PL205229B1 - Sposób wytwarzania rekombinowanej szczepionki przeciwko krwotocznej chorobie królików, szczepionka oraz zastosowanie antygenu rekombinowanego białka do wytwarzania szczepionki - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania rekombinowanej szczepionki przeciwko krwotocznej chorobie królików, szczepionka oraz zastosowanie antygenu rekombinowanego białka do wytwarzania szczepionki. Przedmioty wynalazku umożliwiają otrzymanie rekombinowanego strukturalnego białka kapsydu o właściwościach hemaglutynacyjnych i antygenowych, zdolnego do formowania cząstek pseudowirusowych (VLP) i stymulowania wytwarzania u szczepionych zwierząt przeciwciał neutralizujących.

Krwotoczna choroba królików (ang. Rabbit haemorrhagic disease RHD) określana powszechnie w Polsce jako pomór królików [Górski 1988] jest chorobą wirusową przebiegającą w postaci ostrej lub nadostrej, z wysokim odsetkiem śmiertelności, dochodzącym w niektórych ogniskach do 100%. Okres inkubacji choroby wynosi od 24 do 72 godzin. W obrazie sekcyjnym królików padłych dominuje silny obrzęk płuc z wyraźnymi cechami zapalenia krwotocznego. Stwierdza się obrzęk i zwyrodnienie wątroby, a także powiększenie śledziony oraz rozpulchnienie i przekrwienie nerek. Badaniem histopatologicznym stwierdza się liczne wynaczynienia w płucach, przekrwienie i obrzęk węzłów chłonnych, destrukcję i zanik jąder hepatocytów, zanik miazgi białej śledziony, zwyrodnienie i przekrwienie nerek.

Chorobę po raz pierwszy opisano w Chinach w 1984 roku, a niedługo później ogniska RHD odnotowano w Europie, Azji, Ameryce, Afryce. W Polsce pierwsze przypadki RHD stwierdzono w 1988 r. i wyizolowano szczepy wirusa oznaczone jako SGMiKGM [Górski 1988].

Na podstawie cech morfologicznych i właściwości fizyko-chemicznych (wielkość wirionów o średnicy 28-32 nm, gęstość w gradiencie chlorku cezu 1,31-1,36 g/cm³, oporność na działanie rozpuszczalników organicznych) wirus RHD został zakwalifikowany do rodziny Caliciviridae. Wirus posiada zdolności aglutynowania czerwonych krwinek człowieka grupy 0 [Górski 1988, Liu 1984, Ohlinger 1990, Parra 1990].

Spośród metod stosowanych do diagnostyki zakażeń wirusem RHD najpowszechniej wykorzystuje się odczyn hemaglutynacji (HA), którego ograniczeniem jest brak możliwości wykrywania tzw. szczepów HA-ujemnych [Chasey 1995]; test immunoenzymatyczny (ELISA) używany w wielu modyfikacjach, polecany ze względu na czułość, swoistość reakcji i prostotę wykonania oraz techniki mikroskopii elektronowej, które ze względu na wysokie koszty nie są dostępne w każdym laboratorium.

Genom wirusa RHD zawarty w dwudziestościennym, bezotoczkowym kapsydzie to pojedyncza nić RN A o polarności dodatniej (ss RNA+) i wielkości około (7,5 kb).

Genom po raz pierwszy został sklonowany przez Meyersa i wsp. [Meyers 1991a, 1991b], a następnie jego pełną sekwencję opublikował Rasschaert i wsp. wykazując 98% homologię sekwencji aminokwasowej [Rasschaert 1994]. Sekwencje fragmentu genomu kodującego białko kapsydu przedstawili m. in. [Boga 1997] dla szczepu wyizolowanego w Hiszpanii, Milton i wsp. dla szczepów wyizolowanych w Czechach i Austrii, a także Guittre i wsp., którzy wykazali identyczność sekwencji nukleotydów szczepów francuskich od 96 do 98%.

Na podstawie badań molekularnych ustalono, że genom wirusa RHD wykazuje znaczną homologię z innymi kaliciwirusami (Feline calicivirus -FCV, San Miguel sealion virus - SMSV, Vesicular exanthema virus of swine - VESV), jednakże jest inaczej zorganizowany, gdyż wyróżnia się w nim tylko dwie ramki odczytu (ORF), a nie trzy jak u wymienionych. Główna ramka odczytu (ORF1) wirusa RHD o 2344 kodonach obejmuje prawie cały genom, od nukleotydu 10 do 7042 i koduje poliproteinę o wielkości 257 kDa, którą można rozdzielić na białka niestrukturalne (nt 1000 - 5000) i strukturalne białko kapsydu VP60 (5305 - 7044). Sekwencja kodująca białko VP60 znajduje się przy końcu 3' ORF1. Obok ORF1 występuje, mniejsza ramka odczytu -ORF2 (7025-7378) zawierająca 353 nukleotydy, która koduje białko VP12 o niesprecyzowanej dotychczas funkcji. Obok genomowego występuje również subgenomowe RNA o wielkości 2.2 kb, który koduje skrócone o dwa aminokwasy strukturalne białko kapsydu VP60 i prawdopodobnie spełnia rolę w procesie replikacji [Meyers 1991a, 1991b].

W immunoprofilaktyce RHD praktycznie od momentu rozpoznania choroby w Europie w powszechnym użyciu są inaktywowane szczepionki narządowe. Źródłem antygenu ze względu na brak możliwości namnażania wirusa in vitro są narządy trzewne (głównie wątroba, w której występuje w największej koncentracji) zakażonych i skrwawionych w okresie wiremii królików [Anon. (2004) Manual of diagnostic tests and vaccine for terrestrial animals. OIE, fifth edition, chapter 2.8.3.].

W Polsce od 1989 r. w Państwowym Instytucie Weterynaryjnym produkowana jest szczepionka Cunivac. Podobne produkty lecznicze były lub są nadal produkowane także w innych krajach europejPL 205 229 B1 skich [Anon 2004], np.: od 1988 roku szczepionki przeciwko krwotocznej choroby królików, produkowane są przez firmy Bioveta Ivanovice - w Czechach i Phylaxia - na Węgrzech.

W piśmiennictwie naukowym opisano zastosowanie doświadczalnie wytworzonych rekombinowanych szczepionek genetycznych, które w większości przypadków dostatecznie chroniły zwierzęta przeciw zakażeniu zjadliwym wirusem RHD. W szczepionkach tych aktywnym antygenem są tzw. cząstki wirusopochodne (ang. virus-like paricles) VLP-RHDV, które wykazują wysokie podobieństwo morfologiczne (średnica, wygląd w mikroskopie elektronowym) do natywnego wirusa RHD. VLP udało się uzyskać w systemie bakulowirusowym m. in. dla hemaglutynujących szczepów wirusa RHD, a takż e innych kaliciwirusów, których nie moż na był o namnoż y ć in vitro - np. wirusa Norwalk bę d ącego przyczyną zachorowań jelitowych objawiających się biegunką u ludzi czy wirusa syndromu krwotocznej choroby u zajęcy EBHS. Rekombinowane białka z regionu kapsydu uzyskano także w innych systemach ekspresji: - Saccharomyces cerevisiae i Escherichia coli, chociaż nie w każdym przypadku uzyskano efekt ochronny [Boga 1997, Jiang 1994, Laurent 1994, Laurent 1997, Nagesha 1995, Sibilia 1995].

Produkty ekspresji wirusowego cDNA RHDV uzyskane in vitro w systemach lizatów retykulocytów królika (RRL) i E. coli użyto do badania mechanizmu powstawania i rozpadu dużej poliproteiny (257 kDa) kodowanej przez główną ramkę odczytu ORF 1. W wyniku rozpadu poliproteiny uzyskano kilka białek wirusowych RHDV, w tym białko o masie 60 kDa rozpoznawane przez surowicę odpornościową anty-RHDV [Alonso 1996].

Ekspresję strukturalnego białka kapsydu (VP60) wirusa RHD uzyskano w systemie wirusowym vaccinia (krowianki). Rekombinowany wirus RecV-VP60 namnożono poprzez zakażenie komórek RK13. Jak wykazano w pośredniej reakcji immunofluorescencji (IF) i immunoprecypitacji z przeciwciałami anty-RHDV uzyskany produkt białkowy o masie 60 kDa - posiadał właściwości antygenowe. Po podaniu królikom, w iniekcji śródskórnej i doustnie, białko indukowało powstanie swoistych przeciwciał o wysokim mianie i chroniło w próbie zakaż enia zjadliwym wirusem RHD wykonanej 15 dnia po zakażeniu [Bertagnoli 1996].

Laurent et al. zastosowali system bakulowirusowy w celu ekspresji genu vp60 wirusa RHD. Stwierdzono wydzielanie się do pożywki z hodowli komórek owadzich Sf9 białka rekombinowanego, które formowało się w struktury pseudowirusowe VLP, strukturalnie i immunologicznie nie do odróżnienia od natywnych wirionów wirusa RHD.

Po zaszczepieniu królików drogą domięśniową uzyskano pełną ochronę w próbie zakażenia zjadliwym wirusem wykonanej w 15 dniu po szczepieniu. Zaszczepiono dwie grupy po 10 królików, które otrzymały po 100 μg białka rekombinowanego (VLPs) w połączeniu z pełnym adiuwantem Freunda. Zakażenie wykonano po 15 dniach (grupa nr 1) i/lub po 5 dniach (grupa nr 2) podając zjadliwy wirus w dawce 1000 LD50. Wszystkie króliki szczepione przed 15 dniami przeżyły i stwierdzono u nich wysoki, wzrastający poziom swoistych przeciwciał (test ELISA). W drugiej grupie jeden królik padł i rozpoznano u niego RHD [Laurent 1994].

Laurent et al. uzyskali w systemie bakulowirusowym, stosując komórki owadzie Sf9 ekspresję genu vp60 wirusa syndromu krwotocznej choroby zajęcy - EBHSV, należącego do Caliciviridae. Wirus EBHSV jest bardzo blisko spokrewniony z wirusem RHD. Ma podobną morfologię (wielkość i wygląd w mikroskopie elektronowym). Badania ochrony krzyżowej wykazały, że króliki szczepione rekombinowanym białkiem EBHSV (rEBHSV) nie są odporne na zakażenie zjadliwym wirusem RHD [Laurent 1997].

Gen kodujący strukturalne białko kapsydu RHDV poddano ekspresji w systemie E. coli lub w systemie polimerazy T7 RNA. W systemie E. coli uzyskano białko fuzyjne, które tylko częściowo wykazywało podobieństwo antygenowe do natywnego białka VP60 i po immunizacji nie uzyskiwano ochrony w próbie zakażenia zjadliwym wirusem.

Jednym z systemów prokariotycznych służących do nadprodukcji białek z wielu heterologicznych genów jest system polimerazy RNA faga T7 oraz promotora (φ 10) wraz z rejonem RBS z genu 10 faga T7 (kodującego białko płaszcza), używając E.coli jako gospodarza. Polimeraza faga T7 enzym kodowany przez gen 1 tego faga, jest pojedynczym polipeptydem liczącym 883 aa, co odpowiada masie cząsteczkowej 98,8 kDa. Polimeraza T7 rozpoznaje tylko własne terminatory. Pracuje 8 razy szybciej niż polimeraza E.coli zaś rejon RBS sekwencji liderowej genu 10 faga T7 zwiększa ponad 40 razy wydajność translacji większości przetestowanych genów dzięki istnieniu szeregu sygnałów translacyjnych.

W celu wykorzystania polimerazy RNA faga T7 skonstruowano specjalne wektory, w których umieszczono silny promotor φ 10 z faga T7 i terminator Tφ. Wektory te zaliczane są do pochodnych plazmidu pBR322, są to wektory pT7-3 do pT7-7.

PL 205 229 B1

Natomiast w systemie T7 RNA uzyskano białko rekombinowane, które po dwukrotnej immunizacji królików (1-ego i 7-ego dnia) stymulowało powstawanie swoistych przeciwciał i ochronę po wykonaniu zakażenia śmiertelną dawką oczyszczonego wirusa RHD w 7 dniu po podaniu drugiej dawki immunizacyjnej [Boga 1994].

W systemie drożdży Saccharomyces cerevisiae uzyskano białko rekombinowane, które chroniło w próbie zakaż enia zjadliwym wirusem RHDV. Białko posiadało właś ciwości antygenowe charakterystyczne dla RHDV. W mikroskopie wykazano obecność struktur wirusopodobnych - VLP wykazujących zbliżoną wielkość (średnicę).

W celu oceny immunogennoś ci rekombinowanego białka 4 króliki immunizowano podskórnie próbkami białka całkowitego stanowiącego osad uzyskany metodą ultrawirowania o stężeniu 400 μg (natomiast względna ilość białka rekombinowanego w próbce na podstawie analizy SDS-PAGE wynosiła ok. 10%). Zakażenie zjadliwym wirusem 100 LD50 wykonano 14 dni po immunizacji pojedynczą dawką [Boga 1997].

Strukturalne białko kapsydu VP60 wirusa RHD wyprodukowano w roślinach transgenicznych (ziemniak). Króliki immunizowano w zastrzyku podając im ekstrakt z liści. W surowicy wykazano wysokie miana swoistych przeciwciał anty-RHDV, a króliki były chronione w próbie zakażenia doświadczalnego.

Pierwszego dnia dwa króliki otrzymały podskórnie po 1 ml zawiesiny zawierającej ok. 12 μg rekombinowanego białka VP60 z dodatkiem pełnego adiuwanta Freunda.

Następne dawki podano domięśniowo królikom w 30, 60 i 90 dniu w połączeniu z niepełnym adiuwantem Freunda.

Króliki zakażono wirusem zjadliwym o mianie HA 1:16000 /ml. Króliki przeżyły zakażenie [Castanon 1999].

Białko kapsydu wirusa RHD uzyskano w bakulowirusowym systemie ekspresji w komórkach owadzich. Króliki immunizowano dwukrotnie domięśniowo oczyszczonymi cząstkami pseudowirusowymi VLP w dawce 30ug, natomiast myszy białe immunizowano dootrzewnowo podając 10 μg białka rekombinowanego. Antygen podawano łącznie z adiuwantem Titer Max. Dawkę przypominającą podawano po 14 dniach. Cztery szczepione króliki zakażono doświadczalne zjadliwym wirusem o mianie 1000 LD50. Króliki szczepione przeżyły zakażenie, natomiast 2 króliki kontrolne padły [Nagesha 1995].

Białko kapsydu wirusa RHD uzyskano w bakulowirusowym systemie ekspresji w komórkach owadzich dwiema drogami: 1) na podstawie informacji genetycznej zapisanej na matrycy mRNA analogicznej do subgenomowego RNA wirusa RHD oraz 2) jako fragment większej poliproteiny białkowej, obejmującej białka niestrukturalne (proteazę 3C i polimerazę RNA) i strukturalne białko kapsydu, wytworzonej na podstawie informacji genetycznej genomowego RNA. W obu sposobach ekspresji uzyskano cząstki pseudowirusowe VLPs, podobne antygenowo i morfologicznie do oczyszczonych wirionów natywnej postaci wirusa.

Sześć królików wolnych od swoistych przeciwciał poddano jednokrotnej immunizacji rekombinowanym białkiem VLPs w dawkach zawierających 10 i 100 μg białka z dodatkiem adiuwanta (żelu wodorotlenku glinu). Po 2 tygodniach pobrano surowice i wykonano zakażenie zjadliwym wirusem w dawce 10³LD50. Króliki wykazywały obecność swoistych przeciwciał o mianie od 1/60 do 1/400. Króliki immunizowane przeżyły nie wykazując żadnych objawów choroby, natomiast dwa zwierzęta kontrolne padły do 52 godziny po zakażeniu [Sibilia 1995].

W opisie patentowym PL183976 (opublikowanym 1998-12-07) przedstawiono sposób wykorzystania testu ELISA do badania surowic królików w kierunku krwotocznej choroby królików (RHD). Sposób polega na tym, że w teście ELISA wykorzystuje się mikropłytki opłaszczone swoistą surowicą odpornościową kury przeciw wirusowi pomoru królików, antygen wirusa RHD konserwowany glicerolem, swoistą surowicę odpornościową świnki morskiej przeciw wirusowi RHD, koniugat antyglobulinowy, substrat enzymatyczny - H2O2/OPD oraz układ referencyjny składający się z surowicy króliczej ujemnej, wysokododatniej i niskododatniej - progowej w kierunku krwotocznej choroby królików - RHD.

W opisie patentowym PL183983 (opublikowanym 1998-12-07) przedstawiono sposób wykorzystania testu ELISA do diagnostyki wirusa krwotocznej choroby królików. Sposób polega na tym, że w teście ELISA wykorzystuje się mikropłytki opłaszczone swoistą surowicą odpornościową kury przeciw wirusowi RHD, swoistą surowicę odpornościową świnki morskiej przeciw wirusowi RHD, koniugat antyglobulinowy, substrat enzymatyczny - H2O2/OPD oraz układ kontrolny składający się z antygenu referencyjnego dodatniego o właściwościach hemaglutynujących oraz pozbawionego tych właściwości i antygenu referencyjnego ujemnego.

PL 205 229 B1

W opisie patentowym PL160369 (opublikowanym 1991-03-11) opisano sposób wytwarzania szczepionki przeciwko pomorowi królików.

W zgłoszeniu patentowym US2003186431 (opublikowanym 2003-10-02) opisano szczepionkę przeciwko krwotocznej chorobie królików oraz antygen. Strukturalny antygen VP60 wirusa krwotocznej choroby królików (RHDV) bądź jego fragment może być uzyskiwany w roślinach poprzez zastosowanie wektora wirusowego opartego na poxwirusie (PPV), zawierającego promotor, rekombinowaną sekwencję DNA zawierającą cDNA przyłączone do genomu wirusa PPV, pełną długość, oraz sekwencję DNA kodującą białko RHDV VP60 lub jego fragment wprowadzony pomiędzy sekwencje nukleotydowe kodujące białka Nib i CP wirusa PPV, oraz element klonujący. Otrzymany antygen jest zdolny do pobudzania reakcji obronnych przeciwko krwotocznej chorobie królików (RHDV), i może być wykorzystywany jako rekombinowaną szczepionka podjednostkowa przeciwko pomorowi królików.

W opisie patentowym EP0972840 (opublikowanym 2000-01-19) przedstawiono nowy atenuowany rekombinowany wirus myxoma oraz jego zastosowanie do wytwarzania mieszanych szczepionek przeciwko myksomatozie oraz krwotocznej chorobie królików. Nowy rekombinowany wirus myxoma jest złożony w depozytornii CNCM pod numerem 1-1990. W swoim genomie zawiera sekwencję nukleotydową zdolną do ekspresji antygenu VP60 krwotocznej choroby królików. Szczep jest atenuowany i wykazuje kontrolowaną zdolność transmisji, zarówno jako szczepionka przeciwko myksomatozie, jak i szczepionka anty-RHDV otrzymane z opisanego powyżej wirusa. Opisany jest także sposób otrzymywania atenuowanego rekombinowanego wirusa myxoma, wykorzystywanego przy wytwarzaniu samorozprzestrzeniających się łączonych szczepionek przeciwko myksomatozie i innym chorobom króliczym.

W opisie patentowym W09639177 (opublikowanym 1996-12-12) opisano kompozycje rekombinowanego wirusa poxvirus-calicivirus (wirusa krwotocznej choroby króliczej RHDV) i ich zastosowanie. Opisano atenuowane rekombinowane wirusy zawierające DNA kodujące antygen kaliciwirusa taki jak antygen RHDV, a mianowicie gen kapsydu, a także sposoby i kompozycje zawierające te wirusy, ekspresję ich produktów oraz przeciwciała powstałe w wyniku działania wirusów oraz produkty genowe o licznych zastosowaniach zapobiegawczych, terapeutycznych i diagnostycznych. Wirusowe DNA może być wykorzystywane zarówno do sond jak i primerów. W opisie patentowym CN1134461 (opublikowanym 1996-10-30) opisano rekombinowane kapsydy i białka wirusa krwotocznej choroby królików (RHDV), zestawy diagnostyczne oraz szczepionki zawierające wspomniane kapsydy oraz białka. Rekombinowane kapsydy i rekombinowane białka wirusa krwotocznej choroby królików (RHDV) były wytwarzane w rekombinowanym systemie ekspresji bakulowirusa w hodowli komórkowej owadów. Uzyskane kapsydy i białka są immunogenne i antygenowo analogiczne względem natywnego białka VP60 RHDV i nadają się do wytwarzania szczepionek stosowanych przeciwko krwotocznej chorobie królików, a także do przygotowywania testów diagnostycznych umożliwiających wykrycie obecności przeciwciał rozpoznających RHDV oraz obecności RHDV w próbkach biologicznych pobranych od królików.

W opisie patentowym EP0704529 (opublikowanym 1996-04-03) opisano szczepionkę przeciwko wirusowi krwotocznej choroby królików, wytwarzanie strukturalnego antygenu (VP60) wirusa RHD oraz jego zastosowanie jako szczepionki. Wytwarzanie antygenu oraz sposób szczepienia obejmuje następujące etapy: a) izolacja genu kodującego białko strukturalne (VP60) wirusa RHD; b) klonowanie wspomnianego genu w wektorze transferowym bakulowirusa pAcYM1; c) otrzymanie i izolacja rekombinowanego bakulowirusa AcVP60; d) zainfekowanie komórek owadzich S/9 rekombinowanym bakulowirusem AcVP60; e) otrzymanie i izolacja białka VP60 wytwarzanego przez rekombinowany bakulowirus AcVP60; f) inokulacja królików przy zastosowaniu antygenu.

W zgłoszeniu patentowym KR2002061139 (opublikowanym 2002-07-23), opisach patentowych HU53809 (opublikowanym 1990-12-28), CN86100553 (opublikowanym 1987-09-02), CS8808644 (opublikowanym 1989-12-13) opisano sposób wytwarzania inaktywowanej szczepionki przeciwko krwotocznej chorobie królików (Viral haemorrhagic disease of rabbits (VHD).

W opisie patentowym CS8904066 (opublikowanym 1991-02-12) opisano inaktywowaną oleistą szczepionką przeciwko wirusowi krwotocznej choroby królików oraz sposób jej przygotowania.

W opisie patentowym RU2064304 (opublikowanym 1996-07-27) opisano sposób wytwarzania szczepionki przeciwko myksomatozie oraz wirusowi krwotocznej choroby królików.

W opisie patentowym RU2007452 (opublikowanym 1994-02-15) przedstawiono szczep komórek hybrydowych mus musculus - wytwarzający monoklonalne przeciwciała wykorzystywane przy diagnozowaniu choroby krwotocznej królików. W opisie patentowym CN1043739 (opublikowanym

PL 205 229 B1

1990-07-11) przedstawiono szczep silnie zjadliwy wykorzystywany przeciwko wirusowi krwotocznej choroby królików oraz sposób wytwarzania szczepionki.

W opisach patentowych CS9005797 (opublikowanym 1992-03-18) oraz CS8906486 (opublikowanym 1992-03-18) opisano limfocyty wytwarzane w liniach komórek hybrydowych nowotworów myszy lub myszowatych RHDV-02 oraz RHDV-01 (odpowiednio dla zgłoszeń CS9005797 i CS8906486) wytwarzające monoklonalne przeciwciała przeciwko wirusowi krwotocznej choroby królików. W opisie patentowym FR2690838 (opublikowanym 1993-11-12) przedstawiono szczepionkę przeciwko wirusowi krwotocznej choroby królików zawierającą inaktywowane kultury tkankowe YHD wraz z adiuwantami wprowadzanymi do organizmu bez użycia igły, ponadto kultury te mogą być włączone do szczepionki przeciwko myksomatozie.

W opisie patentowym AU6247000 (opublikowanym 2000-12-14) opisano kompozycję rekombinowanego wirusa poxvirus-calicivirus oraz ich zastosowanie.

Podobnie w opisie patentowym US5989561 (opublikowanym 1999-11-23) opisano kompozycję rekombinowanego wirusa poxvirus-calicivirus krwotocznej choroby królików i ich zastosowanie. W rozwiązaniu tym przedstawione został y atenuowane rekombinowane wirusy zawierają ce DNA kodujące antygen kaliciwirusa taki jak antygen RHDV, mianowicie gen kapsydu, a także sposoby i kompozycje dotyczące wirusa, produkty ich ekspresji oraz przeciwciała wyprodukowane przez ten wirus bądź produkty ekspresji. Rekombinowane wirusy mogą być rekombinowanymi wirusami NYVAC lub ALVAC. Rekombinowane wirusy oraz produkty genowe z nich uzyskane a także przeciwciała wytworzone przez wirusy oraz produkty genowe mogą mieć liczne zastosowania zarówno prewencyjnie, terapeutycznie jak i diagnostycznie. DNA z wirusów może być wykorzystywane do sond oraz do primerów.

W opisie patentowym BG52094 (opublikowanym 1996-07-31) przedstawiono sposób wytwarzania szczepionki przeciwko pomorowi królików. Szczepionka wytwarzana jest z zainfekowanych przez wirusa tkanek wątroby, który jest mechanicznie niszczony roztworem chlorku sodu zawierającego 0,8 - 0,2% saponiny i następnie inaktywowany w temperaturze w przedziale 67 - 69°C przez 80 do 100 min., a następnie zostaje poddany liofilizacji.

Pomimo opisanych powyżej badań poświęconych otrzymywaniu rekombinowanej szczepionki przeciwko wirusowej krwotocznej chorobie królików (RUD) istnieje ciągła potrzeba uzyskania skutecznego rozwiązania umożliwiającego uzyskanie szczepionki markerowej.

Celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie środków, które mogłyby być wykorzystane do opracowania sposobu otrzymania rekombinowanego strukturalnego białka kapsydu o właściwościach antygenowych i hemaglutynacyjnych, zdolnego do formowania cząstek pseudowirusowych (VLP) i stymulowania wytwarzania u szczepionych zwierząt przeciwciał neutralizujących.

Realizacja tak określonego celu i rozwiązanie opisanych w stanie techniki problemów związanych z otrzymywaniem samo-formujących się (ang. self-assembly) kapsydów, podobnych morfologicznie do form występujących u wirusa natywnego umożliwiające wykorzystanie ich w postaci szczepionki genetycznej oraz zapewniające dodatkowe możliwości badania struktury antygenowej wirusa, w tym lokalizacji epitopów odpowiedzialnych za neutralizację i hemaglutynację zostały osiągnięte w niniejszym wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania rekombinowanej szczepionki przeciw krwotocznej chorobie królików (Rabbit Haemorrhagic Disease - RHD), charakteryzujący się tym, że obejmuje pobieranie materiału od zakażonych królików, lomogenizację narządów i izolację materiału genetycznego na drodze izolacji całkowitego RNA, otrzymywanie matrycy DNA - komplementarnej nici DNA, powielanie genu strukturalnego białka kapsydu (vp60) wirusa RHD o wielkości 1,8 kb, klonowanie pełnego genu vp60 do wektora pGEM T-easy i określenie sekwencji nukleotydów i aminokwasów genu vp60 RHDV, wklonowanie genu vp60 do genomu bakulowirusa, transfekowanie komórek owadzich i uzyskanie ekspresji rekombinowanego białka strukturalnego VP60 RHDV, a następnie adsorpcję uzyskanego antygenu rekombinowanego białka VP60 na adiuwancie w postaci żelu wodorotlenku glinu.

Korzystnie gdy stosuje się polski szczep wirusa krwotocznej choroby królików SGM, o właściwościach hemaglutynacyjnych i antygenowych oraz sprawdzonej zjadliwości dla królików.

Korzystnie gdy zakażenia królików dokonuje się zjadliwym szczepem SGM RHDV o właściwościach hemaglutynacyjnych.

Korzystnie gdy pobierania wątroby od zakażonych królików dokonuje się w szczytowym okresie wiremii między 36-72 godziną po zakażeniu.

PL 205 229 B1

Korzystnie gdy izolacji materiału genetycznego dokonuje się na drodze izolacji całkowitego RNA metodą tiocjanian guanidyny-fenol-chloroform-alkohol izoamylowy i precypitacji etanolem.

Korzystnie gdy otrzymywanie matrycy DNA - komplementarnej nici DNA dokonuje się w reakcji odwrotnej transkrypcji (RT).

Korzystnie gdy powielanie genu strukturalnego białka kapsydu (vp60) wirusa RHD o wielkości

1,8 kb dokonuje się przy zastosowaniu metody enzymatycznej amplifikacji, przy czym do amplifikacji materiału genetycznego w łańcuchowej reakcji polimerazy stosuje się startery reakcji obejmujące pełny odcinek genu vp60 o wielkości ok. 1,8 kb, zawierające sekwencję startową atg 5305-5307 i kodon stop 7042-7044.

Korzystnie gdy rekombinowane białko VP60 RHDV będące produktem ekspresji do pożywki hodowli komórek owadzich Spodoptera frugiperda, zbiera się po upływie czwartej doby prowadzenia hodowli i poddaje się badaniu na obecność tiemaglutynujących cząstek pseudowirusowych - VLP (virus-like particles). Korzystnie gdy w odczynie hemaglutynacji (HA) określa się miano HA i aktywność antygenową w teście ELISA.

Korzystnie gdy wklonowania genu vp60 do genomu bakulowirusa dokonuje się za pośrednictwem wektora pFast Bac będącego składnikiem systemu ekspresji białek Bac-to-Bac (Invitrogen).

Korzystnie gdy pierwszy etap obejmuje klonowanie do wektora pGEM T-easy (Promega).

Korzystnie gdy drugi etap obejmuje subklonowanie z wektora pGEM T-easy do wektora pFastBac (Invitrogen).

Korzystnie gdy prowadzi się adsorpcję uzyskanego antygenu rekombinowanego białka VP60 na adiuwancie w postaci żelu wodorotlenku glinu użytym w ilości 5-20%.

Korzystnie gdy adsorpcję antygenu na adiuwancie prowadzi się w temperaturze 2-10°C.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie antygenu rekombinowanego białka VP60, otrzymywanego poprzez zakażenie królików zjadliwym szczepem SGM RHDV o właściwościach hemaglutynacyjnych, pobieranie wątroby od zakażonych królików, homogenizację narządów i izolację materiału genetycznego na drodze izolacji całkowitego RNA, otrzymywanie matrycy DNA komplementarnej nici DNA, powielanie genu strukturalnego białka kapsydu (vp60) wirusa RHD o wielkości 1,8 kb, subklonowanie pełnego genu vp60 do wektora pGEM T-easy i określenie sekwencji nukleotydów i aminokwasów genu vp60 RHDV, wklonowanie genu vp60 do genomu bakulowirusa transfekowanie komórek owadzich i uzyskanie ekspresji rekombinowanego białka strukturalnego VP60 RHDV a następnie adsorpcję uzyskanego antygenu rekombinowanego białka VP60 na adiuwancie w postaci ż elu wodorotlenku glinu, do wytwarzania szczepionki przeciwko krwotocznej chorobie królików (Rabbit Haemorrhagic Disease RHD).

Korzystnie gdy powielania genu strukturalnego białka kapsydu (vp60) wirusa RHD o wielkości

1,8 kb dokonuje się przy zastosowaniu metody enzymatycznej amplifikacji, przy czym do amplifikacji materiału genetycznego w łańcuchowej reakcji polimerazy stosuje się startery reakcji obejmujące pełny odcinek genu vp60 o wielkości ok. 1,8 kb, zawierające sekwencję startową atg 5305-5307 i kodon stop 7042-7044.

Korzystnie gdy rekombinowane białko VP60 RHDV będące produktem ekspresji do pożywki hodowli komórek owadzich Spodoptera frugiperda, zbiera się po upływie czwartej doby prowadzenia hodowli i poddaje się badaniu na obecność tiemaglutynujących cząstek pseudowirusowych - VLP (virus-like particles). Korzystnie gdy wklonowania genu vp60 do genomu bakulowirusa dokonuje się za pośrednictwem wektora pFast Bac będącego składnikiem systemu ekspresji białek Bac-to-Bac (Invitrogen).

Korzystnie gdy pierwszy etap obejmuje klonowanie do wektora pGEM T-easy (Promega).

Korzystnie gdy drugi etap obejmuje subklonowanie z wektora pGEM T-easy do wektora pFastBac (Invitrogen).

Korzystnie gdy prowadzi się adsorpcję uzyskanego antygenu rekombinowanego białka VP60 na adiuwancie w postaci żelu wodorotlenku glinu użytym w ilości 5-20%.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest szczepionka przeciwko krwotocznej chorobie królików (Rabbit Haemorrhagic Disease RHD), charakteryzująca się tym, że zawiera antygen rekombinowanego białka VP60, otrzymywany poprzez zakażenie królików zjadliwym szczepem SGM RHDV o właściwościach hemaglutynacyjnych, pobieranie wątroby od zakażonych królików, homogenizację narządów i izolację materiał u genetycznego na drodze izolacji cał kowitego RNA, otrzymywanie matrycy DNA komplementarnej nici DNA, powielanie genu strukturalnego białka kapsydu (vp60) wirusa RHD o wiel8

PL 205 229 B1 kości 1,8 kb, subklonowanie pełnego genu vp60 do wektora pGEM T-easy i określenie sekwencji nukleotydów i aminokwasów genu vp60 RHDV, wklonowanie genu vp60 do genomu bakulowirusa, transfekowanie komórek owadzich i uzyskanie ekspresji rekombinowanego białka strukturalnego VP60 RHDV, a następnie adsorpcję uzyskanego antygenu rekombinowanego białka VP60 na adiuwancie w postaci żelu wodorotlenku glinu.

Korzystnie gdy powielanie genu strukturalnego białka kapsydu (vp60) wirusa RHD o wielkości

1,8 kb dokonuje się przy zastosowaniu metody enzymatycznej amplifikacji, przy czym do amplifikacji materiału genetycznego w łańcuchowej reakcji polimerazy stosuje się startery reakcji obejmujące pełny odcinek genu vp60 o wielkości ok. 1,8 kb, zawierające sekwencję startową atg 5305-5307 i kodon stop 7042-7044.

Korzystnie gdy wklonowania genu vp60 do genomu bakulowirusa dokonuje się za pośrednictwem wektora pFast Bac będącego składnikiem systemu ekspresji białek Bac-to-Bac (Invitrogen).

Korzystnie gdy drugi etap obejmuje subklonowanie z wektora pGEM T-easy do wektora pFastBac (Invitrogen).

Poniżej zaprezentowano przykładowe realizacje zdefiniowanego powyżej wynalazku.

P r z y k ł a d I. Wirusem RHD o mianie HA 10240, zakażono eksperymentalnie 3 króliki, które zachorowały i padły między 36 a 56 godziną po zakażeniu. Podczas sekcji pobierano płuca, serce, śledzionę, wątrobę i nerki. Narządy każdego królika oznakowano i oddzielnie umieszczano na okres 1 doby w zamrażarce w temperaturze poniż ej - 18°C. Następnie wątrobę od jednego królika rozmrożono, pobrano fragment o masie 2 g, pokrojono nożyczkami na kawałki i roztarto w moździerzu, uzupełniono 8 ml oziębionego 0,85% NaCl i poddano ekstrakcji w temp. 2-8°C przez 1 godzinę. Do homogenatu dodano 2 ml chloroformu cz.d.a, wymieszano i poddano ekstrakcji przez 1 godz. W temp. 2-8°C, a nastę pnie odwirowano przez 10-15 minut przy prę dkoś ci 5000 obrotów/minutę . Uzyskano około 9 ml klarownego supernatantu - zawiesiny wirusa. Oznaczono miano wirusa w odczynie hemaglutynacji i aktywność antygenową w metodzie ELISA.

Materiał genetyczny wirusa izolowano z zawiesiny wirusa metodą tiocjanian guanidyny- fenolchloroform-alkohol izoamylowy i precypitacji etanolem (wg Chomczyńskiego i Sacchi) [Chomczyński 1978] i/lub stosując zestaw do szybkiej izolacji RNA np. firmy Qiagen (RNeasy mini kit). Do otrzymania w reakcji odwrotnej transkrypcji (RT) komplementarnej nici DNA (cDNA) uż yto enzymu odwrotnej transkryptazy AMV i startera oligonukleotydowego VP2 antisense: (7051-7071) 5' GCACCTGCAAGTCCCAATCCG z końca 3' genomu lub uniwersalnego startera dt15 umożliwiającego syntezę nici DNA od końca poły A wg opisanej metodyki (Fitzner A. 1999).

Pełny gen vp60 wirusa RHD powielano metodą PCR - łańcuchowej reakcji polimerazy wykorzystując do tego celu starter oligonukleotydowy VP1(5302-5321) zawierający kodon startowy atg: 5' ATGGAGGGCAAAGCCCG.

Gen vp60 wklonowano wg procedury producenta do wektora typu pGEM T-easy (Promega), który jest przeznaczony do klonowania produktów przeznaczonych do późniejszego sekwencjonowania.

W następnym etapie gen vp60 subklonowano do wektora pFast Bac1 i wprowadzono do genomu bakulowirusa wg procedury Bac-to-Bac (Invitrogen, Life Technologies).

Komórki owadzie Spodoptera frugiperda linii Sf9 hodowano na pożywce syntetycznej HyQ SFXInsect MP (powder) z dodatkiem antybiotyków w hodowli jednowarstwowej lub płynnej do gęstości ok. 2x10⁶/ml. Następnie komórki zakażano zrekombinowanym bakulowirusem niosącym gen vp60 RHDV wg Summers M.D., Smith E., 1987 (A manual of methods for baculovirus vectors and insect Wells culture proedures. Bulletin no 1555. teras Experimental Stadion, College stadion TX, USA) i hodowano przez okres od 48 do 120 godz., korzystnie 96 godz. Następnie zebrane komórki oddzielano od pożywki. Oddzielano z zawiesiny frakcję stałą i supernatant - frakcję rozpuszczalną pożywki zawierającą rekombinowane białko VP60, które używano jako antygen i po określeniu jego właściwości w teście IPMA, metodzie western blot, metodą mikroskopii elektronowej, w odczynie hemaglutynacji i testem ELISA używano do immunizacji zwierząt laboratoryjnych - królików i świnek morskich.

W tym celu pożywkę zawierającą rekombinowane białko wirusa RHD w postaci cząstek pseudowirusowych VLP o mianie HA w wysokości 5120-10240 połączono z adiuwantem 3% żelem wodorotlenku glinu w ilości 10% ( 27 ml pożywki i 3 ml żelu wodorotlenku w postaci jałowego produktu Alhydrogel). Komponenty zmieszano i przetrzymywano w temp. 2-8°C przez 1 godzinę. Mieszaninę użyto jako szczepionkę doświadczalną.

Szczepienie. Grupa 11 królików w wieku 3 miesięcy, o masie ok. 2,0 -2,5 kg z hodowli wolnej od zachorowań na RHD. Od zwierząt pobrano surowicę „0 i wykonano badania serologiczne w odczynie

PL 205 229 B1 zahamowania hemaglutynacji (HI) i w teście ELISA w kierunku przeciwciał swoistych dla wirusa RHD (użyto dwóch różnych zestawów ELISA do badań surowic, z których pierwszy zawiera w swym składzie odpornościowe surowice poliklonalne anty RHDV, natomiast drugi zestaw zawiera przeciwciała monoklonalne). Po sprawdzeniu, że zwierzęta nie mają przeciwciał anty-RHDV, siedem królików (nr 1-7) zaszczepiono podając im jednokrotnie w iniekcji podskórnej w okolicy karku po 1 ml szczepionki w dawce zawierającej 80-100 μg białka rekombinowanego, o mianie HA 5120-10240 j HA/ml.

Dwóm królikom kontrolnym (nr 8k-9k) podano w iniekcji po 1 ml pożywki z hodowli komórek owadzich po transfekcji „dzikim typem bakulowirusa tzn. takim, który nie zawierał genu vp60 wirusa RHD.

Dwa ostatnie króliki (nr 10k-11k) tworzyły grupę kontrolną królików nieszczepionych. Po 8 dniach od 4 królików pobrano krew z żyły brzeżnej ucha w celu oznaczenia swoistych przeciwciał.

W dwunastym dniu po szczepieniu od wszystkich 11 królików ponownie pobrano krew i oznaczono poziom przeciwciał swoistych w surowicach i wykonano zakażenie doświadczalne zakażając króliki w iniekcji podskórnej. Królikom podano po 1,5 ml zawiesiny zjadliwego wirusa RHD w dawce 100 LD50 /ml i mianie HA 10240. Spośród grupy królików szczepionych nr 1-7 wszystkie przeżyły próbę zakażenia i zostały skrwawione po upływie 10 dni, natomiast spośród królików kontrolnych nr 8k-11k trzy padły do 48 godziny po zakażeniu a czwarty padł w trzeciej dobie przed 72 godziną. U królików kontrolnych z narządów trzewnych (wątroba, śledziona, nerki) reizolowano natywny wirus RHD.

Badania wykrywania przeciwciał przeciw wirusowi RHD i oznaczenie miana w surowicach szczepionych królików przedstawia tabela nr 1. Stwierdzono tendencję wzrostową poziomu przeciwciał w próbkach surowicy pobranych w kolejnych dniach po szczepieniu i zakażeniu. Miana swoistych przeciwciał u 6 szczepionych królików w 12 dniu po szczepieniu wyniosły od 1:60 d od 1:320, a u jednego występowały na granicy wykrywalności. Po zakażeniu u wszystkich królików nastąpił silny wzrost miana swoistych przeciwciał.

T a b e l a nr 1

Występowanie przeciwciał przeciw wirusowi RHD w surowicach królików nr 1-11 immunizowanych szczepionką doświadczalną zawierającą cząstki pseudowirusowe VLP

Lp	Miano przeciwciał HI / ELISA
„0”	8 dni p.v	12 dni p.v (wykonano zakażenie dośw. -challenge)	12 dni p.v + 8 dni po zakażeniu RHDV
HI	ELISA	HI	ELISA	HI	ELISA	HI	ELISA
1	<10	<10	80	60	80	70	2560	640/1280
2	<10	<10			80	140	5120	>1280
3	<10	<10			160	330	5120	>1280
4	<10	<10	160	120	160	140	5120	1280
5	<10	<10			80	70	1280	640
6	<10	<10			60	70	2560	1280
7	<10	<10	<10	<10	<10	10	160/320	80/160
8k	<10	<10			<10	<10	Padł 48 h
9k	<10	<10			<10	<10	Padł 48 h
10k	<10	<10			<10	<10	Padł 72 h
11 k	<10	<10	<10	<10	<10	<10	Padł 48 h
Ks+	5120	+		+		+
Ks-	<10	-		-		-

Objaśnienia: HI - odczyn zahamowania hemaglutynacja ELISA - test immunoenzymatyczny p.v - po szczepieniu; Ks + lub - surowice kontrolne: dodatnia i ujemna

PL 205 229 B1

P r z y k ł a d II. Oceniano dynamikę powstawania swoistych przeciwciał (serokonwersję) w surowicach zwierząt laboratoryjnych - królików i świnek morskich immunizowanych dwukrotnie oczyszczonym, rekombinowanym białkiem SGM1800 VP60 w koncentracji ok. 100 μg/ml, z dodatkiem adiuwanta Freunda w formie pełnej (CFA) i niepełnej (ICFA).

Zwierzęta szczepiono śródskórnie i podskórnie, w odstępie 21 dni (świnki morskie) lub 28 dni (króliki). Preparat rekombinowanego białka SGM1800 VP60 - cząstki pseudowirusowe VLP obecne w pożywce hodowli komórek owadzich Sf9 oczyszczono metodą ultrawirowania w gradiencie gęstości sacharozy (60-10%) przy 82000xg, w temp. 4°C przez 1,3 h.

Do immunizacji użyto wybranych frakcji gradientu zawierających cząstki pseudowirusowe VLP o największej aktywności antygenowej, oznaczonej metodami western blotting, ELISA i w odczynie hemaglutynacja

Czterem królikom przy pierwszym szczepieniu podano po 1 ml zawiesiny zawierającej 0,5 ml białka rekombinowanego i 0,5 ml CFA, natomiast przy drugiej immunizacji podano 0,6 ml zawiesiny złożonej po równych częściach z białka rekombinowanego SGM1800VP60 i ICFA. Piąty królik - nieszczepiony stanowił kontrolę.

Trzy świnki morskie immunizowano dwukrotnie podając kompozycję złożoną po równych częściach z pożywki hodowli komórek owadzich zawierającej rekombinowane białko VP60 i z adiuwanta CFA lub ICFA. Każdej śwince morskiej podawano po 0,5 ml mieszaniny.

Od immunizowanych zwierząt pobierano krew przed szczepieniem, po 14, 21 (lub 28) dniach po pierwszej immunizacji oraz 14 dnia po podaniu przypominającej dawki rekombinowanego antygenu.

Na podstawie serologicznych badań w kierunku przeciwciał dla wirusa RHD wykonanych w odczynie zahamowania hemaglutynacji (HI) i testem ELISA u immunizowanych zwierząt stwierdzono bardzo wysokie stężenie swoistych przeciwciał po okresie obserwacji. Zgodnie z przewidywaniem dynamiczny wzrost miana przeciwciał nastąpił po podaniu przypominającej dawki antygenu. Od zwierząt zebrano poliklonalne, monospecyficzne surowice odpornościowe o mianach od 1/5120 do 1/40960, które użyto do opracowania i standaryzacji testu ELISA do diagnostyki wirusologicznej i serologicznej RHD.

LITERATURA

Alonso J.M., Casais R., Boga J.A., Parra Fr. Processing of Rabbit Hemorrhagic Disease Virus Polyprotein. 1996. J. Virol. 70, 1261-1265.

Anon. (2004) Manual of diagnostic tests and vaccine for terrestrial animals. OIE, fifth edition, chapter 2.8.3.

Bertagnoli S., Gelfi J., Petit F., Vautherot J.F., Rasschaert D., Laurent S., Gall Le G., Boilletot E., Chantal J., Boucraut-Baralon C. Protection of rabbits against viral haemorrhagic disease with a vaccinia-RHDV recombinant virus. Vacine, 1996 14, 506-510.

Boga J.A., Casais R., Marin M.S., Martin Alonso J.M., Carmenes R.S., Prieto., Parra F.: Molecular cloning, sequencing and expression in Escherichia coli of the capsid protein gene from rabbit haemorrhagic disease virus (Spanish isolate AST/89). J. Gen. Virol. 1994, 75, 2409-2413

Boga J.A., Martin Alonso J.M., Casais R., Parra F.: A single dose immunization with rabbit haemorrhagic disease virus major capsid protein produced in Saccharomyces cerevisiae induces protection. J. Gen. Virol. 1997, 78, 2315-2318,

Castanon S., Marin M.S., Martin-Alonso J.M., Boga J.A., Casais R., Humara J.M., Ordas R.J., Parra F. Immunization with potato plants expressing VP60 protein protects against rabbit hemorrhagic disease virus. J. Virol. 1999, 73, 4452-4455.

Chasey D., Lucas M.H., Westcott D.G., Sharp G., Kitching A., Hughes S.K.: Development of a diagnostic approach to the identification of rabbit haemorrhagic disease. Vet. Rec. 1995, 137, 158-160,

Chomczyński P., Sacchi N.(1978). Single-step method of RNA isolation by amid guanidinum thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Bioch., 162, 156-159,

Fitzner A., Kęsy A., Niedbalski W., Paprocka G. 1999, Medycyna Wet. 55, 120-122. Zastosowanie reakcji RT-PCR do identyfikacji szczepów wirusa krwotocznej choroby królików (RHD) wyosobnionych w Polsce.

Górski J., Mizak B., Mizak Z., Komorowski A.: Obraz kliniczny oraz zmiany anatomopatologiczne w przebiegu pomoru królików (wirusowej krwiotocznej bronchopneumonii królików). Życie wet. 1988, 63, 266-269.

PL 205 229 B1

Jiang X., Graham D. Y., Wang M., Estes M. K.: Expression, self assembly and antigenicity of the Norwalk virus capsid protein. J. Virol. 1992, 66, 6527-6532,

Laurent S., Vautherot J-F., Madelaine M-F., Le Gall G., Rasschaert D.: Recombinant rabbit hemorrhagic disease virus capsid protein expressed in baculovirus self-assembles into viruslike particles and induces protecion. J. Virol. 1994, 68, 6794-6798.

Laurent S. Vautherot J-F., Gall le G., Madelaine M-F., Rasschaert D.: Structural, antigenic and immunogenic relationships between European brown hare syndrome virus and rabbit haemorrhagic disease virus. J. Gen. Virol. 1997, 78, 2803-2811,

Liu S.J., Xue H.P., Pu B.Q., Quian N.H.: A new viral disease in rabbits. Anim. Husb. Vet. Med. 1984, 16, 253-255)

Meyers G.C., Wirblich FL, Thiel H-J.: Rabbit hemorrhagic disease virus molecular-cloning and nucleotide sequencing of a calicivirus genome. Virology 1991, 184, 664-676,

Meyers G., Wirblich CH., Thiel H-J.: Genomic and subgenomic RNAs of rabbit hemorrhagic disease virus are both protein-linked and packaged into particles. Virology 1991,184, 677-686.

Nagesha H. S., Wang L.F., Hyatt A. D., Morrissy C. J., Lenghaus C, Westbury H. A.: Self assembly, antigenicity, and immunogenicity of the rabbit haemorrhagic disease virus (Czechoslovakian strain V-351) capsid protein expressed in baculovirus. Arch. Virol. 1995, 140, 1095-1108,

Ohlinger V. F., Haas B., Meyers G., Weiland F., Thiel H-J.: Identification of the virus causing rabbit hemorrhagic disease. J. Virol. 1990, 64, 3331-3336,

Parra F., Prieto M.: Purification and characterization of a calicivirus as the causative agent of a lethal hemorrhagic disease in rabbits. J. Virol. 1990, 64, 4013-4015.

Rasschaert D., Huguet S., Madelaine M-F., Vautherot J-F.: Sequence and genomic organization of a rabbit hemorrhagic disease virus isolated from a wild rabbit. Virus Genes. 1994, 9:2, 121-132.

Sibilia M., Boniotti M. B., Angoscini P., Capucci L., Rossi C.: Two independent pathways of expression lead to self-assembly of the rabbit hemorrhagic disease virus capsid protein. J. Virol. 1995, 69, 5812-5815.

Claims (25)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania rekombinowanej szczepionki przeciw krwotocznej chorobie królików (Rabbit Haemorrhagic Disease - RHD), znamienny tym, że obejmuje pobieranie materiału od zakażonych królików, homogenizację narządów i izolację materiału genetycznego na drodze izolacji całkowitego RNA, otrzymywanie matrycy DNA - komplementarnej nici DNA, powielanie genu strukturalnego białka kapsydu (vp60) wirusa RHD o wielkości 1,8 kb, klonowanie pełnego genu vp60 do wektora pGEM T-easy i określenie sekwencji nukleotydów i aminokwasów genu vp60 RHDV, wklonowanie genu vp60 do genomu bakulowirusa, transfekowanie komórek owadzich i uzyskanie ekspresji rekombinowanego białka strukturalnego VP60 RHDV a następnie adsorpcję uzyskanego antygenu rekombinowanego białka VP60 na adiuwancie w postaci żelu wodorotlenku glinu.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się polski szczep wirusa krwotocznej choroby królików SGM, o właściwościach hemaglutynacyjnych i antygenowych oraz sprawdzonej zjadliwości dla królików.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że zakażenia królików dokonuje się zjadliwym szczepem SGM RHDV o właściwościach hemaglutynacyjnych.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że pobierania wątroby od zakażonych królików dokonuje się w szczytowym okresie wiremii między 36-72 godziną po zakażeniu.
5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że izolacji materiału genetycznego dokonuje się na drodze izolacji całkowitego RNA metodą tiocjanian guanidyny-fenol-chloroform-alkohol izoamylowy i precypitacji etanolem.
6. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że otrzymywanie matrycy DNA - komplementarnej nici DNA dokonuje się w reakcji odwrotnej transkrypcji (RT).
7. 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że powielanie genu strukturalnego białka kapsydu (vp60) wirusa RHD o wielkości 1,8 kb dokonuje się przy zastosowaniu metody enzymatycznej amplifikacji, przy czym do amplifikacji materiału genetycznego w łańcuchowej reakcji polimerazy stosuje się startery reakcji obejmujące pełny odcinek genu vp60 o wielkości ok. 1,8 kb, zawierające sekwencję startową atg 5305-5307 i kodon stop 7042-7044.

   PL 205 229 B1
8. 8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że rekombinowane białko VP60 RHDV będące produktem ekspresji do pożywki hodowli komórek owadzich Spodoptera frugiperda, zbiera się po upływie czwartej doby prowadzenia hodowli i poddaje się badaniu na obecność hemaglutynujących cząstek pseudo wirusowych - VLP (virus-like particles).
9. 9. Sposób według zastrz. 1 albo 8, znamienny tym, że w odczynie hemaglutynacji (HA) określa się miano HA i aktywność antygenową w teście ELISA.
10. 10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wklonowania genu vp60 do genomu bakulowirusa dokonuje się za pośrednictwem wektora pFast Bac będącego składnikiem systemu ekspresji białek Bac-to-Bac (Invitrogen).
11. 11. Sposób według zastrz. 1 albo 10, znamienny tym, że pierwszy etap obejmuje klonowanie do wektora pGEM T-easy (Promega).
12. 12. Sposób według zastrz. 1 albo 10, znamienny tym, że drugi etap obejmuje subklonowanie z wektora pGEM T-easy do wektora pFastBac (Invitrogen).
13. 13. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że prowadzi się adsorpcję uzyskanego antygenu rekombinowanego białka VP60 na adiuwancie w postaci żelu wodorotlenku glinu użytym w ilości 5-20%.
14. 14. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że adsorpcję antygenu na adiuwancie prowadzi się w temperaturze 2-10°C.
15. 15. Zastosowanie antygenu rekombinowanego białka VP60, otrzymywanego poprzez zakażenie królików zjadliwym szczepem SGM RHDV o właściwościach hemaglutynacyjnych, pobieranie wątroby od zakażonych królików, homogenizację narządów i izolację materiału genetycznego na drodze izolacji całkowitego RNA, otrzymywanie matrycy DNA - komplementarnej nici DNA, powielanie genu strukturalnego białka kapsydu (vp60) wirusa RHD o wielkości 1,8 kb, subklonowanie pełnego genu vp60 do wektora pGEM T-easy i określenie sekwencji nukleotydów i aminokwasów genu vp60 RHDV, wklonowanie genu vp60 do genomu bakulowirusa transfekowanie komórek owadzich i uzyskanie ekspresji rekombinowanego białka strukturalnego VP60 RHDV a następnie adsorpcję uzyskanego antygenu rekombinowanego białka VP60 na adiuwancie w postaci żelu wodorotlenku glinu, do wytwarzania szczepionki przeciwko krwotocznej chorobie królików (Rabbit Haemorrhagic Disease RHD).
16. 16. Zastosowanie według zastrz. 15, znamienne tym, że powielania genu strukturalnego białka kapsydu (vp60) wirusa RHD o wielkości 1,8 kb dokonuje się przy zastosowaniu metody enzymatycznej amplifikacji, przy czym do amplifikacji materiału genetycznego w łańcuchowej reakcji polimerazy stosuje się startery reakcji obejmujące pełny odcinek genu vp60 o wielkości ok. 1,8 kb, zawierające sekwencję startową atg 5305-5307 i kodon stop 7042-7044.
17. 17. Zastosowanie według zastrz. 15, znamienne tym, że rekombinowane białko VP60 RHDV będące produktem ekspresji do pożywki hodowli komórek owadzich Spodoptera frugiperda, zbiera się po upływie czwartej doby prowadzenia hodowli i poddaje się badaniu na obecność hemaglutynujacych cząstek pseudowirusowych - VLP (virus-like particles).
18. 18. Zastosowanie według zastrz. 15, znamienne tym, że wklonowania genu vp60 do genomu bakulowirusa dokonuje się za pośrednictwem wektora pFast Bac będącym składnikiem systemu ekspresji białek Bac-to-Bac (Invitrogen).
19. 19. Zastosowanie według zastrz. 15 albo 18, znamienne tym, że pierwszy etap obejmuje klonowanie do wektora pGEM T-easy (Promega).
20. 20. Zastosowanie według zastrz. 15 albo 18, znamienne tym, że drugi etap obejmuje subklonowanie z wektora pGEM T-easy do wektora pFastBac (Invitrogen).
21. 21. Zastosowanie według zastrz. 15, znamienne tym, że prowadzi się adsorpcję uzyskanego antygenu rekombinowanego białka VP60 na adiuwancie w postaci żelu wodorotlenku glinu użytym w ilości 5-20%.
22. 22. Szczepionka przeciwko krwotocznej chorobie królików (Rabbit Haemorrhagic Disease RHD), znamienna tym, że zawiera antygen rekombinowanego białka VP60, otrzymywany poprzez zakażenie królików zjadliwym szczepem SGM RHDV o właściwościach hemaglutynacyjnych, pobieranie wątroby od zakażonych królików, homogenizację narządów i izolację materiału genetycznego na drodze izolacji całkowitego RNA, otrzymywanie matrycy DNA - komplementarnej nici DNA, powielanie genu strukturalnego białka kapsydu (vp60) wirusa RHD o wielkości 1,8 kb, klonowanie pełnego genu vp60 do wektora pGEM T-easy i określenie sekwencji nukleotydów i aminokwasów genu vp60 RHDV, wklonowanie genu vp60 do genomu bakulowirusa, transfekowanie komórek owadzich i uzyskanie ekspresji rekombinowanego białka strukturalnego VP60 RHDV a następnie adsorpcję uzyskanego antygenu rekombinowanego białka VP60 na adiuwancie w postaci żelu wodorotlenku glinu.

    PL 205 229 B1
23. 23. Szczepionka według zastrz. 22, znamienna tym, że powielanie genu strukturalnego białka kapsydu (vp60) wirusa RHD o wielkości 1,8 kb dokonuje się przy zastosowaniu metody enzymatycznej amplifikacji, przy czym do amplifikacji materiału genetycznego w łańcuchowej reakcji polimerazy stosuje się startery reakcji obejmujące pełny odcinek genu vp60 o wielkości ok. 1,8 kb, zawierające sekwencję startową atg 5305-5307 i kodon stop 7042-7044.
24. 24. Szczepionka według zastrz. 22, znamienna tym, że wklonowania genu vp60 do genomu bakulowirusa dokonuje się za pośrednictwem wektora pFast Bac będącym składnikiem systemu ekspresji białek Bac-to-Bac (Invitrogen).
25. 25. Szczepionka według zastrz. 22 albo 24, znamienna tym, że drugi etap obejmuje subklonowanie z wektora pGEM T-easy do wektora pFastBac (Invitrogen).