KR20230084078A

KR20230084078A - 제3 유전자형 e형 간염 바이러스 캡시드 단백질의 면역원성 단편 또는 이의 바이러스-유사 입자를 포함하는 e 형 간염의 예방 또는 치료용 백신 조성물

Info

Publication number: KR20230084078A
Application number: KR1020220166855A
Authority: KR
Inventors: 최인수; 박병주; 안희섭; 고현정; 김동휘; 이중복; 박승용; 송창선; 이상원
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2021-12-02
Filing date: 2022-12-02
Publication date: 2023-06-12

Abstract

본 발명은 제3 유전자형 E형 간염 바이러스 캡시드 단백질의 면역원성 단편 또는 이의 바이러스-유사 입자를 포함하는 E형 간염의 예방 또는 치료용 백신 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 서열번호 1의 E형 간염 바이러스(hepatitis E virus) 캡시드 단백질의 aa 368-606인 HEV-239를 항원으로 포함하는 E형 간염의 예방 또는 치료용 백신 조성물, 또는 상기 E형 간염 바이러스 캡시드 단백질 HEC-239의 자가 조립에 의해 생성된 바이러스-유사 입자를 항원으로 포함하는, E형 간염의 예방 또는 치료용 백신 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 조성물은 종래의 풀 캡시드를 이용한 백신의 수율에 비해 높은 수율을 나타낼 수 있으며, 그에 따라 인수공통감염병인 제3 유전자형 E형 간염에 대한 백신으로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

제3 유전자형 E형 간염 바이러스 캡시드 단백질의 면역원성 단편 또는 이의 바이러스-유사 입자를 포함하는 E 형 간염의 예방 또는 치료용 백신 조성물{VACCINE COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING HEPATITIS E COMPRISING IMMUNOGENIC FRAGMENTS OF GENOTYPE 3 HEPATITIS E VIRUS CAPSID PROTEIN OR VIRUS-LIKE PARTICLE THEREOF}

본 발명은 제3 유전자형 E형 간염 바이러스 캡시드 단백질의 면역원성 단편 또는 이의 바이러스-유사 입자를 포함하는 E형 간염의 예방 또는 치료용 백신 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 서열번호 1의 E형 간염 바이러스(hepatitis E virus) 캡시드 단백질의 aa 368-606인 HEV-239를 항원으로 포함하는 E형 간염의 예방 또는 치료용 백신 조성물, 또는 상기 E형 간염 바이러스 캡시드 단백질 HEV-239의 자가 조립에 의해 생성된 바이러스-유사 입자를 항원으로 포함하는, E형 간염의 예방 또는 치료용 백신 조성물에 관한 것이다.

E형 간염은 E형 간염바이러스(Hepatitis E virus, HEV) 감염에 의해 유발되는 급성 질병으로, 다른 간염과 유사하게 황달, 복통, 메스꺼움, 혈뇨 등이 나타나는 전 세계적으로 가장 중요한 인수공통전염병 중 하나이다. 이러한 E형 간염은, 혈액검사를 통해 ALT(alanine aminotransferase) 등의 간 효소 수치 증가, anti-HEV IgM 혹은 IgG 검증, PCR 검사를 통한 바이러스 유전자 검출 등을 통해 진단할 수 있다.

종래 E형 간염은 저개발국가에서만 발생하는 후진국형 질병으로 인식되었으나, 현재는 선진국을 포함한 전세계의 거의 모든 국가에서 발생하는 중요한 질병으로 알려져 있다. 이와 관련한 세계보건기구(WHO) 보고에 의하면, 전 세계 인구의 1/3 이상이 HEV에 감염되는 것으로 알려져 있으며 또한 A형 혹은 B형 간염보다 더 많은 피해를 야기하는 것으로 알려져 있다.

우리나라 국민의 HEV 감염률은 약 15 내지 30%로 파악되고 있으며, 우리나라와 인접한 일본과 중국의 감염률은 각각 약 6%와 20 내지 30%로 알려져 있다. 또한, 미국, 영국 및 독일 등과 같은 선진국의 감염률도 약 13 내지 17%로 매우 높은 것으로 파악되고 있는 실정이다.

전 세계적으로 E형 간염의 발병으로 인해 사망하는 사망자 발생률은 약 2%로서, B형 혹은 C형 간염에 의한 사망자 비율보다 높은 것으로 알려져 있다. 특히, 특정 지역의 E형 간염 환자 중 임산부의 사망 비율은 약 20%(최고 60%) 이상으로 알려져 있을 만큼, E형 간염은 매우 위험한 질병으로 분류되고 있다.

이러한 HEV는 계통분류학상 Hepeviridae과에 속하는 바이러스로서 엔벨로프(envelope)를 보유하지 않은 바이러스이며, 약 7.2 kb의 양방향, 단일 가닥 RNA 게놈을 보유하고 있다. 또한, HEV는 오염된 물 혹은 동물의 고기 섭취를 통해 감염되며, 사람 및 돼지를 비롯한 다양한 동물 종에서 분리되고 있다.

HEV의 대표적인 유전자형(genotype)은 총 7개로 분류되고 있으며, 이 중 대표적인 유전자형은 제1, 제2, 제3, 및 제4 유전자형으로 알려져 있다. 이처럼 다양한 유전자형이 존재하지만, 혈청형의 경우 1개만 존재한다. 이 중에서, 제1 유전자형 및 제2 유전자형은 저개발 국가에서 다발하는 경향이 있으며, 오직 사람에만 감염되고 다른 동물에는 감염되지 않는 것으로 알려져 있다.

그러나, 상기 제3 유전자형 및 제4 유전자형 HEV는 돼지로부터 분리되고 있으며, 사람도 감염시킬 수 있는 인수공통전염병의 원인체로 우리나라를 비슷한 선진국에서의 대부분에 감염형에 해당한다. 또한, 야생 멧돼지 및 토끼 등에서 분리되는 HEV도 제3 유전자형 및 제4 유전자형과 유사하며, 사람도 감염시킬 수 있는 능력을 보유한다. 최근에는, 낙타에서 분리된 제7 유전자형이 사람에게도 감염될 수 있다는 사실이 보고된 바 있다.

이러한 E형 간염의 잠복기는 급성의 경우 약 15 내지 60일이며, 무증상 감염(Asymptomatic infection)부터 전격성 간염(fulminant hepatitis)까지 다양한 임상 양상을 보일 수 있다. 주된 임상증상은 발열, 오심, 근육통 및 황달을 동반하며, 자연치유(self-limited)되는 경향을 보인다. 혈청 AST/ALT치의 상승은 임상 증상 발생 후 약 1주일 정도 경과한 후부터 나타나고, 최고치는 황달의 시작과 대개 일치한다. 정상 수치로 회복하는데에는 약 1주에서 6주가 소요될 수 있다.

급성 E형 간염은 만성화 되지 않는 질환으로 젊은 성인층에 많이 감염되며, 비교적 양호한 예후를 지니고 있으나 임산부의 경우 임신 말기에 발병되면 임산부 사망률이 약 20%, 태아 유산율이 약 33% 정도 되는 치명적인 질환이다.

최근 연구결과에 의하면, 국내에서 사람의 혈청검사를 통해 HEV-3 유전자가 검출된 바가 있으며 이들의 유전자를 비교 분석한 결과 돼지에서 유래한 E형 간염바이러스가 사람에 감염되었다는 사실이 증명된 바 있다 (Journal of Clinical Microbiology, 2005). 이들 바이러스 또한 돼지에서 유래한 것으로 파악되었으며, 즉 국내에서의 급성 E형 간염 환자 발생은 돼지 등과 같은 동물로부터 전염된 결과로 발생율이 지속적으로 높아지고 있는 실정이다.

이에, 상기 HEV 감염을 예방할 수 있는 백신의 개발이 다양한 형태로 연구되었으나, 대부분 최종 임상시험을 통과하지 못한 바 있다.

따라서, 전 세계적으로 발생보고가 이루어지고 있는 E형 간염은 현재 상용화되고 있는 백신이 거의 없는 실정이다. 국내에서도 혈청학적 데이터에 의해 상당한 E형 간염 환자가 발생됨이 확인되고 여러 동물에서 지속적으로 HEV 감염이 확인되고 있지만, HEV에 관한 보건당국 및 국민적 관심부족으로 인해 정확한 진단 및 예방이 부족하다. 특히, 국내에서 주로 발생하는 제3 유전자형 HEV 감염을 예방할 수 있는 백신의 개발은 전무한 상태이므로, 현재 국내에서 발견되는 제3 유전자형 HEV를 예방할 수 있는 백신의 개발이 절실히 필요하다.

본 발명은, 인수공통감염병인 제3 유전자형 E형 간염에 대한 백신으로 유용하게 이용될 수 있는, E형 간염 바이러스 캡시드 단백질의 면역원성 단편을 항원으로 포함하는 E형 간염의 예방 또는 치료용 백신 조성물 또는 상기 항원의 자가 조립에 의해 생성된 바이러스-유사 입자를 포함하는 E형 간염의 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명의 상기 및 다른 목적과 이점은 바람직한 실시예를 설명한 하기의 설명으로부터 분명해질 것이다.

상술한 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 유전자 3형의 E형 간염 바이러스 캡시드 단백질의 면역원성 단편을 항원으로 포함하는, 유전자 3형의 E형 간염 바이러스 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 면역원성 단편의 아미노산 서열은 유전자 3형의 E형 간염 바이러스 캡시드 단백질 아미노산 서열에서 350내지 610번째, 365번째 내지 368번째, 367번째 내지 608번째, 367번째 내지 606번째, 367번째 내지 605번째 또는 368번째 내지 606번째(가장 바람직하게는 368번째 내지 606번째)의 아미노산을 포함할 수 있으며, 상기 면역원성 단편은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.

본 발명에서, 상기"바이러스 캡시드 단백질의 면역원성 단편"의 유전자 서열은 서열번호 2의 유전자 서열을 포함할 수 있다.

구체적으로, 상기 서열번호 2의 유전자 서열은 E형 간염 바이러스 유전자 3형으로부터 유래된 것일 수 있으며, 상기 E형 간염 바이러스 유전자 3형의 캡시드 단백질 아미노산 서열의 368-606번째인 HEV-239일 수 있고, 이는 곤충 세포에 대한 발현이 최적화된 유전자 서열로 구성될 수 있다.

본 발명은 또한, 유전자 3형의 E형 간염 바이러스 캡시드 단백질의 면역원성 단편을 코딩하는 유전자 서열을 포함하는, 유전자 3형의 E형 간염 바이러스 백신 제조용 벡터를 제공한다. 상기 유전자 3형의 E형 간염 바이러스 캡시드 단백질의 면역원성 단편은 서열번호 2의 유전자 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면 상기 벡터는 배큘로바이러스(baculovirus) 유전자 서열에 서열번호 2의 서열이 삽입된 것이며, 이는 서열번호 3으로 표시되는 유전자 서열로 구성될 수 있다. 본 발명은 베큘로바이러스 발현 시스템을 이용하여, 유전자 3형의 E형 간염 바이러스 캡시드 단백질의 면역원성 단편이 형성되고, 상기 면역원상 단편이 다수 개 조합된 나노입자 형태로 제공될 수 있다. 본 발명에서 상기 벡터는 숙주세포를 형질 전환시킬 수 있으며, 상기 숙주세포는 곤충의 세포(특히, 나비류 애벌레)일 수 있으며, 상기 곤충세포로는 이에 제한되지는 않으나, 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda)의 Sf9 세포 또는 트리코플루시아니(Trichoplusia ni)의 BT1-Tn-5B1-4 세포일 수 있다.

본 발명은 또한, 서열번호 1로 표시되는 폴리펩티드를 포함하는 E형 간염 바이러스 유사 입자(virus-like particle (VLP))를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 바이러스 유사 입자의 상기 폴리펩티드는 서열번호 2의 유전자 서열에 의해 발현되는 것이다.

본 발명에 따른 조성물은 종래의 풀 캡시드를 이용한 백신의 수율에 비해 높은 수율을 나타낼 수 있으며, 그에 따라 인수공통감염병인 제3 유전자형 E형 간염에 대한 백신으로 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명은 E 형간염에 대한 239aa 바이러스 유사입자 백신을 baculovirus 시스템으로 이용하는 방법을 제시한다.

다만, 본 발명의 효과들은 이상에서 언급한 효과로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 HEV 캡시드 유전자를 Helicon 백신의 aa 368-606과 비교분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 Spodoptera frugiperda 종에 대해 코돈 최적화된 HEV 제3 형 유전자의 모식도를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 pFastbac1-G3-239a의 크로마토그램 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 HEV 항원 유전자가 삽입된 바이러스벡터를 배양한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 HEV 항원 유전자가 삽입된 바이러스벡터를 배양한 후 확보된 콜로니를 Miniprep kit로 플라스미드 정제 후 서열을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 Bacmid-G3_239을 도입한 Sf9 세포 및 상기 세포의 72 시간 후 CPE(Cytopathic effect)를 비교한 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 Bacmid-G3_239가 형질주입(transfection)된 샘플들의 real-time PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 전체 HEV 캡시드 단백질의 분자량을 확인한 결과이다. 전체 HEV 캡시드 단백질의 분자량은 약 72kDa를 갖는 것으로 나타난다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 HEV 항원 단백질의 분리 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 HEV 항원 단백질의 쿠마시 염색 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따라 분리된 HEV 항원 단백질의 크기를 확인한 결과이다. 도 11를 참조하면, 본 발명에 따라 분리된 3형 HEV 239aa(368 내지 606 번째의 아미노산) 캡시드 단백질 단편은 26kDa 크기를 갖는 것을 확인할 수 있다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따라 20-30%의 수크로스 용액층에서 분리한 바이러스-유사 입자의 전자현미경 사진이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따라 30-40%의 수크로스 용액층에서 분리한 바이러스-유사 입자의 전자현미경 사진이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이러스-유사 입자 접종 스케쥴을 나타낸 이미지이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이러스-유사 입자 접종 이후 항 HEV 항체가를 나타낸 것이다.
도 16은 본 발명에 따라 정제된 HEV-3-239-VLP(유전자 3형 HEV 캡시드 단백질의 239개의 아미노산 서열로 이루어진 면역원성 단편으로 구성된 바이러스 유사 입자)의 분자량을 확인한 결과이다. 도 16을 참조하면, 대장균이 생산한 토끼 HEV 전체 캡시드 단백질의 경우, 약 72kDa 크기로 확인되나 (도 16의 1), HEV-3-239-VLP의 단량체(HEV 239aa)는 26kDa 크기로 확인된다 (도 16의 2).
도 17은 본 발명에 따른 HEV-3-239-VLP 를 염색 후 TEM으로 관찰한 결과이다. 도 17의 (A)는 VLP를 음성으로 염색한 후, 조립된 VLP의 모양과 크기를 TEM으로 관찰하였다. 도 17의 (B)는 면역 염색을 이용하였으며, 금 입자 결합 항체로, 10 nm 크기의 금 입자가 HEV-3-239-VLPs의 표면에 부착되었다.
도 18은 HEV-3-239 VLP로 면역화된 돼지의 혈청에서 항-HEV 항체의 역가를 확인한 결과이다. 도 18를 참조하면 양성 대조군에서 항-HEV 항체의 역가는 4주째에 챌린지(감염)시킨 후 상대적으로 느리게 증가하였다. 대조적으로, 두 백신 접종 그룹 모두에서 항-HEV 항체의 역가는 바이러스 챌린지 2주 후에 유의하게 증가했으며 실험이 끝날 때까지 5주간 유지되었다. 도 18의 값은 백신 접종 돼지와 음성 돼지 사이, 양성 돼지와 음성 대조군 돼지 사이에 통계 분석을 실시한 결과이다.(* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001.)
도 19는 본 발명의 일 실시예에 따라 진행된 HEV-3-239 VLP을 이용한 면역화 실험에서, ALT 및 AST 값을 확인한 결과이다. 도 19의 (A)에서 음성 대조군의 ALT 값은 20 U/L 내외로 유지되었으나, 양성대조군의 ALT 값은 5주째부터 유의하게 증가하기 시작하여 7주째 정상범위(8.18~40.29)를 초과하였다. 도 19의 (B)는 해당 실험에서 돼지 혈청의 AST 값을 나타낸다. 도 19의 (B)를 참조하면, 음성 대조군의 AST 값은 10 U/L 내외로 유지되었다. 반면 양성 대조군의 AST 값은 7주부터 증가하기 시작하여 다른 군에 비해 상대적으로 높은 값을 유지하였다. 두 백신 접종 그룹의 AST 값은 음성 대조군의 AST 값과 유사하게 유지된다. 도 19의 값은 양성대조군과 음성대조군 돼지, 예방접종 돼지와 음성대조군 사이에 통계분석을 실시한 결과이다. (* p < 0.05)
도 20은 본 발명의 일 실시예에 따라 진행된 HEV-3-239 VLP을 이용한 면역화 실험에서, 실험군의 간 조직의 소엽 및 문맥 및 중심정맥(central vein)을 Masson의 트리크롬 염색 방법으로 염색한 이미지이다. 도 20의 (A)및 (B)는 소엽 사이 및 음성 대조군 돼지의 문맥 주위에 비교적 소량의 청색으로 염색된 결합 조직을 나타내며, 도 20의 (C) 및 (D)는 양성 대조군 돼지의 소엽과 중심 정맥 주변 사이의 과도한 결합 조직을, 도 20의 (E) 및 (F)는 양성 대조군 돼지에서 확인된 것보다 100㎍의 VLP 백신으로 백신접종된 돼지의 소엽 사이 및 문맥 주위의 더 작은 결합 조직을 확인할 수 있다. 도 20의 (G) 및 (H) 를 참조하면, 200 ug의 VLP 백신을 접종한 돼지의 소엽 사이 및 문맥 주변의 결합 조직이 양성 대조군 돼지보다 더 작다는 것을 확인할 수 있다.
도 21은 본 발명의 일 실시예에 따른 Masson's trichrome으로 염색된 간 조직 슬라이드에서 섬유화 영역의 백분율을 나타낸다. 도 21를 참조하면, 양성대조군에서는 HEV 감염에 의해 파란색으로 염색된 결합조직이 다른 군에 비해 유의하게 증식되었다. 반면, HEV 감염으로 인한 간 결합 조직의 증식은 HEV-3-239 VLP 백신 접종으로 예방되었다. 도 21의 값은 음성대조군 돼지와 양성대조군 사이, 양성대조군 돼지와 예방접종군 사이에 통계분석을 실시한 결과이다.(* p < 0.05)

이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명한다. 본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 후술되어 있는 실시 예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 게시되는 실시 예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있으며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 게시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다. 명세서 전체에 걸쳐 동일 참조 부호는 동일 구성 요소를 지칭한다.

다른 정의가 없다면, 본 명세서에서 사용되는 모든 용어(기술 및 과학적 용어를 포함)는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공통적으로 이해될 수 있는 의미로 사용될 수 있을 것이다. 또 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 용어들은 명백하게 특별히 정의되어 있지 않는 한 이상적으로 또는 과도하게 해석되지 않는다. 본 명세서에서 사용된 용어는 실시예들을 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다.

본 발명의 명세서 전체에서, "면역원성 단편"이란 용어는 상기 단편이 유래된 단백질의 면역원성을 적어도 부분적으로 유지하는 폴리펩타이드 단편을 지칭한다. 예를 들어 HEV 캡시드 단백질의 면역원성 단편은 면역원성을 적어도 부분적으로 유지하는 HEV 캡시드 단백질의 단편들을 지칭하며, E형 간염 바이러스 캡시드 단백질의 면역원성 단편은 면역원성을 적어도 부분적으로 유지하는 E형 간염 바이러스 캡시드 단백질의 단편을 지칭할 수 있다.

본 발명의 "면역원성 단편"은 면역원성을 유지하는 바 본 발명에 따른"항원 단백질"로 이용될 수 있다. 본 발명의 "면역원성 단편" 또는 "항원 단백질"은 서열번호 1로 표시되는 폴리펩티드를 포함할 수 있으며, 상기 폴리펩티드는 서열번호 2의 유전자 서열에 의해 발현될 수 있다.

본 발명의 명세서 전체에서, HEV-239는 HEV ORF2에 의해 암호화된 폴리펩티드(즉 HEV 캡시드 단백질)의 368 내지 606 번 위치의 아미노산 잔기로 이루어진 폴리펩티드를 지칭하는 것일 수 있다.

본 발명의 명세서 전체에서, "폴리펩티드" 및 "단백질"이란 용어는 동일한 의미를 가지며 호환적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 아미노산을 일반적으로 당해 분야에 널리 공지된 1 글자 암호 및 3 글자 암호에 의해 나타낸 다. 예를 들어, 알라닌을 A 또는 Ala에 의해 나타낼 수 있다.

본 발명의 명세서 전체에서, "벡터"란 용어는 폴리뉴클레오타이드가 삽입될 수 있는 핵산 비히클을 지칭한다. 상기 벡터가 상기 중에 삽입된 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질의 발현을 허용하는 경우, 상기 벡터를 발현 벡터라 칭한다. 상기 벡터를 형질전환, 형질도입 또는 형질감염에 의해 숙주세포 내로 도입시킬 수 있으며, 상기 벡터는 숙주세포에서 발현된 운반된 유전 물질 요소들을 가질 수 있다. 벡터는 당해 분야의 숙련가에 의해 널리 공지되어 있으며, 비제한적으로 플라스미드, 파지, 코스미드 등을 포함한다.

본 발명의 명세서 전체에서, "약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 부형제"란 용어는 환자 및 활성 성분과 약물학적으로 및/또는 생리학적으로 상용성이며, 당해 분야에 널리 공지된 담체 및/또는 부형제, 예를 들어 비제한적으로 pH 조절제, 계면활성제, 항원보강제, 및 이온 강도 향상제를 포함한다. 예를 들어, 상기 pH 조절제는 포스페이트 완충제를 포함하고, 계면활성제는 음이온 계면활성제, 양이온 계면활성제, 또는 비-이온성 계면활성제를 포함하며, 이온 강도 향상제는 염화나트륨을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 명세서 전체에서, "유효량"이란 용어는 기대되는 효과를 성취하거나 적어도 부분적으로 성취하기에 충분한 양을 지칭한다. 예를 들어, 질병(예를 들어 E형 간염 바이러스 감염) 예방에 유효한 양은 질병(예를 들어, E형 간염 바이러스 감염)의 발생을 예방하거나, 억제하거나 지연시키기에 유효한 양을 지칭한다. 질병을 치료하기에 유효한 양은 병에 걸린 환자에게서 상기 질병 및 그의 합병증을 치유하거나 적어도 부분적으로 차단하기에 유효한 양을 지칭한다. 상기와 같은 유효량의 측정은 당해 분야의 숙련가의 능력 내에 있다. 예를 들어, 치료학적 용도에 유효한 양은 치료하려는 질병의 중증도, 환자의 면역계의 일반적인 상태, 환자의 일반적인 조건, 예를 들어 연령, 체중 및 성별, 약물의 투여 수단, 동시에 사용되는 추가적인 요법 등에 따라 변할 수 있다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예 및 실시예를 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 이러한 구현예 및 실시예와 도면은 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시 형태는, E형 간염 바이러스 캡시드 단백질의 면역원성 단편을 항원(단백질)로 포함하는, E형 간염의 예방 또는 치료용 백신 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 다른 실시 형태는, E형 간염 바이러스 캡시드 단백질의 면역원성 단편의 자가 조립에 의해 생성된, 바이러스-유사 입자(virus-like particle)에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 실시 형태는, E형 간염 바이러스 캡시드 단백질의 면역원성 단편의 자가 조립에 의해 생성된, 바이러스-유사 입자를 포함하는, E형 간염의 예방 또는 치료용 백신 조성물에 관한 것이다.

일 실시예에 있어서, 상기 E형 간염 바이러스 캡시드 단백질의 면역원성 단편은, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질(폴리펩티드)일 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 E형 간염 바이러스 캡시드 단백질의 면역원성 단편은, E형 간염 바이러스 캡시드 단백질의 aa 368-606, 즉, HEV-239인 것을 특징으로 할 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 E형 간염 바이러스 캡시드 단백질의 면역원성 단편을 암호화하는 유전자는, 곤충세포에 대해 코돈 최적화된 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 곤충세포는 제한되지 않으나, 예를 들어, 나비목해충(Spodoptera frugiperda)인 것을 특징으로 할 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 E형 간염 바이러스는 제3 유전자형(genotype 3) 또는 제4 유전자형(genotype 4)인 것을 특징으로 할 수 있으며, 구체적으로는 제3 유전자형 E형 간염 바이러스를 의미할 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 바이러스-유사 입자는 Sf9, High Five, TniPro, Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda, 및 Trichoplusiani와 같은 세포들로부터 제조되는 것일 수 있다. 예를 들어, 캡시드 서열을 포함하는 재조합 배큘로바이러스들은 곤충 배양액(예를 들어, Sf9, High Five, TniPro 세포들)을 감염시키는데 사용하고 바이러스-유사 입자는 세포 배양액으로부터 분리되는 것일 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 바이러스-유사 입자가 세포 내로 형성되는 경우, 세포들은 세포들을 용해하면서 상기 바이러스-유사 입자를 실질적으로 손상시키지 않는 화학적, 물리적 또는 기계적 수단들을 사용하여 파열될 수 있다. 그 후, 상기 바이러스-유사 입자들은 수크로오스 기울기(구배), PEG-침전, 펠리타이징 등과 같은 밀도 기울기 원심분리뿐만 아니라 이온 교환 및 겔 여과 크로마토그래피를 포함하는 표준 정제 기술들과 같이 이들의 무결성을 보존하는 방법들을 사용하여 분리 또는 정제되는 것일 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 백신은 생백신, 변형된 생백신, 불활성화 백신, 또는 약독화 백신일 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 백신 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체를 추가 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 항원인 E형 간염 바이러스 캡시드 단백질의 면역원성 단편 또는 이의 바이러스-유사 입자를 생체내 부위에 전달하는데 적합한 임의의 성분을 의미하며, 구체적으로, 물, 식염수, 인산염 완충 식염수, 링거 용액, 덱스트로스 용액, 혈청 함유 용액, 한스 용액, 기타 수용성의 생리학적 평형 용액, 오일, 에스테르 및 글리콜 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

일 실시예에 있어서, 상기 담체는 화학적 안정성 및 등장성을 증진시키기 위해 적합한 보조 성분과 보존제를 포함할 수 있으며, 예를 들어, 트레할로스, 글라이신, 솔비톨, 락토오스 또는 모노소듐 글루타메이트(MSG)와 같은 안정화제를 포함시켜 온도 변화 또는 동결건조에 대해 상기 백신 조성물을 보호할 수 있다. 구체적으로, 상기 백신 조성물은 멸균수 또는 식염수(바람직하게는, 완충된 식염수)와 같은 현탁 액체를 포함할 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 백신 조성물은 면역원에 대한 면역반응을 향상시키기에 충분한 양의 임의의 애쥬번트(adjuvant)를 함유할 수 있다. 예를 들어, 상기 애쥬번트는 알루미늄염 (구체적으로, 알루미늄 포스페이트 또는 알루미늄 히드록시드), 스쿠알렌 혼합물, 무라밀 펩티드, 사포닌유도체, 미코박테리아 세포벽 제조물, 모노포스포릴 지질 A, 미콜산 유도체, 비이온성 블록 공중합체 계면활성제, Quil A, 콜레라 독소 B 서브유닛, 폴리포스파젠 및 유도체, 및 면역자극 복합체 (ISCOMs)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

일 실시예에 있어서, 상기 백신 조성물은 항원, 약제학적 허용가능한 담체, 적절한 보조제, 기타 통상적인 물질들로 구성될 수 있고, 면역학적 효과량으로 투여되는 것일 수 있다. 상기 "면역학적 효과량"이란 E형 간염 바이러스에 대한 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용이나 심각한 또는 과도한 면역반응을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 정확한 투여 농도는 투여될 특정 항원에 따라 달라지며 면역 반응의 발생을 검사하기 위하여 당업자가 공지의 방법을 이용하여 이를 결정할 수 있다. 또한, 투여 형태 및 경로, 수용자의 연령, 건강 및 체중, 증상의 특성 및 정도, 현재 치료법의 종류, 및 치료 횟수에 따라 변화될 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 백신 조성물은 공지의 투여 경로를 통하여 투여될 수 있다. 이와 같은 방법에는 경구, 경피, 근육, 복막, 정맥, 피하, 비강 경로를 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이하, 구체적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. E형 간염 바이러스(HEV) 캡시드 항원의 선발

1-1. 국내 발생 제3 유전자형(genotype 3) E형 간염 바이러스의 캡시드 유전자 확보

먼저, 국내 HEV 분리주인 swKOR-1(genotype 3; 제3 유전자형)의 유전자를 확보하고, 확보된 제3 유전자형 유전자를 Helicon 백신(제1 유전자형; genbank accession no. L08816)의 368 내지 606 아미노산(aa) (이하, 239 aa)과 비교 분석하였다.

도 1 및 표 1은, 제3 유전자형 HEV 캡시드 유전자를 Helicon 백신의 aa 368 내지 606과 비교 분석한 결과를 나타낸 것이다.

전체	L08816(G1)	swKOR-1(G3)	239 aa	L08816(G1)	swKOR-1(G3)
L08816(G1)		0.905	L08816(G1)		0.924
swKOR-1(G3)	0.905		swKOR-1(G3)	0.924

도 1 및 표 1에 나타낸 바와 같이, 분석된 아미노산 서열에서 기존의 Helicon의 유전자와 서열에 비해 전체 캡시드는 90.5%의 일치도를 보였으나, 239 aa (서열번호 1)의 서열만을 분석하였을 경우 92.4%의 일치도를 보인 것을 확인할 수 있었다.

1-2. 배큘로바이러스 시스템을 이용하기 위한 HEV 유전자의 코돈 최적화

분석된 각 유전자(genbank accession no.FJ763142)는 IDT codon optimization tool을 사용하여 나비목해충(Spodoptera frugiperda)종으로 최적화되었다. 코돈 최적화된 HEV 유전자의 유전자 모식도는 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 최적화된 유전자는 위의 유전자 모식도와 같이 5 말단에 SacI, 3말단에 HindIII 제한효소를 추가하여 유전자를 합성하였다.

1-3. HEV 캡시드 유전자의 항원부(239 aa) 유전자 증폭

제3 유전자형 HEV의 ORF2 368-606 aa의 유전자 및 pFastbac-1 벡터는 SacI, HindIII 제한효소 첨가 후 37℃에서 4 시간 동안 반응시키고 전기영동하여 젤 추출을 진행하였다. 절단된 PCR 산물 및 pFastbac-1 벡터는 4℃에서 16 시간 연결반응(ligation)을 진행하였으며, 연결 반응 후 산물은 stellar 수용성 세포와 혼합 후 얼음 하에 30 분 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 상기 stellar 수용성 세포는 42℃에서 45 초 동안 열충격 후 얼음 하에 30 분 동안 정치하였다. 정치 후 LB amp+ 배지에 도말하고, 37℃에서 밤새 배양을 진행하였다.

배양이 끝난 플레이트에서 콜로니를 분리하여 콜로니 PCR로 양성 콜로니를 확보하였으며, 확보된 콜로니는 Miniprep kit을 이용하여 플라스미드를 정제한 후 서열을 확인하였다. 도 3은, 상기 실시예에 따른 pFastbac1-G3-239a (pFastbac-1 벡터에 HEV의 ORF2 368-606 aa 삽입)의 크로마토그램을 나타낸 것이다. 도 3을 참조하면 제작된 플라스미드의 서열을 확인할 수 있다.

실시예 2. HEV 캡시드 유전자의 발현

2-1. HEV 항원 유전자가 삽입된 배큘로바이러스 벡터의 제조

먼저, 상기 실시예 1에서 제조된 pFastbac1-G3-239a는 DH10bac 수용성 세포와 혼합 후 얼음 하에 30 분간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 DH10bac 수용성 세포는 42℃에서 45초간 열충격 후 얼음에서 30 분간 정치하였으며, 정치 후 SOC 배지에 4 시간 동안 회복 후 X-gal, IPTG가 함유된 LB 플레이트에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 배양된 결과는 도 4에 나타내었다.

다음으로, pUC-M13-F, pUC-M13-R 프라이머를 이용하여 콜로니 PCR을 진행하여 약 3kb 크기의 양성 콜로니를 선별하였다 (도 5 참조). 배양이 끝난 플레이트에서 화이트 콜로니를 분리하여 콜로니 PCR로 양성 콜로니를 확보하였다. 확보된 콜로니는 Miniprep kit을 이용하여 플라스미드를 정제 후 서열을 확인하였다.

이후, 제3 유전자형 HEV의 항원부 239 aa의 유전자를 포함하는 bacmid-G3-239a DH10bac 세포를 500 ml의 LB 브로스에 16 시간 배양하였다. 배양 후 O.D.값이 0.9 이상인 것을 확인한 다음, 6,000 rpm에서 30 분간 원심분리하여 펠렛을 확보하였다. 확보된 펠렛은 P1 버퍼 10 ml를 이용하여 재현탁하였으며, P2 버퍼 10 ml를 추가 후 5 분간 배양하고, P3 버퍼를 넣어 얼음에서 20 분 동안 반응시켰다. 그 후, 4,000rpm에서 10 분간 원심분리하고 10 ml QBT 버퍼에 평형된 컬럼에 상층액을 통과시켰다. 다음으로, QC 버퍼 30 ml을 이용하여 컬럼을 2 회 세척하고 50℃에 배양된 QF 버퍼 15 ml로 DNA를 추출하였다. 추출된 QF 버퍼는 10.5 ml의 이소프로판올과 혼합 후 4,000 rpm에서 30 분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후 수득된 펠렛을 5 ml 70% 에탄올을 이용하여 세척하고, 4,000rpm 15 분간 원심분리하였다. 그 후, 실온(RT)에서 펠릿을 건조시키고 증류수 100 ul에 용리하였다. 용리된 bacmid-g3-239a 벡터는 나노드롭을 이용하여 정량하고, 순도를 평가하였다.

2-2. HEV 항원 유전자를 포함하는 배큘로바이러스의 제조

먼저, 0.5×10⁶ cells/mL의 Sf9 세포를 플레이트에 분주한 후, 27℃에서 1 시간 동안 부착시켰다. 그 후, 상기 실시예에서 정제된 bacmid-g3-239a 벡터 5 ul와 100 ul의 SF-900II SFM 배지와 혼합하여 준비하였다. 다음으로, 10 ul의 Cellfectin II 및 100 ul의 SF-900II SFM 배지와 혼합하여 3 분간 반응시키고, 각 배지와 혼합된 DNA 및 시약을 혼합 후 실온에서 30 분 동안 정치하였다.

다음으로, Sf9 세포의 배지를 제거 후 1 ml의 SF-900II SFM 배지를 첨가하였으며, 혼합된 DNA/시약은 총 1 ml가 되도록 SF-900II SFM 배지를 첨가하고 다시 sf9의 배지를 제거 후 DNA/시약 1 ml를 첨가하였다. 5 시간 후 배지를 제거하고 Grace's insect medium를 2 ml 첨가하고 CPE를 관찰하였다. 상기 bacmid-g3-239a를 도입한 Sf9 세포 및 상기 세포의 72 시간 후 CPE(Cytopathic effect)를 비교한 이미지는 도 6에 나타내었다. 도 6에 나타낸 바와 같이, bacmid-g3-239a를 도입한 Sf9 세포는 약 72 시간 후 붉은색 화살표로 나타낸 CPE가 확인된 바 있다.

다음으로, CPE가 관찰된 웰은 상층액을 150 ul 샘플링하여 AcMNPV-RT-F, AcMNPV-RT-R 프라이머를 이용하여 real-time PCR을 수행하여 바이러스의 유무를 확인하였다.

도 7에 나타낸 real-time PCR 결과에서 확인할 수 있는 바와 같이, bacmid-g3-239a를 형질주입(transfection)한 샘플들은 20 내지 25 사이클 내에서 Ct 값이 산출되었다. melting curve 분석에서도 네거티브 세포 용해물 샘플은 76.1도인 반면, 형질주입 샘플은 80도 내외의 값이 산출되었다.

2-3. HEV 항원의 항원성 확인

상기 실시예에서 제조된 HEV 백신 조성물의 항원성을 검증하기 위하여, 토끼의 대장균에서 발현한 제4 유전자형 전체 캡시드 단백질(50 ug)을 토끼에 4 회 접종 후 4 주간 혈청을 채취하였다.

약 70kDa의 HEV 캡시드 단백질을 SDS-PAGE 젤에서 전기영동 후 니트로셀룰로오스 멤브레인에 트랜스퍼하고 2.5% 스킴밀크에 100 배 희석된 채취한 토끼의 혈청과 1 시간 반응시킨 후, 웨스턴 블롯을 시행하였다. 도 8에 나타낸 웨스턴 블롯 실험 결과, 약 70kDa(약 72kDa) 위치에 제3 유전자형의 캡시드 모두가 상기 제조된 토끼 혈청으로 검정이 가능함을 확인하였다.

실시예 3. 제3 유전자형 HEV 캡시드 항원 단백질 발현

본 발명에 따른 HEV 239 캡시드 유전자가 삽입된 재조합 배큘로바이러스를 제작한 후, sf9 단백질 발현 세포에 형질주입시켰다. 형질주입 이후 상기 sf9 단백질 발현 세포의 CPE(Cytopathic effect)가 발생되는지 확인하였다. 전체 sf9 단백질 발현 세포 중 죽은 세포의 비율을 계산하고 60 내지 80%가 되었을 때, 발현된 HEV 항원 단백질을 수거하였다.

하기 표 2는, sf9 단백질 발현 세포의 CPE 발생 비율을 나타낸 것이다.

	사멸 세포 수	전체 세포 수	사멸/전체(%)
HEV G3	1,128	1,831	61.6

실시예 4. 제3 유전자형 HEV 캡시드 항원의 정제

상기 실시예의 sf9 발현 세포 배양 배지에 존재하는 HEV 캡시드 항원 이외에 sf9 단백질 발현 세포내의 HEV 항원 단백질을 수득하기 위해, 얼렸다가 녹이는 과정을 3 번 반복 후 20%의 진폭 초음파 분쇄 과정을 진행하였다. 고속 원심 분리를 6,000×g에서 30 분 동안 진행하여 sf9 세포를 제거하고, 배큘로바이러스 및 sf9 세포를 제거하기 위해 Milipore durapore 0.2 um 필터를 사용하여 제거하였다.

그 후, 수거한 HEV 항원 단백질을 18,000×g에서 1 시간 30 분 동안 초고속 원심 분리를 실시하여 펠렛을 형성시키고, 형성된 펠렛을 TNE 버퍼로 현탁하였다. 그 후, TNE 버퍼로 현탁된 상기 HEV 항원 단백질을 수크로오스 기울기 기법을 이용하여 정제 과정을 거쳤다. 각각 50, 40, 30, 20, 10% 수크로오스 수용액 순으로 층을 만들어 현탁된 HEV 항원단백질을 로딩 후, 35,000 ×g에서 2 시간 30 분 초고속 원심분리 과정을 거쳤다. 정제 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이 침강계수에 따라 각 농도별 수크로오스 수용액 사이에 하얀색 단백질 밴드가 관찰되었다. 각 단백질 밴드별로 채취된 모든 항원을 50 kDa 단백질 투과막과 암모늄 바이카보네이트 버퍼로 투석하여 자가 조립되지 않은 바이러스 캡시드 항원을 모두 제거하였다.

실시예 5. 정제된 HEV239 캡시드 단백질 검증 및 단백질 농도 측정

상기 실시예에서 정제 과정을 거친 제3 유전자형 HEV 239 (제3형 HEV 아미노산 368 내지 606) 캡시드 단백질을 확인하기 위해, SDS-PAGE 젤에서 전기영동 후 쿠마시 염색 과정을 거쳐 26 kDa 크기의 밴드가 보이는지 확인하였다. 도 10 및 도 11에 나타낸 바와 같이, 밴드가 나타난 것을 확인할 수 있었다.

또한, 동일한 SDS-PAGE 과정을 진행 후 니트로셀룰로오스 멤브레인에 트랜스퍼하고, 2.5% 스킴밀크에 희석한 anti-HEV 캡시드 모노클로랄 항체와 1 시간 동안 반응시키고 웨스턴 블롯을 진행하였다. 도 12 및 도 13에 나타낸 바와 같이, 제3 유전자형 239 캡시드 단백질은 20-30%, 30-40%, 40-50%에서 확인되었으며, 그 중 30-40% 수크로오스 기울기 층에서 상기 HEV 239 캡시드 G3 단백질이 가장 많이 포함되어 있었다.

하기 표 3은, 정제된 HEV 239 캡시드의 단백질 농도를 나타낸 것이다. 표 3에 나타낸 바와 같이, 각 수크로오스 기울기 층에서 회수된 단백질 농도를 측정하였을 때, 30-40% 층에서 회수된 단백질의 농도가 가장 높은 것으로 확인되었다. 상기 30-40% 층에서, G3 캡시드 단백질은 4.94 mg/ml로 측정되었다.

유전자형%	mg/ml
G3 20-30%	1.61
G3 30-40%	5.35

실시예 6. 제3 유전자형 캡시드로 구성된 바이러스-유사 입자(virus-like particle, VLP) 확인

상기 실시예에서 진행한 바와 같이, 수크로오스 기울기 각 층별로 채취한 단백질을 정제한 후 HEV G3 239 캡시드 단백질이 바이러스-유사 입자를 형성하는지를 다음과 같이 확인하였다.

먼저, HEV 캡시드에 특이적인 토끼 폴리클로랄 항체를 1차 항체로 사용하고, 금 입자가 부착된 anti-rabbit IgG 모노클로랄 항체를 2차 항체로 사용하였다. 상기 2차 항체가 부착된 VLP 형상을 도 12 및 13에 나타낸 바와 같이 투과 전자 현미경(TEM)으로 확인하였다. 확인 결과, 도 12 및 도 13에 나타낸 바와 같이 수크로오스 기울기 20-30%층에서는 HEV VLP가 확인되었으며, 30-40% 수크로오스 기울기 층에서 가장 많은 VLP가 확인되었다.

이에, 정제된 제3 유전자형 HEV 바이러스-유사 입자를 HEV 예방용 백신으로 사용하기로 결정한 후 하기 실시예의 동물실험을 통해 백신의 유효성을 평가하기로 하였다.

실시예 7. 제3 유전자형 HEV 바이러스-유사 입자 백신이 접종된 토끼를 이용한 공격접종 방어능 평가 및 최소 면역 농도 측정

제3 유전자형 HEV 바이러스-유사 입자를 포함하는 백신의 유효성을 평가하기 위해, 먼저 총 12 두의 SPF 토끼를 준비하여 총 12 주간의 실험을 통해 백신의 효능 및 최소 면역 농도를 측정하였다. 실험은 각 실험군 당 4 마리의 토끼를 사용하였고, 실험군은 음성 대조군, 양성 대조군, 백신 100 ug 투여군으로 나누었다(도 14).

먼저, 백신 접종군 토끼에게 100 ug의 HEV G3 VLP 백신을 접종 후, 2주 후에 부스팅을 진행하였다. 백신에 사용된 아쥬번트는 alum을 사용하였다. 백신 부스팅 2 주 후, 10⁶ 게놈 등가본의 HEV G3를 정맥 주사하여 공격 접종하였다. 모든 토끼로부터 1 주일 간격으로 분변을 채취했으며, 혈청 샘플도 1 주일 간격으로 초 12 주간 채혈을 통해 확보하였다.

상기 공격 접종 후 3주 후, HEV G3 VLP 백신 접종한 군의 흡광도 값이 컷오프 값 이상의 값으로 확인되었으며, 공격 접종 후 5 주 후부터 급격하게 흡광도 값이 증가하는 결과를 보였다(도 15).

E형 간염은 한 가지의 혈청형을 가지고 있으며, 총 HEV 항체를 측정하는 ELISA 키트를 사용하여 항체가를 측정하였다. 따라서, HEV G3 VLP 백신 접종한 군의 혈청 내 항체의 존재를 확인하였으며 공격 접종에 대한 방어능이 있는 것으로 판단하였다.

또한, 혈청 및 분변 샘플로 중합효소연쇄반응(PCR)을 진행하여 HEV RNA의 검출 유무를 확인하였다. 상기 양성 대조군은 혈청 샘플에서 공격 접종 후 3 주부터 6 주까지 HEV 유전체가 검출되었으며, 분변 샘플에서는 공격 접종 후 3 주부터 7 주까지 HEV 유전체가 검출되었다. 음성 대조군과 백신 접종군의 혈청 및 분변에서는 HEV 유전체가 검출되지 않은 것을 확인할 수 있었다.

실시예 8. 제3 유전자형 HEV 바이러스-유사 입자 백신의 효과 확인

8-1. 바이러스 유사 입자(VLP)의 크기 확인

본 발명에 따라 정제된 HEV-3-239-VLP(유전자 3형 HEV 캡시드 단백질의 239개의 아미노산 서열로 이루어진 면역원성 단편으로 구성된 바이러스 유사 입자)의 분자량을 확인하기 위해 항-HEV 단클론 항체로 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 단백질을 10분 동안 가열하여(끓여서) 모노머로 분해하였다. 대장균이 생산한 약 72kDa 크기의 재조합 토끼 HEV 전체 캡시드 단백질을 대조군으로 사용하였다(도 16의 1). HEV-3-239-VLP의 단량체는 예상대로 26kDa 크기로 확인되었다(도 16의 2). 이후, HEV-3-239-VLP 를 음성으로 염색한 후, 조립된 VLP의 모양과 크기를 TEM으로 관찰하였다. 그 결과, HEV-3-239-VLP는 직경이 20-30nm인 20면체 모양을 갖는 것을 확인할 수 있다(도 17의 (A)). 면역 염색은 금 입자 결합 항체로 수행되었으며, 10 nm 크기의 금 입자가 HEV-3-239-VLPs의 표면에 부착되었다(도 17의 (B)). 즉, 본 실시예에서는 HEV-3의 캡시드 단백질의 예측된 크기가 바큘로바이러스 시스템에서 발현됨을 확인하였고, 조립된 HEV-3-239-VLP는 직경 20-30 nm 크기임을 확인하였다.

8-2. VLP의 접종 및 면역원성 확인

본 실시예에서는 본 발명에 따라 제조된 VLP로 백신접종한 돼지에서 분변 바이러스 배출 및 바이러스혈증이 검출되는지 여부를 확인하였다. 첫 번째 백신 접종은 0주차에 시행되었고 추가 접종은 두 백신 접종 그룹에서 2주차에 시행되었다. 4주차에 백신접종군과 양성대조군을 돼지 HEV-3로 챌린지(감염)하였다. 10주차에 돼지를 안락사시키고 간을 채취하였다. HEV-3의 RNA는 예상대로 음성 대조군의 돼지로부터 실험 매주 수집된 모든 혈청 및 분변 샘플에서 검출되지 않았다. 대조적으로, 양성 대조군의 돼지는 6주에서 9주 사이에 바이러스 혈증을 보였고, 6주에서 10주 사이에 분변 바이러스 배출을 보였다(표 4). HEV RNA는 양성 대조군 돼지 3마리 모두의 혈청과 분변에서 검출되었다. 대조적으로, 7주째 돼지 3마리 중 2마리의 혈청에서 일시적인 바이러스 혈증이 검출되었고, 100ug VLP로 백신접종된 3마리의 돼지 중 7주째 돼지 2마리와 8주째 돼지 1마리에서 분변 바이러스 배출이 확인되었다. 그러나, 200ug의 VLP로 백신접종된 3마리의 돼지 모두에서 전체 실험 기간 동안 바이러스혈증 또는 분변 바이러스 배출이 입증되지 않았다(표 4). 이러한 결과는 본 발명에 따라 제조된 VLP의 200ug 용량이 돼지의 HEV-3 감염 보호에 충분하다는 것을 의미한다.

HEV RNA가 검출된 돼지의 수

그룹

접종 후 주 수(Weeks Post-Inoculation)

샘플

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

음성대조군

혈청

0/3

분변

0/3

1/3

2/3

1/3

2/3

0/3

양성대조군

혈청

0/3

2/3

3/3

2/3

1/3

분변

0/3

HEV-3-239-VLP
(100 _g/mL)

혈청

0/3

2/3

0/3

분변

0/3

2/3

1/3

0/3

HEV-3-239-VLP
(200 _g/mL)

혈청

0/3

분변

0/3

8-3. VLP의 접종에 따른 항-HEV 항체 유도 확인

상기 실시예 8-2에 따른 샘플에서, 항-HEV 항체는 예상대로 전체 실험 기간 동안 음성 대조군의 모든 돼지에서 발견되지 않았다. 양성대조군 돼지의 경우 6주차에 항 HEV 항체가 나타나 10주차까지 서서히 증가하였으나, 백신 접종군보다 낮았다(도 18). 두 개의 백신 접종 그룹에서 돼지의 항-HEV 항체 역가는 음성 대조군 돼지와 비교할 때 6주에서 10주 사이에 상당히(p < 0.01) 더 높게 나타났다(도 18). 100 및 200ug의 VLP로 백신접종한 돼지 사이의 항체 역가에는 차이가 없었다. 그러나 이들의 항체 역가는 양성 대조군 돼지보다 유의하게 높았다. 상기 결과는 VLP 백신의 두 가지 상이한 용량이 항-HEV 항체를 생산하기에 충분한 면역원성을 갖는다는 것을 의미한다.

8-4. VLP의 접종에 따른 간염 예방효과 확인

ALT(Alanine aminotransferase)와 AST(aspartate aminotransferase)는 간 손상의 지표이다. 본 실시예에서는 상기 실시예 8-2에 따른 샘플에서의 ALT, AST 변화를 확인하였다. 해당 샘플에서, 음성 대조군의 ALT 값은 실험 내내 약 20 U/L로 유지되었다. 한편, 5주, 7주, 9주 및 10주째에 양성 대조군 돼지의 ALT 값이 음성 대조군 돼지보다 유의하게 높았다(p<0.05). 특히 ALT 값이 정상 범위(8.18-40.29) 7주 및 10주차에. 두 백신 접종 그룹 돼지의 ALT 값은 정상 범위로 유지되었으며(도 19의 (A)), 음성 대조군 돼지의 AST 값은 실험 내내 약 10 U/L로 유지되었다. 대조적으로, 양성 대조군 돼지의 AST 수준은 7주째에 음성 대조군 돼지보다 유의하게 더 높았다(p < 0.05)(도 19의 (B)). 그러나 양성 대조군 돼지의 AST 수치도 정상 범위(13-168) 내에 유지되었다. 두 백신 접종 그룹의 돼지의 AST 값은 음성 대조군 돼지의 값과 유사하게 유지되었다. 이러한 결과는 VLP 백신이 HEV-3 감염으로 인한 간 손상을 예방할 수 있음을 나타낸다.

8-5. VLP 백신 접종 후 조직 병리학적 분석 (간 섬유증 억제 효과 확인)

상기 실시예 8-2에 따른 음성대조군 돼지의 간조직에서는 소엽간 결합조직과 간문문삼주변 부위에 적은 수의 단핵세포와 섬유아세포가 관찰되었다. 그러나, 양성 대조군 돼지의 간 조직은 음성 대조군 돼지보다 소엽내 영역의 단핵 세포 및 소엽 사이의 섬유아세포의 더 많은 국소 침윤을 나타내었다. 두 백신 접종 그룹의 돼지는 또한 간 조직에서 양성 대조군 돼지보다 적은 수의 단핵 세포 및 섬유아세포를 보였다. 간 조직의 섬유화 정도는 Masson's trichrome으로 염색하여 결정하였다. 섬유증은 HEV에 감염된 양성 대조군(도 20 C,D)에 있는 돼지의 간의 간문맥과 중앙 정맥에서 주로 소엽간 결합 조직에서 발견되었다. 반면, 100 및 200ug의 VLP로 백신접종한 돼지의 섬유화 정도는 음성 대조군 돼지에서 발견된 것과 유사한 것으로 보였다(도 20의 A,B,E,F).

이에, 섬유화된 면적을 전체 간 조직 면적과 비교하여 실제 섬유화 정도를 계산하였다. 도 21를 참조하면, 양성 대조군 돼지의 간 조직 섬유화는 음성 대조군 돼지보다 유의하게 높았다(p < 0.05). 그러나 200ug의 VLP를 접종한 돼지의 간조직 섬유화 정도는 양성대조군 돼지에 비해 유의하게 낮았다(p<0.05). 100ug의 VLP를 접종한 돼지의 간 조직 섬유화 정도는 양성 대조군 돼지보다 적었지만 두 그룹 간에 통계적 차이는 없었다(도 21). 이러한 결과는 VLP 백신이 HEV-3에 감염된 돼지의 간 조직에서 유발된 섬유화를 예방할 수 있음을 나타낸다.

이상 본 발명의 실시예들을 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims

유전자 3형의 E형 간염 바이러스 캡시드 단백질의 면역원성 단편을 항원으로 포함하는, 유전자 3형의 E형 간염 바이러스 예방 또는 치료용 백신 조성물.
제1 항에 있어서,
상기 면역원성 단편의 아미노산 서열은 유전자 3형의 E형 간염 바이러스 캡시드 단백질 아미노산 서열에서 368번째 내지 606번째의 아미노산을 포함하는, 백신 조성물.
제1 항에 있어서,
상기 면역원성 단편은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것인,백신 조성물.
유전자 3형의 E형 간염 바이러스 캡시드 단백질의 면역원성 단편을 코딩하는 유전자 서열을 포함하는, 유전자 3형의 E형 간염 바이러스 백신 제조용 벡터.
제4 항에 있어서,
상기 면역원성 단편의 아미노산 서열은 유전자 3형의 E형 간염 바이러스 캡시드 단백질 아미노산 서열에서 368번째 내지 606번째의 아미노산을 포함하는, 벡터.
제1 항에 있어서,
상기 면역원성 단편은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 벡터.
제4 항에 있어서,
상기 벡터는 배큘로바이러스(baculovirus) 유전자 서열에 서열번호 2의 서열이 삽입된 것인, 벡터.
제4 항 내지 제7항 중 어느 한 항의 벡터로 형질 전환된, 숙주세포.
제8 항에 있어서, 상기 숙주세포는 곤충의 세포인, 숙주세포.
제9 항에 있어서, 상기 곤충은 나비류 애벌레인, 숙주세포.
유전자 3형의 E형 간염 바이러스 캡시드 단백질의 면역원성 단편을 항원으로 이루어진, 유전자 3형의 E형 간염 바이러스 유사 입자.
제11 항에 있어서,
상기 면역원성 단편의 아미노산 서열은 유전자 3형의 E형 간염 바이러스 캡시드 단백질 아미노산 서열에서 368번째 내지 606번째의 아미노산을 포함하는, 유전자 3형의 E형 간염 바이러스 유사 입자.
제11 항에 있어서,
상기 면역원성 단편은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 유전자 3형의 E형 간염 바이러스 유사 입자.
제11 항에 있어서,
상기 바이러스 유사 입자는 배큘로바이러스 발현 시스템에 따라 발현된 것인, 유전자 3형의 E형 간염 바이러스 유사 입자.