BR112020014399A2 - Anticorpos potenciadores do fator h e seus usos - Google Patents

Abstract

a presente invenção se refere a novos anticorpos isolados, sintéticos ou recombinantes e seus fragmentos específicos para o fator h. a presente invenção se refere ainda ao uso de tais anticorpos e fragmentos para inibir a ativação do complemento e tratamento de distúrbios associados à ativação do complemento.

Description

ANTICORPOS POTENCIADORES DO FATOR H E SEUS USOS Campo de invenção

[001] A invenção se refere ao campo da imunologia e medicina. Em particular, a invenção se refere a anticorpos específicos para o fator H e suas utilizações.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] O sistema complemento é um elemento importante da imunidade inata que contribui para a proteção de muitos organismos, como mamíferos, contra patógenos invasores. O sistema complemento consiste em mais de 30 componentes diferentes, que são sintetizados principalmente no fígado. Ativação do sistema complemento ocorre por três vias diferentes, a via clássica, a via da lectina e a via alternativa. As três vias convergem na formação de uma C3 convertase, que são diferentes para cada via, mas têm atividade semelhante.

[003] Na via clássica do complemento, a ativação do complexo do componente do complemento (C) 1, consistindo em Clq, Clr e Cls, ocorre após a ligação a complexos anticorpo- antígeno. O complexo Cl cliva C4 e C2, levando à formação de uma C3 convertase consistindo em C4bC2a. A C3 convertase cliva C3 nos componentes ativos C3a e C3b. Na via da lectina, a lectina de ligação à manose se liga a resíduos de manose em superfícies patogênicas que ativam as serina proteases MASP-1 e MASP-2 que são capazes de clivar C4 e C2. Como na via clássica, isso leva à formação da C3 C4bC2a convertase. Esta C3 convertase pode ligar C3b para formar uma C5 convertase. Ao contrário das vias clássica e lectina, a via alternativa apresenta baixo nível de atividade contínua devido à hidrólise espontânea de C3 a C3 (H20) no plasma. Este C3b semelhante a C3b (H20) pode formar uma fase fluida C3 convertase pelo fator de ligação B (FB) que por sua vez é ativado em Bb pelo fator D. Da mesma forma, quando C3b se liga a uma superfície, ele pode ligar FB para formar C3bB. Esse complexo é clivado pelo fator D em C3bBb, que é a C3 convertase da via alternativa que pode ser estabilizada pela adequadadinina (fator P) em C3bBbP. Esta C3 convertase é capaz de clivar C3 em C3a e C3b.

[005] Além deste processo, a via alternativa atua como ciclo de amplificação para as vias de ativação clássica e de lectina, pois o C3b gerado nessas vias pode atuar como ponto de partida para a via alternativa. Assim, o circuito de amplificação resulta em um reforço da via clássica e da lectina. A C3 convertase formada em uma das três vias de ativação pode impedir C3b para formar uma C5 convertase. As conversões C5 de todas as três vias do complemento ativam C5 em C5a e C5b, que inicia a via terminal do sistema de complemento. C5b liga C6, C7, C8 e C9 para formar o complexo de ataque à membrana (MAC), que forma um canal transmembranar e causa lise celular.

[008] Além de formar um poro na membrana dos patógenos, o complemento ajuda a eliminar patógenos ou autocélulas alteradas por opsonização com moléculas C3b e produção de peptídeos pró-inflamatórios, como C3a e C5a, que atraem e ativam células imunológicas para o local da infecção. Devido à forte natureza pró-inflamatória do complemento, as células hospedeiras são bem protegidas por várias proteínas reguladoras da membrana e solúveis em complemento.

[0010] A via alternativa contribui de 80 a 90% para a atividade total do complemento. A regulação dessa via é, portanto, crucial. C3(H2O) formado por hidrólise espontânea de C3 e C3b é geralmente, se não ligado a um patógeno, rapidamente inativado pelo fator H (FH), fator I (FI) e moléculas da superfície celular do hospedeiro, inibindo assim a formação das conversas C3. CD55 (também denominado fator acelerador de decaimento ou DAF) liga C3b na superfície da célula hospedeira. O FI divide C3b para uma forma inativa, mas depende de cofatores expressos na superfície celular (CD46, MCP) ou circulando no plasma (FH). A FH é uma glicoproteína plasmática essencial para controlar a via alternativa do complemento, tanto em solução como em superfícies celulares. FH liga C3b na mesma posição que FB, impedindo assim a formação de conversão C3. O FH também possui atividade de aceleração de decaimento, isto é, promove a dissociação de conversas alternativas da via C3, uma vez formadas. Se o FH se liga ao C3b é determinado pelos carboidratos presentes na superfície da célula.

[0012] O ácido siálico, glicosaminoglicanos e heparina presentes na superfície da célula hospedeira promovem a ligação de FH a C3b, enquanto a ligação de C3b a moléculas expressas na superfície de patógenos resulta na ligação de FB. Assim, a FH exerce sua atividade inibidora do complemento nas células hospedeiras, mas não na superfície das células patogênicas, porque as moléculas da superfície celular que se ligam à FH são expressas nas células hospedeiras, mas geralmente não nas células patogênicas. O FH contém 20 domínios da proteína de controle do complemento (PCC), em umerados de 1 a 20,

começando no terminal N do FH. Os domínios do PCC também são chamados de domínios de repetições curtas de consenso (SCR) ou sushi. Os PCC 1-4 são domínios envolvidos na regulação e os PCC 19-20 estão envolvidos na ligação de C3b e CCP s 6, 7, 8, 19 e 20 posteriores a GAGs e ácido siálico expressos na superfície das células. Anticorpos que se ligam a CCP19 e / ou CCP20 inibem a atividade de FH.

[0014] As proteínas relacionadas ao fator H (CFHRs) são glicoproteínas plasmáticas relacionadas à estrutura e antigenicidade da FH. As proteínas FHR também são compostas por domínios CCP e apresentam graus variados de homologia com os domínios CCP encontrados na FH. Por exemplo, FHR1 compreende domínios correspondentes a CCP6, CCP7, CCP18, CCP 19 e CCP20. Em contraste com a FH, as CFHRs não apresentam forte atividade inibitória do complemento. Uma característica comum dos CFHRs é que eles se ligam ao componente C3b do complemento, competindo com o FH pela ligação ao C3b e, portanto, são considerados reguladores positivos da via alternativa do complemento.

[0016] A deficiência de HF ou o reconhecimento prejudicado das superfícies do hospedeiro devido a mutações estão associados a danos e doenças nos tecidos mediados pelo complemento. Além de controlar a ativação do complemento durante a hemostasia normal, a HF também desempenha um papel importante na limitação dos danos mediados pelo complemento de células e tecidos doentes. Múltiplas mutações no gene FH foram descritas e podem levar à perda de função da proteína FH. A região C-terminal da FH é um ponto de acesso para mutações na doença. Esta é uma região crítica para a ligação do FH às células hospedeiras. A maioria das mutações associadas a doenças nessa região interfere na ligação da FH. A maioria dos pacientes com um gene FH mutado apresenta mutações heterozigotas, o que significa que aproximadamente metade da FH circulante tem função normal. No entanto, aparentemente isso não é suficiente para proteger superfícies próprias em certas condições nas quais o complemento é ativado. A deficiência de HF pode levar a doenças renais, como glomerulenefrite membranoproliferativa (MPGN) e síndrome hemolítica urêmica atípica (aHUS).

[0018] Mais recentemente, foi descrita uma relação entre mutações da HF e doença macular relacionada à idade (DMRI). Atualmente, o tratamento padrão para a deficiência de HF, como no aHUS, é a suplementação ou troca de plasma. Com essa terapia, reguladores de complemento deficientes são suplementados. Além disso, a terapia de troca plasmática remove fatores de complemento mutantes e / ou autoanticorpos direcionados contra fatores de complemento. No entanto, a terapia plasmática também tem algumas limitações. Nenhum estudo clínico prospectivo demonstrou que a terapia de troca plasmática seja segura ou eficaz no tratamento da SHUU e a eficiência da terapia plasmática pode depender das mutações subjacentes. Alguns pacientes desenvolvem reações anafiláticas ao plasma fresco congelado, o que pode exigir a interrupção de qualquer forma de terapia plasmática. Além disso, a troca plasmática pode piorar o quadro clínico da SHUU devido à administração de componentes patogênicos ativos derivados do plasma.

[0022] Recentemente, o anticorpo monoclonal terapêutico eculizumab foi aprovado para o tratamento de aHUS e hemoglobinúria paroxística noturna (PNH) em vários países, entre os quais os EUA e os países europeus. O eculizumab é um anticorpo monoclonal de camundongo humanizado específico para C5 que impede a clivagem de C5 a C5a e C5b. Assim, evita a ativação da via terminal e diminui o influxo de células imunes. No entanto, o uso de eculizumab está associado a efeitos colaterais indesejados. Como bloqueia C5, que é um componente crucial para o início da via terminal, os pacientes tratados com eculizumabe tornam-se vulneráveis à infecção por bactérias encapsuladas (como Neisseria meningitidis), cuja depuração depende muito da formação de MAC. Portanto, a vacinação contra o meningococo é necessária para os pacientes antes de receber tratamento com eculizumabe. Além disso, como o eculizumab atua a jusante de C3, a deposição de C3 é mantida, o que é prejudicial em vários distúrbios que envolvem ativação indesejada ou excessiva do complemento.

[0024] Além disso, altos custos estão envolvidos no tratamento com ecrdizumab e a disponibilidade do anticorpo é limitada.

[0026] Um anticorpo monoclonal de camundongo que se liga ao CCP18 é descrito por Cheng et al. (Clinical Chemistry, 2005). É descrito que este anticorpo, chamado X52.1, aumenta a ligação de FH a C3b e C3d, que se acredita ser causado pela dimerização do FH. A ligação aumentada de FH a C3b e C3d induzida por X52.1 resulta em uma lise aumentada de células mediadas por complemento, incluindo hemácias e vários tipos de células cancerígenas, como mostrado por Corey et al. (J. Biol Chem. 2000). Isso demonstra que o anticorpo X52.1 inibe a atividade inibidora do complemento da FH. De fato, Corey et al. sugere que o anticorpo pode ser usado no tratamento de câncer, melhorando a lise mediada por complemento de células cancerígenas.

[0028] O documento WO 2016/028150 descreve um anticorpo anti-FH agonístico referido como FH.07, que inibe a ativação de vias alternativas, como mostrado por um aumento da ligação de FH a C3b, inibição da deposição mediada de C3 e inibição da atividade hemolítica. Os fragmentos Fab 'e F (ab') 2 do anticorpo mostraram ter o mesmo efeito potenciador de FH.

[0030] Há uma necessidade contínua de novos e aprimorados agentes terapêuticos e que se ligam à HF, como agentes úteis no tratamento de distúrbios associados à ativação indesejada ou excessiva do complemento.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0033] É um objetivo da invenção fornecer novos anticorpos que se ligam à FH. É um outro objetivo fornecer anticorpos que reconhecem especificamente um epítopo na ligação ao FH, o qual resulta em potenciação da atividade do FH, em particular um epítopo localizado no domínio CCP18 do FH. É outro objetivo da invenção fornecer anticorpos que possuam uma alta afinidade de ligação ao FH.

[0034] A invenção, portanto, fornece um anticorpo isolado, sintético ou recombinante ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente ao fator H (FH) e potencializa a atividade da FH, em que o anticorpo ou fragmento tem uma afinidade de ligação à FH com um KD de 2,5 x 10-8 M ou menos e / ou uma afinidade de ligação para um fragmento de FH composto de CCP 18-20 com um KD de 0,1 x 10-9 M ou menos, de preferência em que o referido anticorpo ou fragmento tenha uma afinidade de ligação para FH com um KD de 1,25 x 10-8 M ou menos e / ou uma afinidade de ligação para um fragmento de FH composto de CCP 18-20 com um KD 0,04 x 10-9 M ou menos, mais preferencialmente, em que o referido anticorpo ou fragmento tenha uma afinidade de ligação para FH com um KD 1,25 x 10-8 M ou menos e / ou uma afinidade de ligação para um fragmento FH composto de CCP18-20 com um KD 0,04 x 10-9 M ou menos de 0,1 x 10-9 M ou inferior. Um anticorpo ou fragmento preferido tem preferencialmente uma afinidade de ligação para FH com um KD 0,6 x 10-8 M ou menos e / ou uma afinidade de ligação para um fragmento FH composto de CCP18-20 com um KD de 0,6 x 10-11 M ou menos. O referido anticorpo ou fragmento inibe preferencialmente a deposição de C3 em LPS in vitro com um valor IC50 de 38 nM ou menos e / ou inibe a atividade hemolítica in vitro com um valor de IC50 igual ou inferior a 150 nM. O anticorpo ou fragmento aumenta preferencialmente a afinidade de ligação (KD) de FH para C3b in vitro para no máximo 2 mM e / ou aumenta a afinidade de ligação de FH para C3b in vitro pelo menos 3 vezes A afinidade de ligação é determinada usando ressonância plasmônica de superfície (SPR).

[0035] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um anticorpo isolado, sintético ou recombinante ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente ao fator H (FH) e potencializa a atividade da FH, em que o anticorpo ou fragmento inibe a deposição de C3 no LPS in vitro com um valor de IC50 de 38 nM ou menos.

[0036] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um anticorpo isolado, sintético ou recombinante ou fragmento de ligação a antígeno, que se liga especificamente ao fator H (FH) e potencializa a atividade da FH, em que o anticorpo ou fragmento aumenta a afinidade de ligação (KD) da FH para C3b em in vitro para no máximo 2 mM e / ou aumenta a afinidade de ligação da FH para C3b in vitro pelo menos 3 vezes.

[0037] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um anticorpo isolado, sintético ou recombinante ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que dificulta especificamente o fator H (FH) e potencializa a atividade da FH, em que o anticorpo ou fragmento inibe a atividade hemolítica in vitro com um valor de IC50 de 150 nM ou menos, preferencialmente, 130 nM ou menos, mais preferencialmente, 115 nM ou menos mais preferencialmente 105 nM ou menos, mais preferencialmente 100 nM ou menos.

[0038] O anticorpo ou fragmento de acordo com a invenção se liga preferencialmente ao complemento do domínio da proteína de controle 18 (CCP18) do fator H (FH). A referida atividade de FH é preferencialmente a inibição da ativação alternativa do complemento. A inibição da ativação alternativa do complemento compreende: uma inibição da atividade hemolítica, uma inibição da deposição do componente 3 do complemento (C3) nas células e / ou um aumento da ligação do FH a C3b, iC3b e / ou C3d.

[0039] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um anticorpo isolado, sintético ou recombinante ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente para domínio 18 da proteína de controle do complemento (CCP18) do fator H (FH) compreendendo: - uma sequência de CDR1 de cadeia leve com a sequência

SSVXY, em que X é R, T ou N (SEQ ID NO: 91) ou a sequência QSLVHSNGNTY (SEQ ID NO: 49), - uma sequência CDR2 de cadeia leve com a sequência X1X2S em que X1 = A, K ou Y e X2 = T ou L (SEQ ID NO: 92), - uma CDR3 de cadeia leve com uma sequência selecionada do grupo que consiste em QQWGTKPPT (SEQ ID NO: 19), QQRSSSNPLT (SEQ ID NO: 35), SQSTHVPFT (SEQ ID NO: 51) e QQFTSSPLT (SEQ ID NO: 67), - uma CDR1 de cadeia pesada com a sequência X1FSLTX2X3G, em que X1 = D ou L, X2 = N ou S e X3 = S ou Y (SEQ ID NO: 93), - uma CDR2 de cadeia pesada com a sequência IWSGGXT, em que x = T, N ou S (SEQ ID NO: 94) e - uma sequência de CDR3 de cadeia pesada possuindo a sequência de ARNX1GNYX2X3DY, em que X1 = F ou G, X2 = A ou Y e X3 = V, M ou F (SEQ ID NO: 95) ou AKNGDYGYTMDY (SEQ ID NO: 55).

[0040] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um anticorpo isolado, sintético ou recombinante ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente para domínio 18 da proteína de controle do complemento (CCP18) do fator H (FH) compreendendo: - uma sequência CDR1 de cadeia leve com a sequência SSVXY, em que X é R ou T (SEQ ID NO: 96), - uma sequência de CDR2 de cadeia leve com a sequência ATS (SEQ ID NO: 97), - uma CDR3 de cadeia leve com uma sequência selecionada do grupo que consiste em QQWGTKPPT (SEQ ID NO: 19) e QQRSSSNPLT (SEQ ID NO: 35),

- uma CDR1 de cadeia pesada com a sequência X1FSLTNX2G, em que Xi = D ou G e X2 = S ou Y (SEQ ID NO: 98), - uma CDR2 de cadeia pesada com a sequência IWSGGTT (SEQ ID NO: 99), e - uma sequência de CDR3 da cadeia pesada com a sequência ARNFGNYAXDY, em que X = V ou M (SEQ ID NO: 100).

[0041] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um anticorpo isolado, sintético ou recombinante ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente para domínio 18 da proteína de controle do complemento (CCP18) do fator H (FH) compreendendo uma sequência CDR1 de cadeia leve com a sequência SSVRY (SEQ ID NO: 17), uma sequência de CDR2 de cadeia leve com a sequência ATS (SEQ ID NO: 18) e uma CDR3 de cadeia leve com a sequência QQWGTKPPT (SEQ ID NO: 19), uma CDR1 de cadeia pesada com a sequência DFSLTNSG (SEQ ID NO: 21), uma CDR2 de cadeia pesada com a sequência IWSGGTT (SEQ ID NO: 22) e uma sequência de CDR3 de cadeia pesada com a sequência ARNFGNYAVDY (SEQ ID NO: 23). O anticorpo ou fragmento tem, preferencialmente, uma afinidade de ligação para FH com um KD de 2,5 x 10-8M ou menos e / ou uma afinidade de ligação para um fragmento FH composto de CCP 18-20 com um KD 0,1 x 10-9 M ou menos, de preferência, em que o referido anticorpo ou fragmento tenha uma afinidade de ligação para FH com um KD 1,25 x 10-8 M ou menos e / ou uma afinidade de ligação para um fragmento de FH composto de CCP18-20 com um KD de 0,04 x 10-9 M ou menos. O anticorpo ou fragmento inibe preferencialmente a deposição de C3 em LPS in vitro com um valor de IC50 de 38 11M ou menos, preferencialmente com um valor de IC50 de 30 nM ou menos,

mais preferencialmente, com um valor de IC50 de 27 nM ou menos. O anticorpo ou fragmento inibe preferencialmente a atividade hemolítica in vitro com um valor de IC50 de 150 nM ou menos, preferencialmente, com um valor de IC50 de 130 nM ou menos, mais preferencialmente com um valor de IC50 de 100 nM ou menos. O anticorpo ou fragmento aumenta, preferencialmente, a afinidade de ligação (Kn) de FH para C3b in vitro para no máximo 2 mM, mais preferencialmente, 1,8 mM e / ou aumenta a afinidade de ligação de FH para C3b in vitro pelo menos 3 vezes, mais preferencialmente, 3,5 vezes.

[0042] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um anticorpo isolado, sintético ou recombinante ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente ao fator H (FH) compreendendo uma sequência CDR1 da cadeia leve com a sequência SSVTY (SEQ ID NO: 33), uma cadeia leve Sequência de CDR2 com a sequência ATS (SEQ ID NO: 34) e uma CDR3 de cadeia leve com a sequência QQRSSSNPLT (SEQ ID NO: 35), uma CDR1 de cadeia pesada com a sequência GFSLTNYG (SEQ ID NO: 37), uma CDR2 de cadeia pesada tendo a sequência IWSGGTT (SEQ ID NO: 38) e uma sequência de CDR3 da cadeia pesada tendo a sequência ARNFGNYAMDY (SEQ ID NO: 39). O anticorpo ou fragmento possui preferencialmente uma afinidade de ligação à FH com um KD de 2,5 x 10-8 M ou menos e / ou uma afinidade de ligação para um fragmento FH composto de CCP 18-20 com um KD de 0,1 x 10-9 M ou menos, preferencialmente em que o referido anticorpo ou fragmento tenha uma afinidade de ligação para FH com um KD 0,6 x 10-8 M ou menos e / ou uma afinidade de ligação para um fragmento FH constituído por CCP18-20 com um KD de 0,6 x 10-11 M ou menos. O anticorpo ou fragmento aumenta preferencialmente a afinidade de ligação (KD) de FH para C3b in vitro para no máximo 2 mM, mais preferencialmente, 1,95 mM e / ou aumenta a afinidade de ligação de FH para C3b in vitro pelo menos 3 vezes, mais preferencialmente 3,1 vezes.

[0043] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um anticorpo isolado, sintético ou recombinante ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente ao fator H (FH) compreendendo uma sequência CDR1 da cadeia leve com a sequência QSLVHSNGNTY (SEQ ID NO: 49), uma cadeia leve Sequência GDR2 com a sequência KLS (SEQ ID NO: 50) e uma CDR3 de cadeia leve com a sequência SQSTHVPFT (SEQ ID NO: 51), uma CDR1 de cadeia pesada com a sequência GFSLTNYG (SEQ ID NO: 53), um GDR2 de cadeia pesada com a sequência IWSGGNT (SEQ ID NO: 54) e uma sequência de CDR3 da cadeia pesada com a sequência AKNGDYGYTMDY (SEQ ID NO: 55).

[0044] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um anticorpo isolado, sintético ou recombinante ou seu fragmento de ligação a antígeno que se liga especificamente ao fator H (FH) compreendendo uma sequência de CDR1 de cadeia leve com a sequência SSVNY (SEQ ID NO: 65), uma sequência de CDR2 de cadeia leve com a sequência YTS (SEQ ID NO: 66) e uma CDR3 de cadeia leve com a sequência de QQFTSSPLT (SEQ ID NO: 67), uma CDR1 de cadeia pesada com a sequência GFSLTSYG (SEQ ID NO: 69), uma CDR2 de cadeia pesada com a sequência IWSGGST (SEQ ID NO: 70) e uma sequência de CDR3 de cadeia pesada com a sequência ARNGGNYYFDY (SEQ ID NO: 71).

[0045] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um anticorpo isolado, sintético ou recombinante ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente ao fator H (FH) compreendendo uma sequência de cadeia leve variável compreendendo uma sequência que possui pelo menos 80% de identidade de sequência a uma sequência selecionada do grupo constituído por QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVRYM

HWYQQKAGSSPTAWIFATSNLASGVPPRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWG TKPPTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 20) e uma sequência variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência que possui pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência

QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSDFSLTNSGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGTTEY NAAFMSRLTITKDNSKSQVFFKMNSLLVDDTGIYYCARNFGNYAVDYWGQGTSVTVSS: SEQ ID NO: 24.

[0046] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um anticorpo isolado, sintético ou recombinante ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente ao fator H (FH) compreendendo uma sequência de cadeia leve variável compreendendo uma sequência que possui pelo menos 80% de identidade de sequência da sequência QIVLSQSPTILSASP

GEKVTMTGRASSSVTYMHWYQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSGTSYS LTISRVEAEDAATYYCQQRSSSNPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 36) e uma sequência variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência que possui pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência QVQLRQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSL

TNYGVYWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGTTDYSAAFISRLSISKDNSKSQVFFKMNSLQAD DTAIYYCARNFGNYAMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 40)

[0047] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um anticorpo isolado, sintético ou recombinante ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente ao fator H (FH) compreendendo uma sequência de cadeia leve variável compreendendo uma sequência que possui pelo menos 80% de identidade de sequência da sequência DWMTQTPLSLPVSLG

DQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKLSNRFSGVPDRFSGSGSGTD FTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPFTFGSGTKL EIK (SEQ ID NO: 52) e uma sequência variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQPP

GKGLEWLGVIWSGGNTDYNAAFISRLSISKDNSKSQVFFKMNSLQADDTAIYYCAKNGD YGYTMDISGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 56).

[0048] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um anticorpo isolado, sintético ou recombinante ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente ao fator H (FH) compreendendo uma sequência de cadeia leve variável compreendendo uma sequência que possui pelo menos 80% de identidade de sequência da sequência ENVLTQSPA

IMSASLGEKVTMSCRASSSVNYMYWYQQKSDASKLSWIYYTSNLAPGVPARFSGSGSGN SGNSGSGSGNSYSLTISSMEGEDAATYYCQQFTSSPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 68) e uma sequência variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência que possui pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência QVQLKQSGPGLVQPSQ

SLSITCTVSGFSLTSYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGSTDYNAAFISRLSISKDNSK SQVFFKMNSLQANDTAIYYCARNGGNYYFDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 72).

[0049] Um anticorpo ou fragmento de acordo com a invenção compreendendo as sequências CDR1-3 da cadeia leve e sequências CDR1-3 da cadeia pesada especificadas aqui ou uma sequência variável da cadeia leve e uma sequência variável da cadeia pesada especificadas aqui potencialmente potencializam a atividade de FH. A referida atividade de FH é preferencialmente a inibição da ativação alternativa do complemento. A referida inibição da ativação alternativa do complemento compreende uma inibição da atividade hemolítica, uma inibição da deposição do componente 3 do complemento (C3) e / ou um aumento da ligação de FH a C3b, iC3b e / ou C3d.

[0050] Em um aspecto adicional, a invenção fornece uma molécula de ácido nucleico isolada, sintética ou recombinante compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica o anticorpo ou fragmento, de acordo com a invenção.

[0051] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um vetor compreendendo uma molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção.

[0052] Em um aspecto adicional, a invenção fornece uma célula recombinante compreendendo uma molécula ou vetor de ácido nucleico de acordo com a invenção.

[0053] Em um aspecto adicional, a invenção fornece uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo ou fragmento, de acordo com a invenção e um veículo, diluente e / ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0054] Em um aspecto adicional, a invenção fornece uma composição farmacêutica compreendendo uma molécula de ácido nucleico, de acordo com a invenção e um veículo, diluente e / ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0055] Em um aspecto adicional, a invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende um vetor, de acordo com a invenção e um veículo, diluente e / ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0056] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um anticorpo ou fragmento de acordo com a invenção para uso em terapia.

[0057] Em um aspecto adicional, a invenção fornece uma molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção para uso em terapia.

[0058] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um vetor de acordo com a invenção para uso em terapia.

[0059] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um anticorpo ou fragmento de acordo com a invenção para uso na inibição da ativação alternativa do complemento.

[0060] Em um aspecto adicional, a invenção fornece uma molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção para uso na inibição da ativação alternativa do complemento.

[0061] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um vetor de acordo com a invenção para uso na inibição da ativação alternativa do complemento.

[0062] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um anticorpo ou fragmento de acordo com a invenção para uso no tratamento, alívio ou prevenção de um distúrbio associado à ativação do complemento da via alternativa.

[0063] Em um aspecto adicional, a invenção fornece uma molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção para uso no tratamento, alívio ou prevenção de um distúrbio associado à ativação do complemento da via alternativa.

[0064] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um vetor de acordo com a invenção para uso no tratamento, alívio ou prevenção de um distúrbio associado à ativação alternativa do complemento da via.

[0065] Em um aspecto adicional, a invenção fornece uma utilização da molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção para a preparação de um medicamento para o tratamento, alívio ou prevenção de um distúrbio associado à ativação alternativa do complemento da via.

[0066] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um uso de um vetor de acordo com a invenção para a preparação de um medicamento para o tratamento, alívio ou prevenção de um distúrbio associado à ativação alternativa do complemento da via.

[0067] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um uso de um anticorpo ou fragmento de acordo com a invenção para a preparação de um medicamento para o tratamento, alívio ou prevenção de um distúrbio associado à ativação alternativa do complemento da via.

[0068] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um método para o tratamento, alívio ou prevenção de um distúrbio associado à ativação do complemento de via alternativa compreendendo a administração a um indivíduo em necessidade de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo ou fragmento de acordo com a invenção.

[0069] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um método para o tratamento, alívio ou prevenção de um distúrbio associado à ativação do complemento de via alternativa compreendendo a administração a um indivíduo em necessidade de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção.

[0070] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um método para o tratamento, alívio ou prevenção de um distúrbio associado à ativação do complemento de via alternativa compreendendo a administração a um indivíduo em necessidade de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vetor de acordo com a invenção.

[0071] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um método para o tratamento, alívio ou prevenção de um distúrbio associado à ativação do complemento de via alternativa compreendendo a administração a um indivíduo em necessidade de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica, de acordo com a invenção.

[0072] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um método para inibir a ativação alternativa do complemento, compreendendo a administração a um indivíduo de um anticorpo ou fragmento ,de acordo com a invenção.

[0073] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um método para inibir a ativação alternativa do complemento, compreendendo a administração a um indivíduo de uma molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção.

[0074] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um método para inibir a ativação alternativa do complemento, compreendendo a administração a um indivíduo de um vetor de acordo com a invenção.

[0075] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um método para a produção de um anticorpo ou fragmento de acordo com a invenção, compreendendo o método de fornecer uma célula com uma molécula de ácido nucleico ou um vetor de acordo com a invenção, e permitindo que a referida célula traduza a sequência de ácido nucleico compreendido pela referida molécula ou vetor de ácido nucleico, produzindo desse modo o referido anticorpo ou fragmento de acordo com a invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0076] Em um aspecto, a presente invenção fornece anticorpos agonísticos anti-FH e seus fragmentos, isto é, anticorpos e fragmentos que potencializam a atividade da FH. Em um aspecto, estes anticorpos competem com o anticorpo FH.07 pela ligação ao mesmo epítopo no domínio CCP18 de FH. Os anticorpos anti-FH potencializadores são inibidores potentes da ativação da via alternativa do complemento e, portanto, são úteis no tratamento de distúrbios associados à ativação indesejada ou excessiva da via alternativa do sistema complementar. O FH inibe especificamente o loop de amplificação da via alternativa, em que a clivagem de C3 em C3b e a subsequente ligação do mesmo a FB na superfície celular e a formação da C3 convertase promove a clivagem de outras moléculas de C3 em C3b. A principal vantagem do fato de que os anticorpos e fragmentos da invenção interferem na ativação do complemento no nível de C3 é que se evita o acúmulo de C3b na superfície e a liberação de C3a. Ao contrário, se a ativação do complemento é inibida no nível C5, como no eculizumabe, o acúmulo de C3b e a liberação de C3a não são inibidos. C3b atua como opsonina e C3a é uma anafilatoxina. A acumulação da formação de C3b e C3a é assim preferivelmente evitada, porque esses processos resultam na atração de células imunes e na opsonofagositose do alvo. Isso significa que, por exemplo, pacientes com HPN que recebem eculizumabe ainda precisam de transfusões porque o acúmulo de C3b resulta em opsonização dos glóbulos vermelhos, que são posteriormente removidos no fígado e no baço. Além disso, o tratamento com anticorpos anti-C5 resulta no acúmulo de formação de C3b e C3a em células que, de outra forma, seriam lisadas pelo MAC. Uma desvantagem importante dos anticorpos anti-C5 é que os pacientes se tornam vulneráveis a infecções porque os anticorpos interferem também na ativação do complemento induzida por patógenos. Visando um regulador do sistema de complemento que protege as células hospedeiras, isso é evitado.

[0077] O termo "anticorpo", conforme usado aqui, se refere a uma proteína de imunoglobulina compreendendo pelo menos uma região variável da cadeia pesada (VH), emparelhada com uma região variável da cadeia leve (VL), que é específica para um epítopo alvo. O termo abrange anticorpos policlonais e monoclonais. Se refere a qualquer forma de anticorpo que se ligue especificamente a CCP18, preferencialmente a CCP18, de FH, incluindo imunoglobulinas de comprimento total. Um anticorpo ou seu fragmento de acordo com a invenção compreende pelo menos um local de ligação ao antígeno. O termo "local de ligação ao antígeno", conforme aqui utilizado, se refere a um local de um anticorpo ou fragmento do mesmo compreendendo pelo menos uma sequência de CDR, preferencialmente pelo menos duas sequências de CDR, mais preferencialmente pelo menos três sequências de CDR. Por exemplo, um local de ligação ao antígeno compreende CDRs da cadeia leve 1-3 ou CDRs da cadeia pesada 1-3.

[0078] Como é bem conhecido pelo técnico versado no assunto, os anticorpos contêm duas cadeias pesadas e duas cadeias leves. Uma cadeia pesada de um anticorpo é o maior dos dois tipos de cadeia que compõem uma molécula de imunoglobulina. Uma cadeia pesada compreende um domínio constante e um domínio variável, cujo domínio variável está envolvido na ligação ao antígeno. Uma cadeia leve de um anticorpo é o menor dos dois tipos de cadeia que compõem uma molécula de imunoglobulina. Uma cadeia leve compreende um domínio constante e um domínio variável. O domínio variável da cadeia leve é frequentemente, mas nem sempre, juntamente com o domínio variável da cadeia pesada envolvida na ligação ao antígeno. As regiões determinantes de complementaridade (CDRs) são as regiões hipervisíveis presentes em domínios variáveis de cadeia pesada e domínios variáveis de cadeia leve. No caso de anticorpos de comprimento de calmaria, as CDRs 1-3 de uma cadeia pesada e as CDRs 1-3 da cadeia leve conectada formam juntas o local de ligação ao antígeno.

[0079] Um "fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo" é aqui definido como uma parte de um anticorpo que é capaz de se ligar especificamente ao mesmo antígeno que o anticorpo, isto é, CCP18 de FH, embora não necessariamente na mesma extensão. Um fragmento de um anticorpo potenciador da atividade de FH também potencializa a atividade de FH, embora não necessariamente na mesma extensão. Um fragmento de um anticorpo inibidor de atividade de FH também inibe também a atividade de FH, embora não necessariamente na mesma extensão. Um fragmento de anticorpo de acordo com a invenção compreende preferencialmente as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada de um anticorpo, bem como a sequência CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve do referido anticorpo. Exemplos não limitativos de um fragmento de um anticorpo são um anticorpo de domínio único, um anticorpo de cadeia única, um nanocorpo, um anticorpo, um fragmento variável de cadeia simples (scFv), um fragmento Fab, um fragmento Fab', um fragmento F (ab')2 e um fragmento F(ab)2. Um fragmento preferido de um anticorpo compreende pelo menos um domínio variável da cadeia pesada (VH) e / ou um domínio variável da cadeia leve (VL). Um fragmento mais preferido compreende pelo menos um fragmento Fab. Foi demonstrado que os fragmentos Fab' do potenciador do anticorpo anti-FH FH.07, que compete com os anticorpos da presente invenção pela ligação ao mesmo epítopo, mantêm a capacidade de potencializar a função do FH. Fragmentos particularmente preferidos de um anticorpo da invenção são, portanto, um fragmento Fab, um fragmento Fab', um fragmento F(ab')2 e um fragmento F(ab)2 de anticorpos de acordo com a invenção. Em outra concretização, um fragmento de um anticorpo de acordo com a invenção compreende uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina, uma região constante da cadeia pesada de imunoglobulina, uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina e uma região constante da cadeia leve de imunoglobulina.

[0080] Conforme usado aqui, os termos "específico para" e "se liga especificamente" ou "capaz de se ligar especificamente" se referem à interação não covalente entre um anticorpo e seu epítopo. Indica que o anticorpo ou fragmento se liga preferencialmente ao referido epítopo sobre outros locais de ligação ou outros antígenos. Portanto, embora o anticorpo ou fragmento possa se ligar de maneira não específica a outros locais ou antígenos de ligação, a afinidade de ligação do referido anticorpo ou fragmento para seu epítopo é significativamente maior que a afinidade de ligação do referido anticorpo ou fragmento para qualquer outro local ou antígeno de ligação.

[0081] A porcentagem de identidade de uma sequência de aminoácidos ou sequência de ácidos nucleicos, ou o termo "% de identidade de sequência", é definida aqui como a porcentagem de resíduos de todo o comprimento de uma sequência de aminoácidos ou sequência de ácidos nucleicos que é idêntica aos resíduos em uma sequência de aminoácidos de referência ou sequência de ácido nucleico após alinhar as duas sequências e introduzir lacunas, se necessário, para atingir a identidade percentual máxima. Os métodos e programas de computador para o alinhamento são bem conhecidos na técnica, por exemplo "Alinhar 2".

[0082] Nas sequências de aminoácidos como aqui representadas, os aminoácidos são denotados por símbolos de uma letra. Esses símbolos de uma letra e três letras são bem conhecidos do especialista na técnica e têm o seguinte significado: A (Ala) é alanina, C (Cys) é cisteína, D (Asp) é ácido aspártico, E ( Glu) é ácido glutâmico, F (Phe) é fenilalanina, G (Gly) é glicina, H (His) é histidina, I (Ile) é isoleucina, K (Lys) é lisina, L (Leu) é leucina, M ( Met) é metionina, N (Asn) é asparagina, P (Pro) é prolina, Q (Gln) é glutamina, R (Arg) é arginina, S (Ser) é serina, T (Thr) é treonina, V (Val) é valina, W (Trp) é triptofano, Y (Tyr) é tirosina.

[0083] Os anticorpos e fragmentos preferidos de acordo com a invenção são capazes de potencializar a atividade da FH, preferencialmente da FH humana.

Com o termo "Potencializando a atividade da FH" significa que a atividade da FH é aumentada se um anticorpo ou fragmento de acordo com a invenção se ligar à FH.

A atividade de FH que é potencializada por anticorpos e fragmentos da invenção é preferencialmente inibição da ativação alternativa do complemento, preferencialmente em um indivíduo.

Como aqui utilizado, o termo "ativação alternativa do complemento" se refere à ativação do sistema complemento via via alternativa, ou seja, envolvendo pelo menos a formação da C3 convertase da via alternativa, ou seja, C3bBb / C3bBbP, ou envolvendo um aumento na formação de esta convertase C3. A ativação alternativa do complemento pode envolver ainda a clivagem de C3 em C3a e C3b pela via alternativa C3 convertase, formação da via alternativa C5 convertase, ou seja, G3bBhC3b / C3hBbG3b, e / ou clivagem de C5 e subsequente ligação de C6, C7, C8 e C9 para formar o MAC.

A ativação alternativa do complemento pode incluir ainda um aumento no loop de amplificação da via alternativa.

A ativação alternativa do complemento alternativo é preferencialmente inibida em um indivíduo, preferencialmente em um fluido corporal de um indivíduo, preferencialmente no sangue, fluido intersticial ou fluido cerebrospinal, mais preferencialmente no sangue.

Como usado aqui, um "indivíduo" é um humano ou um animal que compreende um sistema de complemento como parte de seu sistema imunológico.

De um modo preferido, o referido indivíduo é um mamífero, mais preferencialmente um humano. preferencialmente em um fluido corporal de um indivíduo, preferencialmente no sangue, fluido intersticial ou líquido cefalorraquidiano, mais preferencialmente, no sangue. Como usado aqui, um "indivíduo" é um humano ou um animal que compreende um sistema de complemento como parte de seu sistema imunológico. De um modo preferido, o referido indivíduo é um mamífero, mais preferencialmente, um humano. Preferencialmente em um fluido corporal de um indivíduo, preferencialmente no sangue, fluido intersticial ou líquido cefalorraquidiano, mais preferencialmente no sangue. Como usado aqui, um "indivíduo" é um humano ou um animal que compreende um sistema de complemento como parte de seu sistema imunológico. De um modo preferido, o referido indivíduo é um mamífero, mais preferencialmente um humano.

[0084] Como aqui utilizado, "inibição da ativação de complemento alternativo" compreende qualquer alteração na quantidade ou atividade de um componente, fator ou atividade do sistema de complemento alternativo que causa ou é o resultado de sua inibição. A inibição da ativação alternativa do complemento, por exemplo, compreende uma inibição da atividade hemolítica, uma inibição da deposição do componente 3 do complemento (C3) nas células do referido indivíduo, um aumento da ligação da FH a C3b, iC3b e / ou C3d, uma inibição da formação da via alternativa do complemento C3 convertase C3bBb / C3bBbP, uma inibição da ligação do fator B a C3b e / ou inibição da interação entre C3b e fator B, uma inibição da clivagem de C3 em C3a e C3b pela via alternativa C3 convertase , um aumento na ligação do fH às células hospedeiras, em particular ao ácido siálico, glicosaminoglicanos e / ou heparina expressos nas células hospedeiras, uma inibição da alça de amplificação da via alternativa do complemento e inibição da formação da via alternativa do complemento C5 convertase C3bBbC3bP / C3bBbC3bP, uma inibição da clivagem C5 a C5a e C5b pela via alternativa C5 convertase, um aumento na atividade de aceleração de decaimento de FH, ou seja, promoção da dissociação das conversões C3 da via alternativa depois que elas se formam e / ou um aumento na atividade do cofator FI resultando em degradação de C3b. A inibição da ativação alternativa do complemento por FH que é potencializada pelos anticorpos e fragmentos anti-FH da invenção compreende preferencialmente uma inibição da atividade hemolítica, uma inibição da deposição de C3 nas células do referido indivíduo, uma inibição da deposição de C3 nas células do referido indivíduo e / ou um aumento da ligação de FH a C3b, iC3b e / ou C3d.

[0085] "Inibição", como usado aqui, preferencialmente, significa que a atividade indicada é reduzida em pelo menos cerca de 25%, mais preferencialmente, pelo menos cerca de 50%, mais preferencialmente, pelo menos cerca de 75%, mais preferencialmente, pelo menos cerca de 80%, mais preferencialmente, pelo menos cerca de 85%, mais preferencialmente, pelo menos cerca de 90%, mais preferencialmente, pelo menos cerca de 95%. Assim, "inibição da ativação alternativa do complemento" preferencialmente significa que a atividade da via alternativa do complemento é reduzida em pelo menos cerca de 25%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 50%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95%. Da mesma forma, “uma inibição da atividade hemolítica” preferencialmente significa que a atividade hemolítica é reduzida em pelo menos cerca de 25%, mais preferencialmente, pelo menos cerca de 50%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95%.

[0086] "Aumento", conforme usado aqui, preferencialmente, significa que a atividade indicada é aumentada em pelo menos cerca de 25%, mais preferencialmente, pelo menos cerca de 50%, mais preferencialmente, pelo menos cerca de 75%, mais preferencialmente, pelo menos cerca de 80%, mais preferencialmente, pelo menos cerca de 85%, mais preferencialmente, pelo menos cerca de 90%, mais preferencialmente, pelo menos cerca de 95%. Assim, "um aumento da ligação de FH a C3b" preferencialmente significa que a ligação de FH a C3b é aumentada em pelo menos cerca de 25%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 50%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95%. Da mesma forma, "um aumento na ligação de FH às células hospedeiras" significa preferencialmente que a ligação de FH às células hospedeiras é aumentada em pelo menos cerca de 25%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 50%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95%.

[0087] Como usado aqui, "atividade hemolítica" se refere à ruptura de glóbulos vermelhos e à liberação subsequente do conteúdo da célula em, por exemplo, a circulação induzida pela ativação do sistema complemento, preferencialmente como resultado da formação de MAC na superfície celular. A atividade hemolítica é, por exemplo, medida como descrito aqui nos Exemplos, utilizando um ensaio hemolítico como descrito por Sanchez-Corral et al. (2004) e Wouters et al. (2008), opcionalmente com algumas concretizações. Neste ensaio, os glóbulos vermelhos, como os glóbulos vermelhos de ovelha (SRBCs), são incubados com soro,

por exemplo, soro humano, por exemplo, a 37 ° C por 1,25 horas, enquanto se agita. Soros com baixos níveis de HF ou HF disfuncional levam à lise SRBCsLysis que pode parar por adição de tampão veronal contendo 20 mM de EDTA seguido de centrifugação em uma centrífuga pré-resfriada (por exemplo, 7 ° C) por 2,5 minutos. A percentagem de lise de glóbulos vermelhos é determinada medindo a absorbância dos sobrenadantes a 412 nm. O soro pode, por exemplo, ser de indivíduos humanos saudáveis ou de indivíduos humanos que sofrem de um distúrbio associado à ativação indesejada ou excessiva do complemento de via alternativa, como o aHUS. A capacidade de um anticorpo ou fragmento para inibir a atividade hemolítica pode ser determinada através da incubação dos glóbulos vermelhos com soro na presença do anticorpo ou fragmento.

[0088] A inibição da deposição de C3 é, por exemplo, medida utilizando um ensaio de deposição de C3, como aqui descrito nos Exemplos. Este ensaio envolve o revestimento de placas de microtitulação com LPS. As placas são subsequentemente incubadas com soro, por exemplo, de indivíduos saudáveis ou de indivíduos que sofrem de um distúrbio associado à ativação indesejada ou excessiva do complemento alternativo, como indicado acima, na presença ou ausência de anticorpo ou fragmentos. A deposição de C3 no LPS pode ser detectada com um anticorpo anti-C3.

[0089] Um aumento da ligação de FH a C3b é medido, por exemplo, utilizando um ELISA como aqui descrito nos Exemplos. Este ensaio envolve o revestimento da placa ELISA de microtitulação com C3b e a incubação da placa com soro,

por exemplo, de indivíduos saudáveis ou de indivíduos que sofrem de um distúrbio associado à ativação indesejada ou excessiva do complemento alternativo, como indicado acima.

[0090] O FH ligado pode ser detectado com um anticorpo anti-FH, como o anti-FH policlonal marcado com peroxidase. A capacidade de um anticorpo ou fragmento para aumentar a ligação de FH a C3b pode ser determinada pré- incubando o soro na presença do anticorpo ou fragmento antes da incubação com o C3b revestido. Como outro exemplo, a ligação de FH a C3b pode ser determinada usando a ressonância plasmática de superfície (SPR), por exemplo, como descrito aqui nos exemplos. O SPR é uma técnica para medir interações biomoleculares em tempo real em um ambiente sem rótulo. Um dos interativos, por exemplo C3b, é imobilizado em uma superfície do sensor e o outro, por exemplo, FH, é livre em solução e passa sobre a superfície, por exemplo, na presença ou ausência de (diferentes concentrações de) um anticorpo ou fragmento da invenção.

[0091] Os anticorpos ou seus fragmentos preferidos fornecidos pela presente invenção têm um baixo valor de IC50 in vitro, em um ou mais ensaios funcionais, mais preferencialmente, um valor de IC50 in vitro que é menor que o valor de IC50 in vitro do anticorpo FH.07 para o mesmo ensaio funcional "IC50" é um termo bem conhecido no estado da técnica e se refere à concentração de um anticorpo ou fragmento necessário para inibir ou reduzir uma certa atividade funcional em 50%. Quanto menor o valor de IC50 de um anticorpo ou fragmento, maior a atividade inibidora do anticorpo ou fragmento e maior o seu potencial como agente terapêutico. O referido ensaio funcional é, de preferência, um ensaio de deposição de C3b e / ou um ensaio hemolítico como aqui descrito acima. Em um aspecto preferido, um anticorpo ou fragmento do mesmo, de acordo com a invenção, inibe a deposição de C3 no LPS in vitro com um valor de IC50 de 38 nM ou menos, mais preferencialmente, 35 nM ou menos, mais preferencialmente, 32 nM ou menos, mais preferencialmente, 30 nM ou menos, mais preferencialmente 28 nM ou menos, mais preferencialmente, 27 nM ou menos. Em um aspecto preferido adicional, um anticorpo ou seu fragmento de acordo com a invenção inibe a atividade hemolítica in vitro com um valor de IC50 igual ou inferior a 150 nM, mais preferencialmente, 130 nM ou menos, mais preferencialmente, 115 nM ou menos, mais preferencialmente, 105 nM ou menos, mais preferencialmente, 100 nM ou menos, mais preferencialmente 95 nM ou menos.

[0092] Anticorpos ou fragmentos adicionais preferidos da invenção inibem a deposição de C3 em LPS in vitro com um baixo valor de IC50 como aqui descrito acima e inibem a atividade hemolítica in vitro com um baixo valor de IC50 como aqui descrito acima. Portanto, um anticorpo ou fragmento preferido de acordo com a invenção inibe a deposição de C3 em LPS in vitro com um valor de IC50 de 38 nM ou menos e inibe a atividade hemolítica in vitro com um valor de IC50 de 150 nM ou menos, mais preferencialmente, inibe a deposição de C3 em LPS in vitro com um valor de IC50 de 30 nM ou menos e inibe a atividade hemolítica in vitro com um valor de IC50 de 150 nM ou menos, mais preferencialmente, inibe a deposição de C3 em LPS in vitro com um valor de IC50 de 27 nM ou menos e inibe a hemolítica atividade in vitro com um valor de IC50 igual ou inferior a 100 nM. 0 valor IC50 para a deposição de C3 em LPS in vitro é determinado, de preferência, em um ensaio de deposição de C3 como descrito aqui acima. O valor de IC50 para a atividade hemolítica é preferencialmente determinado em um ensaio de atividade hemolítica como descrito aqui acima.

[0093] "Afinidade de ligação " se refere à força da soma total das interações não covalentes entre um único local de ligação de um anticorpo ou parte funcional ou equivalente funcional e seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno). Salvo indicação em contrário, como usado aqui, "afinidade de ligação" se refere à afinidade de ligação intrínseca que reflete uma interação 1: 1 entre membros de um par de ligação (anticorpo e antígeno no presente pedido). A afinidade de ligação é aqui representada pela constante de dissociação de equilíbrio (Kit), que é calculada como a razão k a para ka, ver, por exemplo, Chen, Y., et ak,

1999. A afinidade pode ser medida por métodos comuns conhecidos no estado da técnica, como, por exemplo, um ensaio de ressonância plasmônica de superfície (SPR), como o BiaCore (GE Healthcare Life Sciences GE Healthcare Life Sciences) ou instrumento IBIS-iSPR da IBIS Technologies BV (Hengelo, Holanda) ou ensaios de fase de solução, como o Kinexa.

[0094] Anticorpos preferidos ou seus fragmentos, fornecidos pela presente invenção, têm uma alta afinidade de ligação a FH e / ou um fragmento de FH compreendendo os domínios CCP18-20, mais preferencialmente, uma afinidade de ligação que é maior que a afinidade de ligação do anticorpo

FH.07. A atividade terapêutica in vivo de um anticorpo ou fragmento geralmente requer alta afinidade de ligação, por exemplo, para minimizar a ligação do anticorpo ou fragmento a locais de ligação e / ou antígenos que não sejam o epítopo ou antígeno para o qual é específico e para minimizar a quantidade de anticorpo ou fragmento que precisa ser administrado in vivo.

Por isso, são preferidos os anticorpos com uma alta afinidade de ligação.

Um anticorpo ou fragmento do mesmo possui preferencialmente uma afinidade de ligação para FH com uma constante de dissociação (KD) de 2,5 x 10-8 M ou menos e / ou uma afinidade de ligação para um fragmento FH constituído por CCP18-20 com um KD de 0,1 x 10-9 M ou menos.

Em uma concretização, a invenção fornece, portanto, um anticorpo isolado, sintético ou recombinante ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente ao fator H (FH) e potencializa a atividade da FH, em que o anticorpo tem uma afinidade de ligação à FH com uma KD de 2,5 x 10-8 M ou menos e / ou uma afinidade de ligação para um fragmento de FH constituído por CCP18-20 com um nó de 0,1 x 10-9 M ou menos.

De um modo preferido um anticorpo ou fragmento de acordo com a inveno tem uma afinidade de ligação para FH com um KD de 2,25 x 10-8 M ou inferior, mais preferencialmente 2 x 10-8 M ou inferior, mais preferivelmente 1,75 x 10 8M ou menos, mais preferencialmente 1,5 x 10-8 M ou menos, mais preferencialmente 1,25 x 10-8 M ou menos, mais preferencialmente 1 x 10-8 M ou menos, mais preferencialmente, 0,9 x 10-8 M ou menos, mais preferencialmente, 0,8 x 10-8 M ou menos, mais preferencialmente, 0,7 x 10-8 M ou menos, mais preferencialmente, 0,6 x 10-8 M ou menos e / ou uma afinidade de ligação para um fragmento FH composto por CCP18-20 com um KD de 0,09 x 10-9 M ou menos, mais preferencialmente 0,08 x 10-9 M ou menos, mais preferencialmente, 0,07 x 10-9 M ou menos, mais preferencialmente, 0,06 x 10-9 M ou menos, mais preferencialmente, 0,05 x 10-9 M ou menos, mais preferencialmente, 0,04 x 10-9 M ou menos, mais preferencialmente, 0,03 x 10-9 M ou menos, mais preferencialmente, 0,02 x 10-9 M ou menos, preferencialmente 1 x 10-11 M ou menos, mais preferencialmente 0,9 x 10-11 M ou menos, mais preferencialmente, 0,8 x 10-11 M ou menos, mais preferencialmente, 0,7 x 10-11 M ou menos, mais preferencialmente, 0,6 x 10-11 M ou menos.

Em um aspecto preferido, um anticorpo ou seu fragmento, de um modo preferido tem uma afinidade de ligação para FH com um KD de 1,25 x 10-8 M ou inferior e / ou uma afinidade de ligação para um fragmento FH composto de CCP18-20 com um KD de 0,04 x 10-9 M ou menos.

Em um aspecto preferido adicional, um anticorpo ou fragmento do mesmo possui preferencialmente uma afinidade de ligação para FH com um KD de 0,6 x 10-8 M ou menos e / ou uma afinidade de ligação para um fragmento de FH composto de CCP 18-20 com um KD de 0,6 x 10-11 M ou menos.

A referida afinidade de ligação é, preferencialmente, determinada usando ressonância plasmônica de superfície (SPR), mais preferencialmente, usando SPR em um ensaio como aqui descrito, isto é, em um ensaio em que a afinidade de ligação é determinada por SPR em um chip ProtA, capturando o anticorpo ou fragmento antes de escoar completamente comprimento FH (para afinidade de ligação para FH) ou um fragmento de FH compreendido no domínio 18-20 (para afinidade de ligação para CCP18-20) sobre a superfície.

[0095] Outros anticorpos ou fragmentos preferidos de acordo com a invenção têm uma alta afinidade de ligação e inibem a deposição de C3 em LPS in vitro com um baixo valor de IC50 e / ou inibem a atividade hemolítica in vitro com um baixo valor de IC50. Por isso, um anticorpo ou fragmento preferida de acordo com a invenção tem uma afinidade de ligação para FH com uma KD de 2,5 x 10-8 M ou inferior e / ou uma afinidade de ligação para um fragmento FH composto de CCP18-20 com uma KD de 0,1 x 10-11 M ou menos e inibe a deposição de C3 em LPS in vitro com um valor de IC50 igual ou inferior a 38 nM e / ou inibe a atividade hemolítica in vitro com um valor de IC50 igual ou inferior a 150 nM. Mais preferencialmente, o anticorpo ou fragmento tem uma afinidade de ligação para FH com um KD de 1,25 x 10-8 M ou menos e / ou uma afinidade de ligação para um fragmento FH constituído por CCP18-20 com um KD de 0,04 x 10 <! M ou menos e inibe a deposição de C3 em LPS in vitro com um valor de IC50 igual ou inferior a 30 nM e inibe a atividade hemolítica in vitro com um valor de IC50 igual ou inferior a 115 nM. Ainda mais preferencialmente, o anticorpo ou o fragmento tem uma afinidade de ligação para FH com um KD de 1,25 x 10-8 M ou inferior e / ou uma afinidade de ligação para um fragmento FH composto de CCP18-20 com um KD de 0,04 x 10-9 M ou inferior e inibe a deposição de C3 em LPS in vitro com um valor de IC50 de 27 nM ou menos e inibe a atividade hemolítica in vitro com um valor de IC50 de 100 nM ou menos. A referida afinidade de ligação é preferencialmente determinada por SPR como aqui descrito. O valor de IC50 da deposição de C3 em LPS in vitro é determinado, de preferência, em um ensaio de deposição de C3 como descrito acima. O valor de IC50 para a atividade hemolítica é, preferencialmente, determinado em um ensaio de atividade hemolítica como descrito aqui acima.

[0096] Um anticorpo particularmente preferido, de acordo com a invenção é o anticorpo anti-FHR-1.8E4, cuja preparação e identificação são descritas nos Exemplos. A Tabela 1 fornece uma visão geral das sequências variáveis das cadeias pesada e leve, bem como das sequências CDR individuais, do anticorpo anti-FHR-1.8E4. Ainda mais preferidos são os anticorpos quiméricos ou humanizados monoclonais ou seus fragmentos, compreendendo as sequências CDR da cadeia pesada e as sequências CDR da cadeia leve do anticorpo anti-FHR-1.8E4 ou a região variável da cadeia pesada e a região variável da cadeia leve do anticorpo anti- FHR-1.8 E4 O termo "anti-FHR-1.8E4", conforme usado neste documento, abrange todos os anticorpos e fragmentos que possuem pelo menos a região CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada e da cadeia leve, como mostrado na Tabela 1, tais como, por exemplo, anticorpos isolados e / ou purificados ou anticorpos produzidos de forma recombinante. O anticorpo anti-FHR-1.8E4 compete pela ligação ao mesmo epítopo no CCP18 de FH que o anticorpo FH.07. O anticorpo anti-FHR-1.8E4 tem um baixo valor de IC50 para inibição da deposição de C3 no LPS in vitro de 26,3 nM e um baixo valor de IC50 para inibição da atividade hemolítica in vitro de 94,0 nM. O anticorpo anti-FHR-1.8E4 possui ainda uma alta afinidade de ligação ao FH de comprimento total com um KD de 1,04 x 10-8 e uma afinidade de ligação para um fragmento de FH alta composto de CCP18-20 com um KD de 3,13 x 10-11. O anticorpo anti-FHR-

1.8E4 aumenta ainda mais a afinidade de ligação (KD) de FH para C3b in vitro de 6 mM para 1,66 mM, ou seja, 3,6 vezes.

[0097] Um outro anticorpo particularmente preferido de acordo com a invenção é o anticorpo anti-FHR-1.3B4, cuja preparação e identificação são descritas nos Exemplos. A Tabela 1 fornece uma visão geral das sequências variáveis das cadeias pesada e leve, bem como das sequências CDR individuais, do anticorpo anti-FHR-1.3B4. Ainda mais preferidos são os anticorpos quiméricos monoclonais ou humanizados ou seus fragmentos compreendendo as sequências CDR da cadeia pesada e as sequências CDR da cadeia leve do anticorpo anti-FHR-1.3B4 ou a região variável da cadeia pesada e a região variável da cadeia leve e a região variável da cadeia leve do anticorpo anti-FHR-1.3 B4 O termo "anti- FHR-1.3B4", conforme usado neste documento, abrange todos os anticorpos e fragmentos que possuem pelo menos a região CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada e da cadeia leve, como mostrado na Tabela 1, tais como, por exemplo, anticorpos isolados e / ou purificados ou anticorpos produzidos de forma recombinante. O anticorpo anti-FHR-1.3B4 compete pela ligação ao mesmo epítopo no CCP18 de FH que o anticorpo FH.07. O anticorpo anti-FHR-1.3B4 tem um baixo valor de IC50 para inibição da deposição de C3 no LPS in vitro de 38.41 nM e um baixo Valor IC50 para inibição da atividade hemolítica in vitro de 127,5 nM. O anticorpo anti-FHR-1.3B4 possui ainda uma alta afinidade de ligação para FH de comprimento total com um KD de 0,58 x 10-8 e uma alta afinidade de ligação para um fragmento de FH composto por CCP18-20 com um Kn de 5,44 x 10-12. O anticorpo anti-FHR-1.3B4 aumenta ainda mais a afinidade de ligação (KD) de FH para C3b in vitro de 6 mM para 1,9 mM, ou seja, 3,2 vezes.

[0098] Um outro anticorpo particularmente preferido, de acordo com a invenção, é o anticorpo anti-FHR-l.llEl, cuja preparação e identificação são descritas nos Exemplos. A Tabela 1 fornece uma visão geral das sequências variáveis das cadeias pesada e leve, bem como das sequências CDR individuais, do anticorpo anti-FHR-1.11E1. Ainda mais preferidos são os anticorpos quiméricos ou humanizados monoclonais ou seus fragmentos, compreendendo as sequências CDR da cadeia pesada e as sequências CDR da cadeia leve do anticorpo anti-FHR-l.llEl ou a região variável da cadeia pesada e a região variável da cadeia leve e a região variável da cadeia leve do anticorpo anti-FHR- l.llEl. O termo "anti- FHR-1.11E1", conforme usado neste documento, abrange todos os anticorpos e fragmentos que possuem pelo menos a região CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada e da cadeia leve, como mostrado na Tabela 1, tais como, por exemplo, anticorpos isolados e / ou purificados ou anticorpos produzidos recombinantemente. O anticorpo anti-FHR-l.llEl compete pela ligação ao mesmo epítopo no CCP18 de FH que o anticorpo FH.07. O anticorpo anti-FHR-l.llEl tem um baixo valor de IC50 para inibição da deposição de C3 no LPS in vitro de 25,04 nM.

[0099] Um outro anticorpo particularmente preferido de acordo com a invenção é o anticorpo anti-FHR-1.12F4, cuja preparação e identificação são descritas nos Exemplos. A

Tabela 1 fornece uma visão geral das sequências variáveis das cadeias pesada e leve, bem como das sequências CDR individuais, do anticorpo anti-FHR-1.12F4. Ainda mais preferidos são os anticorpos quiméricos ou humanizados monoclonais ou seus fragmentos, compreendendo as sequências CDR da cadeia pesada e as sequências CDR da cadeia leve do anticorpo anti-FHR-1.12F4 ou a região variável da cadeia pesada e a região variável da cadeia leve e a região variável da cadeia leve do anticorpo anti-FHR-1.12 F4 O termo "anti- FHR-1.12F4", conforme usado neste documento, abrange todos os anticorpos e fragmentos que possuem pelo menos a região CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada e da cadeia leve, como mostrado na Tabela 1, tais como, por exemplo, anticorpos isolados e / ou purificados ou anticorpos produzidos de forma recombinante. O anticorpo anti-FHR-1.12F4 compete pela ligação ao mesmo epítopo no CCP18 de FH que o anticorpo FH.07. O anticorpo anti-FHR-1.12F4 tem um baixo valor de IC50 para inibição da deposição de C3 em LPS in vitro de 345,2 nM.

[00100] É fornecido, portanto, um anticorpo isolado, sintético ou recombinante ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente para domínio 18 da proteína de controle do complemento (CCP18) do fator H (FH) compreendendo: - uma sequência CDR1 da cadeia leve com a sequência SSVXY, em que X é R, T ou N (SEQ ID NO: 91) ou a sequência QSLVHSN GNTY (SEQ ID NO: 49), - uma sequência CDR2 de cadeia leve com a sequência X1X2S em que X1 = A, K ou Y e X2 = T ou L (SEQ ID NO: 92),

- uma CDR3 de cadeia leve com uma sequência selecionada do grupo que consiste em QQWGTKPPT (SEQ ID NO: 19), QQRSSSNPLT (SEQ ID NO: 35), SQSTHVPFT (SEQ ID NO: 51) e QQFTSSPLT (SEQ ID NO: 67), - uma CDR1 de cadeia pesada com a sequência X1FSLTX2X3G, em que X1 = D ou G, X2 = N ou S e X3 = S ou Y (SEQ ID NO: 93), - uma CDR2 de cadeia pesada com a sequência IWSGGXT, em que x = T, N ou S (SEQ ID NO: 94) e - uma sequência de CDR3 de cadeia pesada com a sequência ARNX1GNYX2X3DY, em que X1 = F ou G, X2 = A ou Y e X3 = V, M ou F (SEQ ID NO: 95) ou AKNGDYGYTMDY (SEQ ID NO: 55).

[00101] Em uma concretização preferida, o referido anticorpo compreende: - uma sequência CDR1 de cadeia leve com a sequência SSVXY, em que X é R ou T (SEQ ID NO: 96), - uma sequência de CDR2 de cadeia leve com a sequência ATS (SEQ II) NO: 97), - uma CDR3 de cadeia leve com uma sequência selecionada do grupo que consiste em QQWGTKPPT (SEQ ID NO: 19) e QQRSSSNPLT (SEQ ID NO: 35), - uma CDR1 de cadeia pesada com a sequência X1FSLTNX2G, em que X1 = D ou G e X2 = S ou Y (SEQ ID NO: 98), - uma CDR2 de cadeia pesada com a sequência IWSGGTT (SEQ ID NO: 99), e - uma sequência de CDR3 da cadeia pesada com a sequência ARNFGNYAXDY, em que X = V ou M (SEQ ID NO: 100).

[00102] O referido anticorpo ou fragmento potencialmente potencializa a atividade da FH,

preferencialmente, inibição da ativação alternativa do complemento, como inibição da atividade hemolítica, inibição da deposição do componente 3 (C3) do complemento e / ou um aumento da ligação da FH a C3b, iC3b e / ou C3d . O referido fragmento compreende preferencialmente pelo menos um domínio variável da cadeia pesada (VH) e / ou um domínio variável da cadeia leve (VL). Um fragmento mais preferido compreende pelo menos um fragmento Fab.

[00103] O referido anticorpo ou fragmento possui preferencialmente uma afinidade de ligação para FH com um KD de 2,5 x 10-8 M ou menos e / ou uma afinidade de ligação para um fragmento FH compreendido em CCP18-20 com um KD de 0,1 x 10-9 M ou menos, de preferência, em que o referido anticorpo ou fragmento possui uma afinidade de ligação para FH com um KD de 1,25 x 10-8 M ou inferior e / ou uma afinidade de ligação para um fragmento FH composto de CCP18-20 com um KD 0,04 x 10-9 M ou inferior.

[00104] Em uma outra concretização preferida, a invenção fornece um anticorpo isolado, sintético ou recombinante ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente ao CCP18 de FH compreendendo uma sequência CDR1 de cadeia leve com a sequência SSVRY (SEQ ID NO: 17), uma CDR2 de cadeia leve sequência com a sequência ATS (SEQ ID NO: 18) e uma CDR3 de cadeia leve com a sequência QQWGTKPPT (SEQ ID NO: 19), uma CDR1 de cadeia pesada com a sequência DFSLTNSG (SEQ ID NO: 21), uma CDR2 de cadeia pesada com a sequência IWSGGTT (SEQ ID NO: 22) e uma sequência de CDR3 de cadeia pesada com a sequência ARNFGNYAVDY (SEQ ID NO: 23). Em uma concretização, o referido anticorpo compreende uma sequência de cadeia leve variável compreendendo uma sequência que possui pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência QIVLSQSPAILSASPGEK

VTMTCRASSSVRYMHWYQQKAGSSPTAWIFATSNLASGVPPRFSGSGSGTSYSLTISRV EAEDAATYYCQQWGTKPPTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 20) e uma sequência variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência que possui pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSDFSLTN

SGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGTTEYNAAFMSRLTITKDNSKSQVFFKMNSLLVDDT GIYYCARNFGNYAVDYWGQGTSVTVSS: SEQ ID NO: 24. Em uma concretização adicional, o referido anticorpo ou fragmento compreende uma sequência de cadeia leve variável compreendendo uma sequência que possui pelo menos 85%, mais preferencialmente, pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 95%, mais preferencialmente, pelo menos 96%, mais preferencialmente pelo menos 97%, mais preferencialmente, pelo menos 98%, mais preferencialmente, pelo menos 99% de identidade de sequência com a referida sequência da SEQ ID NO: 20 e uma sequência de cadeia pesada variável compreendendo uma sequência que tem pelo menos 85 %%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 95%, mais preferencialmente pelo menos 96%, mais preferencialmente pelo menos 97%, mais preferencialmente pelo menos 98%, mais preferencialmente pelo menos 99% de identidade de sequência com a referida sequência da SEQ ID NO: 24. Em uma concretização específica, o referido anticorpo ou fragmento compreende uma luz variável sequência de cadeia compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 20 e uma sequência de cadeia leve variável compreendendo a sequência da SEQ ID

NO: 24. O referido anticorpo ou fragmento potencialmente potencializa a atividade de FH, preferencialmente, inibição da ativação alternativa do complemento, como inibição da atividade hemolítica, inibição da deposição do componente 3 do complemento (C3) e / ou um aumento da ligação de FH a C3b, iC3b e / ou C3d. O referido fragmento compreende preferencialmente pelo menos um domínio variável da cadeia pesada (VH) e / ou um domínio variável da cadeia leve (VL). Um fragmento mais preferido compreende pelo menos um fragmento Fab.

[00105] O referido anticorpo ou fragmento compreendendo uma sequência CDR1 da cadeia leve com a sequência SSVRY (SEQ ID NO: 17), uma sequência CDR2 da cadeia leve com a sequência ATS (SEQ ID NO: 18) e uma CDR3 da cadeia leve com a sequência QQWGTKPPT (SEQ ID NO: 19), uma CDR1 de cadeia pesada com a sequência DFSLTNSG (SEQ ID NO: 21), uma CDR2 de cadeia pesada com a sequência IWSGGTT (SEQ ID NO: 22) e uma sequência de CDR3 de cadeia pesada com a sequência ARNFGNYAVDY (SEQ ID NO: 23) preferencialmente possui uma afinidade de ligação para FH com um KD de 2,5 x 1 10-8 M ou menos e / ou uma afinidade de ligação para um fragmento de FH composto de CCP18-20 com um KD de 0,1 x 10-9 M ou menos. De preferência, o referido anticorpo ou fragmento tem uma afinidade de ligação para FH com um KD de 2,25 x 10-8 M ou menos, mais preferencialmente, 2 x 10-8 M ou menos, mais preferencialmente, 1,75 x 10-8 M ou menos, mais preferencialmente, 1,5 x 10-8M ou inferior, mais preferencialmente, de 1,25 x 10-8 M ou inferior, e / ou uma afinidade de ligação para um fragmento FH composto de PCC

18-20 com um KD de 0,09 x 10-9 M ou inferior, mais preferivelmente, 0,08 x 10-9 M ou menos, mais preferencialmente, 0,07 x 10-8 M ou inferior, mais preferivelmente, 0,06 x 10-8 M ou inferior, mais preferivelmente, 0,05 x 10-8 M ou inferior, mais preferivelmente, 0,04 x 10-9 M ou menos.

[00106] O referido anticorpo ou fragmento compreendendo uma sequência CDR1 da cadeia leve com a sequência SSVRY (SEQ ID NO: 17), uma sequência CDR2 da cadeia leve com a sequência ATS (SEQ ID NO: 18) e uma CDR3 da cadeia leve com a sequência QQWGTKPPT (SEQ ID NO: 19), uma cadeia pesada GDR1 com a sequência DFSLTNSG (SEQ ID NO: 21), uma CDR2 de cadeia pesada com a sequência IWSGGTT (SEQ ID NO: 22) e uma sequência de CDR3 de cadeia pesada com a sequência ARNFGNYAVDY (SEQ ID NO: 23) inibe preferencialmente a deposição de C3 em LPS in vitro com um valor de IC50 de 38 nM ou menos. De preferência, o referido anticorpo ou fragmento inibe a deposição de C3 em LPS in vitro com um valor de IC50 de 35 nM ou menos, mais preferencialmente, 32 nM ou menos, mais preferencialmente, 30 nM ou menos, mais preferencialmente 28 nM ou menos, mais preferencialmente, 27 nM ou menos.

[00107] O referido anticorpo ou fragmento compreendendo uma sequência CDR1 da cadeia leve com a sequência SSVRY (SEQ ID NO: 17), uma sequência CDR2 da cadeia leve com a sequência ATS (SEQ ID NO: 18) e uma CDR3 da cadeia leve com a sequência QQWGTKPPT (SEQ ID NO: 19), uma CDR1 de cadeia pesada com a sequência DFSLTNSG (SEQ ID NO: 21), uma CDR2 de cadeia pesada com a sequência IWSGGTT (SEQ ID NO:

22) e uma sequência de CDR3 de cadeia pesada com a sequência ARNFGNYAVDY (SEQ ID NO: 23) inibe preferencialmente a atividade hemolítica in vitro com um valor de IC50 de 150 nM ou menos. Preferencialmente, o referido anticorpo ou fragmento inibe a atividade hemolítica in vitro com um valor de IC50 de 115 nM ou menos, mais preferencialmente, 105 nM ou menos.

[00108] O referido anticorpo ou fragmento compreendendo uma sequência CDR1 da cadeia leve com a sequência SSVRY (SEQ ID NO: 17), uma sequência CDR2 da cadeia leve com a sequência ATS (SEQ ID NO: 18) e uma CDR3 da cadeia leve com a sequência QQWGTKPPT (SEQ ID NO: 19), uma cadeia pesada GDR1 com a sequência DFSLTNSG (SEQ ID NO: 21), uma CDR2 de cadeia pesada com a sequência IWSGGTT (SEQ ID NO: 22) e uma sequência de CDR3 de cadeia pesada com a sequência ARNFGNYAVDY (SEQ ID NO: 23) aumenta preferencialmente a afinidade de ligação (KD) de FH para C3b in vitro para no máximo 2 mM, mais preferencialmente 1,8 mM e / ou aumenta a afinidade de ligação de FH para C3b in vitro pelo menos 3 vezes, mais preferencialmente 3,5 vezes.

[00109] Em uma outra concretização preferida, a invenção fornece um anticorpo isolado, sintético ou recombinante ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente ao CCP18 de FH compreendendo uma sequência CDR1 de cadeia leve com a sequência SSVTY (SEQ ID NO: 33), uma CDR2 de cadeia leve sequência com a sequência ATS (SEQ ID NO: 34) e uma CDR3 de cadeia leve com a sequência QQRSSSNPLT (SEQ ID NO: 35), uma CDR1 de cadeia pesada com a sequência GFSLTNYG (SEQ ID NO: 37), uma CDR2 de cadeia pesada com a sequência IWSGGTT (SEQ ID NO: 38) e uma sequência de CDR3 de cadeia pesada com a sequência ARNFGNYAMDY (SEQ ID NO: 39). Em uma concretização, o referido anticorpo compreende uma sequência de cadeia leve variável compreendendo uma sequência que possui pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência QIVLSQSPTILSASPG

EKVTMTCRASSSVTYMHWYQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTIS RVEAEDAATYYCQQRSSSNPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 36) e uma sequência variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência que possui pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência QVQLRQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSL

TNYGVYWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGTTDYSAAFISRLSISKDNSKSQVFFKMNSLQAD DTAIYYCARNFGNYAMDYWGQGTSVTVSS (ID SEQ NO: 40). Em uma concretização adicional, o referido anticorpo ou fragmento compreende uma sequência de cadeia leve variável compreendendo uma sequência que possui pelo menos 85%, mais preferencialmente, pelo menos 90%, mais preferencialmente, pelo menos 95%, mais preferencialmente, pelo menos 96%, mais preferencialmente, pelo menos 97%, mais preferencialmente pelo menos 98%, mais preferencialmente, pelo menos 99% de identidade de sequência com a referida sequência da SEQ ID NO: 36 e uma sequência de cadeia pesada variável compreendendo uma sequência que tem pelo menos 85 %%, mais preferencialmente, pelo menos 90%, mais preferencialmente, pelo menos 95%, mais preferencialmente, pelo menos 96%, mais preferencialmente pelo menos 97%, mais preferencialmente, pelo menos 98%, mais preferencialmente, pelo menos 99% de identidade de sequência com a referida sequência da SEQ ID NO: 40. Em uma concretização específica, o referido anticorpo ou fragmento compreende uma sequência variável da cadeia leve compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 36 e uma sequência variável da cadeia leve compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 40. O referido anticorpo ou fragmento potencialmente potencializa a atividade de FH, preferencialmente inibição de ativação alternativa do complemento, como inibição da atividade hemolítica, inibição da deposição do componente 3 (C3) do complemento e / ou um aumento da ligação da FH a C3b, iC3b e / ou C3d.

O referido fragmento compreende preferencialmente pelo menos um domínio variável da cadeia pesada (VH) e / ou um domínio variável da cadeia leve (VL). Um fragmento mais preferido compreende pelo menos um fragmento Fab.

O referido anticorpo ou fragmento potencialmente potencializa a atividade da FH, preferencialmente inibição da ativação alternativa do complemento, como inibição da atividade hemolítica, inibição da deposição do componente 3 (C3) do complemento e / ou um aumento da ligação da FH a C3b, iC3b e / ou C3d.

O referido fragmento compreende preferencialmente pelo menos um domínio variável da cadeia pesada (VH) e / ou um domínio variável da cadeia leve (VL). Um fragmento mais preferido compreende pelo menos um fragmento Fab.

O referido anticorpo ou fragmento potencialmente potencializa a atividade da FH, preferencialmente inibição da ativação alternativa do complemento, como inibição da atividade hemolítica, inibição da deposição do componente 3 (C3) do complemento e / ou um aumento da ligação da FH a C3b, iC3b e / ou C3d.

O referido fragmento compreende preferencialmente pelo menos um domínio variável da cadeia pesada (VH) e / ou um domínio variável da cadeia leve (VL). Um fragmento mais preferido compreende pelo menos um fragmento Fab.

[00110] O referido anticorpo ou fragmento compreendendo uma sequência CDR1 da cadeia leve com a sequência SSVTY (SEQ ID NO: 33), uma sequência CDR2 da cadeia leve com a sequência ATS (SEQ ID NO: 34) e uma CDR3 da cadeia leve com a sequência QQRSSSNPLT (SEQ ID NO: 35), uma CDR1 de cadeia pesada tendo a sequência GFSLTNYG (SEQ ID NO: 37), uma CDR2 de cadeia pesada com a sequência IWSGGTT (SEQ ID NO: 38) e uma sequência de CDR3 de cadeia pesada com a sequência ARNFGNYAMDY (SEQ ID NO: 39) possui preferencialmente uma afinidade de ligação para FH com um KD de 2,5 x 10-8 M ou menos e / ou uma afinidade de ligação para um fragmento de FH composto de CCP18-20 com um KD de 0,1 x 10-9 M ou menos. Preferencialmente, o referido anticorpo ou fragmento possui uma afinidade de ligação para FH com um KD de 2,25 x 10-8 M ou inferior, mais preferencialmente, 2 x 10-8 M ou inferior, mais preferivelmente, 1,75 x 10-8 M ou inferior, mais preferivelmente, de 1,5 x 10-8 M ou menos, mais preferencialmente, 1,25 x 10-8 M ou menos, mais preferencialmente, 1 x 10 -8 M ou menos, mais preferencialmente, 0,9 x 10-8 M ou menos, mais preferencialmente, 0,8 x 10-8 M ou menos, mais preferencialmente, 0,7 x 10-8 M ou menos, mais preferencialmente, 0,6 x 10-8 M ou menos, e / ou uma afinidade de ligação para um fragmento FH composto de CCP 18-20 com um KD de 0,09 x 10-9 M ou menos, mais preferencialmente, 0,08 x 10-9 M ou menos, mais preferencialment 0,07 x 10-9 M ou menos, mais preferencialmente 0,06 x 10-9 M ou menos, mais preferencialmente, 0,05 x 10-9 M ou menos, mais preferencialmente, 0,04 x 10-9 M ou menos, mais preferencialmente, 0,03 x 10-9 M ou menos, mais preferencialmente, 0,02 x 10-9 M ou menos, preferencialmente 1 x 10-11 M ou menos, mais preferencialmente, 0,9 x 10-11 M ou menos, mais preferencialmente, 0,8 x 10-11 M ou menos, mais preferencialmente 0,7 x 10-11 M ou menos, mais preferencialmente 0,6 x 10-11 M ou menos.

[00111] O referido anticorpo ou fragmento compreendendo uma sequência CDR1 da cadeia leve com a sequência SSVTY (SEQ ID NO: 33), uma sequência CDR2 da cadeia leve com a sequência ATS (SEQ ID NO: 34) e uma CDR3 da cadeia leve com a sequência QQRSSSNPLT (SEQ ID NO: 35), uma CDR1 de cadeia pesada tendo a sequência GFSLTNYG (SEQ ID NO: 37), uma CDR2 de cadeia pesada com a sequência IWSGGTT (SEQ ID NO: 38) e uma sequência de CDR3 de cadeia pesada com a sequência ARNFGNYAMDY (SEQ ID NO: 39) inibe preferencialmente a atividade hemolítica in vitro com um valor de IC50 de 150 nM ou menos. De preferência, o referido anticorpo ou fragmento inibe a atividade hemolítica in vitro com um valor de IC50 de 105 nM ou menos.

[00112] O referido anticorpo ou fragmento compreendendo uma sequência CDR1 da cadeia leve com a sequência SSVTY (SEQ ID NO: 33), uma sequência CDR2 da cadeia leve com a sequência ATS (SEQ ID NO: 34) e uma CDR3 da cadeia leve com a sequência QQRSSSNPLT (SEQ ID NO: 35), uma CDR1 de cadeia pesada tendo a sequência GFSLTNYG (SEQ ID NO: 37), uma CDR2 de cadeia pesada com a sequência IWSGGTT (SEQ ID NO: 38) e uma sequência de CDR3 de cadeia pesada com a sequência ARNFGNYAMDY (SEQ ID NO: 39) aumenta preferencialmente a afinidade de ligação (KD) de FH para G3b in vitro para no máximo 2 mM, mais preferencialmente, 1,95 mM e / ou aumenta a afinidade de ligação de FH para C3b in vitro pelo menos 3 vezes, mais preferencialmente 3,1 vezes.

[00113] Em uma outra concretização preferida, a invenção fornece um anticorpo isolado, sintético ou recombinante ou um fragmento de ligação ao antígeno, que dificulta especificamente o CCP18 de FH compreendendo uma sequência CDR1 da cadeia leve com a sequência QSLVHSNGNTY (SEQ ID NO: 49), uma CDR2 da cadeia leve sequência com a sequência KLS (SEQ ID NO: 50) e uma CDR3 de cadeia leve com a sequência SQSTHVPFT (SEQ ID NO: 51), uma CDR1 de cadeia pesada com a sequência GFSLTNYG (SEQ ID NO: 53), uma GDR2 de cadeia pesada com a sequência IWSGGNT (SEQ ID NO: 54) e uma sequência de GDR3 de cadeia pesada com a sequência AKNGDYGYTMDY (SEQ ID NO: 55). Em uma concretização, o referido anticorpo compreende uma sequência de cadeia leve variável compreendendo uma sequência que possui pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência DVVMTQTPLSLP

VSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKLSNRFSGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 52)e uma sequência variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência que possui pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGF

SLTNYGVHWVRQPPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNAAFISRLSISKDNSKSQVFFKMNSLQ ADDTAIYYCAKNGDYGYTMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 56). Em uma concretização adicional, o referido anticorpo ou fragmento compreende uma sequência de cadeia leve variável compreendendo uma sequência que possui pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 95%, mais preferencialmente pelo menos 96%, mais preferencialmente pelo menos 97%, mais preferencialmente pelo menos 98%, mais preferencialmente pelo menos 99% de identidade de sequência com a referida sequência da SEQ ID NO: 52 e uma sequência variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência que tem pelo menos 85 %%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente, pelo menos 95%, mais preferencialmente pelo menos 96%, mais preferencialmente pelo menos 97%, mais preferencialmente, pelo menos 98%, mais preferencialmente, pelo menos 99% de identidade de sequência com a referida sequência da SEQ ID NO: 56. Em uma concretização específica, o referido anticorpo ou fragmento compreende uma sequência de cadeia leve variável compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 52 e uma sequência de cadeia leve variável compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 56. O referido anticorpo ou fragmento potencialmente potencializa a atividade de FH, preferencialmente inibição de ativação alternativa do complemento, como inibição da atividade hemolítica, inibição da deposição do componente 3 (C3) do complemento e / ou um aumento da ligação da FH a C3b, iC3b e / ou C3d. O referido fragmento compreende preferencialmente pelo menos um domínio variável da cadeia pesada (VH) e / ou um domínio variável da cadeia leve (VL). Um fragmento mais preferido compreende pelo menos um fragmento Fab.

[00114] Em uma outra concretização preferida, a invenção fornece um anticorpo isolado, sintético ou recombinante ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente ao CCP18 de FH compreendendo uma sequência CDR1 da cadeia leve com a sequência SSVNY (SEQ ID NO: 65), uma CDR2 da cadeia leve sequência com a sequência YTS (SEQ ID NO: 66) e uma CDR3 de cadeia leve com a sequência de QQFTSSPLT (SEQ ID NO: 67), uma CDR1 de cadeia pesada com a sequência GFSLTSYG (SEQ ID NO: 69), uma CDR2 de cadeia pesada com a sequência IWSGGST (SEQ ID NO: 70) e uma sequência de CDR3 de cadeia pesada com a sequência ARNGGNYYFDY (SEQ II) NO: 71). Em uma concretização, o referido anticorpo compreende uma sequência de cadeia leve variável compreendendo uma sequência que possui pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência

ENVLTQSPAIMSASLGEKVTMSCRASSSVNYMYWYQQKSDASKLSWIYYTSNLAPGVPA

RFSGSGSGNSGNSGSGSGNSYSLTISSMEGEDAATYYCQQFTSSPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 68) e uma sequência variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência que possui pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência QVQLKQSGPGLVQPSQSL

SITCTVSGFSLTSYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGSTDYNAAFISRLSISKDNSKSQ VFFKMNSLQANDTAIYYCARNGGNYYFDYWG QGTTLTVSS (SEQ ID NO: 72). Em uma concretização adicional, o referido anticorpo ou fragmento compreende uma sequência de cadeia leve variável compreendendo uma sequência que possui pelo menos 85%, mais preferencialmente, pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 95%, mais preferencialmente, pelo menos 96%, mais preferencialmente pelo menos 97%, mais preferencialmente, pelo menos 98%, mais preferencialmente, pelo menos 99% de identidade de sequência com a referida sequência da SEQ ID NO: 68 e uma sequência de cadeia pesada variável compreendendo uma sequência que tem pelo menos 85 %%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 95%, mais preferencialmente pelo menos 96%, mais preferencialmente pelo menos 97%, mais preferencialmente, pelo menos 98%, mais preferencialmente, pelo menos 99% de identidade de sequência com a referida sequência da SEQ ID NO: 72. Em uma concretização específica, o referido anticorpo ou fragmento compreende uma sequência variável da cadeia leve compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 68 e uma sequência variável da cadeia leve compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 72. O referido anticorpo ou fragmento potencialmente potencializa a atividade de FH, preferencialmente inibição de ativação alternativa do complemento, como inibição da atividade hemolítica, inibição da deposição do componente 3 (C3) do complemento e / ou um aumento da ligação da FH a C3b, iC3b e / ou C3d. O referido fragmento compreende preferencialmente pelo menos um domínio variável da cadeia pesada (VH) e / ou um domínio variável da cadeia leve (VL). Um fragmento mais preferido compreende pelo menos um fragmento Fab.

[00115] Opcionalmente, a sequência de pelo menos uma das referidas CDR é otimizada, gerando, assim, um anticorpo ou fragmento variante, por exemplo, para (adicionalmente) melhorar a afinidade de ligação, seletividade, capacidade de potencialização de FH e / ou estabilidade in vivo ou de armazenamento. Em uma concretização preferida, os anticorpos ou fragmentos de acordo com a invenção têm uma alta estabilidade de armazenamento, em particular uma melhor estabilidade de armazenamento em comparação com o anticorpo

FH.07. Em uma outra concretização preferida, os anticorpos ou fragmentos de acordo com a invenção têm uma estabilidade in vivo elevada, em particular uma estabilidade in vivo melhorada em comparação com o anticorpo FH.07. Em uma outra concretização preferida, os anticorpos ou fragmentos de acordo com a invenção têm uma alta seletividade, em particular uma maior seletividade em comparação com o anticorpo FH.07.

[00116] Além disso, opcionalmente, pelo menos uma sequência em pelo menos uma das regiões estruturais de um anticorpo ou fragmento da invenção é otimizada, por exemplo, para melhorar a eficácia ou estabilidade de ligação do anticorpo ou fragmento ou reduzir os efeitos colaterais de não-humanos sequências após a sua administração a um ser humano. Isso é feito, por exemplo, por procedimentos de mutagênese. Uma pessoa perita é capaz de gerar variantes de anticorpo compreendendo pelo menos uma CDR ou sequência estrutural alterada. As sequências CDR e / ou estrutura são, por exemplo, otimizadas através da mutação de uma molécula de ácido nucleico que codifica essa sequência de estrutura. Por exemplo, a substituição conservadora de aminoácidos é aplicada. Exemplos de substituição conservadora de aminoácidos incluem a substituição de um resíduo hidrofóbico, como isoleucina, valina, leucina ou metionina por outro resíduo hidrofóbico e a substituição de um resíduo polar por outro resíduo polar, como a substituição de lisina por arginina, ácido glutâmico por ácido aspártico ou glutamina por asparagina. Para selecionar um anticorpo ou fragmento aprimorado, a afinidade de ligação, a capacidade de potencialização de FH e / ou a estabilidade dos anticorpos ou fragmentos variantes resultantes são preferencialmente testadas, por exemplo, usando o teste aqui descrito.

Uma vez que os anticorpos ou usando o teste aqui descrito.

Uma vez que os anticorpos ou usando o teste aqui descrito.

Uma vez que os anticorpos ou foram obtidos fragmentos específicos para FH, em particular para CCP18 de FH, a atividade biológica desejada, ou seja, sua capacidade de potencializar a atividade de FH, pode ser testada por vários métodos conhecidos do especialista.

Como aqui descrito anteriormente, potenciar a atividade de FH abrange preferencialmente inibição da atividade hemolítica, inibição da deposição de C3 nas células e / ou um aumento da ligação de FH a C3b.

Os ensaios funcionais para testar essas atividades são descritos aqui antes e detalhados nos Exemplos.

Tipicamente, até três resíduos de aminoácidos de uma sequência de CDR podem variar, mantendo a mesma especificidade, dependendo do número de aminoácidos dos quais a CDR é composta.

Portanto, um anticorpo ou fragmento de acordo com a invenção contém preferencialmente uma CDR1 de cadeia pesada e de cadeia leve, CDR2 e sequência CDR3, em que no máximo 3, preferencialmente no máximo 2, mais preferencialmente no máximo 1 aminoácido de cada CDR é variado em comparação com as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada e leve da Tabela 1. É ainda preferido que o anticorpo ou fragmento compreende uma CDR3 de cadeia leve e uma CDR3 de cadeia pesada do mesmo anticorpo, como representado na tabela 1, uma CDR2 de cadeia leve do referido anticorpo em que no máximo 1 aminoácido é variado e uma CDR1 de cadeia leve, CDR1 de cadeia pesada e pesada CDR2 de cadeia em que no máximo 3 aminoácidos são variados.

Mais preferencialmente, o anticorpo ou fragmento compreende uma CDR2 e CDR3 da cadeia leve e uma CDR3 da cadeia pesada do mesmo anticorpo, como representado na tabela 1, e uma CDR1 da cadeia leve, CDR1 da cadeia pesada e CDR2 da cadeia pesada, em que no máximo 2 aminoácidos, mais de preferência, no máximo 1 aminoácido, são variados, mais preferencialmente, no máximo 1 aminoácido de cada CDR é variado em comparação com as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada e leve da Tabela 1. É ainda preferido que o anticorpo ou fragmento compreenda uma CDR3 da cadeia leve e uma CDR3 da cadeia pesada de o mesmo anticorpo representado na tabela 1, uma CDR2 de cadeia leve do referido anticorpo em que no máximo 1 aminoácido é variada e uma CDR1 de cadeia leve, CDR1 de cadeia pesada e CDR2 de cadeia pesada em que no máximo 3 aminoácidos são variadas.

Mais preferencialmente, o anticorpo ou fragmento compreende uma CDR2 e CDR3 da cadeia leve e uma CDR3 da cadeia pesada do mesmo anticorpo, como representado na tabela 1, e uma CDR1 da cadeia leve, CDR1 da cadeia pesada e CDR2 da cadeia pesada, em que no máximo 2 aminoácidos, mais de preferência no máximo 1 aminoácido, são variados. mais preferencialmente no máximo 1 aminoácido de cada CDR é variado em comparação com as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada e leve da Tabela 1. É ainda preferido que o anticorpo ou fragmento compreenda uma CDR3 da cadeia leve e uma CDR3 da cadeia pesada de o mesmo anticorpo representado na tabela 1, uma CDR2 de cadeia leve do referido anticorpo em que no máximo

1 aminoácido é variada e uma CDR1 de cadeia leve, CDR1 de cadeia pesada e CDR2 de cadeia pesada em que no máximo 3 aminoácidos são variadas.

Mais preferencialmente, o anticorpo ou fragmento compreende uma CDR2 e CDR3 da cadeia leve e uma CDR3 da cadeia pesada do mesmo anticorpo, como representado na tabela 1, e uma CDR1 da cadeia leve, CDR1 da cadeia pesada e CDR2 da cadeia pesada, em que no máximo 2 aminoácidos, mais de preferência no máximo 1 aminoácido, são variados.

É ainda preferido que o anticorpo ou fragmento compreenda uma CDR3 da cadeia leve e uma CDR3 da cadeia pesada do mesmo anticorpo, como representado na tabela 1, uma CDR2 da cadeia leve do referido anticorpo em que no máximo 1 aminoácido é variado e uma CDR1 da cadeia leve, CDR1 de cadeia pesada e CDR2 de cadeia pesada em que no máximo 3 aminoácidos são variados.

Mais preferencialmente, o anticorpo ou fragmento compreende uma CDR2 e CDR3 da cadeia leve e uma CDR3 da cadeia pesada do mesmo anticorpo, como representado na tabela 1, e uma CDR1 da cadeia leve, CDR1 da cadeia pesada e CDR2 da cadeia pesada, em que no máximo 2 aminoácidos, mais de preferência no máximo 1 aminoácido, são variados.

É ainda preferido que o anticorpo ou fragmento compreenda uma CDR3 da cadeia leve e uma CDR3 da cadeia pesada do mesmo anticorpo, como representado na tabela 1, uma CDR2 da cadeia leve do referido anticorpo em que no máximo 1 aminoácido é variado e uma CDR1 da cadeia leve , CDR1 de cadeia pesada e CDR2 de cadeia pesada em que no máximo 3 aminoácidos são variados.

Mais preferencialmente, o anticorpo ou fragmento compreende uma CDR2 e CDR3 da cadeia leve e uma CDR3 da cadeia pesada do mesmo anticorpo, como representado na tabela 1, e uma CDR1 da cadeia leve, CDR1 da cadeia pesada e CDR2 da cadeia pesada, em que no máximo 2 aminoácidos, mais de preferência no máximo 1 aminoácido, são variados. CDR1 de cadeia pesada e CDR2 de cadeia pesada em que no máximo 3 aminoácidos são variados. Mais preferencialmente, o anticorpo ou fragmento compreende uma CDR2 e CDR3 da cadeia leve e uma CDR3 da cadeia pesada do mesmo anticorpo, como representado na tabela 1, e uma CDR1 da cadeia leve, CDR1 da cadeia pesada e CDR2 da cadeia pesada, em que no máximo 2 aminoácidos, mais de preferência no máximo 1 aminoácido, são variados. CDR1 de cadeia pesada e CDR2 de cadeia pesada em que no máximo 3 aminoácidos são variados. Mais preferencialmente, o anticorpo ou fragmento compreende uma CDR2 e CDR3 da cadeia leve e uma CDR3 da cadeia pesada do mesmo anticorpo, como representado na tabela 1, e uma CDR1 da cadeia leve, CDR1 da cadeia pesada e CDR2 da cadeia pesada, em que no máximo 2 aminoácidos, mais de preferência no máximo 1 aminoácido, são variados.

[00117] A invenção, portanto, fornece ainda um anticorpo isolado, sintético ou recombinante ou um fragmento do mesmo que se liga especificamente para domínio 18 da proteína de controle do complemento (CCP18) do fator H (FH) compreendendo: - uma sequência de CDR1 de cadeia leve com uma sequência que é pelo menos 80% idêntica à sequência SSVRY (SEQ ID NO: 17), uma sequência de CDR2 de cadeia leve com uma sequência ATS (SEQ ID NO: 18) e uma Sequência de CDR3 de cadeia leve que é pelo menos 80% idêntica à sequência QQWGTKPPT (SEQ ID NO: 19), uma CDR1 de cadeia pesada com uma sequência que é pelo menos 80% idêntica à sequência DFSLTNSG (SEQ ID NO: 21), uma CDR2 de cadeia pesada com uma sequência que é pelo menos 80% idêntica a sequência IWSGGTT (SEQ ID NO: 22) e uma Sequência de CDR3 de cadeia pesada com uma sequência que é pelo menos 80% idêntica à sequência ARNFGNY AVDY (SEQ ID NO: 23), - uma sequência de CDR1 de cadeia leve com uma sequência que é pelo menos 80% idêntica à sequência SSVTY (SEQ ID NO: 33), uma sequência de CDR2 de cadeia leve com uma sequência ATS (SEQ ID NO: 34) e uma Sequência de CDR3 de cadeia leve que é pelo menos 80% idêntica à sequência QQRSSSNPLT (SEQ ID NO: 35), uma GDR1 de cadeia pesada com uma sequência que é pelo menos 80% idêntica à sequência GFSLTNYG (SEQ ID NO: 37), uma CDR2 de cadeia pesada com uma sequência que é pelo menos 80% idêntica à sequência IWSGGTT (SEQ ID NO: 38) e uma sequência de CDR3 de cadeia pesada com uma sequência que é pelo menos 80% idêntica à sequência ARNFGNYAMDY (SEQ ID NO: 39), - uma sequência de CDR1 de cadeia leve com uma sequência que é pelo menos 80% idêntica à sequência QSLVHSNGNTY (SEQ ID NO: 49), uma sequência de CDR2 de cadeia leve com uma sequência KLS (SEQ ID NO: 50) e uma Sequência de CDR3 de cadeia leve que é pelo menos 80% idêntica à sequência SQSTHVPFT (SEQ ID NO: 51), uma CDR1 de cadeia pesada tendo uma sequência que é pelo menos 80% idêntica à sequência GFSLTNYG (SEQ ID NO: 53), uma CDR2 de cadeia pesada com uma sequência que é pelo menos 80% idêntica à sequência IWSGGNT (SEQ ID NO: 54) e uma sequência de CDR3 de cadeia pesada com uma sequência que é pelo menos 80% idêntica à sequência

AKNGDYGYTMDY (SEQ ID NO: 55),

[00118] - uma sequência de CDR1 de cadeia leve com uma sequência que é pelo menos 80% idêntica à sequência SSVNY (SEQ II) NO: 65), uma sequência de CDR2 de cadeia leve com uma sequência YTS (SEQ ID NO: 66) e uma CDR3 de cadeia leve tendo uma sequência que é pelo menos 80% idêntica à sequência de QQFTSSPLT (SEQ II) NO: 67), uma CDR1 de cadeia pesada com uma sequência que é pelo menos 80% idêntica à sequência GFSLTSYG (SEQ ID NO: 69), uma CDR2 de cadeia pesada com uma sequência que é pelo menos 80% idêntica para a sequência IWSGGST (SEQ ID NO: 70) e uma sequência de CDR3 de cadeia pesada com uma sequência que é pelo menos 80% idêntica à sequência ARN GGNYYFDY (SEQ ID NO: 71).

[00119] O referido anticorpo potencialmente potencializa a atividade de FH. De preferência, o referido anticorpo ou fragmento compreende sequências CDR1, CDR2 e / ou CDR3 da cadeia pesada e / ou sequências CDR1, CDR2 e / ou CDR3 da cadeia leve que são pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 86%, mais preferencialmente, pelo menos 87% , mais preferencialmente pelo menos 88%, mais preferencialmente, pelo menos 89%, mais preferencialmente, pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente, pelo menos 92%, mais preferencialmente, pelo menos 93%, mais preferencialmente pelo menos 94%, mais preferencialmente, pelo menos 95%, mais preferencialmente, pelo menos 96%, mais preferencialmente, pelo menos 97%, mais preferencialmente, pelo menos 98%, mais preferencialmente, pelo menos 99%, idêntico às sequências indicadas.

[00120] A invenção ainda fornece um anticorpo isolado, sintético ou recombinante ou um fragmento do mesmo que se liga especificamente para domínio 18 da proteína de controle do complemento (CCP18) do fator H (FH) compreendendo: - uma sequência de CDR1 de cadeia leve com uma sequência SSVRY (SEQ ID NO: 17) opcionalmente com 1 substituição de aminoácido, uma sequência de CDR2 de cadeia leve com uma sequência ATS (SEQ ID NO: 18) e uma CDR3 de cadeia leve com uma sequência QQWGTKPPT (SEQ ID NO: 19), opcionalmente, tendo 2 substituições de aminoácidos, preferencialmente, 1 substituição de aminoácidos, uma CDR1 de cadeia pesada com uma sequência DFSLTNSG (SEQ ID NO: 21), opcionalmente, tendo 2 substituições de aminoácidos, preferencialmente, 1 substituição de aminoácidos, uma CDR2 de cadeia pesada tendo uma sequência IWSGGTT (SEQ ID NO: 22), opcionalmente, tendo 2 substituições de aminoácidos, preferencialmente, 1 substituição de aminoácidos, e uma sequência CDR3 de cadeia pesada ARNFGNYAVDY (SEQ ID NO: 23), opcionalmente, tendo 2 substituições de aminoácidos, preferencialmente, 1 substituição de aminoácidos, - uma sequência CDR1 de cadeia leve com uma sequência SSVTY (SEQ ID NO:33) tendo, opcionalmente, 1 substituição de aminoácidos, uma sequência CDR2 de cadeia leve com uma sequência ATS (SEQ ID NO: 34) e uma CDR3 de cadeia leve com uma sequência QQRSSSNPLT (SEQ ID NO: 35) tendo, opcionalmente, 2 substituições de aminoácidos, de preferência, 1 substituição de aminoácidos, uma CDR1 de cadeia pesada com uma sequência GFSLTNYG (SEQ ID NO: 37), opcionalmente, tendo 2 substituições de aminoácidos,

preferencialmente, 1 substituição de aminoácidos, uma CDR2 de cadeia pesada com uma sequência IWSGGTT (SEQ ID NO: 38) tendo, opcionalmente, 2 substituições de aminoácidos, preferencialmente, 1 substituição de aminoácidos e uma sequência de CDR3 de cadeia pesada ARNFGNYAMDY (SEQ ID NO: 39) tendo, opcionalmente, 2 substituições de aminoácidos, preferencialmente, 1 substituição de aminoácidos,

[00121] - uma sequência de CDR1 de cadeia leve com uma sequência QSLVHSNGNTY (SEQ ID NO: 49) opcionalmente com 2 substituições de aminoácidos, preferencialmente 1 substituição de aminoácidos, uma sequência de CDR2 de cadeia leve KLS (SEQ ID NO: 50) e uma CDR3 de cadeia leve com uma sequência SQSTHVPFT (SEQ ID NO: 51) opcionalmente tendo 2 substituições de aminoácidos, preferencialmente 1 substituição de aminoácidos, uma CDR1 de cadeia pesada com uma sequência GFSLTNYG (SEQ ID NO: 53) opcionalmente tendo 2 substituições de aminoácidos, preferencialmente 1 substituição de aminoácidos, um CDR2 de cadeia pesada com uma sequência IWSGGNT (SEQ ID NO: 54), opcionalmente, tendo 2 substituições de aminoácidos, preferencialmente, 1 substituição de aminoácidos, e uma sequência de CDR3 de cadeia pesada AKNGDYGYTMDY (SEQ ID NO: 55), opcionalmente, tendo 2 substituições de aminoácidos, preferencialmente, 1 substituição de aminoácidos,

[00122] - uma sequência de CDR1 de cadeia leve com uma sequência SSVNY (SEQ ID NO: 65), opcionalmente com 1 substituição de aminoácido, uma sequência de CDR2 de cadeia leve com uma sequência YTS (SEQ ID NO: 66) e uma CDR3 de cadeia leve com uma sequência QQFTSSPLT (SEQ ID NO: 67)

opcionalmente tendo 2 substituições de aminoácidos, preferencialmente 1 substituição de aminoácidos, uma CDR1 de cadeia pesada com uma sequência GFSLTSYG (SEQ ID NO: 69) opcionalmente tendo 2 substituições de aminoácidos, preferencialmente 1 substituição de aminoácidos, uma cadeia pesada CDR2 tendo uma sequência IWSGGST (SEQ ID NO: 70) opcionalmente tendo 2 substituições de aminoácidos, preferencialmente 1 substituição de aminoácidos, e uma sequência CDR3 de cadeia pesada tendo uma sequência ARNGGNYYFDY (SEQ II) NO: 71 tendo opcionalmente 2 substituições de aminoácidos, de preferência 1 substituição de aminoácidos.

[00123] Os anticorpos ou seus fragmentos, de acordo com a invenção, são preferencialmente anticorpos ou fragmentos monoclonais. Um anticorpo monoclonal é um anticorpo que consiste substancialmente em uma única espécie molecular. Os anticorpos monoclonais são obtidos de uma população de anticorpos homogêneos, com a mesma sequência e ligando o mesmo epítopo, com exceção de possíveis anticorpos variantes ou fragmentos que apresentam uma ou mais mutações que ocorreram espontaneamente, por exemplo, durante a produção. Os anticorpos monoclonais podem ser produzidos de forma vantajosa de forma recombinante, para que possam ser obtidas quantidades do anticorpo significativamente maiores que as dos anticorpos policlonais presentes em um anti- soro. No entanto, os anticorpos e fragmentos policlonais também são abrangidos pela invenção. Um anticorpo ou fragmento, de acordo com a presente invenção, é ainda, preferencialmente, um anticorpo quimérico ou humanizado. O referido anticorpo ou fragmento compreende, assim, preferencialmente, pelo menos regiões constantes da cadeia leve humana e da cadeia pesada. Mais preferencialmente, o referido anticorpo ou fragmento também compreende regiões estruturais humanas nas regiões variáveis das cadeias pesada e leve. Ainda mais preferidos são os anticorpos ou fragmentos humanos, que consistem inteiramente em sequências humanas.

[00124] O uso de anticorpos quiméricos, humanizados ou humanos é preferível à utilização de anticorpos não humanos, porque a utilização de anticorpos ou fragmentos não humanos para o tratamento de doenças humanas é dificultada por vários fatores. O corpo humano pode reconhecer anticorpos não humanos como estranhos, o que resultará em uma resposta imune contra os anticorpos ou fragmentos não humanos, resultando em efeitos colaterais adversos e / ou remoção rápida dos anticorpos ou fragmentos da circulação. A chance de efeitos colaterais é reduzida quando anticorpos quiméricos, humanizados ou humanos são administrados a seres humanos. Além disso, geralmente é alcançada uma meia-vida mais longa na circulação quando são utilizados anticorpos quiméricos, humanizados ou humanos devido à depuração reduzida quando comparados aos anticorpos não humanos.

[00125] Preferencialmente, as sequências da linhagem germinativa humana são utilizadas para regiões estruturais em anticorpos ou fragmentos, de acordo com a invenção. O uso de sequências de linhagem germinativa humana minimiza o risco de imunogenicidade dos referidos anticorpos ou fragmentos, porque é menos provável que essas sequências contenham alterações somáticas exclusivas dos indivíduos dos quais as regiões estruturais são derivadas e podem causar uma resposta imunogênica quando aplicadas a outra indivíduo humano.

[00126] Os procedimentos para humanização de anticorpos ou para fornecer anticorpos quiméricos são bem conhecidos na técnica. Várias abordagens baseadas em DNA recombinante foram estabelecidas com o objetivo de aumentar o conteúdo de resíduos de aminoácidos em anticorpos que também ocorrem na mesma posição semelhante em anticorpos humanos, mantendo a especificidade e afinidade do anticorpo não humano parental. Por exemplo, as regiões estruturais das regiões variáveis dos anticorpos de camundongo são substituídas pelas regiões estruturais humanas correspondentes com o mais alto grau de homologia, deixando intacta a CDR não humana. Outros métodos adequados para humanizar anticorpos de acordo com a invenção incluem, mas não estão limitados a, enxerto de CDRs (Queen, C et al. 1989; Carter, P et al. 1992); resurfacing (Padlan, EA, et al. 1991), super-humanização (Tan, PDA, et.al. 2002), otimização de conteúdo de cadeia humana (Lazar, G.A. et. al. 2007) e humanização (Almagro, JC, et. al. 2008).

[00127] Em uma concretização, um anticorpo ou fragmento de acordo com a invenção é um anticorpo multiespecífico, tal como um anticorpo biespecífico. Anticorpos multiespecíficos são anticorpos monoclonais que têm especificidades de ligação para pelo menos dois antígenos e / ou epítopos diferentes. Em uma concretização, um anticorpo biespecífico tem especificidade de ligação a FH, preferencialmente compreendendo uma cadeia leve variável e em uma cadeia pesada variável que se liga especificamente a CCP18 de FH, como descrito aqui, e tem especificidade de ligação para outro antígeno. Em outras concretizações, os anticorpos biespecíficos podem se ligar a dois epítopos diferentes de FH.

[00128] Um anticorpo ou fragmento, de acordo com a invenção, pode ser de qualquer classe. A "classe" de um anticorpo se refere ao tipo de domínio constante ou região constante possuída por sua cadeia pesada. Existem cinco classes principais de anticorpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, algumas das quais podem ser divididas em subclasses ou isotipos, como IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4. Em uma concretização preferida, um anticorpo ou fragmento de acordo com a invenção é da classe IgG, preferencialmente IgGl ou IgG3.

[00129] Anticorpos específicos para um antígeno particular, como FH de acordo com a presente invenção, podem ser preparados por vários métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, a FH humana pode ser usada como imunógeno para obter anticorpos. Como outro exemplo, o domínio CCP18 da FH humana de uma proteína relacionada à FH pode ser usado como um imunogênio. Um exemplo de tal método é por imunização e geração de hibridoma como descrito nos Exemplos. Anticorpos monoclonais de camundongo para FH podem, por exemplo, ser gerados pela imunização de camundongos, por exemplo, camundongos BALB / c, intraperitonealmente com fator H humano ou a uma proteína relacionada à FH, como FHR-1, opcionalmente na presença de um adjuvante, como a montanida, por exemplo, em intervalos de quatro semanas. Vários dias após a quarta imunização, as células do baço podem ser fundidas, por exemplo, com a linhagem celular SP2/0 do mieloma. A presença de anticorpos específicos do fator H nos sobrenadantes dos hibridomas pode ser testada por ELISA.

Por exemplo, as placas de microtitulação são revestidas com um moAb (por exemplo, kappa moAb RM19 anti-camundongo de rato) para capturar anticorpos IgG de rato.

A especificidade dos anticorpos foi determinada pelo fator H biotinilado.

Outro exemplo de um método para fornecer anticorpos específicos para FH é o rastreamento de bibliotecas de exibição de fagos que expressam sequências de ácidos nucleicos recombinantes que codificam cadeias de imunoglobulina.

Os métodos para a exibição de fagos de anticorpos foram utilizados na técnica e descritos extensivamente.

O rastreamento da biblioteca de anticorpos pode ser realizado com o mesmo antígeno usado para A especificidade dos anticorpos foi determinada pelo fator H biotinilado.

Outro exemplo de um método para fornecer anticorpos específicos para FH é o rastreamento de bibliotecas de exibição de fagos que expressam sequências de ácidos nucleicos recombinantes que codificam cadeias de imunoglobulina.

Os métodos para a exibição de fagos de anticorpos foram utilizados na técnica e descritos extensivamente.

O rastreamento da biblioteca de anticorpos pode ser realizado com o mesmo antígeno usado para A especificidade dos anticorpos foi determinada pelo fator H biotinilado.

Outro exemplo de um método para fornecer anticorpos específicos para FH é o rastreamento de bibliotecas de exibição de fagos que expressam sequências de ácidos nucleicos recombinantes que codificam cadeias de imunoglobulina.

Os métodos para a exibição de fagos de anticorpos foram utilizados no estado da técnica e descritos extensivamente. O rastreamento da biblioteca de anticorpos pode ser realizado com o mesmo antígeno usado para imunização, por exemplo, FH humana, uma proteína relacionada à FH ou o domínio CCP18 da FH humana.

[00130] A invenção fornece ainda uma molécula de ácido nucleico isolada, sintética ou recombinante compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um anticorpo ou seu fragmento de acordo com a invenção. As moléculas de ácido nucleico preferidas codificam pelo menos a CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada e / ou a CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve do anticorpo FHR-1.8E4, conforme representado na Tabela 1. As moléculas de ácido nucleico preferidas adicionais codificam pelo menos a CDR1 da cadeia pesada, CDR2 e CDR3 e / ou CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve do anticorpo FHR-1.3B4, como mostrado na Tabela 1. Outras moléculas de ácido nucleico preferidas codificam pelo menos as CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada e / ou a CDR1 da cadeia leve, CDR2 e CDR3 do anticorpo FHR-1.11E1, como mostrado na Tabela 1. Outras moléculas de ácido nucleico preferidas codificam pelo menos as CDRl, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada e / ou CDR1 da cadeia leve, CDR2 e CDR3 do anticorpo FHR-1.12F4 como representado na Tabela 1. Preferencialmente, uma molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção tem um comprimento de pelo menos 30 nucleotídeos, mais preferencialmente pelo menos 50 nucleotídeos, mais preferencialmente pelo menos 75 nucleotídeos. De preferência, uma molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção codifica um anticorpo monoclonal quimérico ou humanizado ou fragmento do mesmo, compreendendo as sequências CDR da cadeia pesada e sequências CDR da cadeia leve e / ou a região variável da cadeia pesada e a região variável da cadeia pesada e a região variável da cadeia leve do anticorpo FHR-1.8 E4, como mostrado na Tabela 1.

[00131] É fornecida, portanto, uma molécula de ácido nucleico isolada, sintética ou recombinante compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica pelo menos as sequências das SEQ ID NOs: 17, 18, 19, 21, 22 e 23. Além disso, é fornecida uma molécula de ácido nucleico isolada, sintética ou recombinante compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica pelo menos as sequências das SEQ ID NOs: 33, 34, 35, 37, 38 e 39. Além disso, é fornecida uma molécula de ácido nucleico isolada, sintética ou recombinante compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica pelo menos as sequências de SEQ ID NOs: 49, 50, 51, 53, 54 e 55. Além disso, é fornecida uma molécula de ácido nucleico isolada, sintética ou recombinante compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica pelo menos as sequências das SEQ ID NOs: 65, 66, 67, 69, 70 e 71. Além disso, é fornecida uma molécula de ácido nucleico sintético ou recombinante compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica pelo menos as sequências das SEQ ID NOs: 20 e 24. Além disso, é fornecida uma molécula de ácido nucleico isolada, sintética ou recombinante compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica pelo menos as sequências das SEQ ID NOs: 36 e 40. É ainda fornecida uma molécula de ácido nucleico isolada, sintética ou recombinante compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica pelo menos as sequências das SEQ ID NOs: 52 e 56.molécula de ácido nucleico sintético ou recombinante compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica pelo menos as sequências das SEQ ID NOs: 52 e

56.molécula de ácido nucleico sintético ou recombinante compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica pelo menos as sequências das SEQ ID NOs: 52 e 56. É fornecida ainda uma molécula de ácido nucleico isolada, sintética ou recombinante compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica pelo menos as sequências das SEQ ID NOs: 68 e

72. Moléculas de ácido nucleico que codificam uma CDR de cadeia pesada e / ou leve ou um anticorpo que é modificado por exemplo por substituição de aminoácidos conservadora, também são abrangidos pela invenção.

[00132] Uma molécula de ácido nucleico ou sequência de ácido nucleico de acordo com a invenção compreende preferencialmente uma cadeia de nucleotídeos, mais preferencialmente DNA e / ou RNA. No entanto, uma molécula de ácido nucleico ou sequência de ácido nucleico da invenção pode compreender outros tipos de estruturas de ácido nucleico, como, por exemplo, uma hélice de DNA / RNA, ácido nucleico peptídico (PNA), ácido nucleico bloqueado (LNA) e / ou uma ribozima. Tais outras estruturas de ácidos nucleicos são referidas como equivalentes funcionais de uma sequência de ácidos nucleicos e são abrangidas pela invenção. O termo "equivalente funcional de uma sequência de ácido nucleico" também abrange uma cadeia compreendendo nucleotídeos não naturais, nucleotídeos modificados e / ou blocos de construção não nucleotídicas que exibem a mesma função que os nucleotídeos naturais.

[00133] A invenção fornece ainda um vetor compreendendo uma molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção. Um vetor preferido é um plasmídeo. Um plasmídeo é aqui definido como uma molécula de DNA circular, de preferência de fita dupla. Os métodos para preparar um vetor compreendendo uma molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção são bem conhecidos na técnica. Exemplos não limitativos de vetores adequados para gerar um vetor da invenção são vetores retrovirais e lentivirais. Um vetor de acordo com a invenção pode ser usado para uma variedade de aplicações. Um vector de acordo com a invenção é preferencialmente utilizado para expressão in vitro de uma molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção em uma célula, preferencialmente para a geração de anticorpos ou fragmentos de acordo com a invenção. Mais distante, um vetor de acordo com a invenção compreendendo uma molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção pode ser utilizado para terapêutica. A administração desse vetor a um indivíduo, preferencialmente um humano, com necessidade do mesmo resulta na expressão in vivo de um anticorpo ou fragmento, de acordo com a invenção.

[00134] É ainda fornecida uma célula recombinante compreendendo uma molécula ou vetor de ácido nucleico de acordo com a invenção. Tal molécula de ácido nucleico ou vector é de preferência introduzido na referida célula, de modo a que a maquinaria de tradução da célula ácido nucleico irá produzir os anticorpos ou fragmentos codificados. Uma molécula de ácido nucleico ou vetor, de acordo com a invenção, é, preferencialmente, expressa nas chamadas células produtoras, como, por exemplo, células de um ovário de hamster chinês (CHO), NSO (mieloma de camundongo) ou linhagem de células 293 (T), algumas das quais estão adaptadas a produção comercial de anticorpos. A proliferação dessas células produtoras resulta em uma linhagem celular produtora capaz de produzir anticorpos ou fragmentos de acordo com a invenção.

[00135] Preferencialmente, a referida linhagem celular produtora é adequada para a produção de anticorpos para uso em humanos. Por conseguinte, a referida linha celular produtora é preferencialmente livre de agentes patogênicos, como microrganismos patogênicos.

[00136] A invenção fornece ainda um método para a produção de um anticorpo ou fragmento de acordo com a invenção, compreendendo fornecer uma célula com uma molécula de ácido nucleico ou um vetor de acordo com a invenção, e permitindo que a referida célula traduza a sequência de ácido nucleico compreendida pela referida molécula de ácido nucleico ou vector, produzindo desse modo o referido anticorpo ou fragmento de acordo com a invenção. Um método de acordo com a invenção preferencialmente compreende ainda a colheita, purificação e / ou isolamento do referido anticorpo ou fragmento. Anticorpos ou fragmentos obtidos com um método para produzir um anticorpo ou fragmento de acordo com a invenção também são fornecidos.

[00137] Um anticorpo ou fragmento, de acordo com a invenção, pode ser vantajosamente usado em aplicações terapêuticas. Fornecido é, portanto, uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo ou fragmento de acordo com a invenção e um veículo, diluente e / ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

Também são fornecidas composições farmacêuticas compreendendo uma molécula ou vetor de ácido nucleico de acordo com a invenção e pelo menos um veículo, diluente e / ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

Exemplos não limitativos de transportadores adequados são, por exemplo, hemocianina de lapa de buraco de fechadura (KLH), albumina sérica (por exemplo, BSA ou RSA) e ovalbumina.

Um veículo preferido é uma solução, tal como uma solução aquosa, por exemplo solução salina ou uma solução à base de óleo.

Exemplos não limitativos de excipientes que podem ser incorporados em comprimidos, cápsulas e similares são um aglutinante, como goma tragacanta, acácia, amido de milho ou gelatina, um excipiente como a celulose microcristalina, um agente desintegrante, como amido de milho, amido pré-gelatinizado e ácido algínico, um lubrificante como estearato de magnésio, um adoçante como sacarose, lactose ou sacarina e um agente aromatizante, como hortelã-pimenta, óleo de verde de inverno ou cereja.

Quando a forma unitária de dosagem é uma cápsula, ela contém de preferência, além de um ou mais dos excipientes indicados acima, um veículo líquido como o óleo graxo.

Vários outros materiais podem estar presentes como revestimentos ou para modificar a forma física da unidade de dosagem.

Por exemplo, os comprimidos podem ser revestidos com goma-laca e / ou açúcar ou ambos.

Uma composição farmacêutica de acordo com a invenção é preferencialmente adequada para uso humano. e um agente aromatizante, como hortelã-pimenta, óleo de verdura ou cereja.

Quando a forma unitária de dosagem é uma cápsula, ela contém de preferência, além de um ou mais dos excipientes indicados acima, um veículo líquido como o óleo graxo. Vários outros materiais podem estar presentes como revestimentos ou para modificar a forma física da unidade de dosagem. Por exemplo, os comprimidos podem ser revestidos com goma-laca e / ou açúcar ou ambos. Uma composição farmacêutica de acordo com a invenção é preferencialmente adequada para uso humano. e um agente aromatizante, como hortelã-pimenta, óleo de verdura ou cereja. Quando a forma unitária de dosagem é uma cápsula, ela contém de preferência, além de um ou mais dos excipientes indicados acima, um veículo líquido como o óleo graxo. Vários outros materiais podem estar presentes como revestimentos ou para modificar a forma física da unidade de dosagem. Por exemplo, os comprimidos podem ser revestidos com goma-laca e / ou açúcar ou ambos. Uma composição farmacêutica, de acordo com a invenção é preferencialmente adequada para uso humano. Os comprimidos podem ser revestidos com goma-laca e / ou açúcar ou ambos. Uma composição farmacêutica de acordo com a invenção é preferencialmente adequada para uso humano. Os comprimidos podem ser revestidos com goma-laca e / ou açúcar ou ambos. Uma composição farmacêutica de acordo com a invenção é preferencialmente adequada para uso humano.

[00138] As composições farmacêuticas aqui descritas podem ser administradas de várias maneiras diferentes. Os exemplos incluem a administração de uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo de acordo com a invenção e contendo um transportador farmaceuticamente aceitável via via oral, intranasal, retal, tópica, intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, subcutânea,

subdérmica, métodos transdérmicos, intratecais e intracranianos. Para administração oral, o ingrediente ativo pode ser administrado em formas de dosagem sólidas, como cápsulas, comprimidos e pós, ou em formas de dosagem líquidas, como elixires, xaropes e suspensões. As composições estéreis para injeção podem ser formuladas de acordo com a prática farmacêutica convencional dissolvendo ou suspendendo o anticorpo ou fragmento da invenção em um veículo para injeção, como água ou um óleo que ocorre naturalmente como óleo de gergelim, óleo de coco, óleo de amendoim, óleo de semente de algodão, etc., ou um veículo gordo sintético como o oleato de etilo. Tampões, conservantes e / ou antioxidantes também podem ser incorporados.

[00139] A invenção fornece ainda um anticorpo ou fragmento de acordo com a invenção para uso em terapia. É ainda fornecida uma molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção para uso em terapia. A referida terapia pode ser terapêutica ou profilático. Os anticorpos ou fragmentos de acordo com a invenção são particularmente adequados para o tratamento, alívio ou prevenção de um distúrbio associado à ativação alternativa do complemento da via. É fornecido, portanto, um anticorpo ou fragmento de acordo com a invenção para uso no tratamento, alívio ou prevenção de um distúrbio associado à ativação alternativa do complemento da via. Também é fornecida uma molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção para uso no tratamento, alívio ou prevenção de um distúrbio associado à ativação alternativa do complemento da via. Como aqui utilizado, "um distúrbio associado à ativação alternativa do complemento" é aqui definido como um distúrbio no qual a ativação indesejada e / ou excessiva do complemento da via alternativa leva a danos celulares, teciduais ou da matriz extracelular.

Células que podem ser danificadas por ativação indesejada e / ou excessiva da via alternativa são as células que estão em contato com o sangue, por exemplo, glóbulos vermelhos, células epiteliais, em particular células epiteliais hepáticas e / ou renais, plaquetas, glóbulos brancos, células endoteliais. células.

O referido distúrbio é de preferência um distúrbio associado à função ou deficiência de HF prejudicada.

Mais preferencialmente, o referido distúrbio é um distúrbio associado ao comprometimento da função ou deficiência de HF, mas não à ausência de HF.

Uma vez que os anticorpos e fragmentos da invenção potencializam a função da FH, os anticorpos e o fragmento são particularmente adequados para bloquear ou reduzir os efeitos da função ou da deficiência de FH prejudicada.

Contudo, os potenciadores de anticorpos anti-FH da invenção também podem inibir a lise de glóbulos vermelhos que são incubados com soro de indivíduos saudáveis nos quais o FH é artificialmente bloqueado.

Portanto, anticorpos e fragmentos também podem ser usados para bloquear ou reduzir a ativação do complemento de via alternativa indesejada e / ou excessiva causada por outros fatores que não a função de HF prejudicada ou a deficiência de HF.

Exemplos não limitativos de tais ordens que podem ser tratadas são: síndrome hemolítica urêmica atípica (aHUS), hemoglobinúria paroxística noturna (PNH), degeneração macular relacionada à idade (DMRI),

glomerulonefrite membranoproliferativa (MPGN).

[00140] A síndrome hemolítica urêmica atípica (SHUa), também chamada de SHU mediada pelo complemento, é caracterizada por anemia hemolítica, trombocitopenia, microangiopatia trombótica sistêmica (TMA) e insuficiência renal. O início do aHUS ocorre tipicamente na infância e os episódios da doença estão associados a, por exemplo, infecção, gravidez, outra doença, cirurgia ou trauma. Mais de 60% dos pacientes com SHUS morrem ou desenvolvem doença renal terminal (DRT), apesar da troca ou suplementação plasmática. Várias mutações nos componentes ou fatores do sistema complemento foram identificadas em pacientes com SHUa. Mutações no FH, FI FB, proteína de cofator de membrana (MOP), trombomodulina (THBD) ou C3 compreendem cerca de 50% das mutações conhecidas em pacientes com SHUU, cujas mutações do HF são as mais frequentes (cerca de 20 a 30% dos pacientes com SHU). A maioria dos pacientes é heterozigótica para as mutações, o que resulta em deficiência patológica de HF. Além disso, em cerca de 10% dos pacientes, o SHUU é causado por autoanticorpos contra a SF, resultando também em redução da SF funcional.

[00141] Atualmente, o tratamento padrão para a aHUS é a suplementação plasmática ou terapia de troca plasmática. Além disso, o eculizumab é usado no tratamento de pacientes com SHUU. O transplante renal está associado a um alto risco de recorrência, dependente da mutação subjacente ao aHUS. O transplante é contra-indicado em crianças com mutações na HF, CE, FI, C3 ou THBD devido ao aumento do risco de recorrência. Anticorpos ou fragmentos,

preferencialmente compreendendo pelo menos o fragmento Fab, de acordo com a invenção, são particularmente adequados para o tratamento, alívio ou prevenção de aHUS causada por uma mutação no FH ou pela presença de anticorpos auto anti-FH. O efeito potenciador do FH é independente no domínio CCP do FH portador de uma mutação. Por exemplo, CCP19 e CCP20 de FH. No entanto, uma vez que os anticorpos e fragmentos da invenção também podem potencializar a atividade da FH na ausência de função ou deficiência de FH prejudicada, qualquer forma de aHUS dependente de complemento pode ser vantajosamente tratada, aliviada ou impedida com os anticorpos ou fragmentos da invenção.

[00142] A hemoglobinúria paroxística noturna (HPN) é causada por uma mutação genética no cromossomo X de uma célula-tronco hematopoiética totipotente. A mutação leva a uma deficiência na proteína fosfatidilinositol glicano classe A, que é crítica para a síntese de proteínas de ancoragem à membrana de glicosilfofatidilinositol (GPI- AP). O inibidor do sistema complemento CD55 é um exemplo dessa proteína, que se liga a C3b na superfície da célula hospedeira, impedindo assim a formação de C3 convertase. Portanto, uma deficiência dessas proteínas resulta na ativação indesejada ou excessiva do complemento. Uma das principais consequências da HPN é que os glóbulos vermelhos sofrem lise como resultado da atividade excessiva do sistema complemento. Recentemente, o eculizumab foi aprovado para o tratamento da HPN em vários países. Outras terapias incluem transfusão de sangue, terapia com agentes estimuladores de eritrócitos,

tratamento com corticosteróides e esteróides anabolizantes. Uma vez que os anticorpos e fragmentos da invenção também podem potencializar a atividade da FH independente dos níveis de função da FH ou FH, inibindo assim a ativação da via alternativa do sistema complemento, os anticorpos e o fragmento podem ser utilizados com vantagem em pacientes com HPN. Além disso, porque os anticorpos e fragmentos da invenção atuam no nível da deposição de C3, em oposição ao eculizumab que atua mais a jusante das vias de ativação, a depleção de células no fígado é reduzida porque menos células são opsonizadas por C3b.

[00143] A degeneração macular relacionada à idade (DMRI) é um dano à retina que afeta geralmente indivíduos mais velhos, resultando em perda de visão na mácula, o centro do campo visual. Mutações e SNPs (polimorfismos de nucleotídeo único) na HF foram recentemente implicados em cerca de 35% dos pacientes com DMRI. O SNP está localizado no CCP7 de FH e foi demonstrado que influencia a ligação do FH à heparina, comprometendo assim a capacidade do FH de impedir a superfície da célula hospedeira, bem como a matriz extracelular. Anticorpos ou fragmentos, preferencialmente compreendendo pelo menos o fragmento Fab, de acordo com a invenção, são particularmente adequados para o tratamento, alívio ou prevenção de AMD caracterizados por função diminuída de FH, preferencialmente por um SNP no gene que codifica FH.

[00144] A glomerulonefrite membranoproliferativa (MPGN) é uma causa incomum de nefrite crônica que ocorre principalmente em crianças e adultos jovens. Causa lesão glomerular como resultado da proliferação de células mesangiais e endoteliais e expansão da matriz mesangial, espessamento das paredes capilares periféricas por depósitos imunes subendoteliais e / ou depósitos densos intramembranosos e interposição mesangial na parede capilar. A MPGN é frequentemente associada a uma ausência total de HF. A MPGN que pode ser tratada com anticorpos e / ou fragmentos das invenções está preferencialmente associada a função de FH prejudicada ou deficiência de FH, mas não com ausência de FH.

[00145] A invenção fornece, assim, um anticorpo ou fragmento ou molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção para uso no tratamento, alívio ou prevenção de um distúrbio associado à ativação do complemento da via alternativa, em que o referido distúrbio é selecionado do grupo que consiste na síndrome urêmica hemolítica atípica ( aHUS), hemoglobinúria paroxística noturna (HPN), degeneração macular relacionada à idade (DMRI), glomerulonefrite membranoproliferativa (MPGN). Também é fornecida a utilização de um anticorpo ou fragmento, uma molécula de ácido nucleico ou um vetor de acordo com a invenção para a preparação de um medicamento para o tratamento, alívio ou prevenção de um distúrbio associado à ativação alternativa do complemento da via. O referido distúrbio é preferencialmente selecionado do grupo que consiste na síndrome urêmica hemolítica atípica (aHUS), hemoglobinúria paroxística noturna (HPN), degeneração macular relacionada à idade (DMRI), glomerulonefrite membranoproliferativa (MPGN).

[00146] Anticorpos preferidos para uso como medicamento ou agente profilático de acordo com a invenção são anticorpos ou seus fragmentos, de preferência o fragmento Fab, Fab' ou F(ab)2 ou F(ab')2, que compreendem as cadeias pesada e leve CDR1, CDR2 e CDR3 do anticorpo como representado na Tabela 1. O referido anticorpo ou fragmento é, preferencialmente, um anticorpo ou fragmento monoclonal humanizado ou quimérico.

[00147] A invenção fornece ainda um método para inibir a ativação alternativa do complemento, compreendendo administrar a um indivíduo um anticorpo ou fragmento de acordo com a invenção, ou uma molécula de ácido nucleico ou um vetor de acordo com a invenção.

[00148] A invenção fornece ainda um método para o tratamento, alívio ou prevenção de um distúrbio associado à ativação do complemento de via alternativa compreendendo a administração a um indivíduo em necessidade do mesmo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo ou fragmento de acordo com a invenção. Também é fornecido um método para o tratamento, alívio ou prevenção de um distúrbio associado à ativação do complemento de via alternativa compreendendo a administração a um indivíduo em necessidade do mesmo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma molécula ou vetor de ácido nucleico de acordo com a invenção. Além disso, é fornecido um método para o tratamento, aliviar ou prevenir um distúrbio associado à ativação do complemento de via alternativa compreendendo administrar a um indivíduo em necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica, de acordo com a invenção. O referido distúrbio é, preferencialmente, selecionado do grupo que consiste em síndrome hemolítica urêmica atípica (aHUS), hemoglobinúria paroxística noturna (PNH), degeneração macular relacionada à idade (DMRI), glomerulonefrite membranaoproliferativa (MPGN). Como usado aqui, um "indivíduo" é um humano ou um animal que possui um sistema de complemento como parte de seu sistema imunológico, de preferência um mamífero. Em uma concretização particularmente preferida, o indivíduo é um humano.

[00149] Anticorpos preferidos para uso nos métodos da invenção são anticorpos ou seus fragmentos, de preferência o fragmento Fab, Fab', F(ab)2 ou F(ab')2, que compreendem as cadeias pesada e leve CDR1, CDR2 e CDR3 de anticorpo FHR-

1.8E4, que compreende as cadeias pesada e leve CDR1, CDR2 e CDR3 do anticorpo FHR-1.3B4, que compreende as cadeias pesada e leve CDR1, CDR2 e CDR3 do anticorpo FHR-1.11E1 ou que compreende as cadeias pesada e leve CDR1, CDR2 e CDR3 do anticorpo FHR-1.12F4 como representado na Tabela 1. O referido anticorpo ou fragmento é preferencialmente um anticorpo ou fragmento humanizado ou quimérico monoclonal.

[00150] As composições contendo os anticorpos, fragmentos, moléculas de ácido nucleico da invenção podem ser administradas para tratamentos profiláticos e / ou terapêuticos. Em aplicações terapêuticas, anticorpos, fragmentos, moléculas de ácido nucleico ou composições de acordo com a invenção são administrados a um indivíduo, preferencialmente um humano, já sofrendo de uma doença e / ou já apresentando sintomas da doença em uma quantidade suficiente para neutralizar os sintomas da doença e / ou suas complicações. Em aplicações profiláticas, anticorpos, fragmentos, moléculas de ácido nucleico ou composições de acordo com a invenção são administrados a um indivíduo, antes que o indivíduo mostre sintomas do distúrbio para impedir o desenvolvimento desses sintomas ou de suas complicações. Por exemplo, indivíduos que carregam uma mutação genética que pode ou irá causar um distúrbio associado à ativação alternativa do complemento podem ser tratados profilaticamente com anticorpos, fragmentos, moléculas de ácido nucleico ou composições de acordo com a invenção. Os anticorpos, fragmentos ou moléculas de ácido nucleico estão tipicamente presentes em uma composição farmacêutica de acordo com a invenção em uma quantidade terapeuticamente eficaz, que é uma quantidade suficiente para remediar o distúrbio associado à ativação indesejada ou excessiva da via alternativa do sistema de complemento.

[00151] As características podem ser descritas aqui como parte dos mesmos aspectos ou concretizações ou concretizações separadas da presente invenção com o objetivo de clareza e uma descrição concisa. Será apreciado pelo especialista que o escopo da invenção pode incluir concretizações com combinações de todas ou algumas das características descritas neste documento como parte da mesma ou de concretizações separadas.

[00152] A invenção será explicada em mais detalhes nos seguintes exemplos não limitativos.

[00153] Tabela 1. Sequências de aminoácidos e nucleotídeos dos anticorpos FH.07, FHR-1.8E3, FHR-1.3B4,

FHR-1.11E1, FHR-1.12F4 e FHR-1.14C4. (Em umeração CDR de acordo com o sistema de em umeração IMGT (Lefranc 1997, Le franc 1999 e Le franc et al. 2003). LC = cadeia leve, HC = cadeia pesada, CDR = regiões determinantes complementares, VI I = região variável da cadeia pesada, VL = região variável da cadeia leve. Anticorpo Tipo Identidade Sequência SEQ ID NO FH.07 aminoácido LC CDR1 SSVKY 1 FH.07 aminoácido LC CDR2 ATS 2 FH.07 aminoácido LC CDR3 QQWSIIPPT 3 FH.07 aminoácido VL QIVLSQSPTFLSASPGEKVTVTC 4

RASSSVKYMHWYQQKPGASPKPW IFATSNLASGVPARFSGSGSGTS YSLTISRVEAEDAATYYCQQWSI

IPPTFGNGTKLELK FH.07 aminoácido HC CDR1 DFSLARYG 5 FH.07 aminoácido HC CDR2 IWSGGTA 6 FH.07 aminoácido HC CDR3 ARNFGNYAVDY 7 FH.07 aminoácido VH QVQLQQSGPGLVQPSQSLSITCT 8

VSDFSLARYGVHWIRQSPGKGLE WLGVIWSGGTADYNAAFISRLNI NKDNSKSQVFFKMNSLQANDTAI

YYCARNFGNYAVDYWGQGTS FH.07 ácido LC CDR1 tcaagtgtcaaatac 9 nucleico FH.07 ácido LC CDR2 gccacatcc 10 nucleico

Anticorpo Tipo Identidade Sequência SEQ ID NO

FH.07 ácido LC CDR3 cagcagtggagtattatcccacc 11 nucleico cacg

FH.07 ácido VL caaattgttctctcccagtctcc 12 nucleico aacattcctgtctgcatctccag gtgagaaggtcacagtgacttgc agggccagttcaagtgtcaaata catgcactggtatcagcagaaac caggagcctcccccaaaccctgg atttttgccacatccaacctggc ttctggagtccctgctcgcttca gtggcagtgggtctgggacctct tattctctcacaatcagcagagt ggaggctgaagatgctgccactt attactgccagcagtggagtatt atcccacccacgttcggtaatgg gaccaagctggagctgaaac

FH.07 ácido HC CDR1 gatttctcattagctaggtatgg 13 nucleico t

FH.07 ácido HC CDR2 atatggagtggtggaaccgca 14 nucleico

FH.07 ácido HC CDR3 gccagaaattttggtaactacgc 15 nucleico tgtggactac

Anticorpo Tipo Identidade Sequência SEQ ID NO FH.07 ácido VH caggtgcagctgcagcagtcagg 16 nucleico acctggcctagtgcagccctctc agagcctgtccattacctgcaca gtctctgatttctcattagctag gtatggtgtacactggattcgcc agtctccaggaaagggtctggag tggctgggagtgatatggagtgg tggaaccgcagactataatgcag ctttcatatccagactgaacatc aacaaggacaattccaagagcca agttttctttaaaatgaacagtc tccaagctaatgacacagccata tattactgtgccagaaattttgg taactacgctgtggactactggg gtcaaggaacctcag FHR-1.8E4 aminoácido LC CDR1 SSVRY 17 FHR-1.8E4 aminoácido LC CDR2 ATS 18 FHR-1.8E4 aminoácido LC CDR3 QQWGTKPPT 19 FHR-1.8E4 aminoácido VL QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTC 20

RASSSVRYMHWYQQKAGSSPTAW IFATSNLASGVPPRFSGSGSGTS YSLTISRVEAEDAATYYCQQWGT

KPPTFGAGTKLELK FHR-1.8E4 aminoácido HC CDR1 DFSLTNSG 21 FHR-1.8E4 aminoácido HC CDR2 IWSGGTT 22 FHR-1.8E4 aminoácido HC CDR3 ARNFGNYAVDY 23

Anticorpo Tipo Identidade Sequência SEQ ID NO FHR-1.8E4 aminoácido VH QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCT 24

VSDFSLTNSGVHWVRQSPGKGLE WLGVIWSGGTTEYNAAFMSRLTI TKDNSKSQVFFKMNSLLVDDTGI YYCARNFGNYAVDYWGQGTSVTV

SS FHR-1.8E4 ácido VL ccaattgttctctcccagtctcc 28 nucleico agcaatcctgtctgcatctccag gggagaaggtcacaatgacttgc agggccagctcaagtgttaggta catgcactggtaccagcagaagg caggatcctcccccacagcctgg atttttgccacatccaacctggc ttctggagtccctcctcgcttca gtggcagtgggtctgggacctct tactctctcacaatcagcagagt ggaggctgaagatgctgccactt attactgccagcagtggggtact aagccacccacgttcggtgctgg gaccaagctggagctgaaac

Anticorpo Tipo Identidade Sequência SEQ ID NO FHR-1.8E4 ácido VH caggtgcagctgaagcagtcagg 32 nucleico acctggcctagtgcagccctcac agagcctgtccatcacctgcaca gtctctgatttctcattaactaa ttctggtgtacactgggttcgcc agtctccaggaaagggtctggag tggctgggagtgatatggagtgg tggaaccacagagtataatgcag ctttcatgtccagactgaccatc accaaggacaactccaagagcca agttttctttaaaatgaacagtc tgctagttgatgatacaggcata tattactgtgccagaaattttgg taattatgctgtggactactggg gtcaaggaacctcagtcaccgtc tcctcag FHR-1.3B4 aminoácido LC CDR1 SSVTY 33 FHR-1.3B4 aminoácido LC CDR2 ATS 34 FHR-1.3B4 aminoácido LC CDR3 QQRSSSNPLT 35 FHR-1.3B4 aminoácido VL QIVLSQSPTILSASPGEKVTMTC 36

RASSSVTYMHWYQQKPGSSPKPW IYATSNLASGVPARFSGSGSGTS YSLTISRVEAEDAATYYCQQRSS

SNPLTFGAGTKLELK FHR-1.3B4 aminoácido HC CDR1 GFSLTNYG 37 FHR-1.3B4 aminoácido HC CDR2 IWSGGTT 38 FHR-1.3B4 aminoácido HC CDR3 ARNFGNYAMDY 39

Anticorpo Tipo Identidade Sequência SEQ ID NO FHR-1.3B4 aminoácido VH QVQLRQSGPGLVQPSQSLSITCT 40

VSGFSLTNYGVYWVRQSPGKGLE WLGVIWSGGTTDYSAAFISRLSI SKDNSKSQVFFKMNSLQADDTAI YYCARNFGNYAMDYWGQGTSVTV

SS FHR-1.3B4 ácido VL caaattgttctctcccagtctcc 44 nucleico aacaatcctgtctgcatctccag gggagaaggtcacaatgacttgc agggccagctcaagtgtaactta catgcactggtaccagcagaagc caggatcctcccccaaaccctgg atttatgccacatccaacctggc ttctggagtccctgctcgcttca gtggcagtgggtctgggacctct tactctctcacaatcagcagagt ggaggctgaagatgctgccactt attactgccagcagcgcagtagt agtaacccgctcacgttcggtgc tgggaccaagctggagctgaaat

Anticorpo Tipo Identidade Sequência SEQ ID NO FHR-1.3B4 ácido VH caggtgcagctgaggcagtcagg 48 nucleico acctggcctagtgcagccctcac agagcctgtccatcacctgcaca gtctctggtttctcattaactaa ctatggtgtatattgggttcgcc agtctccaggaaagggtctggag tggctgggagtgatatggagtgg aggaaccactgactatagtgcag ctttcatatccagactgagcatc agcaaggacaactccaagagcca agttttctttaaaatgaacagtc tgcaagctgatgacacagccata tactactgtgccagaatttggca ctacgctatggactacatggggt caaggaacctcacaccggtctcc acag FHR- aminoácido LC CDR1 QSLVHSNGNTY 49

1.11E1 FHR- aminoácido LC CDR2 KLS 50

1.11E1 FHR- aminoácido LC CDR3 SQSTHVPFT 51

1.11E1 FHR- aminoácido VL DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISC 52

1.11E1 RSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPG

QSPKLLIYKLSNRFSGVPDRFSG SGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYF

CSQSTHVPFTFGSGTKLEIK FHR- aminoácido HC CDR1 GFSLTNYG 53

1.11E1 FHR- aminoácido HC CDR2 IWSGGNT 54

1.11E1 FHR- aminoácido HC CDR3 AKNGDYGYTMDY 55

1.11E1

Anticorpo Tipo Identidade Sequência SEQ ID NO FHR- aminoácido VH QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCT 56

1.11E1 VSGFSLTNYGVHWVRQPPGKGLE

WLGVIWSGGNTDYNAAFISRLSI SKDNSKSQVFFKMNSLQADDTAI YYCAKNGDYGYTMDYWGQGTSVT

VSS FHR- ácido VL gatgttgtgatgacccaaactcc 60

1.11E1 nucleico actctccctgcctgtcagtcttg gagatcaagcctccatctcttgc agatctagtcagagccttgtaca cagtaatggaaacacctatttac attggtacctgcagaagccaggc cagtctccaaagctcctgatcta caaactttccaaccgattttctg gggtcccagacaggttcagtggc agtggatcagggacagatttcac actcaagatcagcagagtggagg ctgaggatctgggagtttatttc tgctctcaaagtacacatgttcc attcacgttcggctcggggacaa agttggaaataaaac

Anticorpo Tipo Identidade Sequência SEQ ID NO FHR- ácido VH caggtgcagctgaagcagtcagg 64

1.11E1 nucleico acctggcctagtgcagccctcac agagcctgtccatcacctgcaca gtctctggtttttcattaactaa ctatggtgtacactgggttcgcc agcctccaggaaagggtctggag tggctgggagtgatatggagtgg tggaaacacagactataatgctg ctttcatatccagactgagcatc agcaaggacaactccaagagcca agttttctttaaaatgaacagtc tgcaagctgatgacacagccata tactactgtgccaaaaatgggga ttacggctatactatggactact ggggtcaaggaacctcagtcacc gtctcctcag FHR- aminoácido LC CDR1 SSVNY 65

1.12F4 FHR- aminoácido LC CDR2 YTS 66

1.12F4 FHR- aminoácido LC CDR3 QQFTSSPLT 67

1.12F4 FHR- aminoácido VL ENVLTQSPAIMSASLGEKVTMSC 68

1.12F4 RASSSVNYMYWYQQKSDASKLSW

IYYTSNLAPGVPARFSGSGSGNS YSLTISSMEGEDAATYYCQQFTS

SPLTFGAGTKLELK FHR- aminoácido HC CDR1 GFSLTSYG 69

1.12F4 FHR- aminoácido HC CDR2 IWSGGST 70

1.12F4 FHR- aminoácido HC CDR3 ARNGGNYYFDY 71

1.12F4

Anticorpo Tipo Identidade Sequência SEQ ID NO FHR- aminoácido VH QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCT 72

1.12F4 VSGFSLTSYGVHWVRQSPGKGLE

WLGVIWSGGSTDYNAAFISRLSI SKDNSKSQVFFKMNSLQANDTAI YYCARNGGNYYFDYWGQGTTLTV

SS FHR- ácido VL gaaaatgtgctcacccagtctcc 76

1.12F4 nucleico agcaatcatgtctgcatctctag gggagaaggtcaccatgagctgc agggccagctcaagtgtaaatta catgtactggtaccagcagaagt cagatgcctcccccaactcatgg atttattacacatccaacctggc tcctggagtcccagctcgcttca gtggcagtgggtctgggaactct tattctctcacaatcagcagcat ggagggtgaagatgctgccactt attactgccagcagtttactagt tccccactcacgttcggtgctgg gaccaagctggagctgaaac

Anticorpo Tipo Identidade Sequência SEQ ID NO FHR- ácido VH caggtgcagctgaagcagtcagg 80

1.12F4 nucleico acctggcctagtgcagccctcac agagcctgtccatcacctgcaca gtctctggtttctcattaactag ctatggtgtacactgggttcgcc agtctccaggaaagggtctggag tggctgggagtgatatggagtgg tggaagcacagactataatgcag ctttcatatccagactgagcatc agcaaggacaattccaagagcca agttttctttaaaatgaacagtc tgcaagctaatgacacagccata tattactgtgccagaaacggagg taactactactttgactactggg gccaaggcaccactctcacagtc tcctcag FHR- aminoácido LC CDR1 QSLFNSGNQKNY 81

1.14C4 FHR- aminoácido LC CDR2 WAS 82

1.14C4 FHR- aminoácido LC CDR3 QNDYSYPLT 83

1.14C4 FHR- aminoácido VL DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSC 84

1.14C4 KSSQSLFNSGNQKNYLTWYQQKP

GQPPKLLIYWASTRESGVPDRFT GSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVY

YCQNDYSYPLTFGAGTKLELK FHR- aminoácido HC CDR1 GYSFTGYN 85

1.14C4 FHR- aminoácido HC CDR2 IDPYYGDT 86

1.14C4 FHR- aminoácido HC CDR3 ARAFYRDYALDY 87

1.14C4

Anticorpo Tipo Identidade Sequência SEQ ID NO FHR- aminoácido VH EVQLQQSGPELEKPGASVKISCK 88

1.14C4 ASGYSFTGYNMHWVKQSNGTSLE

WIGKIDPYYGDTSYNQRFKGKAT LTVDKSSSTAYMQLKSLTSEDSA VYYCARAFYRDYALDYWGRGTSV

TVSS FHR- ácido VL gacattgtgatgacacagtctcc 89

1.14C4 nucleico atcctccctgactgtgacagcag gagagaaggtcactatgagctgc aagtccagtcagagtctgtttaa cagtggaaatcaaaagaactact tgacctggtaccagcagaaacca gggcagcctcctaaactgttgat ctactgggcatccactagggaat ctggggtccctgatcgcttcaca ggcagtggatctggaacagattt cactctcaccatcagcagtgtgc aggctgaagacctggcagtttat tactgtcagaatgattatagtta tccgctcacgttcggtgctggga ccaagctggagctgaaac

Anticorpo Tipo Identidade Sequência SEQ ID NO FHR- ácido VH gaggtccagctgcagcagtctgg 90

1.14C4 nucleico acctgagctggagaagcctggcg cttcagtgaagatatcctgcaag gcttctggttactcattcactgg ctacaacatgcactgggtgaagc agagcaatggaacgagccttgag tggattggaaaaattgatcctta ctatggtgatactagctacaacc agaggttcaagggcaaggccaca ttgactgtagacaaatcctccag cacagcctacatgcagctcaaga gcctgacatctgaggactctgca gtctattactgtgcaagagcgtt ctatagagactatgctttggact actggggtcgaggaacctcagtc accgtctcttcag sequência aminoácido LC CDR1 SSVXY 91 consenso X = R, T, N sequência aminoácido LC CDR2 X1X2S 92 consenso X1 = A, K, Y X2 = T, L sequência aminoácido HC CDR1 X1FSLTX2X3G 93 consenso X1 = D, G X2 = N, S X3 = S, Y sequência aminoácido HC CDR2 IWSGGXT 94 consenso x = T, N, S

Anticorpo Tipo Identidade Sequência SEQ ID NO sequência aminoácido HC CDR3 ARNX1GNYX2X3DY 95 consenso X1 = F, G X2 = A, Y X3 =V, M, F sequência aminoácido LC CDR1 SSVXY 96 consenso X = R, T sequência aminoácido LC CDR2 ATS 97 consenso sequência aminoácido HC CDR1 X1FSLTNX2G 98 consenso X1 = D, G X2 = S, Y sequência aminoácido HC CDR2 IWSGGTT 99 consenso sequência aminoácido HC CDR3 ARNFGNYAXDY 100 consenso X = V, M

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00154] A Figura 1 mostra ensaios de competição para mapear a localização do epítopo dos anticorpos anti-FHR-1.

[00155] A) A ligação de FH biotinilada (FH-bt) por cada anticorpo monoclonal na ausência ou presença de fragmentos completos de FH ou FH não marcados foi avaliada por ELISA. A ligação é expressa como porcentagem da ligação de FH-bt observada sem adição de concorrentes não identificados (definido como 100%, linha tracejada). B) ELISA de competição com FH-bt, usando mAbs anti-FH e anti- FHR- 1 como captura de mAh (indicado no eixo X) e anti-FH.07 ou anti-FH.16 (como controle) como concorrentes. C) ELISA de competição com FH-bt como em B, mas usando apenas anti-FH.07 como mAb captador e mAbs anti-FHR-1 (indicado no eixo X) como mAbs concorrentes.

[00156] A Figura 2 mostra a análise SPR de mAbs anti- FHR-1 para determinar sua afinidade por FH. A afinidade foi determinada pelo SPR em um chip ProtA ou ProtG.

[00157] (AB) Exemplos de diagramas de sensores de captura dos anticorpos monoclonais indicados antes de fluir FH (A) de comprimento total ou um fragmento de FH constituído pelo domínio 18-20 (B) sobre a superfície. Gráficos ajustados (linhas pretas) e os resultados correspondentes indicados ao lado de cada gráfico foram obtidos seguindo um modelo de ligação 1:1.

[00158] (CD) Resumo de todas as análises de afinidade feitas usando o chip ProtA ou ProtG para o comprimento total (C) ou CCP18-20 (D) para os anticorpos FH.07, 3B4 e 8E4.

[00159] A Figura 3 mostra a caracterização funcional de mAbs anti-FHR-1.

[00160] A) Deposição de C3b em LPS, utilizando soro humano normal a 10% (v / v), com adição dos anticorpos indicados, determinados por ELISA. Os gráficos são representativos para várias experiências independentes, n =

4. Painel superior: IC50 de potenciação da deposição de C3b. Painel inferior: figura representativa da deposição de C3b no LPS para aumentar as concentrações de FH.07, 3B4 e 8E4. A deposição de C3b no soro humano normal a 10% (v / v) sem adição de qualquer anticorpo foi ajustada para 100%. I g (ί 1 Ctrl é um anticorpo de controle negativo.

[00161] B) Ensaio hemolítico utilizando glóbulos vermelhos de ovelha (SRBC) e soro humano normal a 10% (v /

v). A hemólise foi induzida inibindo a FH com anti-FH.09 (soro + FH Inh.), Resultando em 89% de lise. Anticorpos monoclonais contra FH e FHR-1 foram adicionados como IC50 indicado de hemólise calculado a partir de múltiplas experiências. n = 2-4, a análise estatística foi realizada usando ANOVA unidirecional comum, * indica p <0,05

[00162] A Figura 4 mostra em A. sensogramas de análise SPR das interações de FH com C3b com e sem adição de fragmentos anti-FH.07, anti-FHR-1 3B4 ou anti-FHR-1 8E4 Fab ', conforme indicado. A adição de fragmentos Fab ' aumentou a RU medida em pelo menos 2 vezes em todas as superfícies, refletindo maior ligação à FH. B. A análise de equilíbrio da ligação e KD estimado das interações mostra um aumento na afinidade de 2,7, 3,2 e 3,6 vezes, respectivamente para cada Fab'.

EXEMPLOS Materiais e métodos Reagentes

[00163] O fator H purificado humano foi obtido da Comp Tech. (Tyler, Texas, EUA). O Kappa anti-camundongo de rato (RM19) foi obtido da Sanquin (reagentes da Unidade de Negócios, Sanquin, Amsterdã, Holanda). O tampão ELISA de alto desempenho (HPE) foi obtido da Sanquin. Os PCCs FH recombinantes (PCC 15-18, PCC 15-19, PCC 18-20 ou PCC 19-10) foram um presente gentil do dr. Christoph Schmidt e foram produzidos como descrito anteriormente (Schmidt et al. 2008). Anticorpos monoclonais de camundongo (mAbs) contra FH humano foram feitos anteriormente. O anti-FH.07 (IgCU de murídeo) é direcionado contra o CCP 18, o anti-FH.09 (IgGl de murino) é direcionado contra o CCP 6 e o anti-FH.16 (IgGl de murino) é direcionado contra o CCP 16/17. O anti-IL-6.8 foi utilizado como controle de isotipo irrelevante e foi obtido da Sanquin. O anti-C3.19 reage com um epítopo no fragmento C3d da molécula e foi descrito anteriormente (Wolbink et al. 1993). Expressão de proteínas rhFHR

[00164] As proteínas relacionadas ao fator H humano recombinante (rhFHR), contendo um marcador C-terminal 6x- histidina (6xHis) foram produzidas e purificadas como descrito anteriormente (Pouw et al. 2015). Em resumo, as proteínas foram expressas por transfecção transitória de vetores de expressão de pcDNA3.1 em células HEK293F, após o qual as proteínas foram purificadas do sobrenadante por cromatografia de afinidade em Ni 2+ usando colunas HisTrap ™ High Performance de 1 ml (GE Healthcare Life Sciences, Freiburg, Alemanha). Os rFHRs foram filtrados e concentrados usando o Amicon® Ultra Centrifugal Filter Devices (Merck Millipore, Darmstadt, Alemanha). Imunização e geração de hibridomas

[00165] Anticorpos monoclonais de camundongo para FHR-1 foram gerados pela imunização de camundongos BALB / c intraperitonealmente com 25 pg de rhFHR-1 em montanida como adjuvantes em intervalos de quatro semanas. Três dias após a quarta imunização de reforço, as células do baço foram fundidas com a linha celular SP2 / 0 do mieloma. A presença de anticorpos específicos para FHR-1 nos sobrenadantes dos hibridomas foi testada por ELISA. Em resumo, as placas de microtitulação foram revestidas com um kappa moAb anti-

camundongo de rato (RM19) para capturar anticorpos IgG de rato. A especificidade dos anticorpos foi determinada por rhFHR-1 biotinilado. A ligação de rhFHR-1 biotinilado foi determinada por incubação com estreptavidina a 0,1% (v / v) conjugada com HRP, em HPE, durante 30 min. O ELISA foi ainda desenvolvido utilizando 100 pg / mL de 3,5,3',5'- tetrametilbenzidina (TMB) em acetato de sódio 0,1 M contendo 0,003% (v / v) de H2O2, pH 5,5. A conversão do substrato foi interrompida pela adição de 100 pL de H2SO1 e a absorbância foi medida a 450 nm e corrigida para a absorbância a 540 nm com um leitor de placas Synergy 2 Multi-Mode (BioTek Instruments, Winooski, VT, EUA). Todas as etapas de ELISA foram realizadas com um volume final de 100 pL por poço. Ensaio de competição e mapeamento de epítopos mAbs

[00166] A localização do epítopo mAbs anti-FHR-1 foi determinada utilizando fragmentos de FH humano recombinante compostos por múltiplos domínios de CCP (15-18, 15-19, 18- 20 ou 19-20). Em resumo, os mAbs anti-FHR-1 foram capturados em um revestimento de microtitulação RM-19 para garantir a conformação ideal da ligação. Em seguida, FH biotinilado, misturado com uma concentração 100 vezes maior dos fragmentos de FH recombinantes não marcados indicados, foi incubado na placa por 1 hora. A ligação de FH biotinilada foi determinada por incubação com estreptavidina a 0,01% (v / v) conjugada com poli-HRP, em HPE por 30 min. O ELISA foi ainda desenvolvido como descrito acima.

[00167] Para determinar se os mAbs anti-FHR-1 competiam com o anti-FH.07 pela ligação de FH, uma configuração semelhante foi usada. Em resumo, os mAbs foram diretamente revestidos à placa e a ligação de FH biotinilada (FH-ht) na ausência ou presença de uma concentração 10 vezes maior de mAbs indicados foi avaliada por ELISA, como descrito acima. Deposição C3 no LPS

[00168] As placas de microtitulação Polysorp de 96 poços (Nunc) foram revestidas com LPS de Salmonella typhosa (40 µg / mL, L-6386 Sigma-Aldrich) em PBS, O / N à temperatura ambiente. O LPS ativa a via alternativa do complemento. Após lavagem com PBS + Tween-20 a 0,1% (p / v), NHS a 10% (v / v) foi incubado em tampão Veronal (VB; barbital 3 mM, barbital 3 mM, barbital sódio a 1,8 mM, NaCl 145 mM, pH 7,4) contendo 0,05 % (p / v) de gelatina, 5 mM de MgCh, 10 mM de EGTA e 0,1% (p / v) de Tween-20 na presença ou ausência de mAbs anti-FH / anti-FHR-1, controles de isotipo ou aIL6-8 AB como controle negativo nas concentrações indicadas. A deposição de C3b foi detectada com mAb anti-C3.19 biotinilado (0,55 µg / mL em HPE) seguido de incubação com estreptavidina a 0,01% (v / v) conjugada com poli-HRP, em HPE por 30 min. O ELISA foi ainda desenvolvido como descrito acima. Ensaio hemolítico SRBC

[00169] A funcionalidade da FH foi determinada com um ensaio hemolítico, como descrito anteriormente por Sanchez- Corral et al. (2004) e Wouters et al. (2008), com alguns ajustes. O soro humano pré-diluído (20%, v / v), contendo 20 pg / ml de anti-FH.09, foi pré-incubado com os mAbs indicados e misturado em uma proporção de 1 para l com glóbulos vermelhos de ovelha (SRBCs) para atingir uma concentração final de 10% (v / v) de soro e 1,05 * 108 células / ml em VB com 5 mM de Mg CL e 10 mM de EGTA, ou VB com 10 mM de EDTA em branco, seguido de incubação a 37 ° C por 75 minutos enquanto agita. A lise foi finalizada adicionando 100 mB de VB gelado com EDTA 20 mM seguido de centrifugação (2,5 minutos, 1.800 RPM / 471 RCF, 7 ° C). A hemólise foi medida como absorvância dos sobrenadantes a 412 nm, corrigida para a absorvância de fundo medida a 690 nm e expressa como porcentagem do controle de 100% da lise (SRBCs incubados com 0,6% (p / v) de saponina). Como controle negativo, os SRBCs foram incubados com soro diluído em VB suplementado com 10 mM de EDTA para evitar a ativação do complemento. Usando o prisma graphpad 7.04, o EC50 da hemólise foi calculado a partir de múltiplas experiências e as comparações estatísticas foram feitas por ANOVA de uma via comum e teste de comparações múltiplas de Dunnett. Determinando a afinidade de ligação (SPR)

[00170] Os experimentos de ressonância plasmônica de superfície (SPR) foram realizadas usando um BiaCore T200 (GE Healthcare) e chips sensor CMS (GE Healthcare), de acordo com as instruções do fabricante. Em resumo, para determinar sua afinidade, anti-FH.07, anti-FHR-1 3B4 ou anti-FHR-1 8E4 foram capturados em um chip acoplado a ProtA ou ProtG e FH de comprimento total ou um fragmento de FH compreendendo o domínio 18-20 foi corrido sobre o moAB capturado em concentrações decrescentes. Afinidade de ligação do fator H a C3b

[00171] A ligação de FH a C3b na presença de moAbs anti-FH foi determinada por ressonância plasmônica de superfície usando um instrumento Biacore T200 (GE

Healthcare, Little Chalfont, Reino Unido). O C3b purificado (Complement Technologies) foi imobilizado em uma célula de fluxo de um CMS Biacore Sensor Chip (GE Healthcare) usando acoplamento de amina padrão. A célula de fluxo restante foi usada como superfície de referência e preparada realizando uma reação de acoplamento sem a adição de qualquer proteína. Uma resposta de 2000 unidades de resposta (RUs) foi obtida após o acoplamento com C3b. As experiências de SPR foram realizadas a 37 ° C usando uma taxa de fluxo de 10 mΐ / hiίh e em solução salina tamponada com fosfato pH 7,4 (PBS, Orphi Farma) suplementada com 0,01% (p / v) de Tween- 20 (Merck) (PBS-T) a 0,01% (p / v).

[00172] Para determinar o efeito dos anticorpos sem interferência de possíveis reticulações via moAb, foram utilizados fragmentos Fab 'produzidos de forma recombinante dos moAbs. Os fragmentos Fab 'foram misturados com FH purificado por plasma (pdFH). O FH foi injetado por 60 segundos em diferentes concentrações (10 - 0,01953 mM apenas para FH e 5 - 0,01953 mM para complexos com fragmentos moAb Fab ') sobre o chip na ausência ou presença de 10 mM (pelo menos 2 vezes o molar excesso de razão) de fragmentos Fab 'anti-FH.07, anti-FHR-1 3B4 ou anti-FHR-1 8E4 Fab'. Cada fragmento Fab 'também foi injetado sem adição de FH para determinar quaisquer interações dos fragmentos Fab' com as superfícies. A injeção de pdFH foi seguida por uma dissociação de 60 segundos e a superfície foi regenerada entre cada ciclo por uma única injeção de NaCl 1 M (Merck).

[00173] Os dados foram analisados usando afinidades Scrubber 2 (Biologic Software) foram determinadas por análise de equilíbrio. Resultados Anticorpos monoclonais

[00174] Os anticorpos monoclonais FHR-1.3B4, FHR-

1.8E4, FHR-1.11E1, FHR-1.12F4 e FHR-1.14C4 foram criados contra a proteína 1 relacionada ao fator H humano recombinante (FHR-1). Mapeando locais de ligação

[00175] A fim de mapear o local de ligação dos anticorpos monoclonais, a reatividade dos moAbs foi testada contra fragmentos de FH recombinantes, compreendendo vários domínios de CCP (CCP 15-18, CCP 15-19, CCP 18-20 e CCP 19- 20) e completa comprimento humano FH. Como indicado na Fig. 1A, FHR-1.3B4, FHR-1.8E4, FHR-1.11E1, FHR-1.12F4 e FHR-

1.14C4 se ligam aos fragmentos recombinantes CCP 15-18, CCP 15-19 e CCP 18-20 em grau variável, mas não para o PCCh 19-

20. Isso indica que todos os anticorpos são específicos para o CCP18 da FH. Mapeamento de epítopo

[00176] Os ensaios de competição foram realizados com anticorpo anti-FH agonístico FH.07. Como mostrado na Fig. 1B e 1C, a ligação de FHbt ao anti-FH.07, 11E1, 8E4 e 3B4 é eliminada pelo anti-FH.07, mas não pelo 14C4 ou pelo controle de isotipo anti-FH.16. Isso indica que anti-FH.07, 11E1, 8E4 e 3B4 estão se ligando a epítopos idênticos ou sobrepostos no CCP 18, enquanto 14C4 se liga a outro epítopo não sobreposto no CCP 18. A ligação de 12F4 também é eliminada pelo anti-FH.07, mas em menor grau, indicando que esse anticorpo se liga ao mesmo epítopo, mas possivelmente possui uma afinidade mais baixa. Afinidade de ligação

[00177] Todos os anticorpos FH.07, 8E4 e 3B4 se ligam ao FH humano e ao CCP18-20 de FH com afinidades nanomolares ou sub-nanomolares. Ambos os anticorpos 8E4 e 3B4 têm afinidades de ligação mais altas do que a de FH.07 para FH de comprimento total e CCP 18-20, ver Fig. 2 e tabela 2. Tabela 2. Cinética de ligação para os anticorpos FH.07, 3B4 e 8E4. FH CCP18-20 ka (M-1s-1) kd (s-1) KD x10-8 ka (M-1s-1) kd (s- KD x10-9 (M) 1) (M) FH.0.7 6.09 x 103 1.81 x 10-4 2.97 8.33 x 105 2.70 x 0.32 10-4 3B4 1.58 x 104 9.10 x 10-5 0.58 2.39 x 106 1.27 x 5.44 x 10- 10-5 3 8E4 9.00 x 103 9.39 x 10-5 1.04 1.58 x 106 4.96 x 0.03 10-5 Deposição de C3 no LPS

[00178] Todos os FH.07, 3B4, 8E4, 11E1 e 12F4 diminuem a deposição de C3b no LPS (mostrado na Figura 3A para FH.07, 3B4 e 8E4). Em contraste, 14C4 aumentou a deposição de C3b no LPS. A Figura 3A mostra a deposição de C3 no LPS para concentrações crescentes de FH.07, 3B4 e 8E4. É mostrado que 8E4 inibe a deposição de C3 em maior extensão que FH.07.

[00179] Portanto, todos os mAbs que competem com anti- FH.07 também potencializam a função da FH, o que resulta em uma ativação reduzida do complemento. Notavelmente, embora também se ligue ao CCP 18, o mAh não concorrente (14C4) resultou em um efeito oposto, que é a inibição da função FH, portanto mais deposição de C3b. Como mostrado na tabela 3, o IC50 no ensaio de deposição de LPS de 8E4 é menor que o de FH.07.

Atividade hemolítica do SRBC

[00180] Anti-FH.07, 3B4, 8E4 e 11E1 diminuem a hemólise SRBC induzida. 12F4 mostra o mesmo efeito, mas em menor grau. Portanto, todos os mAbs que competem com o anti- FH.07 também potencializam a função da FH na superfície do SRBC, o que resulta em uma hemólise mediada pelo complemento diminuída. 3B4, 8E4 têm um efeito mais alto na potenciação de FH neste ensaio em concentrações mais altas. Conforme mostrado na tabela 3 e na figura SB, o IC50 no ensaio hemolítico de 8E4 e 3B4 é menor que o do FH.07. Tabela 3: Valores de IC50 dos mAbs anti-FHR-1 no ensaio de deposição de C3b no LPS e no ensaio hemolítico, comparado ao anti-FH.07. Para FH.07, 3B4 e 8E4, os valores são baseados em múltiplos experimentos. Ensaio de C3b no LPS Ensaio Hemolítico mAb IC50 (nM) Relativo IC50 (nM) Relativo Anti-FH.07 38.8 1.00 152.7 1.00 Anti-FHR.1.3B4 38.4 0.99 94.0 0.83 Anti-FHR-1.8E4 26.3 0.68 127.5 0.62 Anti-FHR-1.11E1 25.04 n.d. - Anti-FHR-1.12F4 345.20 n.d. - Afinidade de ligação do Fator H para C3b

[00181] Sob condições normais, o FH mostra interação com C3b com um KD estimado de 6,0 mM. No entanto, a adição de fragmentos Fab' de anti-FH/07, aFHR-1 3B4 ou aFHR-1 8E4 aumenta a resposta na superfície revestida por C3b (Fig. 4A) e é representada em afinidades estimadas aumentadas de 2,20 mM, 1,90 mM e 1,66 mM, respectivamente (Fig. 4B).

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[00198] Wouters, Diana, Mieke C Brouwer, Mohamed R Daha, and C Erik Hack. 2008. “Studies on the Haemolytic Activity of Circulating C1q-C3/C4 Complexes.” Molecular Immunology 45 (7): 1893–99.

Claims (29)

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo isolado, sintético ou recombinante ou fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente ao domínio 18 da proteína de controle do complemento (CCP18) do fator H (FH) caracterizado pelo fato de que compreende: - uma sequência de CDR1 de cadeia leve com a sequência SSVXY, em que X é R, T ou N (SEQ ID NO: 91) ou a sequência QSLVHSNGNTY (SEQ ID NO: 49), - uma sequência de CDR2 de cadeia leve com a sequência X1X2S em que X1 = A, K ou Y e X2 = T ou L (SEQ ID NO: 92), - uma sequência CDR3 de cadeia leve selecionada do grupo que consiste em QQWGTKPPT (SEQ ID NO: 19), QQRSSSNPLT (SEQ ID NO: 35), SQSTHVPFT (SEQ ID NO: 51) e QQFTSSPLT (SEQ ID NO: 67), - uma CDR1 de cadeia pesada com a sequência X1FSLTX2X3G, em que X1 = D ou G, X2 = N ou S e X3 = S ou Y (SEQ ID NO: 93), - uma CDR2 de cadeia pesada com a sequência IWSGGXT, em que x = T, N ou S (SEQ ID NO: 94), e - uma CDR3 de cadeia pesada com a sequência ARNX1GNYX2X3DY, em que X1 = F ou G, X2 = A ou Y e X3 = V, M ou F (SEQ ID NO: 95) ou AKNGDYGYTMDY (SEQ ID NO: 55).

2. Anticorpo ou fragmento, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende: - uma sequência de CDR1 de cadeia leve com a sequência SSVXY, em que X é R ou T (SEQ ID NO: 96), - uma sequência de CDR2 de cadeia leve com a sequência ATS (SEQ ID NO: 97), - uma sequência CDR3 de cadeia leve selecionada do grupo que consiste em QQWGTKPPT (SEQ ID NO: 19) e QQRSSSNPLT (SEQ ID NO: 35), - uma CDR1 de cadeia pesada com a sequência X1FSLTNX2G, em que X1 = D ou G e X2 = S ou Y (SEQ ID NO: 98), - uma CDR2 de cadeia pesada com a sequência IWSGGTT (SEQ ID NO: 99), e - uma sequência de CDR3 de cadeia pesada com a sequência ARNFGNYAXDY, em que X = V ou M (SEQ ID NO: 100).

3. Anticorpo ou fragmento, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de CDR1 da cadeia leve com a sequência SSVRY (SEQ ID NO: 17), uma sequência de CDR2 da cadeia leve com a sequência ATS (SEQ ID NO: 18) e uma luz CDR3 de cadeia com a sequência QQWGTKPPT (SEQ ID NO: 19), uma CDR1 de cadeia pesada com a sequência DFSLTNSG (SEQ ID NO: 21), uma CDR2 de cadeia pesada com a sequência IWSGGTT (SEQ ID NO: 22) e uma cadeia pesada Sequência de CDR3 com a sequência ARNFGNYAVDY (SEQ ID NO: 23).

4. Anticorpo ou fragmento, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento tem uma afinidade de ligação para FH com um KD de 2,5 x 10-8 M ou menos e / ou uma afinidade de ligação para um fragmento de FH compreendido de CCP18-20 com um KD de 0,1 x 10-9 M ou menos, preferencialmente, em que o referido anticorpo ou fragmento tem uma afinidade de ligação para FH com um KD de 1,25 x 10-8 M ou menos e / ou uma afinidade de ligação para um fragmento FH compreendido por CCP18-20 com um KD de 0,04 x 10-9 M ou menos.

5. Anticorpo ou fragmento, de acordo com a reivindicação

1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de CDR1 de cadeia leve com a sequência SSVTY (SEQ ID NO: 33), uma sequência de CDR2 de cadeia leve com a sequência ATS (SEQ ID NO: 34) e uma sequência de CDR3 de cadeia leve com a sequência QQRSSSNPLT (SEQ ID NO: 35), uma CDR1 de cadeia pesada com a sequência GFSLTNYG (SEQ ID NO: 37), uma CDR2 de cadeia pesada com a sequência IWSGGTT (SEQ ID NO: 38) e uma Sequência de CDR3 de cadeia pesada com a sequência ARNFGNYAMDY (SEQ ID NO: 39).

6. Anticorpo ou fragmento, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 e 5, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento tem uma afinidade de ligação para FH com um KD de 2,5 x 10-8 M ou menos e / ou uma afinidade de ligação para um fragmento FH compreendido por CCP18-20 com um KD de 0,1 x 10-9 M ou menos, preferencialmente, em que o referido anticorpo ou fragmento tem uma afinidade de ligação para FH com um KD de 0,6 x 10-8 M ou menos e / ou uma afinidade de ligação para um fragmento FH compreendido por CCP18-20 com uma KD de 0,6 x 10-11 M ou menos.

7. Anticorpo ou fragmento, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento: - inibe a deposição de C3 no LPS in vitro com um valor de IC50 igual ou inferior a 38 nM, de preferência com um valor de IC50 igual ou inferior a 30 nM e / ou - inibe a atividade hemolítica in vitro com um valor de IC50 igual ou inferior a 150 nM, de preferência, com um valor de IC50 igual ou inferior a 130 nM e / ou - aumenta a afinidade de ligação (KD) do FH para C3b in vitro para no máximo 2 µM e / ou aumenta a afinidade de ligação da FH para C3b in vitro pelo menos 3 vezes.

8. Anticorpo ou fragmento, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende: - uma sequência de CDR1 de cadeia leve com a sequência QSLVHSNGNTY (SEQ ID NO: 49), uma sequência de CDR2 de cadeia leve com a sequência KLS (SEQ ID NO: 50) e uma CDR3 de cadeia leve com a sequência SQSTHVPFT (SEQ ID NO: 51), uma CDR1 de cadeia pesada com a sequência GFSLTNYG (SEQ ID NO: 53), uma CDR2 de cadeia pesada com a sequência IWSGGNT (SEQ ID NO: 54) e uma sequência de CDR3 da cadeia pesada com a sequência AKNGDYGYTMDY (SEQ ID NO: 55) ou - uma sequência CDR1 de cadeia leve com a sequência SSVNY (SEQ ID NO: 65), uma sequência CDR2 de cadeia leve com a sequência YTS (SEQ ID NO: 66) e uma CDR3 de cadeia leve com a sequência de QQFTSSPLT (SEQ ID NO: 67), uma CDR1 de cadeia pesada com a sequência GFSLTSYG (SEQ ID NO: 69), uma CDR2 de cadeia pesada com a sequência IWSGGST (SEQ ID NO: 70) e uma sequência de CDR3 da cadeia pesada com a sequência ARNGGNYYFDY (SEQ ID NO: 71).

9. Anticorpo ou fragmento, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que compreende: - uma sequência variável de cadeia leve que compreende uma sequência que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em

QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVRYMHWYQQKAGSSPTAWIFATSNLASGVPP RFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWGTKPPTFGAGTKLELK (SEQ ID

NO:20),

QIVLSQSPTILSASPGEKVTMTCRASSSVTYMHWYQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPA RFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQRSSSNPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 36),

DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKLSNR FSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 52) e

ENVLTQSPAIMSASLGEKVTMSCRASSSVNYMYWYQQKSDASKLSWIYYTSNLAPGVPA RFSGSGSGNSYSLTISSMEGEDAATYYCQQFTSSPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 68), e, - uma sequência variável de cadeia pesada que compreende uma sequência que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em

QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSDFSLTNSGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGTTEY

NAAFMSRLTITKDNSKSQVFFKMNSLLVDDTGIYYCARNFGNYAVDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 24),

QVQLRQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVYWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGTTDY

SAAFISRLSISKDNSKSQVFFKMNSLQADDTAIYYCARNFGNYAMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 40),

QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQPPGKGLEWLGVIWSGGNTDY

NAAFISRLSISKDNSKSQVFFKMNSLQADDTAIYYCAKNGDYGYTMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 56), e

QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTSYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGSTDY

NAAFISRLSISKDNSKSQVFFKMNSLQANDTAIYYCARNGGNYYFDYWGQQTTLTVSS (SEQ ID NO: 72).

10. Anticorpo ou fragmento, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo potencializa a atividade de FH, de preferência, em que a referida atividade de FH é a inibição da ativação alternativa do complemento, mais preferencialmente, em que a inibição da ativação alternativa do complemento compreende: - uma inibição da atividade hemolítica, - uma inibição da deposição do componente 3 do complemento (C3) e / ou - aumento da ligação de FH a C3b, iC3b e / ou C3d.

11. Anticorpo ou fragmento, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o referido fragmento compreende uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina e uma região variável da cadeia leve da imunoglobulina, de preferência, em que o referido fragmento compreende ainda uma região constante de cadeia pesada da imunoglobulina e uma região constante de cadeia leve da imunoglobulina.

12. Anticorpo ou fragmento, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o referido fragmento compreende pelo menos um fragmento Fab.

13. Anticorpo ou fragmento, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo monoclonal ou seu fragmento.

14. Anticorpo ou fragmento, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo quimérico ou humanizado ou seu fragmento, compreendendo regiões constantes da cadeia leve e de cadeia pesada humana.

15. Molécula de ácido nucleico isolada, sintética ou recombinante caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica o anticorpo ou fragmento conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 14.

16. Vetor caracterizado pelo fato de que compreende uma molécula de ácido nucleico conforme definido pela reivindicação 15.

17. Célula recombinante caracterizada pelo fato de que compreendendo uma molécula ou vetor de ácido nucleico conforme defnido pela reivindicação 15 ou 16.

18. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo ou fragmento conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 14, uma molécula de ácido nucleico conforme definido pela reivindicação 15, um vetor conforme definido pela reivindicação 16 ou uma célula recombinante conforme definido pela reivindicação 17, e um transportador, diluente e / ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

19. Anticorpo ou fragmento, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, ou uma molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 15 caracterizado pelo fato de que é para uso em terapia.

20. Anticorpo ou fragmento, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, ou uma molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 15 caracterizado pelo fato de que é para uso na inibição da ativação de complemento alternativo.

21. Anticorpo ou fragmento, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, ou uma molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento, alívio ou prevenção de um distúrbio associado à ativação da via alternativa do complemento.

22. Anticorpo ou fragmento ou molécula de ácido nucleico para uso, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o referido distúrbio é selecionado do grupo que consiste em síndrome hemolítica urêmica atípica (aHUS), hemoglobinúria paroxística noturna (PNH), degeneração macular relacionada à idade (AMD), glomerulonefrite membranoproliferativa (MPGN).

23. Uso de um anticorpo ou fragmento conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 14, ou uma molécula de ácido nucleico conforme definido pela reivindicação 15, ou um vetor conforme definido pela reivindicação 16 caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um medicamento para o tratamento, alívio ou prevenção de uma distúrbio associado à ativação da via alternativa do complemento.

24. Uso, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o referido distúrbio é selecionado do grupo que consiste em síndrome hemolítica urêmica atípica (aHUS), hemoglobinúria paroxística noturna (PNH), degeneração macular relacionada à idade (DMRI), glomerulonefrite membranoproliferativa (MPGN).

25. Método para tratar, aliviar ou prevenir um distúrbio associado à ativação da via alternativa do complemento, caracterizado pelo fato de compreender a administração a um indivíduo em necessidade do mesmo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo ou fragmento conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 14, ou uma molécula de ácido nucleico conforme definido pela reivindicação 15, ou um vetor conforme definido pela reivindicação 16, ou uma composição farmacêutica conforme definido pela reivindicação 18.

26. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o referido distúrbio é selecionado do grupo que consiste em síndrome hemolítica urêmica atípica (aHUS), hemoglobinúria paroxística noturna (PNH), degeneração macular relacionada à idade (DMRI), glomerulonefrite membranoproliferativa (MPGN).

27. Método para inibir a ativação alternativa de complemento caracterizado pelo fato de que compreende a administração a um indivíduo de um anticorpo ou fragmento de conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 14, ou uma molécula de ácido nucleico conforme definido pela reivindicação 15, ou um vetor conforme definido pela reivindicação 16, ou uma composição farmacêutica conforme definido pela reivindicação 18.

28. Método para produzir um anticorpo ou fragmento, de conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 14 caracterizado pelo fato de que compreende fornecer uma célula com uma molécula de ácido nucleico ou um vetor conforme definido pela reivindicação 15 ou 16, e permitir que a referida célula traduza a sequência de ácido nucleico compreendida pela referida molécula de ácido nucleico ou vetor, produzindo, assim, o referido anticorpo ou fragmento conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a

14.

29. Método, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de compreender ainda a coleta, purificação e / ou isolamento do referido anticorpo ou fragmento.

B. A. Ligação Fh-bt (OD450/540) Ligação FH-bt (% de comparado a nenhum an

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5 an ti-

FH Fragmentos concorrentes ti- .0 Petição 870200087819, de 15/07/2020, pág. 186/196 FH 7

R -1 an .1 Anti-FH.07 ti- 1E (domínio 18) FH 1 an R -1 ti- .8 FH E4 Anti-FHR-1.3B4

R mAb -1 an .1 ti- 2F FH 4 Coated an R ti- -1 .3 Anti-FHR-1.8E4 revestido

FH B mAb R 4 1/10 -1 .1 4C an 4 Anti-FHR-1.11E1 ti-

FH .1 6 Anti-FHR.1.12FC Anti-FHR-1.14C4 - Figura 1 Concorrente blank Ant-FH-16 (domínio 16/17 anti-FH.16 anti-FH.07 CompetingmAb Em branco mAb

C.

Revestimento: anti-FH.07 Ligação Fh-bt (OD450/540)

Sem competidor Em branco

Concorrente mAb

Figura 1 (continuação)

A.

Resposta (RU)

Tempo (seg) Resposta (RU)

Tempo (seg) Resposta (RU)

Tempo (seg)

Figura 2

B.

Resposta (RU)

Tempo (seg)

3B4:CCP 18-20 Resposta (RU)

Tempo (seg) Resposta (RU)

Tempo (seg)

Figura 2 (continuação)

C.

KD de afinidade (M)

D.

KD de afinidade (M)

Figura 2 (continuação)

A.

IC50 de potenciação (nM)

Deposição de C3b em LPS (Salmolla Typhosa) Deposição de C3b (%)

Figura 3

B.

IC50 de potenciação (nM)

Figura 3 (continuação)

A.

Concentração FH Resposta (RU) Tempo (s) Concentração FH Resposta (RU) Tempo (s) Figura 4

Concentração FH Resposta (RU)

Tempo (s)

Concentração FH Resposta (RU)

Tempo (s)

Figura 4 (continuação)

B.

Resposta (RU) Concentração de FH (M) Figura 4 (continuação)