CN109328076A

CN109328076A - 补体介导的病症的治疗

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Publication number: CN109328076A
Application number: CN201780038436.1A
Authority: CN
Inventors: P.拉赫曼; I.亚历山大
Original assignee: Sydney Childrens Hospitals Network Randwick and Westmead; Cambridge Enterprise Ltd
Current assignee: Sydney Childrens Hospitals Network Randwick and Westmead; Cambridge Enterprise Ltd
Priority date: 2016-05-09
Filing date: 2017-05-03
Publication date: 2019-02-12
Anticipated expiration: 2037-05-03
Also published as: SG11201809543QA; AU2017264750A1; RU2018143411A; RU2018143411A3; RU2768982C2; AU2017264750B2; US20200147240A1; GB201608046D0; IL262852A; EP3454910A1; JP7178905B2; CN109328076B; WO2017194912A1; AU2023202099A1; KR20190019065A; JP2019519494A; ZA201807218B; CA3022500A1; KR20230047420A; MX2018013665A

Abstract

描述了使用基因疗法治疗补体介导的病症，特别是与补体C3b反馈循环的过度活性相关的病症(例如，年龄相关的黄斑变性(AMD))的方法。根据该方法，通过施用编码因子I的重组病毒载体，使得自受试者中的载体表达治疗有效量的编码因子I提高补体因子I的水平。还描述了编码因子I的重组病毒载体、将载体壳体化的重组病毒颗粒、以及它们在治疗方法中的用途。

Description

补体介导的病症的治疗

本发明涉及使用基因疗法提高补体因子I(或其片段或衍生物)水平来治疗补体介导的病症，特别是与补体C3b反馈循环的过度活性相关的病症(例如年龄相关的黄斑变性(AMD))的方法、编码补体因子I(或其片段或衍生物)的重组病毒载体、将载体壳体化的重组病毒颗粒及其在治疗方法中的用途。

补体系统通过触发炎性应答以对免疫系统警示即将来临的危险来形成针对感染的第一道防线。它在标记微生物和感染或受损细胞以促进通过裂解或吞噬清除杀伤它们方面具有重要作用。补体系统可以通过三种不同的机制即经典，凝集素和旁路途径激活(见图1)。所有三种途径在丰富的血浆蛋白C3的切割处会聚，这使得能够激活末端补体步骤以及其他补体效应器机制。

目前，普遍公认旁路途径是由其它两种补体途径之一激活，产生正反馈放大，或由iC3(或C3(H₂O))(其是C3中的内部硫酯键自发水解的结果)或C3b(其在血清中以非常低的浓度不断产生)激活。此种“空转(tickover)”提供需要的最小量的活化的C3，其可以被因子B结合，因子B进一步被因子D切割以形成初始C3转化酶复合物iC3Bb，其可以将天然C3转化为C3b。C3b经历结构重排，使得丝氨酸蛋白酶前体因子B能够与C3b结合。因子D然后可以加入复合物并将因子B切割成Bb和Ba。C3bBb是旁路途径C3转化酶。因子D不切割血清中的因子B，除非因子B与C3b或iC3结合。新生成的C3b可以共价结合到病原体的表面(或任何其他附近表面)，在那里它可以被另一个因子B分子结合。此结合通过备解素稳定，所述备解素通过拮抗因子H的功能活性增加旁路途径C3转化酶的半衰期。

旁路途径由均作用于C3b的两种竞争循环之间的平衡控制。这些是C3b反馈和C3b分解循环，它们位于补体激活的核心(见图2)。一旦iC3或C3b形成并沉积在表面上，就可以发生两种不同的反应，而不依赖于首先如何生成C3b：它可以被因子B(反馈)或因子H(或膜结合性FI辅因子CD46或CD35)(分解)结合。

与C3b(或C3(H₂O))结合导致C3转化酶的放大(在因子B、因子D和备解素的存在下)和膜攻击复合物(MAC)的组装的启动或C3b的失活(在因子H和因子I存在下)。是否发生放大或失活仅取决于C3b所附着的表面的性质。在所谓的“受保护的表面”上，因子H结合(因此也是C3b的因子I切割)受损。例如，因子H与大肠杆菌04的脂多糖(LPS)上的C3b结合远远弱于因子B的结合。

在图3中描绘了补体激活期间C3的分解。C3(185kDa)由两条链组成，即α链和β链，而在C3b中，N端肽C3a(9kDa)被C3转化酶切除。通过C3b的α’-链中的两个因子I介导的切割实现C3b的切割。释放称为C3f(3kDa)的小片段，将α’-链分成68和43kDa片段。这种蛋白水解的C3现在称为iC3b，并且它不能再参与C3或C5转化酶。然而，凭借其与嗜中性粒细胞上的补体受体CR3(CD11b，CD18)的反应性，它是补体诱导的炎症的重要介质。此种对iC3b的第一次切割发生得相当快，并使用因子H作为辅因子，而iC3b的第二次切割慢得多。仅在辅因子补体受体1(CR1)存在下，iC3b才能被因子I进一步切割。因子I在68kDa片段中再次切割iC3b，该片段释放出分子的较大部分，称为C3c。C3dg通过共价键(与糖的酯键或与蛋白质的酰胺键)保持与表面结合。C3dg不与CR3反应，并且不是炎性介质。

影响其功能的补体蛋白的遗传变异与对传染病的抗性和对各种炎性疾病的易感性有关。最佳描述的多态性与年龄相关的黄斑变性(AMD)、致密沉积物病(DDD)和非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)相关。

AMD是受旁路途径中的多态性影响的最常见疾病。它与因子H和FH相关蛋白中的几种常见变体有关：FH单体型1，其包括fH_Y402HSNP(Haines,et al.,Science,308(5720):419–421,April 2005；Edwards,et al.,Science,308(5720):421–424,April 2005；Klein,etal.,Science,308(5720):385–389,April 2005)；FH单倍型2，其包括fH_V62ISNP(Hageman etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,102(20):7227–7232,May 2005)；和FH单倍型3，其包括CFHR1/CFHR3的缺失，保护性(Hughes et al.,Nat.Genet.,38(10):1173–1177,October2006)。引用的研究显示了遗传FH单倍型1的两个拷贝将AMD的风险增加7倍。其他AMD相关的遗传变异在因子B和C3中(C3R102G(Heurich,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,108(21):8761–8766,May 2011))。最近，有低I因子血清水平的素因的罕见因子I突变与晚期AMD的风险显著增加相关(Kavanagh,et al.,Hum.Mol.Genet.,24(13):3861–3870,July2015)。上述多态性列于下表1中。

表1.与年龄相关的黄斑变性相关的多态性

¹Hughes,et al.,同上；²Zareparsi,et al.,Am.J.Hum.Genet.,77(1):149–153,July 2005；³Hageman,et al.,同上；⁴Gold,et al.,Nat.Genet.,38(4):458–462,April2006；⁵Yates,et al.,New England Journal of Medicine,357(6):553–561,August2007。

致密沉积物病DDD在临床上与AMD有关，因为DDD患者也像AMD一样形成视网膜变化，但是比“仅AMD”患者处于早得多的年龄(若他们存活的话)。事实上，H1和H2单倍型的多态性也分别赋予增加或降低的DDD风险，如对AMD(Pickering,et al.,J.Exp.Med.,204(6):1249–1256,June 2007)以及C3中的多态性报道。几种风险单倍型的组合显著增加DDD风险(Abrera-Abeleda,et al.,J.Am.Soc.Nephrol.,22(8):1551–1559,August 2011)。从小鼠研究中已知，DDD的形成完全取决于产生iC3b的能力(Rose,et al.,J.Clin.Invest.,118(2):608–618,February 2008)。疾病形成绝对需要因子I的存在。由于缺乏炎性介质iC3b，完全因子I缺乏消除DDD和AMD的风险。

AMD和DDD两者与液相旁路途径调节的变化相关，因此可以视为系统性疾病，而非眼或肾特异性疾病。这两个器官特别受影响的原因可能在于补体调节蛋白的确切分布和器官结构。在这两个器官中，存在有红细胞和血浆和与血浆直接接触的基底膜的分离，使得针对补体攻击提供的保护更依赖于因子H辅因子和因子I活性。对AMD和DDD有素因的大多数多态性在因子H的负责C3结合的区域中发现。

非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)也与旁路途径基因中，特别地在因子H基因(所有aHUS病例的一半)中的突变有关，但与AMD和DDD相反，这些突变通常在因子H的C端(负责将因子H隔离到表面的区域)发现(Manuelian,et al.,J.Clin.Invest.,111(8):1181–1190,April 2003)。在C3或CFB基因中发现其他易感多态性(Goicoechea de Jorge,etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,104(1):240–245,January 2007；Frémeaux-Bacchi,etal.,Blood,112(13):4948–4952,December 2008)。总之，在存在风险多态性的情况下，aHUS的风险大大增加，所述风险多态性促进细胞表面上不适当的旁路途径激活(Rodríguez deCórdoba,et al.,Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Molecular Basis of Disease,1812(1):12–22,January 2011)。

全基因组关联研究已经鉴定进一步的多态性，其位于例如CR1基因，丛生蛋白(clusterin)(在已经具有AD易感性APOE-ε4等位基因的一个或两个拷贝的个体中两者进一步易患阿尔茨海默病(AD))(Harold,et al.,Nat.Genet.,41(10):1088–1093,October2009；Lambert,et al.,Nat.Genet.,41(10):1094–1099,October 2009)和C5(与类风湿性关节炎相关联)(Kurreeman,et al.,PLoS Med.,4(9):e278,September 2007)。还应注意，通过反馈循环放大补体及其作用是所有补体途径中固有的，因此其操作也有改善其他病理生理过程的潜力。

上述大多数多态性的共同之处在于，疾病等位基因易于增加旁路途径反馈活性，其放大所有补体途径而不管触发刺激物(Lachmann,Adv.Immunol.,104:115–149,2009)。超炎性(hyperinflammatory)补体单元型(定义为代表个体遗传的补体基因的遗传变异模式，其改变炎性疾病和涉及补体的传染病两者的风险)，因此防止感染，特别是在儿童早期，但是代价是以后的生活，当个体已经形成针对常见侵入病原体的IgG抗体时，它易患炎性疾病。因为受补体单元型影响的疾病列表随着遗传研究暗示已知或新的补体多态性而稳定增加(Harris,et al.,Trends Immunol.,33(10):513–521,October 2012)，所以在寻找逆转C3b反馈循环的此种超活性的方法中有相当大的兴趣和需要。

确定产生C3b的量的反馈环的平衡可以在两端倾斜。通过放大反馈环或通过抑制C3b分解机制可以产生更多的C3b。可以通过增加C3b输入(例如，通过来自经典/凝集素途径的更多C3转化酶)，通过加速反馈反应(例如，通过因子B的功能获得突变体，或增加因子D或镁离子)，通过添加眼镜蛇毒液(cobra venom)因子(其具有C3b样特性并且可以结合因子B并在因子D切割因子B后形成C3转化酶)，或通过稳定旁路途径C3转化酶(例如，通过备解素或肾炎因子)来放大反馈环。可以通过缺乏或低浓度的因子H和因子I或膜辅因子蛋白(MCP)或通过易感C3基因型(例如，在C3F中，SNP:R102G比C3S对因子H具有更低的亲和力，因此被因子I更缓慢切割)来预防C3b分解。C3分解也在受保护的表面上受到阻碍。通过促进C3b分解实现C3b反馈循环的负调节。这可以通过提高因子H或因子I的浓度，或通过抑制因子D，因子B或备解素来完成。用于下调C3b反馈循环的特定靶物是因子D，因子H和因子I。

已经开发了用于治疗地图状萎缩(晚期形式AMD)的疗法，并且目前正在进行III期临床研究(Genentech/Roche的MAHALO研究)。此处，通过玻璃体内注射施用的针对因子D的人源化单克隆抑制性抗体(lampalizumab)用于停止地图状萎缩的进展速率。因子D以非常低的血清浓度存在，并且是旁路途径的必需因子。然而，由于其尺寸小(27kDa)，因子D迅速被肾脏清除并迅速再合成。因此，抗因子D治疗起作用用于在诸如视网膜的小隔室中局部抑制因子D，但非系统性起作用。玻璃体内注射的施用途径并非没有相关风险，这是该治疗的另一个缺点。

关于其他两种靶蛋白，自七十年代就已知可以通过增加因子H和I的血浆浓度来下调C3b反馈循环(Nydegger,et al.,J Immunol,120(4):1404–1408,January 1978；Lachmann andHalbwachs,Clin.Exp.Immunol.,21(1):109–114,July 1975)。补体和/或旁路途径病症与许多疾病的稳定增加的关联的新出现的基因组数据(例如Harris et al.,2012(同上)；Haines,et al.,2005(同上)；Hageman,et al.,2005(同上)；Kavanagh,etal.,Hum.Mol.Genet.,24(13):3861–3870,July 2015)支持在针对不受控制的途径相关病症的疗法中使用因子I或因子H。然而，由于几个原因，因子I是更好的靶物。首先，它比因子H以低得多的浓度存在(分别为≈35μg/ml(FI)和≈200-500μg/ml(FH))。较低的量更容易处理并且还降低了治疗成本。此外，存在因子H的变体，称为因子H相关蛋白1-5(FHR1-5)，其与因子H竞争对表面的结合。FHR1、2和5含有共有的二聚化基序，其能够形成三个同二聚体和三个异二聚体，他们具有显著增加的亲合力并且在生理学相关浓度下胜过(out-compete)因子H。增加因子H浓度可能未克服这些竞争性拮抗剂的主要致病作用。最后也是最重要的原因是因子I是不仅促进C3b切割成iC3b而且还加速iC3b分解的唯一调节物。在生理条件下，因子H对iC3b的亲和力太低而不能形成复合物。由于iC3b与补体受体CR3起反应是补体激活引起炎症的主要机制，因此iC3b分解成C3dg对于降低补体诱导的炎症是至关重要的(Lachmann,Adv.Immunol.,104:115–149,2009)。

AMD的研究受到复制人疾病的最佳动物模型的缺乏，特别是由于小鼠中斑的缺乏阻碍。然而，我们已经认识到AMD具有潜在的系统性而非眼特异性缺陷，其通过补体蛋白和调节物中越来越多的一批AMD相关的多态性显示。我们已经理解AMD疗法的关键在于控制系统性旁路途径调节。可以通过增加因子I的血浆水平来实现旁路途径C3b反馈循环的下调。WO2010/103291描述了通过补充血浆纯化的或重组的因子I来治疗AMD的方法。

已经在三种不同的补体单元型中测定因子I补充(在存在酵母聚糖作为旁路途径激活剂的情况下)对iC3b形成及其随后向C3dg的分解的影响(Lay,et al.,Clin.Exp.Immunol.,181(2):314–322,August 2015；Lachmann,et al.,Clin.Exp.Immunol.,September 2015)。将选择的补体单元型分为易感的或保护的，就与AMD相关的三种常见多态性C3S/F_R102G、fH_Y402H和fH_V62I而言纯合的和杂合的。结果显示易感性补体单元型比受保护的和杂合的组两者具有延迟的和少得多的iC3b至C3dg转化，而且还有通过增加总因子I浓度，可以将易感基因型“转化”为受保护的基因型，并且可以克服CFH和C3中不利的多态性。补充22μg/ml因子I(低于正常FI浓度)将“有风险”基因型转变为受保护的基因型(Lachmann等，2015(同上))。因此，仅三个基因座的存在对因子I的旁路途径补体激活的调节具有显著影响，因为超炎性补体单元型通过增加的因子I浓度对下调更具抗性。通过增加因子I的血浆浓度，可以逆转不利的补体单元型的影响，并且疾病进展减慢。

基因疗法是将遗传物质递送到具有治疗意图的患者中。在体内基因疗法的情况下，将载体注射到患者中并进入靶细胞，随后在所述靶细胞中表达载体携带的转基因。最初，基因疗法专注于具有需要直接但相对容易的方法的单成因缺陷(monogenetic defect)的罕见疾病，例如，严重联合免疫缺陷(SCID)。早期的成功使该领域扩展到诸如癌症、心血管疾病、神经变性性病症和传染病等获得性疾病。在治疗血友病B和脂蛋白脂肪酶缺乏中已经取得了显著的成功。然而，尽管进行了大量临床试验，但食品和药物管理局(FDA)尚未批准基因疗法产品。在欧洲，第一种基因疗法Glybera于2012年获得欧洲药品管理局的批准。Glgbera是一种用于罕见的单成因疾病，脂蛋白脂肪酶缺乏(LPLD)的治疗，并且由包装到肌肉内注射的重组病毒载体中的缺少的基因组成。

目前的基因疗法治疗依靠基因替代来替代缺陷基因，而不是实现现有功能性基因的过表达。令人惊讶地，我们发现了通过使用重组病毒载体的基因疗法，血浆因子I水平在小鼠中可以显著增加。

本发明基于以下认识：补体C3b反馈循环的负调节可以通过基因疗法在血浆中体内过表达因子I来实现。所得的旁路途径反馈环的再平衡将促进C3b和iC3b分解，从而消除补体介导的病症，特别是在旁路途径调节中具有潜在缺陷的病症中的主要疾病因素。

根据本发明，提供了在有此需要的受试者中预防、治疗或改善补体介导的病症的方法，其包括对受试者施用包含编码因子I或其保留C3b失活和iC3b降解活性的片段或衍生物的核酸的重组病毒载体，使得从受试者的核酸中表达治疗有效量的编码因子I或其片段或衍生物，从而增加受试者中C3b失活和iC3b降解活性水平。

本发明的方法可用于实现受试者中C3b失活和iC3b降解活性水平的系统性增加。

在具体实施方案中，将受试者中C3b失活和iC3b降解活性的水平提高至超过正常水平的水平。

因此，在一个实施方案中，本发明提供了在有此需要的受试者中预防、治疗或改善补体介导的病症的方法，其包括对受试者施用包含编码因子I或其保留C3b失活和iC3b降解活性的片段或衍生物的核酸的重组病毒载体，使得从受试者的核酸中表达治疗有效量的编码因子I或其片段或衍生物，从而将受试者中的C3b失活和iC3b降解活性水平提高至超过正常水平的水平。

在具体实施方案中，对受试者施用重组病毒颗粒，其将重组病毒载体壳体化。

根据本发明还提供了重组病毒载体，其包含编码因子I，或其保留C3b失活和iC3b降解活性的片段或衍生物的核酸。

根据本发明还提供了重组病毒颗粒，其包含将本发明重组病毒载体壳体化的病毒壳体。

病毒基因组由在大多数病毒中在空间上分离的基因和顺式作用调节序列构成。此种排列用于设计病毒载体。负责复制或壳体/包膜蛋白的病毒基因与治疗性转基因交换，然后所述治疗性转基因在两个末端上侧翼有调节顺式作用序列(Thomas,et al.,Nat.Rev.Genet.,4(5):346–358,May 2003)。缺失的基因以反式起作用，并且可以通过具有整合到基因组中的病毒基因的包装细胞系提供，或者通过与病毒载体共转染的异源质粒提供(Kay et al.,Nat.Med.,7(1):33–40,January 2001)。以此种方式，可以产生含有转基因的复制缺陷型病毒颗粒，其能够转导它们的靶细胞。

“重组病毒载体”指包含一个或多个异源序列，即非病毒起源的核酸序列的重组多核苷酸载体。重组病毒载体可以是多种形式中的任一种，包括质粒，线性人工染色体，其与脂质复合，包囊在脂质体内，并在病毒颗粒中壳体化。可以将重组病毒载体包装到病毒壳体中以产生重组病毒颗粒。“重组病毒颗粒”是指由至少一种病毒壳体蛋白和壳体化重组病毒载体基因组构成的病毒颗粒。

适合于根据本发明的用途的重组病毒载体包括源自逆转录病毒，慢病毒，单纯疱疹病毒-1病毒(HSV-1)，腺病毒和腺伴随病毒(AAV)的重组病毒载体(Thomas等，同上-见本文件的表1，用于比较这些载体在基因疗法中使用的相对优点和缺点)。

病毒载体可以分为整合和非整合载体。整合载体如逆转录病毒和慢病毒将转基因永久插入宿主细胞染色体中。非整合载体如腺病毒和基于HSV的载体介导自附加体的转基因表达。基于AAV的载体主要是非整合载体(<10％整合)。与将遗传至每个子细胞的整合载体相比，非整合载体将在快速分裂的细胞中快速稀释，但也不造成插入诱变的风险。因此，逆转录病毒通常用于转染经历快速细胞分裂和分化的细胞(例如，造血干细胞)，并且非整合病毒用于有丝分裂后组织(例如，肝，肌肉或眼)。

在本发明的具体实施方案中，重组病毒载体是非整合的(或主要是非整合的，即体内整合小于50％，例如小于40％，30％，20％或10％的持久性载体基因组)，附加型病毒载体。

在本发明的具体实施方案中，重组病毒颗粒感染非分裂细胞，例如肝脏细胞(肝细胞)。

在本发明的其他实施方案中，重组病毒颗粒感染分裂细胞，例如B淋巴细胞。

在具体实施方案中，重组病毒颗粒感染导致编码的因子I或其片段或衍生物表达和分泌到受试者血流中的细胞。合适的细胞类型包括肝脏细胞(肝细胞)和B淋巴细胞。

重组病毒颗粒应当能够转导细胞，所述细胞是编码因子I或其片段或衍生物表达的预期靶标。在具体实施方案中，重组病毒颗粒能够转导肝脏细胞(特别是肝细胞)。

在一些实施方案中，重组病毒载体包含编码因子I或其片段或衍生物的核酸，其侧翼为病毒顺式作用调节序列，如反向末端重复(ITR)。

在一些实施方案中，编码因子I或其片段或衍生物的核酸与启动子可操作地连接。示例性启动子包括但不限于巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子，RSV LTR，MoMLV LTR，磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子，猿病毒40(SV40)启动子和CK6启动子，转甲状腺素蛋白启动子(TTR)，ΤK启动子，四环素响应启动子(TRE)，HBV启动子，人α-1-抗胰蛋白酶(hAAT)启动子，白蛋白启动子，肝特异性启动子(LSP)，嵌合肝特异性启动子(LSP)，E2F启动子，端粒酶(hTERT)启动子；巨细胞病毒增强子/鸡beta-肌动蛋白/兔β-珠蛋白启动子(CAG启动子；Niwa et al.,Gene,1991,108(2):193-9)和延伸因子1-alpha启动子(EF1-alpha)启动子(Kim et al.,Gene,1990,91(2):217-23和Guo et al.,Gene Ther.,1996,3(9):802-10)。在一些实施方案中，启动子包含人β-葡糖醛酸糖苷酶启动子，β-肌动蛋白启动子，鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子，与CBA启动子连接的巨细胞病毒增强子，逆转录病毒劳氏肉瘤病毒(RSV)LTR启动子，或二氢叶酸还原酶启动子。

在一些实施方案中，启动子促进编码因子I或其片段或衍生物的核酸在肝脏细胞中，例如在肝细胞中的表达。

适合于本发明中的用途的肝特异性启动子的实例包括HLP,LP1,HLP2,hAAT,HCR-hAAT,ApoE-hAAT和LSP。

这些肝特异性启动子在以下参考文献中更详细描述：

HLP:Mcintosh J.et al,Blood 2013Apr 25,121(17):3335-44和WO2011/005968；

LP1:Nathwani et al,Blood 2006April 1,107(7):2653-2661和WO06/036502；

HCR-hAAT:Miao et al,Mol Ther.2000；1:522-532；

ApoE-hAAT:Okuyama et al,Human Gene Therapy,7,637-645(1996)；

LSP:Wang et al,Proc Natl Acad Sci USA 1999March 30,96(7):3906-3910和

HLP2:WO2016/075473。

启动子可以是组成性，诱导型或可阻抑启动子。示例性启动子和描述可以在例如US 2014/0335054中找到。

组成性启动子的实例包括但不限于逆转录病毒劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子(任选地具有RSV增强子)，巨细胞病毒(CMV)启动子(任选地具有CMV增强子)(参见例如Boshartet al.,Cell,41:521-530(1985))，SV40启动子，二氢叶酸还原酶启动子，13-肌动蛋白启动子，磷酸甘油激酶(PGK)启动子和EF1a启动子(Invitrogen)。

诱导型启动子允许调节基因表达，并且可以通过外源提供的化合物，环境因素如温度，或特定生理状态，例如急性期，细胞的特定分化状态的存在或仅在复制细胞中调节。诱导型启动子和诱导型系统可购自多种商业来源，包括但不限于Invitrogen、Clontech和Ariad。已经描述了许多其他系统并且可由本领域技术人员容易地选择。通过外源提供的促进剂调节的诱导型启动子的实例包括锌诱导型绵羊金属硫蛋白(MF)启动子，地塞米松(Dex)诱导型小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子，T7聚合酶启动子系统(WO98/10088)；蜕皮激素昆虫启动子(No et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:3346-3351(1996))，四环素可阻抑系统(Gossen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:5547-5551(1992))，四环素诱导型系统(Gossen et al.,Science,268:1766-1769(1995)，也见Harvey et al.,Curr.Opin.Chem.Biol.,2:512-518(1998))，RU486诱导型系统(Wang et al.,Nat.Biotech.,15:239-243(1997)和Wang et al.,Gene Ther.,4:432-441(1997))和雷帕霉素诱导型系统(Magari et al.,J.Clin.Invest.,100:2865-2872(1997))。可用于该背景中的其他类型的诱导型启动子是那些受特定生理状态，例如温度，急性期，细胞的特定分化状态，或仅在复制细胞中调节的启动子。

在另一个实施方案中，可以使用因子I或其片段或衍生物的天然启动子或其片段。当期望因子I或其片段或衍生物的表达模拟天然表达时(只要在表达后，受试者中C3b失活和iC3b降解活性的水平升高或超过正常水平)，可以使用天然启动子。当必须在时间或发育上，或以组织特异性方式，或响应特定的转录刺激物调节转基因的表达时，可以使用天然启动子。在另一个实施方案中，其他天然表达控制元件如增强子元件，多腺苷酸化位点或Kozak共有序列也可用于模拟天然表达。

重组病毒载体可以包含在靶组织或细胞中建立编码的因子I或其片段或衍生物的表达所需要的任何调节序列。例如，重组病毒载体可以包含表达盒，所述表达盒包含编码因子I或其片段或衍生物的核酸，所述核酸可操作连接于启动子和多腺苷酸化识别位点。重组病毒载体还可以包含其他调节序列以建立因子I或片段或衍生物的表达，例如核糖体结合元件，终止子，增强子，选择标志物，内含子，多聚A信号和/或复制起点，或者土拨鼠肝炎病毒(WHP)转录后调控元件(WPRE)序列，或突变的WPRE序列。

在一些实施方案中，调节序列赋予组织特异性基因表达能力。在一些情况下，组织特异性调节序列结合组织特异性转录因子，其以组织特异性方式诱导转录。此类组织特异性调节序列(例如，启动子，增强子等)是本领域公知的。

在一些实施方案中，启动子序列可以在受试者中普遍表达，因此可以通过将其递送至靶定组织而在所述组织(例如，肝)的一个或多个细胞中表达。在其他实施方案中，可以使用在靶组织(例如，肝)或靶组织的一个或多个细胞的子集(例如肝细胞)中特异性表达的启动子序列。

在一些实施方案中，因子I或其片段或衍生物仅在靶组织的特定细胞(例如，肝细胞)中表达，而不在该组织的其他细胞中表达。

在具体的实施方案中，编码的因子I或其片段或衍生物从对特定组织或细胞类型特异性的启动子表达，所述特定组织或细胞类型是编码因子I或片段或衍生物的意图表达靶标。例如，启动子可以是肝特异性启动子，如hAAT启动子。

在一个实施方案中，启动子是选自HLP,LP1,HLP2,hAAT,HCR-hAAT,ApoE-hAAT和LSP的肝特异性启动子。

在一个实施方案中，启动子包含核苷酸序列或由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列在其整个长度上与SEQ ID NO:8的核苷酸序列是至少60％，70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同的。在一个实施方案中，启动子包含SEQ ID NO:8的核苷酸序列或由SEQ ID NO:8的核苷酸序列组成。

在一个实施方案中，启动子包含核苷酸序列或由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列在其整个长度上与SEQ ID NO:9的核苷酸序列是至少60％，70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同的。在一个实施方案中，启动子包含SEQ ID NO:9的核苷酸序列或由SEQ ID NO:9的核苷酸序列组成。

在一个实施方案中，启动子包含核苷酸序列或由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列在其整个长度上与SEQ ID NO:10的核苷酸序列是至少60％，70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同的。在一个实施方案中，启动子包含SEQ ID NO:10的核苷酸序列或由SEQ ID NO:10的核苷酸序列组成。

在一些实施方案中，重组病毒载体或表达盒包含肝特异性增强子，例如肝特异性载脂蛋白E(ApoE)增强子。在具体实施方案中，重组病毒载体或表达盒包含肝特异性启动子，例如hAAT启动子，和肝特异性增强子，例如肝特异性载脂蛋白E(ApoE)增强子。

在一些实施方案中，表达盒的侧翼可以有病毒顺式作用调节序列，如反向末端重复(ITR)。

在具体实施方案中，重组病毒颗粒在施用后感染受试者的肝(例如，肝细胞)，导致因子I或其片段或衍生物从肝(例如，肝细胞)中表达，并将因子I或其片段或衍生物分泌入受试者的血流中。在此类实施方案中，编码的因子I或其片段或衍生物可以从肝特异性启动子，例如人α-1-抗胰蛋白酶(hAAT)启动子或白蛋白启动子表达。

在本发明的具体方面，重组病毒载体是重组AAV(rAAV)载体。AVA是一种小的无包膜病毒，其由包装容量约4.7kb的线性单链DNA基因组组成。其复制循环依赖于能够补充AAV复制的缺少基因的辅助病毒的共感染(Buller,et al.,J.Virol.,40(1):241–247,October1981)，例如，腺病毒(认为是天然辅助病毒)(Urabe,et al.,J.Virol.,80(4):1874–1885,February 2006),疱疹病毒(Afione,et al.,J.Virol.,70(5):3235–3241,May1996)或杆状病毒(Samulski,et al.,EMBO J.,10(12):3941–3950,December 1991)。AAV是“天然缺陷”病毒的事实增加安全屏障以防止病毒载体在临床应用中的不适当传播(Nakai,et al.,J.Virol.,75(15):6969–6976,August 2001)。可以通过在两个反向末端重复(ITR)之间插入转基因(即编码因子I或其片段或衍生物的核酸)来产生重组AAV(rAAV)载体。例如，可以通过将此类载体与编码所有其他必需基因的一种或多种质粒共转染来产生重组AAV颗粒。它们可以感染分裂和静止细胞两者，并且与优选整合在人19号染色体中的特定位点处的野生型AAV形成对比，主要以附加体形式持续存在。若存在于分裂细胞中，附加型AAV基因组在细胞分裂期间被迅速稀释。

“重组AAV载体(rAAV载体)”是指包含侧翼为至少一个AAV反向末端重复序列(ITR)的编码因子I或其片段或衍生物的核酸的多核苷酸载体。在具体实施方案中，编码因子I或其片段或衍生物的核酸侧翼为两个AAV ITR。当存在于例如已经用合适的辅助病毒(或其表达适当的辅助功能)和另一种表达AAV rep和cap基因产物(即AAV Rep和Cap蛋白)的质粒感染的宿主细胞中时，可以将此类rAAV载体复制并包装成感染性病毒颗粒，如下面更详细地解释。

在一些实施方案中，rAAV载体包含侧翼为至少一个AAV ITR序列的表达盒，其中表达盒包含编码因子I或其片段或衍生物的核酸，其可操作地连接到启动子和多腺苷酸化识别位点，和任选地WPRE序列或突变体WPRE序列。在具体实施方案中，表达盒侧翼为两个AAVITR序列。在一些实施方案中，表达盒可以进一步包含控制序列，包括转录起始和终止序列。

AAV的“辅助病毒”是指允许AAV(其是缺陷型细小病毒)由宿主细胞复制和包装的病毒。已经鉴定出许多此类辅助病毒，包括腺病毒，疱疹病毒和痘病毒诸如牛痘。腺病毒包括许多不同的亚组，但最常用亚组C的腺病毒5型(Ad5)。人、非人哺乳动物和禽类起源的许多腺病毒是已知的，并且可购自诸如ATCC的保藏中心。也可购自诸如ATCC的保藏中心的疱疹病毒家族包括例如单纯疱疹病毒(HSV)，埃巴病毒(EBV)，巨细胞病毒(CMV)和伪假性狂犬病病毒(PRV)。

“反向末端重复”或“ITR”序列是本领域中充分理解的术语，是指在相反方向的病毒基因组末端发现的相对短的序列。“AAV反向末端重复(ITR)”序列(也是本领域中充分理解的术语)是存在于天然单链AAV基因组的两个末端的约145个核苷酸的序列。ITR的最外的125个核苷酸可以以两个备选取向之任一存在，导致不同AAV基因组之间和单个AAV基因组的两个末端之间的异质性。最外的125个核苷酸还含有几个较短的自身互补性区域(称为A，A'，B，B'，C，C'和D区)，允许在ITR的该部分内发生链内碱基配对。

AAV ITR序列应当如意图的那样发挥功能以用于AAV病毒体的拯救，复制和包装(参见Davidson et al.,PNAS,2000,97(7)3428-32；Passini et al.,J.Virol.,2003,77(12):7034-40；和Pechan et al.,Gene Ther.,2009,16:10-16)。用于在本发明载体中使用的AAV ITR不需要具有野生型核苷酸序列(例如如Kotin,Hum.Gene Ther.,1994,5:793-801中所述)，并且可以通过插入，缺失或取代核苷酸来改变，或AAV ITR可以源自几种AAV血清型中的任一种(参见Gao et al.,PNAS,2002,99(18):11854-6；Gao et al.,PNAS,2003,100(10):6081-6；和Bossis et al.,J.Virol.,2003,77(12):6799-810。

用于在本发明载体中使用的ITR可以包含天然存在的ITR的核苷酸序列或由天然存在的ITR的核苷酸序列组成，或者可以包含下述核苷酸序列或由下述核苷酸序列组成，所述核苷酸序列在其整个长度上与天然存在的ITR的核苷酸序列是至少60％,70％,80％,90％,95％,96％,97％,98％,或99％相同的。特别地，用于本发明载体中使用的AAV ITR可以包含天然存在的AAV ITR的核苷酸序列或由天然存在的AAV ITR组成，或者可以包含下述核苷酸序列或由下述核苷酸序列组成，所述核苷酸序列在其整个长度上与天然存在的AAVITR，诸如以下任一种AAV血清型：AAV1,AAV2,AAV3,AAV4,AAV5,AAV6,AAV7,AAV8,AAV9,AAV10,AAV11,AAV12的AAV ITR的核苷酸序列是至少60％,70％,80％,90％,95％,96％,97％,98％或99％相同的。

尽管体内整合率较低，但是AAV载体可以整合到人类基因组中。rAAV介导的基因表达的主要来源是染色体外的，而不是整合的基因组。在小鼠肝切除术的模型中，少于10％的持久性载体基因组整合在肝中(Miller,et al.,Nat.Genet.,30(2):147–148,February2002)。

AAV具有令人印象深刻的安全性记录，并且尽管大多数人(>70％)对一种或多种血清型呈血清阳性，但是尚未与任何已知的人或动物疾病联系起来。尽管可能影响再施用的中和抗体的产生，AAV载体尚未与毒性或炎症应答联系起来。然而，可以通过操作壳体序列减少此种免疫应答(Mingozzi and High,Blood,122(1):23–36,July 2013)。

在具体实施方案中，重组病毒颗粒是重组腺伴随病毒(rAAV)颗粒。“rAAV颗粒”是指由至少一种AAV壳体蛋白和壳体化的重组病毒载体基因组，特别是壳体化的rAAV载体基因组构成的病毒颗粒。

图4概述了根据本发明的AAV基因疗法方法的基本步骤。使用编码因子I或其片段或衍生物的重组AAV载体来产生将载体壳体化的rAAV颗粒。在例如通过注射将rAAV颗粒施用于受试者后，rAAV颗粒感染靶细胞，并且由载体编码的因子I或其片段或衍生物由靶细胞表达，导致因子I或片段或衍生物分泌到受试者的血流中。下面更详细地解释此类方法。

已知硫酸乙酰肝素(heparan sulfate)蛋白聚糖(HSPG)充当AAV血清型2(AAV2)颗粒的细胞受体(Summerford,C.and Samulski,R.J.(1998)J.Virol.72(2):1438-45)。AAV2颗粒和细胞膜处的HSPG之间的结合用来将颗粒附着到细胞。其他细胞表面蛋白如成纤维细胞生长因子受体和αvβ5整联蛋白也可促进细胞感染。结合后，AAV2颗粒可以经由机制进入细胞，所述机制包括经由网格蛋白包被的小窝(pits)的受体介导的胞吞。在内体酸化后，AAV2颗粒可以从胞吞囊泡释放。这允许AAV2颗粒行进到核周区域然后行进到细胞核。

已知AAV的壳体包括三种壳体蛋白：VP1，VP2和VP3。这些蛋白质含有相当大量的重叠氨基酸序列和独特的N端序列。AAV2壳体包含通过二十面体对称排列的60个亚基(Xie,Q.,et al.(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.99(16):10405-10)。已经发现VP1，VP2和VP3以1:1:10比率存在。AAV2壳体蛋白和HSPG之间的结合通过碱性AAV2壳体蛋白残基和带负电的糖胺聚糖残基之间的静电相互作用发生(Opie,SR et al.,(2003)J.Virol.77:6995-7006；Kern,A et al.,(2003)J.Virol.11:11072-11081)。涉及这些相互作用的特定壳体残基包括R484，R487，K532，R585和R588。病毒最有效地感染它们的天然宿主细胞。假型化涉及将介导细胞进入的表面蛋白质与来自另一种病毒的表面蛋白质交换以改变病毒向性。假型化的实例包括用水疱性口炎病毒的蛋白G假型化的慢病毒(VSV G假型化的慢病毒)，其可以转染几乎每种细胞(Akkina,et al.,J.Virol.,70(4):2581–2585,April 1996；Willett andBennett,Front Immunol,4:261,2013；Sharland,et al.,Discov Med,9(49):519–527,June 2010)。在其他情况下，病毒的向性仅限于靶细胞。这允许减少施用的载体剂量并防止转基因在相应细胞类型之外表达，例如仅在眼(Grimm,et al.,Blood,102(7):2412–2419,October 2003)或肝(Thomas,et al.,J.Virol.,78(6):3110–3122,March 2004；Lisowski,et al.,Nature,506(7488):382–386,February 2014；Niidome and Huang.Gene Ther.,9(24):1647–1652,December2002)中表达。假型(pseudotype)也可以人工产生，例如通过制备由具有改善的人肝细胞向性的DNA改组的AAV壳体构成的文库(Li and Huang.GeneTher.,13(18):1313–1319,September 2006)。这可以帮助克服低载体摄取和转基因表达。

根据本发明，重组病毒颗粒可以是假型化的，以赋予要感染的细胞类型的向性。例如，在重组病毒颗粒感染肝脏细胞(例如肝细胞)的本发明的实施方案中，重组病毒颗粒可以是假型化的，以赋予肝向性，特别是肝细胞向性。在重组病毒颗粒感染B淋巴细胞的本发明的其他实施方案中，可以使用来自埃巴病毒的gp220/350或其片段实现B淋巴细胞的向性。

在某些实施方案中，重组病毒颗粒是假型化以赋予肝向性，特别是肝细胞向性的rAAV颗粒。

已经鉴定出超过100种不同的AAV血清型(Atchison,et al.,Science,149(3685):754–756,August 1965；Warrington,et al.,J.Virol.,78(12):6595–6609,June 2004)。例如，可以通过将另一种血清型的壳体序列包装到辅助质粒中来对rAAV病毒颗粒容易地实现假型化。可以采取几种改善向性和转基因表达的方法：i)构建由随机化壳体序列组成的壳体文库(Li and Huang,Gene Ther.,13(18):1313–1319,September 2006)；ii)将氨基酸序列插入AAV2的壳体中(高达30kDa，插入ScFv序列以将AAV靶向至特定细胞类型的可能性)(Calcedo,et al.,J.Infect.Dis.,199(3):381–390,February 2009)；iii)通过将递送机制的知识与AAV结构分析相结合的合理设计方法(Calcedo,et al.,Clin.VaccineImmunol.,18(9):1586–1588,September 2011)。

任何AAV血清型的使用被认为在本发明的范围内。在一些实施方案中，rAAV载体是源自AAV血清型的载体，包括AAV1,AAV2,AAV3,AAV4,AAV5,AAV6,AAV7,AAV8,AAV9,AAV10,AAV11,或AAV12ITR。rAAV颗粒可以包含源自任何AAV血清型的壳体蛋白，包括AAV1,AAV2,AAV3,AAV4,AAV5,AAV6,AAV7,AAV8,AAV9,AAV10,AAVrh10,AAV11或AAV12壳体。使用不同的AAV血清型来优化特定靶细胞的转导或靶向特定靶组织(例如肝组织)内的特定细胞类型。rAAV颗粒可以包含相同血清型或混合血清型的病毒蛋白和病毒核酸。

本发明的重组病毒颗粒的壳体蛋白可以包含天然存在的壳体蛋白的氨基酸序列或由天然存在的壳体蛋白的氨基酸序列组成(例如，天然存在的AAV壳体蛋白，如AAV血清型AAV1,AAV2,AAV3,AAV4,AAV5,AAV6,AAV7,AAV8,AAV9,AAV10,AAVrh10,AAV11,或AAV12的壳体蛋白)，或者可以是天然存在的壳体蛋白的衍生物，其与天然存在的壳体蛋白的氨基酸序列相比包含一个或多个氨基酸取代，缺失或添加，例如以赋予期望组织类型或细胞类型的增强的向性(例如肝或肝细胞向性)，或降低重组病毒颗粒的免疫原性。

在一些实施方案中，本发明的重组病毒颗粒的壳体蛋白具有氨基酸序列，所述氨基酸沿着其整个长度与天然存在的壳体蛋白的氨基酸序列具有至少60％，70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％或99％的氨基酸同一性。在一些实施方案中，本发明的rAAV颗粒的AAV壳体蛋白具有氨基酸序列，所述氨基酸序列沿着其整个长度与天然存在的AAV壳体蛋白的氨基酸序列，例如血清型AAV1,AAV2,AAV3,AAV4,AAV5,AAV6,AAV7,AAV8,AAV9,AAV10,AAVrh10,AAV11,或AAV12的天然存在的AAV壳体蛋白具有至少60％，70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％或99％的氨基酸同一性。

在一些实施方案中，本发明的重组病毒颗粒的壳体蛋白是非天然存在的壳体蛋白，例如非天然存在的AAV壳体蛋白，例如工程化或嵌合壳体蛋白。

嵌合壳体蛋白包括通过天然存在的AAV血清型的两种或更多种壳体编码序列之间的重组产生的那些。这可以例如通过标志物拯救方法进行，其中一种血清型的非感染性壳体序列与不同血清型的壳体序列共转染，并且定向选择用于选择具有期望特性的壳体序列。可以通过细胞内的同源重组以产生新的嵌合壳体蛋白来改变不同血清型的壳体序列。

嵌合壳体蛋白还包括通过工程化改造壳体蛋白序列以在两种或更多种壳体蛋白之间，例如在不同血清型的两种或更多种壳体蛋白之间转移特定壳体蛋白域，表面环或特定氨基酸残基而产生的那些。

改组或嵌合壳体蛋白也可以通过DNA改组或易错PCR产生。可以如下创建杂合AAV壳体基因：通过将相关AAV基因，例如那些编码多种不同血清型的壳体蛋白的AAV基因的序列随机片段化，然后在自引发聚合酶反应中重新组装片段，所述自引发聚合酶反应也可以引起序列同源性区域的交换。可以筛选通过改组几种血清型的壳体基因以此种方式创建的杂合AAV基因文库，以鉴定具有期望功能的病毒克隆。类似地，易错PCR可用于随机突变AAV壳体基因以创建多种多样的变体文库，然后可以对变体文库选择期望的特性。

还可以对壳体基因的序列进行遗传修饰以引入相对于天然野生型序列的特定缺失，取代或插入。特别地，壳体基因可以通过在壳体编码序列的可读框内或在壳体编码序列的N和/或C端插入无关蛋白质或肽的序列来修饰。

适合于在本发明中使用的非天然存在的壳体蛋白的实例描述于WO2016/181123和WO 2013/029030中。

在一个实施方案中，本发明的重组病毒颗粒的壳体蛋白是MutC壳体蛋白(例如，如WO 2016/181123中所述的Mut C壳体蛋白)。在一个实施方案中，本发明的重组病毒颗粒的壳体蛋白具有氨基酸序列，所述氨基酸序列沿着其整个长度与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少60％，70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％或99％的氨基酸同一性。在一个实施方案中，本发明的重组病毒颗粒的壳体蛋白具有包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列或由SEQ ID NO:11的氨基酸序列组成的氨基酸序列。

在一个实施方案中，本发明的重组病毒颗粒的壳体蛋白是LK03壳体蛋白(例如，如WO 2013/029030中所述的LK03壳体蛋白)。在一个实施方案中，本发明的重组病毒颗粒的壳体蛋白具有氨基酸序列，所述氨基酸序列沿着其整个长度与SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有至少60％，70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％或99％的氨基酸同一性。在一个实施方案中，本发明的重组病毒颗粒的壳体蛋白具有包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列或由SEQID NO:12的氨基酸序列组成的氨基酸序列。

在一个实施方案中，本发明的重组病毒颗粒的壳体蛋白是如Wang et al.MolTher.2015Dec；23(12):1877–1887所述的AAVrh10蛋白或其衍生物，所述衍生物沿着其整个长度与公开的AAVrh10蛋白的氨基酸序列具有至少60％，70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％或99％的氨基酸同一性。

在本发明的具体实施方案中，重组病毒载体是AAV2衍生的病毒载体，即重组病毒载体，其中编码因子I或其片段或衍生物的核酸侧翼为至少一个AAV2ITR序列(Kottermanand Schaffer,Nat.Rev.Genet.,15(7):445–451,July2014)，或其在其整个长度上与天然存在的AAV2ITR的核苷酸序列具有至少60％，70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％或99％同一性的核苷酸序列的衍生物。在一些实施方案中，编码因子I或其片段或衍生物的核酸侧翼为两个AAV2ITR或AAV2ITR衍生物(其中每个AAV2ITR衍生物包含在其整个长度上与天然存在的AAV2ITR的核苷酸序列具有至少60％，70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％或99％同一性的核苷酸序列)。

AAV2具有广泛的向性并且在体内相对有效地转导许多细胞类型，包括肝细胞。用不同壳体蛋白对重组AAV载体进行假型化可以显著改变向性。当与AAV2相比时，AAV8和AAV9两者对肝细胞具有更高的亲和力。特别地，当与AAV2相比时，AAV8可以转导多3至4倍的肝细胞并且每个转导的细胞递送多3至4倍的基因组。

在一个实施方案中，重组病毒载体不是AAV2衍生的病毒载体。

在一些实施方案中，本发明的rAAV颗粒包含AAV8或AAV9壳体蛋白(或其衍生物，所述衍生物沿着其整个长度与天然存在的AAV8或AAV9壳体蛋白的氨基酸序列具有至少60％，70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％的氨基酸同一性)。在具体实施方案中，rAAV颗粒将AAV2衍生的病毒载体壳体化，并且用AAV8壳体假型化(rAAV2/8)或用AAV9壳体假型化(rAAV2/9)(或其衍生物，所述衍生物沿着其整个长度与天然存在的AAV8或AAV9壳体蛋白的氨基酸序列具有至少60％，70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％的氨基酸同一性)。在其他实施方案中，rAAV颗粒将AAV2衍生的病毒载体壳体化，并用Mut C壳体(rAAV2/Mut C)或LK03壳体(rAAV2/LK03)或AAVrh10壳体(rAAV2/rh10)假型化。

本领域中已知用于生产rAAV颗粒的许多方法，包括转染，稳定细胞系生产和感染性杂合病毒生产系统，其包括腺病毒-AAV杂合物，疱疹病毒-AAV杂合物(Conway,et al.,(1997)J.Virology 71(11):8780-8789)和杆状病毒-AAV杂合物。

用于生产rAAV病毒颗粒的rAAV生产培养物都需要：i)合适的宿主细胞，包括例如人衍生的细胞系如HeLa，A549，293或293T细胞，或昆虫衍生的细胞系如SF-9，在杆状病毒生产系统的情况中；ii)合适的辅助功能，由野生型或突变型腺病毒(如温度敏感型腺病毒)，疱疹病毒，杆状病毒或提供辅助功能的质粒构建体提供；iii)AAV rep和cap基因；iv)编码因子I或其片段或衍生物的核酸，其侧翼为至少一个AAV ITR序列；和v)合适的培养基和培养基组分以支持rAAV生产。

本领域已知的合适培养基可以用于生产rAAV颗粒。这些培养基包括但不限于由Hyclone Laboratories和JRH生产的培养基，包括改良Eagle培养基(MEM)，Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)高葡萄糖，定制配制剂，如US6,566,118中描述的定制配制剂，和Sf-900II SFM培养基，如US 6,723,551中所述。

可以使用本领域已知的方法生产rAAV颗粒。参见例如US 6,566,118，US6,989,264和US 6,995,006。在实施本发明时，用于产生rAAV颗粒的宿主细胞包括哺乳动物细胞，昆虫细胞，植物细胞，微生物和酵母。宿主细胞也可以是包装细胞，其中AAV rep和cap基因稳定地保持在宿主细胞中，或者是稳定维持AAV载体基因组的生产细胞。示例性包装和生产细胞源自293，293T，A549或HeLa细胞。使用本领域已知的标准技术纯化和配制AAV载体。

在一些实施方案中，rAAV颗粒可以通过三重转染方法产生，例如下文提供的示例性三重转染方法。简言之，可以将含有rep基因和壳体基因的质粒，辅助腺病毒质粒和包含转基因的质粒(即编码因子I或其片段或衍生物的基因)(例如，使用磷酸钙法，或聚乙烯亚胺(polyyleylenimine)转染入细胞系(例如，HEK-293细胞)中，并且可以收集病毒并任选地纯化病毒。

在一些实施方案中，rAAV颗粒可以通过生产细胞系方法产生，例如下文提供的示例性生产细胞系方法(还见Martin et al.,(2013)Human Gene Therapy Methods 24:253-269中引用)。简言之，可以用含有rep基因，壳体基因和启动子-转基因序列的质粒稳定转染细胞系(例如HeLa细胞系)。可以筛选细胞系以选择用于rAAV产生的前导克隆，然后可以将其扩增至生产生物反应器并用腺病毒(例如，野生型腺病毒)作为辅助剂感染以启动rAAV生产。随后可以收获病毒，可以将腺病毒灭活(例如，通过加热)和/或除去，并且可以纯化rAAV颗粒。

在本发明的一些方面，提供了用于生产本发明的rAAV颗粒的方法，其包括：(a)在生产rAAV颗粒的条件下培养宿主细胞，其中宿主细胞包含(i)一种或多种AAV包装基因，其中每种AAV包装基因编码AAV复制和/或壳体化蛋白；(ii)rAAV载体，其包含编码因子I或其保留C3b失活和iC3b降解活性的片段或衍生物的核酸，所述核酸侧翼为至少一个AAV ITR(优选两个AAV ITR)，和(iii)AAV辅助功能(即生产性AAV生命周期所需要的基因，例如来自腺病毒，疱疹病毒或杆状病毒)；(b)回收宿主细胞产生的rAAV颗粒。在一些实施方案中，(i)，(ii)和(iii)可以在三个分开的质粒上提供，例如如下文实施例1中所述。

在一些实施方案中，所述AAV ITR或每个AAV ITR包含天然存在的AAV ITR的核苷酸序列或由天然存在的AAV ITR的核苷酸序列组成，例如以下血清型AAV ITR中的任一种：AAV1,AAV2,AAV3,AAV4,AAV5,AAV6,AAV7,AAV8,AAV9,AAV 10,AAV11,AAV12，例如AAV2ITR，或包含下述核苷酸序列或由下述核苷酸序列组成，所述核苷酸序列在其整个长度上与天然存在的AAV ITR，诸如以下AAV血清型中的任一种的AAV ITR：AAV1,AAV2,AAV3,AAV4,AAV5,AAV6,AAV7,AAV8,AAV9,AAV 10,AAV11,AAV12的核苷酸序列是至少60％,70％,80％,90％,95％,96％,97％,98％或99％相同的。

在一些实施方案中，壳体化蛋白是AAV8或AAV9或Mut C或LK03或AAVrh10壳体化蛋白。

合适的rAAV生产培养基可以补充有0.5％-20％(ν/ν或w/v)水平的血清或血清衍生的重组蛋白。或者，如本领域已知的，rAAV颗粒可以在无血清条件下产生，所述无血清条件也可以称为不含动物衍生产物的培养基。本领域普通技术人员可以理解，设计用于支持rAAV颗粒产生的商业或定制培养基也可以补充有本领域已知的一种或多种细胞培养组分，包括但不限于葡萄糖，维生素，氨基酸和/或生长因子，以增加生产培养物中rAAV的滴度。

可以在适合于所用特定宿主细胞的多种条件下(在宽的温度范围内，持续不同的时间长度等)培养rAAV生产培养物。如本领域已知的，rAAV生产培养物包含附着依赖性培养物，其可以在合适的附着依赖性容器中培养，诸如例如hyperflask，滚瓶，中空纤维滤器，微载体和填充床或流化床生物反应器。rAAV载体生产培养物还可以包含悬浮适应的宿主细胞，例如HeLa，293，293T和SF-9细胞，其可以以多种方式培养，包括例如旋转瓶，搅拌槽生物反应器和一次性系统，例如Wave bag系统。

可以通过裂解生产培养物的宿主细胞或通过从生产培养物中收获用过的培养基从rAAV生产培养物中收获本发明的rAAV颗粒，条件是细胞在本领域已知引起rAAV颗粒从完整细胞释放到培养基中的条件下培养，如US 6,566,118中更全面描述。裂解细胞的合适方法也是本领域已知的，包括例如多次冷冻/解冻循环，超声处理，微流化和用化学品，例如去污剂和/或蛋白酶处理。

在进一步的实施方案中，纯化rAAV颗粒。如本文所用，术语“纯化的”包括不含也可以在天然存在rAAV颗粒或最初制备rAAV颗粒的地方存在的至少一些其他组分的rAAV颗粒制剂。因此，例如，可以使用纯化技术制备分离的rAAV颗粒，以从来源混合物(诸如培养裂解物或生产培养上清液)中富集它们。富集可以以多种方式测量，诸如例如通过溶液中存在的DNA酶抗性颗粒(DRP)或基因组拷贝(gc)的比例，或通过感染性，或者它可以相对于来源混合物中存在的第二种潜在干扰物质，例如污染物，包括生产培养污染物或过程中污染物，包括辅助病毒或培养基组分测量。

在一些实施方案中，澄清rAAV生产培养物收获物以除去宿主细胞碎片。在一些实施方案中，通过一系列深度滤器过滤澄清生产培养物收获物，所述深度滤器包括例如DOHC级Millipore Millistak+HC Pod滤器，A1HC级Millipore Millistak+HC Pod滤器和0.2μmFilterOpticapXL1O Millipore Express SHC亲水性膜滤器。澄清也可以通过本领域已知的各种其他标准技术实现，例如，离心或通过本领域已知的0.2μm或更大孔径的任何醋酸纤维素滤器的过滤。

在一些实施方案中，用进一步处理rAAV生产培养物收获物以消化生产培养物中存在的任何高分子量DNA。在一些实施方案中，消化在本领域已知的标准条件下进行，包括例如1-2.5单位/ml 的最终浓度于范围为环境至37℃的温度持续30分钟至数个小时的时间段。

可以使用以下一个或多个纯化步骤分离或纯化rAAV颗粒：使用氯化铯进行密度梯度超速离心(例如，如Cooper et al.,Molecular Therapy(2005)11,Supplement 1,S53-S54中所述)或碘克沙醇；平衡离心；流通式阴离子交换过滤；用于浓缩rAAV颗粒的切向流过滤(TFF)；通过磷灰石层析捕获rAAV；辅助病毒的热失活；通过疏水性相互作用层析捕获rAAV；通过尺寸排阻层析(SEC)进行缓冲液交换；纳米过滤；和通过阴离子交换层析，阳离子交换层析或亲和层析捕获rAAV。这些步骤可以单独使用，以各种组合使用，或以不同的顺序使用。纯化rAAV颗粒的方法描述于例如Xiao et al.,(1998)Journal of Virology 72:2224-2232；US 6,989,264；US 8,137,948；和WO 2010/148143。

可以通过任何合适的途径将重组病毒颗粒施用于受试者。在具体实施方案中，将重组病毒颗粒静脉内施用于受试者。

在本发明的具体实施方案中，不通过局部(或表面)施用对受试者施用重组病毒颗粒。

在本发明的具体实施方案中，重组病毒颗粒不施用于眼。因此，在具体实施方案中，重组病毒颗粒的施用不包括眼内施用，如眼内注射，例如视网膜下注射。

可以通过系统性施用对受试者施用本发明的重组病毒颗粒。

技术人员将熟悉可以实现系统性施用的多种途径以及相关技术。

举例来说，可以通过胃肠外施用实现系统性施用。胃肠外施用的实例包括：静脉内施用，动脉内施用，肌内施用，鞘内施用和皮下施用。

因此，在具体实施方案中，对受试者系统性施用本发明的重组病毒颗粒。

本发明的重组病毒颗粒的优选施用途径是静脉内施用。

在一个实施方案中，将本发明的重组病毒颗粒施用到受试者的肝门静脉中。有利地，将重组病毒颗粒施用到肝门静脉中将重组病毒颗粒导向肝。

如上所述，在具体实施方案中，重组病毒颗粒在施用后感染受试者的肝(例如，肝细胞)，导致从肝(例如，肝细胞)表达因子I或其片段或衍生物，并且将因子I或其片段或衍生物分泌到受试者的血流中。在此类实施方案中，编码的因子I或其片段或衍生物可以从肝特异性启动子表达。

从肝分泌到受试者血流中的因子I或其片段或衍生物可以在位于身体其他部位的靶组织或细胞中提供治疗效果。从肝分泌到受试者血流中的因子I或其片段或衍生物可以提供受试者中C3b失活和iC3b降解活性水平的系统性增加。

在Sands Methods Mol Biol.2011；807:141-157和Sharland et al.,DiscoveryMedicine,9(49):519-527,June 2010中讨论了AAV介导的肝定向基因疗法。例如，根据剂量，AAV8可以在门静脉注射后转导小鼠肝中高达90-95％的肝细胞。令人感兴趣的是，可以在静脉内注射后达到相当水平的转导。直接实质内注射AAV载体也介导相对高水平的长期表达。可以通过将肝特异性启动子与AAV8壳体蛋白结合使用赋予额外的特异性。

根据治疗目的，施用有效量的重组病毒载体(在一些实施方案中，由重组病毒颗粒壳体化)。例如，在低百分比的转导可以实现期望的治疗效果的情况下，治疗的目的通常是满足或超过该转导水平。在一些情况下，此种水平的转导可以通过转导仅约1％至5％的靶细胞，在一些实施方案中，至少约20％的期望组织类型的细胞，在一些实施方案中至少约50％，在一些实施方案中至少约80％，在一些实施方案中至少约95％，在一些实施方案中至少约99％的期望组织类型的细胞来实现。

在本发明的一些实施方案中，对受试者施用的病毒颗粒的剂量是1x 10⁸至1x 10¹³个基因组拷贝/kg体重。

在本发明的一些实施方案中，对受试者施用的病毒颗粒的剂量是1x 10⁹至1x 10¹⁵个基因组拷贝。

对于将病毒颗粒施用于受试者的实施方案，作为指导，每次注射施用的病毒颗粒的数量通常为1x 10⁶至1x 10¹⁴个颗粒,1x10⁷至1x10¹³个颗粒,1x10⁹至1x10¹²个颗粒或1x10¹¹个颗粒。

重组病毒颗粒可以通过一次或多次注射，在相同的程序期间，或者间隔数天，数周，数月或数年施用。在一些实施方案中，多种载体可用于治疗受试者。

在一些实施方案中，转导至少5％,10％,15％,20％,25％,30％,35％,40％,45％,50％,55％,60％,65％,70％或75％，高达100％的靶组织细胞(例如，肝的肝细胞)。在一些实施方案中，转导5％至100％，10％至约50％，10％至30％，25％至75％，25％至50％或30％至50％的靶组织细胞(例如，肝的肝细胞)。

鉴定由包含重组病毒颗粒壳体的重组病毒颗粒诱导的细胞的方法是本领域已知的。例如，免疫组织化学或标志物诸如增强型绿色荧光蛋白的使用可用于检测重组病毒颗粒的转导。

在一些实施方案中，将重组病毒颗粒施用(例如通过注射)至期望组织(例如肝)中的一个或多个位置。在一些实施方案中，将重组病毒颗粒施用(例如通过注射)至组织中的1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或超过10个位置中的任一个。

在一些实施方案中，将重组病毒颗粒同时或依次施用至超过一个位置。在一些实施方案中，重组病毒颗粒的多次注射相隔不超过1小时，2小时，3小时，4小时，5小时，6小时，9小时，12小时或24小时。

可以对受试者施用一种或多种另外的治疗剂以治疗补体介导的病症。此类试剂可以与病毒颗粒共施用，或顺序施用。顺序施用之间的间隔可以按照至少(或备选小于)几分钟，几小时或几天计。

应当理解，从重组病毒载体的核酸中表达因子I或其片段或衍生物后，受试者中C3b失活和iC3b降解活性可以包括来自受试者的内源性因子I(即并非通过从重组病毒载体表达产生的受试者的因子I)的C3b失活和iC3b降解活性和通过从重组病毒载体表达产生的C3b失活和iC3b降解活性，使得受试者中C3b失活和iC3b降解活性的总水平增加(相对于施用载体之前的水平)或超过正常水平。

受试者中C3b失活和iC3b降解活性的水平可以是受试者血清中的水平。对于人受试者，C3b失活和iC3b降解活性的正常水平等于受试者血清中30-40μg/ml因子I所提供的水平。

在施用根据本发明的重组病毒颗粒之前，受试者可以具有内源因子I的正常水平。在其他实施方案中，受试者可以具有低于正常水平的因子I，例如受试者血清中的因子I可以小于30μg/ml且大于0μg/ml。

作为进一步的实例，受试者血清中因子I的水平可以小于25μg/ml且大于0μg/ml，或小于20μg/ml且大于0μg/ml，或小于15μg/ml且大于0μg/ml，或小于10μg/ml且大于0μg/ml，或小于5μg/ml且大于0μg/ml。

在本发明的具体实施方案中，将受试者中C3b失活和iC3b降解活性的水平提高至超过正常水平的水平。

在本发明的具体实施方案中，将受试者中C3b失活和iC3b降解活性的水平提高至高于正常水平至少5％，10％，15％，20％或25％的水平。

在本发明的具体实施方案中，将受试者中C3b失活和iC3b降解活性的水平提高至正常水平的多达两倍，或高于正常水平高达80％，60％，40％或20％的水平。

例如，可以将受试者中C3b失活和iC3b降解活性的水平提高至高于正常水平5-100％,5-80％,5-60％,5-40％,5-20％,10-100％,10-80％,10-60％,10-40％,10-20％,15-100％,15-80％,15-60％,15-40％,15-20％,20-100％,20-80％,20-60％,20-40％,25-100％,25-80％,25-60％或25-40％的水平。

如上所述，受试者可以具有低于正常水平的血清中的内源因子I水平。因此，在施用根据本发明的重组病毒颗粒之前，在此类受试者中C3b失活和iC3b降解活性的水平可以低于正常水平。可以通过将C3b失活和iC3b降解活性水平提高至大于施用根据本发明的重组病毒颗粒前受试者中C3b-失活和iC3b-降解活性的基线水平的水平在此类受试者中获得治疗效果。任选地，所述增加的C3b失活和iC3b降解活性水平可以保持低于正常水平。

因此，在本发明的具体实施方案中，将受试者中的C3b失活和iC3b降解活性水平提高至大于施用根据本发明的重组病毒颗粒前受试者中基线水平的水平。

在本发明的具体实施方案中，将受试者中C3b失活和iC3b降解活性的水平提高至高于施用根据本发明的重组病毒颗粒前受试者中基线水平至少5％，10％，15％，20％或25％的水平。

在本发明的具体实施方案中，将受试者中C3b失活和iC3b降解活性的水平提高至施用根据本发明的重组病毒颗粒前受试者中基线水平的高达两倍；或者高于施用根据本发明的重组病毒颗粒前受试者中基线水平高达80％,60％，40％，或20％的水平。

例如，可以将受试者中C3b失活和iC3b降解活性的水平可以提高至高于施用根据本发明的重组病毒颗粒前受试者中基线水平5-100％,5-80％,5-60％,5-40％,5-20％,10-100％,10-80％,10-60％,10-40％,10-20％,15-100％,15-80％,15-60％,15-40％,15-20％,20-100％,20-80％,20-60％,20-40％,25-100％,25-80％,25-60％或25-40％的水平。

补体介导的病症可以是与旁路途径调节中的缺陷，特别与补体C3b反馈循环的过度活性相关的病症。

补体介导的病症可以是以症状为特征的病症，所述症状通过受试者中C3b失活和iC3b降解活性水平的增加而得到改善。

可以根据本发明预防或治疗的补体介导的病症的实例包括年龄相关的黄斑变性(AMD)(特别是早期(干性)AMD，或地图状萎缩)、致密沉积物病(DDD)、非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)、C3肾小球病、膜增生性肾小球肾炎2型(MPGN2或MPGN II型)、动脉粥样硬化、慢性心血管疾病、阿尔茨海默病、系统性血管炎、阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)和老年人炎症或自身炎性疾病。

在一个实施方案中，防止或减少地图状萎缩的形成。在另一个实施方案中，减少地图状萎缩的量。

可以根据本发明预防或治疗的C3肾小球病包括C3肾小球肾炎和致密沉积物病(也称为II型膜增生性肾小球肾炎(MPGN))。

可以根据本发明预防或治疗的补体介导的病症的其他实例包括I型膜增生性肾小球肾炎(MPGN I型)，III型膜增生性肾小球肾炎(MPGN III型)，吉兰-巴雷综合征，亨诺-许兰紫癜，IgA肾病，和膜性肾小球肾炎。膜增生性肾小球肾炎(MPGN)也称为肾小球膜毛细血管性肾小球肾炎(mesangiocapillary glomerulonephritis)。

在本发明的具体实施方案中，根据本发明预防，治疗或改善的补体介导的病症选自DDD，aHUS，C3肾小球病，动脉粥样硬化，慢性心血管疾病，阿尔茨海默病，系统性血管炎，PNH，老年人炎性或自身炎性疾病，I型MPGN，III型MPGN，吉兰-巴雷综合征，亨诺-许兰紫癜，IgA肾病和膜性肾小球肾炎。

在一个实施方案中，在有此需要的受试者中所述预防，治疗或改善补体介导的病症包括降低预先存在的治疗方案的所述受试者需要的剂量和/或施用频率，例如降低补体途径组分抑制剂(例如补体蛋白C5的抑制剂，例如抗C5抗体)或抗炎剂(例如类固醇)的所述受试者的需要剂量和/或施用频率。

在本发明的具体实施方案中，根据本发明预防或治疗的补体介导的病症不是眼病症。

在本发明的具体实施方案中，根据本发明预防或治疗的补体介导的病症不是补体介导的眼病症。

在本发明的具体实施方案中，根据本发明预防或治疗的补体介导的病症不是年龄相关的黄斑变性(AMD)或地图状萎缩。

在本发明的具体实施方案中，根据本发明预防或治疗的补体介导的病症不是糖尿病性视网膜病。

受试者可以有形成补体介导的病症的风险。例如，受试者可以对于与补体介导的病症相关的一种或多种SNP是纯合的或杂合的易感的。

在具体实施方案中，受试者有形成AMD的风险。例如，受试者可以对于与AMD相关的一种或多种SNP是纯合的或杂合的易感的。此类SNP的实例包括因子H的rs1061170(编码Y402H)，因子H的rs800292(编码V62I)，因子B的rs641153(编码R32Q)，或C3的rs2230199(编码R102G)，且特别是因子H的rs1061170，因子H的rs800292，或C3的rs2230199。与晚期AMD相关的CFI中的罕见突变(其通常导致降低的血清因子I水平)的其他实例由Kavanagh etal.,Hum Mol Genet.2015Jul 1；24(13):3861-70描述。它们包括以下SNPs:rs144082872(编码P50A)；4:110687847(编码P64L)；rs141853578(编码G119R)；4:110685721(编码V152M)；4:110682846(编码G162D)；4:110682801(编码N177I)；rs146444258(编码A240G)；rs182078921(编码G287R)；rs41278047(编码K441R)；rs121964913(编码R474)。

本发明的方法可以进一步包括确定受试者是否有形成补体介导的病症(例如AMD)的风险，例如通过确定受试者是否对于与补体介导的病症相关的一种或多种SNP是纯合的或杂合的易感的(例如，通过确定受试者是否对于与上文列出的AMD相关的一种或多种SNP是纯合的或杂合的易感的)。

在Lay等人(Clin Exp Immunol181(2):314-322Aug 2015)描述的研究中，针对影响对AMD和某些形式的肾疾病的素因的三种常见多态性对来自大量正常受试者的血清分型，一种在C3中(R102G)，两种在因子H中(V62I和Y402H)。测试了三组血清；那些对三种风险等位基因纯合的血清；那些对所有三者杂合的血清；和那些对低风险等位基因纯合的血清。当通过酵母聚糖激活旁路补体途径时，这些组在其对外源因子I添加的响应上变化。iC3b转化为C3dg的速率和形成的iC3b的最大量的减少都受到影响。对于这两种反应，有风险的补体单元型需要更高剂量的因子I来产生类似的下调。由于iC3b与补体受体CR3反应是补体活化引起炎症的主要机制，因此可以看出iC3b向C3dg的分解对于减少补体诱导的炎症具有重要意义。这些研究结果首次表明，来自具有不同补体等位基因的受试者的血清确实如通过增加因子I的浓度下调旁路补体途径的体外测定中的预测的那样运行。这些结果支持使用外源因子I作为下调C3b反馈循环的超活性的治疗剂，从而提供对AMD和某些形式的肾病的治疗。

在Lachmann等人(Clinical&Experimental Immunology,Volume 183,Issue 1,pages 150–156,January 2016)中报告的研究中，将最高风险组(对于三种AMD风险等位基因，C3(R102G)，因子H(V621和Y402H)纯合)转化为最小风险组(对于低风险等位基因为纯合)的活性需要的因子I量为约22μg/ml因子I，将最高风险组降低到杂合组(对于所有三种风险等位基因为杂合)的量为12.5μg/ml，并且将杂合组降低到最低风险组的量为5μg/ml。

在本发明的具体实施方案中，若受试者对于与AMD相关的一种或多种SNP是杂合易感的，则将受试者中C3b失活和iC3b降解活性的水平提高至高于正常水平的至少10％的水平。在具体实施方案中，与AMD相关的SNP是因子H的rs1061170，因子H的rs800292或C3的rs2230199。

在本发明的具体实施方案中，若受试者对于与AMD相关的一种或多种SNP是纯合易感的，则将受试者中C3b失活和iC3b降解活性的水平提高至高于正常水平的至少50％的水平。在具体实施方案中，与AMD相关的SNP是因子H的rs1061170，因子H的rs800292或C3的rs2230199。

本发明的方法可以进一步包括在施用后至少一天，两天，三天，四天，五天或六天，至少一周，两周或三周，或至少一个月，两个月，三个月，四个月，五个月或六个月，或至少一年确定受试者中C3b失活和iC3b降解活性的水平，并且若发现活性水平处于或低于正常水平，则重复施用。若发现自第一次施用以来活性水平保持在正常水平以上达一年，则可以每年进行后续检查以确认活性水平继续保持在正常水平以上。

在体内，补体因子I(FI)主要在肝中由肝细胞表达，尽管还发现它在体外在单核细胞，成纤维细胞，角质形成细胞和人脐静脉内皮细胞中表达。FI是由重链和轻链组成的异二聚体，所述重链和轻链通过二硫键共价连接。FI以单个肽原链表达。翻译后，蛋白质经历几种修饰，包括内质网和高尔基体中的N-糖基化。每个链可以在三个天冬酰胺残基处糖基化；这些重链聚糖糖分子构成20-25％的表观蛋白质分子量。此外，FI在反式高尔基体网络中通过弗林蛋白酶(或成对的碱性氨基酸切割酶，PACE)进行蛋白水解切割，其切割出四个带正电荷的氨基酸，即RRKR。这四个氨基酸存在于重链和轻链之间的界面处并形成接头肽。其除去后，将酶原加工成酶活性的经切割的异二聚体形式。尽管pro-FI在其整个序列中含有28个配对的碱性氨基酸残基，但弗林蛋白酶仅在Arg-Arg-Lys-Arg位点处识别和切割。FI具有18个残基的N端前导序列，其在分泌之前被切除，并且将成熟蛋白质释放到血流中(Nilsson,et al.,Mol.Immunol.,44(8):1835–1844,March 2007)。

FI由几个域组成(Nilsson et al.,2011,Mol.Immunol.48(14):1611-1620)。重链由N端FI膜攻击复合物域(FIMAC)、清道夫受体富含半胱氨酸的域(SRCR，也称为CD5域)、低密度脂蛋白受体1和2域和未知同源性的小区域(有时称为D区)组成。FI的轻链是酶活性域，其由含有形成His-Asp-Ser催化三联体的残基的胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶(SP)域组成。

已经表明，因子I的重链结合底物并使完整FI的SP域定向朝向C3b中的两个切割位点，其被切割以形成iC3b。2011年，FI的晶体结构得到发表，并且更为阐明C3b-FH-FI复合物中重链和轻链的排列(Tsiftsoglou and Sim,J.Immunol.,173(1):367–375,July 2004)。提示底物(即C3b-FH复合物)在因子I的活性位点中诱导结构重塑。这进一步得到了下述发现支持：若将FI与C3b预温育，则蛋白酶抑制剂氟磷酸二异丙酯(diisopropylfluorophosphate)仅能够与活性位点丝氨酸反应的。FI在C3b-FH(1-4)复合物的晶体结构上的叠加显示除了SRCR域之外，重链相对于C3b和辅因子紧密堆积。此结合消除重链的变构抑制作用并诱导SP域的重塑，然后所述SP域变得有活性并切割C3b。FIMAC和FI域可及性在适当的FI功能中的重要性在诱变系列中得到了巧妙证实(Schlott,et al.,J.Mol.Biol.,318(2):533–546,April 2002)。

由本发明的重组病毒载体编码的因子I或其片段或衍生物可以包含天然的18个氨基酸残基信号序列以确保成熟因子I的正确加工和分泌。或者，可以使用异源信号序列(即不由天然基因编码的信号序列)，或者可以省略信号序列。

在具体的实施方案中，因子I是人因子I，例如具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的人因子I(变体2，具有18个残基的N端信号序列，NCBI参考序列：NM_000204.4)或SEQ ID NO:4(变体2，没有18个残基的N端信号序列)。

在其他实施方案中，可以使用因子I的其他变体，例如人因子I，变体1(这是更长的同种型，并且与变体2相比在中心编码区中包含交替的框内外显子)。此变体的序列是NCBI参考序列：NM_001318057.1，并且可以在具有或没有18个氨基酸残基的N端信号序列的情况下使用。

因子I的片段或衍生物可以是多肽，其保留C3b失活和iC3b降解活性，并且在其整个长度上与SEQ ID NO:2或4的氨基酸序列具有至少60％，70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或99％氨基酸序列同一性。片段或衍生物可以包含一个或多个氨基酸添加，缺失或取代，例如一个或多个更保守的氨基酸取代。

保守氨基酸取代可能对所得蛋白质的活性具有最小影响。关于保守取代的进一步信息可以参见Ben Bassat et al.(J.Bacterial.,169:751-757,1987),O'Regan etal.(Gene,77:237-251,1989),Sahin-Toth et al.(Protein Sci.,3:240-247,1994),Hochulietal.(Bio/Technology,6:1321-1325,1988)和广泛使用的遗传学和分子生物学教科书。Blosum矩阵通常用于确定多肽序列的相关性。使用大的可信比对数据库(BLOCKS数据库)创建Blosum矩阵，其中计数通过小于某个阈值百分比同一性相关的成对序列比对(Henikoffet al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:10915-10919,1992)。对于BLOSUM90矩阵的高度保守的靶标频率，使用90％同一性的阈值。对于BLOSUM65矩阵，使用65％同一性的阈值。Blosum矩阵中零以上的得分在所选择的百分比同一性被认为是“保守取代”。下表显示了示例性保守氨基酸取代：

因子I的片段或衍生物可以保留天然因子I的C3b失活和iC3b降解活性的至少50％,60％,70％,80％,90％,或95％,或100％。因子I的片段或衍生物和天然因子I的C3b失活和iC3b降解活性可以使用本领域技术人员已知的任何合适的方法测定。例如，Hsiung等人(Biochem.J.(1982)203,293-298)，第295页，左栏描述了因子I蛋白水解活性的测量。用于FI活性的溶血和胶固测定两者描述于Lachmann PJ&Hobart MJ(1978)"ComplementTechnology"于Handbook of Experimental Immunology第3版Ed DM Weir BlackwellsScientific Publications第5A章p17。Harrison RA(1996)于"Weir's Handbook ofExperimental Immunology"第5版；Herzenberg Leonore A'Weir DM,Herzenberg LeonardA &Blackwell C Blackwells Scientific Publications Chapter 75 36-37中给出了更详细的描述，也包括蛋白水解测定。胶固测定是高度灵敏的，并且可以用于检测第一(双重)夹(clip)，将固定的C3b转换成iC3b并且获得与胶固素的反应性；并且通过从固定的iC3b开始并且寻找与胶固素的反应性丧失来检测最终夹至C3dg。溶血测定法用于将C3b转化为iC3b，并且蛋白水解测定法检测所有夹。

在一些实施方案中，编码因子I的核酸编码人因子I，其具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列(变体2，具有18个残基的N端信号序列，NCBI参考序列：NM_000204.4)或SEQ ID NO:4的氨基酸序列(变体2，没有18个残基的N端信号序列)。

在一些实施方案中，编码人因子I的核酸包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列(因子I的CDS的编码区，转录物变体2，mRNA，来自NCBI参考序列：NM_000204.4，具有18个残基的N端信号序列)，或SEQ ID NO:3的核苷酸序列(因子I的CDS的编码区，转录物变体2，mRNA，没有18个残基的N端信号序列)。

在一些实施方案中，可以使用编码因子I或其片段或衍生物的密码子优化的核苷酸序列。可以例如使用密码子优化软件(例如SnapGene)生成合适的密码子优化的序列。

编码因子I的密码子优化的核苷酸序列的实例是SEQ ID NO:7。因此，在一些实施方案中，编码因子I的核酸包含SEQ ID NO:7的核苷酸序列或由SEQ ID NO:7的核苷酸序列组成。

在一些实施方案中，编码因子I或其片段或衍生物的核酸可以包含核酸，所述核酸在其整个长度上与编码具有SEQ ID NO:1或3的核苷酸序列的人因子I的核酸具有至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％或99％核酸序列同一性。

“百分比(％)序列同一性”就参考多肽或核酸序列而言在本文中定义为在比对序列并且在必要时引入缺口以实现最大百分比序列同一性后与参考多肽或核酸序列中的氨基酸残基或核苷酸相同的序列中氨基酸残基或核苷酸的百分比。为了确定百分比氨基酸或核酸序列同一性的比对可以以本领域技术范围内的各种方式实现，例如，使用公开可用的计算机软件程序，例如Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al.,eds.,1987),Supp.30,第7.7.18节,表7.7.1中描述的那些，包括BLAST，BLAST-2，ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。比对程序的一个实例是ALIGN Plus(Scientific andEducational Software，Pennsylvania)。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需要的任何算法。为了本文的目的，给定氨基酸序列A比、与或相对于给定氨基酸序列B的百分比氨基酸序列同一性(或者，其可以描述为比、与或相对于给定氨基酸序列B具有或包含某个％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算：分数X/Y的100倍，其中X是通过序列比对程序在该程序的A和B的比对中评分为相同匹配的氨基酸残基的数目，且其中Y是B中氨基酸残基的总数。应当理解，在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度的情况下，A与B的氨基酸序列同一性百分比将不等于B与A的氨基酸序列同一性百分比。出于本文的目的，给定核酸序列C比、与或相对于给定核酸序列D的百分比核酸序列同一性(或者，其可以描述为比、与或相对于给定核酸序列D具有或包含某个百分比核酸序列同一性的给定核酸序列C)如下计算：W/Z分数的100倍，其中W是通过序列比对程序在该程序的C和D的比对中评分为相同匹配的核苷酸的数目，并且其中Z是D中的核苷酸的总数。应当理解，在核酸序列C的长度不等于核酸序列D的长度的情况下，C与D的百分比核酸序列同一性不等于D与C的百分比核酸序列同一性。

本文提及的受试者是哺乳动物。合适的实例包括驯化动物(例如牛，绵羊，猫，狗，马)，灵长类(例如人和非人灵长类如猴)，兔和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。在一些实施方案中，受试者是人。

如本文所用，“治疗”或“处理”是获得有益或期望的临床结果的方法。出于本发明的目的，有益或期望的临床结果包括减轻症状，减轻疾病程度，稳定(例如，不恶化)疾病状态，预防疾病传播，延迟或减缓疾病进展，改善或缓解疾病状态，减少预先存在的治疗方案的需要剂量和/或施用频率，以及缓解(无论是部分的还是全部的)，无论是可检测的还是不可检测的。“治疗”还可以意味着与不接受治疗时预期的存活相比延长存活。可以将治疗应用足够的时间段和/或以足够的频率应用以获得有益或期望的临床结果。

如本文所用，“预防”是指处理，其中个体已知或怀疑患有病症或有患有病症的风险，但尚未显示病症的症状或显示病症的最小症状。可以在症状发作之前治疗经受预防性治疗的个体。

“治疗有效量”是足以实现有益或期望结果，包括临床结果(例如，症状的改善，临床端点的实现)的量。治疗有效量可以在一次或多次施用中施用。就疾病状态而言，治疗有效量是足以改善，稳定疾病或延迟疾病形成的量。

应当理解，本发明的重组病毒载体通常是分离的重组病毒载体，即从其天然环境的组分中分离和/或回收。类似地，本发明的重组病毒颗粒通常是分离的重组病毒颗粒，即从其天然环境的组分中分离和/或回收。

根据本发明还提供了药物组合物，其包含：本发明的重组病毒载体，或本发明的重组病毒颗粒，和药学上可接受的载体，赋形剂或稀释剂。

本发明的药物组合物可适用于组合物的任何合适的施用方式，例如静脉内施用，或上述任何其它适当的施用方式。

本发明的药物组合物可适用于对人受试者的施用。

根据本发明还提供了试剂盒，其包含：本发明的重组病毒载体，或本发明的重组病毒颗粒，和药学上可接受的载体，赋形剂或稀释剂。

在一些实施方案中，本发明的试剂盒可以进一步包含使用本发明的任何方法，载体或病毒颗粒治疗本文所述的补体介导的病症的用法说明。本发明的试剂盒可包括适于注射需要治疗的受试者的药学上可接受的载体，赋形剂或稀释剂。本发明的试剂盒可以进一步包括以下任何一种：缓冲液，滤器，针，注射器和包装插页，其具有用于对受试者进行施用的用法说明。还可以包括合适的包装材料，并且可以是本领域已知的任何包装材料，包括例如小瓶(例如密封小瓶)，容器，安瓿，瓶，罐，柔性包装(例如，密封的Mylar或塑料袋)。这些包装材料可以进一步消毒和/或密封。

本发明的药物组合物或试剂盒可以以单一单位剂量或多剂量形式包装。本发明的药物组合物和本发明的试剂盒的内容物通常配制成无菌且基本上等张的溶液。

药学上可接受的载体，赋形剂和稀释剂是相对惰性的物质，其有助于施用药理学上有效的物质，并且可以作为液体溶液或悬浮液，作为乳液或作为适合于在使用前溶解或悬浮在液体中的固体形式提供。例如，赋形剂可以给予形式或稠度，或者充当稀释剂。合适的赋形剂包括但不限于稳定剂，润湿剂和乳化剂，用于改变渗透压的盐，包胶剂，pH缓冲物质和缓冲剂。此类赋形剂包括适合于直接递送至受试者(例如静脉内或到肝)的任何药剂，其可以在没有过度毒性的情况下施用。药学上可接受的赋形剂包括但不限于山梨糖醇，任何各种TWEEN化合物，和液体如水，盐水，甘油和乙醇。其中可以包括药学上可接受的盐，例如无机酸盐，例如盐酸盐，氢溴酸盐，磷酸盐，硫酸盐等；和有机酸的盐，如乙酸盐，丙酸盐，丙二酸盐或苯甲酸盐。

在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂可包括药学上可接受的载体。此类药学上可接受的载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油，动物，植物或合成来源的，例如花生油，大豆油，矿物油。盐水溶液和水性右旋糖，聚乙二醇(PEG)和甘油溶液也可用作液体载体，特别是用于注射溶液。还可以使用其他成分，例如防腐剂，缓冲剂，张力剂，抗氧化剂和稳定剂，非离子润湿剂或澄清剂，或增粘剂。

Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.,N.J.1991)中提供了药学上可接受的赋形剂和载体的详尽讨论。

在一些实施方案中，本发明的药物组合物的病毒滴度为至少5x 10¹²,6x 10¹²,7x10¹²,8x 10¹²,9x 10¹²,10x 10¹²,11x 10¹²,15x 10¹²,20x 10¹²,25x10¹²,30x 10¹²,或50x 10¹²个基因组拷贝/mL。在一些实施方案中，组合物的病毒滴度为5x 10¹²至10x 10¹²,10x 10¹²至25x 10¹²或25x 10¹²至50x10¹²个基因组拷贝/mL。在一些实施方案中，组合物的病毒滴度为5x 10¹²to 6x 10¹²,6x 10¹²至7x 10¹²,7x 10¹²至8x 10¹²,8x10¹²至9x 10¹²,9x 10¹²至10x10¹²,10x 10¹²至11x 10¹²,11x 10¹²至15x 10¹²,15x10¹²至20x 10¹²,20x 10¹²至25x 10¹²,25x10¹²至30x 10¹²,30x 10¹²至50x 10¹²,或50x 10¹²至100x 10¹²个基因组拷贝/mL。

在一些实施方案中，本发明的药物组合物的病毒滴度为至少5x 10⁹,6x 10⁹,7x10⁹,8x 10⁹,9x 10⁹,10x 10⁹,11x 10⁹,15x 10⁹,20x 10⁹,25x 10⁹,30x 10⁹或50x 10⁹转导单位/mL。在一些实施方案中，组合物的病毒滴度为5x 10⁹至10x 10⁹,10x 10⁹至15x 10⁹,15x10⁹至25x 10⁹,或25x 10⁹至50x 10⁹转导单位/mL。在一些实施方案中，组合物的病毒滴度为5x 10⁹至6x 10⁹,6x 10⁹至7x 10⁹,7x 10⁹至8x 10⁹,8x 10⁹至9x 10⁹,9x 10⁹至10x 10⁹,10x10⁹至11x 10⁹,11x 10⁹至15x 10⁹,15x 10⁹至20x 10⁹,20x 10⁹至25x 10⁹,25x 10⁹至30x10⁹,30x 10⁹至50x 10⁹或50x 10⁹至100x10⁹转导单位/mL。

如就病毒滴度而言使用，术语“转导单位”是指导致产生功能性转基因产物的感染性重组载体颗粒的数目，如在功能性测定法中测量，如记载于WO 2015/168666中的实施例，或者例如Xiao et al.(1997)Exp.Neurobiol.,144:113-124；或Fisher et al.(1996)J.Virol.,70:520-532(LFU测定法)。

在一些实施方案中，本发明的药物组合物的病毒滴度为至少5x 10¹⁰,6x 10¹⁰,7x10¹⁰,8x 10¹⁰,9x 10¹⁰,10x 10¹⁰,11x 10¹⁰,15x 10¹⁰,20x10¹⁰,25x 10¹⁰,30x 10¹⁰,40x 10¹⁰或50x 10¹⁰个感染单位/mL。在一些实施方案中，组合物的病毒滴度为至少5x 10¹⁰至10x 10¹⁰,10x 10¹⁰至15x 10¹⁰,15x 10¹⁰至25x 10¹⁰或25x 10¹⁰至50x 10¹⁰个感染单位/mL。在一些实施方案中，组合物的病毒滴度为至少5x 10¹⁰至6x 10¹⁰,6x 10¹⁰至7x10¹⁰,7x 10¹⁰至8x 10¹⁰,8x10¹⁰至9x 10¹⁰,9x 10¹⁰至10x 10¹⁰,10x 10¹⁰至11x 10¹⁰,11x 10¹⁰至15x 10¹⁰,15x 10¹⁰至20x10¹⁰,20x 10¹⁰至25x 10¹⁰,25x 10¹⁰至30x 10¹⁰,30x 10¹⁰至40x 10¹⁰,40x 10¹⁰至50x 10¹⁰或50x 10¹⁰至100x 10¹⁰个感染单位/mL。

如就病毒滴度而言使用，术语“感染单位”是指感染性和有复制能力的重组载体颗粒的数量，如通过感染中心测定法，也称为复制中心测定法测量，如记载于例如McLaughlinet al.(1988)J.Virol.,62:1963-1973。

根据本发明，还提供了用于生产rAAV颗粒的试剂盒，其包含：本发明的rAAV载体，和一种或多种辅助质粒，其包含编码AAV复制和壳体蛋白的核酸以及生产性AAV生命周期所需要的基因。

在某些实施方案中，用于生产rAAV颗粒的本发明的试剂盒包含第一辅助质粒和第二辅助质粒，所述第一辅助质粒包含编码AAV复制和壳体蛋白的核酸，所述第二辅助质粒包含编码生产性AAV生命周期所需要的基因的核酸。

生产性AAV生命周期所需要的基因可以是腺病毒，疱疹病毒或杆状病毒基因。在具体实施方案中，基因是腺病毒基因，特别是E1a，E1b，E2a，E4和VA RNA腺病毒基因。

根据本发明，还提供了本发明的重组病毒载体，本发明的重组病毒颗粒或本发明的药物组合物，其用作药物。

本发明还提供了本发明的重组病毒载体，本发明的重组病毒颗粒或本发明的药物组合物，其用于治疗补体介导的病症。

根据本发明，还提供了本发明的重组病毒载体，本发明的重组病毒颗粒或本发明的药物组合物在制备用于治疗补体介导的病症的药物中的用途。

补体介导的病症可以是与旁路途径调节中的缺陷，特别是补体C3b反馈循环的过度活性相关的病症。

可以根据本发明预防或治疗的补体介导的病症的实例包括年龄相关的黄斑变性(AMD)(特别是早期(干性)AMD或地图状萎缩)，致密沉积物病(DDD)，非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)，C3肾小球病，膜增生性肾小球肾炎2型(MPGN2)，动脉粥样硬化，慢性心血管疾病，阿尔茨海默病，阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)，老年人自身炎性疾病。

可以根据本发明预防或治疗的补体介导的病症的其他实例包括I型MPGN，III型MPGN，吉兰-巴雷综合征，过敏性紫癜，IgA肾病和膜性肾小球肾炎。

现在仅通过举例的方式参考附图描述本发明的实施方案，其中：

图1显示了补体激活步骤的概述；

图2显示了脊椎动物补体的旁路途径的反馈环；

图3显示了补体激活期间C3的蛋白水解。C3由α和β链组成。β链是未修饰的，而α链被切割几次：i)C3a被C3转化酶切除，并且剩余的蛋白质现在称为C3b；ii)在两个位点处的FI切割，释放C3f肽(FH作为辅因子)，它现在称为iC3b或C3bi；iii)用CR1作为辅因子，FI再次在iC3b的68kDa片段中切割。虽然C3c扩散开来，但C3dg保持附着于细胞表面，并可被胰蛋白酶样蛋白酶进一步切割；

图4显示了AAV基因疗法的示意图；

图5显示了用于过表达因子I的血清水平的AAV2/8构建体。将转基因(本文是因子I)插入启动子和多腺苷酸化识别位点之间。两侧的侧翼是两个反向末端重复(ITR)。将壳体序列和其他腺病毒基因包装到其他质粒中；

图6显示通过western印迹测量的升高的因子I水平。将小鼠血清稀释至5％并通过SDS PAGE分离10μl。用α-FI抗体(1:500)检测FI，所述α-FI抗体与mFI的重链反应。实验进行两次；

图7显示了来自抑制ELISA的代表性结果。(a)用已知浓度的纯化重组mFI校准测定。低于0.25μg/ml的浓度给出阳性信号。(b)正常小鼠血清(NMS)在低于0.625％的浓度为阳性。(c-f)使用来自用AAV构建体注射的小鼠的血清的抑制ELISA。本文仅显示每组的一个血清样品。实验一式三份进行两次；

图8显示了用于测量过表达因子I的功能活性的C3b和iC3b体外切割测定的结果。快速产生底物即C3α’1链，并比较其分解速率，即生成C3dg。用α-hC3dg(1μg/ml)检测C3切割。实验进行两次；和

图9显示了用于测试过表达因子I的功能活性的iC3b沉积测定的结果。将经注射的小鼠的血清在旁路途径补体结合缓冲液中稀释至25％并加载到LPS包被的平板上。在37℃温育1小时后，用α-人C3c抗体检测结合的iC3b。在415nm处测量吸收。实验一式两份进行两次。

实施例1

AAV表达系统

本实施例描述了在鼠肝细胞中实现因子I过表达的编码鼠因子I的重组病毒载体的制备和将载体壳体化的病毒颗粒(病毒体)的制备。

使用腺伴随病毒(AAV)构建体。它由AAV2病毒骨架组成，所述AAV2病毒骨架用AAV8壳体蛋白假型化以赋予肝向性。因此，病毒主要感染肝，并且FI转基因在其天然位点处过表达。为了进一步抑制因子I转基因的肝外表达，使用具有两个额外ApoE肝控制区的α-1-抗胰蛋白酶(AAT)启动子(参见图5)。将用于病毒生产的所有需要基因在三种质粒之间分开，将所述三种质粒共转染到细胞系中，所述细胞系为AAV包装提供剩余的缺少的基因，如下文进一步描述。

AAV(野生型)：野生型AAV的4.7kb基因组的特征在于两个反向末端重复(ITR)和两组可读框(ORF)，其编码复制(Rep)和壳体(Cap)蛋白。Rep ORF编码四种蛋白质(78、68、52和40kDa)，其主要在调节AAV复制和整合中发挥功能。Cap ORF编码三种结构蛋白(85kDa(VP1)、72kDa(VP2)和61kDa(VP3))。VP1:VP2:VP3比率在壳体中为约1:1:8或1:1:10。

重组AAV(rAAV)：在本实施例中使用的rAAV是用AAV8壳体假型化的AAV2(rAAV2/8)以赋予肝向性。使用下述三种质粒通过三重转染在HEK293细胞中包装rAAV2/8病毒体：

1.pAM2AA(ITR和转基因表达盒)：在此质粒中，来自AAV2的145bp反向末端重复(ITR)位于转基因盒的侧翼。两个ITR是AAV生命周期中所有步骤必需的唯一顺式元件。它们发挥DNA复制起点功能，提供包装和整合信号，并且充当WT AAV基因表达的调节元件。pAM2AA盒包含具有两个ApoE增强子的人α-1-抗胰蛋白酶(hAAT)启动子，随后是编码转基因的cDNA。3’-非翻译区(UTR)含有土拨鼠肝炎转录后调控元件(WPRE)和牛生长激素多腺苷酸化信号(BGH多聚A)。WT AAV的包装容量为约4.7kb。在pAM2AA中，调节区占据≈2390bp，留下≈2310bp，用于插入转基因。

2.p5E18VD/8(AAV辅助序列)：来自AAV2的缺失的病毒编码序列(包括Rep和Cap基因)存在于由p5AAV启动子驱动的此质粒中。在本文，编码AAV2壳体的序列被编码AAV8壳体的序列替换。载体和辅助序列之间没有同源性，降低了产生野生型AAV重组体的可能性。

3.pXX6(腺病毒辅助功能)：对于生产性AAV生命周期必需的腺病毒基因是E1a，E1b，E2a，E4和VA RNA基因。E1a充当反式激活物(transactivator)，其上调腺病毒基因以及AAV Rep和Cap基因的转录。E1b与E4相互作用以促进病毒mRNA的转运。E4还参与促进AAVDNA复制。E2a和VA RNA作用为增强病毒mRNA稳定性和翻译效率，尤其是对于Cap转录物。pXX6含有必需的腺病毒辅助基因，但缺乏腺病毒结构和复制基因。包含在pXX6中的必需辅助基因是E2a，E4和VA基因。E1a和E1b两者已经是缺失的，并且缺少的E1a和E1b基因由HEK293细胞补充。

编码鼠因子I的重组AAV载体(AAV_mFI)的制备

为了能够将因子I克隆到pAM2AA表达载体中，必须将限制性位点改变为相容的酶识别位点(使用引物序列：FI-AAV-F:5′-TCT AGA GGA TCC GCC ACC ATG AAG CTC-3′(SEQID NO:5)；和FI-AAV-R:5′-AAG CTT GGC GGC CGC TCA GAC ATT GTG TTG AGA AAC AAGAGA CCT TC-3′(SEQ ID NO:6)。经由PCR扩增将新序列连接到小鼠因子I cDNA。纯化扩增的构建体后，将其连接到pAM2AA中。使用XbaI和HindIII限制性位点将鼠补体因子I的cDNA克隆到pAM2AA中。一旦制备了载体，沿着所有随后的病毒包装和纯化步骤，AAV_GFP载体以相同的方式处理。这确保没有发生错误，因为在荧光显微镜下可以容易地在视觉上追踪肝GFP的表达。

rAAV2/8病毒体的制备

将具有鼠补体因子I的cDNA的pAM2AA载体转化到SURE2细胞中以防止不想要的重组事件。使用CaPO₄用所有三种质粒转染HEK293细胞。转染后两天，收获细胞，通过在干冰/100％乙醇浴中反复冻融来裂解细胞，然后在-80℃下贮存。在氯化铯梯度上纯化AAV病毒体，并通过实时PCR定量病毒颗粒。

实施例2

通过腺伴随病毒递送系统在体内过表达补体因子I。

本实施例描述了用病毒体注射小鼠，所述病毒体将如实施例1中所述产生的AAV_mFI载体壳体化，注射病毒体后测定因子I的血浆水平，以及评估注射后小鼠中旁路补体途径的下调。

注射小鼠

将12只小鼠分成4组，其接受不同浓度的AAV_mFI或对照病毒制剂：

·低mFI＝5x10⁹个病毒体

·中等mFI＝5x10¹⁰个病毒体(＝先前实验中的100％肝转导)

·高mFI＝5x10¹¹个病毒体

·GFP＝5x10¹¹个病毒体

对小鼠静脉内注射到尾静脉中。在4周后采集血液，并且在8周后扑杀小鼠并分析其血清。

结果

升高的因子I水平的定量

为了定量FI水平，订购多克隆定制的α-mFI抗血清。同时，进行western印迹。本文，α-FI(Santa Cruz，sc-69465)用作检测抗体以粗略定量FI水平。按顺序步骤稀释血清以减少移液误差。FI的相对浓度如下测定：AAV_GFP<AAV_FI低<AAV_FI中等<AAV_FI高(参见图6)。

一旦抗血清到达，就进行灵敏得多的测定，即抑制ELISA。将血清与预先确定浓度的α-mFI-抗血清预温育，然后在用重组mFI包被的微量滴定板上温育。α-mFI-抗血清的制备和结合特异性描述于下面的材料和方法部分。仅未结合的抗体能够与平板上的固定化抗原反应。因此，若抗血清中α-mFI-抗体的量超过血清中存在的mFI，则测定法仅给出阳性结果。用已知的因子I浓度校准测定。

发现当微量滴定板用每孔1μg mFI包被时，高于75μg/ml的抗血清浓度给出强阳性信号(未显示)。图7显示了来自抑制ELISA的代表性结果。该测定在低于0.25μg/ml的浓度给出阳性信号(图7a)。使用此校准，可以确定血清样品中的FI浓度。首先，测试野生型小鼠的正常样品，并且低于0.625％的浓度给出阳性信号(图7b)。已知该测定中阳性信号的阈值为0.25μg/ml mFI，并且可以计算100％血清中mFI的浓度，即40μg/ml。对用AAV构建体注射的每种小鼠血清进行相同的计算(图7c-f)，并测定每组的浓度范围(参见表2)。

表2.通过腺伴随病毒表达系统过表达后因子I的定量

从GFP对照组中的20-40μg/ml FI开始，浓度在低FI剂量中为40-80μg/ml，在中等FI剂量中为80μg/ml，并且在高FI剂量中为80-160μg/ml。推断AAV基因疗法可以将血清浓度提高到正常水平的4倍。

具有升高的因子I水平的血清的功能分析

以与重组因子I类似的方式分析转基因小鼠的血清。由于过表达的蛋白质在理论上将作为内源性FI加工和分泌，因此可以彼此直接比较小鼠的血清。通过免疫印迹法和通过抑制ELISA确认FI增加后，必须确认过表达酶的功能活性。因此，通过体外C3b切割测定，溶血测定和iC3b沉积测定分析血清的FI功能活性。

在体外测定中测量C3b和iC3b切割。用胰蛋白酶将人C3消化成C3b，并与hFH和来自转基因小鼠的血清一起温育。30分钟后，将1μg人C3加载到SDS凝胶上并用克隆9进行印迹。首先在快速反应中将C3b切割成iC3b(抗体与iC3b的C3α’1链反应)，然后在慢得多的反应中进一步切割成C3dg。此种第二反应可以通过增加的FI浓度来加速。显示了在AAV_FI中等和AAV_FI高组中，与人因子H和来自不同小鼠组的血清一起温育的人C3b在培养期内更有效地切割成C3dg(参见图8，泳道10-14)。仅用对照质粒注射的小鼠在温育期内几乎没有C3dg条带。

接着的步骤是显示过表达的因子I在整个血清中也具有功能活性。为此，用LPS包被微量滴定板，并在37℃与转基因小鼠血清温育后测量C3b/iC3b沉积。结果显示在图9中。与重组蛋白一样，注射AAV_mFI的小鼠在LPS上显示较少的C3b/iC3b沉积，因为其旁路途径的正反馈环被因子I中断。C3b/iC3b沉积在AAV_低FI中减少了11％，在AAV_中等FI中减少了38％，在AAV％高FI组中减少了50％。

推断使用病毒载体通过基因疗法将补体因子I过表达至引起旁路补体途径显著下调的水平。

讨论

基因疗法是治疗各种疾病的一种新的令人兴奋的治疗选择。它实现在用含有感兴趣蛋白质的DNA序列的构建体转染相应细胞后体内表达蛋白质。理论上，基因疗法可用于表达每种蛋白质，尽管实际上通常存在限制，诸如例如序列的长度。使用基因疗法，可以替换缺少的蛋白质。然而，这总是带有免疫原性的风险。我们已经理解，若提高现有(内源)蛋白质的浓度，则不发生此种风险。在这项研究中，我们想要阐明补体因子I是否可以通过基因疗法过表达至引起旁路补体途径显著下调的水平。

我们已经成功产生了用于小鼠补体因子I的转基因表达的载体。所用的病毒表达系统基于AAV2，并且其壳体源自AAV8。尽管在肝外组织中也可以发现病毒颗粒，此种AAV2/8构建体一起主要导致小鼠中的肝转导。为了增加肝特异性表达，转基因处于α-1-抗胰蛋白酶启动子的控制下，所述α-1-抗胰蛋白酶启动子具有两个ApoE肝控制区，用于肝细胞中的高水平和特异性表达。因此，转基因表达应当仅在肝细胞中发生(尽管有时在胰腺组织中也可以存在非常少的转基因表达，所述胰腺组织是非常密切相关的组织)。

我们已经证明，通过使用的AAV表达系统过表达FI明显地对补体下调具有影响，其次，此效应是可滴定的，并且随着载体剂量增加而变得更加深远。由于发现商品化的α-FI抗体不适合于在ELISA中测量小鼠FI浓度(在western印迹中，它们不与天然FI反应但仅与变性蛋白质反应)，为了测量总体FI增加，在兔中制备针对小鼠因子I的多克隆抗体。使用此多克隆定制抗体，可以显示血清浓度提高至正常水平的4倍，即对照小鼠中的20-40μg/ml至转基因小鼠中的80-160μg/ml FI。

另一个令人感兴趣的问题是转基因表达是否在急性期反应中进一步增加。由于在使用的构建体中，FI处于α-1-抗胰蛋白酶启动子的控制下(α-1-抗胰蛋白酶和FI都是阳性急性期反应物)，可以预期转基因表达也会在急性期反应中增加。这可以在直接的动物实验中进行测试，该实验可以通过将LPS或IL6注射到野生型和转基因小鼠中，然后比较FI增加的速率而容易地进行。假设内源性和转基因FI表达两者都增加，则这可以是减少AAV施用期间初始病毒载量的解决方案，但是若需要的话具有增加表达的选项。

宿主免疫等因素阻碍了人类广泛使用AAV。一旦暴露于AAV，人们形成阻断基因递送的中和性抗体。然而，通过工程化改造壳体蛋白，可以产生新的变异，其具有更高的转导效率并且不被中和性抗体识别。因此，采用限制这些免疫应答的新方法(Mingozzi,et al.,Science Translational Medicine,5(194):194ra92–194ra92,July 2013)。最近的临床研究显示单次输注AAV载体成功，导致患有严重血友病B的男性中两年治疗水平的因子IX(Mingozzi and High,Blood,122(1):23–36,July 2013)，尽管应当指出正常FIX水平的仅1％的增加实质性改善血友病B患者中的严重出血表型(Nathwani,et al.,N.Engl.J.Med.,371(21):1994–2004,November 2014)。之前，显示骨骼肌中FIX的AAV转基因表达持续10年，尽管在此种情况下，循环FIX水平仍然是亚治疗的(<1％)(Buchlis,et al.,Blood,119(13):3038–3041,March 2012)。

FI增加最多50％是人疗法的目标。这在使用AAV_mFI构建体的小鼠中被远远超过，并且iC3b沉积测定显示在高AAV_mFI剂量下小高达50％的C3b沉积减少。分开地，我们已经显示多50％的FI将高风险补体单元型的活性转化为低风险补体单元型的活性(Lay等，2015(同上))。由于这两种补体单元型都是极为罕见的且大多数人都处于两个极端内，因此仅在50％FI增加的范围内获得大多数人的风险降低的效应。

材料和方法

α-小鼠因子I

此多克隆抗体可购自Santa Cruz Biotechnology，Inc(#sc-69465)。在山羊中针对小鼠因子I的重链中的肽制备抗体，并在还原和非还原western印迹或ELISA中识别重链。若仍然完整，则抗体也识别酶原。然而，因为用于免疫的肽太短，所以抗体不沉淀。

正常工作浓度1:500。

α-小鼠因子I抗血清

此抗体不是商品化的，并且是从Absea Biotechnology Ltd.订购的，以获得针对mFI的沉淀抗体，其将允许在Ouchterlony双重免疫扩散测定中容易地测定因子I水平。用在细菌中产生的重组小鼠因子I的肽片段(203aa-510aa)免疫兔。一旦测试，抗体证明是非沉淀的，因此开发抑制ELISA以测量血清中因子I的水平。为了获得沉淀FI的针对小鼠因子I的多价抗体，将从哺乳动物细胞培养物中纯化的因子I送至Absea Biotechnology Ltd.，但是此第二种α-小鼠因子I抗血清的免疫期(8周)没有及时完成，但是可以用于未来的实验。

克隆9抗体

克隆9是识别C3g中的新表位的大鼠α-人C3g抗体，所述新表位仅当C3被因子I切割成iC3b或C3dg时变得可及(Lachmann,et al.,Immunology,41(3):503–515,November1980)。在天然条件下，克隆9仅与人源的iC3b或C3dg反应，而在变性条件下，它检测人C3的α,α’链和68kDa片段，因为所有这三个片段都包括其在C3g中的表位。用于western印迹中的检测的正常工作浓度为0.5μg/ml，并且用于包被的捕获抗体为1.35μg/ml。名称克隆9和α-hC3g抗体可互换使用。

克隆4抗体

克隆4是大鼠单克隆抗C3c抗体，其识别C3c中的构象性表位并与C3，C3b，iC3b和C3c反应(Lachmann,et al.,Immunology,41(3):503–515,November 1980)。因此，它不与Cdg或C3g结合，这是由于缺乏C3c中的表位。正常工作浓度为5μg/ml。

α-人C3c

此抗体可购自Dako，并用于检测C3b和iC3b沉积。它以1:5000的浓度使用并用α-兔二抗检测。酶联免疫吸附测定法(ELISA)

iC3b沉积测定-“克隆9测定”将Maxisorb Nunc板在4℃以包被缓冲液中浓度1.25μg/孔用克隆9包被过夜。次日，将板用清洗缓冲液(＝PBS-0.05％Tween 20)清洗5次，并用PBS-T中的4％Marvel奶粉在室温封闭2小时。将板清洗5次，并对每个孔添加稀释的血清样品(在PBS/明胶中1:2000)(下文描述了血清样品的制备)。温育1小时后，清洗平板，并且与PBS/明胶中5μg/ml浓度的生物素化的克隆4温育1小时。将板清洗5次，并与PBS/明胶中的1:1000Extravidin-HRP一起温育。最后，在充分清洗后，添加100μl TMB底物(Invitrogen)，并将板在平板振荡器上温育30分钟。用50μl H₂SO₄终止反应，并在微板阅读器(450nm)上读板。

C3b沉积测定将Maxisorb Nunc板用甘露聚糖(Sigma，来自酿酒酵母的甘露聚糖)或脂多糖(Sigma)1μg/孔在4℃在包被缓冲液中包被过夜。次日，将板在TBS-0.05％Tween-20中清洗，并在室温用TBS-T中的1％BSA封闭。2小时后，清洗平板并与连续稀释的重组蛋白和/或血清一起温育。在37℃温育1小时后，用TBS-T清洗平板，并用TBS-T中以1:5000使用的多克隆兔α-人C3c补体(Dako)温育1小时。在充分清洗后，将TBS-T中以1:5000的α-兔IgG(全分子)-碱性磷酸酶(在山羊中产生，Sigma)添加1小时。将板用TBS-T清洗4次，并使用快速对硝基苯磷酸盐片(Sigma)显色并测量(405nm)。或者，通过添加3M NaOH终止测定显色，然后读取。

抑制ELISA在抑制ELISA中，微量滴定板用抗原包被，并且在封闭后，确定抗血清浓度，其当用二抗检测时产生强信号。然后，将该浓度用于抑制测定，并与具有未知抗原浓度的样品的连续稀释液混合。同时，制备已知抗原浓度的稀释系列。在此预温育步骤期间，形成免疫复合物，并且当将混合物加载到经包被的微量滴定板上时，仅抗原浓度不超过特异性抗体量的样品给出阳性信号。若存在过量抗原，则无游离的抗体可用，所述抗体可以与微量滴定板上的固定化抗原结合。因此，抑制测定中的阳性结果显示样品的稀释，其中游离抗原的量是限制性的，并且通过与已知抗原浓度的标准稀释比较，可以确定未知浓度。

为了测定血清样品中小鼠因子I的浓度，将Maxisorb Nunc板在4℃用纯化的重组小鼠因子I(1μg/孔)在包被缓冲液中包被过夜。次日，用TBS-T中的1％BSA在室温封闭平板2小时。在该温育期间，在1％BSA/150mM NaCl中制备小鼠血清(5％向下)或纯化的小鼠因子I(2μg/ml向下)的稀释液。然后将稀释液与测定浓度的纯化的且生物素化的α-mFI IgG(即150μg/ml)以1:1混合。将样品在平板振荡器上在室温温育1小时，然后加载到经包被的平板上。温育1小时后，将平板充分清洗，并且用浓度1:5000的Extravidin-碱性磷酸酶检测结合的生物素化的α-因子I抗体。将平板用TBS-T清洗4次，并使用快速对硝基苯磷酸盐片(Sigma)显色并测量(405nm)。

western印迹

进行western印迹分析以检测特定蛋白质或确认它们在样品中的存在。首先，进行凝胶电泳以根据蛋白质的大小分离蛋白质。将蛋白质样品在4x上样缓冲液中煮沸以使其变性；若分析需要还原性蛋白质，则加入β-巯基乙醇。在4-12％bis-tris蛋白质凝胶(Invitrogen)上在200V进行SDS凝胶电泳50分钟。分离蛋白质后，进行湿转移以将分离的蛋白质转移到PVDF膜上，在那里可以用特异性抗体检测靶蛋白质。

通过在转移缓冲液平衡的印迹纸，凝胶和膜(首先用MeOH活化)中堆叠到转移盒中来组装印迹。转移在350mA，60W下进行1小时。

接下来，将膜在封闭缓冲液中在旋转器上封闭30分钟。将一抗和二抗都滚动温育1小时，其间将膜在清洗缓冲液中清洗3x5分钟。最后的清洗在TBS-T，pH8中进行，因为当最后一次清洗处于微碱性pH时，这两种使用的底物都给出更强的信号。根据二抗的缀合物，使用不同的底物：通过添加3ml TMB或AP底物(Life Technologies)生色检测蛋白质，或者在过氧化物酶缀合的抗体的情况下在添加ECL试剂后也以化学发光检测。

血清的制备

如(Lachmann,J.Immunol.Methods,352(1-2):195–197,January 2010)中所述进行血清制备。在无菌条件下采集血液并在室温下凝结。初始离心通常在台式离心机中以约3.000xg在室温进行约5-10分钟。采集血清并进行20.000xg的第二次高速离心2-5分钟。此步骤对于除去可以随后扭曲结果的所有RBC碎片是必需的。然后，可以将从此第二次离心中取出的血清冷却，等分取样并冷冻用于将来的实验。应当注意的是，用于功能测定的血清绝对不应贮存于高于-80℃的温度。应当通过制备等分试样避免反复冻/融。

体外测定法

因子I原的弗林蛋白酶消化Hek和CHO细胞两者仅分泌部分加工的mFI，并且大部分是因子I的无活性酶原。为了获得活性因子I，用蛋白酶弗林蛋白酶消化纯化的酶原。简言之，将纯化的mFI针对TBS透析，然后调节至10mM CaCl2。每25μg mFI添加1个单位的弗林蛋白酶。反应在30℃进行过夜。次日，立即使用因子I或等分取样，并在-80℃贮存。

C3b切割测定在C3b切割测定中，首先通过有限的胰蛋白酶消化制备C3b，如(Bokisch,et al.,J.Exp.Med.,129(5):1109–1130,May 1969)中所述。简言之，将2μl人C3与0.8μl胰蛋白酶(10μg/ml)在20℃温育刚好60秒。通过添加2.4μl大豆胰蛋白酶抑制剂(10μg/ml)终止反应。此种有限的消化通过切断C3a导致C3的C3b的产生。接下来，将C3b与各种量的鼠因子I或人因子I和2μl人因子H混合，并用TBS将反应体积补足至10μl。或者，添加鼠血清作为因子I的来源。反应在37℃进行30-60分钟，然后通过添加还原性4x上样缓冲液并煮沸来终止反应。通过western印迹分析样品或在4℃贮存。

时间过程为了测试重组小鼠因子I切割C3b和iC3b的能力，开发时间过程测定。为此，将血清在37℃快速解冻，短暂涡旋振荡，然后置于冰上。然后将血清与重组人或小鼠因子I混合，然后加入酵母聚糖至终浓度5％。在该测定中使用旁路途径缓冲液作为缓冲液。一旦制备，将混合物在37℃培养箱中旋转，并在选定的时间点将40μl的每种样品取出到10μl的50mM EDTA中。取样时间为：0,30,60,120,180,240,480,600和1440分钟。在每个时间点对样品进行微量离心以除去酵母聚糖并在-80℃冷冻直至通过ELISA测试。或者，也用LPS作为补体活化试剂(优点在于其实可溶性的)进行测定。

本文引用的所有参考文献，包括出版物，专利和专利申请在此通过引用并入，其程度如同每个参考文献单独且具体地指出通过引用并入并且在本文中完整地阐述一样。本文讨论的参考文献仅仅是为了它们在本申请的提交日之前的公开内容而提供的。本文中的任何内容均不应解释为承认任何参考文献影响本文所述实施方案的新颖性或非显而易见性。

序列表

SEQ ID NO:1

智人补体因子I(CFI)，转录物变体2，mRNA的CDS编码区，来自NCBI参考序列:NM_000204.4:

SEQ ID NO:2

智人补体因子I(CFI)，转录物变体2，mRNA的CDS编码区的翻译，来自NCBI参考序列:NM_000204.4:

SEQ ID NO:3

智人补体因子I(CFI),转录物变体2，mRNA的CDS的编码区，来自NCBI参考序列:NM_000204.4，没有编码N端的18个残基的信号序列的序列：

SEQ ID NO:4

智人补体因子I(CFI)，转录物变体2,mRNA的CDS的编码区的翻译，来自NCBI参考序列:NM_000204.4,没有N端的18个残基的信号序列：

SEQ ID NO:5

引物序列：FI-AAV-F:

tctagaggat ccgccaccat gaagctc 27

SEQ ID NO:6

引物序列：FI-AAV-R:

aagcttggcg gccgctcaga cattgtgttg agaaacaaga gaccttc 47

SEQ ID NO:7

编码智人补体因子I(CFI)的核苷酸序列，为了在人细胞中表达经密码子优化：

SEQ ID NO:8

HLP肝特异性启动子的核苷酸序列：

SEQ ID NO:9

LP1肝特异性启动子的核苷酸序列：

SEQ ID NO:10

HLP2肝特异性启动子的核苷酸序列：

SEQ ID NO:11

MutC壳体蛋白的氨基酸序列：

SEQ ID NO:12

LK03壳体蛋白的氨基酸序列：

序列表

<110> CAMBRIDGE ENTERPRISE LIMITED

THE SYDNEY CHILDREN'S HOSPITALS NETWORK (RANDWICK AND

WESTMEAD) (INCORPORATING THE ROYAL ALEXANDRA HOSPITAL FOR

CHILDREN)

<120> 补体介导的病症的治疗

<130> P/74985.WO01

<150> GB1608046.7

<151> 2016-05-09

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1752

<212> DNA

<213> 智人

<400> 1

atgaagcttc ttcatgtttt cctgttattt ctgtgcttcc acttaaggtt ttgcaaggtc 60

acttatacat ctcaagagga tctggtggag aaaaagtgct tagcaaaaaa atatactcac 120

ctctcctgcg ataaagtctt ctgccagcca tggcagagat gcattgaggg cacctgtgtt 180

tgtaaactac cgtatcagtg cccaaagaat ggcactgcag tgtgtgcaac taacaggaga 240

agcttcccaa catactgtca acaaaagagt ttggaatgtc ttcatccagg gacaaagttt 300

ttaaataacg gaacatgcac agccgaagga aagtttagtg tttccttgaa gcatggaaat 360

acagattcag agggaatagt tgaagtaaaa cttgtggacc aagataagac aatgttcata 420

tgcaaaagca gctggagcat gagggaagcc aacgtggcct gccttgacct tgggtttcaa 480

caaggtgctg atactcaaag aaggtttaag ttgtctgatc tctctataaa ttccactgaa 540

tgtctacatg tgcattgccg aggattagag accagtttgg ctgaatgtac ttttactaag 600

agaagaacta tgggttacca ggatttcgct gatgtggttt gttatacaca gaaagcagat 660

tctccaatgg atgacttctt tcagtgtgtg aatgggaaat acatttctca gatgaaagcc 720

tgtgatggta tcaatgattg tggagaccaa agtgatgaac tgtgttgtaa agcatgccaa 780

ggcaaaggct tccattgcaa atcgggtgtt tgcattccaa gccagtatca atgcaatggt 840

gaggtggact gcattacagg ggaagatgaa gttggctgtg caggctttgc atctgtggct 900

caagaagaaa cagaaatttt gactgctgac atggatgcag aaagaagacg gataaaatca 960

ttattaccta aactatcttg tggagttaaa aacagaatgc acattcgaag gaaacgaatt 1020

gtgggaggaa agcgagcaca actgggagac ctcccatggc aggtggcaat taaggatgcc 1080

agtggaatca cctgtggggg aatttatatt ggtggctgtt ggattctgac tgctgcacat 1140

tgtctcagag ccagtaaaac tcatcgttac caaatatgga caacagtagt agactggata 1200

caccccgacc ttaaacgtat agtaattgaa tacgtggata gaattatttt ccatgaaaac 1260

tacaatgcag gcacttacca aaatgacatc gctttgattg aaatgaaaaa agacggaaac 1320

aaaaaagatt gtgagctgcc tcgttccatc cctgcctgtg tcccctggtc tccttaccta 1380

ttccaaccta atgatacatg catcgtttct ggctggggac gagaaaaaga taacgaaaga 1440

gtcttttcac ttcagtgggg tgaagttaaa ctaataagca actgctctaa gttttacgga 1500

aatcgtttct atgaaaaaga aatggaatgt gcaggtacat atgatggttc catcgatgcc 1560

tgtaaagggg actctggagg ccccttagtc tgtatggatg ccaacaatgt gacttatgtc 1620

tggggtgttg tgagttgggg ggaaaactgt ggaaaaccag agttcccagg tgtttacacc 1680

aaagtggcca attattttga ctggattagc taccatgtag gaaggccttt tatttctcag 1740

tacaatgtat aa 1752

<210> 2

<211> 583

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

Met Lys Leu Leu His Val Phe Leu Leu Phe Leu Cys Phe His Leu Arg

1 5 10 15

Phe Cys Lys Val Thr Tyr Thr Ser Gln Glu Asp Leu Val Glu Lys Lys

20 25 30

Cys Leu Ala Lys Lys Tyr Thr His Leu Ser Cys Asp Lys Val Phe Cys

35 40 45

Gln Pro Trp Gln Arg Cys Ile Glu Gly Thr Cys Val Cys Lys Leu Pro

50 55 60

Tyr Gln Cys Pro Lys Asn Gly Thr Ala Val Cys Ala Thr Asn Arg Arg

65 70 75 80

Ser Phe Pro Thr Tyr Cys Gln Gln Lys Ser Leu Glu Cys Leu His Pro

85 90 95

Gly Thr Lys Phe Leu Asn Asn Gly Thr Cys Thr Ala Glu Gly Lys Phe

100 105 110

Ser Val Ser Leu Lys His Gly Asn Thr Asp Ser Glu Gly Ile Val Glu

115 120 125

Val Lys Leu Val Asp Gln Asp Lys Thr Met Phe Ile Cys Lys Ser Ser

130 135 140

Trp Ser Met Arg Glu Ala Asn Val Ala Cys Leu Asp Leu Gly Phe Gln

145 150 155 160

Gln Gly Ala Asp Thr Gln Arg Arg Phe Lys Leu Ser Asp Leu Ser Ile

165 170 175

Asn Ser Thr Glu Cys Leu His Val His Cys Arg Gly Leu Glu Thr Ser

180 185 190

Leu Ala Glu Cys Thr Phe Thr Lys Arg Arg Thr Met Gly Tyr Gln Asp

195 200 205

Phe Ala Asp Val Val Cys Tyr Thr Gln Lys Ala Asp Ser Pro Met Asp

210 215 220

Asp Phe Phe Gln Cys Val Asn Gly Lys Tyr Ile Ser Gln Met Lys Ala

225 230 235 240

Cys Asp Gly Ile Asn Asp Cys Gly Asp Gln Ser Asp Glu Leu Cys Cys

245 250 255

Lys Ala Cys Gln Gly Lys Gly Phe His Cys Lys Ser Gly Val Cys Ile

260 265 270

Pro Ser Gln Tyr Gln Cys Asn Gly Glu Val Asp Cys Ile Thr Gly Glu

275 280 285

Asp Glu Val Gly Cys Ala Gly Phe Ala Ser Val Ala Gln Glu Glu Thr

290 295 300

Glu Ile Leu Thr Ala Asp Met Asp Ala Glu Arg Arg Arg Ile Lys Ser

305 310 315 320

Leu Leu Pro Lys Leu Ser Cys Gly Val Lys Asn Arg Met His Ile Arg

325 330 335

Arg Lys Arg Ile Val Gly Gly Lys Arg Ala Gln Leu Gly Asp Leu Pro

340 345 350

Trp Gln Val Ala Ile Lys Asp Ala Ser Gly Ile Thr Cys Gly Gly Ile

355 360 365

Tyr Ile Gly Gly Cys Trp Ile Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Arg Ala

370 375 380

Ser Lys Thr His Arg Tyr Gln Ile Trp Thr Thr Val Val Asp Trp Ile

385 390 395 400

His Pro Asp Leu Lys Arg Ile Val Ile Glu Tyr Val Asp Arg Ile Ile

405 410 415

Phe His Glu Asn Tyr Asn Ala Gly Thr Tyr Gln Asn Asp Ile Ala Leu

420 425 430

Ile Glu Met Lys Lys Asp Gly Asn Lys Lys Asp Cys Glu Leu Pro Arg

435 440 445

Ser Ile Pro Ala Cys Val Pro Trp Ser Pro Tyr Leu Phe Gln Pro Asn

450 455 460

Asp Thr Cys Ile Val Ser Gly Trp Gly Arg Glu Lys Asp Asn Glu Arg

465 470 475 480

Val Phe Ser Leu Gln Trp Gly Glu Val Lys Leu Ile Ser Asn Cys Ser

485 490 495

Lys Phe Tyr Gly Asn Arg Phe Tyr Glu Lys Glu Met Glu Cys Ala Gly

500 505 510

Thr Tyr Asp Gly Ser Ile Asp Ala Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro

515 520 525

Leu Val Cys Met Asp Ala Asn Asn Val Thr Tyr Val Trp Gly Val Val

530 535 540

Ser Trp Gly Glu Asn Cys Gly Lys Pro Glu Phe Pro Gly Val Tyr Thr

545 550 555 560

Lys Val Ala Asn Tyr Phe Asp Trp Ile Ser Tyr His Val Gly Arg Pro

565 570 575

Phe Ile Ser Gln Tyr Asn Val

580

<210> 3

<211> 1698

<212> DNA

<213> 智人

<400> 3

aaggtcactt atacatctca agaggatctg gtggagaaaa agtgcttagc aaaaaaatat 60

actcacctct cctgcgataa agtcttctgc cagccatggc agagatgcat tgagggcacc 120

tgtgtttgta aactaccgta tcagtgccca aagaatggca ctgcagtgtg tgcaactaac 180

aggagaagct tcccaacata ctgtcaacaa aagagtttgg aatgtcttca tccagggaca 240

aagtttttaa ataacggaac atgcacagcc gaaggaaagt ttagtgtttc cttgaagcat 300

ggaaatacag attcagaggg aatagttgaa gtaaaacttg tggaccaaga taagacaatg 360

ttcatatgca aaagcagctg gagcatgagg gaagccaacg tggcctgcct tgaccttggg 420

tttcaacaag gtgctgatac tcaaagaagg tttaagttgt ctgatctctc tataaattcc 480

actgaatgtc tacatgtgca ttgccgagga ttagagacca gtttggctga atgtactttt 540

actaagagaa gaactatggg ttaccaggat ttcgctgatg tggtttgtta tacacagaaa 600

gcagattctc caatggatga cttctttcag tgtgtgaatg ggaaatacat ttctcagatg 660

aaagcctgtg atggtatcaa tgattgtgga gaccaaagtg atgaactgtg ttgtaaagca 720

tgccaaggca aaggcttcca ttgcaaatcg ggtgtttgca ttccaagcca gtatcaatgc 780

aatggtgagg tggactgcat tacaggggaa gatgaagttg gctgtgcagg ctttgcatct 840

gtggctcaag aagaaacaga aattttgact gctgacatgg atgcagaaag aagacggata 900

aaatcattat tacctaaact atcttgtgga gttaaaaaca gaatgcacat tcgaaggaaa 960

cgaattgtgg gaggaaagcg agcacaactg ggagacctcc catggcaggt ggcaattaag 1020

gatgccagtg gaatcacctg tgggggaatt tatattggtg gctgttggat tctgactgct 1080

gcacattgtc tcagagccag taaaactcat cgttaccaaa tatggacaac agtagtagac 1140

tggatacacc ccgaccttaa acgtatagta attgaatacg tggatagaat tattttccat 1200

gaaaactaca atgcaggcac ttaccaaaat gacatcgctt tgattgaaat gaaaaaagac 1260

ggaaacaaaa aagattgtga gctgcctcgt tccatccctg cctgtgtccc ctggtctcct 1320

tacctattcc aacctaatga tacatgcatc gtttctggct ggggacgaga aaaagataac 1380

gaaagagtct tttcacttca gtggggtgaa gttaaactaa taagcaactg ctctaagttt 1440

tacggaaatc gtttctatga aaaagaaatg gaatgtgcag gtacatatga tggttccatc 1500

gatgcctgta aaggggactc tggaggcccc ttagtctgta tggatgccaa caatgtgact 1560

tatgtctggg gtgttgtgag ttggggggaa aactgtggaa aaccagagtt cccaggtgtt 1620

tacaccaaag tggccaatta ttttgactgg attagctacc atgtaggaag gccttttatt 1680

tctcagtaca atgtataa 1698

<210> 4

<211> 565

<212> PRT

<213> 智人

<400> 4

Lys Val Thr Tyr Thr Ser Gln Glu Asp Leu Val Glu Lys Lys Cys Leu

1 5 10 15

Ala Lys Lys Tyr Thr His Leu Ser Cys Asp Lys Val Phe Cys Gln Pro

20 25 30

Trp Gln Arg Cys Ile Glu Gly Thr Cys Val Cys Lys Leu Pro Tyr Gln

35 40 45

Cys Pro Lys Asn Gly Thr Ala Val Cys Ala Thr Asn Arg Arg Ser Phe

50 55 60

Pro Thr Tyr Cys Gln Gln Lys Ser Leu Glu Cys Leu His Pro Gly Thr

65 70 75 80

Lys Phe Leu Asn Asn Gly Thr Cys Thr Ala Glu Gly Lys Phe Ser Val

85 90 95

Ser Leu Lys His Gly Asn Thr Asp Ser Glu Gly Ile Val Glu Val Lys

100 105 110

Leu Val Asp Gln Asp Lys Thr Met Phe Ile Cys Lys Ser Ser Trp Ser

115 120 125

Met Arg Glu Ala Asn Val Ala Cys Leu Asp Leu Gly Phe Gln Gln Gly

130 135 140

Ala Asp Thr Gln Arg Arg Phe Lys Leu Ser Asp Leu Ser Ile Asn Ser

145 150 155 160

Thr Glu Cys Leu His Val His Cys Arg Gly Leu Glu Thr Ser Leu Ala

165 170 175

Glu Cys Thr Phe Thr Lys Arg Arg Thr Met Gly Tyr Gln Asp Phe Ala

180 185 190

Asp Val Val Cys Tyr Thr Gln Lys Ala Asp Ser Pro Met Asp Asp Phe

195 200 205

Phe Gln Cys Val Asn Gly Lys Tyr Ile Ser Gln Met Lys Ala Cys Asp

210 215 220

Gly Ile Asn Asp Cys Gly Asp Gln Ser Asp Glu Leu Cys Cys Lys Ala

225 230 235 240

Cys Gln Gly Lys Gly Phe His Cys Lys Ser Gly Val Cys Ile Pro Ser

245 250 255

Gln Tyr Gln Cys Asn Gly Glu Val Asp Cys Ile Thr Gly Glu Asp Glu

260 265 270

Val Gly Cys Ala Gly Phe Ala Ser Val Ala Gln Glu Glu Thr Glu Ile

275 280 285

Leu Thr Ala Asp Met Asp Ala Glu Arg Arg Arg Ile Lys Ser Leu Leu

290 295 300

Pro Lys Leu Ser Cys Gly Val Lys Asn Arg Met His Ile Arg Arg Lys

305 310 315 320

Arg Ile Val Gly Gly Lys Arg Ala Gln Leu Gly Asp Leu Pro Trp Gln

325 330 335

Val Ala Ile Lys Asp Ala Ser Gly Ile Thr Cys Gly Gly Ile Tyr Ile

340 345 350

Gly Gly Cys Trp Ile Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Arg Ala Ser Lys

355 360 365

Thr His Arg Tyr Gln Ile Trp Thr Thr Val Val Asp Trp Ile His Pro

370 375 380

Asp Leu Lys Arg Ile Val Ile Glu Tyr Val Asp Arg Ile Ile Phe His

385 390 395 400

Glu Asn Tyr Asn Ala Gly Thr Tyr Gln Asn Asp Ile Ala Leu Ile Glu

405 410 415

Met Lys Lys Asp Gly Asn Lys Lys Asp Cys Glu Leu Pro Arg Ser Ile

420 425 430

Pro Ala Cys Val Pro Trp Ser Pro Tyr Leu Phe Gln Pro Asn Asp Thr

435 440 445

Cys Ile Val Ser Gly Trp Gly Arg Glu Lys Asp Asn Glu Arg Val Phe

450 455 460

Ser Leu Gln Trp Gly Glu Val Lys Leu Ile Ser Asn Cys Ser Lys Phe

465 470 475 480

Tyr Gly Asn Arg Phe Tyr Glu Lys Glu Met Glu Cys Ala Gly Thr Tyr

485 490 495

Asp Gly Ser Ile Asp Ala Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val

500 505 510

Cys Met Asp Ala Asn Asn Val Thr Tyr Val Trp Gly Val Val Ser Trp

515 520 525

Gly Glu Asn Cys Gly Lys Pro Glu Phe Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val

530 535 540

Ala Asn Tyr Phe Asp Trp Ile Ser Tyr His Val Gly Arg Pro Phe Ile

545 550 555 560

Ser Gln Tyr Asn Val

565

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物序列: FI-AAV-F

<400> 5

tctagaggat ccgccaccat gaagctc 27

<210> 6

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物序列: FI-AAV-R

<400> 6

aagcttggcg gccgctcaga cattgtgttg agaaacaaga gaccttc 47

<210> 7

<211> 1752

<212> DNA

<213> 智人

<400> 7

atgaagctgc tgcatgtctt tctgctgttt ctgtgcttcc atctgcggtt ctgtaaagtg 60

acctatacta gccaggagga tctggtggag aagaagtgtc tggccaagaa gtacacacac 120

ctgagctgcg acaaggtgtt ctgtcagcct tggcagcggt gcatcgaggg cacctgcgtg 180

tgcaagctgc cttaccagtg cccaaagaac ggcaccgccg tgtgcgccac aaatcggaga 240

tcttttccaa catattgcca gcagaagagc ctggagtgtc tgcaccccgg caccaagttc 300

ctgaacaatg gcacctgcac agccgagggc aagttttctg tgagcctgaa gcacggcaac 360

acagatagcg agggcatcgt ggaggtgaag ctggtggacc aggataagac catgttcatc 420

tgtaagagct cctggtccat gagggaggca aacgtggcat gcctggatct gggattccag 480

cagggagcag acacacagag gcgctttaag ctgtccgacc tgtctatcaa tagcaccgag 540

tgcctgcacg tgcactgtag gggcctggag acatccctgg cagagtgcac cttcacaaag 600

cggagaacca tgggctacca ggactttgcc gacgtggtgt gctataccca gaaggccgat 660

agccccatgg acgatttctt tcagtgcgtg aacggcaagt atatctccca gatgaaggcc 720

tgcgacggca tcaatgactg tggcgatcag tctgacgagc tgtgctgtaa ggcctgtcag 780

ggcaagggct tccactgcaa gagcggcgtg tgcatccctt cccagtacca gtgcaacggc 840

gaggtggatt gtatcacagg agaggacgaa gtgggatgcg caggatttgc atctgtggca 900

caggaggaga cagagatcct gacagccgac atggatgccg agaggcgccg gatcaagtct 960

ctgctgccta agctgagctg tggcgtgaag aatcggatgc acatcagaag gaagcgcatc 1020

gtgggaggca agagggcaca gctgggcgat ctgccatggc aggtggccat caaggacgcc 1080

tctggcatca cctgcggcgg catctacatc ggaggatgtt ggatcctgac cgcagcacac 1140

tgcctgagag caagcaagac acacaggtat cagatctgga ccacagtggt ggattggatc 1200

cacccagacc tgaagagaat cgtgatcgag tacgtggata ggatcatctt tcacgagaac 1260

tacaatgccg gcacatatca gaacgacatc gccctgatcg agatgaagaa ggatggcaat 1320

aagaaggact gtgagctgcc cagatccatc cctgcatgcg tgccatggag cccctatctg 1380

ttccagccca acgatacctg catcgtgtcc ggatggggaa gggagaagga caatgagcgg 1440

gtgttttctc tgcagtgggg cgaggtgaag ctgatctcca actgttctaa gttctacggc 1500

aataggtttt atgagaagga gatggagtgc gccggcacct acgatggcag catcgacgcc 1560

tgtaagggcg attccggagg accactggtg tgcatggacg caaacaatgt gacatacgtg 1620

tggggagtgg tgtcctgggg agagaactgc ggcaagccag agttccccgg cgtatatacc 1680

aaggtggcca attattttga ttggatttcc taccacgtcg gcaggccctt tatttcccag 1740

tataatgtct aa 1752

<210> 8

<211> 251

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> HLP肝特异性启动子序列

<400> 8

tgtttgctgc ttgcaatgtt tgcccatttt agggtggaca caggacgctg tggtttctga 60

gccagggggc gactcagatc ccagccagtg gacttagccc ctgtttgctc ctccgataac 120

tggggtgacc ttggttaata ttcaccagca gcctcccccg ttgcccctct ggatccactg 180

cttaaatacg gacgaggaca gggccctgtc tcctcagctt caggcaccac cactgacctg 240

ggacagtgaa t 251

<210> 9

<211> 447

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> LP1肝特异性启动子序列

<400> 9

ccctaaaatg ggcaaacatt gcaagcagca aacagcaaac acacagccct ccctgcctgc 60

tgaccttgga gctggggcag aggtcagaga cctctctggg cccatgccac ctccaacatc 120

cactcgaccc cttggaattt cggtggagag gagcagaggt tgtcctggcg tggtttaggt 180

agtgtgagag gggaatgact cctttcggta agtgcagtgg aagctgtaca ctgcccaggc 240

aaagcgtccg ggcagcgtag gcgggcgact cagatcccag ccagtggact tagcccctgt 300

ttgctcctcc gataactggg gtgaccttgg ttaatattca ccagcagcct cccccgttgc 360

ccctctggat ccactgctta aatacggacg aggacagggc cctgtctcct cagcttcagg 420

caccaccact gacctgggac agtgaat 447

<210> 10

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> HLP2肝特异性启动子序列

<400> 10

ccctaaaatg ggcaaacatt gcaagcagca aacagcaaac acacagccct ccctgcctgc 60

tgaccttgga gctggggcag aggtcagaca cctctctggg cccatgccac ctccaactgg 120

acacaggacg ctgtggtttc tgagccaggg ggcgactcag atcccagcca gtggacttag 180

cccctgtttg ctcctccgat aactggggtg accttggtta atattcacca gcagcctccc 240

ccgttgcccc tctggatcca ctgcttaaat acggacgagg acagggccct gtctcctcag 300

cttcaggcac caccactgac ctgggacagt gaatgatccc cctgatctgc ggcc 354

<210> 11

<211> 736

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> MutC壳体蛋白序列

<400> 11

Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser

1 5 10 15

Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro

35 40 45

Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro

50 55 60

Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp

65 70 75 80

Gln Gln Leu Gln Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala

85 90 95

Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly

100 105 110

Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro

115 120 125

Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg

130 135 140

Pro Val Asp Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Val Gly

145 150 155 160

Lys Ser Gly Lys Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr

165 170 175

Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro

180 185 190

Ala Ala Pro Thr Ser Leu Gly Ser Asn Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly

195 200 205

Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser

210 215 220

Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile

225 230 235 240

Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu

245 250 255

Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr

260 265 270

Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His

275 280 285

Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp

290 295 300

Gly Phe Arg Pro Lys Lys Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val

305 310 315 320

Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu

325 330 335

Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr

340 345 350

Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp

355 360 365

Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser

370 375 380

Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser

385 390 395 400

Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Thr Phe Glu

405 410 415

Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg

420 425 430

Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Asn Arg Thr

435 440 445

Gln Gly Thr Thr Ser Gly Thr Thr Asn Gln Ser Arg Leu Leu Phe Ser

450 455 460

Gln Ala Gly Pro Gln Ser Met Ser Leu Gln Ala Arg Asn Trp Leu Pro

465 470 475 480

Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Leu Ser Lys Thr Ala Asn Asp Asn

485 490 495

Asn Asn Ser Asn Phe Pro Trp Thr Ala Ala Ser Lys Tyr His Leu Asn

500 505 510

Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys

515 520 525

Asp Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Met His Gly Asn Leu Ile Phe Gly

530 535 540

Lys Glu Gly Thr Thr Ala Ser Asn Ala Glu Leu Asp Asn Val Met Ile

545 550 555 560

Thr Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln

565 570 575

Tyr Gly Thr Val Ala Asn Asn Leu Gln Ser Ser Asn Thr Ala Pro Thr

580 585 590

Thr Arg Thr Val Asn Asp Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln

595 600 605

Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His

610 615 620

Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu

625 630 635 640

Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Met Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala

645 650 655

Asn Pro Pro Thr Thr Phe Ser Pro Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr

660 665 670

Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln

675 680 685

Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn

690 695 700

Tyr Asn Lys Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val

705 710 715 720

Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu

725 730 735

<210> 12

<211> 736

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> LK03壳体蛋白序列

<400> 12

Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser

1 5 10 15

Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Gln Pro Gly Ala Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro

35 40 45

Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro

50 55 60

Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp

65 70 75 80

Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala

85 90 95

Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly

100 105 110

Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro

115 120 125

Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg

130 135 140

Pro Val Asp Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Val Gly

145 150 155 160

Lys Ser Gly Lys Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr

165 170 175

Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro

180 185 190

Ala Ala Pro Thr Ser Leu Gly Ser Asn Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly

195 200 205

Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser

210 215 220

Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile

225 230 235 240

Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu

245 250 255

Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr

260 265 270

Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His

275 280 285

Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp

290 295 300

Gly Phe Arg Pro Lys Lys Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val

305 310 315 320

Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu

325 330 335

Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr

340 345 350

Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp

355 360 365

Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser

370 375 380

Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser

385 390 395 400

Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Thr Phe Glu

405 410 415

Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg

420 425 430

Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Asn Arg Thr

435 440 445

Gln Gly Thr Thr Ser Gly Thr Thr Asn Gln Ser Arg Leu Leu Phe Ser

450 455 460

Gln Ala Gly Pro Gln Ser Met Ser Leu Gln Ala Arg Asn Trp Leu Pro

465 470 475 480

Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Leu Ser Lys Thr Ala Asn Asp Asn

485 490 495

Asn Asn Ser Asn Phe Pro Trp Thr Ala Ala Ser Lys Tyr His Leu Asn

500 505 510

Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys

515 520 525

Asp Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Met His Gly Asn Leu Ile Phe Gly

530 535 540

Lys Glu Gly Thr Thr Ala Ser Asn Ala Glu Leu Asp Asn Val Met Ile

545 550 555 560

Thr Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln

565 570 575

Tyr Gly Thr Val Ala Asn Asn Leu Gln Ser Ser Asn Thr Ala Pro Thr

580 585 590

Thr Arg Thr Val Asn Asp Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln

595 600 605

Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His

610 615 620

Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu

625 630 635 640

Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Met Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala

645 650 655

Asn Pro Pro Thr Thr Phe Ser Pro Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr

660 665 670

Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln

675 680 685

Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn

690 695 700

Tyr Asn Lys Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val

705 710 715 720

Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Pro Leu

725 730 735

Claims

1.用于在有此需要的受试者中预防、治疗或改善补体介导的病症的方法，其包括对所述受试者施用包含编码因子I或其保留C3b失活和iC3b降解活性的片段或其衍生物的核酸的重组病毒载体，使得从所述受试者中的所述核酸表达治疗有效量的编码的因子I或其片段或衍生物，从而提高所述受试者中的C3b失活和iC3b降解活性的水平。

2.根据权利要求1的方法，其中将所述受试者中C3b失活和iC3b降解活性的水平提高至超过正常水平的水平。

3.根据权利要求1或2的方法，其中对所述受试者施用重组病毒颗粒，所述重组病毒颗粒将所述重组病毒载体壳体化。

4.根据权利要求3的方法，其中所述重组病毒颗粒在施用后感染所述受试者的肝，导致从所述肝中表达所述因子I或其片段或衍生物。

5.根据权利要求3或4的方法，其中所述重组病毒颗粒是将重组腺伴随病毒(rAAV)载体壳体化的rAAV颗粒。

6.根据权利要求5的方法，其中所述rAAV颗粒是假型化的，以赋予肝向性。

7.根据权利要求5或6的方法，其中所述rAAV颗粒包含一种或两种AAV2ITR或其衍生物，其中每种衍生物AAV2 ITR包含在其整个长度上与天然存在的AAV2 ITR的核苷酸序列至少60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的核苷酸序列，并且其中所述rAAV颗粒是用AAV8壳体蛋白假型化的(rAAV2/8)，或用AAV9壳体蛋白假型化的AAV2(rAAV2/9)，或其衍生物，其包含在其整个长度上与天然存在的AAV8或AAV9壳体蛋白的氨基酸序列至少60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的氨基酸序列。

8.根据前述权利要求中任一项的方法，其中将所述重组病毒颗粒静脉内施用于所述受试者。

9.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述重组病毒载体是非整合的附加型病毒载体。

10.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述编码的因子I或其片段或衍生物从肝特异性启动子，如人α-1-抗胰蛋白酶(hAAT)启动子表达。

11.根据前述权利要求中任一项的方法，其中将所述受试者中C3b失活和iC3b降解活性的水平提高至高达正常水平的两倍的水平。

12.根据前述权利要求中任一项的方法，其中将所述受试者中C3b失活和iC3b降解活性的水平提高至高于正常水平高达80％或高达60％的水平。

13.根据前述权利要求中任一项的方法，其中将所述受试者中C3b失活和iC3b降解活性的水平提高至高于正常水平高达40％或高达20％的水平。

14.根据前述权利要求中任一项的方法，其中将所述受试者中C3b失活和iC3b降解活性的水平提高至高于正常水平至少5％，10％，15％，20％或25％的水平。

15.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述受试者中C3b失活和iC3b降解活性的水平是所述受试者的血清中的水平。

16.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述受试者中C3b失活和iC3b降解活性的正常水平等于由所述受试者的血清中30-40μg/ml因子I所提供的活性。

17.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述补体介导的病症是与补体C3b反馈循环的过度活性相关的病症。

18.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述补体介导的病症是年龄相关的黄斑变性(AMD)(特别是早期(干性)AMD，或地图状萎缩)、致密沉积物病(DDD)、非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)、C3肾小球病、膜增生性肾小球肾炎2型(MPGN2)、动脉粥样硬化、慢性心血管疾病、阿尔茨海默病、系统性血管炎、阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)、老年人炎症或自身炎性疾病、膜增生性肾小球肾炎I型(MPGN I型)、膜增生性肾小球肾炎III型(MPGN III型)、吉兰-巴雷综合征、亨诺-许兰(Henoch-Schonlein)紫癜、IgA肾病或膜性肾小球肾炎。

19.根据权利要求18的方法，其中所述受试者有风险形成AMD。

20.根据权利要求19的方法，其中所述受试者对于与AMD相关的一种或多种SNP是纯合的或杂合的易感的。

21.根据权利要求19或20的方法，其进一步包括确定受试者是否有形成AMD的风险。

22.根据权利要求21的方法，其中通过确定所述受试者对于与AMD相关的一种或多种SNP是否是纯合或杂合的易感的来确定所述受试者是否有形成AMD的风险。

23.根据权利要求20或22的方法，其中若所述受试者对于与AMD相关的一种或多种SNP是杂合的易感的，则所述受试者中C3b失活和iC3b降解活性的水平提高至高于正常水平至少10％的水平。

24.根据权利要求20或22的方法，其中若所述受试者对于与AMD相关的一种或多种SNP是纯合的易感的，则所述受试者中C3b失活和iC3b降解活性的水平提高至高于正常水平至少50％的水平。

25.根据前述权利要求中任一项的方法，其进一步包括在所述施用后至少一周确定所述受试者中C3b失活和iC3b降解活性的水平，并且若发现活性水平处于或低于正常水平，则重复所述施用。

26.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述因子I是具有SEQ ID NO:2或4的氨基酸序列的人因子I。

27.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述因子I的片段或衍生物是在其整个长度上与具有SEQ ID NO:2或4的氨基酸序列的人因子I具有至少60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％氨基酸同一性的多肽。

28.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述受试者是人受试者。

29.重组病毒载体，其包含编码因子I或其保留C3b失活和iC3b降解活性的片段或其衍生物的核酸。

30.根据权利要求29的重组病毒载体，其是非整合的附加型病毒载体。

31.根据权利要求29或30的重组病毒载体，其中所述编码因子I或其片段或衍生物的核酸与启动子可操作连接。

32.根据权利要求31的重组病毒载体，其中所述启动子是肝特异性启动子，如人α-1-抗胰蛋白酶(hAAT)启动子。

33.根据权利要求28-31中任一项的重组病毒载体，其是重组腺伴随病毒(rAAV)载体。

34.根据权利要求33的重组病毒载体，其包含侧翼为AAV反向末端重复(ITR)的表达盒，其中所述表达盒包含与启动子和多腺苷酸化识别位点可操作连接的编码因子I或其片段或衍生物的核酸。

35.根据权利要求34的重组病毒载体，其中所述ITR是AAV2 ITR或其衍生物，其中每种衍生物AAV2 ITR包含在其整个长度上与天然存在的AAV2ITR的核苷酸序列至少60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的核苷酸序列。

36.重组病毒颗粒，其包含将根据权利要求29-35中任一项的重组病毒载体壳体化的病毒壳体。

37.根据权利要求28或29的重组病毒颗粒，其能够转导肝脏细胞，特别是肝细胞。

38.根据权利要求36或37的重组病毒颗粒，其是rAAV颗粒。

39.根据权利要求38的重组病毒颗粒，其中所述rAAV颗粒是假型化的，以赋予肝向性。

40.根据权利要求38或39的重组病毒颗粒，其中所述rAAV颗粒包含AAV8或AAV9壳体蛋白或其衍生物，其包含在其整个长度上与天然存在的AAV8或AAV9壳体蛋白的氨基酸序列至少60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的氨基酸序列。

41.根据权利要求40的重组病毒颗粒，其中所述rAAV颗粒包含一种或两种AAV2 ITR或其衍生物，其中每种衍生物AAV2 ITR包含在其整个长度上与天然存在的AAV2 ITR的核苷酸序列至少60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的核苷酸序列。

42.药物组合物，其包含：根据权利要求29至35中任一项的重组病毒载体，或根据权利要求36至41中任一项的重组病毒颗粒；和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。

43.根据权利要求42的药物组合物，其适用于静脉内施用。

44.试剂盒，其包含：根据权利要求29至35中任一项的重组病毒载体，或根据权利要求36至41中任一项的重组病毒颗粒；和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。

45.用于产生rAAV颗粒的试剂盒，其包含：根据权利要求33至35中任一项的rAAV载体；和一种或多种辅助质粒，其包含编码AAV复制和壳体蛋白的核酸，以及生产性AAV生命周期所需要的基因。

46.根据权利要求45的试剂盒，其包含第一辅助质粒和第二辅助质粒，所述第一辅助质粒包含编码AAV复制和壳体蛋白的核酸，所述第二辅助质粒包含编码生产性AAV生命周期所需要的基因的核酸。

47.根据权利要求29-35中任一项的重组病毒载体、根据权利要求36-41中任一项的重组病毒颗粒、或根据权利要求42或43的药物组合物，其用作药物。

48.根据权利要求29至35中任一项的重组病毒载体、根据权利要求36至41中任一项的重组病毒颗粒、或根据权利要求41或42的药物组合物，其用于治疗补体介导的病症。

49.根据权利要求29-35中任一项的重组病毒载体、根据权利要求36-41中任一项的重组病毒颗粒、或根据权利要求42或43的药物组合物在制备用于治疗补体介导的病症的药物中的用途。

50.根据权利要求48的载体、颗粒或组合物，或根据权利要求48的用途，其中所述补体介导的病症是与补体C3b反馈循环的过度活性相关的病症。

51.根据权利要求50的载体、颗粒或组合物，其中所述补体介导的病症是年龄相关的黄斑变性(AMD)(特别是早期(干性)AMD，或地图状萎缩)、致密沉积物病(DDD)、非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)、C3肾小球病、膜增生性肾小球肾炎2型(MPGN2)、动脉粥样硬化、慢性心血管疾病、阿尔茨海默病、系统性血管炎、阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)、老年人炎症或自身炎性疾病、膜增生性肾小球肾炎I型(MPGN I型)、膜增生性肾小球肾炎III型(MPGN III型)、吉兰-巴雷综合征、亨诺-许兰紫癜、IgA肾病或膜性肾小球肾炎。

52.根据权利要求50的载体、颗粒或组合物，其中所述补体介导的病症是年龄相关的黄斑变性(AMD)。