CN111868083A - 因子h增强抗体及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及对因子H特异的新型分离的、合成的或重组的抗体及其片段。本发明还涉及此类抗体和片段用于抑制补体激活和治疗补体激活相关性病症的用途。
Description
技术领域
本发明涉及免疫学和医学领域。特别地，本发明涉及因子H特异性抗体及其用途。
背景技术
补体系统是先天免疫的重要元素，有助于保护许多生物体(例如哺乳动物)免受入侵病原体的侵袭。补体系统由30多种主要在肝脏中合成的不同组分组成。补体系统的激活通过三种不同途径发生：经典途径，凝集素途径和替代途径。这三种途径在C3转化酶形成时会聚，每种途径的C3转化酶均不同，但活性相似。
在经典补体途径中，由C1q、C1r和C1s组成的补体成分(C)1复合物的激活在结合抗体-抗原复合物时发生。C1复合物切割C4和C2，导致形成由C4bC2a组成的C3转化酶。C3转化酶将C3切割成活性组分C3a和C3b。在凝集素途径中，结合甘露糖的凝集素与致病性表面上的甘露糖残基结合，从而激活能够切割C4和C2的丝氨酸蛋白酶MASP-1和MASP-2。与经典途径一样，这导致C4bC2a C3转化酶的形成。该C3转化酶可以结合C3b形成C5转化酶。与经典和凝集素途径相反，所述替代途径由于血浆中C3自发水解为C3(H2O)而具有较低水平的连续活性。这种C3b-样C3(H2O)可以通过结合因子B(FB)形成液相C3转化酶，而结合因子B(FB)又会被因子D激活为Bb。同样，当C3b结合到表面时，它可能会结合FB形成C3bB。该复合物被因子D切割为C3bBb，C3bBb是替代途径的C3转化酶，可通过备解素(因子P)稳定为C3bBbP。该C3转化酶能够将C3切割成C3a和C3b。除此过程外，替代途径还充当经典途径和凝集素激活途径的扩增环，因为在这些途径中生成的C3b可充当替代途径的起点。因此，扩增环导致经典和凝集素途径的增强。在三种激活途径之一中形成的C3转化酶可以结合C3b以形成C5转化酶。所有三种补体途径的C5转化酶均将C5激活为C5a和C5b，从而启动补体系统的终末途径。C5b结合C6、C7、C8和C9以形成膜攻击复合物(MAC)，后者形成跨膜通道并引起细胞裂解。
紧接着在病原体的膜上形成孔之后，补体通过与C3b分子进行调理作用和产生吸引并激活免疫细胞到感染部位的促炎性肽(如C3a和C5a)，从而帮助清除病原体或改变的自身细胞。由于补体具有很强的促炎特性，因此宿主细胞受到多种膜和可溶性补体调节蛋白的良好保护。
替代途径占总补体活性的80-90％。因此，调节此途径至关重要。由C3的自发水解形成的C3(H2O)及C3b(如果未与病原体结合)通常被因子H(FH)、因子I(FI)和宿主细胞表面分子快速灭活，从而抑制C3转化酶的形成。CD55(也称为衰变加速因子或DAF)在宿主细胞表面结合C3b。FI将C3b切割为非活性形式，但取决于在细胞表面表达的辅助因子(CD46、MCP)或在血浆中循环的辅助因子(FH)。FH是血浆糖蛋白，对于控制溶液和细胞表面的补体替代途径至关重要。FH在与FB相同的位置结合C3b，从而防止C3转化酶的形成。FH还具有衰变加速活性，即一旦形成，其即促进替代途径C3转化酶的解离。FH是否与C3b结合取决于细胞表面上存在的碳水化合物。存在于宿主细胞表面的唾液酸、糖胺聚糖和肝素促进FH与C3b的结合，而C3b与病原体表面表达的分子的结合导致FB的结合。因此，FH在宿主细胞而不是在病原细胞的表面上发挥补体抑制活性，因为与FH结合的细胞表面分子在宿主细胞上表达，但通常不在病原细胞上表达。FH包含20个补体控制蛋白(CCP)结构域，从FH的N端开始编号为1-20。CCP结构域也称为短共有重复(SCR)或sushi结构域。CCP 1-4是参与调控的结构域，CCP 19-20参与结合C3b，且CCP 6、7、8、19和20与在细胞表面表达的GAG和唾液酸结合。结合CCP19和/或CCP20的抗体抑制FH的活性。
因子H相关蛋白(CFHR)是血浆糖蛋白，在结构和抗原性上与FH相关。FHR蛋白也由CCP结构域组成，并且与FH中发现的CCP结构域具有不同程度的同源性。例如，FHR1包含对应于CCP6、CCP7、CCP18、CCP19和CCP20的结构域。与FH相比，CFHR没有强大的补体抑制活性。CFHR的一个共同特征是它们与补体的C3b组分结合，从而与FH竞争与C3b的结合，因此被认为是补体替代途径的正调节剂。
FH缺乏或由于突变导致宿主表面识别受损与补体介导的组织损伤和疾病有关。在正常止血过程中控制补体激活之后，FH在限制补体介导的病变细胞和组织的损伤中也起着重要作用。已经描述了FH基因中的多个突变，其可能导致FH蛋白功能丧失。FH的C端区域是疾病中突变的热点。这是FH与宿主细胞结合的关键区域。该区域中大多数与疾病相关的突变会干扰FH结合。大多数具有突变FH基因的患者具有杂合突变，这意味着大约一半的循环FH具有正常功能。然而，这显然不足以在补体被激活的某些条件下保护自身表面。FH缺乏可能导致肾脏疾病，诸如膜增生性肾小球肾炎(MPGN)和非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)。最近，已经描述了FH突变与年龄相关性黄斑疾病(AMD)之间的关系。
目前，诸如aHUS等中FH缺乏症的标准治疗是血浆补充或血浆置换疗法。通过这种疗法，补充了不足的补体调节剂。血浆置换疗法还可以去除突变补体因子和/或针对补体因子的自身抗体。但是，血浆疗法也有一些局限性。尚无前瞻性临床研究表明血浆置换疗法可安全或有效地治疗aHUS，并且血浆疗法的有效性可能取决于潜在的突变。一些患者对新鲜的冷冻血浆产生过敏反应，这可能需要停止任何形式的血浆疗法。此外，由于施用血浆来源的活性致病性补体组分，血浆置换可能会使aHUS的临床状况恶化。
最近，治疗性单克隆抗体依库丽单抗已在多个国家/地区被批准用于治疗aHUS和阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)，其中包括其中美国和欧洲国家。依库丽单抗是一种特异于C5的人源化小鼠单克隆抗体，可防止C5切割为C5a和C5b。因此，它阻止了终末途径的激活并减少了免疫细胞的流入。然而，依库丽单抗的使用与不良副作用有关。由于它阻止了C5(这是引发终末途径的关键组成部分)，依库丽单抗治疗的患者变得容易感染包膜细菌(例如脑膜炎奈瑟氏球菌)，其清除率非常依赖于MAC的形成。因此，在接受依库丽单抗治疗之前，患者需要接种针对脑膜炎球菌的疫苗。此外，由于依库丽单抗在C3的下游起作用，所以C3的沉积得以维持，这在涉及不希望的或过度的补体激活的多种疾病中是有害的。另外，依库丽单抗治疗涉及高成本，并且抗体的可获得性受到限制。
Cheng等人(Clinical Chemistry,2005)描述了结合CCP18的小鼠单克隆抗体。据描述，该抗体称为X52.1，可增强FH与C3b和C3d的结合，这被认为是由FH的二聚作用引起的。X52.1诱导的FH与C3b和C3d结合增加导致补体介导的细胞(包括RBC和多种癌细胞)的裂解也增加，如Corey et al.(J Biol Chem.2000)所述。这表明抗体X52.1抑制FH的补体抑制活性。事实上，Corey et al.建议通过增强补体介导的癌细胞裂解，将该抗体用于治疗癌症。
WO 2016/028150描述了称为FH.07的激动性抗-FH抗体，其可抑制替代途径激活，如FH与C3b的结合增加、介导的C3沉积的抑制和溶血活性的抑制所示。显示该抗体的Fab’和F(ab’)2片段具有相同的FH增强作用。
持续需要结合FH的新颖和改良的治疗剂，例如可用于治疗与不希望的或过度的补体激活有关的疾病的药剂。
发明内容
本发明的目的是提供结合FH的新型抗体。另一个目的是提供特异性识别FH中的表位的抗体，所述表位的结合导致FH活性增强，特别是位于FH的结构域CCP18中的表位。本发明的另一个目的是提供对FH具有高结合亲和力的抗体。
因此，本发明提供了一种分离的、合成的或重组的抗体或其抗原结合片段，其与因子H(FH)特异性结合并增强FH活性，其中所述抗体或片段对FH的结合亲和力的KD为2.5×10-8M或更低和/或对由CCP18-20组成的FH片段的结合亲和力的KD为0.1×10-9M或更低，优选其中所述抗体或片段对FH的结合亲和力的KD为1.25×10-8M或更低和/或对由CCP18-20组成的FH片段的结合亲和力的KD为0.04×10-9M或更低，更优选其中所述抗体或片段对FH的结合亲和力的KD为1.25×10-8M或更低和/或对由CCP18-20组成的FH片段的结合亲和力的KD为0.04×10-9M或更低或者0.1×10-9M或更低。优选的抗体或片段优选地对FH的结合亲和力的KD为0.6×10-8M或更低和/或对由CCP18-20组成的FH片段的结合亲和力的KD为0.6×10-11M或更低。所述抗体或片段优选以38nM或更低的IC50值在体外抑制C3在LPS上的沉积和/或在体外以150nM或更低的IC50值抑制溶血活性。所述抗体或片段优选在体外将FH对C3b的结合亲和力(KD)增加至最大2μM和/或在体外将FH对C3b的结合亲和力增加至少3倍。使用表面等离振子共振(SPR)确定结合亲和力。
在进一步方面，本发明提供了一种分离的、合成的或重组的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合因子H(FH)并增强FH活性，其中所述抗体或片段在体外以38nM或更低的IC50值抑制C3在LPS上的沉积。
在进一步方面，本发明提供了一种分离的、合成的或重组的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合因子H(FH)并增强FH活性，其中所述抗体或片段在体外将FH对C3b的结合亲和力(KD)增加至最大2μM和/或在体外将FH对C3b的结合亲和力增加至少3倍。
在进一步方面，本发明提供了一种分离的、合成的或重组的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合因子H(FH)并增强FH活性，其中所述抗体或片段在体外以150nM或更低的IC50值抑制溶血活性，所述IC50值优选130nM或更低，更优选115nM或更低，更优选105nM或更低，更优选100nM或更低。
根据本发明的抗体或片段优选结合至因子H(FH)的补体控制蛋白结构域18(CCP18)。所述FH活性优选是抑制替代补体激活。抑制替代补体激活包括：抑制溶血活性，抑制补体组分3(C3)在细胞上的沉积，和/或增加FH与C3b、iC3b和/或C3d的结合。
在进一步的方面，本发明提供了一种分离的、合成的或重组的抗体或其抗原结合片段，其与因子H(FH)的补体控制蛋白结构域18(CCP18)特异性结合，包含：
-具有序列SSVXY的轻链CDR1序列，其中X是R、T或N(SEQ ID NO:91)或序列QSLVHSNGNTY(SEQ ID NO:49)，
-具有序列X1X2S的轻链CDR2序列，其中X1＝A、K或Y且X2＝T或L(SEQ ID NO:92)，
-具有从QQWGTKPPT(SEQ ID NO:19)、QQRSSSNPLT(SEQ ID NO:35)、SQSTHVPFT(SEQID NO:51)和QQFTSSPLT(SEQ ID NO:67)中选择的序列的轻链CDR3，
-具有序列X1FSLTX2X3G的重链CDR1，其中X1＝D或G，X2＝N或S且X3＝S或Y(SEQ IDNO:93)，
-具有序列IWSGGXT的重链CDR2，其中x＝T、N或S(SEQ ID NO:94)，和
-具有序列ARNX1GNYX2X3DY的重链CDR3序列，其中X1＝F或G，X2＝A或Y且X3＝V、M或F(SEQ ID NO:95)或AKNGDYGYTMDY(SEQ ID NO:55)。
在进一步的方面，本发明提供了一种分离的、合成的或重组的抗体或其抗原结合片段，其与因子H(FH)的补体控制蛋白结构域18(CCP18)特异性结合，包含：
-具有序列SSVXY的轻链CDR1序列，其中X是R或T(SEQ ID NO:96)，
-具有序列ATS(SEQ ID NO:97)的轻链CDR2序列；
-具有从QQWGTKPPT(SEQ ID NO:19)和QQRSSSNPLT(SEQ ID NO:35)中选择的序列的轻链CDR3；
-具有序列X1FSLTNX2G的重链CDR1，其中X1＝D或G并且X2＝S或Y(SEQ ID NO:98)，
-具有序列IWSGGTT(SEQ ID NO:99)的重链CDR2，和
-具有序列ARNFGNYAXDY的重链CDR3序列，其中X＝V或M(SEQ ID NO:100)。
在进一步的方面，本发明提供了一种分离的、合成的或重组的抗体或其抗原结合片段，其与因子H(FH)的补体控制蛋白结构域18(CCP18)特异性结合，包含具有序列SSVRY(SEQ ID NO:17)的轻链CDR1序列、具有序列ATS(SEQ ID NO:18)的轻链CDR2序列和具有序列QQWGTKPPT(SEQ ID NO:19)的轻链CDR3、具有序列DFSLTNSG(SEQ ID NO:21)的重链CDR1、具有序列IWSGGTT(SEQ ID NO:22)的重链CDR2以及具有序列ARNFGNYAVDY(SEQ ID NO:23)的重链CDR3序列。所述抗体或片段优选对FH的结合亲和力的KD为2.5×10-8M或更低和/或对由CCP18-20组成的FH片段的结合亲和力的KD为0.1×10-9M或更低，优选其中所述抗体或片段对FH的结合亲和力的KD为1.25×10-8M或更低和/或对由CCP18-20组成的FH片段的结合亲和力的KD为0.04×10-9M或更低。所述抗体或片段优选在体外以38nM或更低的IC50值抑制C3在LPS上的沉积，优选C50值为30nM或更低，更优选C50值为27nM或更低。所述抗体或片段优选在体外以150nM或更低的IC50值抑制溶血活性，优选IC50值为130nM或更低，更优选IC50值为100nM或更低。所述抗体或片段优选在体外将FH对C3b的结合亲和力(KD)增加至最高2μM，更优选1.8μM和/或在体外将FH对C3b的结合亲和力增加至少3倍，更优选3.5倍。
在进一步的方面，本发明提供了一种分离的、合成的或重组的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合因子H(FH)，包含具有序列SSVTY(SEQ ID NO:33)的轻链CDR1序列、具有序列ATS(SEQ ID NO:34)的轻链CDR2序列和具有序列QQRSSSNPLT(SEQ ID NO:35)的轻链CDR3、具有序列GFSLTNYG(SEQ ID NO:37)的重链CDR1、具有序列IWSGGTT(SEQ ID NO:38)的重链CDR2以及具有序列ARNFGNYAMDY(SEQ ID NO:39)的重链CDR3序列。所述抗体或片段优选对FH的结合亲和力的KD为2.5×10-8M或更低和/或对由CCP18-20组成的FH片段的结合亲和力的KD为0.1×10-9M或更低，优选其中所述抗体或片段对FH的结合亲和力的KD为0.6×10-8M或更低和/或对由CCP18-20组成的FH片段的结合亲和力的KD为0.6×10-11M或更低。所述抗体或片段优选地在体外将FH对C3b的结合亲和力(KD)增加至最高2μM，更优选1.95μM和/或在体外将FH对C3b的结合亲和力增加至少3倍，更优选3.1倍。
在进一步的方面，本发明提供了一种分离的、合成的或重组的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合因子H(FH)，包含具有序列QSLVHSNGNTY(SEQ ID NO:49)的轻链CDR1序列、具有序列KLS(SEQ ID NO:50)的轻链CDR2序列和具有序列SQSTHVPFT(SEQ ID NO:51)的轻链CDR3、具有序列GFSLTNYG(SEQ ID NO:53)的重链CDR1、具有序列IWSGGNT(SEQ ID NO:54)的重链CDR2以及具有序列AKNGDYGYTMDY(SEQ ID NO:55)的重链CDR3序列。
在进一步的方面，本发明提供了一种分离的、合成的或重组的抗体或其抗原结合片段，其特异性地结合因子H(FH)，包含具有序列SSVNY(SEQ ID NO:65)的轻链CDR1序列、具有序列YTS(SEQ ID NO:66)的轻链CDR2序列和具有序列QQFTSSPLT(SEQ ID NO:67)的轻链CDR3、具有序列GFSLTSYG(SEQ ID NO:69)的重链CDR1、具有序列IWSGGST(SEQ ID NO:70)的重链CDR2以及具有序列ARNGGNYYFDY(SEQ ID NO:71)的重链CDR3序列。
在进一步的方面，本发明提供了一种分离的、合成的或重组的抗体或其抗原结合片段，其特异性地结合因子H(FH)，包含：包含与从由QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVRYMHWYQQKAGSSPTAWIFATSNLASGVPPRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWGTKPPTFGAGTKLELK(SEQ ID NO:20)组成的组中选择的序列具有至少80％序列同一性的序列的可变轻链序列，和包含与序列QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSDFSLTNSGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGTTEYNAAFMSRLTITKDNSKSQVFFKMNSLLVDDTGIYYCARNFGNYAVDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:24)具有至少80％序列同一性的序列的可变重链序列。
在进一步的方面，本发明提供了一种分离的、合成的或重组的抗体或其抗原结合片段，其特异性地结合因子H(FH)，包含：包含与序列QIVLSQSPTILSASPGEKVTMTCRASSSVTYMHWYQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQRSSSNPLTFGAGTKLELK(SEQ ID NO:36)具有至少80％序列同一性的序列的可变轻链序列，和包含与序列QVQLRQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVYWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGTTDYSAAFISRLSISKDNSKSQVFFKMNSLQADDTAIYYCARNFGNYAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:40)具有至少80％序列同一性的序列的可变重链序列。
在进一步的方面，本发明提供了一种分离的、合成的或重组的抗体或其抗原结合片段，其特异性地结合因子H(FH)，包含：包含与序列DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKLSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPFTFGSGTKLEIK(SEQ ID NO:52)具有至少80％序列同一性的序列的可变轻链序列，和包含与序列QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQPPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNAAFISRLSISKDNSKSQVFFKMNSLQADDTAIYYCAKNGDYGYTMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:56)具有至少80％序列同一性的序列的可变重链序列。
在进一步的方面，本发明提供了一种分离的、合成的或重组的抗体或其抗原结合片段，其特异性地结合因子H(FH)，包含：包含与序列ENVLTQSPAIMSASLGEKVTMSCRASSSVNYMYWYQQKSDASKLSWIYYTSNLAPGVPARFSGSGSGNSYSLTISSMEGEDAATYYCQQFTSSPLTFGAGTKLELK(SEQ ID NO:68)具有至少80％序列同一性的序列的可变轻链序列，和包含与序列QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTSYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGSTDYNAAFISRLSISKDNSKSQVFFKMNSLQANDTAIYYCARNGGNYYFDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:72)具有至少80％序列同一性的序列的可变重链序列。
包含本文指定的轻链CDR1-3序列和重链CDR1-3序列或者本文指定的可变轻链序列和可变重链序列的根据本发明的抗体或片段优选增强FH活性。所述FH活性优选是抑制替代补体激活。所述对替代补体激活的抑制包括：抑制溶血活性，、抑制补体组分3(C3)沉积和/或增加FH与C3b、iC3b和/或C3d的结合。
在进一步的方面，本发明提供了一种分离的、合成的或重组的核酸分子，其包含编码根据本发明所述的抗体或片段的核酸序列。
在进一步的方面，本发明提供了一种包含根据本发明所述的核酸分子的载体。
在进一步的方面，本发明提供了一种包含根据本发明所述的核酸分子或载体的重组细胞。
在进一步的方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含根据本发明所述的抗体或片段以及药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。
在进一步的方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含根据本发明所述的核酸分子及药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。
在进一步的方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含根据本发明所述的载体及药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。
在进一步的方面，本发明提供了一种用于在治疗中使用的根据本发明的抗体或片段。
在进一步的方面，本发明提供了一种用于在治疗中使用的根据本发明所述的核酸分子。
在进一步的方面，本发明提供了一种用于在治疗中使用的根据本发明所述的载体。
在进一步的方面，本发明提供了一种用于在抑制替代补体激活中使用的根据本发明所述的抗体或片段。
在进一步的方面，本发明提供了一种用于在抑制替代补体激活中使用的根据本发明所述的核酸分子。
在进一步的方面，本发明提供了一种用于在抑制替代补体激活中使用的根据本发明的载体。
在进一步的方面，本发明提供了一种用于在与替代途径补体激活相关的病症的治疗、缓解或预防中使用的根据本发明所述的抗体或片段。
在进一步的方面，本发明提供了一种用于在与替代途径补体激活相关的病症的治疗、缓解或预防中使用的根据本发明所述的核酸分子。
在进一步的方面，本发明提供了一种用于与替代途径补体激活相关的病症的治疗、缓解或预防中使用的根据本发明所述的载体。
在进一步的方面，本发明提供了根据本发明所述的核酸分子用于制备用于治疗、缓解或预防与替代途径补体激活相关性病症的药物的用途。
在进一步的方面，本发明提供了根据本发明所述的载体用于制备用于治疗、缓解或预防与替代途径补体激活相关性病症的药物的用途。
在进一步的方面，本发明提供了根据本发明所述的抗体或片段用于制备用于治疗、缓解或预防与替代途径补体激活相关性病症的药物的用途。
在进一步的方面，本发明提供了一种治疗、缓解或预防与替代途径补体激活相关的病症的方法，包含向有此需要的个体给药治疗有效量的根据本发明所述的抗体或片段。
在进一步的方面，本发明提供了一种治疗、缓解或预防与替代途径补体激活相关的病症的方法，包含向有此需要的个体给药治疗有效量的根据本发明的核酸分子。
在进一步的方面，本发明提供了一种治疗、缓解或预防与替代途径补体激活相关的病症的方法，包含向有此需要的个体给药治疗有效量的根据本发明所述的载体。
在进一步的方面，本发明提供了一种治疗、缓解或预防与替代途径补体激活相关的病症的方法，包含向有此需要的个体给药治疗有效量的根据本发明所述的药物组合物。
在进一步的方面，本发明提供了一种抑制替代补体激活的方法，包含向个体给药根据本发明所述的抗体或片段。
在进一步的方面，本发明提供了一种抑制替代补体激活的方法，包含向个体给药根据本发明的核酸分子。
在进一步的方面，本发明提供了一种抑制替代补体激活的方法，包含向个体给药根据本发明所述的载体。
在进一步的方面，本发明提供了一种生产根据本发明所述的抗体或片段的方法，该方法包含提供具有根据本发明所述的核酸分子或载体的细胞，和允许所述细胞翻译由所述核酸分子或载体包含的核酸序列，由此生产根据本发明所述的抗体或片段。
具体实施方式
在一个方面，本发明提供了激动性抗-FH抗体及其片段，即增强FH活性的抗体和片段。在一个方面，这些抗体与抗体FH.07竞争结合至FH的结构域CCP18中的相同表位。增强型抗-FH抗体是替代补体途径激活的有效抑制剂，因此可用于治疗与补体系统的替代途径的不希望或过度激活相关的病症。FH特异性抑制替代途径的扩增环，其中将C3裂解成C3b，随后在细胞表面与FB结合并形成C3转化酶，促进了其它C3分子裂解成C3b。本发明的抗体和片段在C3水平上干扰补体激活这一事实的主要优点是避免了C3b在表面上的积累和C3a的释放。相反，如果在C5水平上抑制补体激活，例如使用依库丽单抗，则不会抑制C3b的积累和C3a的释放。C3b充当调理素且C3a是过敏毒素。因此，优选地防止了C3b的积累和C3a形成，因为这些过程导致免疫细胞的吸引和靶标的调理吞噬作用。这意味着，例如，接受依库丽单抗的PNH患者仍然需要输血，因为C3b的积累会导致红细胞的调理作用，随后这些红细胞会在肝脏和脾脏中被清除。另外，用抗-C5抗体治疗会导致细胞上C3b的积累和C3a形成，其需另外地由MAC裂解。抗-C5抗体的一个重要缺点是患者变得容易感染，因为抗体也会干扰病原体诱导的补体激活。通过靶向保护宿主细胞的补体系统的调节剂，可以避免这种情况。
如本文所用，术语“抗体”是指特异于靶表位的免疫球蛋白蛋白，其至少包含重链可变区(VH)和与之配对的轻链可变区(VL)。该术语涵盖多克隆和单克隆抗体。其是指与FH的CCP18(优选与CCP18)特异性结合的任何形式的抗体，包括全长免疫球蛋白。根据本发明所述的抗体一或其片段包含至少一个抗原结合位点。如本文所用，术语“抗原结合位点”是指包含至少一个CDR序列(优选地至少两个CDR序列，更优选至少三个CDR序列)的抗体或其片段的位点。例如，抗原结合位点包含轻链CDR 1-3或重链CDR 1-3。特别优选的抗原结合位点包含轻链CDR 1-3和重链CDR 1-3。
如本领域技术人员众所周知，抗体包含两条重链和两条轻链。抗体的重链是构成免疫球蛋白分子的两种链中的较大者。重链包括恒定结构域和可变结构域，该可变结构域参与抗原结合。抗体的轻链是构成免疫球蛋白分子的两种链中的较小者。轻链包含恒定结构域和可变结构域。轻链的可变结构域经常但并非总是与重链的可变结构域一起参与抗原结合。互补决定区(CDR)是重链可变结构域和轻链可变结构域中的高变区。如果是全长抗体，则重链的CDR 1-3和相连的轻链的CDR 1-3一起形成抗原结合位点。
本文中，“抗体的抗原结合片段”被定义为能够特异性结合与抗体相同的抗原(即FH的CCP18)的抗体的一部分，尽管不一定达到相同的程度。FH活性增强抗体的片段还可以增强FH活性，尽管不一定达到相同的程度。FH活性抑制抗体的片段也可以抑制FH活性，尽管不一定达到相同的程度。根据本发明的抗体片段优选包含抗体的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及所述抗体的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。抗体片段的非限制性实例是单结构域抗体、单链抗体、纳米抗体、单体、单链可变片段(scFv)、Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段和F(ab)2片段。抗体的优选片段至少包含重链可变结构域(VH)和/或轻链可变结构域(VL)。更优选的片段至少包含Fab片段。增强型抗-FH抗体FH.07的Fab’片段与本发明的抗体竞争结合相同的表位，已证明保留了增强FH功能的能力。因此，本发明的抗体的特别优选的片段是根据本发明的抗体的Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段和F(ab)2片段。在另一个实施方式中，根据本发明的抗体的片段包括免疫球蛋白重链可变区、免疫球蛋白重链恒定区、免疫球蛋白轻链可变区和免疫球蛋白轻链恒定区。
如本文所用，术语“对…特异”和“特异性结合”或“能够特异性结合”是指抗体与其表位之间的非共价相互作用。这表明所述抗体或片段相对于其它结合位点或其它抗原优先于结合所述表位。因此，尽管所述抗体或片段可以非特异性结合其它结合位点或抗原，所述抗体或片段对其表位的结合亲和力显著高于所述抗体或片段对任何其它结合位点或抗原的结合亲和力。
氨基酸序列或核酸序列的同一性百分比或术语“％序列同一性”，在本文中定义为在对比两个序列并且引入缺口(如果必要)以实现最大百分比同一性之后，与参比氨基酸序列或核酸序列中的残基相同的氨基酸序列或核酸序列全长的残基的百分比。用于比对的方法和计算机程序在本领域中是众所周知的，例如“Align 2”。
在本文所述的氨基酸序列中，氨基酸由单字母符号表示。这些单字母符号和三字母符号对于本领域技术人员是众所周知的，并且具有以下含义：A(Ala)是丙氨酸，C(Cys)是半胱氨酸，D(Asp)是天冬氨酸，E(Glu)是谷氨酸，F(Phe)是苯丙氨酸，G(Gly)是甘氨酸，H(His)是组氨酸，I(Ile)是异亮氨酸，K(Lys)是赖氨酸，L(Leu)是亮氨酸，M(Met)是蛋氨酸，N(Asn)是天冬酰胺，P(Pro)是脯氨酸，Q(Gln)是谷氨酰胺，R(Arg)是精氨酸，S(Ser)是丝氨酸，T(Thr)是苏氨酸，V(Val)是缬氨酸，W(Trp)是色氨酸，Y(Tyr)是酪氨酸。
根据本发明的优选抗体和片段能够增强FH的活性，优选人类FH的活性。术语“增强FH活性”是指如果根据本发明所述的抗体或片段结合FH，则FH的活性增加。由本发明的抗体和片段增强的FH的活性优选是抑制替代补体激活，优选在个体中。如本文所用，术语“替代补体激活”是指经由替代途径的补体系统的激活，即至少涉及形成替代途径的C3转化酶，即C3bBb/C3bBbP，或涉及这种C3转化酶形成的增加。替代补体激活可进一步涉及通过替代途径C3转化酶将C3切割成C3a和C3b，形成替代途径C5转化酶，即C3bBbC3b/C3bBbC3b，和/或切割C5并且随后结合C6、C7、C8和C9以形成MAC。替代补体激活可进一步包括替代途径扩增环的增加。所述替代补体激活优选在个体中，优选在个体的体液中，优选在血液、间质液或脑脊髓液中被抑制，更优选在血液中被抑制。如本文所用，“个体”是包含补体系统作为其免疫系统一部分的人或动物。优选地，所述个体是哺乳动物，更优选是人类。
如本文所用，“抑制替代补体激活”包括引起其抑制的或由于其抑制导致的组分的量或活性、替代补体系统的因子或活性的任何改变。替代补体激活的抑制例如包括抑制溶血活性，抑制补体组分3(C3)沉积在所述个体的细胞上，增加FH与C3b、iC3b和/或C3d结合，抑制替代补体途径C3转化酶C3bBb/C3bBbP的形成，抑制因子B与C3b的结合和/或抑制C3b和因子B之间的相互作用，抑制通过替代途径C3转化酶将C3切割为C3a和C3b，增加fH与宿主细胞(特别是与宿主细胞上表达的唾液酸、糖胺聚糖和/或肝素)的结合，抑制替代补体途径的扩增环，和抑制替代补体途径C5转化酶C3bBbC3bP/C3bBbC3bP的形成，抑制通过替代途径C5转化酶将C5切割为C5a和C5b，增加FH的衰变加速活性(即一旦形成替代途径C3转化酸，即促进其解离)，和/或增加FI辅助因子活性，导致C3b降解。由本发明的抗-FH抗体和片段增强的FH对替代补体激活的抑制优选包括抑制溶血活性，抑制C3在所述个体的细胞上的沉积，和/或增加FH与C3b、iC3b和/或C3d的结合。
如本文所用，“抑制”优选是指所指示的活性被降低至少约25％，更优选至少约50％，更优选至少约75％，更优选至少约80％，更优选至少约85％，更优选至少约90％，最优选至少约95％。因此，“抑制替代补体激活”优选意指替代补体途径的活性被降低至少约25％，更优选至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％。类似地，“抑制溶血活性”优选是指溶血活性被降低至少约25％，更优选至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％。
如本文所用，“增加”优选是指所指示的活性增加了至少约25％，更优选至少约50％，更优选至少约75％，更优选至少约80％，更优选至少约85％，更优选至少约90％，最优选至少约95％。因此，“增加FH与C3b的结合”优选是指FH与C3b的结合增加了至少约25％，更优选至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％。类似地，“增加FH与宿主细胞的结合”优选是指FH与宿主细胞的结合增加了至少约25％，更优选至少约50％、75％、80％、85％、90％或95％。
如本文所用，“溶血活性”是指由被体系统的激活诱导的，优选由于在细胞表面形成了MAC，红细胞破裂以及随后红细胞内含物释放到例如循环中。例如，如本文实施例中所述，使用如Sanchez-Corral et al.(2004)和Wouters et al.(2008)所述的溶血测定法来测量溶血活性，可选地进行一些修改。在该测定中，将诸如绵羊红细胞(SRBC)等红细胞与血清(如人血清)例如在37℃下摇晃温育1.25小时。FH水平低或FH功能失调导致SRBC裂解的血清可通过添加含有20mM EDTA的veronal缓冲液，然后在预冷的离心机(例如7℃)中离心2.5分钟来停止裂解。通过在412nm下测量上清液的吸光度来确定红细胞裂解的百分比。血清可以例如来自健康的人类个体或患有与不希望的或过度的替代途径补体激活相关的病症(例如aHUS)的人类个体。抗体或片段抑制溶血活性的能力可通过在所述抗体或片段存在下将红细胞与血清一起温育来确定。
例如，使用如本文在实施例中所述的C3沉积测定法来测量对C3沉积的抑制。该测定法涉及用LPS涂覆微量滴定板。随后，在存在或不存在抗体或片段的条件下，如上所述使用血清(例如来自健康个体的血清，或来自患有与不希望的或过度的替代实体激活相关的病症的个体的血清)温育所述板。可以使用抗-C3抗体检测LPS上的C3沉积。
例如使用如本文实施例中所述的ELISA来测量FH与C3b结合的增加。该测定法包括用C3b包被微量滴定ELISA板，并用血清(例如来自健康个体的或来自患有与上述不希望的或过度的替代补体激活相关的病症的个体的血清)温育该板。可以用抗-FH抗体检测结合的FH，例如过氧化物酶标记的多克隆抗-FH。抗体或片段增强FH与C3b结合的能力可以通过在使用包被的C3b温育之前在所述抗体或片段的存在下预温育血清来确定。作为另一个例子，使用例如本文在实施例中所述的表面等离子体共振(SPR)来确定FH与C3b的结合。SPR是一种在无标签环境中实时测量生物分子相互作用的技术。所述相互作用物之一(例如C3b)被固定在传感器表面，而另一种(例如FH)则在溶液中游离并且例如在存在或不存在(不同浓度的)本发明的抗体或片段的情况下，在所述表面上经过。优选的根据本发明的抗体或其片段在体外将FH对C3b的结合亲和力(KD)增加至最高2μM，更优选至多1.95μM，更优选至多1.8μM，更优选至多1.7μM和/或在体外将FH对C3b的结合亲和力增加至少3倍，更优选至少3.1倍，更优选至少3.2倍，更优选至少3.3倍，更优选至少3.5倍，更优选至少3.6倍。
本发明提供的优选的抗体或其片段在一项或多项功能测定中具有较低的体外IC50值，更优选对于同一项功能测定，其体外IC50值低于抗体FH.07的体外IC50值。“IC50”是本领域公知的术语，且是指为将某一功能活抑制或降低50％所需的抗体或片段的浓度。抗体或片段的IC50值越低，则抗体或片段的抑制活性越强，并且其作为治疗剂的潜力越大。所述功能测定优选地是如上所述的C3b沉积测定和/或溶血测定。在优选的方面，根据本发明的抗体或其片段在体外以38nM或更低、更优选35nM或更低、更优选32nM或更低、更优选30nM或更低、更优选28nM或更低、更优选27nM或更低的IC50值抑制C3在LPS上的沉积。在进一步优选的实施方式中，根据本发明的抗体或其片段在体外以150nM或更低、更优选130nM或更低、更优选115nM或更低、更优选105nM或更低、更优选100nM或更低、更优选95nM或更低的IC50值抑制溶血活性。
本发明的进一步优选的抗体或片段在体外以如上文所述的低IC50值抑制C3在LPS上的沉积并且在体外以如上文所述的低IC50值抑制溶血活性。因此，根据本发明的优选抗体或片段在体外以38nM或更低的IC50值抑制C3在LPS上的沉积并且在体外以150nM或更低的IC50值抑制溶血活性，更优选在体外以30nM或更低的IC50值抑制C3在LPS上的沉积并且在体外以150nM或更低的IC50值抑制溶血活性，更优选在体外以27nM或更低的IC50值抑制C3在LPS上的沉积并且在体外以100nM或更低的IC50值抑制溶血活性。优选在如上文所述的C3沉积测定中确定体外LPS上C3沉积的IC50值。优选在如上文所述的溶血活性测定中确定溶血活性的IC50值。
“结合亲和力”是指抗体或功能部分或功能等同物的单个结合位点与其结合伴侣(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指固有的结合亲和力，其反映结合对的成员(本申请中的抗体和抗原)之间的1:1相互作用。结合亲和力在本文中由平衡解离常数(KD)表示，其以ka与kd之比计算，参见例如Chen,Y.,et al.,1999。亲和力可以通过本领域已知的常用方法来测量，例如表面等离振子共振(SPR)测定法，诸如BiaCore(GE Healthcare Life Sciences GE Healthcare LifeSciences)或在IBIS Technologies BV(Hengelo,the Netherlands)的IBIS-iSPR仪器，或溶液相测定法，诸如Kinexa。
本发明提供的优选的抗体或其片段对FH和/或包含结构域CCP18-20的FH片段具有高结合亲和力，更优选该结合亲和力高于抗体FH.07的结合亲和力。抗体或片段的体内治疗活性通常需要高结合亲和力，例如使所述抗体或片段与除了其特异的表位或抗原以外的结合位点和/或抗原的结合最小化，并使需要体内施用的抗体或片段的量最小化。因此，优选具有高结合亲和力的抗体。抗体或其片段优选对FH的结合亲和力的解离常数(KD)为2.5×10-8M或更低和/或对由CCP18-20组成的FH片段的结合亲和力的KD为0.1×10-9M或更低。因此，在一个实施方式中，本发明提供了一种分离的、合成的或重组的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合因子H(FH)并且增强FH活性，其中所述抗体对FH的结合亲和力的KD为2.5×10-8M或更低和/或对由CCP18-20组成的FH片段的结合亲和力的KD为0.1×10-9M或更低。优选地，根据本发明所述的抗体或片段对FH的结合亲和力的KD为2.25×10-8M或更低，更优选2×10-8M或更低，更优选1.75×10-8M或更低，更优选1.5×10-8M或更低，更优选1.25×10-8M或更低，更优选1×10-8M或更低，更优选0.9×10-8M或更低，更优选0.8×10-8M或更低，更优选0.7×10-8M或更低，更优选0.6×10-8M或更低，和/或对由CCP18-20组成的FH片段的结合亲和力的KD为0.09×10-9M或更低，更优选0.08×10-9M或更低，更优选0.07×10-9M或更低，更优选0.06×10-9M或更低，更优选0.05×10-9M或更低，更优选0.04×10-9M或更低，更优选0.03×10-9M或更低，更优选0.02×10-9M或更低，更优选1×10-11M或更低，更优选0.9×10- 11M或更低，更优选0.8×10-11M或更低，更优选0.7×10-11M或更低，更优选0.6×10-11M或更低。在优选的方面，抗体或其片段优选对FH的结合亲和力的KD为1.25×10-8M或更低和/或对由CCP18-20组成的FH片段的结合亲和力的KD为0.04×10-9M或更低。在进一步优选的方面，抗体或其片段优选对FH的结合亲和力的KD为0.6×10-8M或更低和/或对由CCP18-20组成的FH片段的结合亲和力的KD为0.6×10-11M或更低。所述结合亲和力优选使用表面等离子体共振(SPR)确定，更优选在本文所述的测定中使用SPR，即在测定中，在ProtA芯片上通过SPR确定结合亲和力，在使全长FH(对于对FH的结合亲和力)或由结构域18-20组成的FH片段(对于对CCP18-20的结合亲和力)流经所述表面之前，所述ProtA芯片捕获了所述抗体或片段。
根据本发明进一步优选的抗体或片段具有高结合亲和力并且在体外以低IC50值抑制C3在LPS上的沉积和/或在体外以低IC50值抑制溶血活性。因此，根据本发明的优选抗体或片段对FH的结合亲和力的KD为2.5×10-8M或更低和/或对由CCP18-20组成的FH片段的结合亲和力的KD为0.1×10-9M或更低，并且在体外以38nM或更低的IC50值抑制C3在LPS上的沉积和/或在体外以150nM或更低的IC50值抑制溶血活性。更优选所述抗体或片段对FH的结合亲和力的KD为1.25×10-8M或更低和/或对由CCP18-20组成的FH片段的结合亲和力的KD为0.04×10-9M或更低，并且在体外以30nM或更低的IC50值抑制C3在LPS上的沉积且在体外以115nM或更低的IC50值抑制溶血活性。甚至更优选地，所述抗体或片段对FH的结合亲和力的KD为1.25×10-8M或更低和/或对由CCP18-20组成的FH片段的结合亲和力的KD为0.04×10-9M或更低，并且在体外以27nM或更低的IC50值抑制C3在LPS上的沉积且在体外以100nM或更低的IC50值抑制溶血活性。所述结合亲和力优选通过如本文所述的SPR确定。在体外C3在LPS上的沉积的IC50值优选在如上文所述的C3沉积测定中确定。溶血活性的IC50值优选在如上文所述的溶血活性测定中确定。
根据本发明特别优选的抗体是抗体抗-FHR-1.8E4，实施例中描述了其制备和鉴定。表1提供了抗体抗-FHR-1.8E4的可变重链和轻链序列以及各个CDR序列的概览。甚至更优选的是包含抗体抗-FHR-1.8E4的重链CDR序列和轻链CDR序列或抗体抗-FHR-1.8E4的重链可变区和轻链可变区的单克隆嵌合或人源化抗体或其片段。如本文使用的术语“抗-FHR-1.8E4”涵盖至少具有表1所示的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3区的所有抗体及片段，诸如例如分离的和/或纯化的抗体或重组产生的抗体。抗体抗-FHR-1.8E4与抗体FH.07竞争结合FH的CCP18中的相同表位。抗体抗-FHR-1.8E4具有26.3nM的体外抑制C3在LPS上沉积的低IC50值和94.0nM的体外抑制溶血活性的低IC50值。抗体抗-FHR-1.8E4进一步对全长FH具有高结合亲和力，KD为1.04×10-8，并且对由CCP18-20组成的FH片段具有高结合亲和力，KD为3.13×10-11。抗体抗-FHR-1.8E4进一步将体外FH对C3b的结合亲和力(KD)从6μM提高至1.66μM，即3.6倍。
根据本发明的另一特别优选的抗体是抗体抗-FHR-1.3B4，实施例中描述了其制备和鉴定。表1提供了抗体抗-FHR-1.3B4的可变重链和轻链序列以及各个CDR序列的概览。甚至更优选的是包含抗体抗-FHR-1.3B4的重链CDR序列和轻链CDR序列或抗体抗-FHR-1.3B4的重链可变区和轻链可变区的单克隆嵌合或人源化抗体或其片段。如本文使用的术语“抗-FHR-1.3B4”涵盖至少具有如表1所示的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3区的所有抗体和片段，诸如例如分离的和/或纯化的抗体或重组产生的抗体。抗体抗-FHR-1.3B4与抗体FH.07竞争结合FH的CCP18中的相同表位。抗体抗-FHR-1.3B4具有38.41nM的体外抑制C3在LPS上沉积的低IC50值和127.5nM的体外抑制溶血活性的低IC50值。抗体抗-FHR-1.3B4进一步对全长FH具有高结合亲和力，KD为0.58×10-8，并且对由CCP18-20组成的FH片段具有高结合亲和力，KD为5.44×10-12。抗体抗-FHR-1.3B4进一步将体外FH对C3b的结合亲和力(KD)从6μM增加至1.9μM，即3.2倍。
根据本发明的另一特别优选的抗体是抗体抗-FHR-1.11E1，实施例中描述了其制备和鉴定。表1提供了抗体抗-FHR-1.11E1的可变的重链和轻链序列以及各个CDR序列的概览。甚至更优选的是包含抗体抗-FHR-1.11E1的重链CDR序列和轻链CDR序列或抗体抗-FHR-1.11E1的重链可变区和轻链可变区的单克隆嵌合或人源化抗体或其片段。如本文使用的术语“抗-FHR-1.11E1”涵盖至少具有如表1所示的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3区的所有抗体和片段，诸如例如分离的和/或纯化的抗体或重组产生的抗体。抗体抗-FHR-1.11E1与抗体FH.07竞争结合FH的CCP18中相同表位。抗体抗-FHR-1.11E1具有25.04nM的体外抑制C3在LPS上沉积的低IC50值。
根据本发明的另一特别优选的抗体是抗体抗-FHR-1.12F4，实施例中描述了其制备和鉴定。表1提供了抗体抗-FHR-1.12F4的可变的重链和轻链序列以及各个CDR序列的概览。甚至更优选的是包含抗体抗-FHR-1.12F4的重链CDR序列和轻链CDR序列或抗体抗-FHR-1.12F4的重链可变区和轻链可变区的单克隆嵌合或人源化抗体或其片段。如本文使用的术语“抗-FHR-1.12F4”涵盖至少具有如表1所示的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3区的所有抗体和片段，诸如例如分离的和/或纯化的抗体或重组产生的抗体。抗体抗-FHR-1.12F4与抗体FH.07竞争结合FH的CCP18中的相同表位。抗体抗-FHR-1.12F4具有345.2nM的体外抑制C3在LPS上沉积的低IC50值。
因此，提供了一种分离的、合成的或重组的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合因子H(FH)的补体控制蛋白结构域18(CCP18)，包含：
-具有序列SSVXY的轻链CDR1序列，其中X是R、T或N(SEQ ID NO:91)或序列QSLVHSNGNTY(SEQ ID NO:49)，
-具有序列X1X2S的轻链CDR2序列，其中X1＝A、K或Y且X2＝T或L(SEQ ID NO:92)，
-具有从QQWGTKPPT(SEQ ID NO:19)、QQRSSSNPLT(SEQ ID NO:35)、SQSTHVPFT(SEQID NO:51)和QQFTSSPLT(SEQ ID NO:67)中选择的序列的轻链CDR3，
-具有序列X1FSLTX2X3G的重链CDR1，其中X1＝D或G，X2＝N或S且X3＝S或Y(SEQ IDNO:93)，
-具有序列IWSGGXT的重链CDR2，其中x＝T、N或S(SEQ ID NO:94)，和
-具有序列ARNX1GNYX2X3DY的重链CDR3序列，其中X1＝F或G，X2＝A或Y且X3＝V、M或F(SEQ ID NO:95)或AKNGDYGYTMDY(SEQ ID NO:55)。
在优选的实施方式中，所述抗体包含：
-具有序列SSVXY的轻链CDR1序列，其中X为R或T(SEQ ID NO:96)，
-具有序列ATS(SEQ ID NO:97)的轻链CDR2序列，
-具有从QQWGTKPPT(SEQ ID NO:19)和QQRSSSNPLT(SEQ ID NO:35)中选择的序列的轻链CDR3，
-具有序列X1FSLTNX2G的重链CDR1，其中X1＝D或G且X2＝S或Y(SEQ ID NO:98)，
-具有序列IWSGGTT(SEQ ID NO:99)的重链CDR2，和
-具有序列ARNFGNYAXDY的重链CDR3序列，其中X＝V或M(SEQ ID NO:100)。
所述抗体或片段优选增强FH活性，优选抑制替代补体激活，诸如抑制溶血活性、抑制补体组分3(C3)沉积和/或增加FH与C3b、iC3b和/或C3d的结合。所西安市片段优选至少包含重链可变结构域(VH)和/或轻链可变结构域(VL)。更优选的片段至少包含Fab片段。
所述抗体或片段优选对FH的结合亲和力的KD为2.5×10-8M或更低和/或对由CCP18-20组成的FH片段的结合亲和力的KD为0.1×10-9M或更低，优选其中所述抗体或片段对FH的结合亲和力的KD为1.25×10-8M或更低和/或对由CCP18-20组成的FH片段的结合亲和力的KD为0.04×10-9M或更低。
在进一步优选的实施方式中，本发明提供了一种分离的、合成的或重组的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合FH的CCP18，包含具有序列SSVRY(SEQ ID NO:17)的轻链CDR1序列、具有序列ATS(SEQ ID NO:18)的轻链CDR2序列和具有序列QQWGTKPPT(SEQ IDNO:19)的轻链CDR3、具有序列DFSLTNSG(SEQ ID NO:21)的重链CDR1、具有序列IWSGGTT(SEQID NO:22)的重链CDR2和具有序列ARNFGNYAVDY(SEQ ID NO:23)的重链CDR3序列。在一个实施方式中，所述抗体包含：可变轻链序列，该可变轻链序列包含与序列QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVRYMHWYQQKAGSSPTAWIFATSNLASGVPPRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWGTKPPTFGAGTKLELK(SEQ ID NO:20)具有至少80％序列同一性的序列，和可变重链序列，该可变重链序列包含与序列QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSDFSLTNSGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGTTEYNAAFMSRLTITKDNSKSQVFFKMNSLLVDDTGIYYCARNFGNYAVDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:24)具有至少80％序列同一性的序列。在进一步的实施方式中，所述抗体或片段包含：可变轻链序列，该可变轻链序列包含与所述序列SEQ ID NO:20具有至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少96％、更优选至少97％、更优选至少98％、更优选至少99％序列同一性的序列，和可变重链序列，该可变重链序列包含与所述序列SEQ ID NO:24具有至少85％％、更优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少96％、更优选至少97％、更优选至少98％、更优选至少99％序列同一性的序列。在一个特定的实施方式中，所述抗体或片段包含含有序列SEQ ID NO:20的可变轻链序列和含有序列SEQ ID NO:24的可变轻链序列。所述抗体或片段优选增强FH活性，优选抑制替代补体激活，诸如抑制溶血活性、抑制补体组分3(C3)沉积和/或增加FH与C3b、iC3b和/或C3d的结合。所述片段优选至少包含重链可变结构域(VH)和/或轻链可变结构域(VL)。更优选的片段至少包含Fab片段。
包含具有序列SSVRY(SEQ ID NO:17)的轻链CDR1序列、具有序列ATS(SEQ ID NO:18)的轻链CDR2序列和具有序列QQWGTKPPT(SEQ ID NO:19)的轻链CDR3、具有序列DFSLTNSG(SEQ ID NO:21)的重链CDR1、具有序列IWSGGTT(SEQ ID NO:22)的重链CDR2和具有序列ARNFGNYAVDY(SEQ ID NO:23)的重链CDR3序列的所述抗体或片段，优选对FH的结合亲和力的KD为2.5×10-8M或更低和/或对由CCP18-20组成的FH片段的结合亲和力KD为0.1×10-9M或更低。优选地，所述抗体或片段对FH的结合亲和力的KD为2.25×10-8M或更低，更优选2×10- 8M或更低，更优选1.75×10-8M或更低，更优选1.5×10-8M或更低，更优选1.25×10-8M或更低，和/或对由CCP18-20组成的FH片段的结合亲和力的KD为0.09×10-9M或更低，更优选0.08×10-9M或更低，更优选0.07×10-9M或更低，更优选0.06×10-9M或更低，更优选0.05×10-9M或更低，更优选0.04×10-9M或更低。
包含具有序列SSVRY(SEQ ID NO:17)的轻链CDR1序列、具有序列ATS(SEQ ID NO:18)的轻链CDR2序列和具有序列QQWGTKPPT(SEQ ID NO:19)的轻链CDR3、具有序列DFSLTNSG(SEQ ID NO:21)的重链CDR1、具有序列IWSGGTT(SEQ ID NO:22)的重链CDR2和具有序列ARNFGNYAVDY(SEQ ID NO:23)的重链CDR3序列的所述抗体或片段，优选在体外以38nM或更低的IC50值抑制C3在LPS上的沉积。优选地，所述抗体或片段在体外以35nM或更低、更优选32nM或更低、更优选30nM或更低、更优选28nM或更低、更优选27nM或更低的IC50值抑制C3在LPS上的沉积。
包含具有序列SSVRY(SEQ ID NO:17)的轻链CDR1序列、具有序列ATS(SEQ ID NO:18)的轻链CDR2序列和具有序列QQWGTKPPT(SEQ ID NO:19)的轻链CDR3、具有序列DFSLTNSG(SEQ ID NO:21)的重链CDR1、具有序列IWSGGTT(SEQ ID NO:22)的重链CDR2和具有序列ARNFGNYAVDY(SEQ ID NO:23)的重链CDR3序列的所述抗体或片段，优选在体外以150nM或更低的IC50值抑制溶血活性。优选地，所述抗体或片段在体外以115nM或更低、更优选105nM或更低的IC50值抑制溶血活性。
包含具有序列SSVRY(SEQ ID NO:17)的轻链CDR1序列、具有序列ATS(SEQ ID NO:18)的轻链CDR2序列和具有序列QQWGTKPPT(SEQ ID NO:19)的轻链CDR3、具有序列DFSLTNSG(SEQ ID NO:21)的重链CDR1、具有序列IWSGGTT(SEQ ID NO:22)的重链CDR2和具有序列ARNFGNYAVDY(SEQ ID NO:23)的重链CDR3序列的所述抗体或片段，优选在体外将FH对C3b的结合亲和力(KD)增加至最高2μM，更优选1.8μM和/或在体外将FH对C3b的结合亲和力增加至少3倍，更优选3.5倍。
在进一步优选的实施方式中，本发明提供了一种分离的、合成的或重组的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合FH的CCP18，包含具有序列SSVTY(SEQ ID NO:33)的轻链CDR1序列、具有序列ATS(SEQ ID NO:34)的轻链CDR2序列和具有序列QQRSSSNPLT(SEQ IDNO:35)的轻链CDR3、具有序列GFSLTNYG(SEQ ID NO:37)的重链CDR1、具有序列IWSGGTT(SEQID NO:38)的重链CDR2和具有序列ARNFGNYAMDY(SEQ ID NO:39)的重链CDR3序列。在一个实施方式中，所述抗体包含：可变轻链序列，该可变轻链序列包含与序列QIVLSQSPTILSASPGEKVTMTCRASSSVTYMHWYQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQRSSSNPLTFGAGTKLELK(SEQ ID NO:36)具有至少80％序列同一性的序列，和可变重链序列，该可变重链序列包含与序列QVQLRQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVYWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGTTDYSAAFISRLSISKDNSKSQVFFKMNSLQADDTAIYYCARNFGNYAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:40)具有至少80％序列同一性的序列。在进一步的实施方式中，所述抗体或片段包含：可变轻链序列，该可变轻链序列包含与所述序列SEQ ID NO:36具有至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少96％、更优选至少97％、更优选至少98％、更优选至少99％序列同一性的序列，和可变重链序列，该可变重链序列包含与所述序列SEQ ID NO:40具有至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少96％、更优选至少97％、更优选至少98％、更优选至少99％序列同一性的序列。在一个特定的实施方式中，所述抗体或片段包含含有序列SEQ ID NO:36的可变轻链序列和含有序列SEQ ID NO:40的可变轻链序列。所述抗体或片段优选增强FH活性，优选抑制替代补体激活，诸如抑制溶血活性、抑制补体组分3(C3)沉积和/或增加FH与C3b、iC3b和/或C3d的结合。所述片段优选至少包含重链可变结构域(VH)和/或轻链可变结构域(VL)。更优选的片段至少包含Fab片段。
包含具有序列SSVTY(SEQ ID NO:33)的轻链CDR1序列、具有序列ATS(SEQ ID NO:34)的轻链CDR2序列和具有序列QQRSSSNPLT(SEQ ID NO:35)的轻链CDR3、具有序列GFSLTNYG(SEQ ID NO:37)的重链CDR1、具有序列IWSGGTT(SEQ ID NO:38)的重链CDR2和具有序列ARNFGNYAMDY(SEQ ID NO:39)的重链CDR3序列的所述抗体或片段，优选对FH的结合亲和力的KD为2.5×10-8M或更低和/或对由CCP18-20组成的FH片段的结合亲和力的KD为0.1×10-9M或更低。优选地，所述抗体或片段对FH的结合亲和力的KD为2.25×10-8M或更低，更优选2×10-8M或更低，更优选1.75×10-8M或更低，更优选1.5×10-8M或更低，更优选1.25×10- 8M或更低，更优选1×10-8M或更低，更优选0.9×10-8M或更低，更优选0.8×10-8M或更低，更优选0.7×10-8M或更低，更优选0.6×10-8M或更低，和/或对由CCP18-20组成的FH片段的结合亲和力的KD为0.09×10-9M或更低，更优选0.08×10-9M或更低，更优选0.07×10-9M或更低，更优选0.06×10-9M或更低，更优选0.05×10-9M或更低，更优选0.04×10-9M或更低，更优选0.03×10-9M或更低，更优选0.02×10-9M或更低，更优选1×10-11M或更低，更优选0.9×10-11M或更低，更优选0.8×10-11M或更低，更优选0.7×10-11M或更低，更优选0.6×10-11M或更低。
包含具有序列SSVTY(SEQ ID NO:33)的轻链CDR1序列、具有序列ATS(SEQ ID NO:34)的轻链CDR2序列和具有序列QQRSSSNPLT(SEQ ID NO:35)的轻链CDR3、具有序列GFSLTNYG(SEQ ID NO:37)的重链CDR1、具有序列IWSGGTT(SEQ ID NO:38)的重链CDR2和具有序列ARNFGNYAMDY(SEQ ID NO:39)的重链CDR3序列的所述抗体或片段，优选在体外以150nM或更低的IC50值抑制溶血活性。优选地，所述抗体或片段在体外以105nM或更低的IC50值抑制溶血活性。
包含具有序列SSVTY(SEQ ID NO:33)的轻链CDR1序列、具有序列ATS(SEQ ID NO:34)的轻链CDR2序列和具有序列QQRSSSNPLT(SEQ ID NO:35)的轻链CDR3、具有序列GFSLTNYG(SEQ ID NO:37)的重链CDR1、具有序列IWSGGTT(SEQ ID NO:38)的重链CDR2和具有序列ARNFGNYAMDY(SEQ ID NO:39)的重链CDR3序列的所述抗体或片段，优选地在体外将FH对C3b的结合亲和力(KD)增加至最高2μM，更优选1.95μM，和/或在体外将FH对C3b的结合亲和力增加至少3倍，更优选3.1倍。
在进一步优选的实施方式中，本发明提供了一种分离的、合成的或重组的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合FH的CCP18，包含具有序列QSLVHSNGNTY(SEQ ID NO:49)的轻链CDR1序列、具有序列KLS(SEQ ID NO:50)的轻链CDR2序列和具有序列SQSTHVPFT(SEQID NO:51)的轻链CDR3、具有序列GFSLTNYG(SEQ ID NO:53)的重链CDR1、具有序列IWSGGNT(SEQ ID NO:54)的重链CDR2和具有序列AKNGDYGYTMDY(SEQ ID NO:55)的重链CDR3序列。在一个实施方式中，所述抗体包含：可变轻链序列，该可变轻链序列包含与序列DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKLSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPFTFGSGTKLEIK(SEQ ID NO:52)具有至少80％序列同一性的序列，和可变重链序列，该可变重链序列包含与序列QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQPPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNAAFISRLSISKDNSKSQVFFKMNSLQADDTAIYYCAKNGDYGYTMDYWGQGTSVTVSS(SEQID NO:56)具有至少80％序列同一性的序列。在进一步的实施方式中，所述抗体或片段包含：可变轻链序列，该可变轻链序列包含与所述序列SEQ ID NO:52具有至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少96％、更优选至少97％、更优选至少98％、更优选至少99％序列同一性的序列，和可变重链序列，该可变重链序列包含与所述序列SEQ ID NO:56具有至少85％％、更优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少96％、更优选至少97％、更优选至少98％、更优选至少99％序列同一性的序列。在一个特定的实施方式中，所述抗体或片段包含含有序列SEQ ID NO:52的可变轻链序列和包含含有序列SEQ ID NO:56的可变轻链序列。所述抗体或片段优选地增强FH活性，优选抑制替代补体激活，诸如抑制溶血活性、抑制补体组分3(C3)沉积和/或增加FH与C3b、iC3b和/或C3d的结合。所述片段优选至少包含重链可变结构域(VH)和/或轻链可变结构域(VL)。更优选的片段至少包含Fab片段。
在进一步优选的实施方式中，本发明提供了一种分离的、合成的或重组的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合FH的CCP18，包含具有序列SSVNY(SEQ ID NO:65)的轻链CDR1序列、具有序列YTS(SEQ ID NO:66)的轻链CDR2序列和具有序列of QQFTSSPLT(SEQ IDNO:67)的轻链CDR3、具有序列GFSLTSYG(SEQ ID NO:69)的重链CDR1、具有序列IWSGGST(SEQID NO:70)的重链CDR2和具有序列ARNGGNYYFDY(SEQ ID NO:71)的重链CDR3序列。在一个实施方式中，所述抗体包含：可变轻链序列，该可变轻链序列包含与序列ENVLTQSPAIMSASLGEKVTMSCRASSSVNYMYWYQQKSDASKLSWIYYTSNLAPGVPARFSGSGSGNSYSLTISSMEGEDAATYYCQQFTSSPLTFGAGTKLELK(SEQ ID NO:68)具有至少80％序列同一性的序列，和可变重链序列，该可变重链序列包含与序列QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTSYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGSTDYNAAFISRLSISKDNSKSQVFFKMNSLQANDTAIYYCARNGGNYYFDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:72)具有至少80％序列同一性的序列。在进一步的实施方式中，所述抗体或片段包含可变轻链序列，该可变轻链序列包含与所述序列SEQ ID NO:68具有至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少96％、更优选至少97％、更优选至少98％、更优选至少99％序列同一性的序列，和可变重链序列，该可变重链序列包含与所述序列SEQ ID NO:72具有至少85％％、更优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少96％、更优选至少97％、更优选至少98％、更优选至少99％序列同一性的序列。在一个特定的实施方式中，所述抗体或片段包含含有序列SEQ ID NO:68的可变轻链序列和含有序列SEQ ID NO:72的可变轻链序列。所述抗体或片段优选增强FH活性，优选抑制替代补体激活，诸如抑制溶血活性、抑制补体组分3(C3)沉积和/或增加FH与C3b、iC3b和/或C3d的结合。所述片段优选至少包含重链可变结构域(VH)和/或轻链可变结构域(VL)。更优选的片段至少包含Fab片段。
任选地，所述CDR的至少一个的序列被优化，从而产生变体抗体或片段，例如以(进一步)改善结合亲和力、选择性、FH增强能力和/或体内或储存稳定性。在优选的实施方式中，根据本发明的抗体或片段具有高的储存稳定性，特别是与抗体FH.07相比具有改善的存储稳定性。在进一步优选的实施方式中，根据本发明的抗体或片段具有高体内稳定性，特别是与抗体FH.07相比具有改善的体内稳定性。在进一步优选的实施方式中，根据本发明的抗体或片段具有高选择性，特别是与抗体FH.07相比具有提高的选择性。
此外，任选地本发明抗体或片段的至少一个框架区中的至少一个序列被优先，例如以提高抗体或片段的结合功效或稳定性，或降低在非人类序列施用到人体后的副作用。例如，这是通过诱变程序完成的。本领域技术人员能够产生包含至少一个改变的CDR或框架序列的抗体变体。例如，通过突变编码此类框架序列的核酸分子来优化CDR和/或框架序列。例如，应用保守氨基酸取代。保守氨基酸取代的实例包括一个疏水残基诸如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或蛋氨酸替换另一个疏水残基，和一个极性残基替换另一个极性残基，诸如精氨酸替换赖氨酸、谷氨酸替换天冬氨酸或谷氨酰胺替换天冬酰胺。为了选择改善的抗体或片段，优选测试所得的变体抗体或片段的结合亲和力、FH增强能力和/或稳定性，例如使用本文所述的测试。一旦获得特异于FH(特别是特异于FH的CCP18)的抗体或片段，即可以通过本领域技术人员已知的多种方法来测试其所需的生物活性，即它们增强FH活性的能力。如本文先前所述的，增强FH的活性优选涵盖抑制溶血活性、抑制C3在细胞上的沉积和/或增加FH与C3b的结合。用于测试这些活性的功能测定已在本文前面进行了描述，并在实施例中进行了详细介绍。通常，根据组成CDR的氨基酸的数目，CDR序列的至多三个氨基酸残基可以变化，同时保持相同的特异性。因此，根据本发明所述的抗体或片段优选含有重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3序列，其中与表1的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3序列相比，每个CDR的至多3、优选至多2、更优选至多1个氨基酸被改变。进一步优选的是，所述抗体或片段包含与表1所示相同抗体的轻链CDR3和重链CDR3、其中至多1个氨基酸被改变的所述抗体的轻链CDR2、以及其中至多3个氨基酸被改变的轻链CDR1、重链CDR1和重链CDR2。更优选地，所述抗体或片段包含与表1所示相同抗体的轻链CDR2和CDR3以及重链CDR3、以及其中至多2个氨基酸(更优选至多1个氨基酸)被改变的轻链CDR1、重链CDR1和重链CDR2。
因此，本发明进一步提供了一种分离的、合成的或重组的抗体或其片段，其特异性结合因子H(FH)的补体控制蛋白结构域18(CCP18)，包含：
-具有与序列SSVRY(SEQ ID NO:17)有至少80％同一性的序列的轻链CDR1序列，具有序列ATS(SEQ ID NO:18)的轻链CDR2序列和具有与序列QQWGTKPPT(SEQ ID NO:19)有至少80％同一性的序列的轻链CDR3，具有与序列DFSLTNSG(SEQ ID NO:21)有至少80％同一性的序列的重链CDR1，具有与序列IWSGGTT(SEQ ID NO:22)有至少80％同一性的重链CDR2，和具有与序列ARNFGNYAVDY(SEQ ID NO:23)有至少80％同一性的序列的重链CDR3序列，
-具有与序列SSVTY(SEQ ID NO:33)有至少80％同一性的序列的轻链CDR1序列，具有序列ATS(SEQ ID NO:34)的轻链CDR2序列和具有与序列QQRSSSNPLT(SEQ ID NO:35)有至少80％同一性的序列的轻链CDR3，具有与序列GFSLTNYG(SEQ ID NO:37)有至少80％同一性的序列的重链CDR1，具有与序列IWSGGTT(SEQ ID NO:38)有至少80％同一性的重链CDR2，和具有与序列ARNFGNYAMDY(SEQ ID NO:39)有至少80％同一性的序列的重链CDR3序列，
-具有与序列QSLVHSNGNTY(SEQ ID NO:49)有至少80％同一性的序列的轻链CDR1序列，具有序列KLS(SEQ ID NO:50)的轻链CDR2序列和具有与序列SQSTHVPFT(SEQ ID NO:51)有至少80％同一性的序列的轻链CDR3，具有与序列GFSLTNYG(SEQ ID NO:53)有至少80％同一性的序列的重链CDR1，具有与序列IWSGGNT(SEQ ID NO:54)有至少80％同一性的序列的重链CDR2，和具有与序列AKNGDYGYTMDY(SEQ ID NO:55)有至少80％同一性的序列的重链CDR3序列，
-具有与序列SSVNY(SEQ ID NO:65)具有至少80％同一性的序列的轻链CDR1序列，具有序列YTS(SEQ ID NO:66)的轻链CDR2序列和具有与序列QQFTSSPLT(SEQ ID NO:67)有至少80％同一性的序列的轻链CDR3，具有与序列GFSLTSYG(SEQ ID NO:69)有至少80％同一性的序列的重链CDR1，具有与序列IWSGGST(SEQ ID NO:70)有至少80％同一性的序列的重链CDR2，和具有与序列ARNGGNYYFDY(SEQ ID NO:71)有至少80％同一性的序列的重链CDR3序列。
所述抗体优选增强FH活性。优选地，所述抗体或片段包含重链CDR1、CDR2和/或CDR3序列和/或轻链CDR1、CDR2和/或CDR3序列，所述重链CDR1、CDR2和/或CDR3序列和/或轻链CDR1、CDR2和/或CDR3序列与所指示的序列具有至少85％、更优选至少86％、更优选至少87％、更优选至少88％、更优选至少89％、更优选至少90％、更优选至少91％、更优选至少92％、更优选至少93％、更优选至少94％、更优选至少95％、更优选至少96％、更优选至少97％、更优选至少98％、更优选至少99％的同一性。
本发明进一步提供了一种分离的、合成的或重组的抗体或其片段，其特异性结合因子H(FH)的补体控制蛋白结构域18(CCP18)，包含：
-具有任选地有1个氨基酸取代的序列SSVRY(SEQ ID NO:17)的轻链CDR1序列，具有序列ATS(SEQ ID NO:18)的轻链CDR2序列和具有任选地有2个氨基酸取代(优选1个氨基酸取代)的序列QQWGTKPPT(SEQ ID NO:19)的轻链CDR3，具有任选地有2个氨基酸取代(优选1个氨基酸取代)的序列DFSLTNSG(SEQ ID NO:21)的重链CDR1，具有任选地有2个氨基酸取代(优选1个氨基酸取代)的序列IWSGGTT(SEQ ID NO:22)的重链CDR2，和任选地具有2个氨基酸取代(优选1个氨基酸取代)的重链CDR3序列ARNFGNYAVDY(SEQ ID NO:23)，
-具有任选地有1个氨基酸取代的序列SSVTY(SEQ ID NO:33)的轻链CDR1序列，具有序列ATS(SEQ ID NO:34)的轻链CDR2序列和具有任选地有2个氨基酸取代(优选1个氨基酸取代)的序列QQRSSSNPLT(SEQ ID NO:35)的轻链CDR3，具有任选地有2个氨基酸取代(优选1个氨基酸取代)的序列GFSLTNYG(SEQ ID NO:37)的重链CDR1，具有任选地有2个氨基酸取代(优选1个氨基酸取代)的序列IWSGGTT(SEQ ID NO:38)的重链CDR2，和任选具有2个氨基酸取代(优选1个氨基酸取代)的重链CDR3序列ARNFGNYAMDY(SEQ ID NO:39)，
-具有任选地有2个氨基酸取代(优选1个氨基酸取代)的序列QSLVHSNGNTY(SEQ IDNO:49)的轻链CDR1序列，轻链CDR2序列KLS(SEQ ID NO:50)和具有任选有2个氨基酸取代(优选1个氨基酸取代)的序列SQSTHVPFT(SEQ ID NO:51)的轻链CDR3，具有任选地有2个氨基酸取代(优选1个氨基酸取代)的序列GFSLTNYG(SEQ ID NO:53)的重链CDR1，具有任选地有2个氨基酸取代(优选1个氨基酸取代)的序列IWSGGNT(SEQ ID NO:54)的重链CDR2，和任选具有2个氨基酸取代(优选1个氨基酸取代)的重链CDR3序列AKNGDYGYTMDY(SEQ ID NO:55)，
-具有任选地有1个氨基酸取代的序列SSVNY(SEQ ID NO:65)的轻链CDR1序列，具有序列YTS(SEQ ID NO:66)的轻链CDR2序列和具有任选地有2个氨基酸取代(优选1个氨基酸取代)的序列QQFTSSPLT(SEQ ID NO:67)的轻链CDR3，具有任选地有2个氨基酸取代(优选1个氨基酸取代)的序列GFSLTSYG(SEQ ID NO:69)的重链CDR1，具有任选地有2个氨基酸取代(优选1个氨基酸取代)的序列IWSGGST(SEQ ID NO:70)的重链CDR2，和具有任选地有2个氨基酸取代(优选1个氨基酸取代)的序列ARNGGNYYFDY(SEQ ID NO:71)的重链CDR3序列。
根据本发明的抗体或其片段优选是单克隆抗体或片段。单克隆抗体是基本上由单个分子物种组成的抗体。单克隆抗体是从同质抗体群体中获得的，除了具有在例如生产过程中自发发生的一种或多种突变的可能变体抗体或片段外，具有相同序列并结合相同表位。可以有利地重组产生单克隆抗体，使得可以获得的抗体量显著高于抗血清中存在的多克隆抗体的量。但是，本发明也涵盖多克隆抗体和片段。根据本发明的抗体或片段进一步优选为嵌合或人源化抗体。因此，所述抗体或片段优选至少包含人类轻链和重链恒定区。更优选地，所述抗体或片段还包含重链和轻链可变区中的人类框架区。进一步优选的是完全由人类序列组成的人类抗体或片段。嵌合、人源化或人类抗体的使用优于非人类抗体的使用，因为许多因素阻碍了使用非人类抗体或片段治疗人类疾病。人体可能将非人类抗体识别为外来物，这将产生针对所述非人类抗体或片段的免疫反应，从而导致不利的副作用和/或所述抗体或片段从循环中快速清除。当将嵌合、人源化或人类抗体施用于人类后，减少了副作用的机会。另外，当使用嵌合、人源化或人类抗体时，由于与非人类抗体相比清除率降低，因此通常在循环中获得了更长的半衰期。优选地，将人种系序列用于根据本发明的抗体或片段中的框架区。人类种系序列的使用将所述抗体或片段的免疫原性风险降至最低，因为这些序列不太可能含有体细胞改变(somatic alteration)，而这些体细胞改变是构架区所源自的个体所特有的，并且在应用于另一人类个体时可能引起免疫原性反应。
抗体人源化或提供嵌合抗体的程序是本领域众所周知的。已经建立了各种基于重组DNA的方法，其旨在增加抗体中也存在于人类抗体中相似位置的氨基酸残基的含量，同时保留亲本非人类抗体的特异性和亲和力。例如，将小鼠抗体可变区的框架区替换为具有最高同源性的相应人类框架区，而使非人类CDR保持完整。适用于人源化根据本发明的抗体的其它方法包括但不限于CDR移植(Queen,C et.al.1989；Carter,P et al.1992)；表面重修(Padlan,EA,et.al.1991)，超人源化(Tan,PDA,et.al.2002)、人类字符串内容优化(Lazar,G.A.et.al.2007)和人类工程化(Almagro,JC,et.al.2008)。
在一个实施方式中，根据本发明所述的抗体或片段是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两种不同抗原和/或表位具有结合特异性的单克隆抗体。在一个实施方式中，一种双特异性抗体对FH具有结合特异性(优选包含一条可变轻链和特性结合如本文所述FH的CCP18的一条可变重链)并且对另一种抗原具有结合特异性。在另一实施方式中，双特异性抗体可以结合FH的两个不同表位。
根据本发明所述的抗体或片段可以是任何类别。抗体的“类别”是指其重链拥有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五种主要类别的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些可以进一步分为子类或同种型，诸如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在一个优选的实施方式中，根据本发明所述的抗体或片段是IgG类，优选IgG1或IgG3。
可以通过本领域中已知的各种方法来制备对特定抗原(诸如根据本发明的FH)特异的抗体。例如，可以将人类FH用作引发抗体的免疫原。作为另一个例子，可以将FH相关蛋白的人类FH的CCP18结构域用作免疫原。这种方法的一个例子是通过免疫和杂交瘤的产生，如实施例中所述。例如，可以例如每隔四周，通过腹腔内注射人类因子H或FH相关蛋白(诸如FHR-1)，任选地在佐剂(如montanide)存在下，将小鼠(例如BALB/c小鼠)免疫来产生针对FH的小鼠单克隆抗体。第四次免疫后数天，脾细胞可与例如骨髓瘤细胞系SP2/0融合。可以通过ELISA测试杂交瘤上清液中存在因子H特异性抗体。例如，使用moAb(例如大鼠抗-小鼠κmoAb RM19)包覆微量滴定板以捕获小鼠IgG抗体。通过生物素化因子H确定抗体的特异性。提供FH特异性抗体的方法的另一个例子是通过筛选表达编码免疫球蛋白链的重组核酸序列的噬菌体展示文库。用于抗体噬菌体展示的方法已在本领域中使用并进行了广泛描述。可以使用与用于免疫的相同抗原(例如人类FH、FH相关蛋白或人类FH的CCP18结构域)对抗体进行文库筛选。
本发明进一步提供了一种分离的、合成的或重组的核酸分子，其包含编码根据本发明的抗体或其片段的核酸序列。优选的核酸分子至少编码如表1所示的抗体FHR-1.8E4的重链CDR1、CDR2和CDR3和/或轻链CDR1、CDR2和CDR3。进一步优选的核酸分子至少编码如表1所示的抗体FHR-1.3B4的重链CDR1、CDR2和CDR3和/或轻链CDR1、CDR2和CDR3。进一步优选的核酸分子至少编码如表1所示的抗体FHR-1.11E1的重链CDR1、CDR2和CDR3和/或轻链CDR1、CDR2和CDR3。进一步优选的核酸分子至少编码如表1所示的抗体FHR-1.12F4的重链CDR1、CDR2和CDR3和/或轻链CDR1、CDR2和CDR3。优选地，根据本发明的核酸分子的长度为至少30个核甘酸，更优选至少50个核甘酸，更优选至少75个核甘酸。优选地，根据本发明的核酸分子编码包含如表1所示的抗体FHR-1.8E4的重链CDR序列和轻链CDR序列和/或重链可变区和轻链可变区的单克隆嵌合或人源化抗体或其片段。根据本发明进一步优选的核酸分子编码包含如表1所示的抗体FHR-1.3B4的重链CDR序列和轻链CDR序列和/或重链可变区和轻链可变区的单克隆嵌合或人源化抗体或其片段。根据本发明进一步优选的核酸分子编码包含如表1所示的抗体FHR-1.11E1的重链CDR序列和轻链CDR序列和/或重链可变区和轻链可变区的单克隆嵌合或人源化抗体或其片段。根据本发明进一步优选的核酸分子编码包含如表1所示的抗体FHR-1.12F4的重链CDR序列和轻链CDR序列和/或重链可变区和轻链可变区的单克隆嵌合或人源化抗体或其片段。表1示出了编码抗体FHR-1.8E4、FHR-1.3B4、FHR-1.11E1和FHR-1.12F4的重链和轻链CDR的核酸序列。然而，本发明还涵盖包含与表1中所示的CDR核酸序列不同的核酸序列、但包含编码表1所示的所述重链或轻链CDR序列的氨基酸序列的核酸密码子的、编码根据本发明的抗体的重链或轻链CDR的核酸分子。
因此，提供了一种分离的、合成的或重组的核酸分子，其包含至少编码SEQ ID NO17、18、19、21、22和23的序列的核酸序列。进一步提供了一种分离的、合成的或重组的核酸分子，其包含至少编码SEQ ID NO 33、34、35、37、38和39的序列的核酸序列。进一步提供了一种分离的、合成的或重组的核酸分子，其包含至少编码SEQ ID NO 49、50、51、53、54和55的序列的核酸序列。进一步提供了一种分离的、合成的或重组的核酸分子，其包含至少编码SEQ ID NO 65、66、67、69、70和71的序列的核酸序列。进一步提供了一种分离的、合成的或重组的核酸分子，其包含至少编码SEQ ID NO 20和24的序列的核酸序列。进一步提供了一种分离的、合成的或重组的核酸分子，其包含至少编码SEQ ID NO 36和40的序列的核酸序列。进一步提供了一种分离的、合成的或重组的核酸分子，其包含至少编码SEQ ID NO 52和56的序列的核酸序列。进一步提供了一种分离的、合成的或重组的核酸分子，其包含至少编码SEQ ID NO 68和72的序列的核酸序列。本发明还涵盖编码重链和/或轻链CDR或者例如通过保守氨基酸取代修饰的抗体的核酸分子。
根据本发明的核酸分子或核酸序列优选包含核苷酸链，更优选DNA和/或RNA。然而，本发明的核酸分子或核酸序列可以包含其它种类的核酸结构，诸如例如DNA/RNA螺旋、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)和/或核糖酶。此种其它核酸结构被称为核酸序列的功能等同物，并且被本发明所涵盖。术语“核酸序列的功能等同物”还涵盖包含表现出与天然核苷酸相同功能的非天然核苷酸、修饰的核苷酸和/或非核苷酸结构单元的链。
本发明进一步提供了一种包含根据本发明的核酸分子的载体。优选的载体是质粒。质粒在本文中定义为环状，优选双链，DNA分子。制备包含根据本发明的核酸分子的载体的方法在本领域中是众所周知的。适用于产生本发明载体的载体非限制性实例是逆转录病毒和慢病毒载体。根据本发明所述的载体可以用于各种应用。根据本发明所述的载体优选用于在细胞中体外表达根据本发明的核酸分子，优选用于产生根据本发明的抗体或片段。进一步的，包含根据本发明核酸分子的根据本发明所述的载体可以用于治疗。向有需要的个体(优选人类)施用此种载体导致在体内表达根据本发明所述的抗体或片段。
进一步提供了一种重组细胞，其包含根据本发明的核酸分子或载体。此种核酸分子或载体优选用于引入到所述细胞中以便细胞的核酸翻译机制将产生编码的抗体或片段。优选在所谓的生产者细胞(诸如例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、NSO(小鼠骨髓瘤)或293(T)细胞系，其中一些适用于商业抗体生产)中表达根据本发明的核酸分子或载体。此类生产者细胞的增殖产生能够生产根据本发明的抗体或片段的生产者细胞系。优选地，所述生产者细胞系适用于生产用于在人类中使用的抗体。因此，所述生产者细胞系优选不含病原体，例如病原微生物。
本发明进一步提供了一种生产根据本发明所述的抗体或片段的方法，包含提供具有根据本发明的核酸分子或载体的细胞，和使所述细胞翻译由所述核酸分子或载体包含的核酸序列，由此产生根据本发明所述抗体或片段。根据本发明所述的方法优选地进一步包含收获、纯化和/或分离所述抗体或片段。还提供了使用生产根据本发明的抗体或片段的方法获得的抗体或片段。
根据本发明所述的抗体或片段可以有利地用于治疗性应用。因此，提供了一种药物组合物，其包含根据本发明所述的抗体或片段和药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。还提供了一种药物组合物，其包含根据本发明的核酸分子或载体以及至少一种药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。合适载体的非限制性实例是例如匙孔血蓝蛋白(KLH)、血清白蛋白(例如BSA或RSA)和卵清蛋白。优选的载体是溶液，诸如水溶液，例如盐水或油基溶液。可以掺入到片剂、胶囊剂等中的赋形剂的非限制性实例是粘合剂，诸如黄蓍胶、阿拉伯树胶、玉米淀粉或明胶，赋形剂，诸如微晶纤维素，崩解剂，诸如玉米淀粉、预糊化淀粉和藻酸，润滑剂，诸如硬脂酸镁，甜味剂，诸如蔗糖、乳糖或糖精，和调味剂，如薄荷、冬青油或樱桃油。当剂量单位形式是胶囊剂时，除一种或多种上述赋形剂外，其优选还含有液体载体，例如脂肪油。各种其它材料可以作为包衣存在或用于改变剂量单位的物理形式。例如，片剂可以包覆有虫胶和/或糖或两者。根据本发明的药物组合物优选适合用于人类用途。
本文所述的药物组合物可以以多种不同方式施用。示例包括经由口服、鼻内、直肠、局部、腹膜内、静脉内、肌肉内、皮下、真皮下、经皮、鞘内和颅内方法施用包含根据本发明的抗体且含有药学上可接受的载体的药物组合物。对于口服施用，活性成分可以以固体剂型施用，例如胶囊、片剂和散剂，或以液体剂型施用，诸如酏剂、糖浆剂和悬浮液。可以根据常规制药实践，通过将本发明的抗体或片段溶解或悬浮于注射用载体(诸如水或天然油，如芝麻油、椰子油、花生油、棉籽油等)或合成的脂肪载体(如油酸乙酯)中来配制注射用无菌组合物。也可以掺入缓冲剂、防腐剂和/或抗氧化剂。
本发明进一步提供了一种用于在治疗中使用的根据本发明所述的抗体或片段。进一步提供了一种用于在治疗中使用的根据本发明的核酸分子。所述治疗可以是治疗性或预防性的。根据本发明的抗体或片段特别适合用于治疗、缓解或预防与替代途径补体激活相关的病症。因此，提供了一种用于在与替代途径补体激活相关的病症的治疗、缓解或预防中使用的根据本发明所述的抗体或片段。还提供了一种用于在与替代途径补体激活相关的病症的治疗、缓解或预防中使用的根据本发明的核酸分子。如本文所用，“与替代补体激活相关的病症”在本文中定义为不希望的和/或过度的替代途径补体激活导致细胞、组织或细胞外基质受损的病症。可能由于不希望的和/或过度的替代途径激活而受损的细胞是任何与血液接触的细胞，例如红细胞、上皮细胞(特别是肝和/或肾上皮细胞)、血小板、白细胞、内皮细胞。所述病症优选是与FH功能受损或FH缺乏相关的病症。更优选地，所述疾病是与FH功能受损或FH缺乏相关但与FH缺失无关的病症。由于本发明的抗体和片段增强FH的功能，因此该抗体和片段特别适合于阻断或减少受损的FH功能或FH缺乏的影响。然而，本发明的增强型抗-FH抗体也可以抑制与其中人工阻断了FH的健康个体的血清一起温育的红细胞的裂解。因此，抗体和片段还可用于阻断或减少由FH功能受损或FH缺乏以外的因素引起的不希望和/或过度替代途径补体激活。可以被治疗的此类病症的非限制性例子是非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)、阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)、年龄相关性黄斑变性(AMD)、膜增生性肾小球肾炎(MPGN)。
非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)，也称为补体介导的HUS，其特点是溶血性贫血、血小板减少、全身性血栓性微血管病(TMA)和肾衰竭。aHUS的发作通常在儿童时期，并且该疾病的发作与例如感染、妊娠、其它疾病、手术或创伤相关。尽管有血浆置换或血浆补充，但超过60％的aHUS患者死亡或发展为晚期肾病(ESRD)。在aHUS患者中已鉴定出补体系统组分或因子的多种突变。FH、FI、FB、膜辅因子蛋白(MCP)、血栓调节蛋白(THBD)或C3的突变占aHUS患者已知突变的约50％，其中FH突变最常见(约20-30％的aHUS患者)。大多数患者的突变是杂合的，但仍导致病理性FH缺乏。此外，在大约10％的患者中，aHUS是由针对FH的自身抗体引起的，也导致功能性FH降低。目前，aHUS的标准治疗方法是血浆补充或血浆置换疗法。此外，在aHUS患者的治疗中使用依库丽单抗。肾移植与高复发风险有关，这取决于aHUS的潜在突变。在FH、FB、FI、C3或THBD中具有突变的儿童禁忌移植，因为其复发风险增加。根据本发明的抗体或片段(优选至少包含Fab片段)特别适用于治疗、缓解或预防由FH突变或由抗-FH自身抗体的存在引起的aHUS。对FH的增强作用独立于带有突变的FH的CCP结构域。例如，增强型FH抗体或其片段能够在FH的CCP1、CCP6、CCP7、CCP14、CCP17、CCP18、CCP19和CCP20中携带突变的aHUS患者中抑制替代实体激活。然而，由于本发明的抗体和片段还可以在没有FH功能受损或FH缺乏的情况下增强FH的活性，因此可以用本发明的抗体或片段有利地治疗、缓解或预防任何形式的补体依赖性aHUS。
阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)是由全能造血干细胞的X染色体上的基因突变引起的。该突变导致磷脂酰肌醇聚糖A类蛋白缺乏，其对糖基磷脂酰肌醇膜锚定蛋白(GPI-AP)的合成至关重要。补体系统CD55的抑制剂就是这种蛋白质的一个例子，它可以在宿主细胞表面结合C3b，从而阻止C3转化酶的形成。因此，这些蛋白质的缺乏会导致不希望的或过度的实体激活。PNH的主要后果之一是红细胞由于补体系统的过度活性而发生裂解。最近，依库丽单抗已被多个国家批准用于PNH的治疗。其它疗法包括输血、红细胞刺激剂疗法、使用皮质类固醇和合成代谢类固醇治疗。由于本发明的抗体和片段还可以独立于FH的水平或FH功能而增强FH的活性，从而抑制补体系统替代途径的激活，因此该抗体和片段可以有利地用于PNH患者。此外，因为本发明的抗体和片段在C3沉积的水平上起作用，这与在激活途径更下游起作用的依库丽单抗相反，由于被C3b调理的细胞更少，所以减少了肝脏中细胞的消耗。
年龄相关性黄斑变性(AMD)是对视网膜的损害，通常影响老年人，导致黄斑区(视场中心)视力丧失。最近，已有约35％的AMD患者涉及FH中的突变和SNP(单核苷酸多态性)。SNP位于FH的CCP7中，并被证明会影响FH与肝素的结合，从而损害FH结合宿主细胞表面以及细胞外基质的能力。根据本发明的抗体或片段(优选至少包含Fab片段)特别适合用于治疗、缓解或预防以FH功能降低为特征(优选以编码FH的基因中的SNP为特征)的AMD。
膜增生性肾小球肾炎(MPGN)是慢性肾炎的罕见原因，主要发生于儿童和年轻人。由于肾小球系膜和内皮细胞的增殖以及肾小球系膜基质的扩张、内皮下免疫沉积物和/或膜内致密沉积物使外周毛细血管壁增厚、以及肾小球系膜插入毛细血管壁，其会引起肾小球损伤。MPGN通常与完全缺乏FH相关。可以用本发明的抗体和/或片段治疗的MPGN优选与FH功能受损或FH缺乏相关，而与FH缺乏无关。
因此，本发明提供了一种用于在与替代途径补体激活相关的病症的治疗、缓解或预防中使用的根据本发明的抗体或片段或核酸分子，其中所述病症选自非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)、阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)、年龄相关性黄斑变性(AMD)、膜增生性肾小球肾炎(MPGN)。还提供了根据本发明的抗体或片段、核酸分子或载体用于制备用于治疗、缓解或预防与替代途径补体激活相关性病症的药物的用途。所述病症优选地选自非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)、阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)、年龄相关性黄斑变性(AMD)、膜增生性肾小球肾炎(MPGN)。用作根据本发明的药物或预防剂的优选抗体是包含如表1所示抗体的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3的抗体或其片段，优选Fab、Fab’或F(ab)2或F(ab’)2片段。所述抗体或片段优选是单克隆人源化或嵌合抗体或片段。
本发明进一步提供了一种抑制替代补体激活的方法，包含向个体施用根据本发明所述的抗体或片段、或根据本发明所述的核酸分子或载体。
本发明进一步提供了一种治疗、缓解或预防与替代途径补体激活相关的病症的方法，包含向有些需求的个体施用治疗有效量的根据本发明所述的抗体或片段。还提供了一种治疗、缓解或预防与替代途径补体激活相关的病症的方法，包含向有些需求的个体施用治疗有效量的根据本发明的核酸分子或载体。进一步提供了一种治疗、缓解或预防与替代途径补体激活相关的病症的方法，包含向有些需求的个体施用治疗有效量的根据本发明的药物组合物。所述病症优选地选自非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)、阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)、年龄相关性黄斑变性(AMD)、膜增生性肾小球肾炎(MPGN)。如本文所使用的，“个体”是具有补体系统作为其免疫系统一部分的人类或动物，优选是哺乳动物。在特别优选的实施方式中，所述个体是人类。优选用于本发明方法中的抗体是如下抗体或其片段，优选Fab、Fab’、F(ab)2或F(ab’)2片段，该抗体或其片段包含抗体FHR-1.8E4的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3，包含抗体FHR-1.3B4的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3，包含抗体FHR-1.11E1的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3，或包含如表1所示的抗体FHR-1.12F4的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3。所述抗体或片段优选是单克隆人源化或嵌合抗体或片段。
含有本发明的抗体、片段、核酸分子的组合物可以给药用于预防性和/或治疗性治疗。在治疗性应用中，以足以抵消疾病症状和/或其并发症的量将根据本发明的抗体、片段、核酸分子或组合物施用于已经患有和/或已经显示出疾病症状的个体，优选人类。在预防性应用中，在个体表现出病症症状之前向个体施用根据本发明的抗体、片段、核酸分子或组合物，以预防这些症状或其并发症的发展。例如，使用根据本发明的抗体、片段、核酸分子或组合物可以预防性治疗携带可能或将导致与替代补体激活相关性病症的基因突变的个体。所述抗体、片段或核酸分子通常以治疗有效量存在于根据本发明的药物组合物中，所述治疗有效量为足以弥补与补体系统替代途径的不希望或过度激活相关的病症的量。
为了清楚和简洁的描述，特征在本文中可被描述为本发明的相同或不同的方面或实施方式的一部分。本领域技术人员将认识到，本发明的范围可以包括具有在本文中描述为相同或不同实施方式的一部分的特征的全部或一些的组合。
在以下非限制性实施例中将更详细地解释本发明。
表1.抗体FH.07、FHR-1.8E3、FHR-1.3B4、FHR-1.11E1、FHR-1.12F4和FHR-1.14C4的氨基酸和核苷酸序列(根据IMGT编号系统(Lefranc 1997、Lefranc 1999和Lefranc etal.2003)对CDR编号。LC＝轻链，HC＝重链，CDR＝互补决定区，VH＝重链可变区，VL＝轻链可变区。
附图说明
图1：竞争测定法以绘制抗-FHR-1抗体的表位位置。
A)通过ELISA评估每种单克隆抗体在未标记的全长FH或FH片段存在或不存在的条件下与生物素化FH(FH-bt)的结合。结合表示为在无任何添加未标记的竞争物的情况下观察到的FH-bt结合的百分比(设置为100％，虚线)。B)使用抗-FH和抗-FHR-1mAb作为捕获mAb(指示在X轴上)，并使用抗-FH.07或抗-FH.16(作为对照)作为竞争物，用FH-bt进行的竞争ELISA。C)如B中用FH-bt进行竞争ELISA，但仅将抗-FH.07用作捕获mAb，并将抗-FHR-1mAb(指示在X轴上)用作竞争mAb。
图2：抗-FHR-1mAb的SPR分析以确定其对FH的亲和力。在ProtA或ProtG芯片上通过SPR确定亲和力。
(A-B)在表面上流过全长FH(A)或由结构域18-20组成的FH片段(B)之前捕获指定单克隆抗体的传感图示例。按照1:1结合模型获得拟合图(黑线)和每个图旁边指示的相应结果。
(C-D)使用ProtA或ProtG芯片对抗体FH.07、3B4和8E4进行全长(C)或者CCP18-20(D)进行的所有亲和力分析的概要。
图3：抗-FHR-1mAb的功能表征。
A)
使用10％(v/v)正常人血清，加入指定的抗体，通过ELISA测定的C3b在LPS上的沉积。图代表了多个独立实验，n＝4。
上图：C3b沉积的增强的IC50。
下图：C3b在LPS上沉积以增加FH.07、3B4和8E4浓度的代表图。将在不添加任何抗体的10％(v/v)正常人血清中的C3b沉积设定为100％。IgG1 ctrl是阴性对照抗体。
B)使用绵羊红血细胞(SRBC)和10％(v/v)正常人血清的溶血测定。使用抗-FH.09抑制FH来诱导溶血(血清+FH Inh.)，导致89％裂解。以所示出的从多个实验计算的溶血IC50添加针对FH和FHR-1的单克隆抗体。n＝2-4，采用普通单因素ANOVA进行统计分析，*指示p≤0.05。
图4：A.如所示出的，在添加和未添加抗-FH.07、抗-FHR-1 3B4或抗-FHR-1 8E4Fab’片段的条件下，FH与C3b相互作用的SPR分析传感图。Fab’片段的添加在所有表面上将测得的RU增加了至少2倍，反映了FH结合增加。B.结合的平衡分析和相互作用的估计KD显示每个Fab’的亲和力分别增加2.7、3.2和3.6倍。
实施例
材料和方法
试剂
人类纯化的因子H获自CompTech.(Tyler,Texas USA)。大鼠抗-小鼠κ(RM19)获自Sanquin(商业单位试剂,Sanquin,Amsterdam,the Netherlands)。高性能ELISA缓冲液(HPE)获自Sanquin。重组FH CCP(CCP 15-18、CCP 15-19、CCP 18-20或CCP 19-10)是Christoph Schmidt博士的惠赠并且如先前所述生产(Schmidt et al.2008)。针对人类FH的小鼠单克隆抗体(mAb)是先前制得的。抗-FH.07(鼠类IgG1)针对CCP 18，抗-FH.09(鼠类IgG1)针对CCP 6且抗-FH.16(鼠类IgG1)针对CCP 16/17。抗-IL-6.8被用作无关的同种型对照且获自Sanquin。抗-C3.19与分子C3d片段上的表位反应并且之前已经描述过(Wolbinket al.1993)。
rhFHR蛋白的表达
如先前的描述生产和纯化含有C端6x-组氨酸(6xHis)标签的重组人类因子H-相关性(rhFHR)蛋白质(Pouw et al.2015)。简而言之，在HEK293F细胞中通过pcDNA3.1表达载体的瞬时转染表达蛋白质，之后使用HisTrapTM高性能1ml色谱柱(GE Healthcare LifeSciences,Freiburg,Germany)，通过Ni2+亲和色谱法从上清液中纯化蛋白质。使用
超离心过滤器(Merck Millipore,Darmstadt,Germany)过滤并浓缩rFHRh。
免疫和杂交瘤产生
每隔4周，腹腔内注射25μg处于作为佐剂的金刚胺中的rhFHR-1将BALB/c小鼠免疫以生成针对FHR-1的小鼠单克隆抗体。第四次加强免疫的三天后，将脾细胞与骨髓瘤细胞系SP2/0融合。通过ELISA测试杂交瘤细胞上清液中FHR-1特异性抗体的存在。简而言之，用大鼠抗小鼠κmoAb(RM19)包被微量滴定板，以捕获小鼠IgG抗体。通过生物素化的rhFHR-1确定抗体的特异性。在HPE中通过使用0.1％(v/v)缀合有HRP的链霉亲和素温育30分钟来确定生物素化的rhFHR-1的结合。在0.1M含有0.003％(v/v)H2O2的乙酸钠(pH 5.5)中使用100μg/mL3,5,3’,5’-四甲基联苯胺(TMB)进一步开发ELISA。通过添加100μL H2SO4停止底物转化并且在450nm下测量吸光度，并使用Synergy 2多模式读板器(BioTek Instruments,Winooski,VT,USA)校正540nm处的吸光度。所有ELISA步骤均以每孔100μL的最终体积进行。
表位映射mAb和竞争分析
使用由多个CCP结构域(15-18、15-19、18-20或19-20)组成的重组人类FH片段确定抗-FHR-1mAb的表位的位置。简而言之，抗-FHR-1mAb被捕获在RM-19包被的微量滴定板上以确保最佳的结合构象。随后，将生物素化的FH与100倍高浓度的所示未标记的重组FH片段混合，在板上温育1小时。在HPE中使用0.01％(v/v)缀合有聚-HRP的链霉亲和素温育30分钟以确定生物素化FH的结合。如上所述进一步开发ELISA。为了确定抗-FHR-1mAb是否与抗-FH.07竞争FH的结合，使用了类似的设置。简而言之，将mAb直接涂覆在板上并且如上所述通过ELISA评估在不存在或存在10倍高浓度所示mAb的情况下生物素化FH(FH-bt)的结合。
C3在LPS上的沉积
在室温下使用处于PBS,O/N中的伤寒沙门氏菌LPS(40μg/mL,L-6386Sigma-Aldrich)涂覆Polysorp 96孔微量滴定板(Nunc)。LPS激活补体的替代途径。在使用PBS+0.1％(w/v)吐温-20洗涤后，在存在或不存在指定浓度的抗-FH/抗-FHR-1mAb、同种型对照或作为阴性对照的aIL6-8AB的情况下，在含有0.05％(w/v)明胶、5mM MgCl2、10mM EGTA和0.1％(w/v)吐温-20的Veronal缓冲液(VB；3mM巴比妥、1.8mM巴比妥钠、145mM NaCl，pH7.4)中温育10％(v/v)NHS。使用生物素化的mAb抗-C3.19(0.55μg/mL，在HPE中)检测C3b沉积，随后在HPE中使用0.01％(v/v)缀合有聚-HRP的链霉亲和素温育30分钟。如上所述进一步开发ELISA。
SRBC溶血测定
使用如Sanchez-Corral et al.(2004)和Wouters et al.(2008)先前所述的溶血测定，经过一些调整，确定FH功能。使用指示的mAb预温育含有20μg/ml抗-FH.09的预稀释的人类血清(20％,v/v)，并且以1:1的比率与绵羊红细胞(SRBC)混合以达到10％(v/v)的血清最终浓度，并且以在具有5mM MgCl2和10mM EGTA的VB中或具有10mM EDTA的VB中的1.05*108个细胞/ml作为空白，随后在摇动下于37℃温育75分钟。加入100μl冰冷的具有20mM EDTA的VB停止裂解，然后离心(2.5分钟,1,800RPM/471RCF,7℃)。将溶血测定为上清液在412nm处的吸光度，校正在690nm处测得的背景吸光度，并表示为100％裂解对照(使用0.6％(w/v)皂素温育的SRBC)的百分比。作为阴性对照，将SRBC与稀释在补充有10mM EDTA的VB中的血清一起温育，以防止补体激活。使用graphpad prism 7.04，从多次实验中计算溶血的EC50，并且通过普通单因素ANOVA和Dunnett多重比较检验进行统计比较。
确定结合亲和力(SPR)
使用BiaCore T200(GE Healthcare)和CM5传感器芯片(GE Healthcare)按照制造商的说明进行表面等离子体共振(SPR)实验。简言之，为了确定其亲和力，将抗-FH.07、抗-FHR-1 3B4或抗-FHR-1 8E4捕获到ProtA或ProtG耦合芯片上，并且使全长FH或包含结构域18-20的FH片段以不断降低的浓度在所捕获的moAB上流过。
因子H与C3b的结合亲和力
使用Biacore T200仪器(GE Healthcare,Little Chalfont,UK)通过表面等离子体共振确定在抗-FH moAb存在下FH与C3b的结合。使用标准胺偶联将经纯化的C3b(Complement Technologies)固定在CM5 Biacore传感器芯片(GE Healthcare)的流通池上。将剩余的流通池用作参考表面，并通过在未添加任何蛋白质的条件下进行的偶联反应来制备。与C3b偶联后获得2000个响应单位(RU)的响应。在37℃下，使用10μl/min的流动速率并且在补充有0.01％(w/v)吐温-20(Merck)(PBS-T)的磷酸盐缓冲盐水pH 7.4(PBS,Orphi Farma)中进行SPR实验。
为了在不干扰通过moAb可能发生交联的情况下确定抗体的作用，使用重组生产的moAb的Fab’片段。将Fab’片段与血浆纯化的FH(pdFH)混合。在不存在或存在10μM(至少2倍摩尔比过量)抗-FH.07、抗-FHR-1 3B4或抗-FHR-1 8E4 Fab’片段的情况下，在芯片上以不同浓度注射FH 60秒(10–0.01953μM用于单独的FH，和5–0.01953μM用于与moAb Fab’片段复合)。还在未添加FH的条件下注入各Fab’片段以确定Fab’片段与表面的任何相互作用。注射pdFH之后解离60秒并且在每个循环之间通过单次注射1M NaCl(Merck)再生表面。
使用Scrubber 2(Biologic Software)分析数据，通过平衡分析确定亲和力。
结果
单克隆抗体
针对重组人类因子H相关蛋白1(FHR-1)产生单克隆抗体FHR-1.3B4、FHR-1.8E4、FHR-1.11E1、FHR-1.12F4和FHR-1.14C4。
映射结合位点
为了映射单克隆抗体的结合位点，测试了moAb对包含不同CCP结构域(CCP 15-18、CCP 15-19、CCP 18-20和CCP 19-20)的重组FH片段以及全长人类FH的反应性。如图1A所示，FHR-1.3B4、FHR-1.8E4、FHR-1.11E1、FHR-1.12F4和FHR-1.14C4以不同和度结合重组片段CCP 15-18、CCP 15-19和CCP 18-20，但不结合CCP 19-20。这表明所有抗体均对FH的CCP 18特异。
表位映射
使用激动性抗-FH抗体FH.07进行了竞争测定。如图1B和图1C所示，FHbt与包被的抗-FH.07、11E1、8E4和3B4的结合被抗-FH.07竞争，位未被14C4或同种型对照抗-FH.16所竞争。这表明，抗-FH.07、11E1、8E4和3B4与CCP18中相同或重叠的表位结合，而14C4与CCP 18中另一不重叠的表位结合。12F4的结合也被抗-FH.07竞争，但程度较小，表明该抗体结合至相同的表位，但亲和力可能较低。
结合亲和力
所有抗体FH.07、8E4和3B4以纳摩尔或亚纳摩尔亲和力结合人类FH和FH的CCP18-20。见图2和表2，对于全长FH和CCP18-20，抗体8E4和3B4均具有比FH.07更高的结合亲和力。
表2.抗体FH.07、3B4和8E4的结合动力学。
C3在LPS上的沉积
FH.07、3B4、8E4、11E1和12F4都降低了LPS上C3b的沉积(图3A中显示了FH.07、3B4和8E4)。相反，14C4增加了LPS上C3b的沉积。图3A显示了在FPS.07、3B4和8E4浓度增加时C3在LPS上的沉积。表明，8E4比FH.07在更大程度上抑制了C3沉积。
因此，与抗-FH.07竞争的所有mAb也增强FH的功能，从而导致补体激活降低。值得注意的是，尽管也与CCP 18结合，但非竞争性mAb(14C4)却产生了相反作用，即抑制FH功能，从而导致更多的C3b沉积。如表3所示，8E4的LPS沉积测定中的IC50低于FH.07。
SRBC溶血活性
抗-FH.07、3B4、8E4和11E1减少了诱导的SRBC溶血。12F4显示了相同效果，但程度较小。因此，与抗-FH.07竞争的所有mAb也增强SRBC表面上FH的功能，从而导致补体介导的溶血降低。在该测定中，3B4、8E4在较高浓度下均具有更高的增强FH的作用。如表3和图3B所示，8E4和3B4的溶血试验中的IC50均低于FH.07。
表3：与抗-FH.07相比，LPS C3b沉积测定和溶血测定中抗FHR-1mAb的IC50值。对于FH.07、3B4和8E4，该值均基于多次实验。
因子H与C3b的结合亲和力
在正常条件下，FH显示出以6.0μM的估计K-D与C3b相互作用。然而，加入抗-FH/07、aFHR-1 3B4或aFHR-1 8E4的Fab’片段增加了对C3b包被表面的响应(图4A)并且分别表现为2.20μM、1.90μM和1.66μM的增加的估算亲和力(图4B)。
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Claims (29)
1.一种分离的、合成的或重组的抗体或其抗原结合片段，其特异性地结合因子H(FH)的补体控制蛋白结构域18(CCP18)，包含：
-具有序列SSVXY的轻链CDR1序列，其中X是R、T或N(SEQ ID NO:91)或序列QSLVHSNGNTY(SEQ ID NO:49)，
-具有序列X1X2S的轻链CDR2序列，其中X1＝A、K或Y且X2＝T或L(SEQ ID NO:92)，
-具有由QQWGTKPPT(SEQ ID NO:19)、QQRSSSNPLT(SEQ ID NO:35)、SQSTHVPFT(SEQ IDNO:51)和QQFTSSPLT(SEQ ID NO:67)组成的组中选择的序列的轻链CDR3，
-具有序列X1FSLTX2X3G的重链CDR1，其中X1＝D或G，X2＝N或S且X3＝S或Y(SEQ ID NO:93)，
-具有序列IWSGGXT的重链CDR2，其中x＝T、N或S(SEQ ID NO:94)，和
-具有序列ARNX1GNYX2X3DY的重链CDR3序列，其中X1＝F或G，X2＝A或Y且X3＝V、M或F(SEQ ID NO:95)或AKNGDYGYTMDY(SEQ ID NO:55)。
2.根据权利要求1所述的抗体或片段，其包含：
-具有序列SSVXY的轻链CDR1序列，其中X是R或T(SEQ ID NO:96)，
-具有序列ATS(SEQ ID NO:97)的轻链CDR2序列，
-具有由QQWGTKPPT(SEQ ID NO:19)和QQRSSSNPLT(SEQ ID NO:35)组成的组中选择的序列的轻链CDR3，
-具有序列X1FSLTNX2G的重链CDR1，其中X1＝D或G且X2＝S或Y(SEQ ID NO:98)，
-具有序列IWSGGTT(SEQ ID NO:99)的重链CDR2，和
-具有序列ARNFGNYAXDY的重链CDR3序列，其中X＝V或M(SEQ ID NO:100)。
3.根据权利要求1或2所述的抗体或片段，其包含具有序列SSVRY(SEQ ID NO:17)的轻链CDR1序列、具有序列ATS(SEQ ID NO:18)的轻链CDR2序列和具有序列QQWGTKPPT(SEQ IDNO:19)的轻链CDR3、具有序列DFSLTNSG(SEQ ID NO:21)的重链CDR1、具有序列IWSGGTT(SEQID NO:22)的重链CDR2和具有序列ARNFGNYAVDY(SEQ ID NO:23)的重链CDR3序列。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的抗体或片段，其中所述抗体或片段对FH的结合亲和力的KD为2.5×10-8M或更低和/或对由CCP18-20组成的FH片段的结合亲和力的KD为0.1×10-9M或更低，优选其中所述抗体或片段对FH的结合亲和力的KD为1.25×10-8M或更低和/或对由CCP18-20组成的FH片段的结合亲和力的KD为0.04×10-9M或更低。
5.根据权利要求1或2所述的抗体或片段，其包含具有序列SSVTY(SEQ ID NO:33)的轻链CDR1序列、具有序列ATS(SEQ ID NO:34)的轻链CDR2序列和具有序列QQRSSSNPLT(SEQ IDNO:35)的轻链CDR3、具有序列GFSLTNYG(SEQ ID NO:37)的重链CDR1、具有序列IWSGGTT(SEQID NO:38)的重链CDR2和具有序列ARNFGNYAMDY(SEQ ID NO:39)的重链CDR3序列。
6.根据权利要求1、2和5中任一项所述的抗体或片段，其中所述抗体或片段对FH的结合亲和力的KD为2.5×10-8M或更低和/或对由CCP18-20组成的FH片段的结合亲和力的KD为0.1×10-9M或更低，优选其中所述抗体或片段对FH的结合亲和力的KD为0.6×10-8M或更低和/或对由CCP18-20组成的FH片段的结合亲和力的KD为0.6x10-11M或更低。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的抗体或片段，其中所述抗体或片段：
-在体外以38nM或更低的IC50值，优选以30nM或更低的C50值抑制C3在LPS上的沉积，和/或
-在体外以150nM或更低的IC50值，优选以130nM或更低的IC50值抑制溶血活性，和/或
-在体外将FH对C3b的结合亲和力(KD)增加至最高2μM和/或在体外将FH对C3b的结合亲和力增加至少3倍。
8.根据权利要求1所述的抗体或片段，其包含：
-具有序列QSLVHSNGNTY(SEQ ID NO:49)的轻链CDR1序列、具有序列KLS(SEQ ID NO:50)的轻链CDR2序列和具有序列SQSTHVPFT(SEQ ID NO:51)的轻链CDR3、具有序列GFSLTNYG(SEQ ID NO:53)的重链CDR1、具有序列IWSGGNT(SEQ ID NO:54)的重链CDR2和具有序列AKNGDYGYTMDY(SEQ ID NO:55)的重链CDR3序列，或
-具有序列SSVNY(SEQ ID NO:65)的轻链CDR1序列、具有序列YTS(SEQ ID NO:66)的轻链CDR2序列和具有序列QQFTSSPLT(SEQ ID NO:67)的轻链CDR3、具有序列GFSLTSYG(SEQ IDNO:69)的重链CDR1、具有序列IWSGGST(SEQ ID NO:70)的重链CDR2和具有序列ARNGGNYYFDY(SEQ ID NO:71)的重链CDR3序列。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的抗体或片段，其包含：
-可变轻链序列，其包含与选自以下序列中的序列具有至少80％序列同一性的序列：
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVRYMHWYQQKAGSSPTAWIFATSNLASGVPPRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWGTKPPTFGAGTKLELK(SEQ ID NO:20)，
QIVLSQSPTILSASPGEKVTMTCRASSSVTYMHWYQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQRSSSNPLTFGAGTKLELK(SEQ ID NO:36)，
DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKLSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPFTFGSGTKLEIK(SEQ ID NO:52)，和
ENVLTQSPAIMSASLGEKVTMSCRASSSVNYMYWYQQKSDASKLSWIYYTSNLAPGVPARFSGSGSGNSYSLTISSMEGEDAATYYCQQFTSSPLTFGAGTKLELK(SEQ ID NO:68)，以及
-可变重链序列，其包含与选自以下序列中的序列具有至少80％序列同一性的序列：
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSDFSLTNSGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGTTEYNAAFMSRLTITKDNSKSQVFFKMNSLLVDDTGIYYCARNFGNYAVDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:24)，
QVQLRQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVYWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGTTDYSAAFISRLSISKDNSKSQVFFKMNSLQADDTAIYYCARNFGNYAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:40)，
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQPPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNAAFISRLSISKDNSKSQVFFKMNSLQADDTAIYYCAKNGDYGYTMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:56)，和
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTSYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGSTDYNAAFISRLSISKDNSKSQVFFKMNSLQANDTAIYYCARNGGNYYFDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:72)。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的抗体或片段，其中所述抗体增强FH活性，优选其中所述FH活性是抑制替代补体激活，更优选其中抑制替代补体激活包括：
-抑制溶血活性,
-抑制补体组分3(C3)沉积，和/或
-增加FH与C3b、iC3b和/或C3d的结合。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的抗体或片段，其中所述片段包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，优选其中所述片段进一步包含免疫球蛋白重链恒定区和免疫球蛋白轻链恒定区。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的抗体或片段，其中所述片段至少包含Fab片段。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的抗体或片段，其为单克隆抗体或其片段。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的抗体或片段，其为嵌合或人源化抗体或其片段，包含人类轻链和重链恒定区。
15.一种分离的、合成的或重组的核酸分子，其包含编码根据权利要求1至14中任一项所述的所述抗体或片段的核酸序列。
16.一种载体，其包含根据权利要求15所述的核酸分子。
17.一种重组细胞，其包含根据权利要求15或16所述的核酸分子或载体。
18.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至14中任一项所述的抗体或片段、根据权利要求15所述的核酸分子、根据权利要求16所述的载体或根据权利要求17所述的重组细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。
19.根据权利要求1至14中任一项所述的抗体或片段或根据权利要求15所述的核酸分子，其用于治疗。
20.根据权利要求1至14中任一项所述的抗体或片段或根据权利要求15所述的核酸分子，其用于抑制替代补体激活。
21.根据权利要求1至14中任一项所述的抗体或片段或根据权利要求15所述的核酸分子，其用于治疗、缓解或预防与替代途径补体激活相关的病症。
22.根据权利要求21使用的抗体或片段或核酸分子，所述病症选自由非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)、阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)、年龄相关性黄斑变性(AMD)、膜增生性肾小球肾炎(MPGN)组成的组。
23.根据权利要求1至14中任一项所述的抗体或片段、或根据权利要求15所述的核酸分子、或根据权利要求16所述的载体在制备用于治疗、缓解或预防与替代途径补体激活相关性病症的药物中的用途。
24.根据权利要求23所述的用途，其中所述病症选自由非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)、阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)、年龄相关性黄斑变性(AMD)、膜增生性肾小球肾炎(MPGN)组成的组。
25.一种治疗、缓解或预防与替代途径补体激活相关的病症的方法，其包括向有此需要的个体施用治疗有效量的根据权利要求1至14中任一项的抗体或片段、或根据权利要求15所述的核酸分子、或根据权利要求16所述的载体、或根据权利要求18所述的药物组合物。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述病症选自由非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)、阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)、年龄相关性黄斑变性(AMD)、膜增生性肾小球肾炎(MPGN)组成的组。
27.一种抑制替代补体激活的方法，其包括向个体施用根据权利要求1至14中任一项所述的抗体或片段、或根据权利要求15所述的核酸分子、或根据权利要求16所述的载体、或根据权利要求18所述的药物组合物。
28.一种生产根据权利要求1至14中任一项所述的抗体或片段的方法，该方法包括提供具有权利要求15或16所述的核酸分子或载体的细胞，和使所述细胞翻译由所述核酸分子或载体包含的核酸序列，由此产生根据权利要求1至14中任一项所述的抗体或片段。
29.根据权利要求28所述的方法，其进一步包含收获、纯化和/或分离所述抗体或片段。
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