ES2627913T3 - Viriones de AAV con inmunorreactividad reducida y usos de los mismos - Google Patents

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ES2627913T3 ES11158742.4T ES11158742T ES2627913T3 ES 2627913 T3 ES2627913 T3 ES 2627913T3 ES 11158742 T ES11158742 T ES 11158742T ES 2627913 T3 ES2627913 T3 ES 2627913T3
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capsid
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Alejandra Elena Arbetman
Peter Colosi
Michael A. Lochrie
Richard T. Surosky
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Genzyme Corp
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Abstract

Uso de una proteína de la cápside de virus adeno-asociado (AAV) mutado, en un virión de AAV recombinante, para reducir la inmunorreactividad del virión en comparación con el correspondiente virión de tipo salvaje, en donde dicha proteína de la cápside de AAV mutado comprende una sustitución del aminoácido que se produce en la posición correspondiente a la posición 334 de la proteína de la cápside VP2 de AAV-2.

Description

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Las Figuras 21A-21H muestran una comparación de la secuencia de aminoácidos de VP1s de AAVs que son sensibles o resistentes a la neutralización de anticuerpos de la siguiente manera: AAV-2 de primate (SEQ ID NO: 13), AAV-3B de primate (SEQ ID NO: 18), AAV-6 de primate (SEQ ID NO: 19), AAV-1 de primate (SEQ ID NO: 20), AAV-8 de primate (SEQ ID NO: 21), AAV-4 de primate (SEQ ID NO: 22), AAV bovino (vaca) ("AAV-C1" (SEQ ID NO: 26), AAV-5 de primate (SEQ ID NO: 16) y AAV caprino (cabra) ("AAV-C1" SEQ ID NO: 17). Línea de parvovirus: *, conservada en casi todos los parvovirus. Línea de neutralización: #, localización de mutaciones individuales en la cápside de AAV-2 identificadas como resistentes a la neutralización por sueros humanos. Línea de Accesibilidad: B, el aminoácido está enterrado entre la superficie interior y exterior; I, el aminoácido se encuentra en la superficie interior; O, el aminoácido se encuentra en la superficie exterior. Línea característica de la superficie: C, cilindro; P, meseta; S, pico; Y, cañón. Línea de ADN: B, posible contacto de base; D, probablemente requerida para la unión de ADN, pero no podrá contactar directamente con el ADN; P, posible contacto de fosfato; R, posible contacto de ribosa. Otros línea: A, ubicación de las mutaciones sencillas que disminuyen la unión y neutralización por anticuerpos monoclonales de ratón A20; H, contacto de heparina en AAV-2; M, posible contacto de Mg2+; P, dominio A2 de fosfolipasa.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, métodos convencionales de química, bioquímica, técnicas de ADN recombinante e inmunología, dentro de la experiencia de la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véase, p. ej., Fundamental Virology, 2ª edición, vol. I y II (B.
N. Fields y D. M. Knipe, comps.); Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir y C.C. Blackwell comps., Blackwell Scientific Publications.); T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); A. L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., adición actual); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª edición, 1989); Methods in Enzymology (S. Colowick y N. Kaplan comps., Academic Press, Inc.).
1. DEFINICIONES
Al describir la presente invención, se emplearán los siguientes términos y expresiones, y se pretende que sean definidos como se indica más adelante.
Debe señalarse que, tal como se utiliza en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el", “la” incluyen referentes plurales, a menos que el contenido indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "un polipéptido" incluye una mezcla de dos o más polipéptidos, y similares.
Las siguientes abreviaturas de aminoácidos se utilizan a lo largo del texto:
Alanina: Ala (A) Arginina: Arg (R) Asparagina: Asn (N) Ácido aspártico: Asp (D) Cisteína: Cys (C) Glutamina: Gln (Q)Ácido glutámico: Glu (E) Glicina: Gly (G) Histidina: His (H) Isoleucina: Ile (I) Leucina: Leu (L) Lisina: Lys (K) Metionina: Met (M) Fenilalanina: Phe (F) Prolina: Pro (P) Serina: Ser (S) Treonina: Thr (T) Triptófano: Trp (W) Tirosina: Tyr (Y) Valina: Val (V)
Por "vector" se quiere dar a entender cualquier elemento genético tal como un plásmido, fago, transposón, cósmido, cromosoma, virus, virión, etc., que sea capaz de replicación cuando se asocia con los elementos de control apropiados y que puede transferir secuencias de genes entre células. Por lo tanto, el término incluye vehículos de clonación y expresión, así como vectores virales.
Por un "vector AAV" se quiere dar a entender un vector derivado de cualquier serotipo de virus adeno-asociado aislado a partir de cualquier especie animal, incluyendo, sin limitación, AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-G1 y AAV-C1.
Vectores de AAV pueden tener uno o más de los genes AAV de tipo salvaje eliminadas en su totalidad o en parte, de preferencia los genes rep y/o cap, pero conservan secuencias ITR flanqueantes funcionales. Secuencias ITR funcionales son necesarias para el rescate, la replicación y el empaquetamiento del virión de AAV. Por lo tanto, un vector de AAV se define en esta memoria para que incluya al menos las secuencias requeridas en cis para la replicación y el empaquetamiento (p. ej., ITRs funcionales) del virus. Las ITRs no tienen por qué ser las secuencias de nucleótidos de tipo salvaje, y puede estar alteradas, p. ej., mediante inserción, deleción o sustitución de
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nucleótidos, siempre y cuando las secuencias proporcionen el rescate, la replicación y el empaquetamiento funcionales.
"Funciones helper de AAV" se refieren a secuencias codificadoras derivadas de AAV que se pueden expresar para proporcionar productos génicos de AAV que, a su vez, funcionan en trans para la replicación de AAV productiva. Por lo tanto, las funciones helper de AAV incluyen los dos marcos de lectura abiertos (ORFs) de AAV principales, rep y cap. Los productos de expresión Rep han demostrado poseer muchas funciones, incluyendo, entre otras: reconocimiento, unión y mellado del origen AAV de la replicación de ADN; actividad helicasa de ADN; y modulación de la transcripción de promotores de AAV (u otros heterólogos). Los productos de expresión Cap suministran funciones de empaquetamiento necesarias. Funciones helper de AAV se utilizan en esta memoria para complementar funciones de AAV en trans que faltan en los vectores de AAV.
La expresión "construcción helper de AAV" se refiere, en general, a una molécula de ácido nucleico que incluye secuencias de nucleótidos que proporcionan funciones de AAV eliminadas de un vector de AAV que se ha de utilizar para producir un vector de transducción para el suministro de una secuencia de nucleótidos de interés. Construcciones helper de AAV se utilizan comúnmente para proporcionar la expresión transitoria de genes rep y/o cap de AAV para complementar funciones de AAV que faltan y que son necesarias para la replicación lítica de AAV; sin embargo, construcciones helper carecen de ITRs de AAV y no pueden replicarse ni empaquetarse por sí mismas. Construcciones helper de AAV pueden estar en forma de un plásmido, fago, transposón, cósmido, virus o virión. Se ha descrito un cierto número de construcciones y vectores helper de AAV que codifican productos de expresión Rep y/o Cap. Véase, p. ej., las patentes de EE.UU. Nºs 6.001.650, 5.139.941 y 6.376.237; Samulski et al. (1989) J. Virol. 63: 3822-3828; y McCarty et al. (1991) J. Virol. 65: 2936-2945.
La expresión "funciones accesorias" se refiere a funciones virales y/o celulares no derivadas de AAV de las que el AAV depende para su replicación. Así, la expresión captura proteínas y ARNs que se requieren en la replicación de AAV, incluyendo los restos implicados en la activación de la transcripción génica de AAV, etapa específica para el corte y empalme de ARNm de AAV, replicación del ADN de AAV, síntesis de productos de expresión Cap y ensamblaje de la cápside de AAV. Funciones accesorias de base viral se pueden derivar de cualquiera de los virus helper conocidos tales como adenovirus, virus herpes (distintos de los virus herpes simplex tipo-1) y virus vacuna.
La expresión "vector de función accesoria" se refiere generalmente a una molécula de ácido nucleico que incluye secuencias de nucleótidos que proporcionan funciones accesorias. Una función vectorial accesoria puede transfectarse en una célula huésped adecuada, en donde el vector es entonces capaz de soportar la producción de viriones de AAV en la célula huésped. Expresamente excluidas de la expresión se encuentran partículas virales infecciosas tal como existen en la naturaleza, tales como partículas de adenovirus, virus herpes o virus vacuna. Por lo tanto, los vectores de función accesoria pueden estar en forma de un plásmido, fago, transposón o cósmido.
Se ha demostrado que el complemento completo de genes de adenovirus no es necesario para las funciones helper accesorias. En particular, mutantes de adenovirus incapaces de replicación del ADN y la síntesis de genes tardía han demostrado ser permisivos para la replicación de AAV. Ito et al., (1970) J Gen. Virol. 9:243; Ishibashi et al, (1971) Virology 45: 317. De manera similar, los mutantes dentro de las regiones E2B y E3 han demostrado soportar la replicación de AAV, indicando que las regiones E2B y E3 no están probablemente implicadas en proporcionar funciones accesorias. Carter et al. , (1983) Virology 126: 505. Sin embargo, no es probable que los adenovirus defectuosos en la región E1, o que tienen una región E4 eliminada, sean capaces de soportar la replicación de AAV. Por lo tanto, es probable que las regiones E1A y E4 se requieran para la replicación de AAV, ya sea directa o indirectamente. Laughlin et al., (1982) J. Virol. 41:868; Janik et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1925; Carter et al., (1983) Virology 126: 505. Otros mutantes Ad caracterizados incluyen: E1B (Laughlin et al. (1982), supra; Janik et al. (1981), supra; Ostrove et al., (1980) Virology 104: 502); E2A (Handa et al., (1975) J. Gen. Virol. 29:239; Strauss et al., (1976) J. Virol. 17:140; Myers et al., (1980) J. Virol. 35:665; Jay et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2927; Myers et al., (1981) J. Biol. Chem. 256:567); E2B (Carter, Adeno-Associated Virus Helper Functions en I CRC Handbook of Parvovirus (P. Tijssen comp., 1990)); E3 (Carter et al (1983), supra); y E4 (Carter et al. (1983), supra ; Carter (1995)). Aunque los estudios de las funciones accesorias proporcionadas por adenovirus que tienen mutaciones en la región codificadora de E1B han producido resultados conflictivos, Samulski et al., (1988) J. Virol. 62:206-210, informaron recientemente que se requiere E1B55k para la producción de viriones de AAV, mientras que no se requiere E1B19k. Además, la Publicación Internacional WO 97/17458 y Matshushita et al., (1998) Gene Therapy 5:938-945, describen vectores de funciones accesorias que codifican diversos genes Ad. Vectores de funciones accesorias particularmente preferidos comprenden una región codificadora de ARN de adenovirus VA, una región codificadora de adenovirus E4 ORF6, una región codificadora de E2A de 72 kD, una región codificadora de adenovirus E1A y una región E1B de adenovirus que carece de una región codificadora E1B55k intacta. Vectores de este tipo se describen en la Publicación Internacional Nº WO 01/83797.
Por "virus recombinante" se quiere dar a entender un virus que ha sido alterado genéticamente, p. ej., mediante la adición o inserción de una construcción de ácido nucleico heterólogo en la partícula.
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Un mecanismo bien estudiado para la neutralización es que un anticuerpo neutralizante bloquea físicamente una región en el virus requerida para unirse a receptores que se requieren para la infección. Estudios previos con otros virus han demostrado que los receptores y anticuerpos neutralizantes se unen a un conjunto distinto de aminoácidos y que es posible identificar mutantes en las posiciones particulares en cápsides virales que afectan a la unión de anticuerpos neutralizantes, pero no los receptores u otras funciones necesarias para la infección viral. Experimentos en los cuales se seleccionan virus replicantes de tipo salvaje para que sean resistentes a los anticuerpos neutralizantes han demostrado que las mutaciones, incluso en los aminoácidos individuales, tales como los aquí descritos, pueden resultar en un aumento significativo en la resistencia a la neutralización de anticuerpos.
La capacidad o incapacidad de un virión de AAV mutante de unirse a antisueros de AAV es parcialmente una función de la secuencia de las proteínas de la cápside (codificadas por el gen cap de AAV). Por lo tanto, la invención contempla cambios de aminoácidos individuales, dobles, triples, cuádruples y mayores realizados en la superficie del virión de AAV, así como deleciones y/o inserciones, con el fin de disminuir la inmunorreactividad, p. ej., para alterar la capacidad del virión de AAV para unirse a antisueros de AAV. Tales mutantes pueden ser evaluados en cuanto a la resistencia a la neutralización y, de ser necesario, se pueden hacer cambios más drásticos o múltiples.
Métodos para identificar porciones del virión de AAV susceptibles de mutación con un virión de rAAV funcional resultante se describen en los ejemplos que figuran más adelante. Tal como se detalla en el mismo, se prefieren mutaciones a los aminoácidos en la superficie viral tales como mutaciones a las características que sobresalen de la cápside, incluyendo porciones de la cápside conocidas como el "pico", "cilindro" y "meseta". Las mutaciones son preferiblemente a la región VP2, más preferiblemente a la región VP3 y, en particular, dentro de la región de solapamiento entre VP1, VP2 y VP3 tal como se muestra en la Figura 11. Mutaciones particularmente preferidas se encuentran dentro de las posiciones 80-598 de VP2 (correspondientes a los aminoácidos 217-735 de VP1 y a los aminoácidos 15-533 de VP3).
La secuencia de una VP2 representativa se muestra en la Figura 9 en esta memoria (SEQ ID NO: 12). La proteína principal de la envuelta, VP3 abarca los aminoácidos 203-735 de VP1. La mutación comprende al menos una sustitución, deleción o inserción de aminoácido a la proteína nativa. Mutaciones representativas incluyen una o más sustituciones de los aminoácidos que se producen en una posición correspondiente a una posición de la proteína de la cápside VP2 de AAV-2, seleccionados del grupo que consiste en los aminoácidos 126, 127, 128, 130, 132, 134, 247, 248, 315, 334, 354, 357, 360, 361, 365, 372, 375, 377, 390, 393, 394, 395, 396, 407, 411, 413, 418, 437, 449, 450, 568, 569 y 571.
Generalmente, el aminoácido que se produce de forma natural está sustituido con un aminoácido que tiene una cadena lateral pequeña y/o no está cargado y, por lo tanto, es menos inmunogénico. Aminoácidos de este tipo incluyen, sin limitación, alanina, valina, glicina, serina, cisteína, prolina, así como análogos de los mismos, prefiriéndose alanina. Además de ello, pueden estar presentes mutaciones adicionales. Combinaciones representativas incluyen cualquier combinación de los aminoácidos identificados inmediatamente arriba tales como, pero no limitados a una mutación del aminoácido 360 a histidina y el aminoácido 361 a alanina; el aminoácido 334 a alanina y el aminoácido 449 a alanina; el aminoácido 334 a alanina y el aminoácido 568 a alanina, el aminoácido 568 a alanina y el aminoácido 571 a alanina; el aminoácido 334 a alanina, el aminoácido 449 a alanina y el aminoácido 568 a alanina; el aminoácido 571 a lisina y cualquiera de los aminoácidos especificados anteriormente. Las combinaciones anteriores son meramente ilustrativas y, por supuesto, se determinan fácilmente numerosas otras combinaciones basándose en la información proporcionada en esta memoria.
Tal como se describe adicionalmente en los ejemplos, determinados aminoácidos en la cápside son adyacentes al sitio de unión a heparina. Esta región se denomina "zona muerta" o "DZ" en esta memoria e incluye los aminoácidos G128, N131, D132, H134, N245, N246, D356, D357, H372, G375, D391, D392, E393 y E394. Los aminoácidos en la zona muerta son importantes para la función de AAV y, por tanto, son también dianas para la unión de anticuerpos neutralizantes. Dado que esta región es importante para la función de AAV, sustituciones conservadoras de aminoácidos tales como Q por H, D por E, E o N por D, y similares, se prefieren en la región de la zona muerta y resultan en un mutante de la zona muerta más funcional.
Las diversas posiciones de aminoácidos que se producen en la proteína de la cápside se numeran aquí con referencia a la secuencia de VP2 de AAV-2 descrita en NCBI Nº de Acceso AF043303 y se muestran en la Figura 9 en esta memoria. La Figura 10 muestra la secuencia de aminoácidos de VP1 de AAV-2. Sin embargo, se debe entender que las mutaciones de aminoácidos que se producen en posiciones correspondientes en cualquiera de los serotipos de AAV quedan abarcadas por la presente invención. Las secuencias para la cápside de diversos serotipos de AAV aislados a partir de múltiples especies son conocidas y se describen, p. ej., en Gao et al. ( 2.002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:11854-11859; Rutledge et al. ( 1998) J. Virol. 72:309-319; NCBI Nºs de Acceso NC001863; NC004828; NC001862; NC002077; NC001829; NC001729; U89790; U48704; AF369963; AF028705; AF028705; AF028704; AF513852; AF513851; AF063497; AF085716; AF43303; Y18065; AY186198; AY243026; AY243025; AY243024; AY243023; AY243022; AY243021; AY243020; AY243019; AY243018; AY243017; AY243016; AY243015; AY243014; AY243013; AY243012; AY243011; AY243010; AY243009; AY243008;
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El vector de rAAV que contiene el ácido nucleico heterólogo (HNA) puede construirse utilizando ITRs de cualquiera de los diversos serotipos de AAV. El HNA comprende secuencias de ácido nucleico unidas entre sí que de otro modo no se encuentran en la naturaleza, definiendo este concepto el término "heterólogo”. Para ilustrar este punto, un ejemplo de un HNA es un gen flanqueado por secuencias de nucleótidos que no se encuentran en asociación con ese gen en la naturaleza. Otro ejemplo de un HNA es un gen que por sí mismo no se encuentra en la naturaleza (p. ej., secuencias sintéticas que tienen codones diferentes del gen nativo). La variación alélica o eventos mutacionales que se producen de forma natural no dan lugar a HNAs tal como se utiliza en esta memoria. Un HNA puede comprender una molécula de ARN anti-sentido, un ribozima o un gen que codifica un polipéptido.
El HNA está enlazado operativamente a un promotor heterólogo (constitutivo, específico para células o inducible) de modo que el HNA sea capaz de ser expresado en las células diana del paciente bajo condiciones apropiadas o deseables. Numerosos ejemplos de promotores constitutivos, específicos para células e inducibles son conocidos en la técnica, y un experto fácilmente podría seleccionar un promotor para un uso específico previsto, p. ej., la selección del promotor de α-actina del esqueleto específico para el músculo o el promotor/potenciador de creatina quinasa específico para el músculo para la expresión específica para la célula muscular, la selección del promotor de CMV constitutivo para fuertes niveles de expresión continua o casi continua, o la selección del promotor de ecdisona inducible para la expresión inducida. La expresión inducida permite que el experto en la técnica controle la cantidad de proteína que se sintetiza. De esta manera, es posible variar la concentración de producto terapéutico. Otros ejemplos de promotores inducibles bien conocidos son: promotores esteroides (p. ej., promotores de estrógenos y andrógenos) y promotores de metalotioneína.
La descripción incluye nuevos viriones mutantes que comprenden HNAs que codifican una o más moléculas de ARN anti-sentido, siendo administrados los viriones de rAAV preferiblemente a una o más células o tejido muscular de un mamífero. Moléculas de ARN antisentido adecuadas para su uso con la presente invención en la terapia anti-sentido del cáncer o el tratamiento de enfermedades virales se han descrito en la técnica. Véase, p. ej., Han et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4313-4317; Uhlmann et al., (1990) Chem. Rev. 90:543-584; Helene et al., (1990) Biochim. Biophys. Acta. 1049:99-125; Agarawal et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:7079-7083; y Heikkila et al., (1987) Nature 328:445-449. La descripción también abarca el suministro de ribozimas utilizando los métodos descritos en esta memoria. Para una discusión de ribozimas adecuadas, véase, p. ej., Cech et al., (1992) J. Biol. Chem. 267:17479-17482 y la patente de EE.UU. N° 5.225.347.
La descripción abarca preferiblemente viriones de rAAV mutantes que comprenden HNAs que codifican uno o más polipéptidos, siendo administrados los viriones de rAAV preferiblemente a una o más células o tejidos de un mamífero. Por lo tanto, la descripción abarca el suministro de HNAs que codifican uno o más péptidos, polipéptidos
o proteínas, que son útiles para el tratamiento o la prevención de estados de enfermedad en un sujeto mamífero. Un ADN de este tipo y estados de enfermedad asociados incluyen, pero no se limitan a: ADN que codifica glucosa-6fosfatasa, asociado con la deficiencia de almacenamiento de glucógeno tipo 1A; ADN que codifica fosfoenolpiruvatocarboxiquinasa, asociado con la deficiencia en Pepck; ADN que codifica galactosa-1 fosfato uridil transferasa, asociado con galactosemia; ADN que codifica fenilalanina hidroxilasa, asociado con fenilcetonuria; ADN que codifica alfa-cetoácido deshidrogenasa de cadena ramificada, asociado con la enfermedad de orina de jarabe de arce; ADN que codifica fumarilacetoacetato hidrolasa, asociado con tirosinemia tipo 1; ADN que codifica metilmalonil-CoA mutasa, asociado con acidemia metilmalónica; ADN que codifica acil CoA deshidrogenasa de cadena media, asociado con la deficiencia de acetil CoA de cadena media; ADN que codifica ornitina transcarbamilasa, asociado con deficiencia en ornitina transcarbamilasa; ADN que codifica ácido argininosuccínico sintetasa, asociado con citrulinemia; ADN que codifica proteína del receptor de lipoproteína de baja densidad, asociado con hipercolesterolemia familiar; ADN que codifica UDP-glucouronosiltransferase, asociado con la enfermedad de Crigler-Najjar; ADN que codifica adenosina desaminasa, asociado con la enfermedad de inmunodeficiencia combinada grave; ADN que codifica hipoxantina guanina fosforibosil transferasa, asociado con el síndrome de Gout y Lesch-Nyan; ADN que codifica biotinidasa, asociado con deficiencia en biotinidasa; ADN que codifica betaglucocerebrosidasa, asociado con la enfermedad de Gaucher; ADN que codifica beta-glucuronidasa, asociado con el síndrome de Sly; ADN que codifica la proteína de la membrana de peroxisoma de 70 kDa, asociado con el síndrome de Zellweger; ADN que codifica porfobilinógeno deaminasa, asociado con porfiria aguda intermitente; ADN que codifica alfa-1 antitripsina para el tratamiento de la deficiencia en alfa-1 antitripsina (enfisema); ADN que codifica eritropoyetina para el tratamiento de la anemia debido a la talasemia o la insuficiencia renal; ADN que codifica el factor de crecimiento endotelial vascular, el ADN que codifica angiopoyetina-1 y ADN que codifica el factor de crecimiento de fibroblastos para el tratamiento de enfermedades isquémicas; ADN que codifica trombomodulina e inhibidor de la vía del factor tisular para el tratamiento de vasos sanguíneos ocluidos como se ven, por ejemplo, en la aterosclerosis, trombosis o embolismos; ADN que codifica aminoácido descarboxilasa aromática (AADC) y ADN que codifica tirosina hidroxilasa (TH) para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson; ADN que codifica el receptor beta-adrenérgico, ADN que codifica anti-sentido a , o ADN que codifica una forma mutante de, fosfolamban, ADN que codifica adenosina trifosfatasa-2 del retículo el sarco(endo)plásmico (SERCA2) y ADN que codifica la adenilil ciclasa cardiaca para el tratamiento de la insuficiencia cardíaca congestiva; ADN que codifica un gen supresor de tumores tal como p53 para el tratamiento de diversos cánceres; ADN que codifica una citoquina tal como una de las diversas interleuquinas para el tratamiento de trastornos y cánceres inflamatorios e inmunes; ADN que codifica
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distrofina o minidistrofina y ADN que codifica utrofina o miniutrofina para el tratamiento de distrofias musculares; y ADN que codifica insulina para el tratamiento de la diabetes.
La descripción también incluye nuevos viriones mutantes que comprenden un gen o genes que codifican proteínas de la coagulación de la sangre, proteínas que pueden ser suministradas, utilizando los métodos de la presente descripción, a las células de un mamífero que tiene hemofilia para el tratamiento de la hemofilia. Por lo tanto, la invención incluye: el suministro del gen del Factor IX a un mamífero para el tratamiento de la hemofilia B, el suministro del gen del Factor VIII a un mamífero para el tratamiento de la hemofilia A, el suministro del gen del Factor VII para el tratamiento de la deficiencia en Factor VII, el suministro del gen del factor X para el tratamiento de la deficiencia en Factor X, el suministro del gen del Factor XI para el tratamiento de la deficiencia en Factor XI, el suministro del gen del Factor XIII para el tratamiento de la deficiencia en Factor XIII, y el suministro del gen de la Proteína C para el tratamiento de la deficiencia en Proteína C. El suministro de cada uno de los genes arriba citados a las células de un mamífero se lleva a cabo generando primero un virión de rAAV que comprende el gen y luego administrando el virión de rAAV al mamífero. Por lo tanto, la descripción incluye viriones de rAAV que comprenden genes que codifican uno cualquiera de Factor IX, Factor VIII, Factor X, Factor VII, Factor XI, Factor XIII o Proteína C.
El suministro de los viriones recombinantes que contienen uno o más HNAs a un sujeto mamífero puede ser mediante inyección intramuscular o mediante administración en el torrente sanguíneo del sujeto mamífero. La administración en el torrente sanguíneo puede ser mediante inyección en una vena, una arteria, o cualquier otro conducto vascular los viriones mutantes en el torrente sanguíneo a modo de perfusión de extremidad aislada, una técnica bien conocida en las técnicas quirúrgicas, permitiendo esencialmente el método al experto aislar una extremidad de la circulación sistémica antes de la administración de los viriones de rAAV. Una variante de la técnica de perfusión de extremidad aislada, descrita en la patente de EE.UU. Nº 6.177.403, se puede emplear también por el experto en la técnica para administrar los viriones mutantes en la vasculatura de una extremidad aislada para mejorar potencialmente la transducción en células o tejido muscular. Además de ello, para determinadas afecciones, puede ser deseable administrar los viriones mutantes al SNC de un sujeto. Por "SNC" se quiere dar a entender todas las células y tejido del cerebro y la médula espinal de un vertebrado. Por lo tanto, el término incluye, pero no está limitado a células neuronales, células gliales, astrocitos, fluido cereobrospinal (CSF), espacios intersticiales, hueso, cartílago y similares. Viriones de AAV recombinante o células transducidas in vitro pueden ser suministrados directamente al SNC o al cerebro mediante inyección en, p. ej., la región ventricular, así como al cuerpo estriado (p. ej., el núcleo caudado o putamen del cuerpo estriado), la médula espinal y la unión neuromuscular, o el lóbulo del cerebelo, con un aguja, catéter o dispositivo relacionado, utilizando técnicas neuroquirúrgicas conocidas en la técnica tales como mediante inyección estereotáctica (véase, p. ej., Stein et al, J Virol 73:3424-3429,1999; Davidson et al., PNAS 97: 3428-3432, 2000; Davidson et al., Nat. Genet. 3:219-223,1993; y Alisky y Davidson, Hum. Gene Ther. 11:2315-2329, 2000).
La dosis de viriones de rAAV requerida para lograr un "efecto terapéutico" particular, p. ej., las unidades de dosis en genomas de vectores/por kilogramo de peso corporal (vg/kg), variarán en función de varios factores, incluyendo, pero no limitados a: la vía de administración del virión de rAAV, el nivel de la expresión del gen (o ARN anti-sentido o ribozima) requerido para lograr un efecto terapéutico, la enfermedad o trastorno específico que esté siendo tratado, una respuesta inmune del huésped al virión de rAAV, una respuesta inmune del huésped al gen (o ARN anti-sentido
o ribozima) del producto de expresión, y la estabilidad del producto gen (o ARN anti-sentido o ribozima). Un experto en la técnica puede determinar fácilmente un intervalo de dosis de virión de rAAV para tratar un paciente que tiene una enfermedad o trastorno particular sobre la base de los factores antes mencionados, así como otros factores que son bien conocidos en la técnica.
En términos generales, por "efecto terapéutico” se quiere dar a entender un nivel de expresión de uno o más HNAs suficientes para alterar un componente de una enfermedad (o trastorno) hacia un resultado o criterio de valoración clínico deseado, de modo que una enfermedad o trastorno del paciente muestra una mejora clínica, a menudo reflejada por la mejoría de un signo o síntoma clínico relacionado con la enfermedad o trastorno. Utilizando la hemofilia como un ejemplo de enfermedad específica, un "efecto terapéutico" para la hemofilia se define en esta memoria como un aumento en la eficiencia en la coagulación de la sangre de un mamífero afectado con hemofilia, determinándose la eficiencia, por ejemplo, por criterios de valoración o técnicas bien conocidos tal como empleando ensayos para medir el tiempo de coagulación de la sangre entera o el tiempo de protromboplastina activado. Las reducciones en el tiempo de coagulación de la sangre entera o el tiempo de protromboplastina activado son indicios de una eficiencia incrementada en la coagulación de la sangre. En casos graves de hemofilia, los hemofílicos que tienen menos de 1% de los niveles normales de Factor VIII o Factor IX tienen un tiempo de coagulación de la sangre entera de más de 60 minutos, en comparación con aproximadamente 10 minutos para los no hemofílicos. La expresión de 1% o mayor de Factor VIII o Factor IX ha demostrado reducir el tiempo de coagulación de la sangre entera en modelos animales de hemofilia, de modo que al lograr una concentración plasmática de Factor VIII o Factor IX circulante mayor que 1% es probable lograr el efecto terapéutico deseado de un aumento en la eficiencia en la coagulación de la sangre.
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Vector NTI 3D-Mol 8.0 (Invitrogen, Inc.), o Chime (MDL Information Systems, Inc. Estructuras multiméricas de la cápside de AAV-2 se generaron utilizando el programa generador de oligómeros en el sitio web de Virus Particle Explorer (VIPER), utilizando las funciones de transformación de coordenadas de Swiss PDB viewer junto con la matriz de coordenadas en el archivo PBD (ILP3), o se descargaron de la base de datos de la estructura cuaternaria de proteínas en el European Bioinformatics Institute (nombre de archivo = llp3). Se analizaron posibles sitios de unión de anticuerpo en multímeros de la cápside de AAV-2 construyendo la unidad estructural asimétrica de la cápside de AAV-2 y luego ensamblando manualmente una estructura de IgG (anticuerpo monoclonal IgG2a murino; PDB número de identificación 1IGT) a esa estructura o a otras unidades multiméricas de la cápside de AAV-2 utilizando Swiss PDB Viewer. Las distancias, los enfrentamientos de aminoácidos y las zonas de contacto entre la IgG y la cápside de AAV-2 podrían evaluarse utilizando las herramientas adecuadas en el programa Swiss PDB Viewer.
Se aplicaron varios criterios para seleccionar qué amino ácidos de un total de aproximadamente 145 aminoácidos externos, expuestos en la superficie (dentro de cada una de las 60 unidades estructurales asimétricas idénticas, véase la Figura 1) mutaban. Las mutaciones se realizaron sólo en los aminoácidos externos “expuestos en la superficie", aunque es posible que los aminoácidos debajo de la superficie externa o sobre la superficie interna influyan en la unión del anticuerpo. Los aminoácidos que fueron mutados eran aquellos con cadenas laterales previstas como las más accesibles a la unión de anticuerpos. Esto incluía los aminoácidos en los rasgos que sobresalen de la cápside, conocidos como "pico", "cilindro" y "meseta". Estos rasgos que sobresalen son a menudo dianas para la unión de anticuerpos neutralizantes. Los aminoácidos en zonas que no eran lo suficientemente amplias como para alojar a un anticuerpo ("cañón", "surcos", centro del eje de simetría de 3 pliegues, centro del eje de simetría de 5 pliegues) no estaban mutados. Además de ello, la cadena lateral de aminoácido se seleccionó en base a una zona expuesta de al menos 20 Å2, porque disminuciones de 20 Å2 o más en la zona de contacto entre un antígeno y un anticuerpo (de una zona de contacto total de aproximadamente 600 Å2 a 900 Å2) pueden tener un efecto mensurable sobre la afinidad antígeno-anticuerpo y, por lo tanto, sobre el título de neutralización del anticuerpo. Los aminoácidos seleccionados eran aquellos con la cadena lateral (y no sólo la cadena principal peptídica) expuesta. Se supuso que si sólo la cadena principal peptídica estaba expuesta, entonces un anticuerpo que se unía a un aminoácido de este tipo podía no ser capaz de discriminar bien entre diversos aminoácidos, puesto que todos los aminoácidos tienen la misma la cadena principal peptídica. Finalmente, zonas relativamente planas de antígenos proteicos interactúan a menudo con zonas relativamente planas de anticuerpos, de manera que los aminoácidos seleccionados para la mutación se encontraban en una zona relativamente plana (lado del pico, parte superior del cilindro, parte superior de la meseta). La aplicación de todos los criterios anteriores a los aproximadamente 145 aminoácidos de la cápside situados en la superficie externa de AAV-2 resultó en la selección de 72 posiciones que serían más propensas a afectar a la unión de anticuerpos neutralizantes cuando se cambiaba a otros aminoácidos. La ubicación de estos aminoácidos se indica en la Figura 2 y se lista en las Tablas 1, 4 y 5.
La mayoría de los 127 mutantes (en las 72 posiciones) que se hicieron cambiaron los aminoácidos individuales a alanina, utilizando técnicas conocidas por los expertos en la técnica de la biología molecular. Se eligió la alanina, porque se ha determinado que, de todas las mutaciones que se podrían hacer, la alanina es la menos perjudicial para la estructura de la proteína. También, dado que alanina solamente tiene una cadena lateral de metilo, el cambio de la mayoría de los otros aminoácidos a alanina es probable que interrumpa la unión del anticuerpo. Es decir, en comparación con otros aminoácidos, alanina es menos inmunogénica porque carece de una cadena lateral que contribuye de manera significativa a las zonas de contacto antígeno/anticuerpo y, por lo tanto, a la afinidad de antígeno/anticuerpo. Obsérvese que la numeración que sigue se basa en la secuencia de VP2 de AAV-2 tal como se representa en la Figura 9. Unas pocas posiciones se cambiaron a un aminoácido distinto de alanina. Por ejemplo, en la posición 356 en donde ya hay una alanina, se insertó una arginina. La arginina es lo suficientemente polar como para permanecer en la superficie del AAV y lo suficientemente grande que podría interferir con la unión de los anticuerpos. Existen cinco glicinas que puedan ser accesibles a los anticuerpos. Glicinas se encuentran a menudo cuando gira una cadena peptídica y, por lo tanto, puede ser un componente crítico de la estructura. La mutación de glicinas puede ser problemática debido a la posibilidad de que la estructura pueda ser drásticamente alterada. Por lo tanto, cada una de las cinco glicinas en la superficie de AAV-2 fue considerada sobre una base de caso por caso para decidir qué cambiar en ellas. G128 fue cambiada a aspartato, porque glicina 128 se encuentra en AAV-1 a 6, a excepción de AAV-5, en donde la posición 128 es un ácido aspártico. G191 fue cambiada a serina porque glicina 191 se encuentra en AAV-1 a 6, a excepción de AAV-5, en donde la posición 191 es una serina. G329 fue cambiada a arginina, porque glicina 329 se encuentra en AAV-1 a 6, a excepción de AAV-4, en donde la posición 329 es una arginina. G375 fue cambiada a prolina porque glicina 375 está conservada en AAV-1 a 6 y se pensó que la prolina podría preservar un giro en la cadena del péptido encontrado en esa posición. G449 fue cambiada a alanina, porque, aunque es serina o asparagina en otros AAVs, está entre R448 y R451 en AAV-2, que son críticos para la unión de heparina y la transducción. Por lo tanto, la posición 449 se mutó a un aminoácido más cercano en tamaño a glicina (es decir, alanina). En algunos casos se aislaron mutantes dobles (S130A/N131A, N360H/S361A, S361A/N358K, S361A/S494P, S361A/R592K) además del mutante deseado. Estos fueron presumiblemente un resultado de errores en la polimerasa introducidos durante la mutagénesis, pero se ensayaron como los otros mutantes.
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respectivamente. A continuación, el ADN se amplificó mediante incubación a 95ºC durante 15 s, a continuación a 60ºC durante 60 segundos durante 40 ciclos.
Se construyó una curva patrón utilizando diluciones de 4 veces de pVm lac Z linearizado que oscila entre un número de copias de 61 a 1.000.000. El número de copias de genomas de rAAV-lacZ empaquetados en cada una de las muestras se calculó a partir de los valores de Ct obtenidos de la Q-PCR utilizando el software versión 1.0 Sequence Detection System de Applied Biosystems Prism 7000.
C. Ensayo de unión a Heparina
La unión a heparina de los virus en lisados brutos se realizó como sigue. Veinte microlitros de lisado celular bruto que contenía viriones de AAV-2 con cápsides de tipo salvaje o mutantes se mezclaron con 25 µl de una suspensión al 50% de perlas de heparina. Las perlas de heparina (Ceramic Hyper-DM Hydrogel-Heparin, Biosepra, Cergy-Saint-Christophe, Francia) eran de 80 µm de diámetro y tenían poros de 1000 Å para permitir que el AAV (que es de ~300 Å de diámetro) acceda a la heparina. Las perlas se lavaron a fondo en disolución salina tamponada con fosfato antes de su uso. Las perlas y los viriones se incubaron a 37ºC durante 60 minutos. Las perlas se sedimentaron. Se guardó el sobrenadante que contenía viriones no ligados. Las perlas se lavaron 2 veces con 500 µl de PBS. Los sobrenadantes se reunieron y las proteínas de la cápside no ligadas se precipitaron con ácido tricloroacético a una concentración final de 10%. Las proteínas precipitadas se desnaturalizaron mediante incubación en Tris 20 mM, pH 6,8, SDS al 0,1% a 80ºC durante 5 minutos. Los viriones ligados a perlas de heparina fueron liberados mediante incubación de las perlas en Tris 20 mM, pH 6,8, SDS al 0,1% a 80ºC durante 5 minutos. Todas las muestras de proteínas preparadas de esta manera se fraccionaron por el peso molecular mediante SDS-PAGE utilizando geles de poliacrilamida al 10% (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) y luego se detectaron mediante transferencia Western de la siguiente manera. Las proteínas se transfirieron electroforéticamente a membranas de nilón (Hybond-P, Amersham Biosciences, Piscataway, N.J.). Las membranas eran sondas con un anticuerpo anti-AAV (clon monoclonal B1, Maine Biotechnology Services, Inc. Portland, ME) a una dilución de 1:20 y luego con un anticuerpo anti-ratón de oveja acoplado a peroxidasa de rábano picante (Amersham Biosciences, Piscataway, N.J.) a una dilución de 1:12000. Las proteínas de unión a anticuerpos B1 se detectaron utilizando el sistema de detección de transferencia Western ECL Plus (Amersham Biosciences, Piscataway, N.J.). Las membranas se expusieron a una película de rayos X Biomax MS, Kodak, Rochester, NY) durante 1-5 minutos y las señales se cuantificaron utilizando un aparato AlphaImager 3300 (Alpha Innotech Corp., San Leandro, CA).
D. Ensayo de transducción in vitro.
Células HeLa (American Type Culture Collection, nº de catálogo CCL-2) se sembraron en placas de 24 pocillos a razón de 5e4 células por pocillo. Las células se cultivaron durante 24 h en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Gibco) suplementado con suero bovino fetal al 10% (Gibco) y penicilina-estreptomicina (Gibco) a 37ºC. Diluciones décuplos de lisados brutos que contienen los virus control de tipo salvaje y mutantes se hicieron en DME/FBS al 10%. Las diluciones de virus se añadieron a las células junto con el adenovirus-5 de tipo salvaje (American Type Culture Collection, nº de catálogo VR-5). La cantidad de adenovirus utilizado era 0,1 µl por pocillo, que se tituló previamente y demostró estimular al máximo transducciones rAAV-2 lac Z de células HeLa. Después de 24 horas a 37ºC, las células se fijaron utilizando formaldehído al 2% y glutaraldehído al 0,2% y se tiñeron para la actividad de β-galactosidasa utilizando 1 mg/ml (2,5 mM) de 5-bromo-4-cloro-3-indolil β-D-galactopiranósido en PBS, MgCl2 2 mM, ferricianuro de potasio 5 mM, ferrocianuro de potasio 5 mM, pH 7,2. Después de otras 24 horas, se contó el número de células azules en cuatro campos microscópicos al azar y se calculó la media para cada uno de los pocillos. En lugar de utilizar células HeLa y adenovirus-5, también se podrían utilizar células HepG2 y etopósido 20 µM, y se obtuvieron resultados similares.
E. Ensayos de neutralización de anticuerpos y suero.
Células Hep G2 (American Type Culture Collection, nº de catálogo HB-8065) se sembraron en placas de 24 pocillos a razón de 1,5e5 células por pocillo. Las células se cultivaron durante 24 h en medio mínimo esencial (de Eagle) (KMEM) (ATCC) suplementado con suero bovino fetal al 10% y penicilina-estreptomicina a 37ºC. Diluciones dobles del anticuerpo A20 (Maine Biotechnology, Portland, ME) se hicieron utilizando PBS. Virus de tipo salvaje y mutante se diluyó mezclado 1 microlitro de lisado bruto de la preparación viral con 15 microlitros de KMEM/Albúmina de Suero Bovino (BSA) al 0,1%. Muestras de KMEM/BSA al 0,1% y PBS se incluyeron como controles negativos. Un total de 16 µL de la dilución de A20 se mezcló con 16 µL de virus y se incubó a 37ºC durante una hora. Diez microlitros de la mezcla de virus/A20 se añadieron a cada uno de tres pocillos de células. Después de una hora de incubación a 37ºC, se añadió etopósido (disolución patrón 20 mM en dimetilsulfóxido, Calbiochem) se añadió a cada uno de los pocillos a una concentración final de 20 µM. Después de 24 horas, las células se fijaron utilizando formaldehído al 2% y glutaraldehído al 0,2% y se tiñeron para la actividad de β-galactosidasa utilizando 1 mg/ml (2,5 mM) de 5-bromo-4-cloro-3-indolil β-D-galactopiranósido en PBS, MgCl2 2 mM, ferricianuro de potasio 5 mM, ferrocianuro de potasio 5 mM, pH 7,2. Después de otras 24 horas, se contó el número de células azules en cuatro campos microscópicos al azar y se calculó la media para cada uno de los pocillos. El título de neutralización de un
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anticuerpo se define como la dilución de anticuerpo a la cual hay una reducción del 50% en el número de eventos de transducción virales (es decir, células azules) en comparación con la transducción en ausencia de anticuerpo.
La neutralización de mutantes por sueros humanos recogidos de hemofílicos o a IgG humana purificada de > 10.000 donantes (Panglobulina, ZLB Bioplasma AG, Berna, Suiza) se ensayó de la misma manera. Para IgG humana purificada, se consideró que una concentración de 10 mg/ml era equivalente a sueros sin diluir, ya que la concentración normal de IgG en sueros humanos varía de 5-13 mg/ml.
F. ELISAs
(a)
ELISA de A20:
Se utilizó un kit de ELISA (American Research Products, Belmont, MA) que utiliza un anticuerpo monoclonal (A20) para capturar y detectar AAV-2 para cuantificar el número de partículas. El kit se utilizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La densidad óptica se midió en un lector de placas Spectramax 340PC (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) a una longitud de onda de 450 nm. Se calculó la concentración de virus necesaria para resultar en una lectura de la densidad óptica máxima media y se utilizó para comparar los resultados de diferentes muestras.
(b)
ELISA de IgG/A20:
Placas de microtitulación (96 pocillos, EIA/RIA de fondo plano, poliestireno de alta unión, Costar, Corning, NY) se recubrieron con 100 µl (10 µg) de Panglobulina en tampón bicarbonato de sodio 0,1 M, pH 9,2 durante 16 horas a 20ºC. Las placas se bloquearon con 200 µl de PBS, BSA al 1%, Tween-20 al 0,05% durante 1 hora a 20ºC. Se añadieron cantidades crecientes de AAV-2 nativo o mutante purificado con gradiente de CsCl que oscilan entre 3,08 y 1,010 genomas de vector por pocillo y se incubaron durante 16 horas a 20ºC. El virus no ligado se separó por lavado utilizando partes alícuotas de 3-200 µl de PBS, tampón Tween-20 al 0,1%. A20-biotina del kit de ELISA de AAV-2 se diluyó en la relación 1:50, se añadieron 100 µl por pocillo y se incubó durante 1 hora a 37ºC. A20-biotina no ligada se separó por lavado utilizando partes alícuotas de 3-200 µl de PBS, tampón Tween-20 al 0,1%. Después estreptavidina acoplada a peroxidasa de rábano picante se diluyó en la relación 1:20 y se incubó durante 1 hora a 37ºC. Estreptavidina-HRP no ligada se separó por lavado utilizando partes alícuotas de 3-200 µl de PBS, tampón Tween-20 al 0,1%. Se añadieron sustratos de peroxidasa de rábano picante (kit de sustrato Immunopure TMB Pierce, Rockford, IL) y se incubaron durante 15 min a 20ºC. La reacción se detuvo con 100 µl de ácido sulfúrico 2M y la densidad óptica se midió en un lector de placas Spectramax 340PC (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) a una longitud de onda de 450 nm. Se calculó la concentración de virus necesaria para resultar en una lectura de la densidad óptica máxima media y se utilizó para comparar los resultados de diferentes muestras.
(c)
ELISA de IgG:
Placas de microtitulación (96 pocillos, EIA/RIA de fondo plano, poliestireno de alta unión, Costar, Corning, NY) se recubrieron con cantidades crecientes de AAV-2 nativo o mutante purificado con gradiente de CsCl que oscilan entre 3,08 y 1,010 genomas de vector por pocillo durante 16 horas a 20ºC. en tampón bicarbonato de sodio 0,1 M, pH 9,2 durante 16 horas a 20ºC. Las placas se bloquearon con 200 µl de PBS, BSA al 1%, Tween-20 al 0,05% durante 1 hora a 20ºC. El virus no ligado se separó por lavado utilizando partes alícuotas de 3-200 µl de PBS, tampón Tween20 al 0,1%. Se añadió Panglobulina y se incubó durante 1 hora a 37ºC. La Panglobulina no ligada se separó por lavado utilizando partes alícuotas de 3-200 µl de PBS, tampón Tween-20 al 0,1%. Después se añadió IgG antihumana de burro, acoplada a peroxidasa de rábano picante (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) y se incubó durante 1 hora a 37ºC. El anticuerpo secundario no ligado se separó por lavado utilizando partes alícuotas de 3-200 µl de PBS, tampón Tween-20 al 0,1%. Se añadieron sustratos de peroxidasa de rábano picante (kit de sustrato Immunopure TMB Pierce, Rockford, IL) y se incubaron durante 15 min a 20ºC. La reacción se detuvo con 100 µl de ácido sulfúrico 2M y la densidad óptica se midió en un lector de placas Spectramax 340PC (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) a una longitud de onda de 450 nm. Se calculó la concentración de virus necesaria para resultar en una lectura de la densidad óptica máxima media y se utilizó para comparar los resultados de diferentes muestras.
El empaquetamiento del ADN, la unión a heparina y las propiedades de transducción de mutantes aquí descritos se resumen en la Tabla 1. Las propiedades de neutralización de anticuerpos de algunos de los mutantes descritos aquí se resumen en las Tablas 2 y 3.
Tabla 1. Propiedades mutantes de la cápside de AAV-2.
Mutante1 Síntesis de la cápside2 Empaquetamiento de ADN3 Unión a heparina4 Transducción5
tipo salvaje 100 100 >95 100
Q126A 65 67 >95 55
Q126A/S127L 78 4 >95 0,02
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Mutante1 Síntesis de la cápside2 Empaquetamiento de ADN3 Unión a heparina4 Transducción5 E394A 29 108 >95 22 K395A 34 2046 >95 14 F396A 178 nt >95 148 K407A 220 112 >95 32 E411A 90 513 >95 20 T413A 233 34 >95 252 E418A 264 74 >95 37 K419A 81 806 >95 160 E437A 239 94 >95 24 Q438A 28 101 >95 92 G449A 104 106 >95 196 N450A 217 144 >95 207 Q452A 313 533 >95 473 N568A 439 412 >95 536 K569A 831 333 >95 20 V571A 98 251 >95 142
1 Los mutantes se denominan de la siguiente manera: La primera letra es el aminoácido en la cápside de AAV-2 de tipo salvaje, el número es la posición en la cápside que fue mutada (numerada de acuerdo con la secuencia de VP2 de AAV-2) y la última letra es el aminoácido mutante. Δ128ins1 tiene el aminoácido 128 suprimido y la secuencia
5 DASNDNLSSQSD insertada en su lugar.
2 Según se determina mediante transferencia Western de lisados brutos. Expresado como porcentaje de la síntesis de la cápside de tipo salvaje.
3 ADN específico para el vector, resistente a ADNasa, cuantificado mediante Q-PCR y expresado como un porcentaje de tipo salvaje, que se normalizó a 100%. Media de 2 experimentos, cada uno realizado por triplicado. nt,
10 no sometido a ensayo.
3 Unión a heparina, expresada como un porcentaje de tipo salvaje. Determinaciones individuales, excepto para el tipo salvaje, que está en una media de tres determinaciones, normalizado a 100%.
4 Transducción en células 293 humanas, expresada como un porcentaje del tipo salvaje. Media de 2 experimentos.
Tabla 2. Propiedades de neutralización de anticuerpos de mutantes de la cápside de AAV-2.
Transducción células azules células azules Múltiplo resistente Mutante de suero1 (% de wt) (-suero) (+ suero) % Neut. a neutralización HA2 tipo salvaje 100 13275 3 99,98 1,0 R334A 114 15102 146 99,04 42,7 N450A 89 11802 14 99,88 5,2 Tipo salvaje 100 25960 8 99,97 1,0 E394A 6 1593 6 99,64 11,2 T413A 21 5505 15 99,73 8,5 N360H/S361A 41 10691 7 99,94 2,0 HA151 tipo salvaje 100 11965 16 99,87 1,0 R334A 185 22125 459 97,93 15,8 E394A 16 1947 14 99,27 5,6 V571A 73 8732 39 99,56 3,4 G449A 218 26137 121 99,54 3,5
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Transducción
células azules células azules Múltiplo resistente
Mutante de suero1
(% de wt) (-suero) (+ suero) % Neut. a neutralización
N568A
122 14632 36 99,75 1,9
N450A
95 11387 53 99,54 3,5
tipo salvaje
100 15989 13 99,92 1,0
E411A
18 2876 13 99,54 5,7
N360H/S361A
100 15989 21 99,87 1,6
HA165 tipo salvaje
100 22833 14 99,94 1,0
N360A
16 3717 9 99,75 4,0
R334A
74 16872 162 99,04 15,3
E394A
11 2566 2 99,91 1,4
N568A
102 23246 30 99,87 2,1
N450A
64 14514 26 99,82 2,9
N360H/S361A
49 9558 8 99,92 1,3
1 Los mutantes se rastrearon rápidamente comparando el número de células transducidas que resultan de la infección de células HepG2 por parte de rAAV-2 lac Z con cápsides mutantes o de tipo salvaje en presencia o ausencia de un anticuerpo monoclonal (A20) a una dilución de 1:80 o suero policlonal humano a una dilución de
1:100.
Tabla 3. Propiedades de la titulación de anticuerpos de 4 anticuerpos frente a mutantes de la cápside de AAV-2.
Múltiplo de disminución en título neutralizante1
Anticuerpo2: A20 151 165 HA2 Mutante 3 tipo salvaje 1,0 1,0 1,0 1,0 Q126A 2,5 NR NR NR S127A 57,0 NR NR NR S247A 2,8 NR NR NR Q248A 5,7 NR NR NR R334A NR 3,6 2,4 2,0 N360H/S361A NR 2,2 1,2 1,3 E394A NR 2,1 1,2 1,9 N450A NR 1,7 1,6 1,3
Resistencia multiplicativa predicha: 241529 6 11
1Los títulos se determinaron utilizando diluciones dobles de anticuerpo monoclonal y ajustando los datos a una curva logística de cuatro parámetros utilizando el software Sigma Plot graphing.
Los valores indicados en la tabla son el múltiplo de disminución en el título de los mutantes en relación con la cápside de tipo salvaje. NR, no resistente a la neutralización por el anticuerpo indicado.
2 A20 es un anticuerpo monoclonal de ratón anti-AAV-2 purificado con proteína A. Sueros 151, 165 y HA2 son 3 sueros humanos no purificados.
3 Los mutantes se denominan como sigue: La primera letra es el aminoácido en la cápside de AAV-2 de tipo salvaje, el número es la posición en la cápside que fue mutado (numeradas de acuerdo con la secuencia de VP2 de AAV-2), y la última letra es el aminoácido mutante. Δ128ins1 tiene el aminoácidos 128 suprimido y la secuencia DASNDNLSSQSD (SEQ ID NO: 11) insertada en su lugar.
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Mutante Múltiplo de disminución en título neutralizante1 Múltiplo de disminución en título A20
D357E 1,7
D357N 1,8
N360H/S361A 2,1 *
W365A 10,4 * 0,5
H372K 1,1
G375P 1,9
D377A 1,9
K390A 2,3 *
E394A 1,5
E394K 2,3 * 0,9
K395A 4,9 * 0,9
F396A 1,6
K407A 3,3* 1,6
E411A 2,7*
T413K 2,6*
E418A 1,5
E437A 2,0* 0,8*
Q438A 1,3
R448K 1,0
G449A 2,5 *
N450A 1,6
Q452A 1,3
N568A 2,0 *
K569A 4,0 * 1,7
V571A 3,9 * 1,4
V571K 1,0 217*
R334A/ G449A 3,9 *
R334A/ N568A 2,4 *
G449A/ N568A 1,7
N568A/ V571A 2,5 *
R334A/ G449A/N568A 3,0 *
E411A/ T413A/G449A/
N450A 1,0
E411A/ T413A/ G449A/
N450A/N568A/V571A 1,3
1* = estadísticamente significativo, p <0,05. Los títulos se determinaron haciendo diluciones dobles de IgG. Los datos se representaron utilizando el software Sigma Plot y el recíproco de la dilución a la que se producía el 50% de la neutralización se define como el título.
5 Como se muestra en la tabla, 21 mutantes (S127A, G128A, D132N, R334A, T354A, N360H/S361A, W365A, K390A,
E394K, K395A, K407A, T413K, E437A, G449A, N568A, K569A, V571A, R334A/G449A, R334A/N568A,
N568A/V571A, R334A/G449A/N568A) eran 2-10 veces más resistentes a la neutralización por un gran grupo de IgG
humana en comparación con la cápside de AAV-2 nativo. Como era de esperar, algunos de los mutantes que eran
resistentes a la neutralización por IgG humana agrupada también eran resistentes a la neutralización por sueros 10 humanos individuales (p. ej., R334A, N360H/S361A, G449A, N568A, V571A). Sin estar ligados por una teoría
particular, los epítopos que contienen esos aminoácidos pueden unir anticuerpos con alta afinidad o a alta
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Los productos de PCR se purificaron en geles de agarosa al 1% de bajo punto de fusión (FMC Bioproducts, Rockland, ME), y las secuencias se determinaron utilizando cebadores diseñados a partir de secuencias de AAV-5.
Los datos de la secuencia se analizaron con el paquete de software NTI vector suite (InforMax, Frederick, MD).
Preparaciones de virus de diferentes cultivos de células y pasajes fueron procesados de forma individual para la extracción de ADN y el análisis por PCR. La amplificación por PCR utilizando cebadores directo 1 e inverso 2 revelaron la presencia de secuencias de tipo parvovirus en las cuatro preparaciones. El análisis de las secuencias reveló la presencia de secuencias de AAV. El ORF de VP1 de AAV caprino, que corresponde a los nucleótidos 2.207 a 4.381 del genoma de AAV-5, tiene un 93% de identidad de nucleótidos (2.104/2.266, Huecos 6/2.266) con AAV-5 de primates (véanse las Figuras 12A-12B) aislados de seres humanos (J. Virol 1999; 73:1309-1319). La comparación de proteínas mostró un 94% de identidad (682/726) y un 96% de similitud (698/726) entre las proteínas VP1 de AAV-5 de primates y AAV caprino (véase, la Figura 13). La mayoría, si no todas las mutaciones, parecían estar en la superficie (véase la Figura 15). La Figura 16 muestra la ubicación predicha de los aminoácidos de superficie que difieren entre AAV-5 y AAV caprino, basado en la estructura de la superficie de la cápside de AAV-2. Los 3 triángulos en negro representan inserciones en AAV caprino, en relación con AAV-2, que es probable que se encuentren en la superficie.
Sin estar ligado por una teoría particular, las mutaciones en superficie probablemente fueron impulsadas por presión selectiva debido al sistema inmune humoral y/o adaptación a receptores de rumiantes. La falta de cambios en zonas expuestas no superficiales puede implicar una falta de presión de la respuesta inmune celular. Estas regiones mutadas en el virus caprino pueden mejorar la resistencia a anticuerpos anti-AAV-5 humanos preexistentes.
La secuencia de AAV caprino se comparó con otros serotipos de AAV y estos serotipos se compararon entre sí con el fin de analizar las diferencias en la región no conservada. En particular, las Figuras 14A-14H muestran una comparación de la secuencia de aminoácidos de VP 1 de AAV-1, AAV-2, AAV-3B, AAV-4, AAV-6, AAV-8, AAV-5 de primates y AAV caprino. Los aminoácidos conservados en las secuencias se indican mediante * y se muestra la accesibilidad de las diversas posiciones de aminoácidos en base a la estructura cristalina. B indica que el aminoácido está enterrado entre la superficie interior y exterior. I indica que el aminoácido se encuentra en la superficie interior y O indica que el aminoácido se encuentra en la superficie exterior.
La región no conservada entre AAV-5 y AAV caprino incluye 43 mutaciones. 17 de estas 43 son mutaciones no conservada entre AAV-2 y AAV-8. Sólo una de estas mutaciones se originó en el mismo aminoácido en el AAV caprino y AAV-8. La región no conservada entre AAV-5 y AAV caprino incluye 348 aminoácidos. Esta región no conservada se comprime a 157 aminoácidos cuando se analiza la región que contiene las 17 mutaciones conjuntas.
Las Tablas 8-11 muestran los resultados de las comparaciones.
Tabla 8
Mutaciones en los residuos en superficie (O) de AAV-2 frente a AAV-8 y AAV-5 frente a AAV Caprino
Región
Mutaciones de AAV-2 frente a AAV-8 (x)/residuos en superficie (O) Mutaciones de AAV-5 frente a AAV Caprino (*)/residuos en superficie (O)
100200
04/19 (+2 inserciones) 00/19
200300
01/20 01/20
300400
16/31 03/30
400500
20/46 (+1 inserción) 11/43 (+1 inserción)
500600
13/27 04/30
700750
05/24 01/24
100750
59/167 (35%) 20/167 (12%)
imagen28
65% de identidad 88% de identidad
40
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  1. imagen1
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