KR20230047420A - 보체-매개 장애의 치료 - Google Patents

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피터 라흐만
이언 알렉산더
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캠브리지 엔터프라이즈 리미티드
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Abstract

유전자 요법을 사용하는 보체-매개 장애, 특히 보체 C3b 피드백 사이클의 과다-활성과 연관이 있는 장애(예를 들어 연령-관련 황반 변성(AMD; age-related macular degeneration))의 치료 방법이 기재되어 있다. 이러한 방법에 따르면, 보체 인자 I의 수준은 치료적 유효량의 인코딩된 인자 I이 피험자에서 벡터로부터 발현되도록 인자 I을 인코딩하는 재조합 바이러스 벡터의 투여에 의해 상승된다. 인자 I을 인코딩하는 재조합 바이러스 벡터, 이러한 벡터를 캡시드화하는 재조합 바이러스 입자, 및 치료 방법에 있어서 이들의 용도가 또한, 기재되어 있다.

Description

보체-매개 장애의 치료{Treatment of complement-mediated disorders}
본 발명은 보체 인자 I(또는 이의 단편 또는 유도체)의 수준을 상승시키기 위해 유전자 요법을 사용하여 보체-매개 장애, 특히 보체 C3b 피드백 사이클의 과다-활성(over-activity)과 연관이 있는 장애(예를 들어 연령-관련 황반 변성(AMD; age-related macular degeneration))를 치료하는 방법, 이러한 인자 I을 인코딩하는 재조합 바이러스 벡터(또는 이의 단편 또는 유도체), 이러한 벡터를 캡시드화하는(encapsidating) 재조합 바이러스 입자, 및 이러한 치료 방법에서의 이들의 용도에 관한 것이다.
보체계는 면역계에 임박한 위험을 알리기 위해 염증 반응을 촉발함으로써 감염에 대한 제1선 방법을 형성한다. 이는, 미생물 및 감염되거나 손상된 세포를 태깅(tagging)하여 용해 또는 식세포 청소(phagocytic clearance)에 의한 이들의 살해를 촉진하는 데 필수적인 역할을 가진다. 보체계는 3개의 상이한 메커니즘들인 전형적인 경로, 렉틴 경로 및 대안적인 경로에 의해 활성화될 수 있다(도 1 참조). 모든 3개의 경로들은 풍부한 혈장 단백질 C3의 절단에서 수렴되며, 이는 말단 보체 단계뿐만 아니라 다른 보체 효과기 메커니즘의 활성화를 가능하게 한다.
오늘날 일반적으로, 대안적인 경로가, 양성 피드백 증폭을 초래하는 다른 2개의 보체 경로들 중 하나에 의해 활성화되거나, 또는 C3 내에서 내부 티오에스테르 결합의 자발적인 가수분해의 결과인 iC3(또는 C3(H20)) 또는 혈청에서 매우 저농도로 꾸준히 발생되는 C3b에 의해 활성화된다는 것이 받아들여져 있다. 이러한 "틱오버(tickover)"는 인자 B에 의해 결합될 수 있는 활성화된 C3을 필요한 최소량으로 제공하며, 이는 인자 D에 의해 추가로 절단되어 초기 C3 컨버타제 복합체, iC3Bb를 형성하며, 이는 본래의(native) C3을 C3b로 전환시킬 수 있다. C3b는 세린 프로테아제 전구체 인자 B를 C3b에 결합시킬 수 있는 구조적 재배열을 받는다. 그런 다음, 인자 D가 복합체에 결합하고, 인자 B를 Bb 및 Ba로 절단할 수 있다. C3bBb는 대안적인 경로 C3 컨버타제이다. 인자 D는, 인자 B가 C3b 또는 iC3에 결합되지 않는 한 혈청 내에서 인자 B를 절단하지 않는다. 새로 발생된 C3b는 병원체의 표면(또는 임의의 다른 가까운 표면)에 공유 결합할 수 있으며, 여기서 이는 인자 B의 또 다른 분자에 결합될 수 있다. 이러한 결합은, 인자 H의 기능적 활성을 길항작용시킴으로써 대안적인 경로 C3 컨버타제의 반감기를 증가시키는 프로퍼딘(Properdin)에 의해 안정화된다.
대안적인 경로는 C3b 상에서 작용하는 2개의 경쟁적인 사이클들 사이의 균형에 의해 지배된다. 이들은 C3b 피드백 사이클 및 C3b 절단 사이클이고, 보체 활성화의 중심에 놓여 있다(도 2 참조). 일단 iC3 또는 C3b가 형성되고 표면 상에 침착되면(deposited), C3b가 제1 장소에서 어떻게 발생되었는지와는 상관없이 2개의 상이한 반응들이 발생할 수 있으며: 이는 인자 B(피드백) 또는 인자 H(또는 막 결합된 FI 공동 인자 CD46 또는 CD35)(절단)에 의해 결합될 수 있다.
C3b(또는 C3(H20))의 결합은 C3 컨버타제의 증폭(인자 B, 인자 D 및 프로퍼딘의 존재 하에) 및 막 공격 복합체(MAC)의 어셈블리의 개시, 또는 C3b의 불활성화(인자 H 및 인자 I의 존재 하에)를 초래한다. 증폭 또는 불활성화가 발생하는지의 여부는 전적으로, C3b가 부착되는 표면의 성질에만 의존한다. 소위 "보호된 표면" 상에서, 인자 H 결합(및 따라서 또한 C3b의 인자 I 절단)이 손상된다. 예를 들어, 에스케리키아 콜라이 O4의 지질다당류(LPS) 상에서 C3b에 대한 인자 H 결합은 인자 B의 결합보다 훨씬 더 약하다.
보체 활성화 동안 C3의 절단은 도 3에 도시되어 있다. C3(185 kDa)는 2개의 사슬들인 α 사슬 및 β 사슬로 구성되며, 한편 C3b에서 N-말단 펩타이드, C3a(9 kDa)가 C3 컨버타제에 의해 절단된다. C3b의 절단은 C3b의 α'-사슬에서 2개의 인자 I-매개 절단에 의해 달성된다. C3f(3 kDa)로 지칭되는 작은 단편이 방출되어, α'-사슬을 68 kDa 단편 및 43 kDa 단편으로 나눈다. 이러한 단백분해된 C3는 이제 iC3b로 지칭되고, 이는 더 이상 C3 또는 C5 컨버타제에 참여할 수 없다. 그러나, 이러한 iC3b는 중성구 상의 보체 수용체 CR3(CD11b, CD18)와의 반응성으로 인해 보체-유도 염증의 중요한 매개자이다. iC3b로의 이러한 최초의 절단은 꽤 신속하게 발생하고, 인자 H를 공동인자로서 사용하며, 한편 iC3b의 제2 절단은 훨씬 더 느리다. 공동인자 보체 수용체 1(CR1)의 존재 하에서만, iC3b는 인자 I에 의해 더 절단될 수 있다. 인자 I는 68 kDa 단편에서 iC3b를 다시 절단하고, 이는 C3c로 지칭되는 분자의 큰 부분을 방출한다. C3dg는 공유 결합(당에 대해 에스테르 결합, 또는 단백질에 대해 아미드 결합)에 의해 표면에 결합된 채로 남아 있다. C3dg는 CR3와 반응하지 않으며, 염증 매개자가 아니다.
보체 단백질의 기능에 영향을 미치는 이러한 단백질에서의 유전적 변이는 감염 질환에 대한 내성 및 다양한 염증 질병들에 대한 민감성(susceptibility)과 연관이 있다. 가장 잘 기재된 다형성은 연령-관련 황반 변성(AMD), 고밀도 침착병(DDD; dense deposit disease) 및 비정형 용혈성 요독 증후군(aHUS; atypical haemolytic uremic syndrome)과 연관이 있다.
AMD는 대안적인 경로에서 다형성에 의해 영향을 받는 가장 흔한 질병이다. AMD는 인자 H 및 FH-관련 단백질: fHY402H SNP를 포함하는 FH 하플로타입(haplotype) 1(문헌[Haines, et al., Science, 308(5720):419-421, April 2005; Edwards, et al., Science, 308(5720):421-424, April 2005; Klein, et al., Science, 308(5720):385-389, April 2005]); fHv621 SNP를 포함하는 FH 하플로타입 2(문헌[Hageman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 102(20): 7227-7232, May 2005]); 및 보호성 CFHR1/CFHR3의 결실을 포함하는 FH 하플로타입 3(문헌[Hughes et al , Nat Genet, 38(10):1173-1177, October 2006])에서 몇몇 보편적인 변이체들과 연관이 있다. FH 하플로타입 1의 2개의 복사체들의 유전은 인용된 연구들에 의해 AMD의 위험률을 7배 증가시키는 것으로 나타났다. 다른 AMD-연관된 유전적 변이들은 인자 B 및 C3에 존재한다(C3 R102G(문헌[Heurich, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 108(21):8761-8766, May 2011])). 꽤 최근에, 인자 I 혈청 수준을 낮추는 성향이 있는 희귀 인자 I 돌연변이는, 진행된 AMD에 대한 유의하게 증가된 위험률과 연관이 있다(문헌[Kavanagh, et al., Hum. Mol. Genet, 24(13):3861-3870, July 2015]). 상기 언급된 다형성은 하기 표 1에 열거되어 있다.
Figure pat00001
1Hughes, 등, 상기; 2Zareparsi, et al. Am. J. Hum. Genet, 77(1): 149-153, July 2005; 3Hageman, 등, 상기; 4Gold, et al, Nat. Genet, 38(4):458-462, April 2006; 5Yates, et al., New England Journal of Medicine, 357(6):553-561, August 2007.
고밀도 침착병(dense deposit disease)인 DDD는, DDD 환자에서도 AMD에서와 같이 망막 변화가 발생한다는 점에서 AMD와 임상적으로 연관이 있으나, "AMD-단독" 환자보다 훨씬 더 조기에 발생한다(환자가 살아 남는 경우). 사실상, H1 및 H2 하플로타입에서의 다형성은 또한, AMD(문헌[Pickering, et al, J. Exp. Med., 204(6): 1249-1256, June 2007])에 대해 보고된 바와 같이 DDD에 대한 증가된 위험성 또는 감소된 위험성 각각을 부여할 뿐만 아니라, C3에서 다형성을 부여한다. 몇몇 위험성 하플로타입들의 조합은 DDD 위험성을 급격하게 증가시킨다(문헌[Abrera-Abeleda, et al, J. Am. Soc. Nephrol., 22(8): 1551 -1559, August 2011]). 마우스 연구로부터, DDD의 발병은 전적으로, iC3b를 발생시키는 능력에 따라 다른 것으로 공지되었다(문헌[Rose, et al, J. Clin. Invest., 118(2):608-618, February 2008]). 질병 발병에 있어서 인자 I의 존재가 절대적으로 필요하다. 완전한 인자 I 부족은 염증 매개자 iC3b의 부재로 인해 DDD 및 AMD에 대한 위험성을 없앤다.
AMD 및 DDD는 둘 다 유체상(fluid phase) 대안적인 경로 조절에서의 변화와 연관이 있고, 따라서 눈-특이적 또는 신장-특이적 질병들보다는 전신 질병으로서 나타날 수 있다. 이들 2개의 기관들이 특히 영향을 받는 이유는 아마도, 보체 조절자 단백질의 정확한 분포 및 기관 구조에 있다. 2개의 기관들 모두에서, 적혈구, 혈장, 및 이러한 혈장과 직접 접촉하고 있는 기저막의 분리가 존재하며, 이는 인자 H 공동인자 및 인자 I 활성에 훨씬 더 의존하여 보체 공격으로부터 보호를 형성한다. AMD 및 DDD에 대한 대부분의 다형성 소인은 C3 결합에 책임이 있는 인자 H의 영역에서 확인된다.
비정형 용혈성 요독 증후군(aHUS)이 또한, 대안적인 경로 유전자, 특히 인자 H 유전자에서의 돌연변이와 연관이 있으나(모든 aHUS 경우들의 절반), AMD 및 DDD와는 대조적으로, 이들 돌연변이는 통상적으로, 인자 H를 표면으로 격리시키는 책임이 있는 영역인 인자 H의 C-말단에서 확인되었다(문헌[Manuelian, et al., J. Clin. Invest., 111 (8): 1181-1190, April 2003]). 다른 소인적 다형성들이 C3 또는 CFB 유전자에서 확인되었다(문헌[Goicoechea de Jorge, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 104(1): 240-245. January 2007; Fremeaux-Bacchi, et al., Blood, 112(13):4948-4952, December 2008]). 요약하자면, aHUS의 위험성은 세포 표면 상에서 부적절한 대안적인 경로 활성화를 촉진하는 위험성 다형성의 존재 하에 고도로 증가된다(문헌[Rodriguez de Cordoba, et al., Biochimica at Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease, 1812(1):12-22, January 2011]).
게놈-와이드 연관 연구는 예를 들어 CR1 유전자, 클러스터린(clusterin)(둘 다, 이미 AD 소인적 APOE-ε4 대립유전자의 1개 또는 2개의 복사체를 갖는 개체에서 알츠하이머병(AD)에 대해 추가로 소인적임)(문헌[Harold, et al., Nat Genet, 41 (10):1088-1093, October 2009; Lambert, et al., Nat. Genet, 41 (10): 1094-1099, October 2009]) 및 C5(류마티스 관절염과 연관이 있음)(문헌[Kurreeman, et al., PLoS Med., 4(9):e278, September 2007])에 놓여 있는 추가의 다형성을 식별하였다. 또한, 피드백 사이클을 통한 보체의 증폭 및 이의 효과는 모든 보체 경로들에 고유한 것이고, 따라서 이의 조작은 다른 병리생리학적 과정들을 마찬가지로 개선시키는 잠재력을 가짐을 주지해야 한다.
상기 언급된 대부분의 다형성들은 보편적으로, 질병 대립유전자가, 촉발 자극과는 상관없이 모든 보체 경로들을 증폭시키는 대안적인 경로 피드백 활성의 증가의 소인이 있음을 가진다(문헌[Lachmann, Adv. Immunol., 104:115-149, 2009]). 따라서, 과염증(hyperinflammation) 컴플로타입(complotype)(보체를 수반하는 염증 장애 및 감염 질환 둘 다에 대한 위험성을 변경시키는, 개체에 의해 유전된 보체 유전자에서의 유전적 변이체의 패턴을 나타내는 것으로 정의됨)은 특히 유아기에서 감염으로부터 보호하지만, 개체가 이미 보편적으로 침범하는 병원체에 대해 IgG 항체를 형성한 때인 이후의 삶에서, 이는 염증 질병의 소인을 가지게 된다. 유전자 연구가 공지된 보체 다형성 또는 신규 보체 다형성과 관련이 있음에 따라 컴플로타입에 의해 영향을 받는 질병들의 목록이 꾸준히 성장하기 때문에(문헌[Harris, et al., Trends Immunol., 33(10):513-521 , October 2012]), C3b 피드백 사이클의 이러한 과활성(hyperactivity)을 역전시키기 위한 방법을 발견하는 데 상당한 관심 및 필요성이 존재한다.
발생된 C3b의 양을 확인하는 피드백 루프의 균형은 양 말단에서 팁(tip)될 수 있다. 더 많은 C3b는 피드백 루프의 증폭 또는 C3b 절단 메커니즘의 저해에 의해 발생될 수 있다. 피드백 루프는 C3b 투입의 증가(예를 들어 전형적인/렉틴 경로로부터의 더 많은 C3 컨버타제에 의해), 피드백 반응의 가속화(예를 들어 인자 B의 기능성 돌연변이체의 획득, 또는 인자 D 또는 마그네슘 이온의 증가), 코브라 독 인자의 첨가(C3b-유사 특성을 가지고, 인자 B에 결합하고, 인자 D에 의한 인자 B의 절단 후 C3 컨버타제를 형성할 수 있음), 또는 대안적인 경로 C3 컨버타제의 안정화(예를 들어 프로퍼딘 또는 신장염성 인자에 의해)에 의해 증폭될 수 있다. C3b 절단은 인자 H 및 인자 I 또는 막 공동 인자 단백질(MCP)의 부재 또는 저농도에 의해, 또는 민감한 C3 유전형(예를 들어 C3F, SNP: R102G는 C3S보다 인자 H에 대해 더 낮은 친화성을 가지고, 따라서 인자 I에 의해 더 느리게 절단됨)에 의해 방지될 수 있다. C3 절단은 또한, 보호된 표면 상에서 방해된다. C3b 피드백 사이클의 음성 조절은 C3b 절단의 촉진에 의해 달성된다. 이는, 인자 H 또는 인자 I의 농도를 상승시킴으로써, 또는 인자 D, 인자 B 또는 프로퍼딘의 저해에 의해 수행된다. C3b 피드백 사이클의 하향조절을 위한 특정한 표적은 인자 D, 인자 H 및 인자 I이다.
후기 형태의 AMD인 지도모양 위축(geographic atrophy)의 치료 요법은 이미 개발되었고, 현재 III상 임상 연구(Genentech/Roche에 의한 MAHALO 연구)에 있다. 여기서, 유리체내 주사에 의해 투여되는, 인자 D에 대한 인간화된 모노클로날 저해 항체(람팔리주맙(lampalizumab))는 지도모양 위축의 진행 속도를 중단시키는 데 사용된다. 인자 D는 매우 낮은 혈청 농도로 존재하고, 대안적인 경로에 필수적인 인자이다. 그렇지만, 인자 D는 이의 작은 크기(27 kDa)로 인해, 신장에 의해 급속하게 청소되고, 신속하게 재합성된다. 따라서, 항-인자 D 치료는 전신이 아니라 작은 구획, 예컨대 망막에서 인자 D의 국소 저해를 위해 작용한다. 투여 경로인 유리체내 주사는 연관된 위험이 없이는 수행되지 않으며, 이는 이러한 치료의 또 다른 단점이다.
다른 2개의 표적 단백질들에 관하여, 1970년대부터, C3b 피드백 사이클이 인자 H 및 인자 I의 혈장 농도를 증가시킴으로써 하향조절될 수 있는 것으로 공지되어 왔다(문헌[Nydegger, et al., J Immunol, 120(4): 1404-1408, January 1978; Lachmann and Halbwachs, Clin. Exp. Immunol., 21(1):109-114, July 1975]). 보체 및/또는 대안적인 경로 장애와 다수의 질병들과의 꾸준히 증가하는 연관성에 대한 새로 부상하는 게놈 데이터(예를 들어 Harris 등, 2012(상기); Haines, 등, 2005(상기); Hageman, 등, 2005(상기); 문헌[Kavanagh, et al., Hum. Mol. Genet, 24(13):3861-3870, July 2015])는 비조절된 경로-연관 장애에 대한 요법에서 인자 I 또는 인자 H의 용도를 뒷받침한다. 그렇지만, 인자 I가 몇몇 이유들에서 더 양호한 표적이다. 우선, 인자 I는 인자 H보다 훨씬 더 낮은 농도로 존재한다(각각 대략 35 μg/ml(FI) 및 대략 200 μg/ml 내지 500 μg/ml(FH)). 더 낮은 양은 취급이 더 용이하고, 또한 요법의 비용을 감축시킨다. 나아가, 표면에의 결합에 대해 인자 H와 경쟁하는 인자 H의 변이체, 소위 인자 H-관련 단백질 1-5(FHR1-5)가 존재한다. FHR1, FHR2 및 FHR5는 3개의 호모이량체들 및 3개의 헤테로이량체들의 형성을 가능하게 하는 공유된(shared) 이량체화 모티프를 함유하며, 이들은 생리학적으로 관련 있는 농도에서 친화력(avidity)을 유의하게 증가시켰고 인자 H보다 훨씬 뛰어나다. 인자 H 농도의 증가는 아마도, 이들 경쟁적 길항제들의 지배적인 병원성 효과를 극복하지 못한다. 마지막이고 가장 중요한 이유는, 인자 I가, C3b를 iC3b로 절단하는 것을 촉진할 뿐만 아니라 iC3b의 절단을 가속화하는 유일한 조절자라는 점이다. 생리학적 조건 하에, iC3b에 대한 인자 H의 친화성은 복합체를 형성하기에는 너무 낮다. 보체 수용체 CR3와 반응하는 iC3b가, 보체 활성화가 염증을 유발하는 주요 메커니즘이기 때문에, iC3b를 C3dg로 절단하는 것이 보체-유도 염증을 감소시키는 데 있어서 필수적이다(문헌[Lachmann, Adv. Immunol., 104: 115-149, 2009]).
AMD의 연구는, 특히 마우스에서 망막 황반(macula)의 부재로 인해, 인간 질병을 모사하는 최적의 동물 모델의 결여에 의해 방해를 받는다. 그러나, 본 발명자들은, AMD가 눈-특이적 결함보다는 근본적인 전신 결함을 가지고 있음을 인지하였으며, 이는 보체 단백질 및 조절자에서 AMD-연관된 다형성의 증가하는 목록에 의해 나타나 있다. 본 발명자들은, AMD 요법에 대한 주요점이 전신 대안적인 경로 조절의 조절에 있음을 이해하였다. 대안적인 경로 C3b 피드백 사이클의 하향조절은 인자 I의 혈장 수준을 증가시킴으로써 달성될 수 있다. WO 2010/103291은 혈장-정제된 인자 I 또는 재조합 인자 I의 보충에 의한 AMD의 치료 방법을 기재하고 있다.
iC3b 형성, 및 C3dg로의 iC3b의 후속적인 절단에 미치는 인자 I 보충(대안적인 경로 활성자로서 자이모산(zymosan)의 존재 시)은 3개의 상이한 컴플로타입들에서 측정되어 왔다(문헌[Lay, et al., Clin. Exp. Immunol., 181 (2):314-322, August 2015; Lachmann, etal., Clin. Exp. Immunol., September 2015]). 선택된 컴플로타입들을 AMD와 연관된 3개의 보편적인 다형성인 C3 S/FR102G, fHY402H 및 fHV62I와 관련하여 민감성- 또는 보호성-동형접합성(homozygous) 및 이형접합성(heterozygous)으로 나누었다. 결과는, 민감한 컴플로타입이, 보호된 그룹 및 이형접합 그룹 둘 다보다 iC3b로부터 C3dg로의 전환을 지연시키고 훨씬 더 낮게 하였을 뿐만 아니라, 총 인자 I 농도를 증가시킴으로써 민감한 유전형은 보호된 유전형으로 "전환"될 수 있고, CFH 및 C3에서 불리한 다형성을 극복할 수 있음을 보여준다. 22 μg/ml 인자 I(정상적인 FI 농도보다 낮음)의 보충은 "위험에 있는" 유전형을 보호된 유전형으로 전환시킨다(Lachmann 등, 2015(상기)). 따라서, 단지 3개의 유전자좌들의 존재는, 과염증 컴플로타입이 증가된 인자 I 농도에 의한 하향조절에 더 내성이라는 점에서, 인자 I에 의한 대안적인 경로 보체 활성화의 조절에 놀라운 영향을 미친다. 인자 I의 혈장 농도를 증가시킴으로써, 불리한 컴플로타입의 효과가 역전되고 질병 진행이 둔화될 수 있다.
유전자 요법은 치료 의도를 갖고 환자에게 유전 물질을 전달하는 것이다. 생체내 유전자 요법의 경우, 벡터가 환자 내로 주사되고 표적 세포에 들어가, 이러한 표적 세포에서 벡터에 의해 운반된 이식유전자(transgene)가 후속적으로 발현된다. 초기에, 유전자 요법은 간단하지만 비교적 용이한 접근법을 필요로 하는 단일유전적 결함(monogenetic defect)을 가진 고아병(orphan disease), 예를 들어 중증 복합형 면역부전증(SCID; severe combined immunodeficiency)에 초점을 맞추었다. 초기의 성공은 이러한 분야를 암, 심혈관 질환, 신경퇴행성 장애 및 감염 질환과 같은 후천성 질환까지 확장시켰다. 주목할만한 성공은 B형 혈우병 및 지질단백질 리파제 부족의 치료에서 달성되었다. 그러나, 어?뵉? 유전자 요법 생성물도 수많은 임상 시도에도 불구하고 아직까지는 식품의약국(FDA)에 의해 승인을 받지 못하였다. 유럽에서, 최초의 유전자 요법인 글리베라(Glybera)가 2012년에 유럽 의약청에 의해 승인을 받았다. 글리베라는 희귀 단생 질환(rare monogenetic disease)인 지질단백질 리파제 부족(LPLD)에 대한 치료법이고, 근육내로 주사되는 재조합 바이러스 벡터 내에 포장된 결손 유전자(missing gene)로 구성된다.
현재의 유전자 요법 치료는 기존의 기능성 유전자의 과발현을 달성하기보다는 결함 유전자를 대체하기 위한 유전자 대체에 의존하고 있다. 본 발명자들은 놀랍게도, 인자 I의 혈장 수준이 마우스에서 재조합 바이러스 벡터를 사용하는 유전자 요법에 의해 유의하게 증가될 수 있음을 확인하였다.
본 발명은, 보체 C3b 피드백 사이클의 음성 조절이 혈장 내에서 유전자 요법에 의해 인자 I의 생체내 과발현에 의해 달성될 수 있다는 인지를 기반으로 한다. 대안적인 경로의 피드백 루프의 결과적인 재균형화(re-balancing)는 C3b 및 iC3b 절단을 촉진하고, 따라서 보체-매개 장애, 특히 대안적인 경로 조절에서 기저(underlying) 결함을 갖는 장애에서 주요 질병 인자를 제거할 것이다.
본 발명에 따르면, 보체-매개 장애의 예방, 치료 또는 완화가 필요한 피험자에서 보체-매개 장애의 예방, 치료 또는 완화 방법이 제공되며, 이러한 방법은 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성을 보유하는 인자 I, 또는 이의 단편 또는 유도체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 바이러스 벡터를 피험자에게 투여하여, 치료적 유효량의 인코딩된 인자 I, 또는 이의 단편 또는 유도체가 피험자에서 핵산으로부터 발현되게 함으로써, 피험자에서 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 수준을 증가시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법은 피험자에서 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 수준의 전신 증가에 영향을 미치기 위해 사용될 수 있다.
특정한 실시형태에서, 피험자에서 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 수준은 정상적인 수준을 초과하는 수준까지 증가된다.
따라서 일 실시형태에서, 본 발명은 보체-매개 장애의 예방, 치료 또는 완화가 필요한 피험자에서 보체-매개 장애의 예방, 치료 또는 완화 방법을 제공하며, 이러한 방법은 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성을 보유하는 인자 I, 또는 이의 단편 또는 유도체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 바이러스 벡터를 피험자에게 투여하여, 치료적 유효량의 인코딩된 인자 I, 또는 이의 단편 또는 유도체가 피험자에서 핵산으로부터 발현되게 함으로써, 피험자에서 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 수준을 정상적인 수준을 초과하는 수준까지 증가시키는 단계를 포함한다.
특정한 실시형태에서, 피험자에게 재조합 바이러스 벡터를 캡시드화하는 재조합 바이러스 입자가 투여된다.
또한 본 발명에 따르면, C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성을 보유하는 인자 I, 또는 이의 단편 또는 유도체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 바이러스 벡터가 제공된다.
나아가 본 발명에 따르면, 본 발명의 재조합 바이러스 벡터를 캡시드화하는 바이러스 캡시드를 포함하는 재조합 바이러스 입자가 제공된다.
바이러스 게놈은 대부분의 바이러스들에서 공간적으로 분리되는 유전자 및 cis-작용 조절 서열로 구성된다. 이러한 배열은 바이러스 벡터를 디자인하기 위해 사용된다. 복제에 책임이 있는 바이러스 유전자 또는 캡시드/외피 단백질은 치료적 이식유전자와 교환되고, 그런 다음 양 말단에서 조절성 cis-작용 서열의 측면에 위치한다(문헌[Thomas, et al., Nat. Rev. Genet, 4(5):346-358, May 2003]). 결실된 유전자는 트랜스 작용하고, 게놈 내로 혼입된 바이러스 유전자를 갖는 포장 세포주에 의해, 또는 바이러스 벡터에 의해 공동-형질감염된 이종성 플라스미드에 의해 제공될 수 있다(문헌[Kay et al, Nat. Med., 7(1):33-40, January 2001]). 이러한 방식으로, 이식유전자를 갖는 복제 부족(deficient) 바이러스 입자들은 이들의 표적 세포를 형질도입시킬 수 있도록 생성될 수 있다.
"재조합 바이러스 벡터"는 하나 이상의 이종성 서열, 즉, 바이러스 기원이 아닌 핵산 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오타이드 벡터를 지칭한다. 재조합 바이러스 벡터는 플라스미드, 선형 인공 염색체, 지질과 복합체화된 형태, 리포좀 내에 캡슐화된 형태, 및 바이러스 입자 내에 캡시드화된 형태를 포함하여 많은 형태들 중 임의의 형태로 존재할 수 있다. 재조합 바이러스 벡터는 재조합 바이러스 입자를 발생시키기 위해 바이러스 캡시드 내로 포장될 수 있다. "재조합 바이러스 입자"는 적어도 하나의 바이러스 캡시드 단백질 및 캡시드화된 재조합 바이러스 벡터 게놈으로 구성된 바이러스 입자를 지칭한다.
본 발명에 따라 사용하기에 적합한 재조합 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 헤르페스 심플렉스-1 바이러스(HSV-1; herpes simplex virus-1), 아데노바이러스 및 아데노-연관된 바이러스(AAV) 유래의 재조합 바이러스 벡터를 포함한다(상기 Thomas 등 - 유전자 요법에서 이들 벡터의 상대적인 이점 및 단점의 비교를 위해 이 문헌의 표 1을 참조).
바이러스 벡터는 통합적 벡터 및 비-통합적 벡터로 나뉠 수 있다. 통합적 벡터, 예컨대 레트로바이러스 및 렌티바이러스는 이식유전자를 숙주 세포의 염색체 내로 영구적으로 삽입한다. 비-통합적 벡터, 예컨대 아데노바이러스 및 HSV-기반 벡터는 에피솜으로부터의 이식유전자 발현을 매개한다. AAV-기반 벡터는 영구적으로 비-통합적 벡터이다(<10% 통합됨). 모든 딸세포에 유전될 통합적 벡터와 비교하여, 비-통합적 벡터는 신속하게 분열중인 세포 내에서 급속하게 희석될 뿐만 아니라, 삽입 돌연변이생성의 위험을 제기하지 않는다. 따라서, 레트로바이러스는 통상적으로, 신속한 세포 분열 및 분화를 수행하는 세포(예를 들어 조혈모세포)의 형질감염에 사용되고, 비-통합적 바이러스는 유사분열-후(post-mitotic) 조직(예를 들어 간, 근육 또는 눈)에 사용된다.
본 발명의 특정한 실시형태에서, 재조합 바이러스 벡터는 비-통합적(또는 영구적으로 비-통합적이며, 즉, 지속성(persistent) 벡터 게놈 중 50% 미만, 예를 들어 40%, 30%, 20% 또는 10% 미만이 생체내로 통합됨) 에피솜 바이러스 벡터이다.
본 발명의 특정한 실시형태에서, 재조합 바이러스 입자는 비-분열(non-dividing) 세포, 예를 들어 간 세포(헤파토사이트)를 감염시킨다.
본 발명의 다른 실시형태에서, 재조합 바이러스 입자는 분열 세포, 예를 들어 B-림프구를 감염시킨다.
특정한 실시형태에서, 재조합 바이러스 입자는 인코딩된 인자 I, 또는 이의 단편 또는 유도체의 발현 및 피험자의 혈류 내로의 분비를 초래하는 세포를 감염시킨다. 적합한 세포 유형은 간 세포(헤파토사이트) 및 B-림프구를 포함한다.
재조합 바이러스 입자는 인코딩된 인자 I 또는 단편 또는 유도체의 발현의 의도된 표적인 세포를 형질도입시킬 수 있어야 한다. 특정한 실시형태에서, 재조합 바이러스 입자는 간 세포(특히 헤파토사이트)를 형질도입시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 재조합 바이러스 벡터는 바이러스 cis-작용성 조절 서열, 예컨대 역 말단 반복부(ITR)의 측면에 존재하는, 인자 I, 또는 이의 단편 또는 유도체을 인코딩하는 핵산을 포함한다.
일부 실시형태에서, 인자 I, 또는 이의 단편 또는 유도체를 인코딩하는 핵산은 프로모터에 작동적으로 연결된다. 예시적인 프로모터로는, 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉시 조기 프로모터(immediate early promoter), RSV LTR, MoMLV LTR, 포스포글리세레이트 키나제-1(PGK) 프로모터, 심미안 바이러스 40(SV40; simian virus 40) 프로모터 및 CK6 프로모터, 트랜스티레틴 프로모터(TTR; transthyretin promoter), TK 프로모터, 테트라사이클린 반응성 프로모터(TRE), HBV 프로모터, 인간 알파-1-항-트립신(hAAT) 프로모터, 알부민 프로모터, 간-특이적 프로모터(LSP), 키메라 간-특이적 프로모터(LSP), E2F 프로모터, 텔로머라제(hTERT) 프로모터; 사이토메갈로바이러스 인핸서/닭 베타-액틴/토끼 β-글로빈 프로모터(CAG 프로모터; 문헌[Niwa et al., Gene, 1991 , 108(2): 193-9]) 및 신장 인자 1-알파 프로모터(EFI-알파) 프로모터(문헌[Kim et al., Gene, 1990, 91(2):217-23 및 Guo et al., Gene Ther., 1996, 3(9):802-10]) 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 인간 β-글루쿠로니다제 프로모터, β-액틴 프로모터, 닭(3-액틴 (CBA) 프로모터, CBA 프로모터에 연결된 사이토메갈로바이러스 인핸서, 레트로바이러스 라우스 육종 바이러스(RSV) LTR 프로모터 또는 디하이드로폴레이트 리덕타제 프로모터를 포함한다.
일부 실시형태에서, 프로모터는 간 세포, 예를 들어 헤파토사이트에서 인자 I, 또는 이의 단편 또는 유도체를 인코딩하는 핵산의 발현을 촉진한다.
본 발명에 사용하기에 적합한 간-특이적 프로모터의 예로는 HLP, LP1, HLP2, hAAT, HCR-hAAT, ApoE-hAAT 및 LSP 등이 있다.
이들 간-특이적 프로모터는 하기 참조문헌에 보다 상세히 기재되어 있다:
HLP: Mcintosh J. et al, Blood 2013 Apr 25, 121(17):3335-44 및 WO 2011/005968;
LP1: Nathwani et ai, Blood 2006 April 1, 107(7): 2653-2661 및 WO06/036502;
HCR-hAAT: Miao et al. Mol Ther. 2000; 1: 522-532;
ApoE-hAAT: Okuyama et al, Human Gene Therapy, 7, 637-645 (1996);
LSP: Wang et al, Proc Natl Acad Sci USA 1999 March 30, 96(7): 3906-3910; 및
HLP2: WO 2016/075473.
프로모터는 구성적(constitutive), 유도성 또는 억제성 프로모터일 수 있다. 예시적인 프로모터 및 설명은 예를 들어 US 2014/0335054에서 확인할 수 있다.
구성적 프로모터의 예로는 비제한적으로, 레트로바이러스 라우스 육종 바이러스(RSV) LTR 프로모터(선택적으로 RSV 인핸서가 있음), 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터(선택적으로 CMV 인핸서가 있음)(예를 들어 문헌[Boshart et al., Cell, 41:521-530 (1985)] 참조), SV40 프로모터, 디하이드로폴레이트 리덕타제 프로모터, 13-액틴 프로모터, 포스포글리세롤 키나제(PGK) 프로모터 및 EF1a 프로모터(Invitrogen) 등이 있다.
유도성 프로모터는 유전자 발현의 조절을 허용하고, 외인적으로 공급되는 화합물, 환경 인자, 예컨대 온도, 또는 특정한 생리학적 상태, 예를 들어 급성기(acute phase), 세포의 특정한 분화 상태의 존재 또는 오로지 복제중인 세포에 의해 조절될 수 있다. 유도성 프로모터 및 유도성 시스템은 비제한적으로 Invitrogen, Clontech 및 Ariad를 포함하여 여러 가지 상업적 공급원들로부터 입수 가능하다. 많은 다른 시스템들이 기재되었으며, 당업자에 의해 쉽게 선택될 수 있다. 외인적으로 공급되는 프로모터에 조절되는 유도성 프로모터의 예로는, 아연-유도성 양(sheep) 메탈로티오닌(MT) 프로모터, 덱사메타손(Dex)-유도성 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, T7 폴리머라제 프로모터 시스템(WO 98/10088); 엑디손 곤충 프로모터(문헌[No er al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:3346-3351 (1996)]), 테트라사이클린-억제성 시스템(문헌[Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)]), 테트라사이클린-유도성 시스템(문헌[Gossen et al., Science, 268:1766-1769 (1995)], 또한 문헌[Harvey et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512-518 (1998)] 참조), RU486-유도성 시스템(문헌[Wang etal., Nat. Biotech., 15:239-243 (1997) 및 Wang et al., Gene Ther, 4:432-441 (1997)]) 및 라파마이신-유도성 시스템(문헌[Magari et al., J. Clin. Invest., 100:2865-2872 (1997)]) 등이 있다. 이러한 맥락에서 유용할 수 있는 더욱 다른 유형의 유도성 프로모터들은 특정한 생리학적 상태, 예를 들어 온도, 급성기, 세포의 특정한 분화 상태 또는 복제중인 세포 단독에 의해 조절된다.
또 다른 실시형태에서, 인자 I, 또는 이의 단편 또는 유도체에 대한 본래의 프로모터 또는 이의 단편이 사용될 수 있다. 본래의 프로모터는, 인자 I, 또는 이의 단편 또는 유도체의 발현이 본래의 발현을 모방해야 하는 경우, 사용될 수 있다(발현 후, 피험자에서 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 수준이 증가되거나, 정상적인 수준을 초과하는 한). 본래의 프로모터는, 이식유전자의 발현이 일시적으로 또는 발전적으로, 또는 조직-특이적 방식으로, 또는 특정한 전사 자극에 반응하여 조절되어야 하는 경우 사용될 수 있다. 추가의 실시형태에서, 다른 본래의 발현 조절 요소들, 예컨대 인핸서 요소, 폴리아데닐화 부위 또는 코작(Kozak) 컨센서스(consensus) 서열이 또한 사용되어 본래의 발현을 흉내낼 수 있다.
재조합 바이러스 벡터는 표적 조직 또는 세포에서 인코딩된 인자 I, 또는 이의 단편 또는 유도체의 발현을 구축하는 데 필요한 임의의 조절 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 재조합 바이러스 벡터는 프로모터 및 폴리아데닐화 인지 부위에 작동적으로 연결된 인자 I, 또는 이의 단편 또는 유도체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 발현 카세트를 포함할 수 있다. 재조합 바이러스 벡터는 또한, 인자 I, 또는 단편 또는 유도체의 발현을 구축하기 위해 다른 조절 서열들, 예컨대 리보좀 결합 요소, 종결자, 인핸서, 선별 마커, 인트론, 폴리A 신호 및/또는 복제 기원, 마멋 간염(Woodchuck Hepatitis) 바이러스(WHP) 전사-후 조절 요소(WPRE) 서열 또는 돌연변이화된 WPRE 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 조절 서열은 조직-특이적 유전자 발현 능력을 부여한다. 일부 경우, 조직-특이적 조절 서열은 조직 특이적 방식으로 전사를 유도하는 조직 특이적 전사 인자에 결합한다. 이러한 조직-특이적 조절 서열(예를 들어 프로모터, 인핸서 등)은 당업계에 잘 공지되어 있다.
일부 실시형태에서, 프로모터 서열은 피험자 내에서 어디에서나 발현될 수 있고, 따라서 표적화된 조직(예를 들어 간)의 하나 이상의 세포에서 해당 조직으로의 상기 서열의 전달에 의해 발현될 수 있다. 다른 실시형태에서, 표적 조직(예를 들어 간), 또는 표적 조직의 하나 이상의 세포의 서브셋(예를 들어 헤파토사이트)에서 특이적으로 발현하는 프로모터 서열이 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 인자 I, 또는 이의 단편 또는 유도체는 표적 조직의 다른 세포가 아니라 해당 조직의 특정 세포(예를 들어 헤파토사이트)에서만 발현된다.
특정한 실시형태에서, 인코딩된 인자 I, 또는 이의 단편 또는 유도체는 인코딩된 인자 I, 또는 단편 또는 유도체의 발현의 의도된 표적인 특정한 조직 또는 세포-유형에 특이적인 프로모터로부터 발현된다. 예를 들어, 프로모터는 간-특이적 프로모터, 예컨대 hAAT 프로모터일 수 있다.
일 실시형태에서, 프로모터는 HLP, LP1, HLP2, hAAT, HCR-hAAT, ApoE-hAAT 및 LSP로부터 선택되는 간-특이적 프로모터이다.
일 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호: 8의 뉴클레오타이드 서열과 이의 전체 길이에 걸쳐 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 구성된다. 일 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호: 8의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 구성된다.
일 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호: 9의 뉴클레오타이드 서열과 이의 전체 길이에 걸쳐 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 구성된다. 일 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호: 9의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 구성된다.
일 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호: 10의 뉴클레오타이드 서열과 이의 전체 길이에 걸쳐 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 구성된다. 일 실시형태에서, 프로모터는 서열 번호: 10의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 구성된다.
일부 실시형태에서, 재조합 바이러스 벡터 또는 발현 카세트는 간-특이적 인핸서, 예컨대 간-특이적 아포지질단백질 E(ApoE) 인핸서를 포함한다. 특정한 실시형태에서, 재조합 바이러스 벡터 또는 발현 카세트는 간-특이적 프로모터, 예컨대 hAAT 프로모터, 및 간-특이적 인핸서, 예컨대 간-특이적 아포지질단백질 E(ApoE) 인핸서를 포함한다.
일부 실시형태에서, 발현 카세트는 바이러스 cis-작용성 조절 서열, 예컨대 역 말단 반복부(ITR)의 측면에 존재할 수 있다.
특정한 실시형태에서, 재조합 바이러스 입자는 투여 후 피험자의 간(예를 들어 헤파토사이트)을 감염시켜, 간(예를 들어 헤파토사이트)으로부터의 인자 I, 또는 이의 단편 또는 유도체의 발현, 및 피험자의 혈류 내로의 인자 I, 또는 이의 단편 또는 유도체의 분비를 초래한다. 이러한 실시형태에서, 인코딩된 인자 I, 또는 이의 단편 또는 유도체는 간-특이적 프로모터, 예컨대 인간 알파-1-항-트립신(hAAT) 프로모터, 또는 알부민 프로모터로부터 발현될 수 있다.
본 발명의 특정한 양태에서, 재조합 바이러스 벡터는 재조합 AAV(rAAV) 벡터이다. AAV는 대략 4.7 kb의 포장 능력을 가진 선형 단일 가닥 DNA 게놈으로 구성된 작은 비-외피형 바이러스이다. 이의 복제 사이클은 AAV 복제에 대한 결손 유전자를 보완할 수 있는 헬퍼 바이러스(문헌[Buller, et al., J. Virol., 40(1):241-247, October 1981]), 예를 들어, 아데노바이러스(천연 헬퍼 바이러스인 것으로 여겨짐)(문헌[Urabe, et al., J. Virol., 80(4): 1874-1885, February 2006]), 헤르페스바이러스(문헌[Afione, et al., J. Virol., 70(5):3235-3241, May 1996]) 또는 바큘로바이러스(문헌[Samulski, et al., EMBO J., 10(12):3941-3950, December 1991])의 공동-감염에 의존한다. AAV가 "천연 결함" 바이러스라는 사실은, 임상 적용에서 바이러스 벡터의 부적절한 확산(spread)을 방지하기 위해 안전성 장벽을 부가한다(문헌[Nakai, et al., J. Virol., 75(15): 6969-6976, August 2001]). 재조합 AAV(rAAV) 벡터는 2개의 역 말단 반복부(ITR)들 사이에서 이식유전자(즉, 인자 I, 또는 이의 단편 또는 유도체를 인코딩하는 핵산)의 삽입에 의해 발생될 수 있다. 재조합 AAV 입자는 예를 들어, 모든 다른 필수적인 유전자들을 인코딩하는 하나 이상의 플라스미드에 의해 이러한 벡터를 공동-형질감염시킴으로써 생성될 수 있다. 이들은 분열 세포 및 휴지기 세포를 둘 다 감염시킬 수 있고, 바람직하게는 인간 염색체 19 내의 특이적 부위에서 통합되는 야생형 AAV와는 대조적으로, 주로 에피솜 형태로 지속된다. 에피솜 AAV 게놈이 분열중인 세포에 존재하는 경우, 이러한 게놈은 세포 분열 동안 신속하게 희석되어 나온다.
"재조합 AAV 벡터(rAAV 벡터)"는 적어도 하나의 AAV 역 말단 반복부 서열(ITR)의 측면에 존재하는 인자 I, 또는 이의 단편 또는 유도체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 벡터를 지칭한다. 특정한 실시형태에서, 인자 I, 또는 이의 단편 또는 유도체를 인코딩하는 핵산은 2개의 AAV ITR들에 의해 인접되어 있다. 이러한 rAAV 벡터는 하기에 보다 상세히 설명된 바와 같이, 예를 들어 적합한 헬퍼 바이러스(또는 적합한 헬퍼 기능을 발현하고 있음), 및 AAV rep 및 cap 유전자 생성물(즉, AAV Rep 및 Cap 단백질)을 발현하고 있는 또 다른 플라스미드에 의해 감염된 숙주 세포에 존재하는 경우, 복제되고 감염성 바이러스 입자 내로 포장될 수 있다.
일부 실시형태에서, rAAV 벡터는 적어도 하나의 AAV ITR 서열의 측면에 존재하는 발현 카세트를 포함하며, 여기서, 발현 카세트는 프로모터 및 폴리아데닐화 인지 부위, 및 선택적으로 WPRE 서열 또는 돌연변이체 WPRE 서열에 작동적으로 연결된 인자 I, 또는 이의 단편 또는 유도체를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 특정한 실시형태에서, 발현 카세트는 2개의 AAV ITR 서열들에 의해 인접되어 있다. 일부 실시형태에서, 발현 카세트는 전사 개시 및 종결 서열을 포함하여 조절 서열을 추가로 포함할 수 있다.
AAV에 대한 "헬퍼 바이러스"는, AAV(결함 파보바이러스임)가 숙주 세포에 의해 복제되고 포장될 수 있게 하는 바이러스를 지칭한다. 아데노바이러스, 헤르페스바이러스 및 폭스바이러스, 예컨대 백시나를 포함하여 많은 이러한 헬퍼 바이러스들이 식별되었다. 아데노바이러스가 많은 상이한 서브그룹들을 포함하지만, 아데노바이러스 유형 5의 서브그룹 C(Ad5)가 가장 보편적으로 사용된다. 인간, 비-인간 포유류 및 조류 기원의 수많은 아데노바이러스들이 공지되어 있고, 기탁 기관, 예컨대 ATCC로부터 입수 가능하다. 또한 ATCC와 같은 기탁 기관으로부터 입수 가능한 헤르페스 과(family)의 바이러스는 예를 들어, 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV), 엡스타인-바 바이러스(EBV), 사이토메갈로바이러스(CMV) 및 위광견병 바이러스(PRV)를 포함한다.
"역 말단 반복부" 또는 "ITR" 서열은 당업계에서 잘 이해되는 용어이고, 반대 배향으로 존재하는 바이러스 게놈의 말단에서 확인되는 상대적으로 짧은 서열을 지칭한다. 또한 당업계에서 잘 이해되는 용어인 "AAV 역 말단 반복부(ITR)" 서열은, 본래의 단일 가닥 AAV 게놈의 양 말단에 존재하는 대략 145개 뉴클레오타이드의 서열이다. ITR의 최외곽 125개 뉴클레오타이드는 2개의 대안적인 배향들 중 어느 한 배향으로 존재하여, 상이한 AAV 게놈들 사이에서 및 단일 AAV 게놈의 2개의 말단들 사이에서 이종성을 초래할 수 있다. 최외곽 125개 뉴클레오타이드는 또한, 자가-상보성의 더 짧은 영역을 몇 개 함유하여(A, A', B, B', C, C' 및 D 영역으로 지정됨), 가닥내 염기쌍 형성(base-pairing)이 ITR의 이러한 부위 내에서 발생하게 할 수 있다.
AAV ITR 서열(들)은 AAV 비리온의 구제(rescue), 복제 및 포장을 위해 의도된 대로 작용해야 한다(문헌[Davidson et al., PNAS, 2000, 97(7)3428-32; Passini et al., J. Virol., 2003, 77(12):7034-40; 및 Pechan et al., Gene Ther., 2009, 16:10-16] 참조). 본 발명의 벡터에 사용하기 위한 AAV ITR은 야생형 뉴클레오타이드 서열을 가질 필요가 없고(예를 들어 문헌[Kotin, Hum. Gene Ther., 1994, 5:793-801]에 기재된 바와 같음), 뉴클레오타이드의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 변경될 수 있거나, AAV ITR은 몇몇 AAV 혈청형들 중 임의의 혈청형으로부터 유도될 수 있다(문헌[Gao et al., PNAS, 2002, 99(18): 11854-6; Gao et al., PNAS, 2003, 100(10):6081-6; 및 Bossis et al., J. Virol., 2003, 77(12):6799-810] 참조).
본 발명의 벡터에 사용하기 위한 ITR은 자연 발생 ITR의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 구성될 수 있거나, 또는 자연 발생 ITR의 뉴클레오타이드 서열과 이의 전체 길이에 걸쳐 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 구성될 수 있다. 특히, 본 발명의 벡터에 사용하기 위한 AAV ITR은 자연 발생 AAV ITR의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 구성될 수 있거나, 또는 자연 발생 AAV ITR, 예컨대 하기 AAV 혈청형들 중 임의의 AAV 혈청형: AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12의 AAV ITR의 뉴클레오타이드 서열과 이의 전체 길이에 걸쳐 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 구성될 수 있다.
AAV 벡터는 인간 게놈 내로 통합될 수 있지만, 생체내 통합률(integration rate)은 낮다. rAAV-매개 유전자 발현의 일차 공급원은 통합된 게놈이 아니라 염색체외(extrachromosomal)이다. 뮤린 간 절제술 모델에서, 10% 미만의 지속성 벡터 게놈이 간에서 통합된다(문헌[Miller, et al., Nat. Genet, 30(2): 147-148, February 2002]).
AAV는 인상적인 안전성 기록을 갖고 있고 임의의 공지된 인간 또는 동물 질병과 연관이 있지는 않지만, 대부분의 인간(> 70%)은 하나 이상의 혈청형에 대해 혈청반응양성(seropositive)이다. AAV 벡터가 독성 또는 염증 반응과 연관이 있지는 않지만, 재투여에 영향을 줄 수 있는 중화 항체의 발생에는 연관이 있다. 그러나, 이러한 면역 반응은 캡시드 서열을 조작함으로써 감소될 수 있다(문헌[Mingozzi and High, Blood, 122(1):23-36, July 2013]).
특정한 실시형태에서, 재조합 바이러스 입자는 재조합 아데노-연관된 바이러스(rAAV) 입자이다. "rAAV 입자"는 적어도 하나의 AAV 캡시드 단백질 및 캡시드화된 재조합 바이러스 벡터 게놈, 특히 캡시드화된 rAAV 벡터 게놈으로 구성된 바이러스 입자를 지칭한다.
본 발명에 따른 AAV 유전자 요법 방법의 기본적인 단계는 도 4에 나타나 있다. 인자 I, 또는 이의 단편 또는 유도체를 인코딩하는 재조합 AAV 벡터가 사용되어, 벡터를 캡시드화하는 rAAV 입자를 생성한다. rAAV 입자가 피험자에게 예를 들어 주사에 의해 투여된 후, rAAV 입자는 표적 세포를 감염시키고, 벡터에 의해 인코딩된 인자 I, 또는 이의 단편 또는 유도체가 표적 세포에 의해 발현되어, 피험자의 혈류 내로의 인자 I 또는 단편 또는 유도체의 분비를 초래한다. 이러한 방법은 하기에 보다 상세히 설명되어 있다.
헤파란 설페이트 프로테오글리칸(HSPG)은 AAV 혈청형 2(AAV2) 입자에 대한 세포성 수용체로서 작용하는 것으로 공지되어 있다(문헌[Summerford, C. and Samulski, R. J. (1998) J. Virol. 72(2): 1438-45]). 세포막에서 AAV2 입자와 HSPG 사이의 결합은 이러한 입자를 세포에 부착시키는 역할을 한다. 다른 세포 표면 단백질, 예컨대 섬유아세포 성장 인자 수용체 및 αvβ5 인테그린이 또한, 세포성 감염을 용이하게 할 수 있다. 결합 후, AAV2 입자는 클라트린-코팅된 피트(pit)를 통한 수용체 매개 엔도사이토시스를 포함하는 메커니즘을 통해 세포에 들어갈 수 있다. AAV2 입자는 엔도솜 산성화(endosomal acidification)시 식균 작용 소낭(endocytic vesicle)으로부터 방출될 수 있다. 이는, AAV2 입자를 핵주위 영역까지 이동시키고 그런 다음 세포 핵까지 이동시킬 수 있다.
AAV의 캡시드는 3개의 캡시드 단백질들: VP1 , VP2 및 VP3을 포함하는 것으로 공지되어 있다. 이들 단백질은 유의한 양의 오버랩핑(overlapping) 아미노산 서열 및 독특한 N-말단 서열을 함유한다. AAV2 캡시드는 정20면체 대칭에 의해 배열된 60개의 서브유닛들을 포함한다(문헌[Xie, Q., etal. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. 99(16): 10405-10]). VP1, VP2 및 VP3는 1 : 1 : 10의 비율로 존재하는 것으로 확인되었다. AAV2 캡시드 단백질과 HSPG 사이의 결합은 염기성 AAV2 캡시드 단백질 잔기와 음으로 하전된 글리코스아미노글리칸 잔기 사이의 정전기적 상호작용을 통해 발생한다(문헌[Opie, SR et al., (2003) J. Virol. 77:6995-7006; Kern, A et al., (2003) J. Virol. 11:11072-11081]). 이들 상호작용에 관여하는 특이적 캡시드 잔기는 R484, R487, K532, R585 및 R588을 포함한다. 바이러스들은 이들의 천연 숙주 세포를 가장 효율적으로 감염시킨다. 위형화(pseudotyping)는 바이러스 향성을 변화시키기 위해, 세포 도입을 매개하는 표면 단백질을 또 다른 바이러스 유래의 표면 단백질로 교환하는 단계를 수반한다. 위형화의 예는, 대부분의 모든 세포를 형질감염시킬 수 있는 수포성 구내염 바이러스의 단백질 G로 위형화된 렌티바이러스(VSV G-위형화된 렌티바이러스)를 포함한다(문헌[Akkina, et al., J. Virol., 70(4):2581-2585, April 1996; Willett and Bennett, Front Immunol, 4:261, 2013; Shariand, et al., Discov Med, 9(49):519-527, June 2010]). 다른 경우에, 바이러스의 향성은 오로지 표적 세포로만 제한된다. 이는 투여되는 벡터 용량을 감소시키고, 각각의 세포 유형 밖에서의 이식유전자 발현을 방지하고, 예를 들어 눈(문헌[Grimm, et al., Blood, 102(7):2412-2419, October 2003]) 또는 간(문헌[Thomas, et al., J. Virol., 78(6):3110-3122, March 2004; Lisowski, et al., Nature, 506(7488):382-386I February 2014; Niidome and Huang. Gene Ther., 9(24): 1647-1652, December 2002])에서만 발현되게 한다. 위형화는 또한, 예를 들어 인간 헤파토사이트에 대한 개선된 향성을 가진 DNA-셔플링된 AAV 캡시드로 구성된 라이브러리를 제조함으로써 인공적으로 발생될 수 있다(문헌[Li and Huang. Gene Ther., 13(18):1313-1319, September 2006]). 이는 낮은 벡터 흡수 및 이식유전자 발현을 극복하는 데 일조할 수 있다.
본 발명에 따르면, 재조합 바이러스 입자는 감염되는 세포 유형(들)에 대한 향성을 부여하기 위해 위형화될 수 있다. 예를 들어, 재조합 바이러스 입자가 간 세포(예를 들어 헤파토사이트)를 감염시키는 본 발명의 실시형태에서, 재조합 바이러스 입자는 간 향성, 특히 헤파토사이트 향성을 부여하도록 위형화될 수 있다. 재조합 바이러스 입자가 B-림프구를 감염시키는 본 발명의 다른 실시형태에서, B-림프구에 대한 향성은 엡스타인 바(Epstein Barr) 바이러스 유래의 gp220/35 또는 이의 단편을 사용하여 달성될 수 있다.
소정의 실시형태에서, 재조합 바이러스 입자는 간, 특히 헤파토사이트 향성을 부여하도록 위형화된 rAAV 입자이다.
100개가 넘는 상이한 AAV 혈청형들이 식별되어 왔다(문헌[Atchison, et al., Science, 149(3685):754-756, August 1965; Warrington, et al., J. Virol., 78(12):6595-6609, June 2004). 위형화는 예를 들어, 또 다른 혈청형의 캡시드 서열을 헬퍼 플라스미드 내로 포장함으로써 rAAV 바이러스 입자에 대해 쉽게 달성될 수 있다. 향성 및 이식유전자 발현을 개선하기 위한 몇몇 접근법들이 취해질 수 있다: i) 무작위화된(randomized) 캡시드 서열로 구성된 캡시드 라이브러리의 구축(문헌[Li and Huang, Gene Ther., 13(18):1313-1319, September 2006]); ii) 아미노산 서열을 AAV2의 캡시드 내로 삽입(30 kDa 이하, AAV를 특이적 세포 유형으로 표적화하기 위해 ScFv 서열을 삽입시킬 확률)(문헌[Calcedo, et al., J. Infect. Dis., 199(3): 381-390, February 2009]); 및 iii) 전달 메커니즘의 지식을 AAV 구조 분석과 조합함으로써 합리적인 디자인 접근법(문헌[Calcedo, et al., Clin. Vaccine Immunol., 18(9): 1586-1588, September 2011]).
임의의 AAV 혈청형의 용도는 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주된다. 일부 실시형태에서, rAAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 또는 AAV12 ITR을 포함하여 AAV 혈청형으로부터 유래된 벡터이다. rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11 또는 AAV12 캡시드를 포함하여 임의의 AAV 혈청형으로부터 유래된 캡시드 단백질을 포함할 수 있다. 상이한 AAV 혈청형들이 특정한 표적 세포, 또는 특정한 표적 조직(예를 들어 간 조직) 내의 표적 특이적 세포 유형의 형질도입을 최적화하기 위해 사용된다. rAAV 입자는 동일한 혈청형 또는 혼합된 혈청형의 바이러스 단백질 및 바이러스 핵산을 포함할 수 있다.
본 발명의 재조합 바이러스 입자의 캡시드 단백질은 자연 발생 캡시드 단백질(예를 들어 자연 발생 AAV 캡시드 단백질, 예컨대 AAV 혈청형 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11 또는 AAV12의 캡시드 단백질)의 아미노산 서열을 포함하거나 구성될 수 있거나, 또는 예를 들어 요망되는 조직 유형 또는 세포 유형에 대한 증강된 향성(예컨대 간 또는 헤파토사이트 향성)을 부여하거나 재조합 바이러스 입자의 면역원성을 감소시키기 위해 자연 발생 캡시드 단백질의 아미노산 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 첨가를 포함하는 자연 발생 캡시드 단백질의 유도체일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 재조합 바이러스 입자의 캡시드 단백질은 자연 발생 캡시드 단백질의 아미노산 서열과 이의 전체 길이에 따라 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가진다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 rAAV 입자의 AAV 캡시드 단백질은 자연 발생 AAV 캡시드 단백질, 예를 들어 혈청형 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11 또는 AAV12의 자연 발생 AAV 캡시드 단백질의 아미노산 서열과 이의 전체 길이에 따라 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가진다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 재조합 바이러스 입자의 캡시드 단백질은 비-자연 발생 캡시드 단백질, 예를 들어 비-자연 발생 AAV 캡시드 단백질, 예컨대 조작된 또는 키메라 캡시드 단백질이다.
키메라 캡시드 단백질은 자연 발생 AAV 혈청형의 서열을 코딩하는 2개 이상의 캡시드들 사이의 재조합에 의해 발생되는 것들을 포함한다. 이는 예를 들어, 하나의 혈청형의 비-감염성 캡시드 서열이 상이한 혈청형의 캡시드 서열에 의해 공동-형질감염되는 마커 구제 접근법에 의해 수행될 수 있고, 직접 선별(directed selection)이 요망되는 특성을 갖는 캡시드 서열을 선별하는 데 사용된다. 상이한 혈청형의 캡시드 서열은 세포 내에서 상동성 재조합에 의해 변경되어, 신규 키메라 캡시드 단백질을 생성할 수 있다.
키메라 캡시드 단백질은 또한, 2개 이상의 캡시드 단백질들 사이에서, 예를 들어 상이한 혈청형의 2개 이상의 캡시드 단백질들 사이에서 특정한 캡시드 단백질 도메인, 표면 루프 또는 특정한 아미노산 잔기를 트랜스퍼하기 위해 캡시드 단백질 서열을 조작함으로써 발생되는 것들을 포함한다.
셔플링된 또는 키메라 캡시드 단백질은 또한, DNA 셔플링 또는 오류-유발(error-prone) PCR에 의해 발생될 수 있다. 하이브리드 AAV 캡시드 유전자는 관련된 AAV 유전자의 서열, 예를 들어 다수의 상이한 혈청형들의 캡시드 단백질을 인코딩하는 서열들을 무작위로 단편화한 다음, 후속적으로 자가-프라이밍(self-priming) 폴리머라제 반응에서 단편들을 리어셈블링(reassembling)함으로써 생성될 수 있고, 이는 또한 서열 상동성의 영역에 교차를 유발할 수 있다. 이러한 방식으로 몇몇 혈청형들의 캡시드 유전자를 셔플링함으로써 생성된 하이브리드 AAV 유전자의 라이브러리는 요망되는 기능성을 가진 바이러스 클론을 식별하기 위해 스크리닝될 수 있다. 유사하게는, 오류-유발 PCR은 AAV 캡시드 유전자를 무작위로 돌연변이화하여, 변이체들의 다양한 라이브러리를 생성하는 데 사용될 수 있으며, 그런 다음 이는 요망되는 특성에 대해 선별될 수 있다.
캡시드 유전자의 서열은 또한, 본래의 야생형 서열에 대하여 특정한 결실, 치환 또는 삽입을 도입하기 위해 유전적으로 변형될 수 있다. 특히, 캡시드 유전자는 캡시드 코딩 서열의 개방형 해독틀 내에서 또는 캡시드 코딩 서열의 N-말단 및/또는 C-말단에서 관련이 없는 단백질 또는 펩타이드의 서열의 삽입에 의해 변형될 수 있다.
본 발명에 사용하기에 적합한 비-자연 발생 캡시드 단백질의 예들은 WO 2016/181123 및 WO 2013/029030에 기재되어 있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 재조합 바이러스 입자의 캡시드 단백질은 MutC 캡시드 단백질(예를 들어 WO 2016/181123에 기재된 바와 같은 Mut C 캡시드 단백질)이다. 일 실시형태에서, 본 발명의 재조합 바이러스 입자의 캡시드 단백질은 서열 번호: 11의 아미노산 서열과 이의 전체 길이에 걸쳐 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가진다. 일 실시형태에서, 본 발명의 재조합 바이러스 입자의 캡시드 단백질은 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하거나 구성된 아미노산 서열을 가진다.
일 실시형태에서, 본 발명의 재조합 바이러스 입자의 캡시드 단백질은 LK03 캡시드 단백질(예를 들어 WO 2013/029030에 기재된 바와 같은 LK03 캡시드 단백질)이다. 일 실시형태에서, 본 발명의 재조합 바이러스 입자의 캡시드 단백질은 서열 번호: 12의 아미노산 서열과 이의 전체 길이에 걸쳐 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가진다. 일 실시형태에서, 본 발명의 재조합 바이러스 입자의 캡시드 단백질은 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하거나 구성된 아미노산 서열을 가진다.
일 실시형태에서, 본 발명의 재조합 바이러스 입자의 캡시드 단백질은 문헌[Wang et al. Mol Ther. 2015 Dec; 23(12): 1877-1887]에 기재된 바와 같은 AAVrMO 단백질, 또는 개시된 AAVrMO 단백질의 아미노산 서열과 이의 전체 길이에 걸쳐 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 아미노산 동일성을 갖는 이의 유도체이다.
본 발명의 특정한 실시형태에서, 재조합 바이러스 벡터는 AAV2-유래 바이러스 벡터이며, 즉, 인자 I, 또는 이의 단편 또는 유도체를 인코딩하는 핵산이 적어도 하나의 AAV2 ITR 서열(문헌[Kottemnan and Schaffer, Nat. Rev. Genet, 15(7):445-451, July 2014]), 또는 자연 발생 AAV2 ITR의 뉴클레오타이드 서열과 이의 전체 길이에 걸쳐 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 가진 이의 유도체의 측면에 존재하는 재조합 바이러스 벡터이다. 일부 실시형태에서, 인자 I, 또는 이의 단편 또는 유도체를 인코딩하는 핵산은 2개의 AAV2 ITR들, 또는 AAV2 ITR 유도체들(여기서 각각의 AAV2 ITR 유도체는 자연 발생 AAV2 ITR의 뉴클레오타이드 서열과 이의 전체 길이에 걸쳐 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함함)의 측면에 존재한다.
AAV2는 광범위한 향성을 가지고, 헤파토사이트를 포함하여 많은 세포 유형들을 생체내에서 상대적으로 효율적으로 형질도입시킨다. 상이한 캡시드 단백질들을 이용한 재조합 AAV 벡터의 위형화는 향성을 급격하게 변경시킬 수 있다. AAV8 및 AAV9는 둘 다 AAV2와 비교하여 헤파토사이트에 대해 더 높은 친화성을 가진다. 특히, AAV8은 AAV2와 비교하여 3배 내지 4배 더 많은 헤파토사이트들을 형질도입시키고, 형질도입된 세포 1개 당 3배 내지 4배 더 많은 게놈들을 전달할 수 있다.
일 실시형태에서, 재조합 바이러스 벡터는 AAV2-유래 바이러스 벡터가 아니다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 rAAV 입자는 AAV8 또는 AAV9 캡시드 단백질(또는 자연 발생 AAV8 또는 AAV9 캡시드 단백질의 아미노산 서열과 이의 전체 길이에 걸쳐 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 아미노산 동일성을 갖는 이의 유도체)을 포함한다. 특정한 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV2-유래 바이러스 벡터를 캡시드화하고, AAV8 캡시드(rAAV2/8) 또는 AAV9 캡시드(rAAV2/9)(또는 자연 발생 AAV8 또는 AAV9 캡시드 단백질의 아미노산 서열과 이의 전체 길이에 걸쳐 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 아미노산 동일성을 갖는 이의 유도체)에 의해 위형화된다. 다른 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV2-유래 바이러스 벡터를 캡시드화하고, Mut C 캡시드(rAAV2/Mut C) 또는 LK03 캡시드(rAAV2/LK03) 또는 AAVrh10 캡시드(rAAV2/rh10)에 의해 위형화된다.
형질감염, 안정한 세포주 생성, 및 아데노바이러스-AAV 하이브리드, 헤르페스바이러스-AAV 하이브리드(문헌[Conway, et al., (1997) J. Virology 71(11):8780-8789]) 및 바큘로바이러스-AAV 하이브리드를 포함하는 감염성 하이브리드 바이러스 생성 시스템을 포함하여 rAAV 입자의 생성을 위한 수많은 방법들이 당업계에 공지되어 있다.
rAAV 바이러스 입자의 생성을 위한 rAAV 생성 배양물들은 모두: i) 바큘로바이러스 생성 시스템의 경우 예를 들어 인간-유래 세포주, 예컨대 HeLa, A549, 293 또는 293T 세포, 또는 곤충-유래 세포주, 예컨대 SF-9를 포함하는 적합한 숙주 세포; ii) 야생형 또는 돌연변이체 아데노바이러스(예컨대 온도 민감성 아데노바이러스), 헤르페스 바이러스, 바큘로바이러스에 의해 제공되는 적합한 헬퍼 기능, 또는 헬퍼 기능을 제공하는 플라스미드 구축물; iii) AAV rep 및 cap 유전자; iv) 적어도 하나의 AAV ITR 서열의 측면에 존재하는, 인자 I, 또는 이의 단편 또는 유도체를 인코딩하는 핵산; 및 v) rAAV 생성을 지지하기 위한 적합한 배지 및 배지 구성성분을 필요로 한다.
당업계에 공지된 적합한 배지는 rAAV 입자의 생성에 사용될 수 있다. 이들 배지로는 비제한적으로, 모디파이드 이글 배지(MEM; Modified Eagle Medium), 둘베코스 모디파이드 이글 배지(DMEM; Dulbecco's Modified Eagle Medium) 고 글루코스, 예컨대 US 6,566,118에 기재된 바와 같은 커스텀 제제(custom formulation) 및 US 6,723,551에 기재된 바와 같은 Sf-900 II SFM 배지를 포함하여 Hyclone Laboratories사 및 JRH사에 의해 제조된 배지 등이 있다.
rAAV 입자는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, US 6,566,118, US 6,989,264 및 US 6,995,006을 참조한다. 본 발명을 실시할 때, rAAV 입자를 생성하기 위한 숙주 세포는 포유류 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 미생물 및 효모를 포함한다. 숙주 세포는 또한, AAV rep 및 cap 유전자가 숙주 세포 내에서 안정하게 유지되는 포장 세포, 또는 AAV 벡터 게놈이 안정하게 유지되는 생성자 세포일 수 있다. 예시적인 포장 세포 및 생성자 세포는 293, 293T, A549 또는 HeLa 세포로부터 유래된다. AAV 벡터는 당업계에 공지된 표준 기술을 사용하여 정제되고 제제화된다.
일부 실시형태에서, rAAV 입자는 삼중(triple) 형질감염 방법, 예컨대 하기에 제공되는 예시적인 삼중 형질감염 방법에 의해 생성될 수 있다. 간략하게는, rep 유전자 및 캡시드 유전자를 함유하는 플라스미드, 헬퍼 아데노바이러스 플라스미드, 및 이식유전자(즉, 인자 I, 또는 이의 단편 또는 유도체를 인코딩하는 유전자)를 포함하는 플라스미드가 (예를 들어 칼슘 포스페이트 방법 또는 폴리에틸렌이민을 사용하여) 세포주(예를 들어 HEK-293 세포) 내로 형질감염될 수 있고, 바이러스가 수합되고 선택적으로 정제될 수 있다.
일부 실시형태에서, rAAV 입자는 생성자 세포주 방법, 예컨대 하기 제공된 예시적인 생성자 세포주 방법(또한 문헌[Martin et al., (2013) Human Gene Therapy Methods 24:253-269] 참조)에 의해 생성될 수 있다. 간략하게는, 세포주(예를 들어 HeLa 세포주)는 rep 유전자, 캡시드 유전자 및 프로모터-이식유전자 서열을 함유하는 플라스미드에 의해 안정하게 형질감염될 수 있다. 세포주는 rAAV 생성에 대한 리드(lead) 클론을 선별하기 위해 스크리닝될 수 있으며, 그런 다음 이는 생성 생물반응기까지 확장되고 헬퍼로서 아데노바이러스(예를 들어 야생형 아데노바이러스)에 의해 감염되어 rAAV 생성을 개시할 수 있다. 후속적으로, 바이러스가 수합될 수 있고, 아데노바이러스는 불활성화(예를 들어 열에 의해)될 수 있고/거나 제거될 수 있고, rAAV 입자는 정제될 수 있다.
본 발명의 일부 양태에서, 본 발명의 rAAV 입자의 생성 방법이 제공되며, 상기 방법은: (a) rAAV 입자의 생성 조건 하에 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 여기서, 숙주 세포가 (i) 각각의 AAV 포장 유전자가 AAV 복제 및/또는 캡시드화 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 AAV 포장 유전자; (ii) 적어도 하나의 AAV ITR(바람직하게는 2개의 AAV ITR들)의 측면에 존재하는 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성을 보유하는 인자 I, 또는 이의 단편 또는 유도체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 rAAV 벡터, 및 (iii) AAV 헬퍼 기능(즉, 예를 들어 아데노바이러스, 헤르페스바이러스 또는 바큘로바이러스 유래의 생산성 AAV 수명 사이클에 필요한 유전자)을 포함하는 단계; 및 (b) 숙주 세포에 의해 생성된 rAAV 입자를 회수하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, (i), (ii) 및 (iii)은 예를 들어 하기 실시예 1에 기재된 바와 같이 3개의 별개의 플라스미드들 상에 제공될 수 있다.
일부 실시형태에서, 각각의 AAV ITR은 자연 발생 AAV ITR의 뉴클레오타이드 서열, 예를 들어 하기 혈청형 AAV ITR들 중 임의의 혈청형 AAV ITR: AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV 10, AAV11, AAV12, 예를 들어, AAV2 ITR을 포함하거나 구성되거나, 또는 자연 발생 AAV ITR의 뉴클레오타이드 서열, 예컨대 하기 AAV 혈청형들 중 임의의 AAV 혈청형: AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV 10, AAV11, AAV12의 AAV ITR과 이의 전체 길이에 걸쳐 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 구성된다.
일부 실시형태에서, 캡시드화 단백질은 AAV8 또는 AAV9 또는 Mut C 또는 LK03 또는 AAVrh10 캡시드화 단백질이다.
적합한 rAAV 생성 배양 배지에는 혈청 또는 혈청-유래 재조합 단백질이 0.5% 내지 20%(v/v 또는 w/v)의 수준에서 보충될 수 있다. 대안적으로, 당업계에 공지된 바와 같이, rAAV 입자는, 동물-유래 생성물이 없는 배지로도 지칭될 수 있는 혈청-무함유 조건에서 생성될 수 있다. 당업자는, 생성 배양물 내에서 rAAV의 역가를 증가시키기 위해, rAAV 입자의 생성을 지지하도록 디자인된 상업적인 배지 또는 커스텀 배지에도 비제한적으로 글루코스, 비타민, 아미노산 및/또는 성장 인자를 포함하여 당업계에 공지된 하나 이상의 세포 배양 구성성분이 보충될 수 있음을 알 수 있다.
rAAV 생성 배양물은 이용되는 특정한 숙주 세포에 적합한 여러 가지 조건들 하에(광범위한 온도 범위, 다양한 길이의 시간 등) 성장될 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, rAAV 생성 배양물은 적합한 부착-의존적 용기, 예컨대 하이퍼플라스크, 롤러 보틀, 중공 섬유 필터(hollow fiber filter), 마이크로캐리어(microcarrier), 및 충전층(packed-bed) 또는 유동층(fluidized-bed) 생물반응기에서 배양될 수 있는 부착-의존적 배양물을 포함한다. rAAV 벡터 생성 배양물은 또한, 예를 들어 스피너 플라스크(spinner flask), 교반 탱크 생물반응기 및 일회용 시스템, 예컨대 웨이브 백(Wave bag) 시스템을 포함하여 여러 가지 방식들로 배양될 수 있는 현탁액-적응 숙주 세포, 예컨대 HeLa, 293, 293T 및 SF-9 세포를 포함할 수 있다.
본 발명의 rAAV 입자는 생성 배양물의 숙주 세포의 용해에 의해, 또는 생성 배양물로부터 소모된 배지의 수합에 의해 rAAV 생성 배양물로부터 수합될 수 있되, 단, 세포는 US 6,566,118에 보다 완전히 기재된 바와 같이 온전한 세포로부터 배지 내로 rAAV 입자의 방출을 유발하기 위해 당업계에 공지된 조건 하에 배양된다. 세포의 적합한 용해 방법 또한 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 다수의 냉동/해동 사이클, 초음파처리, 미세유동화, 및 화학물질, 예컨대 세제 및/또는 프로테아제를 이용한 처리를 포함한다.
추가의 실시형태에서, rAAV 입자가 정제된다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "정제된"은, rAAV 입자가 자연적으로 발생하거나 초기에 제조되는 곳에 마찬가지로 존재할 수 있는 다른 구성성분들 중 적어도 일부가 없는 rAAV 입자의 조제물을 포함한다. 따라서, 예를 들어 단리된 rAAV 입자는 공급원 혼합물, 예컨대 배양 용해물 또는 생성 배양물 현탁액으로부터 이들 단리된 rAAV 입자를 농화시키기 위해 정제 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 농화는 여러 가지 방식들, 예컨대 용액 내에 존재하는 DNase-내성 입자(DRP) 또는 게놈 복사체(gc)의 비율, 또는 감염력에 의해 측정될 수 있거나, 또는 공급원 혼합물에 존재하는 제2의 잠재적으로 방해 성분, 예컨대 헬퍼 바이러스를 포함하여 생성 배양물 오염 물질 또는 공정중(in-process) 오염 물질을 포함하여 오염 물질 또는 배지 구성성분과 관련하여 측정될 수 있다.
일부 실시형태에서, rAAV 생성 배양 수합물은 숙주 세포 찌꺼기를 제거하기 위해 정제된다. 일부 실시형태에서, 생성 배양 수합물은 예를 들어, 등급 DOHC Millipore Millistak+HC Pod 필터, 등급 A1 HC Millipore Millistak+ HC Pod 필터 및 0.2 ㎛ 필터 Opticap XL10 Millipore Express SHC 친수성 막 필터를 포함하여 일련의 깊이 필터(depth filter)를 통한 여과에 의해 정제된다. 정제는 또한, 당업계에 공지된 여러 가지 다른 표준 기술들, 예컨대 원심분리 또는 당업계에 공지된 0.2 ㎛ 이상의 기공 크기를 갖는 임의의 셀룰로스 아세테이트 필터를 통한 여과에 의해 달성될 수 있다.
일부 실시형태에서, rAAV 생성 배양 수합물은 추가로, 생성 배양물에 존재하는 임의의 고분자량 DNA를 분해하기 위해 Benzonase®로 처리된다. 일부 실시형태에서, Benzonase® 분해는 당업계에 공지된 표준 조건, 예를 들어 주위 온도 내지 37℃ 범위의 온도에서 30분 내지 수 시간의 기간 동안 1 단위/ml 내지 2.5 단위/ml의 최종 농도의 Benzonase® 하에 수행된다.
rAAV 입자는 하나 이상의 하기 정제 단계를 사용하여 단리되거나 정제될 수 있다: 세슘 클로라이드 또는 이오딕사놀(iodixanol)을 사용한 밀도 구배 초원심분리(예를 들어 문헌[Cooper et al., Molecular Therapy (2005) 11, Supplement 1, S53-S54]에 기재됨); 평형 원심분리; 플로우-스루(flow-through) 음이온 교환 여과; rAAV 입자를 농축시키기 위한 접선 유동 여과(TFF; tangential flow filtration); 아파타이트 크로마토그래피에 의한 rAAV 포착; 헬퍼 바이러스의 열 불활성화; 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의한 rAAV 포착; 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의한 완충제 교환; 나노여과; 및 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피 또는 친화성 크로마토그래피에 의한 rAAV 포착. 이들 단계는 단독으로, 다양한 조합으로 또는 상이한 순서로 사용될 수 있다. rAAV 입자의 정제 방법은 예를 들어 문헌[Xiao et al., (1998) Journal of Virology 72:2224-2232]; US 6,989,264; US 8,137,948; 및 WO 2010/148143에 기재되어 있다.
재조합 바이러스 입자는 임의의 적합한 경로에 의해 피험자에게 투여될 수 있다. 특정한 실시형태에서, 재조합 바이러스 입자는 피험자에게 정맥내 투여된다.
본 발명의 특정한 실시형태에서, 재조합 바이러스 입자는 국소(또는 국지(topical)) 투여를 통해 피험자에게 투여되지 않는다.
본 발명의 특정한 실시형태에서, 재조합 바이러스 입자는 눈에 투여되지 않는다. 따라서, 특정한 실시형태에서, 재조합 바이러스 입자의 투여는 안내 투여, 예컨대 안내 주사, 예를 들어 망막하 주사를 포함하지 않는다.
본 발명의 재조합 바이러스 입자는 전신 투여를 통해 피험자에게 투여될 수 있다.
당업자는 전신 투여가 달성될 수 있는 다수의 경로들, 및 연관된 기술들에 친숙할 것이다.
예로서, 전신 투여는 비경구 투여를 통해 달성될 수 있다. 비경구 투여의 예로는, 정맥내 투여, 동맥내 투여, 근육내 투여, 척추강내(intrathecal) 투여 및 피하 투여 등이 있다. 따라서, 특정한 실시형태에서, 본 발명의 재조합 바이러스 입자는 피험자에게 전신 투여된다.
본 발명의 재조합 바이러스 입자의 투여의 바람직한 경로는 정맥내 투여이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 재조합 바이러스 입자는 피험자의 간문맥 내로 투여된다. 유리하게는, 간문맥 내로의 재조합 바이러스 입자의 투여는 재조합 바이러스 입자를 간까지 안내한다.
상기 기재된 바와 같이 특정한 실시형태에서, 재조합 바이러스 입자는 투여 후 피험자의 간(예를 들어 헤파토사이트)을 감염시켜, 간(예를 들어 헤파토사이트)으로부터 인자 I, 또는 이의 단편 또는 유도체의 발현 및 피험자의 혈류 내로의 인자 I, 또는 이의 단편 또는 유도체의 분비를 초래한다. 이러한 실시형태에서, 인코딩된 인자 I, 또는 이의 단편 또는 유도체는 간-특이적 프로모터로부터 발현될 수 있다.
간으로부터 피험자의 혈류 내로 분비된 인자 I, 또는 이의 단편 또는 유도체는 신체 내의 어디에나 위치한 표적 조직 또는 세포 내에서 치료 효과를 제공할 수 있다. 간으로부터 피험자의 혈류 내로 분비된 인자 I, 또는 이의 단편 또는 유도체는 피험자에서 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 수준에서 전신 증가를 제공할 수 있다.
AAV-매개 간-특이적 유전자 요법은 문헌[Sands Methods Mol Biol. 2011; 807: 141-157 및 Sharland et al., Discovery Medicine, 9(49): 519-527, June 2010]에서 고찰된다. 예를 들어, 용량에 따라, AAV8은 간문맥내 주사 후 마우스 간 내의 90% 내지 95%의 헤파토사이트를 형질도입시킬 수 있다. 흥미롭게는, 유사한 수준의 형질도입은 정맥내 주사 후 달성될 수 있다. AAV 벡터의 직접적인 뇌실질내 주사는 또한, 상대적으로 높은 수준의 장기간 발현을 매개한다. 추가의 특이성은 AAV8 캡시드 단백질과 함께 간-특이적 프로모터를 사용함으로써 부여될 수 있다.
유효량의 재조합 바이러스 벡터(일부 실시형태에서, 재조합 바이러스 입자에 의해 캡시드화됨)는 치료 목적에 따라 투여된다. 예를 들어, 낮은 퍼센트의 형질도입이 원하는 치료 효과를 달성할 수 있는 경우, 치료 목적은 일반적으로, 이러한 수준의 형질도입을 충족하거나 초과하는 것이다. 일부 경우, 이러한 수준의 형질도입은 단지 약 1% 내지 5%의 표적 세포, 일부 실시형태에서 적어도 약 20%의 원하는 조직 유형의 세포, 일부 실시형태에서 적어도 약 50%, 일부 실시형태에서 적어도 약 80%, 일부 실시형태에서 적어도 약 95%, 일부 실시형태에서 적어도 약 99%의 원하는 조직 유형의 세포의 형질도입에 의해 달성될 수 있다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 피험자에게 투여되는 바이러스 입자의 용량은 1 x 108 내지 1 x 1013 게놈 복사체/kg 체중이다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 피험자에게 투여되는 바이러스 입자의 총 양은 1 x 109 내지 1 x 1015 게놈 복사체이다.
바이러스 입자가 가이드로서 피험자에게 투여되는 실시형태에 있어서, 1회 주사 당 투여되는 바이러스 입자의 수는 일반적으로 1 x 106 내지 1 x 1014 입자, 1 x 107 내지 1 x 1013 입자, 1 x 109 내지 1 x 1012 입자, 또는 1 x 1011 입자이다.
재조합 바이러스 입자는 동일한 절차 동안 또는 수일, 수주, 수개월 또는 수년만큼 간격을 둔 기간 동안 하나 이상의 주사에 의해 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 다수의 벡터들이 피험자를 치료하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% 또는 75%, 100% 이하의 표적 조직의 세포(예를 들어 간의 간(hepatic) 세포)가 형질도입된다. 일부 실시형태에서, 5% 내지 100%, 10% 내지 약 50%, 10% 내지 30%, 25% 내지 75%, 25% 내지 50%, 또는 30% 내지 50%의 표적 조직의 세포(예를 들어 간의 간 세포)가 형질도입된다.
재조합 바이러스 입자 캡시드를 포함하는 재조합 바이러스 입자에 의해 형질도입된 세포의 식별 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 면역조직화학 또는 마커, 예컨대 증강된 녹색 형광 단백질의 사용은 재조합 바이러스 입자의 형질도입을 검출하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 재조합 바이러스 입자는 요망되는 조직(예를 들어 간) 내의 하나 이상의 위치에 (예를 들어 주사에 의해) 투여된다. 일부 실시형태에서, 재조합 바이러스 입자는 조직 내의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 10개 초과의 위치들 중 임의의 하나의 위치에 (예를 들어 주사에 의해) 투여된다.
일부 실시형태에서, 재조합 바이러스 입자는 1개 초과의 위치에 동시에 또는 순차적으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 재조합 바이러스 입자의 다수의 주사들은 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 9시간, 12시간 또는 24시간 이하 동안 간격을 두고 수행된다.
피험자에게 보체-매개 장애의 치료를 위한 하나 이상의 추가의 치료제가 투여될 수 있다. 이러한 작용제(들)는 바이러스 입자와 함께 공동-투여되거나, 순차적으로 투여될 수 있다. 순차적인 투여들 사이의 간격은 적어도 수분, 수시간 또는 수일(또는 대안적으로 미만)의 측면에서 수행될 수 있다.
재조합 바이러스 벡터의 핵산으로부터 인자 I, 또는 이의 단편 또는 유도체의 발현 후 피험자에서 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성은 피험자의 내인성 인자 I(즉, 재조합 바이러스 벡터로부터 발현에 의해 생성되지 않은 피험자의 인자 I)로부터의 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성, 및 재조합 바이러스 벡터로부터의 발현에 의해 생성된 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성을 포함할 수 있으며, 따라서 피험자에서 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 총 수준은 (벡터의 투여 이전의 수준과 비교하여) 증가되거나 정상적인 수준을 초과하는 것으로 이해될 것이다.
피험자에서 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 수준은 피험자의 혈청 내의 수준일 수 있다. 인간 피험자의 경우, C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 정상적인 수준은 피험자의 혈청 내에서 30 μg/ml 내지 40 μg/ml 인자 I에 의해 제공된 수준과 동등하다.
본 발명에 따른 재조합 바이러스 입자의 투여 이전에, 피험자는 정상적인 수준의 내인성 인자 I을 가질 수 있다. 다른 실시형태에서, 피험자는 정상적인 수준보다 낮은 수준의 인자 I을 가질 수 있으며, 예를 들어 피험자의 혈청 내에서 인자 I는 0 μg/ml 초과 내지 30 μg/ml 미만일 수 있다.
추가의 예로서, 피험자의 혈청 내 인자 I의 수준은 O μg/ml 초과 내지 25 μg/ml 미만, O μg/ml 초과 내지 20 μg/ml 미만, O μg/ml 초과 내지 15 μg/ml 미만, O μg/ml 초과 내지 10 μg/ml 미만, 또는 O μg/ml 초과 내지 5 μg/ml 미만일 수 있다.
본 발명의 특정한 실시형태에서, 피험자에서 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 수준은 정상적인 수준을 초과하는 수준까지 증가된다.
본 발명의 특정한 실시형태에서, 피험자에서 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 수준은 정상적인 수준보다 적어도 5%, 10%, 15%, 20% 또는 25% 높은 수준까지 증가된다.
본 발명의 특정한 실시형태에서, 피험자에서 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 수준은 정상적인 수준의 2배 이하인 수준, 또는 정상적인 수준보다 80%, 60%, 40% 또는 20% 이하 더 높은 수준까지 증가된다.
예를 들어, 피험자에서 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 수준은 정상적인 수준보다 5-100%, 5-80%, 5-60%, 5-40%, 5-20%, 10-100%, 10-80%, 10-60%, 10-40%, 10-20%, 15-100%, 15-80%, 15-60%, 15-40%, 15-20%, 20-100%, 20-80%, 20-60%, 20-40%, 25-100%, 25-80%, 25-60%, 또는 25-40% 더 높은 수준까지 증가될 수 있다.
상기 기재된 바와 같이, 피험자는 혈청 내에서 내인성 인자 I의 수준을 정상적인 수준보다 낮은 수준으로 가질 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 재조합 바이러스 입자의 투여 이전에 이러한 피험자에서 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 수준은 정상적인 수준보다 낮을 수 있다. 치료 효과는 이러한 피험자에서, C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 수준을 피험자에서 본 발명에 따른 재조합 바이러스 입자의 투여 이전의 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 기준치 수준보다 큰 수준까지 증가시킴으로써 수득될 수 있다. 선택적으로, C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 상기 증가된 수준은 정상적인 수준보다 낮게 유지될 수 있다.
따라서 본 발명의 특정한 실시형태에서, 피험자에서 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 수준은, 피험자에서 본 발명에 따른 재조합 바이러스 입자의 투여 이전의 기준치 수준보다 큰 수준까지 증가된다.
본 발명의 특정한 실시형태에서, 피험자에서 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 수준은 피험자에서 본 발명에 따른 재조합 바이러스 입자의 투여 이전의 기준치 수준보다 적어도 5%, 10%, 15%, 20% 또는 25% 높은 수준까지 증가된다.
본 발명의 특정한 실시형태에서, 피험자에서 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 수준은 피험자에서 본 발명에 따른 재조합 바이러스 입자의 투여 이전의 기준치 수준보다 2배 이하인 수준까지 증가되거나; 피험자에서 본 발명에 따른 재조합 바이러스 입자의 투여 이전의 기준치 수준보다 80%, 60%, 40% 또는 20% 이하만큼 높은 수준까지 증가된다.
예를 들어, 피험자에서 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 수준은 피험자에서 본 발명에 따른 재조합 바이러스 입자의 투여 이전의 기준치 수준보다 5-100%, 5-80%, 5-60%, 5-40%, 5-20%, 10-100%, 10-80%, 10-60%, 10-40%, 10-20%, 15-100%, 15-80%, 15-60%, 15-40%, 15-20%, 20-100%, 20-80%, 20-60%, 20-40%, 25-100%, 25-80%, 25-60% 또는 25-40% 높은 수준까지 증가될 수 있다.
보체-매개 장애는 대안적인 경로 조절에서의 결함과 연관된 장애, 특히 보체 C3b 피드백 사이클의 과다-활성과 연관된 장애일 수 있다.
보체-매개 장애는, 피험자에서 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 증가된 수준에 의해 완화되는 증상을 특징으로 하는 장애일 수 있다.
본 발명에 따라 예방되거나 치료될 수 있는 보체-매개 장애의 예로는, 연령-관련 황반 변성(AMD)(특히 조기(건성) AMD 또는 지도모양 위축), 고밀도 침착병(DDD), 비정형 용혈성 요독 증후군(aHUS), C3 사구체병증, 2형 막증식성 사구체신염(MPGN2 또는 MPGN 유형 II; membranoproliferative glomerulonephritis Type 2), 아테롬성 동맥경화증, 만성 심혈관 질환, 알츠하이머병, 전신 혈관염(systemic vasculitis), 발작성 야간 혈색소뇨증(PNH; paroxysmal nocturnal haemoglobinuria), 및 노인의 염증 또는 자가염증 질환 등이 있다.
일 실시형태에서, 지도모양 위축의 형성이 예방되거나 감소된다. 또 다른 실시형태에서, 지도모양 위축의 양이 감소된다.
본 발명에 따라 예방되거나 치료될 수 있는 C3 사구체병증으로는 C3 사구체신염 및 고밀도 침착병(막증식성 사구체신염(MPGN) 유형 II로도 공지되어 있음)이 있다.
본 발명에 따라 예방되거나 치료될 수 있는 보체-매개 장애의 추가의 예로는, I형 막증식성 사구체신염(I형 MPGN), III형 막증식성 사구체신염(III형 MPGN), 길랑-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome), 헤노흐-쇤라인 자반병(Henoch-Schonlein purpura), IgA 신증(nephropathy) 또는 막 사구체신염(membranous glomerulonephritis) 등이 있다. 막증식성 사구체신염(MPGN)은 또한, 메산쥼모세혈관성 사구체신염(mesangiocapillary glomerulonephritis)으로 공지되어 있다.
본 발명의 특정한 실시형태에서, 본 발명에 따라 예방되거나 치료되거나 완화되는 보체-매개 장애는 DDD, aHUS, C3 사구체병증, 아테롬성 동맥경화증, 만성 심혈관 질환, 알츠하이머병, 전신 혈관염, PNH, 노인의 염증 또는 자가염증 질환, MPGN 유형 I, III형 MPGN, 길랑-바레 증후군, 헤노흐-쇤라인 자반병, IgA 신증 및 막 사구체신염으로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 보체-매개 장애의 예방, 치료 또는 완화가 필요한 피험자에서 상기 예방, 치료 또는 완화는 상기 피험자의 기존의 치료 섭생의 투여의 필요한 용량 및/또는 빈도를 감소시키는 단계, 예를 들어 상기 피험자의 보체 경로 구성성분의 저해제(예컨대 보체 단백질 C5의 저해제, 예를 들어 항-C5 항체) 또는 항염증제(예컨대 스테로이드)의 투여의 필요한 용량 및/또는 빈도를 감소시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 특정한 실시형태에서, 본 발명에 따라 예방되거나 치료되는 보체-매개 장애는 안구 장애가 아니다.
본 발명의 특정한 실시형태에서, 본 발명에 따라 예방되거나 치료되는 보체-매개 장애는 눈의 보체-매개 장애가 아니다.
본 발명의 특정한 실시형태에서, 본 발명에 따라 예방되거나 치료되는 보체-매개 장애는 연령-관련 황반 변성(AMD) 또는 지도모양 위축이 아니다.
본 발명의 특정한 실시형태에서, 본 발명에 따라 예방되거나 치료되는 보체-매개 장애는 당뇨병성 망막병증이 아니다.
피험자는 보체-매개 장애가 발병할 위험에 있을 수 있다. 예를 들어, 피험자는 보체-매개 장애와 연관된 하나 이상의 SNP에 민감한 동형접합성 또는 이형접합성일 수 있다.
특정한 실시형태에서, 피험자는 AMD가 발병할 위험에 있다. 예를 들어, 피험자는 AMD와 연관이 있는 하나 이상의 SNP에 민감한 동형접합성 또는 이형접합성일 수 있다. 이러한 SNP의 예로는, 인자 H의 rs 1061170(Y402H를 인코딩함), 인자 H의 rs800292(V62I를 인코딩함), 인자 B의 rs641153(R32Q를 인코딩함) 또는 C3의 rs2230199(R102G를 인코딩함), 특히 인자 H의 rs1061170, 인자 H의 rs800292 또는 C3의 rs2230199 등이 있다. 보편적으로 혈청 인자 I 수준을 감소시키는 진행된 AMD와 연관된 CFI에서 희귀 돌연변이의 다른 예들은 문헌[Kavanagh et al., Hum Mol Genet 2015 Jul 1;24(13):3861-70]에 의해 기재되어 있다. 이들은 하기 SNP들을 포함한다: rs 144082872(P50A를 인코딩함); 4:110687847(P64L을 인코딩함); rs141853578(G119R을 인코딩함); 4:110685721(V152M을 인코딩함); 4:110682846(G162D를 인코딩함); 4:110682801(N177I를 인코딩함); rs 146444258(A240G를 인코딩함); rs 182078921(G287R을 인코딩함); rs41278047(K441R을 인코딩함); rs121964913(R474를 인코딩함).
본 발명의 방법은 추가로, 예를 들어 피험자가 보체-매개 장애와 연관된 하나 이상의 SNP에 민감한 동형접합성 또는 이형접합성인지 확인함으로써(예를 들어 피험자가 상기 열거된 AMD와 연관된 하나 이상의 SNP에 민감한 동형접합성 또는 이형접합성인지 확인함으로써) 보체-매개 장애(예를 들어 AMD)가 발병할 위험에 있는지 확인하는 단계를 포함할 수 있다.
Lay 등(문헌[Clin Exp Immunol 181(2):314-322 Aug 2015])에 기재된 연구에서, 큰 패널의 정상적인 피험자 유래의 혈청들은 3개의 보편적인 다형성에 대해 유형화되었으며, AMD 및 일부 형태의 신장 질환에 대한 소인에 영향을 미치는 C3에서 1개(R102G), 및 인자 H에서 2개(V62I 및 Y402H)이었다. 3개의 혈청 그룹들을 시험하였다; 3개의 위험 대립유전자들에 대해 동형접합성인 그룹; 모든 3개들에 대해 이형접합성인 그룹; 및 저 위험 대립유전자들에 대해 동형접합성인 그룹. 대안적인 보체 경로가 자이모산에 의해 활성화되는 경우, 이들 그룹은 외인성 인자 I의 첨가에 대한 이들의 반응에 따라 다르다. 형성되는 iC3b의 최대 양, 및 iC3b가 C3dg로 전환되는 속도 둘 다의 감소가 영향을 받는다. 두 반응 모두에 대해, 위험에 있는 컴플로타입은 유사한 하향조절을 생성하기 위해 더 높은 용량의 인자 I을 필요로 한다. 보체 수용체 CR3와 반응하는 iC3b가 보체 활성화가 염증을 유발하는 주요 메커니즘이기 때문에, iC3b가 C3dg로 절단되는 것은, 보체-유도 염증을 감소시키기 위한 주요 유의성을 갖는 것으로 보일 수 있다. 이들 발견은 처음에, 상이한 보체 대립유전자들을 갖는 피험자 유래의 혈청이 인자 I의 농도를 증가시킴으로써 대안적인 보체 경로의 하향조절의 시험관내 검정법에서 예측된 바와 같이 거동함을 나타낸다. 이들 결과는, C3b 피드백 사이클의 과활성을 하향조절하고 이로써 AMD 및 일부 형태의 신장 질환에 대한 치료를 제공하기 위한 치료제로서의 외인성 인자 I의 용도를 지지한다.
Lachmann 등(문헌[Clinical & Experimental Immunology, Volume 183, Issue 1, pages 150-156, January 2016])에서 보고된 연구에서, 최고 위험군(3개의 AMD 위험 대립유전자들인 C3(R102G), 인자 H(V621 및 Y402H)에 대해 동형접합성)을 최저 위험군(저 위험 대립유전자에 대해 동형접합성)의 활성으로 전환시키는 데 필요했던 인자 I의 양은 약 22 μg/ml의 인자 I이었으며, 최고 위험군을 이형접합성 군(3개의 모든 위험 대립유전자들에 대해 이형접합성)으로 감소시키는 것은 12.5 μg/ml이었고, 이형접합성 군을 최저 위험군으로 감소시키는 것은 5 μg/ml이었다.
본 발명의 특정한 실시형태에서, 피험자에서 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 수준은, 피험자가 AMD와 연관이 있는 하나 이상의 SNP에 민감한 이형접합성인 경우 정상적인 수준보다 적어도 10% 높은 수준까지 증가된다. 특정한 실시형태에서, AMD와 연관이 있는 SNP는 인자 H의 rs1061170, 인자 H의 rs800292 또는 C3의 rs2230199이다.
본 발명의 특정한 실시형태에서, 피험자에서 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 수준은, 피험자가 AMD와 연관이 있는 하나 이상의 SNP에 민감한 동형접합성인 경우 정상적인 수준보다 적어도 50% 높은 수준까지 증가된다. 특정한 실시형태에서, AMD와 연관이 있는 SNP는 인자 H의 rs1061170, 인자 H의 rs800292 또는 C3의 rs2230199이다.
본 발명의 방법은 추가로, 투여 후 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일 또는 6일째에, 적어도 1주, 2주 또는 3주째에, 또는 적어도 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월 또는 6개월째에, 또는 적어도 1년째에 피험자에서 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 수준을 확인하는 단계, 및 활성의 수준이 정상적인 수준에 있거나 그보다 낮은 것으로 확인되는 경우 투여를 반복하는 단계를 포함할 수 있다. 활성의 수준이 최초의 투여로부터 1년 동안 정상적인 수준보다 높은 채로 유지된 것을 확인되는 경우, 활성 수준이 정상적인 수준보다 높은 채로 계속 유지되는지 확인하기 위해 후속적인 체크가 매년 수행될 수 있다.
생체내, 보체 인자 I(FI)는 주로 간에서 헤파토사이트에 의해 발현되지만, 이는 또한, 시험관내에서 단핵구, 섬유아세포, 케라티노사이트(keratinocyte) 및 인간 제대 정맥 내피 세포에서 발현되는 것으로 확인되었다. FI는 이황화 결합에 의해 공유 연결된 중쇄 및 경쇄로 구성된 헤테로이량체이다. FI는 단일 프로펩타이드 사슬로서 발현된다. 번역-후, 단백질은 소포체 및 골지체에서의 N-글리코실화를 포함하여 몇몇 변형들을 받는다. 각각의 사슬은 3개의 아스파라긴 잔기에서 글리코실화될 수 있으며; 이들 무거운 중량의 글리칸 당 분자는 겉보기(apparent) 단백질 분자량의 20% 내지 25%를 이룬다. 추가로, FI는 트랜스-골지 네트워크에서 퓨린(furin)(또는 페어드(paired) 염기성 아미노산 절단 효소, PACE)에 의해 단백분해적으로 절단되며, 이는 4개의 양으로 하전된 아미노산들, 즉 RRKR을 절단한다. 이들 4개의 아미노산은 중쇄와 경쇄 사이의 계면에서 확인되고, 링커 펩타이드를 형성한다. 이들 아미노산의 제거 후, 프로-효소(pro-enzyme)가 효소적으로 활성인 절단된 헤테로이량체 형태로 가공된다. 프로-FI가 이의 서열에 전체에 걸쳐 28개의 페어드 염기성 아미노산 잔기들을 함유하긴 하지만, 퓨린은 Arg-Arg-Lys-Arg 부위에서만 인지하고 절단한다. FI는 18-잔기 N-말단 리더 서열을 가지며, 이러한 서열은 분비 전에 절단되고, 성숙한 단백질이 혈류 내로 방출된다(문헌[Nilsson, et al., Mol. Immunol., 44(8): 1835-1844, March 2007]).
FI는 몇몇 도메인들로 구성된다(문헌[Nilsson et al., 2011 , Mol. Immunol. 48(14):1611-1620]). 중쇄는 N-말단 FI 막 공격 복합체 도메인(FIMAC), 스캐빈저 수용체 시스테인-풍부 도메인(CD5 도메인으로도 공지되어 있는 SRCR), 저밀도 지질단백질 수용체 1 및 2 도메인, 및 이따금 D-영역으로 지칭되는 미공지된 상동성의 작은 영역으로 구성된다. FI의 경쇄는 효소적으로 활성인 도메인이며, His-Asp-Ser 촉매적 트리아드(catalytic triad)를 형성하는 잔기를 함유하는 키모트립신-유사 세린 프로테아제(SP) 도메인으로 구성된다.
인자 I의 중쇄가 기질에 결합하고 온전한 FI의 SP 도메인을 C3b 내에서 2개의 절단 부위들 쪽으로 배향시키며, 이들은 절단되어 iC3b를 형성하는 것으로 제시되었다. 2011년에, FI의 결정 구조가 공개되었고, C3b-FH-FI 복합체에서 중쇄 및 경쇄의 배열에 대해 더 많이 밝혀내었다(문헌[Tsiftsoglou and Sim, J. Immunol., 173(1):367-375, July 2004]). 기질(즉, C3b-FH 복합체)은 인자 I의 활성 부위에서 구조적 리모델링을 유도하는 것으로 제시되었다. 이는 나아가, FI가 C3b와 함께 예비배양되는 경우, 프로테아제 저해제 디이소프로필 플루오로포스페이트가 오로지 활성 부위 세린과 반응할 수 있다는 발견에 의해 뒷받침된다. C3b-FH(1-4) 복합체의 결정 구조 상에서 FI의 중첩은, SRCR 도메인과는 별도로, 중쇄가 C3b 및 공동 인자에 대해 밀접하게 충전되어 있음을 보여준다. 이러한 결합은 중쇄의 알로스테릭 저해 효과를 없애고, SP 도메인의 리모델링을 유도하며, 그런 다음 이는 활성적으로 되고 C3b를 절단한다. 적절한 FI 기능에서 FIMAC 및 FI 도메인 접근성의 중요성은 돌연변이생성 시리즈에서 잘 언급되었다(문헌[Schlott, et al., J. Mol. Biol., 318(2):533-546, April 2002]).
본 발명의 재조합 바이러스 벡터에 의해 인코딩되는 인자 I, 또는 이의 단편 또는 유도체는 성숙한 인자 I의 올바른 가공 및 분비를 보장하기 위해 본래의 18 아미노산 잔기 신호 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 이종성 신호 서열(즉, 본래의 유전자에 의해 인코딩되지 않는 신호 서열)이 사용될 수 있거나, 신호 서열이 생략될 수 있다.
특정한 실시형태에서, 인자 I는 인간 인자 I이며, 예를 들어 서열 번호: 2(18-잔기 N-말단 신호 서열을 포함하는 변이체 2, NCBI 참조 서열: NM_000204.4)또는 서열 번호: 4(18-잔기 N-말단 신호 서열이 없는 변이체 2)의 아미노산 서열을 갖는 인간 인자 I이다.
다른 실시형태에서, 인자 I의 다른 변이체들, 예컨대 인간 인자 I, 변이체 1(이는 변이체 2와 비교하여 더 긴 이소폼(isoform)이고 중심 코딩 영역에 대안적인 인-프레임 엑손을 포함함)이 사용될 수 있다. 이러한 변이체의 서열은 NCBI 참조 서열: NM_001318057.1이고, 18-아미노산 잔기 N-말단 신호 서열과 함께 또는 없이 사용될 수 있다.
인자 I의 단편 또는 유도체는, C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성을 보유하고, 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 갖는 인간 인자 I와 이의 전체 길이에 걸쳐 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 아미노산 서열 동일성을 가진 폴리펩타이드일 수 있다. 단편 또는 유도체는 하나 이상의 아미노산 첨가, 결실 또는 치환, 예를 들어 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
보존적 아미노산 치환은 결과적인 단백질의 활성에 최소의 영향을 갖는 경향이 있다. 보존적 치환에 대한 추가 정보는 예를 들어, Ben Bassat 등(문헌[J. Bacterial., 169:751-757, 1987]), O'Regan 등(문헌[Gene, 77:237-251, 1989]), Sahin-Toth 등(문헌[Protein Sci., 3:240-247, 1994]), Hochuli 등(문헌[Bio/Technology, 6:1321-1325, 1988]) 및 광범위하게 사용되는 유전학 및 분자생물학 교과서에서 찾을 수 있다. 블로섬 매트릭스(Blosum matrix)는 폴리펩타이드 서열의 관련성을 확인하는 데 보편적으로 사용된다. 블로섬 매트릭스는 트러스티드 정렬(trusted alignment)의 큰 데이터베이스(BLOCKS 데이터베이스)를 사용하여 제작되었으며, 여기서 일부 미만의 역치 퍼센트 동일성과 관련된 페어와이즈(pairwise) 서열 정렬이 계수되었다(문헌[Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10915-10919, 1992]). 90% 동일성의 역치는 BLOSUM90 매트릭스의 고도로 보존된 표적 빈도에 사용되었다. 65% 동일성의 역치는 BLOSUM65 매트릭스에 사용되었다. 블로섬 매트릭스에서 0 및 이보다 높은 점수는 선택된 퍼센트 동일성에서 "보존적 치환"으로서 간주된다. 하기 표는 예시적인 보존적 아미노산 치환을 보여준다:
Figure pat00002
인자 I의 단편 또는 유도체는 본래의 인자 I의 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성을 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 또는 100% 보유할 수 있다. 인자 I의 단편 또는 유도체, 및 본래의 인자 I의 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성은 당업자에게 공지된 임의의 적합한 방법을 사용하여 확인될 수 있다. 예를 들어, 인자 I 단백분해 활성의 측정은 Hsiung 등(문헌[Biochem. J. (1982) 203, 293-298])의 페이지 295, 좌측 컬럼에 기재되어 있다. FI 활성에 대한 용혈성 검정법 및 교착성 검정법이 둘 다 문헌[Lachmann PJ & Hobart MJ (1978) "Complement Technology" in Handbook of Experimental Immunology 3rd edition Ed DM Weir Blackwells Scientific Publications Chapter 5A p17]에 기재되어 있다. 단백분해 검정법을 또한 포함하는 보다 상세한 설명은 문헌[Harrison RA(1996) in "Weir's Handbook of Experimental Immunology" 5th Edition Eds; Herzenberg Leonore AWeir DM, Herzenberg Leonard A & Blackwell C Blackwells Scientific Publications Chapter 75 36-37]에 의해 제공된다. 교착성 검정법은 고도로 민감하고, 고정된 C3b를 iC3b로 전환시키고 콘글루티닌(conglutinin)과의 반응성을 획득하는 제1(더블) 클립을 검출하고; 고정된 iC3b로 출발하고 콘글루타닌과의 반응성의 상실을 검색함으로써 C3dg의 최종 클립을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 용혈성 검정법은 C3b를 iC3b로 전환시키는 데 사용되고, 단백분해 검정법은 모든 클립들을 검출한다.
일부 실시형태에서, 인자 I을 인코딩하는 핵산은 서열 번호: 2(18-잔기 N-말단 신호 서열을 갖는 변이체 2, NCBI 참조 서열: NM_000204.4) 또는 서열 번호: 4(18-잔기 N-말단 신호 서열을 갖지 않는 변이체 2)의 아미노산 서열을 갖는 인간 인자 I을 인코딩한다.
일부 실시형태에서, 인간 인자 I을 인코딩하는 핵산은 서열 번호: 1(18-잔기 N-말단 신호 서열을 갖는, NCBI 참조 서열: NM_000204.4 유래의 인자 I, 전사체 변이체 2, mRNA에 대한 CDS의 코딩 영역) 또는 서열 번호: 3(18-잔기 N-말단 신호 서열을 갖지 않는, 인자 I, 전사체 변이체 2에 대한 CDS의 코딩 영역)의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 인자 I, 또는 이의 단편 또는 유도체를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열이 사용될 수 있다. 적합한 코돈 최적화된 서열은 예를 들어 코돈 최적화 소프트웨어, 예컨대 SnapGene을 사용하여 발생될 수 있다.
인자 I을 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열의 일례는 서열 번호: 7이다. 따라서 일부 실시형태에서, 인자 I을 인코딩하는 핵산은 서열 번호: 7의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 구성된다.
일부 실시형태에서, 인자 I, 또는 이의 단편 또는 유도체를 인코딩하는 핵산은, 서열 번호: 1 또는 서열 번호: 3의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인간 인자 I을 인코딩하는 핵산과 이의 전체 길이에 걸쳐 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 핵산 서열 동일성을 가진 핵산을 포함할 수 있다.
참조 폴리펩타이드 또는 핵산 서열과 관련하여 "서열 동일성 퍼센트(%)"는 서열들을 정렬하고 필요하다면 최대 서열 동일성 퍼센트를 달성하기 위해 갭을 도입한 후, 참조 폴리펩타이드 또는 핵산 서열 내의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드와 동일한 서열 내의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드의 퍼센트로서 본원에 정의된다. 아미노산 또는 핵산 서열 동일성 퍼센트를 확인하기 위한 정렬은 당업계에 포함된 다양한 방식들에서 예를 들어 문헌[Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1987), Supp. 30, section 7.7.18, table 7.7.1]에 기재된 것들 및 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어를 포함하여 공개적으로 입수 가능한 컴퓨터 소프트웨어 프로그램을 사용하여 달성될 수 있다. 정렬 프로그램의 일례는 ALIGN Plus(Scientific and Educational Software, Pennsylvania)이다. 당업자는, 비교되는 서열들의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 정렬을 측정하기 위한 적절한 파라미터들을 확인할 수 있다. 본원의 목적을 위해, 주어진 아미노산 서열 B에 대한, B와, 또는 B와 비교한 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 퍼센트(대안적으로서, 주어진 아미노산 서열 B에 대한, B와 또는 B와 비교하여 소정의 아미노산 서열 동일성 %를 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로서 지칭될 수 있음)는 하기와 같이 계산된다: 100 x 분수 X/Y, 여기서 X는 A 및 B의 해당 프로그램의 정렬에서 서열 정렬 프로그램에 의해 동일한 매치로서 점수가 매겨진 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B 내의 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 퍼센트는 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 퍼센트와 동일하지 않을 것으로 이해될 것이다. 본원의 목적을 위해, 주어진 핵산 서열 D에 대한, D와, 또는 D와 비교한 주어진 핵산 서열 C의 핵산 서열 동일성 퍼센트(이는 대안적으로, 주어진 핵산 서열 D에 대한, D와, 또는 D와 비교한 소정의 핵산 서열 동일성 퍼센트를 갖거나 포함하는 주어진 핵산 서열 C로서 지칭될 수 있음)는 하기와 같이 계산된다: 100 x 분수 WYZ, 여기서 W는 C 및 D의 해당 프로그램의 정렬에서 서열 정렬 프로그램에 의해 동일한 매치로서 점수가 매겨진 뉴클레오타이드의 수이고, Z는 D 내의 뉴클레오타이드의 총 수이다. 핵산 서열 C의 길이가 핵산 서열 D의 길이와 동일하지 않은 경우, D에 대한 C의 핵산 서열 동일성 퍼센트는 C에 대한 D의 핵산 서열 동일성 퍼센트와 동일하지 않을 것으로 이해될 것이다.
본원에서 지칭되는 피험자는 포유류이다. 적합한 예로는, 가축(예컨대 소, 양, 고양이, 개, 말), 영장류(예를 들어 인간 및 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이), 토끼 및 설치류(예를 들어 마우스 및 래트) 등이 있다. 소정의 실시형태에서, 피험자는 인간이다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료하다" 또는 "치료"는 유익한 또는 요망되는임상 결과를 수득하기 위한 접근법이다. 본 발명의 목적을 위해, 유익한 또는 요망되는 임상 결과는 검출 가능하거나 검출 불가능하든지 간에, 증상의 완화, 질병 정도의 저하, 질병의 안정화된(예를 들어 악화되지 않는) 상태, 질병 확산의 예방, 질병 진행의 지연 또는 둔화, 질병 상태의 완화 또는 경감, 기존의 치료 섭생의 투여의 필요한 용량 및/또는 빈도의 감소, 및 차도(remission)(부분적인 또는 전체적인)를 포함한다. "치료"는 또한, 치료를 받지 않는 경우의 예상된 생존율과 비교하여 연장되는 생존율을 의미할 수 있다. 치료는 유익한 또는 요망되는 임상 결과를 수득하기에 충분한 기간 및/또는 충분한 빈도로 적용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "예방하다" 또는 "예방"은 치료를 지칭하며, 여기서, 개체는 장애를 갖고 있거나 가질 위험에 있는 것으로 공지되어 있거나 의심되지만, 장애의 증상을 나타내지 않거나 최소의 증상을 나타낸다. 예방적 치료를 수행하는 개체는 증상의 개시 전에 치료될 수 있다.
"치료적 유효량"은 임상 결과(예를 들어 증상의 완화, 임상 종점의 달성)를 포함하여 유익한 또는 요망되는 결과를 수행하기에 충분한 양이다. 치료적 유효량은 하나 이상의 투여로 투여될 수 있다. 질병 상태의 측면에서, 치료적 유효량은 질병을 완화하거나, 안정화시키거나, 발병을 지연시키기에 충분한 양이다.
본 발명의 재조합 바이러스 벡터는 일반적으로, 단리된 재조합 바이러스 벡터일 것이며, 즉, 이의 천연 환경의 구성성분으로부터 분리되고/거나 회수될 것으로 이해될 것이다. 유사하게는, 본 발명의 재조합 바이러스 입자는 일반적으로, 단리된 재조합 바이러스 입자일 것이며, 즉, 이의 천연 환경의 구성성분으로부터 분리되고/거나 회수될 것이다.
본 발명에 따르면, 약학적 조성물이 또한 제공되며, 이러한 약학적 조성물은 본 발명의 재조합 바이러스 벡터, 또는 본 발명의 재조합 바이러스 입자, 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함한다.
본 발명의 약학적 조성물은 조성물의 임의의 적절한 투여 방식, 예를 들어 정맥내 투여, 또는 상기 기재된 임의의 추가의 적절한 투여 방식에 적합할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 인간 피험자에게 투여되기에 적합할 수 있다.
본 발명에 따르면, 키트가 또한 제공되며, 이러한 키트는 본 발명의 재조합 바이러스 벡터, 또는 본 발명의 재조합 바이러스 입자, 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 키트는 추가로, 본 발명의 방법, 벡터 또는 바이러스 입자 중 임의의 것을 사용하여 본원에 기재된 보체-매개 장애를 치료하기 위한 설명서를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 치료가 필요한 피험자의 주사에 적합한 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 추가로, 하기들 중 임의의 것을 포함할 수 있다: 피험자 내로의 투여를 수행하기 위한 설명서와 함께 완충제, 필터, 주사바늘, 주사기 및 포장 인서트. 적합한 포장 물질이 또한, 포장될 수 있고, 예를 들어 바이얼(예컨대 밀봉된 바이얼), 용기, 앰플, 보틀, 병, 가요성 포장재(예를 들어 밀봉된 Mylar 또는 플라스틱 백)를 포함하여 당업계에 공지된 임의의 포장 물질일 수 있다. 이들 포장 물질은 추가로 멸균되고/거나 밀봉될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물 또는 키트는 단일 단위 투여량 또는 다중 투여량 형태로 포장될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물 및 본 발명의 키트의 내용물은 일반적으로, 멸균되고 실질적으로 등장성인 용액으로서 제제화된다.
약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 및 희석제는 약물학적으로 효과적인 성분의 투여를 용이하게 하는 상대적으로 불활성 성분이고, 액체 용액 또는 현탁액으로서, 에멀젼으로서, 또는 사용 전에 액체 중 용해 또는 현탁에 적합한 고체 형태로서 공급될 수 있다. 예를 들어, 부형제는 형태 또는 일관성을 제공할 수 있거나, 희석제로서 작용할 수 있다. 적합한 부형제로는, 안정화제, 습윤 및 유화 작용제, 삼투질 농도를 다양화시키기 위한 염, 캡슐화제, pH 완충 성분, 및 완충제 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 이러한 부형제는 피험자에게 (예를 들어 정맥내로 또는 간까지) 직접 전달하기에 적합한 임의의 약학적 제제를 포함하고, 이러한 부형제는 과도한 독성 없이 투여될 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 부형제로는, 소르비톨, 다양한 TWEEN 화합물들 중 임의의 화합물, 및 액체, 예컨대 물, 식염수, 글리세롤 및 에탄올 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 약학적으로 허용 가능한 염, 예를 들어, 무기산의 염, 예컨대 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 포스페이트, 설페이트 등; 및 유기산의 염, 예컨대 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트 또는 벤조에이트가 포함될 수 있다.
일부 실시형태에서, 약학적으로 허용 가능한 부형제는 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 이러한 약학적으로 허용 가능한 담체는 멸균 액체, 예컨대 물 및 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 것을 포함하여 오일, 예컨대 땅콩유, 대두유, 미네랄 오일일 수 있다. 식염수 용액 및 수성 덱스트로스, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 글리세롤 용액이 또한, 특히 주사 용액을 위한 액체 담체로서 이용될 수 있다. 추가의 성분, 예를 들어 보존제, 완충제, 토너시티 작용제(tonicity agent), 항산화제 및 안정화제, 비-이온성 습윤 또는 정화 작용제, 또는 점도-증가제가 또한 사용될 수 있다.
약학적으로 허용 가능한 부형제 및 담체의 완전한 고찰은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J. 1991)]에서 입수 가능하다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 약학적 조성물의 바이러스 역가는 적어도 5 x 1012, 6 x 1012, 7 x 1012, 8 x 1012, 9 x 1012, 10 x 1012, 11 x 1012, 15 x 1012, 20 x 1012, 25 x 1012, 30 x 1012 또는 50 x 1012 게놈 복사체/mL이다. 일부 실시형태에서, 조성물의 바이러스 역가는 5 x 1012 내지 10 x 1012, 10 x 1012 내지 25 x 1012, 또는 25 x 1012 내지 50 x 1012 게놈 복사체/mL이다. 일부 실시형태에서, 조성물의 바이러스 역가는 5 x 1012 내지 6 x 1012, 6 x 1012 내지 7 x 1012, 7 x 1012 내지 8 x 1012, 8 x 1012 내지 9 x 1012, 9 x 1012 내지 10 x 1012, 10 x 1012 내지 11 x 1012, 11 x 1012 내지 15 x 1012, 15 x 1012 내지 20 x 1012, 20 x 1012 내지 25 x 1012, 25 x 1012 내지 30 x 1012, 30 x 1012 내지 50 x 1012, 또는 50 x 1012 내지 100 x 1012 게놈 복사체/mL이다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 약학적 조성물의 바이러스 역가는 적어도 5 x 109, 6 x 109, 7 x 109, 8 x 109, 9 x 109, 10 x 109, 11 x 109, 15 x 109, 20 x 109, 25 x 109, 30 x 109 또는 50 x 109 형질도입 단위/mL이다. 일부 실시형태에서, 조성물의 바이러스 역가는 5 x 109 내지 10 x 109, 10 x 109 내지 15 x 109, 15 x 109 내지 25 x 109, 또는 25 x 109 내지 50 x 109 형질도입 단위/mL이다. 일부 실시형태에서, 조성물의 바이러스 역가는 5 x 109 내지 6 x 109, 6 x 109 내지 7 x 109, 7 x 109 내지 8 x 109, 8 x 109 내지 9 x 109, 9 x 109 내지 10 x 109, 10 x 109 내지 11 x 109, 11 x 109 내지 15 x 109, 15 x 109 내지 20 x 109, 20 x 109 내지 25 x 109, 25 x 109 내지 30 x 109, 30 x 109 내지 50 x 109, 또는 50 x 109 내지 100 x 109 형질도입 단위/mL이다.
바이러스 역가와 관련하여 사용된 바와 같이 용어 "형질도입 단위"는 예컨대 WO 2015/168666의 실시예 또는 예를 들어 문헌[Xiao et. al., (1997) Exp. Neurobiol., 144:113-124; 또는 Fisher et al. (1996) J. Virol., 70:520-532](LFU 검정법)]에 기재된 바와 같이 기능적 검정법에서 측정된 바와 같은 기능성 이식유전자 생성물의 생성을 초래하는 감염성 재조합 벡터 입자의 수를 지칭한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 약학적 조성물의 바이러스 역가는 적어도 5 x 1010, 6 x 1010, 7 x 1010, 8 x 1010, 9 x 1010, 10 x 1010, 11 x 1010, 15 x 1010, 20 x 1010, 25 x 1010, 30 x 1010, 40 x 1010 또는 50 x 1010 감염 단위/ml이다. 일부 실시형태에서, 조성물의 바이러스 역가는 적어도 5 x 1010 내지 10 x 1010, 10 x 1010 내지 15 x 1010, 15 x 1010 내지 25 x 1010, 또는 25 x 1010 내지 50 x 1010 감염 단위/ml이다. 일부 실시형태에서, 조성물의 바이러스 역가는 적어도 5 x 1010 내지 6 x 1010, 6 x 1010 내지 7 x 1010, 7 x 1010 내지 8 x 1010, 8 x 1010 내지 9 x 1010, 9 x 1010 내지 10 x 1010, 10 x 1010 내지 11 x 1010, 11 x 1010 내지 15 x 1010, 15 x 1010 내지 20 x 1010, 20 x 1010 내지 25 x 1010, 25 x 1010 내지 30 x 1010, 30 x 1010 내지 40 x 1010, 40 x 1010 내지 50 x 1010, 또는 50 x 1010 내지 100 x 1010 감염 단위/ml이다.
바이러스 역가와 관련하여 사용된 바와 같이 용어 "감염 단위"는 예를 들어, 문헌[McLaughlin ef al. (1988) J. Virol., 62:1963-1973]에 기재된 바와 같이 복제 중심 검정법으로도 공지된 감염 중심 검정법에 의해 측정된 바와 같은 감염적 및 복제-적임(competent) 재조합 벡터 입자의 수를 지칭한다.
나아가 본 발명에 따라, rAAV 입자의 생성을 위한 키트가 제공되며, 상기 키트는 본 발명의 rAAV 벡터, 및 AAV 복제 및 캡시드 단백질을 인코딩하는 핵산 및 생산성 AAV 수명 사이클에 필요한 유전자를 인코딩하는 핵산을 포함하는 하나 이상의 헬퍼 플라스미드를 포함한다.
소정의 실시형태에서, rAAV 입자의 생성을 위한 본 발명의 키트는 AAV 복제 및 캡시드 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제1 헬퍼 플라스미드, 및 생산성 AAV 수명 사이클에 필요한 유전자를 인코딩하는 핵산을 포함하는 제2 헬퍼 플라스미드를 포함한다.
생산성 AAV 수명 사이클에 필요한 유전자는 아데노바이러스, 헤르페스바이러스 또는 바큘로바이러스 유전자일 수 있다. 특정한 실시형태에서, 유전자는 아데노바이러스 유전자, 특히 E1a, E1b, E2a, E4 및 VA RNA 아데노바이러스 유전자이다.
나아가 본 발명에 따르면, 약제로서 사용하기 위한 본 발명의 재조합 바이러스 벡터, 본 발명의 재조합 바이러스 입자 또는 본 발명의 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명은 또한, 보체-매개 장애의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 재조합 바이러스 벡터, 본 발명의 재조합 바이러스 입자 또는 본 발명의 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명에 따르면, 보체-매개 장애의 치료를 위한 약제의 제조에서, 본 발명의 재조합 바이러스 벡터, 본 발명의 재조합 바이러스 입자 또는 본 발명의 약학적 조성물의 용도가 제공된다.
보체-매개 장애는 대안적인 경로 조절에서의 결함과 연관이 있는 장애, 및 특히 보체 C3b 피드백 사이클의 과다-활성과 연관이 있는 장애일 수 있다.
본 발명에 따라 예방되거나 치료될 수 있는 보체-매개 장애의 예로는, 연령-관련 황반 변성(AMD)(특히 조기(건성) AMD 또는 지도모양 위축), 고밀도 침착병(DDD), 비정형 용혈성 요독 증후군(aHUS), C3 사구체병증, 2형 막증식성 사구체신염(MPGN2), 아테롬성 동맥경화증, 만성 심혈관 질환, 알츠하이머병, 발작성 야간 혈색소뇨증(PNH), 노인의 자가염증 질환 등이 있다.
본 발명에 따라 예방되거나 치료될 수 있는 보체-매개 장애의 추가의 예로는, MPGN 유형 I, III형 MPGN, 길랑-바레 증후군, 헤노흐-쇤라인 자반병, IgA 신증 및 막 사구체신염 등이 있다.
본 발명의 실시형태는 현재, 첨부된 도면을 참조로 하여 예로서만 기재되어 있으며, 여기서:
도 1은 보체 활성화의 단계의 개요를 보여준다;
도 2는 척추동물 보체의 대안적인 경로의 피드백 루프를 보여준다;
도 3은 보체 활성화 동안 C3의 단백분해를 보여준다. C3은 α 사슬 및 β 사슬로 구성된다. β 사슬은 변형되지 않는 한편, α 사슬은 몇 번 절단된다: i) C3a는 C3 컨버타제에 의해 절단되고, 나머지 단백질은 이제 C3b로 지칭되며; ii) 2개의 부위들에서의 FI 절단은 C3f 펩타이드(공동인자로서 FH)를 방출하며, 이는 이제 iC3b 또는 C3bi로 지칭되고; iii) 공동인자로서 CR1과 함께, FI는 다시 iC3b의 68 kDa 단편에서 절단된다. C3c는 확산되는 한편, C3dg는 세포 표면에 부착된 채로 유지되고, 트립신-유사 프로테아제에 의해 더 절단될 수 있다;
도 4는 AAV 유전자 요법의 도식도를 보여준다;
도 5는 인자 I의 혈청 수준의 과발현에 사용된 AAV2/8 구축물을 보여준다. 이식유전자, 여기서는 인자 I가 프로모터와 폴리아데닐화 인지 부위 사이에 삽입된다. 양면 상의 측면에 존재하는 것은 2개의 역 말단 반복부(ITR)들이다. 캡시드 서열 및 추가의 아데노바이러스 유전자는 다른 플라스미드 내로 포장된다;
도 6은 웨스턴 블롯에 의해 측정된 상승된 인자 I 수준을 보여준다. 마우스 혈청을 5%까지 희석시켰고, 10 μl를 SDS PAGE에 의해 분리하였다. FI를, mFI의 중쇄와 반응하는 α-FI 항체(1:500)를 이용하여 검출하였다. 실험을 2회 수행하였다;
도 7은 저해 ELISA의 대표적인 결과를 보여준다. (a) 검정법은 정제된 재조합 mFI의 공지된 농도를 이용하여 보정된다. 0.25 μg/ml보다 낮은 농도는 양성 신호를 제공하며, (b) 정상적인 마우스 혈청(NMS)은 0.625%보다 낮은 농도에서 양성이다. (c 내지 f) AAV-구축물을 주사한 마우스 유래의 혈청을 사용한 저해 ELISA이다. 1개 그룹 당 오로지 1개의 혈청 시료만 여기에 나타나 있다. 실험을 3벌 중복에서 2회 수행하였다;
도 8은 과발현된 인자 I의 기능적 활성을 측정하기 위한 C3b 및 iC3b 시험관내 절단 검정법의 결과를 보여준다. 기질, 즉, C3α'1 사슬이 신속하게 발생되고, 이의 절단 속도, 즉 C3dg의 발생이 비교된다. C3 절단을 α-hC3dg(1 μg/ml)를 이용하여 검출하였다. 실험을 2회 수행하였다;
도 9는 과발현된 인자 I의 기능적 활성을 시험하기 위해 iC3b 침착 검정법의 결과를 보여준다. 주사된 마우스의 혈청을 대안적인 경로 보체 고정 완충제에서 25%까지 희석시키고, LPS-코팅된 플레이트 상에 로딩하였다. 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 결합된 iC3b를 α-인간 C3c 항체를 이용하여 검출하였다. 흡수율을 415 nm에서 측정하였다. 실험을 2벌 중복에서 2회 수행하였다.
실시예 1
AAV-발현 시스템
이러한 실시예는 뮤린 헤파토사이트에서 인자 I의 과발현을 가능하게 하는 뮤린 인자 I를 인코딩하는 재조합 바이러스 벡터의 제조, 및 이러한 벡터를 캡시드화하는 바이러스 입자(비리온)의 제조를 기재한다.
아데노-연관된 바이러스(AAV) 구축물을 사용하였다. 이러한 구축물은 간 향성을 부여하기 위해 AAV8 캡시드 단백질에 의해 위형화된 AAV2 바이러스 백본으로 구성된다. 따라서, 바이러스는 주로 간을 감염시키고, FI 이식유전자는 이의 천연 부위에서 과발현된다. 인자 I 이식유전자의 간외(extra-hepatic) 발현을 더 억제시키기 위해, 2개의 추가의 ApoE 간 조절 영역들을 포함하는 α-1-항-트립신(AAT) 프로모터를 사용하였다(도 5 참조). 바이러스 생성에 필요한 모든 유전자들은, 하기에 더 기재되는 바와 같이, AAV 포장을 위한 잔여 결손 유전자를 제공하는 세포주 내로 공동-형질감염되는 3개의 플라스미드들 사이에서 분할된다.
AAV(야생형): 야생형 AAV의 4.7 kb 게놈은 2개의 역 말단 반복부(ITR)들 및 2개 세트의 개방형 해독틀(ORF)들을 특징으로 하고, 이는 복제(Rep) 단백질 및 캡시드(Cap) 단백질을 인코딩한다. Rep ORF는, 주로 AAV 복제 및 통합을 조절하는 데 작용하는 4개의 단백질들(78, 68, 52 및 40 kDa)을 인코딩한다. Cap ORF는 3개의 구조 단백질(85 kDa(VP1), 72 kDa(VP2) 및 61 kDa(VP3))을 인코딩한다. VP1:VP2:VP3 비율은 캡시드에서 대략 1:1:8 또는 1:1:10이다.
재조합 AAV(rAAV): 이러한 실시예에 사용된 rAAV는 간 향성을 부여하기 위해 AAV8 캡시드에 의해 위형화된 AAV2(rAAV2/8)이다. rAAV2/8 비리온은 하기 기재된 3개의 플라스미드들을 사용하여 삼중 형질감염에 의해 HEK293 세포 내에 포장된다:
1. pAM2AA(ITR 및 이식유전자 발현 카세트): 이러한 플라스미드에서, AAV2 유래의 145 bp 역 말단 반복부(ITR)는 이식유전자 카세트의 측면에 존재한다. 2개의 ITR들은 AAV 수명 사이클에서 모든 단계들에 필수적인 유일한 cis 요소들이다. 이들 ITR은 DNA 복제의 기원으로서 작용하며, 포장 및 통합 신호를 제공하고, WT AAV 유전자 발현을 위한 조절 요소로서 역할을 한다. pAM2AA 카세트는 2개의 ApoE 인핸서들과 함께 인간 α-1-항트립신(hAAT) 프로모터, 및 후속해서 이식유전자를 인코딩하는 cDNA를 포함한다. 3'-비번역 영역(UTR)은 마멋 간염 전사-후 조절 요소(WPRE) 및 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호(BGH 폴리A)를 함유한다. WT AAV의 포장 용량은 대략 4.7 kb이다. pAM2AA에서, 조절 영역은 대략 2390 bp까지 차지하여, 삽입 이식유전자에 대해서는 대략 231O bp를 남겨 둔다.
2. p5E18VD/8(AAV 헬퍼 서열): Rep 유전자 및 Cap 유전자를 포함하여 AAV2 유래의 결실된 바이러스 코딩 서열은 p5 AAV 프로모터에 의해 구동되는 이러한 플라스미드에 존재한다. 여기서, AAV2 캡시드를 인코딩하는 서열은 AAV8 캡시드를 인코딩하는 서열에 의해 대체된다. 벡터와 헬퍼 서열 사이에 상동성이 존재하지 않아, 야생형 AAV 재조합을 발생시킬 확률을 감소시킨다.
3. pXX6(아데노바이러스 헬퍼 기능): 생산성 AAV 수명 사이클에 필수적인 아데노바이러스 유전자는 E1a, E1b, E2a, E4 및 VA RNA 유전자이다. E1a는 아데노바이러스 유전자뿐만 아니라 AAV Rep 및 Cap 유전자의 전사를 상향조절하는 트랜스활성자로서 역할을 한다. E1b는 바이러스 mRNA의 수송을 용이하게 하기 위해 E4와 상호작용한다. E4는 또한, AAV DNA 복제를 용이하게 하는 데 관여한다. E2a 및 VA RNA는 바이러스 mRNA 안정성, 및 특히 Cap 전사체에 대해 번역 효율을 증강시키는 작용을 한다. pXX6은 필수적인 아데노바이러스 헬퍼 유전자를 함유하지만, 아데노바이러스 구조 유전자 및 복제 유전자는 결여되어 있다. pXX6에 포함된 필수적인 헬퍼 유전자는 E2a, E4 및 VA 유전자이다. E1a 및 E1b가 둘 다 결실되었고, 결손 E1a 및 E1b 유전자는 HEK293 세포에 의해 보완된다.
뮤린 인자 I을 인코딩하는 재조합 AAV 벡터(AAV mFH)의 제조
pAM2AA 발현 벡터 내로의 인자 I의 클로닝을 가능하게 하기 위해, 제한 부위는 상용 가능한(compatible) 효소 인지 부위로 변해야 했다(프라이머 서열: FI-AAV-F: 5'- TCT AGA GGA TCC GCC ACC ATG AAG CTC - 3'(서열 번호: 5); 및 FI-AAV-R: 5'-AAG CTT GGC GGC CGC TCA GAC ATT GTG TTG AGA AAC AAG AGA CCT TC - 3'(서열 번호:6)을 사용하여). 새로운 서열을 PCR 증폭을 통해 마우스 인자 I cDNA에 부착시켰다. 증폭된 구축물의 정제 후, 이러한 구축물을 pAM2AA 내로 연결하였다. 뮤린 보체 인자 I의 cDNA를 XbaI 및 HindIII 제한 부위를 사용하여 pAM2AA 내로 클로닝하였다. 일단 벡터가 제조되면, AAV_GFP 벡터를 모든 후속적인 바이러스 포장 및 정제 단계들과 함께 동일한 방식으로 처리하였다. 이는, 간 GFP의 발현이 형광 현미경 하에 시각적으로 쉽게 추적될 수 있기 때문에, 오류가 발생하지 않았음을 보장한다.
rAAV2/8 비리온의 제조
뮤린 보체 인자 I의 cDNA를 포함하는 pAM2AA 벡터를 SURE2 세포 내로 형질변환시켜, 원치않는 재조합 사건을 방지하였다. HEK293 세포를, CaPO4를 사용하여 모든 3개의 플라스미드들에 의해 형질감염시켰다. 형질감염 후 2일째에, 세포를 수합하고, 세포를 건조 얼음/100% 에탄올 배쓰 내에서 반복된 냉동-해동에 의해 용해시킨 다음, -80℃에 저장하였다. AAV 비리온을 세슘 클로라이드 구배 상에서 정제하고, 바이러스 입자를 실시간 PCR에 의해 정량화하였다.
실시예 2
아데노-연관된 바이러스 전달 시스템에 의한 보체 인자 I의 생체내 과발현
이러한 실시예는 실시예 1에 기재된 바와 같이 생성된 AAV_mFI 벡터를 캡시드화하는 비리온을 이용한 마우스로의 주사, 비리온의 주사 후 인자 I의 혈장 수준의 확인, 및 주사 후 마우스에서 대안적인 보체 경로의 하향조절의 평가를 기재한다.
마우스에 주사
12마리의 마우스들을 4개의 그룹으로 나누었으며, 이 그룹들에게 상이한 농도의 AAV_mFI 또는 대조군 바이러스 조제물을 제공하였다:
· 저 mFI = 5x109 비리온
· 중 mFI = 5x1010 비리온(= 이전의 실험에서 100% 간 형질도입)
· 고 mFI = 5x1011 비리온
· GFP = 5x1011 비리온.
마우스에게 꼬리 정맥 내로 정맥내 주사하였다. 4주 후 혈액을 채혈하고, 8주 후 마우스를 안락사시키고(cull), 이들의 혈청을 분석하였다.
결과
상승된 인자 I 수준의 정량화
FI 수준을 정량화하기 위해, 폴리클로날 커스텀-제조 α-mFI 항혈청을 주문하였다. 한편, 웨스턴 블롯을 수행하였다. 여기서, α-FI(Santa Cruz, sc-69465)를, FI 수준을 대략적으로 정량화하기 위한 검출 항체로서 사용하였다. 혈청을 순차적인 단계에서 희석시켜, 파이펫팅 오류를 감소시켰다. FI의 상대 농도를 하기와 같이 확인하였다: AAV_GFP < AAV_FI 저 < AAV_FI 중 < AAV_FI 고(도 6 참조).
일단 항혈청이 도달하면, 훨씬 더 민감한 검정법인 저해 ELISA를 수행하였다. 혈청을 예정된 농도의 α-mFI-항혈청과 함께 예비-인큐베이션한 다음, 재조합 mFI로 코팅된 마이크로타이터 플레이트 상에서 인큐베이션하였다. α-mFI-항혈청의 제조 및 결합 특이성은 하기 물질 및 방법 섹션에 기재되어 있다. 오로지 비결합된 항체만 플레이트 상의 고정된 항원과 반응할 수 있다. 따라서, 이러한 검정법만, 항혈청 내 α-mFI-항체의 양이 혈청 내 mFI를 초과하는 경우에 양성 결과를 제공한다. 이러한 검정법은 공지된 인자 I 농도에 의해 보정된다.
마이크로타이터 플레이트가 1개 웰 당 1 μg mFI로 코팅된 경우, 75 μg/ml 초과의 항혈청 농도가 강한 양성 신호를 제공하는 것으로 확인되었다(도시되지 않음). 도 7은 저해 ELISA의 대표적인 결과를 보여준다. 이러한 검정법은 0.25 μg/ml보다 낮은 농도에서 양성 신호를 제공한다(도 7a). 이러한 교정을 사용하여, 혈청 시료 내 FI의 농도가 확인될 수 있다. 우선, 야생형 마우스의 정상적인 시료를 시험하였으며, 0.625%보다 낮은 농도는 양성 신호를 제공하였다(도 7b). 이러한 검정법에서 양성 신호의 역치가 0.25 μg/ml mFI임을 알고, 100% 혈청 내 mFI의 농도, 즉 40 μg/ml를 계산할 수 있다. 동일한 계산을, AAV-구축물을 주사한 마우스 혈청 각각에 대해 수행하였고(도 7c 내지 7f), 1개 그룹 당 농도 범위를 확인하였다(표 2 참조).
Figure pat00003
표 2. 아데노-연관된 바이러스 발현 시스템에 의한 과발현 후 인자 I의 정량화
GFP 대조군 내 20 μg/ml 내지 40 μg/ml FI로부터 출발하여, 농도는 저 FI 용량에서는 40-80 μg/ml이며, 중 FI 용량에서는 80 μg/ml이고, 고 FI 용량에서는 80-160 μg/ml이다. 혈청 농도는 AAV 유전자 요법에 의해 정상적인 수준의 4배 이하까지 상승될 수 있는 것으로 결론내려졌다.
상승된 인자 I 수준을 가진 혈청의 기능 분석
유전자이식(transgenic) 마우스의 혈청을 재조합 인자 I와 유사한 방식으로 분석하였다. 과발현된 단백질이 이론학적으로 내인성 FI로서 가공되고 분비될 것이기 때문에, 마우스의 혈청은 서로 직접적으로 비교될 수 있을 것이다. FI 증가가 면역블로팅 및 저해 ELISA에 의해 확인된 후, 과발현된 효소의 기능적 활성이 확인되어야 했다. 따라서, 혈청을 시험관내 C3b 절단 검정법, 용혈 검정법 및 iC3b 침착 검정법에 의해 FI 기능적 활성에 대해 분석하였다.
C3b 및 iC3b 절단을 시험관내 검정법에서 측정하였다. 인간 C3를 트립신에 의해 C3b로 절단하고, 유전자이식 마우스 유래의 hFH 및 혈청과 함께 인큐베이션하였다. 30분 후, 1 ㎍ 인간 C3를 SDS 겔 상에 로딩하고, 클론 9와 함께 블로팅하였다. C3b를 우선 신속한 반응(항체가 iC3b의 C3α'1 사슬과 반응함)에서 iC3b로 절단한 다음, 훨씬 더 느린 반응에서 C3dg로 더 절단한다. 이러한 제2 반응은 증가된 FI 농도에 의해 속도가 상승될 수 있다. 상이한 마우스 그룹 유래의 혈청 및 인간 인자 H와 함께 인큐베이션된 인간 C3b는 AAV_FI 중 그룹 및 AAV_FI 고 그룹 내에서 인큐베이션 기간 이내에 C3dg로 더 효율적으로 절단된 것으로 나타난다(도 8, 레인 10 내지 14 참조). 대조군 플라스미드만 주사된 마우스는 인큐베이션 기간 이내에 C3dg 밴드를 거의 보여주지 않는다.
다음 단계는, 과발현된 인자 I가 또한 전체 혈청에서 기능적으로 활성이었음을 보여주는 것이었다. 이를 위해, 마이크로타이터 플레이트를 LPS로 코팅시키고, 37℃에서 유전자이식 마우스 혈청과 함께 인큐베이션한 후 C3b/iC3b 침착을 측정하였다. 결과는 도 9에 나타나 있다. 재조합 단백질로서, AAV_mFI가 주사된 마우스는 LPS 상에서 더 적은 C3b/iC3b 침착을 보여주었는데, 그 이유는 대안적인 경로의 이들의 양성 피드백 루프가 인자 I에 의해 방해되었기 때문이다. C3b/iC3b 침착은 AAV_저 FI 그룹에서 11%만큼, AAV_중 FI 그룹에서 38%만큼, 및 AAV% 고 FI 그룹에서 50%만큼 감소되었다.
보체 인자 I는 바이러스 벡터를 사용하여 유전자 요법에 의해, 대안적인 보체 경로의 유의한 하향조절을 유발하는 수준까지 과발현될 수 있는 것으로 결론내려졌다.
고찰
유전자 요법은 다양한 질병들의 치료를 위한 새롭고 흥미로운 치료 옵션이다. 이러한 요법은, 관심 단백질의 DNA 서열을 갖는 구축물에 의한 각각의 세포의 형질감염 후 이러한 단백질의 생체내 발현을 가능하게 한다. 이론학적으로, 유전자 요법은 모든 단백질의 발현에 이용될 수 있긴 하지만, 실제로는 통상적으로 서열의 길이와 같은 한계가 존재한다. 유전자 요법을 사용하여, 결손 단백질은 대체될 수 있다. 그러나, 이러한 대체는 항상, 면역원성의 위험을 동반한다. 본 발명자들은, 기존의(내인성) 단백질의 농도가 상승되는 경우, 이러한 위험이 발생하지 않음을 이해하였다. 이러한 연구에서 본 발명자들은, 보체 인자 I이 유전자 요법에 의해, 대안적인 보체 경로의 유의한 하향조절을 유발하는 수준까지 과발현될 수 있는지 명시하고자 하였다.
본 발명자들은 마우스 보체 인자 I의 유전자이식 발현을 위한 벡터를 발생시키는 데 성공하였다. 사용된 바이러스 발현 시스템은 AAV2를 기반으로 하고, 이의 캡시드는 AAV8으로부터 유래된다. 종합하여, 이러한 AAV2/8 구축물은 주로 마우스에서 간 형질도입을 초래하지만, 바이러스 입자는 또한, 간외 조직에서도 발견될 수 있다. 간-특이적 발현을 증가시키기 위해, 이식유전자는 헤파토사이트에서의 높은 수준의 특이적 발현을 위한 2개의 ApoE 간 조절 영역들과 함께 α-1-항-트립신 프로모터의 조절 하에 존재한다. 따라서, 이식유전자 발현은 헤파토사이트에서만 발생해야 한다(이따금, 매우 밀접하게 관련된 조직인 췌장 조직에서도 이식유전자 발현이 매우 드물게 존재할 수 있긴 함).
본 발명자들은, 사용되는 AAV 발현 시스템에 의한 FI의 과발현이 명백하게 보체 하향조절에 효과를 가지고, 둘째로 이러한 효과가 적정 가능하고, 벡터 용량이 증가됨에 따라 더욱 두드러진다는 것을 언급하였다. 총 FI 증가를 측정하기 위해, 상업적으로 입수 가능한 α-FI 항체가 ELISA에서 마우스 FI 농도를 측정하는 데 부적합한 것으로 확인되었기 때문에(이들 항체는 본래의 FI와는 반응하지 않지만, 웨스턴 블롯에서 변성된 단백질과만 반응함), 마우스 인자 I에 대한 폴리클로날 항체가 토끼에서 상승되었다. 이러한 폴리클로날 커스텀-제조 항체를 사용하여, 혈청 농도가 정상적인 수준의 4배 이하까지, 즉, 대조군 마우스에서 20 μg/ml 내지 40 μg/ml로부터 유전자이식 마우스에서 80 μg/ml 내지 160 μg/ml FI까지 증가되었음을 보여주는 것이 가능하였다.
또 다른 흥미로운 질문은, 이식유전자 발현이 급성기 반응에서 더 증가되는지의 여부이다. 사용되는 구축물에서, FI가 α-1-항-트립신 프로모터(α-1-항-트립신 및 FI는 둘 다 양성 급성기 반응물들임)의 조절 하에 존재하기 때문에, 이식유전자 발현이 또한 급성기 반응에서 증가될 것으로 예상될 수 있다. 이를, LPS 또는 IL6를 야생형 마우스 및 유전자이식 마우스에 주사한 다음, FI 증가 속도를 비교함으로써 쉽게 수행될 수 있을 간단한 동물 실험에서 시험할 수 있을 것이다. 내인성 FI 발현 및 유전자이식 FI 발현이 둘 다 증가할 것을 가정하면, 이는 AAV 투여 동안 초기 바이러스 로드(laod)를 감소시킬 해결방안이 될 수 있을 것이지만, 필요하다면 발현을 증가시킬 옵션도 존재할 것이다.
인자, 예컨대 숙주 면역력은 인간에서 AAV의 광범위한 사용을 방지하였다. 일단 AAV에 노출되면, 사람은 유전자 전달을 차단하는 중화 항체를 발달시킨다. 그러나, 캡시드 단백질을 조작함으로써, 더 높은 형질도입 효율을 가지고 중화 항체에 의해 인지되지 않는 새로운 변이가 발생될 수 있다. 따라서, 이들 면역 반응을 제한하기 위한 새로운 접근법들이 취해진다(문헌[Mingozzi, et al., Science Translational Medicine, 5(194):194ra92-194ra92, July 2013]). 최근의 임상 연구들은 중증 B형 혈우병 환자에서 인자 IX의 치료적 수준을 2년 동안 초래하는 AAV 벡터의 단일 주입의 성공을 보여주었지만(문헌[Mingozzi and High, Blood, 122(1):23-36, July 2013]), 정상적인 FIX 수준의 단지 1%의 증가가 B형 혈우병 환자에서 중증 출혈 표현형을 실질적으로 완화한다는 것이 주지되어야 한다(문헌[Nathwani, et al., N. Engl. J. Med., 371 (21): 1994-2004, November 2014]). 이전에, 골격근에서 FIX의 AAV 이식유전자 발현은 10년 동안 지속되는 것으로 나타났지만, 이러한 경우, 순환하는 FIX 수준은 치료미달(subtherapeutic)(< 1%)로 남아 있었다(문헌[Buchlis, et al., Blood, 119(13):3038-3041, March 2012]).
최대 50%만큼의 FI 증가는 인간 요법을 목적으로 하는 것이다. 이는 마우스에서 AAV_mFI-구축물을 사용하여 훨씬 초과되고, iC3b 침착 검정법은 높은 AAV_mFI 용량에서 50% 이하의 C3b 침착 감소를 보여준다. 별도로, 본 발명자들은, 50% 초과의 FI는 고-위험성 컴플로타입의 활성을 저-위험성 컴플로타입의 활성으로 전환시키는 것을 보여주었다(Lay 등, 2015(상기)). 이들 컴플로타입이 둘 다 극도로 드물고, 대부분의 사람들이 2개의 극단(extreme) 내에 있을 것이기 때문에, 대부분의 사람들에 대한 위험성 감소 효과는 단지 50% FI 증가 범위 내에서만 필요하다.
물질 및 방법
α-마우스 인자 I
이러한 폴리클로날 항체는 Santa Cruz Biotechnology, Inc(# sc-69465)사로부터 상업적으로 입수 가능하다. 항체는 염소에서 마우스 인자 I의 중쇄 내의 펩타이드에 대해 상승되었으며, 환원성 및 비-환원성 웨스턴 블롯 또는 ELISA에서 중쇄를 인지한다. 여전히 온전한 경우, 항체는 또한, 프로-효소를 인지한다. 그렇지만, 면역화에 사용되는 펩타이드가 너무 짧기 때문에 항체는 침전되지 않고 있다.
정상적인 작용 농도 1:500.
α-마우스 인자 I 항혈청
이러한 항체는 상업적으로 입수 가능하지 않고, 오크터로니(Ouchteriony) 이중 면역확산 검정법에서 인자 I 수준의 용이한 확인을 허용할 mFI에 대한 침전 항체(precipitating antibody)를 얻기 위해 Absea Biotechnology Ltd사로부터 주문하였다. 토끼를 박테리아에서 생성된 재조합 마우스 인자 I의 펩타이드 단편(203 aa 내지 510 aa)을 이용하여 면역화하였다. 일단 시험되면, 항체는 비-침전성인 것으로 판명되었고, 따라서, 저해 ELISA가 혈청에서 인자 I의 수준을 측정하도록 개발되었다. FI를 침전시키는 마우스 인자 I에 대한 다가 항체를 얻기 위해, 포유류 세포 배양물로부터 정제된 인자 I를 Absea Biotechnology Ltd사로 보냈지만, 이러한 제2 α-마우스 인자 I 항혈청에 대한 면역화 기간(8주)은 시간 내에 완료되지 않았지만 향후 실험에 사용될 수 있다.
클론 9 항체
클론 9는, C3가 인자 I에 의해 iC3b 또는 C3dg로 절단되는 경우에만 접근 가능하게 되는 C3g에서 네오-에피토프를 인지하는 래트 α-인간 C3g 항체이다(문헌[Lachmann, et al., Immunology, 41(3):503-515, November 1980]). 본래의 조건 하에, 클론 9는 인간 기원의 iC3b 또는 C3dg와만 반응하는 반면, 변성 조건 하에 클론 9는 인간 C3의 α, α' 사슬 및 68 kDa 단편을 검출하는데, 이들 모든 3개의 단편들이 C3g에 이의 에피토프를 포함하기 때문이다. 웨스턴 블롯에서 검출을 위한 정상적인 작용 농도는 0.5 μg/ml이고, 코팅을 위한 포착 항체로서의 정상적인 작용 농도는 1.35 μg/ml이다. 명칭 클론 9 및 알파-hC3g 항체는 상호호환적으로 사용될 것이다.
클론 4 항체
클론 4는 C3c에서 형태 에피토프를 인지하고 C3, C3b, iC3b 및 C3c와 반응하는 래트 모노클로날 항-C3c 항체이다(문헌[Lachmann, et al., Immunology, 41(3):503-515, November 1980]). 따라서, 이는 C3c에서 에피토프의 부재때문에 Cdg 또는 C3g에 결합하지 않는다. 정상적인 작용 농도는 5 μg/ml이다.
α-인간 C3c
이러한 항체는 Dako사로부터 상업적으로 입수 가능하고, C3b 및 iC3b 침착을 검출하는 데 사용된다. 이는 1:5000의 농도로 사용되고, α-토끼 이차 항체를 이용하여 검출된다.
효소-연결된 면역흡착 검정법(ELISA)
iC3b 침착 검정법 - "클론 9 검정법" Maxisorb Nunc 플레이트를 코팅 완충제 중 1.25 μg/웰의 농도의 클론 9를 이용하여 4℃에서 밤새 코팅시켰다. 다음날, 플레이트를 세척 완충제(= PBS-0.05% Tween 20)로 5x 세척하고, PBS-T 중 4% Marvel 밀크 파우더를 이용하여 실온에서 2시간 동안 블라킹시켰다. 플레이트를 5x 세척하고, 희석된 혈청 시료(PBS/젤라틴 중 1:2000)를 각각의 웰에 첨가하였다(혈청 시료의 제조는 하기에 기재되어 있음). 1시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 세척하고, PBS/젤라틴 중 5 μg/ml 농도의 비오틴화된(biotinylated) 클론 4와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 5x 세척하고, PBS/젤라틴 중 1:1000 엑스트라비딘-HRP와 함께 인큐베이션하였다. 마지막으로, 광범위하게 세척한 후, 100 μl TMB 기질(Invitrogen)을 첨가하고, 플레이트를 플레이트 쉐이커 상에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 반응을 50 μl H2SO4를 이용하여 중단시키고, 플레이트를 마이크로플레이트 리더(450 nm) 상에서 판독하였다.
C3b 침착 검정법 Maxisorb Nunc 플레이트를 코팅 완충제 중 1 μg/웰의 만난(mannan)(Sigma, 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) 유래의 만난) 또는 지질다당류(Sigma)를 이용하여 4℃에서 밤새 코팅시켰다. 다음날, 플레이트를 TBS-0.05% Tween-20에서 세척하고, TBS-T 중 1% BSA를 이용하여 실온에서 블라킹시켰다. 2시간 후, 플레이트를 세척하고, 재조합 단백질 및/또는 혈청의 일련의 희석물과 함께 인큐베이션하였다. 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 TBS-T로 세척하고, PBS/젤라틴 중 5 μg/ml 농도의 비오틴화된(biotinylated) 클론 4와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 5x 세척하고, TBS-T 내에서 1:5000으로 사용된 폴리클로날 토끼 α-인간 C3c 보체(Dako)와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 광범위하게 세척한 후, TBS-T 중 α-토끼 IgG(전체 분자)-알칼리 포스파타제(염소에서 생성됨, Sigma) 1:5000을 1시간 동안 첨가하였다. 플레이트를 TBS-T로 4x 세척하고, 검정법을 Fast p-니트로페닐 포스페이트 정제(Sigma)를 사용하여 발색시키고, 측정하였다(405 nm). 대안적으로, 검정법 발색을 3 M NaOH의 첨가에 의해 중단시키고, 이후에 판독하였다.
저해 ELISA 저해 ELISA에서, 마이크로타이터 플레이트를 항원으로 코팅시키고, 블라킹 후, 이차 항체를 이용하여 검출된 경우 강한 신호를 제공하는 항혈청의 농도를 확인한다. 그런 다음, 이러한 농도를 저해 검정법에서 사용하고, 미공지된 항원 농도의 시료의 일련의 희석물들과 함께 혼합한다. 동시에, 공지된 항원 농도의 희석 시리즈를 제조한다. 이러한 예비-인큐베이션 단계 동안, 면역 복합체가 형성되고, 혼합물을 코팅된 마이크로타이터 플레이트 상에 로딩한 경우, 항원의 농도가 특이적 항체의 양을 초과하지 않는 시료만 양성 신호를 제공한다. 과량의 항원이 존재하는 경우, 마이크로타이터 플레이트 상의 고정된 항원에 결합할 수 있는 유리(free) 항체는 입수 가능하지 않다. 따라서, 저해 검정법에서 양성 결과는, 유리 항원의 양이 제한적인 시료의 희석을 보여주고, 공지된 항원 농도의 표준 희석물과 비교함으로써, 미공지된 농도가 확인될 수 있다.
혈청 시료 내 마우스 인자 I의 농도를 확인하기 위해, Maxisorb Nunc 플레이트를 코팅 완충제 중 정제된 재조합 마우스 인자 I(1 μg/웰)를 이용하여 4℃에서 밤새 코팅시켰다. 다음날, 플레이트를 TBS-T 중 1% BSA를 이용하여 실온에서 2시간 동안 블라킹시켰다. 이러한 인큐베이션 동안, 마우스 혈청(5% 하향(downward)) 또는 정제된 마우스 인자 I(2 μg/ml 하향)의 희석물들을 1% BSA/150 mM NaCl에서 제조하였다. 그런 다음, 희석물들을 확인된 농도, 즉 150 μg/ml의 정제된 및 비오틴화된 α-mFI IgG와 1:1로 혼합하였다. 시료를 플레이트 쉐이커 상에서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 코팅된 플레이트 상으로 로딩하였다. 1시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 광범위하게 세척하고, 결합된 비오틴화된 α-인자 I 항체를 1:5000의 농도에서 엑스트라비딘-알칼리 포스파타제를 이용하여 검출하였다. 플레이트를 TBS-T로 4x 세척하고, 검정법을 Fast p-니트로페닐 포스페이트 정제(Sigma)를 이용하여 발색시키고, 측정하였다(405 nm).
웨스턴 블롯
웨스턴 블롯 분석을 수행하여, 시료에서 특이적 단백질을 검출하거나 이들 단백질의 존재를 확인하였다. 처음, 겔 전기영동을 수행하여, 단백질들을 이들의 크기에 따라 분리하였다. 단백질 시료를 4x 로딩 완충제 내에서 가열하여, 이들 시료를 변성시켰으며; 환원된 단백질이 분석에 필요하다면 β-머캅토에탄올을 첨가하였다. SDS 겔 전기영동을 4-12% 비스-트리스 단백질 겔(Invitrogen) 상에서 200 V에서 50분 동안 수행하였다. 단백질들을 분리한 후, 습식 트랜스퍼를 수행하여, 분리된 단백질을 PVDF 막 상으로 트랜스퍼시켰으며, 이러한 PVDF 막에서 표적 단백질이 특이적 항체를 이용하여 검출될 수 있다.
블롯을, 트랜스퍼 완충제-평형화된 블로팅 페이퍼, 겔 및 막(처음에 MeOH를 이용하여 활성화됨)을 트랜스퍼 카세트 내로 스태킹함으로써 어셈블리하였다. 트랜스퍼를 350 mA, 60 W에서 1시간 동안 수행하였다.
다음, 막을 블라킹 완충제 내에서 로테이터(rotator) 상에서 30분 동안 블라킹시켰다. 일차 항체 및 이차 항체를 둘 다 1시간 롤링 동안 인큐베이션하였으며, 이들 사이에서 막을 세척 완충제 내에서 5분 동안 3x 세척하였다. 마지막 세척이 약한 알칼리 pH에서 수행된 경우 사용된 2개의 기질들이 더 강한 신호를 제공하였기 때문에, 마지막 세척을 TBS-T, pH 8에서 수행하였다. 이차 항체의 컨쥬게이트에 따라, 상이한 기질들을 사용하였다: 단백질을 3 ml의 TMB 또는 AP 기질(Life Technologies)의 첨가에 의해 발색적으로 검출하였거나, 또는 퍼옥시다제 컨쥬게이션된 항체의 경우 ECL 시약의 첨가 후 화학발광적으로 검출하였다.
혈청의 제조
혈청 제조를 문헌(Lachmann, J. Immunol. Methods, 352(1-2): 195-197, January 2010)]에 기재된 바와 같이 수행하였다. 혈액을 멸균 조건 하에 채혈하고, 실온에서 응집되게 방치하였다. 초기 원심분리를 통상적으로, 벤치 원심분리기에서 약 3,000xg에서 실온에서 약 5분 내지 10분 동안 수행한다. 혈청을 취하고, 20,000 xg에서 2분 내지 5분 동안의 제2 고속 원심분리를 수행한다. 이러한 단계는 RBC의 모든 단편들을 제거하는 데 필수적이고, 이들 단편은 이후에 결과를 왜곡시킬 수 있다. 그런 다음, 향후 실험을 위해 이러한 제2 원심분리로부터 제거된 혈청을 냉각시키고, 분취시키고, 냉동시킬 수 있다. 기능적 검정법에 사용되는 혈청은 -80℃보다 높은 온도에서 결코 저장되어서는 안됨을 주지해야 한다. 반복된 냉동/해동은 분취물의 제조에 의해 피해져야 한다.
시험관내 검정법
프로-인자 I의 퓨린 분해 Hek 세포 및 CHO 세포는 둘 다, 오로지 부분적으로 가공된 mFI만 분비하고 있었고, 대부분은 인자 I의 불활성 프로-효소였다. 활성 인자 I를 얻기 위해, 정제된 프로-효소를 프로테아제 퓨린을 이용하여 분해하였다. 간략하게는, 정제된 mFI를 TBS에 대해 투석하였고, 그런 다음 10 mM CaCl2까지 조정하였다. 25 μg mFI 당 1 단위의 퓨린을 첨가하였다. 반응을 30℃에서 밤새 수행하였다. 다음날, 인자 I를 즉시 사용하거나, 분취하고 -80℃에서 저장하였다.
C3b 절단 검정법 C3b 절단 검정법에서, C3b를 우선, 문헌[(Bokisch, et al., J. Exp. Med., 129(5):1109-1130, May 1969)]에 기재된 바와 같이 제한된 트립신 분해에 의해 제조하였다. 간략하게는, 2 μl 인간 C3를 0.8 μl 트립신(10 μg/ml)과 함께 20℃에서 정확하게 60초 동안 인큐베이션하였다. 2.4 μl 대두 트립신 저해제(10 μg/ml)를 첨가하여, 반응을 중단시켰다. 이러한 제한된 분해는 C3a를 절단함으로써 C3의 C3b의 발생을 초래한다. 그런 다음, C3b를 다양한 양의 뮤린 인자 I 또는 인간 인자 I 및 2 μl 인간 인자 H와 혼합하였고, TBS를 이용하여 반응 부피를 10 μl까지 완성시켰다. 대안적으로, 뮤린 혈청을 인자 I의 공급원으로서 첨가하였다. 반응을 37℃에서 30분 내지 60분 동안 수행한 다음, 환원성 4x 로딩 완충제의 첨가 및 가열에 의해 중단시켰다. 시료를 웨스턴 블롯에 의해 분석하거나 4℃에서 저장하였다.
시간 경로 재조합 마우스 인자 I가 C3b 및 iC3b를 절단하는 능력을 시험하기 위해, 시간 경로 검정법을 발달시켰다. 이를 위해, 혈청을 37℃에서 급속하게 해동시키고, 간략하게 보텍싱(vortex)한 다음, 얼음 상에 두었다. 그런 다음, 혈청을 재조합 인간 또는 마우스 인자 I와 혼합하고, 자이모산을 5%의 최종 농도까지 첨가하였다. 대안적인 경로 완충제를 이러한 검정법에서 완충제로서 사용하였다. 일단 제조되면, 혼합물을 37℃ 인큐베이터 내에서 로테이터시키고, 선택된 시점에서 40 μl의 각각의 시료를 10 μl의 50 mM EDTA 내로 제거하였다. 시료화 시간은 0, 30, 60, 120, 180, 240, 480, 600 및 1440분이었다. 각각의 시점에서, 시료를 마이크로퓨지(microfuge)하여 자이모산을 제거하고, ELISA에 의해 시험할 때까지 -80℃에서 냉동시켰다. 대안적으로, 검정법을 또한, 보체 활성화 시약으로서 LPS를 이용하여 수행하였으며, 이러한 시약은 가용성이라는 이점을 가졌다.
본원에 인용된 공개, 특허 및 특허 출원을 포함하여 모든 참조문헌들은 각각의 참조문헌이 원용에 의해 개별적으로 및 구체적으로 포함되는 것으로 가리켜지고 그 전체가 본원에 나타난 것과 동일한 정도까지 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 본원에서 고찰된 참조문헌들은 본 출원의 출원일 전에 이들의 개시내용에 대해 전적으로 제공된다. 본원에서 어떠한 것도, 임의의 참조문헌이 본원에 기재된 실시형태의 신규성 또는 비자명성(non-obviousness)에 영향을 미치는 것을 인정하는 것으로 간주되지 않는다.
서열 목록
서열 번호: 1
NCBI 참조 서열: NM_000204.4 유래의 호모 사피엔스 보체 인자 I(CFI), 전사 변이체 2, mRNA에 대한 CDS의 코딩 영역
Figure pat00004
서열 번호: 2
NCBI 참조 서열: NM_000204.4 유래의 호모 사피엔스 보체 인자 I(CFI), 전사 변이체 2, mRNA에 대한 CDS의 코딩 영역의 번역
Figure pat00005
서열 번호: 3
N-말단의 18개 잔기 신호 서열을 인코딩하는 서열을 포함하지 않는, NCBI 참조 서열: NM_000204.4 유래의 호모 사피엔스 보체 인자 I(CFI), 전사 변이체 2, mRNA에 대한 CDS의 코딩 영역
Figure pat00006
서열 번호: 4
N-말단의 18개 잔기 신호 서열을 인코딩하는 서열을 포함하지 않는, NCBI 참조 서열: NM_000204.4 유래의 호모 사피엔스 보체 인자 I(CFI), 전사 변이체 2, mRNA에 대한 CDS의 코딩 영역의 번역
Figure pat00007
서열 번호: 5
프라이머 서열: FI-AAV-F:
Figure pat00008
서열 번호: 6
프라이머 서열: FI-AAV-R:
Figure pat00009
서열 번호: 7
인간 세포에서 발현을 위해 최적화된 코돈인 호모 사피엔스 보체 인자(CFI)을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열:
Figure pat00010
서열 번호: 8
HLP 간-특이적 프로모터의 뉴클레오타이드 서열:
Figure pat00011
서열 번호: 9
LP1 간-특이적 프로모터의 뉴클레오타이드 서열:
Figure pat00012
서열 번호: 10
HLP2 간-특이적 프로모터의 뉴클레오타이드 서열:
Figure pat00013
서열 번호: 11
MutC 캡시드 단백질의 아미노산 서열:
Figure pat00014
Figure pat00015
Figure pat00016
Figure pat00017
Figure pat00018
서열 번호: 12
LK03 캡시드 단백질의 아미노산 서열:
Figure pat00019
Figure pat00020
Figure pat00021
Figure pat00022
Figure pat00023
SEQUENCE LISTING <110> CAMBRIDGE ENTERPRISE LIMITED THE SYDNEY CHILDREN'S HOSPITALS NETWORK (RANDWICK AND WESTMEAD) <120> Treatment of Complement-Mediated Disorders <130> P/74985.WO01 <150> GB1608046.7 <151> 2016-05-09 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1752 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgaagcttc ttcatgtttt cctgttattt ctgtgcttcc acttaaggtt ttgcaaggtc 60 acttatacat ctcaagagga tctggtggag aaaaagtgct tagcaaaaaa atatactcac 120 ctctcctgcg ataaagtctt ctgccagcca tggcagagat gcattgaggg cacctgtgtt 180 tgtaaactac cgtatcagtg cccaaagaat ggcactgcag tgtgtgcaac taacaggaga 240 agcttcccaa catactgtca acaaaagagt ttggaatgtc ttcatccagg gacaaagttt 300 ttaaataacg gaacatgcac agccgaagga aagtttagtg tttccttgaa gcatggaaat 360 acagattcag agggaatagt tgaagtaaaa cttgtggacc aagataagac aatgttcata 420 tgcaaaagca gctggagcat gagggaagcc aacgtggcct gccttgacct tgggtttcaa 480 caaggtgctg atactcaaag aaggtttaag ttgtctgatc tctctataaa ttccactgaa 540 tgtctacatg tgcattgccg aggattagag accagtttgg ctgaatgtac 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Cys Trp Ile Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Arg Ala Ser Lys 355 360 365 Thr His Arg Tyr Gln Ile Trp Thr Thr Val Val Asp Trp Ile His Pro 370 375 380 Asp Leu Lys Arg Ile Val Ile Glu Tyr Val Asp Arg Ile Ile Phe His 385 390 395 400 Glu Asn Tyr Asn Ala Gly Thr Tyr Gln Asn Asp Ile Ala Leu Ile Glu 405 410 415 Met Lys Lys Asp Gly Asn Lys Lys Asp Cys Glu Leu Pro Arg Ser Ile 420 425 430 Pro Ala Cys Val Pro Trp Ser Pro Tyr Leu Phe Gln Pro Asn Asp Thr 435 440 445 Cys Ile Val Ser Gly Trp Gly Arg Glu Lys Asp Asn Glu Arg Val Phe 450 455 460 Ser Leu Gln Trp Gly Glu Val Lys Leu Ile Ser Asn Cys Ser Lys Phe 465 470 475 480 Tyr Gly Asn Arg Phe Tyr Glu Lys Glu Met Glu Cys Ala Gly Thr Tyr 485 490 495 Asp Gly Ser Ile Asp Ala Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val 500 505 510 Cys Met Asp Ala Asn Asn Val Thr Tyr Val Trp Gly Val Val Ser Trp 515 520 525 Gly Glu Asn Cys Gly Lys Pro Glu Phe Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val 530 535 540 Ala Asn Tyr Phe Asp Trp Ile Ser Tyr His Val Gly Arg Pro Phe Ile 545 550 555 560 Ser Gln Tyr Asn Val 565 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer sequence: FI-AAV-F <400> 5 tctagaggat ccgccaccat gaagctc 27 <210> 6 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer sequence: FI-AAV-R <400> 6 aagcttggcg gccgctcaga cattgtgttg agaaacaaga gaccttc 47 <210> 7 <211> 1752 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 atgaagctgc tgcatgtctt tctgctgttt ctgtgcttcc atctgcggtt ctgtaaagtg 60 acctatacta gccaggagga tctggtggag aagaagtgtc tggccaagaa gtacacacac 120 ctgagctgcg acaaggtgtt ctgtcagcct tggcagcggt gcatcgaggg cacctgcgtg 180 tgcaagctgc cttaccagtg cccaaagaac ggcaccgccg tgtgcgccac aaatcggaga 240 tcttttccaa catattgcca gcagaagagc ctggagtgtc tgcaccccgg caccaagttc 300 ctgaacaatg gcacctgcac agccgagggc aagttttctg tgagcctgaa gcacggcaac 360 acagatagcg agggcatcgt ggaggtgaag ctggtggacc aggataagac catgttcatc 420 tgtaagagct cctggtccat gagggaggca aacgtggcat gcctggatct gggattccag 480 cagggagcag acacacagag gcgctttaag ctgtccgacc tgtctatcaa tagcaccgag 540 tgcctgcacg tgcactgtag gggcctggag acatccctgg cagagtgcac cttcacaaag 600 cggagaacca tgggctacca ggactttgcc gacgtggtgt gctataccca gaaggccgat 660 agccccatgg acgatttctt tcagtgcgtg aacggcaagt atatctccca gatgaaggcc 720 tgcgacggca tcaatgactg tggcgatcag tctgacgagc tgtgctgtaa ggcctgtcag 780 ggcaagggct tccactgcaa gagcggcgtg tgcatccctt cccagtacca gtgcaacggc 840 gaggtggatt gtatcacagg agaggacgaa gtgggatgcg caggatttgc atctgtggca 900 caggaggaga cagagatcct gacagccgac atggatgccg agaggcgccg gatcaagtct 960 ctgctgccta agctgagctg tggcgtgaag aatcggatgc acatcagaag gaagcgcatc 1020 gtgggaggca agagggcaca gctgggcgat ctgccatggc aggtggccat caaggacgcc 1080 tctggcatca cctgcggcgg catctacatc ggaggatgtt ggatcctgac cgcagcacac 1140 tgcctgagag caagcaagac acacaggtat cagatctgga ccacagtggt ggattggatc 1200 cacccagacc tgaagagaat cgtgatcgag tacgtggata ggatcatctt tcacgagaac 1260 tacaatgccg gcacatatca gaacgacatc gccctgatcg agatgaagaa ggatggcaat 1320 aagaaggact gtgagctgcc cagatccatc cctgcatgcg tgccatggag cccctatctg 1380 ttccagccca acgatacctg catcgtgtcc ggatggggaa gggagaagga caatgagcgg 1440 gtgttttctc tgcagtgggg cgaggtgaag ctgatctcca actgttctaa gttctacggc 1500 aataggtttt atgagaagga gatggagtgc gccggcacct acgatggcag catcgacgcc 1560 tgtaagggcg attccggagg accactggtg tgcatggacg caaacaatgt gacatacgtg 1620 tggggagtgg tgtcctgggg agagaactgc ggcaagccag agttccccgg cgtatatacc 1680 aaggtggcca attattttga ttggatttcc taccacgtcg gcaggccctt tatttcccag 1740 tataatgtct aa 1752 <210> 8 <211> 251 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HLP liver-specific promoter sequence <400> 8 tgtttgctgc ttgcaatgtt tgcccatttt agggtggaca caggacgctg tggtttctga 60 gccagggggc gactcagatc ccagccagtg gacttagccc ctgtttgctc ctccgataac 120 tggggtgacc ttggttaata ttcaccagca gcctcccccg ttgcccctct ggatccactg 180 cttaaatacg gacgaggaca gggccctgtc tcctcagctt caggcaccac cactgacctg 240 ggacagtgaa t 251 <210> 9 <211> 447 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> LP1 liver-specific promoter sequence <400> 9 ccctaaaatg ggcaaacatt gcaagcagca aacagcaaac acacagccct ccctgcctgc 60 tgaccttgga gctggggcag aggtcagaga cctctctggg cccatgccac ctccaacatc 120 cactcgaccc cttggaattt cggtggagag gagcagaggt tgtcctggcg tggtttaggt 180 agtgtgagag gggaatgact cctttcggta agtgcagtgg aagctgtaca ctgcccaggc 240 aaagcgtccg ggcagcgtag gcgggcgact cagatcccag ccagtggact tagcccctgt 300 ttgctcctcc gataactggg gtgaccttgg ttaatattca ccagcagcct cccccgttgc 360 ccctctggat ccactgctta aatacggacg aggacagggc cctgtctcct cagcttcagg 420 caccaccact gacctgggac agtgaat 447 <210> 10 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HLP2 liver-specific promoter sequence <400> 10 ccctaaaatg ggcaaacatt gcaagcagca aacagcaaac acacagccct ccctgcctgc 60 tgaccttgga gctggggcag aggtcagaca cctctctggg cccatgccac ctccaactgg 120 acacaggacg ctgtggtttc tgagccaggg ggcgactcag atcccagcca gtggacttag 180 cccctgtttg ctcctccgat aactggggtg accttggtta atattcacca gcagcctccc 240 ccgttgcccc tctggatcca ctgcttaaat acggacgagg acagggccct gtctcctcag 300 cttcaggcac caccactgac ctgggacagt gaatgatccc cctgatctgc ggcc 354 <210> 11 <211> 736 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> MutC capsid protein sequence <400> 11 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Gln Gln Leu Gln Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Asp Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Val Gly 145 150 155 160 Lys Ser Gly Lys Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175 Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro 180 185 190 Ala Ala Pro Thr Ser Leu Gly Ser Asn Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly 195 200 205 Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser 210 215 220 Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile 225 230 235 240 Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 245 250 255 Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr 260 265 270 Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His 275 280 285 Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp 290 295 300 Gly Phe Arg Pro Lys Lys Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val 305 310 315 320 Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu 325 330 335 Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr 340 345 350 Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp 355 360 365 Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser 370 375 380 Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser 385 390 395 400 Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Thr Phe Glu 405 410 415 Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg 420 425 430 Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Asn Arg Thr 435 440 445 Gln Gly Thr Thr Ser Gly Thr Thr Asn Gln Ser Arg Leu Leu Phe Ser 450 455 460 Gln Ala Gly Pro Gln Ser Met Ser Leu Gln Ala Arg Asn Trp Leu Pro 465 470 475 480 Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Leu Ser Lys Thr Ala Asn Asp Asn 485 490 495 Asn Asn Ser Asn Phe Pro Trp Thr Ala Ala Ser Lys Tyr His Leu Asn 500 505 510 Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys 515 520 525 Asp Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Met His Gly Asn Leu Ile Phe Gly 530 535 540 Lys Glu Gly Thr Thr Ala Ser Asn Ala Glu Leu Asp Asn Val Met Ile 545 550 555 560 Thr Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln 565 570 575 Tyr Gly Thr Val Ala Asn Asn Leu Gln Ser Ser Asn Thr Ala Pro Thr 580 585 590 Thr Arg Thr Val Asn Asp Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln 595 600 605 Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His 610 615 620 Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu 625 630 635 640 Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Met Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala 645 650 655 Asn Pro Pro Thr Thr Phe Ser Pro Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr 660 665 670 Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln 675 680 685 Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn 690 695 700 Tyr Asn Lys Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val 705 710 715 720 Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu 725 730 735 <210> 12 <211> 736 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> LK03 capsid protein sequence <400> 12 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Gln Pro Gly Ala Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu 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Phe Asn Arg Phe His 275 280 285 Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp 290 295 300 Gly Phe Arg Pro Lys Lys Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val 305 310 315 320 Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu 325 330 335 Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr 340 345 350 Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp 355 360 365 Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser 370 375 380 Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser 385 390 395 400 Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Thr Phe Glu 405 410 415 Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg 420 425 430 Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Asn Arg Thr 435 440 445 Gln Gly Thr Thr Ser Gly Thr Thr Asn Gln Ser Arg Leu Leu Phe Ser 450 455 460 Gln Ala Gly Pro Gln Ser Met Ser Leu Gln Ala Arg Asn Trp Leu Pro 465 470 475 480 Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Leu Ser Lys Thr Ala Asn Asp Asn 485 490 495 Asn Asn Ser Asn Phe Pro Trp Thr Ala Ala Ser Lys Tyr His Leu Asn 500 505 510 Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys 515 520 525 Asp Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Met His Gly Asn Leu Ile Phe Gly 530 535 540 Lys Glu Gly Thr Thr Ala Ser Asn Ala Glu Leu Asp Asn Val Met Ile 545 550 555 560 Thr Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln 565 570 575 Tyr Gly Thr Val Ala Asn Asn Leu Gln Ser Ser Asn Thr Ala Pro Thr 580 585 590 Thr Arg Thr Val Asn Asp Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln 595 600 605 Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His 610 615 620 Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu 625 630 635 640 Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Met Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala 645 650 655 Asn Pro Pro Thr Thr Phe Ser Pro Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr 660 665 670 Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln 675 680 685 Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn 690 695 700 Tyr Asn Lys Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val 705 710 715 720 Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Pro Leu 725 730 735

Claims (52)

  1. 보체-매개 장애의 예방, 치료 또는 완화가 필요한 피험자에서 보체-매개 장애의 예방, 치료 또는 완화 방법으로서,
    상기 방법은 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성을 보유하는 인자 I(factor I), 또는 이의 단편 또는 유도체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 바이러스 벡터를 피험자에게 투여하여, 치료적 유효량의 인코딩된 인자 I, 또는 이의 단편 또는 유도체가 피험자에서 핵산으로부터 발현되게 함으로써, 피험자에서 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 수준을 증가시키는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    피험자에서 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 수준이 정상 수준을 초과하는 수준까지 증가되는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    피험자에게 재조합 바이러스 벡터를 캡시드화하는 재조합 바이러스 입자를 투여하는, 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    재조합 바이러스 입자는 투여 후 피험자의 간을 감염시켜, 간으로부터 인자 I, 또는 이의 단편 또는 유도체의 발현을 초래하는, 방법.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서,
    재조합 바이러스 입자는 rAAV 벡터를 캡시드화하는 재조합 아데노-연관된 바이러스(rAAV) 입자인, 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    rAAV 입자는 간 향성(tropism)을 부여하기 위해 위형화되는(pseudotyped), 방법.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서,
    rAAV 입자는 1개 또는 2개의 AAV2 ITR 또는 이의 유도체를 포함하며,
    각각의 유도체 AAV2 ITR은 자연 발생 AAV2 ITR의 뉴클레오타이드 서열과 이의 전체 길이에 걸쳐 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, rAAV 입자는 AAV8 캡시드 단백질(rAAV2/8) 또는 AAV9 캡시드 단백질에 의해 위형화된 AAV2(rAAV2/9), 또는 자연 발생 AAV8 또는 AAV9 캡시드 단백질의 아미노산 서열과 이의 전체 길이에 걸쳐 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이의 유도체에 의해 위형화되는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    재조합 바이러스 입자를 피험자에게 정맥내 투여하는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    재조합 바이러스 벡터가 비-통합적(non-integrating), 에피솜(episomal) 바이러스 벡터인, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    인코딩된 인자 I, 또는 이의 단편 또는 유도체가 간-특이적 프로모터, 예컨대 인간 알파-1-항-트립신(hAAT) 프로모터로부터 발현되는, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    피험자에서 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 수준이 정상 수준의 2배까지의 수준으로 증가되는, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    피험자에서 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 수준이 정상 수준보다 80% 또는 60%까지의 수준으로 증가되는, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    피험자에서 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 수준이 정상 수준보다 40% 또는 20%까지의 수준으로 증가되는, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    피험자에서 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 수준이 정상 수준보다 적어도 5%, 10%, 15%, 20% 또는 25%까지의 수준으로 증가되는, 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    피험자에서 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 수준이 피험자의 혈청 내 수준인, 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    피험자에서 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 정상 수준이 피험자의 혈청에서 30 μg/ml 내지 40 μg/ml 인자 I에 의해 제공되는 수준과 동등한, 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    보체-매개 장애가 보체 C3b 피드백 사이클의 과다-활성과 연관이 있는 장애인, 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    보체-매개 장애가 연령-관련 황반 변성(AMD; age-related macular degeneration)(특히 조기(건성) AMD 또는 지도모양 위축(geographic atrophy)), 고밀도 침착병(DDD; dense deposit disease), 비정형 용혈성 요독 증후군(aHUS; atypical haemolytic uraemic syndrome), C3 사구체병증, 2형 막증식성 사구체신염(MPGN2; membranoproliferative glomerulonephritis Type 2), 아테롬성 동맥경화증, 만성 심혈관 질환, 알츠하이머병, 전신 혈관염(systemic vasculitis), 발작성 야간 혈색소뇨증(PNH; paroxysmal nocturnal haemoglobinuria), 노인의 염증 또는 자가염증 질환, I형 막증식성 사구체신염(I형 MPGN), III형 막증식성 사구체신염(III형 MPGN), 길랑-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome), 헤노흐-쇤라인 자반병(Henoch-Schonlein purpura), IgA 신증(nephropathy) 또는 막 사구체신염(membranous glomerulonephritis)인, 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    피험자가 AMD가 발병할 위험에 있는, 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    피험자가 AMD와 연관이 있는 하나 이상의 SNP에 민감한 동형접합성(homozygous) 또는 이형접합성(heterozygous)인, 방법.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서,
    피험자가 AMD가 발병할 위험에 있는지 확인하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    피험자가 AMD와 연관이 있는 하나 이상의 SNP에 민감한 동형접합성 또는 이형접합성인지 확인함으로써 피험자가 AMD가 발병할 위험에 있는지 확인되는, 방법.
  23. 제20항 또는 제22항에 있어서,
    피험자가 AMD와 연관이 있는 하나 이상의 SNP에 민감한 이형접합성인 경우, 피험자에서 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 수준이 정상 수준보다 적어도 10%까지의 수준으로 증가되는, 방법.
  24. 제20항 또는 제22항에 있어서,
    피험자가 AMD와 연관이 있는 하나 이상의 SNP에 민감한 동형접합성인 경우, 피험자에서 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 수준이 정상 수준보다 적어도 50%까지의 수준으로 증가되는, 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    투여 후 적어도 1주일째에 피험자에서 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 수준을 확인하는 단계, 및 활성의 수준이 정상 수준에 있거나 그보다 낮은 것으로 확인되는 경우 투여를 반복하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    인자 I이 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 갖는 인간 인자 I인, 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    인자 I의 단편 또는 유도체가 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 갖는 인간 인자 I과 이의 전체 길이에 걸쳐 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 아미노산 동일성을 가진 폴리펩타이드인, 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    피험자가 인간 피험자인, 방법.
  29. C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성을 보유하는 인자 I, 또는 이의 단편 또는 유도체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 바이러스 벡터.
  30. 제29항에 있어서,
    비-통합적, 에피솜 바이러스 벡터인, 재조합 바이러스 벡터.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서,
    인자 I, 또는 이의 단편 또는 유도체를 인코딩하는 핵산이 프로모터에 작동적으로 연결되어 있는, 재조합 바이러스 벡터.
  32. 제31항에 있어서,
    프로모터가 간-특이적 프로모터, 예컨대 인간 알파-1-항-트립신(hAAT) 프로모터인, 재조합 바이러스 벡터.
  33. 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    재조합 아데노-연관된 바이러스(rAAV) 벡터인, 재조합 바이러스 벡터.
  34. 제33항에 있어서,
    재조합 바이러스 벡터가 AAV 역 말단 반복부(ITR; inverted terminal repeat)의 측면에 있는 발현 카세트를 포함하고, 상기 발현 카세트는 프로모터 및 폴리아데닐화 인지 부위에 작동적으로 연결된 인자 I, 또는 이의 단편 또는 유도체를 인코딩하는 핵산을 포함하는, 재조합 바이러스 벡터.
  35. 제34항에 있어서,
    ITR은 AAV2 ITR 또는 이의 유도체이고,
    각각의 유도체 AAV2 ITR은 자연 발생 AAV2 ITR의 뉴클레오타이드 서열과 이의 전체 길이에 걸쳐 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 재조합 바이러스 벡터.
  36. 제29항 내지 제35항 중 어느 한 항에 따른 재조합 바이러스 벡터를 캡시드화하는 바이러스 캡시드를 포함하는 재조합 바이러스 입자.
  37. 제28항 또는 제29항에 있어서,
    간 세포, 특히 헤파토사이트(hepatocyte)에 형질도입시킬 수 있는, 재조합 바이러스 입자.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서,
    rAAV 입자인, 재조합 바이러스 입자.
  39. 제38항에 있어서,
    rAAV 입자가 간 향성을 부여하기 위해 위형화되는, 재조합 바이러스 입자.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서,
    rAAV 입자가 AAV8 또는 AAV9 캡시드 단백질, 또는 자연 발생 AAV8 또는 AAV9 캡시드 단백질의 아미노산 서열과 이의 전체 길이에 걸쳐 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 이의 유도체를 포함하는, 재조합 바이러스 입자.
  41. 제40항에 있어서,
    rAAV 입자가 1개 또는 2개의 AAV2 ITR 또는 이의 유도체를 포함하고, 각각의 유도체 AAV2 ITR이 자연 발생 AAV2 ITR의 뉴클레오타이드 서열과 이의 전체 길이에 걸쳐 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 재조합 바이러스 입자.
  42. 제29항 내지 제35항 중 어느 한 항에 따른 재조합 바이러스 벡터, 또는 제36항 내지 제41항 중 어느 한 항에 따른 재조합 바이러스 입자; 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는, 약학적 조성물.
  43. 제42항에 있어서,
    정맥내 투여에 적합한 약학적 조성물.
  44. 제29항 내지 제35항 중 어느 한 항에 따른 재조합 바이러스 벡터, 또는 제36항 내지 제41항 중 어느 한 항에 따른 재조합 바이러스 입자; 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는, 키트.
  45. 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 따른 rAAV 벡터; 및 AAV 복제 및 캡시드 단백질을 인코딩하는 핵산, 및 생산성 AAV 수명 사이클에 필요한 유전자를 인코딩하는 핵산을 포함하는 하나 이상의 헬퍼 플라스미드를 포함하는, rAAV 입자의 생성을 위한 키트.
  46. 제45항에 있어서,
    AAV 복제 및 캡시드 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제1 헬퍼 플라스미드, 및 생산성 AAV 수명 사이클에 필요한 유전자를 인코딩하는 핵산을 포함하는 제2 헬퍼 플라스미드를 포함하는, 키트.
  47. 약제로서 사용하기 위한, 제29항 내지 제35항 중 어느 한 항에 따른 재조합 바이러스 벡터, 제36항 내지 제41항 중 어느 한 항에 따른 재조합 바이러스 입자 또는 제42항 또는 제43항에 따른 약학적 조성물.
  48. 보체-매개 장애의 치료에 사용하기 위한, 제29항 내지 제35항 중 어느 한 항에 따른 재조합 바이러스 벡터, 제36항 내지 제41항 중 어느 한 항에 따른 재조합 바이러스 입자 또는 제41항 또는 제42항에 따른 약학적 조성물.
  49. 보체-매개 장애의 치료를 위한 약제의 제조에서, 제29항 내지 제35항 중 어느 한 항에 따른 재조합 바이러스 벡터, 제36항 내지 제41항 중 어느 한 항에 따른 재조합 바이러스 입자 또는 제42항 또는 제43항에 따른 약학적 조성물의 용도.
  50. 제48항에 따른 벡터, 입자 또는 조성물, 또는 제48항에 따른 용도에 있어서,
    보체-매개 장애가 보체 C3b 피드백 사이클의 과다-활성과 연관이 있는 장애인, 벡터, 입자 또는 조성물, 또는 용도.
  51. 제50항에 따른 벡터, 입자 또는 조성물에 있어서,
    보체-매개 장애가 연령-관련 황반 변성(AMD)(특히 조기(건성) AMD 또는 지도모양 위축), 고밀도 침착병(DDD), 비정형 용혈성 요독 증후군(aHUS), C3 사구체병증, 2형 막증식성 사구체신염(MPGN2), 아테롬성 동맥경화증, 만성 심혈관 질환, 알츠하이머병, 전신 혈관염, 발작성 야간 혈색소뇨증(PNH), 노인의 염증 또는 자가염증 질환, I형 막증식성 사구체신염(I형 MPGN), III형 막증식성 사구체신염(III형 MPGN), 길랑-바레 증후군, 헤노흐-쇤라인 자반병, IgA 신증 또는 막 사구체신염인, 벡터, 입자 또는 조성물.
  52. 제50항에 따른 벡터, 입자 또는 조성물에 있어서,
    보체-매개 장애가 연령-관련 황반 변성(AMD)인, 벡터, 입자 또는 조성물.
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