JP2018029614A - 減少した免疫反応性を有するａａｖビリオン、およびその使用 - Google Patents

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Abstract

【課題】免疫反応性が減少したＡＡＶ変異体を提供する。【解決手段】免疫反応性が減少した組み換え型ＡＡＶビリオンの作製方法および使用方法が記載される。組み換え型ＡＡＶビリオンは、変異型キャプシドタンパク質を含むか、または、ＡＡＶ−２に対して減少した免疫反応性を示す非霊長類の哺乳動物ＡＡＶ血清型および単離体に由来する。１実施形態において、脊椎動物被験体（例えば、哺乳動物）の細胞または組織への、組み換え型ＡＡＶビリオンを用いた、異種性の核酸分子（ＨＮＡ）の効率的な送達のための方法、および、この方法において使用するためのＡＡＶベクターが提供される。【選択図】図１

Description

（技術分野）
本発明は、一般に、組み換え型アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを細胞に送達するための組成物および方法に関する。特に、本発明は、免疫反応性が減少したｒＡＡＶビリオン（例えば、変異型ｒＡＡＶビリオン）、ならびにその作製方法および使用方法に関する。
（背景）
科学者は、糖尿病、血友病および癌のようなヒト疾患に関連する遺伝子を頻繁に発見している。研究努力はまた、遺伝的障害に関連しないが、その代わりに多数の疾患を処置するために使用され得るタンパク質をコードする、エリスロポエチン（赤血球産生を増加させる）のような遺伝子を明らかにしている。しかし、遺伝子を同定および単離する試みにおける有意な進歩にも関わらず、生物薬剤学産業が直面する主要な障害は、治療有効量の遺伝子産物を安全かつ持続的に患者に送達する方法である。
一般に、これらの遺伝子のタンパク質生成物は、培養細菌、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞または他の細胞において合成され、そして、直接注射によって患者に送達される。組換えタンパク質の注射は、効を奏しているが、いくつかの欠点に苦しんでいる。例えば、患者はしばしば、血流内のタンパク質の必要なレベルを維持するために、毎週、そして時には毎日の注射を必要とする。それでも、タンパク質の濃度は、生理学的レベルには維持されない−タンパク質のレベルは、通常、注射直後には異常に高く、注射前には最適なレベルからかなり低い。さらに、組換えタンパク質の注射による送達は、しばしば、このタンパク質を、体内の標的の細胞、組織または器官に送達し得ない。そして、タンパク質がその標的に首尾よく到達しても、このタンパク質は、非治療的レベルまで希釈され得る。さらに、この方法は不便であり、しばしば、患者の生活様式を制限する。
これらの欠点は、特定のタンパク質の持続したレベルを患者に送達するための遺伝子治療法を開発することに対する要望を刺激している。これらの方法は、医師が、治療遺伝子のような核酸をコードするデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を、患者に直接（インビボ遺伝子治療）、または患者もしくはドナーから単離した細胞内に（エキソビボ遺伝子治療）導入することを可能にするように設計される。次いで、導入された核酸は、患者自身の細胞、または移植された細胞に、所望のタンパク質生成物を産生するように命令する。従って、遺伝子の送達は、頻繁な注射に対する必要性を除去する。遺伝子治療はまた、医師が、治療のための特定の器官または細胞標的（例えば、筋肉、血球、脳細胞など）を選択することを可能にし得る。
ＤＮＡは、いくつかの方法で患者の細胞に導入され得る。化学的方法（例えば、リン酸カルシウム沈降およびリポソーム媒介性のトランスフェクション）および物理的方法（例えば、エレクトロポレーション）を含む、トランスフェクション法が存在する。一般に、トランスフェクション法は、インビボ遺伝子送達に適さない。組み換え型ウイルスを使用する方法もまた存在する。現行のウイルス媒介性遺伝子送達ベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づくものが挙げられる。レトロウイルスと同様に、そしてアデノウイルスとは異なり、ＡＡＶは、宿主細胞の染色体にそのゲノムを組み込む能力を有する。
（アデノ随伴ウイルス媒介性の遺伝子治療）
ＡＡＶは、Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ属に属するパルボウイルスであり、他のウイルスでは見られない、いくつかの魅力的な特徴を有する。例えば、ＡＡＶは、非分裂細胞を含む広範な宿主細胞に感染し得る。ＡＡＶはまた、異なる種に由来する細胞に感染し得る。重要なことに、ＡＡＶは、ヒトまたは動物の疾患のいずれにも関連せず、そして、組み込まれても、宿主細胞の生理学的特性を変更しないようである。さらに、ＡＡＶは、広範な物理的条件および化学的条件において安定であり、このことは、製造、保存および輸送の要件に役立つ。
およそ４７００ヌクレオチドを含有するＡＡＶゲノムの直線状の単鎖ＤＮＡ分子（ＡＡＶ−２ゲノムは、４６８１ヌクレオチドから構成される）は、一般に、各端部で逆方向末端反復（ＩＴＲ）により隣接される、内部非反復セグメントを含む。このＩＴＲは、約１４５ヌクレオチド長であり（ＡＡＶ−１は、１４３ヌクレオチドのＩＴＲを有する）、複製起点としての機能、およびウイルスゲノムのパッケージングシグナルとしての機能を含む、複数の機能を有する。
ゲノムの内部非反復部分は、ＡＡＶ複製（ｒｅｐ）領域およびＡＡＶキャプシド（ｃａｐ）領域として知られる、２つの大きなオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。これらのＯＲＦは、それぞれ、複製およびキャプシドの遺伝子産物をコードする：複製およびキャプシドの遺伝子産物（すなわち、タンパク質）は、完全なＡＡＶビリオンの複製、組み立ておよびパッケージングを可能にする。より具体的には、少なくとも４種のウイルスタンパク質のファミリーが、ＡＡＶ ｒｅｐ領域から発現される：Ｒｅｐ ７８、Ｒｅｐ ６８、Ｒｅｐ ５２およびＲｅｐ ４０（これらは全て、その見かけ上の分子量から命名されている）。ＡＡＶ ｃａｐ領域は、少なくとも３つのタンパク質をコードする：ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３。
自然状態では、ＡＡＶは、ヘルパーウイルス依存性のウイルスである。すなわち、ＡＡＶは、機能的に完全なＡＡＶビリオンを形成するために、ヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはワクシニアウイルス）と同時に感染する必要がある。ヘルパーウイルスと同時に感染しない場合、ＡＡＶは、ウイルスゲノムが宿主細胞の染色体内に挿入するか、またはエピソームの形態で存在する、潜伏状態を確立するが、感染性ビリオンは産生されない。後のヘルパーウイルスの感染により、この組み込まれたゲノムを「レスキュー」し、複製して、ウイルスキャプシドにパッケージングし、それによって、感染性ビリオンを再構成することが可能になる。ＡＡＶは、異なる種に由来する細胞に感染し得るが、ヘルパーウイルスは、宿主細胞と同じ種でなくてはならない。従って、例えば、ヒトＡＡＶは、イヌアデノウイルスと同時感染したイヌ細胞内で複製する。
核酸を含有する感染性組み換え型ＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を構築するために、適切な宿主細胞株が、核酸を含有するＡＡＶベクターを用いてトランスフェクトされる。次いで、ＡＡＶのヘルパー機能および補助機能が、宿主細胞において発現される。これらの因子が一緒になると、野生型（ｗｔ）のＡＡＶゲノムであるかのようにＨＮＡが複製され、パッケージングされ、組み換え型ビリオンを形成する。患者の細胞が、得られたｒＡＡＶに感染すると、ＨＮＡが進入し、そして、患者の細胞内で発現される。患者の細胞は、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子、ならびにアデノウイルス補助機能遺伝子を欠失しているので、ｒＡＡＶは、複製欠損型である；すなわち、これらは、そのゲノムをさらに複製およびパッケージングすることができない。同様に、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子の供給源がなければ、ｗｔＡＡＶは、患者の細胞において形成され得ない。
ヒトならびに他の霊長類および哺乳動物に感染する、いくつかのＡＡＶ血清型が存在する。８つの主要な血清型（ＡＡＶ−１〜ＡＡＶ−８）が同定されており、このうち、２つの血清型が、最近アカゲザルから単離されたものである。非特許文献１。これらの血清型のうち、ＡＡＶ−２が最もよく特徴付けられており、種々のインビトロアッセイおよびインビボアッセイにおいて、いくつかの細胞株、組織型および器官に導入遺伝子を首尾よく送達するために使用されている。ＡＡＶの種々の血清型は、モノクローナル抗体を用いてか、またはヌクレオチド配列分析を用いることによって、互いに区別され得る；例えば、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３およびＡＡＶ−６は、ヌクレオチドレベルで８２％同一であるが、ＡＡＶ−４は他の血清型に対して７５％〜７８％同一である（非特許文献２）。ヌクレオチド配列の有意なバリエーションが、キャプシドタンパク質をコードするＡＡＶゲノムの領域について注目されている。このような可変領域は、種々のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質に対する血清学的反応性における差異の原因となり得る。
所定のＡＡＶ血清型で最初に処置した後、抗ＡＡＶキャプシド中和抗体がしばしば作製され、これが、同じ血清型によるその後の処置を妨害する。例えば、非特許文献３は、抗ＡＡＶ−２抗体が前から存在するマウスは、組み換え型ＡＡＶ−２ビリオン中で第ＩＸ因子を投与された場合に、第ＩＸ因子の導入遺伝子を発現しないことを示し、これは、抗ＡＡＶ−２抗体がｒＡＡＶ−２ビリオンの形質導入をブロックしたことを示唆した。非特許文献４は、類似の結果を報告した。他にも、ｒＡＡＶ−２ビリオンの実験動物への再投与の成功は、免疫抑制の後にだけ達成されることが実証された（例えば、非特許文献４、前出を参照のこと）。
従って、ヒト遺伝子治療のためにｒＡＡＶを用いることは、かなり問題がある。なぜならば、抗ＡＡＶ抗体は、ヒト集団に蔓延しているからである。種々のＡＡＶ血清型によるヒトの感染は、幼児期に生じ、そして、胎内でさえ生じる可能性がある。実際、１つの研究が、一般集団の少なくとも８０％が、ＡＡＶ−２に感染していると推定した（非特許文献５）。抗ＡＡＶ−２中和抗体は、少なくとも２０〜４０％のヒトにおいて発見されている。本発明者らの研究は、５０人の血友病患者の群において、約４０％がＡＡＶ−２中和能を有し、これは、１ｅ１３ウイルス粒子／ｍｌ、または約６ｅ１６ウイルス粒子／全血液量を凌ぐことを示した。さらに、高い抗ＡＡＶ−２力価を有する群の大半はまた、他のＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５およびＡＡＶ−６）に対しても有意な力価を有した。それゆえ、免疫反応性が減少したＡＡＶ変異体（例えば、前から存在する抗ＡＡＶ抗体により中和されない変異体）の同定は、当該分野で優位な進歩である。このようなＡＡＶ変異体が、本明細書中に記載される。
Ｇａｏら（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：１１８５４−１１８５９ Ｒｕｓｓｅｌｌら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：３０９−３１９ Ｍｏｓｋａｌｅｎｋｏら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２０００）７４：１７６１−１７６６ Ｈａｌｂｅｒｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９８）７２：９７９５−９８０５ ＢｅｒｎｓおよびＬｉｎｄｅｎ（１９９５）Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ １７：２３７−２４５
（発明の要旨）
本発明は、新規ＡＡＶ配列（例えば、対応するネイティブな血清型と比較して、減少した免疫反応性を組み換え型ＡＡＶビリオンに提供するが、細胞および組織に効率的に形質導入する能力を保持する、変異型ＡＡＶ配列）の発見に基づく。免疫反応性が減少したｒＡＡＶビリオンは、自然感染によってか、または以前の遺伝子治療もしくは核酸免疫処置によってのいずれかで、以前にＡＡＶに曝露されたことがあり、それゆえ、抗ＡＡＶ抗体を発生している被験体に、異種性の核酸分子（ＨＮＡ）を送達するために特に有用である。それゆえ、本明細書中に記載されるｒＡＡＶビリオンは、以前に種々のＡＡＶ血清型のいずれかに曝露されたことがある脊椎動物被験体において、以下にさらに記載されるような、広範な種々の障害を処置または予防するために有用である。その結果、本発明によれば、脊椎動物被験体（例えば、哺乳動物）の細胞または組織への、組み換え型ＡＡＶビリオンを用いた、ＨＮＡの効率的な送達のための方法、および、この方法において使用するためのＡＡＶベクターが提供される。
特定の好ましい実施形態において、本発明は、アンンチセンスＲＮＡ、リボザイム、またはタンパク質を発現する１つ以上の遺伝子をコードするＨＮＡを送達するための、変更されたキャプシドタンパク質を含有するＡＡＶビリオンの使用を提供し、この使用において、前記アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、または１つ以上の遺伝子の発現は、哺乳動物被験体において生物学的効果を提供する。１つの実施形態において、ＨＮＡを含有するｒＡＡＶビリオンは、筋肉内（例えば、心筋、平滑筋および／または骨格筋）に直接注射される。別の実施形態において、ＨＮＡを含有するｒＡＡＶビリオンは、静脈内、動脈内もしくは他の血管内への注射によってか、または、隔離された肢還流のような技術を用いることによって、血管系へと投与される。
さらなる実施形態において、ビリオンは、血液凝固タンパク質をコードする遺伝子を含み、十分な濃度で発現される場合、血液凝固障害に罹患する哺乳動物の血液凝固効率の改善のような治療効果を提供する。この血液凝固障害は、血液を凝固させる器官の能力に悪影響を及ぼす任意の障害であり得る。好ましくは、血液凝固障害は、血友病である。その結果、１つの実施形態において、血液凝固タンパク質をコードする遺伝子は、第ＶＩＩＩ因子遺伝子（例えば、ヒト第ＶＩＩＩ因子遺伝子）またはその誘導体である。別の実施形態において、血液凝固タンパク質をコードする遺伝子は、ヒト第ＩＸ因子（ｈＦ．ＩＸ）遺伝子のような第ＩＸ因子遺伝子である。
従って、１つの実施形態において、本発明は、変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質に関し、この変異型タンパク質は、ＡＡＶビリオン中に存在する場合に、対応する野生型ビリオンと比較して、減少した免疫反応性をこのビリオンに与える。この変異は、ネイティブなタンパク質に対して少なくとも１つのアミノ酸の置換、欠失または挿入を含み得る。例えば、１つの置換は、ＡＡＶビリオン表面のスパイク領域またはプラトー領域内である。
特定の実施形態において、アミノ酸置換は、アミノ酸１２６、１２７、１２８、１３０、１３２、１３４、２４７、２４８、３１５、３３４、３５４、３５７、３６０、３６１、３６５、３７２、３７５、３７７、３９０、３９３、３９４、３９５、３９６、４０７、４１１、４１３、４１８、４３７、４４９、４５０、５６８、５６９および５７１からなる群より選択されるＡＡＶ−２ ＶＰ２キャプシドの位置に対応する位置に存在する１つ以上のアミノ酸の置換を含む。さらなる実施形態において、これらの位置の１つ以上において天然に存在するアミノ酸は、アラニンで置換される。さらなる実施形態において、このタンパク質は、ＡＡＶ−２ ＶＰ２の３６０位に見られるアミノ酸に対応する位置に存在するアミノ酸の、ヒスチジンによる置換、および／またはＡＡＶ−２ ＶＰ２の５７１位に見られるアミノ酸に対応する位置に存在するアミノ酸の、リジンによる置換を含む。
さらなる実施形態において、本発明は、上記の変異型タンパク質のいずれかをコードするポリヌクレオチドに関する。
さらなる実施形態において、本発明は、上記の変異型タンパク質のいずれかを含む組み換え型ＡＡＶビリオンに関する。この組み換え型ＡＡＶビリオンは、アンチセンスＲＮＡもしくはリボザイムをコードする異種性核酸分子、または治療タンパク質をコードする異種性核酸分子を含み得、この治療タンパク質は、上記タンパク質のインビボ転写および翻訳を命令し得る制御エレメントに作動可能に連結されている。
なおさらなる実施形態において、本発明は、脊椎動物被験体の細胞または組織に組み換え型ＡＡＶビリオンを送達する方法に関する。この方法は、
（ａ）上記のような組み換え型ＡＡＶビリオンを提供する工程；
（ｂ）細胞または組織に組み換え型ＡＡＶビリオンを送達し、それによって、この上記タンパク質が治療効果を提供するレベルで発現される、工程
を包含する。
特定の実施形態において、細胞または組織は、筋肉細胞または筋肉組織である。この筋肉細胞または筋肉組織は、骨格筋に由来するものであり得る。
さらなる実施形態において、組み換え型ＡＡＶビリオンは、インビボで細胞または組織に送達される。
特定の実施形態において、組み換え型ＡＡＶビリオンは、筋肉内注射によって、または血流内（例えば、静脈内または動脈内）に送達される。さらなる実施形態において、組み換え型ＡＡＶビリオンは、肝臓または脳に送達される。
さらなる実施形態において、組み換え型ＡＡＶビリオンは、インビトロで上記細胞または組織に送達される。
なおさらなる実施形態において、本発明は、脊椎動物被験体の細胞または組織に組み換え型ＡＡＶビリオンを送達する方法に関する。この方法は、
（ａ）組み換え型ＡＡＶビリオンを提供する工程であって、このＡＡＶビリオンは、
（ｉ）ＡＡＶビリオン中に存在する場合に、霊長類ＡＡＶ−２の免疫反応性と比較して、減少した免疫反応性をこのビリオンに与える、非霊長類の哺乳動物アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質；および
（ｉｉ）治療タンパク質をコードする異種性核酸分子であって、このタンパク質は、このタンパク質のインビボ転写および翻訳を命令し得る制御エレメントに作動可能に連結されている、異種性核酸分子
を含む、工程；
（ｂ）組み換え型ＡＡＶビリオンを細胞または組織に送達し、それによって、上記タンパク質が治療効果を提供するレベルで発現される、工程
を包含する。
特定の実施形態において、細胞または組織は、筋肉細胞または筋肉組織であり、例えば、筋肉細胞または筋肉組織は、骨格筋に由来するものである。
組み換え型ＡＡＶビリオンは、インビボまたはインビトロで上記細胞または組織に送達され、そして、筋肉内注射によってか、または血流内（例えば、静脈内または動脈内）に、被験体に送達され得る。さらなる実施形態において、組み換え型ＡＡＶビリオンは、肝臓または脳に送達される。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のビリオン中に存在する場合に、対応する野生型のビリオンと比較して、減少した免疫反応性を該ビリオンに与える、変異型アデノ随伴ウイルスキャプシドタンパク質。
（項目２）
上記変異が、ネイティブなタンパク質に対して、少なくとも１つのアミノ酸の置換、欠失または挿入を含む、項目１に記載のタンパク質。
（項目３）
上記変異が、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、項目２に記載のタンパク質。
（項目４）
上記少なくとも１つのアミノ酸置換が、上記ＡＡＶビリオンの表面のスパイク領域またはプラトー領域にある、項目３に記載のタンパク質。
（項目５）
上記アミノ酸置換が、アミノ酸１２６、１２７、１２８、１３０、１３２、１３４、２４７、２４８、３１５、３３４、３５４、３５７、３６０、３６１、３６５、３７２、３７５、３７７、３９０、３９３、３９４、３９５、３９６、４０７、４１１、４１３、４１８、４３７、４４９、４５０、５６８、５６９および５７１からなる群より選択されるＡＡＶ−２ ＶＰ２キャプシドの位置に対応する位置に生じる１つ以上のアミノ酸の置換を含む、項目４に記載のタンパク質。
（項目６）
上記位置に天然に存在するアミノ酸が、アラニンで置換されている、項目５に記載のタンパク質。
（項目７）
上記タンパク質が、ＡＡＶ−２ ＶＰ２の３６０位に見られるアミノ酸に対応する位置に存在するアミノ酸に対するヒスチジンの置換をさらに含む、項目６に記載のタンパク質。
（項目８）
上記タンパク質が、ＡＡＶ−２ ＶＰ２の５７１位に見られるアミノ酸に対応する位置に存在するアミノ酸に対するリジンの置換を含む、項目５〜７のいずれかに記載のタンパク質。
（項目９）
項目１〜８のいずれかに記載の変異型タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
（項目１０）
項目１〜８のいずれかに記載の変異型タンパク質を含む、組換え型ＡＡＶビリオン。
（項目１１）
上記ビリオンが、アンチセンスＲＮＡまたはリボザイムをコードする異種性核酸分子を含む、項目１０に記載の組み換え型ＡＡＶビリオン。
（項目１２）
上記ビリオンが、治療タンパク質をコードする異種性核酸分子を含み、該タンパク質は、該タンパク質のインビボ転写および翻訳を命令し得る制御エレメントに作動可能に連結されている、項目１０に記載の組み換え型ＡＡＶビリオン。
（項目１３）
脊椎動物被験体の細胞または組織に異種性核酸分子を送達するための、項目１１または１２のいずれかに記載の組み換え型ＡＡＶビリオンの使用であって、該使用により、該異種性核酸分子によりコードされるタンパク質が、治療効果を提供するレベルで発現される、使用。
（項目１４）
上記細胞または組織が、筋肉細胞または筋肉組織である、項目１３に記載の使用。
（項目１５）
上記筋肉細胞または筋肉組織が、骨格筋由来である、項目１４に記載の使用。
（項目１６）
上記組み換え型ＡＡＶビリオンが、インビボで上記細胞または組織に送達される、項目１３に記載の使用。
（項目１７）
上記組み換え型ＡＡＶビリオンが、筋肉内注射により送達される、項目１６に記載の使用。
（項目１８）
上記組み換え型ＡＡＶビリオンが、インビトロで上記細胞または組織に送達される、項目１３に記載の使用。
（項目１９）
上記組み換え型ＡＡＶビリオンが、血流内に送達される、項目１３に記載の使用。
（項目２０）
上記組み換え型ＡＡＶビリオンが、静脈内送達される、項目１９に記載の使用。
（項目２１）
上記組換え型ＡＡＶビリオンが、動脈内送達される、項目１９に記載の使用。
（項目２２）
上記組み換え型ＡＡＶビリオンが、肝臓に送達される、項目１３に記載の使用。
（項目２３）
上記組み換え型ＡＡＶビリオンが、脳に送達される、項目１３に記載の使用。
（項目２４）
組み換え型ＡＡＶビリオンを、脊椎動物被験体の細胞または組織に送達する方法であって、該方法は、
（ａ）項目１２に記載の組み換え型ＡＡＶビリオンを提供する工程；
（ｂ）該組み換え型ＡＡＶビリオンを該細胞または組織に送達し、それによって、上記タンパク質が、治療効果を提供するレベルで発現される、工程
を包含する、方法。
（項目２５）
脊椎動物被験体の細胞または組織にタンパク質をコードする異種性核酸を送達するための組み換え型アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ビリオンの使用であって、該使用により、該タンパク質が治療効果を提供するレベルで発現され、該使用において、該組み換え型ＡＡＶビリオンは、
（ｉ）ＡＡＶビリオン中に存在する場合に、霊長類のＡＡＶ−２の免疫反応性と比較して、減少した免疫反応性を該ビリオンに与える、非霊長類の哺乳動物ＡＡＶキャプシドタンパク質；および
（ｉｉ）治療タンパク質をコードし、該タンパク質のインビボ転写および翻訳を命令し得る制御エレメントに作動可能に連結された、異種性核酸分子
を含む、使用。
（項目２６）
上記細胞または組織が、筋肉細胞または筋肉組織である、項目２５に記載の使用。
（項目２７）
上記筋肉細胞または筋肉組織が、骨格筋由来である、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
上記組み換え型ＡＡＶビリオンが、インビボで上記細胞または組織に送達される、項目２５に記載の使用。
（項目２９）
上記組み換え型ＡＡＶビリオンが、筋肉内注射により送達される、項目２６に記載の方法。
（項目３０）
上記組み換え型ＡＡＶビリオンが、インビトロで上記細胞または組織に送達される、項目２５に記載の使用。
（項目３１）
上記組み換え型ＡＡＶビリオンが、血流内に送達される、項目２５に記載の使用。
（項目３２）
上記組み換え型ＡＡＶビリオンが、静脈内送達される、項目３１に記載の使用。
（項目３３）
上記組み換え型ＡＡＶが、動脈内送達される、項目３１に記載の方法。
（項目３４）
上記組み換え型ＡＡＶビリオンが、肝臓に送達される、項目２５に記載の使用。
（項目３５）
上記組み換え型ＡＡＶビリオンが、脳に送達される、項目２５に記載の使用。
（項目３６）
脊椎動物被験体の細胞または組織に組み換え型ＡＡＶビリオンを送達する方法であって、該方法は、
（ａ）組み換え型ＡＡＶビリオンを提供する工程であって、該ＡＡＶビリオンは、
（ｉ）ＡＡＶビリオン中に存在する場合に、霊長類ＡＡＶ−２の免疫反応性と比較して、減少した免疫反応性を該ビリオンに与える、非霊長類の哺乳動物アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質；および
（ｉｉ）治療タンパク質をコードする異種性核酸分子であって、該タンパク質は、該タンパク質のインビボ転写および翻訳を命令し得る制御エレメントに作動可能に連結されている、異種性核酸分子
を含む、工程；
（ｂ）該組み換え型ＡＡＶビリオンを該細胞または組織に送達し、それによって、該タンパク質が治療効果を提供するレベルで発現される、工程
を包含する、方法。
本発明のこれらおよび他の実施形態は、本明細書中の開示を考慮すれば、当業者に容易に想到する。
図１は、全ウイルス表面上のＡＡＶ−２の非対称性構造単位（白三角）の位置を示す（Ｘｉｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２００２）９９：１０４０５−１０４１０の図３ａから取った）。ＡＡＶビリオン１個につき６０の同一な非対称性構造単位が存在する。各ＡＡＶ−２カプソメアにおいて、合計７３５のうちの少なくとも１４５アミノ酸が、程度の差はあれ、表面上で露出している。 図２は、ＡＡＶ−２構造の非対称性単位（黒三角）内で、実施例に記載されるように変異したいくつかのアミノ酸の位置を示す。変異したアミノ酸を、黒色空間充填モデル（ｂｌａｃｋ ｓｐａｃｅ−ｆｉｌｌｉｎｇ ｍｏｄｅｌ）として示すが、変異していないアミノ酸は、白い棒状モデル（ｗｈｉｔｅ ｓｔｉｃｋ ｍｏｄｅｌ）として示す。主要な表面特徴（スパイク、シリンダー、プラトー、キャニオン）の位置を示し、これらの特徴のおよその境界を、細い円形の黒線で示す。抗体結合に比較的近づきにくいと予測される「キャニオン」領域は、スパイクと、シリンダーとプラトーとの間の領域に位置する。数字２、３および５はそれぞれ、２倍対称軸、３倍対称軸および５倍対称軸を表す。 図３は、インビトロ形質導入に対して１０倍を超える効果を有する変異の位置を示す。変異は、黒色空間充填のアミノ酸に位置し、野生型の形質導入の１０％未満であった。数字２、３および５はそれぞれ、２倍対称軸、３倍対称軸および５倍対称軸を表す。 図４は、インビトロ形質導入に対して、１０倍未満の効果を有する変異の位置を示す。変異は、黒色空間充填アミノ酸に位置し、野生型の形質導入の１０％未満であった。数字２、３および５はそれぞれ、２倍対称軸、３倍対称軸および５倍対称軸を表す。２倍対称軸にかかる２つのデッドゾーンのおよその境界を示す。 図５は、ヘパリン結合を欠失したＡＡＶ−２キャプシド変異のいくつかの位置を示す。黒いアミノ酸は、本明細書において同定されたヘパリン欠損変異を示す。空間充填モデルとして示した黒いアミノ酸（３４７、３５０、３５６、３７５、３９５、４４８、４５１）は、表面上にある。空間充填モデルとして示した灰色のアミノ酸（４９５、５９２）は、表面の直ぐ下にある。数字２、３および５はそれぞれ、２倍対称軸、３倍対称軸および５倍対称軸を表す。ヘパリン結合に対して１００倍以上の効果を有する変異を、円で囲う。 図６は、個々に変異している場合に、マウスモノクローナル抗体による中和に対する抵抗性を与える、ＡＡＶ−２キャプシドの表面上のアミノ酸のいくつかの位置（黒色空間充填モデル）を示す。長方形のボックスは、抗体結合部位のおよそのサイズ（２５Å×３５Å）を表す。数字２、３および５はそれぞれ、２倍対称軸、３倍対称軸および５倍対称軸を表す。 図７は、複数の抗ヒト血清による中和に対する抵抗性を与える、ＡＡＶ−２キャプシドの表面上のアミノ酸のいくつかの位置（黒色空間充填モデル）を示す。長方形のボックスは、抗体結合部位のおよそのサイズ（２５Å×３５Å）を表す。数字２、３および５はそれぞれ、２倍対称軸、３倍対称軸および５倍対称軸を表す。 図８は、野生型キャプシドを有するＡＡＶ−２と比較した、４つのＡＡＶ−２キャプシド変異のマウスモノクローナル抗体力価特性を示す。 図９は、ＡＡＶ−２ ＶＰ２のアミノ酸配列（配列番号１２）を示す。 図１０は、ＡＡＶ−２ ＶＰ１のアミノ酸配列（配列番号１３）を示す。 図１１は、ＡＡＶ−２キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の相対位置を示す。図に示されるように、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３は、ＶＰ３を構成する、同じ５３３Ｃ末端アミノ酸を共有する。図に示されるように、本明細書中に記載される全てのキャプシド変異は、共有領域内にある。 図１２Ａ〜１２Ｂは、霊長類ＡＡＶ−５からのＡＡＶ ＶＰ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列（配列番号１４）およびヤギＡＡＶからのＡＡＶ ＶＰ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列（配列番号１５）の比較を示す。番号付けは、ＡＡＶ−５全長配列に関するものである。 図１２Ａ〜１２Ｂは、霊長類ＡＡＶ−５からのＡＡＶ ＶＰ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列（配列番号１４）およびヤギＡＡＶからのＡＡＶ ＶＰ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列（配列番号１５）の比較を示す。番号付けは、ＡＡＶ−５全長配列に関するものである。 図１３は、霊長類ＡＡＶ−５からのＶＰ１のアミノ酸配列（配列番号１６）およびヤギＡＡＶからのＶＰ１のアミノ酸配列（配列番号１７）の比較を示す。アミノ酸の相違に影をつける。保存的変化を、明るい灰色で示し；非保存的変化を、暗い灰色で示す。 図１４Ａ〜１４Ｈは、以下のような抗体中和に対して感受性もしくは抵抗性のＡＡＶからのＶＰ１のアミノ酸配列の比較を示す：霊長類ＡＡＶ−２（配列番号１３）、霊長類ＡＡＶ−３Ｂ（配列番号１８）、霊長類ＡＡＶ−６（配列番号１９）、霊長類ＡＡＶ−１（配列番号２０）、霊長類ＡＡＶ−８（配列番号２１）、霊長類ＡＡＶ−４（配列番号２２）、霊長類ＡＡＶ−５（配列番号１６）およびヤギＡＡＶ（配列番号１７）。パルボウイルスの列：＊、ほぼ全てのパルボウイルスで保存されている。中和の列：＃、ヒト血清による中和に対して抵抗性であるものと同定されたＡＡＶ−２キャプシドの単一の変異の位置。アクセス可能性の列：Ｂ、アミノ酸が内側表面と外側表面との間に埋もれている；Ｉ、アミノ酸が内側表面上に見られる；Ｏ、アミノ酸が外側表面上に見られる。表面特徴の列：Ｃ、シリンダー；Ｐ、プラトー；Ｓ、スパイク；Ｙ、キャニオン。ＤＮＡの列：Ｂ、塩基と接触可能；Ｄ、ＤＮＡ結合に必要とされる可能性があるが、直接はＤＮＡと接触し得ない；Ｐ、リン酸基と接触可能；Ｒ、リボースと接触可能。その他の列：Ａ、結合およびマウスモノクローナル抗体Ａ２０による中和を減少する単一の変異の位置；Ｈ、ＡＡＶ−２内のヘパリン接触；Ｍ、Ｍｇ２＋と接触可能；Ｐ、ホスホリパーゼＡ２ドメイン。 図１４Ａ〜１４Ｈは、以下のような抗体中和に対して感受性もしくは抵抗性のＡＡＶからのＶＰ１のアミノ酸配列の比較を示す：霊長類ＡＡＶ−２（配列番号１３）、霊長類ＡＡＶ−３Ｂ（配列番号１８）、霊長類ＡＡＶ−６（配列番号１９）、霊長類ＡＡＶ−１（配列番号２０）、霊長類ＡＡＶ−８（配列番号２１）、霊長類ＡＡＶ−４（配列番号２２）、霊長類ＡＡＶ−５（配列番号１６）およびヤギＡＡＶ（配列番号１７）。パルボウイルスの列：＊、ほぼ全てのパルボウイルスで保存されている。中和の列：＃、ヒト血清による中和に対して抵抗性であるものと同定されたＡＡＶ−２キャプシドの単一の変異の位置。アクセス可能性の列：Ｂ、アミノ酸が内側表面と外側表面との間に埋もれている；Ｉ、アミノ酸が内側表面上に見られる；Ｏ、アミノ酸が外側表面上に見られる。表面特徴の列：Ｃ、シリンダー；Ｐ、プラトー；Ｓ、スパイク；Ｙ、キャニオン。ＤＮＡの列：Ｂ、塩基と接触可能；Ｄ、ＤＮＡ結合に必要とされる可能性があるが、直接はＤＮＡと接触し得ない；Ｐ、リン酸基と接触可能；Ｒ、リボースと接触可能。その他の列：Ａ、結合およびマウスモノクローナル抗体Ａ２０による中和を減少する単一の変異の位置；Ｈ、ＡＡＶ−２内のヘパリン接触；Ｍ、Ｍｇ２＋と接触可能；Ｐ、ホスホリパーゼＡ２ドメイン。 図１４Ａ〜１４Ｈは、以下のような抗体中和に対して感受性もしくは抵抗性のＡＡＶからのＶＰ１のアミノ酸配列の比較を示す：霊長類ＡＡＶ−２（配列番号１３）、霊長類ＡＡＶ−３Ｂ（配列番号１８）、霊長類ＡＡＶ−６（配列番号１９）、霊長類ＡＡＶ−１（配列番号２０）、霊長類ＡＡＶ−８（配列番号２１）、霊長類ＡＡＶ−４（配列番号２２）、霊長類ＡＡＶ−５（配列番号１６）およびヤギＡＡＶ（配列番号１７）。パルボウイルスの列：＊、ほぼ全てのパルボウイルスで保存されている。中和の列：＃、ヒト血清による中和に対して抵抗性であるものと同定されたＡＡＶ−２キャプシドの単一の変異の位置。アクセス可能性の列：Ｂ、アミノ酸が内側表面と外側表面との間に埋もれている；Ｉ、アミノ酸が内側表面上に見られる；Ｏ、アミノ酸が外側表面上に見られる。表面特徴の列：Ｃ、シリンダー；Ｐ、プラトー；Ｓ、スパイク；Ｙ、キャニオン。ＤＮＡの列：Ｂ、塩基と接触可能；Ｄ、ＤＮＡ結合に必要とされる可能性があるが、直接はＤＮＡと接触し得ない；Ｐ、リン酸基と接触可能；Ｒ、リボースと接触可能。その他の列：Ａ、結合およびマウスモノクローナル抗体Ａ２０による中和を減少する単一の変異の位置；Ｈ、ＡＡＶ−２内のヘパリン接触；Ｍ、Ｍｇ２＋と接触可能；Ｐ、ホスホリパーゼＡ２ドメイン。 図１４Ａ〜１４Ｈは、以下のような抗体中和に対して感受性もしくは抵抗性のＡＡＶからのＶＰ１のアミノ酸配列の比較を示す：霊長類ＡＡＶ−２（配列番号１３）、霊長類ＡＡＶ−３Ｂ（配列番号１８）、霊長類ＡＡＶ−６（配列番号１９）、霊長類ＡＡＶ−１（配列番号２０）、霊長類ＡＡＶ−８（配列番号２１）、霊長類ＡＡＶ−４（配列番号２２）、霊長類ＡＡＶ−５（配列番号１６）およびヤギＡＡＶ（配列番号１７）。パルボウイルスの列：＊、ほぼ全てのパルボウイルスで保存されている。中和の列：＃、ヒト血清による中和に対して抵抗性であるものと同定されたＡＡＶ−２キャプシドの単一の変異の位置。アクセス可能性の列：Ｂ、アミノ酸が内側表面と外側表面との間に埋もれている；Ｉ、アミノ酸が内側表面上に見られる；Ｏ、アミノ酸が外側表面上に見られる。表面特徴の列：Ｃ、シリンダー；Ｐ、プラトー；Ｓ、スパイク；Ｙ、キャニオン。ＤＮＡの列：Ｂ、塩基と接触可能；Ｄ、ＤＮＡ結合に必要とされる可能性があるが、直接はＤＮＡと接触し得ない；Ｐ、リン酸基と接触可能；Ｒ、リボースと接触可能。その他の列：Ａ、結合およびマウスモノクローナル抗体Ａ２０による中和を減少する単一の変異の位置；Ｈ、ＡＡＶ−２内のヘパリン接触；Ｍ、Ｍｇ２＋と接触可能；Ｐ、ホスホリパーゼＡ２ドメイン。 図１４Ａ〜１４Ｈは、以下のような抗体中和に対して感受性もしくは抵抗性のＡＡＶからのＶＰ１のアミノ酸配列の比較を示す：霊長類ＡＡＶ−２（配列番号１３）、霊長類ＡＡＶ−３Ｂ（配列番号１８）、霊長類ＡＡＶ−６（配列番号１９）、霊長類ＡＡＶ−１（配列番号２０）、霊長類ＡＡＶ−８（配列番号２１）、霊長類ＡＡＶ−４（配列番号２２）、霊長類ＡＡＶ−５（配列番号１６）およびヤギＡＡＶ（配列番号１７）。パルボウイルスの列：＊、ほぼ全てのパルボウイルスで保存されている。中和の列：＃、ヒト血清による中和に対して抵抗性であるものと同定されたＡＡＶ−２キャプシドの単一の変異の位置。アクセス可能性の列：Ｂ、アミノ酸が内側表面と外側表面との間に埋もれている；Ｉ、アミノ酸が内側表面上に見られる；Ｏ、アミノ酸が外側表面上に見られる。表面特徴の列：Ｃ、シリンダー；Ｐ、プラトー；Ｓ、スパイク；Ｙ、キャニオン。ＤＮＡの列：Ｂ、塩基と接触可能；Ｄ、ＤＮＡ結合に必要とされる可能性があるが、直接はＤＮＡと接触し得ない；Ｐ、リン酸基と接触可能；Ｒ、リボースと接触可能。その他の列：Ａ、結合およびマウスモノクローナル抗体Ａ２０による中和を減少する単一の変異の位置；Ｈ、ＡＡＶ−２内のヘパリン接触；Ｍ、Ｍｇ２＋と接触可能；Ｐ、ホスホリパーゼＡ２ドメイン。 図１４Ａ〜１４Ｈは、以下のような抗体中和に対して感受性もしくは抵抗性のＡＡＶからのＶＰ１のアミノ酸配列の比較を示す：霊長類ＡＡＶ−２（配列番号１３）、霊長類ＡＡＶ−３Ｂ（配列番号１８）、霊長類ＡＡＶ−６（配列番号１９）、霊長類ＡＡＶ−１（配列番号２０）、霊長類ＡＡＶ−８（配列番号２１）、霊長類ＡＡＶ−４（配列番号２２）、霊長類ＡＡＶ−５（配列番号１６）およびヤギＡＡＶ（配列番号１７）。パルボウイルスの列：＊、ほぼ全てのパルボウイルスで保存されている。中和の列：＃、ヒト血清による中和に対して抵抗性であるものと同定されたＡＡＶ−２キャプシドの単一の変異の位置。アクセス可能性の列：Ｂ、アミノ酸が内側表面と外側表面との間に埋もれている；Ｉ、アミノ酸が内側表面上に見られる；Ｏ、アミノ酸が外側表面上に見られる。表面特徴の列：Ｃ、シリンダー；Ｐ、プラトー；Ｓ、スパイク；Ｙ、キャニオン。ＤＮＡの列：Ｂ、塩基と接触可能；Ｄ、ＤＮＡ結合に必要とされる可能性があるが、直接はＤＮＡと接触し得ない；Ｐ、リン酸基と接触可能；Ｒ、リボースと接触可能。その他の列：Ａ、結合およびマウスモノクローナル抗体Ａ２０による中和を減少する単一の変異の位置；Ｈ、ＡＡＶ−２内のヘパリン接触；Ｍ、Ｍｇ２＋と接触可能；Ｐ、ホスホリパーゼＡ２ドメイン。 図１４Ａ〜１４Ｈは、以下のような抗体中和に対して感受性もしくは抵抗性のＡＡＶからのＶＰ１のアミノ酸配列の比較を示す：霊長類ＡＡＶ−２（配列番号１３）、霊長類ＡＡＶ−３Ｂ（配列番号１８）、霊長類ＡＡＶ−６（配列番号１９）、霊長類ＡＡＶ−１（配列番号２０）、霊長類ＡＡＶ−８（配列番号２１）、霊長類ＡＡＶ−４（配列番号２２）、霊長類ＡＡＶ−５（配列番号１６）およびヤギＡＡＶ（配列番号１７）。パルボウイルスの列：＊、ほぼ全てのパルボウイルスで保存されている。中和の列：＃、ヒト血清による中和に対して抵抗性であるものと同定されたＡＡＶ−２キャプシドの単一の変異の位置。アクセス可能性の列：Ｂ、アミノ酸が内側表面と外側表面との間に埋もれている；Ｉ、アミノ酸が内側表面上に見られる；Ｏ、アミノ酸が外側表面上に見られる。表面特徴の列：Ｃ、シリンダー；Ｐ、プラトー；Ｓ、スパイク；Ｙ、キャニオン。ＤＮＡの列：Ｂ、塩基と接触可能；Ｄ、ＤＮＡ結合に必要とされる可能性があるが、直接はＤＮＡと接触し得ない；Ｐ、リン酸基と接触可能；Ｒ、リボースと接触可能。その他の列：Ａ、結合およびマウスモノクローナル抗体Ａ２０による中和を減少する単一の変異の位置；Ｈ、ＡＡＶ−２内のヘパリン接触；Ｍ、Ｍｇ２＋と接触可能；Ｐ、ホスホリパーゼＡ２ドメイン。 図１４Ａ〜１４Ｈは、以下のような抗体中和に対して感受性もしくは抵抗性のＡＡＶからのＶＰ１のアミノ酸配列の比較を示す：霊長類ＡＡＶ−２（配列番号１３）、霊長類ＡＡＶ−３Ｂ（配列番号１８）、霊長類ＡＡＶ−６（配列番号１９）、霊長類ＡＡＶ−１（配列番号２０）、霊長類ＡＡＶ−８（配列番号２１）、霊長類ＡＡＶ−４（配列番号２２）、霊長類ＡＡＶ−５（配列番号１６）およびヤギＡＡＶ（配列番号１７）。パルボウイルスの列：＊、ほぼ全てのパルボウイルスで保存されている。中和の列：＃、ヒト血清による中和に対して抵抗性であるものと同定されたＡＡＶ−２キャプシドの単一の変異の位置。アクセス可能性の列：Ｂ、アミノ酸が内側表面と外側表面との間に埋もれている；Ｉ、アミノ酸が内側表面上に見られる；Ｏ、アミノ酸が外側表面上に見られる。表面特徴の列：Ｃ、シリンダー；Ｐ、プラトー；Ｓ、スパイク；Ｙ、キャニオン。ＤＮＡの列：Ｂ、塩基と接触可能；Ｄ、ＤＮＡ結合に必要とされる可能性があるが、直接はＤＮＡと接触し得ない；Ｐ、リン酸基と接触可能；Ｒ、リボースと接触可能。その他の列：Ａ、結合およびマウスモノクローナル抗体Ａ２０による中和を減少する単一の変異の位置；Ｈ、ＡＡＶ−２内のヘパリン接触；Ｍ、Ｍｇ２＋と接触可能；Ｐ、ホスホリパーゼＡ２ドメイン。 図１５（配列番号１６および配列番号１７）は、ＡＡＶキャプシドの表面に関して、ＡＡＶ−５とヤギＡＡＶとの間のアミノ酸相違の位置を示す。 図１６は、ＡＡＶ−２キャプシドの表面構造に基づく、ＡＡＶ−５とヤギＡＡＶとの間で異なる表面アミノ酸の予想位置を示す。３つの黒三角は、表面上に位置する可能性のある、ＡＡＶ−２に関するヤギＡＡＶ内の挿入を表す。 図１７は、種々のｒＡＡＶ ｈＦＩＸビリオンの筋肉内投与後の、ＩＶＩＧ処置ＳＣＩＤマウスの筋肉の形質導入を示す。 図１８は、種々のｒＡＡＶ ｈＦＩＸビリオンの尾静脈投与後の、ＩＶＩＧ処置ＳＣＩＤマウスの肝臓の形質導入を示す。 図１９は、組み換え型ヤギＡＡＶをコードする組み換え型ヤギＡＡＶベクターの静脈内投与後の、ヒト第ＩＸ因子（ｈＦＩＸ）の体内分布を示す。 図２０Ａ（配列番号２５）および２０Ｂ（配列番号２６）は、それぞれ、ウシＡＡＶ ＶＰ１のＡＡＶ−Ｃ１からのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。 図２１Ａ〜２１Ｈは、以下のような抗体中和に感受性もしくは抵抗性であるＡＡＶからのＶＰ１のアミノ酸配列の比較を示す：霊長類ＡＡＶ−２（配列番号１３）、霊長類ＡＡＶ−３Ｂ（配列番号１８）、霊長類ＡＡＶ−６（配列番号１９）、霊長類ＡＡＶ−１（配列番号２０）、霊長類ＡＡＶ−８（配列番号２１）、霊長類ＡＡＶ−４（配列番号２２）、ウシ（雌牛）ＡＡＶ（「ＡＡＶ−Ｃ１」（配列番号２６）、霊長類ＡＡＶ−５（配列番号１６）およびヤギＡＡＶ（「ＡＡＶ−Ｃ１」配列番号１７）。パルボウイルスの列：＊、ほぼ全てのパルボウイルスで保存されている。中和の列：＃、ヒト血清による中和に対して抵抗性であるものと同定されたＡＡＶ−２キャプシドの単一の変異の位置。アクセス可能性の列：Ｂ、アミノ酸が内側表面と外側表面との間に埋もれている；Ｉ、アミノ酸が内側表面上に見られる；Ｏ、アミノ酸が外側表面上に見られる。表面特徴の列：Ｃ、シリンダー；Ｐ、プラトー；Ｓ、スパイク；Ｙ、キャニオン。ＤＮＡの列：Ｂ、塩基と接触可能；Ｄ、ＤＮＡ結合に必要とされる可能性があるが、直接はＤＮＡと接触し得ない；Ｐ、リン酸基と接触可能；Ｒ、リボースと接触可能。その他の列：Ａ、結合およびマウスモノクローナル抗体Ａ２０による中和を減少する単一の変異の位置；Ｈ、ＡＡＶ−２内のヘパリン接触；Ｍ、Ｍｇ２＋と接触可能；Ｐ、ホスホリパーゼＡ２ドメイン。 図２１Ａ〜２１Ｈは、以下のような抗体中和に感受性もしくは抵抗性であるＡＡＶからのＶＰ１のアミノ酸配列の比較を示す：霊長類ＡＡＶ−２（配列番号１３）、霊長類ＡＡＶ−３Ｂ（配列番号１８）、霊長類ＡＡＶ−６（配列番号１９）、霊長類ＡＡＶ−１（配列番号２０）、霊長類ＡＡＶ−８（配列番号２１）、霊長類ＡＡＶ−４（配列番号２２）、ウシ（雌牛）ＡＡＶ（「ＡＡＶ−Ｃ１」（配列番号２６）、霊長類ＡＡＶ−５（配列番号１６）およびヤギＡＡＶ（「ＡＡＶ−Ｃ１」配列番号１７）。パルボウイルスの列：＊、ほぼ全てのパルボウイルスで保存されている。中和の列：＃、ヒト血清による中和に対して抵抗性であるものと同定されたＡＡＶ−２キャプシドの単一の変異の位置。アクセス可能性の列：Ｂ、アミノ酸が内側表面と外側表面との間に埋もれている；Ｉ、アミノ酸が内側表面上に見られる；Ｏ、アミノ酸が外側表面上に見られる。表面特徴の列：Ｃ、シリンダー；Ｐ、プラトー；Ｓ、スパイク；Ｙ、キャニオン。ＤＮＡの列：Ｂ、塩基と接触可能；Ｄ、ＤＮＡ結合に必要とされる可能性があるが、直接はＤＮＡと接触し得ない；Ｐ、リン酸基と接触可能；Ｒ、リボースと接触可能。その他の列：Ａ、結合およびマウスモノクローナル抗体Ａ２０による中和を減少する単一の変異の位置；Ｈ、ＡＡＶ−２内のヘパリン接触；Ｍ、Ｍｇ２＋と接触可能；Ｐ、ホスホリパーゼＡ２ドメイン。 図２１Ａ〜２１Ｈは、以下のような抗体中和に感受性もしくは抵抗性であるＡＡＶからのＶＰ１のアミノ酸配列の比較を示す：霊長類ＡＡＶ−２（配列番号１３）、霊長類ＡＡＶ−３Ｂ（配列番号１８）、霊長類ＡＡＶ−６（配列番号１９）、霊長類ＡＡＶ−１（配列番号２０）、霊長類ＡＡＶ−８（配列番号２１）、霊長類ＡＡＶ−４（配列番号２２）、ウシ（雌牛）ＡＡＶ（「ＡＡＶ−Ｃ１」（配列番号２６）、霊長類ＡＡＶ−５（配列番号１６）およびヤギＡＡＶ（「ＡＡＶ−Ｃ１」配列番号１７）。パルボウイルスの列：＊、ほぼ全てのパルボウイルスで保存されている。中和の列：＃、ヒト血清による中和に対して抵抗性であるものと同定されたＡＡＶ−２キャプシドの単一の変異の位置。アクセス可能性の列：Ｂ、アミノ酸が内側表面と外側表面との間に埋もれている；Ｉ、アミノ酸が内側表面上に見られる；Ｏ、アミノ酸が外側表面上に見られる。表面特徴の列：Ｃ、シリンダー；Ｐ、プラトー；Ｓ、スパイク；Ｙ、キャニオン。ＤＮＡの列：Ｂ、塩基と接触可能；Ｄ、ＤＮＡ結合に必要とされる可能性があるが、直接はＤＮＡと接触し得ない；Ｐ、リン酸基と接触可能；Ｒ、リボースと接触可能。その他の列：Ａ、結合およびマウスモノクローナル抗体Ａ２０による中和を減少する単一の変異の位置；Ｈ、ＡＡＶ−２内のヘパリン接触；Ｍ、Ｍｇ２＋と接触可能；Ｐ、ホスホリパーゼＡ２ドメイン。 図２１Ａ〜２１Ｈは、以下のような抗体中和に感受性もしくは抵抗性であるＡＡＶからのＶＰ１のアミノ酸配列の比較を示す：霊長類ＡＡＶ−２（配列番号１３）、霊長類ＡＡＶ−３Ｂ（配列番号１８）、霊長類ＡＡＶ−６（配列番号１９）、霊長類ＡＡＶ−１（配列番号２０）、霊長類ＡＡＶ−８（配列番号２１）、霊長類ＡＡＶ−４（配列番号２２）、ウシ（雌牛）ＡＡＶ（「ＡＡＶ−Ｃ１」（配列番号２６）、霊長類ＡＡＶ−５（配列番号１６）およびヤギＡＡＶ（「ＡＡＶ−Ｃ１」配列番号１７）。パルボウイルスの列：＊、ほぼ全てのパルボウイルスで保存されている。中和の列：＃、ヒト血清による中和に対して抵抗性であるものと同定されたＡＡＶ−２キャプシドの単一の変異の位置。アクセス可能性の列：Ｂ、アミノ酸が内側表面と外側表面との間に埋もれている；Ｉ、アミノ酸が内側表面上に見られる；Ｏ、アミノ酸が外側表面上に見られる。表面特徴の列：Ｃ、シリンダー；Ｐ、プラトー；Ｓ、スパイク；Ｙ、キャニオン。ＤＮＡの列：Ｂ、塩基と接触可能；Ｄ、ＤＮＡ結合に必要とされる可能性があるが、直接はＤＮＡと接触し得ない；Ｐ、リン酸基と接触可能；Ｒ、リボースと接触可能。その他の列：Ａ、結合およびマウスモノクローナル抗体Ａ２０による中和を減少する単一の変異の位置；Ｈ、ＡＡＶ−２内のヘパリン接触；Ｍ、Ｍｇ２＋と接触可能；Ｐ、ホスホリパーゼＡ２ドメイン。 図２１Ａ〜２１Ｈは、以下のような抗体中和に感受性もしくは抵抗性であるＡＡＶからのＶＰ１のアミノ酸配列の比較を示す：霊長類ＡＡＶ−２（配列番号１３）、霊長類ＡＡＶ−３Ｂ（配列番号１８）、霊長類ＡＡＶ−６（配列番号１９）、霊長類ＡＡＶ−１（配列番号２０）、霊長類ＡＡＶ−８（配列番号２１）、霊長類ＡＡＶ−４（配列番号２２）、ウシ（雌牛）ＡＡＶ（「ＡＡＶ−Ｃ１」（配列番号２６）、霊長類ＡＡＶ−５（配列番号１６）およびヤギＡＡＶ（「ＡＡＶ−Ｃ１」配列番号１７）。パルボウイルスの列：＊、ほぼ全てのパルボウイルスで保存されている。中和の列：＃、ヒト血清による中和に対して抵抗性であるものと同定されたＡＡＶ−２キャプシドの単一の変異の位置。アクセス可能性の列：Ｂ、アミノ酸が内側表面と外側表面との間に埋もれている；Ｉ、アミノ酸が内側表面上に見られる；Ｏ、アミノ酸が外側表面上に見られる。表面特徴の列：Ｃ、シリンダー；Ｐ、プラトー；Ｓ、スパイク；Ｙ、キャニオン。ＤＮＡの列：Ｂ、塩基と接触可能；Ｄ、ＤＮＡ結合に必要とされる可能性があるが、直接はＤＮＡと接触し得ない；Ｐ、リン酸基と接触可能；Ｒ、リボースと接触可能。その他の列：Ａ、結合およびマウスモノクローナル抗体Ａ２０による中和を減少する単一の変異の位置；Ｈ、ＡＡＶ−２内のヘパリン接触；Ｍ、Ｍｇ２＋と接触可能；Ｐ、ホスホリパーゼＡ２ドメイン。 図２１Ａ〜２１Ｈは、以下のような抗体中和に感受性もしくは抵抗性であるＡＡＶからのＶＰ１のアミノ酸配列の比較を示す：霊長類ＡＡＶ−２（配列番号１３）、霊長類ＡＡＶ−３Ｂ（配列番号１８）、霊長類ＡＡＶ−６（配列番号１９）、霊長類ＡＡＶ−１（配列番号２０）、霊長類ＡＡＶ−８（配列番号２１）、霊長類ＡＡＶ−４（配列番号２２）、ウシ（雌牛）ＡＡＶ（「ＡＡＶ−Ｃ１」（配列番号２６）、霊長類ＡＡＶ−５（配列番号１６）およびヤギＡＡＶ（「ＡＡＶ−Ｃ１」配列番号１７）。パルボウイルスの列：＊、ほぼ全てのパルボウイルスで保存されている。中和の列：＃、ヒト血清による中和に対して抵抗性であるものと同定されたＡＡＶ−２キャプシドの単一の変異の位置。アクセス可能性の列：Ｂ、アミノ酸が内側表面と外側表面との間に埋もれている；Ｉ、アミノ酸が内側表面上に見られる；Ｏ、アミノ酸が外側表面上に見られる。表面特徴の列：Ｃ、シリンダー；Ｐ、プラトー；Ｓ、スパイク；Ｙ、キャニオン。ＤＮＡの列：Ｂ、塩基と接触可能；Ｄ、ＤＮＡ結合に必要とされる可能性があるが、直接はＤＮＡと接触し得ない；Ｐ、リン酸基と接触可能；Ｒ、リボースと接触可能。その他の列：Ａ、結合およびマウスモノクローナル抗体Ａ２０による中和を減少する単一の変異の位置；Ｈ、ＡＡＶ−２内のヘパリン接触；Ｍ、Ｍｇ２＋と接触可能；Ｐ、ホスホリパーゼＡ２ドメイン。 図２１Ａ〜２１Ｈは、以下のような抗体中和に感受性もしくは抵抗性であるＡＡＶからのＶＰ１のアミノ酸配列の比較を示す：霊長類ＡＡＶ−２（配列番号１３）、霊長類ＡＡＶ−３Ｂ（配列番号１８）、霊長類ＡＡＶ−６（配列番号１９）、霊長類ＡＡＶ−１（配列番号２０）、霊長類ＡＡＶ−８（配列番号２１）、霊長類ＡＡＶ−４（配列番号２２）、ウシ（雌牛）ＡＡＶ（「ＡＡＶ−Ｃ１」（配列番号２６）、霊長類ＡＡＶ−５（配列番号１６）およびヤギＡＡＶ（「ＡＡＶ−Ｃ１」配列番号１７）。パルボウイルスの列：＊、ほぼ全てのパルボウイルスで保存されている。中和の列：＃、ヒト血清による中和に対して抵抗性であるものと同定されたＡＡＶ−２キャプシドの単一の変異の位置。アクセス可能性の列：Ｂ、アミノ酸が内側表面と外側表面との間に埋もれている；Ｉ、アミノ酸が内側表面上に見られる；Ｏ、アミノ酸が外側表面上に見られる。表面特徴の列：Ｃ、シリンダー；Ｐ、プラトー；Ｓ、スパイク；Ｙ、キャニオン。ＤＮＡの列：Ｂ、塩基と接触可能；Ｄ、ＤＮＡ結合に必要とされる可能性があるが、直接はＤＮＡと接触し得ない；Ｐ、リン酸基と接触可能；Ｒ、リボースと接触可能。その他の列：Ａ、結合およびマウスモノクローナル抗体Ａ２０による中和を減少する単一の変異の位置；Ｈ、ＡＡＶ−２内のヘパリン接触；Ｍ、Ｍｇ２＋と接触可能；Ｐ、ホスホリパーゼＡ２ドメイン。 図２１Ａ〜２１Ｈは、以下のような抗体中和に感受性もしくは抵抗性であるＡＡＶからのＶＰ１のアミノ酸配列の比較を示す：霊長類ＡＡＶ−２（配列番号１３）、霊長類ＡＡＶ−３Ｂ（配列番号１８）、霊長類ＡＡＶ−６（配列番号１９）、霊長類ＡＡＶ−１（配列番号２０）、霊長類ＡＡＶ−８（配列番号２１）、霊長類ＡＡＶ−４（配列番号２２）、ウシ（雌牛）ＡＡＶ（「ＡＡＶ−Ｃ１」（配列番号２６）、霊長類ＡＡＶ−５（配列番号１６）およびヤギＡＡＶ（「ＡＡＶ−Ｃ１」配列番号１７）。パルボウイルスの列：＊、ほぼ全てのパルボウイルスで保存されている。中和の列：＃、ヒト血清による中和に対して抵抗性であるものと同定されたＡＡＶ−２キャプシドの単一の変異の位置。アクセス可能性の列：Ｂ、アミノ酸が内側表面と外側表面との間に埋もれている；Ｉ、アミノ酸が内側表面上に見られる；Ｏ、アミノ酸が外側表面上に見られる。表面特徴の列：Ｃ、シリンダー；Ｐ、プラトー；Ｓ、スパイク；Ｙ、キャニオン。ＤＮＡの列：Ｂ、塩基と接触可能；Ｄ、ＤＮＡ結合に必要とされる可能性があるが、直接はＤＮＡと接触し得ない；Ｐ、リン酸基と接触可能；Ｒ、リボースと接触可能。その他の列：Ａ、結合およびマウスモノクローナル抗体Ａ２０による中和を減少する単一の変異の位置；Ｈ、ＡＡＶ−２内のヘパリン接触；Ｍ、Ｍｇ２＋と接触可能；Ｐ、ホスホリパーゼＡ２ドメイン。
（発明の詳細な説明）
本発明の実施は、他に示されない限り、当該分野の技術範囲内の化学、生化学、組換えＤＮＡ技術および免疫学の従来の方法を使用する。このような技術は、文献に完全に説明されている。例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第２版，ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．Ｉ〜ＩＶ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）；Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，最新版）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版，１９８９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ．Ｋａｐｌａｎ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）を参照のこと。
（１．定義）
本発明を記載する際に、以下の用語が使用され、これらは、以下に示されるように規定されることが意図される。
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容が明確にそうでないと指示しない限り、複数の参照を含むことに注意しなければならない。従って、例えば、「ポリペプチド（ａ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」に対する参照は、２つ以上のポリペプチドの混合物を含む、などである。
以下のアミノ酸の略称が、本文全体において使用される：
アラニン ：Ａｌａ（Ａ） アルギニン ：Ａｒｇ（Ｒ）
アスパラギン：Ａｓｎ（Ｎ） アスパラギン酸 ：Ａｓｐ（Ｄ）
システイン ：Ｃｙｓ（Ｃ） グルタミン ：Ｇｌｎ（Ｑ）
グルタミン酸：Ｇｌｕ（Ｅ） グリシン ：Ｇｌｙ（Ｇ）
ヒスチジン ：Ｈｉｓ（Ｈ） イソロイシン ：Ｉｌｅ（Ｉ）
ロイシン ：Ｌｅｕ（Ｌ） リジン ：Ｌｙｓ（Ｋ）
メチオニン ：Ｍｅｔ（Ｍ） フェニルアラニン：Ｐｈｅ（Ｆ）
プロリン ：Ｐｒｏ（Ｐ） セリン ：Ｓｅｒ（Ｓ）
スレオニン ：Ｔｈｒ（Ｔ） トリプトファン ：Ｔｒｐ（Ｗ）
チロシン ：Ｔｙｒ（Ｙ） バリン ：Ｖａｌ（Ｖ）。
「ベクター」とは、適切な制御エレメントと結合した場合に複製可能であり、かつ細胞間で遺伝子配列を移し得る、任意の遺伝的エレメント（例えば、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、ビリオンなど）を意味する。従って、この用語は、クローニングビヒクルおよび発現ビヒクル、ならびに、ウイルスベクターを含む。
「ＡＡＶベクター」とは、任意の動物種から単離された任意のアデノ随伴ウイルス血清型に由来するベクターを意味し、これらとしては、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８、ＡＡＶ−Ｇ１およびＡＡＶ−Ｃ１が挙げられるがこれらに限定されない。ＡＡＶベクターは、全体もしくは一部が欠失した、１つ以上のＡＡＶの野生型遺伝子（好ましくは、ｒｅｐ遺伝子および／またはｃａｐ遺伝子）を有し得るが、機能的な隣接ＩＴＲ配列は保持している。機能的ＩＴＲ配列は、ＡＡＶビリオンのレスキュー、複製およびパッケージングに必須である。従って、ＡＡＶベクターは、本明細書において、ウイルスの複製およびパッケージングにシスで必要とされるこれらの配列（例えば、機能的ＩＴＲ）を少なくとも含むと規定される。ＩＴＲは、野生型のヌクレオチド配列である必要はなく、これらの配列が、機能的なレスキュー、複製およびパッケージングを提供する限りは、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失または置換によって、変更され得る。
「ＡＡＶヘルパー機能」は、発現されて、ＡＡＶ遺伝子産物を提供し、次いで、生産的なＡＡＶ複製にトランスで機能し得る、ＡＡＶ由来のコード配列をいう。従って、ＡＡＶヘルパー機能は、主要なＡＡＶオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）である、ｒｅｐおよびｃａｐの両方を含む。Ｒｅｐ発現産物は、多くの機能を有することが示されており、これらの中でもとりわけ、ＤＮＡ複製のＡＡＶ起点の認識、結合およびニック；ＤＮＡヘリカーゼ活性；ならびにＡＡＶ（または他の異種性）プロモーターからの転写の調節が挙げられる。Ｃａｐ発現産物は、必須のパッケージング機能を供給する。ＡＡＶヘルパー機能は、本明細書中において、ＡＡＶベクターから欠けているトランスのＡＡＶ機能を補完するために使用される。
用語「ＡＡＶヘルパー構築物」は、一般に、目的のヌクレオチド配列の送達のための形質導入ベクターを生成するために使用されるＡＡＶベクターから欠けているＡＡＶ機能を提供するヌクレオチド配列を含む、核酸分子をいう。ＡＡＶヘルパー構築物は、一般に、ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子および／またはｃａｐ遺伝子の一過性の発現を提供して、溶解性のＡＡＶ複製に必須の欠けているＡＡＶ機能を補完するために使用される；しかし、ヘルパー構築物は、ＡＡＶ ＩＴＲを欠き、そして、それ自体では複製もパッケージングもできない。ＡＡＶヘルパー構築物は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルス、またはビリオンの形態であり得る。Ｒｅｐ発現産物および／またはＣａｐ発現産物をコードする多数のＡＡＶヘルパー構築物およびベクターが記載されている。例えば、米国特許第６，００１，６５０号、同第５，１３９，９４１号および同第６，３７６，２３７号；Ｓａｍｕｌｓｋｉら（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２８；ならびにＭｃＣａｒｔｙら（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２９３６−２９４５を参照のこと。
用語「補助機能」は、非ＡＡＶ由来のウイルスおよび／または細胞の機能をいい、この機能に、ＡＡＶの複製が依存している。従って、この用語は、ＡＡＶの複製に必要とされ得るタンパク質およびＲＮＡを捕らえており、このようなタンパク質およびＲＮＡとしては、ＡＡＶ遺伝子の転写、段階特異的なＡＡＶ ｍＲＮＡのスプライシング、ＡＡＶ ＤＮＡの複製、Ｃａｐ発現産物の合成、およびＡＡＶキャプシドの組み立ての活性化に関与する部分が挙げられる。ウイルスベースの補助機能は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純疱疹ウイルス１型以外）およびワクシニアウイルスのような、公知のヘルパーウイルスのいずれかに由来し得る。
用語「補助機能ベクター」は、一般に、補助機能を提供するヌクレオチド配列を含む核酸分子をいう。補助機能ベクターは、適切な宿主細胞内にトランスフェクトされ得、ここで、このベクターは、ＡＡＶビリオン産物を宿主細胞内で支持し得るものである。用語から明白に除外されるのは、感染性ウイルス粒子である。なぜならば、アデノウイルス粒子、ヘルペスウイルス粒子またはワクシニアウイルス粒子のような感染性ウイルス粒子は自然状態で存在するからである。従って、補助機能ベクターは、プラスミド、ファージ、トランスポゾンまたはコスミドの形態であり得る。
アデノウイルス遺伝子の完全な相補体は、補助ヘルパー機能には必要ではないことが実証されている。特に、ＤＮＡ複製および後期の遺伝子合成ができないアデノウイルス変異体は、ＡＡＶ複製に許容されることが示されている。Ｉｔｏら（１９７０）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．９：２４３；Ｉｓｈｉｂａｓｈｉら（１９７１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４５：３１７。同様に、Ｅ２Ｂ領域およびＥ３領域内の変異は、ＡＡＶ複製を支持することが示されており、これは、Ｅ２Ｂ領域およびＥ３領域が、補助機能を提供することに関与しない可能性を示す。Ｃａｒｔｅｒら（１９８３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １２６：５０５。しかし、Ｅ１領域に障害があるか、またはＥ４領域を欠失したアデノウイルスは、ＡＡＶ複製を支持できない。従って、Ｅ１Ａ領域およびＥ４領域は、直接的または間接的のいずれかで、ＡＡＶ複製に必要とされているようである。Ｌａｕｇｈｌｉｎら（１９８２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４１：８６８；Ｊａｎｉｋら（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：１９２５；Ｃａｒｔｅｒら（１９８３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １２６：５０５。他の特徴付けられたＡｄ変異体としては以下が挙げられる：Ｅ１Ｂ（Ｌａｕｇｈｌｉｎら（１９８２），前出；Ｊａｎｉｋら（１９８１），前出；Ｏｓｔｒｏｖｅら（１９８０）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １０４：５０２）；Ｅ２Ａ（Ｈａｎｄａら（１９７５）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．２９：２３９；Ｓｔｒａｕｓｓら（１９７６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１７：１４０；Ｍｙｅｒｓら（１９８０）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３５：６６５；Ｊａｙら（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：２９２７；Ｍｙｅｒｓら（１９８１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：５６７）；Ｅ２Ｂ（Ｃａｒｔｅｒ，Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｈｅｌｐｅｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，Ｉ ＣＲＣ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ（Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ編，１９９０））；Ｅ３（Ｃａｒｔｅｒら（１９８３），前出）；およびＥ４（Ｃａｒｔｅｒら（１９８３），前出；Ｃａｒｔｅｒ（１９９５））。Ｅ１Ｂコード領域に変異を有するアデノウイルスにより提供される補助機能の研究は、相反する結果を提供しているが、Ｓａｍｕｌｓｋｉら（１９８８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：２０６−２１０は、最近、Ｅ１Ｂ５５ｋはＡＡＶビリオン産生に必要とされるが、Ｅ１Ｂ１９ｋは必要とされないことを報告した。さらに、国際公報ＷＯ ９７／１７４５８およびＭａｔｓｈｕｓｈｉｔａら（１９９８）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：９３８−９４５は、種々のＡｄ遺伝子をコードする補助機能ベクターを記載する。特に好ましい補助機能ベクターは、アデノウイルスのＶＡ ＲＮＡコード領域、アデノウイルスのＥ４ ＯＲＦ６コード領域、アデノウイルスのＥ２Ａ ７２ｋＤコード領域、アデノウイルスのＥ１Ａコード領域、およびインタクトなＥ１Ｂ５５ｋコード領域を欠くアデノウイルスのＥ１Ｂ領域を含む。このようなベクターは、国際公報ＷＯ ０１／８３７９７に記載される。
「組み換え型ウイルス」とは、例えば、異種性の核酸構築物を粒子に付加または挿入することによって、遺伝的に変更されたウイルスを意味する。
「ＡＡＶビリオン」とは、野生型（ｗｔ）ＡＡＶウイルス粒子（ＡＡＶキャプシドタンパク質被膜に結合した直線状の単鎖ＡＡＶ核酸ゲノムを含む）のような完全なウイルス粒子を意味する。この点に関して、いずれかの相補的なセンス鎖（例えば、「センス」または「アンチセンス」）の単鎖ＡＡＶ核酸分子が、ＡＡＶビリオンの任意の１つにパッケージングされ得、そして、両方の鎖が同等に感染性である。
「組み換え型ＡＡＶビリオン」または「ｒＡＡＶビリオン」は、本明細書において、両側にＡＡＶ ＩＴＲが隣接している、目的の異種性ヌクレオチド配列をカプセル化するＡＡＶタンパク質の殻を含む、感染性の複製欠損型ウイルスとして定義される。ｒＡＡＶビリオンは、ＡＡＶベクター、ＡＡＶヘルパー機能、およびその中に導入された補助機能を有する適切な宿主細胞において産生される。この様式で、宿主細胞は、ＡＡＶベクター（目的の組み換え型ヌクレオチド配列を含む）を、その後の遺伝子送達のために、感染性の組み換え型ビリオン粒子内にパッケージングするために必要とされるＡＡＶポリペプチドをコードできるようになる。
「ヤギ組み換え型ＡＡＶビリオン」または「ヤギｒＡＡＶビリオン」は、ヤギキャプシドタンパク質（例えば、ヤギＶＰ１）をコードする遺伝子を含むＡＡＶヘルパー機能を用いて産生された、上記のようなｒＡＡＶビリオンである。
「ウシ組み換え型ＡＡＶビリオン」または「ウシｒＡＡＶビリオン」は、ウシキャプシドタンパク質（例えば、ウシＶＰ１）をコードする遺伝子を含むＡＡＶヘルパー機能を用いて産生された、上記のようなｒＡＡＶビリオンである。
用語「トランスフェクション」は、細胞による外来ＤＮＡの取込みをいうために使用し、そして、外来性のＤＮＡが細胞膜の内部に導入された場合、細胞は、「トランスフェクト」されている。多数のトランスフェクション技術が、当該分野で一般的に公知である。例えば、Ｇｒａｈａｍら（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６，Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｄａｖｉｓら（１９８６）Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＥｌｓｅｖｉｅｒおよびＣｈｕら（１９８１）Ｇｅｎｅ １３：１９７を参照のこと。このような技術は、１つ以上の外来性ＤＮＡ成分（例えば、ヌクレオチド組込みベクターおよび他の核酸分子）を、適切な宿主細胞内に導入するために使用され得る。
用語「宿主細胞」は、例えば、ＡＡＶヘルパー構築物、ＡＡＶベクタープラスミド、補助機能ベクターまたは他の移送ＤＮＡのレシピエントとして使用され得るか、または既に使用されている、微生物細胞、酵母細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞を意味する。この用語は、トランスフェクトされた最初の細胞の子孫を含む。従って、本明細書中で使用される「宿主細胞」は、一般に、外来性ＤＮＡ配列でトランスフェクトされた細胞をいう。天然の変異、偶発的な変異、または意図的な変異が原因で、単一の親細胞の子孫が、形態学的もしくはゲノム的に完全に同一であるか、または、最初の親と全てのＤＮＡが相補的である必要はない。
本明細書中で使用される場合、用語「細胞株」は、インビトロで連続的または持続的に増殖および分裂が可能な細胞の集団をいう。しばしば、細胞株は、単一の前駆細胞に由来するクローン性の集団である。さらに、このようなクローン性の集団の保存または移動の間に、自然発生的な変化または誘導的な変化が、核型に生じ得ることが、当該分野で公知である。従って、参照される細胞株に由来する細胞は、祖先の細胞もしくは培養物と精密に同一である必要はなく、そして、参照される細胞株は、このような変異体を含む。
「相同性」は、２つのポリヌクレオチド部分間または２つのポリペプチド部分間の％同一性をいう。２つのＤＮＡ配列または２つのポリペプチド配列は、これらの配列が、これらの分子の規定される長さにわたって、少なくとも約５０％、好ましくは、少なくとも約７５％、より好ましくは、少なくとも約８０％〜８５％、好ましくは、少なくとも約９０％、そして最も好ましくは、少なくとも約９５％〜９８％の配列同一性を示す場合に、互いに「実質的に相同」である。本明細書中で使用される場合、実質的に相同とは、また、特定のＤＮＡ配列またはポリペプチド配列に対して完全な同一性を示す配列をいう。
一般に、「同一性」とは、それぞれ、２つのポリヌクレオチド配列または２つのポリペプチド配列の、正確なヌクレオチド−ヌクレオチドの対応、またはアミノ酸−アミノ酸の対応をいう。％同一性は、配列を整列させ、２つの整列した配列の間の正確なマッチ数を数え、短い方の配列の長さで割り、そして、結果に１００を掛けることにより、２つの分子間の配列情報の直接比較によって決定され得る。ＡＬＩＧＮ（Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ編，補遺５．３：３５３−３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ）のような容易に利用可能なコンピュータプログラムを用いると、分析に役立ち得る。ＡＬＩＧＮは、ペプチド分析に、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖａｎｃｅ ｉｎ Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２−４８９，１９８１）の局部的相同性アルゴリズムを適合する。ヌクレオチド配列同一性を決定するためのプログラムは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから入手可能）において入手可能であり、例えば、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム、ＦＡＳＴＡプログラムおよびＧＡＰプログラム（これらはまた、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムに依存する）が挙げられる。これらのプログラムは、製造業者により推奨され、そして、上で参照されたＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅに記載される、デフォルトパラメーターを用いて、容易に利用される。例えば、特定のヌクレオチド配列の参照配列に対する％同一性は、デフォルトのスコア付け表および６ヌクレオチド位置のギャップペナルティを用い、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの相同性アルゴリズムを用いて決定され得る。
本発明の文脈において、％同一性を確立する別の方法は、Ｊｏｈｎ Ｆ．ＣｏｌｌｉｎｓおよびＳｈａｎｅ Ｓ．Ｓｔｕｒｒｏｋによって開発され、ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）によって配布されている、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈに版権がある、ＭＰＳＲＣＨパッケージプログラムを使用することである。このパッケージ一式から、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムが採用され得る（ここで、スコア付け表について、デフォルトパラメーター（例えば、１２のギャップオープンペナルティ、１のギャップ拡張ペナルティ、および６のギャップ）が使用される）。作成されたデータから、「マッチ」値が「配列同一性」を反映する。配列間の％同一性または％類似性を計算するための他の適切なプログラムは、一般に、当該分野で公知であり、例えば、別のアライメントプログラムは、デフォルトパラメーターと共に使用される、ＢＬＡＳＴである。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、以下のデフォルトパラメーターを用いて使用され得る：遺伝コード＝標準；フィルタ＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０；マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記述＝５０配列；ソート＝ハイスコア；データベース＝冗長性なし、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋Ｓｗｉｓｓ ｐｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、当該分野で周知である。
あるいは、相同性は、相同な領域の間で安定な二重鎖を形成する条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、その後の、単鎖特異的ヌクレアーゼを用いた消化、および消化したフラグメントのサイズ決定によって、決定され得る。実質的に相同なＤＮＡ配列は、例えば、特定の系について記載されたようなストリンジェントな条件下での、サザンハイブリダイゼーション実験において同定され得る。適切なハイブリダイゼーション条件を規定することは、当該分野の技術範囲内である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前出；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，前出；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，前出を参照のこと。
用語「縮重改変体（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｖａｒｉａｎｔ）」は、その縮重改変体が由来するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、その核酸配列中に変更を含むポリヌクレオチドを意図する。
「コード配列」または選択されたポリペプチドを「コードする」配列は、適切な調節配列の制御下に置かれた場合に、インビボで、ポリペプチドに転写され（ＤＮＡの場合）、翻訳され（ｍＲＮＡの場合）る核酸分子である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンにより決定される。転写終止配列は、コード配列の３’に位置し得る。
用語「異種性」は、コード配列および制御配列のような核酸配列に関する場合、通常は一緒に結合せず、そして／または通常は特定の細胞に結合しない配列を意味する。従って、核酸構築物またはベクターの「異種性」領域は、自然状態では、他の分子と結合して見られない、別の核酸分子内にあるか、またはこの別の核酸分子に結合した、核酸のセグメントである。例えば、核酸構築物の異種性領域は、自然状態ではコード配列と結合して見られない配列により隣接されるコード配列を含み得る。異種性のコード配列の別の例は、コード配列自体が自然状態で見られない構築物（例えば、ネイティブな遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列）である。同様に、通常は細胞内に存在しない構築物を用いて形質転換された細胞は、本発明の目的について、異種性であると考えられる。本明細書中で使用される場合、対立遺伝子の変異、または天然に生じる変異の事象は、異種性のＤＮＡを生じない。
「核酸」配列は、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列をいう。この用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡの任意の公知の塩基アナログを含む配列を捕らえ、例えば、以下が挙げられるがこれらに限定されない：４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、シュードイソシトシン、５−（カルボキシヒドロキシル−メチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチル−アミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルシュード−ウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチル−グアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチル−シトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシ−アミノ−メチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルケオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５’−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン（ｏｘｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、シュードウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、シュードウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、および２，６−ジアミノプリン。
用語ＤＮＡ「制御配列」とは、まとめて、プロモーター配列、ポリアデニル化シグナル、転写終止配列、上流の調節ドメイン、複製起点、内部リボソーム進入部位（「ＩＲＥＳ」）、エンハンサーなどをいい、これは、まとめて、レシピエント細胞におけるコード配列の複製、転写および翻訳を提供する。選択されたコード配列が、適切な宿主細胞において複製、転写、そして翻訳され得る限りは、これらの制御配列の全てが、常に存在する必要はない。
用語「プロモーター」は、本明細書において、ＤＮＡ調節配列を含むヌクレオチド領域をいうために、その通常の意味で使用される。ここで、この調節配列は、ＲＮＡポリメラーゼに結合して、下流（３’−方向）コード配列の転写を開始し得る遺伝子に由来する。転写プロモーターは、「誘導性プロモーター」（このプロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現が、分析物、補因子、調節性タンパク質などによって誘導される）、「抑制性プロモーター」（このプロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現が、分析物、補因子、調節性タンパク質などによって誘導される）および「構成的プロモーター」を含み得る。
「作動可能に連結している」とは、構成要素が、その通常の機能を果たすように構成されている、エレメントの配列をいう。従って、コード配列に作動可能に連結された制御配列は、このコード配列の発現を達成し得る。制御配列は、その発現を命令するように機能しさえすれば、コード配列と連続している必要はない。従って、例えば、まだ翻訳されていないが、転写された介在配列が、プロモーター配列とコード配列との間に存在し得、このプロモーター配列は、依然として、コード配列に「作動可能に連結している」と考えられ得る。
「単離された」とは、ヌクレオチド配列に関する場合、指示された分子が同じ型の他の生物学的高分子が実質的にない状態で存在することを意味する。従って、「特定のポリヌクレオチドをコードする単離された核酸分子」とは、目的のポリペプチドをコードしない他の核酸分子を実質的に含まない核酸分子をいうが、この分子は、組成物の基本特性には、悪影響を及ぼさない、いくつかの追加の塩基または部分を含み得る。
本願全体を通じて、特定の拡散分子中のヌクレオチド配列の相対的な位置を記載する目的で、例えば、特定のヌクレオチド配列が、別の配列に対して「上流」、「下流」、「３’」または「５’」に場所を定めされると記載される場合、それは、当該分野で慣習的であるといわれる、ＤＮＡ分子の「センス」鎖または「コード」鎖における配列の位置であると理解されるべきである。
所定のＡＡＶポリペプチドの「機能的ホモログ」または「機能的等価物」は、ネイティブなポリペプチド配列に由来する分子、ならびに、所望の結果を達成するように、参照ＡＡＶ分子に類似の様式で機能する、組換え的に産生されたか、もしくは、化学的に合成されたポリペプチドを含む。従って、ＡＡＶ Ｒｅｐ６８またはＲｅｐ７８の機能的ホモログは、その組込み活性が残る限りは、これらのポリペプチドの誘導体およびアナログ（内部に、またはそのアミノ末端もしくはカルボキシ末端に生じる、任意の単一もしくは複数のアミノ酸の付加、置換および／または欠失を含む）を包含する。
「効率的な形質導入が可能」とは、本発明の変異型構築物が、対応する野生型配列を用いて得られるトランスフェクション効率の１〜１０％の範囲内のレベルで、インビトロおよび／またはインビボにて、細胞をトランスフェクトする能力を保持するｒＡＡＶベクターまたはビリオンを提供することを意味する。好ましくは、この変異体は、対応する野生型配列の１０〜１００％の範囲内のレベルで、細胞または組織にトランスフェクトする能力を保持する。変異型配列は、細胞および組織にトランスフェクトする能力が増強された構築物をも提供し得る。形質導入効率は、実施例において記載されるインビトロ形質導入アッセイを含む、当該分野で周知の技術を用いて、容易に決定される。
「減少した免疫反応性」とは、変異型ＡＡＶ構築物が、対応する野生型ＡＡＶ構築物と比較して低減したレベルで抗ＡＡＶ抗体と反応することを意味する。用語「抗体」は、本明細書中で使用される場合、ポリクローナル調製物およびモノクローナル調製物の両方、ならびに、以下のものから得られた抗体を含む：ハイブリッド抗体分子（キメラ抗体分子）（例えば、Ｗｉｎｔｅｒら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３−２９９；および米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）；Ｆ（ａｂ’）２フラグメントおよびＦ（ａｂ）フラグメント；Ｆｖ分子（非共有結合性のヘテロ二量体、例えば、Ｉｎｂａｒら（１９７２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ６９：２６５９−２６６２；およびＥｈｒｌｉｃｈら（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ １９：４０９１−４０９６を参照のこと）；単鎖Ｆｖ分子（ｓＦｖ）（例えば、Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３を参照のこと）；二量体および三量体の抗体フラグメント構築物；ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）（例えば、Ｐａｃｋら（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍ ３１：１５７９−１５８４；Ｃｕｍｂｅｒら（１９９２）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４９Ｂ：１２０−１２６を参照のこと）；ヒト化抗体分子（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６；および英国特許公開番号ＧＢ ２，２７６，１６９（１９９４年９月２１日公開）を参照のこと）；ならびに、このようなフラグメントが、親抗体分子の免疫学的結合特性を保持するような分子から得られた、任意の機能的フラグメント。
本発明の変異型構築物は、対応する野生型ＡＡＶ構築物に対して作製された上記の型の抗体のいずれかを用いる、インビトロおよび／またはインビボのアッセイを使用して決定すると、減少した免疫反応性を有し得る。好ましくは、変異型ＡＡＶ構築物は、対応する野生型構築物よりも少なくとも１．５倍低いレベル、好ましくは、少なくとも２倍低いレベル（例えば、少なくとも５〜１０倍低いレベル）、さらに、対応する野生型構築物よりも、少なくとも５０〜１００倍、もしくは少なくとも１０００倍低いレベルで、このような抗体と反応する。
好ましくは、変異型ＡＡＶ構築物は、抗ＡＡＶ中和抗体と、低減したレベルで反応する。例えば、変異型構築物は、本明細書中に記載されるインビトロ中和アッセイのような標準的なアッセイを用いて決定される場合、対応する野生型よりも、少なくとも１．５倍、中和により抵抗性であり、好ましくは、少なくとも２倍、中和により抵抗性であり、なおより好ましくは、少なくとも５〜１０倍以上（例えば、少なくとも５０〜１００倍以上）、対応する野生型よりも、中和により抵抗性である。
用語「被験体」、「個体」または「患者」は、本明細書中で交換可能に使用され、そして、脊椎動物、好ましくは、哺乳動物をいう。哺乳動物としては、マウス、げっ歯類、サル、ヒト、家畜動物、競技用動物およびペットが挙げられるがこれらに限定されない。
用語組成物または薬剤の「有効量」または「治療有効量」とは、本明細書中で提供される場合、無毒性であるが、所望の応答を提供するのに十分な組成物または薬剤の量をいう。必要とされる正確な量は、被験体の種、年齢および全身状態、処置される状態の重篤度、ならびに、目的の特定の高分子、投与様式などに依存して、被験体ごとで変動する。任意の個々の場合の適切な「有効」量は、慣用的な実験を用いて、当業者により決定され得る。
疾患を「処置すること」または疾患の「処置」とは、以下が挙げられる：（１）疾患の予防、すなわち、疾患に曝露され得るか、もしくは、疾患に罹りやすいが、まだ疾患を経験していないか、もしくは疾患の症状を呈していない被験体において、疾患の臨床症状を発症させないようにすること、（２）疾患の阻害、すなわち、疾患またはその臨床症状の発症を停止すること、あるいは（３）疾患の軽減、すなわち、疾患またはその臨床症状を退行させること。
（２．発明を実施する様式）
本発明を詳細に説明する前に、本発明は、特定の処方またはプロセスのパラメーターに限定されず、従って、これらは当然ながら変動し得ることが理解されるべきである。本明細書において使用される用語法は、本発明の特定の実施形態を説明する目的のためだけのものであり、制限することは意図されないこともまた、理解されるべきである。
本明細書中に記載されるものと類似もしくは等価な多数の方法および材料が、本発明の実施において使用され得るが、好ましい材料および方法は、本明細書中に記載される。
本発明の中心は、対応する野生型ビリオンと比較して、減少した免疫反応性を示すｒＡＡＶビリオンの産生に有用な、新規変異型ＡＡＶ配列の発見である。さらに、この変異は、好ましくは、対応する野生型の他の特性（例えば、ＤＮＡパッケージング、レセプター結合、クロマトグラフィーによる精製、ならびにインビトロおよびインビボで細胞に形質導入する能力）を保持する。好ましくは、このような特性は、対応するＡＡＶ野生型について測定された値の少なくとも１〜１０％の範囲内である。より好ましくは、このような特性は、対応するＡＡＶ野生型について測定された値の１０〜１００％の範囲内である。最も好ましくは、このような特性は、対応するＡＡＶ野生型について測定された値の少なくとも１００％以上である。従って、例えば、この変異がＡＡＶ−２キャプシド配列内にある場合、これらの特性の比較は、変異型キャプシド配列を有するＡＡＶ−２ビリオンと、ＡＡＶ−２野生型キャプシドタンパク質配列を除いて変異型ビリオンと同じ構成要素を有するＡＡＶ−２ビリオンとの間である。
上で説明したように、本発明のＡＡＶ変異体は、好ましくは、変異型ビリオンが投与される宿主に存在し得る中和抗体に対して、減少した免疫反応性を示す。このように、ＡＡＶに自然状態で感染した（すなわち、以前の自然感染によるもの）か、または、ＡＡＶに人工的に感染した（すなわち、以前の遺伝子治療または核酸免疫によるもの）被験体の細胞および組織は、新規または現行の疾患を処置または予防するために、組み換え型ＡＡＶビリオンでより効率的にトランスフェクトされ得る。
中和について十分に研究された機構は、中和抗体が、感染に必要とされるレセプターに結合するために必要とされるウイルス上の領域を物理的にブロックすることである。他のウイルスを用いた以前の研究は、レセプターと中和抗体が、別個のセットのアミノ酸に結合すること、そして、中和抗体の結合に影響を与えるが、レセプター、またはウイルス感染に必要とされる他の機能には影響を与えない、ウイルスキャプシド上の特定の位置にある変異を同定することが可能であることを示している。中和抗体に抵抗性である野生型の複製ウイルスが選択される実験は、変異が、本明細書中に記載されるもののような単一のアミノ酸においてさえ、抗体の中和に対する抵抗性を有意に増加させ得ることを示している。
ＡＡＶ変異型ビリオンがＡＡＶ抗血清に結合できるかできないかは、部分的にキャプシドタンパク質（ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子によりコードされる）の配列の機能である。従って、本発明は、免疫反応性を減少させるために（例えば、ＡＡＶビリオンのＡＡＶ抗血清に結合する能力を変更するために）、ＡＡＶビリオンの表面上で作成される、一重、二重、三重、四重およびそれ以上のアミノ酸の変更、ならびに、欠失および／または挿入を意図する。このような変異は、中和に対する抵抗性について評価され得、そして、必要に応じて、より劇的であるか、または多重の変更がなされ得る。
結果として生じる機能的なｒＡＡＶビリオンを有する、変異に敏感なＡＡＶビリオンの部分を同定する方法が、以下の実施例において記載される。実施例において詳述されるように、キャプシドの突出した形状（「スパイク」、「シリンダー」および「プラトー」として知られるキャプシドの部分を含む）に対する変異のようなウイルス表面上のアミノ酸に対する変異が好ましい。変異は、好ましくはＶＰ２領域に対するものであり、より好ましくは、ＶＰ３領域に対するものであり、そして特に、図１１に示されるように、ＶＰ１とＶＰ２とＶＰ３との間の重なり合う領域内である。特に好ましい変異は、ＶＰ２の８０位〜５９８位（ＶＰ１のアミノ酸２１７〜７３５およびＶＰ３のアミノ酸１５〜５３３に対応する）の範囲内で見られる。
代表的なＶＰ２の配列を、本明細書中の図９（配列番号１２）に示す。この主要な被膜タンパク質であるＶＰ３は、ＶＰ１のアミノ酸２０３〜７３５に跨る。この変異は、ネイティブなタンパク質に対して、少なくとも１つのアミノ酸の置換、欠失または挿入を含む。代表的な変異としては、以下のアミノ酸からなる群より選択されるＡＡＶ−２ ＶＰ２キャプシドタンパク質の位置に対応する位置で生じる、アミノ酸の１つ以上の置換を含む：アミノ酸１２６、１２７、１２８、１３０、１３２、１３４、２４７、２４８、３１５、３３４、３５４、３５７、３６０、３６１、３６５、３７２、３７５、３７７、３９０、３９３、３９４、３９５、３９６、４０７、４１１、４１３、４１８、４３７、４４９、４５０、５６８、５６９および５７１。
一般に、天然に存在するアミノ酸は、小さな側鎖を有する、そして／または無電荷であり、そしてそれゆえ、免疫原性が少ないアミノ酸で置換される。このようなアミノ酸としては、アラニン、バリン、グリシン、セリン、システイン、プロリンならびにこれらのアナログが挙げられるがこれらに限定されず、アラニンが好ましい。さらに、追加の変異が存在し得る。代表的な組み合わせとしては、直ぐ上で特定されたアミノ酸の任意の組み合わせ（例えば、アミノ酸３６０のヒスチジンへの変異とアミノ酸３６１のアラニンへの変異；アミノ酸３３４のアラニンへの変異とアミノ酸４４９のアラニンへの変異；アミノ酸３３４のアラニンへの変異とアミノ酸５６８のアラニンへの変異、アミノ酸５６８のアラニンへの変異とアミノ酸５７１のアラニンへの変異；アミノ酸３３４のアラニンへの変異とアミノ酸４４９のアラニンへの変異とアミノ酸５６８のアラニンへの変異；アミノ酸５７１のリジンへの変異と上で特定されたアミノ酸のいずれかの変異）が挙げられるがこれらに限定されない。上記の組み合わせは、単なる例示であり、当然ながら、多数の他の組み合わせが、本明細書中に提供される情報に基づき、容易に決定される。
実施例にさらに記載されるように、キャプシド内の特定のアミノ酸は、ヘパリン結合部位に隣接している。この領域は、本明細書において「デッドゾーン」または「ＤＺ」と呼ばれ、これらとしては、アミノ酸Ｇ１２８、Ｎ１３１、Ｄ１３２、Ｈ１３４、Ｎ２４５、Ｎ２４６、Ｄ３５６、Ｄ３５７、Ｈ３７２、Ｇ３７５、Ｄ３９１、Ｄ３９２、Ｅ３９３およびＥ３９４が挙げられる。デッドゾーン内のアミノ酸は、ＡＡＶの機能に重要であり、従って、中和抗体の結合のための標的でもある。この領域は、ＡＡＶの機能に重要なので、保存的アミノ酸置換（例えば、Ｈに対してＱ、Ｅに対してＤ、Ｄに対してＥまたはＮなど）が、デッドゾーン領域において好まれ、多くの機能的なデッドゾーン変異体を生じる。
キャプシドタンパク質に生じる種々のアミノ酸位置は、本明細書において、ＮＣＢＩ登録番号ＡＦ０４３３０３に記載され、本明細書中の図９に示されるＡＡＶ−２ ＶＰ２配列を参照して番号付けられる。図１０は、ＡＡＶ−２ ＶＰ１のアミノ酸配列を示す。しかし、ＡＡＶ血清型のいずれかの対応する位置で生じるアミノ酸の変異が、本発明に包含されることが理解されるべきである。複数の種から単離された種々のＡＡＶ血清型からのキャプシドの配列が公知であり、例えば、Ｇａｏら（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９９：１１８５４−１１８５９；Ｒｕｔｌｅｄｇｅら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：３０９−３１９；ＮＣＢＩ登録番号ＮＣ００１８６３；ＮＣ００４８２８；ＮＣ００１８６２；ＮＣ００２０７７；ＮＣ００１８２９；ＮＣ００１７２９；Ｕ８９７９０；Ｕ４８７０４；ＡＦ３６９９６３；ＡＦ０２８７０５；ＡＦ０２８７０５；ＡＦ０２８７０４；ＡＦ５１３８５２；ＡＦ５１３８５１；ＡＦ０６３４９７；ＡＦ０８５７１６；ＡＦ４３３０３；Ｙ１８０６５；ＡＹ１８６１９８；ＡＹ２４３０２６；ＡＹ２４３０２５；ＡＹ２４３０２４；ＡＹ２４３０２３；ＡＹ２４３０２２；ＡＹ２４３０２１；ＡＹ２４３０２０；ＡＹ２４３０１９；ＡＹ２４３０１８；ＡＹ２４３０１７；ＡＹ２４３０１６；ＡＹ２４３０１５；ＡＹ２４３０１４；ＡＹ２４３０１３；ＡＹ２４３０１２；ＡＹ２４３０１１；ＡＹ２４３０１０；ＡＹ２４３００９；ＡＹ２４３００８；ＡＹ２４３００７；ＡＹ２４３００６；ＡＹ２４３００５；ＡＹ２４３００４；ＡＹ２４３００３；ＡＹ２４３００２；ＡＹ２４３００１；ＡＹ２４３０００；ＡＹ２４２９９９；ＡＹ２４２９９８；およびＡＹ２４２９９７に記載される。
さらに、発明者らは、本明細書において、ヤギから単離された新規ヤギＡＡＶ（本明細書中で「ＡＡＶ−Ｇ１」と呼ばれる）を発見した。このヤギＡＡＶ ＶＰ１配列は、ＡＡＶ−５のＶＰ１配列と高度に相同であるが、ネイティブなＡＡＶ−５の配列よりも、ＡＡＶ抗体が存在することによる中和に対して、約１００倍以上抵抗性である。より具体的には、６０３ｂｐのｒｅｐ、中央イントロンおよび全てのｃａｐをコードする本明細書中に記載されるヤギＡＡＶの２８０５ｂｐのＰＣＲフラグメントは、対応するＡＡＶ−５配列に対して９４％の相同性を示す。親のｒｅｐに対するＤＮＡおよびタンパク質の相同性は、それぞれ９８％および９９％である。ヤギＶＰ１コード配列と、霊長類ＡＡＶ−５ ＶＰ１コード配列との比較を、図１２Ａ〜１２Ｂに示す。ヤギＡＡＶのｃａｐ領域に対するＤＮＡは、ＡＡＶ−５のものと９３％相同である。ヤギＶＰ１ 対 霊長類ＡＡＶ−５に対するアミノ酸配列を図１３に示す。ヤギ配列は、７２６アミノ酸のＶＰ１タンパク質をコードするが、ＡＡＶ−５ ＶＰ１は、７２４アミノ酸長である。さらに、これら配列は、９４％の配列同一性および９６％の配列類似性を示す。ヤギと霊長類ＡＡＶ−５ ＶＰ１の配列の間には、４３のアミノ酸の相違が存在する。ＶＰ１の直線状アミノ酸配列に関して、ＡＡＶ−５とヤギＡＡＶとの間のアミノ酸相違の分布は、高度に極性である。全てのアミノ酸の相違は、分散した様式で、もっぱらＶＰ１のＣ末端超可変領域に生じる。ＡＡＶ−５とヤギに関するこの領域は、ＡＡＶ−５ ＶＰ１に関して番号付けすると、アミノ酸３８６からＣ末端までの約３４８アミノ酸を含む。他のＡＡＶ血清型における対応する超可変領域は、容易に同定可能であり、多数のＡＡＶ血清型からの領域を、本明細書中の図面に示す。
特定の理論に束縛されないが、ＡＡＶ−５とヤギＡＡＶのＶＰ１における全てのアミノ酸相違は、おそらく表面に露出された領域に生じるという事実は、キャプシドの進化が、新しい宿主の体液性免疫系によって、および／または反芻動物レセプターに対する順応によって、主に駆動されるということを示唆する。
ヤギＡＡＶからのＶＰ１配列の、多数の他の霊長類ＶＰ１配列（ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３Ｂ、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−８およびＡＡＶ−５を含む）との比較を、図１４Ａ〜１４Ｈに示す。結晶構造に基づく、種々のアミノ酸位置の接近可能性もまた、これらの図面に示す。さらに、アミノ酸の表面形状、結合および中和を減少させる単一変異の位置；ヘパリン結合部位；Ｍｇ２＋接触の可能性；ホスホリパーゼＡ２ドメイン；ならびに、塩基接触およびＤＮＡ結合しやすい位置、リン酸基およびリボースと接触する可能性のある位置もまた示す。図面において認められ得るように、ＡＡＶ−５およびヤギＡＡＶは、ＡＡＶ−２およびＡＡＶ−８の両方で異なる１７位において、互いに同一である。
同様に、本発明者らは、本明細書において、ウシから単離された、新規ウシＡＡＶ（本明細書中で「ＡＡＶ−Ｃ１」と呼ばれる）を発見した。ＡＡＶ−Ｃ１ ＶＰ１のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、それぞれ図２０Ａおよび２０Ｂに示す。図２１Ａ〜２１Ｈは、ＡＡＶ−Ｃ１に由来するＶＰ１のアミノ酸配列の、霊長類ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３Ｂ、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−８、ＡＡＶ−５およびヤギＡＡＶ（ＡＡＶ−Ｇ１）に由来するＶＰ１アミノ酸配列との比較を示す。結晶構造に基づく、種々のアミノ酸位置の接近可能性もまた、これらの図面に示す。さらに、アミノ酸の表面形状、結合および中和を減少する単一変異の位置；ヘパリン結合部位；Ｍｇ２＋接触の可能性；ホスホリパーゼＡ２ドメイン；ならびに、塩基接触およびＤＮＡ結合しやすい位置、リン酸基およびリボースと接触する可能性のある位置もまた示す。
図面において認められ得るように、ＡＡＶ−Ｃ１からのＶＰ１は、ＡＡＶ−４とおよそ７６％の同一性を示す。ＡＡＶ−４とＡＡＶ−Ｃ１との間の配列の相違は、キャプシド全体にわたって分散している。ＡＡＶ−Ｃ１ ＶＰ１は、ＡＡＶ−５ ＶＰ１とおよそ５４％の同一性を示し、Ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ−５ ＶＰ１の最初の１３７アミノ酸、およびＡＡＶ−５ ＶＰ１の終止後の非翻訳領域において高い相同性を有する（図示せず）。従って、ＡＡＶ−Ｃ１は、ＡＡＶ−５とＡＡＶ−４との間の天然のハイブリッドであるようである。ＡＡＶ−Ｃ１はまた、ＡＡＶ−２およびＡＡＶ−８からのＶＰ１とおよそ５８％の配列同一性を示し、ＡＡＶ−１およびＡＡＶ−６からのＡＰ１とおよそ５９％の配列同一性を示し、そして、ＡＡＶ−３ＢからのＶＰ１とおよそ６０％の配列同一性を示した。
実施例により詳細に記載されるように、ウシＡＡＶは、ネイティブなＡＡＶ−２配列よりも、ＡＡＶ抗体の存在による中和に対しておよそ１６倍抵抗性である。従って、ヤギおよびウシの配列、ならびに他のこのような非霊長類哺乳動物配列が、霊長類ＡＡＶ配列に対して（例えば、ＡＡＶ−２およびＡＡＶ−５に対して）減少した免疫反応性を有する組み換え型ＡＡＶビリオンを生成するために使用され得る。さらに、非ヤギおよび非ウシのＡＡＶ単離体および株（例えば、ＡＡＶ血清型のいずれか）から、減少した免疫反応性を有するＡＡＶビリオンを提供するために変異され得るＡＡＶキャプシドの領域は、本明細書中に提供されるヤギおよびウシのＡＡＶ配列、ならびに、他の単離体および血清型のものとの、これらの配列および免疫反応性特性の比較に基づいて、合理的に予測され得る。
上記の議論および本明細書中に提供される実施例に基づいて、当業者は、減少した免疫反応性を有するＡＡＶビリオンを生成するために野生型ＡＡＶ配列に対して作成され得る変異を合理的に予測し得る。ＡＡＶキャプシド表面上に見られるアミノ酸、特に、超可変領域に見られるアミノ酸に対するアミノ酸の変化は、減少した免疫反応性を有するＡＡＶビリオンを提供すると期待される。さらに、ヤギおよびウシのＡＡＶ配列によって提供された知識に基づいて、他の非霊長類哺乳動物ＡＡＶが、霊長類ＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ−２およびＡＡＶ−５）に対して減少した免疫反応性を有する組み換え型ＡＡＶビリオンを調製する際に使用するための、非変異型ＡＡＶ配列を提供するために同定され得る。例えば、以下の実施例に示されるように、中和抵抗性に関連し、ＡＡＶ−２変異体とヤギＡＡＶとの間に共通するＡＡＶ−２変異体における位置は、ＡＡＶ−２の位置２４８、３５４、３６０、３９０、４０７、４１３および４４９に対する変更が含まれる。
本発明のＡＡＶ変異体は、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子領域の部位指向型変異誘発により作製され得る。次いで、変異されたｃａｐ領域が、変異したヘルパー機能ベクターおよび任意の適切なトランスフェクション法（本明細書中に記載される三重トランスフェクション法を含む）を用いて、適切なヘルパー機能ベクター内にクローニングされ得、そしてｒＡＡＶベクターが作成され得る。本発明での使用に適切な変異体は、上に定義されるような、減少した免疫反応性により同定される。好ましくは、本発明の変異体は、抗ＡＡＶ抗血清、好ましくは、抗ＡＡＶ−２抗血清によって中和される能力が減少しているが、他の生物学的機能（例えば、インタクトなビリオンを組み立てる能力、ウイルスＤＮＡをパッケージングする能力、細胞レセプターに結合する能力、および、細胞に形質導入する能力）を維持している。
従って、本発明は、ｒＡＡＶビリオンに組み込むために減少した免疫反応性を示す、変異型ＡＡＶ配列、ならびに野生型の非霊長類哺乳動物ＡＡＶ配列の同定および使用を含む。このようなｒＡＡＶビリオンは、「異種性の核酸」（「ＨＮＡ」）を、脊椎動物被験体（例えば、哺乳動物）に送達するために使用され得る。上で説明したように、「組み換え型ＡＡＶビリオン」または「ｒＡＡＶビリオン」は、「組み換え型ＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクター」をカプセル化するＡＡＶタンパク質の殻（すなわち、キャプシド）から構成された感染性ウイルスであり、ｒＡＡＶベクターは、ＨＮＡおよび１つ以上のＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む。ＡＡＶベクターは、当該分野で公知の組換え技術を使用して構築され得、機能的ＩＴＲに隣接される１つ以上のＨＮＡを含み得る。ｒＡＡＶベクターのＩＴＲは、野生型のヌクレオチド配列である必要はなく、その配列が適切な機能（すなわち、ＡＡＶゲノムのレスキュー、複製およびパッケージング）を提供する限りは、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失もしくは置換によって変更され得る。
組み換え型ＡＡＶビリオンは、当該分野で公知の種々の技術（三重トランスフェクション法（米国特許第６，００１，６５０号に詳細に記載される）を含む）を用いて生成され得る。このシステムは、ｒＡＡＶビリオン生成のために、３つのベクター（ＡＡＶヘルパー機能ベクター、補助機能ベクター、およびＨＮＡを含むｒＡＡＶベクターが挙げられる）の使用を含む。しかし、当業者は、これらのベクターによりコードされる核酸配列が、種々の組み合わせで２つ以上のベクターにて提供され得ることを理解する。本明細書中で使用される場合、用語「ベクター」は、適切な制御エレメントに結合された場合に複製し得、かつ、細胞間で遺伝子配列を移動させ得る、任意の遺伝的エレメント（例えば、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、人工染色体、ウイルス、ビリオンなど）を含む。従って、この用語は、クローニングビヒクルおよび発現ビヒクル、ならびにウイルスベクターを含む。
ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、生産的なＡＡＶの複製およびカプセル化のためにトランスで機能する「ＡＡＶヘルパー機能」配列（すなわち、ｒｅｐおよびｃａｐ）をコードする。好ましくは、ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、任意の検出可能な野生型ＡＡＶビリオン（すなわち、機能的なｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を含むＡＡＶビリオン）を生じることなく、効率的なＡＡＶベクターの生成を支持する。本発明での使用に適切なベクターの例としては、米国特許第６，００１，６５０号に記載されるｐＨＬＰ１９、および米国特許第６，１５６，３０３号に記載されるｐＲｅｐ６ｃａｐ６ベクターが挙げられる。
補助機能ベクターは、非ＡＡＶ由来のウイルス、および／または、ＡＡＶの複製が依存する細胞機能（すなわち、「補助機能」）ついてのヌクレオチド配列をコードする。補助機能としては、ＡＡＶの複製に必要とされる機能（ＡＡＶ遺伝子の転写の活性化に関与する部分、段階特異的なＡＡＶ ｍＲＮＡのスプライシングに関与する部分、ＡＡＶ ＤＮＡの複製に関与する部分、ｃａｐ発現産物の合成に関与する部分、およびＡＡＶキャプシドの組み立てに関与する部分が挙げられるがこれらに限定されない）が挙げられる。ウイルスベースの補助機能は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純疱疹ウイルス１型以外）およびワクシニアウイルスのような任意の公知のヘルパーウイルスに由来し得る。好ましい実施形態において、補助機能プラスミドであるｐＬａｄｅｎｏ５が使用される（ｐＬａｄｅｎｏ５に関する詳細については、米国特許第６，００４，７９７号に記載される）。このプラスミドは、ＡＡＶベクターの生成のためのアデノウイルスの補助機能の完全なセットを提供するが、複製能をもつアデノウイルスを形成するために必須の成分を欠いている。
異種性の核酸（ＨＮＡ）を含むｒＡＡＶベクターは、種々のＡＡＶ血清型のいずれかに由来するＩＴＲを用いて構築され得る。ＨＮＡは、そうでなければ自然状態では一緒には見られない、一緒に結合された核酸配列を含み、この概念を、用語「異種」で規定する。この点を例示するために、ＨＮＡの例は、自然状態ではその遺伝子と結合した状態では見られないヌクレオチド配列により隣接された遺伝子である。ＨＮＡの別の例は、自然状態ではそれ自体が見られない遺伝子（例えば、ネイティブな遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列）である。本明細書中で使用される場合、対立遺伝子の変化または天然に存在する変異的事象は、ＨＮＡを生じない。ＨＮＡは、アンチセンスＲＮＡ分子、リボザイム、またはポリペプチドをコードする遺伝子を含み得る。
ＨＮＡは、ＨＮＡが、適切な条件下または所望の条件下で患者の標的細胞内で発現され得るように、異種性プロモーター（構成的、細胞特異的、または、誘導性）に作動可能に連結される。構成的プロモーター、細胞特異的プロモーターおよび誘導性プロモーターの多数の例が当該分野で公知であり、当業者は、特定の意図される用途のためのプロモーターを容易に選択し得る（例えば、筋肉細胞特異的な発現のための筋肉特異的な骨格α−アクチンプロモーターもしくは筋肉特異的なクレアチンキナーゼプロモーター／エンハンサーの選択、強いレベルの連続的もしくはほぼ連続的な発現のための、構成的ＣＭＶプロモーターの選択、または誘導的発現のための誘導性エクジソンプロモーターの選択）。誘導的な発現は、当業者が合成されるタンパク質の量を制御することを可能にする。この様式において、治療的生成物の濃度を変動させることが可能である。周知の誘導性プロモーターの他の例は、ステロイドプロモーター（例えば、エストロゲンプロモーターおよびアンドロゲンプロモーター）およびメタロチオネインプロモーターである。
本発明は、１つ以上のアンチセンスＲＮＡ分子をコードするＨＮＡを含む新規変異型ビリオンを含み、このｒＡＡＶビリオンは、好ましくは、哺乳動物の１つ以上の筋肉細胞または組織に投与される。癌のアンチセンス療法またはウイルス疾患の処置において、本発明で使用するために適切なアンチセンスＲＮＡ分子は、当該分野で記載されている。例えば、Ｈａｎら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：４３１３−４３１７；Ｕｈｌｍａｎｎら（１９９０）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９０：５４３−５８４；Ｈｅｌｅｎｅら（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１０４９：９９−１２５；Ａｇａｒａｗａｌら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：７０７９−７０８３；およびＨｅｉｋｋｉｌａら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２８：４４５−４４９を参照のこと。本発明はまた、本明細書中で開示される方法を用いる、リボザイムの送達を包含する。適切なリボザイムの議論については、例えば、Ｃｅｃｈら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１７４７９−１７４８２および米国特許第５，２２５，３４７号を参照のこと。
本発明は、好ましくは、１つ以上のポリペプチドをコードするＨＮＡを含む変異型ｒＡＡＶビリオンを包含し、このｒＡＡＶビリオンは、好ましくは、哺乳動物の１つ以上の細胞または組織に投与される。従って、本発明は、哺乳動物被験体における疾患状態の処置または予防に有用な、１つ以上のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードするＨＮＡの送達を包含する。このようなＤＮＡおよび関連する疾患状態としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：グルコース−６−リン酸（グリコーゲン貯蔵欠乏症１Ａ型に関連する）をコードするＤＮＡ；ホスホエノールピルビン酸−カルボキシキナーゼ（Ｐｅｐｃｋ欠損症に関連する）をコードするＤＮＡ；ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ（ガラクトース血症に関連する）をコードするＤＮＡ；フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（フェニルケトン尿症に関連する）をコードするＤＮＡ；分枝鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ（メープルシロップ尿症に関連する）をコードするＤＮＡ；フマリルアセト酢酸ヒドロラーゼ（チロシン血症１型に関連する）をコードするＤＮＡ；メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ（メチルマロン酸血症に関連する）をコードするＤＮＡ；中位鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（中位鎖アセチルＣｏＡ欠損症に関連する）をコードするＤＮＡ；オルニチントランスカルバミラーゼ（オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症に関連する）をコードするＤＮＡ；アルギノコハク酸シンテターゼ（シトルリン血症に関連する）をコードするＤＮＡ；低密度リポタンパク質レセプタータンパク質（家族性高コレステロール血症に関連する）をコードするＤＮＡ；ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ（クリグラー−ナジャー病に関連する）をコードするＤＮＡ；アデノシンデアミナーゼ（重篤複合免疫不全疾患に関連する）をコードするＤＮＡ；ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（痛風およびレッシュ−ナイハン症候群に関連する）をコードするＤＮＡ；ビオチニダーゼ（ビオチニダーゼ欠損症に関連する）をコードするＤＮＡ；β−グルコセレブロシダーゼ（ゴーシェ病に関連する）をコードするＤＮＡ；β−グルクロニダーゼ（スライ症候群に関連する）をコードするＤＮＡ；ペルオキシソーム膜タンパク質７０ｋＤａ（ツェルヴェーガー症候群に関連する）をコードするＤＮＡ；ポルホビリノーゲンデアミナーゼ（急性間欠性ポルフィリン症に関連する）をコードするＤＮＡ；α−１アンチトリプシン欠損症（気腫）の処置のためのα−１アンチトリプシンをコードするＤＮＡ；サラセミアまたは腎不全に起因する貧血の処置のためのエリスロポエチンをコードするＤＮＡ；虚血性疾患の処置のための、血管内皮増殖因子をコードするＤＮＡ、アンジオポエチン−１をコードするＤＮＡ、および繊維芽細胞増殖因子をコードするＤＮＡ；例えば、アテローム性動脈硬化症、血栓症または塞栓症において見られるような、血管閉塞の処置のための、トロンボモジュリンおよび組織因子経路インヒビターをコードするＤＮＡ；パーキンソン病の処置のための、芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）をコードするＤＮＡおよびチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）をコードするＤＮＡ；うっ血性心不全の処置のための、β−アドレナリン作動性レセプターをコードするＤＮＡ、ホスホランバンのアンチセンス、もしくはホスホランバンの変異形態をコードするＤＮＡ、筋小胞体（小胞体）アデノシントリホスファターゼ−２（ＳＥＲＣＡ２）をコードするＤＮＡ、および心臓のアデニリルシクラーゼをコードするＤＮＡ；種々の癌の処置のための、ｐ５３のような腫瘍抑制遺伝子をコードするＤＮＡ；炎症性および免疫性の障害および癌の処置のための、種々のインターロイキンのうちの１つのようなサイトカインをコードするＤＮＡ；筋ジストロフィーの処置のための、ジストロフィンまたはミニジストロフィンをコードするＤＮＡ、およびウトロフィン（ｕｔｒｏｐｈｉｎ）またはミニウトロフィンをコードするＤＮＡ；ならびに、糖尿病の処置のための、インスリンをコードするＤＮＡ。
本発明はまた、血液凝固タンパク質をコードする遺伝子を含む新規変異型ビリオンを含み、このタンパク質は、本発明の方法を使用して、血友病の処置のために、血友病を有する哺乳動物の細胞に送達され得る。従って、本発明は、血友病Ｂの処置のために第ＩＸ因子遺伝子を哺乳動物に送達すること、血友病Ａの処置のために第ＶＩＩＩ因子遺伝子を哺乳動物に送達すること、第ＶＩＩ因子欠損症の処置のために第ＶＩＩ因子遺伝子を送達すること、第Ｘ因子欠損症の処置のために第Ｘ因子遺伝子を送達すること、第ＸＩ因子欠損症の処置のために第ＸＩ因子遺伝子を送達すること、第ＸＩＩＩ因子欠損症の処置のために第ＸＩＩＩ因子遺伝子を送達すること、およびプロテインＣ欠損症の処置のためにプロテインＣを送達することを包含する。上記の遺伝子の各々の、哺乳動物の細胞への送達は、まずこれらの遺伝子を含むｒＡＡＶビリオンを作製し、次いで、このｒＡＡＶビリオンを哺乳動物に投与することによって達成される。従って、本発明は、第ＩＸ因子、第ＶＩＩＩ因子、第Ｘ因子、第ＶＩＩ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩＩ因子またはプロテインＣのうちのいずれか１つをコードする遺伝子を含むｒＡＡＶビリオンを包含する。
１つ以上のＨＮＡを含む組換えビリオンの哺乳動物被験体への送達は、筋肉内注射によってか、または哺乳動物被験体の血流内への投与によってであり得る。この血流内への投与は、静脈内、動脈内、または任意の他の血管内に、外科手術の分野において周知の技術である肢隔離灌流（ｉｓｏｌａｔｅｄ ｌｉｍｂ ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）によって血流内に変異型ビリオンを注射することによってであり得る。この方法は、ｒＡＡＶビリオンの投与前に、当業者が肢を全身循環から隔離することを本質的に可能にする。米国特許第６，１７７，４０３号に記載される、肢隔離灌流技術の改変物がまた、変異型ビリオンを隔離された肢の血管系に投与して、筋肉細胞または筋肉組織内への形質導入を強力に促進するために、当業者により採用され得る。さらに、特定の条件については、変異型ビリオンを被験体のＣＮＳに送達することが望ましくあり得る。「ＣＮＳ」とは、脊椎動物の脳および脊髄の全ての細胞および組織を意味する。従って、この用語は、神経細胞、グリア細胞、星状細胞、脳脊髄液（ｃｅｒｅｏｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ）（ＣＳＦ）、間質性空間（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｓｐａｃｅ）、骨、軟骨などを含むが、これらに限定されない。インビトロで形質導入された組み換え型ＡＡＶビリオンまたは細胞は、例えば、脳室領域および線条（例えば、線条の尾状核または被殻）、脊髄および神経筋接合部、または小脳小葉内に、針、カテーテルまたは関連デバイスを用いて、当該分野で公知の神経外科的技術（例えば、定位注射（例えば、Ｓｔｅｉｎら，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７３：３４２４−３４２９，１９９９；Ｄａｖｉｄｓｏｎら，ＰＮＡＳ ９７：３４２８−３４３２，２０００；Ｄａｖｉｄｓｏｎら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３：２１９−２２３，１９９３；ならびにＡｌｉｓｋｙおよびＤａｖｉｄｓｏｎ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１１：２３１５−２３２９，２０００を参照のこと））を使用して、注射によって、ＣＮＳまたは脳に直接送達され得る。
特定の「治療効果」を達成するために必要とされるｒＡＡＶビリオンの用量（例えば、体重１ｋｇあたりのベクターゲノムの単位用量（ｖｇ／ｋｇ））は、いくつかの因子（ｒＡＡＶビリオンの投与経路、治療効果を達成するために必要とされる遺伝子（またはアンチセンスＲＮＡまたはリボザイム）の発現レベル、処置される特定の疾患もしくは障害、ｒＡＡＶビリオンに対する宿主の免疫応答、遺伝子（またはアンチセンスＲＮＡまたはリボザイム）発現産物に対する宿主の免疫応答、ならびに遺伝子（またはアンチセンスＲＮＡまたはリボザイム）産物の安定性を含むが、これらに限定されない）に基づいて変動する。当業者は、前述の因子、および当該分野で周知の他の因子に基づいて、特定の疾患もしくは障害を有する患者を処置するためのｒＡＡＶビリオンの用量範囲を容易に決定し得る。
一般的に、「治療効果」とは、所望の結果または臨床的終点に向けて、疾患（または障害）の構成要素を変化させ、その結果、患者の疾患または障害が、臨床的な改善を示すのに十分な１つ以上のＨＮＡの発現レベルを意味し、しばしば、この疾患または障害に関連する臨床的徴候もしくは症状の寛解により反映される。特定の疾患例として血友病を用いると、血友病についての「治療効果」は、血友病を罹患する哺乳動物の血液凝固効率の増加、として本明細書において定義され、この効率は、例えば、周知の終点もしくは技術（例えば、全血凝固時間または活性型プロトロンボプラスチン時間（ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｏｐｌａｓｔｉｎ ｔｉｍｅ）を測定するためのアッセイを使用すること）によって決定される。全血凝固時間または活性型プロトロンボプラスチン時間のいずれかの減少は、血液凝固効率の増加の指標である。血友病の重篤なケースにおいて、正常なレベルの１％未満の第ＶＩＩＩ因子もしくは第ＩＸ因子を有する血友病患者は、非血友病患者についての約１０分と比較して、６０分を超える全血凝固時間を有する。第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子の１％以上の発現は、血友病の動物モデルにおいて、全血凝固時間を減少することが示されており、従って、１％を超える第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子の循環血漿濃度は、血液凝固効率の増加の所望の治療効果を達成する可能性がある。
本発明の構築物は、代替的に、その生理学的機能または生化学的機能を解明するために、ＨＮＡを宿主細胞に送達するために使用され得る。ＨＮＡは、内因性遺伝子または異種性遺伝子のいずれかであり得る。エキソビボまたはインビボのアプローチのいずれかを使用すると、当業者は、機能未知の１つ以上のＨＮＡを含む変異型ビリオンを実験動物に投与し、ＨＮＡを発現させ、そして、その後の任意の機能の変化を観察し得る。このような変化としては、以下が挙げられ得る：タンパク質−タンパク質相互作用、生化学経路における変更、細胞、組織、器官もしくは器官系の生理学的機能の変更、および／または遺伝子発現の刺激もしくはサイレンシング。
あるいは、当業者は、機能既知または機能未知の遺伝子を過剰発現させて、インビボでのその効果を調べ得る。このような遺伝子は、実験動物に対して内因性であっても、自然状態では異種性（すなわち導入遺伝子）であってもよい。
本発明の方法を使用することによって、当業者はまた、遺伝子発現を消滅もしくは有意に減少させ、それによって、遺伝子機能を決定する別の手段を採用し得る。このことを達成する１つの方法は、アンチセンスＲＮＡを含有するｒＡＡＶビリオンを、実験動物に投与し、標的内因性遺伝子が「ノックアウト」されるように、このアンチセンスＲＮＡ分子を発現させ、次いで、その後の任意の生理学的変化もしくは生化学的変化を観察することによるものである。
本発明の方法は、トランスジェニックマウスおよびノックアウトマウスのような、他の周知の技術と適合性であり、これらの技術を補完するために使用され得る。当業者は、遺伝子機能に関する有用な情報を得るための、本発明の方法と公知の技術の組み合わせを容易に決定し得る。
一旦送達されると、多くの場合、単にＨＮＡを発現するだけでは十分でない；その代わり、ＨＮＡの発現レベルを変えることがしばしば所望される。ＨＮＡの発現レベルを変えることにより、ＨＮＡ発現生成物の用量が変わり、このことは、しばしば、ＨＮＡに関する機能的な情報を獲得および／または洗練するのに有用である。これは、例えば、ＨＮＡを含有するｒＡＡＶビリオンに異種誘導性のプロモーターを組み込むことによって達成され得、その結果、プロモーターが誘導されたときにのみＨＮＡが発現する。いくつかの誘導性プロモーターはまた、ＨＮＡ発現レベルを洗練するための能力を提供し得る；すなわち、誘導物質の濃度を変えることによって、ＨＮＡの発現生成物の濃度を微調整する。このことは、時折、「オン−オフ」システム（すなわち、任意の量の誘導物質が、同じレベルのＨＮＡ発現生成物を提供する、「全か無」の応答）を有することよりも有用である。誘導性プロモーターの多数の例は当該分野で公知であり、エクジソンプロモーター、ステロイドプロモーター（例えば、エストロゲンプロモーターおよびアンドロゲンプロモーター）およびメタロチオネインプロモーターが挙げられる。
（３．実験）
以下は、本発明を実施するための具体的な実施形態の例である。これらの実施例は、例示目的のためだけに提供され、本発明の範囲を制限することは決して意図されない。
使用される数（例えば、量、温度など）に関して精度を保証するための努力がなされているが、いくらかの実験上の誤差および偏差が、当然ながら許容されるべきである。
（実施例１ 組み換え型ＡＡＶ−ＬａｃＺ変異型ビリオンの調製およびその特性）
β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有する組み換え型ＡＡＶ−２ビリオン（ｒＡＡＶ−２ ｌａｃＺ）を、米国特許第６，００１，６５０号に記載される三重トランスフェクション手順を用いて調製した。β−ｇａｌに対する完全なｃＤＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ ０００９１３（領域:相補体（３６２４５５．．３６５５２９））の下で入手可能である。
（Ｉ．ベクターの構築）
（Ａ．変異型ＡＡＶヘルパー機能ベクター）
ＡＡＶ−２の構造（Ｘｉｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２００２）９９：１０４０５−１０４１０を参照のこと）に基づいて、６１の変異体を、オリゴヌクレオチド指向性部位特異的変異誘発により構築した。ＡＡＶの全表面は、正十二面体形状で整列する６０の同一な非対称構造単位から構成される。これは、２つの重要な意味を持つ。第１に、作製される任意の単一のアミノ酸変異が、全てが非対称構造単位内の他のアミノ酸に対して同じ位置で、ウイルスの６０の位置で見られることである。第２に、単一の非対称構造単位を研究することによって、このウイルスの全表面を理解し得ることである。
ＡＡＶ−２構造を、以下のように決定した。単量体ＡＡＶ−２キャプシドタンパク質（ＶＰ１アミノ酸２１７〜７３５；ＶＰ２アミノ酸８０〜５９８）についての座標を、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（識別番号１ＬＰ３）から得た。この構造を、Ｓｗｉｓｓ ＰＤＢ Ｖｉｅｗｅｒバージョン３．７、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ ３Ｄ−Ｍｏｌバージョン８．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ）またはＣｈｉｍｅ（ＭＤＬ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ）を用いて分析した。ＡＡＶ−２キャプシドの多量体構造を、Ｖｉｒｕｓ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（ＶＩＰＥＲ）ウェブサイト上のオリゴマー生成プログラムを用いて作製したか、Ｓｗｉｓｓ ＰＤＢ ｖｉｅｗｅｒの座標変換機能を用いて、ＰＢＤ（１ＬＰ３）のマトリクス座標を連結して作製したか、または、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのタンパク質四元構造データベースからダウンロードした（ファイル名＝１ｌｐ３）。ＡＡＶ−２キャプシド多量体上の可能な抗体結合部位を、ＡＡＶ−２キャプシドの非対称構造単位を構築することによって分析し、次いで、Ｓｗｉｓｓ ＰＤＢ Ｖｉｅｗｅｒを用いて、その構造に対して、または、ＡＡＶ−２キャプシドの他の多量体単位に対して、ＩｇＧ構造（マウスＩｇＧ２ａモノクローナル抗体；ＰＤＢ ＩＤ番号１ＩＧＴ）を手動でドッキングさせた。ＩｇＧとＡＡＶ−２キャプシドとの間の距離、アミノ酸衝突、および接触面積は、Ｓｗｉｓｓ ＰＤＢ Ｖｉｅｗｅｒプログラム内の適切なツールを用いて評価され得る。
いくつかの基準を当てはめて、約１４５個全ての外側の表面に露出されているアミノ酸（６０の同一な非対称構造単位の各々の内部、図１を参照のこと）から、どのアミノ酸を変異させるかを選択した。変異は、外側の「表面に露出されている」アミノ酸においてのみ生じさせたが、外側表面の下、または内側表面上のアミノ酸に抗体結合を支配させることも可能である。変異させたアミノ酸は、抗体結合に対して最も接近可能であると予測された側鎖を有するアミノ酸であった。これは、「スパイク」、「シリンダー」および「プラトー」として知られる、キャプシドの突出した形態上のアミノ酸を含んだ。このような突出した形態は、しばしば、中和抗体の結合のための標的である。抗体を収容するほど十分に広くない領域（「キャニオン（ｃａｎｙｏｎ）」、「ディンプル（ｄｉｍｐｌｅ）」、３重の対称軸の中心、５重の対称軸の中心）のアミノ酸は、変異させなかった。さらに、アミノ酸側鎖を、少なくとも２０Å２の露出面積に基づいて選択した。なぜならば、抗原と抗体との間の接触面積の２０Å２以上の減少（約６００Å２〜９００Å２の全接触面積のうち）は、抗体−抗原親和性に、そしてそれゆえ、抗体の中和力価に、無視できないほどの影響を有し得るからである。選択されたアミノ酸は、側鎖（ペプチド骨格だけではない）が露出されているものであった。ペプチド骨格のみが露出されていると、このようなアミノ酸に結合した抗体は、種々のアミノ酸を識別し得ないと考えられた。これは、全てのアミノ酸が、同じペプチド骨格を有するからである。最終的に、タンパク質抗原の比較的平坦な領域が、しばしば、抗体の比較的な領域と相互作用し、従って、変異のために選択されるアミノ酸は、比較的平坦な領域（スパイクの側面、シリンダーの頂部、プラトーの頂部）にあった。全ての上記の基準を、ＡＡＶ−２の外側表面に位置する約１４５のキャプシドアミノ酸に当てはめることにより、他のアミノ酸に変更したときに、中和抗体の結合に最も影響を与える可能性がある、７２の位置を選択した。これらのアミノ酸の位置を図２に示し、表１、４および５に列挙する。
作製された（７２の位置における）１２７の変異の大部分を、分子生物学の分野の当業者に公知の技術を用いて、単一のアミノ酸からアラニンに変更した。作製され得る全ての変異の中で、アラニンがタンパク質の構造に最も破壊しないこと決定されているので、アラニンを選択した。また、アラニンのみがメチル側鎖を有するので、他のアミノ酸の大半をアラニンに変更することは、抗体結合を妨害する傾向がある。すなわち、他のアミノ酸と比較して、アラニンは、最も免疫原性が低い。なぜならば、アラニンは、抗原／抗体接触領域に有意に寄与し、従って、抗原／抗体親和性に有意に寄与する側鎖を欠くからである。後に続く数字は、図９に示されるＡＡＶ−２ ＶＰ２配列に基づくことに注意されたい。２〜３の位置を、アラニン以外のアミノ酸に変化させた。例えば、既にアラニンがあった３５６位では、アルギニンを挿入した。アルギニンは、ＡＡＶの表面に残るのに十分に極性であり、抗体の結合に干渉し得るほど十分に大きい。抗体に接近可能な５つのグリシンがある。グリシンは、しばしば、ペプチド鎖が曲がり、従って、構造の重要な成分であり得る場所に見られる。グリシンの変異は、構造が劇的に変化し得る可能性に起因して、問題となり得る。従って、ＡＡＶ−２表面上の５つのグリシンの各々は、これらを何に変えるかを決定するために、ケースバイケースの原則に基づいて考えた。グリシン１２８は、１２８位がアスパラギン酸であるＡＡＶ−５を除いて、ＡＡＶ−１〜ＡＡＶ−６において見られるので、Ｇ１２８はアスパラギン酸に変えた。グリシン１９１は、１９１位がセリンであるＡＡＶ−５を除いて、ＡＡＶ−１〜ＡＡＶ−６において見られるので、Ｇ１９１はセリンに変えた。グリシン３２９は、３２９位がアルギニンであるＡＡＶ−４を除いて、ＡＡＶ−１〜ＡＡＶ−６において見られるので、Ｇ３２９はアルギニンに変えた。グリシン３７５は、ＡＡＶ−１〜ＡＡＶ−６で保存されており、そして、プロリンがその位置で見られるペプチド鎖中のターンを保存し得ると考えられたので、Ｇ３７５はプロリンに変えた。グリシン４４９は、他のＡＡＶにおいてはセリンまたはアスパラギンであるが、ＡＡＶ−２においてはＲ４４８とＲ４５１（これらは、ヘパリン結合および形質導入に重要である）の間にあるので、Ｇ４４９はアラニンに変えた。従って、４４９位は、グリシンに最もサイズが近いアミノ酸に変異させた（すなわち、アラニン）。いくつかの場合、所望の変異に加えて、二重変異を単離した（Ｓ１３０Ａ／Ｎ１３１Ａ、Ｎ３６０Ｈ／Ｓ３６１Ａ、Ｓ３６１Ａ／Ｎ３５８Ｋ、Ｓ３６１Ａ／Ｓ４９４Ｐ、Ｓ３６１Ａ／Ｒ５９２Ｋ）。変異誘発の間に導入されたポリメラーゼの誤りの結果がおそらく存在したが、他の変異と同じようにアッセイした。
ＡＡＶヘルパー機能ベクターを、ｐＨＬＰ１９（米国特許第６，００１，６５０号に記載される）、１１６の変異誘発オリゴデオキシヌクレオチド、およびインビトロ変異誘発キット（Ｑｕｉｋ Ｃｈａｎｇｅ ＸＬ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて構築した。簡単に述べると、所望の変異配列の各々を含み、７４〜８３℃の間の融解温度（式：Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（％ Ｇ＋Ｃ）−（６７５／Ｎ）−％ミスマッチ（この式において、Ｇはグアノシンであり、Ｃはシトシンであり、Ｎはプライマーのヌクレオチド長である）を用いて計算した）を有する２つの相補的なオリゴデオキシヌクレオチドを、別々にｐＨＬＰ１９と混合した。以下の条件を用いて、３サイクルのＰＣＲを行なった：変性を９５℃にて１分間行ない、アニーリングを６０℃にて１分間行い、そして、伸長を６８℃にて１分間行なった。次いで、２つの別々の反応物を混合し、以下の条件を用いる追加の１８サイクルのＰＣＲに供した：変性を９５℃にて１分間行なっい、アニーリングを６０℃にて１分間行い、そして伸長を６８℃にて１５分間行なった。ＰＣＲ産物をＤｐｎＩ制限酵素で消化して、完全にメチル化されたか、または半メチル化された（すなわち、非変異）プラスミドを破壊し、次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＸＬ−１０（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換した。各変異誘発反応から１つのコロニーをピックアップし、５００ｎｇのプラスミドＤＮＡを調製し、そして、ＤＮＡ配列決定に供した。変異原性オリゴデオキシヌクレオチドのサブセットを配列決定プライマーとして使用して、変異体の配列を確認した。各場合において、全キャプシド遺伝子を配列決定した。多くの変異体が、この方法で単離され得る。変異体が最初のラウンドのＤＮＡ配列決定により単離されなかった場合、１〜３個多いコロニーをピックアップし、そして５００ｎｇのプラスミドＤＮＡを調製して、ＤＮＡ配列決定に供した。
（Ｂ．ｐＬａｄｅｎｏ５補助機能ベクター）
補助機能ベクターｐＬａｄｅｎｏ５を以下のように構築した。精製したアデノウイルス血清型−２のＤＮＡ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬから入手）から単離したＥ２ａ、Ｅ４およびＶＡ ＲＮＡ領域をコードするＤＮＡフラグメントを、ｐＡｍｐｓｃｒｉｐｔと呼ばれるプラスミド内に連結した。ｐＡｍｐｓｃｒｉｐｔプラスミドを、以下のように組み立てた。オリゴヌクレオチド指向型変異誘発を用いて、ポリリンカーおよびｐＢＳＩＩ ｓ／ｋ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手）に由来するα相補性発現カセットを含む６２３ｂｐの領域を除去し、ＥｃｏＲＶ部位で置き換えた。オリゴヌクレオチド指向型変異誘発に用いた変異原性オリゴの配列は、５’−ＣＣＧＣＴＡＣＡＧＧＧＣＧＣＧＡＴＡＴＣＡＧＣＴＣＡＣＴＣＡＡ−３’（配列番号１）であった。
ポリリンカー（以下の制限部位を含む：ＢａｍＨＩ；ＫｐｎＩ；ＳｒｆＩ；ＸｂａＩ；ＣｌａＩ；Ｂｓｔｌ １０７Ｉ；ＳａｌＩ；ＰｍｅＩ；およびＮｄｅＩ）を合成し、このリンカーのＢａｍＨＩ部位が、改変されたプラスミドのｆ１起点に近くなるように、上で作製したＥｃｏＲＶ部位に挿入して、ｐＡｍｐｓｃｒｉｐｔプラスミドを生じた。このポリリンカーの配列は、５’−ＧＧＡＴＣＣＧＧＴＡＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＣＴＡＧＡＡＴＣＧＡＴＧＴＡＴＡＣＧＴＣＧＡＣＧＴＴＴＡＡＡＣＣＡＴＡＴＧ−３’（配列番号２）であった。
アデノウイルス血清型−２ Ｅ２ａおよびＶａのＲＮＡの配列を含むＤＮＡフラグメントを、ｐＡｍｐｓｃｒｉｐｔに直接クローニングした、特に、Ｅ２ａ領域を含む５９６２ｂｐのＳｒｆＩ−ＫｐｎＩ（部分）フラグメントを、ｐＡｍｐｓｃｒｉｐｔのＳｒｆＩ部位とＫｐｎＩ部位との間にクローニングした。この５９６２ｂｐのフラグメントは、アデノウイルス血清型−２ゲノムの塩基対２１，６０６〜２７，５６８を含む。アデノウイルス血清型−２ゲノムの完全な配列は、ＧｅｎＢａｎｋ番号９６２６１５８の下でアクセス可能である。
アデノウイルス血清型−２ Ｅ４配列を含むＤＮＡを、ｐＡｍｐｓｃｒｉｐｔポリリンカーに挿入する前に改変した。具体的には、ＰＣＲ変異誘発を用いて、Ｅ４の近位にあるアデノウイルスの末端反復をＳｒｆＩ部位で置き換えた。このＳｒｆＩ部位の位置は、アデノウイルス血清型−２ゲノムの塩基対３５，８３６〜３５，８４４に相当する。変異誘発において用いたオリゴヌクレオチドの配列は、５’−ＡＧＡＧＧＣＣＣＧＧＧＣＧＴＴＴＴＡＧＧＧＣＧＧＡＧＴＡＡＣＴＴＧＣ−３’（配列番号３）および５’−ＡＣＡＴＡＣＣＣＧＣＡＧＧＣＧＴＡＧＡＧＡＣ−３’（配列番号４）であった。上記の改変したＥ４遺伝子をＳｒｆＩおよびＳｐｅＩで切断することにより作製した３，１９２ｂｐのＥ４フラグメントを、既にＥ２ａおよびＶＡのＲＮＡ配列を含むｐＡｍｐｓｃｒｉｐｔのＳｒｆＩ部位とＸｂａＩ部位との間に連結し、ｐＬａｄｅｎｏ５プラスミドを生じた。３，１９２ｂｐのフラグメントは、アデノウイルス血清型−２ゲノムの塩基対３２，６４４〜３５，８３６に相当する。
（Ｃ．ｒＡＡＶ−２ ｈＦ．ＩＸベクター）
ｒＡＡＶ−２ ｈＦ．ＩＸベクターは、２つのＡＡＶ−２逆方向末端反復（米国特許第６，０９３，３９２号を参照のこと）の間に、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ｈＦ．ＩＸのエキソン１、ｈＦ．ＩＸイントロン１の１．４ｋｂフラグメント、ｈＦ．ＩＸのエキソン２〜８、２２７ｂｐのｈＦ．ＩＸ ３’ＵＴＲ、およびＳＶ４０後期ポリアデニル化配列を含む１１，４４２ｂｐのプラスミドである。ｈＦ．ＩＸイントロン１の１．４ｋｂのフラグメントは、イントロン１の５’末端（ヌクレオチド１０９８まで）と、エキソン２との接合点まで延びるヌクレオチド５８８２からの配列、から構成される。ＣＭＶの最初期プロモーターおよびＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル配列は、ｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ（登録商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡから入手可能）の公開配列から得られ得る。
（Ｄ．ｒＡＡＶ−２ ｌａｃＺベクター）
（組み換え型ＡＡＶプラスミドｐＶｍＬａｃＺの構築）
１．４３１１ｂｐのＸｂａＩ ＤＮＡフラグメントを、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列を含むｐＳＵＢ２０１から切り出した。ＸｂａＩ末端を、１０ｂｐのＮｏｔＩ合成オリゴヌクレオチド（５’−ＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴ−３’）（配列番号５）と再度アニーリングして、プラスミド中間体ｐＵＣ／ＩＴＲ−ＮｏｔＩを生じた。このプラスミド中間体は、１１６ｂｐの残留ＡＡＶ配列により隔てられたＡＡＶ ＩＴＲ（逆方向末端反復）およびＮｏｔＩリンカーＤＮＡの両方を有する。
２．１３１９ｂｐのＮｏｔＩ ＤＮＡフラグメントを、ＣＭＶプロモーターおよびｈＧＨイントロン配列を含むｐ１．１ｃから切り出した。このＤＮＡ配列を、ｐＵＣ／ＩＴＲ−ＮｏｔＩのＮｏｔＩ部位に挿入して、中間体ｐＳＵＢ２０１Ｎを生じた。
３．１６６８ｂｐのＰｖｕＩＩ（５１３１〜１４９３）ＩＴＲ結合ＣＭＶ発現カセットを、ｐＳＵＢ２０１Ｎから切り出し、ｐＷｅｅ．１ａのＰｖｕＩＩ部位（１２位）に挿入して、プラスミド中間体ｐＷｅｅ．１ｂを生じた。ｐＳＵＢ２０１Ｎから１６６８ｂｐのＰｖｕＩＩフラグメントを切り出して、「Ａ」パリンドローム領域の各ＩＴＲの外側から１５ｂｐを除去した。
４．４７３７ｂｐのＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＶ「ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ」ＤＮＡ配列を、ｐＧＮ１９０９から切り出し、Ｋｌｅｎｏｗ ＤＮＡポリメラーゼを用いて３’の陥没末端を埋めることによって、その末端を、平滑にした。ＡｓｃＩリンカーを両方の末端に連結し、その後、この「ｐＧＮ１９０９／ＡｓｃＩ」ＤＮＡフラグメントを、ｐＷｅｅ．１ｂの骨格のＡｓｃＩ部位（２７０３）にクローニングして、中間体ｐＷｅｅｌ９０９（８１８８ｂｐ）を生じた。このプラスミドは、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子骨格を有するＩＴＲ結合ＣＭＶ発現カセットを有する。
５．３２４６ｂｐのＳｍａＩ／ＤｒａＩ ＬａｃＺ遺伝子を、ｐＣＭＶ−βから切り出し、ＡｓｃＩリンカーをこの平滑末端のフラグメントに連結した。このＬａｃＺ／ＡｓｃＩフラグメントをｐ１．１ｃのＢｓｓＨＩＩ部位の間にクローニングして、ｐ１．１ｃＡＤＨＬａｃＺを生じ、これは、ＣＭＶプロモーターにより駆動されるＬａｃＺ遺伝子を有する。
６．４３８７ｂｐのＮｏｔＩ ＤＮＡフラグメントを、ＣＭＶプロモーターにより駆動されるＬａｃＺ遺伝子を有するｐ１．１ｃＡＤＨＬａｃＺから切り出した。このフラグメントを、１３１４ｂｐのｐ「ＣＭＶプロモーター／ｈＧＨイントロン」発現カセットを除去した後に、ｐＷｅｅ１９０９のＮｏｔＩ部位の間に挿入した。得られた構築物ｐＷ１９０９ＡＤＨＬａｃＺは、ＣＭＶプロモーターの制御下にβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を有し、ＩＴＲに結合している。このプラスミドの骨格は、ＡＡＶヘルパー機能を提供する「ｒｅｐ」遺伝子および「ｃａｐ」遺伝子を保有し、そしてこのβ−ラクタマーゼ（アンピシリン）遺伝子が、抗生物質に対する耐性を与える。
７．「ＣＭＶ／ＬａｃＺ」カセットを含む４７７２ｂｐのＳｓｅＩ ＤＮＡフラグメントを、ｐＷ１９０９ＡＤＨＬａｃＺから切り出し、ｐＵＣ１９のＳｓｅＩ部位に挿入して、Ｐｒｅ−ｐＶＬａｃＺを生じた。この構築物はなお、各ＩＴＲの内側に約５０ｂｐの５’および３’のｐＳＵＢ２０１配列の残留物を含む。
８．Ｐｒｅ−ｐＶＬａｃＺから２９１２ｂｐのＭｓｃＩ「ｐＵＣ／ΔＩＴＲ」ＤＮＡフラグメントを切り出すことによって残留のｐＳＵＢ２０１配列を除去し、これはまた、各ＩＴＲの「Ｄ」領域の約３５ｂｐも除去する。ＭｓｃＩ制限部位、ＩＴＲ「Ｄ」領域およびＮｏｔＩ部位を含む合成リンカー「１４５ＮＡ／ＮＢ」（５’−ＣＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＴＧＣＧＧＣＣ−３’）（配列番号６）を用いて、「ＣＭＶ／ＬａｃＺ」発現カセットを有するｐＷ１９０９ＡＤＨＬａｃＺから４３８４ｂｐのＮｏｔＩフラグメントをクローニングした。得られたプラスミドｐＶＬａｃＺは、アルコールデヒドロゲナーゼエンハンサー配列およびＣＭＶプロモーターの制御下にβ−ガラクトシダーゼ配列を有し、これらは全て、ＡＡＶ ＩＴＲに結合している。
９．以下のように、ＬａｃＺエレメントおよびポリリンカー配列をＩＴＲ結合ＬａｃＺ発現カセットから除去することによって、ｐＶＬａｃＺをさらに改変した。５３４ｂｐのＥｈｅＩ／ＡｆｌＩＩＩ ＬａｃＺ／ポリリンカー配列を、ｐＵＣ１１９から切り出し、この末端を、Ｋｌｅｎｏｗ ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑化し、そしてこのプラスミドを、ＳｓｅＩリンカー（５’−ＣＣＴＧＣＡＧＧ−３’）（配列番号７）に連結して、ｐＵＣ１１９／ＳｓｅＩを作製した。４６６６ｂｐのＳｓｅＩフラグメントを切り出すことによって、「ＡＡＶＬａｃＺ」ＤＮＡ配列をｐＶＬａｃＺから除去した。このＳｓｅＩフラグメントを、ｐＵＣ１１９／ＳｓｅＩのＳｓｅＩ部位にクローニングして、ｐＶｍＬａｃＺを作製した。ｐＶｍＬａｃＺは、ｐＵＣ１１９由来の骨格内のＡＡＶ ＩＴＲに結合したＣＭＶプロモーター／ＡＤＨエンハンサー／β−ガラクトシダーゼ遺伝子を有し、これは、アンピシリン耐性を与え、高コピー数の複製起点を有する。
（ＩＩ．三重トランスフェクション手順）
種々の変異型ＡＡＶヘルパー機能ベクター（上記）、補助機能ベクターｐＬａｄｅｎｏ５（米国特許第６，００４，７９７号に記載される）、およびｒＡＡＶ２−ｌａｃＺベクターであるｐＶｍＬａｃＺ（上記）を使用して、組み換え型ビリオンを生成した。
簡単に述べると、ヒト胚性腎細胞タイプ２９３（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，カタログ番号ＣＲＬ−１５７３）を、１０％胎仔ウシ血清を補充したダルベッコ改変イーグル培地から構成される１０ｍＬの細胞培養培地中、３×１０６細胞／ディッシュの密度で、１０ｃｍ組織培養処理滅菌ディッシュに播種し、そして、５％ ＣＯ２の、３７℃にて加湿した環境下でインキュベートした。一晩のインキュベーションの後、２９３細胞は約８０％のコンフルエントであった。次いで、この２９３細胞をリン酸カルシウム沈殿法（当該分野で周知のトランスフェクション法）によりＤＮＡでトランスフェクトした。滅菌ピペットチップを用いて、１０μｇの各ベクター（変異型ｐＨＬＰ１９、ｐＬａｄｅｎｏ５およびｐＶｍ ｌａｃＺ）を３ｍＬの滅菌したポリスチレンスナップキャップチューブに加えた。１．０ｍＬの３００ｍＭ ＣａＣｌ２（ＪＲＨグレード）を各チューブに加え、上下にピペッティングすることによって混合した。等量の２×ＨＢＳ（２７４ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＫＣｌ、４２ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１．４ｍＭ Ｎａ２ＰＯ４、１２ｍＭデキストロース、ｐＨ７．０５、ＪＲＨグレード）を２ｍＬピペットを用いて加え、この溶液を上下に３回ピペッティングした。このＤＮＡ混合物を、直ちに２９３細胞に、一度に一滴で、ディッシュ全体に均一に加えた。次いで、この細胞を、５％ ＣＯ２中、３７℃で加湿した環境下で６時間インキュベートした。顆粒状の沈殿物が、トランスフェクトした細胞培養物中に見えた。６時間後、このＤＮＡ混合物を細胞から除去し、次いで、これに、胎仔ウシ血清を含まない新しい細胞培養培地を与え、さらに７２時間インキュベートした。
７２時間後、これらの細胞を、固体二酸化炭素上での凍結および３７℃の水浴での融解の３サイクルによって溶解した。トランスフェクトした細胞のこのような凍結−融解による溶解を、全キャプシド合成（ウェスタンブロッティングによる）、ＤＮＡパッケージング（Ｑ−ＰＣＲによる）、ヘパリン結合、インビトロ形質導入（ＨｅＬａ細胞またはＨｅｐＧ２細胞＋アデノウイルス−２もしくはエトポシドについて）および抗体による中和に関して特徴付けた。
（ＩＩＩ．変異型ビリオンの特性）
（Ａ．キャプシド合成アッセイ）
タンパク質の変異は、タンパク質を不安定にし、プロテアーゼによる分解に対して正常なものよりもより感受性にし得る。本明細書中に記載される変異により作成されるキャプシドのレベルを決定するために、粗製溶解物のウェスタンブロッティングを行った。１μｌの各粗製溶解物を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ＰＨ６．８、０．１％ ＳＤＳ中で、８０℃にて５分間インキュベートすることによって変性させた。タンパク質を、１０％ポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画し、次いで、以下のようにウェスタンブロッティングにより検出した。これらのタンパク質を、ナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｐ，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）上に、電気泳動的にブロットした（Ｘｃｅｌｌ ＩＩブロットモジュール，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）。この膜を、１：２０希釈の抗ＡＡＶ抗体（モノクローナルクローンＢ１，Ｍａｉｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ．Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＭＥ）でプローブし、次いで、１：１２０００希釈の西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したヒツジ抗マウス抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）でプローブした。Ｂ１抗体結合タンパク質を、ＥＣＬ Ｐｌｕｓウェスタンブロッティング検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）を用いて検出した。この膜を、Ｘ線フィルム（Ｂｉｏｍａｘ ＭＳ，Ｋｏｄａｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）に１〜５分間曝露し、そして、ＡｌｐｈａＩｍａｇｅｒ ３３００（Ａｌｐｈａ Ｉｎｎｏｔｅｃｈ Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ
Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）を用いてシグナルを定量した。
（Ｂ．ＤＮＡパッケージングアッセイ）
定量的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）を用いて、変異型キャプシドを有するＡＡＶ−２ビリオンによるＤＮＡパッケージングを評価した。この手順において、ＰＣＲ増幅の前に粗製溶解物をＤＮＡｓｅ Ｉで消化して、誤った陽性シグナルを生じ得る（トランスフェクションにおいて使用された）任意のプラスミドを除去した。この粗製溶解物を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０、１０μｇ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡ中１００倍（５μｌの粗製溶解物＋４９５μｌの緩衝液）に希釈した。この希釈物のアリコート（１０μｌ）を、最終容量５０μｌの２５ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０、１ｍＭ ＭｇＣｌ２中１０単位のＤＮＡｓｅ Ｉ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）で、３７℃にて６０分間消化した。ＤＮＡｓｅ Ｉを９５℃で３０分間加熱することにより不活性化した。１μｌ（２０μｇ）のプロテイナーゼＫ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を加え、５５℃で３０分間インキュベートした。プロテイナーゼＫを、９５℃で２０分間加熱することによって不活性化した。この時点で、このサンプルを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０、１０μｇ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡ（必要に応じて）中に希釈した。１０μｌのＤＮＡｓｅ ＩおよびプロテイナーゼＫで処理したサンプルを、以下から構成される４０μｌのＱ−ＰＣＲマスターミックスに加えた：
４μｌ Ｈ２Ｏ
５μｌ ９μＭ ｌａｃＺプライマー＃ＬＺ−１８８３Ｆ（５’−ＴＧＣＣＡＣＴＣＧＣＴＴＴＡＡＴＧＡＴ−３’（配列番号８）Ｏｐｅｒｏｎ，Ｉｎｃ．，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）
５μｌ ９μＭ ｌａｃＺプライマー＃ＬＺ−１９４８Ｒ（５’−ＴＣＧＣＣＧＣＡＣＡＴＣＴＧＡＡＣＴＴ−３’（配列番号９）Ｏｐｅｒｏｎ，Ｉｎｃ．，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）
１μｌ １０μＭ ｌａｃＺプローブ＃ＬＺ−１９０６Ｔ（５’−６ＦＡＭ−ＡＧＣＣＴＣＣＡＧＴＡＣＡＧＣＧＣＧＧＣＴＧＡ−ＴＡＭＲＡ−３’（配列番号１０）Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）
２５μｌ ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）。
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｍｏｄｅｌ ７０００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを以下のプログラムに従って用いて、Ｑ−ＰＣＲ増幅を行なった。Ｔａｑポリメラーゼを活性化するための５０℃で２分間、およびＤＮＡテンプレートを変性するための９５℃で１０分間の２つの初期インキュベーションが存在した。次いで、このＤＮＡを、９５℃にて１５秒間、次いで６０℃にて６０秒間の、４０サイクルのインキュベーションにより増幅した。６１〜１，０００，０００のコピー数に及ぶ直線状にしたｐＶｍ ｌａｃＺの４倍希釈物を用いて、標準曲線を作成した。各サンプル内のパッケージングされたｒＡＡＶ−ｌａｃＺゲノムのコピー数を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｉｓｍ ７０００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍバージョン１．０ソフトウェアを用いて、Ｑ−ＰＣＲから得られたＣｔ値から計算した。
（Ｃ．ヘパリン結合アッセイ）
粗製溶解物中のウイルスのヘパリン結合を、以下のように実施した。野生型もしくは変異型のキャプシドを有するＡＡＶ−２ビリオンを含む２０μｌの粗製細胞溶解物を、ヘパリンビーズの５０％スラリー（２５μｌ）と混合した。このヘパリンビーズ（Ｃｅｒａｍｉｃ Ｈｙｐｅｒ−ＤＭ Ｈｙｄｒｏｇｅｌ−Ｈｅｐａｒｉｎ，Ｂｉｏｓｅｐｒａ，Ｃｅｒｇｙ−Ｓａｉｎｔ−Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅ，Ｆｒａｎｃｅ）は、直径８０μｍであり、１０００Åの孔を有し、ＡＡＶ（直径約３００Å）のヘパリンへのアクセスが可能であった。このビーズを、使用前に、リン酸緩衝化生理食塩水中で十分に洗浄した。このビーズおよびビリオンを、３７℃で６０分間インキュベートした。このビーズをペレット状にした。未結合のビリオンを含む上清を保存した。このビーズを、５００μｌのＰＢＳで２回洗浄した。この上清を合せ、未結合のキャプシドタンパク質を１０％の最終濃度のトリクロロ酢酸で沈殿させた。沈殿したタンパク質を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ６．８、０．１％ ＳＤＳ中で、８０℃にて５分間インキュベーションすることにより変性させた。ヘパリンビーズに結合したビリオンを、そのビーズを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ６．８、０．１％ ＳＤＳ中で、８０℃にて５分間インキュベーションすることにより放出した。この様式で調製した全てのタンパク質サンプルを、１０％ポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分子量で分画し、次いで、以下のようにウェスタンブロッティングにより検出した。このタンパク質を、ナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｐ，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）上に電気泳動的にブロットした。この膜を、１：２０希釈の抗ＡＡＶ抗体（モノクローナルクローンＢ１，Ｍａｉｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ．Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＭＥ）でプローブし、次いで、１：１２０００希釈の西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したヒツジ抗マウス抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）でプローブした。このＢ１抗体結合タンパク質を、ＥＣＬ Ｐｌｕｓウェスタンブロッティング検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）を用いて検出した。この膜を、Ｘ線フィルム（Ｂｉｏｍａｘ ＭＳ，Ｋｏｄａｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）に１〜５分間曝露し、そして、ＡｌｐｈａＩｍａｇｅｒ ３３００（Ａｌｐｈａ Ｉｎｎｏｔｅｃｈ Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）を用いてシグナルを定量した。
（Ｄ．インビトロ形質導入アッセイ）
ＨｅＬａ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，カタログ＃ＣＣＬ−２）を、１ウェルあたり５ｅ４細胞で２４ウェルディッシュにプレートした。この細胞を、１０％胎仔ウシ血清（Ｇｉｂｃｏ）およびペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ）中で、３７℃にて２４時間増殖させた。コントロールの野生型ウイルスおよび変異型ウイルスを含む粗製溶解物の１０倍希釈物を、ＤＭＥ／１０％ ＦＢＳ中で作製した。このウイルス希釈物を、野生型アデノウイルス−５（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，カタログ＃ＶＲ−５）と共に細胞に加えた。使用したアデノウイルスの量は、１ウェルあたり０．１μｌであり、これは、前もって力価測定して、ｒＡＡＶ−２ ｌａｃＺのＨｅＬａ細胞への形質導入を最大限に刺激することが示された。３７℃にて２４時間後、この細胞を、２％ホルムアルデヒドおよび０．２％グルタルアルデヒドを用いて固定し、そして、ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍｌ（２．５ｍＭ）の５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルβ−Ｄガラクトピラノシド、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭフェリシアン化カリウム、５ｍＭフェロシアン化カリウム、ｐＨ７．２を用いて、β−ガラクトシダーゼ活性について染色した。さらに２４時間後、４つのランダムな顕微鏡視野内の青色細胞の数を計数し、各ウェルについて平均した。ＨｅＬａ細胞およびアデノウイルス−５を用いる代わりに、ＨｅｐＧ２細胞および２０μＭのエトポシドもまた使用され得、類似の結果が得られた。
（Ｅ．抗体および血清の中和アッセイ）
ＨｅｐＧ２細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，カタログ＃ＨＢ−８０６５）を、１ウェルあたり１．５ｅ５細胞で２４ウェルディッシュにプレートした。細胞を、１０％の胎仔ウシ血清およびペニシリン−ストレプトマイシンを補充した（イーグルの）最小基本培地（ＫＭＥＭ）（ＡＴＣＣ）中で３７℃にて２４時間増殖させた。Ａ２０抗体（Ｍａｉｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＭＥ）の２倍希釈物をＰＢＳを用いて作成した。１μｌのウイルス調製物の粗製溶解物を１５μｌのＫＭＥＭ／０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と混合することによって、野生型および変異型のウイルスを希釈した。ＫＭＥＭ／０．１％ ＢＳＡおよびＰＢＳのサンプルを、ネガティブコントロールとして含めた。合計１６μｌのＡ２０希釈物を、１６μＬのウイルスと混合し、３７℃で１時間インキュベートした。１０μｌのウイルス／Ａ２０混合物を、３つの細胞のウェルの各々に添加した。３７℃にて１時間インキュベートした後、エトポシド（ジメチルスルホキシド中２０ｍＭストック溶液、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を、２０μＭの最終濃度で各ウェルに添加した。２４時間後、この細胞を、２％ホルムアルデヒドおよび０．２％グルタルアルデヒドを用いて固定し、そして、ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍｌ（２．５ｍＭ）の５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルβ−Ｄガラクトピラノシド、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭフェリシアン化カリウム、５ｍＭフェロシアン化カリウム、ｐＨ７．２を用いて、β−ガラクトシダーゼ活性について染色した。さらに２４時間後、４つのランダムな顕微鏡視野内の青色細胞の数を計数し、各ウェルについて平均した。抗体の中和力価を、抗体なしの形質導入と比較して、ウイルスの形質導入事象（すなわち、青色細胞）の数の５０％減少を生じる抗体の希釈として規定する。
血友病患者から収集したヒト血清による変異体の中和、または、１０，０００人を超えるドナーに由来する精製ヒトＩｇＧ（Ｐａｎｇｌｏｂｕｌｉｎ，ＺＬＢ Ｂｉｏｐｌａｓｍａ ＡＧ，Ｂｅｒｎｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に対する中和を、同じ様式でアッセイした。精製ヒトＩｇＧについて、１０ｍｇ／ｍｌの濃度を、希釈していない血清と同等と考えた。なぜならば、ヒト血清におけるＩｇＧの濃度は、５〜１３ｍｇ／ｍｌに及ぶからである。
（Ｆ．ＥＬＩＳＡ）
（ａ）Ａ２０ ＥＬＩＳＡ：
ＡＡＶ−２を捕捉し、検出するためにモノクローナル抗体（Ａ２０）を使用するＥＬＩＳＡキット（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂｅｌｍｏｎｔ，ＭＡ）を用いて、粒子数を定量した。このキットを、製造業者の指示に従って使用した。光学密度を、４５０ｎｍの波長のＳｐｅｃｔｒａｍａｘ ３４０ＰＣプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）にて測定した。最大半減の光学密度の読みを生じるために必要とされるウイルスの濃度を計算し、異なるサンプルからの結果と比較するために使用した。
（ｂ）ＩｇＧ／Ａ２０ ＥＬＩＳＡ：
マイクロタイタープレート（９６ウェルＥＩＡ／ＲＩＡ平底、高結合ポリスチレン、Ｃｏｓｔａｒ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）を、０．１Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．２中１００μｌ（１０μｇ）のＰａｎｇｌｏｂｕｌｉｎを用いて、２０℃にて１６時間コーティングした。プレートを、２００μｌのＰＢＳ、１％ ＢＳＡ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０で、２０℃にて１時間ブロッキングした。１ウェルあたり３．０８〜１．０１０ベクターゲノムの範囲で増加する量のＣｓＣｌ勾配精製したネイティブ、または変異型のＡＡＶ−２を添加し、２０℃にて１６時間インキュベートした。未結合のウイルスを、ＰＢＳ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０緩衝液のアリコート（２００μｌ）を３回用いて洗い出した。ＡＡＶ−２ ＥＬＩＳＡキットからのＡ２０−ビオチンを、１：５０に希釈し、１ウェルあたり１００μｌを添加し、３７℃で１時間インキュベートした。未結合のＡ２０−ビオチンを、ＰＢＳ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０緩衝液のアリコート（２００μｌ）を３回用いて洗い出した。次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したストレプトアビジンを１：２０に希釈し、３７℃で１時間インキュベートした。未結合のストレプトアビジン−ＨＲＰを、ＰＢＳ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０緩衝液のアリコート（２００μｌ）を３回用いて洗い出した。西洋ワサビペルオキシダーゼ基質（Ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｅ ＴＭＢ基質キット Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を添加し、２０℃で１５分間インキュベートした。この反応を、１００μｌの２Ｍ硫酸で停止し、光学密度を、４５０ｎｍの波長のＳｐｅｃｔｒａｍａｘ ３４０ＰＣプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）にて測定した。最大半減の光学密度の読みを生じるために必要とされるウイルスの濃度を計算し、異なるサンプルからの結果と比較するために使用した。
（ｃ）ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ：
マイクロタイタープレート（９６ウェルＥＩＡ／ＲＩＡ平底、高結合ポリスチレン、Ｃｏｓｔａｒ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）を、０．１Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．２中、１ウェルあたり３．０８〜１．０１０ベクターゲノムの範囲で増加する量のＣｓＣｌ勾配精製したネイティブもしくは変異型のＡＡＶ−２を用いて、２０℃にて１６時間コーティングした。プレートを、２００μｌのＰＢＳ、１％ ＢＳＡ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０で、２０℃にて１時間ブロッキングした。未結合のウイルスを、ＰＢＳ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０緩衝液のアリコート（２００μｌ）を３回用いて洗い出した。パングロブリンを添加し、３７℃で１時間インキュベートした。未結合のパングロブリンを、ＰＢＳ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０緩衝液のアリコート（２００μｌ）を３回用いて洗い出した。次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したロバ抗ヒトＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。未結合の二次抗体を、ＰＢＳ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０緩衝液のアリコート（２００μｌ）を３回用いて洗い出した。西洋ワサビペルオキシダーゼ基質（Ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｅ ＴＭＢ基質キット Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を添加し、２０℃で１５分間インキュベートした。この反応を、１００μｌの２Ｍ硫酸で停止し、光学密度を、４５０ｎｍの波長のＳｐｅｃｔｒａｍａｘ ３４０ＰＣプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）にて測定した。最大半減の光学密度の読みを生じるために必要とされるウイルスの濃度を計算し、異なるサンプルからの結果と比較するために使用した。
本明細書中で記載した変異体のＤＮＡパッケージング、ヘパリン結合および形質導入の特性を、表１にまとめる。本明細書中に記載される変異のいくつかの抗体中和特性を、表２および表３にまとめる。
Figure 2018029614
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見られ得るように、ＡＡＶ−２の表面上の単一のアミノ酸の変更によって、６１のうち３２の変異が、キャプシド合成、ＤＮＡパッケージング、ヘパリン結合およびインビトロでの細胞の形質導入に関して、ほぼ正常な特性を有したと同定された。１０の変異は、抗体による中和により抵抗性であった。
変異は、キャプシドタンパク質を、野生型よりも５倍低いレベル〜８倍高いレベルにした。これらは、野生型よりも２５倍低いレベル〜２０倍高いレベルのＤＮＡをパッケージングした。形質導入に関しては、２８の変異が、少なくとも５０％野生型と同等に形質導入し、１６の変異が、野生型の１０〜５０％形質導入し、６の変異が、野生型の１〜１０％形質導入し、そして、１１の変異が、野生型の１％未満形質導入した（表１）。ヒト頸部癌腫由来のＨｅＬａ細胞もしくはヒト肝臓由来ＨｅｐＧ２細胞の形質導入においてまたは、形質導入を増強するためにアデノウイルスもしくはエトポシドのいずれかを使用する場合は、有意差がなかった。いくつかの変異は、野生型の５倍以上までの形質導入活性を再現可能に有した（表１）。
１％未満の形質導入活性を有する変異の多くは、ヘパリン結合部位（案）の片側の、単一の領域においてクラスター形成していた（表１、図４と図５を比較する）。特定の理論に束縛されないが、この変異は、タンパク質結合部位であり得る領域を覆う。形質導入に最も欠陥のある変異は、Ｎ１３１Ａであった。Ｎ１３１の機能は記載されていないが、これは、４２の既知のＡＡＶサブタイプのうち４０で保存されている。
４つの変異（Ａ３５６Ｒ、Ｇ３７５Ａ、Ｓ３６１Ａ／Ｓ４９４Ｐ、Ｓ３６１Ａ／Ｒ５９２Ｋ）は、他のものよりも顕著にヘパリン結合に影響を与えた。これらの各々は、ヘパリン結合に重要なアミノ酸として以前に同定されていた、Ｒ３４７、Ｒ３５０、Ｋ３９０、Ｒ４４８およびＲ４５１の近くにある（図５）。
野生型ＡＡＶ−２キャプシドの形質導入活性の約１０％以上を有する４５の変異（Ｑ１２６Ａ、Ｓ１２７Ａ、Ｄ１９０Ａ、Ｇ１９１Ｓ、Ｓ２４７Ａ、Ｑ２４８Ａ、Ｓ３１５Ａ、Ｔ３１７Ａ、Ｔ３１８Ａ、Ｑ３２０Ａ、Ｒ３２２Ａ、Ｓ３３１Ａ、Ｄ３３２Ａ、Ｒ３３４Ａ、Ｄ３３５Ａ、Ｔ３５４Ａ、Ｓ３５５Ａ、Ｓ３５５Ｔ、Ａ３５６Ｒ、Ｄ３５７Ａ、Ｎ３５９Ａ、Ｎ３６０Ａ、Ｎ３６０Ｈ／Ｓ３６１Ａ、Ｓ３６１Ａ、Ｓ３６１Ａ／Ｒ５９２Ｋ、Ｅ３６２Ａ、Ｄ３７７Ａ、Ｋ３９０Ａ、Ｅ３９３Ａ、Ｅ３９４Ａ、Ｋ３９５Ａ、Ｆ３９６Ａ、Ｋ４０７Ａ、Ｅ４１１Ａ、Ｔ４１３Ａ、Ｅ４１８Ａ、Ｋ４１９Ａ、Ｅ４３７Ａ、Ｑ４３８Ａ、Ｇ４４９Ａ、Ｎ４５０Ａ、Ｑ４５２Ａ、Ｎ５６８Ａ、Ｋ５６９Ａ、Ｖ５７１Ａ）を、マウスＡ２０モノクローナル抗体による中和についてスクリーニングした。４の変異（Ｑ１２６Ａ、Ｓ１２７Ａ、Ｓ２４７Ａ、Ｑ２４８Ａ）は、野生型キャプシドを有するＡＡＶ２よりもＡ２０による中和に対して有意により抵抗性であった（表３を参照のこと）。これらの変異（Ｑ１２６Ａ、Ｓ１２７Ａ、Ｓ２４７Ａ、Ｑ２４８Ａ）の力価は、それぞれ、１：２０３、１：９、１：１８０および１：８９であり（図８）、これは、野生型ＡＡＶ−２キャプシドに対するＡ２０モノクローナル抗体の中和力価（１：５０９）よりも、２．５倍、５７倍、２．８倍、および５．７倍以上大きい。これらの４の変異は、ＡＡＶ−２キャプシドの表面上で、互いに直ぐ隣接して位置している（図６）。
Ａ２０による中和を減少する４の変異のうちの３（Ｑ１２６Ａ、Ｓ１２７Ａ、Ｑ２４８Ａ）は、キャプシド合成、ＤＮＡパッケージング、ヘパリン結合および形質導入に関して、本質的に正常であった。変異Ｓ２４７Ａによるキャプシド合成および形質導入は、野生型ＡＡＶ−２キャプシドよりも４〜５倍低かった。従って、いくつかの重要な特性においては正常であるが、抗体中和に対する抵抗性が増加したウイルスを有する可能性がある。
変異型ｒＡＡＶビリオンのＱ１２６Ａ、Ｓ１２７Ａ、Ｓ２４７Ａ、Ｑ２４８Ａは、２つの異なるヒト細胞株（ＨｅＬａおよびＨｅｐＧ２）において形質導入効率を維持しながら、中和抗体に対して、予想外に２．５倍〜５７倍の抵抗性を生じた。これらの４つのアミノ酸は、ＡＡＶ−２の表面上で、互いに直ぐ隣接している（図６）。さらに、これらは、ペプチド競合および挿入性変異誘発実験に基づいて、Ａ２０抗体の結合への関与が示唆されている領域にある。これらの知見に基づいて、Ａ２０抗体が、ＡＡＶ−２が細胞に形質導入するために必要な１つ以上の機能をブロックする可能性がある。以前の研究において、Ａ２０は、ＡＡＶ−２のヘパリンへの結合をブロックしないことが示されている（Ｗｏｂｕｓら（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：９２８１−９３）。本明細書において報告される結果は、このデータを支持する。なぜならば、ヘパリン結合に影響を与える変異は、Ａ２０の結合に影響を与える変異から離れて位置するからである。Ａ２０はヘパリン結合をブロックしないが、ＡＡＶ−２が細胞内に入るのを防止する。Ａ２０は、ヘパリンのような「ドッキングレセプター」への結合とは干渉しないが、その代わりに、ＡＡＶ−２の「進入レセプター」への結合と干渉する可能性がある。ＡＡＶ−２の形質導入に必要とされる２つのタンパク質が記載されており、これらは、進入レセプター：塩基性線維芽細胞増殖因子レセプター（ｂＦＧＦＲ）およびαｖβ５インテグリンであり得る。これらのレセプターが結合し得るＡＡＶ−２上の領域は、同定されていない。αｖβ５インテグリン、ｂＦＧＦＲまたは両方が、形質導入に有意に（正常の１％未満）欠陥がある変異を高い濃度で有する、本明細書中で記載される局所的な領域に結合し得る可能性がある。最も形質導入に欠陥がある領域は、Ａ２０結合に影響を与える変異の近くに位置することに注意されたい。
野生型ＡＡＶ−２キャプシドの約１０％以上の形質導入活性を有する同じ４５の変異（Ｑ１２６Ａ、Ｓ１２７Ａ、Ｄ１９０Ａ、Ｇ１９１Ｓ、Ｓ２４７Ａ、Ｑ２４８Ａ、Ｓ３１５Ａ、Ｔ３１７Ａ、Ｔ３１８Ａ、Ｑ３２０Ａ、Ｒ３２２Ａ、Ｓ３３１Ａ、Ｄ３３２Ａ、Ｒ３３４Ａ、Ｄ３３５Ａ、Ｔ３５４Ａ、Ｓ３５５Ａ、Ｓ３５５Ｔ、Ａ３５６Ｒ、Ｄ３５７Ａ、Ｎ３５９Ａ、Ｎ３６０Ａ、Ｎ３６０Ｈ／Ｓ３６１Ａ、Ｓ３６１Ａ、Ｓ３６１Ａ／Ｒ５９２Ｋ、Ｅ３６２Ａ、Ｄ３７７Ａ、Ｋ３９０Ａ、Ｅ３９３Ａ、Ｅ３９４Ａ、Ｋ３９５Ａ、Ｆ３９６Ａ、Ｋ４０７Ａ、Ｅ４１１Ａ、Ｔ４１３Ａ、Ｅ４１８Ａ、Ｋ４１９Ａ、Ｅ４３７Ａ、Ｑ４３８Ａ、Ｇ４４９Ａ、Ｎ４５０Ａ、Ｑ４５２Ａ、Ｎ５６８Ａ、Ｋ５６９Ａ、Ｖ５７１Ａ）を、３つのヒト中和抗血清による中和についてスクリーニングした。野生型キャプシドを有するＡＡＶ２よりも、３つ全てのヒト抗血清による中和に抵抗性であった４の変異（Ｒ３３４Ａ、Ｎ３６０Ｈ／Ｓ３６１Ａ、Ｅ３９４Ａ、Ｎ４５０Ａ）を、最初のスクリーニングで同定した（表２を参照のこと）。これらの変異について試験した場合の抗血清の力価は、野生型ＡＡＶ−２キャプシドに対する３つのヒト抗血清の中和力価の１．３倍〜３．６倍以上の範囲に及んだ（表３）。６の他の変異（Ｎ３６０Ａ、Ｅ４１１Ａ、Ｔ４１３Ａ、Ｇ４４９Ａ、Ｎ５６８Ａ、Ｖ５７１Ａ）は、試験した３つのうちの１つまたは２つの血清による中和に対する抵抗性のレベルが増加した（表２）。
抗体中和抵抗性を与える変異の位置は、参考になる。第１に、マウスモノクローナル抗体に対して抵抗性を与える変異は、ＡＡＶ−２キャプシドの表面上で、互いにすぐ近接して位置し、それゆえ、ヒト抗血清に対して抵抗性を与える変異は、より広い領域に渡って拡がっている（図７）。このことは、ヒト抗血清がポリクローナルであることを示唆しており、これは、驚くべきことではない。第２に、両方のセットの変異は、シリンダーが抗体結合のために容易にアクセス可能であるにも関わらず、プラトーおよびスパイクには位置するが、シリンダーには位置しない。第３に、中和に影響を与える変異は、ＡＡＶ機能に重要な領域の近くにある。ヒト抗血清による中和に影響を与えるいくつかの変異（３６０位、３９４位、４４９位、４５０位）は、中和抗体による結合のための機能的に重要な標的である可能性が高い、ヘパリン結合部位の２アミノ酸以内に位置する。他の変異（１２６位、１２７位、２４７位、２４８位、３３４位、５６８位、５７１位）は、野生型の１０％未満の形質導入活性を有する変異の多くを含む、プラトー（デッドゾーン）上の大きな領域の周辺に位置する（図４）。ヘパリン結合部位と同様に、この領域は、おそらく、重要な機能を有し、そして、中和抗体による結合のための機能的に重要な標的である可能性が高い。
抗体中和に対する抵抗性を与える複数の変異が組み合わされる場合、抗体中和に対する累積的な抵抗性は、しばしば、特に、個々の変異が低いレベルの抵抗性を生じる場合に、倍数的に増加する。それゆえ、本明細書中に記載される変異が、１つのキャプシド内で合わされる場合、これらのキャプシドは、野生型のキャプシドと比較して、５倍〜１０００倍以上抵抗性であり得るようである（表３）。１：１０００以上のＡ２０の希釈は、野生型ＡＡＶ−２の３％未満を中和する。従って、Ａ２０による中和に対していくらかの抵抗性を提供する４つの単一のアミノ酸の組み合わせを有する変異は、希釈していないＡ２０抗血清による中和に対してさえも、ほとんど完全に抵抗性であり得る。
野生型の１０％未満の形質導入活性を有する変異はまた、抗体中和に対しても抵抗性であり得るが、これらは、試験しなかった。なぜならば、本明細書中に記載されるように、中和アッセイは、野生型の約１０％を超える形質導入活性を有する変異をアッセイするために使用される場合に、一番効果を発揮するからである（図３）。これは、力価が正確に計算され得るように、広範な範囲の抗体に対する中和を検出し得ることが望ましいからである。しかし、野生型の１０％未満の形質導入活性を有する変異は、依然として、形質導入欠損変異が競合相手として使用される、本明細書中に記載されるアッセイの改変物を用いて、中和抗体に結合する能力について試験され得る。例えば、野生型「レポーター」ｒＡＡＶ−２ ｌａｃＺウイルスは、任意のゲノムを欠く（「空のウイルス」）か形質導入欠損「競合」ＡＡＶ−２、または別の遺伝子（例えば、緑色蛍光タンパク質）をパッケージングするＡＡＶ−２ウイルスと混合され得る。「競合」ＡＡＶ−２が、中和からレポーターＡＡＶ−２を保護する場合、「競合」キャプシドは、中和抗体に結合し得るはずであり、従って、中和に対して抵抗性ではない。「競合」ＡＡＶ−２が中和からレポーターＡＡＶ−２を保護しない場合、「競合」キャプシドは、中和抗体に結合し得ず、従って、正常な量のキャプシドを作ることが示されている限りは、中和に対して抵抗性であり得る。このように、形質導入欠損であるが、抗体中和に対して抵抗性である変異さえも、同定され得る。中和抗体の存在下で遺伝子を送達するためのビヒクルとして有用なこのような変異を作製するために、通常の形質導入活性を回復するが、なお中和に対して減少した感受性を保持する、アラニン以外のアミノ酸置換を発見することが望ましい。
６６以上の変異を作製し、上記のようなプロトコールを用いて試験した。追加の変異のＤＮＡパッケージング、ヘパリン結合および形質導入の特性を、表４にまとめる。
Figure 2018029614
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表４に示すように、野生型キャプシドと比較して、増加した形質導入を有するいくつかの変異が得られた。例えば、変異Ｓ１３０Ｔ、Ｎ１３３Ａ、Ｄ３５７Ｅ、Ｈ３７２Ｎ、Ｒ４５１Ｋ、Ｇ４４９Ａ／Ｎ４５０Ａ、Ｒ３３４Ａ／Ｎ４５０Ａ、Ｒ３３４Ａ／Ｇ４４９Ａ／Ｎ５６８Ａ、Ｒ３３４Ａ／Ｎ５６８Ａ、Ｇ４４９Ａ／Ｎ５６８Ａは、増加した形質導入を示した。変異Ｓ１３０Ｔは、最もよく形質導入し、野生型のレベルの約１１倍であった。これは、Ｓ（セリン）とＴ（トレオニン）との間の唯一の差はＣＨ２基であるので、驚くべきことであった。また、表４に見られるように、組合せた変異は、通常、最低レベルの形質導入を有する単一の変異のレベルと同じレベルで形質導入された。
キャプシド内の特性のアミノ酸は、ヘパリン結合部位と重なる。この領域は、本明細書において「デッドゾーン」または「ＤＺ」と呼ばれる。デッドゾーン内の変異は、ＡＡＶ−２レセプターの１つ（例えば、ヘパリン）になお結合するが、細胞に形質導入しないキャプシドを生じ得る。アミノ酸置換を、デッドゾーンのアミノ酸内に作製し、これらの置換を、アラニンでの同じアミノ酸の置換と比較した。結果を表５に示す。
Figure 2018029614
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上に示すように、置換がより保存的であれば、デッドゾーンの変異はより機能的であった。例えば、Ｑは、Ｈについての良好な置換基であった。Ｄは、Ｅについての良好な置換基であった。ＥまたはＮは、Ｄについての良好な置換基であった。いくつかの固有の特性を有するグリシンは、置換することが難しかしいことは、驚くべきことではなかった。
変異Ｇ３７５Ｐ（野生型の０．０１％の形質導入）およびＧ３７５Ａ（野生型の２．４％の形質導入）のヘパリン結合特性を比較した。変異Ｇ３７５Ｐは、５０％でヘパリンに結合し、Ｇ３７５Ａは、９５％でヘパリンに結合した。３７５位は、デッドゾーンとヘパリン結合部位の機能の両方に必要とされ得る。Ｇ３７５Ａ変異におけるグリシンのアラニンでの置換は、他のデッドゾーン変異と同じ表現型を生じる−−これは、正常にヘパリンに結合するが、正常な形質導入の１０％未満を示す。しかし、Ｇ３７５Ｐ変異におけるグリシンのプロリンでの置換は、ヘパリン結合を欠損した変異（例えば、Ｒ３４７Ｃ／Ｇ４４９Ａ／Ｎ４５０Ａ）とより類似する表現型を生じる。特定の理論に束縛されないが、グリシンとアラニンとプロリンとの間の構造の差は、グリシンの側鎖が、デッドゾーンの機能に必要とされ得るこどを示唆する。なぜならば、アラニンでの置換は、形質導入を減少させるからである。アミン基を有さないプロリンでの置換が、ヘパリン結合に影響を与えるので、アミン基がヘパリン結合に必要とされ得る。あるいは、プロリン置換は、少し離れたヘパリン結合部位の構造を崩壊させ得る。ヘパリンに結合しなかった３の変異（Ｒ４４８Ａ、Ｒ４５１Ａ、Ｒ３４７Ｃ／Ｇ４４９Ａ／Ｎ４５０Ａ）が存在したが、これらは、ヘパリン結合に必要とされることが以前に知られている位置（３４７、４４８、４５１）であった。
これらの変異のいくつかの、マウスモノクローナル抗体（Ａ２０）による中和活性、そしてまた、精製し、プールしたヒトＩｇＧによる中和活性を決定した。プールしたヒトＩｇＧ調製物は、十分に特徴付けられており、市販されており、高度に精製されており、そして、米国（ＩｇＧを精製するために使用された血液の供給源であった）において見出されているほとんど全ての抗原特異性を表すと考えられているので、プールしたヒトＩｇＧ調製物を使用した。結果を表６に示す。
Figure 2018029614
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表に示すように、２１の変異（Ｓ１２７Ａ、Ｇ１２８Ａ、Ｄ１３２Ｎ、Ｒ３３４Ａ、Ｔ３５４Ａ、Ｎ３６０Ｈ／Ｓ３６１Ａ、Ｗ３６５Ａ、Ｋ３９０Ａ、Ｅ３９４Ｋ、Ｋ３９５Ａ、Ｋ４０７Ａ、Ｔ４１３Ｋ、Ｅ４３７Ａ、Ｇ４４９Ａ、Ｎ５６８Ａ、Ｋ５６９Ａ、Ｖ５７１Ａ、Ｒ３３４Ａ／Ｇ４４９Ａ、Ｒ３３４Ａ／Ｎ５６８Ａ、Ｎ５６８Ａ／Ｖ５７１Ａ、Ｒ３３４Ａ／Ｇ４４９Ａ／Ｎ５６８Ａ）は、ネイティブなＡＡＶ−２キャプシドと比較して、ヒトＩｇＧの大きなプールによる中和に対して２〜１０倍より抵抗性であった。予測されるように、プールしたヒトＩｇＧによる中和に抵抗性であった変異のいくつかはまた、個々のヒト血清による中和に抵抗性であった（例えば、Ｒ３３４Ａ、Ｎ３６０Ｈ／Ｓ３６１Ａ、Ｇ４４９Ａ、Ｎ５６８Ａ、Ｖ５７１Ａ）。特定の理論に束縛されないが、これらのアミノ酸を含むエピトープは、高い親和性または高頻度で、抗体に結合し得る。しかし、プールしたヒトＩｇＧによる中和に抵抗性のいくつかの変異は、個々の血清に抵抗性であると同定されなかった。これは、おそらくは、これらのアミノ酸を含むエピトープが、ヒト集団においてより希にしか見出されないからである。さらに、いくつかの変異は、個々の血清による中和に対しては抵抗性であったが、プールしたヒトＩｇＧによる中和に対しては抵抗性でなかった（例えば、Ｅ３９４Ａ、Ｎ４５０Ａ）。これらの場合、これらのアミノ酸を含むエピトープに結合する抗体は、その結合に影響を与える変異が、ＩｇＧの大きな複合混合物との関連で検出可能とならないように、親和性が低いか、または量が少ない可能性がある。
図７に見られ得るように、これらの変異は、ＡＡＶ−２の表面を横切る種々の位置に分散している。これらが覆う領域の大きさは、平均的なエピトープの大きさの２〜３倍であり、全てのヒトＩｇＧの全体による中和には、少なくとも２〜３のエピトープが関与し得ることを示唆している。
単一の中和抵抗性変異の組み合わせは、時折、複数の変異を含む単一の変異と比較して、かなり高い程度の中和抵抗性を生じた。しかし、この効果の度合いは、明白には、これらの中和抵抗性のレベルに対して倍数的に増加しない。
マウスモノクローナル抗体Ａ２０による中和に抵抗性の２以上の変異をまた同定した：Ｅ４１１Ａ（Ａ２０による中和に対して２．７倍抵抗性）およびＶ５７１Ｋ（Ａ２０による中和に対して２１７倍抵抗性）。Ｖ５７１Ｋ変異は、本発明者らにより「リジンスキャニング」と命名された概念に対する証拠を提供する。大きな側鎖を有するアミノ酸を、アラニンのようなより小さな側鎖を有するアミノ酸に変更することによって、抗体結合部位の一部を除去するのではなく、リジンスキャニングの概念は、小さな側鎖を有するアミノ酸（例えば、Ｖ５７１）を、大きな側鎖を有するリジンで置き換えることである。アラニン置換の場合と同じように、抗体結合部位の一部を除去するのではなく、リジンスキャニングの目的は、抗体結合と立体的に干渉し得るより大きなアミノ酸を挿入することである。リジンは、一般的にＡＡＶ−２の表面上に見られ、従って、一般に認められた置換であるようなので、リジンを選択した。しかし、アルギニン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシンまたはグルタミンにような他の大きなアミノ酸もまた、生物学的活性を損ねることなく、類似の効果を生じ得る。Ｖ５７１Ａは、マウスＡ２０抗体による中和に抵抗性ではないが、Ｖ５７１Ｋは、ネイティブなＶ５７１ ＡＡＶ−２キャプシドによる中和よりも、Ａ２０による中和に対して、２１７倍より抵抗性であることに注意されたい。
Ｖ５７１Ｋは、Ａ２０中和に抵抗性であるとして同定された４の他の変異（Ｑ１２６Ａ、Ｓ１２７Ａ、Ｓ２４７Ａ、Ｑ２４８Ａ；表３）の直ぐ側にある、プラトーに位置する。しかし、Ｅ４１１Ａは、同じエピトープ内であるためにＱ１２６Ａ、Ｓ１２７Ａ、Ｓ２４７Ａ、Ｑ２４８ＡおよびＶ５７１Ｋに十分に近いにも関わらず、スパイク上に位置する。Ａ２０エピトープ内にＥ４１１が含まれることは、Ａ２０が、プラトーおよびスパイクの両方に（すなわち、キャニオンを横切って）結合し得ることを証明する。分子モデリングは、ＡＡＶ−２レセプターの１つである、塩基性ＦＧＦレセプター（ＰＤＢ ＩＤ：１ＦＱ９）が、（トランスフェリンレセプターがイヌパルボウイルスに結合すると考えられる方法と非常に類似する様式および位置で）ＡＡＶ−２キャニオン内に非常によくフィットし得ることを示唆する。塩基性ＦＧＦレセプターがＡＡＶ−２キャニオンに結合する場合、キャニオンを横切るＡ２０の結合は、塩基性ＦＧＦレセプターの結合をブロックし、そして塩基性ＦＧＦレセプターが媒介する可能性のある形質導入の工程である、進入をブロックすることによって、Ａ２０がＡＡＶ−２を中和するという観察を説明する。
このプラトーおよびスパイクの領域は、レセプター結合を妨げることによって、他のＡＡＶを中和する結合に結合し得る。例えば、ＡＡＶ−５は、細胞内に進入するために、ＰＤＧＦレセプターを必要とすることが示されている（Ｄｉ Ｐａｓｑｕａｌｅら，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２００３）９：１３０６−１３１２）。ＰＤＧＦレセプターの構造は公知ではないが、これは、アミノ酸配列が塩基性ＦＧＦレセプターに相同である。例えば、両方が、類似の反復性Ｉｇ様配列ドメインから構成され、従って、類似の三次元構造を有すると予測される。従って、ＰＤＧＦレセプターは、ＡＡＶ−５キャニオンに結合し得る可能性がある。
Ｖ５７１ＫではなくＶ５７１Ａは、プールしたヒトＩｇＧによる中和に対して抵抗性である。逆に、Ｖ５７１ＡではなくＶ５７１Ｋは、マウスモノクローナルＡ２０による中和に対して抵抗性である。ヒトＩｇＧプール内の抗体が、Ｖ５７１に直接結合することが可能である。より小さいアラニン側鎖をバリン側鎖で置換することにより、ヒトＩｇＧによる結合が少なくなり得る。リジン側鎖は、なお結合を生じさせるのに十分な疎水性接触を提供し得るが、結合を妨げるほど大きくない。Ａ２０は、Ｖ５７１に直接結合し得ない（このことは、結合またはＡ２０による中和に対するＶ５７１Ａ変異の効果が存在しないことを説明している）。しかし、Ａ２０は、明らかにＶ５７１の近傍に結合する。Ｖ５７１Ｋが、例えば、立体干渉によって、Ａ２０結合と間接的に干渉することが可能である。
ＩｇＧ ＥＬＩＳＡもまた行なった。特にインビボにおいて、多くの中和の潜在的な機構が存在する。ＡＡＶの機能に必要とされていない領域におけるＡＡＶに対するＩｇＧの結合は、なお遺伝子を送達するＡＡＶの能力の減少を生じ得る。例えば、マクロファージの主な機能は、抗体に結合する外来性生物に結合することである。抗体が結合した生物が、（Ｆｃレセプターを介して）マクロファージに結合すると、この外来性の生物は、呑食されて、破壊される。抗体が、ＡＡＶを中和するために使用し得る別の潜在的な経路は、架橋によるものである。抗体は、二価であり、ＡＡＶは、１エピトープあたり（そして、おそらくは複数のエピトープあたり）６０の抗体結合部位を有するようである。従って、科学文献において十分に実証されているように、特定の抗体およびウイルスの濃度において、ＡＡＶと抗体の架橋ネットワークが形成され得る。このような免疫複合体は、沈殿するか、標的器官に到達する前に、血管系内で留まるほど大きくなり得る。この理由のために、機能的に有意ではないＡＡＶの領域上で、インビボにてＡＡＶに結合する抗体は、機能的に有意な領域に結合する抗体と同じだけ減少した形質導入を生じ得る。結果を表７に示す。
Figure 2018029614
表７に示すように、Ａ２０とヒトＩｇＧのプールの両方に、ネイティブなＡＡＶ−２よりも１０倍低く結合する１の変異（Ｖ５７１Ｋ）を同定した。全てのＡ２０ ＥＬＩＳＡにおいて、変異Ｖ５７１Ｋの結合は、１０倍減少した。全てのヒトＩｇＧ ＥＬＩＳＡにおいて、変異Ｖ５７１Ｋの結合は、１０倍減少した。Ａ２０／ＩｇＧサンドイッチＥＬＩＳＡの形式を使用する場合、変異Ｖ５７１Ｋの結合は、１００倍減少した。位置（５７１）は、ＡＡＶ−２キャプシドの表面上の１２６位、１２７位、２４７位および２４８位の直ぐ側である。１２６位、１２７位、２４７位および２４８位を、マウスモノクローナル抗体Ａ２０による中和のために重要であるとして同定した。従って、この領域は、マウスおよびヒトの両方において抗原性であり得る。
まとめると、抗体による中和は減少したが、生物学的特性には最小限の影響しか与えなかった、ＡＡＶ−２キャプシドの外側表面へのいくつかの変異を同定した。特に、１２７の変異を、ＩｇＧ構造およびＡＡＶ−２構造の手動によるドッキングに基づいて、抗体結合に最もアクセス可能であると思われる７２の位置（表面領域の５５％）に作製した。単一のアラニン置換（５７）、単一の非アラニン置換（４１）、複数の変異（２７）、および挿入（２）を作製した。全ての変異が、キャプシドタンパク質を生成し、野生型の１０倍以内のレベルでＤＮＡをパッケージングした。ヘパリン結合部位に近いか、またはヘパリン結合部位の中にある６の変異を除く全ての変異は、野生型と同様に、ヘパリンに結合した。９８の単一変異のうちの４２は、少なくとも野生型と同等に形質導入した。いくつかの変異は、増加した形質導入活性を有した。１つの変異（ＳからＴへの変異）は、野生型よりも１１倍高い形質導入活性を有した。組み合わせ（上または下）変異は、通常、形質導入の最も低いレベルを有する単一変異のレベルと同じレベルで形質導入した。
１０％未満の形質導入活性を有する、１５の単一アラニン置換変異のうちの１３が、ヘパリン結合部位と重なる領域（表面の１０％）において、互いに近接していた。これらの「デッドゾーン（ＤＺ）」変異は、正常な形質導入活性の０．００１％〜１０％を有したが、これらの全てが、野生型と同じ効率でヘパリンに結合した。ＤＺ変異により形質導入は増加し得、そして、３つの場合において、保存的置換を作製することによって、野生型のレベルを回復し得た。
５の変異は、ＥＬＩＳＡにおいてマウスモノクローナル抗体（Ａ２０）への結合を減少し、そして、インビトロにおいてＡ２０による中和に対して２．５倍〜２１７倍抵抗性であった。これらの５の変異は、互いに、そしてＤＺに対して近接していた。合計２１の単一変異は、３つのヒト抗血清による中和に対して、または、精製したヒトＩｇＧの大きなプール（ＩＶＩＧ，Ｐａｎｇｌｏｂｕｌｉｎ）による中和に対して、野生型と比較して２倍〜１０倍抵抗性であった。変異の異なるセットは、異なるヒト血清に対する抵抗性を与えた。これらの変異の位置は、広範囲に及んだ。これらが覆う領域の大きさは、ヒト血清が、少なくとも２つのエピトープに結合することによって、ＡＡＶ−２を中和することを示唆した。３の変異は、試験した全ての血清に対して抵抗性であったが、これらの３の変異の組み合わせは、ＩＶＩＧによる中和に対する抵抗性を増加させなかった。全てのＩＶＩＧ ＥＬＩＳＡにおいて野生型よりも１０倍低くＩＶＩＧに結合した１つ（ＶからＫ）の変異を同定した。しかし、この変異は、ＩＶＩＧ中和に対して抵抗性ではなかった。
まとめると、「デッドゾーン」における変異は、形質導入には影響を与えるが、ヘパリン結合には影響を与えない。ＤＺの周りの変異は、形質導入を増加し得るか、または抗体の結合を減少し得る。ＤＺは、非常に酸性（酸性アミノ酸６、塩基性アミノ酸０）である。特定の理論に束縛されないが、これは、塩基性タンパク質（例えば、ｂＦＧＦまたはｂＦＧＦレセプター）についての結合部位であり得る。デッドゾーンは、ＡＡＶ−２上のヘパリン結合部位に隣接しているので、タンパク質がデッドゾーンに結合すると、このタンパク質もまたヘパリンに結合し得る。ｂＦＧＦおよびｂＦＧＦレセプターの両方が、ヘパリンに結合する。
（実施例２ 変異型ＡＡＶ−ｈＦ．ＩＸを用いる、マウスにおける第ＩＸ因子の発現）
ｒＡＡＶ−Ｆ．ＩＸを、ｒＡＡＶ−２ ｈＦ．ＩＸベクターおよび上記の方法を用いて調製する。トランスフェクトした細胞の凍結−融解溶解物を沈殿させ、２サイクルの等密度遠心法によりｒＡＡＶビリオンを精製し；そして、ｒＡＡＶビリオンを含む分画をプールし、透析し、濃縮する。濃縮したビリオンを処方し、滅菌濾過（０．２２μＭ）し、ガラスバイアルに無菌的に充填する。ベクターゲノムを、「Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ」法（Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ．Ｈｅｉｄ Ｃ．Ａ．，Ｓｔｅｖｅｎｓ Ｊ．，Ｌｉｖａｋ Ｋ．Ｊ．およびＷｉｌｌｉａｍｓ Ｐ．Ｍ．１９９６．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：９８６−９９４．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）により定量する。
４〜６週齢の雌性マウスに、変異型ｒＡＡＶ−ｈＦ．ＩＸビリオンを注射する。ケタミン（７０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射によりマウスを麻酔し、下肢部に１ｃｍの長軸方向の切開をつくる。変異型組換えＡＡＶ−ｈＦ．ＩＸ（ＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩水、ｐＨ７．８中２×１０１１ウイルスベクターゲノム／ｋｇ）ビリオンを、Ｈａｍｉｌｔｏｎシリンジを用いて、各脚の前脛骨筋（２５μＬ）および大腿四頭筋（５０μＬ）に注射する。４−０ Ｖｉｃｒｙｌ縫合糸で切開を閉じる。７日間隔で、ミクロヘマトクリット毛細管内の眼窩後神経叢から、血液サンプルを採取し、血漿を、ＥＬＩＳＡによってｈＦ．ＩＸについてアッセイする。マウス血漿中のヒトＦ．ＩＸ抗原を、Ｗａｌｔｅｒら（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９６）３：３０５６−３０６１）により記載されたように、ＥＬＩＳＡにより評価する。ＥＬＩＳＡは、マウスＦ．ＩＸとは交差反応しない。全てのサンプルを、二連で評価する。注射したマウスの筋肉から得られるタンパク質抽出物を、ロイペプチン（０．５ｍｇ／ｍＬ）を含有するＰＢＳ中に浸軟させ、その後、超音波処理して調製する。細胞の細片を遠心分離により除去し、１：１０希釈のタンパク質抽出物を、ＥＬＩＳＡにおいてｈＦ．ＩＸについて評価する。ｈＦ．ＩＸの循環血漿濃度を、ＩＭ注射後の種々の時点（例えば、０週間、３週間、７週間および１１週間）で、ＥＬＩＳＡにより測定する。
（実施例３ 変異型ＡＡＶ−ｃＦ．ＩＸを用いる、イヌにおける血友病Ｂ処置）
イヌ第ＩＸ因子（ｃＦ．ＩＸ）遺伝子の触媒ドメインにおける点変異についてヘミ接合性の雄と、ホモ接合性の雌を含む、重篤な血友病Ｂを有するイヌの群を用いて、変異型ｒＡＡＶビリオン（ｒＡＡＶ−ｃＦ．ＩＸ）により送達されるｃＦ．ＩＸの効果を試験する。重篤な血友病のイヌは、血漿ｃＦ．ＩＸを欠き、その結果、全血凝固時間（ＷＢＣＴ）が６０分を超えるまで増加し（正常なイヌは、６〜８分の間のＷＢＣＴを有する）、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）が５０〜８０秒まで増加している（正常なイヌは、１３〜１８秒の間のａＰＰＴを有する）。これらのイヌは、再発性の自然出血を被る。代表的には、有意な出血エピソードは、１０ｍＬ／ｋｇの正常なイヌ血漿の単回の静脈内注入により首尾よく管理される；時折、繰り返し注入が、出血の制御のために必要とされる。
一般的な麻酔下で、血友病Ｂのイヌに、ｒＡＡＶ１−ｃＦ．ＩＸビリオンを、１×１０１２ｖｇ／ｋｇの用量で筋肉内注射する。これらの動物には、手順の間に、正常なイヌ血漿を与えない。
全血凝固時間を、血漿中のｃＦ．ＩＸについて評価する。活性化部分トロンボプラスチン時間を測定する。凝固インヒビターのスクリーニングをまた実施する。処置した血友病のイヌおよび正常なイヌから得た血漿を等量で混合し、そして、３７℃にて２時間インキュベートする。このインヒビタースクリーニングを、ａＰＰＴ凝固時間が、コントロール（イミダゾール緩衝液と共にインキュベートした正常なイヌの血漿、および正常なイヌの血漿と共にインキュベートした、前処置した血友病のイヌの血漿）のものよりも３秒長い場合に陽性とスコア付けする。ＡＡＶベクターに対する中和抗体力価を評価する。
（実施例４ 変異型ＡＡＶ−ｈＦ．ＩＸを用いる、ヒトにおける血友病Ｂの処置）
（Ａ．筋肉送達）
プロトコールの０日目に、患者に、ｈＦ．ＩＸ濃縮物を注入して、因子のレベルを約１００％までにし、そして、超音波誘導の下で、変異型ｒＡＡＶ−ｈ．ＦＩＸビリオンを、片側もしくは両側の前部大腿の外側広筋において１０〜１２部位に直接注射する。各部位の注射容量は、２５０〜５００μＬであり、これらの部位は、少なくとも２ｃｍ間隔が空いている。塩化エチルまたは、局所麻酔薬の共融混合物により皮膚への局所麻酔を施す。その後の筋肉生検を容易にするために、いくつかの注射部位の上にかかる皮膚に傷をつけて印をつけ、超音波により注射の座標を記録する。患者を、注射後２４時間、病院内で観察する；この期間の間に慣用的な隔離措置を取り、ビリオンの水平感染の危険性を最小限にする。患者を退院させ、そして、退院後、３日間、外来診察室にて毎日見、次の８週間は、在宅血友病センターにて毎週見、そして、５ヶ月までは１月に２回見、そして、その年の残りは１ヶ月毎に見、そして、その後毎年追跡する。ｈＦ．ＩＸの循環血漿レベルを、上記のようにＥＬＩＳＡを用いて定量する。
（Ｂ．肝臓送達）
標準的なシェルディンガー技術を用いて、総大腿動脈に、血管造影用導入シースを用いてカニューレ挿入する。次いで、１００Ｕ／ｋｇのヘパリンのＩＶ注射により患者をヘパリン処理する。次いで、ピッグテールカテーテルを大動脈内に進め、腹部大動脈撮影を実施する。腹腔および肝臓の動脈解剖図を描写した後、標準的な選択的血管造影用カテーテル（Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ｓｏｓ−Ｏｍｎｉ，Ｃｏｂｒａまたは類似のカテーテル）を用いて、適切なＨＡを選択する。患者内への挿入の前に、全てのカテーテルを、正常生理食塩水でフラッシュする。次いで、非イオン性造影物質（ＯｍｎｉｐａｑｕｅまたはＶｉｓｉｐａｑｕｅ）を用いて選択的な動脈図を実施する。このカテーテルを、０．０３５ワイヤ（Ｂｅｎｔｓｅｎ，ａｎｇｌｅｄ Ｇｌｉｄｅ、または類似のワイヤ）から取り除く。次いで、６Ｆ ガイドシース（またはガイドカテーテル）を、このワイヤに沿って総ＨＡ内へと進める。次いで、このワイヤを、０．０１８ワイヤ（ＦｌｅｘＴ，Ｍｉｃｒｏｖｅｎａ
Ｎｉｔｅｎｏｌまたは類似のカテーテル）と交換し、６×２ Ｓａｖｖｙバルーンをこのワイヤに沿って胃十二指腸の動脈から離れた適切なＨＡ内へと進める。次いで、このワイヤを取り除き、バルーンカテーテル内に造影剤を手動で注入することによってカテーテルの先端の位置を確認し、そして、管腔を、１５ｍｌのヘパリン処理した正常生理食塩水（ＮＳ）でフラッシュして、造影剤を完全に取り除く。ＡＡＶ−ｈＦＩＸの注入の前に、このバルーンを、２ａｔｍまで膨張させて、ＨＡの流動管腔を塞ぐ。８×１０Ｅ１０〜２×１０Ｅ１２の用量のＡＡＶ−ｈＦＩＸを、およそ４０ｍｌ以下の最終容量（用量および患者の体重に依存する）にし、次いで、自動容積測定注入ポンプを用いて、１０〜１２分にわたって注入する。次いで、３ｍｌの正常生理食塩水（ＮＳ）を（ＡＡＶ−ｈＦＩＸと同じ速度で）注入し、カテーテルの空隙容量をなくす。バルーンを、２分間膨張させたままにし、２分後に、バルーンを収縮させ、カテーテルを取り除く。次いで、大腿穿刺部位の診断用動脈図撮影を、同側側の前部斜方突出部内で実施する。この穿刺部位を、標準的な方法（例えば、６Ｆ Ｃｌｏｓｅｒ（Ｐｅｒｃｌｏｓｅ Ｉｎｃ．，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）または６Ｆ Ａｎｇｉｏｓｅａｌのいずれかを用いる経皮閉鎖デバイスを利用すること）によってか、または、カテーテルの除去部位を１５〜３０分間、手で圧迫することによって、閉鎖する。
（実施例５ 新規ヤギＡＡＶの単離および特徴付け）
（Ａ．細胞培養およびウイルス単離）
パルボウイルスの混入の証拠を有するヒツジアデノウイルス調製物を、以下のようにヤギの回腸から単離した。組織を、Ｅａｒｌｅｓ塩（ＰＨ７．２）およびゲントマイシン（ｇｅｎｔｏｍｙｃｉｎ）を含むイーグルのＭＥＭ培地中でホモジナイズした。このホモジネートを、２０分間の低速遠心分離（１，５００×ｇ）により清浄し、０．４５μｍデバイスを通して濾過滅菌した。上清（５００μｌ）を、３回継代した胎性仔ヒツジ腎臓細胞の初代培養物を含む２５ｃｍ２フラスコに播種し、胎仔ウシ血清（ＵＳＡ）およびラクトアルブミン加水分解物（ＵＳＡ）と共に、３７℃にて、加湿した５％ＣＯ２インキュベーター内で１週間インキュベートした。細胞をトリプシン処理し、スプリットし、そして、再度上記のようにインキュベートし、そして、最終的に、典型的なアデノウイルス細胞変性効果（ｃｙｔｏｐｈａｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔ）（ＣＰＥ）についてアッセイした。ＣＰＥを示すフラスコを−７０℃にて凍結し、溶解し、そして他の細胞型の上に重ねた。これらのフラスコを、その後インキュベートし、ＣＰＥについて試験した。
使用した他の細胞型は、胎仔ヒツジ組織に由来する非不死化（８回継代）ヒツジ胎仔鼻甲介細胞、および長期の継代により維持されたＭａｄｅｎ Ｄａｒｂｙウシ腎臓細胞（１６０回の継代にて使用した）を含んだ。全ての組織培養において、ブタトリプシン（ＵＳＡ）を用い、ヒト細胞培養物またはヒト細胞製品は使用しなかった。
（Ｂ．ウイルスＤＮＡ単離、ならびにＡＡＶ配列の同定および比較）
異なる細胞培養物および継代からの４つの調製物を、ＤＮＡ抽出のために個々に処理した。ウイルスを含有する上清を、消化緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ＰＨ８．０），１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ＰＨ８．０）および０．５％ＳＤＳ）中のプロテイナーゼＫ（２００μｇ）で処理し、３７℃で１時間インキュベートした。フェノールクロロホルム抽出およびエタノール沈殿の後、ウイルスＤＮＡをＴＥ中に再懸濁した。
各調製物のＤＮＡ含量を、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ＤＮＡ定量法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）により決定し、これらの調製物を、２０ｎｇ／μｌに希釈し、その後のＰＣＲアッセイのためにＤＮＡ濃度を標準化した。
（オリゴヌクレオチドプライマー）
公知のＡＡＶの間で高度に保存されているセグメントからの配列アライメントに基づいて、オリゴヌクレオチドプライマーを選択した。
フォワードプライマー１（ＧＴＧＣＣＣＴＴＣＴＡＣＧＧＣＴＧＣＧＴＣＡＡＣＴＧＧＡＣＣＡＡＴＧＡＧＡＡＣＴＴＴＣＣ）（配列番号２３）は、ヘリカーゼドメインに対して相補的であり、そしてリバースプライマー２（ＧＧＡＡＴＣＧＣＡＡＴＧＣＣＡＡＴＴＴＣＣＴＧＡＧＧＣＡＴＴＡＣ）（配列番号２４）は、ＤＮＡ結合ドメインに対して相補的であった。ＰＣＲフラグメントの予想サイズは１．５ｋｂであった。
（ＰＣＲ増幅）
全ての反応を、自動Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ Ｇｒａｄｉｅｎｔ熱サイクラー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）において、５０μｌで行なった。各反応混合物は、１×ＸＬ緩衝液ＩＩ中に、２００ｎｇの鋳型ＤＮＡ、各１μＭのオリゴヌクレオチドプライマー、１ｍＭ Ｍｎ（Ｏａｃ）２、各２００μＭのデオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）、および１．０単位のｒＴｔｈポリメラーゼ，ＸＬ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を含んだ。Ａｍｐｌｉｗａｘ ＰＣＲ ｇｅｍ １００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いてホットスタートを容易にした。サイクリング条件は、以下の通りであった：９４℃にて２分の変性、その後、９４℃にて１５秒の変性、４５℃にて３０秒のアニーリング、および７２℃にて２分の伸長の３５サイクルを続けた。
ＰＣＲ産物（１０μｌ）を、１％ ＮｕＳｉｅｖｅアガロースゲル（ＦＭＣ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＭＮ）内で電気泳動して分離し、エチジウムブロマイドで染色し、そして、ＵＶ光により可視化した。各ゲル上でＤＮＡ分子マーカーを用いて、反応生成物のサイズの決定を容易にした。
アッセイの特異性を制御するために、ＡＡＶ２配列を含むプラスミドからの１００ｎｇのＤＮＡを用いてもまたＰＣＲを実施した。
（ＤＮＡ配列決定）
ＰＣＲ生成物を、１％低融点アガロースゲル（ＦＭＣ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＭＥ）にて精製し、この配列を、ＡＡＶ−５配列から設計したプライマーを用いて決定した。
配列データを、ＮＴＩ ｖｅｃｔｏｒ ｓｕｉｔｅソフトウェアパッケージ（ＩｎｆｏｒＭａｘ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）を用いて分析した。
異なる細胞培養物および継代からのウイルス調製物を、ＤＮＡ抽出およびＰＣＲ分析のために、個々に処理した。フォワードプライマー１およびリバースプライマー２を使用するＰＣＲ増幅により、４つ全ての調製物におけるパルボウイルス様配列の存在が明らかとなった。配列分析により、ＡＡＶ配列の存在が明らかとなった。ＡＡＶ−５ゲノムのヌクレオチド２，２０７〜４，３８１に対応する、ヤギＡＡＶのＶＰ１ ＯＲＦは、ヒトから単離された霊長類ＡＡＶ−５（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ １９９９；７３：１３０９−１３１９）と、９３％のヌクレオチド同一性（２，１０４／２，２６６、ギャップ ６／２，２６６）を有する（図１２Ａ〜１２Ｂを参照のこと）。タンパク質の比較は、霊長類ＡＡＶ−５とヤギＡＡＶのＶＰ１タンパク質の間で、９４％の同一性（６８２／７２６）および９６％の類似性（６９８／７２６）を示した（図１３を参照のこと）。全てではないが、ほとんどの変異が、表面上に見えた（図１５を参照のこと）。図１６は、ＡＡＶ−２キャプシドの表面構造に基づいて、ＡＡＶ−５とヤギＡＡＶとの間で異なる表面アミノ酸の予測位置を示す。３つの充填した三角形は、ＡＡＶ−２に関する、ヤギＡＡＶ内の挿入を表し、これらは、表面上に位置するようである。
特定の理論に束縛されないが、表面の変異は、おそらく、体液性免疫系および／または反芻動物レセプターへの適合に起因する選択的な圧力によって駆動されたものである。表面に露出していない領域に変化がないことは、細胞性免疫応答からの圧力を欠くことを意味し得る。ヤギウイルスにおけるこれらの変異した領域は、既存のヒト抗ＡＡＶ５抗体に対する抵抗性を改善し得る。
非保存領域における差を分析するために、ヤギＡＡＶ配列を他のＡＡＶ血清型と比較し、そして、これらの血清型を、互いに比較した。特に、図１４Ａ〜１４Ｈは、霊長類ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３Ｂ、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−８、ＡＡＶ−５およびヤギＡＡＶに由来するＶＰ１のアミノ酸配列の比較を示す。これらの配列において保存されているアミノ酸を、＊で示し、結晶構造に基づく種々のアミノ酸位置のアクセス可能性を示す。Ｂは、アミノ酸が、内側表面と外側表面に間に埋もれていることを示す。Ｉは、アミノ酸が、内側表面上に見られることを示し、Ｏは、アミノ酸が外側表面上に見られることを示す。
ＡＡＶ−５とヤギＡＡＶとの間の非保存領域は、４３の変異を含む。これらの４３の変異のうちの１７は、ＡＡＶ−２とＡＡＶ−８との間で保存されていない。これらの変異の１つのみが、ヤギＡＡＶおよびＡＡＶ−８の同じアミノ酸に由来したものである。ＡＡＶ−５とヤギＡＡＶとの間の非保存領域は、３４８アミノ酸を含む。この非保存領域は、この領域が１７の連なった変異を含むと分析されると、１５７のアミノ酸に圧縮される。
表８〜１１は、比較の結果を示す。
Figure 2018029614
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（実施例６ ヤギＡＡＶの免疫反応性および他のＡＡＶとの比較）
（Ａ．霊長類ＡＡＶ血清型の中和活性）
表１２に示される霊長類ＡＡＶ血清型の中和活性を、上記の方法を用いて評価した。免疫反応性を、精製し、プールしたヒトＩｇＧ（表１２および表１３においてＩＶＩｇ８と命名した）を用いて決定した。
表１２および表１３に示すように、多くの血清型は、臨床的に適切な濃度のプールしたヒトＩｇＧにより中和された。ＡＡＶ−４およびＡＡＶ−８は、ＡＡＶ−３（ＡＡＶ−５よりも中和に対して抵抗性）よりも中和に対して抵抗性である、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２およびＡＡＶ−６よりもより中和に対して抵抗性であった。
（Ｂ．ヤギＡＡＶ 対 霊長類ＡＡＶ 血清型の中和活性）
ヤギＡＡＶの中和活性を、上記の方法を用いて霊長類ＡＡＶ−５と比較した。免疫反応性を、精製し、プールしたヒトＩｇＧ（表１４においてＩＶＩｇ８と命名した）を用いて決定した。表１４に示すように、ヤギＡＡＶは、ＡＡＶ−５よりも中和に対してより大きい抵抗性を示した。表１４はまた、上記の実施例において決定したように、ヤギＡＡＶに関しての、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６およびＡＡＶ−８の中和活性を示す。
別の実験において、ＡＡＶ−８に関するヤギＡＡＶの中和活性を、３つの異なるヒトＩｇＧの精製プール（それぞれ、表１５および表１６において、ＩＶＩｇ３、ＩＶＩｇ６およびＩＶＩｇ８と命名した）を用いて試験した。これらの表に示すように、ヒトＩｇＧの３つ全てのプールを使用しても、ヤギＡＡＶは、ＡＡＶ−８よりも中和に対してより抵抗性であった。
Figure 2018029614
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（実施例７ ヤギＡＡＶの線条体ニューロンおよびグリア細胞に形質導入する能力、ならびに他のＡＡＶとの比較）
種々のＡＡＶが線条体ニューロンおよびグリア細胞に形質導入する能力を調べるために、以下の実験を行なった。解離させた線条体ニューロンの初代培養物を、胚日数１８のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット胚から調製した。解離させた線条体組織を、小さな片に刻み、そして、トリプシン中で３０分間インキュベートした。次いで、この組織を、パスツールピペットを通してトリチュレートし、そして、細胞を、１ウェルあたり３５０，０００細胞の密度にて、ポリ−Ｄ−リジンでコーティングした１８ｍｍの円形のカバーガラスを含む１２ウェル培養ディッシュにプレートした。この培養培地は、２％ Ｂ−２７、０．５ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび２５ｍＭ Ｌ−グルタミン酸を補充した神経基礎培地であった。培養物を、３７℃にて５％ ＣＯ２内で維持し、そして、解離後、２〜３週間で、実験に使用した。この段階で、ドーパミン作動性ニューロンおよび線条体ニューロンを、形態学的に、そして、生物学的マーカーの発現により、区別する。
線条体の培養物を、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ＬａｃＺ）を含み、実施例１に記載される三重トランスフェクション法を用いて調製した、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−８およびヤギＡＡＶに由来するｒＡＡＶビリオン（１０４ＭＯＩ）と共に、５日間培養した。ヤギＡＡＶについて、ｐＨＬＰ１９（米国特許第６，００１，６５０号に記載される）に存在するキャプシドをコードする配列を、以下のようにして、ヤギＶＰ１コード配列で置き換えた。簡単に述べると、プラスミドｐＨＬＰ１９を、ＳｗａＩおよびＡｇｅＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ ０１９１５−５５９９）で消化し、目的のフラグメントを、１％低融点アガロースゲル（ＦＭＣ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＭＥ）にて精製し、そして、ヤギキャプシドを含有するＰＣＲフラグメントと連結するために使用した。このヤギキャプシドＰＣＲフラグメントを、フォワードプライマー：ＡＡＡＴＣＡＧＧＴＡＴＧＴＣＴＴＴＴＧＴＴＧＡＴＣＡＣＣＣ（配列番号２７）およびリバースプライマー：ＡＣＡＣＧＡＡＴＴＡＡＣＣＧＧＴＴＴＡＴＴＧＡＧＧＧＴＡＴＧＣＧＡＣＡＴＧＡＡＴＧＧＧ（配列番号２８）を用いて増幅した。このＰＣＲフラグメントを、酵素ＡｇｅＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ ０１９１５−５５９９）で消化し、消化したプラスミドと連結するために使用した。
β−ｇａｌタンパク質の十分かつ持続的な発現が、ベクターを用いて形質導入した後に、線条体ニューロンにおいて見られた。発現効率は、ＡＡＶ６で最も高く、ＡＡＶ８、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ヤギＡＡＶおよびＡＡＶ４が続いた。ＡＡＶ６は、ニューロンににだけ形質導入したが、ＡＡＶ５媒介性の遺伝子移送は、ニューロンにおいては不十分であったが、グリア細胞には形質導入した。全ての他のベクターが、ニューロン細胞およびグリア細胞の両方に形質導入した。
（実施例８ ヤギＡＡＶの筋肉に形質導入する能力、および他のＡＡＶとの比較）
ＩＶＩＧの存在下または非存在下で、種々のＡＡＶが筋肉に形質導入する能力を決定するために、以下の実験を行なった。雄性のＳＣＩＤマウス（１５〜２５ｇ）に、ヤギｒＡＡＶビリオン、ｒＡＡＶ−１ビリオン、またはｒＡＡＶ−８ビリオンの２ｅ１１ベクターゲノム（各群マウス５匹）を筋肉内注射した。上記ビリオンの各々は、ヒト第ＩＸ因子をコードする。これらのビリオンを、実施例１に記載した三重トランスフェクション法を用いて作製した。ｐＨＬＰ１９中に存在するキャプシドコード配列を、上記のようにヤギＶＰ１コード配列で置き換えた。ベクターの注射後１週間および２週間で、眼窩後血を回収し、血漿を抽出した。ベクター注射の２４時間前に、ＩＶＩＧ（Ｃａｒｉｍｕｎｅ：ヒト血清のプールからの精製免疫グロブリン，ＺＬＢ Ｂｉｏｐｌａｓｍａ，ロット番号０３２８７−００１１７）で試験したマウスに、尾静脈を介して注射した（２５０μｌ）。ｈＦＩＸ ＥＬＩＳＡを用いて、ヒトＦＩＸを、血漿サンプル中で測定した。
図１７に示すように、ヤギｒＡＡＶビリオンは、筋肉に形質導入せず、ｒＡＡＶ−８ビリオンおよびｒＡＡＶ−１ビリオンは、ｈＦＩＸの同じ発現レベルを示した。ＡＡＶ−１は、インビボにおいて、ＡＡＶ−８よりも中和に対して抵抗性であった。
（実施例９ ヤギＡＡＶの肝臓に形質導入する能力、および他のＡＡＶとの比較、ならびに、ヤギＡＡＶビリオンにより送達された遺伝子から発現されるタンパク質の生体分布）
ＩＶＩＧの存在下または非存在下で、種々のＡＡＶが肝臓に形質導入する能力を決定するために、以下の実験を行なった。雄性のＳＣＩＤマウス（１５〜２５ｇ）に、ヤギｒＡＡＶビリオンまたはｒＡＡＶ−８ビリオンの５ｅ１１ベクターゲノム（各群マウス５匹）を尾静脈を介して注射した。これらのビリオンは、ヒト第ＩＸ因子（ｈＦＩＸ）をコードする遺伝子を含んだ。以下のｒＡＡＶ−２ビリオンのデータは、別の実験からのものであった。特に、肝臓特異的プロモーター（Ｍｉａｏら，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．（２０００）１：５２２−５３２に記載される）の制御下にヒト第ＩＸ因子遺伝子を含む、プラスミドｐＡＡＶ−ｈＦＩＸ１６を用いて、ビリオンを作製した。プラスミドｐＡＡＶ−ｈＦＩＸ１６は、ヒト第ＩＸ因子ミニ遺伝子をコードする１１，２７７ｂｐのプラスミドである。この構築物において、ＦＩＸ ｃＤＮＡは、エキソン１とエキソン２との間に挟まれており、イントロン１が欠失している形態である。このｃＤＮＡは、ＦＩＸの発現の増加を示している。ＦＩＸは、ＡｐｏＥ肝臓制御領域（ＨＣＲ）およびヒトα１アンチトリプシンプロモーター（ｈＡＡＴ）、ならびにウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナル（ｇＧＨ ＰＡ）の転写制御下で発現する。プラスミドｐＡＡＶ−ｈＦＩＸ１６の骨格は、アンピシリン抵抗性を与えるβ−ラクタマーゼ遺伝子、細菌の複製起点、Ｍ１３／Ｆ１複製起点、およびバクテリオファージλＤＮＡのフラグメントを含む。λＤＮＡは、プラスミド骨格のサイズを６，９６６ｂｐまで増加させ、ＡＡＶベクター産生の間にそのパッケージングを防止する。
上記の三重トランスフェクション法を用いて、組み換え型ＡＡＶビリオンを産生した。ヤギｒＡＡＶビリオンについて、プラスミドｐＨＬＰ１９中に存在するＶＰ１コード配列を、上記のように、ヤギＶＰ１コード配列で置き換えた。
注射の後、注射後１週、２週、４週（各群マウス５匹）および８週（各群マウス２匹）に、眼窩後血を回収し、血漿を抽出した。ベクター注射の２４時間前に、ＩＶＩＧ（Ｐａｎｇｌｏｂｕｌｉｎ：ヒト血清のプールからの精製免疫グロブリン，ＺＬＢ Ｂｉｏｐｌａｓｍａ，ロット番号１８３８−００２９９）で試験したマウスに、尾静脈を介して注射した（２５０μｌ）。ｈＦＩＸ ＥＬＩＳＡによって、ヒトＦＩＸを、血漿サンプル中で測定した。
図１８に示すように、静脈内投与後の組み換え型ヤギＡＡＶビリオンでの肝臓の形質導入は低かった。ｒＡＡＶ−２ビリオンを用いるよりも、ｒＡＡＶ−８ビリオンを用いた方がより高いｈＦＩＸの発現が見られ、そして、ｒＡＡＶ−２ビリオンは、ヤギｒＡＡＶビリオンよりも高い発現を示した。ヤギｒＡＡＶビリオンは、インビボにおいて、ｒＡＡＶ−２ビリオンよりも中和に対してより抵抗性であった。ヒトＦＩＸ発現は、１２０の既存のＩＶＩＧ中和力価を持つｒＡＡＶを注射したマウスにおいて減少したが、ｈＦＩＸの発現は、１０の既存のＩＶＩＧ中和力価を持つｒＡＡＶ−２を注射したマウスにおいては完全にブロックされた。
生体分布分析のために、ベクター注射の４週間後に、マウス（各群マウス２匹）を屠殺し、臓器を回収した。回収した臓器には、脳、精巣、筋肉（大腿四頭筋）、腎臓、脾臓、肺、心臓、および肝臓を含めた。ｈＦＩＸを測定するために、異なる組織から抽出したＤＮＡサンプルについて定量的ＰＣＲを行なった。図１９に示すように、雄性ＳＣＩＤマウス内の、尾静脈投与したヤギｒＡＡＶビリオンの生体分布は、ヤギｒＡＡＶビリオンが肺向性を有したことを示した。
（実施例１０ 新規ウシＡＡＶの単離および特徴付け）
パルボウイルスの混入の証拠が、当該分野で公知の方法を使用して、ウシの肺から単離したウシアデノウイルス（ＢＡＶ）８型、Ｍｉｓｋ／６７株（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡから入手可能、寄託番号ＶＲ−７６９）において見られた。この新しい単離対を、「ＡＡＶ−Ｃ１」と名付けた。ＡＡＶ−Ｃ１を、ＰＣＲにより部分的に増幅し、そして配列決定した。図２０Ａおよび２０Ｂは、それぞれ、ＡＡＶ−Ｃ１に由来するＶＰ１のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。ＡＡＶ−Ｃ１に由来するＶＰ１アミノ酸配列を、他のＡＡＶ ＶＰ１と比較した。特に、図２１Ａ〜２１Ｈは、ＡＡＶ−Ｃ１に由来するＶＰ１アミノ酸配列の霊長類ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３Ｂ、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−８、ＡＡＶ−５およびヤギＡＡＶに由来するＶＰ１のアミノ酸配列との比較を示す。これらの配列において保存されているアミノ酸を、＊で示し、結晶構造に基づく種々のアミノ酸位置のアクセス可能性を示す。Ｂは、アミノ酸が、内側表面と外側表面との間に埋もれていることを示す。Ｉは、アミノ酸が、内側表面上に見られることを示し、Ｏは、アミノ酸が外側表面上に見られることを示す。
ＡＡＶ−Ｃ１に由来するＶＰ１は、ＡＡＶ−４とおよそ７６％の同一性を示した。ＡＡＶ−Ｃ１は、ＡＡＶ−５ ＶＰ１とおよそ５４％の同一性を示し、Ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ−５ ＶＰ１の最初の１３７アミノ酸およびＡＡＶ−５ ＶＰ１の終止後の非翻訳領域（図示せず）において高い相同性を有した。従って、ＡＡＶ−Ｃ１は、ＡＡＶ−５とＡＡＶ−４との間で自然のハイブリッドであるようである。ＡＡＶ−Ｃ１はまた、ＡＡＶ−２およびＡＡＶ−８に由来するＶＰ１とおよそ５８％の配列同一性を示し、ＡＡＶ−１およびＡＡＶ−６に由来するＶＰ１とおよそ５９％の配列同一性を示し、そして、ＡＡＶ−３Ｂに由来するＶＰ１とおよそ６０％の配列同一性を示した。
変化がもっぱらＶＰ１のＣ末端超可変領域にあったＡＡＶ−５とヤギＡＡＶ（ＡＡＶ−Ｇ１）との間の相違とは異なり、ＡＡＶ−４とＡＡＶ−Ｃ１との間の配列の相違は、キャプシド全体に分散していた。ＡＡＶ−４配列との類似性は、ＶＰ２の開始からキャプシドの終止までであった。ＡＡＶ−Ｃ１は、哺乳動物ＡＡＶの最も相違するものの１つであるようであり、ＡＡＶ−２との配列相同性は、およそ５８％であった。特に、Ｓｃｈｍｉｄｔらに記載されたウシＡＡＶは、ウシアデノウイルス２型から部分的に増幅されたものである。ＡＡＶ−Ｃ１およびＳｃｈｍｉｄｔらに記載されたウシＡＡＶに由来するヌクレオチド配列の比較は、１２のヌクレオチド変化と５のアミノ酸差異を示した。これらの差は、３３４位（ＡＡＶ−Ｃ１ ＶＰ１において、Ｈの代わりにＱが存在する）、４６４位（ＡＡＶ−Ｃ１ ＶＰ１において、Ｎの代わりにＫが存在する）、４６５位（ＡＡＶ−Ｃ１ ＶＰ１において、Ｋの代わりにＴが存在する）、４９９位（ＡＡＶ−Ｃ１ ＶＰ１において、Ｇの代わりにＲが存在する）、および５１４位（ＡＡＶ−Ｃ１ ＶＰ１において、Ｒの代わりにＧが存在する）で生じた。
ＡＡＶ−Ｃ１の全キャプシドを、プラスミドにクローニングし、これを用いて、擬型ＡＡＶ−２ベクターを生成した。さらなる特徴付けのために、ｐＨＬＰ１９中に存在するキャプシド配列がウシキャプシド配列で置き換えられていること以外は、上記の三重トランスフェクション技術を用いて、ＬａｃＺ遺伝子を含むＡＡＶ−Ｃ１ベクター（ＡＡＶ−Ｃ１−ＬａｃＺ）を生成した。ＡＡＶ−Ｃ１−ＬａｃＺの力価（ｖｇ／ｍｌ）を、上記のように定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）を用いて計算した。表１７に示すように、ＡＡＶ−Ｃ１ ＬａｃＺベクターを、効率よく生成し；Ｑ−ＰＣＲにより高い力価のベクター（２．４５ｅ１０ｖｇ／ｍｌ）を検出した。ＡＡＶ−Ｃ１ ＬａｃＺベクターは、インビトロにおいて十分な細胞の形質導入を示した（ＬａｃＺを発現する細胞が、他のＡＡＶと匹敵する数で存在した）。
Figure 2018029614
（実施例１１ ウシＡＡＶの免疫反応性および他のＡＡＶとの比較）
霊長類ＡＡＶ−２に関するウシＡＡＶ−Ｃ１の中和活性を、実施例６において上述した方法を用いて評価した。免疫反応性を、精製し、プールしたヒトＩｇＧ（ＩＶＩＧ−８、Ｐａｎｇｌｏｂｕｌｉｎ ロット番号１８３８−００３５１，ＺＬＢ Ｂｉｏｐｌａｓｍａ ＡＧ，Ｂｅｒｎｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて決定した。インビトロでの中和アッセイは、ＡＡＶ−Ｃ１が、ＡＡＶ−２よりも、ヒトＩＶＩＧによる中和に対して１６倍より抵抗性であったことを示した。ＡＡＶ−２の５０％以上の中和を示すＩＶＩＧの最低濃度（ｍｇ／ｍｌ）は、０．２ｍｇ／ｍｌであったが、ＡＡＶ−Ｃ１は、３．２５ｍｇ／ｍｌであった。
従って、免疫反応性が減少した変異型ＡＡＶビリオンを作製する方法および使用する方法が記載される。本発明の好ましい実施形態がいくらか詳細に記載されてきたが、特許請求の範囲により規定される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、明らかなバリエーションがなされ得ることが理解される。

Claims (1)

  1. 図面に記載された発明。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019166209A (ja) * 2018-03-26 2019-10-03 株式会社三共 遊技機
JP2020000473A (ja) * 2018-06-28 2020-01-09 ネット株式会社 遊技機

Families Citing this family (168)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU4645697A (en) 1996-09-11 1998-04-02 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Aav4 vector and uses thereof
CA2745131C (en) 1998-05-28 2016-08-09 John A. Chiorini Aav5 vector and uses thereof
WO2000075365A2 (en) 1999-06-08 2000-12-14 University Of Iowa Research Foundation Compounds and methods to enhance raav transduction
PL222683B1 (pl) 2001-11-13 2016-08-31 Univ Pennsylvania Rekombinowane wirusy stowarzyszone z adenowirusem (AAV), sposoby ich wytwarzania, pakująca komórka gospodarza, kompozycja zawierająca wirus, zastosowanie wirusa, wyizolowane wirusy AAV, białka,sztuczne białka kapsydu, cząsteczki, komórki gospodarza, sposoby dostarczania transgenu, sposób identyfikacji serotypu, zestaw diagnostyczny, sposób izolacji nowych wirusów, rekombinowana komórka
US7419817B2 (en) 2002-05-17 2008-09-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services, Nih. Scalable purification of AAV2, AAV4 or AAV5 using ion-exchange chromatography
AU2004227915A1 (en) 2003-03-31 2004-10-21 John F. Engelhardt Pharmico-gene theraphy of epithelial sodium channel associated disoders
US8927269B2 (en) 2003-05-19 2015-01-06 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Avian adenoassociated virus and uses thereof
WO2004112727A2 (en) 2003-06-19 2004-12-29 Avigen, Inc. Aav virions with decreased immunoreactivity and uses therefor
US9441244B2 (en) 2003-06-30 2016-09-13 The Regents Of The University Of California Mutant adeno-associated virus virions and methods of use thereof
US9233131B2 (en) * 2003-06-30 2016-01-12 The Regents Of The University Of California Mutant adeno-associated virus virions and methods of use thereof
WO2005056807A2 (en) * 2003-12-04 2005-06-23 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services, National Institutes Of Health Bovine adeno-associated viral (baav) vector and uses thereof
US20080188431A1 (en) * 2004-09-08 2008-08-07 Chiorini John A Transcytosis of Adeno-Associated Viruses
AU2005316476A1 (en) * 2004-12-15 2006-06-22 University Of Florida Research Foundation, Inc. Chimeric vectors
DK2359867T3 (en) * 2005-04-07 2015-01-05 Univ Pennsylvania A method for increasing an AAV vector function
WO2006119432A2 (en) 2005-04-29 2006-11-09 The Government Of The U.S.A., As Rep. By The Sec., Dept. Of Health & Human Services Isolation, cloning and characterization of new adeno-associated virus (aav) serotypes
JP2009535034A (ja) * 2006-04-28 2009-10-01 ユニバーシテイ・オブ・アイオワ・リサーチ・フアウンデーシヨン 哺乳動物細胞のパルボウイルス形質導入を調節若しくはウイルス感染を変えるための方法および化合物、ウイルス受容体若しくは共受容体の同定方法
EP2019143A1 (en) 2007-07-23 2009-01-28 Genethon CNS gene delivery using peripheral administration of AAV vectors
EP2058401A1 (en) 2007-10-05 2009-05-13 Genethon Widespread gene delivery to motor neurons using peripheral injection of AAV vectors
CA2750811C (en) 2009-01-30 2017-08-29 Amsterdam Molecular Therapeutics (Amt) Ip B.V. Alanine-glyoxylate aminotransferase therapeutics
EP2396343B1 (en) 2009-02-11 2017-05-17 The University of North Carolina At Chapel Hill Modified virus vectors and methods of making and using the same
WO2010109053A1 (es) 2009-03-27 2010-09-30 Proyeto De Biomedicina Cima, S.L. Métodos y composiciones para el tratamiento de cirrosis y fibrosis hepática
EP2287323A1 (en) 2009-07-31 2011-02-23 Association Institut de Myologie Widespread gene delivery to the retina using systemic administration of AAV vectors
WO2011032100A1 (en) 2009-09-11 2011-03-17 Government Of The U.S.A., As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Inhibitors of kshv vil6 and human il6
CN102712933A (zh) 2009-11-05 2012-10-03 西马生物医学计划公司 调控的表达系统
EP2384761B1 (en) * 2010-05-07 2013-09-04 Deutsches Krebsforschungszentrum Modified rodent parvovirus capable of propagating and spreading through human gliomas
US8663624B2 (en) 2010-10-06 2014-03-04 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus virions with variant capsid and methods of use thereof
JP5704361B2 (ja) * 2010-10-27 2015-04-22 学校法人自治医科大学 神経系細胞への遺伝子導入のためのアデノ随伴ウイルスビリオン
SG194583A1 (en) 2011-04-22 2013-12-30 Univ California Adeno-associated virus virions with variant capsid and methods of use thereof
US9677088B2 (en) 2012-05-09 2017-06-13 Oregon Health & Science University Adeno associated virus plasmids and vectors
US10294281B2 (en) * 2012-05-15 2019-05-21 University Of Florida Research Foundation, Incorporated High-transduction-efficiency rAAV vectors, compositions, and methods of use
AU2013279284A1 (en) 2012-06-21 2015-01-29 Association Institut De Myologie Widespread gene delivery of gene therapy vectors
JP6600624B2 (ja) 2013-05-31 2019-10-30 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア アデノ随伴ウイルス変異体及びその使用方法
PT3024498T (pt) * 2013-07-22 2020-03-06 Childrens Hospital Philadelphia Variante aav e composições, métodos e usos para transferência genética em células, órgãos e tecidos
JP6985795B2 (ja) 2013-09-26 2021-12-22 ユニバーシティ オブ フロリダ リサーチ ファンデーション インコーポレーティッド 標的遺伝子治療のための合成コンビナトリアルａａｖカプシドライブラリー
US20160243260A1 (en) 2013-10-24 2016-08-25 Uniqure Ip B.V. Treatment of neurological diseases using adeno-associated virus (AAV) comprising AAV-5 capsid proteins
GB201403684D0 (en) 2014-03-03 2014-04-16 King S College London Vector
CA2942776C (en) 2014-03-17 2023-01-24 Adverum Biotechnologies, Inc. Polyneucleotide cassette and expression vector for expression of a gene in cone cells using truncated m-opsin promoter
EP3913061A1 (en) * 2014-05-02 2021-11-24 Genzyme Corporation Aav vectors for retinal and cns gene therapy
WO2015191508A1 (en) 2014-06-09 2015-12-17 Voyager Therapeutics, Inc. Chimeric capsids
BR112017009497A2 (pt) * 2014-11-05 2018-02-06 Voyager Therapeutics, Inc. polinucleotídeos de aadc para o tratamento da doença de parkinson
ES2878451T3 (es) 2014-11-14 2021-11-18 Voyager Therapeutics Inc Polinucleótidos moduladores
US10597660B2 (en) 2014-11-14 2020-03-24 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (ALS)
KR102528156B1 (ko) 2014-11-28 2023-05-03 유니큐어 아이피 비.브이. 파보바이러스 비리온을 포함하는 조성물 중의 dna 불순물
EP3230441A4 (en) 2014-12-12 2018-10-03 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the production of scaav
EA201791939A1 (ru) 2015-03-02 2018-01-31 Адверум Байотекнолоджиз, Инк. Композиции и способы интравитреальной доставки полинуклеотидов в колбочки сетчатки
WO2016154344A1 (en) 2015-03-24 2016-09-29 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus variants and methods of use thereof
US10081659B2 (en) 2015-04-06 2018-09-25 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services Adeno-associated vectors for enhanced transduction and reduced immunogenicity
GB201508026D0 (en) 2015-05-11 2015-06-24 Ucl Business Plc Capsid
CN108137655B (zh) 2015-09-28 2022-04-22 北卡罗来纳-查佩尔山大学 逃避抗体的病毒载体的方法和组合物
CA3006569A1 (en) 2015-12-02 2017-06-08 Voyager Therapeutics, Inc. Assays for the detection of aav neutralizing antibodies
WO2017139381A1 (en) 2016-02-08 2017-08-17 University Of Iowa Research Foundation Methods to produce chimeric adeno-associated virus/bocavirus parvovirus
US11684679B2 (en) 2016-03-07 2023-06-27 University Of Iowa Research Foundation AAV-mediated expression using a synthetic promoter and enhancer
WO2017189964A2 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease
US11326182B2 (en) 2016-04-29 2022-05-10 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease
US10882886B2 (en) 2016-05-03 2021-01-05 Children's Medical Research Institute Adeno-associated virus polynucleotides, polypeptides and virions
UA124343C2 (uk) 2016-05-13 2021-09-01 4Д Молекьюлар Терапьютікс Інк. Капсиди аденоасоційованого вірусу і спосіб його використання
KR20240056729A (ko) 2016-05-18 2024-04-30 보이저 테라퓨틱스, 인크. 조절성 폴리뉴클레오티드
US11951121B2 (en) 2016-05-18 2024-04-09 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treating Huntington's disease
CN116286986A (zh) 2016-07-29 2023-06-23 加利福尼亚大学董事会 具有变异衣壳的腺相关病毒病毒体和其使用方法
CA3035522A1 (en) 2016-08-30 2018-03-08 The Regents Of The University Of California Methods for biomedical targeting and delivery and devices and systems for practicing the same
CA3040179A1 (en) 2016-10-19 2018-04-26 Adverum Biotechnologies, Inc. Modified aav capsids and uses thereof
WO2018132747A1 (en) 2017-01-13 2018-07-19 University Of Iowa Research Foundation Bocaparvovirus small noncoding rna and uses thereof
JP7081767B2 (ja) * 2017-01-30 2022-06-07 学校法人日本医科大学 アデノ随伴ウイルス（ａａｖ）キャプシドタンパク質の変異体
JP2020506705A (ja) * 2017-02-01 2020-03-05 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア シトルリン血症を処置するための遺伝子療法
AU2018224044B2 (en) 2017-02-21 2024-01-25 The Uab Research Foundation Modified AAV capsid proteins and uses thereof
CA3061652A1 (en) 2017-05-05 2018-11-08 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (als)
CN111108198A (zh) 2017-05-05 2020-05-05 沃雅戈治疗公司 治疗亨廷顿病的组合物和方法
JOP20190269A1 (ar) 2017-06-15 2019-11-20 Voyager Therapeutics Inc بولي نوكليوتيدات aadc لعلاج مرض باركنسون
AU2018302016A1 (en) 2017-07-17 2020-02-06 The Regents Of The University Of California Trajectory array guide system
JP7221275B2 (ja) 2017-08-03 2023-02-13 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッド Ａａｖを送達するための組成物および方法
MX2020001997A (es) 2017-08-28 2020-07-20 Univ California Variantes de capside de virus adenoasociado y metodos de uso de estas.
WO2019060454A2 (en) 2017-09-20 2019-03-28 4D Molecular Therapeutics Inc. CAPSID VARIANT ADENO-ASSOCIATED VIRUSES AND METHODS OF USE
TWI804518B (zh) 2017-10-16 2023-06-11 美商航海家醫療公司 肌萎縮性脊髓側索硬化症(als)之治療
US20200237799A1 (en) 2017-10-16 2020-07-30 Voyager Therapeutics, Inc. Treatment of amyotrophic lateral sclerosis (als)
CR20200282A (es) 2017-11-27 2021-02-18 4D Molecular Therapeutics Inc Cápsides variantes de virus adenoasociados y su uso para inhibir la angiogénesis
MX2020005470A (es) 2017-11-27 2020-11-09 Coda Biotherapeutics Inc Composiciones y metodos para enfermedades neurologicas.
US10610606B2 (en) 2018-02-01 2020-04-07 Homology Medicines, Inc. Adeno-associated virus compositions for PAH gene transfer and methods of use thereof
US11306329B2 (en) 2018-02-19 2022-04-19 City Of Hope Adeno-associated virus compositions for restoring F8 gene function and methods of use thereof
EP3773746A4 (en) * 2018-03-29 2022-01-19 University of Florida Research Foundation, Incorporated VARIANTS OF AAV6
CN112004820B (zh) * 2018-03-30 2023-09-12 利兰斯坦福初级大学董事会 具有增强的人胰腺向性的新型重组腺相关病毒衣壳
JP7406677B2 (ja) 2018-04-03 2023-12-28 ギンコ バイオワークス インコーポレイテッド 抗体を回避するウイルスベクター
MX2020010465A (es) 2018-04-03 2021-01-08 Vectores de virus para direccionamiento a tejidos oftalmicos.
WO2019195444A1 (en) 2018-04-03 2019-10-10 Stridebio, Inc. Antibody-evading virus vectors
CN112313331A (zh) 2018-04-27 2021-02-02 沃雅戈治疗公司 用于测量aadc病毒载体效力的方法
WO2019222328A1 (en) 2018-05-15 2019-11-21 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of parkinson's disease
US20210230632A1 (en) 2018-05-15 2021-07-29 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for delivery of aav
EP3793686A1 (en) 2018-05-16 2021-03-24 Voyager Therapeutics, Inc. Aav serotypes for brain specific payload delivery
WO2019222444A2 (en) 2018-05-16 2019-11-21 Voyager Therapeutics, Inc. Directed evolution
US12060567B2 (en) 2018-06-13 2024-08-13 Voyager Therapeutics, Inc. Engineered untranslated regions (UTR) for AAV production
US20210361318A1 (en) 2018-07-02 2021-11-25 Voyager Therapeutics, Inc. Cannula system and use thereof
AU2019299861A1 (en) 2018-07-02 2021-01-14 Voyager Therapeutics, Inc. Treatment of amyotrophic lateral sclerosis and disorders associated with the spinal cord
JP2021530548A (ja) 2018-07-24 2021-11-11 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッドVoyager Therapeutics, Inc. 遺伝子治療製剤を生産するための系および方法
WO2020028751A2 (en) 2018-08-03 2020-02-06 Voyager Therapeutics, Inc. Aav variants with enhanced tropism
KR20210102870A (ko) 2018-08-30 2021-08-20 테나야 테라퓨틱스, 인코포레이티드 미오카르딘 및 ascl1을 사용한 심장 세포 재프로그래밍
US20210299275A1 (en) * 2018-08-30 2021-09-30 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Gene therapy for the treatment of galactosemia
SG11202103151RA (en) 2018-09-28 2021-04-29 Voyager Therapeutics Inc Frataxin expression constructs having engineered promoters and methods of use thereof
AU2019354995A1 (en) 2018-10-02 2021-05-13 Voyager Therapeutics, Inc. Redirection of tropism of AAV capsids
WO2020072849A1 (en) 2018-10-04 2020-04-09 Voyager Therapeutics, Inc. Methods for measuring the titer and potency of viral vector particles
WO2020072844A1 (en) 2018-10-05 2020-04-09 Voyager Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acid constructs encoding aav production proteins
WO2020077165A1 (en) 2018-10-12 2020-04-16 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for delivery of aav
WO2020081490A1 (en) 2018-10-15 2020-04-23 Voyager Therapeutics, Inc. EXPRESSION VECTORS FOR LARGE-SCALE PRODUCTION OF rAAV IN THE BACULOVIRUS/Sf9 SYSTEM
US20220064671A1 (en) 2019-01-18 2022-03-03 Voyager Therapeutics, Inc. Methods and systems for producing aav particles
AU2020216480A1 (en) 2019-01-31 2021-09-09 Oregon Health & Science University Methods for using transcription-dependent directed evolution of AAV capsids
US20220154210A1 (en) 2019-02-25 2022-05-19 Novartis Ag Compositions and methods to treat bietti crystalline dystrophy
US20220154211A1 (en) 2019-02-25 2022-05-19 Novartis Ag Compositions and methods to treat bietti crystalline dystrophy
MX2021011468A (es) 2019-03-21 2021-12-15 Vectores de virus adenoasociados recombinantes.
SG11202110607WA (en) 2019-04-01 2021-10-28 Tenaya Therapeutics Inc Adeno-associated virus with engineered capsid
WO2020223280A1 (en) 2019-04-29 2020-11-05 Voyager Therapeutics, Inc. Aav variants with enhanced tropism
EP3962536A1 (en) 2019-04-29 2022-03-09 Voyager Therapeutics, Inc. Systems and methods for producing baculoviral infected insect cells (biics) in bioreactors
EP3966227A1 (en) 2019-05-07 2022-03-16 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the vectored augmentation of protein destruction, expression and/or regulation
EP3997226A1 (en) 2019-07-11 2022-05-18 Tenaya Therapeutics, Inc. Cardiac cell reprogramming with micrornas and other factors
WO2021025995A1 (en) 2019-08-02 2021-02-11 Voyager Therapeutics, Inc. Aav variants with enhanced tropism
US20220290182A1 (en) 2019-08-09 2022-09-15 Voyager Therapeutics, Inc. Cell culture medium for use in producing gene therapy products in bioreactors
EP4022070A1 (en) 2019-08-26 2022-07-06 Voyager Therapeutics, Inc. Controlled expression of viral proteins
WO2021046155A1 (en) 2019-09-03 2021-03-11 Voyager Therapeutics, Inc. Vectorized editing of nucleic acids to correct overt mutations
JP2022550435A (ja) 2019-10-04 2022-12-01 ウルトラジェニックス ファーマシューティカル インコーポレイテッド 組換えａａｖの改善された治療的使用のための方法
AU2020367532A1 (en) 2019-10-17 2022-05-12 Ginkgo Bioworks, Inc. Adeno-associated viral vectors for treatment of Niemann-Pick disease type C
TW202140791A (zh) 2020-01-13 2021-11-01 美商霍蒙拉奇醫藥公司 治療苯酮尿症之方法
WO2023172491A1 (en) 2022-03-07 2023-09-14 Ultragenyx Pharmaceutical Inc. Modified batch aav production systems and methods
EP4103724A1 (en) 2020-02-14 2022-12-21 Ultragenyx Pharmaceutical Inc. Gene therapy for treating cdkl5 deficiency disorder
EP4114421A1 (en) 2020-03-02 2023-01-11 Tenaya Therapeutics, Inc. Gene vector control by cardiomyocyte-expressed micrornas
US20230235353A1 (en) 2020-03-19 2023-07-27 Ultragenyx Pharmaceutical Inc. Compositions and methods for reducing reverse packaging of cap and rep sequences in recombinant aav
EP4127189A1 (en) 2020-03-31 2023-02-08 Ultragenyx Pharmaceutical Inc. Gene therapy for treating propionic acidemia
WO2021202651A1 (en) 2020-04-01 2021-10-07 Voyager Therapeutics, Inc. Redirection of tropism of aav capsids
IL297200A (en) 2020-04-15 2022-12-01 Voyager Therapeutics Inc tau binding compounds
GB202005732D0 (en) 2020-04-20 2020-06-03 Synpromics Ltd Regulatory nucleic acid sequences
EP4143206A1 (en) * 2020-05-01 2023-03-08 Trustees of Boston College Controlled modification of adeno-associated virus (aav) for enhanced gene therapy
TW202208397A (zh) 2020-05-13 2022-03-01 美商航海家醫療公司 Aav蛋白殼之趨性重定向
TW202208632A (zh) 2020-05-27 2022-03-01 美商同源醫藥公司 用於恢復ｐａｈ基因功能的腺相關病毒組成物及其使用方法
WO2021247995A2 (en) 2020-06-04 2021-12-09 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating neuropathic pain
WO2022026410A2 (en) 2020-07-27 2022-02-03 Voyager Therapeutics, Inc Compositions and methods for the treatment of niemann-pick type c1 disease
MX2023000815A (es) 2020-07-27 2023-04-11 Voyager Therapeutics Inc Composiciones y metodos para el tratamiento de trastornos neurologicos relacionados con la deficiencia de glucosilceramidasa beta.
WO2022032153A1 (en) 2020-08-06 2022-02-10 Voyager Therapeutics, Inc. Cell culture medium for use in producing gene therapy products in bioreactors
CN113855794A (zh) * 2020-08-18 2021-12-31 深圳市俊元生物科技有限公司 一种基于棘突蛋白基因修饰干细胞的新型冠状病毒疫苗
MX2023002016A (es) 2020-08-19 2023-06-26 Sarepta Therapeutics Inc Vectores de virus adenoasociados para el tratamiento del sindrome de rett.
GB202013940D0 (en) 2020-09-04 2020-10-21 Synpromics Ltd Regulatory nucleic acid sequences
US11781156B2 (en) 2020-10-09 2023-10-10 Tenaya Therapeutics, Inc. Plakophillin-2 gene therapy methods and compositions
US20240141377A1 (en) 2021-03-03 2024-05-02 Voyager Therapeutics, Inc. Controlled expression of viral proteins
WO2022187548A1 (en) 2021-03-03 2022-09-09 Voyager Therapeutics, Inc. Controlled expression of viral proteins
EP4349852A1 (en) 2021-05-28 2024-04-10 Shanghai Regenelead Therapies Co., Ltd. Recombinant adeno-associated virus having variant capsid, and application thereof
MX2024000175A (es) 2021-07-08 2024-03-05 Tenaya Therapeutics Inc Casetes de expresión optimizada para genoterapia.
JP2024531138A (ja) 2021-08-11 2024-08-29 ウルトラジェニックス ファーマシューティカル インコーポレイテッド 筋ジストロフィーを処置するための組成物および方法
EP4405396A2 (en) 2021-09-20 2024-07-31 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of her2 positive cancer
MX2024004936A (es) 2021-11-02 2024-05-08 Voyager Therapeutics Inc Variantes de capsides de aav y sus usos.
WO2023091948A1 (en) 2021-11-17 2023-05-25 Voyager Therapeutics, Inc. Aav capsid variants and uses thereof
WO2023091949A2 (en) 2021-11-17 2023-05-25 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of neurological disorders related to glucosylceramidase beta deficiency
TW202325850A (zh) 2021-11-29 2023-07-01 大陸商上海瑞宏迪醫藥有限公司 Aadc、gdnf多核苷酸及其用於治療帕金森病
CN118786151A (zh) 2021-12-16 2024-10-15 邓迪大学 α-突触核蛋白的靶向降解
WO2023133593A2 (en) * 2022-01-10 2023-07-13 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Aav5 capsid variants
WO2023147374A2 (en) 2022-01-25 2023-08-03 Voyager Therapeutics, Inc. Baculovirus expression system
TW202346599A (zh) 2022-02-08 2023-12-01 美商航海家醫療公司 Ａａｖ衣殼變異體及其用途
GB202201713D0 (en) 2022-02-10 2022-03-30 Univ Dundee An affinity directed phosphatase system for targeted protein dephosphorylation
CN118660913A (zh) 2022-02-21 2024-09-17 上海瑞宏迪医药有限公司 Vegf结合分子及其医药用途
TW202404993A (zh) 2022-04-11 2024-02-01 美商特納亞治療股份有限公司 具經工程化蛋白殼之腺相關病毒
WO2023212298A1 (en) 2022-04-29 2023-11-02 Broadwing Bio Llc Bispecific antibodies and methods of treating ocular disease
WO2023212293A1 (en) 2022-04-29 2023-11-02 Broadwing Bio Llc Complement factor h related 4-specific antibodies and uses thereof
WO2023212294A1 (en) 2022-04-29 2023-11-02 Broadwing Bio Llc Angiopoietin-related protein 7-specific antibodies and uses thereof
WO2023220695A2 (en) 2022-05-13 2023-11-16 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of her2 positive cancer
WO2023235791A1 (en) 2022-06-02 2023-12-07 Voyager Therapeutics, Inc. Aav capsid variants and uses thereof
WO2023240236A1 (en) 2022-06-10 2023-12-14 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of spinal muscular atrophy related disorders
WO2023250388A1 (en) 2022-06-22 2023-12-28 Voyager Therapeutics, Inc. Tau binding compounds
WO2024006741A1 (en) 2022-06-28 2024-01-04 Voyager Therapeutics, Inc. Aav capsid variants and uses thereof
WO2024011112A1 (en) 2022-07-06 2024-01-11 Voyager Therapeutics, Inc. Aav capsid variants and uses thereof
WO2024030976A2 (en) 2022-08-03 2024-02-08 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for crossing the blood brain barrier
WO2024054983A1 (en) 2022-09-08 2024-03-14 Voyager Therapeutics, Inc. Controlled expression of viral proteins
TW202428602A (zh) 2022-09-15 2024-07-16 美商航海家醫療公司 Ｔａｕ結合化合物
WO2024145474A2 (en) 2022-12-29 2024-07-04 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for regulating mapt
WO2024163012A1 (en) 2023-02-02 2024-08-08 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of neurological disorders related to glucosylceramidase beta deficiency

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002538770A (ja) * 1998-11-10 2002-11-19 ユニバーシティ オブ ノース カロライナ アット チャペル ヒル ウイルスベクターとその製造及び投与の方法

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US116A (en) 1837-02-03 William croasdale
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5139941A (en) 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
US5225347A (en) 1989-09-25 1993-07-06 Innovir Laboratories, Inc. Therapeutic ribozyme compositions and expression vectors
GB2276169A (en) 1990-07-05 1994-09-21 Celltech Ltd Antibodies specific for carcinoembryonic antigen
US6001650A (en) 1995-08-03 1999-12-14 Avigen, Inc. High-efficiency wild-type-free AAV helper functions
US6004797A (en) 1995-11-09 1999-12-21 Avigen, Inc. Adenovirus helper-free recombinant AAV Virion production
US6177403B1 (en) 1996-10-21 2001-01-23 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions, methods, and apparatus for delivery of a macromolecular assembly to an extravascular tissue of an animal
DE69841982D1 (de) 1997-03-14 2010-12-16 Philadelphia Children Hospital Zusammensetzungen zum einsatz in einer gentherapie zur behandlung von hämophilie
US6156303A (en) 1997-06-11 2000-12-05 University Of Washington Adeno-associated virus (AAV) isolates and AAV vectors derived therefrom
US6498244B1 (en) 1999-05-28 2002-12-24 Cell Genesys, Inc. Adeno-associated virus capsid immunologic determinants
US7125705B2 (en) 2000-04-28 2006-10-24 Genzyme Corporation Polynucleotides for use in recombinant adeno-associated virus virion production
US6962815B2 (en) 2001-01-05 2005-11-08 Children's Hopital Inc. AAV2 vectors and methods
PL222683B1 (pl) * 2001-11-13 2016-08-31 Univ Pennsylvania Rekombinowane wirusy stowarzyszone z adenowirusem (AAV), sposoby ich wytwarzania, pakująca komórka gospodarza, kompozycja zawierająca wirus, zastosowanie wirusa, wyizolowane wirusy AAV, białka,sztuczne białka kapsydu, cząsteczki, komórki gospodarza, sposoby dostarczania transgenu, sposób identyfikacji serotypu, zestaw diagnostyczny, sposób izolacji nowych wirusów, rekombinowana komórka
AU2003221733A1 (en) * 2002-04-17 2003-11-03 University Of Florida Research Foundation, Inc. Improved raav vectors
WO2004112727A2 (en) 2003-06-19 2004-12-29 Avigen, Inc. Aav virions with decreased immunoreactivity and uses therefor

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002538770A (ja) * 1998-11-10 2002-11-19 ユニバーシティ オブ ノース カロライナ アット チャペル ヒル ウイルスベクターとその製造及び投与の方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BLOOD, (2002), VOL. 100, NO. 11, P. 490B, JPN6010011560, ISSN: 0004109267 *
J. VIROLOGY, (2000), VOL. 74, NO. 18, P. 8635-8647, JPN6011038460, ISSN: 0004109266 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019166209A (ja) * 2018-03-26 2019-10-03 株式会社三共 遊技機
JP2020000473A (ja) * 2018-06-28 2020-01-09 ネット株式会社 遊技機

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