WO1997020036A1 - Adenovirus recombinantes que expresan antigenos del virus de la gastroenteritis porcina transmisible (vgpt) y su empleo en la formulacion de vacunas - Google Patents

Adenovirus recombinantes que expresan antigenos del virus de la gastroenteritis porcina transmisible (vgpt) y su empleo en la formulacion de vacunas Download PDF

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vgpt
protein
sequence
gene
recombinant
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Luis Enjuanes
Juan María TORRES
Carlos Miguel Sanchez
Cristian Smerdou
Carles Sune
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Cyanamid Iberica, S.A.
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    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • This invention relates to recombinant adenoviruses that contain in their genome the S gene sequence of the transmissible swine gastroenteritis virus (VGPT) or sequences derived from said gene.
  • the invention also relates to recombinant vaccines capable of effectively protecting against infection caused by the VGPT comprising at least one of said recombinant adenoviruses.
  • the transmissible swine gastroenteritis virus belongs to the family Coronaviridae. This virus infects the respiratory and enteric tissues of pigs, causing a serious disease in the intestinal tract.
  • Transmissible porcine gastroenteritis was first described in the United States in 1935 [Smith, H.C., Vet. Med. 51, 425 (1956)]. Imported pigs collaborated in the dissemination of the virus throughout all European countries. Since then, GPT has been detected in all continents. This disease produces a severe economic loss, causing 100% mortality in piglets of less than 14 days. In young pigs, between 2 and 8 weeks, mortality is not as high although problems related to the stunted growth of infected animals produce significant losses.
  • the VGPT has four structural proteins: the S or spike protein, the N or nucleoprotein protein, the M protein or membrane protein, and the sM protein or second membrane protein. Induction of neutralizing antibodies is mainly caused by VGPT S glycoprotein medium [Garwes, DJ et al., Vet. Microbiol 3, 179 (1978)].
  • Four antigenic sites, called C, B, D and A, have been defined in the S protein from the amino to the carboxyl end, all of them located in the globular zone of the protein [Correa et al., J. Gen. Virol. 71, 271 (1990); Gebauer et al., Virology 183, 225 (1991)].
  • Sites A, D and B are responsible for the induction of neutralizing antibodies [Delmas, B. et al., J. Gen. Virol. 67, 1405 (1986); Jiménez, G. et al., J. Virol. 60, 131 (1986); Su ⁇ é, C., et al., Virology 177, 559 (1990)]. Additionally, site A is apparently involved in induction of in vivo protection [de Diego, M. et al., J. Virol. 66, 6502 (1992)], although the exact role played by different antigenic sites in inducing resistance against VGPT is unknown [EnJuanes, L. and Van der Zeijst, BAM, 1995, in (SG Siddel ed.) " Coronavirus ", imminent publication].
  • VGPT The main economic losses caused by the VGPT are due to the high mortality rate of the piglets in the first days of life, since these animals have not yet developed a fully functional immune system that effectively protects them against VGPT infection. which makes passive protection necessary via breast milk.
  • the numerous attempts made to obtain a VGPT vaccine have not produced effective protection against VGPT in piglets.
  • VGPT vaccines against VGPT Although its efficacy is questionable.
  • Most of these vaccines have been obtained through serial passes on cell cultures, in order to lose their pathogenicity, although it has been shown that they also lose their immunogenicity. The balance would be in finding out the right number of passes, which is not easy.
  • this invention provides recombinant vaccines that do not require the management of the complete virus, but only a part thereof, with which the risk of a possible accidental release of the virus or that it reverses its virulence disappears, which is a considerable advantage against existing attenuated vaccines.
  • Adenoviruses form a viral group that comprises more than 100 different serotypes, which are characterized by the production of enteric and respiratory infections in a wide variety of animal species, including man.
  • adenoviruses have been classified into six sub-genera (A-F), of which sub-genus C, which comprises adenoviruses 2 and 5, has been widely characterized.
  • A-F sub-genera
  • adenoviruses have been frequently used as heterologous protein expression vectors in mammalian cells and, recently, their possible use as recombinant oral vaccines has been proposed.
  • adenoviruses have been studied as a model for the replication, transcription and processing of messenger RNA, providing an extensive source of knowledge about its biology. This fact, together with the ease with which its genome (double band DNA) can be manipulated by simple recombinant techniques and the high yield obtained in the production of in vitro virus, have motivated the study of this type of vaccines.
  • Adenoviruses 4 and 7 have been used in the United States as vaccines against acute respiratory infections, although their administration has been limited to personnel military. This type of vaccine has proven to be highly safe and efficient, reducing the incidence of acute respiratory infections related to adenoviruses by about 80%.
  • Ad5 adenovirus 5
  • Ad5 adenovirus 5
  • HSV heterologous simplex virus
  • VSV vesicular stomatitis virus
  • rabies virus adenovirus 5 carrying sequences of heterologous simplex virus (HSV), vesicular stomatitis virus (VSV) or rabies virus
  • HSV heterologous simplex virus
  • VSV vesicular stomatitis virus
  • rabies virus rabies virus
  • adenovirus virion has the capacity to enclose within the capsid up to 105% of the length of the genomic DNA of the parental virus, which allows inserting inserts of up to 2 kilobases (kb) in the case of Ad5 , without the need for compensatory deletions (the total size of the Ad5 genome is 36 kb) [Bett, AJ et al., J. Virol. 67, 5911 (1993)].
  • E3 early region 3
  • Vectors containing deletions of 1.88 kb (pFG144K3) and 2.69 kb (pAB14) have been generated in the E3 region, which allowed cloning heterologous genes of up to 3.9 and 4.7 kb, respectively [Bett, A.J. et al., J. Virol. 67, 5911 (1993)].
  • the present invention provides recombinant adenoviruses that express VGPT antigens that can be used in vaccine formulation against VGPT.
  • recombinant adenoviruses that contain the total or partial sequence of the gene encoding the S protein (S gene) of the VGPT genome.
  • a first object of this invention is recombinant adenoviruses that contain in their genome the VGPT S gene sequence or sequences derived from said gene. Preferably, said sequences contain at least one of the antigenic sites of said S protein.
  • Recombinant VGPT proteins expressed by said recombinant adenoviruses are also a further object of this invention.
  • Another object of this invention is recombinant vaccines capable of effectively protecting against infection caused by VGPT that comprise an effective amount of at least one of the aforementioned recombinant adenoviruses together with a pharmaceutically acceptable excipient.
  • Said VGPT vaccine is capable of protecting piglets by inducing lactogenic immunity.
  • Other additional objects of this invention are a method for immunizing pigs against VGPT which comprises the administration of at least one of the aforementioned recombinant adenoviruses, as well as a method for the protection of piglets against VGPT and the disease caused by said virus. , which comprises the administration of at least one of the aforementioned recombinant adenoviruses to sows before or during the gestation period.
  • FIGURES Figure 1 shows the plasmids used in the construction of the Ad-TS recombinant adenoviruses provided by this invention.
  • “um” means the map units on the Ad5 map;
  • the ⁇ and E3 ⁇ refer to the deletion in the corresponding genes (El and E3); and
  • ⁇ indicates a deletion whose size is indicated by the number that is written next to it.
  • Figure 2 shows the strategy followed for cloning the VGPT S gene in Ad5.
  • “An” indicates the polyadenylation signals; “E.R.”; restriction endonuclease; “Pr”, promoter; “TS”, referring to sequences derived from the S gene of the VGPT; “um”, map units on the Ad5 map; AE3, a deletion in the E3 gene.
  • Figure 3 is a representation of the VGPT S gene fragments cloned in Ad5.
  • the numbers written inside the bars indicate the nucleotides of the 5 'and 3' ends of the S gene fragments cloned in Ad5; "An”, “Pr” and “TS” have the same meaning as in Figure 2.
  • Figure 4 shows the results of the induction of antibodies against VGPT in hamsters inoculated with the Ad-TS recombinants.
  • the title in RIA was defined as the inverse of the decimal logarithm of the greatest dilution that gives a union three times greater than the negative control.
  • the neutralization index was defined as the ratio between the number of plaque forming units (pfu) in the presence of preimmune serum and the number of pfu in the presence of immune serum.
  • the arrows indicate the days in which the animals were inoculated.
  • Figure 5 shows the results of the induction of antibodies against VGPT in the serum and in the milk of hamsters immunized with the Ad-TS recombinants during lactation.
  • the title in RIA and the neutralization index were defined as in Figure 4.
  • Figure 6 shows the results of the induction of antibodies against VGPT in pigs inoculated with the Ad-TS recombinants.
  • the RIA titer and neutralization index were defined as in Figure 4.
  • the arrows indicate the days in which the animals were inoculated.
  • Figure 7 shows the results of in vivo protection against VGPT with pig antisera induced with the Ad-TS recombinants.
  • Ad-TS recombinants containing at least one of the antigenic sites (A, B, C, D) of the VGPT S protein, preferably 2, more preferably 3, and even more preferably, the 4 defined antigenic sites, is shown in Figures 1 to 3 and is explained in detail in Example 1 where it is described to obtain four recombinant Ad5-VGPT containing the sequences of the VGPT S gene from nucleotide -8 (considering A of the ATG initiation codon as nucleotide 1) to 1135 (Ad-TS-8), 1587 (Ad-TS-5), 3329 (Ad-TS -9) and 4470 (Ad-TS-06) ( Figure 3).
  • the expression products of said recombinant adenoviruses, or recombinant VGPT proteins comprise the total or partial sequence of the VGPT S protein, and can have at least one of the antigenic sites of the VGPT S protein, preferably 2, more preferably 3, and even more preferably, the 4 defined antigenic sites of the defined S protein.
  • the expression of these recombinant proteins can be confirmed in 293 cells [ATCC CRL 1573] or in pig testis (ST) cells. These recombinant VGPT proteins are recognized by the monoclonal antibodies directed against the antigenic sites they contain.
  • Ad-TS recombinants The ability of Ad-TS recombinants to induce an immune response in pigs is described in Example 4.
  • 4-week pigs were immunized with the obtained Ad-TS recombinants.
  • the titer of anti-VGPT antibodies in the serum samples of the immunized animals was determined by a RIA, as well as by the ability to neutralize the infectivity of the VGPT in vitro.
  • Figure 6 show that after the third immunization, all Ad-TS recombinants had induced antisera with RIA titers greater than 10,000 and with neutralization ratios between 1 and 6.
  • Example 6 An example is described in Example 6 to test the tropism of Ad5-based recombinants that revealed that said recombinants are ideal vectors for inducing lactogenic immunity in pigs because their tropism facilitates the presentation of recombinant antigens in lymphoepithelial tissues associated with gastrointestinal tract (GALT) or with the respiratory tract (BALT).
  • GALT gastrointestinal tract
  • BALT respiratory tract
  • the new recombinant vaccines capable of protecting effectively to pigs from the infection caused by the VGPT comprise, as an antigen, at least one recombinant adenovirus containing the VGPT S gene sequence or a sequence derived therefrom, together with, optionally, a pharmaceutically acceptable excipient.
  • these vaccines may contain an amount of antigen capable of introducing into the animal to immunize a recombinant adenovirus titer of at least 10 9 pfu, preferably between 10 9 and 10 10 pfu.
  • a diluent such as physiological saline or physiological saline with 10% glycerol or other similar saline solutions
  • these vaccines may also contain an adjuvant of those commonly used in the formulation of vaccines, both aqueous, such as aluminum hydroxide, suspensions of alumina gels and the like, oily, based on mineral oils, glycerides and acid derivatives fatty.
  • recombinant vaccines can be prepared by suspending the recombinant adenoviruses in the pharmaceutically acceptable excipient. If said adenoviruses were in lyophilized form, they could be resuspended in said excipient.
  • this invention provides multivalent vaccines capable of preventing disease caused by VGPT and other infections.
  • These vaccines comprise, in addition to a recombinant adenovirus that contains the VGPT S gene sequence or a sequence derived therefrom, an antigen capable of inducing protection against a virus or other pathogen of pigs, and a pharmaceutically acceptable excipient.
  • Said viruses or pathogens are preferably selected from those that enter the animal via mucous membranes or replicate in them, for example, rotavirus, the porcine epidemic diarrhea virus (VDEP or PEDV), the virus causing respiratory syndrome and Reproductive pig (PRRS), Clostridium sp.
  • the recombinant vaccine provided by this invention can be used in combination with other conventional vaccines, either as part thereof or as a diluent or lyophilized fraction to be diluted with other conventional or recombinant vaccines.
  • the vaccines provided by this invention can be administered to the animal orally, nasally or intraperitoneally, preferably, by oronasal route.
  • the recombinant adenovirus can be presented either in the form of a solution or suspension with a suitable excipient or in lyophilized form, the final product being reconstituted in this case with a diluent, adjuvant or any other type of aqueous or oily vaccine that is applied to the animal.
  • the invention provides a method for the immunization of pigs against VGPT which consists of oral, nasal or intraperitoneal administration, or combined forms of these pathways, to said pigs, either of a recombinant adenovirus which contains in its genome the gene sequence VGPT S or a sequence derived from said gene or from a VGPT vaccine that includes an immunologically effective amount of a recombinant adenovirus containing in its genome the VGPT S gene sequence or a sequence derived from said gene and a pharmaceutically excipient acceptable.
  • the invention provides a method for protecting piglets against VGPT and the disease caused by said virus, which consists of oral, nasal or intra-peritoneal administration, or combined forms of these pathways, to sows before or during the gestation period.
  • a recombinant adenovirus that contains in its genome the sequence of the VGPT S gene or a sequence derived from said gene
  • a vaccine against VGPT that includes an immunologically effective amount of a recombinant adenovirus that contains in its genome the sequence of the VGPT S gene or a sequence derived from said gene and a pharmaceutically acceptable excipient.
  • Ad-TS recombinants The system used for cloning heterologous genes in adenovirus is based on the use of two plasmids containing, respectively, the left and right halves of the Ad5 genome.
  • the heterologous gene or genes to be cloned in the adenovirus are normally introduced into the plasmid that carries the genomic part on the right, where the E3 deletion is found.
  • both plasmids are co-transfected into eukaryotic cells, they can be recombined, giving rise to the complete genome of an infectious adenovirus that carries the heterologous gene or genes.
  • Plasmid pFG144K3, which is 14.72 kb, is derived from pFG144 [Ghosh- Choudhury, G., et al., Gene 50, 161 (1986)].
  • Said plasmid pFG144K3 contains the sequences on the left side of the Ad5 genome, which includes map units (um) from 0 to 16.1, with a deletion in the El region of 3.47 kb (map units 1 to 10, 6), and the sequences on the right side of the genome, which cover map units 70 to 100, with a deletion in the E3 region of 1.88 kb (map units 79.6 to 84.8).
  • This last deletion leaves a single Xba I site, which is used for the cloning of heterologous genes.
  • Plasmid pAB14 also contains sequences from the left side of the Ad5 genome but, unlike pFG144K3, the deletion in the E3 region is 2.69 kb (map units 78.3 to 85.8).
  • Plasmid pFG173 contains the left functional half of Ad5. This plasmid has a deletion in the 3.2 kb L4-E3 region, located exactly between map units 75.9 and 84.9 of the Ad5 genome, which eliminates plasmid infectivity and, by itself, is not capable of generating infective adenoviruses.
  • the S gene sequences were flanked by the SV40 promoter (Pr) and by polyadenylation sequences (An), as shown in Figure 3.
  • the S gene fragments were first subcloned into pSV2X3 or pSV2X4 plasmids [Prevec, L., et al., J. Inf. Dis. 161, 227 (1990)] and subsequently the flanking sequences of the SV40 promoter and polyadenylation were removed using the restriction enzymes collected in the Table 1
  • Ad5-VGPT recombinants were obtained containing the VGPT S gene sequences from nucleotide -8 (considering A of the ATG initiation codon as nucleotide 1) to 1135 (Ad-TS-8), 1587 (Ad-TS-5), 3329 (Ad-TS-9) and 4470 (Ad-TS-06). These recombinants encode fragments of 378, 529, 1109 and 1490 amino acids (see Figure 3).
  • Protein extracts from cells from cells infected with the Ad-TS recombinants were separated by polyacrylamide gel electrophoresis, and immediately transferred to a nitrocellulose paper.
  • Protein S antigens were detected with mouse monoclonal antibodies specific for the different antigenic sites (A, B, C, D) of protein S, a second rabbit anti-mouse Ig antibody and i2S I-protein A. The method used was that described by Correa et al., [J. Gen. Virol. 71, 271 (1990)].
  • the titer of anti-VGPT antibodies was determined by a radioimmunoassay (RIA) [following the method previously described by Jiménez, G. et al., J. Virol. 60, 131 (1986)], as well as the ability to neutralize the infectivity of VGPT in vitro [according to the method described by Correa, I., et al., Virus Res. 10, 77 (1988)].
  • RIA radioimmunoassay
  • the RIA titer is defined as the inverse of the highest dilution of serum having a higher value than that of a negative control serum; while the neutralization ratio (IN) is defined as the decimal logarithm (log 10 ) of the quotient between pfu after incubation in the absence and in the presence of the indicated serum.
  • RIA titers and neutralization ratios of the antisera induced by the four Ad-TS recombinants are represented based on the period of time elapsed since the first immunization ( Figure 4). As can be seen, after the Second immunization all recombinants had induced antisera with RIA titres greater than 3,000 and with neutralization ratios between 1 and 2.5.
  • Control animals were treated similarly, but using a serum induced by Ad5 devoid of insert.
  • the titer of the virus in the jejunum-ileum, rasenteric ganglia, lung, and mediastinal ganglia extracts was determined on days 1 and 2 post infection and on the day of death (animals that did not die were sacrificed on day 5 post infection).
  • the samples of said tissues were homogenized in cold saline serum (1: 1, v: v) with an OMNI 2000 homogenizer (Omni International) and the infective virus titer was determined by plating. in 293 cells [Bett et al., J. Virol. 67, 5911 (1993)].
  • Lactogenic immunity is especially efficient when antigen presentation is performed in specialized lymphoepithelial tissues associated with the gastrointestinal tract (GALT) or respiratory tract (BALT).
  • GALT gastrointestinal tract
  • BALT respiratory tract
  • One of the fundamental objectives of this invention is to induce a lactogenic immune response against VGPT using recombinant Ad-TS. Therefore, the efficacy of this invention depends on the ability of these recombinants to infect and express VGPT antigens in the aforementioned tissues (GALT and / or BALT).
  • Ad-luc E3 region of the luciferase gene
  • This recombinant was constructed using the same system as for obtaining Ad-TS recombinants, as mentioned in this description.
  • the product of the heterologous gene cloned in this recombinant (luciferase) is easily detectable by means of a simple and sensitive enzymatic reaction, in the presence of its substrate, luciferin. All this makes the recombinant a useful tool, not only for the determination of the tissues it infects but also to estimate the levels of antigen expressed in each of the tissues.
  • tissues were homogenized as previously mentioned, in cold saline (1: 1, v: v) with an OMNI 2000 homogenizer (Omni International) and determined the titer of the infective virus by plating in 293 cells; Luciferase activity was determined following the previously described method [Mittal, SK, et al., Virus Res. 28, 67 (1993)].
  • samples were collected to study tropism at tissue and cell level using immunohistochemical techniques using a monoclonal antibody that recognizes an Ad5 protein, specifically, the H2-19 monoclonal antibody that specifically recognizes a 72 kDa protein from adenovirus [Branton et al., Cell Biol. 63, 941 (1985)].
  • This tropism facilitates the presentation of recombinant antigens in lymphoepithelial tissues associated with the gastrointestinal tract (GALT) or with the respiratory tract (BALT) by converting recombinants based on Ad5 into Ideal vectors for the induction of lactogenic immunity in pigs.
  • Ad-TS Ad-TS
  • 4-week-old pigs were inoculated with different doses (lxlO ⁇ -lxiO 10 pfu / animal) of the Ad-TS recombinants, simultaneously by oronasal and intraperitoneal route, allowing the infection to progress for several days (1 - 10). After this time, the animals were sacrificed and samples of different tissues were collected for histopathological study.
  • the recombinant Ad-TS-9 is the one that can be used, preferably, in the formulation of the vaccine object of this invention. This recombinant provides protection levels similar to those of the recombinant Ad-TS-06, but is more stable and replicates better in vitro since it has a smaller insert.
  • VGPT vaccine in lyophilized form 293 cells are infected when they are at 80% confluence with a recombinant adenovirus containing the VGPT S gene sequence [Ad-TS-9], in an MOI (multiplicity order infectivity, reason multiplicity of infectivity) of 1.
  • MOI multiplicity order infectivity, reason multiplicity of infectivity
  • 80-90% of the cells are rounded and refractory.
  • the cell culture is collected and the supernatant is subjected to two cycles of freezing and thawing and centrifuged at 2,000g for 10 minutes in order to eliminate cell detritus.
  • the supernatant is mixed with a lyophilization medium and the product is lyophilized so that by vaccine dose there is between 10 9 and 10 10 pfu / animal.
  • Ad-TS-9 adenoviruses obtained, specifically the so-called Ad-TS-9, has been deposited in the European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), in Portón Down, Salisbury, Whiltshire SP4 OJG (United Kingdom), on November 29, 1995, corresponding access number V95112928.

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Abstract

Los adenovirus recombinantes contienen en su genoma la secuencia del gen S del virus de la gastroenteritis porcina transmisible (VGPT) o una secuencia derivada de dicho gen que contiene, al menos, uno de los sitios antigénicos de la proteina S del VGPT. Estos adenovirus recombinantes pueden utilizarse en la formulacíon de vacunas para proteger al ganado porcino de la infección por VGPT y contra la enfermedad causada por dicho virus. Esta invención tiene interés en Veterinaria.

Description

ADENOVIRUS RECOMBINANTES QUE EXPRESAN ANTIGENOS DEL VIRUS DE LA GASTROENTERITIS PORCINA TRANSMISIBLE (VGPT) Y SU EMPLEO EN LA FORMULACIÓN DE VACUNAS
CAMPO DE LA INVENCIÓN
Esta invención se refiere a unos adenovirus recombinantes que contienen en su genoma la secuencia del gen S del virus de la gastroenteritis porcina transmisible (VGPT) o secuencias derivadas de dicho gen. La invención también se refiere a unas vacunas recombinantes capaces de proteger eficazmente de la infección causada por el VGPT que comprenden, al menos, uno de dichos adenovirus recombinantes.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El virus de la gastroenteritis porcina transmisible (VGPT) pertenece a la familia Coronaviridae . Este virus infecta a los tejidos respiratorios y entéricos de los cerdos, produciendo una grave enfermedad en el tracto intestinal. La gastroenteritis porcina transmisible (GPT) se describió en primer lugar en los Estados Unidos en 1935 [Smith, H.C., Vet. Med. 51, 425 (1956)]. Los cerdos importados colaboraron en la diseminación del virus a lo largo de todos los países europeos. Desde entonces, se ha detectado la GPT en todos los continentes. Esta enfermedad produce una severa pérdida económica, provocando un 100% de mortalidad en los lechones de menos de 14 días. En los cerdos jóvenes, de entre 2 y 8 semanas, la mortalidad no es tan alta aunque problemas relacionados con el retraso en el crecimiento de los animales infectados producen unas pérdidas importantes.
El VGPT tiene cuatro proteínas estructurales: la proteína S o formadora de espigas, la proteína N o nucleoproteína, la proteína M o proteína de membrana, y la proteína sM o segunda proteína de membrana. La inducción de anticuerpos neutralizantes se produce principalmente por medio de la glicoproteína S del VGPT [Garwes, D.J. et al., Vet. Microbiol. 3, 179 (1978)]. Se han definido cuatro sitios antigénicos, denominados C, B, D y A, en la proteína S desde el extremo amino al carboxilo, todos ellos localizados en la zona globular de la proteína [Correa et al., J. Gen. Virol. 71, 271 (1990); Gebauer et al., Virology 183, 225 (1991)]. Los sitios A, D y B son los responsables de la inducción de anticuerpos neutralizantes [Delmas, B. et al., J. Gen. Virol. 67, 1405 (1986); Jiménez, G. et al., J. Virol. 60, 131 (1986); Suñé, C. , et al., Virology 177, 559 (1990)]. Adicionalmente, el sitio A está, aparentemente, implicado en la inducción de protección in vivo [de Diego, M. et al., J. Virol. 66, 6502 (1992)], aunque se desconoce el papel exacto que desempeñan los diferentes sitios antigénicos en la inducción de resistencia frente al VGPT [EnJuanes, L. and Van der Zeijst, B.A.M. , 1995, en (S.G. Siddel ed.) "Coronavirus", publicación inminente].
Las principales pérdidas económicas producidas por el VGPT se deben a la elevada tasa de mortalidad de los lechones en los primeros días de vida, ya que estos animales todavía no han desarrollado un sistema inmune completamente funcional que les proteja eficazmente contra la infección por VGPT, lo que hace necesaria la protección pasiva vía la leche materna. Hasta la fecha, los numerosos intentos realizados para obtener una vacuna contra el VGPT no han producido una protección eficaz contra el VGPT en los lechones. Existen vacunas atenuadas contra el VGPT aunque su eficacia es cuestionable. La mayoría de dichas vacunas se ha obtenido mediante pases seriados sobre cultivos celulares, al objeto de que pierdan su patogenicidad, aunque con ello se ha puesto de manifiesto que también pierden su inmunogenicidad. El equilibrio estaría en averiguar el número de pases adecuado, lo cual no es fácil. Por otra parte, el empleo de vacunas atenuadas no es recomendable ya que dichas vacunas pueden ayudar a diseminar la enfermedad correspondiente puesto que, mediante los sucesivos pases, algunas cepas pueden revertir a la virulencia. Por tanto, para solucionar el problema existente relativo a la falta de unas vacunas eficaces y adecuadas contra el VGPT, esta invención proporciona unas vacunas recombinantes que no requieren el manejo del virus completo, sino sólo una parte del mismo, con lo que el riesgo de una posible liberación accidental del virus o de que revierta su virulencia desaparece, lo que supone una ventaja considerable contra las vacunas atenuadas existentes. Los adenovirus forman un grupo viral que comprende más de 100 serotipos diferentes, que se caracterizan por la producción de infecciones entéricas y respiratorias en una gran variedad de especies animales, incluyendo el hombre. Los adenovirus humanos se han clasificado en seis sub-géneros (A- F) , de los cuales el sub-género C, que comprende los adenovirus 2 y 5, ha sido ampliamente caracterizado. En los últimos años, los adenovirus se han utilizado frecuentemente como vectores de expresión de proteínas heterólogas en células de mamíferos y, recientemente, se ha propuesto su posible empleo como vacunas recombinantes por vía oral. Entre las razones que han conducido al estudio de los adenovirus como vacunas potenciales para la inducción de inmunidad secretoria están su tropismo entérico o respiratorio y la posibilidad de utilizarlos para expresar genes heterólogos con elevada eficacia. Estos virus se han estudiado como modelo para la replicación, transcripción y procesamiento del ARN mensajero, proporcionando una extensa fuente de conocimiento sobre su biología. Este hecho, junto con la facilidad con la que se puede manipular su genoma (ADN de doble banda) mediante técnicas recombinantes sencillas y al elevado rendimiento obtenido en la producción de virus in vitro , han motivado el estudio de este tipo de vacunas.
Los adenovirus 4 y 7 se han utilizado en los Estados Unidos como vacunas frente a infecciones respiratorias agudas, aunque su administración se ha limitado a personal militar. Este tipo de vacunas ha demostrado ser altamente segura y eficiente, reduciendo alrededor de un 80% la incidencia de las infecciones respiratorias agudas relacionadas con los adenovirus. Asimismo, se han utilizado formas recombinantes del adenovirus 5 (Ad5) que portan secuencias de glicoproteínas heterólogas del virus del herpex simple (HSV) , del virus de la estomatitis vesicular (VSV) o del virus de la rabia para inducir anticuerpos neutralizantes en especies tan variadas como monos rhesus, ganado vacuno, perros, zorras, mofetas, mapaches, hámsters y ratones [Graham and Prevec, 1992, en (R.W. Ellis ed. ) "Vaccines: New Approaches to Immunological Problems" , págs. 363-385].
La construcción de los adenovirus recombinantes se basa en la inserción de los genes heterólogos en el genoma viral. A menudo ésto requiere la delección de regiones del genoma que no son esenciales para su infectividad. Se ha podido demostrar que el virión de los adenovirus tiene la capacidad de encerrar dentro de la cápsida hasta un 105% de la longitud del ADN genómico del virus parental, lo que permite introducir insertos de hasta 2 kilobases (kb) en el caso de Ad5, sin necesidad de realizar delecciones compensatorias (el tamaño total del genoma de Ad5 es de 36 kb) [Bett, A.J. et al., J. Virol. 67, 5911 (1993)]. Mediante la introducción de delecciones en la región temprana 3 (E3), se pueden construir vectores recombinantes con insertos mayores. Se ha podido comprobar que la región E3 no es esencial para la replicación viral en células normalmente permisivas. Se han generado vectores que contienen delecciones de 1,88 kb (pFG144K3) y 2,69 kb (pAB14) en la región E3, que permitieron clonar genes heterólogos de hasta 3,9 y 4,7 kb, respectivamente [Bett, A.J. et al., J. Virol. 67, 5911 (1993)].
Ante la falta de una protección eficaz contra el VGPT en los lechones, la presente invención proporciona unos adenovirus recombinantes que expresan antígenos del VGPT que pueden ser utilizados en la formulación de vacunas contra el VGPT. No se conocen adenovirus recombinantes que contengan la secuencia total o parcial del gen que codifica para la proteína S (gen S) del genoma del VGPT.
Por tanto, un primer objeto de esta invención lo constituyen unos adenovirus recombinantes que contienen en su genoma la secuencia del gen S del VGPT o secuencias derivadas de dicho gen. Preferentemente, dichas secuencias contienen, al menos, uno de los sitios antigénicos de dicha proteína S. Las proteínas recombinantes del VGPT expresadas por dichos adenovirus recombinantes también constituyen un objeto adicional de esta invención.
Otro objeto de esta invención lo constituyen unas vacunas recombinantes capaces de proteger eficazmente de la infección causada por el VGPT que comprenden una cantidad efectiva de, al menos, uno de los adenovirus recombinantes arriba mencionados junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable. Dicha vacuna contra el VGPT es capaz de proteger a los lechones mediante la inducción de una inmunidad lactogénica. Otros objetos adicionales de esta invención lo constituyen un método para inmunizar cerdos contra VGPT que comprende la administración de, al menos, uno de los adenovirus recombinantes antes citados, así como un método para la protección de lechones contra VGPT y la enfermedad causada por dicho virus, que comprende la administración de, al menos, uno de los adenovirus recombinantes antes citados a cerdas antes de o durante el periodo de gestación.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra los plásmidos utilizados en la construcción de los adenovirus recombinantes Ad-TS proporcionados por esta invención. En esta figura, "um" significa las unidades de mapa en el mapa de Ad5; El~ y E3~ hacen referencia a la delección en los genes correspondientes (El y E3); y Δ indica una delección cuyo tamaño se indica mediante el número que se escribe a su lado.
La Figura 2 muestra la estrategia seguida para el clonaje del gen S del VGPT en Ad5. En esta figura, "An" indica las señales de poliadenilación; "E.R."; endonucleasa de restricción; "Pr", promotor; "TS", referido a secuencias derivadas del gen S del VGPT; "um", unidades de mapa en el mapa de Ad5; AE3, una delección en el gen E3.
La Figura 3 es una representación de los fragmentos del gen S del VGPT clonados en Ad5. En esta figura, los números escritos en el interior de las barras indican los nucleótidos de los extremos 5' y 3' de los fragmentos del gen S clonados en Ad5; "An", "Pr" y "TS" tienen el mismo significado que en la Figura 2.
La Figura 4 muestra los resultados de la inducción de anticuerpos contra el VGPT en hámsters inoculados con los recombinantes Ad-TS. El título en RÍA se definió como la inversa del logaritmo decimal de la mayor dilución que da una unión tres veces superior al control negativo. El índice de neutralización se definió como el cociente entre el número de unidades formadoras de placa (ufp) en presencia de suero preinmune y el número de ufp en presencia de suero inmune. Las flechas indican los días en que los animales fueron inoculados.
La Figura 5 muestra los resultados de la inducción de anticuerpos contra el VGPT en el suero y en la leche de hámsters inmunizados con los recombinantes Ad-TS durante la lactancia. El título en RÍA y el índice de neutralización se definieron como en la Figura 4.
La Figura 6 muestra los resultados de la inducción de anticuerpos contra el VGPT en cerdos inoculados con los recombinantes Ad-TS. El título en RÍA y el índice de neutralización se definieron como en la Figura 4. Las flechas indican los días en que los animales fueron inoculados.
La Figura 7 muestra los resultados de protección in vivo contra el VGPT con antisueros de cerdo inducidos con los recombinantes Ad-TS.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La construcción de los adenovirus recombinantes conteniendo secuencias derivadas del gen S del VGPT, en adelante recombinantes Ad-TS, que contienen, al menos, uno de los sitios antigénicos (A, B, C, D) de la proteína S del VGPT, preferentemente 2, más preferentemente 3, y todavía más preferentemente, los 4 sitios antigénicos definidos, se muestra en las Figuras 1 a 3 y se explica de forma detallada en el Ejemplo 1 donde se describe la obtención de cuatro recombinantes Ad5-VGPT que contienen las secuencias del gen S de VGPT desde el nucleótido -8 (considerando la A del codon de iniciación ATG como el nucleótido 1) al 1135 (Ad-TS-8), al 1587 (Ad-TS-5), al 3329 (Ad-TS-9) y al 4470 (Ad-TS-06) (Figura 3) .
Para determinar la expresión de antígenos de la proteína S del VGPT en células de cerdo en cultivo infectadas con los recombinantes Ad-TS obtenidos se efectuaron ensayos de inmunofluorescencia, inmunoprecipitación e inmunodetección en papel de nitrocelulosa después de electroforesis (Ejemplo 2). Estos ensayos permitieron caracterizar antigénicamente los productos de expresión de los recombinantes obtenidos y conocer si dichos recombinantes expresaban correctamente los sitios antigénicos contenidos en ellos. Los productos de expresión de dichos adenovirus recombinantes, o proteínas recombinantes del VGPT, comprenden la secuencia total o parcial de la proteína S del VGPT, y pueden tener, al menos, uno de los sitios antigénicos de la proteína S del VGPT, preferentemente 2, más preferentemente 3, y todavía más preferentemente, los 4 sitios antigénicos definidos de la proteína S definidos. La expresión de estas proteínas recombinantes puede confirmarse en células 293 [ATCC CRL 1573] o en células de testículo de cerdo (ST). Estas proteínas recombinantes del VGPT son reconocidas por los anticuerpos monoclonales dirigidos contra los sitios antigénicos que contienen.
A continuación se estudió la respuesta inmune sistémica inducida por los diferentes recombinantes Ad-TS obtenidos en hámsters (Ejemplo 3). Para ello se inmunizaron hámsters con dicho recombinantes Ad-TS. El título de anticuerpos anti-VGPT contenidos en las muestras de suero recogidas se determinó por un radioinmunoensayo (RÍA) así como por la capacidad para neutralizar la infectividad del VGPT in vi tro . Los resultados obtenidos (Figura 4) ponen de manifiesto que, tras la segunda inmunización todos los recombinantes habían inducido antisueros con títulos en RÍA superiores a 3.000 y con unas relaciones de neutralización de entre 1 y 2,5.
La respuesta inmune lactogénica se estudió en hembras inmunizadas con los recombinantes Ad-TS apareadas con machos que no eran inmunes. La presencia de anticuerpos específicos anti-VGPT en la leche y en el suero de las hembras amamantadoras se determinó por RÍA y por neutralización. Los resultados demostraron (Figura 5) que los recombinantes estudiados inducían anticuerpos frente al VGPT en la leche y en el suero que además neutralizaban al VGPT in vitro .
La capacidad de los recombinantes Ad-TS para inducir una respuesta inmune en cerdos se describe en el Ejemplo 4. Para ello se inmunizaron cerdos de 4 semanas con los recombinanteε Ad-TS obtenidos. El título de anticuerpos anti-VGPT en las muestras de suero de los animales inmunizados se determinó por un RÍA, así como por la capacidad para neutralizar la infectividad del VGPT in vi tro . Los resultados obtenidos (Figura 6), ponen de manifiesto que después de la tercera inmunización, todos los recombinantes Ad-TS habían inducido antisueros con títulos en RÍA superiores a 10.000 y con unas relaciones de neutralización de entre 1 y 6.
Para estudiar la capacidad protectora in vivo contra el VGPT de los antisueros inducidos en cerdos por los recombinantes Ad-TS (Ejemplo 5) , se incubaron alícuotas de una cepa de VGPT virulenta con cada uno de los antisueros inducidos por dichos recombinantes Ad-TS. La mezcla resultante se administró a unos cerdos de 2 días, altamente susceptibles al VGPT y progenie de madres seronegativas al VGPT. El título del virus en distintos tejidos se determinó los días 1 y 2 post infección y el día de su fallecimiento. Los resultados (Figura 7) muestran que los animales tratados con sueros inducidos por los recombinantes que contenían los cuatro sitios antigénicos de la proteína S estaban completamente protegidos contra la infección por VGPT.
En el Ejemplo 6 se describe un ensayo para comprobar el tropismo de recombinantes basados en Ad5 que puso de manifiesto que dichos recombinantes son vectores ideales para inducir inmunidad lactogénica en cerdos debido a que su tropismo facilita la presentación de antígenos recombinantes en tejidos linfoepiteliales asociados con el tracto gastrointestinal (GALT) o con el tracto respiratorio (BALT). Para evaluar el posible empleo de los recombinantes Ad- TS obtenidos con fines vacunales, se estudiaron los posibles efectos patológicos producidos por la infección con dichos recombinantes (Ejemplo 7). El estudio histopatológico realizado en tejidos de cerdos que habían sido infectados con dichos recombinantes puso de manifiesto que todos los animales infectados desarrollaron una patología pulmonar ligera aunque a lo largo de todo el experimento ninguno de los animales inoculados con los diferentes recorabinantes Ad- TS manifestó ningún tipo de signo clínico o pérdida de apetito. Adicionalmente, no se detectaron alteraciones patológicas significativas a nivel macroscópico o microscópico cuando se sacrificaron los animales. Estos datos confirman que los recombinantes basados en adenovirus que contienen la secuencia del gen S del VGPT o secuencias derivadas de la misma, constituyen una vacuna eficaz para la inducción de inmunidad lactogénica contra GPT. Las nuevas vacunas recombinantes capaces de proteger eficazmente al ganado porcino de la infección causada por el VGPT, proporcionadas por esta invención, comprenden, como antígeno, al menos un adenovirus recombinante que contiene la secuencia del gen S del VGPT o una secuencia derivada de la misma, junto con, opcionalmente, un excipiente aceptable farmacéuticamente.
En general, estas vacunas pueden contener una cantidad de antígeno capaz de introducir en el animal a inmunizar un título de adenovirus recombinante de, al menos, 109 ufp, preferentemente comprendido entre 109 y 1010 ufp.
Como excipiente puede utilizarse un diluyente tal como suero salino fisiológico o suero salino fisiológico con 10% de glicerol u otras soluciones salinas similares. Asimismo, estas vacunas pueden contener también un adyuvante de los habitualmente utilizados en la formulación de vacunas, tanto acuoso, tal como hidróxido de aluminio, suspensiones de geles de alúmina y similares, como oleosos, a base de aceites minerales, glicéridos y derivados de ácido graso.
Estas vacunas recombinantes pueden prepararse suspendiendo los adenovirus recombinantes en el excipiente farmacéuticamente aceptable. Si dichos adenovirus estuvieran en forma liofilizada, se podrían resuspender en dicho excipiente.
Adicionalmente, esta invención proporciona vacunas multivalentes capaces de prevenir la enfermedad provocada por el VGPT y otras infecciones. Estas vacunas comprenden, además de un adenovirus recombinante que contiene la secuencia del gen S del VGPT o una secuencia derivada de la misma, un antígeno capaz de inducir una protección contra un virus u otro agente patógeno del ganado porcino, y un excipiente aceptable farmacéuticamente. Dichos virus o agentes patógenos se seleccionan, preferentemente, entre aquéllos que entran en el animal vía mucosas o se replican en éstas, por ejemplo, rotavirus, el virus de la diarrea epidémica porcina (VDEP o PEDV) , el virus causante del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRS), Clostridium sp. , Serpul ina hydi osenteriae, Pseudorabies (agente causal de la enfermedad de Aujeszky) , Mycoplasma hyopneumoni ae, Escherichia col i , y el agente etiológico de la rinitis atrófica y de la ileitis proliferativa. Estas vacunas multivalentes pueden elaborarse insertando los genes que codifican para los antígenos correspondientes en el mismo adenovirus recombinante que contiene la secuencia del gen S del VGPT o una secuencia derivada de la misma, o bien construyendo recombinantes independientes que posteriormente se mezclarían para su co¬ inoculación.
Alternativamente, la vacuna recombinante proporcionada por esta invención se puede utilizar en combinación con otras vacunas convencionales, ya sea formando parte de las mismas o bien como diluyente o fracción liofilizada para diluirse con otras vacunas ya sean convencionales o recombinantes.
Las vacunas proporcionadas por esta invención pueden administrarse al animal por vía oral, nasal o intra- peritoneal, preferentemente, por vía oronasal. El adenovirus recombinante puede presentarse bien en forma de solución o suspensión con un excipiente adecuado o bien en forma liofilizada, reconstituyéndose en este caso el producto final con un diluyente, adyuvante o cualquier otro tipo de vacuna acuosa u oleosa que se aplique al animal. Adicionalmente, la invención proporciona un método para la inmunización de cerdos contra VGPT que consiste en la administración oral, nasal o intraperitoneal, o formas combinadas de estas vías, a dichos cerdos, bien de un adenovirus recombinante que contiene en su genoma la secuencia del gen S del VGPT o una secuencia derivada de dicho gen o bien de una vacuna contra VGPT que incluye una cantidad inmunológicamente eficaz de un adenovirus recombinante que contiene en su genoma la secuencia del gen S del VGPT o una secuencia derivada de dicho gen y un excipiente farmacéuticamente aceptable. Además, la invención proporciona un método para proteger lechones contra VGPT y la enfermedad causada por dicho virus, que consiste en la administración oral, nasal o intra- peritoneal, o formas combinadas de estas vías, a cerdas antes de o durante el periodo de gestación, bien de un adenovirus recombinante que contiene en su genoma la secuencia del gen S del VGPT o una secuencia derivada de dicho gen, o bien de una vacuna contra VGPT que incluye una cantidad inmunológicamente eficaz de un adenovirus recombinante que contiene en su genoma la secuencia del gen S del VGPT o una secuencia derivada de dicho gen y un excipiente aceptable farmacéuticamente.
EJEMPLOS Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la invención.
Ejemplo 1
Construcción de los recombinantes Ad-TS El sistema utilizado para el clonaje de los genes heterólogos en adenovirus se basa en el empleo de dos plásmidos que contienen, respectivamente, las mitades izquierda y derecha del genoma de Ad5. El gen o los genes heterólogos a clonar en el adenovirus se introducen normalmente en el plásmido que lleva la parte genómica de la derecha, en donde se encuentra la delección de E3. Cuando ambos plásmidos se co-transfectan en células eucarióticas, se pueden recombinar, dando lugar al genoma completo de un adenovirus infectivo que lleva el gen o genes heterólogos. La estructura genética de los tres plásmidos (pFG144K3, pAB14 y pFG173), clave para la construcción de los adenovirus recombinantes, ya ha sido descrita previamente [Bett, A.J. et al., J. Virol. 67, 5911 (1993); Mittal, S.K. , et al., Virus Res. 28, 67 (1993)] y se resume en la Figura 1. El plásmido pFG144K3, que tiene 14,72 kb, deriva del pFG144 [Ghosh- Choudhury, G. , et al., Gene 50, 161 (1986)]. Dicho plásmido pFG144K3 contiene las secuencias del lado izquierdo del genoma de Ad5, que incluye las unidades de mapa (um) desde 0 hasta 16,1, con una delección en la región El de 3,47 kb (unidades de mapa 1 a 10,6), y las secuencias del lado derecho del genoma, que abarcan las unidades de mapa 70 a 100, con una delección en la región E3 de 1,88 kb (unidades de mapa 79,6 a 84,8). Esta última delección deja un único sitio Xba I, que se utiliza para el clonaje de los genes heterólogos. El plásmido pAB14 también contiene secuencias del lado izquierdo del genoma de Ad5 pero, a diferencia del pFG144K3, la delección en la región E3 es de 2,69 kb (unidades de mapa 78,3 a 85,8). El plásmido pFG173 contiene la mitad izquierda funcional del Ad5. Este plásmido tiene una delección en la región L4-E3 de 3,2 kb, localizada exactamente entre las unidades de mapa 75,9 y 84,9 del genoma de Ad5, que elimina la infectividad del plásmido y, por sí mismo, no es capaz de generar adenovirus infectivos.
La estrategia seguida para producir los adenovirus recombinantes que contienen los fragmentos del gen S del VGPT se muestra en la Figura 2. Como puede apreciarse, el gen S se clonó en un plásmido Bluescript (Stratagene) o pYA, tal como se ha descrito previamente [Gebauer et al., Virology 183, 225 (1991)]. El ADN de los plásmidos se preparó utilizando el método de lisis alcalina [Birnboin, H.C y Doly, J. , Nucleic Acids Research 7, 1513, (1979)], y se purificó y centrifugó en un gradiente de densidad de cloruro de cesio. En algunos casos, las secuencias del gen S se flanquearon por el promotor (Pr) del SV40 y por secuencias de poliadenilación (An), tal como se recoge en la Figura 3. En estos casos, los fragmentos del gen S se subclonaron primero en los plásraidos pSV2X3 o pSV2X4 [Prevec, L. , et al., J. Inf. Dis. 161, 227 (1990)] y posteriormente se retiraron las secuencias flanqueantes del promotor de SV40 y de poliadenilación utilizando las enzimas de restricción que se recogen en la Tabla 1
Tabla 1 Clonaie de fragmentos del gen S en Ad5
Sitios de escisión en Plásmido intermedio/ Sitios de escisión de]
Remmhinante el pásmido original sitios de rlnnaje plásmidn intermedio
λd-TS-2 Bluescript/XΛoI pSV2X3/XhoI Xbal λd-TS-8 Bluescript/Xhol pSV2X3/XhθI StulfXbal
Ad-TS-01 Bluescript/Apal/ffindlII pSV2X4/-StuI/HindIII Xbal
Ad-TS-07 Bluescript/HincII — —
Ad-TS-5 Bluescript/Apal/tfi ndiπ pSV2X4/StuI/HindIII Xbal
Ad-TS-02 Bluescript/Apal/HindlII pSV2X4/StuI/fíir-dIII Xbal
Ad-TS-05 pϊk/Smal/Hindlll — ~
Ad-TS-6 Bluescript/Apal/iϊindiπ pSV2X4/StuI/Hindiπ Xbal
Ad-TS-9 pYA/Sjπal/HindlII — ~
Ad-TS-06 pYA/Sroal/AspI — —
A continuación, los fragmentos del gen S, flanqueados o no por las secuencias del promotor de SV40 y de poliadenilación, se clonaron en el único sitio Xba I presente en la región E3 parcialmente deleccionada de los plásmidos pFG144K3 o pAB14. Los plásmidos resultantes, denominados pFG144K-TS o pAB-TS, no son capaces de generar Ad5 infectivos por sí mismos, pero, tras co-transfección en células 293 con el plásmido pFG173, que contiene la mitad 5' funcional del Ad5, son capaces de generar Ad5 infectivos que portan la secuencia del gen S clonada (véanse las Figuras 1 y 2). La co-transfección se realizó mediante el método de precipitación con fosfato calcico [Graham, F. y van der EB, A., J. Virology 52, 456 (1973)]. Al cabo de 8 a 15 días post co-transfección, se aislaron las placas y se crecieron, y a continuación, el ADN viral se analizó con Hind III. Los virus que presentaban el patrón esperado se plaquearon y se purificaron tres veces. Finalmente, se verificó la estructura primaria, secuenciando las zonas de unión de las construcciones. De esta manera, se obtuvieron cuatro recombinantes Ad5-VGPT que contenían las secuencias del gen S de VGPT desde el nucleótido -8 (considerando la A del codon de iniciación ATG como el nucleótido 1) al 1135 (Ad-TS-8), 1587 (Ad-TS-5), 3329 (Ad-TS-9) y 4470 (Ad-TS-06). Estos recombinantes codifican para fragmentos de 378, 529, 1109 y 1490 aminoácidos (véase la Figura 3).
Ejemplo 2
Experimentos de expresión de proteínas S del VGPT en células de cerdo en cultivo infectadas con los recombinantes Ad-TS
Se han realizado tres tipos de experimentos para determinar la expresión de antígenos de la proteína S del VGPT, concretamente: a. Inmunofluorescencia. Se utilizaron anticuerpos monoclonales de ratón, específicos para los distintos sitios antigénicos (A, B, C D) de la proteína S para detectar los productos de expresión en células en cultivo infectadas con los recombinantes Ad-TS. El mareaje se realizó con anticuerpos anti-Ig de ratón marcados con isotiocianato de fluoresceína (FITC). El método utilizado fue el descrito por Sanz et al., [J. Virol. 54, 199 (1985)]. b. Inmunoprecipitación. Las proteínas, marcadas metabólicamente con 3=S-metionina/cisteína (Amersham Ibérica,
Código n° SJQ0079), procedentes de células infectadas con los recombinantes Ad-TS, se inmunoprecipitaron con suero porcino anti-VGPT y Sepharosa-proteína A. El inmunoprecipitado se resuspendió en un tampón de electroforesis que contenía 2,5% de dodecilsulfato sódico (SDS) y 5% de 2-mercaptoetanol [Laemmli, U.K., Nature, 227, 680, (1970)] y a continuación se analizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida y autorradiografía. El método utilizado fue el descrito por Sanz et al., [J. Virol. 54, 199 (1985)]. c. Inmunodetección en papel de nitrocelulosa después de la electroforesis. Los extractos proteicos de células procedentes de células infectadas con los recombinantes Ad-TS se separaron por medio de electroforesis en gel de poliacrilamida, e inmediatamente se transfirieron a un papel de nitrocelulosa. Los antígenos de la proteína S se detectaron con anticuerpos monoclonales de ratón específicos para los diferentes sitios antigénicos (A, B, C, D) de la proteína S, un segundo anticuerpo de conejo anti-Ig de ratón y i2SI-proteína A. El método utilizado fue el descrito por Correa et al., [J. Gen. Virol. 71, 271 (1990)].
Estos experimentos permitieron la caracterización antigénica de los productos de expresión de los recombinantes. En primer lugar, la presencia de antígenos de la proteína S se confirmó en células 293 o en células de testículo de cerdo (ST) [McClurkin, A.W. , y Norman, J.O., Can. J. Comp. Vet. Sci. 30, 190 (1966)] infectadas con uno cualquiera de los cuatro recombinantes Ad-TS. La localización de estos antígenos en las células infectadas era citoplasmática, predominantemente. En los recombinantes Ad- TS-8, Ad-TS-9 y Ad-TS-06, los productos de expresión fueron reconocidos por los anticuerpos monoclonales dirigidos contra los sitios antigénicos de la proteína S contenidos por el inserto en su secuencia, pero no fueron reconocidos por aquellos anticuerpos monoclonales dirigidos contra los sitios que no estaban presentes. Este hecho indica que estos recombinantes expresan correctamente los sitios antigénicos contenidos en ellos. Sin embargo, el producto de expresión del recombinante Ad-TS-5 no fue reconocido por los anticuerpos monoclonales específicos del sitio D, aunque este sitio está contenido en la secuencia del inserto, lo que sugería un plegamiento incorrecto de la proteína en esa región. El peso molecular aparente de los productos de expresión de los cuatro recombinantes [68, 86, 135 y 200 kilodaltons (kDa) respectivamente] era más alto que el que se esperaba teniendo en cuenta únicamente el número de aminoácidos, lo que sugería que estos productos estaban altamente glicosilados, de forma similar a lo que ocurre durante la síntesis de proteína S en la infección con VGPT. En los recombinantes con insertos relativamente pequeños (1135, 1587 y 3329 nucleótidos respectivamente) los niveles de expresión (>3 μg/10e células) eran más altos que en el recombinante con el inserto más largo (4470 nucleótidos), que contenía el gen S completo (<1 μg/10e células).
Ejemplo 3
Tnmunogenicidad de los recomhinantes Ad-TS en hámsters En primer lugar se estudió la respuesta inmune sistémica inducida por los diferentes recombinantes Ad-TS en hámsters. Por ese motivo, se inmunizaron hámsters de 8 semanas con 1,6 x 109 unidades formadoras de placas (ufp) de los recombinantes Ad-TS distribuidos por tres vías: oral (4x10a ufp), nasal (2 x 10e ufp) e intraperitoneal (1 x 109 ufp) . Los animales fueron inoculados los días 0, 32, 60 y 90, y se recogieron muestras de suero los días 0, 32, 47, 87, 105 y 115. En las muestras de suero, el título de anticuerpos anti- VGPT se determinó por un radioinmunoensayo (RÍA) [siguiendo el método previamente descrito por Jiménez, G. et al., J. Virol. 60, 131 (1986)], así como por la capacidad para neutralizar la infectividad del VGPT in vitro [de acuerdo con el método descrito por Correa, I., et al., Virus Res. 10, 77 (1988)]. El título en RÍA se define como la inversa de la dilución más alta de suero que tiene un valor más alto que el de un suero control negativo; mientras que la relación de neutralización (IN) se define como el logaritmo decimal (log10) del cociente entre ufp después de la incubación en ausencia y en presencia del suero indicado. Los títulos en RÍA y las relaciones de neutralización de los antisueros inducidos por los cuatro recombinantes Ad-TS se representan en base al periodo de tiempo transcurrido desde la primera inmunización (Figura 4). Como puede apreciarse, tras la segunda inmunización todos los recombinantes habían inducido antisueros con títulos en RÍA superiores a 3.000 y con unas relaciones de neutralización de entre 1 y 2,5. Al objeto de estudiar la respuesta inmune lactogénica, las hembras, inmunizadas tres veces con los recombinantes Ad- TS, se aparearon con machos que no eran inmunes. Unos 10 días antes del parto, la hembras fueron re-inoculadas con otra dosis del recombinante Ad-TS correspondiente. Entre 24 y 48 horas después del parto, se administraron a las hembras amamantadoras 10 unidades internacionales (UI) de oxitocina y 1 hora más tarde, se recogió la leche aplicando vacío con una jeringa. La presencia de anticuerpos específicos anti- VGPT en la leche y en el suero de las hembras amamantadoras se determinó, como en el caso anterior, por RÍA y por neutralización. Los resultados demostraron (Figura 5) que los recombinantes estudiados (Ad-TS-8, Ad-TS-9 y Ad-TS-06) inducían anticuerpos frente al VGPT en la leche con títulos que oscilaban entre 2 x 103 y 3 x 103 , mientras que en el suero los títulos oscilaban entre 5 x 103 y 1,5 x 10 4 . Adicionalmente, estos anticuerpos neutralizaban al VGPT in vitro con una relación de neutralización de aproximadamente 1 en la leche y entre 2 y 4 en el suero. Los animales inmunizados con Ad5 desprovisto de inserto (siguiendo el mismo protocolo de inmunización que para los recombinantes Ad-TS) no indujeron ningún tipo de respuesta anti-VGPT.
Ejemplo 4
Inmunoqgnicidad de los recomhi nantes Ad-TS en cerdos
A continuación, se realizó un estudio sobre la capacidad de los recombinantes Ad-TS para inducir una respuesta inmune en cerdos. Por ese motivo, se inmunizaron cerdos de 4 semanas con 4 x 109 ufp de los recombinantes Ad-TS distribuidos por tres vías: oral (1 x 109 ufp), nasal (1 x 109 ufp) e intraperitoneal (2 x 109 ufp). Los animales fueron inoculados los días 0, 28 y 56 y se recogieron muestras de suero los días 0, 28, 42, 56 y 70. En las muestras de suero, el título de anticuerpos anti-VGPT se determinó por un RÍA [siguiendo el método previamente descrito por Jiménez, G. et al., J. Virol. 60, 131 (1986)], así como por la capacidad para neutralizar la infectividad del VGPT in vitro [de acuerdo con el método descrito por Correa, I., et al., Virus Res. 10, 77 (1988)]. Los títulos en RÍA y las relaciones de neutralización de los antisueros inducidos por los cuatro recombinantes Ad-TS se han representado en base al periodo de tiempo transcurrido desde la primera inmunización (Figura 6). Como puede apreciarse, tras la tercera inmunización, todos los recombinantes habían inducido antisueros con títulos en RÍA superiores a 10.000 y con unas relaciones de neutralización de entre 1 y 6. Es interesante observar que todos los recombinantes eran más inmunogénicos en cerdos que en hámsters, que los títulos de anticuerpo en RÍA eran más altos y, adicionalmente, que estos anticuerpos eran más neutralizantes.
Ejemplo 5
Protección in vivo contra el VGPT con sueros d≤—cerdos inducidos por los recombinantes Ad-TS
Para estudiar la capacidad protectora in vivo contra el VGPT de los antisueros inducidos en cerdos por los recombinantes Ad-TS, se incubaron alícuotas de 107 ufp de una cepa de VGPT virulenta (PUR-46-SW11-ST2) a 37SC durante 60 minutos con 3 mi de cada uno de los antisueros inducidos por los cuatro recombinantes. Una vez que el periodo de incubación había transcurrido, la mezcla se administró con una boquilla intragástrica en cerdos de 2 días, altamente susceptibles al VGPT y progenie de madres seronegativas al VGPT. Los animales inoculados se alimentaron tres veces al día con leche para lactantes (Nidina 1, Nestlé) suplementada con 3 mi del antisuero correspondiente. Los animales control se trataron de forma similar, pero utilizando un suero inducido por Ad5 desprovisto de inserto. El título del virus en los extractos de yeyuno-íleo, ganglios raesentéricos, pulmón, y ganglios mediastínicos, se determinó los días 1 y 2 post infección y el día del fallecimiento (los animales que no murieron se sacrificaron el día 5 post infección). Para la determinación del título de virus en los tejidos, las muestras de dichos tejidos se homogeneizaron en suero salino frío (1:1, v:v) con un homogeneizador OMNI 2000 (Omni International) y el título de virus infectivo se determinó mediante plaqueo en células 293 [Bett et al., J. Virol. 67, 5911 (1993)]. Los resultados (Figura 7) muestran que los animales tratados con sueros inducidos por los recombinantes que contenían los cuatro sitios antigénicos de la proteína S (Ad-TS-9 y Ad-TS-06) estaban completamente protegidos contra la infección por VGPT. Los títulos de los virus en los grupos tratados con estos dos antisueros eran muy bajos (<102 ufp/g de tejido) en todos los tejidos. Además, no se observó en estos grupos ni mortalidad ni ningún tipo de signos clínicos. Sin embargo, los antisueros inducidos con los recombinantes Ad-TS-5 y con Ad-TS-8 protegían tan sólo parcialmente. Los títulos de virus infectivo en todos los tejidos (101 - 103 ufp/g en el grupo tratado con el antisuero de Ad-TS-5 y 102 - 10* ufp/g en el grupo tratado con el antisuero de Ad-TS-8) eran más bajos que en el grupo tratado con el suero control inducido por Ad5 desprovisto de inserto. En estos dos grupos, se observó enteritis y muerte más tarde que en el grupo control; y al final, el índice de mortalidad fue del 100%. Estos resultados implican que el sitio A de la proteína S del VGPT u otros sitios no contenidos en estos recombinantes son necesarios para la inducción de protección total contra el VGPT. Asimismo, los resultados también muestran que, en ausencia de este sitio antigénico, los fragmentos de la proteina S que incluyen los sitios C+B o C+B+D sólo inducen anticuerpos que protegen parcialmente contra el VGPT. Ejemplo 6
Tropismo en cerdos de los recombinantes basados en Ad5 La inmunidad lactogénica es especialmente eficiente cuando la presentación de los antígenos se realiza en tejidos linfoepitelialeε especializados asociados con el tracto gastrointestinal (GALT) o con el tracto respiratorio (BALT). Uno de los objetivos fundamentales de esta invención es el de inducir una respuesta inmune lactogénica contra el VGPT utilizando recombinantes Ad-TS. Por tanto, la eficacia de esta invención depende de la capacidad de estos recombinantes para infectar y expresar antígenos de VGPT en los tejidos previamente mencionados (GALT y/o BALT) . Para estudiar el tropismo de Ad5 en cerdos, se ha utilizado un Ad5 recombinante que contenía la región E3 del gen de la luciferasa (Ad-luc) que había sido construido y caracterizado previamente [Mittal, S.K. , et al., Virus Res. 28, 67 (1993)]. Este recombinante se construyó utilizando el mismo sistema que para la obtención de los recombinantes Ad-TS, tal como se menciona en esta descripción. El producto del gen heterólogo clonado en este recombinante (luciferasa) es fácilmente detectable por medio de una reacción enzimática sencilla y sensible, en presencia de su sustrato, luciferina. Todo esto convierte al recombinante en una herramienta útil, no sólo para la determinación de los tejidos que infecta sino también para estimar los niveles de antígeno expresados en cada uno de los tejidos.
Para realizar este estudio, cerdos de 4 semanas fueron inoculados con diferentes dosis (lxl0θ - 1x10xo ufp/animal) de Ad-luc por diferentes vías (oronasal, intraperitoneal, entérica e intravenosa), dejando que la infección progresara durante varios días (1 - 7). Transcurrido ese tiempo, los animales fueron sacrificados y se recogieron muestras de distintos tejidos. Estos tejidos se homogeneizaron tal como se ha mencionado previamente, en suero salino frío (1:1, v:v) con un homogeneizador OMNI 2000 (Omni International) y se determinó el título del virus infectivo mediante plaqueo en células 293; la actividad de la luciferasa se determinó siguiendo el método previamente descrito [Mittal, S.K., et al., Virus Res. 28, 67 (1993)]. Simultáneamente, se recogieron muestras para estudiar el tropismo a nivel de tejidos y células mediante técnicas inmunohistoquímicas utilizando un anticuerpo monoclonal que reconoce una proteína del Ad5, concretamente, el anticuerpo monoclonal H2-19 que reconoce específicamente una proteína de 72 kDa del adenovirus [Branton et al., Cell Biol. 63, 941 (1985)]. Los resultados obtenidos en este estudio ponen de manifiesto: a) que los recombinantes basados en Ad5 infectan principalmente a los pulmones, ganglios mediastínicos, intestino, y ganglios mesentéricos de los cerdos, expresando en estos tejidos los productos codificados por las secuencias heterólogas contenidas en ellos; b) que la infección con estos recombinantes implica la producción de virus infectivo en pulmones, ganglios mediastínicos y ganglios mesentéricos, pero no en el intestino, lo que sugiere que la infección en este último órgano es abortiva; c) que el tropismo en cerdos de estos recombinanteε depende de la vía de inoculación: tropismo respiratorio cuando la inoculación es oronasal, pero tropismo intestinal cuando la inoculación es intraperitoneal; d) que, después de la inoculación, la expresión de los productos codificados por las secuencias heterólogas contenidas en ellos alcanza su pico entre los días 1 y 2 post infección, en todos los tejidos, disminuyendo rápidamente hasta unos valores muy bajos o nulos alrededor del día 7 post infección.
Este tropismo facilita la presentación de antígenos recombinantes en tejidos linfoepiteliales asociados con el tracto gastrointestinal (GALT) o con el tracto respiratorio (BALT) convirtiendo a los recombinantes basados en Ad5 en vectores ideales para la inducción de inmunidad lactogénica en cerdos.
Ejemplo 7 Estudio sobre la posible patología producida en cerdos por los recombinantes basados en Ad5
El empleo de recombinantes Ad-TS como vacuna requiere conocer los posibles efectos patológicos producidos por la infección con estos vectores. Para ello, se realizó un detallado estudio histopatológico en tejidos de cerdos que habían sido infectados con estos recombinantes. Para la realización de este estudio, cerdos de 4 semanas fueron inoculados con diferentes dosis (lxlOβ - lxiO10 ufp/animal) de los recombinantes Ad-TS, simultáneamente por vía oronasal e intraperitoneal, dejando que la infección progresara durante varios días (1 - 10). Transcurrido este tiempo, los animales fueron sacrificados y se recogieron muestras de distintos tejidos para el estudio histopatológico. Todos los animales infectados con los recombinantes Ad-TS desarrollaron una patología pulmonar ligera, mientras que en otros órganos, la patología era inexistente o escasamente presente, es decir, congestión esplénica e hiperplasia folicular linfoide en ganglios mesentéricos y mediastínicos. La magnitud de las alteraciones patológicas observada en pulmones estaba en relación directa con la dosis, pero tales alteraciones eran cuantitativamente similares en todas las dosis analizadas. Se observó neumonía lobular, de localización característica en los lóbulos superior y medio, preferentemente en el pulmón derecho. Después de 24 horas post infección, se observó abundante infiltración inflamatoria, especialmente de células mononucleares a nivel intersticial, con un espesamiento de las paredes alveolares y una congestión vascular también de distribución focal. A nivel bronquial, las alteraciones histopatológicas eran poco significativas, con algunos linfocitos en la lámina propia del epitelio bronquial. También se observaron macrófagos alveolares muy grandes, con núcleo bizarro de forma irregular, que contenían, en algunos casos, inclusiones basófilas intranucleares. Más esporádicamente, se observaron células de aspecto similar a nivel intersticial. No se detectaron áreas de edema, necrosis o hemorragia. A los 4 - 5 días post infección había una neumonía en fase de resolución y la magnitud de las alteraciones histopatológicas comenzó a disminuir rápidamente. A los 7 - 10 días post infección, la neumonía había desaparecido y no se detectaron alteraciones histopatológicas de ningún tipo.
Otro resultado relevante con respecto a la ligera patología producida en cerdos por los vectores basados en Ad5 era el hecho de que a lo largo de todo el experimento (10 semanas) ninguno de los más de 50 animales inoculados tres veces con 4 x 109 ufp de los diferentes recombinantes Ad-TS (véase el Ejemplo 4) manifestó ningún tipo de signo clínico o pérdida de apetito. Adicionalmente, cuando estos animales se sacrificaron (10 semanas después de la primera inoculación) , en ninguno de ellos se detectaron alteraciones patológicas significativas a nivel macroscópico o microscópico.
Por consiguiente, teniendo en cuenta todo lo que se ha mencionado previamente, se puede concluir afirmando que los recombinantes basados en adenovirus que contienen la secuencia del gen S del VGPT o secuencias derivadas de la misma, constituyen una vacuna eficaz para la inducción de inmunidad lactogénica contra la gastroenteritis porcina transmisible. Teniendo en cuenta los resultados de protección in vivo , el recombinante Ad-TS-9 es el que se puede utilizar, preferentemente, en la formulación de la vacuna objeto de esta invención. Este recombinante proporciona niveles de protección similares a los del recombinante Ad-TS-06, pero es más estable y se replica mejor in vitro ya que tiene un inserto más pequeño. Ejemplo 8
Preparación de una vacuna contra VGPT en forma liofilizada Se infectan células 293 cuando están al 80% de confluencia con un adenovirus recombinante que contiene la secuencia del gen S del VGPT [Ad-TS-9], en un MOI (multiplicity order infectivity, razón de multiplicidad de la infectividad) de 1. A las 72-96 horas post-infección, el 80- 90% de las células están redondeadas y son refringentes. Se recoge el cultivo celular y el sobrenadante se somete a dos ciclos de congelación y descongelación y se centrifuga a 2.000g durante 10 minutos al objeto de eliminar los detritus celulares. El sobrenadante se mezcla con un medio de liofilización y se liofiliza el producto de forma que por dosis vacunal haya entre 109 y ÍO10 ufp/animal.
DEPÓSITO DE MICROORGANISMOS
Uno de los adenovirus recombinantes obtenidos, concretamente el denominado Ad-TS-9, ha sido depositado en la European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), en Portón Down, Salisbury, Whiltshire SP4 OJG (Reino Unido), el 29 de Noviembre de 1995, correspondiéndole el número de acceso V95112928.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Un adenovirus recombinante caracterizado porque contiene en su genoma la secuencia del gen S del virus de la gastroenteritis porcina transmisible (VGPT) o una secuencia derivada de dicho gen.
2. Un adenovirus recombinante según la reivindicación 1, que comprende una secuencia derivada del gen S de VGPT que contiene, al menos, un sitio antigénico de la proteína S del VGPT.
3. Un adenovirus recombinante según la reivindicación 1, que comprende una secuencia derivada del gen S de VGPT que contiene dos sitios antigénicos de la proteína S del VGPT.
4. Un adenovirus recombinante según la reivindicación 1, que comprende una secuencia derivada del gen S de VGPT que contiene tres sitios antigénicos de la proteina S del VGPT.
5. Un adenovirus recombinante según la reivindicación 1, que comprende una secuencia derivada del qen S de VGPT que contiene cuatro sitios antigénicos de la proteína S del VGPT.
6. Un adenovirus recombinante según la reivindicación 1, que comprende una secuencia derivada del gen S de VGPT que se selecciona del grupo formado por: a) la secuencia del gen S de VPGT desde el nucleótido -8 hasta el 1135; b) la secuencia del gen S de VPGT desde el nucleótido -8 hasta el 1587; c) la secuencia del gen S de VPGT desde el nucleótido -8 hasta el 3329; y d) la secuencia del gen S de VPGT desde el nucleótido -8 hasta el 4470, en todos los casos considerando la A del codon de iniciación ATG como el nucleótido 1.
7. Una vacuna para proteger al ganado porcino de la infección por el virus de la gastroenteritis porcina transmisible (VGPT) y contra la enfermedad causada por dicho virus que comprende una cantidad adecuada de un adenovirus recombinante según las reivindicaciones 1 a 6 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
8. Empleo de un adenovirus recombinante que contiene en su genoma la secuencia del gen S del virus de la gastroenteritis porcina transmisible (VGPT) o una secuencia derivada de dicho gen, según las reivindicaciones 1 a 6, en la elaboración de una vacuna para proteger al ganado porcino de la infección por el VGPT y contra la enfermedad causada por dicho virus.
9. Una proteína recombinante del virus de la gastroenteritis porcina transmisible (VGPT) que comprende la secuencia total o parcial de la proteína S del VGPT.
10. Proteína recombinante según la reivindicación 9, que comprende una secuencia de la proteína S del VGPT que contiene, al menos, un sitio antigénico de dicha proteína S.
11. Proteína recombinante según la reivindicación 9, que comprende una secuencia de la proteína S del VGPT que contiene dos sitios antigénicos de dicha proteína S.
12. Proteina recombinante según la reivindicación 9, que comprende una secuencia de la proteína S del VGPT que contiene tres sitios antigénicos de dicha proteína S.
13. Proteína recombinante según la reivindicación 9, que comprende una secuencia de la proteína S del VGPT que contiene cuatro sitios antigénicos de dicha proteína S.
14. Una proteina recombinante del virus de la gastroenteritis porcina transmisible (VGPT) que contiene la secuencia total o parcial de la proteína S del VGPT caracterizada porque es obtenible por expresión de un adenovirus recombinante según las reivindicaciones 1 a 6.
15. Una vacuna multivalente capaz de prevenir la enfermedad provocada por el virus de la gastroenteritis porcina transmisible (VGPT) y otras infecciones porcinas, que comprende, además de un adenovirus recombinante que contiene la secuencia del gen S del VGPT o una secuencia derivada de la misma, según las reivindicaciones 1 a 6, un antígeno capaz de inducir una protección contra un virus u otro agente patógeno del ganado porcino, y un excipiente aceptable farmacéuticamente.
16. Una vacuna multivalente según la reivindicación 15, que comprende un adenovirus recombinante que contiene la secuencia del gen S del VGPT o una secuencia derivada de la misma junto con la secuencia de los genes que codifican para los antígenos correspondientes.
17. Una vacuna multivalente según la reivindicación 16, en la que dichos antígenos corresponden a virus o agentes patógenos seleccionados del grupo formado por aquéllos que entran en el animal vía mucosas o se replican en éstas.
18. Una vacuna multivalente según la reivindicación 17, en la que dichos virus o agentes patógenos se seleccionan del grupo formado por rotavirus, el virus de la diarrea epidémica porcina (VDEP) , el virus causante del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRS) y Serpul ina hydiosenteriae .
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999008706A1 (en) * 1997-08-14 1999-02-25 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Recombinant porcine adenovirus vector
WO2000047756A1 (fr) * 1999-02-11 2000-08-17 Merial Vecteurs et vaccins viraux a base d'adenovirus porcins recombines
US7569217B2 (en) 2001-09-24 2009-08-04 University Of Saskatchewan Porcine adenovirus E1 and E4 regions

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991018627A1 (en) * 1990-05-29 1991-12-12 Smithkline Beecham Corporation Swine pneumonia vaccine and method for the preparation thereof

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991018627A1 (en) * 1990-05-29 1991-12-12 Smithkline Beecham Corporation Swine pneumonia vaccine and method for the preparation thereof

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CALLEBAUT, P. ET AL: "Development of a recombinant vector virus for vaccination against viral diarrhea and respiratory disease in pigs", MEDED. FAC. LANDBOUWWET., UNIV. GENT (1992), 57(4B), 2077-84 CODEN: MFLRA3;ISSN: 0368-9697, 1992, XP000614551 *
CARLOS M. SÁNCHEZ ET AL.: "Genetic evolution and tropism of transmissible gastroenteritis coronaviruses", VIROLOGY, vol. 190, no. 1, September 1992 (1992-09-01), ORLANDO US, pages 92 - 105, XP002024069 *
ENJUANES, LUIS ET AL: "Antigen selection and presentation to protect against transmissible gatroenteritis coronavirus", VET. MICROBIOL. (1992), 33(1-4), 249-62 CODEN: VMICDQ;ISSN: 0378-1135, 1992, XP000614637 *
ENJUANES, LUIS ET AL: "Induction of transmissible gastroenteritis coronavirus specific immune responses using vectors with enteric tropism", ADV. EXP. MED. BIOL. (1995), VOLUME DATE 1995, 371B, 1535-41 CODEN: AEMBAP;ISSN: 0065-2598, 1995, XP002024070 *
SMERDOU, CRISTIAN ET AL: "Induction of an immune response to transmissible gastroenteritis coronavirus using vectors with enteric tropism", ADV. EXP. MED. BIOL. (1993), 342(CORONAVIRUSES), 455-62 CODEN: AEMBAP;ISSN: 0065-2598, 1993, XP000614783 *
SYLVIA HU ET AL.: "Studies of TGEV spike protein GP195 expressed in E. coli and by a TGE-vaccinia virus recombinant", ADVANCES IN EXPERIMENTAL MEDICINE AND BIOLOGY, vol. 185, no. 3, 1985, pages 63 - 82, XP002024068 *
TORRES, JUAN M. ET AL: "Induction of antibodies protecting against transmissible gastroenteritis coronavirus (TGEV) by recombinant adenovirus expressing TGEV spike protein", VIROLOGY, vol. 213, no. 2, 10 November 1995 (1995-11-10), ORLANDO US, pages 503 - 516, XP002024067 *
TORRES, JUAN M. ET AL: "Tropism of human adenovirus type 5-based vectors in swine and their ability to protect against transmissible gastroenteritis coronavirus", J. VIROL. (1996), 70(6), 3770-3780 CODEN: JOVIAM;ISSN: 0022-538X, 1996, XP000616232 *

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999008706A1 (en) * 1997-08-14 1999-02-25 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Recombinant porcine adenovirus vector
KR100746524B1 (ko) * 1997-08-14 2007-08-07 커먼웰쓰 사이언티픽 앤드 인더스트리얼 리서치 오가니제이션 재조합 돼지 아데노바이러스 벡터
US7323177B1 (en) 1997-08-14 2008-01-29 Vectogen Pty Ltd. Recombinant porcine adenovirus vector
CN100366292C (zh) * 1997-08-14 2008-02-06 联邦科学和工业研究组织 重组的猪腺病毒载体
US7473428B2 (en) 1997-08-14 2009-01-06 Vectogen Pty Ltd. Recombinant porcine adenovirus vector
US7785602B2 (en) 1997-08-14 2010-08-31 Vectogen Pty Ltd. Recombinant porcine adenovirus vector
WO2000047756A1 (fr) * 1999-02-11 2000-08-17 Merial Vecteurs et vaccins viraux a base d'adenovirus porcins recombines
FR2789695A1 (fr) * 1999-02-11 2000-08-18 Merial Sas Vecteurs et vaccins viraux a base d'adenovirus porcins recombines et replicatifs
US7109025B1 (en) 1999-02-11 2006-09-19 Merial Viral vectors and viral vaccines based on recombinant porcine adenoviruses
CN1869243B (zh) * 1999-02-11 2016-01-20 梅瑞尔公司 基于重组猪腺病毒的病毒载体和病毒疫苗
US7569217B2 (en) 2001-09-24 2009-08-04 University Of Saskatchewan Porcine adenovirus E1 and E4 regions

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