CN107074939A

CN107074939A - H因子增强抗体及其用途

Info

Publication number: CN107074939A
Application number: CN201580053289.6A
Authority: CN
Inventors: 塔卡·威廉·库依普斯; 黛安娜·武泰; 玛利亚·克莱尔·布劳威尔; 理查德·本杰明·普维
Original assignee: Stichting Sanquin Bloedvoorziening
Current assignee: Stichting Sanquin Bloedvoorziening
Priority date: 2014-08-20
Filing date: 2015-08-20
Publication date: 2017-08-18
Anticipated expiration: 2035-08-20
Also published as: KR102709811B1; IL250667B1; BR122023020102A2; BR112017003200B1; CN107074939B; US10112993B2; CA2958537A1; CA2958537C; US20170355753A1; WO2016028150A1; ES2739609T3; BR112017003200A2; MX2017002277A; AU2015304079B2; EP3183266A1; JP2017525362A; EP3183266B1; IL250667B2; JP6965157B2; JP2021178857A

Abstract

本发明涉及对H因子特异性的分离的、合成的或重组的抗体以及它们的片段。本发明还涉及这种抗体和片段用于抑制补体激活和治疗与补体激活相关的病症的用途。

Description

H因子增强抗体及其用途

技术领域

本发明涉及免疫学和医学领域。特别地，本发明涉及H因子特异性抗体(factor Hspecific antibody)及其用途。

背景技术

补体系统是先天免疫的重要元素，其有助于保护诸如哺乳动物的许多生物体抵抗入侵的病原体。补体系统由超过30种主要在肝脏中合成的不同成分组成。补体系统的激活通过三种不同途径发生，经典途径(classical pathway)、凝集素途径(lectin pathway)和旁路途径(alternative pathway)。三种途径在形成C3转化酶时收敛(converge)，其对于每种途径是不同的，但具有相似的活性。

在经典补体途径中，由C1q、C1r和C1s组成的补体成分(C)1复合物的激活在结合至抗体-抗原复合物时发生。C1复合物切割C4和C2，导致由C4bC2a组成的C3转化酶的形成。C3转化酶将C3切割成活性组分C3a和C3b。在凝集素途径中，甘露糖结合凝集素结合至病原体表面上的甘露糖残基，其激活能够切割C4和C2的丝氨酸蛋白酶MASP-1和MASP-2。如在经典途径中，这导致C4bC2a C3转化酶的形成。该C3转化酶可以结合C3b以形成C5转化酶。与经典和凝集素途径相反，旁路途径由于血浆中C3到C3(H₂O)的自发水解而具有低水平的连续活性。该C3b样C3(H₂O)可通过结合因子B(FB)形成液相C3转化酶，其进而被因子D激活成Bb。类似地，当C3b结合至表面时，它可结合FB以形成C3bB。该复合物被D因子切割为C3bBb，它是可被备解素(properdin)(P因子)稳定至C3bBbP的旁路途径的C3转化酶。该C3转化酶能够将C3切割成C3a和C3b。除了该过程，旁路途径充当经典和凝集素激活途径的扩增环(amplification loop)，因为在这些途径中产生的C3b可充当旁路途径的起始点。由此，扩增环导致经典和凝集素途径的增强。在三种激活途径之一中形成的C3转化酶可结合C3b以形成C5转化酶。所有三种补体途径的C5转化酶将C5激活为C5a和C5b，其启动补体系统的末端途径(terminal pathway)。C5b结合C6、C7、C8和C9以形成膜攻击复合物(MAC)，其形成跨膜通道并引起细胞溶解。

在病原体的膜中形成孔之后，补体通过使用C3b分子的调理作用(opsonisation)和产生促炎肽诸如C3a和C5a(其吸引并激活免疫细胞到感染部位)帮助清除病原体或变异的自身细胞(altered self-cell)。由于补体的强促炎性质，宿主细胞被多种膜和可溶性补体调节蛋白良好地保护。

旁路途径促成80-90％的总补体活性。因此，该途径的调节至关重要。通常，如果通过C3和C3b的自发水解形成的C3(H₂O)不被病原体结合，则被H因子(FH)、I因子(FI)和宿主细胞表面分子快速失活，从而抑制C3转化酶的形成。CD55(也称为衰变加速因子或DAF)在宿主细胞表面结合C3b。FI将C3b切割成无活性形式，但依赖于在细胞表面上表达(CD46，MCP)或在血浆(FH)中循环的辅因子。Fh是血浆糖蛋白，其对于控制在溶液中和在细胞表面上的补体的旁路途径是重要的。FH在与FB相同的位置结合C3b，从而防止C3转化酶的形成。Fh还具有衰变加速活性，即一旦它们被形成，它就促进旁路途径C3转化酶的解离。FH是否结合C3b由存在于细胞表面上的碳水化合物决定。存在于宿主细胞表面上的唾液酸、糖胺聚糖和肝素促进FH与C3b的结合，而C3b与病原体表面上表达的分子的结合导致FB的结合。因此，FH在宿主细胞上而不是在致病细胞(pathogenic cell)的表面上发挥其补体抑制活性，因为结合FH的细胞表面分子在宿主细胞上表达，但通常不在致病细胞上表达。

FH缺陷或由于突变所致的宿主表面识别受损与补体介导的组织损伤和疾病有关。在正常止血期间控制补体激活之后，FH还在限制病变细胞和组织的补体介导的损伤中起重要作用。已经描述了FH基因中的多种突变，其可能导致FH蛋白的功能丧失。FH的C-端区域是疾病突变的热点。这是FH与宿主细胞结合的关键区域。该区域中大多数疾病相关的突变干扰FH结合。大多数具有突变的FH基因的患者具有杂合突变(heterozygous mutation)，意味着约一半的循环FH具有正常功能。然而，这显然不足以在其中补体被激活的某些条件下保护自身表面。FH缺陷可能导致肾脏疾病，例膜性增生性肾小球肾炎(MPGN)和非典型溶血尿毒综合征(aHUS)。最近，已经描述了FH突变和年龄相关性黄斑病(AMD)之间的关系。

目前，对于诸如aHUS中的FH缺陷的标准治疗是血浆补充或血浆置换疗法。使用这种疗法补充缺陷型补体调控因子。此外，血浆置换疗法清除了针对补体因子的突变补体因子和/或自身抗体。然而，血浆疗法也有一些限制。没有前瞻性临床研究显示血浆置换疗法在治疗aHUS中是安全或有效的，并且血浆疗法的疗效可能依赖潜在的突变。一些患者对新鲜冷冻血浆形成过敏反应，这可能需要停止任何形式的血浆疗法。此外，由于给予血浆源性活性致病性补体成分，血浆置换可能使aHUS的临床表现恶化。

最近，在多个国家(其中有美国和欧洲国家)中，治疗性单克隆抗体艾库组单抗(eculizumab)已被批准用于治疗aHUS和阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)。艾库组单抗(Eculizumab)是针对C5特异性的人源化小鼠单克隆抗体，其防止C5裂解为C5a和C5b。因此，它防止末端途径的激活并减少免疫细胞的流入。然而，艾库组单抗(eculizumab)的使用与不期望的副作用相关。因为它阻断C5(其是引发末端途径的关键组分)，用艾库组单抗(eculizumab)治疗的患者变得易于被荚膜细菌(例如，脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis))感染，其清除非常依赖于MAC形成。因此，在接受用艾库组单抗(eculizumab)治疗之前，要求患者接受针对脑膜炎球菌(meningococcus)的疫苗接种。此外，由于艾库组单抗(eculizumab)作用于C3的下游，维持C3沉积，这在涉及不期望的或过度的补体激活的多种病症中是有害的。此外，艾库组单抗(eculizumab)治疗涉及到高成本，并且抗体的可得性有限。

结合CCP18的小鼠单克隆抗体由Cheng等人(Clinical Chemistry,2005)进行描述。据描述，称为X52.1的该抗体增加FH与C3b和C3d的结合，其被认为是由FH的二聚引起的。由X52.1诱导的FH与C3b和C3d的结合增加导致补体介导的细胞裂解增加，包括RBC和多种类型的癌细胞，如由Corey等人(J Biol Chem.2000)所证实的。这表明抗体X52.1抑制FH的补体抑制活性。事实上，Corey等人表明抗体可以通过增强补体介导的癌细胞裂解用于治疗癌症。

鉴于上述，因此仍需要改善与不期望的或过度的补体激活相关的病症的疗法。

发明内容

本发明的一个目的是提供针对与补体系统的旁路途径的不希望的或过度激活相关的疾病的治疗策略，其克服了这种疾病的当前治疗策略的缺点。本发明的另一个目的是提供可用于治疗这类疾病的抗体，所述抗体具有比当前可用的抗体改善的性质。本发明的抗体及其片段对FH是特异性的，并且增强FH的功能，从而特异性抑制旁路补体途径的激活。

本发明提供了特异性结合至H因子(FH)的补体调控蛋白结构域(complementcontrol protein domain)17(CCP17)和/或CCP18并且增强FH活性的分离的，合成的或重组的抗体或其片段。

本发明人首次开发并分离了能够特异性结合FH的抗体，其能够增强FH的功能。本发明的增强抗FH抗体是旁路补体途径的激活的有效抑制剂。不希望受理论束缚，认为该增强作用不依赖抗体对FH分子的多聚化。如实例中所证实的，抗FH增强抗体抑制或甚至完全阻断用健康人供体血清孵育的红细胞的裂解。在正常条件下，用健康人供体血清孵育绵羊红细胞(SRBC)不导致SRBC的裂解，因为它们受在SRBC表面上与唾液酸结合的血清中的H因子保护。当用阻断FH功能的单克隆抗体孵育正常人血清时，观察到SRBC的裂解。这可通过血清FH对细胞表面的保护不足来解释。由抗FH阻断抗体诱导的这种裂解被本发明的-FH增强抗体抑制或甚至阻断。实例进一步显示本发明的增强抗FH抗体抑制酵母聚糖和脂多糖(LPS)上的旁路途径介导的C3沉积。进一步发现，增强抗FH抗体恢复来自3位无关的aHUS患者的血清中FH的保护功能。如实例中进一步证明的，当用本发明的增强抗FH抗体预孵育血清时，在aHUS患者血清的存在下，孵育的红细胞的裂解被完全消除。

实例进一步证明，不仅完整的抗FH抗体增强FH的功能。对于这种抗体的Fab’和F(ab’)₂片段，观察到相同的效果。由于Fab’不能交联FH分子，因此抗体和抗体片段的增强作用不能是这种交联的结果。然而，实例确实证明抗FH抗体及其片段能够抑制C3沉积，表明测试的片段能够增加FH与C3b、iC3b和C3d的结合。不受理论的束缚，因此认为增强抗FH抗体与FH的结合导致FH的构象变化，其导致细胞表面上的FH与C3b、iC3b和C3d的结合增加。

根据本发明的增强抗FH抗体和片段高度优于诸如艾库组单抗(eculizumab)的抗C5抗体，用于抑制补体系统的旁路途径的不期望的或过度的激活。主要优点是本发明的抗体和片段的补体抑制作用在激活的C3而不是C5的水平上干扰补体激活，并且该干扰通过增强天然存在的抑制剂而发生。因此，仅当C3被激活时才发生对C3的干扰。相反，对于一般的C3抑制剂，所有循环C3都被阻断，这可能导致一般的C3缺陷。尽管C3(例如，作为艾库组单抗(eculizumab)的靶标的C5)参与补体系统的所有三种途径，但FH特异性抑制旁路途径的扩增环，其中将C3切割成C3b，并且其随后在细胞表面与FB结合，并且C3转化酶的形成促进另外的C3分子切割成C3b。本发明的抗体和片段干扰C3水平的补体激活的事实的主要优点是避免了C3b在表面上的累积和C3a的释放。相反，如果补体激活在C5水平被诸如艾库组单抗(eculizumab)抑制，则C3b的积累和C3a的释放不受抑制。C3b用作调理素(opsonin)，且C3a是过敏毒素(anaphylatoxin)。因此，优选防止C3b和C3a形成的积累，因为这些过程导致免疫细胞的吸引和靶标的调理吞噬作用(opsonophagocytosis)。这意味着例如接受艾库组单抗(eculizumab)的PNH患者仍然需要输血，因为C3b的积累导致红细胞的调理作用，其随后在肝和脾中被清除。此外，用抗C5抗体的治疗导致C3b和C3a形成在细胞上的积累，否则其将被MAC裂解。抗C5抗体的一个重要缺点是患者对于感染变得脆弱，因为抗体也干扰由病原体诱导的补体激活。通过靶向保护宿主细胞的补体系统的调控因子，避免这种情况。

如本文所用的，术语“抗体”是指包含至少一种与轻链可变区(VL)配对的重链可变区(VH)的免疫球蛋白，其对靶表位是特异性的。该术语涵盖多克隆和单克隆抗体。它是指特异性结合FH的CCP17和/或CCP18，优选地CCP18，包括全长免疫球蛋白的任何形式的抗体。根据本发明的抗体或其片段包含至少一个抗原结合位点。如本文所用的，术语“抗原结合位点”是指包含至少一个CDR序列，优选地至少两个CDR序列，更优选地至少三个CDR序列的抗体或其片段的位点。例如，抗原结合位点包含轻链CDR 1-3或重链CDR 1-3。特别优选的抗原结合位点包括轻链CDR1-3和重链CDR 1-3。“抗体片段”在本文中被定义为具有至少一种在种类上而不一定是数量上的与所述抗体的共有性质的部分。片段能够特异性结合与所述抗体相同的抗原，即FH的CCP17和/或CCP18，尽管不必具有相同的程度。抗体的片段包含所述抗体的至少一个CDR序列。所述片段优选包含抗体的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及所述抗体的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。抗体片段的非限制性实例是单结构域抗体、单链抗体、纳米抗体(nanobody)、单抗体(unibody)、单链可变片段(scFv)、Fab片段、Fab’片段、F(ab’)₂片段和F(ab)₂片段。抗体的优选片段包含至少重链可变结构域(VH)和/或轻链可变结构域(VL)。更优选的片段包含至少Fab片段。如实例中所证实的，本发明的增强性抗FH抗体的Fab’片段保留增强FH功能的能力。特别优选的片段是根据本发明的抗体的Fab片段、Fab’片段、F(ab’)₂片段和F(ab)₂片段。

如技术人员所熟知的，抗体含有两条重链和两条轻链。抗体的重链是构成免疫球蛋白分子的两种类型链中的较大的。重链包含恒定结构域和可变结构域，该可变结构域参与抗原结合。抗体的轻链是构成免疫球蛋白分子的两种类型链中的较小的。轻链包含恒定结构域和可变结构域。轻链的可变结构域通常但不总是与参与抗原结合的重链的可变结构域一起。互补决定区(CDR)是存在于重链可变结构域和轻链可变结构域中的高可变区(hypervariable region)。在全长抗体的情况下，重链的CDR 1-3和连接的轻链的CDR 1-3一起形成抗原结合位点。

氨基酸序列或核酸序列的一致性百分比，或术语“％序列一致性”在本文中被定义为在比对两个序列之后，与参考氨基酸序列或核酸序列中残基一致的氨基酸序列或核酸序列的全长的残基的百分比，并且如果必要，引入间隙(gap)以实现最大百分比一致性。用于比对的方法和计算机程序是本领域公知的，例如“比对2(Align 2)”。

根据本发明的抗体和片段特异性结合FH的CCP17和/或CCP18。优选的抗体和片段至少结合FH的CCP18。FH是在血浆中循环的155千道尔顿(kDa)可溶性糖蛋白。FH含有20个补体调控蛋白(CCP)结构域，编号为1-20，起始于FH的N端。CCP结构域也被称为短共有重复序列(short consensus repeat)(SCR)或sushi结构域。CCP1-4是参与调节的结构域，且CCP19-20参与结合C3b，并且CCP6、7、8、19和20结合在细胞表面表达的GAG和唾液酸。结合CCP19和/或CCP20的抗体抑制FH的活性。不受理论的束缚，人们认为结合位于结合结构域CCP19和CCP20附近的结构域的抗体(即CCP17和CCP18)增强FH的活性。实际上，如在实例中所证明的，结合CCP18的抗体增强FH的功能。如本文所用的，术语“特异性”和“特异性结合”或“能够特异性结合”是指抗体与它的表位之间的非共价相互作用。这表明抗体或片段优先结合所述表位而不是其他表位或其它抗原。因此，尽管抗体或片段可非特异性地结合至其他表位或抗原，但所述抗体或片段对它的表位的结合亲和力显著高于所述抗体或片段对任何其他表位或抗原的结合亲和力。

根据本发明的抗体和片段能够增强FH的活性，优选地人FH的活性。术语“增强FH活性”是指如果根据本发明的抗体或片段结合至FH，则FH的活性增加。尽管特异性结合FH的抗体是已知的，但这些抗体主要用于FH的检测，例如在免疫测定中。此外，已经描述了阻断或抑制它的功能的FH特异性抗体。本发明人首次开发了FH特异性抗体，其在结合FH时增强它的功能。令人惊讶地发现，本发明的增强抗FH抗体的活性增加FH的补体抑制活性。可在体外或体内增强所述FH活性。优选地，由本发明的抗体和片段增强的FH的活性是优选地对个体中的旁路补体激活的抑制。如本文所用的，术语“旁路补体激活”是指通过旁路途径激活补体系统，即涉及至少旁路途径的C3转化酶的形成(即C3bBb/C3bBbP)，或涉及增加该C3转化酶的形成。旁路补体激活可进一步包括通过旁路途径C3转化酶将C3切割成C3a和C3b，旁路途径C5转化酶的形成(即C3bBbC3b/C3bBbC3b)和/或C5的切割，以及随后C6、C7、C8和C9的结合以形成MAC。旁路补体激活可进一步包括旁路途径扩增环的增加。所述旁路补体激活优选地在个体中，优选地在个体的体液中，优选地在血液、间质液或脑脊液中，更优选地在血液中被抑制。如本文所用的，“个体”是包括补体系统作为它的免疫系统的一部分的人或动物。优选地，所述个体是哺乳动物，更优选地是人。

如本文所用的，“旁路补体激活的抑制”包括引起其抑制或者是其抑制的结果的旁路补体系统的成分、因子或活性的量或活性的任何改变。旁路补体激活的抑制例如包括溶血活性的抑制、在所述个体的细胞上的补体成分3(C3)沉积的抑制、FH与C3b、iC3b和/或C3d的结合的增加、旁路补体途径C3转化酶C3bBb/C3bBbP的形成的抑制、B因子与C3b的结合的抑制和/或C3b和B因子之间的相互作用的抑制、通过旁路途径C3转化酶将C3切割成C3a和C3b的抑制、FH与宿主细胞且特别是与宿主细胞上表达的唾液酸、糖胺聚糖和/或肝素的结合的增加、旁路补体途径的扩增环的抑制和旁路补体途径C5转化酶C3bBbC3bP/C3bBbC3bP的形成的抑制、通过旁路途径C5转化酶将C5切割成C5a和C5b的抑制、FH的衰减加速活性的增加，即一旦它们形成就促进旁路途径C3转化酶的解离，和/或导致C3b降解的FI辅因子活性的增加。通过由本发明的抗FH抗体和片段增强的FH抑制旁路补体激活优选包括溶血活性的抑制、所述个体的细胞上的C3沉积的抑制和/或FH与C3b、iC3b和/或C3d的结合的增加。

如本文所用的，“抑制”优选是指所指示的活性降低至少约25％，更优选地至少约50％，更优选地至少约75％，更优选地至少约80％，更优选地至少约85％，更优选地至少约90％，最优选地至少约95％。因此，“旁路补体激活的抑制”优选是指旁路补体途径的活性降低至少约25％，更优选地至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％。类似地，“溶血活性的抑制”优选是指溶血活性降低至少约25％，更优选地至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％。

如本文所用的，“增加”优选是指所指示的活性增加至少约25％，更优选地至少约50％，更优选地至少约75％，更优选地至少约80％，更优选地至少约85％，更优选地至少约90％，最优选地至少约95％。因此，“FH与C3b的结合的增加”优选是指FH与C3b的结合增加至少约25％，更优选地至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％。类似地，“FH与宿主细胞的结合的增加”优选是指FH与宿主细胞的结合增加至少约25％，更优选地至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％。

如本文所用的，“溶血活性”是指红细胞破裂，和细胞内容物随后释放到例如，由补体系统的激活诱导的循环中，优选地作为在细胞表面处形成MAC的结果。例如，如本文在实例中描述的通过使用Sanchez-Corral等人(2004)和Wouters等人(2008)描述的溶血测定(可选地具有一些修改)来测量溶血活性。在该测定中，例如在37℃用诸如人血清的血清将诸如绵羊红细胞(SRBC)的红细胞孵育1.25小时，同时振荡。具有低水平的FH或功能障碍的FH的血清导致SRBC的裂解。可通过加入含有20mM的EDTA的佛罗拿(veronal)缓冲液，随后在预冷的离心机(例如，7℃)中离心2.5分钟停止裂解。通过测量在412nm处测量的上清液的吸光度来测定红细胞裂解的百分比。血清可例如来自健康人个体或来自患有与不期望的或过度的旁路途径补体激活相关的病症(例如，aHUS)的人个体。可通过在抗体或片段的存在下用血清孵育红细胞来测定抗体或片段抑制溶血活性的能力。

例如，使用如本文在实例中描述的C3沉积测定法测量C3沉积的抑制。该测定包括用酵母聚糖或LPS涂覆微量滴定板(microtiterplate)。随后，在存在或不存在抗体或片段的情况下，用例如来自健康个体或来自患有与如上所述的不期望的或过度的旁路补体激活相关的病症的个体的血清孵育板。可用抗C3抗体检测酵母聚糖或LPS上的C3沉积。

例如，使用如本文在实例中描述的ELISA测量FH与C3b的结合的增加。该测定包括用C3b涂覆微量滴定ELISA板，并用例如来自健康个体或患有与如上所述的不期望的或过度的旁路补体激活相关的病症的个体的血清孵育板。可用诸如过氧化物酶标记的多克隆抗FH的抗FH抗体检测结合的FH。在用涂覆的C3b孵育之前，在抗体或片段的存在下，可通过预孵育血清来测定抗体或片段增强FH与C3b结合的能力。作为另一个实例，可使用表面等离子体共振(SPR)测定FH与C3b的结合。SPR是在无标记环境中实时测量生物分子相互作用的技术。例如，在存在或不存在(不同浓度的)本发明的抗体或片段的情况下，将诸如C3b的相互作用物之一固定至传感器表面，并将诸如FH的另一个在溶液中游离，并通过表面。

根据本发明的抗体或其片段优选是单克隆抗体或片段。单克隆抗体是由单一分子种类组成的抗体。可有利地重组产生单克隆抗体，使得获得的抗体的量显著高于抗血清中存在的多克隆抗体的情况。然而，多克隆抗体和片段也包括在本发明中。根据本发明的抗体或片段优选是嵌合的或人源化抗体。因此，优选地，所述抗体或片段包含至少人轻链和重链恒定区。更优选地，所述抗体或片段还包含重链和轻链可变区中的人构架区(humanframework region)。进一步优选的是人抗体或片段，其完全由人序列组成。使用嵌合的、人源化或人抗体优于使用非人抗体，因为使用非人抗体或片段用于治疗人类疾病受许多因素限制。人体可将非人抗体识别为外来的，这将导致针对非人抗体或片段的免疫应答，导致不利的副作用和/或抗体或片段从循环中的快速清除。当将嵌合的、人源化或人抗体给予人时，副作用的机会减少。此外，由于与非人抗体相比时清除率降低，因此当使用嵌合、人源化或人抗体时，通常实现在循环中更长的半衰期。

可通过本领域已知的各种方法制备对特定抗原特异性的抗体，例如根据本发明的FH。例如，人FH可用作诱发抗体的免疫原。作为另一个实例，人FH的CCP17和/或CCP18结构域可用作免疫原。这种方法的一个实例是通过在实例中描述的免疫和杂交瘤产生。例如，可通过免疫诸如BALB/c小鼠的小鼠，用人H因子腹膜内注射，可选地在佐剂(例如montanide)的存在下，例如以四周的间隔，产生FH的小鼠单克隆抗体。在第四次免疫后数天，可用例如，骨髓瘤细胞系SP2/0融合脾细胞。可通过ELISA测试杂交瘤的上清液中H因子特异性抗体的存在。例如，用moAb(例如，大鼠抗小鼠κmoAb RM19)涂覆微量滴定板以捕获小鼠IgG抗体。通过生物素化H因子测定抗体的特异性。提供FH特异性抗体的方法的另一个实例是通过筛选表达编码免疫球蛋白链的重组核酸序列的噬菌体展示文库。用于抗体噬菌体展示的方法已在本领域中使用并广泛描述。可使用用于免疫的相同抗原(例如，人FH或人FH的CCP17和/或CCP18结构域)进行用于抗体的文库的筛选。

一旦获得FH特异性的抗体或片段(特别是FH的CCP17和/或CCP18)，就可通过本领域技术人员已知的多种方法测试其所需的生物活性，即它们增强FH的活性的能力。如上文描述的，增强FH的活性优选包括溶血活性的抑制、细胞上C3沉积的抑制和/或FH与C3b的结合的增加。测试这些活性的功能测定在上文描述并在实例中详细描述。

根据本发明的特别优选的抗体是抗FH.07抗体，其制备和鉴定在实例中描述。表1提供了抗体抗FH.07的可变重链和轻链序列以及单独CDR序列的概述。甚至更优选的是包含抗体抗FH.07的重链CDR序列和轻链CDR序列或抗体FH.07的重链可变区和轻链可变区的单克隆嵌合或人源化抗体或其片段。如本文所用的，术语“抗FH.07”包括具有至少如表1所示的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3区的所有抗体和片段，例如分离的和/或纯化的抗体或重组产生的抗体。根据本发明的另一优选抗体或片段是与抗体抗FH.07竞争结合FH，特别是竞争结合FH的CCP18的抗体或片段。因此，还提供了特异性结合H因子(FH)的CCP17和/或CCP18，优选地CCP18的抗体或其片段，其增强FH活性，并与抗体抗FH.07竞争结合FH。可使用本领域熟知的方法测定竞争，例如通过使用Biacore T3000仪器(GE Healthcare,LittleChalfont,UK)的表面等离子体共振，由此将FH固定在传感器芯片上，并将潜在的竞争抗体流过固定的FH。基于表1的重链和轻链CDR序列，能够产生包含至少一个如表1所示的CDR序列的抗体或其片段，其对FH的CC18是特异性的。

因此，本发明进一步提供了分离的、合成的或重组的抗体或其片段，包含：

-SEQ ID NO:5的重链CDR1序列，和/或

-SEQ ID NO:6的重链CDR2序列，和/或

-SEQ ID NO:7的重链CDR3序列，和/或

-SEQ ID NO:1的轻链CDR1序列，和/或

-SEQ ID NO:2的轻链CDR2序列，和/或

-SEQ ID NO:3的轻链CDR3序列。所述抗体优选特异性结合FH的补体CCP17和/或CCP18，更优选地结合CCP18，并增强FH活性。更优选地，根据本发明的抗体或片段包含表1的所有三种重链CDR和所有三种轻链CDR。在一个实施例中，根据本发明的抗体或片段包含表1所示的重链可变区序列和/或轻链可变区序列。因此，还提供了具有SEQ ID NO:8的重链序列和/或具有SEQ ID NO:4的轻链序列的根据本发明的抗体或片段。

可选地，优化所述CDR中至少一个的序列，从而产生变体抗体，例如以提高结合亲和力、FH增强能力或体内或储存稳定性。此外，可选地，优化本发明的抗体或片段的至少一个框架区中的至少一个序列，例如以改善抗体或片段的结合效力或稳定性或在其给药于人类之后减少非人类序列的副作用。这例如通过诱变程序进行。技术人员能够产生包含至少一个改变的CDR或框架序列的抗体变体。例如，通过突变编码这种构架序列的核酸分子优化CDR和/或构架序列。例如，应用保守氨基酸取代。保守氨基酸取代的实例包括诸如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或蛋氨酸的一个疏水残基取代另一个疏水残基，以及一个极性残基取代另一个极性残基，例如精氨酸取代赖氨酸、谷氨酸取代天冬氨酸，或谷氨酰胺取代天冬酰胺。为了选择改良的抗体或片段，优选测试所得变体抗体的结合亲和力、FH增强能力和/或稳定性。优选地，人生殖系序列用于根据本发明的抗体或片段中的框架区。人生殖系序列的使用使所述抗体的免疫原性的风险最小化，因为这些序列不太可能包含对衍生框架区的个体而言是独特的体细胞改变，并且当应用于另一个人个体时可引起免疫原性应答。通常，CDR序列的最多达三个氨基酸残基可能变化，同时保留相同的特异性。因此，根据本发明的抗体或片段优选含有重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3序列，其中与表1的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3序列相比，每个CDR的至多3个，优选地至多2个，更优选地至多1个氨基酸发生改变。

因此，本发明进一步提供了分离的、合成的或重组的抗体或其片段，其包含：

-包含与SEQ ID NO:5的序列至少80％一致的序列的重链CDR1序列，和/或

-包含与SEQ ID NO:6的序列至少80％一致的序列的重链CDR2序列，和/或

-包含与SEQ ID NO:7的序列至少80％一致的序列的重链CDR3序列，和/或

-包含与SEQ ID NO:1的序列至少80％一致的序列的轻链CDR1序列，和/或

-包含与SEQ ID NO:2的序列至少80％一致的序列的轻链CDR2序列，和/或

-包含与SEQ ID NO:3的序列至少80％一致的序列的轻链CDR3序列。所述抗体优选特异性结合FH的补体CCP17和/或CCP18，更优选地结合CCP18，并增强FH活性。优选地，所述抗体或片段包含与这些序列至少85％，更优选地至少86％，更优选地至少87％，更优选地至少88％，更优选地至少89％，更优选地至少90％，更优选地至少91％，更优选地至少92％，更优选地至少93％，更优选地至少94％，更优选地至少95％，更优选地至少96％，更优选地至少97％，更优选地至少98％，更优选地至少99％一致的重链CDR1、CDR2和/或CDR3序列和/或轻链CDR1、CDR2和/或CDR3序列。

还提供根据本发明的抗体或片段，其包含或具有含有与SEQ ID NO:8的序列具有至少80％的序列一致性的序列的重链序列和/或包含或具有含有与SEQ ID NO:4的序列具有至少80％的序列一致性的序列的轻链序列，或者与这些重链或轻链可变区序列中的任何一个具有至少85％，更优选地至少86％，更优选地至少87％，更优选地至少88％，更优选地至少89％，更优选地至少90％，更优选地至少91％，更优选地至少92％，更优选地至少93％，更优选地至少94％，更优选地至少95％，更优选地至少96％，更优选地至少97％，更优选地至少98％，更优选地至少99％的一致性的序列。

本发明还提供了包含编码根据本发明的抗体或其片段的核酸序列的分离的、合成的或重组的核酸分子。优选的核酸分子编码至少如表1所示的重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3。优选地，根据本发明的核酸分子具有至少30个核苷酸，更优选地至少50个核苷酸，更优选地至少75个核苷酸的长度。优选地，根据本发明的核酸分子编码单克隆嵌合或人源化抗体或其片段，其包含如表1所示的抗体抗FH.07的重链CDR序列和轻链CDR序列或抗体抗FH.07的重链可变区和轻链可变区。编码抗体抗FH.07的重链和轻链CDR的核酸序列在表1描述。然而，包含不同于在表1中描述的CDR核酸序列的核酸序列但包含编码在表1中描述的所述重链或轻链CDR序列的氨基酸序列的核酸密码子的编码根据本发明的抗体的重链或轻链CDR的核酸分子也包括在本发明中。因此，提供了分离的、合成的或重组的核酸分子，其包含编码至少SEQ ID NO:1、2、3、5、6和7的序列的核酸序列。还提供了分离的、合成的或重组的核酸分子，其包含编码至少SEQ ID NO 4和8的序列的核酸序列。编码重链和/或轻链CDR的核酸分子或通过例如保守氨基酸取代修饰的抗体也包括在本发明中，只要编码的CDR氨基酸序列与表1所示的CDR序列具有至少80％，优选地至少85％，更优选地至少90％，更优选地至少95％的序列一致性。

根据本发明的核酸分子或核酸序列优选包含核苷酸链，更优选地DNA和/或RNA。然而，本发明的核酸分子或核酸序列可包含其他种类的核酸结构，例如DNA/RNA螺旋、肽核酸(PNA)、锁核酸(locked nucleic acid)(LNA)和/或核酶。这种其他的核酸结构被称为核酸序列的功能等同物，并且包括在本发明中。术语“核酸序列的功能等同物”还包括包含表现出与天然核苷酸相同功能的非天然核苷酸、修饰核苷酸和/或非核苷酸结构单元的链。

本发明还提供了分离的、合成的或重组的核酸分子，其包括：

-包含与SEQ ID NO:13的序列至少80％一致的序列的重链CDR1序列，和/或

-包含与SEQ ID NO:14的序列至少80％一致的序列的重链CDR2序列，和/或

-包含与SEQ ID NO:15的序列至少80％一致的序列的重链CDR3序列，和/或

-包含与SEQ ID NO:9的序列至少80％一致的序列的轻链CDR1序列，和/或

-包含与SEQ ID NO:10的序列至少80％一致的序列的轻链CDR2序列，和/或

-包含与SEQ ID NO:11的序列至少80％一致的序列的轻链CDR3序列。根据本发明的核酸分子优选包含具有与所述CDR序列至少85％，更优选地至少90％，更优选地至少95％，更优选地至少96％，更优选地至少97％，更优选地至少98％，更优选地至少99％的序列一致性的序列。优选地，所述核酸分子包含重链序列，所述重链序列包含与SEQ ID NO:16的序列具有至少80％的序列一致性的序列和/或包含轻链序列，所述轻链序列包含与SEQID NO:12的序列具有至少80％的序列一致性的序列，更优选地与SEQ ID NO:12和/或SEQID NO:16具有至少85％，更优选地至少90％，更优选地至少95％，更优选地至少96％，更优选地至少97％，更优选地至少98％，更优选地至少99％的序列一致性。

本发明还提供了包含根据本发明的核酸分子的载体(vector)。优选的载体是质粒。“质粒(plasmid)”在本文被定义为环状，优选地双链DNA分子。制备包含根据本发明的核酸分子的载体的方法是本领域熟知的。适于产生本发明载体的载体的非限制性实例是逆转录病毒和慢病毒载体。根据本发明的载体可以用于多种应用。根据本发明的载体优选用于根据本发明的核酸分子在细胞中的体外表达，优选用于产生根据本发明的抗体或片段。此外，包含根据本发明的核酸分子的根据本发明的载体可以用于治疗。将这种载体给予需要其的个体，优选人类，导致根据本发明的抗体或片段的体内表达。

还提供了包含根据本发明的核酸分子或载体的重组细胞。优选地，将这种核酸分子或载体引入所述细胞中，使得细胞的核酸翻译机器将产生编码的抗体或片段。根据本发明的核酸分子或载体优选在所谓的生产者细胞(producer cell)中表达，例如像中国仓鼠卵巢(CHO)、NSO(小鼠骨髓瘤)或293(T)细胞系的细胞，其中的一些适合于商业抗体生产。这种生产者细胞的增殖导致能够产生根据本发明的抗体或片段的生产者细胞系。优选地，所述生产者细胞系适于产生用于人的抗体。因此，所述生产者细胞系优选不含诸如病原微生物的病原体。

本发明还提供了用于产生根据本发明的抗体或片段的方法，包括向细胞提供根据本发明的核酸分子或载体，并且允许所述细胞翻译由所述核酸分子或载体所包含的核酸序列，由此产生根据本发明的所述抗体或片段。根据本发明的方法优选地进一步包括收获、纯化和/或分离所述抗体或片段。还提供了使用用于产生根据本发明的抗体或片段的方法获得的抗体或片段。

根据本发明的抗体或片段可有利地用于治疗应用。因此，提供了包含根据本发明的抗体或片段以及药学上可接受的运载体(carrier)、稀释剂和/或赋形剂的药物组合物。还提供了包含根据本发明的核酸分子或载体以及至少一种药学上可接受的运载体、稀释剂和/或赋形剂的药物组合物。合适的运载体的非限制性实例是例如钥孔血蓝蛋白(KLH)、血清白蛋白(例如，BSA或RSA)和卵白蛋白。优选的运载体是溶液，例如水溶液，例如盐水或油基(oil-based)溶液。可掺入片剂、胶囊剂等的赋形剂的非限制性实例是诸如黄蓍胶，阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶的粘结剂，诸如微晶纤维素的赋形剂，诸如玉米淀粉、预胶化淀粉和海藻酸的崩解剂，诸如硬脂酸镁的润滑剂，诸如蔗糖、乳糖或糖精的甜味剂，以及诸如薄荷、冬青油或樱桃油的调味剂。当剂型单位形式是胶囊剂时，除了一种或多种上述赋形剂之外，它优选还含有诸如脂肪油的液体运载体。各种其他材料可以包衣形式存在或改变剂量单位的物理形式。例如，可用虫胶和/或糖或两者包衣片剂。根据本发明的药物组合物优选适于人类使用。

可以多种不同的方式给予本文所述的药物组合物。实例包括通过口服、鼻内、直肠、局部、腹膜内、静脉内、肌内、皮下(subcutaneous)、真皮下(subdermal)、透皮、鞘内和颅内方法给予包含根据本发明的抗体和含有药学上可接受的运载体的药物组合物。对于口服给药，可以固体剂型形式(例如，胶囊剂、片剂和粉末剂)或以液体剂型形式(例如，酏剂、糖浆剂和混悬剂)给予活性成分。可根据常规药学实践，通过将本发明的抗体或片段溶解或悬浮在诸如水或天然存在的油(例如，芝麻油、椰子油、花生油、棉籽油等)或合成脂肪载体(例如，油酸乙酯)的注射用载体中配制用于注射的无菌组合物。还可以掺入缓冲剂、防腐剂和/或抗氧化剂。

本发明还提供了用于治疗的根据本发明的抗体或片段。还提供了用于治疗的根据本发明的核酸分子。所述治疗可以是治疗性或预防性的。根据本发明的抗体或片段特别适合于治疗、减轻或预防与旁路途径补体激活相关的病症。因此，提供了根据本发明的抗体或片段，用于治疗、减轻或预防与旁路途径补体激活相关的病症。还提供了根据本发明的核酸分子，用于治疗、减轻或预防与旁路途径补体激活相关的病症。如本文所用的，“与旁路补体激活相关的病症”在本文被定义为其中不期望的和/或过量的旁路途径补体激活导致细胞、组织或细胞外基质损伤的病症。可能被不期望的和/或过度的旁路途径激活损伤的细胞是与血液接触的任何细胞，例如红细胞、上皮细胞，特别是肝和/或肾上皮细胞、血小板、白细胞、内皮细胞。所述病症优选是与受损的FH功能或FH缺陷相关的病症。更优选地，所述病症是与受损的FH功能或FH缺陷相关但不具有FH缺失相关的病症。由于本发明的抗体和片段增强FH的功能，因此抗体和片段特别适于阻断或降低受损的FH功能或FH缺陷的影响。然而，如在实例中所证实的，本发明的增强抗FH抗体不仅抑制用具有受损的旁路途径激活的患者的血清孵育的红细胞的裂解，而且抑制用其中FH被人为阻断的健康个体的血清孵育的红细胞的裂解。因此，抗体和片段还可以用于阻断或减少由除了受损的FH功能或FH缺陷之外的因素引起的不期望的和/或过度的旁路途径补体激活。可被治疗的这类病症的非限制性实例是非典型溶血尿毒综合征(aHUS)、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、年龄相关性黄斑变性(AMD)、膜性增生性肾小球肾炎(MPGN)。

非典型溶血尿毒综合征(atypical hemolytic uremic syndrome)(aHUS)也称为补体介导的HUS，其特征在于溶血性贫血、血小板减少、全身性血栓性微血管病(TMA)和肾衰竭。aHUS的发病通常在儿童期，并且该疾病的发作与例如感染、怀孕、其他疾病、手术或创伤相关。超过60％的aHUS患者死亡或发展终末期肾脏疾病(ESRD)(尽管血浆置换或血浆补充)。已在患有aHUS的患者中鉴定出补体系统的成分或因子的多种突变。FH、FI FB，膜辅因子蛋白(MCP)、血栓调节蛋白(THBD)或C3中的突变包括约50％的患有aHUS的患者中的已知突变，其中FH的突变是最常见的(约20-30％的aHUS患者)。大多数患者对于突变是杂合的，然而这导致病理性FH缺陷。此外，在约10％的患者中，aHUS由针对FH的自身抗体诱发，也导致功能性FH减少。目前，aHUS的标准治疗是血浆补充或血浆置换疗法。此外，艾库组单抗(eculizumab)用于治疗患有aHUS的患者。肾移植与高复发风险相关，其依赖于基于aHUS的突变。由于复发的风险增加，因此在具有FH、FB、FI、C3或THBD突变的儿童中，移植是禁忌的。根据本发明的优选包含至少Fab片段的抗体或片段特别适于治疗、减轻或预防由FH的突变或抗FH自身抗体的存在诱发的aHUS。然而，由于本发明的抗体和片段在不存在受损的FH功能或FH缺陷的情况下也增强FH的活性，因此可有利地用本发明的抗体或片段治疗、减轻或预防任何形式的补体依赖性aHUS。

阵发性睡眠性血红蛋白尿症(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria)(PNH)由全能造血干细胞的X染色体中的基因突变引起。突变导致磷脂酰肌醇聚糖A类蛋白质的缺陷，其对于糖基磷脂酰肌醇膜锚定蛋白(GPI-AP)的合成至关重要。补体系统CD55的抑制剂是这种蛋白质的一个实例，其在宿主细胞表面结合C3b，从而防止C3转化酶的形成。因此，这些蛋白质的缺陷导致不期望的或过度的补体激活。PNH的主要结果之一是红细胞经历补体系统的过度活性所致的裂解。最近，在多个国家中，艾库组单抗(eculizumab)已被批准用于PNH的治疗。其他疗法包括输血、红细胞刺激剂治疗、用皮质类固醇和合成代谢类固醇治疗。由于本发明的抗体和片段优选地也独立于FH或FH功能的水平而增强FH的活性，从而抑制补体系统的旁路途径的激活，因此抗体和片段可有利地用于PNH患者。此外，由于本发明的抗体和片段在C3沉积的水平上起作用，这与在激活途径的更下游起作用的艾库组单抗(eculizumab)相对，因此肝脏中的细胞消耗由于较少的细胞被C3b调理(opsonize)而减少。

年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration)(AMD)是对视网膜的损伤，影响老年个体的侵袭通常导致黄斑、视野中心的视力丧失。最近，FH的突变和SNP(单核苷酸多态性)已影响约35％的AMD患者。SNP位于FH的CCP7中，并且被证明影响FH与肝素的结合，从而损害FH结合宿主细胞表面以及细胞外基质的能力。根据本发明的优选包含至少Fab片段的抗体或片段特别适于治疗、减轻或预防特征在于FH功能降低且优选地特征在于编码FH的基因的SNP的AMD。

膜性增生性肾小球肾炎(membranoproliferative glomerulonephritis)(MPGN)是主要发生在儿童和年轻成年人中的慢性肾炎的罕见原因。它由于肾小球系膜和内皮细胞的增殖以及肾小球系膜基质的扩张、由于内皮下免疫沉积物和/或膜内致密沉积物所致的外周毛细血管壁增厚，以及肾小球系膜插入至毛细血管壁引起肾小球损伤。MPGN通常与完全不存在FH相关。可用本发明的抗体和/或片段治疗的MPGN优选与受损的FH功能或FH缺陷相关，但不具有FH缺失。因此，本发明提供了根据本发明的的抗体或片段或核酸分子的用途，用于治疗、减轻或预防与旁路途径补体激活相关的病症，其中所述病症选自由以下各项组成的组：非典型溶血尿毒综合征(aHUS)、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、年龄相关性黄斑变性(AMD)、膜性增生性肾小球肾炎(MPGN)。还提供了根据本发明的抗体或片段、核酸分子或载体在制备用于治疗、减轻或预防与旁路途径补体激活相关的病症的药物中的用途。所述病症优选选自由以下各项组成的组：非典型溶血尿毒综合征(aHUS)、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、年龄相关性黄斑变性(AMD)、膜性增生性肾小球肾炎(MPGN)。根据本发明可用作药物或预防药的优选抗体是包含如表1所示的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3的抗体或其片段，优选地Fab、Fab’或F(ab)₂或F(ab’)₂片段。所述抗体或片段优选是单克隆人源化或嵌合抗体或片段。

本发明还提供了一种用于抑制旁路补体激活的方法，包括向个体给予根据本发明的抗体或片段，或根据本发明的核酸分子或载体。

本发明还提供了用于治疗、减轻或预防与旁路途径补体激活相关的病症的方法，包括向需要其的个体给予治疗有效量的根据本发明的抗体或片段。还提供了用于治疗、减轻或预防与旁路途径补体激活相关的病症的方法，包括向需要其的个体给予治疗有效量的根据本发明的核酸分子或载体。还提供了用于治疗、减轻或预防与旁路途径补体激活相关的病症的方法，包括向需要其的个体给予治疗有效量的根据本发明的药物组合物。所述病症优选选自由以下各项组成的组：非典型溶血尿毒综合征(aHUS)、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、年龄相关性黄斑变性(AMD)、膜性增生性肾小球肾炎(MPGN)。如本文所用的，“个体”是具有补体系统作为它的免疫系统的一部分的人或动物，优选是哺乳动物。在特别优选的实施例中，个体是人。用于本发明方法的优选抗体是包含如表1所示的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3的抗体或其片段，优选地Fab、Fab’、F(ab)₂或F(ab’)₂片段。所述抗体或片段优选是单克隆人源化或嵌合抗体或片段。

可给予包含本发明的抗体、片段、核酸分子的组合物用于预防性和/或治疗性治疗。在治疗应用中，以足以抵抗疾病的症状和/或其并发症的量将根据本发明的抗体、片段、核酸分子或组合物给予已经患有疾病和/或已经显示疾病症状的个体，优选是人。在预防性应用中，在个体表现出病症的症状之前将根据本发明的抗体、片段、核酸分子或组合物给予个体以预防这些症状或其并发症的发展。例如，可用根据本发明的抗体、片段、核酸分子或组合物预防性治疗携带可能或将会引起与旁路补体激活相关的病症的基因突变的个体。抗体、片段或核酸分子通常以治疗量存在于根据本发明的药物组合物中，所述治疗量是足以治疗病症，特别是与补体系统的旁路途径的不期望的或过度激活相关的病症相关的症状的量。

为了清楚和简洁描述的目的，在本文可将特征描述为本发明的相同或单独的方面或实施例的一部分。本领域技术人员将理解，本发明的范围可包括具有在本文描述为相同或单独的实施例的一部分的特征的全部或一些的组合的实施例。

在以下非限制性实例中更详细地说明本发明。

表1.抗体抗FH.07的氨基酸和核苷酸序列(根据IMGT编号系统的CDR编号(Lefranc1997，Lefranc 1999和Lefranc等人,2003)

附图说明

图1：单克隆抗体抗FH.07的表位的表征。抗FH.07针对CCP 18，如通过结合至重组FH CCP结构域15-18、15-19和18-20所指示的。

图2：抗FH.07抑制由健康供体血清中的moAb抗FH.09(阻断针对CCP6的moAb)诱导的SRBC裂解。A.滴定抗FH.09以诱导SRBC裂解，通过固定量的抗FH.07(500nM)抑制。B.诱导次优裂解的抗FH.09(8.5μg/ml)的固定量，通过增加抗FH.07的量抑制。

图3：A，B.如通过酵母聚糖和LPS涂层上的C3沉积测量的，抗FH.07及其F(ab’)₂和Fab’片段抑制旁路途径激活。A.酵母聚糖上的血清滴定，固定量的抗FH.07(完整的，F(ab’)₂，Fab’，500nM)。B.LPS上固定的血清稀释，抗FH.07的滴定(完整的，F(ab’)₂，Fab’)。C.在桥接ELISA中测定的FH的交联。Fab’不能交联FH。

图4：由于aHUS患者血清中功能性FH不足，SRBC裂解可被抗FH.07(完整的，F(ab’)₂或者Fab’片段)抑制。B，C.在MgEGTA+100μg/ml完整的抗体、F(ab’)₂或Fab’片段中的10％(v/v)血清。

图5：A.如通过ELISA测量的，抗FH.07增加FH与C3b的结合。B，C，D.FH与(B)C3b、(C)iC3b和(D)C3d相互作用的SPR分析的传感图(sensogram)。添加抗FH.07Fab’片段使所测量的RU在所有表面上增加至少2倍，反映增加的FH结合。

具体实施方式

实例

材料和方法

试剂

从CompTech.(Tyler,Texas,美国)获得人纯化的H因子。从Sanquin(BusinessUnit reagents,Sanquin,Amsterdam,荷兰)获得大鼠抗小鼠κ(RM19)。从Sanquin获得高性能ELISA缓冲液(HPE)。从Sanquin获得多克隆兔抗人-H因子，从Quidel获得多克隆山羊抗人FH。

重组FH CCP(CCP 1-4、CCP 1-7、CCP 6-8、CCP 8-15、CCP 12-13、CCP 15-18、CCP15-19、CCP 18-20或CCP 19-10)是dr Christoph Schmidt的友情赠予并且如在前面(Schmidt等人，2008)描述的进行制备。如下所述制备FH的小鼠单克隆抗体。抗FH.07(鼠类IgG1)针对CCP 18，抗FH.09(鼠类IgG1)针对CCP 6。抗IL-6.8用作不相关的同种型对照，并从Sanquin获得。MoAb抗C3.19与分子的C3d片段上的表位反应，并且之前已经描述过(Wolbink等人，1993)。

免疫和杂交瘤产生

通过用在montanide中的25μg人H因子作为佐剂以4周的间隔腹膜内免疫BALB/c小鼠产生H因子的小鼠单克隆抗体。第四次加强免疫后三天，将脾细胞与骨髓瘤细胞系SP2/0融合。通过ELISA测试杂交瘤的上清液中H因子特异性抗体的存在。简言之，用大鼠抗小鼠κmoAb(RM19)涂覆微量滴定板以捕获小鼠IgG抗体。通过生物素化H因子测定抗体的特异性。用链霉亲和素-HRP和TMB显影测定。

表位作图moAb

使用由多个CCP组成的重组人FH片段测试FH特异性moAb的反应性。为此，将50微升的100μg/ml抗FH moAb与0.5ml的2mg/ml的RM-19偶联的sepharose(25μg的moAb每1mg的CnBr-Sepharose)混合。用¹²⁵I标记FH片段，并向每个样品中加入100μl(20000c/30秒)，随后孵育O/N。在具有0.1％(w/v)吐温-20和0.1％(w/v)BSA(PTB)的PBS中进行测定。用含有0.1％(w/v)吐温-20的PBS将样品洗涤5次并计数30秒。测量Sepharose结合放射性并与总输入(设置为100％)比较。

单克隆抗体的F(ab’)₂和Fab’片段的产生

为了制备抗FH moAb的F(ab’)₂片段，在37℃下用胃蛋白酶(20μg/ml)(Sigma P-6887)将5.2mg的每种抗体在5.2ml的0.1M柠檬酸/柠檬酸三钠缓冲液(pH 3.7)中孵育16小时。接下来，加入3M氯化钠和1M TRIS，并将pH调节至8.9。使用protA sepharose柱除去剩余的完整抗体和/或Fc片段。为了制备单价Fab’片段，通过用10mM的二硫赤藓糖醇孵育60分钟还原F(ab’)₂片段。随后，用20mM的碘乙酰胺封闭游离巯基。将片段针对PBS透析，并在SDS-PAGE上检查切割效率。

SRBC溶血测定

使用先前由Sanchez-Corral等人(2004)和Wouters等人(2008)描述的溶血测定(具有一些调整)测量H因子功能性。在补充有5.8％(w/v)蔗糖(VBS)的佛罗拿(veronal)缓冲液(3mM的巴比妥、1.8mM的巴比妥钠、145的NaCl，pH 7.4(VB))中将绵羊红细胞(SRBC)稀释至2.1×10⁸个细胞/ml的终浓度。在添加或不添加适当浓度的所指示的抗FH moAb的情况下，在含有0.05％(w/v)的明胶、10mM的MgCl₂、20mM的EGTA(VBG-AP)的佛罗拿缓冲液中将正常的集合的人血清或aHUS患者血清稀释至20％(v/v)。

通过将50μl的血清样品与50μl的SRBC悬浮液混合以达到10％(v/v)血清的终浓度(在5mM的MgCl₂、10mM的EGTA中含有1.05×10⁸个细胞/ml)，随后在37℃下孵育1.25小时，同时在200rpm下振荡进行测定。通过加入100μl含有20mM的EDTA的冰冷VB，随后在预冷的离心机(7℃)中以1800rpm离心2.5分钟来终止裂解。在Synergy 2酶标仪(BioTek)上在412nm下测量上清液的吸光度。每个样品的裂解表示为与100％裂解对照(在含有0.6％(w/v)皂苷的H₂O中孵育的SRBC)相比的百分比。作为阴性对照，用在补充有10mM的EDTA的VB中稀释的血清孵育SRBC以防止补体激活。

在酵母聚糖和LPS上的C3沉积

用酵母聚糖(100μg/ml，在Nunc polysorp 96孔微量滴定板上在室温下在PBS涂覆的o/n中)或伤寒沙门氏菌(Salmonella typhosa)LPS(Sigma L-6386，40μg/ml，在Nuncpolysorp 96孔微量滴定板上在室温下在PBS涂覆的O/N中)涂覆微量滴定板。在用PBS/吐温洗涤后，在存在或不存在指定浓度的抗FH moAb或抗体片段的情况下，在含有0.05％(w/v)的明胶、5mM的MgCl₂、10mM的EGTA和0.1％(w/v)的吐温20的佛罗拿缓冲液中孵育人健康供体血清。用生物素化moAb抗C3.19(在HPE中，0.55μg/ml)，随后在HPE中用0.01％(v/v)与聚-HRP结合的链霉亲和素孵育来检测C3沉积。

与C3b结合的H因子

在微量滴定ELISA板上o/n涂覆C3b(40μg/ml，在碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液中，pH9.6)。在C3b涂覆板上孵育之前，在室温下用抗FH moAb(100μg/ml)将健康供体血清(在PBS/BSA/泊洛沙姆/EDTA中1:8稀释)预孵育2.5小时。用过氧化物酶标记的多克隆山羊抗FH检测结合的FH。用TMB显色ELISA(1μg/ml)。

FH与C3b、iC3b和C3d的相互作用的SPR分析

使用Biacore T3000仪器(GE Healthcare,Little Chalfont,英国)通过表面等离子体共振测定在抗FH moAb的存在下FH与C3b、iC3b或C3d的结合。使用标准胺偶联将纯化的C3b、iC3b或C3d(补体技术(Complement technology))固定在CM5Biacore传感器芯片(GEHealthcare)的三个流动池之一上。剩余的流动池用作参考表面，并通过进行偶联反应而不添加任何蛋白质来制备。在分别与C3b、iC3b和C3d偶联后，获得4400个响应单位(responseunit)(RU)、4180个RU和1470个RU的响应(response)。在25℃下使用10μl/min的流速并且在具有0.05％(w/v)吐温20(HBS-P)的10mM的HEPES-缓冲的150mM的盐水(pH 7.4)中进行SPR实验。进行0.5μM的FH的重复注射，接触时间为210秒，以获得每个表面上的FH的参考结合信号。在每次样品注射后，允许240秒的解离时间，使用HBS-P作为运行缓冲液，随后1M NaCl的单次30秒注射以再生表面。

为了确定抗FH.07的作用而不干扰通过moAb的可能的交联，使用如上所述产生的Fab’片段。将Fab’片段与0.5μM的纯化的FH以2:1的摩尔比混合，并且在不加入FH的情况下也注入每种Fab’片段，以确定Fab’片段与表面的任何相互作用。

结果

单克隆抗体

我们获得了21种抗人FH的单克隆抗体。按照识别的顺序编号MoAb。所有抗体能够捕获可溶性人FH，表明高亲和力。一些moAb通过阻断与I因子的相互作用来抑制辅因子活性，并且如通过与正常人血清孵育时增强的SRBC裂解所表明的，其它moAb抑制FH与细胞表面的结合。在实例中使用后面抑制性moAb(抗FH.09)之一以诱导在与正常人血清孵育时的SRBC的体外裂解。抗FH.03不抑制FH，并且在实例中用作对照抗体。除了抑制moAb之外，我们识别了一种增强FH的功能的moAb(抗FH.07)。

通过使用重组FH片段绘制moAb的结合位点图

为了绘制抗FH.07的结合位点图，我们测试了该moAb对一组放射性标记的重组CCP结构域或纯化的人FH的反应性。在放射免疫测定中测试moAb的结合并与输入(100％)关联。如图1所示，抗FH.07结合重组片段CCP 15-18、CCP 15-19和CCP 18-20，表明抗FH.07对FH分子的CCP 18是特异性的。

抗FH.07抑制通过阻断抗FH moAb诱导的SRBC裂解

为了研究抗FH.07对H因子的功能的影响，我们首先通过阻断针对FH的抗体诱导SRBC的裂解(抗FH.09)。在正常条件下，用健康人供体血清孵育SRBC不会导致SRBC的裂解，因为这些细胞受在SRBC表面上与唾液酸结合的血清中的H因子保护。在用增加量的阻断moAb抗FH.09孵育正常人血清时，观察到SRBC的剂量依赖性裂解(图2A)。这可以通过血清FH对细胞表面的保护不足来解释。当加入固定量的抗FH.07时，抑制SRBC裂解。这表明抗FH.07抵消抗FH.09的作用(图2A)。

在另外的实验中，将固定量的抗FH.09加入到健康供体血清以诱导SRBC的次优裂解(约60％)。通过添加增加量的抗FH.07，这种裂解可被完全阻断(图2B)，再次表明这些单克隆抗体的相反作用。

抗FH.07抑制酵母聚糖和LPS上的旁路途径介导的C3沉积

为了研究抗FH.07是否对通过FH的旁路途径抑制具有影响并且排除对SRBC或对这些细胞的裂解的直接影响，进行了在作为旁路途径激活剂的酵母聚糖或LPS上的C3沉积测定。在MgEGTA佛罗拿缓冲液中进行实验以排除Ca²⁺依赖性的经典或凝集素途径激活。

在酵母聚糖或LPS涂覆的板上孵育增加的血清浓度导致剂量依赖性C3沉积。通过向血清滴定中加入固定量的抗FH.07(500nM)，抑制C3沉积(图3A)，由向右移动的曲线表示。当向血清中加入相同量的抗FH.03(一种非抑制性抗FH moAb)时，没有观察到这种变化。这表明通过加入抗FH.07加强了FH对旁路途径激活的抑制功能。此外，通过在LPS涂覆的板上添加增加量的抗FH.07达到固定的血清浓度(1:10)，可完全阻断C3沉积(图3B)。

抗FH.07的Fab’片段具有与完整moAb相同的效果

当用抗FH.07孵育时观察到FH抑制功能增加的一种可能机制是通过经抗体的交联使FH多聚化，从而增加FH对表面的亲合力。为了测试这种可能性，我们产生抗FH.07的单价Fab’片段。如果FH的交联是观察到的FH功能增加的原因，则预期单价Fab’片段不显示增强效应。使用桥接ELISA(bridging ELISA)，我们首先检查所产生的Fab’片段是否确实是完全单价的并且不能交联FH分子。为此，用FH涂覆ELISA板，并使用生物素化FH进行检测。如图3C所示，产生的Fab’片段不能在液相中的涂层和FH上交联FH，而F(ab’)₂片段和完整的IgG能够交联FH。然后，在C3沉积测定中在酵母聚糖和LPS涂覆的板上测试抗FH.07、F(ab’)₂和Fab’片段。令我们惊讶的是，我们观察到Fab’片段对FH功能的相同的增强效应。在酵母聚糖和LPS上，抗FH.07Fab’片段导致与完整的IgG抗体相同的C3沉积减少(图3A和3B)。因此，我们得出结论，抗FH.07的影响不是通过单克隆抗体的FH分子交联所致。此外，这是由我们在我们的小组中没有观察到任何其他20种单克隆抗体的任何增强效应的事实强调的。

抗FH.07恢复aHUS患者血清中的FH保护功能

用增加量的具有CCP20的已知突变的aHUS患者的血清孵育SRBC导致由于细胞对补体激活的保护不足所致的细胞裂解(图4A)。然而，该患者血清中接近一半的FH是功能性的，因为该患者(与大多数aHUS患者一样)具有杂合突变。基于先前的结果，我们假设用抗FH.07预孵育aHUS患者血清将导致FH功能的增强，导致SRBC的保护恢复。实际上，当我们用抗FH.07孵育aHUS患者血清时，观察到的SRBC的裂解被完全消除(图14A和4B)，而对照抗体显示无作用。在三个无关的aHUS患者中获得该结果，所有这些患者在FH的SCR 20中都携带独特的杂合突变(图4B)。与如上所述的在酵母聚糖和LPS上的C3沉积实验一致，抗FH.07的F(ab’)₂和Fab’片段也可抑制该患者血清中补体介导的SRBC裂解(图4C)。

在抗FH.07的存在下，H因子与C3b的结合增加

由于抗FH.07的Fab’片段对FH功能发挥与完整的IgG相同的增强作用，因此通过单克隆抗体的FH分子的多聚化不能作为增强的解释。我们假设很可能通过抗FH.07与CCP18结合，FH的构象以增加与表面结合的方式变化。H因子具有位于整个分子不同位点的C3b和糖胺聚糖二者的结合位点。由于我们观察到在酵母聚糖和LPS上的C3沉积的FH增强作用，因此我们首先研究了抗FH.07对FH与C3b结合的影响。为此，用C3b涂覆ELISA板，并用HRP标记的多克隆抗FH检测来自正常人血清的结合FH。如图5所示，抗FH.07显著增加FH与C3b的结合，而其他抗FH moAb(不相关的moAb或不具有增强效应的其他FH特异性抗体)没有影响。

此外，进行SPR实验以研究在不存在和存在下抗FH.07Fab’片段的情况下，FH与C3b、iC3b和C3d的相互作用。简言之，用C3b、iC3b或C3d涂覆CM5Biacore传感器芯片的三个流动池，并在不存在或存在抗FH moAb的情况下，在Biacore T3000系统上测定FH与这些表面的相互作用。

在正常条件下，FH显示与C3b的相互作用和与iC3b和C3d的相对较少的相互作用。加入抗FH.09的Fab’片段或同种型对照(抗IL-6.8)不影响FH与C3b、iC3b或C3d的结合。然而，添加抗FH.07的Fab’片段极大地增加了对C3b涂覆的表面的响应(图5B)。抗FH.07本身不显示与C3b的任何相互作用，表明测量的增加的响应是由FH与每个表面的结合增加引起的。甚至结合iC3b和C3d(其对于天然FH通常较低)，在加入抗FH.07后也增加(分别为图5C和5D)。在所有表面上的测量的相互作用增加至少2倍，由此不能仅通过抗FH moAb Fab’片段的结合后，预期FH的质量增加33％来解释。

参考文献

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Claims

1.一种特异性结合H因子(FH)的补体调控蛋白结构域18(CCP18)并增强FH活性的分离的、合成的或重组的抗体或其片段，其中所述FH活性是抑制旁路补体激活，并且其中所述抗体或其片段包括：

-具有SEQ ID NO:5的序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO:6的序列的重链CDR2和具有SEQID NO:7的序列的重链CDR3序列，和/或

-具有SEQ ID NO:1的序列的轻链CDR1序列、具有SEQ ID NO:2的序列的轻链CDR2序列和具有SEQ ID NO:3的序列的轻链CDR3。

2.根据权利要求1所述的抗体或片段，其中抑制旁路补体激活包括：

-抑制溶血活性，

-抑制所述个体的细胞上的补体成分3(C3)沉积，和/或

-增加FH与C3b、iC3b和/或C3d的结合。

3.根据权利要求1或2所述的抗体或片段，其中所述片段包含至少一种Fab片段。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的抗体或片段，其是单克隆抗体或其片段。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的抗体或片段，其是包含人轻链恒定区和重链恒定区的嵌合抗体或人源化抗体或其片段。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的抗体或片段，包括包含与SEQ ID NO:8的序列具有至少80％序列一致性的序列的重链序列和/或包含与SEQ ID NO:4的序列具有至少80％的序列一致性的序列的轻链序列。

7.一种与包括包含SEQ ID NO:8的序列的重链序列和包含SEQ ID NO:4的序列的轻链序列的抗体竞争结合H因子(FH)的补体调控蛋白结构域18(CCP18)并且增强FH活性的分离的、合成的或重组的抗体或其片段，其中所述FH活性是抑制旁路补体激活。

8.一种分离的、合成的或重组的核酸分子，包含编码权利要求1-6中任一项所述的抗体或片段的核酸序列。

9.根据权利要求8所述的核酸分子，包括：

-包含与SEQ ID NO:11的序列至少80％一致的序列的轻链CDR3序列。

10.根据权利要求8或9所述的核酸分子，包括包含与SEQ ID NO:16的序列具有至少80％序列一致性的序列的重链序列和/或包括包含与SEQ ID NO:12的序列具有至少80％的序列一致性的序列的轻链序列。

11.一种载体，包含权利要求8-10中任一项所述的核酸分子。

12.一种重组细胞，包含权利要求8-11中任一项所述的核酸分子或载体。

13.一种药物组合物，包含权利要求1-7中任一项所述的抗体或片段，或权利要求8-10中任一项所述的核酸分子，或权利要求11所述的载体，以及药学上可接受的运载体、稀释剂和/或赋形剂。

14.根据权利要求1-7中任一项所述的抗体或片段或权利要求8-11中任一项所述的核酸分子或载体，用于在治疗中应用。

15.根据权利要求14所述的用于应用的抗体或片段、核酸分子或载体，用于在抑制旁路补体激活中应用。

16.权利要求1-7中任一项所述的抗体或片段或权利要求8-11中任一项所述的核酸分子或载体，用于在治疗、减轻或预防与旁路途径补体激活相关的病症中应用。

17.权利要求1-7中任一项所述的抗体或片段、权利要求8-10中任一项所述的核酸分子、或权利要求11所述的载体在制备用于治疗、减轻或预防与旁路途径补体激活相关的病症的药物中的用途。

18.一种用于治疗、减轻或预防与旁路途径补体激活相关的病症的方法，包括向需要其的个体给予治疗有效量的权利要求1-7中任一项所述的抗体或片段、权利要求8-10中任一项所述的核酸分子、权利要求11所述的载体、或权利要求13所述的药物组合物。

19.根据权利要求16所述的用于应用的抗体或片段、核酸分子或载体，根据权利要求17所述的用途或根据权利要求18所述的方法，其中所述病症选自由以下各项组成的组：非典型溶血尿毒综合征(aHUS)、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、年龄相关性黄斑变性(AMD)、膜性增生性肾小球肾炎(MPGN)。

20.一种抑制旁路补体激活的方法，包括向个体给予权利要求1-7中任一项所述的抗体或片段、权利要求8-10中任一项所述的核酸分子、或权利要求11所述的载体。

21.一种用于生产权利要求1-6中任一项所述的抗体或片段的方法，所述方法包括向细胞提供权利要求8-11中任一项所述的核酸分子或载体，并且允许所述细胞翻译所述核酸分子或载体所包括的核酸序列，从而生产权利要求1-6中任一项所述的抗体或片段，优选地进一步包括收获、纯化和/或分离权利要求1-6中任一项所述的抗体或片段。

22.根据权利要求21所述的方法，进一步包括收获、纯化和/或分离权利要求1-6中任一项所述的抗体或片段。