JP2021178857A - Ｈ因子を強化する抗体及びその用途 - Google Patents

Abstract

【課題】１つには、望まれない又は過度の補体活性化に関連した疾患の改良された療法を提供すること。【解決手段】Ｈ因子を強化する抗体及びその用途。本発明は、Ｈ因子に対して特異的な、単離された、合成された又は組み換えられた抗体並びにそれらのフラグメントに関する。本発明は、さらに、補体活性化の抑制及び補体活性化に関連する疾患の治療のためのそのような抗体及びフラグメントの使用に関する。【選択図】なし

Description

本発明は免疫学と医学の分野に関する。特に、本発明は、Ｈ因子特異抗体およびその用途に関する。

補体系は、侵入する病原体に対する、哺乳動物等の多くの生命体の保護に寄与する先天免疫の重要な因子である。補体系は、肝臓で主として合成される３０個以上の異なる成分からなる。補体系の活性化は、３つの異なる経路、正経路、レクチン経路及び代替的経路によって生じる。この３つの経路は、Ｃ３転化酵素の形成に集中し、各経路はそれぞれ異なるが、同様の活性を有する。

古典的補体活性化経路において、Ｃ１ｑ、Ｃ１ｒ及びＣ１ｓからなる補体成分（Ｃ）１複合体の活性化は、抗体抗原複合体に結合したときに生じる。Ｃ１複合体は、Ｃ４とＣ２を開裂し、Ｃ４ｂとＣ２ａからなるＣ３転化酵素の形成に結びつく。Ｃ３転化酵素はＣ３を活性成分であるＣ３ａとＣ３ｂに開裂する。レクチン経路において、Ｃ４とＣ２を開裂することができるセリンプロテアーゼＭＡＳＰ−１及びＭＡＳＰ−２を活性化するマンノース結合レクチンが病原性の表面のマンノース残基に結合する。古典的経路のように、これが（Ｃ４ｂＣ２ａ）Ｃ３転化酵素の形成に結びつく。このＣ３転化酵素は、Ｃ３ｂと結合してＣ５転換酵素を形成することができる。古典的経路及びレクチン経路とは対照的に、代替的経路は、血漿中でのＣ３からＣ３（Ｈ２Ｏ）への自発的な加水分解によって連続的に低いレベルの活性を有する。このＣ３ｂのようなＣ３（Ｈ２Ｏ）は、結合因子Ｂ（ＦＢ）によって流体相のＣ３転化酵素を形成することができ、次にはＤ因子によってＢｂに活性化される。同様に、Ｃ３ｂが表面へ結合する場合、Ｃ３ｂはＦＢと結合してＣ３ｂＢを形成することができる。この複合体は、Ｄ因子によってＣ３ｂＢｂに開裂される。Ｃ３ｂＢｂは、プロパージン（Ｐ因子）によってＣ３ｂＢｂＰに安定化されることができる代替的経路のＣ３転化酵素である。このＣ３転化酵素はＣ３をＣ３ａとＣ３ｂに開裂することができる。このプロセスに加えて、代替的経路は、古典的経路及びレクチン活性化経路のための増幅ループとして作用する。これらの経路で生成されたＣ３ｂは代替的経路の出発点として作用できるからである。それによって、増幅ループは古典的経路及びレクチン経路の強化に帰着する。３つの活性化経路のいずれかにおいて形成されたＣ３転化酵素は、Ｃ３ｂと結合してＣ５転換酵素を形成することができる。３つの補体活性化経路のすべてのＣ５転換酵素は、Ｃ５を、補体系の最終経路を開始するＣ５ａ及びＣ５ｂに活性化する。Ｃ５ｂは、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８及びＣ９と結合して膜侵襲複合体（ＭＡＣ）を形成し、細胞膜傷害複合体が膜内外のチャネルを形成し、細胞融解を生じさせる。

病原体の細胞膜に孔を形成した次に、補体は、オプソニン作用によってＣ３ｂ分子と共に病原体又は変更された自己細胞を取り除くことと、感染の部位に免疫細胞を誘引して活性化するＣ３ａ及びＣ５ａのような炎症促進性ペプチドの生産を支援する。補体の強い炎症促進性の性質のために、ホスト細胞は、いくつかの細胞膜及び可溶性の補体制御タンパクによってよく防御されている。

代替的経路は全補体活性に対して８０〜９０％寄与する。従って、この経路のレギュレーションは重大である。Ｃ３の自発的加水分解によって形成されるＣ３（Ｈ２Ｏ）及びＣ３ｂは、一般的に、病原体に結合していなければ、Ｈ因子（ＦＨ）、Ｉ因子（ＦＩ）及び宿主細胞表面分子によって急速に不活性化され、それによってＣ３転化酵素の形成を抑制する。ＣＤ５５（解離促進因子又はＤＡＦとも称される）は宿主細胞表面でＣ３ｂと結合する。ＦＩは、Ｃ３ｂを不活性形に開裂するが、細胞表面で発現される共因子（ＣＤ４６、ＭＣＰ）又は血漿中で循環する共因子（ＦＨ）に依存する。ＦＨは、液体中及び細胞表面の補体の代替的経路のコントロールにとって不可欠な血漿糖タンパクである。ＦＨはＦＢと同じ位置でＣ３ｂと結合し、それによってＣ３転化酵素の形成を防ぐ。また、ＦＨは、分解促進活性を有する。つまり、ＦＨは、代替的経路Ｃ３転化酵素が形成されると、その解離を促進する。ＦＨがＣ３ｂに結合するかどうかは細胞表面に存在する炭水化物によって決定される。宿主細胞表面に存在するシアル酸、グリコサミノグリカン及びヘパリンは、ＦＨのＣ３ｂに対する結合を促進するが、一方で、病原体の表面で発現された分子にＣ３ｂと結合することは、ＦＢの結合に帰着する。ＦＨと結合する細胞表面分子は、ホスト細胞表面では発現されるが、病原性細胞表面では一般に発現されないので、従って、ＦＨは、病原性の細胞の表面に対してではなく、ホスト細胞にその補体阻害活性を及ぼす。

変異によるホスト表面のＦＨ欠失又は損なわれた認識は、補体を介した組織損傷及び疾病に関係している。正常な止血中に補体活性化をコントロールすることの次に、ＦＨは、病気の細胞及び組織の補体を介したダメージを制限することにおいても重要な役割を果たす。ＦＨ遺伝子における多重変異がＦＨタンパクの機能の損失に結びつく可能性があることが記載されている。ＦＨのＣ末端部位は疾病における変異のホットスポットである。これはホスト細胞へのＦＨの結合のための重要な領域である。この部位の最も疾患に関連した変異はＦＨ結合を阻害する。変異したＦＨ遺伝子を有するほとんどの患者がヘテロ接合型変異を有することは、循環するＦＨの約半分が正常な機能を有することを意味する。しかしながら、これは補体が活性化される特定の状態において自己表面を防御するのには十分ではない。ＦＨ欠失は、膜性増殖性糸球体腎炎（ＭＰＧＮ）及び非定型溶血尿毒症症候群（ａＨＵＳ）のような腎臓病に結びつく可能性がある。より最近になって、ＦＨ変異と加齢関連黄斑病（ＡＭＤ）との関係が記述されるようになってきた。

現在、ａＨＵＳ等のＦＨ欠失のための標準的治療は血漿補充療法又は血漿交換療法である。そのような療法によって不十分な補体レギュレーターが補充される。血漿交換療法はさらに変異体補体因子及び／又は補体因子を対象とする自己抗体を取り除く。しかしながら、血漿療法はさらにいくつかの制限がある。血漿交換療法がａＨＵＳの治療において安全又は有効であることを示す見込みのある臨床研究はなく、また、血漿療法の効率は根本的な変異に依存する可能性がある。一部の患者は、新鮮凍結血漿に対するアナフィラキシー反応を発展させ、それはあらゆる形態の血漿療法の停止を必要とする可能性がある。さらに、血漿交換は、血漿に由来する活性な病原性の補体成分の投与によりａＨＵＳの臨床像を悪化させる可能性がある。

近年、治療用モノクローナル抗体エクリズマブは、米国及びヨーロッパのいくつかの国々でａＨＵＳ及び発作性夜間色素尿症（ＰＮＨ）の治療用として承認されている。エクリズマブは、Ｃ５に対して特異的なヒト化されたマウスモノクローナル抗体であり、Ｃ５のＣ５ａとＣ５ｂへの開裂を防ぐ。従って、エクリズマブは、最終経路の活性化を防ぎ、免疫細胞の流入を減少させる。しかしながら、エクリズマブの使用は望まれない副作用に関係している。エクリズマブがＣ５をブロックし、Ｃ５が最終経路の開始のための重大な成分であるので、エクリズマブで治療された患者は被包性細菌（髄膜炎菌血症等）による感染に弱くなり、その除去はＭＡＣ形成に非常に依存する。従って、髄膜炎菌の予防接種はエクリズマブを用いた治療を受ける前の患者に必要である。さらに、エクリズマブはＣ３の下流に対して作用するので、Ｃ３堆積が維持され、それは望まれない又は過度の補体活性化を含むいくつかの疾患において不利益である。さらに、高いコストはエクリズマブ治療と関連しており、抗体の利用しやすさが限定されている。

ＣＣＰ１８に結合するマウスモノクローナル抗体がＣｈｅｎｇら（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００５年）に記載されている。Ｘ５２．１と呼ばれるこの抗体は、Ｃ３ｂ及びＣ３ｄに対するＦＨの結合を増加させ、それはＦＨの二量体化によって引き起こされると考えられることが記載されている。Ｃｏｒｅｙら（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２０００）によって示されるように、Ｘ５２．１によって誘導されるＣ３ｂ及びＣ３ｄに対するＦＨの結合の増加は、ＲＢＣ及びいくつかのタイプの癌細胞を含む、補体を介した細胞溶解の増加に帰着する。これは抗体Ｘ５２．１がＦＨの補体阻害活性を抑制することを実証している。確かに、Ｃｏｒｅｙらは、癌細胞の補体を介した細胞溶解の増強により、癌の治療において抗体を使用できることを示唆している。

従って、上記を考慮して、望まれない又は過度の補体活性化に関連した疾患の改良された療法の必要性が存在する。

本発明は、そのような疾患のための現行の治療戦略の欠点を克服する、補体系の代替的経路の望まれない又は過剰な活性化に関連した疾患に対する治療戦略を提供することを目的とする。本発明は、現在利用可能な抗体よりも改良された特性を有する、疾患の治療において使用することができる抗体を提供することをもう一つの目的とする。本発明の抗体及びそのフラグメントは、ＦＨに対して特異的であり、ＦＨの機能を強化し、それによって補体活性化第２経路の活性化を特異的に抑制する。

本発明は、分離された、合成された又は組み換えられた抗体又はそのフラグメントであって、Ｈ因子（ＦＨ）の補体制御タンパクドメイン１７（ＣＣＰ１７）及び／又はＣＣＰ１８に対して特異的に結合してＦＨ活性を強化するものを提供する。

本発明者らは、ＦＨに特異的に結合することができ、ＦＨの機能を強化することができる抗体を初めて開発及び単離した。本発明の強化用抗ＦＨ抗体は、補体活性化第２経路の活性化の強力な阻害因子である。理論によって拘束されることを意図しないが、この増強作用は抗体によるＦＨ分子の多量体化に依存しないと考えられる。実施例において実証されているように、強化用抗ＦＨ抗体は、健康なヒトドナーの血清を用いてインキュベートされた赤血球の溶解を抑制又は完全にブロックする。正常条件下では、健康なヒトドナーの血清を用いたヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）のインキュベーションは、ＳＲＢＣ表面のシアル酸に結合する血清中のＦＨによって防御されるので、ＳＲＢＣの溶解に結びつかない。ＦＨの機能をブロックするモノクローナル抗体を用いた正常ヒト血清のインキュベーションを行う場合、ＳＲＢＣの溶解が観察される。これは血清ＦＨによる細胞表面の不十分な保護によって説明され得る。抗ＦＨブロッキング抗体によって誘導されるこの溶解は、本発明のＦＨ強化抗体によって抑制又はブロックされる。実施例は、本発明の強化用抗ＦＨ抗体が、代替的経路を介したザイモサン及びリポ多糖類（ＬＰＳ）におけるＣ３堆積を抑制することをさらに示す。さらに、無関係な３人のａＨＵＳ患者から得た血清中のＦＨの保護機能を強化用抗ＦＨ抗体が元に戻すことが判明した。実施例において実証されているように、血清を本発明の強化用抗ＦＨ抗体と共にインキュベートした場合、ａＨＵＳ患者の血清が存在下でインキュベートされた赤血球の溶解は、完全に防止された。

実施例は完全な抗ＦＨ抗体だけがＦＨの機能を強化するのではないことをさらに実証している。そのような抗体のＦａｂ’フラグメント及びＦ（ａｂ’）_２フラグメントについても同じ結果が観察される。Ｆａｂ’はＦＨ分子と架橋することができないので、抗体及び抗体フラグメントの増強効果はそのような架橋の結果ではあり得ない。しかし、その実施例は、抗ＦＨ抗体及びそのフラグメントがＣ３堆積を抑制することができることを実証し、試験されたそのフラグメントがＣ３ｂ、ｉＣ３ｂ及びＣ３ｄに対するＦＨの結合を増加させることができることを示唆している。従って、理論によって拘束されるものではないが、強化用抗ＦＨ抗体のＦＨに対する結合は、ＦＨの構造変化を生じさせ、細胞表面のＣ３ｂ、ｉＣ３ｂ及びＣ３ｄに対するＦＨの結合の増加に帰着すると考えられる。

本発明による強化用抗ＦＨ抗体及びフラグメントは、補体系の代替的経路の望まれない又は過剰な活性化を抑制するためのエクリズマブ等の抗Ｃ５抗体よりもさらに好ましい。主な利点は、本発明の抗体及びフラグメントの補体阻害作用が、Ｃ５ではなく活性化されたＣ３のレベルでの補体活性化を阻害し、この阻害が天然の阻害因子を増強することによって生じるということである。その結果、Ｃ３が活性化される場合のみ、Ｃ３に対する阻害だけが生じる。反対に、一般的なＣ３阻害薬を用いると、循環するＣ３はすべてブロックされ、一般的なＣ３欠失に結びつく可能性がある。エクリズマブのターゲットであるＣ５のようなＣ３は補体系の３つの経路すべてに関係するが、ＦＨは代替的経路の増幅ループを特異的に抑制し、Ｃ３のＣ３ｂへの開裂とその後の細胞表面でのＦＢへのその結合、及び、Ｃ３転化酵素の形成は、Ｃ３分子のＣ３ｂへのさらなる開裂を促進する。本発明の抗体及びフラグメントがＣ３のレベルで補体活性化を阻害するという事実の主な利点は、Ｃ３ｂの表面での蓄積及びＣ３ａの放出が回避されることである。反対に、補体活性化がエクリズマブ等のようにＣ５レベルで抑制される場合、Ｃ３ｂの蓄積及びＣ３ａの放出は抑制されない。Ｃ３ｂはオプソニンとして作用し、Ｃ３ａはアナフィラトキシンである。従って、これらのプロセスが免疫細胞の誘引及びターゲットのオプソニン貪食作用に帰着するので、Ｃ３ｂ及びＣ３ａ形成の蓄積は防止されることが好ましい。Ｃ３ｂの蓄積が赤血球のオプソニン作用に帰着し、その後にそれらは肝臓及び脾臓において除去されるので、これは、例えば、エクリズマブを摂取するＰＮＨ患者がまだ輸液剤を必要とすることを意味する。さらに、抗Ｃ５抗体を用いた治療は、細胞表面でのＣ３ｂ及びＣ３ａ形成の蓄積に帰着し、そうでなければＭＡＣによって溶解される。抗Ｃ５抗体の重大な不利益は、抗体が病原体によって誘導された補体活性化も阻害をするので、患者が感染に対して脆弱になることである。ホスト細胞を防御する補体系のレギュレーターをターゲットとすることによって、これは回避される。

本明細書で使用されているように、「抗体」という用語は、少なくとも軽鎖可変領域（ＶＬ）と対になった重鎖可変領域（ＶＨ）を含む免疫グロブリンタンパクであって、ターゲットエピトープに対して特異的であるものを表す。この用語は、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の両方をカバーする。この用語は、ＣＣＰ１７及び／又はＣＣＰ１８に対して、好ましくは、完全長の免疫グロブリンを含むＦＨのＣＣＰ１８に対して特異的に結合するあらゆる形態の抗体を表す。本発明による抗体又はそのフラグメントは少なくとも１つの抗原結合部位を含む。本明細書で使用されているように、「抗原結合部位」は、少なくとも１つのＣＤＲ配列、好ましくは少なくとも２つのＣＤＲ配列、より好ましくは少なくとも３つのＣＤＲ配列を含む抗体又はそのフラグメントを表す。例えば、抗原結合部位は、軽鎖ＣＤＲ１−３又は重鎖ＣＤＲ１−３を含む。特に好ましい抗原結合部位は、軽鎖ＣＤＲ１−３及び重鎖ＣＤＲ１−３を含む。「抗体のフラグメント」は、種類において前記抗体と少なくとも１つの共有された特性を有するが、量的には必ずしも特性が共有されていない一部分として本明細書に定義されている。フラグメントは、前記抗体と同じ抗原、つまり、フラグメントは、ＦＨのＣＣＰ１７及び／又はＣＣＰ１８に対して特異的に結合することができるが、必ずしも同じ程度でなくてもよい。抗体のフラグメントは、前記抗体の少なくとも１つのＣＤＲ配列を含む。前記フラグメントは、好ましくは、抗体の重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列、並びに、前記抗体の軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む。抗体のフラグメントの非限定的な例は、シングルド
メイン抗体、単鎖抗体、ナノボディ、ユニボディ、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、及び、Ｆ（ａｂ）_２フラグメントである。抗体の好ましいフラグメントは、少なくとも重鎖可変領域（ＶＨ）及び／又は軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。より好ましいフラグメントは少なくともＦａｂフラグメントを含む。実施例で実証されているように、本発明の強化用抗ＦＨ抗体のＦａｂ’フラグメントは、ＦＨの機能を強化する能力を保持している。特に好ましいフラグメントは、本発明による抗体のＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、及び、Ｆ（ａｂ）_２フラグメントである。

当業者に周知であるように、抗体は２つの重鎖及び２つの軽鎖を含む。抗体の重鎖は、免疫グロブリン分子を構成する２種の鎖において大きい方である。重鎖は不変領域と可変領域を含み、可変領域は抗原結合に関係する。抗体の軽鎖は、免疫グロブリン分子を構成する２種の鎖の小さい方である。軽鎖は不変領域と可変領域を含む。軽鎖の可変領域は、多くの場合、しかし常にではなく、抗原結合に関与する重鎖の可変領域と同一である。相補性決定領域（ＣＤＲ）は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の中に存在する高度変異領域である。完全長の抗体の場合、重鎖のＣＤＲ１−３及び接続されている軽鎖のＣＤＲ１−３が一緒に抗原結合部位を形成する。

アミノ酸配列若しくは核酸配列の同一性のパーセンテージ、又は、「％配列同一性」という用語は、必要に応じて、最大のパーセント同一性を達成するように２つの配列を整列し、ギャップを導入した後で、対象標準のアミノ酸配列又は核酸配列の残基と同一であるアミノ酸配列又は核酸配列の完全長の残基のパーセンテージとして本明細書で定義される。例えば、「Ａｌｉｇｎ ２」等のように、整列のための方法及びコンピュータプログラムは当業界において周知である。

本発明による抗体及びフラグメントは、ＦＨのＣＣＰ１７及び／又はＣＣＰ１８に特異的に結合する。好ましい抗体及びフラグメントは、少なくともＦＨのＣＣＰ１８と結合する。ＦＨは血漿中で循環する１５５キロダルトン（ｋＤａ）の可溶性糖タンパクである。ＦＨは、ＦＨのＮ末端から始まって１−２０と番号付けられる、２０個の補体制御タンパク（ＣＣＰ）ドメインを含む。ＣＣＰドメインは、ショート・コンセンサス・リピート（ＳＣＲ）又はスシドメインとも呼ばれる。ＣＣＰ１−４はレギュレーションに関与するドメインであり、ＣＣＰ１９−２０はＣ３ｂに結合することに関与しており、ＣＣＰ６、７、８、１９及び２０は細胞の表面で発現されるＧＡＧ及びシアル酸に結合する。ＣＣＰ１９及び／又はＣＣＰ２０と結合する抗体は、ＦＨの活性を抑制する。理論によって拘束されるものではないが、結合領域ＣＣＰ１９及び結合領域ＣＣＰ２０に隣接するドメイン、つまり、ＣＣＰ１７及びＣＣＰ１８に結合する抗体が、ＦＨの活性を強化すると考えられる。確かに、実施例で実証されているように、ＣＣＰ１８と結合する抗体はＦＨの機能を強化する。本明細書で使用されているように、「〜に対して特異的に」という用語及び「特異的に結合する」という用語又は「特異的に結合することができる」という用語は、抗体とそのエピトープとの間の非共有結合的相互作用を表す。それは、抗体又はフラグメントが他のエピトープよりも又は他の抗原よりも当該エピトープに対して選択的に結合することを示す。従って、抗体又はフラグメントは、他のエピトープ又は抗原に対して非特異的に結合してもよいが、そのエピトープに対する前記の抗体又はフラグメントの結合親和力は、他のエピトープ又は抗原に対する前記の抗体又はフラグメントの結合親和力より著しく高い。

本発明による抗体及びフラグメントは、ＦＨの活性を強化することができ、好ましくはヒトＦＨの活性を強化することができる。「ＦＨ活性を強化する」という用語は、本発明による抗体又はフラグメントがＦＨに結合する場合にＦＨの活性が上昇することを意味する。特異的にＦＨに結合する抗体が知られているが、それらの抗体は、ほとんど、例えば免疫学的検定においてＦＨの検出に使用されている。さらに、ＦＨに対して特異的な抗体であって、その機能をブロック又は抑制する抗体が記載されている。本発明者らは、ＦＨとの結合でその機能を強化する、ＦＨ特異的抗体を初めて開発した。驚くべきことに、本発明の強化用抗ＦＨ抗体の活性は、ＦＨの補体抑制活性を上昇させることがわかった。ＦＨ活性はインビトロ又はインビボにおいて強化されることができる。本発明の抗体及びフラグメントによって強化されるＦＨの活性は、好ましくは代替的補体活性化の抑制であり、好ましくは個体におけるそれである。本明細書で使用されているように、「代替的補体活性化」という用語は、代替的経路を介した補体系の活性化、つまり、少なくとも代替的経路のＣ３転化酵素、すなわち、Ｃ３ｂＢｂ／Ｃ３ｂＢｂＰの生成に関与するもの、又は、Ｃ３転化酵素の生成の増加に関与するものを表す。代替的補体活性化は、さらに、代替的経路Ｃ３転化酵素によるＣ３のＣ３ａ及びＣ３ｂへの開裂、代替的経路Ｃ５転換酵素（つまり、Ｃ３ｂＢｂＣ３ｂ／Ｃ３ｂＢｂＣ３ｂ）の生成、及び／又は、Ｃ５の開裂とその後のＣ６、Ｃ７、Ｃ８及びＣ９の結合によるＭＡＣの生成を含んでいてもよい。代替的補体活性化は、代替的経路増幅ループの上昇を含んでいてもよい。前記代替的補体活性化は、好ましくは個体において、好ましくは個体の体液中で、好ましくは血液中、間質液又は脳脊髄液中でより好ましくは血液中で抑制される。本明細書で使用されているように、「個体」は、免疫系の一部として補体系を含むヒト又は動物である。前記個体は、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。

本明細書で使用されているように「代替的補体活性化の抑制」は、代替的補体系の成分、因子、活性の量又は活性におけるあらゆる変化であって、その抑制を生じさせるもの又はその抑制の結果であるものを含む。代替的補体活性化の抑制は、例えば、溶血作用の抑制、前記個体の細胞表面における補体成分３（Ｃ３）堆積の抑制、Ｃ３ｂ、ｉＣ３ｂ及び／又はＣ３ｄに対するＦＨの結合の増加、代替的補体経路Ｃ３転化酵素Ｃ３ｂＢｂ／Ｃ３ｂＢｂＰの生成の抑制、Ｃ３ｂに対するＢ因子の結合の抑制及び／又はＣ３ｂとＢ因子との間の相互作用の抑制、代替的経路Ｃ３転化酵素によるＣ３のＣ３ａ及びＣ３ｂへの開裂の抑制、ホスト細胞に対する、特に、ホスト細胞の表面で発現されたシアル酸、グリコサミノグリカン及び／又はヘパリンに対するＦＨの結合の増加、代替的補体経路の増幅ループの抑制、代替的補体経路Ｃ５転換酵素Ｃ３ｂＢｂＣ３ｂＰ／Ｃ３ｂＢｂＣ３ｂＰの生成の抑制、代替的経路Ｃ５転換酵素によるＣ５のＣ５ａ及びＣ５ｂへの開裂の抑制、ＦＨの分解促進活性の増加、つまり、代替的経路Ｃ３転化酵素が生成されたときの当該転化酵素の解離の促進、並びに／又は、Ｃ３ｂの分解を結果的に生じさせるＦＩ補因子活性の増加を含む。ＦＨによる代替的補体活性化の抑制であって、本発明の抗ＦＨ抗体及びフラグメントによって強化される抑制は、好ましくは、溶血作用の抑制、前記個体の細胞表面におけるＣ３体積の抑制、並びに／又は、Ｃ３ｂ、ｉＣ３ｂ及び／若しくはＣ３ｄに対するＦＨの結合の増加を含む。

本明細書で使用されているように、「抑制」は、示される活性が、少なくとも約２５％、より好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％減少することを意味する。従って、「代替的補体活性化の抑制」は、代替的補体経路の活性が少なくとも約２５％、より好ましくは少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％低下することを意味する。同様に、「溶血作用の抑制」は、溶血作用が少なくとも約２５％、より好ましくは少なくとも約５０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％又は約９５％低下することを意味する。

本明細書で使用されているように、「増加」は、好ましくは、示される活性が、少なくとも約２５％、より好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは、より好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％増加することを意味する。従って、「Ｃ３ｂに対するＦＨの結合の増加」は、好ましくは、Ｃ３ｂに対するＦＨの結合が少なくとも約２５％、より好ましくは少なくとも約５０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％又は約９５％増加することを意味する。同様に、「ホスト細胞に対するＦＨの結合の増加」は、ホスト細胞に対するＦＨの結合が、少なくとも約２５％、より好ましくは少なくとも約５０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％又は約９５％増加することを意味する。

本明細書で使用されているように、「溶血作用」は、好ましくは細胞表面におけるＭＡＣの生成の結果として、赤血球の破裂及びその後の、例えば、補体系の活性化によって誘導される循環中への細胞成分の放出を表す。溶血作用は、例えば、本明細書中で実施例に記載されているように、Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｃｏｒｒａｌら（２００４）及びＷｏｕｔｅｒｓら（２００８）に記載されているように溶血分析を使用することにより測定され、任意にいくつかの修飾がされていてもよい。この分析では、ヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）等の赤血球は、例えば、攪拌しながら３７℃で１．２５時間にわたって血清（例えば、ヒト血清）と共にインキュベートされる。低レベルのＦＨ又は機能しないＦＨを有する血清はＳＲＢＣ細胞分解に至る。溶解は、２０ｍＭ ＥＤＴＡを含むベロナール緩衝液の追加し、その後に予め冷却した遠心機（例えば７℃）で２．５分間遠心分離することによって停止させることができる。赤血球溶解のパーセンテージは、上澄みの吸収度を４１２ｎｍで測定することによって測定される。血清は、例えば、健康なヒト個体、又は、ａＨＵＳ等の望まれない又は過度の代替的補体活性化経路に関連した疾患を患うヒト個体から得ることができる。抗体又はフラグメントが溶血作用を抑制する能力は、抗体又はフラグメントの存在下で血清と共に赤血球をインキュベートすることによって測定することができる。

Ｃ３堆積の抑制は、例えば、実施例に記載されているように、Ｃ３堆積分析を使用して測定された。この分析は、ザイモサン又はＬＰＳのいずれかを用いた微量定量プレートのコーティングを含む。そのプレートは、次に、上述されているように、抗体又はフラグメントが存在する状態又はしない状態で、血清（例えば、健康なヒトから得たもの又は望まれない若しくは過度の代替的補体活性化に関連した疾患を患う個体から得たもの）と共にインキュベートされる。ザイモサン又はＬＰＳにおけるＣ３堆積は抗Ｃ３抗体で検出することができる。

ＦＨのＣ３ｂへの結合の増加は、例えば、実施例に記載されているようにＥＬＩＳＡを使用して測定される。この分析は、Ｃ３ｂで微小滴定ＥＬＩＳＡプレートをコーティングすること、及び、血清（例えば、健康なヒトから得たもの又は望まれない若しくは過度の代替的補体活性化に関連した疾患を患う個体から得たもの）と共にそのプレートをインキュベートすることを含む。結合したＦＨは、ペルオキシダーゼで標識されたポリクローナル抗ＦＨ等の抗ＦＨ抗体を用いて検出することができる。抗体又はフラグメントがＣ３ｂに対するＦＨの結合を増強する能力は、コーティングされたＣ３ｂと共にインキュベートする前に、抗体又はフラグメントが存在する状態で血清をプレインキュベーションすることによって測定することができる。他の一例として、Ｃ３ｂに対するＦＨの結合は表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して測定することができる。ＳＰＲは、ラベルフリー環境でリアルタイムに生体分子の相互作用を測定する技術である。例えば、本発明の（異なる濃度の）抗体又はフラグメントの存在下又は非存在下において、相互作用因子（例えばＣ３ｂ）の１つはセンサ表面に固定され、他方（例えば、ＦＨ）は溶液中で自由であり、表面を通過する。

本発明による抗体又はそのフラグメントは好ましくはモノクローナル抗体又はフラグメントである。モノクローナル抗体は単一の分子種からなる抗体である。モノクローナル抗体は、組み換えによって有利に生産することができ、抗血清中に存在するポリクローナル抗体より著しく多い量の抗体を得ることができる。しかし、ポリクローナル抗体及びフラグメントも本発明に包含される。本発明による抗体又はフラグメントは、好ましくはキメラ抗体又はヒト化抗体である。従って、前記抗体又はフラグメントは、少なくともヒト軽鎖及びヒト重鎖の不変領域を好ましくは含む。より好ましくは、前記抗体又はフラグメントは、重鎖及び軽鎖の可変領域中にヒトフレームワーク領域を含む。さらに好ましいのは、ヒト化抗体又はフラグメントであって、完全にヒト配列からなるものである。非ヒト抗体又はフラグメントのヒト疾病の治療のための使用は、多くの要因によって阻害されるので、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体の使用は、非ヒト抗体の使用よりも好ましい。人体は非ヒト抗体を外来のものとして認識する可能性があり、それはその非ヒト抗体又はフラグメントに対する免疫反応を生じさせ、不都合な副作用及び／又は循環からの抗体又はフラグメントの迅速な除去に帰着するであろう。キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト化抗体をヒトに投与する場合、副作用の可能性は低下する。さらに、一般的に、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト化抗体を使用した場合、非ヒト抗体と比較して、除去の減少により、循環中でより長い半減期が達成される。

本発明による、ＦＨ等の特定の抗原に対して特異的な抗体は、当業界において知られている様々な方法によって調製することができる。例えば、ヒトＦＨは、抗体を誘導するための免疫原として使用することができる。他の一例として、ヒトＦＨのＣＣＰ１７及び／又はＣＣＰ１８ドメインは、免疫原として使用されてもよい。そのような方法の１つの例は、実施例に記載されているような免疫処置及びハイブリドーマ生成による。例えば、ＦＨに対するマウスモノクローナル抗体は、例えば４週間にわたって、任意にモンタニド等の抗原性補強剤の存在下で、ヒト因子Ｈを腹腔内に入れて、マウス（例えばＢＡＬＢ／ｃマウス）を免疫化することによって生成される。４回目の免疫化の数日後に、脾臓細胞は、例えば、骨髄細胞系ＳＰ２／０と融合されてもよい。融合細胞の上澄みの中のＨ因子特異抗体の存在は、ＥＬＩＳＡによって調べることができる。例えば、微量定量プレートは、マウスＩｇＧ抗体を捕捉するためにｍｏＡｂ（例えば、ラット抗マウスカッパｍｏＡｂ ＲＭ１９）でコーティングされている。抗体の特異性はビオチン化されたＨ因子によって測定した。ＦＨ特異抗体を提供する方法の他の一例は、免疫グロブリン鎖をコードする組み換え型の核酸配列を発現するファージディスプレイライブラリをスクリーニングすることによる。抗体ファージディスプレーのための方法は、当業界において使用されており、広く記述されている。抗体のためのライブラリのスクリーニングは、例えば、ヒトＦＨ又はヒトＦＨのＣＣＰ１７ドメイン若しくはＣＣＰ１８ドメイン等の免疫化に使用されるのと同じ抗原を用いて行うことができる。

ＦＨに対して特異的な、特に、ＦＨのＣＣＰ１７及び／又はＣＣＰ１８に対して特異的な抗体又はフラグメントが得られれば、その所望の生物活性（つまり、ＦＨの活性を強化する能力）は、当業者に知られているいくつかの方法によって調べることができる。本明細書で前述されているように、ＦＨの活性の強化は、好ましくは、溶血作用の抑制、細胞におけるＣ３堆積の抑制、及び／又は、Ｃ３ｂへのＦＨの結合の増加を含む。これらの活性を調べる機能分析は、本明細書において前述されており、実施例に詳述されている。

本発明による特に好ましい抗体は、抗ＦＨ．０７抗体であり、その調製及び同定は実施例に記載されている。表１は、抗ＦＨ．０７抗体の可変の重鎖配列と軽鎖配列及び個々のＣＤＲ配列の概要を提供する。さらにより好ましいのは、抗ＦＨ．０７抗体の重鎖ＣＤＲ配列と軽鎖ＣＤＲ配列、又は、抗ＦＨ．０７抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含むモノクローナルキメラ抗体若しくはモノクローナルヒト化抗体又はそれらフラグメントである。「抗ＦＨ．０７」という用語は、本明細書で使用されているように、例えば、単離及び／又は精製された抗体又は組み換えによって作成された抗体等のように、表１に示されているような少なくとも重鎖及び軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域を有するすべての抗体及びフラグメントを包含する。本発明による他の好ましい抗体又はフラグメントは、ＦＨに対する結合、特に、ＦＨのＣＣＰ１８に対する結合において抗ＦＨ．０７抗体と競合する抗体又はフラグメントである。従って、さらに提供されるのは、ＣＣＰ１７及び／又はＣＣＰ１８に対して特異的に結合する抗体又はそのフラグメントであり、好ましくは、Ｈ因子（ＦＨ）のＣＣＰ１８に対して特異的に結合するものであって、ＦＨ活性を強化し、また、ＦＨに対する結合において抗ＦＨ．０７抗体と競合するものである。競合は、当業界において周知の方法を使用して、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ３０００ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ、英国）を用いて表面プラズモン共鳴によって測定することができる。ＦＨはセンサチップで固定されて、競争する可能性がある抗体は、固定されたＦＨの上を飛ばされる。表１の重鎖及び軽鎖のＣＤＲ配列に基づいて、表１に示されているような少なくとも１つのＣＤＲ配列を含む抗体又はフラグメントを生産することが可能である。その抗体又はフラグメントはＦＨのＣＣ１８に対して特異的である。

従って、本発明は、単離、合成又は組み換えされた抗体又はそのフラグメントであって、
−配列番号５の重鎖ＣＤＲ１配列、及び／又は、
−配列番号６の重鎖ＣＤＲ２配列、及び／又は、
−配列番号７の重鎖ＣＤＲ３配列、及び／又は、
−配列番号１の軽鎖ＣＤＲ１配列、及び／又は、
−配列番号２の軽鎖ＣＤＲ２配列、及び／又は、
−配列番号３の軽鎖ＣＤＲ３配列を含むものさらに提供する。
前記抗体は、ＦＨの補体ＣＣＰ１７及び／又は補体ＣＣＰ１８に対して特異的に結合し、より好ましくはＣＣＰ１８に対して特異的に結合し、ＦＨ活性を強化する。より好ましくは、本発明による抗体又はフラグメントは、表１の３つの重鎖ＣＤＲのすべて及び３つの軽鎖ＣＤＲのすべて含む。一実施形態において、本発明による抗体又はフラグメントは、表１に示されているように、重鎖可変領域配列及び／又は軽鎖可変領域配列を含む。従って、さらに提供されるのは、配列番号８の重鎖配列及び／又は配列番号４の軽鎖配列を有する本発明による抗体又はフラグメントである。

任意に、前記ＣＤＲの少なくとも１つの配列は、例えば、結合親和力、ＦＨを強化する能力、又は、インビボ若しくは貯蔵における安定性を改良するように最適化されており、それによって、変異体抗体を生成している。さらに、任意に、本発明の抗体又はフラグメントのフレームワーク領域の少なくとも１つの少なくとも１つの配列は、例えば、抗体若しくはフラグメントの結合効果若しくは安定を改良するように、又は、ヒトに投与後に非ヒト配列の副作用を低減するように、最適化されている。これは、例えば、変異誘発処理によって行われる。当業者は、少なくとも１つの変更されたＣＤＲ又はフレームワーク配列を含む抗体変異体を生成することができる。ＣＤＲ及び／又はフレームワーク配列は、例えば、そのようなフレームワーク配列をコードする核酸分子を変異させることによって最適化される。例えば、保存アミノ酸置換が適用される。保存アミノ酸置換の例は、イソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニン等の１つの疎水性残基の他の疎水性残基による置換、及び、アルギニンのリジンによる置換、アスパラギン酸のグルタミン酸による置換、又は、アスパラギンのグルタミンによる置換等のような他の極残基による１つの極残基の置換を含む。改良された抗体又はフラグメントを選択するために、結合親和力、ＦＨを強化する能力、及び／又は、得られる変異体抗体の安定を調べることが好ましい。好ましくは、ヒト生殖細胞系列配列は、本発明による抗体又はフラグメント中のフレームワーク領域のために使用される。ヒト生殖細胞系列配列の使用は、フレームワーク領域が由来し、かつ、他のヒト個体に適用された場合に免疫原反応を引き起こす可能性がある個体特有の体細胞変異を含む可能性が低いので、前記抗体の免疫原性のリスクを最小化する。典型的には、アミノ酸残基が同じ特異性を保持しながら、最大３つまでのＣＤＲ配列が変化してもよい。従って、本発明による抗体又はフラグメントは、好ましくは、重鎖と軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含み、表１の重鎖及び軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列と比較して、各ＣＤＲの最大で３つ、好ましくは最大で２つ、より好ましくは最大で１つのアミノ酸が変化している。

従って、本発明は、単離された、合成された、又は組み換えられた抗体又はそのフラグメントであって、
−配列番号５の配列に対して少なくとも８０％同一の配列を含む重鎖ＣＤＲ１配列、及び／又は、
−配列番号６の配列に対して少なくとも８０％同一の配列を含む重鎖ＣＤＲ２配列、及び／又は、
−配列番号７の配列に対して少なくとも８０％同一の配列を含む重鎖ＣＤＲ３配列、及び／又は、
−配列番号１の配列に対して少なくとも８０％同一の配列を含む軽鎖ＣＤＲ１配列、及び／又は、
−配列番号２の配列に対して少なくとも８０％同一の配列を含む軽鎖ＣＤＲ２配列、及び／又は、
−配列番号３の配列に少なくとも８０％同一の配列を含む軽鎖ＣＤＲ３配列を含むものをさらに提供する。前記抗体は、好ましくはＦＨの補体ＣＣＰ１７及び／又は補体ＣＣＰ１８に対して特異的に結合し、より好ましくはＣＣＰ１８に対して特異的に結合し、ＦＨ活性を強化する。好ましくは、抗体又はフラグメントは、これらの配列に対して、少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％同一である重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／若しくは又はＣＤＲ３配列、並びに／又は、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／若しくはＣＤＲ３配列を含む。

さらに提供されるのは、配列番号８の配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む重鎖配列を含み又は有し、及び／若しくは、配列番号４の配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む軽鎖配列を含み又は有し、又は、これらの重鎖若しくは軽鎖の可変領域配列のいずれか１つに対して、少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％同一である配列を含み又は有する本発明による抗体又はフラグメントである。

本発明は、本発明による抗体又はフラグメントをコードする核酸配列を含む、単離された、合成された、又は組み換えされた核酸分子をさらに提供する。好ましい核酸分子は、少なくとも、表１に示されているような重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、並びに、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３をコードする。好ましくは、本発明による核酸分子は、少なくとも３０個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも５０個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも７５個のヌクレオチド長さを有する。本発明による核酸分子は、好ましくは、表１に示されているように、抗ＦＨ．０７抗体の重鎖ＣＤＲ配列及び軽鎖ＣＤＲ配列、又は、抗ＦＨ．０７抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含むモノクローナルキメラ抗体若しくはモノクローナルヒト化抗体又はそれらのフラグメントをコードする。抗ＦＨ．０７抗体の重鎖と軽鎖のＣＤＲ配列をコードする核酸配列は表１に示されている。しかし、本発明による抗体の重鎖又は軽鎖のＣＤＲをコードする核酸分子であって、表１に示されているＣＤＲ核酸配列とは異なるが、表１に示されている前記重鎖又は軽鎖のＣＤＲ配列のアミノ酸配列をコードする核酸コドンを含む核酸配列を含む核酸分子もまた本発明に包含される。従って、提供されるのは、少なくとも配列番号１、２、３、５、６及び７の配列をコードする核酸配列を含む、単離された、合成された又は組み換えられた核酸分子である。さらに提供した、少なくとも配列番号４及び配列番号８の配列をコードする核酸配列を含む、単離された、合成された又は組み換えられた核酸分子である。また、重鎖ＣＤＲ及び／又は軽鎖ＣＤＲをコードする核酸分子又は抗体であって、例えば、保存アミノ酸置換によって修飾されたものは、コードされるＣＤＲアミノ酸配列が、表１に示されているＣＤＲ配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する限り、本発明に包含される。

本発明による核酸分子又は核酸配列は、好ましくはヌクレオチドの鎖を含み、より好ましくはＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含む。しかし、本発明の核酸分子又は核酸配列は、例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡ螺旋、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックされた核酸（ＬＮＡ）及び／又はリボザイム等の他の種類の核酸構造を含んでいてもよい。そのような他の核酸構造は、核酸配列の機能性等価物と呼ばれ、本発明に包含される。「核酸配列の機能的等価物」という用語は、非天然のヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド、及び／又は、天然のヌクレオチドと同じ機能を示す非ヌクレオチド構成要素を含む鎖をさらに包含する。

本発明は、単離された、合成された又は組み換えられた核酸分子であって、
−配列番号１３の配列に対して少なくとも８０％同一の配列を含む重鎖ＣＤＲ１配列、及び／又は、
−配列番号１４の配列に対して少なくとも８０％同一の配列を含む重鎖ＣＤＲ２配列、及び／又は、
−配列番号１５の配列に対して少なくとも８０％同一の配列を含む重鎖ＣＤＲ３配列、及び／又は、
−配列番号９の配列に対して少なくとも８０％同一の配列を含む軽鎖ＣＤＲ１配列、及び／又は、
−配列番号１０の配列に対して少なくとも８０％同一の配列を含む軽鎖ＣＤＲ２配列、及び／又は、
−配列番号１１の配列に対して少なくとも８０％同一の配列を含む軽鎖ＣＤＲ３配列を含む核酸分子をさらに提供する。本発明による核酸分子は、好ましくは、前記ＣＤＲ配列に対して、少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。好ましくは、前記核酸分子は、配列番号１６の配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む重鎖配列、及び／若しくは、配列番号１２の配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む軽鎖配列を含み、配列番号１２及び／若しくは配列番号１６に対してより好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％配列同一性を有する。

本発明は、本発明による核酸分子を含むベクターをさらに提供する。好ましいベクターはプラスミドである。「プラスミド」は環状であり、好ましくは二重らせん構造のＤＮＡ分子として本明細書では定義される。本発明による核酸分子を含むベクターを調製する方法は当業界において周知である。本発明のベクターを生成するのに適したベクターの非限定的な例は、レトロウイルスベクター及びレンチウイルスベクターである。本発明によるベクターは様々な用途に使用することができる。本発明によるベクターは、好ましくは細胞中での本発明の核酸分子のインビトロ発現のために、好ましくは本発明による抗体又はフラグメントの生成のために使用される。さらに、本発明の核酸分子を含む本発明のベクターを治療のために使用することができる。個体、好ましくは、必要性のあるヒトに対するそのようなベクターの投与は、本発明の抗体又はフラグメントのインビボ発現をもたらす。

さらに提供されるのは、本発明による核酸分子又はベクターを含む組み換え型の細胞である。そのような核酸分子又はベクターは、好ましくは、細胞の核酸翻訳機構がコードされる抗体又はフラグメントを生産するように、前記細胞中に導入される。本発明による核酸分子又はベクターは、好ましくは、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＮＳＯ（マウス骨髄腫）又は２９３（Ｔ）細胞株の細胞等のいわゆる産生細胞中で発現される。これらの一部は商業的な抗体産生に適している。そのような産生細胞の増殖は、本発明の抗体又はフラグメントを生産することができる産生細胞株に帰着する。好ましくは、前記産生細胞株は、ヒトで使用される抗体を生産するのに適している。従って、前記産生細胞株は、好ましくは、病原性の微生物等の病原因子を含まない。

本発明は、本発明による抗体又はフラグメントを生産する方法であって、細胞に本発明による核酸分子又はベクターを提供するステップと、前記細胞が核酸分子又はベクターに含まれる核酸配列を翻訳することを可能にし、それによって本発明による前記抗体又はフラグメントを生産するステップを含む方法をさらに提供する。本発明の方法は、好ましくは、前記抗体又はフラグメントを回収、精製、及び／又は単離するステップをさらに含む。また、抗体又はフラグメントを生産するための本発明の方法で得られる抗体又はフラグメントが提供される。

本発明の抗体又はフラグメントは、治療用途において有利に使用することができる。従って、提供されるのは、本発明の抗体又はフラグメントと、薬学的に許容できる担体、希釈剤及び／又は賦形剤とを含む医薬組成物である。さらに提供されるのは、本発明の核酸分子又はベクターと、少なくとも１つの薬学的に許容できる担体、希釈剤及び／又は賦形剤とを含む医薬組成物である。適切な担体の非限定的な例は、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミン（例えば、ＢＳＡ又はＲＳＡ）及びオバルブミンである。好ましい担体は、水溶液（例えば、食塩水）又は油をベースとした溶液等のような溶液である。錠剤、カプセル等に組み込むことができる賦形剤の非限定的な例は、トラガカントゴム、アラビアゴム、トウモロコシデンプン又はゼラチン等のようなバインダー、微結晶性セルロース等のような賦形剤、コーンスターチ、α化デンプン及びアルギン酸等のような崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム等のような潤滑剤、スクロース、ラクトース又はサッカリンのような甘味剤、及び、ペパーミント、ウインターグリーン油又はチェリー油等のような香料である。用量単位形態がカプセルである場合、そのカプセルは、好ましくは、上記の賦形剤の１つ以上に加えて、脂肪油等のような液状単体を含む。コーティングとして、又は、用量単位の物理的形状を修飾するために、様々な他の材料が存在してもよい。例えば、錠剤は、シェラック及び／若しくは糖又は両方でコーティングされていてもよい。本発明の医薬組成物は、ヒト使用に好適である。

本明細書に記載されている医薬組成物は、様々な異なる方法で投与することができる。例は、本発明の抗体を含み、薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物を、口、鼻腔、直腸、局所、腹腔、静脈、筋肉、皮下、皮膚下、経皮、鞘及び頭蓋を介した方法で投与するステップを含む。経口投与については、有効成分は、カプセル、錠剤及び粉末等のような固体製剤形式、又は、エリキシル剤、シロップ剤及び懸濁剤等のような液体形式で投与することができる。注射するための無菌組成物は、水、若しくは、ゴマ油、ココナッツ油、ピーナッツ油、綿実油等のような天然油、又は、オレイン酸エチル等の合成脂質媒体のような注入用媒体中に本発明の抗体又はフラグメントを溶解する又は懸濁することによって、従来の医薬プラクティスによって調剤することができる。バッファー、保存剤及び／又は酸化防止剤が組み込まれていてもよい。

本発明は、さらに、治療において使用するための本発明の抗体又はフラグメントを提供する。さらに提供されるのは、療法において使用するための本発明の核酸分子である。前記療法は治療であってもよいし又は予防であってもよい。本発明の抗体又はフラグメントは、代替的補体活性化経路に関連した疾患の治療、緩和又は予防に特に適している。従って、提供されるのは、代替的補体活性化経路に関連した疾患の治療、緩和又は予防において使用するための本発明の抗体又はフラグメントである。さらに提供されるのは、代替的補体活性化経路に関連した疾患の治療、緩和又は予防において使用するための本発明の核酸分子である。本明細書で使用されているように、「代替的補体活性化に関連した疾患」は、望まれない及び／又は過度の代替的補体活性化経路が、細胞、組織又は細胞間マトリックスのダメージに至る疾患として本明細書に定義される。望まれない及び／又は過度の代替的経路活性化によってダメージを受ける細胞は、例えば、赤血球、上皮細胞、特に、肝臓及び／又は腎臓の上皮細胞、血小板、白血球、内皮細胞等の血液に接しているあらゆる細胞である。前記疾患は、好ましくは、損なわれたＦＨ機能又はＦＨ不足に関連した疾患である。より好ましくは、前記疾患は、ＦＨ欠損に関するものではなく、損なわれたＦＨ機能又はＦＨ不足に関連した疾患である。本発明の抗体及びフラグメントはＦＨの機能を強化するので、抗体及びフラグメントは損なわれたＦＨ機能又はＦＨ不足の影響をブロックし又は弱めるのに特に適切である。しかし、実施例で実証されているように、本発明の強化用抗ＦＨ抗体は、損なわれた代替的経路活性化を有する患者の血清と共にインキュベートした赤血球の溶解を抑制するだけでなく、ＦＨが人工的にブロックされた健康なヒトの血清と共にインキュベートした赤血球の溶解をも抑制する。従って、抗体及びフラグメントは、害されたＦＨ機能又はＦＨ不足以外の要因によって引き起こされる、望まれない及び／又は過度の代替的補体活性化経路をブロック又は低減するために使用することもできる。治療することができるそのような疾患の非限定的な例は、非定型溶血尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、発作性夜間色素尿症（ＰＮＨ）、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、膜性増殖性糸球体腎炎（ＭＰＧＮ）である。

補体を介したＨＵＳとも称される非定型溶血尿毒症症候群（ａＨＵＳ）は、溶血性貧血、血小板減少症、全身性血栓性微小血管障害（ＴＭＡ）及び腎不全を特徴とする。ａＨＵＳの発病は、典型的に幼年期であり、その病気の発現は、例えば、感染、妊娠、他の病気、外科手術又は外傷に関連する。ａＨＵＳ患者の６０％以上は、血漿交換又は血漿補充を受けても、死亡するか又は末期腎疾患（ＥＳＲＤ）に進行する。補体系の成分又は要因にけるいくつかの変異がａＨＵＳを有する患者において確認されている。ＦＨ、ＦＩ、ＦＢ、細胞膜補因子タンパク（ＭＣＰ）、トロンボモジュリン（ＴＨＢＤ）又はＣ３における変異は、ａＨＵＳを有する患者における既知の変異の約５０％を構成し、ＦＨの変異が最も高頻度である（ａＨＵＳ患者の約２０％〜３０％）。大多数の患者は変異についてヘテロ接合であるが、それは病理学的なＦＨ不足に帰着する。さらに、患者の約１０％において、ａＨＵＳはＦＨに対する自己抗体によって引き起こされ、それによってもまた、機能するＦＨが低下する。現在のところ、ａＨＵＳのための標準的な治療は、血漿補充療法又は血漿交換療法である。また、エクリズマブはａＨＵＳを有する患者の治療において使用されている。腎移植は高い再発リスクに関係しており、高い再発リスクは変異が根本にあるａＨＵＳに依存する。再発リスクの増加により、ＦＨ、ＦＢ、ＦＩ、Ｃ３又はＴＨＢＤにおける変異を有する小児において腎移植は禁忌である。好ましくは少なくともＦａｂフラグメントを含む本発明の抗体又はフラグメントは、ＦＨにおける変異又は抗ＦＨ自己抗体の存在によって引き起こされるａＨＵＳの治療、緩和又は予防に特に適している。しかし、本発明の抗体及びフラグメントは、損なわれたＦＨ機能又はＦＨ不足がなくてもＦＨ
の活性を強化するので、本発明の抗体又はフラグメントを用いて、補体に依存したａＨＵＳのあらゆる形態を有利に治療、緩和又は予防することができる。

発作性夜間色素尿症（ＰＮＨ）は、分化全能性造血幹細胞のＸ染色体における遺伝子変異によって引き起こされる。その変異は、グリコシルホスファチジルイノシトール・メンブレン・アンカリング・プロテイン（ＧＰＩ−ＡＰ）の合成にとって重要なホスファチジルイノシトール・グリカン・クラスＡタンパクの欠失に結びつく。補体系ＣＤ５５の阻害因子は、そのようなタンパクの一例であり、ホスト細胞表面でＣ３ｂに結合し、それによってＣ３転化酵素の形成を防ぐ。従って、これらのタンパクの欠失は望まれない又は過度の補体活性化に帰着する。ＰＮＨの主な結果の１つは、補体系の過剰な活動の結果として、赤血球が溶解することである。最近、いくつかの国々においてＰＮＨの治療のために、エクリズマブが承認された。他の治療法は、輸血、赤血球促進剤療法、コルチコステロイド及びタンパク同化ステロイドを用いた治療を含む。本発明の抗体及びフラグメントは好ましくはＦＨのレベル又はＦＨ機能から独立してＦＨの活性を強化し、それによって補体系の代替的経路の活性化を抑制するので、抗体及びフラグメントはＰＮＨ患者において有利に使用することができる。さらに、本発明の抗体及びフラグメントはＣ３堆積のレベルで作用するので、活性化経路のより下流に作用するエクリズマブとは対照的に、がＣ３ｂによってオプソニン化される細胞がより少なくなるため、肝臓中の細胞の消耗が減少する。

加齢黄斑変性（ＡＭＤ）は、網膜情動に対するダメージであり、通常は年配の個体に影響し、視野の中心において、斑点状の視力喪失に帰着する。近年、ＦＨにおいて、変異及びＳＮＰ（一塩基変異多型）は、ＡＭＤ患者の約３５％に関与している。ＳＮＰはＦＨのＣＣＰ７に位置し、ＦＨのヘパリンに対する結合に影響し、それによって、ＦＨがホスト細胞表面と細胞間マトリックスに結合する能力を損なっていることが実証された。好ましくは少なくともＦａｂフラグメントを含む本発明の抗体又はフラグメントは、好ましくはＦＨをコードする遺伝子中のＳＮＰによるＦＨ機能の低下を特徴とするＡＭＤの治療、緩和又は予防に特に適している。

膜性増殖性糸球体腎炎（ＭＰＧＮ）は、主として小児と若年層に生じる慢性腎炎の珍しい原因である。ＭＰＧＮは、血管間膜細胞及び内皮細胞の増殖並びにメサンギウムマトリクスの膨張、内皮下の免疫沈着物及び／又は膜内の高密度沈着物による末梢毛細血管壁の肥厚、並びに、毛細血管壁中への血管間膜の挿入の結果として、糸球体障害を引き起こす。ＭＰＧＮは、多くの場合、ＦＨの完全欠損に関係している。本発明の抗体及び／又はフラグメントを用いて治療することができるＭＰＧＮは、ＦＨ欠損とではなく、好ましくは、損なわれたＦＨ機能又はＦＨ不足に関係している。従って、本発明は、代替的補体活性化経路に関連した疾患の治療、緩和又は予防における本発明の使用のための抗体若しくはフラグメント又は核酸分子であって、前記疾患が、非定型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、膜性増殖性糸球体腎炎（ＭＰＧＮ）からなる群から選択されるものを提供する。さらに提供されるのは、代替的補体活性化経路に関連した疾患の治療、緩和又は予防のための薬物の調製のための、本発明の抗体若しくはフラグメント、核酸分子又はベクターの使用である。前記疾患は、好ましくは、不定形溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、膜性増殖性糸球体腎炎（ＭＰＧＮ）からなる群から選択される。本発明の薬剤又は予防薬として使用されるのに好ましい抗体は、抗体又はそのフラグメントであり、好ましくはＦａｂ、Ｆａｂ’又はＦ（ａｂ）_２若しくはＦ（ａｂ’）_２フラグメントであって、表１に示されているように、重鎖及び軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３で構成される。前記抗体又はフラグメントは、好ましくは、モノクローナルヒト抗体若しくはモノクローナルキメラ抗体又はフラグメントである。

本発明は、本発明の抗体若しくはフラグメント又は本発明の核酸分子若しくはベクターを個体に投与することを含む代替的補体活性化を抑制する方法をさらに提供する。

本発明は、代替的補体活性化経路に関連する疾患を治療、緩和又は予防する方法であって、必要性のある個体に本発明の抗体又はフラグメントの治療的有効量を投与することを含む方法をさらに提供する。さらに提供されるのは、代替的補体活性化経路に関連する疾患を治療、緩和又は予防する方法であって、を必要性のある個体に本発明の核酸分子又はベクターの治療的有効量投与することを含む方法をさらに提供する。さらに提供されるのは、代替的補体活性化経路に関連する疾患を治療、緩和又は予防する方法であって、必要性のある個体に本発明の医薬組成物の治療的有効量を投与することを含む方法をさらに提供する。前記疾患は、好ましくは、非定型溶血尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、発作性夜間色素尿症（ＰＮＨ）、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、膜性増殖性糸球体腎炎（ＭＰＧＮ）からなる群から選択される。本明細書で使用されているように、「個体」は、免疫系の一部として補体系を有するヒト又は動物であり、好ましくは哺乳動物である。特に好ましい実施形態において個体はヒトである。本発明の方法において使用されるのに好ましい抗体は、抗体又はそのフラグメントであり、好ましくは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’Ｆ（ａｂ）_２又はＦ（ａｂ’）_２フラグメントであって、表１に示されているように重鎖及び軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３で構成される。前記抗体又はフラグメントは、好ましくは、モノクローナルヒト化抗体若しくはモノクローナルキメラ抗体又はフラグメントである。

本発明の抗体、フラグメント、核酸分子を含む組成物は予防的処置及び／又は治療的処置のために投与することができる。治療用途においては、本発明の抗体、フラグメント、核酸分子又は組成物は、既に病気を患う及び／又は既に病気の症状を示す、個体に対して、好ましくはヒトに対して、その病気及び／又はその合併症の症状を打ち消すのに十分な量で投与される。予防的用途においては、本発明の抗体、フラグメント、核酸分子又は組成物は、個体が疾患の症状を示す前に、それらの症状又はそれらの合併症の進展を防ぐために、個体に対して投与される。例えば、代替的補体活性化に関連した疾患を引き起こす可能性がある又は引き起こす遺伝子変異を持っている個体は、本発明の抗体、フラグメント、核酸分子又は組成物を用いて予防的に治療することができる。抗体、フラグメント又は核酸分子は、典型的には、本発明の医薬組成物中に治療量で存在し、治療量は、疾患、特に、補体系の代替的経路の望まれない又は過剰な活性化に関連した疾患に関連した症状を治療するのに十分な量である。

明確性及び簡潔な説明の目的のために、特徴は、本発明の一部として又は本発明の個別の態様若しくは実施形態として、本明細書に記載されていてもよい。本発明の範囲が、本発明の一部又は個別の実施形態として、本明細書に記載されている特徴のすべて又はいくつかの組み合わせを有する実施形態を含んでいてもよいことは当業者によって理解されるであろう。

本発明は以下の非限定的な実施例においてより詳細に説明される。

抗ＦＨ．０７抗体のアミノ酸及びヌクレオチド配列（ＩＭＧＴナンバリングシステムに従ったＣＤＲナンバリング（Ｌｅｆｒａｎｃ １９９７、Ｌｅｆｒａｎｃ １９９９、及び、Ｌｅｆｒａｎｃら、２００３）。

図１：モノクローナル抗ＦＨ．０７抗体のエピトープの評価。組み換え型ＦＨのＣＣＰドメイン１５−１８、１５−１９及び１８−２０に対する結合によって示されているように、抗ＦＨ．０７は、ＣＣＰ１８を対象としている。 図２は、抗ＦＨ．０７が、健康なドナー血清中でｍｏＡｂ抗ＦＨ．０９（ＣＣＰ６に対してｍｏＡｂをブロックする）によって誘導されるＳＲＢＣ溶解を抑制することを示している。図２Ａは、ＳＲＢＣ細胞溶解を誘導する抗ＦＨ．０９の力価滴定を示している。ＳＲＢＣ細胞溶解は固定量の抗ＦＨ．０７（５００ｎＭ）によって抑制された。図２Ｂは、最適値以下の細胞溶解を誘導するための固定量の抗ＦＨ．０９（８．５μｇ／ｍｌ）を示している。ＳＲＢＣ細胞溶解は抗ＦＨ．０７の量を増加させることによって抑制された。 図３Ａ及びＢは、ザイモサン及びＬＰＳのコーティング上でのＣ３堆積によって測定されるように、抗ＦＨ．０７及びそのＦ（ａｂ’）_２フラグメント及びＦａｂ’フラグメントは代替的経路活性化を抑制することを示している。図３Ａは、固定量の抗ＦＨ．０７（完全長、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、５００ｎＭ）、ザイモサン上での血清力価滴定を示している。図３Ｂは、ＬＰＳ上での固定された血清希釈物、抗ＦＨ．０７（完全長の、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’）の力価滴定を示している。図３Ｃは、ＦＨの架橋はブリッジングＥＬＩＳＡを用いて測定したものを示している。Ｆａｂ’はＦＨと架橋することができないことを示している。 図４は、ａＨＵＳ患者血清中の機能するＦＨが不十分であることが原因であるＳＲＢＣ溶解は、抗ＦＨ．０７（完全長の、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント又はＦａｂ’フラグメントのいずれか）によって抑制することができることを示している。図４Ｂ及び図４Ｃは、Ｍｇ ＥＧＴＡ中の１０％（ｖ／ｖ）の血清＋１００μｇ／ｍｌの完全長の抗体、Ｆ（ａｂ’）２又はＦａｂ’フラグメントを示している。 図５Ａは、ＥＬＩＳＡによって測定されるように、抗ＦＨ．０７は、ＦＨのＣ３ｂに対する結合を増加させることを示している。図５Ｂ、図５Ｃ及び図５Ｄは、（Ｂ）Ｃ３ｂ、（Ｃ）ｉＣ３ｂ及び（Ｄ）Ｃ３ｄを用いたＦＨ相互作用のＳＰＲ分析のセンサーグラムを示している。抗ＦＨ．０７Ｆａｂ’フラグメントの添加は、ＦＨ結合の増加を反映して、測定されたＲＵをすべての表面において少なくとも２倍増加させた。

実施例
材料と方法
試薬
精製されたヒトＨ因子はＣｏｍｐＴｅｃｈ（Ｔｙｌｅｒ、テキサス、アメリカ）から入手した。ラット抗マウスカッパ（ＲＭ１９）は、Ｓａｎｑｕｉｎ（Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｕｎｉｔ ｒｅａｇｅｎｔｓ、Ｓａｎｑｕｉｎ、アムステルダム、オランダ）から入手した。高機能ＥＬＩＳＡバッファー（ＨＰＥ）はＳａｎｑｕｉｎから入手した。ポリクローナルラビット抗ヒトＨ因子はＳａｎｑｕｉｎから入手し、ポリクローナルヤギ抗ヒトＦＨはＱｕｉｄｅｌから入手した。組み換え型ＦＨ ＣＣＰ（ＣＣＰ１−４、ＣＣＰ１−７、ＣＣＰ６−８、ＣＣＰ８−１５、ＣＣＰ１２−１３、ＣＣＰ１５−１８、ＣＣＰ１５−１９、ＣＣＰ１８−２０又はＣＣＰ１９−１０）は、クリストフ・シュミット博士の親切な贈り物であり、以前に報告されているように（Ｓｃｈｍｉｄｔら、２００８）生産された。以下に記載されているように、ＦＨに対するマウスモノクローナル抗体が作成された。抗ＦＨ．０７（マウスＩｇＧ１）はＣＣＰ１８を対象とし、抗ＦＨ．０９（マウスＩｇＧ１）はＣＣＰ６を対象とする。抗ＩＬ６．８は、無関係の同系コントロールとして使用され、Ｓａｎｑｕｉｎから入手した。ＭｏＡｂ抗Ｃ３．１９は、分子のＣ３ｄフラグメント上のエピトープに影響するものであり、以前に（Ｗｏｌｂｉｎｋら、１９９３）説明されている。

免疫化及び融合細胞の生成
Ｈ因子に対するマウスモノクローナル抗体は、４週間のインターバルで、ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に、アジュバントとしてのモンタニド中の２５μｇのヒト因子Ｈを注入して免疫化することによって生成された。４回目の追加免疫の３日後に、脾臓細胞は骨髄細胞ラインＳＰ２／０と融合された。融合細胞の上澄み中のＨ因子特異抗体の存在はＥＬＩＳＡによって調べられた。簡潔に説明すると、微量定量プレートは、マウスＩｇＧ抗体を捕捉するためのラット抗マウスカッパｍｏＡｂ（ＲＭ１９）でコーティングされていた。抗体の特異性はビオチン化されたＨ因子によって測定した。この分析はストレプトアビジンＨＲＰ及びＴＭＢを用いて現像された。

エピトープマッピングｍｏＡｂ
ＦＨ特異的ｍｏＡｂの反応性は、複数のＣＣＰで構成される組み換え型ヒトＦＨフラグメントを用いて調べた。この目的のために、５０マイクロリットルの１００μｇ／ｍｌ抗ＦＨ ｍｏＡｂを、０．５ｍｌの２ｍｇ／ｍｌ ＲＭ−１９連結セファロースと混合した（ＣｎＢｒセファロース１ｍｇ当たり２５μｇのｍｏＡｂ）。このＦＨフラグメントを１２５Ｉで標識し、１００μｌ（２００００ｃ／３０秒）を各サンプルに加え、その後で一晩インキュベートした。分析は、０．１％（ｗ／ｖ）のトゥイーン２０及び０．１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ（ＰＴＢ）を含むＰＢＳ中で行った。サンプルは、０．１％（ｗ／ｖ）のトゥイーン２０を含むＰＢＳを用いて５回洗浄し、３０秒間カウントした。セファロース結合放射能を測定し、総投入（これを１００％とした）と比較した。

モノクローナル抗体のＦ（ａｂ’）_２フラグメント及びＦａｂ’フラグメントの生成
抗ＦＨｍｏＡｂのＦ（ａｂ’）_２フラグメントを作るために、５．２ｍｌの０．１Ｍクエン酸／三ナトリウム クエン酸塩緩衝液（ｐＨ３．７）中の５．２ｍｇの各抗体を、３７℃で１６時間にわたってペプシン（２０μｇ／ｍｌ）（シグマＰ−６８８７）と共にインキュベートした。次に、３Ｍの塩化ナトリウム及び１ＭのＴＲＩＳを加え、ｐＨを８．９に調節した。残る完全長の抗体及び／又はＦｃフラグメントを除去するために、タンパクＡセファロースカラムを使用した。一価のＦａｂ’フラグメントを作るために、１０ｍＭジチオエリトリトールと共に６０分間インキュベートすることによって、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントを減少させた。次いで、２０ｍＭヨードアセトアミドを用いて遊離チオール基をブロックした。フラグメントをＰＢＳに対して透析し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で切断効率をチェックした。

ＳＲＢＣ溶血アッセイ
以前にＳａｎｃｈｅｚ−Ｃｏｒｒａｌら（２００４）及びＷｏｕｔｅｒｓら（２００８）によって説明されているように、溶血アッセイを使用して、Ｈ因子機能性を測定した。５．８％（ｗ／ｖ）のスクロース（ＶＢＳ）が補充されたベロナール緩衝液（３ｍＭバルビタール、１．８ｍＭナトリウムバルビタール、１４５ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４（ベロナール緩衝液））中で、ヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）を、最終濃度が２．１×１０８細胞／ｍｌとなるように希釈した。０．０５％（ｗ／ｖ）のゼラチン、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ ＥＧＴＡ（ＶＢＧ−ＡＰ）を含むベロナール緩衝液であって、示されている適正濃度の抗ＦＨ ｍｏＡを加えた又は加えていないものにより、正常な貯蔵ヒト血清又はａＨＵＳ患者血清を２０％（ｖ／ｖ）まで希釈した。この分析は、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＥＧＴＡ中に１．０５×１０８細胞／ｍｌの最終濃度を含む１０％（ｖ／ｖ）血清となるように、５０μＬの血清サンプルを５０μＬのＳＲＢＣ懸濁液と混合し、その後に、２００ｒｐｍで攪拌しながら３７℃で１．２５時間にわたってインキュベートした。２０ｍＭ ＥＤＴＡを含む氷冷された１００μＬのベロナール緩衝液を追加することによって細胞溶解を停止し、その後で、あらかじめ冷却した（７℃）遠心分離機において１８００ｒｐｍで２．５分間にわたって遠心分離した。シナジー２マイクロプレートリーダ（ＢｉｏＴｅｋ）上で４１２ｎｍにおける上澄みの吸収度を測定した。各サンプルの細胞溶解は、１００％細胞溶解コントロール（０．６％（ｗ／ｖ）のサポニンと共にＨ２Ｏ中でインキュベートしたＳＲＢＣ）と比較したパーセンテージとして表されている。ネガティブコントロールとして、ＳＲＢＣは、補体活性化を防ぐための１０ｍＭ ＥＤＴＡが補充されたベロナール緩衝液で希釈された血清と共にインキュベートされた。

ザイモサン及びＬＰＳに対するＣ３堆積物
微量定量プレートを、ザイモサン（ＰＢＳ中で１００μｇ／ｍｌがＮｕｎｃ ｐｏｌｙｓｏｒｐ ９６ウェル微量定量プレートの表面に室温で一晩被覆させた）又は腸チフスＬＰＳ（シグマＬ−６３８６、ＰＢＳにおいて４０μｇ／ｍｌがＮｕｎｃ ｐｏｌｙｓｏｒｐ ９６ウェル微量定量プレートの表面に室温で一晩被覆させた）のいずれかで被覆した。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎを用いて洗浄した後に、示されている濃度の抗ＦＨ ｍｏＡｂ又は抗体フラグメントが存在する状態又は存在しない状態で、０．０５％（ｗ／ｖ）ゼラチン、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＥＧＴＡ及び０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０を含むベロナール緩衝液中で、ヒトの健康なドナー血清をインキュベートした。Ｃ３堆積物は、ビオチン化されたｍｏＡｂ抗Ｃ３．１９（ＨＰＥ中で０．５５μｇ／ｍｌ）を用いて検出され、その後、ＨＰＥ中で、ポリＨＲＰと結合した０．０１％（ｖ／ｖ）ストレプトアビジンと共にインキュベートされた。

Ｃ３ｂに対するＨ因子結合
微小滴定ＥＬＩＳＡプレート（炭酸塩・重炭酸塩バッファー、ｐＨ９．６中で４０μｇ／ｍｌ）にＣ３ｂを一晩被覆させた。Ｃ３上が被覆されたプレートでインキュベートする前に、室温で２時間、時間にわたって抗ＦＨ ｍｏＡｂ（１００μｇ／ｍｌ）と共に、健康なドナー血清（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ｐｏｌｏｘａｍｅｒ／ＥＤＴＡ中に１：８に希釈した）を予めインキュベートした。結合したＦＨは、ペルオキシダーゼ標識されたポリクローナルヤギ抗ＦＨ．ＥＬＩＳＡ（１μｇ／ｍｌ）を用いて検出され、ＴＭＢを用いて現像された。

Ｃ３ｂ、ｉＣ３ｂ及びＣ３ｄとのＦＨ相互作用のＳＰＲ分析
抗ＦＨ ｍｏＡｂの存在下におけるＣ３ｂ、ｉＣ３ｂ又はＣ３ｄに対するＦＨの結合は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ３０００ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ、英国）を使用して、表面プラズモン共鳴によって測定された。精製されたＣ３ｂ、ｉＣ３ｂ又はＣ３ｄ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、標準的アミンカップリングを使用して、ＣＭ５ Ｂｉａｃｏｒｅセンサチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の３つのフローセルの１つに固定された。残りのフローセルは、基準面として使用され、あらゆるタンパクを追加することなく結合反応を行うことによって準備された。Ｃ３ｂ、ｉＣ３ｂ及びＣ３ｄとカップリングした後に、それぞれ、４４００反応単位（ＲＵ）、４１８０ＲＵ及び１４７０ＲＵの反応が得られた。ＳＰＲ試験は、１０μｌ／分の流速を用い、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０（ＨＢＳＰ）を含む１０ｍＭＨＥＰＥＳでバッファーされた１５０ｍＭ食塩水（ｐＨ７．４）中で、２５℃で行った。各表面におけるＦＨに対する対象標準結合シグナルを得るために、接触時間を２１０秒として、５μＭ ＦＨのデュプリケート注入をおこなった。各サンプル注入の後に、ランニングバッファーとしてＨＢＳＰを使用して２４０秒間の解離時間を配分し、その後に、表面を再生するために３０秒間の１Ｍ ＮａＣｌの注入を１回行った。

ｍｏＡｂを介した生じ得る架橋の干渉がないように、抗ＦＨ．０７の影響を測定するために、上述されているように生成されたＦａｂ’フラグメントを使用した。Ｆａｂ’フラグメントを０．５μＭの精製されたＦＨと２：１のモル比で混合し、Ｆａｂ’フラグメントの表面とのあらゆる相互作用を測定するために、ＦＨを追加することなく各Ｆａｂ’フラグメントを注入した。

結果
モノクローナル抗体
我々は、ヒトＦＨに対する２１個のモノクローナル抗体を得た。確認した順序でＭｏＡｂをナンバリングした。すべての抗体は、可溶性ヒトＦＨを捕捉することができ、高い親和性を示した。いくつかのｍｏＡｂはＩ因子との相互作用をブロックすることによって補因子活性を抑制し、他のｍｏＡｂは、正常ヒト血清と共にインキュベートした場合の増強されたＳＲＢＣ溶解によって示されるように、細胞表面に対するＦＨの結合を抑制する。正常ヒト血清と共にインキュベートした場合のＳＲＢＣのインビトロ細胞溶解を誘導するために、後者の抑制的ｍｏＡｂ（抗ＦＨ．０９）の１つを実施例で使用した。抗ＦＨ．０３はＦＨを抑制せず、コントロール抗体として実施例で使用された。ｍｏＡｂの抑制に加えて、我々は、ＦＨの機能を増強する１つのｍｏＡｂ（抗ＦＨ．０７）を確認した。

組み換え型ＦＨフラグメントを使用したｍｏＡｂの結合部位のマッピング
抗ＦＨ．０７の結合部位をマッピングするために、我々は、放射性同位体で標識された組み換え型のＣＣＰドメイン又は精製されたヒトＦＨのパネルに対するこのｍｏＡｂの反応性を調べた。ｍｏＡｂの結合は、放射免疫定量法において試験され、入力（１００％）と相関していた。図１に示されているように、抗ＦＨ．０７は、組み換え型のフラグメントであるＣＣＰ１５−１８、ＣＣＰ１５−１９及びＣＣＰ１８−２０に結合し、抗ＦＨ．０７がＦＨ分子のＣＣＰ１８に対して特異的であることを示した。

抗ＦＨ．０７は、ブロッキング抗ＦＨ ｍｏＡｂによって誘導されるＳＲＢＣ細胞溶解を抑制する
Ｈ因子の機能に対する抗ＦＨ．０７の影響を調査するために、我々は、最初にＦＨ（抗ＦＨ．０９）に対するブロッキング抗体によってＳＲＢＣの細胞溶解を誘導した。通常の条件では、健康なヒトドナー血清と一緒にＳＲＢＣをインキュベートすることは、これらの細胞がＳＲＢＣ表面のシアル酸に結合する血清中のＨ因子によって守られているので、ＳＲＢＣの細胞溶解に結びつかない。量を増加させたブロッキングｍｏＡｂ抗ＦＨ．０９と一緒に正常ヒト血清のインキュベートとすると、ＳＲＢＣの用量依存的な細胞溶解が観察された（図２Ａ）。これは、血清ＦＨによる細胞表面の不十分な保護によって説明することができる。固定された量の抗ＦＨ．０７を加える場合、ＳＲＢＣ細胞溶解が抑制された。これは、抗ＦＨ．０７が抗ＦＨ．０９の影響を打ち消していることを示す（図２Ａ）。

追加実験において、ＳＲＢＣの最適値より少ない（約６０％）細胞溶解を誘導するために、健康なドナー血清に固定された量の抗ＦＨ．０９を加えた。抗ＦＨ．０７の量を増加させる追加によって、この細胞溶解を完全にブロックすることができ、再びこれらのモノクローナル抗体の反対の効果を示した（図２Ｂ）。

抗ＦＨ．０７は代替的経路を介したザイモサン及びＬＳＰにおけるＣ３堆積を抑制する
抗ＦＨ．０７がＦＨによる代替的経路抑制に効果があるかどうか調査し、ＳＲＢＣ又はこれらの細胞の細胞溶解に対する直接的効果を除外するために、代替的経路活性化因子としてのザイモサン又はＬＰＳの表面でＣ３堆積分析を行った。Ｃａ２＋に依存する古典的な又はレクチン経路活性化を除外するために、Ｍｇ ＥＧＴＡベロナール緩衝液中で試験を行った。

ザイモサン又はＬＰＳを被覆したプレートのいずれかにおいて血清濃度を増加させてインキュベートを行ったところ、用量依存的なＣ３堆積が生じた。固定量の抗ＦＨ．０７（５００ｎＭ）を血清滴定に加えることによって、Ｃ３堆積は抑制され（図３Ａ）、右に向かって変化するカーブによって示されている。同じ量の抗ＦＨ．０３（非抑止的抗ＦＨ ｍｏＡｂ）を血清に加えた場合、この変化は観察されなかった。これは、代替的経路活性化におけるＦＨの阻害機能が抗ＦＨ．０７の添加によって強められていることを示す。さらに、ＬＰＳで被覆されたプレート上での固定された血清濃度（１：１０）に対する増加する量の抗ＦＨ．０７の添加は、Ｃ３堆積を完全にブロックできるかもしれない（図３Ｂ）。

抗ＦＨ．０７のＦａｂ’フラグメントは完全長のｍｏＡｂと同じ効果を有する
抗ＦＨ．０７と共にインキュベートした場合に観察されるＦＨ阻害機能の増加に関するあり得る１つのメカニズムは、抗体を介した架橋によりＦＨのマルチマー化であり、それによって、表面に対するＦＨの結合力を増加させることである。この可能性をテストするために、我々は、一価のＦａｂ’抗ＦＨ．０７フラグメントを生成した。ＦＨの架橋が観察された前記のＦＨ機能の増強の原因である場合、一価のＦａｂ’フラグメントは増強効果を示さないことが予想される。ブリッジングＥＬＩＳＡを用いて、我々は、生成されたＦａｂ’フラグメントが確かに完全に一価であり、ＦＨ分子と架橋することができないかどうかを最初にチェックした。この目的のために、ＥＬＩＳＡプレートをＦＨで被覆し、検出のためにビオチン化されたＦＨを使用した。
図３Ｃに示されているように、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント及び完全長のＩｇＧが架橋できる一方で、生成されたＦａｂ’フラグメントはコーティング中のＦＨ及び流体相中のＦＨと架橋できなかった。その後、抗ＦＨ．０７Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント及び抗ＦＨ．０７Ｆａｂ’フラグメントを、ザイモサンコーティングプレート及びＬＰＳコーティングプレートでのＣ３堆積アッセイで調べた。驚いたことに、我々は、ＦＨ機能に対するＦａｂ’フラグメントの同じ強化効果を観察した。抗ＦＨ．０７Ｆａｂ’フラグメントは、ザイモサン及びＬＰＳの両方で完全長ＩｇＧ抗体と同じＣ３堆積の減少が認められた（図３Ａ及び３Ｂ）。従って、我々は、抗ＦＨ．０７の影響がモノクローナル抗体によるＦＨ分子の架橋によるものではないと結論を出した。さらに、これは、我々がパネル中の２０個のモノクローナル抗体の他のいずれもが増強効果を観察しなかったという事実によって強調される。

抗ＦＨ．０７はａＨＵＳ患者血清においてＦＨ保護機能を回復する
ＣＣＰ２０に既知の変異を有するａＨＵＳ患者の血清の増加する量と共にＳＲＢＣをインキュベートすると、補体活性化に対する細胞の不十分な保護に起因した細胞溶解に結びつく（図４Ａ）。しかしながら、この患者が（大部分のＨＵＳ患者がそうであるように）ヘテロ接合の変異を有するので、この患者の血清中の約半分のＦＨは機能を有している。以前の結果に基づいて、我々は、抗ＦＨ．０７と共にａＨＵＳ患者血清をプレインキュベートすることにより、ＦＨ機能の増強と、その結果としてＳＲＢＣの保護の回復に結びつくと仮定した。確かに、我々が抗ＦＨ．０７と共にａＨＵＳ患者の血清をインキュベートした場合、ＳＲＢＣの前記の観察された細胞溶解は完全に停止した（図４Ａ及び４Ｂ）。その一方で、コントロール抗体は効力を示さなかった。この結果は、ＦＨのＳＣＲ２０にユニークなヘテロ接合の変異を有する３人の無関係なａＨＵＳ患者において得られた（図４Ｂ）。上述されているザイモサン及びＬＰＳでのＣ３堆積試験に一致するように、抗ＦＨ．０７Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント及びＦａｂ’フラグメントは、この患者の血清において補体を介したＳＲＢＣ細胞溶解を阻害することができた（図４Ｃ）。

Ｃ３ｂに対するＨ因子の結合は抗ＦＨ．０７の存在下で増加した
抗ＦＨ．０７のＦａｂ’フラグメントは完全長ＩｇＧと同じＦＨ機能増強効果を発揮するので、モノクローナル抗体によるＦＨ分子の多量体化は上記の増強作用の説明とはなり得ない。我々は、ＣＣＰ１８に対して抗ＦＨ．０７が結合することによって、おそらく表面に対する結合が増加するようにＦＨのコンフォメーションが変化すると仮定した。Ｈ因子は、分子の全体にわたって異なる部位に位置した、Ｃ３ｂ及びグリコサミノグリカンの両方に対する結合部位を有する。我々は、ザイモサン及びＬＰＳでのＣ３堆積に対するＦＨ増強効果を観察したので、Ｃ３ｂへのＦＨの結合に対する抗ＦＨ．０７の影響を最初に検討した。この目的のために、ＥＬＩＳＡプレートをＣ３ｂで被覆し、ＨＲＰ標識したポリクローナル抗ＦＨを用いて正常なヒト血清に由来する結合したＦＨを検出した。図５に示されているように、抗ＦＨ．０７は、Ｃ３ｂに対するＦＨの結合を有意に増加させたが、他の抗ＦＨ ｍｏＡｂ（無関係なｍｏＡｂ又は増強効果を有しない他のＦＨ特異的抗体）は、効果がなかった。

さらに、抗ＦＨ．０７Ｆａｂ’フラグメントの非存在下及び存在下におけるＣ３ｂ、ｉＣ３ｂ及びＣ３ｄとのＦＨの相互作用を研究するためにＳＰＲ実験を行った。簡潔に説明すると、Ｃ３ｂ、ｉＣ３ｂ又はＣ３ｄのいずれかを用いてＣＭ５ Ｂｉａｃｏｒｅセンサチップの３つのフローセルを被覆し、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ３０００システムによって、抗ＦＨ ｍｏＡｂの非存在下又は存在下におけるこれらの表面とのＦＨの相互作用を測定した。通常の条件下では、ＦＨは、Ｃ３ｂとの相互作用を示し、ｉＣ３ｂ及びＣ３ｄとの相互作用は比較的少なかった。抗ＦＨ．０９Ｆａｂ’フラグメント又はアイソタイプコントロール（抗ＩＬ６．８）の添加は、Ｃ３ｂ、ｉＣ３ｂ又はＣ３ｄに対するＦＨの結合に影響しなかった。しかしながら、抗ＦＨ．０７Ｆａｂ’フラグメントの添加は、Ｃ３ｂが被覆された表面に対する反応を大幅に増大させた（図５Ｂ）。抗ＦＨ．０７自体がＣ３ｂといかなる相互作用をも示さなかったことは、観察された反応の増大が、各表面に対するＦＨの結合の増加によってもたらされたことを示している。ｉＣ３ｂ及びＣ３ｄに対する結合（天然のＦＨに対しては通常低い）でさえ、抗ＦＨ．０７の添加後に増大した（ぞれぞれ、図５Ｃ及び図５Ｄ）。測定された相互作用は、すべての表面で少なくとも２倍増加し、それによって抗ＦＨ ｍｏＡｂ Ｆａｂ’フラグメントの結合後に単にＦＨの質量の期待される３３％の増加によっては説明することができなかった。

参考文献
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Claims (9)

1. 第２の抗体と、Ｈ因子（ＦＨ）の補体制御タンパクドメイン１８（ＣＣＰ１８）に対する結合について競合することができる、単離、合成又は組み換え抗体又はそのフラグメントであって、前記第２の抗体は、
   配列番号８の配列を含む重鎖配列、及び
   配列番号４の配列を含む軽鎖配列
   を含み、
   前記単離、合成又は組み換え抗体又はそのフラグメントは、代替的補体活性化のＦＨ抑制を強化する、抗体又はフラグメント。
2. 請求項１に記載の抗体又はフラグメント、並びに薬学的に許容可能な担体、希釈剤及び／又は賦形剤を含む、医薬組成物。
3. 治療における使用のための、請求項１に記載の抗体又はフラグメント。
4. 代替的補体活性化の抑制における使用のための、請求項３に記載の使用のための抗体又はフラグメント。
5. 代替的補体活性化経路に関連する疾患の治療、緩和又は予防における使用のための、請求項１に記載の抗体又はフラグメント。
6. 代替的補体活性化経路に関連する疾患の治療、緩和又は予防のための薬剤の調製のための、請求項１に記載の抗体又はフラグメントの使用。
7. 代替的補体活性化経路に関係する疾患を治療、緩和又は予防するための医薬組成物であって、請求項１に記載の抗体又はフラグメントを含む又はそれからなる、医薬組成物。
8. 前記疾患が、非定型溶血尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、発作性夜間色素尿症（ＰＮＨ）、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、膜性増殖性糸球体腎炎（ＭＰＧＮ）からなる群から選択される、請求項５に記載の使用のための抗体若しくはフラグメント、請求項６に記載の使用、又は請求項７に記載の医薬組成物。
9. 代替的補体活性化を抑制するための医薬組成物であって、請求項１に記載の抗体又はフラグメントを含む又はそれからなる、医薬組成物。

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