JPH04506900A - ネコ・カリシウイルス遺伝子 - Google Patents
ネコ・カリシウイルス遺伝子Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
ネコ・カリ/ウィルス遺伝子
発明の分野
本発明は組換えDNAに関する。さらに詳しくは、本発明はネコ・カリシウィル
ス蛋白質およびそれに関連するポリペプチドをコードするDNA配列に関する。
これらのDNA配列は、動物がネコ・カリシウィルスに感染しているか否かを判
断するために当該動物をスクリーニングするのに、またそれによりフードされる
ポリペプチドを発現させるのにも宵用である。該ポリペプチドは、ネコをカリシ
ウィルス感染から保護するためのサブユニットワクチンとしておよび異なるウィ
ルスよりなる多価ワクチンとして診断キットで用いることができる。
発明の背景
該カリ/ウィルスはり+)鎖で、セグメント化されていない、ポリアデニル化R
NAゲ/ムを有する小ウィルスの一群である。これらの無エンヘローブ・ウィル
スの浮遊密Ut 1 、36〜1.39g/m12である[オグレスパイ・エイ
・ニスら(Oglesby、^、S、、et al、)、 rブタ水庖疹のブタ
・ウィルスの生物化学的および生物物理学的特性(Biochemical a
nd biophysical properties of vesicul
arexanthema of 5w1ne virus)j 、パイロロジー
(Virology)、44 。
329〜341頁(197L);ブラフス・ジエイ・エフおよびブラウン・エフ
(Burroghs、 J、 N and Brown、 F、)、カリシウィ
ルスの再分類についての物理−化学的証拠(Physico−cheIIIic
al evidence forreclassification of t
he calciviruses)、ジャーナル0オブ1ジエネラル・パイoo
ジー(J、GenJirol、)、 22.281〜285頁(1974)、セ
ルゲル・エム・イーら(Soergel、 M、 E、 、 et at)、鰭
脚類から単離したカリシウィルス血清型の生物物理学的比較(BioPhysi
calcomparison of calicivirus 5erotyp
es 1solated f’rom pinnipeds)、インターバイo
oジー(Intervirology)、5 、 239〜244頁(1975
)]。この群のメンバーはネコ・カリ/ウィルス(FCV)、す7−ミゲエル・
/−・ライオン・ウィルス(San Miguel sea 1ionviru
s) (SMSV) 、ブタの水庖疹ウィルス(VEV)およびヒト・カリ/ウ
ィルスを包含する[(シャファー・エフ・エル(Schaffer、 F、 L
、 )、コンパラテイブ舎バイooジー(ComparaL 1ve1/iro
logy)中のカリシウィルス(Caliciviruses)、14 (フレ
ンケルーコンラート・エイチおよびワーグナー・アール(Fraenkel−C
onrat、H,and Wagner、R,)l)、 249〜284頁(t
979))]。
カカリシイルスはかなり広く分布し、かつ従来信じられていたよりもしばしば病
気を引き起こしかねないという証拠が増えつつある[バーロフ・ジェイ・イーら
(Barlough、 J、 E、 、 et al)、パシフイノク(pac
ific)セイウチに′おける海洋カリシウィルスに対する抗体(Antibo
dies to marine calciviruses in the p
acific walrus)、ジャーナル・サブ・ワイルドライフ・デイジー
ジズ(J、 WildlifeDis、)、22,165〜168頁(1986
);クビノト・ダブり1−・ディら(Cubbitt、買、D、、et al)
、カリシウィルスによって弓1き起こされる冬季嘔吐病(買1nter vom
iting disease caused bycaliciviruses
)、ジャーナル・サブ・クリニカル・ノfソロジー(J、Cl1n、 Path
、)、32. 786〜793 (1979) ; /+ソファ−エフ・エルら
(Schaf「er+ F、 L、 、 et al)、イスの糞から単離され
た新しいカリ/ウィルスの特徴付け(Characterization of
a newcalicivirus 1solatad froa fece
s of a dog)、アーカイブズ6オブ・パイロロジー(Arch、Vi
rol、)、84. 181〜195頁(1985)、スミス・エイ・ダブリ−
(Smith、 A、 W、 )、動物原性感染症についてのCRCハンドブッ
ク・シリーズ(CRCHandbook 5eriesin Zoonoses
)中のカリシウィルスについての海洋保有宿主(Marinereservoi
rs for caliciviruses)、セクト3ビイ (Sect、B
、)、II巻。
182〜190頁(1981)]。ネコ・カリシウィルスはネコ集団において二
二キタス(uniquitous)であり、病気を引き起こすことが示されてき
た[(ジレスビー・ジェイ・エイチおよびスコツト・エフ・ダブり1−(Gil
lespie、 J、 H,and 5eott、 F、頁、)、ネコ・ウィル
ス感染(Feline viral 1nfections)、アドブ+6ト1
サイ+7ンプ・メドゥ(^dv、 Vet、Sci、Conp、Med、)、1
7. 163〜200頁(1973);シャファー・エフ・エル(Schaff
er、 F、 L、 )、コンパラティグ・パイロロジー(Comparati
ve Virology)中のカリンウィルス(Caliciviruses)
、14 、 249〜284頁(1979)、これらのウィルスについてはほと
んど知られておらず、分子生物学およびこれらのウィルスの関連性に関する研究
が欠如している。
ネコにおいてFCV感染によって生じる病気の兆候は、関係する株、暴露の程度
および宿主の耐性に応じて顕著に変動する。ある株は明らかに病気をほとんど引
き起こさないか、あるいは兆候がない。
毒性の低い株は発熱を生じさせないか、あるいは穏やかな発熱を生じさせるに過
ぎないが、舌、硬口蓋および鼻の潰瘍を生じさせる。
高毒性株は発熱、食欲不振、機能低下、呼吸困難または多呼吸を生じさせ、特に
新生児動物では頻繁に死を起こす。舌、硬口蓋および鼻の潰瘍は、高毒性の株に
よって生じる肺兆候に加えて起こり得るが常には起こらない。FCV株は尿道炎
−膀腔炎の原因作用にある程度関係があるともされてきた。
多数の血清学的に区別できるFCV株が認められるに拘わらず、それらは共通の
抗原をつくつか持つ。1のFCV株に対する活性な免疫性を持つことが証明され
たネコは、しばしば、他のFCV株によって感染された場合に病気に対して耐性
である。従って、無毒FCV株は多くに対して広く抗原原性たり得るが、恐らく
、毒性味ならびに無毒性FCVすへてかそうなり得るものではない。
FCVは少なくとも1年間、キャリア・ネコの咽喉から、および糞中に放出され
ることが示されている。回復したネコはしばしばキャリアとなりうるので、放出
は天然における当該ウィルスの執拗性が説明される。
FCV感染の罹患率は高い傾向にあり、重症兆候を伴う肺疾患子ネコにおける死
亡率は100%に近付く可能性がある。舌潰瘍によって特徴付けられる温和形態
の病気はめったに死に至らない。
毒性の高いまたは肺のFCVの主な臨床的特徴は発熱、食欲不振、機能低下、呼
吸困難または多呼吸である。該病気はまず発熱(104〜105F)および食欲
不振または多呼吸として現れる。
該発熱は最初の昇温の後変動する傾向にあるが、体温は該病気の間を通じて昇温
したままである。多呼吸または呼吸困難は最初の発熱の発生後まもなく現れ、湿
性う音が聴診され得る。機能低下は顕著な傾向にあり、明らかな呼吸困難を除き
、感染したネコはネコ汎白血球減少症に罹るようである。死は兆候の開始から数
日以内に起こる。純粋な肺形態のFCV感染は新生児(14〜21日齢)および
4月齢までの離乳ネコの間で最も盛んである。高毒性のFCVに暴露されたより
齢のいった罹患ネコは滲出性肺炎を示唆する最初の兆候を示し、次いで増殖し、
該ネコが回復するに従いまばらとなる。この齢の群において、口および鼻の潰瘍
は肺炎と同時には起こらない。
ネコ呼吸器病合併症を制御するのに用いる殆どのワクチンはFCVコンポーネン
トを含有する。ネコにおける呼吸器病は、通常、異なる因子たるFCV、FHV
およびクラミジア種によって引き起こされる。これらの因子は一緒にあるいは単
独で作用することができ、1の因子による感染は他の因子による感染から臨床的
に区別できない。この合併症の原因部により各病原体からの抗原を含有するワク
チンが導かれた。該FCVは非病原性株であるか、あるいは非常に低毒性のうち
の1つである。しかしながら、FCVワクチンの非経口注射後の攻撃に対する耐
性が生じるのは遅い。首尾よくワクチン接種したネコでさえ、感染状態となりか
ねず、引き続き攻撃ウィルスを放出する。
FCV類は優れた抗原であり、ワクチン接種した、または以前に感染したネコは
高レベルの全身液性抗体を発達させる。かかるクイーン(qu、een)からの
子ネコは初乳中に母親ネコの抗体を得る。不幸にも、受動的に受け継いだ高レベ
ルの抗体を持つ子ネコでさえ、その呼吸管が高毒性のFCVに暴露されると、死
に至る肺FCV感染に罹りかねない。明らかに、循環抗体が感染領域まで拡散す
る機会を持つ以前に、かかるFCVは肺中で十分に樹立されてしまう。このタイ
プの状況において、鼻孔内ワクチン接種は1〜2週齢と早く子ネコで開始するこ
とができ、局所ならびに全身耐性を得る試みでは3週間毎に繰り返す。不幸なこ
とに、このアプローチは一律には成功していない。従って、予防は衛生的および
隔離的方法によってウィルスへの暴露を避けることに依っている〔(フィーライ
ン・メデインン(Feline Medicine)、ビイ・ダブリュー・ブラ
ート(p、w。
Pratt)ii、 97〜99頁(1983)]。
前記したごとく、多くの血清型のFCVがある。血清型の数にも拘わらず、かな
りの交差保護を提供すべきごとき、株間の十分な交差中和があるようである。ま
た、その病原性において、株間の差異もあるらしい。これにより、[低毒性J(
F −9ウイルス)の血清型よりなるワクチン開発に至ったが、これは、他の血
清型での攻撃から保護する。しかしながら、ベテリナリ・インターナル・メデイ
シン・ディジージス・サブ・ザ・ドッグ・アンド・キャット(Veterina
ryInternal Medicine Diseases of the
Dog and Cat)、ニス舎ジエイ拳エノティンガー(S、 J、 Et
tinger)、292頁(1983)のテキストによると、「い(つかの実験
[引用省略コおよび実地条件下にて、ワクチン株が感染の臨床的兆候を生じない
のは不運である」とある。
本発明は、組換え法により製造したカリシウイルス蛋白よりなるFCVサブユニ
、トワクチンを提供することによってこれらの問題点を解消することを目的とす
る。加えて、もう1つの種(例えば、FHV)のもう1つの弱毒ウィルスベクタ
ーにクローン化したカリシウイルス遺伝子よりなる「多価ワクチン」を提供し、
それにより多種類のウィルスからの保護を提供する。かかるワクチンは感染の臨
床的兆候を生じない。
情報の開示
カリシウィルス感染細胞中のウィルス特異的RNAの特徴付けにおいて、ニーレ
スマン・ディ・ダブり1−およびシャファー・エフ・エル(EbresIIla
nn、 D、 W、 and 5chaf fer、 F、 L、 )[rカリ
シウィルス感染細胞中で合成されたRNAはピコルナウィルスの非典型的なもの
である」、ジャーナル・サブ・パイooジー(J4iro1.)、22゜572
〜576頁(1977)]は、感染細胞中では2種のカリシウイルス特異的転写
体があることを示している。彼らの仕事は、アクチノマイシンDの存在下で3H
ウリジンを用いてFCV、5M5VおよびVEV−感染細胞で実験体を標識し、
続いてグリセリン密度勾配遠心およびポリアクリルアミドゲル電気泳動によって
分析することを含むものであった。最大のRNAはウィルスのゲノムRNA(3
6Sまたはほぼ2.6XIO’ダルトン)に対応し、他のものけほぼ1.1.X
IO’クルトン(22S)のサブゲノムRN Aに対応するものであった。彼ら
は、18〜22Sで沈降したウィルスRNAのほぼ1/3はRNA5ei性であ
ることを示した。これは、変性グラジェントでのRNAの分析および同様に処理
した36S RNAとの比較によって、該ゲノムRNAと同サイズであることが
示された。
さらに、18〜223で沈降したRNAのRNA5e耐性集団の特徴付けにおけ
る成果は、2の二本鎖RNA種が存在し、そのうちの1つは該ゲノムRNAに対
応し、1つは該22SサブケノムRNAに対応することを示している[(ニーレ
スマン・ディ・ダブリニーおよびシャーファー・エフ・エル(Ehresman
n、D、W、 and 5chaffer、F。
L、)、rカリシウィルス細胞内RNA:18〜22S RNAの分画ならびに
36Sおよび22 S San Miguel Sae Lion Virus
RMAについての典型的5゛−メチル化キャップの欠落」、パイロロジー(V
irology)、95. 251〜255頁(1979)] 。VEVについ
ての同様の実験で、ブラック・ディ・エヌら(Black、 D、 N、 、
et al、 )(「カリシウイルイRN Aの構造および複製」、ネイチャー
(Nature)。
274.614〜615頁(1978))は、36S、22Sおよび18S R
NAの存在を示している。加えて、該18S RNAはRNA5e感受性である
ことか示された。彼らは、また、やはり185で沈降した少量のRNa s e
耐性RNAの存在を注記している。ニーレスマン・ディ・ダブリニーおよびシャ
ーファー・エフ・エル(Ehresmann、D、11. and 5chaf
fer、F、L、) (前掲)に一致し、これは二本鎖複製形RNAであると考
えられた。
ジェイ・ディ・ネイルおよびダブり1−・エル・メンゲリング0゜D、Ne1l
l and 1’、L、Mengeling) [本出願の発明の後に公表され
た「ネコ・カリシウィルス感染細胞におけるウィルス特異的RNAの更なる特徴
付け」、ウィルス・リサーチ(Virus Re5earch)、11゜59〜
72頁(1988年8月)]は、本出願のFCVゲノムの3゛端部から得られた
cDNAクローンを開示している。この成果の結果、第4番目の一本鎖RNAが
同定され、2の二本鎖RNAの同一性およびサイズが確認され、および各RNA
転写体の長さが見積もられた。該FCVゲ/ム内の各サブゲノムRNAの予備的
位置決めはブロットしたRNAと、該ゲ7ムの異なる領域に起源をもつcDNA
とのハイブリダイゼ−7ジンを通じて行い、FCV RNAは集合した、共通の
末端を有する転写体であることが示された。
フレ、ツ・エムおよびシャーファー・エフ・エル(Fretz、M、 andS
chafTer、 F、 L、 ) [感染細胞におけるカリシウィルス蛋白質
・キャブンドボリペプチド前駆体についての証拠(Calicivirus p
roteinsin 1nfected cells:evidence fo
r a capsid polypeptide precurs−or)、パ
イロロジー(Virology)、89. 318〜321頁(1978)]は
、該キャプシド蛋白質は該22SR,NAの翻訳産物であるらしいと提案してい
る。2.4kb RNAは高コピー数で存在し、キャプシド蛋白質はカリシウイ
ルス感染細胞で存在するもつとも豊富なウィルス蛋白質である[ブラック・ディ
・エヌおよびブラウン・エフ(Black、D、N、 and Brown、F
、)、カリシウィルスでの感染により誘導された蛋白質(Proteins 1
nduced by 1nfection with calici−viru
s)、ジャーナル・サブ・ジェネラル・パイロロジー(J、Gen。
Virol、)、 38.75〜82頁(1977) フレノン・エムおよびン
ヤーファ−・エフーxル(Fretz、M、 and 5chafTer、F、
L、)、感染細胞におけるカリンウイルス:キャブシドポリペプチド前駆体につ
いての証拠(Calicivirus proteins in 1nfect
ed cells:evidenceror a capsid polype
ptide precursor)+ パイロロジー(Virology)。
89.318〜321頁(1978)]。
発明の概要
本発明はFCV免疫原性を示すポリペプチドをコードするDNA配列よりなるこ
とを特徴とする組換えDNA分子を提供する。
さらに詳しくは、本発明はチャー)Aに記載したDNA配列またはその断片より
なる組換えDNA分子で形質転換した宿主細胞を提供する。
また、本発明はチャートAに記載したDNA配列または免疫学的機能同等物より
なる組換えDNA分子で形質転換した宿主によって発現されたポリペプチドなら
びに該ポリペプチドの免疫原性断片および誘導体を提供する。
さらに詳しくは、本発明はチャートに記載した式を有するポリペプチド、その免
疫原性断片およびその免疫学的機能同等物を提供する。
また、本発明はFCVキャプシド蛋白質またはその免疫原性断片、特に挿入され
たFCV外皮蛋白質遺伝子を有するネコ・ヘルペスウィルスをコードするDNA
配列よりなる組換えDNA分子を提供する。
また、本発明は診断すべき動物からの体液を本発明のDNA配列と接触させるこ
とを特徴とする該動物におけるFCV感染の検出法、また、本発明のFCVポリ
ペプチドを用いる診断アッセイを提供する。
発明の詳細な説明
ある免疫応答のいずれのタイプをも刺激する能力をいうために交換可能に用いる
。すなわち、抗原および抗原性は抗体の産生を刺激する物質に限定される意味で
はない。
本発明を実施するのに使用する組換えDNA法のほとんどは当業者によ《知られ
た襟準的な手法であり、例えば、モレキュラー・クローニング(Molecul
ar Cloning)[テイ’マニアティスら(T. Maniatis。
et al.)+コールドスプリングハーバー研究所(1982)j]およびビ
イ・ベルパル(B. Perbal)のア・プラクティカル・ガイド・トウ・モ
レキュラー・クローニング(^Practical Guide to Mol
ecularCloning) [ジョン・ウィリー・アンド・サンズ(Joh
n Wiley &Sons)(1 9 8 4 )]に記載されており、それ
らをここに参照のために挙げる。
スヘての制限エンドヌクレアーゼ、イー・コ!J (E. colt)DNAポ
リメラーゼI1イー・コリDNAポリメラーゼ・クレノー断片、、T4 DNA
リガーセ、T4.DNAポリメラーゼ、EcoRIメチラーゼおよびイー・コリ
DNAリガーゼは、二二一・イングランド・バイオ−ラド(New Engla
nd Biolabs) (ベバリー(Beverly)、マサチューセ,ツ州
)から購入した。AMV逆転写酵素はバイオ−ラド(Bio−Rad) (リノ
チモンド、カリフォルニア州)から購入し、R.NaseHはベセスダ・リサー
チ・ラボラトリーズ(ガイセルスブルグ、マディソン州)から購入し、RNas
in RNase抑制剤はプロメガ・バイオチク(Promega Biote
ch) (マジソン、ウィスコンシン州)カラ購入した。in vitroパッ
ケージング・システムにおけるラムダgt 10およびギガバック(gigap
ack)はストラタジーン・クローニング・シスラムダ(Stratagene
Cloning Systems)(サンジエゴ、カリフォルニア州)から、
[α−”S]dATPは二ニー・イングランド・ヌクレアー(New Engl
and NuclearXボストン、マサチューセ、ツ州)から、および[α−
”]dATPはICNラジオケミカル(Radiochemical) (アー
ビン、カリフォルニア州)から購入した。
FCV株CFi/68 FIVはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ
ンから入手した。FCVは、0.25%ラクトアルブミン加水分解物および10
%胎児牛血清を補足したF−15イ一グルMEM中に維持したクランダールーレ
ーゼ(Crandall−R,eese)子ネコ細胞(CRFK)中で増殖させ
た。FCVはプラーク精製して欠陥となる干渉粒子を除去した。
イー・コリ株DHI(ディ・ハナハン(D、 Hanahan)、ジャーナル・
サブ・モレキュラー+バイオロン(JJol、Biol、) 、166゜557
〜80頁(1983))をプラスミドの維持および増殖に使用し、形質転換菌を
平板培養する際には50μQ/mQアンピシリンを含有するルリア・ブロス(L
B)寒天平板上で維持した。株C600(アブレイヤード・アール・ケイ(Ap
leyard、 R,K、 )、ジエネティックス(Genetics)、 3
9 、440〜452頁(1954))をラムダgt ioの平板培養に用い、
NZY−アミン寒天平板上で維持し、培養した。株JM107(ヤニシューベロ
ンら(Yanisch−Perron。
et al)、 ジーン(Gene)、 33. 103〜119頁(1985
))はpUCプラスミドくヤニシューペロンら(Yanisch−Perron
、 et al、前掲))による形質転換に用い、平板当たり80μg [PT
Gおよび0.01%X−galを含有するLB平板上で培養した。また、JM1
07を用いてジデオキシ鎖停止配列分析のためにFCVcDNAクローンを含有
するM13mp18を増殖させた。JM107は前記したごとく (ヤニンユー
ペロンら(Yanisch−Perron。
et al)、前掲)最小培地上に維持した。
490cm”ローラーボトル中で、密集するまで増殖させたCRFK細胞の感染
によってFCVを増殖させ、FCVは10mf2の合計容量中はぼ0.01のm
、 o、 i、とじた。該ウィルスを37℃で2時間吸着させた。接種物を取り
出し、50m12の無血清培地を添加し、CPEが完了するまで(一般に24時
間以内)37°Cでインキュベージコンを継続した。培地を取り出し、−20℃
で凍結し、室温で解凍し、細胞夾雑物を、5orvall G5−30−ター中
、5000rpmでの4℃における10分間の遠心分離によって除去した。該ウ
ィルスを固体のポリエチレングリコール(P E G、分子量8000)を終濃
度10%(W/V)まで添加することによって上澄みから沈殿させ、該PEGが
溶液状となるまで室温で撹拌した。該沈殿物を5orvallGS−30−ター
中、8000rprnでの20分間の遠心分離によってベレット化し、上澄みを
捨てた。該ペレットを10rr+f!のリン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH7
,2)中に再懸濁し、不溶物を5orvallSA−600ローター中、110
000rpでの10分間の遠心分離によって除去し、上澄みをCsC&段階グラ
ンエンドに重ねた。
該段階グラジェントは、共1.m P B S中にて、1.60 g/mQ C
s C(15mf!の上に1.28g/rr+f! C5C(!5m12を重ね
、直ちに該グラジェントの頂部にvCV上1登みを重ねることによって形成させ
た。
ウィルス粒子(p=1.36)は、5W280−ター中、4℃における3時間の
22000rprnでの遠心によって1.60 : 1.28の界面にバンドを
形成した。白色のウィルスバンドを取り出し、70.ITrローター中、18時
間の48000rprnでの遠心によって等比重C3CI2グラジエント(1,
38g/m+! C5CQ )中に再度バンドを形成させた。該ウィルスバンド
を該グラジェントから取り出し、PBSの1000倍容量に対して一晩透析した
。精製したウィルス粒子を一70℃で貯蔵した。
ノーザンブロノト分析についでは、レラシ・エイチら(Lehrach、 H,
。
et al) [バイオケミストリー(Biochemistry)、16.
4743〜4751頁(1977)]の手法に従い、FCV感染細胞からの全細
胞ポリ(A)”RNA(はぼ3μg)を、ホルムアルデヒド変性アガロースゲル
上で分離した。トーツス・ビイ・ニス(Tho+1Ias、 P、 S、 )
[r変性RNAとニトロセルロースフィルタへ移行させた小DNA断片のハイブ
リダイゼーション」、プロシーディングズ・イブ・す/目ナル・アカデミ−・イ
ブ・サンエンシズ(Proc、 Natl、 Acad、 Sci、 )USA
、77.5201〜5205頁(1980)]の手法に従い、該RNAをニトロ
セルロースフィルターに対してプロットし、予備ハイブリダイズし、3叩−標識
FCV cDNAクローンとハイブリダイズさせた。オートラジェグラフィーは
、コダックXAR−5フィルムを用いて増感スクリーン無しで行った。
実施例1. FCVRNA[Jil製ならびl:FcV cDNAのり。
−ニングおよびスクリーニング
従前に記載されているごとくに[ロベ・ディ・エヌ(Love、 D、 N、
)。
コルネル・ベテゾナリアン(Cornell Vet、)、66. 498〜5
f 2頁(1976)]、単離したウィルス粒子から全長ゲノムFCVRNA
を調製した。クラペッツ・ニス・エイおよびアンワール・アール・エイ(Kra
wetz、S、A、 and An+var+R,A、) [バイオテクニック
ス(Biotechniques)、2. 342〜347頁(1984)コに
よって記載されているグアニジン−HCQ :C5CQ遠心法によって、全細胞
RNAをFCVに感染したおよび非感染の細胞から調製した。
CRFK細胞を増殖させ、細胞をほぼ1oのm、o、i、にて接種した以外は前
記したごとくに接種した。マニアティス・ティら((Maniatis。
T、、etal)、前掲)、に従って、全ポリ(A)”RNAをオリゴ(dT)
セルロースクロマトグラフィーによって単離した。ガルガー・ニス・ジェイおよ
びターペン・ティ・エイチ(Garger、S、J、 and Turpen、
T。
■、)[メソッズーz7ザイモロジー(Methods Enzymol、)、
118゜717〜722頁(1986)]によって記載されているごとく、FC
V二本鎖RNAを、FCV感染細胞がら単離した全細胞RNAからLic12分
別した。
販売業者によって指定されているごとくに、オリゴ(dT)をプライマーとして
用い、AMV逆転写酵素で、第1鎖CDNAをFCVゲ/ムRNAから合成した
。第2鎖cDNAはグブラー・ニーおよびホフ77−ビイ・ジエイ(Guble
r、U、 and Hoffman、B、J、) [ジーン(Gene)、 2
5.263〜269頁(1983)]に従って合成した。
T4.DNAポリメラーゼで該二本鎖cDNAの末端を平滑とし、該cDNAを
EcoRlメ、チラーゼて処理し、EcoR[合成リンカ−を平滑末端として該
cDNAに結んだ。該cDNA−リンカー混合物をEcoRlで消化し、等容量
の4M酢酸アンモニウムおよび2倍容量のエタノールで2回沈殿させた。次いで
、該cDNAをラムダgt ioに結び、in vitroパッケージし、適当
なイー・コリ株上で平板培養した。得られたプラークをニトロセルロースフィル
ターに移し、(マニアティス・ティら(Maniatis、T、、et al)
、前掲)によって記載されているごとく、FCVゲノムRNAを鋳型として用い
て合成したjtp m識のランダム始点cDNAでプローブした。
また、Pstlリンカ−およびpstl−?肖化したpuc 18への結合を用
い、同様に第2のライブラリーを構築した。これは、大きな内部RcoR1断片
のみがラムタライブラリ−から回収されるので行った。
pcVZ内に含有された配列の5゛側のFCV配列をクローン化するために、ア
プライド・バイオンステムズのオリゴヌクレオチド合成器(モデル8750)で
合成した合成オリゴヌクレオチド20量体GGAATTTTGCCCCGGGC
CCTを用いて第1鎖cDNA合成の始点とした(チャートC)。この配列は、
クローン化FCVゲ/ムの5′末端に対応するEcoRI断片の末端のDNA配
列分析から得た。
cDNAを合成し、Pst1合成リンカ−で前記したごとくにクローン化した。
該cDNAをpUClBにクローン化し、JM107を形質転換するのに用い、
前記したごと<IPTGおよびX−galを含有する培地上で平板培養すること
によってスクリーニングした。
ウィリアム−xス−zイら(Williaai、S、A、、et al) [バ
イオテクニックス(Biotechniques)、4. 138〜147頁(
1986)1に記載されているジデオキシ鎖停止法を用いて、FCV cDNA
クローンの端部を配列決定して、FCVゲノムをさらにクローニングするために
前記したごとき合成オリゴヌクレオチドの合成を可能とし、クローン化ポリ(A
)テールの位置によっていずれの鎖がウィルスのセンス鎖をコードしているかを
判断した。
FCVゲノムRNAを鋳型として用いて合成した3 ! p (fi識のランダ
ム始点cDNAを用い、ラムダクローン化ベクターgt中に構築したFCV配列
のc D N Aライブラリーをスクリーニングした。強力なハイブリダイゼー
ション信号をもつプラークを単離し、はぼ4200bpのEcoRI断片を含有
することが判明した。この断片を制限酵素分析のためpUCt sに継代クロー
ン化した(チャートC)。得られたプラスミドをpcv2と命名した。
プラスミドpuc 18におけるPstIリンカ−を用い第2のcDNAライブ
ラリーを構築した。ゲル電気泳動によって白色の形質転換体をcDNAインサー
トの存在について分析し、はぼ1000塩基のインサートを含有するプラスミド
を分析用に選択した。このプラスミドpCV7を制限分析に付し、pcv2が共
通する制限部位を含有することが判明し、また、新規な制限部位を含有するほぼ
500bpの領域を含有していた(チャートC)。Pst[断片をM13mp1
8に継代クローン化し、両向きにおいて末端を配列決定した。これらのうち1つ
の配列は46個のアデニン残基のポリ(A)トラクトを示し、これは、このクロ
ーンはFCVゲノムの3゛末端を含有することを証明する。この分析より、いず
れの鎖がウィルスのセンス鎖をコードするかを決定することができ、かつ該クロ
ーンを適当な向きに置くことかできた。
一旦いずれの鎖がFCVセンス鎖をコードするのかが知れると、FCV2に含有
されるクローン化FCV RNAの5゛部分に対応するEcoR1部位における
配列が決定された。この情報より、ゲノムRNAの最も5゛側EcoRI配列の
ほぼ150塩基だけ3゛側の配列にハイブリダイズする合成オリゴヌクレオチド
を合成し、た。
該EcoRI制限部位の5“側聞列をクローン化するために、このオリゴヌクレ
オチドを用いて逆転写の始点とした。二本鎖cDNAを平滑末端とし、PstI
リンカ−でクローン化し、前記したごと(分析した。はぼ2800塩基のインサ
ートを含有するプラスミドをさらに分析用に選択した。制限エンドヌクレアーゼ
分析は、このクローンか、pcv2の5′末端を共通する制限部位ならびにほぼ
2000塩基の新規配列の領域を含有することを示した。このプラスミドをpc
v8と命名した。制限エンドヌクレアーゼのマツピングの結果をチャートCに示
す。
実施例2 カリシウィルスケツムにおけるcDNAの位置決めFCV−感染の全
細胞ポリ(A)”RNAのノーザンブロノトを、FCVゲノムの異なる領域に対
応するFCV cDNAクローンでプローブした。これは、そこから異なるづブ
ゲノムRNAが得られる位置を見当付けるために行った。これらのc D N
Aクローンのゲノム内の位置をチャートAに示す。FCV3でのブロービングに
より、4のFCV RNAに対応する特徴的な4のバンドが生じ、一方pCV6
でのブロービングにより2.4kb転写体からの信号が喪失した。この結果は、
該2.4kb転写体はFCVゲノムの3゛側3000塩基内からのものであるこ
とを示す。pcv9でのブロービングにより、4.8kb転写体が存在するごと
く、該ゲノムRNAが存在することが示された。これは、この転写体とpcv9
に含有されるFCV配列との間には少ない領域の相同性しかないことを示す。p
cv 10でのブロービングは、全長ゲノムRNAを生じただけであり、42お
よび4.8kb転写体はこのcl)NAプローブの位置の3“側にコードされて
いること、および4.8 k b転写体はpcv9に含有された配列内に起源を
持つことを示す。このマツピングの結果を示すタイアゲラムをチャー1−Dに示
す。
これらの結果はFCVゲノムの3°末端からのcDNAクローンはFCV転写体
のすべてにハイブリダイズすることを示す。用いるプローブをゲノム内で漸次よ
り5“側とするにつれ、2.4kbから4.8kb転写体へのハイブリダイゼー
ション信号は漸次失われる。これは、RNAが、転写体が特定の地点で開始し、
モしてゲノムの3′末端へ続く転写体の、末端が共通し集合した組であること質
を用いてのFCV感染の診断
本実施例において、本発明者らは、ネコにおいてFCV感染を確認するための診
断剤としての、クローン化FCV cDNAでコードするポリペプチドの使用を
述べる。該cDNAクローンは機能制御エレメント(例えば、プロモーター)に
作動可能に連結しており、適当なベクター、例えばイー・コリおよびバクロウィ
ルスにてFCV蛋白質を発現させるのに用いる。かくして発現された蛋白質を多
数の異なるイムノアッセイで用いる。かかる手法は、テストすべきネコからのネ
コFCV抗体がエライザ法についてのベースとして用いる蛋白に結合する固相免
疫酵素法を包含し得る。FCV蛋白に向けられた単クローン抗体が検出システム
の一部として作用する競合的エライザ法を用いることもできる。他の固相支持体
系、例えばビーズ、紙片等もまた蛋白質のアンカーとして作用することができ、
FCV抗体検出についての[ペット・サイド(pet 5ide)Jテストとし
て開発できる。
実施例4 FCV外皮蛋白遺伝子のバクロウィルスへの挿入FCVキャプシド蛋
白質遺伝子は標準的な方法によって種々の系での発現用に設計することができる
。技量ある分子生物学者には、キャプシド蛋白質遺伝子の配列とベクターの入手
可能性の知識か、該キャプシドをワクチンに使用するのに有用な発現ベクターを
構築するのに要求される。これは該キャプシドのサブユニットとしての生産の例
である。
暗号領域のC−末端側半分を以下のごとくに構築する。1350ないし1965
の位置にわたるEcoRV/EcoRI断片(チャー4A、)を単離しく例えば
、pCV2から、チャートC)、以下の合成オリゴヌクレオチドを挿入すると共
にEcoR1リンカ−をSma I部位に挿入した修飾pUc19ベクターのE
coRVおよびPsti部位間にクローン化して、キャプシド蛋白質のC−末端
暗号領域を再構築し、PstI部位に対するリンカ−を提供する:5’ −AA
TTCAATTGGCAAAAATTCGACTTGCCTCTAACATTA
GGAGTGTGATGACAAAATTATGAATTAGATCTACTG
CA−3’ および5’ −GTAGATCTAATTCATAATTTTGT
CATCACACTCCTAATGTTAGAGGCλ^GTCGAATTTT
TGCCAATTG−3’ 。このプラスミドをpFCV−Cと命名する。
キャプシド遺伝子のN−末端側の半分は、62ないt、 1350位置からBa
mHI/EcoRV断片をpBR322のE c o R,VおよびBamH1
部位の間にクローン化することによって設計する。
このプラスミドをBamHlと5altで開き、以下のオリゴヌクレオチドを挿
入してキャプシド蛋白質のN−末端側暗号領域の残りを再構築する・5′ −T
CGACAGATCTCCGCGGTTTGAGCATGTGCTCAACCT
GCGCTAACGTGCTTAAATACTATGATTG−3“および5’
−GATCCAATCATAGTATTTAAGCACGTTAGCGCAG
GTTGAGCACATGCTCAAACCGCGGAGATCTG−3’ 。
このプラスミドをpFcV−Nと命名する。
pFCV−CからのFCV配列をEcoRVおよびPstIて単離し、p F
CV−NからのFCV配列を5alIとEcoRVで単離する。これらの断片を
合し、puc 19のEC0RTおよび5alI間にクローン化してpcOAT
と命名するプラスミドが得られ、これは完全なFCV外皮蛋白遺伝子を含有する
。
pcOATにおける外皮蛋白遺伝子の末端に位置させて合成1) N Aを付加
しために、該完全なFCV外皮蛋白遺伝子はBgllI断片としてこのプラスミ
ドから切り出すことができ、これは標準的なバクロウィルス発現プラスミドルA
c3フ3中の!バクロウィルス・ポリヘトリン・プロモーターから下流に挿入す
ることができる。ノくクロウィルス(例えば、オートグラファ・カリフォルニカ
・ヌクレア・ポリへトロジス9ウイルス(Autographa califo
rnica nuclearpolyhedrosis virus)D N
Aでの共トランスフェク/:Iンおよび閉鎖陰性プラークの採取によって、外皮
蛋白遺伝子を発現するウィルスを単離することができる。該バクロウィルス技術
は1988年6月17日付は出願のPCT出願PCT/US8B10202’l
に記載されており、ここに参照のために挙げる。ネコ・カリンウイルス用ワクチ
ンとしてネコへ注射するのに、この外皮蛋白は、粗製または精製にて用いること
ができる。
便利な制限酵素部位を外皮蛋白遺伝子の3“および5”末端上で合成する。
バクロウィルスにおける発現についでは、ここに参照のために挙げる1988年
6月17日付は出願の米国特許出願88102021号に記載された手法に従い
、Ac NPVポリヘトリン・プロモーターから下流に該遺伝子を挿入し、バク
ロウィルスゲノムに再度組み合わせる。かかる蛋白質はサブユニットワクチンと
して有用である。
実施例5 FCV外皮蛋白遺伝子のネコ・ヘルペスウィルスへの挿入
本発明者らは、チミジンキナーゼ遺伝子を含有するネコ・ヘルペスライJL41
. (F HV)ゲノムのSa l I/BamHI片の使用を以前記載した。
以前の研究では、EcoRVおよびHindlII切断部位間のチミジンキナー
ゼをコードするヌクレオチドを欠失させ、唯一のHind[[部位をこれらのヌ
クレオチドの代わりに挿入して、チミジンキナーゼ遺伝子への唯一の挿入部位を
有するプラスミドpcc 113を得た。(ここに寥照のために挙げる1989
年7月12日付は出願の、アップジョン社代理人整理番号4604.CP参照)
。Pstl切断部位を含有するオリゴヌクレオチドをpGC113の欠失チミジ
ンキナーゼ遺伝子に挿入してpFHVTK−Pを得る。哺乳動物細胞での発現用
に設計したFCV遺伝子のための受容体としてこのプラスミドを用いる。
該pFCV−CプラスミドをBglTIとPstjで切断し、ラン成長ホルモン
のポリアデニル化シグナルPvu■/ E c o RI断片(1989年1月
11日付は出願の米国特許出願07/295967号)を、Pvull末端につ
いてはBamHIリンカ−を用い、およびEcoRI末端についてはPstlリ
ンカ−を用いて挿入する(標準的な方法によって、リンカ−はクローニング中間
体と共に別々の工程で加える)。この13amHIリンカーはBglI[部位に
結合するが、BamHIまたはBg111部位を再生しない。得られたプラスミ
ドをpFCV−C−PAと命名する。FCV配列およびポリアデニル化シグナル
を含有するEcoRV/PstI断片を切り出し、pFCV−Nからの5all
/EcoRV断片と混合し、ptJc 19のPstlおよび5ai1部位間に
クローン化してpcOAT−PAと命名するプラスミドを得る。
pcOAT−PAをPstと5acll[で切断し、外皮蛋白遺伝子とポリアデ
ニル化シグナルを5acI[/Pstl断片として単離する。
サイトメガロウィルスTowne株の主要即時型プロモーターを含有するPst
l/5acll断片はp ON 239から単離することかでき(スベーテおよ
びモカルスキー(Spaete and Mocarski)、ンヤーナル・サ
ブ・バイooジー(J、Virol、)、56. 135〜143頁。
1985)、これはスタッフォード大学のニドワード・モカルスキ−(Ed、M
ocarski)博士から入手することができる。
次いで、Pstlで切断したpFHVTK−Pを前2節にて単離した2の断片と
混合し、結んで、FHVチミジンキナーゼ遺伝子に挿入されたCMVプロモータ
ー−FCV外皮蛋白−bGHポリアデニル化シグナル転写ユニットを含有するプ
ラスミドを単離する。このプラスミドをpCOAT−TKと命名する。
4604.1CP (前掲)の場合に詳細に記載したごとく、pcOAT−TK
を、FHVの野生型株からのDNA”??、クランダールーリーセ(Crand
all−Reese)子ネコ細胞にトランスフェクトし、チミジンアラビノンド
でチミジンキナーゼ陰性組換体を選択する。
これらの組換体はFHVを発現するであろうし、筋肉内または鼻孔内接種によっ
てネコのワクチン接種に用いることができる。
本発明の遺伝子配列を利用できることにより、遺伝子および遺伝子配列の直接的
操作が可能となり、これにより遺伝子もしくはその断片によってフードされる蛋
白の発現の調節および/またはその構造の修飾か可能となる。また、これらの遺
伝子配列の知識により、ハイブリタイセ−7ヨンプローブとして公知の配列を用
い、FCVのいずれの株からも、対応する遺伝子、またはその断片をクローン化
し、当該分野で一般に公知の組換え法によって完全なタンノでり質またはその断
片を発現させることが可能となる。
これらの遺伝子配列の知識(キャプシド蛋白は塩基18〜2021によってコー
ドされる、チャートA参照)により、キャプシド(または外皮)対応ポリペプチ
ドのアミノ酸配列を推定するのが可能となる(チャートB)。その結果、FCV
免疫原性を有するこれらのポリペプチドの断片を、蛋白合成または組換えDNA
技術の他の標準的な方法によって生産することができる。
かかるDNA配列の「誘導体」とは、暗号の縮重に対してなされた塩基置換およ
びそこに挿入されたやはり公知の塩基アナログを包含させる意図である。とりわ
け、FCVからのキャプシド(または外皮)蛋白についての遺伝子暗号の一次構
造(配列)をチャートAに記載する。
切り出した遺伝子またはその断片は、宿主細胞を形質転換するために用いる種々
のクローニング搬送体またはベクターに結ぶことができる。該ベクターは、好ま
しくは、FCVポリペプチド遺伝子の転写および翻訳(これらは−緒になって発
現をなす)を開始し、制御し、および終止するためのDNA配列を有し、従って
それに作動可能に連結している。これらの「発現制御配列」は、好ましくは、形
質転換されるべき宿主細胞に適合したものとする。該宿主細胞が高等動物細胞、
例えば哺乳動物細胞である場合、異種発現制御配列を使用する。さらに、ベクタ
ーには、好ましくは、マーカー遺伝子(例えば、抗生物質耐性)を含有させて、
形質転換宿主細胞の選択用の表現型特性を付与する。加えて、複製ベクターには
レブリフンを含有させることになろう。
典型的なベクターは動物細胞に感染するプラスミド、ファージ、およびウィルス
である。本質的には、宿主細胞を形質転換できるいずれのDNA配列を用いるこ
ともできる。
本明細書中で用いる宿主細胞なる語は、FCVポリペプチド抗原性を示すポリペ
プチドについてコードするDNA配列で形質転換され得る細胞を意味する。好ま
しくは、該宿主細胞はFCVポリペプチドまたはその断片を発現できるものとす
る。該宿主細胞は原核生物または真核生物であり得る。例となる原核生物はイー
・コリ、ビイ・スブチリス、ンユードモナス、およびビイ・ステアロテルモフィ
ラス(stearothermophilus)のごとき細菌である。例となる
真核生物細胞は酵母あるいは昆虫、植物または哺乳動物起源のごとき高等動物細
胞である。哺乳動物細胞系は、その浮遊液を用いることもできるが、しばしば、
細胞の単層の形態となろう。哺乳動物細胞系は、例えばVEROおよびヒーラ細
胞、チセイニーズ・ハムスター・オバリ−(CH○)細胞系、WI38、BHK
、CO3−7またはM D CK細胞系を包含する。昆虫細胞系はスボドブテラ
・フルギベルダ(Spodoptera frugiperda)(^TCCC
RL1711)のSfe系を包含する。
いくつかの入手可能な真核生物プラスミド、宿主細胞およびFCVポリペプチド
をクローン化し発現するためにそれらを使用する方法の概要はケイ・工Iサーら
(K、Es5er、et al、) [真核生物のプラスミド(基礎および応用
) (Plas!+ids or Eukaryotes(Fundament
als and^pplication))、シコブリンゲルーフエアラーク(
S pringer−Verlag)(1986)]に見い出すことができ、こ
こに参照のために挙げる。
前記したごとく、ベクター、例えば、宿主細胞を形質転換するのに用いるプラス
ミドには、好ましくは、FCVポリペプチド遺伝子またはその断片の発現用の適
合する発現制御配列を含有させる。従って、発現制御配列は遺伝子または断片に
作動可能に連結させる。宿主細胞が細菌である場合、有用な発現制御配列の例は
trpプロモーターおよびオペレーター[ゲデルら(Goeadel、 et、
al)、ヌクレイツク・アシノズ・リサーチ(Nuci、Ac1ds Res
、)、 8. 4057 (1980)];lacプロモーターおよびオペレー
ターロチヤングら(Chang。
et al)、ネイチャー (Nature)、275.615 (1978)
] :外膜蛋白プロモーター[EMBO・ジャーナル(EMBOJ、)、1.
771〜775(1982)] ;バクテリオファーンλプロモーターおよびオ
ペレーター[ヌクレイツク・アンノズ・リサーチ(Nucl、 Ac1ds R
es、 111.4677〜4688 (1983)) ] ;]α−アミラー
ゼビイ・スブチリス(B、 5butilis))プロモーターおよびオペレー
ター、終止配列およびその曲選択された宿主細胞に適合する発現増強および制御
配列を包含する。宿主細胞が酵母である場合、有用な発現制御配列は、例えばα
−接合因子を包含する。昆虫細胞については、バクロウィルスのポリヘトリン・
プロモーターを用いることができる(モレキュラー・アンド・セリニラ−・バイ
オロジー(Mo1. Ce1l。
Biol、)、3. 2156〜65(1983) )。宿主細胞が昆虫または
哺乳動物起源である場合、有用な発現制御配列の例は、例えば、5V−40プロ
モーター[サイエンス(Science) 、222,524〜527 (19
83)]または、例えばメタロチオネイン・プロモーター[ネイチ+ (Nat
ure)、296.39〜42 (1982)]または熱ショック・プロモータ
ー[ベルミイーら(Joel 1my、 et al、 )+プロ/−ディング
ズ・サブ・ナショナル・アカデミ−・サブ・サイエンシズ(Proc、 Nat
1.^cad、sci、)、 USA、82. 4949〜53頁(1985
)]を包含する。
当該分野でよく知られている手段により、発現制御配列を含有するプラスミドま
たは複製もしくは組込DNA物質を、必要なあるいは望むサイズに適合させて、
制限酵素を用いて切断し、FCVポリペプチド遺伝子またはその断片と結ぶ。酵
母または高等動物宿主細胞を使用する場合、公知の酵母または哺乳動物遺伝子か
らのポリアデニル化もしくはターミネータ−配列をベクターに組み込むことがで
きる。例えば、ここに参照のために挙げる欧州特許出願0093619号に記載
されているウシ成長ホルモンのポリアデニル化配列を用いることができる。加え
て、宿主細胞の複製を制御する遺伝子配列をベクターに組み込むことができる。
宿主細胞は形質転換受容能力があるものとするか、あるいは種々の方法によって
受容能をもつようにする。コーエン(Cohen)[PNAS、69,2110
(1972)]によって一般的に記載されているごとく、細菌細胞が宿主細胞で
ある場合、それらは塩、典型的にはカルシウム塩での処理によって受容可能とす
ることができる。一般に、酵母宿主細胞はその細胞壁の除去によって、あるいは
イオン処理のごとき他の手段[ジャーナル・サブ・パイテリオロジ−(J、Ba
cteriol、)、153,163〜16B(1983)コによって受容可能
とすることができる。例えば、リン酸カルシウム沈殿法、受容体細胞とDNAを
含有する細菌プロトプラストとの融合、DNAを含有するリポソームでの受容体
細胞の処理、細胞へのDNAの直接的微量注入法を含め、DNAを動物細胞に導
入するにはい(つかの公知の方法がある。電気穿孔法をDNAを細胞へ挿入する
のに用いることもできる。
形質転換した細胞を当該分野でよく知られた方法によって増殖させ[モレキュラ
ー・クローニング(Molecular Cloning)、マニアナイス・テ
ィら(Maniatis T、、 et al、)、コールトスプリングツ1−
バー研究所(1982)、バイオケミカル・メリンス・イン・セル・カルチャー
・アンド・パイロロジー(Bioche+n1cal Methods In
Ce1lCulture and Virology)、クチラー・アール・ジ
エイ(Kuchler、 R,J、 )、ドウデン・ヒノチンソン・アンド・ロ
ス・インコーポレイテッド(Dowden、 Huchinson and R
oss、 Inc、 )、 (+ 977 ) ;メリンスーイン畢イースト・
ジエ不テイノクス(Methods In Yeast Genetics)、
シ工−ルマン・エフら(Sherman、F、、et al)、コールトスプリ
ングツ八−バー研究所、(1,982)]、蛋白が宿主細胞から分泌されるか、
あるいは宿主細胞系を例えば当該分野でよく知られた機械的または酵素的方法で
破壊した後に細胞浮遊液から分泌されるような系における細胞培地から、発現さ
せたFCVポリペプチドまたはその断片を収穫する。
本発明のFCV遺伝子を発現するのに用いることができるいくつかの便法かある
。例えば、ここに参照のために挙げる1989年7月12日に出願したアップジ
ョン社代理人整理番号4604.1CPにおいて、ネコ白血病ウィルスgp85
に関連する実施例に記載されているごとく、キャプシド蛋白遺伝子をネコ・ヘル
ペスウィルスのゲノムに挿入することができる。注目するFCV遺伝子を、ヒト
CNV即時型プロモーターの下流であって、FHVチミジンキナーゼ配列に並べ
てクローン化する。このプラスミドをF)IV DNAチミジンキナーゼ欠落組
換体で共トランスフェクトし、チミジンアラビノンドによって選択する。注目す
るFCV遺伝子よりなり、かく産生された組換えFHVはそれによりコードされ
るFCVポリペプチドを発現する。
また、カクラパーティら(Chakrabarty et at) [モレキュ
ラー・アンド・セリュラー・バイオロジー(Mo1. Ce11. Biol、
) 、 5 。
3403〜09(1985)]に記載されているごとくプラスミドベクターとし
てpSCllを用いることよりなる改良方法にて、マケノトら(Mackett
、et al)の方法[デイエヌエイ・クローニング(DNACloning)
、 IT巻、ア・プラクティカル・アプローチ(A PracticalApp
roach)、デ4−xム・グローバー(D、 M、 Glover)編(19
85)]に従い、注目するFCV遺伝子をワタシニア・ウィルスに挿入すること
もできる。該方法は、実質的には、pGs20の代りにpSC11ベクターで置
き換える以外は、ここに参照のために挙げる国際出願PCT/US 86101
761に記載されている。
前記したごとく、遺伝子構造から演鐸されるFCVポリペプチドのアミノ酸配列
をチャートAおよび已に記載する。FCVポリペプチド抗原性を示すポリペプチ
ドは、チャートAおよびBに記載した配列ならびに該ポリペプチド配列を注射し
た動物、例えば哺乳動物において免疫応答を惹起できるポリペプチド配列のいず
れの部分もおよび該ポリペプチドの免疫原性機能類似体を包含する。
前記したごとく、FCVポリペプチドについてコードする完全な遺伝子を、ベク
ターを構築し、次いで宿主細胞を形質転換してFCVポリペプチドを発現させる
ことに使用できるか、あるいはFCVポリペプチドについてコードする遺伝子の
断片を使用することかでき、これにより、得られた宿主細胞はFCV抗原性を示
すポリペプチドを発現するであろう。FCVポリペプチド遺伝子のいずれの断片
も使用することかでき、その結果、FCVポリペプチドの免疫原性断片またはそ
のアナログであるポリペプチドが発現される。当該分野でよく知られているごと
く、遺伝暗号の縮重により、FCVポリペプチド抗原性を示すポリペプチドをコ
ートする機能的に同等な遺伝子、その断片および誘導体を生産するための塩基対
の容易な置換が可能となる。これらの機能的同等物は本発明の範囲内に含まれる
。
加えて、FCVポリペプチドの完全なアミノ酸配列のうち一定の断片類のみを、
そのスペースを設けかつ第一義的にFCV免疫原性についてのものである他の断
片との相互関係をもちつつ存在させることができると考えられる。かくして、F
CV免疫原性について第一義的に帰せられる重要な断片を除き、FCV遺伝子配
列においてアミノ酸または他の物質をさらに交換することが許容される。
本発明のポリペプチドまたはその免疫原性断片を利用するワクチンは、固定した
宿主細胞、宿主細胞抽出物、または宿主細胞からのあるいは化学合成によって生
産された部分的にまたは完全に精製したFCVポリペプチド調製物よりなり得る
。本発明に従って調製したFCVポリペプチド免疫原は、好ましくは、FCVウ
ィルスフリーとする。かくして、本発明のワクチン免疫原は、実質的に全部が、
所望の免疫原性FCVポリペプチドおよび/またはFCV抗原性を示す他のFC
Vポリペプチドよりなる。
該免疫原はよく知られた手法によ−)でワクチン投与形態に調製できる。該ワク
チンは筋肉内、皮下または鼻孔内投与できる。筋肉的注射のごとき非経口投与に
ついては、免疫原を適当な担体と組み合わせることができ、例えば、水酸化アル
ミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウム(ミョウバン)、硫
酸ベリリウム、シリカ、カオリン、カーホン、油中水型エマルジョン、水中油型
エマルジョン、ムラミルジペプチド、細菌内毒素、リビドX1コリネバクテリウ
ム・バルバム(Corynebacterium parvum)(プロビオノ
バクテリウム・アクネス(Propionobacterium acnes)
)、ボルデテラ・ペルトウシス(Bordetella pertussis)
、ポリリボヌクレオチド、アルギン酸ナトリウム、ラノリン、リンレシチン、ビ
タミンA1サポニン、リポソーム、レバミゾール、DEAE−デキストラン、ブ
ロノクフポリマーまたは他の合成アジュバントのごとき種々のアジュバントまた
は免疫調節剤を含むあるいは含まない水、生理食塩水または緩衝ビヒクル中にて
投与できる。かかるアジュバントは種々の入手源、例えば、メルク・アジ二ノ\
ント65(メルク・アンド・カンパニー・インフーポレイテノト(hlerck
and Company、 Inc、 ) 、ラウエイ(Rahway)、
ニューシャーシー州)から商業的に入手できる。
他の適当なアジュバントはフロイントの不完全アジュバントである(ディフコ・
ラボラトリーズ(Dirco Laboratories)、デトロイト、ミシ
ガン州)。
免疫原およびアジュバントの割合は、両者を有効量にて存在させる限り、広い範
囲にわたって変化させることができる。例えば、水酸化アルミニウムはワクチン
混合物の約0.5%の量で存在させることができる(AQ、03ベース)。用量
ベース当たりでは、免疫原の濃度は、ネコ1匹につき、約1.0μgないし約1
00rr+gの範囲とすることができる。適当な用量サイズは約1〜10m(!
、好ましくは約1.0mQである。従って、筋肉的注射の用量については、例え
ば、0.5%水酸化アルミニウムと混合した免疫#1 、0 m gを含宵する
1、mQよりなるであろう。また、子ネコへの非経口投与として匹敵する投与形
態も調製することができるが、用量当たりの免疫原の量はより少なく、例えば、
用量当たり約0.25〜約1.0mgとすることができる。
また、該ワクチンを他の病気用の他のワクチンと組み合わせて多価ワクチンを生
産することもできる。また、他の薬剤、例えば、抗生物質と組み合わせることも
できる。ワクチンの医薬上有効量を、医薬上許容される担体または賦形剤と共に
ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、および他の哺乳動物のごときワクチン接種者に使用
することができる。
例えばここに参照のために挙げるアイ・ティザード(1,Tizard)の[獣
免疫学への導入(^n 1ntroduction to Veterrnar
y I+u+unology)。
第二板(1982)Jに記載されているごとくに、当業者によく知られた方法に
より他のワクチンを製造することもできる。
チャート八 カリ/ウィルスからのc D N A’430 kko &50
460 470 480丁GTGGAGCCTC; ACCCTrTTCA C
ACCTGAGACT(:ACCCTTCG cAAcMcAcc AAAGT
GTfkT
チャートA、(続き)
11TAcATACGc TAGACTAGAT TAGGCTrTTA GT
AGAAGCGA AACCTAACCT TrAGCCAlA
チャートA、(続き)
TACGCTrATT CGTACAGGTCTGGAGCCTに(: TGT
GTMCCG GOkCGkkCCk ATATGACCAs
チャートA (続き)
L6:lO1640165016601670168017501760177
01780L790 1800L870 1880 1890 1900 19
10 19201930 1940 1950 L960 19フ0 1980
AC′!TCGTCAG CAACGCGACCT(JCACTCCA A(f
fATにAACn’caTcGcc AGCCTCTAAATにAACCAGT
CC:’nGcGCTCG AcccTcAcL:r TC;CA丁ACTTG
AACCTAGCCCTCCCAGAsTT
チャートA (続き)
2170 2180 2190 220Q 2210 22202230 22
1aO2250226022702280ATCACTrAACCC’1TrG
GG丁に C(ACkCTlにCGCCTkkCCCCAGGGAτA(TGA
ATTG にGAAACCCACにGccTC:AACC; cccArrcc
cc TCCCTチャートB、 カリンウイルスタト皮蛋白質L MC5TCA
NVuCYYDIJDPHIKL VINPNKFL)IV GFCDNPLM
CCYPEuPEFCT51 M′l/DC閃5PTIJ VYLES工LGD
D EWSSTHEAID FM’mE AαIHpupc101 v1A但L
ICKV 庇GWDPNLE’L FRLEADDGSX TTPEQG’rM
VG Gl/’IAEPNAQM151 5TAADKATGK 5VDSEW
EAJ下5F)ITSVNIJST 5ETQGKILFK QSLGPLLN
FY201 LTHLAKLYVA IJSGSV[)VRFS l5GSGV
FGGK LSAI”/VPKI DFVQSTSIQ251 ’ITHVLF
DARQ VEPVIFSlffD LJL5TLYHLMS DTDTrSL
VIJ4 VYNPL工NFYA30L N’05NSSGCXV TV5にP
DF KF)IuKPKS KLTHにS11’SD uWsssLWI351
にNRFWSDI丁D FV:fRFFVFQA NRHFDF’NQET
AGWSτPRFRP ZTI丁工SVにES401 AXLGICvATD
YIVPGIPDσIJ PDTrH’GELV FVGDYA工TNに TN
NDITrAAQ551 SV’LPERGMニc聞?■和Qs Xyf費XR
5! DVFNSQILHT 5RQIJLNHYL601 LyPDSFAV
YRlID5NGSVFD IGIDNDGFSF VGVSSIGKLE n
LτASYMGI651 Ql、AKIRLA5N I障jVK■1チャートC
(A)ネコ・カリシウィルス(FCV)cDNAの物理的マ1.プ。
制限エンドヌクレアーゼ切断部位を示す。ゲノムの5′末端のド、ノドは未クロ
ーン化配列を表す。該マ・ノブの下の線は、実施例11こ記載したごとくに逆転
写したゲノムRNAのクローニング1こより得られたc D N Aクローンを
表す。(B)cDNAクローンのゲノムの位置。該c D N Aクローンの末
端における括弧中の制限部位(よりンカー配列を示す。制限エンドヌクレアーゼ
部位は:B、BamHl;E、EcoRI;H,HindI[I;に、Kpnl
:P、Pstl;およびS、5phl
である。
チャートD。
FCVサブゲノムRNAがそれから得られるゲノム領域の物理的マ、ブ。実線は
該サブゲノムRNAに存在する領域を示す。該線の点線の領域は、転写開始が、
転写体の長さに基づいて起こり得る領域およびマツピング・ハイブリダイゼーシ
ョンのデータを示す。
I!l際調査報告
言□、、。1.。□、^、。1.。1.。、。PCT/US90103753
Claims (8)
- 1.以下の: 【配列があります】 のFCVキャプシド蛋白の配列を有する実質的に純粋なポリペプチドまたはFC V免疫原性を示すその断片もしくは誘導体。
- 2.ネコ・カリシウイルス(FCV)キャプシド蛋白の免疫原性を示すポリペプ チドについてコードするDNA配列よりなる組換えDNAからなるワクチン。
- 3.該ポリペプチドについてコードする該DNA配列が【配列があります】 またはFCV免疫原性を示すその断片もしくは誘導体である請求の範囲第2項記 載のワクチン。
- 4.請求の範囲第1項記載のポリペプチドよりなるワクチン。
- 5.実質的にネコ・ヘルペスウイルスDNAよりなるネコ・カリシウイルス(F CV)キャプシド蛋白免疫原性を示すポリペプチドについてコードするDNA配 列からなる組換えDNA分子。
- 6.以下の: 【配列があります】のドCVキャプシド蛋白免疫原性を示すポリペプチドについ てコードするDNA配列またはFCV免疫原性を示すポリペプチドをコードする その断片もしくは誘導体よりなり、かつさらに実質的にネコ・ヘルペスウイルス DNAよりなる組換えDNA分子。
- 7.請求の範囲第5項記載の組換えDNA分子よりなるワクチン。
- 8.請求の範囲第6項記載の組換えDNA分子よりなるワクチン。
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