CN114828886A - 因子h增强抗体及其用途 - Google Patents
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Abstract
本文提供了对因子H特异的新颖分离的合成或重组抗体及其片段，或者编码此类抗体和片段的核酸或载体。本文还提供了此类抗体、片段、核酸或载体用于抑制补体激活和治疗与补体激活相关的病症的用途。
Description
相关申请案
本申请要求2019年7月17日提交的美国临时专利申请号62/875,309的权益和优先权，该美国临时专利申请的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
发明背景
补体系统是先天免疫力的重要部分，它有助于保护许多生物体(诸如哺乳动物)免受侵袭性病原体影响。补体系统由30多种不同的组分组成，所述组分主要在肝脏中合成。补体系统的激活通过三种不同的途径发生，即经典途径、凝集素途径和替代途径。该三种途径在C3转化酶形成时汇集，所述途径中的每一种途径都不同但具有类似的活性。
在经典补体途径中，由C1q、C1r和C1s组成的补体组分(C)1复合物的激活在结合至抗体-抗原复合物后发生。C1复合物切割C4和C2，从而形成由C4bC2a组成的C3转化酶。C3转化酶将C3切割为活性组分C3a和C3b。在凝集素途径中，甘露糖结合凝集素结合至病原表面上的甘露糖残基，从而激活能够切割C4和C2的丝氨酸蛋白酶MASP-1和MASP-2。如在经典途径中，这导致形成了C4bC2a C3转化酶。这种C3转化酶可以结合C3b以形成C5转化酶。与经典途径和凝集素途径相反，替代途径由于C3在血浆中自发水解为C3(H2O)而具有低水平的连续活性。这种C3b样C3(H2O)可以通过结合因子B(FB)而形成流体相C3转化酶，后者又通过因子D激活为Bb。类似地，当C3b结合至表面时，它可以结合FB以形成C3bB。这种复合物通过因子D切割成C3bBb，后者是可以通过备解素(因子P)稳定为C3bBbP的替代途径C3转化酶。这种C3转化酶能够将C3切割成C3a和C3b。除此过程以外，替代途径还充当经典途径和凝集素激活途径的扩增环，因为这些途径中产生的C3b可以充当替代途径的起点。由此，扩增环增强了经典途径和凝集素途径。该三个激活途径之一中形成的C3转化酶可以结合C3b，以形成C5转化酶。所有三个补体途径的C5转化酶都将C5激活为C5a和C5b，从而引发补体系统的终末途径。C5b结合C6、C7、C8和C9以形成膜攻击复合物(MAC)，从而形成跨膜通道并引起细胞溶解。
继在病原体的膜中形成孔隙后，补体通过用C3b分子助噬以及产生将免疫细胞吸引至感染部位并激活免疫细胞的促炎性肽(诸如C3a和C5a)来辅助清除病原体或已被改变的自体细胞。由于补体的强促炎性特性，宿主细胞通过若干种膜性和可溶性补体调控蛋白受到充分保护。
替代途径占总补体活性的80％至90％。因此，这种途径的调控至关重要。由C3自发水解形成的C3(H2O)和C3b在未被病原体结合时一般被因子H(FH)、因子I(FI)和宿主细胞表面分子快速灭活，从而抑制C3转化酶形成。CD55(也称为衰退加速因子或DAF)结合宿主细胞表面的C3b。FI将C3b切割为非活性形式，但取决于细胞表面上表达的辅因子(CD46、MCP)或在血浆中循环的辅因子(FH)。
FH是血浆糖蛋白，它对于控制溶液中和细胞表面上的替代补体途径来说都是必需的。FH在与FB相同的位置结合C3b，从而防止C3转化酶形成。FH还具有衰退加速活性，即，它在替代途径C3转化酶已经形成后促进它们解离。FH是否结合至C3b由细胞表面上存在的碳水化合物决定。宿主细胞表面上存在的唾液酸、糖胺聚糖和肝素促进FH与C3b结合，而C3b与病原体表面表达的分子结合引起了FB结合。FH因此在宿主细胞上而非在病原细胞表面上发挥其补体抑制活性，这是因为结合FH的细胞表面分子表达于宿主细胞上但一般不表达于病原细胞上。FH含有20个补体控制蛋白(CCP)结构域，从FH的N末端开始编号为1至20。CCP结构域也称为短共有重复(SCR)或寿司(sushi)结构域。CCP 1-4是参与调控的结构域，CCP 19-20参与结合C3b，并且CCP 6、7、8、19和20结合至细胞表面表达的GAG和唾液酸。结合CCP19和/或CCP20的抗体抑制FH的活性。
因子H相关蛋白(CFHR)是与FH的结构和抗原性相关的血浆糖蛋白。FHR蛋白还包含CCP结构域，且这些结构域与FH中发现的CCP结构域具有不同程度的同源性。举例来说，FHR1包含对应于CCP6、CCP7、CCP18、CCP19和CCP20的结构域。与FH相比，CFHR不具有强补体抑制活性。CFHR的一个共同特征是它们结合至补体的C3b组分，从而与FH竞争结合至C3b，并且因此被视为替代补体途径的正调控剂。
由于突变所致的FH缺乏或宿主表面识别受损与补体介导的组织损伤和疾病相关。继在正常止血过程中控制补体激活后，FH还在限制补体介导的患病细胞和组织损伤方面起着重要作用。已经描述了FH基因中可能导致FH蛋白丧失功能的多个突变。FH的C末端区域是疾病的突变热点。这是FH与宿主细胞结合的关键区域。这个区域中的大部分疾病相关突变会干扰FH结合。大部分具有突变FH基因的患者具有杂合突变，意味着大约一半的循环FH具有正常功能。然而，在补体被激活的某些条件下，这显然不足以保护自身表面。FH缺乏可能导致肾病，诸如膜性增生性肾小球肾炎(MPGN)和非典型溶血性尿毒综合征(aHUS)。最近，已经描述了FH突变与年龄相关性黄斑疾病(AMD)之间的关系。
目前，FH缺乏(诸如在aHUS中)的标准治疗是血浆补充或血浆交换疗法。利用此类疗法，补充了缺乏的补体调控剂。血浆交换疗法另外还去除了突变补体因子和/或针对补体因子的自体抗体。然而，血浆疗法也有一些限制。尚无前瞻性临床研究证明血浆交换疗法在治疗aHUS方面安全或有效，而且血浆疗法的效率可能取决于潜在突变。一些患者对新鲜冷冻血浆产生了过敏反应，这可能需要停止任何形式的血浆疗法。此外，由于施用了血浆来源的活性病原性补体组分，血浆交换可能使aHUS的临床表达恶化。
最近，治疗性单克隆抗体依库珠单抗(eculizumab)已经在若干个国家(其中包括美国和欧洲国家)被批准用于治疗aHUS和阵发性夜间血红蛋白尿症(PNH)。依库珠单抗是可以防止C5切割为C5a和C5b的C5特异性人源化小鼠单克隆抗体。它因此防止终末途径激活并减少了免疫细胞流入。然而，依库珠单抗的使用与不良副作用有关联。由于它阻断了引发终末途径的关键组分C5，因此用依库珠单抗治疗的患者变得易感染荚膜细菌(诸如脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis))，后者的清除非常依赖于MAC形成。因此，需要患者在接受依库珠单抗治疗前接种脑膜炎球菌疫苗。此外，由于依库珠单抗在C3下游起作用，所以维持了C3沉积，这在涉及不良或过度补体激活的若干种病症中是不利的。另外，依库珠单抗治疗涉及高成本，而且抗体的可用性有限。
Cheng等(Clinical Chemistry,2005)描述了结合CCP18的小鼠单克隆抗体。据描述，这种抗体(称为X52.1)增加了FH与C3b和C3d的结合，这被认为是由FH二聚引起的。X52.1诱导FH与C3b和C3d结合增加导致了补体介导的细胞(包括RBC和如Corey等(J BiolChem.2000)所示的若干种类型的癌细胞)溶解增加。这证明了抗体X52.1抑制FH的补体抑制活性。实际上，Corey等表明该抗体可以通过增强补体介导的癌细胞溶解而用于治疗癌症。
持续需要结合FH的新颖改进治疗剂，诸如可用于治疗与不良或过度补体激活相关的病症的剂。
发明概要
本发明提供了特异性结合因子H(FH)的补体控制蛋白结构域18(CCP18)的抗体或其抗原结合片段，例如分离的合成或重组抗体或其抗原结合片段。此类抗体和抗原结合片段可用于增强FH的活性，例如，增加FH对C3b的结合亲和力、增加FH抑制C3沉积的能力和/或增加FH抑制溶血活性的能力。在一些实施方案中，所述抗体或片段包含：轻链CDR1序列，其包含序列SSVTY(SEQ ID NO:1)或序列TSVTY(SEQ ID NO:13)；轻链CDR2序列，其包含序列ATS(SEQ ID NO:2)或序列ASS(SEQ ID NO:14)；轻链CDR3序列，其包含序列QHRSSSNPLT(SEQID NO:3)；重链CDR1序列，其包含序列GFSLTNYG(SEQ ID NO:5)；重链CDR2序列，其包含序列VWSGGTT(SEQ ID NO:6)或序列IWSGGTT(SEQ ID NO:10)；以及重链CDR3序列，其包含序列ARNFGNYAMDY(SEQ ID NO:7)或序列ARNFGNYAMDF(SEQ ID NO:11)。
在一些实施方案中，所述抗体或片段包含：轻链CDR1序列，其包含序列SSVTY(SEQID NO:1)；轻链CDR2序列，其包含序列ATS(SEQ ID NO:2)；轻链CDR3序列，其包含序列QHRSSSNPLT(SEQ ID NO:3)；重链CDR1序列，其包含序列GFSLTNYG(SEQ ID NO:5)；重链CDR2序列，其包含序列IWSGGTT(SEQ ID NO:10)；以及重链CDR3序列，其包含序列ARNFGNYAMDF(SEQ ID NO:11)。在一些实施方案中，所述抗体或片段包含：可变轻链序列，其包含与SEQID NO:4或16具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列；和可变重链序列，其包含与SEQ ID NO:8或12具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述抗体或片段包含：可变轻链序列，其包含与SEQID NO:4具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列；和可变重链序列，其包含与SEQ ID NO:12具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，所述抗体或片段包含：轻链CDR1序列，其包含序列SSVTY(SEQID NO:1)；轻链CDR2序列，其包含序列ATS(SEQ ID NO:2)；轻链CDR3序列，其包含序列QHRSSSNPLT(SEQ ID NO:3)；重链CDR1序列，其包含序列GFSLTNYG(SEQ ID NO:5)；重链CDR2序列，其包含序列VWSGGTT(SEQ ID NO:6)；以及重链CDR3序列，其包含序列ARNFGNYAMDY(SEQ ID NO:7)。在一些实施方案中，所述抗体或片段包含：可变轻链序列，其包含与SEQ IDNO:4具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列；和可变重链序列，其包含与SEQ ID NO:8具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，所述抗体或片段包含：轻链CDR1序列，其包含序列TSVTY(SEQID NO:13)；轻链CDR2序列，其包含序列ASS(SEQ ID NO:14)；轻链CDR3序列，其包含序列QHRSSSNPLT(SEQ ID NO:3)；重链CDR1序列，其包含序列GFSLTNYG(SEQ ID NO:5)；重链CDR2序列，其包含序列VWSGGTT(SEQ ID NO:6)；以及重链CDR3序列，其具有序列ARNFGNYAMDY(SEQ ID NO:7)。在一些实施方案中，所述抗体或片段包含：可变轻链序列，其包含与SEQ IDNO:16具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列；和可变重链序列，其包含与SEQ ID NO:8具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，所述抗体或片段包含：轻链CDR1序列，其包含序列TSVTY(SEQID NO:13)；轻链CDR2序列，其包含序列ASS(SEQ ID NO:14)；轻链CDR3序列，其包含序列QHRSSSNPLT(SEQ ID NO:3)；重链CDR1序列，其包含序列GFSLTNYG(SEQ ID NO:5)；重链CDR2序列，其包含序列IWSGGTT(SEQ ID NO:10)；以及重链CDR3序列，其包含序列ARNFGNYAMDF(SEQ ID NO:11)。在一些实施方案中，所述抗体或片段包含：可变轻链序列，其包含与SEQID NO:16具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列；和可变重链序列，其包含与SEQ ID NO:12具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，所述抗体或片段对FH的结合亲和力以KD计为2.5×10-8M或更低和/或对包含CCP18-20的FH片段的结合亲和力以KD计为0.1×10-9M或更低，或者其中所述抗体或片段对FH的结合亲和力以KD计为1.25×10-8M或更低和/或对包含CCP18-20的FH片段的结合亲和力以KD计为0.04×10-9M或更低。在一些实施方案中，所述抗体或片段对FH的结合亲和力以KD计为2.5×10-8M或更低和/或对包含CCP18-20的FH片段的结合亲和力以KD计为0.1×10-9M或更低，或者其中所述抗体或片段对FH的结合亲和力以KD计为0.6×10-8M或更低和/或对包含CCP18-20的FH片段的结合亲和力以KD计为0.6×10-11M或更低。在一些实施方案中，本发明的抗体或片段：在存在10％(v/v)血清时抑制体外脂多糖(LPS)上的C3沉积，其中IC50值为38nM或更低，诸如IC50值为30nM或更低；和/或在存在10％(v/v)血清时，抑制体外溶血活性，其中IC50值为150nM或更低，诸如IC50值为130nM或更低；和/或在存在10％(v/v)血清时使体外FH对C3b的KD值降低(使结合亲和力增加)至2μM或更低；和/或在存在10％(v/v)血清时，使体外FH对C3b的结合亲和力增加至少3倍。在某些实施方案中，血清是正常人血清。
在一些实施方案中，所述抗体或片段增强了FH活性，任选地，其中FH活性是抑制替代补体激活，进一步任选地，其中抑制替代补体激活包括：抑制溶血活性；抑制补体组分3(C3)沉积；和/或增加FH与C3b、iC3b和/或C3d的结合。在一些实施方案中，所述抗体或片段包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，而且其中所述抗体或片段还包含免疫球蛋白重链恒定区和免疫球蛋白轻链恒定区。在一些实施方案中，所述抗体或片段包含IgG的恒定区。在一些实施方案中，IgG的恒定区是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。在一些实施方案中，所述抗体或片段包含IgG4(例如人IgG4)的恒定区。在一些实施方案中，IgG4的恒定区在297位包含突变。在某些实施方案中，IgG4的恒定区在297位包含氨基酸残基Q。在某些实施方案中，IgG4的恒定区在297位包含氨基酸残基A。
在一些实施方案中，所述片段至少包含Fab片段。在一些实施方案中，所述抗体或片段是单克隆抗体或其片段。在一些实施方案中，所述抗体或片段是嵌合或人源化抗体或其片段，其包含人轻链和重链恒定区。在一些实施方案中，所述抗体或片段被PEG化。在一些实施方案中，所述抗体或片段是PEG化Fab片段。
在一些实施方案中，本发明提供了一种分离的合成或重组核酸，其包含编码本文公开的抗体或片段中的任一种的核酸序列。在一些实施方案中，本发明提供了一种载体，其包含本文公开的核酸中的任一种。在一些实施方案中，所述载体是AAV载体。在一些实施方案中，所述AAV载体选自由以下组成的组：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12。
在一些实施方案中，本发明提供了一种重组细胞，其包含本文公开的核酸中的任一种或本文公开的载体中的任一种。
在一些实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，其包含本文公开的抗体或片段中的任一种、本文公开的核酸中的任一种、本文公开的载体中的任一种、或本文公开的重组细胞中的任一种，以及药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。
在一些实施方案中，本发明提供了本文公开的抗体或片段中的任一种、本文公开的核酸中的任一种、本文公开的载体中的任一种以供用于治疗。在一些实施方案中，本发明提供了本文公开的抗体或片段中的任一种、本文公开的核酸中的任一种、或本文公开的载体中的任一种以供用于抑制替代补体激活。在一些实施方案中，本发明提供本文公开的抗体或片段中的任一种、本文公开的核酸中的任一种、或本文公开的载体中的任一种以供用于治疗、减轻或预防与替代途径补体激活相关的病症。在一些实施方案中，所述病症选自由以下组成的组：非典型溶血性尿毒综合征(aHUS)、阵发性夜间血红蛋白尿症(PNH)、年龄相关性黄斑变性(AMD)、膜性增生性肾小球肾炎(MPGN)和IgA肾病。
在一些实施方案中，本发明提供了一种本文公开的抗体或片段中的任一种、本文公开的核酸中的任一种、或本文公开的载体中的任一种用于制备用以治疗、减轻或预防与替代途径补体激活相关的病症的药物的用途。在一些实施方案中，所述病症选自由以下组成的组：非典型溶血性尿毒综合征(aHUS)、阵发性夜间血红蛋白尿症(PNH)、年龄相关性黄斑变性(AMD)、膜性增生性肾小球肾炎(MPGN)和IgA肾病。
在一些实施方案中，本发明提供了一种治疗、减轻或预防与替代途径补体激活相关的病症的方法，所述方法包括向有需要的个体施用治疗有效量的本文公开的抗体或片段中的任一种、本文公开的核酸中的任一种、本文公开的载体中的任一种、或本文公开的药物组合物中的任一种。在一些实施方案中，所述病症选自由以下组成的组：非典型溶血性尿毒综合征(aHUS)、阵发性夜间血红蛋白尿症(PNH)、年龄相关性黄斑变性(AMD)、膜性增生性肾小球肾炎(MPGN)和IgA肾病。
在一些实施方案中，本发明提供了一种抑制替代补体激活的方法，所述方法包括向受试者施用本文公开的抗体或片段中的任一种、本文公开的核酸中的任一种、本文公开的载体中的任一种、或本文公开的药物组合物中的任一种。
在一些实施方案中，本发明提供了一种产生本文公开的抗体或片段中的任一种的方法，所述方法包括向细胞提供本文公开的核酸中的任一种或本文公开的载体中的任一种，以及允许所述细胞翻译所述核酸或所述载体包含的核酸序列，从而产生所述抗体或片段。在一些实施方案中，所述方法还包括收集、纯化和/或分离所述抗体或片段。
具体实施方式
A.一般技术和定义
除非本文另外定义，否则本文叙述的科学和技术术语应当具有本领域普通技术人员通常理解的含义。一般来说，本文所述的结合药理学、细胞和组织培养、分子生物学、细胞和癌症生物学、神经生物学、神经化学、病毒学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学使用的命名和技术是本领域中众所周知而且常用的。在矛盾的情况下，应当以本说明书(包括定义)为准。
除非另外指示，否则本发明的实践将采用常规分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学技术，这些技术在本领域技术人员的能力范围内。此类技术充分阐明于文献中，诸如Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版(Sambrook等,1989)Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编,1984)；Methods in Molecular Biology,Humana Press；Cell Biology:A LaboratoryNotebook(J.E.Cellis编,1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney编,1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather和P.E.Roberts,1998)Plenum Press；Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths和D.G.Newell编,1993-1998)J.Wiley and Sons；Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller和M.P.Calos编,1987)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等编,1987)；PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis等编,1994)；Sambrook和Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,NY(2001)；Ausubel等,Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons,NY(2002)；Harlow和Lane Using Antibodies:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(1998)；Coligan等,Short Protocols in Protein Science,John Wiley&Sons,NY(2003)；ShortProtocols in Molecular Biology(Wiley and Sons,1999)。
酶促反应和纯化技术是如本领域通常所实施或如本文所述根据制造商的说明书来进行。结合本文所述的分析化学、生物化学、免疫学、分子生物学、合成有机化学以及医学和制药化学使用的命名法以及实验室程序和技术是本领域中众所周知而且常用的。使用标准技术进行化学合成和化学分析。
贯穿本说明书和实施方案，词语“包含(comprise)”或变化形式(诸如“comprises”或“comprising”)应当理解为隐含包括所陈述的整数或整数组，但不排除任何其他整数或整数组。
应当理解，在本文以措辞“包含”描述实施方案的情况下，还提供了以“由……组成”和/或“基本上由……组成”描述的其他类似实施方案。
使用术语“包括”意指“包括但不限于”。“包括”与“包括但不限于”可互换使用。
在术语“例如(e.g.或for example)”之后的任何实例都不希望为穷举的或限制性的。
除非上下文另有要求，否则单数术语将包括复数，并且复数术语将包括单数。
冠词“一个”在本文用于指一个或多于一个(即，至少一个)该冠词的语法受词。举例来说，“一个要素”意指一个要素或多于一个要素。
“治疗”疾患或患者是指采取诸多步骤以获得有益或所希望的结果，包括临床结果。就疾病或疾患(例如眼病)而言，治疗是指由施用一种或多种疗法(包括但不限于一种或多种预防剂或治疗剂)而减轻或改善感染(例如眼病或与之相关的症状)的进展、严重程度和/或持续时间，或者改善一种或多种症状。
如本文所使用，术语“对……特异”和“特异性结合”或“能够特异性结合”是指抗体与其表位之间的非共价相互作用。它指示所述抗体或片段优先结合至所述表位而非其他结合位点或其他抗原。因此，尽管所述抗体或片段可能非特异性结合至其他结合位点或抗原，但所述抗体或片段对其表位的结合亲和力显著高于所述抗体或片段对任何其他结合位点或抗原的结合亲和力。
氨基酸序列或核酸序列的同一性百分比或术语“序列同一性％”在本文定义为在比对两个序列并且在必要时引入空位以实现最大同一性百分比之后氨基酸序列或核酸序列全长上与参考氨基酸序列或核酸序列中的残基同一的残基的百分比。用于比对的方法和电脑程序在本领域中是众所周知的，例如“Align 2”。
如本文所使用，“FH.07”是指包含SEQ ID NO:32的可变轻链氨基酸序列和SEQ IDNO:36的可变重链氨基酸序列的抗体。
如本文所使用，“FHR-1.3B4”是指包含SEQ ID NO:48的可变轻链氨基酸序列和SEQID NO:52的可变重链氨基酸序列的抗体。
在如本文所示的氨基酸序列中，氨基酸由单字母符号表示。这些单字母符号和三字母符号对本领域技术人员是众所周知的，并且具有以下含义：A(Ala)是丙氨酸，C(Cys)是半胱氨酸，D(Asp)是天冬氨酸，E(Glu)是谷氨酸，F(Phe)是苯丙氨酸，G(Gly)是甘氨酸，H(His)是组氨酸，I(Ile)是异亮氨酸，K(Lys)是赖氨酸，L(Leu)是亮氨酸，M(Met)是甲硫氨酸，N(Asn)是天冬酰氨酸，P(Pro)是脯氨酸，Q(Gln)是谷氨酰胺，R(Arg)是精氨酸，S(Ser)是丝氨酸，T(Thr)是苏氨酸，V(Val)是缬氨酸，W(Trp)是色氨酸，Y(Tyr)是酪氨酸。
术语“增强FH活性”意指FH的活性在根据本发明的抗体或片段结合至FH时增加。在一些实施方案中，通过本发明的抗体和片段增强的FH活性是抑制替代补体激活，诸如在个体中。如本文所使用，术语“替代补体激活”是指经由替代途径激活补体系统，即，至少涉及替代途径的C3转化酶(即，C3bBb/C3bBbP)的形成，或涉及增加这种C3转化酶的形成。替代补体激活还可能涉及通过替代途径C3转化酶将C3切割为C3a和C3b、形成替代途径C5转化酶(即，C3bBbC3b/C3bBbC3bP)和/或切割C5以及随后结合C6、C7、C8和C9以形成MAC。替代补体激活还可以包括替代途径扩增环增加。
在一些实施方案中，本文公开的抗体或片段中的任一种都能够抑制本文公开的替代补体激活过程中的任一个或多个。在一些实施方案中，替代补体激活在个体中(例如在个体的体液，诸如血液、间质液或脑脊髓液中)受到抑制。如本文所使用，术语“个体”与“受试者”或“患者”可互换使用，并且是指包含补体系统作为其免疫系统的一部分的人或动物，诸如哺乳动物(例如，嚙齿动物、猿、马、牛、猪、狗、猫)。在一些实施方案中，个体是哺乳动物。在一些实施方案中，哺乳动物是人。
如本文所使用，“抑制替代补体激活”包括引起或作为其抑制之结果的对替代补体系统组分、因子或活性的量或活性的任何改变。举例来说，抑制替代补体激活包括抑制溶血活性、抑制受试者细胞上的补体组分3(C3)沉积、增加FH与C3b、iC3b和/或C3d结合、抑制替代补体途径C3转化酶C3bBb/C3bBbP形成、抑制因子B与C3b结合和/或抑制C3b与因子B之间的相互作用、抑制替代途径C3转化酶将C3切割为C3a和C3b、增加FH与宿主细胞(具体来说，与宿主细胞上表达的唾液酸、糖胺聚糖和/或肝素)结合、抑制替代补体途径扩增环以及抑制替代补体途径C5转化酶C3bBbC3bP/C3bBbC3bP形成、抑制替代途径C5转化酶将C5切割为C5a和C5b、增加FH的衰退加速活性(即，在替代途径C3转化酶形成后促进其解离)，和/或增加FI辅因子活性从而引起C3b降解。在特定实施方案中，通过本发明的抗FH抗体和片段增强的FH抑制替代补体激活包括抑制溶血活性、抑制受试者细胞上的C3沉积和/或增加FH与C3b、iC3b和/或C3d的结合。
如本文所使用，“抑制”优选地意指指定活性降低至少约25％、至少约50％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％。因此，“抑制替代补体激活”意指替代补体途径的活性降低至少约25％、至少约50％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％。类似地，“抑制溶血活性”意指溶血活性降低至少约25％、至少约50％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％。
如本文所使用，“增加”优选地意指指定活性增加至少约25％、至少约50％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％。因此，“增加FH与C3b结合”意指FH与C3b结合增加至少约25％、至少约50％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％。类似地，“增加FH与宿主细胞结合”意指FH与宿主细胞结合增加至少约25％、至少约50％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％、至少约300％、至少约350％、至少约400％、至少约450％、至少约500％、至少约550％、至少约600％、至少约700％、至少约800％、至少约900％或至少约1000％。
如本文所使用，“溶血活性”是指优选地由于细胞表面上的MAC形成而导致红细胞破裂以及随后例如由补体系统激活诱导细胞内含物释放至循环中。举例来说，如本文在实施例中所述，通过使用如Sanchez-Corral等,(2004)和Wouters等,(2008)所述的溶血测定法来测量溶血活性，任选地进行一些修改。在这种代表性非限制性测定法中，将诸如绵羊红细胞(SRBC)等红细胞与血清(例如人血清)一起例如在37℃下在振荡的同时孵育1.25小时。具有低水平FH或功能障碍FH的血清引起SRBC溶解。可以通过加入含有20mM EDTA的佛罗那缓冲液(veronal buffer)，然后在预冷却离心机(例如7℃)中离心2.5分钟来终止溶解。通过在412nm下测量上清液的吸光度来测定红细胞溶解百分比。血清可以例如来自健康人类个体或罹患与不需要或过度替代途径补体激活相关的病症(诸如aHUS)的人类个体。可以通过将红细胞与血清一起在抗体或片段存在下孵育来测定抗体或片段抑制溶血活性的能力。
“结合亲和力”是指抗体或功能部分或功能等效物的单个结合位点与其结合伴侣(例如抗原)之间的非共价相互作用总和的强度。除非另外指示，否则如本文所使用，“结合亲和力”是指反映结合对的成员(本申请中的抗体与抗原)之间的1:1相互作用的固有结合亲和力。结合亲和力在本文由平衡解离常数(KD)表示，它计算为ka与kd比率，参见例如Chen,Y.等,1999。可以通过本领域中已知的常用方法来测量亲和力，诸如表面等离子体共振(SPR)测定法，诸如BiaCore(GE Healthcare Life Sciences GE Healthcare LifeSciences)或IBIS Technologies BV(荷兰亨格罗)等IBIS-iSPR仪器，或溶液相测定法，诸如Kinexa。
B.抗FH抗体及其片段
WO 2016/028150描述了一种鼠激动性抗FH抗体，称为FH.07，它抑制替代途径激活，如FH与C3b结合增加、抑制介导的C3沉积和抑制溶血活性所示。抗体的Fab'和F(ab')2片段显示具有相同的FH增强作用。WO2019/139481描述了另一种鼠激动性抗FH抗体，称为FHR-1.3B4，它对FH的结合亲和力高于FH.07而且增强FH活性的能力有所增强。
在一个方面，本发明提供了激动性抗FH抗体(例如人源化抗体)及其片段，即，增强FH活性的抗体和片段。在一个方面，这些抗体与抗体FH.07或抗体FHR-1.3B4竞争结合至FH的结构域CCP18中的相同表位。增强型抗FH抗体是替代补体途径激活的有效抑制剂，并且因此可用于治疗与不需要或过度补体系统替代途径激活相关的病症。FH特异性抑制替代途径扩增环，其中C3切割成C3b，其随后在细胞表面结合至FB，并且形成C3转化酶促进了其他C3分子切割成C3b。本发明的抗体和片段在C3层面上干扰补体激活这一事实的主要优势为避免了C3b在表面上积累和C3a释放。相反，如果在C5层面上抑制补体激活，诸如用依库珠单抗，则不会抑制C3b积累和C3a释放。C3b充当调理蛋白，而C3a是过敏毒素。因此优选地防止C3b积累和C3a形成，因为这些过程导致了免疫细胞的吸引和靶标的调理吞噬。这意味着例如接受依库珠单抗的PNH患者仍然需要输血，因为C3b积累会引起红细胞的调理，红细胞随后在肝脏和脾脏中被清除。此外，用抗C5抗体处理导致了细胞上C3b积累和C3a形成，否则这些细胞将会被MAC溶解。抗C5抗体的一个重要缺点是患者变得容易感染，这是因为抗体还干扰由病原体诱导的补体激活。这可以通过靶向保护宿主细胞的补体系统调控剂来避免。
如本文所使用，术语“抗体”是指至少包含与轻链可变区(VL)配对的重链可变区(VH)并且对靶表位特异的免疫球蛋白。该术语涵盖多克隆和单克隆抗体。它是指特异性结合至FH的CCP18的任何形式的抗体，包括全长免疫球蛋白。根据本发明的抗体或其片段包含至少一个抗原结合位点。如本文所使用，术语“抗原结合位点”是指抗体或其片段中包含至少一个CDR序列、优选地至少两个CDR序列、更优选地至少三个CDR序列的位点。举例来说，抗原结合位点包含轻链CDR 1-3或重链CDR 1-3。在一些实施方案中，抗原结合位点包含轻链CDR 1-3和重链CDR 1-3。
如本领域技术人员众所周知，抗体含有两个重链和两个轻链。抗体的重链是构成免疫球蛋白分子的两种类型链中较大的一种。重链包含恒定域和可变域，所述可变域参与抗原结合。抗体的轻链是构成免疫球蛋白分子的两种类型链中较小的一种。轻链包含恒定域和可变域。轻链的可变域通常但并不总是与重链的可变域一起参与抗原结合。互补决定区(CDR)是重链可变域和轻链可变域中存在的高变区。在全长抗体的情况下，重链CDR 1-3和所连接的轻链CDR 1-3共同形成抗原结合位点。
CDR参与抗原结合并赋予抗原特异性和对抗体的结合亲和力。重链和轻链的各个可变域中存在三个CDR，分别命名为各个可变域的CDR1、CDR2和CDR3。如本文所使用，术语“CDR集”是指能够结合靶抗原的单个重链或轻链可变域中存在的三个CDR的组。已经根据不同的系统不同地定义了这些CDR的确切边界。三个重链CDR可以称为CDRH1、CDRH2和CDRH3，而三个轻链CDR可以称为CDRL1、CDRL2和CDRL3。
“抗体的抗原结合片段”在本文定义为抗体中能够特异性结合与所述抗体结合的抗原相同的抗原(例如FH的CCP18)但未必达到相同程度的部分。此外，FH活性增强抗体的片段也增强FH活性，但未必达到相同程度。此外，FH活性抑制抗体的片段也抑制FH活性，但未必达到相同程度。在一些实施方案中，根据本发明的抗体片段包含抗体(例如，本文公开的抗体中的任一种)的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，而且在一些实施方案中还包含抗体的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。抗体片段的非限制性实例有单结构域抗体、单链抗体、纳米抗体、单功能抗体、单链可变片段(scFv)、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段和F(ab)2片段。在一些实施方案中，抗体片段至少包含重链可变域(VH)和/或轻链可变域(VL)。在一些实施方案中，片段至少包含Fab片段。在一些实施方案中与本发明的抗体竞争结合至相同表位的增强型抗FH抗体FH.07或抗体FHR-1.3B4的Fab'片段已经显示保留了增强FH功能的能力。在一些实施方案中，本发明抗体的片段因此是根据本发明的抗体的Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段或F(ab)2片段。在另一个实施方案中，根据本发明的抗体的片段包含免疫球蛋白重链可变区、免疫球蛋白重链恒定区、免疫球蛋白轻链可变区和免疫球蛋白轻链恒定区。
在一些实施方案中，根据本发明的抗体和片段能够增强FH(诸如人FH)的活性。
在一些实施方案中，使用C3沉积测定法，诸如本文在实施例中所述的C3沉积测定法来测量对C3沉积的抑制。这种代表性非限制性测定法包括用LPS涂覆微量滴定板。随后在存在或不存在抗体或片段的情况下将板与例如来自健康个体或者罹患与如上指出的不需要或过度替代补体激活相关的病症的个体的血清一起孵育。可以用抗C3抗体检测LPS上的C3沉积。
在一些实施方案中，使用如本文在实施例中所述的ELISA来测量FH与C3b结合的增加。这种代表性非限制性测定法包括用C3b涂覆微量ELISA板并且将板与例如来自健康个体或者罹患与如上指出的不需要或过度替代补体激活相关的病症的个体的血清一起孵育。可以用抗FH抗体(诸如过氧化物酶标记的多克隆抗FH)检测结合的FH。可以通过在与涂覆的C3b一起孵育之前在抗体或片段存在下预孵育血清来测定抗体或片段增强FH与C3b结合的能力。作为另一个实例，可以使用表面等离子体共振(SPR)来测定FH与C3b的结合，例如，如本文在实施例中所述。SPR是在无标签环境中实时测量生物分子相互作用的技术。将相互作用物之一(例如C3b)固定至传感器表面，并且例如在存在或不存在(不同浓度的)本发明抗体或片段的情况下使另一种相互作用物(例如FH)在溶液中游离并通过表面上。在一些实施方案中，根据本发明的抗体或其片段使体外FH对C3b的结合亲和力增加(使KD值降低)到至多2μM、至多1.95μM、至多1.8μM、至多1.7μM和/或使体外FH对C3b的结合亲和力增加至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍、至少5倍、至少5.5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、或至少10倍。在特定实施方案中，根据本发明的抗体或其片段使体外FH对C3b的结合亲和力(KD)增加至低于1μM、低于750nM、低于500nM、低于300nM或低于250nM。在特定实施方案中，根据本发明的抗体或其片段使体外FH对C3b的结合亲和力(KD)增加至介于250nM与1μM之间。在特定实施方案中，根据本发明的抗体或其片段使体外FH对C3b的结合亲和力增加至少3至5倍。
在一些实施方案中，本发明提供的抗体或其片段在一种或多种功能测定法中具有低体外IC50值，诸如在一些实施方案中，就相同功能测定法而言，其体外IC50值低于抗体FH.07或抗体FHR-1.3B4的体外IC50值。“IC50”是本领域中众所周知的术语，并且是指抑制或降低某种功能活性达50％所必需的抗体或片段浓度。抗体或片段的IC50值越低，抗体或片段的抑制活性越强，并且它作为治疗剂的潜能越大。在一些实施方案中，功能测定法是如本文在上文所述的C3b沉积测定法和/或溶血测定法。在一些实施方案中，根据本发明的抗体或其片段在存在10％(v/v)正常人血清时抑制体外LPS上的C3沉积，IC50值是38nM或更低、35nM或更低、32nM或更低、30nM或更低、28nM或更低、27nM或更低、25nM或更低、23nM或更低、20nM或更低、18nM或更低、15nM或更低、或者10nM或更低。在一些实施方案中，根据本发明的抗体或其片段在存在10％(v/v)正常人血清时抑制体外LPS上的C3沉积，IC50值介于15nM与30nM之间。在一些实施方案中，根据本发明的抗体或其片段在存在10％(v/v)正常人血清时抑制体外溶血活性，IC50值是150nM或更低、130nM或更低、120nM或更低、115nM或更低、110nM或更低、105nM或更低、100nM或更低、95nM或更低、90nM或更低、85nM或更低、80nM或更低、75nM或更低、70nM或更低、65nM或更低、或者60nM或更低。在一些实施方案中，根据本发明的抗体或其片段在存在10％(v/v)正常人血清时抑制体外溶血活性，IC50值介于60nM与80nM之间。
在一些实施方案中，本发明的抗体或片段在存在10％(v/v)正常人血清时以如本文所述的低IC50值抑制体外LPS上的C3沉积，且在存在10％(v/v)正常人血清时以如本文在上文所述的低IC50值抑制体外溶血活性。在一些实施方案中，根据本发明的抗体或片段在存在10％(v/v)正常人血清时以38nM或更低的IC50值抑制体外LPS上的C3沉积并且在存在10％(v/v)正常人血清时以150nM或更低的IC50值抑制体外溶血活性，在存在10％(v/v)正常人血清时以30nM或更低的IC50值抑制体外LPS上的C3沉积并且在存在10％(v/v)正常人血清时以150nM或更低的IC50值抑制体外溶血活性，或者在存在10％(v/v)正常人血清时以27nM或更低的IC50值抑制体外LPS上的C3沉积并且在存在10％(v/v)正常人血清时以100nM或更低的IC50值抑制体外溶血活性。在一些实施方案中，在如本文在上文所述的C3沉积测定法中测定存在10％(v/v)正常人血清时体外LPS上的C3沉积的IC50值。在一些实施方案中，在如本文在上文所述的溶血活性测定法中测定溶血活性的IC50值。
在一些实施方案中，本发明提供的抗体或其片段对FH和/或包含结构域CCP18-20的FH片段具有高结合亲和力，诸如在一些实施方案中，比抗体FH.07或抗体FHR-1.3B4的结合亲和力高的结合亲和力。在一些实施方案中，抗体或片段的体内治疗活性典型地需要高结合亲和力，例如，以便使所述抗体或片段与结合位点和/或除其特异性表位或抗原以外的抗原的结合最小化，并且使需要施用体内的抗体或片段的量最小化。在一些实施方案中，具有高结合亲和力的抗体是优选的。在一些实施方案中，抗体或其片段对FH的结合亲和力以解离常数(KD)计为2.5×10-8M或更低和/或对包含CCP18-20的FH片段的结合亲和力以KD计为0.1×10-9M或更低。在一个实施方案中，本发明因此提供了一种分离的合成或重组抗体或其抗原结合片段，其特异性结合至因子H(FH)并增强FH活性，其中所述抗体对FH的结合亲和力以KD计为2.5×10-8M或更低和/或对包含CCP18-20的FH片段的结合亲和力以KD计为0.1×10-9M或更低。在一些实施方案中，根据本发明的抗体或片段对FH的结合亲和力以KD计为22.5nM或更低、20nM或更低、17.5nM或更低、15nM或更低、12.5nM或更低、10nM或更低、9nM或更低、8nM或更低、7nM或更低、6nM或更低、5nM或更低、4nM或更低、3nM或更低、2nM或更低、1nM或更低、0.9nM或更低、0.8nM或更低、0.7nM或更低、或者0.6nM或更低。在一些实施方案中，根据本发明的抗体或片段对包含CCP18-20的FH片段的结合亲和力以KD计为0.09×10-9M或更低、0.08×10-9M或更低、0.07×10-9M或更低、0.06×10-9M或更低、0.05×10-9M或更低、0.04×10-9M或更低、0.03×10-9M或更低、0.02×10-9M或更低、1×10-11M或更低、0.9×10-11M或更低、0.8×10-11M或更低、0.7×10-11M或更低、或者0.6×10-11M或更低。在一些实施方案中，抗体或其片段对FH的结合亲和力以KD计为1.25×10-8M或更低和/或对包含CCP18-20的FH片段的结合亲和力以KD计为0.04×10-9M或更低。在一些实施方案中，抗体或其片段对FH的结合亲和力以KD计为0.6×10-8M或更低和/或对包含CCP18-20的FH片段的结合亲和力以KD计为0.6×10-11M或更低。在一些实施方案中，使用表面等离子体共振(SPR)，诸如在如本文所述的测定法中使用SPR，即，在通过在ProtA芯片上俘获所述抗体或片段，然后使全长FH(用于对FH的结合亲和力)或包含结构域18-20的FH片段(用于对CCP18-20的结合亲和力)在表面上流动来进行SPR从而测定结合亲和力的测定法中测定结合亲和力。
在一些实施方案中，本发明提供的抗体或其片段增加了FH与C3b的相互作用。在一些实施方案中，抗体或其片段增加了FH对C3b的结合亲和力，其中解离常数(KD)为2μM或更低。在一些实施方案中，根据本发明的抗体或片段增加了对C3b的结合亲和力，其中KD为2μM或更低、1.5μM或更低、1μM或更低、500nM或更低、400nM或更低、或者300nM或更低。在一些实施方案中，根据本发明的抗体或片段使体外FH对C3b的结合亲和力增加(使KD降低)了至少2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍或5倍。
在一些实施方案中，根据本发明的抗体或片段具有高结合亲和力并且以低IC50值抑制体外LPS上的C3沉积和/或以低IC50值抑制体外溶血活性。在一些实施方案中，根据本发明的抗体或片段对FH的结合亲和力以KD计为2.5×10-8M或更低和/或对包含CCP18-20的FH片段的结合亲和力以KD计为0.1×10-9M或更低，并且在存在10％(v/v)正常人血清时以38nM或更低的IC50值抑制体外LPS上的C3沉积和/或在存在10％(v/v)正常人血清时以150nM或更低的IC50值抑制体外溶血活性。在一些实施方案中，所述抗体或片段对FH的结合亲和力以KD计为1.25×10-8M或更低(例如10nM或更低、5nM或更低、或者1nM或更低)和/或对包含CCP18-20的FH片段的结合亲和力以KD计为0.04×10-9M或更低，并且以30nM或更低的IC50值抑制体外LPS上的C3沉积并且在存在10％(v/v)正常人血清时以115nM或更低的IC50值抑制体外溶血活性。在一些实施方案中，所述抗体或片段对FH的结合亲和力以KD计为1.25×10-8M或更低(例如10nM或更低、5nM或更低、或者1nM或更低)和/或对包含CCP18-20的FH片段的结合亲和力以KD计为0.04×10-9M或更低，并且在存在10％(v/v)正常人血清时以27nM或更低的IC50值抑制体外LPS上的C3沉积并且在存在10％(v/v)正常人血清时以100nM或更低的IC50值抑制体外溶血活性。在一些实施方案中，所述抗体或片段对FH的结合亲和力以KD计为1.25×10-8M或更低(例如10nM或更低、5nM或更低、或者1nM或更低)和/或对包含CCP18-20的FH片段的结合亲和力以KD计为0.04×10-9M或更低，并且在存在10％(v/v)正常人血清时以25nM或更低的IC50值抑制体外LPS上的C3沉积并且在存在10％(v/v)正常人血清时以80nM或更低的IC50值抑制体外溶血活性。在一些实施方案中，所述抗体或片段对FH的结合亲和力以KD计为1.25×10-8M或更低(例如10nM或更低、5nM或更低、或者1nM或更低)和/或对包含CCP18-20的FH片段的结合亲和力以KD计为0.04×10-9M或更低，并且在存在10％(v/v)正常人血清时以介于15nM与25nM之间的IC50值抑制体外LPS上的C3沉积并且在存在10％(v/v)正常人血清时以介于15nM与25nM之间的IC50值抑制体外溶血活性。在一些实施方案中，如本文所述通过SPR测定结合亲和力。在一些实施方案中，在如本文在上文所述的C3沉积测定法中测定体外LPS上的C3沉积的IC50值。在一些实施方案中，在如本文在上文所述的溶血活性测定法中测定溶血活性的IC50值。
在一些实施方案中，本文公开的抗体或抗原结合片段中的任一种对FH和/或包含CCP18的FH片段的结合亲和力都高于抗体FH.07的结合亲和力。在一些实施方案中，本文公开的抗体或抗原结合片段中的任一种对FH和/或包含CCP18-20的FH片段的结合亲和力都高于抗体FH.07的结合亲和力。在一些实施方案中，本文公开的抗体或抗原结合片段中的任一种的IC50值都低于抗体FH.07的IC50值。在一些实施方案中，本文公开的抗体或抗原结合片段中的任一种都显示比抗体FH.07更大程度地抑制LPS上的C3沉积。在一些实施方案中，本文公开的抗体或抗原结合片段中的任一种都显示比抗体FH.07更大程度地抑制溶血活性。在一些实施方案中，本文公开的抗体或抗原结合片段中的任一种都与抗体FH.07竞争结合至FH的CCP18中的相同表位。在一些实施方案中，本文公开的抗体或抗原结合片段中的任一种都具有高存储能力，具体来说，与抗体FH.07相比提高的存储稳定性。在一些实施方案中，本文公开的抗体或抗原结合片段中的任一种都具有高稳定性，具体来说，与抗体FH.07相比提高的稳定性。在一些实施方案中，本文公开的抗体或抗原结合片段中的任一种都具有高选择性，具体来说，与抗体FH.07相比增加的选择性。
在一些实施方案中，本文公开的抗体或抗原结合片段中的任一种对FH和/或包含CCP18的FH片段的结合亲和力都高于抗体FHR-1.3B4的结合亲和力。在一些实施方案中，本文公开的抗体或抗原结合片段中的任一种对FH和/或包含CCP18-20的FH片段的结合亲和力都高于抗体FHR-1.3B4的结合亲和力。在一些实施方案中，本文公开的抗体或抗原结合片段中的任一种的IC50值都低于抗体FHR-1.3B4的IC50值。在一些实施方案中，本文公开的抗体或抗原结合片段中的任一种都比抗体FHR-1.3B4更大程度地抑制LPS上的C3沉积。在一些实施方案中，本文公开的抗体或抗原结合片段中的任一种都显示比抗体FHR-1.3B4更大程度地抑制溶血活性。在一些实施方案中，本文公开的抗体或抗原结合片段中的任一种都与抗体FHR-1.3B4竞争结合至FH的CCP18中的相同表位。在一些实施方案中，本文公开的抗体或抗原结合片段中的任一种都具有高存储能力，具体来说，与抗体FHR-1.3B4相比提高的存储稳定性。在一些实施方案中，本文公开的抗体或抗原结合片段中的任一种都具有高稳定性，具体来说，与抗体FHR-1.3B4相比提高的稳定性。在一些实施方案中，本文公开的抗体或抗原结合片段中的任一种都具有高选择性，具体来说，与抗体FHR-1.3B4相比增加的选择性。
在一些实施方案中，本发明提供的抗体或其片段与抗体抗FH.07竞争结合至FH，具体来说，结合至FH的CCP18结构域。
表1列出了本发明的示例性抗体。根据IMGT编号系统(Lefranc 1997；Lefranc1999；和Lefranc等,2003)对CDR序列进行编号。LC＝轻链，HC＝重链，CDR＝互补决定区，VH＝重链可变区，VL＝轻链可变区。
表1：抗体1至抗体4、FH.07和FHR-1.3B4的氨基酸和核苷酸序列
在一些实施方案中，本发明提供了一种分离的合成或重组抗体或其抗原结合片段，其特异性结合至因子H(FH)的补体控制蛋白结构域18(CCP18)，所述抗体或片段包含表1中公开的抗体的VH和VL序列的根据Kabat(参见Kabat等,(1991)Sequences of Proteinsof Immunological Interest,NIH出版物第91-3242号,Bethesda)、Chothia(参见例如Chothia C和Lesk AM,(1987),J.Mol.Biol.196:901-917)、MacCallum(参见MacCallum R M等,(1996)J.Mol.Biol.262:732-745)或本领域中已知的任何其他CDR确定方法确定的重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，根据本发明的抗体是抗体1。表1提供了抗体1的可变重链和轻链序列以及个别CDR序列的概述。在一些实施方案中，所述抗体或片段包含抗体1的重链CDR序列中的至少一个、两个或三个。在一些实施方案中，所述抗体或片段包含抗体1的轻链CDR序列中的至少一个、两个或三个。如本文使用的术语“抗体1”涵盖至少包括如表1中所示的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3区的所有抗体和片段，诸如分离和/或纯化的抗体或重组产生的抗体。在一些实施方案中，抗体1与抗体FH.07或抗体FHR-1.3B4竞争结合至FH的CCP18中的相同表位。
在一些实施方案中，根据本发明的抗体是抗体2。表1提供了抗体2的可变重链和轻链序列以及个别CDR序列的概述。在一些实施方案中，所述抗体或片段包含抗体2的重链CDR序列中的至少一个、两个或三个。在一些实施方案中，所述抗体或片段包含抗体2的轻链CDR序列中的至少一个、两个或三个。如本文使用的术语“抗体2”涵盖至少包括如表1中所示的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3区的所有抗体和片段，诸如分离和/或纯化的抗体或重组产生的抗体。在一些实施方案中，抗体2与抗体FH.07或抗体FHR-1.3B4竞争结合至FH的CCP18中的相同表位。
在一些实施方案中，根据本发明的抗体是抗体3。表1提供了抗体3的可变重链和轻链序列以及个别CDR序列的概述。在一些实施方案中，所述抗体或片段包含抗体3的重链CDR序列中的至少一个、两个或三个。在一些实施方案中，所述抗体或片段包含抗体3的轻链CDR序列中的至少一个、两个或三个。如本文使用的术语“抗体3”涵盖至少包括如表1中所示的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3区的所有抗体和片段，诸如分离和/或纯化的抗体或重组产生的抗体。在一些实施方案中，抗体3与抗体FH.07或抗体FHR-1.3B4竞争结合至FH的CCP18中的相同表位。
在一些实施方案中，根据本发明的抗体是抗体4。表1提供了抗体4的可变重链和轻链序列以及个别CDR序列的概述。在一些实施方案中，所述抗体或片段包含抗体4的重链CDR序列中的至少一个、两个或三个。在一些实施方案中，所述抗体或片段包含抗体4的轻链CDR序列中的至少一个、两个或三个。如本文使用的术语“抗体4”涵盖至少包括如表1中所示的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3区的所有抗体和片段，诸如分离和/或纯化的抗体或重组产生的抗体。在一些实施方案中，抗体4与抗体FH.07或抗体FHR-1.3B4竞争结合至FH的CCP18中的相同表位。
在一些实施方案中，本发明提供了一种分离的合成或重组抗体或其抗原结合片段，其特异性结合至因子H(FH)的补体控制蛋白结构域18(CCP18)并且包含：
-轻链CDR1序列，其具有序列SSVTY(SEQ ID NO:1)或序列TSVTY(SEQ ID NO:13)；
-轻链CDR2序列，其具有序列ATS(SEQ ID NO:2)或序列ASS(SEQ ID NO:14)；
-轻链CDR3序列，其具有序列QHRSSSNPLT(SEQ ID NO:3)；
-重链CDR1，其具有序列GFSLTNYG(SEQ ID NO:5)；
-重链CDR2，其具有序列VWSGGTT(SEQ ID NO:6)或序列IWSGGTT(SEQ ID NO:10)；和/或
-重链CDR3序列，其具有序列ARNFGNYAMDY(SEQ ID NO:7)或序列ARNFGNYAMDF(SEQID NO:11)；和/或
-上述的任何组合。
在一个特定实施方案中，所述抗体或片段包含：
-轻链CDR1序列，其具有序列SSVTY(SEQ ID NO:1)；
-轻链CDR2序列，其具有序列ATS(SEQ ID NO:2)；
-轻链CDR3序列，其具有序列QHRSSSNPLT(SEQ ID NO:3)；
-重链CDR1序列，其具有序列GFSLTNYG(SEQ ID NO:5)；
-重链CDR2，其具有序列VWSGGTT(SEQ ID NO:6)；以及
-重链CDR3序列，其具有序列ARNFGNYAMDY(SEQ ID NO:7)。在一个特定实施方案中，所述抗体或片段包含：
-轻链CDR1序列，其具有序列SSVTY(SEQ ID NO:1)；
-轻链CDR2序列，其具有序列ATS(SEQ ID NO:2)；
-轻链CDR3序列，其具有序列QHRSSSNPLT(SEQ ID NO:3)；
-重链CDR1序列，其具有序列GFSLTNYG(SEQ ID NO:5)；
-重链CDR2，其具有序列IWSGGTT(SEQ ID NO:10)；以及
-重链CDR3序列，其具有序列ARNFGNYAMDF(SEQ ID NO:11)。在一个特定实施方案中，所述抗体或片段包含：
-轻链CDR1序列，其具有序列TSVTY(SEQ ID NO:13)；
-轻链CDR2序列，其具有序列ASS(SEQ ID NO:14)；
-轻链CDR3序列，其具有序列QHRSSSNPLT(SEQ ID NO:3)；
-重链CDR1序列，其具有序列GFSLTNYG(SEQ ID NO:5)；
-重链CDR2，其具有序列VWSGGTT(SEQ ID NO:6)；以及
-重链CDR3序列，其具有序列ARNFGNYAMDY(SEQ ID NO:7)。在一特定实施方案中，所述抗体或片段包含：
-轻链CDR1序列，其具有序列TSVTY(SEQ ID NO:13)；
-轻链CDR2序列，其具有序列ASS(SEQ ID NO:14)；
-轻链CDR3序列，其具有序列QHRSSSNPLT(SEQ ID NO:3)；
-重链CDR1序列，其具有序列GFSLTNYG(SEQ ID NO:5)；
-重链CDR2，其具有序列IWSGGTT(SEQ ID NO:10)；以及
-重链CDR3序列，其具有序列ARNFGNYAMDF(SEQ ID NO:11)。
在一些实施方案中，所述抗体或片段增强了FH活性，诸如抑制替代补体激活，诸如抑制溶血活性、抑制补体组分3(C3)沉积，和/或增加FH与C3b、iC3b和/或C3d的结合。在一些实施方案中，所述片段至少包含重链可变域(VH)和/或轻链可变域(VL)。在一些实施方案中，片段至少包含Fab片段。
在一些实施方案中，所述抗体或片段对FH的结合亲和力以KD计为2.5×10-8M或更低和/或对包含CCP18-20的FH片段的结合亲和力以KD计为0.1×10-9M或更低，诸如对FH的结合亲和力以KD计为1.25×10-8M或更低和/或对包含CCP18-20的FH片段的结合亲和力以KD计为0.04×10-9M或更低的抗体或片段。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种分离的合成或重组抗体或其抗原结合片段，其特异性结合至FH的CCP18并且包含：轻链CDR1序列，其具有序列SSVTY(SEQ ID NO:1)；轻链CDR2序列，其具有序列ATS(SEQ ID NO:2)；和轻链CDR3，其具有序列QHRSSSNPLT(SEQID NO:3)；重链CDR1，其具有序列GFSLTNYG(SEQ ID NO:5)；重链CDR2，其具有序列VWSGGTT(SEQ ID NO:6)；以及重链CDR3序列，其具有序列ARNFGNYAMDY(SEQ ID NO:7)。在一个实施方案中，所述抗体或片段包含可变轻链序列，所述可变轻链序列包含与序列SEQ ID NO:4具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述抗体包含可变重链序列，所述可变重链序列包含与序列SEQ ID NO:8具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一特定实施方案中，所述抗体或片段包括包含SEQ ID NO:4的序列的可变轻链序列和包含SEQ ID NO:8的序列的可变重链序列。在一些实施方案中，所述抗体或片段增强了FH活性，诸如抑制替代补体激活，诸如抑制溶血活性、抑制补体组分3(C3)沉积，和/或增加FH与C3b、iC3b和/或C3d的结合。在一些实施方案中，所述片段至少包含重链可变域(VH)和/或轻链可变域(VL)。在一些实施方案中，所述片段至少包含Fab片段。
在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的合成或重组抗体或其抗原结合片段，其特异性结合至FH的CCP18并且包含：轻链CDR1序列，其具有序列SSVTY(SEQ ID NO:1)；轻链CDR2序列，其具有序列ATS(SEQ ID NO:2)；和轻链CDR3，其具有序列QHRSSSNPLT(SEQID NO:3)；重链CDR1，其具有序列GFSLTNYG(SEQ ID NO:5)；重链CDR2，其具有序列IWSGGTT(SEQ ID NO:10)；以及重链CDR3序列，其具有序列ARNFGNYAMDF(SEQ ID NO:11)。在一个实施方案中，所述抗体或片段包含可变轻链序列，所述可变轻链序列包含与序列SEQ ID NO:4具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述抗体或片段包含可变重链序列，所述可变重链序列包含与序列SEQ ID NO:12具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一特定实施方案中，所述抗体或片段包括包含SEQ ID NO:4的序列的可变轻链序列和包含SEQ ID NO:12的序列的可变重链序列。在一些实施方案中，所述抗体或片段增强了FH活性，抑制替代补体激活，诸如抑制溶血活性、抑制补体组分3(C3)沉积，和/或增加FH与C3b、iC3b和/或C3d的结合。在一些实施方案中，所述片段至少包含重链可变域(VH)和/或轻链可变域(VL)。在一些实施方案中，所述片段至少包含Fab片段。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种分离的合成或重组抗体或其抗原结合片段，其特异性结合至FH的CCP18并且包含：轻链CDR1序列，其具有序列TSVTY(SEQ ID NO:13)；轻链CDR2序列，其具有序列ASS(SEQ ID NO:14)；和轻链CDR3，其具有序列QHRSSSNPLT(SEQ ID NO:3)；重链CDR1，其具有序列GFSLTNYG(SEQ ID NO:5)；重链CDR2，其具有序列VWSGGTT(SEQ ID NO:6)；和重链CDR3序列，其具有序列ARNFGNYAMDY(SEQ ID NO:7)。在一个实施方案中，所述抗体或片段包含可变轻链序列，所述可变轻链序列包含与序列SEQ IDNO:16具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述抗体或片段包含可变重链序列，所述可变重链序列包含与序列SEQ ID NO:8具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一特定实施方案中，所述抗体或片段包括包含SEQ ID NO:16的序列的可变轻链序列和包含SEQ ID NO:8的序列的可变重链序列。在一些实施方案中，所述抗体或片段增强了FH活性，诸如抑制替代补体激活，诸如抑制溶血活性、抑制补体组分3(C3)沉积，和/或增加FH与C3b、iC3b和/或C3d的结合。在一些实施方案中，所述片段至少包含重链可变域(VH)和/或轻链可变域(VL)。在一些实施方案中，所述片段至少包含Fab片段。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种分离的合成或重组抗体或其抗原结合片段，其特异性结合至FH的CCP18并且包含：轻链CDR1序列，其具有序列TSVTY(SEQ ID NO:13)；轻链CDR2序列，其具有序列ASS(SEQ ID NO:14)；和轻链CDR3，其具有序列QHRSSSNPLT(SEQ ID NO:3)；重链CDR1，其具有序列GFSLTNYG(SEQ ID NO:5)；重链CDR2，其具有序列IWSGGTT(SEQ ID NO:10)；和重链CDR3序列，其具有序列ARNFGNYAMDF(SEQ ID NO:11)。在一个实施方案中，所述抗体或片段包含可变轻链序列，所述可变轻链序列包含与序列SEQ IDNO:16具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述抗体或片段包含可变重链序列，所述可变重链序列包含与序列SEQ ID NO:12具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。在一特定实施方案中，所述抗体或片段包括包含SEQ ID NO:16的序列的可变轻链序列和包含SEQ ID NO:12的序列的可变重链序列。在一些实施方案中，所述抗体或片段增强了FH活性，诸如抑制替代补体激活，诸如抑制溶血活性、抑制补体组分3(C3)沉积，和/或增加FH与C3b、iC3b和/或C3d的结合。在一些实施方案中，所述片段至少包含重链可变域(VH)和/或轻链可变域(VL)。在一些实施方案中，所述片段至少包含Fab片段。
在一些实施方案中，本文公开的抗体或片段中的任一种对FH的结合亲和力以KD计为2.5×10-8M或更低和/或对包含CCP18-20的FH片段的结合亲和力以KD计为0.1×10-9M或更低。在一些实施方案中，所述抗体或片段对FH的结合亲和力以KD计为22.5nM或更低、20nM或更低、17.5nM或更低、15nM或更低、12.5nM或更低、10nM或更低、9nM或更低、8nM或更低、7nM或更低、6nM或更低、5nM或更低、4nM或更低、3nM或更低、2nM或更低、1nM或更低、0.9nM或更低、0.8nM或更低、0.7nM或更低、或者0.6nM或更低，和/或对包含CCP18-20的FH片段的结合亲和力以KD计为0.09×10-9M或更低、0.08×10-9M或更低、0.07×10-9M或更低、0.06×10-9M或更低、0.05×10-9M或更低、0.04×10-9M或更低、0.03×10-9M或更低、0.02×10-9M或更低、1×10-11M或更低、0.9×10-11M或更低、0.8×10-11M或更低、0.7×10-11M或更低、或者0.6×10-11M或更低。
在一些实施方案中，本文公开的抗体或片段中的任一种在存在10％(v/v)正常人血清时抑制体外LPS上的C3沉积，IC50值为38nM或更低。在一些实施方案中，所述抗体或片段在存在10％(v/v)正常人血清时抑制体外LPS上的C3沉积，IC50值为35nM或更低、32nM或更低、30nM或更低、28nM或更低、25nM或更低、23nM或更低、20nM或更低、18nM或更低、15nM或更低、或者10nM或更低。在一些实施方案中，根据本发明的抗体或其片段在存在10％(v/v)正常人血清时抑制体外LPS上的C3沉积，IC50值介于15nM与30nM之间。
在一些实施方案中，本文公开的抗体或片段中的任一种在存在10％(v/v)正常人血清时抑制体外溶血活性，IC50值为150nM或更低。在一些实施方案中，所述抗体或片段在存在10％(v/v)正常人血清时抑制体外溶血活性，IC50值为105nM或更低。在一些实施方案中，根据本发明的抗体或其片段在存在10％(v/v)正常人血清时抑制体外溶血活性，IC50值为150nM或更低、130nM或更低、115nM或更低、105nM或更低、100nM或更低、95nM或更低、75nM或更低、70nM或更低、65nM或更低、或者60nM或更低。在一些实施方案中，根据本发明的抗体或其片段在存在10％(v/v)正常人血清时抑制体外溶血活性，IC50值为介于60nM与80nM之间。
在一些实施方案中，本文公开的抗体或片段中的任一种使体外FH对C3b的结合亲和力(KD)增加至2μM或更低、1.5μM或更低、1μM或更低、500nM或更低、400nM或更低、或者300nM或更低，和/或使体外FH对C3b的结合亲和力增加至少2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍或5倍。在一些实施方案中，本文公开的抗体或片段中的任一种使体外FH对C3b的结合亲和力(KD)增加至介于50至500nM之间。在一些实施方案中，本文公开的抗体或片段中的任一种使体外FH对C3b的结合亲和力(KD)增加至介于50至300nM之间。在一些实施方案中，本文公开的抗体或片段中的任一种使体外FH对C3b的结合亲和力(KD)增加至介于100至300nM之间。在一些实施方案中，本文公开的抗体或片段中的任一种使体外FH对C3b的结合亲和力(KD)增加至介于250至300nM之间。
任选地，对本文公开的CDR中任一或多个中的至少一个的序列进行优化，从而产生变异抗体或片段，例如以(进一步)提高结合亲和力、选择性、FH增强能力和/或体内或存储稳定性。在一些实施方案中，根据本发明的抗体或片段具有高存储稳定性，具体来说，与抗体FH.07或抗体FHR-1.3B4相比提高的存储稳定性。在一些实施方案中，根据本发明的抗体或片段具有高体内稳定性，具体来说，与抗体FH.07或抗体FHR-1.3B4相比提高的体内稳定性。在一些实施方案中，根据本发明的抗体或片段具有高选择性，具体来说，与抗体FH.07或抗体FHR-1.3B4相比增加的选择性。
另外，任选地对本发明的抗体或片段的框架区中至少一个中的至少一个序列进行优化，例如以提高抗体或片段的结合效力或稳定性或者减少非人序列在其施用至人类之后的副作用。这是例如通过诱发程序来进行。本领域技术人员能够产生包含至少一个改变的CDR或框架序列的抗体变体。CDR和/或框架序列是例如通过使编码此类框架序列的核酸突变来进行优化。举例来说，应用保守氨基酸取代。在一些实施方案中，本文公开的CDR、框架、可变重链、可变轻链序列中的任一个与本文公开的氨基酸序列中的任一个或多个相比都包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸取代、缺失或插入(例如保守取代)。在一些实施方案中，本文公开的CDR、框架、可变重链、可变轻链序列中的任一个与本文公开的氨基酸序列中的任一个或多个相比都包含至少1、2、3、4或5个氨基酸取代、缺失或插入(例如保守取代)。在一些实施方案中，本文公开的CDR、框架、可变重链、可变轻链序列中的任一个与本文公开的氨基酸序列中的任一个或多个相比都包含不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸取代、缺失或插入(例如保守取代)。在一些实施方案中，本文公开的CDR、框架、可变重链、可变轻链序列中的任一个与本文公开的氨基酸序列中的任一个或多个相比都包含不超过1、2、3、4或5个氨基酸取代、缺失或插入(例如保守取代)。保守氨基酸取代的实例包括一个疏水性残基(诸如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸)取代另一个疏水性残基，以及一个极性残基取代另一个极性残基，诸如精氨酸取代赖氨酸、谷氨酸取代天冬氨酸或谷氨酰胺取代天冬酰胺。
为了选择改进的抗体或片段，可以例如使用本文所述的检验来检验所得变异抗体或片段的结合亲和力、FH增强能力和/或稳定性。一旦已经获得了对FH(具体来说，对FH的CCP18)特异的抗体或片段，就可以通过本领域技术人员已知的若干种方法来测试其所期望的生物活性，即，它们增强FH活性的能力。如本文先前所述，增强FH活性可以涵盖抑制溶血活性、抑制细胞上的C3沉积和/或增加FH与C3b结合。用以检验这些活性的功能测定法先前已经描述于本文中并且详细描述于实施例中。典型地，CDR序列中至多三个氨基酸残基可以在保留相同特异性的同时变异，取决于CDR包含的氨基酸数目。因此，在一些实施方案中，根据本发明的抗体或片段含有重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3序列，其中与表1的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3序列相比，各个CDR中至多3个、至多2个或至多1个氨基酸发生了变异。在一些实施方案中，所述抗体或片段包含与表1中所示相同的抗体的轻链CDR3和重链CDR3、其中至多1个氨基酸变异的抗体的轻链CDR2以及其中至多3个氨基酸变异的轻链CDR1、重链CDR1和重链CDR2。在一些实施方案中，所述抗体或片段包含与表1中所示相同的抗体的轻链CDR2和CDR3以及重链CDR3，以及其中至多2个氨基酸或至多1个氨基酸变异的轻链CDR1、重链CDR1和重链CDR2。
本发明因此还提供了一种分离的合成或重组抗体或其片段，其特异性结合至因子H(FH)的补体控制蛋白结构域18(CCP18)并且包含：
-轻链CDR1序列，其具有与序列SSVTY(SEQ ID NO:1)至少60％或至少80％同一的序列；轻链CDR2序列，其具有与序列ATS(SEQ ID NO:2)至少60％同一的序列；和轻链CDR3，其具有与序列QHRSSSNPLT(SEQ ID NO:3)至少60％、至少70％、至少80％或至少90％同一的序列；重链CDR1，其具有与序列GFSLTNYG(SEQ ID NO:5)至少60％、至少70％、至少80％或至少90％同一的序列；重链CDR2，其具有与序列VWSGGTT(SEQ ID NO:6)至少60％、至少70％、至少80％或至少90％同一的序列；和重链CDR3序列，其具有与序列ARNFGNYAMDY(SEQ IDNO:7)至少60％、至少70％、至少80％或至少90％同一的序列；
-轻链CDR1序列，其具有与序列SSVTY(SEQ ID NO:1)至少60％或至少80％同一的序列；轻链CDR2序列，其具有与序列ATS(SEQ ID NO:2)至少60％同一的序列；和轻链CDR3，其具有与序列QHRSSSNPLT(SEQ ID NO:3)至少60％、至少70％、至少80％或至少90％同一的序列；重链CDR1，其具有与序列GFSLTNYG(SEQ ID NO:5)至少60％、至少70％、至少80％或至少90％同一的序列；重链CDR2，其具有与序列IWSGGTT(SEQ ID NO:10)至少60％、至少70％、至少80％或至少90％同一的序列；和重链CDR3序列，其具有与序列ARNFGNYAMDF(SEQ IDNO:11)至少60％、至少70％、至少80％或至少90％同一的序列；
-轻链CDR1序列，其具有与序列TSVTY(SEQ ID NO:13)至少60％或至少80％同一的序列；轻链CDR2序列，其具有与序列ASS(SEQ ID NO:14)至少60％同一的序列；和轻链CDR3，其具有与序列QHRSSSNPLT(SEQ ID NO:3)至少60％、至少70％、至少80％或至少90％同一的序列；重链CDR1，其具有与序列GFSLTNYG(SEQ ID NO:5)至少60％、至少70％、至少80％或至少90％同一的序列；重链CDR2，其具有与序列VWSGGTT(SEQ ID NO:6)至少60％、至少70％、至少80％或至少90％同一的序列；和重链CDR3序列，其具有与序列ARNFGNYAMDY(SEQ IDNO:7)至少60％、至少70％、至少80％或至少90％同一的序列；
-轻链CDR1序列，其具有与序列TSVTY(SEQ ID NO:13)至少60％或至少80％同一的序列；轻链CDR2序列，其具有与序列ASS(SEQ ID NO:14)至少60％同一的序列；和轻链CDR3，其具有与序列QHRSSSNPLT(SEQ ID NO:3)至少60％、至少70％、至少80％或至少90％同一的序列；重链CDR1，其具有与序列GFSLTNYG(SEQ ID NO:5)至少60％、至少70％、至少80％或至少90％同一的序列；重链CDR2，其具有与序列IWSGGTT(SEQ ID NO:10)至少60％、至少70％、至少80％或至少90％同一的序列；和重链CDR3序列，其具有与序列ARNFGNYAMDF(SEQ IDNO:11)至少60％、至少70％、至少80％或至少90％同一的序列。
在一些实施方案中，所述抗体或片段增强了FH活性。在一些实施方案中，所述抗体或片段包含与指定序列至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的重链CDR1、CDR2和/或CDR3序列和/或轻链CDR1、CDR2和/或CDR3序列。
本发明还提供了一种分离的合成或重组抗体或其片段，其特异性结合至因子H(FH)的补体控制蛋白结构域18(CCP18)并且包含：
-轻链CDR1序列，其具有任选地具有1个氨基酸取代的序列SSVTY(SEQ ID NO:1)；轻链CDR2序列，其具有序列ATS(SEQ ID NO:2)；和轻链CDR3，其具有任选地具有1或2个氨基酸取代的序列QHRSSSNPLT(SEQ ID NO:3)；重链CDR1，其具有任选地具有1或2个氨基酸取代的序列GFSLTNYG(SEQ ID NO:5)；重链CDR2，其具有任选地具有1或2个氨基酸取代的序列VWSGGTT(SEQ ID NO:6)；以及重链CDR3序列ARNFGNYAMDY(SEQ ID NO:7)，其任选地具有1或2个氨基酸取代；
-轻链CDR1序列，其具有任选地具有1个氨基酸取代的序列SSVTY(SEQ ID NO:1)；轻链CDR2序列，其具有序列ATS(SEQ ID NO:2)；以及轻链CDR3，其具有任选地具有1或2个氨基酸取代的序列QHRSSSNPLT(SEQ ID NO:3)；重链CDR1，其具有任选地具有1或2个氨基酸取代的序列GFSLTNYG(SEQ ID NO:5)；重链CDR2，其具有任选地具有1或2个氨基酸取代的序列IWSGGTT(SEQ ID NO:10)；以及重链CDR3序列ARNFGNYAMDF(SEQ ID NO:11)，其任选地具有1或2个氨基酸取代；
-轻链CDR1序列，其具有任选地具有1或2个氨基酸取代的序列TSVTY(SEQ ID NO:13)；轻链CDR2序列ASS(SEQ ID NO:14)；以及轻链CDR3，其具有任选地具有1或2个氨基酸取代的序列QHRSSSNPLT(SEQ ID NO:3)；重链CDR1，其具有任选地具有1或2个氨基酸取代的序列GFSLTNYG(SEQ ID NO:5)；重链CDR2，其具有任选地具有1或2个氨基酸取代的序列VWSGGTT(SEQ ID NO:6)；以及重链CDR3 ARNFGNYAMDY(SEQ ID NO:7)，其任选地具有1或2个氨基酸取代；或
-轻链CDR1序列，其具有任选地具有1个氨基酸取代的序列TSVTY(SEQ ID NO:13)；轻链CDR2序列，其具有序列ASS(SEQ ID NO:14)；以及轻链CDR3，其具有任选地具有1或2个氨基酸取代的序列QHRSSSNPLT(SEQ ID NO:3)；重链CDR1，其具有任选地具有1或2个氨基酸取代的序列GFSLTNYG(SEQ ID NO:5)；重链CDR2，其具有任选地具有1或2个氨基酸取代的序列IWSGGTT(SEQ ID NO:10)；以及重链CDR3序列，其具有任选地具有1或2个氨基酸取代的序列ARNFGNYAMDF(SEQ ID NO:11)。
在一些实施方案中，本文公开的抗体或抗原结合片段中的任一种都包含来自本文公开的重链或轻链序列中的任一个的至少一个或多个CDR。在一些实施方案中，本文公开的抗体或抗原结合片段中的任一种都包含来自SEQ ID NO:4、8、12或16的可变重链或可变轻链序列中的任一个的至少一个或多个CDR。在一些实施方案中，本文公开的抗体或抗原结合片段中的任一种都包含来自本文公开的重链或轻链序列中任一个的至少一个或多个CDR，其中所述CDR是使用Kabat系统确定。在一些实施方案中，本文公开的抗体或抗原结合片段中的任一种都包含来自本文公开的重链或轻链序列中任一个的至少一个或多个CDR，其中所述CDR是使用Chothia系统确定。在一些实施方案中，本文公开的抗体或抗原结合片段中的任一种都包含来自本文公开的重链或轻链序列中任一个的至少一个或多个CDR，其中所述CDR是使用MacCallum系统确定。在一些实施方案中，本文公开的抗体或抗原结合片段中的任一种都包含来自本文公开的重链或轻链序列中任一个的至少一个或多个CDR，其中所述CDR是使用AbM系统确定。在一些实施方案中，本文公开的抗体或抗原结合片段中的任一种都包含来自本文公开的重链或轻链序列中任一个的至少一个或多个CDR，其中所述CDR是使用IMGT系统确定。
通过Kabat描述的系统，也称为“根据Kabat编号”、“Kabat编号”、“Kabat定义”和“Kabat标记”，提供了适用于抗体的任何可变域的明确残基编号系统，并提供了界定各个链的三个CDR的确切残基边界。(Kabat等,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987)和(1991)，它们的内容以引用的方式整体并入。这些CDR称为Kabat CDR，并且大约包含轻链可变域中的残基24-34(CDR1)、50-56(CDR2)和89-97(CDR3)以及重链可变域中的31-35(CDR1)、50-65(CDR2)和95-102(CDR3)。当根据Kabat定义CDR时，轻链FR残基大约位于残基1-23(LCFR1)、35-49(LCFR2)、57-88(LCFR3)和98-107(LCFR4)处，并且重链FR残基大约位于重链残基中的残基1-30(HCFR1)、36-49(HCFR2)、66-94(HCFR3)和103-113(HCFR4)处。“如Kabat中的EU索引”是指人IgG1 EU抗体的残基编号。
本领域中还使用了其他CDR编号系统。Chothia及其同事发现，尽管在氨基酸序列层面上存在巨大差异，但Kabat CDR内的某些子部分采用了近乎相同的肽主链构象。(Chothia等,(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；以及Chothia等,(1989)Nature 342:877-883)。这些子部分命名为L1、L2和L3或H1、H2和H3，其中“L”和“H”分别表示轻链和重链区域。这些CDR可以称为“Chothia CDR”、“Chothia编号”或“根据Chothia编号”，并且大约包含轻链可变域中的残基24-34(CDR1)、50-56(CDR2)和89-97(CDR3)以及重链可变域中的26-32(CDR1)、52-56(CDR2)和95-102(CDR3)。Mol.Biol.196:901-917(1987)。
通过MacCallum描述的系统，也称为“根据MacCallum编号”或“MacCallum编号”，大约包含轻链可变域中的残基30-36(CDR1)、46-55(CDR2)和89-96(CDR3)以及重链可变域中的30-35(CDR1)、47-58(CDR2)和93-101(CDR3)。MacCallum等,((1996)J.Mol.Biol.262(5):732-745)。
通过AbM描述的系统，也称为“根据AbM编号”或“AbM编号”，大约包含轻链可变域中的残基24-34(CDR1)、50-56(CDR2)和89-97(CDR3)以及重链可变域中的26-35(CDR1)、50-58(CDR2)和95-102(CDR3)。
还可以使用可变区的IMGT(国际免疫遗传学信息系统)编号，它是根据如Lefranc,M.-P.,“The IMGT unique numbering for immunoglobulins,T cell Receptors and Ig-like domains”,The Immunologist,7,132-136(1999)中所述的IMGT方法的免疫球蛋白可变重链或轻链中的残基编号，并且明确以引入的方式整体并入本文。如本文所使用，“IMGT序列编号”或“根据IMTG编号”是指根据IMGT对编码可变区的序列的编号。对于重链可变域，当根据IMGT编号时，高变区对于CDR1而言在氨基酸位置27至38的范围内，对于CDR2而言在氨基酸位置56至65的范围内，而对于CDR3而言在氨基酸位置105至117的范围内。对于轻链可变域，当根据IMGT编号时，高变区对于CDR1而言在氨基酸位置27至38的范围内，对于CDR2而言在氨基酸位置56至65的范围内，而对于CDR3而言在氨基酸位置105至117的范围内。在本文所述的构建体和抗原结合臂的一些实施方案中，当根据Chothia编号进行编号时，本文所述的CDR大约包含轻链可变域中的残基24-34(CDR1)、49-56(CDR2)和89-97(CDR3)，以及重链可变域中的27-35(CDR1)、49-60(CDR2)和93-102(CDR3)。在一些实施方案中，当根据Chothia编号进行编号时，轻链可变域中的CDR2可以包含氨基酸49-56。
根据本发明的抗体或其片段在一些实施方案中是单克隆抗体或片段。单克隆抗体是基本上由单个分子种类组成的抗体。单克隆抗体获自具有相同序列且结合相同表位的均质抗体群体，但具有例如在产生过程中自发发生的一个或多个突变的可能变异抗体或片段除外。有利地，可以重组产生单克隆抗体，使得可以获得的抗体的量显著高于抗血清中存在的多克隆抗体的量。然而，本发明还涵盖多克隆抗体和片段。在一些实施方案中，根据本发明的抗体或片段是嵌合或人源化抗体。在一些实施方案中，所述抗体或片段因此至少包含人轻链和重链恒定区。在一些实施方案中，所述抗体或片段还包含重和轻链可变区中的人框架区。在一些实施方案中，提供了完全由人序列组成的人抗体或片段。在一些实施方案中，使用嵌合、人源化或人抗体比使用非人抗体更理想，这是因为许多因素阻碍了使用非人抗体或片段治疗人类疾病。人体可能将非人抗体识别为外源抗体，这将引起针对非人抗体或片段的免疫应答，从而导致了不利副作用和/或抗体或片段自循环中快速清除。当嵌合、人源化或人抗体施用至人时，副作用的机率降低。另外，当由于与非人抗体相比时清除率降低而使用嵌合、人源化或人抗体时，一般实现更久循环半衰期。在一些实施方案中，将人生殖系序列用于根据本发明的抗体或片段中的框架区。使用人生殖系序列可以将抗体或片段的免疫原性风险降至最低，因为这些序列不太可能含有框架区所来源的个体特有并且在应用于另一个人类个体时可能引起免疫原性应答的体细胞变异。
抗体人源化或提供嵌合抗体的程序在本领域中是众所周知的。已经建立了各种基于重组DNA的方法，目标是增加抗体中也出现在人抗体中相同或相似位置的氨基酸残基的含量，同时保留了亲本非人抗体的特异性和亲和力。举例来说，通过具有最高程度同源性的相应人框架区取代小鼠抗体可变区的框架区，从而保持非人CDR完整。适用于使根据本发明的抗体人源化的其他方法包括但不限于CDR移植(Queen,C等,1989；Carter,P等,1992)；表面重整(Padlan,EA等,1991)、超人源化(Tan,PDA等,2002)、人串含量优化(Lazar,G.A.等,2007)和人工程化(Almagro,JC等,2008)。
在一个实施方案中，根据本发明的抗体或片段是多特异性抗体，诸如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同的抗原和/或表位具有结合特异性的单克隆抗体。在一个实施方案中，双特异性抗体对FH具有结合特异性，例如，其包含特异性结合至如本文所述的FH的CCP18的一个可变轻链和一个可变重链，并且对另一个抗原具有结合特异性。在另一个实施方案中，双特异性抗体可以结合至FH的两个不同的表位。
根据本发明的抗体或片段可以属于任何类别。抗体的“类别”是指其重链具有的恒定域或恒定区的类型。存在五个主要抗体类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些可以进一步分成子类或同型，诸如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在某些实施方案中，根据本发明的抗体包含IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的恒定区(例如Fc结构域)。在某些实施方案中，根据本发明的抗体包含人IgG(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的恒定区(例如Fc结构域)。Fc结构域介导抗体的效应功能，包括诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)的能力。在某些实施方案中，本文公开的抗体包含具有一个或多个降低Fc效应功能的突变的Fc结构域。在一些实施方案中，本文公开的抗体包含在选自234、235、236、237、270、297、318、320、322、329和331的一个或多个位置包含突变(例如，相对于野生型人IgG1的取代)的Fc结构域。此类突变在本领域中是已知的，并且包括但不限于L234A、L235A、G237A、P329A或P329G、A330S、P331S、N297Q、N297A及其组合。Fc结构域还结合新生儿Fc受体FcRn，从而促进抗体的再循环并从而增加抗体的半衰期。在某些实施方案中，本文公开的抗体包含具有一个或多个增加Fc与FcRn的结合亲和力的突变的Fc结构域。此类突变在本领域中是已知的，并且包括但不限于M252Y/T256D、T256D/T307Q和T256D/T307W。
在某些实施方案中，除了天然抗体或片段中天然存在的任何修饰以外，本文公开的抗体或片段中的任一种都还可以包含翻译后修饰。此类修饰包括但不限于乙酰化、羧酸化、糖基化、磷酸化、脂质化、聚乙二醇化(聚乙二醇)和酰化。因此，修饰的多肽可以含有非氨基酸要素，诸如聚乙二醇、脂质、单糖或多糖和磷酸酯。在特定实施方案中，所述抗体或片段被PEG化。在其他特定实施方案中，所述抗体或片段是PEG化Fab分子。
可以通过本领域中已知的各种方法来制备对特定抗原(诸如根据本发明的FH)特异的抗体。举例来说，可以使用人FH作为引发抗体的免疫原。作为另一个实例，可以使用FH相关蛋白的人类FH的CCP18结构域作为免疫原。此类方法的一个实例是通过如实施例中所述的免疫和杂交瘤来产生。举例来说，可以通过例如以四周间隔任选地在诸如蒙他尼德(montanide)等佐剂存在下用诸如FHR-1等人因子H或FH相关蛋白经腹膜内使例如BALB/c小鼠等小鼠免疫来产生针对FH的小鼠单克隆抗体。在第四次免疫后若干天，可以使脾细胞与例如骨髓瘤细胞系SP2/0融合。可以通过ELISA检验杂交瘤上清液中因子H特异性抗体的存在。举例来说，用moAb(例如大鼠抗小鼠κmoAb RM19)涂布微量滴定板以俘获小鼠IgG抗体。可以通过生物素化因子H测定抗体的特异性。提供FH特异性抗体的方法的另一个实例是通过对表达编码免疫球蛋白链的重组核酸序列的噬菌体呈现库进行筛检。本领域中已经广泛使用并描述了用于抗体噬菌体呈现的方法。可以用与用于免疫的抗原相同的抗原，例如人FH、FH相关蛋白或人FH的CCP18结构域对抗体库进行筛检。
C.核酸和载体
本发明还提供了一种或多种分离的合成或重组核酸，其包含编码本文公开的抗体或其片段中的任一种的核酸序列。在一些实施方案中，所述核酸至少编码如表1中所示的抗体1的重链CDR1、CDR2和CDR3和/或轻链CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述核酸至少编码如表1中所示的抗体2的重链CDR1、CDR2和CDR3和/或轻链CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述核酸至少编码如表1中所示的抗体3的重链CDR1、CDR2和CDR3和/或轻链CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述核酸至少编码如表1中所示的抗体4的重链CDR1、CDR2和CDR3和/或轻链CDR1、CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，根据本发明的核酸具有至少30个核苷酸、至少50个核苷酸或至少75个核苷酸的长度。在一些实施方案中，根据本发明的核酸编码包含抗体1的重链CDR序列和轻链CDR序列和/或重链可变区和轻链可变区的单克隆嵌合或人源化抗体或其片段。在一些实施方案中，根据本发明的核酸编码包含抗体2的重链CDR序列和轻链CDR序列和/或重链可变区和轻链可变区的单克隆嵌合或人源化抗体或其片段。在一些实施方案中，根据本发明的核酸编码包含抗体3的重链CDR序列和轻链CDR序列和/或重链可变区和轻链可变区的单克隆嵌合或人源化抗体或其片段。在一些实施方案中，根据本发明的核酸编码包含抗体4的重链CDR序列和轻链CDR序列和/或重链可变区和轻链可变区的单克隆嵌合或人源化抗体或其片段。
编码抗体5-7的重链和轻链的核酸序列示于表1中。然而，本发明还涵盖编码根据本发明的抗体的重链或轻链CDR的核酸，其包含与表1中所示的核酸序列不同的核酸序列，但包含编码表1中所示的重链、轻链、重链CDR或轻链CDR序列的氨基酸序列的核酸密码子。
因此提供了一种分离的合成或重组核酸，其包含编码与SEQ ID NO:1、2、3、5、6和7的序列中的任一个或其任何组合或片段至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一的氨基酸序列的核酸序列。还提供了一种分离的合成或重组核酸，其包含编码与SEQ IDNO:1、2、3、5、10和11的序列中的任一个或其任何组合或片段至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一的氨基酸序列的核酸序列。还提供了一种分离的合成或重组核酸，其包含编码与SEQ ID NO:3、5、6、7、13和14的序列中的任一个或其任何组合或片段至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一的氨基酸序列的核酸序列。还提供了一种分离的合成或重组核酸，其包含编码与SEQ ID NO:3、5、10、11、13和14的序列中的任一个其任何组合或片段至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一的氨基酸序列的核酸序列。
还提供了一种分离的合成或重组核酸，其包含编码与SEQ ID NO:4和8的序列中的任一个或其任何组合或片段至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一的氨基酸序列的核酸序列。还提供了一种分离的合成或重组核酸，其包含编码与SEQ ID NO:4和12的序列中的任一个或其任何组合或片段至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一的氨基酸序列的核酸序列。还提供了一种分离的合成或重组核酸，其包含编码与SEQ ID NO:8和16的序列中的任一个或其任何组合或片段至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一的氨基酸序列的核酸序列。还提供了一种分离的合成或重组核酸，其包含编码与SEQ IDNO:12和16的序列中的任一个或其任何组合或片段至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一的氨基酸序列的核酸序列。本发明还涵盖了编码例如通过保守氨基酸取代加以修饰的重链和/或轻链CDR或抗体的核酸。
在一些实施方案中，根据本发明的核酸或核酸序列包含核苷酸链(即，DNA和/或RNA)。然而，本发明的核酸或核酸序列可以包含其他种类的核酸结构，诸如DNA/RNA螺旋体、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)和/或核糖酶。此类其他核酸结构称为核酸序列的功能等效物并且被本发明涵盖。术语“核酸序列的功能等效物”还涵盖包含表现出与天然核苷酸相同的功能的非天然核苷酸、修饰的核苷酸和/或非核苷酸构建块的链。
本发明还提供了一种载体，其包含一种或多种根据本发明的核酸。在一些实施方案中，所述载体是质粒。质粒在本文定义为环形的。在一些实施方案中，质粒是双链DNA分子。用于制备包含根据本发明的核酸的载体的方法在本领域中是众所周知的。适合产生本发明载体的载体的非限制性实例有反转录病毒和慢病毒载体。根据本发明的载体可以用于多种应用。在一些实施方案中，根据本发明的载体用于在细胞中体外表达根据本发明的核酸，诸如用于产生根据本发明的抗体或片段。此外，包含根据本发明的核酸的根据本发明的载体可以用于治疗。向有需要的个体(诸如人)施用此类载体引起了根据本发明的抗体或片段在体内表达。
在一些实施方案中，本发明提供了一种载体，其编码本文公开的抗体或片段中的任一种。在一些实施方案中，所述载体是病毒载体。在一些实施方案中，所述载体是AAV载体。本发明的重组AAV(rAAV)载体可以由多种腺相关病毒产生。举例来说，在复制、整合、切割和转录机制方面，预期来自任何AAV血清型的ITR都具有类似的结构和功能。AAV血清型的实例包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12。在一些实施方案中，rAAV载体是由血清型AAV1、AAV2、AAV4、AAV5或AAV8产生。已知这些血清型靶向感光细胞或视网膜色素上皮细胞。在特定实施方案中，rAAV载体由血清型AAV2产生。在某些实施方案中，AAV血清型包括AAVrh8、AAVrh8R或AAVrh10。还应当理解，rAAV载体可以是选自血清型AAV1至AAV12的两个或更多个血清型的嵌合体。可以通过将一种血清型的重组基因组包装至来源于另一种AAV血清型的衣壳中来改变载体的趋向性。在一些实施方案中，rAAV病毒的ITR可以基于AAV1-12中任一种的ITR，并且可以与选自AAV1-12、AAV-DJ、AAV-DJ8、AAV-DJ9或其他修饰血清型中任一种的AAV衣壳组合。在某些实施方案中，任何AAV衣壳血清型都可以与本发明的载体一起使用。AAV血清型的实例包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-DJ、AAV-DJ8、AAV-DJ9、AAVrh8、AAVrh8R或AAVrh10。在某些实施方案中，AAV衣壳血清型是AAV2。
还提供了一种重组细胞，其包含根据本发明的核酸或载体。在一些实施方案中，将核酸或载体引入至细胞中，使得细胞的核酸翻译机制将产生编码的抗体或片段。在一些实施方案中，在所谓的生产细胞中表达根据本发明的核酸或载体，诸如中国仓鼠卵巢(CHO)、NSO(小鼠骨髓瘤)或293(T)细胞系的细胞，其中一些适于商业抗体生产。此类生产细胞的增殖产生了能够产生根据本发明的抗体或片段的生产细胞系。在一些实施方案中，生产细胞系适合产生供人使用的抗体。在一些实施方案中，生产细胞系不含病原体，诸如病原微生物。
本发明还提供了一种产生根据本发明的抗体或片段的方法，所述方法包括向细胞提供根据本发明的核酸或载体，以及允许所述细胞翻译所述核酸或载体包含的核酸序列，从而产生根据本发明的抗体或片段。在一些实施方案中，根据本发明的方法还包括收集、纯化和/或分离所述抗体或片段。还提供了用根据本发明的产生抗体或片段的方法获得的抗体或片段。
D.药物组合物
在一些实施方案中，根据本发明的抗体或片段可以有利地用于治疗应用。因此提供了一种包含根据本发明的抗体或片段以及药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂的药物组合物。还提供了包含根据本发明的核酸或载体(例如，AAV载体)和至少一种药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂的药物组合物。合适的载体的非限制性实例有例如匙孔戚血蓝蛋白(KLH)、血清白蛋白(例如BSA或RSA)和卵白蛋白。在一些实施方案中，所述载体是溶液，诸如水溶液，例如生理盐水，或基于油的溶液。可以并入片剂、胶囊等等中的赋形剂的非限制性实例有粘合剂，诸如黄蓍树胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，诸如微晶纤维素；崩解剂，诸如玉米淀粉、预胶凝淀粉和海藻酸；润滑剂，诸如硬脂酸镁；甜味剂，诸如蔗糖、乳糖或糖精；以及调味剂，诸如薄荷油、冬青油或樱桃油。在一些实施方案中，剂量单位形式是胶囊。在一些实施方案中，除一种或多种以上指出的赋形剂以外，剂量单位形式还含有液体载体，诸如脂肪油。各种其他材料可以作为包衣剂存在或用于调节剂量单位的物理形式。举例来说，片剂可以用虫胶和/或糖或二者包覆。在一些实施方案中，根据本发明的药物组合物适合人使用。
本文所述的药物组合物可以用多种不同的方式施用。实例包括经由眼内、玻璃体内、视网膜下、口服、鼻内、直肠、局部、腹膜内、静脉内、肌肉内、皮下、真皮下、经皮、鞘内和颅内方法施用包含根据本发明的抗体且含有药学上可接受的载体的药物组合物。在特定实施方案中，本文公开的抗体、片段、载体或药物组合物中的任一种都可以经玻璃体内施用至受试者。在特定实施方案中，本文公开的抗体、片段、载体或药物组合物中的任一种都可以经视网膜下施用至受试者。对于口服施用，活性成分可以呈诸如胶囊、片剂和粉剂等固体剂型，或者呈诸如酏剂、糖浆和悬浮液等液体剂型施用。可以根据常规制药实践，通过将本发明的抗体或片段溶解或悬浮在注射用媒介物，诸如水或如芝麻油、椰子油、花生油、棉籽油等天然存在之油或如油酸乙酯之合成脂肪媒介物中来配制注射用无菌组合物。还可以并入缓冲剂、防腐剂和/或抗氧化剂。
E.治疗/预防应用
本发明还提供了根据本发明的抗体或片段以供用于疗法中。还提供了根据本发明的核酸以供用于疗法中。所述疗法可以是治疗性的或预防性的。根据本发明的抗体或片段尤其适用于治疗、减轻或预防与替代途径补体激活相关的病症。因此提供了一种根据本发明的抗体或片段以供用于治疗、减轻或预防与替代途径补体激活相关的病症。还提供了一种根据本发明的核酸以供用于治疗、减轻或预防与替代途径补体激活相关的病症。如本文所使用，“与替代补体激活相关的病症”在本文定义为其中不需要和/或过度替代途径补体激活引起细胞、组织或细胞外基质损伤的病症。可能被不需要和/或过度替代途径激活损伤的细胞是与血液接触的任何细胞，例如红细胞、上皮细胞(具体来说，肝脏和/或肾脏上皮细胞)、血小板、白细胞、内皮细胞。在一些实施方案中，所述病症是与FH功能受损或FH缺乏相关的病症。在一些实施方案中，所述病症是与FH功能受损或FH缺乏相关但与FH不存在不相关的病症。因为本发明的抗体和片段增强了FH的功能，所以所述抗体和片段特别适合阻断或降低FH功能受损或FH缺乏的影响。然而，本发明的增强型抗FH抗体还可以抑制与人工阻断了FH的健康个体的血清一起孵育的红细胞的溶解。因此，抗体和片段还可以用于阻断或降低由除FH功能受损或FH缺乏以外的因素引起的不合需要和/或过度的替代途径补体激活。此类可以治疗的病症的非限制性实例有非典型溶血性尿毒综合征(aHUS)、阵发性夜间血红蛋白尿症(PNH)、年龄相关性黄斑变性(AMD)、膜性增生性肾小球肾炎(MPGN)。
非典型溶血性尿毒综合征(aHUS)也称为补体介导的HUS，其特征为溶血性贫血、血小板减少症、全身性血栓性微血管病(TMA)和肾衰竭。aHUS发作通常在儿童期，而且该疾病的急性发作与例如感染、怀孕、其他疾病、手术或外伤相关。尽管进行了血浆交换或血浆补充，但超过60％的aHUS患者死亡或发展出终末期肾病(ESRD)。在aHUS患者中已经鉴定出了补体系统的组分或因子中的若干种突变。FH、FI FB、膜辅因子蛋白(MCP)、血栓调节蛋白(THBD)或C3中的突变占aHUS患者中已知突变的约50％，其中FH突变最频繁(占aHUS患者的约20％至30％)。大多数患者的突变是杂合的，但仍然导致病理性FH缺乏。另外，在约10％患者中，aHUS是由针对FH的自体抗体引起，也导致了功能性FH降低。目前，aHUS的标准治疗是血浆补充或血浆交换疗法。另外，还使用依库珠单抗治疗aHUS患者。肾移植与高复发风险相关联，取决于aHUS的基础突变。FH、FB、FI、C3或THBD中存在突变的儿童由于复发风险增加而忌用移植。根据本发明的抗体或片段，诸如至少包含Fab片段的抗体或片段特别适用于治疗、减轻或预防由FH中的突变或由于存在抗FH自体抗体而引起的aHUS。对FH的增强作用与FH的携带突变的CCP结构域无关。举例来说，增强型FH抗体或其片段能够抑制在FH的CCP1、CCP6、CCP7、CCP14、CCP17、CCP18、CCP19和CCP20中携带突变的aHUS患者的替代补体激活。然而，因为本发明的抗体和片段在不存在FH功能受损或FH缺乏时也可以增强FH活性，因此可以有利地用本发明的抗体或片段治疗、减轻或预防任何形式的补体依赖性aHUS。
阵发性夜间血红蛋白尿症(PNH)是由全能造血干细胞X染色体中的基因突变引起。所述突变导致缺乏对合成糖基磷脂酰肌醇膜锚定蛋白(GPI-AP)至关重要的磷脂酰肌醇聚糖A类蛋白。补体系统CD55的抑制剂是此类蛋白质的实例，其结合宿主细胞表面的C3b，从而防止形成C3转化酶。因此，缺乏这些蛋白质导致了不需要或过度的补体激活。PNH的主要后果之一是红细胞由于补体系统的过度活性而发生溶解。最近，若干个国家已经批准依库珠单抗用于治疗PNH。其他疗法包括输血、红细胞刺激剂疗法、用皮质类固醇和同化类固醇治疗。因为本发明的抗体和片段还能与FH或FH功能水平无关地增强FH的活性，从而抑制补体系统替代途径激活，因此所述抗体和片段可以有利地用于PNH患者。另外，由于本发明的抗体和片段在C3沉积层面上起作用，与在激活途径更下游起作用的依库珠单抗相反，所以由于较少细胞受C3b调理而使肝脏中的细胞耗竭降低。
年龄相关性黄斑变性(AMD)是视网膜损伤，通常影响老年个体，导致黄斑(视场中心)视力丧失。最近，FH中的突变和SNP(单核苷酸多态性)已经牵涉到约35％的AMD患者。SNP位于FH的CCP7中，并且被证明影响FH与肝素结合，从而损害FH结合宿主细胞表面以及细胞外基质的能力。根据本发明的抗体或片段，诸如至少包含Fab片段的抗体或片段特别适合治疗、减轻或预防以FH功能减退(即，以编码FH的基因中的SNP)为特征的AMD。
膜性增生性肾小球肾炎(MPGN)是主要发生在儿童和青少年中的慢性肾炎的罕见病因。它由于肾小球膜和内皮细胞增殖以及肾小球膜基质扩增、由内皮下免疫沉积物和/或膜内致密沉积物致使外周毛细血管壁增厚以及肾小球膜插入毛细血管壁中而造成肾小球损伤。MPGN通常与完全不存在FH相关。在一些实施方案中，可以用本发明的抗体和/或片段治疗的MPGN与FH功能受损或FH缺乏相关，但与FH不存在无关。
本发明因此提供了一种根据本发明的抗体或片段或核酸以供用于治疗、减轻或预防与替代途径补体激活相关的病症。在一些实施方案中，所述病症选自由以下组成的组：非典型溶血性尿毒综合征(aHUS)、阵发性夜间血红蛋白尿症(PNH)、年龄相关性黄斑变性(AMD)、膜性增生性肾小球肾炎(MPGN)。还提供了根据本发明的抗体或片段、核酸或载体用于制备用以治疗、减轻或预防与替代途径补体激活相关的病症的药物的用途。在一些实施方案中，所述病症选自由以下组成的组：非典型溶血性尿毒综合征(aHUS)、阵发性夜间血红蛋白尿症(PNH)、年龄相关性黄斑变性(AMD)、膜性增生性肾小球肾炎(MPGN)和IgA肾病。在特定实施方案中，所述病症是IgA肾病。在一些实施方案中，根据本发明的供用作药物或预防剂的抗体或片段是包含如表1中所示的抗体重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3的抗体或其片段(亦即，Fab、Fab'或F(ab)2或F(ab')2片段)。在一些实施方案中，所述抗体或片段是单克隆人源化或嵌合抗体或片段。
本发明还提供了一种抑制替代补体激活的方法，所述方法包括向个体施用根据本发明的抗体或片段，或者根据本发明的核酸或载体。本发明还提供了一种用于治疗、减轻或预防与替代途径补体激活相关的病症的方法，所述方法包括向有需要的个体施用治疗有效量的根据本发明的抗体或片段。还提供了一种用于治疗、减轻或预防与替代途径补体激活相关的病症的方法，所述方法包括向有需要的个体施用治疗有效量的根据本发明的核酸或载体。还提供了一种用于治疗、减轻或预防与替代途径补体激活相关的病症的方法，所述方法包括向有需要的个体施用治疗有效量的根据本发明的药物组合物。在一些实施方案中，所述病症选自由以下组成的组：非典型溶血性尿毒综合征(aHUS)、阵发性夜间血红蛋白尿症(PNH)、年龄相关性黄斑变性(AMD)、膜性增生性肾小球肾炎(MPGN)。如本文所使用，“个体”是具有补体系统作为其免疫系统的一部分的人或动物(例如，哺乳动物)。在一个特定实施方案中，所述个体是人。在一些实施方案中，用于本发明方法的抗体是抗体或其片段，诸如Fab、Fab'、F(ab)2或F(ab')2片段，其包含抗体1的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3；抗体2的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3；抗体3的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3；或抗体4的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，所述抗体或片段是单克隆人源化或嵌合抗体或片段。
可以施用含有本发明抗体、片段、核酸的组合物以进行预防性和/或治疗性治疗。在治疗性应用中，以足以抵消疾病和/或其并发症的症状的量向已经患病和/或已经显示疾病症状的个体(例如人)施用根据本发明的抗体、片段、核酸或组合物。在预防性应用中，在个体显示病症的症状前向个体施用根据本发明的抗体、片段、核酸或组合物以防止这些症状或其并发症发展。举例来说，可以用根据本发明的抗体、片段、核酸或组合物预防性地治疗携带可能或将会引起与替代补体激活相关的病症的基因突变的个体。抗体、片段、核酸或载体分子通常以治疗有效量存在于根据本发明的药物组合物中，所述治疗有效量是足以医冶与不合需要或过度的补体系统替代途径激活相关的病症的量。
出于清楚性和简要描述的目的，诸多特征在本文可以描述为本发明的相同或单独方面或者实施方案的一部分。本领域技术人员应当了解，本发明的范围可以包括具有本文描述为相同或单独实施方案的一部分的所有或一些特征的组合的实施方案。
实施例
这些实施例仅出于说明性目的提供，而不限制本文提供的权利要求书的范围。
试剂
人纯化因子H获自CompTech.(Tyler，Texas USA)。大鼠抗小鼠κ(RM19)获自Sanquin(Business Unit试剂，Sanquin，Amsterdam，Netherlands)。高效ELISA缓冲液(HPE)获自Sanquin。如之前所述(Schmidt等,2008)来产生重组FH CCP(CCP 15-18、CCP 15-19、CCP 18-20或CCP 19-10)。如先前所述来制造针对人FH的小鼠单克隆抗体(mAb)。抗IL-6.8用作同型对照物且获自Sanquin。抗C3.19可以与分子的C3d片段上的表位反应(Wolbink等,1993)。
rhFHR蛋白的表达
如先前所述(Pouw等,2015)来产生并纯化含有C末端6x组氨酸(6xHis)标签的重组人因子H相关(rhFHR)蛋白。简而言之，通过在HEK293F细胞中瞬时转染pcDNA3.1表达载体来表达蛋白质，之后使用HisTrapTM高效1ml柱(GE Healthcare Life Sciences，Freiburg，Germany)通过Ni2+亲和色谱法从上清液纯化蛋白质。使用
超离心过滤器装置(Merck Millipore，Darmstadt，Germany)过滤并浓缩rhFHR。
抗体产生
单克隆抗体FHR-1.3B4是通过以四周间隔用25μg重组人因子H相关蛋白1(FHR-1)，以含25μg rhFHR-1的蒙他尼德作为佐剂经腹膜内使BALB/c小鼠免疫而产生。在第四次加强免疫之后三天，使脾细胞与骨髓瘤细胞系SP2/0融合。通过ELISA检验杂交瘤上清液中FHR-1特异性抗体的存在。简而言之，用大鼠抗小鼠κmoAb(RM19)涂覆微量滴定板以俘获小鼠IgG抗体。通过生物素化rhFHR-1测定抗体的特异性。简而言之，通过同0.1％(v/v)与HRP结合的链霉亲和素一起在HPE中孵育30分钟来测定生物素化rhFHR-1的结合。使用含100μg/mL 3,5,3',5'-四甲基联苯胺(TMB)的0.1M乙酸钠(含有0.003％(v/v)H2O2，pH 5.5)使ELISA进一步显色。通过加入100μL H2SO4终止底物转化，并在450nm下测量吸光度，并且用Synergy 2多模式读板仪(BioTek Instruments，Winooski，VT，USA)校正540nm下的吸光度。所有ELISA步骤都以100μL/孔的最终体积进行。
通过将CDR序列移植至人生殖系抗体的框架区中来使FHR-1.3B4抗体人源化。作为人源化的结果，产生了抗体5。随后使抗体5中的某些氨基酸突变以提高对FH的结合亲和力。如表1公开的抗体1、抗体2、抗体3和抗体4是对FH表现出最高亲和力的抗体。
抗体对因子H的结合亲和力
为了测定抗体1至抗体4的结合亲和力，使用BiaCore T200(GE Healthcare)和CM5传感器芯片(GE Healthcare)，根据制造商的说明书进行表面等离子体共振(SPR)实验。简而言之，将抗体1至抗体9或抗FHR-1.3B4俘获至蛋白A或蛋白G偶联芯片上，并且使全长FH以降低的浓度流过所俘获的moAB。获自SPR实验的结合动力学提供于表2中。
表2：抗体1至抗体9的结合动力学。
如表2所示，抗体1、抗体2、抗体3和抗体4以纳摩尔或次纳摩尔亲和力结合人FH。另外，抗体1至抗体4对全长FH的结合亲和力高于FHR-1.3B4。
表位定位mAb和竞争测定
对某些单克隆抗体(mAb)的结合位点进行定位。具体来说，检验mAb对包含不同CCP结构域(CCP 15-18、CCP 15-19、CCP 18-20和CCP 19-20)的重组FH片段和全长人FH的反应性。使用包含多个CCP结构域(15-18、15-19、18-20或19-20)的重组人FH片段确定mAb(诸如表1公开的那些)的表位的位置。简而言之，将FH.07和FHR-1.3B4俘获在RM-19涂覆过的微量滴定板上以确保最佳结合构象。接下来，在板上将与100倍高浓度的指定未标记重组FH片段混合的生物素化FH孵育1小时。通过同0.01％(v/v)与聚HRP结合的链霉亲和素一起在HPE中孵育30分钟来测定生物素化FH的结合。如先前所述使ELISA进一步显色。发现FH.07和FHR-1.3B4结合人FH的CCP 18。
使用表1公开的抗体或片段的竞争测定用激动性抗FH抗体FH.07进行。为了确定表1公开的人源化抗FHR-1mAb是否会与FH.07竞争结合FH，使用与上述类似的设置。简而言之，将mAb直接涂覆至板上并且如先前所述通过ELISA评价不存在或存在10倍高浓度的指定mAb时生物素化FH(FH-bt)的结合。发现FHR-1.3B4与FH.07竞争。
LPS上的C3沉积
为了研究抗体1至抗体4是否影响FH的替代途径抑制，对LPS进行了C3沉积测定。简而言之，用含伤寒沙门氏菌(Salmonella typhosa)LPS(40μg/mL，L-6386Sigma-Aldrich)的PBS涂覆96孔微量滴定板(Nunc)，在室温下过夜。使用LPS激活补体的替代途径。用PBS+0.1％(w/v)Tween-20，10％(v/v)对板进行洗涤。在含有0.05％(w/v)明胶、5mM MgCl2、10mMEGTA和0.1％(w/v)Tween-20的佛罗那缓冲液(VB；3mM巴比妥、1.8mM巴比妥钠、145mM NaCl，pH 7.4)中，在存在或不存在指定浓度的抗FH/抗FHR-1mAb(抗体1至抗体4或FHR-1.3B4)、同型对照物或作为阴性对照物的aIL6-8 AB的情况下孵育正常人血清(NHS，最终浓度为10％(v/v))。用生物素化mAb抗C3.19(0.55μg/mL，在HPE中)检测C3b沉积，继而同0.01％(v/v)与聚HRP结合的链霉亲和素一起在HPE中孵育30分钟。如上所述使ELISA显色。表3描述了抗体1至抗体4和FHR-1.3B4的IC50值。表4描述了抗体1至抗体4的IC50值(2次重复实验)。
表3：抗体1至抗体4和FHR-1.3B4的IC50值。
| 抗体 | μg/ml | nM |
| 1 | 2.26 | 15.07 |
| 2 | 2.82 | 18.79 |
| 3 | 3.47 | 23.12 |
| 4 | 3.51 | 23.4 |
| FHR-1.3B4 | 5.7 | 38.01 |
表4：抗体1至抗体4的IC50值。
如表3和表4中所示，抗体1至抗体4抑制LPS上的C3b沉积。这表明加入抗体1、2、3或4增强了FH对替代途径激活的抑制功能。另外，如表3所示，抗体1至抗体4在抑制LPS上的C3b沉积方面比FHR-1.3B4更有效，如较低IC50值所表明。
SRBC溶血测定
为了研究抗体1至抗体4对因子H的功能的影响，一般如Sanchez-Corral等(2004)和Wouters等(2008)先前所述进行溶血测定。简而言之，将含有20μg/ml抗FH.09(针对FH的阻断抗体)的预稀释人血清(20％，v/v)与指定mAb(抗体1至抗体4或FHR-1.3B4)一起预孵育，并且在含5mM MgCl2和10mM EGTA的VB或含10mM EDTA的VB(作为空白)中以1:1比率与绵羊红细胞(SRBC)混合，以达到10％(v/v)血清和1.05*108个细胞/ml的最终浓度，然后在振荡的同时在37℃下孵育75分钟。通过加入100μl含20mM EDTA的冰冷VB，然后离心(2.5分钟，1,800RPM/471RCF，7℃)来终止溶解。溶血测量为上清液在412nm下的吸光度，针对在690nm下测量的背景吸光度进行校正，并表示为占100％溶解对照物(与0.6％(w/v)皂苷一起孵育的SRBC)的百分比。作为阴性对照，将SRBC与稀释于补充有10mM EDTA的VB中的血清一起孵育以防止补体激活。
使用Graphpad prism 7.04由使用各种抗体(诸如表1公开的那些)的多次实验计算溶血的IC50，并通过普通单因子ANOVA和邓奈特(Dunnett)氏多重比较检验进行统计比较。表5描述了抗体1至抗体4和FHR-1.3B4的IC50值。表6描述了抗体1至抗体4的IC50值(2次重复实验)。
表5：抗体1至抗体4和FHR-1.3B4的IC50值。
| ug/ml | nM | |
| 抗体 | ||
| 1 | 10.6 | 70.7 |
| 2 | 10.1 | 67.3 |
| 3 | 9.4 | 62.7 |
| 4 | 11.5 | 76.7 |
| FHR-1.3B4 | 11.4 | 76 |
表6：抗体1至抗体4的IC50值。
| μg/ml | nM | μg/ml | nM | |
| 抗体 | ||||
| 1 | 10.7 | 71.33 | 10.9 | 72.67 |
| 2 | 11.45 | 76.33 | 10.4 | 69.33 |
| 3 | 11.1 | 74 | 9.1 | 60.67 |
| 4 | 11.47 | 76.47 | 11.78 | 78.53 |
如表5和表6所示，抗体1至抗体4抑制了SRBC溶解。另外，如表6所示，抗体1至抗体3在抑制SRBC溶解方面比FHR-1.3B4更有效，如较低IC50值所表明。
存在抗FH抗体时因子H对C3b的结合亲和力
使用Biacore T200仪器(GE Healthcare，Little Chalfont，UK)，通过表面等离子体共振来测定存在抗体1至抗体4(诸如表1公开的那些)时FH与C3b的结合。具体来说，使用标准胺偶联将纯化的C3b(Complement Technologies)固定至CM5 Biacore传感器芯片(GEHealthcare)的流动池上。其余流动池用作参考表面，并且通过在不加入任何蛋白质的情况下进行偶联反应加以调理。在与C3b偶联之后获得了2000个应答单位(RU)的应答。在37℃下使用10μl/min的流速并且在补充有0.01％(w/v)Tween-20(Merck)的磷酸盐缓冲生理盐水pH 7.4(PBS，Orphi Farma)(PBS-T)中进行了SPR实验。
为了在不干扰经由moAb进行的可能的交联的情况下确定抗体的作用，使用重组产生的mAb(抗体1至抗体4)Fab'片段。将Fab'片段与血浆纯化的FH(pdFH)混合。在不存在或存在10μM(至少2倍摩尔比过量)的抗FHR-13B4 Fab'片段或抗体1至抗体4的Fab'片段的情况下，以不同的浓度(10-0,01953μM用于单独FH；而5-0,01953μM用于与moAb Fab'片段复合时)将FH注入芯片上，持续60秒。还在未加入FH的情况下注入各个Fab′片段，以测定Fab′片段与表面的任何相互作用。pdFH注射后解离60秒，并在各个循环之间通过单次注射1M NaCl(Merck)使表面再生。
使用Scrubber 2(Biologic Software)分析数据，并通过平衡分析来测定亲和力。表7列出了抗体1至抗体4的结合动力学。
表7：抗体1至抗体4(Fab′片段)的结合动力学。
| 名称 | K<sub>D</sub>(所用重复实验次数) |
| pdFH | 1.3μM(2) |
| pdFH+FHR-1.3B4(Fab′片段) | 299nM(9) |
| pdFH+抗体1(Fab′片段) | 273nM(7) |
| pdFH+抗体2(Fab′片段) | 284nM(7) |
| pdFH+抗体3(Fab′片段) | 336nM(9) |
| pdFH+抗体4(Fab′片段) | 292nM(8) |
如表7中所示，加入抗体1至抗体4的Fab′片段增加了C3b涂覆过的表面上的应答，表明抗体1至抗体4增强了pdFH与C3b的结合。
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以引用的方式并入
本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请都以引用的方式并入在此，达到与如同具体地且个别地指出每一个别出版物、专利或专利申请是以引用的方式并入相同的程度。
等效方案
本发明可以在不脱离其精神或基本特征的情况下以其他具体形式实施。上述实施方案因此在所有方面被视为说明性的，而非限制本文所述的本发明。本发明的范围因此由所附权利要求书而非由上述发明描述指定，并且处于权利要求书等效方案的含义和范围内的所有变化都希望涵盖在其中。
Claims (37)
1.一种分离的合成或重组抗体或其抗原结合片段，其特异性结合至因子H(FH)的补体控制蛋白结构域18(CCP18)，并且包含：
-轻链CDR1序列，其包含序列SSVTY(SEQ ID NO:1)或序列TSVTY(SEQ ID NO:13)；
-轻链CDR2序列，其包含序列ATS(SEQ ID NO:2)或序列ASS(SEQ ID NO:14)；
-轻链CDR3序列，其包含序列QHRSSSNPLT(SEQ ID NO:3)；
-重链CDR1序列，其包含序列GFSLTNYG(SEQ ID NO:5)；
-重链CDR2序列，其包含序列VWSGGTT(SEQ ID NO:6)或序列IWSGGTT(SEQ ID NO:10)；以及
-重链CDR3序列，其包含序列ARNFGNYAMDY(SEQ ID NO:7)或序列ARNFGNYAMDF(SEQ IDNO:11)。
2.根据权利要求1所述的抗体或片段，其包含：
-轻链CDR1序列，其包含序列SSVTY(SEQ ID NO:1)；
-轻链CDR2序列，其包含序列ATS(SEQ ID NO:2)；
-轻链CDR3序列，其包含序列QHRSSSNPLT(SEQ ID NO:3)；
-重链CDR1序列，其包含序列GFSLTNYG(SEQ ID NO:5)；
-重链CDR2序列，其包含序列IWSGGTT(SEQ ID NO:10)；以及
-重链CDR3序列，其包含序列ARNFGNYAMDF(SEQ ID NO:11)。
3.根据权利要求1所述的抗体或片段，其包含：
-轻链CDR1序列，其包含序列SSVTY(SEQ ID NO:1)；
-轻链CDR2序列，其包含序列ATS(SEQ ID NO:2)；
-轻链CDR3序列，其包含序列QHRSSSNPLT(SEQ ID NO:3)；
-重链CDR1序列，其包含序列GFSLTNYG(SEQ ID NO:5)；
-重链CDR2序列，其包含序列VWSGGTT(SEQ ID NO:6)；以及
-重链CDR3序列，其包含序列ARNFGNYAMDY(SEQ ID NO:7)。
4.根据权利要求1所述的抗体或片段，其包含：
-轻链CDR1序列，其包含序列TSVTY(SEQ ID NO:13)；
-轻链CDR2序列，其包含序列ASS(SEQ ID NO:14)；
-轻链CDR3序列，其包含序列QHRSSSNPLT(SEQ ID NO:3)；
-重链CDR1序列，其包含序列GFSLTNYG(SEQ ID NO:5)；
-重链CDR2序列，其包含序列VWSGGTT(SEQ ID NO:6)；以及
-重链CDR3序列，其具有序列ARNFGNYAMDY(SEQ ID NO:7)。
5.根据权利要求1所述的抗体或片段，其包含：
-轻链CDR1序列，其包含序列TSVTY(SEQ ID NO:13)；
-轻链CDR2序列，其包含序列ASS(SEQ ID NO:14)；
-轻链CDR3序列，其包含序列QHRSSSNPLT(SEQ ID NO:3)；
-重链CDR1序列，其包含序列GFSLTNYG(SEQ ID NO:5)；
-重链CDR2序列，其包含序列IWSGGTT(SEQ ID NO:10)；以及
-重链CDR3序列，其包含序列ARNFGNYAMDF(SEQ ID NO:11)。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体或片段，其中所述抗体或片段对FH的结合亲和力以KD计为2.5×10-8M或更低和/或对包含CCP18-20的FH片段的结合亲和力以KD计为0.1×10-9M或更低，或者其中所述抗体或片段对FH的结合亲和力以KD计为1.25×10-8M或更低和/或对包含CCP18-20的FH片段的结合亲和力以KD计为0.04×10-9M或更低。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体或片段，其中所述抗体或片段对FH的结合亲和力以KD计为2.5×10-8M或更低和/或对包含CCP18-20的FH片段的结合亲和力以KD计为0.1×10-9M或更低，或者其中所述抗体或片段对FH的结合亲和力以KD计为0.6×10-8M或更低和/或对包含CCP18-20的FH片段的结合亲和力以KD计为0.6×10-11M或更低。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的抗体或片段，其中所述抗体或片段：
-在存在10％(v/v)血清时抑制体外脂多糖上的C3沉积，其中IC50值为38nM或更低，诸如IC50值为30nM或更低；和/或
-在存在10％(v/v)血清时抑制体外溶血活性，其中IC50值为150nM或更低，诸如IC50值为130nM或更低；和/或
-使体外FH对C3b的KD降低(使结合亲和力增加)到至多2μM和/或使体外FH对C3b的结合亲和力增加至少3倍。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的抗体或片段，其包含：
-可变轻链序列，其包含与SEQ ID NO:4或16具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列；
-可变重链序列，其包含与SEQ ID NO:8或12具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的抗体或片段，其包含：可变轻链序列，其包含与SEQ ID NO:4具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列；和可变重链序列，其包含与SEQ ID NO:8具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。
11.根据权利要求1至9中任一项所述的抗体或片段，其包含：可变轻链序列，其包含与SEQ ID NO:4具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列；和可变重链序列，其包含与SEQ ID NO:12具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。
12.根据权利要求1至9中任一项所述的抗体或片段，其包含：可变轻链序列，其包含与SEQ ID NO:16具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列；和可变重链序列，其包含与SEQ ID NO:8具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。
13.根据权利要求1至9中任一项所述的抗体或片段，其包含：可变轻链序列，其包含与SEQ ID NO:16具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列；和可变重链序列，其包含与SEQ ID NO:12具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的抗体或片段，其中所述抗体或片段增强了FH活性，任选地，其中所述FH活性是抑制替代补体激活，进一步任选地，其中抑制替代补体激活包括：
-抑制溶血活性；
-抑制补体组分3(C3)沉积；和/或
-增加FH与C3b、iC3b和/或C3d的结合。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的抗体或片段，其中所述抗体或片段包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，而且还包含免疫球蛋白重链恒定区和免疫球蛋白轻链恒定区。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的抗体或片段，其中所述抗体或片段包含Fab片段。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的抗体或片段，其中所述抗体或片段是单克隆的。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的抗体或片段，其中所述抗体或片段包含人轻链和重链恒定区。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的抗体或片段，其中所述抗体或片段被PEG化。
20.根据权利要求19的抗体或片段，其中所述抗体或片段是PEG化Fab片段。
21.一种分离的合成或重组核酸，其包含编码根据权利要求1至20中任一项所述的抗体或片段的核酸序列。
22.一种载体，其包含根据权利要求21所述的核酸。
23.如权利要求22所述的载体，其中所述载体是AAV载体。
24.如权利要求23所述的载体，其中所述AAV载体选自由以下组成的组：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12。
25.一种重组细胞，其包含根据权利要求21所述的核酸或根据权利要求22至24中任一项所述的载体。
26.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至20中任一项所述的抗体或片段、根据权利要求21所述的核酸、根据权利要求22至24中任一项所述的载体或根据权利要求25所述的重组细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。
27.根据权利要求1至20中任一项所述的抗体或片段、根据权利要求21所述的核酸、根据权利要求22至24中任一项所述的载体、根据权利要求25所述的重组细胞、或根据权利要求26所述的药物组合物，其用于疗法中。
28.根据权利要求1至20中任一项所述的抗体或片段、根据权利要求21所述的核酸、根据权利要求22至24中任一项所述的载体、根据权利要求25所述的重组细胞、或根据权利要求26所述的药物组合物，其用于抑制替代补体激活。
29.根据权利要求1至20中任一项所述的抗体或片段、根据权利要求21所述的核酸、根据权利要求22至24中任一项所述的载体、根据权利要求25所述的重组细胞、或根据权利要求26所述的药物组合物，其用于治疗、减轻或预防与替代途径补体激活相关的病症。
30.根据权利要求29所使用的抗体或片段、核酸、重组细胞或药物组合物，其中所述病症选自由以下组成的组：非典型溶血性尿毒综合征(aHUS)、阵发性夜间血红蛋白尿症(PNH)、年龄相关性黄斑变性(AMD)、膜性增生性肾小球肾炎(MPGN)和IgA肾病。
31.一种根据权利要求1至20中任一项所述的抗体或片段、根据权利要求21所述的核酸、根据权利要求22至24中任一项所述的载体、根据权利要求25所述的重组细胞、或根据权利要求26所述的药物组合物的用途，其用于制备供治疗、减轻或预防与替代途径补体激活相关的病症用的药物。
32.根据权利要求31所述的用途，其中所述病症选自由以下组成的组：非典型溶血性尿毒综合征(aHUS)、阵发性夜间血红蛋白尿症(PNH)、年龄相关性黄斑变性(AMD)、膜性增生性肾小球肾炎(MPGN)和IgA肾病。
33.一种治疗、减轻或预防与替代途径补体激活相关的病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至20中任一项所述的抗体或片段、根据权利要求21所述的核酸、根据权利要求22至24中任一项所述的载体、根据权利要求25所述的重组细胞、或根据权利要求26所述的药物组合物。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述病症选自由以下组成的组：非典型溶血性尿毒综合征(aHUS)、阵发性夜间血红蛋白尿症(PNH)、年龄相关性黄斑变性(AMD)、膜性增生性肾小球肾炎(MPGN)和IgA肾病。
35.一种抑制替代补体激活的方法，所述方法包括向受试者施用根据权利要求1至20中任一项所述的抗体或片段、根据权利要求21所述的核酸、根据权利要求22至24中任一项所述的载体、根据权利要求25所述的重组细胞、或根据权利要求26所述的药物组合物。
36.一种产生抗体或片段的方法，所述方法包括向细胞提供根据权利要求21所述的核酸或根据权利要求22至24中任一项所述的载体，以及允许所述细胞翻译所述核酸或所述载体包含的核酸序列，从而产生根据权利要求1至20中任一项所述的抗体或片段。
37.根据权利要求36所述的方法，其还包括收集、纯化和/或分离所述抗体或片段。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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