ES2240968T3 - Capsides y proteinas recombinantes del virus de la enfermedad hemorragica del conejo (rhdv), kits de diagnostico y vacunas que las contienen. - Google Patents

Abstract

SE OBTIENEN PROTEINAS Y CAPSIDAS RECOMBINANTES DEL VIRUS DE LA ENFERMEDADES HEMORRAGICA DEL CONEJO (RHDV), EN UN SISTEMA DE EXPRESION DE BACULOVIRUS RECOMBINANTE REPLICADO EN UN CULTIVO DE CELULAS DE INSECTO. ESTAS CAPSIDAS Y PROTEINAS RECOMBINANTES SON ANALOGOS INMUNO Y ANTIGENETICAMENTE A LA PROTEINA NATIVA VP60 DE RHDV, Y SON ADECUADOS PARA LA FORMULACION DE VACUNAS CAPACES DE PROTEGER EFICAZMENTE CONEJOS CONTRA EL RHDV, ADEMAS DE PARA LA PREPARACION DE EQUIPOS DIAGNOSTICOS UTILES PARA LA DETECCION TANTO DE LA PRESENCIA DE ANTICUERPOS QUE RECONOCEN EL RHDV COMO DE LA PRESENCIA DE RHDV EN UNA MUESTRA BIOLOGICA DE UN CONEJO. LA INVENCION ES DE INTERES PARA LA MEDICINA VETERINARIA.

Description

Cápsides y proteínas recombinantes del virus de la enfermedad hemorrágica del conejo (RHDV), kits de diagnóstico y vacunas que las contienen.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a cápsides y proteínas recombinantes del virus causante de la enfermedad hemorrágica del conejo (RHDV), producidas mediante expresión en células de insecto utilizando un sistema de baculovirus recombinantes. La invención también se refiere a kits de diagnóstico y a vacunas que comprenden dichas cápsides y proteínas recombinantes.

Antecedentes de la invención

A comienzos del verano de 1988 se describió la aparición de una extraña enfermedad en España, en granjas rurales de conejos de las zonas de Asturias y Almería-Murcia, en la que los animales reproductores, y a veces los conejos adultos, morían sin manifestar ningún signo clínico aparente. Al principio se atribuyó la enfermedad a una afección de tipo tóxico, debido a su carácter agudo, o al virus de la mixomatosis, ya que se detectaron anticuerpos contra el virus de la mixomatosis en dichos animales enfermos. Ambas hipótesis fueron descartadas y se concluyó que los signos clínicos estaban estrechamente relacionados con una enfermedad contagiosa descrita en China (provincia de Jiangsu) por primera vez en 1984 y denominada "enfermedad hemorrágica del conejo" o "neumonía vírica infecciosa" (Liu, S.J., et al., 1984, An. Hus. Vet. Med., 16(6):253-255).

Según los datos presentados por Xu et al. in 1988 en el Congreso Mundial sobre Conejos celebrado en Hungría (4th World Rabbit Congress W.R.S.A., 1988, 3: 456-462), esta enfermedad fue introducida en China a través de un lote importado de conejos de Angora procedentes de la República Federal Alemana. Este hecho ha sugerido la idea de que este virus puede haber estado en forma latente en Europa durante mucho tiempo. El primer caso de enfermedad vírica hemorrágica en Europa se detectó en Italia en 1986 y, al principio, se denominó "enfermedad X" (Cancelloti, F. M. et al., 1988, Coniglicoltura, 25, 9:41-46). Entre 1988 y 1989 esta enfermedad fue descrita asimismo en Francia, Alemania y España (Villares, A., et al., 1988, Med. Vet., 5:645-650; Plana, J., et al., 1989, Med. Vet., 6:87-88).

La enfermedad afecta principalmente a conejos adultos. Los gazapos y los conejos de engorde parecen disfrutar de protección natural. Los animales de granjas industriales parecen ser menos susceptibles al virus que los que se crían en pequeñas granjas.

El período de incubación es 2-3 días; la tasa de mortalidad superior al 90%. Los signos clínicos son convulsiones, ataxia, disnea y muertes repentinas con epistaxis. Las lesiones se caracterizan por presentar congestión generalizada y petequias o zonas hemorrágicas en diferentes órganos, principalmente los pulmones. Se han detectado diferentes fases degenerativas en el hígado, ya que éste es un órgano diana para la replicación del virus.

El agente causante de la enfermedad es el virus denominado virus de la enfermedad hemorrágica del conejo. Este virus se aisló por primera vez, y simultáneamente, en España (Plana, J., et al., citado anteriormente; Parra, F. y Prieto, M., 1990, J. Virology, 64:4013-4015) y Alemania (Ohlinger, V.F. et al., 1990, J. Virology, 64: 3331-3336). El RHDV tiene un tamaño de 40 nm, carece de cubierta y tiene una única cadena de ARN como material genómico. Sobre la base de los datos morfológicos, se clasificó inicialmente como un picornavirus (Pu, B. et al. 1985, Chi. J. Vet. Med. 11:16-17) y parvovirus (Xu et al., 4th World Rabbit Congress, citado anteriormente). Sin embargo, sobre la base de la información correspondiente al tamaño, densidad, morfología y estructura molecular del virión, se ha clasificado definitivamente como un calicivirus.

Las características moleculares y la secuencia nucleotídica de una cepa del RHDV aislada en Alemania han sido descritas en dos publicaciones:

a) Meyers, G., Wirblich, C. y Thiel, H-J., 1991, "Rabbit hemorrhagic disease virus. Molecular cloning and nucleotide sequencing of a calicivirus genome", Virology, 184:664-676.

b) Meyers, G., Wirblich, C. y Thiel, H-J., 1991, "Genomic and subgenomic RNAs of rabbit hemorrhagic disease virus are both protein-linked and packaged into particles", Virology, 184:677-686.

Recientemente, se ha clonado y secuenciado el genoma completo del RHDV (Meyers, G., et al., citado anteriormente). El genoma del RHDV consta de una molécula de ARN monocatenario que contiene en el extremo 3' una cola de residuos de adenina (poli-A). La longitud del genoma es aproximadamente 800 nucleótidos o pares de bases (pb), y en su estructura contiene un único marco abierto de lectura (ORF) que representa el 89% del genoma vírico. La región 5' codifica proteínas víricas no estructurales, que presentan un alto grado de homología con las codificadas por el calicivirus felino (FCV). En este extremo se han descrito asimismo secuencias similares a las del gen 2C de picornavirus, que están involucradas en la síntesis de ARN, estructuras similares a las que presentan las proteasas que contienen residuos de cisteína, y ARN-polimerasa dependiente de ARN. En contraposición, la región 3' de este único ORF del RHDV codifica la proteína estructural que forma la cápside del virus. Esta región se ha denominado VP60 debido a su tamaño, aproximadamente 60 KDa, y su síntesis se produce tanto a partir de un transcrito largo del ARN genómico, que se procesa más tarde, como a partir de la traducción de un ARN subgenómico de 2200 pb. Estas dos formas del ARN vírico, que son características de otros virus de ARN, han sido descritas para el caso del RHDV (Meyers, G. et al., citado anteriormente), y se ha propuesto que ambas están presentes en el virión asociadas a una proteína de 15 KDa y encapsuladas.

Una de las principales desventajas a la hora de preparar una vacuna contra la enfermedad causada por el RHDV es el hecho de que sólo ha sido posible replicar este virus in vivo. Se han descrito algunos sistemas de células permisivas. Específicamente, en nuestros laboratorios, hemos cultivado el virus en células RH-13 de riñón de conejo, aunque con muy baja producción de virus. Esto significa que, para obtener antígenos para una vacuna, es necesario infectar y sacrificar conejos.

La presente invención proporciona una vía alternativa para superar las desventajas asociadas con una vacuna convencional. Esta alternativa consiste en preparar y utilizar vacunas recombinantes capaces de conferir protección eficaz contra la infección causada por el RHDV. Las nuevas vacunas recombinantes pueden contener las cápsides y/o proteínas recombinantes del RHDV proporcionadas por la presente invención. Estas vacunas recombinantes no requieren la utilización de, virus completo, sino sólo de una parte del mismo, con lo que se elimina el riesgo de accidentes de liberación del virus, lo que supone una ventaja considerable respecto a las vacunas convencionales de primera generación. Por otro lado, se ha puesto a punto un nuevo procedimiento para el diagnóstico del RHDV con técnicas de inmunoabsorción enzimática (ELISA) utilizando las cápsides y/o proteínas recombinantes de la presente invención.

Se conocen muchos sistemas para la expresión y producción de proteínas recombinantes. Uno de los sistemas más eficaces para la producción a gran escala de proteínas recombinantes está basado en la replicación de baculovirus recombinantes derivados del virus de la polihedrosis de Autographa californica (AcNPV), en células de insecto cultivadas. La descripción de la técnica de expresión en baculovirus puede consultarse en, entre otros, los siguientes artículos:

a) LucKow, V.A. and Summers, M.D., "Trends in the development of baculovirus expression vectors". Bio/Techno-
logy, 6:47-55, (1988).

b) Bishop, D.H.L., "Baculovirus expression vectors", Seminars in VIROLOGY, 3:253-264 (1992).

La presente invención proporciona cápsides y proteínas recombinantes del RHDV producidas mediante un sistema de expresión adecuado establecido en células hospedadoras permisivas. En un caso particular, las cápsides y proteínas recombinantes proporcionadas por la presente invención fueron producidas mediante expresión en células de insecto utilizando un sistema de baculovirus recombinante. El baculovirus recombinante capaz de producir dichas cápsides y proteínas recombinantes, así como el vector de transferencia utilizado, constituyen dos objetivos adicionales de la presente invención. Los procedimientos para la obtención de dichos baculovirus y productos (cápsides y proteínas) recombinantes constituyen asimismo un objetivo de la presente invención.

La invención también proporciona una nueva vacuna capaz de proteger conejos contra la infección causada por el RHDV, que comprende las cápsides y/o proteínas recombinantes proporcionadas por la presente invención, y un excipiente o adyuvante adecuado.

Además, la presente invención proporciona una vacuna bivalente o multivalente capaz de prevenir la enfermedad hemorrágica del conejo y otra infección o infecciones del conejo, que comprende las cápsides y/o proteínas recombinantes del RHDV proporcionadas por la presente invención junto con uno o más patógenos de conejo y un excipiente o adyuvante adecuado.

La invención también proporciona un procedimiento y un kit de diagnóstico para la detección de la presencia de anticuerpos que reconocen específicamente el RHDV en una muestra biológica, por ejemplo, suero de conejos sospechosos de estar infectados, que comprende la utilización de las cápsides y/o proteínas recombinantes proporcionadas por la presente invención y procedimientos de detección adecuados.

La invención también proporciona un procedimiento y un kit de diagnóstico para la detección de la presencia de antígeno (RHDV) en una muestra biológica, por ejemplo sangre, suero, pulmón, bazo o hígado, de conejos sospechosos de estar infectados, que comprende un anticuerpo que reconoce específicamente el RHDV, que ha sido obtenido inmunizando animales con las cápsides recombinantes y/o las proteínas recombinantes proporcionadas por la presente invención, y procedimientos de detección adecuados.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra la construcción del vector de transferencia pAcRHDV-710, indicando las manipulaciones realizadas para insertar el gen que codifica la VP60 del RHDV en el plásmido pAcYM1.

Las estructuras del gen VP60 nativo [RHDV(VP60)] y del gen modificado [pRHD-7] se presentan en la Figura 2, donde se muestran las diferencias existentes entre ambas. Puede observarse que, en este caso específico, el gen modificado contiene una secuencia que codifica: (i) dos aminoácidos, diferentes de los presentes en la secuencia de la VP60 nativa (aminoácidos de los sitios +2 y +3), que han sido sustituidos en la proteína recombinante por otros dos aminoácidos, y (ii) cinco aminoácidos adicionales que no están presentes en la secuencia de la VP60 nativa y que proceden de la secuencia que codifica el sitio de clonación múltiple del plásmido pMTL22. Esta Figura también muestra la orientación correcta del gen modificado, en relación con el promotor de polihedrina en el clon recombinante de pAcRHDV-710, obtenida por cartografía con endonucleasas de restricción, donde puede observarse que la distancia entre el sitio BamHI y el comienzo de la transcripción es sólo de 2 bases.

La Figura 3 muestra una preparación de cápsides víricas (Figura 3a) formadas por agregación de una proteína recombinante del RHDV proporcionada por la presente invención y una preparación de viriones purificados (Figura 3b).

Descripción de la invención

Durante varios años, se ha realizado una investigación para identificar el agente causante de la enfermedad hemorrágica del conejo (RHDV). Como consecuencia de esta investigación, el RHDV fue aislado y caracterizado (Plana et al., citado anteriormente), y se preparó una vacuna convencional contra dicha enfermedad infecciosa, comercializada con el nombre CYLAP HVD®.

Más recientemente, los esfuerzos de investigación se han dirigido al aislamiento y la clonación del genoma de dicha cepa aislada del RHDV, con el objeto desarrollar nuevas vacunas recombinantes eficaces contra la infección causada por el RHDV. Con este fin, se ha clonado un segmento de su genoma correspondiente al extremo 3' del genoma vírico que codifica la proteína estructural del virus, denominada VP60, que puede ser responsable de las propiedades antigénicas e inmunogénicas del virus.

La presente invención proporciona cápsides y proteínas recombinantes del RHDV que son inmunogénicamente y antigénicamente análogas al RHDV natural y a la proteína VP60 nativa de este virus. Por este motivo, estos productos -cápsides recombinantes y/o proteínas recombinantes- pueden utilizarse para fabricar vacunas capaces de prevenir la infección causada por el RHDV, y kits de diagnóstico apropiados para este virus. Dichas cápsides recombinantes se obtiene mediante agregación de las proteínas recombinantes del RHDV proporcionadas por la presente invención.

Deberá entenderse que la expresión "antigénicamente análogas al RHDV natural y a la proteína VP60 nativa de este virus", o similar, tal y como se utiliza en la presente descripción, significa que las cápsides recombinantes y/o proteínas recombinantes son capaces de inducir la producción de anticuerpos de la misma forma en que los inducen el RHDV natural y la proteína VP60 nativa de este virus.

Deberá entenderse que la expresión "inmunogénicamente análogas al RHDV natural y a la proteína VP60 nativa de este virus", o similar, deb tal y como se utiliza en la presente descripción, significa que las cápsides recombinantes y/o proteínas recombinantes son capaces de inducir una respuesta inmunitaria en un animal suficiente para protegerlo contra una infección causada por el RHDV, y por este motivo las cápsides recombinantes y/o proteínas recombinantes mencionadas anteriormente son adecuadas para su utilización en la formulación de vacunas del RHDV.

Las cápsides y proteínas recombinantes proporcionadas por la presente invención pueden producirse en un sistema de expresión adecuado establecido en células apropiadas, utilizando técnicas convencionales de ingeniería genética.

En una realización específica de la presente invención, que servirá como ilustración detallada de una de las formas en las que puede realizarse la invención, se clonó y expresó una proteína recombinante que comprende toda la secuencia aminoácida de la proteína VP60 nativa del RHDV, exceptuando dos aminoácidos en los sitios +2 y +3. Esta proteína recombinante se denomina en la presente descripción "VP60 recombinante", "VP60r" o "VP60 modificada".

La proteína VP60 recombinante comprende la secuencia aminoácida de la VP60 nativa del RHDV, con las siguientes modificaciones:

(i) los aminoácidos en los sitios +2 y +3 de la secuencia original de la proteína VP60 nativa han sido sustituidos por otros dos aminoácidos en la proteína VP60 recombinante, y

(ii) la proteína VP60 recombinante incluye una secuencia de cinco aminoácidos adicionales, situada en el extremo aminoterminal, que no está presente en la secuencia de la proteína VP60 nativa. Dicha secuencia de cinco aminoácidos adicionales procede de la secuencia que codifica el sitio de clonación múltiple del plásmido pMTL22. Éstos cinco aminoácidos no son funcionales, y, como alternativa, dicha secuencia adicional podría ser sustituida por otra secuencia análoga de igual o diferente número de aminoácidos, sin alterar el resultado final.

Otras características de dicha proteína VP60 recombinante, que se describirán con más detalle a continuación, son las siguientes:

a) ha sido producida en un sistema de expresión con un baculovirus recombinante replicado en un cultivo de células de insecto;

b) sorprendentemente, es capaz de formar cápsides o estructuras multiméricas o agregados proteináceos similares a las cápsides víricas del RHDV; y

c) tanto la proteína VP60 recombinante como las cápsides o agregados proteicos que puede formar son inmunogénicamente y antigénicamente análogos a la proteína VP60 nativa del RHDV y al virus nativo, por lo que son apropiados para la inmunización de conejos contra la infección causada por el RHDV, y pueden utilizarse:

-

en la formulación vacunas activas, pasivas, univalentes, bivalentes o multivalentes capaces de proteger conejos contra la infección causada por el RHDV y otros patógenos del conejo; y

-

en la preparación de kits de diagnóstico para la detección de la presencia (i) de anticuerpos que reconocen específicamente el RHDV, o (ii) de RHDV mediante la utilización de anticuerpos que reconocen específicamente el RHDV obtenidos inmunizando animales con cápsides y proteínas recombinantes proporcionadas por la presente invención.

Como se describe con más detalle a continuación, en una realización específica de la presente invención se produjeron cápsides y proteínas recombinantes del RHDV, específicamente la proteína denominada VP60 recombinante, en un sistema de expresión con un baculovirus recombinante multiplicado en un cultivo de células permisivas. El procedimiento global para la obtención de dicha proteína VP60 recombinante comprende, básicamente, las siguientes etapas generales:

I.

Preparación de la secuencia del ADNc que se va insertar en un baculovirus; y

II.

Obtención de baculovirus recombinantes que expresan las proteínas recombinantes.

Estas etapas generales se subdividen en otras subetapas. Así, la preparación de la secuencia del ADNc que se va insertar comprende la subetapas siguientes:

I.a

Aislamiento y purificación del RHDV;

I.b

Aislamiento de su ARN vírico total; y

I.c

Síntesis del ADNc a partir del ARN genómico.

La obtención de un baculovirus recombinante, que expresa la VP60 recombinante del RHDV, comprende las siguientes subetapas:

II.a

Preparación del gen que codifica la VP60 del RHDV;

II.b

Inserción de dicho gen en un vector de transferencia de baculovirus;

II.c

Transfección de las células hospedadoras permisivas con dicho vector de transferencia que lleva insertado el gen que codifica la VP60 del RHDV; y

II.d

Selección de baculovirus recombinantes que expresan dicha VP60 recombinante.

A continuación, se lleva a cabo la caracterización de los baculovirus recombinantes, así como la caracterización y purificación de las proteínas recombinantes obtenidas. Todas estas etapas se describen con más detalle a continuación.

El procedimiento para la obtención de cápsides y proteínas recombinantes del RHDV comienza con el aislamiento y purificación del RHDV, en este caso a partir de una cepa aislada disponible en los laboratorios, con arreglo al protocolo descrito en el Ejemplo 1. Una vez aislado y purificado el virus, se aisló el ARN vírico total mediante tratamiento de la muestra con SDS (dodecilsulfato de sodio), pronasa y proteinasa K, y extracción con fenol:cloroformo (Ejemplo 2). El ARN obtenido se analizó en geles neutros de agarosa al 0,7% tiñendo con bromuro de etidio, y se observaron dos bandas principales que podrían corresponder al ARN genómico y subgenómico del virus. La comparación entre estas bandas y los patrones de ARN de tamaños conocidos permitió deducir un tamaño de 8 Kb para una de las bandas.

Después se sintetizó el ADNc correspondiente al extremo 3' del ARN vírico (Ejemplo 3) con un kit comercial (BOEHRINGER), utilizando una estrategia que aprovecha la presencia de colas de poli(A) para emplear el oligonucleótido d(T) como cebador de extensión que puede ser extendido por la enzima transcriptasa inversa y sintetizar moléculas de ADNc. La síntesis de ADNc se verificó y cuantificó por recuento de la radiactividad incorporada en el material sintetizado y electroforesis en geles de agarosa alcalinos y neutros.

Para la clonación del ADNc se llevó a cabo en primer lugar una selección por tamaños del ADNc sintetizado. Se seleccionaron fragmentos de ADNc de tres tamaños, a saber: entre 1.000 y 2.000 pb, entre 2.000 y 5.000 pb, y más de 5.000 pb. El ADNc purificado se clonó con extremos romos en el vector pMTL25, linealizado con SmaI, y desfosforilado con fosfatasa alcalina. La ligación inserto-vector se realizó con ADN-ligasa, y se utilizó para transformar células XL-1Blue de E. coli, que permiten llevar a cabo la selección inicial, basada en el color, de las colonias recombinantes.

El análisis de los clones positivos se realizó empleando preparaciones de ADN plasmídico y cartografiando los sitios de restricción con las enzimas BamHI y EcoRI, sobre la base de la secuencia de una cepa del RHDV aislada en Alemania (Meyers et al., citado anteriormente). De los 38 plásmidos analizados, sólo 10 resultaron positivos y correspondían a la zona 3' del RHDV, con insertos entre 800 y 2.000 pb. Tres de ellos, denominados pRHD-24, pRHD-25 y pRHD-45, tenían un tamaño de aproximadamente 2.000 pb, y, por tanto, contenían con mayor probabilidad el gen de la proteína estructural VP60. Por este motivo, se secuenciaron dichos insertos para verificar su autenticidad y para determinar las zonas de inserción, orientación y el tamaño exacto, empleando la técnica didesoxi con plásmidos bicatenarios. Se utilizaron oligonucleótidos universales (5'GTAAAACGACGGCCAGT3') e inversos (5'AACAGCTATGACCATG3'). Se observó que los clones pRHD-24 y pRHD-25 comenzaban en el nucleótido 5313 (con arreglo a la secuencia de Meyers et al., citado anteriormente) y que el clon pRHD-45 comenzaba en el nucleótido 5193. Los dos primeros clones terminaban en la cola de poli(A) situada en el extremo 3'.

Para identificar el codón de iniciación de la proteína VP60 se emplearon las dos estrategias siguientes:

(a) una aproximación experimental, con el objeto de secuenciar el extremo N-terminal directamente en un secuenciador automático de proteínas, y

(b) una predicción teórica por análisis de la secuencia utilizando el programa informático Microgenie (BECKMANN).

No se obtuvieron resultados prácticos de los estudios de secuenciación directa de la proteína, mientras que el comienzo de la secuencia codificante de la VP60 en el nucleótido 5305 del genoma del RHDV, tomado como referencia para futuros experimentos de expresión de VP60, fue calculado empleando simulación de los tamaños de posibles regiones trasncritas.

Para la obtención de baculovirus recombinantes que expresan la VP60 del RHDV se empleó el siguiente procedimiento: en primer lugar se preparó el gen VP60 que iba a ser insertado. Para ello, se seleccionó el plásmido denominado pRHD-24, en el que el inserto de ADNc comenzaba 5 pb por debajo del codón de iniciación ATG teórico, por lo que fue necesario añadir un ATG que permitiese el comienzo de la expresión. El inserto completo de pRHD-24 se obtuvo por digestión parcial con BamHI y reclonación en el sitio BglII del vector pMTL22, de modo que el marco abierto de lectura del inserto permanecía en fase con el codón ATG perteneciente a la secuencia de NcoI diana del pMTL22. La construcción obtenida se digirió con NcoI y EcoRI para eliminar la región 3' no clonada del clon de ADNc, se trató con el fragmento de Klenow de la ADN-polimerasa I de E. coli, y se clonó nuevamente en pMTL25 digerido con SmaI, dando lugar a un plásmido denominado pRHD-7 (Figura 1). Empleando esta construcción, se pierden los aminoácidos originales situados en los sitios teóricos +2 y +3 de la VP60, y estos dos aminoácidos (Glu y Ala) presentes en la secuencia de la VP60 nativa se sustituyen por otros dos aminoácidos (Ser y Pro) presentes en la VP60 recombinante. También se produce la inserción de una secuencia que codifica cinco aminoácidos (Ala-Cys-Ile-Asp-Arg), que no están presente en la secuencia de la proteína VP60 nativa y que proceden de la secuencia que codifica el sitio de clonación múltiple del plásmido pMTL22. Éstos cinco aminoácidos no son funcionales y, como alternativa, podría sustituirse dicha secuencia adicional por otra secuencia análoga del mismo o diferente número de aminoácidos, sin que se altere el resultado final. El plásmido resultante (pRHD-7) se purificó por lisis alcalina y se caracterizó mediante cartografía con endonucleasas de restricción y secuenciación de las regiones insertadas. Este plásmido se utilizó en la extracción de la VP60 modificada.

A continuación, se insertó el gen que codifica la VP60 modificada en un vector de expresión adecuado, como el vector pAcYM1 que tiene un único sitio BamHI en fase con el promotor de polihedrina. El gen de la VP60 modificada tenía un sitio de restricción BamHI en su secuencia y, por ello, resultó difícil la clonación dicho en vector pAcYM1, ya que fue necesario llevar a cabo nuevas digestiones parciales para permitir la extracción del inserto completo.

Para el aislamiento del gen VP60 a partir del plásmido pRHD-7 se probaron diferentes tiempos de digestión parcial con BamHI. Se observó que los tiempos más adecuados se situaban entre 15 y 30 minutos. Utilizando electroforesis sucesivas en gel de agarosa (Ejemplo 5) se obtuvo una banda de 1,7 Kb y se ligó al plásmido pAcYM1, que se digirió con BamHI y se desfosforiló con fosfatasa alcalina. Con esta mezcla de ligación se transformaron células DH5\alpha de E.coli y se seleccionaron los plásmidos recombinantes pAcRHDV-710 y pAcRHDV-709 (vectores de transferencia) por cartografía con endonucleasas de restricción. Se secuenciaron ambos plásmidos para verificar la orientación adecuada del inserto en relación con el promotor de polihedrina. Se observó que había una distancia de sólo 2 bases entre el sitio BamHI y el sitio de iniciación de la transcripción.

Después se transfectaron células de Spodoptera frugiperda, clon Sf9, con mezclas del ADN infeccioso purificado del virus AcRP23-lacZ progenitor y del correspondiente vector de transferencia. Una vez realizada esta cotransfección, se identificaron los baculovirus recombinantes mediante ensayos fenotípicos del color de las placas, tras la tinción de la progenie vírica con X-gal, y después se purificaron. El baculovirus recombinante, denominado AcNPV RHDV-710, se depositó en la Colección Europea de Cultivos de Células Animales (ECACC).

Los Ejemplos 4 a 6 describen en detalle la obtención de baculovirus recombinantes que expresan la VP60 modificada del RHDV,

Los productos de expresión de los baculovirus recombinantes AcNPV RHDV-710 y AcNPV RHDV-709 en células Sf9 han sido evaluados y la VP60 recombinante ha sido caracterizada de forma adecuada por electroforesis en geles de SDS-PAGE e inmunotransferencia.

Utilizando electroforesis en geles de SDS-PAGE, se obtuvo como producto principal una proteína de 60 KDa que migraba en la misma posición que el RHDV purificado. También se observó que la proteína recombinante estaba presente principalmente en el sobrenadante de la lisis celular, lo que indica que la proteína era muy soluble. Si el gel se desarrollaba durante un período de tiempo suficiente, era posible observar que la proteína recombinante presentaba una movilidad ligeramente inferior a la movilidad del virus. Esto se debía a la fusión en fase de los cinco aminoácidos adicionales.

Mediante inmunotransferencia se verificó que la proteína observada en el gel correspondía a la VP60 nativa del RHDV. Para ello, el gel se transfirió una membrana de nitrocelulosa y las bandas se bloquearon con leche desnatada en polvo y se incubaron con suero policlonal de conejo contra el RHDV (Laboratorios Sobrino). El resultado fue concluyente, ya que el suero policlonal de conejo contra el RHDV reconoció la misma proteína de 60 KDa tanto en células infectadas con el baculovirus recombinante AcNPV RHDV-710 como en el testigo positivo. Sin embargo, no reconoció ninguna proteína en el extracto de células Sf9 no infectadas (Ejemplo 7.2).

Los estudios posteriores realizados con la proteína VP60 expresada por el baculovirus recombinante AcNPV RHDV-710 pusieron de manifiesto que, sorprendentemente, esta proteína era capaz de formar cápsides o estructuras multiméricas o agregados proteicos similares a las cápsides víricas. Por este motivo, se examinaron las preparaciones de VP60 recombinante por microscopía electrónica y se estudió su actividad hemaglutinante. Siguiendo el protocolo descrito en el Ejemplo 8, se obtuvieron cápsides recombinantes con un nivel de pureza superior al 80%, mediante precipitación con concentraciones bajas de sulfato de amonio.

El análisis por microscopia electrónica de las muestras de VP60 recombinante puso de manifiesto, sorprendentemente, la existencia de agregados proteicos (cápsides) similares desde el punto de vista estructural y morfológico a las cápsides víricas. El tamaño de estas cápsides recombinantes es similar al de los viriones originales (35-40 nm). Asimismo, puede observarse que en la preparación de cápsides recombinantes toda las partículas están vacías, es decir, no contienen material genómico (Figura 3).

Por otra parte, las cápsides recombinantes se sometieron a un ensayo de hemaglutinación con eritrocitos humanos del grupo O al 1% en PBS, con resultados positivos de hemaglutinación.

Utilizando la técnica ELISA, se comparó el comportamiento de las cápsides recombinantes frente al del RHDV purificado. Siguiendo el protocolo descrito en el Ejemplo 8.3, se observó que los sueros contra el RHDV reconocieron igualmente tanto el producto de expresión recombinante (VP60 o cápside de VP60) como el virus purificado. No se observó reactividad frente a extractos de células Sf9 no infectadas.

Sobre la base de estos resultados puede afirmarse de forma concluyente que los productos de expresión (cápsides y proteína VP60 recombinante) son antigénicamente análogos al RHDV natural y a la proteína VP60 nativa del RHDV, y que la secuencia introducida no altera la capacidad intrínseca de la proteína para formar estructuras poliméricas de tipo cápside.

Las cápsides y/o proteínas recombinantes de la presente invención pueden ser utilizadas para fines diagnósticos, tanto para la detección de la presencia de anticuerpos específicos contra el RHDV (Ejemplo 11) como para la detección de la presencia de antígeno (RHDV) mediante la utilización de anticuerpos que reconocen específicamente el RHDV, obtenidos inmunizando animales con las cápsides y/o proteínas recombinantes de la presente invención.

Además, las cápsides y/o proteínas recombinantes mencionadas anteriormente pueden utilizarse para inmunizar conejos contra el RHDV, lo que permite su empleo en la formulación de vacunas recombinantes capaces de proteger eficazmente a conejos de la infección causada por el RHDV. Estas vacunas pueden ser activas o pasivas. Las vacunas para inmunización activa pueden prepararse suspendiendo dichas cápsides y/o proteínas recombinantes en un adyuvante adecuado. En el caso de que dichas cápsides y/o proteínas recombinantes vayan a presentarse en forma liofilizada, podrían resuspenderse en un diluyente aceptable desde el punto de vista inmunológico o en un adyuvante. La vacuna pasiva, o más exactamente la inmunización pasiva, puede obtenerse inmunizando activamente animales con dichas cápsides y proteínas recombinantes y aislando anticuerpos policlonales que, una vez aislados y purificados, pueden utilizarse como tratamiento vacunal.

Diluyentes aceptables desde el punto de vista inmunológico son soluciones salinas tamponadas con fosfato (PBS) y otras soluciones similares.

Puede utilizarse cualquiera de los ayunantes empleados habitualmente en la formulación de vacunas como adyuvante de las cápsides y proteínas recombinantes, o como diluyente. Así, estos adyuvantes pueden ser oleaginosos, con base de aceites minerales, glicéridos y derivados de éteres-ácidos grasos, adyuvantes sintéticos y acuosos, tales como hidróxido de aluminio, suspensiones de gel de alúmina, QuilA, MDP (muramil-dipéptido), ISCOM (complejo inmunoestimulante) o liposomas.

Además, la presente invención proporciona vacunas bivalentes o multivalentes capaces de prevenir la enfermedad hemorrágica vírica del conejo u otra infección o infecciones. Estas vacunas comprenden una combinación o asociación de las cápsides y/o proteínas recombinantes proporcionadas por la presente invención, junto con uno o más patógenos de conejo y un excipiente o adyuvante adecuado. Entre estos patógenos se encuentran los siguientes: virus de la mixomatosis, virus del fibroma de Shope, Bordetella bronchiseptica, así como especies de los géneros Pasteurella, Clostridium, Salmonella, Staphylococcus, Haemophilus, etc.

Las vacunas proporcionadas por la presente invención pueden administrarse al animal por vía intramuscular (IM), subcutánea (SC), intradérmica (ID) y oral. Para la administración IM o SC, la vacuna puede ser de tipo oleaginoso [simple (W/O) y (O/W) o doble (W/O/W)], acuoso, o de cualquier otro tipo, por ejemplo, utilizando MDP, liposomas o ISCOM. Para la administración ID, puede utilizarse cualquier sistema convencional de administración, preferiblemente el sistema con el nombre comercial DERMOJET®. La vacuna para la administración por vía oral puede contener, o no, ayudante acuoso junto con el antígeno.

La forma de presentación del antígeno de la vacuna (producto recombinante) puede ser en forma de solución o suspensión con uno de los antígenos mencionados anteriormente. En esta presentación pueden utilizarse diluyentes u otras vacunas de conejo. La presentación puede estar también en forma liofilizada, en cuyo caso el producto final puedo reconstituirse con un diluyente, un adyuvante o cualquier otro tipo de vacuna acuosa u oleaginosa para su aplicación en conejos.

Las vacunas proporcionadas por la presente invención son adecuadas para la protección de conejos salvajes, de granja y de compañía contra el RHDV.

Descripción detallada de la invención (Ejemplos)

La invención se describe a continuación con más detalle, y como Ejemplo, en relación con la obtención de la proteína VP60 recombinante mencionada anteriormente y las cápsides que puede formar, junto a las aplicaciones en vacunas y diagnóstico de ambos productos recombinantes.

Las realizaciones descritas a continuación se proporcionan tan sólo a título de ejemplos ilustrativos de una forma específica en la que puede realizarse la proteína o cápside de la presente invención.

Ejemplo 1 Obtención y purificación del RHDV 1.1. Infección de conejos con el RHDV 1.1.1. Animales

Se utilizaron conejos híbridos criados en granjas, de aproximadamente 3 meses de edad, y que pesaban más de 2 kg. Antes de la infección, se extrajo sangre de los animales mediante punción cardíaca, y se verificó la ausencia de anticuerpos contra el RHDV analizando los sueros mediante la prueba de inhibición de la hemaglutinación (HAI).

Brevemente, la técnica HAI incluye el tratamiento previo del suero para eliminar los componentes que inhiben la hemaglutinación. Con este fin, el suero se incuba a 56ºC durante 30 minutos. A 0,1 ml de suero se le añadieron 0,4 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y 0,5 ml de suspensión de caolín (SIGMA) al 25% en PBS, y se mantuvieron durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación frecuente. Una vez completada la adsorción, las muestras se centrifugaron durante 10 minutos a 200 x g. Al sobrenadante se le añadieron 50 \mul de eritrocitos humanos del grupo O, y la suspensión se agitó y centrifugó otra vez como se ha descrito anteriormente. El resto del ensayo se llevó a cabo en placas de microvaloración estériles con 96 pocillos en forma de U. A 50 \mul de diferentes diluciones del suero tratado se añadieron 4 HAu (unidades de hemaglutinación) del RHDV. Las placas se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente, y después se añadieron 50 \mul de suspensión de eritrocitos humanos del grupo O al 1% en PBS. La reacción se incubó a 4ºC y se controló entre 2 y 24 horas después.

1.1.2. Infección

Se utilizó una cepa aislada patógena del RHDV procedente de nuestro laboratorio (Plana, J., et al., 1988, Med. Vet., 6, 87-88). A partir de esta cepa aislada (PV1-MSV1), se realizaron tres pases en conejos, utilizándose el P3 como el inóculo de esta infección. Los conejos se infectaron por vía intranasal con 0,5 ml de una suspensión del RHDV en solución salina (20.400 HAu/animal). El virus se tituló utilizando un ensayo de hemaglutinación en eritrocitos humanos del grupo O. Para ello, 50 \mul de una suspensión de eritrocitos humanos del grupo O al 1% en PBS se mezclaron con 50 \mul de diluciones diferentes del virus en PBS. La ausencia o presencia de aglutinación en los eritrocitos se evaluó en un punto temporal entre 2 y 24 horas de incubación a 4ºC.

1.1.3. Extracción de hígados

Como consecuencia de la infección, los conejos morían entre 3 y 5 días después de la infección (d.p.i.). Se extrajeron el hígado y el bazo de los animales muertos. Los restos de tejido (grasa, tejido conjuntivo) y vesícula biliar fueron separados del hígado. Finalmente, se lavaron con solución salina (PBS) y se mantuvieron a 4ºC hasta su utilización.

1.2. Purificación del RHDV

La purificación del virus se realizó a partir de hígados de conejos infectados con el RHDV. El hígado se cortó en pedazos y se añadió un volumen aproximadamente igual de PBS. Se preparó un homogeneizado de tejido hepático utilizando un aparato Ultraturrax, con aproximadamente 10 ciclos de 2 minutos, manteniendo la muestra en un baño de hielo durante los intervalos de reposo. Después, la suspensión obtenida se clarificó por centrifugación a 20.000 x g a 4ºC durante 35 minutos. El sobrenadante resultante se centrifugó durante 2 horas a 113.000 x g a 4ºC sobre un colchón de sacarosa al 17% en PBS para la purificación y sedimentación del virus. Una vez retirado el sobrenadante, el precipitado se resuspendió en PBS. Después se extrajo la suspensión del virus (1:1) con 1,1,2-triclorotrifluoretano (MERCK). La fase acuosa procedente de una segunda extracción con disolvente, que contenía el virus, se purificó en un gradiente continuo de sacarosa (15-30% p/v en PBS) por centrifugación a 113.000 x g durante 4 horas. Una vez completada centrifugación, se separó el gradiente automáticamente en fracciones (aproximadamente 1 ml/fracción), y se determinó la presencia del virus en las diferentes fracciones mediante hemaglutinación (Ejemplo 1.1.2). Las fracciones correspondientes a los dos picos máximos de aglutinación, denominadas pico-I y pico-II, se mezclaron, se diluyeron con tampón TE (Tris-HCl 10 mM pH = 8,0 y EDTA 1 mM), y finalmente se centrifugaron para sedimentar el virus a 113.000 x g durante 7 horas.

El análisis del virus purificado se realizó por electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS (dodecilsulfato de sodio) al 9% (Laemmli, U.K., Nature, 227:680, 1970). La detección de las proteínas totales se realizó mediante tinción con azul de Coomassie e inmunotransferencia (Towbin, H., et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 4350-4354). Las inmunotransferencias se visualizaron utilizando antisuero específico contra el RHDV y un conjugado de peroxidasa-proteína A (SIGMA). Se identificó una banda principal de aproximadamente 60 KDa en los picos I y II de los geles teñidos con azul de Coomassie. Después se confirmó que correspondían al tamaño descrito para la proteína estructural VP60 del RHDV. Además de esta proteína, se observó una banda de aproximadamente 40 KDa mediante azul de Coomassie, más abundante en el pico-II que en el pico-I. El hecho de que esta proteína también reacciona con el suero contra el RHDV indica que se trata de un producto de degradación parcial de la proteína de 60 KDa.

Ejemplo 2 Aislamiento del ARN vírico

Se realizó una purificación del ARN total de la muestra del virus, purificado como se describe en el Ejemplo 1.2. Brevemente, se trataron 200 \mul del pico-I con SDS al 1%, 0,5 mg/ml de proteinasa K (SIGMA) y 2 mg/ml de pronasa (SIGMA) a 37ºC durante 30 minutos, para inactivar las proteínas y las RNasas. Después, la muestra se trató con fenol en dos veces consecutivas y con fenol:cloroformo:alcohol isoamílico para extraer el ARN, que se precipitó finalmente añadiendo un volumen 1/10 de acetato de sodio 3 M, 0,25 mg/ml de glucógeno, y 2,5 volúmenes de etanol (1 hora a -20ºC). Una vez terminado este período, el ARN se recuperó por centrifugación a 16.000 x g a 4ºC durante 30 minutos. Tras eliminar el sobrenadante, el ARN precipitado se resuspendió con 40 \mul de TE.

El ARN obtenido se analizó en geles de agarosa neutra al 0,7%, con tinción de bromuro de etidio. Se observaron dos bandas principales, que pueden corresponder al ARN genómico y subgenómico del virus. La comparación de estas bandas con los patrones de ARN de tamaños conocidos permitió deducir un tamaño de 8 Kb para una de las bandas. Hay que señalar la presencia de material de bajo peso molecular en estos geles, que corresponde posiblemente a ADN o ARN celular.

Ejemplo 3 Síntesis de ADNc a partir del ARN total del RHDV 3.1. Preparación del ADNc

Se sintetizó el ADNc correspondiente al extremo 3' del ARN del RHDV. Esta estrategia se aprovecha de la presencia de colas de poli(A) en el extremo 3' con el objeto de utilizar el oligonucleótido d(T) como cebador de extensión que puede extenderse con la enzima transcriptasa inversa para sintetizar copias de moléculas de ADN (ADNc).

La síntesis de ADNc se llevó a cabo utilizando un kit comercial (BOEHRINGER) y se realizó siguiendo el procedimiento descrito brevemente a continuación:

Se incubó 1 \mug del ARN-poli(A) del RHDV, obtenido como se describe en el Ejemplo 2, en presencia de 1 mM en dATP, dCTP (5-10 \muCi de ^{32}P-\alpha-dCTP), dGTP y dTTP, 25 unidades inhibidoras de la RNasa, 0,8 \mug de oligonucleótido d(T)_{12} fosforilado en el extremo 5' y 40 unidades de transcriptasa inversa, en un volumen final de 20 \mul. La reacción se incubó a 42ºC durante 1 hora y después, en el mismo tubo, se comenzó la síntesis de la segunda cadena. Con este fin, se añadió en tampón, RNasa y 25 unidades de ADN-polimerasa de E. coli, y se incubó a 22ºC durante 1 hora, y a 65ºC durante 10 minutos. Finalmente, para generar extremo romos, se añadieron 4 unidades de ADN-polimerasa de T4 y, tras 10 minutos a 37ºC, la reacción se paró añadiendo EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) y sarcosil. Después, la mezcla se extrajo con fenol:cloroformo:alcohol isoamílico, y el material se precipitó con etanol, como se describe en el Ejemplo 2.

La síntesis de ADNc se confirmó y cuantificó por recuento de la radiactividad incorporada en el material sintetizado, y por electroforesis en geles de agarosa en condiciones alcalinas y neutras.

3.2. Clonación del ADNc

En primer lugar, se seleccionó el tamaño del ADNc para evitar la clonación de segmentos excesivamente pequeños. Con este fin, el material procedente de la síntesis de ADNc se recuperó por centrifugación a 16.000 x g durante 30 minutos. El precipitado se secó en vacío, se disolvió en tampón TE y se cargó en un gel de agarosa al 1%. Se seleccionaron fragmentos de ADNc de tres tamaños diferentes: entre 1.000 y 2.000 pb; entre 2.000 y 5.000 pb; y superior a 5.000 pb. En todos los casos, el material se recuperó del gel con papel de DEAE-celulosa, elución con NaCl y precipitación posterior. El ADNc purificado se clonó en extremos romos en el vector pMTL25, un vector derivado del pUC18. Para ello, el vector se linealizó con SmaI y se trató con fosfatasa alcalina con el objeto de reducir el fondo de ligación. Tras la ligación con la ADN-ligasa de T4 a 14ºC durante toda la noche, se transformaron células competentes XL-1Blue de E. coli que, en presencia de X-gal (5-bromo-4-indolil-\beta-D-galacto-piranósido) (BOEHRINGER) e IPTG (isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido) (GOLD BIOCH), permite la selección inicial de las colonias recombinantes por color (colonias azules sin inserto, en comparación con colonias blancas con inserto).

El análisis de los clones positivos se realizó utilizando preparaciones de ADN de plásmido (Birnboim & Doly, 1979, Nucleic Acids Res., 7:1513-1523) y cartografiando los sitios de restricción con las enzimas BamHI y EcoRI, sobre la base de la secuencia de la cepa RHDV aislada en Alemania (Meyers et al., citado anteriormente). De los 38 plásmidos analizados, procedentes de la clonación de las tres selecciones correspondientes del tamaño del ADNc, sólo 10 resultaron positivos, y correspondían a la zona del extremo 3' del RHDV, con insertos entre 800 y 2.000 pb. Tres de ellos, denominados pRHD-24, pRHD-25 y pRHD-45, tenían un tamaño de aproximadamente 2.000 pb y, por consiguiente, contenían más probablemente el gen de la proteína estructural VP60, por lo que fueron secuenciados para confirmar su autenticidad, y para determinar las zonas de inserción, orientación y tamaño exacto. Con este fin, se aplicó la técnica didesoxi a plásmidos bicatenarios (Sanger, F., et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467), y se utilizaron los oligonucleótidos universal (5'GTAAAACGACGGCCAGT3') e inverso (5'AACAGCTATGACCATG3'). Los clones del RHDV analizados se secuenciaron, lo que permitió observar que los clones pRHD-24 y pRHD-25 comenzaban en el nucleótido 5313 (de acuerdo con la secuencia de Meyers et al., citado anteriormente) y el clon pRHD-45 en el nucleótido 5193. Los tres clones terminaban en la cola de poli(A) situada en el extremo
3'.

3.3. Identificación del codón de iniciación de la proteína VP60

Debido a que la proteína VP60 está comprendida en un único marco abierto de lectura que incluye la mayor parte del genoma vírico, se utilizaron dos estrategias para localizar la posición del ATG inicial correspondiente al gen VP60. Una estrategia fue utilizar un enfoque experimental encaminado a intentar secuenciar el extremo N-terminal directamente en un secuenciador automático de proteínas; la otra estrategia fue una predicción teórica mediante un análisis de la secuencia utilizando el programa informático MICROGENIE (BECKMANN).

La secuenciación directa de la proteína no arrojó resultados prácticos, ya que no se obtuvo una secuencia clara. El motivo puede ser la presencia de extremos estructurales que bloquean la porción aminoterminal de la proteína.

Por otra parte, utilizando una simulación de tamaños de posibles regiones de transcripción, se calculó que el comienzo de la secuencia codificante de la proteína VP60 se situaba en el nucleótido 5305 del genoma del RHDV (Meyer et al., citado anteriormente). Este nucleótido se utilizó como referencia en experimentos subsiguientes de expresión de VP60r.

Ejemplo 4 Preparación del gen para su inserción en el vector de transferencia

Siguiendo la hipótesis establecida en el Ejemplo 3.3, se seleccionó el clon de ADNc que comenzaba más cerca de dicho ATG. Ninguno de los clones comenzaba inmediatamente antes y, por ello, se seleccionó el clon pRHD-24. En este clon, el inserto de ADNc comenzaba 5 pb por debajo del ATG teórico inicial y, por consiguiente, requería la adición de un ATG que permitiese el comienzo de la expresión. A continuación se describe la estrategia seguida.

El inserto completo del plásmido pRHD-24 se obtuvo mediante digestión parcial con BamHI, debido a la presencia de otro sitio BamHI interno, y reclonación en el sitio BglII del vector pMTL22, de modo que el marco abierto de lectura del inserto se sitúa en fase con el ATG perteneciente a la secuencia del NcoI diana del pMTL22. A continuación, se digiere esta construcción con NcoI y EcoRI, para eliminar la región 3' no clonada del clon de ADNc, se trata con el fragmento de Klenow de la ADN-polimerasa I de E. coli (a temperatura ambiente durante 15 minutos) con el objeto de obtener extremos romos y, finalmente, se vuelve a clonar en pMTL25 digerido con SmaI. El plásmido resultante se denominó clon pRHD-7 (Figura 1).

Resumiendo: con esta construcción se pierden los aminoácidos originales situados en los sitios +2 y +3 teóricos de la VP60 nativa, produciéndose la sustitución de estos dos aminoácidos (Glu y Ala) por otros dos aminoácidos (Ser y Pro) presentes en la proteína VP60 modificada, y la inserción de cinco aminoácidos (Ala-Cys-Ile-Asp-Arg), que no están presentes en la secuencia de la VP60 nativa y que proceden de la secuencia del pMTL22. El plásmido resultante, denominado pRHD-7, se utilizó en la extracción del gen de la VP60 modificada.

Ejemplo 5 Clonación en el vector de transferencia de baculovirus pAcYM1

El vector pAcYM1 (Matsuura et al., 1987, J. Gen. Virol., 68, 1233-1250) tiene un único sitio de clonación, BamHI, en fase con el promotor de polihedrina. Dado que el gen de la VP60 modificada tiene en su secuencia un sitio de restricción BamHI, la clonación en dicho rector es difícil debido a la necesidad de realizar digestiones parciales que permitan la extracción del inserto completo.

El pAcYM1 presenta una ventaja con respecto a otros vectores de transferencia de baculovirus: no utiliza \beta-galactosidasa como marcador y, por tanto, el único producto de expresión obtenido procede del gen introducido bajo el control del promotor de polihedrina, en este caso particular, el VP60 recombinante.

Para el aislamiento del gen VP60 a partir del clon pRHD-7 se probaron diferentes períodos temporales para la digestión parcial con BamHI. En una primera estrategia, se probaron períodos de tiempo de 0, 1, 2, 5 y 10 minutos. Dado que no se liberó suficiente inserto, se estudiaron períodos de tiempo más prolongados: 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25 y 30 minutos. Se cargó el 10% de cada digestión en un gel de agarosa con el objeto de comprobar el período más adecuado. Los períodos de tiempo más adecuados resultaron ser 15, 20, 25 y 30 minutos. El resto de la digestión se cargó en un gel de agarosa al 1%, en un lado durante 15 y 20 minutos, y en el otro lado durante 25 y 30 minutos, para recoger la banda de 1,7 Kb. La banda mayor (HB) y la banda situada inmediatamente debajo (LB) se recogieron con membranas de PIB-celulosa (SCHLEICHER & SCHUELL). Las muestras de ADN se eluyeron de las membranas siguiendo las instrucciones del fabricante. El material eluido se precipitó con etanol y se resuspendió en un volumen de 30 \mul de TE. Para evitar un posible fondo de religación del vector pMTL25 progenitor, se realizó una digestión total previa con ScaI.

El material preparado este modo se cargó en un gel de agarosa al 1%. Se observaron nuevamente dos bandas en la porción HB eluida, que correspondían a HB y a un contaminante debido a LB. La banda mayor se extrajo nuevamente y se realizó la alquilación con pAcYM1 digerido con BamHI y desfosforilado con fosfatasa alcalina. Con esta mezcla de ligación se transformaron células DH5\alpha de E.coli y se seleccionaron los clones recombinantes pAcRHDV-710 y pAcRHDV-709 por cartografía con endonucleasas de restricción. Ambos clones fueron secuenciados (Figura 2), utilizando la técnica didesoxi (Sanger, 1977, citado anteriormente), para confirmar la orientación correcta del inserto en relación con el promotor de polihedrina. La distancia entre el sitio BamHI y el comienzo de la transcripción era sólo de 2 bases.

Ejemplo 6 Transfección y obtención de baculovirus recombinantes

Se utilizaron cada uno de los vectores de transferencia, denominados pAcRHDV-710 y pAcRHDV-709, para cotransfectar células del insecto Spodoptera frugiperda, Sf9, con ADN del baculovirus progenitor AcRP23-LacZ (donado por Dr. Posee, I.V.E.M., Oxford, RU), siguiendo la técnica de Felgner (Felgner et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413-7417). Para la cotransfección se utilizó una mezcla de 2 \mug del vector de transferencia correspondiente a pAcRHDV-709 o pAcRDHV-710 junto con 500 ng del virus progenitor en presencia de lipofectina (GIBCO-BRL). La mezcla se añadió a una monocapa de 2,5x10^{6} células Sf en matraces T25 (COSTAR). La mezcla de transfección se retiró a las 24 horas y se añadió medio TNMFH con suero fetal al 5%. Las células se incubaron a 27ºC. Se recogieron el sobrenadante del cultivo celular y los restos celulares después de 7 días. El sobrenadante del cultivo de células infectadas se utilizó para seleccionar los baculovirus recombinantes que expresaban la VP60 recombinante mediante cultivos sucesivos en placas en presencia de X-gal y rojo neutro. Los baculovirus recombinantes formaban placas blancas, mientras que los de tipo salvaje formaban placas azules.

Los baculovirus recombinantes obtenidos se denominaron AcNPV RHDV-710 y AcNPV RHDV-709. El baculovirus recombinante AcNPV RHDV-710 se depositó en la Colección Europea de Cultivos de Células Animales (ECACC) el 18 de mayo de 1994, con el número de acceso V94051819.

Ejemplo 7 Evaluación de los productos de expresión de AcNPV RHDV-710 y AcNPV RHDV-709 en células Sf9. Caracterización de la VP60 recombinante 7.1. Electroforesis en geles de SDS-PAGE

Se infectaron células Sf9 con cada uno de los baculovirus recombinantes y se recogieron a las 72 h.p.i. (horas tras la infección). Las células fueron recogidas por centrifugación a 500 x g durante 5 minutos, y después se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) pH:7,4 y se resuspendieron a 10x10^{6} células/ml en tampón de lisis (que contenía SDS al 5%, \beta-mercaptoetanol al 1% y glicerol al 17,4%). Antes de su análisis en un gel de SDS-PAGE al 9%, el extracto se sometió a sonicación para separar la fracción soluble de la fracción insoluble. De forma simultánea, se cargaron muestras con el virus purificado del pico I y con extractos de células Sf9 no infectadas. Los geles se tiñeron con azul de Coomassie. En las muestras correspondientes a los baculovirus recombinantes se observó, como proteína mayoritaria, una proteína de aproximadamente 60 KDa que migraba en una posición similar a la de la proteína vírica purificada. También se observó que la proteína recombinante permanecía en su mayor parte en el sobrenadante de la lisis celular, lo que indicaba que la proteína era muy soluble.

Si el gel se desarrolla durante suficiente tiempo, puede observarse que la proteína recombinante presenta una movilidad ligeramente inferior a la movilidad de la proteína vírica, debido a la fusión en fase de 5 aminoácidos adicionales.

7.2. Inmunotransferencia

Se realizó una prueba de inmunotransferencia para confirmar que la proteína observada en el gel era el producto deseado (VP60r del RHDV). El gel se transfirió una membrana de nitrocelulosa en un dispositivo semiseco (BIORAD), con arreglo a protocolos previamente fijados (Burnette et al., y Towbin et al., citados anteriormente). Las bandas de nitrocelulosa se bloquearon con leche desnatada en polvo (MOLICO®, Nestlé) al 3% en tampón Tris-HCl 20 mM pH:7,5, NaCl 500 mM [TBS] a temperatura ambiente durante 1 hora. Después mezclaron con un suero policlonal de conejo contra el RHDV, se diluyeron a 1:100 en TBS - Tween-20 al 0,05%, a temperatura ambiente durante 2 horas, y después se lavaron con solución de lavado de TBS que contenía Tween-20 al 0,05% durante 30 minutos. Tras la incubación con la proteína A marcada con peroxidasa (dilución 1:1.000 en TBS-Tween-20) durante 1 hora y el lavado subsiguiente, las bandas se visualizaron con 4-cloro-1-naftol (SIGMA), metanol al 17% (v/v) y agua oxigenada al 0,015% TBS, hasta observarse la aparición de bandas visibles. La reacción se paró con agua
destilada.

El resultado fue concluyente. El suero policlonal de conejo contra el RHDV reconoció la misma proteína de 60 KDa, tanto en células infectadas con el baculovirus recombinante AcNPV RHDV-710 como en el testigo positivo (pico I). Sin embargo, no reconoció ninguna proteína en el extracto de células Sf9 no infectadas.

Aparecían bandas, menores que la banda de 60 KDa reconocida por el suero, tanto en el pico I como en los extractos de AcNPV RHDV-710. Se han propuesto varias explicaciones para dar cuenta de la presencia de esta banda adicional, aunque en ningún caso queda afectada la calidad del producto final, como se demuestra en el caso del parvovirus, en el que también aparecen.

En vista del hecho de que, de los dos baculovirus recombinantes obtenidos, el AcNPV RHDV-710 presentó un mejor rendimiento, se seleccionó este clon para todos los experimentos subsiguientes, incluida la preparación del inóculo definitivo depositado en la ECACC (Ejemplo 6).

Ejemplo 8 Análisis de la formación de cápsides vacías cápsides formadas por la VP60 recombinante del RHDV

Con el objeto de analizar si la proteína VP60 recombinante expresada por el baculovirus recombinante AcNPV RHDV-710 era capaz de formar estructuras multiméricas similares a las cápsides víricas, se inspeccionaron las preparaciones de VP60 por microscopia electrónica y se estudió su capacidad de hemaglutinación.

Se infectaron células Sf9 con AcNPV RHDV-710 a una multiplicidad de 1 UFP (unidades formadoras de placas) por célula, y después se incubaron a 27ºC durante 72 horas. Las células se recogieron por centrifugación, se lavaron con PBS como se ha descrito anteriormente, y se resuspendieron a 2x10^{7} células/ml en solución de bicarbonato 25 mM pH: 9,5, para continuar con la lisis celular. El extracto de células lisadas se centrifugó a 9.000 x g durante 15 minutos para separar los restos celulares, y el sobrenadante se sometió a precipitación con sulfato de amonio al 30% en condiciones estándar. Debido al bajo porcentaje de sulfato de amonio, sólo se espera que precipiten estructuras multiméricas. La pureza de la preparación se determinó por análisis en geles de SDS-PAGE al 9%. Se confirmó que era posible obtener procápsides recombinantes con niveles de pureza superiores al 80% en una simple etapa de precipitación.

8.1. Análisis por microscopía electrónica

Se analizaron por microscopía electrónica muestras de VP60 recombinante semipurificadas que presentaban un aspecto de agregados proteicos estructural y morfológicamente similares a las cápsides víricas. La Figura 3a muestra una preparación de cápsides purificadas (aumento de 64k) y la figura 3b muestra los viriones purificados del pico II (aumento de 79k). El tamaño de estas procápsides recombinantes es similar al tamaño de los viriones originales, y puede calcularse que es aproximadamente 35-40 nm. En la preparación de procápsides, puede observarse que todas las partículas están vacías, mientras que en la preparación de viriones están presentes ambos tipos.

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8.2. Prueba de hemaglutinación

Las mismas muestras de VP60 recombinante empleadas en el Ejemplo 8.1 se sometieron a una prueba de hemaglutinación con eritrocitos humanos del grupo O al 1% en PBS. Los títulos obtenidos fueron:

VP60:	15.000 HAu/50 \mul
RHDV (pico I):	390.750 HAu/50 \mul

Sin embargo, hay que tener en cuenta que en el caso de VP60 la cantidad de proteína es cinco veces inferior a la del pico I.

8.3. ELISA

Utilizando la técnica de ELISA, se verificó el comportamiento de las procápsides recombinantes en comparación con el del pico I purificado del RHDV. Se realizó un ensayo en placas con diferentes concentraciones de antígeno en tampón carbonato pH:9,6 a 4ºC (500, 100, 20 y 4 ng por pocillo). Se lavaron tres veces y después se mezclaron con tres sueros de conejo a diluciones entre 1/100 y 1/12.500, utilizando diluciones de 5 veces en PBS al 1%-Molico®. La incubación se realizó a 37ºC durante 2 horas, lavando tres veces y después añadiendo proteína A marcada con peroxidasa a una dilución de 1:1.000 en PBS al 1%-Molico®, a temperatura ambiente durante 1 hora. Se hicieron cinco lavados y el color se visualizó utilizando ABTS [ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico)] como sustrato durante 20 minutos. La reacción se paró con SDS al 1%, y se midió la absorbancia a 405 nm.

Se calculó que la concentración óptima de antígeno en la prueba de ELISA se situaba entre 500 y 100 ng por pocillo.

Inmediatamente después, los sueros se titularon utilizando un factor de dilución 2 en 0,35 \mug de antígeno/pocillo, para comparar el pico-I y la VP60 recombinante. Las condiciones de la prueba fueron similares a las descritas anteriormente. Las diluciones del suero que mejor distinguían entre los positivos y los negativos fueron 1/200 y 1/400.

Los sueros contra el RHDV reconocen por igual el producto de expresión (VP60r) y el virus purificado, sin presentar reactividad frente a extractos de células Sf9 no infectadas.

Sobre la base de estos resultados, pueda afirmarse que el producto de expresión (VP60r) es antigénicamente análogo a la proteína VP60 nativa del RHDV, y que la secuencia introducida no altera la capacidad intrínseca de la proteína recombinante para formar estructuras poliméricas de tipo cápside.

Ejemplo 9 Formulación de vacuna

Se prepararon vacunas, capaces de proteger a los conejos frente a la prueba de provocación con RHDV, en forma de emulsión en aceite o en hidróxido de aluminio/Quil-A, siguiendo el procedimiento descrito a continuación.

Se infectaron 300 ml de un cultivo de células Sf9 en suspensión con el baculovirus recombinante AcNPV-RHD710 a una multiplicidad de infección (m.o.i.) de 1 UFP/célula. Las células se recogieron a las 72 horas tras la infección y después se trataron como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 7, hasta la etapa final de purificación de la proteína VP60 recombinante con sulfato de amonio al 30%. Esta muestra se analizó en geles de SDS-poliacrilamida al 9% y se sometió a inmunotransferencia utilizando un suero contra el RHDV. Se observó una banda principal (>80%) con un peso molecular de aproximadamente 60 KDa, junto con dos bandas más pequeñas (43-60 KDa) que se purificaron junto con la VP60, aunque, dado que no se detectan con el suero contra el RHDV, no son específicas del virus.

La concentración de la proteína VP60 recombinante en la preparación fue 2 mg/ml, determinada por la técnica de Lowry y por tinción del gel de SDS con azul de Coomasie.

A. Se formuló una vacuna oleaginosa de la siguiente manera:

a)

50% de fase antigénica, formada por la proteína VP60 recombinante purificada (VP60r) en tampón PBS; y

b)

50% de una fase oleaginosa, formada por 82,3% de Marcol-82 (ESSO ESPAÑOLA S.A.), 6,5% de Eumulgin-48 (HENKEL), 10% de Montanide-80 (SEPIC), 1,2% de alcohol bencílico (ELF ATOCHEM/ATO) y 0,1 ml de trietanolamina (MERCK).

La fase antigénica fue añadida lentamente a la fase oleaginosa, que se mantuvo agitada. Una vez completada la adición de la fase antigénica, se continuó la agitación durante 10 minutos y la vacuna se conservó a 4ºC hasta su utilización.

\newpage

Se prepararon cinco vacunas diferentes con diversas concentraciones de antígeno recombinante (VP60r) y con antígeno oleaginoso, específicamente:

	Concentraciones de la proteína VP60r
Referencia de la vacuna	(\mug/dosis de 1 ml)
\hskip0,3cm 0,5	W/O/W	0,5
\hskip0,3cm 3	W/O/W	3
\hskip0,3cm 10	W/O/W	10
\hskip0,3cm 25	W/O/W	25
\hskip0,3cm 50	W/O/W	50

B. Además, se formulan otras vacunas utilizando el sistema Munokynin® como adyuvante (hidróxido de aluminio y Quil-A, AMERICAN CYANAMID). Las vacunas se formularon con dos concentraciones diferentes de antígeno recombinante (VP60r) y con adyuvante Munokynin®, específicamente:

	Concentraciones de la proteína VP60r
Referencia de la vacuna	(\mug/dosis de 1 ml)
\hskip0,3cm 0,5	W/W	0,5
\hskip0,3cm 25	W/W	25

Ejemplo 10 Ensayos de eficacia y seguridad de la vacuna en pruebas de laboratorio con conejos 10.1. Animales

Se utilizaron conejos de la raza New Zealand, de 45 días de edad, que estaban exentos de anticuerpos contra el RHDV, a juzgar por la técnica HAI (Ejemplo 1). Los animales se distribuyeron en jaulas en grupos de dos, de modo que en cada jaula se alojaban dos conejos vacunados con la misma concentración de antígeno vacunal.

10.2. Vacunación y revacunación

Se llevó a cabo un ensayo con un total de 39 conejos, de los cuales:

a) 26 conejos fueron vacunados con una dosis de 1 ml de las vacunas descritas en el Ejemplo 9. Veintiún días después de la vacunación inicial, fueron revacunados con una segunda dosis de la misma vacuna, excepto en el caso de la vacuna referencia 3 W/O/W, ya que sólo se revacunó 1 de los 4 conejos vacunados inicialmente con esta vacuna;

b) como testigo positivo, 4 conejos fueron vacunados y revacunados con una dosis de la vacuna comercial "CYLAP HVD®" de Laboratorios Sobrino/Cyanamid; y

c) 9 conejos permanecieron como testigos negativos, de los que 4 fueron inoculados con una solución que contenía sólo adyuvante oleaginoso (referencia W/O/W), otros 4 con una suspensión que contenía sólo adyuvante Munokynin® (referencia W/W), y 1 no fue inoculado.

Los animales se distribuyeron grupos de 4 conejos por dosis y vacuna, excepto para la vacuna de referencia 0,5 W/O/W, para la que había sólo 2 conejos. La vacuna se administró por vía intramuscular (IM) a 2 animales de cada grupo y por vía subcutánea (SC) a otros 2. Los 2 animales en el grupo de la vacuna de referencia 0,5 W/O/W fueron vacunados por vía IM.

Desde el comienzo de la vacunación hasta 35 días tras la vacunación, se evaluaron los siguientes parámetros:

A. Respuesta serológica por medio de la técnica HAI

Se extrajo sangre los animales en los tiempos T_{0}, T_{14}, T_{21} y T_{35}.

	T_{0}:	Extracción de sangre antes de la vacunación
	T_{14}:	Extracción de sangre a los 14 días tras la vacunación
	T_{21}:	Extracción de sangre a los 21 días tras la vacunación, coincidiendo con el tiempo de revacunación
	T_{35}:	Extracción de sangre a los 35 días tras la vacunación y a los 14 días tras la revacunación

La Tabla 1 presenta los resultados de los títulos de inhibición de la hemaglutinación a diferentes tiempos.

TABLA 1 Títulos de HAI de sueros de conejo correspondientes al ensayo de eficacia con la vacuna recombinante contra la enfermedad causada por el RHDV

1

(1): Vía intramuscular	\ding{61}: Muerte debida a infección
(2): Vía subcutánea	\ding{61}*: Muerte debida a hemorragia
ND: No realizado

Puede observarse que a los 14 días tras la vacunación los animales presentaron una respuesta serológica positiva, excepto en los casos correspondientes a las concentraciones bajas de antígeno recombinante (por ejemplo, 0,5 \mug), independientemente del adyuvante utilizado. Los animales vacunados con un placebo no presentaron respuesta serológica detectable por HAI. Como puede apreciarse en los sueros correspondientes a la extracción de sangre realizada el día 21, los títulos de anticuerpo aumentaron, y comenzaron a ser detectables incluso en aquellos sueros procedentes de vacunaciones con concentraciones bajas de antígeno recombinante. Después de la revacunación y antes de la prueba de provocación, se observaron elevados niveles de anticuerpo incluso a concentraciones bajas de antígeno recombinante. A partir de la dosis de 10 \mug, no se observaron diferencias importantes en la respuesta serológica.

B. Reacción local en el lugar de la inyección

No se observaron reacciones significativas de tipo local o general en los conejos durante el período de vacunación.

Los resultados obtenidos en los apartados A y B anteriores permiten afirmar que la vacuna que comprende la proteína VP60 recombinante del RHDV, aparte de ser una vacuna segura, induce la seroconversión en conejos de modo similar a la seroconversión inducida por la vacuna nativa (CYLAP HVD®).

10.3. Eficacia de la vacuna

A los 36 días tras la vacunación se infectaron todos los conejos por vía intranasal con una dosis de 3,6x10^{4} DL_{50} (dosis letal del 50%) del RHDV. La prueba de provocación se realizó en establos de seguridad.

Desde el momento de la infección hasta el 14 d.p.i. se evaluaron los siguientes parámetros:

A. Presencia o ausencia de signos clínicos característicos de la enfermedad, así como el nivel de protección aportado por la vacuna

De un total de 32 conejos infectados, 23 vacunados previamente con el antígeno recombinante (VP60r), 3 con la vacuna nativa comercial, y los 6 restantes placebos (Tabla 1), sólo los 6 animales testigo habían muerto a llegar el quinto día posterior a la infección manifestando signos típicos de la enfermedad hemorrágica del conejo, mientras que los animales vacunados resistieron la infección y seguían vivos a los 14 d.p.i., sin presentar ningún signo clínico aparente de la enfermedad (Tabla 1). No se observaron lesiones microscópicas aparentes en el pulmón o en el hígado, ni se detectó el RHDV en el hígado de estos animales. Hay que señalar que los conejos (referencia nº 4558, 4559 y 4560) vacunados con una sola dosis de 3 \mug de antígeno recombinante (VP60r) también resistieron la infección, lo que indica que una dosis baja de antígeno recombinante puede ser suficiente para conferir protección contra la enfermedad.

B. Respuesta serológica (HAI)

Se extrajo sangre de los animales en los momentos C_{0}, C_{6} y C_{14}:

C_{0}:	Extracción de sangre anterior a la prueba de provocación
C_{6}:	Extracción de sangre a los 6 días después de la prueba de provocación
C_{14}:	Extracción de sangre a los 14 días después de la prueba de provocación

Los resultados obtenidos a partir de la titulación por HAI de los sueros obtenidos después de la infección en animales vacunados aparecen en la Tabla 1. A los 6 d.p.i., los títulos de anticuerpo contra el RHDV son muy similares a los títulos previos a la prueba de provocación (T_{35}/C_{0}), mientras que a los 14 d.p.i. son superiores y, en general, más uniformes. Este aumento en el título de anticuerpos se debe al efecto de refuerzo del virus utilizado en la prueba de provocación.

C. Presencia o ausencia del virus en animales tras la prueba de provocación

Se analizaron muestras del hígado de los animales que habían muerto durante la prueba de provocación, así como de los animales sacrificados a los 14 d.p.i., con el objeto de detectar la presencia del RHDV. Se seleccionaron dos animales de cada grupo de vacunas a partir de aquellos en los que se habían observado posibles lesiones hepáticas (uno de ellos vacunado por vía IM y el otro por vía SC) y se extrajeron muestras de hígado. En ambos casos se aisló el RHDV a partir de estas muestras. Para ello, se preparó un homogeneizado de los hígados en PBS utilizando un aparato Ultraturrax (Ejemplo 1). La suspensión producida se clarificó por centrifugación a 1.600 x g durante 30 minutos. El sobrenadante producido se utilizó para detectar la presencia o ausencia del RHDV por hemaglutinación (Ejemplo 1). Como se muestra en la Tabla 2, el RHDV fue identificado en el hígado de los conejos que habían muerto durante la prueba de provocación (conejos testigos), un hecho que confirma la causa de la muerte.

TABLA 2 Aislamiento y titulación, posterior a la prueba de provocación, del RHDV a partir de hígados de conejo

2

La Tabla 2 demuestra que se detecta un muy bajo nivel del virus solamente en 1 conejo testigo (ref. 4579), que cabe atribuir a la coccidiosis hepática observada a simple vista en el animal. Ésta puede ser la causa de la baja replicación del RHDV, ya que parte del parénquima hepático había sido destruido. No se detectó el virus en el hígado de animales vacunados sacrificados a los 14 d.p.i. Un conejo (ref. 4553), vacunado con la mínima concentración de antígeno recombinante, murió a consecuencia de la extracción de sangre realizada a los 6 d.p.i., como se demuestra por el hecho de que no se aisló el RHDV en el hígado (Tabla 2).

Los resultados obtenidos permiten afirmar que la vacuna recombinante que contenía la proteína VP60 recombinante es muy inmunogénica y confiere protección total, incluso a bajas dosis, contra la enfermedad hemorrágica del conejo. No se han encontrado diferencias apreciables entre la administración de la vacuna por vía intramuscular o por vía subcutánea.

Además, la vacuna recombinante es capaz de prevenir la diseminación (difusión del virus), ya que se ha podido confirmar que la replicación del RHDV no tiene lugar en los órganos diana (hígado) de los animales vacunados a los que se administra el virus en una prueba de provocación.

Ejemplo 11 Utilización de la proteína VP60 recombinante en técnicas y procedimientos de diagnóstico

Como se ha mencionado en el Ejemplo 7.3, la proteína VP60 recombinante puede utilizarse para detectar anticuerpos específicos contra el RHDV. Esta característica es útil para confirmar la infección en animales y determinar la necesidad de vacunación. El procedimiento seguido fue una prueba indirecta de ELISA realizada en placas de microvaloración con 96 pocillos de fondo redondo. Brevemente, el procedimiento fue el siguiente: se realizó un ensayo en placas con 0,25 \mug de antígeno recombinante (VP60r) en tampón carbonato pH:9,6 por pocillo, mantenido a 4ºC durante toda la noche. Los sueros objeto de ensayo se añadieron a la dilución adecuada realizada con PBS al 0,1%-Molico® y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron y se visualizaron utilizando ABTS como sustrato (Ejemplo 8.3).

Este procedimiento para la detección y cuantificación de anticuerpos contra el RHDV se utilizó como ejemplo de la determinación de títulos de ELISA de sueros de conejo correspondientes a la prueba de eficacia con la vacuna recombinante. Los resultados de la titulación por ELISA de anticuerpos contra el RHDV se muestran en la
Tabla 3.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 3 Anticuerpos contra el RHDV determinados por ELISA

3

En general, la correlación entre los títulos obtenidos por HAI y ELISA es bastante buena, aunque la sensibilidad del procedimiento ELISA es 10 veces mayor y los títulos obtenidos son entre 5 y 20 veces superiores.

Conviene hacer hincapié en el hecho de que se detectaron títulos de anticuerpo apreciables por ELISA, pero no por HAI, en cuatro conejos (ref. 4597, 4569, 4572 y 4600), un dato que puede ser indicativo de inmunidad materna residual que, sin embargo, no parece afectar a la inducción de anticuerpos. Este resultado sugiere que la vacuna podría ser eficaz incluso en presencia de anticuerpos maternos.

Ejemplo 12 Vacunación por vía oral: ensayo de eficacia y seguridad de la vacuna

Se prepararon vacunas, capaces de proteger a los conejos contra la prueba de provocación con RHDV, en forma de suspensión acuosa, siguiendo el procedimiento descrito continuación:

Se infectaron 300 ml de un cultivo de células Sf9 en suspensión con el baculovirus recombinante AcNPV-RHD710 a una multiplicidad de infección (m.o.i.) de 1 UFP/célula. Las células se recogieron a las 72 horas tras la infección y después se trataron como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 7, hasta la etapa final de purificación de la proteína VP60 recombinante con sulfato de amonio al 30%. Esta muestra se analizó en geles de SDS-poliacrilamida al 9% y se sometió a inmunotransferencia utilizando un suero contra el RHDV. Se observó una banda principal (>80%) con un peso molecular de aproximadamente 60 KDa, junto con dos bandas más pequeñas (43-60 KDa) que se purificaron junto con la VP60, aunque, dado que no se detectan con el suero contra el RHDV, no son específicas del virus.

La concentración de la proteína VP60 recombinante en la preparación fue 2 mg/ml, determinada por la técnica de Lowry y por tinción del gel de SDS con azul de Coomasie.

A. Se formuló una vacuna como sigue: La proteína VP60 recombinante se diluyó en PBS pH 7,2 de modo que 1 ml de la dilución (1 dosis) contenía 3 \mug de proteína VP60 recombinante. Esta solución se inactivó con etilenimina binaria a una concentración final de 5 mM a 37ºC durante 72 horas.

B. Además, se formuló otra vacuna utilizando la misma solución antigénica a una concentración de 3 \mug de VP60 recombinante por cada dosis de 1 ml, pero sin inactivar.

- Vacunas probadas:

\hskip0,5cm

vacuna inactivada {}\hskip4cm vacuna no inactivada

- Animales

Se utilizaron conejos de la raza New Zealand, de 60 días de edad, exentos de anticuerpos contra el RHDV, a juzgar por la técnica HAI (Ejemplo 1). Los animales se distribuyeron en jaulas.

- Vacunación y revacunación

Se llevó a cabo un ensayo con un total de 15 conejos, de los cuales:

a) 5 conejos fueron vacunados con una dosis de 1 ml de vacuna inactivada. Veintiún días después de la vacunación inicial, fueron revacunados con una segunda dosis de la misma vacuna [Grupo 15, Tabla 4].

b) 5 conejos fueron vacunados y revacunados con una dosis de vacuna no inactivada [Grupo 16, Tabla 4].

c) 5 conejos, que permanecieron como testigos negativos, fueron inoculados con PBS [Grupo 17, Tabla 4].

La vacuna fue administrada a los conejos por vía oral, depositando 1 ml de la fase acuosa en la boca.

Desde el comienzo de la vacunación hasta 35 días después la vacunación, se evaluaron los siguientes parámetros:

A. Respuesta serológica por medio de la técnica HAI

Se extrajo sangre los animales en los momentos T_{-4}, T_{21}, T_{35} y T_{43}.

	T_{-4}:	Extracción de sangre a los 4 días antes de la vacunación
	T_{21}:	Extracción de sangre a los 21 días tras la vacunación, coincidiendo con el tiempo de revacunación
	T_{35}:	Extracción de sangre a los 35 días tras la vacunación y 14 días tras la revacunación
	T_{43}:	Extracción de sangre a los 43 días tras la vacunación y 22 días tras la revacunación

La Tabla 4 presenta los resultados de los títulos de inhibición de la hemaglutinación a diferentes tiempos.

TABLA 4 Títulos por HAI de sueros de conejo correspondientes al ensayo de eficacia (vacunación oral) de la vacuna recombinante contra la enfermedad causada por el RHDV

4

Puede observarse que a los 21 días tras la vacunación, tres de los cinco animales vacunados con la vacuna inactivada (ref. nº 401, 413 y 411) presentaron una respuesta serológica positiva. De los animales vacunados con la vacuna no inactivada, sólo uno (nº 415) experimentó seroconversión.

B. Reacción general

No se observaron reacciones significativas de tipo local o general en los conejos durante el período de vacunación.

Los resultados obtenidos en la Tabla 4 permiten afirmar que la vacuna que comprende la proteína VP60 recombinante RHDV induce seroconversión en conejos, aunque con una potencia inferior a la de la vacuna administrada por vía subcutánea.

- Eficacia de la vacuna

A los 35 días tras la vacunación, todo los conejos fueron infectados por vía intranasal con una dosis de 3,6x10^{4} DL_{50} (dosis letal del 50%) del RHDV. La prueba de provocación se realizó en establos de seguridad.

Desde el momento de la infección hasta 8 d.p.i. se evaluaron los siguientes parámetros:

A. Presencia o ausencia de signos clínicos característicos de la enfermedad, así como el nivel de protección aportado por la vacuna

De un total de 15 conejos infectados, 5 habían sido vacunados con el antígeno recombinante (VP60r) inactivado, 5 con el antígeno recombinante no inactivado, y los restantes 5 eran placebos (Tabla 4). De los animales testigo, el 100% había muerto al octavo día posterior a infección, manifestando signos típicos de la enfermedad hemorrágica del conejo. De los animales vacunados con el antígeno no inactivado, 3 de 4 murieron. De los 5 animales vacunados con la vacuna inactivada, 1 murió.

B. Presencia o ausencia de virus en los animales tras la prueba de provocación

Se obtuvieron muestras de hígados de animales que había muerto antes del octavo día posterior a la infección, así como de animales sacrificados en el 8º día posterior a la infección, siguiendo el procedimiento mencionado en el Ejemplo 1, con el objeto de detectar y cuantificar la presencia del RHDV. Como puede apreciarse en la Tabla 4, las concentraciones del RHDV en los hígados de animales sacrificados fueron prácticamente nulas (correspondientes a animales vacunados), mientras que en los hígados de los animales muertos antes del 8 d.p.i. se detectaron elevadas concentraciones del RHDV. Por consiguiente, estas vacunas, como las vacunas IM y SC (Ejemplos 9 y 10), no sólo previenen los signos clínicos, sino que, además, impiden la replicación del RHDV en el órgano analizado (hígado).

Los resultados obtenidos permiten afirmar que la vacuna recombinante que contiene la proteína VP60 recombinante inactivada es inmunogénica y confiere protección contra la enfermedad hemorrágica del conejo tras la vacunación por vía oral.

Depósito de microorganismos

El baculovirus recombinante denominado AcNPV RHDV-710 fue depositado en la Colección Europea de Cultivos de Células Animales (ECACC), Porton Down, Salisbury, Whiltshire SP4 OJG, Reino Unido, el 18 de mayo de 1994, con el número de acceso V94051819.

La intención es evitar que el alcance de la presente invención se limite al baculovirus recombinante depositado, ya que el depósito efectuado sólo pretende servir como ejemplo ilustrativo de un baculovirus recombinante adecuado para la realización de la presente invención.

Claims (24)

1. Cápside vacía que comprende la proteína VP60 recombinante del virus de la enfermedad hemorrágica del conejo (RHDV).

2. Cápside según la reivindicación 1, que comprende la proteína VP60 recombinante del RHDV expresada en células de insecto permisivas infectadas con un baculovirus recombinante que tiene la secuencia de ADN que codifica la proteína VP60 del RHDV.

3. Cápside según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, siendo dicha cápside antigénicamente e inmunogénicamente análoga al RHDV.

4. Cápside según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha proteína VP60 recombinante del RHDV comprende una proteína VP60 modificada del RHDV, comprendiendo dicha proteína VP60 modificada del RHDV la proteína VP60 nativa del RHDV en la que:

(i) los residuos aminoácidos en los sitios +2 y +3 de la secuencia aminoácida de la proteína VP60 nativa del RHDV, como se muestra la Figura 2, han sido sustituidos por otros dos residuos aminoácidos, y

(ii) una secuencia aminoácida adicional, que tiene hasta cinco residuos aminoácidos, está situada en el extremo aminoterminal de la proteína VP60 recombinante, y dicha secuencia aminoácida adicional no está presente en la proteína VP60 nativa.

5. Cápside según la reivindicación 4, en la que dicha secuencia aminoácida adicional situada en el extremo aminoterminal de la proteína VP60 recombinante tiene la siguiente secuencia:

Ala-Cys-Ile-Asp-Arg

6. Proteína VP60 recombinante del virus de la enfermedad hemorrágica del conejo (RHDV), comprendiendo dicha proteína VP60 recombinante del RHDV una proteína VP60 modificada del RHDV que comprende la proteína VP60 nativa del RHDV en la que:

(i) los residuos aminoácidos en los sitios +2 y +3 de la secuencia aminoácida de la proteína VP60 nativa del RHDV, como se muestra la Figura 2, han sido sustituidos por otros dos residuos aminoácidos, y

(ii) una secuencia aminoácida adicional que tiene hasta cinco residuos aminoácidos está situada en el extremo aminoterminal de la proteína VP60 recombinante, y dicha secuencia aminoácida adicional no está presente en la proteína VP60 nativa.

7. Proteína VP60 recombinante según la reivindicación 6, en la que dicha secuencia aminoácida adicional situada en el extremo aminoterminal de la proteína VP60 recombinante tiene la siguiente secuencia:

Ala-Cys-Ile-Asp-Arg

8. Proteína VP60 recombinante según la reivindicación 6, en la que dicha proteína VP60 recombinante es antigénicamente e inmunogénicamente análoga a la proteína VP60 nativa del RHDV.

9. Vacuna adecuada para la vacunación y protección de conejos contra la enfermedad hemorrágica del conejo (RHD), que comprende:

(i) una cantidad inmunológicamente adecuada de un antígeno que comprende:

i.a) una cápside según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5; o

i.b) una proteína VP60 recombinante del RHDV, según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8; y

(ii) un excipiente o adyuvante adecuado.

10. Vacuna según la reivindicación 9, en la que dicho adyuvante es un adyuvante oleaginoso con base de aceites minerales, glicéridos y derivados de éteres-ácidos grasos.

11. Vacuna según la reivindicación 9, en forma de emulsión W/O o O/W, o en forma de emulsión doble W/O/W.

12. Vacuna según la reivindicación 9, en la que dicho adyuvante es un adyuvante sintético.

13. Vacuna según la reivindicación 9, en la que dicho adyuvante es un adyuvante acuoso seleccionado de entre el grupo constituido por hidróxido de aluminio, una suspensión de geles de alúmina, Quil A, y sus mezclas.

14. Vacuna según la reivindicación 9, en la que dicho adyuvante se selecciona de entre el grupo formado por MDP (muramil-dipéptido), ISCOM (complejo inmunoestimulante) o liposomas.

15. Vacuna según la reivindicación 9, adecuada para la administración por vía intramuscular, subcutánea, intradérmica u oral.

16. Vacuna según la reivindicación 9, en la que el antígeno se presenta en forma de solución o suspensión con un adyuvante o diluyente.

17. Vacuna según la reivindicación 9, estando dicha vacuna en forma liofilizada susceptible de ser reconstituida con un diluyente, adyuvante u otra vacuna de conejo acuosa u oleaginosa.

18. Vacuna según la reivindicación 9, para la protección de conejos salvajes, conejos de granja y conejos de compañía contra el RHDV.

19. Vacuna bivalente o multivalente capaz de prevenir la enfermedad hemorrágica del conejo (RHD) en conejos y otra infección o infecciones de conejos, que comprende:

i) una cantidad inmunológicamente adecuada de un antígeno que comprende:

i.a) una cápside según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o

i.b) una proteína VP60 recombinante del RHDV, según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8;

ii) uno o más antígenos adicionales, estando relacionados dichos antígenos con patógenos de conejo; y

iii) un excipiente o adyuvante adecuado.

20. Vacuna según la reivindicación 19, en la que dichos patógenos se seleccionan de entre el grupo formado por el virus de la mixomatosis, virus de fibroma de Shope, Bordetella bronchiseptica, Pasteurella spp., Clostridium spp., Salmonella spp., Staphylococcus spp. y Haemophilus spp.

21. Utilización de una cápside según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o una proteína VP60 recombinante del RHDV según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en la fabricación de una vacuna para proteger a conejos contra la infección causada por el RHDV.

22. Procedimiento de detección de la presencia de anticuerpos que reconocen específicamente el virus de la enfermedad hemorrágica de los conejos (RHDV) en una muestra biológica procedente de un conejo, que comprende poner en contacto dicha muestra biológica con cápsides vacías según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o con proteínas VP60 recombinantes del RHDV según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, y detectar la formación de un complejo antígeno anticuerpo.

23. Kit de diagnóstico para la detección de la presencia de anticuerpos que reconocen específicamente el virus de la enfermedad hemorrágica de los conejos (RHDV) en una muestra biológica procedente de un conejo, que comprende una cápside vacía según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o una proteína VP60 recombinante del RHDV según cualquiera las reivindicaciones 6 a 8, y medios adecuados de detección.

24. Baculovirus recombinante denominado AcNPV RHDV-710, depositado en la ECACC con el número de acceso V94051819.