ES2320938T3 - Vacuna viva recombinate a base de virus herpes felino de tipo 1, particularmente contra la peritonitis infeccion felina. - Google Patents

Vacuna viva recombinate a base de virus herpes felino de tipo 1, particularmente contra la peritonitis infeccion felina. Download PDF

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Philippe Guy Nicolas Baudu
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Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UNA VACUNA VIVA RECOMBINANTE QUE CONTIENE, COMO VECTOR, VIRUS HERPES FELINO QUE ALBERGA Y EXPRESA AL MENOS UNA SECUENCIA NUCLEOTIDICA QUE CODIFICA PARA UN POLIPEPTIDO; ESTA SECUENCIA SE INSERTA EN LAS SEDES ORF5, ORF2 O AMBAS. FORMULA DE VACUNA MULTIVALENTE Y FRAGMENTOS DE ADN DE VIRUS HERPES FELINO.

Description

Vacuna viva recombinante a base de virus herpes felino de tipo 1, particularmente contra la peritonitis infecciosa felina.
La presente invención se refiere a vacunas, preferentemente para gatos, producidas a partir de virus herpes felinos recombinantes, y a los métodos de obtención y de preparación de estos virus recombinantes. En particular, la presente invención se refiere más particularmente a los virus herpes felinos recombinantes que comprenden una casete de expresión para uno o más gen o genes, extraño o extraños.
La rinotraqueitis infecciosa felina está causada por el virus herpes felino de tipo 1 (en inglés Feline HerpesVirus Type 1 o FHV-1). El virus herpes felino (FHV-1) está clasificado en la familia de los Alphaherpesvirinae. La rinotraqueitis infecciosa felina es una enfermedad muy extendida en gatos y, en la práctica, todos los gatos medicados son vacunados contra esta afección vírica. Actualmente existen varias vacunas para prevenir la rinotraqueitis infecciosa. Estas vacunas son de tipo vivo atenuado, o de tipo inactivado (virus completo o subunidades purificadas). La atenuación de las vacunas vivas utilizadas actualmente se ha obtenido después de pasos repetidos en células, y se desconoce la causa de su atenuación. Además, estas vacunas presentan en general una virulencia residual y por esta razón se administran por vía parenteral (subcutánea o intramuscular) antes que por vía intranasal (que, sin embargo, sería la vía elegida teniendo en cuenta la replicación local de este virus). Las vacunas inactivadas presentan una buena inocuidad, pero su reducida inmunogenicidad requiere múltiples inyecciones para inducir una protección satisfactoria.
Por otro lado, los gatos domésticos están expuestos a muchas otras enfermedades, y el desarrollo de un vector de vacuna que pueda expresar diferentes antígenos de agentes patógenos felinos permitiría simplificar y mejorar la eficacia de los programas de vacunación.
Finalmente, entre las enfermedades que afectan al gato doméstico, algunas resisten siempre a los enfoques de vacunas clásicos. El caso más conocido es el de la peritonitis infecciosa felina causada por un coronavirus (virus de la Peritonitis Infecciosa Felina (PIF) o, en inglés, "FIPV" (Feline Infectious Peritonitis Virus)).
Un vector de FHV-1, cuya atenuación sería tal que pudiera administrarse por vía oronasal a gatos sin provocar patología local y/o general, y que permitiera la inducción de una respuesta inmune protectora al mismo tiempo contra la rinotraqueitis infecciosa felina y contra otros agentes patógenos felinos, constituiría un avance significativo en materia de vacunación de la población felina doméstica.
Ya se han propuesto cierto número de genes de FHV como sitios de inserción:
La solicitud de patente EP-A-0 447 303 propuso la inserción en el sitio RR2 de los virus herpes alfa, incluyendo FHV.
La solicitud proporciona los medios para realizar la inserción en el sitio RR2 del virus herpes del pavo (virus HVT). La solicitud de patente WO-A-90 01547 propone vectores FHV TK- para la expresión de genes heterólogos.
Del mismo modo, la solicitud de patente WO-A-93 09238 propone una vacuna contra la leucemia felina formada por un vector de FHV en el que se ha insertado un gen de FeLV en el gen TK del virus FHV. Véase también en el mismo sentido los artículos de R.C. WARDLEY y col. en J. Gen. Virol. 1992. 73. 1811-1818 y de G.E. COLE y col. en J. Virol. 1990. 64. 4930-4938.
La solicitud de patente WO-A-94 03621 propone la inserción en los genes gl, gE, US9, US10 y US11.
La solicitud de patente WO-A-95 00172 propone insertar un ADN que sirva de marcador en la región del genoma que comprende los genes gl y gE.
La solicitud de patente EP-A-0 576 092 propone el marco abierto de lectura ("ORF") situado entre el gen gC y el gen homólogo del gen HSV-1 UL46 como sitio preferente para la inserción en el genoma de FHV. Véase también M.J. WILLEMSE y col. en J. Gen. Virol. 1994. 75. 3107-3116.
Diversos promotores, incluyendo aquellos generalmente disponibles en el mercado, se han utilizado en las diferentes construcciones descritas en la técnica anterior, entre las cuales se encuentran el promotor HCMV IE (inmediato temprano de CMV humano), la secuencia promotora de la región LTR del virus RSV (Virus del Sarcoma de Rous), y el promotor temprano del virus SV40.
La presente invención tiene como objetivo proporcionar una vacuna de FHV viva, atenuada pero que haya conservado una buena capacidad de replicación in vivo, para inmunizar a los gatos contra la rinotraqueitis infecciosa.
Otro objetivo de la invención es proporcionar una vacuna viva recombinante a base de FHV que sea eficaz contra otros agentes patógenos felinos. En particular, debido a los muchos fracasos observados en la vacunación contra la peritonitis infecciosa felina con vacunas inactivadas o vivas atenuadas, principalmente debido al fenómeno de "facilitación" (exacerbación de la enfermedad), sigue existiendo la necesidad de una vacuna realmente eficaz contra la PIF. Dicha vacuna a base de un vector de FHV-1 recombinante que fuera realmente eficaz contra la peritonitis infecciosa felina, enfermedad para la cual aún no se ha comercializado una vacuna satisfactoria, podría abrir además el camino a vacunas muy eficaces contra otras enfermedades del gato, como, por ejemplo y entre otras, la leucemia felina, el síndrome de inmunodeficiencia felina debido a FIV, o también la panleucopenia felina.
Otro objetivo más de la invención es permitir una vacunación eficaz de los gatos a través de la vía oronasal.
La solicitante ha caracterizado una nueva parte del genoma de FHV, en la que ha caracterizado nuevas regiones del genoma del virus FHV, regiones denominadas en adelante (véase el ejemplo 3) FHV ORF2 y FHV ORF5, que se han mostrado utilizables para la inserción de genes extraños en condiciones que permitan cumplir los objetivos expuestos anteriormente.
La presente invención tiene por objeto, por lo tanto, una vacuna viva recombinante que utiliza como vector un virus herpes felino que comprende, y expresa, al menos una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido, estando esta secuencia insertada en el sitio ORF5 y/o el sitio ORF2.
Preferentemente, la secuencia insertada codifica un polipéptido antigénico y, preferentemente, un polipéptido antigénico de un agente patógeno felino. También pueden insertarse secuencias que codifican proteínas inmunomoduladoras tales como citoquinas. Según una modalidad ventajosa, pueden asociarse una secuencia que codifica una citoquina, o análogo, y una secuencia que codifica un antígeno. Si fuera necesario, pueden asociarse varias secuencias de citoquinas entre sí, opcionalmente en combinación con una o más secuencias que codifican antígenos.
La inserción en los dos sitios recién caracterizados se realiza mediante inserción simple (sin eliminación) o después de la eliminación parcial o total de los ORF utilizados como sitios de inserción.
Según una modalidad particularmente preferida de la invención, se realizan inserciones y/o eliminaciones en los dos sitios descritos. Esta modalidad está particularmente adaptada a la utilización de cepas salvajes virulentas del virus FHV-1 para la obtención de recombinantes. Por lo tanto, puede insertarse al menos una secuencia de nucleótidos en cada uno de los sitios, o también insertarse solamente en un sitio, preferentemente ORF5, y eliminar todo o parte del otro sitio.
Según otra modalidad, que se aplica más a las cepas de vacunas atenuadas, sin limitarse a éstas, la inserción se realiza sólo en uno de los dos sitios, preferentemente el sitio ORF5.
Los virus herpes felinos según la invención son preferentemente los virus FHV de tipo 1.
Puede utilizarse en particular la cepa FHV-1 CO cuya secuencia de la región genómica (ORF1 a ORF8) se indica en la lista de secuencias con la referencia SEC ID Nº 1 (véase también la tabla 1, ejemplo 3). El sitio ORF2 se sitúa entre los nucleótidos 1655 y 2596. El sitio ORF5 se sitúa entre los nucleótidos 5869 y 7113.
Para la expresión de los genes extraños insertados en el genoma de FHV-1 según la presente invención, se utilizará preferentemente un promotor eucariota fuerte, tal como, preferentemente, un promotor inmediato temprano de CMV (IE). Por promotor CMV IE, se entiende particularmente un fragmento tal como se da en los ejemplos así como sus sub-fragmentos que conservan la misma actividad promotora. El promotor CMV IE puede ser el promotor humano (HCMV IE) o el promotor múrido (MCMV IE), o también un promotor CMV IE de origen diferente, por ejemplo de rata, de cobaya o de cerdo.
Se podrán insertar al menos dos secuencias de nucleótidos en uno de los sitios ORF2 u ORF5 bajo el control de promotores diferentes. Podrán ser particularmente promotores CMV IE de diferentes orígenes.
Según una realización ventajosa de la invención, se asocia al promotor CMV IE otro promotor según una disposición "en tándem", de modo que los dos promotores tienen sus extremos 5' adyacentes, aunque las transcripciones iniciadas a partir de estos promotores se hacen en sentidos opuestos, lo que permite insertar, en la región de inserción, dos secuencias de nucleótidos, una dependiente del promotor CMV IE, la otra del promotor asociado. Esta construcción es notable debido a que la presencia del promotor CMV IE, y particularmente de su parte activadora (potenciador), puede activar la transcripción inducida por el promotor asociado. Como promotor asociado, puede mencionarse, por ejemplo, un promotor CMV de diferente especie a la del primer promotor. También pueden preverse otros promotores tales como el promotor RNA1.8 del virus de la enfermedad de Marek (MDV) (G. Bradley y col. J. Virol. 1989. 63.2534-2542).
La secuencia de nucleótidos insertada en el vector de FHV para ser expresada puede ser cualquier secuencia que codifique un polipéptido antigénico de un agente patógeno felino capaz, una vez expresada en condiciones favorables proporcionadas por la invención, de asegurar una inmunización que conduce a una protección eficaz del animal vacunado contra el agente patógeno. Por lo tanto, podrán insertarse, en las condiciones descritas por la presenta invención, las secuencias de nucleótidos que codifican los antígenos de interés para una enfermedad dada.
El caso típico de la invención es la inserción de al menos una secuencia de nucleótidos que codifica adecuadamente un polipéptido del virus de la peritonitis infecciosa felina (PIF o FIPV) y, preferentemente, el polipéptido FIPV M o el polipéptido FIPV S modificado. De este modo se obtiene una vacuna viva recombinante que asegura, además de protección contra la rinotraqueitis infecciosa felina, protección contra la peritonitis infecciosa felina. Si se desea, también puede insertarse, además o en lugar de, una secuencia que codifica otro antígeno del virus PIF, tal como la proteína N, la proteína 7b y/o también los polipéptidos codificados por el gen de la polimerasa (polB) del virus de la PIF.
Otros casos preferidos de la invención son la inserción de secuencias de nucleótidos que codifican antígenos o fragmentos de antígenos del virus de la leucemia felina (FeLV), en particular genes env, gag y pol (Osterhaus A. y col. J. Immunol., 1985. 135. 591-596; Lutz H. Vet. Microbiol. 1990. 23. 131-146; Clark N. y col. JAVMA, 1991. 199. 1433-1443; Thomsen D. y col. J. Gen. Virol., 1992. 73. 1819-1824), del virus de la inmunodeficiencia felina (FIV) (Jarrett O. y col. AIDS, 1990, 4 (suppl. 1): S163-S165; Miyazawa T. y col. Arch. Virol; 1994, 134, 221-234; de Rhonde A. y col. Virology, 1994. 198. 257-264), en particular genes env, gag y pol, del virus de la panleucopenia felina (FPV) (Carlson J. y col. J. Virol. 1985. 55. 574-582; Martyn J. y col. J. Gen. Virol. 1990. 71, 2747-2753), en particular el gen de la cápsida VP2, del calicivirus felino (FCV) (Neill J. y col. J. Virol. 1991. 65. 5440-5447; Carter M. y col. Virology. 1992. 190. 443-448), en particular el gen de la cápsida.
Un caso típico de la invención es una vacuna que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno del virus de la PIF bajo el control del CMV IE y una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno de otra enfermedad viral felina, particularmente las mencionadas anteriormente, bajo el control del otro promotor.
La presente invención también tiene por objeto una fórmula de vacuna multivalente, que comprende, en forma de mezcla o para mezclar, al menos dos vacunas vivas recombinantes tales como se han definido anteriormente, comprendiendo estas vacunas secuencias insertadas diferentes, particularmente de patógenos diferentes.
La presente invención también tiene por objeto los virus FHV modificados en uno o en los dos sitios ORF2 y ORF5 como se ha indicado anteriormente.
La presente invención también tiene por objeto un método de vacunación, en particular de gatos, en el que se administra mediante cualquier vía parenteral o local, pero preferentemente por vía oronasal, una cantidad eficaz de una vacuna tal como se ha definido anteriormente. La dosis de vacuna estará comprendida entre 10^{2} DICC50 (Dosis Infecciosa Cultivo Celular 50%) y 10^{7} DICC50. Tal como se ha definido, la vacuna es eficaz en general después de una sola administración por vía oronasal. Sin embargo, pueden ser necesarias administraciones repetidas.
La presente invención también tiene por objeto los fragmentos de ADN que comprenden toda o parte de la secuencia definida por las posiciones 1 a 8193 en la SEC ID Nº 1, particularmente todos o parte de los sitios ORF2 y ORF5 definidos y/o de las secuencias flanqueantes localizadas cadena arriba y cadena abajo de estos sitios, fragmentos que se utilizarán como brazos flanqueantes para las técnicas de recombinación homóloga con el genoma del virus FHV parental. Por supuesto, la invención se refiere también a las variantes de estos fragmentos que corresponden a las secuencias equivalentes de las otras cepas de FHV. El experto es libre de seleccionar las regiones que sirven de brazos flanqueantes junto con el tipo de inserción (con o sin eliminación) o de eliminación (parcial o total) seleccionado. De manera general, los brazos flanqueantes también podrán tener de 100 a 800 pares de
bases.
La invención se describirá a continuación con más detalle con ayuda de ejemplos de realización no limitantes, tomados en referencia al dibujo, en el que:
Figura 1: Secuencia de la región FHV-1 (10803 pares de bases) y traducción de los diferentes marcos abiertos de lectura (ORF) presentes en esta secuencia (ORF1 a ORF8).
Figura 2: Construcción del plásmido pPB107 (plásmido donador para la inserción de casetes de expresión en el sitio FHV-1 ORF2).
Figura 3: Construcción del plásmido pPB110 (plásmido donador para la inserción de casetes de expresión en el sitio FHV-1 ORF5).
Figura 4: Construcción de la casete de expresión para el gen FIPV M (plásmido pPB105).
Figura 5: Construcción de la casete de expresión para el gen FIPV S (plásmido pPB055).
Figura 6: Mutagénesis del sitio A1 del gen FIPV S (plásmido pJCA084).
Figura 7: Mutagénesis del sitio A2 del gen FIPV S (plásmido pJCA085).
Figura 8: Mutagénesis de los sitios A1 + A2 del gen FIPV S (= FIPV S*) (plásmido pJCA087).
Figura 9: Construcción de la casete de expresión para el gen FIPV S * modificado (mutaciones en los sitios A1 y A2) (plásmido pPB056).
Figura 10: Construcción de la casete de expresión para el gen FIPV N (plásmido pJCA091).
Figura 11: Construcción del plásmido donador para la inserción de la casete de expresión del gen FIPV M en el sitio FHV-1 ORF2 (pPB111).
Figura 12: Construcción del plásmido donador para la inserción de la casete de expresión del gen FIPV S * en el sitio FHV-1 ORF2 (pPB112).
Figura 13: Construcción del plásmido donador para la inserción de la casete de expresión del gen FIPV N en el sitio FHV-1 ORF2 (pPB113).
Figura 14: Construcción del plásmido donador para la inserción de la casete de expresión del gen FIPV M en el sitio FHV-1 ORF5 (pPB114).
Figura 15: Construcción del plásmido donador para la inserción de la casete de expresión del gen FIPV S * en el sitio FHV-1 ORF5 (pPB115).
Figura 16: Construcción del plásmido donador para la inserción de la casete de expresión del gen FIPV N en el sitio FHV-1 ORF5 (pPB116).
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Lista de las secuencias SEC ID para las construcciones en los sitios ORF2 y ORF5
SEC ID Nº 1 Secuencia completa de la región FHV-1 ORF1 - -> ORF8 representada en la figura 1.
SEC ID Nº 2 Secuencia de aminoácidos parcial ORF FHV-1 ORF1 de la figura 1.
SEC ID Nº 3 Secuencia de aminoácidos ORF FHV-1 ORF2 de la figura 1.
SEC ID Nº 4 Secuencia de aminoácidos ORF FHV-1 ORF3 de la figura 1.
SEC ID Nº 5 Secuencia de aminoácidos ORF FHV-1 ORF4 de la figura 1.
SEC ID Nº 6 Secuencia de aminoácidos ORF FHV-1 ORF5 de la figura 1.
SEC ID Nº 7 Secuencia de aminoácidos ORF FHV-1 ORF6 de la figura 1.
SEC ID Nº 8 Secuencia de aminoácidos ORF FHV-1 ORF7 de la figura 1.
SEC ID Nº 9 Secuencia de aminoácidos parcial ORF FHV-1 ORF8 de la figura 1.
SEC ID Nº 10 Oligonucleótido JCA054.
SEC ID Nº 11 Oligonucleótido JCA055.
SEC ID Nº 12 Oligonucleótido PB080.
SEC ID Nº 13 Oligonucleótido PB081.
SEC ID Nº 14 Oligonucleótido PB082.
SEC ID Nº 15 Oligonucleótido PB083.
SEC ID Nº 16 Oligonucleótido PB084.
SEC ID Nº 17 Oligonucleótido PB085.
SEC ID Nº 18 Oligonucleótido JCA056.
SEC ID Nº 19 Oligonucleótido JCA057.
SEC ID Nº 20 Oligonucleótido PB088.
SEC ID Nº 21 Oligonucleótido PB089.
SEC ID Nº 22 Oligonucleótido JCA058.
SEC ID Nº 23 Oligonucleótido JCA059.
SEC ID Nº 24 Oligonucleótido JCA060.
SEC ID Nº 25 Oligonucleótido JCA061.
SEC ID Nº 26 Oligonucleótido JCA062.
SEC ID Nº 27 Oligonucleótido JCA063.
SEC ID Nº 28 Oligonucleótido JCA064.
SEC ID Nº 29 Oligonucleótido JCA065.
SEC ID Nº 30 Oligonucleótido JCA066.
SEC ID Nº 31 Oligonucleótido JCA067.
SEC ID Nº 32 Oligonucleótido JCA068.
SEC ID Nº 33 Oligonucleótido JCA069.
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Ejemplos
Todas las construcciones de plásmidos se han realizado utilizando las técnicas estándar de biología molecular descritas por Sambrook J. y col. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor. New York. 1989). Todos los fragmentos de restricción utilizados para la presente invención se aislaron utilizando el kit "Geneclean" (BIO101 Inc. La Jolla, CA).
El virus utilizado como virus parental es la cepa CO del virus herpes felino de tipo 1 (FHV-1). Este virus se aisló a partir de células renales de un gatito recién nacido cuya madre padecía rinotraqueitis infecciosa (C. Benoit Jeannin, Tesis Doctoral de 3^{er} ciclo, Universidad de Lyon, 1983). Las condiciones de cultivo de este virus ya se han descrito (Fargeaud D. y col. Arch. Virol. 1984. 80. 69-82). En resumen, a células CRFK ("Crandell Rees Feline Kidney cells"), cultivadas en medio mínimo esencial de Eagle (medio "MEM") se les inocula la cepa FHV-1 CO utilizando una multiplicidad de infección de 1. Las células infectadas se incuban a continuación a 37ºC durante aproximadamente 36 horas, hasta la aparición de un efecto citopático completo.
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Ejemplo 1
Extracción del ADN del virus herpes felino de tipo 1
Después del cultivo, el sobrenadante y las células lisadas se recogen y la totalidad de la suspensión viral se centrifuga a 1000 g durante 10 minutos a +4ºC para eliminar los restos celulares. Las partículas virales se recogen a continuación mediante ultracentrifugado a 400000 g durante 1 hora a +4ºC. El sedimento se resuspende en un volumen mínimo de tampón (Tris 10 mM, EDTA 1 mM). Esta suspensión viral concentrada se trata con proteinasa K (100 \mug/ml final) 55 en presencia de dodecil sulfato sódico (SDS) (0,5% final) durante 2 horas a 37ºC. El ADN viral se extrae a continuación con una mezcla de fenol/cloroformo, y después se precipita con 2 volúmenes de etanol absoluto. Después de una noche a -20ºC, el ADN se centrifuga a 10000 g durante 15 minutos a +4ºC. El sedimento de ADN se seca y después se resuspende en un volumen mínimo de agua ultrapura estéril.
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Ejemplo 2
Aislamiento del ARN genómico de la cepa FIPV 79-1146 y clonación del ADN complementario
La cepa FIPV 79-1146 se cultivó en células CRFK en medio DMEM (Gibco). El ARN viral genómico se aisló utilizando la técnica de extracción con tiocianato de guanidio/fenol-cloroformo (Chomczynski P. y Sacchi N., Anal. Biochem. 1987. 162. 156-159). Se sintetizaron oligonucleótidos específicos (que comprenden en sus extremos 5' sitios de restricción para facilitar la clonación de los fragmentos amplificados) de tal manera que abarcan enteramente las regiones codificantes de los genes que deben amplificarse (respectivamente M, S y N). La reacción de transcripción inversa (RT) y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se realizaron según las técnicas estándar (Sambrook J. y col. 1989). Cada reacción de RT-PCR se realizó con una pareja de amplímeros específicos y tomando como matriz (platilla) el ARN genómico viral extraído. El ADN complementario amplificado se extrajo con fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1) entes de ser digerido por las enzimas de restricción.
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Ejemplo 3
Clonación y caracterización de la región FHV-1 ORF1 - ORF7 (fragmentos EcoRI D y EcoRI F)
EL ADN genómico purificado de la cepa CO del virus FHV-1 se digirió con EcoRI y los fragmentos D (aproximadamente 9200 pb) y F (7600 pb) se clonaron en el vector pBlueScript SKII + para dar respectivamente los plásmidos pFHVEcoRID y pFHVEcoRIF. El plásmido pFHVEcoRID se digirió con EcoRI y PstI y el fragmento EcoRI-PstI de 979 pb se aisló y ligó con el vector pBS-SKII +, previamente digerido con EcoRI y PstI para dar el plásmido pPB050. El plásmido pFHVEcoRID se digirió con PstI y el fragmento PstI-PstI de 2388 pb se aisló y ligó con el vector pBS-SKII+, previamente digerido con PstI para dar el plásmido pPB051. Los insertos contenidos en los plásmidos pFHVEcoRIF, pPB050 y pPB051 se secuenciaron completamente en las dos cadenas para dar la secuencia de la figura 1 (SEC ID Nº 1).
Varios marcos abiertos de lectura de tamaño superior a 65 aminoácidos se identificaron en esta secuencia (figura 1).
El primer marco de lectura (ORF1) (posiciones 1 - 1587) es incompleto y codifica una proteína truncada de 529 aminoácidos (SEC ID Nº 2).
El segundo marco de lectura (ORF2) (posiciones 1655 - 2596) codifica un polipéptido de 314 aminoácidos (SEC ID Nº 3).
El tercer marco de lectura (ORF3) (posiciones 2733 - 4094) se sitúa en la cadena complementaria y codifica un polipéptido de 454 aminoácidos (SEC ID Nº 4).
El cuatro marco de lectura (ORF4) (posiciones 4476 - 5660) codifica un polipéptido de 395 aminoácidos (SEC ID Nº 5).
El quinto marco de lectura (ORF5) (posiciones 5869 - 7113) codifica un polipéptido de 415 aminoácidos (SEC ID Nº 6).
El sexto marco de lectura (ORF6) (posiciones 7449 - 8900) codifica un polipéptido de 484 aminoácidos (SEC ID Nº 7).
El séptimo marco de lectura identificado en la secuencia de la figura 1 (ORF7) (posiciones 9153 - 9731) codifica una proteína de 193 aminoácidos (SEC ID Nº 8).
El octavo y último marco de lectura identificado en la secuencia de la figura 1 (ORF8) (posiciones 9908 - 10803) es incompleto. Está situado en la cadena complementaria y codifica una proteína truncada de 298 aminoácidos (SEC ID Nº 9).
Los diferentes marcos abiertos de lectura se agrupan en la siguiente tabla: (Tabla 1)
1
Se piensa que el marco abierto de lectura FHV ORF2 recientemente caracterizado es el homólogo del gen HSV-1 UL40 (RR2).
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Ejemplo 4
Construcción del plásmido donador para el sitio FHV-1 ORF2 (pPB107) (figura nº 2)
El plásmido pFHVEcoRID se digirió con EcoRI y SacII para aislar el fragmento EcoRI-SacII de 1509 pb. Un adaptador KpnI-EcoRI que contiene el sitio PmeI se obtuvo mediante hibridación de los 2 oligonucleótidos sintéticos siguientes:
JCA054 (24 mero) (SEC ID Nº 10):
5' CTTGCCGGGGTTTAAACCGGTTCG 3'
y JCA055 (32 mero) (SEC ID Nº 11):
5' AATTCGAACCGGTTTAAACCCCGGCAAGGTAC 3'
El fragmento EcoRI-SacII y el oligonucleótido de doble cadena se ligaron en el vector pBS-SKII +, previamente digerido con KpnI y SacII, para dar el plásmido pPB106 (4407 pb). Un oligonucleótido sintético de doble cadena que comprende los sitios de clonación HindIII, ClaI y ApaI se obtuvo mediante hibridación de los 2 oligonucleótidos siguientes:
PB080 (32 mero) (SEC ID Nº 12):
5' TGCAAAGCTTATCGATCCCGGGGCCCGGTGCA 3'
y PB081 (32 mero) (SEC ID Nº 13):
5' CCGGGCCCCGGGATCGATAAGCTTTGCATGCA 3'
El oligonucleótido obtenido de este modo se ligó con el plásmido pPB106, previamente digerido con PstI (sitio único en pPB106) y tratado con fosfatasa alcalina, para dar el plásmido pPB107 (4439 pb) (figura nº 2). Este plásmido contiene los brazos flanqueantes 5' (SacII-PstI 530 pb) y 3' (PstI-EcoRI 979 pb) del sitio FHV-1 ORF2 así como un sitio de clonación múltiple que permite la inserción de una casete de expresión.
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Ejemplo 5
Construcción del plásmido donador para el sitio FHV-1 ORF5 (pPB110) (figura nº 3)
El plásmido pFHVEcoRIF (véase el ejemplo 3) se digirió con SacI y SmaI para aislar el fragmento SacI-SmaI 30 de 1367 pb. Un adaptador SaII-KpnI que contiene el sitio PmeI se obtuvo mediante hibridación de los 2 oligonucleótidos siguientes:
PB082 (21 mero) (SEC ID Nº 14):
5' GGGGGCCGTTTAAACCGGTAC 3'
PB083 (17 mero) (SEC ID Nº 15):
5' CGGTTTAAACGGCCCCC 3'
El oligonucleótido de doble cadena obtenido de este modo y el fragmento SacI-SmaI de 1367 pb se ligaron con el vector pBS-SKII +, previamente digerido con KpnI y SacI para dar el plásmido pPB109 (4247 pb). Un sitio de clonación múltiple se obtuvo mediante hibridación de los 2 oligonucleótidos sintéticos siguientes:
PB084 (28 mero) (SEC ID Nº 16):
5' TCGAGAAAGCTTATCGATCCCGGGCCCG 3'
PB085 (28 mero) (SEC ID Nº 17):
5' TCGACGGGCCCGGGATCGATAAGCTTTC 3'
El oligonucleótido de doble cadena obtenido de este modo se ligó con el plásmido pPB109, previamente digerido con SaII y tratado con fosfatasa alcalina, para dar el plásmido pPB110 (4275 pb) (figura nº 3).
Este plásmido contiene los brazos flanqueantes 5' (SacI-SaII 699 pb) y 3' (SaII-SmaI 668 pb) del sitio FHV-1 ORF5 así como un sitio de clonación múltiple que permite la inserción de una casete de expresión.
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Ejemplo 6
Construcción de la casete de expresión para el gen FIPV M (figura nº 4)
Se realizó una reacción de RT-PCR con el ARN genómico de la cepa FIPV 79-1146 y con los siguientes oligonucleótidos:
JCA056 (40 mero) (SEC ID Nº 18)
5' TTTGAGCTCGCGGCCGCATGAAGTAATTTTGCTAATACTC 3'
JCA057 (27 mero) (SEC ID Nº 19)
5' TTTGGTACCGTTTAGTTACACCATATG 3'
para aislar de forma precisa el gen que codifica la glucoproteína de membrana (FIPV M) en forma de una casete SacI-KpnI. Después de la purificación, el producto de RT-PCR de 823 pb se digirió con KpnI y SacI para aislar un fragmento KpnI-SacI de 813 pb. Este fragmento se ligó con el vector pBS-SKII+, previamente digerido con KpnI y SacI, para dar el vector pJCA080 (3668 pb). La secuencia del gen M se verificó mediante secuenciación y se vio que era idéntica a la publicada anteriormente (Vennema H. y col. Virology. 1991. 181. 327-335), secuencia que se incorpora como referencia en la presente solicitud.
El plásmido pCMV\beta (CLONTECH) se digirió con EcoRI y NotI para aislar el fragmento EcoRI-NotI de 819 10 pb que contiene la región promotora del gen inmediato-temprano del citomegalovirus humano (fragmento A). El plásmido pJCA080 se digirió con KpnI y NotI para aislar el fragmento NotI-KpnI (gen FIPV M) de 804 pb (fragmento B). Los fragmentos A y B se ligaron entonces con el vector pGEM-7Zf + (Promega), previamente digerido con EcoRI y KpnI, para dar el plásmido pPB104 (4614 pb).
Se realizó una reacción de PCR con los siguientes oligonucleótidos:
PB088 (30 mero) (SEC ID Nº 20)
5' TTGGGTACCGCCTCGACTCTAGGCGGCCGC 3'
PB089 (32 mero) (SEC ID Nº 21)
5' TTGGGTACCGGATCCGAAAAAACCTCCCACAC 3'
y la matriz pCMV\beta para producir un fragmento de 252 pb que contiene la señal de poliadenilación del gen temprano del virus SV40. Este fragmento se digirió con KpnI para aislar el fragmento KpnI-KpnI de 233 pb (fragmento B). Este fragmento se ligó entonces con el plásmido pPB104, previamente digerido con KpnI y tratado con fosfatasa alcalina, para dar el plásmido pPB105 (4847 pb) (figura nº 4). Este plásmido contiene una casete de expresión promotor HCMV25 IE - gen FIPV M - polyA (señal de poliadenilación) SV40 que puede movilizarse por digestión con ApaI-ClaI o ApaI-HindIII.
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Ejemplo 7
Construcción de la casete de expresión para el gen FIPV S (figura nº 5)
Se realizó una reacción de RT-PCR con el ARN genómico de la cepa FIPV 79-1146 y con los siguientes oligonucleótidos:
JCA058 (39 mero) (SEC ID Nº 22)
5'TTTGAGCTCGCGGCCGCATGATTGTGCTCGTAACTTGCC 3'
JCA059 (38 mero) (SEC ID Nº 23)
5'TTTGGTACCGTTTAGTGGACATGCACTTTTTCAATTGG 3'
para aislar de forma precisa el gen que codifica la glucoproteína de espícula (o "spike" o también denominada en adelante "S") (FIPV S). Después de la purificación, el producto de RT-PCR de 4387 pb se digirió con KpnI y SacI para aislar un fragmento KpnI-SacI de 4375 pb. Este fragmento se ligó con el vector pBS-SKII+, previamente digerido con KpnI y SacI, para dar el vector pJCA081 (7234 pb). La secuencia del gen S se verificó mediante secuenciación y se vio que era idéntica a la publicada anteriormente (de Groot R. y col. J. Gen. Virol. 1987. 68. 2639-2646), secuencia que se incorpora como referencia en la presente solicitud.
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El plásmido pCMV\beta se digirió con EcoRI y NotI para aislar el fragmento EcoRI-NotI de 819 pb que contiene la región promotora del gen inmediato-temprano del citomegalovirus humano (fragmento A). El plásmido pJCA081 se digirió con KpnI y NotI para aislar el fragmento NotI-KpnI (gen FIPV S) de 4372 pb (fragmento B). Los fragmentos A y B se ligaron entonces con el vector pGEM-7Zf +, previamente digerido con EcoRI y KpnI, para dar el plásmido pJCA082 (8180 pb).
Se realizó una reacción PCR con los siguientes oligonucleótidos: PB088 (SEC ID Nº 20) y PB089 (SEC ID Nº 21) (véase el ejemplo 6) y la matriz pCMV\beta para producir un fragmento de 252 pb que contiene la señal de poliadenilación del gen temprano del virus SV40. Este fragmento se digirió con KpnI para aislar el fragmento KpnI-KpnI de 233 pb (fragmento B).
Este fragmento se ligó con el plásmido pJCA082, previamente digerido con KpnI y tratado con fosfatasa alcalina, para dar el plásmido pPB055 (8413 pb) (figura nº 5). Este plásmido contiene una casete de expresión promotor HCMV-IE - gen FIPV S - polyA SV40 que puede movilizarse por digestión con ApaI-ClaI.
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Ejemplo 8
Construcción del gen "Spike" modificado (FIPV S*)
La secuencia del gen FIPV S se mutagenizó para modificar las regiones responsables de la inducción de anticuerpos facilitadores, sin cambiar las funciones de la glucoproteína S. Esta modificación ya se ha descrito en la solicitud de patente FR-94 10379 (publicación Nº 2 724 385), incorporada en este documento como referencia, y se realizó de la siguiente manera:
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8.1.: Mutagénesis del sitio A1 (figura nº 6)
El fragmento central del gen FIPV S HindIII-HindIII de 1723 pb (nucleótidos 1696 a 3418) se clonó en el vector pBS-SKII +, previamente digerido con HindIII y tratado con fosfatasa alcalina, para dar el plásmido pJCA083 (4678 pb). El sitio A1 se sitúa en el sub-fragmento HindIII-SspI (posiciones 1696 a 1845) de este fragmento.
El sitio A1 se mutagenizó mediante PCR utilizando la siguiente estrategia:
Se sintetizaron los siguientes oligonucleótidos:
JCA060 (95 mero) (SEC ID Nº 24)
5'ATGAAGCTTAGTGGTTATGGTCAACCCATAGCCTCGACACTAAGTAACATCACACTACCAATG CAGGATAACAATACTGTTGTGTACTGTATTCG 3'
JCA061 (88 mero) (SEC ID Nº 25)
5'AAAAATATTGTACCATAAAGAACTTTTGCAAGTGGAATGAACATAAACTGAGAATTGGTTAG AACGAATACAGTACACAACAGTATTG 3'
JCA062 (20 mero) (SEC ID Nº 26)
5' ATGAAGCTTAGTGGTTATGG 3'
JCA063 (20 mero) (SEC ID Nº 27)
5' AAAAATATTGTACCATAAAG 3'
Los oligonucleótidos JCA060 y JCA061 se hibridaron entre sí gracias a su secuencia complementaria común de 23 pares de bases. El híbrido obtenido de este modo se utilizó, después de la elongación de sus extremos 3', como matriz para una reacción de PCR utilizando los oligonucleótidos JCA062 y JCA063. Esta reacción de amplificación por PCR permitió obtener un fragmento de 159 pb. Este fragmento se digirió con HindIII y SspI para producir un fragmento HindIII-SspI de 149 pb (fragmento A). Este fragmento contiene el sitio A1 modificado en dos posiciones (Val en lugar de Asp en la posición 568 y Tyr en lugar de Asp en la posición 591). El plásmido pJCA083 se digirió con HindIII y se digirió parcialmente con SspI para aislar el fragmento SspI-HindIII de 1569 pb (fragmento B) con Geneclean (BIO101 Inc., La Jolla. Ca.).
El vector pBS-SKII+ se digirió con HindIII y se trató con fosfatasa alcalina para producir el fragmento C (2960 pb).
A continuación, los fragmentos A, B y C se ligaron juntos para producir el plásmido pJCA084 (4678 pb) 35 (figura nº 6). Este plásmido contiene el fragmento HindIII-HindIII del gen FIPV S modificado en dos aminoácidos del sitio A1.
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El gen FIPV S puede reconstituirse a continuación sustituyendo el fragmento HindIII-HindIII natural (posiciones 1696 a 3418) por el fragmento HindIII-HindIII contenido en el plásmido pJCA084. El gen completo FIPV S modificado en el sitio A1 puede utilizarse entonces para construcciones de plásmidos de expresión o de virus recombinantes.
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8.2.: Mutagénesis del sitio A2 (figura nº 7)
Se sintetizaron los siguientes oligonucleótidos:
JCA064 (20 mero) (SEC ID Nº 28)
5' GGACAATATTTTTAATCAAG 3'
JCA065 (36 mero) (SEC ID Nº 29)
5' TTTAACAACCTGCTCATTGGTTCCTGTACGTGCAGC 3'
JCA066 (36 mero) (SEC ID Nº 30)
5' AAGTTTTATGTTGCTGCACGTACAGGAACCAATGAG 3'
JCA067 (20 mero) (SEC ID Nº 31)
5' ATCACTAACATTTTTAAAGC 3'
Se realizó una reacción de PCR (PCR A) con los oligonucleótidos JCA064 y JCA065 y con el plásmido pJCA083 como matriz para sintetizar un fragmento de PCR de 199 pb (fragmento A).
Se realizó una reacción de PCR (PCR B) con los oligonucleótidos JCA066 y JCA067 y con el plásmido pJCA083 como matriz para dar un fragmento de PCR de 273 pb (fragmento B).
Los fragmentos de PCR A y B se hibridaron entre sí gracias a su región complementaria de 46 pb y el producto de esta hibridación, después de la elongación de los extremos 3', se amplificó mediante una reacción de PCR (PCR C) con los oligonucleótidos JCA064 y JCA067 para dar un fragmento de PCR de 424 pb. Este fragmento de PCR se digirió con SspI y DraI para dar el fragmento de restricción SspI-DraI de 402 pb (fragmento C).
El plásmido pJCA083 se digirió con HindIII y SspI para aislar el fragmento HindIII-SspI de 149 pb (fragmento D).
El plásmido pJCA083 se digirió con HindIII y DraI para aislar el fragmento de restricción DraI-HindIII de 1170 pb (fragmento E).
El vector pBS-SKII + se digirió con HindIII y se trató con fosfatasa alcalina para dar el fragmento F (2960 pb).
Los fragmentos C, D, E y F se ligaron juntos posteriormente para dar el plásmido pJCA085 (4678 pb) (figura nº 7). El fragmento central HindIII-HindIII 1723 pb del gen FIPV S contenido en pJCA085 posee un sitio A2 modificado a nivel de 3 aminoácidos (Tyr en lugar de Asp en la posición 643, Gly en lugar de Arg en la posición 649, y Lys en lugar de Arg en la posición 656).
El gen FIPV S puede reconstituirse a continuación sustituyendo el fragmento HindIII-HindIII natural (posiciones 1696 a 3418) por el fragmento HindIII-HindIII contenido en el plásmido pJCA085. El gen completo FIPV S modificado en el sitio A2 puede utilizarse entonces para construcciones de plásmidos de expresión o de virus recombinantes.
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8.3.: Mutagénesis de los sitios A1 y A2 (figura nº 8)
Los fragmentos A (ejemplo 8.1), C y E (ejemplo 8.2) se ligaron con el vector pBS-SKII+, previamente digerido con HindIII y tratado con fosfatasa alcalina, para dar el plásmido pJCA085. El fragmento central HindIII-HindIII de 1723 pb del gen FIPV S contenido en pJCA085 presenta 2 cambios de aminoácidos a nivel del sitio A1 (véase el ejemplo 8.1) y 3 cambios de aminoácidos a nivel del sitio A2 (véase el ejemplo 8.2).
El plásmido pJCA081 (ejemplo 7) se digirió con HindIII para aislar el fragmento HindIII-HindIII de 5511 pb (fragmento A). El plásmido pJCA085 se digirió con HindIII para aislar el fragmento HindIII-HindIII de 1723 pb (que presenta 5 cambios de aminoácidos con respecto a la secuencia de la cepa FIPV 79-1146) (fragmento B). Los fragmentos A y B se ligaron juntos para dar el plásmido pJCA087 (7234 pb) (figura nº 8). Este plásmido contiene el gen FIPV S modificado a nivel de los sitios A1 y A2 (= gen FIPV S*).
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8.4. Construcción de la casete de expresión para el gen FIPV S* (figura nº 9)
El plásmido pCMV\beta se digirió con EcoRI y NotI para aislar el fragmento EcoRI-NotI de 819 pb que contiene la región promotora del gen inmediato-temprano del citomegalovirus humano (fragmento A). El plásmido pJCA087 (ejemplo 8.3) se digirió con KpnI y NotI para aislar el fragmento NotI-KpnI (gen FIPV S) de 4372 pb (fragmento B). Los fragmentos A y B se ligaron entonces con el vector pGEM-7Zf+, previamente digerido con EcoRI y KpnI, para dar el plásmido pJCA088 (8180 pb).
Se realizó una reacción de PCR con los siguientes oligonucleótidos:
PB088 (SEC ID Nº 20) y PB089 (SEC ID Nº 21) (véase el ejemplo 6) y la matriz pCMV\beta para producir un fragmento de 252 pb que contiene la señal de poliadenilación del gen temprano del virus SV40. Este fragmento se digirió con KpnI para aislar el fragmento KpnI-KpnI de 233 pb (fragmento B).
Este fragmento se ligó con el plásmido pJCA088, previamente digerido con KpnI y tratado con fosfatasa alcalina, para dar el plásmido pPB056 (8413 pb) (figura nº 9). Este plásmido contiene una casete de expresión promotor HCMV-IE - gen FIPV S* - polyA SV40 que puede movilizarse por digestión con ApaI-ClaI.
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Ejemplo 9
Construcción de la casete de expresión para el gen FIPV N (figura nº 10)
Se realizó una reacción de RT-PCR con el ARN genómico de la cepa FIPV 79-1146 y con los siguientes oligonucleótidos:
JCA068 (37 mero) (SEC ID Nº 32)
5' TTTGAGCTCGCGGCCGCATGGCCACACAGGGACAACG 3'
JCA069 (33 mero) (SEC ID Nº 33)
5' TTTGGTACCGTTTAGTTCGTAACCTCATCAATC 3'
para aislar de forma precisa el gen que codifica la proteína de la nucleocápsida "N" (FIPV N). Después de la purificación, el producto de RT-PCR de 1161 pb se digirió con KpnI y SacI para aislar un fragmento SacI-KpnI de 1148 pb. Este fragmento se ligó con el vector pBS-SKII +, previamente digerido con KpnI y SacI, para dar el vector pJCA089 (4007 pb). La secuencia del gen N se verificó mediante secuenciación y se vio que era idéntica a la publicada anteriormente (Vennema H. y col. Virology. 1991. 181. 327-335), secuencia que se incorpora como referencia en la presente solicitud.
El plásmido pCMV\beta (CLONTECH) se digirió con EcoRI y NotI para aislar el fragmento EcoRI-NotI de 819 pb que contiene la región promotora del gen inmediato-temprano del citomegalovirus humano (fragmento A). El plásmido pJCA089 se digirió con KpnI y NotI para aislar el fragmento NotI-KpnI (gen FIPV N) de 1137 pb (fragmento B). Los fragmentos A y B se ligaron con el vector pGEM-7Zf+, previamente digerido con EcoRI y KpnI, para dar el plásmido pJCA090 (4953 pb).
Se realizó una reacción de PCR con los siguientes oligonucleótidos:
PB088 (SEC ID Nº 20) y PB089 (SEC ID Nº 21) (ejemplo 6) y la matriz pCMV\beta para producir un fragmento de 252 pb que contiene la señal de poliadenilación del gen temprano del virus SV40. Este fragmento se digirió con KpnI para aislar el fragmento KpnI-KpnI de 233 pb (fragmento B). Este fragmento se ligó entonces con el plásmido pJCA090, previamente digerido con KpnI y tratado con fosfatasa alcalina, para dar el plásmido pJCA091 (5186 pb) (figura nº 10). Este plásmido contiene una casete de expresión promotor HCMV-IE - gen FIPV N - polyA SV40 que puede movilizarse por digestión con ApaI-ClaI o ApaI-HindIII.
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Ejemplo 10
Construcción del plásmido donador pPB111 y aislamiento de vFHV01 (figura nº 11)
El plásmido pPB105 (ejemplo 6, figura nº 4) se digirió con ApaI y HindIII para aislar el fragmento ApaI-HindIII de 1925 pb (fragmento A). El plásmido pPB107 (ejemplo 4, figura nº 2) se digirió con ApaI y HindIII para aislar el fragmento ApaI-HindIII de 4419 pb (fragmento B). Los fragmentos A y B se ligaron juntos para dar el plásmido pPB111 (6332 pb) (figura nº 11).
Este plásmido contiene la casete de expresión HCMV-IE/gen FIPV M/polyA SV40 en el sitio FHV ORF2.
El plásmido pPB111 se linealizó mediante digestión con PmeI, se extrajo con una mezcla de fenol-cloroformo, se precipitó con etanol absoluto, y después se resuspendió en agua estéril.
Células CRFK, que forman un tapiz celular bien establecido en placa de Petri (Corning 4,5 cm de diámetro) se transfectaron a continuación con la siguiente mezcla:
1 \mug de plásmido pPB111 linealizado + 5 \mug de ADN viral de FHV-1 en 300 \mul de medio MEM y 100 \mug de LipofectAMINE (Gibco-BRL Cat# 18324-012) diluidos en 300 \mul de medio (volumen final de la mezcla = 600 \mul). Estos 600 \mul se diluyeron a continuación en 3 ml (volumen final) de medio MEM y se extendieron en 3x10^{6} células CRFK. La mezcla se dejó en contacto con las células durante 5 horas, y después se eliminó y sustituyó por 5 ml de medio de cultivo. Las células se dejaron entonces en cultivo durante 24 horas a + 37ºC. Después de de 24 horas a 48 horas de cultivo, se recogió 1 ml de sobrenadante de cultivo y varias diluciones de este sobrenadante se utilizaron para infectar nuevas células CRFK (cultivadas en placa de Petri (Corning 4,5 cm de diámetro) para obtener placas (virales) aisladas, estando cada placa (de Petri) infectada con 1 ml de una dilución del sobrenadante inicial. Después de un contacto de 1 hora a 37ºC, el medio de infección se eliminó y sustituyó por 5 ml de medio MEM al 1% de agarosa, mantenido en estado de sobreenfriamiento a 42ºC. Cuando la agarosa se solidificó, las placas se incubaron 48 horas a 37ºC en estufa de CO_{2} hasta la aparición de placas. La capa de agarosa se eliminó entonces y se realizó una transferencia de las placas virales a una membrana estéril de nitrocelulosa del mismo diámetro que la placa de Petri que sirvió para el cultivo. Esta membrana se transfirió a su vez a otra membrana de nitrocelulosa para obtener una "copia" invertida de la primera transferencia. Las placas (virales) transferidas en esta última copia se hibridaron entonces, según las técnicas habituales conocidas por el experto en la materia, con un fragmento del gen FIPV M marcado con digoxigenina (DNA Labelling Kit, Boehringer Mannheim, CAT # 1175033). Después de la hibridación, lavados y puesta en contacto con el sustrato de revelado, la membrana de nitrocelulosa se puso en contacto con una película aurorradiográfica. Las imágenes de hibridación positiva en esta membrana indicaban cuales eran las placas (virales) que contenían virus FHV recombinantes que han insertado la casete FIPV M. Las placas (virales) que corresponden a esta placas (virales) positivas se recortaron de forma estéril en la primera membrana de nitrocelulosa, se colocaron en un tubo Eppendorf que contenía 0,5 ml de medio MEM y se sonicaron para liberar los viriones de la membrana. El medio contenido en el tubo Eppendorf se diluyó a continuación en medio MEM y las diluciones obtenidas de este modo sirvieron para infectar nuevos cultivos de células CRFK. Un virus recombinante, que contiene la casete HCMV-IE/FIPV M/polyA insertada en el sitio ORF2, puro al 100% se aisló de este modo después de 3 ciclos de purificación y se denominó vFHV01. La homología de la recombinación se verificó mediante PCR utilizando oligonucleótidos situados a uno y otro lado del sitio de inserción. La ausencia de reorganización en el genoma del virus recombinante vFHV01, además de en la región de recombinación, se verificó mediante la técnica de transferencia de Southern.
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Ejemplo 11
Construcción del plásmido donador pPB112 y aislamiento de vFHV02 (figura nº 12)
El plásmido pPB056 (ejemplo 8.4, figura nº 9) se digirió con ApaI y ClaI para aislar el fragmento ApaI-ClaI de 5466 pb (fragmento A). El plásmido pPB107 (ejemplo 4, figura nº 2) se digirió con ApaI y ClaI para aislar el fragmento ApaI-Clal de 4426 pb (fragmento B). Los fragmentos A y B se ligaron juntos para dar el plásmido pPB112 (9898 pb) (figura nº 12). Este plásmido contiene la casete de expresión (HCMV-IE/gen FIPV S*/polyA SV40) en el sitio FHV-1 ORF2.
Células CRFK se transfectaron con una mezcla de plásmido pPB112 (linealizado con PmeI) y de ADN viral de FHV-1 como se ha descrito en el ejemplo 10. Una placa viral positiva para la casete HCMV-IE/gen FIPV S* se purificó como se ha descrito en el ejemplo 10, pero utilizando una sonda homóloga FIPV S*, y se amplificó para dar el virus recombinante vFHV02.
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Ejemplo 12
Construcción del plásmido donador pPB113 y aislamiento de vFHV03 (figura nº 13)
El plásmido pJCA091 (ejemplo 9, figura nº 10) se digirió con ApaI y HindIII para aislar el fragmento ApaI-HindIII de 2244 pb (fragmento A). El plásmido pPB107 (ejemplo 4, figura nº 2) se digirió con ApaI y HindIII para aislar el fragmento ApaI-HindIII de 4419 pb (fragmento B). Los fragmentos A y B se ligaron juntos para dar el plásmido pPB113 (6671 pb) (figura nº 13).
Este plásmido contiene la casete de expresión (HCMV-IE/gen FIPV N/polyA SV40) en el sitio FHV-1 ORF2.
Células CRFK se transfectaron con una mezcla de plásmido pPB113 (linealizado con PmeI) y de ADN viral de FHV-1 como se ha descrito en el ejemplo 10. Una placa viral positiva para la casete HCMV-IE/gen FIPV N se purificó como se ha descrito en el ejemplo 10, pero utilizando una sonda homóloga FIPV N, y se amplificó para dar el virus recombinante vFHV03.
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Ejemplo 13
Construcción del plásmido donador pPB114 y aislamiento de vFHV04 (figura nº 14)
El plásmido pPB105 (ejemplo 6, figura nº 4) se digirió con ApaI y HindIII para aislar el fragmento ApaI-HindIII de 1925 pb (fragmento A). El plásmido pPB110 (ejemplo 5, figura nº 3) se digirió con ApaI y HindIII para aislar el fragmento ApaI-HindIII de 4256 pb (fragmento B). Los fragmentos A y B se ligaron juntos para dar el plásmido pPB114 (6169 pb) (figura nº 14). Este plásmido contiene la casete de expresión (HCMV-IE/gen FIPV M/polyA SV40) en el sitio FHV-1 ORF5.
Células CRFK se transfectaron con una mezcla de plásmido pPB114 (linealizado con PmeI) y de ADN viral de FHV-1 como se ha descrito en el ejemplo 10. Una placa viral positiva para la casete HCMV-IE/gen FIPV M se purificó como se ha descrito en el ejemplo 10 y se amplificó para dar el virus recombinante vFHV04.
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Ejemplo 14
Construcción del plásmido donador pPB115 y aislamiento de vFHV05 (figura nº 15)
El plásmido pPB056 (ejemplo 8.4, figura nº 9) se digirió con ApaI y ClaI para aislar el fragmento ApaI-ClaI de 5466 pb (fragmento A). El plásmido pPB110 (ejemplo 5, figura nº 3) se digirió con ApaI y ClaI para aislar el fragmento ApaI-ClaI de 4263 pb (fragmento B). Los fragmentos A y B se ligaron juntos para dar el plásmido pPB115 (9735 pb) (figura nº 5). Este plásmido contiene la casete de expresión (HCMV-IE/gen FIPV S*/polyA SV40) en el sitio FHV-1 ORF5.
Células CRFK se transfectaron con una mezcla de plásmido pPB115 (linealizado con PmeI) y de ADN viral de FHV-1 como se ha descrito en el ejemplo 10. Una placa viral positiva para la casete HCMV-IE/gen FIPV S* se purificó como se ha descrito en el ejemplo 10, pero utilizando una sonda homóloga FIPV S*, y se amplificó para dar el virus recombinante vFHV05.
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Ejemplo 15
Construcción del plásmido donador pPB116 y aislamiento de vFHV06 (figura nº 16)
El plásmido pJCA091 (ejemplo 9, figura nº 10) se digirió con ApaI y HindIII para aislar el fragmento ApaI-HindIII de 2244 pb (fragmento A). El plásmido pPB110 (ejemplo 5, figura nº 3) se digirió con ApaI y HindIII para aislar el fragmento ApaI-HindIII de 4256 pb (fragmento B). Los fragmentos A y B se ligaron juntos para dar el plásmido pPB116 (6508 pb). Este plásmido contiene la casete de expresión (HCMV-IE/gen FIPV N/polyA SV40) en el sitio FHV-1 ORF5.
Células CRFK se transfectaron con una mezcla de plásmido pPB116 (linealizado con PmeI) y de ADN viral de FHV-1 como se ha descrito en el ejemplo 10. Una placa viral positiva para la casete HCMV-IE/gen FIPV N se purificó como se ha descrito en el ejemplo 10, pero utilizando una sonda homóloga FIPV N, y se amplificó para dar el virus recombinante vFHV06.
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Ejemplo 16
Construcción de plásmidos donadores para la inserción de casetes de expresión en el sitio ORF2 de FHV-1
Según la misma estrategia que la descrita anteriormente para la inserción de casetes de expresión (genes situados bajo el control de los promotores HCMV-IE o MCMV-IE o doble promotor MCMV-IE/RNA 1,8 kpb) en el sitio ORF2, es posible construir virus herpes felinos recombinantes que expresan a nivel elevado inmunogenes del calicivirus felino (FCV), del virus de la panleucopenia felina (FPV), del virus de la leucemia felina (FeLV), del virus de la inmunodeficiencia felina (FIV), o de otros patógenos felinos, o también de citoquinas felinas.
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Ejemplo 17
Construcción de plásmidos donadores para la inserción de casetes de expresión en el sitio ORF5 de FHV-1
Según la misma estrategia que la descrita anteriormente para la inserción de casetes de expresión (genes situados bajo el control de los promotores HCMV-IE o MCMV-IE o doble promotor MCMV-IE/RNA 1,8 kpb) en el sitio ORF5, es posible construir virus herpes felinos recombinantes que expresan a nivel elevado inmunogenes de los virus FCV, FPV, FeLV, FIV, o de otros patógenos felinos, o también de citoquinas felinas.
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Ejemplo 18
Producción de vacunas
Para producir una vacuna, los virus recombinantes obtenidos según la invención se cultivan en células CRFK. La recogida del virus recombinante se realiza cuando el efecto citopático es completo. Las células lisadas y el sobrenadante de cultivo se recogen. Después de la clarificación del lisado celular para eliminar los restos celulares, se determina la dilución máxima detectable de la solución viral. La solución viral se diluye a continuación en una solución estabilizada para la liofilización, se distribuye a razón de una dosis de vacuna (de 10^{2} DICC50 a 10^{7} DICC50) por vial, y finalmente se liofiliza.
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Referencias citadas en la descripción
Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad en este respecto.
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Claims (22)

1. Vacuna viva recombinante que comprende, como vector, un virus herpes felino que comprende y que expresa al menos una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido, estando esta secuencia insertada en los sitios ORF5 y/o ORF2 de FHV, sitios que, en el sitio FHV-1 CO, presentan las secuencias de nucleótidos de posiciones respectivas 5869-7113 y 1655-2596 en la SEC ID Nº: 1.
2. Vacuna viva recombinante según la reivindicación 1, caracterizada porque la o las secuencias de nucleótidos se insertan en los sitios ORF5 y/o ORF2 mediante inserción simple, o después de la eliminación total o parcial de estos sitios.
3. Vacuna viva recombinante según la reivindicación 1, caracterizada porque la o las secuencias de nucleótidos se insertan en uno de los sitios ORF5 o ORF2, y porque se realiza una eliminación en el otro de estos sitios.
4. Vacuna viva recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque, para expresar la secuencia insertada, el vector comprende un promotor eucariota fuerte.
5. Vacuna viva recombinante según la reivindicación 4, caracterizada porque el promotor fuerte es un promotor inmediato temprano de CMV, preferentemente el promotor inmediato temprano de CMV múrido o humano.
6. Vacuna viva recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque comprende al menos dos secuencias de nucleótidos insertadas en el sitio ORF5 o ORF2 bajo el control de promotores eucariotas diferentes.
7. Vacuna viva recombinante según la reivindicación 6, caracterizada porque los promotores eucariotas son promotores inmediatos tempranos de CMV de orígenes animales diferentes.
8. Vacuna viva recombinante según la reivindicación 6, caracterizada porque comprende una primera secuencia de nucleótidos asociada al promotor inmediato temprano de CMV y otra secuencia de nucleótidos asociada a otro promotor, teniendo los dos promotores sus extremos 5' adyacentes.
9. Vacuna viva recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada porque comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido antigénico, estando esta secuencia insertada en los sitios ORF5 y/o ORF2.
10. Vacuna viva recombinante según la reivindicación 9, caracterizada porque comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido antigénico de un agente patógeno felino, estando esta secuencia insertada en los sitios ORF5 y/o ORF2.
11. Vacuna viva recombinante según la reivindicación 10, caracterizada porque comprende una secuencia que codifica un antígeno seleccionado entre el grupo de los antígenos del virus de la peritonitis infecciosa felina, del virus de la leucemia felina, del virus de la inmunodeficiencia felina, del virus de la panleucopenia infecciosa felina y del calicivirus felino, estando esta secuencia insertada en los sitios ORF5 y/o ORF2.
12. Vacuna viva recombinante según la reivindicación 10, caracterizada porque comprende una secuencia de nucleótidos, seleccionada entre las secuencias de nucleótidos que codifican los polipéptidos M, S modificado o N de FIPV, estando esta secuencia insertada en los sitios ORF5 y/o ORF2.
13. Vacuna viva recombinante según la reivindicación 10, caracterizada porque comprende al menos una secuencia de nucleótidos seleccionada entre el grupo de las secuencias que corresponden a los antígenos env, gag, pol del virus de la leucemia felina, a los antígenos env, gag, pol del virus de la inmunodeficiencia felina, al antígeno de la cápsida VP2 del virus de la panleucopenia infecciosa felina, al antígeno de la cápsida del calicivirus felino, a los antígenos M, S modificado, N, 7b, polimerasa del virus de la peritonitis infecciosa felina.
14. Vacuna viva recombinante según el conjunto de las reivindicaciones 8 y 12, caracterizada porque la secuencia de nucleótidos insertada bajo el control del promotor inmediato temprano de CMV es una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido M, N o S modificado del virus FIPV y porque la secuencia de nucleótidos insertada bajo el control del promotor asociado es una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno de otra enfermedad
felina.
15. Vacuna viva recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizada porque comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido inmunomodulador, estando esta secuencia insertada en los sitios ORF5 y/o ORF2.
16. Vacuna viva recombinante según la reivindicación 15, caracterizada porque esta secuencia de nucleótidos se selecciona entre el grupo de las secuencias que codifican citoquinas.
17. Fórmula de vacuna multivalente que comprende, en forma de mezcla o para mezclar, al menos dos vacunas vivas recombinantes según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, comprendiendo estas vacunas secuencias insertadas diferentes.
18. Fragmento de ADN que comprende al menos una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por:
- la secuencia definida por las posiciones 1 a 8193 en la SEC ID Nº: 1;
- la secuencia del sitio ORF2 definida por las posiciones 1655 a 2596 en la SEC ID Nº:1;
- la secuencia del sitio ORF5 definida por las posiciones 5869 a 7113 en la SEC ID Nº:1;
- las secuencias flanqueantes de 100 a 800 pb situadas cadena arriba y cadena abajo del sitio ORF2 en la SEC ID Nº:1;
- las secuencias flanqueantes de 100 a 800 pb situadas cadena arriba y cadena abajo del sitio ORF5 en la SEC ID Nº:1
19. Utilización de una vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 1-16 o de una fórmula de vacuna según la reivindicación 17 para la preparación de una vacuna para gatos que se administrará por vía parenteral o local.
20. Utilización según la reivindicación 19, en la que dicha vacuna para gatos se administrará por vía oronasal.
21. Utilización según la reivindicación 19 ó 20, en la que la dosis de vacuna es de 10^{2} DICC50 a 10^{7} DICC50.
22. Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones 19-21, en la que dicha vacuna para gatos se administrará en una sola vez.
ES96939150T 1995-11-30 1996-11-19 Vacuna viva recombinate a base de virus herpes felino de tipo 1, particularmente contra la peritonitis infeccion felina. Expired - Lifetime ES2320938T3 (es)

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