ES2563064T3 - Viriones de AAV con inmunorreactividad reducida y usos de los mismos - Google Patents

Viriones de AAV con inmunorreactividad reducida y usos de los mismos Download PDF

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Abstract

Una proteína de cápside de virus adeno-asociado (AAV) mutado que, cuando está presente en un virión de AAV, imparte al virión una inmunorreactividad reducida en comparación con el correspondiente virión de tipo salvaje, en donde la mutación comprende al menos una sustitución de aminoácido, y en donde la sustitución de aminoácido comprende una sustitución del aminoácido que aparece en la posición correspondiente a la posición 130 de la cápside de VP2 de AAV-2.

Description

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Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "línea celular" se refiere a una población de células capaces de un crecimiento y división continuos o prolongados in vitro. A menudo, las líneas celulares son poblaciones clonales derivadas de una única célula progenitora. Se conoce, además, en la técnica que pueden producirse cambios espontáneos o inducidos en el cariotipo durante el almacenamiento o la transferencia de dichas poblaciones clonales. Por lo tanto, las células derivadas de la línea celular a la que se alude pueden no ser precisamente idénticas a las células o cultivos ancestrales, y la línea celular a la que se alude incluye tales variantes.
"Homología" se refiere al porcentaje de identidad entre dos polinucleótidos o dos restos de polipéptidos. Dos ADN, o dos secuencias de polipéptidos son "sustancialmente homólogos" entre sí cuando las secuencias exhiben al menos aproximadamente 50%, preferiblemente al menos aproximadamente 75%, más preferiblemente al menos aproximadamente 80%-85%, preferiblemente al menos aproximadamente 90%, y más preferiblemente al menos aproximadamente 95%-98% de identidad de secuencia a lo largo de una longitud definida de las moléculas. Tal como se utiliza en esta memoria, sustancialmente homólogo también se refiere a secuencias que muestran identidad completa con la secuencia de ADN o polipéptido especificada.
En general, "identidad" se refiere a una correspondencia exacta de nucleótido a nucleótido o de aminoácido a aminoácido de dos polinucleótidos o secuencias de polipéptidos, respectivamente. El porcentaje de identidad se puede determinar mediante una comparación directa de la información de secuencia entre dos moléculas alineando las secuencias, contando el número exacto de coincidencias entre las dos secuencias alineadas, dividiendo por la longitud de la secuencia más corta y multiplicando el resultado por 100. Se pueden utilizar programas informáticos fácilmente disponibles para ayudar en el análisis tales como ALIGN, Dayhoff, M.O. en Atlas of Protein Sequence and Structure M.O. Dayhoff comp., 5 Supl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, DC, que se adapta el algoritmo de homología local de Smith y Waterman Advances in Appl. Math. 2:482-489, 1981, para el análisis de péptidos. Los programas para la determinación de la identidad de la secuencia de nucleótidos están disponibles en el Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 (disponible de Genetics Computer Group, Madison, WI), por ejemplo los programas BESTFIT, FASTA y GAP, que también se basan en el algoritmo de Smith y Waterman. Estos programas se utilizan fácilmente con los parámetros por defecto recomendados por el fabricante y descritos en el Wisconsin Sequence Analysis Package al que se alude anteriormente. Por ejemplo, el porcentaje de identidad de una secuencia de nucleótidos particular a una secuencia de referencia se puede determinar utilizando el algoritmo de homología de Smith y Waterman con una tabla de puntuación por defecto y una penalización por hueco de seis posiciones de nucleótidos.
Otro método para establecer el porcentaje de identidad en el contexto de la presente invención es utilizar el paquete de programas MPSRCH registrado por la Universidad de Edimburgo, desarrollado por John F. Collins y Shane S. Sturrok, y distribuido por IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA). De este conjunto de paquetes se puede emplear el algoritmo de Smith-Waterman en los casos en los que se utilicen los parámetros por defecto para la tabla de puntuación (por ejemplo, penalización de 12 de hueco abierto, penalización de uno de extensión de hueco, y un hueco de seis). A partir de los datos generados el valor "Coincidencia" refleja la "identidad de secuencia”. Otros programas adecuados para calcular el porcentaje de identidad o similitud entre secuencias son generalmente conocidos en la técnica, por ejemplo, otro programa de alineamiento es BLAST, utilizado con parámetros por defecto. Por ejemplo, pueden utilizarse BLASTN y BLASTP usando los siguientes parámetros por defecto: código genético = estándar; filtro = ninguno; hebra = ambos; corte = 60; esperado = 10; Matriz = BLOSUM62; Descripciones = 50 secuencias; ordenar por = PUNTUACIÓN ALTA; Bases de datos = no redundante, GenBank + EMBL + DDBJ + AP + traducciones GenBank CDS + proteína suiza + Spupdate + PIR. Los detalles de estos programas son bien conocidos en la técnica.
Alternativamente, la homología puede determinarse por hibridación de polinucleótidos en condiciones que forman dúplex estables entre regiones homólogas, seguido por digestión con nucleasa o nucleasas específicas de cadena sencilla, y la determinación del tamaño de los fragmentos digeridos. Secuencias de ADN que son sustancialmente homólogas pueden identificarse en un experimento de hibridación Southern bajo, por ejemplo, condiciones rigurosas, tal como se definen para ese sistema particular. La definición de condiciones de hibridación apropiadas está dentro de la experiencia de la técnica. Véase, p. ej., Sambrook et al., supra; DNA Cloning, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra.
Por la expresión "variante degenerada" se entiende un polinucleótido que contiene cambios en la secuencia de ácido nucleico del mismo, que codifica un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que el polipéptido codificado por el polinucleótido del que se deriva la variante degenerada.
Una "secuencia codificante" o una secuencia que "codifica" un polipéptido seleccionado, es una molécula de ácido nucleico que se transcribe (en el caso de ADN) y traduce (en el caso de ARNm) en un polipéptido in vivo cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia codificante se determinan por un codón de inicio en el extremo 5' (amino) y un codón de parada de la traducción en el extremo 3' (carboxi).
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Una secuencia de terminación de la transcripción puede estar localizada en posición 3' con respecto la secuencia codificante.
El término "heterólogo", que se refiere a secuencias de ácido nucleico tales como secuencias codificantes y secuencias de control, designa secuencias que normalmente no están unidas entre sí, y/o normalmente no están asociadas con una célula particular. Por lo tanto, una región "heteróloga" de una construcción de ácido nucleico o un vector es un segmento de ácido nucleico dentro de o unido a otra molécula de ácido nucleico que no se encuentra en asociación con la otra molécula en la naturaleza. Por ejemplo, una región heteróloga de una construcción de ácido nucleico podría incluir una secuencia codificante flanqueada por secuencias que no se encuentran en asociación con la secuencia codificante en la naturaleza. Otro ejemplo de una secuencia codificante heteróloga es una construcción en donde la secuencia codificante en sí no se encuentra en la naturaleza (p. ej., secuencias sintéticas que tienen codones diferentes del gen nativo). De manera similar, una célula transformada con una construcción que normalmente no está presente en la célula se consideraría heteróloga para los propósitos de esta invención. La variación alélica o eventos mutacionales que se producen de forma natural no dan lugar a ADN heterólogo, tal como se utiliza en esta memoria.
Una secuencia de "ácido nucleico" se refiere a una secuencia de ADN o ARN. La expresión captura secuencias que incluyen cualquiera de los análogos de bases conocidos de ADN y ARN tales como, pero no limitados a 4acetilcitosina, 8-hidroxi-N6-metiladenosina, aziridinilcitosina, pseudoisocitosina, 5-(carboxihidroxil-metil)uracilo, 5fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouracilo, 5-carboximetil-aminometiluracilo, dihidrouracilo, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metiladenina, 1-metilpseudo-uracilo, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metil-citosina, 5-metilcitosina, N6-metiladenina, 7-metilguanina, 5metilaminometiluracilo, 5-metoxi-amino-metil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarbonilmetiluracilo, 5metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, éster metílico de ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, oxibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina y 2,6diaminopurina.
La expresión "secuencias de control" de ADN se refiere colectivamente a secuencias de promotor, señales de poliadenilación, secuencias de terminación de la transcripción, dominios reguladores aguas arriba, orígenes de replicación, sitios de entrada al ribosoma interno ("IRES"), potenciadores, y similares, que proporcionan colectivamente la replicación, transcripción y traducción de una secuencia codificante en una célula receptora. No todas estas secuencias de control necesitan estar siempre presentes, siempre que la secuencia codificante seleccionada sea capaz de ser replicada, transcrita y traducida en una célula huésped apropiada.
El término "promotor" se utiliza en esta memoria en su sentido ordinario para aludir a una región del nucleótido que comprende una secuencia reguladora de ADN, en el que la secuencia reguladora se deriva de un gen que es capaz de unirse a ARN polimerasa e iniciar la transcripción de una secuencia codificante aguas abajo (dirección 3’). Promotores de la transcripción pueden incluir "promotores inducibles" (en donde la expresión de una secuencia de polinucleótidos unida operativamente al promotor es inducida por un analito, cofactor, proteína reguladora, etc.), "promotores represibles" (en donde la expresión de una secuencia de polinucleótido unida operativamente al promotor es inducida por un analito, cofactor, proteína reguladora, etc.), y "promotores constitutivos".
"Unido operativamente" se refiere a una disposición de elementos en la que los componentes así descritos están configurados de modo que realizan su función habitual. Por lo tanto, las secuencias de control unidas operativamente a una secuencia codificante son capaces de efectuar la expresión de la secuencia codificante. Las secuencias de control no necesitan estar contiguas a la secuencia codificante, siempre que funcionen para dirigir la expresión de la misma. Así, por ejemplo, secuencias intermedias no traducidas pero transcritas pueden estar presentes entre una secuencia de promotor, y la secuencia codificante y la secuencia promotora todavía pueden considerarse "unidas operativamente" a la secuencia codificante.
Por "aislada", cuando se refiere a una secuencia de nucleótidos, se quiere dar a entender que la molécula indicada está presente en ausencia sustancial de otras macromoléculas biológicas del mismo tipo. Por lo tanto, una "molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido particular" se refiere a una molécula de ácido nucleico que está sustancialmente libre de otras moléculas de ácido nucleico que no codifican el polipéptido sujeto; sin embargo, la molécula puede incluir algunas bases o restos adicionales que no afectan perjudicialmente a las características básicas de la composición.
Con el propósito de describir la posición relativa de secuencias de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico particular a lo largo de la presente solicitud, tal como cuando una secuencia de nucleótidos particular se describe como situada "aguas arriba", "aguas abajo", "3 prima (3')" o "5 prima (5')" en relación con otra secuencia, ha de
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entenderse que es la posición de las secuencias en la hebra "sentido" o "codificante" de una molécula de ADN a la que se está refiriendo como es convencional en la técnica.
A "homólogo funcional" o un "equivalente funcional" de un polipéptido de AAV dado incluye moléculas derivadas de la secuencia polipeptídica nativa, así como polipéptidos producidos de forma recombinante o sintetizados químicamente que funcionan de una manera similar a la molécula de AAV de referencia para lograr un resultado deseado. Por lo tanto, un homólogo funcional de AAV Rep68 o Rep78 abarca derivados y análogos de esos polipéptidos -incluyendo cualesquiera adiciones, sustituciones y/o deleciones simples o múltiples de aminoácidos que se producen internamente o en los extremo amino o carboxi de los mismos-siempre y cuando se conserve la actividad de integración.
Por "capaces de una transducción eficiente " se quiere dar a entender que las construcciones mutadas de la invención proporcionan vectores o viriones de rAAV que conservan la capacidad de transfectar células in vitro y/o in vivo a un nivel que está dentro de 1-10% de la eficacia de transfección obtenida utilizando la correspondiente secuencia de tipo salvaje. Preferiblemente, el mutante conserva la capacidad de transfectar células o tejidos a un nivel que está dentro de 10-100% de la secuencia de tipo salvaje correspondiente. La secuencia mutada puede incluso proporcionar una construcción con una capacidad mejorada de transfectar células y tejidos. La eficiencia de la transducción se determina fácilmente utilizando técnicas bien conocidas en la técnica, incluyendo el ensayo de la transducción in vitro descrito en los Ejemplos.
Por "inmunorreactividad reducida" se quiere dar a entender que la construcción de AAV mutado reacciona con anticuerpos anti-AAV en un nivel reducido en comparación con la correspondiente construcción de AAV de tipo salvaje. El término "anticuerpo", tal como se utiliza en esta memoria, incluye anticuerpos obtenidos de preparaciones tanto policlonales como monoclonales, así como, lo siguiente: moléculas de anticuerpos híbridas (quiméricas) (véase, por ejemplo, Winter et al. (1991) Nature 349: 293-299; y Patente de EE.UU. Nº 4.816.567); Fragmentos F(ab')2 y F(ab); moléculas Fv (heterodímeros no covalentes, véase, por ejemplo, Inbar et al. (1972) Proc Natl Acad Sci USA 69:2659-2662; y Ehrlich et al. (1980) Biochem 19:4091-4096); moléculas Fv de cadena sencilla (sFv) (véase, por ejemplo, Huston et al. (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85:5879-5883); construcciones de fragmentos de anticuerpos diméricas y triméricas; minicuerpos (véase, p. ej., Pack et al. (1992) Biochem 31:1579-1584; Cumber et al. (1992) J Immunology 149B:120-126); moléculas de anticuerpos humanizados (véase, por ejemplo, Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534-1536; y Publicación de Patente del Reino Unido Nº GB 2.276.169, publicada el 21 de septiembre de 1994); y cualesquiera fragmentos funcionales obtenidos a partir de moléculas de este tipo, en donde esos fragmentos conservan propiedades de unión inmunológicas de la molécula de anticuerpo parental.
Las construcciones mutadas de la presente descripción pueden tener una inmunorreactividad reducida tal como se determina utilizando ensayos in vitro y/o in vivo utilizando cualquiera de los tipos anteriores de anticuerpos que han sido generados contra la correspondiente construcción de AAV de tipo salvaje. Preferiblemente, la construcción de AAV mutada reaccionará con anticuerpos de este tipo a un nivel al menos 1,5 veces más bajo que la correspondiente construcción de tipo salvaje, preferiblemente a un nivel al menos 2 veces menor tal como al menos 5-10 veces menor, incluso a un nivel al menos 50-100 veces o al menos 1000 veces menor que la correspondiente construcción de tipo salvaje.
Preferiblemente, la construcción de AAV mutada reacciona a un nivel reducido con anticuerpos neutralizantes anti-AAV. Por ejemplo, las construcciones mutadas serán preferiblemente al menos 1,5 veces más resistentes a la neutralización que las correspondientes de tipo salvaje, preferiblemente al menos 2 veces más resistentes a la neutralización, incluso más preferiblemente al menos 5-10 veces o más, tal como al menos 50-100 veces o más resistentes a la neutralización que la de tipo salvaje correspondiente, según se determina utilizando ensayos convencionales, tales como los ensayos de neutralización in vitro descritos en esta memoria.
Los términos "sujeto", "individuo" o "paciente" se utilizan indistintamente en esta memoria y se refieren a un vertebrado, preferiblemente un mamífero. Mamíferos incluyen, pero no se limitan a murinos, roedores, simios, seres humanos, animales de granja, animales de deporte y mascotas.
Las expresiones "cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" de una composición o agente, según se proporcionan en esta memoria, se refieren a una cantidad no tóxica pero suficiente de la composición o agente para proporcionar la respuesta deseada. La cantidad exacta requerida variará de un sujeto a otro, dependiendo de la especie, edad y estado general del sujeto, la gravedad de la afección que se trata, y la macromolécula particular de interés, modo de administración, y similares. Una cantidad "eficaz" apropiada en cualquier caso individual puede ser determinada por un experto normal en la técnica utilizando una experimentación rutinaria.
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"Tratar" o "tratamiento" de una enfermedad incluye: (1) prevenir la enfermedad, es decir, provocar que los síntomas clínicos de la enfermedad no se desarrollen en un sujeto que pueda estar expuesto o predispuesto a la enfermedad, pero que todavía no experimente o muestre síntomas de la enfermedad, (2) inhibir la enfermedad, es decir, detener el desarrollo de la enfermedad o sus síntomas clínicos, o (3) aliviar la enfermedad, es decir, provocar la regresión de la enfermedad o sus síntomas clínicos.
2. MODOS DE LLEVAR A CABO LA DESCRIPCIÓN
Antes de describir la presente descripción en detalle, debe entenderse que esta descripción no se limita a formulaciones o parámetros del proceso particulares ya que las mismas pueden, por supuesto, variar. Ha de entenderse también que la terminología utilizada en esta memoria es con el propósito de describir realizaciones particulares de la descripción solamente, y no se pretende que sean limitativos.
Aunque en la práctica de la presente descripción se puede utilizar un cierto número de métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en esta memoria, los materiales y métodos preferidos se describen en esta memoria.
Fundamental de la presente descripción es el descubrimiento de nuevas secuencias de AAV mutantes, útiles en la producción de viriones de rAAV que exhiben inmunorreactividad reducida en comparación con los correspondientes viriones de tipo salvaje. Además de ello, los mutantes conservan preferiblemente otras propiedades de la de tipo salvaje correspondiente tales como el empaquetamiento de ADN, la unión al receptor, la purificación cromatográfica y la capacidad de transducir células in vitro e in vivo. Preferiblemente, tales propiedades se encuentran dentro de al menos 1-10% de los valores medidos para el correspondiente AAV de tipo salvaje. Más preferiblemente tales propiedades están dentro de 10-100% de los valores medidos para el correspondiente AAV de tipo salvaje. Lo más preferiblemente, tales propiedades están al menos 100% o más de los valores medidos para el correspondiente AAV de tipo salvaje. Así, por ejemplo, si la mutación es en una secuencia de la cápside de AAV-2, la comparación de estos atributos sería entre un virión de AAV-2 con la secuencia de la cápside mutada en comparación con un virión de AAV-2 con los mismos componentes que el virión mutado, excepto con la secuencia de la proteína de la cápside de AAV-2 de tipo salvaje.
Como se explicó anteriormente, los mutantes de AAV de la presente descripción exhiben preferiblemente una inmunorreactividad reducida con relación a la de anticuerpos neutralizantes que pueden estar presentes en el huésped al que se administran los viriones mutantes. De esta manera, las células y los tejidos de sujetos que han sido infectados de forma natural con AAV (es decir, debido a la infección natural previa) o han sido infectados artificialmente con AAV (es decir, debido a la terapia génica previa o la inmunización con ácido nucleico) pueden ser transfectados de manera más eficiente con viriones de AAV recombinantes con el fin de tratar o prevenir una enfermedad nueva o en curso.
Un mecanismo bien estudiado para la neutralización es que un anticuerpo neutralizante bloquea físicamente una región en el virus requerida para unirse a receptores que se requieren para la infección. Estudios previos con otros virus han demostrado que los receptores y anticuerpos neutralizantes se unen a un conjunto distinto de aminoácidos y que es posible identificar mutantes en las posiciones particulares en cápsides virales que afectan a la unión de anticuerpos neutralizantes, pero no los receptores u otras funciones necesarias para la infección viral. Experimentos en los cuales se seleccionan virus replicantes de tipo salvaje para que sean resistentes a los anticuerpos neutralizantes han demostrado que las mutaciones, incluso en los aminoácidos individuales, tales como los aquí descritos, pueden resultar en un aumento significativo en la resistencia a la neutralización de anticuerpos.
La capacidad o incapacidad de un virión de AAV mutante de unirse a antisueros de AAV es parcialmente una función de la secuencia de las proteínas de la cápside (codificadas por el gen cap de AAV). Por lo tanto, la descripción contempla cambios de aminoácidos individuales, dobles, triples, cuádruples y mayores realizados en la superficie del virión de AAV, así como deleciones y/o inserciones, con el fin de disminuir la inmunorreactividad, p. ej., para alterar la capacidad del virión de AAV para unirse a antisueros de AAV. Tales mutantes pueden ser evaluados en cuanto a la resistencia a la neutralización y, de ser necesario, se pueden hacer cambios más drásticos o múltiples.
Métodos para identificar porciones del virión de AAV susceptibles de mutación con un virión de rAAV funcional resultante se describen en los ejemplos que figuran más adelante. Tal como se detalla en el mismo, se prefieren mutaciones a los aminoácidos en la superficie viral tales como mutaciones a las características que sobresalen de la cápside, incluyendo porciones de la cápside conocidas como el "pico", "cilindro" y "meseta". Las mutaciones son preferiblemente a la región VP2, más preferiblemente a la región VP3 y, en particular, dentro de la región de solapamiento entre VP1, VP2 y VP3 tal como se muestra en la Figura 11. Mutaciones particularmente preferidas se
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encuentran dentro de las posiciones 80-598 de VP2 (correspondientes a los aminoácidos 217-735 de VP1 y a los aminoácidos 15-533 de VP3).
La secuencia de una VP2 representativa se muestra en la Figura 9 en esta memoria (SEQ ID NO: 12). La proteína principal de la envuelta, VP3 abarca los aminoácidos 203-735 de VP1. La mutación comprende al menos una sustitución, deleción o inserción de aminoácido a la proteína nativa. Mutaciones representativas incluyen una o más sustituciones de los aminoácidos que se producen en una posición correspondiente a una posición de la proteína de la cápside VP2 de AAV-2, seleccionados del grupo que consiste en los aminoácidos 126, 127, 128, 130, 132, 134, 247, 248, 315, 334, 354, 357, 360, 361, 365, 372, 375, 377, 390, 393, 394, 395, 396, 407, 411, 413, 418, 437, 449, 450, 568, 569 y 571.
Generalmente, el aminoácido que se produce de forma natural está sustituido con un aminoácido que tiene una cadena lateral pequeña y/o no está cargado y, por lo tanto, es menos inmunogénico. Aminoácidos de este tipo incluyen, sin limitación, alanina, valina, glicina, serina, cisteína, prolina, así como análogos de los mismos, prefiriéndose alanina. Además de ello, pueden estar presentes mutaciones adicionales. Combinaciones representativas incluyen cualquier combinación de los aminoácidos identificados inmediatamente arriba tales como, pero no limitados a una mutación del aminoácido 360 a histidina y el aminoácido 361 a alanina; el aminoácido 334 a alanina y el aminoácido 449 a alanina; el aminoácido 334 a alanina y el aminoácido 568 a alanina, el aminoácido 568 a alanina y el aminoácido 571 a alanina; el aminoácido 334 a alanina, el aminoácido 449 a alanina y el aminoácido 568 a alanina; el aminoácido 571 a lisina y cualquiera de los aminoácidos especificados anteriormente. Las combinaciones anteriores son meramente ilustrativas y, por supuesto, se determinan fácilmente numerosas otras combinaciones basándose en la información proporcionada en esta memoria.
Tal como se describe adicionalmente en los ejemplos, determinados aminoácidos en la cápside son adyacentes al sitio de unión a heparina. Esta región se denomina "zona muerta" o "DZ" en esta memoria e incluye los aminoácidos G128, N131, D132, H134, N245, N246, D356, D357, H372, G375, D391, D392, E393 y E394. Los aminoácidos en la zona muerta son importantes para la función de AAV y, por tanto, son también dianas para la unión de anticuerpos neutralizantes. Dado que esta región es importante para la función de AAV, sustituciones conservadoras de aminoácidos tales como Q por H, D por E, E o N por D, y similares, se prefieren en la región de la zona muerta y resultan en un mutante de la zona muerta más funcional.
Las diversas posiciones de aminoácidos que se producen en la proteína de la cápside se numeran aquí con referencia a la secuencia de VP2 de AAV-2 descrita en NCBI Nº de Acceso AF043303 y se muestran en la Figura 9 en esta memoria. La Figura 10 muestra la secuencia de aminoácidos de VP1 de AAV-2. Sin embargo, se debe entender que las mutaciones de aminoácidos que se producen en posiciones correspondientes en cualquiera de los serotipos de AAV quedan abarcadas por la presente descripción. Las secuencias para la cápside de diversos serotipos de AAV aislados a partir de múltiples especies son conocidas y se describen, p. ej., en Gao et al. ( 2.002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:11854-11859; Rutledge et al. ( 1998) J. Virol. 72:309-319; NCBI Nºs de Acceso NC001863; NC004828; NC001862; NC002077; NC001829; NC001729; U89790; U48704; AF369963; AF028705; AF028705; AF028704; AF513852; AF513851; AF063497; AF085716; AF43303; Y18065; AY186198; AY243026; AY243025; AY243024; AY243023; AY243022; AY243021; AY243020; AY243019; AY243018; AY243017; AY243016; AY243015; AY243014; AY243013; AY243012; AY243011; AY243010; AY243009; AY243008; AY243007; AY243006; AY243005; AY243004; AY243003; AY243002; AY243001; AY243000; AY242999; AY242998; y AY242997.
Además de ello, los autores de la invención han descubierto un nuevo AAV caprino, aislado de cabra, denomina "AAV-G1" en esta memoria. La secuencia de VP1 de AAV caprino es altamente homóloga a la secuencia VP1 de AAV-5, pero es aproximadamente 100 veces más resistente a la neutralización por anticuerpos de AAV existentes que la secuencia de AAV-5 nativa. Más particularmente, un fragmento de PCR de 2805 pb del AAV caprino descrito en esta memoria, que codifica 603 pb de rep, el intrón central, y todo el cap, muestra un 94% de homología con la secuencia de AAV-5 correspondiente. Las homologías de ADN y proteínas para el rep parcial son 98% y 99%, respectivamente. Una comparación de la secuencia codificante de VP1 caprina con una secuencia codificante de VP1 de AAV-5 de primate se muestra en las Figuras 12A-12B. El ADN para la región cap del AAV caprino es un 93% homólogo al de AAV-5. Las secuencias de aminoácidos para la VP1 caprina frente a un AAV-5 de primate se muestran en la Figura 13. La secuencia caprina codifica una proteína VP1 de 726 aminoácidos, mientras que VP1 de AAV-5 es de 724 aminoácidos de longitud. Adicionalmente, las secuencias exhiben un 94% de identidad de la secuencia y un 96% de similitud de la secuencia. Existen 43 diferencias de aminoácidos entre la secuencia VP1 de AAV-5 caprina y la de primate. Con respecto a la secuencia de aminoácidos lineal de VP1, la distribución de las diferencias de aminoácidos entre AAV-5 y AAV caprina es altamente polar. Todas las diferencias de aminoácidos se producen exclusivamente en la región hipervariable C-terminal de VP1 de manera dispersa. Esta región con relación a AAV-5 y caprina incluye aproximadamente 348 aminoácidos desde el aminoácido 386 al extremo C, numerados con relación a VP1 de AAV-5. Las regiones hipervariables correspondientes en otros serotipos de AAV son
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a las células de un mamífero se lleva a cabo generando primero un virión de rAAV que comprende el gen y luego administrando el virión de rAAV al mamífero. Por lo tanto, la descripción incluye viriones de rAAV que comprenden genes que codifican uno cualquiera de Factor IX, Factor VIII, Factor X, Factor VII, Factor XI, Factor XIII o Proteína C.
El suministro de los viriones recombinantes que contienen uno o más HNAs a un sujeto mamífero puede ser mediante inyección intramuscular o mediante administración en el torrente sanguíneo del sujeto mamífero. La administración en el torrente sanguíneo puede ser mediante inyección en una vena, una arteria, o cualquier otro conducto vascular los viriones mutantes en el torrente sanguíneo a modo de perfusión de extremidad aislada, una técnica bien conocida en las técnicas quirúrgicas, permitiendo esencialmente el método al experto aislar una extremidad de la circulación sistémica antes de la administración de los viriones de rAAV. Una variante de la técnica de perfusión de extremidad aislada, descrita en la patente de EE.UU. Nº 6.177.403, se puede emplear también por el experto en la técnica para administrar los viriones mutantes en la vasculatura de una extremidad aislada para mejorar potencialmente la transducción en células o tejido muscular. Además de ello, para determinadas afecciones, puede ser deseable administrar los viriones mutantes al SNC de un sujeto. Por "SNC" se quiere dar a entender todas las células y tejido del cerebro y la médula espinal de un vertebrado. Por lo tanto, el término incluye, pero no está limitado a células neuronales, células gliales, astrocitos, fluido cereobrospinal (CSF), espacios intersticiales, hueso, cartílago y similares. Viriones de AAV recombinante o células transducidas in vitro pueden ser suministrados directamente al SNC o al cerebro mediante inyección en, p. ej., la región ventricular, así como al cuerpo estriado (p. ej., el núcleo caudado o putamen del cuerpo estriado), la médula espinal y la unión neuromuscular, o el lóbulo del cerebelo, con un aguja, catéter o dispositivo relacionado, utilizando técnicas neuroquirúrgicas conocidas en la técnica tales como mediante inyección estereotáctica (véase, p. ej., Stein et al, J Virol 73:3424-3429,1999; Davidson et al., PNAS 97: 3428-3432, 2000; Davidson et al., Nat. Genet. 3:219-223,1993; y Alisky y Davidson, Hum. Gene Ther. 11:2315-2329, 2000).
La dosis de viriones de rAAV requerida para lograr un "efecto terapéutico" particular, p. ej., las unidades de dosis en genomas de vectores/por kilogramo de peso corporal (vg/kg), variarán en función de varios factores, incluyendo, pero no limitados a: la vía de administración del virión de rAAV, el nivel de la expresión del gen (o ARN anti-sentido o ribozima) requerido para lograr un efecto terapéutico, la enfermedad o trastorno específico que esté siendo tratado, una respuesta inmune del huésped al virión de rAAV, una respuesta inmune del huésped al gen (o ARN anti-sentido
o ribozima) del producto de expresión, y la estabilidad del producto gen (o ARN anti-sentido o ribozima). Un experto en la técnica puede determinar fácilmente un intervalo de dosis de virión de rAAV para tratar un paciente que tiene una enfermedad o trastorno particular sobre la base de los factores antes mencionados, así como otros factores que son bien conocidos en la técnica.
En términos generales, por "efecto terapéutico” se quiere dar a entender un nivel de expresión de uno o más HNAs suficientes para alterar un componente de una enfermedad (o trastorno) hacia un resultado o criterio de valoración clínico deseado, de modo que una enfermedad o trastorno del paciente muestra una mejora clínica, a menudo reflejada por la mejoría de un signo o síntoma clínico relacionado con la enfermedad o trastorno. Utilizando la hemofilia como un ejemplo de enfermedad específica, un "efecto terapéutico" para la hemofilia se define en esta memoria como un aumento en la eficiencia en la coagulación de la sangre de un mamífero afectado con hemofilia, determinándose la eficiencia, por ejemplo, por criterios de valoración o técnicas bien conocidos tal como empleando ensayos para medir el tiempo de coagulación de la sangre entera o el tiempo de protromboplastina activado. Las reducciones en el tiempo de coagulación de la sangre entera o el tiempo de protromboplastina activado son indicios de una eficiencia incrementada en la coagulación de la sangre. En casos graves de hemofilia, los hemofílicos que tienen menos de 1% de los niveles normales de Factor VIII o Factor IX tienen un tiempo de coagulación de la sangre entera de más de 60 minutos, en comparación con aproximadamente 10 minutos para los no hemofílicos. La expresión de 1% o mayor de Factor VIII o Factor IX ha demostrado reducir el tiempo de coagulación de la sangre entera en modelos animales de hemofilia, de modo que al lograr una concentración plasmática de Factor VIII o Factor IX circulante mayor que 1% es probable lograr el efecto terapéutico deseado de un aumento en la eficiencia en la coagulación de la sangre.
Las construcciones de la presente descripción pueden utilizarse alternativamente para suministrar un HNA a una célula huésped con el fin de elucidar su o sus funciones fisiológicas o bioquímicas. El HNA puede ser un gen endógeno o heterólogo. Utilizando cualquiera de un enfoque ex vivo o in vivo, el experto puede administrar los viriones mutantes que contienen uno o más HNAs de función desconocida a un animal experimental, expresar el o los HNAs y observar cualesquiera cambios funcionales posteriores. Tales cambios pueden incluir: interacciones proteína-proteína, alteraciones en las vías bioquímicas, alteraciones en el funcionamiento fisiológico de las células, tejidos, órganos o sistemas de órganos, y/o la estimulación o el silenciamiento de la expresión génica.
Alternativamente, el experto puede sobre-expresar un gen de función conocida o desconocida y examinar sus efectos in vivo. Este tipo de genes pueden ser endógenos para el animal experimental o de naturaleza heteróloga (es decir, un transgén).
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1.
Un fragmento de ADN de Xba I de 4311 pb se escindió de pSUB201 que contiene secuencias rep/cap de AAV. Los extremos de Xba I fueron re-asociados con un oligonucleótido sintético Not I de 10 pb (5'-AGCGGCCGCT-3') (SEQ ID NO: 5) para dar un plásmido intermedio pUC/ITR-Not I que tiene tanto ITRs (repeticiones terminales invertidas) de AAV separadas por 116 pb de la secuencia AAV residual como ADN de enlazador Not I.
2.
Un fragmento de ADN de Not I de 1319 pb se escindió de p1.1c que contiene el promotor de CMV y las secuencias de intrón hGH. Esta secuencia de ADN se insertó en el sitio Not I de pUC/ITR-Not I, para dar el pSUB201N intermedio.
3.
Una casete de expresión de CMV de 1668 pb unida a ITR de Pvu II (5131-1493) se escindió de pSUB201N y se insertó en el sitio Pvu II (posición 12) de pWee.1a, para dar el intermedio de plásmido pWee.1b. La escisión del fragmento PvuII de 1668 pb de pSUB201N separó 15 pb desde el exterior de cada una de las ITRs, en la región palindrómica “A”.
4.
Una secuencia de ADN Not I/Eco RV "AAVrep/cap" de 4737 pb que se escindió de pGN1909 y los extremos se hicieron romos rellenando los extremos rebajados en 3’ utilizando ADN polimerasa de Klenow. Enlazadores Asc I se ligaron a ambos extremos, seguido de la clonación de este fragmento de ADN "pGN1909/AscI" en la cadena principal de pWee1909 en un sitio Asc I (2703), para dar el pWee1909 intermedio (8188 pb). Este plásmido tiene la casete de expresión de CMV unida a ITR con una cadena principal del gen rep/cap de AAV.
5.
Un gen Sma I/Dra I LacZ de 3246 pb se escindió de pCMV-beta y los enlazadores Asc I se ligaron al fragmento de extremos romos. Este fragmento LacZ/Asc I se clonó en p1.1c entre los sitios Bss HII, para dar p1.1cADHLacZ, que tiene el gen LacZ dirigido por el promotor de CMV.
6.
Un fragmento de ADN Not I de 4387 pb se escindió de p1.1cADHLacZ que tiene el gen LacZ dirigido por el promotor de CMV. Este fragmento se insertó entre los sitios Not I de pWee1909, después de separar una casete de expresión de "promotor de CMV/intrón de hGH" de 1314 pb. La construcción resultante, pW1909ADHLacZ, tiene el gen β-galactosidasa bajo el control del promotor de CMV y ligado por ITRs. La cadena principal del plásmido porta los genes "rep" y “cap” que proporcionan funciones helper de AAV y el gen β-lactamasa (ampicilina) gen confiere resistencia a los antibióticos.
7.
Un fragmento de ADN Sse I de 4772 pb que contiene una casete "CMV/LacZ" se escindió de pW1909ADHLacZ y se insertó en el sitio Sse I de pUC19, para dar Pre-pVLacZ. Esta construcción todavía contiene aproximadamente 50 pb de las secuencias pSUB201 5’ y 3’ remanentes internas a cada una de las ITRs.
8.
Las secuencias pSUB201 remanentes fueron separadas mediante escisión 2912 bp de un fragmento de ADN Msc I “pUC/ΔITR” de Pre-pVLacZ, que también separa aproximadamente 35 pb de la región "D" de cada una de las ITRs. Un enlazador sintético "145NA/NB" (5'-CCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCC-3') (SEQ ID NO: 6) que contiene un sitio de restricción Msc I, la región “D” de ITR y un sitio Not I se utilizó para la clonación en un fragmento de Not I de 4384 pb de pW1909ADHLacZ, que tiene la casete de expresión "CMV/LacZ". El plásmido resultante pVLacZ, tiene al gen β-galactosidasa bajo el control de una secuencia potenciadora de la alcohol deshidrogenasa y el promotor de CMV, todos ligados por ITRs de AAV.
9.
pVLacZ se modificó adicionalmente separando elementos LacZ y la secuencia de poli-enlazador fuera de la casete de expresión de LacZ ligada por ITR, como sigue. Una secuencia Ehe I/Afl III-LacZ/polienlazador de 534 pb se escindió de pUC119, los extremos se hicieron romos utilizando ADN polimerasa de Klenow y el plásmido se ligó a un enlazador Sse I (5'-CCTGCAGG-3') (SEQ ID NO: 7), para producir pUC119/Sse I. La secuencia de ADN "AAVLacZ" se separó de pVLacZ cortando un fragmento de Sse I de 4666 pb. Este fragmento de Sse I se clonó en el sitio Sse I de pUC119/SseI para generar pVmLacZ. pVmLacZ tiene el promotor de CMV/potenciador de ADH/gen β-galactosidasa ligado por ITRs de AAV en una cadena principal derivada de pUC119 que confiere resistencia a la ampicilina y tiene un origen de replicación con un alto número de copias.
II. Proceso de Transfección Triple
Los diversos vectores de la función helper de AAV mutados (arriba descritos), el vector de función accesoria pLadeno5 (descrito en la patente de EE.UU. Nº 6.004.797) y el vector de rAAV2-lacZ, pVmLacZ (descrito anteriormente) se utilizaron para producir viriones recombinantes.
En síntesis, células de riñón embrionario humano tipo 293 (American Type Culture Collection, número de catálogo CRL-1573) se sembraron en placas estériles tratadas con cultivo de tejidos de 10 cm a una densidad de 3x106 células por placa en 10 mL de medio de cultivo celular que consiste en medio de Eagle modificado por Dulbeco
22
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La región no conservada entre AAV-5 y AAV caprino incluye 43 mutaciones. 17 de estas 43 son mutaciones no conservada entre AAV-2 y AAV-8. Sólo una de estas mutaciones se originó en el mismo aminoácido en el AAV caprino y AAV-8. La región no conservada entre AAV-5 y AAV caprino incluye 348 aminoácidos. Esta región no conservada se comprime a 157 aminoácidos cuando se analiza la región que contiene las 17 mutaciones conjuntas.
Las Tablas 8-11 muestran los resultados de las comparaciones.
Tabla 8 Mutaciones en los residuos en superficie (O) de AAV-2 frente a AAV-8 y AAV-5 frente a AAV Caprino
Región
Mutaciones de AAV-2 frente a AAV-8 (x)/residuos en superficie (O) Mutaciones de AAV-5 frente a AAV Caprino (*)/residuos en superficie (O)
100200
04/19 (+2 inserciones) 00/19
200300
01/20 01/20
300400
16/31 03/30
400500
20/46 (+1 inserción) 11/43 (+1 inserción)
500600
13/27 04/30
700750
05/24 01/24
100750
59/167 (35%) 20/167 (12%)
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65% de identidad 88% de identidad
42
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