ES2073036T5 - Proteinas b19 de parpovirus humano y particulas de tipo virus, su produccion y su utilizacion en pruebas de diagnostico y vacunas. - Google Patents
Proteinas b19 de parpovirus humano y particulas de tipo virus, su produccion y su utilizacion en pruebas de diagnostico y vacunas.Info
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A LAS PROTEINAS DE REVESTIMIENTO VP1 Y VP2 DEL PARPOVIRUS HUMANO B19 Y A LAS PARTICULAS DE TIPO VIRUS QUE CONSISTEN EN VP2 O EN VP1 Y VP2. LA INVENCION COMPRENDE ADEMAS INFORMACION GENETICA EN FORMA DE VECTORES DE EXPRESION RECOMBINANTE QUE CONTIENEN LOS GENES QUE CODIFICAN DICHAS PROTEINAS, Y ORGANISMOS QUE A TRAVES DE MANIPULACION GENETICA UTILIZANDO DICHOS VECTORES HAN ADQUIRIDO LA CAPACIDAD DE PRODUCIR DICHAS PROTEINAS Y/O PARTICULAS. LA INVENCION COMPRENDE ADEMAS LAS UTILIZACIONES DE DICHAS PROTEINAS Y PARTICULAS DE TIPO VIRUS PARA DIAGNOSTICOS O VACUNAS.
Description
Proteínas B19 de parvovirus humano y partículas
de tipo virus, su producción y su utilización en pruebas de
diagnostico y vacunas.
La invención se refiere tanto al campo de la
manipulación genética mediante la tecnología del DNA recombinante
para la producción de ciertas proteínas y/o partículas formadas por
una o más de estas proteínas, como a los campos del diagnóstico y
la preparación de vacunas. La invención trata de ciertas proteínas
víricas, que pueden estar o no en forma de partículas de tipo
vírico, dichas proteínas o partículas se pueden usar por ejemplo en
ensayos para detectar anticuerpos dirigidos contra esas proteínas,
o se pueden usar para obtener tales anticuerpos, o para conseguir
protección frente al virus, o para la incorporación en su seno de
epítopes de proteínas u otros patógenos, para conseguir protección
frente a estos otros patógenos (y por tanto ofrece varias
posibilidades de uso para fines de vacunación).
Más particularmente, la invención se refiere a
las proteínas de la envuelta VP1 y VP2 del parvovirus humano B19, y
a partículas de tipo vírico formadas por VP2 o por VP1 y VP2. La
invención comprende además información genética en forma de
vectores de expresión recombinantes que contienen los genes que
codifican estas proteínas, y organismos que han adquirido la
capacidad de producir las proteínas y/o partículas en cuestión,
debido a la manipulación genética que usa dichos vectores.
El parvovirus humano B19 se descubrió por azar en
1975 en muestras de suero de algunos donantes de sangre sanos.
Desde aquel momento se ha descubierto que el virus causa eritema
infeccioso, también conocido como "quinta enfermedad" y la
denominada "crisis aplásica" en pacientes con anemia hemolítica
crónica. el virus B19 está asociado además con el aborto y la
muerte fetal, con la artritis y con la anemia crónica en pacientes
inmunodeficientes. Las infecciones pueden ocurrir también con otros
síndromes o aparecer de forma completamente asintomática.
Las infecciones con este virus, que se encuentra
en todo el mundo, aparecen usualmente en epidemias que tienen lugar
aproximadamente cada 3-6 años, pero pueden ocurrir
esporádicamente en años intermedios.
Hoy en día, catorce años después del
descubrimiento del virus B19, el diagnóstico para la infección por
el virus se realiza sólo en un número limitado de laboratorios en
el mundo. Debido a que el virus no se puede manifestar en pacientes
en el momento en el que surgen los síntomas (la viremia y la
excreción del virus preceden a los síntomas), el diagnóstico se debe
centrar en mostrar la existencia de anticuerpos (IgM) específicos
de B19.
Con esta finalidad (y también para la preparación
de vacunas adecuadas, por ejemplo), es necesario tener un
suministro suficiente de antígeno B19 para poner en marcha los
ensayos. Lo que falta, sin embargo, es un sistema de cultivo
celular in vitro adecuado para propagar el virus, con lo cual
se podría obtener antígeno suficiente.
El diagnóstico del parvovirus B19 existente se
realiza con antígeno vírico que se obtiene más o menos por azar (el
escrutinio de donantes de sangre ofrece una probabilidad estimada
de 1 a 50.000 de que se encuentre sangre virémica).
Por estas razones, existe una gran necesidad de
antígeno producido mediante técnicas de DNA recombinante.
Consecuentemente, se han realizado ya varias propuestas en este
sentido, pero ninguna de ellas ha demostrado ser realmente útil
para la creación de un ensayo diagnóstico.
La presente invención se basa en el uso de un
sistema de vector de expresión que se desarrolló bastante
recientemente, denominado el "sistema de vector de expresión de
baculovirus". En este sistema se usa un vector vírico
recombinante del baculovirus de la poliedrosis nuclear
Autographida californica (AcNPV), para expresar las
proteínas del virus B19 en células de insecto: Spodoptera
frugiperda (S19). Este sistema ofrece muchas ventajas sobre los
sistemas actuales de vectores de expresión:
- a)
- En vista del uso para propósitos de diagnóstico y posiblemente terapéuticos (vacunas), no se espera reactividad cruzada frente a proteínas del baculovirus o de las células de insecto (en proteínas que se expresan en E. coli, esto tampoco se puede excluir siempre).
- b)
- Las proteínas víricas se pueden producir en grandes cantidades (1/500 mg/l) hasta incluso el 50-75% de la proteína total, detectadas sobre gel de SDS-poliacrilamida (Summers y Smith, 1986, A manual of methods for baculovirus vector and insect cell culture procedures; Yong Kang, 1988; Adv. in Virus Res. 35, 177-192). Estas son cantidades considerablemente mayores que las producidas en sistemas de expresión procariotas o en células ováricas de hámster chino, según se describió por Kajigaya et al., (Blood, 75(5), suplemento 1, 44ª, resumen 86; 1988).
- c)
- Las proteínas se pueden producir como proteínas sin fusionar, como contraste, por ejemplo, con la proteína B19, que se ha producido como proteína de fusión en E. coli por Sisk y Berman (Biotechnology 5, 1077-1080, 1987). Esta proteína de fusión recombinante de \beta-galactosidasa-B19 se disuelve sólo en presencia de dodecil-sulfato sódico (SDS). Las proteínas VP1 y VP2, expresadas en células de insecto según la invención, como contraste, se pueden disolver fácilmente mediante tratamiento de las células con ultrasonidos en un tampón que contiene NaHCO_{3} 25 mM y 20 mg/l de NaN_{3} (pH 9,5). En tal tratamiento, 95% de las proteínas celulares pasan a la fracción de sobrenadante soluble.
- d)
- Las proteínas se pueden producir en una línea celular de insecto que es fácil de cultivar, a diferencia de la producción de proteínas víricas en células de médula ósea eritroide humana (Ozawa et al., 1987; Blood 70, 384-391) o células hepáticas eritroides fetales humanas (Yaegashi et al., 1989; J. Virol. 63, 2422-2426).
- e)
- Debido a que en el sistema de vector de expresión de baculovirus se producen modificaciones pre- y postraduccion, como fosforilación, glicosilación, escisión del péptido señal y eliminación de intrones mediante escisión, el sistema es potencialmente muy adecuado para la producción de proteínas biológicamente activas con una estructura (virtualmente) nativa (Yong Kang, 1988; Adv. in Virus Res. 35, 177-192). En este sistema, VP1 y VP2 de B19 se pueden expresar tanto separada como conjuntamente. Además, existe la posibilidad de que se formen espontáneamente partículas de tipo vírico, procedentes de una o más de estas proteínas.
- f)
- Una ventaja adicional del baculovirus es que no se multiplica en células de mamífero y, por tanto, no es patógeno para seres humanos, lo cual hace que sea mucho más seguro trabajar con este sistema y utilizarlo.
Según la invención, se ha conseguido actualmente
producir las proteínas de la envuelta VP1 y VP2 del parvovirus
humano B19 con un gran rendimiento, en una forma antigénicamente
activa como proteínas no fusionadas, en forma o no de partículas
víricas, usando el sistema de expresión de baculovirus en células de
insecto (Spodoptera frugiperda). Además, se ha conseguido
desarrollar, usando células de insecto productoras de proteínas del
virus B19, un ensayo de inmunofluorescencia (IFA) específico y
sensible y un ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA)
específico y sensible, para la detección de anticuerpos dirigidos
contra las proteínas víricas de B19 VP2 y/o VP1 y VP2. Sin embargo,
basándose en las proteínas del virus B19 y el partículas de tipo
vírico producidas en células de insecto según la invención, se
pueden desarrollar también otros ensayos, como un radioinmunoensayo
o un ensayo de aglutinación.
La invención incluye principalmente las
partículas de tipo vírico VP2 y/o VP1 y VP2 y/o las proteínas
recombinantes VP1 y VP2 del parvovirus humano B19, formadas en
células de Spodoptera frugiperda, las cuales, mediante un
sistema de vector de expresión de baculovirus, se han provisto de la
información genética necesaria para la expresión de la proteína VP2
y/o VP1 y VP2 del virus B19. La invención comprende además
partículas recombinantes de tipo vírico constituidas por la
proteína VP2 o por las proteínas VP1 y VP2 del parvovirus humano
B19, formadas en células de Spodoptera frugiperda las
cuales, mediante el sistema de vector de expresión de baculovirus,
se han provisto de la información genética necesaria para la
expresión de la proteína VP2 o de la proteína VP1 y VP2.
Además, la invención incluye células de
Spodoptera frugiperda que, mediante un sistema de vector de
expresión de baculovirus, se han provisto de la información
genética necesaria para la expresión de la proteína VP2 o de la
proteína VP1 y/o VP2 del parvovirus humano B19.
La invención proporciona además un método para
producir proteína VP1 y VP2 del parvovirus humano B19, y métodos
para producir partículas de tipo vírico que están formadas por
proteína VP2 o por ambas proteínas, cultivando células de
Spodoptera frugiperda que, mediante un sistema de vector de
expresión de baculovirus, se han provisto de la información
genética necesaria para la expresión de la proteína o proteínas del
virus B19, según sea necesario. Opcional y preferiblemente, la
proteína del virus B19 formada en las células y/o las partículas de
tipo vírico formadas en las células y constituidas por proteína VP2
o por proteína VP1 y VP2, se aíslan de las células. Un método
adecuado para este propósito consiste en un tratamiento por
ultrasonidos de las células en un tampón que contiene NaHCO_{3}
25 mM y 20 mg/l de NaN_{3} (pH 9,5). El resultado de tal
tratamiento es que una gran parte de las proteínas presentes en las
células, por ejemplo 95%, se obtiene en forma disuelta en el
sobrenadante. Mediante métodos de purificación conocidos per
se, las proteínas del virus B19 se pueden aislar con una pureza
mayor.
La invención incluye también vectores de
expresión de baculovirus recombinantes, provistos de la información
genética necesaria para la expresión de la proteína VP1 y/o VP2 del
parvovirus humano B19 en células de Spodoptera
frugiperda.
Realizaciones preferidas de tales vectores de
expresión de baculovirus recombinantes son los plásmidos
pAcB19VP1-YM1 y pAcB19VP2-YM1, que se describirán más adelante.
pAcB19VP1-YM1 y pAcB19VP2-YM1, que se describirán más adelante.
La invención incluye también baculovirus
recombinantes provistos de la información genética necesaria para
la expresión de la proteína VP1 y/o VP2 del parvovirus humano B19
en células de Spodoptera frugiperda. Realizaciones
preferidas de tales baculovirus recombinantes son los virus
AcB19VP1L y AcB19VP2L, que se describirán más adelante.
La invención también comprende además el uso de
partículas recombinantes de tipo vírico VP2 y/o VP1 y VP2, y de
proteína recombinante VP1 y VP2 del parvovirus humano B19, formadas
en células de Spodoptera frugiperda, que mediante el sistema
de vector de expresión de baculovirus, se han provisto de la
información necesaria para la expresión de las proteínas del virus
B19, en un ensayo para detectar anticuerpos dirigidos contra la
proteína del virus B19 en una muestra a ensayar. La invención
comprende el uso de partículas recombinantes de tipo vírico,
formadas por proteína VP2, o por proteína VP1 y VP2 del parvovirus
humano B19, formadas en células de Spodoptera frugiperda, que
mediante el sistema de vector de expresión de baculovirus, se han
provisto de la información genética necesaria para la expresión de
las proteínas del virus B19, en un ensayo para la detección de
anticuerpos dirigidos contra el virus B19, en una muestra a
ensayar. En realizaciones preferidas de la invención, esto se
refiere al uso de células de Spodoptera frugiperda, que
mediante el sistema de vector de expresión de baculovirus, se han
provisto de la información genética necesaria para la expresión de
las proteínas VP2 y/o VP1 y/o VP2 del parvovirus humano B19, en un
ensayo para detectar anticuerpos dirigidos contra la proteína del
virus B19 en una muestra a ensayar, más particularmente en un IFA o
ELISA para detectar anticuerpos dirigidos contra la proteína del
virus B19 en una muestra a ensayar.
La invención comprende también una preparación de
vacuna para inducir una respuesta inmunitaria, que proporcione
protección frente al parvovirus humano B19, que comprende
partículas de tipo vírico VP2 y/o VP1 y VP2 y proteínas
recombinantes VP1 y VP2 del parvovirus humano B19, formadas en
células de Spodoptera frugiperda, que mediante el sistema de
vector de expresión de baculovirus, se han provisto de la
información genética necesaria para la expresión de las proteínas
del virus B19, o de una porción antigénicamente activa de esta
proteína recombinante del virus B19, en combinación con uno o más
vehículos y/o adyuvantes adecuados para propósitos de vacunación, y
además, una preparación de vacuna para inducir una respuesta
inmunitaria que proporcione protección frente al parvovirus humano
B19, que comprende partículas recombinantes de tipo vírico formadas
por proteína VP2 o por proteína VP1 y VP2 del parvovirus humano
B19, formadas en células de Spodoptera frugiperda, que
mediante el sistema de vector de expresión de baculovirus, se han
provisto de la información genética necesaria para la expresión de
estas proteínas del virus B19, en combinación con uno o más
vehículos y/o adyuvantes adecuados para fines de vacunación.
La invención comprende además el uso de proteína
recombinante VP1 y VP2 del parvovirus humano B19 (o partículas de
tipo vírico formadas por VP1 o por VP1 y VP2), formadas en células
de Spodoptera frugiperda, que mediante el sistema de vector
de expresión de baculovirus, se han provisto de la información
genética necesaria para la expresión de las proteínas del virus B19,
o de una porción antigénicamente activa de esta proteína
recombinante del virus B19, para inducir una respuesta inmunitaria
en el exterior del cuerpo del mamífero, que proporcione protección
frente al pravovirus humano B19.
En la sección experimental más adelante, se
demuestra mediante exposición e ilustración, cómo la invención se
realizó y se puede realizar. Según se muestra mediante los
Ejemplos, las secuencias de DNA que codifican las proteínas
estructurales VP1 y VP2 del parvovirus humano B19, se aislaron del
virus B19, a partir del suero de un paciente. Luego, a través de
las etapas de subclonación en pUC19 y pUC7, el DNA de B19 se clonó
en el vector de baculovirus pAcYM1, detrás del promotor para el gen
de poliedrina del baculovirus. Por medio de cotransfección de este
vector recombinante con el DNA de baculovirus de tipo silvestre,
seguido de recombinación en las células de insecto (Spodoptera
frugiperda), finalmente se aisló el virus recombinante que, tras
infección en las células de insecto, condujo a la producción de las
proteínas VP1 y VP2 de la envuelta de B19, que estaban o no en
forma de partículas de tipo vírico. Usando estas proteínas de B19,
se desarrollaron ensayos IFA y ELISA sensibles y específicos, que
permitían la detección rápida y sencilla de anticuerpos específicos
de B19.
Las proteínas producidas de esta forma, que
pueden o no estar en forma de partículas de tipo vírico, pueden
servir también como antígenos que se pueden obtener fácilmente para
otros ensayos diagnósticos, como ensayos de RIA y aglutinación y
para la (posible) producción de vacunas y subunidades de
vacunas.
La Fig. 1 muestra la estructura genética del
parvovirus humano B19, que es un virus de DNA monocatenario que
tiene un DNA de aproximadamente 5500 nucleótidos. Según Ozawa et
al., 1987; J. Virol. 61, 2395-2406, los
nucleótidos 2444-4787, contienen la secuencia que
codifica VP1 (84 kd) y los nucleótidos 3125-4787
contienen la secuencia que codifica VP2 (58 kd). No se muestran los
4 sitios de escisión donadores, localizados entre los nucleótidos
2177 y 2195, y los 2 sitios aceptores, localizados entre los
nucleótidos 3043 y 3050. Para la producción de VP2 durante la
replicación del virus, la secuencia intermedia (nucleótidos
2177-3050, que incluye el codón de iniciación para
VP1) se elimina mediante escisión.
La Fig. 1 muestra también el diagrama de
clonación para la construcción del baculovirus recombinante con los
genes del parvovirus humano B19.
Ejemplo
1
Una vez demostrada la presencia de DNA de B19 en
el suero de un paciente mediante "reacción en cadena de la
polimerasa" e hibridación de manchas puntuales
("dot-blot hybridization") con sondas de DNA
específicas de B19 (Salimans et al., 1989; J. Virol. Meth.
23, 19-28), el DNA de B19 se aisló del mismo
mediante incubación con proteinasa K y SDS (se incubó 1 ml de suero
a 37ºC durante 2 h con 100 \mug de proteinasa K en un tampón que
contenía Tris-Cl 10 mM (pH 7,5), EDTA 5 mM y SDS al
0,5%), extracción con fenol para eliminar la proteína y
precipitación de DNA mediante etanol. El DNA se ensayó en cuanto a
su tamaño, patrones de enzimas de restricción y análisis de
transferencia de Southern (Maniatis et al., 1982; Molecular
cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor, N.Y.) con sondas
de DNA específicas de B19.
Las técnicas para las manipulaciones con DNA de
B19 y DNA plasmídico se realizaron esencialmente según se describe
por Maniatis et al. (1982; Molecular cloning: a laboratory
manual). El DNA de B19 se cortó con HindIII (2430 pb) y
ScaI (4920 pb) y se ligó en pUC19 (cortado con HidIII
y SmaI) para obtener una cantidad mayor de la secuencia
codificadora (Ligando ScaI en SmaI, este sitio de
corte se eliminaba). El plásmido obtenido
(pUC19-B19VP1) se ensayó mediante análisis de
enzimas de restricción e hibridación y se transformó y propagó en
E. coli JM101.
Para crear sitios BamHI en los extremos
del DNA de B19, el DNA se clonó en pUC7, que contiene un
policonector simétrico con dos sitios BamHI. El DNA de B19
se cortó a partir de pUC19 con HindIII y EcoRI y
también con ScaI para eliminar el residuo del DNA del
vector. El fragmento de DNA de B19 con longitud adecuada se aisló a
partir de gel de agarosa, relleno con "polimerasa de fragmentos
grandes de Klenow" y se ligó en plásmido pUC7 cortado con
HincII (también con extremos romos). El DNA ligado
(PUC7-B19VP1) se transformó y propagó en E. coli
JM101. Se ensayaron colonias separadas para la presencia de DNA
de B19 mediante análisis de enzimas de restricción e hibridación
con una sonda de DNA específica de B19 (el fragmento PstI de 700 pb
de B19, Salimans et al., 1989; J. Virol. Meth. 23,
19-28).
Las técnicas para manipulaciones con el
baculovirus, el vector de baculovirus y las células de insecto se
realizaron esencialmente según se describe por Summers y Smith en
1986 (un manual de métodos para procedimientos de cultivo de vector
de baculovirus y células de insectos). El sitio de restricción a
continuación del promotor de poliedrina del baculovirus es un sitio
BamHI. Debido a que el DNA de B19 contiene también un sitio
BamHI interno, se optó por la siguiente estrategia: el DNA
de B19 se cortó a partir de pUC7 con EcoRI y la parte
restante de pUC7 se cortó con ScaI (esta digestión con
ScaI no es necesaria para clonar el DNA de VP2). El DNA de
B19 se aisló del gen, se desfosforiló con fosfatasa alcalina
intestinal de ternera (CIP) y finalmente, se realizó una digestión
parcial con BamHI. El fragmento de BamHI con la
longitud apropiada (2,5 kb para VP1 y 1,8 kb para VP2) se ligó
después con el vector de baculovirus pAcYM1, se cortó con
BamHI y se trató con CIP (Matsuura et al., 1987; J.
Gen. Virol. 68, 1233-1250). El plásmido
(pAcB19VP1-YM1) así obtenido, se propagó en E.
coli HB101. Los plásmidos recombinantes se analizaron para la
presencia de DNA de B19 (con sondas de DNA de B19 específicas) y la
orientación adecuada de las mismas respecto al promotor de
poliedrina (mediante análisis de enzimas de restricción).
Las construcciones con la orientación apropiada
se cultivaron y aislaron de las células bacterianas según el método
de "ebullición rápida" de Holmes y Quigley (1981; Anal. Bioch.
114, 193-197), con una purificación final sobre un
gradiente CsCI.
Mediante una cotransfección de la construcción
pAcB19VP1-YM1 con el DNA de baculovirus de tipo
silvestre (AcNPV), el DNA se introdujo en las células de insectos
(Spodoptera frugiperda-Sf) (según el método
II de Summers y Smith, 1986; A manual of methods for baculovirus
vector and insect cell culture procedures). En
0,5-3,0% de las infecciones, el vector recombinante
(pAcB19VP1- YM1) recombina con el DNA del virus de tipo silvestre
durante la absorción hacia el interior de las células, generando
así un virus recombinante que contiene el DNA de B19: AcB19VP1L. El
gen de poliedrina se ha reemplazado por el DNA de VP1 (en el
Ejemplo 2, en el que se describe la formación de un virus AcB19VP2L
recombinante, mediante el DNA de VP2).
La titulación del virus (tanto de tipo silvestre
y recombinante) producido mediante las células Sf se determinó
mediante un ensayo en placa. Se colocaron veinte unidades
formadoras de placa (ufp) sobre una monocapa de células Sf en una
placa de 96 pocillos (20 ufp/pocillo) y se incubaron a 27ºC. Tres
días después de la infección, los sobrenadantes se eliminaron y
retuvieron y las células se lisaron y se motearon sobre
nitrocelulosa (Pet et al., 1989; Nucl. Acid Res. 17, 451).
El escrutinio para la presencia de virus recombinante se realizó
con una sonda de DNA específica del parvovirus B19.
La titulación de los pocillos que contenían los
sobrenadantes recogidos de virus recombinante se determinó mediante
un ensayo en placa, y luego se diluyó hasta 1 ufp/pocillo sobre una
placa de 96 pocillos. Tras el escrutinio según se describió aquí
anteriormente con el ensayo de hibridación de manchas puntuales, se
determinó la titulación de los sobrenadantes positivos en un ensayo
de placa, y además se realizó un escrutinio para la ausencia de
proteína poliedrina en las placas con microscopio, indicando que la
placa contiene virus recombinante. Estas placas se inocularon sobre
una monocapa Sf en una placa de 96 pocillos. Después de tres días,
se repitió la hibridación de manchas puntuales y los pocillos
positivos se ensayaron en un ensayo de placa. Los recombinantes se
consideraron puros cuando menos de 1 de cada 500 placas contenían
virus de tipo silvestre.
A partir de células infectadas con virus
recombinante, se aisló el DNA total, se cortó con enzimas de
restricción y, después de una transferencia de Southern, se usó
para infectar células de insecto (Sf) con una m.o.i. (multiplicidad
de infección) de 1-5 y para expresar parvovirus VP1
y VP2 en estas células. Luego, las proteínas de la envuelta VP1 y
VP2 del parvovirus humano B19, producidas en el sistema del vector
de expresión de baculovirus, se analizaron y ensayaron con las
técnicas descritas a continuación:
Dos días después de la infección con virus
recombinante (AcB19VP1L, m.o.i. 5), se cultivaron células de
insecto (10^{6} células Sf en placas Petri de 35 mm) durante 4 h
a 27ºC en medio "Grace" exento de metionina, al cual se habían
añadido 100 uCi de ^{35}S-metionina, para
determinar la síntesis de novo de proteínas. Una vez
desechado el sobrenadante, las células se colocaron en PBS
(solución salina tamponada con fosfato). Tanto el sobrenadante como
la fracción celular se colocaron en tampón de lisis, se llevaron a
ebullición durante 5 min. y se analizaron sobre un gel de
poliacrilamida-SDS al 10%. Los mismos experimentos
se realizaron con células no infectadas y con células infectadas
por baculovirus de tipo silvestre. La autorradiografía (no
mostrada) reveló que la banda de poliedrina (30 kd) que dominaba
fuertemente en la infección de tipo silvestre, desaparecía en los
virus recombinantes, y que se sintetizaba una proteína del tamaño
del VP1 de B19 (84 kd).
Tras infección con virus recombinante (m.o.i. 5),
se analizaron células de Spodoptera frugiperda durante 5
días para la producción de VP1 del virus B19 sobre gel de
SDS-poliacrilamida al 10%. Los geles se tiñeron con
"fast-geen". Los resultados del gel (no
mostrados) revelaron que desde el día 2, VP1 se producía en grandes
cantidades como un producto estable, que todavía estaba claramente
presente después de 5 días. VP1 se producía en cantidades
comparables a las de la proteína poliedrina en células infectadas
con baculovirus de tipo silvestre.
100 ng de proteína de lisados celulares de
células Sf 2 días después de la infección (m.o.i. 5) se sometieron
a electroforesis sobre gel de SDS-poliacrilamida al
10% y se transfirieron a nitrocelulosa (3 h; 70V en Tris 25 mM,
glicina 192 mM y metanol al 20%). Luego, se ensayaron 20 sueros
humanos para reactividad con el antígeno VP1 recombinante (15
sueros positivos para IgG y 5 sueros negativos para IgG). Las
reacciones se realizaron a temperatura ambiente: bloqueo durante la
noche mediante incubación del filtro e nitrocelulosa en PBS/suero
de ternera fetal al 5% (FCS)/Tween 20 al 0,05%; incubación con
sueros (dilución 1:500 para los sueros positivos y dilución 1:50
para los sueros negativos) diluidos en PBS/FCS al 5% durante 1,5 h;
seguido de lavado de los filtros durante 1 h con PBS/Tween 20 al
0,05% y luego incubación con Ig total humana
anti-cabra marcada con fosfatasa alcalina diluida
1:500 (Tago, nº de catálogo: 2493) en PBS/Tween 20 al 0,05%/FCS al
5%; tras lavar 2 veces en PBS/Tween 20 al 0,05% y 2 veces en PBS,
los anticuerpos unidos se detectaron con fosfato de
5-bromo-4-cloro-3-indolilo
(BCIP). Los 15 sueros positivos para IgG reaccionaron todos con la
banda de VP1 recombinante sobre el gel, y los 5 sueros negativos
para IgG no produjeron ninguna reacción.
Células Sf infectadas con virus recombinante
(AcB19VP1L, m.o.i. 1) se colocaron en medio TC100
(Gibco-BRL) tras 3-4 días, se
mezclaron con células sin infectar, hasta un porcentaje de
aproximadamente 25% de células que contenían VP1 recombinante de
B19 y se motearon sobre placas de 18 pocillos (nutacon, nº de
catálogo 10-404) con una concentración de
aproximadamente 500 células/pocillo (5 \mul) y, tras secar al
aire, se fijaron en acetona al 100% durante 20 min. a –20ºC. Luego
las células se incubaron con suero humano (sueros positivos y
negativos para Ig B19) a diferentes diluciones en VBS (solución
salina tamponada con veronal). Estos sueros se trataron previamente
con polvo de hígado para una reducción de la posible coloración de
fondo. Tras incubación durante 1-2 h a 37ºC, las
placas de vidrio se lavaron en PBS y se secaron al aire antes de la
incubación con una dilución 1:40 de una IgG humana
anti-cabra marcada con FITC (Kallestad, nº de
catálogo: 104) en VBS con "azul de Evans" (Hoffmann La Roche).
Después de lavar en PBS y secar al aire, se añadió tampón
Tris/glicerol (1g de Tris en PBS, glicerol al 80%, pH 9,9) y se
realizó el análisis bajo el microscopio de UV. En
B19-IFA, con sueros de pacientes positivos, se
podían observar las células fluorescentes. La utilidad de
B19-IFA se ensayó en diversos experimentos, según
se describe más adelan-
te:
te:
Se ensayaron 30 pacientes según el procedimiento
en diluciones 1:50 y 1:500, sin que el investigador supiese cuales
de los sueros eran positivos y cuales negativos. Tras la lectura
por varios colaboradores, se compararon los resultados con los
datos del ensayo RIA (Cohen et al., 1983; J. Hyg. 91,
113-130): en el IFA de B19 los 17 sueros positivos
para IgG se leyeron como positivos y los 13 negativos para IgG se
leyeron como negativos.
De varios sueros positivos para anticuerpos de
B19 (positivos según los resultados de los ensayos de RIA,
realizados con virus aislado de suero como antígeno, Cohen et
al., 1983; J. Hyg. 91, 113-130), se determinó
una titulación IFA. Los resultados se resumen en la Tabla 1. Los
datos revelan que este IFA de B19 produce resultados
correspondientes a los datos de RIA: sueros con valores positivos
elevados en el RIA también tienen títulos elevados en el IFA de B19
y sueros con valores positivos bajos en el RIA producen títulos
inferiores en el IFA de B19.
\vskip1.000000\baselineskip
| Comparación entre RIA e IFA para el ensayo de anticuerpos de B19 | |||
| IgG RIA (a.u.) | IFA (título) | IgM RIA (a.u.) | IFA (título) |
| 100 | 8192 | >100 | 1280 |
| 100 | > 16384 | 88 | 1280 |
| 91 | >16384 | 50 | 1280 |
| 70 | 8192 | 31 | 2560 |
| 55 | 8192 | 25 | 1280 |
| 40 | 8192 | 16 | 640 |
| 25 | 8192 | 16 | 320 |
| 15,5 | 4096 | 8,3 | 40 |
| 11 | 4096 | 5,3 | <10 |
| 8,4 | 1024 | 5 | 80 |
| 7,6 | 512 | 4,4 | 10 |
| 4,2 | 512 | 4,1 | 40 |
| 4,0 | 512 | 3,1 | 10 |
| 2,5 | <32 | 3,4/2,9 | <10 |
| 1,8 | 128 | 3,3 | 160 |
| 1,2 | <32 | 2,3/1,9 | <10 |
| <1 | <32 | 1,6 | <10 |
| <1 | <32 | <1 | <10 |
| <1 | <32 | <1 | <10 |
| a.u. = unidades arbitrarias; <1 = RIA de valor negativo; <32 =IFA de valor negativo a la dilución mínima de IgG; | |||
| <10 = IFA de valor negativo a la dilución mínima de IgM |
\vskip1.000000\baselineskip
Se escrutaron 100 donantes de sangre
seleccionados aleatoriamente para la presencia de anticuerpos de
IgG específicos para B19, y los resultados mostraban que en este
IFA de B19, 76% de los donantes eran positivos, lo que se
corresponde muy bien con los datos descritos para el parvovirus
humano B19 para este grupo de edad.
Ejemplo
2
La clonación del VP2 de parvovirus B19 empezó a
partir del DNA de B19 que se había clonado en pUC19, según el
procedimiento descrito en el Ejemplo 1 en los puntos 1 y 2. Un
fragmento de 1,8 kb, que codificaba VP2, se cortó a partir de la
construcción pUC19 (pUC19-B19VP1) con HpaII
(3083 pb) y EcoRI, se aisló desde gel de agarosa relleno con
"DNA-polimerasa de fragmento largo de Klenow"
y se ligó con plásmido pUC7 cortado con HincII. La nueva
construcción pUC7 (pUC7-B19VP2), se propagó a
continuación en E. coli JM101. Las colonias bacterianas se
ensayaron a continuación para la presencia de una inserción de B19,
mediante análisis de enzimas de restricción e hibridación con una
sonda de DNA específica de B19 (Salimans et al., 1989; J.
Virol. Meth. 23, 19-28). Además, se siguió el mismo
procedimiento descrito para VP1 en el Ejemplo 1, puntos
4-7, para generar baculovirus recombinante con el
DNA que codificaba VP2 del parvovirus humano y para producir VP2 en
las células de insectos (AcB19VP2L).
\newpage
Ejemplo
3
Dos días después de la infección con los virus
recombinantes (AcB19VP1L y AcB19VP2L, m.o.i. 5) se cultivaron
células de insecto (10^{6} células Sf en placas Petri de 35 mm)
durante 4 h a 27ºC en medio "Grace" exento de metionina, al
cual se habían añadido 100 \muCi de
S^{35}-metionina, para determinar la síntesis
de novo de proteínas. Una vez desechado el sobrenadante, las
células se colocaron en PBS (solución salina tamponada con fosfato).
Tanto el sobrenadante como la fracción celular se colocaron en
tampón de lisis, se llevaron a ebullición durante 5 min y se
analizaron sobre un gel de SDS-poliacrilamida al
10%. Se realizaron los mismos experimentos con células infectadas
por baculovirus de tipo silvestre, y sin infectar. La
utorradiografía (no mostrada) reveló que la banda de poliedrina (30
kd), que dominaba fuertemente en la infección de tipo silvestre,
desaparecía en las células infectadas con los virus recombinantes,
y que se sintetizaban proteínas del tamaño de VP1 (84 kD) y de VP2
(58 kD). Los resultados se confirmaron mediante análisis
SDS-PAGE, según se describió en el punto 9 del
Ejemplo 1.
Ejemplo
4
Se infectaron células Sf con el baculovirus
recombinante VP2 (m.o.i. 20). 72 h después de la iniciación de la
infección, las células se lavaron en PBS, se recogieron y se
sometieron a ultrasonidos en PBS.
Los desechos celulares se eliminaron mediante
centrifugación (10 min, 1.000 x g), después de lo cual el
sobrenadante se colocó sobre un cojín de sacarosa al 40% y la
centrifugación se realizó durante 2,5 h a 100.000 x g. El glóbulo se
volvió a suspender en PBS y luego se separó sobre un gradiente
lineal de sacarosa (15-30%, v/v). Después de
centrifugación durante 2,5 h a 110.000 x g se observó una banda
opalescente. El material de esta banda se examinó mediante
microscopía electrónica. Se encontraron partículas que mostraban
gran similitud con la cápsida del parvovirus en cuanto a diámetro
(aproximadamente 21 nm) y morfología. Después del análisis de la
fracción del gradiente de sacarosa mediante
SDS-PAGE y tinción con plata, se encontró una
proteína del tamaño de VP2 (58 K). Mediante inmunoprecipitación y
análisis de transferencia Western con un suero humano específico
para el parvovirus B19, se demostró que la proteína VP2 está
efectivamente implicada aquí. El hecho de que, tras la tinción con
plata, no se detectasen otras proteínas, indica un elevado grado de
pureza. La cantidad de proteína en las fracciones de gradiente
enriquecidas para las partículas se determinó mediante el
procedimiento de Bradford. Basándose en los datos obtenidos, el
número de partículas por célula de insecto infectada se estimó en
al menos 10^{5}, asumiéndose que cada partícula está hecha de
hasta 60 moléculas. Para determinar si las partículas VP2
purificadas se pueden usar para poner en marcha un ensayo
diagnóstico, se realizó un ELISA con 8 sueros humanos positivos
para B19 y 3 negativos para B19. En la Tabla 2, los resultados se
comparan con los obtenidos para proteína recombinante VP1. Todos
los sueros positivos para B19 reconocían las cápsidas VP2. Además,
para siete de los ocho sueros se demostró que la reacción con las
cápsidas VP2 era más fuertemente positiva que con la proteína VP1
purificada.
| ELISA para mostrar anticuerpos específicos de parvovirus en 11 sueros humanos con proteínas recombinantes | ||
| VP1 y VP2 como antígenos | ||
| Extinción* | Número de sueros purificados VP1 | Partículas VP2 |
| <0,5 | 3 | 3 |
| 0,5-1,0 | 2 | 0 |
| 1,0-2,0 | 5 | 0 |
| >2,0 | 1 | 8 |
| *Extinción < 0,5: negativa; >0,5:positiva |
Claims (14)
1. Partículas de tipo vírico recombinantes
constituidas por la proteína VP2 del parvovirus humano B19,
formadas en células de Spodoptera frugiperda, en las que las
células comprenden un vector de expresión de baculovirus
recombinante, provisto de la información genética necesaria para la
expresión de la proteína VP2 del parvovirus humano B19 en su
interior.
2. Partículas de tipo vírico recombinantes según
la reivindicación 1, en las que el vector de expresión de
baculovirus recombinante está contenido en un baculovirus
recombinante.
3. Un método para producir partículas de tipo
vírico según la reivindicación 1 o 2, constituidas por la proteína
VP2 del parvovirus humano B19, cultivando células de Spodoptera
frugiperda definidas en la reivindicación 1 o 2.
4. Un método, según la reivindicación 3, en el
que las partículas de tipo vírico formadas en las células se aíslan
de las células.
5. Uso de partículas de tipo vírico recombinantes
según la reivindicación 1 o 2, en un ensayo para detectar
anticuerpos dirigidos contra la proteína VP2 del virus B19, en una
muestra a ensayar.
6. Uso de células de Spodoptera frugiperda
según se definen en la reivindicación 1, y en las cuales se ha
expresado VP2 en forma de partículas de tipo vírico, en un ensayo
para detectar anticuerpos dirigidos contra la proteína VP2 del
parvovirus B19 en una muestra a ensayar.
7. Uso, según la reivindicación 6, en el que el
ensayo es un IFA o ELISA.
8. Una preparación de vacuna para inducir una
respuesta inmunitaria que proporciona protección frente al
parvovirus humano B19, que comprende partículas de tipo vírico
recombinantes según la reivindicación 1 o 2, en combinación con uno
o más vehículos y/o adyuvantes adecuados para propósitos de
vacunación.
9. Uso de partículas de tipo vírico
recombinantes, según la reivindicación 1 o 2, para inducir una
respuesta inmunitaria externamente al cuerpo del mamífero, que
proporciona protección frente al parvovirus humano B19.
10. Células de Spodoptera frugiperda que
comprenden un baculovirus recombinante que incluye un vector de
expresión de baculovirus recombinante provisto de la información
genética necesaria para la expresión de la proteína VP1 del
parvovirus humano B19, y un baculovirus recombinante que comprende
un vector de expresión de baculovirus recombinante provisto de la
información genética necesaria para la expresión de la proteína VP2
del parvovirus humano B19.
11. Un método para producir proteína VP1 y VP2
del parvovirus humano B19, y/o partículas de tipo vírico formadas
por proteína VP1 y VP2 del parvovirus humano B19, cultivando
células de Spodoptera frugiperda según la reivindicación
10.
12. Un método para producir una preparación de
vacuna para inducir una respuesta inmunitaria que proporciona
protección frente al parvovirus humano B19, usando el método de la
reivindicación 11.
13. Uso de células de Spodoptera
frugiperda según la reivindicación 10, en un ensayo para
detectar anticuerpos dirigidos contra el virus B19, en una muestra
a ensayar.
14. Uso según la reivindicación 13, en el que el
ensayo es un IFA o ELISA para detectar anticuerpos dirigidos contra
el virus B19 en una muestra a ensayar.
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