcRγ^neg）またはその代用マーカープロファイルを発現するNK細胞である。いくつかの態様において、組成物はNK細胞の集団を含み、前記組成物中のNK細胞の60％超または約60％超は、g-NK細胞（FcRγ^neg）またはその代用マーカープロファイルを発現するNK細胞である。いくつかの態様において、組成物はNK細胞の集団を含み、前記組成物中のNK細胞の65％超または約65％超は、g-NK細胞（FcRγ^neg）またはその代用マーカープロファイルを発現するNK細胞である。いくつかの態様において、組成物はNK細胞の集団を含み、前記組成物中のNK細胞の70％超または約70％超は、g-NK細胞（FcRγ^neg）またはその代用マーカープロファイルを発現するNK細胞である。いくつかの態様において、組成物はNK細胞の集団を含み、前記組成物中のNK細胞の75％超または約75％超は、g-NK細胞（FcRγ^neg）またはその代用マーカープロファイルを発現するNK細胞である。いくつかの態様において、組成物はNK細胞の集団を含み、前記組成物中のNK細胞の80％超または約80％超は、g-NK細胞（FcRγ^neg）またはその代用マーカープロファイルを発現するNK細胞である。いくつかの態様において、組成物はNK細胞の集団を含み、前記組成物中のNK細胞の85％超または約85％超は、g-NK細胞（FcRγ^neg）またはその代用マーカープロファイルを発現するNK細胞である。いくつかの態様において、組成物はNK細胞の集団を含み、前記組成物中のNK細胞の90％超または約90％超は、g-NK細胞（FcRγ^neg）またはその代用マーカープロファイルを発現するNK細胞である。いくつかの態様において、組成物はNK細胞の集団を含み、前記組成物中のNK細胞の95％超または約95％超は、g-NK細胞（FcRγ^neg）またはその代用マーカープロファイルを発現するNK細胞である。代用マーカープロファイルは本明細書記載のいずれであってもよい。例えば代用マーカープロファイルはCD16^pos/CD57^pos/CD7^dim/neg/CD161^negでありうる。別の例において、代用マーカープロファイルはNKG2A^neg/CD161^negでありうる。さらなる例において、g-NK細胞代用マーカープロファイルはCD38^negである。代用表面マーカープロファイルは、表現型CD45^pos/CD3^neg/CD56^posを、さらに含みうる。

いくつかの態様において、組成物のg-NK細胞、またはその一定のパーセンテージ、例えば約70％超は、パーフォリンおよび/またはグランザイムBについて陽性である。パーフォリンまたはグランザイムBについて陽性である細胞の数を測定するための方法は、当業者には公知である。方法には例えば細胞内フローサイトメトリーが含まれる。一例において、パーフォリンまたはグランザイムBについて陽性である細胞のパーセンテージまたは数は、細胞を、例えばMiltenyi BiotecのInside Stain Kitなどを使って透過処理してから、パーフォリンおよびグランザイムBに対する抗体で染色することによって、決定されうる。次に細胞染色を、例えばフローサイトメトリーなどを使って、解析することができる。

いくつかの態様において、組成物のg-NK細胞の70％超または約70％超はパーフォリンについて陽性であり、かつ組成物のg-NK細胞の70％超または約70％超はグランザイムBについて陽性である。いくつかの態様において、組成物のg-NK細胞の75％超または約75％超はパーフォリンについて陽性であり、かつ組成物のg-NK細胞の75％超または約75％超はグランザイムBについて陽性である。いくつかの態様において、組成物のg-NK細胞の80％超または約80％超はパーフォリンについて陽性であり、かつ組成物のg-NK細胞の80％超または約80％超はグランザイムBについて陽性である。いくつかの態様において、組成物のg-NK細胞の85％超または約85％超はパーフォリンについて陽性であり、かつ組成物のg-NK細胞の85％超または約85％超はグランザイムBについて陽性である。いくつかの態様において、組成物のg-NK細胞の90％超または約90％超はパーフォリンについて陽性であり、かつ組成物のg-NK細胞の90％超または約90％超はグランザイムBについて陽性である。いくつかの態様において、組成物のg-NK細胞の95％超または約95％超はパーフォリンについて陽性であり、かつ組成物のg-NK細胞の95％超または約95％超はグランザイムBについて陽性である。

いくつかの態様において、NK細胞、例えばg-NK細胞によるパーフォリンおよびグランザイムBの発現レベルは、細胞内フローサイトメトリーによって測定することができ、レベルは平均蛍光強度（MFI）のレベルに基づいて測定することができる。いくつかの態様において、MFIに基づくパーフォリンおよびグランザイムBの発現レベルは、g-NK細胞とFcRγ^posである細胞との間では異なるだろう。いくつかの態様において、組成物の、パーフォリンについて陽性であるg-NK細胞は、MFIレベルに基づいて、FcRγ^posNK細胞が発現するパーフォリンの平均レベルの少なくとも2倍または少なくとも約2倍である平均レベルのパーフォリンを発現する。いくつかの態様において、組成物の、パーフォリンについて陽性であるg-NK細胞は、MFIレベルに基づいて、FcRγ^posNK細胞が発現するパーフォリンの平均レベルの少なくとも3倍または少なくとも約3倍である平均レベルのパーフォリンを発現する。いくつかの態様において、組成物の、パーフォリンについて陽性であるg-NK細胞は、MFIレベルに基づいて、FcRγ^posNK細胞が発現するパーフォリンの平均レベルの少なくとも4倍または少なくとも約4倍である平均レベルのパーフォリンを発現する。いくつかの態様において、組成物の、グランザイムBについて陽性であるg-NK細胞は、MFIレベルに基づいて、FcRγ^posNK細胞が発現するグランザイムBの平均レベルの少なくとも2倍または少なくとも約2倍である平均レベルのグランザイムBを発現する。いくつかの態様において、組成物の、グランザイムBについて陽性であるg-NK細胞は、MFIレベルに基づいて、FcRγ^posNK細胞が発現するグランザイムBの平均レベルの少なくとも3倍または少なくとも約3倍である平均レベルのグランザイムBを発現する。いくつかの態様において、組成物の、グランザイムBについて陽性であるg-NK細胞は、MFIレベルに基づいて、FcRγ^posNK細胞が発現するグランザイムBの平均レベルの少なくとも4倍または少なくとも約4倍である平均レベルのグランザイムBを発現する。

提供される態様のいずれかの一部において、組成物は10⁶または約10⁶個の細胞から、10¹²または約10¹²個の細胞を含む。提供される態様のいずれかの一部において、組成物は、10⁶もしくは約10⁶から、10¹¹もしくは約10¹¹個の細胞、10⁶もしくは約10⁶から、10¹⁰もしくは約10¹⁰個の細胞、10⁶もしくは約10⁶から、10⁹もしくは約10⁹個の細胞、10⁶もしくは約10⁶から、10⁸もしくは約10⁸個の細胞、10⁶もしくは約10⁶から、10⁷もしくは約10⁷個の細胞、10⁷もしくは約10⁷から、10¹²もしくは約10¹²個の細胞、10⁷もしくは約10⁷から、10¹¹もしくは約10¹¹個の細胞、10⁷もしくは約10⁷から、10¹⁰もしくは約10¹⁰個の細胞、10⁷もしくは約10⁷から、10⁹もしくは約10⁹個の細胞、または10⁷もしくは約10⁷から、10⁸もしくは約10⁸個の細胞、10⁸もしくは約10⁸から、10¹²もしくは約10¹²個の細胞、10⁸もしくは約10⁸から、10¹¹もしくは約10¹¹個の細胞、10⁸もしくは約10⁸から、10¹⁰もしくは約10¹⁰個の細胞、10⁸もしくは約10⁸から、10⁹もしくは約10⁹個の細胞、10⁹もしくは約10⁹から、10¹²もしくは約10¹²個の細胞、10⁹もしくは約10⁹から、10¹¹もしくは約10¹¹個の細胞、10⁹もしくは約10⁹から、10¹⁰もしくは約10¹⁰個の細胞、10¹⁰もしくは約10¹⁰から、10¹²もしくは約10¹²個の細胞、10¹⁰もしくは約10¹⁰から、10¹¹もしくは約10¹¹個の細胞、または10¹¹もしくは約10¹¹から、10¹²もしくは約10¹²個の細胞を含む。

提供される態様のいずれかの一部において、組成物は少なくとも10⁶または少なくとも約10⁶個の細胞を含む。提供される態様のいずれかの一部において、組成物は、10⁶もしくは約10⁶から、10¹⁰もしくは約10¹⁰個の細胞、10⁶もしくは約10⁶から、10⁹もしくは約10⁹個の細胞、10⁶もしくは約10⁶から、10⁸もしくは約10⁸個の細胞、10⁶もしくは約10⁶から、10⁷もしくは約10⁷個の細胞、10⁷もしくは約10⁷から、10¹⁰もしくは約10¹⁰個の細胞、10⁷もしくは約10⁷から、10⁹もしくは約10⁹個の細胞、10⁷もしくは約10⁷から、10⁸もしくは約10⁸個の細胞、10⁸もしくは約10⁸から、10¹⁰もしくは約10¹⁰個の細胞、10⁸もしくは約10⁸から、10⁹もしくは約10⁹個の細胞、または10⁹もしくは約10⁹から、10¹⁰もしくは約10¹⁰個の細胞を含む。

提供される態様のいずれかの一部において、組成物は少なくとも10⁸または少なくとも約10⁸個の細胞を含む。提供される態様のいずれかの一部において、組成物は少なくとも10⁹または約10⁹個の細胞を含む。提供される態様のいずれかの一部において、組成物は少なくとも10¹⁰または約10¹⁰個の細胞を含む。提供される態様のいずれかの一部において、組成物は少なくとも10¹¹または約10¹¹個の細胞を含む。提供される態様のいずれかの一部において、組成物は10⁸または約10⁸から、10¹¹または約10¹¹個の細胞を含む。提供される態様のいずれかの一部において、組成物は10⁸または約10⁸から、10¹⁰または約10¹⁰個の細胞を含む。提供される態様のいずれかの一部において、組成物は10⁸または約10⁸から、10⁹または約10⁹個の細胞を含む。提供される態様のいずれかの一部において、組成物は10⁹または約10⁹から、10¹¹または約10¹¹個の細胞を含む。提供される態様のいずれかの一部において、組成物は10⁹または約10⁹から、10¹⁰または約10¹⁰個の細胞を含む。提供される態様のいずれかの一部において、組成物は10¹⁰または約10¹⁰から、10¹¹または約10¹¹個の細胞を含む。

提供される態様のいずれかの一部において、組成物は少なくとも10⁶または約10⁶個のg-NK細胞を含む。提供される態様のいずれかの一部において、組成物は、10⁶もしくは約10⁶から、10¹⁰もしくは約10¹⁰個のg-NK細胞、10⁶もしくは約10⁶から、10⁹もしくは約10⁹個のg-NK細胞、10⁶もしくは約10⁶から、10⁸もしくは約10⁸個のg-NK細胞、10⁶もしくは約10⁶から、10⁷もしくは約10⁷個のg-NK細胞、10⁷もしくは約10⁷から、10¹⁰もしくは約10¹⁰個のg-NK細胞、10⁷もしくは約10⁷から、10⁹もしくは約10⁹個のg-NK細胞、10⁷もしくは約10⁷から、10⁸もしくは約10⁸個のg-NK細胞、10⁸もしくは約10⁸から、10¹⁰もしくは約10¹⁰個のg-NK細胞、10⁸もしくは約10⁸から、10⁹もしくは約10⁹個のg-NK細胞、または10⁹もしくは約10⁹から、10¹⁰もしくは約10¹⁰個のg-NK細胞を含む。提供される態様のいずれかの一部において、g-NK細胞はFcRγ^negである。提供される態様のいずれかの一部において、g-NK細胞は、g-NK代用表面マーカープロファイルを有する細胞である。いくつかの態様において、g-NK細胞代用表面マーカープロファイルはCD16^pos/CD57^pos/CD7^dim/neg/CD161^negである。いくつかの態様において、g-NK細胞代用表面マーカープロファイルはNKG2A^neg/CD161^negである。提供される態様のいずれかの一部において、g-NK細胞またはg-NK代用マーカープロファイルを有する細胞は、表面表現型CD45^pos/CD3^neg/CD56^posをさらに含む。提供される態様のいずれかの一部において、g-NK細胞またはg-NK代用マーカープロファイルを有する細胞は、表面表現型CD38^negをさらに含む。

提供される組成物のいずれかの特定態様において、組成物中の細胞は同じドナーに由来する。したがって組成物は、1または複数の異なるドナーからの細胞の混合集団を含まない。本明細書において提供される増大方法は、一定のNK細胞サブセット、特にg-NK細胞サブセット、またはg-NK細胞のための代用マーカーと関連するかg-NK細胞のための代用マーカーを含むNK細胞サブセット、例えば上述のNK細胞サブセットのいずれかの、500倍もしくは500倍超、600倍もしくは600倍超、700倍もしくは700倍超、800倍もしくは800倍超、900倍もしくは900倍超、1000倍もしくは1000倍超、またはそれ以上の高収率増大をもたらす。任意の態様の一部において、増加は1000倍または約1000倍である。任意の態様の一部において、増加は2000倍または約2000倍である。任意の態様の一部において、増加は2500倍または約2500倍である。任意の態様の一部において、増加は3000倍または約3000倍である。任意の態様の一部において、増加は5000倍または約5000倍である。任意の態様の一部において、増加は10000倍または約10000倍である。任意の態様の一部において、増加は15000倍または約15000倍である。任意の態様の一部において、増加は20000倍または約20000倍である。任意の態様の一部において、増加は25000倍または約25000倍である。任意の態様の一部において、増加は30000倍または約30000倍である。任意の態様の一部において、増加は35000倍または約35000倍である。特定の態様において、増大は、一定のNK細胞サブセット、特にg-NK細胞サブセット、またはg-NK細胞のための代用マーカーと関連するかg-NK細胞のための代用マーカーを含むNK細胞サブセット、例えば上述のNK細胞サブセットのいずれかの数の、1000倍または約1,000倍の増加をもたらす。特定の態様において、増大は、一定のNK細胞サブセット、特にg-NK細胞サブセット、またはg-NK細胞のための代用マーカーと関連するかg-NK細胞のための代用マーカーを含むNK細胞サブセット、例えば上述のNK細胞サブセットのいずれかの数の、3,000倍または約3,000倍の増加をもたらす。特定の態様において、増大は、一定のNK細胞サブセット、特にg-NK細胞サブセット、またはg-NK細胞のための代用マーカーと関連するかg-NK細胞のための代用マーカーを含むNK細胞サブセット、例えば上述のNK細胞サブセットのいずれかの数の、35,000倍または約35,000倍の増加をもたらす。

場合により、単一ドナーから得られたNK細胞の初期供給源から、提供される方法によって達成される増大により、必要とする対象に投与するための複数回分の用量を与える細胞の組成物が産生されうる。したがって、提供される方法は、同種異系法には特に適している。場合により、提供される方法による一人のドナーから単離された出発NK細胞集団からの1回の増大は、必要とする対象への投与のための20回分超または約20回分超の用量、例えば30回分、40回分、50回分、60回分、70回分、80回分、90回分、100回分、または約30回分、40回分、50回分、60回分、70回分、80回分、90回分、100回分の用量、または前記のいずれかの間の値である回数分の用量をもたらすことができる。いくつかの態様において、1回分の用量は、1×10⁵もしくは約1×10⁵個の細胞/kgから、1×10⁷もしくは約1×10⁷個の細胞/kg、例えば1×10⁵もしくは約1×10⁵個の細胞/kgから、7.5×10⁶もしくは約7.5×10⁶個の細胞/kg、1×10⁵もしくは約1×10⁵個の細胞/kgから、5×10⁶もしくは約5×10⁶個の細胞/kg、1×10⁵もしくは約1×10⁵個の細胞/kgから、2.5×10⁶もしくは約2.5×10⁶個の細胞/kg、1×10⁵もしくは約1×10⁵個の細胞/kgから、1×10⁶もしくは約1×10⁶個の細胞/kg、1×10⁵もしくは約1×10⁵個の細胞/kgから、7.5×10⁵もしくは約7.5×10⁵個の細胞/kg、1×10⁵もしくは約1×10⁵個の細胞/kgから、5×10⁵もしくは約5×10⁵個の細胞/kg、1×10⁵もしくは約1×10⁵個の細胞/kgから、2.5×10⁵もしくは約2.5×10⁵個の細胞/kg、2.5×10⁵もしくは約2.5×10⁵個の細胞/kgから、1×10⁷もしくは約1×10⁷個の細胞/kg、2.5×10⁵もしくは約2.5×10⁵個の細胞/kgから、7.5×10⁶もしくは約7.5×10⁶個の細胞/kg、2.5×10⁵もしくは約2.5×10⁵個の細胞/kgから、5×10⁶もしくは約5×10⁶個の細胞/kg、2.5×10⁵もしくは約2.5×10⁵個の細胞/kgから、2.5×10⁶もしくは約2.5×10⁶個の細胞/kg、2.5×10⁵もしくは約2.5×10⁵個の細胞/kgから、1×10⁶もしくは約1×10⁶個の細胞/kg、2.5×10⁵もしくは約2.5×10⁵個の細胞/kgから、7.5×10⁵もしくは約7.5×10⁵個の細胞/kg、2.5×10⁵もしくは約2.5×10⁵個の細胞/kgから、5×10⁵もしくは約5×10⁵個の細胞/kg、5×10⁵もしくは約5×10⁵個の細胞/kgから、1×10⁷もしくは約1×10⁷個の細胞/kg、5×10⁵もしくは約5×10⁵個の細胞/kgから、7.5×10⁶もしくは約7.5×10⁶個の細胞/kg、5×10⁵もしくは約5×10⁵個の細胞/kgから、5×10⁶もしくは約5×10⁶個の細胞/kg、5×10⁵もしくは約5×10⁵個の細胞/kgから、2.5×10⁶もしくは約2.5×10⁶個の細胞/kg、5×10⁵もしくは約5×10⁵個の細胞/kgから、1×10⁶もしくは約1×10⁶個の細胞/kg、5×10⁵もしくは約5×10⁵個の細胞/kgから、7.5×10⁵もしくは約7.5×10⁵個の細胞/kg、1×10⁶もしくは約1×10⁶個の細胞/kgから、1×10⁷もしくは約1×10⁷個の細胞/kg、1×10⁶もしくは約1×10⁶個の細胞/kgから、7.5×10⁶もしくは約7.5×10⁶個の細胞/kg、1×10⁶もしくは約1×10⁶個の細胞/kgから、5×10⁶もしくは約5×10⁶個の細胞/kg、1×10⁶もしくは約1×10⁶個の細胞/kgから、2.5×10⁶もしくは約2.5×10⁶個の細胞/kg、2.5×10⁶もしくは約2.5×10⁶個の細胞/kgから、1×10⁷もしくは約1×10⁷個の細胞/kg、2.5×10⁶もしくは約2.5×10⁶個の細胞/kgから、7.5×10⁶もしくは約7.5×10⁶個の細胞/kg、2.5×10⁶もしくは約2.5×10⁶個の細胞/kgから、5×10⁶もしくは約5×10⁶個の細胞/kg、5×10⁶もしくは約5×10⁶個の細胞/kgから、1×10⁷もしくは約1×10⁷個の細胞/kg、5×10⁶もしくは約5×10⁶個の細胞/kgから、7.5×10⁶もしくは約7.5×10⁶個の細胞/kg、または7.5×10⁶もしくは約7.5×10⁶個の細胞/kgから、1×10⁷もしくは約1×10⁷個の細胞/kgである。いくつかの態様において、1回分の用量は、1×10⁵もしくは約1×10⁵個の細胞/kgから、1×10⁸もしくは約1×10⁸個の細胞/kg、例えば2.5×10⁵もしくは約2.5×10⁵個の細胞/kgから、1×10⁸もしくは約1×10⁸個の細胞/kg、5×10⁵もしくは約5×10⁵個の細胞/kgから、1×10⁸もしくは約1×10⁸個の細胞/kg、7.5×10⁵もしくは約7.5×10⁵個の細胞/kgから、1×10⁸もしくは約1×10⁸個の細胞/kg、1×10⁶もしくは約1×10⁶個の細胞/kgから、1×10⁸もしくは約1×10⁸個の細胞/kg、2.5×10⁶もしくは約2.5×10⁶個の細胞/kgから、1×10⁸もしくは約1×10⁸個の細胞/kg、5×10⁶もしくは約5×10⁶個の細胞/kgから、1×10⁸もしくは約1×10⁸個の細胞/kg、7.5×10⁶もしくは約7.5×10⁶個の細胞/kgから、1×10⁸もしくは約1×10⁸個の細胞/kg、1×10⁷もしくは約1×10⁷個の細胞/kgから、1×10⁸もしくは約1×10⁸個の細胞/kg、2.5×10⁷もしくは約2.5×10⁷個の細胞/kgから、1×10⁸もしくは約1×10⁸個の細胞/kg、5×10⁷もしくは約5×10⁷個の細胞/kgから、1×10⁸もしくは約1×10⁸個の細胞/kg、7.5×10⁷もしくは約7.5×10⁷個の細胞/kgから、1×10⁸もしくは約1×10⁸個の細胞/kgである。いくつかの態様において、1回分の用量は、5×10⁷もしくは約5×10⁷から、10×10⁹もしくは約10×10⁹、例えば5×10⁷もしくは約5×10⁷から、5×10⁹もしくは約5×10⁹、約5×10⁷もしくは約5×10⁷から、1×10⁹もしくは約1×10⁹、5×10⁷もしくは約5×10⁷から、5×10⁸もしくは約5×10⁸、約5×10⁷もしくは約5×10⁷から、1×10⁸もしくは約1×10⁸、1×10⁸から、10×10⁹もしくは約10×10⁹、1×10⁸もしくは約1×10⁸から、5×10⁹もしくは約5×10⁹、約1×10⁸もしくは約1×10⁸から、1×10⁹もしくは約1×10⁹、1×10⁸もしくは約1×10⁸から、5×10⁸もしくは約5×10⁸、5×10⁸もしくは約5×10⁸から、10×10⁹もしくは約10×10⁹、5×10⁸もしくは約5×10⁸から、5×10⁹もしくは約5×10⁹、約5×10⁸もしくは約5×10⁸から、1×10⁹もしくは約1×10⁹、1×10⁹もしくは約1×10⁹から、10×10⁹もしくは約10×10⁹、1×10⁹もしくは約1×10⁹から、5×10⁹もしくは約5×10⁹、または5×10⁹もしくは約5×10⁹から、10×10⁹もしくは約10×10⁹である。いくつかの態様において、1回分の用量は、5×10⁸または約5×10⁸個の細胞である。いくつかの態様において、1回分の用量は、1×10⁹または約1×10⁹個の細胞である。いくつかの態様において、1回分の用量は、5×10⁹または約5×10⁹個の細胞である。いくつかの態様において、1回分の用量は、1×10¹⁰または約1×10¹⁰個の細胞である。上記の態様のいずれにおいても、用量は、g-NK細胞またはg-NK細胞のための代用マーカーと関連するかg-NK細胞のための代用マーカーを含むNK細胞サブセット、例えば上述のNK細胞サブセットのいずれかの数、または上記いずれかの生存細胞の数として与えられる。上記の態様のいずれにおいても、用量は、本方法によって産生された増大された細胞の組成物中の細胞の数または上記いずれかの生存細胞の数として与えられる。

組成物には、投与のための、例えば養子細胞療法のための、薬学的組成物および製剤が含まれる。いくつかの態様において、工学的に操作された細胞は、薬学的に許容される担体と共に製剤化される。

薬学的に許容される担体は、医薬としての投与に適合するあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張化および吸収遅延剤などを含むことができる（Gennaro,2000,Remington:The science and practice of pharmacy,Lippincott,Williams＆Wilkins、ペンシルベニア州フィラデルフィア）。そのような担体または希釈剤の例としては、水、食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、および5％ヒト血清アルブミンが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。リポソームおよび固定油などの非水性ビヒクルも使用しうる。組成物には補助的な活性化合物も組み入れることができる。薬学的担体は、NK細胞に適するもの、例えば食塩溶液、デキストロース溶液またはヒト血清アルブミンを含む溶液などであるべきである。

いくつかの態様において、上述の組成物のための薬学的に許容される担体またはビヒクルは、その中で、生きたNK細胞の投与を可能とするのに十分な時間にわたって、NK細胞を維持することができる、またはNK細胞が生存能を保つことができる、任意の非毒性水性溶液である。例えば薬学的に許容される担体またはビヒクルは食塩溶液または緩衝食塩溶液であることができる。薬学的に許容される担体またはビヒクルは、NK細胞の効力を増加させうるさまざまな生体物質も含むことができる。細胞培地および細胞担体は、例えば多糖類、例えばメチルセルロース（M.C.Tate,D.A.Shear,S.W.Hoffman,D.G.Stein,M.C.LaPlaca,Biomaterials 22,1113,2001、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）、キトサン（Suh J K F,Matthew H W T.Biomaterials,21,2589,2000、Lahiji A,Sohrabi A,Hungerford D S,et al.,J Biomed Mater Res,51,586,2000、これらはそれぞれ参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）、N-イソプロピルアクリルアミドコポリマーP（NIPAM-co-AA）（Y.H.Bae,B.Vernon,C.K.Han,S.W.Kim,J.Control.Release 53,249,1998、H.Gappa,M.Baudys,J.J.Koh,S.W.Kim,Y.H.Bae,Tissue Eng.7,35,2001、これらはそれぞれ参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）、ならびにポリ（オキシエチレン）/ポリ（D,L-乳酸-co-グリコール酸）（B.Jeong,K.M.Lee,A.Gutowska,Y.H.An,Biomacromolecules 3,865,2002、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）、P（PF-co-EG）（Suggs L J,Mikos A G.Cell Trans,8,345,1999、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）、PEO/PEG（Mann B K,Gobin A S,Tsai A T,Schmedlen R H,West J L.,Biomaterials,22,3045,2001、Bryant S J,Anseth K S.Biomaterials,22,619,2001、これらはそれぞれ参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）、PVA（Chih-Ta Lee,Po-Han Kung and Yu-Der Lee、Carbohydrate Polymer,61,348,2005、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）、コラーゲン（Lee C R,Grodzinsky A J,Spector M.,Biomaterials 22,3145,2001、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）、アルギネート（Bouhadir K H,Lee K Y,Alsberg E,Damm K L,Anderson K W,Mooney D J.Biotech Prog 17,945,2001、Smidsrd O,Skjak-Braek G.,Trends Biotech,8,71,1990、これらはそれぞれ参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）を含むことができる。

いくつかの態様において、NK細胞、例えばNKG2C^pos細胞またはそのサブセットは、組成物中に有効量で存在することができる。いくつかの態様において、組成物は、有効量のg-NK細胞、例えばFcRγ^neg細胞またはそのg-NK代用マーカープロファイルを有する細胞を含有する。細胞の有効量は、患者ならびに疾患のタイプ、重症度および程度によって変動しうる。したがって医師は、対象の健康状態、疾患の程度および重症度、ならびに他の変数を考慮した上で、何が有効量であるかを、決定することができる。

一定の態様において、組成物中のそのような細胞の数は、治療有効量である。いくつかの態様において、その量は、動物におけるがん、ウイルス感染症、微生物感染症、または敗血症性ショックに関連する重症度、持続時間および/または症状を低減する量である。いくつかの態様において、治療有効量は、本明細書に記載する組成物を投与された患者または動物において、がんの成長または蔓延を、当該組成物を投与されていない患者（もしくは動物）または患者（もしくは動物）の群におけるがんの成長または蔓延と比較して、少なくとも2.5％、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも25％、少なくとも35％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも75％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％低減させる細胞の用量である。いくつかの態様において、治療有効量は、がん、ウイルスおよび微生物細胞の成長を阻害または低減する活性をもたらす細胞傷害活性をもたらす量である。

いくつかの態様において、組成物は、10⁵もしくは約10⁵から、10¹²もしくは約10¹²個のNKG2C^pos細胞もしくはそのサブセット、または10⁵もしくは約10⁵から、10⁸もしくは約10⁸個のNKG2C^pos細胞もしくはそのサブセット、または10⁶もしくは約10⁶から、10¹²もしくは約10¹²個のNKG2C^pos細胞もしくはそのサブセット、または10⁸もしくは約10⁸から、10¹¹もしくは約10¹¹個のNKG2C^pos細胞もしくはそのサブセット、または10⁹もしくは約10⁹から、10¹⁰もしくは約10¹⁰個のNKG2C^pos細胞もしくはそのサブセットである量のNKG2C^pos細胞またはそのサブセットを含む。いくつかの態様において、組成物は、10⁵個超もしくは約10⁵個超のNKG2C^pos細胞もしくはそのサブセット、10⁶個超もしくは約10⁶個超のNKG2C^pos細胞もしくはそのサブセット、10⁷個超もしくは約10⁷個超のNKG2C^pos細胞もしくはそのサブセット、10⁸個超もしくは約10⁸個超のNKG2C^pos細胞もしくはそのサブセット、10⁹個超もしくは約10⁹個超のNKG2C^pos細胞もしくはそのサブセット、10¹⁰個超もしくは約10¹⁰個超のNKG2C^pos細胞もしくはそのサブセット、10¹¹個超もしくは約10¹¹個超のNKG2C^pos細胞もしくはそのサブセット、または10¹²個超もしくは約10¹²個超のNKG2C^pos細胞もしくはそのサブセットを含む。いくつかの態様において、そのような量は、ある疾患または状態を有する対象に、例えばがん患者に、投与することができる。

いくつかの態様において、組成物は、10⁵もしくは約10⁵から、10¹²もしくは約10¹²個のg-NK細胞、または10⁵もしくは約10⁵から、10⁸もしくは約10⁸個のg-NK細胞、または10⁶もしくは約10⁶から、10¹²もしくは約10¹²個のg-NK細胞、または10⁸もしくは約10⁸から、10¹¹もしくは約10¹¹個のg-NK細胞、または10⁹もしくは約10⁹から、10¹⁰もしくは約10¹⁰ g-NK細胞である量のg-NK細胞を含む。いくつかの態様において、組成物は、10⁵個超もしくは約10⁵個超のg-NK細胞、10⁶個超もしくは約10⁶個超のg-NK細胞、10⁷個超もしくは約10⁷個超のg-NK細胞、10⁸個超もしくは約10⁸個超のg-NK細胞、10⁹個超もしくは約10⁹個超のg-NK細胞、10¹⁰個超もしくは約10¹⁰個超のg-NK細胞、10¹¹個超もしくは約10¹¹個超のg-NK細胞、または10¹²個超もしくは約10¹²個超のg-NK細胞を含む。いくつかの態様において、そのような量は、ある疾患または状態を有する対象に、例えばがん患者に、投与することができる。

いくつかの態様において、組成物の体積は、少なくとも10mL、50mL、100mL、200mL、300mL、400mLもしくは500mLまたは少なくとも約10mL、50mL、100mL、200mL、300mL、400mLもしくは500mL、例えば10mL～500mLもしくは約10mL～500mL、10mL～200mLもしくは約10mL～200mL、10mL～100mLもしくは約10mL～100mL、10mL～50mLもしくは約10mL～50mL、50mL～500mLもしくは約50mL～500mL、50mL～200mLもしくは約50mL～200mL、50mL～100mLもしくは約50mL～100mL、100mL～500mLもしくは約100mL～500mL、100mL～200mLもしくは約100mL～200mL、または200mL～500mLもしくは約200mL～500mL（それぞれ両端の値を含む）である。いくつかの態様において、組成物は、少なくとも1×10⁵個の細胞/mL、5×10⁵個の細胞/mL、1×10⁶個の細胞/mL、5×10⁶個の細胞/mL、1×10⁷個の細胞/mL、5×10⁷個の細胞/mLもしくは1×10⁸個の細胞/mLまたは少なくとも約1×10⁵個の細胞/mL、5×10⁵個の細胞/mL、1×10⁶個の細胞/mL、5×10⁶個の細胞/mL、1×10⁷個の細胞/mL、5×10⁷個の細胞/mLもしくは1×10⁸個の細胞/mLの細胞密度を有する。いくつかの態様において、組成物の細胞密度は、1×10⁵個の細胞/mL～1×10⁸個の細胞/mLもしくは約1×10⁵個の細胞/mL～1×10⁸個の細胞/mL、1×10⁵個の細胞/mL～1×10⁷個の細胞/mLもしくは約1×10⁵個の細胞/mL～1×10⁷個の細胞/mL、1×10⁵個の細胞/mL～1×10⁶個の細胞/mLもしくは約1×10⁵個の細胞/mL～1×10⁶個の細胞/mL、1×10⁶個の細胞/mL～1×10⁷個の細胞/mLもしくは約1×10⁶個の細胞/mL～1×10⁷個の細胞/mL、1×10⁶個の細胞/mL～1×10⁸個の細胞/mLもしくは約1×10⁶個の細胞/mL～1×10⁸個の細胞/mL、1×10⁶個の細胞/mL～1×10⁷個の細胞/mLもしくは約1×10⁶個の細胞/mL～1×10⁷個の細胞/mL、または1×10⁷個の細胞/mL～1×10⁸個の細胞/mLもしくは約1×10⁷個の細胞/mL～1×10⁸個の細胞/mL（それぞれ両端の値を含む）である。

いくつかの態様において、組成物は、薬学的組成物を含めて、無菌である。いくつかの態様において、細胞の単離、濃縮、または培養は、例えば、例えば無菌培養バッグにおいて、エラー、ユーザーハンドリングおよび/または汚染を最小限に抑えるために、閉鎖環境または無菌環境で実行される。いくつかの態様において、無菌性は例えば無菌濾過膜による濾過などによって容易に達成することができる。いくつかの態様において、培養は、ガス透過性培養容器を使って実行される。いくつかの態様において、培養は、バイオリアクターを使って実行される。

提供されるNK細胞を凍結保存するのに適した組成物も、本明細書において提供される。いくつかの態様において、NK細胞は無血清凍結保存培地中で凍結保存される。いくつかの態様において、組成物は凍結保護物質を含む。いくつかの態様において、凍結保護物質は、DMSOおよび/またはsグリセロールであるか、またはDMSOおよび/もしくはsグリセロールを含む。いくつかの態様において、凍結保存培地は、5％または約5％から、10％または約10％DMSO（v/v）である。いくつかの態様において、凍結保存培地は5％または約5％DMSO（v/v）である。いくつかの態様において、凍結保存培地は6％または約6％DMSO（v/v）である。いくつかの態様において、凍結保存培地は7％または約7％DMSO（v/v）である。いくつかの態様において、凍結保存培地は8％または約8％DMSO（v/v）である。いくつかの態様において、凍結保存培地は9％または約9％DMSO（v/v）である。いくつかの態様において、凍結保存培地は10％または約10％DMSO（v/v）である。いくつかの態様において、凍結保存培地は市販の凍結保存溶液（CryoStor（商標）CS10）を含有する。CryoStor（商標）CS10は、10％ジメチルスルホキシド（DMSO）を含有する凍結保存培地である。いくつかの態様において、凍結保存用に製剤化された組成物は、例えば-40℃～-150℃の温度範囲での、例えばまたは約80℃±6.0℃の範囲での貯蔵など、低温において、例えば極低温において貯蔵することができる。

いくつかの態様において、組成物は、患者への投与前に極低温で保存することができる。いくつかの態様において、NK細胞サブセット、例えばg-NK細胞を、例えば提供される方法に従って、単離し、処理し、かつ増大させてから、対象への投与前に、極低温で貯蔵することもできる。

小スケールでの極低温における保存のための典型的方法は、例えば米国特許第6,0168,991号に記載されている。小スケールの場合は、前もって冷却しておいた5％ヒトアルブミン血清（HAS）への（例えば約200×106/mlの濃度での）低密度懸濁により、極低温で細胞を保存することができる。そのHAS溶液には等量の20％DMSOを加えることができる。混合物のアリコートをバイアルに入れ、約-80℃の極低温チャンバー内で一晩凍結させることができる。

いくつかの態様では、凍結保存されたNK細胞を、融解により、投与のために調製する。いくつかの事例では、NK細胞は、融解後、直ちに対象に投与することができる。そのような態様において、組成物は、さらなる処理が何もなくても、使用準備ができている。他の事例では、NK細胞は融解後に、対象への投与に先だって、例えば薬学的に許容される担体での再懸濁、活性化作用物質または刺激作用物質とのインキュベーションなどによってさらに処理されるか、または活性化され、洗浄され、薬学的に許容される緩衝液に再懸濁される。

IV. 処置の方法
対象における疾患または状態を処置するのに使用するための、本明細書記載のg-NK細胞を含む、提供される細胞組成物に関係する組成物および方法が、本明細書において提供される。いくつかの態様において、提供される組成物のいずれか、例えばg-NK細胞を含む組成物を、それを必要とする個体に投与する工程を含む、個体における状態を処置する方法が、本明細書において提供される。特定の態様において、組成物は本明細書において提供される方法によって産生される。そのような方法および使用には、疾患、状態、または障害を有する対象への治療用の細胞またはそれを含有する組成物の投与を伴う治療方法および使用が含まれる。場合により、疾患または障害は腫瘍またはがんである。いくつかの態様において、疾患または障害はウイルス感染症である。いくつかの態様において、細胞またはその薬学的組成物は、疾患または障害の処置を達成するために有効量で投与される。使用には、上述の方法および処置における、ならびにそのような治療方法を実行するための医薬の調製における、細胞またはその薬学的組成物の使用が含まれる。いくつかの態様において、本方法は、これにより、対象における疾患または状態を処置する。

いくつかの態様において、処置方法または使用は、提供される方法によって産生される増大されたNK細胞の組成物を含有する有効量の組成物の、個体への投与を伴う。いくつかの態様では、10⁵もしくは約10⁵から、10¹²もしくは約10¹²、または10⁵もしくは約10⁵から、10⁸もしくは約10⁸、または10⁶もしくは約10⁶から、10¹²もしくは約10¹²、または10⁸もしくは約10⁸から、10¹¹もしくは約10¹¹、または10⁹もしくは約10⁹から、10¹⁰もしくは約10¹⁰個の前記増大されたNK細胞が、個々の対象に投与される。いくつかの態様では、10⁵個もしくは10⁵個超もしくは約10⁵個超、10⁶個もしくは10⁶個超もしくは約10⁶個超、10⁷個もしくは10⁷個超もしくは約10⁷個超、10⁸個もしくは10⁸個超もしくは約10⁸個超、10⁹個もしくは10⁹個超もしくは約10⁹個超、10¹⁰個もしくは10¹⁰個超もしくは約10¹⁰個超、10¹¹個もしくは10¹¹個超もしくは約10¹¹個超、または10¹²個もしくは10¹²個超もしくは約10¹²個超の前記増大されたNK細胞を含有する細胞の用量が、個体に投与される。いくつかの態様では、1kgあたり10⁶または約10⁶から、10¹⁰個の増大されたNK細胞が対象に投与される。

いくつかの態様において、処置方法または使用は、セクションIIIに記載のいずれかを含む、提供されるNK細胞組成物のいずれかの有効量の、個体への投与を伴う。いくつかの態様では、10⁵もしくは約10⁵から、10¹²もしくは約10¹²、または10⁵もしくは約10⁵から、10⁸もしくは約10⁸、または10⁶もしくは約10⁶から、10¹²もしくは約10¹²、または10⁸もしくは約10⁸から、10¹¹もしくは約10¹¹、または10⁹もしくは約10⁹から、10¹⁰もしくは約10¹⁰個の、提供される組成物のいずれかからのNK細胞が、個々の対象に投与される。いくつかの態様において、10⁵個もしくは10⁵個超もしくは約10⁵個超、10⁶個もしくは10⁶個超もしくは約10⁶個超、10⁷個もしくは10⁷個超もしくは約10⁷個超、10⁸個もしくは10⁸個超もしくは約10⁸個超、10⁹個もしくは10⁹個超もしくは約10⁹個超、10¹⁰個もしくは10¹⁰個超もしくは約10¹⁰個超、10¹¹個もしくは10¹¹個超もしくは約10¹¹個超、または10¹²個もしくは10¹²個超もしくは約10¹²個超の、提供される組成物のいずれかからのNK細胞を含有する細胞の用量が、個体に投与される。いくつかの態様では、1kgあたり10⁶または約10⁶から、10¹⁰個の、提供される組成物のいずれかのNK細胞が、対象に投与される。

いくつかの態様において、処置方法または使用は、NKG2C^pos細胞またはそのサブセットの集団を含有する組成物の有効量の、個体への投与を伴う。いくつかの態様では、10⁵もしくは約10⁵から、10¹²もしくは約10¹²個のNKG2C^pos細胞もしくはそのサブセット、または10⁵もしくは約10⁵から、10⁸もしくは約10⁸個のNKG2C^pos細胞もしくはそのサブセット、または10⁶もしくは約10⁶から、10¹²もしくは約10¹²個のNKG2C^pos細胞もしくはそのサブセット、または10⁸もしくは約10⁸から、10¹¹もしくは約10¹¹個のNKG2C^pos細胞もしくはそのサブセット、または10⁹もしくは約10⁹から、10¹⁰もしくは約10¹⁰個のNKG2C^pos細胞もしくはそのサブセット。いくつかの態様では、10⁵個もしくは10⁵個超もしくは約10⁵個超のNKG2C^pos細胞もしくはそのサブセット、10⁶個もしくは10⁶個超もしくは約10⁶個超のNKG2C^pos細胞もしくはそのサブセット、10⁷個もしくは10⁷個超もしくは約10⁷個超のNKG2C^pos細胞もしくはそのサブセット、10⁸個もしくは10⁸個超もしくは約10⁸個超のNKG2C^pos細胞もしくはそのサブセット、10⁹個もしくは10⁹個超もしくは約10⁹個超のNKG2C^pos細胞もしくはそのサブセット、10¹⁰個もしくは10¹⁰個超もしくは約10¹⁰個超のNKG2C^pos細胞もしくはそのサブセット、10¹¹個もしくは10¹¹個超もしくは約10¹¹個超のNKG2C^pos細胞またはそのサブセット、または10¹²個もしくは10¹²個超もしくは約10¹²個超のNKG2C^pos細胞またはそのサブセットを含有する細胞の用量が、個体に投与される。いくつかの態様では、対象の体重1キログラムあたり10⁶または約10⁶から、10¹⁰個のg NKG2C^pos細胞またはそのサブセットが、対象に投与される。

いくつかの態様において、処置方法または使用は、NKG2A^neg細胞またはそのサブセットの集団を含有する組成物の有効量の、個体への投与を伴う。いくつかの態様では、10⁵個もしくは約10⁵個から、10¹²個もしくは約10¹²個のNKG2A^neg細胞もしくはそのサブセット、または10⁵個もしくは約10⁵個から、10⁸個もしくは約10⁸個のNKG2A^neg細胞もしくはそのサブセット、または10⁶個もしくは約10⁶個から、10¹²個もしくは約10¹²個のNKG2A^neg細胞もしくはそのサブセット、または10⁸個もしくは約10⁸個から、10¹¹個もしくは約10¹¹個のNKG2A^neg細胞もしくはそのサブセット、または10⁹個もしくは約10⁹個から、10¹⁰個もしくは約10¹⁰個のNKG2A^neg細胞もしくはそのサブセット。いくつかの態様では、10⁵個もしくは10⁵個超もしくは約10⁵個超のNKG2A^neg細胞もしくはそのサブセット、10⁶個もしくは10⁶個超もしくは約10⁶個超のNKG2A^neg細胞もしくはそのサブセット、10⁷個もしくは10⁷個超もしくは約10⁷個超のNKG2A^neg細胞もしくはそのサブセット、10⁸個もしくは10⁸個超もしくは約10⁸個超のNKG2A^neg細胞もしくはそのサブセット、10⁹個もしくは10⁹個超もしくは約10⁹個超のNKG2A^neg細胞もしくはそのサブセット、10¹⁰個もしくは10¹⁰個超もしくは約10¹⁰個超のNKG2A^neg細胞もしくはそのサブセット、10¹¹個もしくは10¹¹個超もしくは約10¹¹個超のNKG2A^neg細胞もしくはそのサブセット、または10¹²個もしくは10¹²個超もしくは約10¹²個超のNKG2A^neg細胞またはそのサブセットを含有する細胞の用量が、個体に投与される。いくつかの態様では、対象の体重1キログラムあたり10⁶個または約10⁶個から、10¹⁰個のg NKG2A^neg細胞またはそのサブセットが、対象に投与される。

いくつかの態様において、処置の方法または使用は、NKG2C^posNKG2A^neg細胞またはそのサブセットの集団を含有する組成物の有効量の、個体への投与を伴う。いくつかの態様では、10⁵個もしくは約10⁵個から、10¹²個もしくは約10¹²個のNKG2C^posNKG2A^neg細胞もしくはそのサブセット、または10⁵個もしくは約10⁵個から、10⁸個もしくは約10⁸個のNKG2C^posNKG2A^neg細胞もしくはそのサブセット、または10⁶個もしくは約10⁶個から、10¹²個もしくは約10¹²個のNKG2C^posNKG2A^neg細胞もしくはそのサブセット、または10⁸個もしくは約10⁸個から、10¹¹個もしくは約10¹¹個のNKG2C^posNKG2A^neg細胞もしくはそのサブセット、または10⁹個もしくは約10⁹個から、10¹⁰個もしくは約10¹⁰個のNKG2C^posNKG2A^neg細胞もしくはそのサブセット。いくつかの態様では、10⁵個もしくは10⁵個超もしくは約10⁵個超のNKG2C^posNKG2A^neg細胞もしくはそのサブセット、10⁶個もしくは10⁶個超もしくは約10⁶個超のNKG2C^posNKG2A^neg細胞もしくはそのサブセット、10⁷個もしくは10⁷個超もしくは約10⁷個超のNKG2C^posNKG2A^neg細胞もしくはそのサブセット、10⁸個もしくは10⁸個超もしくは約10⁸個超のNKG2C^posNKG2A^neg細胞もしくはそのサブセット、10⁹個もしくは10⁹個超もしくは約10⁹個超のNKG2C^posNKG2A^neg細胞もしくはそのサブセット、10¹⁰個もしくは10¹⁰個超もしくは約10¹⁰個超のNKG2C^posNKG2A^neg細胞もしくはそのサブセット、10¹¹個もしくは10¹¹個超もしくは約10¹¹個超のNKG2C^posNKG2A^neg細胞もしくはそのサブセット、または10¹²個もしくは10¹²個超もしくは約10¹²個超のNKG2C^posNKG2A^neg細胞またはそのサブセットを含有する細胞の用量が、個体に投与される。いくつかの態様では、対象の体重1キログラムあたり10⁶個または約10⁶個から、10¹⁰個のg NKG2C^posNKG2A^neg細胞またはそのサブセットが、対象に投与される。

いくつかの態様において、処置方法は、g-NK細胞を含有する有効量の組成物を個体に投与する工程を含む。いくつかの態様では、10⁵もしくは約10⁵から、10¹²もしくは約10¹²個のg-NK細胞、または10⁵もしくは約10⁵から、10⁸もしくは約10⁸個のg-NK細胞、または10⁶もしくは約10⁶から、10¹²もしくは約10¹²個のg-NK細胞、または10⁸もしくは約10⁸から、10¹¹もしくは約10¹¹個のg-NK細胞、または10⁹もしくは約10⁹から、10¹⁰もしくは約10¹⁰個のg-NK細胞。いくつかの態様では、10⁵個もしくは10⁵個超もしくは約10⁵個超のg-NK細胞、10⁶個もしくは10⁶個超もしくは約10⁶個超のg-NK細胞、10⁷個もしくは10⁷個超もしくは約10⁷個超のg-NK細胞、10⁸個もしくは10⁸個超もしくは約10⁸個超のg-NK細胞、10⁹個もしくは10⁹個超もしくは約10⁹個超のg-NK細胞、10¹⁰個もしくは10¹⁰個超もしくは約10¹⁰個超のg-NK細胞、10¹¹個もしくは10¹¹個超もしくは約10¹¹個超のg-NK細胞、または10¹²個もしくは10¹²個超もしくは約10¹²個超のg-NK細胞を含有する細胞の用量が、個体に投与される。いくつかの態様では、10⁶または約10⁶から、10¹⁰個のg-NK細胞/kgが対象に投与される。

いくつかの態様において提供される処置方法または使用のいずれかによる投与のための用量は、1×10⁵もしくは約1×10⁵個の細胞/kgから、1×10⁷もしくは約1×10⁷個の細胞/kg、例えば1×10⁵もしくは約1×10⁵個の細胞/kgから、7.5×10⁶もしくは約7.5×10⁶個の細胞/kg、1×10⁵もしくは約1×10⁵個の細胞/kgから、5×10⁶もしくは約5×10⁶個の細胞/kg、1×10⁵もしくは約1×10⁵個の細胞/kgから、2.5×10⁶もしくは約2.5×10⁶個の細胞/kg、1×10⁵もしくは約1×10⁵個の細胞/kgから、1×10⁶もしくは約1×10⁶個の細胞/kg、1×10⁵もしくは約1×10⁵個の細胞/kgから、7.5×10⁵もしくは約7.5×10⁵個の細胞/kg、1×10⁵もしくは約1×10⁵個の細胞/kgから、5×10⁵もしくは約5×10⁵個の細胞/kg、1×10⁵もしくは約1×10⁵個の細胞/kgから、2.5×10⁵もしくは約2.5×10⁵個の細胞/kg、2.5×10⁵もしくは約2.5×10⁵個の細胞/kgから、1×10⁷もしくは約1×10⁷個の細胞/kg、2.5×10⁵もしくは約2.5×10⁵個の細胞/kgから、7.5×10⁶もしくは約7.5×10⁶個の細胞/kg、2.5×10⁵もしくは約2.5×10⁵個の細胞/kgから、5×10⁶もしくは約5×10⁶個の細胞/kg、2.5×10⁵もしくは約2.5×10⁵個の細胞/kgから、2.5×10⁶もしくは約2.5×10⁶個の細胞/kg、2.5×10⁵もしくは約2.5×10⁵個の細胞/kgから、1×10⁶もしくは約1×10⁶個の細胞/kg、2.5×10⁵もしくは約2.5×10⁵個の細胞/kgから、7.5×10⁵もしくは約7.5×10⁵個の細胞/kg、2.5×10⁵もしくは約2.5×10⁵個の細胞/kgから、5×10⁵もしくは約5×10⁵個の細胞/kg、5×10⁵もしくは約5×10⁵個の細胞/kgから、1×10⁷もしくは約1×10⁷個の細胞/kg、5×10⁵もしくは約5×10⁵個の細胞/kgから、7.5×10⁶もしくは約7.5×10⁶個の細胞/kg、5×10⁵もしくは約5×10⁵個の細胞/kgから、5×10⁶もしくは約5×10⁶個の細胞/kg、5×10⁵もしくは約5×10⁵個の細胞/kgから、2.5×10⁶もしくは約2.5×10⁶個の細胞/kg、5×10⁵もしくは約5×10⁵個の細胞/kgから、1×10⁶もしくは約1×10⁶個の細胞/kg、5×10⁵もしくは約5×10⁵個の細胞/kgから、7.5×10⁵もしくは約7.5×10⁵個の細胞/kg、1×10⁶もしくは約1×10⁶個の細胞/kgから、1×10⁷もしくは約1×10⁷個の細胞/kg、1×10⁶もしくは約1×10⁶個の細胞/kgから、7.5×10⁶もしくは約7.5×10⁶個の細胞/kg、1×10⁶もしくは約1×10⁶個の細胞/kgから、5×10⁶もしくは約5×10⁶個の細胞/kg、1×10⁶もしくは約1×10⁶個の細胞/kgから、2.5×10⁶もしくは約2.5×10⁶個の細胞/kg、2.5×10⁶もしくは約2.5×10⁶個の細胞/kgから、1×10⁷もしくは約1×10⁷個の細胞/kg、2.5×10⁶もしくは約2.5×10⁶個の細胞/kgから、7.5×10⁶もしくは約7.5×10⁶個の細胞/kg、2.5×10⁶もしくは約2.5×10⁶個の細胞/kgから、5×10⁶もしくは約5×10⁶個の細胞/kg、5×10⁶もしくは約5×10⁶個の細胞/kgから、1×10⁷もしくは約1×10⁷個の細胞/kg、5×10⁶もしくは約5×10⁶個の細胞/kgから、7.5×10⁶もしくは約7.5×10⁶個の細胞/kg、または7.5×10⁶もしくは約7.5×10⁶個の細胞/kgから、1×10⁷もしくは約1×10⁷個の細胞/kgである。いくつかの態様において、投与のための用量は、1×10⁵もしくは約1×10⁵個の細胞/kgから、1×10⁸もしくは約1×10⁸個の細胞/kg、例えば2.5×10⁵もしくは約2.5×10⁵個の細胞/kgから、1×10⁸もしくは約1×10⁸個の細胞/kg、5×10⁵もしくは約5×10⁵個の細胞/kgから、1×10⁸もしくは約1×10⁸個の細胞/kg、7.5×10⁵もしくは約7.5×10⁵個の細胞/kgから、1×10⁸もしくは約1×10⁸個の細胞/kg、1×10⁶もしくは約1×10⁶個の細胞/kgから、1×10⁸もしくは約1×10⁸個の細胞/kg、2.5×10⁶もしくは約2.5×10⁶個の細胞/kgから、1×10⁸もしくは約1×10⁸個の細胞/kg、5×10⁶もしくは約5×10⁶個の細胞/kgから、1×10⁸もしくは約1×10⁸個の細胞/kg、7.5×10⁶もしくは約7.5×10⁶個の細胞/kgから、1×10⁸もしくは約1×10⁸個の細胞/kg、1×10⁷もしくは約1×10⁷個の細胞/kgから、1×10⁸もしくは約1×10⁸個の細胞/kg、2.5×10⁷もしくは約2.5×10⁷個の細胞/kgから、1×10⁸もしくは約1×10⁸個の細胞/kg、5×10⁷もしくは約5×10⁷個の細胞/kgから、1×10⁸もしくは約1×10⁸個の細胞/kg、または7.5×10⁷もしくは約7.5×10⁷個の細胞/kgから、1×10⁸もしくは約1×10⁸個の細胞/kgである。

いくつかの態様において、用量は、g-NK細胞の数、またはg-NK細胞のための代用マーカーと関連するかg-NK細胞のための代用マーカーを含むNK細胞サブセット、例えば本明細書記載のNK細胞サブセットのいずれかの数、または前記のいずれかの生存細胞の数として与えられる。上記の態様のいずれかにおいて、用量は、提供される方法によって産生される増大された細胞の組成物中の細胞の数、または前記のいずれかの生存細胞の数として与えられる。

いくつかの態様において、処置方法または使用のいずれかによる投与のための用量は、5×10⁷もしくは約5×10⁷から、10×10⁹もしくは約10×10⁹、例えば5×10⁷もしくは約5×10⁷から、5×10⁹もしくは約5×10⁹、約5×10⁷もしくは約5×10⁷から、1×10⁹もしくは約1×10⁹、5×10⁷もしくは約5×10⁷から、5×10⁸もしくは約5×10⁸、約5×10⁷もしくは約5×10⁷から、1×10⁸もしくは約1×10⁸、1×10⁸から、10×10⁹もしくは約10×10⁹、1×10⁸もしくは約1×10⁸から、5×10⁹もしくは約5×10⁹、約1×10⁸もしくは約1×10⁸から、1×10⁹もしくは約1×10⁹、1×10⁸もしくは約1×10⁸から、5×10⁸もしくは約5×10⁸、5×10⁸もしくは約5×10⁸から、10×10⁹もしくは約10×10⁹、5×10⁸もしくは約5×10⁸から、5×10⁹もしくは約5×10⁹、約5×10⁸もしくは約5×10⁸から、1×10⁹もしくは約1×10⁹、1×10⁹もしくは約1×10⁹から、10×10⁹もしくは約10×10⁹、1×10⁹もしくは約1×10⁹から、5×10⁹もしくは約5×10⁹、または5×10⁹もしくは約5×10⁹から、10×10⁹もしくは約10×10⁹である。いくつかの態様において、投与のための用量は、5×10⁸または約5×10⁸個の細胞である。いくつかの態様において、投与のための用量は、1×10⁹または約1×10⁹個の細胞である。いくつかの態様において、投与のための用量は、5×10⁹または約5×10⁹個の細胞である。いくつかの態様において、投与のための用量は、1×10¹⁰または約1×10¹⁰個の細胞である。いくつかの態様において、用量は、g-NK細胞の数、またはg-NK細胞のための代用マーカーと関連するかg-NK細胞のための代用マーカーを含むNK細胞サブセット、例えば本明細書記載のNK細胞サブセットのいずれかの数、または前記のいずれかの生存細胞の数として与えられる。上記の態様のいずれかにおいて、用量は、提供される方法によって産生される増大された細胞の組成物中の細胞の数、または前記のいずれかの生存細胞の数として与えられる。

いくつかの態様において、増大されたNK細胞を含有する組成物は、提供される方法に従った増大の後すぐに個体に投与される。他の態様では、増大されたNK細胞が、投与に先だって、例えば上述の方法により、貯蔵されるか、培養下での成長によって増大される。例えばNK細胞は、個体への投与に先だって、6ヶ月超、12ヶ月超、18ヶ月超または24ヶ月超にわたって貯蔵することができる。

いくつかの態様において、NK細胞およびそのサブセット、例えばg-NK細胞を含有する、提供される組成物は、皮下投与経路、筋肉内投与経路、静脈内投与経路、および/または硬膜外投与経路などの非経口経路を含む任意の好都合な経路で、対象に投与することができる。

特定の態様において、提供される組成物は静脈内注入によって投与される。いくつかの態様では、10×10⁶個から10×10⁹個または約10×10⁶個から10×10⁹個の細胞が、1mLから100mLの体積で、静脈内注入によって投与される。いくつかの態様では、50×10⁶個または約50×10⁶個の細胞が投与される。いくつかの態様では、1×10⁹個または約1×10⁹個の細胞が投与される。いくつかの態様では、5×10⁹個または約5×10⁹個の細胞が投与される。いくつかの態様では、10×10⁹個または約10×10⁹個の細胞が投与される。前記の細胞数を投与する注入のために細胞の体積を決定することは、当業者の水準内にある。ある例では、0.5×10⁹個の細胞が、2.5×10⁷個または約2.5×10⁷個の細胞/mL（例えば200mL中に5×10⁹個または約5×10⁹個の細胞）の濃度で製剤化された、組成物、例えば解凍された冷凍保存組成物からの、約20mLの体積の静脈内注入によって投与される。

提供されるNK細胞およびそのサブセット、例えばg-NK細胞、ならびに組成物は、腫瘍もしくは過剰増殖性障害または微生物感染症、例えばウイルス感染症、酵母感染症、真菌感染症、原生動物感染症および/もしくは細菌感染症を持つ個体を処置する方法において使用することができる。提供されるNK細胞およびそのサブセット、例えばg-NK細胞、ならびに組成物で対象を処置する開示の方法は、治療用モノクローナル抗体、例えば抗腫瘍抗原抗体もしくは抗がん抗体、抗ウイルス抗体または抗細菌抗体などと組み合わせることができる。提供されるNK細胞およびそのサブセット、例えばg-NK細胞、ならびに組成物は、動物、例えば哺乳類動物、例えばヒト対象の処置のために投与することができる。

いくつかの例において、本方法は、過剰増殖性障害、例えば血液学的悪性疾患または固形腫瘍を処置することを含む。本明細書記載の組成物で処置することができるがんおよび増殖性障害のタイプの例としては、多発性骨髄腫、白血病（例えば骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、赤白血病、慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病、および慢性リンパ性白血病）、リンパ腫（例えばホジキン病および非ホジキン病）、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、血管肉腫、内皮肉腫、ユーイング腫瘍、大腸癌、膵がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、腎細胞癌、ヘパトーマ、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、子宮がん、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、乏突起神経膠腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、異形成および過形成が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。がんの処置および/または防止には、がんに関連する1つまたは複数の症状の軽減、がんの進行の阻害または低減、がんの退縮の促進、および/または免疫応答の増進が含まれるが、それらに限定されるわけではない。

いくつかの例において、本方法は、ウイルス感染症、例えば体内にウイルスが存在することによって引き起こされる感染症を処置することを含む。ウイルス感染症は、DNAまたはRNAウイルスによって引き起こされ得、慢性または持続性ウイルス感染症を含み得る。これは、宿主に感染し、致命的になる前に、宿主の細胞内で長期間にわたって、通常は数週間、数ヶ月または数年にわたって、複製することができるウイルス感染症である。本発明に従って処置されうる慢性感染症を起こすウイルスとしては、例えばヒトパピローマウイルス（HPV）、単純ヘルペスウイルスおよび他のヘルペスウイルス、B型およびC型肝炎のウイルス、ならびに他の肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、および麻疹ウイルスが挙げられ、これらはいずれも、重大な臨床疾患を生じる場合がある。長期感染は最終的には、患者にとって致命的な疾患の誘導、例えばC型肝炎ウイルスの場合であれば肝がんの誘導につながりうる。本発明に従って処置しうる他の慢性ウイルス感染症としては、エプスタイン・バーウイルス（Epstein Barr virus）（EBV）、ならびに他のウイルス、例えば腫瘍に関連しうるものが挙げられる。

本明細書記載の組成物および方法で処置または防止することができるウイルス感染症の例としては、コロナウイルス（例えば、感染症がCOVID-19である、SARS-CoV-2）、レトロウイルス（例えばヒトTリンパ球向性ウイルス（HTLV）I型およびII型ならびにヒト免疫不全ウイルス（HIV））、ヘルペスウイルス（例えば単純ヘルペスウイルス（HSV）I型およびII型、エプスタイン・バン（Epstein-Ban）ウイルスならびにサイトメガロウイルス）、アレナウイルス（例えばラッサ熱ウイルス）、パラミクソウイルス（例えばモルビリウイルス属のウイルス、ヒト呼吸器合胞体ウイルス、およびニューモウイルス）、アデノウイルス、ブニヤウイルス（例えばハンタウイルス）、コルナウイルス（cornavirus）、フィロウイルス（例えばエボラウイルス）、フラビウイルス（例えばC型肝炎ウイルス（HCV）、黄熱ウイルスおよび日本脳炎ウイルス）、ヘパドナウイルス（例えばB型肝炎ウイルス（HBV））、オルソミオウイルス（orthomyovirus）（例えばセンダイウイルスならびにインフルエンザウイルスA、BおよびC）、パポーバウイルス（例えばパピローマウイルス）、ピコルナウイルス（例えばライノウイルス、エンテロウイルスおよびA型肝炎ウイルス）、ポックスウイルス、レオウイルス（例えばロタウイルス）、トガウイルス（例えば風疹ウイルス）、ならびにラブドウイルス（例えば狂犬病ウイルス）によって引き起こされるウイルス感染症が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。ウイルス感染症の処置および/または防止には、該感染症に関連する1つまたは複数の症状を軽減すること、ウイルス複製の阻害、低減もしくは抑制、および/または免疫応答の増進が含まれるが、それらに限定されるわけではない。

いくつかの態様において、提供されるNK細胞およびそのサブセット、例えばg-NK細胞、ならびに組成物は、酵母感染症または細菌感染症を処置する方法に使用される。例えば、本明細書記載の提供されるg-NK細胞および組成物ならびに方法は、化膿性レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）、肺炎レンサ球菌（Streptococcus pneumoniae）、淋菌（Neisseria gonorrhoea）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）、破傷風菌（Clostridium tetani）、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）、臭鼻菌（Klebsiella ozaenae）、クレブシエラ・リノスクレロモチス（Klebsiella rhinoscleromotis）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、コレラ菌（Vibrio cholera）、大腸菌（Escherichia coli）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、カンピロバクター（ビブリオ）・フィタス（Campylobacter（Vibrio）fetus）、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）、エロモナス・ハイドロフィラ（Aeromonas hydrophila）、セレウス菌（Bacillus cereus）、エドワージエラ・タルダ（Edwardsiella tarda）、腸炎エルシニア（Yersinia enterocolitica）、ペスト菌（Yersinia pestis）、仮性結核菌（Yersinia pseudotuberculosis）、志賀赤痢菌（Shigella dysenteriae）、シゲラ・フレックスネリ（Shigella flexneri）、ソンネ赤痢菌（Shigella sonnei）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、梅毒トレポネーマ（Treponema pallidum）、フランベジアトレポネーマ（Treponema pertenue）、トレポネーマ・カラテネウム（Treponema carateneum）、ヴァンサンボレリア（Borrelia vincentii）、ライム病ボレリア（Borrelia burgdorferi）、黄疸出血性レプトスピラ（Leptospira icterohemorrhagiae）、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、トキソプラズマ・ゴンディ（Toxoplasma gondii）、ニューモシスティス・カリニ（Pneumocystis carinii）、野兎病菌（Francisella tularensis）、ブルセラ・アボルツ（Brucella aborts）、ブタ流産菌（Brucella suis）、ヤギ流産菌（Brucella melitensis）、マイコプラズマ属（Mycoplasma spp.）、発疹チフスリケッチア（Rickettsia prowazeki）、ツツガムシ病リケッチア（Rickettsia tsutsugumushi）、クラミジア属（Chlamydia spp.）、ピロリ菌（Helicobacter pylori）またはそれらの組み合わせに関係する感染症を処置することができる。

先の態様のいずれかにおいて、提供されるg-NK細胞およびその組成物は、疾患または障害の処置のための単独療法として使用することができる。

A. 併用療法
いくつかの態様において、本明細書において提供されるg-NK細胞を含有する組成物は、対象における疾患または状態を処置するための1つまたは複数の他の作用物質との併用療法において投与することができる。そのような態様において、本明細書において提供されるg-NK細胞を含有する組成物は、1つまたは複数の他の作用物質の投与前に、またはその投与と同時に、またはその投与に続いて（投与後に）投与することができる。例えば、g-NK細胞は、抗微生物剤、抗ウイルス剤、および他の治療剤と同時に、または逐次的に投与することができる。例示的な併用療法は以下のサブセクションに記載する。

1. 抗体併用
いくつかの態様において、本明細書において提供されるg-NK細胞を含有する組成物は、抗体またはFc含有タンパク質によって活性化されるか、抗体またはFc含有タンパク質と接触させると、例えば通常型NK細胞と比較して、増強された活性を呈する。例えば、g-NK細胞は、抗体被覆腫瘍細胞によるCD16の抗体媒介性架橋によって活性化されうる。

いくつかの態様では、個体における状態を処置する方法であって、g-NK細胞またはその組成物と抗体とを対象に投与する工程を含む方法が、本明細書において提供される。当業者は、本明細書記載の提供されるg-NK細胞および組成物と共に対象に投与するための適当な治療用（例えば抗がん）モノクローナル抗体を、例えばその個体の特定疾患または特定状態に応じて、選択することができる。適切な抗体としては、ポリクローナル、モノクローナル、フラグメント（例えばFabフラグメント）、一本鎖抗体および他の形態の特異的結合分子を挙げることができる。

いくつかの態様において、抗体には、ヒト化抗体またはヒト抗体が、さらに含まれうる。ヒト化型の非ヒト抗体は、非ヒトIgに由来する最小限の配列を含有する、キメラIg、キメラIg鎖またはキメラIgフラグメント（例えばFv、Fab、Fab'、F(ab')2または抗体の他の抗原結合性部分配列）である。いくつかの態様において、抗体はFcドメインを含む。

一般に、ヒト化抗体は、非ヒト供給源から導入された1つまたは複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基はしばしば「インポート」残基と呼ばれ、それらは通例「インポート」可変ドメインから採用される。ヒト化は、齧歯類のCDRまたはCDR配列で、ヒト抗体の対応する配列を置換することによって達成される（Jones et al.,1986;Riechmann et al.,1988;Verhoeyen et al.,1988）。そのような「ヒト化」抗体は、インタクトなヒト可変ドメインよりもかなり小さな部分が非ヒト種からの対応する配列で置換されている、キメラ抗体（1989）である。実際、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかのCDR残基と場合によってはいくつかのFc残基が齧歯類抗体中の類似する部位からの残基で置換されているヒト抗体である。ヒト化抗体としては、レシピエントの相補性決定領域（CDR）の残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のCDRからの残基で置き換えられている、ヒト抗体（レシピエント抗体）が挙げられる。場合により、対応する非ヒト残基が、ヒト抗体のFvフレームワーク残基を置き換える。「ヒト化抗体」は、レシピエント抗体にもインポートされるCDR配列またはフレームワーク配列にも見いだされない残基を含みうる。一般に、ヒト化抗体は、CDR領域のすべてではないとしても大半が非ヒトIgのそれに対応し、FR領域のすべてではないとしても大半がヒト抗体コンセンサス配列のそれである、少なくとも1つの、典型的には2つの、可変ドメインの実質上すべてを含む。ヒト化抗体は、最適には、抗体定常領域（Fc）の、典型的にはヒト抗体のそれの、少なくとも一部分も含む（Jones et al.,1986;Presta,1992;Riechmann et al.,1988）。

ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリー（Hoogenboom et al.,1991;Marks et al.,1991）およびヒトmAbの調製（Boerner et al.,1991;Reisfeld and Sell,1985）を含むさまざまな技法を使って産生することもできる。同様に、内因性抗体遺伝子が部分的にまたは完全に非働化されているトランスジェニック動物へのヒトIg遺伝子の導入を、ヒトAbを合成するために利用することもできる。チャレンジすると、遺伝子の再編成、アセンブリおよび抗体レパトアを含めあらゆる面でヒトに見られるものとよく似たヒト抗体産生が観察される（1997a;1997b;1997c;1997d;1997;1997;Fishwild et al.,1996;1997;1997;2001;1996;1997;1997;1997;Lonberg and Huszar,1995;Lonberg et al.,1994;Marks et al.,1992;1997;1997;1997）。

具体的には、本発明の細胞は、腫瘍関連抗原を認識する抗体と共に投与することにより、腫瘍にターゲティングすることができる。本g-NK細胞が、腫瘍関連抗原を認識する多種多様な抗体と共に使用するのに適していることは、当業者には理解されると考えられる。腫瘍関連抗原の非限定的な例として、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD52、CD56、CD70、CD74、CD140、EpCAM、CEA、gpA33、メソテリン、α-フェトプロテイン、ムチン、PDGFR-α、TAG-72、CAIX、PSMA、葉酸結合タンパク質、細胞分散因子受容体キナーゼ、ガングリオシド、サイトケライン、frizzled受容体、VEGF、VEGFR、インテグリンαVβ3、インテグリンα5β1、EGFR、EGFL7、ERBB2（HER2）、ERBB3、フィブロネクチン、HGF、HER3、LOXL2、MET、IGF1R、IGLF2、EPHA3、FR-α、ホスファチジルセリン、シンデカン1、SLAMF7（CD319）、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP、ビメンチン、またはテネイシンが挙げられる。いくつかの事例では、抗体が抗CD20抗体（例えば、リツキシマブ）、抗HER2抗体（例えば、セツキシマブ）、抗CD52抗体、抗EGFR抗体、および抗CD38抗体（例えば、ダラツムマブ）、抗SLAMF7抗体（例えば、エロツズマブ）である。

提供される方法において、g-NK細胞を含む細胞組成物との併用療法で使用することができる非限定的抗体としては、トラスツズマブ（Herceptin（登録商標））、ラムシルマブ（Cyramza（登録商標））、アテゾリズマブ（Tecentriq（商標））、ニボルマブ（Opdivo（登録商標））、デュルバルマブ（Imfinzi（商標））、アベルマブ（Bavencio（登録商標））、ペンブロリズマブ（Keytruda（登録商標））、ベバシズマブ（Avastin（登録商標））、エベロリムス（Afinitor（登録商標））、ペルツズマブ（Perjeta（登録商標））、ado-トラスツズマブエムタンシン（Kadcyla（登録商標））、セツキシマブ（Erbitux（登録商標））、デノスマブ（Xgeva（登録商標））、リツキシマブ（Rituxan（登録商標））、アレムツズマブ（Campath（登録商標））、オファツムマブ（Arzerra（登録商標））、オビヌツズマブ（Gazyva（登録商標））、ネシツムマブ（Portrazza（商標））、イブリツモマブチウキセタン（Zevalin（登録商標））、ブレンツキシマブベドチン（Adcetris（登録商標））、シルツキシマブ（Sylvant（登録商標））、ボルテゾミブ（Velcade（登録商標））、ダラツムマブ（Darzalex（商標））、エロツズマブ（Empliciti（商標））、ジヌツキシマブ（Unituxin（商標））、オララツマブ（Lartruvo（商標））、オクレリズマブ、イサツキシマブ、Truxima、Blitzima、Ritemvia、Rituzena、Herzuma、Ruxience、ABP 798、Kanjinti、Ogivry、BI 695500、Novex（RTXM83）、トシツモマブもしくはOntruzant、またはそれらのバイオシミラーが挙げられる。例示的な抗体として、リツキシマブ、トラスツズマブ、アレツズマブ（aletuzumab）、セルツキシマブ（certuximab）、ダラツムマブ、ベルツズマブ、オファツムマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブまたはエロツズマブが挙げられる。

いくつかの態様において、抗体は抗PD-1抗体または抗PD-L1抗体であることができる。PD-1またはPD-L1を標的とする抗体にはニボルマブ、ペンブロリズマブまたはアテゾリズマブがあるが、それらに限定されるわけではない。

選択されたがんタイプに特異的な抗体を選ぶことができ、これにはがんの処置用に承認された任意の抗体が含まれる。例として、乳がん用のトラスツズマブ（Herceptin）、リンパ腫用のリツキシマブ（Rituxan）および頭頸部扁平上皮癌用のセツキシマブ（Erbitux）が挙げられる。当業者は、特定の腫瘍抗原または疾患抗原に結合することのできるFDA承認モノクローナル抗体を熟知しており、それらはいずれも、腫瘍または疾患を処置するために、提供される方法に従って使用することができる。

いくつかの態様において、本方法は胃または胃食道接合部の腺癌を処置するための方法であり、抗体はトラスツズマブ（Herceptin（登録商標））またはラムシルマブ（Cyramza（登録商標））である。

いくつかの態様において、本方法は膀胱がんを処置するための方法であり、抗体はアテゾリズマブ（Tecentriq（商標））、ニボルマブ（Opdivo（登録商標））、デュルバルマブ（Imfinzi（商標））、アベルマブ（Bavencio（登録商標））またはペンブロリズマブ（Keytruda（登録商標））である。

いくつかの態様において、本方法は脳のがんを処置するための方法であり、抗体はベバシズマブ（Avastin（登録商標））である。

いくつかの態様において、本方法は乳がんを処置するための方法であり、抗体はトラスツズマブ（Herceptin（登録商標））である。

いくつかの態様において、本方法は子宮頸がんを処置するための方法であり、抗体はベバシズマブ（Avastin（登録商標））である。

いくつかの態様において、本方法は結腸直腸がんを処置するための方法であり、抗体はセツキシマブ（Erbitux（登録商標））、パニツムマブ（Vectibix（登録商標））、ベバシズマブ（Avastin（登録商標））またはラムシルマブ（Cyramza（登録商標））である。

いくつかの態様において、本方法は内分泌/神経内分泌腫瘍を処置するための方法であり、抗体はアベルマブ（Bavencio（登録商標））である。

いくつかの態様において、本方法は頭頸部がんを処置するための方法であり、抗体はセツキシマブ（Erbitux（登録商標））、ペンブロリズマブ（Keytruda（登録商標））、ニボルマブ（Opdivo（登録商標））、トラスツズマブまたはラムシルマブである。

いくつかの態様において、本方法は骨がんを処置するための方法であり、抗体はデノスマブ（Xgeva（登録商標））である。

いくつかの態様において、本方法は腎がんを処置するための方法であり、抗体はベバシズマブ（Avastin（登録商標））またはニボルマブ（Opdivo（登録商標））である。

いくつかの態様において、本方法は白血病を処置するための方法であり、抗体はリツキシマブ（Rituxan（登録商標））、アレムツズマブ（Campath（登録商標））、オファツムマブ（Arzerra（登録商標））、オビヌツズマブ（Gazyva（登録商標））またはブリナツモマブ（Blincyto（登録商標））である。

いくつかの態様において、本方法は肺がんを処置するための方法であり、抗体はベバシズマブ（Avastin（登録商標））、ラムシルマブ（Cyramza（登録商標））、ニボルマブ（Opdivo（登録商標））、ネシツムマブ（Portrazza（商標））、ペンブロリズマブ（Keytruda（登録商標））またはアテゾリズマブ（Tecentriq（商標））である。

いくつかの態様において、本方法はリンパ腫を処置するための方法であり、抗体はイブリツモマブチウキセタン（Zevalin（登録商標））、ブレンツキシマブベドチン（Adcetris（登録商標））、リツキシマブ（Rituxan（登録商標））、シルツキシマブ（Sylvant（登録商標））、オビヌツズマブ（Gazyva（登録商標））、ニボルマブ（Opdivo（登録商標））またはペンブロリズマブ（Keytruda（登録商標））である。

いくつかの態様において、本方法は多発性骨髄腫を処置するための方法であり、抗体はボルテゾミブ（Velcade（登録商標））、ダラツムマブ（Darzalex（商標））またはエロツズマブ（Empliciti（商標））である。

いくつかの態様において、本方法は神経芽細胞腫を処置するための方法であり、抗体はジヌツキシマブ（Unituxin（商標））である。

いくつかの態様において、本方法は、卵巣上皮/卵管/原発性腹膜がんを処置するための方法であり、抗体はベバシズマブ（Avastin（登録商標））である。

いくつかの態様において、本方法は膵がんを処置するための方法であり、抗体はセツキシマブ（Erbitux（登録商標））またはベバシズマブ（Avastin（登録商標））である。

いくつかの態様において、本方法は皮膚がんを処置するための方法であり、抗体はイピリムマブ（Yervoy（登録商標））、ペンブロリズマブ（Keytruda（登録商標））、アベルマブ（Bavencio（登録商標））またはニボルマブ（Opdivo（登録商標））である。

いくつかの態様において、本方法は軟部組織肉腫を処置するための方法であり、抗体はオララツマブ（Lartruvo（商標））である。

いくつかの態様では、対象に、本明細書記載のg-NK細胞の集団と有効用量の二重特異性抗体とが投与される。いくつかの態様において、二重特異性抗体は第1結合ドメインと第2結合ドメインとを含み、第1結合ドメインは免疫細胞、例えばNK細胞またはマクロファージ上の表面抗原に特異的に結合する。いくつかの態様において、第1結合ドメインは、NK細胞またはマクロファージ上の活性化受容体、例えばCD16（CD16a）に特異的に結合する。いくつかの態様において、第2結合ドメインは腫瘍関連抗原に特異的に結合する。標的とする腫瘍関連抗原はがんタイプに基づいて選ぶことができ、これには、限定するわけではないが、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD52、CD56、CD70、CD74、CD140、EpCAM、CEA、gpA33、メソテリン、α-フェトプロテイン、ムチン、PDGFR-α、TAG-72、CAIX、PSMA、葉酸結合タンパク質、細胞分散因子受容体キナーゼ、ガングリオシド、サイトケライン、frizzled受容体、VEGF、VEGFR、インテグリンαVβ3、インテグリンα5β1、EGFR、EGFL7、ERBB2（HER2）、ERBB3、フィブロネクチン、HGF、HER3、LOXL2、MET、IGF1R、IGLF2、EPHA3、FR-α、ホスファチジルセリン、シンデカン1、SLAMF7（CD319）、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP、ビメンチン、またはテネイシンが含まれる。いくつかの態様において、第1結合ドメインはCD16に特異的に結合し、第2結合ドメインはCD30に特異的に結合する。

g-NK細胞および追加の作用物質は、逐次的にまたは同時に投与することができる。いくつかの態様において、追加の作用物質は、g-NK細胞の投与前に投与することができる。いくつかの態様において、追加の作用物質は、g-NK細胞の投与後に投与することができる。例えばg-NK細胞は、選択されたがんタイプに特異的な抗体と同時に投与することができる。あるいは、g-NK細胞は、選択されたがんタイプに特異的な抗体が投与される時とは異なる選択された時点で投与することができる。

特定の例では、g-NK細胞の集団の前、後または実質上同時に、有効量の抗体が、対象に投与される。いくつかの例では、約0.1mg/kg～約100mg/kg（例えば約0.5～10mg/kg、約1～20mg/kg、約10～50mg/kg、約20～100mg/kg、例えば約0.5mg/kg、約1mg/kg、約2mg/kg、約3mg/kg、約4mg/kg、約5mg/kg、約8mg/kg、約10mg/kg、約16mg/kg、約20mg/kg、約24mg/kg、約36mg/kg、約48mg/kg、約60mg/kg、約75mg/kg、または約100mg/kg）の抗体が、対象に投与される。熟練した臨床家は、特定の抗体、特定の疾患または状態（例えば腫瘍または他の障害）、対象の全身の状態、対象が受けているまたは対象が過去に受けていた任意の追加処置、および他の関連因子を考慮して、抗体の有効量を選択することができる。対象には、本明細書記載のg-NK細胞集団も投与される。抗体およびg-NK細胞集団は、典型的には非経口的に、例えば静脈内に投与されるが、腫瘍へのもしくは腫瘍近くへの注射もしくは注入（局所投与）または腹膜腔への投与も使用することができる。当業者は適当な投与経路を決定することができる。

いくつかの態様において、ウイルス処置の対象には、ウイルスに対する有効用量の1種または複数種の抗体が、本明細書記載のg-NK細胞の集団と共に投与される。いくつかの態様において、前記1種または複数種の抗体は、スパイク糖タンパク質、例えばSARS-Cov-2の糖タンパク質に特異的に結合する抗体である。いくつかの態様において、対象には、本明細書記載のg-NK細胞の集団が、有効用量のFc融合タンパク質、例えば組換えACE2-Fc融合タンパク質と共に投与される。いくつかの態様において、対象には、本明細書記載のg-NK細胞の集団と、ウイルスに対する抗体、例えばSARS-Cov-2に対する抗体を含有する血清とが投与される。いくつかの態様において、血清は、同じウイルスが引き起こす感染症から回復している患者から収集された回復期血清である。いくつかの態様では、同じウイルスが引き起こす感染症から回復している複数の患者から回復期血清を収集し、組み合わせ、本明細書記載のg-NK細胞の集団と共に、それを必要とする対象に投与する。

2. サイトカインまたは成長因子
本明細書に提供されるいくつかの態様において、g-NK細胞は、サイトカインおよび/または成長因子と組み合わせて個体に投与することができる。いくつかの態様によれば、前記少なくとも1種の成長因子は、SCF、FLT3、IL-2、IL-7、IL-15、IL-12、IL-21、およびIL-27からなる群より選択される成長因子を含む。特定の態様において、組換えIL-2が対象に投与される。他の特定の態様において、組換えIL-15が対象に投与される。他の特定の態様において、組換えIL-21が対象に投与される。いくつかの態様において、g-NK細胞およびサイトカインまたは成長因子は、逐次的に投与される。例えば、g-NK細胞を最初に投与し、次にサイトカインおよび/または成長因子を投与しうる。いくつかの態様において、g-NK細胞は、サイトカインまたは成長因子と同時に投与される。

いくつかの態様において、対象には、NK細胞の生残および/または成長をサポートするために、1種または複数種のサイトカイン（例えばIL-2、IL-15、IL-21、IL-27、および/またはIL-12）が投与される。サイトカインは、NK細胞の前、後、またはNK細胞と実質上同時に投与することができる。いくつかの例では、NK細胞の後に、サイトカインを投与することができる。一具体例では、NK細胞の投与から約1～8時間以内（例えば約1～4時間以内、約2～6時間以内、約4～6時間以内、または約5～8時間以内）に、サイトカインが対象に投与される。

3. 化学療法剤および集学的併用療法
いくつかの態様において、提供される方法は、g-NK細胞を、がん治療薬または処置とともに、例えば、化学療法剤または細胞毒性作用物質または他の処置とともに、投与する工程を含むこともできる。

いくつかの態様において、提供される方法は、g-NK細胞を、化学療法剤と組み合わせて個体に投与する工程を含むこともできる。いくつかの態様において、化学療法剤は、シクロホスファミド、フルダラビン、メチルプレドナゾン（methyl prednasone）を含みうる。いくつかの態様において、化学療法剤は、サリドマイド;シスプラチン（cis-DDP）、オキサリプラチン、カルボプラチン、アントラセンジオン、ミトキサントロン;ヒドロキシ尿素、メチルヒドラジン誘導体、プロカルバジン（N-メチルヒドラジン、MM）、副腎皮質抑制剤、ミトタン（.omicron.,.rho.'-DDD）、アミノグルテチミド、RXRアゴニスト、ベキサロテン、チロシンキナーゼ阻害剤、イマチニブ、メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン（L-サルコリシン）、クロラムブシル、エチレンイミン、メチルメラミン、ヘキサメチルメラミン、チオテパ、ブスルファン、カルムスチン（BCNU）、セムスチン（メチル-CCNTJ）、ロムスチン（CCNU）、ストレプトゾシン（ストレプトゾトシン）、DNA合成アンタゴニスト、エストラムスチンホスフェート、トリアジン、ダカルバジン（OTIC、ジメチル-トリアゼノイミダゾールカルボキサミド）、テモゾロミド、葉酸アナログ、メトトレキサート（アメトプテリン）、ピリミジンアナログ、フルオロウラシン（fiuorouracin）（5-フルオロウラシル、5-FU、5FTJ）、フロクスウリジン（フルオロデオキシウリジン（fluorodeox＞'uridine）、FUdR）、シタラビン（シトシンアラビノシド）、ゲムシタビン、プリンアナログ、メルカプトプリン（6-メルカプトプリン、6-MP）、チオグアニン（6-チオグアニン、TG）、ペントスタチン（2'-デオキシコホルマイシン、デオキシコホルマイシン）、クラドリビンおよびフルダラビン、トポイソメラーゼ阻害剤、アムサクリン、ビンカアルカロイド、ビンブラスチン（VLB）、ビンクリスチン、タキサン、パクリタキセル、nab-パクリタキセル、（Abraxane）、タンパク質結合型パクリタキセル（Abraxane（登録商標））、ドセタキセル（Taxotere（登録商標））;エピポドフィロトキシン、エトポシド、テニポシド、カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン、ダクチノマイシン（アクチノマイシンD）、ダウノルビシン（ダウノマイシン、ルビドマイシン）、ドキソルビシン、リポソームドキソルビシン（Doxil）、ブレオマイシン、マイトマイシン（マイトマイシンC）、イダルビシン、エピルビシン、ブセレリン、副腎皮質ステロイド、プレドニゾン、プロゲスチン、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、ジエチルスチルベストロール、エチニルエストラジオール、タモキシフェン、アナストロゾール;プロピオン酸テストステロン、フルオキシメステロン、フルタミド、ビカルタミド、およびロイプロリドからなる群より選択される。

いくつかの態様において、がん治療薬は細胞毒性作用物質、例えば細胞毒性低分子である。いくつかの態様において、がん治療薬は、免疫調節剤、Bcl2阻害剤、P13K阻害剤、低分子プロテアソーム阻害剤、低分子チロシン、低分子サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、アルキル化剤、代謝拮抗物質、アントラシリン（anthracyline）、抗腫瘍製抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、有糸分裂阻害剤、コルチコステロイド、または分化誘導剤（differentiating agent）である。

いくつかの態様において、がん治療薬は免疫調節剤である。いくつかの態様において、がん治療薬はサリドマイドまたはその誘導体である。例えば場合により、がん治療薬はレナリドミドまたはポマリドミドである。場合により、がん治療薬はレナリドミドである。

いくつかの態様において、がん治療薬はBcl-2阻害剤である。例えばがん治療薬はベネトクラクスであることができる。

いくつかの態様において、がん治療薬はP13K阻害剤である。例えばがん治療薬はイデライシブ（Idelaisib）である。

いくつかの態様において、がん治療薬は低分子チロシンである。例えばがん治療薬はメシル酸イマチニブであることができる。

いくつかの態様において、がん治療薬はサイクリン依存性キナーゼ阻害剤である。例えばがん治療薬はセキシクリブ（Sekiciclib）であることができる。

いくつかの態様において、がん治療薬はアルキル化剤である。アルキル化剤の例としては、アルトレタミン、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、ロムスチン、メルファラン、オキサリプラチン、テモゾロミドまたはチオテパが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。

いくつかの態様において、がん治療薬は代謝拮抗物質である。代謝拮抗物質は、RNAおよびDNAの通常のビルディングブロックに取って代わることによってDNAおよびRNAの伸長を妨害する。これらの作用物質は細胞の染色体が複写されている時期に細胞を損傷する。それらは、白血病、乳房、卵巣および腸管のがん、ならびに他のタイプのがんを処置するために、よく使用される。代謝拮抗物質の例としては、5-フルオロウラシル（5-FU）、6-メルカプトプリン（6-MP）、カペシタビン（Xeloda（登録商標））、シタラビン（Ara-C（登録商標））、フロクスウリジン、フルダラビン、ゲムシタビン（Gemzar（登録商標））、ヒドロキシ尿素、メトトレキサートまたはペメトレキセド（Alimta（登録商標））が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。

いくつかの態様において、がん治療薬はアントラサイクリン（antracycline）である。アントラサイクリン薬は、がん細胞内のDNAを伸長および増幅しないように変化させることによって作用する。アントラサイクリンは、細胞周期中のDNAの複写に関与する酵素を妨害する抗腫瘍性抗生物質である。それらはさまざまながんに広く使用されている。アントラサイクリン薬を投与する時の主たる懸念は、高用量で投与された場合に、それらが心臓を永続的に損傷しうることである。そのため、アントラサイクリン薬にはしばしば生涯用量限度（lifetime dose limit）が設けられる。場合により、FcεRIγ欠損NK細胞（G-NK）と併用投与すれば、これらの薬物の用量およびスケジュールを低減させることができる。提供される併用療法において使用することができるアントラサイクリン（antracycline）の例として、ダウノルビシン、ドキソルビシン（Adriamycin（登録商標））、エピルビシンまたはイダルビシンが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。

いくつかの態様において、がん治療薬は抗腫瘍性抗生物質である。抗腫瘍性抗生物質の例として、アクチノマイシン-D、ブレオマイシン、マイトマイシン-Cまたはミトキサントロンが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。

いくつかの態様において、がん治療薬はトポイソメラーゼ阻害剤である。トポイソメラーゼ薬は、DNAの鎖をそれらが複写されうるように分離するのを助けるトポイソメラーゼと呼ばれる酵素を妨害する。トポイソメラーゼ阻害剤は、それらが影響を及ぼす酵素のタイプに応じてグループ分けされる。トポイソメラーゼ阻害剤は、一定の白血病ならびに肺がん、卵巣がん、消化管がんおよび他のがんを処置するために使用される。トポイソメラーゼ阻害剤はトポイソメラーゼI阻害剤またはトポイソメラーゼII阻害剤でありうる。トポイソメラーゼI阻害剤の例として、トポテカンまたはイリノテカン（CPT-11）が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。トポイソメラーゼII阻害剤の例として、エトポシド（VP-16）、テニポシドまたはミトキサントロンが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。

いくつかの態様において、がん治療薬は有糸分裂阻害剤である。有糸分裂阻害剤は、細胞が分裂して新しい細胞を形成するのを停止することによって作用する化合物であるが、酵素が細胞の再産生に必要なタンパク質を作らないようにすることによって、あらゆる時期の細胞を損傷しうる。それらは、乳がんおよび肺がんを含む多種多様ながんタイプ、骨髄腫、リンパ腫および白血病を処置するために使用される。これらの薬物は神経損傷を引き起こしうるので、投与することができる量が制限されうる。場合により、FcεRIγ欠損NK細胞（G-NK）と併用投与すれば、これらの薬物の用量およびスケジュールを低減させることができる。有糸分裂阻害剤の非限定的な例として、ドセタキセル、エストラムスチン、イクサベピロン、パクリタキセル、ビンブラスチン、ビンクリスチンまたはビノレルビンが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。

いくつかの態様において、がん治療薬はコルチコステロイドである。コルチコステロイドは、単にステロイドと呼ばれることも多く、多くのがんタイプおよび他の病気の処置に有用な天然のホルモンおよびホルモン様薬物である。これらの薬物ががん処置の一部として使用される場合、それらは化学治療薬と見なされる。コルチコステロイドの非限定的な例として、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン（Solumedrol（登録商標））またはデキサメタゾン（Decadron（登録商標））が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。

いくつかの態様において、がん治療薬は分化誘導因子である。分化誘導因子の非限定的な例として、レチノイド、トレチノイン（ATRAまたはAtralin（登録商標））、ベキサロテン（Targretin（登録商標））または三酸化ヒ素（Arsenox（登録商標））が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。

いくつかの態様において、がん治療薬は、シスプラチン、カルボプラチン、およびオキサリプラチンからなる群より選択される。一定の態様において、がん治療薬は、パクリタキセル、Abraxane（登録商標）、およびTaxotere（登録商標）からなる群より選択される。一態様では、化学療法剤は、アスパラギナーゼ、ベバシズマブ、ブレオマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、5-フルオロウラシル、ヒドロキシ尿素、ストレプトゾシン、および6-メルカプトプリン、シクロホスファミド、パクリタキセル、およびゲムシタビンからなる群より選択される。

g-NK細胞と併用されるがん治療薬の他の非限定的な例として、エベロリムス（Afinitor（登録商標））、トレミフェン（Fareston（登録商標））、フルベストラント（Faslodex（登録商標））、アナストロゾール（Arimidex（登録商標））、エクセメスタン（Aromasin（登録商標））、ラパチニブ（Tykerb（登録商標））、レトロゾール（Femara（登録商標））、ペルツズマブ（Perjeta（登録商標））、ado-トラスツズマブエムタンシン（Kadcyla（登録商標））、パルボシクリブ（Ibrance（登録商標））、リボシクリブ（Kisqali（登録商標））、Ziv-アフリベルセプト（Zaltrap（登録商標））、レゴラフェニブ（Stivarga（登録商標））、ランレオチド酢酸塩（Somatuline（登録商標）デポ）、ソラフェニブ（Nexavar（登録商標））、スニチニブ（Sutent（登録商標））、パゾパニブ（Votrient（登録商標））、テムシロリムス（Torisel（登録商標））、アキシチニブ（Inlyta（登録商標））、カボザンチニブ（Cabometyx（商標））、メシル酸レンバチニブ（Lenvima（登録商標））、メシル酸イマチニブ（Gleevec（登録商標））、ダサチニブ（Sprycel（登録商標））、ニロチニブ（Tasigna（登録商標））、ボスチニブ（Bosulif（登録商標））、トレチノイン（Vesanoid（登録商標））、イブルチニブ（Imbruvica（登録商標））、イデラリシブ（Zydelig（登録商標））、ベネトクラクス（Venclexta（商標））、ポナチニブ塩酸塩（Iclusig（登録商標））、ミドスタウリン（Rydapt（登録商標））、クリゾチニブ（Xalkori（登録商標））、エルロチニブ（Tarceva（登録商標））、ゲフィチニブ（Iressa（登録商標））、アファチニブジマレイン酸塩（Gilotrif（登録商標））、セリチニブ（LDK378/Zykadia（商標））、オシメルチニブ（Tagrisso（商標））、アレクチニブ（Alecensa（登録商標））、ブリガチニブ（Alunbrig（商標））、サイラムザ、デニロイキンジフチトクス（Ontak（登録商標））、ボリノスタット（Zolinza（登録商標））、ロミデプシン（Istodax（登録商標））、ベキサロテン（Targretin（登録商標））、ボルテゾミブ（Velcade（登録商標））、プララトレキサート（Folotyn（登録商標））、イデラリシブ（Zydelig（登録商標））、ベリノスタット（Beleodaq（登録商標））、ベンダムスチン、カーフィルゾミブ（Kyphosis（登録商標））、パノビノスタット（Farydak（登録商標））、イキサゾミブクエン酸エステル（Ninlaro（登録商標））、オラパリブ（Lynparza（商標））、ルカパリブカンシル酸塩（Rubraca（商標））、ニラパリブトシル酸塩一水和物（Zejula（商標））、ビノレルビン（Navelbine（登録商標））、エルロチニブ（Tarceva（登録商標））、スニチニブ（Sutent（登録商標））、ビスモデギブ（Erivedge（登録商標））、ソニデギブ（Odomzo（登録商標））、ベムラフェニブ（Zelboraf（登録商標））、トラメチニブ（Mekinist（登録商標））、ダブラフェニブ（Tafinlar（登録商標））、コビメチニブ（Cotellic（商標））、アリトレチノイン（Panretin（登録商標））、パゾパニブ（Votrient（登録商標））、アリトレチノイン（Panretin（登録商標））、トラベクテジン（Yondelis（登録商標））またはエリブリン（Halaven（登録商標））が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。

いくつかの態様において、g-NK細胞を含有する組成物は放射線療法と共に投与される。

いくつかの態様において、併用療法は、本明細書において提供されるg-NK細胞を含有する組成物、抗体、例えば上述のいずれか、および細胞毒性低分子または細胞毒性放射線療法の組み合わせを伴う集学的がん療法である。いくつかの態様において、細胞毒性低分子または放射線療法は、対象には別途、例えばg-NK細胞を含有する組成物の投与前または投与後に、投与される。いくつかの態様において、細胞毒性低分子または放射線療法は、g-NK細胞を含有する組成物と並行して、例えば同時に、またはほぼ同時に、対象に投与される。場合によっては、集学的がん療法は、さらなるサイトカインサポートを提供するための1つまたは複数のサイトカインまたは成長因子、例えばIL-2またはIL-15の投与を、さらに含むことができる。

集学的がん療法は2種以上の処置方法を組み合わせた療法である。集学的療法は併用療法とも呼ばれる。さまざまながんに対して、異なる有効なモダリティを利用することができる。腫瘍の相違するバイオロジーとさまざまなモダリティの効力によって、それぞれに対する具体的アプローチが決定されうる。抗体ベースの療法は、がんおよび他の適応症の処置に頻繁に使用されるようになった。抗体療法に対する応答は、腫瘍細胞に対するこれらの抗体の直接的阻害効果に焦点があてられてきたが、これらの抗体は宿主の免疫系に対する効果を有することも示されている。FcεRIγ欠損NK細胞（G-NK）は、抗体のFc受容体（CD16）に結合した時にADCCを媒介する免疫エフェクター細胞である。提供される態様は、抗体療法の効力が、低分子および/または放射線療法の追加に加えてFcεRIγ欠損NK細胞（G-NK）と併用した場合に改良されるように設計されている。

いくつかの態様において、胃または胃食道接合部の腺癌の集学的処置は、（1）トラスツズマブ（Herceptin（登録商標））またはラムシルマブ（Cyramza（登録商標））であるモノクローナル抗体および（2）放射線療法、カペシタビンまたはシスプラチンであるがん治療薬または細胞毒性作用物質と組み合わされた、本明細書において提供されるg-NK細胞の組成物の投与を含む。特定の態様において、胃または胃食道接合部の腺癌の集学的処置は、トラスツズマブ（Herceptin（登録商標））＋シスプラチンと組み合わされた、本明細書において提供されるg-NK細胞の組成物の投与を含む。

いくつかの態様において、膀胱がんの集学的処置は、（1）アテゾリズマブ（Tecentriq（商標））、ニボルマブ（Opdivo（登録商標））、デュルバルマブ（Imfinzi（商標））、アベルマブ（Bavencio（登録商標））またはペンブロリズマブ（Keytruda（登録商標））であるモノクローナル抗体、および（2）放射線療法またはシスプラチン＋フルオロウラシルであるがん治療薬または細胞毒性作用物質と組み合わされた、本明細書において提供されるg-NK細胞の組成物の投与を含む。特定の態様において、膀胱がんの集学的処置は、アテゾリズマブ（Tecentriq（商標））＋シスプラチン＋5-FUと組み合わされた、本明細書において提供されるg-NK細胞の組成物の投与を含む。

いくつかの態様において、脳のがんの集学的処置は、（1）ベバシズマブ（Avastin（登録商標））であるモノクローナル抗体、および（2）エベロリムス（Afinitor（登録商標））、放射線療法、カルボプラチン、エトポシドまたはテモゾロミドであるがん治療薬または細胞毒性作用物質と組み合わされた、本明細書において提供されるg-NK細胞の組成物の投与を含む。特定の態様において、脳のがんの集学的処置は、ベバシズマブ（Avastin（登録商標））＋放射線療法と組み合わされた、本明細書において提供されるg-NK細胞の組成物の投与を含む。

いくつかの態様において、乳がんの集学的処置は、（1）トラスツズマブ（Herceptin（登録商標））であるモノクローナル抗体、および（2）タモキシフェン（Nolvadex）、トレミフェン（Fareston（登録商標））、エベロリムス（Afinitor（登録商標））、フルベストラント（Faslodex（登録商標））、アナストロゾール（Arimidex（登録商標））、エクセメスタン（Aromasin（登録商標））、ラパチニブ（Tykerb（登録商標））、レトロゾール（Femara（登録商標））、ペルツズマブ（Perjeta（登録商標））、ado-トラスツズマブエムタンシン（Kadcyla（登録商標））、パルボシクリブ（Ibrance（登録商標））、リボシクリブ（Kisqali（登録商標））、シスプラチン/パラプラチン、パクリタキセル、ドキソルビシンまたは放射線療法であるがん治療薬もしくは細胞毒性作用物質と組み合わされた、本明細書において提供されるg-NK細胞の組成物の投与を含む。特定の態様において、乳がんの集学的処置は、トラスツズマブ（Herceptin（登録商標））＋シスプラチンと組み合わされた、本明細書において提供されるg-NK細胞の組成物の投与を含む。

いくつかの態様において、結腸直腸がんの集学的処置は、（1）セツキシマブ（Erbitux（登録商標））、パニツムマブ（Vectibix（登録商標））、ベバシズマブ（Avastin（登録商標））またはラムシルマブ（Cyramza（登録商標））であるモノクローナル抗体、および（2）Ziv-アフリベルセプト（Zaltrap（登録商標））、レゴラフェニブ（Stivarga（登録商標））、放射線療法、5-フルオロウラシル（5-FU）、カペシタビン、イリノテカンまたはオキサリプラチンであるがん治療薬または細胞毒性作用物質と組み合わされた、本明細書において提供されるg-NK細胞の組成物の投与を含む。特定の態様において、結腸直腸がんの集学的処置は、セツキシマブ（Erbitux（登録商標））＋オキサリプラチンと組み合わされた、本明細書において提供されるg-NK細胞の組成物の投与を含む。

いくつかの態様において、内分泌/神経内分泌腫瘍の集学的処置は、（1）アベルマブ（Bavencio（登録商標））であるモノクローナル抗体、および（2）ランレオチド酢酸塩（Somatuline（登録商標）デポ）であるがん治療薬または細胞毒性作用物質と組み合わされた、本明細書において提供されるg-NK細胞の組成物の投与を含む。特定の態様において、内分泌/神経内分泌腫瘍の集学的処置は、アベルマブ（Bavencio（登録商標））＋オキサリプラチンと組み合わされた、本明細書において提供されるg-NK細胞の組成物の投与を含む。

いくつかの態様において、頭頸部がんの集学的処置は、（1）セツキシマブ（Erbitux（登録商標））、ペンブロリズマブ（Keytruda（登録商標））、ニボルマブ（Opdivo（登録商標））、トラスツズマブまたはラムシルマブであるモノクローナル抗体、および（2）放射線療法、カルボプラチン、シスプラチン、カペシタビン、イリノテカン、5-フルオロウラシルまたはパクリタキセルであるがん治療薬または細胞毒性作用物質と組み合わされた、本明細書において提供されるg-NK細胞の組成物の投与を含む。特定の態様において、頭頸部がんの集学的処置は、セツキシマブ（Erbitux（登録商標））＋シスプラチンと組み合わされた、本明細書において提供されるg-NK細胞の組成物の投与を含む。

いくつかの態様において、骨巨細胞腫の集学的処置は、（1）デノスマブ（Xgeva（登録商標））であるモノクローナル抗体、および（2）放射線療法、ドキソルビシン、シスプラチン、エトポシド、シクロホスファミドまたはメトトレキサートであるがん治療薬または細胞毒性作用物質と組み合わされた、本明細書において提供されるg-NK細胞の組成物の投与を含む。特定の態様において、骨巨細胞腫の集学的処置は、デノスマブ（Xgeva（登録商標））＋ドキソルビシンと組み合わされた、本明細書において提供されるg-NK細胞の組成物の投与を含む。

いくつかの態様において、腎がんの集学的処置は、（1）ベバシズマブ（Avastin（登録商標））またはニボルマブ（Opdivo（登録商標））であるモノクローナル抗体、および（2）ソラフェニブ（Nexavar（登録商標））、スニチニブ（Sutent（登録商標））、パゾパニブ（Votrient（登録商標））、テムシロリムス（Torisel（登録商標））、エベロリムス（Afinitor（登録商標））、アキシチニブ（Inlyta（登録商標））、カボザンチニブ（Cabometyx（商標）メシル酸レンバチニブ（Lenvima（登録商標））、ビンブラスチン、5-フルオロウラシル（5-FU）、カペシタビンまたはゲムシタビンであるがん治療薬または細胞毒性作用物質と組み合わされた、本明細書において提供されるg-NK細胞の組成物の投与を含む。特定の態様において、腎がんの集学的処置は、ベバシズマブ（Avastin（登録商標））＋ソラフェニブ（Nexavar（登録商標））と組み合わされた、本明細書において提供されるg-NK細胞の組成物の投与を含む。

いくつかの態様において、白血病の集学的処置は、（1）リツキシマブ（Rituxan（登録商標））、アレムツズマブ（Campath（登録商標））、オファツムマブ（Arzerra（登録商標））、オビヌツズマブ（Gazyva（登録商標））またはブリナツモマブ（Blincyto（登録商標））であるモノクローナル抗体、および（2）メシル酸イマチニブ（Gleevec（登録商標））、ダサチニブ（Sprycel（登録商標））、ニロチニブ（Tasigna（登録商標））、ボスチニブ（Bosulif（登録商標））、トレチノイン（Vesanoid（登録商標））、イブルチニブ（Imbruvica（登録商標））、イデラリシブ（Zydelig（登録商標））、ベネトクラクス（Venclexta（商標））、ポナチニブ塩酸塩（Iclusig（登録商標））、ミドスタウリン（Rydapt（登録商標））、メトトレキサート、シタラビン、ビンクリスチン、ドキソルビシン、ダウノルビシンまたはシクロホスファミドであるがん治療薬または細胞毒性作用物質と組み合わされた、本明細書において提供されるg-NK細胞の組成物の投与を含む。特定の態様において、白血病の集学的処置は、リツキシマブ（Rituxan（登録商標））＋シクロホスファミドと組み合わされた、本明細書において提供されるg-NK細胞の組成物の投与を含む。

いくつかの態様において、肺がんの集学的処置は、（1）ベバシズマブ（Avastin（登録商標））、ラムシルマブ（Cyramza（登録商標））、ニボルマブ（Opdivo（登録商標））、ネシツムマブ（Portrazza（商標））、ペンブロリズマブ（Keytruda（登録商標））、アテゾリズマブ（Tecentriq（商標））であるモノクローナル抗体、および（2）クリゾチニブ（Xalkori（登録商標））、エルロチニブ（Tarceva（登録商標））、ゲフィチニブ（Iressa（登録商標））、アファチニブジマレイン酸塩（Gilotrif（登録商標））、セリチニブ（LDK378/Zykadia（商標））、オシメルチニブ（Tagrisso（商標））、アレクチニブ（Alecensa（登録商標））、ブリガチニブ（Alunbrig（商標））、サイラムザ、放射線療法、シスプラチン、カルボプラチン、パクリタキセル（Taxol）、nab-パクリタキセル、Abraxane）、ドセタキセル（Taxotere）、ゲムシタビン（Gemzar）、ビノレルビン（Navelbine）、イリノテカン（Camptosar）、エトポシド（VP-16）、ビンブラスチンまたはペメトレキセド（Alimta）であるがん治療薬または細胞毒性作用物質と組み合わされた、本明細書において提供されるg-NK細胞の組成物の投与を含む。特定の態様において、肺がんの集学的処置は、ネシツムマブ（Portrazza（商標））＋カルボプラチンと組み合わされた、本明細書において提供されるg-NK細胞の組成物の投与を含む。

いくつかの態様において、リンパ腫の集学的処置は、（1）イブリツモマブチウキセタン（Zevalin（登録商標））、ブレンツキシマブベドチン（Adcetris（登録商標））、リツキシマブ（Rituxan（登録商標））、シルツキシマブ（Sylvant（登録商標））、オビヌツズマブ（Gazyva（登録商標））、ニボルマブ（Opdivo（登録商標））またはペンブロリズマブ（Keytruda（登録商標））であるモノクローナル抗体、および（2）デニロイキンジフチトクス（Ontak（登録商標））、ボリノスタット（Zolinza（登録商標））、ロミデプシン（Istodax（登録商標））、ベキサロテン（Targretin（登録商標））、ボルテゾミブ（Velcade（登録商標））、プララトレキサート（Folotyn（登録商標））、イブルチニブ（Imbruvica（登録商標））、イデラリシブ（Zydelig（登録商標））、ベリノスタット（Beleodaq（登録商標））、シクロホスファミド、クロラムブシル、ベンダムスチン、イホスファミド、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、フルダラビン、ゲムシタビン、メトトレキサート、ドキソルビシン、ビンクリスチンまたはエトポシド（VP-16）であるがん治療薬または細胞毒性作用物質と組み合わされた、本明細書において提供されるg-NK細胞の組成物の投与を含む。特定の態様において、リンパ腫の集学的処置は、リツキシマブ（Rituxan（登録商標））＋シクロホスファミドと組み合わされた、本明細書において提供されるg-NK細胞の組成物の投与を含む。

いくつかの態様において、多発性骨髄腫の集学的処置は、（1）ボルテゾミブ（Velcade（登録商標））、ダラツムマブ（Darzalex（商標））またはエロツズマブ（Empliciti（商標））であるモノクローナル抗体、および（2）カーフィルゾミブ（Kyphosis（登録商標））、パノビノスタット（Farydak（登録商標））、イキサゾミブクエン酸エステル（Ninlaro（登録商標））、メルファラン、ビンクリスチン（Oncovin）、シクロホスファミド（Cytoxan）、エトポシド（VP-16）、ドキソルビシン（Adriamycin）、リポソームドキソルビシン（Doxil）、ベンダムスチン（Treanda）であるがん治療薬または細胞毒性作用物質と組み合わされた、本明細書において提供されるg-NK細胞の組成物の投与を含む。特定の態様において、多発性骨髄腫の集学的処置は、ダラツムマブ（Darzalex（商標））＋シクロホスファミドと組み合わされた、本明細書において提供されるg-NK細胞の組成物の投与を含む。

いくつかの態様において、神経芽細胞腫の集学的処置は、（1）ジヌツキシマブ（Unituxin（商標））であるモノクローナル抗体、および（2）放射線療法、シクロホスファミド、シスプラチンまたはカルボプラチン、ビンクリスチン、ドキソルビシン（Adriamycin）、エトポシド、トポテカン、ブスルファンまたはチオテパであるがん治療薬または細胞毒性作用物質と組み合わされた、本明細書において提供されるg-NK細胞の組成物の投与を含む。特定の態様において、神経芽細胞腫の集学的処置は、ジヌツキシマブ（Unituxin（商標））＋ドキソルビシン（Adriamycin）と組み合わされた、本明細書において提供されるg-NK細胞の組成物の投与を含む。

いくつかの態様において、卵巣上皮/卵管/原発性腹膜がんの集学的処置は、（1）ベバシズマブ（Avastin（登録商標））であるモノクローナル抗体、および（2）オラパリブ（Lynparza（商標））、ルカパリブカンシル酸塩（Rubraca（商標））、ニラパリブトシル酸塩一水和物（Zejula（商標））、シスプラチン、カルボプラチン、パクリタキセル（Taxol（登録商標））、ドセタキセル（Taxotere（登録商標））、カペシタビン（Xeloda（登録商標））、シクロホスファミド（Cytoxan（登録商標））、エトポシド（VP-16）、ゲムシタビン（Gemzar（登録商標））、イホスファミド（Ifex（登録商標））、イリノテカン（CPT-11、Camptosar（登録商標））、リポソームドキソルビシン（Doxil（登録商標））、メルファラン、ペメトレキセド（Alimta（登録商標））、トポテカンまたはビノレルビン（Navelbine（登録商標））であるがん治療薬または細胞毒性作用物質と組み合わされた、本明細書において提供されるg-NK細胞の組成物の投与を含む。特定の態様において、卵巣上皮/卵管/原発性腹膜がんの集学的処置は、ベバシズマブ（Avastin（登録商標））＋パクリタキセル（Taxol（登録商標））と組み合わされた、本明細書において提供されるg-NK細胞の組成物の投与を含む。

いくつかの態様において、膵がんの集学的処置は、（1）セツキシマブ（Erbitux（登録商標））またはベバシズマブ（Avastin（登録商標））であるモノクローナル抗体、および（2）エルロチニブ（Tarceva（登録商標））、エベロリムス（Afinitor（登録商標））、スニチニブ（Sutent（登録商標））、ゲムシタビン（Gemzar）、5-フルオロウラシル（5-FU）、オキサリプラチン（Eloxatin）、アルブミン結合型パクリタキセル（Abraxane）、カペシタビン（Xeloda）、シスプラチン、イリノテカン（Camptosar）、パクリタキセル（Taxol）、ドセタキセル（Taxotere）またはアルブミン結合型パクリタキセル（Abraxane）であるがん治療薬または細胞毒性作用物質と組み合わされた、本明細書において提供されるg-NK細胞の組成物の投与を含む。特定の態様において、膵がんの集学的処置は、エルロチニブ（Tarceva（登録商標））＋オキサリプラチン（Eloxatin）と組み合わされた、本明細書において提供されるg-NK細胞の組成物の投与を含む。

いくつかの態様において、皮膚がんの集学的処置は、（1）イピリムマブ（Yervoy（登録商標））、ペンブロリズマブ（Keytruda（登録商標））、アベルマブ（Bavencio（登録商標））またはニボルマブ（Opdivo（登録商標））であるモノクローナル抗体、および（2）ビスモデギブ（Erivedge（登録商標））、ソニデギブ（Odomzo（登録商標））、ベムラフェニブ（Zelboraf（登録商標））、トラメチニブ（Mekinist（登録商標））、ダブラフェニブ（Tafinlar（登録商標））、コビメチニブ（Cotellic（商標））、アリトレチノイン（Panretin（登録商標））、放射線療法、ダカルバジン、テモゾロミド、Nab-パクリタキセル、パクリタキセル、シスプラチン、カルボプラチンまたはビンブラスチンであるがん治療薬または細胞毒性作用物質と組み合わされた、本明細書において提供されるg-NK細胞の組成物の投与を含む。特定の態様において、皮膚がんの集学的処置は、アベルマブ（Bavencio（登録商標））＋シスプラチンと組み合わされた、本明細書において提供されるg-NK細胞の組成物の投与を含む。

いくつかの態様において、軟部組織肉腫の集学的処置は、（1）オララツマブ（Lartruvo（商標））であるモノクローナル抗体、および（2）パゾパニブ（Votrient（登録商標））、アリトレチノイン（Panretin（登録商標））、放射線療法、イホスファミド（Ifex（登録商標））、ドキソルビシン（Adriamycin（登録商標））、ダカルバジン、エピルビシン、テモゾロミド（Temodar（登録商標））、ドセタキセル（Taxotere（登録商標））、ゲムシタビン（Gemzar（登録商標））、ビノレルビン（Navelbine（登録商標））、トラベクテジン（Yondelis（登録商標））またはエリブリン（Halaven（登録商標））であるがん治療薬または細胞毒性作用物質と組み合わされた、本明細書において提供されるg-NK細胞の組成物の投与を含む。特定の態様において、軟部組織肉腫の集学的処置は、オララツマブ（Lartruvo（商標））＋ドセタキセル（Taxotere（登録商標））と組み合わされた、本明細書において提供されるg-NK細胞の組成物の投与を含む。

4. 腫瘍溶解性ウイルス
いくつかの態様において、提供される方法は、g-NK細胞を腫瘍溶解性ウイルスと共に投与する工程も含むことができる。g-NK細胞と腫瘍溶解性ウイルスとの併用処置は、上述の1つまたは複数の他の作用物質、例えば抗体の投与を、さらに含むことができる。

g-NK細胞と腫瘍溶解性ウイルスとの組み合わせは、療法の一方または両方の活性を助長しまたは増加させうると考えられる。いくつかの態様において、腫瘍溶解性ウイルスの使用は、NK細胞に対する腫瘍細胞の感受性を増強しうる。腫瘍溶解性ウイルスが、転移性黒色腫、卵巣がんおよび乳がんモデルにおいて、NK細胞を活性化し（↑IFN-γ）、腫瘍へのNK細胞遊走を増強することを示す証拠は、腫瘍溶解性ウイルス療法から得られている（Miller et al.,2003 Mol Ther 7:741:747、Benencia et al.,2005 Mol Ther 12:789-802、Zhao et al.,2014 PLoS One 9:e93103）。第一相臨床試験において、腫瘍溶解性レオウイルスはNK細胞の循環レベルを増加させることが見いだされ（White et al.,2008 Gene Ther 15:911-920）、NK細胞は、前立腺がんおよびA549肺がんの動物モデルにおいて、腫瘍溶解性レオウイルスおよびパラポックスウイルスの抗腫瘍効力を媒介することが見いだされた（Gujar et al.,2011 Mol Ther 19:797-804、Rintoul et al.,2012 Mol. Ther. 20:1148-1157）。NK細胞による腫瘍浸潤の増加は、腺癌および膠芽腫の動物モデルにおいて、腫瘍溶解性のコクサッキーウイルスおよび麻疹ウイルスでも観察され、NK細胞の腫瘍内濃度は生存率と正に相関した（Miyamoto et al.,2012 Cancer Res. 72:2609-2621、Allen et al.,2006 Cancer res. 66:11840-11850）。腫瘍溶解性ウイルス活性を腫瘍細胞のNK細胞媒介クリアランスに結びつける機序は、増強された腫瘍免疫原性である。具体的に述べると、腫瘍溶解性ウイルスに感染した腫瘍は、NK細胞によってより容易に認識され、殺傷されることが、自然細胞傷害性受容体NKp30およびNKp44によって媒介される細胞傷害性の増加、ならびに細胞傷害性サイトカインIFN-γ、TNF-αおよびMIP1α/βの増強された発現によって証明された（Bhat et al.,2011 Int J Cancer 128:908-919、Dempe et al.,2012 Cancer Immunol Res 61:2113-2123、Bhat et al.,2013 BMC Cancer 13:367）。インビボでNK細胞を誘引し活性化することが示されている他の腫瘍溶解性ウイルスには、インフルエンザウイルス（Ogbomo et al.,2010 Med Microbiol Immunol 199:93-101）、水疱性口内炎ウイルス（Heiber et al.,2011 J Virol. 85:10440-10450）およびニューカッスル病ウイルス（Jarahian et al.,2009 J Virol. 83:810-821）がある。術後がん外科手術患者の研究において、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、術後免疫抑制を反転させ、転移形成を防止することが見いだされた（Tai et al.,2014 Front Oncol 4:217）。したがって腫瘍溶解性ウイルスは、本来であれば免疫無防備状態の個体において、NK細胞の抗腫瘍免疫を増強することができると考えられる。

いくつかの態様において、腫瘍溶解性ウイルスは、特定の細胞、例えば免疫細胞を標的とする。いくつかの態様において、腫瘍溶解性ウイルスは、対象における腫瘍細胞および/またはがん細胞を標的とする。腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍細胞に蓄積し腫瘍細胞内で複製するウイルスである。細胞内での複製により、腫瘍細胞は溶解され、腫瘍は縮小し、排除されうる。腫瘍溶解性ウイルスは、広い宿主域および細胞タイプ域も有することができる。例えば腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍および/または転移巣を含む免疫特権細胞または免疫特権組織、ならびに創傷組織および創傷細胞に蓄積して、広範な細胞タイプにおける異種タンパク質の送達および発現を可能にすることができる。腫瘍溶解性ウイルスは腫瘍細胞特異的に複製して、腫瘍細胞の溶解と効率のよい腫瘍退縮をもたらすこともできる。

例示的な腫瘍溶解性ウイルスとして、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス、レオウイルス、ニューカッスル病ウイルス、パルボウイルス、麻疹ウイルス、水疱性口内炎ウイルス（VSV）、コクサッキーウイルスおよびワクシニアウイルスが挙げられる。いくつかの態様において、腫瘍溶解性ウイルスは、固形腫瘍に特異的にコロニー形成し、他の器官には感染しない。場合により、腫瘍溶解性ウイルスは、異種タンパク質核酸を固形腫瘍に送達するための感染性因子として使用することができる。

腫瘍溶解性ウイルスは当業者に公知であるもののいずれであってもよく、例えば水疱性口内炎ウイルス、例えば米国特許第7,731,974号、同第7,153,510号、同第6,653,103号および米国特許出願公開第2010/0178684号、同第2010/0172877号、同第2010/0113567号、同第2007/0098743号、同第20050260601号、同第20050220818号および欧州特許第1385466号、同第1606411号および同第1520175号参照;単純ヘルペスウイルス、例えば米国特許第7,897,146号、同第7,731,952号、同第7,550,296号、同第7,537,924号、同第6,723,316号、同第6,428,968号および米国特許出願公開第2014/0154216号、同第2011/0177032号、同第2011/0158948号、同第2010/0092515号、同第2009/0274728号、同第2009/0285860号、同第2009/0215147号、同第2009/0010889号、同第2007/0110720号、同第2006/0039894号、同第2004/0009604号、同第2004/0063094号、国際特許公開番号WO 2007/052029、同WO 1999/038955参照;レトロウイルス、例えば米国特許第6,689,871号、同第6,635,472号、同第5,851,529号、同第5,716,826号、同第5,716,613号および米国特許出願公開第20110212530号参照;ワクシニアウイルス、例えば2016/0339066参照、ならびにアデノ随伴ウイルス、例えば米国特許第8,007,780号、同第7,968,340号、同第7,943,374号、同第7,906,111号、同第7,927,585号、同第7,811,814号、同第7,662,627号、同第7,241,447号、同第7,238,526号、同第7,172,893号、同第7,033,826号、同第7,001,765号、同第6,897,045号および同第6,632,670号参照が挙げられる。

腫瘍溶解性ウイルスとしては、それぞれのビルレンスを減弱し、安全性プロファイルを改良し、腫瘍特異性を増強するために遺伝子改変されたウイルスも挙げられ、それらは、ウイルスの総合的効力を改良するために細胞毒、サイトカイン、プロドラッグ変換酵素などの追加遺伝子も装備している（例えばKirn et al.,（2009）Nat Rev Cancer 9:64-71、Garcia-Aragoncillo et al.,（2010）Curr Opin Mol Ther 12:403-411、米国特許第7,588,767号、同第7,588,771号、同第7,662,398号および同第7,754,221号、ならびに米国特許出願公開第2007/0202572号、同第2007/0212727号、同第2010/0062016号、同第2009/0098529号、同第2009/0053244号、同第2009/0155287号、同第2009/0117034号、同第2010/0233078号、同第2009/0162288号、同第2010/0196325号、同第2009/0136917号および同第2011/0064650号参照）。いくつかの態様において、腫瘍溶解性ウイルスは、癌性細胞内で選択的に複製し、よって腫瘍溶解性になるように改変されたものであることができる。例えば、腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍療法用に、また遺伝子療法ベクターとして、改良された指向性を有するように操作されたアデノウイルスである。ONYX-015、H101およびAd5ΔCR（Hallden and Portella（2012）Expert Opin Ther Targets,16:945-58）およびTNFerade（McLoughlin et al.（2005）Ann. Surg. Oncol.,12:825-30）または条件複製型（conditionally replicative）アデノウイルスOncorine（登録商標）は、それらの例である。

いくつかの態様において、腫瘍溶解性ウイルスは改変単純ヘルペスウイルスである。いくつかの態様において、腫瘍溶解性ウイルスは、タリモジンラヘルパレプベク（Talimogene laherparepvec）（T-Vec、ImlygicまたはOnco Vex GM-CSFとしても公知である）である。いくつかの態様において、感染性因子は、例えばWO 2007/052029、WO 1999/038955、US 2004/0063094、US 2014/0154216に記載の改変単純ヘルペスウイルス、またはその変異体である。

V. キットおよび製造品
特定のサブセット、例えばg-NK細胞について濃縮されたNK細胞を含有する提供される組成物を含む製造品およびキットが、本明細書において提供される。いくつかの態様において、組成物は、提供される方法のいずれかによって産生される。いくつかの態様において、キットは、提供される組成物のいずれかと、その組成物を単独療法として投与することに関する説明書とを含む。いくつかの態様では、提供される組成物のいずれかと追加の作用物質とを含むキットが、本明細書において提供される。いくつかの態様において、追加の作用物質は、ウイルスに対する抗体を含む血清、例えば回復期血清である。いくつかの態様において、追加の作用物質はFcドメインを含む。いくつかの態様において、追加の作用物質はFc融合タンパク質または抗体である。いくつかの態様において、追加の作用物質はヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体である。これらの態様の一部において、追加の作用物質は完全長抗体である。例示的な抗体としては記載の抗体がどれでも挙げられる。

g-NK代用表面マーカープロファイル、例えば本明細書に記載するものを検出するための複数の試薬を含む製造品またはキットも、本明細書において提供される。いくつかの態様において、試薬は、CD16、CD38、CD57、CD7、CD161、NKG2Cおよび/またはNKG2Aから選択される表面マーカーのパネル、例えば2、3、4または5種の表面マーカーを検出するための試薬を含む。いくつかの態様において、試薬は、CD16、CD57、CD7およびCD161を含む表面マーカーのパネルを検出するための試薬を含む。いくつかの態様において、試薬は、CD161およびNKG2Aを含む表面マーカーのパネルを検出するための試薬を含む。

いくつかの態様において、キットは、1種または複数種の他のNK細胞表面マーカーを検出するための1つまたは複数の追加試薬を、さらに含むことができる。例えばキットは、1種または複数種のさらなる表面マーカーCD45、CD3および/またはCD56を検出するための1つまたは複数の追加試薬、例えば1、2または3つの追加試薬を含むことができる。いくつかの態様において、試薬は、CD3、CD56およびCD38を含む表面マーカーのパネルを検出するための試薬を含む。いくつかの態様において、試薬のそれぞれは、パネルの特異的表面マーカーを検出するための結合分子である。

特定の態様において、試薬は、パネルの1種または複数種の表面マーカーに特異的な抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。場合により、抗体または抗原結合フラグメントなどの結合分子は、検出可能な部分に直接的または間接的にコンジュゲートすることができる。いくつかの例において、抗体のうちの1つまたは複数は、結合の検出が可能になるように改変される。例えば抗体は、直接的検出または二次作用物質を介した検出を可能にする検出可能な分子にコンジュゲートすることができる。いくつかの態様において、抗体は、例えば発蛍光団で、直接標識される。いくつかの例において、抗体は、二次試薬、例えば一次抗体に結合する二次抗体試薬であって、検出可能なタンパク質、例えば蛍光プローブまたは検出可能な酵素、例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼにカップリングされているものを使って検出することができる。いくつかのそのような例において、キットは二次抗体をさらに含むことができる。

キットは、任意で、1つまたは複数の構成要素、例えば使用説明書、デバイスおよびさらなる試薬（組成物を希釈しおよび/または凍結乾燥タンパク質を再構成するための滅菌水または食塩水）、ならびに本方法を実施するためのチューブ、容器およびシリンジなどの構成要素を含むことができる。いくつかの態様において、キットは、試料の収集、試料の調製および処理のための試薬、および/または試料中の1種もしくは複数種の表面マーカーの量を定量するための試薬、例えば限定するわけではないが、抗体などの検出試薬、緩衝液、酵素的染色のための基質、発色原、またはスライド、容器、マイクロタイタープレーなどの他の材料、および任意で本方法を実施するための説明書を、さらに含むことができる。当業者には、提供される方法に従って使用することができる数多くの他の考えうる容器およびプレートおよび試薬がわかると考えられる。

いくつかの態様において、キットは、細胞、抗体もしくは試薬、またはそれらの組成物、または1つまたは複数の他の構成要素を梱包するための梱包材料を含む製品として提供することができる。例えばキットは、キットの構成要素を隔離しまたは整理するのに適した容器、ボトル、チューブ、バイアルおよび任意の梱包材料を含有することができる。1つまたは複数の容器は、ガラスまたはプラスチックなど、さまざまな材料から形成されうる。いくつかの態様において、1つまたは複数の容器は、本方法において使用するための細胞または抗体または他の試薬を含む組成物を保定する。本明細書における製造品またはキットは、別々の容器または同じ容器に細胞、抗体または試薬を含みうる。

いくつかの態様において、組成物を保定する1つまたは複数の溶液は、使い捨てバイアルまたは場合によっては組成物の反復使用を可能にしうる多数回使用バイアルであることができる。いくつかの態様において、製造品またはキットは、適切な希釈剤を含む第2容器を、さらに含みうる。製造品またはキットは、商業上、治療上および使用上の観点から、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、治療剤および/または使用説明書を含む添付文書などといった他の材料をさらに含みうる。

いくつかの態様において、キットは任意で説明書を含むことができる。説明書は典型的には、細胞組成物、試薬および/または抗体と任意でキットに含まれる他の構成要素ならびにそれらを使用するための方法を説明する明確な表現を含む。いくつかの態様において、説明書は、疾患または状態を例えば提供される態様のいずれかに従って処置する目的での対象への投与に、細胞組成物および抗体を使用するための方法を示す。いくつかの態様において、説明書は、g-NK代用マーカー表現型を、例えば提供される態様のいずれかに従って検出するためのパネルとして、抗体などの試薬を使用するための方法を示す。いくつかの態様において、説明書は、容器上のまたは容器に付随するラベルまたは添付文書として提供される。いくつかの態様において、説明書は、組成物の再構成および/または使用のための指示を示しうる。

VI. 例示的態様
提供される態様には以下の態様が含まれる。
1. FcRγ欠損NK細胞（g-NK）を増大させるための方法であって、
該方法は、
（a）ナチュラルキラー（NK）細胞について濃縮された初代ヒト細胞の集団を得る工程であって、NK細胞について濃縮された該集団がヒト対象からの生物学的試料から選択される、工程、および
（b）濃縮NK細胞の該集団を、（i）照射HLA-E+フィーダー細胞対濃縮NK細胞の比が1:10～10:1である、HLAクラスIおよびHLAクラスIIが欠損している照射HLA-E+フィーダー細胞と、（ii）少なくとも1つの組換えサイトカインがインターロイキン（IL）-2であり、少なくとも1つの組換えサイトカインがIL-21である、有効量の2種以上の組換えサイトカインとを含む培養培地において培養する工程
を含み、
ここで該方法により、g-NK細胞に富む増大されたNK細胞集団が産生される、
該方法。
2. 前記対象がCMV血清陽性である、態様1の方法。
3. 前記対象からの生物学的試料中のNK細胞におけるg-NK細胞のパーセンテージが5％超または約5％超であり、任意で、前記対象は、前記生物学的試料中のNK細胞におけるg-NK細胞のパーセンテージが5％超または約5％超であるということについて選択された対象である、態様1または態様2の方法。
4. 前記対象からの生物学的試料中のNK細胞におけるg-NK細胞のパーセンテージが10％超または約10％超であり、任意で、前記対象は、前記生物学的試料中のNK細胞におけるg-NK細胞のパーセンテージが10％超または約10％超であるということについて選択された対象である、態様1または態様2の方法。
5. 前記対象からの生物学的試料中のNK細胞におけるg-NK細胞のパーセンテージが30％超または約30％超であり、任意で、前記対象は、前記生物学的試料中のNK細胞におけるg-NK細胞のパーセンテージが30％超または約30％超であるということについて選択された対象である、態様1または態様2の方法。
6. FcRγ欠損NK細胞（g-NK）を増大させるための方法であって、
該方法は、
（a）対象からの末梢血試料中のナチュラルキラー（NK）細胞の少なくとも20％または約20％がNKG2Cについて陽性（NKG2C^pos）であり、かつ該末梢血試料中のNK細胞の少なくとも70％がNKG2Aについて陰性または低発現（NKG2A^neg）である対象を選択する工程、
（b）初代ヒト細胞の集団を得る工程であって、NK細胞について濃縮された該集団が、該対象からの生物学的試料から選択された、（i）CD3について陰性または低発現でありかつCD57について陽性（CD3^negCD57^pos）であるか、または（ii）CD3について陰性または低発現でありかつCD56について陽性（CD3^negCD56^pos）であるかのどちらかである細胞である、工程、および
（c）照射HLA-E+フィーダー細胞対濃縮NK細胞の比が1:10～10:1である、HLAクラスIおよびHLAクラスIIが欠損している照射HLA-E+フィーダー細胞を含む培養培地において、濃縮NK細胞の該集団を培養する工程であって、該培養する工程がNK細胞の増大のための条件下にある、工程
を含み、
ここで該方法により、g-NK細胞に富む増大されたNK細胞集団が産生される、
該方法。
7. NK細胞について濃縮された前記集団が、前記生物学的試料から選択された、CD3について陰性または低発現でありかつCD57について陽性（CD3^negCD57^pos）である細胞である、態様1～6のいずれかの方法。
8. NK細胞について濃縮された前記集団が、前記生物学的試料から選択された、CD3について陰性または低発現でありかつCD56について陽性（CD3^negCD56^pos）である細胞である、態様1～6のいずれかの方法。
9. 前記増大されたNK細胞集団から、NKG2Cについて陽性（NKG2C^pos）でありかつ/またはNKG2Aについて陰性もしくは低発現（NKG2A^neg）である細胞を選択する工程をさらに含む、態様1～8のいずれかの方法。
10. FcRγ欠損NK細胞（g-NK）を増大させるための方法であって、
該方法は、
（a）ナチュラルキラー（NK）細胞について濃縮された初代ヒト細胞の集団を得る工程であって、NK細胞について濃縮された該集団が、ヒト対象からの生物学的試料から選択された、（i）CD3について陰性もしくは低発現でありかつCD57について陽性（CD3^negCD57^pos）であるか、または（ii）CD3について陰性もしくは低発現でありかつCD56について陽性（CD3^negCD56^pos）であるかのどちらかである細胞である、工程、
（b）照射HAL-E+フィーダー細胞対濃縮NK細胞の比が1:10～10:1である、HLAクラスIおよびHLAクラスIIが欠損している照射HLA-E+フィーダー細胞を含む培養培地において、濃縮NK細胞の該集団を培養する工程であって、該培養する工程がNK細胞の増大のための条件下にある、工程、および
（c）増大された集団から、NKG2Cについて陽性でありかつNKG2Aについて陰性もしくは低発現（NKG2C^posNKG2A^neg）であるNK細胞を選択する工程
を含み、
ここで該方法により、g-NK細胞に富む増大されたNK細胞集団が産生される、
該方法。
11. NK細胞について濃縮された前記集団が、NKG2Cについて陽性（NKG2C^pos）である細胞についてさらに選択された細胞である、態様7～8および態様10のいずれかの方法。
12. NK細胞について濃縮された前記集団が、NKG2Aについて陰性もしくは低発現（NKG2A^neg）である細胞についてさらに選択された細胞である、態様7～8および態様10のいずれかの方法。
13. NK細胞について濃縮された前記集団が、NKG2Cについて陽性でありかつNKG2Aについて陰性もしくは低発現（NKG2C^posNKG2A^neg）である細胞についてさらに選択された細胞である、態様7～8および態様10のいずれかの方法。
14. FcRγ欠損NK細胞（g-NK）を増大させるための方法であって、
該方法は、
（a）ナチュラルキラー（NK）細胞について濃縮された初代ヒト細胞の集団を得る工程であって、NK細胞について濃縮された該集団が、ヒト対象からの生物学的試料から選択された、NKG2Cについて陽性（NKG2C^pos）でありかつ/またはNKG2Aについて陰性もしくは低発現（NKG2A^neg）であり、かつ（i）CD3について陰性もしくは低発現でありかつCD57について陽性（CD3^negCD57^pos）であるか、または（ii）CD3について陰性もしくは低発現でありかつCD56について陽性（CD3^negCD56^pos）であるかのどちらかである細胞である、工程、および
（b）照射HLA-E+フィーダー細胞対濃縮NK細胞の比が1:10～10:1である、HLAクラスIおよびHLAクラスIIが欠損している照射HLA-E+フィーダー細胞を含む培養培地において、濃縮NK細胞の該集団を培養する工程であって、該培養する工程がNK細胞の増大のための条件下にある、工程
を含み、
ここで該方法により、g-NK細胞に富む増大されたNK細胞集団が産生される、
該方法。
15. NK細胞について濃縮された前記集団が、前記生物学的試料から選択された、NKG2Cについて陽性でありかつNKG2Aについて陰性もしくは低発現（NKG2C^posNKG2A^neg）である細胞である、態様14の方法。
16. 前記対象がCMV血清陽性である、態様10～15のいずれかの方法。
17. 前記対象からの生物学的試料中のNK細胞におけるg-NK細胞のパーセンテージが5％超または約5％超であり、任意で、前記対象は、前記生物学的試料中のNK細胞におけるg-NK細胞のパーセンテージが5％超または約5％超であるということについて選択された対象である、態様10～16のいずれかの方法。
18. 前記対象からの生物学的試料中のNK細胞におけるg-NK細胞のパーセンテージが10％超または約10％超であり、任意で、前記対象は、前記生物学的試料中のNK細胞におけるg-NK細胞のパーセンテージが10％超または約10％超であるということについて選択された対象である、態様10～16のいずれかの方法。
19. 前記対象からの生物学的試料中のNK細胞におけるg-NK細胞のパーセンテージが30％超または約30％超であり、任意で、前記対象は、前記生物学的試料中のNK細胞におけるg-NK細胞のパーセンテージが30％超または約30％超であるということについて選択された対象である、態様10～16のいずれかの方法。
20. 前記濃縮NK細胞集団におけるg-NK細胞のパーセンテージが、20％または約20％から、90％または約90％である、態様1～19のいずれかの方法。
21. 前記濃縮NK細胞集団におけるg-NK細胞のパーセンテージが、40％または約40％から、90％または約90％である、態様1～19のいずれかの方法。
22. 前記濃縮NK細胞集団におけるg-NK細胞のパーセンテージが、60％または約60％から、90％または約90％である、態様1～19のいずれかの方法。
23. NK細胞について濃縮された前記集団が、前記生物学的試料から選択された、CD3について陰性または低発現でありかつCD57について陽性（CD3^negCD57^pos）である細胞である、態様10～22のいずれかの方法。
24. NK細胞について濃縮された前記集団が、
（a）前記生物学的試料から、（1）CD3について陰性もしくは低発現（CD3^neg）である細胞または（2）CD57について陽性（CD57^pos）である細胞を選択し、これにより、第1選択集団を濃縮する、選択することと、
（b）該第1選択集団から、（1）CD3について陰性もしくは低発現（CD3^neg）である細胞または（2）CD57について陽性（CD57^pos）である細胞のうちのもう一方について細胞を選択し、これにより、CD3について陰性もしくは低発現でありかつCD57について陽性（CD3^negCD57^pos）である細胞について濃縮する、選択することと
を含むプロセスによって、前記生物学的試料から選択され、
任意で該プロセスは、前記生物学的試料から、CD3について陰性もしくは低発現（CD3^neg）である細胞を選択し、これにより、第1選択集団を濃縮する、選択することと、該第1選択集団から、CD57について陽性（CD57^pos）である細胞を選択することとを含む、
態様7または態様23の方法。
25. NK細胞について濃縮された前記集団が、前記生物学的試料から選択された、CD3について陰性または低発現でありかつCD56について陽性（CD3^negCD56^pos）である細胞である、態様10～22のいずれかの方法。
26. NK細胞について濃縮された前記集団が、
（a）前記生物学的試料から、（1）CD3について陰性もしくは低発現（CD3^neg）である細胞または（2）CD56について陽性（CD56^pos）である細胞を選択し、これにより、第1選択集団を濃縮する、選択することと、
（b）該第1選択集団から、（1）CD3について陰性もしくは低発現（CD3^neg）である細胞または（2）CD56について陽性（CD56^pos）である細胞のうちのもう一方について細胞を選択し、これにより、CD3について陰性もしくは低発現でありかつCD56について陽性（CD3^negCD56^pos）である細胞について濃縮する、選択することと
を含むプロセスによって、前記生物学的試料から選択され、
任意で該プロセスは、前記生物学的試料から、CD3について陰性もしくは低発現（CD3^neg）である細胞を選択し、これにより、第1選択集団を濃縮する、選択することと、該第1選択集団から、CD56について陽性（CD56^pos）である細胞を選択することとを含む、
態様8または態様26の方法。
27. 前記対象が、該対象からの末梢血試料中に、少なくとも20％または少なくとも約20％の、NKG2Cについて陽性（NKG2C^pos）であるNK細胞を有するということについて選択された対象である、態様1～5および態様7～26のいずれかの方法。
28. 前記対象が、該対象からの末梢血試料中に、少なくとも70％または少なくとも約70％の、NKG2Aについて陰性もしくは低発現（NKG2A^neg）であるNK細胞を有するということについて選択された対象である、態様1～5および態様7～27のいずれかの方法。
29. 得られた前記濃縮NK細胞集団が、凍結された凍結保存生物学的試料であり、かつ該凍結保存生物学的試料が、前記培養する工程に先立って解凍される、態様1～28のいずれかの方法。
30. 得られた前記濃縮NK細胞集団が、前記培養する工程に先立って、凍結も凍結保存もされない、態様1～28のいずれかの方法。
31. 増大のための条件が、有効量の、1種または複数種の組換えサイトカインを含む、態様10～30のいずれかの方法。
32. 前記1種または複数種の組換えサイトカインが、有効量のSCF、GSK3i、FLT3、IL-2、IL-6、IL-7、IL-15、IL-12、IL-18、IL-21、IL-27、またはそれらの組み合わせを含む、態様31の方法。
33. 前記1種または複数種の組換えサイトカインが、有効量のIL-2、IL-7、IL-15、IL-12、IL-18、IL-21、IL-27、またはそれらの組み合わせを含む、態様31または態様32の方法。
34. 前記1種または複数種の組換えサイトカインのうちの少なくとも1つがIL-21である、態様31～33のいずれかの方法。
35. 前記組換えサイトカインが、IL-2、IL-7、IL-15、IL-12、IL-18もしくはIL-27、またはそれらの組み合わせをさらに含む、態様1～10および態様34のいずれかの方法。
36. 前記組換えサイトカインのうちの少なくとも1つがIL-2である、態様1～10および態様31～35のいずれかの方法。
37. 前記組換えサイトカインがIL-21およびIL-2である、態様1～10および態様31～36のいずれかの方法。
38. 前記組換えサイトカインがIL-21、IL-2およびIL-15である、態様1～10および態様31～37のいずれかの方法。
39. 前記組換えサイトカインがIL-21、IL-12、IL-15およびIL-18である、態様1～10および態様31～35のいずれかの方法。
40. 前記組換えサイトカインがIL-21、IL-2、IL-12、IL-15およびIL-18である、態様1～10および請求項31～39のいずれかの方法。
41. 前記組換えサイトカインがIL-21、IL-15、IL-18およびIL-27である、態様1～10および態様31～35のいずれかの方法。
42. 前記組換えサイトカインがIL-21、IL-2、IL-15、IL-18およびIL-27である、態様1～10および態様31～40のいずれかの方法。
43. 前記組換えサイトカインがIL-2およびIL-15である、態様31～36のいずれかの方法。
44. 組換えIL-21が、前記培養する工程の少なくとも一部分の期間中、前記培養培地に加えられ、任意で、前記培養する工程の開始時もしくはほぼ開始時に、および/または前記培養する工程の期間中に1回もしくは複数回、10ng/mLまたは約10ng/mLから、100ng/mLまたは約100ng/mLの濃度で加えられる、態様1～10および態様34～42のいずれかの方法。
45. 組換えIL-21が、前記培養する工程の少なくとも一部分の期間中、前記培養培地に加えられ、任意で、前記培養する工程の開始時もしくはほぼ開始時に、および/または前記培養する工程の期間中に1回もしくは複数回、25ng/mLまたは約25ng/mLの濃度で加えられる、態様1～10、34～42および44のいずれかの方法。
46. 組換えIL-2が、前記培養する工程の少なくとも一部分の期間中、前記培養培地に加えられ、任意で、前記培養する工程の開始時もしくはほぼ開始時に、および/または前記培養する工程の期間中に1回もしくは複数回、10IU/mLまたは約10IU/mLから、500IU/mLまたは約500IU/mLの濃度で加えられる、態様32、33、35～38、40、42および43のいずれかの方法。
47. 組換えIL-2が、前記培養する工程の少なくとも一部分の期間中、前記培養培地に加えられ、任意で、前記培養する工程の開始時もしくはほぼ開始時に、および/または前記培養する工程の期間中に1回もしくは複数回、100IU/mLまたは約100IU/mLの濃度で加えられる、態様32、33、35～38、40、42、43および46のいずれかの方法。
48. 組換えIL-2が、前記培養する工程の少なくとも一部分の期間中、前記培養培地に加えられ、任意で、前記培養する工程の開始時もしくはほぼ開始時に、および/または前記培養する工程の期間中に1回もしくは複数回、500IU/mLまたは約500IU/mLの濃度で加えられる、態様32、33、35～38、40、42、43および46のいずれかの方法。
49. 組換えIL-15が、前記培養する工程の少なくとも一部分の期間中、前記培養培地に加えられ、任意で、前記培養する工程の開始時もしくはほぼ開始時に、および/または前記培養する工程の期間中に1回もしくは複数回、1ng/mL～50ng/mLまたは約1ng/mL～50ng/mLの濃度で加えられる、態様32、33、35および38～43のいずれかの方法。
50. 組換えIL-15が、前記培養する工程の少なくとも一部分の期間中、前記培養培地に加えられ、任意で、前記培養する工程の開始時もしくはほぼ開始時に、および/または前記培養する工程の期間中に1回もしくは複数回、10ng/mLまたは約10ng/mLの濃度で加えられる、態様32、33、35、39～43および49のいずれかの方法。
51. 組換えIL-12が、前記培養する工程の少なくとも一部分の期間中、前記培養培地に加えられ、任意で、前記培養する工程の開始時もしくはほぼ開始時に、および/または前記培養する工程の期間中に1回もしくは複数回、1ng/mL～50ng/mLまたは約1ng/mL～50ng/mLの濃度で加えられる、態様32、33、35、39、40および42のいずれかの方法。
52. 組換えIL-12が、前記培養する工程の少なくとも一部分の期間中、前記培養培地に加えられ、任意で、前記培養する工程の開始時もしくはほぼ開始時に、および/または前記培養する工程の期間中に1回もしくは複数回、10ng/mLまたは約10ng/mLの濃度で加えられる、態様32、33、35、39、40、42および51のいずれかの方法。
53. 組換えIL-18が、前記培養する工程の少なくとも一部分の期間中、前記培養培地に加えられ、任意で、前記培養する工程の開始時もしくはほぼ開始時に、および/または前記培養する工程の期間中に1回もしくは複数回、1ng/mL～50ng/mLまたは約1ng/mL～50ng/mLの濃度で加えられる、態様32、33、35および39～42のいずれかの方法。
54. 組換えIL-18が、前記培養する工程の少なくとも一部分の期間中、前記培養培地に加えられ、任意で、前記培養する工程の開始時もしくはほぼ開始時に、および/または前記培養する工程の期間中に1回もしくは複数回、10ng/mLまたは約10ng/mLの濃度で加えられる、態様32、33、35、39～42および53のいずれかの方法。
55. 組換えIL-27が、前記培養する工程の少なくとも一部分の期間中、前記培養培地に加えられ、任意で、前記培養する工程の開始時もしくはほぼ開始時に、および/または前記培養する工程の期間中に1回もしくは複数回、1ng/mL～50ng/mLまたは約1ng/mL～50ng/mLの濃度で加えられる、態様32、33、35および41～42のいずれかの方法。
56. 組換えIL-27が、前記培養する工程の少なくとも一部分の期間中、前記培養培地に加えられ、任意で、前記培養する工程の開始時もしくはほぼ開始時に、および/または前記培養する工程の期間中に1回もしくは複数回、10ng/mLまたは約10ng/mLの濃度で加えられる、態様32、33、35、41～42および55のいずれかの方法。
57. 前記組換えサイトカインが、前記培養する工程の開始時またはほぼ開始時を始まりとして、前記培養培地に加えられる、態様1～10および態様31～56のいずれかの方法。
58. 前記組換えサイトカインが、前記培養する工程の期間中、さらに1回または複数回、培養培地に加えられる、態様57の方法。
59. 前記培養する工程の期間中、前記培養培地を1回または複数回交換する工程をさらに含む、態様1～58のいずれかの方法。
60. 前記培養培地の交換が、前記培養する工程の継続期間にわたって2または3日ごとに、任意で最大5日間にわたる培地交換なしの初期増大後に、実行される、態様59の方法。
61. 前記培養培地の各交換時に、前記組換えサイトカインを含有する新鮮培地が加えられる、態様59または態様60の方法。
62. 前記組換えサイトカインがIL-21を含み、該IL-21が、前記培養する工程の少なくとも一部分の期間中、抗IL-21抗体との複合体として加えられ、任意で、前記培養する工程の開始時もしくはほぼ開始時に加えられる、および/または前記培養する工程の期間中に1回もしくは複数回、加えられる、態様1～10および態様31～61のいずれかの方法。
63. 前記培養する工程に先立って、前記抗IL-21抗体と前記組換えIL-21とをインキュベートして前記IL-21/抗IL-21複合体を形成させ、
該IL-21/抗IL-21複合体が培養培地に加えられる、
態様62の方法。
64. 前記抗IL-21抗体の濃度が、100ng/mL～500ng/mLまたは約100ng/mL～500ng/mLである、態様62または態様63の方法。
65. 前記抗IL-21抗体の濃度が250ng/mLまたは約250ng/mLである、態様62～64のいずれかの方法。
66. 前記組換えIL-21の濃度が、10ng/mL～100ng/mLまたは約10ng/mL～100ng/mLである、態様62～65のいずれかの方法。
67. 前記組換えIL-21の濃度が25ng/mLまたは約25ng/mLである、態様62～66のいずれかの方法。
68. 前記ヒト対象が、CD16 158V/V NK細胞遺伝子型またはCD16 158V/F NK細胞遺伝子型を有し、任意で、前記生物学的試料が、CD16 158V/V NK細胞遺伝子型またはCD16 158V/F NK細胞遺伝子型について選択されたヒト対象に由来する、態様1～67のいずれかの方法。
69. 前記生物学的試料が末梢血単核球（PBMC）であるか、または末梢血単核球（PBMC）を含む、態様1～68のいずれかの方法。
70. 前記生物学的試料が血液試料である、態様1～69のいずれかの方法。
71. 前記生物学的試料がアフェレーシス試料または白血球アフェレーシス試料である、態様1～69のいずれかの方法。
72. 前記生物学的試料が、凍結された凍結保存試料であり、かつ該凍結保存試料が、前記培養する工程に先立って解凍される、態様1～71のいずれかの方法。
73. 前記生物学的試料が、前記培養する工程に先立って、凍結も凍結保存もされない、態様1～71のいずれかの方法。
74. 前記選択する工程が免疫親和性に基づく選択を含む、態様1～73のいずれか一項記載の方法。
75. 前記HLA-E+フィーダー細胞がK562細胞である、態様1～74のいずれかの方法。
76. 前記K562細胞が、膜結合型IL-15（K562-mb15）または膜結合型IL-21（K562-mb21）を発現する、態様75の方法。
77. 前記HLA-E+フィーダー細胞が221.AEH細胞である、態様1～74のいずれかの方法。
78. 照射HLA-E+フィーダー細胞対NK細胞の比が、1:1もしくは約1:1またはそれより大きい、態様1～77のいずれかの方法。
79. 照射HLA-E+フィーダー細胞対NK細胞の比が1:1～5:1（両端の値を含む）である、態様1～78のいずれかの方法。
80. 照射HLA-E+フィーダー細胞対濃縮NK細胞の比が1:1～3:1（両端の値を含む）である、態様1～79のいずれかの方法。
81. 照射HLA-E+フィーダー細胞対濃縮NK細胞の比が2.5:1または約2.5:1である、態様1～80のいずれかの方法。
82. 照射HLA-E+フィーダー細胞対濃縮NK細胞の比が2:1または約2:1である、態様1～80のいずれかの方法。
83. 照射HLA-E+フィーダー細胞対濃縮NK細胞の比が1:1または約1:1である、態様1～80のいずれかの方法。
84. 前記濃縮NK細胞集団が、凍結保存のために凍結された後に解凍されている、態様83の方法。
85. 前記濃縮NK細胞集団が、新しく単離されている、または前もって凍結および解凍されていない、態様78～82のいずれかの方法。
86. 前記培養する工程の少なくとも一部分の期間中、前記培養培地に加えられる組換えサイトカインが、500IU/mL IL-2、10ng/mL IL-15、および25ng/mL IL-21である、態様1～85のいずれかの方法。
87. 前記濃縮NK細胞集団が、少なくとも2.0×10⁵個もしくは少なくとも約2.0×10⁵個の濃縮NK細胞、少なくとも1.0×10⁶個もしくは少なくとも約1.0×10⁶個の濃縮NK細胞、または少なくとも1.0×10⁷個もしくは少なくとも約1.0×10⁷個の濃縮NK細胞を含む、態様1～86のいずれかの方法。
88. 前記濃縮NK細胞集団が、2.0×10⁵個もしくは約2.0×10⁵個の濃縮NK細胞から、5.0×10⁷個もしくは約5.0×10⁷個の濃縮NK細胞、1.0×10⁶個もしくは約1.0×10⁶個の濃縮NK細胞から、1.0×10⁸個もしくは約1.0×10⁸個の濃縮NK細胞、1.0×10⁷個もしくは約1.0×10⁷個の濃縮NK細胞から、5.0×10⁸個もしくは約5.0×10⁸個の濃縮NK細胞、または1.0×10⁷個もしくは約1.0×10⁷個の濃縮NK細胞から、1.0×10⁹個もしくは約1.0×10⁹個の濃縮NK細胞を含む、態様1～86のいずれかの方法。
89. 前記培養する工程の開始時の濃縮NK細胞集団が、0.05×10⁶個の濃縮NK細胞/mL～1.0×10⁶個の濃縮NK細胞/mLまたは約0.05×10⁶個の濃縮NK細胞/mL～1.0×10⁶個の濃縮NK細胞/mLの濃度である、態様1～88のいずれかの方法。
90. 前記培養する工程の開始時の濃縮NK細胞集団が、0.05×10⁶個の濃縮NK細胞/mL～0.5×10⁶個の濃縮NK細胞/mLまたは約0.05×10⁶個の濃縮NK細胞/mL～0.5×10⁶個の濃縮NK細胞/mLの濃度である、態様1～89のいずれかの方法。
91. 前記培養する工程の開始時の濃縮NK細胞集団が、0.2×10⁶個または約0.2×10⁶個の濃縮NK細胞/mLの濃度を含む、態様1～90のいずれかの方法。
92. 前記培養する工程が閉鎖システムにおいて実行される、態様1～91のいずれかの方法。
93. 前記培養する工程が無菌培養バッグにおいて実行される、態様1～92のいずれかの方法。
94. 前記培養する工程がガス透過性培養容器を使って実行される、態様1～93のいずれかの方法。
95. 前記培養する工程がバイオリアクターを使って実行される、態様1～94のいずれかの方法。
96. 前記培養する工程が、前記方法によって少なくとも2.50×10⁸個または少なくとも約2.50×10⁸個のg-NK細胞の増大が達成される時点まで実行される、態様1～95のいずれかの方法。
97. 前記培養する工程が、前記方法によって少なくとも5.00×10⁸個または少なくとも約5.00×10⁸個のg-NK細胞の増大が達成される時点まで実行される、態様1～96のいずれかの方法。
98. 前記培養する工程が、前記方法によって少なくとも1.0×10⁹個または少なくとも約1.0×10⁹個のg-NK細胞の増大が達成される時点まで実行される、態様1～97のいずれかの方法。
99. 前記培養する工程が、前記方法によって少なくとも5.0×10⁹個または少なくとも約5.0×10⁹個のg-NK細胞の増大が達成される時点まで実行される、態様1～97のいずれかの方法。
100. 前記培養する工程が、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、15日、16日、17日、18日、19日、20日、21日、22日、23日、24日もしくは25日、または約5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、15日、16日、17日、18日、19日、20日、21日、22日、23日、24日もしくは25日、または少なくとも5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、15日、16日、17日、18日、19日、20日、21日、22日、23日、24日もしくは25日、または少なくとも約5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、15日、16日、17日、18日、19日、20日、21日、22日、23日、24日もしくは25日間にわたって実行される、態様1～99のいずれかの方法。
101. 前記培養する工程が、14日、または約14日、または少なくとも14日、または少なくとも約14日間にわたって実行される、態様1～100のいずれかの方法。
102. 前記培養する工程が、21日、または約21日、または少なくとも21日、または少なくとも約21日間にわたって実行される、態様1～100のいずれかの方法。
103. 前記培養する工程の終了時に、前記培養する工程の開始時と比較して増加した数のg-NK細胞を産生する、態様1～102のいずれかの方法。
104. 前記増加が、100倍超もしくは約100倍超、200倍超もしくは約200倍超、300倍超もしくは約300倍超、400倍超もしくは約400倍超、500倍超もしくは約500倍超、600倍超もしくは約600倍超、700倍超もしくは約700倍超、または800倍超もしくは約800倍超である、態様103の方法。
105. 前記増加が1000倍超または約1000倍超である、態様103または態様104の方法。
106. 前記増加が、2000倍超もしくは約2000倍超、3000倍超もしくは約3000倍超、または35000倍超もしくは約35000倍超である、態様103または態様104の方法。
107. 前記方法によって産生されたg-NK細胞に富む増大された集団を収集する工程をさらに含む、態様1～106のいずれかの方法。
108. g-NK細胞に富む前記増大された集団のうち、該集団の50％超がFcRγ^negである、態様1～107のいずれかの方法。
109. g-NK細胞に富む前記増大された集団のうち、該集団の60％超がFcRγ^negである、態様1～107のいずれかの方法。
110. g-NK細胞に富む前記増大された集団のうち、該集団の70％超がFcRγ^negである、態様1～107のいずれかの方法。
111. g-NK細胞に富む前記増大された集団のうち、該集団の80％超がFcRγ^negである、態様1～107のいずれかの方法。
112. g-NK細胞に富む前記増大された集団のうち、該集団の90％超がFcRγ^negである、態様1～107のいずれかの方法。
113. g-NK細胞に富む前記増大された集団のうち、該集団の95％超がFcRγ^negである、態様1～107のいずれかの方法。
114. g-NK細胞に富む前記増大された集団のうち、30％超もしくは約30％超がNKG2Cについて陽性（NKG2C^pos）であり、および/または50％超もしくは約50％超がNKG2Aについて陰性もしくは低発現（NKG2A^neg）である、態様1～113のいずれかの方法。
115. g-NK細胞に富む前記増大された集団のうち、35％超もしくは約35％超がNKG2Cについて陽性（NKG2C^pos）であり、および/または60％超もしくは約60％超がNKG2Aについて陰性もしくは低発現（NKG2A^neg）である、態様1～113のいずれかの方法。
116. g-NK細胞に富む前記増大された集団のうち、40％超もしくは約40％超がNKG2Cについて陽性（NKG2C^pos）であり、および/または70％超もしくは約70％超がNKG2Aについて陰性もしくは低発現（NKG2A^neg）である、態様1～113のいずれかの方法。
117. g-NK細胞に富む前記増大された集団のうち、45％超もしくは約45％超がNKG2Cについて陽性（NKG2C^pos）であり、および/または80％超もしくは約80％超がNKG2Aについて陰性もしくは低発現（NKG2A^neg）である、態様1～113のいずれかの方法。
118. g-NK細胞に富む前記増大された集団のうち、50％超もしくは約50％超がNKG2Cについて陽性（NKG2C^pos）であり、および/または85％超もしくは約85％超がNKG2Aについて陰性もしくは低発現（NKG2A^neg）である、態様1～113のいずれかの方法。
119. g-NK細胞に富む前記増大された集団のうち、55％超もしくは約55％超がNKG2Cについて陽性（NKG2C^pos）であり、および/または90％超もしくは約90％超がNKG2Aについて陰性もしくは低発現（NKG2A^neg）である、態様1～113のいずれかの方法。
120. g-NK細胞に富む前記増大された集団のうち、60％超もしくは約60％超がNKG2Cについて陽性（NKG2C^pos）であり、および/または95％超もしくは約95％超がNKG2Aについて陰性もしくは低発現（NKG2A^neg）である、態様1～113のいずれかの方法。
121. 前記ヒト対象がCD16 158V/V NK細胞遺伝子型を有し、かつ前記g-NK細胞がCD16 158V/V（V158）であるか、または前記ヒト対象がCD16 158V/F NK細胞遺伝子型を有し、かつ前記g-NK細胞がCD16 158V/F（V158）である、態様1～120のいずれかの方法。
122. g-NK細胞に富む前記増大された集団から、もう一つの表面マーカーNKG2C^pos、NKG2C^neg、CD16^pos、CD57^pos、CD7^dim/neg、CD161^neg、CD38^neg、または前記のいずれかの組み合わせに基づいて細胞の集団を精製する工程をさらに含む、態様1～121のいずれかの方法。
123. 前記精製する工程が、NKG2C^posかつNKG2A^negである細胞について選択することを含む、態様122の方法。
124. 前記精製する工程が、CD16^pos/CD57^pos/CD7^dim/neg/CD161^negである細胞について選択する工程を含む、態様122の方法。
125. 前記精製する工程が、NKG2A^neg/CD161^negである細胞について選択することを含む、態様122の方法。
126. 前記精製する工程が、CD38^negである細胞について選択することを含む、態様122の方法。
127. g-NK細胞に富む前記増大された集団のうち、g-NK細胞の70％超または約70％超がパーフォリンについて陽性である、態様1～126のいずれかの方法。
128. g-NK細胞に富む前記増大された集団のうち、g-NK細胞の80％超または約80％超がパーフォリンについて陽性である、態様1～126のいずれかの方法。
129. g-NK細胞に富む前記増大された集団のうち、g-NK細胞の85％超または約85％超がパーフォリンについて陽性である、態様1～126のいずれかの方法。
130. g-NK細胞に富む前記増大された集団のうち、g-NK細胞の90％超または約90％超がパーフォリンについて陽性である、態様1～126のいずれかの方法。
131. g-NK細胞に富む前記増大された集団のうち、g-NK細胞の70％超または約70％超がグランザイムBについて陽性である、態様1～130のいずれかの方法。
132. g-NK細胞に富む前記増大された集団のうち、g-NK細胞の80％超または約80％超がグランザイムBについて陽性である、態様1～130のいずれかの方法。
133. g-NK細胞に富む前記増大された集団のうち、g-NK細胞の85％超または約85％超がグランザイムBについて陽性である、態様1～130のいずれかの方法。
134. g-NK細胞に富む前記増大された集団のうち、g-NK細胞の90％超または約90％超がグランザイムBについて陽性である、態様1～130のいずれかの方法。
135. g-NK細胞に富む前記増大された集団のうち、細胞の10％超が、任意でCD107aによって測定された場合に、腫瘍標的細胞に対して脱顆粒することができる、態様1～134のいずれかの方法。
136. 前記脱顆粒が前記腫瘍標的細胞に対する抗体の非存在下で測定される、態様135の方法。
137. g-NK細胞に富む前記増大された集団のうち、細胞の10％超が、腫瘍標的細胞に対してインターフェロンγまたはTNF-αを産生することができる、態様1～136のいずれかの方法。
138. 前記インターフェロンγまたはTNF-αが前記腫瘍標的細胞に対する抗体の非存在下で測定される、態様137の方法。
139. 前記増大された濃縮g-NK細胞集団を、薬学的に許容される賦形剤中に製剤化する工程をさらに含む、態様1～138のいずれかの方法。
140. 前記増大された濃縮g-NK細胞集団を、凍結保護物質を含む無血清凍結保存培地と共に製剤化する工程を含む、態様139の方法。
141. 前記凍結保護物質がDMSOである、態様140の方法。
142. 前記凍結保護物質がDMSOであり、前記凍結保存培地が5％～10％DMSO（v/v）であり、任意で10％または約10％DMSO（v/v）である、態様140の方法。
143. 態様1～142のいずれかの方法によって産生されるg-NK細胞を含む、組成物。
144. 増大されたナチュラルキラー（NK）細胞の組成物であって、該組成物中の細胞の少なくとも50％または少なくとも約50％がFcRγ欠損NK細胞（g-NK）であり、該g-NK細胞の70％超または約70％超がパーフォリンについて陽性であり、かつ該g-NK細胞の70％超または約70％超がグランザイムBについて陽性である、該組成物。
145. 前記g-NK細胞の80％超または約80％超がパーフォリンについて陽性であり、かつ該g-NK細胞の80％超または約80％超がグランザイムBについて陽性である、請求項144の組成物。
146. 前記g-NK細胞の90％超または約90％超がパーフォリンについて陽性であり、かつ該g-NK細胞の90％超または約90％超がグランザイムBについて陽性である、請求項144の組成物。
147. 前記g-NK細胞の95％超または約95％超がパーフォリンについて陽性であり、かつ該g-NK細胞の95％超または約95％超がグランザイムBについて陽性である、請求項144の組成物。
148. 前記g-NK細胞がFcRγ^negである、請求項144の組成物。
149. 前記g-NK細胞がg-NK細胞代用マーカープロファイルを呈する、請求項144の組成物。
150. 前記g-NK細胞代用マーカープロファイルがCD16^pos/CD57^pos/CD7^dim/neg/CD161^negである、請求項149の組成物。
151. 前記g-NK細胞代用マーカープロファイルがNKG2A^neg/CD161^negである、請求項149の組成物。
152. 前記g-NK細胞代用マーカープロファイルがCD38^negである、請求項129の組成物。
153. 前記g-NK細胞代用表面マーカープロファイルがさらにCD45^pos/CD3^neg/CD56^posである、態様150～152のいずれかの組成物。
154. 前記細胞の60％超または約60％超がg-NK細胞である、態様144～153のいずれかの組成物。
155. 前記細胞の70％超または約70％超がg-NK細胞である、態様144～153のいずれかの組成物。
156. 前記細胞の80％超または約80％超がg-NK細胞である、態様144～153のいずれかの組成物。
157. 前記細胞の90％超または約90％超がg-NK細胞である、態様144～153のいずれかの組成物。
158. 前記細胞の95％超または約95％超がg-NK細胞である、態様144～153のいずれかの組成物。
159. 前記細胞の80％超または約80％超がパーフォリンについて陽性である、態様144～158のいずれかの組成物。
160. 前記細胞の90％超または約90％超がパーフォリンについて陽性である、態様144～158のいずれかの組成物。
161. パーフォリンについて陽性である前記細胞では、該細胞が、細胞内フローサイトメトリーによって測定された場合に、平均蛍光強度（MFI）に基づいて、FcRγ^posである細胞によって発現されるパーフォリンの平均レベルの少なくとも2倍または少なくとも約2倍である平均レベルのパーフォリンを発現する、態様144～160のいずれかの組成物。
162. 前記細胞の80％超または約80％超がグランザイムBについて陽性である、態様144～161のいずれかの組成物。
163. 前記細胞の90％超または約90％超がグランザイムBについて陽性である、態様144～161のいずれかの組成物。
164. グランザイムBについて陽性である前記細胞では、該細胞が、細胞内フローサイトメトリーによって測定された場合に、平均蛍光強度（MFI）に基づいて、FcRγ^posである細胞によって発現されるグランザイムBの平均レベルの少なくとも2倍または少なくとも約2倍である平均レベルのグランザイムBを発現する、態様144～163のいずれかの組成物。
165. 少なくとも10⁸個または少なくとも約10⁸個の細胞を含む、態様144～164のいずれかの組成物。
166. 前記組成物中のg-NK細胞の数が、10⁸個もしくは約10⁸個から、10¹²個もしくは約10¹²個の細胞、10⁸個もしくは約10⁸個から、10¹¹個もしくは約10¹¹個の細胞、10⁸個もしくは約10⁸個から、10¹⁰個もしくは約10¹⁰個の細胞、10⁸個もしくは約10⁸個から、10⁹個もしくは約10⁹個の細胞、10⁹個もしくは約10⁹個から、10¹²個もしくは約10¹²個の細胞、10⁹個もしくは約10⁹個から、10¹¹個もしくは約10¹¹個の細胞、10⁹個もしくは約10⁹個から、10¹⁰個もしくは約10¹⁰個の細胞、10¹⁰個もしくは約10¹⁰個から、10¹²個もしくは約10¹²個の細胞、10¹⁰個もしくは約10¹⁰個から、10¹¹個もしくは約10¹¹個の細胞、または10¹¹個もしくは約10¹¹個から、10¹²個もしくは約10¹²個の細胞である、態様144～165のいずれかの組成物。
167. 前記組成物中のg-NK細胞の数が、5×10⁸個もしくは約5×10⁸個の細胞、1×10⁹個もしくは約1×10⁹個の細胞、5×10⁹個または約5×10⁹個の細胞、または1×10¹⁰個もしくは約1×10¹⁰個の細胞である、態様144～166のいずれかの組成物。
168. 前記組成物の体積が、50mLまたは約50mLから、500mLまたは約500mL、任意で200mLまたは約200mLである、態様144～167のいずれかの組成物。
169. 前記組成物中の細胞が、同じ生物学的試料から増大された、単一ドナー対象からのものである、態様144～168のいずれかの組成物。
170. 薬学的組成物である、態様144～169のいずれかの組成物。
171. 薬学的に許容される賦形剤を含む、態様144～170のいずれかの組成物。
172. 凍結保護物質を含む無血清凍結保存培地中に製剤化される、態様144～171のいずれかの組成物。
173. 前記凍結保護物質がDMSOであり、前記凍結保存培地が5％～10％DMSO（v/v）である、請求項172の組成物。
174. 前記凍結保護物質が10％または約10％DMSO（v/v）である、請求項173の組成物。
175. 無菌である、態様144～174のいずれかの組成物。
176. 態様166～175のいずれかの組成物を含む、無菌バッグ。
177. 凍結保存適合バッグである、態様176の無菌バッグ。
178. 態様143～177のいずれかの組成物を含む、キット。
179. 疾患または状態を処置するための単独療法として前記組成物を投与することに関する説明書をさらに含む、態様178のキット。
180. 疾患または状態を処置するための追加の作用物質をさらに含む、態様178のキット。
181. 前記疾患または状態が、炎症状態、感染症、およびがんからなる群より選択される、態様179または態様180のキット。
182. 前記疾患または状態が感染症であり、該感染症はウイルスまたは細菌によって引き起こされる、態様179～181のいずれかのキット。
183. 前記感染症がウイルスによって引き起こされる、態様182のキット。
184. 前記ウイルスがRNAウイルス、任意でコロナウイルスである、態様183のキット。
185. 前記ウイルスがDNAウイルスである、態様183のキット。
186. 前記ウイルスがSARS-CoV-2であり、前記感染症がCOVID-19である、態様183または態様184のキット。
187. 前記追加の作用物質が前記ウイルスに対する抗体を含有する血清である、態様183～186のいずれかのキット。
188. 前記血清が、ウイルスが引き起こす感染症から回復している患者からの回復期血清である、態様187のキット。
189. 前記追加の作用物質が抗体またはFc融合タンパク質、任意で組換えACE2-Fc融合タンパク質である、態様183～186のいずれかのキット。
190. 前記疾患または状態が、がんであり、かつ該がんが白血病、リンパ腫、または骨髄腫である、態様179～181のいずれかのキット。
191. 前記疾患または状態が、がんであり、かつ該がんが固形腫瘍を含む、態様179～181のいずれかのキット。
192. 前記がんが、胃または胃食道接合部の腺癌、膀胱がん、乳がん、脳のがん、子宮頸がん、結腸直腸がん、内分泌/神経内分泌がん、頭頸部がん、消化管間質がん、骨巨細胞腫、腎がん、肝がん、肺がん、神経芽細胞腫、卵巣上皮/卵管/原発性腹膜がん、膵がん、前立腺がん、皮膚がん、および軟部組織癌の中から選択される、態様191のキット。
193. 前記追加の作用物質が抗体またはFc融合タンパク質である、態様191または態様192のキット。
194. 前記追加の作用物質が腫瘍関連抗原を認識するかまたはそれに特異的に結合する抗体である、態様191～193のいずれかのキット。
195. 前記抗体が、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD52、CD56、CD70、CD74、CD140、EpCAM、CEA、gpA33、メソテリン、α-フェトプロテイン、ムチン、PDGFR-α、TAG-72、CAIX、PSMA、葉酸結合タンパク質、細胞分散因子受容体キナーゼ、ガングリオシド、サイトケライン、frizzled受容体、VEGF、VEGFR、インテグリンαVβ3、インテグリンα5β1、EGFR、EGFL7、ERBB2（HER2）、ERBB3、フィブロネクチン、HGF、HER3、LOXL2、MET、IGF1R、IGLF2、EPHA3、FR-α、ホスファチジルセリン、シンデカン1、SLAMF7（CD319）、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP、ビメンチン、またはテネイシンを認識するかまたはそれに結合する、態様194のキット。
196. 細胞毒性作用物質またはがん治療薬をさらに含む、態様190～195のいずれかのキット。
197. 前記追加の作用物質が細胞毒性作用物質またはがん治療薬である、態様190～195のいずれかのキット。
198. 前記追加の作用物質が腫瘍溶解性ウイルスである、態様190～192のいずれかのキット。
199. 前記追加の作用物質が、免疫細胞上の活性化受容体に特異的に結合する少なくとも1つの結合ドメインと腫瘍関連抗原に特異的に結合する少なくとも1つの結合ドメインとを含む二重特異性抗体である、態様190～192のいずれかのキット。
200. 前記免疫細胞がNK細胞である、態様199のキット。
201. 前記活性化受容体がCD16（CD16a）である、態様199または態様200のキット。
202. 前記腫瘍関連抗原が、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD52、CD56、CD70、CD74、CD140、EpCAM、CEA、gpA33、メソテリン、α-フェトプロテイン、ムチン、PDGFR-α、TAG-72、CAIX、PSMA、葉酸結合タンパク質、細胞分散因子受容体キナーゼ、ガングリオシド、サイトケライン、frizzled受容体、VEGF、VEGFR、インテグリンαVβ3、インテグリンα5β1、EGFR、EGFL7、ERBB2（HER2）、ERBB3、フィブロネクチン、HGF、HER3、LOXL2、MET、IGF1R、IGLF2、EPHA3、FR-α、ホスファチジルセリン、シンデカン1、SLAMF7（CD319）、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP、ビメンチン、またはテネイシンである、態様199～201のいずれかのキット。
203. 態様178～202のいずれかのキットを含む、製造品。
204. 態様143～175のいずれかの組成物を、その必要がある個体に投与する工程を含む、疾患または状態を処置する方法。
205. 前記疾患または状態が、炎症状態、感染症、およびがんからなる群より選択される、態様204の方法。
206. 前記疾患または状態が感染症であり、該感染症はウイルスまたは細菌によって引き起こされる、態様204または態様205の方法。
207. 前記感染症がウイルスによって引き起こされる、態様206の方法。
208. 前記ウイルスがDNAウイルスである、態様207の方法。
209. 前記ウイルスがRNAウイルスである、態様207の方法。
210. 前記ウイルスがコロナウイルスである、態様207または態様209の方法。
211. 前記コロナウイルスがSARS-CoV-2であり、前記感染症がCOVID-19である、態様210の方法。
212. 前記疾患または状態が、がんであり、かつ該がんが白血病、リンパ腫、または骨髄腫である、態様204または態様205の方法。
213. 前記疾患または状態が、がんであり、かつ該がんが固形腫瘍を含む、態様204または態様205の方法。
214. 前記がんが、胃または胃食道接合部の腺癌、膀胱がん、乳がん、脳のがん、子宮頸がん、結腸直腸がん、内分泌/神経内分泌がん、頭頸部がん、消化管間質がん、骨巨細胞腫、腎がん、肝がん、肺がん、神経芽細胞腫、卵巣上皮/卵管/原発性腹膜がん、膵がん、前立腺がん、皮膚がん、および軟部組織癌の中から選択される、態様213の方法。
215. 前記組成物が単独療法として投与される、態様204～214のいずれかの方法。
216. 前記疾患または状態を処置するために追加の作用物質を個体に投与する工程をさらに含む、態様204～214のいずれかの方法。
217. 前記疾患または状態がウイルスであり、前記追加の作用物質が前記ウイルスに対する抗体を含有する血清である、態様216の方法。
218. 前記血清が、ウイルスが引き起こす感染症から回復している患者からの回復期血清である、態様217の方法。
219. 前記追加の作用物質が抗体またはFc融合タンパク質である、態様216の方法。
220. 前記抗体がFcドメインを含みかつ/または完全長抗体である、態様219の方法。
221. 前記疾患または状態がウイルスであり、前記追加の作用物質が組換えACE2-Fc融合タンパク質である、態様219の方法。
222. 前記疾患または状態が、がんであり、かつ前記抗体が、該がんに関連する腫瘍抗原を認識する、態様219または態様220の方法。
223. 前記抗体が、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD52、CD56、CD70、CD74、CD140、EpCAM、CEA、gpA33、メソテリン、α-フェトプロテイン、ムチン、PDGFR-α、TAG-72、CAIX、PSMA、葉酸結合タンパク質、細胞分散因子受容体キナーゼ、ガングリオシド、サイトケライン、frizzled受容体、VEGF、VEGFR、インテグリンαVβ3、インテグリンα5β1、EGFR、EGFL7、ERBB2（HER2）、ERBB3、フィブロネクチン、HGF、HER3、LOXL2、MET、IGF1R、IGLF2、EPHA3、FR-α、ホスファチジルセリン、シンデカン1、SLAMF7（CD319）、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP、ビメンチン、またはテネイシンを認識するかまたはそれに特異的に結合する、態様222の方法。
224. 前記追加の作用物質が腫瘍溶解性ウイルスである、態様216の方法。
225. 前記追加の作用物質が、免疫細胞上の活性化受容体に特異的に結合する少なくとも1つの結合ドメインと腫瘍関連抗原に特異的に結合する少なくとも1つの結合ドメインとを含む二重特異性抗体である、態様216の方法。
226. 前記免疫細胞がマクロファージである、態様225の方法。
227. 前記免疫細胞がNK細胞である、態様225の方法。
228. 前記受容体がCD16（CD16a）である、態様225～227のいずれかの方法。
229. 前記腫瘍関連抗原が、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD52、CD56、CD70、CD74、CD140、EpCAM、CEA、gpA33、メソテリン、α-フェトプロテイン、ムチン、PDGFR-α、TAG-72、CAIX、PSMA、葉酸結合タンパク質、細胞分散因子受容体キナーゼ、ガングリオシド、サイトケライン、frizzled受容体、VEGF、VEGFR、インテグリンαVβ3、インテグリンα5β1、EGFR、EGFL7、ERBB2（HER2）、ERBB3、フィブロネクチン、HGF、HER3、LOXL2、MET、IGF1R、IGLF2、EPHA3、FR-α、ホスファチジルセリン、シンデカン1、SLAMF7（CD319）、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP、ビメンチン、またはテネイシンである、態様225～228のいずれかの方法。
230. 前記疾患または状態を処置するためにがん治療薬または細胞毒性作用物質を対象に投与する工程をさらに含む、態様222～229のいずれかの方法。
231. 1×10⁵個または約1×10⁵個のNK細胞/kgから、1×10⁷個または約1×10⁷個のNK細胞/kgを、個体に投与する工程を含む、態様204～230のいずれかの方法。
232. 5×10⁷個または約5×10⁷個のNK細胞から、10×10⁹個または約10×10⁹個のNK細胞を、個体に投与する工程を含む、態様204～231のいずれかの方法。
233. 前記個体がヒトである、態様204～232のいずれか一つの方法。
234. 前記組成物中のNK細胞が前記個体にとって同種異系である、態様204～233のいずれか一つの方法。
235. 前記組成物中のNK細胞が前記対象にとって自家である、態様204～233のいずれか一つの方法。

VII. 実施例
以下の実施例は例示のために含まれるに過ぎず、本発明の範囲を限定しようとするものではない。

実施例1: g-NK代用表面マーカーの同定
細胞内マーカーFceRIγ（FcRγ^neg）が陰性であるg-NK細胞を同定するための代用表面マーカーとして使用することができる細胞外表面マーカーの組み合わせを同定するための研究を行った。ヒト末梢血試料におけるg-NK細胞のパーセンテージは、g-NK細胞サブセットCD45^pos/CD3^neg/CD56^pos/FcRγ^negを同定するためのFceRIγに関する細胞内染色ならびにCD45、CD3およびCD56に関する細胞外染色により、フローサイトメトリーで決定した。図1に示すとおり、試料中のg-NK細胞のうち、NK細胞表現型CD45^pos/CD3^neg/CD56^posを有する細胞であって、CD16^pos/CD57^pos/CD7^dim/neg/CD161^negまたはNKG2A^neg/CD161^negの細胞外表面表現型を有するものは、試料中のg-NK細胞の存在と強く相関した。具体的に述べると、CD16^pos/CD57^pos/CD7^dim/neg/CD161^negNK細胞サブセット内またはNKG2A^neg/CD161^neg NK細胞サブセット内でのg-NK細胞のパーセンテージは、どちらも80％を上回った。

実施例2: FcRγ欠損NK細胞（g ^- NK）を優先的に増大させるための方法
CMV陽性ヒトドナーまたは比較のためのCMV血清陰性ドナーからの全血から、Histopaque（登録商標）密度遠心分離法により、製造者の説明書に従って、ヒト末梢血単核球（PBMC）を単離した。PBMCをバフィーコートから採取し、洗浄し、フローサイトメトリーにより、生存CD45^pos細胞について評価した（PBMCを残存赤血球から識別するため）。自家PBMCのおよそ2/3を使用して、Miltenyi MACS（商標）マイクロビーズを用いる免疫親和性に基づく磁気ビーズ分離で、T細胞を除去するためのCD3^pos細胞の枯渇（CD3枯渇）、CD3枯渇と、それに続く（1）CD57^posNK細胞を濃縮するためのCD57の正の選択、または（2）CD16の正の選択（CD16^posNK細胞および単球を濃縮）のいずれかにより、ナチュラルキラー（NK）細胞を濃縮した。これに代えて、CD3枯渇とそれに続くCD56濃縮（T細胞を除去しNK細胞を濃縮する）によって、NK濃縮を実行することもできる。

単離されたg-NK細胞のパーセンテージは、細胞外表面マーカーCD45、CD3、CD56、CD16、CD57、CD7およびCD161の組み合わせで細胞を染色するか、抗FceRI抗体を用いる細胞内染色で細胞を染色することによって、決定した。g^-NK細胞のパーセンテージは、CD45^pos/CD3^neg/CD56^pos/FceRI^neg（FcRγ^neg）である生存細胞として同定された。増大または機能アッセイの前（または後に）細胞選別を実行する場合は、細胞外表面染色だけを使用することができ、g^-NK細胞のパーセンテージは、代用表面マーカープロファイルを使って、CD45^pos/CD3^neg/CD56^pos/CD16^pos/CD57^pos/CD7^dim/neg/CD161^negリンパ球またはCD45^pos/CD3^neg/CD56^pos/NKG2A^neg/CD161^neg、またはそれらの生存細胞として同定される。

新鮮単離NK細胞は直ちにNK細胞増大に使用するか、または凍結保存して増大前に解凍した。NK細胞増大プロトコールは、凍結/解凍された濃縮NK細胞にも、凍結/解凍PBMCから濃縮されたNK細胞にも使用できると考えられる。

増大に先立って、生存CD71^pos（標的細胞マーカー）細胞の数を決定することにより、HLA-E^bright221.AEHリンパ腫細胞をフィーダー細胞として調製した。221.AEHは、HLA-Eを高度に発現する721.221細胞株（HLA-E^bright）に由来するトランスフェクタントである（Lee et. Al 1998,J Immunol 160:4951-60）。上述したPBMCの磁気ビーズ分離後の濃縮NK細胞数の約2.5倍の数の221.AEH標的細胞を、RPMI-1640＋10％ウシ胎児血清（FBS）に、1×10⁶個の細胞/mLとなるように再懸濁した。再懸濁した221.AEH細胞に100Gyを照射した。加えて、上で単離した自家PBMCの残り1/3も、増大用フィーダー細胞として使用するために、照射（100Gy）した。増大中のフィーダー細胞としての照射PBMCの使用は必要ではないが、これがNK細胞増大の効力を改良することは研究によって示されている。

5％ヒトAB（または自家）血清と100IU/mLの組換えIL-2とを補足した95％無血清培地（例えばCellGenix GMP幹細胞増殖培地（SCGM））で構成される培養培地中、0.2×10⁶個のNK細胞/mLの濃度で、約10×10⁶個のNK細胞の、新鮮なまたは解凍した磁気濃縮NK細胞を播種した。播種したNK細胞と、PBMC対NK細胞比が5:1の照射自家PBMCおよび221.AEH対NK細胞が2.5:1の比である照射221.AEHフィーダー細胞との共培養を、0日目に開始した。任意で、照射PBMCフィーダー細胞なしで増大を実行することもできる。共培養細胞は、37℃および5％CO₂で、14日（新鮮細胞）または21日（解凍細胞）にわたって培養した。類似の研究では、AEH対NK細胞の比が1:1の照射221.AEHフィーダー細胞を共培養に含めて、21日ではなく14日間にわたって共培養した点以外は、上述のように解凍NK細胞を共培養した。

増大の最初の5日間は、50ng/mLの抗CD3モノクローナル抗体（OKT3）を加えることによって、フィーダー細胞として機能するPBMCを活性化した。新鮮細胞または解凍細胞について、5日後に抗CD3抗体を洗い流し、その後は2～3日ごとに100IU/mLの組換えIL-2を補充した（14日間の増大を受けている新鮮細胞または解凍細胞についてはd5、d7、d9、d11およびd14、21日間の増大を受けている解凍細胞についてはd5、d7、d9、d11、d14、d16、d18およびd21）。場合により、14日間の増大については、新鮮組換えIL-2を含む培地を5日目、7日目および10日目に補充した。培地を交換または補充するたびに細胞を計数した。g-NKのパーセンテージをd7およびd14にフローサイトメトリーによって評価した。

14日間の増大の例示的要約を図2Aに示す。

比較のために、NKG2C^pos NK細胞を増大させるように設計された代替法によって、NK細胞を増大させた（Bigley et al. 2016,Clin Exp Immunol 185:239-251に記載されている）。代替法では、CD3枯渇とそれに続くCD56マイクロビーズ（Miltenyi Biotec）を使った正の選択によって、NK細胞を濃縮した（上述のような増大前のCD16またはCD57磁気濃縮は含まなかった）。濃縮NK細胞を、30ng/mlの組換えIL-15および非照射フィーダー細胞、721.221（HLA-E^negリンパ腫）または221.AEH（HLA-E^highリンパ腫）標的細胞のどちらかと共に、10:1のNK細胞対標的細胞比で、37℃で14日間培養した。代替法は、フィーダー細胞としての抗CD3活性化自家PBMCを含まなかった。代替法はウシ胎児血清を含有する培養培地も含んだ。

0日目および増大の終了時（14日目または21日目）に、g-NK（CD45^pos/CD3^neg/CD56^pos/FceRI^neg）のパーセンテージをフローサイトメトリーによって決定した。具体的に述べると、Millipore（米国マサチューセッツ州バーリントン）から購入したFcRγ抗体を使用する細胞内フローサイトメトリーによって、g-NKのパーセンテージを決定した。

図2Bおよび2Cは、14日間の増大（新鮮細胞）および解凍細胞の21日間の増大について、上記の方法によって観察された、増大の終了時におけるNK細胞増大を表している。図2Dおよび2Eは、CD3枯渇とそれに続くCD16濃縮（CD3negCD16pos）を伴うプロセスについての結果も、また解凍細胞からの14日間の増大についての結果も、表している点以外は、同様の結果を表している。増大が、提供される方法により、CD3枯渇（CD3^neg）だけで濃縮されたNK細胞から出発して実行された場合は、1000万個のNK細胞から平均で12億個のg-NK細胞の増大が、14日後に達成され、これは、この方法によって増大された21億個のNKG2C^posのサブセットに相当した。21日間の増大については図2Bに示すように（CMVpos CD3neg 14d 対 CMVpos CD3neg 解凍 21dの比較）、また14日間の増大については図2Dに示すように（CMVpos CD3neg 14d 対 CMVpos CD3neg 解凍 14dの比較））、観察された増大は、本方法が新鮮濃縮NK細胞（14日）で実行されたか、それとも前もって凍結され解凍されたNK細胞で実行されたかに関わらず、類似していた。解凍NK細胞の増大は図2Dに図解したデータセットの方が優れていた。使用した221.AEH対NK細胞比が低かったからである（図2Bにおける解凍NK細胞の増大では2.5:1であったのに対して、1:1）。具体的に述べると、ある実験において、まずCD3枯渇だけで濃縮されたNK細胞の場合、新鮮NK細胞からは約12億個のg-NKが、また凍結NK細胞では7億個のg-NKが増大された。図2Dに示すように、提供される方法を、増大前にまずCD3^negCD16^pos細胞を濃縮することによって実行したところ、平均収量は、CD3枯渇のみと比較していくらか増加した。提供される方法を、増大前にまずCD3^neg/CD57^pos細胞を濃縮することによって実行すると、平均収量は、当初1000万個の濃縮NK細胞から出発して14日後に約80億個のg^-NK細胞へと、かなり増加した。対照的に、代替法（Bigley et al. 2016）では、同じ出発集団から約2300万個のg^-NK（または約4500万個のNKG2C^pos NK細胞）しか得られなかった。

図2Cおよび図2Eに示すとおり、CMV^posドナーからの増大後のg-NK細胞のパーセンテージは、増大前の濃縮NK細胞におけるg-NK細胞のパーセンテージと比較して増加していた。221.AEH対NK細胞を2.5:1の同じ比で共培養を実行した場合、前もって凍結することなく14日間増大させた新鮮NK細胞の方が、前もって凍結されていて21日間増大させたNK細胞よりも、濃縮は大きかった（図2C、CMVpos CD3neg 14d 対 CMVpos CD3neg 解凍 21dの比較）。図2Eに示すとおり、凍結されていたNK細胞の比を高くして共培養を実行した場合（1:1の221.AEH対NK細胞比）、増大の終了時におけるg-NK細胞のパーセンテージは、出発NK細胞が新鮮であるか凍結されていたかに関わらず、出発NK細胞間で類似していた。これらの結果は、平均すると、解凍PBMCは14日後には新鮮試料と類似する増大を達成できることを実証している。

増大前のCD3枯渇によって濃縮されたNK細胞では、g-NKのパーセンテージが、最初はNK細胞の6％であったが、増大後は28％まで増加した。最初にCD3枯渇とそれに続くCD16選択によってNK細胞について濃縮された細胞では、より大きな増加が観察された。しかし比率の増加は、CD3枯渇だけによるNK細胞の濃縮またはCD16^pos細胞の濃縮と比べて、初期NK細胞を増大前にCD3^neg/CD57^pos細胞について濃縮した場合には、特に大きかった。具体的に述べると、CD3枯渇とそれに続くCD57の正の選択によってNK細胞を濃縮した場合には、g-NKのパーセンテージが、最初はNK細胞の28％であったが増大後は82％へと増加することが観察された。これらの結果は、提供されるプロセスが1000倍を上回る増大率で高い収量をもたらしうることを裏付けている。

この研究では、g-NKの収量が他のドナーよりも有意に高い「スーパードナー（super donor）」が同定された。この「スーパードナー」では、増大前にCD3枯渇とそれに続くCD57の正の選択によってNK細胞を濃縮した場合に、1000万個のNK細胞が14日後には276億個のg-NKを与え、g-NKのパーセンテージは静止時の31％から増大後は85％まで増加した。

CMV血清陰性ドナーでは、観察されたg-NKの増大がはるかに小さく、CMV血清陰性ドナーからの1000万個のNK細胞から開始して平均収量は2600万個のg-NKだった（図2Bおよび2D）。CMV血清陰性ドナーでは、g-NKサブセットについて優先的増大は見られなかった（0日目に2.1％であったのに対して14日目に1.7％）（図2Cおよび2E）。これらの結果は、CMV感染者ではg^-NKがメモリー様特性を有することと、この特性が221.AEH細胞によって活性化されることとを示唆している。CMV感染細胞は、221.AEH細胞のように、HLA-Eをアップレギュレートしていた（Tomasec et al.（2000）Science,287:1031）。さらにまた、これらの知見は、g^-NKが「メモリー様」NK細胞であることを示した以前の研究（Zhang et al.,2013,J Immunol 190:1402-1406）や、NKG2C^pos NK細胞（CMV血清陽性のドナーからのもの）が同種異系HSCTレシピエントではCMV再活性化に応答して増大するが、CMV血清陰性ドナーからのものはそうではないという以前の研究（Foley et al.,2012,Blood 119:2665-2674）とも合致している。

EBVの存在は後述するゲノム解析によって決定された。簡単に述べると、細胞を37℃の水浴で解凍し、5mlの温かい培地に移してから、遠心分離し、新鮮培地に再懸濁した。各試料から4×10⁶個の細胞を2mlチューブに分注し、残りの細胞は90％FBS＋10％DMSO中で凍結し、-80℃で貯蔵した。Pure LinkゲノムDNAミニキット（カタログ番号K1820-00、Invitrogen）を使って細胞からゲノムDNA（gDNA）を抽出し、Qubit（DNA BR）を使って定量した。またTapeStation（gDNAテープ）を使って品質を確認した。qPCR（Brilliant III Ultra-Fast SYBR（登録商標）Greenマスターミックス、カタログ番号600883、Agilent）では各反応につき50ngのgDNAを使用した。EBNA1用およびGAPDH用のプライマー（IDT）を使ってEBVを検出し、定量した。その結果、照射221.AEHフィーダー細胞で増大させた細胞にはEBVが見いだされないことが示された。

実施例3: 増大されたNK細胞の細胞傷害活性の評価
実施例2に記載の方法によって増大させたNK細胞の機能的活性を、代替法との比較で、標的特異的細胞傷害活性を計測することによって評価した。

実施例2に記載の増大からの凍結NK細胞を解凍し、14日間増大させたNK細胞とHLA欠損K562細胞株およびHLA-E^bright221.AEH細胞株とを、1:1のエフェクター対標的細胞比で共培養することによって、NK細胞の細胞傷害性を評価した。37℃で4時間のインキュベーション後に、ヨウ化プロピジウム（PI）を加え、4色フローサイトメトリーを使って、NK細胞、生標的細胞および死標的細胞の数を分析した。NK細胞の細胞傷害性は、特異的溶解のパーセンテージ（％総溶解-％自発性細胞死）として定量した。図3に示すように、実施例1に記載の代替法によって増大させたNK細胞は、NK細胞によるHLA欠損K562細胞株およびHLA-E^bright 221.AEH細胞株の殺傷を、それぞれ15％から40％および5％から20％に増強することができた（非増大細胞との対比）。しかし、濃縮CD3^negCD57^pos NK細胞から出発した実施例1に記載の方法は、K562細胞および221.AEH細胞のそれぞれ80％（対して、代替法では40％）および53％（対して、代替法では20％）を殺傷することができる増大されたNK細胞をもたらした（図3参照）。

実施例4: 抗CD20抗体と組み合わせた、増大されたNK細胞の、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）の評価
実施例2に記載の方法によって増大させたNK細胞の機能的活性を、抗CD20抗体との組み合わせで抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）を計測することによって評価した。

ADCC細胞傷害性アッセイのために、実施例2に記載の増大からの凍結NK細胞を解凍し、10％FBS補足RPMI-1640培地中、37℃で1時間インキュベートした。次にNK細胞を、10％FBS補足RPMI-1640培地中、10μg/mLリツキシマブ（抗CD20）の存在下で、RAJI標的細胞（1.0×10⁴個の細胞、CD20^posB細胞腫瘍細胞株）と共に、0.5:1、1:1、2.5:1、5:1および10:1のNK細胞対標的細胞比でインキュベートした。ADCCは、腫瘍標的細胞を同定するための抗CD71抗体および細胞死のマーカーとしてのヨウ化プロピジウム（PI）による染色に基づくフローサイトメトリーで決定した（Bigley et al.,（2014）Brain Behav Immun.,39:160-71）。図4Aに示すように、ADCCは、g-NK低対象［増大前のg^-NK平均＝2％、n＝4］（10:1の比で31％殺傷）と比べて、g^-NK高対象［増大前のg^-NK平均＝24％、n＝4］ではかなり高かった（10:1の比で94％殺傷）。

異なるサブセットの活性を比較するために、増大されたNK細胞を、生存NK細胞かつ細胞外表面マーカーで、フローサイトメトリーにより、次の3つのカテゴリーに選別した:通常型［cNK;CD45^pos/CD3^neg/CD56^pos/NKG2C^neg］、適応型（NKG2C^pos）［CD45^pos/CD3^neg/CD56^pos/NKG2C^pos/NKG2A^neg］およびg-NK［CD45^pos/CD3^neg/CD56^pos/CD16^pos/CD57^pos/CD7^neg/CD161^neg］。g-NKは細胞外表現型［CD45^pos/CD3^neg/CD56^pos/CD161^neg/NKG2A^neg］を使って分類することもできると考えられる。この実験では、g^-NK細胞の割合が最も高い（g-NK_平均＝25.3±8.5％）を持つ4人の対象から、通常型NK、適応型（NKG2C^pos）NKおよびg-NKを取得した。図4Bに示すように、1:1のNK細胞-標的細胞比におけるg^-NKのADCC殺傷率（76％）は、NKG2C^pos NK細胞または通常型NK細胞（それぞれ30％または24％）よりも、はるかに良好だった。さらにまた、g^-NKの機能は、それが新鮮NK細胞に由来したか前もって凍結されたNK細胞に由来したかに関わらず、類似していた（図4B）。上述の「スーパードナー」の場合、増大されたg^-NKの殺傷率（97％）は、1:1のNK細胞標的細胞比において、それぞれのNKG2C^pos NK細胞または通常型NK細胞（それぞれ55％または38％）よりも、はるかに良好だった。

これらの結果は、提供される方法が、NKG2C^pos NK細胞または通常型NK細胞よりもはるかに優れたADCCキラーである何十億個ものg^-NKを、わずか2週間で生成させることができることを実証している。

実施例5: ERBBファミリー特異的抗体と組み合わせた、増大されたNK細胞の、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）の評価
実施例2に記載の方法によって増大させたNK細胞の機能的活性を、代替法との比較で、抗HER2抗体と組み合わせた抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）を計測することによって評価した。

ドナーはCMV血清陽性（n＝4）であり、磁気選別したNK細胞（増大前のg-NKパーセンテージ＝18.3±2.9％）を、実施例2に記載の方法を使って増大させた。次に、増大されたNK細胞を、CD57マイクロビーズを使ってCD57^pos「g-NK」画分とCD57^neg「cNK」画分とに磁気選別し、後のADCCアッセイのために凍結保存した。CD57^pos画分とCD57^neg画分の実際のg-NKパーセンテージはそれぞれ82.2±1.6％および2.4±0.7％だった。CD57^pos画分内およびCD57^neg画分内のg-NKパーセンテージは、Millipore（米国マサチューセッツ州バーリントン）から購入したFcRγ抗体を使用する細胞内フローサイトメトリーによって決定した。ADCC細胞傷害性アッセイのために、以前の増大からの凍結NK細胞を解凍し、10％FBS補足RPMI-1640培地中、37℃で1時間インキュベートした。ADCCアッセイは標的として乳がん細胞株SKBR3および頭頸部がん細胞株CAL27を使用して行われた。本発明者らが以前に記載したとおり（Bigley et al.,2014）、増大されたNK細胞を、CD71標識SKBR3標的細胞およびCD71標識CAL27標的細胞（1.0×10⁴個の細胞）と、最終体積2.2mLの標的細胞特異的培地中、1:1、5:1、10:1および20:1のNK細胞:標的細胞比で共培養した。SKBR3アッセイに使用した培地は、2.5μg/mLトラスツズマブ（抗HER2）を含む10％FBS補足マッコイ5A培地であり、CAL27アッセイに使用した培地は、10μg/mLセツキシマブ（抗EGFR）を含む10％FBS補足DMEMである。いずれの場合も、処置抗体が存在しない状態で、基礎細胞傷害性も測定した。自発的細胞死（すべてのアッセイについて10％未満）を考慮に入れるために、標的細胞のみのチューブを使用した。抗体単独に起因すると考えられる細胞死を説明するために標的細胞＋抗体のチューブ（NK細胞の添加なし）も設けた。37℃で4時間のインキュベーション後に、細胞を洗浄し、チューブ内のNK細胞の数を定量するために、抗CD3抗体および抗CD56抗体で染色した。最終洗浄後に、ヨウ化プロピジウム（PI）を加え、4色フローサイトメトリーを使って、NK細胞、生標的細胞および死標的細胞の数を決定した（Bigley et al.,2018）。細胞傷害性は、各NK細胞容量における％総細胞死から％自発的細胞死を差し引くことによって決定した（基礎細胞傷害性＝％総細胞死-％自発的細胞死）。SKBR3細胞株とCAL27細胞株はATCC（米国バージニア州マナッサス）から購入した。

図5Aおよび5Bに示すように、g-NKは、SKBR3標的およびCAL27標的を通常型NK細胞よりはるかによく殺傷することがわかった。具体的に述べると、g-NKは、トラスツズマブが存在する場合に、20:1のNK:標的比で46％のSKBR3細胞を殺傷し、それは、同じ比のcNKによって殺傷されるSKBR3細胞が18％であるのと比べて、はるかに多かった（n＝4）（図5A）。基礎細胞傷害性（トラスツズマブなし）は、20:1のNK:標的比において、g-NKでは18％、cNKでは14％だった。通常型NK細胞のADCCは、g-NK細胞の基礎細胞傷害性と同じだった。同様に図5Bは、g-NKが、セツキシマブが存在する場合に、20:1のNK:標的比で80％のCAL27細胞を殺傷し、それは、同じ比のcNKによって殺傷されるCAL27細胞が50％であるのと比べて、はるかに多かったことを示す結果を表している（n＝4）。基礎細胞傷害性（セツキシマブなし）は、20:1のNK:標的比で、g-NKとcNKのどちらについても12％だった。

上記と同じドナーNK細胞を使った別の一連の実験では、NK細胞を結腸直腸がん細胞株HT-29およびSW-480標的細胞または肺がん細胞株A-549標的細胞と、1:1、5:1、10:1および20:1のNK細胞対標的細胞比で共培養した。HT-29アッセイに使用した培地は5μg/mLセツキシマブを含む10％FBS補足マッコイ5A培地であり、SW-480アッセイに使用した培地は5μg/mLセツキシマブを含む10％FBS補足リーボビッツL-15培地であり、A-549アッセイに使用した培地は5μg/mLセツキシマブを含む10％FBS補足F-12K培地である。ADCCは、腫瘍標的細胞を同定するための抗CD71抗体および細胞死のマーカーとしてのPIによる染色に基づくフローサイトメトリーで決定した。処置抗体が存在しない状態で、基礎細胞傷害性も測定した。

図6A～6Cの結果は、（上記と同じドナーNK細胞を使用して）g-NKはHT-29、SW-480およびA-549標的をcNKよりはるかによく殺傷するとわかったことを示している。具体的に述べると、図6Aに示すとおり、g-NKは、セツキシマブが存在する場合に、20:1のNK:標的比で35％のHT-29細胞を殺傷し、それは、同じ比のcNKによって殺傷されるHT-29細胞が14％であるのと比べて優れていた（n＝4）。基礎細胞傷害性（セツキシマブなし）は、20:1のNK:標的比で、g-NKでは14％、通常型NK細胞では11％だった。同様に図6Bは、g-NKが、セツキシマブが存在する場合に、20:1のNK:標的比で56％のSW-480細胞を殺傷し、それは、同じ比のcNKによって殺傷されるSW-480細胞が23％であるのと比べて、はるかに多かったことを示す結果を表している（n＝4）。基礎細胞傷害性（セツキシマブなし）は、20:1のNK:標的比で、g-NKでは24％、cNKでは18％だった。さらにまた、図6Cは、g-NKが、セツキシマブが存在する場合に、20:1のNK:標的比で62％のA-549細胞を殺傷し、それは、同じ比のcNKによって殺傷されるA-549細胞が23％であるのと比べて著しく優れていたことを示している（n＝4）。基礎細胞傷害性（セツキシマブなし）は、20:1のNK:標的比で、g-NKでは23％、通常型NK細胞では17％だった。cNK細胞のADCCは、3つすべての細胞株について、g-NK細胞の基礎細胞傷害性と同じだった。

総合するとこれらの結果は、増大されたg-NKが、液状腫瘍に対するADCCも固形腫瘍に対するADCCも等しく増強することができ、NK細胞のADCCに対して高度または軽度の感受性を有する腫瘍に対するADCCも増強できることを示している。

実施例6: 増大されたNK細胞のインビボでの持続性の評価
実施例2に記載するようにNK細胞を増大させた。1週間の順化後に、1×10⁷個の増大されたg-NK（新鮮または凍結/解凍）またはcNK（凍結/解凍）を雌NOD scidガンマ（NSG）マウスに単回注射し、IL-15を補足した（2μg I.P. 3日ごと）（表E1参照）。g-NKは一人のCMV血清陽性ドナーから増大させ（g-NKのパーセンテージは増大前が61％、増大後が90％だった）、一方、cNKは一人のCMV血清陰性ドナーから増大させた（g-NKのパーセンテージは増大前も増大後も0％だった）。g-NKのパーセンテージは細胞内フローサイトメトリーを使って確認した。増大後に凍結され、この研究に使用するために解凍された細胞の場合、凍結細胞用の凍結培地は90％FBSおよび10％DMSOであった。凍結細胞産物はマウスに投与する前に湯浴で素早く解凍した（37℃）。

各NK細胞のインビボでの持続性を決定するために血液試料を収集した。血液収集のために、注入後、5、8、14、15および22日目に、EDTAバキュテナーを使って50μLを採血し、後のフローサイトメトリーのために凍結した（10％DMSO添加）（図7A）。22日目にすべてのマウスを屠殺し、骨髄および脾臓を生存可能に凍結した（90％FBSおよび10％DMSO）（それぞれ図7B、図7C）。

（表Ｅ１）持続性研究の計画

図7Aに示すように、新鮮単離g-NKまたは凍結解凍g-NKはどちらも、NSGマウスの血流中で凍結解凍cNKよりも十分に長く持続することが、すべての時点（5、8、14、15および22日目）で観察された。具体的には、22日後には、脾臓において持続しているcNKはほとんど見つからなかったが、g-NKは相当な数が検出された（図7B）。骨髄でもg-NKの持続性の方がcNKの持続性より優れていた（図7C）。

実施例7: 抗CD20抗体と組み合わせた、増大されたNK細胞による、抗腫瘍活性の評価
実施例2に記載の方法によって増大させたNK細胞の機能的活性を、抗CD20抗体と組み合わせて注射した場合のインビボでの腫瘍に対する阻害を計測することによって評価した。

5×10⁵個のルシフェラーゼ標識Rajiヒトリンパ腫細胞株を雌NOD scidガンマ（NSG）マウスに静脈内注射し、2日間成長させた。モノクローナル抗体リツキシマブをマウスに単独でI.P.投与するか、21日間にわたって3回I.V.投与される15×10⁶個の増大されたg-NK細胞（実施例2）と組み合わせてI.P.投与した（表E2参照）。生物発光イメージングを使って毎週腫瘍量をモニターし、生存率を2または3日ごとに記録した。g-NKは一人のCMV血清陽性ドナーから増大させ（g-NKのパーセンテージは増大前が61％、増大後が90％だった）、一方、cNKは一人のCMV血清陰性ドナーから増大させた（g-NKのパーセンテージは増大前も増大後も0％だった）。g-NKのパーセンテージは細胞内フローサイトメトリーを使って確認した。

（表Ｅ２）Raji効力研究の計画

g-NKの養子移入はRajiリンパ腫の異種移植変モデルにおけるリツキシマブの効力を著しく増強し、g-NKの注入は、NSGマウスの生存率を、無処置のマウスまたはリツキシマブ単独で処置されたマウスとの比較で高めることができた。図8Aおよび8Bに示すように、処置を受けなかったマウスは、注入の7日後には迅速な腫瘍成長を呈し、25日目より前に無処置のマウスはすべて死んだ。リツキシマブ単独を投与されたマウスは、28日目の後に、遅延はしたが依然として迅速な腫瘍成長を示し、生存率は30日目の後に低下し始めた。リツキシマブと組み合わされたg-NKの投与を受けたマウスは、28日目の後にわずかな腫瘍成長を呈したに過ぎず、すべてのマウスが35日目まで生残した。

これらの結果は、モノクローナル抗体と組み合わせると、g-NKの抗リンパ腫効果が、インビボで活用されうることを実証している。

実施例8: 抗CD38抗体または抗CD319抗体と組み合わせた、増大されたNK細胞の、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）の評価
実施例2に記載の方法によって増大させたNK細胞の機能的活性を、代替法との比較で、ダラツママブ（Daratumamab）（抗CD38）またはエロツザマブ（Elotuzamab）（抗CD319）と組み合わせた抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）を計測することによって評価した。

増大前（新鮮単離）ADCC:ドナーはCMV血清陽性（n＝14）およびCMV血清陰性（n＝2）だった。すべてのドナーをg-NK細胞のパーセンテージについてプレスクリーニングし、g-NK細胞の比率に基づいて「g-NK」ドナー（n＝10 CMV^pos）または「通常型」ドナー（n＝4 CMV^pos、n＝2 CMV^neg）に大別した。「g-NK」ドナーにおけるg-NKの比率は30.0±2.1％であり、一方、「通常型」ドナーではg-NKの比率が1.6±0.4％しかなかった。「g-NK」ドナーからCD57^posNK細胞を磁気選別し、「通常型」ドナーからバルクNK細胞（CD3^neg/CD56^pos）を磁気選別した。「g-NK」ドナーおよび「通常型」ドナーから磁気選別された画分の実際のg-NKパーセンテージは、それぞれ84.3±2.4％および1.6±0.4％だった。したがって、一般に、通常型ドナーからのNK細胞（cNK）では、細胞の約98～99％がFcεR1γ^posであることがわかった。各画分内のg-NKパーセンテージは、Millipore（米国マサチューセッツ州バーリントン）から購入したFcRγ抗体を使用する細胞内フローサイトメトリーによって決定した。

ADCC細胞傷害性アッセイのために、凍結PBMCを解凍し、10％FBS補足RPMI-1640培地中、37℃で1時間インキュベートした。次に、「g-NK」ドナーおよび「通常型」ドナーからそれぞれCD57^posNK細胞およびバルクNK細胞を単離するために、磁気ビーズ分離を行った。ADCCアッセイは標的として多発性骨髄腫細胞株MM.1S（ATCC、バージニア州マナッサス）を使用して行われ、Bigley et al. 2014に記載の方法と同様に、NK細胞をCD71標識MM.1S標的細胞（1.0×10⁴個の細胞）と、最終体積2.2mLの標的細胞特異的培地中、0.5:1、1:1、2.5:1および5:1のNK細胞:標的細胞比で、共培養した。ADCCアッセイに使用した培地は、1μg/mLダラツムマブ（抗CD38）または1μg/mLエロツズマブ（抗CD319）を含む10％FBS補足RPMI-1640培地である。いずれの場合も、処置抗体が存在しない状態で、基礎細胞傷害性も測定した。自発的細胞死（すべてのアッセイについて10％未満）を考慮に入れるために、標的細胞のみのチューブを使用した。37℃で4時間のインキュベーション後に、細胞を洗浄し、チューブ内のNK細胞の数を定量するために、抗CD3抗体および抗CD56抗体で染色した。最終洗浄後に、ヨウ化プロピジウム（PI）を加え、4色フローサイトメトリーを使って、NK細胞、生標的細胞および死標的細胞の数を決定した（Bigley et al.,2018）。

増大後（増大させた）ADCC:5人のドナーをg-NK細胞のパーセンテージについてプレスクリーニングし、g-NK細胞の比率に基づいて「g-NK」ドナー（n＝3）または「通常型」ドナー（n＝2）に大別した。「g-NK」ドナーにおけるg-NKの比率は30.3±2.0％であり、一方、「通常型」ドナーではg-NKの比率が1.6±0.4％しかなかった。「g-NK」ドナーからCD57^posNK細胞を磁気選別し、「通常型」ドナーからバルクNK細胞（CD3^neg/CD56^pos）を磁気選別した。「g-NK」ドナーおよび「通常型」ドナーから磁気選別された画分の実際のg-NKパーセンテージは、それぞれ84.0±2.5％および1.6±0.4％だった。次に、実施例2に記載したようにg-NK画分およびcNK画分を増大させ、上述のように、後のADCCアッセイのために凍結保存した。

ダラツムマブまたはエロツズマブと組み合わせた場合、3つの異なるエフェクター：腫瘍比（E:T 1:1、2.5:1、および5:1 ）で、g-NKはMM.1S多発性骨髄腫細胞に対してcNKよりも強いADCCを有する（p＜0.001) 。具体的に述べると、ダラツムマブまたはエロツズマブが存在する場合、新鮮単離g-NKは、MM.1S細胞に対し、4つすべてのNK細胞用量において、cNKより著しく高い細胞傷害性を有した（図9A参照）。同様に、ダラツムマブまたはエロツズマブと組み合わせた場合、増大されたg-NKは増大されたcNKよりも強い抗骨髄腫ADCCを有した（図9B参照）。抗体が存在しない場合、MM.1S細胞に対するg-NKとcNK（非増大物または増大物）の細胞傷害性には差がなかった（p＝0.3；図9Aおよび9B参照）。総合すると、このデータは、g-NKが多発性骨髄腫に対して強い抗体依存性細胞傷害活性を有することを示している。

実施例9: 抗CD38抗体または抗CD319抗体と組み合わせた、増大されたNK細胞による、抗腫瘍活性の評価
実施例2に記載の方法によって増大させたNK細胞の機能的活性を、抗CD38抗体または抗CD319抗体と組み合わせて注射した場合のインビボでの腫瘍に対する阻害を計測することによって評価した。

1×10⁶個のルシフェラーゼ標識MM.1Sヒト骨髄腫細胞株を雌NOD scidガンマ（NSG）マウスに静脈内注射し、7日間成長させた。モノクローナル抗体ダラツムマブまたはエロツズマブをマウスに単独でI.P.投与するか、31日間にわたって6回I.V.投与される増大されたg-NK細胞または生理学的レベルの対照物質cNK細胞と組み合わせてI.P.投与した（表E3参照）。生物発光イメージングを使って毎週腫瘍量をモニターした。研究の終了時に、g-NKアームおよびcNKアームのマウスそれぞれ3匹から骨髄試料および脾臓試料を採取し、後のフローサイトメトリー分析で各NK集団の持続性を決定するために、生存可能に凍結した。g-NKは一人のCMV血清陽性ドナーから増大させ（g-NKのパーセンテージは増大前が61％、増大後が90％だった）、一方、cNKは一人のCMV血清陰性ドナーから増大させた（g-NKのパーセンテージは増大前も増大後も0％だった）。g-NKのパーセンテージは細胞内フローサイトメトリーを使って確認した。

実施例2に記載したようにg-NK細胞を増大させて、各回、2×10⁷個の細胞を投与し、一方、非増大cNKは、各回、3×10⁵個の細胞を投与した。cNK用量はヒトにおける生理的レベルのNK細胞/kgに等しい（Cooley et al.,2019）。

（表Ｅ３）MM効力研究の計画

MM.1Sが接種されダラツムマブまたはエロツズマブのどちらか一方で処置されたNSGマウスにおける腫瘍量および生存率に対する、養子移入されたg-NKの利益を、図10および11に記載する。ダラツムマブとg-NKとで処置されたマウスは、ダラツムマブ単独で処置されたマウスまたはダラツムマブ＋生理的レベルのcNK細胞で処置されたマウスよりも、腫瘍量（BLI）が著しく低かった（図10A参照）。加えて、エロツズマブとg-NKとで処置されたマウスも、エロツズマブ単独で処置されたマウスまたはエロツズマブ＋生理的レベルのcNK細胞で処置されたマウスの場合より、腫瘍量が低かった（図10B参照）。さらにまた、図11A（ダラツムマブ）および図11B（エロツズマブ））に示すように、g-NKとダラツムマブまたはエロツズマブとの組み合わせは、ビヒクル、mAb単独、g-NK単独、またはmAb＋生理的レベルのcNKで処置されたマウスと比較した場合に、より優れた生存率をもたらした。総合すると、このデータは、モノクローナル抗体と組み合わせると、g-NKの抗骨髄腫効果が、インビボで活用されうることを実証している。

図12A～12Cには、MM.1Sが接種されダラツムマブまたはエロトズマブのどちらか一方で処置されたNSGマウスにおけるg-NKの優れた持続性が記載されている。g-NKはダラツムマブ処置マウスの脾臓と骨髄では、cNKよりも高いレベルで持続し（図12Aおよび12B参照）、一方、血中でのg-NKとcNKの持続性には差がなかった（図12C参照）。さらにまた、ダラツムマブ処置マウスの骨髄および脾臓におけるg-NKの数は、他のどの群の場合よりも高かった（図12Aおよび12B参照）。g-NKは、エロツズマブ処置マウスの脾臓および血液では、cNKより高いレベルで持続し（図12Aおよび12C）、一方、骨髄でのg-NKとcNKの持続性には差がなかった（図12B参照）。g-NKのみ（ダラツムマブもエロツズマブもなし）で処置したマウスの血液におけるg-NKの数は、他のどの群よりも著しく高かった（図12C参照）。

実施例10: g-NK細胞に関する細胞表面マーカーの評価
この実施例では、一つには、標的表面マーカーの欠如に起因するg-NK細胞の抗体からの保護を実証する。

およそ2.0×10⁵個のNK細胞および/またはMM.1S細胞もしくはRaji細胞をフローチューブに分注し、2μLの7-AAD生存性色素、ならびに表E4に記載するように、2μLの抗CD45、2μLの抗CD20、2μLの抗CD38、2μLの抗CD3、10μLの抗SLAMF7および2μLの抗CD56抗体で染色した。4℃で10分間のインキュベーション後に、細胞を洗浄し、抗FceRI抗体（Millipore）を使って細胞内染色を行った。染色プロセスの完了後に、CD20、CD38およびSLAMF7発現g-NK、cNKおよびMM.1SまたはRaji細胞のパーセンテージを、8色フローサイトメトリー（Miltenyi MACSQuant Analyzer 10）によって評価した。

（表Ｅ４）NK、MMおよびRaji細胞におけるCD20、CD38およびSLAMF7発現を決定するためのフローサイトメトリーパネル

＊FcRgは細胞内エピトープである。

g-NK、cNKおよびMM.1S細胞におけるCD20、CD38およびSLAMF7の発現を図13A～13Dに提示する。g-NKとcNKはどちらも、Rajiリンパ腫細胞上に高度に発現しているCD20の発現を欠いていた（図13A）。g-NKによるCD38の発現は、cNK細胞およびMM.1S細胞の場合よりもはるかに少なかった（図13B参照；両方についてp＜0.001）。g-NKとcNKの間でSLAMF7の発現に差はなかった（p＝0.9）が、g-NKとcNKはどちらも、MM.1S細胞よりはるかに低いSLAMF7の発現を呈した（図13C参照；両方についてp＜0.001）。増大されたg-NKでは、増大されたcNKと比較した場合に、CD38^posNK細胞の低減したパーセンテージも見られた（図13D参照、p＜0.001）。さらに、CD38発現の強度（MFI）は、CD38pos cNKおよびMM1/S細胞と比較して、CD38pos g-NK細胞で低減した（図13E、p＜0.001）。 cNKおよびMM.1S細胞に対するg-NK細胞のCD38発現の低減を示す代表的なヒストグラムを、図13Fに示す。

g-NKによるCD20、CD38またはSLAMF7の発現の欠如は、リツキシマブ（抗CD20）、ダラツムマブ（抗CD38）またはエロツズマブ（抗SLAMF7）によるmAb誘導性フラトリサイドからの保護を与えた。総合するとこのデータは、とりわけダラツママブなどの治療用抗体の存在下で、g-NKの持続性がcNKと比較して有利である理由を、さらに例証している。

g-NK細胞におけるCD38発現が、通常型NK細胞と比較して減少しているまたは低いという観察結果は、g-NK細胞を濃縮するためのマーカーとしてCD38を使用することができるという戦略を裏付けている。CD38とg-NK細胞表現型との逆相関は、実施例2に記載の増大法におけるCD57濃縮に代わる戦略と合致する。これらの知見は、NK細胞が、免疫親和性に基づく分離により、T細胞を除去するためのCD3^pos細胞の枯渇（CD3枯渇）と、それに続くCD56^posNK細胞を濃縮するためのCD56選択と、それに続くCD38^pos細胞を除去するまたは枯渇させるためのCD38に対する負の選択、すなわちCD3^negCD56^posCD38^negによってPBMCから濃縮される、g-NK細胞を増大させるための方法を裏付けている。このNK細胞サブセットの単離および濃縮に続いて、CD3^negCD56^posCD38^negNK細胞サブセットを凍結するか、または新鮮な状態で使用し、次に実施例2または図2に記載の方法に従って、例えば照射221.AEH標的細胞（例えば2.5:1または2:1の221.AEH対NK細胞）および任意で照射PBMCフィーダー細胞（例えば5:1のPBMC対NK細胞）と共に、組換えIL-2（例えば100IU/mLまたは500IU/mL）の存在下で、約14日間にわたって培養することなどによって、増大させることができる。以下の実施例25に示される結果は、IL-21（例えば、IL-2（500IU/mL）、IL-15（10ng/mL）、およびIL-21（25ng/mL））をさらに含む同様の増大法が、CD38発現が低下したg-NK細胞をもたらし、同時に増大およびエフェクター機能を改善することをさらに支持するものである。照射PBMCフィーダー細胞を増大において使用する場合、その増大の少なくとも一部分は、実施例2に記載するように、細胞を活性化するために抗CD3モノクローナル抗体（OKT3）とのインキュベーションを含む。

実施例11: トラスツズマブまたはセツキシマブと組み合わせた、増大されたNK細胞による、卵巣がん細胞に対する抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）の評価
実施例2に記載の方法によって増大させたNK細胞の機能的活性を、代替法との比較で、トラスツズマブまたはセツキシマブと組み合わせた抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）を計測することによって評価した。

増大前（新鮮単離）ADCC:ドナーはCMV血清陽性（n＝14）およびCMV血清陰性（n＝2）だった。すべてのドナーをg-NK細胞のパーセンテージについてプレスクリーニングし、g-NK細胞の比率に基づいて「g-NK」ドナー（n＝10 CMV^pos）または「通常型」ドナー（n＝4 CMV^pos、n＝2 CMV^neg）に大別した。「g-NK」ドナーにおけるg-NKの比率は30.0±2.1％であり、一方、「通常型」ドナーではg-NKの比率が1.6±0.4％しかなかった。「g-NK」ドナーからCD57^posNK細胞を磁気選別し、「通常型」ドナーからバルクNK細胞（CD3^neg/CD56^pos）を磁気選別した。「g-NK」ドナーおよび「通常型」ドナーから磁気選別された画分の実際のg-NKパーセンテージは、それぞれ84.3±2.4％および1.6±0.4％だった。各画分内のg-NKパーセンテージは、Millipore（米国マサチューセッツ州バーリントン）から購入したFcRγ抗体を使用する細胞内フローサイトメトリーによって決定した。

ADCC細胞傷害性アッセイのために、凍結PBMCを解凍し、10％FBS補足RPMI-1640培地中、37℃で1時間インキュベートした。次に、「g-NK」ドナーおよび「通常型」ドナーからそれぞれCD57^posNK細胞およびバルクNK細胞を単離するために、磁気ビーズ分離を行った。ADCCアッセイは標的として卵巣がん細胞株SKOV3（ATCC）を使用して行われた。Bigley et al.2014に記載の方法を使って、NK細胞を、最終体積2.2mLの標的細胞特異的培地中、CD71標識SKOV3標的細胞（1.0×10⁴個の細胞）と、0.5:1、1:1、2.5:1および5:1のNK細胞:標的細胞比で共培養した。ADCCアッセイに使用した培地は、1μg/mLトラスツズマブ（抗Her2）を含む10％マッコイ5A培地である。いずれの場合も、処置抗体が存在しない状態で、基礎細胞傷害性も測定した。自発的細胞死（すべてのアッセイについて10％未満）を考慮に入れるために、標的細胞のみのチューブを使用した。37℃で4時間のインキュベーション後に、細胞を洗浄し、チューブ内のNK細胞の数を定量するために、抗CD3抗体および抗CD56抗体で染色した。最終洗浄後に、ヨウ化プロピジウム（PI）を加え、4色フローサイトメトリーを使って、NK細胞、生標的細胞および死標的細胞の数を決定した（Bigley et al.,2018）。

トラスツズマブまたはセツキシマブと組み合わせた場合、SKOV3卵巣がん細胞に対するg-NKのADCCは、cNKより強かった。具体的に述べると、トラスツズマブが存在する場合、新鮮単離g-NKは、SKOV3細胞に対し、4つすべてのNK細胞用量において、cNKより著しく強い細胞傷害性を有した（図14A参照）。同様に、トラスツズマブまたはセツキシマブと組み合わせた場合、増大されたg-NKは増大されたcNKよりもはるかに強い抗SKOV3 ADCCを有した（図14Bおよび14C参照）。抗体が存在しない場合、SKOV3細胞に対するg-NKとcNK（非増大物または増大物）の細胞傷害性には差がなかった（図14Aおよび14B参照）。総合すると、このデータは、g-NKが卵巣がんのような固形腫瘍悪性疾患に対して強い抗体依存性細胞傷害活性を有することを示している。

実施例12: 抗HER2抗体と組み合わせた、増大されたNK細胞による、抗腫瘍活性および持続性の評価
実施例2に記載の方法によって増大させたNK細胞の機能的活性を、抗HER2抗体（トラスツズマブ）と組み合わせて注射した場合のインビボでの腫瘍に対する阻害を計測することによって評価した。

5×10⁶個のSKOV3ヒト卵巣がん細胞株を雌NOD scidガンマ（NSG）マウスに静脈内注射し、30日間成長させた。モノクローナル抗体トラスツズマブをマウスに単独でI.P.投与するか、72日間にわたって3～6回I.V.投与される増大されたg-NK細胞またはcNK細胞と組み合わせてI.P.投与した（表E5参照）。カリパス測定を使って毎週腫瘍量をモニターした。研究の終了時に、g-NKアームおよびcNKアームのマウスから骨髄試料および脾臓試料を採取し、後のフローサイトメトリー分析のために、生存可能に凍結した。g-NKは一人のCMV血清陽性ドナーから増大させ（g-NKのパーセンテージは増大前が61％、増大後が90％だった）、一方、cNKは一人のCMV血清陰性ドナーから増大させた（g-NKのパーセンテージは増大前も増大後も0％だった）。g-NKのパーセンテージは細胞内フローサイトメトリーを使って確認した。

（表Ｅ５）SKOV3効力研究の計画

SKOV3が接種されトラスツズマブで処置されたNSGマウスにおける腫瘍量および生存率に対する、養子移入されたg-NKの利益を、図15A～Bに記載する。トラスツズマブとg-NKとで処置されたマウスは、トラスツズマブ単独で処置されたマウスまたはトラスツズマブ＋同数のcNK細胞で処置されたマウスよりも、腫瘍サイズが小さかった（図15A参照）。加えて、g-NKとトラスツズマブとの組み合わせは、ビヒクル、トラスツズマブ単独、またはトラスツズマブ＋cNKで処置されたマウスと比較して、生存率が増加する傾向をもたらした（図15B参照）。総合すると、このデータは、モノクローナル抗体と組み合わせると、g-NKの抗腫瘍効果が、固形悪性疾患に対して、インビボで活用されうることを実証している。

血液試料、骨髄試料および脾臓試料は、SKOV3が接種されトラスツズマブで処置されたNSGマウスにおけるg-NKの優れた持続性を示した。g-NKは、トランスツズマブ処置マウスの血液（図16A参照）、脾臓（図16B参照）および骨髄（図16C参照）において、cNKより高レベルに持続した。

実施例13: ダラツママブと組み合わせた、増大されたNK細胞による、多発性骨髄腫細胞に対する抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）の評価
実施例2に記載の方法によって増大させたNK細胞の機能的活性を、代替法との比較で、ダラツムマブまたはエロツザマブと組み合わせた抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）を計測することによって評価した。

ドナーはCMV血清陽性（n＝5）であり、磁気選別したNK細胞（増大前のg-NKパーセンテージ＝34.6±12.6％）を、実施例2に記載の方法を使って増大させた。次に、増大されたNK細胞を、CD57マイクロビーズを使ってCD57^pos「g-NK」画分とCD57^neg「cNK」画分とに磁気選別し、後のADCCアッセイのために凍結保存した。CD57^pos画分とCD57^neg画分の実際のg-NKパーセンテージはそれぞれ83.1±1.6％および1.8±0.5％だった。CD57^pos画分内およびCD57^neg画分内のg-NKパーセンテージは、Millipore（米国マサチューセッツ州バーリントン）から購入したFcRγ抗体を使用する細胞内フローサイトメトリーによって決定した。

ADCC細胞傷害性アッセイのために、以前の増大からの凍結NK細胞を解凍し、10％FBS補足RPMI-1640培地中、37℃で1時間インキュベートした。ADCCアッセイは、標的として多発性骨髄腫細胞株ARH-77およびMM.1R（それぞれATCCから）を使用して行われた。Bigley et al.2014に記載の方法を使って、増大されたNK細胞を、最終体積2.2mLの標的細胞特異的培地中、CD71標識ARH-77標的細胞およびMM.1R標的細胞（1.0×10⁴個の細胞）と、1:1、2.5:1、5:1および10:1のNK細胞:標的細胞比で共培養した。アッセイに使用した培地は、1μg/mLダラツムマブ（抗CD38）を含む10％FBS補足RPMI-1640培地である。いずれの場合も、処置抗体が存在しない状態で、基礎細胞傷害性も測定した。自発的細胞死（すべてのアッセイについて10％未満）を考慮に入れるために、標的細胞のみのチューブを使用した。37℃で4時間のインキュベーション後に、細胞を洗浄し、チューブ内のNK細胞の数を定量するために、抗CD3抗体および抗CD56抗体で染色した。最終洗浄後に、ヨウ化プロピジウム（PI）を加え、4色フローサイトメトリーを使って、NK細胞、生標的細胞および死標的細胞の数を決定した（Bigley et al.,2018）。

ダラツムマブと組み合わせた場合、g-NKは多発性骨髄腫細胞株に対して強いADCCを有する。具体的に述べると、ダラツムマブが存在する場合、増大されたg-NKは、ARH-77細胞に対し、4つすべてのNK細胞用量において、増大されたcNKより著しく強い細胞傷害性を有した（図17A参照）。ダラツムマブが存在する場合、増大されたg-NKは、MM.1R細胞に対しても、4つすべてのNK細胞用量において、増大されたcNKより著しく強い細胞傷害性を有した（図17B参照）。総合すると、このデータは、g-NKが多発性骨髄腫細胞株に対してMM.1Sを超える強い抗体依存性細胞傷害活性を有することを示している。

実施例14: セツキシマブと組み合わせた、増大されたg-NK細胞による、多発性骨髄腫細胞に対する抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）の評価
実施例2に記載の方法によって増大させたNK細胞の機能的活性を、代替法との比較で、セツキシマブと組み合わせた抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）を計測することによって評価した。

増大前（新鮮単離）ADCC:ドナーはCMV血清陽性（n＝14）およびCMV血清陰性（n＝2）だった。すべてのドナーをg-NK細胞のパーセンテージについてプレスクリーニングし、g-NK細胞の比率に基づいて「g-NK」ドナー（n＝10 CMV^pos）または「通常型」ドナー（n＝4 CMV^pos、n＝2 CMV^neg）に大別した。「g-NK」ドナーにおけるg-NKの比率は30.0±2.1％であり、一方、「通常型」ドナーではg-NKの比率が1.6±0.4％しかなかった。「g-NK」ドナーからCD57^posNK細胞を磁気選別し、「通常型」ドナーからバルクNK細胞（CD3^neg/CD56^pos）を磁気選別した。「g-NK」ドナーおよび「通常型」ドナーから磁気選別された画分の実際のg-NKパーセンテージは、それぞれ82.2±1.6％および2.4±0.7％だった。各画分内のg-NKパーセンテージは、Millipore（米国マサチューセッツ州バーリントン）から購入したFcRγ抗体を使用する細胞内フローサイトメトリーによって決定した。

ADCC細胞傷害性アッセイのために、凍結PBMCを解凍し、10％FBS補足RPMI-1640培地中、37℃で1時間インキュベートした。次に、「g-NK」ドナーおよび「通常型」ドナーからそれぞれCD57^posNK細胞およびバルクNK細胞を単離するために、磁気ビーズ分離を行った。ADCCアッセイは標的として結腸直腸がん細胞株SW-480を使用して行われた。Bigley et al. 2014に記載の方法を使って、NK細胞を、最終体積2.2mLの標的細胞特異的培地中、CD71標識SW-480（ATCC）標的細胞（1.0×10⁴個の細胞）と、0.5:1、1:1、2.5:1および5:1のNK細胞:標的細胞比で共培養した。SW-480アッセイに使用した培地は、5μg/mLセツキシマブ（抗EGFR）を含む10％FBS補足リーボビッツL-15培地である。いずれの場合も、処置抗体が存在しない状態で、基礎細胞傷害性も測定した。自発的細胞死（すべてのアッセイについて10％未満）を考慮に入れるために、標的細胞のみのチューブを使用した。37℃で4時間のインキュベーション後に、細胞を洗浄し、チューブ内のNK細胞の数を定量するために、抗CD3抗体および抗CD56抗体で染色した。最終洗浄後に、ヨウ化プロピジウム（PI）を加え、4色フローサイトメトリーを使って、NK細胞、生標的細胞および死標的細胞の数を決定した（Bigley et al.,2018）。

セツキシマブと組み合わせた場合、g-NKは、SW-480結腸直腸がん細胞に対してcNKより強いADCCを有する（図18Aおよび18B参照）。セツキシマブが存在する場合、新鮮単離g-NKは、SW-480細胞に対し、4つすべてのNK細胞用量において、cNKより著しく強い細胞傷害性を有した（図18A参照）。同様に、セツキシマブと組み合わせた場合、増大されたg-NKは増大されたcNKよりもはるかに強い抗SW480 ADCCを有した（図18B参照）。抗体が存在しない場合、SW-480細胞に対するg-NKとcNK（非増大物または増大物）の細胞傷害性には差がなかった（図18Aおよび18B参照）。総合すると、このデータは、g-NKが結腸直腸がんのような固形腫瘍悪性疾患に対して強い抗体依存性細胞傷害活性を有することを示している。

実施例15: g-NKが媒介するADCCの効力に対するCD16 158V多型の評価
158Vは、タンパク質の158番目のアミノ酸位置に、一般的なフェニルアラニン（F）の代わりにアミノ酸バリン（V）が存在するCD16の遺伝子多型である（Koene et al.,1997）。これは、CD16の発現量の増加と抗体親和性の増加につながり、それがCD16 158V+NK細胞による増強されたADCCをもたらす（Hatjiharissi et al.,2007）。158V/Vドナーおよび158V/FドナーからのNK細胞は、ARH-77骨髄腫細胞およびDaudiリンパ腫細胞を、158F/Fドナーからのものよりはるかに強くADCCによって殺傷し、158V/Vドナーの能力が最も高いことが観察された（Hatjiharissi et al.,2007）。この実施例は、少なくとも一つには、158V多型を保因するg-NKに関するADCC効力の相関を実証している。

40人のCMV血清陽性ドナーをスクリーニングして、g-NKを最も高い比率で持つ12人のドナーを決定した。これらのドナーのg-NKを磁気ビーズ分離（CD3^neg/CD57^pos）によって濃縮し、以下の組み合わせの腫瘍/抗体に対するADCCについて試験した:1）SW-480/セツキシマブ;2）SKOV3/トラスツズマブ;3）SKOV3/セツキシマブ;4）MM.1S/ダラツムマブ;および5）MM.1S/エロツズマブ。g-NKのADCCを、g-NKを有しないドナー（n＝4）からの通常のNK細胞（cNK）と比較した。これらの12人のドナーのうち、5人のドナーは、NK細胞によるADCC活性が一貫して高いことから、「スーパードナー」と分類された。

すべてのドナーからのNK細胞を多型検査とビニングに供することで、各ドナーがCD16の158V多型（V/V、V/FおよびF/F）に関してどのサブグループに属するかを決定した。予想される分布は35％V/V、25％V/Fおよび40％F/Fだったので（Hatjiharissi et al.,2007;Somboonyosdech et al.,2012）、この予想からの逸脱はいずれも、158V多型がこれらのドナーで見られた高いADCCにおいて役割を果たしうることを示唆しうる。多型検査のために凍結NK細胞を解凍し、PBSで洗浄し、100gで遠心分離した。NK細胞懸濁液をフローチューブに収集し、CD45に対する2μLの蛍光抗体（残存赤血球から白血球を識別するため）および2μLの7-AAD（生存性色素）で染色した。暗所、室温で10分間のインキュベーション後に、細胞を500μLのPBSで希釈し、7-AAD^neg/CD45^pos白血球の数をフローサイトメトリーによって定量した。細胞カウント後に、CD16^pos NK細胞の集団を単離するために、磁気ビーズ分離（Miltenyi MACS（商標）CD16マイクロビーズ）を行った。磁気ビーズ分離後に、10X GenomicsシングルセルRNAシーケンシングを使って、各ドナーがどのCD16多型群（V/V、V/F、またはF/F）に属するかを決定した。ADCCアッセイに関して、158V g-NKとこの多型を欠くg-NKについての実際のg-NKパーセンテージは、それぞれ82.2±2.1％および82.8％±1.9％だった。g-NKのパーセンテージは細胞内フローサイトメトリーによって決定した。

その結果、g-NK細胞が一貫して高いADCC活性を示す5人の「スーパードナー」は、CD16 158V多型を呈することが示された。さらにまた、図19に示すように、158V g-NKは、代表的ながんのパネル（結腸直腸:SW-480、卵巣:SVOV3、SKOV3、および多発性骨髄腫:MM.1S）でも、それぞれの抗体が存在する場合には、平均して有意に高いADCC活性を示した。加えて、CD16遺伝子の発現は、試験したすべての血液腫瘍細胞株および固形腫瘍細胞株に対するADCC効力とも正に相関した（図20）。全体として、これらの結果は、158V遺伝子型を保因するg-NKの方が、g-NK細胞にとってADCCの一次メディエーターであるCD16の発現および親和性が増強されているために、血液腫瘍と固形腫瘍のどちらの排除にも、より有効であるという観察結果と合致している。

実施例16: CD38およびSLAMF7の発現レベルがさまざまである多発性骨髄腫細胞株に対するNK細胞のエフェクター機能
この研究では、6つの多発性骨髄腫（MM）細胞株（AM01、KMS11、KMS18、KMS34、LP1およびMM.1S）に対するNK細胞エフェクター機能を測定し、それらMM細胞株についてはCD38またはSLAMF7の表面発現をフローサイトメトリーによって評価した。AM01細胞株とLP1細胞株はDSMZドイツ微生物細胞培養コレクション（German Collection of Microorganisms and Cell Cultures）から入手した。KMS11細胞株、KMS18細胞株およびKMS34細胞株は、日本がん研究資源バンク（Japanese Cancer Research Resources Bank:JCRB）から入手した。MM.1S細胞株はATCCから入手した。結果は、評価したMM細胞上でのCD38（図21A）およびSLAMF7（図21B）の一様でない発現レベルを示した。g-NK細胞のパーセンテージが高いドナー（g-NK細胞ドナー）に由来する増大されたNK細胞と、g-NK細胞のパーセンテージが低いドナー（通常型NK（cNK）細胞ドナー）に由来する増大されたNK細胞との間で、エフェクター活性を比較した。NKG2C^pos/NKG2A^negg-NK細胞とNKG2C^neg/NKG2A^posg-NK細胞との間でもエフェクター活性を比較した。

10人のドナー（年齢38.3±10.3歳、男6、女4）からNK細胞を採取した。10人のドナーのうち、5人はCMV血清陽性であって、g-NK細胞のパーセンテージが高く（g-NKドナー）、5人はCMV血清陰性（通常型ドナー）であった。g-NKドナーの場合、g-NK細胞のパーセンテージは30.3％±2.0％であったのに対し、通常型ドナーの場合、g-NK細胞のパーセンテージは1.6％±0.4％であった。CD57^posNK細胞をg-NKドナーから単離し（g-NK細胞）、バルクNK細胞（CD3^neg/CD56^pos）を通常型ドナーから単離した（通常型NK細胞）。単離されたフラクションにおいて、g-NK細胞のパーセンテージは、g-NK細胞および通常型NK細胞について、それぞれ84.0％±2.5％および1.6％±0.4％だった。本明細書の実施例2に記載した方法を使用し、2:1の221.AEH対NK細胞比で、500IU/mlのIL-2を増大培地に加えて、g-NK細胞と通常型NK細胞の両方を増大させ、凍結保存した。

NKG2C^posNK細胞とNKG2A^negNK細胞のパーセンテージも調べた。増大前に、g-NKドナーは29.1％±7.3％のNKG2C^posパーセンテージおよび54.7％±11.1％のNKG2A^negパーセンテージを有した。増大後は、g-NK細胞の場合、NKG2C^posNK細胞とNKG2A^negNK細胞のパーセンテージが、それぞれ50.5％±7.9％および80.4％±13.0％に上昇した。増大前に、通常型NKドナーは1.9％±1.4％のNKG2C^posNK細胞パーセンテージと22.7％±6.1％のNKG2A^negパーセンテージを有した。増大後は、通常型NK細胞の場合、NKG2C^posNK細胞とNKG2A^negNK細胞のパーセンテージは、それぞれ3.9％±1.0％および20.6％±2.6％だった。

A. 細胞媒介性細胞傷害
増大されたNK細胞の解凍後直ちに、10⁴個のNK細胞を、1μg/mLダラツムマブ（抗CD38）または1μg/mLエロツズマブ（抗CD319）の存在下、1:1のNK細胞対MM細胞比で、MM標的細胞と共培養した。CO₂インキュベータ中、37℃で4時間のインキュベーション後に、細胞を洗浄し、NK細胞の数を定量するために、抗CD3抗体および抗CD56抗体で染色した。最終洗浄後に、ヨウ化プロピジウム（PI）を加え、4色フローサイトメトリーを使って、NK細胞、生標的細胞および死標的細胞の数を解析した（Bigley et al.（2016）,Clin.Exp.Immunol.,185:239-251）。

図22A～22Eに示すように、増大されたg-NK細胞は、ダラツムマブ（図22A）またはエロツズマブ（図22B）と組み合わせた場合に、6つすべてのMM細胞株に対して、増大された通常型NK細胞よりも高い細胞媒介性細胞傷害性を有した。ダラツムマブ処理MM細胞に対するg-NK細胞媒介性細胞傷害の強さは、MM細胞によるCD38の発現と正に相関した（図22C;R²＝0.92）。エロツズマブ処理MM細胞に対するg-NK細胞媒介性細胞傷害の強さは、MM細胞によるSLAMF7の発現と正に相関した（図22D;R2＝0.96）。さらにまた、SLAMF7^highMM細胞株KMS34およびMM.1Sに対するg-NKの細胞傷害性は、ダラツムマブによるものよりも、エロツズマブによるものの方が強かった（図22E）。逆に、CD38^high多発性骨髄腫細胞株LP1に対するg-NK細胞傷害性は、エロツズマブによるものよりも、ダラツムマブによるものの方が強かった（図22E）。

再発/抵抗性患者からの初代骨髄腫腫瘍細胞に対する細胞傷害活性も評価した。骨髄穿刺液を得て、赤血球を溶解し、全骨髄単核球を1μg/mLダラツムマブまたはエロツズマブと共に37℃で30分間インキュベートした後、洗浄し、1×10⁶個の細胞/mLの密度で培地に再懸濁した。各条件（ダラツムマブまたはエロツズマブ）について、2×10⁶個の単離された単核球を、NK細胞（g-NKまたはcNK）と、最終体積1mLの培地中、0:1（NK細胞なしの対照）、2:5:1および20:1（NK:初代）の比で共インキュベートし、次に37℃、5％CO₂で4時間インキュベートした。E:T比を決定するために使用した試料中の腫瘍細胞のパーセントは、共培養を開始する前に、別のアリコートにおいて、フローサイトメトリーによって評価した。前記4時間の共培養の終わりに、フローサイトメトリーを使って生CD138^pos形質細胞を評価した。具体的には、試料を、CD138、CD38、SLAMF7およびCD56に対する蛍光標識抗体で染色した。腫瘍細胞溶解を、各E:Tでの共培養後に存在する生形質細胞（CD138^pos）の分率として、NK細胞なしの対照と比較して測定した。NK細胞なしの対象と比較した各条件下でのCD138^pos形質細胞の喪失を使って、細胞傷害性を計算した。図22F（ダラツムマブ、dara）および図22G（エロツズマブ、elo）に示すように、この患者では、患者由来の骨髄腫細胞に対して、増大されたg-NK細胞の細胞傷害性は、どちらの比で組み合わせた場合も、cNK細胞より強かった。したがって、上記の結果と同様に、これらの結果は、mAbとのインキュベーション後にg-NK細胞はcNK細胞より有意に増強された溶解を起こすという観察結果と合致する。特に、cNK細胞の場合、2:5:1のE:T比では、細胞傷害性が観察されなかった。

総合すると、これらの結果は、増大されたg-NK細胞が、増大された通常型NK細胞との比較で、増強された細胞媒介性細胞傷害性を有し、ダラツムマブ媒介性の細胞媒介性細胞傷害の度合いはMMのCD38発現に比例し、エロツズマブ媒介性の細胞媒介性細胞傷害の度合いはMMのSLAMF7発現に比例することを示している。したがって、これらの結果は、g-NK細胞は、通常型FcεR1γ^posNK細胞との比較で、MMにおけるmAb効力を強力に増強し、増加した活性を示すことができることを実証している。

B. 抗体依存的脱顆粒およびサイトカイン発現
増大されたNK細胞の解凍後直ちに、2.0×10⁵個のNK細胞を、1μg/mLダラツムマブまたは1μg/mLエロツズマブの存在下、1:1のNK細胞対MM細胞比で、MM標的細胞と共培養した。脱顆粒アッセイの場合、2μLのVioGreenコンジュゲート抗CD107aを共培養に加えて、CO₂インキュベータ中、37℃で1時間のインキュベーションを行った後、モネンシンを含有するBD GolgiStop 4μLを加えた。サイトカイン発現アッセイの場合は、代わりに、ブレフェルジンAを含有するBD GolgiStop 6μLを加えた。次に細胞を、CO₂インキュベータ中、37℃で、さらに5時間インキュベートした。インキュベーションに続いて、細胞を採取し、洗浄し、0.5μLの抗CD45抗体、0.5μLの抗CD3抗体、および1μLの抗CD56抗体で染色した（抗体はすべてMiltenyi Biotecから購入した）。次に、Miltenyi BiotecのInside Stainキットを製造者の説明書どおりに使用して、細胞を固定し、透過処理した。次に、細胞を、表E6に記載するように、1μLの抗FcRγ、2μLの抗パーフォリン、2μLの抗グランザイムB、2μLのインターフェロンγ、および2μLのTNF-α抗体で染色した。最終洗浄後に、8色フローサイトメトリーを使って細胞を解析した。

（表Ｅ６）機能アッセイ用の抗体パネル

i. 脱顆粒
図23A～23Eに示すように、増大されたg-NK細胞は、ダラツムマブ（図23A）またはエロツズマブ（図23B）と組み合わせた場合に、6つすべてのMM細胞株に対して、増大された通常型NK細胞よりも強い脱顆粒（CD107a^pos）を呈する。ダラツムマブ処理MM細胞のg-NK脱顆粒の強さは、MM細胞によるCD38の発現と正に相関した（図23C）。エロツズマブ処理MM細胞に対するg-NK脱顆粒の強さは、MM細胞によるSLAMF7の発現と正に相関した（図23D）。さらにまた、CD38^highMM細胞株LP1に対するg-NKの脱顆粒は、ダラツムマブによるものの方が、エロツズマブによるものよりも強く、SLAMF7^lowMM細胞株KMS11に対するg-NKの脱顆粒も、ダラツムマブによるものの方がエロツズマブによるものよりも強かった（図23E）。逆に、SLAMF7^highMM細胞株MM.1Sに対するg-NKの脱顆粒は、エロツズマブによるものの方がダラツムマブより強かった（図23E）。

図23F～23Gに示すように、CD38^highMM細胞株LP1に対するダラツムマブ依存的脱顆粒は、NKG2C^pos/NKG2A^negg-NK細胞の方が、NKG2C^neg/NKG2A^posg-NK細胞よりも強かった（図23F）。SLAMF7^highMM細胞株MM.1Sに対して、エロツズマブ依存的脱顆粒は、NKG2C^pos/NKG2A^negg-NK細胞の方が、NKG2C^neg/NKG2A^posg-NK細胞よりも強かった（図23G）。

総合すると、これらの結果は、増大されたg-NK細胞が、増大された通常型NK細胞と比較して増強された脱顆粒を有し、ダラツムマブ媒介性脱顆粒の度合いはMMのCD38発現に比例し、エロツズマブ媒介性脱顆粒の度合いはMMのSLAMF7発現に比例することを示している。加えて、NKG2C^pos/NKG2A^negg-NK細胞は、CD38^highおよびSLAMF7^highMM細胞株に対して、NKG2C^neg/NKG2A^posg-NK細胞と比較して増強された脱顆粒を有する。

ii. パーフォリンおよびグランザイムBの発現
図24A～24Bに示すように、増大されたg-NK細胞は、パーフォリン陽性細胞のパーセンテージで測定した場合（図24A）も総パーフォリン発現量（GMFI）で測定した場合（図24B）も、増大された通常型NK細胞よりも多くの細胞溶解性タンパク質パーフォリンを発現した。加えて、増大されたg-NK細胞は、グランザイムB陽性細胞のパーセンテージで測定した場合（図24A）も総グランザイムB発現量（GMFI）で測定した場合（図24B）も、増大された通常型NK細胞よりも多くのアポトーシス促進タンパク質グランザイムBを発現した。

総合すると、これらの結果は、増大されたg-NK細胞が、増大された通常型NK細胞と比較して増強された、パーフォリンおよびグランザイムBの発現を呈することを示している。

iii. インターフェロンγ発現
図25A～25Eに示すように、増大されたg-NKは、ダラツムマブ（図25A）またはエロツズマブ（図25B）と組み合わせた場合、6つすべてのMM細胞株に応答して、増大された通常型NKの場合よりも強いインターフェロンγ発現（インターフェロンγ^pos）を有した。ダラツムマブ処理MMに応答して起こるg-NKのインターフェロンγ発現の強さは、MM細胞によるCD38の発現と正に相関した（図25C）。エロツズマブ処理MM細胞に応答して起こるg-NKのインターフェロンγ発現の強さは、MM細胞によるSLAMF7の発現と正に相関した（図25D）。さらにまた、SLAMF7^highMM細胞株KMS34およびMM.1Sに応答して起こるg-NKのインターフェロンγ発現は、ダラツムマブよりもエロツズマブによるものの方が強かった（図25E）。逆に、CD38^highMM細胞株LP1に応答して起こるg-NKのインターフェロンγ発現は、エロツズマブよりもダラツムマブによるものの方が強かった（図25E）。ダラツムマブの存在下でLP1細胞と共に培養（E:T 1:1）した後の代表的なフロープロットは、g-NK細胞（FcεR1γ^neg）およびcNK細胞（FcεR1γ^pos）について、ダラツムマブに応答して、より多くのインターフェロンγ産生が起こることを示している（図25F）。

図25G～25Hに示すように、CD38^highMM細胞株LP1に対するダラツムマブ依存的IFN-γ発現は、NKG2C^neg/NKG2A^posg-NKよりも、NKG2C^pos/NKG2A^negg-NK細胞の方が強かった（図25G）。SLAMF7^highMM細胞株MM.1Sに対して、エロツズマブ依存的IFN-γ発現は、NKG2C^neg/NKG2A^posg-NKよりも、NKG2C^pos/NKG2A^negg-NK細胞の方が強かった（図25H）。

総合すると、これらの結果は、増大されたg-NK細胞が、増大された通常型NK細胞と比較して増強された抗体依存的インターフェロンγ発現を有し、ダラツムマブ媒介性インターフェロンγ発現の度合いはMMのCD38発現に比例し、エロツズマブ媒介性インターフェロンγ発現の度合いはMMのSLAMF7発現に比例することを示している。加えて、NKG2C^pos/NKG2A^negg-NK細胞は、CD38^highおよびSLAMF7^highMM細胞株に対して、NKG2C^neg/NKG2A^posg-NK細胞と比較して増強されたIFN-γ発現を有する。

iv. TNF-α発現
図26A～26Eに示すように、増大されたg-NKは、ダラツムマブ（図26A）またはエロツズマブ（図26B）と組み合わせた場合に、6つすべてのMM細胞株に応答して、増大された通常型NKの場合よりも強いTNF-α発現（TNF-α^pos）を有した。ダラツムマブ処理MM細胞に応答して起こるg-NKのTNF-α発現の強さは、MM細胞によるCD38の発現と正に相関した（図26C）。エロツズマブ処理MM細胞に応答して起こるg-NKのTNF-α発現の強さは、MM細胞によるSLAMF7の発現と正に相関した（図26D）。さらにまた、SLAMF7^highMM細胞株KMS34およびMM.1Sに応答して起こるg-NKのTNF-α発現は、ダラツムマブよりもエロツズマブによるものの方が強かった（図26E）。逆に、CD38^highMM細胞株LP1およびSLAMF7^lowMM細胞株KMS11に応答して起こるg-NK TNF-α発現は、エロツズマブよりもダラツムマブによるものの方が強かった（図26E）。ダラツムマブの存在下でLP1細胞と共に培養（E:T 1:1）した後の代表的なフロープロットは、g-NK細胞（FcεR1γ^neg）およびcNK細胞（FcεR1γ^pos）について、ダラツムマブに応答して、より多くのTNF-α産生が起こることを示している（図26F）。

図26G～26Hに示すように、CD38^highMM細胞株LP1に対するダラツムマブ依存的TNF-α発現は、NKG2C^pos/NKG2A^negg-NK細胞の方が、NKG2C^neg/NKG2A^posg-NK細胞よりも強かった（図26G）。SLAMF7^highMM細胞株MM.1Sに対して、エロツズマブ依存的TNF-α発現は、NKG2C^pos/NKG2A^negg-NK細胞の方が、NKG2C^neg/NKG2A^posg-NK細胞よりも強かった（図26H）。

総合すると、これらの結果は、増大されたg-NK細胞が、増大された通常型NK細胞と比較して増強された抗体依存的TNF-α発現を有し、ダラツムマブ媒介性TNF-α発現の度合いはMMのCD38発現に比例し、エロツズマブ媒介性TNF-α発現の度合いはMMのSLAMF7発現に比例することを示している。加えて、NKG2C^pos/NKG2A^negg-NK細胞は、CD38^highおよびSLAMF7^highMM細胞株に対して、NKG2C^neg/NKG2A^posg-NK細胞と比較して増強されたTNF-α発現を有する。

実施例17: 異なるサイトカインの存在下でのg-NK細胞の増大
CMV血清陽性ドナーから50mLの新鮮全血（NKG2C^posNK細胞およびNKG2A^negNK細胞のパーセンテージはそれぞれ56.24％および11.68％）をACDバキュテナーチューブに収集し、PBSで1:1希釈した。PBMCを、Histopaque（登録商標）密度遠心分離により、製造者の説明書に従って単離した。PBMC含有バフィーコートを採取した後、PBMCをPBSで洗浄し、計数した。細胞カウント後に、g-NK細胞の頻度を増加させるために、磁気ビーズ分離を行った。この磁気ビーズ分離は、CD57^posNK細胞を単離するための、CD3枯渇とそれに続くCD57濃縮であった。

トランスジェニックリンパ腫細胞株221.AEH（Lee et al.（1998）Journal of Immunology,160:4951-4960）およびトランスジェニック白血病細胞株K562-mb15-41BBL（Fujisaki et al.（2009）Cancer Research,69（9）:4010-4017）を、NK細胞増大のためのフィーダー細胞として調製した。フィーダー細胞は新鮮培養から採取され（すなわち凍結保存ストックではない）、使用前に照射された。221.AEH細胞およびK562-mb15-41BBL細胞は、1mLあたり5×10⁵個の細胞の播種密度と1mLあたり2×10⁵個の細胞の継代培養密度で増大させた。221.AEHフィーダー細胞を成長させるために使用した培地は、10％FBSおよび200μg/mLのハイグロマイシンBを含むRPMI-1640である。K562-mb15-41BBLフィーダー細胞を成長させるために使用した培地は、10％FBSを含むRPMI-1640である。

非凍結保存NK細胞を、次の4つの異なる条件下で増大させた:2:1のAEH対NK細胞比、500IU/mL IL-2;2:1のK562-mb15-41BBL対NK細胞比、500IU/mL IL-2;1:1:1のAEH対K562-mb15-41BBL対NK細胞比、500IU/mL IL-2;および2:1のAEH対NK細胞比、500IU/mL IL-2、10ng/mL IL-15、および25ng/mL IL-21。すべての増大を、5％ヒトAB血清とそれぞれのサイトカインとを補足したCellGenix GMP SCGM培地において実行した。共培養細胞は37℃および5％CO₂で21日間培養した。培地を交換または補充するたびに細胞を計数し（5、7、10、13、16、19および21日目）、g-NKのパーセンテージを0日目、13日目および21日目にフローサイトメトリーによって評価した。

図27A～27Bに示すように、増大培地へのIL-21の添加は、g-NK細胞増大の著しい増加につながった。総g-NK細胞数は、IL-21の存在下で増大させたg-NK細胞が最も高かった（図27A）。21日目までのg-NK細胞の増大倍率も、IL-21の存在下で増大させたg-NK細胞が最も高かった（図27B）。

総合すると、これらの結果は、IL-21の存在がg-NK細胞の増大を改良することを示している。

実施例18: 異なるサイトカインの存在下で増大させたg-NK細胞の細胞エフェクター機能
この研究では、実施例17に記載したように、IL-21の存在下を含む、異なるフィーダー細胞およびサイトカインの存在下で増大させたg-NK細胞において、NK細胞のエフェクター機能を測定した。アッセイは、標的細胞株LP1およびMM.1Sを0.5:1のNK対MM細胞比で使用し、抗体ダラツムマブおよびエロツズマブを使って、実施例16に記載するように行った。

A. 細胞媒介性細胞傷害
図28A～28Bに示すように、IL-21の存在下で21日間増大させたg-NK細胞は、CD38^highMM細胞株LP1（図28A）およびSLAMF7^highMM細胞株MM.1S（図28B）に対して、IL-21なしで増大させたg-NK細胞よりも強い細胞媒介性細胞傷害性を有した。IL-21増大g-NK細胞では、抗体の非存在下でも、ダラツムマブまたはエロツズマブのどちらかの存在下でも、より強い細胞媒介性細胞傷害が観察された。

総合すると、これらの結果は、IL-21の存在下で増大させたg-NK細胞が、腫瘍細胞に対して、IL-21なしで増大させたg-NK細胞と比較して増強された細胞媒介性細胞傷害性を有することを示している。

B. 脱顆粒
図29A～29Dに示すように、13日間の増大後（図29A～29B）も21日間の増大後（図29C～29D）も、IL-21の存在下で増大させたg-NK細胞は、CD38^highMM細胞株LP1（図29Aおよび図29C）およびSLAMF7^highMM細胞株MM.1S（図29Bおよび図29D）に対して、IL-21なしで増大させたg-NK細胞の場合よりも多く、脱顆粒した。IL-21増大g-NK細胞では、抗体の非存在下でも、ダラツムマブまたはエロツズマブのどちらかの存在下でも、より強い脱顆粒が観察された。

総合すると、これらの結果は、IL-21の存在下で増大させたg-NK細胞が、腫瘍細胞に対して、IL-21なしで増大させたg-NK細胞と比較して増強された脱顆粒を有することを示している。

C. パーフォリンおよびグランザイムBの発現
図30A～30Dに示すように、13日間の増大後（図30A～30B）も21日間の増大後（図30C～30D）も、IL-21の存在下で増大させたg-NK細胞は、パーフォリン陽性細胞のパーセンテージで測定した場合（図30Aおよび図30C）も総パーフォリン発現量（MFI）で測定した場合（図30Bおよび図30D）も、IL-21なしで増大させたg-NK細胞よりも多くの細胞溶解性タンパク質パーフォリンを発現した。加えて、13日間の増大後も21日間の増大後も、IL-21の存在下で増大させたg-NK細胞は、グランザイムB陽性細胞のパーセンテージで測定した場合（図30Aおよび図30C）も総グランザイムB発現量（MFI）で測定した場合（図30Bおよび図30D）も、IL-21なしで増大させたg-NK細胞よりも多くのアポトーシス促進タンパク質グランザイムBを発現した。

総合すると、これらの結果は、IL-21の存在下で増大させたg-NK細胞が、IL-21なしで増大させたg-NK細胞と比較して増強された、パーフォリンおよびグランザイムBの発現を有することを示している。

D. インターフェロンγ発現
図31A～31Dに示すように、13日間の増大後（図31A～31B）も21日間の増大後（図31C～31D）も、IL-21の存在下で増大させたg-NK細胞は、CD38^highMM細胞株LP1（図31Aおよび図31C）およびSLAMF7^highMM細胞株MM.1S（図31Bおよび図31D）に対して、IL-21なしで増大させたg-NK細胞よりも多くのインターフェロンγを発現した。IL-21増大g-NK細胞では、抗体の非存在下でも、ダラツムマブまたはエロツズマブのどちらかの存在下でも、より強いインターフェロンγ発現が観察された。

総合すると、これらの結果は、IL-21の存在下で増大させたg-NK細胞が、腫瘍細胞に対して、IL-21なしで増大させたg-NK細胞と比較して増強されたインターフェロンγ発現を有することを示している。

E. TNF-α発現
図32A～32Dに示すように、13日間の増大後（図32A～32B）も21日間の増大後（図32C～32D）も、IL-21の存在下で増大させたg-NK細胞は、CD38^highMM細胞株LP1（図32Aおよび図32C）およびSLAMF7^highMM細胞株MM.1S（図32Bおよび図32D）に対して、IL-21なしで増大させたg-NK細胞よりも多くのTNF-αを発現した。IL-21増大g-NK細胞では、抗体の非存在下でも、ダラツムマブまたはエロツズマブのどちらかの存在下でも、より強いTNF-α発現が観察された。

総合すると、これらの結果は、IL-21の存在下で増大させたg-NK細胞が、腫瘍細胞に対して、IL-21なしで増大させたg-NK細胞と比較して増強されたTNF-α発現を有することを示している。

実施例19: 追加のサイトカインの存在下でのg-NK細胞の増大
別の研究では、サイトカイン混合物およびサイトカイン濃度のさまざまな組み合わせの存在下で増大させたNK細胞の増大率を比較した。実施例17の場合と同様に、上述のように、同じドナーからNK細胞を採取した。NK細胞を1mLあたり2×10⁵個の細胞の密度および継代培養密度で播種し、それらを照射221.AEHフィーダー細胞と、2:1の221.AEH対NK細胞比で共培養した。NK細胞増大のために、サイトカインを以下の濃度で加えた:100IU/mL（低IL-2）または500IU/mL（IL-2）のIL-2;10ng/mLのIL-15;25ng/mLのIL-21;10ng/mLのIL-12;10ng/mLのIL-18;および/または10ng/mLのIL-27。すべての増大を、5％ヒトAB血清とそれぞれのサイトカインとを補足したCellGenix GMP SCGM培地において実行した。

図33に示すように、IL-21の存在下で増大させたNK細胞は、IL-2およびIL-15;IL-12、IL-15およびIL-18;ならびにIL-15、IL-18およびIL-27だけの存在下で増大させたNK細胞よりも、高いg-NK細胞増大率を有した。最も高いg-NK細胞増大率につながるサイトカインの組み合わせは、IL-15の存在下でも非存在下でも、IL-2およびIL-21だった。

総合すると、これらの結果は、IL-21の存在が、他のサイトカイン混合物よりも大きく、g-NK細胞の増大率を改善することを示している。

実施例20: 追加のサイトカインの存在下で増大させたg-NK細胞の細胞エフェクター機能
実施例19に記載したようにIL-21の存在下を含むサイトカインの存在下で15日間増大させたg-NK細胞において、NK細胞エフェクター機能を測定した。アッセイは、標的細胞株LP1およびMM.1Sを0.5:1のNK対MM細胞比で使用し、抗体ダラツムマブおよびエロツズマブを使って、実施例16に記載するように行った。

A. 細胞媒介性細胞傷害
図34Aおよび図34Bに示すように、IL-2、IL-15およびIL-21の存在下で増大させたg-NK細胞は、CD38^highMM細胞株LP1（図34A）およびSLAMF7^highMM細胞株MM.1S（図34B）に対して、IL-2およびIL-15の存在下で増大させたg-NK細胞よりも強い細胞媒介性細胞傷害性を有した。IL-2、IL-15およびIL-21の存在下で増大させたg-NK細胞では、抗体の非存在下でも、ダラツムマブまたはエロツズマブのどちらかの存在下でも、より強い細胞媒介性細胞傷害が観察された。

総合すると、これらの結果は、IL-2、IL-15およびIL-21の存在下で増大させたg-NK細胞が、IL-2およびIL-15の存在下で増大させたg-NK細胞と比較して増強された細胞媒介性細胞傷害性を有することを示している。

B. 脱顆粒
図34Cおよび図34Dに示すように、IL-2、IL-15およびIL-21の存在下で増大させたg-NK細胞は、CD38^highMM細胞株LP1（図34C）およびSLAMF7^highMM細胞株MM.1S（図34D）に対して、IL-2およびIL-15の存在下で増大させたg-NK細胞よりも多く、脱顆粒した。IL-2、IL-15およびIL-21の存在下で増大させたg-NK細胞では、抗体の非存在下を含むすべての条件下で、より強い脱顆粒が観察された。

総合すると、これらの結果は、IL-2、IL-15およびIL-21の存在下で増大させたg-NK細胞が、IL-2およびIL-15の存在下で増大させたg-NK細胞と比較して増強された脱顆粒を有することを示している。

C. パーフォリンおよびグランザイムBの発現
図34Eおよび図34Fに示すように、IL-2、IL-15およびIL-21の存在下で増大させたg-NK細胞は、パーフォリン陽性細胞のパーセンテージで測定した場合（図34E）も総パーフォリン発現量（MFI）で測定した場合（図34F）も、IL-2およびIL-15の存在下で増大させたg-NK細胞よりも多くの細胞溶解性タンパク質パーフォリンを発現した。加えて、IL-2、IL-15およびIL-21の存在下で増大させたg-NK細胞は、グランザイムB陽性細胞のパーセンテージで測定した場合（図34E）も総グランザイムB発現量（MFI）で測定した場合（図34F）も、IL-2およびIL-15の存在下で増大させたg-NK細胞よりも多くのアポトーシス促進タンパク質グランザイムBを発現した。増大培地へのIL-2、IL-15、IL-18、IL-21およびIL-27は、g-NK細胞によるグランザイムB発現を増強した。

総合すると、これらの結果は、IL-2、IL-15およびIL-21の存在下で増大させたg-NK細胞が、IL-2およびIL-15の存在下で増大させたg-NK細胞と比較して増強された、パーフォリンおよびグランザイムBの発現を有することを示している。

D. インターフェロンγ発現
図34G～34Hに示すように、IL-2、IL-15およびIL-21の存在下で増大させたg-NK細胞は、CD38^highMM細胞株LP1（図34G）およびSLAMF7^highMM細胞株MM.1S（図34H）に対して、IL-2およびIL-15の存在下で増大させたg-NK細胞よりも多くのインターフェロンγを発現した。IL-2、IL-15およびIL-21の存在下で増大させたg-NK細胞では、抗体の非存在下を含むすべての条件下で、より強いインターフェロンγ発現が観察された。増大培地へのIL-2、IL-12、IL-15、IL-18およびIL-21の添加は、抗体の非存在下を含むすべての条件下で、g-NK細胞によるインターフェロンγ発現を増強した。増大培地へのIL-2、IL-15、IL-18、IL-21およびIL-27の添加は、抗体の非存在下を含むすべての条件下で、g-NK細胞によるインターフェロンγ発現を増強した。

総合すると、これらの結果は、IL-2、IL-15およびIL-21の存在下で増大させたg-NK細胞が、IL-2およびIL-15の存在下で増大させたg-NK細胞と比較して増強されたインターフェロンγ発現を有することを示している。

E. TNF-α発現
図34I～34Jに示すように、IL-2、IL-15およびIL-21の存在下で増大させたg-NK細胞は、CD38^highMM細胞株LP1（図34I）およびSLAMF7^highMM細胞株MM.1S（図34J）に対して、IL-2およびIL-15の存在下で増大させたg-NK細胞よりも多くのTNF-αを発現した。IL-2、IL-15およびIL-21の存在下で増大させたg-NK細胞では、抗体の非存在下を含むすべての条件下で、より強いTNF-α発現が観察された。増大培地へのIL-2、IL-15、IL-18、IL-21およびIL-27の添加は、抗体の非存在下を含むすべての条件下で、g-NK細胞による抗体誘導性TNF-α発現を増強した。

総合すると、これらの結果は、IL-2、IL-15およびIL-21の存在下で増大させたg-NK細胞が、IL-2およびIL-15の存在下で増大させたg-NK細胞と比較して増強されたTNF-α発現を有することを示している。

実施例21: IL-21の存在下で増大させたg-NK細胞の増大および細胞エフェクター機能
この研究では、IL-21の存在下で増大させたNK細胞の増大率およびNK細胞エフェクター機能を、IL-21の非存在下で増大させたNK細胞の場合と比較した。CMV陽性ヒトドナーまたは比較のためのCMV血清陰性ドナーからの全血から、Histopaque（登録商標）密度遠心分離法により、製造者の説明書に従って、ヒト末梢血単核球（PBMC）を単離した。ドナーはCMV血清陽性（n＝8）およびCMV血清陰性（n＝6）だった（年齢37.8±10.6歳;男性8人および女性6人）。

PBMCをバフィーコートから採取し、洗浄し、フローサイトメトリーにより、生存CD45^pos細胞について評価した。NK細胞は、Miltenyi MACS（商標）マイクロビーズを使用する免疫親和性に基づく磁気ビーズ分離によって、T細胞を除去するためのCD3^pos細胞の枯渇（CD3枯渇、CD3^neg）により、またはCD57^posNK細胞（CD3^negCD57^pos）を濃縮するためのCD3枯渇とそれに続くCD57についての正の選択により、濃縮した。g-NK細胞を増大するための以後の実験では、増大に先立ってまずCD3^neg/CD57^pos細胞を濃縮する後者の方法を使用した。さらなる比較として、NK細胞を、CD3枯渇とそれに続くCD16についての正の選択（CD16^posNK細胞と単球を濃縮する）によって濃縮した（CD3negCD57pos）。NK細胞を1mLあたり2×10⁵個の細胞の密度および1mLあたり2×10⁵個の細胞の継代培養密度で播種した。NK細胞を、ガンマ照射（100Gy）221.AEHフィーダー細胞と、2:1の221.AEH対NK細胞比で共培養し、IL-2（500IU/mL）、IL-15（10ng/mL）およびIL-21（25ng/mL）の存在下で、またはIL-2のみ（500IU/mL）の存在下で、増大させた。実施例22においてさらに述べるように、PBMCがNK細胞の増殖に先立って凍結保存されていた場合には、1:1の照射221.AEHフィーダー細胞対NK細胞の比を使用した。すべての増大を、5％ヒトAB血清とそれぞれのサイトカインとを補足したCellGenix GMP SCGM培地において実行した。NK細胞を2週間増大させ、培地を2～5日ごとに換えた。後で機能アッセイにおいて使用するために、増大されたNK細胞を90％FBSおよび10％DMSOを使って凍結保存した。

14日間の増大後に、増大および細胞エフェクター機能を評価した。アッセイは、標的細胞株LP1およびMM.1Sを0.5:1のNK対MM細胞比で使用し、抗体ダラツムマブおよびエロツズマブを使って、実施例16に記載するように行った。

以下の実施例に記載するいくつかの研究では、g-NK細胞の表現型および機能的活性をcNK細胞と比較した。上述の方法を使用した場合、CMV血清陰性ドナーからのcNK細胞の収量は不十分であり、CMV血清陽性ドナーからはg-NK細胞が優先的に増大されることから（下記セクションAに記載の結果）、インビトロでの機能研究とインビボでの研究のために、代替法を使ってcNK細胞を増大させた。この増大方法では、K652-mbIL15-41BBLフィーダー細胞と500IU/mL IL-2とを使って、cNK細胞を2週間で180±89倍（n＝5 CMV^neg）に増大させた（Fujisaki et al.,2009 Cancer Res.,68（9）:4010-4017）。5人のCMVnegドナー（年齢38.9±9.8歳;男性3人および女性2人）におけるg-NK細胞の比率は、増大前は1.5±0.5％であり、増大後は1.6±0.4％だった。

A. g-NK細胞の増大率
培地交換時に細胞を計数し、g-NK細胞のパーセンテージを0日目および14日目にフローサイトメトリーによって評価した。図35Aおよび図35Bに示すように、増大に先立ってまずCD3^neg/CD57^pos細胞について濃縮し、次にIL-21の存在下で増大させたNK細胞は、類似する条件だがIL-21を含まないものよりも、高いg-NK細胞増大率を有した。FcRγの細胞内染色とフローサイトメトリーを使って測定すると、g-NK細胞のパーセンテージを測定した場合（図35A）も、g-NK細胞の数を測定した場合（図35B）も、より高いg-NK細胞増大率が観察された。

増大前のCMV血清陽性ドナーにおけるg-NK細胞の比率は30.8±3.1％（全NK細胞の％）であり、一方、CMV血清陰性ドナーでは、g-NK細胞の比率がわずか1.8±0.3％（全NK細胞の％）だった。CD3^neg/CD57^pos細胞について初期濃縮した後の増大後は、g-NK細胞の比率がCMV血清陽性のドナーでは84.0±1.4％に増加したが、CMV血清陰性ドナーでは変化しなかった（1.5±0.4％）（図35C）。CMV血清陽性ドナーとCMV血清陰性ドナーにおけるg-NK細胞の比率を表す代表的フローサイトメトリーのドットプロットおよびヒストグラムを、図35Eおよび図35Fに示す。g-NKサブセット内でのNKG2Cpos/NKG2Aneg NK細胞のパーセンテージは、1.7～51％（26.8±13.9％）の範囲にわたった。このように、g-NK細胞とNKG2C^pos/NKG2C^negNK細胞との間には表現型の一部重複があるものの、これらは同一ではない。

g-NK細胞の代表的増大を図35Dに示す。ここでは、この増大方法が、検出可能なg-NK集団を持つCMV血清陽性のドナーからのg-NK細胞の比率を増加させ、全NK細胞数の少なくとも400倍の増加を伴うことが示されている。

B. 細胞媒介性細胞傷害
図35Gおよび図35Hに示すように、IL-21の存在下で増大させたNK細胞は、CD38^highMM細胞株LP1（図35C）およびSLAMF7^highMM細胞株MM.1S（図35H）に対して、IL-21なしで増大させたg-NK細胞よりも強い細胞媒介性細胞傷害性を有した。IL-21増大g-NK細胞では、抗体の非存在下でも、ダラツムマブまたはエロツズマブのどちらかの存在下でも、より強い細胞媒介性細胞傷害が観察された。

C. 脱顆粒
図35Iおよび図35Jに示すように、IL-21の存在下で増大させたg-NK細胞は、CD38^highMM細胞株LP1（図35I）およびSLAMF7^highMM細胞株MM.1S（図35J）に対して、IL-21なしで増大させたg-NK細胞よりも多く、脱顆粒した。IL-21増大g-NK細胞では、抗体の非存在下でも、ダラツムマブまたはエロツズマブのどちらかの存在下でも、より強い脱顆粒が観察された。

D. パーフォリンおよびグランザイムBの発現
図35Kおよび図35Lに示すように、IL-21の存在下で増大させたg-NK細胞は、総パーフォリン発現量（GMFI）で測定した場合（図35L）にIL-21なしで増大させたg-NK細胞よりも多くの細胞溶解性タンパク質パーフォリンを発現したが、パーフォリン陽性細胞のパーセンテージで測定した場合（図35K）はそうではなかった。加えて、IL-21の存在下で増大させたg-NK細胞は、グランザイムB陽性細胞のパーセンテージで測定した場合（図35G）も総グランザイムB発現量（GMFI）で測定した場合（図35L）も、IL-21なしで増大させたg-NK細胞よりも多くのアポトーシス促進タンパク質グランザイムBを発現した。

パーフォリン（図35M、左）およびグランザイムB（図35M、右）のベースライン発現も、増大されたg-NK細胞では、cNK細胞よりも有意に高かった（n＝5）。NK細胞およびcNK細胞について、パーフォリン発現およびグランザイムB発現の代表的ヒストグラムを図35Nに示す。

総合すると、これらの結果は、IL-21の存在下で増大させたg-NK細胞が、腫瘍細胞に対して、IL-21なしで増大させたg-NK細胞と比較して増強された、パーフォリンおよびグランザイムBの発現を有することを示している。

E. インターフェロンγ発現
図35Oおよび図35Pに示すように、IL-21の存在下で増大させたg-NK細胞は、CD38^highMM細胞株LP1（図35O）およびSLAMF7^highMM細胞株MM.1S（図35P）に対して、IL-21なしで増大させたg-NK細胞よりも多くのインターフェロンγを発現した。IL-21増大g-NK細胞では、抗体の非存在下でも、ダラツムマブまたはエロツズマブのどちらかの存在下でも、より強いインターフェロンγ発現が観察された。

F. TNF-α発現
図35Qおよび図35Rに示すように、IL-21の存在下で増大させたg-NK細胞は、CD38^highMM細胞株LP1（図35Q）およびSLAMF7^highMM細胞株MM.1S（図35R）に対して、IL-21なしで増大させたg-NK細胞よりも多くのTNF-αを発現した。IL-21増大g-NK細胞では、抗体の非存在下でも、ダラツムマブまたはエロツズマブのどちらかの存在下でも、より強いTNF-α発現が観察された。

G. g-NKドナー間でのエフェクター機能の比較
g-NK細胞およびcNK細胞を記載のとおり増大させ、エフェクター活性を異なるドナー間で比較した。アッセイは、標的細胞株MM.1Sを0.5:1のNK対MM細胞比で使用し、抗体ダラツムマブおよびエロツズマブを使って、実施例16に記載するように行った。共培養後に、細胞を固定し、透過処理し、インターフェロンγ（IFNγ）およびTNF-α（TNFα）について、細胞内サイトカイン染色によって解析した。図35S（IFNγ）および図35T（TNFα）に示す結果は、g-NKドナー間でのドナー変動性は低く、mAb依存的IFNγおよびTNFα応答については、5未満の標準誤差であることを表している。同様の結果が他のエフェクター機能についても見られた。これらの結果は、すべてのg-NKドナーのエフェクター機能が、試験したどのcNKドナーよりも優れていることを示した。

実施例22: IL-21/抗IL-21複合体の存在下でのg-NK細胞の増大
凍結保存されたPBMCを解凍し、磁気選別により、CD3^negCD57^posNK細胞について濃縮した。これらのNK細胞の増大に先立って、IL-21と抗IL-21抗体とを組み合わせることにより、IL-21/抗IL-21複合体を形成させた。IL-21と抗IL-21抗体とを、37℃ならびにそれぞれ25ng/mLおよび250ng/mLの濃度で、30分間、共インキュベートした。次に、前記複合体を、500IU/mL IL-2および10ng/mL IL-15と共に、NK細胞増大培地に加えた。NK細胞を照射221.AEHフィーダー細胞と、1:1のNK対221.AEHフィーダー細胞比で共培養した。比較のために、NK細胞を、それぞれ500IU/mL、10ng/mLおよび25ng/mLの濃度のIL-2、IL-15およびIL-21の存在下でも増大させた。

図36に示すように、IL-2、IL-15およびIL-21/抗IL-21複合体の存在下で増大させたg-NK細胞は、IL-2、IL-15およびIL-21の存在下で増大させたg-NK細胞よりも、高い増大率を有した。

実施例23: 凍結保存後のg-NK細胞エフェクター機能の維持
前もって凍結保存されたg-NK細胞のNK細胞エフェクター機能を、新鮮濃縮（すなわち非凍結保存）g-NK細胞（n＝4）のものと比較した。CD3^neg/CD57^pos濃縮NK細胞を、照射221.AEHフィーダー細胞と、2:1の221.AEH対NK細胞比ならびに500IU/mLのIL-2、10ng/mLのIL-15および25ng/mLのIL-21の存在下で、共培養した。増大後に、NK細胞をそのまま機能的に評価するか、または10％DMSOを含む90％FBS中、凍結保存培地1.8mlあたり2000万個の細胞という濃度で、凍結保存した。LP1細胞株およびMM.1S細胞株に対するNK細胞エフェクター機能を、抗体なしで、および1μg/mLダラツムマブまたは1μg/mLエロツズマブの存在下で、評価した。

A. 脱顆粒
図37Aおよび図37Bに示すように、前もって凍結保存されたg-NK細胞は、CD38^highMM細胞株LP1（図37A）およびSLAMF7^highMM細胞株MM.1S（図37B）に対して、新鮮なg-NK細胞のそれに匹敵する脱顆粒レベルを有した。抗体の非存在下でも、ダラツムマブまたはエロツズマブのどちらかの存在下でも、同等な脱顆粒レベルが観察された。

総合すると、これらの結果は、多発性骨髄腫標的細胞に応答して起こるg-NK細胞脱顆粒が凍結保存後も維持されることを示している。

B. パーフォリンおよびグランザイムBの発現
図37Cおよび図37Dに示すように、前もって凍結保存されたg-NK細胞は、新鮮なg-NK細胞のそれに匹敵するパーフォリン発現（図37C）およびグランザイムB発現（図37D）を有した。総合すると、これらの結果は、g-NK細胞のパーフォリン発現およびグランザイムB発現が凍結保存後も維持されることを示している。

C. インターフェロンγ発現
図37Eおよび図37Fに示すように、前もって凍結保存されたg-NK細胞は、CD38^highMM細胞株LP1（図37E）およびSLAMF7^highMM細胞株MM.1S（図37F）に対して、新鮮なg-NK細胞のそれに匹敵するインターフェロンγ発現レベルを有した。抗体の非存在下でも、ダラツムマブまたはエロツズマブのどちらかの存在下でも、同等なインターフェロンγ発現が観察された。

総合すると、これらの結果は、多発性骨髄腫標的細胞に応答して起こるg-NK細胞インターフェロンγ発現が凍結保存後も維持されることを示している。

D. TNF-α発現
図37Gおよび図37Hに示すように、前もって凍結保存されたg-NK細胞は、CD38^highMM細胞株LP1（図37G）およびSLAMF7^highMM細胞株MM.1S（図37H）に対して、新鮮なg-NK細胞のそれと比較して低下したTNF-α発現レベルを有した。抗体の非存在下でも、ダラツムマブまたはエロツズマブのどちらかの存在下でも、低下したTNF-α発現が観察された。

総合すると、これらの結果は、多発性骨髄腫標的細胞に応答して起こるg-NK細胞TNF-α発現は、凍結保存後には減少することを示している。

実施例24: cNK細胞と比較したg-NK細胞のインビボでの持続性の評価
実質的に実施例21に記載のとおりに増大させたNK細胞をマウスに注射し、生物学的試料を、それらの持続性を評価するために、フローサイトメトリーを使った解析に供した。

実施例21に記載のとおり、まず凍結保存PBMCからCD3^neg/CD57^pos細胞について濃縮した後、IL-2（500IU/mL）、IL-15（10ng/mL）、およびIL-21（25ng/mL）刺激性サイトカインの存在下、照射221.AEHフィーダー細胞と共に1:1の221.AEH対NK細胞比で増大させることにより、g-NK細胞を増大させた。IL-2（500IU/mL）、IL-15（10ng/mL）およびIL-21（25ng/mL）刺激性サイトカインの存在下で221.AEHフィーダー細胞を用いる記載の方法を使っても、CMV-血清陰性ドナーからのcNK細胞の収量は不十分であるため、実施例21に記載の代替法を使って、cNK細胞を増大させた。cNK細胞は、トランスジェニック白血病細胞株K562-mb15-41BBLとIL-2とを使って2週間増大させた。すべての細胞を、凍結保存PBMCおよび凍結保存フィーダー細胞から増大させた。凍結保存細胞用の凍結培地はCS-10（Biolife Solutions、米国ワシントン州ボセル）とした。凍結保存細胞産物は、マウスに投与する前に熱水浴で急速に解凍した（37℃）。

1×10⁷個の増大されたNK細胞（新鮮g-NK、凍結保存g-NKまたは凍結保存cNK細胞）の単回用量を、雌NOD.Cg-PrkDc^scidIL2rg^tm1Wjl/SzJ（NSG）マウス（n＝9、各群3匹）に尾静脈から静脈内注射した。NK細胞サポートを提供するために、約2μg/マウスのヒト組換えIL-15を3日ごとにI.P.経路で投与した（表E7参照）。注入後6、16、26、および31日目に収集した血液をフローサイトメトリーによって直ちに解析した。31日目にマウスを屠殺し、直ちにフローサイトメトリー解析を行うために、骨髄および脾臓を採取した。

（表Ｅ７）持続性研究デザイン

図38A～Cは、cNK細胞との比較で増強された、末梢血（図38A）、脾臓（図38B）、および骨髄（図38C）における新鮮g-NK細胞および凍結保存g-NK細胞の持続性を示している。凍結保存g-NK細胞の持続性は、凍結保存cNK細胞で見られた持続性より、末梢血では複数の時点で（p＜0.001）（図38A）、そして脾臓（p＜0.001）（図38B）および骨髄（p＜0.05）（図38C）でも31日目の屠殺時に（p＜0.001）、＞90％高かった。図38Aは、新鮮g-NK細胞と凍結保存g-NK細胞とが、この研究の少なくとも26日目までは、同等レベルに持続したことも示している。

これらの結果は、g-NK細胞が有意に改良された持続性を呈するという観察結果と合致している。これらの結果は、mAb ADCCを増強するための実行可能なオフ・ザ・シェルフ型細胞療法としての、新鮮なまたは凍結保存されたg-NKの有用性を実証している。

実施例25: g-NK細胞上のCD38およびSLAMF7ならびにg-NK細胞のフラトリサイド活性の評価
この研究では、増大されたg-NK細胞のフラトリサイド率を、増大されたcNK細胞のそれと比較した。上記実施例10における図13Bおよび図13D～13Fに示すように、g-NK細胞ではCD38発現がcNK細胞よりも著しく低く、図13Cに示すように、g-NK細胞上およびcNK細胞上には、等しく低いレベルのSLAMF7が存在する。実施例21に記載の増大方法ではIL-21の存在下でも類似する結果が観察されたことから、IL-21を使って増大させたg-NK細胞とIL-21を使わずに増大させたg-NK細胞の間では、CD38発現にもSLAMF7発現にも相違はないことが示された。これらの結果は、これらの標的に対するg-NK細胞によるフラトリサイド効果の欠如という可能性を示している。というのも、もしNK細胞がmAb標的を発現するなら、ADCC活性が、腫瘍だけでなく、フラトリサイドによるNK細胞の排除も、もたらしうるからである。cNK細胞が高レベルのCD38を発現するという知見は、CD38^highNK細胞の＞90％が患者におけるダラツムマブ処置後に迅速に枯渇することを示唆する以前の結果と合致している（Casneuf et al.,2017 Blood Adv,1（23）:2105-2114）。

実質的に実施例21記載の方法を使用し、6人のユニークなドナーを使って、増大されたg-NKを生成させ（6人のCMV+、男3、女3、年齢39±7歳）、8人のユニークなドナーを使って、cNKを増大させた（8人のCMV-、男4、女4、年齢38±9歳）。g-NKの比率はg-NKドナーについては85±4％であり、cNKドナーについては2±1％であった。

フラトリサイドを評価するために、約1×10⁴個の増大されたNK細胞（g-NKまたはcNK）を、1μg/mLダラツムマブ（抗CD38）の存在下で培養した。5％CO²インキュベータ中、37℃で4時間のインキュベーション後に、細胞を洗浄し、NK細胞の数を定量するために、抗CD3抗体および抗CD56抗体で染色した。最終洗浄後に、ヨウ化プロピジウム（PI）を加え、3色フローサイトメトリーを使って、生NK細胞および死NK細胞の数を解析した（Bigley et al.（2016）,Clin.Exp.Immunol.,185:239-251）。図39に示すように、g-NK細胞のフラトリサイドはcNKのフラトリサイドの13分の1である。エロツズマブで実行した類似の実験は、エロツズマブで処理されたg-NKまたはcNKについては、フラトリサイドが検出されないことを示した。

実施例10での結果と合わせて、これらの結果は、フラトリサイド関連枯渇に煩わされることなくMMにおいて増強されたmAb抗腫瘍活性を与えるg-NK細胞の能力と合致する。

実施例26: 多発性骨髄腫の散在性同所性異種移植片MM.1Sモデルにおけるインビボでの効力
ダラツムマブと組み合わされたNK細胞（増大されたg-NK細胞またはcNK細胞）のインビボでの効力を、多発性骨髄腫のマウスモデルにおける腫瘍阻害および生存率を測定することによって評価した。実施例21に記載するように、凍結保存PBMCからまずCD3^neg/CD57^pos細胞について濃縮し、次に、IL-2（500IU/mL）、IL-15（10ng/mL）およびIL-21（25ng/mL）刺激性サイトカインの存在下、照射221.AEHフィーダー細胞と共に1:1の221.AEH対NK細胞比での増大を行うことにより、g-NK細胞を増大させた。IL-2（500IU/mL）、IL-15（10ng/mL）およびIL-21（25ng/mL）刺激性サイトカインの存在下で221.AEHフィーダー細胞を用いる記載の方法を使っても、CMV-血清陰性ドナーからのcNK細胞の収量は不十分であるため、実施例21に記載の代替法を使って、cNK細胞を増大させた。cNK細胞は、トランスジェニック白血病細胞株K562-mb15-41BBLとIL-2とを使って2週間増大させた。すべての細胞を、凍結保存PBMCおよび凍結保存フィーダー細胞から増大させた。

約5×10⁵個のルシフェラーゼ標識MM.1Sヒト骨髄腫細胞を雌NSGマウスの尾静脈に静脈内注射し、14日間、成長させた。5週間の継続期間にわたって毎週、6.0×10⁶個の増大されたg-NKまたはcNK細胞の静脈内投与と組み合わせて、モノクローナル抗体ダラツムマブをI.P.経路で投与した。腫瘍投与の2週間後を始まりとして、NK細胞サポートを提供するために2μg/マウスのヒト組換えIL-15を、3日ごとにI.P.経路によって投与した。この研究において処置されたマウスの群を表E8に要約する。

腫瘍量をモニターするために生物ルミネセンスイメージング（BLI）を週に2回行った。腫瘍接種の1週間後を始まりとして、マウスを不快感および忍容性の徴候ならびに体重について、毎日チェックした。150mg/kgのD-ルシフェリンを皮下注射した15分後にマウスを撮像した。Living Imageソフトウェア（PerkinElmer）を使ってマウス全体の総フラックス（光子/秒）を定量した。後肢麻痺、毛繕いおよび/または嗜眠などといった症候性骨髄腫の発症後は直ちに腫瘍保持マウスを屠殺した。屠殺までの時間を、生存時間の代用値として使用した。組織収集のために、最初のNK細胞投与の43日後に、生き残ったマウスをすべて屠殺した。研究の完了時に、フローサイトメトリーを使って、生物学的試料からのg-NK細胞、cNK細胞およびMM.1S（CD138pos/CD45neg）細胞を定量することで、腫瘍量とNK細胞生存率とを決定した。

（表Ｅ８）MM効力研究デザイン

g-NKとダラツムマブとの共投与は、cNKとダラツムマブとによる処置と比較して、有意な腫瘍阻害と、増強された生存率をもたらした。図40Aに示すように、g-NK細胞＋ダラツムマブは、7匹中5匹のマウスにおいて、骨髄腫腫瘍負荷を排除したことが、処置の5週間後のBLIイメージングによって証明された。定量的BLI解析により、g-NK＋ダラツムマブは持続的で統計的に有意な腫瘍退縮を誘導することが示された（図40B）。カプラン-マイヤー生存率解析は、g-NK＋ダラツムマブ処置マウスの全生存期間確率が、ビヒクルで処置したマウスまたはcNKとダラツムマブとで処置したマウスよりも有意に良いことを示した（p＜0.0001）（図40C）。この研究の終わりに、g-NK細胞を投薬したマウスはすべて、体重減少も毒性も観察されることがなく精力的であったが、対照マウスまたはcNK細胞とダラツムマブとで処置したマウスはいずれも、研究の終わる前に、重度の体重減少があり、骨髄腫に屈した（図40D）。興味深いことに、g-NK細胞で処置したマウスのうちの一匹は、マウスのうちの一匹の麻酔誘導性窒息ゆえに、腫瘍接種後21日目まで投薬されなかったが、このマウスは、g-NKマウスのなかで最も高いピークBLIを有したにも関わらず、この研究の終わりには検出可能な腫瘍BLIを有しなかった（図40A、♯印のマウス）。g-NK細胞を投薬した7匹のマウスのうち、2匹だけが、ごくわずかに検出可能な量の残存腫瘍BLIを有した。

骨髄のフローサイトメトリー解析により、検出可能な腫瘍BLIがない5匹のg-NK処置マウスは、実際に無腫瘍（骨髄中にCD138pos細胞なし）であることが確認された。7匹すべてのg-NK処置マウスについて、平均腫瘍量は、cNKとダラツムマブとで処置したマウスとの比較で、99％超、低減した（p＜0.001;図40E）。骨髄における腫瘍量および持続性NK細胞を表す代表的フローサイトメトリードットプロットを、図40Fに示す。研究の過程で撮影したすべてのBLI像を図40Gに示す。屠殺前にすべてのマウスについてX線像を得て、対照マウスまたはcNK細胞とダラツムマブとで処置したマウスには、後肢骨の骨折と奇形があり、一方、g-NK細胞とダラツムマブとで処置したマウスのうちの1匹は、多少の骨変形を有することがわかった（図40H）。

血液、脾臓および骨髄中のNK細胞の解析は、cNK細胞との比較で、ダラツムマブ処置マウスにおけるg-NK細胞の持続性の大きな増加を示した（図41A～C）。注目すべきことに、g-NK細胞数は、cNK細胞よりも、血液では＞90％高く（図41A）、脾臓では＞95％高く（図41B）、骨髄では＞99％高かった（図41C）。

総合すると、これらの結果は、インビボでのmAbの効果を増強することに関して、cNK細胞との比較を含めて、g-NK細胞の優位性をさらに裏付けており、ダラツムマブと組み合わせて与えられるg-NK細胞はMMに対して潜在的に治癒的であることを示唆している。さらに、これらの結果は、増強された生存率とフラトリサイドに対する体制が、g-NK細胞の優れた抗腫瘍効果と持続性とをもたらすことを裏付けている。

開示した特定態様は、例えば本発明のさまざまな局面を例示するなどの目的で提供されているのであって、本発明の範囲は、それらの特定態様に限定されるものではない。記載の組成物および方法のさまざまな変更態様は、本明細書における記載および教示から、明らかになると考えられる。そのような変形は、本開示の真の範囲および要旨から逸脱することなく実施することができ、本発明の範囲に包含されるものとする。

Claims

FcRγ欠損NK細胞（g-NK）を増大させるための方法であって、
該方法は、
（a）ナチュラルキラー（NK）細胞について濃縮された初代ヒト細胞の集団を得る工程であって、NK細胞について濃縮された該集団がヒト対象からの生物学的試料から選択される、工程、および
（b）濃縮NK細胞の該集団を、（i）照射HLA-E+フィーダー細胞対濃縮NK細胞の比が1:10～10:1である、HLAクラスIおよびHLAクラスIIが欠損している照射HLA-E+フィーダー細胞と、（ii）少なくとも1つの組換えサイトカインがインターロイキン（IL）-2であり、かつ少なくとも1つの組換えサイトカインがIL-21である、有効量の、NK細胞を増大させるための2種以上の組換えサイトカインとを含む培養培地において培養する工程
を含み、
ここで該方法により、g-NK細胞に富む増大されたNK細胞集団が産生される、
該方法。
FcRγ欠損NK細胞（g-NK）を増大させるための方法であって、
該方法は、
（a）対象からの末梢血試料中のナチュラルキラー（NK）細胞の少なくとも20％または約20％がNKG2Cについて陽性（NKG2C^pos）であり、かつ該末梢血試料中のNK細胞の少なくとも70％がNKG2Aについて陰性または低発現（NKG2A^neg）である対象を選択する工程、
（b）ナチュラルキラー（NK）細胞について濃縮された初代ヒト細胞の集団を該対象から得る工程であって、NK細胞について濃縮された該集団が、該対象からの生物学的試料から選択された、（i）CD3について陰性または低発現でありかつCD57について陽性（CD3^negCD57^pos）であるか、または（ii）CD3について陰性または低発現でありかつCD56について陽性（CD3^negCD56^pos）であるかのどちらかである細胞である、工程、および
（c）照射HLA-E+フィーダー細胞対濃縮NK細胞の比が1:10～10:1である、HLAクラスIおよびHLAクラスIIが欠損している照射HLA-E+フィーダー細胞を含む培養培地において、濃縮NK細胞の該集団を培養する工程であって、該培養する工程がNK細胞の増大のための条件下にある、工程
を含み、
ここで該方法により、g-NK細胞に富む増大されたNK細胞集団が産生される、
該方法。
前記増大されたNK細胞集団から、NKG2Cについて陽性（NKG2C^pos）でありかつ/またはNKG2Aについて陰性もしくは低発現（NKG2A^neg）である細胞を選択する工程をさらに含む、請求項1または請求項2記載の方法。
FcRγ欠損NK細胞（g-NK）を増大させるための方法であって、
該方法は、
（a）ナチュラルキラー（NK）細胞について濃縮された初代ヒト細胞の集団を得る工程であって、NK細胞について濃縮された該集団が、ヒト対象からの生物学的試料から選択された、（i）CD3について陰性もしくは低発現でありかつCD57について陽性（CD3^negCD57^pos）であるか、または（ii）CD3について陰性もしくは低発現でありかつCD56について陽性（CD3^negCD56^pos）であるかのどちらかである細胞である、工程、
（b）照射HAL-E+フィーダー細胞対濃縮NK細胞の比が1:10～10:1である、HLAクラスIおよびHLAクラスIIが欠損している照射HLA-E+フィーダー細胞を含む培養培地において、濃縮NK細胞の該集団を培養する工程であって、該培養する工程がNK細胞の増大のための条件下にある、工程、および
（c）増大された集団から、NKG2Cについて陽性でありかつNKG2Aについて陰性もしくは低発現（NKG2C^posNKG2A^neg）であるNK細胞を選択する工程
を含み、
ここで該方法により、g-NK細胞に富む増大されたNK細胞集団が産生される、
該方法。
NK細胞について濃縮された前記集団が、NKG2Cについて陽性（NKG2C^pos）である細胞についてさらに選択された細胞であるか、
NK細胞について濃縮された前記集団が、NKG2Aについて陰性もしくは低発現（NKG2A^neg）である細胞についてさらに選択された細胞であるか、または
NK細胞について濃縮された前記集団が、NKG2Cについて陽性でありかつNKG2Aについて陰性もしくは低発現（NKG2C^posNKG2A^neg）である細胞についてさらに選択された細胞である、
請求項1～4のいずれか一項記載の方法。
FcRγ欠損NK細胞（g-NK）を増大させるための方法であって、
該方法は、
（a）ナチュラルキラー（NK）細胞について濃縮された初代ヒト細胞の集団を得る工程であって、NK細胞について濃縮された該集団が、ヒト対象からの生物学的試料から選択された、NKG2Cについて陽性（NKG2C^pos）でありかつ/またはNKG2Aについて陰性もしくは低発現（NKG2A^neg）であり、かつ（i）CD3について陰性もしくは低発現でありかつCD57について陽性（CD3^negCD57^pos）であるか、または（ii）CD3について陰性もしくは低発現でありかつCD56について陽性（CD3^negCD56^pos）であるかのどちらかである細胞である、工程、および
（b）照射HLA-E+フィーダー細胞対濃縮NK細胞の比が1:10～10:1である、HLAクラスIおよびHLAクラスIIが欠損している照射HLA-E+フィーダー細胞を含む培養培地において、濃縮NK細胞の該集団を培養する工程であって、該培養する工程がNK細胞の増大のための条件下にある、工程
を含み、
ここで該方法により、g-NK細胞に富む増大されたNK細胞集団が産生される、
該方法。
NK細胞について濃縮された前記集団が、前記生物学的試料から選択された、NKG2Cについて陽性でありかつNKG2Aについて陰性もしくは低発現（NKG2C^posNKG2A^neg）である細胞である、請求項6記載の方法。
前記対象がCMV血清陽性である、請求項1～7のいずれか一項記載の方法。
前記対象からの生物学的試料中のNK細胞におけるg-NK細胞のパーセンテージが、5％超もしくは約5％超であるか、10％超もしくは約10％超であるか、または30％超もしくは約30％超である、請求項1～8のいずれか一項記載の方法。
前記濃縮NK細胞集団におけるg-NK細胞のパーセンテージが、20％もしくは約20％から、90％もしくは約90％であるか、40％もしくは約40％から、90％もしくは約90％であるか、または60％もしくは約60％から、90％または約90％である、請求項1～9のいずれか一項記載の方法。
NK細胞について濃縮された前記集団が、前記生物学的試料から選択された、CD3について陰性または低発現でありかつCD57について陽性（CD3^negCD57^pos）である細胞である、請求項1～10のいずれか一項記載の方法。
NK細胞について濃縮された前記集団が、
（a）前記生物学的試料から、（1）CD3について陰性もしくは低発現（CD3^neg）である細胞または（2）CD57について陽性（CD57^pos）である細胞を選択し、これにより、第1選択集団を濃縮する、選択することと、
（b）該第1選択集団から、（1）CD3について陰性もしくは低発現（CD3^neg）である細胞または（2）CD57について陽性（CD57^pos）である細胞のうちのもう一方について細胞を選択し、これにより、CD3について陰性もしくは低発現でありかつCD57について陽性（CD3^negCD57^pos）である細胞について濃縮する、選択することと
を含むプロセスによって、前記生物学的試料から選択され、
任意で該プロセスは、前記生物学的試料から、CD3について陰性もしくは低発現（CD3^neg）である細胞を選択し、これにより、第1選択集団を濃縮する、選択することと、該第1選択集団から、CD57について陽性（CD57^pos）である細胞を選択することとを含む、
請求項11記載の方法。
NK細胞について濃縮された前記集団が、前記生物学的試料から選択された、CD3について陰性または低発現でありかつCD56について陽性（CD3^negCD56^pos）である細胞である、請求項1～10のいずれか一項記載の方法。
NK細胞について濃縮された前記集団が、
（a）前記生物学的試料から、（1）CD3について陰性もしくは低発現（CD3^neg）である細胞または（2）CD56について陽性（CD56^pos）である細胞を選択し、これにより、第1選択集団を濃縮する、選択することと、
（b）該第1選択集団から、（1）CD3について陰性もしくは低発現（CD3^neg）である細胞または（2）CD56について陽性（CD56^pos）である細胞のうちのもう一方について細胞を選択し、これにより、CD3について陰性もしくは低発現でありかつCD56について陽性（CD3^negCD56^pos）である細胞について濃縮する、選択することと
を含むプロセスによって、前記生物学的試料から選択され、
任意で該プロセスは、前記生物学的試料から、CD3について陰性もしくは低発現（CD3^neg）である細胞を選択し、これにより、第1選択集団を濃縮する、選択することと、該第1選択集団から、CD56について陽性（CD56^pos）である細胞を選択することとを含む、
請求項13記載の方法。
前記対象が、前記対象からの末梢血試料中に、少なくとも20％または少なくとも約20％の、NKG2Cについて陽性（NKG2C^pos）であるNK細胞を有するということについて選択された対象であり、および/または前記対象が、前記対象からの末梢血試料中に、少なくとも70％または少なくとも約70％の、NKG2Aについて陰性もしくは低発現（NKG2A^neg）であるNK細胞を有するということについて選択された対象である、請求項1および3～14のいずれか一項記載の方法。
得られた前記濃縮NK細胞集団が、凍結された凍結保存試料であり、かつ該凍結保存試料が、前記培養する工程に先立って解凍される、請求項1～15のいずれか一項記載の方法。
得られた前記濃縮NK細胞集団が、前記培養する工程に先立って、凍結も凍結保存もされない、請求項1～15のいずれか一項記載の方法。
増大のための条件が、有効量の、1種または複数種の組換えサイトカインを含む、請求項2～17のいずれか一項記載の方法。
前記1種または複数種の組換えサイトカインが、有効量のSCF、GSK3i、FLT3、IL-2、IL-6、IL-7、IL-15、IL-12、IL-18、IL-21、IL-27、またはそれらの組み合わせを含む、請求項18記載の方法。
前記1種または複数種の組換えサイトカインが、有効量のIL-2、IL-7、IL-15、IL-12、IL-18、IL-21、IL-27、またはそれらの組み合わせを含む、請求項18または請求項19記載の方法。
前記1種または複数種の組換えサイトカインのうちの少なくとも1つがIL-21である、請求項18～20のいずれか一項記載の方法。
前記1種または複数種の組換えサイトカインのうちの少なくとも1つがIL-2である、請求項18～21のいずれか一項記載の方法。
前記1種または複数種の組換えサイトカインが、IL-7、IL-15、IL-12、IL-18もしくはIL-27、またはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項1、請求項21または請求項22記載の方法。
前記組換えサイトカインがIL-21およびIL-2である、請求項1および21～23のいずれか一項記載の方法。
前記組換えサイトカインがIL-21、IL-2、およびIL-15である、請求項1および21～23のいずれか一項記載の方法。
組換えIL-21が、前記培養する工程の少なくとも一部分の期間中、10ng/mLまたは約10ng/mLから、100ng/mLまたは約100ng/mLの濃度で、前記培養培地に加えられる、請求項1および21～25のいずれか一項記載の方法。
組換えIL-21が、前記培養する工程の少なくとも一部分の期間中、25ng/mLまたは約25ng/mLの濃度で、前記培養培地に加えられる、請求項1および21～26のいずれか一項記載の方法。
組換えIL-2が、前記培養する工程の少なくとも一部分の期間中、10IU/mLまたは約10IU/mLから、500IU/mLまたは約500IU/mLの濃度で、前記培養培地に加えられる、請求項1および22～27のいずれか一項記載の方法。
組換えIL-2が、前記培養する工程の少なくとも一部分の期間中、100IU/mLまたは約100IU/mLの濃度で、前記培養培地に加えられる、請求項1および22～28のいずれか一項記載の方法。
組換えIL-2が、前記培養する工程の少なくとも一部分の期間中、500IU/mLまたは約500IU/mLの濃度で、前記培養培地に加えられる、請求項1および22～28のいずれか一項記載の方法。
組換えIL-15が、前記培養する工程の少なくとも一部分の期間中、1ng/mL～50ng/mLまたは約1ng/mL～50ng/mLの濃度で、前記培養培地に加えられる、請求項23および25～30のいずれか一項記載の方法。
組換えIL-15が、前記培養する工程の少なくとも一部分の期間中、10ng/mLまたは約10ng/mLの濃度で、前記培養培地に加えられる、請求項23および25～31のいずれか一項記載の方法。
前記組換えサイトカインが、前記培養する工程の開始時またはほぼ開始時を始まりとして、前記培養培地に加えられる、請求項1および18～32のいずれか一項記載の方法。
前記培養する工程の期間中、前記培養培地を1回または複数回交換する工程をさらに含み、前記培養培地の各交換時に、前記組換えサイトカインを含有する新鮮培地が加えられる、請求項1および18～33のいずれか一項記載の方法。
前記培養培地の交換が、前記培養する工程の継続期間にわたって、2または3日ごとに実行される、請求項34記載の方法。
前記培地を交換する工程が、最大5日間にわたる培地交換なしの初期増大後に、任意で最大5日間にわたる培地交換なしの初期増大後に、行われる、請求項34または請求項35記載の方法
前記組換えサイトカインがIL-21を含み、該IL-21が、前記培養する工程の少なくとも一部分の期間中、抗IL-21抗体との複合体として加えられ、任意で、前記培養する工程の開始時もしくはほぼ開始時に加えられる、および/または前記培養する工程の期間中に1回もしくは複数回、加えられる、請求項1および18～36のいずれか一項記載の方法。
前記抗IL-21抗体の濃度が100ng/mL～500ng/mLもしくは約100ng/mL～500ng/mLであり、かつ/または前記組換えIL-21の濃度が10ng/mL～100ng/mLもしくは約10ng/mL～100ng/mLである、請求項37記載の方法。
前記抗IL-21抗体の濃度が250ng/mLまたは約250ng/mLであり、かつ/または前記組換えIL-21の濃度が25ng/mLまたは約25ng/mLである、請求項37または請求項38記載の方法。
前記ヒト対象が、CD16 158V/V NK細胞遺伝子型またはCD16 158V/F NK細胞遺伝子型を有し、任意で、前記生物学的試料が、CD16 158V/V NK細胞遺伝子型またはCD16 158V/F NK細胞遺伝子型について選択されたヒト対象に由来する、請求項1～38のいずれか一項記載の方法。
前記生物学的試料が末梢血単核球（PBMC）であるか、または末梢血単核球（PBMC）を含む、請求項1～40のいずれか一項記載の方法。
前記生物学的試料が血液試料である、請求項1～41のいずれか一項記載の方法。
前記生物学的試料がアフェレーシス試料または白血球アフェレーシス試料である、請求項1～42のいずれか一項記載の方法。
前記生物学的試料が、凍結された凍結保存試料であり、かつ該凍結保存試料が、前記培養する工程に先立って解凍される、請求項1～43のいずれか一項記載の方法。
前記生物学的試料が、前記培養する工程に先立って、凍結も凍結保存もされない、請求項1～43のいずれか一項記載の方法。
前記HLA-E+フィーダー細胞がK562細胞である、請求項1～45のいずれか一項記載の方法。
前記K562細胞が、膜結合型IL-15（K562-mb15）または膜結合型IL-21（K562-mb21）を発現する、請求項46記載の方法。
前記HLA-E+フィーダー細胞が221.AEH細胞である、請求項1～45のいずれか一項記載の方法。
照射HLA-E+フィーダー細胞対NK細胞の比が、1:1～5:1（両端の値を含む）であるか、または1:1～3:1（両端の値を含む）である、請求項1～48のいずれか一項記載の方法。
照射HLA-E+フィーダー細胞対濃縮NK細胞の比が、2.5:1もしくは約2.5:1であるか、または2:1もしくは約2:1である、請求項1～49のいずれか一項記載の方法。
前記濃縮NK細胞集団が新しく単離されている、または前もって凍結および解凍されていない、請求項50のいずれか一項記載の化合物。
照射HLA-E+フィーダー細胞対濃縮NK細胞の比が1:1または約1:1である、請求項1～49のいずれか一項記載の方法。
前記濃縮NK細胞集団が、凍結保存のために凍結された後に解凍されている、請求項52記載の方法。
前記培養する工程の少なくとも一部分の期間中、前記培養培地に加えられる前記組換えサイトカインが、500IU/mL IL-2、10ng/mL IL-15、および25ng/mL IL-21である、請求項1および18～53のいずれか一項記載の方法。
前記濃縮NK細胞集団が、2.0×10⁵個もしくは約2.0×10⁵個の濃縮NK細胞から、5.0×10⁷個もしくは約5.0×10⁷個の濃縮NK細胞、1.0×10⁶個もしくは約1.0×10⁶個の濃縮NK細胞から、1.0×10⁸個もしくは約1.0×10⁸個の濃縮NK細胞、1.0×10⁷個もしくは約1.0×10⁷個の濃縮NK細胞から、5.0×10⁸個もしくは約5.0×10⁸個の濃縮NK細胞、または1.0×10⁷個もしくは約1.0×10⁷個の濃縮NK細胞から、1.0×10⁹個もしくは約1.0×10⁹個の濃縮NK細胞（それぞれ両端の値を含む）を含み、任意で、前記濃縮NK細胞集団が1.0×10⁶個または約1.0×10⁶個の濃縮NK細胞を含む、請求項1～54のいずれか一項記載の方法。
前記培養する工程の開始時の濃縮NK細胞集団が、0.05×10⁶個の濃縮NK細胞/mL～1.0×10⁶個の濃縮NK細胞/mLまたは約0.05×10⁶個の濃縮NK細胞/mL～0.5×10⁶個の濃縮NK細胞/mLの濃度であり、任意で、前記培養する工程の開始時の濃縮NK細胞集団が0.2×10⁶個または約0.2×10⁶個の濃縮NK細胞/mLの濃度を含む、請求項1～55のいずれか一項記載の方法。
前記培養する工程が閉鎖システムにおいて実行される、請求項1～56のいずれか一項記載の方法。
前記培養する工程が無菌培養バッグにおいて実行される、請求項1～57のいずれか一項記載の方法。
前記培養する工程がガス透過性培養容器を使って実行される、請求項1～58のいずれか一項記載の方法。
前記培養する工程がバイオリアクターを使って実行される、請求項1～59のいずれか一項記載の方法。
前記培養する工程が、前記方法によって少なくとも2.50×10⁸個もしくは少なくとも約2.50×10⁸個のg-NK細胞、少なくとも5.00×10⁸個もしくは少なくとも約5.00×10⁸個のg-NK細胞、少なくとも1.0×10⁹個もしくは少なくとも約1.0×10⁹個のg-NK細胞、または少なくとも5.0×10⁹個もしくは少なくとも約5.0×10⁹個のg-NK細胞の増大が達成される時点まで実行される、請求項1～60のいずれか一項記載の方法。
前記培養する工程が、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、15日、16日、17日、18日、19日、20日、21日、22日、23日、24日もしくは25日、または約5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、15日、16日、17日、18日、19日、20日、21日、22日、23日、24日もしくは25日、または少なくとも5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、15日、16日、17日、18日、19日、20日、21日、22日、23日、24日もしくは25日、または少なくとも約5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、15日、16日、17日、18日、19日、20日、21日、22日、23日、24日もしくは25日間にわたって実行される、請求項1～61のいずれか一項記載の方法。
前記培養する工程が、14日、または約14日、または少なくとも14日、または少なくとも約14日間にわたって実行される、請求項1～62のいずれか一項記載の方法。
前記培養する工程が、21日、または約21日、または少なくとも21日、または少なくとも約21日間にわたって実行される、請求項1～62のいずれか一項記載の方法。
前記培養する工程の終了時に、前記培養する工程の開始時と比較して増加した数のg-NK細胞を産生し、該増加が1000倍超または約1000倍超である、請求項1～64のいずれか一項記載の方法。
前記方法によって産生されたg-NK細胞に富む増大された集団を収集する工程をさらに含む、請求項1～65のいずれか一項記載の方法。
g-NK細胞に富む前記増大された集団のうち、該集団の50％超がFcRγ^negであるか、該集団の60％超がFcRγ^negであるか、該集団の70％超がFcRγ^negであるか、該集団の80％超がFcRγ^negであるか、該集団の90％超がFcRγ^negであるか、または該集団の95％超がFcRγ^negである、請求項1～66のいずれか一項記載の方法。
g-NK細胞に富む前記増大された集団のうち、（i）30％超もしくは約30％超がNKG2Cについて陽性（NKG2C^pos）であり、かつ/もしくは50％超もしくは約50％超がNKG2Aについて陰性もしくは低発現（NKG2A^neg）であるか、（ii）35％超もしくは約35％超がNKG2Cについて陽性（NKG2C^pos）であり、かつ/もしくは60％超もしくは約60％超がNKG2Aについて陰性もしくは低発現（NKG2A^neg）であるか、（iii）40％超もしくは約40％超がNKG2Cについて陽性（NKG2C^pos）であり、かつ/もしくは70％超もしくは約70％超がNKG2Aについて陰性もしくは低発現（NKG2A^neg）であるか、（iv）45％超もしくは約45％超がNKG2Cについて陽性（NKG2C^pos）であり、かつ/もしくは80％超もしくは約80％超がNKG2Aについて陰性もしくは低発現（NKG2A^neg）であるか、（v）50％超もしくは約50％超がNKG2Cについて陽性（NKG2C^pos）であり、かつ/もしくは85％超もしくは約85％超がNKG2Aについて陰性もしくは低発現（NKG2A^neg）であるか、（vi）55％超もしくは約55％超がNKG2Cについて陽性（NKG2C^pos）であり、かつ/もしくは90％超もしくは約90％超がNKG2Aについて陰性もしくは低発現（NKG2A^neg）であるか、または（vii）60％超もしくは約60％超がNKG2Cについて陽性（NKG2C^pos）であり、かつ/もしくは95％超もしくは約95％超がNKG2Aについて陰性もしくは低発現（NKG2A^neg）である、請求項1～67のいずれか一項記載の方法。
前記ヒト対象がCD16 158V/V NK細胞遺伝子型を有し、かつ前記g-NK細胞がCD16 158V/V（V158）であるか、または前記ヒト対象がCD16 158V/F NK細胞遺伝子型を有し、かつ前記g-NK細胞がCD16 158V/F（V158）である、請求項1～68のいずれか一項記載の方法。
g-NK細胞に富む前記増大された集団から、もう一つの表面マーカーNKG2C^pos、NKG2C^neg、CD16^pos、CD57^pos、CD7^dim/neg、CD161^neg、CD38^neg、または前記のいずれかの組み合わせに基づいて細胞の集団を精製する工程をさらに含む、請求項1～69のいずれか一項記載の方法。
g-NK細胞に富む前記増大された集団のうち、g-NK細胞の70％超もしくは約70％超がパーフォリンについて陽性であるか、g-NK細胞の80％超もしくは約80％超がパーフォリンについて陽性であるか、g-NK細胞の85％超もしくは約85％超がパーフォリンについて陽性であるか、またはg-NK細胞の90％超もしくは約90％超がパーフォリンについて陽性である、請求項1～70のいずれか一項記載の方法。
g-NK細胞に富む前記増大された集団のうち、g-NK細胞の70％超もしくは約70％超がグランザイムBについて陽性であるか、g-NK細胞の80％超もしくは約80％超がグランザイムBについて陽性であるか、g-NK細胞の85％超もしくは約85％超がグランザイムBについて陽性であるか、またはg-NK細胞の90％超もしくは約90％超がグランザイムBについて陽性である、請求項1～71のいずれか一項記載の方法。
g-NK細胞に富む前記増大された集団のうち、細胞の10％超が、任意でCD107aによって測定された場合に、腫瘍標的細胞に対して脱顆粒することができ、任意で、該脱顆粒が、該腫瘍標的細胞に対する抗体の非存在下で測定される、請求項1～72のいずれか一項記載の方法。
g-NK細胞に富む前記増大された集団のうち、15％超もしくは約15％超、20％超もしくは約20％超、30％超もしくは約30％超、40％超もしくは約40％超、または50％超もしくは約50％超が、標的抗原を発現する細胞（標的細胞）および該標的抗原に対する抗体（抗標的抗体）の存在下、任意でCD107a発現によって測定された場合に、脱顆粒を呈する、請求項1～73のいずれか一項記載の方法。
g-NK細胞に富む前記増大された集団のうち、細胞の10％超が腫瘍標的細胞に対してインターフェロンγまたはTNF-αを産生することができ、任意で、該インターフェロンγまたはTNF-αが、該腫瘍標的細胞に対する抗体の非存在下で測定される、請求項1～74のいずれか一項記載の方法。
g-NK細胞に富む前記増大された集団のうち、15％超もしくは約15％超、20％超もしくは約20％超、30％超もしくは約30％超、40％超もしくは約40％超、または50％超もしくは約50％超が、標的抗原を発現する細胞（標的細胞）および該標的抗原に対する抗体（抗標的抗体）の存在下、エフェクターサイトカインを産生し、任意で、該エフェクターサイトカインがIFN-γまたはTNF-αである、請求項1～75のいずれか一項記載の方法。
前記増大された濃縮g-NK細胞集団を、薬学的に許容される賦形剤中に製剤化する工程をさらに含む、請求項1～76のいずれか一項記載の方法。
前記増大された濃縮g-NK細胞集団を、凍結保護物質を含む無血清凍結保存培地と共に製剤化する工程をさらに含む、請求項77記載の方法。
前記凍結保護物質がDMSOである、任意で、前記凍結保護物質がDMSOでありかつ前記凍結保存培地が5％～10％DMSO（v/v）、任意で10％または約10％DMSO（v/v）である、請求項78記載の方法。
請求項1～79のいずれか一項記載の方法によって産生されたg-NK細胞を含む、組成物。
増大されたナチュラルキラー（NK）細胞の組成物であって、該組成物中の細胞の少なくとも50％または少なくとも約50％がFcRγ欠損（FcRγ^neg）NK細胞（g-NK）であり、該g-NK細胞の70％超または約70％超がパーフォリンについて陽性であり、かつ該g-NK細胞の70％超または約70％超がグランザイムBについて陽性である、該組成物。
（i）前記g-NK細胞の80％超または約80％超がパーフォリンについて陽性であり、かつ該g-NK細胞の80％超または約80％超がグランザイムBについて陽性であるか、（ii）該g-NK細胞の90％超または約90％超がパーフォリンについて陽性であり、かつ該g-NK細胞の90％超または約90％超がグランザイムBについて陽性であるか、または（iii）該g-NK細胞の95％超または約95％超がパーフォリンについて陽性であり、かつ該g-NK細胞の95％超または約95％超がグランザイムBについて陽性である、請求項80または請求項81記載の組成物。
パーフォリンについて陽性である前記細胞では、該細胞が、細胞内フローサイトメトリーによって測定された場合に、平均蛍光強度（MFI）に基づいて、FcRγ^posである細胞によって発現されるパーフォリンの平均レベルの少なくとも2倍または少なくとも約2倍である平均レベルのパーフォリンを発現し、かつ/または
グランザイムBについて陽性である前記細胞では、該細胞が、細胞内フローサイトメトリーによって測定された場合に、平均蛍光強度（MFI）に基づいて、FcRγ^posである細胞によって発現されるグランザイムBの平均レベルの少なくとも2倍または少なくとも約2倍である平均レベルのグランザイムBを発現する、
請求項80～82のいずれか一項記載の組成物。
前記組成物中の細胞の10％超が、任意でCD107a発現によって測定された場合に、腫瘍標的細胞に対して脱顆粒することができ、任意で、該脱顆粒が、該腫瘍標的細胞に対する抗体の非存在下で測定される、請求項80～83のいずれか一項記載の組成物。
前記組成物中の細胞のうち、15％超もしくは約15％超、20％超もしくは約20％超、30％超もしくは約30％超、40％超もしくは約40％超、または50％超もしくは約50％超が、標的抗原を発現する細胞（標的細胞）および該標的抗原に対する抗体（抗標的抗体）の存在下、任意でCD107a発現によって測定された場合に、脱顆粒を呈する、請求項80～84のいずれか一項記載の組成物。
前記組成物中の細胞の10％超が、腫瘍標的細胞に対してインターフェロンγまたはTNF-αを産生することができ、任意で、該インターフェロンγまたはTNF-αが、該腫瘍標的細胞に対する抗体の非存在下で測定される、請求項80～85のいずれか一項記載の組成物。
前記組成物中の細胞のうち、15％超もしくは約15％超、20％超もしくは約20％超、30％超もしくは約30％超、40％超もしくは約40％超、または50％超もしくは約50％超が、標的抗原を発現する細胞（標的細胞）および該標的抗原に対する抗体（抗標的抗体）の存在下で、エフェクターサイトカインを産生する、請求項80～86のいずれか一項記載の組成物。
増大されたナチュラルキラー（NK）細胞の組成物であって、該組成物中の細胞の少なくとも50％または少なくとも約50％がFcRγ欠損（FcRγ^neg）NK細胞（g-NK）であり、かつ該組成物中の細胞の15％超または約15％超が、標的抗原を発現する細胞（標的細胞）および該標的抗原に対する抗体（抗標的抗体）の存在下で、エフェクターサイトカインを産生する、該組成物。
20％超もしくは約20％超、30％超もしくは約30％超、40％超もしくは約40％超、または50％超もしくは約50％超が、標的抗原を発現する細胞（標的細胞）および該標的抗原に対する抗体（抗標的抗体）の存在下で、エフェクターサイトカインを産生する、請求項88記載の組成物。
前記エフェクターサイトカインがIFN-γまたはTNF-αである、請求項87～89のいずれか一項記載の組成物。
前記エフェクターサイトカインがIFN-γおよびTNF-αである、請求項87～90のいずれか一項記載の組成物。
前記組成物中の細胞のうち、15％超もしくは約15％超、20％超もしくは約20％超、30％超もしくは約30％超、40％超もしくは約40％超、または50％超もしくは約50％超が、標的抗原を発現する細胞（標的細胞）および該標的抗原に対する抗体（抗標的抗体）の存在下、任意でCD107a発現によって測定された場合に、脱顆粒を呈する、請求項87～91のいずれか一項記載の組成物。
増大されたナチュラルキラー（NK）細胞の組成物であって、該組成物中の細胞の少なくとも50％または少なくとも約50％がFcRγ欠損（FcRγ^neg）NK細胞（g-NK）であり、かつ該組成物中の細胞の15％超または約15％超が、標的抗原を発現する細胞（標的細胞）および該標的抗原に対する抗体（抗標的抗体）の存在下、任意でCD107a発現によって測定された場合に、脱顆粒を呈する、該組成物。
前記組成物中の細胞のうち、20％超もしくは約20％超、30％超もしくは約30％超、40％超もしくは約40％超、または50％超もしくは約50％超が、標的抗原を発現する細胞（標的細胞）および該標的抗原に対する抗体（抗標的抗体）の存在下、任意でCD107a発現によって測定された場合に、脱顆粒を呈する、請求項93記載の組成物。
前記細胞の60％超もしくは約60％超がg-NK細胞であるか、前記細胞の70％超もしくは約70％超がg-NK細胞であるか、前記細胞の80％超もしくは約80％超がg-NK細胞であるか、前記細胞の90％超もしくは約90％超がg-NK細胞であるか、または前記細胞の95％超もしくは約95％超がg-NK細胞である、請求項80～94のいずれか一項記載の組成物。
少なくとも10⁸個または少なくとも約10⁸個の細胞を含む、請求項80～95のいずれか一項記載の組成物。
前記組成物中のg-NK細胞の数が、10⁸個もしくは約10⁸個から、10¹²個もしくは約10¹²個の細胞、10⁸個もしくは約10⁸個から、10¹¹個もしくは約10¹¹個の細胞、10⁸個もしくは約10⁸個から、10¹⁰個もしくは約10¹⁰個の細胞、10⁸個もしくは約10⁸個から、10⁹個もしくは約10⁹個の細胞、10⁹個もしくは約10⁹個から、10¹²個もしくは約10¹²個の細胞、10⁹個もしくは約10⁹個から、10¹¹個もしくは約10¹¹個の細胞、10⁹個もしくは約10⁹個から、10¹⁰個もしくは約10¹⁰個の細胞、10¹⁰個もしくは約10¹⁰個から、10¹²個もしくは約10¹²個の細胞、10¹⁰個もしくは約10¹⁰個から、10¹¹個もしくは約10¹¹個の細胞、または10¹¹個もしくは約10¹¹個から、10¹²個もしくは約10¹²個の細胞である、請求項80～96のいずれか一項記載の組成物。
前記組成物中のg-NK細胞の数が、5×10⁸個もしくは約5×10⁸個の細胞、1×10⁹個もしくは約1×10⁹個の細胞、5×10⁹個または約5×10⁹個の細胞、または1×10¹⁰個もしくは約1×10¹⁰個の細胞である、請求項80～97のいずれか一項記載の組成物。
前記組成物の体積が、50mLまたは約50mLから、500mLまたは約500mL、任意で200mLまたは約200mLである、請求項80～98のいずれか一項記載の組成物。
前記組成物中の細胞が、同じ生物学的試料から増大された、単一ドナー対象からのものである、請求項80～99のいずれか一項記載の組成物。
薬学的組成物である、請求項80～100のいずれか一項記載の組成物。
薬学的に許容される賦形剤を含む、請求項80～101のいずれか一項記載の組成物。
前記組成物が、凍結保護物質を含む無血清凍結保存培地中に製剤化されており、任意で、該凍結保護物質がDMSOであり、かつ該凍結保存培地が5％～10％DMSO（v/v）である、請求項80～102のいずれか一項記載の組成物。
無菌である、請求項80～103のいずれか一項記載の組成物。
請求項80～104のいずれか一項記載の組成物を含む、無菌バッグ。
凍結保存適合バッグである、請求項105記載の無菌バッグ。
請求項80～104のいずれか一項記載の組成物を含む、キット。
疾患または状態を処置するための単独療法として前記組成物を投与することに関する説明書をさらに含む、請求項107記載のキット。
疾患または状態を処置するための追加の作用物質をさらに含む、請求項108記載のキット。
請求項107～109のいずれか一項記載のキットを含む、製造品。
請求項80～104のいずれか一項記載の組成物を、その必要がある個体に投与する工程を含む、疾患または状態を処置する方法。
前記疾患または状態が、炎症状態、感染症、およびがんからなる群より選択される、請求項111記載の方法。
前記疾患または状態が、がんであり、かつ該がんが白血病、リンパ腫、または骨髄腫である、請求項111または請求項112記載の方法。
前記組成物が単独療法として投与される、請求項111～113のいずれか一項記載の方法。
前記疾患または状態を処置するために追加の作用物質を個体に投与する工程をさらに含む、請求項111～113のいずれか一項記載の方法。
前記追加の作用物質が抗体またはFc融合タンパク質である、請求項115記載の方法。
前記疾患または状態が、がんであり、かつ前記抗体が、該がんに関連する腫瘍抗原を認識する、請求項116記載の方法。
前記疾患または状態を処置するためにがん治療薬または細胞毒性作用物質を対象に投与する工程をさらに含む、請求項111～117のいずれか一項記載の方法。
1×10⁵個または約1×10⁵個のNK細胞/kgから、1×10⁷個または約1×10⁷個のNK細胞/kgを、個体に投与する工程を含む、請求項111～118のいずれか一項記載の方法。
5×10⁷個または約5×10⁷個のNK細胞から、10×10⁹個または約10×10⁹個のNK細胞を、個体に投与する工程を含む、請求項111～119のいずれか一項記載の方法。
前記個体がヒトである、請求項111～120のいずれか一項記載の方法。
前記組成物中のNK細胞が前記個体にとって同種異系である、請求項111～121のいずれか一項記載の方法。
前記組成物中のNK細胞が前記対象にとって自家である、請求項111～122のいずれか一項記載の方法。
対象における疾患または状態を処置するのに使用するための、請求項80～104のいずれか一項記載の薬学的組成物。
対象における疾患または状態を処置するための医薬の製造における請求項80～104のいずれか一項記載の薬学的組成物の使用。
前記疾患または状態が、炎症状態、感染症、およびがんからなる群より選択される、請求項124記載の使用のための薬学的組成物または請求項125記載の使用。
前記組成物が、単独療法としての投与のためのものである、請求項124～126のいずれか一項記載の使用のための薬学的組成物または該使用。
前記組成物が、前記疾患または状態を処置するために前記個体に追加の作用物質を投与するためのものである、請求項124～126のいずれか一項記載の使用のための薬学的組成物または該使用。
前記追加の作用物質が抗体またはFc融合タンパク質である、請求項128記載の使用のための薬学的組成物または該使用。
前記疾患または状態が、がんであり、かつ前記抗体が、該がんに関連する腫瘍抗原を認識する、請求項128もしくは請求項129記載の使用のための薬学的組成物または該使用。